水溶性フラーレンの設計とそれらを用いた抗酸化作用に関する研究
東京工業大学物質理工学院

道信

剛志

The radical scavenging properties of fullerene (C 60 ) have attracted much attention with a view to commercialization.
However, a hydrophobic feature of C 60 made it difficult to homogeneously distribute in an aqueous solution. In order toincrease the water solubility, chemical modification was often adopted. Alkyne-appended C 60 derivative was synthesized
by a Bingel method. The alkyne moiety of this C 60 derivative was further functionalized by the Cu(I)-catalyzed azidealkyne cycloaddition (CuAAC) reaction. Azide-substituted poly(ethylene glycol) (PEG) was attached to the C 60 derivativeby CuAAC, yielding PEGylated C 60 . Although sufficiently long PEG with the molecular weight of 5000 was employed, thePEGylated C 60 was not soluble in water but soluble in methanol. The high solubility in methanol allowed for the evaluationof radical scavenging properties. When a solution of PEGylated C 60 in methanol was added to a mixed aqueous solution ofβ-carotene and linoleic acid, the peroxide attack to β-carotene was clearly suppressed. This was due to the radical scavenging
property of the C 60 derivative. This suppression effect became stronger when the concentration of PEGylated C 60 increased.
This result again supports the radical scavenging property of PEGylated C 60 derivative and poses the potential use as anantioxidant.

1. 緒

溶解性を付与することに成功した。また、PEG 鎖の長さ言が溶解性を大きく左右することを明らかにした。得られたフラーレン（C60）は優れたラジカル補足能を有している
1）

ため抗酸化剤としての応用が期待されている 。しかし、PEG - フラーレン誘導体の抗酸化作用を評価することを目的とした。

水への溶解性が極めて低いため、生体高分子との複合化は困難であった。表面に多数の水酸基を導入した水溶性フラーレンは「ラジカル・スポンジ」という商標名が与えられて

2. 方
2. 1. 試法

薬

おり、優れたラジカル補足能を有することが実証済みでフラーレン誘導体 1 は文献に従い、合成した 4）。そのある 2）。そのため、水溶性フラーレンを配合した化粧品は他の試薬は関東化学、東京化成工業、Aldrich より購入し、既に市販されており、肌の老化防止と美白効果を増進するそのまま使用した。と謳われている。水溶性フラーレンは一般的にビタミン Cの 172 倍の抗酸化作用、プラセンタの 800 倍のコラーゲ

2. 2. 合成ン生成促進能を有すると言われている。しかし、「ラジカ

50 mL ナス型フラスコにフラーレン誘導体 1（24 mg,ル・スポンジ」の化学構造では C60 の π 共役系はほとんど完0.022 mmol）と THF（7.2 mL）を加えた後、0 ℃で撹拌し全に断絶されており、それにともない抗酸化作用に代表さた。テトラ -n- ブチルアンモニウムフルオリドの THF 溶液れるフラーレンの特性が失われていると考えられる。この（1 M，0.055 mL）を加え、0 ℃のままで 1.5 時間撹拌した。

問題を解決するために、フラーレンを希望の置換基で化学室温に戻した後、塩水（200 mL）を加え、有機層のみをク修飾する道筋がしばしば採用される 3）。例えば、巨大な水ロロホルム（400 mL）で抽出した。抽出した有機層はさら溶性（高）分子鎖をフラーレンに置換することで水溶性の問に塩水（200 mL）で 2 回洗浄した後、硫酸ナトリウムを加題は解決できることが知られているが、置換基の分子量がえて乾燥した。ろ過して硫酸ナトリウムを除去した後、エ大きくなるとフラーレン密度が低下するという新たな問題

バポレーションによりろ液を約 15 mL に濃縮した。ここが生じる。本研究では、C60 に水溶性高分子であるポリエへメトキシポリエチレングリコールアジド 5000（111 mg，チレングリコール（PEG）を連結することでメタノールへの0.0222 mmol）と Cu（PPh3）3Br（2.06 mg，0.00221 mmol）を加えた後、窒素雰囲気下、60 ℃で 22 時間撹拌した。室温に冷却した後、クロロホルムと水を加え、有機層を水で洗Design and Antioxidative Effects ofWater Soluble Fullerenes
Tsuyoshi Michinobu
D epa r t ment of M at er i a l s S c ienc e
and Engineering, Tokyo Institute ofTechnology Tsuyoshi Michinobu

