皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

東北大学大学院

中

畑

則

薬学研究科

道、大 久 保聡子

It is well known that ceramide forms corneocyte lipid-bound envelop in skin to protect from external stimuli. In order toclarify the other physiological role of ceramide, neurotrophic factor biosynthesis and secretion from Swiss 3T3 fibroblasts
were examined. C-2 ceramide and C-6 ceramide potently augmented the secretion of neurotrophic factors from 3T3 cells,
determined by the differentiation of PC-12 cells when they were cultured under the conditioned medium of 3T3 cells withthe ceramides. Sphingomyelinase and phosphatidylcholine-specific phospholipase C, which produce endogenous ceramides,
also elicited the secretion of neurotrophic factors from 3T3 cells. Stimulation of cannabinoid receptors is known to produce
ceramide through an activation of sphingomyelinase. 3T3 cells express CB1 and CB2 receptors, and the stimulation of
the receptors in the cells by 2-arachidonylglycerol resulted in the secretion of neurotrophic factors. Sphingomyelinase andphosphatidylcholine-specific phospholipase C stimulated the NGF and IL-6 mRNA expressions, which were inhibited by
GF109203X, a protein kinase C inhibitor. In addition, C2-ceramide activated the phosphorylation of MAPK/ERK, p38 MAPK
and JNK. These results suggest that ceramide may have neurogenerative and/or neuroprotective activity in peripheral
tissues including skin by a mediation of the secretion of neurotrophic factors. Therefore, the drugs, which activate ceramide
biosynthesis, inhibit cramide degradation, or activate ceramide-mediated cellular signaling pathway, may be useful forneurotrophic factor secretion. The neurotrophic factor secretion would contribute to the protection of skin from external
stimuli by forming the functional systems of the tissues.

１．緒

神経機能の維持も重要な問題となる。そこで本研究では、

言

セラミドの細胞機能に対する作用、とくに神経細胞の機能

セラミドはスフィンゴミエリンからスフィンゴミエリナ

維持に焦点をあて、神経細胞の再生や機能維持を司る神経ーゼによって生合成される脂質成分であり、皮膚を構成す

栄養因子の生合成よび分泌作用について検討を加えるととる細胞間脂質の中で最も多く存在することが知られている

もに、その生理機構発現のメカニズムの解明を目的とした。

１）。皮膚は生体を構成する臓器の中で最も大きなものであ

２．実り、常に変化する外界と接しており、体内の恒常性を維持するためのバリアとして機能している。このバリアの実質

２. １.

験

細胞培養

的な担い手がセラミドと考えられており、皮膚の表皮細胞

線維芽細胞株 Swiss 3 T 3 細胞は５% 牛胎児血清（fetal

を取り囲むようにして存在しラメラ構造という層状の構造

calf serum, FCS）、ペニシリン（50 unit/mL）およびストをとることが知られている。一方、最近の脂質研究の進展

レプトマイシン（50 µg/mL）を添加したダルベッコ変法

により、セラミドが静的な構造物としてだけでなく、細胞

イーグルスメディウム（DMEM）を用い、150 mm のディ内において、その機能を調節する生理活性を有する物質でッシュで継代培養した４）。3 T 3 細胞は、37℃で、95％ air-あることが明らかになってきた２）。組織全体のバランスを

５% CO 2 で飽和したインキュベーター中で培養し、メデ保持するために特定の細胞が積極的に死を迎えるメカニズ

ィウムは 3 − 4 日間隔で交換した。PC- 12 細胞は 10％ FCS、ムであるアポトーシスや、細胞の分化誘導などに、セラミ

５％ウマ血清（horse serum）および上記抗生物質を添加

３）

ドが関わることが明らかにされている 。したがって、皮した DMEM 中、150 mm のデイッシュで継代培養した５）。

膚に存在するセラミドも静的なバリア形成能に加えて、皮PC- 12 細胞は、37℃で、95％ air- ５％ CO 2 で飽和したイ

膚周辺における細胞間情報伝達を介した、ダイナミックなンキュベーター中で培養し、メディウムは 3 − 4 日間隔で皮膚構造の維持に関与する可能性が考えられる。すなわち、交換した。

皮膚機能を維持するためには、血管新生やその循環作用や神経栄養因子の分泌能の測定

エルプレートに分注し、上記培養液中で３日間培養した後、Norimichi Nakahata, Satoko Ohkubo

0.5％ FCS 含有 DMEM に置換し、薬物を加えて２日間培養

Graduate School of Pharmaceutical Sciences
Tohoku University

した。一方、PC-12 細胞は 4×10 ４個 /mL の濃度で 0.25mL

＊

＊

２. ２.

