ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

東京医科歯科大学 難治疾患研究所

堀成人疾患研究部門

久

分子病態分野枝

Anaphylactic reactions to measles, mumps and rubella vaccines and the combined measles-mumps-rubella (MMR)
vaccines have been suggested to be caused by allergy containing bovine gelatin in the vaccines as a stabilizer. Since
gelatin can be derived from collagen molecules present in all multicellular animals, it has long been believed to be
nonimmunogenic and thought to be weakly allergic in human. Therefore, gelatin has been widely used as a stabilizer
in vaccines. The present study was designed to investigate the reactivity of IgE in bovine gelatin-sensitive children
to gelatins from various animals by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The IgE in the children reacted
to mammalian gelatins including kangaroo and mouse gelatins, to which they had little or no exposure as a foodor a vaccine stabilizer. Most of the children who displayed sensitivity may be due primarily to the antigenic crossreactivity between mammalian gelatins.
Gelatin, obtained from bone and skin, consists mainly of denatured type I collagen, which is composed of two
α1 and one α2 chains. Furthermore, the study was designed to elucidate the IgE reactivity to α1 and α2 chains ofbovine type I collagen in gelatin-sensitive children. Purified α1 and α2 chains of bovine type I collagen were obtainedby separation of column chromatography. All serum samples which were reacted with bovine type I collagen showed
positive reaction to α 2 chain. In our previous study, we reported that homology (98%) between α1 chains of humanand bovine type I collagen is higher than homology (93%) between α2 chains of them. These homology data mightsuggest that the α2 chain has higher allergenicity than the α1 chain. To analyze IgE-binding sites of α2 chain,recombinant proteins covering 100 kDa collagenous domain of α2 chain were expressed by pRSET vector. One offive recombinant proteins located in central portion of collagenous domain showed strong reactivity for patients sera.
To further determine epitope, several small recombinant proteins covering the central collagenous domain wereprepared. The 4 kDa recombinant protein spanning from 461Pro to 500Glu was shown cross-reactivity to patients sera
but the protein from 431Ala to 475Gly was not shown. Taken together these data, a major epitope in the α2 chain ofbovine type I collagen was suggested to locate in 25 amino acid residues with 475Gly to 500Glu.
In the future, our analyzed data of IgE-binding epitope in the α2 chain of bovine type I collagen may become toolfor developing a gelatin which has no or low allergenicity to humans

１．緒

こえて広く保存されていることから、これまで、コラーゲ言ンの免疫原性は非常に低いと考えられてきた。しかしワク近年小児において麻疹、ムンプス、風疹ワクチン接種

チン添加剤中のウシゼラチンがアレルギー原因物質である

後、副反応としてアナフィラキシーを起こす例があり、卵ことが明かとなったことから、本研究はウシコラーゲンに成分がアレルギーの原因と考えられてきた。これまでこの代わる種特異性の低いコラーゲンの開発を目的とし、種々アナフィラキシーの原因アレルゲンがワクチン添加物としの動物由来コラーゲンとの反応性を検討した。さらにⅠ型

１, ２）

。こ

コラーゲンの抗原性の検索を行うため、構成鎖 α1 鎖およのゼラチンはコラーゲンの変性物であり、主にウシコラーび α2 鎖を単離精製し、また α2 鎖をカバーする組み換えゲンがその由来となっている。コラーゲンは現在ワクチンタンパクを作成し、抗原部位の局在を明らかにした。ゼラの添加剤みならず、他の薬剤の安定化剤および止血用膜なチンは優れた安定性と安価で多量供給できることから、さどの医薬品、美容形成用剤および化粧品、またゼリーとしらに需要は拡大するものと推測される。今後安全なゼラチての食料品など、生活密着した用途に広がっている。一方ンを開発するために、エピトープ分解除去の方法の確立を

コラーゲンは人体の全タンパク量の 1/3 を占め、特徴的な予定している。て含まれるゼラチンであることを明かにしてきた（Gly-Pro-X）の繰り返し配列をしており、３本の α 鎖が２．実３重ヘリックスを構成している。これらの構造は動物種をEpitope analysis of gelatin allergy anddevelopment of low-allergic gelatin
Hisae Hori
Department of Molecular Pathogenesis,
Division of Adult Diseases, MedicalResearch Institute, Tokyo Medical and
Dental University

２. １

試

験

料

安定剤としてゼラチンを含んでいるワクチン接種後、アナフィラキシーを含む即時型アレルギー反応を惹起した小児 15 例から得られた血清およびゼラチン含有の菓子（グミ）を食べた後即時型アレルギー反応を惹起した小児１例から得られた血清。

