ごあいさつ
この度コスメトロジー研究振興財団として、24 冊目の研究報告書を刊行いたしました。
設立以来 25 年以上にわたって、化粧品科学及び関連分野に貢献する研究テー
マに対し助成活動を滞りなく継続できたことは、多くの関係者の皆様のご理解ご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
当財団の助成領域につきましては、医学、化学、薬学、生理学、心理学、文学、社会学など多岐にわたる分野の研究者のお力添えにより、コスメトロジーという分野が発展してきたといっても過言ではありません。助成させていただいた研究
テーマは、新素材設計、ライフサイエンス、化粧心理、文化論など多種多様であり、化粧品学の発展に有用な貢献ができたと考えております。また当財団の活動がその社会貢献の一助になっていることを幸いに思っております。
今回の報告書では、平成 25 ～ 26 年度に助成を受けられた方の中から 30 名の方の研究成果を掲載いたしました。
素材、物性に関する分野では、製剤化技術に関わる研究、独創的な視点での機能性素材開発に関するテーマが顕著であったと思われます。
生体作用、安全性に関する分野では、皮膚の老化に関する研究、皮膚の機能・構造における新たなメカニズムに関わる研究が中心であったと思われます。
精神、文化に関する分野の研究につきましては、香粧品による認知心理学的な研究が多く、大変興味深い内容であったと考えています。
この研究報告書 COSMETOLOGY 誌がより幅広く活用されることを祈念します。
当財団は分野の枠や研究機関の属性などにとらわれることなく、化粧品学の発展のために、優れた研究に対して積極的に助成を行っていきたいと考えております。
今後とも、皆さまのますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 28 年 7 月
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・ 紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルションの調製 ………………………………………………… 4
横浜国立大学大学院環境情報研究院 荒 牧 賢 治
・ カチオン性高分子の部分的疎水化と化粧品原料微粒子の油中分散安定化剤への応用 ………………… 11
横浜国立大学大学院環境情報研究院 飯 島 志 行
・天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明 ……………………………………………… 16
新潟大学工学部機能材料工学科 落 合 秋 人・モルフォ蝶のミステリーに基づく、けばけばしくならない光輝粉体の開発 ……………………………… 22
大阪大学大学院工学研究科 齋 藤 彰・ 保湿性・抗菌性を有するバイオベースの新しいスキンケア素材の開発 ……………………………………… 27
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 機能化学研究部門 佐 藤 俊・ ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの比較 ……………………………… 32
国立研究開発法人 海洋研究開発機構 海洋生命理工学研究開発センター 出 口 茂・ コスメトロジー素材に向けてのアロエ C -グリコシルクロモン類の高機能化 …………………………… 38
神戸大学大学院理学研究科 林 昌 彦
・ 明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発 ……………………………………………………… 43
東京工業大学大学院理工学研究科 平 田 修 造
・ 外部刺激による高分子ミセルの特異的形成／崩壊制御とその物質輸送系への応用 …………………… 53
京都大学工学研究科高分子化学専攻 松 岡 秀 樹
・ 抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究 …………………………………… 59
稔
群馬大学大学院理工学府分子科学部門 山 路
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・ 必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明 …………………………………………… 70
育代
お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系 市
・ 天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究 …………………… 77
長崎国際大学薬学部薬品資源学研究室 宇 都 拓 洋
・ 皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム ………………………… 84
岐阜大学大学院医学系研究科生命機能分子設計分野 大 沢 匡 毅
・ 香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節 …………………………………………………… 90
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 柏 谷 英 樹
・ 新規細胞膜上、女性ステロイドホルモン受容体を介した生理・病態機能の解明 ………………………… 95
東京農工大学大学院農学研究院応用生命化学専攻 木 村 郁 夫
・ スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討およびそのメカニズムの解明 …………………… 99
充
神戸大学大学院医学研究科内科系講座皮膚科学分野 国 定・ ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明 ……………………………… 105
神戸大学大学院農学研究科 白 井 康 仁

・ 新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発 ………………………… 112
信州大学大学院医学系研究科循環病態学講座 新 藤 隆 行・ 皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明 …………………………… 117
日本大学薬学部健康衛生学研究室 榛 葉 繁 紀・ フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発 ……………………………… 124
北海道大学大学院医学研究科皮膚科学分野 乃 村 俊 史・ 皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析 ……………………………………… 129俊太郎
昭和大学薬学部社会健康薬学講座衛生薬学部門 原・ 皮膚感覚神経−毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割 ………………………………… 134
理化学研究所 多細胞システム形成研究センター細胞外環境研究チーム 藤 原 裕 展
・ 紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析 …………………………… 141
信州大学大学院農学研究科 水 品 善 之・ ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制に関する研究……………………………………………… 149
茂
東京薬科大学生命科学部 柳Ⅲ．精神、文化に関する分野
・ 自閉スペクトラム症児の香料過敏についての調査 ………………………………………………………… 154
金沢大学子どものこころの発達研究センター 熊 㟢 博 一・ 中・高年の見た目年齢の解析………………………………………………………………………………… 159
愛媛医療センター神経内科 小 原 克 彦

・ 顔の魅力度認知における部分情報の統合 …………………………………………………………………… 167
東京大学大学院工学系研究科先端学際工学専攻 三 枝 千 尋・ 笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定 ………………………………………………… 172
秋田県立大学システム科学技術学部機械知能システム学科 佐 藤 和 人
・ 睡眠誘導効果をもつ（−）−酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果 ……………………… 181
九州大学農学研究院 清 水 邦 義・ リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索………………………………………………… 190
産業医科大学保健センター 八谷 百合子■記念講演
・第 26 回表彰・贈呈式記念講演「ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜」 …………………………………… 201
早稲田大学理工学術院 教授 服 部 正 平■コスメトロジー研究雑感■付……………………………………………………………………………………………… 213

録

事業報告書

……………………………………………………………………………………………………………… 233

平成 27 年度

研究助成を受けられた方々

役員一覧………………………………………………………………………… 235………………………………………………………………………………………………………………… 237

●
Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルションの調製
横浜国立大学大学院環境情報研究院

荒牧賢治

Oil-in-cubic phase (O/I1) emulsions encapsulating cosmetic UV abosorbing agents, 2-ethylhexyl 4-methoxycinnamate(EHMC), 2-etylhexyl 2-cyano-3,3-diphenylacrylate (OCR) and 1-(4-tert-butylphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)-1,3-propanedione (TBMP), were prepared by vortex mixing accompanied with a heating-cooling process. A ternary
phase diagram in a water/C12EO25/EHMC system at 25°C was constructed and a two-phase equilibrium of an oil phaseand an I1 phase, which is necessary to prepare the O/I1-type emulsions, was comfirmed. Also melting of the I1 phase
into fluid micellar solution phase was confirmed, allowing emulsification with a heating-cooling process. The O/I 1-type
emulsions were formulated in the ternary system as well as a four-component system containing, in addition, a cosolvent(isopropyl mylistate), which can reduce the composition of EHMC having a poisonous nature with keeping low surfactant
concentration. Formulation of the O/I1-type emulsions with other UV absorbing agents (OCR and TBMP) was also possibleby the same emulsification method. UV absorbability of the O/I1-type emulsions encapsulating UV absorbing agents was
confirmed by UV aborption spectra. We have also studied the formulation and UV absorbability of the S/I1-type dispersions
obtained by subtituting isopropyl mylistate with tripalmitin.

1. 緒

くの研究がなされた。O/LC 型ゲルエマルションに使用で言きるリオトロピック液晶はミセルキュービック相のものが混じり合わない２種類の液体の一方をもう片方へ液滴と多く6−12）、それ以外に、ヘキサゴナル液晶（H1）も報告されして分散させたエマルションの粘度は分散相の体積分率、ている 13, 14）。O/LC 型と逆構造である W/LC 型も逆ミセル

または連続相の粘度により主に支配される。相互作用を持

キュービック相（I2）や逆ヘキサゴナル液晶（H2）を用いて調たない剛体球の空間充填率 0.74 をエマルションの分散相製できる 15, 16）。HCE と異なり、O/LC 型や W/LC 型ゲルエ体積分率が超えるとゲル状のエマルション（ゲルエマルシ

マルションは水、界面活性剤、油を含む系の油相あるいは

ョン）が得られる。このようなゲルエマルションは高内相

水相と液晶相との２相平衡領域で得られる 17, 18）。また、分比エマルション（HCE）と呼ばれる 1, 2）。また、分散相体積

散相体積分率が 0.74 より低い場合でもゲルエマルション

分率が 0.74 以下でも荷電エマルション滴のナノエマルシが得られる 19, 20）。リオトロピック液晶の中でも I1 相は最ョン化によりゲルエマルションが得られることも報告されも粘度が高い 21）ため、O/I1 型ゲルエマルションも高粘性ている 3）。連続相の増粘によりゲルエマルションは食品エとなる。ただし、分散相分率が高くなると粘度低下が生じ

マルションとしてよく使用される。多くの食品ゲルエマル

る。O/LC 型、W/LC 型ゲルエマルション調製については、ションの場合はタンパク質や天然高分子により連続相をゲ

ポリ（オキシエチレン）型界面活性剤系が多いが、その他にル化させることで得られる。また、界面活性剤の分子集合

も糖系 22）、ポリグリセリン型界面活性剤 7）、アミノ酸型界構造を利用したゲルエマルションも可能であり、ラメラ液

面活性剤 12）などが報告されている。以上のように O/LC 型、晶中に油滴を分散させたゲルエマルションが化粧品用の安W/LC 型ゲルエマルションについてはその調製、構造、レ

定なナノエマルション調製法として知られる液晶乳化法のオロジー特性などの基礎的な研究はなされてきたが、応用プロセスにおいて重要であることが古くから知られてい研究は少ない 23, 24）。本研究においてはサンスクリーン剤へる 4, 5）。近年では Rodriguez らがミセルキュービック相（I1）の応用を指向し、紫外線吸収剤を内包させた O/I1 型ゲルを連続相としたエマルション調製を初めて報告 して以来、エマルションの調製を行った。また、紫外線吸収剤の保持

液晶中油滴分散型（O/LC 型）ゲルエマルションに関する多安定性を向上させることを期待して油相に融点が室温以上6）であるトリグリセリドを用いた S/I1 型ゲルエマルションの調製を試みた。
有害な紫外線から肌を守るために使用されるサンスクリ
Preparation of O/I 1 -Type Gel Emulsions
Encapsulating UV Absorbing Agents
Kenji Aramaki
Graduate School of Environment andInformation Sciences, Yokohama National
Universityーン剤にはメトキシ桂皮酸オクチルやオクトクリレンに代表される有機系紫外線吸収剤と酸化チタン、酸化亜鉛などの無機系ナノ粒子による紫外線散乱剤が主に配合されている。そのうち、有機系紫外線吸収剤については、吸収された紫外線のエネルギーと無機系紫外線吸収剤の光触媒作用−4−紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルションの調製

による分解が進み、時間経過とともに紫外線防御効果の低

2. 2. 2. O/I1 型 , S/I1 型ゲルエマルションの調製

減が生じること、アレルギーの誘引や毒性が指摘されていねじ口試験管に最終組成になるように入れた試薬混合物

ること、などの問題点が指摘されている。そこで Fig.1 にを加熱し、ボルテックスミキサーで撹拌しながら冷却した。

示すように有機系紫外線吸収剤を O/I1 型ゲルエマルショ

O/I1 型エマルションの相分離の有無は目視で判別し、S/I1

ンの油滴に内包させることにより問題点の解決ができると型エマルションの相分離の有無は光学顕微鏡観察により判考えた。分散された油滴はゲル状のキュービック液晶に別した。

覆われているため、合一やクリーミングが生じない。また、

2. 2. 3. 吸光度測定

分散相の油には多くの油剤（炭化水素、エステル油、トリ

2 mg/cm2 の薄膜に成形したサンプルについて紫外可視

グリセリドなど）を用いることができる。有機系吸収剤は分光光度計 UV-2550PC（島津製作所社製）を用いて測定

油溶性のため、エマルション中の油滴に安定保持されるこし、紫外光吸収スペクトルを得た。

とが期待できる。また、化学的プロセスを必要とするシリ3. 結果と考察

カや高分子膜で紫外線吸収剤をカプセル化する手法 25, 26）に

3. 1. 水 /C12EO25/EHMC 系の相挙動比べると調製が容易である点も特徴である。

2. 実

3. 1. 1. 25 ℃における３成分状態図

験Fig. 2 に水 /C12EO25/EHMC 系の 25 ℃における相図を示

2. 1. 試薬す。水 - 界面活性剤軸上では界面活性剤濃度が増すと、流親水基の重合度が 25 であるポリ（オキシエチレン）ドデ

動性の高い光学的等方性溶液相（ミセル相、Wm）から高粘

シルエーテル（東京化成工業製）
を界面活性剤として用いた。

性・光学的等方性相（ミセルキュービック相、I1）、さらに

以下、これを C12EO25 と呼ぶ。紫外線吸収剤はいずれも東再び Wm へ転移した。60 ℃以上では I1 相が消失し、二つの京化成工業製の 2- エチルヘキシル 4- メトキシケイヒ酸

Wm 相領域は連続する 6）ため、これら二つの Wm 相は本質

（メトキシケイヒ酸オクチル）、2- エチルヘキシル 2- シア

的に同一のものである。水 / 界面活性剤系に EHMC が加ノ -3, 3- ジフェニルアクリル酸（オクトクリレン）、1-（4-わると相挙動はやや複雑になる。界面活性剤高濃度領域で

tert- ブチルフェニル）- 3 -（4- メトキシフェニル）- 1, 3 -はラメラ液晶（Lα）、ヘキサゴナル液晶（H1）、両連続キュー

プロパンジオン（アボベンゾン）の３種類を用い、それぞれビック相（V1）が Wm 相、I1 相に加えて形成される。EHMC

EHMC、OCR、TBMP と呼ぶ。油剤は東京化成工業製のの水への溶解度は低く、必然的に界面活性剤の分子集合体

ミリスチン酸イソプロピル（IPM）を用い、水は逆浸透膜で中に可溶化される。ゆえに、EHMC の添加による分子集

濾過したものを用いた。

合体の構造転移は他の油剤の可溶化による構造転移 27−29）と同一の機構により引き起こされていると考えられる。各2. 2. 実験方法

相への可溶化限界を超えると過剰の油相（EHMC 相）とそ

2. 2. 1. 相平衡図の作成
所定の組成の試薬をねじ口試験管に入れ、ボルテックス
ミキサーを用いて撹拌した。その後、恒温槽に静置し状態観察を目視により行った。複屈折性のサンプルについては２枚の偏光板を直交させたものの間に置き、観察した。

Fig.1 Structure of O/I1-type emulsions encapsulating UV
absorbing agent

Fig. 2 Phase diagram in the water/C12EO25/EHMC system at
25℃ are shown. Wm, I1, V1, H1, Lα, S and O indicate micellar,
discontinuous cubic, bicontinuous cubic, hexagonal,
lamellar, solid and oil phases, respectively.

−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

れぞれの相の 2 相平衡状態（Wm+O や I1+O）となる。
3. 1. 2. EHMC 組成 - 温度状態図
水 /C12EO25 重量比を 6/4 に固定し、EHMC 組成と温度を変数とした状態図を Fig. 3 に示す。EHMC を含まない I1相の融解温度は 55 ℃付近であるが、10% の EHMC の可溶化により 65 ℃付近へ上昇した。55 ℃以上の高温領域では
H1, V1, Wm 相が形成された。これらの相への EHMC の可溶化限界は温度上昇とともに増加した。同様の現象は他のポリ（オキシエチレン）型界面活性剤系においても報告されて 30−33）おり、温度上昇による界面活性剤膜の曲率が減少
する 34）ことによる。EHMC 濃度が高くなると 2 相平衡領域になり、室温付近で形成される I1+O のサンプルを 90 ℃まで加熱すると、相状態は H1+O、V1+O を経て Wm+O になる。このような温度上昇による秩序 - 無秩序転移は油相（EHMC 相）を高粘性の I1 相へ乳化分散させるために適しており、他の相への相転移（例えば Lα 相への転移）などが生じる場合はエマルション化できない 13）。

3. 2. 紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルショ
ンの調製

Fig. 3 Temperature-EHMC composition phase diagram in
the water/C12 EO 25/EHMC system at constant water-tosurfactant weight ratio, 6/4, is shown. Phase notations aresame as in Fig. 2.

Fig. 3 に示したように EHMC 濃度が 20% 以上組成で 90℃での相状態は Wm+O である。よってこの温度ではボル

以下の EHMC を配合した O/I1 型ゲルエマルションを得る

テックスミキサーで容易に O/W 型エマルションが得らことができた。EHMC の代わりに OCR を用いたときのエれた。その後、サンプルを室温まで冷却することによりマルション化試験結果を Table 1（b）に示す。エマルショ

O/I1 型ゲルエマルションが得られた。エマルション化は

ン化限界は 60 〜 70% となり、EHMC 系よりも低くなった。

EHMC 濃度が最大 80% まで可能であった。しかし、有機OCR については化粧品基準で配合上限は 10% とされてお系紫外線吸収剤は毒性があるため、各国で化粧品への配合り、その条件下では OCR/IPM=9/1 において 12% の界面上限が規定されている。日本では化粧品基準（平成 12 年 9

活性剤濃度で O/I1 型ゲルエマルションを得ることが可能

月 29 日厚生省告示第 331 号）により、例えば EHMC ではであった。Table 1（c）は TBMP 系におけるエマルション

上限値が 20% となっている。水 /C12EO25/EHMC 系におい化試験結果である。他の二つの紫外線吸収剤が常温で液体ても EHMC 濃度が 20% 以下で O/I1 型ゲルエマルションはであったのに対して TBMP は粉末状であり、IPM への溶得られるが、この場合は界面活性剤濃度が 32% と非常に解度も低い。そのため、TBMP/IPM=9/1 の結果のみ示し高くなる。界面活性剤濃度を低く保ったままで EHMC 濃

た。この系においても 60% までエマルション化が可能で度を 20% 以下に抑えるために、ミリスチン酸イソプロピ

あり、TBMP の配合上限は 10% を満たす O/I1 型ゲルエマル（IPM）を cosolvent として配合し、EHMC と IPM の混合

ルションが、界面活性剤濃度 16% で調製できた。

物を油相とすることにした。Table 1（a）は油相の濃度と油果である。エマルション調製操作の後、25 ℃で 24 時間静3. 3. 紫外線吸収剤を内包した S/I1 型ゲルエマルショ
ンの調製置したサンプルについて目視により相分離が生じているも油剤を IPM からトリパルミチン（TP）に変更してエマルのを U、相分離がないものを S と表記してある。また、＊ション化を行った。TP の融点は 64 ℃であり、室温で固体を付したものは化粧品基準を満たす組成であることを示状態となる。また、TP に室温で液体である EHMC を混合す。エマルション化限界は油相の組成が変化しても大きさせると融点は 50 ℃程度まで低下するが、室温では固体

く変化せず、80% までは安定なエマルションを得ることが状態となる。したがって、得られたエマルションの油滴できた。混合油の組成範囲の自由度が高いために、界面は固体状態であり、本研究ではこのようなエマルション

活性剤を低く保ったまま、EHMC を 20% 以下に抑えた O/

を S/I1 型エマルションと呼ぶ。Fig. 4 は水 /C12EO25/TP/

I1 型ゲルエマルションを得ることができる。すなわち、こEHMC 系において、水 /C12EO25=65/35、TP/EHMC=6/4

こでは IPM/EHMC=9/1 のときに 8% の界面活性剤で 20%のときに得られたサンプルの油相重量％を変えたときの顕相中の混合割合を変化させたときのエマルション化試験結−6−紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルションの調製

Table 1（a）Emulsification test results for O/I1-type emulsions with EHMC

Table 1（b）Emulsification test results for O/I1-type emulsions with OCR

Table 1（c）Emulsification test results for O/I1-type emulsions with TBMP

Fig. 4 Photomicrographs of S/I1-type dispersions in the water/C12EO25/TP/EHMC system at water/
C12EO25 =65/35 and at TP/EHMC=6/4 are presented. Oil（TP+EHMC）composition in the system is(a) 30wt%, (b) 50wt% and (c) 60wt%. The bar indicates 20μm.

−7−コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

微鏡観察結果である。油相重量％が 30 ％のとき、10 ミク

プルについては EHMC, OCR, TBMP ともそれぞれの物質

ロン程度の粒子径の球状油滴が観察され、エマルションのが有する紫外線吸収領域に対応する紫外線吸収特性を有す

外観も均一である。油相重量％が 60 ％になるとサンプルることが分かった。すなわち、EHMC では UV-B 領域（280の外観は均一状態を保ったままであるが、顕微鏡観察で見−320 nm）、OCR では UV-A（320−400 nm）と UV-B の二られる油滴の形状が球状でなくなり、粗大化した。S/I1 型

つの領域にわたって、TBMP では UV-A 領域において強は O/I1 型よりも明らかに高粘性であり、油滴の合一が生

い吸収が生じた。Fig. 5（b）は S/I1 型ゲルエマルションにじてもマクロな相分離までは至らないと考えられる。本研ついての同様の紫外吸収スペクトルであり、EHMC によ

究では Fig. 4（a）（b）の状態をエマルション化できたもの

る紫外線吸収特性を示した。よって、本研究で得られた（S）、Fig. 4（c）の状態を相分離が生じた（U）と判定し、そO/I1 型および S/I1 型ゲルエマルションは適切な UV 吸収能の結果を Table 2 にまとめた。TP/EHMC 比を変えたとこ力を有することが確かめられた。

ろ、概ね 40 〜 50% の油相重量％まではエマルション化が4. 総可能であることが分かった。

括O/I1 型ゲルエマルションはおよそ過去 10 年間にエマル

3. 4. 紫外線吸収剤を内包したO/I1 型およびS/I1 型ゲルエマルションの UV 吸収特性

ション化試験、レオロジー特性、光学特性などの基礎研究がなされてきたが、応用研究についてはほとんどなされて

Fig. 5（a）は 3 種の紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲ

こなかった。本研究においては O/I1 型ゲルエマルション

ルエマルションについての紫外吸収スペクトルである。

について UV ケア化粧品への利用可能性を調べるために実Blank と記したものは紫外線吸収剤を含まない O/I1 型ゲル施した。非イオン性界面活性剤であるポリ（オキシエチレ

エマルションのスペクトルであり、紫外線吸収はほとんど

ン）ドデシルエーテル（親水鎖重合度 25）を用いて温度変化生じなかった。それに対し、紫外線吸収剤を内包したサンによる相変化を利用することにより有機系紫外線吸収剤でTable 2

Formulation test results for S/I1-type dispersions with EHMC

Fig. 5 UV absorption spectra for the O/I1-type emulsions (a) and the S/I1-type dispersions (b)encapsulating UV absorbing agents are shown.

−8−

紫外線吸収剤を内包した O/I1 型ゲルエマルションの調製

ある EHMC, OCR, TBMP を安定にエマルション化するこ

behavior of cubic and hexagonal phase based gelとができた。また、cosolvent として IPM を用いて紫外線

emulsions, J. Colloid Interface Sci. 336, 329-334, 2009.

吸収剤を希釈することで界面活性剤濃度を低く保ったまま、

10）Alam, MM, Shrestha LK, Aramaki K, : Glycerol

安定な O/I1 型ゲルエマルションを得ることができた。まeffects on the formation and rheology of cubic phase

た得られた各エマルションはそれぞれの紫外線吸収剤が有and related gel emulsion, J. Colloid Interface Sci. 3 2 9,する紫外線吸収能を発揮することを確かめた。さらに、紫366-371, 2009.

外線吸収剤の保持能力がより高いことが期待できる固体油

11）Alam, Md. M.; Sugiyama, Y.; Watanabe, K.; Aramaki,

を cosolvent として用いた S/I1 型ゲルエマルションの調製

K. Phase behavior and rheology of oil-swollen micellar

も行い、紫外線吸収能を発揮するものが得られた。

cubic phase and gel emulsions in nonionic surfactant
systems, J. Colloid Interface Sci. 341, 267-272 (2010).

謝辞12）Alam MM, Aramaki K, : Self assembly and rheologyof emulsions-mimicking food emulsion rheology, Food

本研究を遂行するにあたり、実験を行った横浜国立大学

Structure, 1, 137-144, 2014.

大学院環境情報学府環境システム学専攻の木村美波氏、増13）Alam MM, Aramaki K, : Hexagonal Phase Based田収希氏に感謝します。

Gel-Emulsion (O/H1 Gel-Emulsion): Formation and（引用文献）

Rheology, Langmuir, 24, 12253-12259, 2008.

1） Kunieda H, Evans DF, Solans C, Yoshida M, : The

14）Alam, MM, Matsumoto Y, Aramaki K, : Effects ofstructure of gel-emulsions in a water/ nonionicsurfactant hydrophilicity on the oil solubilization andsurfactant/oil system, Colloids Surf. 47, 35-43, 1990.

rheological behavior of a nonionic hexagonal phase J.
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2） Pal R, : Rheology of high internal phase ratio15）Uddin MH, Rodriguez C, Watanabe K, Lopez-

emulsions, Food Hydrocolloids, 20, 997-1005, 2006.
3） Kawada H, Kume T, Matsunaga T, Iwai H, Sano

Quintela A, Kato T, Furukawa H, Harashima A,

T, Shibayama M, : Structure and Rheology of a Self-

Kunieda H, : Previous Article Next Article Table

Standing Nanoemulsion, Langmuir, 2 6, 2 4 3 0-2 4 3 7,of Contents, Phase Behavior and Formation of2010.

Reverse Cubic Phase Based Emulsion in Water/4） Suzuki T, Takei H, Yamazaki S, : Formation ofPoly(oxyethylene) Poly(dimethylsiloxane) Surfactants/

fine three-phase emulsions by the liquid crystal

Silicone Oil Systems, Langmuir, 17, 5169-5175, 2001.

emulsification method with arginine β-branched16）May A, Aramaki K, Gutierrez JM, Phase Behavior

monoalkyl phosphate, J. Colloid Interface Sci. 129, 491-

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− 10 −

interfacial curvature, Colloid Polym. Sci. 2 7 2, 1 0 0 51019, 1994.

カチオン性高分子の部分的疎水化と化粧品原料微粒子の油中分散安定化剤への応用
横浜国立大学大学院環境情報研究院

飯島志行

Series of polyethyleneimine (PEI)–fatty acid complex has attempted to be prepared in isopropyl myristate (IPM) using
stearic acid, oleic acid and isostearic acid for their application as a dispersant for TiO2/IPM suspensions. While it was notpossible to fabricate PEI-stearic acid complex those were soluble in IPM, PEI complex with oleic acid and isostearic acidhas successfully dissolved in IPM when the content of fatty acids were larger than 40 mol% and 80 mol%, respectively,
based on the number of ethyleneimine monomer units. FT-IR analysis of PEI-OA and PEI-ISA dissolved in IPM showed thatthe hydrogen bonded COOH groups originally found in the spectra of free fatty acid has disappeared and new peaks those
attributes to carboxylates has generated, which confirms the complex formation between carboxyl group of fatty acid andamine group of PEI. PEI-OA and PEI-ISA, which fatty acid complex ratio was 80 mol% based on EI unit content, was used
for further investigation as a dispersant for TiO2/IPM suspensions. It was interestingly found that while PEI-ISA effectively
adsorbed on TiO2 fine particles in IPM and reached to a saturated adsorption condition when the additive content was 2.4
mg/m2, the adsorbed content of PEI-OA has kept increasing as increasing their additive content under the tested condition(~3.0 mg/m2) which suggests multi-layer adsorption. In spite of different adsorption structures, the sedimentation test of
TiO2/IPM diluted suspension showed that the addition of PEI-OA and PEI-ISA can improve their dispersion stability when
additive content was larger than 2.4 mg/m2 while the suspension without and less complex addition formed sedimentation
rapidly due to aggregate formation. It was also found that the dispersion improvement by PEI-OA and PEI-ISA can achieved
under dense suspension; the suspension kept flowing for 15 vol% and 20 vol% suspension with 2.4 mg/m2 addition of PEIISA and PEI-OA, respectively, while non-treated TiO2 / IPM suspension rapidly solidified at 15 vol%. It was revealed thatthe dispersant design through the complex formation between PEI and fatty acid is applicable to IPM solvent system and thedestined complex efficiently improved the stability of TiO2 / IPM suspensions.

が報告されており、所望の微粒子材質／分散媒の組合せに

1. はじめにおいて所望の分散特性を実現するためには、取り扱っていサンスクリーンや口紅などをはじめとした化粧品剤の開る系に適合する分散剤構造を専門性の高い高分子合成化学

発において、紫外線散乱や色彩調整などの機能付与を目的のアプローチでいくつか設計したうえで、その中から経験として酸化チタン、酸化亜鉛や酸化鉄などを例とした各種的に選択されてきたのが現状である 5）。そのため、無機微

無機微粒子の濃厚系油中分散体が多用されている。最終製

粒子の各種分散媒中における分散安定性を効率的にチュー品使用時の透明感、密着感、すべり感などの質感の制御

ニングにするにあたって、さまざまな分散系に適用できてを実現するにあたっては、各原料微粒子の油中での分散制

かつ、簡便に分散剤構造を設計できる新しい設計手法が求御が大きな鍵であり、原料微粒子種や溶媒に応じた様々なめられている。

分散安定化剤が配合されている。無機微粒子の油中分散安これらの課題を解決するべく、筆者らはこれまでに非水定化を実現するための分散安定化剤の設計は、化粧品剤の系溶媒中（トルエン）で各種分子量のカチオン性分散剤（ポ開発分野に限らず国内外において古くから検討されておリエチレンイミン（PEI）とオレイン酸（OA）を混合し、超り、これまでにアクリル酸−メタクリル酸アルキル共重合

音波処理と撹拌処理を施すことによって得られる会合体が、体、グリセリン・ポリグリセリンやポリエチレングリコー

窒化ケイ素、酸化イットリウム、酸化アルミニウムなど性ルの脂肪酸エステルおよびそれらの誘導体など、多岐にわ状の異なる微粒子に効果的に吸着可能であり、トルエン中たる化合物が開発・利用されてきた 1−4）。それぞれについて、における分散安定性を劇的に改善できることを報告してい分散安定化剤の分子量や親水基／疎水基比などが粒子に対る 6）。また、本プロセスが各種分子量の PEI に適用可能でする吸着特性や分散安定化状態に多大に影響を及ぼすことあることも見出しており、PEI とオレイン酸の会合体の分子量によって微粒子間に作用する立体障害斥力および濃厚

Partial hydrophobication of cationicp oly mers a nd appl icat ions towa rd
stabilizer of cosmetic raw powders in oil
Motoyuki Iijima
Graduate School of Environment andInformation Sciences, Yokohama National
University

系トルエンスラリーの流動特性が制御できることも報告した。本会合体の形成プロセスは簡便でありながら様々な
分子量の PEI と様々な有機鎖を有する脂肪酸の組み合わせに拡張できることが想定され、無機微粒子の油中分散安定性の制御に有効であることが期待されるが、会合する脂肪酸種や対象とする溶媒種が、会合体の形成状態と微粒子の− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

分散安定性に与える影響は明らかになっていないのが現状

導電率の関係を示す検量線から溶媒に残存する未吸着のである。本研究では、酸化チタン微粒子／ミリスチン酸イ

PEI- 脂肪酸会合体量および粒子表面に吸着した PEI- 脂肪

ソプロピル（IPM）濃厚系スラリーを対象とし、脂肪酸種が酸会合体量を見積もった。

IPM 中における PEI との会合体形成状態に与える影響、得さらに、TiO2/IPM 濃厚系サスペンションの分散安定化

られた会合体の酸化チタン微粒子表面に対する吸着性、おに与える PEI- 脂肪酸会合体の添加効果を明らかにするた

よび IPM 中における分散安定性に与える影響を明らかにめ、2.4 mg/m2 となるように PEI- 脂肪酸会合体を溶解しする。

たIPM溶液に 5 ~ 20 vol %となるようにTiO2 微粒子を加え、

2. 実

1min. 間の遊星混合（2000 rpm）および 24h. の振盪処理を施験

2. 1. IPM 中におけるPEI- 脂肪酸会合体の調製と評価
ポリエチレンイミン（PEI、和光純薬工業、分子量 1800）
0.125g と異なる有機鎖を持つ脂肪酸としてオレイン酸

すことで得られる TiO2/IPM サスペンションの流動特性を
レオメーターで評価した。流動特性の評価直前には、再度サスペンションに 1min. 間の遊星混合を施し、ずり速度を300 s−1 に上下する過程でのせん断応力を測定した。

（OA、和光純薬工業）、ステアリン酸（SA、東京化成工業）、またはイソステアリン酸（ISA、東京化成工業）をミ

3. 結果および考察

うえ、25 ℃で 10 分間の超音波処理を施すことにより PEI-

3. 1. 各種脂肪酸を用いた IPM 中におけるPEI- 脂肪酸会合体の調製

脂肪酸会合体を調製した。脂肪酸の添加量は、PEI を構成

Fig. 1 には、脂肪酸としてステアリン酸、オレイン酸おするエチレンイミン（EI）モノマーユニット数に対して 30

よびイソステアリン酸を用い、IPM 中で PEI と様々な添加～ 100 mol % となるよう、Table 1 に示す通りに添加した。

比条件で混合することにより会合体の調製を検討した様子

各 PEI- 脂肪酸会合体の IPM 中における溶解性を目視観察、を示す。はじめに、PEI 自体は親水性のカチオン性高分子

会合状態を FTIR-ATR により評価した。

であるため、単体では IPM には溶解せず、IPM 層と PEI

リスチン酸イソプロピル（IPM、東京化成工業）中に加えた層が分離した状態で存在した。PEI を構成する EI ユニッ2. 2. PEI- 脂肪酸会合体を分散安定化剤として用いた
TiO2/IPM サスペンション調製と評価

トに対して様々な添加比のステアリン酸を混合した条件で

脂 肪 酸 の 添 加 比 率 が EI モ ノ マ ー ユ ニ ッ ト に 対 し て

濁し、IPM に溶解した状態で会合体が得られないことが80 mol % の PEI- 脂肪酸会合体を、Table 1 に従って IPM

明らかとなった。IPM 中におけるステアリル鎖間の分子は、Fig. 1（a）に観察されるように、すべての条件で系が白中で調製し、
分散安定化剤として利用した。TiO2 微粒子（テイカ、MT- 500B、比表面積（BET 法）38.9 m2/g）1.0 g に対して粒子濃度が 5 wt%、PEI- 脂肪酸会合体の添加量がサスペンション内の粒子総表面積に対して 0 〜 3.0 mg/m2となるように IPM と PEI- 脂肪酸会合体を混合し、超音波処理（1min.）および 24h. の撹拌を施すことで TiO2/IPM サ
スペンションを調製した。得られたサスペンションを IPM
で 4 倍希釈した溶液 10mL をメスシリンダーに移し、静置した際の粒子沈降挙動から TiO2 微粒子の分散安定性を評価した。
また、サスペンションを遠心分離（10 min, 3300 rpm）して得られる上澄み溶液についてエタノールで 3 倍希釈した後の導電率を測定し、予め求めておいた各会合体濃度と PEI- 脂肪酸会合体／トルエン／エタノール混合溶液のTable 1 Reagent contact for producing PEI-fatty acidcomplex in IPM

Fatty acid ratio [mol%]

30

40

70

80

100

Fatty acid [g]

0.24

0.32

0.57

0.66

0.82

IPM [g]

4.63

4.54

4.30

4.21

4.05

Fig. 1 各種脂肪酸を用いて調製した PEI- 脂肪酸会合体の IPM
に対する溶解性（図中の数値は EI モノマーユニットに対する脂肪酸のモル比）− 12 −

カチオン性高分子の部分的疎水化と化粧品原料微粒子の油中分散安定化剤への応用

間力が強く、会合体が十分に溶解できなかったものと推察示す。脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合と全く同様のしている。一方、脂肪酸としてオレイン酸を用いた系（Fig.

傾向が観察され、イソステアリン酸単体からは水素結合

1（b））では、EI ユニットに対するオレイン酸の添加比がした -COOH の伸縮振動（1710 cm-1）と C-O-H の変角振動増大するにつれて溶液が透明化し、80 mol % 以上のオレ（1418 cm-1）が認められた一方で、PEI-ISA 会合体からはイン酸を加えた条件では PEI が溶解していることが確認さ

IPM に由来する吸収に加えて、カルボン酸塩（-COO-） 型

れた。オレイン酸が PEI と会合することで PEI が疎水化さの逆対称（1407 cm-1）および対称伸縮振動（1543 cm-1）に帰れ、会合体として IPM 中に溶解しているものと考えられる。

属される吸収認められた。また、ISA の添加比を増大させ

また、脂肪酸をイソステアリン酸とした系では、イソステていくと再び水素結合型の（塩を形成していない）-COOH

アリン酸の添加量が 40 mol % 以上で混合溶液が透明化し、基に由来する吸収が再度認められる様子も観察され、ISA

オレイン酸添加系を同様に会合体として IPM 中に溶解しの添加比が EI モノマーユニットに対して 100 mol % の条ていることが観察された（Fig. 1（c））
。分岐構造に伴うイ件では会合体生成に寄与しない過剰量の ISA が存在していソステアリン酸鎖の 1 分子あたりの占有面積が大きいことることも明らかとなった。

から PEI が効果的に疎水化され、オレイン酸と比べてより少ない添加比で会合体として溶解できたものと推察される。
Fig. 1 で PEI と脂肪酸の混合溶液が透明化した条件にお3. 2. IPM 中に お ける PEI-OA および PEI-ISA のTiO2 微粒子に対する吸着

いて、PEI- 脂肪酸の会合状態を FTIR-ATR によって評価

Fig. 1 および Fig. 2 により IPM 中に可溶であることがした結果を Fig. 2 に示す。Fig. 2（a）は、オレイン酸、PEI、

明らかになった PEI-OA および PEI-ISA について、TiO2

IPM および PEI-OA 会合体の FTIR スペクトルを示して微粒子に対する吸着特性を評価した結果を Fig. 3 に示す。

おり、オレイン酸からは水素結合した -COOH の伸縮振動

PEI に対する脂肪酸の添加比率は、IPM に可溶でありか（1710 cm−1）、C-O-H の変角振動（1418cm−1）ならびに CH2

つ未会合の脂肪酸が生成しない条件として、EI ユニット

−1

、PEI かに対して 80 mol % とした。PEI-ISA については、その添らは N-H 変角運動（1600 cm ）および CH2 はさみ変角運動加量が少ない条件ではほぼすべての添加した PEI-ISA がのはさみ変角振動（1462 cm ）に帰属する吸収

7−9）

−1

−1

が認められた。一方、IPM

TiO2 微粒子の表面に吸着しており、2.4 mg/m2 の添加条件中における PEI-OA 会合体のスペクトルでは、水素結合しで飽和吸着状態に至った。これは、既報 6）で報告したトル

た -COOH 型の伸縮振動（1710 cm−1）の吸収は消失し、IPM

エン中における窒化ケイ素微粒子に対する PEI-OA の吸着（1462 cm ）に帰属する吸収10）-に由来する吸収に加えて、カルボン酸塩（-COO ）型の逆対−1-1挙動と類似した傾向である。一方、IPM 中で PEI-OA を称（1407 cm ）および対称伸縮振動（1543 cm ）に帰属されTiO2 微粒子上に吸着する系ではこれらと挙動が大きく異る吸収が認められた 8）。これは、オレイン酸の COOH 基なっており、PEI-OA の添加量増大に伴って吸着量も増大-

が会合体中では -COO 塩として存在していることを示しし続け、多層吸着する挙動が観察された。本現象の具体的ており、カチオン性高分子である PEI のアミノ基との塩となメカニズムは現時点で十分に解明できていないが、Fig.

して会合していることが示唆された。Fig. 2（b）には、イ1 に示した脂肪酸会合度を変えた PEI-OA と PEI-ISA のソステアリン酸を用いた PEI 会合体の FTIR スペクトルを

IPM に対する溶解試験結果より、PEI-OA の IPM に対す

Fig. 2 IPM に溶解した (a) PEI-OA および (b) PEI-ISA の FTIR スペクトル− 13 −

Fig. 3 PEI-OA および PEI-ISA の IPM 中における TiO2 微粒子に対する吸着挙 動 (EI
モノマーユニット数に対する脂肪酸添加比は 80 mol%)コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る溶解性が相対的に劣ることが示されており、PEI-OA はで効果的に TiO2 微粒子が分散化した様子が観察された。

IPM 中で溶解状態にあるより粒子表面上に吸着した方がPEI-OA については、2.4 mg/m2 以上の添加条件では添加安定であることが推察される。

量の増大に伴って分散安定性が改善する傾向が観察された。PEI-OA、PEI-ISA いずれを添加した場合においても、

3. 3. PEI-OA および PEI-ISAを用いたTiO2/IPM
サスペンションの分散安定化

TiO2 微粒子表面に会合体が吸着することによって粒子はFig. 4 には PEI-OA および PEI-ISA の IPM 中におけるによって分散安定性が改善したものと考えられる。また、微粒子分散安定化剤としての応用性を確認するため、様々

PEI-OA については添加量の増大に伴って多層に吸着してな添加量で会合体を加えた TiO2/IPM サスペンションの沈いることが示唆されており（Fig. 3）、添加量の大きい条件

降挙動を示す。PEI-OA および PEI-ISA のいずれの場合

下ではより大きな立体障害斥力が発現し、分散安定性が向においても、会合体未添加の条件および会合体の添加量が上したものと考えられる。

疎水化され、IPM との親和性向上と立体障害斥力の付与

少ない条件で TiO2 微粒子の沈降が促進し、凝集状態にあFig. 5 お よ び Fig. 6 に は 会 合 体 の 添 加 が 濃 厚 系 TiO2/

ることが観察された。会合体の添加量をより増大させる

IPM サスペンションの流動特性に与える影響を評価した

につれて TiO2 微粒子の沈降速度はしだいに低下し、PEI-

結果を示す。Fig. 5 は会合体を添加していない TiO2/IPM

2

ISA では特に飽和吸着状態（2.4 mg/m ）に至る添加量以上

サスペンションの概観事例であるが、粒子濃度が 15 vol %以上になると凝集体の生成に伴ってサスペンションが固化する様子が観察された。一方、Fig. 6 には PEI-OA またはPEI-ISA を 2.4 mg/m2 の条件で添加した TiO2/IPM サスペ
ンションの流動曲線を示す。PEI-ISA を添加した系では粒子濃度が 15 vol % まで向上させてもサスペンションは流動性を有しており、会合体未添加系と比べて分散安定性の改善が認められた。ただ、低いせん断速度領域においてせん
断速度の上昇過程と下降過程間において測定されたせん断

Fig. 4 （a）PEI-OA および（b）PEI-ISA を添加した TiO2/IPM サス
ペンションの沈降挙動

Fig. 5 TiO2/IPM サスペンションの概観（会合体
未添加、15 vol %）Fig. 6 （a）PEI-ISA および（b）PEI-OA を 2.4 mg/m2 添加した濃厚系 TiO2/IPM サスペンションの流動曲線− 14 −

カチオン性高分子の部分的疎水化と化粧品原料微粒子の油中分散安定化剤への応用

応力の値が異なる様子も読み取れ、依然弱い凝集体がサス

properties of silica particles in nonaqueous media with

ペンション中に存在していることも示唆された。PEI-OA

a non-ionic surfactant, dodecyl hexaethylene glycolを添加した系では、TiO2 微粒子の濃度を 20 vol % まで上

monoether, C1 2E6, Colloids and Surfaces A, 3 1, 1 6 2-

昇させてもサスペンションの流動性が認められ、PEI-ISA

174, 2008の系で発現した顕著な流動曲線のヒステリシスな挙動は認

3） Asaro F, Benedetti A, Savko N, Pellizer G,: Inverse

められなかった。各粒子濃度における TiO2/IPM サスペン

nonionic microemulsion studied by means of 1H, 1 3C

ションの粘度も PEI-OA を添加した系の方が低いことも観and PGSTE NMR during silica nanoparticle synthesis,

察されており、PEI-OA が IPM 中でより効果的に TiO2 微

Langmuir, 25, 3224-3231, 2009
4） Palla BJ, Shah DO,:Stabilization of high ionic strength

粒子を分散安定化できることが明らかとなった。

4. 総

slurries using surfactant mixtures: Molecular factors

括that determine optimal stability, J. Colloid Interface
Sci., 256, 143-152, 2002

IPM 中においてステアリン酸、オレイン酸、イソステ
アリン酸を用いた PEI との会合体形成を試みたところ、オ

5） Zhang W, Du Z, Chang CH, Wang G,: Preparation

レイン酸とイソステアリン酸を用いた系において IPM にand properties of comb-like surfactants containing

可溶な PEI- 脂肪酸会合体が調製できることが明らかとpoly(ethylene oxide) methyl ester grafts, J. Colloid andInterface Sci. 337, 563-568, 2015

なった。PEI- 脂肪酸会合体を可溶化するために必要なエチレンイミンモノマーユニット数に対する脂肪酸添加比6） Iijima M, Okamura N, Tatami J,: Polyethyleneimine-

は、オレイン酸では 80 mol% 以上、イソステアリン酸では

oleic acid complex as a polymeric dispersant for Si3N4

40 mol% 以上であった。得られた PEI- 脂肪酸会合体の分and Si3N4-based multicomponent nonaqueous slurries,

散安定化剤としての適応可能性を確認するため、80 mol %Ind. Eng. Chem. Res., 54, 12847-12854, 2015の条件でオレイン酸とイソステアリン酸を加えて調製した

7） Tandon P, Raudenkolb S, Neubert RHH. Rettig

PEI- 脂肪酸会合体の IPM 中における TiO2 微粒子上への吸W, Wartewig S,: X-ray diffraction and spectroscopic

着特性を評価したところ、両者ともに効果的に吸着する

studies of oleic acid-sodium oleate, Chem. Phys. Lipids,

ことが明らかになったが、PEI-ISA の系では添加量の増

109, 37-45, 2001

2

大に伴って 2.4 mg/m の添加条件で飽和吸着状態に至った

8） De Palma R, Peeters S, Van Bael MJ, Van den Rul

一方で、PEI-OA については多層吸着する傾向が観察され

H, Bonroy K, Laureyn W, Mullens J, Borghs G, Maes

2

た。PEI-ISA、PEI-OA ともに 2.4 mg/m 以上の添加条件

G,: Silane ligand exchange to make hydrophobic

で TiO2 微粒子の IPM 中における分散安定性が改善し、特superparamagnetic nanoparticles water-dispersible.

に濃厚系サスペンションにおいては会合体未添加系でサスChem. Mater., 19, 1821-1831, 2007

ペンションが凝集固化した一方で、PEI-ISA では 15 vol %、9） Kadamne JV, Jain VP, Saleh M, Proctor A,;

PEI-OA では 20 vol % でも高い流動性を保ったサスペンシ

Measurement of conjugated linoleic acid (CLA) in

ョンが得られることが明らかとなった。IPM を溶媒としCLA-rich soy oil by attenuated total reflectance-

た系においても、PEI- 脂肪酸会合体の調製が可能であり、

fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR),
J. Agric. Food Chem.,57, 10483-10488, 2009

微粒子の分散安定性の制御に有効であることが確認された。

10）Iijima, M.; Yamazaki, M.; Nomura, Y.; Kamiya, H.
（引用文献）

Effect of structure of cationic dispersants on stability of

1） Chaari K, Bouaziz J, Bouzouita K, J. Colloid andcarbon black nanoparticles and further processability
through layer-by-layer surface modification. Chem.

Interface Sci. 285, 469-475, 2005
2） Thwala JM, Goodwin JW, Mills PD,: Dispersion− 15 −

Eng. Sci., 85, 30-37, 2013

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明
新潟大学工学部機能材料工学科

落合秋人

Tyrosinase is a rate-limiting enzyme in melanin biosynthesis. Thus, many inhibitors against tyrosinase have been
proposed to be skin-lightening agents. However, many of the existing inhibitors cannot be widely used in the cosmetic
industry owing to their high cytotoxicity and low activity. In this study, we isolated new naturally derived peptides from the
enzymatic hydrolysate of rice bran protein that exhibited inhibitory activity against tyrosinase. Furthermore, mutational andstructural analyses were tried for elucidating the structure-function relationship of these peptides.

1. 緒

されている 4）。また、チロシナーゼ阻害活性を持つアルブ

言チン、グルタチオン、アスコルビン酸は、比較的安全では紫外線から皮膚を保護する生体防御反応として、我々のあるものの、その活性が相対的に低く、化粧品向けの有用

身体はメラニンと呼ばれる褐色色素を生産する。通常、皮な美白素材にはなっていない。申請者は、過去に合成ペプ

膚のターンオーバー（皮膚細胞の新陳代謝）によってメラ

チド TH10 がチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、ニンは自然に肌から排出されるが、色素の過剰生産もしくC 末端のチロシン（Y）残基がこの阻害活性に必須であるこはターンオーバーの低下などの理由で “しみ” や “そばかす”とを明らかにした 5）。そこで、芳香族アミノ酸のカルボキ

1）などの色素沈着を起こす 。ターンオーバーが乱れる要因

シル基側のペプチド結合を切断するキモトリプシンで米糠として、過度な紫外線の暴露、栄養バランスの崩れ、疲労、

タンパク質を消化した結果、消化産物中には多数のチロシ

ストレス、ホルモンバランスの崩れなどが挙げられるが、ナーゼ阻害成分が派生することを見出した。また、この酵

一般的には加齢に伴う新陳代謝の衰えが原因である。また、

素消化産物からチロシナーゼ阻害ペプチド CT-1, CT-2 を最近の研究では、お年寄りが継続的にスキンケアと化粧を単離同定した。これらは、それぞれ 9 残基もしくは 6 残基行うことで日常生活動作（ADL）が向上することが明らかのペプチドであり、共通して C 末端にチロシン残基を含む。

になっている。これらのことから、若い世代においてのみ

一方で、これらのペプチドの阻害の強さ（IC50）には大きなならず、10 年後には 65 歳以上の高齢者が 30 ％近くに達相違が確認され、阻害活性の発現には様々な要因を考慮すするとされる超高齢化社会を迎える中で、生活の質を高める必要があることがわかった 6）。

るためのスキンケア、特に美白については多くの人々が望これらの背景を踏まえ、本研究では、チロシナーゼを阻む皮膚ケアであり、生き生きとした生活を支えるためにま害するペプチドのさらなる網羅的な単離・同定を行い、構すます重要な課題であると言える。

造生物学的手法や阻害ペプチドの派生ペプチドを用いてチ

メラニン色素の沈着は、主にメラニン形成の出発段階に
2）

ロシナーゼ阻害活性を与える構造要因を明らかにする。こ関わるチロシナーゼ酵素の働きによる 。チロシナーゼは、れらの結果と合わせて、ペプチドの一次構造とチロシナー

図１に示すように、メラニン形成の出発段階に関わる中核

ゼ阻害活性との相関解析を行い、チロシナーゼ阻害ペプチ酵素である 2, 3）。そのため、これまでに多くのチロシナー

ドの高い活性の発現に必要な構造要因を明らかにする。

ゼ阻害成分が色素沈着防止剤や美白剤として提案されてい2. 実る 4）。現在、色素沈着防止剤や美白剤として、様々な化学
合成品や天然物成分が用いられているが、近年の白斑問題

験

2. 1. チロシナーゼ活性の測定に象徴されるように、コウジ酸やハイドロキノンなどの既

チロシナーゼの酵素活性は、L- チロシンまたは L-DOPA

存物質はアレルギー性や毒性が強く、その安全性が問題視を基質として、チロシナーゼのモノフェノラーゼ反応またはジフェノラーゼ反応を波長 475 nm における光吸収を測

Searching for the naturally derived
peptides having a skin whitening effectand elucidation of its action mechanism
Akihito Ochiai
Department of Materials Science andTechnology, Faculty of Engineering,
Niigata University

定することにより測定した。酵素阻害は、モノフェノラー
ゼ反応に対する各ペプチドの 50 % 阻害濃度（IC50）を求めることにより評価した。また、本研究においては、マッシュルーム由来のチロシナーゼ（Tyrosinase from Agaricus
bisporus, AbTyr, Sigma）を使用した。AbTyr は真核生物のモデル系として、チロシナーゼ阻害試験に一般的に使用− 16 −

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明

図1

ヒト細胞におけるメラニン形成機構

タカラバイオ株式会社）を用いて生存細胞数を測定し、ペされている。

プチド添加後の 3 日目までに細胞増殖に与える影響を観察

2. 2. 新規チロシナーゼ阻害ペプチドの単離と同定した。

新規のチロシナーゼ阻害ペプチドは、米糠タンパク質の2. 4. AbTyr の結晶化とＸ線回折実験

酵素加水分解物から単離・同定した。
まず、3.0 g の米糠タンパク質（RBP55, 築野食品工業株

結晶化には高純度のタンパク質が必要であるため、式会社）を秤量して超純水中に懸濁した。ホモジナイザー

AbTyr の市販品（Sigma 社）をゲルろ過クロマトグラフィを用いて米糠タンパク質を均一に撹拌した後、透析によりーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに低分子物質を除去し、Trypsin と Chymotrypsin をそれぞ高純度化した。AbTyr と CT-2 との複合体の結晶は、過去

れ 60 mg 加えて 50 ℃, 6 時間インキュベートすることによに報告されている AbTyr の結晶化条件 7）を参考にして、9り加水分解反応を行った。得られた加水分解物から、チロ% PEG 4000, 0.1 M NaAc（pH 4.5），5 mM HoCl, 1.56 mM

シナーゼ阻害活性を有する画分を 2 種類のゲルろ過クロマ

CT-2 を含む条件において、蒸気拡散法を用いて調製した。

トグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを使用して分X 線回折実験は、高エネルギー研究機構（つくば市）の放射

離し、均一なペプチド成分を単離した。単離したペプチド

光を利用した。

の MS/MS ス ペ ク ト ル を MALDI-TOF MS（Auto Flexし、Mascot プログラム（マトリクスサイエンス株式会社）

2. 5. AbTyrとチロシナーゼ阻害ペプチドとのドッキ
ングシミュレーション解析を利用してイネゲノムデータベースと照合することにより

AutoDock Vina（version 1. 5. 4）ソフトウェアを使用

III, BRUKER DALTONICS）を用いた質量分析により収集

その配列を同定した。

して、AbTyr と各チロシナーゼ阻害ペプチドとの結合をまた、これらペプチドの派生ペプチドは、ペプチド合成

シミュレーション解析した。解析には短鎖ペプチド SWY,

装置（PSSM-8、島津株式会社）を用いて Fmoc 固相法によSWW, もしくは YWS を使用した。AbTyr の立体構造は既り化学合成し、逆相クロマトグラフィーによって高純度化

7）に報告されているものを使用した（PDB ID : 2y9w）。それして使用した。

ぞれのシミュレーション解析において、AbTyr の活性中心を構成する 3 つのアミノ酸残基（Asn-260, His-244, Glu-

2. 3. B16 マウスメラノーマ細胞を用いたメラニン合成抑制試験
チロシナーゼ阻害ペプチドによるメラニン合成抑制試験322）を柔軟性を持つ残基として指定し、グリッドマップサ
イズは 16×18×18、グリッドセンターを x=7, y=27, z=99に設定した。

はマウス B16 メラノーマ細胞を使用して以下のように行

3. 結った。5 % FBS を含む E-MEM 培地を用いて 1×104 cells/
mL の培養細胞溶液を調製し、6well マイクロプレートに果

3. 1. 新規チロシナーゼ阻害ペプチドの探索

1.5 mL/well ずつ分注して 37 ℃, 5 % CO2 雰囲気下で 24 時

米糠タンパク質加水分解物を 2 種類のゲルろ過クロマト

間培養した。その後、上清培地を各種濃度のペプチドを含グラフィーによって分離し、各画分のチロシナーゼ阻害活

む 5 % FBS 含有 E-MEM 培地と交換し、さらに 3 日間培養性を測定した。高い阻害活性を有するピーク画分を回収し、した。培養後の細胞を 0.25 % トリプシンおよび 1 N NaOH

逆相クロマトグラフィーによってさらに精製を行った。得により剥離・溶解させ、420 nm における吸光度を測定すられた複数の主要ピークをそれぞれ分取し、同一のカラムることにより細胞内に蓄積したメラニン量を定量した。

を用いた再クロマトグラフィーによって、それぞれのピ

また、96 well マイクロプレートにおいて、同様の条件にークに含まれるチロシナーゼ阻害ペプチドを単離した。質てペプチド処理および培養を行った。その後、生細胞測定

量分析とイネゲノムデータベースにおける照合検索を行い、キット（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System,

2 種類のチロシナーゼ阻害ペプチド CT-3, CT-4 を同定し

− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

た。CT-3 および CT-4 は、それぞれ 7 残基と 9 残基のアして、マウス B16 メラノーマ細胞におけるメラニン合成抑

ミノ酸から構成されており、CT-3 は C 末端にチロシン残制試験を行った（図 3）。CT-1 と CT-3 では、むしろメラ基を有している一方で、CT-4 はチロシン残基を有してい

ニン合成量を増大させる結果となった。一方で、最も強いなかった。これらのペプチドを化学合成してチロシナー

チロシナーゼ活性阻害を示した CT-3 は、0.5 mM で 60 %ゼ阻害活性を測定した結果、CT-3 は 400µM の濃度でモ程度のメラニン合成抑制効果を示した。既存のメラニン合

ノフェノラーゼの活性を 35% 程度抑制することがわかっ成抑制剤であるアルブチンを濃度 0.5 mMで処理した場合た（図 2）。この阻害活性は、過去に同定した阻害ペプチドは約 70 % 程度の抑制効果を示すことから、CT-3 はアルCT-1 と同等であった。一方で、CT-4 は CT-1~CT-3 のブチンと同等の効果が期待できると考えられた。また、こペプチドと比較してやや低い阻害活性（400µM の濃度でモ

れらのペプチドは全て、1 mM の濃度範囲において全く細ノフェノラーゼの活性を 10 % 程度抑制）を示した（図 2）。

胞毒性を示さなかった。

阻害活性の強い 3 種類のペプチド（CT-1~CT-3）を使用

3. 2. チロシナーゼ阻害活性に関わるペプチド中の各アミノ酸残基の役割の解明
強いチロシナーゼ阻害活性を示した CT-1~CT-3 およびTH10 は、その配列の C 末端に共通してチロシン残基を有することがわかった。過去の研究においても、TH10 の C
末端チロシン残基がそのチロシナーゼ阻害活性に必須であることを明らかにしている。これらのペプチドは、L- チ
ロシンのアナログ基質としてチロシナーゼの酵素反応を阻害していると推測された。そこで我々は、過去に報告されているチロシナーゼ阻害ペプチドのなかから、TH10 の10 残基の配列のうち 7 残基が一致し、かつ同等のチロシ
図2

米糠加水分解物から見出したチロシナーゼ阻害ペプチド

図3

ナーゼ阻害活性を示すペプチド P48）に着目した（表 1）。P4

マウス B16 メラノーマ細胞におけるメラニン形成抑制試験− 18 −

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明と TH10 は、配列中にそれぞれ 3 残基と 1 残基のチロシン

3. 3. AbTyr の結晶化とＸ線回折実験を有している。これらのチロシン残基を中心に変異を導入

チロシナーゼ活性阻害に関わるペプチドの詳細な阻害機し、合計 12 種類の派生ペプチドを設計して（表 1）、配列

構を明らかにするため、Ｘ線結晶構造解析により AbTyrと阻害活性との相関を解析した。

とその阻害ペプチドとの複合体立体構造の解明を試みその結果、チロシン残基を欠失させた派生ペプチド

た。阻害ペプチドとして、CT-1, CT-2, CT-3, TH10, およ（TH10-1, TH10-2, TH10-3）において完全にチロシナーゼ

び P4 を使用した。1.56 mM の CT-2 を含む 9 % PEG4000,

阻害活性が喪失したことから、チロシナーゼ阻害活性の発0.1 M NaAc（pH 4.5），5 mM HoCl の組成から成る結晶化

現にはチロシン残基が必須であることが立証された。興味

条件において、AbTyr/CT-2 複合体の結晶を得た（図 4

深いことに、P4 の C 末端以外に配置されたチロシン残基左）。得られた結晶を用いて、高エネルギー加速器研究機の欠失（P4-1, P4-2, P4-3）は、その阻害活性に影響を及ぼ

構の Photon Factory の放射光を使用して回折実験を行っさなかった。また、C 末端のチロシン残基のみを欠失させた。その結果、最大分解能 2.4 Å 程度の回折像を得ることた派生ペプチド（P4-4）においては完全に阻害活性が喪失ができた（図 4 右）。しかしながら、結晶の重なりが原因としたことから、C 末端に配置されたチロシン残基のみがチみられる回折像の光暈が特定の振り角において生じ、立体

ロシナーゼの阻害に関与することが明らかになった。一方構造の決定には至らなかった。TH10 および P4 との複合で、C 末端から 2 番目に配置されたトリプトファン残基に体結晶も得られたが、同様に構造決定には至らなかった。

変異を導入すると、その阻害活性は顕著に低下した。従って、チロシン残基周辺のアミノ酸配列も阻害活性の強弱に影響することが示唆された。

3. 4. ドッキングシミュレーション解析を用いた AbTyrと阻害ペプチドとの結合様式の解明
前述の「3. 2.」の結果から、C 末端に配置されたチロシン

表 1 TH10 および P4 と設計したそれらの派生ペプチドのチロ
シナーゼ阻害活性
ペプチド
TH10
P4
TH10-1
TH10-2
TH10-3
TH10-4
P4-1
P4-2
P4-3
P4-4
P4-5
P4-6
P4-7
P4-8
a
b

アミノ酸配列MRSRERSSWYYRSRKYSSWYMRSRERSSW–MRSRERSSWFMRSRERSSWWYWSSRERSRM–RSRKYSSWY–RSRKRSSWYYRSRKRSSWYYRSRKYSSW–YRSRKRSSW––RSRKYSSW––RSRKRSSRYYWSRKRSSW–

残基のみがチロシナーゼの阻害に関与することを明らかにした。AbTyr とその阻害ペプチドとの複合体立体構造の解析が不調に終わったため、シミュレーションソフトウェa

IC50
102 µM
123 µM–b–b–b–b
123 µM133 µM
122 µM–b–b–b
400 µM–b

ア AutoDock Vina を用いて AbTyr と阻害ペプチドとの結合様式の解明を試みた。計算を容易にするため、TH10 のC 末端側 3 残基と一致する SWY、その C 末端のチロシン残基をトリプトファン残基に置換した SWW, および SWYの配列を逆順に配列した YWS の 3 種類のペプチドを使用した。
シミュレーション解析を行った結果、3 つの短鎖ペプチ
ドはいずれも AbTyr の活性クレフトに結合していた。触媒残基および銅イオンが近接する Binding Pocket 1（BP1）

チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性に対する 50% 阻害濃度
決定不能（IC50 > 400µM）

図4調製した AbTyr/CT-2 複合体の結晶（左）とＸ線回折像（右）− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図5

AbTyr と 3 種類の短鎖ペプチドとの相互作用（左 : リボンモデル，右 : 分子表面モデル）には SWY の C 末端チロシン残基、SWW の C 末端トリプを介さないチロシナーゼ阻害機構が存在することを示した。

トファン残基、YWS の N 末端チロシン残基がそれぞれ結今回調製した AbTyr と CT-2 の複合体結晶から 2.4 Å 分

合していた（図 5 左）。SWY ペプチドの C 末端チロシン残解能までのＸ線回折像を得ることができた。しかしながら、基は BP1 に結合しており、TH10 および P4 の C 末端チロ

調製した結晶においては結晶性が極端に悪い格子面が存在

シン残基が AbTyr のアナログ基質として機能している可

し、各ペプチドとの複合体立体構造の決定には至らなかっ

能性を強く支持した。また、SWW 配列をもつ TH10-2 ペた。そこで、AutoDock Vina ソフトウェアを用いたシミ

プチドはチロシナーゼ阻害活性を持たない（表 1）。この理ュレーション解析により AbTyr と阻害ペプチドとの結合

由は、SWW の C 末端トリプトファン残基と触媒銅イオン様式の解明を試みた。解析の結果、ペプチド中のチロシンとの間には 6 Å 程度の距離があることから（図 5 右）、基質

残基が AbTyr のアナログ基質として機能することにより、（チロシン）の接近を妨げることができず、活性を抑えられチロシナーゼ活性を阻害する可能性を示した。また、そのないからと考えられる。また、YWS 配列をもつ TH10-4

チロシン残基はペプチド中の C 末端に配置される必要があ

ペプチドもチロシナーゼ阻害活性を持たない（表 1）。シミり、同じ芳香族アミノ酸であるトリプトファン残基残基にュレーション解析の結果は、YWS の N 末端チロシン残基

よって代替できないことを示した。

が BP1 を塞ぐことが可能であることを示している。一方で、これらの結果は、C 末端にチロシン残基をもつペプチド

このチロシン残基には N 末端アミノ基が残っていることかを網羅的にスクリーニングすることにより、高い阻害活性ら図 1 に示す反応が進み、結果として YWS ペプチドからを有するチロシナーゼ阻害ペプチドを設計することが可能

メラニン様物質が生成してしまう可能性を示した。

になることを示している。一方で、我々は C 末端チロシン

4. 考

残基に隣接するアミノ酸残基もチロシナーゼ阻害活性の強察弱に影響を与えることを明らかにした。より高い阻害活性本研究により、チロシナーゼ阻害活性を示す 2 種類の新規なペプチド（CT-3, CT-4）を見出した。それらの阻害を有するチロシナーゼ阻害ペプチドを設計するには、阻害機構のさらなる解明が必要であると考えられる。

活性は、過去に見出した CT-2 ペプチドに比べてやや低く、それぞれ 400 µM の濃度で 35 %, 10 % 程度の活性を阻害し謝辞た。阻害活性の強い CT-1, CT-2, CT-3 のペプチド配列を本研究を遂行するに当たり、公益財団法人コスメトロジ

比較すると、共通して C 末端にチロシン残基を有すること

ー研究振興財団よりご援助頂きましたことに深く感謝申しがわかった。TH10 と相同性の高い P4 の配列をシャッフ上げます。

リングした派生ペプチドの阻害活性を解析することにより、C 末端に配置されたチロシン残基の存在が阻害活性に重要（発表論文）

であるという共通則を提示することができた。一方で、今

1） Ochiai A, Tanaka S, Imai Y, Yoshida H, Kanaoka T,

回我々が見出した CT-4 はその配列中にチロシン残基を有Tanaka T, Taniguchi M,: New tyrosinase inhibitory

していないものの、弱い阻害活性を示した。チロシン残基

decapeptide: Molecular insights into the role of− 20 −

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明

tyrosine residues, J. Biosci. Bioeng., 121, 607– 613, 2016.

プチドによるチロシナーゼ活性の阻害とメラニン形成の抑制： 2011 年度日本生物工学会大会要旨集，148 頁，（引用文献）

2011.

1） Lynde CB, Kraft JN, Lynde CW,: Topical treatments6） 落合 秋人，田中 聖也，吉田 久志，ほか 2 名：チロシ

for melasma and postinflammatory hyperpigmentation,

ナーゼ阻害作用を示す米糠タンパク質由来新規ペプチド

Skin Therapy Lett., 11, 1–6, 2006.

の同定と機能解析： 2013 年度日本農芸化学会大会プロ
グラム集，71 頁，2013.

2） Sánchez-Ferrer Á, Neptuno Rodríguez-López J,
García-Cánovas F, et al.,: Tyrosinase: a comprehensive7） Ismaya WT, Rozeboom HJ, Schurink M, et al.,:review of its mechanism, Biochim. Biophys. Acta, 1247,

Crystallization and preliminary X-ray crystallographic

1–11, 1995.

analysis of tyrosinase from the mushroom Agaricus
bisporus, Acta crystallogr., F67, 575–578, 2011.

3） Burton SG,: Oxidizing enzymes as biocatalysts,
Trends Biotechnol. 21, 543–549, 2003.

8） Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, et al.,: Short-4） Solano F, Briganti S, Picardo M, et al.,: Hypopigmenting

sequence oligopeptides with inhibitory activity against

agents: an updated review on biological, chemical andmushroom and human tyrosinase, J. Invest. Dermatol.,clinical aspects, Pigment Cell Res., 19, 550–571, 2006.

129, 2242–2249, 2009.

5） 吉田久志，富谷倫之，落合秋人，ほか 2 名：米由来ペ− 21 −

モルフォ蝶のミステリーに基づく、けばけばしくならない光輝粉体の開発
大阪大学大学院工学研究科

齋藤彰

Morpho butterfly’s blue is known as a typical structural color, which attracts interest due to metallic luster froma biological body. However, the blue by interference having high reflectance (>~60%) contradicts single color in too
wide angle. The key of this mystery is nanostructure having nano-disorder preventing the rainbow color. According tothis principle, we have developed a new type of color powder having luster without loud glitter by emulating the 3D
nanostructures. Also we have developed a quite simple process to fabricate the Morpho-powder and film based on a newprinciple.

1. 緒

研究の目的は、特異なモルフォ発色体の 1）（発色膜のみの）

言

効率的な分離、2）粉体化と制御（サイズと、光特性に関わ

構造色は光波長レベルのナノ構造による発色で、大抵はる概形）、3）解析（光学的証明）と設計である。これにより、干渉や反射による「光輝色」を帯びる。このためすでに多く

未だ実現されないモルフォ発色体の、化粧品への応用が初の化粧品（マニキュア・アイシャドー等）
で使われている。

めて可能になる。

しかし干渉や鏡面反射のため、反射率や色の角度依存性が2. 実

大きい原理的な特性がある（正反射に鋭い強度ピークをもち、虹色になる）。したがって塗布量によっては容易に「派手な（けばけばしい）」発色となってしまう。

験

モルフォ発色の本質は、ナノの乱雑さを含む切れ切れ多層膜である（図 2（b））。人工発色体はその物理エッセンス

近年、生物の構造色は広く知られてきた（玉虫や真珠、を抽出し、乱雑さを設計したナノパターン上への多層膜蒸孔雀など）。中でもモルフォ蝶の発色は他と違い、特異で着で発色を再現した（図 2（d））。当初基板表面のナノパタある。それは「干渉色ながら干渉に矛盾し、どこから見ーン作製には半導体プロセスを用いたが、高価で時間がかても青い（虹色でない）」物理学的ミステリーである（図 1）。

かるため量産ではナノインプリントリソグラフィ（NIL）

その理由が実は特異なナノ構造に起因し、「秩序」と「乱雑を導入し、樹脂によるパターン複製で劇的に（約千倍）効さ」の矛盾する要素を巧みに利用した自然の妙であること

率が向上した（図 3）。ただし工程に分厚い基板を要する上、を筆者は 2003 年、ナノ構造の再現で実証した。

発色多層膜の蒸着の都合で平板上にのみ作製し得る。ここ

その後、筆者は工学へ視点を変え、モルフォ発色の多様が前項の通り、応用の大きな足かせであった。

な応用価値を見出した。それは、色素不要なケミカルフリ

そこで粉体化だが、それにはまず発色部（ 1 µm 厚）の膜

ー発色（低環境負荷と高い安全性）や、広視野で単色の光を剥離し（図 4）、その後、膜を粉体化するのが最善である。

輝性、長期にわたる無退色、省材料、などである。しかし、

ここで、多層膜下に犠牲層を挟み剥離を易化する、等は技

応用には多くの壁があり、筆者は約 10 年、壁を順々に除術的に可能だが、追加工程は量産化にそぐわない。量産のいてきた（量産技術、光特性制御、乱雑効果の予測と設計、

NIL 工程に合う簡便なプロセスが肝要である。そこで NIL等）。

用の特殊アクリル樹脂に注目し、溶液で樹脂部を剥離し、本計画当初、発色体は作製プロセスの制約で厚い基板上（＞ 1mm 厚）に平板状でのみ作製可能だった。この点は応用の大きな足かせとなる。化粧品を始め多くの応用にとって（インク、塗料等も同様）、最大の近道は、基板を除く「発色部のみ（〜 1 µm 厚）」の「粉体化」の実現である。そこで本Development of color powder having
luster without loud glitter that is basedon the mystery of Morpho butterfly
Akira Saito
Graduate School of Engineering, OSAKA
Univ.

− 22 −

10°

回折
格子

モルフォ蝶

40°

図1

角度依存性の比較

モルフォ蝶のミステリーに基づく、けばけばしくならない光輝粉体の開発

A. Saito, S. Yoshioka, S. Kinoshita:
Proc. SPIE, 5526（2004）188. ほか

モルフォ蝶

➡

鱗粉断面 SEM 像
図2

図3

➡

光学原理抽出➡

簡便なナノ加工➡

発色再現

モルフォ発色体の再現プロセス

ナノパターン作製プロセスと、（c）量産化プロセス .

図41） 発色部のみを分離した。この際、使用樹脂の特性から、

3. 結

極めて簡便な剥片剥離法を見出した。さらに中間報告時
点では未発見だった新たな効果を見出し、発色部の（剥片でない）連続フィルム剥離も簡便に可能になった。こ発色体フィルム化果

中間報告書に記載した内容の詳細は紙幅の都合である程度省略しつつ、全体のまとまりに留意して以下、記す。

の結果、粉体を照準にした当初計画に対し予想外の手段

3. 1. 粉体化プロセス開発（連続平坦多層膜）

でフレキシブルフィルム作製も可能になった。
2） また量産化を目指し、（主に超音波衝撃による）発色膜

まず、量産型（NIL 仕様）で安価な平坦基板上の連続多層の粉体化を行った。ただし化粧品用途と、光特性との対膜（ナノパターン無し）を用いて剥離・粉砕の条件出しを行

応を考え、「粉体サイズと形状の制御（異方的な概形に反った。パラメータとして①基板を浸漬する溶媒の種類、②射方向が依存するため）」が必要で、その制御パラメータ

その溶媒の温度、③超音波粉砕の時間を振り、粉体化に最を半経験的に求めた。

適な条件を求めた。

3） 最終的に剥離した粉体・フィルムの光特性を確認し、

3. 1. 1.

剥離用溶媒の選定「設計・制御まで含めた光輝粉体技術」への道筋ができ、溶媒は超純水・エタノール・アセトン 3 種で薄膜剥離の化粧品を主とする応用に近づいた。特に、粉体のみなら様態を比較した。使用樹脂 PAK-01 の特性から超純水を、ず連続フィルムも含めた「基板フリー化」
を極めて簡便にアクリル樹脂の溶解性から代表的な有機溶剤エタノール・

実現する技術が開発できた点は重要である。

アセトンを、候補として選択した。

主な目標サイズは 50 〜 100 µm だが（目的により異なる）、各溶媒（20 ℃）に樹脂膜厚〜 10 µm の連続多層膜を基板

微小粒でモルフォ固有の光特性が再現されるか否かは、頻ごと浸漬し、時間経過を撮影・観察した結果、以下であった。

繁に議論されてきた。筆者は最近開発した理論計算により

・超純水………浸漬開始から約 2 時間で基板・樹脂の端部

サイズと光特性の相関を得ており、理論上は、上記サイズ

から亀裂が生じ、亀裂が進行したが、24までは光特性は保たれる予想であった。結果はこの予測を時間後まで剥離せず。なお亀裂の進行速度支持しており（後述）、したがって作製と計測の間で相互対は場所によるムラがある（原因は恐らく樹応を詰めつつ、理論予測を援用し、設計を含むモルフォ発

脂膜厚の不均一性にある）。

色固有の粉体を実現する方法論が確立できたと言える。

・エタノール…24 時間浸漬しても、特に変化なし。

− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

数で（㈱エスエヌディ、型名 US-2、高周波出力 120 W、発・アセトン……24 時間浸漬しても、特に変化なし。
超純水での亀裂発生を剥離につながる現象と考え、次の振周波数：38 kHz）、粒径の粉砕時間依存性を調べた。
処理時間で 8 種の試料を用意し、各試料ごとに粉体 100

温度最適化では、超純水のみを使用した。
3. 1. 2.

剥離温度個の粒径を光学顕微鏡で測定した（平均粒径と標準偏差を

超純水の温度上昇に連れ亀裂の進行速度も増し、〜 80 ℃
で比較的短時間（50 分）でガラスから樹脂と多層膜が剥離算出）。なお、粉体形状が非等方なため、粒径は「粉体面積の平方根」と定義した。
粉砕時間に伴う平均粒径と標準偏差の変化を図 5 に示すした。超純水 80 ℃での時間経過の詳細な観察から、剥離（エラーバーが標準偏差に対応）。平均粒径は粉砕開始かの原理についてヒントが得られた。
上述の通り当初、剥離方法は樹脂－ガラス界面の樹脂溶

ら 5 分後、標準偏差は 7 分後まで減少を続ける。また両値解を考えた。ところが、諸般の観察（おもに亀裂）と使用樹とも、一定時間後ほぼ一定値（平均粒径 ~70 µm、標準偏差

脂の特性から、結論として剥離原因は樹脂溶解でなく、膨~30 µm）で推移する。粉砕時間が長くなると、粒径 >120

潤とわかった。つまり基板側面から超純水が樹脂に浸透し、µm の粉体は減少、40~100 µm は増加傾向を示す。粉砕時

樹脂が膨潤する。それでガラス－樹脂界面に界面応力が生間に伴い、粒径のばらつき（標準偏差）が減少する様子がよ

じ、樹脂がガラスから剥離する（この過程で樹脂の膨張にくわかる。
この通り、量産型モルフォ発色粉体作製の条件出し用に、より亀裂を観測）。剥離後は軽い振動など弱い力で多層膜と樹脂の分離が確認された（膨潤による界面応力で、密着より安価・高効率な連続多層膜で粉体化を試みた結果、超性が低下したため）。

音波洗浄器により系統立った粒径制御が可能とわかった。

本実験で使用した超純水と樹脂では、温度上昇に伴い膨潤速度も上昇する結果が得られた。また溶解と同様、極性（または溶解度パラメータ）が近い物質の組み合わせは膨潤

3. 2. 粉 体化プロセス開発（モルフォ蝶型切れ切れ
多層膜）

しやすいことがわかっている。
3. 1. 3.

次に、前節で求めた剥離条件（80 ℃超純水へ浸漬）でモ

超音波粉砕と粒径の測定（連続平坦多層膜）

ルフォ発色薄膜の剥片を作り、超音波処理によりモルフォ

超純水 80 ℃への浸漬で剥片状の発色体が剥離した状態
でガラス基板のみ除き、超音波洗浄器で粉砕を行った。こ

発色粉体作製を試みた。
3. 2. 1.

剥離の際、数 cm サイズの大きな発色体は、予め数 mm 程度に量産型（NIL 仕様）の連続平坦多層膜とモルフォ発色膜の砕いて超音波にかけた。超音波洗浄器は一定の出力・周波間に剥離条件で大きな差異は無いと考え、前節の剥離条件（超純水 80 ℃に浸漬）で試みた。その結果、3 時間程度の浸漬で樹脂および多層膜の剥離に成功した。さらに条件に応じて（樹脂の厚み、加熱時の振動環境、等）、発色体が剥片化することなく、一体の連続フィルムとして剥離する現象が見出された（図 6：この場合 90 分）。
これは予想外で、前節の剥離原理（樹脂膨潤による応力と亀裂）と多層膜（総厚 ~1 µm の極めて脆い TiO2 と SiO2）構成を考えると一見、説明ができない。その後、調査と検討の結果、やはりこの現象も樹脂膨潤が鍵と判った。つまり膨潤応力は膜部（樹脂＋多層膜）を曲げて剥離するだけでなく、ナノパターンがあるため、膜部全体を安定に固定化

図5

超音波粉砕時間による粒径変化（平均径とばらつき）

図6

する作用があるのである。ナノパターン形状を考えるとわ剥片化せず連続フィルムとして剥離したモルフォ発色体− 24 −

モルフォ蝶のミステリーに基づく、けばけばしくならない光輝粉体の開発

かるが、NIL で複製された樹脂凹凸（幅 300 nm、高さ 100

果、同条件で前項に比べ若干、大きな粒径の粉体が得られnm）上に多層膜が蒸着される。材質上、膨潤は樹脂のみでた（図 7）。ただし上述のとおり、最終的な粒径は超音波の生じ、多層膜部は膨潤する樹脂に対して反作用を及ぼす。

パワーと処理時間で制御可能である。一般に使用される、

基板面内方向を考えると、固い多層膜部の反作用は一種の薄膜干渉に基づく光輝化粧品の粒径は 50 ~100µm である。

アンカー効果として働き、樹脂と多層膜を強固に保持する

したがって将来の実用化に鑑みても、すでに近い値の粉体ことになる。勿論、樹脂の応力はこの一体化した発色膜（樹化が実現できた。用途に応じて更に精緻な粒径制御が必要

脂＋多層膜）を基板から剥離するのにも働き、連続膜が剥な場合、出力や周波数可変な超音波発生器を用い、さらに離する。この「連続一体剥離」
は上記「膨潤アンカー効果」と厳密な粒径制御、光学特性の測定などを行い、様々な用途

いう新たな原理に基づき、発色部をフレキシブルフィルムに応じたモルフォ発色粉体の作製が可能となる。

として自立剥離する、新手法として応用可能である。本研
究ではコスメトロジーの観点で粉体が主眼だが、ディスプ

3. 3.

レイ等デバイスの観点では、本技術は新たな価値を生み出す可能性がある。

粉体の光学特性

3. 1. で述べた連続多層膜粉体と、3. 2. のモルフォ発色粉
体の反射特性を図 8 に示す。青色波長（460 nm）における本務である粉体作製（次項）に当たり、樹脂膜厚等の条件

半値全幅（FWHM）は、連続多層膜粉体 ~5 °に対し、モル次第では連続平坦膜と同様、数 mm ～数 cm 径の剥片とな

フォ発色粉体は ~40 °で、「広角で青く見える」モルフォ固るため、以下では剥片化したモルフォ発色体の超音波粉砕

有の反射角広がりが確認できる。

を試みた。なお、全てモルフォ発色用のナノパターンを転粉体でない発色体に比べてエッジ散乱により緑色反射も写した領域（□ 10 mm）
を、剥離後に選択して量産型モルフ

強くなっており、スペクトルは若干ブロードになっている

ォ発色体として用いた。

と予想される。しかし、50 ~100 µm のサイズでも、モルフ

3. 2. 2.

ォ蝶固有の「広角で単色」かつ「高反射率」という光学特性が超音波粉砕と粒径の測定得られた知見を元に、切れ切れ多層膜に基づくモルフォ

保たれることは判明した、といえる。

発色粉体を作製した。連続平坦多層膜の場合と比べ、諸々4．考の差異は見られたが、同様の行程で剥離→超音波粉砕の結察

コスメトロジー分野で構造色や反射による光輝効果を用いる多くの発色は現在、冒頭の通り「鋭い正反射と、反射の強い角度依存性、虹色干渉」を原理的に避けられない。
一方、ナノの乱雑さに基づくモルフォ発色を再現した粉体が実現されると、「高反射率ながら、滑らかな反射角度分布をもち、広角で単色（かつモルフォ蝶は青が支配的だが、人工物では色調整が可能）」という反射特性が得られる。こうした光特性の実効的な意義は、本課題名の通り、量を塗布しても派手にならず、光輝材特有な正反射のギラつき・
けばけばしさが無い「上品な発色」である。しかも合成色素不用なため（発色材は SiO2 と TiO2 のみ）、環境負荷が低い
図7

モルフォ蝶型人工発色粉体

上に毒性が無く、人体への安全性も高い。

連続多層膜粉体

図8

モルフォ発色粉体

連続多層膜とモルフォ型切れ切れ多層膜、各粉体の光学特性（反射率の角度・波長依存性）− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

こうした光輝材は従来、量の多寡を問わず「存在すらせず」、コスメトロジー分野でのインパクトには大きな期待が持てる。本粉体の、多数を塗布した集団的色彩効果は世界でまだ誰も見ていない。微小サイズによるモルフォ発色
失効の懸念は、筆者のシミュレーション結果から ~50 µm
径ならば問題なく、その効果は図 9 のように予想されたが、

図9

図 8 からその予想は正しいと判った。安全で新規な色彩効

粉の光特性

果をもつ本光輝材は、およそ粉体をベースにした多くのコカー効果は、フレキシブル発色フィルムの簡便な（湯浸だスメトロジー関連品への波及効果が期待できる。
また従来のコスメティック粉体と比べた上記の考察に加け）作製を可能にする。恐らくこの意義は大きく、反射型

え、さらに幅広いモルフォ発色体利用から見た本結果の意

デバイスや量産発色体の運搬（ロール状）に威力を発揮する

義を考えることも価値があろう。発色体の実態は、NIL にであろう。

よる複製の如何によらず「多層膜」である（図 3（b）
：発色

真の実用に残る唯一の壁は、コストである。NIL やレーを担う多層膜の総膜厚は、色にもよるが 1~2 µm）。多層ザ、電鋳で 5 − 6 桁の能率・コスト改善に成功したが、実膜形成法は当座、光学薄膜の厚み精度の要求が高いため真用ベースではまだ 2 桁程改善を要するだろう。しかし粉体空蒸着を要する。従って、現状では厚い平坦基板にしか発工程のさらなる効率化、制御の高精度化（光特性と粉体サ色できない。これでは装飾を始め、用途を厳しく制限してイズ）等、残りは研究よりも開発に委ねられる部分である。

しまう。

基本技術の点では目途が立ち、本課題の予想と計画に沿っしかし上述したモルフォ発色粉体の完成で、発色の付与

た進捗は実現できた、と言える。

範囲は「平板だけ」という形状（と蒸着槽サイズ）の制約から解放され、飛躍的に広がった。しかもモルフォ発色体の単

謝

辞

なる破砕
（それでは体積比で圧倒的な基板が邪魔）でなく、本研究を行うに当たり、大阪大学大学院工学研究科・精多層膜の「簡便な薄膜化（剥離）プロセス」「均一な粉体作製」

密科学・応用物理学専攻・桑原研究室の各位、特に石橋幸「粉体の光特性」が保証できた。

成氏の協力があったこと、また、コスメトロジー研究振興

加えて、剥離プロセスの過程で新たに発見した膨潤アン

財団よりご支援いただいたことを深く感謝申し上げます。

− 26 −

保湿性・抗菌性を有するバイオベースの新しいスキンケア素材の開発
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 機能化学研究部門

佐藤俊

Skin care products are now widely used not only by women but also by men of all ages. They require skin-care productswith versatile effects like moisturizing, anti-aging, and antimicrobial functions. Also, due to growing consumers’ demands
for safer chemical materials, skin care products made from natural and/or bio-based materials are preferred. Thus, novel
bio-based materials with moisturizing function and antimicrobial activity are necessary for the application to cosmetic
products. In this study, characteristics of glyceric acid, which is a phytochemical and can be mass produced from glycerol
by acetic acid bacterial fermentation, were investigated. It was observed that water-retention ability of glyceric acid sodium
salt in agar gels were comparable to that of glycerol, which is a practical skin hydration reagent. In addition, glyceric acidsodium salt showed no effect on the recovery of sodium dodecyl sulfate-treated human skin cells by using three-dimensional
cultured human skin model. It was also found that glyceric acid as well as other short chain fatty acids like acetic, propionic,
and lactic acids inhibited growth of Propionibacterium acnes, which is one of normal skin bacteria and causes inflammatoryacne by their overgrowth, on agar medium. These results suggest that glyceric acid possesses a potential in use as a cosmetic
ingredient with moisturizing function and antimicrobial effect.

