食用乳酸菌による化粧品素材としての機能性多糖の生産とその改質

谷

新潟大学

工学部

口正之

Effect of co-existence of yeast cells on production of extracellular polysaccharide, (Kefiran) by Lactobacillus
kefiranofaciens was investigated on the basis of the assumption of interaction between the yeast cells andthe lactic acid bacterium in kefir grains. In the single culture of L. kefiranofaciens, not only the addition ofyeast extract to the medium but also controlling the pH of the culture at 5.5 resulted in significant increase inamount of Kefiran produced. Since the yeast cells are considered to produce carbon dioxide and ethanol in kefirgrains, the influences of aeration of gas containing carbon dioxide and addition of ethanol to the medium onKefiran production by L. kefiranofaciens alone were also studied. The optimal gas composition for producing
Kefiran was found to be N２ : CO ２ = 9:1. By supplying ethanol at a concentration of 10 g/L, the amount of
Kefiran produced was enhanced. Partially purified Kefiran was prepared from culture supernatant by ethanol
precipitation, followed by anion-exchange chromatography. Gel filtration analysis indicated that the averagemolecular weight of partially purified Kefiran was several millions Da.

１ 緒 言
ケフィール粒は、図１に示すような、ケフィラン生産菌であるホモ型乳酸長桿菌 Lactobacillus
kefiranofaciens と ヘ テ ロ 型 乳 酸 短 桿 菌
Lactobacillus kefir などの乳酸菌と、乳糖発酵性および乳糖非発酵性の酵母などの複数の微生物から形成されている １）。その中で多糖ケ

図１

フィランを主に生産しているのは、乳酸桿菌 L.

ケフィール粒における微生物間の相互作用

kefiranofaciens であることが既に報告されている２）。

〜４単位連結した部分にケフィロヘプタオース

これらの乳酸菌と酵母の間には、栄養源のやり取が１単位組込まれた基本構造の繰り返しからでりや生育環境に関して相互作用や共生関係が存きており、その分子量は約 100 万台であることが在すると推定されている。すなわち、乳酸菌は乳報告されている３）。ケフィールから得られるケフ糖を分解し、ガラクトースを乳糖非発酵性酵母に

ィール粒あるいは多糖ケフィランは抗腫瘍活性、提供し、酵母は乳糖発酵性酵母も含めてエタノー抗血栓作用などの生理活性を示すことから、医療ルや二酸化炭素を生成して、乳酸菌の生育に適し分野において利用すること、またケフィランの水た環境に整えていると考えられている。

溶液が強い粘性を有することから、食品用の増粘多糖ケフィランは、ケフィロヘキサオースを３
Production of Functional Polysaccharide
as a Cosmetic Material by a
Lactic Acid Bacterium for Food
Processing and Modification of the
Polysaccharide.

剤、安定化剤などとして利用することが考えられている。
筆者らは、これまでにセラミックフィルタ−や合成高分子膜を濾材として用いて代謝産物の除去と新鮮培地の供給が連続的にできる濾過培

Masayuki Taniguti

養システムを完成し、この膜濾過培養方式が種々

Niigata Universityの乳酸菌の高濃度培養および有用代謝産物の効− 27 −

率的生産に適用できる実用的な生産法であるこ
４−８）

ケフィラン溶液に再び等量のエタノールを添加。すなわち、Ａ）発酵乳製して、再沈殿させ、再び遠心分離によって回収し品のスタ−タ−としてのホモ乳酸菌およびビフた。この操作を合計３回繰り返して、粗ケフィラ

