高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

杉山

広島大学 医学部総合薬学科 1、広島大学附属病院
１
１

政

則 、熊

谷

孝

則 、森

皮膚科 2

田

栄

伸２

Streptomyces（S.）castaneoglobisporus HUT6202 produces a large amount of diffusible melanin-like pigment. We havecloned an operon, designated mel, which is responsible for the synthesis of melanin pigment, from the chromosomal DNA
of S. castaneoglobisporus. The sequence analysis revealed that the mel operon consists of two genes: the tyrosinase gene（tyrC）consisting of 819 bp and a gene, designated orf378, consisting of 378 bp. The orf378 was located just upstreamof the tyrC gene. Although the precise function of the orf378 product remains unclear, its functuion is thought to be
involved in the transfer of copper ion which is essential for tyrosinase.
The present study has the following aims: the first is to express the microbial mel operon in human epidermis or in
albino mouse hair follicle cells. This approach will be applicable for the gene therapy of pigment disorders. The second
is to establish a cell line that expresses mel constitutively. The cell line can be used to screen inhibitors of melaninsynthesis, which will be applicable for the cosmetology.
In the present study, we tested whether the microbial mel operon is expressed in mammalian cells using COS-7 cells
as host cells. The orf378 and tyrC genes, contained in the operon, were PCR-amplified and independently inserted into
downstream of the cytomegalovirus promoter, respectively. When COS-7 cells were co-transfected with the mammalian
expression vectors, the transfectants expressed tyrosinase activity, suggesting that the microbial mel is expressed in
mammalian cells. A human keratinocyte A431 cell was also used for constitutive expression of the mel operon.

１．緒

髪を黒髪に再生するための遺伝子治療へ応用できるものと言考えられる。もうひとつは、mel 遺伝子を恒常的に発現す

筆者らは 200 種以上の放線菌を検索した成果として、る細胞株を樹立することである。樹立した細胞株はチロシ

Streptomyces（S.）castaneoglobisporus HUT6202 が、既ナーゼ活性を阻害する物質を検定する細胞として利用できにメラニン色素を産生することが知られている他の放線菌ることから、美白成分を検索するための新規スクリーニン

S. antibioticus に比べ、100 倍以上高いメラニン色素産生

グ系が構築可能になると考えられる。

能を有することを見出した。そこで、ショットガンクロー

上記に掲げた最終目標を達成するためには、微生物由来

ニング法を用いて、本菌の染色体 DNA からメラニン色素の mel 遺伝子が真核細胞で発現可能か否か調査する必要

産生遺伝子（mel ）をクローニングした。mel 遺伝子の構がある。そこで、本研究では、COS-7 細胞およびヒト角化造を調べた結果、S. castaneoglobisporus の mel 遺伝子は、細胞（keratinocyte）A431 株を用いて mel 遺伝子の発現

チロシナーゼをコードする 819 bp から成る遺伝子（tyrC）

を検討した成果について報告する。

とそのすぐ上流に存在する 378 bp から成る遺伝子（orf378）

２．実とでオペロンを形成していることが明らかになった１〜３）。
orf378 によってコードされるタンパク質の機能について

２. １

は、未だ不明な点が多いが、チロシナーゼ活性に必須な銅イオンの輸送に関与しているものと考えられている。

験

使用細胞と培養条件

COS-7 細胞は、10％ fetal bovine serum（FBS, PAA
laboratories）を含む Dulbecco's modified Eagle medium

本研究は、以下に述べる 2 つを最終目標としている。そ（DMEM, Gibco BRL）を用いて、37℃、5％ CO2 -95％ airのひとつは、ヒトケラチノサイトおよびアルビノマウスの条件下にて培養した。ヒト角化細胞（keratinocyte）と毛穴細胞（albino mouse hair follicle cells）において、S.

