表皮細胞におけるエピプラキンの機能

大分大学医学部皮膚科

藤原作平

Epiplakin(EPPK), a cytoskeletal linker protein, was originally identified as an autoantigen in serum from apatient with subepidermal blistering disease. To clarify the function of EPPK, we performed slot-blot assays using
fusion proteins that included various wild-type and mutated EPPK domains. At least two of the 4.6 repeats in the B
domains of epiplakin were necessary for the binding of fusion proteins to keratin. The repeated structures of linker
domains were also important for the binding of EPPK to keratin in these assays. Similar but weaker binding tovimentin and desmin was also detected. To confirm these interactions between EPPK and intermediate filaments(IFs), we performed cell- overlay assays with fusion proteins. In HeLa cells, the distribution of fusion proteins in thecytoplasm and their partial colocalization with keratin filaments suggested that the B domains are mainly importantfor interactions with IFs, while linker domains might include multifunctional regions that are involved in binding to
IFs and to molecule(s) other than IFs.

１．緒

これらの繰り返し構造に着目し、中間径フィラメントとの言相互作用を検討した。

エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原と２．実して同定された分子量 552kDa（ヒト）ないし 725kDa（マウス）の分子であるが、表皮細胞内に局在する。構造上の２−１験

Slot-blot Assays

特徴として、他のプラキン分子、例えばデスモプラキン、

まず B ドメイン、Linker ドメインと B+Linker ドメイ

BPAG1、プレクチンのカルボキシ末端に見られる B ドメ

ンのそれぞれに対するプライマーを用いて、ヒト白血球由

イン構造が、ポリペプチド全体にわたりヒトでは 13 個、来の遺伝子断片を鋳型として、PCR 法により各ドメイン

マウスでは 16 個見い出され、特にカルボキシ末端にはほを支配する cDNA を得た（Fig. 1a）。配列を確認した上で、ぼ完全に保存された５（ヒト）−８（マウス）回の繰り返し構PGEX 発現ベクターに組み込み、GST 融合蛋白質を得造が存在している（Fig. 1a） 。 プラキン分子は細胞骨格た。B ドメイン内のリピート数とケラチンとの相互作用を結合蛋白に分類され、その中のデスモプラキンやプレクチ調べるために、B ドメイン中の 4.6 回のリピートのうちの 1ンなどは中間径フィラメントと相互作用することは、すでリピート（1R）、2 リピート（2R）、3 リピート（3R）を含に明らかになっていたが、新たな分子であるエピプラキン

むコンストラクトを作成し、GST 融合蛋白質として発現

１）と中間径フィラメントとの相互作用は不明であった。今回させた（Fig. 1b）。次に Linker ドメイン内の 1 リピート

この相互作用を検討するために、いくつかの融合蛋白質を（L1R）、2 リピート（L2R）、3 リピート（L3R）を含むコン使った Slot-blot Assays と Cell-Overlay Assays による実ストラクトを作成し、GST 融合蛋白質として発現させた験を行った。一般にプラキン分子の B ドメイン構造には、 （Fig. 1c）。これらの GST 融合蛋白質を用いて、Slot-blot
38 アミノ酸モチーフ（plakin repeat domain=PRD）からAssays を行った。メタノール処理後の PVDF 膜上に中間なる 4.6 回の繰り返し構造が存在するが、これはエピプラ

径フィラメントをしみこませた後、ブロッキングをおこな

キンにも存在し、これが機能の単位になっている可能性がい、それぞれの GST 融合蛋白質を加え、一晩インキュベある（Fig. 1b）。さらにエピプラキンでは、B ドメイン構ートした。翌日抗 GST 抗体を加え、２時間インキュベー

造を連結するリンカードメインにも 3 回の繰り返し構造がトした後、二次抗体を加え、さらに１時間インキュベート

存在するが、これはエピプラキンに特異的で、他のプラキ

後、化学発光法で抗原を検出した。中間径フィラメントのン分子には見られない構造である（Fig. 1c）。今回我々は、高次構造が各ドメインとの相互作用にどのような影響を及
ぼすかを調べるために、PVDF 膜上に中間径フィラメン

The function of epiplakin in keratinocytes

トをブロットした後６M のグアニジン塩酸で変性し、GST

Sakuhei Fujiwara, M.D.Ph.D

融合蛋白質との反応性を上記と同様の方法で検討した。

Department of Anatomy, Biology and
Med icine（ Der matolog y）Facu lty of
Medicine, Oita University

２−２

Cell-Overlay Assays

さらに、これらの GST 融合蛋白質と細胞全体との反応性を検討するために、培養 HeLa 細胞、HaCaT 細胞をメ

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コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

