酸化ストレスの生体分子イメージングから迫る
対紫外線スキンケア分子の新規探索と機能評価
群馬大学大学院医学系研究科教育研究支援センター岩脇研究室

岩脇隆夫

Oxidative stress has recently gotten a great deal of attention, because it is reported to be responsible for a variety ofdiseases and health concern and to be associated with fatigue and aging. Although oxidative stress is subject to occur
everywhere of the body, skin cells are more exposed with oxidative stress by ultraviolet radiation, especially UV-A. The
UV-related oxidative stress causes the protein degradation and accelerates the aging process in the skin cells. Thus, wellcontrolled oxidative stress needs for anti-aging of the skin cells. We have previously developed the gene constructs andmodel mice for visualizing oxidative stress in vivo. Here we also introduced the gene constructs into human-derived skincells, and established experimental tools to easily measure oxidative stress in vitro. By using these tools, we discovered andevaluated the function of crocetin for anti-aging of the skin cells. Crocetin, is a carotenoid found in fruits of gardenia andsaffron. We confirmed that crocetin mitigated oxidative stress and damage of the skin cells exposed to UV-A irradiation.
These results indicate that crocetin might be potentially useful for protection against shin damage induced by UV-A.

1. 緒の細胞ストレスについて研究を行ってきており、最近では酸言化ストレス可視化モデルマウスの開発に成功している 1）。こストレスというと多くの人は心的なものを連想するが、のマウスは酸化ストレス応答反応で重要な働きを担う生物の構成単位である細胞も外的および内的環境から様々Nrf2 の機能を巧妙に利用している。具体的には酸化ストなストレスに曝されている。それゆえに細胞はそれらストレスレポーター遺伝子は Nrf 2 の分解に関わるドメインとレスに対して順応できる分子メカニズムを発達させてきルシフェラーゼや GFP 遺伝子の融合体が抗酸化応答エレた。細胞レベルで感じとられるストレスの一種に「酸化スメントで活性化されるように構成されている。このようなトレス」というものがあり、これは主に細胞内に発生する遺伝子を持つマウスでは酸化ストレスに曝されると転写レ活性酸素が原因で生じるストレスである。この酸化ストレベルでその酸化ストレスレポーター遺伝子が活性化される。

スは様々な疾患や健康問題の原因であることや、また疲労さらに、その翻訳産物（酸化ストレスレポータータンパクや老化とも密接に関連することが報告されるようになって、質）は内在性 Keap1 の分解抑制から免れ、安定化すること近年大きな注目を浴びている。さらには研究の世界だけで光るようになるのである（図 1）。

でなく、美容の世界でも「酸化ストレス」は関心を集めていて、女性雑誌などでは酸化ストレスを解消する「抗酸化力」や「アンチエイジング」という言葉とともに特集が組まれるほどになっている。体のいたる所で酸化ストレスは発生する可能性を含んでいるのであるが、肌細胞ではとりわけ紫外線（特に UV-A 波）が原因で酸化ストレスが生じやすい。
この酸化ストレスは肌細胞内のタンパク質の酸化を引き起こし、肌の老化を進めてしまう。ゆえに肌細胞の老化を食い止めるには、酸化ストレスを上手くコントロールできることが重要である。そこで本研究では肌細胞で有用な抗酸化物質の新規探索および機能評価を行う。
私たちはこれまで主に小胞体ストレスや酸化ストレスなど

Screening and functional evaluation ofmolecules for anti-UV skin-care by using
in vivo imaging of oxidative stressTakao Iwawaki
Iwawaki Laboratory, Education andResearch Support Center Graduate
School of Medicine, Gunma University

図１ 上パネルはマウスに導入された遺伝子コンストラクトとその産物の酸化ストレス応答を模式的に表している。下のパネルはモデルマウスが UV-A 紫外線照射された際のイメージング結果を示している。

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2. 方し、細胞の生存性を確認した。また、HO-1 遺伝子の発現法応答性も確認した。10 µM の亜ヒ酸ナトリウムを 8 時間処

株化肌細胞および試験管内再構成皮膚に先述の酸化ス

理したとき、HO-1 mRNA 発現レベルは非ストレス条件下トレスレポーターを導入し、それらを用いて低分子化合の 70 〜 120 倍に上昇する（図 2）。一方、100 µM のジエチ物ライブラリーの中から紫外線誘導性酸化ストレスを軽ルマレイン酸を 8 時間処理する場合や 200 µM の過酸化水減するものを探し出すこと、そしてその効果を評価する

素を 8 時間処理する場合でも HO-1 mRNA 発現レベルは非ことを目指した。具体的に使用した細胞は HEK001 細胞

ストレス条件より上昇するが、亜ヒ酸ナトリウムに比べ（ATCC#CRL-2404）と NHEK-Ad 細胞（Lonza#00192627）て、その程度は小さかった。したがって、安定導入細胞株である。遺伝子導入方法としては一般的なリン酸カルシウの品質確認には 10 µM 亜ヒ酸ナトリウムの 8 時間を採用

