皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生
陽森

東京薬科大学The involvement of tumor cell-fibroblast interaction in matrix metalloprotemases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) production was exam med. Co-cultures of human skin fibroblasts with human MCF-7 cells of epithelial ori­
gin showed increased MMP and TIMP production when compared to cultures of the in­dividual cells. The effect was dependent on the cellular ratio between human skin fibro­
blasts and MCF-7 cells. The stimulatory factors can be detectd in the conditioned medi­um from MCF-7 cell cultures. The addition of membrane fractions prepared from MCF-7 cells to the fibroblast cultures also stimulated MMP and TIMP production. However,kinds of increased MMPs were different from kinds of MMPs induced by soluble factors
released from tumor cells.
These results demonstrated that MCF-7 cells have two forms of stimulatory factor
MMP stimulatory factors that is present at outer surface of MCF-7 cells and MCF-7
cells derived factors that stimulate MMP production of fibroblasts.

MMPsはその基質特異性の違いから 3つのグ

1. 緒

言

ル ー プに大別される。 第1グル ー プは、 間質の主要構成成分であるI型コラ ーゲンを基質とする組皮膚病変や皮膚障害においてサイトカインの関

織性コラゲナ ー ゼ(MMP-1)に代表されるも与が報告されているがサイトカインと組織破壊にのである 第2グル ー プは、 基底膜の構成成分で関連する酵素との関係は必ずしも明確ではない。

あるIV型コラ ーゲンを分解しうるMMPであり、著者は皮膚線維芽細胞と表皮細胞など種々の細これには72kDa.IV型コラゲナ ー ゼ(MMP-2)胞間の相互作用によって皮膚線維芽細胞の産生すおよび92kDa.IV型コラゲナ ー ゼ(MMP-9)のる細胞外マトリックス分解酵素の変動を調べてい2種類が知られている。 これら酵素は変性コラ ー

るうち、 皮膚線維芽細胞とガン細胞の相互作用にゲンであるゼラチンに対しても強い分解活性を示

興味ある現象を見いだした。 そこで、 細胞外マトすことからゼラチナ ー ゼとも呼ばれている。 第3リックスの分解に関与する酵素の中で 特にマトのグル ー プは、 ストロムライシン(MMP-3)

リックスメタロプロテア

ー ゼ(MMPs)に着目に代表されるもので前者の中間的な基質特異性を有し、 プロテオグリカン、 ラミニンやフィプロネ

した。
Production of matrix degrading enzymes byskin fibroblast-tumor cell inter­actionYo MonTokyo College of Pharmacy

クチ ン な ど も 分 解 す る 。 また MMP-3はproMMP-1やproMMP-9の活性化にも関与して い る こ とか知 られ て い る 。 一方、 これ ら
MMPs産生細胞から共に産生され1: 1のモル比でMMPsを不活化する組織性メタロプロテア ー ゼ
インヒビタ ー (TIMP)が知られている。 従って今日では局所におけるMMPsとTIMPの量的-57-

バランスの崩れが細胞外マトリックスの分解を誘起すると考えられて いる。

究所竹沢俊明博士よりそれ ぞれ提供を受けた。
正常ヒト乳腺上皮細胞はクラボウよりMamma­

以上のことから著者は、 正常ヒト乳腺上皮細胞
および乳ガン細胞株MCF-7 、 および BT-20細

ry Pack Kitを購入し使用した。 細胞は5% CO2-95% air気相下、 37℃で75c面flaskを用いて培胞を使用し、 正常ヒト 線維芽細胞 との細胞間相互作用の面からMMPおよびTIMP産生に ついて検討を加え た。

養 し、 細胞が confluentになった時点で随時継代した。 その際、 培養液は線維芽細胞 、 MCF-7細胞およびBT-20細胞 については10% ( v/v)

2. 実験材料および実験方法

FBS/MEM を 、 正 常 ヒ ト 乳 腺 上 皮 細 胞 はMammary Pack Kitに付属していたMEGMを使用した。 なお全ての実験において 線維芽細胞は

