腸内細菌由来の腸肝シグナル応答による胆汁酸ホメオスタシスの制御機序の解明

宮田昌

東北大学大学院薬学研究科

緒明助教

実験方法

言

1. 動物への薬物処理

腸内細菌は宿主の生理機能の一部を担い、宿主の臓器の一つと考えられている。腸内細菌叢の変化は宿主のエ

雄性 C57BL/6N マウスあるいは Fxr 欠損マウス（米ネルギー代謝を変動させるという近年の多くの報告より

国 国 立 衛 生 研 究 所、Dr. Frank J. Gonzalez よ り 供

腸内細菌は宿主の脂質や糖代謝調節に関与していると考与）を用いた。FXR 標的遺伝子発現解析の実験ではえられるようになったが、これらの関連についての直接

C57BL/6N マウスあるいは Fxr 欠損マウスにアンピシ的な分子レベルの知見は少ない。

リン（100 mg/kg）を 3 日間経口投与した。またアンピ胆汁酸はコレステロールから生合成され、消化管におシリンと胆汁酸との併用実験ではアンピシリン最終投与

いて脂質や脂溶性ビタミンなどの吸収に関与するだけで時に胆汁酸（100 mg/kg あるいは 500 mg/kg）をアンピなく、核内受容体や膜受容体を介するシグナル伝達物質シリンと併用し、3 時間後に解剖した。胆汁酸単独投与として脂質や糖代謝の調節にも関与するとされている。

実験では胆汁酸（500 mg/kg）を１度投与後 3 時間で解この胆汁酸の生体内ホメオスタシスは胆汁酸の核内受容剖した。Asbt タンパク発現の解析実験では C57BL/6N

体 farnesoid X receptor（FXR）シグナルにより厳密にマウスにアンピシリン（100 mg/kg）を投与後、3、12、調節されていると考えられてきた 。

24 時間で解剖した。アンピシリンと胆汁酸併用実験で

1）はアンピシリン投与後 12 時間で胆汁酸（500 mg/kg）

最近申請者らはマウスに抗菌薬を投与して腸内細菌による胆汁酸の代謝変換を阻害すると、胆汁酸ホメオを投与し 3 時間後に解剖した。

スタシスが変化し、胆汁酸プールサイズが増加する事
2. 胆汁酸組成解析を見いだし た。この時、消化管の FXR 標的遺伝子のﬁbroblast growth factor（FGF）15/19 の 発 現 が 減 少HPLC を用いて組成解析を実施した。分離カラムはし、これにより肝臓の胆汁酸合成の律速酵素 CYP7A1L-column ODS 2.1 150 mm（5μm）（財団法人 化学

発 現、 活 性 が 増 加 す る こ と 、 消 化 管 の 胆 汁 酸 吸 収物質評価研究機構）を、反応カラムは Enzymepak 3α

ト ラ ン ス ポ ー タ ー apical sodium-dependent bile acid-HSD column 4.0 20 mm（日本分光）を用いた。胆汁transporter（ASBT）発現と吸収活性が増加することを酸は 3α-hydroxysteroid dehydrogenase（3α-HSD）に明らかにした 。FGF15/19 はエンドクリン作用を持つよる反応で生成するβ -NADH を励起波長（365 nm）,ペプチドで肝臓に作用し、胆汁酸合成や糖新生を抑制し、蛍光波長（470 nm）で FP-920S 蛍光検出器（日本分光）グリコーゲン合成を亢進するなどの作用が報告されていにより検出した 5）。

2）3）る 4）。そこで本研究では腸内細菌の胆汁酸代謝変換に依3. 遺伝子発現レベルの解析存する消化管と肝臓をつなぐシグナルである回腸 FXR/FGF15/19 シグナル等の調節機序、消化管胆汁酸吸収ト

回腸より定法に従い RNA を単離し、High-Capacityランスポーター（ASBT）の発現調節機序を明らかにすcDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）