浄、硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過により硫酸ナトリウムを除去した後、エバポレーションして溶媒を留去した。
最後にカラム精製（Bio-Beads S-X1，クロロホルム）により精製し、目的化合物を得た（89 mg，68 %）。得られたフラーレン誘導体はメタノールに可溶であったが、20 〜 37 ℃

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コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017の温度範囲で水には不溶であった。
13. 結

H NMR（3 0 0 MHz, CDCl3）：δ = 1.4 4-2.2 9（m, 7 H），果3.37（s, 3 H）
，3.44 -3.80（m, 4（n+1）H），4.29（br s, 4 H），Bingel 反応を用いて C60 誘導体 1 を合成した。1 のトリ

7.68 ppm（br s, 1 H）
；IR（neat）：3243.7，2884.0，2130.0，

メチルシリル基を脱保護した後、銅触媒存在下で 1 当量の1717.3，1591.0，1483.0，1466.6，1451.2，1358.6，1342.2，メトキシポリエチレングリコールアジドを加えて付加環化

1280.5，1241.0，1144.6，1105.0，1060.7，1006.7，962.3，反応（クリック反応）させた（Scheme 1）。カラム精製によ-1

879.4，841.8，717.4，700.0，664.4 cm .

り未反応原料を取り除き、目的物を単離した。ポリエチ
レングリコール（PEG）鎖の分子量によってフラーレン誘2. 3. 抗酸化作用の評価

導体の溶解性に大きな差が現れた。PEG2000 を用いた場

フラーレン誘導体の抗酸化作用は既報の方法に従い、評5，6）

合はクロロホルムやトルエンのような有機溶媒に可溶で。まず、フラーレン誘導体のメタノール溶液あったがアルコールには不溶であった。一方、PEG5000（0.0023 M）を作製した（A 液）。次に、㌼ - カロテンのクロを用いた場合はメタノールに可溶となった。本研究ではロホルム溶液（1 g/L）
（B 液）
、リノール酸のクロロホルム

PEG5000 を連結した C60 誘導体について詳細に述べる。

価した溶液（0.1 g/mL）（C 液）、Tween 40 のクロロホルム溶液得られた PEG5000-C60 誘導体は 1H NMR、IR、MALDI-（0.2 g/mL）（D 液）を調整した。B 液 0.25 mL、C 液 0.1 mL、TOF MS より構造を確認した。1H NMR では、PEG 鎖、D 液 0.5 mL をサンプル瓶に量り取り、窒素ガスを噴きつ末端アルキンおよびトリアゾール環のピークが新たに検けてクロロホルムを蒸発させた。そこに、超純水（50 mL）、出 さ れ た。IR で は、 末 端 ア ル キ ン の C ≡ C 伸 縮 振 動 が0.2 M phosphate buffer（4.45 mL）を加え、遮光して 30 分2130.0 cm-1 に観測された。さらに MALDI - TOF MS を測間撹拌した。この溶液を E 液とした。UV セルに E 液 2.85定したところ、PEG5000 ではピークトップ分子量（Mass/mL と一定量の A 液を加え、50 ℃で均一撹拌しながら㌼ -Charge）約 5000 で分子量分布を有するスペクトルが得ら

カロテンの吸収 470 nm の時間変化を追跡した。比較試料れたのに対し（Fig. 1 ⒜）、PEG5000-C60 誘導体ではピークとして A 液と同量の超純水を用いて同様の測定を行った。

トップ分子量が若干高分子量側にずれるとともに positive

470 nm 吸収の相対強度は以下の（1）
式に従い、算出した。

mode ではピーク全体がブロード化する様子が見られた

100 ｛–（Atest at 0min – Atest at t min）

（Fig. 1 ⒝）。これは n 型半導体特性を有する C60 誘導体の（Acontrol at 0 min – Acontrol at 180 min）/｝
× 100 （1）

MALDI - TOF MS の特徴であり、確かに目的物が得られたことを示している。

Scheme 1 Synthesis of PEGylated C60 derivative by CuAAC.

