クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割

クエン酸による細胞機能の調節機構：
美容および美白、老化における役割
国立研究開発法人国立成育医療研究センター

宮戸健二

Citric acid is a substance produced naturally in citrus fruits, such as grapefruits, oranges and lemons, and makes anaddition of sour taste to foods and drinks. Citrate synthase (CS) produces citric acid and initiates citric acid cycle (alsoknown as tricarboxylic acid cycle [TCA] and the Kreb’s cycle) that assumes respiratory activity in mitochondria of all
types of cells. In general, chemical properties of CS are beneficial for skin care and often contained in skin care products;
however, its cosmetic effect is still unproven scientifically. To address this issue, we studied a physiological role of citricacid by producing mice lacking a gene encoding extra-mitochondrial citrate synthase (hereafter, eCS). eCS proteins are
expressed in several types of cells such as neurons, sperm and hair sheath cells in mice. The eCS proteins are also producedin human cells; nonetheless, its biological role is unclear. From general knowledge about citric acid, we assumed that eCS
deficiency might reduce cellular activity, presumably causing metabolic problems. Expectedly, eCs-deficient mice exhibited
hypopigmented hairs due to the reduction of cellular activity of melanocyte stem cells, regardless of male or female.
Furthermore, the frequency of mating behavior of the male mice was low, and their sperm-fertilizing ability decreased agedependently, resulting in male subfertility. Moreover, graying hairs went age-dependently forward to white hairs in addition
to hair loss. Interestingly, the supplementation of cyclic AMP (cAMP) improved lower cellular activities in sperm andmelanocytes isolated from eCs-deficient mice under the in vitro condition, although the supplementation of citric acid was
unaffected. We discovered the role of eCS in pigmentation and reproduction. We further propose that enhancement of eCS
activity (or local application of cAMP) not only suppresses hair graying, but also improve male sexual dysfunction.

1. 緒

られる。

言

クエン酸は柑橘系果物の果汁の主成分だけでなく、補助クエン酸は、細胞内小器官であるミトコンドリアで働く

食品（サプリメント）としても販売されており、容易に体内

クエン酸回路（TCA 回路または Krebs 回路）を動かす 8 種に摂取することができる。さらに、クエン酸には様々な効

類の酸のうちの 1 つである。酵母からヒトまで、真核生物能があることが知られている。最も知られているのは疲労のあらゆる細胞がミトコンドリアをもっており、クエン酸

回復効果であり、クエン酸には筋肉における乳酸の濃度を合成から始まるクエン酸回路によって細胞のエネルギー低くする作用が知られている。また美容に関しても、皮膚源であるアデノシン三リン酸（ATP）が産生される。一方、の弾力性を高める作用が知られている。一方、クエン酸

細胞質にはクエン酸回路の前段階にあたる解糖系が存在し、摂取によって癌細胞が形成されにくくなるといった作用

クエン酸回路に比べて効率が悪いものの ATP を産生するが知られている。それ以外にも、骨粗鬆症の予防効果、高ことができる。

血圧の予防効果。通風や結石の改善効果などが知られてい多くの細胞では、好気的条件下ではクエン酸回路を使っる。しかしながら、実はクエン酸の効能については実際た ATP 産生が行われる。一方、癌細胞では好気的な環境に証明された例は少なく、科学的根拠が乏しいのが現状で下であっても解糖系を使って ATP が産生されることが知ある。例えば、クエン酸の作用として知られる「疲労回復」、

られており、Warburg 効果（ワールブルク効果、または好「筋肉や神経の疲労予防」について、科学的に検証を試みた

気的解糖）と呼ばれ 1，2）。癌細胞において Warburg 効果がものの証明に至らず、最近では否定的な見方もされている。

生じるメカニズムは未だに不明であるものの、解糖系からさらに、クエン酸を主成分とする医薬品がないことも、ク

クエン酸回路への切り替えにはクエン酸合成が必須である

エン酸の健康への効果が疑問視される一因となっている。

ことから、クエン酸合成酵素の何らかの機能異常または機能獲得が Warburg 効果を引き起こしている可能性が考え

ただし、クエン酸による細胞毒性は報告されておらず 3）、クエン酸が細胞の呼吸活性の制御に必須であるという事実については疑う余地がない。そのため、クエン酸を効率よく細胞に摂取する方法、または、細胞内におけるクエン酸

