毛形成におけるホスフォリパーゼ Cδ1 の機能解析

東京薬科大学生命科学部

深 見希代子Nude mice exhibit athymia and hairlessness by a loss-of-function mutation in the transcription factor Foxn1 gene.
Although the immunologic functions of Foxn1 have been studied intensively, there have been relatively few studies of its
functions in skin. Foxn1 regulates expression of hair keratins, which is essential for normal hair structure; however, it waslargely unknown how Foxn1 regulates hair keratin expression and hair formation. In the present study, we found that micelacking phospholipase C (PLC)-d1, a key molecule in the phosphoinositide signaling pathway, and nude mice show similar
hair abnormalities, such as lack of cuticle and bending. We also found that expression of hair keratins was remarkably
decreased in skin of PLCd1 knockout mice. Furthermore, expression of PLCd1 was induced in Foxn1-transfected
U2OS cells. In addition, we showed that PLCd1 expression was remarkably decreased in skin of nude mice. In skin andkeratinocytes of nude mice, activation of PLC downstream effectors, such as PKC and NFAT, was impaired as well as
those of PLCd1 KO mice. These results indicate that PLCd1 is an essential molecule downstream of Foxn1 in normal hairformation, and strongly suggest that hairlessness in nude mice is caused by insufficient expression of PLCd1.

1．緒体（Chemicon, USA）は市販品を使用した。

言

毛は美容の対象として、非常に多くの人々に関心を持た

２−２．in situ ハイブリダイゼーション

れている器官でありながら、毛の形成についての詳細なメ皮膚を 4％パラホルムアルデヒドで固定後、8-mm の厚カニズムは未解明な部分が多い。申請者らは、イノシトさの切片を作製した。PLCd1、Foxn1、mHa3 の検出はジールリン脂質代謝系の要となる酵素、ホスフォリパーゼ

ゴキシゲンラベルのリボプローブを用いて行なった。

C（PLC）の一つである PLCd1 のノックアウト（KO）マウスを作製し、このマウスが顕著な体毛減少を示すこと

２−３．ノザンブロット解析を報告している。最近、PLCd1KO マウスの体毛減少のメ

RNA は RNeasy Mini Kit（QIAGEN） を 用 い て 皮 膚カニズムを詳細に検討したところ、ヌードマウスと外見のか ら 調 整 し た。mHa3 お よ び GAPDH は DIG Northern

みならず、毛の詳細な形状等がよく似ていることが判明しStarter kit（Roche, Germany）によるジゴキシゲンラベてきている。ヌードマウスは転写因子 Foxn1 が先天的にルのリボプローブを用いて行なった。

変異し、その結果、毛の形成に必要なヘアケラチンである

3．結

mHa3 が減少することが無毛の原因と考えられている。
そこで本研究では、ヌードマウスと PLCd1KO マウスの果３−１．PLCδ1KO マウスはヌードマウスと非常に類類似性と相違点を種々の解析法により検討し、ヌードマウ似した表現型を示す

スと PLCd1KO マウス間のシグナル伝達の共通性を明らか

PLCd1KO マウスはヌードマウスと同様に無毛となるにすることにした。

（図１B, C）が、電子顕微鏡で皮膚構造を観察した場合に2．実も、コントロールマウスでは毛が存在しているのに対し、

験

両マウスではほとんど毛が見られないこと（図１D, E, F）、

２−１．PLCδ1KO マウスの作製および抗体等

また存在している毛も折れ曲がっている（図１H, I）など、

PLCd1KO マウス作製についてはすでに報告している非常に類似していることが判明した。更にコントロールマ（EMBO J.2003）。PLCd1 抗 体（BD Pharmingen, USA），ウスの毛で観察されるキューティクルが両マウスでは見らFoxn1 抗体（Santa Cruz Biotechnology, USA）, b-actin 抗れないなどの事実が判明した（図１G, H, I）。

The roles of phospholipase C
δ1 in theformation of hair follicles

３−２．ヌードマウス同様、PLCδ1KO マウスは皮膚でのヘアケラチンが減少している

Kiyoko FukamiLaboratory of Genome and Biosignal,
Tokyo University of Pharmacy and LifeScience

ヌードマウスでは転写因子 Foxn1 が先天的に変異し、毛の形成に必要なヘアケラチンである mHa3 が減少している。そこで PLCd11KO マウスの皮膚における mHa3 のmRNA 量をノザンブロットで検討した所、ヌードマウス− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009と同様に mHa3 の mRNA 量が顕著に減少していた（図２）。て、毛の形成や毛を保持するために重要な部位であるprecortex 部分に発現していることが判明した（図３）。

