ヒト皮膚における血管新生刺激サイトカインの発現とその作用機序に関する包括的研究
聖マリアンナ医科大学

相

馬

良

皮膚科

直

Background: Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces proliferation of endothelial cells and in vivo
angiogenesis. The regulation of the secretion of VEGF from human skin fibroblasts has not been well investigated,
although paracrine interactions between fibroblasts and endothelial cells have been suggested to play a key role ingranulation tissue formation. Objective: To explore the significance of human skin fibroblasts as a source of VEGF in
granulation tissue formation. Methods: VEGF secreted from cultured human skin fibroblasts was measured by ELISA.
VEGF mRNA expression was examined by real-time polymerase chain reaction analysis. Results: Transforming growth
factor-β1, platelet-derived growth factor-BB and interleukin-1α strongly up-regulated VEGF secretion from human skinfibroblasts. Epidermal growth factor, transforming growth factor-α, basic fibroblast growth factor, tumor necrosis
factor-α and interferon-γ had no significant effects on VEGF secretion. Transforming growth factor-β1, platelet-derived
growth factor-BB and interleukin-1α acted synergistically each other. The levels of secreted VEGF after the stimulationof these cytokines were high enough to exert its biological activities. Interferon-γ enhanced interleukin-1a-induced VEGF
production but diminished the effect of transforming growth factor-β1. The results of ELISA were confirmed at the mRNAlevel by real-time polymerase chain reaction analysis, except for the synergistic effect of interferon-γ with interleukin-1α.
Conclusions: Fibroblasts could be an important source of VEGF during wound healing. Paracrine interactions between
fibroblasts and endothelial cells via VEGF may play a key role in the formation of granulation tissue.

１

緒ていると考えられている。このような背景のもと、培養ケラチ

言ノサイトによる VEGF 発現は非常に詳しく調べられており、

Vascular endothelial growth factor（VEGF）は血管内皮

epidermal growth factor（EGF），transforming growth factor-

細胞に特異的に働き、その増殖を刺激する細胞増殖因子でβ1（TGF-β1），interleukin-1β（IL-1β），interleukin 4（IL-4），ある。ホモダイマー構造を持つ分子量 40-45kDa の糖蛋白で、interferon-γ（IFN-γ），tumor necrosis factor-α（TNF-α），短波

内皮細胞の表面にある２種類の特異受容体に結合して活性長紫外線、過酸化水素などの酸化剤、低酸素状態などがを発揮する。mRNA の alternative splicing による５種のア

VEGF 発現を誘導することが知られている６）− 10）。このようイ ソ フ ォ ー ム が 知 ら れ、 大 き い 方 の ２ つ、 す な わ ちに、皮膚の創傷治癒においてはケラチノサイトが VEGF

VEGF189 と VEGF206 は細胞表面に結合した状態で、小さの主要な供給源と考えられてきた。

い方の３つである VEGF121、VEGF145、VEGF165 は分泌

創傷治癒の場においては、良好な肉芽組織の形成が重要型で存在する。この３種の分泌型アイソフォームは内皮細であり、肉芽組織は炎症性細胞、新生血管、線維芽細胞か胞の増殖を刺激し、
in vivo において血管新生を刺激する１）２）。

ら成っている。この血管新生に VEGF が主要な役割を果た

ヒト皮膚においてはケラチノサイトが VEGF を産生、分していると考えられている。皮膚潰瘍の治癒には活発な血３）

泌することが知られている 。血管新生が行われている創管新生を伴う肉芽組織の形成が必須であるが、潰瘍底には傷治癒の場において、創傷辺縁のケラチノサイトは VEGF

ケラチノサイトは存在せず、この肉芽形成にケラチノサイト由を発現し、後期においては創を被覆すべく遊走してきたケ

来の VEGF が作用していないことは明らかである。一方、

ラチノサイトにも VEGF の発現が見られる 。また VEGF

肉芽組織における血管新生には、線維芽細胞と血管内皮細受容体は創傷の血管の内皮細胞に強く発現している 。正常胞の paracrine interaction が大きな役割を果たしているこのマウスでは創傷部に VEGF 発現が認められるのに対し、創とが、種々の共培養系を用いた実験で示唆されているが 11）−

