新規ナノ粒子を用いた皮内 siRNA デリバリーによる皮膚の恒常性維持
長崎大学病院薬剤部

佐々木均

To advance the therapeutic outcome of the skin disease, small interfering RNA (siRNA) is expected. However, thetherapeutic use of siRNA requires a drug-delivery system because unmodified naked siRNA is immediately degraded by
nucleases, it penetrates poorly through the plasma membrane, and it induces interferon responses after systemic injection.
For safe and effective delivery of siRNA, we developed binary complex based on dendrigraft poly-L-lysine (DGL) andternary complex which was constructed by addition of γ-polyglutamic acid (γ-PGA) to binary complex. The siRNA which
could knock down the firefly luciferase gene was used as a model siRNA. The complexes were approximately 50 - 140 nm inparticle size. The binary complex showed a cationic surface charge although an anionic surface charge was observed in the
ternary complex. The binary complex and the ternary complex showed a significant silencing effect in the mouse melanoma
B 16 -F 10 cell expressing luciferase regularly (B 16 -F 10 /Luc cells). The binary complex showed significant cytotoxicity andblood agglutination although the ternary complex decreased these toxicities. Furthermore, the ternary complexes showedsignificantly silencing effects in the tumor-metastasized mice in vivo. Thus, we developed the siRNA vector having a
potential to become a new nucleic medicine in skin disease therapy.

1. 緒

化には至っていない。この背景には、不十分な遺伝子発現

言

効率や、血中投与後の細胞毒性や血液毒性などの問題点が

皮膚は人体最大の臓器であり、絶え間ない異化同化を繰挙げられる。

り返し、恒常性を保っている。しかし、外来抗原や紫外線

我々は、核酸物質と様々な電荷を持った高分子とを静電などの刺激、表皮の細菌増殖、老化などにより、恒常性が的に自己組織化させることで、安全性が高く、高効率に破綻すると、しみ・そばかす、にきび、アレルギー疾患、遺伝子を発現できるナノ粒子の構築に成功した（特願 2012-

感染症、膠原病、悪性腫瘍など、様々な疾患が引き起こさ

501869、PCT/JP2011/054195）。このナノ粒子は表面が負れる。

電荷であり、細胞毒性を示さない 1，2）。また、サプリメン

近年、これらの疾患の理解が進み、治療標的として遺伝トや医薬品に使用されている既知の成分により構築してい子やタンパク質が同定されている。特に遺伝子量やタンパるため、生体適合性および安全性が高く、迅速な臨床応用

ク量を制御できる small interfering RNA（siRNA）への期が可能である。

待は大きい。しかし、核酸物質は生体内での安定性や持続本研究では、我々が開発した画期的ナノ粒子を用いて、性に劣り、皮膚透過性や細胞内取り込みが低い。このため、核酸物質を皮膚の標的部位へ安全かつ高効率に送達させる

核酸物質を皮膚の標的細胞内へ安全に高効率に導入できる

ことで、RNA 干渉を引き起こすことを目的とする。皮膚Drug Delivery System（DDS）技術との組み合わせが有用モデルとして、マウスメラノーマ細胞株 B16 -F10 細胞をである。現在、核酸医薬の DDS を目的とした微粒子、高用い、遺伝子発現抑制を評価するために、ルシフェラーゼ

分子および多機能性キャリアなどのベクター開発が活発にを恒常発現させた細胞株 B16 -F10/Luc を作製した。核酸行われ、世界的な競争が展開されている。国内外において、物質のモデルとして、核酸物質の DDS 研究で汎用される導入効率の高いウイルスベクターを用いた研究が主流に行

ルシフェラーゼを抑制する siRNA を用い、ナノ粒子を作われてきたが、安全性や標的指向性の欠如が問題となって製した。作製したナノ粒子の細胞取り込み、遺伝子発現

おり、臨床応用には至っていない。導入効率の低い非ウイ抑制および細胞毒性を B16 - F10/Luc 細胞を用いて評価しルスベクターにおいては、カチオン性成分が広く用いられた。さらに、メラノーマ肺転移モデルマウスを作製し、inてきたが、永年にわたる研究にもかかわらず、未だに実用

vivo における有用性についても評価した。

2. 方
Maintenance of skin homeostasis byintradermal siRNA delivery using novel
nano particles
Hitoshi Sasaki
Depa rtment of Hospita l Pha rmacy,
Nagasaki University Hospital法

2. 1. ナノ粒子の作製
siRNA と し て、 ホ タ ル ル シ フ ェ ラ ー ゼ を 抑 制 す る
siRNA（センス鎖：5’ -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’、
アンチセンス鎖：5’ -UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3’）
および scramble siRNA（センス鎖：5’ -CUUACGCUGUCAU− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

