食用きのこ成分のメラノーマ細胞活性に及ぼす影響

東京海洋大学大学院 海洋科学技術研究科 食品生産科学科部門

長 阪玲 子Commercial mushrooms processing can produce about 100 kg of trimmings waste in Japan daily. Make use of suchmaterials for applications could alleviate concerns on agricultural waste disposal. We already revealed that edible mushroom(Flammulina velutipes) extract inhibited melanosis in commercially raw fish, shellfish, and meat. We conducted to find thewhitening activity compounds in edible mushrooms used for skin-whitening purpose and considered their mechanisms inmelanin biosynthesis. In humans, skin pigmentation results from the synthesis and distribution of melanin, besides tyrosinase
is a key enzyme for melanin biosynthesis.  These days many cosmetics of skin-whitening are popular among women. This
study demonstrated that melanin synthesis and tyrosinase content of B16/BL6 melanoma cells suppressed by mushroomextract. These results suggested that mushroom extract could be considered an alternative therapeutic agent for treating
hyperpigmentation and an effective component in whitening cosmetics.

１．緒ーマ細胞でのメラニン生成阻害活性が報告されている．ま言

た，ベニバナ種子から分離された成分による B 16 メラノー

我が国の食用きのこ生産量は約 48 万トンであり，平成マ細胞でのメラニン生成阻害活性も報告されている 8）．こ

20 年の林業総産出額 4 , 449 億円の内 2 , 324 億円，52 . 5％をのように近年食物由来の PPO 活性抑制作用を持つ成分に占めている．中でもエノキタケは古くから食習慣がある上，ついて注目が集まっており，国内だけでなく海外において年間 10 数トン規模の生産があり，安価で大量に手に入れも安全な成分による美白作用のある化粧品が切望されていることが出来る．これまでに共同研究者である大島らによると言える．しかし，PPO 活性抑制作用を持つ物質は高って，エノキタケを始めとする食用きのこにおいて子実体価なものが多く，それ故に美白作用のある化粧品は比較的や菌糸体並びに廃棄菌床中に抗酸化性を持つ成分が多く含高価な傾向にある．

まれることを見出した．この成分は抗酸化成分として知ら

図１に示すように生体内のメラニンの生成は，血中かれるビタミンＥの約 7 , 000 倍の抗酸化能を有することを明ら供給されたチロシンが PPO によって酸化されることらかにした．また，エノキタケなど数種の食用キノコ可食部から始まる（図１）．チロシンは酸化され L-DOPA（L- 3 , 4 -およびその栽培に用いられる水溶性抽出物は，抗酸化物質dihydroxyphenylalanine）となり，さらに DOPA キノンへやポリフェノールオキシダーゼ（PPO）前駆体のタンパクと代謝される．PPO の一種の酵素であるチロシナーゼは質発現抑制作用をもち，この作用によってカニやエビなどの褐変防止作用を発揮することが明らかになっている 1− 3）．

O

PPO 活性の抑制はメラニン色素の生産を抑制することが知られ，PPO 活性阻害作用を有する化粧品は美白作用を有する．また，メラニン原因症予防治療剤としても有効+NH3HOであることが知られている．従来から市場にある美白化粧チロシン
チロシナーゼ品の多くは，表皮メラニン細胞においてメラニンの生成に働く PPO の活性を阻害するなどの働きを持つ．PPO 阻害活性のある物質としては，コウジ酸 4）やアルブチン 5）がよく知られている．このほかにも，トウモロコシふすま 6）や小麦ふすま 7）の成分にチロシナーゼ阻害活性，B 16 メラノ

OーOHO+NH3HOOー

ドーパチロシナーゼ

Effect of edible mushroom on melanomacells
Reiko Nagasaka
Food Chemistry and Functional Nutrition,
D ep a r t ment o f Fo o d S c i enc e a ndTechnology, Graduate School of Marine
Science and Technology− 36 −OO+O

