皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析
島根大学医学部医学科免疫学講座

小谷仁司

Skin aging is one of the important problems in the cosmetics field that is difficult to control or improve. In recentyears, it has become clear that the functional deterioration due to skin aging is due to the SASP factor secreted by aging
cells. Therefore, we decided to search for a plant extract that specifically removes senescent cells in the skin by means ofsenolysis. In this study, we screened the senolytic effect of many plant extracts. Among them, we focused on the ginger
extract and performed a detailed analysis, but unfortunately, we could not clarify the selective activity of senescent cells.
However, it was suggested that the combination of some flavonoids and the anticancer drug dasatinib has a senolytic effect.
In the future, we would like to further search for the remaining plant extracts and contribute to the development of cosmetics
that are useful for improving skin aging.

１．緒

言

皮膚の老化は美容にとって最も目立つとともに、抑制・改善が難しい問題点の 1 つとなっている。加齢による皮膚細胞の老化だけでなく、日々の生活において、肌は日光により UV 照射され、皮膚の細胞は酸化ストレスを生じ、DNA の損傷をはじめ皮膚細胞の老化が非加齢的にも生じている。また、酸化ストレスによる皮膚の老化だけでなく、皮膚のシミが生成することなどを気にするため、日焼け止めを塗り、日傘をさし、日光を避けるというのが現状における防御策となっている。本研究では、近年注目されてきている老化細胞除去薬（senolytic drug）という概念を、皮膚の老化改善に適用することにより、新たな皮膚老化改善に有用な天然植物成分を見出すことができるのではないかと考え研究に取り組むことにした。これまでの皮膚Fig. 1 細胞老化メカニズムと老化細胞除去薬（senolytic drug）による皮膚老化改善作用老化抑制などの方法論は、老化を起こす原因となる紫外線照射を防ぐ日焼け止めや、DNA 損傷を起こす酸化ストレ

２．方スの抑制を目的に、抗酸化物質などが注目されていた。し法

かし、皮膚の機能低下は老化細胞が産生する老化細胞分泌

本研究では、株化培養細胞のケラチノサイトを用いて、因子（インターロイキン 6：IL- 6 をはじめとする炎症性サ細胞老化を誘導し、in vitro において老化ケラチノサイトイトカインなど）に大きく制御されていることから、老化と非老化ケラチノサイトに対する細胞生存率や細胞死誘導細胞の増加を抑制するのではなく、老化細胞を特異的に取活性を比較することにより老化細胞特異的に細胞死を誘導り除くという新たな方法論で皮膚機能を健康的に維持する（老化細胞除去）する天然植物成分を探索・機能解析するこことを目指し、老化細胞除去活性を有する天然植物成分のととした。また、これまでの研究で抗癌剤誘導性の細胞老探索を進めることとした。

化を起こすヒト癌細胞株に関しても同様の評価をおこなうことにより、老化細胞除去活性を持つ天然植物成分の絞り込みをおこなうこととした。

Search and functional analysis of natural
plant components that improve skin aging
Hitoshi Kotani
Department of Immunology Shimane
University Faculty of Medicine

2 . 1. 使用細胞株
株化されたヒトケラチノサイトである HaCaT 細胞はドイツ連邦共和国ガン研究センターより入手した。比較対象として使用するヒト癌細胞株は肺癌細胞株である A 549 細胞または乳癌細胞株である MDA-MB- 231 細胞を使用し− 40 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析た。HaCaT 細 胞 お よ び MDA-MB- 231 細 胞 は DMEM 培

クロプレートリーダーにより測定した。

地（高グルコース）に 10 % FBS と抗生物質のゲンタマイシンを添加した培地を用いて 37 ℃ 5 %CO 2 存在下での培養をおこなった。A 549 細胞は RPMI 1670 培地に 10 % FBS

