ポリフェノールの皮膚における抗老化作用の検討

金澤成行

大阪大学大学院医学系研究科形成外科学 博士課程
（現 大阪大学大学院医学系研究科形成外科学 助教）

諸言100 μM）
・カテキン（0、1、10、100 μM）を添加し、24

活性酸素・フリーラジカルは生命を維持するために必時間後の細胞数を、吸光度 490nm として表されるホルマ要であるが、様々な物質に対して非特異的な化学反応をザン産物の量を測定することで比較した（CellTiter 96 Ⓡもたらすために、その有害性が近年指摘されている。細

Ｒ AQ One Solution cell proliferation assay; Promega）。

胞内の酵素で分解しきれない余分な活性酸素は癌や生活

なお、カテキンについては過酸化水素（0.1mM）による習慣病など様々な病気の原因であるといわれている。ま酸化ストレス負荷をかけた後、実験を行った。

た、活性酸素の増加が、細胞を傷つけ癌を増加させるの
2. ウエスタンブロッティング法

みでなく、しみ、くすみなどの原因となるメラニンを増加させてしまうことが知られている。そして、活性酸素・線維芽細胞をクロロゲン酸 10μM 存在下で 30 分間

フリーラジカルによる細胞のダメージは皮膚の老化にも培養した後、タンパクを抽出し Akt、CREB のタンパク悪影響をもたらしていると考えられている。

活性の変化を調べた。さらに、Akt の上流である PI3-

近年、コーヒーに含まれるポリフェノールの一つであkinase を LY294002（10μM）で阻害した後、先程とるクロロゲン酸が強い抗酸化作用をもち、フリーラジカ同様に CREB の活性化を調べた。

ルの生成を阻害するという仕組みが明らかになった。ま次に、過酸化水素（0.1mM）による酸化ストレス条た、ワイン、茶、リンゴ、ブルーベリーなどに多く含ま件下にカテキン 10μM で線維芽細胞を 30 分間刺激しれるカテキンも抗酸化作用をもち、活性酸素を抑えるとた後、JNK や p38-MAPK の蛋白活性化の状態を解析し考えられている。そこで、抗酸化作用をもつクロロゲンた。

酸やカテキンは皮膚の老化をある程度予防できる可能性
3. タネル染色があるのではないかと考えた。
皮膚の老化において、主要な役割を担っている細胞のDNA 鎖分解物の標識法（TUNEL）に基づく単一細一つに皮膚線維芽細胞がある。皮膚の弾力にとってコ胞レベルでの、アポトーシスを免疫組織化学的に検出すラーゲンやエラスチンなどのタンパクは重要であるが、る In Situ 細胞死検出キット TMR red（Roche）を用いそれらを産生しているのが線維芽細胞である。つまり、た。過酸化水素（0.1mM）による酸化ストレスを与え線維芽細胞の活性化の減弱は皮膚の老化に直結するといた条件においてカテキン（10μM）を加え、24 時間後える。したがって、本研究により培養皮膚線維芽細胞をのタネル染色陽性細胞の数を測定した。評価はタネル染用いてクロロゲン酸やカテキンが線維芽細胞の生存にど色陽性細胞数／すべての細胞数で行った。のような影響を与えるかを、細胞生存に関連するタンパ結クに焦点をあてて、明らかにした。

果

1. クロロゲン酸、カテキンの線維芽細胞生存促進作用実験方法について

1. 細胞増殖試験

最初に、クロロゲン酸が線維芽細胞に与える影響を調線維芽細胞（NIH3T3）を用いて、96 ウェルプレートべるために、クロロゲン酸を各濃度別（0、1、10、100に 濃 度 1×10 /ml で 培 養し、クロロゲン 酸（0、1、10、μM）に添加し、24 時間後の細胞数を解析した。図 1A51

金成

行

B

10

1.88

absorbanceabsorbanceA澤6420chlo

0 µM

1.4
1.00.6catechin

1 µM 10 µM 100 µM

H2O20 µM

1 µM

10 µM 100 µM（＋）

図 1 クロロゲン酸・カテキンの線維芽細胞生存促進作用（A）クロロゲン酸の各濃度（0、1、10、100 μ M）添加 24 時間後の細胞数（B）酸化ストレス下におけるカテキンの各濃度（0、1、10、100 μ M）添加 24 時間後の細胞数 **；p<0.01に示すとおり、クロロゲン酸 1、10、100μM で有意に/Akt 経路が生存シグナルに重要である。このうち、PI3