2. 1 培養器具および試薬
細胞培養プラスチック器具はCorning製；
Eagle's minimum essential medium
C MEM) はGland Island Biochemical Co.
2+2+
製； Ca and Mg free phosphate-bufferedsaline (PBS (-))は日水製薬製； fetal bovime

継代数12-22のものを、 正常ヒト乳腺上皮細胞は継代数9-10の ものを使用した。
混合培養は線維芽細胞がconfluentになった時
点で乳腺上皮細胞 、 MCF-7細胞あるいはBT20細胞を混合 し、 10% ( v/v) FBS/MEMで 24
h培養 した後、 0.2% ( w/v) LAH/MEMで洗

serum (FBS)はM. A. Bio-products製；
alkaline phosphatase-conjugated goat anti
- (rabbit IgG) IgG, alkaline phosphatase­conjugated donkey anti- (sheep Ig·G) IgG, 5

浄、 同培養液に交換した。 また MCF-7細胞培
養上清、 MCF-7細胞膜画分に よる線維芽細胞の処理は、 線維芽細胞がconfluentになった時点で-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, Ni­
tro Blue TetrazoliumはSigma製； Sephadex
G-75は Pharmacia 製； gelatinはDIFCO
Laboratories Co. 製； human recombinant

中で実施した。 それぞれの培養上清は培養処理
48h後に回収し、 ー20℃で凍結保存し試料とした。

Transforming Growth Factor (TGF) aはGIBCO BRL 製 ； polyclonal goat anti
- (human TGF a) IgG は R&D Systems
Inc. 製； human platelet TGF /3 1はキング醸

造製をそれぞれ購入し使用した。 なおSheep an­ti- ( human proMMP-1, MMP-3 お よび
TIMP)および Rabbit anti- (human proMMP-2)抗体はKansas大学医学部Hideaki Na­
gase教授より提供を受けた。
その他の 試薬は全 て特級試薬を使用した。
2.2 細胞培養および処理方法
ヒト乳ガン細胞株MCF-7細胞およびBT-20
細胞は防衛医科大学校小佐野博史博士より 、 正常ヒト皮膚線維芽細胞はグレ ー ス株式会社中央研-58-

0.2% (w/v) LAH/MEMで洗浄後、 同培養液

2. 3 MCF-7 細胞培養上清の調製
MCF-7細胞を75c面flaskで培養し、 conflu­
entになった時点で 0.2% (w/v) LAH/MEM
で洗浄 し、 同培養液に交換した。 48h後に培養上清を回収 、 4℃、 l,OOOrpmで 5min遠心分離し、さらに上清を45 /.Lillのシリンジフィルタ ーに て細胞を完全に除去した。 回収した上清はフィルト
ロン OM-5 membrane (岩城硝子社製）を用いて限外ろ過をし、 100倍に濃縮したものをー20℃
で凍結保存し試料とした。
2.4 MCF-7細胞膜画分の調製
Biswasらの方法 ll に従って調製 し、 試料とした。

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酪素の産生

2. 5 MM P-3およびゼラチナーゼの活性測定
培養液中の潜在型 MMP-3およびゼラチナ ー
ゼの活性化は培養液に 2mM APMA(50mM製）を用いて200mAでlh転写させた。転写後た
だちにニトロセルロ ー ス膜をドライミル ク 溶液(10%(w/v) fatty-free dry milk/lOmM

Tris-HCl/0.9 % (w/v ) NaCl/0.02 % ( w/v) NaN 3(pH 7.5)) に浸しlOminのblock­in gを行い、 ついで蒸留水およびTBS buffer(50mM Tris-HCl/200mM NaCl (pH 7.5))'l'ris-HCl/150mM NaCl/lOmM CaCh ( pH

