ウィントシグナルを制御する天然由来化粧品素材，有効成分の探索

千葉大学大学院 薬学研究院

當 銘

一 文

Wnt signaling is conserved in various species, and implicated in numerous aspects of development, cell biology, andphysiology. Particularly, it is involved in melanogenesis and hair inducing process including regeneration of hair follicle.
Thus, compounds that regulate Wnt signaling could be effective cosmetic agents for whitening or hair restoration. We
screened the plants and actinomycetes extracts from our natural resource library for Wnt signaling regulating naturalcompounds.  Activity-guided fractionation led to the isolation of new limonoid from Xylocarpus granatum and six
cardenolides from Calotropis gigantea as active compounds. Also, several active compounds such as macrolactams wereobtained from the fermented actinomycetes sampled from Chiba prefecture. These active compounds would be helpful andevidence-based cosmetic agents.

１．緒の重要性，さらにこれら二種の細胞間に作用する分泌性

言のシグナル因子が大きく関与することがトランスジェニ

ウィントシグナルは，動物の発生過程，その後の種々のックマウスやコンディショナルノックアウトマウスを用組織・器官形成に至るまで多彩な役割を演じている．また，いた研究で明らかになりつつある 3，4）．毛包においてウがん，神経疾患などの疾患に加え，体内時計，再生医療にィントシグナル伝達分子が発現していることが知られて1）おいても重要な役割を担っている ．このようにさまざまおり，皮膚が毛包へと分化する際，ウィントシグナルのな生命現象に関わるウィントシグナル経路であるが，その発現が重要な役割を果たすとの報告があり，毛包形成，シグナル経路を制御する化合物の化粧品分野への応用を考

毛髪生成に重要な役割を果たしていることが明らかにさえると，以下の理由から美白，育毛分野があげられる．

れている．従ってウィント亢進作用をもつ化合物には，美白：肌の色は，表皮基底層に存在するメラノサイト（色育毛作用が期待される．

素細胞）などにより産生されるメラニン量や性状により当研究室では，独自に構築した天然資源抽出物ライブラ決められる．メラニンは，メラノサイト内に存在するメリー（熱帯産植物や放線菌などの抽出物）を対象として，ラノソームにおいてチロシナーゼによる酸化反応によりウィントシグナル制御に関するスクリーニングを行ってき生成することが知られており，チロシナーゼの阻害はメた．その結果，ウィントシグナルを阻害，または亢進するラニン生成を抑制することができる．最近の研究により，抽出物を複数見出しており，それらから美白，または育毛

ウィントシグナルを阻害することで，チロシナーゼが抑作用を有する有効成分を見出し，その作用メカニズムを解2）制されることが知られている ．従ってウィント阻害作

析することで，エビデンスに基づく化粧品素材を創製する

用を示す化合物には，美白作用が期待される．

ことを目的としている．

育毛：最近では脱毛の発症メカニズムについても分子レベ

２．実

ルで解明されつつある．毛髪の退縮に向かう機構については，アポトーシスによるものであることが明確になっ

２.１てきたが，休止していた毛包の発毛段階へのスイッチン

験

TCF/β-catenin 転写活性試験

TCF/b-catenin 転写活性をウィントシグナルの指標とし，グに関しては，以前から指摘されていた男性ホルモン（アTCF/LEF 結合領域を有するルシフェラーゼレポーター遺ンドロゲン）の関与に加え，最近では，毛包上皮幹細胞伝子（SuperTOPFlash）が安定発現した STF/ 293 細胞株の存在と，この幹細胞へシグナルを伝達する毛乳頭細胞を用いた．対数増殖期にある STF/ 293 細胞 5）を 96 穴白色
平 底 マ イ ク ロ プ レ ー ト に 各 ウ ェ ル 中 200 mL あ た り 3 ×104 cells の密度で細胞を播種し，10 %FBS 含有 D-MEM 培
地中で 24 時間培養した．培地の除去後，種々の濃度の試

Exploration of natural cosmetic agentsthat regulate Wnt signaling pathway
Kazufumi Toume
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, Chiba University料（植物エキス，分画後の画分，単離した化合物）を含有する 200 mL の培地を添加し 24 時間培養した．その後培地を取り除き，PBS で細胞を１回洗浄後，細胞溶解剤 Cell
Culture Lysis Reagent（プロメガ）を 20 mL 加え 30 分間振− 31 −コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

