皮膚表皮でのナノマテリアルの動態と免疫応答の可視化
─ナノマテリアルに対する新たな安全性評価法の確立に向けて─
大阪大学免疫学フロンティア研究センター

藤 井文 彦Nanomaterials have been used in various fields, such as cosmetic products. The skin, as the primary interface between thebody and the environment, provides the first line of defense against pathogens. We are especially interested in the motion ofnanomaterials in the skin. In addition to three dimensional (3D) motion of nanomaterials, their rotational motion is also crucial
to reveal their dynamics in tissue. To track nanomaterials at single particle level, first, we synthesized fluorescent probes
based on semiconductor nanocrystals. In previous period, we reported on rod-shaped nanocrystals, quantum rods (QRs), forrotational measurement. In present period, we have developed a system that combines nanometry and nanomaterial science
to simultaneously measure 3D and rotational motion. Then, we demonstrated simultaneous 3D and rotational single particle
tracking of membrane receptors, CD36, in freshly isolated macrophages. The receptors were tracked three dimensionally at
nanometer accuracy and had their relative orientations determined simultaneously. The combined technology presented here
will be able to provide new information on motion and function of various nanomaterials in tissue, such as skin.

１．緒

将来的には、本技術を２光子顕微鏡などの小動物観察用顕言微鏡に応用することによって、皮膚組織におけるこれまで近年、ナノメーターサイズの物質を用いた化粧品やそのに無い観察法を提案したい。

他の製品が数多く存在し、日常的にナノマテリアルに接す

２．実験方法る機会が増えている。様々なナノマテリアルを化粧品に利用していくためには、ナノマテリアルと生体間、特に皮膚２．
１

量子ロッド（Quantum rod : QR）の合成組織との相互作用を観察し、理解しなければならない。詳QR はコア（CdSe）とシェル（CdS）から成る半導体のナ細なナノマテリアルの体内動態と分子間相互作用を把握す

ノ 結 晶 で あ り る。 コ ア の 合 成 は、tri - n - octylphosphine

るためには、高い時空間分解能をもった観察法を利用するoxide（TOPO）、octadecylphosphonic acid（ODPA）、ことが必要である。光を使った生体イメージングは、光のcadmium oxide（CdO）および Tri - n - octylphosphine（TOP）

回折限界や生体分子による多重散乱の問題を伴うものの、の混合溶液を、窒素ガス雰囲気下で 370℃まで加熱し、生体分子や生きた細胞のダイナミクスを観るための強力なTOP に溶解した Se を加えて行った。得られた CdSe のナ手法である。量子ドット（QD）を含むナノメーターサイズ

ノ結晶と、TOPO、ODPA、hexylphosphonic acid（HPA）、の半導体ナノ結晶は、蛍光タンパク質や色素の弱点を克服

CdO が入った溶液の温度を 350℃に保ち、TOP に溶解したできる次世代の蛍光イメージング用プローブである。本研

S を加えてコアの周りにシェル構造を成長させた。

究では、光イメージング法と半導体ナノ結晶を用いて、ナノマテリアルの動態とそれに対する免疫応答を皮膚表皮で２．２

グル タ チ オン 被 覆 QR（Glutathione coatedQR：GSH-QR）の合成明らかにし、化粧品の安全性に関する新たな評価法を提案することを目的としている。上記の目的のために、去年度還元型グルタチオン（Glutathione：GSH）を用いて、以はシリカ被覆ナノ粒子や超高輝度ナノ粒子に加えて、回転下の手順で QR を被覆した。QR 溶液からクロロホルムを運動を可視化するために棒状の半導体ナノ結晶、量子ロッ除いた後、QR をテトラヒドロフラン（Tetrahydrofuran:ド（Quantum rod：QR）を合成した。今年度は特にこのTHF）に溶解した。GSH 水溶液を QR 溶液に加えて混合しQR に注目して、ナノ粒子の回転運動の可視化を１粒子精た後、70℃まで温度を上昇させた。混合溶液が２層に分離度で行った。1 例として、免疫細胞の膜上受容体を QR ですることを確認した後、遠心操作を行って GSH-QR を回収標識し、受容体の回転運動を可視化することに成功した。