NH3Oー

ドーパキノン
図１食用きのこ成分のメラノーマ細胞活性に及ぼす影響

この 2 つの反応を触媒する酵素である．DOPA キノンはその後自動的に酸化しユーメラニンやフェオメラニンが合成

２. ３ 食用キノコ抽出成分が B16/BL6 マウスメラノー
マ細胞のチロシナーゼ活性に及ぼす影響される．これらが代謝される時に活性酸素種が生成される

２. ３. １が，キノコ抽出物に抗酸化性があることから，キノコ抽出チロシナーゼは，チロシンと DOPA を基質にすること物中がこの代謝経路そのものを制御する可能性がある．しが分かっているが，本研究では L-DOPA を基質とし，チたがってキノコ抽出物のメラニン産生への抑制効果およびロシナーゼ DOPA オキシダーゼとしての活性を調べた．

そのメカニズムを検討することとした．特に，エノキタケ

２. ２と同様の条件で B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞を子実体抽出液が PPO 活性抑制効果や PPO の前駆タンパク培養した．細胞を集めた後 1 % Triton-X 100 および 1 mM質の発現抑制効果を持つことから，メラニン産生に与えるPMSF を加えて 4℃で 30 分インキュベートしたのちホモジ影響を検討することで，将来的に美白化粧品といった製品ナイズし，遠心分離により上清を得た．酵素試料としてへの応用のための知見を蓄積することを目的とした．本研用いる上清のタンパク定量を Lowry 法 9）を用いて行った．

究によりエノキタケ抽出物による美白作用およびそのメカ

5 mM の L-DOPA 溶液にタンパク量として 100 mg の酵素試

ニズムを明らかにし，安価でより効果的な安全性の高い美料を加え，37℃で 60 分インキュベートしたのち，分光光白化粧品の開発を目指した．

度計をもちいて 492 nm の吸光度を測定した．

２．実験

２. ３. ２

２.１ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞の細胞活性に及ぼす食用キノコ抽出成分の影響
２. １. １

エノキタケ抽出物の調製

分光光度計を用いた評価

酵素電気泳動法による評価

酵素電気泳動法によりチロシナーゼ活性を測定した．具体的には前述の酵素試料を 10 % ポリアクリルアミドゲル
電 気 泳 動 で 分 離 し，5 mM の L-DOPA に よ り 染 色 し，37

細胞活性に及ぼす影響を検討するために，まずエノキタ℃で 15 分間インキュベートを行った．得られたバンドをケ抽出物の調製を行った．エノキタケの部位による差異をImage J（National Institute of Health）にて取り込み，数検討するために，食用で用いられる子実体部分，廃菌床部値化した．

分それぞれについて検討した．エノキタケ 100 g に蒸留水200 g を加え，90℃にて 30 分間熱した後，4℃，5000 rpm

２. ３. ３ウェスタンブロッティングによる評価の条件下で 15 分間遠心分離を行った．得られた上清に蒸２. ３. ２同様 10 % ポリアクリルアミドゲル電気泳動で留水を加え，それぞれ 1 ml あたりエノキタケ 500 mg 含有

酵素試料を分離したのち，セミドライブロッティング装するように調製した．

置 を 用 い て メ ン ブ レ ン（MILLPORE Immobilon Psq）に転写した．メンブレンは 3 %BSA 溶液でブロッキングを

２. １. ２

細胞毒性試験行い，60 分のインキュベート後 0 . 5 % の Tween 20 を含ん

96 well マイクロプレートに B 16 /BL 6 マウスメラノー

だ TBS で洗浄した．1 次抗体は Tyrosinase（H- 109）
：sc-マ細胞を 2 . 5 × 103 cell/well になるよう播種し，インキュ15341（SANTA CRUZ Biotechnology，INC.）を 用 い た．

ベート後，２. １. １で調製したそれぞれの抽出物を種々

2 次 抗 体 は Anti-IgG（H+L），Rabbit，Alexa 680 を 用 い，の濃度になるよう培地に添加した．72 時間培養後，CellOddessy（LI-COR）で目的タンパク質の検出を行った．

Counting Kit- 8（CCK- 8；同仁化学研究所）を用いて細胞３．結増殖測定を行った．具体的には CCK- 8 溶液を各ウェルに果た．マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を測定

３.１ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞の細胞活性に及ぼす食用キノコ抽出成分の影響

し，得られた数値により各抽出物の細胞増殖への影響につエノキタケ子実体部分抽出物，廃菌床部分抽出物それぞ10 ml ずつ添加後，2 時間インキュベートし呈色反応を行っいて評価した．また同時に細胞形態を観察した．

