皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発
国立研究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター

武尾真The skin plays essential roles in temperature control, barrier, bacteriostatic action, buffering action, and excretory action.
Three - dimensional (3D) human skin equivalents (HSEs) are widely used for researches in the field of cosmetology andskin care biology as alternative model for animal experiments. However, the conventional HSE has quite simple structure
consists of epithelium and dermis, and can partially mimics the physiological function of natural skin due to the lack of skinappendages such as hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands.
In this study, we aimed to develop a three-dimensional regenerated skin organ system with the same tissue structure andfunction as the natural skin. To this end, 1) we developed a novel HSE that maintains the normal ECM and cellular alignment observed in the natural skin in accordance with tension by reproducing tensional homeostasis. 2) We established a technology to regenerate mature hair follicles in vitro and succeeded in constructing a skin organ system (Bioskin) in vitro byincorporating the mature hair follicles into functional three-dimensional human skin. This Bioskin was able to maintain hairshaft growth, demonstrating usefulness of the Bioskin as an in vitro evaluation model that have similar function as a naturalskin organ system. Our study will provide the basic technology and novel skin model not only for cosmetology but also forclinical field.

1．緒

言

皮膚は表皮層、真皮層、皮下脂肪層の三層から成り、さらに毛包や汗腺、皮脂腺などの皮膚付属器が複雑に三次元配置された「器官系」であり、温度調節機能、バリア機能、静菌・緩衝作用、排泄作用などを有し生体の恒常性の維持において重要な役割を担っている。このため、スキンケアやコスメトロジーにおける研究開発においては、安全性は当然のことながら、機能性の評価が重要となってくる。現
在欧州を中心に研究開発における動物実験の縮小を求める社会的需要が世界的に普及しつつあり、動物実験代替法として三次元培養ヒト皮膚モデルが広く用いられている。しかしながら、従来のヒト皮膚モデルは上皮と真皮という非常に単純な構造であり、正常ヒト皮膚に存在する毛包・皮

図1

皮膚付属器を有する三次元再生皮膚器官系の構築

脂腺・汗腺などの皮膚付属器や皮下組織が存在せず、構造的、機能的に不十分なモデルである（図 1）。一方、より生歯や毛髪、分泌腺が発生し、生体器官と同じように機能す体に近い条件での安全性、有効性の試験のために国外からることを実証した 2 - 5）。また、iPS 細胞から作製した胚様輸入したヒト生体皮膚もしくは死体皮膚が使用されている

体から毛包や皮脂腺を含む皮膚器官系を再生する技術を世が、個体差に起因するロット間差や皮膚の絶対量の不足な界に先駆けて開発した 6）。そこで本研究課題ではこれらのどの問題がある。これまでに本研究グループは、三次元的技術を応用し、人工皮膚に生体外で発生させた毛包や皮脂な細胞操作技術である「器官原基法」を開発し、幅広い器官腺を組み込み、生体の皮膚と同等の構造と選択透過性や径1）再生の研究に道を拓いた 。この再生した器官原基を歯や毛穴透過性などの機能を有する三次元再生皮膚器官系（バ毛髪、分泌腺を失った部位に移植することにより、完全なイオスキン）を構築することを目的とした。本研究の成果としての天然皮膚と同等の構造と機能を持つ次世代三次元人工皮膚モデルは、動物実験代替法としてより生体に近い

Development of regenerative skin organsystem with skin appendages
Makoto Takeo
R I K E N C enter for Biosystems
Dynamics Research

状態での安全性試験を行うことを可能とするだけではなく、これまでの人工皮膚モデルでは不可能であった機能性、有効性の評価も可能とし、コスメトロジーの発展に大きく寄与すると期待できる。

− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

２．方インサートから外し、さらに 3 日間気相培養した。Bell 型法

モデル；コラーゲン溶液に NHDF を混合し固化させた後

2. 1. 実験動物

7 日間浮遊培養し収縮させた。その後上層に NHEK を播

C57BL/6Nマウスは、日本SLC株式会社より購入した。

種し 4 日間浸漬培養後、7 日間気相培養を行った。（図 2）

また、この研究は理化学研究所神戸支部施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。

2. 4. 再構成原基の作製および生体外培養
E 18 胎児皮膚由来上皮細胞および間葉細胞、もしくは、

2. 2. 細胞培養

成体マウスヒゲ由来バルジ領域上皮細胞および初代培養毛

ヒト表皮角化細胞（NHEK ; Kurabo, Osaka, Japan）、ヒ乳頭細胞を用いて「器官原基法」により再構成原基を作製しト皮膚線維芽細胞（NHDF ; Kurabo）は 37 ℃、5 % CO 2 環た。これらをカルチャーインサート上に置き、専用培地に境下でそれぞれの専用培地（Humedia-KG 2 , 10 % FBS, 1 %て培養を行った（図 3）。

