光照射による分子集合体の構造変換及びその機能化に関する研究
大阪大学大学院工学研究科

水 上進

Controlled release systems induced by external stimulation have attracted great attention, because these systems enablespatiotemporal regulation of active drugs in target organs. Furthermore, the drug efficacy could be enhanced, and thus
the dosage could be reduced. Until now, several strategies for controlled release have been proposed. As the external
stimulation, temperature, pH, light, etc. have been used. Especially, controlled release by light is very promising, becauselight irradiation does not need complex instruments and can be concentrated on the small area. Additionally, laser devices
are clinically used in photodynamic therapy. However, there are almost no practical photo-controlled drug release systems.
Therefore, we started to develop a novel drug release system triggered by light irradiation. We focused on the membranedamaging properties of antimicrobial peptides (AMPs) such as magainin. AMPs are attracting increased attention as
novel types of antibiotics. Their target is the lipid bilayer of bacterial membrane, and they kill bacteria by disrupting theirmembranes. We synthesized an AMP mimic foldamer modified with (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methoxycarbonyl(Bhc) groups, which are photocleavable protective groups. The caged group is deprotected by irradiation UV light around365 nm. When the caged molecule was treated, the AMP mimic foldamer was reproduced. Then, we applied the caged
compound to the controlled drug release system. After several kinds of liposomes containing fluorescence dyes were treatedwith the caged compound. Only when the samples were treated with UV light, fluorescence dyes were released.

１．緒た。リポソームは、脂質二分子膜が殻のようになった構造

言を持つ小胞である。内部に水を含み水中で安定に分散する。

ドラッグデリバリーシステム（Drug Delivery System:作成方法を変えることで大きさを制御でき、直径が 100DDS）は、薬物の投与を量的・時間的・空間的に制御すnm ～ 1 µm のものを Large Unilamellar Vesicles（LUVs）

る手法であり、副作用の低減や薬効の増強などを可能とすと 呼 び、10µm 以 上 の も の を Giant Unilamellar Vesicles

るため、近年盛んに研究されており、実用化されているも（GUVs）と呼ぶ。近年では、化学修飾などによって安定性のも存在する。近年、外部刺激によってキャリアに内包さが向上したため、様々な分野への応用が期待されている 。

れた薬物の放出を制御する研究は大きな注目を集めている。

一方、薬物を放出させるスイッチについては、これまでこれまでに行われた研究例において、用いられた外部刺激の研究ではリポソームを構成するリン脂質に光応答性官能としては、温度変化、pH 変化、酵素活性、あるいは金属基を修飾するものがほとんどであった。今回我々は、リポイオンなどが挙げられるが、近年では非侵襲的な刺激ソームを破壊して内包薬物を放出させる機能性分子を光応が大きな注目されている。消化管や血管内に答性官能基で修飾し、その薬物放出活性を光によって制御として光２）

１）

おける内視鏡技術の発達により、体内の局所で光を照射す

３）するシステムを考案した。

ることも不可能ではない。それゆえ、光によって薬物放出

まず、リポソームを破壊する機能性分子として、抗菌をコントロールすることができれば、多くの疾患においてペ プ チ ド （Antimicrobial Peptides: AMPs） に 注 目 し

幅広い応用が期待できる。しかしながら、光照射によってた。抗菌ペプチドは、1920 年代からグラム陰性菌などの薬物放出を引き起こす手法の中で、臨床で用いられているバクテリアに対して原核生物が分泌するものとして研究さものはまだ無い。そこで、本研究において、新規メカニズれてきたが、1979 年に蛾のさなぎ由来の抗微生物作用たムに基づく光誘導薬物放出システムの開発に取り組んだ。

んぱく質セクロピンが、1987 年にはアフリカツメガエル

２．実
２．
１４）

Xenopus laevis の皮膚からマガイニン（図１(a)）が単離され、

験抗菌ペプチドの研究は一気に進展した。

光応答薬物放出システムの開発コンセプト

抗菌ペプチドの性質は、１．ウイルスや微生物にのみ作

本研究では、薬物キャリアとしてはリポソームを選択し用し、ホスト生物には無害である（選択毒性）、２．即効Structural conversion and functionalizationof self-assembled structures induced byphotoirradiation

性がある、３．広い抗菌スペクトルを持つ、の３つが挙げられる。特に１．の選択毒性は抗菌ペプチドの医療への応用にとって重要である。選択毒性の理由として考えられShin Mizukamiているのが、原核生物と真核生物の細胞膜表面の構成リン

Graduate School of Engineering, OsakaUniversity

脂質の違いである。微生物の細胞膜表面にはフォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、カルジオピリン等の酸性リン脂質が存在するのに対し、健康な動物細−2−光照射による分子集合体の構造変換及びその機能化に関する研究