ィズス菌の生産、Ｂ）耐塩性乳酸菌の高濃度かつンを部分精製しながら回収した。とを報告してきた

高速生産、Ｃ）Lactococcus lactis によるペプチド

粗ケフィラン溶液中の全糖をフィノール・硫酸性抗生物質ナイシンの連続生産、Ｄ）Lactococcus

法によって測定し、培養液中の粗ケフィラン濃度

lactis による抗菌性を有する発酵フレ−バ−の生を算出した。

産、Ｅ）ビフィズス菌を用いた安全な食品保存用抗菌剤の生産などについて報告してきた。
そこで、

２. ４ ケフィランの精製

本研究では、多くの分野において利用可能な機能回収した多糖溶液を精製するために陰イオン性多糖であるケフィランを、化粧品用の保水剤、交換クロマトグラフィーを行った。陰イオン交潤滑剤などとして利用することを目的として、食換クロマトグラフィーには、DEAE − Toyopearl

用乳酸菌による機能性多糖ケフィランの生産を650 M（東ソー㈱）を担体として用いた。その担中心に検討した。

体は、0 . 02 M Tris − HCl 緩衝液（pH 8 . 8）で平衡化した後に使用した。溶出液をフラクションコレ

２ 実 験

クターにより 10 . 0 mL ずつ採取し、タンパク量を２. １ ケフィラン生産菌とその培養培地

280 nm における吸光度によって、全糖量をフェ

本研究では、予備的な検討の結果、Lactobacills

ノール・硫酸法によってそれぞれ測定した。

kefiranofaciens JCM 6985 をケフィラン生産菌として用いた。本菌はラクトースを炭素源とした

２. ５ ケフィランの分子量測定

MRS 培地を用いて、培養温度を 30℃として培養した。

エタノール沈殿によって回収した多糖溶液および陰イオン交換クロマトグラフィーより得られた成分について分子量を測定した。分子量は、２. ２ 培養方法カラム（Asahipak GS − 710）を用いた高速液体ク

本研究では、乳酸桿菌 L. kefiranofaciens によ

ロマトグラフィーによって測定した。検出器は示るケフィラン生産に対する酵母の存在の影響を差屈折計を使用した。分子量マーカーとしてプル３つの因子に分けて検討した。すなわち、１）酵ラン標準品を用いた。

母エキスの添加の効果、２）酵母の生育によって発生する二酸化炭素の通気の効果、および３）酵２. ６ 培地成分の分析
培養液中のラクトース濃度は、示差屈折計を検母によって生成するエタノールの添加の効果に出器とした高速液体クロマトグラフィーを用いついて検討した。て測定した。また、培養液中の乳酸濃度は、電気
２. ３ ケフィランの回収伝導度検出器を備えた有機酸分析システムを用

培養液を回収した後、遠心分離によって菌体をいて測定した。

除去した。得られた上澄液中の粗ケフィランは、３ 結果と考察上澄液と等量のエタノールを添加することによって沈殿させた。沈殿した粗ケフィランは遠心分

３. １ 酵母エキスの影響離によって回収した。回収した粗ケフィランは、図２は、L. kefiranofaciens によるケフィラン

培養液の 1 / 10 容量の蒸留水に溶解した。この粗生産に対する酵母エキスの添加濃度の影響を示− 28 −

食用乳酸菌による化粧品素材としての機能性多糖の生産とその改質

図２

図３

酵母エキスの影響

気ガス組成の影響す。これらの培養おいて、初期ラクトース濃度はエキスを５g/L 添加した場合に、2 . 5 g/L とした

50 g/L、通気するガスの組成はＮ２対 CO ２を９対場合に比べて増加した。したがって、５g/L 程度１とし、その混合ガスを 0 . 3 vvm になるようにの酵母エキスは L. kefiranofaciens の増殖とケフ気した。また pH は予備的に検討した結果をもとィラン生産にとって必要であることが判明した。に、ケフィラン生産にとって最適な 5 . 5 に設定し以下の実験では、酵母エキスを５g/L となるようた。に添加してケフィランを生産した。

