皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討
和歌山県立医科大学皮膚科

神人正寿

Skin senescence may be induced by various factors including intrinsic aging and extrinsic aging. In this study, we
compared the expression of exosome and microRNAs in the serum and skin between young and senescent people. Exosome
expression was determined using ELISA and immunostaining. microRNA expression was evaluated by PCR array, real-time
PCR analysis, and in situ hybridization. microRNA was forcedly overexpressed using microRNA mimics. Cell senescence
was examined by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal).
We could not find significant correlation of age with exosome expression of serum or skin in young and senescentpeople. However, according to the result of microRNA PCR array, miR- 124 was the most increased microRNA in senescentskin when compared to young skin. in situ hybridization revealed that the signal for miR- 124 was evident in keratinocytes ofsenescent skin, but not in the young skin.
Cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) overexpressed with miR- 124 mimic changed theirmorphology to an enlarged and irregular shape. In addition, SA-β-Gal positive NHEKs were significantly increased by thetransfection of miR- 124 mimic.
The expression of miR- 124 was increased in the UVB-irradiated NHEKs compared to control cells in a dose-dependent
manner. Taken together, our results indicated that miR- 124 is increased by UV irradiation in keratinocytes, which causes cellsenescence.

1. 緒

基 程度の microRNAであり、様々な mRNAの three prime

言

untranslated regions（3 ' UTRs）の相補的配列に結合し翻他臓器の老化と比しての皮膚の老化の特徴として、intrinsic訳を阻害することで蛋白発現調節をしている。ヒトゲノムにはaging（内因性老化）とextrinsic aging（外因性老化）の 2 つ

2 , 000 種類以上の microRNA が存在することが分かっておの要因が存在する点がある。前者では加齢による細胞の機り、60 % 以上の遺伝子を制御しうると考えられている 1）。近年、能低下により皮膚の萎縮や細かいシワの形成がみられる一方microRNA が生体内で様々な遺伝子発現を調節することで細で、後者の主な原因は紫外線の影響により生じるphotoaging

胞増殖や分化において重要な働きをしていることが明らかに（光老化）であり、表皮の肥厚と深いシワ、シミ、さらには毛なっているが、microRNAの各疾患における役割も検討され細血管拡張などをきたす。しかしこのような複雑な老化に対つつある。例えば、全身性強皮症では miR-29 a が低下してする科学的アプローチは進んでおらず、シワ・シミなどの変化おり、targetであるコラーゲン遺伝子などの発現を増加させのそれぞれに特異的に関与する分子メカニズムは未だ分かっることで線維化に関与している 2）。microRNA 関連の研究論ていない。

文は H 31 . 2 月現在 Pubmed 上で約 82000 編と急速に増加し皮膚老化には上記のように遺伝素因と環境素因が発症にており、研究代表者らもmicroRNAと皮膚疾患に関してこれ関与すると考えられているが、研究代表者らはその環境素因まで 46 編の研究論文を発表している。その中で我々は皮膚を媒介するものとしてnon-coding RNAに注目してきた。ヒ

老化とmicroRNAの関連についての研究報告を他の研究室

トの細胞には蛋白質をコードしていないnon-coding RNA がにさきがけて行ってきた。具体的には老化皮膚にみられる血存在しこれまで「ゴミ」と思われてきたが、実は DNA（遺伝素管異常であるcherry angiomaでは血管内皮細胞が増殖して因）を後天的に修飾することで環境因子として DNA-mRNA-いるが、その血管内皮細胞で miR- 424 の発現が減少してお蛋白発現をオン／オフする機構であるエピジェネティクスにり、そのためにMEK 1 とcyclin E 1 が増加することで細胞増関わる（図 1）。小分子 RNAを主体とするものと比較的長い殖能が活性化し内皮細胞の腫瘍性増加をきたすことを見出し、RNAを主体とするものに分類され、前者の代表が平均 22 塩

このような経路の阻害が本腫瘍の新しい治療につながる可能性を示した 3）。さらに老化皮膚・紫外線暴露で多く出現する有棘細胞癌におけるmicroRNAの関与も明らかにしている 4）。

The role of exosome in skin aging and its
implications to therapy
Masatoshi Jinnin
Department of Dermatology, Wakayama
Medical University Graduate School ofMedicine

一方、H 29 年 7 月に国立がん研究センターが血液 1 滴に含まれるmicroRNA から 13 種類の癌を早期発見する新しい検査法を開発したことがプレスリリースされ注目された。従来、microRNAを含むRNAは体液中では RNase の働きにより直ちに分解されると考えられてきたが、実際には体液中の− 98 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

