【研究報告】（自然科学部門）

慢性便秘症に関する神経堤幹細胞移植治療の有用性の検討

藤村慶應義塾大学小児外科
緒匠

博士課程

言
食事摂取は生命維持に不可欠な行動であり、その食事を支えているのは正常な腸管運動にほかならない。正常な腸管運動は栄養や水分を吸収するためにはなくてはならない機能で、ひいてはヒトの生存には欠かすことができない。その腸管運動を担う神経節細胞の異常、いわゆる便秘に苦しむ人々は多数存在する。筆者の専門である小児外科領域ではヒルシュスプルング病をはじめとする先天的に腸管神経が欠損する疾患や、ヒルシュスプルング病類縁疾患と呼ばれる腸管神経機能が著しく低下す

図1る疾患が存在する 1 4）。こうした疾患においては治療に–

3 系統に細胞移植実験の概要

分化する多分化能をもつ腸管由来神経堤細胞を無神経節腸管をもつ腸管運動不全モデルマウスに移植し、一定期間経過中の移植細胞の生着、分化傾向を観察する

複数回の手術を要したり、手術後も良好な排便機能が得られないために命を落としたりする症例も少なくない。
また、小児において慢性便秘と判断されている中には軽度の腸管運動不全という病態が紛れ込んでいること参考に全身麻酔下に腸管を体外に挙上し、塩化ベンザルもあり、1 歳を過ぎてからようやく診断される場合もあコニウムを浸したガーゼで腸管を包んだ。15 分間の神る。これらは命を落とすことはなくても、排便機能不良

経細胞の焼灼処置を行い、無神経節腸管を持つ薬剤性腸による QOL の低下は著しい5）。このような症例に対し管運動不全モデルマウス6）を作成した。て手術を施行するかは小児に対する手術自体のリスク、
2.

全身麻酔のリスクを考えると悩ましいことも多い。我々

移植ドナー細胞の腸管由来神経堤細胞の分離・培養は低侵襲かつ満足な排便機能をもたらす新たな治療戦略

蛍光（Venus）と発光（Luciferase）の両方を介しての一つとして、腸管に対する新規の幹細胞移植治療法の追跡することを可能にした ﬀLuc と呼ばれる蛍光発光融開発を目標としている。

合蛋白質を恒常的に発現するトランスジェニックマウス（Hara-Miyauchi et al., 2012）、日齢 13.5 から腸管を摘出実験方法

し、Trypsin EDTA 0.25％を加えてピペッティングと遠本研究では腸管由来の神経堤細胞を分離・培養し、心を行い、神経堤細胞を分離した。分離した腸管由来神それらを無神経節腸管を持つモデルマウスに移植した。

経堤幹細胞を DMEM/F12 に栄養因子を含めた培地を用移植後細胞の生着・分化傾向を調査し（図 1）、消化管いて培養し（Nagoshi et al., 2008）、14 日後に sphere を機能の改善に関する評価も行った。動物実験においては形成したものをドナー細胞とした。

慶應義塾大学の実験動物指針・倫理指針を順守した。ま3.

た、実験は慶應義塾大学遺伝子組み換え実験安全委員会の承認を受けて行われた。

腸管由来神経堤細胞のモデルマウスへの移植における発光イメージングを可能にするため、

2. で調整した神経堤細胞の sphere を機械的に single cell1.にしたものを PBS で 4.0×105/5 μl 程度の懸濁液に調整し薬剤性腸管運動不全モデルマウスの作成
4 週齢の C57BL/6 マウスに対し、Yoneda らの報告をたものをガラスマイクロピペットと Stereotaxic injector1藤村匠（KDS Legato 130, Muromachi-kikai, Tokyo, Japan）を用いて全身麻酔下にモデルマウス無神経節腸管に移植した。
発光イメージング

4.

移植細胞に導入されているﬀLuc（蛍光発光融合蛋白質）の Luciferase が 加 え た 基 質 で あ るLuciferin（Summit
Pharmaceuticals International Corporation, Tokyo, Japan）
を、ATPを利用して発光する性質を活かして、Xenogen
100 - IVIS cooled CCD optical macroscopic imagingsystem（SC BioScience, Tokyo, Japan）を用いて生着細図2胞を検出した。腸管由来神経堤細胞を無神経節腸管に神経堤細胞を蛍光標識したマウスを用いて作成したモデルを作成後 2 週間経過した時点で腸管を摘出し、蛍光顕微鏡で観察した。
（矢印（黄色）で挟まれた部分が無神経節部分）
B. モデル作成から 2〜8 週間の間、経時的に免疫組織化学染色を行い、薬剤処置を行った部分の腸管神経に可逆性がないことを確認した。

移植したマウスに 500μl の Luciferin を腹腔内投与し、1回／週のペースで 8 週間にわたり、発光イメージングによる観察を行った。
免疫組織化学5.

