太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンスクリーンの効果
岡山大学

根岸友薬学部

惠、豊島

め ぐ み

The use of sunscreen seems to be important to avoid the damage caused by sunlight. There are numerous
epidemiological investigations showing that the sunlight is carcinogenic to humans. The biological activity of sunscreen
is evaluated by its ability to protection from erythema. However, we consider that the sunscreen's protective effectagainst sunlight induced-mutation should also be taken into account. In this study we examined the protective effectof two commercial sunscreens against the mutagenicity induced by natural sunlight and against the DNA damage
induced by sunlight or UVB-irradiation. The mutagenicity was detected by the Drosophila wing spot test and DNA
damaging activity was estimated by the Drosophila in vivo DNA repair test. When the sunscreen was pasted on thecover of petri dish in which Drosophila larvae were exposed to the sun, the mutagenicity was suppressed down toalmost the control level. We prepared by ourselves sunscreens containing UVB absorbents at various concentrations,and measured the transmittance. From the results, it is suggested that the protection against the light of wavelength
was shorter than 320 nm may be important to avoid the genotoxicity of sunlight.

１．緒

言

２．実

太陽光紫外線はヒトの皮膚にさまざまな影響を与える重２. １

験ショウジョウバエ体細胞突然変異検出系

要な因子であり、その作用は波長により大きく異なっていショウジョウバエは卵、幼虫、蛹、成虫と約 10 日間でることは知られているが、その詳細な波長特性は未だ不明

完全変態する昆虫である。孵化後の体細胞分裂は幼虫期のである。従来、地表に届いている太陽光紫外線は波長によっ４日間、成虫原基（将来成虫の器官となる組織）でしか行て UVB（290 - 320 nm）、UVA（320 - 400 nm）に分けられなわれない。したがって突然変異を検出できるのはこの時ている 1）。一般に UVB は紅斑生成作用、UVA は黒化作期に幼虫を処理したときに限られる。体細胞突然変異を検用があると言われている。しかしながら、紫外線のスペク出する系として、ショウジョウバエ翅毛スポットテストをトラムが連続的なものである以上、このような分類は不完用いた 3）。これは翅毛形態マーカーとして炎毛（flr）を持全なものである。太陽光紫外線の作用を解析するには、太つ雄（y; Dp（1;3）scJ 4 , y+ flr/TM 1 , Me ri Sbd 2）と多翅毛

陽光そのものを材料とする研究と合わせて、単色光照射に（mwh）を持つ処女雌（y; mwh j v）を交配させて得た三齢より個々の波長における作用を調べる詳細な実験が必要で幼虫を被験体として用い、成虫になったときのハネ翅毛にある。また、従来 UVA 領域の光は UVB あるいはそれ以現れる形態の変化を指標として調べる方法である。すなわ

下の波長の光に比べてあまり研究されてこなかったが、短ち標的器官とする成虫原基は翅原基である。この翅原基は波長紫外線と違って大気や窓ガラスなどで吸収されず、ヒ図１のように成虫原基としては表皮近くに存在し、紫外線トの皮膚においても UVB に比べて表皮の内部まで透過すへの曝露が可能と考えられる。この試験系では遺伝子突然る ことから、その重要性が見直されてきている。太陽光2）

紫外線の最も重大な作用は発がん作用であるが、発がん作用のスクリーニング法として、変異作用を指標とすることは広く認められている。そこで本研究では、UVB から
UVA 領域の種々の波長の光の変異作用と自然太陽光の変異作用を詳細に検討すると同時に、サンスクリーン塗布による変異抑制の実験を行った。
Mutagenicity of solar UV in Drosophila
and its protection by sunscreen
Tomoe Negishi, Megumi Toyoshima＊

Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Okayama University＊− 70 −

太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンスクリーンの効果

変異のみでなく、組換え、端部欠失、不分離等真核生物特し、UVA 量は UVX- 36 センサーで測定した。曝露後、幼有の染色体レベルでの変化も検出される。処理した三齢幼虫をインスタント培地に移し暗所で成虫まで飼育し、翅虫はインスタント培地（Formula 4 - 24 , Carolina Biological