れの B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞に対する細胞毒性試験を行った．その結果，子実体部分抽出物では若干の細胞２. ２ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞のメラニン産生量に及ぼす食用キノコ抽出成分の影響

数の増減はみられるものの（図２），細胞に対する毒性は24 well マイクロプレートに B 16 /BL 6 マウスメラノーマ部分抽出物において，高濃度で有意に細胞増殖が抑えられ細胞を播種し，インキュベート後，２. １. １で調製した子た．また，子実体部分抽出物の投与による細胞形態への影

実体抽出液を終濃度エノキタケ湿潤重量 0，12 . 5，25，50

響は見られなかったが，廃菌床部分抽出物の投与により細（mg/ml）となるよう培地に添加し 24 時間培養後，アルカ胞が膨らみ，先端が枝状になるなど細胞形態が変化した．

ほぼ見られなかった．しかし，図３に示すように，廃菌床リ条件下でメラニンを抽出した．

− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

図２

図３

エノキタケ子実体部分における細胞毒性試験

エノキタケ廃菌床部分における細胞毒性試験

３. ２ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞のメラニン産生量に及ぼす食用キノコ抽出成分の影響
B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞に子実体部分抽出物を異なる濃度で投与した際の細胞の様子を図４に示す．また，メラニン産生量を図５に示す．図５に示した通り，メラニン産生量は子実体部分抽出物の濃度依存的に減少した．

３. ３ 食用キノコ抽出成分が B16/BL6 マウスメラノーマ細胞のチロシナーゼ活性に及ぼす影響
３. ３. １

図４ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞にエノキタケ子実体部分抽出物を種々の濃度で投与した際の細胞の様子

分光光度計を用いた評価

L-DOPA を基質としたときの B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞のチロシナーゼ活性を測定した結果を図６に示した．
図６に示す通り，子実体部分抽出物の濃度に依存してチロシナーゼ活性が低下したことが分かった．
３. ３. ２

酵素電気泳動法による評価

酵素電気泳動法により，B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞におけるチロシナーゼ活性を調べたところ，３. ３. １同様に子実体部分抽出物の投与によりチロシナーゼ活性が低下することが明らかになった（図７）．Image J にて得られ

図５ B16/BL6 マウスメラノーマ細胞にエノキタケ子実体部分抽出物を種々の濃度で投与した際のメラニン産生量たバンドを数値化したところ，子実体部分抽出物の濃度に依存してチロシナーゼ活性が有意に抑制されることが明らかになった（図８）．
３. ３. ３ウェスタンブロッティングによる評価

チロシナーゼタンパク発現量を測定したところ，チロシナーゼ発現量は有意ではなかったものの，子実体抽出物の濃度に依存して減少する傾向が見られた．

４．考図６ L-DOPA を基質とした B16/BL6 マウスメラノーマ細胞のチロシナーゼ活性察

美白は女性にとって最も興味のある美容だというだけでなく，近年のオゾン濃度の低下による紫外線照射量の増加による皮膚がんのリスク問題にとっても重要な役割を示すと言える．紫外線から守る働きを持つ褐色色素のメラニンであるが，過剰なメラニン色素の沈着は肌の老化を促進し，図７ 酵素電気泳動法による，子実体抽出物の B16/BL6 マウ
スメラノーマ細胞におけるチロシナーゼ活性への影響− 38 −

食用きのこ成分のメラノーマ細胞活性に及ぼす影響

本研究は PPO 抑制作用を食品であるキノコ抽出物から見出すものであり，さらなる検討により美白作用やそのメカニズムが解明され，安全・安心な化粧品が提供できる可能性が広がっていくだろう．美白効果のある安全な化粧品を安価で提供出来ることは，美しく豊かな人間生活の実現に寄与することが出来ると期待している．美容だけでなく，本研究成果により皮膚がんのリスクを減少させることは我図８ 酵素電気泳動法による，子実体抽出物の B16/BL6 マウ
スメラノーマ細胞におけるチロシナーゼ活性が国の保健衛生の向上に貢献できると考えられる．
（引用文献）
１）Encarnacion AB, Fagutao F, Hirayama J, et al.