図1

coding RNA と non-coding RNA の相関

microRNA は比較的安定して検出できる。近年の研究によ射することで皮膚に強発現させるとブレオマイシンによる線維り、その理由は microRNA がエキソソームなどに保護されて化を抑制できることを示した。

いるからではないかと考えられている。エキソソームは細胞かさらにエキソソームそのものについても、我々は最近全ら細胞外に分泌される 0 . 1 µm 以下の小胞で、血液、唾液、尿、身性強皮症の皮膚線維化にエキソソームが関係することを関節液、さらには乳汁など様々な体液中に存在し、脂質二重初めて証明する 10）とともに、現在難治性皮膚潰瘍に対す膜で形成されているため非常に安定している（4 ℃で 2 週間保るエキソソームの臨床試験を行っている（NCT 02565264）存が可能）。内部には microRNAのほか、蛋白質や mRNAが、これは現時点で国内唯一のエキソソームの臨床応用のを含有している。その後分泌元の細胞の情報を持つエキソソ試みである。

ームがほかの細胞に取り込まれることによって細胞間コミュ以上のような取り組みを経て、本研究計画において我々ニケーションが行われていることも判明しており、様々な疾患は、皮膚老化においても microRNA やエキソソームの量、の病態における役割が精力的に研究されるようになった。例あるいはエキソソームの質（microRNA、蛋白質、あるい

えば悪性腫瘍において腫瘍細胞の転移先の臓器特異性を決は mRNA の発現プロファイル）が変化し、皮膚を構成する定するメカニズムはこれまで不明であったが、エキソソームに各細胞（角質細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など）の変化含まれるインテグリンにより規定されていることが報告され 6）、を誘導している可能性に注目し、皮膚老化と血液中・皮膚エキソソーム解析による早期癌の検出・診断やエキソソーム組織中の microRNA あるいはエキソソームの量および質治療などの可能性が示唆されている。の相関を調べた。

我々もこれまで microRNA が多数の皮膚疾患の病態に関

2. 方わるのみならず、その血中あるいは毛髪中濃度が全く新しい診断あるいは病勢マーカーになりうると同時に、治療のター法

2 . 1. 血清および皮膚組織ゲットとなる可能性を明らかにしてきた。たとえば尋常性乾癬

血清サンプルは、13 名の 27 〜 56 歳の正常人から採取しにおいては表皮の増殖をcyclin E 1 やMEK 1 を介して制御すた。また、0 ～ 10 歳の若年者と 80 ～ 100 歳の高齢者の顔るmiR- 424 の血清濃度がバイオマーカーとなることをみいだ

面の手術時の余剰皮膚をそれぞれ 3 例収集しホルマリン固7）した 。また、重症薬疹の皮疹部表皮では miR-124 が増加定・パラフィン包埋したものを研究に使用した。また、非露し、アポトーシスに抑制的に働くBCL 2 L 10 発現を抑えて皮光部の正常皮膚サンプルもそれぞれ 3 例ずつ用意した。

膚のアポトーシスを誘導するとともに、血清中 miR-124 濃度が重症度と相関することを明らかにした 8）。同様に、全身性2 . 2 . エキソソーム解析

強皮症の硬化皮膚では let-7aの発現が低下しており、皮膚血清中のエキソソームは ExoQuick（SBI 社）を用いて収線維芽細胞においてtargetであるコラーゲン発現を増加させ集した。 さらにそれぞれ のサンプルについて ExoELISAることで線維化に寄与している 9）。さらに血清 let− 7a 濃度はkit（SBI 社）を用いたenzime-linked immunosorbent assay

疾患の活動性と逆相関し、またマウスの腹腔内にlet-7aを注（ELISA）を行い、定量を行った。

− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20192 . 3 . microRNA PCR Array

2 . 8 . microRNA mimic

PCR アレイには細胞の分化および発生に関する 88 種類

内在性 microRNAの機能を模倣するようにデザインされの microRNA に対するプライマーがセットされた 96 -well

た合成二本鎖 RNAであるmicroRNA mimicは Qiagen 社か

RT 2 miRNA PCR Array Kit（SABioscience 社）を使用した。

ら購入した。本研究では miR- 124 に特異的な microRNA

Kit に含まれる house keeping gene を用い比較 Ct 法で解析

mimicおよびcontrol microRNA mimicを使用し、transfectionした。

reagent としては lipofectamine RNAiMAX（invitrogen 社）を用いて細胞に導入した。

2 . 4 . real-time PCR
Takara Thermal Cycler Dice（TP 800）により real-time
PCR 法を行った。プライマーとしては miR- 124 およびU 6 を使用した。