Research for the mechanism of cellularresponse to ceramides that show skinprotection

3T3 細 胞 を 4×10 ４ 個 /mL の 濃 度 で 0.5mL ず つ 24 ウ

ずつ 48 ウエルプレートに分注し、２日間培養した後、メデ
ィウムを薬物処理を行った 3T3 細胞の培養上清（0 . 25 mL）− 56 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究と 交 換 し、 さ ら に２日間培養した。また、薬物 を 直 接

7 . 4）に２％ BSA を加えたブロッキングバッファーによりPC- 12 細胞に作用させたものを比較実験として行った。

室温で２時間処理した。TBST で洗浄後、ブロッキングバ

PC- 12 細胞は顕微鏡（オリンパス IX- 70）を用いて形態変ッファーで 500 倍に希釈した一次抗体とインキュベートし化を観察し、3 T 3 細胞から分泌された神経栄養因子によた（４℃、overnight）。用いた一次抗体は、抗 phospho-６）

p 42 / 44 mitogen-activated protein kinase（MAPK）抗体、る細胞の分化を調べた 。

抗 phospho-p 38 MAPK 抗体、抗 phospho-JNK 抗体の三２. ３.

種である。TBST で洗浄後、ブロッキングバッファーでRT-PCR3 T 3 細胞（4 × 10 cells/well）を 6 -well のディッシュ

1000 倍に希釈したパーオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG 抗に播き、通常のメディウムで 2 日間培養してから、FCS

体とインキュベートした（室温、２時間）。化学発光検出を含まないメディウムで 1 日間培養した。細胞から総キットを用いて、パーオキシダーゼと基質により生じた化RNA 画分を抽出した後、逆転写反応によって cDNA と学発光を化学発光検出フィルム（Hyperfilm ECL、Amer-し、それを水で４倍希釈して PCR のテンプレートとしsham）に感光させて検出した８）。

5た。PCR 反応は 94℃で２分間加熱したサンプルを、熱変

３.

性を 94℃で 30 秒、アニーリングを 56℃で 30 秒、伸長反応を 72℃で 20 秒行い、このサイクルを 16 − 30 回繰り返し結果た。得られた DNA 断片は 1 . 5％アガロース電気泳動を行

３. １. 外来性セラミドによる 3 T 3 細胞からの神経栄養因子分泌による神経細胞の分化誘導って分離し、エチジウムブロマイドにて染色後、そのバ線維芽細胞は皮膚組織に存在することが知られている

ンドの濃淡を撮影装置（FAS-III, Toyobo）によって記録が、その細胞株である 3 T 3 細胞からの神経栄養因子の分７）した 。Nerve growth factor（NGF）については、セン泌についてバイオアッセイを行った。すなわち、3 T 3 細

スプライマー（CTTCAACAGGACTCACAGGA）および胞を薬物存在下に２日間培養し、その培養上清を用いて神アンチセンスプライマー（GTGCAGTATGAGTTCCAGTG）

経のモデル細胞である PC- 12 細胞を培養し、PC- 12 細胞を用いた。インターロイキン -6（IL-6）については、センスの形態的な分化を観察した（図１）。3 T 3 細胞から神経栄

プライマー（GAGGAGACTTCACAGAGGAT）、アンチセ

養因子が分泌されるとすれば、PC- 12 細胞は形態的な分化

ンスプライマー（TCCTTAGCCACTCCTTCTGT）を用を示すことになる。コントロールの実験として、NGF のいた。カンナビノイド受容体（CB）については、CB 1（セ生合成を促進させることが知られているプロテインキナー

ンスプライマー：ATAAGAGGATCGTCACCAGG、アンゼ C の活性化薬 PMA ９）について検討を加えた。その結果、チセンスプライマー：AGTTCAGCAGGCAGAGCATA）

3 T 3 細胞の培養時に PMA を加えなかったものと相違し、および CB 2（センスプライマー：AAGCCCTCGTACCT-PMA を加えたものの培養上清は PC- 12 細胞を強く分化さ

GTTCAT、アンチセンスプライマー：AGGCACAGCATG-せた（図１）。

GAACAGAA）を用いた。なお、比較のために β- アクチ

本実験系を用いて、セラミドの作用について検討を加え

ンの cDNA も RT-PCR によって測定した（センスプライた。その結果、C 2 - セラミドを 3 T 3 細胞とともに培養しマー：AGGGAAATCGTGCGTGACAT、アンチセンスプ

