プレバイオティックオリゴ糖による腸内恒常性維持機構の解明

福

田

真

嗣

独立行政法人理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センター 研究員（現 慶應義塾大学先端生命科学研究所 特任准教授）

緒言

統合することで、腸内環境改善効果が報告されている難消化性多糖摂食時の腸内環境の変動を検出する新規な体

われわれの腸内環境は腸管上皮細胞や粘膜免疫細胞、系的研究手法も構築している。

さらには 1,000 種類・100 兆個以上もの数の腸内共生細以上のことから本研究では、FOS 摂食時のヒト腸内菌で構成されており、これらが複雑に相互作用すること。特に腸内細菌叢は宿環境の変動について、われわれが独自に構築した統合オ

主の健康維持・増進に寄与したり、あるいは逆に腸管関ミクス解析手法を用いることで、プレバイオティックオ

連疾患の発症にも関与することが知られているため、腸リゴ糖摂取による腸内恒常性維持機構について解析を内細菌叢を含む腸内環境全体の代謝動態を理解し、それ行った。

でその恒常性を維持している

1, 2）らを制御することは、われわれの Quality of Life を向実験方法

上させるという意味でも重要である。腸内細菌叢の制御

1. フラクトオリゴ糖摂食試験

方法の一つとして、ビフィズス菌などのいわゆる善玉菌の増殖促進効果を有し、腸内環境の改善効果をもたら20 代から 30 代の健康なボランティア 7 名（男性 4 名、

すプレバイオティクスの一種であるフラクトオリゴ糖

女性 3 名）に腸内細菌叢が大きく変動すると考えられ（FOS）摂食があげられる。動物試験では FOS を摂食す

る酒、薬、発酵食品などの摂取を試験期間の 1 週間前

ると腸管免疫系が賦活化され、アレルギー抑制効果や病から禁止し、10 g の FOS を 1 日 2 回、1 週間摂食して原菌の感染防御に重要な免疫グロブリン（Ig）の一種でもらった。FOS は株式会社明治のメイオリゴ W を使用

ある IgA の産生が誘導されることが報告されているした。FOS 摂食前中後の各期間で 2 回以上糞便を採取

。

3-5）

し、-80℃で保存した。

しかしながら、FOS 摂食による腸内細菌叢の変動に伴う宿主免疫応答の詳細な分子メカニズムについては不明な点が多い。われわれはこれまでに、宿主－腸内細菌叢

2. IgA量測定

間相互作用の詳細を解析するための基盤技術として、腸糞便試料は凍結乾燥し、ジルコニアビーズを用いて物

内フローラの代謝動態をリアルタイムにモニタリングす

理的に破砕を行った。糞便サンプル 10mg をタンパクる手法を世界に先駆け構築し 、その技術を基盤とした

質分解酵素阻害剤を含む PBS で希釈し、ELISA キット

統合オミクス解析手法を用いることで、病原菌－プロバ（Bethyl）を用いて IgA 量を測定した。

6）

イオティクス間相互作用の一端を明らかにしてきた 7）。
3. 腸内細菌叢解析

また腸管免疫応答に重要であるパイエル板上皮層に点在する M 細胞からの細菌認識受容体を世界に先駆けて明破砕した糞便サンプル 10 mg から常法に従って DNA

らかにした 。加えて、環境中に微生物が存在しない無を抽出し、DNA 100 ng を鋳型として GC クランプ付

菌環境下で飼育されたマウス（無菌マウス）に限られた

954f プライマーおよび 1369r プライマーを用いて PCR

菌のみを定着させたノトバイオートマウスモデル実験系

反応を行った。その後、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動を用いて、宿主－腸内フローラ間相互作用を解析するこ（DGGE）を行い、腸内細菌叢プロファイルの解析を行っとで、腸内細菌が産生する代謝産物が宿主免疫系へ大きた 10）。

