皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバリーと分泌方向性の制御
京都大学大学院

薬学研究科

高

喜

倉

信

Epithelial cells, generally displaying cell polarity, are considered to be good targets for gene therapy because of theirdistribution of enormous surface area of various tissues and organs in animal bodies. Polarized epithelial cells possess
two functionally and compositionally distinct cell surface domains that are separated from each other by tight junctions.
They play fundamental roles in the specialized vectorial transport and secretion of proteins in tissue and organs.
Newly synthesized domain-specific membrane proteins are conveyed through the endoplasmic reticulum (ER)-Golgi
apparatus to the trans-Golgi network (TGN), and packaged into transport carriers for membrane integration. The
destination of the membrane proteins seems to be determined by interrelation between some signal sequences on theprotein and various cellular components playing roles in sorting and trafficking. Secretory proteins are also considered
to be transported in the same manner as the membrane proteins. In spite of many investigations of the issue, themechanisms regulating apical or basolateral sorting of secretory proteins remain elusive.
The green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria and its variants are widely used in cell imaging
applications to reveal the location of proteins. Results from those applications are providing new insights into proteinfunction and cellular processes in the complex environment of the cell. The GFP-tagging technology is useful for directly
investigating the intracellular localization, movement and fate of secretory proteins of interest in living cells.
We have recently examined the mode of secretion polarity of interferon (IFN)-β expressed exogenously in several
epithelial cell lines. The secretion of constitutive IFN-β from the stable transformants was apparently unpolarized.
Meanwhile, intriguingly, IFN-β transiently expressed by gene transfection was predominantly secreted from the cell
membrane side to which the transfection or the induction was carried out. In this study, we have investigated thesubcellular localization of the cytokine using GFP-tagged IFN-β under confocal laser scanning microscopy (CLSM). Our
results suggested that IFNs expressed stably and transiently are transported via different post-TGN vesicles. The
same secretory protein, at least as far as IFN is concerned, can be sorted to the apical or basolateral membrane side
depending on the gene expression strategy, which deems to be regulated at the post-TGN stages.

１．緒

リーが可能になると考えられる。この際 ､ 遺伝子産物の言

分泌方向性 ､ すなわち apical, basal どちら側に分泌され上皮細胞は体表面や体腔の表面を覆う極性を有する細胞てくるかは、効果を左右する重要な因子となる。細胞生１、２）、広大な表面積を有しており遺伝子治療の重要なタ

物学の分野では、発現したタンパク質は、それ自身のシーゲットと考えられる。その形質膜はタイトジャンクシ

グナルと細胞選別機構によって、存在するべき場所へとョンにより頂側膜（apical）側と基底膜（basal）側に物輸送されることが知られている。しかしながら、我々は理的に隔てられ、膜を構成するタンパク質や、脂質の組

既に多孔性フィルター上でモノレイヤーを形成した上皮で３）成も異なっている 。このように、性質の異なる形質膜細胞において、インターフェロン - β（I F N - β）をモデル

ドメインを持つことで、上皮細胞は外から内、または内とした遺伝子導入実験を行った結果、I F N β を構成的にから外へと一方向性の物質の流れを生み出し ４−６）、生体発現させた場合には、極性を示すことなく apical 側及び内の恒常性を保つ重要な働きを担っている。このようなbasal 側にほぼ同量の IFNβ が分泌され、一過性に発現さ性質を利用して、上皮細胞にサイトカインなどの分泌性せた場合には、a p i c a l 側から遺伝子導入した場合には生理活性タンパク質をコードした治療用遺伝子を導入・

apical 側へ、basal 側から遺伝子導入した場合には basal発現させた後、方向選択的に分泌させることができれば、側への導入方向選択的な分泌が観察され、同一タンパク

タンパク質医薬品の局所あるいは、全身循環へのデリバ

質であるにも関わらず、遺伝子発現様式に依存した異なControl of secretion polarity of bioactive
protein after gene delivery to the skin

