接触過敏症の皮膚浸潤細胞に特異的に発現している遺伝子の解析

小東邦大学

理学部

林

芳郎

Although the cellular and molecular mechanisms underlying the delayed-type hypersensitivity (DTH) reaction havebeen intensively investigated, the functions of infiltrating leukocytes and skin resident cells in the elicitation phaseof the DTH reaction are not completely understood. To gain more insight into the role of these cells in the DTH
reaction, we performed differential display analysis aiming at identification of the genes showing elevated expression
during the DNCB-induced guinea pig skin DTH reaction. About 250 cDNA fragments, each corresponding to the 3'end of a RNA species, were obtained through differential display analysis. Characterization of 50 of them led to theidentification of 28 genes whose expression was elevated in the DNCB-induced DTH reactive tissue. Sequencing of
the 28 cDNA fragments and homology search analysis demonstrated that 10 of them represented known genes, someof which, in particular elafin (an elastase inhibitor) and ferritin, are considered to play roles in the DTH reaction. The
other 18 cDNA fragments are probably derived from unknown genes. Northern blot hybridization with the 18 cDNA
fragments as probes revealed that the expression of these genes during the DTH reaction changed with different
kinetics. Cloning of the cDNAs of two of these genes indicated that one is that for guinea pig tryptophanyl-tRNA
synthetase, a protein recently found to be induced by IFN-γ and upregulated during the late stages of mononuclear
phagocyte maturation in vitro. Strong induction of the gene for tryptophanyl-tRNA synthetase during the DTH
reaction suggests its involvement in the in vivo immune response.

質が放出され、炎症反応に関わっている。

１ 緒 言

この DTH 反応には様々なサイトカイン、ケ遅延型過敏症（DTH）はいわゆる細胞性免疫のモカイン、接着分子などが関係している。たと一種で、白血球の浸潤、フィブリンの沈着、血管えば抗体やノックアウトマウスを用いた研究か透過性の昂進などを特徴とする 。これには、ツら、ICAM −１、LFA −１、E −セレクチン、L −セベルクリン反応、ハプテンで惹起される接触過敏

レクチン、CD 4、IL −１、IL −８、IL − 12、IFN −症などが含まれ、いずれもランゲルハンス細胞がγ が必須であること、IL − 10、IL −１ra（IL −１レ

抗原提示に重要な役割を演じている。すなわち１セプターアンタゴニスト）が反応を沈静化するこ

回目の抗原投与時（感作）、活性化されたランゲとなどが明らかになっている。これらのほかにもルハンス細胞は所属リンパ節に移動して特異的 T

MIP −１α、MCP −１、TNF、IL −６など多様なサ細胞に抗原を提示してこれを活性化する。次いイトカイン、ケモカインが関わっているとの報告

で２回目の抗原投与（惹起）を行うと、抗原特異。さらに我々がある（たとえば文献２）や３）など）的記憶 T 細胞と単球などが活性化されて浸潤し、自身もモルモット DTH 反応に TNF や低分子量サイトカインなどの様々な因子を放出して、炎症マクロファージ走化性因子が関わっていること反応を増幅させる。このとき、これら浸潤細胞だを報告した４、５）。

１）

DTH 反応の大きな特徴は白血球の浸潤である。

けでなく常在性細胞や神経末端からも様々な物
Identification and Cloning of Genes
Associated with the Guinea Pig
Skin Delayed-type Hypersensitivity
Reaction
Yoshiro Kobayashi
Faculty of Science, Toho University

モルモット DTH 反応部位では約 40％が単球／マクロファージであった５）。ゼラチンスポンジモデ
ルで調べた報告によると最初に好中球が浸潤し、ついでリンパ球、単球が浸潤した。
DTH 反応について以上のように分子および細胞レベルで研究が進められているものの、従来は− 95 −

他の研究から推定されたものについて検討する

β −アクチン cDNA プローブを用いた。結果はという方向が主であった。そこで今回我々は、惹BAS 1000 バイオイメージアナライザで分析し起過程の解析が特に臨床上重要な意味を持ってた。

