【研究報告】（自然科学部門）

大脳皮質第一次味覚野における味覚情報処理機構の解明

豊田

大阪大学大学院歯学研究科口腔生理学教室
緒言博

紀准教授

現している TRPV1 受容体がどのような役割を果たして大脳皮質第一次味覚野（島皮質）は、末梢からの味いるかは不明である。そこで本研究では、島皮質におけ覚情報を受けるだけでなく脳に蓄積された味覚情報の想る TRPV1 受容体の電気生理学的特徴および興奮伝播に起に関与しているため、味覚の受容・認知において非常及ぼす影響を検討することによって、味覚情報処理に果に重要な脳部位である。しかし、島皮質神経回路の機能たす役割について考察した。

的特性はいまだほとんど解明されておらず、どのような情報処理機構により味覚情報と他の感覚情報が統合さ実験方法れ、味覚認知が賦活されるのかは不明である。島皮質第1.

島皮質における TRPV1 受容体の発現分布の検討

2/3 層では、侵害受容性ニューロンが多く存在し、第実験には、生後 15〜22 日齢の Wistar 系ラットを使用

5/6 層では、味覚刺激、内臓感覚、温・冷覚、触覚に応した。麻酔下にて PBS で灌流後、脳を摘出した。大脳

答するニューロンが多く存在する 1, 2）。いわゆる「味」

皮質を凍結用包埋材に包埋し、ドライアイス上で凍結しとは、味覚そのものだけでなく、「歯ごたえ」や「舌触た。クリオスタット（CM3050S）にて、島皮質を含む厚り」、「熱い・冷たい」といった感覚情報や香辛料等によさ 20 μm の連続冠状断脳幹切片を作製し、フォイル付きるが統合されることにより生じるため、第スライドガラス上に貼付した。切片を 30 秒間風乾した

2/3 層と第 5/6 層において処理される感覚情報の統合が、後、70％エタノールで 1 分間固定し、RNase free 蒸留水

味覚認知のために重要であると考えられる。

で洗浄後に 0.05％トルイジンブルー溶液で染色を行った。

痛覚情報

膜電位測光法を用いた先行研究により、島皮質ではその後、RNase free 蒸留水で洗浄後に 5 分間風乾した。

機能的カラムが存在し、同一カラム内に存在する錐体細本実験では、このように固定、染色を行ったスライドガ胞群の活動の同期化や脱同期化が、第 2/3 層と第 5/6 層ラスを用いて、レーザーマイクロダイセクションシステ3）間で強く起こることが明らかになっている 。島皮質でム（Leica）による細胞採取を行った。スライドガラスは、はこのような神経回路な特性を有しているため、様々な組織を貼り付けた面を下向きに顕微鏡ステージにセット感覚情報が、同一カラム内で速やかに処理されているもした。光学顕微鏡画像を PC モニターで確認しながら細のと考えられる。しかし、島皮質における錐体細胞群の胞採取部位である島皮質第 2/3 層および第 5 層を同定し、活動の同期化や脱同期化を制御する分子基盤、つまり、マウス操作により切り抜く部位を選択した後、UV レー

味覚情報処理に関与する分子基盤に関しては不明な点がザ ー に て 当 該 部 位 を 切 り 取 っ た。RNeasy Micro Kit

多い。

（Qiagen）を用いて、採取したサンプルから total RNA をTRPV1（transient receptor potential vanilloid recep-抽出した。抽出ステップの途中で、DNase I set（Qiagen）

tor 1）はカプサイシンの受容体であり、熱刺激によっを用いてカラム上でゲノム DNA を除去した。抽出され4）て活性化されることが知られている 。TRPV1 受容体

た total RNA を鋳型として、Sensiscript（Qiagen）を用は末梢感覚神経に多く発現しているため、我々がカプサいて逆転写反応により cDNA を合成した。逆転写反応

イシンを含むスパイシーフードを味わう際、舌や口腔粘は 37 度で 60 分間行い、その後 93 度で 5 分間行った。次膜に存在する TRPV1 受容体を介して、味覚や侵害受容に、 合 成 し た cDNA を 鋳 型 と し、TRPV1 に 特 異 的 な感覚が発生しているものと考えられる。また、TRPV1

プ ラ イ マ ー（Forward: GACATGCCACCCAGCAGG、受容体は中枢神経系においても発現しており、島皮質にReverse: TCAATTCCCACACACCTCCC） を 用 い て

5）

PCR（熱 変 性；93 度、60 秒 間： ア ニ ー リ ン グ；60 度、おいて強く発現している 。しかしながら、島皮質に発1

豊田博

紀

60 秒間：伸長反応；72 度、60 秒間のステップを 30 サイ

水平断脳スライス標本を 1 時間インキュベーションした。

クル）を行った。

色素を負荷したスライス標本を正立型ノマルスキー微分干渉顕微鏡（BX51WI）下に設置した記録用チャンバー

2.

