ノックアウトマウスによる cell envelope のバリアー機能解析
京都府立医科大学

山西皮膚科学教室

清文

At the cell periphery of the stratum corneum is the cell envelope, a highly insoluble membranous structurecomposed of proteins polymerized via ε-(γ-glutamyl) lysine cross-linking. We generated mice with defective cellenvelope by gene targeting for transglutaminase 1. The skin barrier function of TGase 1-/- neonates, assessed bymeasurement of TEWL, by in vitro diffusion of mannitol, and by in vivo transdermal absorption of lucifer yellow, wasmarkedly impaired, and these mice died within 4-5 h after birth. This knock-out study has clearly demonstrated thatthe cell envelope formation by TGase 1 gene is essential for maintenance of the skin barrier function.

るエラフィン、シスタチン−α も見出され、微生

１ 緒 言物のプロテアーゼに対して抵抗性であることか

細胞は形質膜によって外界から隔てられた環ら、微生物に対する生体防御にも関わることが境を維持し、生命活動を可能にしているが、われ示唆される。ε−（γ − glutamyl）lysine 結合を触われの生体を外部環境から保護し、内部環境を保媒する酵素として、transglutaminases（TGases）

つ生物学的なシステムとして、体表面に角質が産（E 2 . 3 . 2 . 13）の存在が知られているが、TGase生される。角質は皮膚の表層を構成する表皮細２（tissue TGase）は各組織に広く発現するのに胞（角化細胞）が終末分化（角化）の結果、細胞そ対し、表皮角化細胞では、TGase １（keratinocyteのものが特異な変化をとげて作り出される構造TGase）と TGase ３（epidermal TGase）が特異的である 。形態的には、細胞内には、細胞骨格をに発現すること２〜５）、さらに、遺伝性皮膚疾患で構成するケラチン中間径線維がフィラグリンとある常染色体劣性葉状魚鱗癬（MIM 242300）の家ともに凝集して充満し、細胞の周囲には 15 から系において TGase １の突然変異が見出され６、７）、20 nm に肥厚した電子密度の高い膜様構造が形

葉状魚鱗癬の一部の患者において cell envelope成される。この構造は cell envelope（電顕的にはの形成不全が見られることから、TGase １が cellmarginal band) とよばれ、不溶性で化学的な抵抗envelope の形成に関与する可能性が推測される。

性を有する ε −（γ − glutamyl）lysine 結合で架橋

本研究では、TGase １のジーンターゲティングにされた蛋白から成り、機械的あるいは化学的侵襲

より TGase １遺伝子破壊マウスを作製し８）、cellに対する障壁として機能すると考えられている。

envelope の形成における TGase １の役割を明確

また、cell envelope を構成する蛋白として、ロリにし、cell envelope の障害にともなう皮膚バリア

クリン、インボルクリン、コーニフィンなどの構ー機能の変化を解析した。

１）

造蛋白以外に、プロテアーゼインヒビターであAnalysis of cell envelope for skinbarrier function in Knockout mice
Kiyofumi Yamanishi
Department of Dermatology, kyoto
Prefectural University of Medicine

２ 実 験
pPNT および ES 細胞 R 1 は、それぞれ、Dr. R.
Mulligan、Dr. A. Nagy より供与された。mouseTGase 1 genomic DNA は 129 /SVJ genomiclibrary（Stratagene）をスクリーニングして得られ、その５' 上流 5 . 5 kb と exon ３より３' 側− 100 −ノックアウトマウスによる cell envelope のバリアー機能解析の 2 . 5 kb の領域を pPNT の Xba I − Kpn I およマウスゲノムライブラリーからクローンニング

び Xho I − Not I site に挿入し、pPNTmtg １をした TGase １ゲノム DNA を用いて、pPNT を構築した。１× 10 個の ES 細胞に直鎖化したもとに、exon １から３が Neo によって破壊されpPNTmtg １（25 µg）を electroporation で導入後、るようにデザインしたターゲティングベクター

G 418（150 µg/mL）と gancyclovir（0.51µg/mL）を構築し８）、ES 細胞株 R １に導入後、G 418 と７で選択を行い、ES 細胞コロニーを PCR（primers:gancyclovir による posotive − negative selection

