リボザイムを用いた皮膚細胞新規老化遺伝子の単離と解析
筑波大学

柳応用生物化学系

澤純

In the somatic cells of humans, the telomere repeats have been proposed to provide each cell with a counting mechanismthat helps prevent the unlimited proliferation of wayward cells in adult tissues. According to this idea, somatic cells are bornwith a full complement of telomeric repeats; howevwr, the telomerase enzyme, hTERT, is turned off in a tissue like theskin, so that each time a cell divides, it loses 50-100 nucleotides from each of its telomeres. After many cell generations, thedescendent cells will inherit defective chromosomes and consequently will withdraw permanently from the cell cycle andcease dividing-a process called replicative cell senescence. In theory, such a mechanism could provide a safeguard against theuncontrolled cell proliferation of abnormal cells in somatic tissues.
The idea that telomere length acts as a “measuring stick” to count cell division and thereby regulate the cell’ s life time
has been tested in several ways. For certain types of human cells grown in tissue culture, the experimental results support
the theory. However, the molecular mechanism of replicative cell senescence remains unknown. To investigate this process,we tried to identify new genes, those are involved in the process of replicative cell senescence by the method using ribozyme
library. In addition, we examined the transcriptional regulation of hTERT, a human telomerase enzyme. hTERT expression
is regulated by the methylation status of its promoter region. To express the TERT, the promoter region should be
hypermethylated. In contrast, in somatic cells, the promoter region of TERT is hypomethylated to inhibit the expression ofTERT gene. Therefore, we tried to examine the regulation mechanism for DNA methylation and demethylation.

１．緒ら細胞増殖抑制を制御する因子が細胞の老化に関与してい言ることが示唆される。増殖抑制に関わる因子の多くは癌抑ヒト正常体細胞を培養すると無限には分裂できず、分列制因子として知られており、p53 や p21 のように老化関連可能回数には限界がある。これを体細胞の有限分裂寿命、因子・癌抑制因子両方の因子として機能しているものも知または発見者の名をとって Hayflick の分裂限界と呼んでられている。そこで新規癌抑制遺伝子を探索するとともにいる。“細胞の老化” とはこの分裂限界に近づくその過程これらの遺伝子と老化との関連を解析する。のことをいい、ヒトでは細胞分裂回数が 50 〜 70 回と決ま

テロメアの長さは、テロメラーゼ（hTERT）と呼ばれるった範囲内で停止する。この分裂寿命は細胞自身の持つテロ酵素によって調節を受けている。HTERT は germ cell とメア短縮という現象と関連が深いことが明らかになっている。

stem cell において発現が認められ、normal somatic cell でテロメアとは染色体の両末端に存在する部分で６塩基は発現が見られない。HTERT 遺伝子の normal somatic（− TAAGGG −）の反復配列からなる 12kbp（ヒト）のcell での発現は、テロメアの伸長による細胞の不死化とそ塩基配列からなる。DNA 複製の際に約 50 〜 150bp ずつれに引き続く癌化を引き起こす可能性がある。したがって、短縮していき、テロメアサイズが 5000bp に近づくと増殖TERT 遺伝子の発現調節は極めて厳密に行なわれなくては停止機能を持つ CDK inhibitor 遺伝子ファミリーなどの遺ならない。近年、hTERT 遺伝子の発現調節に TERT 遺伝伝子群の発現が上昇することにより、細胞増殖を停止する。

子プロモーター上の DNA メチル化状態が関与することがこのようにテロメア短縮、それに伴う CDK inhibitor 遺報告された。ゲノム DNA の CpG シトシンのメチル化修飾

伝子ファミリーの発現と細胞の分裂停止には相関関係があは哺乳類や植物などで広く認められる。DNA のメチル化ると推測されるが、その分子機構については未だ不明のま修飾は遺伝子発現を調節するエピジェネティクス機構の一まである。本研究では未だ明らかにされていない細胞老化

つとして知られており、遺伝子の転写抑制やへテロクロマの分子機構の解明を目的とし、老化を規定する新規の因子チン形成を介して、初期発生や分化・X 染色体の不活性化・の同定を試みる。老化に伴い細胞増殖が抑制されることかインプリンティングなど様々な生命現象に関わっていると

Molecular cloning of novel genes involvedin the aging
Jun Yanagisawa
Institute of Applied Biochemistry,
Tsukuba University