8）

く影響していることを明らかにした 9）。統合オミクス解
析手法により得られる多量の情報を統計学的手法により
1

福

田

真

4. 代謝物解析

嗣

菌叢構成のプロファイルが大きく異なることが示され、

凍 結 乾 燥 し た 糞 便 10 mg に 90% 重 水 と 1mM 3-

個人間の違いが大きいため FOS の摂食による変動を評（トリメチルシリル）-1-プロパンスルホン酸ナトリウ

価することができなかった（図 2A および B）。そこで次ム（DSS） を 含 む 600 μl リ ン 酸 バ ッ フ ァ ー（0.1Mに、各個人内での FOS 摂食による腸内細菌叢の変動を

K2HPO4/KH2PO4、（pH7.0）） を 添 加 し、65˚C、5 分調べるために、個人ごとの腸内細菌叢の構成の変化を主

で 低 分 子 化 合 物 を 抽 出 し た。 遠 沈 後 5 mm φ NMR

成分分析によって解析した。菌叢解析の結果から、各々

管 に 上 清 を う つ し、DRU-700 NMR（Bruker） を 用の検体で FOS 摂食時における共通した変動は見られな

い て、 H-NMR 測 定 を 行 っ た。NMR ス ペ ク ト ル は、かった（図 2C）。

1

NMRPipe ソフトウェアを使用して処理した。 H-NMR
1

3. 代謝物解析の化学シフトデータは、0.06 ppm から 9.98 ppm の間

FOS 摂食による代謝物の変動を評価するために、糞を 0.04 ppm で分割し、化学シフトとシグナルの強度を数値化した便から抽出した代謝産物を NMR 法によって測定した。

。

6, 7）

1

5. 多変量解析

H NMR のシグナルを 0.04 ppm 毎に区切り、面積強度

として数値化を行った。得られた代謝物の数値プロファ

FOS 摂食による腸内環境変動を評価するため、腸内イルを主成分分析によって解析した結果、腸内細菌叢の細菌叢情報および代謝物情報をそれぞれ正規化し、R ソ

場合と同様に個人による違いが大きく反映され、FOS

フトウェアを用いて主成分分析を行った。さらに解析結

摂食前、FOS 摂食中、および FOS 摂食後の各期間での果に基づく寄与率および因子負荷率も算出した。
加えて、違いは見られなかった（図 3A および B）。これらの個FOS 摂食による菌叢および代謝物の変動情報の詳細に

人差に強く寄与しているのは 1.9 ppm や 2.4 ppm にピーついて言及するため、両者間の相関係数をスピアマンのクをもつ代謝物であることが示唆された。個人内での代順位相関係数を用いて算出し、相関係数のパターンに基

謝物プロファイルの変動を調べるために個々について主

づいて最小分散法を用いてクラスタリングを行った

成分分析を行ったが、FOS の摂食による共通した変動。

10）は見られなかった（図 3C）。
結果

4. 相関解析による共変動因子の探索

1. 糞便中IgA量の変動
糞便中 IgA 量は ELISA 法によって測定した。7 名分

FOS 摂食による代謝物と腸内細菌との関係性を明らかの IgA 量を測定した結果、FOS 摂食前、FOS 摂食中、にするために、腸内細菌叢－代謝物間の相関解析を行っ

および FOS 摂食後の各期間の平均 IgA 量を比較してもた。個人ごとに腸内細菌叢－代謝物間の相関係数を算出

有意な差は得られなかった（図 1A）。個人別に糞便中し、相関情報に基づいて階層クラスタリングを行った（図IgA 量を FOS 摂食前、FOS 摂食中、および FOS 摂食

4）。FOS 摂食により IgA 量が増加していた ID4 と ID5

後の期間ごとに平均した結果を図 1B に、またサンプル

由来の複数のバンドより構成されるクラスターが存在し毎の IgA 量を図 1 Ｃに示す。IgA 量の変動は個体によったことから、これらのバンドのシークエンス解析を行って大きく異なり、ID4 および ID5 は FOS 摂食に伴いたところ、Bifidobacterium sp. や Ruminococcus sp. な

IgA 量が増加傾向にあったが、それら以外の検体ではどに近縁な菌であることが明らかとなった（図 5）。また、

FOS の摂食による IgA 量の大きな変動は見られなかっ

IgA 量が増加した ID4 と ID5 のみに存在する腸内細菌でた（図 1B および C）。

構成されるクラスターには、両者に共通する代謝物由来のシグナルが存在することが明らかとなった（表 1）。

2. 腸内細菌叢解析

次に FOS 摂食により IgA の変動に伴って増減する代

FOS を摂食した際の腸内細菌叢の変動を DGGE 法を

謝物を同定するために、代謝物－ IgA 間の相関解析を用いて評価した。ゲルのバンドパターンはマーカーに対行ったところ、FOS 摂食により IgA 量が増加した個人