GAUCGAdTdT-3’、アンチセンス鎖：5’ -UCGAUCAUGACAGC

さ れ た。 一 方、siRNA -DGL 複 合 体 に お い て は、siRNA-GUAAGdTdT-3’）を用いた。siRNA と第 5 世代の dendrigraft

DGL2 複合体でわずかな siRNA の流出が観察されたが、そpoly-L-lysine（DGL）
を様々な電荷比で組み合わせ、siRNAの他の siRNA-DGL 複合体ではバンドは確認されなかっ- DGL 複合体を調製した。さらに、siRNA-DGL 複合体にた（図 1）。siRNA-DGL 複合体の siRNA 封入率を評価した。

γ-PGA を様々な電荷比で添加し、siRNA-DGL- γ-PGA 複

siRNA - DGL2 複合体の封入率は 89.2% であったが、電荷合体を構築した。ポジティブコントロールとして siRNA-

比が増加するにつれて封入率は上昇し、siRNA - DGL4, 6,

invivofectamine 複合体も作製した。

8, 10, 12 複合体においてはほぼ 100%の封入率であった（図2）。さらに、siRNA-DGL6 複合体の形状を観察した結果、

2. 2. ナノ粒子の製剤学的評価

ゆがんだ球状であることが明らかとなった（図 3）。

作製したナノ粒子の粒子径および表面電荷を Zetasizer
価するために、アガロース電気泳動を行った。泳動後のゲ

3. 2. in vitro における siRNA-DGL複合体の遺伝
子抑制効果

ルは、Gel Doc EZ System を用いて観察した。また、透過siRNA- DGL 複合体の遺伝子抑制効果を B16-F10/Luc 細型電子顕微鏡 JEM-1230（日本電子株式会社）を用いてナ胞を用いて評価した。ルシフェラーゼを抑制する siRNA

Nano ZS（Malvern 社）で測定した。複合体の安定性を評

ノ粒子の形状を観察した。

表 1 siRNA-DGL 複合体の粒子径と表面電荷

2. 3. in vitro における遺伝子発現抑制の評価
細胞はルシフェラーゼを恒常発現しているマウスメラ
ノーマ細胞株 B16 - F10/Luc 細胞を用いた。B16-F10/Luc
細胞を 1 × 104 個播種し、24 時間前培養した。その後、
siRNA の濃度が 1 µg/mL となるように OPTIMEMI 培地で希釈した各ナノ粒子を細胞に添加し、2 時間インキュベートした。インキュベート後の細胞を、RPMI1640 でさらに 22 時間培養した。培養後に細胞を lysis buffer で溶解し、細胞中のルシフェラーゼ活性を測定した。

2. 4. in vitro における細胞毒性
B16-F10/Luc 細胞を 3 × 103 個播種し、24 時間前培養し た。 そ の 後、siRNA の 濃 度 が 1 µg/mL と な る よ う に
OPTIMEMI 培地で希釈した各ナノ粒子を細胞に添加し、2 時間インキュベートした。インキュベート後の細胞をRPMI1640 でさらに 22 時間培養し、WST-1 assay により細胞毒性を評価した。

図 1 siRNA - DGL 複合体の電気泳動

2. 5. メラノーマ肺転移に対する遺伝子抑制効果
C57BL/6N マウスに B16-F10/Luc 細胞を 1 × 105 個静脈内投与し、メラノーマ肺転移マウスを作製した。細胞投与後 14 日目に、siRNA-DGL6-γ-PGA10 複合体（siRNA40µg）を尾静脈内投与した。複合体投与 24 時間後（細胞投与後 15 日目）に肺を摘出し、ルシフェラーゼ活性を測定した。

3. 結

果

3. 1. siRNA-DGL複合体の製剤学的評価
siRNA- DGL 複合体の粒子径と表面電荷を測定した。
siRNA-DGL 複 合 体 は 51-90 nm の 粒 子 径、24 -44 mV の表面電荷を示した（表 1）。複合体の安定性を評価するた
めに電気泳動を行った。Naked siRNA ではバンドが確認− 84 −

図 2 siRNA - DGL 複合体の封入率

新規ナノ粒子を用いた皮内 siRNA デリバリーによる皮膚の恒常性維持

図 3 siRNA - DGL 複合体の TEM image

図 4 siRNA - DGL 複合体の遺伝子抑制効果を内包した siRNA-DGL6, 8, 10, 12 複合体は細胞中のルシフェラーゼ活性を有意に抑制した。一方、スクランブル
siRNA を内包した siRNA-DGL 複合体では遺伝子抑制効果を示さなかった（図 4）。