1. 緒

言

みずみずしく健康的な美しい素肌へ導くためのスキンケ
ア化粧品は、現在では男性向け市場の拡大もあり、ニー

図1

ズの多様化に応える特徴ある製品が求められている。ま

グリセリン
（A）
およびグリセリン酸
（B）
の化学構造

た、ニキビや肌荒れ等に効果のある成分を配合させることのため、グリセリン酸の詳細な物性評価や化粧品素材としで、より高いスキンケア効果を持つ製品の開発も重要であての機能性評価は、現在でも十分に行われていない。

る。そのためには、スキンケア化粧品の基本機能である保近年、Habe らは、食酢の醸造で用いられる酢酸菌と同湿効果に加えて、抗菌性や美白効果等、複数の機能を有す種の菌株を用いたグリセリン酸の量産化技術の開発に成功

る高機能素材の開発が鍵となる。

した 4）。この技術では、有害な金属触媒や有機溶剤を用いグリセリンは、高い保湿効果を有する天然素材としてスることなく、グリセリンを特異的にグリセリン酸へと変換

キンケア製品に広く利用されているが、ニキビの原因菌することが可能である。例えば、Gluconobacter frateurii

である Propionibacterium acnes のグリセリン資化能から、

NBRC103465 株を用いた場合、5 L 容ジャーファーメンタ

増殖を促進する効果が指摘されている 1）。また、酢酸やプーでの pH 制御法による流加培養で、培養 6 日目に発酵液

ロピオン酸等の有機酸は、一般に抗菌作用が知られてい中のグリセリン酸濃度は 136 g/L に達した。また、グリセ

るが、乳酸菌の生産する培養液中の有機酸が P. acnes の増リン酸には、2 位の炭素に不斉が存在するが、酢酸菌株の2）殖を阻害することも報告されている 。そこで、両者の効種類を選択することで、D 体をエナンチオマー過剰率 99 %果を兼ね備えた新しい素材として、筆者はグリセリンの酸以上で生産できるプロセスも開発されている。そのため、化誘導体：グリセリン酸に注目した（図 1）。グリセリン酸

天然由来の化合物であり、かつ、食酢製造で利用されていは、植物に微量含まれる有機酸の一種で、天然由来の安全る酢酸菌類を用いた光学活性なバイオ生産物であるという性の高い化合物と考えられる 3）。しかし、化学触媒による点で、化粧品等に応用可能な新しいバイオ素材として魅力

グリセリンの酸化反応では、多段階の酸化反応制御が難し的である。
そこで本研究では、グリセリン酸に期待される保湿効果

く、グリセリン酸の量産技術は確立されていなかった。そや抗菌性等の機能性を評価・検証し、新しいバイオベース
A nove l bi o -ba s e d m at e r i a l w it hmoisturizing function and antimicrobialactivity
Shun Sato
Resea rch I nst itute for Sust a inable
Chemistry, National Institute of Advanced
I ndustria l S cience and Technolog y（AIST）のスキンケア素材の開発を行うことを目的とした。まず、グリセリン酸が保湿性および抗菌性を有するかどうかを評価するための手法を検討し、グリセリンや乳酸等、現在化
粧品等に配合されている化合物と比較した。さらに、ヒト
皮膚再構築モデルを用いて、脱脂処理を施した皮膚細胞に対するグリセリン酸の影響を評価した。

− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

2. 実

し、キット添付の LSE アッセイ培地で 37 ℃、5 % CO2 下

験で 24 時間培養した。その後、Cell Count Reagents SF を

2. 1. 試薬培地の 1/10 量添加して、37 ℃で 4 時間インキュベートした。

2 mol/L DL- グリセリン酸は、東京化成工業㈱製のも培地中に生成したホルマザン色素生成量は、450 nm の吸のを用いた。ナトリウム塩への変換は、1 当量の 1 N 水酸

光度測定により評価した。生細胞数の評価は、SDS 処理し化ナトリウム（和光純薬工業製）を添加して中和し、pH 試ていない条件を対照とし、コントロールを 100 % とする相験紙を用いて溶液の pH が約 8 付近であることを確認した。

対値で示した。また、SDS 処理後に水のみを塗布した条件

加えた水酸化ナトリウム水溶液の量から、グリセリン酸ナも並行して行った。

トリウム水溶液の濃度を算出した。プロピオン酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、50 % 乳酸ナトリウム、グリセリン、

2. 4. 細菌株および培養条件

寒天、およびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）は、和光純薬

大腸菌 DH5α 株（タカラバイオ株式会社）は、グリセロー

工業製のものを用いた。大腸菌の培養には、LB培地（Difco）

ルストック溶液から 1 白菌耳 LB 寒天培地に植菌し、37 ℃

を、Propionibacterium acnes の培養には、GAM ブイヨン

で一晩培養し、コロニーを形成させた。1 コロニーを LB 液

「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）を用いた。固体培地の体培地 5 mL を含む試験管に植菌し、37 ℃、200 strokes/

作製には、寒天（和光純薬工業製）を 1.5 wt% となるように

min で振とう培養した。P. acnes NBRC107605 株は、30%加えた。試薬の溶解および培地の調製には、1 次イオン交

スキムミルクで懸濁した培養液の−80 ℃ストック溶液か換水を用いた。液体および固体培地の滅菌は、オートクレ

ら、GAM ブイヨン「ニッスイ」固体培地上に植菌し、嫌気ーブ（121 ℃、20 分）を用い、培地に添加する試薬類の滅菌培養用アクロネパックおよびアクロネパックジャー（三菱は、0.2 µm ポアサイズのフィルターを用いて滅菌したもの

ガス化学）を用いて 37 ℃で培養した。固体培地上に形成さを使用した。生細胞数測定にはCell Count Reagents SF（ナれたコロニーは、継代培養および液体培養で用いた。液体

カライテスク社製）を用いた。

培養は、10 mL のニッスイ培地を含む試験管に 1 コロニーを植菌し、嫌気ジャー中で静置して 37 ℃で培養した。培2. 2. 寒天ゲルを用いた水分保持能の評価

養経過後 2 − 3 日で、試験管の底部に増殖した菌が沈降しグリセリン酸の保湿性評価として、試験薬を含有する寒ていることが観察された後、ピペッティングにより沈殿し天ゲルの重量変化から、重量減少率を指標に評価した。直ている菌を分散させた培養液 100 µL を GAM ブイヨン「ニ径 3 cm のガラスシャーレに、加熱溶解させた 1 wt% の寒ッスイ」固体培地上に播種し、37 ℃、嫌気ジャー内で培養

天水溶液を 2 mL と、等量の試験薬水溶液を 80 ℃に加熱しした。

たホットプレート上で混合し、室温で冷却した。ゲル化
した寒天の重量を測定し、濃硫酸 100 mL を入れて調湿し

2. 5. 細菌に対する増殖阻害効果の評価

た 3 L 容のガラスデシケーターに寒天シャーレを静置した。

グリセリン酸の抗菌性の評価方法として、大腸菌およデシケーターを 25 ℃の恒温槽に入れて 24 時間経過後、寒び P. acnes の増殖阻害効果を、固体培地上に播種した細菌

天の重量差から、下記の式（1）に従い、添加した試験薬のの増殖阻害によりグリセリン酸を染み込ませたろ紙ディス

水分保持能を評価した。

ク周縁にできるハローで評価した。固体培地上に培養液
100 µL を塗り広げ、表面を乾燥させた後、滅菌した桐山

Weight loss（%）=［（Wt=24 ─ Wt=0）/Wt= 0 ］×100（1）

ロート用ろ紙ディスク（φ= 8 mm）に 10 µL の試験薬を滴下し、所定の温度で 1 − 7 日培養した。培養後、ディスク

ここで、Wt=0 は、寒天ゲルの初期重量、Wt=24 は、デシケ

周縁にできたハローの大きさを観察し、コントロールとしーター内で 24 時間静置後の寒天ゲルの重量である。

て用いた滅菌水の場合と比較した。

2. 3. ヒト皮膚再構築モデルを用いたグリセリン酸の皮膚細胞への影響評価

3.

結

果

3. 1. グリセリン酸の水分保持能評価

グリセリン酸の水分保持能評価の一つとして、脱脂さグリセリン酸がグリセリン様の保湿性能を有するかどれた肌における皮膚細胞に対する影響を、ヒト皮膚再構うかを検証するため、0.5 wt% の寒天ゲルから蒸散する水築モデルを用いて評価した。三次元培養皮膚モデル LSE-

分量を抑制する能力での評価を試みた。図 2 には、寒天のhigh（東洋紡）の組織頂上部表面を、森田らの方法に従い、み、グリセリン、グリセリン酸ナトリウム、および乳酸を

5）

1 wt% SDS 水溶液で脱脂した 。SDS を表面から除去洗浄

10 wt% 添加して作製したゲルの 24 時間に損失した重量減

したのち、1 wt% グリセリン酸ナトリウム水溶液を塗布

少量を、初期重量に対して % で表示したものである。寒天− 28 −

保湿性・抗菌性を有するバイオベースの新しいスキンケア素材の開発

図 2 保湿剤を含有する 0.5 wt% 寒天ゲルの重量減少量の評価。
調湿したデシケーター内、24 時間、25℃で静置した寒天ゲルの重量減少を、初期重量に対して相対的に示した。デシケータ
ー内の相対湿度は、57±3%。データは、3 回の平均および
標 準 偏 差を示した。No addition、無 添 加（コントロール）；
GANa、グリセリン酸ナトリウム；LANa, 乳酸ナトリウム。

図 3 グリセリン酸ナトリウムを含有する 0.5 wt% 寒天ゲルの重量減少量の評価。調湿したデシケーター内、24 時間、25℃で静置した寒天ゲルの重量減少を、初期重量に対して相対的に示した。デシケーター内の相対湿度は、
51 ± 3%。データは、3 回の平均および標準偏差を示した。GANa、グリセリン酸ナ
トリウム。

のみの場合、ゲル重量に対して 13.6 wt% の水分が 24 時間で損失されているのに対し、10 wt% のグリセリンを添加した場合は、損失量が約 2.7 wt% 減少することが分かった。
添加しているグリセリンが 10 wt% であることから、減少
した水分量の約 1 割は、添加したグリセリンによって初期の寒天ゲル中の水が減少した分として考慮することができる。そのため、約 1.3 % 程度の水分が、グリセリン添加によってゲル中に保持されたことが示唆された。この条件において、同様にグリセリン酸ナトリウムでの試験を行った。
グリセリン酸を 10 wt% 添加したゲルでは、グリセリンと同様に損失した水分量が 2 wt%、無添加の場合に比べて減

図 4 三次元皮膚培養モデルを用いたグリセリン酸の保水性能の評価。ドデシル硫酸ナトリウム処理したヒト皮膚モデルに 1 wt% グリセリン酸ナトリウム水溶液
を 塗 布 し、24 時 間 後 の 生 細 胞 数 を Cell Count
Reagent SF を用いて評価した。ドデシル硫酸ナトリ
ウム処理していない条件（Control）を 100 % として相対的に示した。データは、3 検体の平均および標準偏差を示した。H2O、水のみ；GANa、1 wt% グリセ
リン酸ナトリウム水溶液。

少していた。また、乳酸を同濃度で添加した場合、最も重量減少が抑制され、無添加に比べて水分の減少量が 3.3
wt% 低下した。
一方で、水分保持効果におけるグリセリン酸ナトリウムの濃度の効果を検討した（図 3）。グリセリン酸ナトリウムの濃度の増加に伴い、水分の減少量が低下している傾向が見られ、5 wt% のグリセリン酸ナトリウムを添加した場
合は、無添加と比べて 2 . 2 wt%、10 wt% 添加では 2 .7 wt%、
水分の減少が抑制された。一方で、同じ炭素数 3 の脂肪酸

おけるグリセリン酸が皮膚細胞に与える影響を 24 時間後であるプロピオン酸ナトリウムを同濃度で添加した場合、の生細胞数により評価した。森田らの方法を参考に、SDS

添加することで 1 wt% 程度の水分減少量の抑制が見られ処理した三次元培養細胞モデルの頂上部表面に 1 wt% グリ

たものの、その効果に濃度依存性は見られなかった（data

セリン酸ナトリウム水溶液を塗布して培養した。その結果、

not shown）。

SDS 処理をしていない条件に比べて、生細胞数は 80 % 以
上減少していることが示唆された（図 4）。しかし、SDS 処

3. 2. 肌荒れ状態の皮膚細胞に対するグリセリン酸の理後に水のみを塗布したものと比較しても生細胞数の違い

影響評価は見られなかったことから、グリセリン酸には脱脂処理さ

上記 3. 1. より、グリセリン酸ナトリウムが水分保持能をれた細胞に対する賦活性は見られないと考えられた。

有していることが示唆された。そこで、グリセリン酸の保湿能をさらに評価するため、ヒトの皮膚構成を再構築した

3. 3. グリセリン酸の抗菌活性評価

三次元皮膚培養モデルを用いて、脱脂された状態の皮膚に− 29 −

グリセリン酸による微生物の増殖阻害効果を評価するたコスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 5 P. acnes の増殖に対するグリセリン酸の効果。
グリセリン酸を含むディスク周囲にできるハローの存在で、増殖抑制の効果を評価した。P. acnes は
GAM 寒天培地上で嫌気ジャー内、37℃、3 日間培養した。GA、グリセリン酸。

図 6 P. acnes の増殖に対する有機酸類の効果。
1 M の各試験薬を含むディスク周囲にできるハローの 存 在で、増 殖抑 制の 効 果を評 価した。P.
acnes は GAM 寒天培地上で嫌気ジャー内、30℃、3 日間培養した。AA、酢酸；PA、プロピオ
ン酸；Gly、グリセリン；LA、乳酸；GA、グリ
セリン酸。

め、初めに、大腸菌 K 株由来である DH5α 株および短鎖の有機酸を用いて、薬剤ディスク周囲にできるハローでの評価を検討した。LB 寒天培地上に一晩振とう培養して増殖した菌液を播き、その上に各試験薬を染み込ませたディスクを置き、培養経過に伴う菌の増殖を観察した。その結果、
水および何も染み込ませかったディスクには、ディスクの見られなかった。

周囲まで菌が増殖していたが、酢酸やプロピオン酸など、

4. 考

増殖阻害効果が知られている有機酸類では、ディスク周囲察に菌が増殖していないハローが見られた（data not shown）。

グリセリン酸は、グリセリンの片末端のヒドロキシ基がそこで、この手法を用いて P. acnes に対するグリセリン酸

酸化された化合物である（図 1）。そのため、グリセリンにの増殖阻害効果の評価を試みた。P. acnes が増殖した培養見られるポリオールとしての性質、および、カルボン酸に液 100µL を播種した GAM 寒天培地上に、グリセリン酸を由来する有機酸としての性質の両方が期待される化合物で所定濃度染み込ませたディスクを静置し、37 ℃で培養した。

ある。グリセリンは、古くから保湿剤として化粧品等で利培養 3 日後では、プレート全面に P. acnes の増殖が認めら用されており、一方で、有機酸は、微生物の増殖を阻害す

れ、コントロールとした滅菌水を染み込ませたディスクる効果から食品等でその効果を発揮している。そのため、の縁まで菌の増殖が認められた（図 5）。一方で、グリセリ

本研究では、グリセリン酸に関する双方の機能について検ン酸濃度 0.1 M のディスクでは、コントロールの場合と同証した。

様に菌が増殖していたが、1.0 M のディスク周辺には、菌保湿剤としての性能は、寒天ゲルに保持されている水分が増殖していない領域が 1 − 2 mm 認められた。また、こ量を比較することで、水分保持能として評価した。その結の領域は、7 日間培養した後でもはっきり残っており、周果、グリセリン酸は、グリセリンや乳酸など化粧品等で保囲に増殖した P. acnes の炭素源として消費される等により、湿剤として用いられている低分子の糖アルコールやヒドロ

グリセリン酸濃度が低下せず、増殖阻害効果を維持していキシ酸と同様に、水分保持能を有していることが明らかにることが示唆された。

なった。また、プロピオン酸の比較実験から、水分保持効

また、グリセリン酸と同じ濃度において、短鎖有機酸類

果においては、ヒドロキシ基の存在が重要であることが分およびグリセリンを用いて比較実験を行った。図 6 に示す

かった。さらに、ヒト皮膚の再構築モデルを用いて、界面ように、グリセリン酸を含む有機酸類（酢酸、プロピオン

活性剤処理により脱脂した皮膚の細胞に対する影響を評価

酸、および乳酸）では、ディスクの周辺に P. acnes が増殖した結果からは、試験した条件下での細胞賦活性は見られしていない領域が数 mm 観測された。一方、グリセリンをず、グリセリン酸に期待される保湿能は検証できなかった。

染み込ませたディスクの周囲には同様のクリアな領域が観一方、微生物の増殖阻害効果は、ニキビの原因菌である

察されず、コントロールとした滅菌水のディスクと同様に

P. acnes を用いて、その効果を検証した。グリセリン酸は、

P. acnes が周囲まで増殖していた。また、類似の構造の有対照として用いた短鎖の有機酸類と同様に、P. acnes の増機酸類の場合でもハローが認められ、P. acnes の増殖を阻殖を阻害できることが分かった。また、この効果は同濃度害することが分かった。一方、グリセリン酸のナトリウムのグリセリンには見られず、グリセリンとは異なる性質を塩では、同濃度での試験において、P. acnes の増殖阻害は有していることが確認された。また、ナトリウム塩では同− 30 −

保湿性・抗菌性を有するバイオベースの新しいスキンケア素材の開発

様の増殖阻害が見られなかったことから、グリセリン酸は

2） Kang MS, Oh JS, Lee SW, Lim HS, Choi NK, Kim

培地中の pH を低下させることで、抗菌性を発揮している

SM,: Effect of Lactobacillus reuteri on the proliferation of

ものと推測された。

Propionibacterium acnes and Staphylococcus epidermidis,
J. Microbiol., 50, 137-142, 2012.

以上から、グリセリン酸は、保湿性と有機酸に認められる抗菌性を兼ね備えたバイオベース素材であることが明ら

3） Habe H, Fukuoka T, Kitamoto D, Sakaki K,:

かになった。今後は、グリセリン酸の保湿性および抗菌性

Biotechnological production of D-glyceric acid and itsの定量的な評価によって、スキンケアに有効なバイオベー

application, Appl. Microbiol. Biotechnol., 8 4, 4 4 5-4 5 2,

ス素材であることを実証するとともに、種々の皮膚細胞に2009.

対する賦活性等、新たな機能が見いだされることによって、

4） Habe H, Shimada Y, Yakushi T, Hattori H, Ano

多機能なスキンケア素材としてのグリセリン酸の応用展開

Y, Fukuoka T, Kitamoto D, Itagaki M, Watanabe K,が期待される。

Yanagishita H, Matsushita K, Sakaki K,: Microbial
production of glyceric acid, an organic acid that can

謝辞

be mass produced from glycerol, Appl. Environ.

本研究の遂行にあたり、公益財団法人コスメトロジー研
究振興財団によりご援助いただきましたことに深謝いたし

Microbiol., 75, 7760-7766, 2009.
5） Morita T, Kitagawa M, Suzuki M, Yamamoto

ます。

S, Sogabe A, Yanagidani S, Imura T, Fukuoka
T, Kitamoto D,: A yeast glycolipid biosurfactant,（参考文献）

mannosylerythritol lipid, shows potential moisturizing

1） Gribbon EM, Cunliffe WJ, Holland KT,: Interaction

activity toward cultured human skin cells: theof Propionibacterium acnes with skin lipids in vitro, J.

recovery effect of MEL-A on the SDS-damaged

Gen. Microbiol., 139, 1745-1751, 1993.

human skin cells, J. Oleo Sci., 58, 639-642, 2009.

− 31 −

ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの比較
国立研究開発法人 海洋研究開発機構 海洋生命理工学研究開発センター

出口

茂、木 下

圭剛

Dodecane-in-water nanoemulsions were prepared by a conventional top-down process and a bottom-up MAGIQ in thepresence of four different types of nonionic surfactants. A good correlation was found between the final droplet size anddynamic surface tension, suggesting that adsorption dynamics of surfactants to oil/water interfaces is critical in determining
droplet size in MAGIQ.

１．緒

例えば水と 2, 6 - ルチジンの混合物は 34.1 ℃に下限臨界

言

溶解温度（LCST）を有し、LCST 以下の温度では均一混合、本来、互いに混ざり合わない水と油を乳化物として混合

LCST 以上の温度では二相分離する。水／ルチジンの均一し取り扱う技術は、化粧品開発・製造のみならず、食品、溶液を LCST 以上に加熱すると、相分離によってルチジン

インク、医薬品、化学工学など広範な産業分野で利用され（組成によっては水）の液滴が生成するが、その際に乳化剤ている大変重要な基盤技術である。最近では油滴サイズをを添加しておくと、エマルションが生成されることが報告

20 ～ 200 nm 程度にまで超微細したナノエマルションがされている 1）。しかしながら同様の温度に依存した相挙動

注目を集めている。油滴サイズのナノ化に伴って、通常のを示す系は極めて限られており、例えば水と炭化水素の混

エマルションには見られない様々な新特性が現れるためで合物など、一般的に乳化の対象とされる実験系には適用である。例えば通常のエマルションは牛乳のように白濁してきない。

いるのに対し、ナノエマルションは透明あるいは半透明で筆者の所属する国立研究開発法人海洋研究開発機構は、ある。また油滴サイズの小ささを活かして、肌への浸透性

有人調査潜水船「しんかい 6500」（図 2）に代表される深海を高めた機能性化粧品、ドラッグデリバリーシステムでの調査ファシリティーを運用して、主として海底資源、気薬物キャリア、ナノ材料合成のためのリアクターなど、エ候、地震、ならびに生物に関する研究を行っている。地球

マルションの新たな用途も生まれようとしている。

上の水の 97% は、地球表面の約 70 ％を占める海洋に存在

通常の乳化は「トップダウン」プロセスであり、水／油／
乳化剤の混合物に、撹拌や超音波照射などによって外部からエネルギーを加え、粗大油滴を繰り返し引きちぎって微小油滴を生成する（図 1 ）。この際、外部から加えたエネル
ギーが油滴内部と外部の圧力差（ラプラス圧と呼ばれる）に勝ったときに油滴の微細化が進行する。ところが、ラプラス
圧は油滴サイズに反比例するため、サイズの低下とともに油滴の更なる微細化は困難となっていく。一方、ナノサイズの固体粒子（ナノ粒子）の製造では、粒子を構成する原子あるいは分子の自己組織化を利用してボトムアップで合成するのが一般的である。ナノサイズの液滴の調製でも、当然

図1

トップダウン（上）とボトムアップ（下）による微細油滴の生成

ボトムアップの方が好ましいと考えられる。しかしながら、そのためには本来混ざり合わない水と油が分子レベルで混合した均一溶液が必要となるというジレンマがある（図１）。
*
Comparison of Top-down and Bottomup Process for Preparing Nanoemulsions
Shigeru Deguchi *, Keigo Kinoshita
R&D Center for Marine Biosciences,
Japan Agency for Marine-Earth Scienceand Technology− 32 −

図2

有人調査潜水船「しんかい 6500」

ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの比較する。海洋の全球平均深度は 3,800 メートルであり、その物質の極性の指標となる比誘電率を例にとると、常温・常内水深 200 メートル以深が深海と呼ばれる。水深 10 メー

圧での水の比誘電率は 80 前後と液体としては極めて高い

トルごとに水圧は 0.1 MPa（1 気圧が 0.1 MPa に相当）ずつ

値を示すが、超臨界状態では 2 と炭化水素と同じ値にまで上昇するため、世界最深部（マリアナ海溝、チャレンジャ

減少する 4）。そのため超臨界状態の水は様々な油を分子レ

ー海淵、水深約 11,000 メートル）での水圧は約 110 MPa にベルで溶解することができる 5）。MAGIQ（Monodisperse

達する。また太陽光は水深 200 メートルまでしか届かない

nAnodroplet Generation In Quenched hydrothermal

ため、深海は常に暗黒の世界で、水温も 2− 4 ℃に保たれ

solution）と呼ばれる我々が確立した乳化手法は、油と超臨ている。ところが深海には例外的に超高温環境も存在する。

界水の均一溶液を調製した後、室温まで 200 ℃／秒を超え

熱水噴出孔と呼ばれる、深海底から湧き出す温泉である（図る速度で冷却して急激に相分離を誘起することによって、

3）。地上と比べて深海底は熱源である地下のマグマ溜り

油分子を自己集合させて微細油滴を生成する（図 4）。独自に近いため、熱水噴出孔から吹き出す水の温度は極めて高に開発した流通型の装置を用いて１体積パーセントのドデい。2008 年に大西洋中央海嶺で発見された熱水噴出孔では、カンを水に乳化した実験では、10 秒以内という極めて短臨界点（臨界温度：374 ℃、臨界圧力：22.1 MPa）を超えた

い時間で平均直径 61 nm のサイズの揃った油滴を分散した

2）

ナノエマルションを生成できた 3）。また超高温での加熱時

超臨界状態の水が噴出している 。
我々は高温・高圧の極限である超臨界水の性質に着目し、従来法とは根本的に異なる原理に基づく「ボトムアッ間を数秒に抑えたことで、ドデカンの熱分解も 1 % 以下に抑えられていた 3）。

プ」のナノ乳化手法を確立した 3）。超臨界水は我々が良く

本申請課題では、同一組成の試料を用いて高圧乳化と知る常温・常圧の水とは著しく異なる特性を示す。例えばMAGIQ の 2 つの異なる手法で乳化を行い、得られたエマ
ルションの油滴サイズや分布を比較検討することで、ナノエマルション調製におけるトップダウン手法とボトムアップ手法との違いの明確化、さらにはボトムアップでのナノ
油滴生成メカニズムを解明することを目的として研究を行
った。

２．実

験

ドデカン／水系をモデルとして、従来のトップダウン手
法とボトムアップの MAGIQ の 2 つの異なる方法でエマルションを調製し、得られた油滴のサイズと分布を比較・検討した。乳化剤には Brij 97（polyoxyethylene（10）oleyl

図 3 南部マリアナトラフ・うらしま熱水 域（水深2935 メートル）で発見された熱水噴出孔。勢いよく噴き出す黒色の熱水の最高温度は 270℃

ether）、Brij 9 8（polyoxyethylene（2 0）oleyl ether）、Tween 20（polyoxyethylene（20）sorbitan monolaurate）、
Tween 8 0（polyoxyethylene（2 0）sorbitan monooleate）の 4 種の非イオン性界面活性剤を用いた。
トップダウンの乳化には、予め撹拌機（Heidolph 社製
RZR 2051、半月型撹拌翼を装着）を用い、500 rpm で 3 分間処理したプレエマルションを高圧ホモジナイザー（GEA
Niro Soavi 社製 Panda PLUS 2000）を用い、25 MPa の圧力条件で 20 パスの処理を行った。MAGIQ による乳化は、
図 5 に示す流通型の装置を用いて、25 MPa の一定圧力下で行った。予熱コイルによって加熱した水にドデカンを注入した後、404 〜 440 ℃に保たれた混合管の内部で約 4.5
秒間加熱することによって均一溶液を得た。その後、乳化剤の冷水溶液と混合するとともに冷却コイルも併用して溶液を急冷し、相分離を誘起してナノ油滴を生成した。
油 滴 サ イ ズ の 測 定 は 動 的 光 散 乱 法（ 大 塚 電 子 ㈱ 製

図 4 MAGIQ のコンセプトを示す高温・高圧顕 微 鏡 像。250
気圧でドデカン／水混合物を観察

FPAR-1000）を用いて 25 ℃で行った。また動的表面張力
測定は、九州大学 瀧上研究室にて懸滴法を用いて行った。

− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図5

MAGIQ によるナノエマルション調製のための流通型装置

得られた結果を Filippov らの理論

図 6 高圧ホモジナイザーを用いて調製したナノエマルション中の油滴サイズ

5）を用いて解析し、吸着の緩和時間を求めた。

３．結剤の種類に強く依存した（図 7）。乳化剤として Brij 97 と果

Tween 80 を用いた場合には、得られた油滴の最小サイズ

3. 1. 高圧ホモジナイザーによるトップダウンのナノエ
マルション調製は、高圧ホモジナイザーを用いた場合よりも小さかった。

高圧ホモジナイザーを用いて、界面活性剤の濃度を様々ーで得られた最小の油滴直径は 100 nm であったのに対し、に変えながら 1 体積 % のドデカンを乳化した結果を図 6 に

MAGIQ では直径 61 nm の油滴が得られた。乳化剤として示す。

Brij 98 を用いた場合には、得られた油滴の最小サイズは

例えば 5 mM の Brij97 を用いた場合、高圧ホモジナイザ

1 mM 以下の低濃度の界面活性剤濃度の添加時には、油調製方法によらず同じであった。一方、乳化剤に Tween

滴サイズは活性剤濃度の増加とともに急激に低下した。界20 を用いた場合には、MAGIQ で得られた油滴のサイズ

面活性剤濃度とともに水／ドデカン界面の界面張力が低下

は高圧ホモジナイザーを使った時よりも大きかった。

しラプラス圧が減少した結果、油滴の微細化が促進されたものと考えられる。ところが界面活性剤濃度が 1 mM 以上

3. 3. 動的表面張力と油滴のサイズになると、得られた油滴のサイズは 120 nm 前後と一定のボトムアップの MAGIQ で得られた結果（図 7）を詳細に値となり、界面活性剤濃度にはあまり依存しなかった。ま検討したところ、油滴サイズと界面活性剤の Hydrophilic-

た界面活性剤の種類は、いずれの界面活性剤濃度範囲におLipophilic Balance（HLB）との間に良好な相関を見出しいても生成する油滴のサイズに大きくは影響しなかった。

た（図 8）。より具体的には乳化剤に用いた界面活性剤の緒言にも述べたように、トップダウンの乳化で油滴の微HLB が小さいほど油滴サイズも小さくなることがわかっ細化を進めるためには、油滴内外の圧力差（ラプラス圧）にた。HLB は、乳化の際に適切な界面活性剤を選定する指打ち勝つだけのエネルギーを外部から投入する必要がある。

標として広く用いられている。疎水性の高い界面活性剤ほラプラス圧は油滴サイズに反比例するため、油滴サイズがど小さな HLB を有することから、乳化剤として用いた界小さくなるにつれて困難となる。図６の結果は、油滴サイ

面活性剤の疎水性が高いほど、小さな油滴が得られることズが 120 nm 前後にまで低下すると、高圧ホモジナイザー

を定性的に示す結果である。

で投入されるエネルギーに対してラプラス圧が大きくなり

しかしながら HLB の科学的な意味は明確ではない。そすぎ、それ以上の油滴の微細化が進行しないことを示して

こで MAGIQ における油滴生成メカニズムに関する知見をいる。換言すると、トップダウンでのナノエマルションの得るために、動的表面張力に着目した。動的表面張力は、生成では、投入するエネルギーの大きさが最終的な油滴サ

界面活性剤溶液中で新しく形成された油／水界面に、界面イズを決定する一義的な要因となっていると解釈できる。

活性剤が吸着することによって起こる界面張力の低下を経時的に測定して得られるものであり、界面活性剤分子の濃3. 2. MAGIQ によるボトムアップのナノエマルション
調製

度、拡散係数、疎水性／親水性のバランス、ミセル中での高圧ホモジナイザーを用いた場合とは全く異なり、の界面活性剤分子の吸着ダイナミクスを評価する指標とし

MAGIQ によって調製した油滴のサイズは用いた界面活性

滞在時間など、様々な複合的要因を総合的に含めて界面へて利用できる。

− 34 −

ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの比較

図 7 異なる界面活性剤を使用してトップダウン（○）とボトムアップ（●）で調製したナノエマルション
中のドデカン油滴のサイズ

図 8 界面活性剤の HLB と MAGIQ で調製した油滴サイズとの相関

図 9 動的界面張力と MAGIQ で調製した油滴サイ
ズとの相関実験に用いた界面活性剤の水／ドデカン界面での動的表

４．考

面張力測定を行い、吸着の緩和時間を求めた後、MAGIQ

察で得られた油滴のサイズと比較したところ、吸着の緩和時

トップダウンの乳化では、最終的に得られる油滴のサイ間が短いほど、すなわち水／ドデカン界面への吸着が速い

ズは、外部から加えるエネルギーと水／油の界面張力で決界面活性剤を用いたときほど、生成される油滴のサイズが定される。一方、油分子の自己組織化によってボトムアッ7）小さくなることがわかった（図 9） 。

プで油滴を生成する MAGIQ では、得られる油滴のサイズ− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016を決定する因子は大きく異なると予想される。またトッである。MAGIQ は、この他にも 1）乳化に要する時間が短

プダウンの乳化では、乳化剤には 1）水／油界面に吸着しい、2）流通型の装置を使用するためスケールアップが容易、て界面張力を低下させる、2）生成した油滴を安定化する、

3）乳化剤選択の幅が広いなどの特長も有する。その一方の２つの役割があるのに対し、MAGIQ での油滴生成は相で、MAGIQ による乳化機構、中でも最も重要な油滴生成

分離によって進行するため、乳化剤の機能は油滴の安定化

メカニズムに関する基礎的知見はほとんど得られていなかのみとなる。図 6 と図 7 の結果は、2 つの異なる乳化手法

った。
今回の研究によって、油と水の均一溶液の相分離時によでの油滴生成メカニズムや乳化剤の役割の違いを反映したって 1 次油滴が生成した後、合一による油滴の成長と界面ものと考えられる。
MAGIQ によるボトムアップの油滴生成を説明する最も活性剤分子による油滴の安定化という２つのプロセスが同単純なメカニズムは、油／水均一溶液を急冷した際に「相時進行して、最終的に安定なナノ油滴が生成されるという分離によって微細油滴が生成され、その表面に界面活性剤

メカニズムを強く支持する結果を得ることができた。さらが吸着することで安定化される」というものである。これに２つのプロセスの内、後者が油滴サイズを決定する支配に従えば、MAGIQ で生成される油滴のサイズは添加する的要因であることもわかった。そのため MAGIQ では、従界面活性剤の濃度や種類には依存しないはずである。とこ

来のトップダウンの乳化では考慮されてこなかった動的表

ろが図７に示した 1 体積 % のドデカンを MAGIQ によって

面張力、すなわち界面活性剤の水／油界面への吸着速度が、水に乳化した実験では、油滴サイズは活性剤の濃度や種類生成される油滴のサイズを決定する上で大きな役割を果たに大きく依存した。そこで我々は、現在、ドデカンと水のしていることが明らかとなった。今後、MAGIQ を用いた均一溶液を急冷して相分離を誘起した際に、スピノーダル

様々な研究開発を行う際に、乳化剤選定の指針となりうる

分解によって 1 次油滴が生成した後、重要な知見である。
MAGIQ での乳化に用いる乳化剤の選定では、調製した

1）１次油滴の合一による油滴の成長
2）表面へ吸着した界面活性剤分子による油滴の安定化

エマルションの保存安定性への取り組みも必要である。例の 2 つのプロセスが同時進行し、最終的に安定なナノ油滴

えば、5 mM の Brij 97 を、直径 61 nm のドデカン滴を含が生成されるという新たなメカニズムを考えている。このむナノエマルションを調製できるが、得られたエマルショ

メカニズムに従えば、最終的な油滴のサイズは 2 つのプロ

ンの保存安定性は十分に高いというわけではなく、室温でセスのダイナミクスのバランスで決定される。

１週間程度放置すると、オストワルド熟成によって油滴サ

本研究によって、図 9 に示したように、油／水界面へのイズが 200 nm 前後にまで増加する。今後は、油滴の微細界面活性剤の吸着速度が MAGIQ によって生成される油滴化と保存安定性の向上を両立できる乳化剤の検討も進めてのサイズを支配していることが明らかとなった。さらに合いく予定である。

一による油滴の成長速度は乳化する油の量に依存するとエマルションは熱力学的に不安定な系であるため、生成考えられるが、エマルション中の油の量が一定であって経路によって生成物が大きく異なる。極端な場合には、油も界面活性剤の濃度や種類によって生成されるナノ油滴に水を加えた場合と、水に油を加えた場合でも、生成すのサイズが大きく変化した図 7 の結果をも考慮すると、水るエマルションが異なる。これが「乳化はサイエンスでは／油界面への界面活性剤分子の吸着ダイナミクスこそが、なくアートである」と言われる所以である。従来プロセス

MAGIQ によって生成される油滴のサイズを決定する支配とは根本的に異なる原理で乳化を行う MAGIQ は、化粧品的要因だと推察される 7）。

の製造はもちろんのこと、ナノ乳化を必要とする様々な産

５．総業分野で利用されることが期待されるが、高温・高圧の括

超臨界水を取り扱うための特殊な機器を必要とすること

油／界面活性剤／水の相挙動を利用した転相乳化などのが技術の普及に向けた大きなボトルネックであった。そこ

乳化など、ナノエマルションの調製に向けた様々な手法

で我々は、高温・高圧機器の専業メーカーである株式会が確立されてきた。しかしながら従来の手法は系の組成

社 AKICO と共同で、高温・高圧機器の取り扱いに関するに強く依存するなど、汎用性には乏しい。一方、超臨界

特別な専門知識がなくても MAGIQ を安全に利用できるナ

水はメタンからイコサンまでの直鎖炭化水素、スクアラ

ノエマルション製造装置の開発を進めている。2016 年 3ンに代表される分岐炭化水素など多様な油を溶解するた

月に販売開始を予定している装置は、サイズも 1300W ×

め、MAGIQ は高い汎用性を有すると期待される。さらに750D × 1600H（mm）と、家庭用冷蔵庫１台半ほどの大は酸素、水素、窒素などの無極性ガスも超臨界水には自由

きさに収まっている。これを契機として MAGIQ の普及がに相溶することから、ナノバブル製造などへの応用も可能

進むと期待している。

− 36 −

ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの比較（引用文献）

fascinating medium for soft matter, Soft Matter, 3,797–803, 2007.

1） Herzig E M, White K A, Schofield A B, Poon W C K,
Clegg P S, : Bicontinuous emulsions stabilized solely by5） Brunner E, : Fluid mixtures at high pressures
IX. Phase separation and critical phenomena in 2 3

colloidal particles, Nature Mater., 6, 966–971, 2007.

(n-alkane + water) mixtures, J. Chem. Thermodyn., 22,2） Koschinsky A, Garbe-Schönberg D, Sander S,

335–353, 1990.

Schmidt K, Gennerich H-H, Strauss H, : Hydrothermal
venting at pressure-temperature conditions above

6） Filippov L K, Filippova N L, : Dynamic surface

the critical point of seawater, 5° S on the Mid-Atlantic

tension and adsorption kinetics from micellar solutions

Ridge, Geology, 36, 615–618, 2008.

on planar surfaces, J. Colloid Interface Sci., 1 8 7, 3 0 4–
312, 1997.

3） Deguchi S, Ifuku N, : Bottom-up formation of
dodecane-in-water nanoemulsions from hydrothermal7） Kinoshita K, Ishiwata D, Kondo Y, Takiue T,homogeneous solutions, Angew. Chem. Int. Ed., 5 2,

Deguchi S, : Importance of Adsorption Dynamics of6409–6412, 2013.

Surfactants in Bottom-up Formation of Dodecane-in-4） Deguchi S, Tsujii K, : Supercritical water: A− 37 −

Water Nanoemulsions by MAGIQ, in preparation.

コスメトロジー素材に向けてのアロエC-グリコシルクロモン類の高機能化
神戸大学大学院理学研究科

林昌彦

Isolation and determination of structure of acacetin-7-O-β-D-galactopyranoside, a natural flavonoid isolated from flower
heads of Chrysanthemum morifolium, has been reported in 1994. We achieved the total synthesis of compound acacetin7-O-β-D-galactopyranoside by employing a one-pot synthesis of the aglycon. The key reactions in this approach include
the modified Baker-Venkataraman reaction and regio- and stereoselective O-glycosylation. Furthermore, we synthesized
3-feruloyl-γ-quinide and examined the glycosidation using 1-fluoro sugar.

1．緒言

フラボノイド類は自然界、特に植物界に多く存在し、現在 7000 種を超える報告がある。フラボノイドの基本骨格は図 1 のように示される 1）。
フラボノイドの中には糖と結合した配糖体の形で存在するものも多く、O -グリコシドあるいは C- グリコシドの形で存在する。O -グリコシドの代表として、グアイヤペリン、
チュリパニン、アピゲニン 4’ - グリコシドおよびアカセチ
ン -7-β-D- ガラクトピラノシドの構造を図 2 に示す。
一方、C-グリコシドには、ビテキシン、イソビテキシン、
オリエンチン、マンギフェリンなどが知られている（図 3）。
一般にフラボノイドのようなポリフェノール類は抗酸化作用がある。さらに配糖化することによって非糖化合物単体に比べ生体への吸収効率が高く、生理活性が高くなる。
さらに、単体の糖、あるいは非糖化合物にはない生理活性を獲得できる可能性もある。そこで、本研究では、コスメ
トロジー素材に向けてフラボノイドの配糖化研究を行った。

図1

図2

代表的なフラボノイド O- グリコシドの構造

図3

代表的なフラボノイド C- グリコシドの構造

フラボノイドの基本骨格

High performance of alone C-glycosyl
chromone towards cosmetology
Masahiko Hayashi
Graduate School of Science, Kobe University− 38 −

コスメトロジー素材に向けてのアロエ C －グリコシルクロモン類の高機能化

2．実

種々のルイス酸触媒を用いて配糖化を検討した結果、表験2、エントリー 4 に示したように、グリコシル供与体とまず、代表的なフラボノイド O- グリコシドとしてアカして β -ガラクトピラノシドを用い、塩化メチレン中、ル

セチン -7-β-D- ガラクトピラノシドの合成を行い、次に、イス酸として三フッ化ホウ素を用いた場合に、収率 78%、

これまでに配糖化の報告例のない 3 -フェルロイル - γ - キ

α/β = 3：97 で目的とする配糖化生成物が得られた。最後に、ニドの合成および、そのモデル化合物の配糖化実験を行っアセチル基を脱保護し、アカセチン -7-β-D- ガラクトピラ

た。

ノシド（図 4）の合成を完了した（式 3 および表 2）。
天然から得られたもの（文献 5）と今回合成した化合物の3．結果および考察

物性値を表 3 にまとめる。天然からでは未報告の物性も今

3. 1. アカセチン -7-β- D -ガラクトピラノシドの合成

回の合成品で明らかにできた。

アグリコン部分は改良型 Baker-Venkataraman 転位反3. 2. 3-フェルロイル -γ- キニドの合成

応 2, 3）を用いて式 1 の方法で合成した。
次に、配糖化の際に、グリコシル供与体として用いる

Hofmann らの方法 6） を参考に、適宜改良を加えながら、

1- フルオロ糖は HF- ピリジンあるいは DAST を用いて調スキーム1の方法で、3-フェルロイル- γ -キニドを合成した。

4）

製した（式 2 および表 1） 。

式1Table 1

Fluorination of O-pentaacetylated-α- D -galactopyranoside

式2

式3

Table 2Glycosidation using lewis acid catalyst

図4− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Table 3 Comparison between the spectral data of acacetin-7-O-β- D -galactopyranosideobtained from natural sources and synthetic acacetin-7-O-β- D -galactopyranoside.

Scheme 1− 40 −

コスメトロジー素材に向けてのアロエ C －グリコシルクロモン類の高機能化

3. 3. 3-フェルロイル -γ- キニドのモデル化合物の配糖化実験は次のように説明できる。ルイス酸である三フッ化ホウ素

3-フェルロイル-γ -キニドの配糖化（グリコシル化反応）

が 1- フルオロ糖を活性化し、生じたオキソカルベニウム

ここで、O - グリコシドと C- グリコシドが得られた理由を行うにあたり、下に示すスキーム 2 からアグリコンとしイオンに対してフェノールのヒドロキシ基が求核攻撃をし、て o- メトキシフェノールをモデル化合物としてグリコシ

まず、O - グリコシドが生成する。三フッ化ホウ素はこのル化反応の検討を行った。

フェノキシドも活性化し、アノメリック炭素（Ｃ）とフェノ

その結果、O - グリコシドと C- グリコシドが 5：4 の比

キシドの酸素（O）結合を切断し、オルト位のベンゼン環上率で合計収率 90% で得られた。O- グリコシド、C- グリコの炭素が求核攻撃をすることによって、C- グリコシドがシドいずれも α 体のみが得られた。

生成する（スキーム 3）。

Scheme 2

式4Scheme 3− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

4．総

（引用文献）

括１）武田幸作、齋藤規夫、岩科司 ,: 植物色素フラボノイド ,文一総合出版 , 2013.

本研究によりフラボノイド配糖体のうち O- グリコシドの一つアカセチン -7-β-D- ガラクトピラノシドの立体選択

２）Baker, W. J. Chem. Soc., 1381–1389 (1933).

的全合成を達成した。さらに、3- フェルロイル-γ - キニド３）Mahal, H. S.; Venkataraman, K. J. Chem. Soc., 1767–
1771 (1934).

の合成およびそのモデル化合物の配糖化実験を行った。今後、身体および環境にやさしいこれらのフラボノイド配糖４）Hashimoto, S.; Hayashi, M.; Noyori, R. Tetrahedron
Lett., 25, 1379–1383 (1984).

体がコスメトロジー素材として利用されることを期待して

５）Hu, C.- Q.; Chen, K.; Shi, Q.; Kilkuskie, R. E.; Cheng,いる。

Y.-C; Lee, K.-H. J. Nat. Prod., 57, 42–51 (1994).
謝辞６）Frank, O.; Zehentbauer, G.; Hofmann, T.; Eur. Food

本研究は公益財団法人コスメトロジー研究振興財団のご援助により遂行することができました。深く感謝申し上げます。

− 42 −

Res. Technol. 222, 492–508 (2006).

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発
東京工業大学大学院理工学研究科

平田修造

We show that hydroxyl steroidal matrices embedding properly designed aromatic molecules as acceptors andtransition-metal complexes as donors exhibit high RSA on exposure to weak incoherent light at room temperature and in
air. Accumulation by photosensitization of long-lived room-temperature triplet excitons in acceptors with a large triplet–
triplet absorption coefficient allows a nonlinear increase in absorbance also under low-power irradiation conditions. As
a consequence, continuous exposure to weak light significantly decreases the transmittance of thin films fabricated withthese compounds. These optical limiting properties may be used to protect eyes and light sensors from exposure to intenseradiation generated by incoherent sources and for other light-absorption applications that have not been realized withconventional RSA materials.

１．緒

このホストゲスト材料では、ゲストに対しての励起光の照言

射強度を強めていくと、ゲストの T1 の寿命が長いために、

非線形吸収現象とは、材料に入射する光の強度が変化すゲストの T1 が材料中に蓄積されていくと考えられる。もると材料の吸収効率が変化する現象のことを指す 1）。これ

しこのゲストの T1 状態が基底状態よりも大きな吸光係数までにカーボンブラック

2 , 3）、フラーレン

4 , 5）、金 属フタロ

シアニン 6-8）、カーボンナノチューブ 9 -1 3）、金 属ポルフィリ
14-16）

17, 18）を示せば、照射強度の増加とともに吸収効率が増加すると考えられる。

19 -2 2）、金属

本課題では室内のような弱い白色光下で薄い着色状態を

28-33）

示し、日差しの強い太陽光下（10 mW/cm2）では瞬時にそなどで大きな非線形吸収特性を示す分子や材料が報告されの色が濃くなり、再び弱い白色光に戻った際に数秒で薄いてきた。しかし、従来このような非線形吸収現象は大型で色の状態に戻る素材の開発を目的とした。

ン、共 役系高分 子

ナノワイヤー

2 3）、半導 体ナノ粒子、白金ビスアセチリド

24-27）、グラフェン

高額なレーザーからの強いパルス光によってのみ瞬間的に２．実生じる現象であった 27）。それゆえ、このような材料の用

験

広く使われてこなかった。もし太陽光や発光ダイオードの2. 1. 非コヒーレント光照射下での励起子の蓄積を確認するための実験

ような弱い非コヒーレントな連続光からの光照射で大きな

まずヒドロキシステロイドに芳香族ゲストをドープした

非線形吸収現象が生じる材料が開発されれば、そのような材料に関して、ゲストが吸収する波長の弱い光を照射した材料は一般消費者が広くその機能を扱うことができるよう場合に、ゲストの三重項励起子が蓄積されるのかを確認すになる。例えば、太陽光などの白色光の照射強度が増加するために以下の実験を行った。

途は一部の研究室の光学的用途に限定され、一般消費者にると、吸収効率が上昇するような材料が構築できれば、室図 1 に用いた芳香族ゲストおよびヒドロキシステロイド

内では発色が目立たないが、外の日差しが強い環境では色の構造を示す。本実験では 0.3 wt% の芳香族ゲストをヒドが濃くなるような材料の構築となる。このような材料は新

ロキシステロイドの 1 つである β-estradiol にドープした

しい色剤としての可能性を秘めている。

ホストゲスト材料を作成した。具体的には図 1 に示す構造

我々はこれまでの研究でヒドロキシステロイドに軽原素のみからなる平面性芳香族化合物をゲストとしてドープす
ると、ゲストの励起三重項状態（T1）の寿命が通常の 1000の芳香族ゲストを 200 ℃で融解した β-estradiol に入れ、溶

（a）

（b）

倍以上の 1 秒以上にまで増加することを見出している 34, 35）。

Large nonlinear absorption under weakcontinuous incoherent light
Shuzo Hirata
Department of Organic and Polymeric
Materials, Tokyo Institute of Technology

図1− 43 −

三重項励起子の蓄積の確認のために用いた材料の構造式（a）ゲスト分子 （b）
ホスト分子

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

解させた後、その融液をガラス基板上に滴下し、もう一枚のガラス基板と挟みこみ、その後室温まで急冷することで、（a）

2 枚のガラス基板の間に非晶状態のホストゲスト材料の薄膜が挟まれた状態の試料を得た。図 1 の G1 をゲストとして用いたサンプルをサンプル A、G2 をゲストとして用いたサンプルをサンプル B とする。
次に、図 2 に示す測定系を用いてサンプル A もしくはサンプル B に励起光を照射する時（図 2（a））と照射しない時（図 2（b））の可視光境域の透過率を測定した。この際励起（b）

光の照射パワーを変化させ、それぞれに対して試料の可視域の透過率を測定した。

2. 2. 非線形吸収特性を確認するための実験
非線形吸収機能を構築するために、図 3（a）に示すよ
うにドナー（D）とアクセプター（A）をゲストとして
β-estradiol にドープした材料を提案した。その材料中に用いた化合物の構造を示す。本実験では 1 wt% の D と 5 wt%の A をヒドロキシステロイドの 1 つである β-estradiol に

図 2 三重項励起子の蓄積の確認のために用いた評価光学系の模式図 （a）励起光を照射しない時 （b）励起光を照射した時

（a）

（b）

図3

用いた材料の概要（a）および D と A の化学構造（b）− 44 −

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発

ドープしたホストゲスト材料を作成した。具体的には図し、半導体レーザーからの 405 nm の光をその薄膜に照射

3（b）に示す構造の D と A をそれぞれ 200 ℃で融解したし、その強度を ND フィルターで増加させながら薄膜の透β-estradiol に入れ、溶解させた後、室温まで急冷すること

過率を測定した。またその際の吸収スペクトルの変化を重で、非晶状態のホストゲスト材料の粉末を得た。

水素キセノンランプと CCD により測定した。

次に図 4（a）に示す測定システムを構築し、上記ホスト

３．結

ゲスト材料の粉末を積分球に入れて、拡散反射法により吸果

紫外線をロングパスフィルターでカットし、白色光のみを

3. 1. 弱い光照射下のβ-estradiol 中の単一の芳香族ゲストの三重項励起子の蓄積の確認

積分球中の材料粉末に絞って照射し、材料粉末から反射さ

図 5 には図 1 中の G1 および G2 の β-estradiol 中での吸れた光を積分球で拡散させて検出器である CCD に入れて収スペクトルおよび三重項励起子の吸収スペクトルを示す。

検出した。次に、材料を入れずに同様の測定を行いベーG1 および G2 は 405 nm の光を吸収する。吸収した後最低光度を測定した。まずキセノンランプからの光に含まれるスとなる反射光を測定した。この 2 つの差を考えることで、励起一重項状態（S1）から最低励起三重項状態（T1）への項間

材料の吸光度を算出した。

交差を経て三重項励起子が形成されると、可視域全体に吸次に上記材料の薄膜を 2 枚のガラス基板中で挟み込ん収が生まれる。
図 6 の上段は 405 nm の光を 1 W/cm2 の光強度でサンだ素子を作製した。その薄膜を図 4（b）の光学系にセット

（a）

（b）

図 5 サンプル A および B 中の G1 および G2 の吸収スペクト
ル（上段）
および三重項励起子の吸収スペクトル（下段）

図 4 拡散反射法による材料の吸収評価法の測定系（a）と材料
薄膜の透過率の照射光強度依存性の評価系（b）

図 6 サンプルA および B に対して 405 nm の光を照射する前後における透過率（上段）
および吸光度（下段）の波長依存性− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

プル A もしくは B へ照射した時のサンプル A および B の透非共役系の剛直なホスト中に平面性芳香族をドープすると過率の変化である。405 nm の励起光の照射により可視域

1W/cm2 以下の弱い光でも十分三重項励起子を蓄積させの透過率が大きく減少した。図 6 の下段は上段の透過率変ることが可能であることが確認された。

化からランバートベールの法則に基づいて吸光度を算出した場合の結果である。図 6 の下段の吸収スペクトルの形状
は、図 5 の三重項励起子の吸収スペクトルの形状と類似す

3. 2. ドナー分子とアクセプター分子からなる材料における非線形吸収機能の確認

るため、405 nm の光照射とともにサンプル A もしくはサ

図 8 は、1 wt% の D1 を D として、5 wt% の A1 を A として、

ンプル B に三重項励起子が蓄積され、その三重項励起子がβ-estradiol ホストに分散させた材料（材料 1）の粉末の吸光

可視域に新しい吸収を示していると考えられる。

度と照射された白色光強度の関係である。材料 1 の粉末は

図 7 は 405 nm の光を照射した時のサンプル B の透過率

白色光の強度が弱い時（0.1 mW/cm2）は 400 から 450 nm に変化（緑色）および G2 のりん光強度変化（赤色）を測定した

かけて弱い吸収を示し、青い光がわずかに吸収されるため結果である。405 nm の光照射が停止した直後の透過率がに薄い黄色に見える（図 8 の（Ⅰ）の写真）。一方で白色光の基の値に戻る挙動は、G2 のりん光の減衰と同期している強度の増加とともに 400 から 450 nm にかけての吸光度がことから、サンプル B に関しては 405 nm の光照射ととも大きく増加した（図 8 の（Ⅱ）→（Ⅳ））。この状態では白色光に G2 の三重項励起子が材料中にと蓄積され、それによりに含まれる青色領域の光のみ強く材料に吸収されるように透過率が減少していることが裏付けられた。

なるため、吸収されずに反射された光の色調である橙色の以上の結果から、β-estradiol のような水素結合のある色調が強くなっていく（図 8 の（Ⅱ）→（Ⅳ）の写真）。

４．考察

図 9 の上段は D1 と A1 の基底状態および T1 状態の吸収スペクトルである。また図 9 の下段は D1 と A1 のりん光
スペクトルである。
図 10 は図 9 の光学スペクトルから考察される材料 1 の非線形吸収のメカニズムを説明するための図である。A1は紫外域のみの吸収しか示さない（図 9 上段）ので、可視光が材料中に照射されると可視光はD1 にのみ吸収される（図10（a）の①）。次に、D1 は重原子を有しているため重原子効果が強く働き、S1 から T1 への 100% の項間交差が生じる（図 10（a）の②）。そして、A1 は D1 よりも低い T1 エネ

図 7 サンプル B に対して 405 nm の光を照射する前後におけるサンプル B の透過率（緑）およびりん光強度（赤）の時間変化

図 8 非コヒーレント光に応答する非線形吸収材料の非線形吸収特性

図 9 D1 と A1 の吸収スペクトル（上段）とりん光スペクトル（下段）− 46 −

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発

ルギーを有する（図 9 の下段）ため、D の T1 から A の T1 へ増加し、青色の光が材料から反射しにくくなることで橙色

エネルギー移動が生じ
（図 10
（a）
の③）
A の T1 が形成される。

が濃くなっていく。

A は平面性が高く軽元素のみからなる芳香族化合物である

このような非晶の光学材料のシステムは、日差しの強いため、ヒドロキシステロイド中では 1 秒以上の長い τ を有時のみ色が濃くなるような色材などへ応用できる可能性がする。それゆえ、A の三重項励起子が材料中に蓄積されてある（図 11 の（i））。通常白色光が強い場合は、照り返しのいく（図 10（b））
。この A の三重項励起子は、T1 から Tn 状

光が強くなるため白身がかった色調に見える場合が多い。

態への新たな吸収を示すようになるが、その吸光係数は非本材料を用いると日差しの強い時は、色が自動的に濃くな常に大きい（図 10（a）の④、図 4 の上段）
。結果的に可視るため、暗い環境や明るい環境の両者に対してはっきりと光の照射光強度の増加とともに青色領域の材料の吸光度が色合いを出すことが要求される応用に有効であると考えら

（a）

（b）

図 10 非線形吸収メカニズムの説明 （a）エネルギーダイアグラムによる説明 （b）A の励起子蓄積の様子のイラストレーションによる説明

図 11

非線形吸収材料の応用の展望− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

性を得た。

れる。
またこのような色材が塗られた紙は、室内の弱い光では

図 13 は 405 nm の光の照射強度を増加させた時に材料 1

文字などを自然に目視することが可能である一方で、スキからなる薄膜において観測される吸収スペクトルや吸光ャナで取り込む際のスキャナの強い白色光により瞬時に色度の変化である。図 13（a）に示す通り、照射光強度を 10づくと考えられる（図 11（ii））
。このような現象により取mW/cm2 から 100 mW/cm2 まで照射強度を増加させると、り込まれた画像のコントラストが低下するため、高解像度

400 nm から 550 nm まで吸収が増加する。この増加したスのデータ取り込みを防ぐことが必要とされる応用に好適とペクトルの形状は照射光強度に依存せず、その形状は図 8考えられる。それゆえ、本材料は紙幣、パスポートそしての上段の A1 の T1 の吸収スペクトルに類似している。そ機密文書の偽造防止などに有効である可能性がある。

れゆえ、白色光に含まれる青色光の強度の増加とともにまた本材料からなる薄膜は非晶性のため光散乱が生じず、A1 の T1 が材料中で蓄積されていくことで非線形吸収特性

ガラスに用いると日差しが強い時のみ吸光度が増加するこが発現していることがわかる。また、図 13（b）は時間 0とでサングラスのようになり、エネルギーを用いないで動− 2 秒までは弱い 405 nm の青色光を照射し、時間 2 秒の作するスマートウィンドウ（図 11（iv））などへの応用が期時に瞬間的に強い 405 nm の光に切り替え、時間 6.8 秒の待される。またこのような特徴はレーザーポインターから時に再び弱い 405 nm の光に切り替えた場合の 405 nm の

目を守るような用途（図 11（iii））
への展開も可能である。

吸光度の変化である。時間 2 秒で強い光を照射すると、照例えば図 12 はさまざまな材料（材料 1 から 4）をガラス

射強度を強くするほど吸光度が増加していることがわかる。

板で挟み込んだ薄膜を作製し、その薄膜に青色や緑色の光

図 13（c）は時間 6.8 秒を最初の時間とした場合の吸光度のを強度を変化させて照射した時の、調光特性の結果であ減衰とりん光強度の減衰の結果である。吸収の減衰の時る。材料 1 から 4 では 1 wt% の D と 5 wt% の A をヒドロキ

定数が A1 のりん光の減衰の時定数と同様であることから、システロイドの 1 つである β-estradiol 中にドープしたも

A1 の蓄積により吸光度の増加が生じていることが裏付け2のである。これらの薄膜は 1 mW/cm 以下の弱い光強度でられる。A1 は青色光を吸収しないことからも、D1 からのは 60% の透過率を示すが、光照射強度（I0）の増加とともに三重項三重項（TT）エネルギー移動により、A1 の T1 が形

2

透過率は減少し、I0=100 mW/cm では明確に減少し、さ成されていることがわかる。

らに I0=1 W/cm2 では大きな低下を示した。このように
2

mW/cm 領域の非コヒーレント光下での調光特性が確認

非線形吸収が図 10 のメカニズムに基づいて生じる場合、材料薄膜の透過率変化は理論的に以下の式 1 で表される。
σ34
ΦT τ ΦS（I0）I0
log
（T
（I0）
/T
（0））
= logT（0）（λ）

された。また、適切な D と A の組み合わせを用いること
により、青色領域から緑色領域の光に対する大きな調光特（式 1）

ここで、I0 は光の入射光強度、T（0）は I0 が弱い時の薄膜の透過率、T（0）は照射光強度が I0 の時の透過率、σ34（λ）
は波長 λ における A の TT 吸収の吸光係数、ΦT は D からA への TT エネルギー移動の効率、τは A の T1 の寿命、ΦS（I0）は照射光強度が I0 の時の薄膜の膜厚方向での光の減衰や照射光強度による励起子蓄積のアニヒレーションの補正因子である。
材料 5 − 9 からなる薄膜を新たに作製し上記理論式の検証を行った。材料 5 − 9 は 1 wt% の D と 3 wt% の A が
β-estradiol 中にドープされた薄膜であり、どの D と A を用いたかを表 1 に示した。また表 1 には、各々の材料の式
1 中に含まれるさまざまな物理因子の値も示す。
図 14 は材料 5− 9 からなる薄膜に対しての透過率と照射光強度の関係の実験値（プロット）および表 1 のデータを式 1 に代入することで得られた計算値（破線）を比較したものである。実験値は理論値といい一致を示した。このことから、光強度に基づく薄膜の透過率の減少は、図 10 のメ

図 12 非線形吸収材料の薄膜からなるガラスの調光特性 . 材
料 1 から 4 は 1 wt% の D と 5 wt% の A が β-estradiol 中にドープされた薄膜である。材料 1：D=D1, A=A1, 材料 2：
D=D1, A=A2, 材料 3：D=D2, A=A3, 材料 4：D=D3, A=A4

カニズムに基づき、A の T1 の蓄積により生じていることが裏付けられた。
式 1 より、照射光強度が弱い時の透過率が同じ場合、大きな透過率の減少（大きな非線形吸収）を得るためには、A− 48 −

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発

（a）

（c）

（b）

図 13 材料 1 からなる薄膜の非線形吸収特性の詳細（a）異なる強度の 405 nm の光が薄膜に照射された時の定常状態における吸光度変化（b）異なる強度の 405 nm の光が薄膜に照射された時の吸光度の時間変化（c）405 nm の照射光が停止された直後の薄膜の吸光度変化 (i) とりん光強度変化 (ii)

表1

各材料の光物理パラメーターのまとめ

材料

λ
（nm）

D

A

Cd*1
（wt%）

Ca*2

ФT

τ
T（0）
σ34（λ）（秒） （103cm-1M-1） （wt%）

5

405

D1

A1

1.0

3.0

0.25

1.65

15

28

6

405

D1

A6

1.0

3.0

0.27

2.77

3.4

30

7

405

D1

A7

1.0

3.0

0.25

0.49

16

30

8

405

D1

A8

1.0

3.0

0.25

0.04

17

30

9

405

D4

A1

1.0

3.0

0.22

1.38

15

30

＊

1：β-estradiol 中の D の濃度＊
2：β-estradiol 中の A の濃度− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 14

材料 5 − 9 の薄膜の透過率と 405 nm の照射光強度との関係
シンボル：実験値 破線：式 1 による計算値の T1 の吸収の吸光係数が大きいこと、D から A の三重項

果、青色領域から緑色領域の吸光度が増加する材料の構築

三重項エネルギー移動の効率が大きいこと、そして A のに成功した。このような非コヒーレント光によって生じる

T1 の寿命が長いことが重要になることが確認された。

非線形吸収機能はこれまでに類がない。本成果は Nature

５．結Materials に 2014 年 9 月 7 日に publish された 37）（論文の論謝辞の項に貴財団からの助成を受けた旨を記載した）。ま本実験では弱い白色光下で薄い着色状態を示し、日差した本成果は Nature Materials の news & views38）や米国化の強い太陽光下（10 mW/cm2）では瞬時にその色が濃くな学協会の Noteworthy Chemistry39）で取り上げられた。現り、再び弱い白色光に戻った際に数秒で薄い色の状態に戻在はまだ大きな吸光度の増加を得るためには 100 mW/cm2

る素材の開発を目的とした。

以上の照射光強度を必要とするため、太陽光で大きな非線

芳香族化合物を非晶ヒドロキシステロイドにドープした
2形吸収機能を得るためには今後照射光強度の閾値を 1/10

材料においては、1 W/cm の励起光の光照射により、効率以下に下げていくことが重要になる。現在さまざまなアプ

よく芳香族化合物の三重項励起子が材料中に蓄積され、そローチから閾値を下げる試みに挑戦中である。

れにより大きな透過率の変調が生じることが確認された。
このような成果は、サポート光により可視光の透過率を（引用文献）

任意に変調することが可能な光学素子へ応用可能と考え

1） Perry JW,: Organic and metal-containing reversible

2

られる。このような 1 W/cm の光照射による十分な濃度

saturable absorbers for optical limiters, Nonlinearの励起子の蓄積はこれまでに類がないため、その成果はOptics of Organic Molecules and Polymers, 13, 813-840,

36）

1997.

Advanced Optical Materials に採択されている （論文の2） Mansour K, Soileau MJ, Van Stryland EW,: Nonlinear

謝辞の項に貴財団からの助成を受けた旨を記載した）。

optical properties of carbon-black suspension (ink), J.

さらに金属錯体からなる D と軽元素のみの平面性芳香族

Opt. Soc. Am. B, 9, 1100-1109, 1992.

からなる A を非晶ヒドロキシステロイドにドープした材
2

料は、mW/cm クラスの白色光の照射下で、照射光強度3） Nashold KM, Walter DP,: Investigation of opticalの増加とともに吸光度が増加する非線形吸収機能を示した。

limiting mechanism in carbon particle suspensions andその現象は、D から A への三重項光増感により A の室温

fullerene solutions, J. Opt. Soc. Am. B, 12, 1228-1237,

長寿命三重項励起子が材料中に蓄積されていくことに由来1995.

している。さまざまな D と A の組み合わせを検討した結4） Tutt LW, Kost A,: Optical limiting performance of− 50 −

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発

18488, 2009.

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II

I

II

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Zawadzka M, Locos OB, Mhuircheartaigh EMN,:

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− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

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− 52 −

外部刺激による高分子ミセルの特異的形成／崩壊制御とその物質輸送系への応用
京都大学工学研究科高分子化学専攻

松岡秀樹

By utilizing the special characteristics of "non-surface active" polymers, a novel drag delivery system of polymer micellehas been established. The critical micelle concentration (cmc) of "non-surface active" polymers increases with increasing
added salt concentration. Hence, this polymer micelle can be disintegrated by salt addition, which was applied to drug
release system with salt addition as a trigger. The system with UV irradiation as a trigger was also investigated.

１．緒

この界面不活性高分子の特徴（特異性）の一つは，cmc の言

異常な添加塩濃度依存性である．通常のイオン性低分子界

一般の低分子界面活性剤水溶液の表面張力は，活性剤濃面活性剤の cmc は，塩濃度の増加と共に減少する．これ

度の増加と共に減少し，屈曲点を経て，一定値となる（図 1）．

は古くから知られる Corin-Harkins 則であり，ミセル中のこの屈曲点が，水中でミセルが形成され始める濃度，すな

イオン性頭部間の斥力が添加塩により緩和されることにわち，臨界ミセル濃度 cmc である．この挙動は，どの教より説明される．しかるに，界面不活性高分子の cmc は，科書にも記述されており普遍現象と信じられてきた．しか図 4 の例のように，塩濃度の増大と共に，増加することがしながら，分子が大きな「高分子」となると，必ずしも，こ我々の研究により発見された．真逆の傾向である 3）．これのような性質を示さないことが，我々のイオン性両親媒性
高分子に関する研究により示された 1, 2）．図 2 は，その一例である．試料は，水素化ポリイソプレンを疎水鎖，ポリスチレンスルホン酸を親水鎖とするジブロックコポリマーである．この水溶液の表面張力は，高分子濃度が増大しても変化せず，純水の値（73 mN/m）のまま一定である．しかし，図に示すように，疎水性色素の可溶化実験により
cmc の存在が示され，ある一定以上の濃度で，ミセルが形成されていることが分かる．我々は，この特性を「界面不活性性」と名付けた．そして，10 年以上に渡る系統的基礎研究により，その根源は，気水界面における鏡像電荷効果と水中のミセルの非常に高い安定性によりもたらされるものであることを明らかとした 1, 2）．親水鎖が高分子イオンであるため，鏡像電荷による斥力が非常に強くなる．そのため，気水界面への吸着が起こりにくくなる．一方，水中のミセルは，疎水鎖が高分子のため，非常に安定な疎水性

図 1 ドデシル硫酸ナトリウム（分子構造：上）水溶液の表
面張力の濃度依存性．疎水性色素の可溶化実験の結果（写真）より，cmc 以上でのミセルの形成が確認できる．

コアを形成する．さらには，親水鎖コロナも高分子であり，これに覆われることもあり，非常に安定なミセルとなる．
従って，気水界面に吸着すること無く，ミセルを形成する，という「界面不活性性」が発現することになる（図 3）．すな
わち，界面不活性性は，ある種の高分子効果なのである．

Control of unimer/micelle transitionof amphiphilic diblock copolymer byexternal stimuli and its application to
drag delivery systems
Hideki Matsuoka
Department of Polymer Chemistry, Kyoto
University− 53 −

図 2 水素化ポリイソプレンとポリスチレンスルホン酸ナト
リウムのジブロックコポリマー水溶液の表面張力（青）と可溶化実験の結果（緑および写真）．

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 3 「界面不活性性」発現機構の模式図
図 5 界面不活性高分子水溶液に対する添加塩の効果の模式図

図 4 界面不活性高分子の cmc の添加塩濃度依存性
低分子イオン性界面活性剤と真逆に，上昇傾向を示す．

図6

は図 5 に模式的に示すように，鏡像電荷斥力が添加塩によ本研究で用いた，３種のイオン性両親媒性ブロックコポリマー

２．実り遮蔽され，吸着しやすくなる，平衡が，ミセル側から吸着側へシフトしたためと考えられる．

験

図 6 に示す 3 種の高分子は，可逆的付加開裂連鎖移動

この cmc 増大の特性を利用すると，図４から分かるよ（RAFT）重合により合成した．近年開発された水溶性の連

うに，塩を加えることにより cmc を跨ぐことができ，ミ鎖移動剤を用いることにより，水溶性モノマーを直接重合

セルを「崩壊」
させることが可能になると期待される．低分することが可能となり，100% イオン基を導入した親水鎖子の場合は，逆向きに跨ぐので，ミセルを
「形成」
させるこ

の合成が可能となると共に，疎水鎖とのブロック重合も容とはできるが，崩壊は不可能である．よって，このような易に行えるようになっている．

添加塩によるミセルの崩壊制御は，界面不活性高分子によってのみ達成される，特異機能ということができる．

表面張力の測定は，協和界面科学製 FACE CBVP-Z により行った．試料水溶液は，調製後一晩静置してから測定

本研究では，図 6 に示す 3 種の高分子（親水鎖が，強酸を行った．cmc の決定は，静的光散乱法により行った．大性，弱酸性，およびカチオン性）について，この cmc 増加

塚電子製 SLS-7000 により散乱角度 90 °方向への静的散現象の普遍性を確認すると共に，添加塩のイオン種依存性

乱強度を測定し，ダイレクトとの強度比 Is/I0 を濃度に対（NaCl, KCl, NaBr などなど）を調査し，さらには，ミセル

してプロットし，その屈曲点を cmc とした．ミセルの大内に取り込ませた色素を，塩の添加により放出させること

きさ（流体力学的半径）は，大塚電子製 SLS - 7000 に光子を試みた．さらには，より発展的応用として，光照射によ相関計 GC-1000 を組み合わせたシステムにより決定した．

り疎水性からイオン性の親水鎖に変化するブロックを有す

蛍光強度測定は，日立製 F-2500 により測定した．照射する高分子ミセルを構築し，UV を照射することにより，ミる UV 光には，三永電機社製コンパクト UV 光源 UV-203F

セル内部の色素を放出する系の構築を試みた．

を用いた．Hg-Xe ランプからの波長 360 nm, 強度 30 mW/
cm2 の UV 光を試料に照射した．

− 54 −

外部刺激による高分子ミセルの特異的形成／崩壊制御とその物質輸送系への応用

ブラシ）の中のイオン濃度が極めて高いために，添加され３．結果と考察た塩イオンがコロナ内に浸入できず，ミセル構造が添加

図 7 は，用いた 3 試料水溶液の表面張力と Is /I0 の濃度

塩の影響を受けない領域である．同様の傾向は，水面のイ依存性である．表面張力は，いずれの試料も高分子濃度にオン性高分子ブラシに対しても観察されている 4）．その後，依存しておらず，純水の値，すなわち，73 mN/m 附近でRh は減少しているが，これは塩イオンがコロナに浸入し，ほぼ一定である．その一方，静的光散乱強度には，明らか

コロナを形成するイオン性高分子鎖が静電反発により伸張な屈曲点があり，cmc が存在すること，すなわち，ある濃した状態から，それが遮蔽され，収縮していっていること

度以上でミセルが形成されていることがわかる．よって，を示している．その後 Rh は一定となっているが，これは「表面張力が低下せずミセルを形成する」という界面不活性

完全にイオン鎖が収縮しきった状態と考えられる．

高分子の特性を，今回のいずれの高分子も有することが確

図 9 と図 10 は，用いた 3 種の高分子の cmc に対する添認された．弱酸およびカチオン性高分子の場合，高濃度で加塩効果のイオン種依存性である．図 9 は，塩のカチオン

やや表面張力が低下する傾向が認められる．これは，界面を Li+, Na+, K+ と変えた場合，図 10 は，アニオンを，F-,

不活性性があまり高くない高分子に見られる特徴である．

Cl-, Br- と変えた場合を示している．図 9 では，親水鎖が

図 8 には，DLS 測定により得られたミセルの流体力学的カチオンの高分子は，塩のカチオン種を変えて，影響を半径 Rh の添加塩濃度依存性を示す．Rh はある一定の塩濃受けていないが，アニオン性の高分子は，強酸，弱酸，い-4度（図では，10 M 程度）まで Rh は変化していない．これは，ずれもイオン種により cmc 増大の程度が異なっているこ

ミセル表面を覆うイオン性高分子のコロナ（一種の高分子とがわかる．塩のカチオンは，アニオン性親水鎖のカウン

図7

用いた３種のポリマー水溶液の表面張力（赤）と静的光散乱強度（青）の濃度依存性図 8 界面不活性高分子ミセルの流体力学的半径（Rh）の塩濃度依存性．サンプルは，PnBA-b-PSSNa− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

ターイオンとなり，ペアを組むため，イオン種依存性が表+変えた図 10 では，逆にカチオン性親水鎖のポリマーにイれるものと考えられる．さらに，効果の程度は，Li がもオン種依存性が見られ，そのイオン種の順番は，やはりっとも cmc を増大させる効果が強く，次に Na+, K+ の順とHofmeister 順列に従っている．しかしながら，近年にななっている．この順番は，古典的な Hofmeiser 順列

5）と一って，Hofmeiser 順列の起源に異説が唱えられるようにな+致していることが興味深い．Li は非常に強い水の構造形

り，必ずしも水の構造性を反映するものではないとの考え

成イオン，Na+ は，やや弱い構造形成イオン，K+ は，構が提示されている 6）．このような可能性も念頭に，今後の造破壊イオンである．この事実は，cmc の変化が，溶媒で検討課題としたい．

ある水の構造性と何らかの相関を有することを示している

次に，蛍光色素であるピレンをミセル内部に取り込ま可能性がある．今後の課題として興味深い．アニオン種をせ，塩の添加によりミセルが崩壊し，ピレンが放出される

図9

３種のポリマーの cmc に対する添加塩の効果とそのカチオン種依存性

図 10

３種のポリマーの cmc に対する添加塩の効果とそのアニオン種依存性− 56 −

外部刺激による高分子ミセルの特異的形成／崩壊制御とその物質輸送系への応用

様子を蛍光分光測定により追跡した．強酸性の高分子を試

つ目は，このミセルが高分子であるため，ミセルの形成／料として用いた．ピレンの蛍光発光の第一ピーク I1 と第 3崩壊の転移がシャープではないことの影響である．活性剤

ピーク I3 の比，I1/I3 は，ピレンが存在する環境の極性を濃度を変化させての形成／崩壊現象も，低分子界面活性剤

反映することが知られている

7, 8）．図 11 は，I1/I3 の添加塩

濃度依存性である．図中の右上がりの点線は，cmc の塩濃に比べ，高分子の場合は，そのシャープさがかなり劣っていることが知られている．

度依存の線である．このように，cmc を跨ぐ前後で，I1/

次に，光照射による制御を試みた 9）．用いた高分子は，I3 が 1.50 程度から，1.55 程度にジャンプする傾向が確認さ図 12 に示すカルボキシベタインを親水鎖，ポリメタクリ

れた．I1/I3 は，環境の疎水性が高いほど，小さな値となる．

ル酸のニトロベンゼンエステルを疎水鎖とするものである．

よって，I1/I3 = 1.50 は，ピレン分子がミセルのコア内に存

このエステル結合は，UV 照射により容易に切断され，高在することを示し，1.55 とジャンプしたところは，ミセル

分子鎖は，親水性のポリメタクリル酸へと転移し，アルデの崩壊によりピレン分子がミセルコアから放出されたことヒドが放出される．

を示していると考えられる．変化があまり劇的ではないが，

pH 7 におけるこのミセルの Rh は，25 nm，色素（ナイル

これには二つの理由が考えられる．一つは，cmc 直前，直レッド）を取り込ませたミセルの Rh は，32 nm となり，十後の状況となっているため，形成されるミセルもまだ「し分な量が取り込まれていることが確認できた．これに UVっかりした」ミセルではなく，そのコアも緩い状態で，そを照射し，吸光度を測定した結果が，図 13 である．照射前は，の疎水性もまだ十分高くない状態である可能性がある．二図 11 ピレンからの蛍光発光強度の塩濃度依存性と cmc との関係

図１3

図１2 光照射によるミセル崩壊転移に用いたポリマーの分子構造とその反応様式，およびミセル崩壊制御

ナイルレッドの発光スペクトル
ポリマー濃度：0.2 mg/ml，（a）pH7 の緩衝液中 （b）
水中（励起波長： 550 nm）− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Interface Communication（日本化学会・コロイドおよ

十分強い吸収があり，疎水性で水に不溶なナイルレッドが，ミセルコア内に取り込まれることにより，水中に存在してび界面化学部会ニュースレター ）, 38 (3), 30 - 33, 2013.

いることが分かる．これに UV を照射すると，照射時間を

3） Kaewsaiha, P.; Matsumoto, K.; Matsuoka, H. "Non-

長くするほど，吸光度は減少し，またピーク位置もレッド

surface activity and micellization of ionic amphiphilic

シフトし，純水中でのプロファイルに近づいているが，完

diblock copolymers in water. Hydrophobic chain length

全に消失はしなかった．これは，UV 照射による反応の効

dependence and salt effect on surface activity and the

率が，70% 程度とやや低く，ミセルが完全には崩壊していcritical micelle concentration". Langmuir, 2 1, 9 9 3 8 −ない可能性が考えられる．実際，DLS により UV 照射後の9945, 2005.

Rh を測定すると，40 nm と大きな値となった．しかしなが4） Kaewsaiha, P.; Matsumoto, K.; Matsuoka, H. "Salt

ら，その時の散乱強度は非常に弱くなっており，この大きEffect on the Nanostructure of Strong Polyelectrolyte

な Rh は，大きなミセルが形成されたことを意味するのでBrushes in Amphiphilic Diblock Copolymer Monolayers

は無く，UV 照射により疎水鎖の 70% が親水鎖に転移した

on the Water Surface". Langmuir, 23 (13), 7065 − 7071,

ため，疎水性のコアが溶媒である水で膨潤したためと考え

2007.

られる．今後，反応効率の改善により，完全な崩壊・放出

5） Kunz, W.; Henle, J.; Ninham, B. W. ‘Zur Lehre vonder Wirkung der Salze’ (about the science of the effect

系が構築できると期待される．

４．総of salts): Franz Hofmeister’ s historical papers. Curr.

括

Opin. Colloid Interface Sci., 9, 19 − 37, 2004.

添加塩濃度の増加に伴い cmc が増加するという，「界面

6） Zhang,Y. Cremer, P.S., "Interactions between

不活性高分子」が持つ特長を活かして，「塩を添加すること

macromolecules and ions: the Hofmeister series", Curr.

により，薬物が放出される」という drag delivery に応用可Opinion in Chem. Biol., 10, 658-668（2006）

能な高分子ミセル系の構築に成功した．また，trigger と7） Kalyanasundaram, K., Thomas, J. K., "Environmental

して光を用いる系についても，検討を行った．添加塩によEffects on Vibronic Band Intensities in Pyrene

る系は，発汗による香料の放出など，コスメ系材料への応

Monomer Fluorescence and Their Application in

用も期待でき，新しい機能材料開発の可能性が示された．

Studies of Micellar Systems", J.Amer.Chem.Soc., 9 9(7),2039-2044, 1977.

（引用文献）

8） Ananthapadmanabhan, K.P., Goddard, E. D., Turro,
N. J., Kuot, P. L., "Fluorescence Probes for Critical

1） Matsuoka, H.; Chen, H.; Matsumoto, K. "Molecularweight dependence of non-surface activity for ionicMicelle Concentration" Langmuir, 1, 352-355, 1985.

amphiphilic diblock copolymers". Soft Matter, 8, 9 1 4 09） Shrivastava, S., Matsuoka, H., "Photocleavable
amphiphilic diblock copolymer micelles bearing a− 9146, 2012.
2） 松岡秀樹，「イオン性両親媒性ジブロックコポリマ
ーの「界面不活性」性は何故発現するか？」，Colloid &− 58 −

nitrobenzene block", Coll.Polym.Sci., 294, 879 -887, 2016.

抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究
群馬大学大学院理工学府分子科学部門

山路稔

The alkyl keto-diketones having five-membered rings undergo photoinduced tautomerization to the enol in acetonitrile.
The alkyl enol-diketones, thus formed, undergo thermal tautomerization to the original keto forms in a few days. The alkyl
enols show fast internal conversion from the excited singlet state to the ground state without yielding the correspondingisomeric forms (rotamer).

1．緒

し、熱的にエノール体へ異性化することを報告している24）。

言

AB の C2 位をメチル化した 1,1- （4-tert- ブチルベンゾイ

芳香族アルケンのケトーエノール互変異性化反応は、溶液中で頻繁に観測される反応である

1-3）ル）（4’ - メトキシベンゾイル）メタン（MeAB）は UV-C

。β- ジケトンの波長領域に吸収帯を示す 23）。レーザー閃光分解法を使っ一つとしてよく知られている 1, 3- ジベンゾイルメタン

た MeAB の研究では、ケト体の MeAB は光励起後に励起（DBM）の分子構造は室温溶液中でエノール体であり 4-8）、一重項（S1）からの項間交差を経由して n,π* 三重項（T1）状UV-A 波長領域に π,π* 遷移に由来する強い吸収帯を示態を形成することが示されている 23）。MeAB は光励起にす。DBM の殆どの誘導体は光励起しても発光を示さず効よりエノール体への互変異性化は起こさない。一方、メ率良く励起エネルギーを放出する。これは励起状態で回転チル基をプロピル基にした 1,1-（4-tert- ブチルベンゾイル）

異性体（rotamer）を形成し、熱失活で励起エネルギーを緩（4’- メトキシベンゾイル）プロパン（PrAB）は溶液中 n, π*和するからである。一般的な反応過程を Scheme 1 に示す。

三重項を経由して Norrish II 型反応を起こすことが報告

DBM のその反応機構が UV-A サンスクリーンとして機されている 26）。 本研究では AB の芳香環をフラン（F）と能する。特に 4-tert- ブチル -4’ - メトキシジベンゾイルメ

チオフェン（T）に置換したメチルおよびプロピルジケトン

タン（アボベンゾン、以下 AB と略す）は世界中で UV- サン（Chart 1）を新規に合成した。これらの化合物が光熱異性

スクリーンとして使用されている

2, 4, 8-25）。我々はエノール化反応を起こすことを新たに見出し、その光化学的反応機体の AB がアセトニトリルで光照射によりケト体へ異性化

構を定常光およびレーザー閃光分解法を用いて解明した。

Scheme 1

Keto-enol tautomerization of DBM and isomerization processes of enol DBM.

Steady state and laser photolysis studies
of keto-enol tautomerizations in 2 -alkyl1 , 3 -diketones having five-memberedrings in acetonitrile: Temporal UV-A
sunscreen
Minoru Yamaji
Division of Molecular Science, Graduate
School of Science and Engineering,
Gunma University

Chart 1 Molecular structures and abbreviations of thecompounds used in this study.

− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016２．実

験

ビス（2- フロイル）メタン（FF）、（2- フロイル）（2- テノイル）メタン（FT）およびビス（2- テノイル）メタン（TT）
は アセチル体とエチルエステル体を THF 中、NaH の存
在下でクライゼン縮合することにより合成した。1, 1- ビス（2- フロイル）メタン（MeFF）、1, 1- （2- フロイル）（2テノイル）メタン（MeFT）、1, 1- ビス（2- テノイル）メタン（MeTT）、1, 1- ビス（2- フロイル）
メタン（PrFF）、1, 1- （2フロイル）（2- テノイル）ブタン（PrFT）、1, 1- ビス（2- テノイル）ブタン（PrTT）はアセトン中 K2CO3 存在下ヨウ化
メチルおよびヨウ化プロピルとジケトンの反応で合成した。
吸光度分析用のアセトニトリル（ACN）とエタノールを測定に用いた。
吸収スペクトルとケイ光スペクトルはそれぞれ JASCO
U-best 50 と日立 F- 4010 ケイ光計を用いて測定した。試料は 1 cm の光路長セルにいれて、純アルゴンで脱酸素を行った。レーザー閃光分解に用いた試料濃度は励起波長で約 0.7 になるように調整した。光分解光源は低圧水銀灯（254 nm）および高圧水銀灯（λ>330 nm）と Nd : YAG レー
ザ ー（LT- 2137 from Lotis-TII, 10 mJ/pulse，パ ル ス 幅
18 ns）の第 3（355 nm）および第 4（266 nm）高調波を用いた。過渡吸収測定の光路図は既報に記してある 27）。過渡吸収シグナルはユニソク社製 USP-T1000 -MLT を用いて解析した。汎密度関数理論（DFT）に基づく量子化学計
算は Gaussian 09 Rev D.01 を用いて B3LYP/6-31G（d）レベルで行った 28）。

3．結果と考察3. 1. 吸収発光測定
Fig. 1 に FF、FT、TT、MeFF、PrFF、MeFT、PrFT、
MeTT および PrTT の吸収発光スペクトルを示す。
360 nm に吸収を示すアルキル無置換のジケトンは、エFig.1 Absorption spectra（solid）in ACN at 2 95 K andfluorescence（blue broken）and phosphorescence（red）
spectra in EtOH at 77 K. The alkyl-free diketones were
excited at 370 nm while the alkyl diketones were at 300
nm.

ノール体であることを示す。一方、260− 270 nm に吸収を示すアルキル置換体は、ケト体であることが判る。いずれ

ず起こらなかった。一方、254 nm の UV-C 光をアルキルの化合物からの 295 K でのケイ光は観測されない。アルキ

体に照射した時に観測された吸収スペクトル変化を Fig. 2ル無置換体からは 77 K で弱いケイ光が観測された。ケイに示す。

光が観測されなかったことはアルキル置換体の S1 の電子照射時間の増加につれて 270 nm のケト体の吸光度は減状態構造は n, π* であり、アルキル無置換体は π, π* である。

少し、新たな吸収帯が 380 nm に現れた。この吸収帯はア観測されたリン光から三重項エネルギー（ET）を決定し結

ルキル基を有さない化合物の吸収スペクトルとは異なって果を Table 1 に示した。吸収極大波長（λmax）と S1 エネルいる。光分解中、等吸収点は現れなかったことは光分解ギー（ES）も Table 1 に示した。

で様々な中間体が生成しているためと考えられる。そのため反応出発物質のアルキルプロピルのケト体の光分解

3. 2. 定常光光分解の量子収率は、吸収スペクトル変化からは決定できなかっ

我々はアセトニトリル中、330 nm より長波長の UV-B

た。光照射後、試料を室温暗所に放置後 2、3 日経過する

光を 30 分間、アルキル置換されていない化合物に照射しと、380 nm の吸収帯は消滅し、元のケト体の吸収が現れた。

たが、吸収スペクトルの変化は溶存酸素の有無にかかわらこれは 380 nm の吸収帯がアルキル基を有するエノール体− 60 −

抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究

Table 1 Absorption properties, excited state energies, triplet properties and lifetimes of therotamers for the 1,3-diketones used in the present work.

Fig. 2 Absorption spectral changes obtained upon 254 nm
photolysis of PrFF（a），PrFT（b）and PrTT（c）in Ar-purged
ACN at 295 K. The irradiation times are noted in the figure.

− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016であることを強く証明する事実である。酸素溶存したア

照射時間の増加につれて 270 nm のアルキルメチルのケ

セトニトリル中ではケト体の光分解は起こらなかった。こト体の吸光度は減少し、新たな吸収帯が 380 nm に現れた。

のことからプロピル体の様々な中間体の三重項がケト体か

この吸収帯はアルキル基を有さない化合物の吸収スペクト

らエノール体への異性化反応に関連していると考えられる。

ルとは異なっている。プロピル基を有するケト体の光分解

一方、エノール体からケト体への熱異性化反応は一次反応生成物と同様にメチル基を有するエノール体が生成してい解析でも二次反応解析でも解析できなかったので、回復過るものと考えられる。光分解中、等吸収点は現れなかった

程の反応速度論的議論はできなかった。以上の実験事実かことは光分解で様々な中間体が生成していると考えられる。

ら様々な分子構造を有したプロピルジケトンのケト体がこそのため反応出発物質のアルキルメチルのケト体の光分解の反応過程で並列的に、または連鎖的に発生していると思の量子収率は吸収スペクトル変化からは決定できなかった。

われる。330 nm より長波長の光をエノール体に照射した

MeFF と MeFT はアルゴン飽和したアセトニトリル溶が、溶存酸素の有無にかかわらず回復過程は早くならなか

液中の光照射で吸収スペクトルが減少したが、酸素溶存中った。以上の結果をまとめると、プロピル基をもつケト体では減少が遅くなった。これは MeFF と MeFT が三重項

はアセトニトリル中の光照射により三重項でエノール体へで分解反応が進行するためである。一方、MeTT のアセの異性化反応を起こし、2、3 日で元のケト体へ回復する

トニトリル中の光分解過程では、溶存酸素の有無にかかわことが判った。メチル置換されたケト体でも同様の光 - 熱らず光分解が進行することが判った。これは MeTT の光反応が吸収スペクトルから観測された。

分解は励起一重項で進行していることを示唆する。光分解

Fig. 3 に MeFF、MeFT および MeTT のアセトニトリで反応したメチルケト体の反応生成物であるメチルエノー

ル溶液溶液に 254 nm に光を照射したときに観測された吸ル体は、暗所放置により 2，3 日後、元のケト体の吸収体

収スペクトルを示す。

が回復することが判った。結局、アルキルケト体は光照射

Fig. 3 Absorption spectral changes upon 254 nm photolysis of MeFF in Ar-purged ACN（a）
and aerated ACN（b），of MeFT in Ar-purged ACN（c）and aerated ACN（d），and of MeTT
in Ar-purged ACN（e）and aerated ACN（f）．

− 62 −

抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究

によりエノール体へ光異性化し、2，3 日の寿命で元のケト体へ回復することが判った（Scheme 2）。

秒領域の寿命（τT）で減少した。得られた寿命の値を Table
1 に示す。酸素溶存条件下では減衰の寿命は短くなったこ

本研究で見出された見出された光熱異性化過程は、報とから、観測された過渡吸収スペクトルはアルキルケト体

告されているアルキル AB 類の光反応（MeAB は光照射にの三重項−三重項吸収と同定できる。三重項−三重項吸収23）

PrAB は Norrishの極大波長（λT−Tmax ）を Table 1 に示す。MeTT 以外のアル）とは全く異なる挙動を示した。

キルケト体で得られた三重項減衰の寿命の逆数がエノール

この違いは芳香環の違いに由来すると考えられる。DBM

体へ異性化するときの速度定数である。三重項−三重項吸の三重項電子構造が n,π* であるのに対し、ベンゼン環を収が消滅後、350 nm より長波長域には何も吸収は観測さフラン環およびチオフェン環に置換したアルキルケト体のれなかった。

より三重項生成し、異性化は起こらず
Type Ⅱ反応を起こす

26）

次にレーザー閃光分解法を用いて、光照射により生成し三重項電子構造が π, π* に入れ替わったため、異性化がたアルキルエノール体とアルキル基を持たないエノール進行したと考えられる。

体の過渡吸収を測定した。DBM のエノール体の光反応に

3. 3. レーザー閃光分解法による過渡吸収測定

おける特徴は Scheme 1 に示した様に光異性化反応である。

Fig. 4 はアルキルジケトンのアセトニトリル溶液に 266

DBM のエノール体にレーザー光照射後観測される過渡吸

nm のレーザー光を照射したときに観測された過渡吸収ス

収スペクトルは、回転異性体が生じることによるブリーチ

ペクトルを示す。

ングであることが多く報告されている 6, 8, 12, 15）。Fig. 5 にア

MeFF と PrFF の過渡吸収スペクトルの形はよく似ていルキル基を持たない FF、FT、および TT に 355 nm レー

るが、他のアルキルケト体の過渡吸収スペクトルの形とは

ザー光を照射したときに観測された過渡吸収スペクトルを異なっている。過渡吸収は一次の速度式に従ってマイクロ示す。

Scheme 2

Keto-enol tautomerizations of the alkyl diketones studied in the present work.