とうした．その後プレートと発光基質液（プロメガ）をマり活性成分の分画・精製を行った．構造は，核磁気共鳴イクロプレートルミノメーター（サーモ社製ルミノスキャ（NMR）や質量分析（MS）等のスペクトル解析にて解析をンアセント）へセットしルシフェラーゼ活性を測定した．

行った．

なお，試料添加時のルシフェラーゼ遺伝子の発現量（化学３．結果及び考察

発光量）を指標として，TCF/b-catenin 転写活性すなわちウィントシグナル制御作用を評価した（図１）．STF/ 293
細胞は，John Hopkins 大学の Jeremy Nathans 教授よりご

３.１ Xylocarpus granatum から得られたウィント阻害成分恵与頂いた．

スクリーニング試験においてウィント阻害作用を示した
バングラデシュ産センダン科植物 X. granatum の葉部メ

２. ２

スクリーニング試験

タノール抽出物について活性を指標に分離精製を進めたとスクリーニングは，上記の TCF/b-catenin 転写活性を指ころ，4 種のリモノイド類（1 − 3 等）を単離した．スペク

標に当研究室で独自に採集，構築したタイ，インドネシア，トルデータに基づく構造解析の結果，化合物 1，2 は新規

バングラデシュ産の植物エキスおよび当研究室で独自に分化合物であることが判明し，それぞれ xylogranin A（1）離培養を行い構築した放線菌エキスからなるライブラリーおよび B（2）と命名した．このうち化合物 2，3 は強いウを対象とした．なお本スクリーニング研究で用いた放線菌ィントシグナル阻害作用を示し，その IC 50 値はそれぞれは千葉県を中心に全国各地の土壌，海水，海泥などから分48 . 9，54 . 2 nM であった．一方化合物 1 は活性を示さなか離したものである．

った．化合物 2，3 はオルトエステル基が存在するが，1 にはない．DFT 計算の解析の結果，活性を示す化合物 2，3 と，２. ３

成分の分画，構造解析

1 は異なる安定構造を示し，この構造の違いが活性へ影響

上記スクリーニング試験において，顕著なウィントシグしているものと示唆された．

ナル制御作用を示した抽出物を選別し，活性を指標に溶媒強力な作用を示した 2 について本シグナルの亢進が知ら

分配，各種カラムクロマトグラフィー（Diaion HP- 20，シれているヒト大腸がん細胞（SW 480 細胞）における以下のリカゲル，ODS，Sephadex LH- 20，ODS HPLC 等）によ解析を行った．本シグナルにおける転写活性化因子である

図１

スクリーニングアッセイシステムおよび活性評価の概略

12
図２

X. granatum から単離したリモノイド化合物− 32 −

3

ウィントシグナルを制御する天然由来化粧品素材，有効成分の探索

b-catenin のタンパク質発現量を検討したところ，細胞全分配し，活性が認められた酢酸エチル可溶部について活性体，細胞質では顕著な変化は認められなかったが，核内に試験を指標として，シリカゲル，ODS カラムによる分画おいては濃度依存的な減少が認められた（図３A）．また，を行った．その結果，6 種のカルデノライド類（4 － 9）を免疫染色法による b-catenin の局在について解析を行った

単離し，NMR 及び MS スペクトルデータの解析および文ところ，対照群では核内に存在していた b-catenin が，2 の献値との比較によりそれぞれの構造を決定した．これら 6添加により核内から消失する傾向が認められた（図３B）．

種の化合物は強力なウィントシグナル阻害作用を示し，そ以上のことから 2 は，核内の b-catenin を減少させることの IC 50 値は 0 . 7 − 3 . 8 nM であった．これら化合物のウィンによりウィントシグナルを阻害するものと示唆された．

トシグナルへの作用は知られておらず，本研究により初めさらにウィントシグナルの標的遺伝子である c-myc，て明らかとなった．

PPARd の発現量への 2 の影響を検討した．まず，ウエス

またこれらの化合物のうち，calotropin（7）について３タンブロット法により，標的遺伝子産物の発現量を検討し種のヒト大腸がん細胞（DLD 1，HCT 116，SW 480）およたところ，200 nM の濃度で c-myc は細胞全体，核内におび非がん細胞（293，293 T）に対する毒性試験を行った．