島皮質錐体細胞におけるカプサイシン投与に対するに移した。顕微鏡に装着した 150 W キセノンランプから電流応答の解析発せられる励起光（533±3 nm）を、ダイクロイックミ

実験には生後 13〜16 日齢の Wistar 系ラットを用いた。

ラーおよび 10 倍水浸対物レンズ（0.3NA）を介してスラ麻酔下で断頭後、直ちに脳を摘出し、95％酸素および 5％イス標本に投射した。発生した蛍光（716±4 nm）を 80

二酸化炭素の混合ガスを飽和させたスクロースを含む氷×80 ピクセル CCD カメラ（NeuroCCD-sm）でサンプリ

冷人工脳脊髄液中に 5 分間浸漬した。脳ブロックから脳ングレート 1 kHz にて測定した。CCD カメラの光学的幹部を残してトリミングした後、2.5％アガロースゲルで計測可能領域は 1.6×1.6 mm であり、1 ピクセルあたり包埋し、マイクロスライサー（Super Zero 1）を用いて20×20 μm となる。光学的信号の変化を専用システム

島皮質を含む厚さ 250 μm の冠状断脳幹スライス標本を作（Opti Plex）で記録、処理した。刺激電極は、島皮質の製した。その後、室温の人工脳脊髄液中で 1 時間以上ス不全顆粒皮質から無顆粒皮質移行部第 IV 層に刺入した。

ライス標本を回復させた。人工脳脊髄液を持続的に灌流興奮伝播の時空間的パターンを解析するため、計測したさせた記録用チャンバーへ標本を移し、島皮質錐体細胞光学的信号は空間的平均化を行い、信号強度に応じて擬を赤外線微分干渉顕微鏡（BX51-W1）弱拡明視野（100似カラーを付与した。

倍）にて同定した。顕微鏡下（600 倍）にて、島皮質第2/3 層錐体細胞からホールセルパッチクランプ記録を行っ結果および考察た。電気信号は、パッチクランプ用増幅器（Axopatch1.

島皮質における TRPV1 受容体の発現分布200B）にて増幅し、専用ソフトウェア（Axograph 4.5）

温度受容に関わる分子であるTRP（Transient Receptorを 用 い て 解 析 し た。 人 工 脳 脊 髄 液 は、126 mM NaCl、Potential）受容体には、6 つの TRP 受容体サブタイプ；

10 mM D-glucose、26 mM NaHCO3、2.0（0.5）mM CaCl2、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8、TRPA1

1.0 mM MgCl2 の組成とした。パッチ電極内には、セシウが知られている。これらの受容体は、主として一次感覚ムを主成分とする内液（140 mM CsCl、10 mM HEPES–ニューロンの神経終末に発現すると考えられていたが、Na、2 mM Mg–ATP、0.3 mM GTP–Na3、10 mM EGTA）

最近の知見により、中枢神経系のニューロンにも多く発を充填した。パッチ電極の作製には、微小ガラス電極作現していることが明らかとなった5）。特に、大脳皮質に製器（P97）を用いた。電流応答を記録する際、1 μMTTX、おいても TRPV1 受容体の発現が報告されているため5）、

100 μM Ni＋、500 μM Cd2＋を添加した。記録細胞から50〜TRPV1 受容体が味覚情報処理に重要な機能を担ってい100 μm 離した位置にパフ電極を設置し、気圧式微量注出る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る。 そ こ で、 生 後 15〜22 日 齢 の装置（Picopump PV820）を用いてカプサイシンを 5 秒

Wistar 系ラットを使用し、島皮質第 2/3 層および第 5 層間投与した。その際、ランプパルス（−100〜＋50 mV）における TRPV1 mRNA の発現分布を解析した。レー

を与え、カプサイシン投与前後での電流応答を観察した。

ザーマイクロダイセクション（LMD）法により凍結組カプサイシン溶液は、人工脳脊髄液にカプサイシンを織切片から組織を採取し、RT-PCR により解析した結果、20 μM になるように溶解したものを pH 7.3 に調整して使島皮質第 2/3 層および第 5/6 層において、TRPV1 受容体用した。検定には ANOVA（analysis of variance）を使の発現を確認することができた。

用し、各検定の有意水準は ＜0.05 とした。
2.
3.