Fig. 4 Transient absorption spectra at 100 ns obtained upon 266 nm laser photolysis of the alkyl diketones
in Ar-purged ACN at 295 K.

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

380 nm に観測されるブリーチングはアルキル無置換体のし、B3LYP/6-31G（d）レベルの DFT 計算で算出した。ア

S1 状態で生成した回転異性体により現れたと解釈できる。

ルキル基を有さないエノール体とその回転異性体の生成

ブリーチングは回転異性体の緩和に伴う現象で、数百マイ熱も同様の方式で算出した。FT、MeFT および PrFT の

クロ秒の寿命（τrot）で回復した。得られた τrot, の値を Table

エノール体の構造には Chart 2 に示す様に Enol Type F と1 に示した。τrot の値は溶存酸素の有無に依存しなかった。

Enol Type T の二つの構造が考えられるので、計算の際は以上の実験事実からアルキル基を持たない FF、FT およそれらも考慮した。

び TT は DBM の光化学過程と同じ失活過程を辿ることがTable 2 に ケト体とエノール体の生成熱の差（ΔfH（enol）

判った。一方、事前に 254 nm の光照射を行い生成させた− ΔfH（keto））、および回転異性体とエノール体の生成熱

アルキル基を有するエノール体に 355 nm のレーザー光照の差（ΔfH（rot）− ΔfH（enol））を示した。

射を行い、過渡吸収の観測を行った。しかし、320 − 600

アルキルエノール体の生成熱の値はケト体の値より 8 −nm の波長領域で、100 ナノ秒から 2 ミリ秒の時間領域では、

19 kcal mol -1 程大きいことが判る（Table 2）。このことは、

過渡吸収は何も観測されなかった。アルキル基を有するエ

アルキルエノール体からケト体へは発熱的に異性化反応

ノール体からはケイ光は観測されていないことから、アルが起こる可能性を示唆している。逆にアルキル基を有する

キル基を有するエノール体の励起一重項からの失活過程は場合の回転異性体とエノール体の生成熱の差は（ΔfH（rot）

内部転換であることが判った。

-ΔfH（enol）、Table 2）、−1 . 3 kcal mol-1 から 14 . 2 kcal mol-1まで変化している一方、アルキル基の無いエノール体は発

3. 4. DFT量子化学計算による生成熱の計算

熱的な結果が得られている。我々はアルキル基の無いエノ本研究で扱ったアルキルジケトンのエネルギー状態を議ール体で（FF, FT および TT）回転異性体が生成している論するために、それらのケト体およびエノール体の生成熱

ことを確かめている。計算で得られた生成熱の差（Δf H（rot）（ΔfH）を、アセトニトリルを連続媒体としたモデルに適用− ΔfH（enol））が発熱的であることから、回転異性体が観測されなかった理由は状態エネルギーにあるのではなく、励起一重項状態で進行する C- C 二重結合を軸とした回転の際のアルキル基の立体障害に由来すると考えた。以上の考察を踏まえて、本研究で用いたアルキルジケトンのケト
体、エノール体および回転異性体のエネルギーダイアグラ
ムを Scheme 3 に示す。
アルキルケト体の光反応は MeTT は S1 状態で、その他のアルキル体は T1 状態で進行しエノール体を形成する。
元のケト体の分子構造とは異なる励起状態を経由してエノール化は進行すると考えられる。形成されたエノール体は熱的障壁（ΔE）を有する様々な分子構造を有する中間体を経て元のケト体を回復する。対して、アルキルエノール体を光励起するとその S1 状態が形成されるが、S1 状態は回転異性体を形成することなく内部変換により基底状態へ失活する。回転異性体が形成されない理由はジケトン骨格の
C- C 二重結合を軸とした回転に対して、C2 位に位置するアルキル基の立体障害のためであると考えられる。

Fig. 5 Transient absorption spectra obtained upon 355 nm
laser pulsing in FF（a），FT（b）and TT（c）in Ar-purged
ACN at 295 K. Insets; time profiles at 380 nm.

Chart 2 Molecular configurations for the enol forms of FT,
MeFT and PrFT.

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抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究

Table 2 Differences in ΔfH between the keto and enol forms and between
the enol and rotamer forms.

Scheme 3 A schematic energy diagram for the tautomerization of the alkyl
diketones and the photophysical pathway of the enol forms. The S1 energyof the enol form was evaluated from the onsets of the absorption spectra to
be ca. 68 kcal mol-1.

4．総事実よりアルキルエノール体は一時的な UV-A サンスク括リーンとして振る舞うことが判った。サンスクリーンとし

我々は 5 員環を有する 2 -アルキル- 1, 3-ジケトンを新規ての光熱変換機構は従来の DBM 体で見られた回転異性体に合成し、アセトニトリル中で定常光およびレーザー閃形成ではなく、内部転換過程であることが新たに判明した。

光分解法によりそれらの光化学的挙動について研究を行

この光熱変換機構が生じる理由は、アルキルエノール体のった。アルキルケト体を光励起するとエノール体が生成

S1 状態でのジケトン骨格の C-C 二重結合を軸とした回転することが新たに判った。この光反応過程では様々な構造に対して C2 位に位置するアルキル基の立体障害であるとの MeTT の S1 状態、その他のアルキルケト体では T1 状態考えられる。アルキルエノール体からアルキルケト体へのが関与している。光生成したエノール体は数日内で元のケ

熱回復過程もこのアルキル基による立体障害が影響していト体へ回復する。この回復反応過程には熱的障害が存在すると考えられる。量子化学計算により決定したケト体、エると考えられる。一方、光生成したアルキルエノール体を

ノール体および回転異性体の生成熱に基づき、ケト - エノ

光励起すると回転異性体を形成することなく S1 状態からール光熱異性化反応過程とエノール体の光励起失活過程の

内部転換過程によって基底状態へ失活する。これらの実験

エネルギー相関図を Scheme 3 にまとめた。

− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

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− 66 −

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抗炎症効果のある UV サンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究

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− 67 −

必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明
お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系

市

育代

Essential fatty acids (EFA) and their downstream long-chain polyunsaturated fatty acid (PUFA) are localized to cell
membranes as phospholipid esters and play critical roles in regulating membrane structure, dynamics, and permeability. It
is reported that EFA deficiency state causes the disruption of the skin barrier. Therefore, changes of fatty acids during EFA
deficiency might participate in pathologic changes in the skin. In EFA deficiency animals, 5,8,11-eicosatrienoic acid (Meadacid, C20:3n-9) is endogenously synthesized from oleic acid, and is detected in the plasma and tissues. Mead acid is thought
to be used in biological membranes as a substitute for other PUFAs. In this study, we investigated the change of Mead acidin inflammation and the influence of the decrease of Mead acid on the skin barrier function during EFAD state.
To study change of fatty acid metabolism in the skin by inflammation, we investigated the change of Mead acid in humankeratinocyte HaCaT cells of EFAD state. The mRNA of inflammatory cytokine, such as IL-1β and IL-6 were significantly
increased by the stimulation of TNF-α. The mRNA of filaggrin and involucrin, which proteins correlate with barrier
function, were decreased by TNF-α, suggesting that the barrier function was disrupted in HaCaT cells by inflammatory. The
Mead acid composition in the cells with treatment of TNF-α was reduced 33% of the level in control cells, but other fatty
acid compositions did not changed significantly. These results suggesteed that Mead acid synthesis was suppressed in EFAD
keratinocytes by inflammation.
Next, we examined the influence of the inhibition of Mead acid synthesis on barrier function in human keratinocyte
HaCaT cells. The level of Mead acid was significantly decreased by the addition of 50 μM Δ6 desaturase inhibitor sc26196.
The mRNA level of filaggrin and involucrin was significantly decreased by the addition of sc26196. Moreover, weinvestigated the influence of Mead acid reduction on inflammatory response and ER stress. Although the IL-1β and IL-6
mRNA were unchanged by treatment of sc26196, the mRNA levels of ER stress marker genes, such as CHOP and GRP78
were significantly increased. These results suggested the possibility that inhibition of Mead acid synthesis induced the skinbarrier dysfunction via up-regulation of ER stress.

1．緒

必須脂肪酸欠乏時には、生体内でミード酸（C20 : 3n-9）

言という多価不飽和脂肪酸がオレイン酸から産生されること

必須脂肪酸は生体膜の構成成分であるだけでなく、生体が知られており 5）、我々は必須脂肪酸欠乏時に産生される機能の恒常性維持にも重要な物質である。哺乳動物においミード酸に関して産生遺伝子と産生経路を明らかにしていて必須脂肪酸が欠乏すると、成長異常や生殖機能の障害、る6）。ミード酸はアラキドン酸（C20 : 4n-6）と同じΔ 5 位に二皮膚の水分・バリア機能損失などの障害がみられることが重結合を有するなど構造が類似している。アラキドン酸は知られている1, 2）。皮膚のバリア機能において、セラミド

プロスタグランジンやロイコトリエンなど炎症性代謝物のやコレステロール、遊離脂肪酸から成る細胞間脂質は重要前駆体であり、代謝物は関節リウマチ 7）や気管支喘息 8）なな役割を果たしており、皮膚における脂質の変化とバリア

どの様々な炎症性疾患に関与していることが知られている。

3）

機能の異常との関連が指摘されている 。必須脂肪酸欠乏

ミード酸に関してもロイコトリエン様の化合物が同定され時の脂質の変化と皮膚バリア機能異常については、必須脂ているが 9）、ミード酸やその代謝物の生理機能はよくわか肪酸欠乏モデル動物の皮膚のセラミドにおいて、リノールっていない。そこで本研究では、皮膚細胞におけるミード

酸含有アシルセラミドが減少し、代わりにオレイン酸含有酸の生理作用を明らかにするにあたり、必須脂肪酸欠乏時

アシルセラミドが増加すること、そしてその脂質の変化がのミード酸の産生抑制が皮膚のバリア機能に及ぼす影響を

経皮水分蒸散量の増加に関与している可能性が示唆されて

検討した。

4）

いる 。しかしながら、必須脂肪酸欠乏時の脂肪酸の変化

また、皮膚において必須脂肪酸は重要な構成成分であり、必須脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸は生体膜のリン脂質にと皮膚障害に関する知見は乏しい。

多く存在している。生体膜リン脂質には、飽和脂肪酸から多価不飽和脂肪酸まで様々な脂肪酸が結合しており、多く
The clarification of the mechanism of skinlesions in essential fatty acid deficiency
statesIkuyo Ichi
Natural Science Division, Faculty of Core
Research, Ochanomizu Universityの分子種が存在するが、ホスファチジルイノシトール（PI）はホスファチジルコリン（PC）やホスファチジルエタノー
ルアミン（PE）などの他のリン脂質と異なり、sn-1 位にス
テアリン酸（C18 : 0）、sn-2 位にアラキドン酸を有する分子種がその殆どを占めている。我々は以前、必須脂肪酸欠− 70 −

必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明

乏マウスの PI においてミード酸が圧倒的に多く分布する

ノールによるメチルエステル化を行い、GC-MS（GCMS-

ことを見出している。このように必須脂肪酸欠乏時の PI

QP2010 Ultra, 島津製作所）にて脂肪酸を解析した。

では、減少したアラキドン酸の代わりに同じ Δ5 位に二重3．結結合を持つミード酸が選択的に取り込まれた可能性がある。

果つ物質であり、様々な生命現象に関与するが、PI が他の

3. 1. HaCaT細胞におけるミード酸の産生抑制がストレス因子に及ぼす影響

リン脂質に比べて特徴的な脂肪酸鎖が必要である生物学的我々は、必須脂肪酸欠乏時のミード酸が Δ6 位不飽和化

意義は分かっていない。最近、PI の脂肪酸鎖を規定する

酵素を介して、オレイン酸（C18 : 1n-9）から産生されるこ遺伝子で、sn-2 位にアラキドン酸を導入するアシル基転とを明らかにしている 5）。そこで、Δ6 位不飽和化酵素の移酵素 lysoPI acyltransferase 1（LPIAT1）が同定された阻害剤 sc26196 を用いて、ミード酸の産生を抑制した際の10）細胞機能や炎症性因子に及ぼす影響を調べた。

PI は細胞内シグナル伝達において極めて重要な役割を持。LPIAT1 欠損マウスは脳の形態形成に異常があり、生後間もなく死に至る。しかし、必須脂肪酸欠乏時の皮膚に必須脂肪酸欠乏状態にあり、ミード酸が存在するヒト

おいてリン脂質の脂肪酸鎖の変化が皮膚のバリア異常とど

表皮角化細胞 HaCaTへの 50 µM の sc26196 添加よって、のように関わっているかは不明である。そこで本研究では、

ミード酸は 15% 程度まで減少した（図 1）。しかしなが必須脂肪酸欠乏の皮膚細胞において PI の特異的な脂肪酸

ら、他の多価不飽和脂肪酸の変化はみられなかった。また、組成がどのような意義を有しているか検討を行った。

MTT assay により、sc26196 添加による細胞死について

2．実

調べたところ、50 µM の sc26196 添加では細胞死はみられ験なかった（図 2）。

2. 1. 細胞培養

次に、必須脂肪酸欠乏におけるミード酸の産生抑制が皮ヒト表皮角化細胞株 HaCaT 細胞およびマウス線維芽
細 胞 株 NIH3T3 細 胞 は、10 %FBS と 1 %PS（PenicillinStreptomycin）と 1% ピルビン酸ナトリウムを含む DMEM培地で、37 ℃、5 %CO2 条件下で培養した。

2. 2. Δ6 位不飽和化酵素の阻害剤によるミード酸の産生抑制
必須脂肪酸欠乏状態にある HaCaT 細胞において、細胞播種の 48 時間後にミード酸産生酵素である Δ 6 位不飽和化酵素の阻害剤 sc26196 を 2, 10, 50 µM 添加し、24 時間後に細胞を回収した。

2. 3. TNF-αによる炎症誘導の条件

図 1 Δ6 不飽和化阻害剤による HaCaT 細胞の脂肪酸組成の変化
細 胞播 種の 48 時間 後に、50µM の sc26196 を添 加し、245ng/mLおよび20 ng/mL添加し、24時間後に細胞を回収した。
時 間 後 に 細 胞を回 収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vsControl

HaCaT 細胞において、細胞播 種 48 時間後に TNF-α を

2. 4. siRNAによる発現抑制
LPIAT1の siRNA には stealth RNAi（MSS246502 invitrogen）
を用い、コントロールには stealth RNAi Negative Control
Duplexe を用いた。NIH3T3 細胞において、細胞播種 24 時
間後に 20 nM のLPIAT1 の siRNA（stealth RNAi ; MSS246
502 invitrogen）
を Lipofectamine RNAiMAX を用いて導入
し、72 時間後に細胞を回収した。LPIAT1 の発現抑制効率
は定量 PCR を用いて確認した。

2. 5. ガスクロマトグラフィー質量分析装置（GC-MS）
による脂肪酸の分析
細胞は Bligh & Dyer 法にて脂質を抽出後、硫酸 - メタ

図 2 Δ6 不飽和化阻害剤添加が細胞死に及ぼす影響
細胞播種の 48 時間後に、50µM の sc26196 を添加し、24時間後に細胞を回収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vsControl− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

膚のバリア機能関連タンパク質であるフィラグリンやイン

皮膚バリア機能の低下を誘導する可能性が示唆された。

ボルクリンの遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。表皮は皮膚におけるバリア機能の異常に、皮膚細胞の炎症性因

約 95% が角化細胞で構成され、分化度の異なる角化細胞

子 13）や小胞体ストレス 14）の増加が関与しているという報が重層化した構造をしているが、バリア機能は主に最外層告がある。ミード酸産生を抑制した HaCaT 細胞では、炎である角層が担っていることが知られている。角層におけ症性サイトカインの IL-6 や IL-1β が増加し（図 4a）、小胞るバリア機能に関与する代表的なタンパク質として、フィ体ストレスマーカーである CHOP や GRP78 の遺伝子発現

ラグリンとインボルクリンが挙げられる。フィラグリンは、も有意に増加した（図 4b）。これらの結果より、ミード酸

角化細胞骨格を形成するケラチン線維を束ね、角層構造をの産生抑制による HaCaT 細胞の皮膚バリア機能の低下に強固に保つとともに、分解産物である天然保湿因子は、角は、炎症性サイトカインや小胞体ストレスの増加が関与し層の水分保持に関与している 11）。また、インボルクリンている可能性が示唆された。

は角層の細胞膜の内側に存在する不溶性タンパク質膜の主酸欠乏の HaCaT 細胞への sc26196 添加によってフィラグ

3. 2. HaCaT 細胞における必須脂肪酸欠乏時の炎症誘導がミード酸産生に及ぼす影響

リンやインボルクリン遺伝子発現は有意に減少した（図 3）。

我々は以前、必須脂肪酸欠乏状態のマウスマクロファ

したがって、表皮角化細胞におけるミード酸の産生抑制はージ細胞株 Raw264.7 細胞への炎症刺激によってミード酸

成分となり強靭な細胞構造を形成している 12）。必須脂肪

図 3 ミード酸産生抑制が皮膚バリア機能関連因子発現へ及ぼす影響
細胞播種の 48 時間後に、50µM の sc26196 を添加し、24 時間後に細胞を回収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs Control

図 4 ミード酸の産生抑制が炎症因子や小胞体ストレスに及ぼす影響
細胞播種の 48 時間後に、50µM の sc26196 を添加し、24 時間後に細胞を回収し、（a）
炎症サイトカインと（b）小胞体ストレスの mRNA を測定した。
Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs Control− 72 −

必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明の産生が抑制されることを明らかにしている（未発表）。必ていた（図 5a）。次に、皮膚バリア機能関連タンパク質の須脂肪酸欠乏時の皮膚細胞において炎症誘導が脂肪酸代謝

フィラグリンやインボルクリンの遺伝子発現を調べたとこに及ぼす影響は不明であることから、ヒト表皮角化細胞株

ろ、TNF-α 添加によってこれらの遺伝子発現は有意に減HaCaT 細胞を用いて、必須脂肪酸欠乏時の TNF-α による

少しており（図 5b）、HaCaT 細胞への炎症刺激によってバ炎症誘導が脂肪酸代謝に及ぼす影響を検討した。

リア機能低下が誘導されている可能性が示唆された。そこ

必須脂肪酸欠乏状態の HaCaT 細胞において、5 ng/mL

で、TNF-α による炎症誘導時の脂肪酸組成の変化を比較

及び 20 ng/mL の TNF-α 添加では細胞生存率に変化はみしたところ、ミード酸は Control の 33% まで減少した。しられなかったことから、以降の実験は 20ng/mL の TNF-α

かし、その他の脂肪酸組成に大きな変化はみられなかったを用いて行った。まず、炎症性サイトカインの IL-6 や（図 6）。したがって、炎症誘導によるミード酸の減少が皮IL-1β の遺伝子発現は TNF-α による炎症誘導時に増加し

膚のバリア機能の破綻に関与している可能性が示唆された。

図 5 TNF-α による炎症誘導と皮膚バリア機能関連因子への影響
細胞播種の 48 時間後に 20ng/mL の TNF-αと 50µM を添加し、24 時間
後に細胞を回収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05; 異なる文字間で有意差あり

図 6 HaCaT 細胞における TNF-α の炎症誘導による脂肪酸組成の変化
細胞播種 48 時間後に 20ng/mL の TNF-α を添加し、24 時間後に細胞を回収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs Control− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

しかしながら、皮膚細胞におけるミード酸の抗炎症作用に

現抑制細胞では mRNA が 20% 程度まで減少しており、こついては、ミード酸の添加実験を行うなどして明らかにすの添加濃度で LPIAT1 の発現抑制が十分に行われている

る必要がある。

ことを確認した。これらの細胞の各リン脂質のミード酸を比較したところ、LPIAT1 の発現抑制細胞では PI でのみ

3. 3. 線維芽細胞におけるリン脂質のミード酸減少が細胞機能に及ぼす影響
先の研究より、必須脂肪酸欠乏マウスにおいてミード酸

ミード酸の減少がみられ、ホスファチジルコリン（PC）やホスファチジルエタノールアミン（PE）での減少はみられなかった（図 7）。

はリン脂質の中でも PI での増加が著しいことを報告してそこでこれらの細胞を用いて、PI におけるミード酸のいる。必須脂肪酸欠乏時のミード酸は、PI の sn-2 位にア減少が細胞増殖やストレス応答に及ぼす影響を調べた。まラキドン酸を導入するアシル基転移酵素 LPIAT1 によっず、siLPIAT1 細胞において細胞増殖が亢進している可能て導入される可能性があることから、LPIAT1 の発現抑制性が示された（図 8）。

によって PI のミード酸が減少する可能性がある。そこで次に、LPIAT1 遺伝子発現抑制による小胞体ストレス

本研究では、培養細胞の中でもミード酸が多く分布するマや炎症性因子の遺伝子発現の変化を調べた。その結果、

ウス線維芽細胞 NIH3T3 を用いて、LPIAT1 の発現抑制に

LPIAT1 の発現抑制細胞でこれらのストレスマーカーに変よるリン脂質の脂肪酸組成の変化を調べた。LPIAT1 の発化はみられなかった（図 9）。したがって、PI におけるミー
ド酸の減少によって細胞増殖は促進するが、ストレス因子には影響を及ぼさないことがわかった。

図 7 LPIAT1 発現抑制細胞のリン脂質におけるミード酸の変化
細胞播種 24 時間後の細胞に 50nM の LPIAT1 の siRNA をト
ランスフェクションし、72 時間後に細胞を回収した。リン脂質を分 画 後、 各リン脂 質のミード 酸を比 較した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs siControl

図 8 LPIAT1 の発現抑制が細胞増殖に及ぼす影響
細胞播種 24 時間後の細胞に LPIAT1 の siRNA をトランスフェ
クションし、72 時間後に細胞を回収した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs siControl

図 9 LPIAT1 の発現抑制が小胞体ストレス及び炎症因子に及ぼす影響
細胞播種 24 時間後の細胞に LPIAT1 の siRNA をトランスフェクションし、72 時間後に細胞を回収した。小胞体ストレスのマーカーとして ATF-6、CHOP、PERK を、炎症性のマーカーとして IL-6 と IL-1β の mRNA を測定した。Mean±SE（n=3），＊；p<0.05 vs siControl− 74 −

必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明

4．考いる。生体膜リン脂質には、飽和脂肪酸から多価不飽和脂察

肪酸まで様々な脂肪酸が結合しており、多くの分子種が存

わが国において、通常の食生活で必須脂肪酸が欠乏する

在するが、PI は sn-1 位にステアリン酸、sn-2 位にアラキことは殆どないが、クローン病など脂質の吸収阻害がみら

ドン酸の分子種がその殆どを占めている。PI における脂れる場合や長期にわたって中心静脈栄養を行っている患者

肪酸鎖の特性の意義は不明であるが、必須脂肪酸欠乏時にでは、必須脂肪酸欠乏症が生じることがある。近年、高齢

PI でミード酸が増加したのは、減少したアラキドン酸の者における栄養不良が増加しており、また高齢者では脂質代わりに同じ Δ5 位に二重結合を持つミード酸が選択的に吸収能の低下もみられることから、今後栄養不良に伴う必PI に取り込まれたことが考えられる。LPIAT1 の遺伝子

須脂肪酸欠乏の高齢者などが増加する可能性がある。皮膚発現抑制では、PI でのみミード酸が減少し、細胞増殖がにおける脂質やタンパク質はバリア機能に重要な役割を果増加する傾向がみられた。siLPIAT1 ノックアウトマウス

たしていることが知られているが、皮膚における脂肪酸のでは PI のアシル基が 1 本少ない LysoPI が増加することが生理作用に関する報告は少なく、また必須脂肪酸欠乏時の報告されているが 15）、LysoPI は癌化したラット甲状腺上皮膚における脂肪酸代謝に関する知見はない。そこで本研

皮細胞において、細胞増殖を活性化させることが報告され究では必須脂肪酸欠乏状態の培養細胞を用いて、必須脂肪ている 16）。したがって、本研究でみられた LPIAT1 発現

酸欠乏時に産生されるミード酸の減少による「炎症性因子」抑制細胞における細胞増殖の亢進は、LysoPI の増加が関変化や、ミード酸の産生抑制による皮膚バリア機能の異常

与している可能性が考えられる。

を調べることで、ミード酸の皮膚における生理的意義について検討した。

一方、PI 由来のセカンドメッセンジャーであるイノシ
トール 1, 4, 5- 三リン酸（IP3）や、ジアシルグリセロール

まず、必須脂肪酸欠乏時のミード酸の産生抑制によっ（DAG）の産生には、ホスホリパーゼ C（PLC）という酵素て、皮膚のバリア機能因子であるフィラグリンとインボルが関与しており、PLC には 6 種類のアイソザイムが存在

クリンの遺伝子発現が減少し、バリア機能の異常が引き起する。PLC のアイソザイムのうち、PLCδ1 欠損マウスでこされている可能性が示唆された。in vitro の実験においは、表皮の肥厚や分化異常がみられたり 17）、PLCγ1 の発て、炎症刺激や小胞体ストレスによってフィラグリンやイ現抑制によりインボルクリンの発現が抑制されたりするな

ンボルクリンの発現が減少することが報告されていること

ど 18）、PI の代謝異常によって皮膚機能に異常がみられるから 13, 14）、炎症因子や小胞体ストレス因子への影響を調べことが報告されている。必須脂肪酸欠乏症でも表皮細胞のたところ、必須脂肪酸欠乏時のミード酸の産生抑制によっ異常による皮膚障害がみられるが、その発症メカニズムはて CHOP や GRP78 などの小胞体ストレス因子の遺伝子発不明である。必須脂肪酸欠乏では本来生理的に重要なアラ現の増加がみられた。必須脂肪酸欠乏時には魚鱗癬様の皮

キドン酸を持つ PI の代わりに、ミード酸を持つ PI が増加

膚障害がみられるが、魚鱗癬の症状がみられる先天性の皮することが、必須脂肪酸欠乏症の皮膚障害の要因であるこ膚疾患患者では CHOP のタンパク質発現が増加しており、とも考えられる。今回、LPIAT1 の発現を抑制することで小胞体ストレスの上昇が皮膚機能の異常を誘導している可PI におけるミード酸の減少はみられたが、炎症性サイト能性が示唆されている

14）。本研究において、HaCaT 細胞

カインなどのストレス因子に対する影響はみられなかった。

におけるミード酸の産生抑制により CHOP や GRP78 の遺本研究において PI におけるミード酸の特異的な増加がも伝子発現が増加したことから、小胞体ストレスが誘導されつ意義を明らかにすることはできなかったが、今後も必須

バリア機能異常が誘導された可能性があるが、今後この要脂肪酸欠乏時のミード酸の変化と皮膚の異常との関連につ因については詳細に検討する必要がある。

いて研究を進めることで、皮膚における脂肪酸の新たな機

また、我々は以前にマクロファージ様の Raw 細胞を用能を解明したいと考えている。

いて、抗炎症作用のある EPA（エイコサペンタエン酸）に比べて弱いながらも、ミード酸が抗炎症作用を有する脂肪（引用文献）酸であることを示している（未発表）。今回、必須脂肪酸欠1） George OB, Mildred MB, : A new deficiency disease

乏時のミード酸の産生抑制によって、炎症性サイトカイン

produced by the right exclusion of fat from the diet, J.

である IL-6 や IL-1β も有意に増加していたことから、必Biol. Chem., 82, 345-67, 1929.

須脂肪酸欠乏時のミード酸は炎症反応に対して抑制的に作

2） Innis SM, : Essential fatty acids in growth anddevelopment, Prog. Lipid Res., 30, 39-103, 1991.

用し、皮膚のバリア機能維持を担っている可能性が考えら

3） Lavrijsen AP, Bouwstra JA, Gooris GS, Weerheim A,れる。
必須脂肪酸欠乏時のミード酸はリン脂質の中でホスファ

Boddé HE, Ponec M, : Reduced skin barrier function

チジルイノシトール（PI）に多く分布することが報告されてparallels abnormal stratum corneum lipid organization− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016human involucrin gene, Cell, 46, 583-9, 1986.

in patients with lamellar ichthyosis, Invest. Dermatol.,13）Kim BE, Howell MD, Guttman-Yassky E, Gilleaudeau

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2012.

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Mead acid (20:3n-9), an indicator of essential fatty acid15）A n d e r s o n K E , K i e l k o w s k a A , D u r r a n t T N ,deficiency, Biochim. Biophys. Acta, 1841, 204-13, 2014.

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Nakasaki Y, Hattori M, Tanaka F, Udagawa O, Kono

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systemic interleukin-1 7 levels in mice, Nat Commun.,

Arai H, : LPIAT1 regulates arachidonic acid content

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in phosphatidylinositol and is required for cortical18）Xie W, Samoriski GM, McLaughlin JP, Romoser VA,

lamination in mice, Mol. Biol. Cell, 23, 4689-700, 2012.

Smrcka A, Hinkle PM, Bidlack JM, Gross RA, Jiang

11）Rawlings AV, Scott IR, Harding CR, Bowser PA, :H, Wu D, : Genetic alteration of phospholipase C beta3

Stratum corneum moisturization at the molecular level,

expression modulates behavioral and cellular responses

J. Invest. Dermatol., 103, 731-41, 1994.

to mu opioids, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10385-90,

12）Eckert RL, Green H, : Structure and evolution of the− 76 −

1999.

天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究
長崎国際大学薬学部薬品資源学研究室

宇都拓洋

Licorice (Glycyrrhiza spp.) is the most important ingredient for the Japanese Kampo medicine and the traditional
Chinese medicine, and has been reported to show various pharmaceutical functions. Liquiritin (LQ) and its aglycon
liquiritigenin (LQG) are major licorice flavonoids classified as a phloroglucinol. Our screening of components of licorice
extract revealed that LQ and LQG activate melanin synthesis in melanoma cells. In this study, we elucidated the molecularmechanism of melanin synthesis activated by LQ and LQG. In addition, we investigated the intracellular accumulationand target protein of LQ and LQG using anti-LQ/LQG monoclonal antibody (anti-LQ/LQG mAb). LQ and LQG activatedmelanin synthesis in mouse (B16-F1 and B16-4A5) and human (HMV-II) melanoma cell lines. LQ and LQG enhanced theexpression of tyrosinase (Tyr), TRP-1, and TRP-2. Molecular analysis suggests that LQ and LQG activate the p38 and PKA
signaling pathways leading to the MITF expression. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-LQ/LQG
mAb indicated that LQ and LQG cannot be detected in cellular lysate, and Western blotting using anti-LQ/LQG mAb as theprimary antibody demonstrated that LQ binds to an approximately 35-38 kDa protein. These results suggest that LQ and
LQG enhance melanin synthesis via the activation of p38 and PKA signaling pathways by binding to an approximately 3538 kDa protein.

１．緒る他、健康食品にも利用されている。さらに最近は、甘草言エキスや甘草フラボノイドが配合されている化粧品、育毛

メラニンはメラノサイトより合成され、紫外線や活性酸剤、染毛剤などが多く市販され、甘草の持つ美容効果への素種の刺激から皮膚を保護する役割を持つとともに、メラ

関心が高まっており、甘草エキス成分の機能解析や作用機

ニン合成の減少が白髪や白斑の原因になることが知られ序に関する科学的エビデンスが求められている。

ている 1, 2）。メラニンは、メラノサイト内のメラノソーム

我々は、これまでに約 30 種類の活性天然物に対するにおいて L- チロシンを出発物質として生合成されており、特異的モノクローナル抗体（mAb）の作製に成功しており、一連の合成反応は、チロシナーゼ（Tyr）、Tyrosinase-

それらを用いたアッセイ系の開発を中心に研究を行ってき

related Protein-1（TRP-1） お よ び TRP-2 に よ り 調 節

た 7-10）。さらに、これら抗天然化合物特異的 mAb をツーされている 3）。またこれらメラニン合成因子の発現は、ルとして、高感度 ELISA やドットブロットによる生薬成

Microphthalmia-associated Transcription Factor（MITF）

分定量法の開発、免疫染色による植物組織中の活性成分局がプロモーター領域の M-box に結合することで誘導され、在分布解明、主有効成分のみをアフィニティーカラムで除MITF の活性化は複雑なシグナル伝達系により制御されて去し、主要成分除去エキスを用いた生薬成分の相乗効果解

いる

4, 5）

。これまでメラニン合成を抑制する天然化合物の明などの応用研究を展開してきた 11-12）。そこで本研究は、探索およびその作用機序解明に関する報告は数多いが、メ

甘草エキス成分に対する特異的 mAb を作製し、細胞内でラニン合成を誘導する天然化合物に関する報告は少なく、の挙動や分子標的を解明し、甘草エキスのメラニン合成制

メラニン合成を促進することで皮膚がんや白髪予防、白斑御機構に関する新たな知見を見出すことを目的とした。

治療などが期待されることから、これらの研究が望まれている。

甘草成分の解析は国内外で盛んに行われてきており、約500 種の成分がこれまでに同定されている。主要生理活性

甘草は全漢方処方の約 7 割に配合される重要な生薬で、成分はグリチルリチン（GC）であることが知られているが、抗炎症、抗アレルギー、抗潰瘍など多くの薬効が知られてフラボノイド類（甘草フラボノイド）をはじめとする GC 以

6）

いる 。また甘草は、味噌や醤油などに甘味料と用いられ外の成分も、抗炎症、抗がん、抗菌作用など多彩な機能を持つことが報告されている 6, 13）。しかしながら、甘草エキス

Analysis of the mechanism of actionof constituents from licorice root using
monoclonal antibody against naturalcompounds
Takuhiro Uto
Department of Pharmacognosy, Facultyof Pharmaceutical Sciences, Nagasaki
International University

成分のメラニン合成への影響に関する報告はほとんどない。
本研究の初期実験として、甘草エキス成分のメラニン合成に与える影響をスクリーニングしたところ、代表的な甘草
フラボノイドであるリクイリチン（LQ）とそのアグリコン
であるリクイリチゲニン（LQG）（図 1）が、B16 メラノー
マ細胞においてメラニン合成誘導活性を持つことを見出し− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Healthcare）にて行った。

2. 5. 抗 LQ/LQG-mAb の作製
LQ-MeOH 溶液に、NaIO4-H2O 溶液を滴下し、室温で30 分間撹拌した。この反応液に 50 mM Carbonate Buffer（pH 9.6）で溶解した Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）
図１を滴下し、室温で 6 時間撹拌した。反応生成物を精製水

LQ および LQG の化学構造に対して透析し、凍結乾燥後、LQ-KLH コンジュゲートた。そこで本研究は、はじめに LQ および LQG のメラニンを得た。また同様の手法で LQ-Human Serum Albumin

合成に関与する酵素群、さらにそれらを制御する転写因子（HSA）コンジュゲートも作製した。これらの免疫複合体

やシグナル伝達分子への影響を解析し、さらに LQ および中の LQ の結合数を MALDI-TOF MS で確認後、マウスへ

LQG に対する mAb（抗 LQ/LQG-mAb）を作製することで、免疫感作し、抗体価が上昇した時点でマウスの脾臓細胞を

LQ および LQG の細胞内挙動と分子標的の解析を行った。

単離した。得られた脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞融合

２．実を行い、HAT セレクションによりハイブリドーマを選抜験

し mAb の作製を行った。

2. 1. 細胞培養
B16-F1 および HMV-II は ECACC、B16-4A5 は RIKEN

2. 6. 競合的 ELISAの確立

Cell Bank よ り 入 手 し た。B16-F1 お よ び B16-4A5 は50 mM Carbonate Buffer で溶解した LQ-HSA を 96-well

10% FBS 含 有 DMEM 培 地、HMV-II は 10 % FBS 含 有plate に 100 µL ず つ 分 注 し、 抗 原 を 固 相 化 し た。0.05%

RPMI1640 培地で培養した。

Tween-PBS（T-PBS）で洗浄後、300 µL の 5 % Skim MilkPBS）を加え、1 時間ブロッキングした。T-PBS で洗浄後、

2. 2. メラニン産生量測定

LQ もしくはセルライセートを 50 µL を加え、さらに抗 LQ/
4細胞を 24-well plate に 1×10 cells/well で播種し、1 日

LQG-mAb 溶液を 50 µL を分注した。1 時間の競合反応後、培養後、LQもしくはLQG を添加した。3 日培養後、細胞をT-PBS で洗浄し、100 µL の Horseradish Peroxidase（HRP）

120 µL の 1N NaOH で溶解し、415 nm の吸光度をマイク-labeled Anti-mouse IgG（Fc specific）Solution を 加 え

ロプレートリーダーで測定し、メラニン産生量を測定した。

さらに 1 時間インキュベートした。洗浄後、100 µL の 2,

2. 3. 細胞増殖抑制能測定を加え十分に発色したのち、405 nm における吸光度を測

2-Azino-di（3-ethylbenzthiazoline）Sulfonic Acid（ABTS）
細胞生存率は 3-（4, 5-Dimethylthiazol-2-yl）-2, 5-diphenyl

定した。

-tetrazolium Bromide（MTT）法を用いた。B16-F1 細胞を
96well plate に 0.2×10 4cells/well で 一 晩 培 養し、LQ もし

2. 7. 交差反応性の算出

くは LQG を添加した。3 日間培養後、MTT（5 mg/mL）を

LQ およびその類縁化合物に対する交差反応性を調べる

10 µLずつ各ウェルに添加し、さらに 4 時間培養した。沈殿ために、各種化合物を用いて競合的 ELISA を行った。各した MTT-formazanを 100 µL の 0.04N HCl–Isopropanolに種化合物の交差反応性は、サンプル非存在下での吸光度をて溶解し、マイクロプレートリーダーで吸光度（595 nm）を測

100% とし、吸光度が 50% 阻害される濃度（IC50）で算出した。

定した。

2. 8. LQ および LQG の細胞内蓄積量測定

2. 4. Western Blotting

B16-F1 細胞（1×106cells）を10 cm プレートに播種し、一B16-F1 細 胞（3×105cells） を 6cm デ ィ ッ シ ュ に 播 種

晩培養後、経時的に LQ もしくは LQG で処理した。細胞し一晩培養し、LQ もしくは LQG で処理した。培養後、回 収 は PBS で 細 胞 を 十 分 洗 浄 し、Proteinase Inhibitors

RIPA buffer で細胞溶解後、Protein Assay Dye Reagent

Cocktail を含む PBS で回収した。超音波破断機で細胞を粉Concentrate（Bio-Rad）にてタンパク量を定量した。SDS-

砕後、タンパク量を定量し、抗 LQ/LQG-mAb を用いた競PAGE は Laemmli 法を用い、等量のセルライセートタン

合的ELISAにてLQおよびLQGの細胞内蓄積量を測定した。

パクを Polyacrylamide Gel にて分離し、PVDF メンブラン

３．結に転写した。ブロッキング後、各種一次抗体中で 4 ℃下一晩処理し、HRP 結合二次抗体で１時間反応させた。検出果

3. 1. LQ および LQG のメラニン合成誘導能

は ECL Prime（GE Healthcare）を用いて LAS-1000（GE− 78 −マ ウ ス メ ラ ノ ー マ 細 胞 B16-F1 細 胞 に お け る LQ ま

天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究

た は LQG の メ ラ ニ ン 合 成 能 の 結 果 を 図 2A に 示 す。

ク質発現上昇に起因することが示唆された。

α-Melanocyte-Stimulating Hormone（α-MSH）はポジティブコントロールとして用いた。コントロール（未処理）と比較して LQ または LQG で処理した細胞ではメラニン合3. 3. LQまたは LQG の転写因子およびシグナル伝達
因子への影響成が誘導されており、その効果は LQ より LQG が強かっ

MITF は活性化されると核内へ移行し、Tyr、TRP-1、た。また同様の結果が B16-4A5 細胞やヒトメラノーマ細TRP-2 遺伝子のプロモーター領域の M-Box に結合するこ胞 HMV-II においても確認された（data not shown）。さらとにより転写活性を高める14）。CREB は MITF 遺伝子の転写に、LQ および LQG の細胞毒性は認められなかったことか調節を担い、
Akt、ERK、p38 により制御されている 14）。また、ら（図 2B）、LQ および LQG はメラニン合成促進能を有す

p38 と ERK は直接的に MITF を誘導することも報告されることが示唆された。

ている 15）。そこで、LQ および LQG のこれら転写因子およびシグナル伝達因子への影響を調べた。LQ または LQG は

3. 2. LQまたは LQG のTyr、TRP-1および TRP-2のタンパク質発現への影響
in vitro チロシナーゼ活性解析の結果、LQ および LQG は、

MITF タンパク質発現を誘導した（図 4A）。さらに図 4B に示すように、LQ または LQG 処理後 5 分より CREB、ERK、
p38 のリン酸化が誘導され、時間経過とともにリン酸化が直接的にチロシナーゼ活性を誘導しなかった（図 3A）。そ消失した。一方、PI3K-Akt 経路は、α-MSH の刺激によ

こで、メラニン合成に関与する酵素群の発現を解析したとり逆に不活性化されメラニン産生を誘導することが知られ

こ ろ、LQ お よ び LQG は 共 に Tyr、TRP-1、TRP-2 の 発ているが 15）、LQ および LQG による Akt リン酸化の抑制能現を誘導した（図 3B）。この結果より、LQ および LQG のは強くなかった。

メラニン合成促進能は、Tyr、TRP-1、TRP-2 のタンパ

A

さらに LQ および LQG のメラニン合成への各シグナル

B

図２

A

B16-F1 細胞における LQ および LQG のメラニン合成誘導能（A）、細胞生存率への影響（B）＊
p ＜ 0.01 vs control

B

図３

LQ および LQG の in vitro チロシナーゼ活性（A）、Tyr、TRP-1、TRP-2 発現への影響（B）− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

伝達系の関与を調べるために、PI3K 阻害剤（LY294002）、

ハイブリドーマを樹立し mAb を調製した。精製した mAb

p38 阻害剤（SB203580）、MEK 阻害剤（U0126）、PKA 阻害のアイソタイプのタイピングを行った結果、サブクラス剤（H-89）による LQ または LQG 誘導性メラニン合成へ与は IgG 2 a で軽鎖が κ の mAb であることを確認した。次にえる影響を解析した。図 5 に示すように、LQ または LQG

抗 LQ/LQG-mAb を用いて競合的 ELISA の確立を行った。

誘導性メラニン合成は、SB203580 と H-89 で抑制されたプレートに固相化した LQ-HSA と遊離の LQ との競合によことから、LQ および LQG のメラニン合成には p38 およびるアッセイ系を検討した結果、0.39 〜 25 µg/mL（0.93 〜

PKA が関与していることが示唆された。

59.75 µM）の濃度範囲内で吸光度との間に良好な直線関係が得られた（data not shown）16）。

3. 4. 抗 LQ/LQG-mAb の作製
さらなる LQ および LQG の作用機序解析を目的として
抗 LQ/LQG-mAb の作製を行った。今回我々は、LQ をハ

3. 5. 抗 LQ/LQG-mAb の交差反応性試験および構造活性相関

プテンとし KLH をキャリアタンパク質とした免疫原（LQ-

抗 LQ/LQG-mAb の特異性を調べるために、構造類似

KLH コンジュゲート）の調製を行った。LQ-KLH コンジ

化合物および各種天然化合物に対する交差反応性を競合

ュゲートの調製は、LQ の糖部を NaIO4 で開環し、開環し的 ELISA により測定し、IC50 を算出した。その結果、本た糖部のアルデヒドを KLH のリジン残基とアルカリ条件

mAb は、LQG（IC5 0 ＝ 3 3.0 9 µM）、Hesperetin（IC5 0 ＝下での縮合によりシッフベース形成することで作製した。

17. 83 µM）、Naringenin（IC50 ＝ 79.41µM）に対して交差

LQ-KLH コンジュゲートを免疫原としてマウスに免疫し、反応は示したものの、その他の Flavone 類および構造類似

A

B

図４

図５

LQ および LQG の MITF 発現（A）、CREB、Akt、ERK、p38 リン酸化（B）への影響

LQ および LQG 誘導性メラニン合成への各種阻害剤の影響
LY294002（LY）:10 µM、SB203580（SB）:10 µM、U0126（U）: 5 µM、H-89（H）: 2.5 µM− 80 −

天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究

化合物に対しては交差反応を示さなかった（表 1）。これら

的に LQ または LQG 処理した細胞から得られたセルライセの結果より、C-7 の hydroxyl 基と C-2 − C-3 間の単結合

ート中には LQ または LQG はほとんど検出されなかったが本 mAb の認識に重要な役割を果たしていることが示唆（data not shown）。

された。本 mAb は LQG も良好に認識することから、LQG
を用いて競合的 ELISA を行ったところ、1.56 〜 50 µg/mL

3. 7. LQ の結合タンパク質の検出（6.09 〜 195.12 µM）の濃度範囲内で吸光度との間に良好な

LQ および LQG の標的分子同定を目的として、抗 LQ/

直線関係が得られた。よって本 mAb は LQ と LQG に非常LQG-mAb を一次抗体とした Western Blotting を行った。

に特異性が高い mAb であり、LQ および LQG の作用機序

抗 LQ/LQG-mAb は LQG よりも LQ に対する反応性が強い

解析に有用なツールになりうる可能性が示唆された16）ことから、LQ 処理細胞由来のセルライセートの解析を行。

った。図 6 に示すように、コントロールおよび LQ 処理由3. 6. LQ および LQG の細胞内蓄積

来のセルライセートにおいて非特異的なバンドがいくつか

LQ または LQG 処理した B16-F1 細胞から調整したセル
ライセート中の LQ および LQG の蓄積量を、抗 LQ/LQG-

検出されるが、LQ 処理 5 分において 35-38kDa 付近に LQ
結合タンパク質のバンド（◀）が検出された。

mAb を用いた競合的 ELISA で測定した。60 分以内で経時
表１

抗 LQ/LQG-mAb の交差反応性

図６ 抗 LQ/LQG-mAb を用いた Western Blottingによる LQ 結合タンパク質の検出− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

４．考および LQG 量を測定したが、LQ および LQG はほとんど

察

検出されなかった。この結果は、セルライセート中の LQ

本研究は、代表的な甘草フラボノイドである LQ とそのおよび LQG 量が ELISA の感度の 0.39 〜 25 µg/mL（0.93

アグリコンの LQG の持つメラニン合成誘導能に注目し研〜 59.75 µM）以下であるため検出できなかったと考えられ、究を行った。近年 LQ および LQG の生物活性に関する報告

LQ および LQG は細胞内には多く取り込まれずに細胞膜表は多くなっているが、メラニン合成に関する報告は皆無で面のレセプター等に関与していると考えている。さらにある。LQ および LQG は、マウスメラノーマ細胞（B16-F1、

抗 LQ/LQG-mAb を一次抗体とした Western Blotting の結B16-4A5）およびヒトメラノーマ細胞（HMV-II）において果、LQ で 5 分処理した細胞由来のセルライセートにおいて、メラニン合成を促進し、その効果は LQ より LQG が強かっ35-38kDa 付近に LQ 結合タンパク質のバンドが検出された。また、LQ および LQG はチロシナーゼ酵素活性に直接た。これは p38、ERK、CREB がリン酸化された時間とも的に影響せず、Tyr、TRP-1、TRP-2 の発現を高めるこ

一致していることから、LQ 結合タンパク質のメラニン誘とでメラニン合成を促進していることが明らかになった。

導機構への関与が示唆される。

さらに転写因子・シグナル伝達系の解析や各種阻害剤にケミカルバイオロジー研究の発展により、天然化合物

よる解析結果をまとめると、LQ と LQG は p38 及び PKAの標的分子の同定を試みる研究が活発になってきている活性化を引き起こし、CREB のリン酸化誘導を介する経が、天然由来の生理活性物質の多くは単一ではなく複数の路もしくは直接的に MITF の発現を誘導することで、Tyr、標的をもつことや、標的分子との結合様式やアフィニティ

TRP-1、TRP-2 の発現を高めてメラニン合成を促進してーの違いが多様であり解析が困難な点が多い。現在の標的いることが示唆された（図 7）。

分子解析法として、アフィニティークロマトグラフィー法

さらに我々は、LQ および LQG の細胞内での挙動・分布、や分子プローブ法が広く知られているが、これらの手法で標的分子の同定を目標として、特異的 mAb の作製を行っは限界があるため新しい手法が求められている。我々はた。本研究では、LQ-KLH コンジュゲートを免疫原とし抗天然物特異的 mAb をツールとして、生薬成分の細胞やてマウスに免疫することでハイブリドーマを樹立し、抗組織内の局在解明や標的分子同定に取り組んでいる。本

LQ/LQG-mAb の作製に成功した。本 mAb は、LQ と LQG

手法は生薬成分の構造を修飾する必要はなく、生細胞や組に加えて Hesperetin と Naringenin に対して交差反応は示織での解析が可能という利点がある。しかしながら、目的

すが、その他の Flavone 類及び構造類似化合物に対しては成分と標的分子の結合部位と、抗体のエピトープが近い

交差反応を示さないことから、LQ および LQG の作用機序位置であれば抗体が結合できずに検出できない可能性が解析に有用なツールになりうる可能性が示唆された。抗ある。また、目的成分と標的分子間の結合様式が弱い場合

LQ/LQG-mAb を用いた競合的 ELISA を用いて、LQ およ

は、Immunocytochemistry（ICC）や Western Blotting でび LQG 処理した B16-F1 細胞由来セルライセート中の LQは検出できない恐れもある。本研究で用いた抗 LQ/LQGmAb は、Western Blotting では LQ 結合タンパク質を検出できたが、ICC では良好な検出ができなかった（data notshown）。今後、LQ 結合タンパク質を抗 LQ/LQG-mAb を用いた免疫沈降法により単離し、質量分析法により標的タ
ンパク質を同定する予定である。またエピトープの異なる
mAb による ICC や Western Blotting に加えて、アフィニ
ティークロマトグラフィー法や分子プローブ法も行うこと
で、LQ および LQG の細胞内の挙動・局在や標的分子同定を確実なものとしたい。抗天然化合物特異的 mAb を用いた解析が、メラニン合成を制御する天然化合物の作用機構に関する新たな知見に繋がることを期待している。
（謝

辞）本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご支援いただきましたことに深く感謝申し上げます。また、本研究の共同研究者である長崎国際大学薬学部の正山征洋
教授、健康管理学部の藤井俊輔助手のご助言およびご協力
図７

LQ および LQG によるメラニン合成促進の分子機構に心より御礼申し上げます。

− 82 −

天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究（引用文献）

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− 83 −

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム
岐阜大学大学院医学系研究科生命機能分子設計分野

大沢匡毅

The skin epidermis serves as a protective barrier that shelters the body from environmental insults and dehydration.
Defects in skin barrier result in various forms of skin inflammatory diseases including psoriasis and atopic dermatitis, themost common diseases in the human population. Therefore, understanding molecular basis of skin barrier formation has
important implications for establishing effective therapeutic strategies for such skin disorders.
One of the key aspects of terminal differentiation of epidermal keratinocytes is dynamic cellular remodeling, in which
various filamentous proteins and lipids are cross-linked to form rigid bundles and cell organelles including nucleus andmitochondria are eliminated to induce cell death. Although each of these processes has been extensively studied, themolecular mechanism that coordinates these events to achieve the dramatic cellular remodeling is poorly understood.
One candidate mechanism that enables such quick remodeling might be autophagy, a process that promotes cellular selfcannibalization. Autophagy is an intracellular bulk degradation system that delivers cytoplasmic organelles and proteinsto the lysosome, where they are degraded to be quickly eliminated from the cell. Accumulating evidence indicates that
autophagy has been implicated in wide range of the cellular remodeling that occurs during organogenesis, thereby enabling
cells to rapidly differentiate or change their fate in order to acquire new functions. Therefore, we hypothesize that theinduction of autophagy may play an important role in promoting epidermal terminal differentiation. In this study, we aim at
obtaining an experimental proof for the involvement of autophagy in the regulation of epidermal terminal differentiation andbarrier formation. Our study will uncover a novel role of autophagy in regulating epidermal barrier formation and provide
new insights into development of novel therapeutic strategies for skin disorders.

1．緖

アウトしたマウスを作成したところ、角化層形成が著し言く低下していることを認めた。この結果から Notch シグナ

皮膚は生体内の環境と外界とを隔てるバリアとして働く。

ルの活性化が角化層の形成に対し必須な作用を持つことがこのような皮膚上皮のバリア機能は、皮膚上皮の最上層に判明した 4）。我々は、Notch シグナル経路の下流で角化層存在する角質層によって維持されている。従来の研究によの形成を制御する分子を検索し、オートファジー制御分って、角質層の機能異常による皮膚のバリア機能の低下が子 Bnip3 に注目するに至った。遺伝子発現解析実験により

1）

さまざまな皮膚病の原因となっていることが示されている 。

Bnip3 の発現が Notch シグナルの支配下で制御されている

角質層は、細胞骨格の再編成、脱核、ミトコンドリアや細ことが確認され、また、組織学的解析により皮膚の顆粒層

胞内小器官の除去、細胞死など、上皮細胞がダイナミック

細胞に Bnip3 の発現が局在していることが示された。さら2）なリモデリングを果たすことによって形成される 。しかに、培養ケラチノサイトを用いて Bnip3 の分子機能解析をし、このような細胞のダイナミズムがどのような分子的機行い、Bnip3 がケラチノサイトのオートファジーを誘導す

構によって制御されているのかについては明らかにされてるとともに細胞分化を促進する作用を持つことを明らかにいない。近年の研究から、細胞内小器官のクリアランスにした 5）。しかし、Bnip3 ノックアウトマウスでは皮膚上皮

オートファジーが中心的な役割を果たしていることが示さの角質化が正常に起こることから、生体内のケラチノサイ

れている 3）。そこで、我々は、皮膚上皮の角質化の過程に

トでは Bnip3 の作用を補完する何らかの分子が存在してい

おいても細胞のリモデリングにオートファジーが何らかのることが考えられた。
以上の成果を踏まえ、本研究では、Bnip3 の類縁分子で役割を果たしているという仮説を考えた。
我々は、従来の研究で、皮膚上皮細胞の増殖分化の制ある Nix（Bnip3l）に注目し3）、Nix が Bnip3 と協調的に働く

御に Notch シグナルが中心的な役割を果たしていることをことによってケラチノサイトのオートファジー誘導や細胞4）示した 。Notch シグナルを皮膚上皮細胞特異的にノック分化が制御されているという仮説を立て、ケラチノサイト
に対する Nix の分子機能を明らかにすることを目標に研究を進めた。

Molecular mechanisms of epidermal
cornification during skin development
Masatake Osawa
Department of Regeneration and Applied
Biomedical Sciences, Graduate School of
Medicine, Gifu University

2．実験

2. 1. マウス皮膚切片および培養ケラチノサイトの免
疫組織染色− 84 −

子宮から取り出したマウス胎児を PBS で洗浄後、氷上皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム

で冷やした 4 ％ PFA 溶液に浸し、800w の電子レンジで 1

チノサイトの懸濁液を予めコラーゲンゲルを形成させたカ

分間マイクロウエーブ処理をした後に氷上で 30 分間放置

ルチャーインサート上に添加し、CnT-PR 培地を加え細胞し固定を行った。マウスの胎児または新生児から採取したがコンフルエントになるまで培養を行った。その後、イン皮膚片についても同様な方法によって固定を行った。固定

サート内の培地を除去し，細胞を空気曝露させた。インサした胎児または皮膚片は OTC コンパウンドに包埋し液体ート外に CnT-PR-3D を添加し、CO2 インキュベーター内

窒素中で凍結させ凍結ブロックを作成した。

で 14 日間培養を行い、皮膚上皮の積層化を誘導させた。

クリオスタットにより厚さ 10µm の切片を作成した。凍
結切片を 4 ％ PFA 溶液に浸し 0 ℃で 10 分間固定を行った。

2. 3. 培養ケラチノサイトの分化誘導

固定後、切片を PBS+1% SDS 溶液に浸し室温で 10 分放置

初代培養ケラチノサイトに TryLE Express（Gibco 社）

し抗原賦活化処理を行った。その後、切片を PBS+0.05%を加え、細胞をディッシュから剥離させた後に、0.5 mM

Tween-20 によって 5 回洗浄することにより浸透化処理

CaCl2 を添加した CnT- 02 培地（CELLnTECH 社）に細胞をを行った。浸透化した切片を PBS+5% Skim milk+0.05%

懸濁し、非付着性ペトリディッシュ上に播種し浮遊細胞培

Tween-20（ブロッキング液）に浸し 4 ℃で一晩ブロッキ養を行った。分化誘導後、継時的に細胞を回収し、qRT-

ングを行った。ブロッキングを行った切片に対し、1 次抗体

PCR アッセイおよびウエスタンブロッティングによりケを含むブロッキング液を添加し室温で 1 時間反応をさせた後ラチノサイトの各種マーカー分子の発現変化を解析した。

に、Alexa 488 またはAlexa 555 をコンジュゲーとした 2 次抗体と反応させた。抗体染色を終えた切片は、PBS+0.05%

2. 4. siRNAを用いた遺伝子ノックダウン

Tween-20 によって 3 回洗浄した後、DAPIを含むAnti-fade

初代培養ケラチノサイトに対し、Lipofectamine RNAigold（In Vitrogen社）
封入剤を添加しカバーグラスで封入した。

MAX（In Vitrogen 社）を用いて siRNA のトランスフェク

封入後のサンプルはコンフォーカル顕微鏡によって観察ションを行った。トランスフェクションに用いた siRNAを行った。

は以下の通りである。
Nix-si#1: GCCATGCAGTTACATCTCTTT

2. 2. マウスケラチノサイトの初代培養および 3 次元
重層化皮膚上皮構築培養

Nix-si#2: GCCTAGACATACATGAAACTT

胎 生 15 日 目 の マ ウ ス 胎 児 か ら 皮 膚 を 採 取 し、PBS

Scrambled: GTTCGTAACCATGCCTCTATT

Nix-si#3: GTCCATCAGTGAGCTTGTACA+1mM EDTA 溶液の表面上に浮かせ 37 ℃で 1 時間イン

3．結

キュベートした。実体顕微鏡下でピンセットを用いて表果

皮と真皮を分離した後、表皮を TrypLE Express（Gibco

3. 1. マウス皮膚上皮発生期におけるNixの発現パターン社）上にのせ、37 ℃で 20 分間インキュベートした。その皮膚上皮は胎児期 14 .5 〜 15 .5 日目に基底層の細胞が積後、ペトリディッシュの底面に表皮を擦りつけ細胞を解離層化を開始することによって始まり、胎児期 18 . 5 日目頃にさせた。解離した細胞を CnT-57 培地（CELLnTECH 社）

角化層形成が起こり皮膚上皮の発生が完了する。皮膚上皮に懸濁し、遠心分離によって細胞を回収した。細胞を 4×発生過程における Nix の発現パターンを調べるために、胎4210 個 /cm になるように播種し培養を行った。ケラチノ

児期 15 .5 日目以降の皮膚切片を作成し、抗 Nix 抗体を用

サイトの 3 次元重層化培養は、3D Keratinocyte Starter

いて免疫組織染色を行った。その結果、皮膚上皮におけるKit（CELLnTECH 社）のプロトコールを改変して行った。

Nix の発現は胎児期 16 .5 日目以降から認められるように

Millipore カルチャーインサートの培養膜上に 1 型コラーなり、その発現は顆粒細胞層に限局していることが判明し6

ゲンを加えゲルを形成させた。1×10 個 /mL の培養ケラた（図 1）。顆粒層は角化層へと最終分化を起こす過程にあ

図 1 マウス胎児皮膚上皮における Nix の発現パターン
胎生 15.5 日目、16.5 日目、および 17.5 日目から採取した皮膚切片を抗 Nix 抗体および抗ケラチン 15抗体を用いて免疫組織蛍光色染色を行い、コンフォーカル顕微鏡によって観察した。Nix の発現は胎生
16.5 日目より認められるようになり、その発現は皮膚上皮の顆粒層に局在していることがわかった。

− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る細胞であることから、Nix が最終分化に何らかの作用を対しては Nix の方がより鋭敏に反応することを示している。
従来の報告から、Nix はオートファジー（ミトファジー）

果たしていることが考えられた。

を誘導することで細胞からミトコンドリアを除去する働き

3. 2. 培養ケラチノサイトを用いたNixの分子機能解析を持つことが示されている 7）。このことから、浮遊培養に

ケラチノサイトをカルシウムイオン存在下で浮遊培養をよって誘導される Nix の発現上昇がケラチノサイトにおけ行うと、ケラチノサイトは速やかに最終分化を起こし、脱るミトコンドリア除去に関与している可能性が考えられた。

6）

核まで至る 。このようなケラチノサイトの分化誘導培養

このような可能性を調べるために、浮遊培養による分化誘系を用いて、Nix の分子機能解析を行った。

導刺激によりケラチノサイトにおいてオートファジーが起はじめに、ケラチノサイトの分化と Nix との発現の関連

こるかどうか検討を行った。浮遊培養 12 時間後のケラチ性を調べるために、浮遊培養開始前のケラチノサイトとノサイトをサイトスピンによって回収し、抗 LC3 抗体と

24 時間の浮遊培養を行ったケラチノサイトをそれぞれ回収

抗 Nix 抗体を用いて細胞免疫染色を行った。その結果、浮し、ケラチノサイトの分化マーカーであるKrt1 と Krt10 の遊培養後のケラチノサイトにおいて Nix の発現が認められ遺伝子発現量および Nix の遺伝子発現量を qRT-PCR 法にるとともに、細胞質に LC3 陽性の顆粒が観察され、オーよって比較定量を行った。その結果、Krt1と Krt10 同様

トファゴソーム形成が起こっていることが示唆された。また、に、Nix の遺伝子発現量が細胞分化誘導刺激により著明に浮遊培養後のケラチノサイトを経時的に回収し、抗 LC3 抗

上昇することを認めた（図 2）。一方、Nix の類縁分子であ体を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、オる Bnip3 については分化誘導刺激の前後においてその発現

ートファゴソーム形成を示す LC3B-II のバンドが時間経過量に有意な差が認められなかった。我々は、従来の報告でとともに増強することが明らかになり、ケラチノサイトに

Bnip3 がケラチノサイトの分化に重要な働きをしているこ

おいてオートファジーが誘導されていることが判明したとを示したが、この結果より、浮遊培養による分化刺激に（図 3）。また、浮遊培養後のケラチノサイトを、抗 LC3 抗体および抗ミトコンドリア抗体（Tomm 20）を用いて免疫染色を行ったところ、LC3 陽性のオートファゴソームとミトコンドリアが共局在していることが観察され、浮遊培養後のケラチノサイト中でミトファジーが起こっていることが示唆された。また、より長期間の浮遊培養を行ったケラ
チノサイトの中には、脱核を完了しミトコンドリアを失っ

図 2 ケラチノサイトの分化誘導開始前後における各種遺伝子の発現変化および Nix 遺伝子ノックダウンが分化に及ぼす影
響
浮遊培養による分化誘導前のケラチノサイトと、24 時間分化
誘 導を行ったケラチノサイトから RNA を回 収した後、qRTPCR 法によってそれぞれの遺伝子発現量を比較定量した。Nixに対する siRNA をトランスフェクションしたケラチノサイトについても同様な定量を行った。

図 3 ケラチノサイトの分化刺激によって起こる Nix の発現誘導とオートファゴソーム形成
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った。その後ケラチノサイトを回収し、抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、
抗 Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。

− 86 −

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズムた細胞が認められ、これらは Nix を強く発現していることられた。そこで、皮膚上皮形成の過程をより忠実に再現でがわかった（図 4）。これらの結果から、ケラチノサイトのきる皮膚 3 次元培養系を用いて、ケラチノサイトに対する分化誘導に伴い、Nix の発現、ミトファジーの誘導、およNix の分子機能について再検討を行った。
培養ケラチノサイトをコラーゲンゲルの上に播種し空気びミトコンドリアの排除がシークエンシャルに起こることに暴露し積層化を誘導した。培養 9 日目には積層化が完了が明らかになった。
ケラチノサイトにおけるNix の機能を調べるために、siRNAし、顆粒層および角化層が認められ、組織学的所見上は生を用いて Nix 遺伝子のノックダウンを行い、ケラチノサイ

体の皮膚上皮と同等な構造が観察された。このようにしてトの分化やオーファジー誘導に対する影響を調べた。Nix

作成した 3 次元構成皮膚の切片を、抗 LC3 抗体、抗ミトに対する 3 つの異なる siRNA を設計し、ノックダウン効

コンドリア抗体、および抗 Nix 抗体を用いて免疫染色を行率が 90% 以上であることを確認した。Nix に対する siRNAった。その結果、3 次元構成皮膚においても、顆粒層およをトランスフェクションした培養ケラチノサイトに対して

び角化層からミトコンドリアが消失していることが観察さ

浮遊培養によって分化刺激を与えた後、分化マーカー遺伝

れるとともに Nix の発現とオートファゴソームの形成が認子の発現量を qRT-PCR 法によって比較定量するとともに、められ、生体の皮膚上皮と同様な現象が起こっていること

抗 LC3 抗体を用いてウエスタンブロッティング法によりがわかった（図 6）。そこで、Nix の分子機能を調べるために、

オートファゴソーム形成に対する影響を解析した。その結

予め Nix に対する siRNA をトランスフェクションした培養

果、Nix のノックダウンにより、浮遊培養刺激誘導性のケ

ケラチノサイトを用いて皮膚 3 次元培養を行った。その結ラチノサイトの分化に遅延が起こるとともに、オートファ

果、Nix に対する siRNA によって処理を行ったケラチノサ

ゴソーム形成が低下することが認められた。これらの結果

イトを用いた場合には、積層化が著しく阻害され、明瞭なから、Nix がケラチノサイトの分化やオートファジーの誘皮膚上皮が形成されなかった（図 6）。この結果より、Nix

導に重要な役割を果たしていることが示唆された（図 5）。

はケラチノサイトの分化や積層化構造の構築に必要な役割を果たしていることが示唆された。

3. 3. 皮膚 3 次元培養系を用いた Nixの分子機能解析

4．考

以上の研究では、ケラチノサイトの浮遊培養系を研究

察ツールとして用いて Nix の分子機能解析を行った。しかし、本研究では、ケラチノサイトの分化や角化細胞形成に対このような培養系は人為的であり、それによって得られたする Nix の役割について検討を行った。これまでに、皮膚知見についても生理的現象を反映していない可能性が考え上皮における Nix の発現について解析された例はない。そ図 4 ケラチノサイトの分化刺激によって起こるミトファジーとミトコンドリアの消失
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った後、ケラチノサイトを回収し、抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、抗Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。
左写真：ミトコンドリアとオートファゴソームの共局在が認められることよりミトファジーが起こっていることがわかる。右写真：
分化誘導刺激 24 時間後には脱核しミトコンドリアを失った細胞が認められた。

図 5 ケラチノサイトの分化刺激によって起こるオートファジ
ー誘導
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った後、経時的にケラチノサイトを回収し、抗 LC3 抗体を用いてウ
エスタンブロッティング法によりオートファゴソーム形成に対する影響を解析した。オートファゴソーム形成が起こるとLC3 の C 末がリン脂質と共有結合を起こし、LC3-BII の割合が増加する。

− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 6 A、B：皮膚 3 次元培養において認められるオートファジー誘導とミトコンドリアの除去、C：
Nix のノックダウンが皮膚 3 次元培養に及ぼす影響
A、B：ケラチノサイトの 3 次元培養によって作成された皮膚片を抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、
抗 Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。白矢印で挟んだ領域では Nixの発現およびオートファジーが認められミトコンドリアが存在しない。C：Nix のノックダウンしたケ
ラチノサイトを用いた場合は積層化が起こらない。

こで、本研究では、まず、免疫組織染色法を用いて皮膚与していることが示唆された。また、我々は、従来の研究

上皮発生過程における Nix の発現パターンを詳細に解析しにおいて、Bnip3 の分子機能解析を行い、Nix と同様にた。その結果、Nix が皮膚上皮の顆粒層に限局して発現し

Bnip3 についてもケラチノサイトの分化やオートファジーていることが明らかになった。我々は従来の研究において、制御に関与していることを報告している 5）。これらの研究

Nix の類縁分子である Bnip3 も顆粒層に発現していること

結果より、Nix と Bnip3 が相加的もしくは相乗的に作用すを報告している。これらの結果から、皮膚上皮顆粒層のることにより、ケラチノサイトが制御されている可能性が細胞には Nix と Bnip3 が共に発現していることが示された。

考えられる。実際に、Nix と Bnip3 については、ともにオ

今後、これらの分子についてより詳細な機能解析を行うたートファゴソームの膜上に存在する LC3/GABARAP タン

めには、遺伝子ノックアウトマウスを作成し、皮膚上皮にパク質と結合することによりミトコンドリアを選択的にオおける表現型について詳細に解析を行う必要がある。Nix

ートファゴソームへとリクルートする機能を持つことが示と Bnip3 は互いに重複する機能を持ち、それぞれを補完しされており3）、ミトファジーを誘導するという点においてこ

あうことができる。皮膚上皮に Nix と Bnip3 が共発現してれらの分子は同様な機能を有している。本研究において、いるという結果から、遺伝子ノックアウトマウスを作成し我々は、皮膚上皮の顆粒層ではオートファジーが誘導され分子機能解析を行う際には、これらの分子の補完作用を避ているとともにミトコンドリアが消失していることを見出けるために、双方の遺伝子を同時にノックアウトしたマウした。これらのことから、ケラチノサイトにおいても、スを作成する必要性が考えられる。我々は、すでに双方のNix と Bnip3 が協調的に働くことによりミトコンドリアの遺伝子を皮膚上皮特異的にノックアウトしたマウスの作成

クリアランスを行い、最終分化に伴うダイナミックな細胞に着手している。

のリモデリングを可能にしていることが考えられる。

本研究では、培養ケラチノサイトを用いて Nix の発現解一方で、本研究では、Nix と Bnip3 の発現制御機構や分析および分子機能解析を行った。その結果、ケラチノサイ

子機能に相違点があることも認められた。Nix mRNA のトの分化に伴い Nix の発現が著明に上昇するとともにオー

発現はケラチノサイトの浮遊培養刺激により速やかに上昇

トファゴソームの形成が誘導されることを見出した。また、することが認められたが、Bnip3 の発現量は分化誘導刺激

Nix 遺伝子の発現を siRNA によってノックダウンしたとこの前後で変化することがなく一定に保たれていた。また、ろ、ケラチノサイトの分化とオートファゴソーム形成が遅Nix をノックダウンしたケラチノサイトを用いて皮膚の 3延することが認められた。これらの結果より、Nix がケラ次元培養を行った場合は積層化が著しく阻害されたが、チノサイトの分化や分化に伴うオートファジーの誘導に関

Bnip3 をノックダウンしたケラチノサイトを用いた場合は− 88 −

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム

30 (3) :277-279.

このような著明な異常は観察されなかった。これらの結果から、両者の遺伝子の発現が異なる仕組みにより制御され2） Candi E, Schmidt R, & Melino G (2005) The cornifiedている可能性が考えられ、また、両者の分子機能やその作

envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev

用の仕方にも違いがあることが示唆される。実際に、Nix

Mol Cell Biol 6 (4) : 328-340.

はミトコンドリア膜の脱分極を誘導することにより活性化

3） Ney PA (2 0 1 5) Mitochondrial autophagy: Origins,

酸素の産生を上昇させオートファジーを誘導する作用を持

significance, and role of BNIP3 and NIX. Biochim

8）

Biophys Acta 1853 (10 Pt B) : 2775-2783.

つことが示されているが 、Bnip3 は活性化酸素非依存性
9）にオートファジーを誘導することが報告されており 、両4） Moriyama M, et al. (2 0 0 8) Multiple roles of Notch

者はオートファジー誘導能を持つという点においては同様

signaling in the regulation of epidermal development.

な機能を持つが、その作用メカニズムは異なることが推測

Dev Cell 14(4):594-604.

される。近年、ケラチノサイトの分化を誘導するためには

5） Moriyama M, et al. (2014) BNIP3 plays crucial roles

ミトコンドリアから産生される活性化酸素が必須な役割をin the differentiation and maintenance of epidermal

もつことが報告された。本研究では、Nix がケラチノサイ

keratinocytes. J Invest Dermatol 134 (6) : 1627-1635.

トの分化誘導に重要な役割を果たしていることが示された

6） Li L, Tennenbaum T, & Yuspa SH (1996) Suspension-

が、このような分化誘導は Nix によるミトコンドリアから

induced murine keratinocyte differentiation is mediatedby calcium. J Invest Dermatol 106 (2) : 254-260.

の活性化酸素の産生制御を介して行われている可能性が考7） Sandoval H, et al. (2 0 0 8) Essential role for Nix in

えられる。

autophagic maturation of erythroid cells. Nature

本研究によって、皮膚上皮の角質化の過程にオートファ

454(7201):232-235.

ジーが関与していることが示唆された。一般的に、ストレスにより肌の調子が悪くなるということが広く信じられて

8） Ding WX, et al. (2010) Nix is critical to two distinct

いる。オートファジーはさまざまなストレスの影響を受け

phases of mitophagy, reactive oxygen species-、ストレスによってオートファジー活性がmediated autophagy induction and Parkin-ubiquitin-

変化することを介して角化層の機能が変化する可能性が考

p62-mediated mitochondrial priming. J Biol Chem 285

えられる。本研究のさらなる発展によって、皮膚のオート(36) : 27879-27890.

ることから

10）

ファジー制御機構の分子的詳細が明らかにされれば、皮膚

9） Quinsay MN, Thomas RL, Lee Y, & Gustafssonの健康を維持するための方策として、オートファジー制御

AB (2010) Bnip3-mediated mitochondrial autophagy

を標的にした新たなアプローチ法を開拓できる可能性があis independent of the mitochondrial permeability

る。

transition pore. Autophagy 6 (7) : 855-862.
10）Huang Z, Zhou L, Chen Z, Nice EC, & Huang C（引用文献）(2016) Stress Management by Autophagy: Implications

1） Ramos-e-Silva M & Jacques C (2 0 1 2) Epidermal
barrier function and systemic diseases. Clin Dermatol− 89 −

for Chemoresistance. Int J Cancer.

香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科

柏谷英樹

To reveal the central neuronal circuit underlying the odorant-X induced analgesia, I examined the contribution of
hypothalamic orexin neurons, one of the higher centers for the intrinsic analgesia-system. Formalin test revealed that theodorant-X induced analgesia was not observed in orexin mutant mice, indicating that the orexin neurons are essential for theodorant-X induced analgesia.

1．緒

言

世界には多様な香気が存在するが、その中の一部は鎮痛効果を持つことが予想されており、一部の民間療法では香気療法が取り入れられている。実際、いくつかの香気分子は末梢組織において鎮痛効果を持つことが証明されている。
例えばウィンターグリーン（ツツジ科）
由来の香気分子であるサリチル酸メチルは独特の香気を持つが、体内に摂取されるとサリチル酸へ代謝され、末梢で COX-2 を阻害しプ
ロスタグランジン生成を阻害することで鎮痛効果を発揮する。しかしながら、香気成分が「香り」
として、言い換えれば嗅覚系を介した嗅覚入力として鎮痛効果を持つのか、もし持つならばそれはどのような神経回路メカニズムが介在するのか、については明らかになっていない。
本申請者は、この嗅覚系を介した鎮痛効果を検証しようと考え、種々の匂い暴露下で 疼痛行動（ホットプレート
テスト及びホルマリンテスト）を観察し、鎮痛効果を持つ
匂い分子 odorant-X（テルペノイドの一種。未発表データであるため仮称）を見出した。図 1 は、ホルマリンテスト
における odorant-X の鎮痛効果を調べたデータである。ホルマリンテストでは特徴的な 2 相性の疼痛行動を示すが、図1

odorant-X 香気暴露により両相で有意に疼痛行動が減少しodorant-X 香気誘発性鎮痛（ホルマリンテスト）ている（p<0.05；マンホイットニー U 検定）。この鎮痛効
果は嗅覚遮断マウス（嗅上皮破壊マウス及び嗅球破壊マウとが知られているオレキシンペプチドに着目し、オレキシンス）では消失することから、嗅覚入力を介して鎮痛効果が含有神経が香気誘発性鎮痛に関与するかどうかを検討した。

現れることが明らかになった。

2．実

本研究では、この香気誘発性鎮痛がどのような中枢神経回路により発現するかを明らかにすることを目的としてい験

2. 1. 香気暴露及びホルマリンテスト

る。申請者は鎮痛を含む多様な自律神経反応に関与するこ

自作のオルファクトメーターにより定流量・濃度の気化
odorant-X を作成し、0.5 L の観察チャンバー内を換気した。換気は 1 L/min で行った。室温は 25±1 ℃とした。マウスを予め 5 分間観察チャンバー内で odorant-X に暴露しO r e x i n neu r o n s i n hy p ot h a l a mu scontribute to odor-induced analgesia
Hideki Kashiwadani
Graduate School of Medical and Dental
sciences, Kagoshima University

た後、左後肢足底に 20 µL の 2 % ホルマリン液を皮内注入し、観察チャンバー内に戻した後、ホルマリン誘発性疼痛行動を観察した（ホルマリンテスト）。疼痛行動は注入側後肢のlicking, lifting, flinching, biting に費やした時間の計測で行− 90 −

香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節

い、5 分間毎の疼痛行動量としてあらわした 1）。匂い暴露

す作業を 4 回行った。馴化後、マウスを同型のケージに移群のコントロールとして、無臭空気暴露群の疼痛行動量をし、匂い分子 20µL を染み込ませた 2×2 cm のろ紙を静置測定し、疼痛行動量差を検証した。ホルマリンテストでは、した同型のケージにマウスを移し、ろ紙の嗅探索行動時間

ホルマリンによる侵害受容器刺激性疼痛と中枢シナプス感を計測した。

作及び末梢炎症性疼痛の表出時間の異なる 2 相性の疼痛行動を示すことが知られている。Odorant-X 香気誘発鎮痛

2. 6. innate odor avoidance test

がどちらの疼痛行動に影響与えるかを検証するため、疼痛

マウスの odorant-X に対する生得的な嫌悪を判定する
ため、innate odor avoidance test（IOA test）を行った 4）。

行動量差は 1 相、2 相に分けて検証した。

実験は 3 室の連なった手製のテストチャンバーを用い、両2. 2. 動物（マウス）側のチャンバーは無臭空気または香気で換気（１L/min）で香気誘発性鎮痛に対するオレキシン神経の関与を検証
2）

きるよう設定した。実験 2 日前、無臭空気で換気したテスするため、オレキシン神経除去マウス 、及びオレキシン

トチャンバー内にマウスを静置し、60 分間自由にチャン

ペプチド欠損マウス 3）における匂い誘発性鎮痛を検証した。

バー内を探索させ装置に馴化させた。翌日、両側のチャン

これらのミュータントマウスは、共同研究者である桜井武

バーを無臭空気で換気した状態でマウスを中央チャンバー

教授（金沢大学大学院医薬保健学総合研究科）より提供をに静置し、両側のチャンバーへの侵入回数及び滞在時間を受けた。実験は雄マウス（25−32g）を用いて行った。複数

10 分間測定し、両側チャンバーの好悪に関してバイアス

回実験による学習効果を除外するため、全ての動物は 1 度がかかっていないことを確認した。実験当日、片方の匂いのみ疼痛実験に用い、ホルマリンテスト終了後直ちに麻酔

チャンバーを無臭空気で、他方のチャンバーにオルファク

薬の過剰投与により安楽死させた。オレキシン神経活性化

トメーターから導入した香気で還流し、それぞれのチャン

を c-Fos 発現により検証する際は、ミュータントマウスのバーへマウスが探索した回数及び滞在時間を 10 分間計測

background strain である C57BL6 マウスを用いた。

した。

2. 3. 匂い分子2. 7. 血中コルチコステロンの ELISAによる定量

Odorant-X は東京化成工業より入手した。匂い分子のOdorant-X 暴露によるマウスのホルモン性ストレス応

劣化を防ぐため、odorant-X は 4 ℃で保存し、実験毎に分答を計測するため、匂い刺激60分後のコルチコステロン（ス

注して用いた。

トレスホルモンの一種）の血中濃度を ELISA 法により計測した。オルファクトメーターを用いて 60 分間匂い暴露し2. 4. 免疫抗体染色た後、素早く（15 秒以内）断頭を行い、EDTA 管に全血採オレキシン神経の c-Fos 活性化を検証するため、抗オレ血した。ELISA には corticosterone ELISA kit（ADI-900-

キシン A 抗体と抗 c-Fos 抗体による免疫抗体蛍光二重染

097, ENZO, NY, USA）を用い、添付のプロトコルに従い色を行った。1 時間の匂い暴露後、ウレタン水溶液（1. 5g/

計測を行った。

kg, i.p.）により深麻酔し、4%PFA により灌流固定を行っ3．結た。抜脳後 40 µm 切片を作成し、floating staining method
を用いて染色を行った 4）。c-Fos の可視化にはウサギ抗果3. 1. オレキシン神経除去マウスでは匂い誘発性鎮痛

c-FosA 抗血清（1/1000, oncogene）、ビオチン化抗ウサギが消失する

IgG 抗体（1/250, Jackson ImmunoResearch）及びストレプ

Odorant-X 香気誘発性鎮痛に対するオレキシン神経のト ア ビ ジ ン 結 合 AlexaFluor488 抗 体（1/200, Invitrogen）

寄与を検証するため、オレキシン神経を選択的に除去したを、オレキシン神経の可視化にはヤギ抗オレキシン抗血清

マウス（ORX-AB）を用い、odorant-X 暴露下及び無臭空（1/100, Santa Cruz）
及びCF568結合抗ヤギIgG抗体（1/200,

気暴露下でのホルマリン誘発性疼痛行動量を測定した。

Biotium）を用いた。c-Fos 陽性細胞のカウントは、1 匹あたり視床下部を含む 3 枚の脳切片から行った。

図 2A は ORX-AB においてホルマリン性疼痛の 1 相及び2 相の総疼痛行動量を odornat-X 暴露群と無臭空気暴露群で比較している。1 相、2 相両相で疼痛行動量は両群で大差

2. 5. innate odor preference testがなく、野生型マウスで観察された odorant-X 暴露によるマウスの odorant-X に対する生得的な好悪を判定する

疼痛行動量減少は観察されなかった（p>0.05 ; マンホイット

ため、innate odor preference test（IOP test）を行った 5）。

ニー U 検定）。この結果から、odorant-X 誘発性鎮痛の発現動物を実験環境及び手順に慣らすため、プラスチックケーには視床下部オレキシン神経が必要不可欠であることが示

ジ（20×15×13 cm）に静置し、30 分毎に新しいケージへ移唆された。

− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

3. 2. オレキシンペプチド欠損マウスでは匂い誘発性
鎮痛が消失するかを検証するため、野生型マウスでホルマリンテスト時

オレキシン神経は、神経伝達物質としてオレキシンの他カーである最初期遺伝子産物 c-Fos を発現するオレキシにグルタミン酸等を含有することが知られている。そこで、

ン神経の割合を定量化した。その結果、コントロール群

香気誘発性鎮痛にはオレキシンペプチドによる神経伝達が及び odorant-X 暴露群の両群で視床下部オレキシン神経

必須であるのか、あるいはオレキシン神経に含まれる他ので c-Fos 発現細胞が観察されるが、odorant-X 暴露群で有神経伝達物質による神経伝達が必須であるのかを検証する

意に c-Fos 陽性オレキシン神経の数が増加していた（図 3）。

ことを目的とし、オレキシンペプチドを選択的に欠損させこれらの結果は、odorant-X 香気暴露により活性化されるたマウス（ORX-KO）を用いて、odorant-X 香気誘発性鎮視床下部オレキシン神経が増加し、その結果 odorant-X 香

痛を検証した。

気誘発性鎮痛が発現することを示唆している。

同様 1 時間の odorant-X 香気暴露を行い、神経活性マー

図 2B は ORX-KO においてホルマリン性疼痛の 1 相及びで比較している。1 相、2 相両相で疼痛行動量は両群で大3. 4. Odorant-X 刺激はマウスに強いストレス応答を引き起こさない

差がなく、野生型マウスで観察された odorant-X 暴露によOdorant-X 香気暴露はマウスに有意な鎮痛効果をもたる疼痛行動量減少は観察されなかった（p>0.05; マンホイッ

らすが、これは odorant-X 暴露がマウスに強いストレスをトニー U 検定）
。この結果から、odorant-X 誘発性鎮痛の引き起こし、その結果ストレス誘発性鎮痛が惹起された可発現にはオレキシンペプチドによる神経伝達が必要である

能性が考えられる。odorant-X がマウスに強いストレスをことが示唆される。

引き起こすのであれば、マウスは odorant-X に対して忌避

2 相の総疼痛行動量を odornat-X 暴露群と無臭空気暴露群

行動をとることが予想されるため、innate odor preference

3. 3. Odorant-X 刺激によりオレキシン神経は活性化する

test（IOP test）及び innate odor avoidance test（IOA test）

Odorant-X 刺激で実際オレキシン神経が活性化される

IOP test で、odorant-X 香気を付着させたろ紙の探索時により odorant-X に対する忌避性を検証した。
間と無臭ろ紙の探索時間を比較した所、有意な差は検出されず、odorant-X 香気付着ろ紙の探索時間が延長する傾向を示した（p>0.99 ; ダン多重比較検定）。一方、マウスに先天的忌避行動を誘発する trimethylthiazolin（TMT）を付着させたろ紙に対する探索行動は無臭ろ紙と比較し有意に減少した（p<0.05 ; ダン多重比較検定）。
次に IOA test で odorant-X 香気灌流チャンバーと無臭
空気灌流チャンバーの滞在時間を比較した所、有意な差は検出されなかった（p>0.99 ; ウィルコックソン検定）。一方、TMT 灌流チャンバーでは有意に滞在時間が減少した（p<0.05 ; ウィルコックソン検定）。

図 2 オレキシン神経除去マウス（A) 及びオレキシンペプチド欠損マウス（B) では odorant-X 香気誘発性鎮痛は消失する

図 3 Odorant-X 香気暴露により、視床下部オレキシン神経において c-Fos 蛋白質陽性細胞数は増加する− 92 −

香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節

これらの odorant-X に対する好悪行動テストから、マウの匂い分子しか検証できない。一方、電気生理学的手法をスは odorant-X に対して、TMT 臭気に示す忌避行動を惹用いると、1 細胞あたり 30 程度の候補分子の応答を検証

起することはなく、TMT がもたらすような強い忌避性スすることが可能であり、また 1 匹あたり 20 程度の細胞のトレスを引き起こさないことが示唆された。

応答を記録することができる。この新しいスクリーニング

更に、odorant-X がマウスへ与えるストレスをより直接的に検証するため、ストレスホルモンの一種であるコル法を用いることで、より鎮痛効果の高い香気成分の分離同定が容易になることが予想される。

チコステロンの血中濃度変化を ELISA 法により検証した。

これまでに明らかになった odorant-X 香気誘発性鎮痛に

げっ歯類に有意なストレス反応を引き起こす TMT 暴露で関するデータをまとめた論文を執筆・投稿したところ、複はコルチコステロン量は有意に増加したが（p<0.0001; テュ

数の査読者から機械的痛覚刺激に対する香気誘発性鎮痛ーキー多重比較検定）、odorant-X 香気暴露時にはコルチの効果を付け加えるべき、というコメントがついた。そコステロン量の有意な増加は見られなかった（p>0.20 ; テ

こで古典的な von Frey 法により機械的痛覚刺激に対するューキー多重比較検定）。これらの結果より、odorant-X

応答閾値の測定を試みたが、香気刺激後動物が安静状態

暴露はマウスに対して忌避行動を惹起するような強いストに至るまでの経過時間にばらつきが大きく実験手法としレスをもたらすことなく、odorant-X 誘発性鎮痛はストレて不適当であることが判明した。そこで本申請で新たにス誘発性鎮痛とは異なる機序で発現していると考えられる。

pincher test 装置を購入しコントロール実験を行った。そ4．考の結果、非常に高安定度及び高時間分解能でマウスの機械察的痛覚閾値の測定が可能であることが明らかになった。現

本研究により、odorant-X 香気誘発性鎮痛の発現には、オレキシン含有神経が必要であることが明らかになった。

在、pincher test 装置により機械的痛覚刺激に対する香気
誘発性鎮痛の効果を検証中である。

オレキシン含有神経は視床下部に局在することが知られて

5．統

おり、睡眠覚醒、摂食、体温調節、循環調節、鎮痛とい括った多様な自律神経調節に深いかかわりを持つ 6）。これま

本助成による研究で、odorant-X 誘発性鎮痛が視床下部

でに、ストレス誘発性鎮痛発現にオレキシン神経が関与す

オレキシン含有神経を介して発現することが明らかになっることが示唆されてきた 7）。ストレス誘発性鎮痛と香気誘た。しかしながら、嗅覚情報がどのような神経経路を介し発性鎮痛はオレキシンを活性化する入力経路に差があるが、てオレキシン神経を活性化するのか、あるいはオレキシン

共通した出力系により鎮痛効果を発現する可能性が考えら

神経からの出力がどのような経路を介して実際鎮痛効果をれる。

もたらすのか、いまだに不明である。上述の c-Fos 発現をまた、オレキシン神経は直接脊髄後角に軸索投射し、上7）

指標に本申請者はオレキシン神経の上流、下流の神経回路

向する疼痛情報を抑制する可能性が指摘されている 。実の解明に取り掛かっており、いくつかの候補経路が見出さ

際、脊髄内にオレキシン受容体アゴニストを局所注入する

れている。今後これらの経路の薬理学的、電気生理学的ブことで鎮痛効果が現れることが示されている 8）。また、オ

ロックにより実際香気誘発性鎮痛が遮断されるか検証する

レキシン神経は中脳水道鎮痛回路を賦活化し、下行性抑制予定である。これら香気誘発性鎮痛の神経回路を解明する系を介して鎮痛効果を現すことも、薬理学的方法で示されことにより、香気誘発性鎮痛を臨床応用するための基礎デ

9）ている 。香気誘発性鎮痛は、多機能性ペプチドであるオータを得ることができる。また本研究により odorant-X はレキシンの受容体を直接的に刺激することなく鎮痛を誘発

マウスに対して明らかな忌避性ストレス反応を引き起こす

できるため、臨床応用への障害がより少ないと考えている。

ことがなく、odorant-X 誘発性鎮痛はストレス誘発性鎮痛

本研究で用いた鎮痛香 odorant-X は、これまでアロマセとは異なる機序で発現することが強く示唆された。これら

ラピーの世界で鎮痛効果を持つと信じられている複数の植の結果は香気誘発性鎮痛の臨床応用へ大きな前進となり、物由来香気成分から、ガスクロマトグラフィ等により分離

機能性香気研究の重要な手掛かりとなると予想される。

同定された匂い分子リストを作成し、マウスの行動学的ス
クリーニングで見出した。本研究によりオレキシン神経が（文献）

鎮痛効果発現のハブとなっていることが明らかになったた

1） Miyata M, Kashiwadani H, Fukaya M, et al: Role ofめ、オレキシン神経をターゲットとした麻酔下マウスを用

thalamic phospholipase Cb4 mediated by metabotropic

いた電気生理学的手法により、鎮痛作用を持つ候補香気をglutamate receptor type 1 in inflammatory pain, J.