い て，PPARd は 核 内 に お い て 減 少 が み ら れ た． ま た，

その結果，7 はとくに大腸がん細胞に対して顕著な細胞毒

mRNA の発現量をリアルタイム PCR 法により検討したと性を示すことがわかった．次に，SW 480 細胞において，ころ，c-myc は化合物添加により低濃度では上昇したが，活性化合物 7 がウィントシグナルの転写活性化因子である200 nM の濃度では減少し，また，PPARd も 200 nM の濃b-catenin と標的遺伝子である c-myc のタンパク質の発現度で減少した．したがって，2 はウィントシグナルの標的量へ及ぼす影響を検討した．その結果，7 により b-catenin遺伝子の発現を mRNA レベルで抑制することが示された．のタンパク質量は細胞全体，核，細胞質で濃度依存的に減少することが認められた（図５A）．また，標的遺伝子で３. ２ Calotropis gigantea から得られたウィントシグナル阻害成分ある c-myc の減少も確認された．しかし，7 とプロテアソバングラデシュ産ガガイモ科植物 C. gigantea の滲出液少は認められなかった．さらに 7 の添加により b-catenin抽出物にも強力なウィントシグナル阻害作用が認められ，の 分 解 シ グ ナ ル で あ る CK 1 a お よ び GSK 3 b に よ る

その活性成分について探索を行った．本植物抽出物を溶媒b-catenin のリン酸化の促進が認められ，7 は，b-catenin のーム阻害剤である MG- 132 とを併用すると，b-catenin の減AB

図３xylogranin B（2）によるβ-catenin の核内局在の阻害− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

47
図４5689C. gigantea から単離したカルデノライド類

リン酸化を促進することにより，その分解を促進すること

griseoviridin（10），千葉市産土壌由来の放線菌株 CKK 784が 示 唆 さ れ た．7 に よ り 促 進 さ れ た GSK 3 b に よ る

からは biscaberin（11）を始めとする数種のマクロラクタ

b-catenin のリン酸化は GSK 3 b 阻害剤である LiCl の処理にム類および N-formylantimycic acid methyl ester（15）をより抑制されたが，CK 1 a によるリン酸化は抑制されなか単離，同定した．これらのうち，10 および 11 は濃度依存った．また，促進された CK 1 a と GSK 3 b による b-catenin

的に TCF 転写阻害活性を示した ．のリン酸化は、CK 1 a 阻害剤である CKI- 7 の添加により抑制された．また CKIaRNAi により b-catenin の分解も抑制

３. ４

ウィントシグナル促進成分された．このことから 7 のウィントシグナル阻害のメカニ

前述のスクリーニングの結果，数種の植物抽出物にはウィンズムとして，7 が CK 1 a のタンパク量の増加を誘導するこトシグナルを更新する作用が認められた．そのうちバングラとにより，b-catenin のリン酸化を誘導し，続くプロテア

デシュ産ミカン科植物 Zanthoxylum rhetsa について活性をソーム系での分解を促進することによるものと示唆された指標に分画を進めた結果，活性成分としてケルシトリン（図５B）．

（16）を得た．本植物の分画物にはほかにも活性画分があり，現在それらの活性成分について成分探索を進めている．

３. ３

放線菌から得られたウィントシグナル阻害成分

４．総２種の放線菌株について各々ウィントシグナル阻害作用括をもつ活性成分の探索を行った．まず，九十九里町産海水

ウィントシグナル伝達機構を対象とした研究はきわめて

サ ン プ ル よ り 分 離 し た 放 線 菌 株 CKK 748 か ら は熾烈な競争の最中にある 7，8）．特にメラニン生成とウィンA

トシグナルに関しては，ウィントシグナルを制御する因子である GSK- 3 b を抑制することで，メラニン生成が抑制されることなどが報告されている 9）．また，ウィントシグナ
ルと薄毛に関しては，毛乳頭細胞死抑制にウィントシグナ

Bル経路が関与することや 10），成体における毛包形成とウィントシグナル経路の関与が報告されている 11）．
一方，ウィントシグナルを制御する低分子を美白，育毛につなげる研究例は比較的少ない．最近の美白への応用例
としては，ショウガ科植物より得られたカルダモニンが報告されている 2）．また，ウィントシグナルに作用して育毛作用を示す化合物に関しては，放線菌由来のラディシコー
ルなどがあげられる 12）．天然からウィントシグナル伝達経路を介して美白・育毛作用を示す成分が見出されれば，その利用価値はきわめて高いことが期待される．

図５ ウェスタンブロットによる SW480 細胞におけるcalotropin（7）の影響の解析

本研究では，上記の知見をもとに，有用な美白・育毛作用を示す化合物の発見をめざし，当研究室保有の天然資源− 34 −

ウィントシグナルを制御する天然由来化粧品素材，有効成分の探索

図６

ウィントシグナルに関するスクリーニングにより放線菌から単離した化合物抽出物ライブラリーについて TCF/b-catenin 転写活性を指３）岸本治郎，日本農芸化学会誌 2003，77，566 - 569 .

