物質保持能を制御できるコラーゲン擬似分子の作製

大阪府立大学 21 世紀科学研究機構ナノ科学・材料研究センター

児島千恵

Collagen is the most abundant protein in mammals, and it is composed of glycine-proline-(hydroxy)proline (GlyPro-Pro(Hyp)) repeats to form a triple helix. It has been used as a biomaterial. For example, collagen gels are useful for
long-term slow release in drug delivery applications. However, the release from collagen gels is generally uncontrollable.
Therefore, functional collagen materials capable of controlled release are desired. Artificial collagen materials have beenstudied as an alternative to natural collagens extracted from animals, because natural collagens can be contaminated with
infectious pathogens and allergens. However, short collagen peptides cannot form a triple helix, which limits the preparation.
Dendrimers have highly controllable sizes, topologies and surface properties, quite different from linear polymers. We havereported that polyethylene glycol (PEG)-attached dendrimers are a potential drug carrier. In addition, dendrimers were used
as a knot, whose terminal groups were modified with collagen model peptides to induce the triple helical structures.
In this study, a collagen model peptide ((Pro-Pro-Gly)5)-attached dendrimer was synthesized as a potential functional
collagen material. The peptides which clustered at the surface of the dendrimer formed a collagen-like triple helix.
Interestingly, the helical structures were thermally reversible, different from a natural collagen. For the biomedical
applications, the thermal stability of the triple helical structure in the collagen-mimic dendrimer remains to be improved.
Various collagen-mimic dendrimers were prepared by using different generation dendrimers and a longer collagen model
peptide, (Pro-Pro-Gly)10. The peptide length much affected the triple helical structures, but the dendrimer generation did
not. The peptide binding ratio slightly affected it. These results suggest that the peptide length and the peptide density were
influenced on the triple helix formation. Interestingly, the (Pro-Pro-Gly)10-modified dendrimer assembled below 40°C and theassembly was dissolved by heating. On the other hand, the (Pro-Pro-Gly)5-modified dendrimer did not. The hydrogels using
these collagen-mimic dendrimers were prepared. Even though the (Pro-Pro-Gly)5-modified dendrimers formed the hydrogels
by cooling only in the presence of ethanol and sodium sulfate, the (Pro-Pro-Gly)10-modified dendrimer could in the absenceof any additives. In addition, the hydrogel was dissolved at 45°C. Therefore, this kind of collagen-mimic material is usefulfor drug delivery system and regenerative medicine.

１．緒

して内包物質を放出するシステムが有効である。しかし、

言

現在のところ刺激応答性のコラーゲン（ゼラチン）ゲルのコラーゲンは細胞外基質に多く含まれる分子量約 10 万開発には至っていない。

の棒状蛋白質であり、生体材料として有用である。コラー

一方、著者らはこれまでにデンドリマーを薬物運搬体とゲンには繰り返し配列があることが知られており、グリシ

して利用したドラッグデリバリーシステムの研究を行ってン - プロリン - プロリンの繰り返しペプチドはコラーゲン

きた。デンドリマーは樹状構造をとる合成高分子であり、モデルペプチドとしてよく用いられている。このような繰

重合ではなく有機合成によって分子鎖を分岐させながら成り返し配列によってコラーゲンは三重へリックス構造を形長させていくため、段階的に分子量（世代数）を増加させ成し、さらに、それらが会合することによってゲル化するることができる。デンドリマーは分子量が単一であるだけ

ことが知られている。一方、コラーゲンが熱変性したゼラ

でなく、表面には多数の反応性官能基を、内部には低分子

チンも分子間で見られる三重へリックス構造が架橋点となを保持できる空間を有するため、ペプチドの担体や薬物運ってゲルを生成する。
このようなゲルには、
水とともに様々搬体として有用である。筆者らはこれまでに、デンドリマ

な生理活性物質が保持されるため、長期間の徐放化材料とーに抗がん剤などを内包して薬物運搬体として利用したり、して医薬品および化粧品の分野で既に多くの研究されてき様々な刺激応答性部位を付与することで刺激応答性デンド