P 1、P 2）と Southern hybridization（probe 1、2）を行い、TGase １遺伝子の一方の allele に相同組で解析し、相同組み換えを起こした ES クロー換えをおこした ES クローンを単離した。ES クンを単離した。ES クローン由来 F ２ マウスの遺ローン # 27 と # 32 を C 57 BL/ 6 マウスの胚盤胞伝子型は、PCR（primers : P ３、P ４、P ５）とにマイクロインジェクションし、偽妊娠マウスにSouthern hybridization（probe １、２）で解析し移植した。その結果、# 27 よりキメラマウスがた。Northern hybridization には Oligotex dT 30得られ、キメラマウスと B 6 を交配しヘテロマウ（TAKARA）で部分精製した５µg の poly（A）

ス（TGase １＋ / −）を得、さらにヘテロマウス同RNA を用い、各 TGase cDNA に対応する RT −士を交配して TGase １欠損マウス（TGase １− / −）PCR 産物をプローブにした。Hematoxylin − eosinを作製した。TGase １− / −における TGase ファ

染色および in situ hybridization には４µm パラ

ミリーの mRNA を Northern blotting で解析したフィン組織切片を用いた。In situ hybridization

ところ、TGase １mRNA は、TGase １＋ / −ではは digoxigenin ラベルマウス TGase １およびTGase １＋ / ＋の 1 / 2 であったが、TGase １− / −でkeratin 14 antisense cRNA probe を用いて行った。

は検出されなかった。また、TGase ２、TGase

蛍光抗体法によるロリクリンの観察には、抗マウ３mRNA には変化が認められなかった。

＋TGase １− / −新生仔マウスは、やや体格が小さス・ロリクリン抗体（BAbCo）を用いた。透過電く、皮膚は緊張して皺襞が少なく、紅皮症状態を顕による観察は、常法に従って実施した。
経皮水分蒸散（TEWL）の測定には Courage呈した（図１）。TGase １− / −は生後全くほ乳せず、and Khazaka Tewameter TM 210 を用いた。In4 - 5 時間のうちにで死亡した。なかには、葉状魚

vitro における経皮吸収の測定は、新生仔マウス 背 部 皮 膚 を 採 取 し、 拡 散 セ ル（ 有 効 表 面 積: 0 . 126 cm 2）に挟んで 37℃ Ringer 液（pH 7 . 4）に平衡化したのちに、表皮側に［３H］mannitol（NEN）（10 µCi/mL）を添加後、500 µL の溶液を真皮側から採取し、その直後に等の Ringer 液を添加する操作を経時的に行った。In vivo における蛍光色素の経皮吸収は、新生仔マウスをペトリ皿に固定し背部を１mM lucifer yellow を含む Ringer液（pH 7 . 4）に１時間浸したのちに、背腹方向に５µm の凍結切片を作製し、propidium iodide（５µg/mL）で対比染色後、蛍光顕微鏡で観察した。

３ 結 果
TGase １のジーンターゲッティングは、129SVJ− 101 −

図１ TGase １欠損マウスの肉眼的所見
正常新生仔マウス（上）に比較して、TGase １欠損マウスは（下）は体格が小さく、皮膚は緊張し、皺壁が粗く、紅皮症状態である。

鱗癬の新生児でみられる collodion baby を思わせ障害が示唆された。

るような、透過性のうすい膜で包まれている新生仔も認められた。

皮膚の生理学的な指標として、皮膚のバリアー機能を解析するために、まず、エバポリメーター−/

新生仔マウス皮膚の HE 染色像では、TGase １を用いて経皮水分蒸散 TEWL の測定を行った。

−の表皮は伸展し、角層は、正常マウスでみられその結果、TGase １＋ / ＋や TGase １＋ / −に比し、る明確な層状構造とは異なり、均質で、下層からTGase １− / −の TEWL は 100 倍以上亢進してい中層にかけて扁平なケラトヒアリン顆粒の残存ることが明らかになった（図３）。また、新生仔が認められた。In situ hybridization では、正常皮膚をもちいて mannitol の透過性を測定したとマウス表皮において TGase 1 mRNA は有棘層上ころ、TGase １− / −皮膚における mannitol の透層から顆粒層にかけて発現するが、TGase 1 − / −過速度は対照の 1000 倍以上と著明な亢進を示し