7 .5)に溶解）を等量添加し、 ゼラチナ ー ゼ 活性は5min 、またMMP-3 活性は30min 37℃でそれぞれインキュベーションして実施した。 MMP

にて 数回洗浄した。洗浄 後1% ( w/v) BSA/

-3の活性測定は［旧］カ ルボキシメチル 化ト ランスフェリンを基質 2) とし、 10 µ1の基質溶液(3mgトランスフェリン /ml 、 240,000dpm/mgト
ランスフェリン）に活性化した酵素液 10 µ1を加え37℃で一 定時間反応させた後、氷冷した 3.3%(w/v)トリクロル酢酸(TCA) を200µ1 加え、8,000 X gで5min遠心分離し得られた上清100µ1の放射活性を液体シンチレー ションカウンタ ーにて測定した。 ゼラチナ ー ゼ 活性 測定はCowston
and Barrettの方法 3) で調製した[ 14c Jアセチ
ル 化 Type Iコラーゲンを60℃ 、 20minインキュ
ベーションしゼラチン化 させたものを基質とした。
200µ1の基質溶液(4mgゼラチン /ml 、 3,000
dpm/mgゼラチン）に活性化した酵素液100µ1を加え 37℃ で一 定 時 間 反 応 させ た後、60 % Cw/v) TCAを100µ1 加え、8,000 X gで5min遠心分離し得られた上清100µ1の放射活性を液体シン
チレ ー ションカウンタ ーにて測定した。 なお酵素

活性 1 unitは上記条件下でlminに1 µgのゼラチンを分解 する酵素量とした。
2. 6

Western blotting法

細胞培養上清に終濃度3.3%になるよう TCAを加え、 8,000 X gで5min遠心分離し、 得られた沈殿にLaemmliの方法 4) に従って 調整した
sample solutionを加え、 7.5%から13% Cw/v)アクリルアミド ゲル を用い て SDSー ポリアク

リルアミ ド ゲル電気泳動(SDS-PAGE) を行った後、 ゲルをtransfer buffer(20mM Tris/
150mM glycine/20% C v/v) methanol/0.1%(w/v) SDS)に浸したニトロセルロ ース膜 に密着させ、セミドライ型転写装置（マリソル社

PBS (-)で希釈した1次抗体溶液に4℃で12h以上浸した。 1次抗体結合 後、 blockingおよび洗浄を同様に行い1% (w/v) BSA/PBS(-)
で希釈した
アル カリフォスファタ ー ゼを結合した
2 次抗体溶液に室温でlh浸した。 その後TBS
bufferで数回洗浄し、 基質溶液(0.4mM Nitro
Blue
Tetrazolium/0.4mM 5-bromo-4chloro-3-indolyl phosphateをlOOmM Tris­

HCl/lOOmM NaCl/5mM MgCb (pH 8.0)に溶解）に浸し適当な時間発色させた。 発色後、 蒸
留水およびTBS bufferですばやく洗浄しstop
solution ( 20mM Tris-HCl/5mM EDTA

(pH8.0))に適当な時間浸した後、 ろ紙にて脱水し乾燥した。
2. 7 Gelatin zymography
ゼラチン(1.2mg/叫）を含む7.5% (w/v)ア

クリルアミドゲル を用いて非還元条件下で、Laemmliの方法 4) に従い SDS-PAGEを行った後、 ゲル 中からSDSを除去するため2.5%(vIv) Triton X-100を含むbuffer(50mM Tris
-HCl/5mM CaClり1µ, M ZnClz/0.02% (w/v)
NaN3 (pH 7.5)) でlh洗浄 後、 37℃で適当な時間Triton X-100を含まない 上記buffer中でインキュベーションした。 その後ゲル を染色液
(0.1 %(w/v) Coomassie Brilliant Blue/50% ( v/v ) methanol/20 % C v/v ) aceticacid) 中、 静かに浸とうしながらlOmin 染色し、その 後 30 %( v/v ) methanol/1 % ( v/v )formic acidにて脱色処理を行った。

