インターロイキン 12 による紫外線防護に関する研究

長崎大学先導生命科学研究支援センター

松田尚樹

Interleukin-12(IL-12), one of the cytokines produced in UV-irradiated human skin, has been reported to prevent
UV-induced immunosuppression through the mechanisms involving enhancement of DNA repair. This fact let us
to speculate on the potential use of IL-12 for biological protection against harmful solar UV radiation. We examined
effects of exogenously-added IL-12 on UV-irradiated human epidermal keratinocytes, the expression of IL-12
in those cells, and UV-induced intracellular signaling molecules responsible for IL-12 production. The removalof cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) from the genomic DNA in cells irradiated with 100J/m2 of UV-B (80µW/cm2) was accelerated by the presence of human recombinant IL-12 at doses of 50 or 100ng/ml. Treatmentof the irradiated cells with IL-12 also resulted in elevated survival level following UV-B irradiation. When cells
were irradiated with 200J/m2 of UV-B, IL-12 concentration in conditioned medium for 24h post-irradiation wasapproximately 12pg/ml, which was 10 fold higher than that in unirradiated control. Expression for IL-12A(p35)mRNA was also increased to 2.4 fold over the control level in 16h following exposure. Both the IL-12 secretion andIL-12 mRNA expression were inhibited by a JNK inhibitor and by an antioxidant. These results suggested that UVinduced oxidative stress in the cells triggers activation of intracellular signaling, including a JNK pathway. Although
the downstream signaling is to be determined, activated JNK would lead to secretion of IL-12 through upregulationof IL-12 mRNA expression. IL-12 then enhances elimination of CPD from damaged DNA. Thus, UV-induced
signaling pathways toward production of IL-12 are possibly a positive autocrine regulation of DNA repair system. To
potentate this mechanism may lead to a new approach toward biological protection against solar UV light.

１．緒

photolyase の適用が既に試みられているが、健常者が日常言の生活で使用し得る生物学的防護法は未だ確立していない。

オゾン層破壊による太陽紫外線（以下 UV）被ばく量増

サイトカインの一種であるインターロイキン 12（IL-12）

加に伴う人体影響が危惧されている。UV の悪影響を低減

は、免疫担当細胞により産生され、免疫ネットワークをするための UV 防護として、衣服、帽子、眼鏡等の着用制御する液性因子としてクローニングされたものである。

や、サンスクリーン剤の塗布による物理的あるいは化学的

その後、皮膚構成細胞も IL-12 を産生し、UV がこれを誘な方法が用いられ、これらの方法はいずれも有効であるが、導すること 1，2）、また IL-12 が UV による皮膚免疫抑制に生体の UV 防御反応を促進するものではない。そのため、対して拮抗的に働くこと３） が報告されてきたが、この機

UV を浴びた後に適用しても有効な生物学的 UV 防護法が構の一つとし - て、IL-12 による DNA 損傷の除去修復促望まれている。

進の可能性が示されている４）。このことは、IL-12 が免疫UV 被ばく後の表皮には DNA 損傷が生じており、その系に対して働くのみならず、UV を浴びた後の組織防護大部分は修復されるが、修復されない損傷や誤った修復に働く可能性を示す。一方、UV 照射された細胞内では、を受けた損傷が、細胞死または突然変異を引き起こし、ひDNA 損傷に起因する、あるいは起因しないシグナル分子

いては、短期的には重篤な日光皮膚炎、長期的には発が群が活性化し、細胞の増殖、アポトーシス、また分化機能んを誘導する。したがって、生物学的 UV 防護のアプロといった多様な細胞機能の発現に関わっているが５―７）、そーチの一つとして、DNA 損傷の修復を促進する因子をの IL-12 誘導との関連性については知られていない。

