【研究報告】（自然科学部門）

炎症性腸疾患における寛解維持のための脂質ナノエマルションの開発

山崎

宮崎大学農学部応用生物科学科緒言

正夫

准教授

布測定計で測定した。透析により乳化剤として用いた炎症性腸疾患（IBD）は主として若年層に好発する疾

コール酸を除去後、エマルションの粒径とゼータ電位を患であり、現在約 15 万人の患者が存在すると推定され測定した。ている。本疾患は厚生労働省より難病指定を受けており、発症の要因が不明であることから発症予防の観点かデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎モデルらの研究が極めて困難である。本疾患は下痢、血便、腹本実験は、宮崎大学動物実験に関する指針の「動物痛を主症状としており、罹患者の生活の質は著しく低下福祉」に関する項目、すなわち「第 7：実験動物の管し、低脂肪、低刺激食を基本とした食事制限が求められ理」、「第 8：実験操作」および「第 9：実験終了後の処置」

ることも多い。本疾患は日本において爆発的に増加傾向に 従 っ て 行 っ た。CLA 試 験 に お い て、 予 備 飼 育 後、にあり、今後ますます大きな健康問題となることが懸念

Control 群（ =4）, DSS 群（ =8）, CLA ナノエマルショされる。従来、本疾患の患者に対してはステロイド剤なン+DSS 群（ =7） の 3 群 に 分 け、Control 群 に は PBS、どが処方されてきたものの、幅広い副作用や不十分な有DSS 群にはナノエマルションの外水相、CLA ナノエマ効性からその使用には問題点も多い。

ル シ ョン+DSS 群 に は 90 nm CLA ナ ノ エ マ ル シ ョ ン

このような背景から、機能性食品分野の観点から大（0.77 mg/g）を 1 日おきに計 10 回経口投与した。投与開きく貢献できるのは『再燃の防止、寛解の維持』あるい

始 8 日後より飲水を 3％DSS 含有水に切り替え、10 日間は『新規な発症の防止』であると考えた。筆者はこの手自由飲水させた。体重、糞便スコア、潜血スコアの測定段として、機能性脂質の有用性に着目した。筆者はナノを 1 日おきに行った。糞便の状態を表す糞便スコアはエマルション化した共役リノール酸（CLA）が抗炎症（0；正常な便、1；形のある軟便、2；形の崩れた軟便、性を持つことを示してきているが、本疾患の予防あるい3；下痢）、血便の状態を表す潜血スコアは（0；潜血なは寛解維持の観点からはさらなるエビデンスの蓄積が求し、1；潜血あり、2；出血跡あり、3；常に出血）としめられる。さらに、γ-リノレン酸（GLA）の抗炎症作用て測定をした。スコア化は Wirtz らの論文を参考にしについても示唆しているが、γ-リノレン酸と IBD の関連た1）。GLA 試験において、8 週齢雄の BALB/c マウスをはほとんど明らかとされていない。本研究では、CLA予備飼育後、サフラワー群（ =3）、サフラワー+DSS 群ナノ粒子と GLA の抗 IBD 作用を評価するとともに、（ =11）、ボラージ群（ =4）、ボラージ +DSS 群（ =12）での腸管炎症モデル構築によって、脂肪酸の抗炎の 4 群に分け、サフラワー群、サフラワー+DSS 群には症性を網羅的に解析する。

サフラワー食、ボラージ群、ボラージ+DSS 群にはボラージ食を 3 週間自由摂食させた。摂食開始から 1 週間

方法

後、飲水を 3％DSS 含有水に切り替え、1 週間自由飲水

CLA ナノエマルションの調製させた。本実験でも前述の通り病状のスコア化を行っトリグリセリド型 CLA（CLA-TG）を予備乳化後、た。大腸における脂肪酸組成はガスクロマトグラフィー