る事により腸内細菌由来の腸肝シグナルによる胆汁酸ホを 用 い て cDNA 合 成 し た。Real-time PCR は Power

メオスタシスの調節機序を解明することを目的とした。

SYBR® Green PCR mix（Applied Biosystems）を用い
ABI PRISM®7000 で実施した。

1

宮田昌明

考えられた。

Asbt発現解析
Kessler らの方法を用い回腸の刷子縁膜を調製した 。
6）

2. 胆汁酸併用投与による消化管FXR標的遺伝子の発現

Anti-Asbt 抗 体 は Dr. Paul A. Dawson（Wake Forest変動University）より供与された。Anti- β -actin 抗体（AC-15）
は Sigma-Aldrich Inc. より購入した。イムノブロットの検出は上記の可能性を検証するためにアンピシリンと種々のLuminata Crescendo Western HRP substrate（Millipore

胆汁酸の併用投与実験を実施した。腸内細菌代謝型胆汁Corporation）および Image Capture G3（Liponics Inc.）を酸の、CA と TDCA で FXR 標的遺伝子の Fgf15、Shp用いて化学発光により検出した。

mRNA レベルの有意な増加が認められたがタウロコー結与で消化管管腔内の TCA は増加し、腸内細菌による脱ル酸（TCA）では認められなかった。アンピシリン投果

1. アンピシリン投与による消化管FXR標的遺伝子の発アミノ酸抱合により生成する CA は減少することから、現変動

これらの２種類の胆汁酸に注目して単独投与とアンピシ

雄性 C57BL/6N マウスに３日間アンピシリンを投与

リンとの併用投与実験により胆汁酸組成と FXR 標的遺すると肝臓内胆汁酸合成の増加に伴って消化管管腔内の伝子発現変動をさらに詳細に解析した。単独投与では総胆汁酸レベルは増加するが、腸内細菌の減少に伴う胆CA, TCA 投与で共に消化管管腔内の CA レベルの有意

汁酸代謝変換の低下により腸内細菌による代謝変換によな増加が認められたが、アンピシリンとの併用投与ではり生成される胆汁酸（腸内細菌代謝型胆汁酸）のコール

消化管管腔内の胆汁酸変換が低下しているため CA レベ酸（CA）, タウロデオキシコール酸（TDCA）は検出限

ルは CA 併用群でのみ増加が認められた（表 1）。回腸界（1μmol）以下まで低下した。このとき回腸の FXRでの吸収の影響を考慮して門脈中の胆汁酸組成も測定し標的遺伝子発現を解析すると Fgf15, Shp, Ibabp, Ostα

たが、消化管管腔内と同様な結果が認められた。
CA あるいは TCA 単独投与とアンピシリンとの併用

より抗菌薬投与による腸内細菌減少に起因する胆汁酸の投与時の FXR 標的遺伝子の発現を測定すると、単独投質的変動が回腸の FXR シグナルを軽減させた可能性が与では CA, TCA ともに FXR 標的遺伝子の発現増加がRelative mRNA levelsともに有意な減少が認められた（図 1）。これらの結果

2

Fgf15

10Shp

21***
Vehicle

ABPC01***

VehicleIbabp

20ABPC2***

VehicleABPCOstα10***Vehicle

ABPC

図 1 回腸 FXR 標的遺伝子の発現に対するアンピシリン（ABPC）処置の影響
溶媒対象群に対する有意差を示す（***, p < 0.001）
表 1 胆汁酸の単独あるいはアンピシリン併用投与時の消化管管腔内と門脈中の胆汁酸レベル
Bile acid

Treatment group
ABPC/Vehicle

Intestinal lumen ( μ mol)
< 0.01CA
TCA
7.33 ± 0.77

Portal vein ( μ mol/L)
CATCA<1261 ± 144

ABPC/CA(500 mg/kg)

ABPC/TCA(500 mg/kg)< 0.011.47 ± 0.43
12.29 ± 1.45** 12.94 ± 0.92**

60 ± 21369 ± 156

<1445 ± 109*

VehicleCA(500 mg/kg)

TCA(500 mg/kg)

0.10 ± 0.07
3.65 ± 0.81

0.90 ± 0.43 **8.29 ± 2.36**

1.03 ± 0.74*
8.77 ± 2.05**

3±3
228 ± 174

63 ± 14**232 ± 183

54 ± 52*
230 ± 186

アンピシリン群あるいは溶媒対象群に対する有意差を示す (*, p < 0.05; **, p < 0.01)。

2腸内細菌由来の腸肝シグナル応答による胆汁酸ホメオスタシスの制御機序の解明認められ、併用投与では CA 濃度の上昇した CA 併用投序について解析するため、抗菌薬投与初期（3, 12, 24 時

