植物由来環状ペプチド類のチロシナーゼ阻害活性に関する研究
東京薬科大学竹谷薬学部

孝一

We have focused our attention on various naturally occurring cyclic peptides with unique structures andbiological activities, especially tyrosinase inhibitors, from higher plants. As a part of our continuing studies insearch of new bioactive cyclic peptides from higher plants, we have isolated 26 novel cyclic peptides, named
pseudostellarins A - H from the roots of Pseudostellaria heterophylla, dichotomins A - I from the roots of Stellaria
dichotoma var. lanceolata, yunnanins A - F from the roots of Stellaria yunnanensis, and delavayin from the rootsof Stellaria delavayi, all of them belonging to Caryophyllaceae family. Some of them showed tyrosinase inhibitory
and cell growth inhibitory activities. These structures were elucidated by extensive 2D NMR such as COSY,HOHAHA, HMBC, HMQC, phase sensitive NOESY and ROESY spectra, chemical degradation and ESI MS / MS
methods. Also, in order to determine the importance of the specific functional groups for the overall conformationof cyclic heptapeptides, and in an attempt to understand the relationships between chemical composition andthree-dimensional structure, conformational analyses of cyclic peptides, pseudostellarin D (4), yunnanins A (18) andC (20) using X-ray crystallography, high field NMR and MD calculations were undertaken. The dominant solution
conformations of 4, 18 and 20 analyzed by high field NMR and MD calculations employing distance constraints
were homologous to those observed in the solid state.

性を有するアルブチン，コウジ酸などが化粧品な

１ 緒 言

どに利用されている。しかしながら，従来知られ環状ペプチドは抗腫瘍活性，抗菌活性，免疫抑ているチロシナーゼ阻害剤の作用は，十分に満足制活性などの多用な生理活性作用が報告されておされるものではなく，新規構造のチロシナーゼ阻り，医薬品開発の重要な化合物群の一群を築きつ害剤が求められているにもかかわらず，その新素つある。これら環状ペプチド類は海洋生物・菌類

材に関する研究は，国内外を問わず非常に少ないの二次代謝産物の生理活性物質として単離，構造のが現状でり，我々は太子参３〜７）を含め，銀柴決定されていることが多いのに対して，高等植物

胡 Stellaria dichotoma var. lanceolata ８〜 11），千針由来環状ペプチド類の報告例が希であったので，

万線草 Stellaria yunnanensis12 〜 15）および Stellaria

高等植物由来の環状ペプチド類に的を絞り，活性delavayi 16）中の環状ペプチド類の探索研究を行い，物質の単離・構造決定を行ってきている１，２）。こそれぞれより新規環状ペプチドを単離・構造決定の研究過程において，ナデシコ科の漢方生薬であし，pseudostellarins A− H（１−８）, dichotomins

る太子参（Pseudostellaria heterophylla の根）より

A− I（9 − 17）, yunnanins A − F（18− 23）およびチロシナーゼ阻害活性作用を有する環状ペプチド

delavayin A− C（24− 26）と命名した。これらの構

pseudostellarin 類を単離・構造決定することがで造は１，２次元 NMR および ESI MS/MS により決きた。このチロシナーゼ阻害活性は，メラニンの定した。また，これらのコンホメーション解析お生成を抑制して皮膚の美白を保持するので，本活よび生理活性についても検討した。

Studies on the tyrosinase
inhibitors of cyclic compounds
from higher plants
Koichi Takeya
School of Pharmacy, Tokyo
University of Pharmacy & LifeScience

２ 実験・結果
太子参（10kg）を 90％メタノールで加温抽出し，得られた抽出物を n−ブタノール／水で分配した。次いで n−ブタノール画分（167.3g）をドラーゲンドルフ試薬，硫酸試薬を指標に分離・精製− 36 −

植物由来環状ペプチド類のチロシナーゼ阻害活性に関する研究を行った。まず，n−ブタノール可溶画分を Diaion

環状ペプチドの全構造を示し，その構造決定の代表

HP− 20 を用い，溶媒系として水−メタノールのグ的なものとして，
dichotomin A（9），Yunnanin B（19），ラジエント系で分離し，引き続き 80％，100％メタ

