炎症性皮膚疾患におけるストレス応答性キナーゼASK1の機能解析

東京大学大学院薬学系研究科

一 條

秀 憲、水 上潤 哉

The skin provides a first line of defense against various physicochemical and biological stresses such as wound andmicrobial pathogens and induces inflammatory response. The adaptive responses to these stresses are essential for the
maintenance of homeostasis and dependent on the stress recognition mechanism and intracellular signaling systems.
Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) is activated in response to various stimuli such as oxidative stress and a
mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) family member that activates both the p38 and JNK signalingcascades. Recent studies revealed that ASK1 is required for the production of inflammatory cytokines and migration ofmacrophages and induces apoptosis of keratinocytes in the skin.
Contact hypersensitivity (CHS) is a form of delayed-type hypersensitivity, an immune response to a variety of reactive
contact sensitizers, such as metals, preservatives, and hair dyes. Whereas the sensitization phase of CHS has been focusedon as a model for investigating T-cell-dependent immune response by immunologists, the elicitation phase in which allergic
contact dermatitis is clinically manifested has received much attention from clinicians. Even in the mouse model of CHS,
however, it is difficult to distinguish between the role of a certain molecule involved in the CHS response in the sensitization
phase and that in the elicitation phase. Here we show, using a chemical genetic approach, that ASK1 plays an important rolein the both sensitization and elicitation phase of the CHS response and would be a therapeutic target for the inflammatory
skin diseases.

1．緒も、その多くは対症療法に頼っているのが現状である。

言

このような炎症性皮膚疾患の病態への理解を深め、治療・

皮膚の炎症性疾患は、化粧品の安全性を考える上で最も予防方法を見いだすためには、抗原を含む様々なストレス

重要な疾患であり、その病態ならびに治療・予防方法を明

刺激を受容・認識し、その情報を免疫系へと正確に伝達すらかにすることは、安全性の高い化粧品やその安全な使用る分子機構を明らかにする必要がある。我々は、その機構法の開発に向けての必須の課題である。

を担う分子として、様々なストレスに応答してアポトーシ

皮膚は常に外界からの様々なストレスに直接さらされる

スの誘導 2）や炎症性サイトカインの産生調節に働く分子で組織であり、高度に発達した獲得免疫系と、幅広い生物種あり 3、4）、自然免疫応答においても重要な機能をもつ 5）において保存されている自然免疫系とを協調的に制御する

ASK1 というストレス応答性キナーゼに着目した。最近、ことで、生体を守る最前線の防御壁としての役割を果たし

ASK1 ノックアウトマウスの皮膚では接触過敏反応が著し1）ている 。しかし、過大なストレス刺激や免疫系の不全あく減弱することを見いだしたことから、ASK1 が様々な炎

るいは過剰応答はその防御機構を破綻させ、多様な炎症性症性皮膚疾患における鍵因子と考え、ASK1 の皮膚疾患に皮膚疾患を引き起こす。もっともポピュラーな炎症性皮膚おける機能を明らかにするとともに、治療・予防の標的と疾患としては接触皮膚炎が知られており、いったん接触抗しての有用性を探ることを本研究の目的とした。

原に対する感作が成立すると抗原に接触する度に皮膚炎を

2．実引き起こすため、日常生活に多大な影響を及ぼす疾患とし

験て多くの患者が苦しんでおり、化粧品もその原因の一つと本研究では、おもにマウス接触過敏反応モデルを用いてして重要視されている。治療法としては、初期感作を未然獲得免疫系における ASK1 の新たな機能を明らかにするこに防ぐこと自体は容易ではないため、抗原に再暴露した際とで、その病態を解明するとともに、治療・予防への応用の発症をいかに予防するかが重要であるが、その手がかりに向けての創薬基盤を確立することを目的とした。研究内はまだつかめていない。その他の炎症性皮膚疾患について容としては、マウスの個体レベルでの解析に加え、細胞レ
ベル、分子レベルまで解析を進め、ASK1 の活性を時期特＊異 的 に、 濃 度 依 存 的 に 制 御 で き る ノ ッ ク イ ン マ ウ ス（ASK1ASKA マウス）を新たに作製し様々な実験に用いるこA role of stress response kinase ASK1 inthe inflammatory skin disease.