３ − ３. PLCδ1、Foxn1、mHa3 は 毛 包 に お い て 同
局在する

３−４ Foxn1 の過剰発現は PLCδ1 の発現を誘導する

PLCd1KO マウスとヌードマウスの類似性が観察されPLCd1 及び mHa3 の mRNA が毛包において同じ部位にたことから、ヌードマウスの原因遺伝子である Foxn1 と発現していることが明らかになり、これらのタンパク質がPLCd1 の関連性を検討することにした。

機能的に関連している可能性が強く示唆された。またヌー

Foxn1 は毛包に発現が多いことが報告されている。そドマウスおよび PLCd1KO マウスの両マウスで mHa3 のこ で、in situ hybridization に よ り、Foxn1、PLCd1、 及mRNA の発現量が減少していることから、シグナル伝達

び mHa3 の 発 現 を 検 討 し た。 図 ３ に 示 す 様 に、Foxn1、において、Foxn1 と PLCd1 は mHa3 の上流にあると考え

PLCd1、 及 び mHa3 の mRNA は い ず れ も、 毛 包 に お いられた。そこで Foxn1 と PLCd1 のシグナルの伝達経路での関連性を次に検討することにした。
骨肉腫細胞である USOS 細胞に Foxn1 を強制発現した場合には、PLCd1 の発現が mRNA およびタンパク質の両方で誘導されることが判明した（図４）。逆に PLCd1 をUSOS 細胞に強制発現した場合には、Foxn1 の発現は誘導されなかった。このことから、Foxn1 は PLCd1 の上流に

図 １. A-C: PLCδ1KO マ ウ ス と ヌ ー ド マ ウ ス の 外 観、D − I：
マウス皮膚の走査香型電子顕微鏡像。コントロールマウスでは多くの毛が存在するのに対し、PLCδ1KO マウスとヌードでは毛がほとんど観察されず (D-F)、折れ曲がっている (G-I)。

図 ２. ノ ザ ン ブ ロ ッ ト に よ る PLCδ1KO マ ウ ス 皮 膚 で のmHa3 の mRNA の発現。PLCδ1KO マウス皮膚ではヘアケラチンの mHa3 の mRNA 量がヌードマウスと同様に減少している。

図３. in situ hybridization による毛包における Foxn1、PLCδ1、及び mHa3 の mRNA の発現。毛の形成に重要な precortex 部位に、これらの mRNA がいずれも発現している。

図４. Foxn1 の強制発現は PLCδ1 の発現を誘導する。USOS細胞に Foxn1 を強制発現した場合、PLCδ1 タンパク質の発現 が 誘 導 さ れ る（A）。 一 方、PLCδ1 を USOS 細 胞 に 強 制発現した場合には、Foxn1 の発現は誘導されなかった（B）。

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毛形成におけるホスフォリパーゼ Cδ1 の機能解析

位置し、PLCd1 の発現を調節していると考えられた。

で TG マ ウ ス を 作 製 し た（Foxn1:: PLCd1TG/PLCd1KOマウス）。PLCd1KO マウスでは、表皮の肥厚、皮膚の炎

３−５．ヌードマウス毛包では PLCδ1 の発現が低下している症、cyst の形成、毛包形成異常、ヘアケラチンの減少が観察されるが、これらの異常は Foxn1:: PLCd1TG/PLCd1

毛包の形成においては、Foxn1 → PLCd1 → mHa3 といマウスではすべて回復した。このことから PLCd1 がこううシグナルの流れが存在することが示唆されたので、ヌーした組織では Foxn1 下流分子として生体内で機能していドマウスにおいて PLCd1 の発現が低下しているかを調べることが強く示唆された。一方脂腺では、このトランスジてみることにした。

ーンで脂腺拡大が回復しないことから、脂腺では PLCd1

第一に毛包での PLCd1 の発現を in situ hybridization により検討した。図５A、B に示す様に、野生型のコントは Foxn1 と独立したシグナルを経由していると考えられる（図６）。

ロールマウスの毛包では PLCd1 の発現が強く観察される

次 に、 ヌ ー ド マ ウ ス で TG マ ウ ス を 作 製（Foxn1::のに対し、ヌードマウスの毛包では、PLCd1 の発現がほPLCd1TG/nude マウス）した所、外見上は毛の形成が回とんど見られなかった。またウエスタンブロット法によ復しなかった。またヌードマウスの無胸腺、表皮の肥厚り、皮膚における PLCd1 タンパク質の発現を比較した所、は全く回復しなかったので、これらの組織では Foxn1 とヌードマウス皮膚において PLCd1 タンパク質の発現量PLCd1 の関連性は薄いと考えられる。しかしながら、毛が著しく減少していることが判明した（図５C）。同様に包形成やヘアケラチンの発現は部分的ではあるものの回復