適用することが考えられる。事実、DNA 損傷の修復に

本研究では、UV による組織の損傷を低減し、組織の再必要な遺伝子の機能を欠損した XP（色素性乾皮症）患生を促す新たな UV 防護因子としての IL-12 の可能性を探者の臨床においては、DNA 損傷の除去修復の際に必須ることを目的とし、培養ヒト表皮角化細胞を用いて、中波の UV-endonuclease V や、 損 傷 の 光 回 復 を 可 能 と す る

長 UV（UV-B）照射後の DNA 損傷修復と細胞死に対する exogenous に与えられた IL-12 の作用、および UV-B

Biological protection from ultraviolet
radiation by interleukin-12
Naoki Matsuda

照射による endogenous な IL-12 産生誘導と、それに関わる UV-B 誘導細胞内シグナル分子群について検討した。

２．材料と方法

Center for Frontier Life Sciences,Nagasaki University

細 胞 に は 初 代 培 養 正 常 ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞（normal
human epidermal keratinocytes: NHEK）、またはヒト表− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

皮角化細胞由来樹立株（HaCaT）を用い、培養液にはそ

そこで、あらかじめ細胞を IL-12（ヒト・リコンビナ

れぞれ EpiLife-KG2（Kurabo）または DMEM/10％ FBSント体、Sigma）で１時間培養した後に UV-B を照射し、を用いた。なお NHEK は継代数１- ３の細胞を実験に供

さ ら に IL-12 存 在 下 で 培 養 を 続 け、CPD 及 び 6-4PP 量した。UV-B 照射には、CO2 インキュベータ内に設置したを測定したところ、10ng/ ㎖および 50ng/ ㎖の IL-12 にUVB ランプ（UVP F8T5 8W、波長ピーク 302nm、線量率

よって照射６時間後における CPD 量が有意に減少して80µW/ ㎠）を用いた。

いた（Fig. ２）。しかし照射 24 時間後では IL-12 の作用

照 射 後 の 細 胞 よ り DNA を 単 離 し、UVB に よ る 主 要は見られなかった。また、データには示さないが、IL-12な DNA 損傷であるシクロブタン型ピリミジンダイマーは 6-4PP の量には影響を与えなかった。さらに、UV-B（CPD）及び 6-4 光産物（6-4PP）を、抗 CPD 抗体（TDM-2）

照射後の細胞の生存率は、IL-12 の存在により上昇したまたは抗 6-4PP 抗体（64 M-2）を用いて ELISA 法によ（Fig. ３）。以上を合わせると、exogenous に加えられたり測定した。また UVB 照射後の細胞生存率をコロニー

IL-12 は、CPD の修復のうち特に初期過程を促進し、そ形 成 法 に よ り 求 め た。 一 方、 照 射 後 の 細 胞 に よ る IL-の結果、UV-B による細胞死を防ぐことが考えられる。

12A（p35）mRNA の発現は等長プライマー伸長法（IPE

次に、UV-B による IL-12 の産生誘導について検討し法、TrimGen）により、また培養液中に分泌された IL-12たところ、NHEK 細胞では、200J/ ㎡の UV-B 照射 16 時（p70）量は ELISA（Endogen）により定量した。細胞内間後における IL-12 mRNA の顕著な発現（非照射に対シグナル分子としてはすでに UV-B に応答することを報告

して約 2.4 倍、Fig.４）と、24 時間後における培養液へのしている MAP kinase 群である ERK1/2、JNK1/2、およIL-12 の分泌の線量依存的な増加（200J/ ㎡では約 12pg/び p38 に着目し、それぞれのシグナル伝達系の阻害剤でml、Fig. ５）が認められた。興味深いことに、HaCaT ではある PD98059（MEK inhibitor, 100µM）、
SP600125（JNK1/2

このような UV-B による IL-12 の誘導は見られなかった

inhibitor, 20µM）、および SB203580（p38 inhibitor, 25µM、 （data not shown）。
以 上 Calbiochem） に よ る IL-12 発 現 量 の 変 化 を 調 べ た。

