安定型アスコルビン酸誘導体の免疫賦活活性とそのメカニズム
岡山大学薬学部

格本山A stable form of ascorbate, AA-2P significantly enhanced anti-SRBC antibody productions
by cultured splenocytes at a concentration of 0.5rnM, as had been previously described withAA-2G, whereas AA-2S was without effect. In this culture system, it was confirmed that AA-2Gand AA-2P were cleaved by lymphocyte's a-glucosidase and phosphatase, respectively, to releaseintact ascorbic acid. We also demonstrated that AA-2P synergistically enhanced the antibodyresponeses with nerve growth factor (NGF) by T-cell depleted splenocytes, as had been previously
reported with AA-2G, whereas AA-2S did not. SRBC-induced expression of NGF receptor on B
cell surface was stimulated by AA-2P as well as AA-2G. These results indicate that AA-2G orAA-2P, as an ascorbate source, may be a useful tool for finding new biological actions and for
elucidation of their mechanisms.

緒

養細胞に対し ても 作 用 を 発揮 す る 。 例 え ば、

言AA-2G はヒト線維芽細胞におけるコラ ー ゲン合
ビタミンC はビタミンの中でもそ の働きや機成を促進する 6) 。 この場合、 培地中に含まれる血能について最もよく知られており、 それ故に研究

清また は細胞膜面上の a — グルコシダーセによし尽くされたかに見えるビタミンである。 しかし、り AA-2G から遊離したアスコルビン酸が本作用近年細胞レベル、分子レベル並びに遺伝子レベルを発揮するしていることも明らかにされている。の研究が進むにつれ、 今なお新しい機能の発掘と我々は AA-2Gをアスコルビン酸供給源として用生体内での意義について知見が蓄積されつつある。

い、 牌細胞培養系において、 アスコルビン酸の抗最近、 我々は新規安定型アスコルビン酸誘導体、体産生増強作用を初めて実証した 7 〉 。

ビタミンC

2- 0 - a -D-g 1 ucopyranosy 1-L-ascorbi c acidの免疫増強作用については、 古くより多くの研究(AA-2G)を見い出し、その酵素的大巌合成にも成功

者により報告されているが、 in vitroにおける細した 1-3) 。

胞レベルで作用が認められないことから、 例えば

AA-2G は熱や酸化に対し極めて安定であるが、抗体産生増強作用のメカニズムに関してはこれま経口投与された場合には、 i肖化管組織の a グルコで全く不明であった。 この原因がアスコルビン酸—

スとアスコルビン酸が生の不安定さにあることを証明した。 その後、 我々

じ、 それが吸収され抗壊血病作用（モルモット）

はアスコルビン酸の抗体産生促進作用が神経成長などのビタミンC活性を発揮する · 5> o AA-2Gは培因子 (NGF) により相乗効果を受けること を見

Immnostimulatory activity of stable ascorbates

ところ、 B リンパ球上のNGF受容体発現がアスコルシダーゼによリグルコ ー4

いだした（投稿中）。 そのメカニズムを解析した｀

and it's mechanism

ヒ ン酸により増強されるという輿味ある知見を見いだしている（投稿中）。

Itaru Yamamoto

本研究では、 主に安定型アスコルビン酸誘導体
Okayama UniversityであるAA-2PとAA-2S について、 AA-2Gと同様の作用があるか否かにつき検討した。

-62-

― -―—-

安定型アスコルピン酸誘導体の免疫試活活性とそのメカニズム(A)l l -使用した。

-ニ

動物：雌性BALB/cマウスは7週齢で（株）日本クレアより購入し、一定の環境下で馴化後10週齢でNGF

FCS 含有 RPMI1640培地を24穴カルチャ ー プレ ー．

4Xl炉をSRBC抗原及びNGFなどの薬物と共に、10%．

ASA 2

抗SRBC抗体産生応答：マウ スT細胞除去牌細胞++＿＋++〗 〗実験方法と材料

ト(NUNC)を用いて5日間培養した。 培養終了後細0胞を回収・洗浄後、補体並びにSRBC存在下、 プラー246
Anti-SRBCx10-2/Culture

ク形成細胞をcunninghamの方法 8) に準じて計数8(B)した。
NGF受容体発現細胞の測定：培養細胞lXl炉をMEM

Medium

培地50µ1に懸獨し、ビオチン化NGF溶液6µ1を加SRBCぇ、氷冷下30分放置し、洗浄後0. 5% BSA 含有PBS+/IA-2Gに懸櫛しフロ ー サイトメトリ ー にて解析した。