-59-

』一

正常乳腺上皮細胞あるいは乳ガン細胞株(MCF-7およびBT-20細胞）と正常線
維芽細胞との混合培養におけるMMPsお仁proMMP-1

UOJ
I
gnpoJd
a>l
eau

3. 1

:

r・

]
A

3. 実験結果

よびTIMP産生の検討
正常乳腺上皮細胞あるいは2種の乳ガン細胞株(MCF-7およびBT-20細胞）と 正常 線維芽細
生をウエス タンプ ロ ット法 により検討した。
Fig.lに示したように 線維芽細胞単独のみでも

凡二
]
c
［

proMMP-1 [A]、 proMMP-3 [ B] および
TIMP [CJ産生を認めた
Clane1)が、 MCF-20細胞Clane 4)との混合培養ではTIMP産
生はMCF汀細胞との混合培養時とほぼ同様であるが（それぞれ1.56倍および1.6倍） proMMP-1およびproMMP-3産生には顕著な変化は認められなかった。 また正常乳腺上皮細胞、 MCF-7細胞およびBT-20細胞それぞれ単独 (lanes
5-7)てはこれらの産生はいずれも認められなかった。
次に、 proMMP-2産生についてもウエスタン
プロット法およびゼラチンザイモグラフィ ー により検討した(Fig.2)。 正常乳腺上皮細胞と線維芽細胞との混合培養Clane 2)では、 線維芽細
胞単独Clane 1)と比べ変化を認めなかった。
しかしMCF-7細胞 (lane3)、 あるいはBT-20
細胞 (lane 4)と線維芽細胞との混合培養では

Fig.1← TIMP

7
6

1

がら、 正常乳腺上皮細胞Clane 2)あるいはBTuon:
rnpoJda11ne1a�-7細胞と混合培養することにより、 それぞれ10倍、 4.2倍、 1.8倍増加したClane3)。 しかしなこ

胞との混合培養におけるMMPおよびTIMP産仁proMMP・3[B]

Production of MMPs and TIMP by hu­
man skin fibroblasts cocultured withnormal or neoplastic breast cells. Con­
fluent fibroblasts at the 18th passage
were coculturedwith normal or neoplas­
tic breast cells in 10 % (w/v) FBS/
MEM for 24h, and then the medium waschanged to 0.2 % (w/v) LAH/MEM
and incubated further for 48h. The har­vested medium was performed to west­
em blot with antibodies against
proMMP-1 〔幻 、proMMP-3 〔B〕'吋
Tl叩〔CJ as described in the methods.
Lane 1, human skin fibroblast(HSF) ; lane 2、coculture of HSF andnormal human mammary epithelial
cells ( HMEC) ; lane 3, coculture of
HSF and MCF-7 cel Is ; lane 4, cocultureof HSF and BT-20cells; lane 5, HMEC;
lane 6、 MCF-7 cells and lane 7, BT-20
cel Is.

proMMP-2産生はそれぞれ 2.94倍および3.15倍の増加が認められた。 また正常乳腺上皮細胞、

3. 2 MCF-7細胞と正常線維芽細胞との混合培

MCF-7 細 胞 、 BT-20 細 胞 そ れ ぞ れ 単 独養によるMMPsおよびTIMP産生におよ(lanes 5-7)では、 proMMP-2産生はいずれ

ぼすMCF-7細胞数の影響も認められなかった(Fig.1-2)。

MCF-7細胞と線維芽細胞とのi昆合培養におけるMMPsおよびTIMP産生におよばすMCF-7細胞の細胞数の影響を検討した。 Fig.3に示され-60-

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生

1
l
←l ,

6

7

5

1

uononpoJ
d
a>ne1
a1:1

ニ

たように、線維芽細胞のみClane 1)と比較し、MCF-7細胞の細胞数を段階的に増やしながら混合培養する(lanes 2-6)と、 MCF-7細胞の細胞数の増加に従ってproMMP-1 [ A J、
proMMP-3 [ B]およびTIMP [ CJ産生の増加が認められ、線維芽細胞とMCF-7細胞の細胞数比が2: 1Clane 6)のときは増加率がそれ
ぞれ 3.7倍、 2.4倍および1.3倍であった。 しかしながらMCF-7細胞のみClane 7)では、 これ

