食品と医薬品間の相互作用に関する新規リスク評価系の構築

中村和昭

独立行政法人国立成育医療研究センター研究所薬剤治療研究部実験薬理研究室 室長

諸実験方法

言

1. 肝移植時に摘出された肝組織からの肝細胞調整

食品中の化学物質と医薬品との相互作用は、医薬品との飲み合わせの観点から医薬品相互作用と同様の基準で国立成育医療研究センター倫理委員会の承認に基づ評価される必要がある。しかし、食品中の化学物質のリき、提供に同意を得られた検体に対して、肝組織切断面

スク評価には化学物質単独での発がん性や催奇形性、生より門脈もしくは中心静脈を確保し、血管腔へカニュー殖毒性等の動物や微生物等を用いた評価は行われている

レを挿入後血管周囲とともにカニューレを結索することものの、ヒトを試験対象とした医薬品との相互作用の観により固定し、灌流路を確保した。コラゲナーゼ環流法

点からの実験的な検討は十分に行われていない。医薬品

にて組織を分散し、細胞懸濁液をガーゼとナイロンメッ間の相互作用の機序としては代謝過程における相互作用シュにて濾過することにより大型の細胞塊を除去し、肝が重要であり、そのほとんどが薬物代謝酵素チトクロム

細胞懸濁液を得た 2）。

P450（CYP）の阻害または誘導に起因する。食品中の化学物質と医薬品の相互作用も同様の機構と考えられ、食2．ヒトにおける食品中の化学物質による肝細胞毒性並品と医薬品の相互作用により有害事象を引き起こす代表

びに発生毒性の検討的な例として、グレープフルーツジュースや西洋弟切草単離したヒト新鮮肝細胞を用いて、モデル食品としによる CYP の阻害・誘導作用が挙げられる 。医薬品間てヒペルホリンの肝細胞毒性を検討した。また、マウの相互作用は処方時に留意されるのに対し、食品と医薬ス ES 細胞を用いた発生毒性試験法である Embryonic

品との相互作用は消費者の食生活に依るところが大きく、

Stem Cell Test（EST 法）3, 4）により、ヒペルホリンの日常生活において予期せずに生じる可能性が高い。服用

発生毒性を検討した。さらにヒペルホリンの ES 細胞のされた薬物は体内へ吸収された後、その 90% 以上が肝未分化マーカー発現への影響をリアルタイム PCR 法に臓により代謝されることから、食品中の化学物質によるより検討し 5）、ヒペルホリン細胞死誘導効果を細胞死検

肝臓への影響は、服用する医薬品の薬物動態を変化させ、出 ELISA キットにより測定した。

1）

副作用を増悪させる恐れがある。したがって、食品中の結化学物質による健康障害の予防の観点から、食品中の化果学物質によるヒト肝臓への影響に対する評価系が必要で本研究に用いるヒト肝細胞を調整するため、ドナー余ある。しかし、これまでにヒト肝細胞を用いた食品中の剰肝臓・レシピエント摘出肝臓から肝細胞を分離した。

化学物質の安全性を評価する系は確立されていない。本

研究期間中、ドナー 5 検体、胆道閉鎖症 13 検体、肝線研究では、食品中の化学物質と医薬品との相互作用を検維症、糖原病 Ib が各 2 検体および CPS1 欠損症、カロリー討するための実験系確立の基礎として、生体肝移植手術病、糖原病 IIIa、アラジール症候群が各 1 検体、合計の際に生じる摘出肝から肝細胞の単離・培養を行い、ヒ27 検体より、肝細胞単離を行った。

ト新鮮肝細胞を用いた食品中の化学物質による肝細胞毒

単離したヒト新鮮肝細胞を用いて、ヒペルホリンの肝性試験系を検討した。さらに、ES 細胞を用いた生殖発細胞毒性を検討した結果、肝細胞生存率に対する IC50生毒性試験系により、食品中の化学物質による胎生期の（50% 細胞生存率抑制濃度）は 5.36μM であった（図 1）。

安全性についても評価可能な試験系の構築を試みた。

EST 法による発生毒性試験では、マウス ES 細胞に対1村和

昭

1200

expression level（%）（vs. 0 µM）

servival rate（%）

中12080604020002468hyperforin（µM）

10図1 ヒペルホリンのヒト肝細胞に対する毒性

800600Oct4400200002468hyperforin（µM）

10

図 3 ヒペルホリンによるマウス ES 細胞未分化マーカ一発現への影響

ヒペルホリンは、ヒト新鮮肝細胞に対して細胞毒性を示した。

してヒペルホリンは細胞毒性を示し、その IC50 は 5.89

高濃度のヒペルホリンにより ES 細胞の未分化マーカ一発現が亢進する。

μM であった（図 2A）。ヒペルホリンはマウス繊維芽細胞（NIH-3T3 細胞）に対しても細胞毒性を示し、その伝子発現を亢進させた（図 3）。
マウス ES 細胞および繊維芽細胞に対するヒペルホリ