る分泌方向性を示すことを見出している７）（F i g . １）。そこで、Green fluorescent protein（GFP）とヒト IFN-β

Yoshinobu Takakuraとの融合タンパク質発現ベクターを作製し、発現させた

Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Kyoto University

輸送過程について、イヌ腎上皮細胞株 M D C K 細胞を中IFN のトランスゴルジネットワーク（TGN）以降の小胞心に用いて詳細な検討を行った。

− 66 −

皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバリーと分泌方向性の制御測定し、安定発現における分泌方向性を評価した。一方、一過性の遺伝子発現実験においては、プラスミド DNA（３µg/mL）と LipofectAMINE2000TM（10µg/mL）の複合体
を、多孔性フィルター上で 5 日間培養した細胞の apical側及び basal 側から導入した。複合体を含む Opti-MEM
培地で 4 時間培養後、通常の培地と交換し、導入後 24 時間までに各コンパートメント中へ分泌した IFN 量を測定した。いずれの実験においても、IFN の細胞層を介した漏出の有無を調べるために、遺伝子導入したものとは異種の IFN をマーカーとして添加し、透過の有無を確認した。

2．4 遺伝子導入により発現した融合タンパク質の局
在の観察
HuIFNβ-GFP 及び GFP 安定発現株は、フィルター上で5 日間培養後固定した。固定前に５µg/mL の brefeldin A（BFA）で 30 分間処理 ､ もしくは 20℃の 10mM HEPES
Fig. 1 Secretion polarity of stably or transiently expressed human IFN-β in Pam-T and MDCK cells. Cells were culture
on Transwell for 5 days. In transient expression experiments, human IFN-β gene was transfected onto apical orbasal side. Open bars and gray bars showed human IFN
activities in Pam-T and MDCK cells, respectively. The values represent the mean of three determinations with S.D.

２．実

入り DMEM に培地を交換後 20℃で２時間処理し、固定した。また、一過性の遺伝子発現実験においては ､ 融合タ
ンパク質発現ベクターを導入して ､10 時間後に固定した。
固定前に、BFA 処理 ､ 及び 20℃低温度処理を行った。固定、透過後、免疫染色により各オルガネラを染色あるいは
propidium iodide（PI）で核を染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した ｡ 一次抗体に小胞体、ゴルジ体、トランスゴ
ルジネットワーク（TGN）のマーカータンパクである験

protein disulfide isomerase（PDI）（1D3）
、
Golgi-58K（58K-9）、

2．1 ヒトIFN-βと GFP との融合タンパク質（HuIFN
β-GFP）発現ベクターの作製
ヒト IFN-β 遺伝子をコードした pCMV-HuIFNβ のヒト

furin convertase に対する抗体を用いた。いずれの場合も二次抗体に、Alexa Fluor 594 標識 2 次抗体を用いた。免疫染
色後共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。

IFN-β cDNA 部位を PCR で増幅し、GFP 発現ベクターのレポーター遺伝子の N 末に組み込み、
ヒト IFN-β（HuIFNβ）と GFP との融合タンパク質（HuIFNβ-GFP）を発現する

2．5 シクロヘキシミド（CHX）及び 20℃低温度処
理の IFN-β 分泌過程に与える影響
CHX 及び 20℃低温度処理の融合タンパク質細胞内輸送

ベクター（pCMV-HuIFNβ-GFP）を作製した。

に与える影響を観察するため、1×105 個の融合タンパク質2．2

安定発現細胞をカバーグラス上に播種し、１日間培養した。

安定発現株の作製

播種後 24 時間培養した細胞に対し、ベクターとカチオ

その後、0、10、20µg/mL の CHX を含んだ 20℃または 37との複合体℃の DMEM に培地を交換して２、４時間培養し、固定後を用いてトランスフェクションを行った。細胞を 100 mm

共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。また、分泌培養皿に移し、抗生物質 G418 で培養した。G418 耐性コに与える影響を調べるため 1×105 個の融合タンパク質安定

ロニーを回収して、さらに培養後、上清中の IFN 量をバ

発現 MDCK 細胞を 24 穴プレートに播種し、0, 10, 20 µg/

８）

イオアッセイにより定量し 、最も活性が高かったものを

mL の CHX を含んだ 37℃の DMEM に培地を交換して 2 時

安定発現株として確立した。同様の方法を用いて蛍光の有間培養後、CHX を含有しない DMEM に交換してさらに 10、無を指標に GFP 安定発現株を樹立した。

30、60、120 分間培養した上清を回収し、IFN 量を測定した。

TM

ン性リポソームである LipofectAMINE2000

2．3

2．6

分泌方向性の検討

TGN 以降の小胞輸送過程の解析）上でカバーグラス上で MDCK 細胞及び融合タンパク質安定

５日間培養後、培地を交換し、24 時間までに細胞層の発現細胞を 1 日間培養した。MDCK 細胞に対しては、マapical 側及び basal 側に分泌された細胞上清中の IFN 量を