して A431 細胞を用いた。

castaneoglobisporus 由来 mel 遺伝子の発現系を構築することである。この系は、将来的に白斑病の遺伝子治療や白Application to cosmetology of the highly
expressed melanin-synthesizing gene
operon from a microbial source

mel 遺伝子発現用ベクターの構築

orf378 発現用ベクターは、PCR 法により増幅した orf378
遺伝子を真核細胞用ベクター pcDNA3.1/Hygro（-）（Invitrogen）に挿入することにより作製した。修飾を加えない orf378 遺伝

Masanori Sugiyama , Takanori Kumagai ,＊Eishin Morita2

子は、sense primer 5'-CACGGATCCATGCCCGAGATCAC

Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of
Medicine, Hiroshima University1 and Departmentof Darmatology, Hiroshima University Hospital2

anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTCAGTTGGCGGGGAA

1

＊

２. ２

1

CCGCCGC-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）およびCGGCAG-3'（ イ タ リ ッ ク は HindIII サ イ ト を 示 す ） を− 26 −

高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

用 い て 増 幅 し た。orf378 の 4 番 目 の 塩 基 を C か ら G にた遺伝子（tyrCKG）は、sense primer 5'-CACGGATCCGCC

変 異 さ せ た 遺 伝 子（orf378G ） は、sense primer 5'-CAC

GCCACCATGGCCGTACGCAAG AACCAG-3'（イタリック

CTCGAGATGGCCGAGATCACCCGCCGC-3'（ イ タ リ

は BamHI サイトをアンダーラインはコザック配列をそれぞッ ク は XhoI サ イ ト を 示 す ） お よ び anti-sense primer

れ示す）および anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTTAGG

5'-CACAAGCTT TCAGTTGGCGGGGA-ACGGCAG-3'

CGTCGAACGTGTAGTA-3'（イタリックは HindIII サイト（イタリックは HindIII サイトを示す）を用いて増幅しを示す）を用いて増幅した。なお、上記に述べた 4 種の遺た。orf378 の ス タ ー ト コ ド ン の す ぐ 上 流 に コ ザ ッ ク 配

伝子の PCR 反応は全て、1 サイクル目は 96℃ 4 min、65℃ 1

４）を 挿 入 し た 遺 伝 子（orf378K） は、sense primer

min、72℃ 2 min の条件で行い、その後、96℃ 1 min、62℃

5'-CACCTCGAGGCCGCCACCATGCCCGAGATCAC-

1 min、72℃ 2 min の条件で 30 サイクル行った。また、鋳型

CCGCCGC-3'（イタリックは XhoI サイトをアンダーライン

DNA としては、orf378 の増幅に用いたものと同様のフラグ

はコザック配列をそれぞれ示す）および anti-sense primer

メントを使用した。

列

5'-CACGGATCCTTAGTTGGCG-GGGAACGGCAG-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）を用いて増幅した。orf378

２. ３

COS-7 細胞への遺伝子導入のスタートコドンのすぐ上流にコザック配列を挿入し、さらCOS-7 細胞への遺伝子導入は、Lipofectamine（GIBCOに 4 番目の塩基を C から G に変異させた遺伝子（orf378KG）

BRL）を用いたリポフェクション法により行った。φ9cm

は、sense primer 5'-CACCTCGAGGCCGCCACCATGGCCのディッシュ当たり、Lipofectamine 試薬は 80µL、COS -7

GAGATCACCCGC-CGC-3'（イタリックは XhoI サイトをア

細胞は 1×10 ６細胞となるように調整した。また、遺伝子

ンダーラインはコザック配列をそれぞれ示す）および anti-

導入は 37℃にて 5 時間行った。

sense primer 5'-CACGGATCCTTAGTTGGCGGGGAACGG
CAG-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）を用いて増幅

２. ４

チロシナーゼ活性測定

した。なお、上記に述べた 4 種の遺伝子の PCR 反応は全て、

mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞を 37℃にて 66 時間培

1 サイクル目は 96℃ 4 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min の条件

養した後、0.1M phosphate buffer（pH 6.2）を用いて洗浄した。

で行い、その後、96℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min の条

洗浄後、細胞を同 buffer 中に懸濁し、超音波破砕を行った

件で 30 サイクル行った。また、鋳型 DNA としては、プラ

後、15,000×g、20 min、4℃の遠心により得た上清をチロ

スミド pUCM1

１）の mel 遺伝子を含む約 2.3 kb の KpnI フラ

シナーゼ活性測定用の試料として用いた。チロシナーゼ活性測定は、Horowitz らの方法５）に基づいて行った。すなわ

グメントを用いた。
tyrC 用発現ベクターは、PCR 法により増幅した tyrC 遺ち、10 mM の L-DOPA および 5 M の CuSO4 を含む 0.1 M

