゜

還元型ネオフ テリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果
束京理科大学小島

生命科学研究所周Effect of the reduced form of neopterin (NPH4) on human fibroblast cell and mousemelanoma (B-16) cell injuries induced by long-wave length ultraviolet light (UV-A) irradiation
was examined.
The reduced form of neopterin, NPH4, didn't inhibit the incorporation of 3圧proline into
collagen of human fibroblast cells induced by UV-A irradiation, but dose-dependently did thelowering of 3H-thymidine (3H- TdR) incorporation into DNA fraction of the B-16 cell injury
On the other hand, the oxidized form of neopterin, NP, drastica!Iy elevated the reduction of bothprecusors induced by UV-A irradiation at a high concentration. Radical oxygen species (ROS)
which induced the cell injuries in B-16 cell. Among various kinds of ROS, scavengers, only catalase,a scavenger for hydrogen peroxid, protected the cells from the injury, suggesting that hydrogen
peroxide may involve in the cell injury induced by UV-A irradiation. In the in vitro analysis ofchemiluminescence induced by hydrogen peroxide, NPH4 reduced the siginal intensity in dose­
dependent manner, while NP dramatically enhanced the signal intensity at a high concentration.
In hydrogen peroxide-induced B-16 cell injury model, almost the same data were obtained aswell as in UV-A irradiation. These results suggest that neopterin would be applicable toprotecting skin from ultraviolet-induced injury and skin cancer therapy

1

緒

言

一方、 近年、 心筋梗塞、 動脈硬化、 糖尿病、 ア
ルツハイマ ー 病、 癌、自己免疫疾患等の成人病・

ネオプテリンは分子量253の2ー アミノ-4 ー ヒドロ

難病 の 発症に 生体内で 産 生 され る 活 性 酸 素 種

キシプテリジン誘導体の1つで、 核酸(GTP)由来(ROS)が関与していることが明らかとなってきの補酵素（ピオプテリン）の前駆休であり、 食細た。 これらの多くは、 先に述べたネオプテリン高胞の1つであるマクロファ ー ジより、 インタ

フェ値を示す疾患であり、 かつ、 同一細胞より両物質

ロン r の剌激により遊離されることが明らかとが遊離されることから、 ネオプテリンが食細胞でなっている。 ネオプテリン の生理活性につい ての活性酸素の産生・遊離の制御に関与している可は、 いまだ解明されていないが、 これまで、能性か示唆された。 すなわち、 我々は本物質を食AIDSをはじめとする種々の感染症、 悪性腫瘍、自細胞での活性酸素の産生および遊離活性酸素に対ー已免疫疾患、 異種臓器移植の拒絶反応、 川崎病、するスカベンジャ ー （抗酸化剤）と推定した。 こ

糖尿病等の患者血中および尿中に顕著に増加するの仮定の下で、 ネオプテリンの抗酸化能を種々のことことから、 これら疾患の診断に用いる試みが系で測定したところ、 本物質の遠元体である5、なされている。

6、7、8 ー テトラハイドロネオプテリン(NPH4)に極めて強い活性があることを見いだした 1 - 3) 。 また、 酸化型ネオプテリン(NP)もマクロファ ー ジ

Effect of the reduced form of〗neopterin (NPH4) on the skin 1111ury
induced by ultraviolet lightの活性酸素産生過程に作用し、 この発生を抑制することを既に明らかにしている 4) 。 これらの結果

Shuji Ko11ma

は、 過剰生産されたROS、 あるいは、 これらに対Research Institute for Biosciences,

する生体の防御系の低下・欠損等による正常細胞

Science University of Tokyoの傷害、 いわゆる「活性酪素ストレス」に対する-66-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