タノール固定後、GST 融合蛋白質を加えインキュベート

作用が一番強く、次いで GST-B、GST-Linker の順であっ

後に洗浄し、抗 GST 抗体を加え、さらに二次抗体を加えた（Fig. 3）。中間径フィラメントについては、ケラチン、て Cell-Overlay Assays を行った。

ビメンチン、デスミン順で弱くなった（Fig. 3）。ケラチ

３．結
３−１

ンを６M のグアニジン塩酸で変性させた後には、B ドメ

果インとの相互作用がほぼ消失した（Fig. 4）。B ドメインSlot-blot Assays

内のリピート数を変化させた融合蛋白質を用いて Slot-blot

B ド メ イ ン、Linker ド メ イ ン、B+Linker ド メ イ ン のAssays を行なった結果、少なくとも、2 ないし 3 リピ

GST 融合蛋白質が、正しく作成されているか否かを確認

ートで GST-B ドメインとケラチンとの相互作用にほぼ匹するため、作成した融合蛋白質を SDS ポリアクリルアミ

敵したため、GST-B ドメインとケラチンとの相互作用に

ド電気泳動を行ない、クーマシーブルー蛋白染色、抗 B

は少なくとも 2 ないし 3 つのリピートが必要であることがドメイン抗体、抗 Linker ドメイン抗体、抗 GST 抗体との明らかになった（Fig. 5）。HeLa 細胞と HaCaT 細胞から反応性を検討した（Fig. 2 a-d）
。その結果、融合蛋白質は抽出されたケラチンを使って、同様の Slot-blot

それぞれの抗体と反応することが示され、また B ドメイン、を行なった結果、同様の結果が得られた（Fig. 5）。次にLinker ドメインはアミノ酸配列上も正しい融合蛋白質でLinker ドメイン内のリピート数を変化させた融合蛋白質

あることが明らかになった。Slot-blot Assays の結果、Bを用いて Slot-blot

ドメイン、Linker ドメインと B+Linker ドメインの GST

数が増すとともに相互作用が強くなった（Fig. 6）

AssaysAssays を行なった結果、リピートの２））。

融合蛋白質の中、B+Linker ドメインとケラチンとの相互

Figure1 Schematic representation of epiplakin (a) and the repeat structures of the B domain (b) and the linker domain (c).
(a) Numbered boxes indicate B domains that are 46-70% homologous to the B domain in desmoplakin. The double-lined
linker regions and the five corresponding B domains (9-13) are almost identical (1). We performed PCR to generate
GST-B domain (8B), GST-linker domain (L8-9), and GST-B+linker domain (B8+L8-9).
(b) The structure of each B domain includes 4.6 copies of a motif of 38 amino acids, which is referred to as the plakin
repeat domain (PRD). The sequence shown is that of B8. When at least three amino acid residues are identical in the 4.6
copies, they are shown in green, while identical amino acid residues in the first and third or second and fourth copies
are shown in yellow. 1R denotes a GST-fusion protein that contains one copy unit, and 2R and 3R denote fusion
proteins with two and three copies units, respectively.
(c) The structure of the linker domain between B8 and B9, with 2.7 repeats of a sequence of 82 amino acids (1). These
repeats are lined up along the entire linker domain. L1R denotes the GST-fusion protein that included the first one
repeat of the linker domain (repeat 1). L2R and L3R denote GST-fusion proteins that included two linker repeats(repeat1+repeat2) and three linker repeats (repeat1-3), respectively. L3R also included a non-repeated structure (residue
2555-2612).

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表皮細胞におけるエピプラキンの機能

Figure 2 The purity of GST-fusion proteins was examinedby SDS-PAGE.
GST-B domain (lane 1), GST-linker domain (lane 2),
GST-B+linker domain (lane 3), and GST (lane 4) wereseparated on an SDS-polyacrylamide gel (12.5%
polyacrylamide) and then stained with Coomassie Brilliant
Blue (a). Proteins were immunostained with polyclonal
antibodies specific for the B domain (b) or with monoclonal
antibodies specific for the linker domain (c) or withpolyclonal antibodies specific for GST (d). Molecularmarkers were included on the left side of a and b.

Figure 3 Keratin interacted most strongly with GST-B+linker
domain, less strongly with GST-B and least strongly with
GST-linker domain.
In slot-blot assays, the indicated protein or BSA (as acontrol) was immobilized on membranes and then themembranes were incubated with the indicated fusion
protein (GST-B, 1.0 µg/ml; GST-linker, 1.3 µg/ml; GSTB+linker, 1.6 µg/ml; these concentrations are equal on amolar basis.) or with GST (as a control) and probed with
GST-specific rabbit polyclonal antibodies and HRPconjugated goat antibodies against rabbit IgG. The
immunoreactive proteins on membranes were visualized bychemiluminescence and exposure to x-ray film. The protein
loading was monitored with Coomassie Brilliant Blue
staining (CBB) or reaction using anti-keratin (right upper
panel) or anti-vimentin (right lower panel) antibodies andHRP-conjugated goat antibodies against mouse IgG. The
immunoreactive proteins on membranes were visualized
described above.
Keratin interacted most strongly with GST-B+linker
domain and it reacted less strongly with GST-B and GSTlinker domain, in that order. Although vimentin and desmin
also bound to GST-B+linker, GST-B, and GST-linker
domain, in a descending order of avidity, the binding was
weaker than that to keratin.