胞膜表面には酸性リン脂質は露出していない。また、微生基と呼ばれ、これまでに多くの種類の保護基が報告されて物膜には存在しないコレステロールが豊富に存在し、そのいる。本研究においては、1999 年に古田らによって開発他の構成脂質もフォスファチジルコリンなどの中性脂質でされ、その後の生理学研究において多くの応用例が見られある。抗菌ペプチドは正電荷を多く持つので、負電荷を帯る Bhc（（6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl）methyl）基

びた膜には静電相互作用によって吸着するが、電気的に中を選択した。Bhc 基は光反応の量子収率、水溶性などの性の膜には作用しない。そこで、薬物キャリアとなるリポ面で優れた性質を有しており、特にヌクレオチドや mRNAソームを微生物の細胞表面を構成する酸性の脂質成分で作のケージに応用されており、ニューロン等の情報伝達分子の製することにより、抗菌ペプチドが真核細胞に影響を与え挙動を光制御するツールとしても幅広く利用されている 。

６）

７）

ることなくリポソームのみを選択的に破壊できると考えられる。本研究では、マガイニン２の構造および機能アナロ

２・２５）

光感受性膜傷害性分子 BBhcPT の合成

グとして、Tew らによって報告された PT （Pyrimidine

抗菌ペプチドアナログ PT および光感受性保護基 MOM-Trimer; 図１（b））を用いることにした。このとき、PT のBhc-ONp をそれぞれ合成し、それらを縮合させた後、脱殺菌作用に重要なカチオン性官能基を光応答性保護基でブ保護を行い、光応答性膜傷害性分子 BBhcPT を合成した

ロックすることで、抗菌ペプチドのリポソーム破壊能を光（図３）。合成した化合物は NMR スペクトルおよび質量分制御できると考えた（図２）。

析により同定を行った。

光応答性保護基は、生理学の分野ではケージド（Caged）

図１ （a）マガイニン２、（b）膜傷害性分子 PT、および（c）光応答性膜傷害性分子 BBhcPT の構造

図２

光応答性薬物放出システムの概要−3−

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

２・３ 紫外光照射による BBhc-PT における Bhc 基脱離の確認

２・４ リポソームの調製および光照射によるリポソーム破壊実験

紫外光（360 nm）を照射することで、化合物 BBhcPT

水溶性蛍光物質カルセインを含むリポソーム（Giantから Bhc 基が脱離して PT が生成する過程を以下のプロ

Unilamellar Vesicles; GUVs）を作成した。調製したリポ

トコルで確認した。まず、１mM BBhcPT の DMSO 溶液ソームをポリリジンコートガラスボトムディッシュに移し、を、10 mM MOPS 緩衝液（pH 7.1）により 100 倍希釈し、静電相互作用によりカバーグラスに沈着させた。蛍光顕微10 µM とした。続いて、この溶液 100 µl を石英セルに入鏡下、カルセインの蛍光を観測することで、リポソームれ、レオネット社製の光照射装置を用いて紫外光（360 nm）の形態変化を追跡した。ここに、BBhcPT を添加し、360を当てた。その後、各サンプルを逆相 HPLC により測定した。

nm の UV 光を照射しながら、リポソームの形態変化を蛍光顕微鏡により観察した。
BocHN

OH
O2N

OTs

NO2NO2O2N

TsCl, DIEACH2Cl2SH

BocHN

DIEA, CH2Cl2

BocHN

BocHN
HOS

O

NH2H2NN

N

S, WSCD, HOBt
DMF

NH
N

H 2N

N

S

H
N

OMOM

Br
O O
H2N
S
H2NN

H
NON

O2N

H
N

NH2OMOM

Br

OO

Br

O

OMOMOPyridine
DMF

S

50% TFA in CH2Cl2NH2O

O

H2 N

SnCl2・2H2O
NaOAc・3H 2O
EtOH

NO2BocHN

OHO

S

O2N

O
O

OOO

O

OHN

HN

O
S
H 2N

PT

O
OH

Br

OHBr

O

O
O
O
TMS bromide
CH2Cl2N

H
N

O

HN

HN
S

H2N

O

O

O

N

H
NO

N

H
N

S
NH2O

BBhcPT
図３BBhcPT の合成スキーム

−4−N

H
NO

S
NH2

光照射による分子集合体の構造変換及びその機能化に関する研究

３．結除前の BBhcPT によって影響を受けないことを確認した。

果GUVs に DMSO を添加した後 360nm の紫外光を照射した。

図４に示すように、BBhcPT は 360 nm の紫外光を照射したところ、経時的に HPLC ピークが減少し、1800 秒後

また、BBhcPT を 10mM の最終濃度で添加し、490 nm の励起光で挙動の観察を行った。には完全に消失した。この結果より、BBhcPT は紫外光最終濃度 5 µM の光感受性抗菌ペプチドアナログ 2 をガ照射によって、脱保護を受け、膜傷害活性を回復することラスボトムディッシュ上のリポソームに添加し、6 分間静が示唆された。