2 . 9. 細胞数測定
細胞数測定に際しては、接着細胞をトリプシン処理で浮遊させ、Coulter Particle Counter（Beckman Coulter 社）
で細胞数をカウントした。

2 . 5 . in situ hybridization
miR- 124 に相補的な配列を持つ 5’ -locked digoxigeninlabeled nucleic acid probe（Exiqon 社 ） を 使 用 し て、
4 µm に 薄 切 し た パ ラ フ ィ ン 包 埋 組 織 に 対 し て in situ

2 . 10 . 統計解析
統計解析として、中央値の比較には Mann-Whitney testを使用し、p 値 < 0 . 05 を統計学的に有意とした。

hybridization を施行した。

3. 結

2. 6. senescence-associated β-galactosidase（SA-β-Gal）
染色果3 . 1. 年齢とエキソソーム量の相関
最初に、27 〜 56 歳の正常人から血清中のエキソソーム

Cellular Senescence Assay Kit（Chemicon Internationalを抽出し、その抽出物を ELISA 法にて定量した。年齢とInc 社）を用いて行った。細胞に fixing solution を投与し 15

血清中エキソソーム量の相関を調べたが、明らかな相関を分間室温でおいた後、SA-β-gal Detection Solution を加え、認めなかった（R= 0 . 18 , P= 0 . 55 , 図 2）。また、免疫染色を37 度で１晩培養した。

施行したが老化皮膚とエキソソーム発現量を見いだすことができなかった（data not shown）。

2 . 7. in situ hybridization

そこで次に老化皮膚における microRNA 発現の検討を

正 常 ヒ ト 表 皮 角 質 細 胞（normal human epidermal

行った。

keratinocytes; NHEK）は Lonza 社から購入した。KGMGold Bullet Kit を用いて、5 % CO 2 インキュベーターで培養を行った。

3 . 2 . 老化皮膚とmicroRNAの検討
まず、若年者（0 ～ 10 歳）と高齢者（80 ～ 100 歳）の顔面

図2

正常人における、年齢と血清中エキソソーム量の相関− 100 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

皮膚組織 3 例ずつから抽出した microRNA を等量混合した化細胞の形態が大型化し細胞老化の兆候を示した（図 5）。

サンプルを用意し、それぞれの皮膚における microRNA のSA-β-gal にて老化細胞の核を染色すると miR- 124 mimic

発現パターンを PCR アレイで評価した。アレイに含まれを導入した細胞ではコントロール細胞よりも SA-β-gal 陽る 88 種類の microRNA の中で若年者に比べ高齢者の顔面皮膚で発現が増加しているものとして、let- 7 a, miR- 18 a,miR- 124 , miR- 192 , miR- 196 a, miR- 206 , miR- 208 , miR215, miR-219-5p, miR-302c, miR-488, およびmiR-518b
がリストアップされた。この中で最も発現の差が大きかった miR- 124 に注目した。アレイの結果を validate するためにサンプル数を増やし、miR- 124 に特異的なプライマーを用いて real-time PCR を行ったところ、miR- 124 は若年者に比べて高齢者の顔面の皮膚において発現が上昇しており、統計学的な有意差もみられた（図 3）。そのため、PCR アレイの結果が再現されたと考えられた。
次に、miR- 124 が老化皮膚のどの細胞で増加しているか局在を調べた。若年者および高齢者の正常顔面皮膚組織の in situ hybridization では、高齢者の表皮基底層が miR124 のプローブで染色されたが、若年者のほうでは染色されなかった（図 4）。つまり、miR- 124 は老化皮膚の表皮基底層で増加していると考えられた。
続いて、老化皮膚における miR- 124 の機能を調べた。
miR- 124 mimic を 強 発 現 さ せ る と 培 養 ヒ ト 正 常 表 皮 角

図4

図 3 若年皮膚（n=3）と高齢者皮膚（n=6）における miR-124 発現量の比較 *p<0.05

in situ hybridization 法による、若年者および高齢者の正常顔面皮膚組織の miR-124 発現の比較

図5

miR-124 強発現下での、細胞形態の変化− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 6 miR-124 強発現下での、培養正常表皮角化細胞の SA-β-gal染色率の変化 *p < 0.05

図 7 培養正常表皮角化細胞における、miR-124 発現量に対する UVB 照射の影響 *p < 0.05性細胞の率が有意に高くなった（図 6）。つまり、miR- 124