より効率的にスクリーニングすることが可能となった。ホ

Neurosci., 23, 8098-108, 2003

ルマリンテストを用いると 1 匹あたり 1 時間程度の時間を

2） Chemelli RM, Willie JT, Sinton CM, et al: Narcolepsy

要し、また動物の学習効果等を勘案すると 1 匹あたり 1 つin orexin knockout mice: molecular genetics of sleep− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Nat. Rev. Neurosci.15, 719-31, 2014

regulation, Cell 98, 437-51, 1999
3） Hara J, Carsten TB, Nambu T, et al: Genetic ablation

7） Kuwaki T: Orexin links emotional stress toof orexin neurons in mice results in narcolepsy,

autonomic functions, Auton. Neurosci. 161, 20-7, 20118） Yamamoto T, Nozaki-Taguchi N, Chiba T: Analgesic

hypophagia, and obesity, Neuron 30:345-54, 2001
4） Yonemitsu T, Kuroki C, Takahashi N, et al:effect of intrathecally administered orexin-A in the

TRPA1 detects environmental chemicals and induces

rat formalin test and in the rat hot plate test, Br. J.

avoidance behavior and arousal from sleep, Sci. Rep. 3,

Pharmacol. 137, 170-6, 2002
9） Azhdari Zarmehri H, Semnanian S, Fathollahi Y, et

3100, 20135） Kobayakawa K, Kobayakawa R, Matsumoto H, et al:

al: Intra-periaqueductal gray matter microinjection

Innate versus learned odour processing in the mouseof orexin-A decreases formalin-induced nociceptive

olfactory bulb, Nature 450, 503-8, 2007

behaviors in adult male rats, J. Pain 12, 280-7, 20116） Sakurai T: The role of orexin in motivated behaviors,− 94 −

新規細胞膜上、女性ステロイドホルモン受容体を介した生理・病態機能の解明
東京農工大学大学院農学研究院応用生命化学専攻

木村郁夫

Sex steroid hormones are involved in not only reproductive functions but also aggression, maternal behavior, learning,memory, moods, feeding, and so on. Some of these actions are related to unknown rapid non-genomic action, as whichcannot be currently explained by the genomic action of nuclear receptors. Recently, several sex steroid receptors were
found on the plasma membrane. Hence, it implies that these membrane receptors may be related to the non-genomic
actions. In these receptors, a progesterone membrane receptor (mPR), a putative G-protein coupled receptor, is activated byprogesterone and abundantly expressed in the brain. Here, we examined neurotrophic effects of mPR and the intracellularsignaling in central nervous system. In the future, further functional analysis of mPR will provide new insights into not
only understanding of neurotrophic activity but also physiological function by progesterone in brain and may represent an
important avenue of research for drug development for the treatment of infertility, metabolic disorders, and dysrhythmia
targeting this receptor.

1．緒ていると予想される。しかしながら、詳細な機能に関して

言は未だ明らかにされていない。我々は MAPR ファミリー性ステロイドホルモンは核内受容体を介して働き、遺伝に属する neudesin、neuferricin を世界で初めて単離・同子発現調節を介した性成熟等の長期的な機能に関与するこ定し 4, 5）機能解析を進める一方で、もう一つのプロゲステとが知られてきた。しかし近年、攻撃性や摂食、睡眠、そロン細胞膜上受容体ファミリーであるmPRファミリーの解して記憶や学習といった高次脳機能に至るまで、性機能以析にも着手した。mPRファミリーは 7 回膜貫通型と予測さ外の様々な作用にも性ステロイドホルモンが関与することれており、GPCR である可能性が高いと考えられていた 6）。

が明らかになった。これらは核内受容体による転写調節を

また、mPR ファミリーのうちいくつかの受容体は中枢神介した genomic な反応では説明づけられない作用が多数で経系に高発現することが報告されており 2）、これらの受容あり、その分子実体は近年まで明らかにされていなかった。

体を介したプロゲステロンによる即時的作用が生体にとっ近年、性ステロイドホルモンの細胞膜上受容体として重要な役割を果たしている可能性が示唆された。そこで

1）て、エストロゲンに対し GPR30 、プロゲステロンに対

我々は、これらプロゲステロン細胞膜上受容体のうち、特し mPR（membrane progesterone receptor）ファミリー 2）、に中枢神経系に高発現すると報告されている受容体に着目

MAPR（membrane- associated progesterone receptor）

した。そしてその詳細な発現解析、プロゲステロンによる

ファミリー

3）

が同定され、これらが性ステロイドホルモン

細胞内シグナル伝達機構解析を行った。

による即時性作用に関与する可能性が示唆された。これら

2．実の細胞膜上ステロイドホルモン受容体は一般的に知られている核内受容体を介した genomic な作用に対し、即時性の験

2. 1. 定量 RT-PCR

non-genomic な作用（MAPK 経路の活性化、細胞内 Ca 濃

マウスの各組織から total RNA を抽出し、逆転写後、度の上昇等）を有する。そのために、ステロイドホルモンSYBR green を用いたインターカレーター法により PCR 産が関与する乳癌細胞等の増殖の直接的な原因であると予想物を定量した。
In situ hybridization

され、創薬開発の観点からも非常に有用な標的として注目

マウス胎児全身、成体脳の凍結切されている。加えて、これらの受容体は卵成熟期だけでは片を作製し、35S- 標識アンチセンス RNA プローブを用いなく、成体においても種々の組織において高い発現が確認て切片中の mRNA を標識した。その後 X 線フィルムに感されていることから成体においても重要な生理機能を担っ光させシグナルを検出した。

2. 2. 細胞培養
P hy s i o l o g i c a l f u n c t i o n v i a n o v e lprogesterone membrane receptor
Ikuo Kimura
Department of Applied Biological Science,
Tokyo University of Agriculture andTechnology Graduate School of Agriculture

Flp-in mPR T-REx HEK293 細胞は 10 % FBS、ハイグ
ロマイシン、ブラストサイジンを添加した DMEM 培地
を用い培養した。ラット副腎褐色細胞腫由来 PC12 細胞
は 10 % HS、5% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地で培養した。全ての細胞は 37 ℃、− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

5% CO2 条件下で培養した。

Lipofectamine 2000 を用いて siRNA を導入した。その後

cAMP assay 細胞を 24well プレートに播種し、HEK293

NGF・プロゲステロンを添加し、3 日後に写真撮影した。

細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には神経成長因子

神経突起が細胞体以上に伸長している細胞の最大突起長のNGF を添加し 24 時間インキュベートした。細胞は各濃度みを imageJ（NIH）で測定した。

のプロゲステロンで 10 分間刺激し、0.1N HCl で回収した。
得られたサンプルについて、cAMP kit（cayman）のプロ

2. 6. mPRノックアウト（KO）マウスの作製

トコルに従って cAMP 濃度の測定を行った。

2. 3. Ca2+mPR のコーディング領域を含む配列の一部を LacZ 配列に置換したターゲティングベクターを設計し、ジーンター

assay

ゲティング法により mPRKO マウスを作製した。

細胞をコラーゲンコート 96well プレートに播種し、3．結

HEK293 細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には NGFを添加し 24 時間インキュベートした。FLIPR Calcium 4

3. 1. mPR は中枢神経系に高発現する

assay kit を用いて細胞内 Ca2+ の変動を測定した。
ERK1/2 assay

果

各組織における mPR の発現量を RT-PCR により解析す

細 胞 を 24well プ レ ー ト に 播 種 し、ると、
mPRは脳、精巣において高発現していた（図 1A）。更に、

HEK293 細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には NGF

胎児、成体マウス脳切片を用いて in situ hybridization を行を添加し 24 時間インキュベートした。細胞は各濃度のったところ、mPR は胎児期から中枢神経系に発現しており、プロゲステロンで 10 分間刺激し、Lysis buffer で回収し成体脳においては部位特異的に発現が見られることが確認た。各サンプルについて、Western blot 法により ERK1/2、できた（図 1B）。

Phospho-ERK1/2 量を測定した。
突起伸長活性評価

mPR がどの細胞に発現しているか調べるため、神経細リ ジ ン コ ー ト 6 well プ レ ー ト に胞、アストロサイト、神経幹細胞それぞれについての RT-

PC12 細胞を播種し、Lipofectamine 2000 を用いて siRNAPCR による mPR 発現量を調べた結果、mPR はアストロサを導入した。その後 NGF・プロゲステロンを添加し、3 日

イトではなく神経細胞、神経幹細胞に発現しており、成熟後に写真撮影した。神経突起が細胞体以上に伸長している

ニューロンまたは分化過程のニューロンにおいて何らかの細胞の最大突起長のみを imageJ（NIH）
で測定した。

役割を果たしていることが示唆された。

2. 4. ERK1/2 assay

3. 2. 強制発現系を用いた mPR 下流シグナルの検討細胞を 24well プレートに播種し、HEK293 細胞にはドFlp-in mPR T-REx HEK293 細胞にドキシサイクリン

キシサイクリン、PC12 細胞には NGF を添加し 24 時間イを添加して mPR を強制発現させ、プロゲステロン刺激

ンキュベートした。細胞は各濃度のプロゲステロンで 10による細胞内シグナリングを調べた。mPR ファミリーは分間刺激し、Lysis buffer で回収した。各サンプルについて、

GPCR であると予測されていたため、GPCR の下流シグナ

Western blot 法により ERK1/2、Phospho-ERK1/2 量を測ルである Ca2+、cAMP 濃度の測定を行ったところ、どちら定した。

もプロゲステロン刺激によっては反応が見られなかった。
次にプロゲステロン刺激による ERK1/2 のリン酸化を調

2. 5. 突起伸長活性評価

べたところ、mPR 発現下でプロゲステロン濃度依存的にリジンコート 6 well プレートに PC12 細胞を播種し、ERK1/2 の活性化が見られた。したがって、mPR はプロ

図 1 mPR の発現：（A）7 週齢マウスの mPR mRNA 発現量解析（n=3）．
（B）35S 標識アンチセンスmPRプローブを用いたin situ hybridization 法による胎生 15.5 日齢マウス切片（左 , Scale bar : 5 mm）、7 週齢マウス脳切片（右 , Scale bar : 2 mm）の mPR 発現部位確認 .

− 96 −

新規細胞膜上、女性ステロイドホルモン受容体を介した生理・病態機能の解明

ゲステロン刺激を受け ERK1/2 を活性化させることが示唆いる性ステロイドホルモンの細胞膜上受容体のうち、プされた。

ロゲステロンをリガンドとする mPR に着目した。mPR フ
ァミリーは 7 回膜貫通型と予測されており、GPCR である

3. 3. 内因性 mPR 発現細胞株を用いたプロゲステロ
ン下流シグナルの検討

う報告もあった 7）。当研究室では脂肪酸受容体を中心とし次に、mPR を内因性に発現する細胞を用いてプロゲス

た GPCR の機能解析を行っており 8-10）、その経験を活かしテロン刺激による下流シグナルを調べた。ラット副腎褐色て GPCR 下流シグナルの解析を行うことで mPR が GPCR

細胞腫由来 PC12 細胞は神経成長因子 NGF を添加するこであるかどうかについて検討を行った。その結果、mPRとで神経細胞様に分化するため、神経分化のモデルとしを強制的または内因性に発現する細胞において、プロゲスて用いられる。NGF による分化誘導開始後、各時間におテロン刺激によって Ca2+ 動員、cAMP 濃度の変化といったけるプロゲステロン受容体の発現を調べたところ、mPR

GPCR下流シグナルは確認されなかった。したがって、
我々の発現のみが細胞の分化に伴い急激に上昇していたため、では、mPR は GPCR とは異なるシグナル伝達に関与してPC12 細胞の分化の過程もしくは分化後に mPR が何らかのいる可能性が高いと考えている。今後更に mPR を介した役割を果たしている可能性が示唆された。

シグナル伝達機構の解明を進めていく予定である。

と考えられていたが 6）、GPCR とは異なる構造を持つといmPR の発現が神経分化の初期段階から急激に上昇する

また今回、プロゲステロンが ERK1/2 のリン酸化を亢進ことから、プロゲステロンが mPR を介して神経分化に何させることを示した。しかし PC12 細胞におけるプロゲス

らかの影響を与えるのではないかと考え、以下の実験を行

テロン 10 µM による ERK1/2 のリン酸化は各受容体の阻った。PC12 細胞を NGF で分化誘導する際、プロゲステロ

害によっては抑制が見られず、今回 PC12 細胞におけるプンを同時添加すると、神経突起の伸長が有意に促進された。

ロゲステロンの ERK1/2 リン酸化亢進作用がどの受容体を更に、mPR に対する siRNA を導入した後に同様の実験を介するものか確かめることはできなかった。強制発現系に行うと、プロゲステロンによる神経突起伸長促進作用が抑おいては mPR 発現時にプロゲステロン 1 µM、10 µM でリ制される傾向が見られた。したがって、mPR がプロゲス

ン酸化亢進が見られるため、本来プロゲステロンの作用がテロンによる神経分化促進作用に関与していることが示唆

1 µM で現れる可能性を考え、今後 PC12 細胞においてもされた。

この濃度において解析を行う必要があると考えている。

また、NGF で分化誘導し、mPR の発現が上昇した状態

本研究は、中枢神経系に高発現するプロゲステロン受容でプロゲステロン刺激による各シグナルについて検討し

体 mPR が生体において果たす役割の解明において、基礎たところ、強制発現系における結果と同様に PC12 細胞に的データを提供するものである。mPR ノックアウトマウ

おいてもプロゲステロン刺激による GPCR 下流シグナルはスの作製が完了した現在、今後更に mPR ファミリーの機見られなかったが、ERK1/2 のリン酸化はプロゲステロン

能解析を進めることにより、性ステロイドホルモンが関与

濃度依存的に亢進していた。このプロゲステロンによるする高次脳機能の解明、更にはこれらの受容体をターゲッ

ERK1/2 リン酸化の亢進について、どの受容体を介したもトとする性ステロイドホルモン関連疾患、中枢神経系疾患のか確かめるため、核内受容体 PR の阻害剤 RU486 または領域における新規治療薬開発への新たな知見を提供するも

MAPR ファミリーに属する細胞膜上プロゲステロン受容のと期待される。

体 PGRMC-1 の阻害剤 AG205 で前処置したものについて、
ERK1/2 のリン酸化を測定した。しかし各受容体の阻害によって ERK1/2 リン酸化亢進の抑制は見られなかった。

（参考文献）
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Prossnitz ER : A transmembrane intracellular estrogen

3. 4. mPRKO マウスの表現型

receptor mediates rapid cell signaling. Science., 3 0 7,1625-1630, 2005.

我々は独自に mPRKO マウスを作製し、その表現型について検討を行うことで in vivo における機能解析も行った。

2） Z h u Y , B o n d J , T h o m a s P : I d e n t i f i c a t i o n ,mPRKO マウスはほぼメンデル則に従って得られた。まclassification, and partial characterization of genes in

た、WT マウスと KO マウスで体重に差は見られなかった

humans and other vertebrates homologous to a fish

が、脳、精巣といった mPR が発現する組織の重量が WT

membrane progestin receptor. Proc Natl Acad Sci U S
A., 100, 2237-2242, 2003.

マウスに比べて KO マウスで軽かった。

4．考3） M i f s u d W , B a t e m a n A : M e m b r a n e - b o u n d

察progesterone receptors contain a cytochrome

本研究では、近年その存在が明らかになり注目を浴びて− 97 −

b5-like ligand-binding domain. Genome Biol., 3,

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Bonnefond A, Hara T, Yengo L, Kimura I, Leloire

RESEARCH0068, 2002.
4） Kimura I, Yoshioka M, Konishi M, Miyake A,

A, Liu N, Iida K, Choguet H, Besnard P, Lecoeur

Itoh N : Neudesin, a novel secreted protein with a

C, Viveguin S, Ayukawa K, Takeuchi M, Ozawa K,

unique primary structure and neurotrophic activity. J

Tauber M, Maffeis C, Morandi A, Buzzetti R, Elliott

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P, Pouta A, Jarvelin MR, Korner A, Kiess W, Pigeyre5） Kimura I, Nakayama Y, Kinishi M, Kobayashi T,

M, Caiazzo R, Van Hul W, Van Gaal L, Horber F,

Mori M, Ito M, Hirasawa A, Tsujimoto G, Ohta M,

Balkau B, Levy-Marchal C, Rouskas K, Kouvastsi A,

Itoh N, Fujimoto M : Neuferricin, a novel extracellular

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D, Koshimizu TA, Wolowczuki U, Tsujimoto G, Froguel

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de Vlieg J, Zhu Y, Tubbs C : Steroid and G protein

9） Kimura I, Inoue D, Maeda T, Hara T, Ichimura A,

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Miyauchi S, Kobayashi M, Hirasawa A, Tsujimoto :progestin membrane receptor subtypes and their

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7） Smith JL, Kupchak BR, Garitaonandia I, Hoang
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expression of human mPRalpha, mPRbeta and

Maeda T, Terasawa K, Kashihara D, Hirano K, Tani T,

mPRgamma in yeast confirms their ability to function

Takahashi T, Miyauchi S, Shioi G, Inoue H, Tsujimoto

as membrane progesterone receptors. Steroids., 7 3,

G : The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat

1160-1173, 2008.

accumulation via the short-chain fatty acid receptor8） Ichimura A, Hirasawa A, Poulain-Godefroy O,− 98 −GPR43. Nat Commun., 4, 1829, 2013.

スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討
およびそのメカニズムの解明
神戸大学大学院医学研究科内科系講座皮膚科学分野

国定充

Reactive oxygen species produced in response to UV radiation are important in skin tumor development. We havepreviously reported that deficiency of the Ogg1 gene, encoding the repair enzyme for 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG),
increases skin tumor incidence in mice upon repetitive UVB exposure and modulation of UVB-induced inflammatory
response. Spirulina platensis (S. platensis) is used as a human food supplement because it contains abundant nutritional
and antioxidant components. Therefore, we investigated the inhibitory effects of S. platensis on UVB-induced skin tumor
development in Ogg1 knockout-(KO) mice and the wild-type (WT) counterpart. Dietary S. platensis suppressed tumor
induction and development in both genotypes compared to our previous data without S. platensis. Induction of erythema andear swelling, one of the hallmarks of UVB-induced inflammatory responses, were suppressed in the skin of Ogg1-KO miceand albino hairless mice fed with dietary S. platensis. Compared with untreated mice, S. platensis-administered mice showedsignificantly reduced 8-oxoG formation in the skin after UVB exposure. Moreover, we found that S. platensis effectively
down-regulated the signal proteins p38 MAPK, SAPK/JNK, and ERK after UVB exposure especially in Ogg1-KO mice. Our
results suggest that S. platensis exerts anti-tumor effects against UVB irradiation in the skin through its anti-inflammatory
and antioxidant effects. Now we are currently working on other factors, that is, aging related genes by S. platensis.

1．緒

言

２．実

験

年特に注目されているのはそれによる発癌およびしみ・し2. 1. 経口 S. platensis 摂取による皮膚腫瘍形成の時期の検討

わなどの老化現象である。発癌について我々は今まで紫

過去の我々の C57Bl マウス（野生型および活性酸素に外線による直接的な DNA 損傷が主な原因とされていたが、よ る DNA 障 害 の 8-oxoG を 修 復 で き な い Ogg1ノッ ク ア

その他に紫外線によって皮膚に生じる活性酸素により間ウトマウス）の実験結果 6） を参照にして週 3 回、マウス

接的に DNA 損傷が生じそれによって皮膚発癌が引き起この背中を剃毛後、2.5kJ/m2 のブロードバンド UVB 光源

されることを報告してきた 1）。一方、中南米やアフリカな（TL 2 0W/1 2RS fluorescent lamps（Philips, Eindhoven,

どで自生する Spirulina platensis（S. platensis）という珪藻

Holland））を用いて照射を続けた。群においては 10 ％ S.

類があるがそれは β カロチンなどを多く含み、元来抗酸化platensis が 入 っ た 飼 料 と 通 常 飼 料、 そ れ ぞ れ 野 生 型 と紫外線による人体における影響は様々なものがあるが近作用があるとされ、その肝庇護作用

2）3）や抗ウイルス作用 、4）

抗アレルギー作用 などが報告されてきたが S. platensis がOgg1 ノックアウトの群に分けて 45 週まで照射を継続し、どの群において皮膚腫瘍形成が早いかを比較・検討した。

紫外線を受けた皮膚に対しての作用などは今まで研究がなされて来なかった。今回我々は S. platensis による紫外線の皮膚における影響、特に発癌に着目していかに短期、ま2. 2. 経口 S. platensis 摂取によるUVB 照射によるマウス皮膚における炎症反応の評価

たは中長期で影響を及ぼすか検討した。また我々は紫外線

マウス皮膚においてUVB照射後のDNA損傷から紫外線発−活性酸素− DNA 損傷による皮膚発癌において炎症因子癌に至る経緯で重要な要素として炎症反応が挙げられる 5）。

が重要な役割があることも報告している 5）のでその作用点

S. platensis 摂取（4 週間投与）によってその炎症反応が抑制

として炎症因子がいかに関与しているかも合わせて検証しされているかを経時的に野生型および Ogg1 ノックアウト

た。

マウス、さらにはアルビノヘアレスマウスにて、評価方
法としてはマウス耳介の腫脹（mm）を計測し、紅斑反応はスコア化して比較した。尚紫外線照射は単回で照射量はOgg1 マウスには 2.5 kJ/m2, アルビノヘアレスマウスには
1.5 kJ/m2 とした。
The study of effects on ultravioletinduced skin aging by Spirulina platensis
Makoto Kunisada
Division of Dermatology, Department
of Internal Related, Kobe University
Graduate School of Medicine

2. 3. 経口S. platensis摂取によるUVB照射によるマウス皮膚における炎症反応関連遺伝子の検討
2. 2. と同様に４週間 S. platensis を投与しその後単回
UVB を照射後、皮膚より mRNA を抽出しそれを用いてリ− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

および Cxcl1 の発現を野生型および Ogg1 ノックアウトマ

3. 2. 経口S. platensis摂取によるUVB照射によるマウス皮膚における炎症反応の評価

ウスにて 3，6，24 時間後にてそれぞれ比較検討を行った。

UVB 照射後の耳介腫脹の比較では S. platensis 摂取群がさらに Il1β では抗体を用いた免疫染色にて 24 時間後での通常飼料摂取群と比較して野生型あるいは Ogg1 ノックア検討を行い、同様に TLR4 では免疫組織染色およびリアル

ウトマウスいずれにおいても抑制することが経時的に確認

タイム RT-PCR 法で同様比較した。

できた（図 2a）
。またマウスのバックグラウンドを変えてアルタイム RT-PCR 法で皮膚の炎症で重要とされる Il1β

同様現象が見られるかアルビノヘアレスマウスを用いた実2. 4. S. platensis の実効成分であるフィコシアノビ
リンにおけるシグナル蛋白の影響の検討

験でも耳介腫脹は抑制されていた（図 2b）。ヘアレスマウス

S. platensis の実効成分はフィコシアニンとされその活

2c のごとく 72 時間後では紅斑反応の抑制が S. platensis 摂性型としてフィコシアノビリン（Phycocyanobilin: PCB）と取群においても観察され鱗屑の減少も見られた（図 2c, d）。

ではさらに UVB 照射後の紅斑反応をも比較検討したが図されている。それが細胞内のシグナル蛋白にいかなる影ト法にて p38, JNK, ERK においてそれぞれリン酸化され3. 3. 経口S. platensis摂取によるUVB照射によるマウス皮膚における炎症反応関連遺伝子の検討た蛋白も含めて、30 分後、2，6，24 時間後において検討し

図 3 のごとく、UVB 照射後の S. platensis 摂取群においた。検討したものは胎児マウス皮膚より単離した線維芽細ては通常飼料摂取群と比較して皮膚炎症関連遺伝子とし胞（Mouse embryonic fibroblasts: MEFs）について PCB をて知られる Il1β 、Cxcl1 いずれにおいても発現の抑制が見精製した粉末（5 μg/mL）を MEFs に添加し、UVB 照射後られた（図３a, b, c）。特に Ogg1 ノックアウトマウスでのに検討した。

Il1β はすべての UVB 照射後のタイムポイントにおいてそ響を及ぼしているかを検討するためにウエスタンブロッ

３．結の傾向が統計学的有意差をもって示された（図３a）。また果

TLR4 においても免疫組織染色法やリアルタイム RT-PCR

3. 1. 経口 S. platensis 摂取による皮膚腫瘍形成の時期の検討

法いずれにおいても UVB 照射後の発現抑制が S. platensis
摂取群において見られた（図３d, e）。

図 1 のごとく、S. platensis 摂取群では Ogg1 遺伝子型に関わらず 1 週から 6 週遅らせることができた。また S.
platensis 摂取群では通常飼料を与えた群では照射後約 45
週で 100 ％皮膚腫瘍を生じるのに対し、45 週時点でも全マウスの約 40 ％にしか腫瘍形成を認めなかった。

3. 4. S. platensis の実効成分であるフィコシアノビ
リンにおけるシグナル蛋白の影響の検討
ウエスタンブロット法にて、またマウス胎児よりの線維芽細胞（MEFs）を用いて PCB 添加でいかにシグナル蛋白、

図１ S. platensis 添加において野生型および Ogg1 ノックアウトマウス両方において腫瘍発生時期を遅らせることができた。

− 100 −

スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討およびそのメカニズムの解明

図２ S. platensis 群と通常飼料群での炎症反応の比較 a マウスの耳介腫脹の野生型および Ogg1
ノックアウトマウスでの比較 b ヘアレスマウスでの耳介腫脹比較実験 c 紫外線照射後 72 時間後のヘアレスマウス背部の紅斑反応の比較 d c の紅斑反応比較をスコア化して比較したもの− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図３ S. platensis 摂取群と通常飼料群での炎症因子・遺伝子の比較
a Il1β と b Cxcl1 の expression の比較、リアルタイム RT-PCR 法
c Il1β の免疫組織染色
d TLR4 における免疫組織染色およびリアルタイム RT-PCR 法での検討 (e)− 102 −

スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討およびそのメカニズムの解明

図４ ウエスタンブロット法によるシグナル蛋白のリン酸化 上段：野生型 -MEFs、下段：Ogg1 ノックアウトマウス -MEFs、それぞれ左より p38, JNK, ERK とそのリン酸化された蛋白を検討

ここでは紫外線応答に重要とされるもののリン酸化に注

我々はまた S. platensis および紫外線が皮膚におよぼす

目し評価した。p38 のリン酸化では特に Ogg1-MEFs につ関係の中で MAPK が多分に関与することを示した。Kim

いて照射後早い時間（30 分後）において強い抑制が見られ、らは p38 MAPK が UVB で誘導される炎症反応を制御し、JNK のリン酸化でも同様に野生型 -MEFs では明らかでは

それらはおそらく Cxcl1 や Il6 やシクロオキシゲナーゼ 2なかったものの、Ogg1-MEFs にて 30 分後において抑制などの誘導を介して行われている可能性を報告している 9）。

が認められた。それとは対照的に ERK のリン酸化では野S. platensis が紫外線誘導の皮膚の炎症を抑える仕組みで

生型 -MEFs, Ogg1-MEFs とともに照射後遅い時間帯にてはこの p38MAPK の他に JNK も今回の実験では働いていリン酸化抑制が認められた（図 4）。

ることが示されているので今までの抗酸化作用のある N ア

４．考

セチルシステインで JNK が抑制されている報告 10）などと察

照らし合わせると S. platensis のシグナル蛋白に対する作

S. platensis においては我が国ではまだ馴染みが薄いが用は多点に渡ると考えられる。

欧米各国ではサプリメントとして普及している。今回の我々の実験の結果からその作用点は紫外線により産生さ

謝

辞れる活性酸素量を抑制していることが考えられるが、実本研究はコスメトロジー研究振興財団の助成を得て遂行

際 S. platensis は還元型のグルタチオンのレベルを上昇さされています。また S. platensis の原末や PCB 原末飼料をせることが報告されているので 7）、今回の実験においては提供して頂いた DIC ライフテック社にも合わせて深く感

還元型グルタチオンの上昇は結果的に活性酸素で誘導され謝いたします。

る DNA 損傷である 8-oxoG の産生を抑制していると考えられその効果により発癌作用を抑制していると考えられる。 （参考文献）
また S. platensis は今回の実験で皮膚における炎症反応も

1） Kunisada M, Sakumi K, Tominaga Y et al. (8-Oxoguanine

抑制することを示すことができた。我々は以前マウス皮膚formation induced by chronic UVB exposure makes Ogg1に繰り返し UVB 照射すると炎症部位より有意にペルオキ

knockout mice susceptible to skin carcinogenesis.

シ亜硫酸（peroxynitrites）が上昇することを示した 8）。ペCancer Res 65:6006–10 2005

ルオキシ亜硫酸は好中球やマクロファージなど炎症部位よ

2） Ismail MF, Ali DA, Fernando A et al. Chemoprevention

り放出される一酸化窒素やスーパーオキサイドによって産of rat liver toxicity and carcinogenesis by Spirulina. Int

生されるので、以上を考え合わせると S. platensis の働き

J Biol Sci 5:377–87 2009は抗炎症反応には特に PCB によりペルオキシ亜硫酸のス
カベンジャーとして機能していると考えられる。

3） Hayashi K, Hayashi T, Kojima I A natural sulfatedpolysaccharide calcium spirulan, isolated from Spirulina− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

platensis: in vitro and ex vivo evaluation of anti-herpes7） Dasgupta T, Banejee S, Yadav PK et al. Chemomodulation

simplex virus and anti-human immunodeficiency virusof carcinogen metabolising enzymes, antioxidant

activities. AIDS Res Hum Retroviruses 12:1463-71 1996

profiles and skin and forestomach papillomagenesis by

4） Kim HM, Lee EH, Cho HH et al. Inhibitory effect of

Spirulina platensis. Mol Cell Biochem 226: 27-38 2001

mast cell-mediated immediate-type allergic reactions8） Hattori Y, Nishigori C, Tanaka T et al. 8-hydroxy-2’

in rats by Spirulina. Biochem Pharmacol 5 5:1 0 7 1-6-deoxyguanosine is increased in epidermal cells of

1998

hairless mice after chronic ultraviolet B exposure. J Invest

5） Kunisada M, Yogianti F, Sakumi K et al. Increased

Dermatol 107:733-7 1996

expression of versican in the inflammatory response

9） Kim AL, Labasi JM, Zhu Y et al. Role of p3 8 MAPK

to UVB- and reactive oxygen species-induced skinin UVB-induced inflammatory responses in the skin oftumorigenesis. Am J Pathol 179:3056–65 2011

SKH-1 hairless mice. J Invest Dermatol 124:1318-25 2005

6） Kunisada M, Kumimoto H, Ishizaki K et al. Narrow-10）Assefa Z, Garmyn M, Bouillon R et al. Differential

band UVB induces more carcinogenic skin tumors

stimulation of ERK and JNK activities by ultraviolet

than broad-band UVB through the formation of

B irradiation and epidermal growth factor in human

cyclobutane pyrimidine dimer. J Invest Dermatol 1 2 7:

keratinocytes. J Invest Dermatol 108:886-91 1997

2865 -71 2007

− 104 −

ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明
神戸大学大学院農学研究科

白井康仁

It is well-known that keratinocytes differentiation is partly regulated by PKC. However, function of diacylglycerol (DG)
kinase (DGK), which can attenuate PKC activity by reducing the amount of DG, in keratinocyte differentiation is fully
unknown. Therefore, we tried to identify DGK subtype(s) expressed in the keratinocytes and investigate function(s) of DGKin the skin.
We found that human keratinocytes, HaCaT cells, express almost all DGK subtypes except for DGKκ. At least DGKβ,γ, and ι, were up-regulated during the differentiation, while DGKη was down-regulated. mRNA level of the other DGK
subtypes did not changed. We focused on DGKγ and found that the DGK subtype was expressed in the basal, spinous andgranular layers but not in the cornified layer by immunofluorescent staining. To further explore a function of DGKγ in the
differentiation, we overexpressed GFP-DGKγ in HaCaT cells and compare the cell shape. However, we could not detectremarkable difference. Therefore, we then tried to produce DGKγ knock out (KO) mouse and succeeded. We checked “allergy
level”, “bailer function” and “recovery speed from wounding” using the KO mice. However, there was no significant
difference between KO and WT mouse in all tested.

１．緒

言

表皮は外部環境からの乾燥、外傷、感染などから個体を防御するバリアとなっている。この表皮は、基底細胞層でつくられたケラチノサイトが、有棘細胞層での細胞周期の停止、顆粒細胞層での扁平化および分化マーカー蛋白質の合成を経て、角化細胞へと分化することにより形成されていく。また、魚鱗癬や乾癬等の角化異常症はケラチノサイ
ト分化の異常であるといえる。
ケラチノサイトには、少なくとも５つのプロテインキナーゼＣ（PKC）サブタイプ（α, ε δ, η ζ）が存在し、ケラチノ
サイトの分化において重要な働きをしていることが知られている。例えば、これまでに、少なくとも PKCα や η が重要な働きをしていることが知られている 1-3）。我々も、独自に活性化した PKCη が、低分子量Ｇタンパク質のひとつである RalA に直接結合することでケラチノサイトの扁平化を誘導していることを明らかにした 4）。
一方、本研究の対象であるジアシルグリセロールキナー
ゼ（DGK）は、PKC の活性化剤であるジアシルグリセロー

図１ 哺乳類の DGK サブタイプとドメイン構造
C1：Conserved region1, RVH：recoverin homology,
PH：pleckstrin homology, SAM：steril a motif,
MARCKS：myristrated alanine-rich C-kinase substrate,
RA：Ras associating,Gly, Pro：glycine & proline rich domain.

ル（DG）をリン酸化し、ホスファチジン酸（PA）に変換する
脂質キナーゼである。即ち、DGK は、DG を減少させるこ（図１）。各サブタイプは組織発現様式が異なり、異なったとで間接的に PKC 活性を抑制できる。また、この DGK に機能を有していると考えられている。一方、産生されるは 10 種類のサブタイプが存在することが報告されている

PA も、mTOR や Raf1 キナーゼなどを活性化する脂質シグナルである。さらに、皮膚における脂質組成はバリア機能などに深くかかわっている。従って DGK は、PKC の抑制や、他の酵素の活性化、あるいは皮膚における脂質組成

Function of diacylglycerol kinase in
keratinocyte differentiation
Yasuhito Shirai
Graduate School of Agricultural Science,
Kobe Universityを調節することによって、ケラチノサイトの分化や、皮膚バリア機能に重要な働きをしていると推察される。しかし、未だにケラチノサイトに発現している DGK サブタイプや、その機能に関しては全く不明である。

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

そこで本研究では、ケラチノサイト分化における DGK

10 mM EGTA、2 mM EDTA、1 % triton-X 100、20 μg/の機能を明らかにし、将来的な DGK をターゲットとする

mL leupeptin、1 mM PMSF/ 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）〕

スキンケア商品の開発を目指すことを研究の目的とした。

に懸濁し、handy sonic（UR-20P TOMY SEIKO CO., LTD）

２．実を用いて氷 上 で 破 砕 し た（output 5、30 秒 2 回 ）。 遠 心験後（15000 rpm、4 ℃、10 分間）、上清のタンパク質量を2. 1. 材料

BCA 法（Promega）により測定し、10 % ゲルを用いた SDS-

すべてのプライマーは Invitorgen に合成をお願いした。
5）

PAGE に供した。泳動後、ニトロセルロース膜に転写しDGKγ 抗体は当研究室で作製したものを用いた 。その他

た。5 ％スキムミルクでブロッキングしたのち、１次抗体の試薬は、研究に十分たるグレードのものを使用した。

に DGKγ 抗体を、２次抗体にはHRPO標識抗ウサギIgG抗体を用いた。尚、検出には ECLTM Western blotting Detection

2. 2. HaCaT 細胞の培養

Reagent（Amersham Bioscience）を用い、化学発光強度を実験には、不死化ヒトケラチノサイトである HaCaT を

imager で記録した。

用いた。培養には 10 % FBS、ペニシリン（100 units/mL）、ス ト レ プ ト マ イ シ ン（100 μg/mL） を 含 む Dulbeccoʼs

2. 5. マウス皮膚蛍光免疫染色

Modified Eagle Medium（Wako）を用いた。尚、培養はす

WT および DGKγKO マウスを頸椎脱臼により安楽死さべて 37 ℃、5 % CO2 の条件下で行った。尚、ケラチノサ

せ、心臓より 0.9 %NaCl で灌流した後、皮膚を採取した。

イトの分化は 1.5 mΜ カルシウムを用いて 72 時間培養す

O.C.T. Compound（Sakura Finetek）
で皮膚を包埋し、クリることにより行い、分化したことは分化マーカーである

オスタット（Leica CM1850）で 10 μm にスライスした。スラインボルクイリンとケラチン１の発現誘導を Quantative-

イスした切片をスライドガラスに貼り付け、皮膚凍結切PCR にて確認した 4）。

片試料とした。作製した切片を、段階的に濃度を高くした
エタノール溶液に順に浸し脱水した。ついで、エタノール

2. 3. Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction（RT-PCR）

脱水後の切片をアセトンに浸漬し、固定した。水和した後、上述の条件で分化させた HaCaT 及び分化させてない

浄後蒸留水を除き、0.3 % Triton X in PBS（-） で 30 分間

細 胞 か ら 定 法 に 従 い、SV Total RNA Isolation System

切片を室温でインキュベートした。洗浄後、2 % NGS in（Promega）を用いて mRNA を抽出した。200 ng に相当す

PBS（-）で 30 分間切片を室温でインキュベートすることにる mRNA を鋳型にランダムプライマーを用いて逆転写し、よりブロッキングした。１次抗体には、DGKγ 抗体または

最終的に 20 μL の cDNA 溶液を得た。得られた cDNA 溶

TGase1 抗 体 を 0.03 % Tween 20 in PBS（-） （PBS -Tw）液 1 μL を鋳型に、表１に示すプライマーセットを用いて、で適当な濃度に希釈し、72 時間、4 ℃で反応させた。ついで、PCR に供した。尚、ポリメラーゼは KOD plus（TOYOBO）

anti-rabbit Alexa 546 を PBS-Tw で 1000 倍希釈し、2 次を用い、アニーリング温度及びサイクル数は表１に示すよ抗体として 1 時間、室温で反応させた。PBS -Tw で洗浄しうに設定した。その他の条件は定法に従った。

たのち、50 % グリセロールで封入し、共焦点レーザー顕数分間流水で洗浄を行い、その後蒸留水で洗浄した。洗微鏡および一体型顕微鏡で観察した。

2. 4. SDS-PAGE 及びウエスタンブロット
上述の条件で分化させた HaCaT 及び分化させてない

2. 6. DGKγノックアウトマウスの作製

細胞を 10 cm シャーレに用意した。全細胞を回収後、そDGKγ KO マウスの作製は、大阪大学微生物研究所に依れ ぞ れ 300 μL の homogenate buffer〔250 mM sucrose、

頼した。飼料は、飼育繁殖固形飼料を自由に摂食させ、自表１Sub-type
α
β
γ
δ
ε
ζ
η
ι
κ
θ

PCR に用いたプリマー及びアニーリング温度（A）とサイクル数（B）

Forward primer
AGGAGACCCCATGGGGTGATCATGATGGAACCGTGTCCACATCTTACTGCCCGGAAGATTGGATTGCATTGGGTTGGGGTACAG
TCAATCCCCGACAAGTCTGCCAAGACGCTATGCAGGAGGGGAAATGTAAGCA
GCGCTCTTACAGGAAACCACCAGGCACGGGAAGAGGAGCCTGG

Reverse primer
GCATGGGCATCTGGTTCCACCAAACACAATGCAGTCC
ATCCAAAATCCAGCCA
CAGGTCTTGTCGCACA
CCCATCCCTTCCCATACAAAGCCCAGGCTGAATCAATGACTTGCCTCAGCAAGGGTTTCATGAGAGGACACCTGCACTGGGATA
CTGGCCCATGTGCACGAC− 106 −

A
59
59
59
59
59
59
59
57
59
59

B
35
35
35
35
35
35
35
35
35
40

ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明

2. 9. HE 染色

動給水により自由に飲水させた。
温度は 18− 26 ℃で保ち、12 時間明、12 時間暗の光条件

2. 8. のように処理した切片を、マイヤー・ヘマトキシで飼育した。また、飼育及び以下の動物実験は本学倫理委

リン溶液（武藤化学株式会社）に 1 分間浸漬した後、数分

員会の規定に基づいて行った。

間流水洗浄を行った後、蒸留水に浸漬した。続いて、1 %DGKγ KO マウスは、図 2 に示すような insertion をもっエオジン Y 溶液（武藤化学株式会社）に 1 分間浸漬し、段ていることから、図 2 下に示す位置にプライマーを設計し、階的に濃度を高くしたエタノール溶液に順に 1 分間ずつ

907bp のバンドが検出されたものを野生型（WT）、523bp

浸し脱水した。その後キシレンに 3 分間 ×3 回透徹した後、のバンドが検出されたものを DGKγ KO、両方のバンドがMount-Quick（大道産業株式会社）にて封入し、一体型顕認められたものを DGKγ ヘテロとした。尚、genotyping

微鏡の 2 倍レンズを用いて観察した。

に は 尾 部 か ら 定 法 に よ り 調 製 し た genome と EnocoTaq
polymerase（Lucigen）を使用し、アニーリング温度 62 ℃、

2. 10. トルイジンブルー染色

サイクル数 40 に設定した。

2. 8. のように処理した切片を、0.3 % Triton X in PBS（-） で 30 分間切片を室温でインキュベートした。0.03 %2. 7. 接触性皮膚炎発症モデルマウスの作製

Tween-20 in PBS（-） （PBS-Tw）で 5 分 ×3 回洗浄した。

WT 及 び DGKγ KO マ ウ ス の 腹 部 の 毛 を 除 去 し、5 %トルイジンブルー溶液（pH 2.0）に 40 分間浸漬した後、TNCB（アセトン：エタノール =1：4）50µL を 2 日連続

PBS-Tw で 3 回洗浄した。さらに 95 % エタノールに 1 回、腹部に塗布し、感作した。最後の感作から 3 日後、右耳の100 % エタノールに 2 回素早く通し、その後キシレンで 3

各面に 1% TNCB を 20µL ずつ塗布し、接触性皮膚炎を誘分×3 回透徹した後、Mount-Quick にて封入し、一体型顕発した。また、ネガティブコントロールとして左耳の各面

微鏡の 20 倍レンズを用いて観察した。

に溶媒（アセトン：エタノール =1：4）
を 20 µL ずつ塗布した。

2. 11. 経皮吸収試験

2. 8. マウス皮膚凍結切片の作製

DGKγ ヘテロマウス同士の mating によって生後 0 日目

WT および DGKγ KO マウスを頸椎脱臼により安楽死の新生児を得た。新生児を 37 ℃の 0.4w/v % trypan blue

させ、接触性皮膚炎誘導 24 時間後の両耳の皮膚を採取しsolution（Wako）中で 5 min 振とうした後、1×PBS（-） でた。O.C.T. Compound（Sakura Finetek）で皮膚を包埋し、2 回洗浄し、写真撮影を行った。染色した新生児の背部のクリオスタット（Leica CM1850）で 10µm にスライスした。

皮膚を採取し、2. 3. のように凍結切片を作製した。一体型

スライスした切片をスライドガラスに貼り付け、皮膚凍結

顕微鏡の 20 倍レンズを用いて観察した。

切片試料とした。作製した切片を、段階的に濃度を高くしたエタノール溶液に順に 1 分間ずつ浸し脱水した。エタノ

2. 12. Wound healing assayール脱水後の切片をアセトンに浸漬し、固定した。100 %10 週齢の WT および DGKγ KO マウスの背部の毛をバリから濃度を段階的に低くしたエタノール溶液に順に 1 分間

カンで除去した。局所麻酔薬としてマーカイン®0.125 %ずつ浸し水和した後、数分間流水で洗浄を行い、その後蒸（AstraZeneca）を塗布した後、イヤーパンチを用いて背部留水で洗浄した。

図2

DGKγKO の作製に用いたインサーションカセット（上）と野生型 DGKγ 遺伝子の一部（下）− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016の皮膚に直径約 2 mm の傷を付けた。写真撮影を行って傷の治癒を観察した。

3. 3. マウス表皮におけるDGKγの局在
そこで、実際に DGKγ が分化に伴って増加しているのか、

３．結どの細胞層に発現しているのかを蛍光免疫染色で調べた。

果

尚、コントロールとして、顆粒層から有棘層にかけて発現3. 1. HaCaTに発現しているDGKサブタイプの同定
まず、ケラチノサイトに発現している DGK サブタイプが増加するトランスグルタミナーゼ１（TGase1）の抗体を用いた。

を同定するために、RT-PCR を行った。その結果、ケラ

その結果、図 6 に示すように、DGKγ は TGase1 よりもチノサイトには DGKα, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ιが発現しているこ

深い層、即ち基底層から、その発現が認められた。また、とが明らかになった（図 3）。

基底層から有棘層にかけて、蛍光強度が強くなったことか
ら、分化とともに増加することが確認された。一方、角質

3. 2. HaCaTの分化に伴い変動するDGKサブタイプの同定
ついで、どのブタイプがケラチノサイトの分化に伴って層には、その発現は認められなかった。

3. 4. HaCaTにおけるDGKγの機能解析

変動するか、PCR で調べた。その結果、少なくとも β, γ, ι

分化に伴い、DGKγ の発現量が増加してくることから、が分化に伴い増加していることが明らかとなった（図４）。

DGKγ はケラチノサイトの形態に関係しているのではない

一方、ηは分化ともに減少する傾向を示し、他のサブタイかと考え、HaCaT に GFP - DGKγ を強発現させ、細胞の面プには顕著な変動は認められなかった。この中で、ιは変積及び厚さを測定した。しかし、顕著な差は認められなか化量が小さかったこと、また β は神経系における役割が報った（data not shown）。

告されているのに対し

6-8）、γ サブタイプは比較的変化量も多く、その機能がほとんど明らかでなかったため、γサブタイプに着目することにした。そこで、本当に DGKγが分化に伴い増加しているのかをタンパク質レベルで確認する

3. 5. DGKγノックアウト（KO）マウスの作製とその表
現型
そこで、DGKγ KO マウスを作製することにした。まず、こととした。その結果、図 5 に示すように、DGKγタンパ

genotyping によって KO と判断されたマウスについて、本ク質量は分化に伴い、顕著に増加した。

当に DGKγ がノックアウトされているか否か確認するため

図3

図4

HaCaT 細胞に発現している DGK サブタイプ
Mr.：サイズマーカー

分化・未分化 HaCaT における DGK 発現の確認− 108 −

ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明

図 5 分 化に伴う DGKγ タンパク質
量の変化

図6

図7

マウス皮膚における DGKγ の局在

DGKγKO マウス皮膚における DGKγ の消失に、ウエスタンブロット及び蛍光免疫組織染色を行った（図 7）。

トルイジンブルー染色によって各耳切片中の肥満細胞を赤

その結果、脳における DGKγ の発現は完全に消失しており紫色に異染色し、細胞数や脱顆粒率を遺伝子型間で比較し（data not shown）、皮膚における免疫反応も消失した（図た。その結果、KO マウスの方が皮膚炎誘導による 1 mm2７）。このことから、作製したマウスは DGKγ がノックア

あたりの肥満細胞数の増加が、小さい傾向にあった（図ウトされていることが確認された。そこで、得られた WT、8C）。即ち、浸潤してきているマスト細胞が少ない傾向が

DGKγ KO、ヘテロマウスの体重を 2 週齢目から 12 週齢ま認められた。一方、WT、KO 共に皮膚炎誘導によって肥で 1 週間ごとに測定したが、雌雄ともに顕著な体重の変化

満細胞の脱顆粒が促進される傾向が見られたものの、遺伝も見られず、メンデルの法則にしたがって生まれてきた

子型間で有意な差は見られなかった（図 8D）。脱顆粒率は、（data not shown）。さらに、皮膚においても、脱毛やバリ

皮膚切片全体の肥満細胞数中の脱顆粒している肥満細胞数

ア機能障害を示す表現型は今のところ観察されていない。

から算出した。

3. 6. 接触性皮膚炎試験

3. 7. 経皮吸収試験

一方、我々は DGKγ がマスト細胞からのヒスタミン分泌に
9）

経皮吸収試験は皮膚のバリア機能における DGKγ の必

関与していることを明らかにしている 。そこで、DGKγ要性を検討するために行った。DGKγ ヘテロマウス同士の接触性皮膚炎への関与を調べるために、KO マウスを用の mating によって得た新生児を、生後間もなく 0.4w/v %いて接触性皮膚炎試験を行った。

trypan blue solution（Wako）中で振とうした。その結果、

10 週齢の雄の WT および DGKγKO マウスに、TNCB を染色前後で比較するとマウスの皮膚表面に青い染色が見用いて接触性皮膚炎を発症させ、遺伝子型間でその症状をられたが、WT と DGKγ KO マウス間で見た目や染色の濃比較した。皮膚炎誘導 24 時間後の耳切片を HE 染色してさに有意な差は見られなかった（data not shown）。さらに観察し（図 8A）
、耳の平均の厚みを算出した。 耳の平均の組織学的に染色の浸潤度を比較するために、染色後の新

厚みは、耳切片染色図を 12 分割し、各地点の耳の幅を測定、生児の背部の皮膚を用いて、凍結切片を作製した。その結平均することで算出した。その結果、溶媒のみを塗布した

果、両遺伝子型で表皮の角質層に青い染色が見られたが、左耳と比較して TNCB を塗布した右耳の方が、WT、KOWT と DGKγ KO マウス間で差は見られなかった（data not

共に厚みが増していた（図 8B）。更に、KO マウスは、WT

shown）。

と比較して耳の厚みの増加率が高い傾向にあった。続いて、− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 8 接触性皮膚炎誘導 24 時間後の皮膚炎症状の比較(A) 接触性皮膚炎誘導 24 時間後の耳切片を用いて HE 染色を行った。 ( 黄色線 = 300 µm)(B) 遺伝子間で、耳の平均の厚みを比較した。図 . 1A のように HE 染色した耳切片図を 12 分割し、各地点の耳の厚みから平均の耳の厚みを算出した。
(C) 遺伝子型間で、皮膚切片 1 mm2 あたりの肥満細胞数を比較した。
(D) 遺伝子型間で肥満細胞の脱顆粒率を比較した。脱顆粒率は、皮膚切片全体の肥満細胞数中の脱顆粒している
肥満細胞数から算出した。また、トルイジンブルー染色によって染色された肥満細胞が、8 つ以上の顆粒を放出している時、脱顆粒していると判断した。

図9

傷の治癒速度の比較

経過日数ごとに 0 日目からの傷の治癒率を雄（A）、雌（B）
ごとに示した。
（雄 : n=2、雌 : n=3）

3. 8. Wound healing assay

創傷 0 日目からの傷の治癒率を算出した。その結果、WT

Wound healing assay は 傷 の 治 癒 に DGKγ が 関 与 し て

及び DGKγKO マウス共に、創傷 10 日目で傷が完治した。

いるかどうかを検討するために行った。10 週齢の WT お

しかし、雌雄共に遺伝子型間で、傷の治癒速度に大きな差

よび DGKγKO マウスの背部の毛を剃り、皮膚に直径約 2は見られなかった（図 9A, B）。

mm の傷を付け、経過日数ごとに測定した傷の面積を元に、− 110 −

ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明（参考文献）

４. 総括及び考察

1） Koster, M.I. and Roop, D.R. Mechanism regulating

本研究により、ケラチノサイトには多くの DGK サブ
タイプが発現していることが明らかになった。例えば、

epithelial stratification. Annu. Rev. Cell Biol. 2 3, 9 3113, 2007.

DGKβ, γ, ιサブタイプは分化に伴い増加し、ηは減少する

2） Denning, M.F. Epidermal keratinocytes: regulation of

ことが示唆された。しかし、本実験は、それぞれのサブタ

multiple cell phenotypes by multiple protein kinase C

イプが分化前と分化後を比較してその増減をみたものでisoforms. Int. J. Biochem. Cell Boil. 36, 1141-1146, 2004.

あるので、各サブタイプ間の発現量を比較することは困難

3） Nishizuka, Y. Intracellular signaling by hydrolysis

である。また、mRNA の量を調べただけであり、タンパ

of phospholipids and activation of protein kinase C.

ク質レベルの解析を今後行っていく必要がある。このうち、Science 258, 607-614, 1992.

DGKγは皮膚の蛍光免疫染色において、染色することには

4） Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino K., Kuramasu, M.,

成功しているが、皮膚のウエスタンにおいて、そのバンド

Nakamura, T., Yanagita, T., Mizuno, K., Hide, I., Nakata,を確認するにはいたっていない。増減が確認されたサブタ

Y. and Saito, N. Novel PKCα-mediated phosphorylation

イプについても、ウエスタンや蛍光免疫染色を行い、もっsite(s) on cofilin and their potential role in terminating

ともケラチノサイトの分化に寄与していそうなサブタイプ

histamine release. Mol. Biol. Cell 23: 3707-3721, 2012.
5） Adachi N, Oyasu M, Taniguchi T, Yamaguchi Y,を特定し、同様の実験を行っていく予定である。
皮膚に発現していることが明らかになった DGK サブタ

Takenaka R, Shirai Y, and Saito N. Immunocytochemical

イプのうち、少なくとも DGKγは基底層から顆粒層まで発localization of a neuron-specific diacylglycerol kinase β

現し、分化とともにタンパク質レベルで増加することがand γ in the developing rat brain. Mol. Brain Res. 139,

明らかとなった。しかし、今のところ、培養細胞におい288-299, 2005.

ても、KO マウスにおいてもケラチノサイトの分化におい6） Ishisaka M., Tsuruma K., Shimazawa M., Shirai Y.,て DGKγの重要性を示唆するような知見は得られていない。

Saito N. and Hara H. Increased seizure susceptibility

一方、我々は DGKγがマスト細胞からのヒスタミン分泌にin a mouse with diacylglycerol kinase β deficiency.

必須であることを発見した 。そこで、DGKγ KO マウス

Neuroscience & Medicine, 4, 117-122, 2013.

9）を用いて接触性皮膚炎試験も行った。その結果、炎症部位

7） Kakefuda K., Oyagi A., Ishisaka, M., Tsumura, K.,へのマスト細胞の浸潤の減少傾向は認められたものの、皮Shimazawa M., Yokota, K., Shirai Y., Horie K., Saito

膚の肥厚や脱顆粒を起こしているマスト細胞の数には有意

N., Takeda J. and Hara H. Diacylglycerol kinase β

な差は認められなかった。実際 DGKγ KO マウスにおいて、knockout mice exhibit lithium-sensitive behavioral

ヒスタミン量が減少しているのか、他の炎症性メディエー

abnormalities. PLoS ONE 5. e13447, 2010.

ターの量がどのようになっているのか調べていく必要があ8） Shirai Y., Kouzuki T., Kakefuda K., Moriguchi S.,
Oyagi A., Horie K., Morita S., Shimazawa M., Fukunaga

る。
さらに、皮膚のバリア機能及び傷に対する治癒速度など

K., Takeda J., Saito N. and Hara H. Essential role ofを検討したが、有意な差は認められなかった。今後、皮neuron-enriched diacylglycerol kinase (DGK), DGKβ膚における DGKγ の新たな機能を検討すべくより詳細なin neurite spine formation, contributing to cognitive

検討が必要と考えられる。一方、皮膚には DGKγ 以外にも

function. PLoS ONE 5. e11602-, 2010.

DGKβ, ι, ηサブタイプは分化に伴い変動していることから、

9） Sakuma M, Shirai Y, Ueyama T, Saito N. Diacylglycerol

これらのサブタイプの機能についても検討してく必要があkinase γ regulates antigen-induced mast cell degranulation

ろう。そして何よりも、さらに、ヒト皮膚組織を用いて、by mediating Ca

ケラチノサイトに発現している DGK サブタイプについて、Commun., 445:340-350, 2014.

調べていく必要がある。

− 111 −

2+

influxes. Biochem Biophys Res

新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づく
アンチエイジング法の開発
信州大学大学院医学系研究科循環病態学講座

新藤

隆 行、桜 井敬 之、神 吉昭子

Adrenomedullin (AM), originally identified as a vasodilating peptide, is now recognized to be a pleiotropic molecule
possessing various bioactivities. We have reported that knockout mice deficient in AM or RAMP2, an AM-receptor
accessory protein, show embryonically lethal, and proved that RAMP2 is the critical determinant of the vascular functionsof AM. However, not only in the vascular system, AM and RAMP2 are highly expressed in adipose tissue. To clarify thepathophysiological roles of AM-RAMP2 system in adult, we performed conditional gene targeting of RAMP2. Using genetargeted mice, we found that AM-RAMP2 system plays critical roles of maintaining homeostasis in adult. AM-RAMP2
system can thus be a novel therapeutic target of anti-aging.

１．緒

我々はこれまでに、AM と AM の受容体活性調節タンパ

言クである RAMP 2 のノックアウトマウスを樹立し、AM ホ

生体は、健康な状態を維持していく上で、様々な恒常性

モノックアウトマウス（AM-/-）と RAMP2 ホモノックア

維持（ホメオスターシス）の制御システムを有している。生

ウトマウス（RAMP 2 -/-）では、共に血管形成異常や浮腫

体内生理活性物質とその受容体システムは、元来生体が備が認められ、胎生致死となることを明らかにした。このこ

えたホメオスターシス制御システムの一つであるが、一方とから、AM の血管における機能が RAMP2 によって規定でその調節異常は、老化現象の進行や様々な生活習慣病のされていることがはじめて明らかとなった 4, 5）。

原因となる。こうしたホメオスターシス制御システムを統本研究では、通常のジーンターゲティングの方法に加合的に理解し、人為的に介入・操作することができれば、

えて、Cre-loxP システムを用いたコンディショナルター

様々な病気の予防やアンチエイジング法の開発につながる

ゲティングの方法により、血管あるいは脂肪組織特異的ことが期待される。

な RAMP2 ノックアウトマウスを作成し、成体におけるアドレノメデュリン（adrenomedullin:AM）は、ヒト褐色1）細胞腫から分離された生理活性ペプチドである 。AM は

AM-RAMP2 システムによる、ホメオスターシス制御機
構の詳細なメカニズムについて検討を行った。

血管、心臓、腎臓など様々な臓器で産生・分泌され、血管２．実拡張作用、抗酸化作用、抗炎症作用、臓器保護作用など多験

彩な生理活性を有する因子である。AM は脂肪組織にも由RAMP2 のエクソン 2 〜 4 の両側に loxP サイトを配置し来し、血中の 1/4 は脂肪組織由来とされている。また、ヒた RAMP2flox マウスを樹立し、CAG-Cre トランスジェ

トの血中 AM 濃度は肥満に伴い上昇し、Body mass index

ニックマウスと交配することで、全身で RAMP2 を欠損2）に相関することも報告されており 、AM はメタボリックシするマウス（RAMP 2 -/-） を作成した。ホモノックアウト

ンドロームの病態にも重要な役割を持つと考えられている。

マウス（RAMP 2 -/-） は胎生致死となるため、成体が得ら

一方、AM 受容体は G タンパク共役型受容体である CLRれるヘテロノックアウトマウス（RAMP 2 +/-） を用いて検（calcitonin receptor-like receptor）という 7 回膜貫通型討を行った。次に血管における RAMP2 の病態生理学的受容体であるが、CLR には、RAMP（receptor activity-

意義を明らかとするために、RAMP2 flox マウスと、血管

modifying protein）という 1 回膜貫通型タンパクが結合し、内皮細胞特異的に Cre リコンビナーゼを発現する vascular受容体機能を制御している 3）。RAMP には 1、2、3 の 3 種

endothelial（VE）-cadherin Cre トランスジェニックマウス

類のサブアイソフォームがあり、CLR が RAMP2 またはを交配し、Cre-lox P システムにより、血管内皮細胞特異

RAMP3 と結合することにより AM 受容体として機能する。

的 RAMP2 ノックアウトマウス（E-RAMP 2 -/-）を作成した。さらに脂肪細胞特異的に Cre リコンビナーゼを発現す*

る aP2Cre トランスジェニックマウスと RAMP2flox マウ
Anti-aging based on a novel system
maintaining homeostasis in the body
Takayuki Shindo*, Takayuki Sakurai,
Akiko Kamiyoshi
Department of Cardiovascular Research,
Shinshu University Graduate School of
Medicine

スを交配し、脂肪細胞特異的 RAMP2 ノックアウトマウス（A-RAMP 2 -/-）を作成した。
これらの遺伝子改変マウスを用いて、野生型（WT）マウスと表現型を比較検討することで、RAMP 2 欠損に伴う生体内
ホメオスターシス破綻と老化との関係について検討を行った。

− 112 −

新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発

３．結様の形態変化が認められた（図 2）。肝臓組織の Sirius red

果染色による検討では、通常の肝硬変とは異なり、線維化は全身型の RAMP2 ヘテロノックアウトマウス（Conventional

肝細胞側ではなく、血管の走行に沿って進行していた。

RAMP 2 +/-） は成体まで成長し、外見上の変化は認めな

E-RAMP2-/- の腎臓では、水腎症と多発性嚢胞腎が自いが、1 年齢を超える加齢マウスでは、肺、腎臓、肝臓と然発症し、嚢胞の周囲には線維化が著明であった（図３）。

いった主要な臓器に血管炎様の細胞浸潤が自然発症し、胸糸球体も拡大しており、糸球体硬化症を伴っていると考え部大動脈では、早期老化マーカーである SA-β-gal 染色陽られた。電顕像からは、糸球体において、足突起の融合、性の所見が認められた。さらに、炎症性接着因子である

基底膜の肥厚、内皮細胞と基底膜の部分的離開などが確認

ICAM-1,VCAM-1 が、8 週齢の若年期から発現が亢進しされた。

ていた。一方、E-RAMP2 -/- では、RAMP2 +/- より、病以上の結果から、血管内皮細胞の RAMP2 が失われると、変がさらに早期に出現した（図 1）。血管炎様の所見は若年

血管の恒常性が障害を受け、加齢と共に、各臓器の機能不期でも認められ、6 ヶ月齢程になると、より著明となった。

全の原因になると考えられた。

浸潤細胞は、CD3 や F4/80 陽性細胞が多いことから T リ

一方。A-RAMP2 -/- マウスは、普通食投与下におい

ンパ球やマクロファージの浸潤による慢性炎症が生じていて 5 週齢の若年期より WT マウスと比較して体重が有意ることが示唆された。

に増加した（図 4）。A-RAMP 2 -/- は、白色脂肪組織にこれらの炎症細胞浸潤のメカニズムを検討するため

お い て RAMP2 遺 伝 子 が WT マ ウ ス の 約 30 ％ に 低 下 しに、WT と RAMP2+/- マ ウ ス か ら、 肝 臓 類 洞 内 皮 細ていることが確認された。エネルギー消費を調べるた

胞を初代培養し、マクロファージの接着実験を行った。

め、呼吸代謝測定を行った結果、普通食投与下において、RAMP2+/- 由 来 の 内 皮 細 胞 で は、WT と 比 較 し て、 マ

A-RAMP2 -/- は WT マウスと比較して、明期、暗期ともク ロ フ ァ ー ジ の 接 着 性 が 亢 進 し て い た。 ま た、Real-に酸素消費量の低下と呼吸商の上昇が見られた（図 5）。呼time PCR 法により内皮細胞の遺伝子発現を検討したとこ

吸商が上昇していることから、脂肪を消費しにくく、肥満

ろ、RAMP 2 +/- の肝臓類洞内皮細胞では、VCAM-1 のになりやすいと考えられた。

発現亢進、eNOS の発現低下が認められた。これらのこと

次に、病理解析を行った。A-RAMP2-/- は WT マウス

から、RAMP2 発現が低下したマウスでは、加齢と共に血と比較して、個々の脂肪細胞が肥大化し（図 6A）、間質に管の恒常性が失われ、炎症性接着因子の発現が亢進するこ

おける F4/80 免疫染色陽性のマクロファージ浸潤も増加しとで、炎症細胞が接着しやすくなり、各臓器内の血管炎症ていた（図 6B）。さらに加齢マウスでは、脂肪組織間質のの原因になると考えられた。

著明な線維化の亢進が認められた（図 6C）。また、皮下脂

一方で、E-RAMP2 -/-のほとんどは、周産期に致死であ肪組織において、若年期より皮下脂肪層の肥厚と（図 7A）、ったが、一部のE-RAMP2 -/-では成体が得られ、これらを用いて病理学的解析を中心に解析を進めた。E-RAMP 2 -/の肝臓においては、6 ヶ月齢以上の加齢マウスで、肝硬変

図 1 6 ヶ月齢 E-RAMP2-/- マウスの肝臓と腎臓の病理像（Scale bars =100μm）− 113 −

図2

6 ヶ月齢 E-RAMP 2 -/- マウスの肝臓の外観

図3

6ヶ月齢 E-RAMP 2 -/- マウスの腎臓の断面像

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図4

A-RAMP 2 -/- マウスの外観と体重増殖曲線

図5

図6A-RAMP 2 -/- マウスの呼吸代謝測定

A-RAMP2 -/- マウスの白色脂肪組織の病理像
A: HE 染色B: F4/80 免疫染色
C: Masson Trichrome 染色

図7− 114 −

A-RAMP2 -/- マウスの皮下脂肪組織の病理像
A: HE 染色B: Masson Trichrome 染色新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発

線維化の亢進が認められた（図 7B）。A-RAMP2 -/- では、ことが予想された。E-RAMP2-/- の肝臓、腎臓における、皮下組織において、ビメンチン免疫染色陽性の線維芽細胞

superoxide、酸化脂質、NADPH oxidase の亢進が確認さの数も増加しており、トルイジンブルー陽性の肥満細胞のれた。AM には、強力な酸化ストレス抑制効果があること数も増加していた。Real-time PCR 法により皮膚におけるから、酸化ストレスの亢進が、E-RAMP2-/- において臓遺伝発現を検討したところ、A-RAMP2 -/- では RAMP2

器障害を促進した、もう一つの原因と考えられた。

の発現が WT の 4 割程度まで低下し、一方で AM は代償

一方、脂肪組織は様々なアディポカインを産生する臓性に約 3 倍に増加していた。A-RAMP2 -/- の皮膚では器であり、生体の恒常性維持に重要な役割を担うが、AM

TNF-α, IL-1β, MCP-1 といった炎症性サイトカイン、ケモ

も脂肪組織から多く分泌されている。A-RAMP2-/- では、

カインの発現が WT の 2 倍程度まで発現亢進しており、一普通食下でも肥満を発症し、酸素消費量の低下を認めるこ方で、IL-10 といった抗炎症性サイトカインは 2 割程度まとから AM はアディポカインの一つとして、生体内の代で発現が抑制されていた。

謝恒常性を直接制御していると考えられた。興味深いのは、脂肪細胞には、エネルギーを蓄積する白色脂肪細胞の他

A-RAMP2-/- では、皮下脂肪組織においても、若年期よにも、熱産生を行う褐色脂肪細胞、白色脂肪組織中に存在

り皮下脂肪層の肥厚と、線維化の亢進を認め、老化現象にし、熱産生を行うベージュ脂肪細胞が存在し、それぞれが似た組織像を示したことである。RAMP2 は皮膚の恒常性

異なる機能を有する。

維持にも係わっていることから、美容上のアンチエイジン

そこで次に、褐色脂肪組織の解析を行った。褐色脂肪

グについても、重要なターゲットとなりうる可能性がある。

組織においては、白色脂肪組織と同様に A-RAMP2 -/- で

５．総は RAMP2 遺伝子が野生型マウスの約 20 ％に低下してい括ることが確認された。褐色脂肪組織のリアルタイム PCR

生体のホメオスターシス維持において、生体内生理活性による遺伝子発現解析により、普通食投与下において、分子群は重要な機能を有しており、老化現象とは、これら

A-RAMP 2 -/- は野生型マウスと比較して、脂肪酸酸化系の生体内生理活性分子によるホメオスターシス機構が、環遺伝子である ACSL1 とミトコンドリア関連遺伝子である

境に応じて適応や変容を繰り返し、徐々に調節異常が蓄積

ATP synthase、COX IV、UCP1 などの発現低下が見られした状態とも考えられる。従って、生理活性分子によるホた。従って、褐色脂肪組織のミトコンドリア機能の維持とメオスターシスのメカニズムの包括的な解析を進めること

エネルギー消費にも、AM-RAMP 2 システムが関与してで、アンチエイジングや、健康長寿のための新しい予防・いると考えられた。

治療法につながることが期待される。

一方、鼠径部皮下脂肪組織は、若年期には褐色脂肪様の

今回、コンディショナルターゲティングの手法を用いる

脂肪細胞（ベージュ脂肪細胞）が多く見られるが、加齢と共ことで、生理活性ペプチド AM と、その受容体活性調節タに、白色脂肪細胞の割合が増加する。A-RAMP2 -/- マウ

ンパクである RAMP2 の生体内ホメオオスターシス維持に

スの鼠径部皮下脂肪組織においては、野生型マウスと比較おける意義を示すことができた。AM-RAMP2 系は、アン

して若年期に白色脂肪細胞の割合が多いことから、白色脂

チエイジングや、新しい予防・治療法開発のための良いタ肪細胞の分化制御にも AM-RAMP2 システムが関与してーゲット分子として期待される。

いることが示唆された。
以上の結果から、RAMP2 は、脂質の代謝と共に、炎症（引用文献）や線維化抑制など、脂肪組織の恒常性に関与しており、そ

1） Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichikiの破綻は、肥満や皮膚の老化の原因となると考えられた。

Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T: Adrenomedullin:

４．考

a novel hypotensive peptide isolated from human察

pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun

E-RAMP2-/- の主要臓器では、血管炎様の細胞浸潤が1993, 192:553-60.

認められた。これらの血管炎様の所見は、若年期でも認め

2） Nomura I, Kato J, Tokashiki M, Kitamura K: Increased

られるが、生後 6 ヶ月ほど経過した個体において、より広plasma levels of the mature and intermediate forms of

範囲に現れた。肝臓では、血管炎様の細胞浸潤のみならず、

adrenomedullin in obesity. Regulatory peptides 2 0 0 9,

肝硬変様の形態変化が確認できた。活性化されたマクロフ

158:127-31.

ァージが多数確認できることから、慢性炎症が起きている

3） McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown

ことが示唆された。また、線維化は中心静脈周辺から広がJ, Thompson N, Solari R, Lee MG, Foord SM: RAMPs

るのではなく、類洞内皮細胞に沿って進行していることか

regulate the transport and ligand specificity of the

ら、類洞内皮細胞の障害が、肝線維化の原因となっている

calcitonin-receptor-like receptor. Nature 1998, 393:333-9.

− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 20164） Shindo T, Kurihara Y, Nishimatsu H, Moriyama N,5） Ichikawa-Shindo Y, Sakurai T, Kamiyoshi A, Kawate

Kakoki M, Wang Y, Imai Y, Ebihara A, Kuwaki T, Ju

H, Iinuma N, Yoshizawa T, Koyama T, Fukuchi J, Iimuro

KH, Minamino N, Kangawa K, Ishikawa T, Fukuda M,

S, Moriyama N, Kawakami H, Murata T, Kangawa K,

Akimoto Y, Kawakami H, Imai T, Morita H, Yazaki Y,

Nagai R, Shindo T: The GPCR modulator protein RAMP2

Nagai R, Hirata Y, Kurihara H: Vascular abnormalities

is essential for angiogenesis and vascular integrity. J Clinand elevated blood pressure in mice lacking

Invest 2008, 118:29-39.

adrenomedullin gene. Circulation 2001, 104:1964-71.

− 116 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明
日本大学薬学部健康衛生学研究室

榛葉繁紀

In this study, we examined if reactive oxygen species (ROS) level shows circadian rhythm in the skin and role of themolecular clock system in the process. ROS level and gene expression involved in ROS production showed clear circadianrhythm in the skin of mice. The rhythmicity was diminished in the skin of molecular clock deficient mice. Consequently, we
are led to conclude that molecular clock system may regulate the skin homeostasis by controlling the cellular ROS level.

1．緒

上述したように皮膚機能においてサーカディアンリズム

言の存在が示唆されること、さらにはサーカディアンリズ

皮膚は、水分の喪失や透過を防ぐ水分保持機能、体温をムのマスターレギュレーターである Bmal1 の遺伝子欠損

調節する体温保持機能、さらには微生物や物理化学的刺激により皮膚機能の低下に基づく老化現象が観察されるこから生体を守るバリア機能など、内的ならびに外的環境変となどから皮膚機能維持における BMAL1 の重要性が予想化に適応してホメオスタシスの維持を行うための様々な機される。そこで、本研究では、皮膚機能におけるサーカデ

1）

能を担っている 。これらの皮膚機能が睡眠不足等の生活時間の変化により低下することが数多く報告されている

2, 3）

。

ィアンリズムを明らかにするとともにその調節におけるBMAL1 の役割を検討する

このような生活時間の変化による皮膚機能の変化は、皮膚

2．実においてサーカディアンリズムが存在することを示唆しており、事実、体温調節、皮脂の産生さらには水分蒸散量などに日内変動が存在することが知られている

2, 3）

。

験

2. 1. 実験動物
実験動物の取り扱いは日本大学薬学部実験動物倫理規定

各組織・細胞における生理機能の日内変動は、多くの時に準じて行った。1 ケージ当たり 3−6 匹に分配し自由給餌、計遺伝子により転写レベルにおいて調節されており、そ温度 23±1 ℃、相対湿度 50±10 ％、明暗 12 時間周期の条の中心は転写因子 Brain and muscle Arnt-like protein-1

件で飼育した。BMAL1 ヘテロ欠損マウス同士の交配によ（BMAL1）である。BMAL1 欠損（KO）マウスは、行動のり BMAL1 ホモ欠損マウスを繁殖した。また同腹より得ら

サーカディアンリズムの消失をはじめとして多くの生理れた野生型マウスをコントロールマウスとした。恒暗条件

4）

機能の異常を示すが 、中でも最も著しい表現型は寿命の5）短縮ならびに各組織における老化マーカーの増加である 。

下における実験では、サンプル採取の前にマウスを恒暗条
件下で 5 日間馴化させた後に実験に用いた。
明 暗 条 件 下 に お け る 実 験 で は 時 刻 を ZT（Zeitgeber

BMAL1KO マウスの寿命は、平均 37 週であり、通常の5）

C57BL/6J マウスのそれに比較して著しく短い 。また生time）で表示した。ZT0 は明期の開始を、また ZT12 は暗後 30 週以内にほぼ全ての BMAL1KO マウスは白内障を生期の開始を示す。

5）

じる 。これらに加えて、剃毛後の体毛の再伸長阻害さら恒 暗 条 件 下 に お け る 実 験 で は 時 刻 を CT（Circadianには皮下脂肪の減少等、皮膚機能に関連した老化現象が観time）で表示した。CT0 は明暗条件下における明期の開始察される 5）。BMAL1 欠損に伴うこれら老化現象の発現メに相当する時刻を示す。

カニズムは明らかではないが、BMAL1KO マウスでは各臓器において活性酸素種（reactive oxygen species ; ROS）
量が増加しており、このことが加齢促進に関係していると5）推察される 。

2. 2. Total RNAの抽出
組織を Phosphate buffered saline（PBS）で洗浄し、凍結プレス破砕装置 クライオプレス（マイクロテック・ニ
チオン化㈱）で破砕した後、TRI REAGENT（シグマア
ルドリッチ㈱）を用いて、total RNA を抽出した。残存する DNA を除去するために total RNA10 µg を DNase（RT-Regulation of skin functions by themolecular clock system
Shigeki Shimba
Department of Health Science, School of
Pharmacy, Nihon University

grade, 和光純薬工業㈱）2units により 37 ℃、15 分間の処理を行った。反応後フェノール / クロロホルム抽出により
RNA を抽出し、アルコール沈殿により精製した。

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

2. 3. 逆転写反応

レギュレーターである Bmal1 遺伝子の発現量は、暗期か

2. 2. で得られた RNA を 0.8 µM oligo dT プライマー（イら明期（ZT22-ZT2）にかけて最大となり、明期から暗期

ンビトロジェン㈱）および 1mM dNTP（インビトロジェ（ZT10-ZT14）にかけて最小となる日内変動が認められたン㈱）を含む Reaction buffer（和光純薬工業㈱）中におい（Fig. 1）。BMAL1 のパートナーである Clock の発現量は、て 60 ℃、5 分間、次いで 37 ℃、10 分間反応させた。その他の組織と同様にリズム性は認められなかった（Fig. 1）。

後、Reverse Transcriptase（和光純薬工業㈱）200 units

BMAL1/CLOCK の転写を負に制御する Cry1 の発現量はを加えて 37 ℃、60 分間、次いで 95 ℃、15 分間反応させ、暗期にピークを迎えた。BMAL1/CLOCK の標的遺伝子でcDNA を得た。

ある Rev-erb α ならびに D site albumin promoter binding
protein（Dbp）の発現パターンは BMAL1 におけるそれと2. 4. Real-time PCR 法によるmRNAの定量

逆位相を示し、明期にピークを迎えた（Fig. 1）。また時計

2. 3. で得られた cDNA（0.1 µg total RNA 相当）ならび遺伝子関連転写因子である RAR-related orphan receptorに各種プライマー（最終濃度 0.2 µM）を Platimun SYBR（Ror）の発現量には日内変動は認められなかった（Fig. 1）。

Green qPCR SuperMix-UDG（インビトロジェン㈱）と混合し、MX3000P Q-PCR system（ストラタジーン㈱）を用いて変性：94 ℃，30 秒間、アニーリング：58 ℃，30 秒間、伸長反応：72 ℃，30 秒間を 35 〜 40 サイクル条件下で反応

3. 2. マウス皮膚における皮膚機能関連遺伝子発現の日内変動（明暗条件下飼育下）
明暗条件下にてその発現量が日内変動する皮膚機能関連遺伝子を探索するために、各遺伝子発現量を検討し、片側を行い、各 mRNA の発現量を測定した。

ANOVA 解析により日内変動の有無を判定した。活性酸素

2. 5. ROS 量の測定

消去酵素 Catalase（Cat）の発現は ZT10 にトラフが存在す組織を PBS で洗浄した後、凍結プレス破砕装置 クライ

る日内変動を示した。また、Cu, Zn- スーパーオキシドジ

オプレス（マイクロテック・ニチオン㈱）で破砕した。そのスムターゼならびにグルタチオンペルオキシダーゼの発現後、PBS 中にてホモジナイズし、次いで 900×g, 15 分間（4も弱いながら日内変動を示した。活性酸素産生酵素である℃）遠心分離して得られた上清を組織抽出液とした。

NADPH オキシダーゼのサブユニットに関して、測定した試料中のタンパク質量を定量するために、組織抽出液にプロテインアッセイ CBB 溶液（ナカライテスク㈱）を添

いずれの遺伝子発現量も、ZT6 に最小値を示し、ZT14 に最大値を示す日内変動が観察された。

加し、混合・発色させた後、595 nm の吸光度を測定した。
を用いて作成した検量線から、タンパク質量を算出した。

3. 3. マウス皮膚における時計遺伝子発現のサーカディアンリズム（恒暗条件下）

タンパク質量で補正した組織抽出液に H2DCFDA（イマウス皮膚における自律的な遺伝子発現の日内変動（サンビトロジェン㈱）を加え、37 ℃で 30 分間インキュベー

ーカディアンリズム）の存在を確認するために、マウスをトした後、485 nm ならびに 520 nm における蛍光強度を測

恒暗条件下で飼育し、その際の皮膚における時計遺伝子発定した。

現を検討した。その結果、明暗条件下と同様、時計遺伝子

同様にウシ血清アルブミン（BSA）（インビトロジェン㈱）発現に振幅が認められ、特に Bmal1 および Clock は明暗条

2. 6. 8-OHdG 測定

件下よりも大きな振幅を示した（Fig. 2）。また、明暗条件

組織を採取した後、DNA エキストラクター TIS キット

下にて振幅を示さなかった Ror の発現量は、ZT18 におい（和光純薬工業㈱）を用いて DNA を抽出した。得られたて増加が認められ、Cry1 と同様の発現パターンを示した。

DNA を、8-OHdG 測定前処理試薬セット（和光純薬工業

以上のことから、マウス皮膚における遺伝子発現にサーカ㈱）を用いて前処理した後、含まれる 8-OHdG 量を高感度

ディアンリズムの存在が確認された。

8-OHdG Check（日本老化研究所）
を用いて測定した。

3．結

3. 4. マウス皮膚における遺伝子発現のサーカディア
ンリズム（恒暗条件下）

果

3. 1. マウス皮膚における時計遺伝子発現の日内変動

マウス皮膚において、その発現にサーカディアンリズム（明暗条件飼育下）を持つ皮膚機能に関連した遺伝子を探索するため、恒暗条

マウス皮膚における時計遺伝子の発現ならびにその日

件下で飼育したマウス皮膚における各遺伝子の発現量を検

内変動を確認するため、明暗条件下（明期：暗期＝ 12h：

討した。検討した遺伝子のうち、Col1a1、Mmp3、Foxo1、12h）で飼育したマウス背部より皮膚を採取し、その時計

Cu-Zn-Sod、Mn-Sod、Gpx, p40 phox ならびに p67 phox の発遺伝子の発現を検討した（Fig. 1）。体内時計のマスター

現量が、CT2~CT14 にかけて低く、CT18~CT22 に高い− 118 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明る。そこで、マウス皮膚における ROS 量の日内変動を検発現の変動を示した。

討した。明暗条件下では ZT2 および ZT10 が高い傾向にあ3. 5. マウス 皮 膚 に お ける活 性 酸 素 種（reactive
oxygen species ; ROS）量り、最大時と最小時で約 2 倍の量的違いが認められた（Fig.

活性酸素は細胞内代謝や遺伝子発現をはじめとする多く

においては約 5 倍の量的違いが認められた（Fig. 3B）。この分子反応を制御しており、様々な生理反応に影響を与えれらの結果から、ROS 量にサーカディアンリズムが存在3A）。恒暗条件下では CT10 が最も高く、最大時と最小時

Fig. 1 マウス背部皮膚における時計遺伝子発現の日内変動
明暗条件下（12 時間明期 -12 時間暗期条件下）にて飼育したマウス背部の皮膚を４時間ごとに採取し、mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。Mean±SEM (n=5)− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る ROS 量 を 測 定 し、ROS 産 生 お け る BMAL1 の 関 与 をすることが示された。

検討した。若齢（10 週齢）においてコントロールマウスと3. 6. BMAL1 欠損に伴うマウス皮膚におけるROS 量

BMAL1KO マウスの間に皮膚 ROS 量の違いは認められな

前節において、皮膚における ROS 量にサーカディア

かった（Fig. 4）。しかしながら、20 週齢において、コント

ンリズムがあることが示された（Fig. 3B）。そこでコント

ロールマウス皮膚における ROS 量は 10 週齢時に比べて約

ロールマウスならびに BMAL1KO マウスの皮膚におけ3 倍に増加したが、BMAL1KO マウスのそれは 10 週齢時

Fig. 2 マウス皮膚における時計遺伝子発現のサーカディアンリズム
恒暗条件下にて馴化させたマウス背部の皮膚を４時間ごとに採取し、mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。Mean±SEM（n=5）− 120 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明成する。そこで 3. 6. において ROS 量に差の生じた 20 週齢と同程度であった（Fig. 4）。

のコントロールマウスと BMAL1KO マウス皮膚を用いて、

3. 7. DNA 酸 化 損 傷 マ ー カ ー 8-Hydroxy-2'deoxyguanosine（8-OHdG）
量

8-OHdG 量を検討した。その結果、BMAL1KO マウス皮膚において減少傾向が見られた（Fig. 5）。

細胞内 ROS による DNA の酸化損傷に伴い 8-OHdG が生（A）明暗条件下（B）恒暗条件下

Fig. 3 マウス背部皮膚における ROS 量の日内変動およびサーカディアンリズム
明暗条件下（12 時間明期 -12 時間暗期条件下）にて飼育したマウス（A）ならびに恒暗条件下にて馴化させたマウス（B）の背部皮膚を４時間ごとに採取し、その ROS 量を、H2DCFDA を用いて測定した。Mean±SEM（n=5）

Fig. 4 マウス背部皮膚における ROS 量
明暗条件下にて飼育した 10 週齢（10w）ならびに 20 週齢（20w）のコントロールマウスおよび BMAL1KO マウスから背部皮膚を ZT10 に採取し、その際の ROS 量を、H 2DCFDAを用いて測定した。Mean±SEM（n=3）（*p<0.05）− 121 −

Fig. 5 マウス皮膚における 8-OHdG 量
明暗条件下にて飼育した 20 週齢のコントロー
ルマウスおよび BMAL1KO マウス皮 膚を ZT10に採取し、8-OHdG 量を、ELISA キットを用いて測定した。Mean±SEM（n=3）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

3. ８. BMAL1KO マウス皮膚における活性酸素関連遺伝子の発現変化
BMAL1 による皮膚機能調節を検討するため、ZT10 お

NADPH オキシダーゼサブユニット類の発現は、検討した
いずれの時間においても BMAL1KO マウスにおいて減少傾向が認められた（Fig. 6B）。

よび ZT22 においてコントロールマウスと BMAL1KO マ

4．考

ウスの背部皮膚を採取し、その遺伝子発現を検討した。活察性酸素消去系酵素の発現はいずれの時間においてもコン

皮膚機能におけるサーカディアンリズムを解明するためトロールマウスと BMAL1KO マウスとの間に差異は認めには、まず皮膚における時計遺伝子の発現パターンを明らられなかった（Fig. 6A）。一方、活性酸素生成酵素である

かにする必要がある。明暗条件下で飼育したマウス皮膚を
4 時間ごとにサンプル採取し、時計遺伝子発現パターンを（A）解析したところ、Ror を除くすべての時計遺伝子は日内変動を示した（Fig. 1）。そこで、これら明暗条件下における遺伝子発現変化が、光刺激により誘導される “日内変動” であるのか、あるいは自律的な“概日リズム（サーカディアンリズム）”の存在を反映しているものなのかを明らかにする
目的で、恒暗条件下においてマウスを飼育し、その皮膚にCatCu, Zn-Sod

Mn-Sod

おける遺伝子発現を解析した。その結果、時計遺伝子の発Gpx

現は明暗条件下と同様の発現パターンを示し、さらには明暗条件下では変動しなかった Ror の発現量にもリズム性が生じていた（Fig. 2）。また、Bmal1 や Clock の発現パター
ンを両飼育条件間で比較するとわかるように、恒暗条件下のほうが明暗条件下よりも、変動の幅が大きくなっている
ことがわかる（Fig. 1 および 2）。これらの結果から、皮膚における遺伝子発現にはサーカディアンリズムが存在する

Cat

Cu, Zn-Sod

Mn-Sodこと、そしてその活性は光刺激の影響を少なからず受ける

Gpx

ことが示され、Ror の発現は、この光刺激によるサーカデ（B）ィアンリズムの抑制の一例であると考えられる。
恒暗条件下で飼育したマウス背部皮膚を用いた検討から皮膚における ROS 量にサーカディアンリズムの存在が示されたことから、皮膚における ROS 量制御への BMAL1の関与が示唆された（Fig. 3B）。BMAL1KO マウスにおける ROS 量はコントロールマウスのそれに比較して、脾
臓、心臓、腎臓は増加、その一方で肝臓では低下が報告

p22phox p40phox p47phox p67phox gp91phox

されている 5）。そこで皮膚における ROS 量を測定したところ、10 週齢時における ROS 量は、コントロールマウ
スと BMAL1KO マウスとの間で差異は認められなかったが、BMAL1KO マウスでは、コントロールマウスにおいて観察された加齢に伴う ROS 量の増加は認められなかった（Fig. 4）。さらにこの際、DNA 酸化損傷のマーカーである 8-OHdG の値も、BMAL1KO マウスにおいて減少傾向が見られた（Fig. 5）。これらの結果より、BMAL1 は皮膚における ROS 量、特に加齢に伴う皮膚における ROS 量のp22phox p40phox p47phox p67phox gp91phox

Fig. 6 BMAL1KO マウス皮膚における活性酸素関連因子の遺伝子発現
明暗周期条件下にて飼育した 10 週齢のコントロールマウスおよび BMAL1KO マウスから背部皮膚を ZT10 および ZT18 に採取し、その mRNA の発現を、real-time PCR 法を用いて検討した。
（A）活性酸素消去系 （B）活性酸素産生系 Mean±
SEM（n=7）（*p<0.05）

産生を制御していることが明らかとなった。
次いで ROS 量の制御に関与する因子の遺伝子発現量を検討した。これら因子の発現は、時計遺伝子により産み出されるサーカディアンリズム、そして明暗周期による、すなわち光刺激により誘導される日内変動のいずれの影響も受けることが示された。例えば、恒暗条件下飼育マウスを− 122 −

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解明

用いた検討により、Cu, Zn-Sod、Mn-Sod、ならびに Gpx

variations of the skin barrier function in humans:の発現にサーカディアンリズムの存在が確認されたが、そtransepidermal water loss, stratum corneum hydration,の一方で、明暗条件下で飼育した BMAL1KO マウスにおskin surface pH, and skin temperature. J. Invest.