2. 3

生体の持つ「巧みな防御機構」の発見につながる

紫外線の照射UV-A (東芝、FL-20S、BL/DMR)の照射はカバばかりでなく、先に記載した活性酸素関連疾患にー対する治療薬への応用も大いに期待される。

プレ ー トを付けた状態で、2. OmW/cm 2 の線量率で所定の時間照射した。

ところで、紫外線暴露による皮膚の炎症あるいは皮府癌等の発生についても、 その詳細については明らかではないが、 紫外線照射により発生する

2.4

ROSの関与が示唆されている 5 - 7) 。 そこで、本研

ヒト線維芽細胞の紫外線照射によるコラ ー
ゲン生成量の測定

究では紫外線による皮膚傷害に対するネオプテリ

ヒト真皮線 維芽 細胞（森永乳業製 ）を、 ハム

ンの効果を抗酸化活性と関連付け、 ヒト線維芽細

F l2Cl0% FCS含有）培地に懸洵し、24ウェルに

胞およぴマウス ・ メラノー

2xl炉個ずつまき、37℃のco パンキュ ベ ー タ(5%マ(B-16)細胞を用い

C0 2 /95%Air)中で、4-5日コンフルエントにな

検討した。

2

実

験

るまで培養する。UV-A照射

co、80、160、および240分）後、培地を除き、PBSで3回洗浄、 sH ープロ
2. 1

ESRによるネオプテリンの抗酸化活性の解析

リン(0. 2µCi/ml)を各ウェルに入れ、さらにスピント ラップ剤と しては 5,5-d imethyl­

24時間培養する。培地を除去し、PBSで細胞を3回

pyr r oline-1- oxide(DMPO)を用い、日本電子製

洗後、50µg/mlプロテア ー ゼK(含〇. 25%N ーラウ

RADICAL Bio-SENSOR (JES-FR80)にて解析した。

を各ウェルに100µl
リルザルコシン・25mM EDTA)

ス

ー

パ

ー

オキサ イド アニオンはヒポキサンチン加える。細胞が完全に溶 解した後、ピペッテング(HPX)(0. 5mM〉とキサンチンオキシダー ゼ(XOD)

し、100µlを液体シンチレ ーションカウンター 用(0. 25V /ml)の反応にて生成させた。ヒドロ キ

バイアルに取り、シンチレ ー タ(10ml)を入れ、ー

放射能を測定した。つぎに、本合成を約30%抑制

ンルラジカルは、予め、硫酸第一鉄と金属キレタであるDiethylenetriaminepentaaceticacid

する照射線量(29J/cm 2 =240分照射）にて、(DETAPAC)を等モル(lmM)反応させておいた水

NPH4および NPのコラ ー ゲン合成に対する作用を検溶液(Fe-DETAPAC)と過酸化水素の反応で生成さ

討した。

せた。
2. 5
2. 2

細胞の培養

細胞傷害の測定

細胞傷害の程度は、照射細胞をPBS(-)で3回マウスメラノ ー マ細胞を理研細胞バンクより入洗浄後、 aH ーチミジン( 3 H-TdR)のDNA画分への取グルMEM(10%FCS含有）培地を用い、込活性から評価した。すなわち、UV-A照射後の洗37℃のCO 2 インキュベ ー タ(5%C0 2 /95%Air)中浄B-16細胞に 3 H-TdRを各ウエルに18. 5KBq/mlにで、コンフルエントあるいはセミ コンフルエン

なるように加え、1時間CO 2 インキュ ベー タで培養

手し、イ

ー

ト、になるまで培養した。つぎに、0. 25%トリプ

する。 ハンクス液で2回洗浄した後、0. 25%トリ

シン/0. 02% EDTA溶液を用い細胞を回収し、プシン/0. 02%EDTA溶液50µ1を各ウエルに加え、PBS (-)で3回洗浄後、2 x 10 6 ce11s/田1 MEM

1-2分インキュ ベー タ内に放置し、1mlのハンクトにまく。

ス液を加え、細胞をガラスチュ ー プに回収する。

さらに、12時間培養したのもに、ネオプテリンを各チュ ー プ に10% TCA 1mlを加え、30分問氷上に加え、紫外線(UV-A)を照射した。

放置する。ガラスフィルタ ー (Whatman、GF/C)

細胞懸菊液を調製し、1mlを24穴プレーをセットした濾過器で、TCA不溶画分を回収し、5%TCA、エタ ノ ー ル／エ ーテル(1 : 1)およびエ-67-

テルの順で各々2回ずつ洗浄する。 フィルタ ー1% H2船を加え反応を開始した。 蛍光体からの蛍を室温で放置し、十分乾燥後、バ イアルビンに移光をルミネッセンスリ ー ダ(Atoka BLR102)で連し、トルエンシンチレ ータ10mlを加え、放射能を紛もH勺しこ言ci泉した。

