創傷をより綺麗に修復させる皮膚再生促進薬の開発
東海大学医学部基盤診療学系再生医療科学

住吉秀明

It is generally known that a serious dermal injury causes scar formation. The cleaner dermal restoration, that is scarless regeneration, is an important theme in the next stage of regenerative medicine for keeping the quality of life of patients.
Our previous study indicated that the scar tissue made a different composition of collagen fiber from that in normal dermal
tissue. Artificial dermis has been utilized clinically for accelerating wound healing in the field of skin regenerative medicine.
However, because of the inefficient re-epithelialization, conventional artificial dermis requires the subsequent epidermal
auto-transplantation.
In the present study, we have developed a novel artificial dermis containing “jellyfish” collagen that accelerates skinregeneration through both re-epithelialization and granulation tissue formation. Since the jellyfish (Aurelia aurita) collagenis water soluble, the artificial dermis was prepared as a mixture of porcine type I collagen and jellyfish collagen. The
effect was evaluated in vivo using the skin full-thickness wound mouse model. The results indicated that, the collagen filmwith jellyfish promoted epidermal cell migration. On the other hand, collagen sponge with jellyfish enhanced fibroblast
infiltration into the granulation tissue. Subsequently we determined the most effective content ratio of the porcine andjellyfish collagens, and further examined the combinatorial effect of collagen film and sponge materials. Additionally wetried the freeze and drying procedure under t-butyl alcohol solvent, to mimic native dermal collagen fiber structure.
We developing new artificial dermis could also call “artificial skin” because more physiological infiltration both ofdonor keratinocytes and fibroblasts like native wound restoration. Experiments are in progress to demonstrate that acceleratecleaner dermal healing without scar formation when used with additional time span. It provides a novel devise that can beused in the variety range of skin diseases instead of the conventional manners.

1. 緒に二次的な線維化として生じたコラーゲン線維がどのように言走行しており、正常真皮と異なっているかを観察した。観

これまで重篤な創傷の後に「傷跡」が残ってしまうことは、

察結果を基に、一般的な人工真皮に用いられているブタ I

止むを得ないこととされてきた。傷跡をいかに自然に近い型コラーゲンを基本成分とし、自然な真皮の線維構造をで状態で修復できるかというテーマは、美容面と精神面におきるだけ模倣した細胞が進入し易い構造物の作製を試みた。

ける受傷者の QOL を維持する上で重要な要素であるにも研究目的のもう一つは、早く綺麗に傷を治癒させるため関わらず、未だ再生医療の主題にはなっていない。しかしの付加的な成分の探索である。当初は V 型コラーゲン α3今後の皮膚再生医療は損傷を回復させるだけでなく、より

鎖等、創傷治癒過程で発現する微量 ECM 成分に着目した

自然に綺麗に再生させることを実現させる段階に進むべきが、微量成分を充分量確保するのが困難であった。その進であると考える。

化の過程で V 型コラーゲンと似ているといわれるミズク

我々は本研究の目標として、傷跡と健常皮膚を構成する

ラゲ（Aurelia aurita）由来のコラーゲン 4）を配合した結果、細胞外基質（Extracellular matrix : ECM）の微細構造の相

従来の人工真皮にはない、再上皮化と肉芽形成両方を促進

違点の解析と、健常皮膚構造を模倣し更に再生を促進する

するはたらきが見出された。クラゲコラーゲンは安価で大コラーゲンをベースとした新しい人工皮膚の開発を行なった。

量に確保できる新しい資源であり、細胞の接着性の評価 5）、マウスを用いた皮膚の創傷治癒における我々の先行研究

免疫の賦活化 6，7）、軟骨組織の足場グラフトとしての利用

では、創傷時に新生されるコラーゲンは組成や微細線維例 8）などがこれまで報告されているが、人工皮膚としての構造が正常真皮組織と異なることを報告している

1 − 3）。再応用例はない。我々はこの表皮細胞と肉芽形成細胞に対す

生肉芽組織は瘢痕となり傷跡を形成する。本研究において、る遊走促進効果を最大限発揮できるように最適化した人

更に長期（9 ヶ月）にわたって傷跡の微細構造を解析し、特工真皮を作製し、さらに創傷モデルマウスへの移植実験を行ない、in-vivo における生着と皮膚再生の評価を行なった。

Development of regenerating compounds
for cleaner dermal restoration
Hideaki Sumiyoshi
Regenerative Medicine, Division Basic
Clinical Science, Tokai University Schoolof Medicine