溶 液 を 高 圧 力 で 3.0 μm、0.8 μm の 順 に SPG 膜 に 通 し、により測定した。

粒子の微細化を行った。平均粒径が約 700 nm になった
腸管炎症評価ところで溶液を高圧力で Anodisc47 の 0.2 μm、0.1 μm、

HT-29 ヒト大腸ガン細胞を Toll-like receptor （TLR）

0.02 μm の膜に順次通し、粒子径を動的光散乱式粒度分
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山崎正夫

5 リガンドであるフラジェンリンで刺激し、産生されると で、6 日 目 に 糞 便 ス コ ア の 有 意 な 抑 制 が み ら れ た

IL-8 量 を ELISA 法 で 測 定 し た。HT-29 細 胞 を 5.0×104（図 1b）。潜血スコアについては DSS を処理群で、2〜4cells/cm2 で播種し、種々の脂肪酸により 24 時間処理し日目からスコアが増加し、8 日目をピークにスコアの減た後、さらにフラジェンリン 100 ng/ml と各脂肪酸の共少傾向がみられた。また、CLA ナノエマルション投与

処理により刺激し、上清中への IL-8 産生を ELISA 法には潜血スコアに影響しなかった（図 1c）。DSS 大腸炎モより測定した．

デルにおいては大腸の短縮がみられ、大腸の長さが病態の指標として使用されている。そのため、実験終了時の結果大腸の長さを測定した。Control 群と比較して DSS を群

CLA ナノエマルションの調製において、有意な大腸の短縮がみられた（図 1d）。また、筆者らの以前の結果から、CLA ナノエマルションはCLA ナノエマルション投与により、わずかに大腸短縮

90 nm 粒径のものが 200 nm 粒径のものに比べて抗炎症の抑制傾向がみられた。また、各種組織重量については活性が強いことが明らかとなっている。そこで、本試験

肝 臓 と 脾 臓 重 量 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た が、では粒径 90 nm 程度の CLA ナノエマルションを調製す

Control と比較して DSS を処理した群では睾丸周囲脂肪ることを目標とした。今回得られたエマルションの平均と腎周囲脂肪の有意な減少がみられた。次に CLA ナノ

粒径は 93.6±0.4 nm で、以前に抗炎症性を認めたエマルエマルション投与によって CLA の大腸組織での蓄積をション 89.4±0.9 nm に近いものであった。また、本エマ検討するため、大腸組織の脂肪酸組成を調べた。大腸組ルションのゼータ電位は−11.3±0.2 mV であった。

織中においては CLA ナノエマルション処理による CLA量の増加はみられず、 10,CLA ナノエマルションの IBD に対する作用

12-CLA は検出されなかった。

Control 群と比較して DSS 群において、8 日目から有ボラージ油摂取の IBD に対する作用意に体重減少を示した（図 1a）。CLA ナノエマルションの投与で体重減少の抑制傾向が見られた。糞便スコアにサフラワー+DSS 群とボラージ+DSS 群において有意ついては Control 群と比較して DSS 群において、4 日目な体重差はみられず、本試験においては DSS 投与によから増加を示し、8 日目をピークにスコアの減少傾向がる体重減少もみられなかった。糞便スコアは DSS 投与みられた。また、CLA ナノエマルションを処理するこで明確の上昇が認められ、疾患の発症が確認できた。投与 9 日目にスコアは最大となったが、投与期間を通じてサフラワー+DSS 群と比較してボラージ+DSS 群において、スコアが低い傾向がみられた（図 2a）。潜血スコア
ついてはサフラワー+DSS 群と比較してボラージ+DSS群において、5 日目に有意な低値を示した（図 2b）。病態の指標である大腸の長さに各群間で差はみられなかった。次にボラージ油摂取による GLA の大腸組織や血中における蓄積を検討した（表 1, 2）。大腸組織においてボラージ油を摂取した群ではサフラワー油を摂取した群