3. 3. in vitro における siRNA-DGL複合体の細胞
毒性
siRNA- DGL 複 合 体 を B16-F10/Luc 細 胞 に 添 加 し、 細胞生存率を WST- 1 assay により測定した。電荷比が 2 お
よび 4 の siRNA - DGL 複合体は細胞毒性を示さなかったが、電荷比が 6 以上の siRNA-DGL6，8，10，12 複合体では有意な細胞毒性が認められた（図 5）。

3. 4. siRNA-DGL6-γ-PGA 複合体の製剤学的評価
siRNA-DGL6 複合体に様々な電荷比で γ -PGA を添加し、siRNA- DGL6 - γ - PGA 複合体を調製し、粒子径と表面電荷を測定した（表 2）。その結果、siRNA-DGL6-γ -PGA6 では

図 5 siRNA - DGL 複合体の細胞毒性
表 2 siRNA-DGL-γ- PGA 複合体の粒子径と表面電荷凝集がみられ粒子径の測定ができなかったが、その他のsiRNA-DGL6 -γ -PGA 複合体は 64-140 nm の粒子径を示した。また、γ - PGA の添加量に比例して、表面電荷は低下し、電荷比が 6 以上で負電荷となった。複合体の安定性を評価するために電気泳動を行った。siRNA-DGL6 - γ -PGA12 複合体でわずかな siRNA の流出が観察されたが、その他のsiRNA-DGL6 -γ -PGA 複合体ではバンドは確認されなかった（図 6）。次に siRNA-DGL6-γ-PGA 複合体の siRNA 封入率を評価した。siRNA-DGL6-γ-PGA12 複合体の封入率は76.8% とやや低かったが、その他の siRNA-DGL6 -γ-PGA複合体は 85% 以上の高い封入率を示した（図 7）。また、
siRNA-DGL6 -γ - PGA10 複合体の形状を観察した結果、約100 nm の球状のナノ粒子が観察された（図 8）。

3. 5. in vitro における siRNA-DGL6-γ-PGA 複合体の遺伝子抑制効果
siRNA-DGL6 - γ -PGA 複 合 体 の 遺 伝 子 抑 制 効 果 を− 85 −

図 6 siRNA-DGL-γ- PGA 複合体の電気泳動

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図 7 siRNA - DGL-γ- PGA 複合体の封入率
図 9 siRNA - DGL-γ- PGA 複合体の遺伝子抑制効果

図 8 siRNA - DGL-γ- PGA 複合体の TEM image

B16-F10/Luc 細胞を用いて評価した。ルシフェラーゼを抑 制 す る siRNA を 内 包 し た siRNA-DGL6-γ-PGA 複 合 体の遺伝子抑制効果は siRNA-DGL6 複合体と同程度であり、B16-F10/Luc 細胞中のルシフェラーゼ活性を有意に抑制した（図 9）。
図 10 siRNA - DGL-γ- PGA 複合体の細胞毒性

3. 6. in vitro における siRNA-DGL6-γ-PGA 複合体の細胞毒性
siRNA- DGL6 - γ -PGA 複合体を B16-F10/Luc 細胞に添加

ルマウスに尾静脈内投与し、in vivo における遺伝子抑制

し、細胞生存率を WST-1 assay により測定した。siRNA-

効果を評価した。コントロールとして 5% 糖液を投与し、DGL6-γ -PGA4 複 合 体 と siRNA-DGL6-γ -PGA12 複 合 体 で

ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て siRNA-invivofectamine

は siRNA - DGL6 複合体と同様にコントロールと比較して有意

複 合 体 を 投 与 し た。Naked siRNA お よ び ス ク ラ ン ブ ル

な細胞毒性を示した。一方、siRNA-DGL6-γ -PGA6，8，10 複

siRNA を内包した siRNA-DGL6 - γ -PGA10 複合体では、遺合体においては、高い細胞生存率が認められた（図 10）。

伝子抑制効果を示さなかった。一方、ルシフェラーゼを抑制する siRNA を内包した siRNA-DGL6 - γ - PGA10 複合体は

3. 7. 赤血球凝集試験

siRNA-invivofectamine 複合体に匹敵する高い遺伝子抑制

siRNA-DGL6 複合体と siRNA-DGL6-γ -PGA10 複合体の効果を示した（図 12）。

血液毒性を赤血球凝集試験により評価した。siRNA-DGL6

4. 考

複合体は凝集を示したが、siRNA-DGL6- γ-PGA10 複合体
は凝集を示さなかった（図 11）。

察

デンドリマーは、中心から規則的に分枝した構造を持つ
樹状高分子であり、分岐度が高い、対称性が良い、分子構

3. 8. メラノーマ肺転移に対する siRNA- DGL6 -γ-PGA10 複合体の遺伝子抑制効果

造と分子量の分布を持たないといったユニークな特徴を有siRNA-DGL6 -γ - PGA10 複合体をメラノーマ肺転移モデる 3-5）。今回使用した DGL はアミノ酸であるリジンだけでしており、遺伝子ベクターとしての有用性が報告されてい− 86 −