ウス IFN-β 発現プラスミド（pCMV-MuIFNβ）及び pCMV-

安定発現株を、多孔性フィルター（TranswellTM− 67 −

HuIFNβ を同時に導入し、融合タンパク質安定発現細胞に対しては pCMV-MuIFNβ を導入した。導入後 8 時間から、10µg/mL の cycloheximide（CHX）、10mM HEPES を含んだ DMEM で、20 ℃ ２ 時 間 培 養 し た。 そ の 後、37 ℃ の10µg/mL の CHX を含んだ培地に交換し、0、5、10、15、
30 分間培養後、固定した。固定後、一次抗体にマウス
IFN-β 抗体９）
（6D-G8）、２次抗体に Alexa Fluor 546 標識二次抗体を用いて、免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。画像解析は Image-Pro Plus ver. 4.5を用いて作製した Fluorogram の対角線上の任意の場所を選び、コロカライゼーション係数 M1、M2 を算出した 10）。

３．結
3．1

果

融合タンパク質の分泌方向性の検討

まず、Pam-T 細胞及び MDCK 細胞において、融合タン
パク質を安定に発現させた場合と一過性に発現させた場合の分泌方向性について検討した（Fig. ２）｡ その結果、安定発現株からは両方向にほぼ均等な分泌が見られたのに対し ､ 一過性に発現させた場合には ､ 遺伝子導入方向選択的な分泌を示した ｡ これより ､GFP と融合させた場合でもFig. 2 Secretion polarity of stably or transiently expressed
HuIFNβ-GFP in Pam-T and MDCK cells. Cells were culture
on Transwell for 5 days. In transient expression experiments, HuIFNβ-GFP gene was transfected onto apical orbasal side. Open bars and gray bars showed human IFN
activities in Pam-T and MDCK cells, respectively. The values represent the mean of three determinations with S.D.

IFN-β の活性は失われず、IFN-β 単独の場合の一過性及び構成的な発現パターン（Fig. １）と同様の細胞外への分泌方向性を示すことが明らかとなった。

3．2

融合タンパク質の細胞内オルガネラへの局在解析

遺伝子発現様式に依存した IFN-β の分泌方向性の違い
が細胞内のいずれの部位において生じるかを解明するため､ 共焦点レーザー顕微鏡を用いて Pam-T 及び MDCK 細胞に発現させた融合タンパク質の細胞内における局在を X-Z
軸方向のスキャンにより観察した（Fig. ３）。その際 ､ 融合タンパク質を細胞内に蓄積させて観察を容易にするため
BFA 及び 20℃低温度処理を行った。BFA は、ゴルジ体を分解させる化合物としてよく知られており、タンパク質の分泌を阻害することが報告されている 11、12）。20℃低温
度処理は新たに生合成されたタンパク質を TGN に蓄積させる方法として知られている 13）。
ま ず、BFA を 用 い て 観 察 を 行 っ た 場 合（Fig. 3A）、
GFP 安定発現株では両細胞において細胞内全体に強い
GFP 由来のシグナルが局在していた ｡ これに対し、融合
タンパク質安定発現細胞では、融合タンパク質は Pam-T
細胞では核周辺に局在が認められ、その分布は核をはさんで apical 側及び basal 側にほぼ均等に観察された。また
MDCK 細胞では、主として核に対して apical 側にその局在が偏っている様子が観察された。一方 apical 及び basal側から遺伝子導入後、一過性に発現させた融合タンパク質の細胞内局在は、各々の細胞の融合タンパク質安定発現株
における局在パターンと同様であることが示された ｡ 以上

Fig. 3 Confocal microscopic observation of stably or transiently
expressed HuIFNβ-GFP in Pam-T and MDCK cells (X-Z section). A shows the intracellular localization of stably or transiently expressed HuIFNβ-GFP in Pam-T and MDCK cells
under BFA treatment. B shows that in MDCK cells under
20℃ temperature treatment. N.D. indicates not detection.