いて、これら遺伝子の発現に差が認められなかった。このDermatol., 110, 20-23, 1998.

ことは、これら遺伝子の発現の制御は、BMAL1 による制

3） Le Fur I, Reinberg A, Lopez S, Morizot F, Mechkouri

御を受けるものの、光刺激の影響が強いことを示している。

M, Tschachler E: Analysis of circadian and ultradian

他にも Cat あるいは NADPH オキシダーゼのサブユニット

rhythms of skin surface properties of face and forearmの一部の発現解析からも、光刺激による制御が支持される。

of healthy women. J. Invest. Dermatol., 1 1 7, 7 1 8-7 2 4,

これらの結果から、皮膚において様々な機能が 1 日を通2001.

じて変動していることが示唆され、またその制御には時計

4） Bunger MK, Wilsbacher LD, Moran SM, Clendenin

遺伝子による制御のみならず、光刺激の関与も大きいこと

C, Radcliffe LA, Hogenesch JB, Simon MC, Takahashiが明らかとなった。したがって本研究で得られたこれら知

JS, Bradfield CA: Mop3 is an essential component of

見は、生活時間の重要性を説くものであり、今後、化粧品

the master circadian pacemaker in mammals. Cell, 103,

開発をはじめとして、皮膚機能調節における概念に科学的1009-1017, 2000.
5） Kondratov RV, Kondratova AA, Gorbacheva VY,

エビデンスを与えるものである。

Vykhovanets OV, Antoch MP: Early aging and age（引用文献）

related pathologies in mice deficient in BMAL1, the1） 清水

core component of the circadian clock. Genes Dev., 20,

広：あたらしい皮膚科学 中山書店 2011.

2） Yosipovitch G, Xiong GL, Haus E, Sackett-Lundeen

1868-1873, 2006.

L, Ashkenazi I, Maibach HI: Time-dependent− 123 −

フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発
北海道大学大学院医学研究科皮膚科学分野

乃村俊史

Filaggrin plays a crucial role in epidermal barrier formation. Recently, loss-of-function mutations in the gene encoding
filaggrin (FLG) have been shown to predispose to atopic dermatitis. Since most of the FLG mutations identified area nonsense mutation, we, in this study, aimed to develop novel therapeutic strategies for atopic dermatitis targeting at
nonsense mutations in FLG. First, we performed mutation analysis of FLG to clarify the mutation frequency in the Japanese
population and showed that 10% of the population carry one or more FLG mutations. Subsequently, we established reporter
gene assays that can detect readthrough efficacy and performed compound screening by using these assays. Notably, we
identified about 50 potential hits from the compound libraries. These results would open a new avenue for developing more
effective and specific therapies for this intractable disease.

緒

言

アトピー性皮膚炎は、小児の約 10 − 20% が罹患する極
めて頻度の高い疾患である。しかし、アトピー性皮膚炎の病因は長らく不明であり、その治療はステロイド剤外用を中心とした対症療法に頼らざるを得ず、難治例では皮膚萎縮などのステロイドの副作用を高率に生じ、大きな社会問題となってきた。ステロイドに代わる新規治療薬の開発が強く求められる中、申請者は最近、日本人アトピー性皮膚炎患者の比較的小さな集団を解析し、その約 30% がフィラグリン遺伝子変異を持つことを明らかにした 1- 3）（図 1）。
フィラグリンは、皮膚バリア機能に必須のタンパク質であり、遺伝子変異により皮膚バリア機能が低下すると種々の抗原に易感作性となり、アトピー性皮膚炎を発症しやすく

図 1 アトピー性皮膚炎患者の一部はフィラグリン遺伝子に生じたナンセンス変異により発症する。

変異を読み飛ばしタンパク質合成をし続ける「リードスルなると推測されている。
そこで本研究では、まず、サンプルサイズの大きな集団ー」という現象を使い、フィラグリン遺伝子のナンセンス

を用いてフィラグリン遺伝子変異の保有率を解析し、さら変異を読み飛ばすことを目指す。日本人アトピー性皮膚炎に皮膚バリアの破綻に伴う慢性抗原刺激がアトピー性皮膚患者で同定されたフィラグリン遺伝子変異の 80% 以上が炎の主要な病因であるという新しい仮説のもとに、アトピ

ナンセンス変異であるため 3）、リードスルー活性を持つ薬

ー性皮膚炎の病因に直接的に基づいた初めての治療の試み

剤を用いれば多くの患者で正常の機能を持つフィラグリン

として、フィラグリン遺伝子に生じたナンセンス変異を読の産生増加が見込める。本研究では、リードスルー治療をみ飛ばすリードスルー療法の開発を目指すことにした（図用い、患者皮膚でのフィラグリンの発現そのものを増やす

2）。通常、ナンセンス変異により早期終止コドンができことで正常な角層形成を促しバリア機能を是正するという、

るとそこでリボソームはタンパク質の翻訳を中止するた

従来の治療法とは全く異なる独創的な治療法の開発を目指

め、機能性タンパク質が産生されず、疾患を発症する。本

す
（図 2）
。

研究では、リボソームによる mRNA 翻訳時にナンセンス実験

1. フィラグリン遺伝子変異保有率解析
D evelopment of novel t herapeut ic
strategies for atopic dermatitis targetingat filaggrin
Toshifumi Nomura
Department of Dermatology, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

環境と子供の健康に関する北海道研究（通称：北海道スタディ）は、平成 13 年からリクルートを開始し、現在、北海道内の約 2 万人の児が登録している出生コホート研究であり、一般集団を対象にしている。今回の研究では、そのうち、7 歳に到達した児 1,065 名を対象にフィラグリン

− 124 −

フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発

図 2 フィラグリン遺伝子に生じた変異を読み飛ばす（「リードスルー」）ことで皮膚バリア機能が回復し、アトピー性皮膚炎の治療と予防につながることが期待される。

遺伝子変異
（臍帯血）
とアトピー疾患の発症率などについて解析した。フィラグリン遺伝子変異については、これまで我々が同定した 11 種類の変異のうち、頻度の高い 8 種類のフィラグリン遺伝子変異（3321delA, S1695X, Q1701X,
S2554X, S2889X, S3296X, K4022X, 新規変異 1 つ）について Sanger 法を用いたダイレクトシークエンスでスクリーニングした。アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎、気管支喘息）の有無と重症度については、International Study of
Asthma and Allergies in Childhood（ISAAC）の問診票を用いて、2 歳時、4 歳時、7 歳時に判定した。

2. リードスルー活性を測定可能なレポータージーンア
ッセイの確立pGL4.20 ベクターのルシフェラーゼ遺伝子（luc2）内に、site directed mutagenesis により、人工的に早期終止コド

図 3 この細胞株はリードスルーが起こったときにのみ発光強度が増すため、薬剤のリードスルー活性測定に有用である。

も、得られた複数のクローンについて、Western blot 法を用いて characterization を行った。

ン（TAA）を作成した（Y179X）。制限酵素を用い、同変異を有する luc2 遺伝子を pcDNA5/FRT ベクター内の CMV
プロモーターの下流にクローニングした。変異 luc2 遺伝

3. フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発（リードスルー治療）

子を挿入した同ベクターと pOG44 を 293FlpIn 細胞に co-

2. で作成した変異 luc2 遺伝子を持つ stable cell line を、

transfection し、ハイグロマイシンで選択後に得られたコ

19,992 種類の化合物で 24 時間治療し、発光量を計測した。

ロニーから、stable cell line を作成した（図 3）。それぞれ

なお、アミノグリコシド系抗生物質の一つである G418（注：のコロニーから得られたクローンについて、ルシフェラ

重大な副作用を持ち、人体には投与不可能）を用いた治療ーゼアッセイによる characterization を行った。同様に、によりこの細胞株は強い発光を示したため、G418 を陽性

GFP 遺伝子内に、site direct mutagenesis を用い、人工的

コントロールとして用い、陰性コントロールには、DMSOに早期終止コドン（TAA）を作成した（Y40X）。pcDNA5/（1 ％）を用いた。また、すべての実験で細胞数自動カウン

FRT ベクターにクローニングし、ルシフェラーゼと同様

ト装置や分注機を用いることでなるべくマニュアルでの作の方法で stable cell line を作成した。この細胞株について業を減らし、再現性の高い実験になるよう工夫を凝らした。

− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

結果

1. フィラグリン遺伝子変異保有率解析
1065 人 中 96 人 に フ ィ ラ グ リ ン 遺 伝 子 変 異 を 認 め（heterozygote が 9 3 人、compound heterozygote が 3人）、解析集団の 9.3% がフィラグリン遺伝子変異を有していた（図 4）。変異の内訳は、3321delA：15 人、S1695X：
0 人、Q1701X：2 人、S2554X：11 人、S2889X：38 人、S3296X：7 人、K4022X：27 人、新規変異：2 人であった（図 4）。フィラグリン遺伝子変異とアトピー性皮膚炎の関連について解析したところ、2 歳時、4 歳時では、オッズ比がそれぞれ 1.55（95% 信頼区間：1.08-2.22）、1.47（95%信頼区間：1.03-2.09）であり有意差を認めたが、7 歳時ではオッズ比が 1.34（95% 信頼区間：0.95 − 1.90）であり、有図 4 日本人の一般人口の約 10% がフィラグリン遺伝子変異を有している。

意差を認めなかった。また、アトピー性皮膚炎の重症度については、フィラグリン遺伝子変異保有群のほうが非保有群と比べて有意に高かった（4 歳時）。しかしながら、変異の種類と重症度の間には明らかな相関は認めなかった。フィラグリン遺伝子変異やアトピー性皮膚炎の有無と気管支喘息の発症率には有意差を認めなかった。

2. リードスルー活性を測定可能なレポータージーンア
ッセイの確立ダ イ レ ク ト シ ー ク エ ン ス に よ り、luc2 遺 伝 子 内 に
Y179X が、GFP 遺伝子内に Y40X が、それぞれ作成されていることを確認した。変異 luc2 遺伝子を持つ stable cellline は、無治療ではルシフェラーゼアッセイにおいて極めて低い発光しか示さないのに対し、強力なリードスルー薬である G418（ヒトには使用不可能なアミノグリコシ

図 5 ルシフェラーゼアッセイを用いた 1 次スクリーニングにより、130 個の hit compound を同定した。

ド系抗生剤）で 24 時間治療後には強い発光を示した。一方、変異 GFP 遺伝子をトランスフェクションした stable

た（全化合物の約 0.65%）（図 5）。最も強い発光を示した

cell line は、抗 GFP 抗体を用いた Western blot で目的の化合物は、陰性コントロールと比べ、約 60 倍の発光増加

バンドが確認できなかった。そこで、同ベクターをアトを認めた。なお、陽性コントロールの %CV は 7.9%、陰性

ピー性皮膚炎 293 細胞に transient transfection し、同様

コントロールの %CV は 14.8% であり、Z’ factor は 0.77 との方法で Western blot を施行したところ、G418 の濃度依

良好な値を示した。130 個の化合物について、ルシフェラ

存性に GFP の発現量も増加していた。その後、変異 luc2

ーゼアッセイを用い、retest screening を施行したところ、遺伝子を持つ stable cell line を用いて、細胞数など種々の約 40% の化合物が再度、強い発光増加を示した。

条件を変えてルシフェラーゼアッセイを行い、96 ウェル

考

プレートに 5,000 個の細胞を播き、500mg/mL の G418 で察

24 時間治療した場合に、最も精度の高いデータ（%CV、Z’

1. フィラグリン遺伝子変異保有率解析

factor）が得られることを確認した。

1. 1. フィラグリン遺伝子変異の保有率について
英国の学童調査では変異の保有率は 13.8% であり 4）、北

3. フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発（リードスルー治療）
2. で作成した変異 luc2 を持つ stable cell line を用いて、海道八雲町の成人を対象にした八雲スタディでの変異の保有率は 11.1% であった 5）。今回の我々の結果でも対象集団の約 10% 弱が変異を保有しており、フィラグリン遺伝子

primary screening を行ったところ、陰性コントロールと変異の保有率は日本でも英国でも約 10% 程度と推測され比べ約 4 倍以上の発光を示した化合物が、130 個同定される。人口の少なくとも 1 割は遺伝的に皮膚バリア機能が低− 126 −

フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発下しており、経皮的に易感作性でアトピー性皮膚炎を発症疾患を予防できる可能性を示唆する重要な知見である。
リードスルー治療については、現時点ではリードスルー

しやすいことが予想される。
1. 2. フィラグリン遺伝子変異とアトピー性皮膚炎について活性を持ちヒトへの投与が可能な薬剤はアミノグリコシド

欧米のスタディでは、フィラグリン遺伝子変異はアトピ系抗生剤（ゲンタマイシンなど）と PTC124 しか知られていー性皮膚炎の重要な発症因子であることが示されておりないが、両者ともにリードスルー活性が低く、前者は副作（オッズ比：2.13 〜 4.78）6, 7）、日本人でも両者に有意な相用の点から患者への長期投与が困難である。薬剤のリード

関は認められたが、欧米のデータと比するとオッズ比はや

スルー活性を測定可能なレポータージーンアッセイシステ

や低めであった。

ムとして、ルシフェラーゼと GFP を用いたアッセイを確立し、約 2 万種類の化合物をスクリーニングし、約 50 個

2. リードスルー活性を測定可能なレポータージーンア
ッセイの確立のリードスルー活性の高い化合物を同定することに成功した。これらの化合物は、アトピー性皮膚炎の治療や予防のアトピー性皮膚炎に対するリードスルー治療の開発に向

みならず、種々の遺伝性疾患の治療にも有効である可能性

けては、我々の保有する約 2 万種類の化合物を用いた大規があり、今後、モデル動物を用い、効果と安全性を検討し模スクリーニングを企画し、ルシフェラーゼアッセイを用ていく予定である。また、今回我々が確立したスクリーニ

いて、drug screening に不可欠な、薬剤のリードスルー活

ングシステムはリードスルー化合物の検索に有用であっ性を測定可能なレポータージーンアッセイシステムを構築たため、追加で化合物ライブラリーを購入し、さらなるすることに成功した。また、GFP を用いたアッセイシス

drug screening を行うことも可能である。これにより、アテムも構築した。ルシフェラーゼアッセイは感度が高い一

トピー性皮膚炎患者皮膚でのフィラグリンの発現そのもの方、疑陽性が多いことが知られているが、我々が今回作成を増やすことで正常な角層形成を促し、バリア機能を是正した GFP アッセイと併用することで、これらの欠点を克するという、従来の治療法とは全く異なる独創的な治療法

服することが可能である。また、今回のスクリーニングで、の開発が可能となるものと確信している。

%CV、Z’ factor ともに良好な値を示し、今回我々が確立したアッセイがリードスルー活性測定において精度と質の（引用文献）
1） Nomura T, Sandilands A, Akiyama M, et al. Unique

高いものであることを確認した。

mutations in the filaggrin gene in Japanese patients

3. フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発（リードスルー治療）

with ichthyosis vulgaris and atopic dermatitis. J

上述の実験 2. で作成した、良質なアッセイシステムを

2） Nomura T, Akiyama M, Sandilands A, et al. Specific

用い、我々は約 50 個のヒット化合物を同定した。これら

filaggrin mutations cause ichthyosis vulgaris andの化合物は、強いリードスルー活性を持つことが予想され、

significantly associated with atopic dermatitis in Japan.

今後アトピー性皮膚炎や種々の遺伝性疾患への臨床応用に

J Invest Dermatol 128: 1436-1441, 2008.

Allergy Clin Immunol 119: 434-440, 2007.

つながることが期待される。また、今後、これらのヒット

3） Nomura T, Akiyama M, Sandilands A, et al.

化合物について、GFP など他のレポータージーンアッセ

Prevalent and rare mutations in the gene encoding

イを用いた評価を進めるとともに、フィラグリン遺伝子に

filaggrin in Japanese patients with ichthyosis vulgaris

ナンセンス変異を持つアトピー性皮膚炎患者由来の培養細and atopic dermatitis. J Invest Dermatol 1 2 9: 1 3 0 2-胞を治療し、フィラグリンの発現が回復するか検討を行う

1305, 2009.

予定である。また、ナンセンス変異を持つモデル動物への

4） Brown SJ, Relton CL, Liao H, et al. Filaggrin

投与により、in vivo での効果と副作用についても詳細な

haploinsufficiency is highly penetrant and is associated検討を行う予定である。

with increased severity of eczema: further delineation

総of the skin phenotype in a prospective epidemiological括

study of 792 school children. Br J Dermatol 161: 884-

本研究により、日本人の約 10% がフィラグリン遺伝子889, 2009.

変異を持ち、アトピー疾患を発症しやすい状態であること

5） Kono M, Nomura T, Ohguchi Y, et al. Comprehensiveが明らかになった。これは、アトピー性皮膚炎の治療にフscreening for a complete set of Japanese-population-ィラグリンの発現を増やすことが重要であることを示唆す

specific filaggrin gene mutations. Allergy 69: 537-540,

るとともに、アトピー性皮膚炎を発症するから保湿剤の使

2014.

用などにより皮膚バリア機能を回復させることでアトピー

6） Irvine AD, McLean WH, Leung DY. Filaggrin− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

mutations associated with skin and allergic diseases. N

eczema: results from the 2 birth cohort studies

Engl J Med 365: 1315-1327, 2011.

LISAplus and GINIplus. J Allergy Clin Immunol 1 2 5:7） Cramer C, Link E, Horster M, et al. Elder siblings

1254-1260, 2010.

enhance the effect of filaggrin mutations on childhood− 128 −

皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析
昭和大学薬学部社会健康薬学講座衛生薬学部門

原俊太郎

Microsomal prostaglandin (PG) E synthase-1 (mPGES-1) and prostacyclin synthase (PGIS) are PG terminal synthasesthat function downstream of inducible cyclooxygenase (COX)-2 in the PGE2 and PGI2 biosynthetic pathways, respectively.
In the present study, to reveal the role of these PG terminal synthases in skin diseases, we investigated the effects of genetic
deletion of mPGES-1 and PGIS on skin disease models in mice. As the results, we found that both mPGES-1- and PGISdeficient mice exhibited a significantly decreased contact hypersensitivity response, indicating that mPGES-1 and PGIS
cooperatively exacerbate skin inflammatory reactions. Chemical-induced skin carcinogenesis was also suppressed by
mPGES-1 deficiency, but PGIS deficiency did not affect skin carcinogenesis. mPGES-1 plays an important role in skincarcinogenesis, but contribution of PGIS might be little.

１．緒言

プロスタグランジン（PG）類は様々な生理現象に関わるばかりでなく、炎症やがんといった幅広い病態の発症や進行にも関わることが知られている。各々の PG 類はシク
ロオキシゲナーゼ（COX）によりアラキドン酸から産生された PGH2 に、それぞれの PG 類に特異的な PG 最終合成酵素が作用することにより産生される（図 1）。アスピリンなどの非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は COX を抑制し
この PG 類の産生を抑えることで、抗炎症作用、抗がん作

図1

プロスタグランジン類の合成経路用といった薬理作用を発揮するが、従来用いてこられた
NSAIDs は胃粘膜保護作用など重要な生理作用を示す PG

mPGES-1 と PGIS はいずれもこのうち COX-2 と選択的に類を含め、すべての PG 類産生を抑えてしまうために、多機能連関し、それぞれ PGE2、PGI2 を産生する酵素である1）。

くの副作用を併せもつことが問題となっている。また、皮本研究では、mPGES-1 および PGIS の遺伝子欠損マウス

膚疾患においては、NSAIDs がアレルギー性皮膚炎を逆にを用い、皮膚炎や皮膚がんを惹起した際に、野生型マウス

増悪化すること、一部の NSAIDs が光過敏症を誘発すること、病態の発症や進行にどのような違いがみられるか検討とも知られており、NSAIDs の皮膚疾患への適用を妨げるした。また、病態の発症や進行に伴い産生される各 PG 類を、大きな要因となっている。そこで、本研究では、皮膚疾

LC-MS/MS を用い経時的に定量解析した。

患にも適用可能な新たな NSAIDs の創製を指向し、従来の本研究で解析を行う mPGES-1 の特異的阻害剤について

NSAIDs が標的とする COX に代わる新たな創薬標的としは、現在、副作用の少ない NSAIDs として国内外でそのて、COX の下流ではたらく PG 最終合成酵素、中でも PGE開発が進んでいるが、この新たな阻害剤は、これまでの合成酵素の 1 つ、膜結合型 PGE 合成酵素 -1（mPGES-1）

NSAIDs とは作用点だけでなく構造もかなり異なり、それと、PGI 合成酵素（PGIS）に注目した。NSAIDs の標的でゆえに光過敏症等を起こさない可能性も期待できる。これある COX には、生体の恒常性維持に主に関わる構成型

らの研究は、PG 最終合成酵素群を標的とする新たな皮膚の COX-1 と、炎症やがんの発症や進展に伴い発現誘導さ疾患の治療薬の可能性を示すだけでなく、今まで明らかとれる誘導型の COX-2 の 2 つのアイソザイムが存在するが、なっていなかった皮膚疾患の新たな発症、進展の機構の解明にもつながることが期待される。

２．実
Role of prostaglandin terminal synthases
in skin disease
Shuntaro Hara
Division of Health Chemistry, Department
of Healthcare and Regulatory Sciences,
School of Pharmacy, Showa University験

2. 1. 動物
mPGES-1 の遺伝子欠損マウス 2）は大阪大学の審良静男教授より寄贈された mPGES-1 遺伝子ヘテロ欠損（+/-）マウス（C57BL/6×129Sv 系）を、PGIS の遺伝子欠損マウス 3）− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016は神奈川工科大学の横山知永子先生より寄贈された PGIS

ール中でホモジネートした。3000 rpm、4 ℃、5 分間遠心遺伝子ヘテロ欠損（+/-）マウス（C57BL/6 系）を交配した

した後に、上清を回収し脂質を抽出した。調製したライゼ

ものおよび、それぞれ Balb/c 系に 10 代以上戻し交配しートに内部標準として LTB4-d4 を加え、3 mL の PBS にてたものを用いた。これらのマウスの尻尾先端部から DNA

希釈後、塩酸を 1 滴加えた試料を事前にメタノール 5 mL、を抽出後、常法によりジェノタイピングし、KO、ヘテロ、蒸留水 5 mL で洗浄した SEP-PAK C18（Waters）カラムにWT に識別し、各実験に使用した。

吸着させ、蒸留水、15 ％エタノール、ベンゼンの順に各5 mL で洗浄後、酢酸エチル・メタノール（9：1）溶液 3 mL

2. 2. DNFB 誘導アレルギー性接触皮膚炎モデル

で溶出して PG 類を抽出した。溶媒を除去し、水：アセト

アレルギー性接触皮膚炎における mPGES-1、PGIS の役割を検討するために、
dinitrobenzene sulfonic acid（DNFB）

ニトリル：ギ酸（63：37：0.02）に再度溶解し、測定用サンプルとした。

によるアレルギー性接触皮膚炎を惹起した。DNFB はア

PG 類の測定は LC-MS/MS の系 4） で行った。液体クロ

セトン：オリーブオイル＝ 4：1 溶液として用いた。まず、マトグラフィー（LC）の分離は Prominence HPLC システ

Balb/c 系マウスの腹部の毛をバリカンで剃り、翌日に 0.5

ム（島津）を用いて以下の条件で行った（カラム：TSKgel％ DNFB を塗布した後 5 日間おいて感作を成立させた。5ODS-100 V column（2.0×150mm 内 径、5 µm particle、

日後、マウスの右耳介皮膚に 0.3 ％ DNFB を塗布し、耳介

Tohso）、サンプル流入量：5 µL）。移動相は水：アセトニの厚さを 1、2、3、5、7、14 日と継時的に測定し、アレル

トリル：ギ酸（63：37：0.02）とアセトニトリル：イソプロ

ギー性皮膚炎の指標とした。また、コントロールとして左パノール（1：1）のグラジェントでカラムに保持された試料

耳介にはアセトンのみを塗布した。DNFB を耳介に塗布しを流速 300 µL/min で溶出させた。MS/MS 解析はトリプて 2 日後の耳介組織を摘出し、組織標本の作製、組織中のル四重極質量分析装置 QTRAP5500 システム（AB Sciex）

PG 類の定量に用いた。

を用いてイオンを検出した。

2. 3. TPA 誘導一次刺激性接触皮膚炎モデル

2. 6. RNAの調製、逆転写、定量的 PCR

一次刺激性接触皮膚炎における mPGES-1、PGIS の役

摘 出 し た 組 織 に TRIZOL（Invitrogen）500 µL を 加 え

割 を 検 討 す る た め に、12-O-tetradecanoylphrobol-13-て細胞を破砕し、常法により RNA を抽出した。抽出しacette（TPA）による皮膚炎を惹起した。TPA はエタノ

た RNA を High Capacity cDNA Reverse Transcription

ールに溶解して 16 mM に調製してストックし、使用時にKit（Applied Biosystems）を用いて逆転写反応を行い、16 µM になるようにアセトン溶液とした。マウスの右耳介

cDNA を得た。合成した cDNA を用いて定量的 PCR を行に TPA 3.2nmol（200 µL/mouse）
を塗布後、耳介の厚さを 1、い、mRNA 発現を解析した。反応は Applied Biosystems

3、5、6、24 時間と継時的に測定し、皮膚炎の指標とした。

Step OneTM Real-Time PCR SystemによってPower SYBRR

また、コントロールとして左耳介にはアセトンのみを塗布

Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて

した。

行った。

2. 4. DMBA/TPA 誘導皮膚発がんモデルを用いた
解析

2. 7. 組織標本の作製摘出した組織を中性緩衝ホルマリン溶液によって固定後、皮膚での化学発がんにおける mPGES-1、PGIS の役割

パラフィン包埋して薄切した。ヘマトキシリン・エオジン

を 検 討 す る た め に、7, 12-dimethylbenz [a] anthracene

染色には、マイヤーヘマトキシリン溶液（WAKO）および（DMBA）/TPA を 用 い た 2 段 階 発 が ん モ デ ル に よ る 解

1 ％エオシン Y 液（武藤化学）を用いた。

析 を 行 っ た。DMBA は 2 mM ア セ ト ン 溶 液 と し、TPA

３．結は 16 µM ア セ ト ン 溶 液 と し た。 マ ウ ス の 背 部 皮 膚 に、果

1 週間に 2 度ずつ TPA 3.2 nmol（200 µL/mouse）を塗布し3. 1. mPGES-1の欠損はアレルギー性接触皮膚炎を抑制するた。20 週間後に皮膚に生じたポリープ数をカウントする

はじめに、mPGES-1 の接触性皮膚炎における役割を明とともに、皮膚組織の病理学的解析、PG 類の定量、PG 産らかとするために、DNFB を用いたアレルギー性接触皮膚

生酵素の発現レベル解析を行った。

炎モデルによる解析を行った。DNFB を腹部に塗布し、感DMBA 0.4 µmol（200 µL/mouse）を塗布し、1 週間後から作させたのち、DNFB を耳介に塗布すると、野生型マウス

2. 5. 組織中 PG 類の定量では 2 日後をピークに耳介が肥厚し、その後緩やかに寛解摘出した組織を Bead Crusher（Taitec）を用いてメタノした。

− 130 −

皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析

一方、mPGES-1 欠損マウスでは、野生型マウスと同じく

PGIS の欠損は PGI2 産生を抑制し、アレルギー性接触皮膚2 日目をピークに耳介の肥厚が認められたが、野生型マウ炎を抑制することが示唆された。

スと比較すると肥厚の程度は抑制されていた。

さらに、一次刺激性皮膚炎への PGIS の関与を調べるた
めに、TPA を耳介に塗布して皮膚炎を惹起し、耳介の肥3. 2. PGIS の欠損はアレルギー性接触皮膚炎を抑制する厚を測定した。TPA による耳介の肥厚は PGIS 欠損マウス
においても野生型マウスと同程度であった。

次に、PGIS の接触性皮膚炎における役割を検討するために、同様に、DNFB を用いてアレルギー性接触皮膚炎を3. 3. mPGES-1 の欠損は皮膚化学発がんを抑制する惹起した。PGIS 欠損マウスにおいても DNFB を耳介に塗さらに、mPGES-1 の皮膚化学発がんにおける役割を明布してから 2 日目に最も肥厚が認められたが、野生型マウ

らかとするために、DMBA/TPA による皮膚化学発がんモスと比較して、耳介の肥厚は抑制された（図 2）。

デルによる解析を行った。野生型マウスでは DMBA/TPA

野生型マウスの耳介組織中の PG 類の量を測定したとの塗布により 12 匹中 11 匹のマウスに皮膚腫瘍が形成されころ、DNFB を塗布してから 2 日後には PGI2 代謝物であたのに対し、mPGES-1 欠損マウスでは 8 匹中 2 匹にしかる 6-ketoPGF1α 量が増加していたが、PGIS 欠損マウスで腫瘍は観察されず、発がん率の顕著な低下が認められたは 6-ketoPGF1α は検出されなかった。これらの結果より、（図 3）。さらに、腫瘍数を測定したところ、野生型マウス

図2

野生型および PGIS 欠損マウスにおけるアレルギー性接触皮膚炎反応
HE 組織染色（bar：100μm）

図3

野生型および mPGES-1 欠損マウスにおける皮膚化学発がん
上：肉眼所見、下：HE 組織染色（bar：100μm）− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016では 12 匹中 4 匹において 10 個以上の腫瘍が認められたが、

DNFB による接触性皮膚炎が抑制されたのは、mPGES-1/

mPGES-1 欠損マウスでは腫瘍が形成された 2 匹においてPGE2/EP1 のシグナルが抑制されたためであると考えら

も 5 個または 6 個しか認められなかった。これらの結果よれる。また、PGI2 受容体である IP の欠損マウスにおいてり、mPGES-1 の欠損は発がん率、腫瘍数ともに顕著に抑も IFNγ 産生の減少に伴い、DNFB によるアレルギー性

制することが示唆された。

接触皮膚炎の抑制が認められている 8）。また、PGI2 誘導

野 生 型 マ ウ ス の 皮 膚 組 織 中 の COX-2、mPGES-1 の

体は Th1 分化を促進することも報告されていることから、

mRNA 発現を定量的 PCR にて解析したところ、未処理のmPGES-1 と PGIS は PGE2 および PGI2 産生を介してとも

皮膚組織と比較して DMBA/TPA 塗布により顕著に COX-に Th1 分化を促進し、アレルギー性接触皮膚炎に関与す

2、mPGES-1 発現が促進され、腫瘍組織ではさらに増加しることが考えられた。

た。このときの PGE2 産生を LC/MS を用いて測定したと一方、皮膚化学発がんにおいては、mPGES-1 は促進的

ころ、COX-2、mPGES-1 発現の増加に伴い、腫瘍組織にに作用することに対し、PGIS は関与しないことが明らかおいて顕著に増加していた。一方、mPGES-1 欠損マウスとなった。PGE2 は多くの組織において発がんを促進する

では DMBA/TPA による PGE2 産生が抑制されていた。

ことが報告されており 2）、皮膚においても EP2 の欠損によ

これらの結果より、mPGES-1 の欠損は PGE2 産生を抑って DMBA/TPA による発がんが抑制されること 9）や、反制し、DMBA/TPA による皮膚における化学発がんを抑制

対に EP1、2、4 を過剰発現させたマウスでは発がんが促することが明らかとなった。

進されること 10~12）が報告されている。今回 mPGES-1 の欠損が皮膚においても化学発がんを抑制することが明らか

3. 4. PGIS の欠損は皮膚化学発がんに関与しないとなったことで、皮膚においても mPGES-1 によって産生

さらに、PGIS の皮膚化学発がんにおける役割についてされた PGE2 が EP 受容体を介して発がんを促進しているも解析を行った。Balb/c 系 PGIS 欠損マウスでは DMBA/

ことが裏付けられた。PGI2 とがんの関連については PGISTPA によって 8 匹中 7 匹に皮膚に腫瘍が形成され、野生の遺伝子多型が発がんリスクに関わるといった報告 13）が型マウスと同程度の発がんが認められた。Balb/c 系マウあるものの、その機構についてはほとんどわかっていな

スは発がん率が高く、ほぼすべてのマウスに発がんが認めい。我々はこれまでに PGIS の欠損が大腸における化学発られている。我々はこれまでに大腸においては PGIS の欠損

がんを促進することを見出してきた 5）が、皮膚発がんへのは化学発がんを促進することを見出しており 5）、より発がPGIS の関与については全く不明であった。本研究によりんしにくい条件下では皮膚においても PGIS の欠損が発がん組織によって PGIS の発がんへの寄与は異なる可能性が示を促進する可能性も考え、次に C57BL/6 系マウスを用いて唆された。今後どのような要因が PGIS と発がんを結びつ同様に皮膚発がんを誘導した。その結果、C57BL/6 系マ

けるのか解明していく必要がある。

ウスにおいても、PGIS 欠損マウスでは野生型マウスと同程度の発がんが認められた。また、皮膚においては PGI2 代

５．総謝物である 6-ketoPGF1α はほとんど検出されなかった。

括

本研究により、アレルギー性接触皮膚炎においてはこれらの結果より、皮膚組織中の PGI2 産生量は少なく、

mPGES-1 と PGIS がともに促進的に作用し、協調的な働

PGIS の欠損は DMBA/TPA による皮膚発がんには関与しなきをしていることが明らかとなった。また、皮膚化学発がいと考えられた。

んにおいては mPGES-1 が促進的に働く一方で、PGIS の４．考

関与はないことが示唆された。

察

以上の結果より、mPGES-1 と PGIS はそれぞれ、PGE2
および PGI2 産生を介して接触性皮膚炎を促進することが示唆された。PGE2 受容体には EP1 〜 EP4 の 4 種類が知ら

謝

辞本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団より研究助成を賜りましたこと、心より感謝いたします。

れているが、このうちの EP1 の欠損マウスでは Th1 への分化が抑制されることで DNFB によるアレルギー性接触皮膚炎が抑制される 6）。しかし、EP3 欠損マウスでは反対7）に増悪することが報告されている 。これは、ケラチノサ
イトに発現する EP3 が CXCL1 の発現を抑制することで好（引用文献）
1） Smith WL, Urade Y, Jakobsson PJ, : Enzymes of thecyclooxygenase pathways of prostanoid biosynthesis,
Chem. Rev., 111, 5821-5865, 2011.

中球の浸潤を抑制し、抗炎症作用を示すため、EP3 の欠2） Sasaki Y, Kamei D, Ishikawa Y, Ishii T, Uematsu

損によって抗炎症作用が抑制されてしまったことによる

S, Akira S, Murakami M, Hara S, : Microsomalと報告されている。今回、mPGES-1 欠損マウスにおいて

prostaglandin E synthase-1 is involved in multiple− 132 −

皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析

steps of colon carcinogenesis, Oncogene, 31, 2943-2952,

8） Nakajima S, Honda T, Sakata D, Egawa G, Tanizaki
H, Otsuka A, Moniaga CS, Watanabe T, Miyachi

2012.
3） Yokoyama C, Yabuki T, Shimonishi M, Wada M,

Y, Narumiya S, Kabashima K, : Prostaglandin I 2-IP

Hatae T, Ohkawara S, Takeda J, Kinoshita T, Okabesignaling promotes Th1 differentiation in a mouse

M, Tanabe T, : Prostacyclin-deficient mice develop

model of contact hypersensitivity, J Immunol., 1 8 4,

ischemic renal disorders, including nephrosclerosis and5595-5603, 2010.

renal infarction, Circulation, 106, 2397-2403, 2002.

9） Sung YM, He G, Fischer SM, : Lack of expression4） Kuwata H, Yoshimura M, Sasaki Y, Yoda E, Nakataniof the EP2 but not EP3 receptor for prostaglandinY, Kudo I, Hara S, : Role of long-chain acyl-coenzyme

E2 results in suppression of skin tumor development,

A synthetases in the regulation of arachidonic acid

Cancer Res., 65, 9304-9311, 2005.

metabolism in interleukin 1β-stimulated rat fibroblasts,
Biochim. Biophys. Acta, 1841, 44-53, 2014.

10）Surh I, Rundhaug JE, Pavone A, Mikulec C, Abel
E, Simper M, Fischer SM. : The EP1 receptor for5） Sasaki Y, Kamiyama S, Kamiyama A, Matsumoto

prostaglandin E2 promotes the development andK, Akatsu M, Nakatani Y, Kuwata H, Ishikawa Y,

progression of malignant murine skin tumors, Mol.

Ishii T, Yokoyama C, Hara S, : Genetic-deletion ofCarcinog., 51, 553-564, 2012.

cyclooxygenase-2-downstream prostacyclin synthase11）S u n g Y M , H e G , H w a n g D H , F i s c h e r S M . :suppresses inflammatory reactions but facilitates

Overexpression of the prostaglandin E2 receptor

carcinogenesis, unlike deletion of microsomal

EP2 results in enhanced skin tumor development,

prostaglandin E synthase-1, Sci. Rep., 5, 17376, 2015.

Oncogene, 25, 5507-5516, 2006.

6） Nagamachi M, Sakata D, Kabashima K, Furuyashiki12）Simper MS, Rundhaug JE, Mikulec C, Bowen

T, Murata T, Segi-Nishida E, Soontrapa K, Matsuoka

R, Shen J, Lu Y, Lin K, Surh I, Fischer SM, : The

T, Miyachi Y, Narumiya S, : Facilitation of Th1-

tumor promoting activity of the EP4 receptor for

mediated immune response by prostaglandin E

prostaglandin E2 in murine skin, Mol. Oncol., 8, 1626-

receptor EP1, J. Exp. Med., 204, 2865-2874, 2007.

1639, 2014.

7） Honda T, Matsuoka T, Ueta M, Kabashima K,13）Poole EM, Bigler J, Whitton J, Sibert JG, Potter JD,

Miyachi Y, Narumiya S, : Prostaglandin E 2 -EP 3

Ulrich CM. : Prostacyclin synthase and arachidonate

signaling suppresses skin inflammation in murine

5-lipoxygenase polymorphisms and risk of colorectal

contact hypersensitivity, J. Allergy Clin. Immunol., 124,

polyps, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1 5, 5 0 2-

809-818, 2009.

508, 2006.

− 133 −

皮膚感覚神経—毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割
理化学研究所 多細胞システム形成研究センター細胞外環境研究チーム

藤原裕展

Accurate sensory perception requires the precise targeting and structure of sensory nerve endings and specialized
non-neural end cells. However, the mechanisms that regulate the sensory terminal architecture remain poorly understood.
We demonstrated that an extracellular matrix protein, EGFL6, which is localized in the upper bulge region of mouse hairfollicles, sustains the architecture and location of the piloneural mechanoreceptor complex. During development of thepiloneural complex, EGFL6 is deposited in a highly organized palisade pattern in the upper bulge region and interdigitates
tightly with protrusions of the terminal Schwann cells and sensory axon endings of the piloneural complex. In Egfl6 null
mice, the structure of the terminal Schwann cells and sensory nerves is abnormal and they are often located in positions
slightly lower than normal on the hair follicle. Electrophysiological analysis of skin-nerve preparation showed the decreased
mechano-sensitivity in the KO mouse. Our results indicate that the specialized extracellular matrix acts as a framework toregulate the architecture and function of sensory terminals in the hair follicle.

1．緒

言

毛を作る器官である毛包は、発生過程で神経・血管・筋肉などと正確に連結されることにより、感覚受容、体温調
節、威嚇などの高次機能を創発的に獲得する。しかし、これら異なる組織間の相互作用や連結を制御する分子機構は殆ど明らかにされていない。本研究では、毛包バルジ領
域のわずか上部に特異的に結合する感覚神経複合体の毛包へのターゲティングとその複雑な末端構造の形成に、バルジ上部の毛包幹細胞及び、毛包と神経複合体とのインター

図1

フェースに位置する基底膜がどのように関わっているのか

特殊化された基底膜を介した皮膚感覚神経を明らかにする（図 1）。また、感覚神経切除により毛包幹在する立毛筋前駆細胞のバルジへの接続と立毛筋への分化

細胞の多能性が変化することが報告されていることから 1）、を誘導するというものである。これに加え、感覚神経複合

感覚神経複合体による毛包幹細胞制御機構も解析し、基底体が結合するバルジ上部の基底膜が、nephronectin ファ

膜を介した神経 - 毛包幹細胞相互依存の可能性を探求する。

ミリーメンバーである EGFL6 で高度に特殊化されている

本研究により、触覚と毛形成とをつなぐ分子基盤の解明をことを見出している（図 1）。これらの知見を基盤とし、本目指す。

研究では EGFL6 の役割を切り口として、皮膚感覚神経複

我々は、毛包と間充織組織との連結には、これら組織間の相互作用とそれを仲介する基底膜の領域特殊化が重要な合体と毛包幹細胞との相互作用を制御する機構の理解を目指した。

役割を担っているとの仮説を立て、研究を展開している。

2．実

最近、我々は、鳥肌形成を担う立毛筋の毛包バルジ領域への結合が、立毛筋と毛包幹細胞とを隔てるバルジ基底膜の験

2. 1. EGFL6 抗体の作製

領域特殊化によって制御されていることを見出した 2）。分

マウス EGFL6 蛋白質を特異的に認識する抗体を作製し子機構としては、毛包発生過程において毛包幹細胞が基底た。抗体作製に用いる抗原を得るため、EGFL6 たん白質

膜分子 nephronectin を分泌することにより、真皮側に存の N 末端部を欠く mEgfl 6 -Mucin-MAM-Myc-His コンス
トラクトを作製し、293 細胞へ導入した後、培地への組換
え蛋白質の分泌を確認した。培地に分泌された EGFL6 蛋

Role of the regionally specialized basement
membra ne in t he i nt erdep endence
between skin sensory nerves and hairfollicle stem cells
Hironobu Fujiwara
Tissue Microenvironment, RIKEN Center
for Developmental Biology

白質を、ニッケルアフィニティカラムにより精製した。精製 EGFL6 をウサギに免疫し、免疫組織染色及び、ウェスタ
ンブロッティングで EGFL6 を特異的に認識する抗血清を得た。抗原アフィニティカラムを用い、抗血清から EGFL6 蛋
白質に特異的に結合する IgG を精製した。染色パターンの− 134 −

皮膚感覚神経−毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割

特異性は、Egfl6 ノックアウトマウスにおける染色性の消失によって確認した。

2. 4. Egfl6 ノックアウトマウスにおける感覚神経複合体の構造解析
感覚神経複合体の構造と配置における EGFL6 の役割を

2. 2. EGFL6 の局在解析検討するため、Egfl6 ノックアウトマウスにおける感覚神

上記方法で作製したラビット抗マウス EGFL6 抗体により、発生期から成体にかけての EGFL6 の局在の変化を解経複合体を上記 3 次元イメージング法で可視化し、その構造と配置の変化を、定量的解析を交えて検討した。

析した。胎生 14.5 日（E14.5），E16.5，E18.5，生後 1 日（P1），
P5，P49 のマウス背部皮膚凍結切片を、毛包幹細胞マーカ

2. 5. 皮膚感覚神経の電気生理ーであるケラチン 15 の抗体とともに染色した。

8 −12 週齢のマウス後ろ足から、感覚神経束を損じないようにして皮膚を切り出した。テストチャンバーに皮膚を2. 3. 皮膚 3 次元イメージング法を用いた EGFL6 の局在解析

固定し、32 ℃のクレブス溶液に浸した。Aδ-LTMR（low-

毛包とその付属器官（立毛筋、感覚神経など）の相互作用した。神経活動電位は DAPSYS データ取得システムで解部位は空間的に非常に限局されており、かつ複雑な立体構析した。皮膚への触覚刺激は、Kleindiek nanotechnik 社

造を取る。このような解剖学的構造を正確に把握するにの piezo-controlled micromanipulator を用い、4~1280 μm

は、2 次元的な組織切片解析から脱却し、3 次元的組織学の範囲でプローブを移動させることで、皮膚に組織の歪みを可能とする方法論の確立が必須である。ここでは、毛包、を生じさせた。

threshold mechano-receptor）神経を同定し、電極を接続

EGFL6、そして感覚神経複合体の 3 者の局在を、3 次元的

3．結に高精度で同時に捉えることができる「皮膚 3 次元イメー
ジング法」を確立した。表皮と真皮を含む皮膚を切り出し、果

3. 1. 毛包発生におけるEGFL6 沈着パターンの変化

4% パラホルムアルデヒド（PFA）で 1 − 3 時間固定し、皮我々は先行研究において、EGFL6 が成体マウス背部皮

膚ホールマウント標本とした。毛包、EGFL6、感覚神経

膚毛包のバルジ上部に特異的に沈着することを見出して複合体を長時間の抗体染色により標識し、組織の透明化をいる 2）。ここでは、独自に開発した EGFL6 抗体を用いて、施した後、共焦点顕微鏡により 100 枚程度の Z-stack 画像

発生期における EGFL6 蛋白質の局在変化を詳細に解析を取得した。3 次元画像解析ソフト Imaris により Z-stack

した。毛包形成が始まる前のマウス胎仔皮膚では（E14.5）、

画像を 3 次元的に再構成し、毛包‐知覚神経接続部の 3 次

EGFL6 は表皮と真皮を区切る基底膜に一様に存在した（図元高精度画像を得た。

2）。毛包形成が始まると（E16.5 − 18.5）、毛芽と毛乳頭

図 2 マウス背部毛包における EGFL6 蛋白質の局在。凍結組織切片を EGFL6 抗体 （緑）と毛包幹細胞マーカーである Keratin15 の抗体（赤）で染色した。矢尻は毛包と毛乳頭の接続部を示す。バーは 50μm。

− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

を区切る基底膜からは消失し、表皮と真皮を区切る基底感覚神経と nestin 陽性の終末シュワン細胞がバルジ上部に膜と毛包の幹部を覆う基底膜に局在した。毛包発生の後到達した後に、終末シュワン細胞の突起部の外周に沈着す期には（P1, 5）毛包幹細胞が存在する毛包バルジ部に局在ることが示された（図 4）。特徴的な EGFL6 のストライプ

した（矢印）。バルジ部の EGFL6 は、成体（P49）では消失

パターンは、終末シュワン細胞がフォーク状構造を完成さし、バルジ上部にその沈着部は移動した（矢印）。このよ

せてから形成されることも明らかとなった。また、蛍光染

うに、EGFL6 の存在部位は基底膜領域に限局されながら色像と電子顕微鏡写真の解析より、EGFL6 は感覚神経とも、その局在は発生段階に応じてダイナミックに変化す

シュワン細胞の両者に接触する可能性が示唆された。

ることが明らかとなった。成体になり EGFL6 の局在がバルジ上部に限局されると、毛包の成長サイクルに関わらず、EGFL6 の沈着部は固定された。

3. 3. Egfl6 ノックアウトマウスにおける感覚神経複合体の構造と配置の変化
これまでの解析により、EGFL6 が感覚神経複合体と3. 2. EGFL6 と感覚神経複合体との共局在

高度に共局在していることが明らかとなった。ここでは、バルジ上部には機械刺激を感知する感覚神経複合体が接3）

EGFL6 が終末シュワン細胞と感覚神経の形態及び配置の続される 。そこで、成体毛包において、EGFL6 が感覚制御に関わるかどうかを、Egfl6 ノックアウトマウスを用

神経複合体と共局在するかどうかを検討した。毛包の感覚いて解析した。まず、毛包あたりの終末シュワン細胞の数

神経複合体は、神経マーカー β III-tubulin で染色される複を数えたところ、Egfl6 ノックアウトマウスにおいてその数種類の低閾値機械感受性神経（Low threshold mechano-数が有意に減少していることが明らかとなった（図 5）。次

receptors; LTMRs）の軸索終末が、nestin 陽性の終末シュに、終末シュワン細胞の突起部の幅及び各突起の長さを定ワン細胞の突起にサンドイッチされることにより形成さ量解析したところ、突起部の幅には有意な差は認められなれる。感覚神経複合体と EGFL6 の解剖学的構造は高度なかったが、突起の長さが減少していることが示された。終3 次元構造を形成することが予想されたため、ここでは、

末シュワン細胞の形態変化をいくつかの項目に分けて解析

新たに開発した皮膚 3 次元高解像度イメージングにより、し、その結果をスコア化したところ、Egfl6 を欠失していEGFL6 の局在パターンを詳細に解析した。先行研究では、るシュワン細胞では、より多くの細胞で形態的な変化が観

イメージングの解像度の低さから、EGFL6 がバルジ上部

察されることが明らかとなった。

2）に連続的な帯状の染色パターンを示したが 、改良され次に、感覚神経の形態変化を検討した。Zigzag 型毛包た解析法では、EGFL6 は毛包長軸方向の柵状ストライプ

は、TrkB 陽性の Aδ-fiber と、Ret 陽性の C-fiber から構成

パターンとして沈着していることが示された（図 3）。また、される。それぞれの本数と長さに変化は認められなかった

マウス背部皮膚には形態的に異なる Guard, Awl/Auchene,

が、軸索終末のパラレル構造が乱れ、交差を形成している

Zigzag と呼ばれる 3 種類の毛包が存在するが、全ての毛軸索終末の数が有意に増加した（図 6）。これらの結果から、包のバルジ上部で EGFL6 の柵状ストライプパターンが観

EGFL6 が感覚神経複合体の構造形成に重要な役割を果た

察された。

していることが示された。

EGFL6、β III-tubulin、nestin の共染色から、EGFL6 は、

図 3 皮膚３次元高解像度イメージングにより可視化された EGFL6 と感覚神経終末。マウス背部皮膚のホールマウント標本を EGFL6 抗体（緑）と神経マーカーである βIII-tubulin の抗体（赤）で染色した。
矢尻はバルジ上部を示す。バーは 50μm。

− 136 −

皮膚感覚神経−毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割

3. 4. Egfl6 ノックアウトマウスにおける触覚機能の低下

で、皮膚に機械的刺激を与えた。その結果、EGFL6 ノッ

成体マウスの後肢から皮膚組織を切り出し、皮膚に機活動電位のスパイクの数が顕著に減少していた（図 7）。一械刺激を与えた際の Aδ-fiber 感覚神経の活動電位を測定

方、機械刺激の強度を増すと、その差は消失した。この結し た。Kleindiek piezo-controlled micromanipulator に 取果から、感覚神経複合体周囲に局在する EGFL6 は、比較り付けたプローブを、皮膚組織表面に接触させ、プローブ

的軽い触覚刺激の受容に必須であることが示された。

クアウトマウスからの皮膚では、低度の機械刺激に対するを rostral-caudal の方向に 4~1280 μm の範囲で動かすこと

図４ マウス感覚神経終末の構成因子の発生順序。マウス背部皮膚のホールマウント標本を βIII-tubulin の抗体（白）、nestin 抗体（赤）、EGFL6 抗体（緑）とで共染色し、３次元画像を再構成した。

− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図５ Egfl6 ノックアウトマウスにおける終末シュワン細胞の形態変化。A）nestin 染色により終末シュワン細胞の形態を可視化した。B）終末シュワン細胞の形態異常をスコア化した。C−E）終末シュワン細胞の突起長、細胞体の幅、毛包当たりの細胞数を計測した。F）K15 との共染色により、終末シュワン細胞の配置を検討した。G）K15 陽性部に異所性に位置する終末シュワン細胞を持つ毛包の割合。

− 138 −

皮膚感覚神経−毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割

図６ Egfl6 ノックアウトマウスにおける感覚神経終末の形態変化。A − D）Ret-eGFP と TrkB 染色により Aδ
-fiber と C-fiber 神経終末の形態を可視化した。E）毛包当たりの軸索終末の数を定量した。F）軸索終末の長さを定量した。G）軸索終末の交差点の数を定量した。H）
軸索終末の直線性を定量した。

図 7 皮膚を機械刺激した際の Aδ-fiber 活動電位の測定。A）皮膚組織に機械刺激を与えた際の活動
電 位の 数を定 量した。Kleindiek マニピュレータに 取り付けたプローブを皮 膚 組 織 に接 触させ、Rostral-Caudal 方向に 4~1280μm の距離移動させた。B）活動電位を発生させるために必要な機会
刺激の閾値を測定した。C）１回の機械刺激プロトコル（4~1280μm）
で誘発される活動電位の総数。

− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

4．考

広範に沈着が認められる。よって、EGFL6 は複数の異な察る生物学的現象を、異なる細胞種に働きかけることにより毛包上皮と間充織組織との相互作用には、主に 1. 毛包 -仲介していることが予想される。EGFL6 の機能を更に深毛乳頭相互作用、2. 毛包 - 立毛筋相互作用、3. 毛包 - 感覚

く理解するには、EGFL6 のノックアウトマウスの解析に

4）神経複合体相互作用がある 。これら毛包と周囲の間充織

加え、EGFL6 を認識する細胞表面レセプターや EGFL6 と組織との接続及び相互作用は、毛成長、立毛、体温調節、結合する細胞外マトリックスや可溶性因子の同定が必要で感覚受容などの毛包の高次機能の発現に不可欠である。しある。EGFL6 のレセプターとしてはインテグリン α8 β1かし、これら異種組織間の相互作用の分子基盤は殆ど理解が報告されているが 5）、皮膚においては両者の局在はほとされていなかった。本研究では、この中でも特に報告がなんど一致しない（data not shown）。今後は、生化学的・細かった 3. 毛包 - 感覚神経複合体相互作用の理解につなが胞生物学的な解析を通して、EGFL6 の真のレセプターのる成果が得られた。すなわち、毛包幹細胞から分泌され同定を進める必要がある。

ると考えられる EGFL6 が（data not shown）、バルジ上部に投射される感覚神経複合体と互いに組み合わさるように（文献）

ストライプ構造を形成することにより、感覚神経複合体の1） Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., and

形態、さらには触覚受容能を制御することが示された。こJoyner, A. L. (2 0 1 1) Nerve-derived sonic hedgehog

れは、毛包の長軸に沿ってコンパートメント化される上皮

defines a niche for hair follicle stem cells capable of系毛包幹細胞が、神経細胞に最適化された細胞外微小環境、

becoming epidermal stem cells. Cell stem cell 8, 5 5 2-

つまりニッチを提供していることを示すものである。

565

EGFL6 のバルジ上部への沈着は、感覚神経とシュワン

2） Fujiwara, H., Ferreira, M., Donati, G., Marciano, D.

細胞がパラレルパターンを形成した後に出現する（図 4）。

K., Linton, J. M., Sato, Y., Hartner, A., Sekiguchi, K.,

よって、EGFL6 マトリックスは、感覚神経やシュワン細Reichardt, L. F., and Watt, F. M. (2011) The basement

胞のストライプパターンの形成を誘導するというよりは、

membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell

むしろ一度形成された構造の機能化のために作られるフレ

niche. Cell 144, 577-589

ームワーク様の役割を持つと考えられる。EGFL6 のノッ

3） Li, L., Rutlin, M., Abraira, V. E., Cassidy, C., Kus, L.,

クアウトマウスにおいて、シュワン細胞と軸索終末の形態

Gong, S., Jankowski, M. P., Luo, W., Heintz, N., Koerber,に異常が現れるが、これは上記の仮説をサポートするもの

H. R., Woodbury, C. J., and Ginty, D. D. (2 0 1 1) Theである。毛包は、皮膚の伸展などに伴う強い変形にさらさ

functional organization of cutaneous low-threshold

れるが、そのような条件においても正確な機械刺激の受容mechanosensory neurons. Cell 147, 1615-1627

機能と構造の維持が求められる。そのために、感覚神経終4） Watt, F. M., and Fujiwara, H. (2011) Cell-extracellular

末部は自身の機能に特化した細胞外マトリックス構造を周

matrix interactions in normal and diseased skin. Cold

囲に形成している可能性が考えられる。

Spring Harbor perspectives in biology 3

発生期を通した EGFL6 の局在パターンの解析より、

5） Osada, A., Kiyozumi, D., Tsutsui, K., Ono, Y.,

EGFL6 は表皮と間充織を区切る基底膜様の染色パターン

Weber, C. N., Sugimoto, N., Imai, T., Okada, A., andを示した。これは、EGFL6 が基底膜蛋白質として機能すSekiguchi, K. (2 0 0 5) Expression of MAEG, a novel

ることを示唆している。但し、EGFL6 の基底膜内での局

basement membrane protein, in mouse hair follicle

在は、毛包器官形成の過程でダイナミックに変化し、発生

morphogenesis. Experimental cell research 303, 148-159

初期においては感覚神経複合体が存在しない部位において− 140 −

紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析
信州大学大学院農学研究科

水品

善之

Many naturally occurring agents are believed to protect against ultraviolet (UV)-induced skin damage. I established an
in vitro assay to measure cellular DNA polymerase (Pol) activity in cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEK)
by modifying Pol inhibitor activity, and screened 10 tropical plant extracts for Pol activity enhancement. I found that the fruitof Rose Myrtle (Rhodomyrtus tomentosa) was the strongest enhancer of Pol activity in UVB-irradiated NHEK. I next sought
to examine the effect of the Rose Myrtle extract active component, piceatannol, on UVB-induced damage and inflammationin cultured NHEK. The protective effect of rose myrtle extract and the two key components, piceatannol and piceatannol‑4'‑O‑β‑D‑glucopyranoside, on UVB‑induced damage and inflammation in cultured NHEK was investigated. The 80% ethanol
extract from rose myrtle fruit with piceatannol exhibited protection of UVB‑induced cytotoxicity in NHEK; however, piceatannol‑4'‑O‑β‑D‑glucopyranoside exhibited no protection, as determined by a 3‑(4,5‑dimethylthiazol‑2‑yl)‑2,5‑diphenyltetrazol
ium bromide assay. This extract and piceatannol reduced the production of UVB‑induced cyclobutane pyrimidine dimers andenhanced the cellular enzyme activity of the DNA polymerases in UVB‑irradiated NHEK, suggesting that UVB‑stimulated
DNA damage was repaired by the polymerases. In addition, the secretion of prostaglandin E2, which is an inflammatory
mediator, was decreased. These results indicated that rose myrtle fruit extract and its key constituent, piceatannol, arepotential photoprotective candidates for UV‑induced skin damage.

1．緒

Pol は、ヒトをはじめとする高等真核生物ではゲノム解言析などによって、数多くの分子種が近年に次々と発見されUVB（290 - 320 nm）は紫外線の中でも皮膚に対する影て、2015 年現在では、15 種類の Pol 分子種が報告されて響が大きいとされており、直接 DNA に作用して損傷を引

4-7）いる（Table 1）。Polの機能は、主にDNAの複製（コピー）、

き起こすとともに、他の光吸収物質を介して活性酸素種を

損傷 DNA の修復、DNA の組換えの 3 つであり、各 Pol 分発生させることで、紅斑や色素沈着などさまざまな影響を子種がこれらの機能を分業していると考えられている 4, 5）。

及ぼすことが知られている。また、紫外線の長期暴露は光ミトコンドリアの DNA 合成（複製と修復）は Polγ が担当し、老化を引き起こし、シミ、シワ、たるみ、乾燥の原因とな

残りの 14 種類の Pol は細胞核の DNA 合成を行う。15 種類

1）の Pol 分子種は、このような機能の類似性やアミノ酸配列

このような紫外線の皮膚に対する有害作用は一般的にの相同性からＡ、Ｂ、Ｘ、Ｙの 4 つのファミリーに分類さ広く認識されており、サンスクリーン剤（すなわち物理的れている 4, 5, 8）。さらに、in vitroにおける酵素反応は塩（KCl）遮蔽剤）の使用が普及している。しかし、この方法だけでによって阻害されるPol分子種（＝DNA複製型のPolα、δ、ε）

は紫外線による損傷を完全に防ぐことはできないと考えらと、塩の存在で活性に影響を受けないか、むしろ活性化す

れており、紫外線による DNA 損傷などは最少紅斑量の 10

る Pol 分子種（上記の 3 つ以外）に分かれる。

る 。

分の 1 でも起こること

2）やサンスクリーン剤を使用して紅

これまでに私は、各 Pol 分子種の活性がある精製酵素を斑が現れていなくても、免疫抑制やマトリックスメタロプ

準備し、in vitro 系の Pol 阻害活性測定法を開発して 9-11）特ロテアーゼの活性化が起こることが示されている 3）。そこ許を取得した 12）。この測定法を応用して、Pol 精製酵素ので、紫外線を物理的に遮蔽する方法だけでなく、皮膚本来代わりに皮膚上皮系の角化細胞（ケラチノサイト）
を用いて、がもつ防御能力を上げる防御法を開発できないかと考えた。

紫外線を照射した細胞の抽出液を調製し、細胞内の Pol 活

生体（細胞）に内在する損傷 DNA を修復する酵素群のひと性を測定する技術を立ち上げた。そして、UVB 照射によつである DNA 修復型 DNA 合成酵素（DNA ポリメラーゼ、ってヒト皮膚角化細胞内の Pol 活性が上昇することを確認

Pol と略す）に注目した。

した。さらに、この細胞内 Pol 活性を上昇させる天然物があるか探索（スクリーニング）した。その際の探索源は熱帯

Screening for suppression of inflammatory
responses against UVB-induced DNA
damage in skin cells from natural plant
extract, and analysis of its suppressive
mechanism
Yoshiyuki Mizushina
Graduate School of Agriculture, Shinshu
University

植物抽出物とした。なぜならば、熱帯地方は日々強い紫外線に暴露されており、そこに生息する植物は常に DNA 損
傷が起こっている。熱帯植物には、内在性の損傷 DNA 修
復系、すなわち修復型 Pol を活性化させる物質が存在すると考えられるからである。
本研究では、熱帯植物抽出物から正常ヒト新生児表皮角− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

化細胞
（Normal Human Epidermal Keratinocytes, NHEK）

UVB（0 ～150 mJ/cm2）を照射して、KGM に戻して 2～24

内の DNA 修復型 Pol を活性化する成分の単離・精製、化時間培養した。

学構造の決定、紫外線ダメージ抑制メカニズムの解析を実

2. 2. NHEK 内の Pol 活性測定

施した。

２．実

培養した NHEK をスクレイパーで回収して、プロテ験ア ー ゼ 阻 害 剤 を 含 む 細 胞 溶 解 緩 衝 液（50 mM Tris–HCl

2. 1. NHEKの細胞培養（pH 7.5），1 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 5 %NHEK と増殖添加剤を含む Epilife-KG2 培地（KGM）は2

glycerol）に溶解させた。遠心上清を回収してタンパク定

クラボウから購入した。NHEK を 75cm シャーレに 3×量したものを細胞抽出液として Pol 活性測定に使用した。

105 個 /5 mL KGM を播種して、37 ℃、5 ％ CO2 条件下でPol 反応には、基質として鋳型 DNA とデオキシリボヌ

75% コンフルエントになるまで培養した。MDSO に溶かクレオチド（dNTP）の２つを必要とするが、in vitro 系のした被験試料を最終 0.05 % になるように添加後、24 時間

本測定における Pol の基質は、鋳型 DNA として合成 DNA培養した（Fig. 1）。培地を Hank’s 緩衝液に交換してからの poly（dA）/oligo（dT）18、 デ オ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド とTable 1

Human Pol species− 142 −

紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析

して放射性同位元素のトリチウムで標識した［3H］-dTTP
3

トになるまで培養後、KGM で溶解した被験試料を各シャを用いた（Fig. 1）。そして、Pol によって重合された［ H］

ーレに添加し 24 時間培養した。培地を Hank’ s 液へ交換し、-dTTP の放射活性を液体シンチレーションカウンターで50mJ/cm2 の UVB を照射した。KGM で溶解した被験試料

定量することで Pol 活性とした 10, 11）。

に交換し、4 時間培養後、細胞をセルスクレーパーにより回収した。

2. 3. 細胞死抑制作用の評価

回収した細胞より QIAamp Blood Kit（QIAGEN）を用

NHEK を 48 穴プレートに播種し、サブコンフルエント

いて DNA の抽出、精製後、同濃度になるよう希釈した

2になるまで培養後、培地を Hank’s 液に交換し、50mJ/cm

DNA 中の CPD 量を抗 CPD モノクローナル抗体（コスモバの UVB を照射した。KGM で溶解した被験試料（溶解のたイオ）を用いた ELISA 法により定量した。

め終濃度 0.5% DMSO を含む、以降の実験についても同様に含む）に交換し、24 時間培養後の生存率を MTT アッセ

2. 5. プロスタグランジン E2（PGE2）の評価

イにより測定し、UVB 非照射を 100%、UVB 照射被験試

NHEK を 48 穴プレートに播種し、サブコンフルエン

料無添加を 0% となるように細胞死抑制率を計算した。

ト に な る ま で 培 養 し た の ち、KGM-hyd に 交 換 し、 さら に 1 日 培 養 し た。 培 地 を Hank’ s 液 へ 交 換 し、50 mJ/

2. 4. DNA 中のシクロブタン型ピリミジンダイマー
（CPD）
の評価
NHEK を 60 mm シャーレに播種し、サブコンフルエン

Fig. 1cm2 の UVB を照射した後、KGM-hyd で溶解した被験試料に交換し、24 時間培養した。培養上清中の PGE2 量を
PGE2EIAKit（Cavman Chemical）を用いて定量した。

In vitro cellular Pol activity assay using cell extract from UVB-exposed NHEK

− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

2. 6. 統計学的検定

出物を用いた。

実験結果は平均値 ± 標準誤差により示した。また、統計学的有意差検定には、Student’s t-test を用い、p< 0.05の場合を有意差ありと判断した。

３．結

3. 3. テンニンカ抽出物とピセアタンノールの NHEK
内 Pol 活性化
Fig. 1 に示した UVB 照射 NHEK 内 Pol 活性測定系を用果

いて、テンニンカ抽出物とピセアタンノールのPol活性化を調

3. 1. NHEK 内の Pol 活性測定の条件検討査した。測定系の条件は、UVB（50 mJ/cm2）照射し 4 時

NHEK 内の Pol 活性測定系を立ち上げるにあたり、UVB
照射量と照射後の培養時間の検討を行った。NHEK の細胞抽出液には塩が含まれていない。塩が無い細胞抽出液と120 mM KCl を添加した場合の Pol 活性を比較した。前者は DNA 複製型の Polα、δ、ε を含む全ての Pol 分子種（DNA
複製＋ DNA 修復）の活性値であり、後者は Polα、δ、ε を除いた DNA 修復型 Pol 分子種のみの活性値であると考えられる（Table 1）。
まず UVB 照射後の培養時間を 1 時間に固定して、UVB
照射量を 0 ～ 150 mJ/cm2 の範囲で振った。UVB 照射量が12.5 mJ/cm2 と 50 mJ/cm2 では Pol 活性の増加は見られなかったが、50 mJ/cm2 以上では Pol 活性化が見られた（Fig.
2A）。この UVB 照射による Pol 活性化は、120 mM KCl 有
りの方が 1.2 倍以上高くなった。
次 に UVB 照 射 量 を 100 mJ/cm2 に 固 定 し て、UVB 照
射後の培養時間を 2 ～ 24 時間の範囲で振った。その結果、4 時間培養で最も高い Pol 活性の増加を見出した（Fig. 2B）。
Fig. 2A では UVB 照射量と Pol 活性化は相関しているよ
うに見えるが、150 mJ/cm2 照射では細胞死（アポトーシ
ス）を誘発するため不適であると考えた。そこで、2 番目に Pol 活性化させた 50 mJ/cm2 が至適であると考察した。
Fig. 2B から UVB 照射後は 4 時間培養が至適であることが分かった。これらの条件で Pol 活性化する熱帯植物の探索を行った。

3. 2. NHEK 内の Polを活性する熱帯植物の探索と活性成分の精製と同定
10 種類の熱帯植物果実の抽出物（凍結乾燥後の 80 ％エ
タノール抽出物）は、丸善製薬㈱から提供していただいた。
UVB 照射した NHEK の Pol を最も活性化したのはテンニンカ（Rhodomyrtus tomentosa）であった。そこで、テンニ
ンカ果実の乾燥物 100 g を 1 L の 80 ％エタノールで大量に抽出した。得られた抽出物（6.6 g）を疎水カラムクロマトグ
ラフィー（Diaion HP-20）、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー、および HPLC にかけることにより、Pol 活性化成分（1.14 mg）の完全精製に成功した。そして、NMR および MS で構造解析した結果、既知物質のピセアタンノール（Fig. 3）であった。
以降の実験は、市販試薬のピセアタンノールとピセアタ
ンノールを含有しているテンニンカの 80 ％エタノール抽

Fig. 2 Examination of cellular Pol activity in UVB-exposed
NHEK.（A）Cellular Pol activity was dependent upon thelevel of UVB irradiation（0–150 mJ/cm 2）．NHEK were
cultured for 1 h after UVB irradiation.（B）Pol activity isdependent upon incubation time（2–24 h）above 100 mJ/
cm2 UVB-exposed NHEK. Gray bars and black bars are all
human Pol species and DNA repair-related Pol species,
respectively（the standard reaction conditions without orwith 120 mM KCl, respectively）．The Pol activity of vehicle
control without UVB irradiation was taken as 100%. Alldata are expressed as mean ± SEM（n = 3）．*P < 0.05
compared with the UVB（−）vehicle control.

− 144 −

紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析

Fig. 3 Structure of purified compound1（piceatannol）from Rose Myrtle fruit（Rhodomyrtus tomentosa）

間培養した（Fig. 2）。塩（120 mM KCl）無しの全 Pol 分子種の活性を Fig. 4A、塩有りの DNA 修復型 Pol 分子種の活性を Fig. 4B に示す。Fig. 4A, B は同じ傾向であり、テンニ
ンカ抽出物（10 μg/mL）、ピセアタンノール（ 2 μg/mL）ともに Pol 活性を 1.1 ～ 1.2 倍上昇させた。UVB 照射と併用す
ると 1.6 ～ 2 倍近くまで Pol 活性が増加した。この増加は
UVB 照射と被験試料の添加の相加効果ではなく相乗効果であった。ピセアタンノールはテンニンカ抽出物の 5 分の1 の添加濃度であったが Pol 活性化が大きかった。ピセア
タンノールの配糖体である piceatannol‑4'‑O‑β‑D‑glucopyra
nosideにはPol活性化作用は見られなかった（データ示さず）。

3. 4. テンニンカ抽出物とピセアタンノールの UVB 照
射 NHEKの細胞毒性
50 mJ/cm2 の UVB 照射による NHEK への影響を調査した。NHEK は、UVB 照射によって細胞生存率が若干低下した。しかし、アポトーシスは誘導していなかった（データ示さず）。そこへテンニンカ抽出物とピセアタンノールを添加すると濃度依存的に細胞生存率が高くなった（Fig. 5）。

3. 5. テンニンカ抽出物とピセアタンノールの UVB 照
射 NHEKの DNA 修復能UVB による直接的な DNA 損傷に対する作用を検討する
ために、主要な DNA 損傷である CPD に着目し、NHEK を
用いて UVB によって生成する CPD の低下作用を検討した。
その結果、Fig. 6 のようにピセアタンノールとテンニンカ
抽出物には UVB 照射 4 時間後における CPD 量の低下作用が観察された。その強さはピセアタンノールの方が顕著であった。

Fig. 4 Effect of Rose Myrtle extract and piceatannol on
NHEK Pol activity with or without UVB irradiation.（A）Pol
activity of all human Pol species using standard reaction
conditions without KCl.（B）Pol activity of DNA repairrelated Pol species using standard reaction conditions with
120 mM KCl. NHEK were incubated for 24 h with orwithout each compound（10μg/mL Rose Myrtle extract
and 2μg/mL piceatannol）before UVB（5 0 mJ/cm 2 ）irradiation. Pol activity of vehicle control without UVB
irradiation was taken as 100%. All data are expressed asmean ± SEM（n = 3）．**P < 0.01 compared with the UVB（−）vehicle control.

3. 6. テンニンカ抽出物とピセアタンノールの UVB 照
射 NHEKのプロスタグランジン E2（PGE2）産生へ
の影響

４．考

察

紫外線による皮膚の炎症に対する作用検討のため、炎症

テンニンカ果実エキスの NHEK に対する UVB 誘導細胞性メディエーターとして PGE2 に着目し、NHEK を用いて死抑制作用について、エキスより単離した成分について同UVB 照射による PGE2 産生に対するテンニンカ抽出物およ様の作用が認められるか試験したところ、ピセアタンノー

びピセアタンノールの効果を検討した。その結果、Fig. 7

ルに抑制作用が確認されたことから活性成分のうちの一のように抑制作用を示した。その効果は、1.0 μg/mL のピつであると考えられる。テンニンカ抽出物 50 μg/mL 中にセアタンノールで顕著であった。

含まれるピセアタンノールの濃度は、その含量から約 0.1− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Fig. 5 Effect of Rose Myrtle extract and piceatannol on cell
viability of UVB-exposed NHEK. NHEK were irradiatedwith UVB（50 mJ/cm2），and treated with each compoundat the indicated concentrations. MTT assays were used toevaluate living cells 24 h after treatment. The cell viabilityof vehicle control with or without UVB irradiation was taken
as 0% or 100%, respectively. All data are expressed asmean ± SEM（n=6）．*P < 0.05 and **P < 0.01 comparedwith the UVB（−）vehicle control.

Fig. 6 Effect of Rose Myrtle extract and piceatannol on
UVB-induced CPD production in NHEK. NHEK werei n c u b a te d wit h e a c h c o m p o u n d a t t h e i n d ic a te dconcentrations before a nd af ter U V B（5 0 m J/cm 2 ）irradiation. CPD was quantitatively evaluated by DNAELISA. CPD production by vehicle control with or without
UVB irradiation was taken as 100% or 0%, respectively.
All data are expressed as mean ± SEM（n = 6）．*P < 0.05
and **P < 0.01 compared with the UVB（+）vehicle
control.

Fig. 7. Effect of Rose Myrtle extract and piceatannol on UVBinduced PGE 2 production in NHEK. NHEK were incubatedwith each compound at the indicated concentrations after
U V B（5 0 mJ/cm 2 ）irradiation. Supernatant PG E 2 wasquantitatively evaluated by ELISA. PGE 2 production by
vehicle control with or without UVB irradiation was taken as
100% or 0%, respectively. All data are expressed as mean ±SEM（n = 5）．**P < 0.01 compared with the UVB（+）vehicle
control.

− 146 −

紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析

μg/mL と考えられる。実際にピセアタンノールについて

５．総

0.1μg/mL では試験していないが、その上下の濃度におけ括る試験結果より、ピセアタンノールのみがテンニンカ抽出

本研究では、紫外線防御を単なるサンスクリーン剤で物の活性を担っているとは考えられないが、主要な成分で行うという従来の考えだけでなく、DNA 修復型 Pol 活性はあると考えられる。テンニンカ抽出物中には、その他の化という生物化学的なアプローチによって防御する「non-単離できていない成分が含まれると考えられ、ピセアタン

sunscreen photoprotection」という新しい観点を取り入れ、ノールをはじめ、多種の活性成分が相乗 • 相加効果を発揮

植物エキスの紫外線による肌への影響を抑える作用と肌本し、成分単独では得られない高い作用を示すであろう。

来が持つ防御作用を高める作用について、その有効成分の

我々の皮膚は常に外界からの物理的刺激、化学的刺激、探索とともに検討した。

温度変化、そして紫外線曝露など様々な刺激に晒されてい熱帯植物のうち、テンニンカ果実の 80 ％エタノール抽る。その一つである紫外線曝露はシミ・シワ・たるみとい出物に含まれるピセアタンノールは、ヒト表皮角化細胞にった皮膚の形態的変化（光老化）、炎症及び皮膚ダメージのおいて Pol 活性化と UVB ダメージ抑制作用を有し、その長期蓄積による皮膚がん前駆症を誘因し放置すると皮膚が作用メカニズムとして CPD の減少作用といった DNA ダメ

んなどの病気を引き起こす原因となる。細胞は環境要

ージ抑制作用が示唆された。また、PGE2 のような炎症要因による刺激で生じた DNA 損傷の増大に対して DNA 修

因を抑制する作用も認められた。これより、テンニンカ抽復を行うが、DNA 修復が追いつかなくなった細胞はがん

出物やピセアタンノールの CPD のような DNA 損傷の抑制化するかアポトーシス（プログラム細胞死）により除去されに基づいた抗炎症作用のメカニズムの可能性について考察る。光老化や発がんの直接的原因は、紫外線によって引きできた（Fig. 8）。

13）

起こされる CPD の生成による DNA 損傷と活性酸素種によ以上の結果から、テンニンカ抽出物は、その成分である

る DNA 塩基の酸化損傷（8-oxo-dG）であり、ともに Pol（特ピセアタンノールの働きにより、DNA 修復型 Pol 活性化に DNA 修復型 Pol 分子種）の塩基の取り込みエラーによりに伴う DNA 損傷作用というアプロ一チにより、紫外線に突然変異を誘発する原因となり得る。従って、光老化や発よる細胞へのダメージを抑制することで紅斑のような短期がんを未然に防ぐためには、これらの DNA 損傷の発生を的な症状や光老化のような長期的な症状を抑制する植物素抑えること、すなわち DNA 損傷修復作用を促進させるこ材であると考えられ、日常的に使用する基礎化粧品への応とが非常に有効であると考える。皮膚細胞内の DNA 修復用が期待される。さらに本研究の成果として、紫外線防御型 Pol 活性を増大（活性化）させることができれば紫外線暴を単なるサンスクリーン（紫外線遮蔽）剤で対処するという露による DNA 損傷は直ちに修復されて正常な状態を維持

従来の概念とは異なった皮膚細胞本来が持つ紫外線防御能できる。

力を高める『ノン・サンスクリーン剤』の開発が期待できる。

色素性乾皮症（XP）は重篤な光過敏症と Polη 欠損に伴う DNA 修復異常に関連した発がんを特徴とする常染色体謝辞

劣勢遺伝疾患である。XP はさまざまな DNA 修復に関連

本研究を実施するにあたり、研究助成を賜りました公益した遺伝子の変異により 8 つのグループに分けられる（A

財団法人コスメトロジー研究振興財団に心から感謝を申し～ G とバリアント体）。この XP 原因遺伝子である Polη は、上げます。特に、本助成期間中に大学を異動しましたが、ヌクレオチド除去修復（NER）遺伝子に属しているためスムーズな手続きに携わってくださいました財団事務局の（Table 1）、XP 患者の傷害を受けた細胞は CPD を取り除

川端徹様に深謝いたします。

くことができず、高頻度な発がんに繋がる

14）。また、XP

患者では紫外線照射により、光過敏反応として重篤な炎症を起こすことは有名である。これらのことから、XP 患者

本研究の一部は、すでに次の学術論文として公表している。

では CPD のような DNA 損傷の修復ができないことによっ

Shiratake S, Nakahara T, Iwahashi H, Onodera T,て、炎症が悪化することを示している。つまり CPD が炎*Mizushina Y, : Rose myrtle（Rhodomyrtus tomentosa）症の引き金である可能性が考えられる。また、XPA 患者

extract and its component, piceatannol, enhanceにおいて UV 照射後の重篤な炎症部位で高濃度の PGE2 がthe activity of DNA polymerase and suppress the15）

inflammatory response elicited by UVB-induced DNA

観察されるという報告から、CPD は PGE2 産生を誘導する可能性が示唆された。よって CPD の減少は抗炎症につdamage in skin cells, Mol. Med. Rep., 12, 5857-5864, 2015.

ながると考えられ、今回の試験におけるテンニンカ抽出物（*Corresponding author）とピセアタンノールの PGE2 産生抑制作用のメカニズムの一序として、CPD 量の減少が考えられる。

− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Fig. 8 The relationship between enhanced DNA repair-related Pol
activity and suppression of inflammation in UVB-irradiated skin cells
treated with plant extract.

（引用文献）

microorganisms, J. Antibiot. (Tokyo), 49, 491-492, 1996.

1） 武田克之 , 原田昭太郎 , 安藤正典 , 監修 , : 化粧品の有10）Mizushina Y, Tanaka N, Yagi H, Kurosawa T, Onoue

用性評価技術の進歩と将来展望 , 薬事日報社 , 125-143,

M, Seto H, Horie T, Aoyagi N, Yamaoka M, Matsukage

2001.

A, Yoshida S, Sakaguchi K, : Fatty acids selectively2） 栗原浩司 , : フレグランスジャーナル , 9, 83-88 2002.

inhibit eukaryotic DNA polymerase activities in vitro,

3） Matsui MS, : 第 9 回 光 老 化 研 究 会 講 演 要 旨 集 , 34,

Biochim. Biophys. Acta, 1308, 256-262, 1996.
11）Mizushina Y, Yoshida S, Matsukage A, Sakaguchi

2008.
4） Hubscher U, Maga G, Spadari S, : Eukaryotic DNA

K, : The inhibitory action of fatty acids on DNA

polymerases, Annu. Rev. Biochem., 71, 133-163, 2002.

polymerase beta, Biochim. Biophys. Acta, 1 3 3 6, 5 0 9521, 1997.

5） Bebenek K, Kunkel TA, In: DNA Repair andReplication Advances in Protein Chem., (Yang W, eds),

12）特許 第 3821867 号 , 発明の名称：DNA ポリメラーゼ
活性阻害剤 , 出願日：1995 年 7 月 4 日 , 登録日：2006 年

Elsevier, San Diego, 69, 137-165, 2004.

6 月 30 日 , 特許権者：坂口謙吾 , 東洋水産㈱ , 発明者：

6） Takata K, Shimizu T, Iwai S, Wood RD, : Human
DNA polymerase N (POLN) is a low fidelity enzyme
capable of error-free bypass of 5S-thymine glycol, J.

田中伸和 , 北村晃利 , 坂口謙吾 , 水品善之 , 松原行雄
13）Scharffetter-Kochanek K, Wlaschek M, BrenneisenP, Schauen M, Blaudschun R, Wenk J, : UV-induced

Biol. Chem., 281, 23445-23455, 2006.
7） Yamtich J, Sweasy JB, : DNA polymerase family X:
function, structure, and cellular roles, Biochim. Biophys.

reactive oxygen species in photocarcinogenesis andphotoaging, Biol. Chem., 378, 1247-1257, 1997.
14）Robbins JH, Kraemer KH, Lutzner MA, Festoff BW,

Acta, 1804, 1136-1150, 2010.
8） Friedberg EC, Feaver WJ, Gerlach VL, : The many

Coon HG, : Xeroderma pigmentosum. An inherited

faces of DNA polymerases: strategies for mutagenesis

diseases with sun sensitivity, multiple cutaneousand for mutational avoidance, Proc. Natl. Acad. Sci.

neoplasms, and abnormal DNA repair, Ann. Intern.
Med., 80, 221-248, 1974.

USA, 97, 5681-3, 2000.
9） Mizushina Y, Yagi H, Tanaka N, Kurosawa T,15）Kuwamoto K, Miyauchi-Hashimoto H, Tanaka

Seto H, Katsumi K, Onoue M, Ishida H, Iseki A, Nara

K, Eguchi N, Inui T, Urade Y, Horio T, : Possible

T, Morohashi K, Horie T, Onomura Y, Narusawa

involvement of enhanced prostaglandin E2 production

M, Aoyagi N, Takami K, Yamaoka M, Inoue Y,

in the photosensitivity in xeroderma pigmentosum

Matsukage A, Yoshida S, Sakaguchi K, : Screening ofgroup A model mice, J. Invest. Dermatol., 114, 241-246,

inhibitor of eukaryotic DNA polymerases produced by

2000.

− 148 −

ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制に関する研究
東京薬科大学生命科学部

柳茂

We previously identified a mitochondrial ubiquitin ligase MITOL, whose dysfunction causes production of reactive
oxygen species from mitochondria. Here, we generated keratinocyte–specific MITOL-deficient mice and examined therelationship between MITOL and ageing. Interestingly, MITOL-deficient mice revealed typical senescence-associated skinphenotypes. Our results provide novel insight into how mitochondrial function controls ageing.