新規ナノ粒子を用いた皮内 siRNA デリバリーによる皮膚の恒常性維持

図 11 siRNA-DGL-γ- PGA 複合体の赤血球凝集内において負電荷を帯びている血清タンパクや赤血球と結合し、凝集することも知られている。したがって、遺伝子ベクターを臨床応用するためには、このようなカチオン性
由来の毒性を排除することが重要である。
カチオン性複合体の細胞毒性を克服するための有用な手
段の 1 つとして、カチオン性化合物にアニオン性化合物を添加することが挙げられる。アニオン性化合物はカチオン性化合物と比較して、細胞膜の破壊が少なく、ミトコンド
リアやリソソームへの損傷が弱いことが報告されている 7）。
我々は以前、様々なアニオン性化合物をスクリーニングした結果、γ-PGA がカチオン性化合物の毒性を軽減できる
図 12 メラノーマ肺移転に対する siRNA-DGL-γ-PGA 複合体の遺伝子抑制効果

ことを見出した 1，2）。γ- PGA は非免疫原性で炎症反応を引き起こさない生体適合性に優れた生体分解型の高分子である 8）。そこで、高い遺伝子抑制効果と比較的低い細胞毒性構築されたデンドリマー構造を有する新規カチオン性高分を示した siRNA-DGL6 複合体に様々な量の γ- PGA を添加子であるため、生体適合性に優れており、臨床使用も期待

し、siRNA-DGL6 -γ - PGA 複合体の調製を試みた。
γ- PGA の 濃 度 依 存 的 に siRNA-DGL6 -γ-PGA 複 合 体 のできる。そこで本研究では DGL をコアとした siRNA ベク

表面電荷は低下し、siRNA に対する γ -PGA の電荷比が 6ターの開発を行った。
ま ず、siRNA-DGL 複 合 体 の 製 剤 学 的 評 価 を 行 っ た。

以上で siRNA-DGL6 - γ - PGA 複合体の表面電荷はアニオン

DGL の直径は 16 nm であり、siRNA と様々な電荷比で自性を示した。一方、siRNA-DGL6 - γ-PGA 複合体の粒子径

己組織化することで粒子径 100 nm 以下のナノ粒子を形成は siRNA-DGL 複合体とほぼ同じであった。また、siRNA-した。また、粒子からの siRNA の流出がほとんどなかっ

DGL6 - γ-PGA 複合体からの siRNA の流出はほとんどなく、たことから、siRNA がナノ粒子に内包されていることがsiRNA が安定に内包されていることが示唆された。し示唆された。さらに、siRNA-DGL6 複合体の TEM におい

かしながら、siRNA-DGL6 - γ -PGA12 複合体においては、ても 100 nm 程度のナノ粒子であることが確認できた。

siRNA の放出が確認された。硫酸ヘパリンなどの一部の

DGL の電荷比が 6 以上の複合体で B16-F10/Luc のルシ

アニオン性高分子はカチオン性複合体の静電的結合を崩壊

フェラーゼ活性を抑制することができた。カチオン性複合し、siRNA の安定性を損なうことが知られている。その体はアニオン性に帯電している細胞表面との相互作用によため、siRNA-DGL6 -γ-PGA12 複合体では、大量の γ-PGA

り細胞取り込みが促進される。また、DGL は高い pH 緩衝と DGL との静電的相互作用により siRNA が部分的に放出2）能を有することが報告されている 。そのため、エンドソされたと考えられる。

ーム脱出が促進されたことも高い遺伝子抑制効果を示した

一般に、アニオン性複合体は細胞表面との相互作用が減一因であると考えられる。一方で、カチオン性化合物はこ

少することによって、細胞取り込みが低下する。しかしの細胞表面との直接的な相互作用、あるいはカチオン性化ながら、siRNA-DGL6- γ -PGA 複合体は表面電荷がアニオ合物の存在下で形成される活性酸素種（ROS）
によって、間ン性にも関わらず、カチオン性の siRNA-DGL6 複合体に接的に細胞傷害を引き起こすことが報告されている 6）。実匹敵する高い遺伝子抑制効果を示した。これらの結果は