ー測定する。なお、各々の活性はDNAに取り込まれた放射能 (CPM/wel 1)あるいは、非照射群に対す(A) Control

る割合（％）として表示した。
2. 6

抗酸化酵素• 酸化剤の細胞傷害活性に対する作用

B-16細胞でのUV-A傷害 および酸化型ネオプテリ
ン (NP)によるこの促進効果に関与するROSを同定する為、SOD (lOOOU/ml)、 カタラ ー ゼ(CAT、200U/ml)、 a — フェニ ー ル ー N-t ー プチ ー ルニトロン(PBN、100µIii)およぴマニト ー ル(MAN、100µIii)(B) NPH4 (0.5 mM)を培地に添加した細胞について、UV-Aを2. OmW/
cm2 の線量率で、10分間照射し、傷害活性を比較
した。
2. 7

過酸化水素によるB-16細胞傷害に対するネ
オプテリンの作用

l、10、 および100'µMの過酸化水素を含むMEM培
地を調製し、B-16細胞を10分間過酸化水素に暴露させた後、PBS (-)で十分洗浄、 3H-TdRを含む(C) NPH4 (1.0 mM)

培地を各ウエルに加え、1時間CO2インキュベータで培養する。 その後の操作は2. 5に従い、過酸化水素によるB-16細胞に対する傷害を検討した。
さらに、過酸化水素濃度を10µMに固定し、先に述ぺたUV-A照射と同様の方法でNPの作用を検討した。
2. 8

Fig.l[A]. ESR spectra of DMPD spin adducts
formed in a hypoxanthine/xanthineoxidase (HPX/XDD) system w ithout(A) or w I th NPH4 of 0. SmM (B) andl.Dm M (C).
Each spectrum was obtained at 60
sec after adding XDD.
Si gnals appearing both at highand low field are due to Mn(II)i n s t a I Ie d i n t he c a"v i t y a s areference.
the main species present include
DMPD-DDH and DMPD-DH.

ケミルミネッセンスによる過酸化水素の反応性の検討

Weissらの方法

8)に従い、濃度のことなるNPH4

およびNPを0. lM PBS (pH7. 5)にとかし調製した。
蛍光体として、lOmM 5 ー アミノ ー 2, 3 ー ジヒドロ —l, 4 ー フタラジンジオンをDMSOに溶かしたのもをス
トック溶液とし、用時、PBSで40µMに希釈したものを用いた。650µ1のPBS、150µlの蛍光体溶液
およびネオプテリンを含む反応溶液に100µlの-68-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚侶害に対する効果

Neopterin Kit (INCSTAR)を用い定量した。 残存(A) Control

NP量は照射前のNP量を100とした際の割合（％）
で表示した。
2. 10

チロシナ ー ゼ活性の測定

50mM PBS(pH6. 8) 0.8ml、チロシナ ー ゼ(Sigma
社製、750µg/ml)0. 5ml、ネオプテリン0. 5mlをガラス製セルに入れ、2分間プリインキュベートする。 この反応液に0. 05%L-D0PA 0. 5mlを添加し、反応を開始する。 反応開始後、37℃でイン
キュベートしながら475nmの吸光度の変化を2分間(B) NPH4 (0.5 mM)記録し、初速度より活性を求めた。

士ロ
象

3

3. 1

果

ESRによるネオプテリンの抗酸化活性の解析

HPX/XOD反応系及びFe-DETAPAC/H 2 船反応系により、それぞれ、02―ラジカルおよび• OHラジカ
120

d
3
:>』
U.I
Ol
QlJ
UO:>.Ilぶ）一o』（(C) NPH4 (1.0 mM)

Fig.l[B]. ESR spectra of DMPO spin adducts
f o rm ed in the F enton rea c t i on
without (A) or with NPH4 of O .SmM
(B) and 1. OmM (C) .
E a ch spectrum was obtained at 60
sec after adding hydroperoxide.
S ignals appearing both at highand low field are due to Mn (II)i n s t alled in th e c avity a s arefe r e n c e . t h e m a in s p e c i e spresent is DMPO-OH.
2. 9

100
80

60
40
20

80

160

24 0

Irradiation time (min)Fig.2. Effect of UV-A irradiation times on
the incorporation of 'H-pro Iin into
human fibroblast cell.
Resu lts were expressed as relative
percent of UV-A-irradiated cells tothe onirradiated cells.
···statistica lly significant diffrence
from the nonirradiated group(p<O. 001, Student, t-test).