毛スポットの観察あるいは性比の計数を行った。曝露後

Supply Co.）に移し、成虫になるまで 25℃で飼育する。羽の幼虫の取扱は光回復の影響を避けるために黄色ランプ化したハエのハネを集め、スライド標本とした後、翅毛の下で行った。サンスクリーンの効果を調べる時は、原の形態変化を顕微鏡で観察する。変異した翅毛の集団を則として日本化粧品工業 SPF 測定法基準及び UVA 防止スポットと呼び、染色体組換えによってのみ生じる双子効果測定法基準に従い、シャーレのフタに 2 mg/cm 2 あスポット（炎毛と多翅毛のスポットが隣接して存在するもるいは 2 µL/cm 2 になるように塗布した。サンスクリーンの）、どちらか一種類のみのスポットであるシングルスポッ

としては市販のものを用い、SPF 16 と SPF 87 の製品のトに分類して計数する 3）。

効果を比較した。サンスクリーン塗布時の透過波長、透過率は分光光度計（Hewlett Packard 8452 A Diode Array

２. ２

ショウジョウバエ DNA 傷害修復試験Spectrophotometer）を用いて、フタを光路上において測4)

この試験系に用いる株（sc z 1 w+（TE） mei- 9 a mei- 41 D 5 /定した。

C( 1 )DX, y f）は図２に示したように常に雄は除去修復欠損、複製後修復欠損となるように工夫された株である。し２. ４

健康線用蛍光ランプ照射

たがって雄はその体細胞 DNA に何らかの損傷を受けた場

ブロードな波長域を持つ実験光として健康線用蛍光ラ合、修復ができずに生存率が減少する。それに反して雌はンプ（FL 20 S・E、Toshiba、波長 275 - 400 nm、ピーク波

正常に損傷を修復できるので生存数に変化は見られない。

長 310 nm）（健康ランプ）を用いた。照射装置は図４に示

そこで成虫での雌雄の比を求めることによって DNA 損傷の程度を知ることができる。スポットテスト同様に処理し、羽化してきた成虫の雌雄の個体数を計数して性比を得る。
本研究で用いたショウジョウバエは梁治子博士（大阪大学医学部）並びに藤川和男博士（近畿大学原子力研究所）に分与していただいた。

２. ３

太陽光曝露方法 5)

シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 三 齢 幼 虫 を 集 め、
1 . 5 mL ショ糖溶液の入ったプラスチックシャーレ（ADVANTEC）におよそ 150 匹の幼虫を入れ、曝露に用いた。長時間曝露中の幼虫の逃亡を避けるために、嫌気性菌培養用シャーレを用い、通気用にフタに径 5 mm の穴を開けメッシュを張った。岡山大学のキャンパス草地に図３のような装置を組み、曝露中の温度を一定に保つために循環装置付きの恒温水槽の水面すれすれにシャーレを置いた。曝露中の温度はシャーレ内に張ったサーモテープでチェックし、25 ± 2℃に保った。日射量は MED（minimum erythemadose）を Erythema UV Intensity &Dose Meter（Solar Light Co.）で測定した。UVB は UVX radiometer（UVP,Inc.）に UVX- 31 センサーを付けて測定− 71 −した。２. ３で述べたものと同様のシャーレを用いて照射し、線量測定はシャーレのフタの下で行なって、約 3 mW/m 2 であった。サンスクリーンの実験は太陽光曝露と同様にシャーレのフタに塗布して行なった。市販の製品に加えて、UVB 吸収剤として 4 -dimethylaminobenzoicacid（東京化成）を吸水軟膏（Merk）を基剤として一定量混和したものを用意した。また、UVA 吸収剤として 2 -（2 -benzotriazolyl）-p-cresol（東京化成）を吸水軟膏製剤としたものを作製して効果を比較した。それぞれの吸収剤の紫外部吸収曲線は図５のようである。吸収剤：基剤が１：40、１：４、５：４の製剤を調製した。また、吸水軟膏の代りに紫外部に吸収が無い流動パラフィン（シオエ製薬）を溶剤として用いた製品を調製し、効果の検討を行なった。