とで、ASK1 の治療標的としての重要性を十分に検討した。

＊

Hidenori Ichijo , Junya Mizukami
Graduate School of Pharmaceutica l
Sciences, The University of Tokyo（1）接触過敏反応における ASK1 の機能解析：− 112 −

野生型マウスおよび ASK1KO マウスに DNFB、FITC

炎症性皮膚疾患におけるストレス応答性キナーゼ ASK1 の機能解析

を Day0、1 に感作させ、Day 5 に耳に再感作を行い、24 時
間後の炎症の程度を耳の腫脹で検討した。

（2）ASK1 は皮膚ランゲルハンス細胞の分化、遊走能に寄与しないCHS では表皮に存在する Langerhans cell（LC）が抗原（2）初期感作後の樹状細胞における ASK1 の機能解析を取り込み、所属リンパ節へ遊走することが重要である。

これまでの解析から接触過敏反応の感作期においてまず初めに LC での ASK1 の役割について検討するため、

ASK1 が重要な役割を担うことを明らかにしていることか

表皮シートを PE ラベルされた MHC class Ⅱ抗体を用いてら、まず感作初期に関わる樹状細胞の形成、機能について

染 色 し た。MHC class Ⅱ 陽 性 の LC の 形 態、 細 胞 密 度 は検討した。

WT マウス、ASK1KO マウスでは同様であった。次に LCの遊走を検討するため、FITC をマウス皮膚に塗布した。

（3）感作後のリンパ球の分化やサイトカイン産生における ASK1 の役割の解析

LC は皮膚に塗布された FITC を取り込み、FITC 陽性細胞として所属リンパ節へ遊走する 7）。FITC 塗布 24 時間後、初期感作後リンパ球でのサイトカイン産生パターンの解所属リンパ節を採取し、LC の数をフローサイトメトリー

析から、ASK1 は TH の分化誘導を制御することが示唆さで測定したところ、所属リンパ節での MHC class Ⅱ-FITCれる。TH の分化誘導は抗原提示細胞である樹状細胞とナ陽性 LC の数は、WT マウス、ASK1KO マウスで同様であイーブ T リンパ球との相互作用が非常に重要であり、樹状った。以上の結果より、LC の発生やリンパ節への遊走に細胞、T リンパ球、それぞれの細胞における細胞内シグナ

ASK1 は影響を及ぼさなかった。

ル伝達および共刺激分子の発現等により厳密に制御されている。そこで、感作リンパ節細胞の養子免疫実験やサイト
カイン産生、ならびにナイーブ T リンパ球から各 TH サブ
セットへの分化における ASK1 の関与を検討した。

（2）ASK1KO マウスでは DNFB 感作後の Th17 細胞の分化が低下するリンパ節に遊走した LC はナイーブ T 細胞に抗原提示を行い、ハプテン特異的な T 細胞に誘導することが知られてASKA（4）ASK1
マウスを用いた接触過敏反応の惹起相における ASK1 の役割の解析

おける ASK1 の役割を解析するために、DNFB 感作 WT マ

接触過敏反応は初めて抗原に接触する感作期（Day 0−5）

ウス、ASK1KO マウスをドナーとして所属リンパ節よりと再度抗原に接触してから炎症反応がおこる炎症惹起期

リンパ節細胞を採取し、ナイーブな WT マウス、ASK1KO（Day 6 以降）に分けられる。ASK1 ノックアウトマウスのマウスに後天的に細胞を移植した。感作 ASK1KO リンパ解析から感作期における重要性は明らかとなっているが、節細胞の WT レシピエントマウスでは、感作 WT リンパ節

炎症惹起期における機能はまだ明らかとなっていない。

細胞のレシピエントマウスと比較して CHS 反応が抑制さ

ASKA

いる 8、9）。そこで、次に抗原提示を受けたリンパ節細胞にマウスに DNFB を塗布して感作を成立させたのれていた。逆に、WT ドナー由来の感作リンパ節細胞をナ

ち、Day 5 に再度 DNFB を塗布する前に低分子化合物であイーブ ASK1KO マウスに移植した時には、DNFB チャレ

る 1Na- PP1 の投与／非投与群を検証することで、炎症惹ンジにより正常な CHS 反応が惹起された。これらの結果

起期の ASK1 の機能を明らかにした。

から、感作リンパ節細胞での ASK1 が CHS 反応において

ASK1

3．結

重要な役割を担うことが示唆された。

果

感作後のリンパ節内では抗原特異的なリンパ球の分化が（1）ASK1 は CHS 反応の誘導に働く

誘導され、再度抗原刺激を受けると局所へ遊走して炎症性CHS における ASK1 の役割を検討するために、我々は除サイトカインの産生に重要な役割を担う。ASK1 の欠損が毛した背部皮膚に DNFB を塗布することで、WT マウス、