この UV-B 誘導 IL-12 産生に関わる細胞内シグナル伝

シグナル分子のリン酸化は western blot により検出した。

達経路を推定するために、UV-B で活性化することが確かめられている MAP kinase 群の阻害剤の存在下で UV-B を３．結果照射し培養を続けたところ、IL-12 分泌（照射 24 時間後、100J/ ㎡の UV-B を照射された HaCaT における CPD 及

Fig. ６）および IL-12 mRNA 発現（照射 16 時間後、Fig.７）

び 6-4PP 量の経時変化を Fig. １に示す。CPD 量は照射後のいずれもが、JNK1/2 の特異的阻害剤である SP600125

8 時間で半減し、24 時間後にも約 20% が残存したのに対により非照射のレベルまで抑制された。また、抗酸化剤

して、6-4PP は照射後 2 時間で急激に減少し、16 時間後で あ る N-acetyl-cysteine（NAC） は SP600125 と 同 様 ににはほぼ未照射のレベル（OD=0）に達した。すなわち、IL-12 産生を抑制するとともに、UV-B による JNK1/2 の

CPD はゆっくりと、6-4PP は早く修復されることが示さ

リン酸化を阻害していた（Fig. ８）。

れた。

Fig.1

Repair kinetics of CPD (left) and 6-4PP (right) of HaCaT cells following exposure to UV-B (100J/ ㎡ ).

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Fig.2 Effect of exogenously-added IL-12 on removal of CPD in HaCaTcells in 6 h or 24h following exposure to UV-B (100J/㎡ ).

Fig.4 mRNA expression for IL-12 (p35) in normal humanepidermal keratinocytes in 16h or 24h following exposure
to UV-B (100J/㎡ or 200J/㎡ ).

Fig.3 Clonogenic cell survival of HaCaT cells in
the presence or absence of IL-12 following
irradiation with UV-B at various doses.

Fig.5 Secretion of IL-12(p70) by normal human epidermal
keratinocytes in 24h following exposure to increasing
doses of UV-B.

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コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Fig.6 Inhibition of IL-12 secretion by various MAPK inhibitors and an antioxidant in 24hfollowing irradiation with 200J/㎡ of UV-B. PD:PD98059 (MEK inhibitor, 100µM），SP:SP600125（JNK1/2 inhibitor, 20µM）,SB:SB203580（25µM），NAC:N-acetyl
cysteine (antioxidant, 1mM).

Fig.7 Inhibition of IL-12A mRNA expression by various MAPK inhibitors and by anantioxidant in 16 h following irradiation with 200J/㎡ of UV-B.

Fig.8 Phosphorylation of JNK and its inhibition by NAC in 24h following irradiation with
400J/㎡ of UV-B.

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４．考（参考文献）

察１）Kondo S, Jimbow K:Dose-dependent induction ofUV-B はヒト表皮角化細胞による IL-12 の産生を誘導しIL-12 but not IL-10 from human keratinocytes after

たこと、一方、exogenous に加えた IL-12 が CPD の修復

exposure to ultraviolet light A. J Cell Physiol 177,を促進し UV-B による細胞死を抑制したことは、UV-B に493-498, 1998.

より放出誘導された IL-12 が DNA 損傷の修復を促進する

２）Werth VP, Bashir MM, Zhang W:IL-12 completelyという、一種の autocrine な upregulation 機構の存在を示

blocks ultraviolet-induced secretion of tumor

唆する。しかし、exogenous に加えられた IL-12 の有効

necrosis factorαfrom cultured skin fibroblasts and

濃度域（ng）は、培養液中に検出された IL-12 濃度（pg）

keratinocytes. J Invest Dermatol 120, 116-122, 2003.

よりも高く、また IL-12 は CPD の修復のうち特に照射 6３）Schwarz A, Grabbe S, Aragane Y et al.:

時間以内の初期過程を促進したが、培養液中への IL-12 のInterleukin-12 prevents UVB-induced local分泌が確認されたのは照射 24 時間を経た後であった。そimmunosuppression and overcomes UBN-inducedのため、この autocrine な regulation が生理的に生じていtolerance. J Invest Dermatol 106, 1187-1191, 1996.

