二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果
分子科学研究所

手老龍吾

Lipid bilayer membranes on TiO2 substrates were investigated by means of atomic force microscopy（AFM）
and fluorescence microscopy. Lipid bilayer membranes deposited on flat solid surfaces are called "supported planar
bilayers"（SPBs）, and expected to be an effective cell-membrane-mimicking model system in vitro. TiO2 is widelyused in cosmetic products such as sunscreens, face-powders, foundations, etc. I propose that the SPB on TiO2
surfaces can be a good model-system of the cell/cosmetics interface on skins.
Single-stepped rutile-TiO 2 low index surfaces were used in order to clarify the effects of surface atomic,（001）and（110）surfaces
structures and chemical properties of each TiO2 surface. Single-stepped TiO（100）2were prepared by HF aq. immersion and thermal treatment at 700-850°C at O 2 flow. The SPBs were formed byvesicle fusion methods using extruded vesicles through 50-100 nm and sonicated vesicles. Two kinds of saturated
phospholipids, dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC）and dipalmitoylphosphatidylcholine（DPPC）, an
unsaturated phospholipid, dipalmitoleoylphosphatidylcholine（DPoPC）, or their mixture were used for the SPBs on
purpose.
was incubated in the 100-nm-filtered and sonicated DPoPC vesicle
After the single-stepped TiO（100）surface
2
suspension, a defect-less and full-coverage SPB formed. Fluorescence recovery after photobleaching experimentshowed that the SPB retains the fluidity. In the AFM images, the trace of the single steps was recognized on
the DPoPC-SPB on the TiO2（100）. This step-trace was also observed on both gel-phase and liquid-crystal-phasedomains in a phase-separated binary SPB of DPPC and DPoPC. The gel-domains edges along the substrate steps
preferentially appeared. It was also found that the nucleation of the gel-domains occurred on the terrace regions.
These results indicated the atomic structure on the substrates actually affects to the assembly of lipid molecules in
the SPBs.
The DMPC 50-nm-filtered vesicles transformed to planar bilayer on the O2-annealed TiO（100）, but adsorbed
2
as vesicles on the UV-irradiated TiO（100）. Stable hydrogen-bonded water layer formed due to the UV-induced
2hydrophicity on the TiO2 surface. The water layer worked as the barrier for the interaction between the DMPC headgroup and the substrate.

１．緒

言

脂質分子

化粧品には金属酸化物や粘土鉱物などの様々な無機材
料の微粒子が使われており、生体物質 ( 細胞 ) と無機物質

水の層（1-2nm）の界面系として捉えることができる。細胞膜の主成分である脂質分子を固体表面上に平面二重膜として堆積した固体基板“supported planar bilayer（SPB）”（図 1）は細胞膜のモ

図1

デルシステムとして生化学や医療分野で有力視されている。
本来は流動的で壊れやすい脂質二重膜が固体表面に支持さSupported planar bilayer（SPB）の模式図

うな影響を与えるかを明らかにする事を目的とする。

れることにより安定化され、また、走査プローブ顕微鏡や近年では化粧品に用いられる TiO2 は透明度を上げるた

各種分光法などの高空間分解能・高感度の表面科学的実験

めに超微粒子化が進んでいる。ナノメーターサイズの微粒手法を用いて解析を行うことができる点が長所として挙げ子は、粒径や調整方法によって低指数面の組み合わせで形られる。本研究では、白色顔料や UV カット素材として化成される特徴的な構造を取ることが知られている１, ２）。図粧品に広く用いられている TiO2 の表面に堆積した SPB を

2 がルチル型 TiO2 の代表的な低指数表面の構造である。

用いて、無機固体の物理的・化学的特性が脂質膜にどのよ

ルチル型 TiO2 表面は酸化物表面の中ではこれまでに最も多くの研究がなされており、表面原子構造、電子状態、化Effect of Surface Properties and UV
irradiation on the Supported Lipid
Bilayer Membranes on Titanium Dioxide
Surfaces