た培養上清には神経栄養因子が含まれており、PC- 12 細胞

ライマー：TCCTGCTTGCTGATCCACAT）。

を強く分化させた（図２）。同様な作用が C 6 - セラミドにも認められることから、セラミドによって線維芽細胞内の

２．
４．

情報伝達系が活性化され、神経栄養因子の生合成が促進さウエスタンブロッテイング
５細胞（2 × 10 cells/well）を 12 -well のディッシュに播れることが推定された。なお、C 2 - セラミドや C 6 - セラき、通常のメディウムで２日間培養してから、FCS を含

ミドを直接 PC- 12 細胞に作用させても、形態的な分化はまないメディウムで１日間培養した。薬物で刺激した後、認められなかった。

500 µL のサンプルバッファー（75 mM Tris-HCl, 2％ SDS,
15％ glycerol, 3％ 2 -mercaptoethanol, pH 6 . 8）で反応を停止した。サンプルを 95℃で５分間煮沸し、完全にタン

３. ２. 内因性セラミドによる神経栄養因子分泌による神経細胞の分化誘導

パク質を変性させた後、11％の分離ゲルを用いて SDS-

次に、内因性のセラミドの生合成を促進させるスフィン

PAGE を行った。泳動終了後、セミドライ・トランスファ

ゴミエリナーゼとホスファチジルコリン特異的ホスホリー装置（ATTO）を用い、ゲルから PVDF 膜（Immobilon;

パーゼ C を 3 T 3 細胞とともに培養し、その培養上清中でpolyvinylidene difluoride, Millipore）へタンパク質を転PC- 12 細胞の培養を行った。セラミドの生合成を促進す

写した。転写終了後、PVDF 膜を TBST（Tris-bufferedると考えられる、二つの酵素処理は 3 T 3 細胞からの神経

saline; 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 0 . 05％ Tween 20 , pH

栄養因子の分泌を促進し、その結果 PC- 12 細胞の分化誘− 57 −

図 1 神経栄養因子分泌の評価方法（A）と PC- 12 細胞の分化作用（B）
A：3 T 3 細胞を薬物と 2 日間培養し、その培養上清で PC- 12 細胞を培養した。
3 T 3 細胞が神経栄養因子を分泌すると、
PC- 12 細胞の形態的分化が引き起こされる。B：3 T 3 細胞を薬物非存在下（a）あるいは PMA（100 nM）存在下（b）で培養した上清を用いた場合の PC- 12 細胞の形態。スケール：50 μm。

図 2 外来性セラミドによる 3T3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC-12 細胞の分化
3T3 細胞を薬物非存在下（a）、C2- セラミド 10μM 存在下（b）および C6- セラミド 10μM 存在下 (c)で培養した上清を用いたときの PC-12 細胞の分化作用。スケール： 50μm。

図 3 内因性セラミドによる 3 T 3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC- 12 細胞の分化3 T 3 細胞を薬物非存在下（a）、スフィンゴミエリナーゼ 0 . 01 U/mL 存在下（b）およびホスファチジル
コリン特異的ホスホリパーゼ C 0 . 01 U/mL 存在下 (c) で培養した上清を用いたときの PC- 12 細胞の分化作用。スケール： 50 μm。

導が強く引き起こされた（図３）。なお、スフィンゴミエ
リナーゼとホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C

３. ３. カンナビノイド受容体刺激による神経細胞の分化誘導を直接 PC- 12 細胞に作用させた場合には、PC- 12 細胞のマリファナの成分である Δ9 -tetrahydrocannabinol はカン

分化は引き起こされなかった。

ナビノイド受容体を介して作用を現し、時間感覚や空間感覚の混乱、記憶の障害、多幸感、幻覚、離人症などの多彩な精− 58 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

図 4 3T3 細胞におけるカンナビノイド受容体の発現と 2- アラ
キドニルグリセロールによる 3T3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC-12 細胞の分化
A：3T3 細胞の CB1 および CB2 受容体の発現を RT-PCR によって調べた。対照として、これらの受容体の発現が知られている
NG108-15 細胞（NG）を用いた。ハウスキーピングジーンとして β- アクチンを用いた。B：3T3 細胞を薬物非存在下（a）および 2- アラキドニルグリセール 10μM 存在下（b）で培養した上清を用いたときの PC-12 細胞の分化作用。スケール：50μm。