与でのみ発現増加が認められた（図 2A, 2B）。これらの間後）の消化管管腔内の胆汁酸組成と Asbt 発現レベル

結果は、消化管管腔内の CA レベルの増加が FXR 標的を解析した。消化管管腔内の胆汁酸組成は投与後 12 時遺伝子の発現増加を誘起することを示している。一方で間で有意な変動が認められ、上記のアンピシリン投与 3

TCA の FXR 標的遺伝子発現誘導に対する寄与は低いこ日と同様な CA, TDCA の有意な減少、TCA の有意な増とを示唆している。一方 Fxr 欠損マウスでは CA とア加が認められた（表 2）。一方回腸 Asbt の mRNA レベ

ンピシリン併用で FXR 標的遺伝子の有意な増加は認め

ルはアンピシリン投与 24 時間以内では変動は認められられなかった。

なかったが、回腸刷子縁膜の Asbt タンパクレベルは胆汁酸組成の変動と一致して 12 時間以降で有意に増加し3. 抗菌薬投与初期のAsbt発現変動た（図 3）。この結果より Asbt は胆汁酸シグナルによりタンパクレベルでの発現調節を受けることが示唆され3 日間の抗菌薬投与により回腸刷子縁膜の Asbt タンた。

パクレベル、回腸 mRNA レベルが増加し、糞中胆汁酸排泄が減少し、門脈血中胆汁酸濃度が増加することから回腸胆汁酸吸収能が増加する事を明らかにしている 3）。

4. 胆汁酸併用投与による消化管Asbtタンパク発現変動

本研究ではさらに胆汁酸による急性の Asbt 発現調節機

胆汁酸による Asbt のタンパクレベルでの発現調節機

A）
Relative mRNA levels

50101250Fgf1515＊＊＊10＊＊＊30Vehicle

CATCA

ABPC ABPC ABPC+CA +TCAIbabp

22000.53＊＊＊＊＊Vehicle

CA

ABPC ABPC ABPC+CA +TCA

Ostα＊＊＊＊2＊＊10TCA0311050Shp40＊＊＊200

ABPC ABPC ABPC+CA +TCA

＊10.51ABPC ABPC ABPC+CA +TCA

1.5＊115Ostα

21.52020Ibabp

2＊＊25300Shp30＊＊40B）
Relative mRNA levels

Fgf15Vehicle CATCA0Vehicle

CATCA

図 2 回腸 FXR 標的遺伝子の発現に対する胆汁酸処置の影響
A）胆汁酸とアンピシリンとの併用投与 。
B）胆汁酸単独投与。アンピシリン群あるいは溶媒対象群に対する有意差を示す (*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 )。