2 . 7. 細胞死の評価
解析と抗生物質のゲンタマイシンを添加した培地を用いて 37℃ 5 %CO 2 存在下での培養をおこなった。

Annexin V & PI染色とFACS

細胞死の測定は、APC 蛍光ラベルされた Annexin V とPropidium Iodide（PI）を回収した細胞に添加し、FACS を用いて測定をおこなった。

2 . 2 . 使用植物エキス
本研究で使用する植物エキスは、生薬約 150 種類のメタ

2 . 8 . 細胞老化の誘導方法

ノール抽出エキスおよび、共同研究者により採取された沖他の研究者により既に HaCaT 細胞での細胞老化誘導が縄・奄美産植物エキスの 80 ％メタノール抽出エキスを利報告されている Bromodeoxyuridine（BrdU）の添加での方用し、100 µg/mL となるように調製して、細胞生存率を指法 1）でおこなうこととした。具体的には、BrdU 45 µM を標として非老化細胞と老化細胞の比較をおこなうことによ含む培地で 7 日間培養をおこなうことで細胞老化を誘導しり老化細胞除去活性をスクリーニングした。

た。比較対象とする癌細胞株の細胞老化誘導に関しては、我々の研究室で既に確立している DNA ポリメラーゼ阻害

2 . 3 . ウエスタンブロット法剤の１つである aphidicolin 500 nM を含む培地で 5 日間培細胞を回収し、PBS で洗浄した後に RIPA buffer を添加養をおこなうことで細胞老化を誘導した。これらの細胞老し、氷上で 30 分かけてタンパク抽出をおこなった。タン化が誘導されたことの確認は、老化細胞の指標となる p 21

パク定量をおこない、同タンパク量となるようにポリア

タンパクの発現や SA-β-gal 染色、細胞の肥大化などによクリルアミドゲルを用いて電気泳動をおこなった。その後、り確認をおこなった。

PVDF 膜に転写し、5 % スキムミルク溶液でブロッキング３．結した後、1 次抗体および 2 次抗体と反応させ、画像解析装
置 Amersham imageQuant 800（Cytiva）によりタンパク発現を測定した。

果

皮膚の老化改善作用を調べるために、in vitro での細胞老化誘導をヒトケラチノサイトである HaCaT 細胞株に対して BrdU を添加し、７日間培養をおこない細胞老化を2 . 4 . Senescence associated betagalactosidase（SA-β-gal）染色とFACS 解析誘導した。その結果、老化細胞の指標の１つである p 21

SA-β-gal 染色とその測定は、4 % パラホルムアルデヒとが確認された（Fig. 2）。さらに、老化細胞が産生するドで固定した細胞に基質である SPiDER-β Gal（同仁化学）

SA-βgal の発現を基質となる SPiDER-βGal を用いて確認を添加した後、フローサイトメーター（FACS）CytoFLEXをおこなったところ、BrdU 45 µM 添加後 7 日の細胞にお（BECKMAN COULTER）を用いて測定した。

いて SA-β-gal 活性の増化が確認されるとともに、老化細のタンパク発現が BrdU の濃度依存的に増化しているこ胞の特徴である細胞の肥大化が確認された（Fig. 2）。この

2 . 5 . RNA 抽出とrealtime RT-PCR

細胞の肥大化に関しては、顕微鏡での形状観察と FACS に細胞を回収し、Nucleo ZOL（Takara）を用いて RNA 抽出をおこない、さらに ReverTra Ace qPCR RT Master

よる細胞サイズをあらわす forward scatter（FSC）の増大で確認した。

Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて逆転写を

次に老化細胞除去活性を持つ天然植物エキスのスクリーおこない、作成した cDNA を用いて、realtime RT-PCR

ニングをおこなうにあたり、HaCaT 細胞だけでなく他のを お こ な っ た。Realtime RT-PCR は THUNDERBIRD

老化細胞を同時にスクリーニングして、活性を持つ植物のSYBR qPCR Mix（TOYOBO）を 用 い て Thermal Cycler

絞り込みをおこないやすくするため、ヒト肺癌細胞株であDice TP 900（Takara）により測定し、ΔΔCt 法により各る A 549 細胞を用いて、既に我々の研究室で確立されていmRNA 発現量の解析をおこなった。