した。得られたペレットに蒸留水を加えた後、カリウムブトキシド（Potassium t-butoxide：KOBu t ）を加えることに

Visualization for movement of nanomaterials
and immune responses to them in epidermis−Toward establishment of a new safety
evaluation method for nanomaterials−
Fumihiko Fujii
WPI Immunology Frontier ResearchCenter, Osaka University

よって半透明の GSH-QR 溶液を得た。

２．３ 抗体付 加 QR（Monoclonal antibody conjugated
QR : mAb-QR）の合成
まず、GSH-QR の細胞膜への非特異的な吸着を抑制するために、以下の手順で GSH のアミノ基に PEG を付加した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

GSH- QR 溶液にクロスリンカー試薬として sulfo-SMCC をよって発光波長を nm ステップで変えることが出来る。し加えた後、続いて PEG-SH を加えて室温で２時間反応させたがって長時間このナノ結晶を生体中で追跡することが可た。

能であり、多色の光イメージングにも適している。QD に次に、GSH のカルボキシル基に以下の手順で抗 CD36 抗似た特性に加えて、QR は細長い形状をしているため偏光体を付加した。GSH -QR 溶液にクロスリンカー試薬とし特性をもっており、QR で標識した生体分子の回転情報、て EDCSulfo - NHS を加えた後、続いて抗 CD36 抗体を加えつまり方向を知ることができる。このナノマテリアルを使て４℃で一晩反応させた。最後に PEG-NH2 を加えることって、皮膚表皮からのナノマテリアルの取り込みを、3 次によって、未反応のカルボキシル基を終端した。

元でトレースするだけでなく、回転情報を交えた詳細な情報を得ることができる。そこで、QR を作製し、その特性２．
４QR の物性評価を調べた。

QR 溶液の蛍光スペクトルと量子収率は、それぞれ蛍光QR はコア（CdSe）とシェル（CdS）から成る構造をして光度計（FP - 6200, Jasco）と絶対量子収率測定装置（C10027,おり、コアの周りにシェルを一定方向に伸長させることにHamamatu photonics）を用いて測定した。QR の形状は、よって得られる。得られた QR を透過型電子顕微鏡（TEM）

カーボン支持膜がコートされた銅製グリット上に QR 溶液で観察したところ、幅は平均 4 nm、長さは 50 nm であり、を載せて乾燥させた後、transmission electron microscope縦横比（Aspect ratio：AR）は 13 だった（Figure１）。AR（H-800, Hitachi）を用いて観察した。GSH-QR の水和半径が 5 以上のときは偏光度は 0.6 以上となることから２）、得と GSH - QR への抗体の付加の評価は、それぞれ Zetasizer

られた QR の 99% 以上が 0.6 以上の偏光度をもつことが示

Nano ZS（Malvern Instruments） と compact FCS 装 置

唆された。

（C9413-01MOD，Hamamatsu Photonics K.K., Japan）を用いて行った。

２．
５得られた疎水性 QR を水溶化するために、トリペプチド鎖の１種である還元型グルタチオン（GSH）を用いて QR

マクロファージの単離と観察

腹腔由来のマクロファージは、6 − 10 週例の C57BL/6
マウスから採取した。採集したマクロファージは、1.0×105cells/well の 密 度 で 8-well LabTek chambers（NalgeNunc International、Rochester，NY）に培養した。mAbQR を加えた後のマクロファージの観察は、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000，Olympus）で、473nm の励起光と 575− 675nm の検出用フィルターを用いて行った。

２．
６

回転と３次元運動観察用の顕微鏡の構築

回転運動および３次元運動を同時に観察するための顕微鏡は、IX−71（Olympus）、対物レンズ（Olympus 60X PlanApo，1.45NA，oil）、リレー光学系（GA01，G-angstrom, Japan）、CCD カメラ（EM-CCD，Ixon DV887，Andor Technology
plc., UK）
、レーザー（J050BS−18−11−11, Showa optronics
Co., Japan）を用いて構築した。
回転運動を解析するために、観察対象からの蛍光を偏光ビームスプリッターを用いて分離し、３次元運動を解析するために、分離した信号を凸型および凹型のレンズペアに通し、信号を CCD カメラに導いた。

３．結果と考察３．
１

QR, GSH-QR, mAb-QR の特性

量子ロッド（QR）は、量子ドット（QD）と同じく半導体元素からなるナノサイズの結晶である１），２）。QD と同様に高輝度で光退色に耐性があり、サイズを変化させることに

Figure 1 (a) TEM images of QRs. (b) Distribution of width(upper panel), length (middle panel) and aspect ratio (lowerpanel) of QRs.