2. 方

法

2. 1. マウスの創傷モデルの作製と瘢痕組織の観察・
正常真皮との比較− 89 −

マウスの創傷モデルは、6 mm の生検用トレパンを用いコスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017て背部両側に表皮、真皮、皮下組織全層を欠損させるもの

細胞と組織の観察をすると同時に、宿主マウスの表皮角化を採用した。受傷後 6 日目と 9 ヶ月後の傷跡の組織の外観

細胞の創傷辺縁部から人工真皮上への伸長距離と、肉芽形を撮影した後、マウスを安楽死させ、創面を横断する検体

成細胞の人工真皮内への遊走数を計測した。全ての移植マを採材し、パラフィン標本と電子顕微鏡用樹脂包埋標本を

ウスの表皮角化細胞の伸長距離、肉芽形成細胞の遊走数を作製した。標本は HE 染色、透過型電子顕微鏡による観察

集計し、統計処理を行なった。有意差の検定は t 検定を用を行ない、細胞と組織形態、コラーゲン線維束の走行、密いた。

度、直径の計測を行ない、正常真皮と瘢痕組織の組織構築
における相違点についての比較を行なった。本研究の実験で用いたマウスは、東海大学内に設置される「東海大学動2. 4. フィルム･スポンジ ハイブリッド型、J.C. 混合人工皮膚の開発物実験委員会」の審査・承認を得た上で実施された。

フィルム材とスポンジ材の特性を併せ持つハイブリッド
型人工真皮の成型を行なった。最終的には t -BA 凍結乾燥

2. 2. コラーゲンを基礎材料とした人工真皮用フィル
ム材･スポンジ材の作製法を基本とし、酸性可溶化したコラーゲン溶液を液体のま

ブタ I 型コラーゲンはブタ胎児皮膚組織より既成の方法

換し凍結乾燥する方法を開発し、フィルム構造を表面にも9）を用い、アテロコラーゲンとして抽出 ･ 精製を行なった 。

つ二層性の人工真皮が作製された。このハイブリッド型人ミズクラゲコラーゲンは株式会社海月研究所より購入した。

工真皮を上記と同じく全層欠損モデルマウスへの移植を行

2. 2. 1. コラーゲンフィルムの作製

ない、短期の創傷治癒に対する寄与について従来の人工真コラーゲンフィルムは 500 µg/ml のコラーゲン 5mM 酢

ま薄くコラーゲンゲル上にコーティングした後、t -BA 置

皮と比較した。

酸可溶化液を 1 X PBS による中性化を行ない、線維形成

3. 結させた後ラップフィルム上に薄く進展させ風乾することで作製した。ミズクラゲ混合コラーゲンフィルムはミズクラ
ゲコラーゲン（以下 J.C.）がブタ I 型コラーゲン（以下 P.C.）果

3. 1. 正常真皮組織と受傷後の瘢痕組織（傷跡）のコラ
ーゲン超微細組織構築の比較に対し含まれる量が各 0、20、40、45、50、55、60、65、

皮膚を全層欠損する深い創傷から治癒した瘢痕組織の特80、100 各 % で混合したものを作製し、総コラーゲン量

徴を、電子顕微鏡を用いて超微細構造レベルで解析した。

が 500 µg/ml となるようにした。風乾後 85 ％エタノール

受傷後 6 日目に形成されるコラーゲン線維は細くて方向性で洗浄し脱塩を行なった。作製したコラーゲンフィルムはが一定でないコラーゲン細線維 ①（破線内）と、中間径の走査電子顕微鏡によって超微細構造を確認した。

コラーゲン線維 ② が共に存在し（図 1）、細線維は直径 15.1

2. 2. 2. コラーゲンスポンジの作製± 1.1 nm（n 100）、中間径線維は 40.6 ± 5.6 nm（n 100）でコラーゲンスポンジは 1 mg/ml コラーゲン 5 mM 酢酸可あった。9 ヶ月後の瘢痕組織の外見は正常部位と色調、質溶化液を 1 X PBS によって中性化し 37 ℃に加温すること感も異なり明瞭に見分けることが可能であった（図 1）。コ

で、コラーゲンゲルを作製し、そのまま凍結乾燥させるもラーゲン線維径は直径 39.2 ± 4.6nm（n 100）であり、受傷のと、エタノールから t- ブチルアルコール（t-BA）に溶媒

後 6 日目の中間径線維と同じであった。これに対し正常真転換して凍結乾燥させたものを作製した。ミズクラゲ混合

皮のコラーゲン線維は直径 94.7 ± 7.1nm（n 100）と明らか

コラーゲンスポンジは J.C. が P.C. に対し、各 0、20、50 各に太い上に、綺麗な流紋状の走行を持つこと、線維の間隙% で混合したものを作製し、総コラーゲン量が 1 mg/ml