学反応特性について多くの情報が既に得られている ３, ４）。

Ryugo Tero

性の「何が」「どのように」脂質膜に影響するのかを要素

Institute for Molecular Science

化することができると期待される。また、TiO2 は UV 照

それぞれの低指数面の SPB に対する特性を TiO2 単結晶表面を試料として用いることでモデル化すれば、基板表面物

射による超親水性の発現など、多様な表面機能を示す。本

− 36 −

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果

２．３

a : TiO2（110）

基板表面上への SPB 形成

TiO2 表面への SPB 形成はベシクル展開法６, ７）によって行った。洗浄・焼成した TiO2 表面上にベシクル懸濁液を滴下し、40℃に 30 分間保った後、液相を緩衝溶液で置換して未反応のベシクルを取り除いた。
b : TiO2（110）

２．４

AFM および蛍光顕微鏡観察

AFM 観察は、TiO2 表面形状は大気中、SPB 形成後の試料は緩衝溶液中でそれぞれ行った。前者は通常のタッピ
ングモード、後者は磁気励振モードで行った。
蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の た め に、 あ ら か じ め 色 素 ラ ベ

c : TiO2（110）ル し た リ ン 脂 質（lissamine rhodamine B sulfonyldioleoylphosphatidylethanolamine（Rb-DOPE）, Ex/Em:
550/590 nm）を１% 混ぜてベシクル懸濁液を調製した。
脂質膜の蛍光顕微鏡観察は水銀ランプを備えた落射型顕微

図 2 ルチル型 TiO2 低指数面のバルク終端構造モデル⒜ TiO（110）;⒝ TiO（001）;⒞ TiO（100）。ルチル型
22
2
TiO2 の単位格子は正方晶なので、（001）面と（100）面は等しくない。

鏡を用いて行った。

３．結
３．１

果

TiO2 低指数面の表面構造レポートでは、TiO2 の表面構造および表面状態が SPB の

酸素雰囲気下で焼成した後の TiO2 低指数表面の AFM

形状や性質、ドメイン構造に及ぼす影響を原子間力顕微鏡像を図 3 に示す。TiO（110）（図 3a）,（001）（図 3b）,（100）2（AFM）と蛍光顕微鏡を用いて調べた結果について報告する。 （図 3c）の 3 種類の低指数面を用いて、平坦なテラスとス

２．実
２．
１

テップで形成される表面を再現性よく調製することができ験た。図 3d には TiO（100）面（図3c）のラインプロファ
2リン脂質ベシクル懸濁液の調製

イルのみを示したが、それぞれのステップの高さは単位格

目的に応じて、ゲル - 液晶相転移温度（Tc）の異なる 3
種類のリン脂質を使用した ; dipalmitoylphosphatidylcholine

子１つ分の高さに等しく、シングルステップが形成されていることがわかる。

（DPPC, Tc ＝ 41℃）
, dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC,

TiO（100）面上では、焼成温度を変えることでモフォロ
2

Tc ＝ 24 ℃）, dipalmitoleoylphosphatidylcholine（DPoPC,

ジーの異なるステップ & テラス構造が現れることを見出− 36℃）。ガラスバイアル壁面に広げて真空乾燥させたした。焼成温度 700℃ではシングルステップが形成される

後、リン脂質フィルムを緩衝溶液（KCl 150 mM, MgCl2（図 3c, d）が、焼成温度 800℃ではステップ高さが 2 倍に40 mM, HEPES 5 mM /pH 7.2 KOH）中で撹拌して 0.1 ㎎

なったダブルステップ構造が現れた（図 3e）。テラス幅も/ ㎖のベシクル懸濁液とした。この懸濁液を凍結・解凍 5

およそ 2 倍に広がっているため、面全体での平均の傾きは回、超音波破砕、ポリカーボネート膜（50 nm または 100

変わっていない。焼成温度 850℃の表面では、ステップ高

nm メッシュ）を通すフィルタリング５）、のプロセスによさはシングルステップ相当ながら、いびつなステップ形状って SPB 形成に適した small unilamellar vesicle を調製しを持ち、テラス上に［001］方向に走るストリーク構造が