図1

CLA ナノエマルションが DSS 誘導性炎症性腸疾患の病状に及ぼす影響コントロール群に比べて有意差有り * <0.05

図22

ボラージ油が DSS 誘導性炎症性腸疾患の病状に及ぼす影
響
サフラワー群に比べて有意差有り * <0.05

炎症性腸疾患における寛解維持のための脂質ナノエマルションの開発

表1脂肪酸（重量％）
パルミチン酸パルミトレイン酸
ステアリン酸
オレイン酸
リノール酸
GLA
DGLA
AA
DHA
Δ5 不飽和化指標
AA/（DGLA+AA）
Δ6 不飽和化指標
GLA/（LA+GLA）

各脂質摂取が大腸脂肪酸組成に及ぼす影響

サフラワー

ボラージ

サフラワー+DSS

ボラージ+DSS

18.9±0.1
4.7±0.6
7.0±1.027.8±5.1
19.8±2.5 a
0.0±0.0 a
1.4±0.5 ab
5.3±1.1
0.8±0.1

16.7±1.0
3.0±0.4
9.0±0.523.7±3.0
14.7±2.1 ab
1.2±0.4 b
3.8±0.6 c8.3±1.2
1.1±0.2

16.5±1.3
3.6±0.98.3±1.520.2±3.917.9±2.2 a
0.1±0.0 a
1.2±0.3 b
7.3±1.3
1.5±0.3

16.1±1.2
3.8±0.6
10.0±1.218.8±3.89.2±1.0 b
1.3±0.2 b
2.7±0.3 ac
10.0±1.4
2.0±0.3

0.78±0.08 ab

0.69±0.04 a

0.86±0.02 b

0.77±0.02 ab

0.00±0.00 a

0.09±0.03 b

0.01±0.00 a

0.13±0.02 b

共通のアルファベットを有さない群間に有意差有り（Tukey–Kramer test, ＜0.05）．
表2脂肪酸（重量％）
パルミチン酸パルミトレイン酸
ステアリン酸
オレイン酸
リノール酸GLADGLAAADHA
Δ5 不飽和化指標
AA/（DGLA+AA）
Δ6 不飽和化指標
GLA/（LA+GLA）

各脂質摂取が血清脂肪酸組成に及ぼす影響

サフラワー

ボラージ

サフラワー
+DSS

ボラージ
+DSS

14.7±1.8
0.7±0.1
9.3±0.5
5.7±0.5
16.7±0.3 a
0.3±0.0 a
0.8±0.0 a
29.0±4.4 b
3.5±0.715.4±0.1
0.7±0.2
9.7±0.5
7.7±1.0
16.3±2.4 a
2.6±0.4 b
2.0±0.2 b
16.6±2.5 a
2.6±0.513.4±0.5
0.7±0.0
11.2±0.6
5.6±0.3
16.5±0.5 a
0.3±0.0 a
0.9±0.0 a
27.5±1.7 b
3.2±0.2

13.9±0.7
0.8±0.1
11.1±0.6
6.5±0.4
10.3±0.6 b
1.7±0.1 c
1.3±0.1 c
28.0±2.0 b
3.1±0.4

0.97±0.00 ac

0.89±0.01 b

0.97±0.00 a

0.95±0.01 c

0.02±0.00 a

0.14±0.00 b

0.02±0.00 a

0.14±0.00 b

共通のアルファベットを有さない群間に有意差有り（Tukey–Kramer test, ＜0.05）．と比較して GLA 量、ジホモ γ リノレン酸（DGLA）量が抗炎症作用の報告される EPA、DHA は IL-8 産生を強く多く、アラキドン酸量（AA）も多い傾向を示した。そ抑制しており、DHA は今回評価対象とした脂肪酸の中れに伴い Δ5 不飽和化指標については低い傾向を示し、では最も強い活性を示した。興味深いことに GLA およΔ6 不飽和化指標については有意に高かった。血清におびその代謝物である DGLA、AA についても IL-8 産生抑いてボラージ油を摂取した群ではサフラワー油を摂取し制作用が認められた。

た群と比較して GLA 量、DGLA 量が多かった。それに考伴い、Δ6 不飽和化指標については有意に高かった。ボ察CLA は抗炎症作用を有する脂肪酸としての報告があラージ群では AA 量が他の群より少なかった。