1．緒in vivo における生理的機能を明らかにすることが課題で言ある。

ミトコンドリアの主な生理的役割は脂肪酸の β 酸化

皮膚は紫外線（UV）などの環境要因の影響により、皮膚や、電子伝達系による酸化的リン酸化によるエネルギー

細胞、色素細胞、真皮結合細胞、血管などにダメージが蓄（ATP）産生である。この ATP の産生の過程では、生体内積することで老化が進行する。紫外線（UV）は表皮細胞内酸素の 90 ％以上を消費するが、その一方で消費酸素のうにおいて細胞老化の原因とされる ROS のレベルを上昇さ

ちの数％を活性酸素種（ROS : reactive oxygen species）とせるため、皮膚老化現象と ROS の関係性が注目されておして漏出する。これらの活性酸素は種々の要因によりミト

り、実際に表皮細胞増殖に関与する表皮ケラチノサイト成コンドリア自身にも影響を与え、細胞内に遊離して様々な長因子が UV によって引き起こされる表皮ケラチノサイト

1）

生物現象
（老化、がん、アポトーシスなど）を誘起している 。

内の ROS のレベルの上昇を抑えていることが報告されてまたミトコンドリアは絶えず融合分裂を繰り返しながらそいる 11）。ミトコンドリアは生体内の主要な ROS の産生源の機能を維持している。ミトコンドリアの分裂には通常細であり、近年ではミトコンドリアダメージによる ROS の胞質に存在している分裂因子である Drp1 がミトコンドリ

レベルの上昇が皮膚老化を進行させるという報告がされてアにリクルートされることにより行われ 、この過程においる 12）。今回、皮膚老化とミトコンドリア機能維持の関

いては、ミトコンドリアの外膜に局在する hFis や Mff など係性に着目し、MITOL がミトコンドリアダメージによる

2）の Drp1 結合分子が関与する

3, 4）。また、ミトコンドリアの細胞内の ROS のレベルの上昇を防ぐことで、皮膚老化を融合にはミトコンドリア外膜に局在する Mitofusin5）や、ミ制御するという仮説を立て、表皮ケラチノサイトにおける6）

トコンドリア内膜に局在する Opa1 などの融合因子が関MITOL のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、わっている。

この仮説を検証した。

MITOL はミトコンドリア外膜に局在する E3 ユビキチ

2．実験
（材料と実験方法）

ンリガーゼであり、ミトコンドリア分裂因子である hFis1,
Drp1 をユビキチン化し、分解を促進する 7）。また、ミト

マウスを用いた実験

コンドリアに蓄積する変性タンパク質を分解することで細▼動物

胞内毒性を軽減し、ミトコンドリアの品質管理に関与す

・C57BL/6N mouse（日本 SLC）

る

8, 9）

。さらに、我々は MITOL の基質として微小管関連

タンパク質である MAP1B-light chain 1（LC1）を同定し、MITOL が一酸化窒素（NO）によって修飾された LC1 を選
択的にユビキチン化しその分解を促進することで細胞内における毒性を回避することを報告した

10）。今後 MITOL の・MITOL Flox mouse（理研）
・STOCK Tg（KRT1 4-cre）1Amc/J（The JacksonLaboratory）▼ゲノム PCR/ アガロースゲル電気泳動
・ゲノムサンプルは mouse tail を 50 mM NaOH で可溶化したものを使用・DNA マーカー：ΦX174-Hinc Ⅱ digest（TaKaRa）
・アガロースゲル : 2 % Agarose（ニッポン・ジーン）in

Role of mitochondria in skin senescence
Shigeru Yanagi
Tokyo University of Pharmacy and Life
Sciences

TAE▼ウエスタンブロット
・SDS-PAGE により分離し、PDVE メンブレン（Millipore）に転写後、各抗体を用いてブロットした。

− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

・〈 抗 体 〉抗 MITOL 抗 体（ 当 研 究 室 で 作 製 ）、α-tubulin

パク質をサンプルとし、ウエスタンブロットを行った結果、（SIGMA）

作製したマウスのサンプルからは MITOL のバンドは確認▼パラフィン切片できなかった。以上の結果より、表皮特異的 MITOL ノッ

・HE 染色：Mayer’ s Hematoxylin Soln（和光純薬工業）

クアウトマウスの作出に成功した。

・1 ％ Eosin Y Solutions（和光純薬工業）
・TUNEL assay：in situ cell death detection kit, TMR
red（Roche）

MITOL cKOマウスの表現系
出生後 1 〜 6 ヶ月では MITOL cKO マウスでは顕著な・DAB 染色：（Dako）

表現型を示さなかったが、7 ヶ月の時点において、オスの▼ サ ザ ン ブ ロ ッ ト（TRFs：Southern blots of terminal

MITOL cKO マウスでは白髪の増加が観察された。この白restriction fragments）

髪の増加は背中や両足を中心に起こっており、白髪は体・フェノール / クロロホルム処理によりゲノムを精製

全体の毛の 1/3 程を占めていた。また、白髪だけではなく、・制限酵素処理：Hinf Ⅰ（TaKaRa）、Rsa Ⅰ（TaKaRa）

脱毛および皮膚異常が観察された。その後、この MITOL

5・プローブ telomere 5 repeat：（CCC TAA）

cKO マウスを 1 ヶ月毎に観察した。その結果、時間経過・プローブ合成キット：DIG Oligonucleotide 3' end Labelingとともに白髪が進行した。この白髪の進行は尾部から頭部

Kit, 2nd generation（Roche）、ハイブリダイゼーション：に向かって行われており、白髪は体全体の毛の 2/3 程を占

Perfect Hyb（TOYOBO）

めた。また、それと同時に脱毛、皮膚の異常も進行してお・抗 DIG 抗体：Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments（Roche）

り、皮膚の一部ははがれ落ちた。メスの MITOL cKO マ

・発色液：Amersham CDP-Star（GE Healthcare）

ウスでは出生後 7 ヶ月の時点において、雄の MITOL cKO
マウスのような特徴は観察されなかったが、出生後 12 ヶ細胞を用いた実験

月の時点において、白髪や脱毛が観察された。

▼細胞 HaCaT（ヒト表皮角化細胞由来）

MITOL cKOマウスの表皮構造に異常が観察される▼細胞培養・遺伝子導入
・5% CO2 , 37 ℃条件下において 10% Fetal Bovine Serum

オスの MITOL cKO マウスでは 7 ヶ月齢から脱毛および（GIBCO）、100U/mL penicillin, 100mg/mL streptomycin

皮膚の脱落などの表現型が観察された。そこで、皮膚組織を含んだ DMEM（Nissui）で培養した。遺伝子導入は切片を作成し、MITOL cKO マウスの皮膚構造を観察する

lipofectoamine 2000 を用いて行った。

ことにした。コントロールマウスおよび MITOL cKO マウ▼ qRT-PCR

スから皮膚を採取し、皮膚切片を作成し、組織標本の一般

・RNAの抽出にはRNeasy Mini Kit（QIAGEN）
を使用した。
®

・cDNA合成にはReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）

的手法である HE 染色法を行い双方のマウスの皮膚構造を観察した。その結果、表皮層において、MITOL cKO マウ
スではコントロールマウスに比べ、有棘層の肥厚（表皮過を使用した。
▼ ROS generatin detection assay

形成）が観察された。さらに、毛胞に着目すると、コント

・CM-H2DCFDA（invitrogen）蛍光プローブで処理し、ロールマウスに比べ、MITOL cKO マウスでは毛胞ひとつに対して肥大化した皮脂腺が増加していることがわかった。

flow cytometry を用いて検出した。

3．結MITOL cKO マウスでは表皮過形成および肥大化した皮脂

果腺の数の増加など、表皮構造形成の異常が起こっているこ

表皮特異的MITOL欠損マウス（MITOL cKOマウス）の作製
MITOL Flox マウスに KRT14-cre 遺伝子をもつマウスとがわかった。

MITOL cKOマウスでは細胞死が進行するを掛け合わせ、表皮特異的な MITOL ノックアウトマウス

皮膚組織切片を作成し、TUNEL assay を行うことで細を作製した。今回用いた MITOL Flox マウスは Exon2 が胞死の検定を行った。その結果、MITOL cKO マウスではlox P に挟まれるように設計をした。MITOL 遺伝子がノコントロールマウスに比べ、顕著に TUNEL positive な細ックアウトされていることは、ゲノム PCR 法、ウエスタ

胞が多く観察されており、これら TUNEL ポジティブな細ンブロッティング法で確認を行った。マウスの表皮サンプ

胞は表皮層の中でも特に有棘層に集中していた。また、こルからゲノムを抽出し、ゲノム PCR を行った。作製したのような TUNEL ポジティブな細胞は MITOL cKO マウ

マウスのサンプルからは欠損バンドである約 600bp にバスの毛包内にも多く観察された。

ンドが確認できたため、このマウスではターゲットとする
Exon2 が欠損していることがわかった。また、表皮タン− 150 −

ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制に関する研究

4．考

スは老化の分子機構を解析する良い解析モデルになるだろ察う。

本研究の結果から、MITOL cKO マウスでは、白髪の増加や脱毛、皮膚異常など老化モデルマウスに近似した表現（参考文献）型を示すことがわかった。また、MITOL cKO マウスで観

1） Marchi S, Giorgi C, ：Mitochondria-ros crosstalk in

察された、表皮の肥厚や皮脂腺の肥大化などの炎症症状のthe control of cell death and aging, J. Signal Transduct.,

進行、表皮および毛胞における細胞死の増加、テロメア

2012, 329635, 2012.

鎖の短縮は、MITOL cKO マウスの表皮において老化が進行していることをサポートする結果である

13, 14）。さらに、

HaCaT 細胞に MITOL siRNA を遺伝子導入した実験結果

2） Otsuga D, Keegan BR,：The dynamin-related
GTPase, Dnm1p, controls mitochondrial morphology inyeast, J. Cell Biol. 143, 333-349, 1998.

から、MITOL cKO マウスの示した表現型の原因が、表皮

3） James D, Parone PA,： hFis1, a novel component of

ケラチノサイト内の ROS のレベルの上昇、および分化マ

the mammalian mitochondrial fission machinery, J. Biol.

ーカーであるインボルクリンの減少であることを示唆する

Chem. 278, 36373-36379, 2003.

結果も得ることができた。老化分野におけるミトコンドリ

4） Otera H, Wang C,： Mff is an essential factor

ア研究としては、加齢によるミトコンドリア遺伝子の変異

for mitochondrial recruitment of Drp1 duringの蓄積が細胞機能に悪影響を与える『ミトコンドリア遺伝

mitochondrial fission in mammalian cells, J. Cell Biol.

子変異説』が提唱されており、表皮細胞においては、ROS

191, 1141-1158, 2010.

によってミトコンドリア遺伝子の変異が起こることが証明
15）5） Huang P, Galloway CA,：Control of mitochondrial。また、実際にミトコンドリア DNA 修復機

morphology through differential interactions of

能不全マウス（PolgD257A/D257A）では脱毛や白髪化、また、細mitochondrial fusion and fission proteins, PLoS One, 6,胞死の増加などの老化現象が進行することが明らかにされe20655, 2011.

されているており、このマウスは早老症のモデルマウスとして確立さ

6） AlexanderC, Votruba M,：OPA1, encoding a。今回、MITOL cKO マウスで観察された白dynamin-related GTPase, is mutated in autosomal

髪の増加や脱毛、皮膚異常、細胞死の増加などの老化を示

dominant optic atrophy linked to chromosome 3q2 8,

す表現型は、表皮ケラチノサイト内のミトコンドリアダメ

Nat. Genet., 26, 211-215, 2000.

れている

16）

ージによって引き起こされたものであり、細胞内において

7） YonashiroR, Ishido S,：A novel mitochondrial
ubiquitin ligase plays a critical role in mitochondrial

MITOL が老化に関与することが示唆された。
今回、メスの MITOL cKO マウスでは、脱毛、白髪の増加、

dynamics, EMBO J., 25, 3618-3626, 2006.

表皮異常、および表皮の肥厚や皮脂腺の肥大化の増加など

8） Yonashiro R, Sugiura A,： Mitochondrial ubiquitinの炎症反応の進行がオスで観察された時期よりも遅れて観ligase MITOL ubiquitinates mutant SOD1 and

察され、かつその程度が軽度であることがわかった。生体attenuates mutant SOD1-induced reactive oxygen内での活性酸素の除去にエストロゲンが関わることが報告

species generation, Mol. Biol. Cell., 20, 4524-4530, 2009.

。メスの MITOL cKO マウスの表現型の遅9） Sugiura A, Yonashiro R,：A mitochondrial ubiquitin

れは、エストロゲンの活性酸素の除去機能に起因している

ligase MITOL controls cell toxicity of polyglutamine-

ことが推測される。

expanded protein, Mitochondrion, 11, 139-146, 2011.

されている

17）

MITOL cKO マウスでは表皮肥厚が観察され、さらに、

10）Yonashiro R, Kimijima Y,：Mitochondrial ubiquitin

HaCaT 細胞を用いた MITOL ノックダウンの実験結果よligase MITOL blocks S-nitrosylated MAP1B-light

り、表皮分化マーカーであるインボルクリンの mRNA の

chain 1-mediated mitochondrial dysfunction and

発現量の低下が観察されている。インボルクリンは表皮分

neuronal cell death, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 0 0,化の過程において、有棘層から角層にかけて発現が強くな

2382-2387, 2012.

る分化マーカーであり、細胞内の Ca 濃度依存的な C キ11）Kovacs D, Raffa S,：Keratinocyte growth factor

ナーゼの活性化により、その発現が促進されることが知ら

down-regulates intracellular ROS production induced

れている。MITOL cKO マウスで観察された表皮の肥厚は、

by UVB, J. Dermatol. Sci., 54, 106-113, 2009.

2+

ケラチノサイト内の ROS のレベルの上昇による細胞ダメ

12）Velarde MC, Flynn JM,：Mitochondrial oxidative

ージだけではなく、Ca2+ の濃度調節異常による分化異常のstress caused by Sod2 deficiency promotes cellular

可能性も考えられる。結論としてミトコンドリア機能低下

senescence and aging phenotypes in the skin, Aging

は老化に直結しており、今回作成された MITOL cKO マウ（Albany NY），4, 3-12, 2012.

− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 201613）Pillai S, Oresajo C,：Ultraviolet radiation and skinrecord the effects of UV exposure and oxidative stressaging: roles of reactive oxygen species, inflammation

using human skin as a model tissue, Mutagenesis, 2 5,

and protease activation, and strategies for prevention

101-107, 2010.

of inflammation-induced matrix degradation - areview, Int. J. Cosmet. Sci., 27, 17-34, 2005.

16）Kujoth GC, Hiona A,： Mitochondrial DNA mutations,oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging,14）Kuhn A, Herrmann M,： Accumulation of apoptotic

Science, 309, 481-484, 2005.

cells in the epidermis of patients with cutaneous lupus17）Yang XP, Reckelhoff JF,： Estrogen, hormonal

erythematosus after ultraviolet irradiation, Arthritis

replacement therapy and cardiovascular disease, Curr.

Rheum, 54, 939-950, 2006.

Opin. Nephrol. Hypertens. 20, 133-138, 2011.

15）Birch-Machin MA, Swalwell H, ：How mitochondria− 152 −

自閉スペクトラム症児の香料過敏についての調査
金沢大学子どものこころの発達研究センター

熊﨑博一

In this experiment, we used an olfactory measurement that uses pulse ejection. Pulse ejection system can present scent
for a short duration the picoliter level. This experiment was conducted to elucidate the sensory abnormality in children with
autism spectrum disorder (ASD). This experiment examined odor detection threshold and adaptation to change. We could
have shown that olfactory trait of children with ASD are different from children with TD.

1．緒

刺激し、異常な脳発達に影響を与えているかもしれない”

言と述べている 5）。一方で適度な香料濃度は ASD 児の情意

自閉スペクトラム症（Autism Spectrum Disorder：以下

安定をもたらすと考えられる。

ASD と略す）とは、対人相互作用やコミュニケーションのASD 者の嗅覚特性に関して、両親からのレポート、質発達に障害を持ち、常同行動や限局的・反復的な興味お問紙を用いた先行研究は現在までに多数認めている 6, 7）。

よび行動のパターンを示す発達障害である。世界的診断

一方で実験器具を用いた既存の嗅覚研究では、感度が低1）基準である DSM-5 にて感覚過敏や感覚刺激に対する低

く、ASD 児の嗅覚特性についての解明は進んでいなかっ反応といった感覚の問題が初めて診断基準の一つに取りた。従来の実験における香り提示は高濃度の長時間連続提上げられた。感覚の問題は ASD の患者にとって実生活の示となり、空間に香りが残留する残り香の問題、徐々に香中で抱く困難性の本質に近く、情動・行動や運動・行為のりの濃度差を感じなくなる順応の問題があった。また複数問題に影響する。感覚の問題の中で嗅覚は、視覚や聴覚との香りを提示し、一時的に記憶にとどめておかないといけ異なりその伝達経路が視床を通らないこともあり、注目ないため、ワーキングメモリーを要することも大きな課題

されてこなかった歴史がある。“Gillberg の診断基準” で有であった。さらに言語能力を要する課題が多かったことも名な Gothenburg 大学の Gillberg 先生はその著の中で“ASD課題であった。
「香り発生デバイス」（図 1）は精密な射出

児はにおいに対し思いがけない反応を示すことも非常に制御が可能であり、児童の嗅覚特性の同定に道を拓くこと多いこと、ASD 児がある種の部屋や特定の環境を避けるができる。
「香り発生デバイス ｣ を用いて ASD 児の嗅覚検のも異常な嗅覚認知で説明できるかもしれないこと、に知閾値を導き出し、定型発達児の嗅覚検知閾値と比較する

おいが ASD 児に対し強い影響を及ぼすことに気づいていことを目的とした。

2）ない専門家も多い。
” との警鐘を鳴らしている 。作業療法

また ASD 児の特徴の一つに変化への適応が悪いことが士の Lane らは、嗅覚過敏の強いことがコミュニケ―ショ

挙げられる。においにおいても、あるにおいになじんでい

ン能力や不適応行為の予後を示唆すること 3）、Hubberd らる中でにおいの種類が変化したときにその変化に気がつかは、偏食の半分以上は嗅覚特性によって説明できることをずに反応の遅れの原因となっている可能性がある。日常生

4）

報告しており 、ASD 児がその嗅覚認知のために我々の活においてにおいの種類の変化に気がつく能力は ASD 者

想像以上に社会生活に支障が出ている可能性を指摘していの社会性と関連している可能性もあり、ASD 重症度とにる。ASD 児が特定の人を避ける、特定の人の前で情緒がおいの種類の切り替えについての能力の関係を調べること

不安定になるのも異常な嗅覚認知にて説明できる可能性もをもう一つの目的とした。

考えられている。香料濃度が高いことが ASD 児の不快感・拒絶の誘因になり対人関係を築けず、情動行動に影響を与える可能性もある。Bagasra 等は “ある種の香りが神経をInvestigation of spice sensitivity forchildren with autism spectrum disorders
Hirokazu Kumazaki
Resea rch C enter for Ch i ld Ment a l
Development, Kanazawa University− 154 −

図1

香り発生デバイス自閉スペクトラム症児の香料過敏についての調査

2．実

気温を約 23 ℃に設定した。被験者の前にタッチパネルデ験ィスプレイ（図 3）を置き、実験者は対面にてコントロール

2. 1. 実験１用のディスプレイを操作した。実験者と被験者の間には仕

2. 1. 1. 被験者

切り板を置いた。

被験者は 5 ～ 15 歳の ASD と診断されている患者、及び2. 1. 5. 香り発生デバイスの設定

定型発達児を対象とした。参入条件として 1）IQ ≧ 70、2）

初期値を EQUT：80，ET：200ms に設定した。ET に研究に自発的に参加していること、除外条件として 1）感

ついては固定、EQUT については後述のように徐々に低冒症状を認めないこと、2）嗅覚疾患にて耳鼻科通院をし下させた。

ていないこととした。ASD については助成者が、被験者

2. 1. 6. タッチパネルディスプレイの開発の生育歴について十分に調査するとともに、広汎性発達

ASD 者はワーキングメモリーに障害を有するケースが障害日本自閉症協会評定尺度（Pervasive Developmental

多く、ワーキングメモリーの弱さに配慮したセッティング

Disorders Autism Society Japan Rating Scale：PARS）をは重要であった。一方で ASD 者は視覚的な理解は強くデ用いて診断した。また全被験者に対して神経疾患の既往がィスプレイを用いることで、ASD 者のワーキングメモリ

ないことを確認した。ヘルシンキ宣言に基づいた本研究のーの弱さを補えるのではないかと考えた。タッチパネルデ

主旨・内容・実験の安全性および被験者の権利に関する説

ィスプレイは図 3 のようになっており、箱をクリックする明を行い、書面による参加の同意を得た。実験開始 30 分と香りが射出される仕組みとなっている。

前より飲食の摂取をしないように教示した。

2. 1. 7. 香料の好み

2. 1. 2. 香り発生デバイス

本実験では香料の好みについて 5 段階のリッカート尺度「香り発生デバイス」は単位時間射出量［ejection quantityを用いて調査した。それぞれの香料について、香りが心地

per unit time：EQUT］256 段階、最小射出時間［ejection

よいという質問を作り、1. 全く同意できない、2. 同意でき

time：ET］667 マ イ ク ロ 秒 と 非 常 に 精 密 に 香 り を 射 出ない、3. どちらともいえない、4. 同意できる、5. 非常に制御できる射出量を微細に制御することができる pulse

同意できる、で回答させた。

ejection system（図 2）を用いて人の嗅覚特性を測定する

2. 1. 8. 小児自閉症評定尺度（Childhood Autism Rating装置である。微小時間で香りを提示する「パルス射出」が可Scale：CARS）

能となっている。このパルス射出により微小香料の香りを

ASD 児の重症度測定のためにアメリカ・ノース・カロラ

提示することができ、残り香が室内に充満する問題、徐々イナ州の自閉症治療教育プログラム（TEACCH：Treatmentに順応し濃度差を感じなくなるといった問題がない。またand Education of Autistic and related Communication

意図通りに香りを感じさせることができ、感度も高い。

handicapped Children）で用いられている CARS を用いた。

2. 1. 3. 試薬

CARS は“人との関係”、“模倣”、“感情”、“身体の使い方” “物予備実験では香料にバナナ様エッセンスである酢酸イソとの関係”、“環境変化に対する適応”、“視覚による反応性”、アミル（isoamyl acetate）、オレンジ様エッセンスであるリ“聴覚による反応性” “味覚・嗅覚・触覚による反応性”、“不モネン（limonene）、パイナップル様エッセンスであるカプ

安反応”、“言語性のコミュニケーション”、“非言語性のコ

ロン酸アリル（allyl caproate）、バラ様エッセンスである

ミュニケーション”、“活動水準”、“知的機能”、“全体的なβ- フェニルエチルアルコール（phenethyl alcohol）、ペパ

印象”の 15 項目からなり、この 15 項目のそれぞれについて、ーミント（peppermint）を用いた。本番実験では多くの児が不快に感じない酢酸イソアミル（isoamyl acetate）、カプ
ロン酸アリル（allyl caproate）
を用いた。
2. 1. 4. 実験環境
実験室は被験者にとっては馴染みのある部屋で行った。

図2

Pulse ejection system

図3− 155 −

タッチパネルディスプレイ（嗅覚検知閾値）コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

正常範囲内
（1 点）
、軽度の異常（2 点）、中等度の異常（3 点）、

験者の間には仕切り板を置いた。

重度の異常
（4 点）
という評点をつける。

2. 2. 4. 香り発生デバイスの設定

例えば “味覚・嗅覚・触覚による反応性” は味覚・嗅覚・触覚刺激に対する反応性を評定する。また子どもがこれら

EQUT：80, ET:200ms に設定した。
2. 2. 5. タッチパネルディスプレイ

の感覚様式を適切に使えるかの評定もする。子どもが時々

図4のようなタッチパネルを開発した。時間制限（1分半）

食べられない物のにおいを嗅いだりなめたりする程度で 2を設け，一定時間ごとに種類を切り換えた。バナナの香り

点、においを嗅ぐことについて中等度の強さで嗅ぐ程度でがする際にはバナナのボタン、パイナップルの香りがする

3 点、子どもが対象物に対して通常の扱い方や興味の示し際にはパイナップルのボタンを押す設定とした。

方をしないで感覚的ににおいを嗅ぐことに没頭する程度で2. 2. 6. 手順

4 点となる。

時間制限（1 分半）を設け，一定時間ごとに種類を切り替

2. 1. 9. 手順

えた。初めの 30 秒はバナナの香り、次の 20 秒はオレンジ

EQUT80 で開始した。3 つの箱のうち、１つは香料を有の香り、次の 20 秒はバナナの香り、最後の 20 秒はオレン

しており、残りの 2 つは香料を有していない設定とした。

ジの香りとした。香りは 0.8 秒間隔で射出された。バナナ

タッチパネル上の箱をクリックすると 3 箱のうち 2 箱は無の香りがする際にはディスプレイ上でバナナのボタン、オ

香料の気体が射出、1 箱は有香料の気体が射出された。そレンジの香りがする際にはディスプレイ上でオレンジのボ

れぞれの箱を 2 回ずつクリックできる設定とし、香料を有

タンを押すように説明した。1 回以下しかボタンタッチのしている箱がどこにあるかを当てる設定とした。被験者がミスをしなかった方を課題達成者、2 回以上ミスした方を香料を有している箱を当てることができなかったら、実験

課題非達成者とした。

は終了とした。被験者が香料を有している箱を 2 回連続で

3．結当てることができたら、EQUT を半分の濃度として同様の試みを繰り返した。EQUT を 80, 40, 20, 10 と低下させ
EQUT10で2回当てることができた際に、実験を終了とした。

果

3. 1. 実験 1 の結果
ASD 児 20 名、健常児 20 名が参加した。ASD 児では定型発達児と比べて CARS の Total スコア及び味覚・嗅覚・

2. 2. 実験 2

触覚スコアとも有意に高かった。イソアミルアセテート、

2. 2. 1. 被験者

カプロン酸アリルにおいては ASD 児で健常児より嗅覚検5 ～ 15 歳の ASD 児を対象とした。参入条件として 1）
IQ ≧ 70、2）研究に自発的に参加していること、除外条件
として 1）感冒症状を認めないこと、2）嗅覚疾患にて耳鼻知閾値が高いとの結果が出た（表 1）。
全被験者が 5 種類の香料を不快とは感じないことを確認した。

科通院をしていないこととした。ASD の診断については助成者が、被験者の生育歴について十分に調査するとと

3. 2. 実験 2 の結果

もに、広汎性発達障害日本自閉症協会評定尺度（Pervasive

ASD 児 8 名、定型発達児 6 名が参加した。ASD 児ではDevelopmental Disorders Autism Society Japan Rating

定型発達児と比べてオレンジのミス率、及び全体のミス率

Scale：PARS）を用いて診断した。また全被験者に対して神経疾患の既往がないことを確認した。対照群として健常者が参加した。ヘルシンキ宣言に基づいた本研究の主旨・内容・実験の安全性および被験者の権利に関する説明を行い、書面による参加の同意を得た。実験開始 30 分前より飲食の摂取をしないように教示した。
2. 2. 2. 香料
香料にはバナナ様エッセンスである酢酸イソアミル（isoamyl acetate）、オレンジ様エッセンスであるリモネン（limonene）
を用いた。
2. 2. 3. 実験環境
実験室は被験者にとっては馴染みのある部屋で行った。
気温を約 23 ℃に設定した。被験者の前にタッチパネルデ
ィスプレイ（内容については後述）を置き、実験者は対面にてコントロール用のディスプレイを操作した。実験者と被図4− 156 −

タッチパネルディスプレイ（においの種類切り換え実験）

自閉スペクトラム症児の香料過敏についての調査

表1
IA
AC

ASD 児、TD 児の嗅覚検知閾値ASD
61.5±41.6
51.5±45.5TD
17.0±10.8
12.0±25.5

表2

P
＊
＊

オレンジミス率（％）
バナナミス率
（％）
全体ミス率
（％）
気づく時間
（秒）

＊p<0.01
IA：isoamyl acetate
AC：allyl caproate

ASD
26.6±25.7
23.0±22.8
26.6±21.1
4.47±1.78

非 ASD
5.56±3.14
10.8±5.96
8.84±4.77
3.04±1.21

有意差
P<0.01
なし
P<0.01
なし

り危険認識（食物の腐敗・煙・ガスから守る）、生殖活動のが有意に高いとの結果となった
（表 2）
。

4．考

においの種類切り換え実験の結果

誘発（フェロモン）、興奮や鎮静（アロマ）、食事の好き嫌察い・食欲、気分、自律神経・内分泌・免疫と多岐にわた

実験 1 では 2 種類の香料に対し ASD 児と健常児の嗅覚る。本研究の結果から ASD 児では多くの香料において嗅検知閾値を比較した。ASD 児では 2 種類の香料に対し鈍覚検知閾値が大きく異なることが示唆されるが、まずは今麻との結果となった。実験 2 の結果 ASD 児が定型発達児

後 ASD 児一人一人の嗅覚特性を支援者が容易に把握できと比べてにおいの種類切り換えに対する反応が悪い可能性るシステムが必要と考える。
Parkinson 病では嗅覚特性が運動症状、認知症状の予測が示唆された。
現在まで実験室環境にて ASD 群と健常児の嗅覚検知閾

因子で嗅球は病理学的に最初に障害となっていること 12, 13）、値を比較した研究は４つあった。Suzuki et al は 12 名のAlzheimer 型認知症では初期より識別力が低下しており、ASD 群（平均 30 代）と 12 名の健常群（平均 30 代）に対し嗅覚障害の程度と海馬の容積に相関があること 14）、統合

1-butanol を用いて嗅覚検知閾値を比較した 8）。ASD 群

失調症ではその前駆期である Ultra High Risk において同と健常群で嗅覚検知閾値に大きな差異はないとの結果を定力が障害されていること 15）、また同定力は発症予測因子、得た。Dudova et al は 31 名の ASD 群（平均年齢 10 歳）と陰性症状とも相関関係にあること、パーソナリティー障害

35 名の健常群（平均年齢 10 歳）に対し Sniffin Sticks with

においても嗅覚の同定力の低下がみられる 16）、など多く

n-butanol を用いて嗅覚検知閾値を比較した 9）。ASD 群の神経性心疾患において嗅覚特性が予後のマーカーとして

では健常群と比べて嗅覚検知閾値は高いとの結果を得注目されている。嗅覚特性は ASD の診断及び予後を判断すた。Tavassoi et al は 38 名の ASD 群（平均年齢 28 歳）とる上で重要なマーカーとなり得るとの報告があり 17）、本42 名の健常群（平均年齢 28 歳）に対し Sniffin Sticks with

研究結果もそれを示唆するものとなった。

n-butanol を用いて嗅覚検知閾値を比較した

10）。ASD 群と臨床場面においては、ペンキのにおいが嫌で図工室に入健常群で嗅覚検知閾値に大きな差異はないとの結果を得た。

れない、体臭が気になり人に向き合うことができない、おAshwin et al は 17 名の ASD 群（平均年齢 27 歳）と 17 名の盆のにおいが嫌いでおやつが食べられない、色々なものの健常群（平均年齢 28 歳）に対し Alcohol Sniffin Test（香料においを嗅ぐ、においがするからと繰り返し手を洗う、調は isopropyl alcohol）を用いて嗅覚検知閾値を比較した 11）。

子が悪くなるとマスクをつけたりタオルを首に巻くなど多健常群では ASD 群と比べて嗅覚検知閾値は高いとの結果

くの嗅覚に起因する問題が見られる。本実験では香料に対を得た。

する嗅覚検知閾値、香料の変化への適応について調べたが、上記のように現在までの嗅覚検知閾値に関する結果は一

こういった臨床所見について検討するには他にも嗅覚順応貫していなかったが、その理由としてそれぞれの実験にお（香料物質に連続的にさらされてからそのニオイを感じなける用いた香料が異なること、被験者の年齢が異なっていくなるまでの現象）についても検討する必要がある。今後ることが考えられた。香料に対する検知閾値は年齢の変化も多くの側面から ASD 児の香料に対する特性を明らかにに伴い大きく変化すること、また香料によって大きく異なし、ASD 児の社会支援を行っていきたいと考えている。

ることが知られている。また緒言で述べたように、実験室

5．総のセッティングの影響も大きく受ける。

括Ashwin et al の研究においては被験者が香料に順応しな

本研究では、ASD 児の香料過敏についておよび香料のいように最大限配慮された。一方で結果は本実験結果とは変化への適応について実験し検討を行った。ASD 児と定異なり ASD 群は香料に敏感というものであった。検知閾

型発達児の間で香料に対する嗅覚検知閾値が大きく異なる

値は香りについての好み、不安の影響を受けることが知ら可能性があること、ASD の重症度によって香料の変化にれている。多くの ASD 児で isopropyl alcohol を不快に感対する適応が大きく異なることが明らかになった。嗅覚特じていたことが示唆される。

性は ASD の診断及び予後を判断する上で重要なマーカー

嗅覚機能は生命を営むに当たり多くの役割を果たしておとなり得ること、ASD 児がその嗅覚特性のために多くの− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

困難を有していることを考慮すれば ASD の嗅覚特性につnot odor identification, is impaired in children with

いて追及する意義は大きい。今後は ASD 児の香料に対す

autism. Eur Child Adolesc Psychiatry. 2011;20: 333-40.

る閾値や変化への適応だけでなく、順応など他の多くの嗅10）Tavassoli T, Baron-Cohen S: Olfactory detection

覚特性について検討し、ASD 児の社会困難と嗅覚特性のthresholds and adaptation in adults with autism

関係について明らかにしていきたい。

spectrum condition. J Autism Dev Disord. 2012;42:9059.

（引用文献）

11）Ashwin C, Chapman E, Howells J, Rhydderch

1） American Psychiatric Association (APA). Diagnostic

D, Walker I, Baron-Cohen S. Enhanced olfactoryand statistical manual of mental disorders (5th ed.,sensitivity in autism spectrum conditions. Mol Autism.

pp. 5–2 5). Arlington, VA: American Psychiatric2014;5: 53.
12）Doty RL (2 0 0 7) Olfaction in Parkinson’ s disease.

Publishing.2013.
2） A G U I D E T O A S P E R G E R S Y N D R O M E b y
Christopher Gillberg. Cambridge University Press

Parkinsonism Relat Disord 13(Suppl 3):S225–S228
13） Kranick SM, Duda JE (2008) Olfactory dysfunctionin Parkinson’ s disease. Neurosignals 16(1):35–40

2002.
3） Lane AE, Young RL, Baker AE, Angley MT.

14） Stamps JJ, Bartoshuk LM, Heilman KM. A brief

Sensory processing subtypes in autism: association

olfactory test for Alzheimer's disease. J Neurol Sci.

with adaptive behavior. J Autism Dev Disord. 2 0 1 0;

2013 Oct 15; 333(1-2):19-24.
15） Atanasova B, Graux J, El Hage W, et al (2 0 0 8)

40:112-22.
4） Hubbard KL, Anderson SE, Curtin C, Must A,
Bandini LG. A Comparison of Food Refusal Related

Olfaction: a potential cognitive marker of psychiatricdisorders. Neurosci Biobehav Rev 32(7):1315–1325

to Characteristics of Food in Children with Autism16） Croy I, Springborn M, Lötsch J et al. Agreeable

Spectrum Disorder and Typically Developing Children.

smellers and sensitive neurotics--correlations among

J Acad Nutr Diet. 2014; 114: 1981-7.

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5） Bagasra O, Golkar Z, Garcia M, Rice LN, Pace DG.
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One. 2 0 1 1 Apr 2 7;6(4):e1 8 7 0 1. doi: 1 0.1 3 7 1/journal.
pone.0018701.
17） Brewer WJ, Castle D, Ch Pantelis. Olfaction and theHypotheses.2013;80:795-803.
6） Leekam SR, Nieto C, Libby SJ, Wing L, Gould J.

brain. Cambridge University Press, New York; 2006.

Describing the sensory abnormalities of children andadults with autism. J Autism Dev Disord. 2007; 37:894-

本研究は下記の学会に発表しました。
・H. Kumazaki, A. Tomoda, K. Okada, T. Muramatsu, M.

910.
7） Tomchek SD, Dunn W. Sensory processing in

Mimura. Olfactory Detection Thresholds in Children

children with and without autism: a comparative study

with Autism Spectrum Disorders Using Pulse Ejection

using the short sensory profile. Am J Occup Ther.

Systems.

2007; 61:190-200.

International Meeting for Autism Research (IMFAR)
2015 (Salt Lake City, Utah, USA)

8） Suzuki Y, Critchley HD, Rowe A, Howlin P, Murphy
DG: Impaired olfactory identification in Asperger’ s

・自閉スペクトラム症向けの嗅覚アプリケーションを用いsyndrome. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2 0 0 3;た嗅覚特性の評価

15:105-7.

熊崎博一、友田明美、小坂浩隆、松浦絵理、岡田謙一、

9） Dudova I, Vodicka J, Havlovicova M, Sedlacek Z,
Urbanek T, Hrdlicka M: Odor detection threshold, but

村松太郎、三村將 .
第 111 回日本精神神経学会総会 2015 年 6 月 大阪

− 158 −

中・高年の見た目年齢の解析
愛媛医療センター神経内科

小原克彦

Background and Objective: Several studies have shown that perceived facial age is a biomarker for systemic aging. In
addition, it has been reported that subjects who looked younger compared with their twin counterpart had a better survival
rate. Moreover, we reported that subjects who looked younger than their chronological age had a significantly lower agerelated increase in carotid atherosclerosis compared with those who looked older than their chronological age. However, theeffects of perceived facial age with makeup on end organ damages and frailty indices have not been fully investigated.
Methods: Perceived age of photos of face and standing posture was evaluated in 427 middle-aged to elderly subjects(188 men and 239 women), by 20 nurses and 5 attendants who were familiar with elderly subjects. All women were wearing
makeup. The following parameters were evaluated for each participant; carotid intima-media thickness, brachial-ankle pulse
wave velocity, augmentation index on radial arterial waveform as atherosclerotic indices; brain damages by MRI, plasmab-type natriuretic peptide concentration, estimated glomerular filtration rate, urinary excretion of protein and albumin as
indices for end-organ damages; cognitive function, sarcopenic indices including hand grip strength, skeletal muscle mass,and thigh muscle cross-sectional area on CT, pulmonary function, and speed of sound in the calcaneus bone, as indices forfrailty.
Results: The mean chronological age, mean perceived age, and mean difference between perceived age and chronologicalage were 67.2±10.5, 65.0±8.3, and –2.2±4.9 years, respectively. Perceived age was significantly related to chronological age(r=0.89). Perceived age was also significantly related to body height, body weight, blood pressure, all atherosclerotic indices,
all end-organ related indices, and all frailty-related indices. On the other hand, after correction for chronological age andsex, only blood pressure and anti-dyslipidemic drug use were significantly related to the difference between perceived age
and chronological age. Further, the interaction between chronological age and the presence of hypertension was significantly
related to the difference between perceived age and chronological age [F=10.3, p=0.002], after correction for chronologicalage and sex.
Conclusions: Perceived age itself is a biomarker for not only atherosclerosis, but also for end-organ damages and thefrailty. Makeup may underlie the lost of their association after correction for the chronological age. The findings indicate thesocio-medical significance of makeup in the aged society.

1．緒

護リスクの高い集団を抽出することが重要である。

言

ヒトが対象者を評価する場合に、瞬時に性別や年齢を推社会の高齢化に伴い高齢者医療や福祉が重大な関心事に定する。これは、相手が自己に対して目上か否かの判断になっている。平均寿命の伸長に伴い要介護状態での生存期必要であり、ヒトが社会生活を円滑に営む上において非常間が長くなり、医療費や介護費は国費を圧迫することになに重要な知覚であり、発達や成熟の過程で自然に備わる能る。要介護の原因（要支援は除く）として、平成 25 年度の力である。

国民生活基礎調査の報告では、脳卒中 22 ％、認知症 21%、

一方、暦年齢が同じであっても、見た目年齢には大きな衰弱 13%、転倒・骨折 11%、関節疾患 7% の順であり、神幅があり、年齢以上に老けて見られる場合も、年齢よりも経疾患やロコモーティブ症候群をはじめとした整形外科的若くみられる場合も存在する。欧米の成績では、皮膚の状な疾患が健康寿命を損なう主な要因である。

態（シワ、シミ、クスミなど）と共に、目や鼻といった顔面

高齢者の要介護に至る状態としてフレイルが提唱されて器官の相対的な位置、輪郭の明瞭さ、唇の厚さなどが影響いる。フレイルは、虚弱や脆弱を示す状態であり、ホメオを与えているようであるが、完全には明らかにされていな

スターシスに破綻をきたし、ADL の障害を介して、要介

い 4-6）。

護や施設入所に至るリスクと考えられている 1-3）。有効な

この見た目年齢が身体機能や生命予後を反映するバイオ予防介入を加えるために、フレイルを適切に評価し、要介マーカーとなる可能性が示されている。暦年齢以上に若く見られるヒトは、老けて見られるヒトに比し、動脈硬化が少なく、生命予後も良好であることが示されている 4-6）。
我々も、暦年齢よりも若く見られるヒトでは、頸動脈の加Clinical evaluation of perceived age in
middle aged to elderly subjects
Katsuhiko Kohara
Department of Neurology, Ehime Medical
Center

齢性肥厚が小さいことを認めている 7）。また皮膚の老化指標であるシミの存在は、女性において動脈硬化を反映していることを認めた 8）。一方、見た目年齢が臓器障害やフレ
イル指標をどの程度反映するのかに関しては、これまで十− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

い、空腹時血糖、総コレステロール、HDL コレステロール、分な検討がなされていない。
化粧をした状態での見た目年齢は、化粧をしない場合に中性脂肪を計測した。身体計測を行い、身長、体重から体比し、老化のバイオマーカーとしての効果が低くなること

格指数（BMI）を求めた。降圧薬、高脂血症薬、糖尿病治療が予想される。本研究の中間報告において、化粧により、薬の使用はアンケートにて聴取した。

約５歳見た目年齢が若くなることを報告した。最終報告で
は、化粧をした普段の見た目年齢のバイオマーカーとして

2. 3. 臓器障害の評価の有用性を 13 項目の動脈硬化関連指標、8 項目の臓器障

臓器障害関連因子として脳障害を MRI により評価し

害指標、そして 14 項目のフレイル関連指標において検討た。心に対する負荷指標として、血漿 BNP 濃度を測定しした。さらに、見た目年齢に影響を及ぼす要因についてもた。腎障害の指標として推定糸球体濾過値（eGFR）と尿蛋検討を行った。

白、尿中アルブミン排泄量を評価した。

2．実

2. 3. 1. 脳障害の評価験

3T MRI 装置により無症候性脳梗塞および微小出血の有愛媛大学抗加齢ドックを受診し研究参加に同意を得た

無と脳室周囲白質障害、深部白質障害の程度をそれぞれ 4
および 5 段階で評価した 12-13）。

427 名を対象とした。

2. 3. 2. 心機能障害の評価

2. 1. 見た目年齢の評価

血漿 BNP 濃度は、PATHFAST BNP キット（三菱化学

ドック受診時の化粧をしている状態での顔と全身の写真をそれぞれ撮影した。女性は、全員化粧をしていた。見たメディエンス）を用いて測定した 14）。
2. 3. 3. 腎機能障害の評価

目年齢評価は、高齢者診療の経験が豊富な老年内科病棟勤

推定糸球体濾過値（eGFR）は、血清クレアチニン（Cr）値

務の看護師 20 名と事務員 5 名の併せて 25 名が行った。バより以下の式により求めた。eGFR =194× 年齢− 0.287×

ックグランドの情報は分からない状態で、パソコンに表示

Cr − 1.094×0.739（女性の場合の係数）（mL/min/1.73 m2）。

される顔と全身の写真から年齢を推定した。個々人の見たスポット尿から、尿中蛋白および尿中アルブミンを測定し、目年齢は、評価者 25 名の平均値とした。見た目年齢と受それぞれ尿中クレアチニンにて補正した。

診時の実年齢との差を『見た目年齢差』
として求めた。

2. 4. フレイルの評価

2. 2. 動脈硬化因子の評価

フレイル関連指標として認知機能、サルコペニア関連指

動脈硬化指標として頸動脈内膜中膜厚（IMT）、上腕 足首間脈波伝搬速度（baPWV）、橈骨動脈圧波形から求め

標、骨密度、肺機能、重心動揺を求めた。
2. 4. 1. 認知機能
認知機能は、タッチパネル式認知機能テスト（MSP-

た血圧の増幅係数（AI：augmentation index）を評価した。
また、動脈硬化リスク因子として、血圧、空腹時血糖、総1100、日本光電社、15 点満点）により求めた 15）。

コレステロール、HDL コレステロール、中性脂肪を調べた。

2. 4. 2. サルコペニア関連指標

2. 2. 1. 頸動脈内膜中膜厚の計測

骨 格 筋 の 量 的、 質 的 異 常 を 評 価 し た。 電 子 握 力 計

7.5MHz の プ ロ ー ブ を 用 い て 頸 動 脈 エ コ ー（SSD-（TKK5410、竹井機器工業）により利き腕の握力を測定し3500SV、Aloka 社製）
により左右両側の総頸動脈を前、側面、た 11）。バイオインピーダンス法（カラダスキャンHBF-701、オ

後の 3 方向からスキャンし、1 cm 間隔の 3 ポイントにおいムロンヘルスケア社製）により骨格筋率を求め、体重から9-11）

骨格筋量を算出した 11）。361 名においては、大腿中央部のて遠位側の内膜中膜厚を計測し、その平均値を求めた。

2. 2. 2. 上腕 -足首間脈波伝搬速度の計測

CT 断層像から大腿筋横断面積計測した 9-11）。

血圧脈波検査装置（Form ABI、オムロンヘルスケア社
製）により上腕 - 足首間脈波伝搬速度を計測した

9-11）

骨密度の指標としては、踵骨内超音波伝導速度を CM-。

2. 2. 3. 血圧増幅係数の計測

200（Furuno 社製）により測定した。

血圧脈波検査装置（HEM-9000AI、オムロンヘルスケア社製）により、左橈骨圧波形より収縮期血圧の増幅係数を計測した

2. 4. 3. 骨密度指標

10-11）

2. 4. 4. 肺機能
肺機能として、スパイロ（Microspiro HI-801；チェスト社製）により肺活量、機能的肺活量、一秒量を求めた。

。

2. 4. 5. 重心動揺の使用

2. 2. 4. 脈硬化危険因子
血圧は座位で 5 分間の安静後にオシロメトリック法によ

ふらつきの指標として開眼立位の重心動揺をり 2 回計測し（HEM-9000AI、オムロンヘルスケア社製）、

Gravicorder G-5500（アニマ社製）により計測し、総軌跡その平均値を求めた。最低 12 時間の絶食後に採血を行

長と外周面積として求めた 13）。

− 160 −

中・高年の見た目年齢の解析

2. 5. 統計処理

高血圧患者では正常血圧者に比し、加齢に伴う見た目年齢

統計解析は、市販のソフトウェア（JMP Ver10, SAS

差の変化が小さいことを認めた。これらの成績は、化粧に

institute）
を用いて行った。P<0.05 を統計学的有意とした。

より減弱するものの、見た目年齢には、臓器障害やフレイ

3．結ルに対するバイオマーカーとしての効果があり、高血圧な果

ど生活習慣病が影響を与えている可能性が考えられる。

3. 1. 実年齢と見た目年齢

今回の検討においても、見た目年齢差は、実年齢と有意表 1 に対象者の臨床的背景を示す。平均実年齢は、男性な負の相関を示した。すなわち、実年齢が進むほど（年を67.4±11.2 歳、女性 67.0±9.9 歳であった。一方、見た目とるほど）、若く見られることを示している。この所見は、年齢の平均は、男性 65.5±8.6 歳、女性 64.6±8.1 歳であり、これまでの報告と一致した所見であり、一般的に認められ見た目年齢差は、男性－1.9±5.4 歳、女性－2.4±4.4 歳である現象と考えられる 4-6）。
これまでの我々自身の報告とは異なり 7）、今回の検討でった。

は、見た目年齢差は、実年齢とは独立した動脈硬化のリス

3. 2. バイオマーカーとしての見た目年齢

ク因子とはならなかった。中間報告で示した通り、化粧が表 2 に見た目年齢と諸指標との単相関を示す。見た目年

見た目年齢に影響し、その結果、見た目年齢の持つバイオ

齢は、実年齢と r = 0.89 と強い相関を示し、検討した多く

マーカーとしての強さが弱まった可能性が考えられる。

の指標と有意な相関を示した。特に血圧をはじめとした動一方、見た目年齢自体は、実年齢で補正をしない（実年

脈硬化指標、脳、心、腎の臓器障害指標、そして認知機能齢が分からない）状況では、動脈硬化関連因子のみではな

や肺活量、重心動揺、骨塩指標などの全てのフレイル指標

く、すべての臓器障害やフレイル関連因子と強く相関してと有意な相関を示した。

いた。このことは、実年齢が分からない日常の生活状況において、我々が相手の見た目から推定する年齢は、動脈硬3. 3. 実年齢との独立した効果

化や脳・心・腎の臓器障害、さらには全身の種々の身体機

見た目年齢差が、実年齢とは独立して諸指標と関連す

能の老化をも適切に評価していることを示している。

るかを検討するために、性・年齢を補正して検討した（表フレイルの定義は、主に 2 種類存在する。累積負荷指数 16）

3）。見た目年齢差は、実年齢と強い負の相関を示し（男性は、疾病や機能障害などを加算することで求める指数であr = －0.68, 女性 r = －0.59）、男女いずれも年を取るほど若り、種々のパラメータを組み合わせて評価する。生物学的

く見えることが示された。
一方、検討した諸指標のうち、性・症候群モデル 17）は、握力の低下、歩行速度の低下、活動

実年齢で補正後も、見た目年齢差と有意な相関を示したの性の低下、強い疲労感、予期せぬ体重減少の 5 項目のうちは、血圧値と高脂血症治療薬の服用のみであった。

3 項目以上を満たした場合がフレイルと定義される。
本研究では、フレイルのみならず臓器障害として、認知3. 4. 高血圧が見た目年齢に及ぼす影響

機能、肺機能、サルコペニア指標、重心動揺（ふらつき）、

以上の結果に基づき、高血圧と脂質異常症が見た目年齢

骨密度指標、心機能、腎機能、脳障害の程度など全身機能・差に影響を及ぼしている可能性を検討した。高血圧の有無、障害指数を詳細に検討した。その結果、これらの指標は、脂質異常症の有無でそれぞれ 2 群に分けて、実年齢と見た全て見た目年齢と有意な相関を示していた。しかし、実年

目年齢との関係を示したのが図 1 である。高血圧の有無に齢で補正を行った見た目年齢差は、これらの指標とは有意より実年齢と見た目年齢差との関係が有意に異なった。すな相関を示さなかったことから、ここでも、化粧の効果がなわち、高血圧患者と正常血圧者では、加齢に伴う見た目関係している可能性があると思われる。

年齢差の変化に差があり、高血圧患者は高齢期に見た目年

興味深いことに、高血圧の存在が、見た目年齢差に影響齢差が小さく、すなわち、正常血圧者より老けて見られるを与えていた。この関係の詳細な機序は明らかではないが、ことを示している。一方、このような関係は、脂質異常症

高血圧は動脈硬化の重要な危険因子であると共に、加齢とでは認められなかった。

共に罹患率が急増し、60 歳代の 6 割、70 歳代では 7 割に4．考

高血圧が存在する。動脈硬化指標そのものは、様々な要因

察が影響するため、化粧により見た目年齢の効果が減弱した

今回の検討において、化粧をした状態での見た目年齢は、実年齢と同等の動脈硬化、臓器障害、フレイルに対するバが、加齢性の変化が強い高血圧は、化粧の効果を凌駕した影響を示したのかも知れない。

イオマーカーとなることを認めた。一方、化粧をした状態

今回の研究から、化粧の持つ社会的・生物学的な意味合での見た目年齢差が、実年齢とは独立してこれらの障害のいを考えるとき、化粧は『見た目年齢』を若くすることのみ予測因子となることは見出すことができなかった。さらに、

ではなく、その背景に存在する『健康であること』にも影響− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

表1

対象者の臨床的背景− 162 −

中・高年の見た目年齢の解析

表2

見た目年齢との相関− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

表3

見た目年齢差との相関− 164 −

中・高年の見た目年齢の解析

図1

高血圧および脂質異常症と見た目年齢差

高血圧患者では正常血圧者に比し、加齢に伴う見た目年齢差の低下が小さい。

− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

を与えており、健康に見せるための化粧が見た目を若くしているとも考えられる。

５．総

Skin Res Technol., 22, 20-24, 2016.
9） Ochi M, Kohara K, Tabara Y, et al. Arterial stiffness
is associated with low thigh muscle mass in middle-

括

aged to elderly men. Atherosclerosis. 2 1 2, 3 2 7-3 3 2,

化粧をした状態での見た目年齢は、動脈硬化、臓器障害、2010.

フレイルのバイオマーカーとなることを認めた。見た目年10）Kohara K, Ochi M, Tabara Y, et al. Arterial stiffness

齢の効果は、化粧により減弱するものの老化のバイオマー

in sarcopenic visceral obesity in the elderly: J-SHIPP

カーとして有用であると考えられる。

study. Int J Cardiol., 58, 146-148, 2012.
11）Ohara M, Kohara K, Tabara Y, et al. Portable indices（文献）

for sarcopenia are associated with pressure wave

1） Afilalo J, Alexander KP, Mack MJ, et al. Frailty
assessment in the cardiovascular care of older adults. J

reflection and central pulse pressure: the J-SHIPP
study. J Hypertens., 33, 314-322, 2015.
12）A new guideline making committee of a brain

Am Coll Cardiol., 63, 747-762, 2014.
2） Robertson DA, Savva GM, Kenny RA. Frailty anddock. Brain MRI examination. In: Japanese Society

cognitive impairment – A review of the evidence andfor Detection of Asymptomatic Brain Disease, ed.

causal mechanisms. Ageing Research Rev., 12, 840-851,

Braindock Guideline 2 0 1 4. 4th edition, Tokyo, Japan:

2013.

Kyobunsha, 38-47, 2014. (In Japanese).

3） Chen LK, Liu LK, Woo J, et al. Sarcopenia in Asia:

13）Tabara Y, Okada Y, Ohara M, et al. Association ofconsensus report of the Asian Working Group for

postural instability with asymptomatic cerebrovascular

Sarcopenia. J Am Med Dir Assoc., 15, 95-101, 2014.

damage and cognitive decline: the Japan Shimanami

4） Christensen K, Thinggaard M, McGue M, et al.

health promoting program study. Stroke., 4 6, 1 6-2 2,2015.

Perceived age as clinically useful biomarker of ageing:

14）Yamashita T, Kohara K, Tabara Y, et al. Muscle

cohort study. BMJ., 339, 2009, b5262.
5） Gunn DA, Rexbye H, Griffiths CE, et al. Why

mass, visceral fat, and plasma levels of B-typesome women look young for their age. PLoS One., 4,natriuretic peptide in healthy individuals (from the
J-SHIPP Study). Am J Cardiol.,114, 635-640, 2014.

e8021,2009.
6） Mayes AE, Murray PG, Gunn DA, et al. Ageing15）Inoue M, Jinbo D, Nakamura Y, et al. Development

appearance in China: biophysical profile of facial skinand evaluation of a computerized test battery for

and its relationship to perceived age. J Eur Acad

Alzheimer’ s disease screening in community-based

Dermatol Venereol., 24, 341-348,2010.

settings. Am J Alzheimers Dis Other Demen., 24, 132135, 2009.

7） Kido M, Kohara K, Miyawaki S, et al. Perceived ageof facial features is a significant diagnosis criterion16）Rockwood K, Fox RA, Stolee P, et al. Frailty infor age-related carotid atherosclerosis in Japaneseelderly people: an evolving concept. CMAJ., 1 5 0, 4 8 9495, 1994.

subjects: J-SHIPP study. Geriatr Gerontol Int., 12, 733-

17）Fried LP, Tangen CM, Walston J, et al; Cardiovascular

740, 2012.
FacialHealth Study Collaborative Research Group. Frailty inpigmentation as a biomarker of carotid atherosclerosis

older adults: evidence for a phenotype. J Gerontol A

in middle-aged to elderly healthy Japanese subjects.

Biol Sci Med Sci.56, M146-156, 2001.

8） Miyawaki S, Kohara K, Kido T, et al.

− 166 −

顔の魅力度認知における部分情報の統合
東京大学大学院工学系研究科先端学際工学専攻

三枝

千尋

Human facial attractiveness plays an important role in interpersonal impression formation. Studies have suggested thateach facial part differently contributes to holistic facial attractiveness; however, it remains unknown whether the differential
contribution of facial parts is stable over time. In the current study, we examined how contributions of facial parts to whole
facial attractiveness changes over time and gaze direction of the face.

1．緒

く傾向があることが示唆された 10）。

言知覚される顔の魅力は対人的なコンテクストによっても顔はその持ち主に関する様々な情報を映し、対人コミュ

変化する。例えば、評価者の方に視線を向けている顔画像のニケーションにおいて重要な役割を持つ。なかでも顔の魅魅力度は、評価者から視線をそらしている顔画像の魅力度

力は、善良さなどのポジティブな性格特徴と関連付けて知よりも魅力度が高いと知覚されることが報告されている 11）。

覚される傾向があり 1）、外見の魅力が社会生活において重視線方向は相手が注意を向けている対象を知る手がかりで要な意味を持つことが示されてきた。その重要性から、顔あり、評価者に向けられた視線は、その顔の持ち主が評の魅力はごくわずかな時間のうちに判断することが可能と価者に対して注意を向けていることを示すと考えられる。

考えられている。顔の魅力、信頼性や有能さ、好ましさとJones らの研究 12）では、魅力的な顔に対する選好が、そのいった社会的な性質の判断はともに 100 ミリ秒間のみ提示

顔の視線方向と表情に応じて変化することも報告されておされた顔画像に対しても行うことが可能であること、顔のり、対人的なコンテクストに依存した魅力知覚の様相の変魅力が他の社会的な性質の評価と高い相関を持つことが報化が示唆されている。

告されている 2）。また別の研究では、13 ミリ秒という非これまでの研究においては、短時間のみ提示された顔の常に短い提示時間であっても顔の魅力判断は可能であるこ

魅力判断を構成する要素については検討されてこなかった。

と、メイクアップを施した顔の魅力判断も 250 ミリ秒といしかし実生活においては相手の顔を長時間見つめるような

3, 4）

。これら

シチュエーションは少ないと考えられ、ごくわずかな時間の研究結果は、顔の魅力がごく短時間の間に取得した視覚

のみ見た顔の魅力がどのような構成要素に基づいて判断さ情報のみに基づいて判断できることを示唆している。

れるのかを明らかにすることは、日常生活において知覚さう短い時間の間にできることが示されている

それでは魅力的な顔とはどのような要素から構成されるれる顔の魅力を理解する上で重要と考えられる。そこで本のだろうか。魅力的な顔の形態特徴として、対称性の高い研究においては、顔全体の魅力評価に対する部分情報の寄

顔、平均化された顔、平均化された顔からさらに性差を与の提示時間による変化、及び、対人的なコンテクストの強調した顔が美しいと評価されること

5-7）、顔の色やテク8）

スチャも魅力評価に影響を及ぼすことが報告されている 。

違いによる部分情報統合の変化を明らかにすることを目的とし、実験心理学的手法を用いた検討を行った。

また、顔全体の魅力評価に対する顔のパーツの影響として

2．実は、目と眉の魅力度は顔全体の魅力と有意に相関するもの験

魅力評価は評価者の性別によっても異なることが知られて

2. 1. 顔全体の魅力に対するパーツ情報寄与の時間依存性（実験 1）

おり、筆者らの研究では女性評価者が男性顔の魅力を評価

2. 1. 1. 顔画像の準備の鼻と口は相関を持たないことが示唆されている 9）。顔のする際に、魅力的とされる顔ほど評価者間で評価がばらつ

HKU Face Database に含まれるアジア人女性 58 名の顔写真（正面から撮影されたカラー写真）を用い、顔全体提示
条件では 58 枚の写真それぞれのフェイスラインより内側を正方形に切り抜いた画像を、パーツ提示条件の刺激画像

Judgment of facial attractiveness as anintegration of facial parts
Chihiro Saegusa
Research Center for Advanced Scienceand Technology, The University of Tokyo

として目の部分のみ、鼻の部分のみ、口の部分のみをそれ
ぞれ長方形に切り抜いた画像を実験に用いた。
予備実験において得られた時間制約のない条件における魅力評定値（男性評定者 16 名、女性評定者 20 名、平均年− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

齢 21 . 8 歳）をもとに、58 枚の画像を各群が同程度の平均魅ー画面上に提示し、その魅力度を「1：魅力的ではない」～

2）「7：魅力的である」の７段階尺度で評価させた。各画像は力評定値を持つ 3 群にわけた後、Willis & Todorov の報告を参考に、各群に対して 3 つの提示時間条件（20 ミリ秒、ブロック内においてランダムな順序で 2 回ずつ提示された。

100 ミリ秒、1000 ミリ秒）を 3 通りの組み合わせによって魅力度の評定には、尺度の全範囲を用いるよう教示した。

割り当てた。この際、同じモデルの顔から作成された各刺2. 1. 4. 解析激画像（顔全体、目のみ、鼻のみ、口のみ）に対しては必ず実験プログラムの不備により実験を完了しなかった 4 名

同じ提示時間条件が割り当てられるように組み合わせた。

を除く 39 名分（男性 23 名、女性 16 名）のデータを解析に

実験参加者は刺激群と提示時間の 3 通りの組み合わせに対用いた。7 段階尺度による評定値は、下記の換算式を用いして均等に割り付けられた。

て標準化得点に換算した上で解析に用いた：

2. 1. 2. 実験参加者

標準化得点 z =（x – μ）/σ

実験参加者は通常の視力（矯正視力含む）を有する 19 歳

ここで、x は各試行における評定値、μ は各実験参加者

から 30 歳の男女 43 名（男性 24 名、女性 19 名；平均年齢が実験中に用いた評定値の平均値、σ は各実験参加者が実22.3 歳）であった。

験中に用いた評定値の標準偏差である。

2. 1. 3. 実験手続き
条件に該当する 4 ブロックにより構成された。パーツのみ

2. 2. 短時間提示でのパーツ情報統合に対する視線方向の影響（実験 2）を提示する 3 つのブロックの順序は実験参加者間で均等に2. 2. 1. 顔画像の準備

実験は、目のみ、鼻のみ、口のみ、顔全体の 4 つの提示なるように割り付けを行い、顔全体提示条件のブロックは実験 1 で用いたのと同じ HKU Face Database のアジア

必ず最後になるようにした。画像提示に用いたモニターは、人女性 58 名の正面顔画像を用いて刺激作成を行った。視

22 インチの Mitsubishi Diamond CRT モニター（画面解

線方向を統制するため、FaceGen Modeller の PhotoFit 機

像度：1024×768、リフレッシュレート：100 ヘルツ）であり、能を用いて各顔画像から顔モデルを作成し、視線が正面を画面上に提示された刺激画像の視角は、顔全体条件の場合向いている直視条件の刺激画像を合成した。またモーフには 9.2 °× 9.2 °、目のみの場合には 7.7 °×1.5 °、鼻のみのィング機能によって視線を左右に同じだけ操作すること場合には 3.1 ° ×4.6 °、口のみの場合には 4.2 °×2.3 °であった。

で、視線が左右に逸れている逸視条件の刺激画像を合成し各ブロックのはじめには、ブロック内で提示する全画像をた。合成した各刺激画像から、顔全体、目のみ、鼻のみ、

1 枚あたり 0.5 秒ずつモニター画面にプレビュー表示した。

口のみの各提示条件に用いる刺激をそれぞれ切り出してその後、各画像をあらかじめ割り当てられた提示時間（20実験に用いた（図 1）。刺激画像を実験 1 と同様に 3 群にわ

ミリ秒、100 ミリ秒、1000 ミリ秒のいずれか）だけモニタけ、3 通りの組み合わせによって 3 つの提示時間（20 ミリ秒、

a）直視条件の顔刺激例b）逸視条件の顔刺激例

図1

実験に使用した顔刺激の例（文献13を改変）− 168 −

顔の魅力度認知における部分情報の統合

100 ミリ秒、1000 ミリ秒）に割り当てた。

ついても 20 ミリ秒という短い時間の間に得られる視覚情

2. 2. 2. 実験参加者

報に基づいた魅力評価が可能であることが示唆された。

実験参加者は通常の視力（矯正視力を含む）を有する 19

各提示時間条件（20 ミリ秒、100 ミリ秒、1000 ミリ秒）、～ 30 歳の男女 38 名
（男性 21 名、女性 17 名；平均年齢 22.3 歳）

及び、各画像提示条件（顔全体、各パーツのみ）におけるそであった。

れぞれの刺激画像の魅力を、全実験参加者の魅力評定の平2. 2. 3. 実験手続き

均値を算出することにより求めた。各提示時間条件におけ顔の各パーツの魅力評価を行う 4 ブロック（視線一致条

る顔全体の魅力を目的変数、それと同じ提示時間条件にお件の目、視線が逸れた条件の目、鼻、口）と顔全体の魅力

ける目のみ、鼻のみ、口のみの魅力を説明変数とした重評価を行う 2 ブロック（視線一致条件の顔全体、視線が逸回帰分析を行い、各提示時間条件における顔全体の魅力にれた条件の顔全体）の合計 6 ブロックから構成された。ブ

対するパーツ情報の寄与を求めた。この結果、目の標準化

ロックの順序は常にパーツ条件の 4 ブロックを実施した後偏回帰係数は 20 ミリ秒提示条件において β = 0.54、100 ミに顔全体条件の 2 ブロックを実施した。また、パーツ条件

リ秒提示条件において β = 0.50、1000 ミリ秒提示条件に／顔全体条件内でのブロック順序は実験参加者間で均等において β = 0.49（いずれも p < .001）と一貫して高く、提示なるように割り付けを行った。各ブロックの初めに、ブロ

時間の長さによらず顔全体の魅力度評価に影響を及ぼすこック内で提示される 58 枚の刺激画像を各 0.5 秒ずつプレとが示唆された。一方、口の標準化偏回帰係数は 20 ミリ

ビュー表示した。その後、58 枚の画像をランダムな順序

秒提示において β = 0.30、100 ミリ秒提示において β = 0.32、で 1 回ずつ、画像に割り当てられた提示時間の間モニター

1000 ミリ秒提示において β = 0.35、また鼻の標準化偏回帰

画面上に提示し、実験参加者に提示画像の魅力度を「1：魅係数は 20 ミリ秒提示において β = 0.27、100 ミリ秒提示に

力的ではない」～「7：魅力的である」の 7 段階尺度で評価

おいて β = 0.31、1000 ミリ秒提示において β = 0.36 であり、させた。他の実験条件は全て実験 1 と同じになるように設

いずれの場合にも提示時間が長くなるとともに係数が大き定した。

くなる傾向が見られた（20 ミリ秒の鼻の係数のみ p = .051;

2. 2. 4. 解析

他の全ての係数について p < .001 ～ .05）
。これらの重回帰実験プログラムの不備により実験を完了しなかった 2 名

分析の結果から、目は 20 ミリ秒間という短い時間のみ提を除く 36 名分（男性 20 名、女性 16 名）のデータを解析に示された顔の魅力評価にも大きく影響するものの、他のパ用いた。実験 1 と同様に、7 段階尺度による評定値を標準ーツ（鼻と口）の影響は提示時間が長くなるにつれて大きく化得点に換算して解析を行った。

なり、パーツ種類によって顔全体の魅力評価に対する寄与

3．結の提示時間依存性が異なることが示唆された。

果

3. 1. 顔全体の魅力に対するパーツ情報寄与の時間依

3. 2. 短時間提示でのパーツ情報統合に対する視線方

顔全体の魅力評価は 13 ミリ秒間という短い時間のみ提顔全体の魅力に対するパーツの魅力の寄与の対人的なコ示された顔刺激に対しても可能であることが先行研究 3）にンテクストによる違いとして、評価する顔刺激の視線方向

よって示されている。しかし短時間のみ提示された顔のパの効果を検討した。顔全体の魅力を目的変数、各パーツのーツに対する魅力評価が可能であるかは不明である。そこ

魅力を説明変数とした 3. 1. と同様の重回帰分析を行ったで、短時間提示された顔全体の魅力評価に対する各パーツ

結果、直視条件においては、20 ミリ秒という短い提示時の魅力の寄与を検討するにあたり、まず短時間提示された間の条件においても、全てのパーツの標準化偏回帰係数が顔のパーツに対する魅力評価の一貫性を調べることとした。

有意または有意傾向であった（目：β = .44, p < .001；鼻：各提示時間条件における顔のパーツに対する魅力度評定の

β = . 27, p < .05；口：β = . 20, p = .077）。

存性

向の影響

平均値と、予備実験から得られた時間制約なし条件におけ

一方で逸視条件においては、20 ミリ秒提示条件の顔魅る顔のパーツの魅力度評定の平均値とのピアソン積率相関

力評価に対してはいずれのパーツの偏回帰係数も有意で分析を行った。この結果、目の魅力評定において 20 ミリはなかった（目：β = .25, p = .082; 鼻：β = .10, p = .45; 口：秒という短い提示時間後の魅力評価が、時間制約なし条件

β = − .169, p = . 24）。また直視条件では 20 ミリ秒間提示条における魅力評価と高い正の相関を示した（目：r = 0.86,

件における重回帰モデルの説明力が R2 = . 386（p <.001）で

p < .001）ほか、口と鼻の魅力評価においても 20 ミリ秒提

あるのに対し、逸視条件では重回帰モデルの説明力は低い

示後の魅力評価と時間制約なし条件における魅力評価にという結果が得られた（R2 = .074, p = .24）
。従って逸視条は有意な正の相関（鼻：r = 0.69, p < .001; 口：r = 0.64, p <件においては、顔全体の魅力がパーツの魅力のみからは説.001）が認められ、顔全体の場合と同様に顔の各パーツに明できず、パーツ情報の寄与が低下しているものと考えら− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図2

顔全体の魅力と各パーツの魅力との相関（文献13を改変）したのに対し、鼻と口の魅力は提示時間が 20 ミリ秒と短れた。
実験 1 の結果では、直視条件における重回帰モデルの各パーツの偏回帰係数は、提示時間によらずゼロよりも有意い場合には顔全体の魅力に対する寄与は低く、提示時間が長くなるにつれて寄与が高まる傾向が見られた。

に高い（20 ミリ秒提示における鼻の係数のみ有意傾向）と顔全体の魅力評価に対して目の魅力が大きく寄与する理いう結果が得られた。しかし実験 2 の重回帰分析において由として、目は白目部分と黒目部分が接していることから

は、鼻と口の偏回帰係数はいずれも有意傾向にしかなかっ

大きな輝度コントラストを持ち、そのため顕著性が高く、た。本実験の結果解析においては目と口の魅力評定の間に注意をひきやすい刺激であることが考えられる。また同時弱い正の相関が確認され、これが重回帰モデルに影響を及に、目は対人コミュニケーションにおいて非常に重要な役ぼしている可能性が考えられる。そこで直視条件と逸視条割を担うパーツであることから、対人的な顕著性が高く、件における顔全体と顔のパーツの魅力の関係を、ピアソン

他のパーツよりも速く知覚される可能性もある。

相関分析によっても確認した（図 2）。この結果、提示時間

そこで、対人的なコンテクストが異なる場合に、顔全体が 1 秒と長い場合には逸視条件における顔全体－パーツ間の魅力に対する各パーツの寄与がどのように変化するかをの相関係数は同程度であるものの（例えば直視条件におけ明らかとするため、顔刺激の視線方向を変化させた実験

る目－顔全体：r = .730、逸視条件における目−顔全体：r2 を実施した。この結果、顔刺激の視線が評価者を向いて= .691；Z = 0.425、p = .337）、提示時間が 20 ミリ秒と短いいる直視条件においては、20 ミリ秒間提示後の顔全体の場合には逸視条件における相関係数は直視条件における

魅力に顔の各パーツの魅力が有意に寄与した。一方で、顔相関係数よりも低いという結果（例えば直視条件における刺激の視線が評価者から逸れている逸視条件においては、

目−顔全体：r = .514、逸視条件における目−顔全体：r =20 ミリ秒間提示後の顔全体の魅力に対してパーツの魅力.206；Z =1.84、p <.05）が得られ、重回帰分析によって得情報が統合されていない可能性が示唆された。これらの結られた傾向と同様の結果が得られた。

果は、目は社会的手がかりとしての重要性が高いために短4．考

時間提示においても顔全体の魅力に大きく寄与すると考え察られること、また視線が評価者の方に向けられることによ

実験 1 から、顔全体の場合と同様に顔のパーツも 20 ミ
リ秒の間に取得した情報に基づいて魅力判断が可能であるって、顔全体の魅力に対するパーツ情報の統合が促進されることを示唆している。

こと、20 ミリ秒という短い時間提示された顔についても顔の魅力判断は可能であるが、魅力知覚を構成するパーツ

謝辞とその寄与は提示時間によって変化している可能性がある

本研究にご支援をいただいたコスメトロジー研究振興財

ことが示唆された。また、パーツの寄与の提示時間に依存

団に深く感謝いたします。また、本研究の共同研究者でした変化はパーツの種類によっても異なり、目の魅力は提ある早稲田大学の渡邊克巳教授に深謝申し上げます。本

示時間の長さによらず顔全体の魅力に対する高い寄与を示

報告書において述べた研究成果は引用文献 13 に掲載され、− 170 −

顔の魅力度認知における部分情報の統合

本報告書は論文誌発行元である American Psychological
Association の許諾範囲内において作成しました。上述の

7） Perrett, D. I. et al. Effects of sexual dimorphism on
facial attractiveness. Nature 394, 884-7 (1998).

文献、及び、助成金が研究の一部を担った引用文献 10 では、

8） Fink, B., Grammer, K. & Thornhill, R. Human (Homo

Cosmetology Foundation より助成を受けている旨明記しsapiens) facial attractiveness in relation to skin texture
and color. J. Comp. Psychol. 115, 92-99 (2001).

ました。

9） 加藤隆，阿磨大介，森岡久美子，赤松茂．顔の魅力度（引用文献）

判断におけるパーツの魅力の影響．信学技報，HIP97-53，

1） Dion, K., Berscheid, E. & Walster, E. What is beautiful

1998.
10）Saegusa, C. & Watanabe, K. Is an attractive faceis good. J. Pers. Soc. Psychol. 24, 285-290 (1972).
2） Willis, J. & Todorov, A. First Impressions Making Up

attractive for all? An exploratory research on attractivenessYour Mind After a 100-Ms Exposure to a Face. Psychol.

evaluation by female observers. in 2 0 1 4 6th Int. Conf.

Sci. 17, 592-599 (2006).

Knowl. Smart Technol. 105–107 (IEEE, 2014). doi:10.1109/

3） Olson, I. R. & Marshuetz, C. Facial attractiveness is

KST.2014.6775403
11）Ewing, L., Rhodes, G. & Pellicano, E. Have you got

appraised in a glance. Emotion 5, 498-502 (2005).
4） Etcoff, N. L., Stock, S., Haley, L. E., Vickery, S. A. &House, D. M. Cosmetics as a feature of the extended

the look? Gaze direction affects judgements of facial
attractiveness. Vis. cogn. 18, 321-330 (2010).

human phenotype: modulation of the perception of12）Jones, B. C., Debruine, L. M., Little, A. C., Conway, C.

biologically important facial signals. PLoS One 6, e25656

A. & Feinberg, D. R. Integrating Gaze Direction and(2011).

Expression in Preferences for Attractive Faces. 17, 588591 (2006).

5） Grammer, K. & Thornhill, R. Human (Homo sapiens)
facial attractiveness and sexual selection: the role of13）Saegusa, C. & Watanabe, K. Judgments of Facial

symmetry and averageness. J. Comp. Psychol. 108, 233-

Attractiveness as a Combination of Facial Parts

242 (1994).

Information Over Time : Social and Aesthetic Factors. J.

6） Langlois, J. H. & Roggman, L. A. Attractive faces are

Exp. Psychol. Hum. Percept. Perform. 42, 173 -179 (2016).

only average. Psychol. Sci. 1, 115 -121 (1990).

− 171 −

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定
秋田県立大学システム科学技術学部機械知能システム学科

佐藤和人

This paper presents a framework of tempos and rhythms to clarify the relevance between psychological states and facial
expressions, particularly addressing repetitive operations of intentional facial expressions after giving a stress stimulus. By
acquiring image datasets of facial expressions under the states of pleasant–unpleasant stimulus for 20 subjects, we extracted
expressive tempos for respective subjects. Consequently, averages of extraction rates show that the pleasant state was 81.1%.
The unpleasant state was 77.8%. Regarding effects of pleasant–unpleasant stimulus on the expressive tempos, particularly
addressing the variation of the number of frames constituting one tempo, the variation in unpleasant stimulus became greaterthan that in the pleasant stimulus. The results show that the analysis using expressive tempos and rhythms is valid as anindicator for estimating the psychological state.

1．緒

一方，人間は動いているもの，音を発しているものなど

言

身の回りのもの全てにリズムを感じることができる．また，魅力的な笑顔は人を惹きつけ，相手の心を和ませる幸福

人間は会話や生活のリズムというように日常生活を営むのシンボルであり，コミュニケーションの潤滑剤として有上で何らかのリズムを感じており 5, 6），これらのリズムは効である．魅力的な笑顔が有する幾何学的特徴を分析した

パーソナルテンポに基づいている．パーソナルテンポとは，

研究 1）によると，男女共に最も魅力的に感じる笑顔の部位

個人固有の生体リズムのことであり，特に制約のない自由

は目，次いで魅力ある部位は口の順で，目尻や口元など目な行動場面で自然に表出される個人固有の速さを表す．会と口に付随する部位も笑顔の魅力要因として大きいことが話における表情の表出は日常的な生活行動の一つであるこ

報告されており，魅力的な笑顔には目と口を構成要素とすとから，パーソナルテンポに基づく固有なリズムが存在する表情矩形のアスペクト比に黄金比が認められている．まると考えられる．

た，顔パーツから形成される印象と顔の全体印象との関連

我々は，これまでに表情と心理状態との関連性を明らか

2）

性について調べた山田らは ，目は他者の印象を形成するにするために，表情空間チャートという枠組みを用いて，際に大変重要な役割を果たしており，各パーツから形成さストレスと表情表出の関係性を検証した結果，ストレスのれる印象を加算結合することにより全体印象をある程度説

蓄積程度の違いが表情の種別や表出プロセスに影響するこ明可能であるとしているものの，どのパーツからの情報をとを明らかにした 7, 8）．また，ストレス刺激後の意図的表

相対的に重視しているかについては個人差が存在する可能情を繰り返し表出するプロセスに着目した表出テンポと性を示唆している．笑顔の表出に着目して男女別の視点でリズムという枠組みを提案した 9）．表出テンポとリズムは，

捉えると，女性は男性よりも良く笑顔を表出する規則があ

表情の表出程度をラベル化した時系列変化 6）において，無ると言われており 3），男性に比べて笑顔であることが自然表情から表情表出を経て無表情に戻る区間を 1 テンポ，テ

で笑顔を創ることに長けている．特に，女性はポジティブ

ンポを複数回繰り返したものを 1 リズムと位置付け，快刺

情動表出の調整に優れており，自然な表出と変わらず，受激時に比べて不快刺激時の方が，「喜び」表情の 1 テンポをけ手にポジティブな影響をもたらすことができる．しかし構成するフレーム数のばらつきが大きいことを示した．更ながら，意図的に表情表出を創り出す場合，自然な表情表に，ベイジアンネットワーク（Bayesian Networks：BNs）
を用

出とは異なる表情筋が動くと言われており 4），表出過程にいて，心理的ストレスの蓄積程度と表情表出の相互関係を焦点を当てると，笑顔を創り出す顔パーツの変形程度や動グラフィカルに表現したストレスモデルを構築し，心理的作するタイミングが微妙に異なることが予想される．

ストレスの影響が現れ易い表情が「喜び」と「悲しみ」
表情であることを明らかにすると共に，表情の種別によって現れ

Measurement of Cosmetic Effect andVisualization of Impression Space by
Rhythm of Smile Expression
Kazuhito Sato
Department of Machine Intelligence andSystems Engineering Faculty of Systems
Science and Technology Akita Prefectural
University

易い顔部位（目元や口元など）が異なる可能性を示した 10-12）．
本研究では，情動喚起ビデオによる快・不快刺激後の「喜び」表情の表出過程に着目し，顔部位が刻む表出リズムを
相互情報量の観点から定量的に解析することにより，人間の心理状態に起因する表情表出時の複雑性や曖昧性を客観的に表現することを試みる．さらに，接客支援ツール（Smile− 172 −

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定

Learning）の試作開発を通して，化粧効果と他者に与える印象変化の相関関係について，受け手の視線誘導効果の定量的解析を基に検証する．

2. 1. 表出強度の時系列変化の取得
前処理として，時系列表情画像に対して輝度値の正規化を行い，照明条件などによる濃淡値の影響を軽減する．また，ヒストグラムの平滑化によって，画像の明瞭化とコン

2．実験方法

トラストの調整を行う．さらに，特徴表現法として Gabor顔という対象の形状が人物それぞれで異なるように，表Wavelets 特徴の方位選択性により，目，眉，口，鼻とい

情表出の仕方，例えばある感情をどの程度の大きさの顔面った表情のダイナミクスを特徴づける顔パーツを強調する．

変形として表情に表出するかについては個人差がある．こGabor Wavelets 変換した時系列表情画像に粗視化処理をのため，赤松は，個々人の表情表出の特性に応じて修正して行うことで，情報量の圧縮と顔画像を撮影する際に発生すいく適応的な学習メカニズムが必要と述べている 13）．した

る微少な位置ずれの影響を緩和する．

がって，本研究では，被験者が意図的に表出した表情を対次に，表出強度の時系列変化を取得する手順の詳細を図象として，時間軸方向への圧縮による正規化と表情表出に2 に示す．はじめに，粗視化処理を施した時系列表情画像

おける位相変化を抽出するために SOMs（Self Organizingの輝度値情報を SOMs により学習し，表情の位相変化が類Maps）を用いて表情パターンの分類を行う．さらに，似する顔画像ごとに 15 個の写像ユニットに分類する．次SOMs により分類した表情画像を，安定性と可塑性を併せに，これら 15 個の写像ユニットの中でも類似したユニッ

持った適応的学習アルゴリズムである Fuzzy ART を用い

トを Fuzzy ART で同一のカテゴリに統合する．さらに，て再分類する．SOMs は，予め決められた写像空間の中で

Fuzzy ART によって統合されたカテゴリを無表情（真顔）

相対的にカテゴリ分類を行うが，Fuzzy ART は，ビジラから最大表出まで並べ替えることで，表情の表出程度を定ンスパラメータで制御された一定の粒度のもとでカテゴ

量的にラベル化した表出強度を取得する．最後に，時系列

リ分類を行うため，長期間に及ぶ時系列データに対しても，表情画像の各フレームと表出強度の対応付けを行い，表出同じ基準で分類することができる．提案手法の処理手順を

強度の時系列変化を生成する．図 2 は，「顔全体」を対象領

図 1 に示す．以下では，表出強度の時系列変化の抽出，相域とした場合を示しており，眉や目を含む「顔上部」と口元

互情報量による表情表出リズムの定量化について個別に説などの「顔下部」についても同様の手続きで表出強度の時系

明する．

列変化を求める．

Fig. 1

Overview of the procedures used for our proposed method.

− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

2. 2. 相互情報量による表情表出リズムの定量化
相互情報量とすると，各関心領域の相互情報量は以下のように求めら

14, 15）は，信号間の変化の同期性や絡み合いを表現可能であり，2 つの時系列データ間の線形・非線形依存度を表す量として捉えることができる．2 つの信号間の情報の流れや動力学的なカップルリングを表しており，観測対象の 2 つのシステムが完全に異なる独立なものであれれる．
・顔全体と顔上部の相互情報量
I（Rw；Ru）：
I（Rw；Ru）= H（Rw）+ H（Ru）- H（Rw , Ru）

ば，この 2 つの信号間の相互情報量はゼロになる．これをI（Rw；Rd）：

表情表出過程に適用すると，各顔部位間の同期性や機能的I（Rw；Rd）= H（Rw）+ H（Rd）- H（Rw , Rd）

な連結度を数値化することができる．2. 1. で求めた「顔全（2）

・顔上部と顔下部の相互情報量

体」「顔上部」「顔下部」における表出強度の時系列変化のI（Ru；Rd）：

1 例を図 3 に示す．本研究では，表情表出過程における顔I（Ru；Rd）= H（Ru）+ H（Rd）- H（Ru , Rd）

部位間の相互情報量として，次に示す 3 つの関心領域を対（1）・顔全体と顔下部の相互情報量（3）

ここで H（Rw），
H（Ru），
H（Rd）はそれぞれ Rw（t），Ru（t），
Rd（t）のエントロピー，H（Rw, Ru），H（Rw, Rd），H（Ru,

象に算出する．
表情表出過程における顔全体，顔上部，及び顔下部の表Rd）はは両者の結合エントロピーである．なお，導出手順の詳細は割愛する．

出強度の時系列変化をそれぞれ，
Rw=Rw（t），Ru=R（t），Rd=R（t）
udFig. 2

Fig. 3

Procedure details for acquiring a time-series variation of ELs.

Each mutual information among time-series changes of facial parts.

− 174 −

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定を図4に示す．女性被験者5名を対象に図4の（a）に快刺激時，

3．実験データセット

図 4 の（b）に不快刺激時の算出結果を示している．女性被本研究では，長期間に渡る表情変化を扱うために，独験者の全体的な傾向として，「領域 1：顔全体と顔上部」「領

自のデータセットを構築した．1 回の実験は，平常時の域 2：顔全体と顔下部」「領域 3：顔上部と顔下部」の順に

step1，快ビデオ視聴時の step2 および不快ビデオ視聴時

相互情報量の値が減少する被験者（K, O, L, P）と「領域 2：の step3 で構成される．快・不快状態を引起す情動喚起ビ

顔全体と顔下部」の値が他の値に比べて突出して大きい被デオを視聴するタスクを被験者に与え，一過性のストレス験者 M が存在する．被験者 K, M, O は，快刺激及び不快刺状態を測定するために唾液アミラーゼ試験によるストレス

激によって各相互情報量の傾向に大きな変化は見られな測定を行った．また，情動喚起ビデオは，視聴時間が約 3い．一方，被験者 L と P は，快刺激と不快刺激で各相互情分の快ビデオ（3 種類の漫才映像）と不快ビデオ（2 種類の残報量の傾向に特異的な変化が見られる．特に，被験者 L は

酷映像とインプラント手術映像）を用意し，視聴した際のその傾向が顕著で，快刺激時では「領域 1：顔全体と顔上部」

主観評価（5 段階評価）も実施した．なお，全ての被験者に「領域 2：顔全体と顔下部」「領域 3：顔上部と顔下部」の順

対して，研究倫理規定に基づき事前に実験内容を十分説明に相互情報量の値が減少するが，不快刺激時では「領域 2：

し，被験者の自由意志により書面により実験参加の同意を

顔全体と顔下部」が大きな値を示す．被験者 P は，不快刺得た．さらに，特定の被験者からは，実験参加の同意と併激時で「領域 1：顔全体と顔上部」「領域 2：顔全体と顔下部」

せて顔画像掲載の許諾に関する同意も得ている．

「領域 3：顔上部と顔下部」の順に相互情報量の値が減少す

基本 6 表情の中で，自発的に最も表出しやすいと考えらるが，快刺激時では「領域 1：顔全体と顔上部」の値が減少

れる「喜び」の表情に注目し，快状態時の
「喜び」
，不快刺激

し相互情報量の順序関係が被験者 L と逆転する傾向を示す．

状態時の「喜び」を対象として，20 名の被験者に対して表

次に，快刺激及び不快刺激共に同じ傾向ではあるが，各情画像を取得した．各被験者は事前に選定した情動喚起

顔領域における相互情報量の順序性が大きく異なる被験者

ビデオを視聴した直後に表情表出を行った．被験者の内KとMを比較する．被験者Kは，快刺激及び不快刺激共に「領

訳は，男子大学生 10 名（J ＝ 20 歳，B, G, H, I ＝ 21 歳，A,

域 1：顔全体と顔上部」の値が「領域 2：顔全体と顔下部」にE, F= 22 歳，C, D= 23 歳），女子大学生 10 名（K, M, O, P

比べて大きく，「領域 3：顔上部と顔下部」の値も被験者 M＝ 20 歳，L, Q, R, S, T ＝ 21 歳，N=23 歳）である．撮影期に比べて大きい．一方，被験者 M は，快刺激及び不快刺間は全ての被験者において 3 週間（1 週間間隔）とした．撮

激共に「領域2：顔全体と顔下部」の値が突出して大きく，「領

影環境は，室内の一角にカーテンで仕切られた表情撮影用

域 1：顔全体と顔上部」と「領域 3：顔上部と顔下部」の値がスペースにおいて，被験者の頭部がフレーム中に含まれる

被験者 K に比べて極めて小さい．被験者 K と M の快刺激状態で正面顔画像を撮影した．あらかじめ被験者には，頭時における「喜び」表情の時系列変化を表したサムネイル画

部をあまり動かさないで表情を表出するように指示して撮像を図 5 に示す．図 5 の（a）が被験者 K，図 5 の（b）が被験影したため，一定の範囲内に顔領域が収まっているが，微者 M である．図 5 の各上部には，「喜び」表情を表出した

少な変動に対しては，テンプレートを画像上で移動させな際の特徴的な区間を拡大表示している．図 4 の各相互情報

がら表情画像と比較し，次いで画像間の差分情報を利用す量の算出結果と図 5 の拡大表示したサムネイル画像を比べることによる，テンプレートマッチングによって補正した．

ると，被験者 K は顔上部の眉や目元，及び顔下部の口元に被験者には 20 秒間を目安に自分のタイミングで表情表出「喜び」表情の変化が確認できるが，被験者 M は顔上部のを 3 回繰り返し，3 回表出し終えたら無表情を継続するよ

眉や目元には表情変化が全く認められず，顔下部での口元う指示した．カメラのサンプリングレートは毎秒 10 フレの口角のみ大きく変化している．被験者 K は，表情表出時

ームに設定し，1 セット 200 フレームの画像列から構成さの顔上部と顔下部が共に同期して変化しており，実験者のれるよう設定した．

主観的印象ではあるが，より自然な表情表出に見える．一方，被験者 M は，顔下部の口角のみ変化しており，不自4．結果および考察

然な「喜び」表情に見えると共に違和感が残る．

はじめに，各顔領域が刻む表出強度の時系列変化における相互情報量の算出結果を基に男女別の傾向を分析する．
次に，快・不快刺激が表情の表出リズムに与える影響を相
互情報量の観点から考察する．

4. 2. 男性被験者の分析
男性被験者 5 名の各顔領域が刻む時系列変化の相互情報量を算出した結果を図 6 に示す．図 6 の（a）に快刺激時，
図 6 の（b）に不快刺激時の算出結果を示している．男性被4. 1. 女性被験者の分析

験者の全体的な傾向として，「領域 1：顔全体と顔上部」「領

各顔領域が刻む時系列変化の相互情報量を算出した結果

域 2：顔全体と顔下部」「領域 3：顔上部と顔下部」の順に− 175 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

相互情報量の値が減少する被験者 D 及び F と，
「領域 2：て小さい．被験者 D と J の快刺激時における「喜び」表情の顔全体と顔下部」の値が他の値に比べて突出して大きい被時系列変化を表したサムネイル画像を図7に示す．図7の（a）験者 C，G 及び J が存在する．被験者 C，D，F，G 及び J 共に，が被験者 J，図 7 の（b）が被験者 D である．図 7 の各上部に快刺激及び不快刺激によって各顔領域が刻む時系列変化のは，女性被験者と同様に「喜び」表情を表出した際の特徴的

相互情報量の順序関係に変化は見られない．

な区間を拡大表示している．図 6 の各相互情報量の算出結

次に，女性被験者と同様に，各顔領域における相互情報

果と図 7 の拡大表示したサムネイル画像を比べると，被験量の順序性が大きく異なる被験者 D と J を比較する．被験者 D は顔上部の眉や目元，及び顔下部の口元に「喜び」
表情

者 D は，快刺激及び不快刺激共に「領域 1：顔全体と顔上部」の変化が確認できるが，被験者 J は顔上部の眉や目元にはの値が「領域 2：顔全体と顔下部」に比べて大きく，「領域

表情変化が全く認められず，顔下部での口元の口角のみ大3：顔上部と顔下部」の値も被験者 J に比べて大きい．一方，

きく変化している．被験者 D は，表情表出時の顔上部と顔被験者 J は，快刺激及び不快刺激共に「領域 2：顔全体と顔下部が共に同期して変化しており，より自然な表情表出に下部」の値が突出して大きく，「領域 1：顔全体と顔上部」

見える．一方，被験者 J は，顔下部の口角のみ変化しており，と「領域 3：顔上部と顔下部」の値が被験者 D に比べて極め不自然な「喜び」表情に見えると共に違和感が残る．これら（a）Pleasant stimulus with emotion-evoking videos
Fig. 4（b）Unpleasant stimulus with emotion-evoking videos

Mutual information results among each facial part for female.

（a）Subject K
Fig. 5（b）Subject M

Time-series changes of smile facial expression with pleasant stimulus for specified subjects of female.