た。しかし、保持された生理活性物質の効果を最大限に発リマーの作製を行ってきた 1−5）。本研究では、薬物保持能現するためには、単なる徐放ではなく何らかの刺激に応答を有するデンドリマーを用いて、薬物の放出を制御することのできる新規コラーゲン擬似分子の作製を行った。そこ

Preparation of Collagen-Mimic Compounds
Capable of Controlled Release
Chie Kojima
Nanoscience and Nanotechnology
Research Center, Research Organization
for the 21st Century, Osaka Prefecture
University

で、コラーゲンでみられるグリシン - プロリン - プロリン
（Gly-Pro-Pro（GPP））の繰り返しペプチドと、ペプチド担体および薬物運搬体であるデンドリマーからなる分子を設計した。コラーゲンの三重へリックスは温度によってその形成性が変化することが知られているため、このデンドリ
マーでは温度による内包物質の放出制御が可能であると考− 52 −

物質保持能を制御できるコラーゲン擬似分子の作製えられる。また、デンドリマーの薬物保持能を利用したハ10 mg/ml）を調製し、それぞれ 400 μ l に 0.5M ホウ酸緩衝

イドロゲルも作製できると考えられる（図１）。本研究では、水溶液（pH 8.5）を 3.6ml に加えた。その後それぞれにフル

まず（Pro-Pro-Gly）（PPG5）
をポリアミドアミン（PAMAM）
5

オレスカミンの アセトン溶液（0.3mg/ml）を 200 μl ずつ加

デンドリマー（第４世代）と結合させたコラーゲン擬似デえ、 ボ ル テ ッ ク ス し た。 分 光 蛍 光 光 度 計（FP-6200,

ンドリマーを合成した。そして、その高次構造と温度依存

JASCO）を用いて、励起波長 390nm、蛍光波長 479nm で性について検討した。次に、上記コラーゲン擬似デンドリ

蛍 光 強 度 を 測 定 し た。 ア ミ ン 濃 度 が 0, 20, 50, 100, 150,

マーにおけるコラーゲン様の高次構造の改善のため、様々

200 μM のデンドリマー水溶液を用いて同様の操作を行い、な世代数の PAMAM デンドリマーを用いてコラーゲン擬

検量線を作成した。

似デンドリマーの合成を行い、その高次構造の解析を行った。また、長鎖の（Pro-Pro-Gly）10（PPG10）を用いたコラ

2. 3

コラーゲン擬似デンドリマーの高次構造の解析

ーゲン擬似デンドリマーも合成し、その高次構造を解析し各サンプルの水溶液（0.04 mg/ml）を調製し、4 ℃で 24 時た。そして、そのコラーゲン擬似デンドリマーの会合体に間以上インキュベーション後、円二色性分散計（J-820,

ついても検討した。さらに、コラーゲン擬似デンドリマー

JASCO）を用いて 20℃、260−190 nm で測定を行った。温のハイドロゲルの形成性について検討した。

度変化測定は、上記と同様にサンプル調製し、4℃で上記

２．実
2. 1

と同様の波長で測定した後、10℃から 70℃まで 5 ℃毎に昇

験

温、続いて降温し、CD スペクトル測定を行った。なお、コラーゲン擬似デンドリマーの合成

各温度では 15 分間保持した後に測定を行った。温度の調

市販のコラーゲンペプチド PPG5 および PPG10 を無水酢

整にはペルチェホルダ（PTC-432L, JASCO）を用いた。

酸でアセチル化した。次に、PPG5 に関しては縮合剤 o-（7-Ｘ線粉末回折法（XRD）は MiniFlexII（リガク社製）を

azabenzotriazol-1-yl）-1,1,3,3-tetramethyluronium

用い、30kV, 15mA の出力で CuKa 線を使用して行った。

hexafluorophosphate（HATU）と 補 助 剤、1-Hydroxy-7azabenzotriazole（HOAt）を 用 い て ポ リ ア ミ ド ア ミ ン