Fig.2

Production of proMMP-2 by HSF cocul­
tured with normal or neoplastic breast
cells . The conditioned medium in Fig.1
was performed to gelatin zymography orwestern blot with antibody against
proMMP-2 as described in the methods.
Lane 1、 HSF; lane 2, coculture of HSF
and HMEC ; lane 3, coculture of HSF
and MCF-7 cells ; lane 4, coculture of
HSF and BT-20 cells; lane 5, HMEC;
lane 6, MCF-7 cells and lane 7 , BT-20
cells.

らの産生はいずれも認められなかった(Fig.3-4)。
次に、 proMMP-2産生についても同様検討した。 Fig.4 に示したように、 混合培養におけるMCF-7細胞数 が増えるに従ってproMMP-2産生は増加し(lanes 2-6)
、線維芽細胞とMCF7細胞の細胞数比が2: 1Clane 6)のとき4.3倍まで増加した。 しかし MCF- 7細胞のみ(lane7)では、 proMMP-2 産生は全く認められな[BJ.,,g 3"'"o 1>ua:C.

Production of MMPs and TIMP in cocul—
ture of HSF and MCF-7 cells. Confluent
HSFs at the 17th passage were cocul­
tured with various cell number of MCF7 cells in 1 0% (w/v) FBS/MEM for 24h,and then the medium was changed to 0.2% (w/v) LAH/MEM and incubated for
48h. The harvested medium was per­formed to western blot with antibodies
against proMMP-1 (A〕 ， 訂oMMP-3(B〕 , or Tl叩〔C〕 as described in
the methods. Lane 1, HSF ; lanes 2-6,
HSF cocultured with MCF-7 cells (ra­tios of ce!I number of HSF: MCF-7; 32:. , respective1, 1 6 : 1, 8 : 1 4 : 1 and 2・1ly) and lane 7, MCF-7 cells.

Fig.4

7

7

5

6

6

5

4

4

3

Fig.3

2 3

1

C 5. 1
.. 1
uo11
unpo,
d
3>eau

．
．

<1)�

5 3 1
d
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uon:
aAl
eau

＝コ2,-

□

3 2 1
uononpoJ
d
a>eau

かった。

Production of proMMP-2 in coculture of
HSF and MCF-7 cells. The conditioned
medium in Fig. 3 was performed togelatin zymography or western blot with
antibody against pr凶MP-2 as de­scribed in the methods. Lane 1 、 HSF;
lanes 2-6, HSF cocultured with MCF-7
cells (ratios of cell number of HSF :MCF-7; 32: 1 , 16: 1, 8: 1、4: 1 and 2 : 1,
respectively) and lane 7, MCF-7 cells.

3.3 線維芽細胞のMMPsおよびTIMP産生におよぼすMCF-7細胞の培養上清の影響
Fig.5に示したようにMCF-7細胞培養上清中-61-

冒璽暑旦璽こ [BJ[A]

proMMP-3

TIMP

Clane 3)にはproMMP-1 [A]、 proMMP-

Fig.6

TIMP

2

UO!I
Oll
PO」d
8>-ea8

Effect of MCF-7 conditioned medium(MCF-7-CM) on the production of
MMPs and TIMP by HSF. Confluent
HSFs at the 18th passage were treatedwith MCF-7-CM in 0.2% (w/v) LAH/
MEM for 48h, and then the harvested
medium was performed to gelatin zy­
mography or western blot with. antibod­
ies against proM叩-1 〔A〕 ， 釘oMMP-2 (B〕，proMMP崎〔C〕 , or TIMP〔D) as described in the methods. Lane
1, untreated HSF ; lane 2,HSF treatedwith MCF-7-CM and lane 3, MCF-7CM.