た

６, ７）

。これらのプロセス（凍結時は除く）は懸濁液をそ観察された（図 3f）。
図 3 に示した TiO2 表面は、いずれの表面も室温の大気

れぞれのリン脂質の Tc 以上に保って行った。

中、緩衝溶液中で安定に存在することを確認した。次に、

２．
２

シングルステップ TiO2 表面の調製

これらの TiO2 表面のうち、TiO（100）表面上へのSPB
2

TiO2 表面の処理は、文献８）のウェット法を一部変更

形成にの結果について述べる。

して用いた。アセトン、メタノール、純水中で超音波洗浄した TiO2 単結晶基板を H2SO4+H2O2（4：1）溶液中で５s 煮

３．２

TiO（100）表面上のSPB
2

沸して有機物を完全に取り除き、10% HF 水溶液中に 10

図 3c に示したシングルステップ TiO（100）表面上にベ2min 浸漬した後、酸素流通下（1.0 L/min）で 700-850℃、シクル展開法によって SPB 形成を行った。100 nm フィル

１h 焼成した。

ターを通してから超音波破砕した DPoPC ベシクル懸濁液
下で TiO（100）を40℃でインキュベーションすることに2− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

a

a

b

b

20 µm

Height
[nm]

1.40

0
0

e

1.00

d
B

0.25 nmA

Distance [µm]2.0fHeight
[nm]

c

0
0

0.20nmDistance [µm]2.0

図 4 シングルステップ TiO（100）表面上に形成した
2
DPoPC-SPB の⒜蛍光顕微鏡像と⒝ AFM 像 (2.0×2.0
μ ㎡）⒜は同じ領域で FRAP を行い、蛍光が回復していく過程を撮影したもの。A, B で示した輝点と明るい領域はそれぞれ吸着ベシクルと 2 層目の二重膜。

光顕微鏡像とステップ高さがシングルステップよりも低く観察されることなどから観察領域全体が脂質膜に覆われていると考えられるが、直接的なデータであるとは言いがたい。そこで、室温で液晶相の DPoPC（(Tc= − 36℃）に室温でゲル相をとる DPPC（Tc=41℃）を 1：1 で混ぜた 2 相系 SPBを形成し、AFM 観察を行った（図 5a）。2 種類の脂質を混ぜることで DPPC の Tc が低下するため、[001]

インキュベーション（40℃）時には全体が液晶の

図 3 HF 処理後に酸素雰囲気下で 1h 焼成した TiO2 単結晶低指数表面の AFM 像⒜ )TiO2（110）, 焼成温度 800℃（(1.0×1.0μ ㎡）; ⒝ TiO（001）,2
850℃（(1.0×1.0μ ㎡）; ⒞ TiO2（100）, 700℃（2.0×2.0μ ㎡）;⒟ ) 図 3c のラインプロファイル ; ⒠ TiO2（100）, 800℃（2.0×2.0
μ ㎡）; ⒡ TiO（100）,
850℃（2.0×2.0μ ㎡）, 挿入図は 400×2
400n㎡。全て大気中、室温で観察。

SPB が形成されるが、室温付近では相分離が起こ
り、DPPC リッチなゲル相ドメインが析出する。液晶からゲルへの相転移に伴いランダムな配向をとっていたリン脂質の炭化水素鎖がオールトランス
配向に変化してパッキングするため、膜厚が増加して、1 分子当たりの占有面積は減少する。そのため、AFM 像の高さの差から、ゲル相と液晶相のドメインを区
よって、ディフェクトの無い SPB が TiO2 表面全体を覆う

別することができる。また、面積の減少にともない SPB

ことを蛍光顕微鏡観察によって確認した（図 4a）。蛍光消に欠陥が形成されて基板表面が露出するため、SPB の厚光回復法（FRAP）によって、形成された SPB が連続的さを評価することができる。ゲル相ドメイン、液晶相ドメで流動性を保っていることが示された。吸着ベシクルと 2インの膜圧はそれぞれ 5.8 nm, 4.3 nm であった（図 5a）。