が密であり線維の表面も滑らかである等、構造上の明らかとなるようにした。コラーゲンスポンジは走査電子顕微鏡

な違いがみられた（図 1）。本実験から、創傷治癒後の再生にて超微細構造を確認した。

組織はコラーゲン分子構造のレベルで異なる組織として構築されることが確認された。

2. 3. 創傷モデルマウスへのコラーゲン生体デバイス
2. 1. の全層欠損モデルに上記の人工真皮候補である、

3. 2. ブタ/ミズクラゲコラーゲンを用いた新しい人工真皮の開発

ミズクラゲコラーゲンを含有するフィルム材とスポンジ材

広く臨床応用されている、ブタの I 型コラーゲン（P.C.）

をそれぞれ移植し、短期の創傷治癒に対する寄与を観察しを基本素材とし、新素材であるミズクラゲコラーゲン

た。人工真皮デバイスを創部に密着させ、ドレッシング（J.C.）を組み込んだ新しい人工真皮の試作例を示す。SDS -テープで被覆し創部の保護と保湿を行なった。移植後 6 日

PAGE によるタンパク質電気泳動像から J.C. は P.C. に匹敵

後にマウスを安楽死させ、人工真皮デバイスと創傷中心部する分子量を持つことが示されている（図 2A）。J.C. は水を横断する面が表面に出るように HE 染色標本を作製した。

溶性であり、また中性下で加温してもゲル化しない性質が移植− 90 −

創傷をより綺麗に修復させる皮膚再生促進薬の開発

図 1 正常真皮組織と瘢痕組織のコラーゲン超微細組織構築の比較

図 2 ブタ・ミズクラゲ配合コラーゲンを素材とする人工皮膚デバイスあるため、基本的に P.C. と混合することで新しい人工真皮

コラーゲンスポンジの作製の成型が行なわれた。走査型電子顕微鏡（以下 SEM）のよ

コラーゲンをゲル化させた後、凍結乾燥することでコラり確認された超微細構造を示す。

ーゲンスポンジを作製した。この方法では J.C. 濃度は 50%

コラーゲンフィルムの作製まで作製できた。ゲル化コラーゲンをそのまま凍結乾燥

フィルム形状なら、J.C. が 100% でも作製が可能であった。

すると ､ 一般的なハニカム構造の発泡スポンジとなり、そ図 2B 上段に SEM による超微細構造を示す。P.C. のみからこに線維構造は認められなかった。J.C. の混合による形状

作製したコラーゲンフィルムは直径 100 nm に及ぶ線維構的な差も認められなかった（図 2B 中段）。我々は SEM で造を有していた。J.C. 濃度を高めるほどコラーゲンの線維

コラーゲン分子を観察する際に用いられる t - ブチルアルコ

量は少なくなり、50 % より高濃度になるとほぼ無構造にール（以下 t - BA）溶媒置換と凍結乾燥によるスポンジ成型なった。

を試みた。その結果、天然のコラーゲンと同等の直径約− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

100 nm の緻密な線維構造を再現したコラーゲンスポンジ

ものであり、人工真皮内部への細胞の遊走 ･ 生着を調べを作製することができた（2B 下段）。このサンプルで J.C. をたものである。J.C. を混合しないもの（左端）に比べ、20%、

含むスポンジは線維量が減少するものの線維径には影響を

50% J.C. 混合スポンジの方が明らかに多くの細胞が遊走し与えず、J.C. は P.C. の線維束形成過程に干渉しないと考えていることが示されている。人工真皮内部への細胞の遊走られた。また粗になった P.C. 線維の隙間に J.C. を混合したは図 3B に示されるとおり、フィルム材にはみられていな

ときのみ無構造の固形物が沈着しているのが観察された。

い。このことより、ミズクラゲコラーゲン（J.C.）の成分はフィルム形状では表皮角化細胞による再上皮化を、スポン

3. 3. 創傷モデルマウスへのコラーゲン埋め込みデバイス（人工真皮）の移植

ジ形状では肉芽形成を促進し、創傷治癒を著しく促進する

皮膚全層欠損による創傷モデルマウスに実験 3. 2. で作

図 4 は図 3B、3C の全実験データを数値化しグラフに示製したコラーゲンフィルムとスポンジを人工真皮として移ことが示された。
したものである。
図 4A は表皮角化細胞の伸長距離を表す。J.C. が 40 ％以植する手術を行なった。移植手術行程を図 3A に示す。
①フィルム材移植例、②スポンジ材移植例、③シールと上のフィルム材において有意な伸長促進効果が示された。