過剰紫外線による細胞の損傷は皮膚がんの主因ともなってEdible Mushroom (Flammulina velutipes) Extract

いる．本研究では食用キノコ抽出物にメラニン産生を抑えInhibits Melanosis in Kuruma Shrimp (Marsupenaeus

る働きがあり，さらに B 16 /BL 6 マウスメラノーマ細胞のjaponicus). J. Food Sci., 76 ( 1 ), C 52 -C 58 , 2011 .

チロシナーゼ活性を抑制する効果があることを明らかにし

２）Bao HND, Ochiai Y, Ohshima T, Antioxidative
activities of hydrophilic extract prepared from solidた．

waste medium of mushroom (Flammulina velutipes)

エノキタケ子実体部分抽出物は細胞毒性がない（図２）cultivation. Biores. Technol., 101 , 6248 - 6255 , 2010 .

が，図３に示すようにエノキタケ廃菌床部分には高濃度帯で細胞毒性が見られた．また細胞形態の観察からも廃菌床

３）Jang MS, Sanada A, Ushio H, et al. Inhibitory effects

部分抽出物には細胞毒性がある可能性が示唆された．したof Enokitake mushroom extracts on polyphenol oxidase

がってエノキタケ廃菌床部分は直接肌に塗布する可能性のand prevention of apple browning. LWT-Food Sci.

ある化粧品への展開は適していないと考えられる．しかし，Technol., 35 : 697 - 709 , 2002 .

エノキタケ廃菌床部分も多くの廃棄物となりうることから，４）Montero P, Lopez-Caballero ME, Perez-Mateos M.

エノキタケ廃菌床部分の有効利用は今後の課題であるとも

The effect of inhibitors and high pressure treatment

いえる．今後はエノキタケ廃菌床部分の効果的な利用も展

to prevent melanosis and microbial growth on chilled

望に入れて研究を進める必要がある．

prawns (Penaeus japonicus). J. Food Sci., 66, 1201–1206,
2001 .

また，子実体部分抽出物においてメラニン産生抑制作用があることが明らかになった．エノキタケには PPO 活性５）Sugimoto K, Nishimura T, Nomura K, et al.

抑制作用があることを明らかにしていることから，エノキ

Syntheses of arbutin-a-glycosides and a comparison

タケ中の成分が PPO 活性を阻害し，その結果としてメラof their inhibitory effects with those of α-arbutin andニン産生を抑制したと考えられる，また，皮膚における色arbutin on human tyrosinase, Chem. Pharm. Bull. 51 ,

素沈着の原因となるメラニン色素の合成は紫外線やストレ798 - 801 , 2003 .

スといった様々な刺激により促進されるといわれている．

６）Choi SP, Kang MY, Koh HJ, et al. Antiallergic

活性酸素がメラニン産生を促進することが知られているこ

activities of pigmented rice bran extracts in cellとから，子実体抽出部分におけるメラニン産生抑制効果は

assays. J. Food Sci. 72 , S 719 –S 726 , 2007 .

エノキタケのもつ抗酸化成分による可能性がある．今後は７）樋口誠一，高橋学，山路明俊，小麦由来機能性成分の抗酸化評価試験などと組み合わせてメラニン産生抑制効果

新規利用技術の開発，埼玉県産業技術総合センター研究の詳細なメカニズムについて検討する必要がある．

報告，5，71 - 75，2007 .

チロシナーゼ活性についてはタンパク質発現量で有意な８）Roh JS, Han JY, Kim JH, et al. Inhibitory Effects of

差異は見られなかったものの，L-DOPA を基質とした酵素

active compounds isolated from safflower (Carthamus

活性および酵素電気泳動法での検討では子実体抽出部分にtinctorius L.) seeds for melanogenesis. Biol. Pharma.

よってチロシナーゼ活性が有意に低下することが明らかに

Bull. 27 , 1976 - 1978 , 2004 .

なった．今後はメラニン産生抑制およびチロシナーゼ活性９）Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein

に対するエノキタケ子実体抽出部分の作用機序の詳細な解

measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol.

析とともに PPO 前駆タンパク質抑制効果などと併せて作

Chem. 193 , 265 - 275 , 1951 .

用機序を検討していく予定である．

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