− 36 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

２. ２ ウシⅠ型コラーゲンおよび各種動物由来コラーゲンの作成

３． 結

Ⅰ型コラーゲンはウシ皮膚真皮層を細切後 0.5M 酢酸で

３. １

果

ゼラチン中のアレルゲンの同定抽出し、食塩沈殿法にて精製した。各種動物由来コラーゲ

ゼラチン特異的 IgE 抗体の測定は共同研究者阪口雅弘

ンも同様に皮膚組織から 0.5M 酢酸またはペプシン消化で博士の開発した蛍光 ELISA を用い１）、ワクチン接種後ア３）

ナフィラキシーを起こした患者血清と熱変性コラーゲンを抽出後上記と同様に単離精製した 。

用い反応性を調べた。

２. ３

ウシⅠ型 α1 鎖および α2 鎖の調製

ウシ皮膚よりペプシン消化で可溶化し、食塩分別法で精３. １. １ 市販ゼラチンと精製コラーゲンに対する反応性製したⅠ型コラーゲンから、Piez らの CM（カルボキシメの検討４）チル）クロマトグラフィー分離法にて各鎖を単離した 。

ワクチンに添加されている市販ゼラチンのアレルゲン性

α2 鎖はさらにアミノ酸特異的な分解（CNBr によるメチの有無を確認する目的で精製コラーゲンとの反応性を比オニンの分解、リジルエンドペプチダーゼ）を行い、抗原較検討した。ウシ皮膚由来精製コラーゲンを加熱変性後性の変化を検討した。

ELISA にて反応性を調べた。10 例の患者血清 IgE はワクチン含有のゼラチンと同様ウシⅠ型コラーゲンに強い反応性を示した（Fig. １）。

２. ４ ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖の組み換えタンパクの作製
アレルギー患者血清中のエピトープを系統的に分析す
５）

３. １. ２ ゼラチンアレルギー反応の種特異性の検索

より、Fig. ３に示した

ゼラチンによるアレルゲン性の種特異性について検索す

数種の組み換えタンパクに対応する cDNA フラグメントる目的で６種の哺乳動物、鳥類、両生類、魚類、頭足類（200 アミノ酸残基）を作製した。バクテリア発現ベクタなどの皮膚よりコラーゲンを抽出精製し、上記と同様各ー（pRSET、His-Tag）に組み込み , 融合タンパクを作製し、種動物コラーゲンを熱変性後 ELISA にて反応性を調べた

ニッケル吸着カラムで精製した。

（Table １）。ウシコラーゲンに対する反応性と比較するとるためにウシⅠ型 α2 鎖 cDNAブタ等の哺乳類由来のコラーゲンに幅広い交差反応性を認

２. ５

めたが、これまで摂取されたことの無いマウス、カンガル

ゼラチン特異的 IgE 抗体との反応

上記ウシおよび各種動物由来コラーゲン、ウシ α2 鎖、ーのコラーゲンにも反応することから、ウシコラーゲンに組み換えタンパクに対する IgE 抗体の測定はマイクロプ

よるアレルギー反応は動物種を越えて共通の抗原決定基にレートに抗原（10µg/mL）をコートし、アレルギー患者由来することが推測された。一方、これまでに多く摂取さ血清（1：10 希釈）と蛍光 ELISA にて行った。

れているニワトリのコラーゲンとは低い反応性を示し種特異性反応が認められた。またサカナコラーゲン単独で陽性

Table １

Reactivity of anti-gelatin IgE to gelatin from various animals.

Fig.1 IgE reactivity to bovine gelatin and denatured type Ⅰ collagen. Each child's serum wasdiluted to approximately1 Ua/mL as level of specific IgE to gelatin.

− 37 −

を示す例も認められたが、その後の研究の結果、いわゆるクを作成し同定を行った。

サカナアレルギーの患者血清では類似のサカナコラーゲンと反応するもののウシゼラチンとは反応しないことが明か
６）となった 。

３. ２ ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖組み換えタンパクによる抗原性部位の検出
ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖のアミノ酸配列はこれまで部分

３. １. ３ Ⅰ型コラーゲン構成鎖のアレルゲン性について配列の報告であったため、ウシ大動脈由来の cDNA ライブ

コラーゲンは十数種の型が知られているが、抽出時に混ラリーより全 cDNA をクローニングし、全アミノ酸配列を入する可能性のあるⅡ型コラーゲンからⅤ型コラーゲンに明かにした５）。そのウシⅠ型 α ２鎖 cDNA を鋳型として 200対する反応性を調べたところ、Ⅰ型コラーゲンに特異的でアミノ酸配列に相当する cDNA フラグメントを作製し、発あった。したがってこのアレルギー反応がⅡ型からⅤ型コ現ベクターに組み込み融合タンパクを作製した（Fig. ３）。