ネオプテリンのUV-Aに対する安定性

NPをlOOng/ml PBSに調製、2. OmW/cがの線量率でUV-A を時間を変えて照射した。 残存NP量は-69-

ルを発生させ"'還元型ネオプテリン(NPH4)とのすように、 ヒト線維芽細胞にUV-Aを照射するとコ反応性をESRにて検討した。 この結果、Fig. 1に示

ラ ー ゲン合成量は照射時間の増加と共に、減少しすように、NPH4は、 いずれのラジカルに対してた。 つぎに、UV-A照射時間を240分とし、ネオプ

も、極め て高 い 反 応 性 を 示 し 、 濃度依存的にテリンの存在下での、コラ ー ゲン合成量を測定しDMPO-OOH (Fig. l[A])およびDMPO-OH (Fig. l[B])た。Fig. 3に示すように、 ネオプテリンの存在にのピよりコラ ー ゲン合成量は抑制され、とりわけ、酸ークを低下させ．、た。

一

方、酸化型ネオプテリ

ンには、 これらラジカルとの反応性は認められな化型ネオプテリンに顕著であった。

かった。
3. 3
3. 2

ヒト線維芽細胞のUV-A照射によるコラー

ゲ

害に対するネオプテリンの作用
つぎに、細胞を紫外線に対しより感受性の高いン生成量の変化コラ ー

マウス ・ メラノマ(B-16)細胞の紫外線傷

ゲンは、主としてプロリンとハイドロプ

マウス ・メラノマ(B-16)細胞にかえ、UV-Aの細ロリンからなるアミノ酸配列の規則的な繰り返し

胞傷害に対するネオプテリンの作用を検討した。

から構成されている。 そ全で、 aH標識プロリンのFig.Aに示すように、2. OmW/cm 2 の線量率で5分以細胞内取り込みにより、UV-Aによるコラ ー ゲンの上照 射 す る と 、 非照 射群と比較し 、 有意

生合成の変化を測定した。 この結果、Fig. 2に示(p< 0. 05)な H-Tdrの取り込み活性の抑制がみ

3

6

120

4

80

一

3

40

20

UV-A

NPH4

Fig.3. Effects of the reduced and the ox1d i zed f o rm of ne opt eri n on the 'H­
prolin incorporation into human fib­roblast cell irradiated with UV-A.
The eel Is were exposured for 240 min
in the presence of NPH4 and NP at
30りµ,r.; by UV-A. •••st atisticallysignificat difference from the non­
irradiated control group (p<0.001,
Student, t-test).

10

20

30

Irradiation time (min)NP

UV-A irradiation

5

。
。

Cont

60

ー

3J
U 3J.I

2

ー。

g=PBH

d p l() Al!A!Pn {l JO（ぷ ） 一 0』JU OJ ;

5

zeE

(＜

100

Fig. 4. Effect of UV-A irradiation times on
the mouse melanoma(B-,16) cell injury.
The eel I damages were evaluated inviyro by measuring用 — thymidine ('H­
TdR) incorporation into eellular DNA
of the ce 11 s. Resu Its were expressed
as relative percent of UV-A-irradia­
ted eel Is to the nonirradiated eel Is.
・・Statistically significat diffe­
rence from the nonirradiated control
group (p<O. 01, Student, t-test).

-70-

還元型ネオプテリン (NPH4) の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

120

120
で 25) I O』JU OJ 3q J JO

80

100
80

60

一

60

。

20

Cont

UV-A

10

U 3JJ3^I40

ーg 』3d.

(S ) I O』 lU O;> aq l JO lU

100

100

40
20

Cont UV-A

1

10

100

UV-A + NP (µM)

UV-A + NPH4 (µM)

Fig_ 6. Effect of doses of the oxidized fromof neopterin(NP) on the UV-A-induced
B-16 cell injury.
The eel I damages were evaluated 1n
vitro by measuring 3H-thymidine ( 3 H­
TdR) incorporation into cellular DNA
of the ce11 s. Resu I ts were expressed
as relative percent of UV-A-inradi­
ated cells with or without NP to thenonirradiated cells. "Statisticallys1gnificat difference from the non­
irradiated control group (o<0 .01,
Student, t-test). *"Statisticallysignificat difference from the non­
irradiated group(p<0.001, Student, t-test).

Fig.5. Effect of doses of the reduced fromof neopterin (NPH4) on the UV-A­
i nducued B-16 ce11 injury.
The ce 11 damages were eva I ua ted In
vitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into cellular DNA
of the cel Is.
Results were expressed as relative
percent of UV-A-inraddated c ellswith or without NP to the nonirra­
diated cells.
*Statistically significat difference
from the nonirradiated control group(p(O. 05, Student, t-test).

