皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント ー ネガティフ
トランスジェニックマウスを用いた皮膚の成熟過程の検討
京都大学

田中医学部

俊宏

Retinoic acid plays an important role in the development of the organs, including skin. We
constructed a cDNA functioning as a dominant-negative styled retinoic acid receptor andintroduced it into mice. The resultant transgenic mice skin revealed a marked reduction of skinmaturation. Macroscopic examination and microscopic examination of these transgenic mice
showed thinning of the epidrmis with the loss of primary wickels and rete ridge formation of
dermo-epidermo junction. These findings indicate that the retinoic acid act as a strong
physiological maturation factor of the skin. Keratins and filaggrin were analyzed as
differentiation marker. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of purified keratin revealed
normal amount of keratin 1, 10, 5, 14 were expressed both controls and transgenic mice skin
Ectopic expression of keratin 6 and 16 were detected in transgenic mice skin. Although, theexpression of keratin occurs in transgenic mice, the exprssion pattern of these keratin werecompletely different to those of control mice as detected by immunofluorescence study. A
complete depletion of fillagrin was observed with this technique. All these data indicate that
retinoic acid plays an important role in the epidermal layer formation in fetal skin development

緒

言実験は、欠損状態を人為的に作製することである
が、レチノイン酸は生体にとって必須の物質であ

レチノイン酸は完成した皮膚に対して種々の薬ることから、皮膚以外の臓器に影響を及ぽさずに理作用を持つことは既に知られている。 例えば本皮膚にレチノイン酸それ自体の欠乏状態を作り出物質の過剰はhyper vitamine A syndromeをひきすことはできない。われわれはこの問題を解決す

おこし、また、欠乏は、成人皮膚に過角化を生じるために、皮膚のみで特異的に発現するプロモ ーさせる。培養表皮細胞を用いた実験でも本物質のタ ー を用いて、レチノイン酸受容体のドミナント過剰または欠乏が、種々の遺伝子発現に影響を与ーネガティプの形質をもつ点突然変異体のレチノえ、特に分化マ ー カ ー であるケラチンの遺伝子発イン酸受容体をトランスジェニックマウスに導入

現に大きな作用を持つことが知られている。しかすることを試みた。

し、本物質の生理作用については、これが真に生実理作用をもち機能しているか否かを含めて、不明

験のままであった。生理作用を検定する最も確実な
図 l にトランスジェニックマウス作成に用いたDNAのコンストラクトを示す。 プロモタ ー は皮膚Study of fetal skin maturation withdominantnegative retinoic acidreceptor transgenic mice.

基底細胞層に特異的な発現を示す Kl4 プロモ ー ターを用いた。これにたいしてベ ー タ ー ガラクトン

ダ ー ゼ、正常なレチノイン酸受容体、点突然変異'Toshihiro Tanakaを持つレチノイン酸受容体をそれぞれコ ー ドする

Faculty of Mecl1cmecDNAをつなげた。ベ ー タ ー ガラクトシダーゼは発Kyoto University

現が正しく行なわれていることを確認する目的-118-

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント ー ネカティプトランスジエニックマウスを用いた皮膚の成熱過程の検討

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図1. トランスジェニックマウス作成に為のcDNAコンストラクトとコントロ ー ルのペ ー タガラクトシダ ー ゼの発現。
A: コンストラクト。 ケラチン14ブロモー
タにたいして 、 ペ ー タガラクトシダ ーゼ、 点突然変異体レチノイン酸受容体、正常なレチノイン酸受容体および点突然変異体をもつ甲状腺ホルモン受容体をそれぞれコ ー ドするcDNAをつなげた。
B : コントロ ー ルのペ ー タガラクトシダーゼの発現をトランスジェニックマウスで観察したもの。 基底細胞層のみが染色されている 。

図2. トランスジェニックマウスのマクロ、ミクロの所見。
A: マ クロの所見。 上段はコントロ ール マ ウ ス 。 撻康な皮 膚 を も つ。 下 段は点 突 然 変 異 体 レ チ ノ イ ン 酸 受 容 体を導入したトランスジェニックマウス。
皮溝は消失し、 真皮の血管が透けてみえる。
B: ヘマトキシン ー エオジン染色によるミクロの所見。 上段はコントロ ー ルマ
ウスの皮膚。 下段はトランスジェニック。
皮膚は著明に薄くなっている 。 一次皮
溝 は消退しレ ー テリッジは平坦となっている。

で、 正常なレチノイン酸受容体は過剰発現による影響がないことを確認するために用いた。 これらの cDNAに続いて Kl4遺伝子由来のポリ A シグナルを導入した。 トランスジェニックマウスの作成は常法通りに行なった ！） 。生まれたトランスジェニッ
クマウスはサザン法にて導入した外来遺伝子の挿入を確認した。 マウスの形質の観察は、 肉眼的所見およびヘマトキシン ー エオジン染色による光顕所見によった。 トランスジェニックマウス表皮に発現されているケラチンは加熱により表皮を真皮から剥離した後 Steinert らの方法に準じて精製し、 10%SDS ボリアクリルアミドゲル電気泳動後

クマシ ー プリリアントプル ー にて染色した 2) 。 各-119-

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ケラチンの同定は、おのおのにたいして特異的に反応する抗体を用いて、前述の方法で得たケラチ

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NANANANANAンを免疫プロット法にて同定した。 ケラチンの分布はトランスジェニックマウス皮屑をFuchsらの方法に準じてカルモイ固定を行った。 そ の後おの
50K一

おのにたいして特異的に反応する抗体を第一抗体とし、さらにFITC標識された坑マウス抗体または坑ウサギ抗体にて染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。

