哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究
九州大学

野村

理学部

一也

In this study, we showed that antibodies against human blood group B trisaccharides block
Ca2+ dependent cell-cell adhesion of frog (Xenopus laevis) embryonic cells. We isolated several
different novel pentaglycosylceramides with blood group B activity. The structure is novel inthat it lacks N-acetylhexosamine in its core carbohydrate structure. By using two dimensional
electrophoresis followed by western blot analysis, we identified two series of acidic proteins in
30-60 kDa range. We showed that one series of protein spots represents proteins with glycosyl
phophatidylinositol anchor (GPI-anchor). The effect of phosphatidylinositol specific phospholi­
pase C on Ca2+ dependent cel卜cell adhesion was tested and the enzyme treatment inhibited
Ca2+ dependent adhesion of embryonic cells completely. From these experiments, we concluded
the presence of novel GPl-anchored cel卜cell adhesion molecules with human blood group B
antigens. Blood group B active glycosylceramides were also detected in the nematode
Caenorhabditis elegans . In the nematode and in frog cells, the blood group B active
glycoconjugates colocalized with cadherins. The colocalization is observed in nematode nervous
cells and in frog embryonic cells and in skin cells. The cadherins and blood group B active
glycoconjugates seem to be forming supramolecular complex on cell surface. On the basis of on
our findings, it now seems possible to isolate homologous glycoconjugates (especially GPI­
anchored glycoproteins) from mammalian skin cells. Isolation of mammalian homologues ofthese novel GPI-anchored glycoproteins and glycosylceramides of frog cells will certainly shedlight on the mechanism of skin cell adhesion, thus deepening our understanding of the dynamic
nature of homeostasis of skin cells through differentiation and apoptosis. The possible interactionof signaling pathways through ceramide, cadherin and diacylglycerol is also discussed.

1

緒

シュウムの他にヒトB型血液型物質に対する抗体

言を加えておくといくら待っても細胞は凝集塊を形
私達はアフリカツメガエル(l'enopus laevis)成せず、 バラバラのままである。この後抗体を洗の初期胚（卵母細胞から胞胚まで）におけるカルい流してやると細胞は急速に接着をするようにな

シュウムに依存した細胞接着が、 ヒトのABO式血り大きな凝集塊を形成する。抗体の代わりにヒト

液型物質の一つであるB型物質に対する抗体で完

B型血液型糖鎖自体を加えると拮抗阻害により同全に阻害されることを明らかにした。

様に細胞の接着は破壊された。 これらの実験によカルシュウムを除いて細胞 一個ー個がバ ラバラ

り従来機能が無いと考えられていたヒトB型血液になるように解離したカエルの胚細胞はカルシュ型糖鎖は非常に意外なことにカエルでは細胞接着

ウムを加えてやると15分から1時間程度で接着を分子として機能していることが確実となった I) o始め大きな凝集塊を形成する。 この実験でカルではこのB型血液型糖鎖はいったいどのような分子上に存在しているのだろうか？ヒト血液型

Study on novel glycosylceramides
mediating cell-cell adhesion of

B型物質は主としてアフリカツメガエルの初期胚の膜上に存在する糖蛋白質と糖脂質上に存在してmammalian skin cells-their possible
involvement in apoptosis
Kazuya Nomura
Department of Biology, Faculty ofScience, Kyushu University

おり、 その中の糖脂質について構造決定を行った
ところ、 全く新しし9ヽ構造を有する 5 糖の中性糖脂)質であることが判明した(Fig. 1) I 。 このグリコ
シルセラミドはどのようにして細胞接着に機能し-77-