DNFB 感作後のリンパ球にどのように影響するかを調べ

ASK1KO マウスを感作させた。

るために、次にリンパ球の構成、サイトカイン産生や分化５日後に CHS を惹起させるため、DNFB を経表皮的に6）について解析した。

塗 布 し、 耳 に チ ャ レ ン ジ（ 再 塗 布 ）を 行 っ た 。WT、

DNFB 誘導性 CHS では感作後に Th1 細胞、Th17 細胞がASK1KO マウスともに DNFB 塗布後に耳の浮腫を生じた

分化誘導される。DNFB 感作による IFN - γ 産生細胞およびが、耳の腫脹を測定したところ ASK1KO マウスでは WT

IL-17 産生細胞の数は WT、ASK1KO マウスにおいていず

マウスと比較して有意に耳の腫脹が軽減していた。接触感れも増加していた。しかしながら、ASK1KO マウスでは

作 物 質（contact sensitizer）と し て FITC（Fluorescein

WT マウスと比較して IL-17 産生細胞数が有意に減少してisothiocyanate）を用いた時も同様に ASK1KO マウスではいた。DNFB感作マウスからリンパ節細胞を採取し、in vitro

CHS 反応が減弱していた。

で DNBS（dinitrobenzene sulfonic acid）でチャレンジしたところ、ASK1KO マウス由来リンパ節細胞からの IFN-γ− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

産生は、WT マウスと比較して差は見られなかった、興味

ンジ 24 時間後の耳の厚さを測定したところ、惹起相での深 い こ と に ASK1KO マ ウ ス 由 来 の リ ン パ 節 細 胞 で はみ 1Na-PP1 を投与したマウスにおいて耳の腫脹が低下し

DNBS チャレンジによる IL-17 の産生は著しく低下していていた。以上の結果から、ASK1 は CHS の惹起相で炎症反た。IL-17 は主にナイーブ T 細胞から分化した Th17 細胞か応に重要な役割を担うことが示された。

10）

ら産生されることが知られ 、特にその分化には制御転写

また、DNFB 感作後の ASK1ASKA マウスから採取したリ因子 RORγt（RAR-related orphan nuclear receptor γ t）がンパ節細胞に、in vitro で 1Na-PP1 を加え、惹起相を想定

11）

重要な役割を担うことが知られている 。そこで DNFB 感

した DNBS 依存的なサイトカイン産生を検討した。その結作５日後のリンパ節細胞から CD4+T 細胞を分離し、転写

果、1Na-PP1 投与のリンパ節細胞では 1Na-PP1 非投与リン

因 子 のmRNA発 現 を 検 討 し た と こ ろ、DNFB感 作 後 のパ節細胞と比較して、DNBS 依存的な IFN-γ の産生には差ASK1KOマウス由来 CD4+T 細胞では RORγt の発現が有意は見られなかったが、IL-17 の産生が有意に低下していた。

に低下していた。以上の結果から ASK1 は DNFB 感作後に

4．考Th17 への分化や IL-17 産生に影響することが示唆された。

察CHS の感作期および惹起期で ASK1 が非常に重要な役（4）ASK1 は惹起相において IL-17 産生を促進し CHSを誘導する割を担うことが明らかとなった。我々は CHS における
ASK1 の時期特異性を解明するため、ASKA を用いた化学

次に CHS の惹起相における ASK1 の時期特異的な役割

遺伝学的手法によりノックインマウスを作製し実験を行っを検討するため、我々は通常は野生型 ASK1 と同じく機能た。小分子阻害剤の不利な点は機能的な選択性にあるが、するものの、ATP 類似薬（1Na-PP1）の投与によって活性蛋白キナーゼ情報伝達解析のための化学遺伝学的手法は、ASKAが阻害される ASK1 変異体のノックインマウス（ASK1

分子特異性において小分子阻害剤より優れることが報告さマウス）を作製した。この変異体は ASKA（ATP analog-

れている 15）。この化学遺伝学的手法を用いて、CHS におsensitive allele）テクノロジーに基づいて設計したもので、ける ASK1 の時期特異的な役割および重要性を見いだした。

ASK1 のキナーゼ領域への点変異の導入により ATP 結合

CHS の病因についての研究は、ナイーブ T 細胞が抗原部位を改変することで、天然型 ATP を用いたキナーゼ活

特異的なエフェクター T 細胞に分化する感作相に焦点が性は野生型キナーゼと同等に維持されるが、1Na-PP1 によ

おかれている報告が多い。DNFB 誘導性 CHS では、感作って選択的に活性阻害を受ける（1Na-PP1 は野生型のプロ相でランゲルハンス細胞が抗原を取り込み、所属リンパ節