いることも考慮して、differential display 法を用・cDNA ライブラリーとクローニング：ConA 刺

いて DTH 反応の惹起時に発現が上昇している遺激モルモット脾臓細胞由来 mRNA を用いて、伝子を網羅的に取得することとし、動物としてモラムダ ZAPII にライブラリーを構築し、定法ルモットを選んだ。これはその DTH 皮膚反応がによりクローニングを行った。陽性のクローン

囓歯類のなかで最もヒトに類似しているからで由来の cDNA 断片はファージミドとして回収ある。

した。

２ 実 験

３ 結 果

・DTH 反応の誘導：ジニトロクロロベンゼン

３. １ DTH 反応で発現が昂進する cDNA 断片（DNCB）100 µg をフロイント完全アジュバンの特徴

トと混合し、モルモット（Hartley albino ♀、Differential display 法で約 250 種類の cDNA 断６〜７週齢）足裏に注射した。２週間後、毛刈片が DTH 反応で発現が昂進する遺伝子の候補とりした背部皮膚に DNCB エタノール溶液を塗して得られた。そこでその中から 50 種類を無作布、様々な時間の後皮膚を切除して以後の実験為に選び、惹起後 24 時間後の皮膚組織と同じ動に用いた。

物で惹起していない皮膚組織とから RNA を単離

・皮膚浸潤細胞と常在細胞の単離：既報 に準じ４）て単離した。

し、ノザンブロットハイブリダイゼーションを行ったところ、28 種類については確かに DTH 反応で・RNA の 単 離 と 精 製： 細 胞 か ら の 粗 RNA は発現が昂進していた。これらを DEG（differentiallyQIAshredders を用いて単離した。これはさらexpressed gene）と名付け、その塩基配列を決定に DNase I で処理した後 RNeasy Total RNAし、ホモロジー検索を行った。その結果、18 種

Kit で精製した。皮膚組織からの全 RNA はグ類がおそらくこれまでに報告されていないものアニジン中でポリトロンでホモジナイズ後、定で、残りの 10 種類は既知の遺伝子であろうと推法により抽出した。

定された（Table １）。これらの中には、エラフ・Differential display 法： 既 法 ６、 ７） に 従 い、ィン、フェリチン重鎖、Hox − 1 . 7、ミトコンドリ

EcoRI 部位を付加した 26 種類の 10 mer のプラ

アチトクロム b、リボソーム RNA、リボソームイマーと HindIII 部位を付加した３種類の１塩L 34 蛋白質などが含まれていた。

基アンカーオリゴ dT とを用いて、RT − PCRを行い、６％アクリルアミド８M 尿素ゲルで３. ２ 18 種類の DEG の DTH 反応における発分離し、目的のバンドを回収した。これをプラ

現の経時変化スミドに回収して塩基配列を決定し、FASTA

これら 18 種類の DEG の DTH 反応における役と BLAST を用いてホモロジー検索を行った。

割を知るためにまず、発現の経時変化を調べた。

・ノザンブロットハイブリダイザーション：全

その結果およそ３つのグループに分類できるこRNA を１％アガロースホルムアルデヒドゲルとが明らかになった（Fig. １）。

で分離、ニトロセルロースに転写、定法に従い、⑴ DEG ４、６、７、13 はその発現が 12 時間目に様々な cDNA プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。対照としてはモルモットピークとなった。
⑵ EG10、12、14 はその発現が時間とともにゆっ− 96 −

接触過敏症の皮膚浸潤細胞に特異的に発現している遺伝子の解析

Table １NameSize

The identified genes differentially expressed during the DTH reaction

Identity

Name

DEG# 1 167 bpunique
DEG ２129 bpunique
DEG ３141 bp
elafinDEG ４124 bpunique, 90％ homology
with D31886*
DEG ５149 bp
mitochondrion
cytochrome b
DEG ６162 bpunique
DEG ７201 bpunique
DEG ８156 bp
ribosomal RNA
DEG ９90 bp
MHC class II antigen
DEG 1073 bpunique
DEG 11 515 bp
ferritin heavy chain
DEG 12 253 bpunique, 70％ homology
with AA323500*
DEG 13 231 bp
uniqueDEG 14 358 bp
unique, 65％ homology
with AA261572* & T67068*
DEG 15 159 bp
Hox− 1.7 protein

Size

DEG 16 312 bp
with AC0015*
DEG 17 194 bp
DEG 18 127 bp
DEG 19 184 bp
with H11836*
DEG 20 246 bp
with N53996*
DEG 21 275 bp
DEG 22 213 bp
with AA211693*
DEG 23 160 bp
DEG 24 110 bp
DEG 25 124 bp
DEG 26 287 bp
DEG 27 326 bp
antigen
DEG 28 170 bp#DEG: differentially expressed gene fragments.
* accession number of EST, STS,GSS, or HTGS sequence data.