Pseudostellarin E（５）について説明する。

ノール画分をシリカゲルカラムクロマト，ODS カ

Dichotomin A（９）は無色針状晶（mp 179 〜

ラムを用いた逆相 HPLC で順次，分離・精製した180℃）として得られ，高分解能 FABMS（m/z結果，８種類の環状ペプチド pseudostellarins A−＋）
により，分子式は C35 H48 N ６O ８681.3652（M＋H）

H（1− 8）を単離した。銀柴胡（8.5kg），千針万線と決定した。Pyridine− d ５中における１H NMR に草（7.0kg）および Stellaria delavayi（10kg）についおいて，６個のアミドプロトン（δ: 8.35，8.60，ても同様の分離・精製手法を用い，メタノール抽

8.79，9.07，9.21，9.97）が， ま た 13 C NMR に出物を順次，分離・精製することにより，それぞおいて，６個のアミドカルボニル（δ: 170.69，，yunnanins A− F（18−れ dichotomins A− I（9− 17）

171.29，172.33，172.39，172.72× ２）由来のシグ23）および delavayins A− C（24− 26）と命名した環ナルが観測されたこと，さらに HMBC スペクト状ペプチドを得た。

ルにおいて，すべてのアミド結合に２J H − C カップ

単離された 26 種の化合物は，赤外吸収スペクリングが観測されたことより，９は Fig. １に示す

トルにおけるアミドカルボニルの吸収や pyridineような環状ペプチドであることが判明し，ROESY− d 5 , DMSO− d6 による H， C NMR の測定からによりその構造を確認した。

１13

得られたスペクトルデータより，ペプチド性化合Yunnanin B（19）は白色粉末として得られ，高物であることが示唆されたため，まず各サンプル＋）により，分解能 FABMS（m/z 639.3114（M＋H）

を常法に従い 6N HCl，110℃で加水分解した後，分子式は C32 H42 N ６O ８と決定した。Pyridine− d ５

アミノ酸分析を行い，含有アミノ酸の組成を決定

中における１H NMR において，６個のアミドプロした。次いで２次元 NMR を用いて各アミノ酸のトン（δ: 8.51，9.04，9.11，9.32，9.34，9.95）が，H,C NMR シグナルを帰属した後，HMBC スペ

また 13 C NMR において，６個のアミドカルボニ

クトルによるロングレンジ相関および NOESY，ル（δ: 170.28，171.44，171.60，172.21，172.75，

ROESY スペクトルによる NOE 相関を解析する

173.80）由来のシグナルが観測されたこと，さらことにより１次構造を決定した。また，各アミに HMBC スペクトルにおいて，すべてのアミドを結合に２J H − C カップリングが観測されたことよ

適用して分析したところ，２種類の異常アミノ

り，19 は Fig. １に示すような環状ヘキサペプチド酸（γ− hydroxy Ile，δ− hydroxy Ile）を除いて，であることが判明した。しかしアミノ酸分析の結

pseudostellarin 類，dichotomin 類，yunnanin 類，果，Gly，Ala，Ser，Phe× ２の５個のアミノ酸のdelavayin 類の構成アミノ酸のいずれもＬ体である存在しか確認されなかったため，残る１残基は異ことが判明した。また，この際アミド結合（CO−常アミノ酸であることが示唆された。残る１残基

NH）との HMBC スペクトルにおけるロングレンの構造は H− H COSY により，NH（δ: 9.04，1H，ジ相関，あるいは連続した異種アミノ酸間におけd）/αH（δ: 4.81，1H，dd）/βH（δ: 2.60，1H，る NOE，ROE 相関の観察，高分解能 FABMS かm）のカップリングシークエンスが観測され，さら決定された分子式などから，同じアミノ酸組成

らに βH は，メチルプロトン γH（δ: 0.91，3H，の直鎖ペプチドに比べ，H ２O が１分子少ないことd）と２組の連続したメチレンプロトン γH（δ:などから，すべて環状ペプチドであると決定した。