ム法、Effectene 法（Qiagen#301425）、および Amaxa 法をする。ちなみに HO-1 遺伝子は酸化ストレスにより活性化順次試した。安定的な遺伝子導入株を選択する際の薬剤にされる Nrf2 を介して転写誘導されることが知られている。

はネオマイシン（シグマ #G8168）またはハイグロマイシン

酸化ストレス可視化用レポーター遺伝子の安定導入細胞株（InvivoGen#ant-hm-1）を使用した。ゆえにレポーター遺を得るための遺伝子導入方法について GFP 発現プラスミ

伝子はネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐ドを用いて検討を行った。始めに最も安価に行うことが性遺伝子と共導入された。各遺伝子およびタンパク質の発できるリン酸カルシウム法を HEK001 細胞に試してみた

現レベルはそれぞれ ABI 社の TaqMan プローブを用いたが、GFP 陽性は全細胞あたり 1 % 程度でしかなかった。続

リアルタイム PCR 法および一般的に行われるウエスタン

いて Effectene 法を試してみたが、GFP 陽性は全細胞あた

ブロット解析または ELISA 解析により調べられた。レポり 2 〜 3 % 程度でしかなかった。そこで Amaxa 法を試しーター（ルシフェラーゼ）活性の測定には Dual luc assayてみたところ、GFP 陽性は全細胞あたり 60 〜 70% であっキット（プロメガ #E1910）とルミノメーター（ベルトール

た。酸化ストレス可視化用レポーター遺伝子の安定導入細ド #LB9507）を用いた。レポーター（ルシフェラーゼ）活胞株を作成するにあたっては Amaxa 法を採用した。

性のライブイメージングには IVIS（Xenogen）を用いた。

HEK001 細胞へ酸化ストレス可視化用レポータープラス

また活性酸素種の発生量を評価するために CM-H2DCFDAミドと内部標準用レポータープラスミドとネオマイシン耐（Life Technologies#C6827）を用いた。

性遺伝子発現プラスミドを 2：2：1 の割合（質量比）で共3. 結導入した。15 日後、細胞からゲノム DNA を抽出し、PCR

果法で導入遺伝子が保持されていることを確認した。また亜肌細胞を用いた研究は今回が初めてであったので、各ヒ酸ナトリウムで酸化ストレス処理を行い、その 8 時間後

HEK001 細胞および NHEK-Ad 細胞の特徴をつかむところにライブイメージング解析を行い、細胞溶解液のルシフェから実験をスタートさせた。HEK001 細胞を ATCC の推ラーゼ活性を測定した。その結果、酸化ストレス可視化用奨する条件で培養したところ、正常な増殖（10 継代以上）レポーターの活性は亜ヒ酸ナトリウム処理した方がしなかを確認できた。NHEK-Ad 細胞も Lonza の推奨する条件で培養したところ、正常な増殖を確認できた。ただし、7 継代ぐらいで増殖が停止した。レポーター遺伝子の導入は低経代数で行うベきと考えた。安定的な遺伝子導入ではネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして用いることを考えたため、各細胞のネオマイシンおよびハイグロマイシンに対する感受性を確認することとした。その結果、1 週間の培養で完全に細胞を死滅させる濃度は、ネオマイシンが 50 µg/mL、ハイグロマイシンが 50 µg/mL であった。酸化ストレス可視化用レポーター遺伝子の安定導入細胞株が得られた後、その品質確認を酸化ストレス誘導剤処理により行う予定であるため、各細胞の酸化ストレス誘導剤処理に対する反応性を確認しておく必要性がある。そこで３種類の代表的な酸化ストレス誘導剤である亜ヒ酸ナトリウム（メルク #1.06277.1000）、ジエチルマレイン酸（シグマ #D97703）、および過酸化水素（ナカライ #18411-25）を様々な濃度で培地に加えて培養

図２ 各種濃度の亜ヒ酸ナトリウム（ASN）により処理された細胞における HO-1 遺伝子発現レベルを示す。上のヒストグラムは
HEK001 細胞、下のヒストグラムは NHEK-Ad 細胞から得られたデータである。

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コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図３ 酸化ストレスレポーター遺伝子を安定導入されたHEK001 細胞におけるレポーター（ルシフェラーゼ）活性のライブイメージング像を示す。亜ヒ酸ナトリウム（ASN）処理により期待通り高レポーター活性が得られていることがわかる。

図４ UV-A 紫外線照射およびクロセチン添加の影響を酸化ストレスレポーター遺伝子により評価している。各ヒストグラムで用いられた細胞は、（左）酸化ストレスレポーター遺伝子を安定導入された HEK001 細胞、（中）酸化ストレスレポーター遺伝子を一過的に導入された HEK001 細胞、および（右）酸化ストレスレポーター遺伝子を一過的に導入された NHEK-Ad 細胞。

