新たな皮膚タイトジャンクションバリア・角質層バリア機能評価方法の開発

慶應義塾大学医学部皮膚科学教室・総合医科学研究センター

久 保亮 治Skin is the structure that covers our body and protects it from not only the entry of pathogens or allergens but also
from the leakage of water, solutes or nutrients. These outside-in and inside-out skin barrier functions are dependent on theepidermis, a stratified epithelial cellular sheet. Terminally differentiated cornified cellular sheets called stratum corneum (SC)constitute the outermost epidermal barrier in mammals. Beneath the SC, apical paracellular spaces of epidermal cells aresealed with tight junctions (TJs) that might limit paracellular leakage of water and electrolytes to maintain fluid homeostasis.
Here we analyzed the barrier functions of the SC and TJs.

緒によって構成されるバリア構造である。全身を覆う角質層

言を持つのは、両生類の成体・爬虫類・鳥類・哺乳類であり、
1）

皮膚は、我々の身体の外表を覆う構造物である。その最すなわち陸上の空気環境に生きる脊椎動物である 。角質も重要な機能が、外界と生体の境界をなすバリアとしてのバリアは空気環境と液性環境の間を隔てるバリアであり、機能である。外界からの刺激・侵略に対するバリアとして、内側の細胞を乾燥や外力による障害から守っている。

物理的な外的刺激によるダメージを防ぎ、紫外線によるダ角質層の内側の顆粒層は、非常に扁平化したケラチノサ

メージを防ぎ、病原微生物の繁殖・侵入を防ぎ、アレルゲイトが複数積み重なってできた層である。顆粒層の細胞をンの侵入を防ぐ。侵入者に対しては、自然免疫のシステム

表面から順に SG 1 , SG 2 , SG 3 細胞とそれぞれ名付けると、により対抗するとともに、抗原提示細胞が侵入者を捕捉しSG 2 細胞の細胞間にのみタイトジャンクションが存在してて獲得免疫のシステムに抗原提示を行う。また１つは、身細胞間を通る物質移動を制限するバリアを形成しており、体内部のホメオスターシスを保つためのバリアでもある。

表皮の細胞外液性環境をタイトジャンクションバリアの外水・イオン・蛋白の漏出を防ぎ、熱を保持するかまたは余側（角質層とタイトジャンクションバリアに挟まれた SG 1分な熱を放出し、体内のホメオスターシスを保つ。皮膚の細胞を取り囲む細胞外液性環境）と内側（SG 2 細胞以下の構造を詳細に調べていくことで、これらのバリア機能を実顆粒層、有棘層、基底層の細胞を取り囲む細胞外環境）の現するために進化してきたメカニズムが徐々に明らかとな２つのコンパートメントに分割しているってきている。の有棘層は、デスモソームの発達したケラチノサイトが重2−4）。顆粒層の下陸生脊椎動物において、皮膚の基本構造はほぼ共通して層する層であり、ランゲルハンス細胞と呼ばれる表皮内樹いる。皮膚はまず、表皮・真皮・皮下組織の３つに大きく状細胞がこの有棘層に散在している。最後の基底層は、基分けられる（図１）。皮下組織は脂肪織によるクッション底膜直上に存在する一層の細胞層であり、哺乳類の表皮にの役割と熱保持、栄養保持に関わる。真皮は頑丈なコラーおいては唯一細胞分裂が観察される層である。基底膜からゲンからなる層で、物理的な刺激から身体を守るとともに、外れた細胞は、細胞分裂を停止して分化を続け、有棘層、その内部には毛嚢・脂腺・汗腺・血管・リンパ管など様々顆粒層を経て、最終的に角質細胞へと分化する（図１）。

な構造を含有している。また、真皮樹状細胞と呼ばれる抗以上のように、我々の皮膚には、角質層とタイトジャンク原取得細胞が真皮には存在している。最外層の表皮はケラションという２つのバリアが存在している。

チノサイト（表皮細胞）により構成される重層上皮組織で表皮タイトジャンクションバリアの存在は長年にわたっあり、表面から順に、角質層・顆粒層・有棘層・基底層にて見逃されてきた。申請者は哺乳類表皮タイトジャンクシ分けられている。最も表面の角質層は、角化脱核した角質ョンバリアを世界で初めて３次元可視化することに成功し、細胞（corneocyte）とその細胞間を埋める角質細胞間脂質

表皮内抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞が表皮タイ
トジャンクションバリアを保ったままタイトジャンクショ