Fig. 1 MALDI-TOF MS spectra of ⒜ PEG 5000 and ⒝ PEGylated C60（matrix: dithranol）．

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水溶性フラーレンの設計とそれらを用いた抗酸化作用に関する研究

PEG5000 - C60 誘導体の抗酸化能を評価した。リノール酸の酸化により生成した過酸化ラジカルが㌼ - カロテンを攻撃すると㌼ - カロテンの 470 nm の吸収強度が減少する
ことが知られている 7，8）。ここにラジカル補足能がある抗酸化剤を添加しておくと㌼ - カロテンへの攻撃が妨げられる。470 nm の吸収強度変化が抗酸化能と直接関連すると仮定し、評価した。C60 誘導体を添加していない時は㌼ - カロテン溶液にリノール酸添加後 10 分程度で 470 nm 吸収強度の急激な減少が起きたのに対し、PEG5000 -C60 誘導体を 4.79 mM 添加した場合は減少が穏やかになった（Fig. 2）。
さらに、PEG5000-C60 誘導体の濃度を 9.96 mM へ増やすとさらに吸収強度の減少は緩和したことより、PEG5000-C60誘導体に明確な抗酸化作用があることが示唆された。水への溶解性が限られているためこれ以上高濃度での実験がでFig. 2 Time-dependent absorbance change of ㌼- carotene at
470 nm.

きていないが、既報値と同等の抗酸化能を有していると考えられる。

ものと考えられる。分子量 5000 の PEG 鎖を導入すること

4. 考でメタノールへ可溶な C60 誘導体とすることができた。完察

全に水溶性とするにはさらに長い PEG 鎖を導入する必要

アルコールに溶解する PEG5000-C60 誘導体を新たに合があることが分かった。得られた PEG5000 - C60 誘導体の成し、その抗酸化作用を実証した。完全に水に溶解するメタノール溶液を用いて C60 誘導体の抗酸化作用を評価しC60 誘導体を得るにはさらに長い PEG 鎖を導入するか、2た。PEG5000 - C60 誘導体を少量（4.79 〜 9.96 mM）添加する

本の PEG 鎖を C60 に付加させる必要がある。そうするとさと、リノール酸過酸化ラジカルの㌼ - カロテンへの攻撃を抑らに高濃度溶液が調整できるため、ラジカル補足能および制することが示された。このことより PEG5000-C60 誘導抗酸化能の向上を実現できるはずである。

体には抗酸化作用があることが明らかとなった。

今後の予定として、抗酸化作用を既存の抗酸化剤と比較する。また、それによって今回新規に合成した PEG -C60誘導体の抗酸化作用を定量的に評価する。さらに、C60 誘（引用文献）
1） E. Choe and D. B. Min, Compr. Rev. Food Sci. Food
Saf. 2009, 8, 345-358.

導体によるラジカル補足能を実証するため、スピントラップ試薬を用いてラジカル濃度を定量し、議論する。そのた

2） L. Xiao, H. Takada, X. H. Gan, and N. Miwa, Bioorg.
Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1590-1595.

めに水溶液用ガラスセル中で電子スピン共鳴（ESR）により

3） Y.-G. Ko, S. G. Hahm, K. Murata, Y. Y. Kim, B. J. Ree,ラジカルを検出する。

S. Song, T. Michinobu, and M. Ree, Macromolecules

また、今回合成した PEG-C60 誘導体は未反応の末端ア

2014, 47, 8154-8163.

ルキンがもう一つ残っている。分子量 5000 の PEG を置換することでアルコールへの溶解性が確保できているため、

4） J. Iehl and J.-F. Nierengarten, Chem. Eur. J. 2 0 0 9,15, 7306-7309.

再度 CuAAC 反応を利用することでアジド化タンパク質へC60 を連結できると考えている。新規なバイオナノ構造体

5） S. Kato, H. Aoshima, Y. Saitoh, and H. Miwa, Bioorg.
Med. Chem. Lett. 2009, 19, 5293-5296.の創製が可能になる道筋を確立する。

5. 総

6） M. Horie, A. Fukuhara, Y. Saito, Y. Yoshida, H. Sato,括H. Ohi, M. Obata, Y. Mikata, S. Yano, and E. Niki,Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 5902-5904.

フラーレンの π 電子系を損なうことなく、水溶性置換基を導入する方法論を確立した。アジド基はフラーレンと

7） H. Tsuchihashi, M. Kigoshi, M. Iwatsuki, and E. Niki,

反応することが知られているが、CuAAC 反応の方がはる

Arch. Biochem. Biophys. 1995, 323, 137-147.

かに速く進行するため、目的化合物が優先的に得られた

8） R. Farhoosh, Food Chem. 2005, 93, 633-639.

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