PLCd1mRNA の減少も RT-PCR により明らかになった（デし、cyst の形成も激減した。こうした事実は、PLCd1 がータ示さず）。これらの事実は、Foxn1 → PLCd1 → mHa3毛の形成においては Foxn1 の下流分子として重要な役割というシグナルの流れが毛包において存在していることをを担っていることを示している（図７）。

示している。

4．考察

３−６.「ヌードマウスの体毛減少は PLCδ1 欠損が原因である」ことの検証の変異が原因であるヌードマウスと形態的に酷似しヌードマウスの体毛減少が PLCd1 の発現低下のみで説て い る こ と、 ヌ ー ド マ ウ ス で PLCd1 の 発 現 が 低 下 し、明できるのであれば、ヌードマウスに PLCd1 を発現させFoxn1 → PLCd1 → mHa3 というシグナルの流れが存在することにより、体毛が正常に形成されるようになることることを明らかにした。また Foxn1 の欠損による無毛とが期待される。そこで、ヌードマウスの原因遺伝子であいうヌードマウスの表現型を PLCd1 の強制発現で補完する Foxn1 プ ロ モ ー タ ー 制 御 下 で PLCd1cDNA を 発 現 することができるのかを明らかにするために、TG マウスをる TG マウスを作製した。第一に、Foxn1 の発現部位で作製した。現在、回復する異常と回復しにくい異常が判明の PLCd1 発現の影響を検討するため、PLCd1KO マウスしつつあり、Foxn1 と PLCd1 の関連性がわかってきている。

今 回 我 々 は、PLCd1KO マ ウ ス が、 転 写 因 子 Foxn1

図５. ヌードマウスでは PLCδ1 の発現が低下している。A、B ; in situ hybridization による毛包における PLCδ1 mRNA の発現。コントロールマウスでは強い PLCδ1 mRNA のシグナルが見られるのに対し（A）、ヌードマウス毛包では、PLCδ1 の発現がほとんど見られない（B）。C ; ウエス
タンブロット法による皮膚における PLCδ1 タンパク質の発現比較。ヌードマウス皮膚で PLCδ1の発現が激減している。

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コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

図６. Foxn1::PLCδ1TG/PLCδ1KO マウスでの皮膚構造。Foxn1::PLCδ1TG/PLCδ1KO マウスでは、
PLCδ1KO マウスで観察される無毛の回復（A）、毛包形成の回復（B）、Cyst の形成（矢印）の正常化（C）が確認できる。一方、脂腺の拡大は回復しない（D、矢印）。

図 ７. Foxn1::PLCδ1TG/ ヌ ー ド マ ウ ス で の 皮 膚 構 造。Foxn1::PLCδ1TG/ ヌ ー ド マ ウ ス で は、
PLCδ1KO マウスで観察される無毛は回復しない（A）。一方、毛包形成（B）や Cyst の異常形成（C）
は部分的であるが回復した。

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毛形成におけるホスフォリパーゼ Cδ1 の機能解析

今後、より詳細にマウスの表現型を解析し、毛包形成のメによるものです。コスメトロジー研究振興財団からは多大カニズムを明らかにしていきたい。毛の形成メカニズムはな研究資金の御支援をいただきました。心よりお礼申し上

不明な点が多く PLCd1 が関与するという事実は興味深い。

げます。

育毛、脱毛など毛の形成に関わる研究は一般社会の関心も高いので今後は応用的な点からも解析する必要があると思（文われる。

１）Ichinohe M., Nakamura Y., Sai K., Nakahara M.,

献）

また最近、Foxn1 がメラニン色素の表皮細胞への輸送

Yamaguchi H., and Fukami K.: Lack of phospholipaseにも関与していることが明らかになってきている。今後皮C-d1 induces skin inflammation. Biochem. Biophys. Res.

膚において PLCd1 が Foxn1 と同様に美白などに応用できる可能性についても検討していきたい。

Comm., 356: 912-8, 2007.
２）Nakamura Y., Ichinohe M., Hirata M., Matsuura H.,Fujiwara T., Igarashi T., Nakahara M., Yamaguchi H.,

謝辞Yasugi S., Takenawa T. and Fukami K.：Phospholipase

以上の研究は、東京薬科大学生命科学部ゲノム情報学研

C-d1 is an essential molecule downstream of Foxn1, the究室の中村由和助教をはじめとして、大学院生の一戸学、gene responsible for the nude mutation, in normal hair

平田真之、松浦宏和らとの共同研究によるものです。また

development. FASEB J. 22, 841-849,2008.

電子顕微鏡像の解析は愛媛大学の藤原隆先生との共同研究− 49 −