Development of new methods to analyze
stratum corneum barrier and tightjunction barrier in the epidermis
Akiharu Kubo
D epa r t ment of D er mat olog y, Keio
University School of Medicine Centerfor Integrated Medical Research, Keio
University School of Medicine3）

ンバリア外の抗原を取得する機能を持つことを発見した 。
すなわち、角層層という静的な構造物によるバリアが破れても、タイトジャンクションという動的なバリアにより外来物質の侵入を防ぎ、同時にランゲルハンス細胞が外来物質を能動的に取り込み免疫系に提示していると考えられる（図１）。しかし、表皮タイトジャンクションバリア機能の− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

図１

皮膚表皮が持つバリア機構

詳細は、未だ不明な点が数多く残されている。本研究は、

ると、切片作成・染色・切片封入の各段階において、そのこれまで曖昧に「皮膚のバリア」として捉えられてきた外物質は洗い流されて大部分は消失し、残ったものも拡散に来物質侵入阻止機構を、角質層とタイトジャンクションとよって大きくその存在位置を変えていると考えられる。しいう２つのバリアとランゲルハンス細胞によって構成されかし、従来の研究では、この問題はほとんど無視されておるシステムとして捉えなおし、新しい表皮タイトジャンク

り、おそらくは残存しているごく一部の分子の局在を持っションバリアの透過性評価方法、および角質層バリアの評て、角質への透過性を評価しているものと考えられた。

価方法を開発することで、２つのバリアの性質の違いを明

今回われわれは、この問題を解決するために、皮膚切片らかにし、皮膚バリア機構への理解を深めることを目的と作成に川本法を導入した。本方法は鶴見大学歯学部 RI 研した。

究センターの川本忠文博士が開発した、切片支持用粘着フ実ィルムを用いた切片作成方法で、水溶性物質の組織内分布験5）を保持したまま切片を作成することができる方法である 。
カルセイン（B i s [ N, Nbis（carboxymethyl）aminomethyl ]１．角質バリアの評価
角質への物質浸透を正確に可視化する方法の開発をおこ

fluorescein ; Sigma-Aldrich）飽和水溶液、またはリポソーない、同方法を用いて、野生型マウス皮膚とフィラグリンム（Presome CSII- 101（Nippon Fine Chemical, Osaka,欠損マウス皮膚において、角質への物質透過性に変化がな

Japan））に封入したカルセイン溶液を、６−８週の野生型いかを調べた。

マウスおよびフィラグリン欠損マウスの尻尾皮膚に３時間

角質への物質浸透性を切片上で可視化する時に最も問題塗布した後、尻尾を切りだして凍結し、専用の凍結包埋剤となるのは、透過性評価に用いた物質が拡散により本来存（SCEM）を用いて包埋、凍結した。切片支持用粘着フィ在する場所から移動してしまうことである。蛋白質と反応

ルム（Cryofilm type 2 C（9））を用いてクライオスタットにして共有結合を生じるような物質を透過性評価に用いる場て切片を作成してそのままフリーズドライした後、紫外線合は問題ないが、通常の水溶性物質を透過性評価に用いた照射により急速に硬化する切片封入剤（SCMM-R 1）を用場合、たとえ皮膚をホルマリン固定したとしても、アルデいてスライドガラス / フィルム間に切片を封入し、蛍光顕ヒド結合を生じる残基が物質中に含まれていなければ、そ微鏡により浸透度を観察した。の物質は皮膚中にフリーの状態で存在することとなる。す− 62 −

新たな皮膚タイトジャンクションバリア・角質層バリア機能評価方法の開発

図２ 野生型マウス（+/+）とフィラグリンノックアウトマウス（-/-）における角質透過性試験。
（A）カルセイン水溶液塗布後３時間の角質浸透度。（C）リポソーム封入カルセイン溶液塗布後３時間の角質浸透度。
（B, D）各顕微
鏡視野において、角質の 50％以上の深さまでトレーサーが浸透している部分の、角質全体に占める割合。
（Kawasakiet al., JACI 2012 7）より引用）

２．タイトジャンクションバリアの評価

２．タイトジャンクションバリア

In vivo における皮膚タイトジャンクションバリアの透ケラチノサイトの表面抗原の１つであるデスモグレイン過性を評価する方法としては、ランタン（分子量 138 Da）１に対する single-chain variable fragment（scFv）をトレの細胞間への浸透を電子顕微鏡により観察する方法と、蛋ーサーとして用いた。本 scFv はヒトデスモグレイン１の細白 質 ビ オ チ ン 化 試 薬（sulfo-NHS-LC-biotin（ 分 子 量 556

