皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明
日本大学薬学部健康衛生学研究室

榛葉繁紀

In this study, we examined if reactive oxygen species (ROS) level shows circadian rhythm in the skin and role of themolecular clock system in the process. ROS level and gene expression involved in ROS production showed clear circadianrhythm in the skin of mice. The rhythmicity was diminished in the skin of molecular clock deficient mice. Consequently, weare led to conclude that molecular clock system may regulate the skin homeostasis by controlling the cellular ROS level.

1．緒

上述したように皮膚機能においてサーカディアンリズム

言の存在が示唆されること、さらにはサーカディアンリズ

皮膚は、水分の喪失や透過を防ぐ水分保持機能、体温をムのマスターレギュレーターである Bmal1 の遺伝子欠損調節する体温保持機能、さらには微生物や物理化学的刺激により皮膚機能の低下に基づく老化現象が観察されるこから生体を守るバリア機能など、内的ならびに外的環境変となどから皮膚機能維持における BMAL1 の重要性が予想化に適応してホメオスタシスの維持を行うための様々な機される。そこで、本研究では、皮膚機能におけるサーカデ

1）能を担っている 。これらの皮膚機能が睡眠不足等の生活時間の変化により低下することが数多く報告されている

2, 3）

。

ィアンリズムを明らかにするとともにその調節におけるBMAL1 の役割を検討する

このような生活時間の変化による皮膚機能の変化は、皮膚

2．実においてサーカディアンリズムが存在することを示唆しており、事実、体温調節、皮脂の産生さらには水分蒸散量などに日内変動が存在することが知られている

2, 3）

。

験2. 1. 実験動物
実験動物の取り扱いは日本大学薬学部実験動物倫理規定

各組織・細胞における生理機能の日内変動は、多くの時に準じて行った。1 ケージ当たり 3−6 匹に分配し自由給餌、計遺伝子により転写レベルにおいて調節されており、そ温度 23±1 ℃、相対湿度 50±10 ％、明暗 12 時間周期の条の中心は転写因子 Brain and muscle Arnt-like protein-1

件で飼育した。BMAL1 ヘテロ欠損マウス同士の交配によ（BMAL1）である。BMAL1 欠損（KO）マウスは、行動のり BMAL1 ホモ欠損マウスを繁殖した。また同腹より得らサーカディアンリズムの消失をはじめとして多くの生理れた野生型マウスをコントロールマウスとした。恒暗条件

4）

機能の異常を示すが 、中でも最も著しい表現型は寿命の5）短縮ならびに各組織における老化マーカーの増加である 。

下における実験では、サンプル採取の前にマウスを恒暗条
件下で 5 日間馴化させた後に実験に用いた。
明 暗 条 件 下 に お け る 実 験 で は 時 刻 を ZT（ZeitgeberBMAL1KO マウスの寿命は、平均 37 週であり、通常の5）

C57BL/6J マウスのそれに比較して著しく短い 。また生time）で表示した。ZT0 は明期の開始を、また ZT12 は暗後 30 週以内にほぼ全ての BMAL1KO マウスは白内障を生期の開始を示す。

5）

じる 。これらに加えて、剃毛後の体毛の再伸長阻害さら恒 暗 条 件 下 に お け る 実 験 で は 時 刻 を CT（Circadianには皮下脂肪の減少等、皮膚機能に関連した老化現象が観time）で表示した。CT0 は明暗条件下における明期の開始察される 5）。BMAL1 欠損に伴うこれら老化現象の発現メに相当する時刻を示す。

カニズムは明らかではないが、BMAL1KO マウスでは各臓器において活性酸素種（reactive oxygen species ; ROS）量が増加しており、このことが加齢促進に関係していると
5）推察される 。