考えられている。また、多くの腫瘍でメチル化異常は癌抑制遺伝子を不活性化したり、ゲノムの不安定化を助長することが知られている。ゲノムのメチル化シトシンは脱アミノ反応で値チミンに変化しやすく、この結果生じた T-G ミスマッチが修復されないと、様々な疾患を引き起こす。
現在、DNA メチル化はメチル化維持活性をもつ Dnmt1と de novo メチル化活性をもつ Dnmt3a および Dnmt3b に− 103 −よって調節されていると考えられている。一方、DNA 脱チル化・脱メチル化は、シトシン残基に起こり、hTERTメチル化はその現象は捕らえられているものの、制御機構のみならず、多くのプロモーター活性を制御し、転写の活についてはほとんど明らかになっていないが、受動的脱メ性化・不活化において重要な役割を担っているものと考えチル化と能動的脱メチル化機構があると考えられている。

られているが、その分子機構についてはほとんど明らかに

受動的脱メチル化とは、DNA 複製後の新規の DNA 鎖になっていないのが現状である。そこで、今回はとくに不明メチル化がおこらずに維持されることである。能動的脱メな点が多い DNA の脱メチル化機構に焦点をあて、その解チル化とは、複製に依存せずに酵素などの働きによってメ析を行なうこととし、まず、DNA 脱メチル化が認められチル基が外れることである。

る細胞株を探索することとした。

また、メチル化 DNA に特異的に結合するタンパクの存在も明らかになった。現在、MeCP2・MBD1・MBD2・２．２．１

ヒト IL-2 遺伝子の刺激による脱メチル化誘導

MBD3・MBD4 の５種類が知られており、主に DNA メチ

2003 年３月にマウス T リンパ球では IL-2 遺伝子プロモル化とヒストンの修飾やクロマチンとの相互作用を仲介しーターが刺激により脱メチル化し、IL-2 の分泌が高まるとている。MBD4 は T-G ミスマッチに対するグリコシラー報告された。（nature immunology, 4,235,2003）この脱メゼ活性をもち、その他は転写抑制に働くと考えられている。

チル化反応は 20min で生じ、複製に関わらず脱メチル化

そして、これらメチル化 DNA 結合タンパクの異常が遺伝することも明らかとなった。そこで、我々は T リンパ球系の細病や腫瘍で認められている。

胞株である Jurkat 細胞を用いて、脱メチル化が誘導されこのように、DNA メチル化脱メチル化がさまざまな生るか否か検討した。Jurkat 細胞株に PMA（Phorbol-12-命現象に関わり、また、疾患の原因にもなりうることが明Myristate-13-acetate）20ng/ml および Ca-ionophore1_M

らかとなってきた。しかしながら、どのようにして DNA処理を 24hr 行い、RT-PCR にて IL-2mRNA の発現誘導を検メチル化パターンが決定し維持され、そして解除されるか討し、さらに、Bisulfite を用いてメチル化状態を検討した。という DNA メチル化の時間的空間的制御ネットワークの分子基盤はほとんど解明されていない。そこで我々は hTERT

２．２．２

マウス APRT 遺伝子の in vivo, in vitro aasay

遺伝子の DNA メチル化・脱メチル化による転写制御機構を用いた脱メチル化誘導を明らかにするため、DNA 脱メチル化に関する因子の取Cedar らは teratocarcinoma 由来の F9 細胞内で、APRT得と、脱メチル化機構の解明を目的とし研究を行なった。

遺伝子の脱メチル化が誘導されることを報告した。彼等は２．実

plasmid に CpG を含む APRT 遺伝子上流の 2.5Kb をサブクロー験

ニングし、それを F9 細胞に transfection することによって、脱２．
１ リボゾームライブラリーを用いた老化遺伝子・癌抑制遺伝子のスクリーニングメチル化が誘導されること（nature 371,435,1994）、また、F9 細胞の細胞抽出液と APRT 遺伝子上流のメチル化 DNA fragment

上記のように、老化遺伝子は、癌抑制遺伝子としての性とを反応させることによって、脱メチル化されることを明らか質を併せ持つ可能性が高い。そこでリボザイムライブラリにした（Cell, 86, 709, 1996）。そこで、彼らのデータの再現性ーを用い、癌抑制遺伝子のスクリーニングを試みた。リボを調べるため、同様の実験を行なった。