2. 4

PPG10-G4 の会合体の解析（PAMAM）デンドリマー（第１世代から第５世代、G1-

示差走査熱量測定（DSC）は Nano-DSC II（CalorimetryG5）と反応させ、世代数の異なるコラーゲンデンドリマー

Science 社製）を用いて、１mg/ml のサンプル溶液を 5 ℃

を 合 成 し た（PPG5-G1; PPG5-G2; PPG5-G3; PPG5-G4;から 90℃の範囲で測定した。

PPG5-G5）。また、PAMAM デンドリマー（G4）に対して

透過型電子顕微鏡（TEM）解析では、まず 10mg/ml の反応の仕込み比を調製することで、様々なペプチド結合数

サンプル溶液を室温でグリッドに滴下し、２% リンタングの コ ラ ー ゲ ン デ ン ド リ マ ー を 合 成 し た（
（PPG5）
0.3-G4;

ステン酸水溶液によってネガティブ染色し、試料を調製し（PPG5）。一方、PPG10 に関しては縮0.5 -G4;（PPG5）
0.8 - G4）た。そして、JEOL2000（JEOL）を用いて、200 kV の条件

合剤4（4,6-dimethoxy-1,
3, 5-triazin-2-yl）-4-methylmorpholinium

で観察した。

chloride（DMT-MM）を用いて PAMAM デンドリマー（G4）と温度変化透過率測定は１mg/ml の水溶液を 4 ℃で 12 時
間 以 上 保 持 し た 後、313nm に お け る 透 過 率 を JASCO反応させた（PPG10-G4）。

V-630 を用いて測定した。温度は 1℃/min で変化させた。

2. 2
1

コラーゲン擬似デンドリマーの同定

H NMR は JEOL JNM-LA400（JEOL）を用いて行った。

2. 5

ハイドロゲルの作製

フルオレスカミンによるアミンの定量は以下のように行

15 wt% の PPG10-G4 および PPG10 の水溶液を調製し、4った。適当な濃度のコラーゲンデンドリマー水溶液（5 ～℃で 12 時間以上保持した。その後、ステンレスボールをFig. 1 Design of collagen-mimic dendrimers and application.

− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

上に加え、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃で順にそ

世代数やペプチド結合率の異なる様々なコラーゲンデンドリ

れぞれ 15 分間インキュベーションした後に写真を撮影しマーを合成し、その高次構造形成性について評価した。

た。ボールが溶液の上もしくは中にある状態をゲル、チュ

3. 2. 1

マー世代数の効果

ーブの底に沈んだ状態をゾルとした。

３．結
3. 1

PPG5 を結合したデンドリマーにおけるデンドリ

G1 から G5 の PAMAM デンドリマーを原料として用い、

果

図２と同様の方法でコラーゲンデンドリマーを合成した。

PPG5 を結合した PAMAM（G4）デンドリマー

合成した化合物の 1H NMR スペクトルおよびフルオレス

合成スキームを図２に示す。PPG5 をアセチル化した後カミンアッセイにより、デンドリマーに結合したコラーゲに、G4 の PAMAM デンドリマーのアミン末端と結合させンモデルペプチド数を定量した結果を表１に示す。デンド