2. 2. Total RNAの抽出組織を Phosphate buffered saline（PBS）で洗浄し、凍結プレス破砕装置 クライオプレス（マイクロテック・ニチオン化㈱）で破砕した後、TRI REAGENT（シグマアルドリッチ㈱）を用いて、total RNA を抽出した。残存する DNA を除去するために total RNA10 µg を DNase（RT-Regulation of skin functions by themolecular clock system
Shigeki Shimba
Department of Health Science, School of
Pharmacy, Nihon Universitygrade, 和光純薬工業㈱）2units により 37 ℃、15 分間の処理を行った。反応後フェノール / クロロホルム抽出によりRNA を抽出し、アルコール沈殿により精製した。

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

2. 3. 逆転写反応

レギュレーターである Bmal1 遺伝子の発現量は、暗期か2. 2. で得られた RNA を 0.8 µM oligo dT プライマー（イら明期（ZT22-ZT2）にかけて最大となり、明期から暗期

ンビトロジェン㈱）および 1mM dNTP（インビトロジェ（ZT10-ZT14）にかけて最小となる日内変動が認められたン㈱）を含む Reaction buffer（和光純薬工業㈱）中におい（Fig. 1）。BMAL1 のパートナーである Clock の発現量は、て 60 ℃、5 分間、次いで 37 ℃、10 分間反応させた。その他の組織と同様にリズム性は認められなかった（Fig. 1）。

後、Reverse Transcriptase（和光純薬工業㈱）200 units

BMAL1/CLOCK の転写を負に制御する Cry1 の発現量はを加えて 37 ℃、60 分間、次いで 95 ℃、15 分間反応させ、暗期にピークを迎えた。BMAL1/CLOCK の標的遺伝子でcDNA を得た。

ある Rev-erb α ならびに D site albumin promoter bindingprotein（Dbp）の発現パターンは BMAL1 におけるそれと2. 4. Real-time PCR 法によるmRNAの定量逆位相を示し、明期にピークを迎えた（Fig. 1）。また時計

2. 3. で得られた cDNA（0.1 µg total RNA 相当）ならび遺伝子関連転写因子である RAR-related orphan receptorに各種プライマー（最終濃度 0.2 µM）を Platimun SYBR（Ror）の発現量には日内変動は認められなかった（Fig. 1）。

Green qPCR SuperMix-UDG（インビトロジェン㈱）と混合し、MX3000P Q-PCR system（ストラタジーン㈱）を用いて変性：94 ℃，30 秒間、アニーリング：58 ℃，30 秒間、伸長反応：72 ℃，30 秒間を 35 〜 40 サイクル条件下で反応

3. 2. マウス皮膚における皮膚機能関連遺伝子発現の日内変動（明暗条件下飼育下）
明暗条件下にてその発現量が日内変動する皮膚機能関連遺伝子を探索するために、各遺伝子発現量を検討し、片側を行い、各 mRNA の発現量を測定した。

ANOVA 解析により日内変動の有無を判定した。活性酸素

2. 5. ROS 量の測定

消去酵素 Catalase（Cat）の発現は ZT10 にトラフが存在す組織を PBS で洗浄した後、凍結プレス破砕装置 クライ

る日内変動を示した。また、Cu, Zn- スーパーオキシドジオプレス（マイクロテック・ニチオン㈱）で破砕した。そのスムターゼならびにグルタチオンペルオキシダーゼの発現後、PBS 中にてホモジナイズし、次いで 900×g, 15 分間（4も弱いながら日内変動を示した。活性酸素産生酵素である℃）遠心分離して得られた上清を組織抽出液とした。

NADPH オキシダーゼのサブユニットに関して、測定した試料中のタンパク質量を定量するために、組織抽出液にプロテインアッセイ CBB 溶液（ナカライテスク㈱）を添

いずれの遺伝子発現量も、ZT6 に最小値を示し、ZT14 に最大値を示す日内変動が観察された。

加し、混合・発色させた後、595 nm の吸光度を測定した。
を用いて作成した検量線から、タンパク質量を算出した。

3. 3. マウス皮膚における時計遺伝子発現のサーカディアンリズム（恒暗条件下）

タンパク質量で補正した組織抽出液に H2DCFDA（イマウス皮膚における自律的な遺伝子発現の日内変動（サンビトロジェン㈱）を加え、37 ℃で 30 分間インキュベーーカディアンリズム）の存在を確認するために、マウスをトした後、485 nm ならびに 520 nm における蛍光強度を測恒暗条件下で飼育し、その際の皮膚における時計遺伝子発定した。