る aphidicolin 誘導性細胞老化を利用することとした。このaphidicolin はセファロスポラム・アフィジコラという菌類

2 . 6. 細胞の生存率の測定（CCK- 8）assay

Cell Counting Kit- 8から単離された抗生物質の１つであり、DNA ポリメラーゼ阻害作用を持つ化合物である。A 549 細胞に aphidicolin細胞の生存率の測定は、96 well plate を用いてサンプル

500 nM を添加し、5 日間培養することにより細胞老化誘添加し培養したのち、細胞の入った well に CCK- 8 試薬（同導をおこなった。A 549 に関しても細胞老化の確認のた

仁化学）を添加し、1 〜 2 時間後に各 well の吸光度をマイめ、SA-β-gal の発現確認と p 21 タンパクの発現確認をお− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 2 BrdU 添加により細胞老化誘導した HaCaT 細胞の解析
A. SA-β-gal 活性・細胞サイズの FACS 解析
B. p21 タンパク発現解析
C. SASP および抗アポトーシスタンパクの mRNA 発現解析

Fig. 3 Aphidicolin 添加により細胞老化誘導した A549 細胞の解析
A. SA-β-gal 活性・細胞サイズの FACS 解析
B. p21 タンパク発現解析
C. SASP および抗アポトーシスタンパクの mRNA 発現解析

こなった（Fig. 3）。さらに、細胞老化を誘導した HaCaT 細factor）2）の mRNA 発現を調べるために RNA 抽出をおこな胞および A 549 細胞に関して、組織の機能低下を起こす原い、realtime RT-PCR 法を用いて mRNA 発現量を非老化因となることが示唆されている老化細胞分泌因子（SASP細胞と比較した（Fig. 2 , 3）。その結果、HaCaT 細胞におい− 42 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析て老化誘導された細胞でインターロイキン（IL）- 1 β、IL- 6、比較検討をおこなう方法として進めた。ここでは、既に老IL- 8 などの炎症性サイトカインの mRNA 発現が増化して化細胞除去薬として報告のある Bcl- 2 および Bcl-xL 阻害いるとともに、細胞周期に関わる p 21 や抗アポトーシス剤である ABT- 2633）という化合物をポジティブコントロタンパクである Bcl- 2 および Bcl-xL などの mRNA 発現もールとして使用した。使用した植物エキスは生薬メタノー増化していることが明らかになった。同様に A 549 に関し

ル抽出エキス 150 種類と奄美産植物 80 ％メタノール抽出ても老化細胞で IL- 1 β、IL- 6、p 21 などの mRNA 発現増エキス 560 種類であり、現在もスクリーニングを完了して化が確認されたが、Bcl- 2 や Bcl-xL の mRNA 発現はほといない沖縄産植物 80 ％メタノール抽出エキスについて継んど変化していなかった。

続的に探索をおこなっている。スクリーニングの結果、生これらの細胞老化誘導した HaCaT 細胞と A 549 細胞を薬抽出エキスではオウバク、カシュウ、カンキョウ、シン用いて、非老化細胞と比較をおこないながら植物エキス

イ、ウワウルシなどで、HaCaT 細胞の老化細胞での生存100 µg/mL を 48 時間添加した時の細胞の生存率を CCK-率が低い結果が得られた。（Fig. 4）さらに、A 549 細胞に8 assay によりスクリーニングをおこなうことで、老化細おいても老化細胞での生存率が低い結果が得られた生薬エ