− 68 −

皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバリーと分泌方向性の制御

より、安定及び一過性に発現させた融合タンパク質の細胞定発現株の場合と同様、主に TGN/Golgi 体への分布が観外への分泌方向性は異なるにも関わらず、BFA 処理下の察された（Fig. 4B, control）。また、BFA 及び 20℃低温

細胞内局在パターンは同様であることが示された ｡

度処理を行った場合にも同様の結果が得られた（Fig. 4,

BFA は MDCK 細胞における選別輸送を消失させるこ

BFA, 20℃）。これより、HuIFNβ-GFP を安定に発現させとや、オルガネラに対し様々な形態変化を起すことが知らた場合及び一過性に発現させた場合の細胞内局在は BFA、れている。そこで MDCK 細胞については、20℃低温度処

20℃低温度処理の有無によらず同様であり、主として理により融合タンパク質を TGN に蓄積させた場合につい

TGN/Golgi 体に局在していることが示された。

ても検討した。しかしながら、この場合にも BFA 処理の次に、MDCK 細胞において発現させた融合タンパク質

3．3 異なる様式により発現させた IFN-β の TGN 以降における小胞輸送過程の解析の細胞内オルガネラへの局在について解析した。その際、次に、同一細胞において異なる様式により発現させた融BFA 及び 20℃低温度処理を行った場合についても検討し合タンパク質とマウス IFN-β の TGN 以降の小胞輸送課程た。まず、いずれの処理も行わずに検討した結果、融合タ

について検討した。実験方法は、カバーグラス上で培養しン パ ク 質 を 安 定 に 発 現 す る MDCK 細 胞（MDCKた MDCK（HuIFNβ-GFP）に対してマウス IFN-β を一過（HuIFNβ-GFP））では ､ 融合タンパク質は主として核に対性に発現、あるいは MDCK 細胞に対して融合タンパク質

して apical 側にその局在が偏っており、オルガネラ染色と、マウス IFN-β を同時に一過性に発現させた。発現さとの比較により、主に TGN/Golgi 体に局在していること

せた 2 種類の IFN-β を CHX 含有培地で、20℃低温度処理が示された（Fig. 4A, control）。一方 ､apical 側からの遺により TGN へ蓄積させ、その後 37℃で培養することによ

伝子導入により、一過性に発現させた HuIFNβ-GFP も安り TGN 以降の輸送を再開させ、経時的に細胞を固定し、時とほぼ同様の細胞内局在パターンを示した（Fig. 3B）。

Fig. 4 Relative localization of HuIFNβ-GFP expressed in MDCK monolayers to various organelles.
MDCK(HuIFNβ-GFP) (A) and parental MDCK (B) monolayers were grown on Transwell for 5 days. The
latter monolayers were apically transfected with HuIFNβ-GFP gene and incubated for 10 h. Either monolayer was treated with 20℃ for 2 h or with BFA (5μg/mL) for 30 min just prior fixation, followed by staining with the ER- (a-c, m-o), Golgi- (d-f, p-r), or TGN-specific antibodies (g-i, s-u) and appropriate secondary
antibodies, or alternatively with PI for nuclei (j-l, v-x). In control experiments, no 20℃ treatment or BFA
treatment was carried out. Typical x-z sections of the confocal images are shown.

− 69 −

CHX 除去後の融合タンパク質の分泌について検討した結果、観察した。
まず、実験に先立ち、タンパク質合成阻害剤である CHX
及 び 20 ℃ 低 温 度 処 理 の 最 適 条 件 を 検 討 し た。MDCKIFN-β は新たに細胞内で合成されてから分泌されるまでに少なくとも 30 分を要することが示された（Fig. 5C）。

（HuIFNβ-GFP）をカバーグラス上で培養し、0、10、20µg/

また、HuIFNβ-GFP とマウス IFN-_ を異なる様式から発mL の各濃度の CHX 存在下、20℃（Fig. 5A）及び 37℃（Fig.

現させた場合、それぞれ異なる分泌方向性が維持されるか5B）で２、４時間培養し観察した。その結果、37℃においどうかを検討するため、フィルター上で培養した MDCKて 10µg/mL 以上の CHX では２時間以上処理を行った場合、 （HuIFNβ-GFP）に対し、マウス IFN-β を一過性に発現させ発現させた融合タンパク質が細胞内において観察されなかた。その結果、両方向へほぼ均等に分泌する融合タンパクったのに対し（Fig. 5B, h, i, k, l）、20℃で培養した場合には、質の分泌方向性に影響を与えることなく、マウス IFN-β は細胞内に蓄積した融合タンパク質が確認された（Fig. 5A, b,