現を検討した。その結果、明暗条件下と同様、時計遺伝子同様にウシ血清アルブミン（BSA）（インビトロジェン㈱）発現に振幅が認められ、特に Bmal1 および Clock は明暗条

2. 6. 8-OHdG 測定件下よりも大きな振幅を示した（Fig. 2）。また、明暗条件組織を採取した後、DNA エキストラクター TIS キット

下にて振幅を示さなかった Ror の発現量は、ZT18 におい（和光純薬工業㈱）を用いて DNA を抽出した。得られたて増加が認められ、Cry1 と同様の発現パターンを示した。

DNA を、8-OHdG 測定前処理試薬セット（和光純薬工業以上のことから、マウス皮膚における遺伝子発現にサーカ㈱）を用いて前処理した後、含まれる 8-OHdG 量を高感度ディアンリズムの存在が確認された。

8-OHdG Check（日本老化研究所）を用いて測定した。

3．結3. 4. マウス皮膚における遺伝子発現のサーカディアンリズム（恒暗条件下）

果

3. 1. マウス皮膚における時計遺伝子発現の日内変動

マウス皮膚において、その発現にサーカディアンリズム（明暗条件飼育下）を持つ皮膚機能に関連した遺伝子を探索するため、恒暗条マウス皮膚における時計遺伝子の発現ならびにその日件下で飼育したマウス皮膚における各遺伝子の発現量を検内変動を確認するため、明暗条件下（明期：暗期＝ 12h：討した。検討した遺伝子のうち、Col1a1、Mmp3、Foxo1、12h）で飼育したマウス背部より皮膚を採取し、その時計

Cu-Zn-Sod、Mn-Sod、Gpx, p40 phox ならびに p67 phox の発遺伝子の発現を検討した（Fig. 1）。体内時計のマスター

現量が、CT2~CT14 にかけて低く、CT18~CT22 に高い− 118 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明る。そこで、マウス皮膚における ROS 量の日内変動を検発現の変動を示した。

討した。明暗条件下では ZT2 および ZT10 が高い傾向にあ3. 5. マウス 皮 膚 に お ける活 性 酸 素 種（reactiveoxygen species ; ROS）量り、最大時と最小時で約 2 倍の量的違いが認められた（Fig.

活性酸素は細胞内代謝や遺伝子発現をはじめとする多くにおいては約 5 倍の量的違いが認められた（Fig. 3B）。この分子反応を制御しており、様々な生理反応に影響を与えれらの結果から、ROS 量にサーカディアンリズムが存在3A）。恒暗条件下では CT10 が最も高く、最大時と最小時

Fig. 1 マウス背部皮膚における時計遺伝子発現の日内変動
明暗条件下（12 時間明期 -12 時間暗期条件下）にて飼育したマウス背部の皮膚を４時間ごとに採取し、mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。Mean±SEM (n=5)− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る ROS 量 を 測 定 し、ROS 産 生 お け る BMAL1 の 関 与 をすることが示された。

検討した。若齢（10 週齢）においてコントロールマウスと3. 6. BMAL1 欠損に伴うマウス皮膚におけるROS 量

BMAL1KO マウスの間に皮膚 ROS 量の違いは認められな

前節において、皮膚における ROS 量にサーカディアかった（Fig. 4）。しかしながら、20 週齢において、コントンリズムがあることが示された（Fig. 3B）。そこでコント

ロールマウス皮膚における ROS 量は 10 週齢時に比べて約ロールマウスならびに BMAL1KO マウスの皮膚におけ3 倍に増加したが、BMAL1KO マウスのそれは 10 週齢時