結図 3. 精製したケラチンの SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動と抗体を用いた同定 。 左は電気泳動後のゲルをクマシ ー プリイアントプル ーで染色したもの 。
N: コントロ ー ルマウス皮虜由来のケラチン 。
A: トランスジェニックマウス皮虚由来のケラチン。 右は左の蛋白をそれぞれ上段にあるケラチンにたいする抗体で免疫プロットをおこなったもの 。

果

図l下段にベ ー タカラクトシダ ー ゼの発現様式を示す。 これまでの報告どうりにKl4 プロモ ー ターは皮膚に特異的な発現を示す。 作成したトラン
スジェニックマウスのマクロの所見を図 2上段に、ミクロの所見を図2下段に示す。 コントロ ー ルマウス（上）に比べて、外来性DNAの挿入があり、いて免疫ブロット法を行ったのが上の図である。

かつ発現のあるトランスジェニックマウス（下）これより各々のケラチンは免疫学的にも同定されの皮rt'¾は、ひ薄であり、かつ危弱である。 真皮のた。 これらのケラチンのうちKl/KIO、K5/Kl4 はと―血管が透過される。 このト フ ンス ソェニックマウ

もにコントロ ー ルマウスでもトランスジェニック

スは皮膚より急速に水分を失い生後(El9. 5にてマウスでも発現しているが、それらが表皮細胞の帝王切開にて出産）数時間で死亡するのが特徴で

terminal differentiationをつうじて正しい位置ある。 これらの変化は皮膚のみで生じ、他の臓器で発現しているかどうかを、これらケラチンの局には特筆すべき変化はない。 光顕所見ではコント在を調べることを通じて検討したのが図4である。

ロ ー ル（上）に比べてトランスジェニックマウス

図4は左が正常コントロ ー ルマウス皮屑を基質と（下）は、1)一次皮溝の消失、2)マルビギ ー 層したもの右がトランスジェニックマウス皮固であの著名な減少、3)顆粒層の減少、4)表皮一真皮る。 免疫プロットの結果に対応して、K6/Kl6はコテリッジの消失が特徴としてあげられントロ ー ルマウスでは検出されない。 一 方ケラチる。 なお正常レチノイン酸受容体を導入したトランの分析ではコントロ ー ル、トランスジェニックンスジェニックマウスの皮府には変化はない。

ともに発現されているKl/KIO、K5/Kl4 は発現の局間のレー

図3にトランスジェニックマウス表皮より精製在が変化していることが示 された。 すなわちトラしたケラチンのSDS-PAGEの結果を示す。 左がクマンスジェニックマウス皮膚では、Kl/KIO はコントシ ー ブリリアントプル ー 染色である。 発現されてロ ー ルよりおくれて発現を開始しK5/Kl4 はコントいるケラチンはコントロ ー ルでは主として Kl/

ロ ー ルより遅れて消失することが明らかと なっKIO 、K5/Kl4 であるが、トランスジェニックマウた。

スでは、Kl/KIO、K5/Kl4 に加えてK6/Kl6が発現している。 これらのケラチンは分子量から明らかであるが、各々について特異的に反応する抗体を用-120-

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント--ネカティプトランスジエニックマウスを用いた皮膚の成熱過程の検討

ca内のトランスクリプションファクタ ー である。 培養細胞を用いた実験からこの受容体はケラチン遺伝子に直接働きその発現を制御することが知られている。 我々の作成したトランスジェニックマウ
ス表皮では免疫プロット法で見る限りケラチンl、10、5、14は正しく発現しているように見える。 しかし蛍光抗体法でその発現局在を検討するとノントランスジェニックマウスと比較して明らかに発現のタイミングが異なっていることが分かった。 同時に分化のマ ー カ ー であるフィラギリ

dbンの発現が全く見られなくなっていることがあきらかとなった。 すなわち発生過程における分化をつかさどる一群の調節機構に変化が生じると考えられる結果である。 肉眼的所見ではこのマウスは皮膚の非薄化と脆弱性を示す。 。 光学顕微鏡を用いた観察でも、このトランスジェニックマウスは表皮の非薄化を示す。 すなわち、 ヘマトキシン 一工オジン染色標本の観察では、マルピギ ー 層の著明な減少と一次皮溝の消失およびレ ー テリッヂの消失が観察される。 これらの変化は、胎生16から17にかけて見られる形態学的特徴と 一 致してお図4. 蛍光抗体所見。
a : コントロ ー ルマウス皮虐をKIOにたいする抗体で検出。
b : コントロ ー ルマウス皮膚をK14にたいする抗体で検出。
C : トランスジェニックマウス皮虐をKIOにたいする抗体で検出。
d : トランスジェニックマウス皮膚をK14にたいする抗体で検出。

考り、この観点からは胎児期の皮膚分化の阻害と考えられる。 フィラグリンの発現も胎生16ていどに始まるとされており分化マ ー カ ー からも成熟化の遅延がうかがわれる。 これらの観察よりレチノイン酸は皮膚の発生に生理的に重要な役割を演じておりかつそれは胎生皮膚発生での皮膚の成熟化を司ると考えられた。

文察献1) Gordon jw in guide to techniques inー

ネガティプ法にmouse development (eds Wa ssarman PM &よりレチノイン酸とその受容体の相互作用が失わDePamphilis ML) 747-771 (Academic Press,

われわれの用いたドミナントれることにより皮膚の発生にあきらかな異常が生じることが明らかとなった。 レチノイン酸受容体

San Diego 1993)
2) Steinert. P et al, .BjoclJemical .I. 149 39-48

はDNAに直接働きかけて遺伝子発現を制御する核1975-121-