層目の SPB が存在するため、定量的な拡散係数の算出は

AFM 像の Z 方向のコントラストを強調すると、いずれのできなかった。図 4a の試料をそのまま AFM で観察したドメイン上でも TiO2 基板のステップ構造を認識すること

ものがを図 4b である。表面全体を覆っている脂質膜が、ができたことから（図 5b）、相状態にかかわらず SPB が基板のステップ & テラス構造を反映した階段状の構造を

基板表面の原子レベル構造を反映した形状をとっているこ

とっていることがわかる。

とが確認された。また、ゲル相ドメインの 2 次元的な形状

一般的に液晶相の SPB は流動性が高くて膜に欠陥が出来にくいため、AFM 像からは被覆率 100% の SPB と何もに着目すると、図 5c のように基板ステップ方向に伸びた
エッジ多く観察された。

９）無い表面の見分けがつきにくい 。図 4b においても、蛍− 38 −DPPC と DPoPC の混合比と観察温度を制御すること

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果a
Height
[nm]

10.0

0

gel

0

a

5.8nm

b

gel domains

4.5nm
Distance [µm]2.0liquid crystal

liquid crystal
bare TiO2bc

図 6 ⒜ ダ ブ ル ス テ ッ プ TiO2（100） 表 面 上 に 形 成 し た
DPoPC+DPPC（3：1） の 2 相 混 合 SPB の AFM 像（2.0×2.0μ ㎡）。⒝図 6a の液晶相上に観察されるステップ構造を破線で示した。

ab

step direction

図5⒜ シ ン グ ル ス テ ッ プ TiO（100）
表面上に形成した
2
DPoPC+DPPC（1：1） の 2 相 混 合 SPB の AFM 像（2.0×2.0μ㎡）。⒝ 図 5b の Z 方向のコントラストを強調した像。
⒞ステップ方向に沿ったエッジを持つゲル相ドメインのAFM 像（1.5×1.5μ ㎡）。

で、ゲル / 液晶ドメインの割合を変化させることができる。図 6 はダブルステップの TiO（100）表面（図3e）上2に形成した DPPC：DPoPC = 1：3 の混合 SPB を 30 K/s

図 7 シングルステップ TiO（100）表面上へのベシクル展開
2法による SPB 形成における、基板表面への紫外光照射の効
果。⒜紫外光照射なし。平面膜が形成されている。⒝紫外光照射を行ったTiO2（100）。表面にベシクルが吸着したままで、平面膜形成が進んでいない。

で 25℃から 5℃に冷却し、5℃で観察した AFM 像である。
この冷却条件では DPoPC リッチな液晶相の SPB の中に、ーを通して粒径を約 50 nm にそろえた DMPC- ベシクル懸小さなゲル相ドメインが点在しているのが観察された（図濁液を用いて、紫外光照射の有無により SPB 形成に差が6a）。ゲル相ドメインの大きさがテラス幅と同程度まで小現れるかどうかを確かめた。紫外光照射を行わない TiO2

さくなっており、液晶ドメイン上から基板のステップ構造（100）表面上では図４-６同様 SPB が形成された（図 7a）が認識できるため、ゲル相析出の核生成サイトを調べるこのに対し、あらかじめ紫外光照射した TiO（100）面上で2とができる。図 6b から、ゲル相の析出は平坦なテラス上はベシクルが吸着したままで平面膜の形成が進まなかったで優先的に起きていることが確認された。

（図 7b）。

３．
３

４．考TiO2 表面への UV 照射効果

TiO2 の重要な表面特性として、紫外光照射による超親焼成後の TiO2 表面でシングルステップ現れるという結。基材表面の親水性は微粒子

果は文献８） に倣ったものであるが、加熱を酸素下で行っの分散度などにも関係する要因であり、また、紫外光誘起たことによってステップ形状などに違いが現れている。ま

水性の発現が上げられる

10）

察の表面改質は屋外に長時間滞在した際の基材の材質変化とた、TiO（100）表面が焼成温度によってステップ& テラ
2

しても影響すると考えられる。そこで、ベシクル展開法にス構造を保ちながらも、異なるモフォロジーを持つことはよって脂質を堆積する前の TiO2 表面上に紫外光照射を行