導入方向選択的な分泌を示すことが確認された（Fig. ６）。

c, e, f）
。以上より、発現させた融合タンパク質を TGN に蓄

Fig. ７ は、 カ バ ー グ ラ ス 上 で 培 養 し た MDCK積させるための最適条件として、10µg/mL CHX 処理下、

（HuIFNβ-GFP）に対してマウス IFN-β を一過性に発現、20℃、２時間培養を選択し、以下の実験条件とした。また、あるいは MDCK 細胞に対して GFP 融合タンパク質とマ

Fig. 5 Effects of CHX and temperature on cellular processing and secretion of HuIFNβ-GFP.
Stable MDCK(HuIFNβ-GFP) cells cultured on coverslips were treated for 2 or 4 h with
0, 10 or 20μg/mL CHX at 20℃ (A) or 37℃ (B), followed by fixation and confocal microscopy. In parallel, secretion of the IFN activity from MDCK(HuIFNβ-GFP) (C) was
examined; After treatment with 0, 10 or 20μg/mL CHX for 2 h, cells were incubatedin regular medium without CHX at 37℃ . During the incubation, aliquots of culture fluids
were picked up at indicated time points and assayed for antiviral activity. Each value represents the mean ± SD of three separated experiments.

− 70 −

皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバリーと分泌方向性の制御

Fig. 6 Secretion of IFN-β from MDCK(HuIFNβ-GFP) cells following transfection of the mouse
IFN-β gene. pCMV-MuIFNβ was applied to the apical side (A) or to the basal side (B). Shaded
and open bars indicate mouse and human IFN activities, respectively. The values represent
the means of three determinations with S.D.

Fig. 7 Post-TGN localization of mouse IFN-β and HuIFNβ-GFP expressed in MDCK cells. In A,
stable MDCK(HuIFNβ-GFP) cells were transfected with MuIFNβ gene. In B, parental MDCK
cells were co-transfected with pCMV-HuIFNβ-GFP and pCMV-MuIFNβ. After transfection,
cells were incubated for 8 h and then subjected to 20℃ -treatment for 2 h. Thereafter, cells
were warmed to 37℃ (time 0) (a, k) and incubated for 5 min (b, l), 10 min (c, m), 15 min (d,n) and 30 min (e, o), followed by fixation and immunostaining of mouse IFN-β (red signal). N
indicates the nucleus area. Notice that several orange-yellow spots are pointed by arrowheads
in panels m-o. Scatter-plots of the pixel fluorogram (ordinate for green; abscissa for red) of themerged images (a-e, k-o) are shown in the respective lower panels (f-j, p-t), and colocalization coefficients, M1 (contribution of green) and M2 (contribution of red), which were computedfor intensity ranges defined by arbitrary area of interest (AOI) along the diagonal line of eachpanel, are shown at the bottom of the panels. The scale bar in panel a represents 10µm.

− 71 −

ウス IFN-β を同時に一過性に発現させた場合の結果で、TGN で選別を受けた後、遺伝子発現様式に依存した異な赤いシグナルは免疫染色したマウス IFN-β を、緑色が融る経路を介して輸送されると考えられた。

合タンパク質を示している。上段は同一細胞において安定

この可能性について検討するため、同一細胞において融に発現させた融合タンパク質と一過性に発現させたマウス

合タンパク質とマウス IFN-β を異なる様式で発現させた

IFN-β の分布を（Fig. 7A）、下段はコントロールとして、場合の TGN 以降における小胞輸送過程を解析した。トラ

同一細胞において一過性に発現させた両タンパク質の分布

ンスウェル上で培養した細胞を用いた場合、遺伝子導入効を示している（Fig. 7B）。その結果、それぞれ０分におい率も低く蛍光のシグナルも弱いため、カバーグラス上で培ては両タンパク質が共に TGN に蓄積している像が観察さ養した非極性細胞を用いた。非極性状態の細胞においてれたが、時間の経過と共に、異なる様式により発現させたも、apical 側へ輸送されるタンパク質、basal 側へ輸送さIFN-β のそれぞれのシグナルは別々に分布した。一方、両れるタンパク質はそれぞれ TGN 以降、異なる小胞によっタンパク質とも一過性に発現させた場合には、時間が経過て輸送されることが報告されている 14）。また、この実験