られ、10-30分の照射で非照射群の約70%の値を示した。 次に、 照射時間を10分(1. 2J/cmりに傷害を促進する結果について、 種々のラシカル・固定し、 この細胞傷害に対するNPH4およびNPの作

スカベンジャ ー を用い、 さら に検討を加えた。 こ

用を、 検討した。 Fig. 5に 示すように、 還元型ネの結果、 Fig_ 7に示すように、 それぞれ、1出、オプテソンであるNPH4は濃度依存的にこの細胞傷

02→および ·OHに対する スカベンジャ ー である害を抑制した。 一方、 酸化型ネオプテリンは、PBN、 SOD、 およびMANには 細胞傷害の抑制は全く

lOµMまでは顕著な作用を示さないものの、見られず、 過酸化水素に対するスカベンジャ ー で100µ1,! では、 この傷害を顕著 に促進した(Fig. 6)。

あるCATにのみ顕著な傷害活性の解除がみられた。

還元型ネオプテリンの抗酸化活性については、 す

この結果、 このUV-AによるB-16細胞傷害の発生に

でに、明らかにしたように、 極めて強い 抗酸化活は、 紫外線照射 により発生するROSのうち、 主と性があること、 および本実験にて明らかとなった

して、 過酸化水素が関与することが示唆された。

ように、 NPH4がUV-Aによる細胞障害を抑制することより、 この障害の発生に活性酸素の関与が推定された。 そこで、 酸化型ネオプテリンによる細胞

-71-

8
(E dg )� J
BU6!
S!
SUCIIU!I6[Al NPH4 (µM)—←
60---0--

゜
一

4

40

0.1
1.0
10
100

2

2

p g =P8ll
AI
E d品 ） A 1l
3A l
I
(

--- ゜
----

80

。

゜

0.0

0.2

0.4
0.6
Time (min)

0.8

1.0

Cont UV-A PBS SOD CAT MAN PBN
UV-A + NP (µM)

3. 4

ネオプテリンの過酸化水素の反応性に対す

UV-A照射によるB-16細胞傷害の発生に過酸化水素の関与が示唆され、 酸化型ネオプテリンによる傷害の増強が過酸化水素の細胞傷害活性の促進を介する事が推定された。 そこで、 過酸化水素の反--o-- 1.0-- 10,,_,... ・ 100

50

゜

る作用

[Bl NP (µM)

ー。
ーー 。.100
ー(E d9 1)A1
1
sua1
u11
eu61
s

Fig.7. Effect of radical scavengers on the
UV-A-induced B-16 eel I injury.
The ce 11 damages were eva Iua ted , nvitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into eel lular DNA
of the cells.
Results were ex pressed as radio­
activity (cpm) incorporated into thecel 1/wel I. PBS, PBS(-); SOD, super­o xi d e dismutes (1000U/ml); CAT,ca ta Iase (200U/m I); MAN, mann ito I(100µ,M); PBN, a-phenyl-N-t-butylni 一
trone (100µ,M),**Statistically significat difference
from the nonirradiated control group(p(O. 01, Student, t-test).
·**statistically significat difference
from the noni rradiated control group(p(O. 001, Student, t-test).

150

0.0

0.2

0.4
0.6
Time (min)

0.8

1.0

Fig.8. Effect of neopterins on the signal
i n t e n s i t y ind u c e d by hy d r o gen
peroxide.
The signal intensity was measured byluminoldependent chemiluminescence.
The light output after addition ofhydrogen peroxide containing luminol
with or without neopterins was con­tinuously record for 1 min.
The s igna I intensity was expressed
as counts per minut (cpm) at eachtime interval.
[A]NPH4, reduced form of neopterin;[B]NP, the oxidized form of neopterin.