るかという点について、IL-12 をノックダウン、もしくは４）Schwarz A, Staender S, Berneburg M et al.: Interleukin-12
suppresses ultraviolet radiation-induced apoptosis by

強制発現させた細胞系での確認が必要である。
UV による IL-12 の誘導には細胞種波長依存性があり、inducing DNA repair. Nat Cell Biol 4, 26-31, 2001.

HaCaT で は UV-B に よ る IL-12 の 誘 導 は 見 ら れ な か っ５）Matsuda N, Horikawa M, Wang LH et al.: Differentialた（data not shown）。HaCaT に は 樹 立 化 に 伴 い p53 等

activation of ERK 1/2 and JNK in normal humanの遺伝子に変異が生じていることが知られており 、正fibroblast-like cells in response to UVC under different

常な細胞とは異なる UV-B 応答性が関与しているのか

oxygen tensions. Photochem Photobiol 72, 334-339, 2000.

もしれない。また波長依存性も存在し、IL-12 誘導能は６）Yanase H, Ando H, Horikawa M et al.: Possible

UV-A が UV-B よ り も 高 い。 さ ら に UV-B 照 射 に よ る

involvement of ERK 1/2 in UVA-induced

immunosuppression は UV-A の共照射により抑制される

melanogenesis in cultured human epidermal

ことも報告されている 9）。以上を合わせ考えると、太陽

melanocytes. Pigment Cell Res, 14, 103-109, 2001.

8）

光紫外線の大部分を占める UV-A が、日常生活における

７）Horikawa-Miura M, Matsuda N, Yoshida M et al.:The higher lethality of UVB radiation to cultured

UV-B 防御的な働きをしている可能性もあろう。
UV を受けた表皮細胞の IL-12 の産生機構についてはhuman cells is associated with the specific activation of

明らかではなかったが、今回の結果は、UV-B により産a DNA damage-independent signaling pathway. Radiat

生された活性酸素種が JNK1/2 経路を活性化し、その下Res, in press.

流で IL-12 遺伝子発現が制御されていることを示唆する。

８）Lehman TA, Modali R, Boukamp P et al.: p53

JNK による IL-12 産生制御に関する同様の報告は、マクmutations in human immortalized epithelial cell lines.

ロファージにおける LPS 誘導 IL-12 産生系においても見Carcinogenesis 4, 833-839, 1993.

。UV を照射され細胞内で活性化するシグナル伝

９）Reeve VE, Domanski D, Slater M: Radiation

達経路のうち、JNK1/2 経路は一般にアポトーシスに関連

sources providing increased UVA/UVB ratios induce

すると考えられてきた 5）。今回の結果と合わせ考えると、

photoprotection dependent on the UVA dose in

JNK1/2 経路はアポトーシスによる損傷細胞の排除のみな

hairless mice. Photochem Photobiol 82, 406-411, 2006.

らず、IL-12 産生を介した DNA 損傷修復によっても UV10）Utsugi M, Dobashi K, Ishizuka T et al.: c-Jun N-terminal

られる10）

kinase negatively regulates lipopolysaccharide-induced

防御的に働いているのかもしれない。
本研究では、ヒト表皮角化細胞における UV-B 照射→IL-12 production in human macrophages: Role of

活性酸素種→ JNK1/2 → IL-12 → CPD 修復→細胞生存のmitogen-activated protein kinase in glutathione redox

一連の autocrine regulation の機構の存在を示した。今後、

regulation of IL-12 production. J Immunol 171, 628-635,

生物学的な紫外線防護法開発へのアプローチの一つとして、

2003.

この機構に変化を及ぼす薬物、因子、素材等の投与によるIL-12 産生の間接的活性化が考えられよう。

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