ではその発現は認められず、対照として、ケラチ（図４）、さらに lucifer yellow の経皮吸収実験でン 14 mRNA の発現は、正常と同様に、基底層かは、lucifer yellow を１時間新生仔背部皮膚に接ら有棘層数層にかけて認められた。Cell envelopeの主要な構成蛋白であるロリクリンの局在はTGase １− / −の角層において低下し、TGase １− /では、ロリクリン局在化の障害が示唆された。

−18.5 日胎仔表皮の電顕的観察では、TGase １− /−マウスでは、正常のコンパクトな角質の構造とは異なり、角質細胞は膨化し、ケラトヒアリンF 顆粒の残存が認められた。marginal band（cellenvelope）は消失し、その代わり、細胞膜にそって電子密度の高い顆粒が認められた（図２）。これらの所見から、TGase １− / −では、ケラトヒア
リン F 顆粒の分解の遅滞と cell envelope 形成の

図２ TGase １欠損マウス角質の電顕所見正常マウス（胎生 18.5 日）では、角質細胞辺縁は肥厚した cell envelope がみられるが（囲み内矢印）、TGase１欠損マウスでは cell envelope は欠落し、細胞膜に沿って、あるいはその近傍の細胞質内に高電子密度顆粒がみられる。

図３ TGase １欠損マウスの経表皮水分蒸散（TEWL）
野生型（＋／＋）、ヘテロ変異新生仔マウス（＋／−）に比較して、TGase １欠損マウス（−／−）では TEWLは 100 倍以上に増加している。

図４ TGase １欠損マウスにおける mannitol の経皮吸収
新生仔マウス剥離皮膚をもちいて mannitol 透過速度を測定した結 、正常マウス（○）に比較して、TGase1 欠損マウス（●）では 1000 倍以上の増加が観察される。

− 102 −

ノックアウトマウスによる cell envelope のバリアー機能解析

触させた場合、対照では lucifer yellow は角層にtranscriptional activation of the humanでは真皮にまで到達すtransglutaminase 1 gene. J.Biol.Chem., 271 ,止まるが、TGase １−/−ることが確認された。これらの結果から、TGase１

では皮膚のバリアー機能が著しく障害され−/−9790 - 9794 , 1996 .
４）Yamada K, Matsuki M, Morishima Y et al.:ていると考えられた。

Activation of the human transglutaminase
1 promoter in transgenic mice: Terminal

４ 考 察

differentiation-specific expression of the

TGase １遺伝子欠損マウスの解析から、TGase

TGM 1 -lacZ transgene in keratinized stratified

１ 遺 伝 子 は 角 質 の 発 生 と 成 熟、 と く に cellsquamous epithelia. Hum.Mol.Genet., 6 , 2223 -envelope の形成に必須であり、生後の外部環境

2231 , 1997 .

への適応と個体の生存のために極めて重要な遺５）Kim I-G, Lee S-C, Lee J-H, et al.: Structure andにorganization of the human transglutaminase

おける皮膚のバリアー機能の著しい障害は、cell

3 gene: evolutionary relationship to theenvelope の欠損に起因すると考えられるが、celltransglutaminase family J.Invest.Dermatol.,envelope を構成する前駆蛋白の重合不全、あるい

103 , 137 - 142 , 1994 .

伝子であることが示唆された。TGase １−/−

は、cell envelope を覆う lipid envelope の何れが６）Huber M, Rettler I, Bernasconi K, et al.:

主要な役割を担っているのか、今後の研究課題でMutations of keratinocyte transglutaminase inある。

lamellar ichthyosis. Science, 267 , 525 - 528 , 1995 .
７）Russell LJ, DiGiovanna JJ, Rogers GR, et al.:

引用文献

Mutations in the gene for transglutaminase１）Roop DR: Defects in the barrier. Science, 267 ,1 in autosomal recessive lamellar ichthyosis.
Nature Genet., 9 , 279 - 283 , 1995 .

474 - 475 , 1995 .
２）Y a m a n i s h i K , I n a z a w a J , L i e w F - M ,８）M a t s u k i M , Y a m a s h i t a F , I s h i d a -et al. : Structure of the gene for human

Yamamoto A, et al.: Defective stratum corneumtransglutaminase 1 . J. Biol. Chem., 267 , 17858 -and early neonatal death in mice lacking thegene for transglutaminase 1 (keratinocyte17863 , 1992 .
３）Ueda E, Ohno S, Kuroki T, et al. Theeta isoform of protein kinase C mediates− 103 −

transglutaminase). Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95 ,1044 - 1049 , 1998 ./