Penstrep, 10 ng/mL bFGF 含有 DMEM）を用いて培養を行

２. 5. 組織学的解析

い、皮膚モデルの作製に供した。

作製した人工皮膚を 4 % パラホルムアルデヒド溶液で固2. 3. 人工皮膚モデルの作製

定し、パラフィンまたはティシュー ･ テック O. C. T. コン

THS モデル；コラーゲン溶液（KOKEN, Tokyo, Japan）

パウンド（Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan）に異なる濃度の NHDF をそれぞれ混合し、カルチャーイに包埋した。パラフィン組織切片（10 µm 厚）を作製後、

ン サ ー ト（Corning, NY, USA）に 積 層 し 固 化 さ せ た

HE 染 色 を 行 い、Axio Scan.Z 1（Carl Zeiss, Oberkochen,（Dermal equivalent, DE）。 こ れ を Snapwell イ ン サ ー トGermany）にて撮影した。また、パラフィン組織切片（10µm（Corning）に挟み込み、上層に NHEK を播種した。4 日間厚）または凍結組織切片（10 µm 厚または 50 µm 厚）を作製

浸漬培養後、7 日間気相培養を行った。TRS モデル；THS後、免疫染色を行い、LSM 780 共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）モデルと同様に細胞を播種し、気相培養 4 日目に Snapwellにて撮影した。

図2

皮膚モデル作製方法の概略図

図3

再構成原基作製方法の概略図− 136 −

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発

2. 6. バリア機能測定

様に組織全体が収縮しており、張力均衡は喪失している。

表皮バリア機能は OECD テストガイドラインに従ってそこで、コラーゲンゲル中に線維芽細胞を播種した後、す評価した。各濃度の SDS 溶液を人工皮膚表面に 1 時間塗

ぐに Snapwell インサートに人工真皮を固定することによ布し、24 時間培養後の細胞生存率を MTT アッセイによりり、横方向の牽引力バランスを再現する張力恒常性皮膚モ

評 価 し た。TEER 測 定 は、EndOhm（World Precision

デル（Tensional Homeostasis Skin model ; THS モデル）をInstruments, Sarasota, FL, USA）を用いて行った。TEWL測構築した。この THS モデルは、培養中に容器から切り離定は、VAPO SCAN system（ASAHI BIOMED, Kanagawa,されると天然皮膚同様に収縮する（Tension Release SkinJapan）を用いて行った。

model ; TRS モデル）ことから、張力均衡の再現が示された（図 4 A）。線維芽細胞の三次元的な形態とコラーゲン線

2. 7. 遺伝子発現解析

維を比較すると、天然皮膚や TRS モデルは張力方向に配RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN, Venlo, Netherlands）を用向性をもって引張された形態をとるのに対し、Bell 型モデ

い て 人 工 皮 膚 か ら RNA を 抽 出 し、SuperScript VILO

ルや TRS モデルではその配向性を失っていた（図 4 A）
。さ（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて cDNA をらに、THS モデルでは、表皮細胞層が分化し、気層培養合成した。Real-time PCR は、Applied Biosystems Quant

か ら 7 日 目 に は、 ケ ラ チ ン 5（KRT 5）、 ケ ラ チ ン 10

Studio 12 K Flex（Thermo Fisher Scientific）を用いて行っ（KRT 10）、フィラグリン（FLG）、クローディン 1（CLDN 1）た。などのケラチノサイト分化マーカーの局在が表皮層で観察３．結され、天然皮膚と同様に基底層、有棘層、顆粒層、角質層