するバンドの相対位置と強度で数値化を行い、それぞれとそうでない個人がクラスタリングされ（図 6）、IgA 量を比較するために多変量解析手法のひとつである主成分が増加した ID4 および ID5 で共通する正または負の相分析を用いて解析を行った。その結果、個人間の腸内細関をする代謝物由来のシグナルが示された（表 2）。
2

プレバイオティックオリゴ糖による腸内恒常性維持機構の解明

B

6

3
2
1
0

Beforeintake

C

FOS

4
3
2
1
ID1

12

5
0

Days

Days

ID5

ID6

10

6

4

2
0

ID5

0

Days

ID7

ID4
10

5
0

ID7
10

5

ID6

5
0

Days

µg/mg dry fecesµg/mg dry feces

10

8

ID4

10

µg/mg dry feces

0

ID3

ID3

10

5

ID2

ID2
µg/mg dry fecesµg/mg dry feces

10

5

0

After
intakeID1µg/mg dry feces7µg/mg dry fecesµg/mg dry feces4µg/mg dry feces

A

Days

Days

Before intake
FOS

5

After intake

0Days

図 1 FOS 摂食に伴う IgA 量の変動
A： FOS 摂食に伴う 7 人分の平均 IgA 量の変動
B： 各個人の FOS 摂食に伴う平均 IgA 量の変動
C： 各個人の FOS 摂食に伴う IgA 量の変動
FOS 摂食前、中、後をそれぞれ白、黒、灰色で示す。

さらに IgA- 代謝物間相関解析、腸内細菌叢－代謝物

FOS 摂食に伴う糞便中 IgA 量の変動について調べたが、間相関解析の二つの結果から、両者で共通する代謝物由

糞便中 IgA 量が増加した検体は 7 名のうちの 2 名であっ来のシグナルが存在することが明らかになった（表 3）。

た。また、腸内細菌叢の解析結果から腸内細菌叢は個人

このことから、FOS 摂食に伴う ID4、ID5 の菌叢中の間で大きく異なり、それは FOS 摂食による変動よりも

Bifidobacterium sp.、Ruminococcus sp. などに近縁な大きいことが明らかとなった。各検体の FOS 摂食に伴菌による代謝物の変動が、IgA 量の増加に関与する可能う代謝物の変動についても同様に、個人間での代謝物の性が示唆された。

違いが大きく、主成分分析のみでは FOS 摂食による個人内の変動について言及することができなかった。そこ

考察で、個人内での詳細な変動情報を抽出するために、腸内細菌叢解析情報と代謝物解析情報、および IgA 量情報

近年、性別や年齢、BMI（Body Mass Index）値もしの 3 者間における相関解析を行った。

くは日々の食事の傾向などにより、代謝産物プロファイ

FOS 摂食により IgA 量が増加した検体では、IgA 量ルを始めとする種々の生体恒常性プロファイルに個人間の違いがあることが報告されているの変動と相関する代謝物や腸内細菌が存在することが明。本試験でも11, 12）