図 5 3T3 細胞におけるスフィンゴミエリナーゼおよびホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C
による NGF および IL-6mRNA 遺伝子発現
3T3 細胞を GF109203X 存在下（右）非存在下（左）の条件で、薬物無添加（lane 1）スフィンゴミエリ
ナーゼ 0.5U/mL（lane 2）、ホスファチジルコリン
特異的ホスホリパーゼ C 0.2U/mL（lane 3）および PMA 100nM（lane 4）とともに 3 時間培養し、NGF および IL-6 mRNA を RT-PCR で解析した。ハ
ウスキーピングジーンとしてβ-アクチンを用いた。

神症状が発現する 10）。カンナビノイド受容体には CB1 受容する神経機能変化の検討により、細胞内に増加したセラミ体と CB2 の二つが存在し、中枢神経とともに末梢にも存在

ドは神経栄養因子の生合成を促進し、神経細胞の機能的活することが報告されている

11）。中枢神経系の作用については性化を引き起こすことが示唆された。そこで、3 T 3 細胞

多くの研究が為されているが、末梢におけるカンナビノイド

における神経栄養因子の遺伝子発現について検討を加えた受容体の生理的な意義については不明な点が多い。カンナビ（図５）。内因性のセラミドを増加させることが知られていノイド受容体は Gi と共役し、サイクリック AMP を減少さるスフィンゴミエリナーゼおよびホスファチジルコリン

12）、最近、その細胞内情報伝達

特異的ホスホリパーゼ C は顕著な NGF mRNA の発現をにスフィゴミエリナーゼの活性化を介するセラミドの生成が亢進し、また、インターロイキン - 6（IL- 6）mRNA の発せる作用が認められているが13）。そこで、3T3

現誘導も引き起こした。この作用はプロテインキナーゼ C細胞にカンナビノイド受容体が発現しているか否かをはじ阻害薬の GF 109203 X によって顕著に抑制された。したがめに検討したところ、CB1 および CB2 受容体ともに 3T3って、セラミドは神経栄養因子の遺伝子発現を介した生合細胞に発現していることが見い出された（図 4A）。さらに、成の促進作用を有するとともに、その経路に PKC の介在

内因性カンナビノイド受容体刺激薬である 2-arachidonylglyc-することが示唆された。皮膚などの末梢組織において、細erol（2-AG）は、3T3 細胞に作用して神経栄養因子の分泌

胞内セラミドの増加が神経の伸長作用を促し、機能的な組を促進し、その培養上清中で培養した PC-12 細胞の形態的織へと構築する役割を担うものと考えられる。

重要な役割を担っていることが報告された分化を強く引き起こした（図 4B）。なお、2-AG は PC-12 細胞の分化を直接は引き起こさなかった。

３. ５.

セラミドの情報伝達系

そこで、細胞内に増加したセラミドによってどのような３. ４.

細胞内情報伝達系が活性化されるかについて検討を加えセラミドによる神経栄養因子の遺伝子発現3 T 3 細胞および PC- 12 細胞を用いた神経栄養因子を介た。とくに、mitogen-activated protein kinase（MAPK）− 59 −

ファミリーのうち、p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および保持する作用のあることが知られており３）、本研究におい

JNK のリン酸化について検討した（図６）。その結果、C 2ても、JNK や p 38 などの MAPK 活性化作用が示された。

セラミドは p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および JNK のこれらの結果は、動的な皮膚機能維持においても、セラミ

リン酸化を引き起こすことが明らかになった。

ドは重要な役割を担っているものを示唆するものである。

４.

考

したがって、セラミドの化粧品としての利用方法あるいは察

その価値を考える場合、セラミド自身を化粧品中に加える

細胞膜を構成するリン脂質は、その構造体であるばかり

方法とともに、セラミドの生合成を刺激する薬物、分解をではなく、細胞情報伝達系の基質や情報伝達分子として阻害する薬物、さらにセラミドの情報伝達系を刺激する薬

巧みに利用されている。例えば、リン脂質の分解系とし物を開発し、それらを化粧品として用いると、より生理的て、炎症などに関与するアラキドン酸 / プロスタグランジな機能性に富む化粧品になる可能性が示唆された。

4）ン類の生成を担うホスホリパーゼ A2 、細胞内 Ca

2+

濃度

５.