置した。蛍光顕微鏡システムによる 488 nm の励起光照射

次に、蛍光物質カルセインを内包させた LUVs を用いて、ではリポソームの形態にほとんど影響を与えないことを

BBhcPT を添加した後、紫外光を照射することで、カル確認した。次に、励起光の波長を 350 nm に変更し、リポセインの放出を定量的に測定した（図５）。照射時間に対ソームの観察を行った。紫外光による励起開始の数十秒後するカルセインの流出と BBhcPT の残存率を比較するこからリポソーム膜の形態変化が観察され始め、２分半後にとで、BBhcPT は光照射によってケージ解除されることは内部のカルセインが完全に流出するのが確認された（図で膜傷害能を発現し、リポソームを破壊することが示され６）。また、BBhcPT の濃度を増やすことによって、素早た。

いカルセインの放出が起こることも明らかとなった。低濃

最後に、光照射によるリポソームに内包された化合物の度の BBhcPT の添加では、図６のようなダイナミックな放出を蛍光顕微鏡によって観察した。蛍光物質カルセイ

リポソーム破壊は観測されず、リポソーム内の蛍光強度がンを封入した GUVs を作製し、ポリリジンコートガラスボ徐々に消光していく傾向が見られた。この場合は、リポソトムディッシュに沈着させた。その後、BBhcPT を添加しーム上に細孔を形成し、カルセインが徐々に漏出した為とて静置した後、蛍光顕微鏡を用いて紫外光を照射しながら、思われる。

GUVs の挙動を観察した。
まずコントロールとして、GUVs が紫外光及びケージ解

BBhcPT濃度：5μM
BBhcPT remaining
Relative leakage

8080606040402020Relative leakage (%)

1000

図４．紫外光照射による BBhcPT の HPLC チャートの時間変化

UV 照射前0500 1000 1500 2000 2500 3000
Irradiation time (s)Remained BBhcPT (%)

10003500

図５．BBhcPT の光解除効率（◆）
、および流出したカルセインの割合（●）の経時変化

10s
20s
30s
40s
60s
80s
100s
図６．紫外光照射によって引き起こされた、リポソームに内包されたカルセインの放出−5−150sコスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

４．考（参考文献）

察１）(a) A. Chilkoti, M. R. Dreher, D. E. Meyer, D.

本研究において、抗菌ペプチドの細菌膜傷害活性に着目

Raucher, Adv. Drug Deliv. Rev. 2002, 54, 613–630. (b) D.

し、脂質集合体ドラッグキャリアであるリポソーム内に内Schmaljohann, Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 58, 1655–1670.
(c) N. Rapoport, Prog. Polym. Sci. 2007, 32, 962–990.

包された薬物を光刺激によって放出させるシステムの構築に成功した。抗菌ペプチドアナログの膜傷害活性に重要な

２）P. Shum, J. -M. Kim, D. H. Thompson, Adv. Drug Deliv.
Rev. 2001, 53, 273–284.

官能基を光感受性保護基で保護することで、紫外光照射のときのみ膜傷害活性を発現させることができた。また、リ

３）V. P. Torchilin, Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4, 145–160.

ポソームの組成は最近の細胞膜に近い組成を選択すること

４）M. Zasloff, Nature 2002, 415, 389–395.

で、選択性を出すようにデザインされている。現段階は、

５）G. N. Tew, D. Liu, B. Chen, R. J. Doerksen, J. Kaplan,

まだシステムの基本原理を開発したところであるが、今後

P. J. Carrol, M. L. Klein, W. F. DeGrado, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 2002, 99, 5110-5114.

ドラッグキャリア内に光感受性分子を組み込み、より汎用性が高い光感受性ドラッグキャリアへと発展させる予定で

６）T. Furuta, S. S. Wang, J. L. Dantzker, T. M. Dore, W.

ある。本研究で用いる薬物キャリアはリポソームであり、J. Bybee, E. M. Callaway, W. Denk, R. Y. Tsien, Proc.

このような脂質からなる自己集合体は化粧品にも馴染みのNatl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96, 1193–1200.

深い成分である。すなわち本研究の応用例としては、医療

７）H. Ando, T. Furuta, R. Y. Tsien, H. Okamoto, Nat.

応用のみならず、紫外線に暴露された場合の皮膚の保護能を有する機能性化粧品の開発などコスメトロジーへと発展する可能性を持つ。

−6−

Genet. 2001, 28, 317–325.