3

福

B
ID2

50000

ID3

0

ID4

‒50000ID5
ID6‒100000‒100000050000

PC1（25.6%）
ID1

PC2（22.7%）

1500
1000

500

0

‒500

0

PC1（36.2%）
ID4

1000
500
0
‒500
‒1000
‒1000

0

PC1（34.2%）

1000‒100000

500

0

‒500

0

PC1（51.1%）

2000

ID5

1000
500
0
‒500

0

PC1（40.2%）

1000‒500000PC1（25.6%）

1500
1000
500
0
‒500
‒1000
‒1500
‒2000

500

50000

100000

ID3

0

2000

PC1（49.0%）

4000

ID6

0
‒500
‒1000
‒1000

0

PC1（31.2%）

1000

ID7

1500
1000

Before intake

500

FOS

0
‒500
‒1000
‒1000

1000

‒1000
‒1000

After intake‒50000

ID2

1500

‒1000
‒2000

2000

FOS

0

‒150000‒150000

100000PC2（25.0%）

PC2（25.0%）‒50000

Before intake

50000‒100000

ID7

C

‒1000
‒2000

100000PC2（21.8%）‒150000‒150000

PC2（28.7%）150000ID1

100000嗣

PC2（18.9%）

PC2（19.7%）150000PC2（30.6%）

真PC2（19.7%）A田

After intake
01000

PC1（41.1%）

2000

図 2 FOS 摂食による腸内細菌叢変動
A, B, C：腸内細菌叢情報の主成分分析結果
A, B は 7 人分のデータ。A では個人ごとに色分けし、B では FOS 摂食期間で色分けした。C は個人ごとのデータ。

らかとなった。このうち、IgA 量の変動と正の相関や負の 一 種 で あ る Bifidobacterium longum が 産 生 し た アの相関をする代謝物の存在が明らかとなった。今後はこスパラギン酸やセリンを大腸菌が二次的に代謝するこれらの物質同定を行う予定である。

とで、別の代謝物を産生することも報告されているこ

IgA 量が増加した検体では、上述した代謝物と相関しと か ら 7）、FOS の 摂 食 に よ り 初 め に Bifidobacteriumて Bifidobacterium sp. や Ruminococcus sp. の 増 加 が

sp. が FOS を利用してある種の代謝物を産生し、次に見られた。ビフィズス菌は腸内において積極的に FOS

Ruminococcus sp. などがさらに代謝することで、粘膜を利用することが知られておりからの IgA 分泌を促すような因子を産生した可能性が、またビフィズス菌

13）

4

プレバイオティックオリゴ糖による腸内恒常性維持機構の解明

B

200

ID3

50

ID4

0

ID5

‒50

ID6

‒150
‒400

‒200

0

200

PC1（39.3%）

C

10

0

‒10

0

PC1（44.3%）

50

ID4

4

2
0

‒2

‒4

20

PC2（6.0%）

PC2（20.7%）20

PC2（30.2%）

PC2（17.0%）

PC2（18.5%）

ID1

0

10

PC1（62.0%）

20

0.02
0.01
0
‒0.01
‒0.02
‒0.03
‒0.04
‒0.05
‒0.05

Before intake

50

FOS

0

After intake

‒50
‒100

ID7

‒150
‒400

‒200

ID2

‒20

0

20

PC1（51.6%）

40

ID5

0

PC1（47.8%）0200

PC1（39.3%）

0.05

3
2
1
0
‒1
‒2
‒3
‒4

ID3

‒5

20
15
10
5
0
‒5
‒10
‒15
‒40

0

PC1（34.1%）

5

ID6

‒20

0

PC1（54.2%）

20

ID7

10

Before intake

0

FOS

‒10

After intake

‒20
‒30
‒50

20
15
10
5
0
‒5
‒10
‒15
‒40

100

PC2（28.1%）

‒100

‒6
‒10

150

ID2

100

PC2（18.3%）

PC2（16.1%）

150

‒20
‒50

200

ID1

PC2（16.1%）

A0

PC1（62.2%）50

図 3 FOS 摂食による代謝物変動
A, B, C：糞便中代謝物の主成分分析結果
A, B は 7 人分のデータ。A では個人ごとに色分けし、B では FOS 摂食期間で色分けした。C は個人ごとのデータ。

示唆された。このような、いわゆる栄養共生（cross-り 14）、本研究においても IgA 量が増加していた ID4 とfeeding）が FOS 摂食により生じている可能性も示唆さ

ID5 由来の異なる腸内細菌が共通の代謝物と相関を示しれた。

たことと関連が見られた。したがって、FOS 摂食によ本研究では IgA －代謝物間、腸内細菌－代謝物間のる糞便中 IgA 量増加のメカニズムは、腸内細菌叢−代謝相関解析から、両者で共通する代謝物が存在することが物−宿主相互作用を介した効果であると考えられる。