２. ５

単色光照射の変異原性

太陽光紫外線の波長による生物活性を見るために単色光照射による変異原性及び DNA 傷害性を検察した。かなり広い範囲に一定波長の光が照射できる装置が必要であり、この実験は国立岡崎共同研究機構基礎生物学研究所にある大型スペクトログラフ 6）を用いる共同研究グルー
プ（代表者：檜枝光太郎（立教大学））で行った。
水平方向に分光された光を鏡を使って垂直方向に方向を変え、先の実験と同様にプラスチックシャーレの上方から光が照射されるようにした。光強度はフォトダイオード（S 1337 - 66 BQ,
Hamamatsu Photonics）でモニターしながら光電子密度計（photon density meter HK- 1）を用いて測定した。照射時の室温は 25℃に保たれるように空調した。照射および照射後の操作は太陽光ならびに健康ランプの実験と同様に行った。

３．結
３. １

果

太陽光および健康線用蛍光ランプの活性とサンスクリーンの効果
翅毛スポットテストを用いた太陽光変異原性の２年間のモニター実験により、年間を通じて太陽光に変異原性が観察された。その強さは日射量に比例しており、冬期は夏期の 1 / 3 〜
1 / 5 であった 5）。今回、日差しの強くなる４月末にサンスクリーンによる効果を調べた。太
陽光の変異原性と曝露時にサンスクリーンをフタ全体に約 40 mg 塗布した場合の結果を図− 72 −

太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンスクリーンの効果６に示した。４時間曝露時の MED は８、UVA は 170 kJ/が得られた。ここで MED 3 に相当する積算紫外線量は 11m 、UVB は 57 kJ/m であった。サンスクリーンの塗布

月９日では５時間、11 月 11 日では３時間で達成されておにより、ほぼコントロールレベルまで変異原性が抑えらり、同じ MED でも短時間で曝露されたときの方が致死作れた。このときサンスクリーンを塗布したシャーレのフ用が強いことが示された。この時の UVA および UVB は

タの紫外線透過率は、SPF 値に関わらず、図７のように11 月９日がそれぞれ、60 . 4 kJ/m 2、19 . 6 kJ/m 2、11 日は300 nm 以下の光はほとんど透過せず、また 320 nm 以上の25 . 5 kJ/m 2 となり、UV でも 11 日の方が高かっ
89 . 3 kJ/m 2、紫外光でも 80％以上の遮光効果が見られた。このことはた。天候が良好で紫外線量が多いときには SPF 値の違い変異原活性がいずれのサンスクリーンでもほぼ 15 - 20％にによる効果の差が明らかであり、紫外線量が多いときは高なったことと良く一致していると言える。一方、太陽光のい SPF 値のサンスクリーンを用いる必要があると言える。

細胞傷害は DNA 傷害修復試験を用いることにより、よりこのとき用いたサンスクリーンは 5 mg/ 20 cm 2 とした。こ

高感度に検出されることがわかったので、この試験系を用の SPF 値の違いによる効果の違いは健康ランプを用いた

いてサンスクリーンの効果の検討を行なった。少し天候のUVB 照射実験においてより顕著に見られた。図９に見ら違う日に２回の実験を行なったところ、図８のような結果れるように線量が高くなると SPF 16 のサンスクリーンを22塗布した場合は雄に顕著な致死作用が観察された。それぞれのサンスクリーン塗布状態での透過光の波長と透過率に差がある（図 10）のでこれらのどちらの違いがこの致死作用に寄与しているか調べる必要がある。

３. ２

紫外線吸収剤を用いた実験

市販のサンスクリーンでは UV 吸収剤の成分が不明なので、吸収される紫外線領域と活性抑制の関係が明らかにしにくい。そこで、サンスクリーンの成分として使用されている UVA および UVB 吸収剤を用いて、研究室でサンスクリーンを調製して健康ランプの DNA 傷害作用に対する効果を調べた。基剤に吸水軟膏を使用して、UVB 吸収剤の製剤を調製したところ図 11 のような結果を得た。UVA吸収剤ではいずれの混合比でも健康ランプによる致死傷害を抑制できなかった。UVB 吸収剤では吸収剤が 20％以上