ラーゲンの混在に由る可能性は低いと考えられた。そこで
Ⅰ型コラーゲン構成鎖の α1 鎖 , α2 鎖を単離精製し、それ３. ２. １ ウシ α2 鎖をカバーする 5 個の組み換えタンパぞれの反応性を調べたところ、ヒトとのホモロジーが 98

クとの反応性％の α1 鎖とは全く交差性は認められず、α2 鎖（ホモロジ

α2 鎖のヘリックス構造部位に相当する 100kDa（約 1000ー 93％）に特異的であることが明らかになった（Fig. ２）。

アミノ酸残基）に対応する５個の組み換えタンパク、Ⅰ

エピトープはウシ α2 鎖の特定部位に局在すると考えられ、（1NGln -9NPro/1Gly - 224Leu）、Ⅱ（213Asn - 417Ala）、Ⅲ（418Gly

さらに詳細な抗原部位を特定するために、組み換えタンパ- 662Pro）、 Ⅳ（663Val -880Glu）、 Ⅴ（879Val - 1014Ser/1C Gly15CAla）を用いて患者血清との反応性を検索した（Table ２）。

患者血清 16 例中 14 例がⅢに、６例がⅡに、３例がⅣ、１例がⅤに陽性反応を示し、抗原部位は複数あることが示唆されたが、主要なエピトープはヘリックス構造中央部Ⅲ（418Gly - 662Pro）にあると判明した。
３. ２. ２

主要エピトープの局在部位の解明

さらに組み換えタンパクⅢ（418Gly - 662Pro）について
３つの部位、Ⅲ a（418Gly - 510Ala）、Ⅲ b（491Leu - 588Pro）、Ⅲ c（572Leu - 675Ser）に対応する cDNA フラグメントを作成し、融合蛋白を発現、精製した。これら組み換えたんぱくに対する反応性を調べたところ、Ⅲ（418Gly 662

Fig.2 IgE reactivity to α1 and α2 chains of bovine type Ⅰcollagen. Each child's serum was diluted to approximately
1 Ua/mL as level of specific IgE to gelatin.

Pro）に陽性の 14 検体はすべてⅢ a に反応し、抗原部位は 418Gly - 510Ala の 93 残基に局在することが明らかになった（Fig. ４）。ただし１症例 no.4 においてⅢ b にも反応性

Fig.3 A schematic representation of the collagen α2（Ⅰ）chain and its recombinant proteins. Reco ｍ binant proteins Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ ,Ⅲ a, Ⅲ b, Ⅲ c and Ⅲ a-1 to a-3 are prepared from bacterial expression vector pRSET.

− 38 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発がみとめられた。さらにⅢ a 中の抗原の局在を検索するた
408

めにⅢ a-1（ Lys -444

431475

三重ヘリックスを構成しており、コラーゲンに特異的なアGly）、Ⅲ a-2（ Ala - Gly）およびミノ酸である Hydroxyproline, Hydroxylysine は、コラー

Ⅲ a-3（461Pro-500Glu）を作成し、その反応性を調べたところ、ゲンの高次構造の安定化に寄与している。これらの構造は

Ⅲ a-3 に明らかな反応性が認められた（Fig. ５）。これらの動物種をこえて広く保存されており、ウシとヒトとの相同タンパクを CNBr 分解、lysylendopeptidase 処理しても抗性は α1 鎖で 98％、α2 鎖で 93％と高く、コラーゲンの免原性に変化は認められないことから、メチオニンおよびリ疫原性は非常に低いと考えられてきた。しかし、近年コラジン残基は抗原部位に含まれないと推測された。

ーゲンのヘリックス構造を認識し、種特異性を示すモノク４．考

ローナル抗体のエピトープが明かとなり、コラーゲンも免察

疫原性は高いことがわかった７）。今回ゼラチンアレルギー

Ⅰ型コラーゲンは特徴的な（Gly-Pro-X）の繰り返し配の抗原物質がウシⅠ型コラーゲンであり哺乳動物のコラー列をしている分子量 100kDa の α1 鎖２本と α2 鎖１本がゲンと共通の抗原性を保持していること、さらにⅠ型コラ

Table ２ Reactivity of anti-gelatin IgE to recombinant proteins for α2 chainof bovine type Ⅰ collagen.