ザイムライブラリーとは、酵素 RNA で特異的 mRNA にアニールし触媒活性によりｍ RNA を破壊するリボザイム

２．２．３

TAT 遺伝子のグルココルチコイドによる脱メの集合である。癌抑制因子ｍ RNA が破壊されると細胞はチル化誘導癌化し、足場依存性が低くなるため、軟寒天培地中での増Tyrosine aminitransferase（TAT）遺伝子は肝臓特異的殖が可能になる。そこでランダムに基質ｍ RNA を破壊すに発現している。肝細胞において、この遺伝子上流約るリボザイムライブラリーを正常細胞に導入し、癌抑制因

2.4Kb 付近の４つの CpG は脱メチル化していることが知ら

子ｍ RNA の破壊された細胞株について、軟寒天培地中でれている。一方、発現していない組織では TAT 遺伝子上の増殖を指標にクリーニングすることを試みた。

流の CpG はメチル化していることが報告されている。また、肝細胞ではグルココルチコイドによりこの領域の脱メチル

２．
２hTERT 遺伝子プロモーター上の脱メチル化機化を誘導できると報告されている。そこで、まず、Bisulfite構の解明を用いて実際にグルココルチコイド（Dexamethasone）で、前述したように hTERT 遺伝子プロモーターはメチル脱メチル化が誘導されるかどうかの検討を行なった。Dex化・脱メチル化によってその活性の制御が行なわれている。

10 − 7M で 24 時間処理した後、Bisulfite sequence を行なった。

HTERT の発現は、プロモーターの hypermethylation で次に、TAT 遺伝子の Dex による脱メチル化反応が複製に関わ促進し、逆に hypomethylation で抑制される。DNA のメっているかどうかを検討した。ミモシン mimosine という− 104 −トリクロロ酢酸とフェノールの生体におよぼす安全性に関する研究

Dex 処理行なった。なお、mimosine の効果は細胞内への３．２ hTERT 遺伝子プロモーター上の脱メチル化機構の解明

BrdU の取込みの有無で確認した。あらかじめ mimosine0.5mM

３．２．１

G1 期での細胞周期停止薬で処理して、複製を止めた状態で、−7

ヒト IL-2 遺伝子の刺激による脱メチル化誘導で 12 時間処理した細胞に、Dex 10 M を加え、さらに 12 時

Jurkat 細胞では刺激処理によって IL-2 遺伝子の発現が間処理した。その後、bisulfite にてメチル化状態を検討した。

確認されたが、DNA のメチル化については刺激により誘導されておらず、刺激処理前よりすでに脱メチル化されて① Dexamethasone（dex）による TAT 遺伝子発現誘導いることが明らかになった。この細胞株は T 細胞系由来

肝細胞に合成グルココルチコイドである dexamethasone−7のものであり、すでに分化が終了しているものと考えられ（Dex）[10 M] 処理を 24 時間行い、TAT 遺伝子の上流る、したがって、刺激前より CpG は脱メチル化状態であ-2.5kb 付近の CpG に脱メチル化誘導をかけた。同時にったと考えられる。この細胞を使って、脱メチル化酵素の細胞から RNA を抽出し、RT-PCR を行い、dex による精製は行えないと判断した。また、in vitro の脱メチル化

Tat 遺伝子発現を確認した。

活性測定系を用いて、Jurkat 細胞の細胞抽出液中の脱メ② TAT 遺伝子プロモーターのメチル化確認

チル化活性を測定したが、測定可能な脱メチル化活性はBisulfite sequencing PCR（DNA の CpG ジヌクレオチ

Jurkat 細胞抽出液中には存在しないことが明らかとなった。

ドのシトシンをチミンへ化学変化させる方法。メチル化
シトシンはチミンに変化しないので、シーケンスにより

３．
２．
２ APRT 遺伝子の in vivo, in vitro aasay を用いた

メ チ ル 化 を 確 認 で き る。
） 肝 細 胞 の ゲ ノ ム DNA を脱メチル化誘導

Sodium bisulfite で処理し特定の部分（図１参照）をク

Cedar らとまったく同じ実験系を用いて teratocarcinoma
由来の F9 細胞内で、APRT 遺伝子の脱メチル化が誘導さローニングし、シーケンスを行った。
③細胞周期を同調させた場合の脱メチル化確認れるか否かを検討した。plasmid に CpG を含む APRT 遺細胞を Mimosine[0.5mM] 処理を 12 時間行い、細胞周期−7