− 98 −

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Figure 2 Schematic representation for the preparation ofGSH-QRs. Four pictures show that QRs in tetrahydrofuran(THF) (leftmost), after adding of GSH and heating at 70℃(second from left), in water (second from right) and afteradding of potassium t-butoxide (KOBut) (rightmost).

─ナノマテリアルに対する新たな安全性評価法の確立に向けて─Figure 3 (a) Fluorescent image of CdSe, CdSe/CdS (QRs)and GSH coated CdSe/CdS (GSH-QRs). (b) Normarized
fluorescence spectra (lower panel) of CdSe, QRs and GSHQRs.

を被覆した。Figure２に示したように、疎水性 QR と GSH溶液を混合して熱を加え、脱プロトン化剤である KOButを加えることで簡便に水溶化 QR を得ることが出来る。
GSH は、生体中にも存在する低分子化合物であり毒性が低い。加えて、アミノ基とカルボキシル基の官能基をもつため、抗体等の生体分子を QR 表面に簡便に付加することができる。
疎水性 QR と GSH-QR の蛍光スペクトルを比較したところ大差は無く（Figure３）、両者の量子収率はそれぞれ 49および 48% だった。半導体ナノ結晶は、水溶化の過程で表面に欠陥が生じることによって、量子収率が著しく低下

Figure 4 (a) DLS histograms of GSH-QRs (blue line) and polymer
coated QRs (Poly-QRs, red line). (b) Autocorrelation functionsof GSH-QRs (blue line) and mAb-QRs (red line). The arrowmarks an increase in QR diffusion time.

することが知られている。したがって、ここで示した
GSH を用いた被覆法は、簡便さに加えて QR の特性を損なわない水溶化法といえる。広く用いられているポリマー被覆 QR（Poly-QR）とサイズを比較した場合、半分程度の水和半径であった（Figure４a）。従来の被覆法よりも小さな水溶化 QR を調製可能ということで、生体分子の標識にもより適した被覆法といえる。先に述べた GSH の利点として、GSH-QR 表面に簡便に抗体を付加できることも確認した（Figure４b）。
以上の特性をもった GSH-QR を標識剤として用いて、膜受 容 体 CD36 の 運 動 を 観 察 し た（Figure５a）。CD36 は、マクロファージの膜上に存在するスカベンジャーレセプターの１種であり、様々なリガンドとの結合によって細胞質中に移行することが知られている。ここでは、CD36 の３次元運動および回転運動を１分子の精度で観察することに

Figure 5 (a) Schematic description of the internalization ofmAb-QR labeled CD36 from the cell membrane to thecytoplasm. (b) The merged image of fluorescent anddifferential interference contrast (DIC). Red represents
mAb-QR signals through a band path filter (575− 675 nm).

よって、合成した QR の有用性を実証した。
QR を CD36 に特異的に結合させるために、クロスリンカー試薬を用いて GSH-QR の表面に抗 CD36 抗体を付加しされたことから、目的どおり大部分の mAb-QR が CD36 に結合していることが確認できた。

た（mAb-QR）。Figure５b に示したように、マクロファー
腔由来のマクロファージが染色された。この現象は、非標

３．２ 回転と３次元運動を同時観察するための顕微鏡の構築

識の抗 CD36 抗体を事前に過剰に加えることによって阻害

CD36 の回転運動および３次元運動を観察するために、ジの培養液に mAb-QR を加えることによって、マウス腹− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Figure 6 Optical setup for simultaneous 3D and rotational
single particle tracking. 1/2λ, 1/2 phase plate; S, slit; BS,beam splitter; L, lens; M, mirror; Pr, prism; CvC, convex
cylindrical lens; and CnC, concave cylindrical lens.