縫合による創部の保護、④⑤ 移植後 6 日経過時の外観でまた 45 ％以上で一定化し、60 ％以上になると人工皮膚がある。④は 100% P.C. フィルム材で上皮化が完全ではなく、融解し、データが得られなかった。図 4B は単位面積あた滲出液のため光沢がある。⑤は 50% J.C. 混合フィルム材、りの、スポンジ内への細胞遊走数を示したもので、E は辺既に上皮が被覆している。

縁部、C は中央部である。J.C. を 20 ％、50 ％含むスポンジ

図 3B は 6 日経過後の人工真皮組織サンプルにおいて HE
染色像を行ない、表皮角化細胞の人工真皮上での伸長距離で有意に多くの細胞が遊走しており、J.C. が肉芽を形成す
る細胞を人工皮膚内に誘引する効果が示された。

を測定した図であり、数字の単位は µm である。上段はフィルム材、下段はスポンジ材の代表例を示す。表皮角化細胞の伸長はおよそ 500 µm 前後であったが、J.C. を 50 % 含

3. 4. フィルム･スポンジ ハイブリッド型、J.C. 混合人
工真皮の開発むフィルム材では伸長距離が突出して伸びていた。同様の

これまでの実験結果を受け、フィルムとスポンジの特性

効果は下段に示しているスポンジ材にはみられなかった。

を併せ持ったハイブリッド型人工真皮の成型を試みた。図

図 3C は同じスポンジ材のサンプルを高倍率で観察した

5A に示すように最薄 5 µm のフィルムを表面に持つ二層性

図 3 創傷モデルマウスへの新型人工皮膚デバイスの移植と 6 日後組織の解析− 92 −

創傷をより綺麗に修復させる皮膚再生促進薬の開発

図 4 人工皮膚への表皮角化細胞の伸長と肉芽組織細胞の遊走生着効果

図 5 フィルム／スポンジハイブリッド型人工皮膚 J.C. 複合・非複合タイプの作製の人工真皮が作製された。45% J.C. 混合（左側）と、P.C. の

4. 考

みで作製したもの
（右側）
を示す。

察

図 5B はこれらのハイブリッド型人工真皮を創傷モデル

皮膚は人間の最外部のバリアであり、環境からの様々なマウスに移植し、6 日後の組織回復を観察したものである。

刺激 ･ 衝撃に曝され、しばしば損傷するが直ぐ修復される

ねらい通り 45% J.C. を混合したもの（左端）はフィルム表面

ことから皮膚の再生能力はかなり高いという認識がある。

において、表皮角化細胞の伸長（黒矢頭）、人工真皮内部（星しかしながら、実験結果 3. 1. に示されるように、治癒後印）への肉芽細胞の遊走（矢印）両方に優れており、P.C. のの瘢痕（傷跡）の組織は構築が全く異なり線維芽細胞の形態みで作製したもの（5B 中央）や市販人工真皮（同右端）と比やコラーゲン線維の直径や走行も異なることから、創傷

べ、ミズクラゲコラーゲンの持つ治癒促進効果を最大限に治癒は真皮線維芽細胞とは性質の異なる線維芽細胞により引き出せる素材に仕上がった。

なる異形の再生といえる。さらに瘢痕は後に拘縮し、引き攣れが起こってくる。つまり欠損による大規模な創傷では− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

真皮は再生しないのが現実である。真皮のコラーゲンは直5. 総

径 100 nm 程の太くて密な線維が、規則的で綺麗な流紋を括形成するがこれは他の組織にない独特の構造である。創傷

創傷部分の治癒 ･ 再生においては表皮角化細胞よる再上治癒時に動員される線維芽細胞はこの構造を造れないため、皮化と線維芽細胞による肉芽形成が同時に速やかに進行す

創傷を綺麗に修復させるために真皮の構造を模したコラーることが、予後の改善に繋がる重要な要素となる 10）。広

ゲン線維の足場を人工的に作製し、迅速に足場へ細胞を生範囲の欠損を従う重度外傷の治療法として人工真皮が用い着させる構造体を考えた。一般的な人工真皮にも用いられられてきたが 11，12）、従来の人工真皮は人工物の足場上にている、精製ブタ I 型コラーゲンを試験管の中で自己会合

