エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測定法の開発
東京大学大学院総合文化研究科先進科学研究機構

柳澤

実穂

Although biopolymer microgels are used in a variety of applications, their viscoelastic properties have been difficult todetermine due to their difficulty in analysis. In this study, the surface viscoelasticity of gelatin microgels prepared in lipid
droplets were investigated using cyclic micropipette aspiration. It was found that the gelatin gel gelled inside the small
droplets with a radius of about 50 μm or less covered with a lipid membrane was about 10 times harder than the bulk gel.
By changing the aspiration pressure cyclically, we also evaluated their storage modulus E’ (reflecting elasticity) and loss
modulus E’’ (reflecting viscosity). Then, the microgels have a smaller E’’/E’ ratio than the corresponding bulk gels, meaning
the microgels have a distinct nanostructure from bulk gels. Nanostructure analysis showed that small microgels contained
more beta sheets in their structures than bulk gels. Our findings indicate that the confinement of gelling polymers in lipid
membranes contributes to the variation in viscoelasticity of protein-based microgels through changes in secondary structure.

1.

緒

約 50 µm 以下のミクロゲルは、従来のバルクゲルよりも約言10 倍ゲル弾性が高くなること、従来知られてきたナノ構コラーゲンから得られるタンパク質由来のゼラチンや海造であるヘリックス構造だけでなく、ベーターシート構造藻から得られる多糖類由来のアガロースなど、多くの生体も多く含まれることを見出した 1）。これらのサイズ依存性高分子ゲルはその優れた生体親和性や生分解性により、化から、エマルション重合によりゼラチン・ゲルにベーター

粧品や医薬品、食品などの材料として活用されている。特シートが形成され、それが新たな架橋点となることでゲルに油中液滴（エマルション）中でのゲル化（エマルション重弾性が上昇したと考えられる。しかし、なぜエマルション合法）により得られる 1 ミリメートル以下の小さなミクロ重合がゼラチン・ミクロゲルのナノ構造変化とゲル弾性上ゲルは、その大きな表面積・体積比により、周囲の環境変昇を招いたのかは不明である。そこで本申請研究では、こ化にすばやく応答し、例えば体積変化に応じてゲル中に内の問いに対し（i）膜界面効果として考えられる膜の電気的包した薬物を放出する医薬用カプセルなど、高度な機能性特性や界面に働くラプラス圧とヤング率の相関関係を解析材料として注目されている。こうしたミクロゲルの基本的すること、（ii）そしてナノ構造をより強く反映する粘弾性機能は、そのナノ構造と粘弾性特性に依存しているが、ミを１つのミクロゲルに対して測定する手法を開発し、そのクロゲル分散液としての解析が進む一方、実際に機能を担解析からナノ構造変化の要因へ迫ることを目的とした。

うミクロゲル単体に対しては未解明な点が多い。

２．方エマルション重合により形成されるミクロゲルは、重合時に常にゲル化高分子が膜界面と接しており、界面物性が法

2. 1. エマルション界面の影響評価ミクロゲルの構造や物性へ影響することが予想される。生エマルション重合過程における膜界面効果として、膜物

体高分子ゲルでは、ゲル構造がタンパク質の 2 次構造であ性特性と膜によるミクロ空間閉じ込めに伴うラプラス圧、るヘリックス構造やベーターシート構造であることから、膜との直接的接着による影響をそれぞれ個別に評価するた膜界面の電荷などを含む物性がそれら 2 次構造転移を変化め、膜物性と油水界面に生じる界面張力が異なる 2 種のリさせる可能性が高い。実際に筆者らは、生体高分子ゲルとン脂質：1 , 2 -dioleoyl-sn-glycero- 3 -phosphocholine（DOPC）、してゼラチンを用い、リン脂質からなるエマルション中で1 , 2 -Dioleoyl-sn-glycero- 3 -phosphoethanolamine

ゲル化させて得られるミクロゲルに対し、表面弾性（ヤン（DOPE）、界面活性剤：Span 80 を用いてゼラチン・ミクグ率）の測定とナノ構造解析を行った。その結果、半径がロゲルを作製した。膜表面電荷は基本的に全て負に帯電しており、その大きさは DOPC < DOPE < Span 80 の順でViscoelastic analysis of biopolymer
m icrogel prepa red f rom emu lsion
polymerization
Miho Yanagisawa
Komaba Institute for Science, Graduate
S chool of A r ts a nd S ciences , TheUniversity of Tokyoあることが知られている。また、界面張力の大きさは、DOPC < Span 80 < DOPE << 活性剤無しの順で大きくなる。ゼラチン・ミクロゲルは、これらのリン脂質や界面活性剤を溶解したミネラルオイルと高温（約 60 ℃）のゼラチン溶液を攪拌してエマルション化し、その後ゲル化温度（30 ℃）以下に冷却することで作製した。さらに、ゲル化− 46 −

エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測定法の開発

しない高分子であるポリエチレングリコール（PEG）とゼラチンからなる 2 成分混合溶液を、均一相状態でエマルション化し、部分濡れ型の相分離パターン形成後にゲル化させることで、膜接触有りと膜接触無しの異なる 2 面を持つヤヌス型のミクロゲルを作製できる 2）。これより、ゲル化時に同じ DOPC 膜で覆われたミクロ空間へ閉じ込められているが、膜接着している部分と膜接着していない部分を有するミクロゲルが形成できる。このそれぞれの部分に対してヤング率とナノ構造を解析すれば、膜への直接的接触と膜によるミクロ空間閉じ込めのどちらが弾性率上昇やナノ構造転移へ影響をもたらしているのかを導くことができる。

2. 2. ベーターシートの蛍光可視化
ミクロゲル中に形成されたベーターシート構造を可視化

図 1 ミクロゲルの周期的吸引による表面粘弾性測定（上）と、吸引に伴うキャピラリー内への変形長さ L と吸引圧 P の時間変化（下）を示す模式図するため、ベーターシートに富むアミロイド構造の蛍光観察に使用される Thioflavin T（ThT）をゲル化前のゼラチン溶液に添加し、温度をゲル化温度以下に冷却した後での蛍光強度変化を、共焦点レーザー顕微鏡（FV 1200 , オリンパス）にて観察した 1）。

2. 3. ミクロゲル表面の粘弾性測定
ミクロゲルの表面弾性（ヤング率）
は、ゲル表面をガラスキャピラリーにより微小吸引し、吸引圧 P と吸引長さ L の比例関係から求めた 1）。本研究ではさらに、ゲル化過程で膜に接していた部分と接していなかった部分の異なる２面

図 2 球形ミクロゲルを覆う膜の負帯電度とゲル表面のヤング率の相関関係を備えたミクロゲルに対し、局所的なヤング率を測定することで、膜への直接的接触がヤング率へ及ぼす影響を導く 3）。
さらに、キャピラリーの吸引圧 P をサインカーブのように周期的に変化させることで粘弾性を評価するシステムを構築した（図 1）4）。吸引圧力と変形長さの時間変化に対して、その振幅と、圧力と変形の間の遅延に該当する位相差 δ を用いて、貯蔵弾性率 E’、損失弾性率 E’’ を求めることで粘弾性を評価する。これにより、ミクロゲルの弾性が支配的であったとしても、微小変形に伴うミクロゲル表面の粘弾

図 3 非球形のゼラチン・ミクロゲルにおける局所的なヤング率（Ave. ± SE.）
。凸面（脂質膜接触有り）と凹面（脂質膜接触無し）でのヤング率の違い。N はゲル数。

性を評価できるようになる。
（DOPC < DOPE < Span 80 の順）、ヤング率が大きくな３．結果と考察ることが分かった（図 2）。負に帯電する界面活性剤をゲル⒤ 膜界面の効果化する生体高分子に添加すると、ヘリックス形成が阻害さはじめに、異なる脂質や界面活性剤を用いて半径が 50れることが報告されており 5）、我々の実験においても、負µm 以下の球形のゼラチン・ミクロゲルを作製し、その表帯電した膜がヘリックス形成を阻害し、逆にベーターシー面のヤング率と膜物性の相関関係を調べた。エマルション

ト形成を促進したためにヤング率が上昇した起源と考えら重合過程では、膜界面に働く張力の大きさに比例するラプれる。

ラス圧による影響を受ける。そこで、膜界面張力値の異なつぎに、直接的な膜接触が表面ゲル弾性へ与える影響をる 4 つの系（DOPC < Span 80 < DOPE << 活性剤無し）に導くため、膜接触有りと無しのそれぞれの面に対して弾性対して、ヤング率を比較したところ、系統的な違いは見ら測定を行った（図 3）。その結果、接触有りの面が接触無しれなかった。次にエマルションを覆う膜の電気物性との相の面よりも高弾性となったものの、バルクゲルの弾性（5関関係を調べた。その結果、帯電の度合が増すにつれてkPa）と比べると共に遥かに高弾性であった 3）。このことは、− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