1.49，1.95，each 1H，m），δH（δ: 3.80，3.87，

なお，Table １に P. heterophylla, S. dichotoma var

each 1H，m）とカップリングしていることが明ら

lanceolata, S. yunnanensis, S. delavay から得られたかとなった。また，δH が 3.80，3.87 ppm で共鳴

113ノ酸の絶対立体配置の決定には，Marfey 法17）

− 37 −

Table １ Structure of Cyclic Peptides from P. heterophylla. S. dichotoma var lanceolata, S. yunnanensis,
and S. delavayi

Fig. １ Structures of Dichotomin A and Yunnanin B. Dashed arrows show
HMBC correlations and arrows show NOE relationship in pyridine-d 5 .

− 38 −

植物由来環状ペプチド類のチロシナーゼ阻害活性に関する研究していること，FABMS より得られた分子式より，

Gly− Pro− Val− Ile− Phe）と決定した（Fig. ２）。

残る１残基の構造は，Ile の δ 位に水酸基が置換

MS/MS を用いた環状ペプチドの構造決定では，した δ− hydroxy Ile であることが判明した（Fig.

これまでイオン化法として FAB が一般的に用い１）。最終的には HMBC，ROESY より各アミノ酸られてきたが，環状ペプチドをリニア体に変換すのシークエンスを決定し，19 の構造は cyclo（Glyることにより，より緩和なイオン化法である ESI− Ser− δ− hydroxy Ile− Phe− Phe− Ala）であることも構造決定に利用できることが示され，その有用が明らかとなった。

性が認められた。

Pseudostellarin E（５）（白色粉末，m/z 878.5154

続いて環状ペプチド Pseudostellarin D（４），（M＋H），C45 H67 N ９O ９）はアミノ酸分析の結果，Yunnanin A（18），Yunnanin C（20）のコンホメ

Gly× ２，Val，Ile，Leu，Phe，Pro× ３の存在がーション解析について述べるが，天然物および合CDCl３，確認され，引き続き H NMRを測定したが，成品由来の環状ペプチド類の中で，ペンタ，ヘPyridine− d ５, DMSO− d ６, CD ３OD のいずれの溶

キサ，オクタペプチドなどの例は多数知られて媒においてもブロードシグナルを与えたため，構いるが，環状ヘプタペプチドの存在は，Ilamycin

造決定にはイオン化法として ESI を用いたタンデ

B1, Evolidine, Hymenamide 類，Phakellistatin 類，ムマススペクトロメトリー法を適用した。まず，Axinastatin 類，Rhizonin A などの十数例しか知＋１

Pseudostellarin E を α−キモトリプシンで酵素分られておらず，詳細なコンホメーションに関する解し，そのリニア体とした後，ESI MS/MS を行い，知見も十分とはいえない。そこで我々は，単離さ得られたフラグメントピークを詳細に検討するこれた３種類の環状ヘプタペプチド４，18，20 につとにより，その構造を cyclo（Gly− Pro− Pro− Leu−

いて X 線結晶構造解析，NMR および分子動力学+ ion of linear peptide from
Fig. ２ ESI MS/MS fragmentation of m/z 896（M+H）
pseudostellarin E− 39 −（MD）法，モンテカルロ（MC）法などの計算化学により解析し，さらに得られた ROE を制限項と的手法を用いたコンホメーション解析を行った。

して MD，MC 計算を行った。その結果，４およ

まず，化合物４, 18, 20 の単結晶を用いて X 線び 18 では β− turn 構造のサブタイプや β− bulge

結晶解析を行った（Fig. ３）。その結果，X− Pro ペ構造の存在など，結晶中のコンホメーションと類プチド結合を含め，すべてのペプチド結合が trans似性が示された（Fig. ４）。これに対し，20 は結晶ジオメトリーであり，これまでにない特徴的なコ構造において観測された T y r ５NH− Ile ２C ＝ O のンホメーションを有していることが判明した。ま分子内水素結合および Gly ３− Phe ４位の Type II'β

た，Table ２，３に示すように，分子中に２カ所の− turn の存在は示されず，Phe ４− Tyr ５位に Typeβ− turn 構造と分子内水素結合の存在が示された。