光学的膜電位測定

島皮質ニューロンにおけるカプサイシン応答電流
島皮質を含むスライス標本を作製し、第 2/3 層および膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的測定は、第 5/6 層に存在する錐体細胞からホールセルパッチクラ時間的・空間的解像度に優れ、多シナプス性の興奮伝播ンプ記録を行った。電圧固定下で保持電位を−60 mV とを計測することができるため、局所神経ネットワークのし、TRPV1 チャネルのアゴニストであるカプサイシン解析に適している。膜電位感受性色素（voltage-sensitive（20 μM）を 5 秒間パフ投与したときの電流応答を記録しdye RH414）を含む人工脳脊髄液中にて、島皮質を含むた。 そ の 際、 脱 分 極 性 の ラ ン プ パ ル ス（−100〜＋502大脳皮質第一次味覚野における味覚情報処理機構の解明

mV）を与えることにより、カプサイシン投与前後でののとき得られた結果が青線、2.0 mM のとき得られた結コンダクタンスを比較した。また、細胞外カルシウム濃果が赤線で示されている。カプサイシンの投与回数が増度を 0.5 mM または、2.0 mM にして電流応答を観察しえるにつれてコンダクタンスが増加しており、細胞外カた。

ルシウム濃度が 2.0 mM のときの方が、0.5 mM のときよりも大きなコンダクタンス変化が認められた。

細胞外カルシウム濃度が 2.0 mM のときにおける第2/3 層錐体細胞からの記録を図 1A に示す。カプサイシ

TRPV1 チャネルの脱感作を促進させる酵素として、ンの投与回数が増えるにつれ、カプサイシンにより生じカルシウム／カルモジュリン-依存性ホスファターゼ

る内向き電流が大きくなるとともに、ランプパルスに応

6, 7）（カルシニューリン）やカルモジュリン 8, 9）が知られて答する電流応答が増加していた。これらの結果から、第いる。その一方では、脱感作を抑制する酵素として、プ2/3 層錐体細胞に発現している TRPV1 受容体は、脱感ロテインキナーゼ A10）、プロテインキナーゼ C11）および作されにくい性質を持つことが明らかとなった。後根神カルモジュリンキナーゼ II7）が知られている。したがっ経節や三叉神経節神経細胞に発現する TRPV1 受容体て、島皮質第 2/3 層錐体細胞に発現する TRPV1 受容体

は、脱感作する性質が知られているため、島皮質第 2/3と後根神経節や三叉神経節神経細胞に発現する TRPV1層錐体細胞に発現している TRPV1 受容体とは性質が異受容体では、これらの酵素活性が異なる可能性が示唆さなる可能性が示唆された。平均化したコンダクタンスのれる。

グラフを図 1B に示す。細胞外カルシウム濃度が 0.5 mM

図1

カプサイシンパフ投与に対する味覚野第 3 層錐体細胞の電流応答

A. カプサイシンパフ投与に対する電流応答。B.
ロールに対して正規化した値を示す。

図2

ランプパルス投与時に生じた電流応答から算出されたコンダクタンス。コント

カプサイシン応答電流に対する PKC 活性化の効果

A. 10 μM PMA 存在下における電流応答。B.
値を示す。

10 μM PMA 存在下におけるコンダクタンス変化。コントロールに対して正規化した

3

豊

3.

田博

カプサイシン応答電流に対する PKC 活性化の影響

紀4.

味覚野第 4 層刺激により誘発された興奮に対するカプサイシンの効果

カプサイシン応答電流は、PKC の活性化により増強
7, 12, 13）。また、カプサイシン応

これまで我々は、不全顆粒島皮質第 4 層に電気刺激を答電流の脱感作が、PKC の活性化により抑制されるこ与えると、第 4 層に引き起こされた興奮が第 2/3 層およすることが知られている
10）とが報告されている 。そこで、PKC 活性薬である PMA

び第 5/6 層の両方向に伝播し、カラム状の興奮を示すこ（phorbol 12-myristate 13-acetate）存在下で、第 2/3 層とを明らかにした3）。そこで、島皮質味覚野に発現して錐体細胞におけるカプサイシン応答電流を記録した。

いる TRPV1 受容体の活性化により、島皮質に生じる興PMA 存在下において、細胞外カルシウム濃度が 2.0 mM奮伝播様式がどのように変化するかを観察した。味覚野のときに得られた結果を示す（図 2A）。一回目のカプサを含む島皮質水平断スライスの明視野像を図 3A に示す。