12、
13、
14）

テインキナーゼは一切阻害しない）
ASKA

まず我々は、ASK1。

へ遊走する。リンパ節でランゲルハンス細胞から抗原提示を HEK293 細胞に過剰発現させ、を受けたナイーブ T 細胞は Th1、Th17 などのエフェクタ

1Na-PP1 による ASK1 の活性阻害効果を検討した。Flag-

ー T 細胞に分化する 16）。Th17 細胞への分化は IL-23、IL-6、

ASK1ASKA を過剰発現した HEK293 細胞は、Flag-ASK1 を

TGF-b などのサイトカイン制御だけでなく転写因子の発過剰発現させた細胞とともに H2O2 刺激依存的な活性化が現が必要で 17）、RORγ t は Th17 細胞に特異的に発現する転検 出 で き た。 し か し、1Na-PP1 を 前 投 与 し て お く と、写因子として同定されている 11）。特に分化した Th17 細胞

Flag-ASK1ASKA の 過 剰 発現では H2O2 刺激依存的な ASK1から産生される炎症性サイトカインの一つである IL-17 はの活性化が抑制された。一方、1Na-PP1 の類似体である

マウス CHS の誘導に必要不可欠である 18）。また IL-17 はヒ

1NM-PP1 による ASK1 の活性阻害効果は弱いことが分かトにおいても接触皮膚炎のみならず感染防御や慢性炎症性っ た。Flag-ASK1 を 過 剰 発 現 さ せ た 細 胞 で は 1Na-PP1、疾患の長期化など、炎症反応において重要な役割を担って

1NM-PP1 による ASK1 の活性化阻害効果は見られなかっい る 19）。ASK1KO マ ウ ス で は 感 作 後 の CD4+T 細 胞 でた。次に ASK1ASKA ノックインマウスにおける PP1 の活性

RORγ t 発 現 が 低 下 し て お り、ASK1 が 感 作 期 に お い て阻害効果を検討した。H2O2 刺激後の 1Na-PP1 の ASK1 活

Th17 へ の 分 化 制 御 を 担 う 可 能 性 が 示 唆 さ れ た。 ま た

ASKA性阻害効果は、ASK1

マウス骨髄由来マクロファージにおいて 1Na-PP1 濃度依存的に見られるが、WT マウス由ASK1KO マウス由来の感作リンパ節細胞では DNBS 依存
的な IL-17 産生が低下していた。

来骨髄マクロファージでは阻害効果が見られなかった。こしかしながら、DNFB 誘導性 CHS において惹起相のみ

れらの結果は、1Na-PP1 が選択的かつ強力に ASK1 の活性の ASK1 活性阻害で CHS 反応が抑制され、in vitro におい化を阻害し、高濃度のこの化合物が野生型の ASK1 シグナて感作リンパ節細胞は DNBS 刺激時の ASK1 活性化を阻害

ル伝達に影響を及ぼさないことを示している。

することで IL-17 産生が有意に低下した。これらの結果か

次に in vivo での ASK1 シグナル伝達における 1Na-PP1

ら、ASK1 は感作期における Th17 分化制御に加え、惹起による阻害効果の効力および特異性を検討した。コントロ

相においてはエフェクター細胞からの IL-17 産生を促し、ール群、惹起相投与群に分けて 1Na-PP1 を投与し、チャレCHS 反応を誘導することが示唆された（Fig. 1）。

− 114 −

炎症性皮膚疾患におけるストレス応答性キナーゼ ASK1 の機能解析

Figure 1 The role of ASK1 in CHS.
ASK1 は、感作期においてヘルパー T 細胞での RORγt の発現や Th17 への分化制御を担い、惹起相においてはエフェクター細胞からの IL-17 産生を促し、CHS 反応を誘導することが示唆された。

5．総

6:587-92

括６）Kabashima, K. et al. Prostaglandin E2-EP4 signaling

IL-17 は CHS の病因の主要な役割を担うが、ASK1 を介

initiates skin immune responses by promoting

する IL-17 産生機構や実際にどのような炎症細胞が関与しmigration and maturation of Langerhans cells. Nat.

ているかなどは依然として検討する余地がある。それでもMed. 9, 744-749 (2003)

なお、ASK1 の活性を制御することで、惹起相での IL-17

７）Macatonia, S.E., Knight, S.C., Edwards, A.J., Griffiths,

産生の調節を介して、臨床的に局所の炎症反応や組織破壊

S. & Fryer, P. Localization of antigen on lymph

を制御できる可能性があり、ASK1 が新たな CHS の治療標

node dendritic cells after exposure to the contact

的となることが期待される。

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