I β− turn の存在が示唆されるなど，溶液中のコ

また，４，18 にはそれぞれ Tyr − Gly 位に β−ンホメーションは結晶中と大きく異なることが推bulge 構造が存在することが明らかとなり，コン測された。

２１

ホメーションの類似性が示された（Fig. ３）。

Pseudostellarin 類 にはチロシナーゼ阻害活

また，溶液中のコンホメーションは，NMR（in性 が 観 測 さ れ，そ れ ぞ れ の IC50（mM）値 は，DMSO− d ６）における ROESY 測定，アミドプロpseudostellarins A（１: 131）
，B（２: 187）
，C（３トンの温度依存性実験（300 − 330K）， J NHα ビシ: 63），D（４: 100）
, E（５: 175）
，F（６: 50）
，G（７ナルカップリング定数による二面角 φ の計算など: 75）というものであった。また，その他の活性

３Fig. 3 Computor-generated Crystal Structures of 4 , 18 and 20
Dashed lines show intramolecular hydrogen bonds.

Table ２ β − Turn Forms of 4 , 18 , 20compound4		18		20		

residues
Pro 4 − Leu 5Leu 7 − Gly 1
Gly 4 − Pro 5
Pro 7 − Gly 1
Gly 3 − Phe 4
Pro 7 − Gly 1β− turn form
Type I
Type II
Type II'Type II
Type II'Type II

Table ３ Hydrogen Bonds & Intermolecular Very Short
Contacts of 4 , 18 , 20compound		distance（Å）
		angle（°）
4O3− N6 3.40
O3− N6H 162
O6− N2H 103		
O6− N2 2.93
O6− N3H 150		
O6− N3 3.03
O3− N6H 159
18
O3− N6 3.01
O6− N2H 141		
O6− N2 3.19
O6− N3H 165		
O6− N3 3.02
O6− N2H 151
20
O6− N2 2.77
O2− N5H 143		
O2− N5 2.99
O2− N6H 144		
O2− N6 3.69

− 40 −

植物由来環状ペプチド類のチロシナーゼ阻害活性に関する研究

謝 辞本研究をご支援いただきましたコスメトロジー
研究振興財団に対しまして，厚く御礼申し上げますとともに，本研究を遂行するにあたり，ご助力をいただきました森田博史博士，代田修博士，栢下隆氏に深謝いたします。
引用文献
１）Itokawa, H. and Takeya, K., Antitumor
Substances from Higher Plants, Heterocycles 35,1467 - 1501（1993）.
Fig. ４ Superimposed Structures of Crystal State of 14and Its Energetically Stable Conformers by MD/MMand MC/MM Simulations２）Itokawa, H., Takeya, K., Hitotsuyanagi, Y. andとして，P388 培養細胞に対する細胞増殖阻害活３）Morita, H., Kayashita, T., Kobata, H., Gonda, A.,性を検討したところ，それぞれの IC50（mg/mL）

Takeya, K. and Itokawa, H., Pseudostellarins D

値は，dichotomins A（９: 2.5）
，B（10 : 3.5）
，C- F, New Tyrosinase Inhibitory Cyclic Peptides（11:5.0），E（13: 3.0）
，yunnanin C（20: 2.2）であり，

from Pseudostellaria heterophylla, Tetrahedron

dichotomin D（12）にはシクロオキシゲナーゼ阻害

50, 9975-9982（1994）.

活性が認められた。

Morita, H., Macrocyclic Peptide Alkaloids fromPlants, The Alkaloids 49, 301 - 387（1997）.

４）Morita, H., Kayashita, T., Kobata, H., Gonda, A.,Takeya, K. and Itokawa, H., Pseudostellarins A

3 考 察- C, New Tyrosinase Inhibitory Cyclic Peptides

高等植物より単離・構造決定した環状ペプチド

from Pseudostellaria heterophylla, Tetrahedronにチロシナーゼ阻害活性を見出し，漢方生薬の50, 6797-6804（1994）.