IC50 は 2.38μM であった（図 2B）。

ンの生存率低下効果を検討するため、ヒペルホリン添加
120時の両細胞のアポトーシスを検討した結果、ヒペルホリ

ES

100

ンは繊維芽細胞に対しては細胞死誘導効果を示したが80（図 4A）、ES 細胞に対しては細胞死誘導効果を示さな60かった（図 4B）。

402000 0.010.11.0

hyperforin（µM）

survival rate（%）

B140120
10080
60
40
200

3T30 0.010.1

1.0

10

B
apoptotic cell ratio（vs. 0 mM）

hyperforin（µM）

cardiomyocytes（beating cells）（%）

A

10apoptotic cell ratio（vs. 0 mM）

survival rate（%）

AC

Sox2

1000

100

120
10080
60
40
20002

468hyperforin（µM）

104

NIH-3T3

32
10

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0024681068

10hyperforin（µM）

ES024hyperforin（µM）

図 4 ヒペルホリンによる細胞死誘導効果

図 2 ヒペルホリンによる発生毒性の検討(A) 繊維芽細胞、(B)ES 細胞。
ヒペルホリンは繊維芽細胞に対しては細胞死を誘導するが、ES細胞に対しては細胞死を誘導しなかった。

（A）ES 細胞に対する細胞毒性、（B）繊維芽細胞に対する細胞毒性、（C）ES 細胞の心筋分化に対する影響。ヒペルホリンはES 細胞、繊維芽細胞に対して細胞毒性を示した。

考察

また、ヒペルホリンはマウス ES 細胞の心筋への分化

これまで、実験的にヒト肝細胞を用いる場合にはヒトを抑制し、ID50（50% 分化抑制濃度）は 1.76μM であっ

凍結肝細胞を使用する以外に有効な手段はなかったが、た（図 2C）。高濃度のヒペルホリンはマウス ES 細胞に肝細胞は肝機能を一定以上に維持しつつ、凍結保存をすおいて、未分化マーカーである Oct3/4 および Sox2 遺ることが困難であり、ヒト凍結肝細胞の使用は必然的に2

食品と医薬品間の相互作用に関する新規リスク評価系の構築要だと考えられる。

肝機能の低い肝細胞を使用せざるを得なかった。本研究から、手術摘出肝から得られたヒト新鮮肝細胞を用いて、要

ヒペルホリンによる肝細胞毒性の評価が可能であること

約が示された。医薬品と同様に食品中の化学物質の肝細胞本研究では食品の安全性の観点から、食品中の化学物に対する影響も、できる限り肝機能を高度に維持した肝質と医薬品との相互作用を検討するための基礎研究とし細胞を用いることが生体内での作用を検討する上で重要て、西洋弟切草の有効成分であるヒペルホリンをモデルであると考えられ、本研究の結果は、今後のヒト新鮮肝物質として用い、肝毒性および発生毒性試験系の検討を細胞を用いた医薬品および食品中の化学物質による肝毒行った。本研究による検討から、高濃度のヒペルホリン性を検討する上で一つのモデル実験となると期待される。

はヒト新鮮肝細胞に対して細胞毒性を示したが、その作

これまでにヒペルホリンを服用した際の血中ヒペルホ用はヒペルホリン摂取時に想定される血中ヒペルホリンリン濃度のピーク値は 168.35ng/ml（約 30nM）と報告

濃度を考慮すると、肝毒性は低いと考えられた。またヒされており 、また西洋弟切草として摂取した場合は血ペルホリンはマウス ES 細胞に対して細胞毒性と分化抑7）中にヒペルホリンは検出されないと報告されている 。

制作用を示したが、この作用も血中ヒペルホリン濃度を本研究によりヒペルホリンのヒト新鮮肝細胞に対する毒考慮すると、通常摂取による催奇形性は低いと考えられ性が明らかとなったが、その IC50 値は前述の血中ヒペた。本研究を発展させることにより、今後肝代謝を考慮ルホリン濃度の約 160 倍であった。また、本研究からした食品と医薬品の相互作用における肝毒性および発生マウス ES 細胞およびにマウス繊維芽細胞対するヒペル毒性試験系の確立が可能であると考えられる。

6）

ホリンの細胞毒性が明らかとなったが、その IC50 値は
謝それぞれ前述の血中ヒペルホリン濃度の約 200 倍およ

辞び 100 倍であった。さらにヒペルホリンはマウス ES 細本研究は、公益財団法人三島海雲記念財団の平成 23 年度

胞の心筋分化に対して影響を与えたが、その ID50 値は「学術研究奨励金」により行われました。公益財団法人三島海想定される血中ヒペルホリン濃度の約 60 倍であった。

雲記念財団ならびに関係者各位に深く感謝申し上げます。

ヒペルホリンはこれまでにも安全性の高い成分であると文考えられてきたが、本研究の結果からも、通常の西洋弟切草の摂取は肝毒性を示さず、発生毒性も極めて低いこ

献1）中島恵美：薬の生体内運命（中島恵美編）、pp194-211,
ネオメディカル、2009.
2）Nakamura K., et al.,:J. Biosci. Bioeng., 111, 78-84, 2011.
3）Spielmann H.,et al.,: In vitro toxicology, 10, 119-127, 1997.
4）Nakamura K, et al.,:Methodological Advances in theCulture, Manipulation and Utilization of Embryonic StemCells for Basic and Practical Applications（A. Craig, ed）,
pp413-428, Intech, 2011.
5）Kusakawa S et al.,: Life sciences, 83, 871-877,2008.
6）Agrosi M, et al.,:Phytomedicine, 7, 455-462, 2000.
7）Vitiello B, et al.,: J. Clin. Psychopharmacol., 25, 243-249,2005.とが実験的に示された。
ヒペルホリンは繊維芽細胞に対しては細胞死を誘導するものの、ES 細胞に対しては細胞死を示さなかったことから、ヒペルホリンの効果は ES 細胞と繊維芽細胞に対しては異なることが示された。したがって、食品中の化学物質の安全性を評価する際には標的となる細胞での化学物質の作用およびその機構を詳細に解析することが必3