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Figure 4 Denatured keratin decreased binding with GST-B
domain.
In slot-blot assays, keratin was immobilized on a PVDFmembranes and the membranes were denatured with (lane
2 and 4) or without (lane 1 and 3) 6M guanidinium chloride
and two pieces of membranes (lane 1 and 2) wereincubated with GST-B, 1.0 μg/ml and probed with GSTspecific rabbit polyclonal antibodies. The proteins werevisualized as described in the legend to Fig. 3. The protein
loading was monitored by reaction using anti-keratin
antibodies, HRP-conjugated goat antibodies against mouse
IgG and a chemiluminescent reagent (lane 3 and 4). After
denaturing keratin, the binding ability of the GST-B fusion
protein decreased.

Figure 5
Repeated structures of B domain areimportant for binding to keratin.
For slot-blot assays, keratin, IF fractions extracted
from HeLa cells and HaCaT cells, and BSA (as acontrol), were immobilized on a PVDF membrane.
Each membrane was incubated with 1.0 µg/ml of
GST-fusion proteins that included one, two and threecopies of PRD (1R-3R as shown in Fig.1), GST-B
domain and GST (as a control). The proteins werevisualized as described in the legend to Fig. 3. The
protein loading was monitored by with Coomassie
Brilliant Blue staining (CBB)
2R and almost 3R in the B domain were necessary
for binding to keratin, or to IFs extracted from HeLa
or HaCaT cells.

Figure 6 Repeated structures of the linker domain are also
important for the binding to keratin.
Immobilized keratin or BSA (as a control) on a PVDF
membrane was incubated with 3.0 µg/ml of fusion proteins(L1R, L2R, L3R and GST-linker) and GST (as a control), as
shown schematically in Fig. 1. The proteins were visualized
as described in the legend to Fig. 3. The protein loading
was monitored by with Coomassie Brilliant Blue staining(CBB). L3R that included three linker repeats bound to
keratin almost as strongly as the entire linker domain, while
L2R and L1R to keratin bound less strongly in that order.

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表皮細胞におけるエピプラキンの機能

３−２

Cell-Overlay Assays

径線維の棒状ドメインと結合するとしたモデルが提唱されHeLa 細胞を用いた Cell-Overlay Assays の結果、GST-Bているが 6）、ケラチンとの相互作用をする上で、B ドメ

ドメインは、核周囲に顆粒状に分布し、一部にケラチンとイン内の少なくとも 3 リピートが、GST-B にほぼ匹敵しの局在が認められた（Fig. 7, B- C）。GST-Linker ドメイン

た我々のデータは、このモデルを支持している。しかし、は、細胞内に点状に分布し、ケラチンとの局在は見られ

彼らはデスモプラキンの Linker ドメインは、ビメンチンず（Fig. 7, E -F）、GST-B ＋ Linker ド メ イ ン は、GST-Bとの結合に大きく寄与しないとしており、今後おそらく球と GST-Linker ドメインの中間的分布すなわち一部顆粒状、状であるエピプラキンの Linker ドメインの結晶解析を進

一部点状の分布がみられた（Fig. 7, H-I）
。このことから、める必要があろう。B+Linker ドメインはケラチンと最も

GST-Linker ドメインは、ケラチン以外の他の分子とも相強く相互作用し、ビメンチン、デスミンの順に弱くなる現互作用することが示唆された。HaCaT 細胞における結果

象は、デスモプラキンと中間径フィラメントとの相互作用

も HeLa 細胞と同様の結果が得られた。

に類似している。プレクチンの B と一部の Linker ドメイ

４．考

ンは、ケラチン（5/14）よりむしろビメンチンとの相互作察用が強い。エピプラキン、デスモプラキン、プレクチンのSlot-blot Assays および Cell-Overlay Assays の結果、エピ

B ドメイン間のホモロジーは互いに 70％でほぼ等しいが、プラキンの B ドメインは、ビメンチンよりもケラチンとエピプラキンとデスモプラキン、あるいはエピプラキンと強く結合することが明らかになった。加えて Linker ドメ