酵母エキスを添加しない場合には、菌体の増殖が非常に悪く、ケフィランもほとんど生産しなか

３. ２

気ガス組成と pH 制御の影響ったが、酵母エキスの添加濃度を増加するにつれ

図３は、L. kefiranofaciens によるケフィランて、濁度の値が高くなり、また、ケフィランの生生産に対する 気ガス組成の影響を示す。これら産量も増加した。特に、ケフィラン生産量は酵母の培養において、pH は制御せず、初期ラクトー− 29 −

ス濃度は 50 g/L とした。結果は左から通気をし２の割合を９対１とした場合には約 1 . 4 倍多くなない場合、Ｎ２と CO ２の割合を９対１、および５り、ケフィラン生産にとって pH 制御が有効であ対５になるように調節した結果を示す。この図のることがわかった。しかし、ケフィランの生産量一番上に示す pH の変化からわかるように、いずはラクトースの消費量に応じて増加せず、消費しれの培養においても pH は培養３日目以降４以下たラクトース量当たりのケフィラン収率は増加となり、濁度からわかるように、生育はほとんどしなかった。

停止した。
通気ガス中の CO ２の割合を増加することによ３. ３ ラクトース濃度の影響って、ラクトースの分解物であるガラクトースがケフィラン生産に対する炭素源の初期濃度の蓄積し、消費されなかった。一方、最終的なケフ影響を検討した。図５は通気ガスの組成を９対ィランの生産量は、通気ガス中のＮ２対 CO ２の割１、pH を 5 . 5 に制御して、ラクトース濃度を合を変えてもほとんど影響を受けなかった。これ

50、75、および 100 g/L として培養した結果を示は、CO ２ はラクトースの代謝に何らかの影響をす。いずれの培養においても、乳酸濃度が 30 g/与えるものの、pH が低下するために生育が停止

L 以上になると生育はほとんど停止したが、ラクし、ケフィランの生産量には差がでなかったためトースは消費され続けた。初期のラクトース濃度と考えられる。

が高くなるにつれて、ラクトースをすべて消費す

そこで、次に全く同じ培養条件で pH を 5 . 5 にるまでに必要な時間は徐々に長くなり、分解産物制御して、ケフィラン生産に対する通気ガス組成であるガラクトースとグルコースが培養液中にの影響を検討した。図４は、pH 制御をした培養残存するようになった。一方、ケフィランの生産の結果を示す。いずれの培養においても、pH を量は、初期のラクトース濃度が高くなるにつれて制御することによって 50 g/L のラクトースは４増加した。ただし、ラクトースの消費量に応じて日間で全て消費され、いったん生成したガラクトケフィランの生産量は増加せず、消費したラクトースもすべて消費された。また、菌体の生育量もース量当たりのケフィラン収率は低下した。

増加し、乳酸の生産量も、pH を制御しない場合

たとえば、初期ラクトース濃度を 100 g/L としに比べて約２倍に増加した。一方、ケフィラン生た培養において、ラクトースは６日目にすべて消産量は、pH を制御しない培養に比べて、Ｎ２と CO費されたが、ガラクトースとグルコースはそれぞ

図４

pH 制御培養における 気ガス組成の影響− 30 −

食用乳酸菌による化粧品素材としての機能性多糖の生産とその改質

図５

ラクトース濃度の影響

図６

エタノール添加の影響

れ約 40 と約 11 g/L 残存しており、乳酸の蓄積がエタノールを添加して培養した場合と添加し糖代謝、およびその結果としてケフィラン生産にない場合を比較して、ラクトース消費速度、乳酸影響を及ぼしたと考えられた。

生成量、生育量に大きな変化はなかったが、ケフィランの生産量は増加した。しかし、添加するエ３. ４ エタノール添加の影響

タノール濃度を 20 g/L に増加しても、ケフィラ酵母の存在に関係する第三の因子であるエタノールのケフィラン生産に対する効果についてン生産 は、エタノール濃度を 10 g/L にした場合に比べて、増加しなかった。