太子参（Pseudostellaria heterophylla の根）の環状５）Morita, H., Kayashita, T., Takeya, K. and Itokawa,ペプチド pseudostellarin A− G にチロシナーゼ阻

H., Conformational Analysis of a Tyrosinase

害活性を認めた。近縁植物である銀柴胡 Stellaria

Inhibitory Cyclic Pentapeptide, Pseudostellarin A,

dichotoma var. lanceolata，千針万線草 Stellaria

from Pseudostellaria heterophylla, Tetrahedron

yunnanensis および Stellaria delavayi 中にも環状ペ50, 12599-12608（1994）.

プチド類を見出し，同様のチロシナーゼ阻害活性

６）Morita, H., Kobata, H., Takeya, K. andを期待している。また，これら環状ペプチド類のItokawa, H., Pseudostellarin G, A New

構造とコンホメーションとチロシナーゼ阻害活性

Tyrosinase Inhibitory Cyclic Octapeptide fromとの関連研究を進めているが，結論を得ていない

Pseudostellaria heterophylla, Tetrahedron Lett.のが現実であるが，環状ペプチド類は，新規タイ35, 3563-3564（1994）.

プのチロシナーゼ阻害活性物質であり，リード化

７）Morita, H., Kayashita, T., Takeya, K. and合物として今後，期待される化合物であると考え

Itokawa, H., Cyclic Peptides from Higher Plants,

る。

Part 15. Pseudostellarin H, A New Cyclic
Octapeptide from Pseudostellaria heterophylla, J.
Nat. Prod. 58, 943 - 947（1995）.

− 41 −８）Morita, H., Kayashita, T., Shishido, A., Takeya, K.,（1994）.

Itokawa, H. and Shiro, M., Dichotomin A, A New

13）Morita, H., Kayashita, T., Shimomura, M.,

Cyclic Hexapeptide from Stellaria dichotoma L.

Takeya, K. and Itokawa, H., Cyclic Peptides

var. lanceolata Bge., Bioorg.Med.Chem.Lett. 5,from Higher Plants. Part30. Three Novel Cyclic

2353 - 2356（1995）.

Peptides, Yunnanins D, E and F from Stellaria

９）Morita, H., Kayashita, T., Shishido, A., Takeya,yunnanensis, Heterocycles 43, 1279-1286（1996）.

K., Itokawa, H. and Shiro, M., Dichotomins A - E,14）Morita, H., Kayashita, T., Shimomura, M.,

New Cyclic Peptides from Stellaria dichotoma L.

Takeya, K. and Itokawa, H., Cyclic Peptides

var. lanceolata Bge., Tetrahedron 52, 1165-1176

from Higher Plants. Part 30. Three Novel Cyclic（1996）.

Peptides, Yunnanins D, E and F from Stellaria

10）Morita, H., Shishido, A., Kayashita, T., Takeya,

yunnanensis, Heterocycles 43, 1279-1286（1996）.

K. and Itokawa, H., Cyclic peptides from higher15）Morita, H., Kayashita, T., Shimomura, M.,

plants. 39. Dichotomins F and G, cyclic peptides

Takeya, K. and Itokawa, H., Cyclic Peptides fromfrom Stellaria dichotoma var. lanceolata, J. Nat.

Higher Plants. 24. Yunnanin C, a Novel Cyclic

Prod. 60, 404 - 407（1997）.

Heptapeptide from Stellaria yunnanensis, J. Nat.

11）Morita, H., Takeya, K. and Itokawa, H., Cyclic
Octapeptides from Stellaria dichotoma var.

Prod. 59, 280-282（1996）.
16）Morita, H., Kayashita, T., Uchida, A., Takeya,

lanceolata, Phytochemistry 45, 841 - 845（1997）.

K. and Itokawa, H., Cyclic peptides from higher12）Morita, H., Shishido, A., Kayashita, T.,

plants. 33. Delavayins A-C, three new cyclic

Shimomura, M., Takeya, K. and Itokawa, H.,

peptides from Stellaria delavayi, J. Nat. Prod. 60,

Two Novel Cyclic Peptides, Yunnamins A and B

212 - 215（1997）.

from Stellaria yunnanensis, Chem.Lett. 2415-2418− 42 −