A. 塩化ベンザルコニウムを用いた腸管運動不全モデル
マウスの腸管移植部位腸管における蛍光蛋白質および神経細胞マーカー、グリア細胞マーカーによる多重免疫染色で細胞の分化系譜を確認した。
消化管機能評価6.

移植細胞観察期間内に 2 回／週のペースで体重を測定し、移植後腸管内の便量測定による消化管機能評価を行い、シャム手術群とモデルマウス群、細胞移植群間で比較を行った。
図3

結果

発光イメージングを用いた移植細胞の観察

移植細胞は Luciferin を加えた際の発光を利用して、観察することが可能である。
移植細胞一時的に減少するが、生着後は 3.0×106 photons/sec/cm2 程度の発光強度を維持しており、一定の細胞数の生着が示唆される。

・作成した腸管運動不全モデルマウスは 8 週間にわたり、経時的な病理学的所見の変化（図 2）、体重増加率と便量測定による消化管機能評価を行い、消化管機能低下モデルとして有用であることを確認した。

られるようになった8）。本研究は腸管神経領域では移植・腸管由来神経堤幹細胞を用いた薬剤性ヒルシュスプル細胞が生着し、分化したことに加え、移植細胞の生着後ング病モデルマウスへの移植実験は 8 週間にわたっての挙動を提示した初めての報告である。機能的に移植群移植細胞が生着することを発光を利用して証明できた

はモデル群に比較して体重は増加し、観察期間終了後の（図 3）。移植細胞は腸管内で神経、グリアのマーカー

腸管内残便量は減少していることから、細胞移植は腸管陽性を発現する細胞に分化していた。腸管内残便量と運動機能改善にも寄与すると考えられる。

体重増加率を用いた機能評価で明らかな消化管機能の今後の課題として、腸管由来神経堤細胞は臨床では改善傾向も示すことができた。

非常に限られた場面でしか採取できないため、より簡便にアクセスできるドナーソースの検索、開腹手技を必要

考察としない細胞移植法の開発が必要である。また、近年、中枢神経を中心に細胞移植による神経再生の報告が腸管神経は神経節を構成しているが、神経節中には腸管

7）

続々となされ 、近年、腸管神経でも同様の報告が認め

運動亢進性神経・抑制性神経など異なる機能を持つもの
2

慢性便秘症に関する神経堤幹細胞移植治療の有用性の検討が混在している可能性が示唆されており、今後は移植細デル動物に対し、神経堤由来の幹細胞を移植し、腸管神胞の性質の詳細な解析が必要である。

経の再生と腸管運動機能改善が可能であり、神経堤細胞移植治療が慢性便秘の新たな治療戦略の一つとなる可能

小児の慢性便秘の治療で悩む症例の初期治療として、性が示唆された。

また、手術後の排便機能低下に苦しむ症例の補助治療としてこの細胞移植治療の有用性が期待される。本治療法

謝がさらに内視鏡を用いたさらに低浸襲な治療に発展すれ

辞ば、小児に限らず、高齢者の薬物治療に反応しない便秘本研究の遂行にあたり、ご支援を賜りました公益財症例に対しても用いることが可能であり、あらゆる便秘団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に深く感の治療法として発展していく可能性がある。

謝申し上げます。貴財団助成は大きな励みになり、本研究の結果をもって海外学会に挑戦することもできまし

要約た。また、本研究では慶應義塾大学医学部小児外科の黒生命維持に不可欠である食物摂取を可能にするのは田達夫先生、下島直樹先生および医局の皆様、生理学の正常な腸管運動である。それらに異常をきたすいわゆる岡野栄之先生、芝田晋介先生および研究室の皆様にご助

便秘に対する新たな治療戦略として、腸管神経節細胞の力頂きましたことを感謝致します。

起源である神経堤細胞に注目した細胞移植治療の開発を文目指し、その有用性を検討した。
腸管由来神経堤幹細胞を、無神経節腸管を持つ腸管

献1） J. A. Badner, et al.:., 46, 568–580,1990.
2） J. Amiel, et al.:
, 38, 729–739, 2001.
3） M. A. Parisi, et al.:
, 12, 610–617,2000.
4） E. Passarge:., 31, 11–12, 2002.
5） 日本小児栄養消化器肝臓学会，日本小児消化管機能研究会：小児慢性機能性便秘診療ガイドライン 初版，pp.
26–36, 2013.
6） A. Yoneda, et al.:., 18, 234–237. 2002.
7） S. Okada, et al.:
, 19, 1839–1841, 2005.
8） R. Hotta, et al.:., 123, 1182–1191, 2013.

運動不全モデルに移植した。移植後に、発光を用いた観察で移植細胞の生着・生存を確認し、移植部位腸管における細胞の分化系譜を評価し、腸管運動機能の変化も評価した。
発光イメージングシステムで 8 週間にわたって移植細胞の生存を確認することができ、移植腸管切片で神経に分化しており、細胞移植により腸管機能の改善を示唆する結果が得られた。これらの結果から、腸管運動不全モ3