Figure 8 3D measurements. (a) Fluorescence images of asingle GSH-QR at various Z-positions ranging from −800
to 800 nm. (b) Ellipticity as a function of Z-position at
various polarized intensity ratios (ー 0.60 to 0.59).

Figure 7 Polarization dependency. (a) Fluorescent imagesof a single GSH-QR on a coverslip simultaneously recordedin p- (upper images) and s-polarizations (lower images).
The detection angle was changed from 0°to 180°. (b) The
relative fluorescence intensity of a single GSH-QR as afunction of detection angle.

Figure 9 Simultaneous 3D and rotational tracking of CD36
in macrophages. 3D movements of a single mAb-QR. The
angle of the mAb-QRs is indicated by the color bar (bottom).

Figure６のような２つの特徴をもった光学系を組んだ。まとなっていた。

ず、回転運動を解析するために、QR からの偏光を偏光ビ

また、QR と対物レンズの距離を変化させたときの蛍光ームスプリッターを用いて分離した。加えて、３次元運動像の楕円率を測定した。Figure 8 a は 1 粒子の QR の蛍光像を解析するために、偏光ビームスプリッターを通した後のを示している。対物レンズを QR から遠距離側へ移動させ信号をシリンド状のレンズペアを通過させた。

ることによって、縦長だった蛍光像が横長へと変化した。

この光学系を用いて、QR の偏光を測定した。Figure７a

したがって、蛍光像の縦横比から QR の Z 位置を見積もる

は 1 粒子の QR の蛍光像を示している。p 偏光（上段の画像）ことが可能である（Figure８b）。この顕微鏡では、偏光度と s 偏光（下段の画像）に違いがあり、実際に QR が偏光特の影響を受けずに見積もれる Z 位置は約１mm であった。

性をもつことが確認された。検出角度を 20 度ステップで変化させると蛍光強度が徐々に変化し、p と s 偏光の蛍光３．３

CD36 の回転および３次元運動の同時観察強度は対称性をもって変化した。したがって、pとs 偏光の上述した mAb-QR および顕微鏡を用いて、マクロファ

強 度 比 か ら QR の 角 度 を 見 積 も る こ と が 可 能 で あ るージ膜上の CD36 の運動を１分子精度で観察した。その１（Figure７b）。ちなみに、ここで測定した QR の偏光度は例を Figure９に示した。この CD36 は、緩慢な角度変化を0.8 を超えており、多数の QR の偏光度を平均すると約 0.6伴いながら、３次元位置を大きく変化させながら移動した。

− 100 −

皮膚表皮でのナノマテリアルの動態と免疫応答の可視化

─ナノマテリアルに対する新たな安全性評価法の確立に向けて─

この運動は、エンドソーム内に取り込まれた CD36 が、エQR で標識した免疫細胞膜上の受容体の回転および３次元ンドソームの動きに合わせて回転運動を伴い、細胞質に移運動を１粒子精度で同時に観察することに成功した。この動する様子を示しているのかもしれない。別の CD36 は、技術を生体深部の観察法に拡張することによって、これま激しく角度を変化させていたが、Z 位置の変化はほとんどでに無い独創的な観察法を提案できる。

観察されなかった。この CD36 は、細胞表面の膜上で自由５．謝に回転運動をしているが、細胞質への移動を伴っていないことを示しているのかもしれない。

本研究は、平成 21 年度コスメトロジー研究振興財団の生体分子の回転運動を観察するために、従来は有機系色３、４）素が使用されてきた

辞研究助成を受けて行ったものです。本成果は、渡邉朋信、。それらの色素類は、蛍光強度が梅本英司、神隆、宮坂昌之、柳田敏雄、諸博士との共同研低く、光退色性を有するなどの不十分な点がある。特に、究によるものです。特に、渡邉朋信博士には顕微鏡の構築