応性に対するネオプテリンの作用をケミルミネッ
センス法により検討した。 この結果、 Fig. 8に示の、100µ, Mては、 著しくこのシグナル強度を高めすように、 PN H4が過醗化水素によるシグナル強度た。 この結果は、 先に示したUV-A照射による細胞NPは0. 1-

傷害に対するNPの傷害促進効果の発現結果と良くを浪度依存的に抑制するのに対し、10µMの濃度範囲では顕著な作用を示さないもの

一致した。

-72-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

120

10

40

2

。

゜
゜

20

4

60

6

80

8

(
W U\
/
W d:>
>t
) AJ
!
A!
P go=
peH

一

J8d
0 E U8::In J
OJ U0::>01e 6) I

100

10

100

Cont

Cone. of hydrogen peroxide (µM)

NP

NP+CAT
H202

Fig.9. Effect of doses of hydrogen peroxideon B-16 cell injury.
The eel I damages were evaluated 1n
vitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into eellular DNA
of the ce II s.
Results were expressed as relative
percent of hydrogen peroxide-treatedcells to the untreated cells.
*Statistically significat difference
from the untreated group(p(O. 05, Student, t-test).
**Statistically significat difference
from the untreated group(p(O. 01, Student, t-test).
3. 5

H202

Fig. 10. Effect of doses of hydrogen pero­
xide-induced B-16 cell injury by
the oxidized form of neopterin andits abolishment by catalase.
The ce 11 damages we re eva I ua led In
vitro by measuring 'H-thymidine ('H-TdR) incorporation into cellular
DNA of the cells.
The cells were treated with 10µ.M
hydrogen peroxide 10 min with orwithout NP. Results were expressed
as radioactivity (cpm) incorporated
into the cells/well. Catalase (CAT,200U/ml)was added to 10µ.M hydrogen
peroxide-treated cells with NP,·S tatisti·ca I I y significat di f f erence
from the untreated group(p<O. 05, Student, t-test).
.. Statistically significat difference
from the untreated group(p<O. 01, Student, t-test).

過酸化水素によるB - 16細胞傷害とネオプテ
リンの作用

これまでの結果より、UV-A照射によるB-16細胞
傷害の発生に過酸化水素が関与し、 NPH4はこの反応性を抑制、 一方、NPはこれを増強することによ

化水素によるB-16細胞傷害はUV-Aによる細胞傷害が示唆された。 これらの仮定を確認する目的で、と同様、NPにより促進され、当然の事ながら、本実験では、過酪化水素による細胞傷害 を作成の促進効果はCATにより完全に解除された。

こり、それぞれ、UV-A傷害の抑制及び促進をする事し、この像害に対 するNPH4及びNPの作用を検討し3. 6

た。Fig. 9に示すように、10µM以上の過酪化水素

ネオプテリンの吸収スペクトルと紫外線に対する安定性により有意な細胞傷害が惹起された(p<O. 05)。
つぎに、 過 酸 化 水索の浪度を10 µ Mとし、N P

還元型ネオプテリン(NPH4)が、 ヒト線維芽細(lOOµM)およびCAT(200 U/ml)の作用を検討し胞での紫外線によるコラ ー ゲン合成の抑制に対した。 この結果、Fig. 10より明らかなように、過酸ては促進的に、メラノ ー マ細胞でのDNA合成の抑-73-

,-r I二仁戸仁仁仁下―干l丁 1-1 I I I寸十□寸二則丑．＿一ニこ：.·;;;. _:_-::: ==-ニニ+:.:••:••:ご二こ ニニニ.ニ-二亡 ー：：：：：：：：二．ニニ—:�—：ーニ ここ.::::―:二 ― 一 —三三二三三::=-:.:::三二三•三二三三三ニ-三ーニ□三三三 ��口:i一□三デ亨二＝三三三三三三三ロニ戸三三三二三□三―ー•三三戸ニーこ一—ぞニニ三三三三三—□三：三：：i三��=三三□こ三三三三ロ•
一
三 三ニニ三三二三三二： ニ ー＝二三ーニ三三二□三言三三二―ー―-ニ== -�--== ニ：三二口三三
三三 三二三ロニ一 三二丁
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一三・
ニニ 二三 ― -==—三― ― ＝ ニー□□一二―-----=―-—-= ニ三 二三＝—二三
ロニ＝一三 一ニ―ロ
三 ＿ニ 一 三二＿＝ ―-三ロニ三ーニ亨三 ＝ 二言・•三三三三
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1;J

200

300
Fig. 11400

Absorption spectrum of the reduced

nm

form of neopter In

制に対しては防御的に作用すると言う、 矛盾した部(300-400nm)に吸収波長を有するスペクトル結果を示した。 紫外線の傷害活性が活性酸素に起を示した。 また、 Fig. 12 に示すように、 UV-A照射