膚由来線維芽細L929細胞にトランスフェクトした

Galal-3
Galf31-3Galf31-4Glcf31-l'Cer
Fucal-2
Fig. 1Novel glycosylceramides foundin frog (Xenopus I eaves)embryonic eel Isているのだろうか？またB型糖鎖を含有している細胞を用いた。スクリ ー ニングの方法としては
B型 糖 鎖 の場合 は 9 6 穴 そ れぞれ の 培 養 上 清 を
ELISAプレ ー トに100µ1入れこれにlxl炉ケのB型
ヒト赤血球を加え直ちにプレ ー トごと遠心する。
赤血球に対する抗体含む上清を加えた穴では赤血球の凝集が遠心終了直後からはっきりと観察できる。この迅速スクリ ー ニング法を採用してからは百発百中で候補を見つけ ることが出来るように糖蛋白質はどのようなものでどのように細胞接着に関与しているのだろうか？代表的なカルシュウ
ム依存性細胞接着分子であるカドヘリンとは一体どの様な関係にあるのだろうか？
アフリカツメガエル初期胚でみつかったB型糖鎖含有グリコシルセラミドとB型糖鎖含有糖蛋白質はツメガエルの皮膚細胞にも存在しておりその機能が皮膚細胞の分化と恒常性の維持に重要な役割を果たしていると考えられる。本研究ではカエなった。また候補がB型物質に特異的であるかど
うかはO型赤血球やA型赤血球を凝集しないことで確認しさらにB型糖脂質との反応性で最終的確認を行った。XBカドヘリンに対するモノクロ ー ナル抗体·(1)スクリ ー ニングには培養上清を96穴培養皿にいれ同時にEDTAで解離した1 X 1炉ケ程度のXBカドヘリンを発現させたマウス皮膚由来L929細胞を同時にまきこんだ。1日培養した後細胞と細胞の接着が阻害されている穴を選び同様の実験を再度

ルの細胞接着に重要な役割を果たしているこれらくりかえすとともに抗体の産生の有無をチェック

B型糖鎖含有複合糖質の研究を通じて哺乳類の皮した。さらに候補の穴で産生される抗体を使いウ膚細胞における相同分子の手がかりを求め、 これエスタンプロッティングして確認した。

ら分子の細胞接着とアボト ー シスヘの寄与の可能性を追求した。

2. 2 糖脂質と糖蛋白質の分析

2

実得られた抗体や本研究で用いた抗体がどのよう験な抗原を認識しているかをさまざまな方法で調べた。糖脂質についてはFolch分配法で抽出分離しナル抗体の作成た後、 薄層クロマトグラフィ-法で展開した I) 。

P3Ulミエロ ー マ細胞と免疫感作したBalb/cマウ

この薄層プレ ー トに抗体液を重層して一晩放置しスの牌臓細胞をポリエチレングリコ ー ル4000 (メたうえでよく洗い流し 、 つぎにアルカリフォス

2. 1

モノクロード）によっファタ ー ゼ標識の二次抗体をかけて数時間以上放て融合させることでハイプリド ー マを得た。融合

置し 、 この二次抗体をよく洗い流した後BCIP/

ルク・カスクロマトグラフィ ー グレは文献

2)

ーNBTの発色剤で発色して観察した。に正確に従った。 目的とするクロ ンをー

スクリ ー ニングの後、 限外希釈法でクロ ー ニング

蛍光抗体法には3%パラフォル ムアルデヒドでしハイプリド ー マを得た。抗原としてヒトB型糖固定した胞胚のクライオスタット切片を作成し、ナル抗体の作成にはヒト抗体 と 数 時 間 イ ンキュベ ー ト し た後よく洗い

B型赤血球・豚B型ムコ多糖・アフリカツメガエル

FITC標識の二次抗体をかけて更に数時間インキュ

胞胚膜フラクションを用いた。カエルのXBカドへ

ベ ー トした。この切片をよく洗った後レ ー サー共鎖に対するモノクローリンに対するモノクロ ー ナル抗体の作成にはクロ焦点顕微鏡(Zeiss LSM410)で観察した。またウーニングしたXBカドヘリンの遺伝子をマウスの皮エスタンプロッティング法は通常の7. 5%ゲルに-78-

リコシルセラミドがある。セラミドの部分の脂肪よるSDS電気泳動の後、 セミドラ イのプロッティング装置でニトロセルロース膜に転写するという酸の組成にのみ違いのある2種類の中性糖脂質、は色素染色

およぴ糖鎖の数の多いもう1種合計3種類の主要なーB型糖鎖含有中性糖脂質が存在することが判明しSによる膜の可逆的染色法により行った。二次元た。 膜表面に存在するこれらのB型糖鎖含有糖脂電気泳動にはPharmacia Biotech社製のMulti­