傷治癒が遅延したマウスでは VEGF 発現は低下している 。

13）

これらの結果から VEGF が創傷治癒に重要な役割を果たし

かっていない。

４）

５）

６）

、その paracrine がどのような分子を介しているのかは分
無刺激状態でのヒト皮膚線維芽細胞における VEGF 産生

Comprehensive studies on the expression
and working mechanisms of angiogenic
cytokines in human skin

量は、ケラチノサイトのそれと比べて非常に低い 14）。しかYoshinao Soma

個々の細胞から分泌される VEGF は微量であっても、全体

Department of Dermatology, St. Marianna
University School of Medicine

としては無視できない量に達する可能性もある。我々は線し線維芽細胞は肉芽組織中に最も多数存在する細胞であり、維芽細胞から分泌される VEGF が、線維芽細胞と血管内皮細胞の paracrine interaction における最重要分子であるとの仮− 23 −

説を掲げ、その可能性を検証しようと考えた。ヒト皮膚線

2. 4

維芽細胞からの VEGF 分泌はこれまでにほとんど調べらStudent's t-test を用いて統計解析を行った。

れていない。我々は種々の growth factor やサイトカイン

３を、単独あるいは組み合わせて線維芽細胞に作用させ、その VEGF 産生を調べた。その結果、潰瘍底の肉芽形成においては、線維芽細胞から産生分泌される VEGF が重要

2. 1

実

結

果

3. 1 個々のサイトカインのヒト皮膚線維芽細胞のVEGF 分泌に及ぼす影響であると考えられたので、以下に報告する。

２

統計解析

ヒト皮膚線維芽細胞からの VEGF 分泌に及ぼす種々のサイトカインの影響を Fig. １に示す。TGF-β1, PDGF-BB験と IL-1α は 強 力 に VEGF 分 泌 を 増 加 さ せ た が、EGF,

細胞培養とサイトカイン

TGF-α, bFGF, TNF-α と IFN-γ は有意な効果を示さなかっ

手術時に採取した皮膚片より定法通りにヒト皮膚線維芽細胞を培養し、継代数４から６の細胞を実験に供した。培た。TGF-β1、PDGF-BB、IL-1α の VEGF 分泌増加作用はそれぞれ 15 倍、5 倍、10 倍であった。

養液には 10％のウシ胎児血清を加えた Eagle minimum
essential medium（MEM）を使用した。遺伝子組換えヒ3. 2 サイトカインの組み合わせによる VEGF 分泌の変化

ト T G F - β1, I L -1α , I F N - γ は R & D S y s t e m s I n c .

予備実験において、EGF, TGF-α, bFGF, TNF-α は単独（Minneapolis, MN）より購入した。遺伝子組換えヒト

でも他のサイトカインと組み合わせても、線維芽細胞から

platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB), EGF,の VEGF 分泌を変化させなかったが、IFN-γ は他のサイ

basic fibroblast growth factor（bFGF), TGF-α は Pepro

トカインと組み合わせるとある作用を示すという結果が得

Tech EC Ltd.（London, UK) から、遺伝子組換えヒトられた。そこで、IFN-γ を PDGF-BB, IL-1α, TGF-β1 と組

TNF-α は Genzyme/Techne（Boston, MA）より購入した。

み合わせた場合の効果について検討した。Fig. ２に示すよ
う に、IFN-γ は 単 独 で は 効 果 を 示 さ な い が、IL-1α の

2. 2

Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）

VEGF 分泌刺激作用を増強させ、TGF-β1 の作用を減弱さ

24 穴プレートでコンフルエントになるまで培養したヒ

せ た。PDGF-BB の 作 用 に は 影 響 し な か っ た。 ま た、ト皮膚線維芽細胞を無血清 MEM 培地で 48 時間培養し、飢餓状態としたのち、培地を吸引し、種々のサイトカイン
を加えた無血清 MEM 培地 0.5 ml を加えた。37℃で 48 時
間培養後、培養上清を回収し、凍結保存した。細胞数はCoulter Counter（Beckman Coulter, Japan) で計測した。
培養上清中の VEGF 濃度は IBL 社（Gunma, Japan）より購入した ELISA キット（感度 7.8 pg/ml）を用いて行った。