対する表皮角化細胞の生着が悪く、再上皮化が起こらない

させると、直径 100 nm の真皮に近いコラーゲン線維を構ため、後日に表皮の再移植が必要となる点に課題があった。

築できるが、凍結乾燥を行なうと線維構造は失われハニカ

表皮の細胞が生着するには、コラーゲンスポンジ内に自身

ム構造となる。私達は走査電子顕微鏡のサンプル調整で用の細胞が侵入し自己組織化するのを待たなければならず、

いる t- ブチルアルコール（t-BA）による凍結乾燥法を用いこの間体液の漏出と感染を防がねばならない。我々は今回、て線維束構造を保持したコラーゲンスポンジを独自に開発

人工真皮への直接的な自己表皮による再上皮化と、肉芽組した。コラーゲンは加工性に優れており、風乾によりフィ織による自己組織化が同時に起こることだけでなく、肉芽

ルム状、凍結乾燥によりスポンジ状の成形を行える。傷を由来の線維芽細胞は真皮を模したコラーゲン線維構造の型

綺麗に修復しうる構造材の理想的な形状の検討にこれを応枠に鋤き込まれ、拘縮の起こらない真皮様組織を再現する用した。

というこれまでにない要素を持った「人工皮膚」を目指すも

本実験のもう一つねらいである創傷を早く治すための皮のを開発した。この人工皮膚は乾燥体として常備すること

膚再生促進薬の探索について、V 型コラーゲンなどの創傷が可能で ､ 従来品通りに開封して直ぐ使うことができる上、治癒時に特異的に発現してくる微量コラーゲン成分は mg

自家培養細胞、幹細胞、増殖因子を必要としない安価で汎単位のコラーゲンスポンジに混合できる量の確保ができな

用性の高いデバイスとしての利用が可能であり ､ 数多くのかった。その一方でサンプルとして試験されたミズクラゲ

事例に対処できることを期待している。長期経過について

コラーゲン（J.C.）に予想外の表皮角化細胞の伸長促進と肉の検討がこれからであり、ミズクラゲコラーゲンの生体反芽組織細胞の遊走促進効果が見出されたため、J.C. の皮膚

応性の評価等、今後の課題として残されている面も多いが、再生医療への応用と可能性の開拓を目的とする新規人工真本助成研究から生まれた新規のシーズとして、実用化を目

皮構造体の開発を行なった。

指し育てていきたいと考えている。

結果として、J.C. が加えられることによる効果は、表皮角化細胞の伸長はフィルム材に、肉芽組織細胞の遊走はス（引用文献）

ポンジ材に特異的に見られる現象であり、統計的に優位で

1） Sumiyoshi H, Kitamura H, Matsuo N, Tatsukawa

あることが確認された。その効果は 45%以上で一定となり、S, Ishikawa K, Okamoto O, Fujikura Y, Fujiwara S,

J.C. の量比が多くなると構造体が脆くなることから、最適

Yoshioka H, Transient expression of mouse pro-α3(V)

混合比を 45% とした。無脊椎動物の原始的線維性コラー

collagen gene in wound healing, Connect. Tissue Res,ゲンは V 型コラーゲンに構造的に近いとされるが、この

53, 4, 313-317, 2012.

効果の由来は現時点で不明である。J.C. はブタ I 型コラー

2） 住吉秀明，稲垣 豊，マウス皮膚創傷治癒モデルにおゲンの線維形成を阻害せず、I 型コラーゲンは直径 100 nm

ける筋膜由来線維芽細胞と希少コラーゲンのはたらき，の線維を形成し、隙間に J.C. に由来する固形物が充填され日本食品 ･ 機械研究会，：食品加工技術，33，3，2013，

る構造となること、また中性溶液で水溶性を示すことなど、

22-28 頁哺乳類のコラーゲンと異なる性質を有していた。最終的に

3） 住吉秀明，稲垣 豊，コラーゲン分子種と線維症形成

J.C. の効果を最大現に引き出せるよう、実験結果 図 5A にへのかかわり，医歯薬出版，：医学のあゆみ，244，6，

示される上面がフィルム、下面がスポンジの二層性ハイブ

2013，515-520 頁

リッド人工真皮を開発した。創傷モデルマウスへの移植に

4） Miki A, Inaba S, Baba T, Kihira K, Fukada H, Oda

より、この人工真皮が真皮の構造を模倣したコラーゲン線

M, Structural and physical properties of collagen維を持ち、かつ、表皮角化細胞の伸長と、肉芽を形成する

extracted from moon jellyfish under neutral pH

線維芽細胞の遊走 ･ 生着の両方を促進できる新しい機能を

conditions, Biosci. Biotethnol. Biochem., 7 9, 1 0, 1 6 0 3-

持っていることを確認した。

1607, 2015.
5） Addad S, Exposito J Y, Faye C, Blum S R, Lethias
C, Isolation, characterization and biological evaluation− 94 −

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