食物が腸管免疫に及ぼす影響の評価システム構築と食物アレルギーの機序解明

安達東京医科歯科大学難治疾患研究所免疫疾患

諸言

貴弘准教授

細胞に導入し、トランスジェニックマウスを作製した。

腸管には多数の免疫担当細胞が存在し、食物に対してこ の ﬂoxed Cameleon マ ウ ス とそ れ ぞ れ IgG1 陽 性 B

は寛容を誘導するが、食物摂取に付随して摂取される病細胞特異的に、樹状細胞特異的に Cre 組換え酵素を発原微生物に対しては生体防御に働く。しかし、この精巧現する IgG1-Cre マウス、CD11c-Cre マウスと交配し、な免疫系も時として破綻し、食物により免疫系が始動さIgG1 陽性 B 細胞特異的、樹状細胞特異的に Cameleon

れ、食物アレルギーを引き起こすことはよく知られていを発現するマウスを作製した。また、ﬂoxed Cameleon

る。同じく IgE を介する花粉症では、花粉が飛散しなトランスジェニックマウスを CAG-Cre マウスと交配さい時期でも抗体が産生され続け、免疫記憶が成立していせ、全身性に Cameleon を発現させたマウスを作製した。

る。本来、この免疫記憶による抗体産生は、インフルエ

遺伝子組換えマウスは東京医科歯科大学動物実験委員会

ンザなどに対するワクチン効果を発揮し、生体防御に必および組換え DNA 安全員会の承認を得て、指針に従っ須なものであるが、同時にアレルギーや自己免疫疾患のて SPF 下で飼育し、実験に用いた。

原因ともなっている。食物アレルギーに関しても一旦感カルシウムイオンの測定

作されると疾患が継続することから、免疫記憶が深く関わっていると推測される。しかし、食物アレルギーに対蛍光タンパク質カルシウムプローブ Cameleon を用いして、その原因となる IgE の産生機序や産生細胞の動た。図 1 に示すように Cameleon は CFP と YFP の間態はほとんど解明されておらず、その発症の全容はよくにカルモジュリンのカルシウム結合ドメインを持ち、カわかっていない。食物は多くの成分を含み、摂取後、消ルシウム結合状態では分子内の CFP と YFP が隣接し、化、吸収、さらには代謝され、様々な物理的・化学的変CFP から YFP へのエネルギー移動（Föster resonance化を受けるため、in vivo での正確な評価システムが必energy transfer：FRET）が起こる。このエネルギー移要であるが、現在のところいい解析系はない。これらの動の効率を測定し、細胞内のカルシウム濃度の変化を検問題点を解決すべく、食物が免疫系に及ぼす影響を正確出した。に解明することを目指し、マウスをモデルとして、その生体イメージング解析系の確立を行った。

マウスを麻酔後、腹部あるいは脇腹の一部を外科的に実験方法

切開して腸管あるいは脾臓を取り出し、マウスを観察台マウスに固定し、臓器の動きを最小限にとどめるようにして生を体イメージングを、ニコン社製共焦点レーザー顕微鏡

条件的に発現するトランスジェニックマウス（Floxed

A1 システムを用いておこなった 2）。励起波長 458nm

蛍光タンパク質カルシウムプローブ Cameleon

1）Cameleon トランスジェニックマウス）はＣＡＧプロ

で YFP と CFP の蛍光波長を測定し、YFP/CFP の比をモーター（サイトメガロウィルス / チキンβアクチン）とることによって FRET を検出した。

を持つｐＣＸＮ２ベクターを用いた。プロモーター下流
細胞集団の解析に並列に LoxP 配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、そのさらに下流に Cameleon 遺伝子を挿入しマウスより脾臓、骨髄、腸間膜リンパ節、小腸パイエた。このコンストラクトを直鎖化した後、マウス卵母ル板を取り出し、それらリンパ組織から細胞を調製した。
1

安達

貴弘

かった腸管でもＢ細胞が容易に観察できる。

細胞を蛍光標識された抗 CD4 抗体、抗 CD3 抗体、抗B220 抗体、抗 CD138 抗体、抗 CD19 抗体、抗 CXCR4

CD19-Cre マ ウ ス と 交 配 し た ﬂoxed Cameleon マ ウ抗体で染色し、フローサイトメーター CyAnADP ™（コース で は Ｂ 細 胞 の マ ー カ ー で あ る CD19 陽 性 細 胞 特 異ルター社製）を用いて解析した。
結果

