栄養素トランスポーターの消化管全長における発現解析

岩永敏

北海道大学大学院医学研究科

緒彦

教授

維が大腸がんの予防になる」ことをある程度説明できる

言2)

摂取された食品由来の栄養素が消化管のどの部位で、。この例が示すように、輸送体の研究から、栄養素のどういうメカニズムで取り込まれるかは、消化生理およ吸収部位や生体に及ぼす影響を解明できる状況にある。

び栄養学では重要な研究課題のひとつである。しかし、そこで、本研究では、これまで取り組んできた短鎖脂肪消化活動により消化管腔内で生産された栄養素の動きを酸輸送体の解析で確立した手法を使って、グルコース、生体において追跡するのは容易ではない。一方、トランコレステロールや脂肪酸など、さまざまな輸送体の発現スポーターの発現解析から、栄養素の取り込み部位を特をマウスの消化管全長にわたって解析し、輸送体の分布定し、その特性や取り込み能力を解明する手だてがある。

地図を作成すること目標に開始した。

栄養素の輸送体についての遺伝子情報は、ゲノム解析が終了しているので、構造に関するすべての情報が手に入方る時代になったという背景がある。

法8 週 齢 の 雄 性 BALB/c マ ウ ス を 15 〜 16 時 間 絶 食

我々は、これまでに食物繊維の発酵によって生じる短にした後、ペントバルビタールで深麻酔した。in situ

鎖脂肪酸（プロピオン酸や酪酸など）の取り込み輸送体の解析を行い、回腸末端から大腸において、Na+ との共hybridization 法ならびに PCR 用には瀉血後に新鮮組織輸送のかたちでこれらを取り込む輸送体の発現様式を解潅流固定後に腸管と腎臓を得た。in situ hybridizationを採取、免疫組織化学用には 4% paraformaldehyde で1)明した 。この輸送体（SMCT1）は結腸下位での発現法には、図１に示すように十二指腸（D）、空腸前部（J1）、が強く、そこでは上皮の管腔側に存在する。SMCT1 は空腸後部（J2）、回腸前部（I1）、回腸末端（I2）、盲腸（Ce）、短鎖脂肪酸とともに水を吸収するので、糞塊（固形便）結腸（Co）、そして直腸（R）を採取した。消化管におの形成にも寄与する。また、この輸送体はがん抑制遺伝ける輸送体の mRNA の発現を調べるために、アイソトー子の産物でもあるので、以前から言われていた「食物繊プ標識による in situ hybridization 法を行なった。各ト図1

サンプリングの場所を示す模式図
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480 を用い、β-actin を housekeeping gene として数値

ランスポーターサブタイプの mRNA に相補的なアンチ33化した。

センス DNA プローブ（45 塩基）を合成し、 P で標識したものをハイブリダイズに用いた。
ハイブリダイズ後、スライドグラスを直接Ｘ線フィルムに密着し、１週間露結光した。また、一部の切片は乳剤に浸漬し、45 日後にオー1.

トラジオグラフにより可視化した。

果小腸型 SMCT

乳酸などモノカルボン酸の輸送体として高親和性

PCR 解析用には、全部で 28 ヶ所の部位から組織を採SMCT1 が同定され、ついで低親和性の SMCT2 が同定取した（図１）。他のトランスポーターとの発現を比較された。本研究では、SMCT2 が小腸に発現することをするために同一組織を使って、定量 PCR（quantitative-in situ hybridization 法と PCR 法により明らかにした。

PCR：Q-PCR）を行なった。定量 PCR 法は、lightCycler

SMCT2 は近位空腸（J1）から回腸末端（I-2）にかけて図2

腸管でのグルコース輸送体の遺伝子発現（in situ hybridization 法）2

栄養素トランスポーターの消化管全長における発現解析発現していた。最も強いシグナルは、十二指腸（D）を現を調べることにした。蛋白レベルでの発現解析には特除く小腸近位側半分、すなわち空腸（J-1 と J-2）に認異抗体が必要であるが、サブタイプが多数存在する輸送められた。一方、高親和性の SMCT1 の mRNA は下位体に関しては、すべての抗体が作成（取得）できるわけ

空腸（J-2）から大腸にかけて発現しており、小腸前半ではない。そこで、遺伝子レベルの解析をすることにし、部では SMCT2 のみが、大腸では SMCT1 のみが発現しin situ hybridizaion 法と Q-PCR 法を用いた。現在のとていることがわかった。

ころ、両方法の結果はかなりよく相関しており、手技的には問題ないことを確信した。この方法で、消化管におグルコース関連輸送体（図２）2.

