新規ライブイメージング法を用いたメラニン色素輸送の解析

京都大学理学研究科生物科学専攻動物学系

田 所

竜 介

Our skin and hair have various colors, which are established by melanin pigment. Melanin pigmentation in the skin is
physiologically important to protect our body from UV irradiation. Melanocytes are known as melanin-producing cells inwhich melanin is synthesized in melanosomes. In the tanning processes, melanocytes extend numerous dendrites that areattached to surrounding keratinocyes, and subsequently melanin granules are transferred through melanocyte dendrites tokeratinocytes. Although several different models for intercellar melanin-transfer have been proposed by in vitro experiments
1,2,3,4,5,6,7,8
and electron microscopic observations, the mechanisms of melanin-transfer in vivo remain controversial. So far, wedeveloped an imaging technique, and visualized behavior of melanocyte during skin pigmentation in chicken embryo. We
found that melanocytes release vesicles. In this study, first, we statistically showed the difference of vesicle size between
the tissues. Second, to analyze molecular mechanism underlying the difference, we established a gene transfer technique tomanipulate melanocytes and keratinocytes by other genes respectively in vivo.

１．緒言

２．実験のバリエーションをもっている。この体の色を作り出して実験１ 表皮と毛組織において小胞放出機構が異なるのか？

いるのがメラニン色素であり、有害な紫外線から身を守る

前述の通り我々は、色素輸送期の表皮および毛組織におという重要な役割を担っている。この一方で、メラニン色いて、色素細胞が小胞を放出することを見出しつつある。

素はシミやソバカスなど美容上の問題を引き起こす厄介者

小胞の大きさにはバリエーションがあり、１mm 程度の小として嫌遠される。また、白斑などの色素疾患が社会生活型小胞と２−５mm 程度の大型の膜小胞に大別できる。ま上の心の負担を招くなど、メラニン色素は生活の質（QOL）た、小型と大型の膜小胞はそれぞれ含有しているメラニンと密接に関係している。メラニン色素は、表皮や毛組織に顆粒の量が異なる。興味深いことに、大型の膜小胞は色素散在する色素細胞によって合成され、のちに表皮や毛のケ輸送が盛んな毛組織において多く見られるという可能性もラチノサイトに輸送されることで、表皮と毛を着色して紫見出した。これらの結果を受けて我々は「要求される色素外線防御などの生理機能を発揮する。つまり、メラニン色の量に応じて輸送法が使い分けられる」という仮説を立て

素の細胞間輸送を理解することは、色素生物学の本質的なるに至った。本研究では、この仮説を検証するにあたり、課題の一つであり、美容分野および臨床においても極めてのちの遺伝子解析などを見据えて正常表皮および毛組織に重要な課題である。我々は、これまでに自身が確立したトおける膜小胞の大きさを測定して統計的な評価基準の作製

リ胚の表皮および毛の培養法と、色素細胞への蛍光標識法を行った。

ヒトの皮膚や毛髪は、白色から黒褐色といった様々な色を組み合わせることで、メラニン輸送期における色素細胞の振る舞いを観察してきた。また、これらの観察から色素細胞が異なるサイズの小胞を放出する可能性を見出した。
本研究は、この過程を包括的に理解することを目指すものである。

実験２ 輸送法の違いを生み出す分子機構の解明を目指した表皮遺伝子操作法の確立
本研究により膜小胞は大型と小型の２サイズに大別されることを見出した。これまでの細胞生物学的な知見から、膜 小 胞 に は 小 型 小 胞（100 nm 以 下 ）と 大 型 小 胞（0 . 2 〜
1 . 5 mm）が報告されており、これらの生成過程は全く異なることが明らかにされている（参）。つまり、膜小胞のサ
イズは膜小胞を分類する上で最も重要な指標の一つとされLive-imaging technique to visualize
behavior of melanocytes in the skin ofchicken embryo
Ryosuke Tadokoro
Department of Zoology, Graduate Schoolof Science, Kyoto Universityている。我々がみいだした大型の膜小胞（２〜５mm）は細胞生物学的には稀なサイズの膜小胞であり、通常の膜小胞（0 . 2 〜 1 . 5 mm）とは異なる過程を経て形成されることも見出した。本研究において、この膜小胞の生成過程の違いを生み出す分子メカニズムを調べるにあたり、色素細胞およ− 100 −新規ライブイメージング法を用いたメラニン色素輸送の解析び周囲の表皮細胞を遺伝子操作する必要がある。そこで、ける大型膜小胞の存在比率を調べたところ、表皮が８％そ

本研究では生体内において表皮遺伝子操作法を確立するこして毛組織においては 43％であった。この評価基準を設とにした。

定することにより、色素沈着が過剰な系統とそうでない系３．結統間の比較により、例えば色素沈着の過剰な系統（ウコッ果ケイ）において大型膜小胞の存在比率が高くなるなど、色３．１ 表皮と毛組織においてメラニン色素輸送法が異なるのか素輸送法と輸送量の関係を調べることが可能になった。

色素細胞由来の膜小胞を可視化するため、胚発生期において色素細胞の前駆細胞に GFP 遺伝子を導入し色素細胞

３．２ 輸送法の違いを生み出す分子機構の解明を目指した表皮遺伝子操作法の確立の蛍光標識をおこなった。胚発生を進め、色素輸送が活発表皮細胞に遺伝子導入を行うにあたり電気穿孔法、化学になる時期に胚を単離し、表皮組織および毛組織の観察を的手法およびウイルスによる導入を試みた。化学的手法に行った。観察にはニコン社製共焦点レーザー顕微鏡 A 1 R

