皮膚器官培養系を用いた化学物質の刺激性、抗原性の検討
東京医科歯科大学

横関医学部皮膚科博雄

In order to predict the contact allergens or irritants in various chemicals, we analyzed mRNA of cytokines expressedin epidermis by stimulation of various chemicals in a human skin organ culture systems. After painting haptens,primary
irritants or vehicle control on human skin specimens sliced to 1 mm thickness and cut into approximately 5×5 mm
blocks, the pieces were cultured in serum-free medium. After separating epidermis from dermis, total mRNA wasextracted and mRNA of cytokines was assessed by the reverse transcriptase-plymerase chain reaction. Only haptens
but not irritants induced IL-1βmRNA at 1-3 hours. TNF-αmRNA was induced 9 hours after application of haptens and1 hour after application of primary irritants. IL-1αmRNA was not induced by either haptens or primary irritants. Thus,
cytokine mRNA expression induced by haptens in epidermis from that induced by primary irritants.
These results indicate that analysis of the epidermal cytokines mRNA expression induced by chemicals in a humanskin organ culture system is usuful methods to predict haptens or primary irritants from various chemicals.

しかし、in vitro での感作性試験はまだ十分に１ 緒 言検討されていない。1986 年に Kimber らはハプ接触皮膚炎（contact dermatitis、CD）は、湿疹

テンで経皮感作したのちのリンパ節細胞を調整性疾患群の代表的な疾患であり皮膚科の外来患し、リンパ節細胞の３H − thymidine の取り込み量者数では最も多い疾患である。現代の進歩した化を測定すること（LLNA）によりそのハプテンの学産業は新たに多くのアレルゲンを生みだし、そ抗原性を定量し得ることを報告した２）。一方、私のアレルゲンによる接触アレルギーが増加してたちの教室でも化学物質を結合させた表皮細胞きた。また戦後、生活様式が大きく異なり、シャと脾細胞を混合培養することにより化学物質のンプー、石鹸などを多量に使用することによる刺感作性を定量することに成功した３、４）。しかし、激性皮膚炎も増加してきた。現在、このように接これらの in vitro 試験はマウスを用いた系で一部触皮膚炎が増加することは生体環境上大きな社

ヒトにおける抗原性とは異なる結果が認められ会問題となっている。

た。一方、皮膚にハプテンもしくは一時刺激物質

化粧品や医薬部外品はその使用に関し、医師のTNF−α など種々を塗布することにより IL−１β、指導を必要とせず使用方法に関しては野放し状のサイトカインが誘導されることが明らかにさ態であるため、特に安全性を高くする必要があれた５、６）。そこで今回、ヒトの皮膚を用いて器る。現在では９種類の安全性試験を施行するよう官培養することによりハプテンと一時刺激性物法的に義務づけられている 。特に接触アレルギ質ではサイトカインの mRNA の発現パターンがーを起こしやすいかどうかを判定する感作性試験

異なる結果が見られたのでここに報告する７、８）。

１）は、接触アレルギーの予防上最も大切な試験である。
Analysis of Cytokine mRNA Expression
Induced by haptens or irritants inhuman organ culture system
Hiroo Yokozeki, M.D.
Department of Dermatology,
School of Medicine, Tokyo Medicaland Dental University

２ 実験方法２. １ 皮膚器官培養
厚さ１mm の正常分層植皮片を 5 × 5 mm に細切した後、種々の化学物質を表皮側に塗布、表皮側を上にしてパラフィンで被ったレンズペーパ
ーの上に乗せ無血清培地（セルグロッサーＨ）で− 123 −

IL −１α は化学物質による刺激のない状態で発現

24 時間培養し経時的に皮膚を回収した５、６）。

しており各種の化学物質の刺激後１時間後に強２. ２ 化学物質による刺激く発現している。しかし、化学物質による刺激後皮膚器官培養時に表皮に 0 . 1 mM DNCB（ジニトロクロロベンゼン）、2 . 5％ PPD（パラフェニレの IL −１α の発現レベルとコントロールの間では差が認められなかった８）。

ンジアミン）、10 −６M レチノイン酸、１％メチ
ルサリチレート、１µg/mL superantigen（SEB）

３. ２ IL −１β の mRNA 発現レベルの比較検討
各種の化学物質を塗布後 24 時間培養した後のを塗布する。

IL −１β の発現レベルを図４に示した。縦軸に IL
２. ３ RNA 抽出と cDNA 作成−１β と βactin の RNA の発現の比率を表示し回 収 し た 皮 膚 は 0 . 5 mM ammmoniumている。IL −１β の mRNA 発現量は DNCB で刺thiocyanate を用いて表皮と真皮を分離する。得激した時は３時間後に、PPD で刺激した時は１られた表皮シートは PBS で洗浄後、RNA zol時間後にピークがみられる。しかし、MS、RAで RNA を抽出する。RNA より RAV reverseなどの刺激因子では特に発現のピークは認めらtranscriptase（Takara Co. Ltd）を用いて cDNAれなかった８）。

を作成する。
３. ３ TNF − α の mRNA 発現レベルの比較検討
２. ４ Polymerase chain reaction（PCR）解析

各種の化学物質を塗布後 24 時間培養した後のRT − PCR は IL −１α、IL −１β、TNF − α, β −TNF − α の RNA 発現レベルを図５に示した。

actin、ICAM −１、VCAM −１の primer を用いて

DNCB、PPD などのハプテンでは培養後９時間

表皮シートより抽出し作成した cDNA にて施行

後にピークが見られ MS、RA などの刺激因子で後半定量を行い比較検討した。

は培養後１時間後にピークが認められた。この結果は刺激因子が直接表皮に作用し TNF − α を誘３ 結 果導するという報告に一致する。また、ハプテン

RT − PCR 法が半定量性があることを明らかにを塗布後９時間して TNF − α が発現する結果は、するために RT − PCR の cycles 数とその結果得ら