非常に興味深い（図 3c-e）。これらの表面上での SPB の挙った場合の SPB 形成への影響について調べた。

動を詳細に調べることによって、無機材料の表面処理方法

まず、シングルステップ TiO（100）面（図7c）に低圧2
水銀灯（25 W）を用いて大気中で紫外光照射を行い、表面構造に変化が現れないことを確認した。次に、フィルタと生体膜の相互作用について新しい知見が得られると期待できる。
本研究においては TiO（100）表面にベシクル展開法に
2− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

よって比較的容易に SPB 形成をすることができたが、過性を低下させた方が SPB 形成速度が上昇することを報告

去の報告では TiO2 表面上では SPB の形成が進みにくいとした７）。これは、表面水酸基密度が高く最も親水度が高いされてきた 11, 12）。SPB は固液界面に存在する有機分子の自SiO2 表面近傍には、水素結合で表面水酸基と結ばれた安己組織化構造であり、基板表面の形状と化学状態、溶液の定な水の層が存在するためである。この水素結合ネットワ

イオン濃度や pH、脂質の組成と相状態など、非常に多くークがベシクルの基板表面への安定吸着を妨げ、平面膜形のパラメーターを含む複雑な系である。TiO（001）, TiO2
2成のための障壁として働いている。光照射によって表面水（110）表面上での平面二重膜形成にも着手しており、いず酸基密度が増加した TiO2 表面上で SPB 形成が進まなかっ

れも質の良い SPB を作製できそうな感触を得ている。こたことも、同様のメカニズムで説明することができると考れらの実験によって、「表面」の持つパラメーターを要素えている。

化することに近づくと期待している。

５． 総

Supported bilayer においては、脂質分子は基板表面に括直接吸着しているのではなく、図 1 に示したように 1-2

TiO2 単結晶基板上にステップ & テラス構造を調整してnm の水の層を介して基板上に支持されている 13）。この水SPB 形成を行い、その構造を AFM と蛍光顕微鏡によっの層を挟んだ上で、図 4, 5 で観察されたように、厚さ約 5て観察した。SPB は原子ステップ高さの表面構造を反映

nm ある SPB はたった 0.25 nm の表面原子ステップ構造

した形状をとっており、その微細なひずみによって SPBを反映した形状をとっており、基板表面と脂質膜間の距離

内での相分離の際にドメイン構造や核生成サイトの形状・が広範囲にわたってオングストロームオーダーで精密に決位置が影響されることを明らかにした。また、TiO2 表面

まっていることがわかる。また、図 5, 6 の結果は、この脂の光誘起親水性の発現によって脂質膜の吸着構造が大きく質膜の厚さのわずか 5% 程度の小さなひずみが、脂質膜内変化することを見出した。

のドメイン形状やゲル相の核生成などの相分離過程に大きく影響を及ぼしていることを示している。ゲル相ドメイン

謝辞の形状が表面ステップ構造を反映したことから、脂質膜中

本研究は、分子科学研究所・宇理須恒雄教授、名古屋大での 2 次元分子拡散がステップに垂直 / 平行な方向で異方学・宇治原徹助教授との共同研究である。本研究に対して性を持っている可能性がある。表面微細構造を利用した指助成をいただきました財団法人コスメトロジー研究振興財

向性分子輸送や、拡散速度の違いを利用した分子選別など団に深く感謝いたします。

につながると期待できる。ゲル相の核生成がテラス上で選択的に起きた（図 6）のは、ステップ構造によってできた（参考文献）

歪によって分子の分配係数が変化したためであろう。脂質

１）P. M. Oliver, G. W. Watson, E. T. Kelsey, et al.,

膜が歪んだ状態のステップ上にはよりフレキシビリティのAtomistic simulation of the surface structure of the

高い液晶相の DPoPC が優先的に存在するため、結果としTiO2 polymorphs rutile and anatase, J. Mater. Chem. ,て平坦なテラス上の SPB 内での DPPC 濃度が上昇し、過7, 563-568, 1997.