質はかなり大量に存在する糖脂質でありその存在phorllシステムを使い、 一次元目の等電点電気泳量の多さは重要な機能の存在をうかがわせる。

動にはImmobiline Dry strip (PI 3. 0-10), 二次

A型糖鎖含有複合糖脂質もごくわずかながら存在

元目のSDS電気泳動にはExcel Gel SDS precast

するがB型糖鎖含有糖脂質に比ぺると0.1%以下し方法で行った。転写の効率のモニタ済みの分子量マーーー

カ をつかうとともにポンソ

gradient gelを利用した。プロッティングはフイか存在せず、 またB型糖鎖を含む極微量のガング

ルムリム ー バー

リオシドも検出したがあまりにも微量のためにそセミドライプロッティング装置で行った。の構造解析は不可能であった。

でゲルをはがした後、 ATTO社製の3結

次にB型糖鎖を含有する糖蛋白質については二次元電気泳動法と抗B型糖鎖モノクロ ー ナル抗体

果を利用したウエスタンプロッティングで解析した。
3. 1

B型糖鎖に対するモノクロ ー ナル抗体の作製�ヽ�ぞ令害 する。 しかし市販品の 利用は抗体のアフィニ

���

．

",?

カエルのカルシュウム依存性細胞接着を完全に阻ー゜ー"

B型糖鎖に対する市販のモノクロ ー ナル抗体はティ ークロマトグラフィ ー などへの 利用などを考えると経済的ではない。そこで自前で強力な抗B型血液型物質に対するモノクロ ー ナル抗体を作゜成した。 こうして得られた抗体はB型ヒト赤血球を特異的に凝集する他、 胞胚解離細胞のカルシュウム依存性細胞接着を完全に阻害し、 さらに胞胚fftt* ←58, ←40のクライオスタット切片をそめてみると見事に膜表面を染色した。また数種類のB型糖鎖含有糖蛋

Fig. 2

白質に対して特異性の違う抗体が得られた。さらに面白いことにヒト B型糖鎖の抗体を作製するには、 カエルの膜フラクションがもっとも抗原性のNovel blood group B active
proteins separated by two­
dimensional electrophoresis

Fig. 2に示すように分子量30-60kDaにわたる 複数点から適していることもわかった。

種の蛋白質がアフリカツメガエルの膜フラクショ
ヒト血液型B型糖鎖を含む複合糖質の同定

ンに 存 在 し て い る ことがわかった。これらはカエルの初期胚に存在するB型糖鎖含有複合糖fucosidaseやgal�ctosidaseなどB型糖鎖を消化す

質は糖蛋白質と糖脂質からなる。それぞれどのよる酵素で抗原性が失われるのでB型糖鎖を含有しうな分子がB型糖鎖を付加されておりどのようにていることが確認できた。またこれらの蛋白質は

3. 2

細胞接着に関与しているのだろうか？これを調べカエルの皮膚細胞にも存在すること•が分かった。

るため糖脂質と糖蛋白質の分析を行った。糖脂質

このようにB型糖鎖を有する数種類の分子が存在の方の主要分子としてはFig. 1に示した中性のグするわけだがこれらはいったいどのような性質を-79-えて接着活性に対する効果をみてみた。その結果もった分子なのだろうか？

は劇的で酵素処理した割球は全くカルシュウムがあっても接着せず、カルシュウム依存性細胞接着

3.3 B型糖鎖含有糖蛋白質の性質の解明
アフリカツメガエルの膜を脱脂質するとB型糖性は完全に酵素処理で失われてしまった。また酵鎖に対する抗体による蛍光染色性がかなり弱まる素を除いてよく洗い2時間程度回復 させると接着ことがわかった。 これはグリコシルセラミドが膜能は回復した。 この実験からアフリカツメガエルから失われることによると当初は考えた。確かにの初期胚の細胞接着には B型糖鎖を付加 さ れ た

グリコシルセラミドは脂質をぬく操作（クロロホCPIアンカ ー 型蛋白質が接着分子として働いていI)水による抽出 ) をすると失ることがわかった。現在この分子の部分的アミノわれるが、念のために蛋白質もこの操作で抽出さ酸配列の決定を試みようとしているところであれないかどうか調べてみた。すると面白いことにる。

ルム、メタノー ル、

二次元電気泳動で検出されるFig. 2の膜タンパク質群の中で分子量の高い方の一 群の糖蛋白質が消3. 5えてしまうことが判明したのである。脂質と同じB型糖鎖とカドヘリンは相互作用している可能性が高い