った方より 3.5 倍高かった（図 3）。一方、NHEK-Ad 細胞へもレポーター遺伝子を安定導入しようと試みたが、遺伝子導入後、細胞が十分な数に達する前に増殖が停止するため、これを諦めた。
2 種類の肌細胞のうち NHEK-Ad 細胞へのレポーター遺伝子安定導入はできなかったが、HEK001 細胞へは計画通り実行できた。ただ、この細胞の増殖速度が極めて遅かったため、また色々な条件検討が必要だったため、薬剤スクリーニングにずいぶん時間を取られたが漸く完了した。
しかし結果はテストした低分子化合物ライブラリーの中には酸化ストレスを軽減するものが見出せなかった。一方

図５ UV-A 紫外線照射およびクロセチン添加の影響を HO-1
mRNA レベルと Nrf2 タンパク質レベルにより評 価している。
各ヒストグラムで用いられた細胞は、（左）HEK001 細胞と（右）NHEK-Ad 細胞。

で、本研究提案にはなかったが、国内で行っていた共同研
究からクロセチンに紫外線誘導性酸化ストレスを軽減する
2）化ストレス応答性分子である HO-1 mRNA および Nrf2 タ効果 が見出されたので本研究で樹立されたレポーター遺ンパク質の発現レベルを UV-A 紫外線照射と非照射間で比伝子安定導入細胞を用いて同効果の評価を行った。クロセ

較したところ、UV-A 紫外線は両分子の発現レベルを顕著

チンはクチナシの実やサフランなどに含まれている黄色のに高めた（図 5）。しかしながら UV-A 紫外線照射の１時間天然色素で、カロテノイドカルボン酸の一つである。カロ前にクロセチン（最終濃度 1 µM）を培地中へ加えると、上テノイドのうち㌼カロテンやリコピンには優れた抗酸化効

記のレポーターの活性上昇および酸化ストレス応答性分子果がよく知られているが、クロセチンはそれらメジャーなの発現レベル上昇は幾分低く抑えられた（図４と５）。次カロテノイドとは異なり両親媒性低分子化合物であり、体に活性酸素種の発生量についても UV-A 紫外線照射と非照内へ取り込まれやすい性質を持つ。また抗酸化効果につい射間およびクロセチン添加と非添加間で比較したところ、ても多くの報告があり、疲労回復や抗老化を謳った市販サ

UV-A 紫外線は活性酸素種の発生量を顕著に高めるが、そプリメントなどに含まれて（特に眼の）健康を気にする人々

れはクロセチン添加によって部分的に軽減される結果が得からは注目を浴びている。しかしながら肌細胞におけるクられた（図 6）。

ロセチンの紫外線誘導性酸化ストレス軽減効果は不明であ

4. 考り、その効果は今回の研究で以下の通り示された。酸化ス
トレスレポーター遺伝子安定導入 HEK001 細胞へ UV-A 紫2

察

私たちは今日までにイメージング技術を用いて簡便に酸外線（365nm 5mW/cm ）を 40 分間照射したところ、レポ化ストレスの評価ができる実験系を構築しており、それをーター活性は非照射コントロール細胞に比べて 4.5 倍高かヒトに由来するケラチノサイトへ導入することで肌細胞にった（図４）。また同様の実験を酸化ストレスレポーター遺特化した酸化ストレス評価を可能にした。これは抗酸化機伝子一過的導入 HEK001 細胞と NHEK-Ad 細胞で行ったと能を有した低分子化合物のハイスループットな解析に適しころ、レポーター活性は UV-A 紫外線によって 4 〜 4.5 倍ており、有用な実験ツールとなることが期待される。実際、上昇した（図４）。さらにレポーター遺伝子を導入していな

本研究では、以前より抗酸化機能性面で注目されていたク

い HEK001 細胞と NHEK-Ad 細胞で同様の実験を行い、酸ロセチンについてケラチノサイトでの UV-A 紫外線誘導性− 48 −

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このクロセチンによる抗酸化効果は他の細胞種では知られていたが、今回ヒトの肌細胞においても同効果を初めて確認できた。先にも述べた通り、クロセチンは既にサプリメントとして多くの人が口にしており、その安全性は高いと考えることができる。ゆえに本研究は今後のスキンケア商品開発において有意義な成果となるはずである。
（引用文献）
図６ UV-A 紫外線照射およびクロセチン添加の影響を活性酸素種の産生レベルにより評価している。各ヒストグラムで用いられた細胞は、（左）HEK001 細胞と（右）NHEK-Ad 細胞。

1） Oikawa D, Akai R, Tokuda M, Iwawaki T: A
transgenic mouse model for monitoring oxidative
stress, Sci. Rep., vol. 2, no. 229, 2012.
2） O h b a T , I s h i s a k a M , T s u j i i S , T s u r u m a K ,酸化ストレスに対する抗酸化性能を明らかにした。UV-A

Shimazawa M, Kubo K, Umigai N, Iwawaki T, Hara

紫外線照射に先立ってクロセチン処理を行うと、細胞内でH: Crocetin protects ultraviolet A-induced oxidative

発生する活性酸素種の量は抑えられ、これに伴って酸化ス

stress and cell death in skin in vitro and in vivo, Eur.

トレスにより活性化される応答分子の発現量も低下した。

J. Pharmacol., vol. 789, 244-253, 2016.

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