− 176 −

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定の結果は，女性被験者と共通の傾向を示しており，各顔領

悲しい時に泣くのをこらえるなど，ある情動を経験した時

域が刻む時系列変化の相互情報量から表情表出時の印象をに表情による情動表出を抑制することである．表出抑制が定量化する新たな指標として期待できる．

社会的サポートや他者との親密さ，社会的満足感の低下と関係していることが示唆されている 17）．更に，女性は男

4. 3. 快・不快刺激が相互情報量に及ぼす影響性に比べて笑顔を創ることに長け，かつポジティブな情動

表情表出における不一致表出とは，悲しい時にも笑顔を見せるなど，ある情動を経験した時，それとは一致しない

表出の調整に優れ，受け手に対して自然な表出と変わらない影響を与えるとされている 3）．

情動を表出することを意味する．これまでの先行研究では，

快ビデオ視聴後に「喜び」表情を表出する場合は一致表出

ネガティブ情動経験中にポジティブ情動を表出することは，であり，不快ビデオ視聴後に「喜び」表情を表出する場合は表出者の交感神経活動の増幅 35）や，主観的情動経験の増大，不一致表出に相当する．相互情報量の順序性が大きく異な16）を招くことが明らかにされておる女性被験者 K と M の表情表出リズムを図 8 に示す．4. 1.

り，表出者に認知的負荷がかかり易く精神的健康に悪い影の印象分析では，被験者 K の笑顔は自然な印象を与える

響を与えかねない．また，表情表出における表出抑制とは，のに対して，被験者 M の笑顔には不自然さが感じられた．

情動経験時の記憶低下（a）Pleasant stimulus with emotion-evoking videos
Fig. 6（b）Unpleasant stimulus with emotion-evoking videos

Mutual information results among each facial part for male.

（a）Subject D
Fig. 7（b）Subject J

Time-series changes of smile facial expression with pleasant stimulus for specified subjects of male.

− 177 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

各顔部位が刻む表出リズムに着目すると，被験者 K の表出る顔上部（眉や目元）と顔下部（口元）の程度や同期を示すタ

リズムは，顔部位間で協調が取れた時系列変化を示していイミング構造を定量化した値と解釈できる．4. 1. 及び 4. 2.

る．一方，被験者 M の表出リズムは，顔上部と顔下部のの分析結果を総合的に捉えると，領域 1 と領域 2 の相互情

時系列変化がバラバラで協調的な動きが認められない．各

報量の大小関係に着目することで「目は口ほどに物を言う」

顔領域の相互情報量（領域 1，領域 2，領域 3）は，顔部位という言葉の定量的解釈の可能性が覗える．また，顔上部が刻む表情表出リズムにおける信号波形の類似性や同期のと顔下部のタイミング構造を定量化した領域 3 の値を中心程度を表現しており，顔全体から受ける印象形成に寄与すに，領域 1 と領域 2 の値の大小関係や順序関係に着目する（a）Subject K

Fig. 8（b）Subject M
Comparison of time-series changes of ELs with unpleasant stimulus.

− 178 −

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定

ことは，表情表出時の自然さや不自然さの程度を定量化す粧後）の 6 種類である．その後，前方正面の大型液晶ディる指標として有効と考える．更に，男性被験者に比べて，スプレイに 6 種類の接客映像を再生しながら，頭部視線追女性被験者は，意図的に「喜び」
表情を創ることが容易で，跡装置（FaceLab）を用いて，化粧前後における受け手の視かつ不一致表出の影響を受け難いものと推察する．

線変化を計測した．

4. 4. 化粧による視線誘導効果

化粧前から各化粧工程後の接客動画に対する受け手の視線

図 9 に視線誘導効果の 1 例を示す．図 9 の（a）～（f）は，試作した接客支援ツール（Smile Learning）の印象空間を誘導効果をヒートマップの形式で表現した結果である．図

通して，化粧前後（ベースメイク，アイメイク，アイブロ

中，赤い部分は視線が集中した領域，青い部分は視線集中

ー，リップメイク，チーク）における受け手の視線変化をが疎の領域を表している．なお，各接客動画の先頭フレー

定量的に解析する．検証実験では，8 大接客用語の中からムの静止画上にヒートマップを重畳して結果表示している．

「①いらっしゃいませ」「②ありがとうございます」「③か

図 9 の全体的な傾向として定性的ではあるが，化粧前（9しこまりました」を選択し，①から③の順番に繰り返したの（a））に比べて，各化粧工程後の視線の分布が広がる傾向

接客の様子
（上半身）
を動画撮影する．具体的には，「真顔」が見られる．また，視線の集中度を表す赤い領域も，リッで「接客用語」を発話し，「1 礼」した後，「笑顔」を表出する

プメイク後（9 の（e））やチーク後（9 の（f））のように，少しというプロセスを 3 種類の接客用語で繰り返すよう指示し拡大する傾向が確認できる．これらの結果は，接客時におた．撮影した動画は，化粧前，ベースメイク後，アイメイ

ける化粧の有効性を支持するものと推察できる．

ク後，アイブロー後，リップメイク後，及びチーク後（化（a）化粧前（b）ベースメイク後（c）アイメイク後（d）アイブロー後（e）リップメイク後（f）チーク後（化粧後）Fig. 9Heat maps of eye-gaze movements each cosmetic process.

− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

5．総響リズム支援による会話支援システム ,” 情報処理学会第括

71 回全国大会 ,pp.4-227 ～ 4-228, Mar. 2009.

本研究では，被験者 20 名（男女各 10 名）に対して，平常

6） 大石周平 , 尾田政臣 , “話者間の精神テンポの差がコミ状態，快・不快刺激を与えた状態の表情画像データセットュニケーションの円滑化に及ぼす影響 ,” 電子情報通信学を取得した．また，情動喚起ビデオによる快・不快刺激後会技術研究報告 , pp.31-36, 2005.

の「喜び」表情の表出過程に着目し，顔部位が刻む表出リ

7） 間所洋和 , 佐藤和人 , 門脇さくら , “表情の時系列変化

ズムを相互情報量の観点から定量的に解析することによを可視化する表情空間チャート ,” 知能と情報 ( 日本知能

り，人間の心理状態に起因する表情表出時の複雑性や曖昧

情報ファジィ学会誌 )，vol.23, No.2,pp.157-169, 2011.

性を客観的に表現することを試みた．評価実験では，被験8） H. Madokoro and K. Sato, “Facial Expression Spatial者 10 名（男女各 5 名）を対象に，各顔領域（顔全体，顔上部，

Charts for Representing of Dynamic Diversity of Facial

顔下部）が刻む時系列変化の相互情報量を求め分析した結Expressions,” ' Journal of Multimedia, Vol. 6, No. 1, pp.
1-12, Jan. 2007.

果，以下の点が明らかとなった．
・各顔領域が刻む表出リズムにおける相互情報量の大小関

9） 佐藤和人 , 間所洋和 , 門脇さくら ,” 一過性のストレス刺激が意図的な表情に及ぼす影響” , 第 11 回情報科学技術係や順序関係から表情の印象を推定可能
・表出リズムの相互情報量は表情表出時の自然さや不自然フォーラム , RJ-005, pp.29-36, 2012.
10）佐藤和人 , 間所洋和 , 門脇さくら ,” 意図的な表情表出にさの程度を測る指標として有効
・女性被験者は，男性被験者に比べて意図的に「喜び」表情を創ることが容易で，かつ不一致表出の影響を受け難い

及ぼす心理的ストレス要因の分析” , 第 12 回情報科学技
術フォーラム , RJ-002, pp.21-28, 2013.

更に，Smile Learning の印象空間を通して，化粧前後に11）K. Sato, H. Otsu, H. Madokoro and S. Kadowaki,

おける受け手の視線変化を解析した結果，接客時における"Analysis of Psychological Stress Factors and Facial

化粧の有効性を支持する視線誘導効果を確認した．

Parts Effect on Intentional Facial Expressions,"

今後は，印象形成に及ぼす顔部位における表出テンポのProceedings of The Third International Conference

ゆらぎを定量化し，そのタイミング構造を解析することにon Ambient Computing, Applications, Services andより，自然な表情と意図的な表情の発現パスの違いを明らTechnologies, pp.7-16, Oct. 2013.

かにすると共に，意思疎通の可視化へ挑戦する予定である．

12）K. Sato, H. Otsu, H. Madokoro and S. Kadowaki,"Analysis of Psychological Stress Factors by Using謝辞Bayesian Network," Proceedings of 2 0 1 3 IEEE

本研究は，平成 25 年度コスメトロジー研究振興財団の助成を受けて行われたものである．実験データの取得に際International Conference on Mechatronics andAutomation, pp.811-818, Aug. 2013.

し，被験者として長期に渡り表情画像の撮影に協力して頂

13）赤松茂 , “人間とコンピュータによる顔表情の認識 [I] -きました本学の 20 名の学生諸氏に深く感謝申し上げます．

コミュニケーションにおける表情とコンピュータによるその自動解析 -,” 信学誌 , Vol.85, No.9, pp.680-685, Sep（引用文献）

2002.

1） 井口竹喜 , “魅力的な笑顔に表れる幾何学的特徴 : 感性14）池田徹志 , 石黒浩 , 浅田稔，“相互情報量最大化に基づ× 技術 = カンセイウエアの魅力づくり“, 電子情報通信学

く信号情報源の移動軌跡の推定 “，電子情報通信学会論

会技術研究報告 . SIS, スマートインフォメディアシステ

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15）菊池登志子，岸浩一郎，宮道壽一，” 相互情報量により

ム , pp. 51-56, 2007.
2） 山田 貴恵 , 笹山 郁生 , “ 顔のパーツから形成される印

学習パラメータを調整した効率的データ自動分割アルゴ

象と顔全体から形成される印象との関連 “, 性の検討 . 福リズム”，電子情報通信学会誌 D，Vol. J82-D- Ⅱ , No. 4,

岡教育大学紀要 , vol. 48, no. 4, 229-239, 1999.

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3） L. E l li s , “ G ender d ifferen c es in smilin g: A n16）W. Sato, M. Noguchi, and S. Yoshikawa, “Emotion

evolutionary neuroandrogenic theory,” Physiology andelicitation effect of films in a Japanese sample,” Social

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4） K. M. Prkachin, “Effects of deliberate control on17）S. Srivastava, M. Tamir, K. M. McGonigal, O. P. John,

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Personality and Social Psychology, Vol. 96, pp.883-897, 2009.

− 180 −

睡眠誘導効果をもつ（−）−酢酸ボルニルの睡眠促進効果
ならびに肌質改善効果
1

九州大学農学研究院 、近畿大学産業理工学部

清水

邦 義 1、松 本

清 1、大 貫2

宏一朗 2

This study aimed to investigate whether (-)-bornyl acetate promoted sleep and had any concomitant effects on skincondition. Healthy women over 50 years of age participated in our experiment for 2 weeks. Each of them inhaled water mist
with/without (-)-bornyl acetate every night for 1 h after they went to bed. They maintained logs of sleep time and wake time,measured their skin's moisture level, and constantly wore a triaxial accelerometer to record daily physical activity. They
filled out questionnaires regarding sleep quality and skin condition on the first and last day of the experiment. The results
showed that subjects in the group inhaling water mist with (-)-bornyl acetate went to bed about 20 min earlier and showed
an increase in sleep duration for 2 weeks. In addition, the subjective measures of oil and moisture content of the facial skin
improved. These findings suggest that (-)-bornyl acetate affected the temporal characteristics of sleep and improved thesubjective assessments of oil and moisture content of the skin. Moreover, we observed that skin moisture of eye area wasrelated to sleep length.

1．緒

る “グリシン” に着目し、若年女性を対象にグリシン食品の言

就寝直前の摂取による睡眠の質と肌質への効果を検討して社会生活の夜型化・24 時間化が進行した現代社会においる。その結果、睡眠の質の向上、成長ホルモン分泌量のいて、睡眠障害による経済的な損失は年間 3 兆円を超える

増加、皮膚バリア機能改善および敏感肌改善が認められたと試算されている。不眠症の治療では、睡眠時の緊張や不ことを報告している。

安を取り除き寝つきをよくするために、睡眠導入剤が用い以上のことから、肌質の改善・向上までも視野に入れ、られているが、一定の効果は期待できるものの副作用の問

香りによって睡眠覚醒リズムに働きかけ、睡眠の質の向上

題があるため、そのような薬剤に頼らない方法の検討が進を図る方法を探索することは、十分に検討の余地があり、められている。アロマテラピーのように天然由来の香りをそれが特定されれば香りの新しい機能性を見いだすことと用いた睡眠サポートもそのひとつである。例えば、ラベンなり、実用的にも学術的にも価値のある知見となる。

ダーの香りには睡眠の質を改善する効果がある

1, 2）

一方、
（－）- 酢酸ボルニルは、マツやモミなどのマツ科。

睡眠不足による肌機能の低下に注目した Kahan ら

3, 4）

は、

樹木の針葉から採る精油に多く含まれる成分のひとつであ人や動物を対象とした睡眠不足や睡眠遮断と肌機能との関り、松葉の爽やかな香りを有し、“森の香り” とも呼ばれる連を調査した研究例をレビューし、睡眠不足による睡眠覚成分である。爽やかな印象を持つ香料であることから、ウ醒リズムの不調は肌質の低下をもたらすと結論づけていッディな香りの商品（例えば、石鹸、入浴剤、ルームフレ

る。これに対し国内では、山崎ら 5）が魚介類に多く含まれグランスなど）を作る際などによく使用され、特に男性化
粧品に使われることが多い。吸引することによって作業効率低下の抑制効果や作業後の覚醒状態の低下効果（θ 波増強）および自律神経の緊張緩和効果が認められており 6-9）、
効果的な睡眠を促進する可能性がある。
肌質を健やかな状態に導くためには、肌質改善効果のあるとされる食品成分や天然素材からの抽出成分を、経口または経皮によって摂取することが有効な方法として、数多くの研究がなされている。しかし、肌質は睡眠とも関わり

図 1-1

が深く 4）、肌質の改善や維持に対して睡眠という行動的側

睡眠不足と肌質低下の関係面からサポートすることも重要であると考えられる。
*

そこで本研究では、人を対象に日常生活における睡眠時
Sleep promotion and skin condition-Bornyl acetate
improvement using（-）
Kuniyoshi Shimizu* 1 , Sayaka Matsumoto1,
Koichiro Ohnuki 2
Faculty of Agriculture, Kyushu University1 ,Facultyof Humanity-Oriented Science
Engineering, Kinki University2に（－）- 酢酸ボルニルを提示した時の睡眠の質の評価を行うことによって、（－）- 酢酸ボルニルが人の睡眠覚醒リズ
ムにどのような影響をあたえるのかを明らかにする。また、一定期間（－）- 酢酸ボルニルの吸引を実施し、その前後の肌質を評価することによって、（－）- 酢酸ボルニルの肌質− 181 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

アロマディフューザーに入れる溶液は、香りあり群には
超純水 100mL に対し（－）- 酢酸ボルニル 10μL を添加したものとし、香りなし群には超純水 100mL のみとした。溶液は、1 回分の分量をスクリュー管に封入したものを実験
日数分用意し、1 回ごとに溶液の交換を行うこととした。
アロマディフューザーは、枕元の頭から半径 50cm 程度
離れたところに配置した。香りの吸引は、タイマー機能を利用して就床開始 1 時間として、実験 2 日目から 14 日目まで実施した。
どちらの群にも、「香りはごく薄い濃度に調節している
ため、香りを感じない場合もありますが、気にせずに実験を行ってください」と教示した。
図 1- 2期待される就床時の香り吸引による効果

2. 3. 測定項目の改善効果についても検討する。さらに、睡眠覚醒リズム
や肌質向上に対して、より効果的な（－）- 酢酸ボルニルの提示方法を特定する。

睡眠の質および肌質の評価には、それぞれ客観的な評価と主観による評価を用いた。
睡眠の質の客観的な評価には、実験期間中の就床および2．実

起床の時刻と身体活動量を用いた。就床および起床の時

験

刻は、睡眠および睡眠以外の時間（活動時間）の時間的な本研究は、九州大学農学研究院の倫理委員会の承認を得

側面の評価が可能である。身体活動量（METS）は、被験者て実施された。実験は、被験者が日常生活の中で就床時にが実験期間中に活動量計（オムロン 活動量計 HJA-3501T（－）- 酢酸ボルニルを吸引することを 2 週間続ける必要があ

Active style Pro）を腹側のウエストの位置に装着して計測るためモニター調査方式とし、被験者募集時に実験内容をした。就床中や日中の身体活動の程度から睡眠の質を評価

伝え、被験者の書面による同意を得た後に開始された。実することができる。睡眠および活動時間の時間的側面、身験に用いる道具や質問紙の一式が被験者の自宅に送付され、体活動量は、実験期間中の変動を検討した。

被験者は日常生活の中で実験を 2 週間行い、実験終了後に睡眠の質の主観による評価には、質問紙の PSQI（ピッ10-12）
ツバーグ睡眠質問票）と OSA-MA（OSA 睡眠感調査

使用した道具と質問紙の一式は回収された。

票 MA 版）13, 14）を用いた。PSQI は直前の 2 週間の睡眠を振2. 1. 被験者

り返って回答してもらうものであった。また、睡眠の質に

本研究では、（－）- 酢酸ボルニル吸引による睡眠への効関する内省と日中の身体活動に関する内省との関連を検討

果に加えて肌質への波及効果を検討するため、被験者にはするために、日中に身体をどの程度動かしたと思うか（運

肌質に対する関心度の観点から女性を対象とした。また、動感）の質問を追加した。OSA-MA は起床時にその夜の睡女性の肌質には月経周期が深く関与することからその影響眠についての内省を回答してもらうものであった。いずれを取り除くために、閉経を迎えていることが予想されるも実験の開始日と終了日に回答してもらい、睡眠に関して

50 歳以上を対象として募集を行い、26 名が実験に参加しの主観評価の実験前後の変化を検討した。

た。就床時に香りを吸引する群（香りあり群）と香りを吸引

肌質の客観的な評価には、肌水分計（スカラ モイスチ

しないプラセボ群（香りなし群）の 2 群を設定し、13 名ずャーチェッカー MY-808S）を用いた。測定方法は簡易で、つランダムに割り当てた。26 名中 3 名が 50 歳未満であっセンサーを肌に水平に押し当てて数秒待つと表示部に測定たため以降の分析から除外し、香りあり群は 11 名（50 ～部位の水分率（%）が表示される。肌の乾燥の程度を意識し71 歳 , M= 57.8 歳 , SD= 6.3 歳）、香りなし群は 12 名（50 ～やすい目尻（右目）と衣服に覆われていることが多い前腕内72 歳 , M= 57.4 歳 , SD= 6.3 歳）であった。

側（左腕の肘から 3 cm の位置）の 2 ヶ所についてそれぞれ
3 回ずつ、毎晩就床前と毎朝起床後に測定することとした。

2. 2. 就床時の香りの吸引

肌水分は、睡眠の時間的側面や身体活動量と同様に、実験（－）- 酢酸ボルニルの香り試料には、シグマアルドリッ

期間中の変動を検討した。

チ B55203 95%（Aldrich）を用いた。就床時の香りの吸引

肌質に関する質問紙は、実験開始日の夜とその翌朝、実には、アロマディフューザー（良品計画 超音波アロマデ

験終了日の夜と翌朝の計 4 回、肌水分の計測と合わせて実ィフューザー 11SS）を使用した。

施することとした。顔（全体）、目尻、前腕内側の 3 ヶ所に− 182 −

睡眠誘導効果をもつ（−）− 酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果

ついて、水分、油分、弾力の程度を自身の感覚に基づいてた。1 週間ごとの平均就床持続時間は、香りなし群では第それぞれ回答してもらうものであった。選択肢は「ない（-2

1 週 388.23±15.75 分、第 2 週 383.82±20.37 分、香りあり

点）」、「やや少ない（-1 点）」、「適度（0 点）」、「やや多い（1

群の第 1 週 383.27±27.84 分、第 2 週 405.03±29.89 分であ点）」、「非常に多い（2 点）」の 5 つとして採点し、睡眠の質った。分散分析を行ったところ、週 × 群の交互作用の差の主観評価と同様に、肌質の主観評価の実験前後の変化をに有意傾向が得られた（F（1, 21）= 4.09，p = 0.055）
。起床持

検討した。

続時間については、同様の分析の結果、週 × 群の交互作

3．結用に有意差が得られ（F（1, 21）= 6.46, p = 0.018）、香りなし

果

群には第 1 週（1049.94±16.04 分）と第 2 週（1058.84±21.95

まず、睡眠の質について客観的指標の 2 週間の変動を検分）の間に起床持続時間の差はなかったのに対し、香りあ

討し、主観評価の実験前後の変化を検討した。次に肌質にり群は第 1 週（1057.16±27.45 分）に比べ第 2 週（1032.70±

ついて客観的指標の 2 週間の変動を検討し、主観評価の実

30.30 分）は起床持続時間が短くなっていたことが示され

験前後の変化を検討した。

た（p = 0.017）。

次に、2 週間連続して記録した項目は 1 週目と 2 週目の以上の分析の結果、時間に関する項目では、香りなし群

差を、睡眠の質や肌質に関する内省については実験前後には実験期間中にはいずれの測定項目においても変化は見ら記入した質問紙の合計点の差をとり、各項目の相関関係をれなかったが、香りあり群は就床時刻が早くなり就床持続検討した。

時間の延長傾向と起床持続時間の短縮が観察された。
3. 1. 2. 身体活動量

3. 1. 睡眠の質への影響

身体活動量は実験期間中の連続記録であったため、日々

3. 1. 1. 時間項目の就床時刻と起床時刻に基づいて、就床中（就床持続時間）

就床時刻の実験期間 2 週間の変動については、香りなしと日中（起床持続時間）に分けて検討した。どちらも個人に

群は実験期間中通して大きな変動はなかったのに対し、香よってまた日によって時刻や時間の長さが異なっていため、

りあり群は第 1 週に比べて第 2 週は就床時刻が早くなる傾

まず、全体を 6 等分した区間に分けて時間経過による変動

向が観察された。1 週間ごとの平均就床時刻を算出し、週の全体的な傾向を検討した後に、それぞれ特定の時間帯に（2 水準）× 群（2 水準）の分散分析を行ったところ、週 × 群

注目して検討した。

の交互作用に有意差が得られた（F（1, 21）= 4.92, p = 0.037）。

就床中の 6 区分は、就床直後の区分を就床 1 とし、順に下位検定の結果、香りなし群には第 1 週（23：45±0：18，

就床 2、3、4、5、起床直前の区分を就床 6 として各区分

M±SE）と第 2 週（23：49±0：20）の間に就床時刻の差はの平均活動量を算出し検討したところ、一晩の活動量は就なかったのに対し、香りあり群は第 1 週（24：12± 0：29）

床直後が高く、就床途中は低下し、起床直前にまた増加すに比べ第 2 週（23：53±0：30）は就床時刻が早くなっていることが示された。そこで、就床直後と起床直前のそれぞたことが示された（p = 0.019）。

れ 120 分間を 15 分ごとに区切り、各区間の合計活動量の起床時刻に関しては、両群ともに実験期間通して大きな変動を検討した。これらの分析では、就床持続時間が 240

変動はなく、1 週間ごとの平均起床時刻も、香りなし群で分未満の日のデータは除外したため、香りあり群の 1 名はは第 1 週 6：13±0：16、第 2 週 6：12±0：15、香りあり

データ欠損となった。

群では第 1 週 6：35±0：17、第 2 週 6：38±0：20 であった。

就床直後 120 分間では、香りなし群 / あり群とも第 1

就床時刻と同様の分散分析を行ったが、有意差は得られな

週 /2 週とも、就床後 0 ～ 15 分の活動量が顕著に高く（10かった。

METS 前後）、15 ～ 30 分で急速に低下し（4 METS 前後）、

次に、就床時刻から翌朝の起床時刻までの時間を就床

30 分以降はそのままの水準を保っていた。週（2 水準）×

持続時間とし、起床時刻からその日の就床時刻までを起時間経過（8 水準）× 群（2 水準）の分散分析を行ったとこ

床持続時間として、それぞれの時間の長さ（分）を検討しろ、時間経過の主効果に有意な差が認められた（F（7, 140）
= 47.03, p < 0.001）。下位検定の結果、就床後 0 ～ 15 分の活動量は 15 分以降 120 分までの 15 分ごとの活動量よりも高く（ ps < 0.001）、就床後 15 ～ 30 分の活動量は 30 分以降
105 分までの 15 分ごとの活動量よりも高かったことが示された（ps < 0.05 または ps < 0.01）。群の主効果にも有意な差が認められ（ F（1, 20）= 5.92, p = 0.024）、香りあり群の就床後 120 分間の活動量は香りなし群よりも高かったこと

図 3-1-1

就寝時刻の変動が示された。

− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 3-1-2-1

就床直後および起床直前の 15 分ごと身体活動量

起床直前の 120 分間では、香りなし群 / あり群とも第 1
週 /2 週とも、起床直前 120 ～ 75 分までの 15 分ごとの活動量は2.5 METS前後で、その後～起床直前15分までに徐々に増加し（5.3 METS 前後）、直前の 15 分間で 10 METS 前
後まで急増した。同様に分散分析を行ったところ、時間経
過の主効果のみに有意な差が認められ（F（7,140）= 34.64,
p < 0.001）、群間の差は得られなかった。
日中の 6 区分は、起床直後の区分を日中1とし、順に区分 2、
3、4、5、就床直前の区分を日中 6 として、各区分の平均活動量を算出した。全体的に、日中 1 と 2 の活動量が高く（1.6 METS 前後）、日中 3 から 5 にかけて徐々に減少し（1.4
METS 前後）、日中 6 ではさらに減少していた（0.9 METS前後）。また、一般的な社会活動の時間として 10 時から
18 時までに注目し、8 時間を 2 時間ごとに区切り、各区間の合計活動量の変動を検討した。香りなし群 / あり群とも第 1 週 /2 週とも、10− 12 時の活動量が 200 METS 前後

図 3-1-2-2

身体活動量による睡眠周期分析

図 3-1-2-3

体動からみた睡眠周期の変動で最も高く、その後徐々に低下して 16 −18 時には、ばらつきは大きいが、190 METS 前後まで低下していた。日中の 6 区分および 10 時から 18 時までの時間のいずれにおいても、週 × 時間経過 × 群の分散分析まで実施したが、群間に顕著な差は観察されなかった。
次に、就床中の身体活動すなわち体動は睡眠段階が深くなるほど体動が少なくなる 15）ことに着目し、身体活動量に基づく睡眠周期の検討を試みた。就床時刻から 3 時間について、睡眠中のある時間（1 分）の前後 15 分を合わせた
合計 31 分間の合計活動量（METS）を体動密度 16）として算出し、その変動の周波数解析を行った。この分析では、就床持続時間が 180 分未満の日のデータは除外したため、香香りなし群と香りあり群の差は認められたが、日中の身体りあり群の 1 名はデータ欠損となった。

活動量には群間の差はほとんど見られなかった。また、身下図に示す通り、睡眠周期のパワーは、低い周波数

体活動量に基づく睡眠周期についても検討を行ったが群間（0.00013 Hz, 128 分周期）から高い周波数（0.00052 Hz, 32の差は観察されなかった。

分周期）にかけてなだらかに減少し、群および週の間に顕3. 1. 3. PSQI（ピッツバーグ睡眠質問票）
実 験 開 始 日 の 回 答 を Pre、 終 了 日 の 回 答 を Post と し著な差は観察されなかった。
以上の身体活動量の分析の結果、就床中の身体活動量にて、それぞれの総合得点と項目別得点の変化を検討した。

関しては、一晩の変動の仕方や就床直後の活動量について

PSQI の得点は、得点が低いほど睡眠の質が良好であった− 184 −

睡眠誘導効果をもつ（−）− 酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果

ことを示すものである。香りあり群の 1 名は記入漏れがあったため、データ欠損となった。
香りなし群の総合得点は 5.91±0.67 点から 5.08±0.71 点に減少し、香りあり群も 7.20±1.16 点から 6.20±0.85 点に減少していた。時間（2 水準）× 群（2 水準）の分散分析を行った結果、時間の主効果に有意差が認められたことから（F（1, 20）= 7.69, p = 0.011）、どちらの群も総合得点が Pre から Post にかけて減少し、睡眠の質は総合的に改善されて

図 3-1-3

PSQI 総合得点の変動

図 3-1-4

OSA-MA 因子Ⅱの変動いたことが示された。
3. 1. 4. OSA-MA（OSA 睡眠感調査票 MA 版）
初日の回答を Pre、最終日の回答を Post として、5 つの因子ごとに得点の変化を検討した。OSA-MA は、得点が高い方が睡眠感は良好であったことを示すものである。
因子Ⅰ（起床時眠気）、Ⅲ（夢み）、Ⅳ（疲労回復）について
は、Pre から Post への変化が小さく、香りなし群とあり群の差もほとんど見られなかった。因子Ⅱ（入眠と睡眠維持）とⅤ（睡眠時間）
については、香りなし群とあり群の差はほとんど見られないものの、Pre から Post にかけて増加する
傾向がみられた。分散分析の結果、いずれも時間の主効果の差は有意傾向（因子Ⅱ : p= 0.054, Ⅴ : p= 0.091）であることが示された。
以上の分析の結果、起床時の睡眠感に関しては、どちらの群も入眠と睡眠維持および睡眠時間について改善傾向は

図 3-2-1

就床前の目尻の肌水分の変動あるものの、香りなし群とあり群の間の差は観察されなかった。

なく、全般的に香りあり群の方がより高い値を示した、就
床前（夜）と同様の分析の結果、群の主効果に有意差が得ら

3. 2. 肌質への影響

れ（F（1, 21 ）= 6.09, p= 0.022）、香りあり群の朝の目尻の肌

3. 2. 1. 肌水分

水分（第 1 週：41.5±0.8 ％，第 2 週：40.7±0.7 ％）は、香り

毎晩就寝前
（夜）
に測定された目尻の肌水分は、香りあり群も香りなし群も実験期間を通して大きな変動はなく、全なし群（第 1 週：38.8±0.6 ％，第 2 週：38.7±0.5 ％）よりも高かったことが示された。

般的に香りあり群の方がより高い値を示した。1 週間ごと

毎晩と毎朝に測定した前腕内側の肌水分については、実の平均値を算出し、週（2 水準）× 群（2 水準）の分散分析

験期間中の変動は少なく、香りなし群とあり群の差もほとを行った。群の主効果に有意差が得られ（F（1, 21）= 5.38,

んど見られなかった。それぞれ分散分析を行ったが、いず

p = 0.030）。香りあり群の夜の目尻の肌水分（第 1 週：41.5

れの主効果にも交互作用にも有意差は得られなかった。し±0.5 ％，第 2 週：41.5±0.6 ％）は、香りなし群（第 1 週：

たがって、どちらの群も前腕内側の肌水分には変化はなか39.6±0.8 ％ ,ったことが示された。

第 2 週：38.5 ±1.0 ％）よりも高かったこと

以上の分析の結果、目尻の肌水分については、就床前もが示された。
毎朝起床後（朝）に測定された目尻の肌水分についても、

起床後も、香りなし群より香りあり群の方が高かったもの

香りあり群も香りなし群も実験期間を通して大きな変動はの、どちらの群も実験期間中の変動は見られなかった。こ

図 3 - 2 - 2 就床前の目尻の肌質主観評価の得点変化（左：水分、中：油分、右：弾力／ 0 点：適度、-1 点：やや少ない、-2 点：非常に少ない）− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

れに対し、前腕内側の肌水分には、就床前にも起床後にも=14.31，p = 0.0010）。交互作用の下位検定の結果、香りな群間の差と実験期間中の変動は観察されなかった。

し群では Pre と Post の間に有意差はなく、香りあり群では3. 2. 2. 肌質の主観評価

Pre から Post にかけて有意に得点が増加していた（水分：顔（全体）、目尻、前腕内側の 3 ヶ所について、水分、油

p = 0.0014，油分：p <0.001）。

分、弾力の程度を「ない（- 2 点）」から「非常に多い（2 点）」

起床後の目尻、就床前と起床後の顔（全体）、就床前と起の 5 件法で回答してもらったが、ほぼ 0 点以下が選択され床後の前腕内側については、水分、油分、弾力とも実験前ており、全体として、水分、油分、弾力は適度または少な後の変化は小さく、群間の差もほとんど見られなかった。

いと感じていたと考えられる。

それぞれ分散分析を行ったが、いずれの主効果にも交互作

就床前の目尻の肌質の評価は、香りなし群では水分、油用にも有意差は得られなかった。したがって、どちらの群分、弾力全てにおいて実験前後の変化は見られなかったも起床後の目尻、就床前と起床後の顔（全体）、就床前と起が、香りあり群の水分と油分には Pre（-1 点前後）から

床後の前腕内側についての肌質の主観評価には、実験前後

Post（- 0.3 点前後）に得点が増加していた。水分、油分、の変化も群間の差もなかったことが示された。

弾力のそれぞれに時間（2 水準）× 群（2 水準）の分散分析を

以上の分析の結果、香りなし群と香りあり群との違いが行った結果、水分と油分には時間の主効果に有意差が認め見られたのは、就床前の目尻の水分と油分の主観評価で、られ（水分：F（1, 21）= 8.70，p= 0.0076，油分：F（1, 21）

いずれも香りなし群は実験前後の変化がなく、香りあり群=14.31，p= 0.0010）、時間 × 群の交互作用にも有意差が得では実験前から実験後にかけての改善が観察された。

られた（水分：F（1, 21）= 5.49，p=0.0029, 油分：F（1, 21）
表 3-3

睡眠に関する項目と肌質に関する項目の相関分析

睡眠に関する項目Ａ：就床時刻の変化量（分）睡眠に関する項目Ｂ：就床持続時間の変化量（分）睡眠に関する項目Ｃ：就床後 45-60 分の身体活動量の変化量（METS）
睡眠に関する項目Ｄ：就床後 60-75 分の身体活動量の変化量（METS）
睡眠に関する項目Ｅ：睡眠周期のパワーの変化量（METS2）
睡眠に関する項目Ｆ：PSQI（ピッツバーグ睡眠質問票）
総合得点の変化量（点）
睡眠に関する項目Ｇ：OSA-MA（OSA 睡眠感調査票 MA 版）
合計点の変化量（点）
肌質に関する項目Ｈ：就寝前（夜）の目尻の肌水分の変化量（%）
肌質に関する項目Ｉ：就寝前（夜）の目尻の肌質の主観評価合計点の変化量（点）
r：相関係数，n：サンプル対の数，p：有意確率− 186 −

睡眠誘導効果をもつ（−）− 酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果

3. 3. 睡眠および肌質に関する項目の関連性の検討③就床後 45 - 60 分および 60 - 75 分の身体活動量では、高睡眠と肌質の関連について検討するために、睡眠およい正の相関関係が認められた（r = 0.874, p <0.001）。就

び肌質に関する項目の変化量の相関関係を検討した。睡床後 45 - 60 分および 60 - 75 分の時間帯は、睡眠周期の眠に関しては 7 項目（就床時刻、就床持続時間、就床後最初のサイクルの中で、睡眠段階が深く体動が最も少な

45-60 分および 60-75 分の身体活動量、睡眠周期のパワー、

くなることが予想される時間帯である。したがって、こPSQI 総合得点、OSA-MA 合計点）
、肌質に関しては 2 項

れらの時間帯の身体活動量すなわち体動は睡眠の質を左目（就寝前の目尻の肌水分および肌質の主観評価水分・油

右する項目の一つと考えられ、肌質に関する項目との関分・弾力の合計点）を選出した。全被験者を対象に、第 1連も期待されたが、相関関係としては検出されなかった。

週と第 2 週の各平均値の差または実験前 Pre と実験後 Post

④睡眠周期のパワーと PSQI 総合得点の間には、中程度正の差をそれぞれ算出し、これらの変化量に年齢を加えたの相関関係が認められた（r = 0.484, p = 0.026）。睡眠周

10 項目の相関係数を求めた。

期のパワーは、睡眠周期に近い周波数帯域（0.00013 Hz,

その結果、①就床持続時間と就床時刻、②就床持続時間

128 分周期および 0.000195 Hz, 約 85 分周期）のパワーと肌水分、③就床後 45-60 分および 60-75 分の身体活動量、を合計したもので、パワーの増加はその周期の体動がよ④睡眠周期のパワーと PSQI 総合得点の 4 つの項目対に有り明白に出現していたことを示すものである。PSQI 総

意な相関関係が認められた。

合得点は、高いほど睡眠の質が低下することを示すもの①就床持続時間と就床時刻では、高い負の相関関係が認めであることから、体動の出現頻度と睡眠の質との間にもられた（r = - 0.821, p <0.001）。このことは、就床時刻が対応関係があることを示していると考えられる。

早まれば就床持続時間が延長し、就床時刻が遅延すると以上の分析の結果、複数の睡眠に関する項目の中でも就就床持続時間が短くなることを示し、当然の結果である

床持続時間について、就床前の目尻の肌水分との間に対応といえる。

関係が観察され、睡眠の時間的側面と肌質との関連が示唆②就床持続時間と肌水分では、中程度の正の相関関係が認された。

められ（r = 0.457, p =0.028）、就床持続時間が延長すると4．考

肌水分も増加し、就床持続時間が短縮されると肌水分も減少するという対応関係であった。このことは、睡眠と肌質の関連性を示唆するものと考えられる。

図 3-3

察

本研究は、睡眠誘導効果をもつ天然由来の香り（－）- 酢酸
ボルニルを用いた睡眠サポート法を提案し、睡眠促進によ

睡眠および肌質に関する項目
（変化量）
の相関関係

− 187 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る肌質への波及効果を検討することを目的として、50 歳以上の成人女性を対象に就床時の香りの吸引を 2 週間実施
し（香りあり群）、プラセボ群（香りなし群）との比較を行った。
睡眠の質の評価には、就床・起床の時刻とその持続時間、就床中と日中の身体活動量、直近の 2 週間の睡眠に関する
内省、起床時の睡眠感を用いた。
時間に関する項目では、就床時に（－）- 酢酸ボルニルの香りを吸入した香りあり群において、就床時刻が早くなり就床持続時間の延長傾向と起床持続時間の短縮が観察された。
起床時刻（6：30 頃）は変化せずに就床時刻が早まった（第1 週では 0：10 頃だったのが第 2 週では 23：50 頃になった）ことから、社会生活への影響は少なく、睡眠時間確保の観点からも睡眠の質の改善につながる変化であったともいえ図4る。なお、全被験者の各測定項目の変化量の相関分析では、本研究の成果

就床時刻が早いことと就床持続時間の延長との対応関係

月上旬にかけて実施されたことから、前腕内側は季節的にも示されており、この結果とも一致している。
（－）
- 酢酸

衣服（長袖）に覆われていることが多い部位であり、衣類でボルニルの香りには、作業後の覚醒状態の低下効果（θ 波

保護されている部位とみなすことができる。そのため、外6-9）

気に晒されている顔の部位に比べると変動が起きにくい状増強）および自律神経の緊張緩和効果が報告されており、これらの効果によって睡眠の質が向上し、より早い就床行

況にあったと考えられる。
肌質（水分、油分、弾力）の主観評価は、顔（全体）、目尻、動を促進した可能性が考えられる。
身体活動量に関しては、就床中でも日中においても、顕前腕内側の 3 ヶ所について実験開始日と終了日のそれぞれ

著な群間の差の検出には至らなかった。また、就床後 3 時

就床前と起床後の計 4 回実施したところ、就床前の目尻の間の身体活動量すなわち体動に基づいて睡眠周期の検討を

水分と油分の主観評価に関して、就床時に香りの吸引を行行ったが、こちらでも群間の差は観察されなかった。これった香りあり群では実験前から実験後にかけての改善が観らは、身体活動量による睡眠の質の評価は未だ開発途中で察された。水分は実験期間中の毎晩毎朝に計測を行ってお、評価方法が定まっていないことも理由のひとつり、就寝前の目尻の肌水分の測定値は増加しておらず、油と考えられる。睡眠の質の客観的な評価には、脳波、眼球分については測定をしていないため、被験者が何に基づい運動、筋電図などの生体信号を収録して評価する終夜睡眠て肌質の評価をしたのか推測は難しい。グリシン食品摂取あり

15, 16）、身体に多数の電が睡眠の質と肌質に及ぼす効果を調査した山崎ら 5）は、睡極を装着する必要があるなどの様々な制約があり、個人レ

眠の質の向上とともに PSQI の総合得点と皮膚バリア機能

ベルでの計測は困難である。睡眠研究の推進のためには日との対応関係を確認している。本研究においても、全被験常生活の中で簡易的に計測できる方法の開発が必要であり、者を対象とした分析ではあるが、就床持続時間の変化量と今後も身体活動量・体動による睡眠評価を試み続け知見を

就床前の目尻の肌水分の変化量との間には正の相関関係が蓄積していく必要がある。

認められている。したがって、就床時刻が早まり就床持続

ポリグラフィ検査が一般的であるが

17）

睡眠に関する内省と起床時の睡眠感については、どちら時間が延長した香りあり群の被験者は、睡眠の質の改善との群にも実験前から後にかけて改善が見られた。ただし、ともに肌質も改善されたと仮定すると、肌水分測定以外の群間の差は得られなかったことから、この改善効果はプラ

ところで何らかの変化を感じ取り、それが肌質の主観評価

セボ効果と考えられる。

得点に反映されたことが可能性のひとつとして考えられる。

一方、肌質の評価は、肌水分の測定と肌質（水分、油分、以上の結果から本研究では、（－）- 酢酸ボルニルを就床時に吸引することによって、睡眠の時間的側面に改善効果が弾力）の主観評価を用いた。
肌水分の測定は、目尻と前腕内側の 2 ヶ所について就床確認され、肌質には夜間の目尻の水分と油分に対する主観

前と起床後に行い、目尻では就床前も起床後も、香りなしに対して好ましい波及効果が認められた。また、本研究の群より香りあり群の方が高く、どちらの群も実験期間中の測定項目からも、睡眠と肌質の関連性が示唆された。これ

変動は見られなかった。実験初期から香りあり群の方が高らの香りの効果をより正確に把握しより有効に発揮させるい値を示していたため、この結果は就床時の香りの吸引のためには、測定項目の精度の向上とともに、吸引時の（－）-

効果とは考えにくい。前腕内側の肌水分は、実験期間中の酢酸ボルニルの濃度や吸引する期間も合わせて引き続き検変動も群間の差も見られなかった。実験は 3 月下旬から 4討していく必要がある。

− 188 −

睡眠誘導効果をもつ（−）− 酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果（引用文献）

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ニルの多機能性- 酢酸ボルニルが視～ “森の香り”（－）− 189 −

150 頁 .

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索
1

産業医科大学保健センター 、早稲田大学大学院情報生産システム研究科

八谷 百合子 1、柴田美雅 1、犬島2

浩2

The purpose of this study is to examine the effect of an olfactory stimulus on changes in a physiological index and sleep.
Using aromas during the loading of stress, we measured beat-to-beat interval (R-R interval) times from electrocardiogram(ECG) recordings. Measurement of heart rate (HR) variability from short and long-term ECG recordings is a non-invasive
method for evaluating cardiac autonomic regulation. In an analysis of the power spectrum in the R-R interval times, the highand low frequencies in the physiological index of stress loading suggest that the aromas have an effect on the autonomic
nervous system. As the strain on the sympathetic nerve was relaxed, we conclude that the aroma affected the sympathetic
nerves. We also measured the average amount of sleep and quality of waking by the activity meter and a questionnaire during
the aroma-load. We conclude that there are individual differences in amount of sleep and quality of waking.

1．緒

2．実

言

職場では，うつ病，不安障害，心身症などのストレス関1）

連疾患が急増している ．ストレス関連疾患は，長期にわ2）験

2. 1. 植物芳香成分のリラックス効果
2. 1. 1. 対象たる休職や過労死などとの関連性が報告されている ．健

平均年齢 23±1.0 歳（22 ～ 24 歳），コンピュータ使用経康管理や労務管理の上で，ストレス関連疾患を予防するこ験が平均年数 6.0±1.7 年（5 ～ 8 年）の男子大学生 3 名（被験とは重要な課題である．また，ストレスを誘引とする不眠

者記号 A ～ C）を被験者とした．

の影響のため，日中の集中力の低下や頭痛などから労働の

2. 1. 2. 植物芳香成分の呈示方法

意欲が減退し，生産活動の低下をもたらすと言われている．

本研究では，植物芳香成分として，フランスの Pranarom

よって，このような状態に陥る前に，ストレスや不眠を緩社のラベンダー・アングスティフォリィア（真性）を使用し和することが必要であり，ストレス緩和法が望まれている．

た．ラベンダーの主な成分は酢酸リナリルであり，副交感

植物芳香成分は，抗不安作用，鎮静作用，抗うつ作用など，神経に働き，精神安定や鎮静作用を持ち 3），ストレスによ

ストレスを緩和しリラックスや安眠の効果があると言われる疲労感に対して，中枢神経を刺激し，リフレッシュ効果ている．しかし，植物芳香成分の効果の有用性についてはがある 4）．今回使用したラベンダー・アングスティフォリ

未だ不明である．その原因としては，香りの効果は身体的

ィア（真性）は，酢酸リナリル 40.00 ％とリナロール 42.19

条件，環境的条件に左右されるものと考えられる．心理学％を含んでいた．それぞれ 200 μg のラベンダーを含ませ的な測定のための質問紙や，採血，唾液，生理学的検査とた濾紙 3 枚を専用の設置台に刺し，実験室の中央に置いた

して指尖容積脈波，皮膚電気抵抗，皮膚温度，脳波などを（Fig. 1）．

測定した結果があるが，いずれも有意差は認められていな
い．よって，植物芳香成分の効果について，心理的な測定や生理学的検査から確認できる状況に至っていない．
本報告では，成人を対象として作業負荷方法の選定と生体信号の計測を行い，心電図の心拍変動の解析を時系列で検討することで植物芳香成分のリラックス効果を検討した
結果と活動量計および問診票を用いて睡眠状況を把握し，植物芳香成分の安眠効果について評価したことを報告する．
*

Exploration of useful scented liquid fromplants for relax and good sleep
Yuriko Hachiya* 1 , Minori Shibata 1, Hiroshi
Inujima 2
Health Center, University of Occupational
and Environmental Health 1 , Graduate
School of Information, Production and
Systems, Waseda University2

Fig. 1 The lavender diffusing equipment
ラベンダーの拡散装置（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香
成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-075，p. 63，2014，の p. 63 の図 1 より転載）− 190 −

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索

2. 1. 3. 植物芳香成分によるリラックス効果実験の流れった．実験で使用した心電図の測定機器は，ECG monitor

植物芳香成分によるリラックス効果実験のスケジュール（model: Bioview 1000，PB1402, NEC, Tokyo, Japan）であを Fig. 2 に示す．被験者１人につき 2 回実験を行った．1った．なお，被験者には informed consent を行い，同意回目の実験では，安静後水を嗅がせ，「暗算作業ソフト」を書を得た上で実験を実施した．本研究の実施について，産使用し作業負荷を与え，アニメーション視聴によるリラ

業医科大学倫理委員会の承認を得た．

ックスの後安静とした．別な日に行った 2 回目の実験では，

2. 1. 4. 実験環境

安静後ラベンダーを実験室に設置し，実験終了まで植物芳

生体情報は環境（室温，湿度，照度，騒音，気圧，電磁

香成分を連続して嗅がせた．安静後「暗算作業ソフト」を使波など）と被験者の体調に左右されやすい．また，VDT 作

用し作業負荷を与え，アニメーション視聴によるリラック

業を行う室内の温度は 17 ～ 28 ℃，湿度は 40 ～ 70 ％，エスの後安静とした．実験に際して被験者の状態を統一する

アコンの風などが作業者に直接当たらないようにするこため，被験者に「前日はアルコールを飲まない，十分に睡とが重要といわれている 5）．よって，測定は周囲の環境を眠をとる」等を指導した．被験者は，非喫煙者のみとした．

一定にできる産業医科大学人工気候室で行い，条件は室実験当日に体調に問題がないことを確認した後，各種測定

温 25 ℃，湿度 60 ％，騒音 60 dB，照度 680 Lux，上着衣量装置を装着後，約 1 時間程度実験室の中で環境に慣れても140g，風速 0.2m/s，シールド使用（減衰率 40dB 以上（atらい，データ収集を行った．被験者が 10 分おきに 0 － 9

0.5 ～ 200MHz））とした．

「疲労感の変化」
をキー・ボードから入までの数字を使って

2. 1. 5. 暗算作業ソフト

力し自動的に記録した．これは 0 を疲労感無し，9 を作業

オリジナルの「暗算作業ソフト」の画面を Fig. 3 に示す．

が続けられないほどの疲労感としたものである．一瞬で判

被験者は，3 つの数字を足し合わせ，下一桁の数字を「暗断できるように 0 ～ 9 の段階に区分し，言葉は付帯しなか

算作業ソフト」に入力した．「暗算作業ソフト」は，作業量

Fig. 2 Experiment procedure during mental arithmetic operation
植物芳香成分によるリラックス効果実験のスケジュール（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014，の p.
64 の図 2 より一部修正の上転載）

Fig. 3 Outline of measurement for workload of mental arithmetic operation
暗算作業ソフトの画面（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-056 ～ 080・
082 ～ 093，63 － 67，2014，の p. 64 の図 3 より一部修正の上転載）− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016とミス入力数を自動計算した．また，「暗算作業ソフト」はおり，負荷が強くなるに従って心拍変動は減少する．精被験者が入力した「疲労感の変化」
も自動的に記録した．

神的ストレスを受けると交感神経緊張が亢進し，LF 成分

2. 1. 6. 解析ソフト

が増大および HF 成分が減少する．よって，LF 成分と HF

ECG monitor で測定した心電図波形をVITALRHYTHM

成分は鏡像を形成する．本研究において，心拍における2100（有限会社メディカルトライシステム）で解析した．

0.04 ～ 0.15 Hz の低周波数帯域を P1 とし，心拍における2. 1. 7. 心拍変動

0.15 ～ 0.40 Hz の高周波数帯域を P2 とした．また，LF/

6）

2. 1. 7. 1. 心拍変動

HFを求め，
P1/ P2が高ければ精神的負荷が高いものとした．
2. 1. 7. 3. R-R 間隔の測定

循環器機能は，交感神経と副交感神経の相互作用を通して調節されている．吸気相と呼気相に同期した周期性変化

心電図の波形例を Fig. 4 に示す．心電図は，心臓の拍動は，心拍変動と呼ばれる．心拍変動は，心拍の R-R 間隔に伴う心臓の電気的な活動をグラフの形にしたものである．

の 1 拍ごとの変動を測定する．本研究では，心拍変動の評

本実験では胸部誘導（3 点誘導）で測定した心電図を 1ms で価の一つである心拍の周期変動の周波数分析を用い，低周

サンプリングした．1ms の精度で R 波を検出し R-R 間隔を

波数（low frequency :LF，0.04 ～ 0.15 Hz）
，高周波数
（high

順次計測した．R-R 間隔の時系列例を Fig. 5 に示す．

frequency :HF，0.15 ～ 0.40 Hz）のパワースペクトル解析

2. 1. 7. 4. パワースペクトルの計算用いた．

本研究では，心拍変動の振動成分の抽出のため，R-R 間

2. 1. 7. 2. ストレスと心拍変動

7）隔の時系列のスペクトル解析を行った．R-R 間隔時系列に心拍変動は精神的ストレスの指標となることが知られて対しパワースペクトルを求めた．パワースペクトルの例を

Fig. 4 Typical example of the electrocardiograph
心電図の波形例（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-075，p. 65，2014，の p. 65 の図 4 より転載）

Fig. 5 An example of the R-R interval times
R-R 間隔の時系列例（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，
電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014，の p. 65の図 5 より転載）− 192 −

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索

Fig. 6 に示す．低周波数帯域（P1）
高周波数帯域（P2）のピーのシャツの襟に装着させ（Fig. 7），姿勢情報，歩数およびク位置にマークを表示した．

運動量を測定する．なお，入浴前は活動量計をシャツの襟から取り外し，入浴後再び同位置に装着させる．毎朝起2. 2. 植物芳香成分の安眠効果

床時に，睡眠感調査票に記入させる．ただし，8 日目から

2. 2. 1. 対象

14 日目までの就寝時は，就寝直前にラベンダー 200 μg を

平均年齢 23±1.0 歳（22 ～ 24 歳）の男子大学生 3 名（被験濾紙に吸収させ，その濾紙を寝室に置いたまま就寝させる．

者記号 D ～ F）
を被験者とした．

翌朝，使用した濾紙は廃棄させる．実験開始から 15 日後に，

2. 2. 2. 評価項目

活動量計と睡眠感調査票を回収しデータを保管する．なお，

・3 軸加速度センサ搭載の丸型活動量計 MTN-210（キッ

被験者には informed consent を行い，同意書を得た上でセイコムテック）による 6 方向の姿勢情報（立位，倒立位，実験を実施した．本研究の実施について，産業医科大学倫仰臥位（左右），側臥位（左右），仰臥位）による睡眠と覚理委員会の承認を得た．

醒の評価，歩数および運動量による活動量の評価

3．結果・考察・事前問診票（Epworth Sleepiness Scale，ピッツバーグ

8）

3. 1. 植物芳香成分のリラックス効果の結果

睡眠質問票，睡眠健康調査票（SHRI）
・睡眠感調査票（OSA 起床時睡眠感調査票（MA 版），起床
時間記入票）

3. 1. 1. P1とP2 の結果と考察
本研究では，解析データは R-R 間隔，1 回のパワースペ

2. 2. 3. 植物芳香成分による安眠効果実験の流れ

クトル解析処理ポイントは256点，加算平均回数は1回（256

被験者に事前問診票を渡し記入させ回収する．次に，被点毎にパワースペクトル解析が 1 回行われる），ウィンド験者に活動量計，睡眠感調査票，直径 20cm 円形の濾紙をウはなし，タイプは R-Rms2 を選択した．実験開始から直8 等分に切ったものとラベンダーを渡し，以下のように行後のパワースペクトル解析処理ポイントの 256 点が 128 秒

う．活動量計を 24 時間連続して木曜日から 14 日間被験者であったため，心電図を 1ms でサンプリングしたものをFig. 6 An example of the power spectrum
パワースペクトルの例（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，
電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14-056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014，の p. 65の図 6 より転載）⬇活動量計

Fig. 7

The activity meter− 193 −

活動量計

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

128 秒毎にパワースペクトル解析を行った．代表例として，

上段の被験者 A の P1/P2 の実線は，変化は見られなか

被験者 A の香りの有無別におけるコントロール中およびった．ラベンダーの効果により，暗算作業中の交感神経緊

ストレス中の心拍変動の低周波および高周波のパワーの結張状態が緩和されたのではないかと推測した．中段の被験果を Fig. 8 に示す．

者 B の P1/ P2 の点線は，徐々に増加した．これに比べラ

a 点より安静を開始，b 点より暗算作業を開始，c 点よりベンダーを使った実線は，変化が見られなかった．被験者

リラックスを開始，d 点より再び安静を開始した．Fig. 8

B は，被験者 A と同様にラベンダーの効果により暗算作業の上段のグラフは，ラベンダーを使わない実験であった．

中の交感神経緊張状態が緩和されたと推測した．最下段のP1 は徐々に増加し，P2 は変化しなかった．これは，暗算

被験者 C の P1/ P2 は，点線が徐々に増加した．ラベンダ

作業による精神的ストレスの影響があったものと判断した．

ーを使わない場合でも暗算作業中の交感神経緊張状態は回Fig. 8 の下段のグラフは，ラベンダーを使った実験であ避された．また，実線は漸次増加した．ラベンダーの香りった．P1 はいくつかのピークを除いて増加せず，P2 は変が，暗算作業中の被験者にストレスを与えたためと思われ化しなかった．ラベンダーを使用したことにより，暗算作る．植物芳香成分が個人とって心地よい香りと感じる否か

業中にリラックスできたものと思われた．

は個人差があり，被験者 C にとっては心地よい香りではな

以上より，被験者 A については，ラベンダーが暗算作
業による交感神経緊張を緩和させ，精神的ストレスを減少かったと思われた．
本研究では，被験者の好みにかかわらず，ストレスによさせたと推測した．

る疲労感に対してリフレッシュ効果があると言われるラベ

3. 1. 2. 被験者A，B，C の P1/ P2 の結果と考察

ンダーを使用した．被験者の嗜好性は考慮しなかったが，次に，被験者 A ，B，C の植物芳香成分使用別の P1/
P2 を Fig. 9 に示す．P1/ P2 が高ければ交感神経が緊張状

今後の研究においていろいろな植物芳香成分を選択し実験を行うことが課題と思われる．

態であり，精神的負荷が高いと言われている．上段は被験者 A，中段は被験者 B，最下段は被験者 C である．ラベン
ダーを使わなかった結果を点線，ラベンダーを使った結果を実線で示す．

3. 2. 植物芳香成分の安眠効果の結果
丸型活動量計 MTN-210 解析ソフトを使用し，6 方向の
姿勢情報による睡眠と覚醒の評価，歩数および運動量によFig. 8 The power spectrum of high and low frequency in case of subject A
コントロール中およびストレス中の心拍変動の低周波および高周波のパワー（被験者 A の香り有無別）（八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会
資料知覚情報研究会 PI-14-056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014，の p. 66 の図 7 より一部修正の上転載）− 194 −

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索

る活動量の評価，各問診票の集計を行った．

合に比べてラベンダーを使用した場合の方が，睡眠時間が3. 2. 1. 睡眠日誌の結果

短く，目覚めも悪かった．被験者 E は，ラベンダーを使用

植物芳香成分の安眠効果として，問診票による平均睡眠しなかった場合に比べてラベンダーを使用した場合の方が，時間と起床時の目覚めについての検討結果を示す．平均睡睡眠時間が長く，目覚めも良かった．植物芳香成分の安眠

眠時間と起床時の目覚めの良さにおいて，ラベンダーを使効果については，個人差があるものと推測された．

用しなかった場合と使用した場合を比較した．結果を Fig.

3. 2. 2. 活動量計の解析

10 ～ Fig. 12 に示す．目覚めの良さは，1 が大変目覚めが次に活動量計の解析結果の代表例として，被験者 E のラ

悪く，
10が大変目覚めが良いと定義し，被験者に記録させた．

ベンダーを使わなかった場合の結果を Fig. 13 に，ベンダ

被験者 D と被験者 F は，ラベンダーを使用しなかった場ーを使った場合の結果を Fig. 14 に示す．黒色の部分は日Fig. 9The high and low frequency rate of power spectrum in case of A, B and C
A, B, C: subjects' code
心拍変動の低周波および高周波成分の比率（被験者 A, B, C の香り有無別）（八谷百合子，柴田美雅，
犬島浩：植物芳香成分吸引時における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報研究会 PI-14056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014，の p. 66 の図 8 より転載）

Fig. 10A average amount of sleep and quality of waking from sleep（subject D）
平均睡眠時間と目覚めの良さ（被験者 D）− 195 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Fig. 11A average amount of sleep and quality of waking from sleep（subject E）
平均睡眠時間と目覚めの良さ（被験者 E）

Fig. 12A average amount of sleep and quality of waking from sleep（subject F）
平均睡眠時間と目覚めの良さ（被験者 F）

Fig. 13

The result of analysis on the activity meter in case of subject E without lavender
活動量計の解析結果（被験者 E，ラベンダー無）− 196 −

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索

Fig. 14

The result of analysis on the activity meter（subject E，lavender（+））
活動量計の解析結果（被験者 E，ラベンダー有）中活動していることを示す．青色の部分は就寝中を示し，計算を行わせ，30 分間のアニメーション視聴によるリラ

その内黄色の部分は，中途覚醒を示す．被験者 E は，問診

ックス時間の後，10 分間の安静を経て，実験を終了した．

票においてラベンダーを使用した場合の方が，目覚めが良同じプロトコールを用い，ラベンダーを使う 2 回目の実験

かったと答えている．活動量計の黄色の部分の中途覚醒状を行った．2 回目の実験では，10 分間の安静後から実験終

況を Fig. 13 と Fig. 14 で比べると，ラベンダーを使用した了までストレスによる疲労感に対してリフレッシュ効果が場合のうち，木曜日と金曜日は全く中途覚醒が見られなかあるラベンダーを継続して嗅がせた．実験を通して，心電った．被験者 E については，ラベンダーによる安眠効果が図を測定し R-R 間隔の時系列のスペクトル解析を行った．

あったと推測される．

低周波数帯域と高周波帯域比率を比較した結果，被験者 3

4．総名のうち 2 名については，ラベンダーにより交感神経緊張

括状態の緩和作用が見られたと推測された．

本研究は，生体情報の変化を検討することで，嗅覚刺激

次に，植物芳香成分による安眠効果について検討した．

がストレス作業および睡眠に対してどのように影響を与

睡眠日誌の評価において，ラベンダーを使用した場合の方えるか検討することを目的とした．被験者男子学生 3 名をが，睡眠時間が長く，目覚めが良い被験者 1 名を確認した．

対象に各 2 回ずつ暗算作業を行わせた．ラベンダーを使わ

しかし，他の 2 名は睡眠時間が短く目覚めも悪かった．植なかった 1 回目の実験では，10 分間の安静後 60 分間暗算

物芳香成分の安眠効果については，個人差があるものと推− 197 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

測される．活動量計の中途覚醒状況において，ラベンダーを使用しなかった場合に比べ，ラベンダーを使用した場合の方が，中途覚醒が少ない被験者を確認した．今後は，被験者を増やし，データの再現性および属性による特徴を示

候群，医学の歩み，228，6，687，2009．
2） 田中喜秀，脇田慎一：ストレスと疲労のバイオマーカ
ー，日本薬理学雑誌，137，185，2011．
3） 川端一永・吉井友季子・田永智子：臨床で使うメディ
カルアロマセラピー，メディカ出版，2000，6 頁．

す事が必要と思われる．

4） 今西二郎：メディカル・アロマセラピー，金芳堂，
謝辞

2000，137 頁

本研究を進める上でご協力を頂いた，産業医科大学共同

5） 厚生労働省安全衛生部労働衛課編：VDT 作業におけ利用研究センター門司幸一様，合同会社メディスアール竹る労働衛生管理―ガイドラインと解説，中央労働災害防

田貞則様，早稲田大学大学院情報生産システム研究科立野止協会，2002．

繁之准教授，産業医科大学産業生態科学研究所人間工学研究室藤木通弘教授に深く感謝します．尚，この研究の一部

6） 林博史編集：心拍変動の臨床応用－生理的意義－病態
評価 , 予後予測－，医学書院，1999，1 － 16 頁．

は，公益財団法人コスメトロジー研究振興財団からの第7） Pagani M. Furlan R, Pizzinelli P et al ：Spectral

24 回（平成 25 年度）研究助成金（課題番号 J-13-30）および

analysis of R-R and arterial variabilities to assess

公益財団法人北九州産業学術推進機構からの平成 25 年度

sympatho-vagal interaction during mental stress in

産学連携研究開発事業シーズ探索助成金によって実施した．

humans，J Hypertens，7(Suppl 6) ，S14-S15，1989．
8） 八谷百合子，柴田美雅，犬島浩：植物芳香成分吸引時（引用文献）

における心拍変動の検討，電気学会研究会資料知覚情報

1） 久保千春 , 吉原一文：ストレス関連疾患と慢性疲労症

研究会 PI-14-056 ～ 080・082 ～ 093，63 － 67，2014．

− 198 −

●第 26 回表彰・贈呈式記念講演
●

服部 正平

第26回表彰・贈呈式

記念講演（日本薬学会長井記念ホール・平成27年11月19日）

ヒト常在菌叢と超生命体〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜
早稲田大学理工学術院 教授

服部正平

はっとり・まさひら
1972年岐阜大学工学部工業化学科を卒業、79年大阪市立大学大学院工学研究科博士課程（工学博士）を修了後、東亜合成化学工業㈱研究員に、84年には九州大学遺伝子情報実験施設助手、87年に米国・スクリプス研究所及びカリフォルニア大学・サンディエゴ
研究員、91年に東京大学医科学研究所・ヒトゲノム解析センター助教授、99年から理化学研究所ゲノム科学総合研究センターチー
ムリーダー、2002年、北里大学北里生命科学研究所教授、2006年7月から東京大学大学院新領域創成科学研究科教授を9年ほど務められ、2015年4月から現職の早稲田大学の教授に就任、現在に至る。
・専門分野：情報生命科学分野（特にメタゲノムデータの情報学的解析）
・その他：日本学術振興会、ゲノムテクノロジー委員会、他多数参画

10

ただいま紹介いただきました服部です。

重い。かつ、まあ、10 ぐらいの人間の固体数に比べてノーベル賞を取られた大村先生とはもう十数年前からつ10 ですから、もし微生物が人間と同じ大きさでしたら、き合いがあるんですけど、土壌からああいうすごい薬をつ

私 1 人の周りに 10 人の人間がいる、そのくらい密にいるくるというのはあり得ない話なんですが、初めて会ったとと。この認識をまず持っていただくと、私が今後話をする

きは、もうこの人は普通じゃないというのはしゃべっていことに関してはすごく理解が早いと思われます。

30

20

るだけでわかりました。もうそのころから、この人がノー

このように地球上にはいっぱい微生物が棲んでいるんでベル賞を取ってもおかしくないなあというのはすごく感じ

すが、我々の体も例外ではないというわけです。ここに書ていまして、それまで僕はほんとうに大村先生の存在を何いてありますように、いろんな部位にいろんなタイプの菌も知らなかったんですけれども、おそらく多くの方も知らが、1,000 菌種以上、または単位面積と単位グラム当たりに、なかったと思うんですね。というのは、アフリカの風土病

10 ぐらいの菌が棲んでおりまして、消化器系、特に大によくきく薬なので、日本には関係ないなというのがあっ腸ですが、最も多い菌種と菌種数が生息しているというわたと思うんです。しかし、毎年数千万人の人が救われていけです。ヒトの細胞というのは、最近 37 兆個に変わりまる薬を見つけた人と思うと、これは何かすごい人だなといしたが、それでもヒト常在菌の数は数百兆個になりまして、

うふうにずっと昔から思っていまして、大村先生と会った一けた多い細胞がヒト 1 人に棲みついているということに次の年から、私は講義で、学生に大村先生を紹介することなっているわけです。

14にしたんですよ。日本にこんなすごい先生がいるんだよと。

このような常在菌を調べる方法としまして、当然これは

それでもほとんどが知らなくて、今年ノーベル賞を取られパスツール以来、北里柴三郎以来その存在は知られておりて、やっぱり取ったかという感じがありました。

まして、それを何とかしようという研究が始まっておりま

そういうことで、ノーベル賞を取ったとき、実は僕もすす。実際のところ、1960 年ごろになりまして、日本ではごく忙しくなりました。どんな先生でしたかというインタ

光岡先生というパイオニアの先生がいらっしゃいまして、ビューをすごく受けまして、ちょっとだけテレビに出たこ

当然のことながら、培養して微生物を確認するということとがあります。そういうことで、私はきょう、常在菌の話がされ始めました。しかしながら、我々の体に棲んでいるをさせていただきます。

菌というのはなかなか培養ができないということがわかっ

これは微生物の話なので、微生物はどんなものかというておりまして、ほんの一部しか見えません。そこで、その認識を改めていただきたいということで、見えないもので後、なかなか見えないものをどうするかということが問題

すから、どのぐらいいるんだというのはわからないんですになっていたんですが、1980 年に移りますと、遺伝子、が、ここに書いてありますように、これはそれぞれのいろ

DNA を調べる技術が出てきました。これはいわゆる分子

んなものの重さが書いてあります。例えば、ヒトの 1 つの生物学になるわけです。そうしますと、ここにいる菌の塊

細胞は大体 10-9グラムなんですね。我々 1 人の体重が 5を全部 DNA にしちゃう。我々はこれをゲノムと言うんで×10 で、今人口が大体 70 億人ぐらいということで、そう

すが、そうしちゃう。英語では細菌叢のことを flora と言すると世界中の人間の総重量は 3×10 なんですが、細菌ったり、僕らは microbiota と言います。そこから出てくるは 1 個大体 10

4

14

-12

グラムあります。ところが、これは 2009

ゲノムの塊をマイクロバイオーム（microbiome）という言

年の『Nature』の報告なんですが、地球上に細菌の総数はい方をします。このように DNA ができるわけです。そう

10 いると。この掛け算をしますと 10 オーダーになると。

するとこの DNA を対象にしまして、例えば、PCR 等を使

そういうことは、重さにして人間よりも微生物は 1,000 倍ってバクテリアの 16 S リボソーム RNA 遺伝子というのが

30

17− 201 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

ありまして、すべてのバクテリアが持っております。そのMicrobiome Project、HMP というのを立ち上げ、かつ欧

遺伝子を調べることで、どんな菌がいるのかということが州連合では MetaHIT というプロジェクトが、中国の BGI可能になりました。そうすると、培養する必要がなくて、というセンターと一緒になって、やはりこれも 2008 年にその DNA を調べるだけでどんな菌がいるのかわかるわけ始まった。というわけで、2008 年から世界的に本格的な解で、培養できなかった菌の正体もここでわかるようになっ析が始まって今に至っているわけです。
実際今どのようにしてこの常在菌を研究しているかといたわけです。
ところが、この方法では菌種はわかったんだけどそいつう図がこの図になります。大きく 2 つの戦略をとっておりらが何をしているかわからない、機能がわからないというます。右と左です。左は、実際に我々自身のサンプルから問題が残っておりました。それを解決したのが、今度はどんな菌がいるのか、メタゲノムとか 16S とか、あとこれ

2004 年、10 年ほど前になりますが、メタジェノミクスとは代謝物等を見て、健常者及び病態の方々からいただいて、いう方法でそれが解決されました。すなわち、こちらの場

そのデータベースをつくる。これは何が質問かというと、合は 16 S リボソーム RNA 遺伝子だけをターゲットにしてWho is there? そこにどんなやつがいるんだということにいたんですが、ランダムに遺伝子を見つけるという、我々なるわけです。一方、そこにいる菌種たちは一体何をしてはショットガンシークエンス法と言っているんですが、そいるのかを研究するのが右になります。これは What are

れをすることでそれぞれの微生物が持っている遺伝子を網

they doing? ということになるわけです。この場合、ヒト羅できるというわけです。これによって菌種と機能の情報は使えませんので、我々は特殊なマウス、いわゆる無菌マを獲得することができるようになりました。しかしながら、ウスというのを使います。全く菌を持たないマウスをつく

こちらはすごく膨大でして、この方法を使ってもすべてをりまして、それに研究したいバクテリア及びそのフローラ

つかまえることができるのかという大問題が残っておりまを接種して、それを持つマウスをつくります。これをノトした。

バイオートマウスといいます。これはもう 1950 年か 60 年

それを解決したのが、ここに書いてありますが、NGSというんですが、これは next-generation sequencer とい

か、ものすごく古くからある技術でして、ここに来てこの技術が大事になっています。

いまして、我々は次世代シークエンシング技術という言い

このようにしてできたノトバイオートマウスに対して、方をします。これはすごい量のデータを出す機械、シーク

ここに書いてあるいろんな遺伝子の解析、代謝物の解析及エンサーが 2008 年以降実用化されまして、これを使うこび細胞の解析、そういうデータを得て、宿主と微生物の間とで非常に複雑な細菌叢のほぼ全部を網羅できるようになの相互作用を調べる。それによって接種した微生物が宿主って今日に至ってきたという流れがあります。

に対して何をしているのかということを解明しようと。こ先ほどの NGS、次世代シークエンサーですが、これはの 2 つが両輪になって現在進んでいるというわけです。私

私が従事しましたヒトゲノム解析ですが、それにこういうはヒトゲノムとこちらのほうを得意としますので、主にこシークエンサーを使ったんですが、そのころ、ヒト 1 人のちらの話をしばらくさせていただきます。

ゲノムを決めるのに何千億円とかかっておりました。しかこれはややこしい図なんですが、基本的にどういうデー

しながら、その後、このシークエンサーという解読機械がタが得られるかを示した図です。ここに細菌叢の DNA がどんどん開発され続けまして、今では 10 万円か 20 万円であります。16S 解析はこのような形でやるということです。

ヒト 1 人のゲノムが決まる、このぐらいのスピード、さらこれで菌種の解析ができます。一方、メタゲノム解析は、に 10 万倍早く、コストも 10 万分の 1 になりまして、そのこっちからこっちへ来まして、いっぱい配列データを得る。

おかげで、今までとても対象にできなかった細菌叢の解読

それを、これはコンピュータ上なんですが、微生物の非重ができるようになったということが背景にあります。

複 配 列 を 得 て、 そ こ か ら 遺 伝 子 を 同 定 す る。 こ れ に

こういうような流れの中で、2008 年に、これはやはり

bioinformatics をやりまして、得られた遺伝子に対して、世界的なコンソーシアムをつくってやりましょうというこ

COG とか KEGG とかというデータベースがあります、ことになりました。これをInternational Human Microbiome

れは機能データベースでして、こういう遺伝子はこういう

Consortium といいまして、IHMC と我々は略しております。

機能を持っているというのがわかるので、ここで得られた

このような、日本を含め、欧米の各国が集まって、データ

遺伝子と、ここに相同検索というのをやることで、機能とを共有し、技術を共有し、世界で競争しながら協働的にやか代謝系の解析ができるというわけです。

りましょうというわけです。実際我々は、2005 年に、日

もう一方、ここはヒトの糞便と書いてありますが、やは本においては HMGJ という日本のコンソーシアムをつくり培養も大事だということで、ヒトから取れてくるバクテってこれをスタートさせました。IHMC ができると同時に、リアの培養も始めておりまして、取れた培養株に関しても、そ の 背 景 に あ っ た ん で す が、 米 国 の NIH が Human

やはり NGS で、そのゲノム情報を得るというわけです。

− 202 −

第 26 回表彰・贈呈式記念講演 「ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜」

これはリファレンスゲノムというわけです。これは 1 個のわかっていただけると思います。

バクテリアの全ゲノム情報がそれぞれ入っておりまして、

もう一つおもしろいのは、家族間で似ているとか、お母

それが今 7,000 株以上たまった、これもデータベースになさんの菌が子供にうつるとか、そのような話があるんです

ります。このデータベースを利用して、メタゲノムで得らが、結論から言いますと、皆さん個人個人は、親子に関係れた配列がどのゲノムに由来しているか、どの菌種から来なく、自分自身の独自の菌叢を持つということに帰結しまているかというのをマッピングという方法によって調べるす。

ことができます。このようなやり方で菌叢解析をしており

これはアメリカのデータで、154 名の親子と双子を、双子も一卵性と二卵性双生児の子供の糞便、腸内細菌を見る。

ます。
これは、126 名の日本人の方で、青いのが 19 歳～ 59 歳

さらにこれは経時変化をとっていまして、自分自身同士をの成人で、緑が 1.5 歳～ 8 歳の、離乳後の赤ちゃんから小比べる。縦の軸は、ここに書いてありますように、高くな

学生、それと離乳前の赤ちゃん、これは 5 ～ 6 名しか書いるほどそれぞれの菌叢の間の類似性が低くなる。UniFracてありませんが、その腸内細菌がどのぐらいの菌種を持っdistance と言うんですが、これが短いほど類似性が高いとているか、どのぐらいの菌種数でできているかを調べた図

いう、ちょっとややこしいんですが、そういうような、細です。このように、生まれたての赤ちゃんは 30 ～ 40 菌種

菌叢間の似ぐあいを調べる方法があります。それで調べたでできていますが、一たん離乳しますと、2 歳でも 3 歳でのがこのデータでして、大事なことはここを見ていただきもほぼ大人と一緒ぐらいの菌種数を持つようになります。

たいと思います。この 2 人は、一卵性にしろ二卵性にしろ、以降、成人になりますと、このようなでこぼこはあります

兄弟です。このぐらいの類似性、違い性があるのですが、が、大体 150 とか、そのぐらいの菌種がここで検出できる

自分自身の distance が短くなっており、自分自身と極めてということになっています。このように、おぎゃあと生ま似ている。それに比べて兄弟というのはあまり似ていないれてからだんだんと菌叢ができ上がってくるというのがわということを実は示しています。左は全くの他人同士の似かっていただけると思います。

ぐあいでして、全く違うという場合はこのぐらい。一部、

このようにして菌種数を調べることができるということ

親子とか兄弟間で似ますが、自分自身と比べると区別がでと、あとは菌種の組成を見ることができる。ここにも乳幼きるぐらい兄弟間でも違うということを言っています。

児から成人の各 126 人の菌種組成を見ています。腸内細菌

これはなぜかというのは簡単でして、先ほど言いましたというのは、ヒトの常在菌というのはすべてそうなんです

が、我々は 10 個の人間がいるけど、その 10 倍このバクが、4 つの種類の門レベルという、分類の仕方で一番大雑テリアが周りにいるということを考えてもらいますと、同把にバクテリアを分けるレベルを門と言います。門レベル

じ菌が来るということはまずあり得ないということから理ですと、ファーミキューテス、アクチノバクテリア、バク

解してもらえると思います。

10

20

テロイデーテス、プロテオバクテリア、その他ということ

各個人が独特の菌叢を持つことから、このような論文もであるんですが、基本的にヒトの腸内細菌というのはこの出ております。これは皮膚の細菌叢を使って個人識別をす

4 種類の門からできているというわけです。しかしながら、るというものです。コンピュータのキーボードがありまし

年齢によってその優勢性が変わる、メジャーになる菌が変て、皆さんこういうふうにさわります。そのときに、指のわったりします。しかしながら、一般的に成人になるとこ

皮膚細菌叢がここにくっつくわけです。そのときに、A さのようになるというわけです。

ん、B さん、C さん、それぞれがあって、それぞれがコン

これはアメリカのデータから取ってきたんですが、鼻腔ピュータを持っている。ここにいるキーボード上の細菌叢とか皮膚とか口腔内の、これは実はもう何百人とヒトが並と、その方の皮膚の細菌叢を取ってきて、どのぐらい似てんでいまして、それぞれの組成の割合が書いてあります。

いるかというのを調べて展開した結果がここにありまして、

一応ファーミキューテスの順番に並べているんですが、こ近いほどそれぞれが似ているということを示しています。

のように見ていただくと、腸内細菌はこんな感じですが、

ちゃんと A さん、B さん、C さんが分かれて、かつその人

この黄色なんかを見ますと、ほほとか皮膚とか口腔の中での皮膚細菌叢とその人のキーボードが極めて似ているといはこのプロテオバクテリアが結構たくさんいるとか、そのうことになるわけです。このような形で、法医学で使える

4 門の間において組成が部位によってちょっとずつ変わる

ぐらい違うと。ゲノム自身は、一卵性双生児とか親子とか、ということがわかるということ。あと、個人間で非常に多その辺は個人識別はすごく難しいんだけど、これは一卵性様性が高いというのがわかります。これを主成分分析しま

双生児の識別ができるぐらい厳密なものであるということ

すと、このように消化器系、泌尿器系、皮膚、口腔・鼻腔になるわけです。

がきれいに分かれまして、ここに書いてありますが、生息

きょうは皮膚の話にご興味あるということなので、ここ部位によって菌叢構造が大きく異なるということがこれでで、我々が実際やっている日本人の皮膚細菌叢の幾つかの− 203 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

実はやっておりまして、緑になるほどポジティブ、正の相菌種解析データを示します。
これは、人数も違いますが、個人が並んでいまして、耳関がある、赤がネガティブ相関。こういうこともやっておの裏とほほと腕と額 ── 腕というのは、前の、この辺なんります。これはまだ今のところデータだけでして、これかですが ── あと頭皮の 16S 解析をやったときの菌種の組成

らどうするかという大問題があるんですが、とにかく皮膚の多い順番で並べているという、こんなデータを得ること

細菌叢とは一体何だということを知りたいということで、ができました。基本的に、このブルーはプロピオニバクテ

多角的にデータを見るということを進めております。

リウムというものでして、その次の赤は、何となく赤が多

ここで一応皮膚の話は終わりますが、あと、先ほど唾液く感じるんですが、これはスタフィロコッカス。このようとか胃液が出てきましたので、唾液と胃液と糞便がどのぐなものが優勢している。しかしながら、このように見てもらい似ているかというデータを示します。同一の人から同らうと、同じ皮膚でも部位によって全然違うし、多様性も時に 3 カ所取ったというやり方をして、30 人ぐらい調べ

すごく高いということがわかっていただけると思います。

ました。これ各被験者なんですが、近くにいるほど菌叢がこれは、どのぐらいの菌種数でできているかというのを似ているということになります。見事に唾液と胃液は区別調べたものです。左に、我々の腸内細菌と、実はこれ、唾

つかないぐらいにごちゃ混ぜになっちゃう。一方、糞便は液と胃液と糞便のそれぞれを構成する菌種、これ何十人とこっちに来るというわけです。個人差はこれだけ長くなる

やっていますので中央値が出ておりますが、このぐらいの、ので、これは多様性のためです。すなわち、胃にいる細菌

左が菌種数、実測した菌種数と思っていただければいいと叢というのは基本的に唾液と一緒。これも、今まで胃は胃思います。それに対してほほ、前の腕、額、頭皮、このよの細菌叢がいるという話があったんだけど、実はそうじゃ

うに見てみますと、このように、皮膚の場合は部位によっない。もう唾液がそのまま来ているんだということを言って構成する菌種の数がかなり違うというわけです。こういていまして、一々胃液を調べることはなくて、唾液を調べう場合は多様性が低い、かなり限られた菌種でできている。

ればその人の胃液がわかるということを実は証明しており一方、腕は、便とか唾液に比べてもっと多くの菌種で構成ます。
次に唾液にいきますが、これは非常におもしろくて、こされているということがわかりました。
下の Chao1 というのは、ここにある 3,000 のデータを用こに書いてありますが、概日リズムを持つ。菌叢の揺らぎいたときに実際に得られた菌種数なんですが、この 3,000がありまして、それが 24 時間で揺らいでいる。24 時間ごというものを無限大に増やしたとき、どれくらいまでこのとに同じ菌叢に戻っているということを実は証明しており

菌種数が大きく増えるかという、そういう estimation なんます。

です。そうすると、ちょっとここに桁が変わりますが、傾これはある人なんですが、4 時間ごとに唾液を取りまし

向は全く一緒なんです。実際このぐらいの菌種数で、皮膚て菌叢を解析します。実際、菌種の組成解析はこういうふの場合でしたら 300 とか 400 できるということがわかった。

うに揺らぐんですが、これをもう少し門ごとに調べますと、

あと、これは年齢による違いを見てみました。先ほどのこのようなでこぼこ、これ 3 日ほど調べているんですが、菌種数なんですが、n は 18 と 19 で少ないんですが、23 歳

1 日ごとに増えたり減ったりする、こういうふうになりま～ 37 歳と 60 歳～ 67 歳の間で、それぞれ先ほどの部位にす。これの自己相関係数をとります。すると、このように、対して菌種数を見ますと、このような感じで得られまして、

24 時間で最大の自己相関係数になる。すなわち、24 時間

どうも皮膚の細菌叢というのは年をとるほど多様性が増えで最大ということは 24 時間をピークにするような概日リる。すなわち young の人に比べて 60 ～ 67 歳の場合は構ズムということがわかるわけです。かつ、これとこれで見成する菌種が多くなることがわかってきました。これはますと、ピークがお互い逆さまになるということがわかり

我々、唾液とか糞便、腸内細菌でやっているんですが、こます。

れらはあまり年齢による違いはないんですが、皮膚に関し

さらにもっと細かく、属レベルでやりますと、これは何ては結構明確に、部位にかかわらず、高齢になるほど菌種人も被験者を使っているんですが、どうも朝型菌がいると数が増えるというデータを得ております。

いうわけです。午前 4 時から正午ぐらいまでに増える菌がこれはもっと複雑なんですが、実は我々は細菌叢を調べいると。その後減るんですが、こういうタイプの菌。それるだけではなくて、皮膚についているといいますか、そこと昼型菌。これはおそらく正午ぐらいから夜の 8 時ぐらいにいる代謝物、いろんな低分子の代謝物も定量しておりままでずっと増える菌、その後減っちゃう菌とか、一方、夜して、そこで得られるいろんな代謝があるんですが、代謝型菌がいまして、夕方 16 時ごろからミッドナイトに増え物と、皮膚細菌叢を構成する菌種を並べまして、それの相ている菌。これも同じですが、こんな名前の菌がいますよ関解析。この代謝物が多いとこの菌種が多くなるとか、こと。あとは、このようにサーカディアン、24 時間するん

れが少なくなるとこれが少なくなる、そういう相関解析をだけど、個人ごとでばらばらという菌。時間はいつかわか− 204 −

第 26 回表彰・贈呈式記念講演 「ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜」

らないけど、ばらばらの菌もいると。こういうふうに唾液てきたわけです。

の細菌叢というのは、要するに人の生活リズムと同じよう

より具体的にイメージしてもらうために、実はある 1 人に彼らも菌叢が変わるということ。よくある質問で、食事のデータを持ってきております。この方は健常者なんですをした場合どうなるんだというのがありまして、口腔内のが、その中で異常が見つかったという人です。見た目は健場合、食事をしたときどうなるかを調べました。

常で、自覚もない人なんですが、調べてみると、まず日本

これややこしいんですが、食べる直前の、正午なんでお人の平均の菌種数の半分以下ぐらいに減っちゃっていたと

昼御飯なんですが、その菌叢を取っておいて、それから食いうのがわかったということと、あと、この人の菌種組成べる。食べた後、30 分置きに唾液を取っていったわけです。

なんですが、これ属レベルなんですが、まずBifidobacterium

その結果どういうことがわかったかというと、これ見えにとか Faecalibacterium というのが、通常の日本人には結構

くいスライドで申し訳ないんですが、3 人書いてあります

たくさんいる優勢菌なんだけど、この人はゼロ、全然検出が、この辺が 24 時間の変動の幅としてください。ところが、できなかったということです。あと、ほとんど健常者には食事をすると、30 分後ぐらいに一たん動くんです。すごいない Fusobacterium が 20 ～ 30 ％ぐらい占めるという、く菌叢が変わる。変わるんだけれど、24 時間のサーカデ優勢する菌になっていたという、この大きな違いです。

ィアンリズムほど変動しない。この幅よりも皆短いという

この方と最も類似した菌叢を持っていたのはこの B さん

わけで、ちょっと変動するというのがわかって、多くの場で、この方も健常者のボランティアでやっていたんですが、合は 90 分以内にもとに戻り、食事の影響がなくなる。こ

これがおかしいということで、ちゃんと調べると胃がんがういうことがわかってきました。すなわち、唾液というの

見 つ か っ た と い う こ と で し て、 こ の 人 も や は り

はどうも食事等の外的な要因よりも内的な要因でレギュレ

Bifidobacterium と Faecalibacterium がすごく少ないといーションがかかっている。すなわち、ほんとうに肝臓とかうことと、Fusobacterium が異常なぐらい多くなってい

腎臓とか、ああいう臓器と全く一体になっているような、た。腸内細菌というのはこのぐらいわかるんですね。それ

1 つの臓器のような振る舞いをしているということをこのも別に腸内でなくても、この場合、真ん中の方は胃がんだ

データは示しております。おそらく皮膚も、時間ごとに取ったんですけど、ただ、もうひとりの方は、今のところ何れるので、そういうことをやれば、皮膚の部位によってひも発症していないんです。でもおそらく発症すると思って、ょっとしたら違うかもしれないけど、あるかもしれません。

期待すると言うと変だけど、そのぐらい腸内細菌というの

ここまで来まして、腸内細菌の話を少しさせていただきは、この因果関係はまだはっきり言えませんが、いいマー
カーになるということを認識していただければいいかなとます。
2008 年から、このように腸内細菌の研究は世界的に進思っています。

んで、すごい発見の 1 つは、病気とすごく関係しているとそこで、これから少し、私たちのやっている研究で、おいう、前から病気と関係しているとは言われていたんだけ

そらく皆さん興味津々で聞いていただけることを少し話さ

れど、消化器系の病気でしょうという感覚だったわけです。

せていただきたいと思います。

ところが、そうじゃなくて、もう全身のあらゆる病気、ここれはメタゲノムを使った解析の話です。メタゲノムとこに書いてありますように、大腸がんは当然イメージあるいう方法自体は、平成 24 年の高校生の生物の副読本になんだけど、肝臓がんとか、神経系の難病ですが多発性硬化っているぐらいですから、今の高校生は皆メタゲノムとい症、自閉症等々、あと早産、未熟児も腸内細菌が絡んでいうことは知っているぐらいになっております。我々は日本るというわけです。代謝系、免疫系、神経系。そういうふ

人の腸内細菌をずっと調べております。一方で、このよううに絡んでいるということがわかってきました。

にスウェーデンとかデンマークとかロシア、アメリカ、中この絡んでいるという 1 つの指標は、その患者さんの菌国、スペイン、さらにはアフリカの原住民である、マラウ

叢を調べると、正常な方に比べて非常に構造が変わっていィに住んでいる方とか、ベネズエラのアマゾンの近くに住る。これを僕らは dysbiosis と、異常構造をとっているとんでいる原住民の人とか、実はそういうデータがたまって言っております。これは IBD、炎症性腸疾患を持ってきておりまして、全部合わせると 1,000 人以上になっています。

いるんですが、このように、healthy に比べて大きく変わ

ここで、各国の人の腸内細菌というのはどのぐらい似てるということと、もう一つの指標は、構成している菌種数

いてどのぐらい違うのだろうということを調べました。実が、病気になっちゃうと基本的に減る。いわゆる多様性が際日本人の場合は 106 人なんですが、これ成人ですが、経減っちゃうというのが一般的にあります。こういう病気で時変化もあって、1 人から何サンプルも取ったりして、合はすべてこういうことが検出されまして、どうも病気と腸計 178 サンプルの便をいただいて、シークエンシングで配内細菌の dysbiosis は関係しているということが明確にな

列データをいっぱい出して、いろいろバイオインフォマテってきたし、あらゆる病気と関係しちゃうということが出ィックスをやって、106 人の中に 23 million、2,300 万の遺− 205 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