標としたスクリーニングを行った．その結果，バングラデ

４）岸本治郎，実験医学 2000，18，1817 - 1820 .

シュ産植物より，ウィントシグナルを阻害，または促進す

５）Xu, Q.; Wang, Y.; Dabdoub, A.; Smallwood, P. M.;

る化合物を，千葉県の海水および土壌より分離培養した放Williams, J.; Woods, C.; Kelley, M. W.; Jiang, L.; Tasman,

線菌からは，ウィントシグナルを阻害する天然化合物の発W.; Zhang, K.; Nathans, J. Vascular development in the

見に成功した．そのうち，化合物 2，7 については，そのretina and inner ear: control by Norrin and Frizzled- 4 ,ウィントシグナル阻害作用について解析を行い，それぞれa high-affinity ligand-receptor pair. Cell 2004 , 116 , 883 -b カテニンを減少させることが判明したが，2 については895 .

核内においてのみ b カテニンを減少させること，7 につい

６）Tamai, Y.; Toume, K.; Arai, M. A.; Ishibashi, M.ては，CK 1 a のタンパク質発現を増加させることで細胞全Griseoviridin and cyclic hydroxamates found in体の b カテニンを減少させることを明らかにした．

a screening program for Wnt signal inhibitor.

今後，さらなるウィントシグナル制御作用をもつ天然化

Heterocycles 2012 , 86 , 1517 - 1524 .

合物の探索とそれらの作用機構の詳細な解析を進め，分子７）Espada, J.; Calvo, M. B.; Díaz-Prado, S.; Medina, V.

レベルでのエビデンスに基づく新たな香粧品素材の開発へ

Wnt signalling and cancer stem cells. Clin. Transl.

貢献したい．

Oncol. 2009 , 11 , 411 - 427 .
８）Reya, R.; Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and謝辞cancer. Nature 2005 , 434 , 843 - 850

本研究はコスメトロジー研究振興財団の研究助成により９）Bellei, B.; Flori, E.; Izzo, E.; Maresca, V.; Picardo, M.

行われました．心より感謝申し上げます．また研究の遂行

GSK 3 β inhibition promotes melanogenesis in mouse

にあたりまして，ご指導・ご協力いただきました千葉大学

B 16 melanoma cells and normal human melanocytes.

大学院 薬学研究院の石橋正己教授，荒井緑准教授，大槻Cell Signal. 2008 , 20 , 1750 - 1761

崇博士をはじめ共同研究者の皆様に感謝申し上げます．

10）鳥居，西沢ら，Wnt 5 a の毛乳頭細胞死抑制作用とその（引用文献）

11）Ito, M.; Yang, Z.; Andl, T.; Cui, C.; Kim, N.; Millar, S.

メカニズム．
フレグランスジャーナル 2009 , 37, 54 - 60１）Luo, J.; Chen, J.; Deng, Z. L.; Luo, X.; Song, W. X.;

E.; Cotsarelis, G. Wnt-dependent de novo hair follicle

Sharff, K. A.; Tang, N.; Haydon, R. C.; Luu, H. H.; He,regeneration in adult mouse skin after wounding.

T. C. Wnt signaling and human diseases: what are theNature 2007 , 447 , 316 - 320

therapeutic implications? Lab. Invest. 2007 , 87 , 97 - 103 .

12）Shinonaga, H.; Noguchi, T.; Ikeda, A.; Aoki, M.;

２）Cho, M.; Ryu, M.; Jeong, Y.; Chung, Y. H.; Kim, D. E.;

Fujimoto, N.; Kawashima, A. Synthesis and structure-

Cho, H. S.; Kang, S.; Han, J. S.; Chang, M. Y.; Lee, C.

activity relationships of radicicol derivatives and WNT-K.; Jin, M.; Kim, H. J.; Oh, S. Cardamonin suppresses

5 A expression inhibitory activity. Bioorg. Med. Chem.

melanogenesis by inhibition of Wnt/b-catenin signaling,

2009 , 17 , 4622 - 4635

Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009 , 390 , 500 - 505− 35 −