Fig. 2 マウス皮膚における時計遺伝子発現のサーカディアンリズム
恒暗条件下にて馴化させたマウス背部の皮膚を４時間ごとに採取し、mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。Mean±SEM（n=5）− 120 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明成する。そこで 3. 6. において ROS 量に差の生じた 20 週齢と同程度であった（Fig. 4）。のコントロールマウスと BMAL1KO マウス皮膚を用いて、

3. 7. DNA 酸 化 損 傷 マ ー カ ー 8-Hydroxy-2'deoxyguanosine（8-OHdG）
量

8-OHdG 量を検討した。その結果、BMAL1KO マウス皮膚において減少傾向が見られた（Fig. 5）。

細胞内 ROS による DNA の酸化損傷に伴い 8-OHdG が生（A）明暗条件下（B）恒暗条件下

Fig. 3 マウス背部皮膚における ROS 量の日内変動およびサーカディアンリズム
明暗条件下（12 時間明期 -12 時間暗期条件下）にて飼育したマウス（A）ならびに恒暗条件下にて馴化させたマウス（B）の背部皮膚を４時間ごとに採取し、その ROS 量を、H2DCFDA を用いて測定した。Mean±SEM（n=5）

Fig. 4 マウス背部皮膚における ROS 量
明暗条件下にて飼育した 10 週齢（10w）ならびに 20 週齢（20w）のコントロールマウスおよび BMAL1KO マウスから背部皮膚を ZT10 に採取し、その際の ROS 量を、H 2DCFDAを用いて測定した。Mean±SEM（n=3）（*p<0.05）− 121 −

Fig. 5 マウス皮膚における 8-OHdG 量
明暗条件下にて飼育した 20 週齢のコントロー
ルマウスおよび BMAL1KO マウス皮 膚を ZT10に採取し、8-OHdG 量を、ELISA キットを用いて測定した。Mean±SEM（n=3）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

3. ８. BMAL1KO マウス皮膚における活性酸素関連遺伝子の発現変化
BMAL1 による皮膚機能調節を検討するため、ZT10 お

NADPH オキシダーゼサブユニット類の発現は、検討した
いずれの時間においても BMAL1KO マウスにおいて減少傾向が認められた（Fig. 6B）。

よび ZT22 においてコントロールマウスと BMAL1KO マ

4．考

ウスの背部皮膚を採取し、その遺伝子発現を検討した。活察性酸素消去系酵素の発現はいずれの時間においてもコン皮膚機能におけるサーカディアンリズムを解明するためトロールマウスと BMAL1KO マウスとの間に差異は認めには、まず皮膚における時計遺伝子の発現パターンを明らられなかった（Fig. 6A）。一方、活性酸素生成酵素であるかにする必要がある。明暗条件下で飼育したマウス皮膚を4 時間ごとにサンプル採取し、時計遺伝子発現パターンを（A）解析したところ、Ror を除くすべての時計遺伝子は日内変動を示した（Fig. 1）。そこで、これら明暗条件下における遺伝子発現変化が、光刺激により誘導される “日内変動” であるのか、あるいは自律的な“概日リズム（サーカディアンリズム）”の存在を反映しているものなのかを明らかにする
目的で、恒暗条件下においてマウスを飼育し、その皮膚にCat

Cu, Zn-Sod

Mn-Sod

おける遺伝子発現を解析した。その結果、時計遺伝子の発Gpx

現は明暗条件下と同様の発現パターンを示し、さらには明暗条件下では変動しなかった Ror の発現量にもリズム性が生じていた（Fig. 2）。また、Bmal1 や Clock の発現パターンを両飼育条件間で比較するとわかるように、恒暗条件下のほうが明暗条件下よりも、変動の幅が大きくなっていることがわかる（Fig. 1 および 2）。これらの結果から、皮膚における遺伝子発現にはサーカディアンリズムが存在する

