【研究報告】（自然科学部門）

加齢に伴う学習・記憶機能低下に及ぼすトレハロース摂取の影響

本田陽子

地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター研究所
老化制御研究チーム健康長寿ゲノム探索
緒言

客員研究員の影響を研究した。

アルツハイマー型認知症など神経変性疾患の高齢者での罹患が急増しており深刻な社会問題になっている。

実験方法

これらは一度、罹患すると現在では医学的に完治させる

1） 実験動物：老化促進マウス SAMP10 雄 40 匹。

ことは容易ではない。その発症に未解明で制御が難しい

2） トレハロースの投与：1 ヵ月齢よりトレハロースを「老化」の過程が関わることが完治の方法を見出せない

2％濃度に溶かした塩素 2 ppm 添加、5 μm フィルターろ大きな理由と考えられる。老化を抑制する化合物を見出過水道水（対照群は同塩素添加水道水のみ）を飲水投与すことができれば、これらの高齢期に発症する神経変性した。

疾患を大きく予防できる可能性がある。現在、免疫抑制

3） 飼育条件：餌は放射線 6 kGy 照射、CRF-1（オリエ薬であるラパマイシンがマウスの老化を抑制することがンタル酵母工業（株）製）を自由摂取、紙製床敷「ペー1）

報告されているが 、白内障や腎臓障害など多くの副作

パークリーン」（日本エス・エル・シー製）、明暗サイク用が知られ、高齢期の神経変性疾患の予防薬として使用

ル 8〜20 時まで明、20 時〜翌 8 時まで暗、飼育室温度 22するのは難しい。

±1℃、湿度 55±5％、各ケージ 5 匹で飼育した。

そこで我々は、老化を抑制する化合物のヒントを得

4） 学習・記憶機能試験：上記の条件で飼育した 17 ヵるために、寿命が 1 ヵ月と短い線虫を用いた遺伝子解析

月齢の SAMP10 マウス 40 匹（トレハロース投与群 20 匹、により老化抑制に関わる遺伝子を探索した。その結果、対照群 20 匹）を被検体とした。本試験は①オープン老化抑制遺伝子としてトレハロース合成酵素遺伝子を見フィールド、②受動的回避学習、③水迷路学習の 3 課題出した。この合成酵素の生成物であるトレハロースを線より構成されており。すべての被検体にこれら 3 課題を2）この順序で与えた。

虫に与えると老化が抑制されることを証明した 。

①オープンフィールドトレハロースはグルコースの二糖で、細胞内に蓄積した変性・凝集タンパク質などを分解・除去するオート

タイヨー電気株式会社製のマウス用オープンフィー

ファジー（自己貪食）系を活性化することが知られていルド実験装置を用いた。被検体を放つオープンフィール

3, 5, 6）

。老化に伴って変性・凝集タンパク質が細胞内

ドは、天井部のない透明アクリル板製の立方体の箱（各に蓄積することが知られており、トレハロースはオート

辺 30 cm） で あ り、 防 音 チ ャ ン バ ー（縦 70 cm× 横ファジーを活性化させて、これらの分解・除去を促進す

60 cm× 高 さ 50 cm） 内 に 格 納 さ れ て い た。 オ ー プ ンる可能性がある。

フィールドの各側面外側、床面から 2 cm の位置にはそる

トレハロースの摂取がヒトでも老化を抑制し、高齢れぞれ 2 個の赤外線センサーが 10 cm 間隔で内向きに設期の神経変性疾患の予防に有効である可能性を探るた

置されていた。被検体が各側面の 2 個の赤外線センサー

め、マウスで加齢に伴う学習・記憶機能の低下などの脳の前方を連続して通過すると移動反応（locomotion）と障害へのトレハロースの効果を確かめた。そこで加齢にして検出された。さらに向かい合う 2 側面の床面から伴って学習や記憶能力が顕著に低下し、脳の萎縮が見ら

4.5 cm の 位 置 に も そ れ ぞ れ 12 個 の 赤 外 線 セ ン サ ー がれるマウスとして知られる老化促進マウス SAMP10 を2.5 cm 間隔で内向きに並置され、これらのセンサーの前用いて、長期にわたるトレハロースの摂取の、加齢に伴方を被検体が遮断すると立ち上がり反応（rearing）とう学習・記憶機能の低下と脳における遺伝子発現変化へして検出された。防音チャンバー内部には白色 LED が1本田陽子設置されており、点灯時の照度は 110 lux であった。まフォームの縁とプールの内壁との最短距離は 15 cm とした防音チャンバー背面部には小型換気扇が取り付けられた。水位はプラットフォームの表面上約 5 mm とした。ており、換気を行うと共にその駆動音をマスキングノイ