皮膚老化における関与の有無を再度確かめたいと考えていは表皮角化細胞において細胞の老化を誘導している可能性る。
本報告書は文献 11 の内容をもとに作成した。

が示唆された。
最後に、miR- 124 が老化皮膚で増加するメカニズムを検討した。培養正常表皮角化細胞に UVB 照射を 3 日間連（引用）続で行い、その 24 時間後に細胞から microRNA を回収し

1） Friedman, R.C., et al. Most mammalian mRNAs areた。miR- 124 の発現は、UVB の照射量に比例して上昇し、conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-コントロール群と 10 mJ 照射群では有意差が見られた（図105（2009）．

7）。逆に、非露光部の正常皮膚組織を用いて real-time2） Maurer, B., et al. MicroRNA-2 9, a key regulator ofPCR を行ったが、若年者と高齢者で miR- 124 発現に有意

collagen expression in systemic sclerosis. Arthritis

差は認めなかった（data not shown）。この結果により、紫Rheum. 62, 1733-1743（2010）．

外線暴露が老化皮膚での miR- 124 の発現上昇に関係して

3） Nakashima, T., et al. Down-regulation of mir-4 2 4contributes to the abnormal angiogenesis via MEK1いると示唆された。

4. 考

and cyclin E1 in senile hemangioma: its implications to察

therapy. PLoS One 5, e14334（2010）．

本 研 究 に お い て 我 々 は microRNA の う ち miR- 124 が4） Yamane, K., et al. Down-regulation of miR-1 2 4/-

老化皮膚において紫外線の影響で増加し、それによって

2 1 4 in cutaneous squamous cell carcinoma mediates

細胞老化を誘導していることを示した 11）。皮膚老化の予

abnormal cell proliferation via the induction of ERK. J.

防・改善はコスメトロジーの重要なテーマである。これ

Mol. Med. (Berl) 91, 69-81（2012）．

まで我々は基礎研究として、例えば老化の原因となる活

5） Shimozono, N., et al. NUP1 6 0-SLC4 3A3 Is a Novel

性 酸 素 を 除 去 す る Superoxide dismutase の 皮 膚 疾 患 にRecurrent Fusion Oncogene in Angiosarcoma. Cancer

おける研究歴を有する 12 - 14）。そして、この研究により皮Res. 75, 4458-4465（2015）．

膚老化の microRNA を介した分子機序が明らかになれば、

6） Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins

microRNA による皮膚老化・肌年齢の定量化や客観的評価

determine organotropic metastasis. Nature 5 2 7, 3 2 9-に加え、microRNA による皮膚老化のコントロールが可能

335（2015）．になる可能性がある。さらに、microRNA による皮膚老化

7） Ichihara, A., et al. microRNA-mediated keratinocyteの予防は美容という観点のみならず、皮膚老化に伴う様々

hyperproliferation in psoriasis vulgaris. Br. J. Dermatol.

な疾患（皮膚癌や皮膚掻痒症など）の予防につながる可能．
165, 1003-1010（2011）性もある。今後、miR- 124 のターゲットの同定も必要と

8） Ichihara, A., et al. Upregulation of miR-1 8a-5p

なるが、たとえば web 上のプログラムである Targetscan

contributes to epidermal necrolysis in severe drug

（http://www.targetscan.org/vert_ 72 /）では ERK 2 など細eruptions. J. Allergy Clin. Immunol. 1 3 3, 1 0 6 5-1 0 7 4胞増殖に関わる分子がターゲットと予測されている。

（2014）．

一方、エキソソームについても今後さらに皮膚および血9） Makino, K., et al. The downregulation of microRNA

清サンプル数を増やして実験を繰り返すことで、将来的にlet-7a contributes to the excessive expression of type

− 102 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

I collagen in systemic and localized scleroderma. J.

12）Jinnin, M., et al. Elevated serum levels of manganesesuperoxide dismutase in patients with eosinophilicImmunol. 190, 3905-3915（2013）10）Nakamura, K., et al. Altered expression of CD 6 3and exosomes in scleroderma dermal fibroblasts. Jfasciitis. Clin. Rheumatol. 22 , 505（2003）．
13）Jinnin, M., et al. Serum levels of manganesesuperoxide dismutase in patients with localized

Dermatol Sci. 84 , 30 - 39（2016）．
11）Harada, M., et al. The expression of miR-124 increases

scleroderma. Exp. Dermatol. 13 , 357 - 360（2004）．

in aged skin to cause cell senescence and it decreases14）Jinnin, M., et al. Serum levels of manganese superoxide

in squamous cell carcinoma. Biosci. Trends 1 0 , 4 5 4 -dismutase in patients with mixed connective tissue459（2017）．

disease. Clin. Exp. Rheumatol. 23 , 549 - 550（2005）．

− 103 −