胞特異的に細胞傷害を示すという老化細胞除去活性を持キスに、カンキョウが見出された。

つ植物エキスを探索することとした。当初の研究計画でこのカンキョウという生薬は食品で知られる生姜をもとは、HaCaT 細胞に蛍光タンパクを定常発現させ、赤色蛍とした生薬であり、同じ生姜をもととしたショウキョウと光タンパクと緑色蛍光タンパクを発現させた細胞で、非老呼ばれる生薬と区別して使われている。ショウキョウのほ化細胞と老化細胞を色分けし、同じ well 内で植物エキス

うはあまり老化細胞と非老化細胞での生存率に変化はなく、添加をおこない、蛍光タンパクの色の比率で老化細胞を特同じ生姜由来でこのように結果が異なることに興味を持異的に細胞傷害する活性を持つものを探索する予定としてち、少し調べることとした。カンキョウは生姜を蒸してかいたが、HaCaT 細胞を入手するのに時間がかかったため、ら乾燥させるという漢方医学的な修治という処理がおこな

CCK- 8 assay という簡便な細胞生存率を測定する方法で、われている生薬であり、蒸さずに乾燥させたものをショウFig. 4 老化誘導細胞と非老化誘導細胞を用いた生薬抽出エキスの老化細胞除去活性スクリーニング結果− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

キョウと呼んでいる。では、この蒸すという処理で何が起られ、さらに、カンキョウに多く含まれる 6 -shogaol でのこっているかについてだが、生姜に多く含まれる gingerolapoptosis が annexin V の発現割合を見ると、老化細胞のという化合物が、この処理により shogaol という化合物にほうがほんの少し apoptosis の割合が多いが、非老化細胞化学変化し、shogaol の含有量が増加するというのが知らでも濃度依存的に apoptosis が誘導され、グラフには記載れている。そこで、カンキョウおよびショウキョウの比較されていないが、6 -shogaol の 40 µM ではそのほとんどのと、市販で購入することができる 6 -gingerol と 6 -shogaol細胞が apoptosis するほどであることが明らかとなった。

を用いて、HaCaT 細胞の非老化細胞と老化細胞に対する次に、奄美産植物エキスにおけるスクリーニング結果のapoptosis 誘導に関して比較をおこなうこととした（Fig. 5）。

一部を紹介する。奄美産植物エキスは 560 種類ほどあり、その結果、アポトーシス誘導により活性化する PARP とその中から老化細胞のほうで細胞生存率が低く見られたトannexinV の発現をウエスタンブロット法と FACS で解析

ベラ、ヒメガマ、アイダクグ、ナチシダ、キツネノマゴをしたところ、スクリーニングの時の結果に反し、非老化グラフで示す（Fig. 6）。これらの植物エキスに関する詳細

細胞でのアポトーシス誘導がカンキョウエキスで強く見な解析をおこなう必要があるが、これらの奄美産植物エキ

Fig. 5 生姜含有成分（6-gingerol および 6-shogaol）の HaCaT 細胞への apoptosis 誘導活性評価
A. 生姜含有成分の化学構造と修治（boil or steam）による化学変化
B. 生姜エキス（カンキョウ・ショウキョウ）とその成分による PARP の活性化のウエスタンブロット解析
C. 生姜含有成分による apoptosis 細胞（Annexin V 陽性細胞）の FACS 解析

Fig. 6 HaCaT 細胞での奄美産植物抽出エキス（100µg/mL）の老化細胞除去活性スクリーニング結果の一部− 44 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析

Fig. 7 HaCaT 細胞でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価

Fig. 8 A549 細胞でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 9 ヒト乳癌細胞株（MDA-MB-231 細胞）でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価

スは共同研究者により、採取された植物であり、さらにエ存率が特異的に低下する結果が得られ、その他にもクリシキス量を増やして様々な解析をおこなうためには、奄美でンやアピゲニン、ルテオリンやノビレチンなどをダサチニの植物採取をおこなう必要が出てくることから、現在の新ブと組み合わせることで、老化細胞での細胞生存率が低下型コロナウイルス感染に関わる社会情勢から、植物採取のしている傾向が見られた。しかし、HaCaT 細胞や A 549ために移動することが難しいことから、詳細な解析は一旦細胞では老化細胞より非老化細胞での細胞生存率が低下す保留とし、残っている沖縄産植物エキスのスクリーニングる傾向が多く見られ、その結果の解析が難しいこととなっを進めていくこととした。