胞外ドメインと特異的に結合することが確認されている 。

Da））の浸透性を蛍光抗体染色法にて観察する方法の２つ

まず、ヒト皮膚切片を用いて scFv を一次抗体として用いがあった。今回我々は、ケラチノサイトの表面抗原の１つた免疫染色を行ったところ、デスモグレイン１の発現はタで あ る デ ス モ グ レ イ ン １ に 対 す る single-chain variableイトジャンクションバリアの内側の細胞にも、外側の細胞

fragment（scFv：分子量約 32 kDa） をトレーサーとし（顆粒層の最上層の細胞）にも認められた。次に scFv をヒて用いて、タイトジャンクションバリア機能を評価した。

ト皮膚サンプルに ex vivo で皮下注したのち組織培養し、

6）

結

6）

scFv の拡散を観察した。24 時間後までの観察において、

果

scFv のシグナルは、ヒト皮膚のタイトジャンクションバ

１．角質バリア

リアの内側のケラチノサイト表面からは検出されたが、タ川本法にて作成した皮膚切片上では、従来の方法で作成イトジャンクションバリアの外側のケラチノサイト表面かした皮膚切片に比べて、カルセインの蛍光が著明に強かっらは検出されなかった。すなわち、scFv は表皮タイトジた。これは、サンプル作成中に拡散によってカルセインがャンクションバリアを通過できないと考えられた。

洗い流されることがなかったためと考えられた。カルセイ考

ン水溶液を用いた透過性試験では、野生型マウス、フィラグリン欠損マウスともに、角質の上層でカルセインの浸透察１．角質バリアは止まっており、２つのマウス間で明らかな差は認められ角質への物質浸透を正確に可視化する方法の開発をおこなかった（図２ A, B）。一方、リポソームに封入したカルない、同方法を用いて、野生型マウス皮膚とフィラグリン

セインを用いた透過性試験では、野生型マウスではカルセ欠損マウス皮膚において、角質への物質透過性に変化がな

イン水溶液と同様に角層の上層で浸透が堰き止められていいかを調べた。川本法を用いた切片作成により、従来の方たのに対し、フィラグリン欠損マウスでは角質の下層まで法よりも正確に、水溶性物質の角質への浸透を可視化する浸透している像が認められた（図２ C, D）。これは、脂溶ことが可能となった。また、本方法を用いることで、フィ性物質に対する角層のバリア機能が、フィラグリン欠損マラグリン欠損マウスの角質バリア機能が低下していることウス皮膚において減弱していることを示唆している 。

を示すことができた。サンプル作成中の物質移動を最小限

7）− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013に留めることができる本方法を用いることで、水溶性物質

２）Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratakeの角質透過性試験を正確に行うことが可能になると考えら

A, Sugitani Y, Noda T, Kubo A, Tsukita S: J Cell Biolれた。

156 , 1099 - 1111 , 2002
３）Kubo A, Nagao K, Yokouchi M, Sasaki H, Amagai M:

２．タイトジャンクションバリアJ Exp Med 206 , 2937 - 2946 , 2009

これまで、in vivo でのタイトジャンクションの透過性４）Kubo A, Nagao K, Amagai M: J Clin Invest 122 , 440 447 , 2012

評価方法は、分子量 500 程度の小さな分子に対する閉鎖結合能の測定によっていた。本手法を用いることで、表皮タ５）Kawamoto T: Arch Histol Cytol 66 , 123 - 143 , 2003

イトジャンクションバリアの、低分子に対するバリア機能６）Ishii K, Lin C, Siegel DL, Stanley JR: J Invest
Dermatol 128 , 939 - 948 , 2008と高分子に対するバリア機能を別々に、in vivo において

７）Kawasaki H, Nagao K, Kubo A, Hata T, Shimizu測定することが可能になると考えられた。

A, Mizuno H, Yamada T, Amagai M: J Allergy Clin
（引用文献）

Immunol 129 , 1538 - 1546 .e 1536 , 2012１）Schempp C, Emde M, Wölfle U: J Dtsch Dermatol８）Yoshida K, Yokouchi M, Nagao K, Ishii K, Amagai
M, Kubo A : J Dermatol Sci, in press

Ges 7 , 750 - 757 , 2009

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