Regulation of cell function by citric acid:
Roles in beauty care, skin whitening andanti-aging
Kenji Miyado
National Research Institute for Child
Health and Development

合成酵素の活性を上昇させる方法（例えば、食材や飲料成分）が明らかになれば、クエン酸は「若さの持続」のカギを握る物質として再認識されるかもしれない。そこで本研究
では、クエン酸の健康や美容における効果を科学的に検証するとともに、クエン酸の摂取方法およびクエン酸合成酵− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

PVDF 膜を 1 次抗体（抗 eCS 抗体、抗 DCT 抗体、抗 β - アク素を活性化させる物質の同定についても検討した。

2. 方チン抗体）を含む 1% スキムミルク溶液中で室温 2 時間振法

盪させ、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（HRP）を

2. 1. 遺伝子改変マウスの作製結合させた 2 次抗体を含む 1% スキムミルク溶液中で室温

クエン酸合成酵素（citrate synthase、以下 CS）は、ミト

2 時間振盪させた。1%Tween 20 溶液によって洗浄した後、コンドリア内に存在する酵素であるが、一方ではミトコン

Enhanced ChemiLuminescence（ECL）Plus 検 出 試 薬 を

ドリア外の細胞質にも存在する。しかしながら、このこと用いて目的のタンパク質を検出した。

はあまり知られていない。我々は、ミトコンドリア外に3. 結存在する CS（extra-mitochondrial CS、以下 eCS）をコードする遺伝子を欠損させたマウス（eCs 遺伝子欠損マウス）を作製して解析を行った。eCs 遺伝子欠損マウスは米国の果

3. 1. eCs 遺伝子欠損マウスにおけるメラニン色素産生異常

Knockout Mouse Project（KOMP）Repository に 作 製 を

CS は、ミトコンドリア内に存在する酵素である一方、依頼した。作製されたヘテロ欠損マウスの交配によってホミトコンドリア外の細胞質にも存在するが、このことはあモ欠損マウスを作製した。マウスの飼育および関連するすまり知られていない 4）。CS はすべての細胞の呼吸系を司べての実験は国立成育医療研究センター研究所・動物実験

る酵素であるため、CS 変異マウスは発生初期の段階で致規則に基づいて行った（機関内承認番号 #2004-04）。

死になるはずである。そのため、Cs 欠損マウスを用いて成体におけるクエン酸の役割を解析することは困難である。

2. 2. 色素細胞（メラノサイト）の体外培養

ただし、マウスでは、CS 以外に、ミトコンドリア外 CS（eCS）

eCs 遺伝子欠損マウスの胎仔から皮膚を分離した後、コをコードするもう１つの遺伝子（eCs）が存在する。そこで、ラゲナーゼ処理によって組織片からメラノサイトを単離し常法に従って胚性幹細胞を用いて eCs 遺伝子欠損マウスをた後、培養シャーレに播種した。細胞が増殖するまで培養作製した。

し、カルシウム波の測定および免疫染色を行った。野生型

マウスの遺伝的背景を黒色系統の C57BL/ 6 にしたとこ

細胞のコントロールとして C57BL/6J マウスの胎仔からもろ、eCs 遺伝子欠損マウス（以下、KO マウス）は灰色を呈

メラノサイトを単離、培養した。

した（図 1A）。1990 年代までに毛色を決定する遺伝子はすべて同定されたはずであるが、eCS は色素形成を調節して

2. 3. 細胞内のカルシウム波の測定

いるタンパク質として働いている可能性が出てきた。そ培地中にカルシウム結合性の蛍光試薬（Oregon Green

こで、マウスの背中の 4 種類の毛のうち 2 種類（Awl とBAPTA - 1 AM）（Molecular Probes, Invitrogen, Eugene,

Zigzag）を比較したところ、KO マウスでは明らかに含有OR）を最終濃度 2 µM になるように添加し、細胞に取りされるメラニン色素の量が少なかった（図 1B）。そこで毛込ませた後、培地を交換して高感度 CCD カメラ（Andorを回収し、抽出液中に含まれるメラニン色素の量を吸光度