2 1

[CJ

2

POJd
Oll
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-eau

2 1

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雪雪誓誓履←

proMMP・2

2 1

21．
． 3uo,
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A
． 1
．
g
•
1
•
=
1:l
proMMP-3[CJ｀口 f[J口!= [BJ｀

proMMP-1

proMMP・1

Effect of plasma membrane of MCF-7
cells on the production of MMPs and
TIMP by HSF. A high-speed membrane(100,000 x g) fraction was preparedfrom sonicated MCF-7 cells as de—scribed in the methods. Confluent HSFs
at the 19th passage were treated withmembrane fraction of MCF-7 cells in 0.2% (w/v) LAH/MEM for 48h, and thenthe harvested medium was performed
to gelatin zymography or western blot
with antibodies against proMMP-1〔A) , proM血-2 〔B〕 ， 町oMMP-3〔 C 〕 、 or TIMP 〔 D〕、Lane 1, un廿ea←
ed HSF; lane 2, HSF treated with mem­brane fraction of MCF-7 cells and lane
3, membrane fraction of MCF-7 cells.

2 [BJ、 proMMP-3 [ C]およびTIMP [DJのいずれも検出されなかったが、 この培養上清をも検出されなかったが、 このMCF-7細胞の細胞

線維芽細胞に添加し培養する(lane 2 )と、 混

膜 画 分 を 線 維芽細 胞 に添 加 することに より合培養したときと同様proMMP-1、 proMMP

proMMP-1、proMMP-3およびTIMP産生が-2 、 proMMP-3およびTIMP産生の顕著な増促進したClane 2)。 しかしながらproMMP-2産加が認められた。

生には変化が認められなかった([B]lane2)。

3.4 線維芽細胞のMMPsおよびTIMP産生に

3. 5 線維芽細胞のゼラチナ ー ゼ活性におよぼすMCF-7細胞培養上清の影響およぼすMCF-7細胞膜の影響
MCF-7細胞の細胞膜画分を線維芽細胞に添加

これまでMCF-7細胞培養上清 により線維芽細したときのMMPsお よ びTIMP産生を検討し胞のMMPs産生が促進することが明らかとなった (Fig.6) 。 MCF-7 細胞膜画分Clane 3)

たが、 同時にこれらの阻害活性を有するTIMPにはproMMP-1 [ A]、 proMMP-2 [ B]、

産生も促進することが示された。 そこで実際の活proMMP-3 [ C]およびTIMP [ D]いずれ

性発現におよぼす影響について検討した。 Fig.7-62-

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生に示したようにMCF-7細胞培養上清にはゼラチ

Table 1. Effect of MCF-7-CM on the growth of
HSF in growth phase.

ナ ー ゼ活性はほとんどないが、MCF-7細胞培養
上清を線維芽細胞に添加することにより、ゼラチ-

Cell number (x 10 4 celh/well)

ナ ー ゼ活性は、3-5倍に有意に増加した。

5

Control

3.81 • 0.17

5.85 • 0.44

HCF-7-CH(100%)

4.90 • 0.66 ••6.50 • 0.43 •01

一方、正常乳腺上皮細胞との混合培養ではMMP

5

0

>i
l
>l
k
ue aseu11e1a,i

HSFs at the 19th paeeage (3 x 104 cells/veil) vere Incubated In
12 mu! tlvellplate !or 2 h, and then medium vas changed to MEM o r
SX(v/v) FBS/MEM containing condonsad MCF-7-CM corr●● ponding t o!OOX(v/v) original CM. A!ter 48 h cultiv&tion, cell number o ! HSF
vas counted. The d●ta are expres,ed as the mean values • SD o! 6
wells. • and ••, significantly di!!erent from cont:ol (p<0.05 •nd
p<0.01, respectively).