Cat

Cu, Zn-Sod

Mn-Sodこと、そしてその活性は光刺激の影響を少なからず受ける

Gpx

ことが示され、Ror の発現は、この光刺激によるサーカデ（B）

ィアンリズムの抑制の一例であると考えられる。
恒暗条件下で飼育したマウス背部皮膚を用いた検討から皮膚における ROS 量にサーカディアンリズムの存在が示されたことから、皮膚における ROS 量制御への BMAL1の関与が示唆された（Fig. 3B）。BMAL1KO マウスにおける ROS 量はコントロールマウスのそれに比較して、脾臓、心臓、腎臓は増加、その一方で肝臓では低下が報告

p22phox p40phox p47phox p67phox gp91phox

されている 5）。そこで皮膚における ROS 量を測定したところ、10 週齢時における ROS 量は、コントロールマウ
スと BMAL1KO マウスとの間で差異は認められなかったが、BMAL1KO マウスでは、コントロールマウスにおいて観察された加齢に伴う ROS 量の増加は認められなかった（Fig. 4）。さらにこの際、DNA 酸化損傷のマーカーである 8-OHdG の値も、BMAL1KO マウスにおいて減少傾向が見られた（Fig. 5）。これらの結果より、BMAL1 は皮膚における ROS 量、特に加齢に伴う皮膚における ROS 量のp22phox p40phox p47phox p67phox gp91phox

Fig. 6 BMAL1KO マウス皮膚における活性酸素関連因子の遺伝子発現
明暗周期条件下にて飼育した 10 週齢のコントロールマウスおよび BMAL1KO マウスから背部皮膚を ZT10 および ZT18 に採取し、その mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。
（A）活性酸素消去系 （B）活性酸素産生系 Mean±SEM（n=7）（*p<0.05）

産生を制御していることが明らかとなった。
次いで ROS 量の制御に関与する因子の遺伝子発現量を検討した。これら因子の発現は、時計遺伝子により産み出されるサーカディアンリズム、そして明暗周期による、すなわち光刺激により誘導される日内変動のいずれの影響も受けることが示された。例えば、恒暗条件下飼育マウスを− 122 −皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明

用いた検討により、Cu, Zn-Sod、Mn-Sod、ならびに Gpx

variations of the skin barrier function in humans:の発現にサーカディアンリズムの存在が確認されたが、そtransepidermal water loss, stratum corneum hydration,の一方で、明暗条件下で飼育した BMAL1KO マウスにおskin surface pH, and skin temperature. J. Invest.

いて、これら遺伝子の発現に差が認められなかった。このDermatol., 110, 20-23, 1998.

ことは、これら遺伝子の発現の制御は、BMAL1 による制

3） Le Fur I, Reinberg A, Lopez S, Morizot F, Mechkouri

御を受けるものの、光刺激の影響が強いことを示している。

M, Tschachler E: Analysis of circadian and ultradian

他にも Cat あるいは NADPH オキシダーゼのサブユニットrhythms of skin surface properties of face and forearmの一部の発現解析からも、光刺激による制御が支持される。

of healthy women. J. Invest. Dermatol., 1 1 7, 7 1 8-7 2 4,

これらの結果から、皮膚において様々な機能が 1 日を通2001.

じて変動していることが示唆され、またその制御には時計

4） Bunger MK, Wilsbacher LD, Moran SM, Clendenin

遺伝子による制御のみならず、光刺激の関与も大きいこと

C, Radcliffe LA, Hogenesch JB, Simon MC, Takahashiが明らかとなった。したがって本研究で得られたこれら知

JS, Bradfield CA: Mop3 is an essential component of

見は、生活時間の重要性を説くものであり、今後、化粧品

the master circadian pacemaker in mammals. Cell, 103,

開発をはじめとして、皮膚機能調節における概念に科学的1009-1017, 2000.
5） Kondratov RV, Kondratova AA, Gorbacheva VY,エビデンスを与えるものである。

Vykhovanets OV, Antoch MP: Early aging and age（引用文献）

related pathologies in mice deficient in BMAL1, the1） 清水

core component of the circadian clock. Genes Dev., 20,

広：あたらしい皮膚科学 中山書店 2011.

2） Yosipovitch G, Xiong GL, Haus E, Sackett-Lundeen

1868-1873, 2006.

L, Ashkenazi I, Maibach HI: Time-dependent− 123 −