+AA-2P+AA-2S

結 果+AsA
AA-2G は全牌細胞系においては、0. 25mM以上の+2-ME濃度で抗体産生を著明に増強することをすでに報告している

7)0。 この増強作用はAA-2Gによる単なる非特異的な牌細胞の生存維持作用ではなく、特異的抗体産生細胞数の増加によること、すなわち、分化促進作用に基づくことを明らかにしている。 一方、T細胞除去牌細胞系では0. 25mMのAA-2Gは単独ではほとんど増強作用を示さず、 また、N G F も同様に単独では抗体産生に対し無作用である。 しかし両者を併用すると相乗効果が出現し、抗体産生は著明に促進される。
ここではAA-2Gと同様、 既知の安定型アスコルビン酸誘導体であるAA-2P並びにAA-ZSにも抗SRBC抗体産生におけるNGF との相乗作用が認め

2468NGFR positive cells(%)

10Fig.1(A) Combind effect of NGF and several
A s A der iv a t ives o n anti-SRBC PFC
response in Teel I depleted spleno­cytes.
(B) Flow cytometric analysis of Teel I
depleted splenocytes stimulated withSRBC in the presence of severa I As A
der i vatives, Sp I eno cy t es were cu I tured
with NGF (30ng/m I) and AA-2G (0. 5mM),AA-2P(0. 5mM), AA-2S(0. 5mM). ASA(0. 5mM) or 2-ME (0. 5µM) for 5days(A) or 4days(B). NGF was added to thecultured medium at day 4. Significant
differences from each control wasexpressed as •: P<O. 05, •• :<O. 01.

られるか否かを検討した。 その結果、図lAに示す
ように0.5mMのAA-2Pは単独では何等作用は認めらリンパ球膜面上の NGF受容体の発現促進であるこ

れないにもかかわらず、30ng/ml のNGFを同時にとが明らかにされている。 そ こで、AA-2Pの 場培地に添加すると、AA-2GとNGFの場合に認められ合にも同様の現象が観察されるか否かにつき検討たとほぼ同程度の相乗効果が認められた。

した。 その結果、図lBに示したように、抗原SRBC

ところで、先に我々が報告したように、AA-2Gの剌激下、0. 5mMの AA-2PによりNGF受容体の発現とNGFの相乗効果の 原因の 一 つはAA-2GによるB増加が認められた。
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それに対し、AA-2S (0.5mM)及びAsA (0.5mM)

コルビン酸含量の間に相関性があるか否かを知る

では抗体産生における NGFとの相乗効果は認めらために、 培養Bリンパ球内のアスコルビン酸含れず、また AA-2SやAsAではNGF受容体発現促進効

巌を経時的に測定 した。 その結果、 NGFとの相果も認められなかった。 また、抗体産生促進効果

乗効果の認められたAA-2GまたはAA-2Pを添加したは認められるが NGFとの相乗効果の認められていときに、培養期間中、細胞内アスコルビン酸含最ない2 メルカプトエタノが培養開始時のレベルに維持されていることが判ーール(2ME)でも、NGF受容体発現促進作用は観察されなかった。 デタに明した。 それに対して、相乗効果の認められなかは示していないが、デヒドロアスコルビン酸やイったAA-2S及びAsAではコントロ ー ルと同様に培養‘ノアスコルビン酸に関しては、全牌細胞系で抗体後期にはアスコルビン酸含量がほとんど消失して産生促進作用やNGFとの相乗作用、さらにはNGF受いた（図3)。

ー容体発現作用もすべて認められていない 。
図2にはNGF受容体を発現している細胞数を示し

800212345゜゜SRBC04Medium9いることが判明した。

（細胞では顕著に NGF受容体発現細胞数が増加してs11a�o こ Bu)にくらべ、AA-2Gまたは AA-2Pの存在下培養したB

06SEuaiuo�vsv H'fn11a�1?
J\u1た。 図から明らかなように、抗原SRBCのみの場合

Days after addition

8624+2-ME

゜+AsA

1012

Number of NGFR expressing cellsXJ0-4/Culture

Fig. 2 F I OW Cy t o m e t r i C a n a I y S i S o f T
celldepleted splenocytes stimulatedwith SRBC in the presence of several
As A der ivatives. splenoc ytes werecultured with or without SRBC in thepresence of AA-2G(O. 5mM), AA-2P(O. SmM),
AA-2S (0. 5 m M), ASA (0. 5mM) or 2- ME( 0.5µ,M) for 4days. Cultured cells(lXlO') w e r e i n c u b a t e d w i t hbiotinylated-NGF and then stored withPE-conjugated streptavidin.