5
1．

(E /SlJ
Un)

0
2．

＊＊

Serum concentration (X, v/v)
0Treatment

産生はほとんど影響がなかった。 また正常乳腺上皮細胞や乳ガン細胞株自体にはこれらのMMP産生能は認められなかった。 このことから混合培養

HSF+MCF-7 CM

Fig.7

によるMMP産生の増加は正常乳腺上皮細胞ではEffect of MCF-たCM on the gelat1naseactivity produced by HSF. Confluent
HSFs at the 12th passage were treatedwith MCF-7-CM (12.5% . 25% , 50% ,and100%,respectively) in 0.2% (w/v) LAH/MEM for 48h. The harvested
medium was performed to assay for
gelatinase activity as described in themethods. Results are presented as themean士SD of 3 wells. • and ● •, signifi­
cantry different from untreated HSF (p<0.05 and p<0.01, respectively) .

見られず、乳ガン細胞株にのみ認められるが、細胞株によっても異なることも明らかとなった。 さらにMCF-7細胞と線維芽細胞の混合培養の細胞数比を変化させたところ、MCF-7細胞の細胞数に依存してMMPs産生が増加した。 混合培養において免疫蛍光法によりproMMP-1、 -2およびー3の産生細胞を検討したところ、proMMP1およびー3の増加は線維芽細胞の産生能の促進の3.6 線維芽細胞の増殖におよぼすMCF-7細胞結果であることが明らかとなった。

（未発表デ ータ）

培養上清の影響
線維芽細胞の増殖におよぼすMCF-7細胞培養

この線維芽細胞 5 - 6 lの MMPs産生を促進させ

上清の影響を検討した。 Table.lに示したようにる因子としてMCF-7細胞から産生される液性因

MCF-7細胞培養上清は線維芽細胞の増殖を無血子によるものと、MCF-7細胞と線維芽細胞が接清および5%血清存在下ともに有意に増加させた。

着することによる場合 ” が考えられる。

察

4. 考

MCF-7細胞の培養上清を線維芽細胞に添加したところ、混合培養の時と同様proMMP-1、
proMMP-2、proMMP-3およびTIMP産生が今回、正常乳腺上皮細胞と2種の乳ガン細胞株促進したのに対し、MCF-7細胞の細胞膜画分添を用い 正 常 線 維 芽 細 胞 と の 混 合 培 養 に よ る

加ではproMMP-1、proMMP-3およびTIMP

MMPs産生を検討した。 MCF-7細胞との混合産生は促進するもののproMMP-2産生には変化培 養 で は proMMP-1 、 proMMP-2 お よ びが認められなかった。 従ってMCF-7細胞の産生

proMMP-3産生が著しく増加した。 BT-20細するMMP産生促進因子は細胞膜と液性因子とで胞においてはproMMP-2産生は増加したが他の異なることが示唆された。

MMP産生ではあまり変化が認められなかった。

一方、MMPsは、通常はこれらの産生細胞が-63-

同時に産生すると理解されている。組織性メタロ

生促進作用の結果と併せて、線維芽細胞のMMP

プロテア ー ゼインヒビタ ー (TIMP)と1:1のモ

産生を促進させる因子は増殖因子を含めて複数存

ル比で複合体を形成することにより不活化される。

在することが示唆された。

proMMP-2 お よ び proMMP-3 は そ れぞれ

以上、乳ガン細胞株MCF-7細胞と正常線維芽TIMP-2とTIMP-1と特異的に結合し活性化を細胞との細胞間相互作用について検討した。in

阻害する。従って局所でのMMPsとTIMPとのvivoでのMCF-7細胞の転移能を検討した報告

量的バランスがMMP活性発現に重要であるとさはあるがその詳細な機構についてはほとんど明られている。

かではないが、本実験からMCF-7細胞は自らはSchultzら

8)