プレクチンの Linker ドメイン間のホモロジーは、デスモ

インもケラチンと結合することが明らかになった。後者

プラキンとプレクチンの Linker ドメイン間のホモロジー

は、B+Linker ドメインとケラチンとの相互作用が B ドメ

よりも低い。したがってエピプラキンの B+Linker ドメイ

インとケラチンとの相互作用よりも強かったことを、よくンが中間径フィラメントと相互作用するにあたっては、高説明しうる。しかしこれらの結果は、B ドメインがケラチ

次構造が重要と考えられる。

ン 5/14 よりビメンチンと強く結合し、Linker ドメインが、は B ドメインがケラチンと相互作用する形式については、

ケラチン 5/14 やビメンチンと反応しないとした Jang ら

エピプラキンが、数本のケラチンを束ねると我々は想定しの結果と異なっている 3）。この違いは、我々がヒト表皮ており、今後この仮説を検証していきたい。

B+Linker ドメインあるいのケラチン（おそらくケラチン 5/14 以外にケラチン 1/10

一方エピプラキンのノックアウトマウスを使った実験でも含む）を使用したことや、Linker ドメイン融合蛋白質

は、野生型マウスに比し創傷治癒が速くなる傾向が認めらの結合能の不安定性によると考えられる。新規に調整しれた 7）。現時点では、エピプラキンノックアウトマウス

た Linker ドメイン融合蛋白質は、ケラチンと再現性良くでは、ケラチン 6 の発現が低下し、それに伴ってデスモゾ結合した。Linker ドメインが、繰り返し配列をとること

ームの構造が変化し、表皮細胞の移動が速くなるのではな

は、エピプラキンの特徴であり、繰り返し構造が増すごといかと考えているが、今後エピプラキンノックアウトマウに、ケラチンへの結合能が増したことは大変興味深い。デスでは、野生型マウスと比較してデスモゾームやケラチン

スモプラキン、BPAG1、プレクチン、エンボプラキンやの配行などにどのような違いを生じているのか、電子顕微

ぺリプラキンなどの他のプラキン分子の L サブドメイン

鏡レベルで詳しく検討する余地がある。また創傷治癒過程と呼ばれる Linker ドメイン（ぺリプラキン以外は C ドメ

で発現するケラチン 6、17、18 とエピプラキンとの相互作

インのアミノ末端側、ぺリプラキンには C ドメインがなく、用についても検討する必要があると考えられる。

棒状ドメインのカルボキシ末端側）が、ケラチンやビメ

５．総

ンチンと結合することが知られているが 4）、その部分と

括共通の配列は、エピプラキンの Linker ドメインには見ら

エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原れなかった。また Fontao らが、デスモプラキンの Linker

として同定された表皮内蛋白質であるが、その B ドメイ

ドメインが、単層上皮のケラチン 8/18 やビメンチンと反ン、Linker ドメイン共に中間径フィラメントと相互作用応するが、ケラチン 5/14 と結合しないことを報告していし、GST 融合蛋白質の中では、B+Linker ドメイン、次いる 5)。エピプラキンでは、今後ケラチン 8/18 やケラチン

で GST-B、GST-Linker の順で相互作用が弱くなった。中6/16 または 6/17 と結合するか否か、そしてそれが B ドメ

間径フィラメントに関しては、ケラチン、ビメンチン、デイン、Linker ドメインのいずれと結合するかを検討する

スミンの順に弱くなった。B ドメイン、Linker ドメイン

必要があろう。最近のデスモプラキンの B ドメインの結共に、その繰り返しのリピート数が増すに連れて中間径フ晶解析から、4.6 回の繰り返し構造のうち 1-2 回と 3-4 回のィラメントとの相互作用が強くなった。

繰り返し構造の間に溝が形成され、それがおそらく、中間− 61 −

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Figure 7 GST-B bound to the cytoplasm partially along keratin filaments, although GST-linker and GST-B+linker
distributed mainly in dots in the cytoplasm in HeLa cells.
HeLa cells were fixed with 100% methanol and then were incubated with fusion proteins in 1% BSA/PBS.
After washing with PBS, cells were incubated with a mixture of anti-pan-keratin monoclonal antibody C11 andanti-GST rabbit polyclonal antibodies, and then washed with PBS. Cells were subsequently incubated with FITCand Rodamine-conjugated secondary antibodies directed against mouse or rabbit IgG.
GST-B(red)localized around the nucleus in the cytoplasm partially along keratin filaments (green) in HeLa
cells(B). Both GST-linker and GST-B+linker distributed mainly in dots in the cytoplasm(E,H) and did not
colocalized with keratin filaments, which indicated that linker domains interacts with other component(s) otherthan IFs. Bars=20µm− 62 −

表皮細胞におけるエピプラキンの機能（References）

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