た。得られた化合物の 1H NMR スペクトルおよびフルオレ

リマーの末端数とペプチド結合数がほぼ一致すること、デスカミンによる残存アミンの定量を行った。その結果より、

ンドリマーにおける未反応アミン数がほとんど検出されな

デンドリマーのほぼ全ての末端にペプチド鎖が結合していかったことから、いずれのデンドリマーでもほぼ全ての末

ることがわかった。次に、このコラーゲン擬似デンドリマ

端にペプチド鎖が結合していることがわかった。

ーの CD スペクトル測定を行った。コラーゲンの三重ヘリ

これらのコラーゲンデンドリマーの CD スペクトル測定を

ックスでは 225 nm 付近に正の極大が見られることが知ら行った結果を図３に示す。いずれのコラーゲンデンドリマ

れている。コラーゲンデンドリマーの CD スペクトルではーでも 225 nm 付近にコラーゲン特有の正の極大を示すス

コラーゲン特有のパターンが見られたことから、コラーゲ

ペクトルが得られた。しかし、そのパターンはデンドリマ

ンデンドリマーではコラーゲン様の三重ヘリックスが形成ーの世代によっては差異が見られなかったことから、デンすることを明らかにした。ペプチド単独では特徴的なコラ

ドリマー世代数はヘリックス形成性に影響を与えないこと

ーゲンの CD スペクトルが見られなかったことから、デンがわかった。

ドリマー表面におけるペプチド集積が三重ヘリックス形成

3. 2. 2

PPG5 を結合したデンドリマーにおけるペプチド結

合率の効果

6）

性を惹起することが示唆された 。また、XRD の結果から、コラーゲンデンドリマーにおいてコラーゲン三重ヘリック

アセチル化した PPG5 と G4 の PAMAM デンドリマーをスのパッキングとピッチに起因するシグナルがみられた。

原料として用い、様々な比で反応させることにより、ペプ

このことからも、デンドリマーで見られる高次構造がコラ

チド結合率の異なるコラーゲンデンドリマーを合成した。

ーゲン様の三重ヘリックスであることがわかった。このコ合成した化合物の 1H NMR スペクトルによりデンドリマ

ラーゲンデンドリマーを用いてハイドロゲル形成を行った

ーに結合したコラーゲンモデルペプチド数を定量した結果

ところ、15 wt%、かつ、エタノールと硫酸ナトリウム共存を表１に示す。これより、反応の仕込み比に依存してデン

6）下においてのみ、ハイドロゲルが形成した 。

ドリマーの末端に様々な含率でペプチド鎖が結合したことがわかった。

3. 2

PPG5 を結合した PAMAM デンドリマーにおける高次構造形成性の改善

これらのコラーゲンデンドリマーの CD スペクトル測定

7）

上記のコラーゲンデンドリマー（PPG5-G4）ではコラーゲン
様の三重ヘリックス形成が見られたが、その形成性は天然のコラーゲンと比べると低かった。次に三重ヘリックス形成性の向上のために、デンドリマーの構造に着目して、コラーゲ
ンデンドリマーの改善を行った。すなわち、デンドリマーのFig. 2 Synthetic scheme of collagen-mimic dendrimers.

Fig. 3 CD Spectra of PPG5-Gn and Ac-PPG5 in H2O（20℃,
0.04mg/ml）− 54 −

物質保持能を制御できるコラーゲン擬似分子の作製を行った結果を図４に示す。ペプチド結合率の異なるコラ

カミンアッセイによりデンドリマーのほぼ全ての末端にペーゲンデンドリマーでは、末端の 83％にペプチドが結合

プチド鎖が結合していることがわかった。このコラーゲン

したデンドリマーが最も高いモル楕円率を示した。これは、デンドリマーの CD スペクトル測定においてコラーゲン特

コラーゲンペプチドが三重ヘリックス構造を形成するため有のパターンが見られたことから、コラーゲンデンドリマには、ペプチド鎖の密度が重要であることを示唆している。

ーではコラーゲン様の三重ヘリックスが形成することが明以上より、コラーゲン様の三重ヘリックス構造の形成はコらかとなった。またこの Rpn 値は 0.13 となり、天然コラー

ラーゲンペプチドの集積化によって誘起されていると考えゲンに匹敵するものとなった。さらに、XRD の結果からられる。コラーゲンの三重ヘリックス形成性を示す指標ともデンドリマーで見られる高次構造がコラーゲン様の三重

して Rpn 値がある。これは 225 nm 付近の正の極大ピーク

ヘリックスであることがわかった。

と 200 nm 付近の負の極大ピークの比である 8）。天然コラ

次に、コラーゲンデンドリマーの三重ヘリックスの温度

ーゲンが 0.11 であったのに対して、PPG5 デンドリマーで応答性について検討した。PPG5 ではモル楕円率が加温に最も効率の高かった（PPG5）
0.8 -G4 では 0.06 であった。しよって徐々に減少するのに対して、PPG10 では、ペプチ

たがって、その三重ヘリックス形成性は依然として低調な

ド単独およびコラーゲンデンドリマーのいずれにおいても、ままであり、コラーゲンデンドリマーのさらなる改善が必ある温度付近で著しいモル楕円率の減少（転移）が見られ要である。

た。また、ペプチド単独では 33℃付近で転移したのに対

3. 3

PPG10 を結合した PAMAM（G4）デンドリマー

9）

してコラーゲンデンドリマーでは 40℃および 65℃で転移がみられたことから、デンドリマーに結合させることで転3. 2 において PPG5 を結合したコラーゲンデンドリマー