膜接触がゲル弾性を高めるが、ミクロ閉じ込めによりその効果が内部まで到達すると解釈できる 2）。さらに、この相分離したミクロゲルに対して ThT を添加したところ、ゲル化に伴いミクロゲルの中央まで蛍光強度が均一に上昇した（図 4）。この結果は、膜の負電荷により形成が誘起されるベーターシート構造が、膜近傍だけでなく、ミクロゲルの内部まで生じることを意味している。
図4

相分離ミクロゲルの ThT 蛍光画像

ⅱ ミクロゲルの粘弾性特性
次に、キャピラリー吸引の圧力を周期的に変化させることで、弾性を反映する貯蔵弾性率 E ’ と粘性を反映する損失弾性率E ’’の相関を調べた。バルクゲルでは、粘弾性比E ’’/E’ はゼラチン濃度によらず、また低周波数領域（ f < 0 . 1Hz）で は ほ ぼ 一 定 と な る（ 図 5）。 そ こ で、 周 波 数 を f =0 . 01 Hz に固定して、ミクロゲルとバルクゲルに対して、粘弾性比率を測定し比較した（図 6）。その結果、ミクロゲ
ルの方が小さな E ’’ /E’ 値をもつことが分かった 6）。この値の違いは、ゼラチン濃度では説明できないことから、ミクロゲルがバルクゲルとは異なるナノ構造を持つことを支持

図 5 バルクサイズのゼラチン・ゲルにおける粘弾性比（E’’/E’）と周波数 f の関係する。ミクロゲルでは、トリプルヘリックスだけでなく、多量のベーターシートも形成されていることから、従来の未反応なランダムコイル部位がベーターシートへ転移することで粘性が低下し、E ’’/E’値が減少したと考えられる。

５．総括

本申請研究では、エマルション重合によりナノ構造とヤング率が上昇するゼラチン・ミクロゲルに対し、その理由を膜物性と膜接着、ラプラス圧による膜界面効果の評価と、ゲル表面の粘弾性測定から迫ることを目的とした。その結果、膜の負帯電と膜によるミクロ閉じ込めがゲル弾性上昇

図 6 周波数 f = 0.01Hz の 5.0 wt% ゼラチンのバルクゲルとミクロゲルに対する粘弾性比（E ’’/E ’）の比較を生むこと、ランダムコイルがベーターシートへ転移することで従来のバルクゲルとは異なる粘弾性比を持つことが

2） M. Yanagisawa, S. Nigorikawa, T. Sakaue, K.

明らかとなった。この知見は、ゼラチン・ゲルに限定されFujiwara, M. Tokita, PNAS, 111, 15894-15899（2014）

ず、他の生体高分子ゲルに対しても成り立つことが期待さ

3） Sakai, N. Hiro-oka, S. Sasaki, S. Kidoaki, M.

れる。また、本研究により構築したキャピラリー吸引によYanagisawa, Nihon Reoroji Gakk., 47, 55-59,（2019）．

る粘弾性評価は、その他のミクロ材料の力学評価として役

4） 特願 2020-15270, 柳澤実穂 , 酒井淳 ,「粘弾性測定方法

立っており

7 , 8）および粘弾性測定装置」、今後は同様のサイズを持つ生細胞などの力学的評価にも応用可能であることを実証していきたい。

5） R. Wustneck, E. Buder, R. Wetzel, H. Hermel,
Cholloid Polym. Sci., 267, 429-433（1989）．

謝辞6） A. Sakai, A. Sakai, Y. Murayama, M. Yanagisawa,Langmuir, 36: 5186-5191（2020）．

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コーセー

7） Y. Kurashina, M. Tsuchiya, A. Sakai, T. Maeda, Y.

コスメトロジー研究財団に深くお礼申し上げます。

Jung Heo, F. Rossi, N. Choi, M. Yanagisawa, H. Onoe,（引用文献）

Appl. Mater. Today, 21, 100937（2021）．

1） A. Sakai, Y. Murayama, K. Fujiwara, T. Fujisawa, S.

8） S. Hayasaki, M. Shimizu, Y. Katsurada, A. Sakai, M.

Sasaki, S. Kidoaki, and Miho Yanagisawa, ACS Cent.

Yanagisawa, Y. Atomi, T. Watanabe, J. Fiber Sci.

Sci., 4, 477-483（2019）．

Technol., 76: 288-295（2020）．

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