検討した。図６は、Ｎ２と CO ２の割合を９対１、pH を 5 . 5 に制御した培養における、エタノール３. ５ ケフィラン生産量の比較添加の影響を示す。初期ラクトース濃度を 50 g/

図７は、これまで述べてきた各培養における粗L とし、エタノールを 10g/L と 20g/L となるようケフィラン生産量を比較した結果を示す。すなわに添加した。また、初期ラクトース濃度を 75g/L

ち、ケフィラン生産に対する通気ガス組成、pHとし、エタノールを 10g/L となるように添加した。

制御、初期ラクトース濃度およびエタノール添加− 31 −

量の影響についてまとめた結果を示す。
pH を制御しない培養において、Ｎ２と CO ２の割合を変えても粗ケフィランの生産量に影響しなかったが、同一の通気ガス条件では、pH を 5 . 5 に制御した場合に粗ケフィラン生産量は増加した。しかし、二酸化炭素の割合を増加した場合には、pH を制御しても粗ケフィラン生産量はわずかしか増加

図７

しなかった。なお、窒素のみをケフィラン生産 の比較通気した場合、L.kefiranofaciensは増殖できなかった。これらの結果より、Ｎ ２ と CO ２ の割合を９対１として通気し、pHを制御することによって、L.
kefiranofaciens の増殖速度および粗ケフィランの生産量を増加できることがわかった。また、初期ラクトース濃度を 50、75、100 g/L と順次増加するにつれて、ケフィランの生産量

図８

陰イオン交換クロマトグラフィーによるケフィランの精製は、徐々に増加した。また、エタノールを添加すると、初期ラクトース濃度をル沈殿によって回収し、フェノール・硫酸法によ50 g/L と 75 g/L にした培養において、ケフィラって求めた全糖量として、ケフィラン生産量を表ンの生産量はともに増加した。

してきた。しかし、エタノール沈殿によって回収以上の結果より、初期ラクトース濃度を増加すした粗ケフィランには、不純物を含んでいる可能ることによって、およびエタノールを 10 g/L 程性がある。そこで、つぎにエタノール沈殿によっ度添加することによって、ケフィランの生産 をて回収したケフィランの水溶液を陰イオン交換増大できることがわかった。

クロマトグラフィーを用いて、さらに部分精製し最終的に、pH を 5 . 5 に制御し、Ｎ２と CO ２のた。図８は、培養して得られた粗ケフィランを割合を９対１とした混合ガスを通気し、10 g/L のDEAE- Toyopearl を用いて、精製した結果を示

エタノールを添加することによって、最も多くのす。おおよそ８割の全糖は未吸着画分に溶出されケフィランを生産できることがわかった。

たが、低い濃度の NaCl を含むフラクションにもわずかに検出された。また、大部分のタンパク質

３. ６ ケフィランの部分精製

は NaCl の濃度が 0 . 4 M 付近のフラクションに溶

これまでは、ケフィランを培養液からエタノー出された。ケフィランはグルコースとガラクトー− 32 −

食用乳酸菌による化粧品素材としての機能性多糖の生産とその改質

図９

ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子 の測定スからなる中性糖であることから、未吸着画分を３. ８ 精製ケフィラン生産量の比較

エタノール沈殿によって再回収し、部分精製ケフ

図 10 は、陰イオン交換クロマトグラフィーにィランとした。また、培養条件を変えても得られよって部分精製したケフィランの濃度を比較しる粗ケフィランの成分はほとんど同じであり、こた結果を示す。部分精製ケフィランは代表的な培のクロマトグラフィーの結果と同じようなプロ養において得られた粗ケフィランから調製した。

ファイルを示した。

各培養条件とも、陰イオン交換クロマトグラフィー後、エタノールで再沈殿して得られた部分精製

３. ７ ケフィランの分子量ケフィランの回収率は、55％程度であった。

ゲル濾過クロマトグラフィーによってケフィ部分精製ケフィランの量も、粗ケフィランの場ランの分子量分布を検討した。図９は、エタノー合と同じように、pH を 5.5 に制御し、Ｎ２と COル沈殿によって得られたケフィラン水溶液、およ２