伝子を真核細胞用ベクター pcDNA3.1（-）（Invitrogen）に

phosphate buffer（pH 6.2）1.5mL に 100µL のタンパク質試

挿入することにより作製した。修飾を加えない tyrC 遺伝子料を加えた後、475 nm の吸光度を 10 分間測定し、その初は、sense primer 5'-CACGGATCCATGACCGTACGCAAG

速度よりチロシナーゼ活性を求めた。なお、1 分間に 1 nmol

AACCA G-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）およびの dopaquinone を生成させる酵素量を 1 U（unit）と定義した。

anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTCAGGCGTCGAACGTGTAGTAG-3'（イタリックは HindIII サイトを示す）を用い

２. ５

mel 遺伝子の安定形質発現株の作成て増幅した。tyrC 遺伝子の 4 番目の塩基を A から G に変異

orf 378 および tyrC を保有するベクターをそれぞれ 8 µgさせた遺伝子（tyrCG）は、sense primer 5'-CACCTCGAG

ずつ、リポフェクション法により表皮細胞である A431 に

ATGGCCGTACGCAAGAACCAG-3'（イタリックは XhoI サ

co-transfect した。この際、A431 は φ9 cm のディッシュ

イトを示す）および anti-sense primer 5'-CACGGATCCTCA

当たり、1×10 ６細胞になるように調整した。遺伝子導入後、

GGCGTCGAACGTGTAGTAG-3'（イタリックは BamHI サ

geneticin 500µg/µL および hygromycin 50µg/µL にて二イトを示す）を用いて増幅した。tyrC 遺伝子のスタートコ

重選択を行った。

ドンのすぐ上流にコザック配列を挿入した遺伝子（tyrCK）

３.

は、sense primer 5'-CACGGATCCGCCGCCACCATGACCGTACGCAAGAACCAG-3'（イタリックは BamHI サイトをア

３. １

結果と考察

COS-7 細胞における mel 遺伝子の発現性

ンダーラインはコザック配列をそれぞれ示す）および anti-

まず、mel 遺伝子の真核細胞での発現性を COS -7 細胞

sense primer 5'-CACAAGCTTTTAGGCGTCGAACGTGTA

を用いて調査した。mel 遺伝子に含まれる tyrC および

GTA-3'（イタリックは HindIII サイトを示す）を用いて増幅

orf378 をそれぞれ PCR で増幅した後、真核細胞用ベクタ

した。tyrC 遺伝子のスタートコドンのすぐ上流にコザック

ー pcDNA 3.1（-）および pcDNA 3.1/Hygro（-）にそれ配列を挿入し、さらに 4 番目の塩基を A から G に変異させぞれ挿入し、それらの発現ベクターを構築した。構築した− 27 −

ベクターを用いて COS -7 細胞への遺伝子導入実験を行った

組み合わせにおいては、それぞれの遺伝子の 4 番目の塩基結果、orf378 を保有するベクターのみ、あるいは、tyrC をが G に置換されているため、本来の遺伝子によってコー保有するベクターのみを transfect した COS-7 細胞においてドされるタンパク質と比較すると、2 番目のアミノ酸が置は、チロシナーゼ活性は全く認められなかった。一方、tyrC

換することになる（図１）。しかしながら、これらの組みを保有するベクターと orf 378 を保有するベクターを co-

合わせを導入した COS-7 細胞においてもチロシナーゼ活transfect した COS-7 細胞においては、チロシナーゼ活性が性が認められたことから、このアミノ酸置換がチロシナー認められた。以上の結果から、S. castaneoglobisporus 由来の