移点が高温になることがわかった。これは、デンドリマー

では、結合率を変化させることで僅かに高次構造形成性が表層における三重ヘリックス構造の安定化を示唆している。

向上したものの、著しい高次構造形成性の向上はみられな

DSC からもこの熱転移を支持する結果が得られた。

かった。次に、高次構造形成性の改善を目的としてペプチ

コラーゲンはゲル化に際して会合体を形成することが知ドの鎖長に着目した。PPG5 は PPG2 と比べて三重ヘリッられている。そこで、本研究ではコラーゲンデンドリマー

クス構造の形成性が著しく向上することを既に報告していの会合挙動について検討した。水溶液の濁度について測定る 6）。そこで、より鎖長の長い PPG10 を G4 デンドリマー

したところ、1 mg/ml においてコラーゲンデンドリマーはに結合させたデンドリマーを作製し、その高次構造形成性

低温で白濁しており、40℃付近で濁度が解消する現象が見について検討した。

られた。この温度は CD における一段階目の転移点と一致

まず、図２に示すように、PPG10 をアセチル化した後に、している。コラーゲンデンドリマーは低温条件では会合体

G4 の PAMAM デンドリマーのアミン末端と結合させた。

を形成しており、高温にすると会合体が崩壊することが示

ペプチドの溶解性の問題により、デンドリマーとの縮合反唆された。

応も水中で行い、縮合剤は水溶性の DMT-MM を用いた。

このような温度に応答した会合特性を利用することによ得られた化合物の 1H NMR スペクトルおよびフルオレスってハイドロゲルの作製を行った。PPG5 デンドリマー、

Table 1 Characterization of collagen-mimic dendrimers.

Fig. 4 CD Spectra of（PPG5）n-G4 in H2O（20℃ , 0.04 mg/ml）− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

PPG10 ペプチドでは水溶液中でゲル化しなかったのに対マーの作製を行ってきた。そして、デンドリマーの世代数

して、PPG10 デンドリマーではゲル化することがわかっや結合数よりも、ペプチド鎖長を改善することで、天然のた。得られた PPG10 デンドリマーゲルでは低温ではゲル

コラーゲンに近い性質を示すコラーゲンデンドリマーの作で、45℃以上に加温するとゾル化することがわかった。こ製に成功した。このようなコラーゲン擬似分子は、次世代の温度応答性はコラーゲンの熱変性体であるゼラチンゲルのコラーゲン（ゼラチン）材料として、医薬品や化粧品なと類似の性質であり、PPG10 デンドリマーは人工ゼラチ

どに応用可能であり、新規素材として大いに有用である。

ン材料として応用することができる。

また、この手法を用いることにより、古典的な蛋白質であ４．考るにもかかわらず機能が完全には解明されていないコラー察

ゲンの生理活性の解析にもつながると期待される。

本研究では、物質保持能を有するデンドリマーとコラー

本研究成果は３つの学術論文にまとめ、2009年にJ. Am. Chem.

ゲンモデルペプチドを用いて、様々なコラーゲンデンドリ

Soc. 誌、2010 年 にBiopolymers 誌、2011 年 にBiopolymers

マーの作製を行ってきた。そして、PPG5 および PPG10 を誌に掲載された 6, 7, 9）。

結合させたコラーゲンデンドリマーでは、１）コラーゲン

本研究は大阪府立大学大学院工学研究科応用化学分野の様の三重ヘリックス構造をとること、２）その三重ヘリッ河野健司教授、原田敦史准教授にご指導いただき、卒業生

クス形成性は温度に依存することを明らかにしてきた。この津村清子さん（現在、サクラクレパス勤務）、末廣智幸君の温度応答性を利用することで、温度に応答した薬物送達（現在宇部興産勤務）に協力いただいて、遂行しました。