果の細胞層に組織化されていることが確認された（図 4 B）。

3. 1. 張力均衡型人工皮膚の構築および構造評価
はじめに、バイオスキンの土台となる機能的人工皮膚の3. 2. 張力均衡型人工皮膚の皮膚機能評価構築を行った。皮膚は圧迫や引張といった外的な力だけで次に、THS モデルと TRS モデル、Bell 型モデルの皮膚なく、組織内部で細胞同士がコラーゲン線維を介して引っ機能を比較評価した。化学物質の安全性評価項目の一つで張り合うことで生じる内的な力も存在し、これらの張力がある SDS 塗布による皮膚一時刺激性評価では表皮バリア均衡した状態にある。この張力の均衡は機械的ストレス信機能については、THS モデルは従来モデルと同レベルの号を介して皮膚器官の恒常性を維持する上で重要な役割を細胞生存率、TEWL 値、TEER 値を示した（図 5 A-D）
。ま

果たしている 。従来の Bell 型モデルは、コラーゲンゲルた、フルオレセインを使用した局所投与試験では、PBS 塗中に線維芽細胞を播種した後に浮遊培養し、線維芽細胞の布群と比較すると SDS 塗布群ではフルオレセインの表皮収縮力による人工真皮の収縮がコラーゲン線維の再編成を層への劇的な拡散が見られた（図 5 E, F）。これらの結果か促すとされてきた。しかし、従来のこの工程は切除皮膚同ら、THS モデルは既存の人工皮膚モデルと同様のバリア

7）

図4

張力均衡型人工皮膚の構造

A. 各人工皮膚モデルの実体像およびHE染色像、Scale bars, 1mm（実体像）or 50 µm（HE染色像）
B. 天然ヒト皮膚およびTHSモデルの免疫染色像、Scale bars, 50 µm− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

剤の塗布によっても確認された（図 6 C）
。以上の結果から、機能試験に使用することができることが示された。
次に真皮機能として、線維症や老化に伴うしわ、たるみの形成に重要な役割を果たす細胞外基質関連タンパク質のTHS モデルは既存の人工皮膚と比較し、より生体に近い機能性を有することが示された 8）。

遺伝子発現と線維形成を評価した。その結果、THS モデ
ルではコラーゲン・エラスチン線維形成機能の向上が確認

3. 3. 毛包の生体外培養方法の構築された（図 6 A）。更に、老化に伴う真皮細胞外基質の減少皮膚器官系の生体外での再構築に向けて、生体外培養にに対して効果的とされるレチノイン酸誘導体（ATRA）をおいて成熟毛包を再生する技術の確立を行った。初めに、各人工皮膚に添加したところ、THS モデルにおいて顕著マウス胎児皮膚由来細胞を用いて「器官原基法」により再生なコラーゲンおよびヒアルロン酸合成遺伝子の発現促進と毛包原基を作製し、生体外で発生させる培養条件の検討をコラーゲン線維の形成促進が確認された（図 6 B）
。この薬行った。その結果、毛包発生時に作用するサイトカインシ物に対する応答性は、内服・血中投与を想定した培地へのグナルの制御下で培養することにより、再生毛包原基の初薬物添加だけでなく、外用剤塗布を想定したローション製

期発生誘導から成長期 VI 期の毛包にまで成熟させること

図5THSモデルの皮膚バリア機能の解析

A-D. SDSを用いた皮膚刺激性試験 A. 実体像およびHE染色像、Scale bars, 1 mm（実体像）or 50 µm（HE染色像）
B. 細胞生存率 C. TEWL分析 D. TEER分析 E. F. フルオレセインを用いた局所投与アッセイ 垂直断面の共焦点画像（E）、
2 . 5 D強度プロット（F）Scale bars, 50 µm− 138 −

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発

図6 THSモデルの真皮機能の解析
A. 真皮ECM関連タンパク質のReal-time PCR解析 B. C. 人工皮膚モデルのATRAに対する反応性試験、IAM ; the intravenous administration model、TAM ; the topical application modelに世界に先駆けて成功した。さらに、これまでに生体外増た。また、胎児性および成体組織幹細胞を用いて生体外で幅に成功している毛包間葉性幹細胞である毛乳頭細胞と毛毛包を発生させることに世界で初めて成功し、この毛包を包上皮性幹細胞を用いて作製した成体マウスヒゲ由来再生人工皮膚へ組み込むことによって長期的な毛幹形成が認め毛包原基の初期発生も同様に誘導可能であり、間葉系幹細られ、バイオスキンの概念が実証された。