Fig. １− 97 −Identityunique, 90％ homologyuniqueribosomal L34 proteinunique, 60％ homologyunique, 80％ homology
uniqueunique, 80％ homologyuniqueuniqueunique
B cell activation gene
α chain of MHC class II
T cell receptor

くり増大した。

反映しているのであろう。一方フェリチンは鉄イ⑶残りの DEG はその発現が 24 時間目で最高とオンの無毒化、貯蔵に重要であり、特にマクロフなった。そのうち、DEG 16、17、20、22 は 48

ァージ内のフェリチンは細菌感染防御における時間でも発現がまだ高いのに対し、残りの７種鉄イオン代謝で重要な役割を果たしている８）。し類は 48 時間目にはほとんど対照レベルまで低たがって DTH において、活性化されたマクロフ下した。

ァージの鉄代謝が感染防御以外の未知の役割を演じている可能性があろう。またエラフィンはエ

３. ３ DEG 21 cDNA のクローニング

ラスターゼ特異的阻害剤で、上皮細胞で主に産生DEG21cDNA をクローニングしたところ、1896されるが好中球でも少量産生され、血管新生を制塩基の挿入配列をもつクローンが得られた。これ御しているといわれているから９）、DTH 反応では 305 残基のアミノ酸からなる蛋白質をコードで血管新生が関係している可能性があろう。最後にき、この部分はマウストリプトファン tRNA 合

Hox − 1 . 7 はホメオボックス遺伝子の一つで、本成酵素（WRS）のカルボキシル末端側と 94％の相来は発生過程でパターン形成に関わる遺伝子と同性がみられた。従って、DEG 21 はモルモットされてきたが、最近 T 細胞や NK 細胞の増殖とWRS であると結論された。

関連しているとの報告もある 10）。しかし現在のところこの遺伝子が生体内の免疫反応に関わっ４ 考 察ているかどうかは不明である。

これまで DTH の研究は、サイトカイン、ケ残りの 18 種類の DEG 断片はこれまでに報告

モカイン、接着分子など、他の研究から DTHされていない遺伝子ではないかと想定された。こでの役割が想定されたものについて調べるといれらの遺伝子の発現の DTH 反応に伴う経時変化う方向でなされてきた。今回我々は differentialはおよそ３種類に分類された。この発現のパター

dsplay 法により DTH 反応局所で昂進している遺ンが特定の細胞集団の数の増減を反映している伝子を直接単離するという従来とは別の方法を可能性もあるが、浸潤細胞で発現が実際に昂進し試みた。多くの生体内の反応がそうであるようにていて DTH 反応を制御している可能性もある。

DTH 反応も高度に複雑な反応であるから、我々DEG 21 は新規遺伝子と想定された DEG 断片のアプローチからまったく新しい知見が得られの一つであったがクローニングの結果モルモッる可能性が高いと考えられたためである。その結ト WRS 遺伝子であることが明らかとなった。

果、250 種類の cDNA 断片が候補として得られ、WRS 遺伝子はハウスキーピング遺伝子であるが無作為に 50 種類について調べたところ 28 種類

マクロファージで IFN − γ によって強く誘導さが DTH 反応で発現が昂進していた。この結果はれること 11、12）や、マクロファージの成熟化に伴DTH 反応が多くの遺伝子の関係した高度に複雑い増加すること 13）が報告されている。IFN − γな反応であるということと一致する。