Technology, Belfast, UK）
を用いて経時的に観察を行った。

2. 4. 免疫染色
新生仔の皮膚から分離したメラノサイトを培養した後、2% ホルムアルデヒド溶液で固定し、1% スキムミルク溶液
でブロッキングした後、1 次抗体（抗 eCS 抗体、抗 c-kit 抗体、
抗 TRP2 抗体）を含む 1% スキムミルク溶液中で室温 2 時
間振盪させ、さらに蛍光物質（Alexa488 または Alexa564）と結合させた 2 次抗体を含む 1% スキムミルク溶液中で室温１時間振盪させた。ハンクス溶液で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（LSM510，Zeiss）を用いて蛍光像を撮影した。また、対比染色としてヘキスト 33324 によって染色体 DNA を染色した。

2. 5. ウエスタンブロット解析
皮膚組織の抽出物を SDS 電気泳動によって分離した後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にタンパク質を転写した。

図 1 eCs 欠損マウスにおけるメラニン色素形成異常および生殖能低下
A，色素形成異常．B，マウス体毛のメラニン色素沈着．C，毛から抽出したメラニン色 素 含 量の定 量化．D，小 脳での
eCs の発現（LacZ 染色）．E，精巣重量の低下．WT，野生型
マウス；KO，eCs 欠損マウス．

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クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割で測定したところ、有意な差が認められた（図 1C, D）。また、eCs 遺伝子を欠損させた領域には β - ガラクトシダー
ゼ（LacZ）遺伝子を挿入していたため、LacZ 染色によって
eCs 遺伝子の発現領域を調べたところ、小脳の特定の神経細胞層に eCS の発現が認められた（図 1D）。
一方、精巣にも発現が認められ、さらに精巣の重量がKO マウスでは有意に低下していることもわかった（図1E）。メラニン色素の量が低下した原因として、⑴ メラニン色素の合成量の低下、⑵ メラノサイトの細胞数の低下、が推測された。そこでこれらの点について検討を行ったと
ころ、メラノサイトの細胞数が KO マウスでは有意に低下していることが明らかになった（図 2A, B）。
続いて、eCS が関与するメラニン色素の産生過程を明らかにすることを試みた 5）。メラニン産生にはメラノサイト
刺激ホルモン（α - MSH）を介したシグナル伝達系によってチロシンがドーパミンに変換され、さらに、2 種類のメラ

図 2 eCs 欠損マウスにおけるメラノサイト数の低下
A，メラノサイト数の低下．B，メラノサイトの透過型電子顕微鏡画像．C，メラノサイトにおけるメラニン色素形成と eCS の役割の模式図．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

ニン色素（フェオメラニンおよびユーメラニン）がチロシ
ナーゼ関連タンパク質（Tyrosinase-related protein-1，-2,
以下 TRP1, 2）よって生成される。そこでまずメラノサイ
トにおける eCS の発現の有無と、メラノサイトにおけるTRP1, 2 の発現量を比較した。
マウスの背側の皮膚から凍結切片を作製して抗 eCS 抗体で免疫染色したところ、eCS はメラノサイトが存在する
毛包の基部ではなく、毛幹に沿って存在する上皮細胞層に広く発現していることがわかった（図 3A, B）。この領域はバルジ領域に存在する幹細胞がメラノサイトへと分化する
過程で通過する領域である。さらに KO マウスの凍結切片について TRP1, 2 に対する抗体で免疫染色を行ったところ（図 3C）、TRP1 について KO マウスでは有意に発現が低下しており、TRP2 についても低下する傾向が認められた（図3D）。一方、KO マウスに対して飲用水に混ぜることで
α - MSH を投与したものの、KO マウスの毛に含まれるメ
ラニン色素の蓄積量を増やすことはできなかった（図 4A）。

図 3 eCS 発現部位およびメラニン色素生成への関与
A，eCS 発現組織．Red，eCS；blue，ヘキスト 33342．B，
ウエスタンブロット解析．C，メラノサイトにおける TRP1，2 の発現．D，メラノサイトにおける TRP1，2 の発現．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

さらに、チロシンについても同様の方法で KO マウスに投与したものの、KO マウスの毛に含まれるメラニン色素の蓄積量には影響を与えなかった（図 4B）。
次に、図 2C の模式図でチロシナーゼの活性を制御する
サイクリック AMP（cAMP）によって KO マウスから単離したメラノサイトを処理したところ、メラニン色素の産生量が上昇することがわかった。すなわち、毛幹の上皮細胞層から分泌される cAMP が幹細胞からメラノサイトへの分化を制御していることが推測された。さらに、eCS はcAMP の毛幹の上皮細胞層における産生および分泌に重要な役割を果たしていることが考えられた。