た。

さらに、老化細胞除去活性を持つ天然由来化合物を探索

４．考するために、他の研究者により既に報告 4）がある、フラボ

察

ノイドのクエルセチンと抗癌剤のダサチニブの組み合わせ

本研究では、スクリーニング結果からのヒットエキスとを参考に、様々なフラボノイドとダサチニブの組み合わせしてカンキョウエキスに注目して、その特徴的な成分の解で老化細胞除去活性を持つものがないか調べることとした。

析などもおこなったが、残念ながら非老化細胞でも細胞傷

ここでは、HaCaT 細胞と A 549 細胞、さらにヒト乳癌細害を示す結果となってしまった。このカンキョウエキスを胞株の MDA-MB- 231 について CCK- 8 assay による細胞

詳細に解析する際には、新たにカンキョウの購入から抽出生存率を指標として比較をおこなった（Fig. 7 - 9）
。その結までおこなっており、スクリーニング時のカンキョウとロ果、ポジティブコントロールとして利用した ABT- 263 のットが異なるという原因も影響している可能性が考えられ老化細胞に対する特異性が MDA-MB- 231 細胞で特に高る。生姜という素材であることから、幅広いロットの抽出いことが明らかとなった。さらに、HaCaT 細胞は非老化エキスでの検討と成分分画をおこなったものでの評価も今細胞でも ABT- 263 に濃度依存的な生存率抑制効果があり、後おこなっていくべきであると考える。さらに、今回の老老化細胞特異的な活性を調べるのが難しいことが明らかと化細胞と非老化細胞の比較という方法では多くの問題点もなった。フラボノイドの結果では、MDA-MB- 231 細胞で明らかとなった。老化細胞は細胞周期が止まり増殖しなく既に報告があるフィセチンとクエルセチンで老化細胞の生なり、細胞も肥大化するが、非老化細胞は細胞増殖が起き− 46 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析るということから、薬剤添加から解析までの時間が経つほ続的に実施し、皮膚の老化改善に役立つ製品として研究成

ど細胞増殖の影響が大きく影響するという同じ細胞数で実果を社会に還元していきたいと考えている。

験を行うとしても、CCK- 8 assay など細胞サイズの異なるものを同じように評価するのは問題ないのかなど、考慮すべき内容はたくさん存在する。これらの点に注意をしなが（引用文献）
1） E. Michishita, N. Matsumura, T. Kurahashi, T.

らさらに研究を進めていく予定である。

５．総Suzuki, H. Ogino, M. Fujii, D. Ayusawa, Biosci.
Biotechnol. Bio- chem., 66（4），877-879（2002）

括2） Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J.N., Weigand, B.M.,

本研究により、皮膚の老化改善に有効となる天然植物エPalmer, A.K., Weivoda, M.M., Inman, C.L., Ogrodnik,

キスを明らかにすることはできなかったが、老化細胞除去

M.B., Hachfeld, C.M., Fraser, D.G., et al. Nat. Med., 2 4,活性を持つ植物エキスの探索がスタートするとともに、問1246-1256. 2018

題点などを明らかにさせながら進めていくことができるよ3） Kota Sato, Soichiro Iwasaki, Hironori Yoshino Int JMol Sci. 22（24）:13233. 2021

うになった。まだ、奄美産植物のナチシダのように非常に老化細胞に特異的な植物エキスも残っており、まだスクリ

4） Hidetaka Ota, Ayuto Kodama Sci Rep.1 2（1）:2 4 2 5.

ーニング中の沖縄産植物エキスもあるため、より老化細胞に特異性の高い植物エキスおよびその活性成分の探索を継− 47 −2022