上昇を引き起こすイノシトールリン脂質特異的ホスホリパ
ーゼ C 15）、さらにコリンリン脂質を分解するホスホリパー
ゼD

16）やホスホリパーゼ C の活性調節機構

17）

などリン脂

総

括

皮膚に多量に存在するセラミドがその周辺細胞にて生合成されると、他の細胞機能に影響を与える可能性があるこ質を利用する多彩な情報伝達系が知られている。すなわち、とから、特に神経機能に影響を与える神経栄養因子の生生体を形成する物質が、単一な役割を担っているのではな

合成に対するセラミドの作用について検討を加えた。線

く、複数の機能を有しているものと考えられる。

維芽細胞株 3 T 3 細胞に外来性の C 2 - セラミドおよび C 6 -リン脂質の１つとして知られているスフィンゴミエリン

セラミドを添加して培養すると、神経モデル細胞であるの代謝物であるセラミドの生理的な役割が、皮膚組織の構

PC- 12 を分化させる因子の分泌を促した。スフィンゴミエ

造維持によって外界の刺激から皮膚を静的に守ることに加リナーゼおよびホスファチジルコリン特異的ホスホリパー

えて、細胞内の情報を動的に伝え、細胞機能に変化を与えゼ C を 3 T 3 細胞に作用させて細胞内セラミドを増加させることが本研究によって明らかになった。すなわち、セると、神経栄養因子の生合成・分泌が促進され、それによ

ラミドには神経栄養因子の生合成・分泌の促進作用があり、って PC- 12 は分化した。カンナビノイド（CB）受容体刺このセラミドの作用は、皮膚組織などの末梢における神経

激はセラミドの生合成を引き起こすことが知られているが、機能維持に重要な役割を担っているものと推定される。ス3 T 3 細胞に CB 1 および CB 2 受容体が発現していること

フィンゴミエリナーゼやホスファチジルコリン特異的ホス

を RT-PCR 法を用いて確認した。内因性 CB 受容体アゴ

ホリパーゼ C による NGF mRNA 発現作用は PKC の阻害

ニストである 2 - アラキドニルグリセロールは 3 T 3 細胞に薬である GF 109203 X で阻害されたことより PKC の介在作用して神経栄養因子の合成・分泌を引き起こし、PC- 12が考えられるが、この作用はセラミドが PKC アイソフォ

細胞を分化させた。スフィンゴミエリナーゼやホスファ

18）とチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C は NGF および IL- 6一致する。一方、セラミドには積極的に細胞死を惹起する

mRNA の発現を顕著に増大し、その作用はプロテインキ

アポトーシスを引き起こし、組織全体としてのバランスを

ナーゼ C 阻害薬の GF 109203 X によって減弱された。一方、ームのうち PKC-ζ の活性化を引き起こすという報告

図 6 C2- セラミドによる MAPK 群のリン酸化反応
3T3 細胞に C2- セラミド 50μM を添加した後、240 分まで経時的にサンプリングし、そのリン酸化
p42/44 MAPK（P-p42/44)、リン酸化 p38（P-p38) およびリン酸化 JNK (P-JNK) をウエスタンブロッテイ
ングにて測定した。

− 60 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

セラミドの細胞内情報伝達系について MAPK のリン酸化

ane A ２ stimulates mitogen-activated protein kinaseを検討したところ、p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および

and arachidonic acid liberation in rabbit platelets. Pros-JNK いずれのリン酸化反応も活性化し、その情報伝達のtaglandins 52 , 403 - 413 , 1996 .

一部には MAPK カスケードの活性化が考えられる。以上

９） Obara Y, Kobayashi H, Ohta T, et al. : Scabronine G-の結果より、セラミドには NGF をはじめとする神経栄養

methylester enhances secretion of neurotrophic factors

因子の生合成・分泌の促進作用があることが明らかになっ

mediated by an activation of protein kinase C-ζ. Mol

た。このセラミドの作用は、皮膚組織などの末梢におけPharmacol 59 , 1287 - 1297 , 2001 .

る神経機能維持に重要な役割を担っているものと推定され、

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セラミドは皮膚表皮角層に形成されるラメラ構造の形成とともに、皮膚の神経機能維持をも制御している可能性が示

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