Fig.3 Time course of Intrace llular As Acontents in T cel I-depleted spleno­cytes. Sple·nocytes were cultured withSRBC in the presence of AA-2G(O.SmM:O·t
AA-2P (0.SmM: ●） ， AA-2S(O. SmM: ロ） ， ASA(0, 125mM: ●） for Sdays, Then the cel Is
were washed and lysed with TC A at theindicated days. Those supernatants
were analyzed by HPLC equipped withECD.
このことか ら、AA-2GやAA-2PのNGFとの抗 体産生の相乗効果やNGF受容体発現促進には一定の細胞内アスコルビン酸含嚢の維持が重要である
こと、すなわち、アスコルビン酸がその作用の本体であることが示唆された。

察考次に、安定型AA-2GとAA-2Pのみでこのような作

これまでのビタミンCに関する研究には三つの用が認められ、AsAを遊離しないAA-2Sや不安定な方向性がある。 第 ー はビタミンCの新しい生理活

AsAでは 認められなかったことと、 細胞内アス性並びにその作用メカニズムに関する研究である。

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安定型アスコルピン俄誘導体の免疫試活活性とそのメカニズム

第二は新規アスコルビン酸誘導体の合成並びに天AA-2G の免疫賦活作用発現が酵素により切断さ然からの抽出•構造決定に関する研究であり、第れ徐々に生じたアスコルビン酸そのものに基づく三はビタミン C 及びその誘導体の医療的応用であことを示唆するものである。そこで、アスコルビる。中でも新規アスコルビン酸誘導体の発見や開ン酸を12時間毎に5日間の培養期間中総計10回に発は、それをきっかけにビタミン C の研究を広範渡り分割添加したところ、アスコルビン酸に抗体囲に活性化する傾向がある。

産生促進作用のあることが認められた。

先に我々は 哺 乳 動 物 a—

グルコシダ ーゼやその後の研究により、抗体産生におけるAA-2G

Bacill硲 stearothermophylus 由来CGTaseを用いてアとNGFとの相乗作用とAA-2GによるB 細胞上の NGF受スコルビン酸と二糖または多糖から新規安定型ア容体発現促進作用を見いだしたが、この作用もそスコルビン酸誘導体、 AA--2G が合成出来ことをの本体はアスコルビン酸であることを証明した。

発見した l - 3, 9) 。 AA-2G は酸化的条件下で安定

そこで本研究では、 AA-2G と同様、安定型アであり、生体に投与された場合または細胞培養系

スコルビン酸として知られるAA-2PやAA-2Sにおいに添加された時 には、a — グルコシダ ー ゼによても AA-2G で認められている抗体産生促進作用

りアスコルビン酸を遊離しビタミン C 活性を発揮など 一 連の作用が認められるか否かを検討した。

ビタミンCには IFN 誘導能や抗ウイルス作用、さな差異が観察された。すなわちAA-2Pのみに AA-2G

その結果、 AsA、 AA-2SとAA-2P との間で明確する叫らには免疫増強作用があると言われている。しかと同様の免疫活性作用が観察された。これは、しながら、実験的にそれを証明することは極めて

AA-2G と Al!,.-2P の場合には、a — グルコシダ ー ゼ困難である。その理由として、アスコルビン酸はやホスファタ ー ゼにより水解を受け、遊離したア

他のビタミンと異なり化学的に極めて不安定であスコルビン酸が培養期間を通じてリンパ球に対しること、また実験動物であるマウスやラットでは作用を発揮出来た結果であり、一方、 AsAは不アスコルビン酸を生合成していること、ヒトの場安定であり、 AA-2S はアスコルビン酸を遊離で合にも常時食事からアスコルビン酸を得ているこきなかったため、それぞれ作用を示すに至らなかとから、ビタミン C 投与により誘導されるったものと考えられる。

一定の効果を観察出来ないためと考えられている。そこ

AA-2GやAA-2Pのような安定型アスコルビン酸誘で、例えば細胞培養系でアスコルビン酸の免疫賦導体を用いることにより、細胞培養系でアスコル活作用などが観察されるならば、そのメカニズムビン酸の作用解明が可能となった意義は大きいもの解析や基礎的・応用的研究が可能となる。しかのと思われる。すなわち、培養ヒト線維芽細胞にしながら、これまでそのような報告はない。我々おけるコラ ー ゲン生合成のように、アスコルビンもマウス牌細胞を用いたin vitro一次抗体産生系