細胞増殖し、濃度依存性に線維芽細胞の生存を促進する

キナーゼ /Akt 経路、そして Akt のターゲット分子の一ことがわかった。

つである CREB に対してクロロゲン酸が与える影響についてウエスタンブロット法にてタンパクの活性を調べ

次に、カテキンが酸化ストレス下の線維芽細胞に与た。

える影響を調べるために、カテキンを各濃度別（0、1、

図 2 に示すとおり、クロロゲン酸刺激により Akt、10、100 μM）に添加し、24 時間後の細胞数を解析した。
図 1B に示すとおり、カテキンは濃度依存性に線維芽細CREB ともにタンパクの活性化を認めた。

胞の生存を促進（細胞死を抑制）した。

さらに、PI3 キナーゼ阻害剤（LY294002）を用いてPI3 キナーゼ /Akt を阻害すると CREB の活性化の減弱

2. クロロゲン酸はAkt、CREBを活性化するを認め、クロロゲン酸による線維芽細胞生存促進作用が種々の増殖因子によって細胞の生存が維持されるが、阻害された（図 3）。

受容体の下流で活性化される複数の細胞内シグナル伝達

以上から、クロロゲン酸は PI3 キナーゼ /Akt/CREB機構のうちで、Ras/MAP キナーゼ経路や PI3 キナーゼの経路を活性化することにより、線維芽細胞の生存を促A進していることが示唆された。

Bchlo0m 15m 30m 60mchlo

Akt

CREB

25

2.5

202.0p-CREB/CREB levels

p-CREB

p-Akt/Akt levels

p-Akt

151050chlo

0m 15m 30m 60m0m15m 30m 60m

3. カテキンはJNK、p38MAPKの活性化を抑制する
JNK および p38MAPK は、TNF-α や Fas による刺激や、熱ショック、UV 照射、高浸透圧といったさまざまな物理化学的ストレスで活性化し、細胞にアポトーシスを誘導することが知られている。カテキンの酸化ストレス下における線維芽細胞に与える影響を調べるため

1.5に、過酸化水素による酸化ストレス刺激、カテキン添加

1.0による JNK、p38MAPK の活性化の変化をウエスタン

0.50chlo

ブロッティング法で調べた。
0m15m 30m 60m

過 酸 化 水 素 に よ る 酸 化 ス ト レ ス を 与 え る と JNK、p38MAPK の活性化を認めたが、カテキン添加により、

図 2 クロロゲン酸刺激による Akt、CREB の活性化の変化これらの活性化が抑制できた（図 4）。以上より、カテ（A）クロロゲン酸刺激後 0、15、30、60 分後の Akt の活性化を phospho-Akt/Akt で表している。
（B）クロロゲン酸刺激後 0、15、30、60 分後の CREB の活性化を phospho-CREB/CREB で表している。
**；p<0.01

キンは酸化ストレスによる JNK、p38MAPK の活性化を抑制することがわかった。

2ポリフェノールの皮膚における抗老化作用の検討

ABchlo

LY294

p-CREB

8CREB6（＋）

1.5420chlo0 µM

LY294（−）

0 µM

1 µM

10 µM 100 µM（＋）

p-CREB/CREB
levelsabsorbance10（−）（−）（＋）（−）（＋）

1.00.5

LY2940（−）（＋）
（−）
（＋）
（−）

chlo（＋）

図 3 Akt 阻害による細胞生存、CREB 活性化への影響（A）Akt 阻害下でのクロロゲン酸刺激 24 時間後の細胞数（B）Akt 阻害下でのクロロゲン酸刺激による CREB の活性変化**；p<0.01AAB
H2O2（−）（＋）（−）