伝子を見つけました。その中で、似たような遺伝子というと、日本人は赤ですが、やはり何げに日本人は日本人で塊のはありますので、それを排除するということで、ユニーをつくる、青のアメリカの人は塊をつくるというわけで、

クな配列、non-redundant な遺伝子として 106 名から約

それぞれ国々でお互い似ぐあいが違うんだなというのがわ

4.9 million、490 万のユニークな遺伝子を見つけました。

かるわけです。

このような遺伝子を見つけるわけですが、これに対してそのトータルをとったのが右の図でして、これは上にい先ほど言ったような KEGG とか COG というデータベース

くほどお互いが似ているというわけです。これは、1 つのに blast というやり方で、この遺伝子は何だ、どういう機

国の中の個人同士を比べたときの似ぐあいのボックスプロ

能を持っているんだというようなことを調べますと、機能ットです。右は、違う国の個人間の似ぐあいを調べたときに関する composition analysis ができる。もう一方、メタに、こんな感じになりまして、どうも違う国同士よりも国

ジェノミックにいっぱい得られた配列データ、リードを、内同士で比べるほうがお互いが似合うというわけで、これ前に言いましたが、レファランスのジェノムにマッピング

はすなわち国ごとに特異的な菌叢を持つということを実はという方法で、個々のデータがどの菌株から由来している示すことになるわけです。

かを調べると、バクテリアの composition analysis ができ

それをもう少し平均的にかきますと、こんなふうになりる。このやり方で、菌種組成と機能の両方で各国のデータます。それぞれの国の関係がここに見えます。近くなるほを比べることでその違いを見ようということをやりました。

どお互い似るということで、これを階層式クラスタリング

これは日本人の場合ですが、106 名の大人で、属レベルといいます。これでいきますと、大きく 2 つ、実は 3 つなで菌種組成を見ております。Bacteroides というのがあっんですが、大きくぱっと見た感じでは左と右に分かれて 4て、赤が Bifidobacterium とか、いろいろ優勢菌種はいるカ国ずつ。左はアメリカ、中国、デンマーク、スペインでんですが、このように個人間ですごくばらばらになっていすが、特徴は、ブルーの Bacteroides という菌が多いといるというわけで、これは先ほど言ったような個人間の多様うわけです。右は、Bacteroides はこのように少ないんで性が多いということになります。

すが、Ruminococcus というのは実は左に比べると多いとこれをもう少しまとめて、平均をとってみますと、日本いう特徴があります。これがベネズエラ、マラウィで、原人で一番多い菌種は何ですかと言われたときに、ボックス

住民ですが、原住民は似ていますので一緒くたにしますと、プロットなんですが、こういう幅で Bifidobacterium といここはここで独特に、Prevotella というものが多い。こううのが一番多い。その後、Ruminococcus 等々、こういういう特徴に分かれるというわけです。
そこで、目ざとい人はすぐわかっていただけると思いま

順番で各菌種が組成比を持っているというわけです。
この図自体は非常におもしろくて、これはベキ分布といすが、なぜ日本とスウェーデンとロシアが一緒なんだとか、う分布をしています。英語で言うと Power Law というわ

なぜアメリカと中国が似ているんだとか、何げに中国と日けです。これは何を言っているかというと、いっぱい菌種

本人は似ているんじゃないかと思うんですが、そういう答はいるんですが、その大部分をつくっているものはほんのえになっていない。このなぞ解きが非常におもしろくていわずかな菌種であるということを実は言っています。すな

ろいろやりました。

わち、例えば、アマゾンの本の売り上げがあります。アマ

もう一つ言い忘れましたが、Bifidobacterium というの

ゾンは何十万冊という本があるんだけど、その売り上げのは日本人だけに独特に多いんですね。これもなぜ多いか、多くを上げているのは前の 100 冊であるとか、それと同じ

今のところまだ解を得ていませんが、こういう結果になっようなことが見えまして、なぜ自然界においてもこういうています。

ことが見えるのかという数理的な問題が残っておりますが、腸内細菌に影響するものが何かというのを調べますと、

数理的にこれを解決するということがあるわけです。こうやはり当然日々の食事があるわけです。実はもう一つ我々いう基本構造がある。

が最終的に見つけたのは、抗生物質の使用量というのがあさて、各国の比較ですが、これは門レベル、これは属レります。この 2 つのデータベースをとってきます。これはベル。門が一番分類が大まか。ぱっと見た感じで、各国で、

食事情報、FAOSTAT というデータベースがありまして、

特に日本はほかと違うなというのは見てもらったらわかる

これはかなりお墨付きがある、119 の food item の毎年の、んですが、属レベルでも何げに国々で違うなというのがわ

1 人何グラム食べるかという dietary data があります。こ

かっていただけると思います。

のデータと、もう一つは、各国が出している抗生物質の使

それを、千何十人か忘れましたが、とにかく各被験者の用量のデータがあります。これを調べる。

似ぐあいで、これは主成分解析なんですが、このようにド

まず初めに食事情報を調べますが、これが FAOSTAT

ットをしますと各個人がドットされるんですが、近くにいでして、1961 年からやっていて、245 カ国のデータが毎るほど似ているというふうに考えてください。そうします

年出ている。1 人 1 日何グラム、ここに細かいですが、ビ− 206 −

第 26 回表彰・贈呈式記念講演 「ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜」ールとか、ポテトとか、豚肉とか、こういう量が各国のデ

実は抗生物質です。いろんな抗生物質がありまして、実はータとして得られています。このデータを利用するわけで11 カ国のデータがあるんですが、ベータラクタム系とか、す。先ほどの相関解析をするわけです。

total antibiotics とか、テトラサイクリンとか、いろいろ

菌種組成の増減と各国の食事データの相関解析をずらっなデータが出ておりまして、それと各菌種の増減を見たととやりますと、結果的にこういうデータが得られます。こころ、先ほど食事とは全く関係なかった Bacteroides が有れは横が菌種で、縦が、食事情報を 9 種類に分けました。

意 に ベ ー タ ラ ク タ ム、 い わ ゆ る ペ ニ シ リ ン と か、total

穀物とか、海産物とか、動物製品（animal products）とか、

antibiotics の量と極めて正の相関をすることがわかりまし

オイルとかシュガー、こういうふうに大きく 9 つのカテゴた。これがその相関図でして、この相関係数も極めて高く、リーに分けて相関解析をしましたが、こういう結果が得ら

これ以上言うことないというような相関が出ております。

れ ま す。 赤 が 正 の 相 関 に な り ま す。Prevotella と か

抗生物質の使用からの各国の関係を先ほどと同じように

Succinamonas という菌が、ある意味、炭水化物ですね、穀クラスタリングしますと、こんなような相関図が出ます。

物類と極めて強い正の相関をする。一方で、逆相関するのすなわち、ここできれいに分かれるわけです。たくさんが動物性の食べ物であるというデータが得られるわけです。

antibiotics を使う国は左に来まして、幸い日本は少ないでもう一つ、全く逆の相関する菌種としまして、Ruminiclostridium

す、low antibiotics でここになりまして、菌種組成との関と Akkermansia というのが全く逆で、穀物類にはネガテ係と antibiotics の関係というのが極めて高い相関を示してィブな相関を示す一方、animal products に対しては正のおります。ただし、ベネズエラとマラウィは、さすがに抗相関をする。すなわち、例えばこれ、animal products を生物質のデータがないので外しておりますが、このようにいっぱい食べる国では、この Prevotella とこれが少なくて、して、食事以上に抗生物質の使用量のほうが我々の菌種組

Ruminiclostridium と Akkermansia が多い。そういう傾向

成と相関するというデータになったわけです。

を示すということになって、かつこれは統計的に有意であ

今の量はヒトに対する抗生剤でした。ところが、アメリ
カなんかを見てもらうとわかるんですが、実はヒトよりもるというふうになるわけです。
一方、先ほどクラスター解析の図で Bacteroides が左の

5 倍ぐらい使っているのが家畜です。実は家畜にえさのご

国に非常に多く占めると言っていたんですが、このメジャとく使っているわけです。実際その家畜の抗生物質の影響

ーな菌に対しては、食事というのは全く有意な相関を示すを見ようということで、7 カ国のデータを得ることができものはありませんでした。すなわち、Bacteroides に対応ました。これはトータルの抗生物質になるんですが、それする食事というのはどうもなさそうであるということになと先ほどの Bacteroides の相関を見ますと、これも見事に、ったわけです。そこで僕らはもう少し詳しく、なぜそうな

単に消費量だけでも高い係数だし、各国の人口で割ってもっているかということを調べました。

高い相関係数が出まして、ヒトの抗生物質だけじゃなくて

これは 2011 年の FAOSTAT の食事情報を、プロテインとリピッドと炭水化物の割合で分けて、このデータで各国

家畜の抗生物質に対しても極めて高い相関を示したことになります。

の関係、食事の似ぐあいをクラスタリングするとこういう

もう一つ、よく我々は院内感染ということで耐性遺伝子

ふうになりまして、予想どおり、日本と中国というのはほが蔓延して大変なことになっているというのが病院などでかの西洋国に比べるとやはり似ているわけです。だから、言われていますが、実はその耐性遺伝子がどこから来てい日本は西洋化されたと言っていますが、食事に関しては全るかを調べたのが、これは 2011 年のデータです。ちょっ

然されていない。相変わらず欧米とは違う。この認識をまと見にくいんですが、単純に言いますと、farm から来てず持っている必要があるというわけです。

いる、あと食事からの耐性、要するに農場にいる耐性遺伝

先ほどのデータですが、食事データから得られた各国の子及び食事中に含まれる耐性遺伝子と、腸内細菌が持って関係が右にかいてありまして、菌種組成から得られた各国

いる耐性遺伝子が極めて似ている。赤いということはものの関係が左にかいてありまして、先ほどの質問にありましすごく似ているということで、要は、実は farm から抗生物たように、なぜスウェーデンと日本が近いのかということ

質耐性遺伝子が来ている。すなわち、腸内細菌の環境と家と、全然食事は合わない。日本と中国では食事が似ている

畜等の環境というのはお互いが association している。すんだけど菌叢が合わない。というわけで、先ほど言ったよ

ごいコネクションを持っているというわけで、そのことか

うに、食事だけでは菌種組成、腸内細菌はレギュレーショ

ら言うと、我々のデータもそのことをサポートするというンされていないということをこれが示していることになることになるわけです。
だから実際こういうことが起こっているんじゃないかとわけです。
次に、一気に調べたわけではないんですが、このなぞをいうわけです。抗生物質というのは、第一次か第二次世界解くのに 2 年ほどかかりました。それでたどり着いたのが大戦か忘れましたが、100 年ぐらい前に初めて出てきたわ− 207 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

けです。だから当時は抗生剤はなかったわけで、基本的には 2 人ですね。最後は、自分しか持っていない遺伝子はど

我々は感染症に苦しんでいたわけです。そこで抗生物質がのぐらいあるかを調べて、このとき、被験者数を増やして使えるようになってくるわけです。そうすると、抗生物質

いったときにそのような遺伝子がどのぐらい見つかるかをを使い出すと、基本的に我々の周りの菌の組成も当然抗生調べています。そしてこういうグラフを得る。
これはすなわち何を言っているかというと、この辺はも物質の影響を受けるわけです。
例えば、緑とオレンジの菌がいるとします。これが抗生うすべて平らになっていますよね。2 人以上が同時に持っ物質に耐性度が高いとしますと、初めはぷつぷつと普通にている遺伝子というのは、100 人を超えるとほぼプラトー

いたんだけど、だんだん抗生剤の使用量が多くなってくるに達する。これ以上、100 人から 1,000 人に増やしても、と、緑とオレンジの菌が増えてくる。それがどんどん月日

見つかる遺伝子は個人に特異的な遺伝子がほとんどであるがたつにつれてもっと大きくなる。我々はそれを次の世代ということを実は言っていて、だから、我々が 106 名調べに、赤ちゃんが実は曝露されるわけです。すなわち、昔にている理由は、もうこれで大体その集団における遺伝子を比べて年代とともにそれぞれの各世代は違う細菌叢ででき確保しているということになる。ほんの一部じゃないかとている。先ほど、腸内細菌の違いは病気と関係すると言っいう疑問に対して答えています。あと見つかるのは個人にたわけですが、今の現代病が結局こういう関係にあるとい特異的な遺伝子ばかりになるということになるわけです。

うのがわかっていただけると思います。抗生剤が多くある

そういうことを実は言っております。

ほど感染症は少なくなるんだけど、日本、アメリカもそう

こういう機能の話で非常におもしろかった論文はこのですが、現代病が増えてくる。現代病というのは、花粉症

2010 年のものです。これは、海洋細菌が持っているあるもあれば、自己免疫疾患、いろいろ、昔にはなかった病気

種の酵素、porphyranase というのがあります。これは、が増えてきているというわけです。

ノリやワカメの多糖類を分解する酵素です。これはポリフ

これを平たく言うと抗生剤の使用が今の現代病をつくっ

ィランという多糖類ですが、これを分解する酵素は海洋細ている、その原因であるということを実は物語っているよ

菌 が 持 っ て い る と い う 論 文 だ っ た ん で す が、 こ のうな気がするというわけです。これをやると結構ブーイン

porphyranase の遺伝子を調べると、日本人の腸内細菌もグを受けます。でもこれがサイエンスであり、事実ではな

この遺伝子を持っていたという論文です。それも 13 人中

いかなというのが腸内細菌の今の研究から出てきたという5 人が持っていて、その当時のデータでアメリカ人は 0 でことになるわけです。

あった。これはどうも日本人の腸内細菌が特異的に持って次に遺伝子の話、機能の話を少しさせていただきます。

いる遺伝子だというデータです。すなわち、どのように起実際我々は 490 万ほどの遺伝子を見つけたんですが、ほか

こっているかというと、遺伝子の水平伝播というのがありをスウェーデンとアメリカとデンマーク、スペイン、中国、

まして、海洋細菌が持っているこの遺伝子が何らかのこと

たくさんデータのあるところと比べるわけです。結局似てである種の腸内細菌にうつって、その腸内細菌がその遺伝いる遺伝子はどのぐらい、全く一緒の遺伝子はどのぐらい子を持つようになるというわけです。

あったかというと、このぐらいありまして、和集合はどの

我々はノリやワカメ、生で魚を食べます。そうすると、ぐらいかというと、約 1,000 万以上になりました。すなわ

この多糖類はどんどんおなかの中に入ってきます。そうす

ち我々は人類として 1,000 万以上の遺伝子を持っているとると、この遺伝子を持っている腸内細菌はそれをえさにでいうわけです。ヒトの遺伝子というのは 2.5 万ぐらいで、きます。すなわちエネルギーとして彼らは生きることがでそこから出てくるたんぱく質の種類みたいなものは 20 万

きる。一方、欧米の方は、例えばこういう菌がいても、ノ種ぐらいなんですね。それに比べたら全然けた違いに我々

リやワカメを食べる機会は少ない。だから、この菌はそのは多様な遺伝子を抱えているということになるわけです。

エネルギーとなるえさが来ないから、基本的に生きられな

もう一つの特徴は、日本人が持っている遺伝子の半分はい。日本人の中ではよく生きられるけど、欧米の方の中で日本人に特異的である。それは、先ほど言ったように、極は生きられない。まあ、そういうわけで、もっと後で調べめて特徴的な遺伝子が各国で出てきているといったこととたんですが、日本人は大体 7 割の方がこの遺伝子を持って一致するわけです。

いる。一方、欧米の人は、少し持っていましたが、3 ％ぐ

このような遺伝子を持つんですが、お互いが、例えば、らいしか持っていない。このように、食文化、習慣が腸内

これは我々 106 人を調べているんですが、そのうちの半分、細菌機能の獲得と維持に関係しているという論文が出たわ

53 名の人が共通して持っている遺伝子はいくつかというけです。しかしこれは全くの氷山の一角でして、先ほどののを調べたのがこのようになります。その次、30 ％の人

490 万の遺伝子を、多くのほかの国と調べた結果、日本人が共通して持っている遺伝子はどのぐらいか。そういうふの機能的特徴はこういうふうになりました。

うにして 20 ％、10 ％、5 ％、2 ％、で 1 ％。1 ％というの炭水化物の代謝とアミノ酸の代謝が欧米の方よも圧倒的− 208 −

第 26 回表彰・贈呈式記念講演 「ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜」に多いということと、膜合成、複製・組換・修復の遺伝子

マウスに移すと肥満になっちゃうとか、これはメタボリッ

が欧米に比べて圧倒的に少ない。このデータはある意味、

ク症のあるマウスなんですが、そいつの糞便を健全なマウ

日本人にとっては朗報なんです。なぜかというと、この修スに入れるとメタボリック症になる。すなわち、病気の細復というのは、傷がついたものを修復する遺伝子なんです。

菌叢があって、それが病気を起こす。その逆が、これは有だから、修復の遺伝子が多いことは傷が多いということで名な話でして、正常な、健康な細菌叢は病気を治すというす。我々のように欧米に比べて少ないということはあまりわ け で す。 こ れ は 2013 年 に 出 た ん で す。 こ れ は傷がついていないということになるわけです。だから、日Clostridium difficile が関係した慢性の炎症がありまして、

本人は長寿だとか、そういうのがあるんですが、そういう

通常は抗生剤と腸洗浄で治すんですが、これはほとんど治ことと関係してくるかもしれません。

らない。治癒率は 20 ～ 30 ％。ところが、これにプラス、

もう一つの特徴は、ちょっとこれは難しいんですが、メ

健常な人の便を移植する、便微生物移植なんですが、それタンを生産する代謝系というのが、日本人はほとんど持っをすると、一気に治癒率が上がった。これが 2013 年に出ていない。一方、酢酸を生産する代謝系というのはほかのまして、今 2015 年ですが、もう世界中でいろんな便微生

国より日本人が非常に多いというわけです。このメタンを物移植をやられて、ほんとうかいなというぐらいの治癒率

生成する代謝系というのは、いわゆる古細菌という、またがいろんな病気で上がってきております。

ちょっと違う菌種がいまして、極めて珍しいんですが、そうすると、正常な腸内細菌叢には病気を治す力がある

Methanobrevibacter という菌がつくる。しかし、このよと。僕らは、本田先生と一緒に、その中でどの菌がそうい

うに系が少ないということは、この菌を持っているか持っうことをやっているのかを探そうということをしたわけでていないかを調べているだけなんですが、日本人はその菌す。その中で僕らがねらったのは、Treg という、T 細胞を持っている人が非常に少ないという、これとこれが一致ですね。免疫細胞なんですが、これ 2 種類ありまして、しているわけです。

Th17 というのは炎症を誘発するような細胞です。一方、このデータからすごくおもしろいことが推察されます。

逆に炎症を抑えるのが Treg という細胞で、要するにこのすなわち、我々、炭水化物を食べると、酢酸とかそういうTreg がたくさんあると炎症を抑える。だから逆に、炎症

短鎖脂肪酸、これはヒトの細胞のエネルギーになるんですを起こしている、病気の人は、実は Treg が下がっているが、それと二酸化炭素と水素ガスを出します。だから、先んですね。このような、この T 細胞が上がったり下がったほど日本人は炭水化物の代謝能が高いと言いましたが、いりするんですが、この上がったり下がったりするのは結局っぱいこれが出てきます。ところが、これが右の反応にい何が起因しているかというと、実は腸内細菌であったとい

くためには、この水素ガスを何とか処理する必要があるわう話です。それは 2011 年ぐらいからわかってきたんです。

けです。水素ガスを消費する必然性があるわけです。そのさらにその中でどの菌が、というのを探そうとやったのがときに、どうも欧米の方は、この水素ガスをこういうルー

次のスライドです。

トで、メタン生成のルートで、最終的にメタンができて、実はこれ、先ほどから言っているマウスを使っています。

水素を消費してメタンを生成する。一方、日本人は、酢酸

ヒトの糞便を無菌マウスに入れて、ノトバイオートをつく

生成が多くて、この右のライン、こういう形でいっぱい水って、Treg をたくさん持っているマウスを探すという実素を使ってくれて、最後に酢酸ができる、こういうルート

験をします。Treg がぽっと上がるマウスを探すと、そのをどうも使っているみたいだと。

マウスから菌を取ってきまして、これを 2 万分の 1 に希釈

昔の文献があるんですが、欧米の方よりも日本人のほうして、要するに菌種数を減らす。さらにそれをマウスに移が呼気の中に含まれるメタンの量が少ない。日本人はメタ

植して、またそのマウスから Treg をいっぱい出しているンの量が少ない。これは遺伝子とかいっぱいいろんなこと

菌種を探す。こういうことを数回繰り返して、最後 30 菌が今まで調べられたんだけれども、結論は出ていなかった種ぐらいになったときにやめて、そこから培養して 17 菌んです。おそらくこれでしょう、というふうに今考えてい種まで取ったんですが、その 17 菌種を今度はカクテルをるし、酢酸をつくること自体がほんとうにむだがないとい

つくって無菌マウスに入れると、ボンと Treg が上がって、うか、これまたエネルギーになっちゃうので、そういう、

ここで Treg を上げる 17 菌種をつかまえたわけです。これ

すごく日本人にとってはいい話のようなメカニズムが入っは実際にヒトの糞便を入れたときに大体こういう菌種がでているみたいです。

きていて、だんだん赤くなっていくんですが、このように

それと、腸内細菌は病気と関係すると言いましたが、病していくと、最終的に 30 菌種ぐらいになったのが 4 番目

気になったために腸内細菌が変わっちゃったと思うんです

でして、そのうち取ったのが 17 菌種、この黄色で示してが、実はそうではない。変わった腸内細菌が実は病気を起いる菌が最終的に取れていたんです。

こすという話です。これは肥満マウスの腸内細菌を普通のこれおもしろいのは、この 17 菌種を 1 菌種ごとに無菌− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

マウスに入れて Treg の induction を見ると、1 菌種ごとはの生理状態というのは具体的にはどうなっているかという何の効果もないんです。17 混ぜるとドンと上がっちゃう。

概念がここに書いてあります。昔はヒトゲノム、ヒトの遺実際これはランダムに 3 菌種とか 5 菌種とか混ぜてやって伝子が大きく絡んでいるでしょうとか、食事がこのようにも、17 菌種ミックスに比べたら有意に上がらなかったと絡んでいるでしょうとか言っていたんですが、ここに書いいうわけで、どうも常在菌というのは単独ではフルに機能てありますように、常在菌がここに来まして、こいつのほしない。一方、病原菌は 1 種類で機能するんですが、そこうがすごく大きな影響を持っている。食事、ほかの環境、は概念的に違うなというのがあります。常在菌はチームで抗生物質の環境も実はこっちに影響して、よりこっちのほ機能する。それが常在菌の特徴である。すなわち、常在菌うに影響していると。こういうのがほんとうであって、今というのは極めて robust。1 個の菌が暴れまくったら我々多くの薬があるじゃないですか。でもあのターゲットは皆にとっては困るわけです。いつもいるから。だからそうい

こっちのほうのたんぱく質になっていますが、今後はおそうふうにさせていない。1 個 1 個は大きく影響しないよう

らくこっちをターゲットにするほうがより効果的ではないにさせるというような性格があるのではないかというわけ

かなと今考えている次第であるわけです。
こういうことで、ヒトマイクロバイオームの市場というです。
実際、この 17 菌種のカクテルを入れますと、腸炎を抑のは、今はサイエンスの話でしたが、今後いっぱいありま

制したり下痢を抑制したりする。これがほんとうのプロバ

す。メタゲノム技術というのは、常在菌だけではなくて、

イオティクスかなというのが、まあ、薬になると思うんで大気を見る、家畜・畜産、魚介養殖場、海洋、土壌。今はすが、なっています。

宇宙飛行士・ISS の中でも今やろうとしております。それ

このように、ばあっと今流しましたが、基本的に我々は、とあと病院施設がどんなふうな環境下にあるかというのを生命医学をやっているんですが、ベースとなる技術は、こより正確にメタゲノム技術で解析できるんじゃないかといこに書いたように、情報学、統計学、いっぱいあるビッグ

うわけです。

データからほんとうにいいものを出す、これが統計学で情ちょっとオーバーしましたが、ここで私の話を終わらせ

報学、こういうものが今後必要になってくるというふうにていただきます。ご清聴どうもありがとうございました。

考えているわけです。
先ほどの、便が病気を治すというわけで、ヒトの、宿主− 210 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

社会貢献を意識する研究テーマ立案について
荒牧

賢治

今回採択していただいた課題においては新しい構造をもついての基礎的な学術研究を中心に行ってきました。界面つエマルションである O/LC 型エマルションの化粧品への活性剤は多様な工業製品と製造プロセスに用いられており、応用を検討しました。界面活性剤は水中でミセルを作りま

特に化粧品においては性状や使用感の設計において主要なすが、濃度が高くなるとリオトロピック液晶を形成します。

役割を果たしています。そのため、化粧品関連の企業の方

この液晶相中に油滴を分散させたエマルションを O/LC 型と共同研究などを実施させて頂きましたが、基本的には応エマルションと呼びます。液晶相は粘性が高いゲル状であ用を強く意識して行う研究は行ってきませんでした。今回

り、O/LC 型エマルションもゲル状のエマルションが得ら

は研究室独自の研究シーズ（素材）を応用展開させることれます。この特性を活かして油滴中に化粧品用の有機系紫を試みたということで私としてもこれまであまり行ったこ

外線吸収剤を安定保持したエマルション製剤を得ることがとがないことでした。実際に研究成果を学会発表してみる

本研究の目的です。有機系紫外線吸収剤はある程度毒性がと産業界からの注目も純粋な基礎研究よりも高いことがわあるため、メイクアップ製品に配合した場合に肌に直接接かり、研究テーマの社会還元を意識して行うことが重要で触しないようにする必要があり、本研究は一つのソリューあることが認識できました。今回本研究助成に採択して頂ションを提案しました。

いたおかげで研究費の支援以上に、今後の研究テーマ立案

私の研究室では従来から界面活性剤の分子集合体（ミセに際して新しい指針が得られたことが一番の収穫です。
（横浜国立大学大学院環境情報研究院）

ルやリオトロピック液晶）についてその構造と構造変換に

平成 26 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
飯島志行

はじめに、コスメトロジー研究振興財団第 25 回研究助に具現化する際に強力なツールになると信じています。本

成を賜りましたこと、ご関係各位の皆様方に深く御礼を申

助成研究の遂行により、カチオン性高分子と脂肪酸の無数し上げます。当研究は無機微粒子の油中分散制御を目的との組合せから比較的簡便、自在かつ体系的に高分子分散剤

した高分子分散剤の構造設計に関わる課題であり、サンスの構造設計と微粒子分散制御の実現を予感する貴重な成果

クリーンや口紅などに代表される各種化粧品製剤はもちろが得られました。一方で、微粒子表面における高分子の吸ん、先進セラミックス材料やポリマーナノコンポジット材

着構造や非水系溶媒中における粒子間相互作用などのより料などのプロセッシングの場面でも極めて需要な役割を果

直接的な評価手法の開拓と理論的体系化による微粒子分散たす課題であると考えております。化粧品製剤開発を目的

化のメカニズム解明には、体系的に構造設計された添加剤とした観点からは、生体毒性の低い材料を使用したプロセ

を用いた基礎的な検討を継続する必要がある点も現実かとスの構築が必須である点で使用可能な手法や物質が大きく思われます。特に、原料として用いられている粉体ではそ制限され、その他の機能性材料開発にはない困難性も改めの粒子径、形状、表面粗さを一例とした基礎的物性の分布て実感した次第です。こうした困難性の高い分散系においが様々であり、より現象の解釈を複雑にしている点において、分散剤をはじめとした添加剤の選定やその配合量は長ても、解決するべき課題は山積しています。本助成で得ら年にわたって培われてきた経験に頼られている部分も少なれた成果を基盤に、引き続き微粒子の表面設計と分散安定

くはないことから、体系的な添加剤の設計手法や操作因子化技術の構築と現象の評価・理解に向けて努力して参りたの解明などの基盤技術の蓄積は、新しい材料や着想を迅速い所存です。

− 213 −

（横浜国立大学大学院環境情報研究院）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

研究を終えて落合

秋人

今回、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団より支念ながら、研究を始めてほどなくして海外の研究者から美援を受けて、美白剤としてのペプチドの研究をさせて頂い白に有効なペプチドが報告され、商品化までされてしまった。この研究は、私が 5，6 年前に新潟大学に着任して最初た。仕方がないので、我々の方向性は正しかったのだと自に始めた研究の一つである。美白剤に関して、これまでに分に言い聞かせるようにしている。

多くの研究が国内外でなされており、多数の美白剤候補化

ただ、我々の研究が終わってしまったわけではない。米、合物が既に報告されていた。しかしながら、世間を賑わし

特に未利用資源の一つである米糠を有効利用する、またはた多くの報道に見受けられる通り、それら化合物に関して高い美白効果を有するペプチドを設計するという本来の目安全性が担保されているとは言い難かった。そこで着目し的は未だ失われていない。今後何年かをかけて目的の達成たのがペプチドである。ペプチドはアミノ酸からなる生体のために研究を続けることになるであろう。近い将来、そを構成する成分であり、保水や皮膚の再生を目的として既の成果を報告することができると考えている。最後に、こに様々な化粧品に利用されているように、肌への適合性もの研究を遂行するにあたり多くの方々のご協力やご支援を優れている。また、新潟大学は日本有数の米所に立地する賜った。特に、私にペプチド研究の場を提供して頂いた新大学であり、米に関する研究が非常に多い大学でもある。

潟大学谷口正之教授、および本研究にご支援を賜った公益

その結果辿り着いたのが、米由来ペプチドを利活用する研財団法人コスメトロジー研究振興財団にはこの場を借りて究である。具体的には米（米糠）タンパク質を酵素加水分解

感謝の意を述べたい。 （新潟大学工学部機能材料工学科）

し、そこから美白成分を分離しようというものである。残平成 25 年度

研究助成

慈雨と執念、蝶とコスメトロジー
齋藤彰

コスメトロジー研究振興財団研究助成に採択を賜り、本それだけに謎は尽きず、対象自体は光輝材として当初より

当にありがとうございました。筆者は自身で競争的資金をコスメトロジー分野への深い関連を謳われながら、自身で得るようになって 20 年ほど経ちますが、たまたま幸運だは研究開始 10 年以上経てもまだ市場に貢献していません。

ったらしく、財源で大きな苦労をした記憶があまりありま

むしろ過去数十年、今に至るまで「発色再現」を謳った例はせん（普通の苦労はもちろん、しばしばです）。ところが本世界中に多いですが、結果は光特性の一部のみを利用した助成の開始年は未曽有の干ばつに陥り、暗黒の春から始ま場合が多く（それはそれで独創性の高い物もありますが）、ったのを今もよく覚えています。そんな中、乏しい残額を

光特性を十分に汲み出した真の応用はまだです。それだけ指折りながら必死で関連分野の助成を応募し、通ったのがに採択の眼力と恩義には何としても報いたいと思っていま

本助成です。干天の慈雨でした。
「これで学生も無理をせす。今回お陰さまで、生産技術で複数の進展が得られましず実験できる」「（約束もあった）少し遠い出張に行ける」とた。これをテコに、執念で世の役に立ちたい思いです。こ

本当に嬉しかった思いは今後とも忘れません。

れからも初心を忘れず、貴財団に受けた恩を返せるように

筆者のテーマは、輝くモルフォ蝶の（物理学的に一見、矛盾する）不思議な色に学び、それを工学で役立てる試み

励みます。
（大阪大学大学院工学研究科精密科学・応用物理学専攻）です。自然・生物は老獪で、多くの神秘を隠しています。

− 214 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

グリセリンとグリセリン酸
佐藤俊

化粧品・トイレタリー分野の市場調査を見ると、内訳と開発を進めてきた。グリセリン酸は、その構造からグリセ

して 46% がスキンケア製品であると推定されている（2012

リンの性質を保持しつつ、同時に有機酸類の機能を発現で年、出荷額ベース、矢野経済研究所ホームページより）。

きる化合物であると期待される。その生産方法は、従来のその多くの製品に、保湿機能や粘性等の物性制御のために

化学触媒反応ではなく、酢酸菌を用いた発酵法によるもの

グリセリンが配合されている。一方で、スキンケア製品にであり、グリセリンを原料とするバイオベース素材である

は、保湿機能だけが求められているわけではなく、美白

ことも化粧品素材として有利な点ではないかと考えられた。

も、アンチエイジングも、ニキビケアも、といった複数の

そこで本研究では、グリセリンの特徴に加えて +α の機能機能が要求される。これら複数の機能性を持たせるためにを有する素材の開発を目指して、グリセリン酸のスキンケ

は、一つの素材が複数の機能を発現することが最も簡単な

ア素材としての可能性を探索した。実験を進めると、グリ方法である。しかし、それぞれの機能性は、異なる作用機

セリン様の性質に加えて有機酸としての性質を持ち合わせ構により発現しているものが多く、一つの素材でカバーすることが確認でき、スキンケア素材としてのポテンシャル

ることの難しさは容易に想像できる。グリセリンに、現状は有していると考えている。さらなる +α の機能が見出さ以上の機能性が見出せるかと考えると、それは構造を見る

れれば、グリセリン酸はグリセリン +α の機能を有する新限り、難しい。そんな中、筆者の所属する研究グループでは、素材に成長すると期待している。

グリセリンの酸化誘導体であるグリセリン酸の量産化技術（国立研究開発法人産業技術総合研究所機能化学研究部門）

平成 26 年度

研究助成

自然という偉大な本を読み解く力出口茂2013 年 1 月に放映されたNHKスペシャル「世界初撮影！

言葉通り、自然は様々な技術革新に向けたインスピレーシ

深海の超巨大イカ」が 16.8 ％の高視聴率を記録して以来、ョンの宝庫である。中でも人の手がまだまだ及んでいない

ちょっとした深海ブームが訪れている。最近では深海を題

深海には、いまだ開かれてもいないページが多数残されて材にした映画やドラマが製作されるなど、メディアでの露いる。ところが自然という本をただ漠然と眺めるだけでは、出も高い。筆者の所属する海洋研究開発機構も深海ブーム

イノベーションにつながる発想は到底生まれてこない。

の恩恵を受けて認知度が高まったように感じられる。ただ筆者らが開発した MAGIQ は油分子の自己組織化によっ残念なことに、自己紹介をするときには、たとえ相手が研てナノ乳化を実現した技術である。従来のトップダウンと究者であっても「海洋研究開発機構」と言うよりは、「「しんは 180 度異なるボトムアップで乳化を行う着想は、実は熱かい 6500」を運用している機関です」と言った方が通りが水噴出孔と呼ばれる深海底から湧き出す温泉から生まれた。

良い。つまり「しんかい 6500」というハードは広く知られ海洋学や海洋生物学など、海洋に関連した科学を専門とすているが、ソフト面、すなわち「しんかい 6500」を使ってる研究者であれば、誰もが深海熱水噴出孔の存在を知って得られた科学的成果は、一部の専門家を除いてはあまり知いる。MAGIQ は、海洋科学の常識を界面化学という異分られていないのが現実である。これは大変もったいない話

野の視点で読み解いたからこそ生まれた技術なのだ。自然だ。

という偉大な本からヒントを得るには、それを読み解く力「人間が作り出したものは、すべて自然という名の偉大なこそが最も重要であると言えよう。

本の中に書かれている」というのは、サグラダ・ファミリ（国立研究開発法人海洋研究開発機構・アの設計で名高いアントニ・ガウディの言葉である。彼の− 215 −

海洋生命理工学研究開発センター長）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

有機合成とコスメトロジーの合体
林昌彦

有機合成化学者として、天然からはごく微量しか得られこれまで配糖体の報告例のない、3 -フェルロイル - γ - キないものを必要量安定かつ安全に合成・製造・提供するこニドをアグリコンとした配糖化研究を実施しました。する

と、さらには、天然物の性質・機能を凌駕する新規な物質と、予想していた O -グリコシド体だけでなく、C -グリコを創生することは最も重要なことだと考えております。そシド体も得られました。自然界にはフラボノイドの O -グの分野としてコスメトロジー分野は非常に身近な物質科学

リコシド体と C -グリコシド体の両方が存在しますが、同です。今回は「配糖化」をキーワードに申請し、採択してじアグリコンではどちらか一方です。フラスコ内では、一いただき、研究を実施することができました。自然界にフつのアグリコンから両方作ることができます。今回得られラボノイド類は極めて多種多様に存在し、配糖化された化た知見を基に、配糖化研究をより「深化」させ、真の意味で合物も数多く存在します。今回の助成期間では、まず、自のコスメトロジー分野に化学者として貢献できるよう今後然界にある O -グリコシドの一つアカセチン-7- β - D - ガラとも引き続き研鑽を積んでいきたいと考えております。
（神戸大学大学院理学研究科）

クトピラノシドの簡便な合成法を達成しました。さらには、

平成 25 年度

研究助成

本研究を通して感じたこと
平田修造

本研究助成の研究内容では、励起状態の寿命を数多く評のも事実である。本助成を受けて開発を行っている材料も、価することが性能の向上を得ていく上で極めて重要であっ現時点では後者に相当するため、具体的な商品ターゲット

た。本助成の資金を活用して導入した小型発光寿命測定装を定めて、具体的な仕様を目標値に掲げて研究を行うこと

置を用いることで、ドナー分子からアクセプター分子のエが必要となると感じている。このような取り組みに対して、ネルギー移動過程や、蓄積した励起子の寿命を正確に且つ是非産業界からもアカデミックの分野に積極的なアプロー

高速にスクリーニングすることができ、結果的に研究が加チをお願いしたい。

速した。この点に関して研究助成をいただいた公益財団法

また本研究者は、他の研究助成者および本内容の開発を

人コスメトロジー研究振興財団に心から感謝申し上げたい。

通して出会った若手研究者とコミュニケーションをとる中

本材料を産業的な展開のフェーズに引き上げるためには、

で、いいアイディアやスキルを持つ若手研究者が急増して報告書で記載した基礎的な性能が必要であることは間違いいることを実感している。このような研究者の研究は、第ないと感じている。本助成による研究者は、これまでに有3 者的な観点で見た時、著名な研究者をも凌駕するクラス

機 EL 材料の研究も行ってきたが、分子ベースとする光機の内容も数多く含んでいるように感じる。それゆえ、公益能性材料の用途は、最近光触媒、光ディスク、そして有財団の観点からこのような若手研究者に最大のチャンスを機 EL の材料に限定され、その他の学術的な多くの研究が与える場の継続的な提供を切にお願いしたい。

産業的な展開を見せていないと感じる。それゆえその他の
数多くの光機能性材料の研究が“おもちゃ”に留まっている− 216 −

（東京工業大学大学院理工学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 26 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
松岡秀樹

この度は，私の申請研究を採択くださり，誠に有り難う

研究は，私が 10 年以上研究を進めているイオン性両親媒ございました．個人的には，久しぶりに民間助成を頂いた性高分子について，「偶然発見した特性」が，コスメ関係へことになりました．私の研究は，高分子界面化学に関する応用できるのではないか，と思いつき，提案させていただ

非常に基礎的なものです．そのため，実際，やってみないいたもので，申請時にある程度出口を示すことができ，結とどうなるか分からない研究であり，先が見通せないた

果的にもそれが可能なことを示すことができました．しかめ，予算申請時に大変苦労することになります．新しい高しながら，これは，10 年以上にわたる「基礎研究」があっ

分子，新しい系になるので，「予想される成果」
を具体的にたからこそ，実現したことであり，いきなりの単なる思い示すことが非常に困難です．その一方，科研費でさえ，「予つき等では決してありません．やはりそのような「土台」が想される成果」を示す必要があり，ひいては，「社会にどの必要なのです．今年は，TV ドラマの影響で，「技術」といように役立つか」
まで，記すよう，要求されます．応用研究・

う言葉が流行ったと思います．もちろん技術は大事ですが，技術開発では，それが可能で，求められることは当然と思「科学」も大事なのです．数年前，政府内で，「科学技術」といますが，基礎研究は，「どうなるか分からない」から行ういう表記にするか，「科学・技術」という表記にするかで，ものであり，逆に言えば，結果が分かっているのなら，や議論になったことがあると聞いています．もちろん前者は，る必要が無い研究，と言うことになります．さらに，近年は，科学に基づいた「技術」であり，後者は，「科学」と
「技術」
の

私が
「若手」
であったころと大きく異なり，「若手研究者」を二つを意味します．この二つが共に等しく重視され，相乗重視し支援する傾向が強くなっており，年齢的に私には応効果を生み出していくのが正しい姿なのでは，と考えます．

募すらできない fund が非常に多くなっており，ますます（京都大学工学研究科高分子化学専攻）

研究環境が厳しくなってきた，と感じております．今回の平成 26 年度

研究助成

ひなた

陽向で生かせ、コスメトロジー
山路稔

このたびは、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に学反応を経てようやく DNA の損傷が起きることがわかり採択していただき、謝意を表したく存じます。その研究補ました。今度はこの DNA 損傷を引き起こす UV-C 光線を

助金にて UV サンスクリーン分子の研究の遂行完了を無事

コスメトロジーの力で人体への影響を軽減する分子の研報告できることを慶びに思います。有機分子の光化学・光究に至りました。UV- C 光線を効率的に吸収し、一時的で物理基礎過程を研究していた小生としては、何か応用に繋はありますが UV-A のサンスクリーンに化学的に変化し、がる研究を始めてみたいと常々考えておりました。人間はその役割を終えると元の UV- C サンスクリーンに戻る分子

太陽の下で一生暮らしていかなければなりません。近年紫を発見しました。自然科学の研究対象は無限です。次はサ

外線が良いも悪いも人体に与える影響は科学・医学に関す

ンスクリーン分子にプラス α の機能を持たせた分子の開発

るニュースや美容・化粧品業界で少なからず話題になってに挑みたいとワクワクしています。コスメトロジー研究振いました。小生近年、UV- C 紫外線により DNA が損傷す

興財団の今後の発展をお祈りします。

る光反応機構を基礎研究の立場から解明するに至りました。
とても小さな確率で光を二度吸収することにより起こる化− 217 −

（群馬大学大学院理工学府分子科学部門）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
市

皮膚異常は栄養不良の代表的な所見でありますが、栄養不良は様々な疾病において病状の進行を左右することが知育代

器に比べて特殊な脂質組成であると言われております。
必須脂肪酸欠乏には魚鱗癬と言われる皮膚症状がみられ、られています。栄養不良は食事摂取不足だけでなく、疾病

どのような脂質が皮膚症状の異常に関わっているかは未だや術後など様々なストレスに起因する代謝変化によっても不明でありますが、今後も必須脂肪酸欠乏時の皮膚障害の生じます。栄養不良は病状の悪化に関与するだけでなく、メカニズム解明に繋がる研究を行い、皮膚障害に関わる脂重症化すると死に結びつくことがあり、栄養不良には早期

質成分の探索を行っていきたいと考えております。

の診断が求められています。皮膚の異常も栄養障害でみら最後に、本研究を遂行するために研究助成のご支援を頂れる症状であり、見逃してはならない栄養不良の所見です。

きましたこと、更に研究の幅を広げるきっかけを頂いたこ

栄養不良に伴う皮膚障害では、皮膚の乾燥や皮脂量の減少とに関しまして、コスメトロジー研究振興財団ならびに関がみられますが、皮膚は分化度の異なる角化細胞が重層化

係者各位に、心より感謝申し上げます。
（お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系）

した構造をし、バリア機能を担っていることから、他の臓

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
宇都拓洋

この度、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択

ンピ（牡丹皮）も薬用化粧品に含まれているのをよく見かけして頂き、深く感謝申し上げます。私はこれまで、漢方薬ます。このように生薬などの天然物が化粧品素材として有の原料である生薬成分を中心に機能解析研究を行ってきま用であることは確かですが、それらに含まれる活性成分のしたが、皮膚や化粧品に関する研究経験はなく、本研究助

作用機序については不明な部分が多く残されています。白成によりコスメトロジー分野に研究の幅を広げることが出樺樹皮などから単離されたロドデノールによる健康被害が来ました。研究を進める中、ドラッグストアの化粧品コー問題になったことは記憶に新しいですが、天然由来成分のナーの商品を手に取り成分を確かめたり、化粧品 CM を注安全性試験の難しさや詳細な作用機序解明の必要性を痛感意深く見たりするようになりましたが、各メーカーの工夫しました。今回の助成による研究は、漢方薬の 7 割に含まを凝らした商品開発やアピール法は大変興味深いです。

れる重要な生薬であるカンゾウ（甘草）のフラボノイドに注

漢方薬とコスメトロジーの分野はオーバーラップする部

目し、そのメラニン合成に関する分子機構と標的分子の解分が多くあります。化粧水などに使われているハトムギは、析を行うことで、新しい知見を得ることが出来ました。こよく知られていることですが、ハトムギの種皮を除いた種の研究成果はコスメトロジー分野では小さなことかもしれ

子はヨクイニン（薏苡仁）と呼ばれ、いぼとりや肌荒れに、ませんが、今後も研究成果を積み重ねていくことで、コス漢方では利尿、消炎、鎮痛、排膿の目的に用いられていま

メトロジー研究の発展に少しでも貢献できればと考えておす。また、婦人病の漢方薬に使われるトウキ
（当帰）
やボタ

ります。

− 218 −

（長崎国際大学薬学部）

コスメトロジー研究雑感

平成 26 年度

研究助成

コスメトロジー研究雑感大沢匡毅

私が研究を続けていくうえでの一番のモチベーションのらです。近年の応用科学偏重の社会的風潮にも抵抗感を感

拠り所は単に生物学が好きだということであり、“自分のじます。応用研究は社会に直接貢献するので是非推進する

手で生命の神秘を解き明かしたい”という欲望に突き動かべきだと思います。また、研究費は税金で賄われているのされて研究を行っています。また、自然科学の中でなぜ生だから、納税者のためになる研究を行うべきだといった考物学に魅了されたのかといえば、生物学が観察という行為

え方も理解できます。しかし、科学研究を行う根源的なもに立脚した“見える科学”だからです。

のは研究者の好奇心であり、純粋に好奇心を満たしたいと

私は子供の頃から生き物が大好きでした。これまでにいう気持ちで行う基礎研究についても、もっと尊重される

様々な種類の生き物を飼育しました。彼らの生命の営みをべきだと思うのです。たとえその成果が社会貢献を果たさ日々観察し、そこから感動を得ることが単に好きだったのないとしても、少なくとも学問の進歩には何らかの貢献をです。そして、このような気持ちは自分のラボを構えるよするはずです。応用研究も学問の進歩がなければ成立しなうになった今でも何ら変わりません。

い訳ですから。残念ですが、最近は、基礎科学に情熱を持

私が皮膚の分野に転向したのはつい 15 年ほど前のことす。転向した理由は単純で、皮膚は観察するには打って付った学生に出会う機会がほとんどなくなってきました。
貴財団の助成金システムはとてもユニークだと感じます。

けの研究対象だからです。皮膚に異常が起こると、ハゲた

これほど広範囲かつ異分野のテーマを採択する助成システ

り、カサカサになったり、白髪になったりと、摩訶不思議

ムはないと思います。今後も、特定の方向に偏ることなく、なことがたくさん起こります。そして、“なんでこんなこ基礎から応用研究まで大きな視野でテーマを採択するポリとが起こるんだ！” と一大奮起できるのです。それが純粋シーを貫いていただきたく思います。この度は、我々の研に楽しいのです。

究に対し研究費を支援してくださいましたコスメトロジー

なぜこんなことを書いているのかと申しますと、それは、研究振興財団に心より感謝申し上げます。
（岐阜大学大学院医学系研究科生命機能分子設計分野）

私が日本の基礎科学を取り巻く現状に懸念を感じているか

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
柏谷

英樹

「香気」
は不可視な存在でありながら、
「こころ」
や
「からだ」

香気誘発性鎮痛という現象論だけではどうしても「怪しに多大な影響を与えるものとして、紀元前より人々の強いげだなぁ」という印象をぬぐえないところでしたが、ここ関心を引いてきました。現在でも「アロマセラピー」というに脳科学的なエビデンスを加えることができたのは、香気形で多くの方に親しまれています。しかしながら香気は必誘発性鎮痛を科学的に検証する上で大きな前進であったの

然的に嗅感覚を伴うためプラセボ効果が大きく、その効果ではないかと自負しているところです。オレキシン含有神を科学的に実証することは困難であると考えられてきまし経は鎮痛だけではなく、循環、呼吸、睡眠・覚醒、摂食なた。実際「香気で鎮痛効果を…」という話を学会で持ち出

ど多様な自律神経出力のスイッチボードとなる神経細胞ですと、それだけで「胡散臭い奴だ」という眼差しで見られす。アロマセラピーで用いられる精油の効能の「いくらか」ることも多々あり、研究費の獲得にも四苦八苦していたとは、精油の香気がオレキシン神経を介して自律神経調節をころをコスメトロジー研究振興財団の研究助成によりサポ行う結果なのではないか、と妄想する今日この頃です。

ートして頂き、心より感謝を申し上げます。

（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）− 219 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感木村郁夫

この度は本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興

イドの即時性機能について、この受容体を介した新たなシ

財団よりご援助頂きましたことを深く感謝申し上げます。

グナル伝達メカニムズにより証明が可能ではないかと考え

我々は現在、
腸内細菌叢や性差に関係する脂質リガンド（短ております。そして、さらには、この細胞膜受容体を創薬

鎖脂肪酸およびプロゲステロン）の細胞膜上受容体を介し標的とした新たな性差依存的疾患治療や、化粧品応用が可た即時性の生理機能（特にエネルギー制御関連生命現象）を能なのではと大いに期待し、我々一同、現在研究に精進し明らかにすることにより、肥満・糖尿病に代表される生活ております。本助成金のおかげで順調に研究も進行してお習慣病などのエネルギー代謝疾患の治療・予防に対する機り、さらには、これら細胞膜上の各種遺伝子改変動物を作能性食品、プロバイオティクス、そして創薬応用へ繋げる

成し、生体での機能について検討を始めたところで、ここことを目標に日々研究に励んでおります。特に本研究助成

からまた、新たな発見があると固く信じ、大変期待しておでの研究テーマである「細胞膜上の性ステロイドホルモン

ります。今後は、色々な分野に目を向けながらも、創薬研受容体」については、従来、ステロイドはその脂質特性か

究や化粧品開発に役立つ成果を挙げることを目標に、一緒

ら核内受容体に結合し、多様な生理活性を発揮すると考えに研究を進めてくれるスタッフおよび学生と共に日々、頑られておりましたが、この細胞膜上の受容体の発見により、張っていきたいと考えております。

今までの通説を覆す、今まで全く説明できなかったステロ（東京農工大学大学院農学研究院応用生命化学専攻）

平成 25 年度

研究助成

スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討、実験を終えて国定充

この度けい藻類で抗酸化作用を有するといわれていたがあり信頼性がある結果を求めた。また、スピルリナの原

Spirulina platensis（S. platensis：スピルリナ）が紫外線皮末を用いた皮膚線維芽細胞を対象とした実験もすんなりと膚癌において抑制するか、またその作用機序について本研は進まなかった。スピルリナに含まれるフィコシアニンお究はコスメトロジー研究振興財団の助成を得て遂行された。

よびフィコシアノビリンの至適濃度について研究グループ

しかし、論文採択に至る良い実験データを蓄積するには想内でも違った意見があり、紫外線およびスピルリナ添加に像以上の時間と労力を費やし、むしろそれらの苦労の方がより目的とするシグナル蛋白の変化がより明瞭に見られる

強く雑感として残っている。まず、紫外線のマウスに対す濃度を実験によりまたは文献の情報を参考に模索していっる慢性紫外線照射実験であるが当初は以前自分で確立したた。最終的には至適濃度を見つけることができ、結果シグ

プロトコル通りいかなかった。慣れない留学生に教えながナル蛋白のりん酸化が捉えられ、シグナル蛋白によってもらの実験であったが、マウスが紫外線照射による皮膚腫瘍

時間や種類により差異がかなり存在することも明らかに出発生を待っている間に別の病因により死亡させてしまった

来た。最後にこれらの研究成果は大学院生のヨギアンティ

り、少しの実験中の手間取りでマウス皮膚に余計な反応を他、統括して頂いた錦織教授、他の研究メンバーの協力が起こしたりと安定した時間内で終わることに努めることになければ到底なり得なかった。またスピルリナを対象とし終始した。当たり前のことであるが動物実験を対象にするて扱うにあたりスピルリナの原末や成分原末を提供して頂わけであるので in vitro 系のように安定した結果は出にく

いたDICライフテック社にも合わせて深く感謝いたします。

いのは分かっていたが、努めて細胞の実験のような再現性（神戸大学大学院医学研究科内科系講座皮膚科学分野）− 220 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー研究に寄せて白井康仁

今回、プロテインキナーゼ C（PKC）の活性化剤である

れていたとしても、それがヒトで再現できるかはまた別のジアシルグリセロール（DG）をリン酸化し、ホスファチジ問題である。かくして、研究は終わりの見えない旅だとつン酸（PA）に変換する脂質キナーゼであるジアシルグリセ

くづく思う。

ロールキナーゼ γ（DGK γ）のノックアウトマウスを作製し、旅のゴールはもちろん、人に役立つようなスキンケア商

その皮膚における機能解明を試みた。しかし、バリア機能品の開発である、多くのアトピー性皮膚炎や、魚鱗癬などを調べてみても、創傷治癒を調べてみても、今のところ顕の皮膚疾患に悩む方々のお役に立てれば、私の旅はどれだ

著な表現型は認められていない。DGK は皮膚の分化におけ有意義で楽しいことだろう。たとえ大きな皮膚疾患でないて重要な PKC の機能を調節でき、且つ基底層から有棘

くとも、日々の水仕事に手を傷めている方の力になれれば層にかけて発現が増加していたことから、皮膚の分化におと心から思う。なかなか、ゴールの見えない旅路ではある

いて何らかの働きをしていると考えられるが、残念ながらが、様々な人との出会いで、その道中や行き先は大きく変未だその機能は不明である。DGK には複数のサブタイプ

わるのかもしれない。小生の陳腐な研究成果を目にし、何が存在し、よく似た機能を持つことから、DGK γ KO マウ

か「こうすればよいのでは？」という奇特な御仁がおられれスにおいても、他のサブタイプが代償しているのかもしれば、ぜひしばらく旅を伴にしていただきたいものである。

ない。このあたりが、KO マウスを用いた研究の悩ましい

きっと、すばらしい未来が開けるのではないかと思う。

ところである。さらに、もし仮に KO マウスで表現型が現（神戸大学大学院農学研究科）

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
新藤

今回の研究は、我々が遺伝子改変マウスを用いた研究を進める中で、若年期より皮下脂肪層の肥厚と、線維化の亢隆行

分子メカニズムの解明が進むことで、アンチエイジング法
開発への展開が期待されると考えています。

進を認め、老化現象に似た組織像を示すマウスラインがた

超高齢者社会を迎えつつある我が国において、健康長寿

またま得られたことがその端緒となりました。我々はホメという問題は避けて通ることのできない重大な課題となる

オスターシス維持に関わる生体内システムの研究を行ってと同時に、老化とアンチエイジング研究の、今後ますますいますが、老化現象とは、ホメオスターシスを制御する生の発展が望まれます。

体内システムが、環境に応じて適応や変容を繰り返し、徐々今回の研究課題採択にあたり、コスメトロジー研究振興に調節異常が蓄積した状態とも考えられます。従って、今財団および選考に当たられた先生方に、心より御礼申し上後、生体内ホメオスターシス維持に関わる生理活性因子のげます。 （信州大学大学院医学系研究科循環病態学講座）− 221 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジーとは何か？
榛葉

何となくはわかるが、言葉あるいは文字にして説明でき
る自信はない。

繁紀

体内時計、正確には時計遺伝子による生体機能調節機構の解明である。簡単に言えば、1 日を通じて皮膚機能はどの私が専門とする薬学には香粧品学がある。どうやらそれように変化し、それはどのように制御されているのかを知と似ているものか？これが本研究助成事業に応募するにありたいと思っている。今回の研究では、皮膚の機能が内的たっての私の正直な気持ちであった。助成期間が終了する

因子（時計遺伝子）と外的因子（光）の両方により制御されて現在に至って、香粧品学と違うことは理解できた。しかしいることを示すことができた。これら知見は、皮膚の機能

まだコスメトロジーとは何かを説明できない。
「何を寝ぼを適切な状態に保つためには生活環境と体内時計の協調、けたことを」とお叱りを受けそうだが、本研究助成事業にすなわち規則正しい生活時間を過ごすことの重要性に科学採択されたテーマのタイトルをみていただければ、それを的エビデンスを与えるものである。このような研究もコスご理解いただけると思う。すなわちコスメトロジーがカバ

メトロジーの裾野の広さの拡大の一助となれば幸いである。

ーする範囲は科学から文化まで多彩であり、裾野の広さと最後ではありますが、今回、研究助成金のご支援をいた懐の深さを感じさせる。だからこそ私のような異端な研究

だき、あらためてコスメトロジー研究振興財団に心からお者まで受け入れていただけたと感謝する次第である。

礼申し上げます。

（日本大学薬学部健康衛生学研究室）「異端」と書いたが、私の主要な研究テーマのひとつは、

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
乃村俊史

アトピー性皮膚炎は非常に common な疾患ですが、長現在もこの両分野は私の研究の基軸となっています。またらくその病態はクリアに説明されておりませんでした。

その後、2008 年から約 2 年半、再度 McLean 教授のもと2006 年にスコットランドの McLean 教授によりアトピーに留学し、今回の研究の基盤となった遺伝性疾患に対する性皮膚炎の多くが遺伝的に皮膚バリア機能異常を有してい治療開発に関わる研究に従事いたしました。アトピー性皮ることが解明されましたが、これは我々皮膚科医のみなら膚炎のメインの病態が皮膚バリア機能異常─特にフィラグず、世界中の医師に大きな衝撃を与えました。皮膚バリア

リン遺伝子変異─であることが解明された今、患者皮膚で機能異常と免疫異常の両方が疾患の形成に関わっているこ

フィラグリンを増やすことでアトピー性皮膚炎の治療や予とは古くから指摘されていましたが、どちらかと言えば後防ができることが期待されています。今回の研究で用いた者が病態の中心にあると思われていたからです。2006 年

リードスルー治療をはじめとした新しい治療法が開発され、当時、卒後 5 年目であった私はすぐさまスコットランドに多くの患者さんが苦しむアトピー性皮膚炎治療の新時代が行く機会を与えられ、１ヶ月間みっちりと手技を学ぶだけ来ることを願ってやみません。最後になりますが、本研究ではなく、最新の疾患概念を McLean 教授から直接学ぶとにご支援を頂きましたコスメトロジー研究振興財団に深謝いう貴重な体験をすることができました。これによりアトいたします。（北海道大学大学院医学研究科皮膚科学分野）

ピー性皮膚炎と皮膚バリア機能に興味を抱くようになり、− 222 −

コスメトロジー研究雑感

平成 26 年度

研究助成

新たな NSAIDs の創製を指向して
原俊太郎

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択していただき、心より感謝致します。

生合成を抑えることで、痛みをとめてくれます。腰や膝が痛い時は、特に、ケトプロフェンテープなどの NSAIDs を

今回私は「皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合含む外用鎮痛付剤がとても有効ですが、これらは長期に貼成酵素群の機能解析」という研究課題に助成いただきまし

り続けると皮膚がかぶれてしまうし、薬によっては光過敏た。私事ですが、若い頃からかなり太ってしまった私は、症のような副作用も気にしなくてなりません。すぐに痛み

最近になり、腰や膝の痛みに悩まされています。痛みをやをとめてくれる一方で副作用の少ない NSAIDs をつくるこ

わらげるためには、やせることと、患部の周りの筋肉を鍛とができないか？これが私たちの研究の目的です。今回得えることが大切なのはわかっておりますが、痛みを感じるることができた研究成果を、少しでも臨床応用へ結びつけ

とき、何よりも助かるのは様々な非ステロイド性抗炎症薬ていきたいと考えております。

（NSAIDs）です。NSAIDs はシクロオキシゲナーゼという（昭和大学薬学部社会健康薬学講座衛生薬学部門）

酵素を阻害し、私の専門領域であるプロスタグランジンの平成 25 年度

研究助成

細胞社会のダイナミズム
藤原裕展

皮膚は単純な器官だと思われる方が多いのですが、実は皮膚に存在する細胞たちが、どのように折り合いをつけな

非常に複雑な器官です。まず、皮膚には由来の異なる様々がら、そして協力しながら皮膚という細胞社会を形成してな細胞が存在します。外胚葉由来の表皮細胞、中胚葉由来

いるのか、興味は尽きません。

の立毛筋、血管細胞、線維芽細胞、毛乳頭細胞、脂肪細私が行っている研究は非常に基礎的な研究ですので、臨胞、種々の免疫系細胞、そして、神経堤細胞由来の色素細床応用を簡単に展望することはできません。しかし、長い胞、末梢神経などです。さらに、これら多様な細胞が、発目で見ると、正常発生を知ることで、発生異常としての病生期に適切な時に適切な場所で増殖分化し、適切な細胞と気の仕組みを理解することに貢献できるでしょう。また、

出会い、相互作用することで、はじめて精巧な皮膚構造

発生メカニズムの理解は、失われた組織の再生にも貢献すができあがり、皮膚特有の生理機能が発揮されます。これ

ると考えます。これからも、皮膚の細胞社会の成り立ちをほどまでに複雑で精巧な器官が、自律的にできあがるとは、研究することで、基礎科学の発展に関わっていきたいと思まったく驚くしかありません。今回の研究では、発生といいます。

う長い旅の途中で表皮細胞と感覚神経という全く異なる旅

最後になりましたが、本研究をご支援いただきましたコ

路を経た細胞が、毛包バルジで再会するドラマに立ち会う

スメトロジー研究振興財団及び関係者の皆様に、心からおことができました（感覚神経の核は脊髄のすぐ近くにあり、

礼申し上げます。

皮膚まで長い軸索を伸ばしています）。この出会いのスト（理化学研究所 多細胞システム形成研究センター

ーリーを、早く多くの皆様に知って頂いて、皮膚科学や発生生物学の面白さや魅力に触れていただきたいと思います。

− 223 −

細胞外環境研究チーム）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 26 年度

研究助成

研究室運営は自転車操業
水品

善之

この度は、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団

あり、阻害剤を中心とするコスメトロジーらしいテーマをの第 25 回（平成 26 年度）研究助成を賜りまして、誠にあり強引に設定して応募しました。不採択になってから、真剣がとうございました。昨今の大学は、大学本部からの研にじっくりと考えて、逆転の発想、すなわち「阻害剤」
では究費（校費）が削減され続けており、外部資金を獲得しない

なく「活性化剤」が想い浮かびました。そして、翌年の応募と研究レベルが維持できなくなっています。公官庁や民間では無事に採択となりました。従って、私の本財団の戦績

財団の競争的研究費に積極的に応募し続けて、かなりの高は 1 勝 1 敗の勝率 5 割になります。しかしながら、他の民倍率の競争の中でどうにか食いつないでいる、まさに綱渡間財団の研究助成金については、私のテーマ設定が悪いのりの自転車操業状態です。本財団の研究助成は、一年前のか、文章表現が悪いのか、なかなか採択に至りません。近

第 24 回（平成 25 年度）にも「植物精油から哺乳類 DNA 合

年は自身の採択率が 10 ％くらいと厳しい結果になっていま

成酵素の分子種選択的活性調節成分の探索と化粧品開発へす。それでもめげることなく、日々の研究活動（近年は教向けた抗炎症・抗アレルギー作用の解明」というテーマで育活動や大学運営活動も非常に多い）の合間に申請書を書応募しましたが、残念ながら不採択でした。当時の私は、き続けている状態です。

（信州大学大学院農学研究科）

DNA 合成酵素の阻害剤を探索・研究することがメインで

平成 25 年度

研究助成

表舞台に登場したミトコンドリア柳

私は以前内科の医師として病院勤務をしておりましたが、茂アの機能は悪くなり有害な活性酸素を大量に作り出し、遺原因もわからず有効な治療法もない病気が多いことに驚き

伝子やタンパク質を壊してしまいます。それが原因でがん、ました。病気の原因を解明し、根本的な治療法を開発した

アルツハイマー病、心不全、老化など様々な病気を引き起いと考えて研究の道を志したのですが、なかなか思い通りこすことがわかってきました。今ではこれら一連の研究がにはいかず日々悪戦苦闘しています。現在興味をもって研大きな流れとなり、「ミトコンドリア疾患学」なる新たな分究を進めているのはミトコンドリアです。いまでも神経細野が生まれています。ミトコンドリアは疾患の裏舞台から

胞のミトコンドリアの動画を見て興奮したのを覚えていま

表舞台に登場してきたのです。最近私たちは、ミトコンド

す。ミトコンドリアは融合と分裂を繰り返しながら活発に

リアの機能を良くする新しい酵素を発見し、MITOL と命動き回っていました。先祖はバクテリアだったことが納得名しました。MITOL を増やしてやるとミトコンドリアかできました。なかには細胞の外に飛び出そうとする挙動不らの活性酸素は減少し、ミトコンドリアはとても元気にな

審なミトコンドリアもあり、他のオルガネラとはまったくります。MITOL の役割を解明することにより、ミトコン

異なる不思議な動きをしていました。このようなミトコン

ドリア機能の破綻を予防する新しい創薬の開発が可能にな

ドリアの動態は、ミトコンドリアダイナミクスと呼ばれ、るのではないかと期待しているのですがそんなに簡単には

世界的にも注目される研究テーマの一つになっています。

いきません。

ミトコンドリアダイナミクスが破綻すると、ミトコンドリ− 224 −

（東京薬科大学生命科学部）

コスメトロジー研究雑感

平成 26 年度

研究助成

なぜ自閉スペクトラム症児の嗅覚特性に着目するのか
熊﨑

私は児童精神科医師として臨床の立場から自閉スペクトラム症（Autism Spectrum Disorder）児に関わっている。

博一

りわけ感覚過敏は高頻度に起こっていることが報告されている。

ASD は有病率が高く、また根本的な治療を認めないため

自閉スペクトラム症児にとっての感覚の問題は本質的と社会問題となっている。ASD の介入・支援には新しい発の見方もあり注目を集めているが、嗅覚についてはその伝想が不可欠と考えている。ASD 児の多くには、社会コミ

達経路が視床を通過しないこともあり注目されてこなかっュニケーション障害、限局的な興味関心や反復的行動などた歴史があった。一方で臨床場面において当事者から垣間だけではなく、感覚や運動の問題が見られる。2013 年に見ることができる嗅覚特性は社会的な困難及び予後と直結発刊されたアメリカ精神医学会の診断基準である DSM-5しており深刻な問題が多いと考えられた。Bromley らの調においても ASD の診断項目において感覚の問題が取り上査によると ASD 児の 41 ％に臭いに対する過敏が起こってげられているように、感覚過敏や感覚刺激への低反応はいることがわかっている。

ASD 児によく観察される問題である。例えば、赤ちゃん

コスメトロジー研究振興財団には、本研究のようなまだの泣き声を聞くとパニックになる、他の人から触られるとまだ注目されていない研究に対し、支援を与えてくださっ

かんしゃくを起こすなどの感覚過敏がある子どもがいる。

たことに感謝の気持ちである。本助成が研究資金面でどれ一方、呼ばれても気付かないように見える、痛みに鈍感にほど力になってくれたか計り知れない。今後もASD児の嗅見えるなどの低反応の問題や、背中があることがわからな

覚特性について多方面から検討を重ね、ASD児の嗅覚特性

いなどの身体図式の問題も報告されている。感覚の問題はに迫っていくことこそが貴財団への恩返しと考えている。

ASD 児の 70−90 ％に見られることが指摘されている。と（金沢大学子どものこころの発達研究センター）
平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
小原克彦

高齢者の診療を行い、老化の臨床研究を行っているが、が、以前の研究では、コンピュータにより評価した見た目

老化をどのように定義するかは、非常に難しい。老化を自年齢もヒトによる評価と同じく、動脈硬化に対してバイオ覚し、老いを受け入れることはさらに難しい。自分自身

マーカーとなっていた。

の心で感じている年齢と実年齢とには大きな差があるか

見た目が若いことは、特に女性にとっては、重要である。

らである。定義では、65 歳以上が高齢者になるが、65 歳

中年期以降では、美しさよりも、若さが求められているのの誰もが自分を高齢者とは思っていない。自己は物心ついかもしれない。化粧はその意味では、心強い味方である。

てから途切れることなく連続しており、30 歳代のことを昨中間報告で示した通り、見た目年齢を約５歳若くする効果

日のことのように思い返すことができるからである。しかがある。しかし、化粧を施した見た目年齢は、当然のことし、客観的に見た 65 歳は、明らかに 30 歳ではない。老化ながら、老化のバイオマーカーとしての効果が少ないようは、文字通り、一目見れば明らかである。自分で認めなくである。

ても、他人は、客観的に自分を評価しているのである。し

化粧以外に見た目を若くする方法はあるのだろうか。健かし、実際自分が何歳に見られているのかは分からない。

康であり続けることが重要である。今回の成績でも、高血誰しも、うぬぼれがあり、親しい友人でもなかなか本当の圧があると、高齢期の見た目年齢差が小さく（見た目年齢ことは（角が立つので）、教えてくれない。今回の研究では、が高く）なることが示された。若いころから健康的な生活

看護師に見た目年齢の評価をお願いしたが、写真に写った習慣を続けることが、地味だが確実な方法のように感じる。

顔の見た目年齢を教えてくれるアプリが存在する。パテン

超高齢社会のわが国で、心身のみならず見た目も若い高齢

トの関係で、今回の研究では利用することができなかった者が増えることを願いたい。

− 225 −

（愛媛医療センター）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
三枝

千尋

スキンケアやメイクアップ、ヘアカラー、ヘアスタイリ

た。学位研究の主となる研究に対して研究助成を頂きましングなど、人は日常生活の中で化粧行動に手間と時間を費たコスメトロジー研究振興財団に改めて深くお礼申し上げ

やしている。化粧をすることでより魅力的になる、というます。

のが化粧動機の一部であることは確かだ。しかし魅力的であるかどうかは、どのように判断されるのだろうか。

人の魅力知覚に関する研究は研究者にとっても魅力的に映るようで、日々魅力知覚に関する新たな知見が公開されこうした疑問を抱いたことから、「魅力」
を研究テーマとています。公開される研究をウォッチしていて感じるのは、した社会人大学院生生活が始まりました。魅力に関する先「魅力」を切り出す研究者の視点の多様さ、そして魅力とい行研究は数多くあり、特に対人認知の文脈から魅力を探る

う研究テーマの奥深さです。こうした点が、魅力研究が研

社会心理学、配偶者選択の観点から魅力を探る進化心理学究者にとっても魅力的である理由の一因なのかもしれませに関する研究が数多く見つかる一方で、魅力を構成する視ん。筆者自身も、魅力を切り出す新たな視点を見つけ、魅覚的要素がどのように統合されるかという観点の研究はあ

力の新たな一面を明らかにし、さらには新しい魅力を創造

まりないこと、魅力知覚の特徴でもある「ぱっと見た瞬間することを目指し、魅力に関する研究を継続していきたいに魅力的だとわかる」ことに寄与する視覚要素は明らかにと思います。

されていないことがわかり、魅力を構成する視覚的要素の（東京大学大学院工学系研究科先端学際工学専攻）

統合過程に関する研究を学位研究のテーマとして選びまし平成 25 年度

研究助成

笑顔に魅せられて佐藤

和人

私は、これまで人の顔を対象とした研究を精力的に行っんじる自然で爽やかな笑顔が基本だと考える。私は次のよてきた。人それぞれの顔には、自己主張されたその人の個うな仮説を立てた。
「笑顔の表出テンポとリズムが相手の性がにじみ出る。そんな中でも、笑顔は魅力的だ。なぜな

印象形成に大きく寄与するだろう」と。しかし、笑顔の表

ら笑顔には国境が無い。文化や言葉の壁さえ、いとも簡単

出テンポとリズムという概念が受け入れられるかどうか不に乗り越えてしまうような不思議な力が込められている。

安があった。幸いにも今回の研究助成では、おもてなしのふと目にした紛争地域で暮らす子供達の笑顔に心が奪われ心を育む「Smile Learning」の試作開発にご助成頂いた。おる。生活の大変さを微塵も感じさせない明るい笑顔がそこ陰様で、笑顔のリズムが創る印象空間の可視化に一歩近づにあった。相手を差別することなく全てを受け入れてくれ

くことができました。心より感謝申し上げます。今後は、るようなメッセージを子供達の笑顔に感じた。やはり何とコミュニケーションにおける印象空間の可視化を意思疎通

言っても、笑顔は万国共通の優れたコミュニケーションツの可視化へ発展させたいと夢を膨らませています。

ールであることを痛感した。

（秋田県立大学）

世界が注目する日本人の「おもてなしの心」
は、礼節を重− 226 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

香りの複雑さへチャレンジ！
清水邦義

覚醒を促す香り、眠りを誘う香り…。物質にもよるが、一つであろう。香りの生理応答の解析だけでも複雑すぎる

モノテルペン類やセスキテルペン類などの構造的多様性

のに、さらに、好き嫌いという被験者の歴史的背景まで含は、非常に低分子かつ類似した構造であっても、ヒトに相む要因が重なり合うと、もはやお手上げしたくなることも反する効果を引き起こす。香り成分の構造と機能の関係にある。受容体レベル、細胞レベルであれば、きれいな結果

ついては、近年の嗅覚受容体に関する生命科学研究の著しを出すことも可能かもしれないが、ヒトとなると、なかな

い発展により、その分子機構についての解明が進みつつあか思ったような結果がでない。その中で、今回は、森の香る。しかしながら、香りがヒトに及ぼす影響を、実際に検りとも形容される（-）- 酢酸ボルニルに着目し、ヒト試験を証することは難しい。なぜなら、構造だけでなく、濃度も実施した。アロマディフューザーを被験者に配布し、タイ

関連してくるためである。人体に作用する薬の影響を考え

マー機能を利用して就床開始から１時間、香りを提示した。

る際には、その薬の血中濃度が高いほど作用も強くなると果たして、このような提示方法で、プラセボ群と比較して、される濃度依存性が考慮されることが多い。一方、香り

なんらか差が得られるだろうか。詳細については、報告書に限っては、必ずしも、濃度依存性が得られるとは限らなを参照いただきたいが、ヒト実験は、いつもデータを解析い。ごくごく低濃度の香りの方が、高濃度の香りと比較しする最後まで、はらはらどきどきである。しかし、すべてて、ヒトへの影響が大きい場合も報告されている。そのメの香りの物質、受容体、細胞レベルで得られる基礎研究が、カニズムは複雑多岐にわたり、いまだ不明な点も多い。香

最終的には、ヒトでの検証によって完結することは言うまりとヒトの関係は、生理応答のみならず、好き嫌いといっでもない。チャレンジし続けるしかない！

た嗜好性の要因が複雑に絡み合いながら成り立っている。

（九州大学農学研究院）

そのことも、メカニズムの解明を困難にさせている要因の
平成 25 年度

研究助成

香りとコスメトロジー
八谷 百合子

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択して頂き、心より感謝致します。

入ることなど、犬島教授より香りセンサの開発に関することなど、加えて睡眠については、スタンフォード大学睡眠大学院生の頃より、生体疲労信号解析および疲労度推定

研究所で研究をされていた、睡眠研究がご専門の産業医科手法に関する研究を行ってきました。職場では、さまざま

大学人間工学研究室の藤木通弘教授より、活動量計によるなストレス因子によりうつ病などのストレス関連疾患が急

睡眠解析方法や Epworth Sleepiness Scale などに関するア

増していますが、ストレス関連疾患では精神疲労を伴ってドバイスを頂きました。そして、何よりコスメトロジー研

いることが多いと報告されています。精神疲労の評価は、

究振興財団様のご支援頂きました研究助成により「リラッ主に質問調査票などによる主観的疲労が把握されています

クスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索」に関すが、私は生体信号より定量的に評価を行う方法を開発しまる研究を実施することができました。

した。この結果を発表したところ、産業医科大学耳鼻咽喉

数々のよい出会いに恵まれましたことに感謝し、今後も科・頭頸部外科学の嗅覚・味覚の制御機構がご専門の柴田

リラックスや安眠の効果がみられる植物芳香成分の探索を美雅先生と早稲田大学大学院情報生産システム研究科の信続け、コスメトロジー（美容学、化粧品学）と健康に関す

号処理技術がご専門の犬島浩教授がご興味をお持ち下さり、る研究の発展に寄与したいと思います。本研究にご支援頂

香りによるリラクゼーションや安眠の効果について研究をきました貴財団に改めてお礼申しあげます。

行うことになりました。柴田先生より嗅細胞の嗅小毛の表面にある受容体に香りがつくとその情報がすぐに脳の中に− 227 −

（産業医科大学保健センター）

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

平成 26 年度

国際交流助成

痒みを計る
室田

浩之

痒みは掻きたいという
「情動」
であり、
「皮膚感覚」でもあある種のオピオイドは疼痛を抑えるが痒みを増強すること、る。1660 年、Hafenreffer 博士はこれらをうまく融合する

生体は痛みに対して回避行動を示すが、痒みに対して掻破形で「痒み」を「掻きたい衝動を引き起こす不快な皮膚の感行動を示すこと、などである。これらの知見は痒みが本質覚」と定義した。20 世紀になり、痒みの理解は爆発的に進的に痛みと異なることを示唆している。最近になって痒みむ。1922 年、Maximillian Von Frey 博士は「痒みは弱い痛は興奮した痛覚神経と興奮していない痛覚神経の間の極み」であるという説を提唱した。von Frey 博士は自身の考

端なコントラストによって生じるという “Spatial contrast

案した（von Frey）フィラメントを用いることでヒトの全

theory” が提唱された。このように本質のつかみづらい痒

身の皮膚感を調べた。触感を伴わず痛覚のみを感じる部位

みを評価するのは難しい。痒みの評価方法の確立は化粧品（pain point: 痛点）があることから、皮膚に痛覚受容器が存の性能評価への応用が期待される。コスメトロジー研究

在すると提唱した。さらに痛点からフィラメントを離した振興財団の助成を受け、第８回国際痒み学会においてハイ瞬間に痒みの残感覚が生じることを見出した。痒みだけをデルベルグ大学の Weisshaar 教授と痒み評価の国際基準に感じる itch point がないため、痒みは弱い痛みであるとい関する討論会が実現した。その成果をもとに Internationalう仮説を立てた。この説では痒みは独立した “感覚様式” でForum on the Study of Itch は痒みの評価基準のアンケー

はなく本質的には痛みということになる。この考えは本邦ト用紙を作成し検証研究を行うことになった。痒いところ

でも広く長期間受け入れられていた。この仮説に反する知に手が届く評価方法になることを願っている。

見もある。強い痒みは痛みを誘発しないこと、モルヒネや− 228 −

（大阪大学大学院医学系研究科皮膚科学教室）

コスメトロジー研究雑感

平成 26 年度

学術集会支援助成第 47 回日本結合組織学会学術大会を終えて稲垣豊

この度、コスメトロジー研究振興財団の学術集会支援助には、発癌やその進展機序を理解する上で、また今日の再成を受け、平成 27 年 5 月 15 日・16 日の２日間にわたって、

生医学の発展と再生医療の実現化にとっても、マトリック

東京港区のコクヨホールにおいて第 47 回日本結合組織学

ス生物学や結合組織研究が果たす役割が一層注目されてい会学術大会をお世話させて頂きました。

るところです。

本学会は、昭和 44 年に第１回の学術集会が東京の地で今年度は、上述の学術的重要性を鑑みて、日本結合組織開催された、半世紀近くの歴史と伝統を有する学会であり学会とマトリックス研究会が発展的に統合して初めての学ます。その特徴は、マトリックス関連分子や病態解析の専術大会であり、メインテーマとして「伝統と創造 ─世代を門家が一堂に会し、また基礎から臨床までの幅広い領域の越えた学問の継承─」を掲げました。新たな試みとして企研究者が自由闊達な意見交換を行う場として、大きな発展画した、学部生と大学院生を対象とした「若手フォーラム」を遂げてきたところにあります。

が好評を博しました。また、一般演題の司会にも次代を担

細胞外マトリックスは、単に組織や臓器の形態を保持す

う中堅研究者を積極的に起用することで、世代を越えて結るのみならず、皮膚を初めとする全身の細胞の発生・分化・合組織研究・マトリックス医学生物学が継承される工夫を増殖・老化等に深く関わり、生命活動に必須であることが凝らし、これからの新たな学問の潮流を築く上で有意義な明らかになってきました。しかしながら、慢性炎症に起因２日間を学会員が共有して、成功裏に幕を閉じました。

するマトリックスの動的変容は臓器線維症や動脈粥状硬化

今回の学術大会で得られた成果を皮膚の健康や疾病予防症などを引き起こし、今やその総死亡数は癌患者を凌ぐとに活かすとともに、ご支援を賜ったコスメトロジー研究振言われます。また、今日の超高齢化社会において、骨・関興財団にあらためて感謝を申し上げる次第です。

節組織の変性疾患は日常活動に支障をもたらし、身体機能（東海大学医学部再生医療科学／の低下とともに多くの内臓合併症を引き起こします。さら− 229 −

第 47 回日本結合組織学会学術大会 会長）

●
事業報告（平成 27 年度）
役員●

事業報告書

事業報告書（自平成 27 年 4 月 1 日

至平成 28 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2015

2016

5

7

公募開始

全国 577 の大学、病院、研究機関等へ公募要領及び推薦書を送付、関連学術雑誌７誌、当財団 HP 他３機関 HP に掲載
7
8
公募締切り
応募総数112件
7/15 〜 8/21
各選考委員による個別審査
9
2
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9
3
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9
4
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9 24
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成30課題を選考
11 19
理事会
本選考委員会より答申、助成課題決定
第26回 表彰・贈呈式
研究助成対象30課題の代表者へ、助成金贈呈書、目録等を授与
記念講演
演題：ヒト常在菌叢と超生命体 〜微生物が作る体内ミクロコスモス〜
講演者：服部 正平 先生 早稲田大学理工学術院 教授
12 11
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額2 , 8 0 0 万円
選考委員への承認（書面） 平成28年度研究助成公募内容他
2 20《国際交流助成関連》
2015

6
7

22
31

審査
助成金交付

応募課題の審査
国際交流助成金の交付

50万円《学術集会支援助成関連》
2014
2015

11
4

7
1

審査
助成金交付

応募課題の審査
学術集会支援助成金の交付

平成26年度事業報告及び収支決算報告の承認、任期満了に伴う評議員
候補者の選出、株主としての議決権行使、報告事項
平成27年９月24日開催の選考委員会決定内容の承認
平成27年度収支予算書の一部変更の承認、平成27年度（第26回）研究
助成者等の承認、平成28年度の事業計画及び予算案の承認、報告事項

50万円《理事会関連》
2015

5

28

第一回通常理事会

10
11

2
19

理事への承認（書面）
第二回通常理事会《評議員会関連》
2015

6

12

12

25

定時評議員会

平成26年度事業報告及び収支決算報告の承認、任期満了に伴う評議員の選任、評議員会長の互選、報告事項
評議員への報告（書面） 第二回通常理事会議決事項、第26回表彰･贈呈式− 233 −

コスメトロジー研究報告Vol.24, 2016

《その他》
1）報告書発行
2015
5
1
中間報告集
9
1
完了報告書集2）情報公開（当財団HP）
2015
4 10
公募要領
6 30
事業報告及び収支決算
役員の変更
9
1
研究報告の要旨
11 20
予算書一部修正
研究助成者及び課題名

研究業績 中間報告集 第24号
コスメトロジー研究報告 2015 vol.23
2015年度「コスメトロジー研究」公募要領
平成26年度事業報告書及び収支決算報告書
評議員任期満了に伴う改選「コスメトロジー研究」2015 vol. 23 掲載課題の要旨
平成27年度予算書の一部修正
平成27年度研究助成者及び研究課題名− 234 −

事業報告書平成 27 年度 助成を受けられた方々
１）研究助成（30 名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（８名）
氏

名

井嶋

博之

九州大学大学院工学研究院

教授

ヘパリン導入コラーゲンからなるG/Oエマルションの開発

川崎信治

東京農業大学応用生物科学部
バイオサイエンス学科教授

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発

小山義之

公益財団法人結核予防会
新山手病院臨床医用工学研究室

室長

低刺激性生体接着材料の開発とその化粧品への応用酒井健一

東京理科大学理工学部工業化学科講師

アミノ酸系機能性界面制御剤による革新的な乳化技術の開発

谷口正之

新潟大学自然科学系工学部
機能材料工学科教授

化粧品・スキンケア製品に適した米糠タンパク質由来生理活性単鎖ペプチド素材の開発

鳴瀧

彩絵

名古屋大学大学院工学研究科
結晶材料工学専攻

准教授

エラスチン類似ポリペプチドの合理的設計による温度応答性ゲル
の創製

東

顕二郎

千葉大学大学院薬学研究院

講師

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価九州工業大学大学院生命体工学
研究科生命機能応用工学専攻

准教授

安全性に優れた化学合成コラーゲンによるドラッグデリバリー用
球状微粒子の創成

宮崎

敏樹

所

属

職位

研究課題

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（16 名）
氏

名

飯田真智子

所

属

職位

研究課題

名古屋大学大学院医学系研究科
環境労働衛生学

研究員

革新的なシミ予防・治療法の開発

井川健

東京医科歯科大学大学院
医歯学総合研究科皮膚科

准教授

ヒトiPS細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討する。

石田竜弘

徳島大学大学院医歯薬学研究部

教授

ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗PEG抗体誘導とPEG化製剤の薬理効果への影響

大塚篤司

京都大学大学院医学研究科皮膚科

助教

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明

大林典彦

筑波大学医学医療系准教授

メラニン合成酵素を輸送するRab32およびRab38の不活性化因子
GAPの色素細胞における機能解析片岡健

岡山理科大学理学部
臨床生命科学科

准教授

創薬のための毛囊を有するin vitro人工皮膚モデルの開発

木戸博

皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復による皮膚バ
徳島大学疾患酵素学研究センター
特任教授
生体防御・感染症病態代謝研究部門
リア機能増強とアトピー・アレルギーの発症予防

久原篤

甲南大学理工学部
統合ニューロバイオロジー研究所

准教授

皮下組織のコラーゲンが体の温度適応に与える影響

倉岡功

大阪大学大学院基礎工学研究科
物質創成専攻機能物質化学領域

准教授

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法
の開発

河野

望

東京大学大学院薬学系研究科
衛生化学教室講師

皮膚アレルギーを制御するオメガ3由来脂肪酸メディエーターの産生・作用機構の解明− 235 −

コスメトロジー研究報告Vol.24, 2016

氏

名

鈴木

亮

夏賀
西村

職位

研究課題

名古屋市立大学大学院薬学研究科
生体超分子システム解析学分野

講師

皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究
とその応用

健

北海道大学病院皮膚科

助教

皮膚加齢における基底膜蛋白の生理学的意義の解明

智自治医科大学分子病態研究部

教授

生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立

謙一郎

大阪大学大学院医学系研究科

准教授

皮膚の恒常性維持における転写補助因子MRTF-A/Bの役割

林

所

属

宮戸

健二

国立成育医療研究センター・
研究所・再生医療センター

室長

クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化にお
ける役割

山下

富義

京都大学大学院薬学研究科

准教授

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

第３分野：精神、文化に関する分野（６名）
氏

名

奥田

逸子

恒次
徳田

所

属

職位

研究課題

国際医療福祉大学三田病院
放射線診断センター准教授

顔面加齢の評価のための画像解析手法の開発：主観的感覚的評価
から客観的定量的評価へ

祐子

国立研究開発法人森林総合研究所
構造利用研究領域

主任
研究員

植物由来の香りが睡眠におよぼす影響の解明

克己

筑波大学医学医療系教授

現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識

野々村美宗

山形大学大学院理工学研究科

准教授

バイオミメティック触覚センシングシステムによる化粧料の使用
感評価

村田

航志

福井大学医学部
組織細胞形態学･神経科学領域

助教

香りのなつかしさの神経メカニズム森悦秀

九州大学大学院歯学研究院教授

新しい顔面3次元形状評価法の開発
形状の特徴を定量化する試み─

─相同モデル化による顔面

２）国際交流助成（１件）
実施責任者

招聘者

目

的

大阪大学大学院
痒み研究の第一人者である博士を招聘し、学会へ参加していただくことで、
Department of Dermatology,
医学系研究科痒み研究の更なる深化を図る
Heidelberg University
教授（第８回国際かゆみ学会：平成27年9月26日～ 30日 奈良春日野国際フォー
Dr. Elke Weisshaar
片山 一朗
ラムにて）

３）学術集会支援助成（１件）
実施責任者
稲垣

豊

所

属

東海大学医学部
基盤診療学再生医療科学

職位
教授

集会名

及び

内容

第47回日本結合組織学会学術大会 平成27年5月14日～ 16日（コクヨホールにて）
目的：結合組織研究とマトリックス医学生物学の更なる発展− 236 −

事業報告書役

員
平成 28 年 3 月 31 日現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

土子

利明

元株式会社コーセー

理

事

宇佐美昭次

早稲田大学

理

事

関根

茂

日光ケミカルズ株式会社

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

廣部

雅昭

東京大学

理

事

山㟢

幹夫

元新潟薬科大学

監

事

小田倉正典

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

評議員

齊藤

勲

元厚生省大臣官房審議官

評議員

仙名

保

慶應義塾大学

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

評議員

花輪

隆昭

元昭和館

評議員

原田

敬之

東京女子医科大学

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学

東邦大学

常勤監査役

名誉教授
取締役会長

名誉教授
名誉教授
名誉教授
名誉教授
学長

常務取締役

名誉教授
名誉教授

元厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官
東京医科歯科大学

名誉教授

館長
名誉教授

名誉教授

− 237 −

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公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒 104 — 0032

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コスメトロジー研究報告

Vol.24／2016

非売品

2016年９月１日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

土子 利明
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒104−0032 東京都中央区八丁堀三丁目11番８号
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表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2016

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