び陰イオン交換クロマトグラフィーによって精のエタノールを添加することによって、気も pH製し、再回収されたケフィラン水溶液の分子量分制御もしない培養に比べて約 1 . 8 倍増加できるこ布を示す。とがわかった。の割合を９対１とした混合ガスを 気し、10 g/L保持時間が約８分の高分子量ピークと 17 分、４ 総 括18 分の低分子量ピークは未精製ケフィランにおいて検出されたが、それらのピークは精製ケフィ

本研究では、ケフィール中の乳酸菌と酵母のランでは消失しており、先ほど示したイオン交換相互関係を推定して、乳酸桿菌 L. kefiranofaciens

クロマトグラフィーによってケフィランがさらによるケフィラン生産に対する酵母の存在の影に精製されたことを確認できた。また、３つのピ響を検討した。また、得られたケフィランを部分ークが存在するが、精製ケフィランの分子量はお精製し、その分子量を推定した。本研究の結果は、およそ数百万であることがわかった。

以下のようにまとめられる。
１．酵母エキスを添加した培地を用いて、混合ガ− 33 −

図 10

精製ケフィラン生産 の比較

ス（Ｎ２：CO ２＝９：１）を通気し、pH を 5 . 5４）小林 猛、谷口正之：膜型バイオリアクターに制御することによって、L. kefiranofaciens にによる醗酵生産 , 化学工学会編 ,：バイオリアよる粗ケフィランの生産量を増加できた。

クター , アイピーシー，東京，1988 , 139 - 161 頁．

２．初期ラクトース濃度を増加することによって、

５）Taniguchi M., Nakagawa I., Hoshino K., etおよび 10g/L のエタノールを添加することにal.:Production of Superoxide Dismutase from

よって、粗ケフィランの生産量を増大できた。

Streptococcus lactis by Using a Bioreactor with

３．陰イオン交換クロマトグラフィーによってケa Microfiltration Module. Agric. Biol. Chem.,

フィランを精製した結果、その分子量は数百万53 , 2447 - 2453 , 1989 .

であった。また、精製ケフィランは、粗ケフィ

６）Hoshino K.,Taniguchi M., Marumoto H., et

ランと同じように培養条件を工夫することにal.:Continuous Lactic Acid Production from

よって増加できた。

Raw Starch in a Fermentation System Using a
Reversibly Soluble-Autoprecipitating Amylase

謝 辞and Immobilized cells of Lactobacillus casei.

本研究をご支援いただきましたコスメトロジー
研究振興財団に対しまして、厚くお礼申し上げます。

Agric. Biol. Chem., 55 , 479 - 485 , 1991 .
７）Taniguchi M., Hoshino K., Ito T., et al.:Production of Superoxide Dismutase in

引用文献

Streptococcus lactis by a Combination of Use１）戸羽隆宏：中温性乳酸菌を使った発酵乳、of Hyperbaric Oxygen and Fermentation withJapanese Journal of Dairy and Food Science, 36 ,Cross-Flow Filtration. Biotechnol. Bioeng., 39，

235 - 244 , 1987 .

886 - 890 , 1992 .

２）戸羽隆宏、足立 達：ケフィール粒の微生物

８）Taniguchi M., Hoshino K., Urasaki H., et学、バイオサイエンスとバイオインダストリ

al.:Continuous Production of an Antibiotic

ー、47 , 383 - 388 , 1989 .

Polypeptide (Nisin) Using a Bioreactor Coupled

３）足立 達、伊藤敞敏、戸羽隆宏、ほか２名：乳酸菌の生態、微生物、６，15 - 26 , 1990 .

to a Microfiltration Module. J. Ferment. Bioeng.,
77，704 - 708 , 1994 .

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