ハプテンにより IL −１β 発現が誘導され IL −１β

れたバンドの強さをデンシトメーターで測定しにより間接的に TNF − α が誘導されたと考えらた。その結果、図１に見られるように各種のサイれた８）。

トカインの RT − PCR の cycle 数と OD との間に比例関係が認められた。次に RT − PCR を施行し３. ４ superantigen（SEB）刺激によるサイトカた cDNA の量とその結果得られたバンドの ODインの動態に比例関係が見られることを図２に示している。

皮膚器官培養時に１µg/mLSEB を加え経時的以上、今回の RT − PCR 法で半定量性があることに皮膚を回収してその表皮シートより RNA をが明らかにされた。

抽出し IL −１α、IL −１β、TNF − α、ICAM −１、
VCAM −１の mRNA 発現レベルを RT − PCR 法

３. １ IL −１α 発現レベルの比較検討で解析した。その結果図６に示されるように IL −各種の化学物質を塗布後 24 時間培養した後の１α は３〜６時間後にピークがみられ IL −１β はIL −１α の発現レベルを図３に示した。縦軸に３時間後に mRNA の発現が見られた後持続的にIL −１α と βactin の発現の比率を表示している。

発現していた。TNF − α は１時間後より持続的− 124 −

皮膚器官培養系を用いた化学物質の刺激性、抗原性の検討

図１ RT − PCR 法を施行した cycle 数と得られたバンドの OD の関連性

図２ RT− PCR 法を施行した cDNA の と得られたバンドの OD の関連性

− 125 −

図３ 各種の化学物質の存在下での表皮における IL− 1αの mRNA の発現

図５ 各種の化学物質の存在下での表皮における TNF− αの mRNA の発現

図４ 各種の化学物質の存在下での表皮における IL− 1βの mRNA の発現

図６ スーパー抗原（ＳＥＢ）存在下での IL− 1α、IL− 1β、TNF− α、ICAM−１、VCAM−１の mRNA の発現レベル− 126 −

皮膚器官培養系を用いた化学物質の刺激性、抗原性の検討に発現している。また、接着因子である ICAM −るか、刺激物質、抗原性の低い物質をアレルゲン

1 は６〜 12 時間後にピークが見られた。この結と鑑別しうるかさらに検討する必要がある。

果ブドウ球菌由来のスーパー抗原により IL −１α、IL −１β、TNF − α などのサイトカインが産生さ

なお以上の業績は J Dermatol：25 , 421 - 428：
1998 で報告した。

れその相互作用により ICAM −１の発現が誘導さ
文 献れることが明らかにされた７）。

１）昭和 62 年６月 18 日付、厚生省薬務局審査第４ 総 括２課、事務連絡。

化学物質の抗原性、刺激性を In vitro での試２）Kimber I , Weisenberger C : A murine local

験法で判定することは非常に困難なことである。

lymph nodes assay for the identification ofKimber らはマウスの耳介に化学物質を塗布後そcontact allergens. Assay development andのリンパ節細胞の増殖能により抗原性を判定す

results of an initial validation study, Arch

る LLNA 法を開発したが一時刺激物質の SDS とToxicol. 63 : 274 - 282 , 1989

ハプテンとの鑑別が不可能であった。また、私た３）Yokozeki H, Katayama I, Nishioka K :ちの教室で開発した化学物質を結合した表皮細Experimental study for the development of an

胞とＴリンパ球をマクロファージの存在下で培

in vitro test for contact allergens I, Int Arch

養し抗原特異的Ｔ細胞が誘導できるかどうかでAllergy Immunol, 106 : 394 - 400 , 1995

抗原性を判定する In vitro sensitization test でも４）Arimura M, Yokozeki H, Katayama I et al.などま:Experimental study for the development of an

だ抗原性試験として用いるには感度が不十分で

in vitro test for contact allergens II, Int Archあると考えられた。今回、ヒトの皮膚を用いた器

Allergy Immunol, 115 : 228 - 234 , 1998

ニッケルなどの抗原が判定できない

３、４）

官培養法では表皮より DNCB,PPD などのハプテ

５）Enk AE, Katz SI : Early molecular events in

ンでは１〜３時間後の早期に IL −１β の mRNAthe induction phase of contact sensitivity, Proが発現し９時間後に TNF − α の mRNA が発現

Natl Acad Sci, 89 : 1398 - 1402 , 1992した。一方、一時刺激性物質では表皮から IL −１６）B a r k e r J N W N , S a r m a V , D i x i t V e t a l

β の mRNA の発現はみられず１時間後に TNF −.:Keratinocytes as initiators of inflammation, 337

α の mRNA 発現が見られた。スーパー抗原では: 211 - 214 , 1991

早期よりすべてのサイトカインの mRNA の発現

７）Matsunaga T, Katayama I, Yokozeki H et al.:が見られた。このように塗布した物質がハプテン

Superantigen-induced cytokine expression inか刺激物質かにより表皮細胞内のサイトカイン

organ-cultured human skin, J Dermatol Sci, 11の mRNA 発現時期が異なることが明らかになっ: 104 - 110 , 1996

た。この特性を利用して各物質の抗原性、刺激性８）Matsunaga T, Katayama I, Yokozeki H et al.:を評価できる可能性が示唆された。しかし、２種

Epidermal cytokine mRNA expression induced

類のハプテンと一時刺激物質しか検討しておらby hapten differ from that induced by primary

ずニッケル、コバルト、クロム、ホルマリン、ウ

irritant in human skin organ cultur system, Iルシなどの典型的な接触アレルゲンを検出でき

dermatol, 25 : 421 - 428 , 1998

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