水は毒性のない水溶性のインクを加えて黒濁させた。水ズとした。音圧はオープンフィールドの床面中央部で約温は 25±1℃に維持した。

45 dB（C）であった。すべての被検体に、10 分間のセッ（1）獲得訓練（Days1〜5） 全被検体に対し、1 日 5ションを 1 日 1 回、3 日間連続で与えた。各セッション試行の獲得訓練を 5 日間連続で与えた。各試行では、被では、被検体をオープンフィールドの床面中央部に置い検体をプラットフォームが設置されていない仮想の 4 分た後、速やかに防音チャンバー閉じて行動測定を開始し象限いずれかの壁際からランダムな順序で頭を壁面に向た。セッションの開始と修了は防音チャンバー内の照明けてプールへ投入して水泳させ、プラットフォームに両の点灯と消灯により規定した。

前肢が接触するまでの時間を逃避潜時として計測した。

②受動的回避学習

被検体がプラットフォームにのると 10 秒間そこに留め

タイヨー電気株式会社製のマウス用回避学習実験装た。 プ ー ル へ 投 入 後 60 秒 以 内 に 被 検 体 が プ ラ ッ ト

置を用いた。実験箱（縦 30 cm×横 15 cm×高さ 15 cm）

フォームに到達しなかった場合は、実験者が被検体をプは側面部と天井部が厚さ 5 mm のアクリル板製で、床部ラットフォームの上へ誘導し、そこに 10 秒間留めた。

は直径 3 mm の鉄棒が 10 mm 間隔で並列された通電可能

この場合、逃避潜時は 60 秒として記録した。試行間間なグリッド状であった。実験箱内をアクリル板製のギロ

隔は 30 秒とした。

チンドアによって区分けし、暗室と明室を構成した。暗（2）プローブテスト（Day6） 獲得訓練最終日の翌日、室は側面壁と天井部が黒色、明室は側面壁が白色で天井プラットフォームを取り去ったプールに被検体を放ち、部が透明であった。明室の天井部には白色 LED が取り1 分間自由に水泳させるプローブテストを 1 試行実施

付けられており、その照度は明室の床面中央部で約し た。 行 動 追 跡・ 解 析 ソ フ ト（株 式 会 社 行 医 研 製

340 lux であった。暗室内の側面床上 15 mm、ギロチンBeChase3.0） を 用 い て、 プ ラ ッ ト フ ォ ー ム 設 置 象 限

ドアから 50 mm の位置には、被検体の反応検出用の赤（ターゲット象限）およびその他の仮想の 4 分象限それ外線センサーが設置されていた。

ぞれへの滞在時間を測定した。

（1）条件付け（Day1） 被検体を暗室の中へ入れ、105） 組織採取：学習・記憶機能試験終了後、被検体は秒間放置したのちにギロチンドアを開け、被検体が暗室3.5 時間の絶食後、全採血を開始し血清を採取した。ネへ移動するまでの潜時を測定した。移動から 10 秒後にンブタール麻酔下で全採血後、生理食塩水で全身灌流をグリッド床から電激（140 V、5 秒）を 1 回提示して条件実施した。灌流後、腎臓（左右）、脳を摘出し、脳は縦付けを行った。被検体は電激提示終了から 10 秒間暗室方向で分割し、左側（脳は左脳側）はブアン固定、右側内に放置し、実験装置から取り出した。

（脳は右脳側）は液体窒素で凍結した。

（2）保持テスト（Day2） 条件付けの 24 時間後に保6） 遺 伝 子 発 現 解 析： 液 体 窒 素 凍 結 さ れ た 右 脳 は、持テスト（受動的回避テスト）を 1 試行実施した。条件RNeasy mini spin columns, QIAGEN を 用 い て total

付け試行と同様に被検体を暗室へ入れて 10 秒間放置しRNA を抽出され、NanoDrop, BioAnalyzer にて品質検た後にギロチンドアを開き、暗室へ移動するまでの潜時査を行われた後、SurePrint G3 Mouse GE マイクロアレを測定した。被検体が暗室へ移動しても電撃は提示しな

イ 8×60K にて解析された。

かった。被検体が移動しなかった場合は 180 秒で試行を結打ち切り、反応潜時は 180 秒として記録した。

果1） 記憶・学習機能試験③水迷路学習①オープンフィールド高 さ 30 cm の 設 置 台 上 に 水 平 に 固 定 さ れ た 内 径95 cm、高さ 35 cm の背の低い円筒形プールを用いた。

各群の移動反応得点は 3 日間の試験期間で減少した

プラットフォームは直径 10 cm、厚さ 1 cm の円盤に台が、トレハロース投与による有意な違いは認められな座を取り付けたもので、高さは 21 cm であった。プラッかった（図 1a）。立ち上がり反応得点はトレハロース投