表 2 アンピシリン投与後の経時的な消化管管腔内胆汁酸の組成変動
3 hr

12 hr

Bile acidVehicle

ABPCVehicle

CA

0.07 ± 0.06

0.07 ± 0.06

24 hr
ABPCVehicle

ABPC

0.05 ± 0.03

< 0.010.04 ± 0.02

< 0.018.01 ± 0.84***(µmol)
TCA

5.63 ± 0.94

5.18 ± 0.61

5.48 ± 0.47

6.22 ± 0.38*

5.62 ± 0.32

TDCA

0.13 ± 0.03

0.12 ± 0.07

0.10 ± 0.03

< 0.010.14 ± 0.04

< 0.01Others

2.58 ± 0.34

2.32 ± 0.25

2.44 ± 0.23

2.96 ± 0.33*

2.45 ± 0.66

4.07 ± 0.61**

Total

8.41 ± 1.11

7.68 ± 0.77

8.08 ± 0.63

9.18 ± 0.56*

8.25 ± 0.93

12.08 ± 1.34***

溶媒対象群に対する有意差を示す (*, p < 0.05; **, p < 0.01；***, p < 0.001)。

3宮田昌明A）

B）
1.5Vehicle
ABPC

03 hrleABPC

0.5Vehic

β-actin

le
ABPC

Asbt

1.0Vehicle
ABP
C

Relative Asbt mRNA levels

24 hrVehicleABPC

12 hr
VehicVehicle
ABPC3 hr

12 hr

24 hr

図 3 アンピシリン投与後の経時的な回腸 Asbt 発現変動
A）回腸刷子縁膜の Asbt タンパクレベル、B）回腸 Asbt mRNA レベル。
A）

B）
1.5

β-actin

0.5+CA―

Vehic

le

A0+TCA

Asbt

1.0+TDC+TC

Relative Asbt mRNA levels

ACA+TD+CA―

Veh
icle

ABPC

ABPC

図 4 回腸 Asbt 発現における胆汁酸分子種特異的な影響
A）回腸刷子縁膜の Asbt タンパクレベル、B）回腸 Asbt mRNA レベル。

考序を明らかにするためアンピシリンと胆汁酸の併用投与

察実験を実施した。アンピシリン投与後 12 時間で腸内細胆汁酸のホメオスタシスは主に肝臓での胆汁酸合

菌代謝型胆汁酸の CA あるいは TDCA, それ以外の TCA成と消化管からの吸収の過程で制御されていると考を投与し、その 3 時間後の回腸刷子縁膜 Asbt タンパクえられる。本研究により腸内細菌代謝型胆汁酸（CA発現を解析した。アンピシリン投与で増加した Asbt タや TDCA）により Fgf15 等の回腸 FXR 標的遺伝子のンパクレベルは CA あるいは TDCA 併用で、顕著に減mRNA レベルの発現が促進的に、さらに回腸胆汁酸吸少したが、TCA 併用では顕著な減少は認められなかっ収トランスポーター Asbt タンパク発現が抑制的に調節た（図 4）。これらの結果は腸内細菌代謝型胆汁酸によされていることが明らかになった。

り回腸刷子縁膜の Asbt タンパクの発現が抑制的に調節

FGF15/19 は肝臓の胆汁酸合成の律速酵素の CYP7A1されていることを示唆する。

を抑制的に調節することより 7）、上記の結果は腸内細菌が胆汁酸代謝変換を介して肝臓の胆汁酸合成（CYP7A14

腸内細菌由来の腸肝シグナル応答による胆汁酸ホメオスタシスの制御機序の解明発現）を抑制的に調節することを意味する。さらに腸内汁酸は回腸刷子縁膜上の胆汁酸吸収トランスポーターの細菌が胆汁酸代謝変換を介して回腸の胆汁酸吸収トラン

Asbt タンパクレベルを急性にかつ抑制的に調節することスポーター（Asbt）タンパクの発現を抑制的に調節し、で消化管の胆汁酸吸収をコントロールしている。腸内細胆汁酸吸収を抑えていることを意味する。腸内細菌は胆菌は上記の機構を介して宿主の胆汁酸プールが過剰にな汁酸代謝変換を介して、少なくともこれら２種類の機序らないよう負に制御していることが示唆された。

により胆汁酸プールサイズを負に調節することで、胆汁酸ホメオスタシスの維持に関与していると考えられる。
謝

これまで腸内細菌による胆汁酸変換は 7α- 脱水酸化辞による２次胆汁酸生成の意義が注目されていたが、本研本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記

究では TCA から CA 等への脱アミノ酸抱合により消化念財団による研究助成を賜りましたことを深く感謝申し

管の FXR シグナルが活性化されたり、Asbt タンパク発上げます。

現が調節されていることが明らかになり、胆汁酸脱アミ
文ノ酸抱合の生理的意義の一端が解明された。腸内細菌代謝型胆汁酸の CA や TDCA がどのような機序により特1）P.Lefebvre,et al,: Physiol Rev 89, 147-191,2009.
2）M.Miyata,et al,: J Pharmacol Exp Ther 331, 10791085, 2009.
3）M.Miyata,et al,: J Pharmacol Exp Ther 336, 188-196,
2011.
4）S. A.Jones : Adv Exp Med Biol 728, 171-182, 2012.
5）H.Kitada,et al,: J Biol Chem 278, 17838-17844, 2003.
6）M.Kessler,et al,: Biochim Biophys Acta 506, 136-154,1978.
7）T.Inagaki,et al,: Cell Metab 2, 217-225,2005.

異的に FXR シグナルを活性化するのか、ASBT タンパクレベルを調節するのかが今後の課題である。
要

献

約
腸内細菌による代謝変換で生成された腸内細菌代謝型胆汁酸（CA や TDCA）はマウス消化管の FXR シグナ
ルを活性化させ、その標的遺伝子である回腸 Fgf15 の発現を上昇させる。その Fgf15 は肝臓に作用し、胆汁酸合成を抑制させると考えられる。さらに腸内細菌代謝型胆5