よう な 操 作 で 抽 出 さ れ る蛋 白質 と し て は G P I

カドヘリンはカエルでは120-140kDa程度の大き(glycosylphosphatidylinositol)アンカ ー 型蛋な分子量をもつ膜一回貫通型蛋白質でB型糖鎖は白質が考えられる。 そこで さっそくこれら抽出さ付加されていない。しかしカルシュウム依存性細れる蛋白質が、GPIアンカ ー胞接着の主要分子と考えられており私達の発見し型蛋白質かどうかを調べてみた。結果は明確で、GPIアンカ ー型蛋白たB型糖鎖含有複合糖質はこのカドヘリンと相互質を特異的に二相分配できる界面活性剤Triton作用している可能性が高い。そこでこの可能性のX114で膜を抽出すると、B型糖鎖を含む糖蛋白質追求のためにまずカエルの胞胚型カドヘリンに対はTriton X114がわに分配され、さらに膜をGPIアするモノクロ ー ナル抗体を作製した。方法としてンカ ー を特異的に切断する酵素であるphosphatiは哺乳類皮膚細胞としてマウスの皮膚由来の線維-dylinositol特異的phospholipase C (PI PLCと芽細胞であるL929細胞をえらび、これに熊本大学略）で処理するとこれらは水層側に分配 されるこの但馬達哉助手と私たちの共同研究の結果えられとが判明した。この酵素は蛋白分解酵素活性はなたアフ リ カ ツ メガ エ ル の初期胚型カド ヘ リ ン

く、かつ極めて特異的であるのでB型糖鎖含有糖(XBカドヘリン）の完全長遺伝子をリポフェクチ蛋白質の分子量高い一 群はGPIアンカ ー 型糖蛋白ンを利用してL929細胞に導入（京都大学医学部永質であると結論された。

淵昭良先生のプロトコルによる導入ベクタ ー を用いた。）し、カルシュウム依存性細胞接着能を有3.4

GPIアンカー型B型糖鎖含有糖蛋白質は細胞しかつ約119kDaのXBカドヘリンを発現している細胞株をクロ ー ニングした。 この細胞を用いてマウ接着に関与している
このGPIアンカ ー 型B型糖鎖含有糖蛋白質は細胞スを免疫感作しカエルのXBカドヘリンに対するモ接着に関与しているのだろうか？幸いなことにノクロ ー ナル抗体llDを得た。B型糖鎖に対するモPI PLCは中性付近のpHで活性が保たれており、かノクロ ー ナル抗体とカドヘリンに対するモノクロつカルシュウム存在下でその活性があまり阻害さーれない。そこでカルシュウムを除いて胞胚を単 一の胞胚や皮膚細胞ではカドヘリンとB型糖鎖が同細胞にまで解離し、これにカルシュウムを加えてーの細胞接着部位に存在していることが分かっ再凝集させる実験系（緒言参照）にこの酵素を加た。

-80-ナル抗体で二重染色するとアフリカツメガエル

哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

この実験からカドヘリンとB型糖鎖が皮府細胞糖蛋白質がGPIアンカ ー 型糖蛋白質であることはや胞胚細胞で局在性を同じにして相互作用してい細胞接着にPhospholipaseCやdiacylglycerolを介る可能性が強く示唆されたわ けである。 私達はした信号伝達系が関与していることをうかがわせ

B型糖鎖はカドヘリンと細胞膜上で超分子複合体る。 カドヘリンを介する信号伝達系としてはショを形成しているものと考え現在弱い相互作用を検ウジョウバエのwingless相同分子からカテニンヘ出できる最子プラズモン共鳴を用いたバイオセンの信号の流れが詳しく解明されており、 さらに成サー長因子であるEGFのリセプタ ー がカドヘリンと膜(B!Acore)を利用し、B型糖鎖とカドヘリン上で会合している可能性が指摘されている 3) 。 その結合定数の決定を行っているところである。