り、マクロファージにおける LPS 応答を抑制することが知られている2）。筆者らの以前の成果から、CLA の抗における脂肪酸の腸管炎症抑制作用
フラジェリン刺激（100 ng/ml）により HT-29 細胞よ炎症作用はナノエマルションとしたものでも認められるり産生される IL-8 量は 3.3 倍に増強され、炎症応答の誘ことが示されており、様々な病態における CLA ナノエ導が確認された。脂肪酸濃度を細胞毒性の認められないマルションの実質的な炎症抑制効果の検証が期待され

50 μM に調製したところ、飽和脂肪酸、オレイン酸、リた。本試験では DSS 誘導性炎症性腸疾患に対する作用

ノール酸は IL-8 産生に影響を与えなかった。これまでを検証した。炎症性腸疾患の病状はいくつかのパラメー
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山崎正夫

することが示され、腸管上皮細胞に対しても抗炎症性を有することが明らかとなった。さらに、その代謝物である DGLA、AA も比較的高い抗炎症活性を有しており、GLA が生体内で代謝を受けた場合も抗炎症性が発揮されることが期待された。
そこで、GLA を高濃度で含有するボラージ油の摂取が炎症性腸疾患の病状におよぼす影響を検討した。その結果、摂取した GLA は血清、大腸に蓄積されており、その代謝物のレベルも増加していた。病状の改善効果については便の状態から判断すると、抑制傾向は認められ図3た。一方で、本試験では実験終了時点でいずれの群の動HT-29 細胞の IL-8 産生に及ぼす脂肪酸の効果
フラジェリン + コントロール群に比べて有意差有り* <0.05, ** <0.01, *** <0.001

物も寛解状態に近い程度に回復しており、GLA の効果を明確に評価するに至らなかった。このため、実験デザ

PA; パルミチン酸、SA; ステアリン酸、OA; オレイン酸、LA; リノール酸、GLA; γ-リノレン酸、DGLA; ジホモ-γリノレン酸、AA; アラキドン酸、ALA; α-リノレン酸、
EPA; エイコサペンタエン酸、DHA; ドコサヘキサエン
酸、CLA1; 9c, 11t-共役リノール酸、CLA2; 10t, 12c-共役リノール酸

インについて一考が必要であり、さらに本モデルで現れる病状が脂肪酸組成や脂質メディエーターの変化によりどの程度の影響を受けるかについても明確とする必要がある。
謝

ターで表すことができるが、体重減少と腸長短縮に対し辞て CLA ナノエマルション投与は顕著な影響を与えな

本研究の遂行にあたりご支援いただきました公益財かった。便の状態や血便の状態についてはスコアの抑制

団法人三島海雲記念財団に御礼申し上げます。また、ナ傾向が認められ、一定の効果は認められた。しかしながノエマルションの調製にあたり技術的ご指導をいただきら、CLA の摂取に炎症性腸疾患の症状抑制効果が報告ました宮崎県工業技術センター、清水正高氏、山本建次

されており

3, 4）

氏、濱山真吾氏に感謝申し上げます。

、ナノエマルション化による積極的なメリットは認められなかった。特に、大腸組織において文

CLA の蓄積が明確には認められず、炎症部位への送達性向上が課題と考えられる。

献1） S. Wirtz, et al.:, 2, 541–546, 2007.
2） Y. Iwakiri, et al.:
, 67, 435–443, 2002.
3） J. Bassaganya-Riera, et al.:, 31, 721–727,2012.
4） J. Bassaganya-Riera, et al.:, 127, 777–791, 2004.
5） C. S. Chang, et al.:
, 33, 46–57, 2010.

GLA の抗炎症作用については、以前筆者らはマクロファージを用いた試験によって LPS 応答を抑制することを示しており、他にも類似の報告が見られる5）。本研
究で新たに腸管炎症モデルとして HT-29 細胞におけるTLR5 応答を評価したところ、GLA は IL-8 の産生を抑制

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