トフォームは円形の水面を均等に 4 分割した仮想の 4 分

与群において 2 日目、3 日目において対照群よりも高象限の内、特定の区画の中央部に設置した。プラットかった（図 1b）。
2

加齢に伴う学習・記憶機能低下に及ぼすトレハロース摂取の影響

図2

受動的回避学習

縦軸は被検体が暗室へ移動するまでの潜時（秒）を表す。
条件付け 、保持テスト□
図 1a

オープンフィールドの結果（移動）縦軸は 10 分間の測定中に赤外線を横切った回数を表す。

図 3a

水迷路学習、獲得訓練（Days1〜5）

縦軸は被検体がプラットフォームへ到達するまでの逃避潜時（秒）を表す。
●トレハロース投与群、○対照群
図 1b

オープンフィールドの結果（立ち上がり）

縦軸は 10 分間の測定中に立ち上がった回数を表す。

②受動的回避学習
トレハロース投与群において、条件付けの際の暗室へ移動するまでの潜時は対照群のそれよりも短い傾向があったが、電気ショックを与えられた後の保持テストにおいては、トレハロース投与群の暗室へ移動するまでの潜時は対照群のそれよりも長かった（図 2）。
③水迷路学習1 日目から 5 日目までの獲得訓練において、トレハロース投与群の逃避潜時は対照群のそれと比べて短かった（図 3a）。すなわち対照群よりも早い時間でプラット図 3bフォームへ到達した。しかし 6 日目のプローブテストに

水迷路学習、プローブテスト（Day6）

縦軸は被検体がプラットフォーム設置象限（ターゲット象限）およびその他の仮想の 4 分象限それぞれへの滞在時間（秒）を表す。
トレハロース投与群、□対照群

おいては、トレハロース投与群と対照群との間に有意な違いは認められなかった（図 3b）。
3本田陽子2） 遺伝子発現変化：DNA マイクロアレイ解析の結果、また、低下すると種々の動物で寿命延長に関わるといれ

トレハロース長期投与により脳で発現が 2 倍以上増加しているインスリンシグナル経路の関連遺伝子や、炎症にた遺伝子の中に、オートファジー関係 1 遺伝子、FGF 関関わる遺伝子の発現が低下していたことから、トレハ

係 2 遺伝子、FOXO 転写因子 1 遺伝子が、トレハロースロースが老化を抑制する効果をもつ化合物であることが長期投与により脳で発現が 1/2 以下に低下した遺伝子の示唆された。

中にインスリンシグナル関係 3 遺伝子、炎症に関係する
要インターロイキン受容体 1 遺伝子など興味深いものがみられた。

約
加齢に伴って学習や記憶能力が顕著に低下し、脳の萎縮が見られるマウスとして知られる老化促進マウス
考察

SAMP10 を用いて、長期にわたるトレハロースの摂取受動的回避学習の結果から、トレハロース投与は電の、加齢に伴う学習・記憶機能の低下と脳における遺伝気ショックの記憶保持に関しては有効であると考えられ子発現変化への影響を研究したところ、老化を抑制するた。水迷路学習の獲得訓練においても、トレハロースを効果が示唆された。しかしこの系統のマウスにおいては長期間投与された群は、プラットフォームの位置へ比較高度な記憶・学習の試験が困難であることがわかり、さ的速い時間に到達することができた。しかし水迷路学習らに糖輸送に関連した遺伝子の変異が近年報告されたこのプローブテストにおいては、対照群においても記憶学とから、通常の寿命を示すマウスを用いた実験の必要性習の獲得がなされず、トレハロースの効果を検証するこが示唆された。とができなかった。この結果は、本研究で材料とした
謝

SAMP10 マ ウ ス が、 水 迷 路 学 習 で 試 験 さ れ る 高 度 な辞

空間記憶の保持には向いていなかったことを示唆して本研究を行うにあたり、研究助成をして下さった公い る。 近 年、 本 研 究 で 用 い た SAMP10 マ ウ ス の 系 統益財団法人三島海雲記念財団に厚く御礼申し上げます。

（SAMP10/TaSlc）においてグルコース輸送体遺伝子のまた、共同研究者である東京都健康長寿医療センター研ひとつにフレームシフトの変異が発見された。その結果究所の本田修二研究員と、マウスの記憶学習試験でお世腎臓での糖の再吸収率が低下し、尿中に大量のブドウ糖話になった土江伸誉博士に感謝致します。

4）が放出されていることがわかった 。この系統のマウス
文に二糖であるトレハロースを長期間投与することが、どのような生理的影響を与えるかは不明である。

献1） D. E. Harrison, et al.:
, 460, 392–395, 2009.
2） Y. Honda, et al.:
, 9, 558–569, 2010.
3） S. Sarkar, et al.:
, 282, 5641–5652, 2007.
4） K. Unno, et al.:
, 454,89–94, 2014.
5） K. Castillo, et al.:
, 9, 1308–1320, 2012.
6） X. Zhang, et al.:
, 10, 588–602, 2014.
7） C. J. Kenyon:, 464, 504–512, 2010.

トレハロースを長期間投与された SAMP10 マウスの脳における遺伝子発現を解析した結果、オートファジーに関連した遺伝子の発現増加が認められたことは興味深い。トレハロースはハンチントン舞踏病やパーキンソン病の原因となる、異常なタンパク質の除去を行うオートファジーを促進する物質として報告されている 3, 5, 6）。

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