シャーレのフタに SPF87（ ）あるいはSPF16（ ）のサンスクリーンを塗布した場合と何も塗布しなかった場合（ ）の性比の減少を示す。

− 73 −

混合されることで顕著な抑制効果がみられた。しかしながり抑制作用が見られた。従って抑制作用は 320 nm 以下のらこの時、塗布されたシャーレにおける各波長の光の透過紫外線を透過しなくなることによって発現すると考えられ率を見ると、図 12 のように 20％以上混合した場合は波長る。と透過率に差が見られた。長波長側での透過率の差を無くすために流動パラフィンを用いて製剤したところ、図 13３. ３

単色光照射の変異原性と致死傷害性のような透過率になり、長波長側での透過率の差は解消さ

サンスクリーンの吸収剤の吸収波長と作用スペクトルれ、それぞれの製剤の差は透過波長の違いと考えることがの関係を調べるため、まず単色光照射による変異原性とできた。その時の致死傷害抑制作用は図 11 とほぼ同様な致死傷害性を調べた。310 nm、320 nm、330 nm、340 nm、結果を示した。すなわち UVB 吸収剤 20％以上の混合によ

360 nm、380 nm、400 nm の 光 を 照 射 し 変 異 原 性 を 調 べ− 74 −

太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンスクリーンの効果たところ、340 nm までの光で線量依存的に有意に突然変異を検出できた（図 14）7）。DNA 傷害性は図 15 のようになった。320 nm の光は修復欠損の雄に致死作用を示した。
330 nm、340 nm の光は長時間照射することによって傷害が発現した。しかし 360 nm 以上の長波長の紫外線では傷害は観察されず、突然変異が 360 nm 以上の光でほとんど誘発されなかったことと一致した。

４．考察

本研究においてわれわれは、太陽光紫外線の生物影響のうち発がんに関わるとされる体細胞突然変異について、ショウジョウバエの系を用いて検討した。さらに太陽光の生物活性障害を防御するために使用されるサンスクリーンの活性評価に抗変異原性を加えることができるかどうかを検討した。
太陽光曝露時におけるサンスクリーンの効果は SPF 値に関わらず、基準量の 40 mg/ 20 cm 2（20 cm 2 はおよそのシャーレフタの面積）を塗布することによって顕著な防御効果が見られた（図６）。しかしながらこの時、図３からもわかるように、シャーレの表面は白塗りの状態で肉る致死作用は曝露約 1 . 5 時間（MED １）で顕著に見られた。

眼的にも光を透過しない状態と予想された。実際に図７

DNA 傷害修復試験では紫外線量の違いに対する SPF 値のに示したように 320 nm 以下の光はほとんど透過していな差が一層はっきり観察された（図９）。すなわち線量が強い。そこで、以後の DNA 傷害修復試験を用いた実験にいときには SPF 値の低いサンスクリーンでは効果が弱いは 5 mg/ 20 cm のを塗布し、肉眼的には透明感が残ったことが示された。この時サンスクリーンを塗布したフタの状態で効果を調べた。DNA 傷害修復試験は翅毛スポット

紫外線透過の状況は図 10 に示したように、それぞれのサテストによる突然変異検出より高感度であり、雄に対すンスクリーンで透過波長と透過率いずれも違っていた。サ

2− 75 −

ジョウバエ幼虫に対して紫外線は、波長が長くなるに従って変異原性が指数関数的に減少し、360 nm 以上の光はほとんど傷害を示さなかった 7、8）。培養細胞やある種の魚を用いた研究で 360 nm 付近に変異原性や発がん性が見られるという報告 9、10）があるが、ショウジョウバエ翅原基ではそのような活性は観察されなかった。これは生物材料の感受性の違いや、用いた検出方法においてどのような変化が検出されるのか、等の条件によるものと考えられる。
サンスクリーンを用いた太陽光や UVB の実験において示唆された、320 nm 以下の光をカットすることが傷害を防御するために必要である可能性を確かめ、SPF 値との相関性を明らかにしていくために、さらに単色光での研究を進める必要がある。
なお、今回の実験ではサンスクリーンの適用をシャーレのフタに塗布するという方法で行ったが、実際にヒトに適用する場合は細胞に直接サンスクリーンが接触することになる。したがってショウジョウバエの系でも直接接触した場合の効果および有害性についても検討していく必要がある。