を実現することが可能となる。デンドリマーは様々な薬物

また、DSC 測定では京都工芸繊維大学の田中直毅先生に、を保持することができるため、本研究で作製するコラーゲ

XRD 測定では大阪府立大学の中平敦先生に、XRD 解析でンデンドリマーは温度応答性薬物送達における薬物運搬体

は東京大学の本郷千鶴博士にご協力いただきました。こことして有用である。我々は、モデル薬物としてローズベンに深謝いたします。最後に、本研究を遂行するにあたり、

ガルを用いて、その薬物放出の温度依存性についても検討

研究助成をいただいたコスメトロジー研究振興財団に深くした。その結果、ヘリックスが解裂する高温条件下では薬感謝いたします。

6）

物の保持能が低減することを明らかにしてきた 。コラー
ゲンデンドリマーの応答温度を調節することができれば、（引用文献）

生体内で利用できる新規温度応答性薬物運搬体として利用

１）Kojima C, Kono K, Maruyama K, et al, :Synthesisof polyamidoamine dendrimers having polyethylene

することが可能である。

glycol grafts and their ability to encapsulate anticancer

本研究ではハイドロゲル形成についても検討した。生体

drugs, Bioconjugate Chem., 11, 910-917, 2000.

に応用するためには、37℃で安定なハイドロゲルを作製する必要がある。PPG10 デンドリマーでは上記の条件を満

２）Haba Y, Kojima C, Harada A, et al, :Preparation

たしていることから、バイオマテリアルとして応用するこof poly(ethylene glycol)-modified poly(amidoamine)とが可能である。コラーゲンの熱変性体であるゼラチンはdendrimers encapsulating gold nanoparticles and their

30℃付近でゾル化するため、生体内でゲルとして利用する

heat-generating ability, Langmuir, 23, 5243-5246, 2007.

ためには架橋が必要である。一方、本研究のコラーゲンデ

３）Haba Y, Kojima C, Harada A, et al, :Comparison of

ンドリマーでは架橋剤の添加を行うことなく体温付近でのthermosensitive properties between poly(amidoamine)

ゲル作製が可能であった。また、加温によってゾル化する

dendrimers having peripheral N-isopropylamide groups

ため、温度応答性薬物送達に応用することもできる。このand linear polymers with the same groups, Angew.
Chem. Int. Ed., 46, 234-237, 2007.

ようなハイドロゲルは温度応答性薬物送達だけでなく、再４）Kono K, Kojima C, Hayashi N, et al, :Preparation

生医療などへの展開も可能となる。

and cytotoxic activity of poly(ethylene glycol)-modified

コラーゲン様の高次構造はペプチド鎖長だけでなく、その配列にも大きく依存することが知られている

poly(amidoamine) dendrimers bearing adriamycin,

10）

。様々な

Biomaterials, 29, 1664-1675, 2008.

配列でのコラーゲン擬似分子を作製すれば、様々な用途に適した人工コラーゲン材料の設計・作製することが可能と

５）Kojima C, :Design of stimuli-responsive dendrimers,
Expert Opinion on Drug Delivery, 7, 307-319, 2010.

なるため、今後の研究の展開が期待される。

５．総

６）Kojima C, Tsumura S, Harada A, et al, :A collagen-括mimic dendrimer capable of controlled release, J. Am.
Chem. Soc., 131, 6052-6053, 2009.

本研究では、物質保持能を有するデンドリマーとコラー
ゲンモデルペプチドを用いて、様々なコラーゲンデンドリ

７）Suehiro T, Kojima C, Tsumura S, et al, :Higher order− 56 −

物質保持能を制御できるコラーゲン擬似分子の作製

structure of short collagen model peptides attached to９）Suehiro T, Tada T, Waku T, et al, :Temperature-

dendrimers and linear polymers, Biopolymers, 93, 640-

dependent higher order structures of the (Pro-Pro-

648, 2010.

Gly)10-modified dendrimer", Biopolymers, 95, 270-277,

８）Khew SK. Yang QJ, Tong YW, :Enzymatically

2011.

crosslinked collagen-mimetic dendrimers that promote10）Koide T, :Triple Helical Collagen-Like Peptides:

integrin- targeted cell adhesion, Biomaterials, 29, 3034-

Engineering and Applications in Matrix Biology,

3045, 2008.

Connective Tissue Res., 46, 131-141, 2005.

− 57 −