酸によっても促進効果が観察できる作用はむしろにおいて、アスコルビン酸の作用を検討したが、稀であり、それ故にアスコルビン酸の生理作用•

既知の免疫賦括物質に見られるような抗体産生増薬理作用のメカニズム解明が遅れていたからであ強作用は観察出来なかった”る。

。

ところで、著者らはAA-2G の生理活性、 薬理

一般に哺乳動物はアスコルビン酸を生合成し、活性に関する研究過程で、 AA-2G がアスコルビ

その1日合成最は体重60kg当たり少なくとも4g、ン酸と異なり、培養マウス牌細胞を用いた抗体産多いものでは12gを越えることが知られている。

生系において、顕著な抗SRBC PFC 応答促進作用を

一方、生合成能を欠くヒトの場合、ビタミン C

グルコシダ ー ゼの1日の所要量は 50mgと定められており、この量阻害剤（キャスタロスペルミン）の存在下では消で壊血病は予防できる。それではこの開きは一体示すこと 、そして本作用はa失する こ と を 観 察した7)ー

何を意味するのか。ビタミン C のコラーゲン合成。 これらの知見は、-65-

促進作用を介しての抗壊血病作用以外に、ビタミ
ン C は生体の恒常性と言う基本的機構に対し、様々な形で 関与していで可能性があるのではないか。
筆者らが見い出した抗体産生増強におけるビタミ
ンCと神経蛋白質(NGF)の相互作用に関する•

transglu cosylation with rat intestialand rice seed a-glucosidases: It'si m p r o ved stability and structurede termination", Chem. Pharm., Bull., 383020-3023 (1990)

5) Wakamiya H., Suzuki E., Yamamoto I.,
A k i ba M., Otsuka M., A r akawa N,

知見は、 ビタミン C の生体防御作用を考える上で重要な意義を持つものと考える。 それと共に、こ"Vitamin C activity of 2-0-a-D-glucopy­
ranosyl-L-ascorbic acid in guinea pigs"]. Nutr. Sci. vitoin., 38 , 235-245 (1992)

れらの知見はビタミン C と神経系との直接の関わり合いを示しており、従来から示唆されているビタミン C の精神・神経機能への役割を研究する手がかりを与えたものと思われる l 0)6) Yamamoto I., Muto N., Murakami K.,
Akiyama J. "Collagen synthesis in humanskin fibroblasts is stimulated by a参考文献

1) Yamamoto I., Muto N., Nagata E., .
Nakamura T.,and Suzuki Y., "Formation of

stable form of ascorbate, 2-0-a-D­
glucopyranosyl-L-aseorbic acid",]. Nutr.,_122 871-877 (1992)

a stable L-ascorbic acid a-glucosidases

7) Yamamoto I., T anaka M., Muto N.,"Enhancement of in vitro antibody produc­

catalyzed transglucosylation", Biochim.
Biophys.Acta., 1035 44-50 (1990)
2) Muto N., Nakamura T., Yamamoto I.,"Enzymatic formation of a nonreducing

tion of murine splenocytes by ascorbic
ac id 2 - 0 -a- g l ucoside",

Int. ].

L-ascorbic a c i d a-gluco s idases

Immunopharmacol., 15 319-325 (1993)

catalyzing site-specific transglucosy­8) Cunningham A. J., Szenberg A. "Further

latio n from rat small i ntestin e",

improvements in the plaque technique fordetecting single antibody forming cells",]. Biochem., 107 222-227 (1990)
3) Aga H., Yoneyama M., Sakai S., Yamamoto I.
"Synthesis of 2-0-a-D-glucopyranosyl
L-ascorbic acid by cyclomaltodextrin
g 1 u c a n o t r a n s f e r a s e f r o m Bacillus
steo,rothermophilus," Agric. Bio(Chem., 55 1751

Immunology., 14 599-600 (1968)
9) T a n aka M., Muto N., Yamamoto I.

"Characterization of Bacill硲 stearothermoph枷s,c ycl odextr in glucanotransferase inascorbic acid 2-0-a-glucoside for­mation",Bioehim. Biophys. Acta,1078 127-132-1756 (1991)(1991)
10)ボ ー リングL. 「ビタミンCとカゼ、 インフル

4) Yamamoto I., Muto N., Murakami K.,
Suga S., Yamaochi H. "L-ascorbic acida-glucoside formed by regioselective

エンザ（村田晃訳）」共立出版(1977)-66-