【研究報告】（自然科学部門）

自然免疫を基軸にした食による生体防御近（現緒言澤未歩

名古屋大学大学院生命農学研究科博士課程

東京大学大学院農学生命科学研究科特任助教）

る自然免疫活性化機構の解析を目的とし、検討を行った。

免疫系は、病原体など外来異物の感染から生体を予防するシステムであり、自然免疫と獲得免疫（適応免実験方法・結果疫）がある。自然免疫は病原体などの多様な抗原に対し

1.

修飾タンパク質結合因子としての補体 C1q の機能性解析て発動する初期防御機構であるが、外来抗原のみでな
1）

く、自己由来の内因性抗原を認識することができる 。

過去の検討において、プルダウンアッセイによるヒ自然免疫系に認識される内因性抗原には、アポトーシス

ト血清中の AGEs 結合タンパク質の探索を行ったとこ

細胞、細胞内分子や炎症タンパク質、翻訳後修飾を受けろ、補体 C1q が同定された。C1q は自然免疫系のエフェた自己分子などが挙げられる。自然免疫系による内因性クター分子の一種であり、補体古典経路の開始因子であ抗原の認識は重要なハウスキーピング機能であると考える4）。コラーゲン様ドメイン、球状ドメインから成るユられ、自己免疫応答の阻害にも重要である。病原体や微ニークな構造を持ち、およそ 410 kDa の巨大な分子を構

生物由来の外来抗原と自己由来の内因性抗原は、共通し成している。等温滴定型カロリメーターを用いた相互作た分子（自然抗体やスカベンジャー受容体）により認識用解析を行った結果、C1q と AGEs-BSA の間で相互作されることから、自然免疫系はこれら抗原の構造を厳密用に伴う発熱反応が確認され、直接的な相互作用が起に見分けているのではなく、抗原に共通した何らかのパこっていることを確認した（図 1）。

ターンを感知し、結合することが予想される。

また、C1q 上の AGEs 結合部位を明らかにするため、非酵素的な翻訳後修飾のひとつである糖化は、糖とC1q ペプチドを用いた競合アッセイを行ったところ、AGEsタンパク質の反応であり、酵素的に起こるグリコシル化とは区別される2）。グルコースなどの還元糖はタンパク質、核酸、脂質などのアミノ基と反応し、シッフベース、アマドリ産物を生成し、最終的には最終糖化産物（Advanced Glycation Endproducts: AGEs）を生成する。
AGEs は、糖尿病の際の高血糖状態や加齢により生体内に蓄積することが確認されており3）、糖化に伴う修飾、架橋形成、不溶化、機能の低下などは、組織の機能障害の一因であると予想されている。AGEs が抗原性を持つことや、獲得免疫系を活性化して抗体産生を引き起こすこと、自己免疫応答を誘発することが知られるが、自然免疫応答との関与については未解明な部分が多い。
老化や疾病時には自然免疫系の機能が低下することが知られるが、自然免疫系の機能を適切な活性化状態に図1維持することは、疾病の一次予防として重要であると考えられる。本研究課題では、自然免疫系分子である補体等温滴定型カロリメーターによる AGEs と C1q の相互作
用解析

BSA と C1q では相互作用は認められないが、AGEs と C1q では相互作用に伴う発熱が確認された。

C1q のAGEs 結合分子としての機能性解析、食品成分によ1近澤未歩が明らかとなった（図 2B）。また、AGEs と C1q の結合アッセイの際、バッファー中に NaCl を高濃度添加すると、結合はほぼ 100％阻害されることからも、相互作用には電荷が関与する可能性が高いと考えられた（図2C）。
次に、AGEs に C1q が結合することによる生体の機能性について明らかにするため、分化 THP-1 細胞に蛍光標識した AGEs とヒト血清を共投与し、AGEs の取り込みをフローサイトメトリーにて確認した結果、血清の投図2

与により AGEs の取り込みは大きく増加することが明ら

AGEs–C1q の相互作用と電荷かとなった（図 3）。C1q 除去血清では取り込み促進は起

A. Competitive Assay で 用 い た C1qA（14–26） ペ プ チ ド 配 列。
B. C1qA（14–26）ペプチドを用いた Competitive ELISA。C. NaCl添加による AGEs–C1q 相互作用阻害。C1qA（14–26） ペプチドの塩基性アミノ酸の数を減らすことで、AGEs–C1q 相互作用の阻害活性が消失した。スクランブルペプチドは阻害活性を持つことから、C1qA（14–26）の配列は重要でないことがわかる。また、AGEs–C1q 結合アッセイの際、Buﬀer 中に NaCl を添加することにより相互作用が阻害された。

こらないが、C1q 除去血清に精製 C1q を添加することで、通常血清と同程度まで取り込みが回復することか
ら、血清による AGEs 取り込み促進における C1q の重要性が示唆された。
2.