こでEGFをカエルの細胞にかけてみた。
3. 6

B型糖鎖の発現量は細胞周期に依存しており通哺乳類皮膚細胞での細胞接着分子とアポト常は全細胞集団の20%程度でGl初期とG2、M期にーシスの関係の解明に向けてアフリカツメガエルを用いて得られた以上の結のみ発現している。 だがこの成長因子をかけると果は胞胚の細胞や皮膚の細胞においてCPIアンカ24時間で発現量は100%に増加した。 この事実は‘型のB型糖鎖含有糖蛋白質が存在しておりカトB型糖鎖の発現がEGFからの信号伝達とうまく共役ヘリンと超分子複合体を形成しながら、細胞接着していることを示唆している。 この信号伝達系に機能していることを強く示唆している。 現在まはGPIアンカ ー と共役しているのだ ろうか？二次でのところカドヘリンと相互作用する分子として元電気泳動を利用して判明したGPIアンカ ー では両生類や哺乳類・烏類などすべての脊椎動物でな い 高分子量側の分子群がEGFリセプタ ー 自体細胞質側で結合するカテニン類が知られている。

である可能性も検討中である。 phosphol ipase C

私達が発見したようにグリコシルセラミドやCPIやdiacylglycerolを介した信号伝達系の細胞接着ー型蛋白質か、皮膚の細胞を含む多細胞生への関与の可能性は細胞接着における信号伝達系物の細胞において、カドヘリンと相互作用していのクロストー クの観点から極めて興味深い。 またることはまったく知られていなかったのである。

成長因子を培養液から除去した際に生ずるアポト

この研究の遅れの原因は一つはグリコシルセラミーシスにおいてカドヘリンの機能はどう変化する

ドの研究者でカドヘリンとの関連を追及する研究のか、またこのアポト ー シスにおいてB型糖鎖を者が私達以外皆無であったこと、もうひとつは有するグリコシルセラミドがどのような変化をみCPIアンカ ーせるのかなどを詳細に調べることで、哺乳類皮膚アンカー型蛋白質やグリコシルセラミドのカ一蛋白質の相互作細胞とカエル皮膚細胞• カエル胚細胞に共通した用であるため比較的弱く、通常の免疫沈降反応で細胞接着とアポト ー シスの実態が解明できるものは複合体として落ちてこなかったことによると思と期待される。

ドヘリンとの相互作用が、糖鎖われる。 ツメガエルの細胞接着機構は哺乳類の皮3. 7

膚細胞の接着機構とカドヘリンに関する限り完全

グリコシルセラミドとカドヘリンの関係の線虫を用いた解析に同ーであり互換性を有することが知られてい‘る。 本研究の結果、カト ヘリンと相互作用すると線虫(C. どlegans)は現在最も遺伝子レベルで考えられる新しいグリコシルセラミドとCPIアン解析の進んでいる生物である。 その全ゲノムDNAーカ 型糖蛋白質が同定できた訳で、これらの分子の塩基配列決定計画はヒトゲノムプロジェクトをの相同分子を哺乳類皮膚細胞で検索同定できる可リ ー ドするかたちで進んでおり数年以内には確実能性は極めて高い。に全ゲノムの塩基配列が決定されるはずだし、体を構成する細胞1000個あまりがどのように分裂しカドヘリンが相互作用する相手のB型糖鎖含有-81-て発生するかという細胞系譜が完全に判明していとB型糖鎖の相互作用という事実がさらに一般的る。 また神経細胞（といっても300個ほどしかなに成立することを強く示唆している。線虫はアポい）の配線図がほぼできあがっていることも他のト ー シスの研究がもっとも進んでいる生物であ生物の研究の追随を許さない。 さらに突然変異のり、 アポト ー シスの抑制遺伝子ced-9やアポト ー系統の蓄租・遺伝解析の進歩も他に類をみない利シスを引き起こす遺伝子ced-3のホモログとして点である。 この生物は下等とはいえ、 さまざまなそれぞれ、 ヒトのアポト ー シスにかかわるbcl-2哺乳動物と共通の遺伝子を機能させている。最近

やinterleukin 1 fl converting enzy田e (ICE)なでは癌遺伝子rasへの信号伝達系路の解明に大きどが解明されてきている 6) 。 これらのアポト ー ン

く貢献したことは記憶に新しい 4) 。 この線虫にもスの研究の蓄積を利用してグリコシルセラミドとカドヘリンやグリコシルセラミドはあるのだろう

カドヘリンのアポト ー シスヘの関係を解明し哺乳か？もしこの生物にグリコシルセラミドがあり、類皮JS細胞のグリコシルセラミドとアポト ー シス、またあわよくば B型糖鎖を持つグリコシルセラミ