伝子上流の 2.5Kb をサブクローニングし、それを F9 細胞

Ｍ ] 処理を 12に transfection することによって、脱メチル化が誘導され時間行った。その後、Bisulfite sequencing 法を用いて、ること、また、F9 細胞の細胞抽出液と APRT 遺伝子上流メチル化状況を調べた。なお、肝細胞の同調は、BrdUのメチル化 DNA fragment とを反応させることによって、の取り込みにより確認した。

脱メチル化されることを同様の実験系を用いて確認した。

を G1 終盤に同調させて、続いて dex[10しかしながら、実際に Bisulfite PCR を行い sequence を３．結果と考察調べてみると、脱メチル化は誘導されていなかった。以上

３．
１ リボゾームライブラリーを用いた老化遺伝子・癌抑制遺伝子のスクリーニングの結果から、Ceder らの Nature と Cell は実験操作の問題軟寒天培地中での増殖を見るため、メチルセルロース濃論に至った。F9 細胞内で脱メチル化が起こるという報告

度 1.8％で癌細胞（HeLa）、正常細胞（NIH3T3）をそれぞは、実験操作上のアーティファクトであり、事実ではない。

で脱メチル化が誘導されたように見えただけであるとの結れ培養した。その結果、HeLa 細胞は癌化しコロニーを形成したが NIH ３T3 細胞も増殖してしまった。そこで、

３．２．３

TAT 遺伝子のグルココルチコイドによる脱メ

NIH ３T3 細胞が増殖を示さない至的培地条件の検討をメチル化誘導

チルセルロース濃度を変えて行った。
（図）

肝細胞の TAT 遺伝子は、dex 処理によって遺伝子発現

その結果、NIH ３T3 細胞はメチルセルロース濃度 2.0%が強く誘導されることを RT-PCR で確認した。次に TAT以降増殖を示さなくなった。一方、HeLa 細胞は 3.0% 以遺伝子プロモーターのメチル化状態をみるため、Bisulfite

降コロニー形成率が半分ほどに落ち込んだ。これは、メチsequencing PCR を行った。その結果、CpG 3-5 では dex

ルセルロースが細胞増殖に悪影響を与えたためと考えられた。

処理前は 65％メチル化していたが、処理後メチル化は４

これらの結果から、メチルセルロース濃度を 2.4％とし、% へと減少した。このことから、dex 処理によって TATリボザイムライブラリーをレトロウイルスを用いて遺伝子プロモーターの脱メチル化が誘導されることが明ら

NIH3t3 に感染させスクリーニングを行なった。３回の独かとなった（Fig. １ A）。そこで、この脱メチル化が複製立したスクリーニングを行なったが、足場非依存的増殖を依存的かどうかをみるために、細胞周期の同調を施し、示すクローンが得られなかった。良好な結果が得られない

dex 処理による脱メチル化誘導を行った。その結果、CpG原因として、リボザイムライブラリーの品質とリボザイム

3-5 では dex 処理により、脱メチル化が誘導された。このによるターゲットの切断効率の低さが考えられるため、今ことから、脱メチル化が複製依存的ではなく、積極的な機後改良を加え続行をする予定である。

構によることが証明された（Fig. １ B）。

− 105 −

一方、GREs より上流の部分の CpG 1,2 については、にくいという可能性がある。第二に、GRE の上流のクロdex 処理により特に脱メチル化されることはなかった（細マチン構造が密になっているために、クロマチンのリモデ胞周期の同調を行った場合も、同様の結果が得られた）リングが起こりにくく、脱メチル化機構が抑えられている（Fig.1 A,B）
。Dex 刺激により、GREs の上流で脱メチル可能性がある。今後、本系を用いて脱メチル化の分子機構化されず、下流で脱メチル化する理由としては、次に示すの解析を行い、hTERT 遺伝子制御機構の解明へとつなげように様々なものが考えられる。第一に、CpG 1,2 は CpGたいと考えている。

3-5 よりも GREs から離れているために、脱メチル化されFig. １ TAT 遺伝子のグルココルチコイドによる脱メチル化誘導
Ａ．TAT 遺伝子プロモーターの dexamethasone による脱メチル化誘導
H4IIE 細胞をグルココルチロイドの合成リガンドである dexamethasone（10 − 7M）で処理し、24 時間後、Bisulfite sequencing 法でメチル化状態について検討した。
Ｂ．複製非依存的な脱メチル化誘導
G1 期への細胞周期同調剤である mimosine（0.5mM）を 12 時間処理後、dexamethasone（10 − 7M）で 12 時間処理し、Bisulfite sequencing 法でメチル化状態について検討した。

− 106 −