イシン投与により大きな内向き電流が観察された。カプ不全顆粒島皮質第 4 層に刺激電極を設置した。カプサイ

サイシン投与オフセット後も、内向き電流が観察され、シン非存在下で電気刺激を与えると、第 4 層で生じた興基線レベルには回復しなかった。そのため、二回目およ奮は第 2/3 層および第 5/6 層の両方向に伝播し、カラム

び三回目のカプサイシン投与では、ランプパルスに対す状の興奮を示した（図 3B）。一方、カプサイシン存在下る応答電流は、一回目とほとんど変化していなかった。

で電気刺激を与えると、カラム状の興奮は消失せず、時平均化したコンダクタンスのグラフを図 2B に示す。一間の経過とともに吻尾方向に広がり、味覚野全体に興奮回目のカプサイシン投与によりコンダクタンスが大きくが広がっていた（図 3C）。これらの結果から、TRPV1増加していたが、二回目および三回目のカプサイシン投受容体の活性化により、味覚情報処理が速やかに行われ与では、コンダクタンスは、一回目とほとんど変化してる可能性が示唆された。

いなかった。これらの結果から、PKC の活性化により、これまで島皮質の神経回路を対象とした研究は非常にTRPV1 受容体の活性化が生じていることが明らかと少なく、その分子メカニズムまで明らかにした研究はほなった。

とんどない。したがって、本研究は味覚野特異的な神経

図3

カプサイシンにより味覚野第 4 層刺激により誘発された興奮が増強する

A. 味覚野の明視野像。刺激電極は中大脳動脈（MCA）吻側 200 μM に設置。白矢頭は味覚野と自律機能関連領野の境界を示している。B. カプサイシン非存在下（a）および存在下（b）における第 4 層微小電気刺激によって生じた興奮の疑似カラーイメージ。
4

大脳皮質第一次味覚野における味覚情報処理機構の解明機構がどのような分子メカニズムによって成立するのかく増大したことから、PKC の活性化により、TRPV1 受という課題に足がかりを与える点において極めて重要で容体の活性化が生じていた。さらに、島皮質に生じる興あると考えられる。今後さらに、島皮質における TRPV1

奮伝播における TRPV1 受容体の役割を検討したとこ

チャネルが味覚情報処理に果たす役割について検討を行ろ、TRPV1 受容体の活性化により、興奮伝播増強が生う必要があると考えられる。

じていた。これらの結果から、TRPV1 受容体の活性化により、味覚情報処理が速やかに行われる可能性が示唆要約された。

TRPV1 受容体は中枢神経系においても発現が認めら
謝れ、島皮質において強く発現している。しかしながら、辞本研究を遂行するにあたり、御援助を賜った公益財島皮質に発現している TRPV1 チャネルの機能的役割に団法人三島海雲記念財団に厚く御礼を申し上げます。

関しては不明な点が多い。そこで本研究では、島皮質における TRPV1 受容体の電気生理学的特徴を解析し、また、興奮伝播に及ぼす影響を検討することによって、味文覚情報処理に果たす役割について考察した。島皮質にお1） E. Kosar, et al.:
2） T. Yamamoto, et al.:3） H. Sato, et al.:4） M. Tominaga, et al.:
5） A. Liapi, et al.:
6） R. J. Docherty, et al.:
7） J. Jung, et al.:8） M. Numazaki, et al.:8002–8006, 2003.
9） T. Rosenbaum, et al.:10） D. P. Mohapatra, et al.:
2003.
11） S. Mandadi, et al.:12） V. Vellani, et al.:13） Y. Zhou, et al.:

ける TRPV1 受容体の発現分布を検討したところ、第2/3 層および第 5 層において TRPV1 mRNA の発現が確認された。次に、第 2/3 層錐体細胞におけるカプサイシン応答電流を観察したところ、カプサイシンの投与回数が増えるにつれ、カプサイシンにより引き起こされる内向き電流が大きくなったことから、第 2/3 層錐体細胞に発現している TRPV1 受容体は、脱感作されにくい性質を持つことが明らかとなった。また、PMA 存在下では、第 2/3 層錐体細胞におけるカプサイシン応答電流が著し

5

献, 379, 329–341, 1986.
, 51, 616–635, 1984.
, 28, 3076–3089, 2008.
, 451, 143–150, 2005.
, 22, 825–834, 2005.
, 431, 828–837, 1996.
, 279, 7048–7054, 2004.
, 100,, 123, 53–62, 2004.
, 278, 50080–50090,, 35, 471–478, 2004.
, 534, 813–825, 2001.
, 41, 601–608, 2001.