しても、矢印で示すように、それぞれのシグナルが一部共にはマウス IFN-β を用いたが、MDCK 細胞において一過存 し て い る 様 子 が 観 察 さ れ た。 画 像 解 析 か ら 求 め た性に発現させた場合には導入方向選択的に分泌されるこ

colocalization coefficients（M1, M2）も 10）、これらの結論と、ヒト IFN-β との間にはアミノ酸配列の相同性（約を支持していると考えられる。以上より、MDCK 細胞に50%）があることから、ヒト IFN-β と同様の分泌経路によおいて異なる様式により発現させた IFN-β は、TGN 以降って輸送されると考えられる。また実験に先立ち、MDCK異なる小胞輸送系により運ばれる可能性が示された。

細胞の融合タンパク質安定発現細胞に対してマウス IFN-β

4．考を apical 側あるいは basal 側から導入した場合、両方向に

察

ほぼ均等に分泌する融合タンパク質の分泌方向性に影響を

我々は既に、外来性の IFN-β 遺伝子を特定の上皮細胞与えることなく、マウス IFN-β は導入方向選択的に分泌において発現させると、同一タンパク質であるにも関わらされることを確認しており、それぞれ異なる経路を介してず、遺伝子発現様式に依存した異なる分泌方向性を示すこ

輸送されている可能性が考えられる（Fig. ６）。検討の結果、とを明らかにしている。そこで、GFP をヒト IFN-β の C

MDCK 細胞に対して融合タンパク質とマウス IFN-β を同末端に結合させた融合タンパク質発現ベクターを作製し、時に一過性に発現させた場合、時間が経過してもそれぞれ発現させた融合タンパク質の細胞内における局在を可視化のシグナルが一部共存している様子が観察され、両タンパすることで、一過性及び構成的に発現させた IFN-β の異ク質が TGN 以降共通の経路により輸送されている可能性

なる分泌方向性が細胞内のいずれの部位において生じるかが示唆された（Fig. 7B）。これに対し、融合タンパク質安を詳細に検討した。

定発現細胞に対してマウス IFN-β を一過性に発現させた

発現させた融合タンパク質の細胞内局在について場合では、時間の経過と共に、異なる様式より発現させた

Pam-T 細胞及び MDCK 細胞を用いて検討した結果（Fig.

IFN のそれぞれのシグナルが別々に分布している様子が３）、異なる様式において発現させた IFN-β の分泌方向性観察され、両タンパク質が異なる経路を介して輸送されては異なるにも関わらず、細胞内局在パターンは同様である

いる可能性が示された（Fig. 7A）。

ことが明らかとなった。Pam-T 細胞と MDCK 細胞におい観察に使用した共焦点レーザー顕微鏡の実験条件におけるて細胞内融合タンパク質の局在パターンに違いが生じたの分解能の問題や、カバーグラスとトランスウェルでの培養

は、おそらく、これらの細胞におけるオルガネラの局在パ

条件の違い、生細胞におけるリアルタイムイメージングのターンが異なるためと考えられる。

必要性などはデータ解釈の際に留意するべき点ではある

また、分泌経路に関わるオルガネラを免疫染色し、発現が、得られた結果は MDCK 細胞において安定及び一過性させた HuIFNβ-GFP と細胞内オルガネラとの局在を比較に発現させた IFN-β は、TGN 以降それぞれ異なる経路を検討した。MDCK 細胞を用いて解析した結果、HuIFNβ-GFP

介して輸送される結果、分泌方向性が異なる可能性を示すを安定に発現させた場合及び一過性に発現させた場合のいものである。

ずれにおいても、融合タンパク質は主に TGN/Golgi 体に局在しており、BFA、20℃低温度処理の有無によらず同（引用文献）様であった。よって、MDCK 細胞において発現させた融１） Lau C, Soriano HE, Ledley FD, et al. Retroviral gene

合タンパク質は、分泌方向性が異なっても同様の細胞内局

transfer into the intestinal epithelium. Hum. Gene

在パターンを示したため、異なる様式により発現させたTher. 6, 1145-1151, 1995.

IFN-β は小胞体で生合成後、TGN/Golgi 体まで見かけ上

２） Lozier JN, Yankaskas JR, Ramsey WJ, et al. Gut

選別を受けることなく輸送され、他のタンパク質と同様に

epithelial cells as targets for gene therapy of− 72 −

皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバリーと分泌方向性の制御

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