ゼ活性に影響を及ぼす可能性は否定できないものの、活性mel 遺伝子は真核細胞において発現可能であることが明らか自体を失わせることはないものと考えられた。A 〜 D のになるとともに、チロシナーゼの活性発現には tyrC のみで組み合わせについて、それぞれの遺伝子を保有するベクタは不十分であり、
orf378 の存在が必須であることがわかった。

ーを 16µg ずつ用いて COS-7 細胞に導入した際、それらの導入細胞で発現したチロシナーゼ活性を図２に示す。各々

３. ２

mel 遺伝子の発現量の検討

高く、コザック配列の挿入と 4 番目の塩基を G に置換す

orf 378 の発現量に依存するものと考えられる。本研究のることが、チロシナーゼ活性を上昇させるのに有効に働い最終目標を達成するためには、発現するチロシナーゼ活性ているものと考えられた。ただし、コザック配列のみを挿は高ければ高いほどよい。Kozak は、真核細胞内において、入した C の組み合わせの場合、本来の遺伝子の組み合わ遺伝子からタンパク質への翻訳効率を網羅的に調べた結果

せである A と比較して活性が減少していること、および、

４）、遺伝子配列に以下のような特徴がある場合、効率的に4 番目の塩基を G に置換したのみの B の組み合わせでは、タンパク質に翻訳されることを明らかにしている。⑴スタ

A と比較して活性が若干高いことを考慮すると、4 番目のートコドン（ATG）の直前に 5'-GCCGCCACC-3'（コザック

塩基置換のほうがチロシナーゼ活性の上昇に有効に働くも配列）が存在する。⑵スタートコドン直後の塩基が G である。

のと考えられる。次に、導入するベクター量のチロシナー

そこで、このような特徴を導入した orf 378 および tyrC

ゼ活性への影響を調べるため、A 〜 D の組み合わせにつ遺伝子を PCR 法により増幅し（図１および実験の項を参いて、それぞれの遺伝子を保有するベクターを 8 µg ずつ照）、orf378 系については pcDNA 3.1/Hygro（-）
、tyrC

用いて同様の実験を行った。その結果、A 〜 D の組み合系については pcDNA 3.1（-）に挿入し、発現ベクターをわせ全てにおいて、16 µg ずつ用いた場合に比べ活性が上構築した。構築後、それらを以下の組み合わせにしたがっ昇した。また、A 〜 D の組み合わせ間の比較では、16 µgて COS-7 細胞に導入し、導入細胞におけるチロシナーゼずつ用いた場合と同様に、D の組み合わせがもっとも活性orf378K/tyrCK
orf378�� orf378G�� orf378K�
�orf378KG�
�

tyrC�

�

tyrCG�

�

tyrCK�

� tyrCKG�

B）orf378G/tyrCGD）orf378KG/tyrCKG。B および D の

5' --- --- --- ATG CCC GAG --- --Met Pro Glu
5' --- --- --- ATG GCC GAG --- --Met Ala Glu
5' GCC GCC ACC ATG CCC GAG --- --Kozak
Met Pro Glu
5' GCC GCC ACC ATG GCC GAG --- --Kozak
Met Ala Glu
5' --- --- --- ATG ACC GTA --- --Met Thr Val
5' --- --- --- ATG GCC GTA --- --Met Ala Val
5' GCC GCC ACC ATG ACC GTA --- --Kozak
Met Thr Val
5' GCC GCC ACC ATG GCC GTA --- --Kozak
Met Ala Val

300

C）

3'
3'
3'
3'
3'
3'

Specific activity (U/mg protein)

活性を比較した：A）orf378/tyrC

�のチロシナーゼ活性を比較すると D の組み合わせが最もCOS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性は、tyrC および

3'

100

0

3'

図 1 PCR で増幅した mel 遺伝子の 5' 末端配列
下線部はコザック配列を示す。塩基配列中の太字 G は、置換した塩基を示す。この塩基置換により、orf378 によりコードされるタンパク質の 2 番目のアミノ酸は Pro から Alaに変異し、tyrC によりコードされるタンパク質では Thr からAla に変異する。