Ⅰ 食物の免疫系へ及ぼす影響のin vivo評価システムの構築

免疫細胞特異的Cameleon発現マウスの作製
蛍光蛋白質カルシウムセンサー Cameleon（図 1）を用いてＢ細胞のカルシウムシグナリングを測定できることを我々は既に示している。そこで本研究では各種免疫担当細胞特異的に、リアルタイムで生体イメージングが行える in vivo の系を Cameleon を用いて構築することにした。既に DNA 組換え酵素 Cre を利用して誘導的に Cameleon を発現するマウス（ﬂoxed Cameleonマウス）を樹立し、Ｂ細胞特異的に Cre を発現する

図1マウス（CD19-Cre マウス）と交配したＢ細胞特異的

ＣＦＰとＹＦＰの蛍光蛋白質の間にカルモジュリンのカルシウム結合部位を持っている。カルシウムの有無により構造変化を伴い、カルシウム結合状態ではＣＦＰとＹＦＰが隣接し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、Ｃａｍｅｌｅｏｎを励起波長433nm 付近を用いた場合、蛍光波長がシフトする。

Cameleon 発現マウスでは、図２に示すように、Ｂ細胞が集団を形成しているリンパ組織で Cameleon の発現がみられた。また、これまで自家蛍光が高く観察が難し

図2

蛍光蛋白質カルシウムセンサーＣａｍｅｌｅｏｎの構造マウスの各リンパ組織でのＢ細胞特異的Ｃａｎｌｅｏｎの発現CD19-Cre マウスと交配した floxed Cameleon マウスの各リンパ組織をについて蛍光顕微鏡により観察した。緑色に見えるのがＣａｍｅｌｅｏｎ発現細胞の集団。

2

食物が腸管免疫に及ぼす影響の評価システム構築と食物アレルギーの機序解明

的に Cameleon の発現がみられる（図 3 上段左）。また IgG1-Cre マウスと交配したものではＢ細胞のマーカーである B220 陽性細胞のうち、約 1% ほどの細胞でCameleon の発現がみられた。さらに、樹状細胞、Ｔ細胞特異的 Cameleon 発現マウスを得る目的で、CD11cCre マ ウ ス、CD4-Cre マ ウ ス と 交 配 し た。 末 梢 血 を採 血 し、 Ｔ 細胞 特異的に、あるいは 樹状 細胞 特異 的に Cameleon が 発 現 し て い る こ と を 確 認 し た。CD4Cre マ ウ ス と 交 配 し た ﬂoxed Cameleon（CD4-Cre/Cameleon）マウスでは末梢血中のリンパ球の約 10％（CD19 陰性）が、また CD11c-Cre マウスと交配したもの（CD11c-Cre/Cameleon）では脾臓細胞の約 5% がCameleon 陽性であった（図 3 中段）。CD11c は一部のＢ細胞にも発現していることが知られており、IgM 陽性細胞の一部でも Cameleon の発現がみられた。細胞系譜特異的 Cameleon 発現マウスが交配では得られない細胞系譜については、CAG-Cre マウスとの交配により胚細胞レベルで組換えを起こし、全身性に Cameleonを発現するマウスも作製した。図 3（下段）に示すとおり、ほとんどの脾臓の細胞で Cameleon の発現がみられた。
生体イメージングによるパイエル板Ｂ細胞のカルシウムシグナリングの検出

Ｂ細胞あるいは IgG1 陽性Ｂ細胞特異的に蛋白性のカルシウムイオン蛍光プローブ Cameleon を発現するマウスを利用して、生体イメージングにより、腸管での免疫細胞の動態およびその活性化をリアルタイムで詳細に観察し、免疫細胞を直接調べた。
小腸パイエル板の生体イメージングを行った。麻酔したマウスより腸管を取り出し、腸管の蠕動運動を抑制す

図3るために腸管内をアガロースを含むリン酸緩衝液で満たし、共焦点顕微鏡でパイエル板を観察した。腸の動きは

各種 Cre マウスと交配した ﬂoxed Cameleon
マウスの脾臓での Cameleon 発現細胞

フローサイトメーターによりマウス脾細胞での Cameleon 発現細胞を細胞表面マーカーを用いて解析した。CD19 あるいはＢ
２２０はＢ細胞のマーカーである。IgM はクラススイッチを起こす前のＢ細胞のマーカーである。

完全に抑えるのは不可能であるが、FRET センサーを用いたことにより、蛍光輝度の減衰や動きによる変化を補正し、細胞内カルシウムシグナリングを検出するのに成功した。しかし、食物の影響を評価するため、腸管にリ赤い細胞が高いことを示している。この方法を用いて、ン酸緩衝液を満たすための穴を腸管に開けることなく、小腸パイエル板を生体イメージングによって観察した。