Fig.4 Reactivity of the sera from children with systemic allergic reaction to recombinant proteins of 418Gly to 675Ser
in bovine α2 (Ⅰ) chain. Ⅲa, 418Gly - 510Ala; Ⅲb,491Leu 598
Pro; Ⅲc, 578Leu - 675Ser

Fig.5 Reactivity of the sera from children with systemic allergic reaction to recombinant proteins of 408Leu to 500Glu
in bovine α2 (Ⅰ) chain. Ⅲa-1, 408Lys - 444Gly; Ⅲa-2,431Ala 475
Gly; Ⅲc: 461Pro - 500Glu− 39 −

ーゲンの２本の分子鎖（α1 鎖および α2 鎖）のうち α2 鎖を減弱させる方法を検討中である。に特異性があり、一次構造を認識していることが判明した
８）, ９）。さらに α2 鎖の部分組み換えタンパクを作成し、そ（参考文献）の抗原性を調べたところ、すくなくとも４個所の抗原性部

１） Sakaguchi M., Ogura H., and Inoue S.: IgE antibody

位がみとめられた。さらにエピトープは主要な反応性を示

to gelatin in children with immediate-type reactions toすⅢ（418Gly - 662Pro）のうちⅢ a-3（461Pro-500Glu）の 40 残

measles and mumps vaccines. J. Allergy and Clinical基にあり、さらにオーバーラップ

Immunology. 96, 563-565, 1995.

を除くと475

しているアミノ酸配列

500

Gly- Glu の 25 アミノ酸残基配列中に局在する

２） K e l s o J . M . , J o n e s R . T . a n d Y u n g i n g e r J . W .

ことを明かにした（Fig. ６）。またヒトと異なるアミノ酸配Anaphylaxis to measles, mumps and rubella vaccine

列部位を考慮すると、Ⅱでは 271Gly-300Ala 近傍に、Ⅲ a では

mediated by IgE to gelatin. Journal of Allergy and467

Clinical Immunology, 91, 867-872, 1993.

500

Leu- Glu 近傍にウシゼラチンアレルギー抗体 IgE の結合部位が局在すると推測され（Fig. ６）、上記の組み換えタ３） Miller E.J. and Rhodes R.K., Preparation andンパクを用いた抗原部位の検索結果と一致した。本実験はcharacterization of the different types of collagen.

バクテリアでの発現系であることから、前述のコラーゲン

Methods Enzymol ., 82, 33-64, 1982.

特異的なアミノ酸（Hydroxyproline, Hydroxylysine）の４） P i e z K . A . , E i g n e r E . A . , L e w i s M . S . , T h e

水酸化とその糖付加修飾は行なわれていないにもかかわらchromatographic separation and amino acid

ず、組み換えタンパクとの反応性が認められた。したがっcomposition of the subunits of several collagens.て、コラーゲン特異的アミノ酸は抗原決定部位には関与しBiochemistry , 2, 58-66, 1963.ていないことを示唆しているが、詳細は動物細胞培養系に

５） Shirai T., Hattori S., Sakaguchi M., et al: Theて修飾された融合タンパクを作製し、アレルギー患者血清

complete cDNA coding sequence for the bovine

中 IgE のエピトープを系統的に分析する系を確立する必

proα2(I) chain of type I procollagen. Matrix Biology,

要がある。今後アレルゲン性のないコラーゲンの開発には

17,85-88, 1998.

本研究により特定されたエピトープのアミノ酸配列を参考

６） Sakaguchi M., Toda M., Ebihara T., Irie S., Horiにし、感受性の高いプロテアーゼ処理によりアレルゲン性

H. Imai A, Yanagida M, Miyazawa H, Ohsuna H,

Fig.6 Amino acid sequence in bovine α2 chain of putative epitope for spacific IfE anitibody from children with anaphylaxis to vaccines.

− 40 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

Ikezawa Z, Inouye S.: IgE antibody to fish gelatin (type８） Sakaguchi M., Hori H., Ebihara T., et al: Reactivty ofI collagen) in patients with fish allergy. Journal of

the IgE in bovine gelatin-sensitive children to gelatins

Allergy and Clinical Immunology, 106, 579-584, 2000

from various animals. Immunology 96, 286-290, 1999.

７） Hori H., Keene D. R., Sakai L. Y., et al: Repeated９）Sakaguchi M., Hori H., Hattori S., et al: IgE reactivity

helical epitopes of defined amino acid sequence into α1 and α2 chains of bovine type I collagen inhuman type III collagen identified by monoclonalchildren with bovine gelatin allergy. Journal of Allergy

antibodies. Molecular Immunology, 29, 759-770, 1992.

and Clinical Immunology, 104, 695-699, 1999.

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