明らかとなった。近年、各個人で異なる菌群が類似の役割を担い、同様の代謝応答をするといった報告があ
5

福

田

真

嗣

Correlation Coefﬁcient
0

1

0

1

H chemical shift10（ppm）‒1

DGGE based bacterial band
図 4 FOS 摂食による腸内細菌叢変動および代謝物変動の相関
縦軸は代謝物のケミカルシフト、横軸は腸内細菌叢情報を表す。
赤は正の相関、青は負の相関を示す。
相関係数に基づいて腸内細菌叢情報の階層クラスタリング解析を行った。

6

プレバイオティックオリゴ糖による腸内恒常性維持機構の解明

図 5 IgA 量の増加と正の相関を示した腸内細菌の 16S rRNA をコードする DNA に基づく系統樹
赤文字が FOS 摂食により IgA 量が増加した ID4 および ID5 由来の腸内細菌。
ID4 では 3 種類、ID5 では 4 種類の異なる 16S rRNA をコードする DNA 配列が得られた。

表 1 ID4 および ID5 の腸内細菌叢 - 代謝物相関解析において相関のあった代謝物由来の 1H-NMR シグナル
正の相関を示した
代謝物のケミカルシフト(ppm)

負の相関を示した
代謝物のケミカルシフト
(ppm)

7.42

7.26

7.18

7.10

6.90

6.82

3.30

4.34

3.26

1.42

3.02

1.18

2.14

1.14

1.74

0.90

1.70

0.86

7

福

田

真

嗣

表 2 IgA- 代謝物相関解析において相関のあった代謝物由来の 1H-NMR シグナル

Correlation Coefﬁcient0

正の相関を示した
代謝物のケミカルシフト
(ppm)

1

10（ppm）‒1

負の相関を示した
代謝物のケミカルシフト
(ppm)

7.42

7.26

6.90

7.14

3.98

7.10

3.62

6.82

3.30

1.42

2.14

1.38

2.02

1.10

1.70

0.90

1.02

0.86

0.98

0.82

H chemical shift

0.78

正の相関を示した
代謝物のケミカルシフト(ppm)

負の相関を示した
代謝物のケミカルシフト
(ppm)

7.42

7.26

6.90

7.10

ID3

ID2

ID1

ID6

ID7

0

1

表 3 ID4 および ID5 において共通して相関のあった代謝物由来の 1H-NMR シグナル

図 6 FOS 摂食による IgA 変動および代謝物変動の相関

3.30

6.82

2.14

1.42

1.70

0.90
0.86

縦軸は代謝物情報、横軸は個体 ID 番号。
赤は正の相関、青は負の相関を示す。
相関係数に基づいて各個体の階層クラスタリング解析を行った。

本研究結果から、特にヒトの腸内環境のように個人差の方が大きかった。個人内の腸内環境の変動を見出すたが大きい場合の解析を行うには、異なる個人間での比較

めに腸管内代謝物変動と腸内フローラ変動の相関解析を解析を行うのではなく、同一個人内での小さな変動も抽行ったところ、短鎖脂肪酸を含むいくつかの代謝物の変出できるような相関解析手法を用いることが有用である動は、腸内細菌叢の変動と相関しており、それらの菌群

ことが示された。したがって本解析手法は、プロバイオ

は個人ごとに異なった。以上のことから、FOS 摂食にティクスやプレバイオティクスの評価を行うだけでな

よるヒト腸内環境の改善効果の一端は、腸内フローラ－

く、ヒトの腸管関連疾患のような腸内環境の変動を伴っ代謝物－宿主を介した効果であると考えられたが、腸内た病態の分子メカニズムの解明や、バイオマーカーの探

環境の変動は各個人で異なる菌群が類似の代謝応答をし索等にも応用することも可能ではないかと考えている。

ている可能性が示唆された。

要

謝

約

辞

腸内細菌叢の組成は個人ごとに大きな違いがあり、本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記

FOS 摂食による個人内での変動よりも個人間での違い

念財団より学術研究奨励金を賜りましたことを深く感謝の方が大きかった。腸管内代謝物に関しても個人ごとに申し上げます。

違いはあったが、個人内での変動よりも個人間での違い
8プレバイオティックオリゴ糖による腸内恒常性維持機構の解明

文

献

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