そして細胞接着の関連の解明を行いたいと考えてドがあればグリコシルセラミドの合成系路の研究いる。

や遺伝子発現の制御機構の研究がゲノムプロジェ

4

クトやミュ ー タントの蓄積を利用して飛躍的に進考察むと予想できる。 その結果はほとんどの場合ただちに哺乳類にフィ ー ドバッ クできるであろう。 こカエルと線虫は哺乳類とは一 見かけ離れた研究の期待のもとに線虫のグリコシルセラミドの研究材料であるか、 意外に哺乳類の研究に役立つものを開始したところ大変期待できる結果が得られである。 皮府細胞の細胞接着とアポト ー シスを媒た。

介するであろう グリコシルセラミドやセラミドの線虫を大量培養したうえで超音波破砕して脂質研究の過程で、 私達は細胞接着分子であるカドへを Felch 分配 5) により抽出した。 薄層クロマト グ

リンと相互作用している新しい グリコシルセラミ

ラフィ ー で脂質を展開し糖を染色するオルシノ ードとGPIアンカ ー 型糖蛋白質の存在を明らかにし

ル試薬で発色すると各種の糖脂質が存在することた。 これらがカエルのみならず哺乳類細胞にも存ー プレ在することはほぼ確実であると考えられ今後GPIート上での抗体染色法によって検討した結果酸性

アンカ ー 型糖蛋白質の部分的アミノ酸配列の決定

糖脂質分画ではなく中性糖脂質分画にさまざまなによる遺伝子の単離をおこない、 その遺伝子を利B型糖鎖含有糖脂質が存在することが判明した。

用して哺乳類皮I目細胞での相同分子を同定する計

これらの脂質が B型糖鎖構造をもつことはこれら画である。 またカエルと線虫での研究をさらにすが判明した。 さらに薄層クロマトグラフィー

すめて哺乳類におけるアポト ー シスと細胞接着にゼで処理して染色性が失われることで確認した。

おけるGPIアンカ ー 型糖蚕白質の機能の解明を行

ヒト血液型B型糖鎖が線虫C.elegansに存在するこい、 カドヘリンを介した細胞接着とそれに関わると（しかしA型糖鎖やO型糖鎖も確認できなかっ信号伝達系のネットワ ー クを解明したいと考えてた。）はB型血液型糖鎖が非常に基本的な役割を果いる。の脂質をaガラクトシダ

ー

ゼやaガラクトシダたしていることを強く示唆している。 さらに面白いのは、 古典的カドヘリンとよばれるカドヘリン
一謝

辞般に対する抗体が咽頭の神経を染色しさらにその神経細胞にB型糖鎖が局在しているという結果本研究を多方面にわたり支援していただきましである。 このことはカエルで確認したカドヘリン

たコスメトロジ ー 研究振典財団に心から感謝いた-82-

哺乳類皮膚細胞のアホト ー シスと細胞接活をつかさとるセフミトの研究

821-827 1995

します。 またこの研究のあらゆる局面で相談にのっていただきました理化学研究所国際フロン2)

ティア ・糖細胞情報のチ ー ムリ ー ダ ー 平林義雄先

細胞免疫実験操作法、 川口進•原田孝之訳理工学社

3)

生、 九州大学農学部の伊東信先生、 京都大学農学

第17章

H. H oschuetzky et. al. J. Ce!l lliol.,
127 1375-1380 1994

部山本憲二先生、 その他私たちのすべての共同研
4)

究者の方々に感謝いたします。 また当時ケンプリッジ大学におられたChris Wylie教授とJanet

形態形成にかかわる遺伝子群（蛋白質・核酸・酵素増刊）、西田育巧

他編、 共立出版、178-190.

Heasman博士、 Adrian Turner博士には筆者の目を5)

糖鎖生物学に向けさせていただいたことについて

R. L. Schnaar and L. K. Needham, Methods
in Enzymology, Vol. 230, p371. Academic

心からの感謝を捧げます。

Press, New York, 1994.

引用文献
1)

K.

Nomura et. al.

6) アポト ー シス実験プロトコ ー ル、 田沼靖ー監
Jlioc力emical .I.,306

修、 細胞工学別冊、 秀潤社-83-