2. 3 RNA 抽 出 と real-time polymerase chain
reaction（real-time PCR）
T-25 培養フラスコでコンフルエントになるまで培養したヒト皮膚線維芽細胞を無血清 MEM 培地で 48 時間培養し、飢餓状態としたのち、培地を吸引し、種々のサイトカ
インを加えた無血清 MEM 培地を加えた。37℃で８時間
培養後、細胞を回収し、SV Total RNA Isolation System（Promega Co., Madison, WI）を用いて、全 RNA を抽出した。
1st Strand cDNA Synthesis KIT for RT-PCR（RocheDiagnostics Co., Indianapolis, IN）を用いて逆転 反応を行い、1 mg の全 RNA より cDNA を合成した。増幅反応はLightCycler-Primer Set Human VEGF と LightCycler
FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche）を用いて行った。LightCycler Software Ver. 3.5 にてデータを抽出し、Excel（Microsoft, Redmond, WA）を用いて解析した。

Fig. 1
Effects of individual cytokines on the secretion of
VEGF from human skin fibroblasts. Confluent cultures of human skin fibroblasts were serum-starved for 48 hours. Thencells were treated with 10 ng/ml of TGF-β1, PDGF-BB, IL-1α,
EGF, TGF-α, bFGF, TNF-α, or 500 U/ml of IFN-γ for 48
hours. VEGF concentrations in the conditioned media were
determined by ELISA. Data are expressed as mean ± SD of
triplicate determinations. *P<0.05; ***P<0.001− 24 −

ヒト皮膚における血管新生刺激サイトカインの発現とその作用機序に関する包括的研究

PDGF-BB, IL-1α, TGF-β1 の組み合わせの効果を調べたと

3. 4

IFN-γ が IL-1α と TGF-β1 の作用に及ぼす影響

ころ、この３つのサイトカインはそれぞれ相乗的に作用す

IFN-γ が IL-1α と TGF-β1 の作用に及ぼす影響をさらにることが示された（Fig. ２）。３種すべてを加えた場合に検証するため、種々の濃度の IFN-γ を IL-1α、TGF-β1 ともっとも強い VEGF 分泌刺激作用がえられ、TGF-β1 と共に加え、VEGF 分泌を調べた（Fig. ４）。100, 300, 500

PDGF-BB の組み合わせがそれに次いだ。これらのサイト

U/ml の IFN-γ は IL-1α による VEGF 産生刺激作用を増強

カインによる刺激作用の強力さは驚くべきもので、無刺激したのに対し、同じ濃度の IFN-γ は TGF-β1 の VEGF 産の細胞から分泌される VEGF は 5.4±1.0 pg/10 cells に過生刺激作用を減弱させた。すなわち IFN-γ は線維芽細胞かぎないが、３種すべてを加えた場合の VEGF 分泌は 551.0

らの VEGF 分泌に関して、bifunctional に作用することが±38.3 pg/10 cells に及び（Fig. ２）、約 100 倍の刺激効

示された。

5

5

が示された。３種すべてを加えた場合の培養上清中のVEGF 濃度は 1.6 ng/ml であり、VEGF の生物学的活性を発揮するのに十分な濃度であった。

3. 5 サイトカインで刺激された細胞の VEGF 発現のreal-time PCR による検討
Real-time PCR の結果を Fig. ５に示す。TGF-β1, PDGF-

3. 3

PDGF-BB と TGF-β1, IL-1α の相乗作用

BB, IL-1α は VEGF mRNA 発現を有意に増加させ、これ種々の濃度の PDGF-BB と TGF-β1 または IL-1α を一緒に加は ELISA の結果とよく一致していた。PDGF が IL-1α やえた場合の VEGF 分泌を調べたのが Fig. ３である。TGF-β1,

TGF-β1 と相乗的に作用することも ELISA と同様であっ

IL-1α, PDGF-BB は単独でそれぞれ 28 倍、12 倍、10 倍の刺激

た。IFN-γ は TGF-β1 の VEGF 発現増強作用を有意に減弱効果を示したが、PDGF-BB を TGF-β1 または IL-1α と組み合させ、これも Fig. ４に示す ELISA の結果とよく一致してわせると、PDGF の濃度に依存して VEGF 分泌は増加した。