観察することが望ましいので観察方法の改良を行った。

ＦＲＥＴを起こしている細胞が多く見られた。複数のマ腸管をガラスボトムシャーレに乗せ、スポンジで上からウスで再現性よくカルシウムシグナリングをモニターで腸管を押さえ、固定した。この方法で共焦点顕微鏡によきた。

る観察に耐えうる程度の固定ができ、生体イメージングができることが確かめられた。細胞内のカルシウム濃度

IgE B細胞特異的Cameleon発現マウスの作製

は図 4 に示すように疑似カラーによって示されており、アレルギーの影響をを調べるため、IgE 発現細胞特異3

安図4

達貴弘

生体イメージングによるパイエル板でのカルシウムシグナリングの検出

CD19-Cre/floxed Cameleon マウスを麻酔し、小腸パイエル板を共焦点顕微鏡により観察した。
（上）CD4 陽性Ｔ細胞（青）と Cameleon 発現細胞（緑）を示す。
（下）10 分間観察した YFP とCFP の比（高いほど細胞内カルシウムぬ度が高い）のイメージを経時的に示した。疑似カラーで赤が細胞内カルシウム濃度が高い。

的に Cameleon を発現するマウスを IgE-Cre マウスとまだ困難である。安定した解析系のためには腸管を傷つ交配することによって作製した。

けないように固定することが必要である。実際に食物の影響を評価するまでには至らなかったが、本研究で構築考察したマウスのモデル系で食物の違いによる免疫細胞の変化を詳細に検討できると思われる。

全身性に Cameleon を発現させるマウスも作製でき、また我々が作製した条件的 Cameleon 発現マウスにお要いても種々の Cre マウスとの交配により、細胞系譜特約

異的 Cameleon を発現し、蛍光輝度が高く、腸管などB 細胞やＴ細胞の抗原受容体やその他の受容体から自己蛍光が高い組織でも Cameleon 発現細胞を容易にのカルシウムシグナリングを含むシグナリングは増殖、検出できる。本研究により腸管でもリアルタイムで免疫分化、アポトーシスといった機能に重要である。しか細胞の動態のみならず、活性化もモニターできることをし in vivo でのこれらのシグナリングを観察するのはこ示した。しかし、腸管は蠕動運動をしており、観察はいれまで困難であった。我々はＢ細胞やＴ細胞での代表4

食物が腸管免疫に及ぼす影響の評価システム構築と食物アレルギーの機序解明的な細胞内シグナリングであるカルシウムシグをモニ樗木教授、手塚助教、IgG1-Cre マウスをいただきましターできるマウスを作製し、生体で細胞の動態と細胞たハーバード大学 Rajewsky 教授、CD4-Cre マウスを内シグナリングを生体で見られるシステムを構築した。

使わせていただいた東京医科歯科大学（現・東京大学）

Cameleon はそれぞれ細胞系譜特異的に発現していた。

高柳教授、IgE-Cre マウスをいただきました東京理科大

in vivo イメージングで腸管のパイエル板での B 細胞の学久保教授、マウスを作製していただいた難治疾患研究

活性化状態をリアルタイムで見られるシステムを構築し所・組換えマウス実験室・宇佐美技術職員、ソーティンた。さらに免疫記憶の実体となる長期の抗体産生を起こグにご助力いただいた幹細胞支援室・齋藤技術専門職員、

す骨髄で長寿命形質細胞についても ex vivo のイメージ

山崎技術補佐員に感謝いたします。また本研究を支援しングによりカルシウムシグナリングを検出できることをていただきました公益財団法人三島海雲記念財団に心よ示した。本研究により、食物摂取やアレルギーなどの疾りお礼申し上げます。

患による免疫細胞の動態、活性化を詳細に調べるマウス
文

実験系が構築できた。
謝献

1）Nagai, T., et al, : Proc Natl Acad Sci USA 101, 105549, 2004.
2）実験医学別冊 最強のステップ UP シリーズ in vivo イ
メージング実験プロトコール原理と導入のポイントから２光子顕微鏡の応用まで、（石井 優／編）、羊土社、2013.
3）Adachi, T. & Tsubata, T., : Biochem Biophys ResCommun 367, 377-82, 2008.

辞
蛍光蛋白質カルシウムセンサー YC3.60 遺伝子をいただきました理研・宮脇博士、生体イメージングの実験を支援していただいた東京医科歯科大学烏山教授、
CAG-Cre マウスをいただきました大阪大学岡部教授、
CD11c-Cre マウスをいただきました東京医科歯科大学

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