因することから、 線維芽細胞での紫外線によるコに対するNPの安定性は極めて低く、2. Om屑/c耐のラー

ゲン合成の抑制に対しても、 当然、 NPH4 が防線量率で10分間の照射により、 大部分のNPは分解

御的に作用することが期待された。 この実験で消失した。 また、 NPH4 についても UV-A に対し、 極は、 紫外線のメラノー用と比較し、 コラ

ゲン合成に対し紫外線が抑制

ーマ細胞でのDNA合成抑制作

めて不安定であった。 なお、 分解産物については不明である。

作用を示すのに、 大線量の照射を要することから、 NPH4 が照射中に酸化型ネオプテリン (NP) に

3. 7

変化した、 あるいは紫外線を吸収し、 コラ ー ゲン

ネオプテリンのチロシナ ー ゼ活性に対する作用

合成に対し抑制作用を有する他の化合物に変化しネオプテリンのチロシナ ー ゼ活性に対する作用たことが考えられる。 そこで、 本実験では、を検討したところ、 酸化型および還元型ネオプテ

NPH4の吸収スペクトルおよび紫外線に対する安定

リン、 いずれもl. 0�1000µMの濃度範囲では、 本性を検討した。 Fig. 11 より明らかなように、 紫外

活性には何ら作用しなかった。

-74-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射反膚偽害に対する幼米

マウス・ メラノマ(B-16)細胞でのDNA合成抑制

100

検討した。

80

一

（
邑 dN o O!J
eJ6u1
u1
eEOU

に対するネオプテリン(NPH4およびNP)の作用を
ヒト線維芽細胞でのコラ ー ゲン合成は大線量(291 /cmりの紫外線照射により、非照射群に対60

し約30%の抑制がみられた。 この抑制は還元型およぴ酸化型ネオプテリンの、いずれによっも解除

40

されず、むしろ増強された。 一 方、B-16細胞でのDNA合成は、1. 2J/ C記(2. OmV/cm 2 で10分間照20射）と極めて少線量の紫外線で非照射群に対し約
5

10

20

30%の抑制が得られた。 この紫外線傷害に対し、

30

還元型ネオプテリンであるNPH4は用量依存的に抑Irradiation time (min)制作用を示した。 一方、酸化型ネオプテリンであFig.12. Decomposition of the oxidized formof neopterin by UV-A irradiation as
a function of time.
One µ,M of the oxidized form of NP
was irradiated for different times
by UV-A at a dose of 2. OmW/cm'.
Remaining NP at each time interval
was assayed by Neopterin RIA kit.
Each point was expressed as rela­tive percent(%) of UV-A-irradiatedsample to the non-irradiated sample
and the mean 士S.E.M. for 3 inde­
pendent assays.

の、高混度(100µM)では、 その傷害をさらに一層促進した。 紫外線の傷害活性が活性酸素に起因することから、線維芽細胞での紫外線によるコラーゲン合成の抑制に対しても、当然、NPH4が防御的に作用することが期待されたが、本実験では、反対にコラ ー ゲン合成の抑制をさらに増強した。
この理由としては、紫外線のメラノ ーマ細胞でのDNA合成抑制作用と比較し、 コ ラ ー ゲン合成に対する紫外線の抑制実験では、照射線量が29/Jcm 2と大線量の紫外線を用いるため、NPH4が照射中に

察

4

考

るNPは低濃度領域では顕著な作用を示さないもの

酸化型ネオプテリン(NP)に変化した、あるいは
紫外線を吸収し、 コラ ー ゲン合成に対し抑制作用

これまで、紫外線による皮膚の炎症をはじめ、を有する他の化合物に変化したことに起因すると皮内癌の誘発・憎悪化等に、照射後、皮膚内に発が考えられる。 NPH4が極めて強い抗酸化剤である

生する種々のROSが関与することが報告されていこと、および、NPが活性酸素種を介した細胞毒性る。 すなわち、細胞に紫外線が照射されることにを高めると言うこれまでの報告 8) から、本紫外線

より細胞内の水分子は励起され、この後に続く連傷害モデルに おいても、これまでの報告のよう鎖反応により、種々のROSを生成、細胞膜の脂質に、この傷害の発生にROSの関与が示唆された。

過酸化等を介し、先に述べた種々の皮膚障害を発

そこで、B-16細胞での紫外線傷害に対する種々の5

生するものと考えられている - 7) 。
一

ラジカル・ スカベンジャ ー の抑制作用を検討し、方、ネオプテリンの抗酸化活性については、
1 -4)