いた。しかし IFN-γ は IL-1α による VEGF mRNA 発現増

TGF-β1 と PDGF-BB の組み合わせ、IL-1α と PDGF-BB の加作用に対し有意の影響を与えず、これは ELISA の結果

組み合わせでの最大効果は、それぞれ 69 倍と 44 倍であった。

と一致しなかった。

Fig. 2
Effects of the combinations of cytokines on VEGF
secretion. Confluent cultures of human skin fibroblasts wereserum-starved for 48 hours. Then cells were treated with 10
ng/ml of TGF-β1, PDGF-BB, IL-1α, and/or 500 U/ml of IFN-γ
for 48 hours. VEGF concentrations in the conditioned media
were determined by ELISA. Data are expressed as mean ±SD of duplicate determinations. NS: not significant; *P<0.05;**P<0.01

Fig. 3
Synergistic effects of PDGF-BB with TGF-β1 or IL-1α.
Confluent cultures of human skin fibroblasts were serumstarved for 48 hours. Then cells were treated with 10 ng/ml
of TGF-β1 or IL-1α with or without the indicated concentrations of PDGF-BB for 48 hours. VEGF concentrations in theconditioned media were determined by ELISA. Data are expressed as mean ± SD of duplicate determinations.

− 25 −

Fig. 5
Real-time PCR analysis of VEGF expression in cells treated with cytokines. Confluent cultures of human skin fibroblasts were serum-starved for 48 hours. Then cells were treated with 10 ng/ml of TGF-β1, PDGFBB, IL-1α and/or 500 U/ml of IFN-γ for 48 hours. Total RNA was extracted from the cells, reverse transcribed
into cDNA, which was then subjected to the real-time PCR analysis as described in Materials and Methods.
Expression levels for VEGF were normalized to the amount of GAPDH mRNA and indicated relative to its expression level in untreated cells. As a reference, cells treated with TGF-β1 and PDGF-BB were taken. Data
are expressed as mean ± SD of triplicate determinations. NS: not significant; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

Fig. 4
Effects of IFN-γ on VEGF secretion induced by IL-1α and TGF-β1. Confluent culturesof human skin fibroblasts were serum-starved for 48 hours. Then cells were treated with 10 ng/
ml of IL-1α (A) or TGF-β1 (B) with or without the indicated concentrations of IFN-γ for 48 hours.
VEGF concentrations in the conditioned media were determined by ELISA. Data are expressed
as mean ± SD of duplicate determinations.

− 26 −

ヒト皮膚における血管新生刺激サイトカインの発現とその作用機序に関する包括的研究

４

考

ELISA の結果と real-time PCR の結果に乖離が認められ察たため、我々は同じ実験を２回繰り返したが結果は同じ

肉芽組織の形成には、マクロファージの集積、線維芽細で、IL-1α 単独の場合と IL-1α と IFN-g の両方を加えた場

胞の遊走と増殖、細胞外基質の蓄積、血管新生などのステ合とで、VEGF mRNA 発現量に差はなかった。このこと

ップが必要である。これらの現象は様々な細胞増殖刺激因

か ら、 お そ ら く は IFN-γ と IL-1α の 相 乗 作 用 は post-

子や走化性因子、すなわち PDGF, TGF-β, EGF, bFGF,

transcriptional なレベルで働いているものと思われた。まVEGF, IL-1, TNF-α, insulin-like growth factor, connective

た我々は、IFN-γ が TGF-β1 による VEGF 産生刺激作用を

tissue growth factor, IFN-γ などにより制御されている15）抑制する効果があることを、ELISA および real-time PCR− 17）。本研究では、皮膚線維芽細胞が創傷治癒におけるで示した。同様の現象は Trompezinski らによって蛋白レ

VEGF の主要な産生源となりうる可能性を検討するため、ベルでのみ示されている８）。このことから、IFN-γ は線維種々の細胞増殖因子やサイトカインが、線維芽細胞の芽細胞からの VEGF 分泌の制御において bifunctional な

VEGF 産生に及ぼす影響について調べた。

作用をもつサイトカインであると思われた。

線維芽細胞における VEGF の誘導は、ケラチノサイト

PDGF と TGF-β1 は創傷治癒の早期の段階で血小板からのそれと比べ、十分に検討されていない。マウスの線維芽放出される。IL-1 と IFN-γ は単球やマクロファージなどの細 胞 株 で あ る NIH/3T3 や AKR-2B に お い て PDGF と種々の炎症細胞から放出される。すなわち、これらのサイ