H2O2（＋）（−）（＋） catechin （−）（＋）（−）（＋）
catechin （−）（＋）

p-p38

JNK

p38

3.0
2.0
1.00

H2O2（−）（＋）
（−）
（＋）
（−）

（＋）

（−）

（＋）

（＋）

TUNEL

5.0

4.03.0DAPI

2.01.0catechin0H2O2200 µm（−）（＋）
（−）
（＋）
（−）

（＋）

200 µmB

酸化ストレス下におけるカテキン刺激による JNK、
p38MAPK 活性の変化

12tunnel positivecells/all cells（%）

catechin

図4p-p38/p38 level

p-JNK/JNK level

p-JNK

H2O2catechin（A）酸化ストレス下でのカテキン刺激による JNK 活性の変化
を phospho-JNK/JNK で表している。
（B）酸化ストレス下でのカテキン刺激による p38MAPK 活性の変化を phospho-p38MAPK/p38MAPK で表している。
**；p<0.011086420catechin （−）（＋）
H2O2（＋）

図 5 酸化ストレス下におけるカテキン刺激による細胞死の抑制（A）酸化ストレス下でのカテキン添加 24 時間後のタネル染色陽性細胞の数を測定した。
（B）タネル染色陽性細胞数／全ての細胞数で評価した。
**；p<0.013

金澤成

4. カテキンは酸化ストレスによる細胞死を抑制する

行

Akt の細胞生存促進のメカニズムについても近年徐々過酸化水素による酸化ストレス刺激は細胞死を促進すに明らかになりつつある。アポトーシス誘導因子の中でる。アポトーシスを起こした細胞を検出できるタネル染

Akt による制御が初めて明らかとなったのは Bad（Bcl-2色により、カテキンが細胞死を本当に抑制するのかどうantagonist of cell death）で ある。Bad は生 存促 進 型かを検証した。先程の結果同様、カテキン添加群にタネの Bcl-2 ファミリーに属する Bcl-2 や Bcl-xL と結合しル染色陽性細胞数の減少を有意に認めた（図 5）。このてそれらを不活性化することで、アポトーシスを誘導結果からもカテキンは酸化ストレス下における細胞死をする。Akt は Bad の Ser136 をリン酸化して不活性化抑制することが示唆された。

することで生存を促進することが Datta らにより 1997
年に小脳顆粒細胞を用いて示された 6）。また、Akt は考察CREB（cAMP-responsive element binding protein）

ポリフェノール (polyphenol) とは、分子内に複数のの Ser133 をリン酸化して活性化することが知られてフェノール性ヒドロキシ基（ベンゼン環、ナフタレン環いる。CREB は生存促進型の Bcl-2 ファミリーであるなどの芳香環に結合したヒドロキシ基）を持つ植物成分

Bcl-2 や Mcl-1 などを転写活性化する。このように Aktの総称である。ほとんどの植物に含有され、その種類はは多様なターゲットを持ち、様々な段階でアポトーシス300 種類以上といわれている。光合成によってできる植を抑制している。そして、本研究においても、クロロ物の色素や苦味の成分であり、植物細胞の生成、活性化ゲン酸の線維芽細胞生存促進作用に対して Akt、そしてなどを助ける働きを持つとされている。本研究はこれらCREB の関与が認められた（図 2,3）。のポリフェノールのうち、コーヒーに多く含まれている

カテキン (catechin) は、狭義には化学式 C15H14O6

クロロゲン酸と、お茶に多く含まれているカテキンの皮で表される化合物であり、フラボノイドの 1 種である。

膚線維芽細胞の生存に対する影響について調べたもので広義にはその誘導体となる一連のポリフェノールも含ある。

み、この意味での使用例の方が多い。カテキンには実にクロロゲン酸（chlorogenic acid）は 5- カフェオイル

多様な生理活性があることが報告されており、血圧上昇

キナ酸 (5-caffeoylquinic acid) とも呼ばれ、caffeic acid

抑制作用、血中コレステロール調節作用、血糖値調節作のカルボキシル基がキナ酸 5 位のヒドロキシ基と脱水用、抗酸化作用 7）、老化抑制作用、抗癌、抗菌、抗アレ縮合した構造を持つ化合物である。コーヒー豆から初めルギー作用など多岐にわたる。しかし、線維芽細胞におて単離され、現在では多くの双子葉植物の種子や葉からけるカテキンの作用というのはあまりわかっていない。