3. 2. eCS による雄の生殖能力の制御
図 1 E に示したように eCS は雄の生殖能力にも関与して

図 4 eCs 欠損マウスのメラノサイトへの薬剤投与の効果
A，飲料水によるα-MSH 投与の効果．B，飲料水によるチロシン投与の効果．C，メラノサイトへの直接投与による cAMP の効果．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

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コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 5 精子における eCS の役割
A，CS および eCS タンパク質のドメイン比較．B，CS およびeCS の組織での発現．C，精子での eCS の発現部位．D，先体反応前後での精子頭部における eCS の発現．E，マウス未受
精卵への Cs mRNA インジェクション後のカルシウムオシレーシ
ョン．F，マウス未受精卵の eCs mRNA インジェクション後のカ
ルシウムオシレーション．

図 6 精子における eCS の役割
A，ウエスタンブロット解析．PLCz1 の発現．B，クエン酸合
成活性（WT v.s. KO）．C，体外受精．D，交配による産仔数．E，カルシウムオシレーション（WT v.s. KO）．F，カルシウムオシレー
ション評価のパラメータ．G，波形の高さ．H，間隔．I，頻度．J，開始の時間．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

いる可能性が考えられた。そこで、eCS タンパク質の発現を調べたところ、精子で発現していることがわかった（図わかった（図 6D）。さらに体外受精によって融合した KO

5A，B）。さらに野生型精子を抗 eCS 抗体によって免疫染精子による卵でのカルシウムオシレーションのパターンを色したところ、精子頭部に発現量が多いことがわかり、明調べたところ、開始が極めて遅くなることがわかった。図らかにミトコンドリアの局在とは異なっていた（図 5C）。

5F の結果と合わせて考えると、eCS は卵活性化因子としeCS が受精に関与する可能性が考えられたが、精子外膜はて融合直後から 40 分までのカルシウムオシレーションを卵との融合前に脱落するため、eCS が精子外膜の脱落後に誘導する因子であると推測された。すなわち、卵活性化に

精子頭部に存在するか否かによって関与するステップが異は 2 つの因子が関わっており、前半（開始）と後半（持続）でなってくる。そこで、精子外膜の脱落前後での eCS の局

役割を分担している可能性が考えられた。

在を調べたところ、eCS は精子外膜の脱落後でも精子頭部

4. 考に留まることがわかった（図 5D）。加えて、イモリでは CS察が受精後の細胞周期の再開（卵活性化）
を誘導することが報本研究では eCS が「メラノサイトによるメラニン色素の告されていることから 6）、CS および eCS をコードするメ

生成」および「男性の生殖機能」の両方に必須であることをッセンジャー RNA（mRNA）を野生型の未受精卵にマイ

初めて明らかにした（図 7A，B）。さらに、cAMP の塗布

クロインジェクションしたところ、どちらの mRNA でもによってメラノサイトのメラニン合成系が活性化されるこ

卵活性化に必要なカルシウム波（カルシウムオシレーショ

とも新しい発見である。本研究の成果は、脱色やカラーリン）を誘導することが明らかになった（図 5E，F）。同様に、

ングといった方法ではなく、cAMP と cAMP の競合阻害

メラノサイトにおいてもカルシウムオシレーションが起こ物質（アンタゴニスト）を用いて、メラノサイトにおけるメ

ること、さらに KO マウスのメラノサイトにおいては頻度

ラニン色素産生能を可逆的に制御する方法の開発につながが極めて少なくなることがわかった。

る。投与方法については現在検討中であり、近い将来には

一 般 的 に、 精 子 に よ る 卵 活 性 化 は ホ ス ホ リ パ ー ゼ
7）Czeta1（PLCz1）
によって誘導されることが知られている 。

皮膚への塗布によって簡便に物質をメラノサイトに導入することが可能になる。

そこで、KO マウスから採取した精子における PLCz1 の発

メラノサイトはメラニン色素を産生して真皮に紫外線が現を調べたところ、野生型精子と同程度の PLCz1 の発現

届かないようにすることで、炎症反応から肌を守ってくれが確認された（図 6A）。また、KO マウス由来精子では CS

る細胞である。日焼け止めスプレーには物理的・化学的に活性が低下していることがわかった（図 6B）。

肌を守るための紫外線保護成分が含まれているが、紫外線

次に KO 精子を用いて体外受精を行ったところ、有意差を吸収した際に生じる化学反応で、かえって肌にダメージは認められなかったものの、交配による産仔数は生後 6 ヶを与えてしまい、かぶれ、湿疹、吹き出物につながってし月（人間では 30 歳に相当）の雄ではほぼゼロになることがまう場合があり、シミやシワを防ぐために日焼け止めを塗− 120 −

クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割

役割について科学的根拠が提示され、クエン酸合成酵素の新しい機能の解明につながると考えられる。この成果は、脱色や毛染めといった方法ではなく、ミトコンドリア外のクエン酸合成酵素の活性制御、または cAMP の投与によって体全体のメラニン色素の量をコントロールできることを示している。すなわち、白髪といった毛色の変化に対して、毛染めではなく、cAMP の塗布によって自然な黒色に戻すことができるかもしれない。皮膚の老化や、小脳の機
図 7 eCs のメラニン色素形成および生殖における役割
A，生殖および毛髪の周期性の模式図．B，細胞における CS
および eCS の役割分担．

能への eCS の関与についても今後検討する必要がある。
（引用文献）
1） Vander Heiden, M. G. & DeBerardinis, R. J.

布しているにも関わらず、別の症状で悩まされることにな

Understanding the Intersections between Metabolismってしまう。一方、cAMP の塗布でメラノサイトが活性化

and Cancer Biology. Cell 168（4），657-669（2017）．

され、メラニン色素が促進されれば、科学的にも根拠が明

2） Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C. & Thompson,
C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic

確であり、日焼け止めの代替法として有用である。
一方、eCS が男性の生殖機能に関与することは、イモリの研究から予想していたものの、精子でも CS が発現して

requirements of cell proliferation. Science 324（5930），
1029-33（2009）．

いるため、明確な結果が出ることは予想していなかった。

3） Fiume, M. M. et al. Safety Assessment of Citric Acid,

ところが、年齢依存的に（人間では 30 歳からに相当）、KO

Inorganic Citrate Salts, and Alkyl Citrate Esters as

マウスの産仔数が激減することから、男性の生殖機能におUsed in Cosmetics. Int J Toxicol 33（2 suppl），
16S-46S

ける eCS の関与は予想よりも大きいと考えられる。また、（2014）．

女性の生殖機能にも、年齢依存的に（やはり人間の 30 歳か4） Huang, Y. C. et al. Disruption of the peroxisomal

らに相当）、KO マウスの産仔数が激減するといった結果

citrate synthase CshA affects cell growth andも得られており、今後は男性・女性の両方向からの検討がmulticellular development in Dictyostelium discoideum.
Mol Microbiol 53（1），81-91（2004）．

必要である。
小脳における eCS の発現についてはまだ検討段階であ5） Steingrimsson, E., Copeland, N. G. & Jenkins, N. A.

る。小脳も「うつ病」「自律神経失調症」との関連があるこ

Melanocyte stem cell maintenance and hair graying.

とから今後検討する必要がある。一方、動物、植物、微生Cell 121（1），9-12（2005）．

物に存在するホルモンとして知られるメラトニンは、概日

6） Harada, Y., Kawazoe, M., Eto, Y., Ueno, S. &2+

リズムを司り、我々の睡眠を制御する物質であるが、メラ

Iwao, Y. The Ca

トニンの分泌とメラニン色素生成、さらには生殖機能に

physiologically polyspermic newt fertilization: its

は深い関係があることが報告されている。また、我々の研

signaling mechanism in egg cytoplasm and the species-

究からも生殖系に異常を生じるマウスにおいて、神経系にincrease by the sperm factor in

specificity. Dev Biol 351（2），266-276（2011）．

も異常を示すことを報告している 8，9）。神経系、色素形成、

7） Sanders, J. R. & Swann, K. Molecular triggers of egg

生殖系が何らかのメカニズムによってつながっている可能

activation at fertilization in mammals. Reproduction
152（2），R41-50（2016）．

性が考えられる。

5. 総

8） Miyado, K. et al. Requirement of CD9 on the egg

括plasma membrane for fertilization. Science 287（5451），

本研究から、ミトコンドリア以外に存在するクエン酸合321-324（2000）．

成酵素の重要性が明らかになった。クエン酸は、我々にと

9） Ishibashi, T. et al. Tetraspanin protein CD9 is a novelって容易に摂取できるものであるため、その生理作用につparanodal component regulating paranodal junctional

いては正確な知識が必要である。本研究から、クエン酸のformation. J Neurosci 24（1），96-102（2004）．

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