カテキン類による自然免疫系活性化の検討
これまでの検討により、緑茶中に含まれるフラボノイドの一種であるエピガロカテキンガレート（EGCG）とヒト血清アルブミン（HSA）をインキュベートする
ことにより、マウス血清中の IgM 自然抗体との交差性が上昇することが確認された。また、EGCG–HSA の抗原性の上昇に伴い、酸化タンパク質の指標であるカルボニルタンパク質が生成していることも明らかとなり、
EGCG は HSA と反応することで、内因性抗原と類似する特性を生み出し、自然免疫応答を活性化することが予想された。そこで、EGCG の自然免疫調節機能について解析を行った。
図3

まず、EGCG 摂取により、自然免疫応答が活性化されマクロファージによる AGEs 取り込み実験るかについて検討した。マウスに PBS で溶解した EGCG

THP-1 細 胞 に 蛍 光 標 識 し た AGEs と ヒ ト 血 清 を 共 投 与 し、AGEs の取り込みをフローサイトメトリーで測定した。通常ヒト血清（NHS）添加により AGEs 取り込みは促進されるが、C1q 除去血清（C1q-deﬁcient serum）では取り込みは促進されなかった。また、C1q 除去血清に精製 C1q を添加することでAGEs 取り込み促進活性が回復した。** <0.01（Tukeyʼs test）（1 匹当たり 10 mg）を経口投与し、24 時間後に採血を行い、血中の IgM 抗体量とカルボニルタンパク質量をELISA に よ り 測 定 し た。 そ の 結 果、EGCG 投 与 群 はPlacebo 投与群と比較し血中 IgM 抗体量の増加、カルボニルタンパク質量の減少傾向が確認された（図 4）。

は C1qA 鎖の 14–26 番目の領域（C1qA（14–26））に結合す

次に、タンパク質の EGCG 処理により、タンパク質のることが明らかになった。C1qA（14–26） はリジン、アル構造変化が起こっていると予想し、どのような構造が生ギニンといった塩基性アミノ酸を豊富に含む領域であ成されているのか明らかにするため、LC-MS/MS によるり、リガンドとの相互作用には電荷が重要であることがアルデヒドの検出を試みた。アルデヒドは -Aminobenzoic

予想された。そこで、通常 C1qA（14–26）に 5 個存在する塩Acid（ABA）と NaCNBH3 を用いた還元アミノ化反応に基性アミノ酸を 2 個、0 個に減らしたペプチドを作製し、より標識し、LC-MS/MS による検出を行った5）。その結競合アッセイを行った結果、塩基性アミノ酸が 2 個以下

果、EGCG–HSA より、Lysine 残基由来のカルボニル化になることにより、結合阻害活性が完全に消失すること合物である α-aminoadipic semialdehyde（AAS）が検出
2

自然免疫を基軸にした食による生体防御構造が生成することを確認した。EGCG 処理により、AGEs などの翻訳後修飾と同様にタンパク質の構造変化が起こり、表面電荷が減少することで、自然免疫応答を活性化する性質が付与されることが予想される。マウスへの投与実験においても、EGCG による自然免疫系活性化の可能性が示唆されたが、生体内でどのようなメカニズムで活性化が起こっているのかについては今後より詳図4細な検討が必要である。

EGCG 投与マウス血清中の IgM 抗体量、カルボニル量の変化

これまでに得られた結果より、自然抗体や C1q によ

マウスに PBS に溶解した EGCG を経口投与し、24 時間後に採血を行った。血清中の IgM 抗体量、カルボニルタンパク質量をELISA により測定した。* <0.05（Studentʼs -test）

る抗原認識においては、糖化などの修飾や EGCG 処理に伴うタンパク質の表面電荷の減少が重要であることが予想された。病原体や内因性抗原の特定の構造ではなく、電荷の変化を指標とする抗原認識は、多様な抗原に対して自然免疫系が速やかに対応するためのメカニズムのひとつであることが予想される。
要約
AGEs と相互作用する血清因子として補体 C1q を同定し、その相互作用メカニズムや生体における機能性について解析を行った。結果、C1q と AGEs は両者の表面電荷を介して直接的に相互作用すること、C1q が AGEs に結合することでマクロファージによる AGEs の取り込み図5を促進することを明らかにした。また、自然免疫応答活EGCG 処理 HSA 中のカルボニル検出性 化 に 寄 与 す る こ と が 予 想 さ れ る 食 品 成 分 と し て、Lysine 由 来 の カ ル ボ ニ ル で あ る AAS を ABA に よ り 標 識 し、
LC-MS/MS により検出した。結果、HSA を EGCG 処理することにより、AAS が生成することを確認した。

EGCG に着目し検討を行った。結果、EGCG はタンパク質の Lysine 残基を修飾することで、タンパク質の自然抗体に対する抗原性を上昇させ、自然免疫系を活性化さされた（図 5）。

せることが示唆された。

考謝察

辞

今回、内因性抗原のひとつである AGEs の自然免疫系本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りましたによる認識や、生体内における機能性を明らかにするた公益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様にめに検討を行った。AGEs の蓄積は、老化や糖尿病に伴深く感謝申し上げます。

う 種 々 の 機 能 変 化 に 関 与 す る こ と が 予 想 さ れ る が、文

AGEs 蓄積を防ぐための機構のひとつとして、補体 C1qによる AGEs の認識、マクロファージによる AGEs 除去

献1） C. J. Binder:, 30, 56–60, 2010.
2） R. Singh, et al.:
, 44, 129–146, 2001.
3） J. A. Dunn, et al.:
, 28, 9464–9468, 1989.
4） U. Kishore, U. B. M. Raid:, 49,159–170, 2000.
5） M. Akagawa, et al.:
, 19, 1059–1065,2006.

促進が重要である可能性が示唆された。
また、食品成分である EGCG がタンパク質の自然抗体に対する抗原性を増大させること、タンパク質のEGCG 処理により、酸化修飾に伴い生成するカルボニル

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