見いだされている。クロロゲン酸の作用についてこれましたがって、本研究は酸化ストレス下におけるカテキンで多くのことが様々な細胞を用いて報告されている。癌の線維芽細胞に対する細胞死への影響を調べた。

細胞増殖抑制作用 1）、解毒作用 2）、抗炎症作用 3）、抗酸MAP (mitogen-activated protein) キ ナ ー ゼ 経 路 は、化作用などである。しかし、これまでクロロゲン酸の線細胞内での情報伝達を担っており、哺乳類においては 3維芽細胞に対する作用は不明なところも多く、報告も少つの代表的な経路から構成されている。これらのうち、ない。したがって、本研究により、クロロゲン酸の線維JNK (c-Jun N-terminal kinase) ならびに p38MAPK 経芽細胞における作用を明らかにしようと考え、そしてク路はストレス応答キナーゼとも呼ばれ、紫外線、放射線、ロロゲン酸による線維芽細胞生存促進作用を発見するに酸化ストレスや熱ショックといった様々なストレス刺激至った（図 1）。

や炎症性サイトカインによって活性化され、アポトーシ
スの誘導をはじめとする多彩なストレス応答に関与して哺乳類細胞の生死は生存シグナルと細胞死シグナルのバランスによって決定される。そして、このバランスをいる。

決定するメカニズムに様々なキナーゼが関与しているこJNK は細胞死の制御に重要な役割を担っている Bcl-2とが、近年明らかになりつつある。
この生存促進にキナーファミリー分子の機能を調節していることが知られてゼによるシグナル伝達が重要な働きをしている。生存シいる。アポトーシス抑制にはたらく Bcl-2 は JNK にグナルの代表的なキナーゼが Akt と ERK1/2 である。

よってリン酸化されてその抑制能が阻害される。一方、本研究においても、クロロゲン酸の線維芽細胞生存促進p38MAPK は Fas や Bax などのアポトーシスの誘導に作用に対して、Akt の関与が認められた（図 2,3）。

関与しているといわれている。本研究では過酸化水素4,5）4ポリフェノールの皮膚における抗老化作用の検討

による酸化ストレスで JNK、そして p38MAPK の活性芽細胞の細胞死を抑制する作用があり、酸化ストレス刺化を認めた。さらには、カテキンにより、これらの活性激によりストレス応答キナーゼである JNK、p38MAPK化が阻害され、細胞死が抑制された（図 4,5）。つまり、の活性化を抑制することがわかった。ポリフェノールは、カテキンは酸化ストレスによるアポトーシスを抑制でき果物、茶、コーヒー、ココアなど日常的に摂取しているることが示唆された。

食品に含まれており、これらを摂取することは、皮膚の健康維持に有益である可能性が示唆された。

ポリフェノールは、野菜、果物、茶、コーヒー、ココアなど日常的に摂取している食品に含まれている成分で、謝

生体に様々な生理的機能を果たしていると考えられるが、辞まだ未解明のところが多い。ヒト皮膚の健康におけるポ本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜わりました

リフェノールの役割を少しでも明らかにすることで、ヒ公益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様のトの健康維持・増進に貢献できることを願ってやまない。

御理解と御厚意に深く感謝するとともに厚く御礼を申し上げます。

要約文

本研究により、ポリフェノールの一つであるクロロゲン酸やカテキンが皮膚線維芽細胞の生存にどのような影

献1）MT. Huang, et al.: Cancer Res., 48, 5941-5946, 1988.
2）R. Feng, et al.: J. Biol. Chem., 280, 27888-27895, 2005.
3）MT. Huang, et al.: Cancer Res., 51, 813-819, 1991.
4）H. Dudek, et al.: Science, 275, 661-665, 1997.
5）Z. Xia, et al.: Science, 270, 1326-1331, 1995
6）SR. Datta, et al.: Cell, 91, 231-241, 1997.
7）ME. Cavet, et al.: Mol Vis., 17, 533-542, 2011.

響を与えるかを、細胞生存に関連するタンパクに焦点をあてることで明らかにした。クロロゲン酸には線維芽細胞の生存を促進する作用があり、生存促進の代表的なキナーゼである Akt、その標的分子である CREB の関与が認められた。また、カテキンは酸化ストレスによる線維5