によって誘導される免疫関連分子にトリプトフ

28 種類の DEG 断片の中で 10 種類はすでに報ァンを取り込むのに必要なのではないかとの説もあるが、誘導される意義は現在のところ不明

告されている遺伝子であった（Table １）
。これ

14）

らのうち、MHC や TCR の発現の増大は免疫応である。今回 DTH 反応でこの遺伝子の発現が昂答におけるこれらの役割を反映しているのであ進したことは WRS の重要な働きを示唆している

ろう。またリボソーム RNA や蛋白質、ミトコンのではないかと考えている。

ドリアチトクロム b の発現の増大は、DTH 反応

今後残りの遺伝子のクローニングを初め、それ局所に浸潤した細胞の活発な代謝や蛋白合成をらのコードする蛋白質の DTH 反応における役割− 98 −

接触過敏症の皮膚浸潤細胞に特異的に発現している遺伝子の解析を解明していかなければいけないと考える。

oligo-dT primers. Nucleic Acids Res. 22 , 5763 5764 , 1994 .

引用文献８）Harrison, P. M. & Arosio, P. : The ferritins:１）Turk, J. L. : Delayed type hypersensitivity,

molecular properties, iron storage function

2 nd edn. Elsevier/North Holland Biomedicaland cellular regulation. Biochim. Biophys. ActaPress, Amsterdam, 1980 .

1275 , 479 - 514 , 1996 .

２）Larsen, C. G., Thomsen, M. K., Gesser, B., et９）Webster, J., Jones, P.L., Sallenave, J.M.,

al. : The delayed-type hypersensitivity reaction

et al. :Elastase-specific inhibitor elafin andis dependent on IL- 8 : Inhibition of a tuberculin

endogenous vascular elastase (EVE) in vascularskindevelopment. FASEB J. 11 , A 224 , 1997 .

reaction by anti-IL- 8 antibody. J.

Immunol. 155 , 2151 - 2157 , 1995 .

10）Caré A., Testa, U., Bassani, A., et al. :３）Saulnier, M., Huang, S., Aguet, M., et al. :Role

Coordinate expression and proliferativeof interferon-gamma in contact hypersensitivity

role of HOX B genes in activated adult T

assessed in interferon-gamma receptor-lymphocytes. Mol.Cell. Biol. 14 , 4872 - 4877 ,

deficient mice. Toxicology 102 , 301 - 312 , 1995 .

1994 .

４）Higashi, N., Yoshizuka, N., Ohuchi, A., et al.

11）Fleckner, J., Rasmussen, H. H. & Justesen, J.

:Involvement of inflammatory cytokines in a: Human interferon gamma potently inducesdelayed-type hypersensitivity reaction. Cell.

the synthesis of a 55 -kDa protein (gamma 2 )Immunol. 161 , 288 - 294 , 1995 .

highly homologous to rabbit peptide chain５）Higashi, N., Yoshizuka, N. & Kobayashi, Y. :release factor and bovine tryptophanyl-tRNA

Phenotypic properties and cytokine production

synthetase.

of skin-infiltrating cells obtained from guinea

11520 - 11524 , 1991 .

pig delayed-type hypersensitivity reaction sites.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 ,12）Fleckner, J., Martensen, P. M., Tolstrup, A.

Cell. Immunol. 164 , 28 - 35 , 1995 .

B., et al. : Differential regulation of the human６）Bauer, D., Muller, H., Reich, J., et al. :interferon inducible tryptophanyl-tRNA

Identification of differentially expressed mRNA

synthetase by various cytokines in cell lines.

species by an improved display technique(DDRT-PCR). Nucleic Acids Res. 21 , 4272 - 4280 ,Cytokine 7 , 70 - 77 , 1995 .
13）Krause, S. W., Rehli, M., Kreutz, M., et al.

1993 .

: Differential screening identifies genetic

７）L i a n g , P . , Z h u , W . , Z h a n g , X . , e t a l . :markers of monocyte to macrophage

Differential display using one-base anchoredmaturation. J. Leukoc. Biol. 60 , 540 - 545 , 1996 .
14）Xue, H. & Wong, T. F. : Interferon inductionof human tryptophanyl-tRNA synthetasesafeguards the synthesis of tryptophan-richimmune-system proteins: a hypothesis. Gene
165 , 335 - 339 , 1995 .

− 99 −