胞を毛包周囲に配置することにより、成長期 VI 期まで成近年、化粧品・ヘルスケア業界では科学的根拠に基づく製品開発への期待と関心が高まっている。しかしながら動熟することが明らかとなった。
次に、３. 1 . で作製した機能性三次元人工皮膚に成体マ物実験の規制や動物実験代替法が十分でなく、機能評価可ウス由来成熟再生毛包を組み込んだところ、再生毛の上皮能な人工皮膚の開発に期待が寄せられている。しかし、こ組織と人工皮膚の表皮組織が接続し、毛幹が伸長し、健全れまで組織再生によって構築された皮膚は正常ヒト皮膚にな毛包組織が維持されていたことから、成体由来体性幹細存在する毛包・皮脂腺・汗腺などの皮膚付属器や皮下組織胞を用いた生体外人工皮膚器官系（バイオスキン）構築に向が存在せず、不完全な皮膚構造であり、十分な高度化がなけた概念が実証された。

されていないという現状にある。本研究課題における成果

４．考により、これまで克服できなかった組織からの器官再生、察さらに皮膚付属器である毛包を有する三次元人工皮膚器官

本研究において、三次元人工皮膚に張力を付加すること系の再生が達成可能であることが示された。また、本研究により、天然皮膚に近い組織構造と生体反応を示すことがにおいて得られた既存の人工皮膚に様々な付属器官や細胞明らかとなり、組織および器官の機械的刺激が組織・器官を組み込むための技術と知見は、樹状細胞や活性型肥満細構造と機能発現に重要な役割を果たしていることが示され胞、抗原特異的リンパ球などの組み込みを可能とし、皮膚− 139 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

炎やアクネ菌感染モデル、非アレルギー性皮膚炎モデル、and their niches. Nature Commun. 3, 784（2012）

アレルギー性皮膚炎モデルなど、研究のニーズに応じた

4） Hirayama M, Ogawa M, Oshima M, Sekine Y, Ishida

様々な評価系へとカスタマイズできる可能性を示しており、

K, Yamashita K, Ikeda K, Shimmura S, Kawakita T,

コスメトロジーのみならず医薬品分野を含む多くの研究分

Tsubota K, Tsuji T. Functional lacrimal gland

野の進歩・発展において、多大なる貢献が可能であると期

regeneration by transplantation of a bioengineered待される。今後は、皮膚器官系としての機能評価および生organ germ. Nature Commun. 4, 2497（2013）

体外評価モデルとしての機能評価を行い社会実装を目指す。

5） Ogawa M, Oshima M, Imamura A, Sekine Y, Ishida
K, Yamashita K, Nakajima K, Hirayama M, Tachikawa

謝辞T, Tsuji T. Functional salivary gland regeneration by

本研究を遂行するにあたりご支援を頂きました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に感謝いたします。

transplantation of a bioengineered organ germ. NatureCommun. 4, 2498（2013）
6） Takagi R, Ishimaru J, Sugawara A, Toyoshima K,（引用文献）

Ishida K, Ogawa M, Sakakibara K, Asakawa K,

1） Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y,

Kashiwakura A, Oshima M, Minamide R, Sato A,Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T. The

Yoshitake T, Takeda A, Egusa H, Tsuji T.

development of a bioengineered organ germ method.

Bioengineering a 3D integumentary organ system

Nature Methods 4, 227-230（2007）

from iPS cells using an in vivo transplantation model.

2） Ikeda E, Morita R, Nakao K, Ishida K, Nakamura T,Sci. Adv. 2, e1500887（2016）

Takano-Yamamoto T, Ogawa M, MizunoM, Kasugai S,7） Hsu CK, Lin HH, Harn HIC, Hughes MW, Tang MJ,Tsuji T. Fully functional bioengineered toothYang CC. Mechanical forces in skin disorders. J.

replacement as an organ replacement therapy. Proc.

Dermatol. Sci. 90, 232-240（2018）

Natl. Acad. Sci. USA 106, 13475-80（2009）8）Kimura S, Tsuchiya A, Ogawa M, Ono M, Suda N,3） Toyoshima K, Asakawa K, Ishibashi N, Toki H,Sekimoto K, Takeo M, Tsuji T. Tissue-scale tensional

Ogawa M, Hasegawa T, Irie T, Tachikawa T, Sato A,

homeostasis in skin regulates structure andTakeda A, Tsuji T. Fully functional hair follicle

physiological function. Commun. Biol. 3, 637（2020）

regeneration through the rearrangement of stem cells− 140 −