本傷害に関与するROSを推定した。 この結果、過。 そ

酸化水素に対するスカベンジャ ー であるカタラ ー

こで本研究では、紫外線の中でも、比較的、細胞

ゼのみに本傷害に対する回復作用がみられ、過酸に対する傷害活性が低い長波長紫外線(UV-A)を

化水素を介した細胞傷害が示唆された。 この仮定

ー ゲン合成およびは、紫外線に代えて、過酸化水素により惹起した

これまで私共が報告してきた通りである

用い、 ヒト線維芽細胞でのコラ-75-

細胞傷害に対しても、ほぼ同様な結果を示したこ

2) Kojima S, Icho T, Hayashi M, Kajiwara Y

ネオプテリンの紫外線細胞傷害促進の機序として

effectof 5, 6, 7, 8-tetrahydroneopterin
on adriamycin -induced cardiotoxicity.

とからも支持されると思われる。 さらに、酸化型

Kitabatake K, and Kubota K, : Inhibitory

は、NPが紫外線照射により発生した過酸化水素の細胞傷害活性を上昇させた結果によると考えられる。

J Exp肋,gr,勿col乃er 226 1699-1704 1993.

3) lcho T, Kojima S, Shinohara N, Kajiwara

Y, Kitabatake K and Kubota K : Protective

紫外線の細胞傷害に対するNPH4の抑制作用、およびNPの細胞傷害促進作用が明らかとなり、それ

effect of tetrahydroneopterin against

及び皮膚癌に対する紫外線治療の際には、その安及ioc.ヵ喧肪'BF!DBCOJ 45 1953-1958 1993.

free radical-induced injury.

ぞれ紫外線暴露による皮膚炎症に対する防護剤、定性が問題となる。 そこで、ネオプテリンの紫外

4) Kojima S, Nomura T, lcho T, Kajiwara Y,

Kitabatake K and Kubota K: Inhibitory線に対する安定性を検討した。 この結果、ネオプ
テリンはUV-Aの発光スペクトル領域である320-

effect of neopterin on NADPH-dependent­

対し極めて不安定であり、照射後、直ちに分解あmacrophages. /i'E.8S letters 329 125-128

400nmに吸収スペクトルを有し、かつ本紫外線にsuperoxide generating oxidase of rat

るいは他の化合物に変化する事が明らかとなっ
た。

1993.

5) Ogura R, Sugiyama M, Sakanoshita T, andすること、一方、酸化型ネオプテリンがその傷害

oxide of skin exposed ultraviolet I ight.

は、それぞれ、皮膚の紫外線によるsunburn ある(eds). T h e Biological RoleofReactive

Hidaka T: Role of oxygen in I ipid per­以上、還元型ネオプテリンが紫外線傷害を抑制

In : Hayashi 0, Imamura S and Hiyachi Yを促進することが明らかとなった。 これらの作用

いはsuntun等の急性傷害に対する防護剤として、またNPを紫外線と組み合わせることにより、皮膚癌等の局所疾患の治療へ応用することが可能と思

Oxygen Species in Skin, University ofTokyo Press, Tokyo, 1988, pp 495-471.
6) Ogura R and Sugiyama H:Cellular membrane
damage and lipid peroxide following ex­

われる。

posure of the skin to ultraviolet rays.

謝In: Kl igman AM and T akase Y (eds) .

辞

コスメトロジ ー 研究振興財団より研究支援頂き、基礎研究を進める機会が与えられましたことを厚く御礼中し上げます。 お蔭様で、当初の研究

Cutaneous Aging. University of Tokyo

Press, Tokyo, 1988, pp 495-471.
7) Schellreuter KU and胃ood JM:Free radical

reduction in the human epidermis. Ji'ree

予定内容以外に、新たな結果を見出す事かできました。 今後も、皆様方の御指摘ならびに、なおー
層の御支援頂ければ幸いです。

彪d.Boil Jfed6 519-532 1989
8) Weiss G, Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G

引用文献
1) Kojima S, Icho T, Kajiwara Y, and Kubota
K:Neopterin as an endogenous antioxidant.
凡'i'BS letters 304 163-166 1992.

!ates toxicity mediated by reactive

Werner ER, Werner-Fe11mayer G, Semenitz E,
Dierich Hand屑achter H : Neopterin modu­

oxygen and ch 1 oride spec I es. Ji'£ガ:5'letters
321 89-92 1993.

-76-