は、rTIMP-1は腹腔内投与によりマウスB16メラノ ー マの肺転移を抑制すること、
Kohkhaら

9)

全くMMPsを産生しないがMCF-7細胞が産生する液性因子あるいは 接着することにより線維芽は、TIMP-1のアンチセンスcD­細胞はMMP産生を促進することが明らかとなっNAを正常マウス3T3細胞に発現させてTIMP-

た。またこの結果はガン転移における正常細胞由1の産生を抑制すると浸潤性と転移能を獲得した

来のMMPsの関与を強く示唆するものである。

細胞が得 られることを、逆にDeclerck ら I O lは

しかも今日までガン細胞の産生するMMP産生促

TIMP-2のcDNAを導入発現させることにより進活性が液性因子および接着の二通りで行われる転移能が低下することを報告している。これらの例はMCF-7細胞が最初であり、またこのMMP

事実はTIMPが転移抑制遺伝子産物のひとつで産生を促進させる因子は、複数存在することが示あることを示すと共に、MMPとTIMP産生の唆された。しかしこれらの因子については同定す

量的不均衡が転移性浸潤を誘起する要因になってるまでには至らず、さらに検討が必要であると考いる可能性を示唆している。

えられる。

今回線維芽細胞のゼラチナ ー ゼ活性におよぼす
MCF-7細胞培養上清の影響を検討したところ、

引用文献

線維芽細胞のゼラチナ ーl ) Biswas, C. and Nugent, M. A.

ゼ活性の有意な増加を認めた。従ってMCF-7細胞の培養上清を線維芽細胞に添加することにより線維芽細胞のMMPおよ(1987) J.

Cell. Biochem., 35, 2 47-258
2 ) Vater, C. A., Nagase, H. and Harris, E. D.

びTIMP 産 生 は共に増 加 す る が 、 全体 として

Jr. (1986) Biochem. J., 237, 853-858

MMP産生がTIMPに対し優位であることが明

3) Cawston, T. E. and Barrett, A. J. (1979 )らかとなりMCF-7細胞と正常細胞との相互作用によるMMPsの増加が転移浸潤に強く関与してAnal. Biochem. 99, 340-345
4) Laemmli, U. K. (1970) Nature (London) ,277, 680-685

いることが示唆された。
一方、MCF-7細胞培養上清添加により線維芽細胞の増殖は有意に促進されることが明らかとな
り、このことから線維芽細胞のMMP産生を促進

5) Nakajima, M., Chop, A. M. (1991) Semrn.
Cancer Biol., 2, 115-127
6) Pyke,C.,

Ralfkiaer,

E.,

Huhtala,P.,

するのはMCF-7細胞培養上i青中の増殖因子であHurskainer, T., Dano, K. and Tryggrason,

る可能性が示唆された。またMCF-7細胞培養上

K. (1992) Cancer Res., 52, 1336-1341

清をゲルろ過にて分離した場合、ゼラチナ ー ゼお7) Nabeshima, K., Lane, W. S. and Biswas, C.,

よびproMMP-3産生促進活性は異なることが示(1991) Arch. Biochem. Biophys., 285, 90-96

され、また先の線維芽細胞にMCF-7細胞培養上

8) Shultz, R. M., Silberman, S., Persky, B., Ba­

清あるいは細胞膜画分を添加したときのMMP産

jkowski, A.S. and Carmichael, D.F. (1988)

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I

皮慈線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生

Cancer Res., 48, 5539-5545

M. (1992) Cancer Res., 52, 701-708

9) Kohka, R., Waterhouse, P., Yagel, S., Lala,
P. K., Overall, C. M., Norton, G. and Den­

（本研究の 一 部は第65回日本生化学大会

hardt, D. T. (1989) Sience, 243, 947-950
10) Declerck, Y. A., Perez, N., Shimada, H.,
Boone, T. C., Langley, K. E. and Taylor, S.

C 1992)において中島、 伊東、 森によって発表された。）-65-