グルコースおよびフルクトースの輸送体としては、けるすべての栄養素、ミネラル、イオンチャネルなどのGLUT ファミリーと SGLT ファミリーが消化管には発現発現地図を作成するという方針を立て、今回は短鎖脂肪している。消化管では、管腔側からの取り込みに関与す酸、グルコースおよび脂肪の輸送体を調べた。

る SGLT1 が十二指腸から回腸末端部まで連続して強く短鎖脂肪酸は大腸で産生され、大腸上皮の管腔側に発現するほかに、大腸でも有意な発現が見られた。免疫発現する SMCT1 (slc5a8) で吸収される 1)。本研究は、組織化学により、SGLT1 は大腸上皮の管腔側の刷子縁SMCT1 のサブタイプである SMCT2（slc5a12）が小腸に存在することが示された。腸上皮細胞に発現し、血管における SMCT の主要な発現型であることを強く示唆

側への受動的な輸送を担う GLUT2 は、回腸末端部を除いて小腸に限局して発現した。フルクトースの取り込した。SMCT2 の発現は小腸の刷子縁に特異的であり、Na+ の濃度勾配を利用してモノカルボン酸を取り込むこみに関与する GLUT5 も GLUT2 と類似の発現パターンとの形態学的裏付けがとれた。空腸での腸内発酵はなであった。一方、腸粘膜には発現しないとされていたいことから，SMCT2 は小腸における乳製品中の乳酸やGLUT1 が大腸と胃に発現していた。

酢酸の吸収に関与しているのであろう。これらは食物と3.

ともに大量に小腸に流入するので、ここに低親和性の脂肪酸関連輸送体

脂肪酸やコレステロール関係では、FATP (fatty acid

SMCT2 を配置することは理にかなっている。これまで、transporter)-4 と Niemann-Pick type C1-like 1 (NPC1-

小腸内の乳酸（食事性のもの、乳酸菌が産生したもの）

like 1) が十二指腸から回腸末端部まで強く発現していは細菌が利用するだけで、生体の栄養素になり得ないとた。大腸の FATP4 の発現は弱くなるものの直腸を除く考えられてきた。SMCT2 の発現はこのことを否定する大腸でも有意なレベルにあった。NPC1-like 1 の発現はものである。消化管は，基質親和性と細胞内局在が異な小腸の始まり（D と J1）で発現がやや低かったが、そるモノカルボン酸トランスポーター群を発現させることれ以降は小腸全域で強い発現域をもっていた。Scarb

で、効果的な吸収を行っていると考えられる。

(scavenger receptor class B)-1 は十二指腸を中心に発現グルコースは小腸上皮の管腔側に発現する SGLT1 でしており、空腸や回腸での発現は弱かった。Scarb2 お取り込まれ、血管側へは GLUT2 を使って輸送される。

よび Scarb3 (CD36, FAT) の発現は消化管を通して低かっ２つの異なる性質の輸送体による取り込み機構が小腸でた。

構築されていることを今回確認した。しかし、大腸に4.

も SGLT1 と GLUT1 のペアからなる輸送機構が存在す

そのほか

胆 汁 酸 関 係 の 輸 送 体 と し て ASBT (apical sodium-ることが明らかになった。大腸には栄養素になるべきグ

dependent bile acid transporter) と I-BABP (ileal bile

ルコースは正常状態ではほとんど存在しないと思われる

acid-binding protein) の発現を調べた。ともに回腸末端が、わずかに存在するグルコースあるいは下痢などの異部（I-2）で最も強い発現を示した。ASBT-1 はさらに、常事態で大腸に到達するグルコースの取り込みに、大腸大腸でも弱いながら発現が見られた。一方、I-BABP はの SGLT1/GLUT1 輸送体が寄与していると思われる。
脂肪酸やコレステロールを吸収する輸送体分子として回腸全域でかなり強く発現していたが、小腸の前半部さまざまなものが知られているが、今回の発現解析から、（D~J-2）での有意な発現はなかった。

FATP4 と NPC1-like 1 が主要な取り込み分子であり、ほ考

かに十二指腸では Scarb1 が関与していることが判明し察
本研究では、消化管の栄養素がどこで取り込まれるかた。FATP4 と NPC1-like 1 は空腸と回腸に主要な発現域を明らかにするために、各栄養素に特異的な輸送体の発をもち、小腸での脂肪酸の取り込みを担うと考えられる。
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ただし、まだ検索していない ABCG ファミリーや FATP

検索範囲を広げることで、近い将来の取り込み機構の発のその他のサブタイプの関与を否定はできない。

現地図づくりが現実的なものになったといえよう。

胆汁酸の輸送体は、回腸のとくに末端部に最も強く発現し、胆汁酸の取り込みがここに限局していることを示

謝

辞本研究の遂行にあたっては、財団法人三島海雲記念財した。

団からの研究助成に負うところが大きい。心から感謝い要たしますとともに、貴財団の益々の発展をお祈り申し上約げます。

本研究では、消化管における栄養素の取り込み機構の全貌を明らかにする目的で、栄養素輸送体の発現様式を遺伝子レベルで検索した。短鎖脂肪酸、グルコース、脂文献肪・コレステロールの輸送体に関して調べた。その結果、

1) K. Takebe, et al. : Biomed. Res. , 26, 213-221, 2005.

サブタイプの種類が多い輸送体の発現を遺伝子レベルで2) H. Li, et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 8412-8417, 2003.

調べることの有用性・確実性が示され、この手法による

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