TGF-β が VEGF を誘導すること、低酸素状態がヒト

トカインは創傷治癒の場に確実に存在し、重要な役割を担

皮膚線維芽細胞の VEGF 発現を増強させること 10）20）、低っ て い る と 考 え ら れ て い る 15）16）。 本 研 究 に お い て、酸素状態、TGF-β, PDGF, IL-1 がヒト滑膜線維芽細胞のPDGF-BB、TGF-β1、IL-1α は強力な VEGF 誘導作用を有VEGF 発現を誘導することすることが明らかとなり、さらに IFN-γ はこれらの VEGF

21）18）19）などが断片的に報告されているに過ぎない。最近 Trompezinski らは一連の報告で、誘導に対し bifunctional に作用することが明らかとなった。

ヒト皮膚線維芽細胞からの VEGF 分泌は TGF-β、紫外線

そしてこれらの刺激により線維芽細胞から放出された

照射、prostaglandin E2、IL-4 により増強されることを示

VEGF は、生物学的活性を十分に発揮できる濃度であった。

す一方、常状態における線維芽細胞からの VEGF 分泌は以上より我々は、線維芽細胞がヒト創傷治癒における

ケラチノサイトからのそれに比べてきわめて少量であり、VEGF の重要なソースであり、VEGF を介する線維芽細

しばしば検出限界以下であると述べている胞と血管内皮細胞の相互作用が、肉芽形成において中心的。本研

８）14）22）

究で我々は、TGF-β1 だけでなく PDGF-BB と IL-1α もヒな役割を果たしているのではないかと結論した。

ト皮膚線維芽細胞からの VEGF 分泌を強力に刺激することを初めて示した。TGF-β1, PDGF-BB, IL-1α による分泌（文

増加は、それぞれ 15 から 28 倍、5 から 10 倍、10 から 12

１） Ferrara N, Houck K, Jakeman L et al: Molecular and

倍という目覚ましいものであった（Fig. １, ３）。さらにこbiological properties of the vascular endothelial growth

れらのサイトカインによる増強作用は相乗的であり（Fig.

factor family of proteins. Endocr Rev, 13: 18-32, 1992.

２）、この３種すべてを作用させた場合には、培養上清中

２） Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S et al: Vascular

VEGF 濃度は 1.6ng/ml に達した。これは VEGF の血管内

endothelial growth factor (VEGF) and its receptors.

皮細胞増殖作用を発揮するのに十分な濃度である。これら

献）

FASAB J, 13: 9-22, 1999.

の 組 み 合 わ せ に よ る 相 乗 的 な VEGF 分 泌 刺 激 作 用 は、

３） Ballaun C, Weninger W, Uthman A et al: Human

real-time PCR による分析で、mRNA レベルでも証明されkeratinocytes express the three major splice forms ofた（Fig. ５）。

vascular endothelial growth factor. J Invest Dermatol,

IFN-g 自 体 は VEGF 分 泌 に 何 の 作 用 を 持 た な い が、

104: 7-10, 1995.

IL-1α と一緒に加えた場合には、IL-1α の VEGF 分泌刺激

４） Brown LF, Yeo K-T, Berse B et al: Expression of

作用を増強させた。IFN-γ と IL-1 はいずれも重要な炎症性vascular permeability factor (vascular endothelial

サイトカインであり、両者の相乗効果はケラチノサイトに

growth factor) by epidermal keratinocytes during

おける inducible nitric oxide synthase（INOS）誘導 23）、

wound healing. J Exp Med, 176: 1375-1379, 1992.

同じくケラチノサイトにおける RANTES 誘導、内皮細５） Peters KG, de Vries C, Williams LT: Vascular

24）など、いくつかの現象において

endothelial growth factor receptor expression during

報告されている。本研究により、線維芽細胞からの VEGF

embryogenesis and tissue repair suggests a role in

分泌刺激も、これらの炎症性サイトカインの重要な作用のendothelial differentiation and blood vessel growth.

一つである可能性が初めて示唆された。この点についてはProc Natl Acad Sci USA, 90: 8915-8919, 1993.

胞における bFGF 誘導25）− 27 −

６） Frank S, Hubner G, Breier G et al: Regulation of17） Nickoloff BJ, Naidu Y: Perturbation of epidermal

vascular endothelial growth factor expression in

barrier function correlates with initiation of cytokine

cultured keratinocytes. J Biol Chem, 270: 12607-12613,

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− 28 −