皮膚などの生体深部で蛍光を観察する場合は、２光子顕微を、梅本英司博士には免疫細胞の実験を遂行いただきまし

鏡を用いなければならないが、励起光強度が高いため、そた。同助成会および諸博士に心より感謝いたします。の弱点が顕著に現れる。ここで示した半導体ナノ結晶は、それらの点を克服できる蛍光体である。加えて、半導体ナ（参考文献）

ノ結晶は構成する元素を換えることによって、近赤外領域

１）Peng, X. G., Manna, L., Yang, W. D., Wickham, J.,に蛍光ピークをもつ量子収率の高い蛍光体を調製すること

Scher, E., Kadavanich, A., Alivisatos, A. P. Shapeも可能である。近赤外領域の光は、ヘモグロビンおよび水

control of CdSe nanocrystals. Nature 404, 59-61 (2000).

による吸収、その他の分子による散乱が少ないため、生体

２）Hu, J. T., Li, L. S., Yang, W. D., Manna, L., Wang, L.

に対する透過能が高い。これを利用することによって、皮W., Alivisatos, A. P. Linearly polarized emission from膚などの生体深部での観察が容易となる。

colloidal semiconductor quantum rods. Science 292,

また、回転運動を観察には、金ナノロッドも使用されてきた

５−８）

2060-2063 (2001).

。従来の生体イメージングでは、多種類の分子を３）Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Shaw, M. A., Corrie,

多色の色素で標識し、相対的な位置関係や相互作用の解析

J. E. T., Goldman Y. E. Three-dimensional structuralが行われてきた。回転運動の観察でも、今後は多種類の分

dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence

子を観察する必要性が増えてくると推測する。しかしながpolarization. Nature 422, 399-404 (2003).

ら、金ナノロッドの測定では光散乱を検出するために、多４）Gould, T. J., Gunewardene, M. S., Gudheti, M. V.,

色イメージングには不向きである。一方、QR の吸収は短Verkhusha, V. V., Yinhttp://www.nature.com/nmeth/

波長領域の広範囲におよんでおり、蛍光スペクトルの半値

journal/v5/n12/abs/nmeth.1271.html - a3, S., Gosse, J. A.

幅は約 30nm と狭い。したがって、多種類の QR を１種類

and Hess, S. T. Nanoscale imaging of molecular positionsの光源で励起し、得られた多色の蛍光を光学フィルターでand anisotropies. Nature Methods 5, 1027- 1030 (2008).

分離することにより、容易に多色イメージングが可能である。

５）Sonnichsen, C., Alivisatos, A.P. Gold nanorods as以上の特性によって、多種類のナノマテリアルの動態を、

novel nonbleaching plasmon-based orientation sensors

皮膚などの生体深部で観察する場合、ここで報告した QRと観察法が有効である。皮膚でのナノ粒子の動態はこれまでにも報告されてきたが、我々はナノマテリアルの回転情

301-304 (2005).
６）Failla, A. V., Qian, H., Qian, H., Hartschuh, A.,
Meixner, A. J. Orientational imaging of subwavelength

報を得る技術を新たに確立した。

４．総for polarized single-particle microscopy. Nano Lett. 5,Au particles with higher order laser modes. Nano Lett.

括6, 1374-1378 (2006).

本研究では、半導体ナノ結晶と光イメージング法を用い

７）Chang, W. S., Ha, J. W., Slaughter, L. S., Link, S.て、皮膚表皮におけるナノマテリアルの動態とそれに対す

Plasmonic nanorod absorbers as orientation sensors.

る免疫応答の可視化を目指した。前期は、回転情報を得る

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 2781-2786 (2010).

ための量子ロッド（Quantum rod：QR）、粒子径をコント８）Wang, G., Sun, W., Luo, Y., and Fang, N. Resolving

ロールしたナノ粒子（Silica coated nanoparticle：Si-NP）、

rotational motions of nano-objects in engineered

生体深部での追跡を可能とする超高輝度ナノ粒子

environments and live cells with gold nanorods and（Ultrablight nanoparticle：UB-NP）を開発した。今期はdifferential interference contrast microscopy. J. Am.

特に QR に注目し、それを用いて回転および３次元運動のChem. Soc. 132, 16417-16422 (2010).

同時観察を試みた。皮膚表皮での観察には至らなかったが、− 101 −