おいては、およそ６種類の試薬を用いたが表皮における試を用いた。それぞれの組織において、画像解析ソフト

薬の拡散が激しくほとんど遺伝子が導入されず、電気穿孔（NIS-elements および ImageJ）を用いて膜小胞の数と直径法においては遺伝子導入されるものの導入効率が低く、導を測定した結果を図１のグラフにまとめた（図１）。表皮入される部位も限定されることが明らかになった。そこで、組織においては、膜小胞の直径がおよそ１mm 以下（小型ウイルスによる遺伝子導入の条件検討を行った。具体的に膜小胞）のものが多く、それ以上のサイズの膜小胞は全体は、ウイルスに感染しやすいトリ系統を探索するにあたり、の１割にみたない（図１）。これに対して、毛組織内の膜ヒペコ種をはじめとして数種類のトリ系統についてウイル小胞は表皮において見られる膜小胞と同程度のサイズも認ス感染効率を測定した。その結果、白色レグホンにおいてめられるものの、２mm 以上の巨大な膜小胞（大型膜小胞）

写真に示す通り、表皮への遺伝子導入が可能となった。加の存在が顕著である（図１）。これら膜小胞の全体数におえて、表皮細胞のみならず色素細胞にもウイルスが感染することが危惧されたが、幸いなことに本実験においては色素細胞へのウイルス感染はほとんど観察されない。次に、表皮細胞を遺伝子操作した状態で色素細胞から放出される膜小胞を観察するために、表皮細胞へ遺伝子導入した胚の色素細胞に対して、電気穿孔法を用いて遺伝子導入を試みた（図２）。これら両手法を同一個体に施すことで死亡率が上がるが、電気穿孔法に用いる電圧を 6 V 程度に抑えることにより全体の約半数が生き残ることを見出した。以上、本研究により表皮細胞および色素細胞を別々の遺伝子により操作する方法を確立した（図２）。

図１

表皮と毛における小胞の大きさ比較

図２

表皮と色素細胞の遺伝子操作− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

２）Yamamoto O, Bhawan J. Three modes of melanosome

４．考察・総括

transfers in Caucasian facial skin: hypothesis based onan ultrastructural study. Pigment Cell Res., 7 : 158 – 169

メラニン色素輸送の研究はこれまで主に in vitro 共培養や組織の電子顕微鏡観察により解析され、多くの研究者が（1994）

異なる解析系を用いて様々な説を提唱してきた

1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8）３）Virador VM, Muller J, Wu X, Abdel-Malek ZA, Yu ZX,

現在、実際の組織においてどの輸送法が使われているのか

Ferrans VJ, Kobayashi N, Wakamatsu K, Ito S, Hammerという問いが長らく続いているが未だ決定的な結論に到達

JA, Hearing VJ. Influence of alpha-melanocyte

していない。我々の研究結果は、実際の組織内においてメ

stimulating-hormone and ultraviolet radiation on the

ラニン色素が２者択一的な方法ではなく、複数の方法によtransfer of melanosomes to keratinocytes., Faseb J., 16 ;り表皮に輸送されることを示唆する。また組織などシチュ

105 - 107（2002）。

エーションの違いにより輸送方法に違いがあることが想像

４）Scott G, Leopardi S, Printup S, Madden BC. Filopodia

される。この結果を踏まえて、著者は「どの輸送モデルがare conduits for melanosome transfer to keratinocytes.

正しいのか」という排他的な問いでなく、これまで報告さJ. Cell Sci., 115 : 1441 – 1451（2002）

れた複数の色素輸送モデルが生体内のどのようなシチュエ

５）Bhawan J. Ultrastructure of melanocyte–keratinocyteーションにおいて用いられるのかを正しく理解することがinteractions in pigmented basal cell carcinoma. Pigment

重要であると考えるに至った。現在、本研究の趣旨である

Cell Res., 5 : 38 – 47（1979）

色素輸送法がどのように使い分けられるのか、そしてその

６）Garcia RI, Flynn E, Szabo G. Ultrastructure of melanocyte–違いがどのような分子メカニズムにより生じるのかという

keratinocyte interactions. Pigment Cell Res., 4 ; 299 –深淵な疑問に答えることはできない。しかしながら、本研

307（1979）

究はこれまで困難とされてきた“組織内における色素輸送

７）Cerdan D, Redziniak G, Bourgeois CA, Monsigny

を高解像度で可視化する手法”に加えて“個体内においてM, Kieda C. C 32 human melanoma cell endogenous

色素細胞および表皮細胞を別々に遺伝子操作する方法”を

lectins: characterization and implication in vesicle-確立するに至った。これらの手法を用いて、近い将来、色mediated melanin transfer to keratinocytes. Exp Cell.

素輸送の謎を解き明かせると信じてやまない。

Res., 203 ; 164 – 173（1992）８）Aspengren S, Hedberg D, Wallin M. Studies of pigment（参考文献）

transfer between Xenopus laevis melanophores and１）Swift JA. Transfer of melanin granules fromfibroblasts in vitro and in vivo. Pigment Cell Res., 19;136–

melanocytes to the cortical cells of human hair. Nature,145（2006）

203 : 976 – 977（1964）− 102 −