際、siRNA に対する DGL の電荷比が増加するにつれて細γ-PGA 被膜型複合体が γ -PGA に特異的な受容体を介して胞毒性も大きくなった。さらに、カチオン性化合物は生体エネルギー依存的に取り込まれたという以前の報告に一致− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

するものであった。また、siRNA-DGL6-γ -PGA 複合体は
siRNA-DGL6 複合体で認められた細胞毒性および血液毒性（引用文献）
1） Kurosaki T, Kitahara T, Fumoto S, Nishida K,を軽減することができた。したがって、生体内へ投与後にNakamura J, Niidome T, Kodama Y,

Nakagawa

血栓や塞栓を生じる可能性がなく、in vivo においても安H, To H, Sasaki H, : Ternary complexes of pDNA,

全に投与できる可能性が示された。

polyethylenimine, and gamma-polyglutamic acid forgene delivery systems, Biomaterials., 3 0, 2 8 4 6-2 8 5 3,

そこで、siRNA-DGL6- γ-PGA 複合体の in vivo における2009.

有用性を、メラノーマ肺転移モデルマウスを用いて評価した。その結果、siRNA-DGL6-γ-PGA10 複合体は siRNA-2） Kodama Y, Nakamura T, Kurosaki T, Egashira K,

invivofectamine 複 合 体 に 匹 敵 す る 遺 伝 子 抑 制 効 果 を 示

Mine T, Nakagawa H, Muro T, Kitahara T, Higuchi

した。一方で、スクランブル siRNA を内包した siRNA-

N, Sasaki H, : Biodegradable nanoparticles composed

DGL6- γ - PGA10 複合体では遺伝子抑制効果を示さなかっof dendrigraft poly-L-lysine for gene delivery, Eur J
Pharm Biopharm., 87, 472-479, 2014.

たことから、siRNA-DGL6-γ-PGA10 複合体の効果は毒性によるものや off-target によるものではなく、複合体によ3） Petit MW, Griffiths P, Ferruti P, Richardson SC, :り効率的に siRNA をメラノーマ細胞へ導入できた結果でPoly(amidoamine) polymers: soluable linear amphiphilic

あることが示唆された。

drug-delivery systems for genes, proteins, and5. 総

oligonucleotides, Ther Deliv., 2, 907-917, 2011.

括4） Wang M, Hu H, Sun Y, Qiu L, Zhang J, Guan G, Zhao

本研究では、siRNA と DGL および γ -PGA を自己組織化

X, Qiao M, Cheng L, Cheng L, Chen D, : A pH-sensitive

させることで siRNA-DGL- γ-PGA 複合体を作製することにgene delivery system based on folic acid-PEG-chitosan成功した。siRNA-DGL- γ-PGA 複合体は皮膚がんであるメ- PAMAM-plasmid DNA complexes for cancer cell

ラノーマ細胞株において、細胞毒性を示すことなく、高い

targeting, Biomaterials., 34, 10120-10132, 2013.

遺伝子抑制効果を示した。さらに、メラノーマ肺転移モデ

5） Zhou J, Wu J, Hafdi N, Behr JP, Erbacher P, Peng L,

ルマウスに siRNA-DGL- γ-PGA 複合体を静脈内投与した結: PAMAM dendrimers for efficient siRNA delivery and

果、in vivo においても遺伝子抑制効果を示した。したがpotent gene silencing, Chem Commun., 22, 2362-2364,って、siRNA-DGL -γ- PGA 複合体は皮膚に対して安全かつ2006.

高効率に siRNA を送達させることで、RNA 干渉を制御で

6） H u i Y i X u e , S h i m e n g L i u , H o L u n W o n g , :Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of

きる可能性が示唆された。

siRNA-based nanomedicine, Nanomedicine (Lond)., 9,
謝辞

295–312, 2014.

本研究を遂行するに当たり、公益財団法人コスメトロジ

7） Fröhlich E, : The role of surface charge in cellularー研究振興財団よりご援助いただきましたことを深く感謝

uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles, Int J

申し上げます。

Nanomedicine., 7, 5577-5591, 2012.
8） Ye H, Jin L, Hu R, Yi Z, Li J, Wu Y, Xi X, Wu Z,:
Poly(gamma, L-glutamic acid)-cisplatin conjugate
effectively inhibits human brast tumor xenografted innude mice, Biomaterials., 27, 5958-5965, 2006.

− 88 −