200

A

B

C

D

図 2 各種組み合わせの mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性
各 種 orf378 お よ び tyrC 遺 伝 子 を 保 有 す る ベ ク タ ー を
16µg ずつ、A 〜 D の組み合わせにしたがって COS-7 細胞に導入し、チロシナーゼ活性を測定した。
A：orf378/tyrC B：orf378G/tyrCG C：orf378K/tyrCK
D：orf378KG/tyrCKG− 28 −

高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

Specific activity (U/mg protein)2500

子治療に応用可能であることを示唆する。さらに、本研究において、mel 遺伝子を構成的に発現する候補細胞が１株取得できた可能性がある。この株が実際にメラニン色素を2000

産生することが視覚的に判別できれば、チロシナーゼ活性の阻害物質をスクリーニングするための検定細胞となり得1500るとともに、その阻害剤が美白剤として利用できることを示唆するものである。

1000（引用文献）
１） Ikeda, K., Masujima, T., Suzuki, K. and Sugiyama, M.:

500

0Cloning and sequence analysis of the highly expressedmelanin-synthesizing gene operon from Streptomyces
A

B

C

castaneoglobisporus. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 80-

D85, 1996.

図 3 各種組み合わせの mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性
各種 orf378 および tyrC 遺伝子を保有するベクターを 8 µg
ずつ、A 〜 D の組み合わせにしたがって COS-7 細胞に導入し、チロシナーゼ活性を測定した。
A：orf378/tyrC B：orf378G/tyrCG C：orf378K/tyrCK
D： orf378KG/tyrCKG

２） Ikeda, K., Masujima, T. and Sugiyama, M.: Effects ofmethionine and Cu2+ on the expression of tyrosinase
activity in Streptomyces castaneoglobisporus. J. Biochem.,
120, 1141-1145, 1996.
３） Ikeda, K., Suzuki, K., Yoshioka, H., Miyamoto, K.,
Masujima, T. and Sugiyama, M.: Construction of a
new cloning vector utilizing a cryptic plasmid and theが高く、コザック配列の挿入と 4 番目の塩基を G に置換

highly expressed melanin-synthesizing gene operon

することが、チロシナーゼ活性を上昇させるのに有効であfrom Streptomyces castaneoglobisporus. FEMS Microbiol

ることが改めて確認された。本研究では、導入するベクタ

Lett., 168, 195-199, 1998.

ー量のチロシナーゼ活性に及ぼす影響を調べたのみである

４） Kozak, M.: The scanning model for translation: an
update. J. Cell Biol., 108, 229-241, 1989.

が、遺伝子導入に使用する細胞数や遺伝子導入時間を至適化することにより、さらにチロシナーゼ活性を上昇させる

５） Horowitz, N.H., Fling, M. and Horn, J.: Tyrosinase

ことが可能であると考えられる。

（Neurospora crassa）. Methods Enzymol., 17, 615-620,
1970.

３. ３

mel 遺伝子の安定形質発現株の樹立

mel 遺伝子を構成的に発現する細胞株は、チロシナーゼ
活性を阻害する物質を検索するための検定細胞として利用可能である。本研究では、Keratinocyte A431 細胞を用いて mel 遺伝子の安定形質発現株の樹立を試みた。orf378
用発現ベクターは hygromycin 耐性遺伝子を、tyrC 用発
現ベクターは geneticin 耐性遺伝子を有することから、それぞれのベクターを A431 細胞に導入した後、2 つの薬剤を用いて二重選択を行った。その結果、1 つのクローンを得ることができた。現在、このクローンを増殖中であり、今後、本クローンのチロシナーゼ活性を測定する予定であ
る。

４.

総

括

本研究において、放線菌 S. castaneoglobisporus 由来のメラニン色素産生遺伝子 mel は真核細胞内で発現できることを示した。この成果は、微生物由来のメラニン産生遺伝子が白斑病の遺伝子治療や白髪を黒髪にするための遺伝− 29 −