５．謝辞

本研究は岡山大学遺伝子実験施設根岸和雄博士、ならびに岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所大型スペクトログラフにおける檜枝光太郎博士（立教大学）、古澤佳也博士（放射線医学総合研究所）との共同研究であります。関
係諸氏に深く感謝致します。また、本研究の遂行を可能にンスクリーンの防御効果は、透過率をさげることによるのし御援助いただいた岡山大学薬学部早津彦哉教授並びにコ

か、透過波長が長くなることが原因なのかは興味深い問題

スメトロジー研究振興財団研究助成に感謝致します。

である。そこで、紫外部に吸収の無い流動パラフィンを用いた実験を行ったところ、サンスクリーンの効果は主に短（引用文献）

い波長の光（320 nm 以下）を透過しなくなることによって

１）Roy CR, Gies HP, Lugg DJ, et al., : The measurement

示されることが示唆された（図 12、13）。またここではデーof solar ultraviolet radiation, Mutation Res., 422 , 7 - 14 ,タを示していないが、UVA 吸収剤（2 -（2 -benzotriazolyl）

1998 .

- p - cresol）を用いて調製した製剤では透過率のみ変化

２）Bruls WAG, Slaper H, van der Leun JC, et al.,

し、いずれの混合比でも 290 nm 以上の光を透過しており、: Transmission of human epidermis and stratum

DNA 傷害作用の抑制効果が全く見られなかったことは、

corneum as a function of thickness in the ultraviolet

先の考察を支持するものであろう。従ってサンスクリーンand visible wavelength, Photochem. Photobiol., 40 , 485 -製剤としては 320 nm 以下の紫外線を透過しないものが望ましいと考えられる。

494 , 1984 .
３）Graf U, Wügler FE, Katz AJ, et al., : Somatic mutation

本研究のこのような結果は、紅斑生成に対する効果だけ

and recombination test in Drosophila melanogaster,

でなく、DNA 傷害性あるいは変異原性の防御作用の強さを考慮してサンスクリーンの評価を行う必要があることをEnviron. Mutagen., 6 , 153 - 188 , 1984 .
４）Negishi T, Shiotani T, Fujikawa K, et al., : The

支持するものである。

genotoxicities of N-nitrosamines in Drosophila

さらに太陽光紫外線のどの領域の波長が変異原活性やmelanogaster in vivo: the correlation of mutagenicity in

DNA 傷害性発現に寄与しているかを調べ、サンスクリー

the wing spot test with the DNA damages detected by

ンの各波長での効果を検討するため、単色光照射による変the DNA-repair test, Mutat. Res., 252 , 119 - 128 , 1991 .

異原性と DNA 傷害作用の検出を行った。その結果ショウ

５）Negishi T, Takinami S, Nikaido O, et al., : Somatic cell

− 76 −

太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンスクリーンの効果

mutation induced by sunlight in Drosophila, J. Epidem.,

cell mutation induced by UVA- and monochromatic

9 , s 66 -s 71 , 1999 .

UV-radiation in repair-proficient and -deficient６）Watanabe M, Furuya M, Miyoshi Y, et al., : Design

Drosophila melanogaster. in preparation.

and performance of the Okazaki large spectrograph９）Coohill TP, Peak MJ, Peak JG, : The effects of thefor photobiological research, Photochem. Photobiol., 36 ,ultraviolet wavelength of radiation present in sunlight

491 - 498 , 1982 .

on human cells in vitro. Photochem. Photobiol., 46 ,７）Takinamai S, Mochizuki M, Hayatsu H, et al., :1043 - 1050 , 1987 .

Somatic cell mutation and photoproduct formation

11）Setlow RB, Grist E, Thomson K, et al., : Wavelengths

induced by solar UV-radiation in Drosophila,

effective in induction of malignant melanoma. Proc.

Environmental Toxicology, in press.

Natl. Acad. Sci. USA, 90 , 6666 - 6670 , 1993 .

８）Negishi T, Nagaoka C, Hayatsu H, et al., : Somatic− 77 −