飽和度を越えた時点でゲル相の析出が始まると考えている。

２）T. Ohno, K. Sarukawa, and M. Matsumura, Crystal

しかし、このような立体的効果だけでなく、ステップとテfaces of rutile and anatase TiO2 particles and their

ラスでの原子の化学状態の違いが影響している可能性も残roles in photocatalytic reactions, New J. Chem., 26,

されており、今後 TiO（110）（001）面など表面原子配列や,
21167-1170, 2002.

化学特性の異なる低指数表面を用いての実験で詳細を明ら

３）Y. Iwasawa, Dynamic oxide interfaces by
microscopic techniques at high resolutions, Surf. Sci.,

かにしたい。

404-404, 8-19, 1998.

紫外光照射による超親水性発現のメカニズムについては今でも盛んに研究が行われているが、TiO2 表面において

４）U. Diebold, The surface science of titanium dioxide,
Surf. Sci. Rep., 48, 53-229, 2003.

は水分子が光誘起の解離吸着を起こして準安定的に表面水
10）。ベ５）R. C. MacDonald, R. I. MacDonald, B. P. M. Menco, et

シクルあるいは SPB のリン脂質分子は親水性頭部によっal., Small-volume extrusion apparatus for preparationて水を介して親水基板表面に支持されているため、直観of large, unilamellar vesicles, Biochim. Biophys. Acta,

酸基密度が増加した状態になると報告されている

1061, 297-303, 1991.

的には基板表面親水性の上昇にともないベシクル吸着が強まり SPB 形成速度は上昇しそうに思えるが、図 7 の結

６）R. Tero, M. Takizawa, Y. J. Li, et al., Lipid membrane

果は全くの反対である。筆者は以前、表面親水性を制御しformation by vesicle fusion on silicon dioxide surfaces

た SiO2 表面上への SPB 形成において、ある程度まで親水

modified with alkyl self-assembled monolayer islands,− 40 −

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果

Langmuir, 20, 7526-7531, 2004.

252-259, 2004.

７）R. Tero, H. Watanabe, and T. Urisu, Supported

11）C. A. Keller and B. Kasemo, Surface Specific Kinetics

phospholipid bilayer formation on hydrophilicity-of Lipid Vesicle Adsorption Measured with a Quartz

controlled silicon dioxide surfaces., Phys. Chem. Chem.

Crystal Microbalance, Biophys. J., 75, 1397-1402, 1998.

Phys., 8, 3885-3894, 2006.

12）I. Reviakine, F. F. Rossetti, A. N. Morozov, et al.,８）Y. Yamamoto, K. Nakajima, T. Ohsawa, et al.,Investigating the properties of supported vesicularPreparation of atomically smooth TiO2 single crystal

layers on titanium dioxide by quartz crystal

surfaces and their photochemical property, Jpn. J.

microbalance with dissipation measurements, J. Chem.
Phys., 122, 204711-204711-204718, 2005.

Appl. Phys., 44, L511-L514, 2005.
９）S. Furuikea, J. Hirokawa, S. Yamada, et al., Atomic

13）C. M. Ajo-Franklin, C. Yoshina-Ishii, and S. G. Boxer,force microscopy studies of interaction of the 20S

Probing the Structure of Supported Membranes

proteasome with supported lipid bilayers, Biochim.

and Tethered Oligonucleotides by Fluorescence

Biophys. Acta, 1615, 1-6, 2003.

Interference Contrast Microscopy, Langmuir, 21,10）K. Hashimoto and H. Irie, Photo-induced Hydrophilic

4976-4983, 2005.

Conversion on TiO 2 Surface, Hyomenkagaku, 25,− 41 −