JASIS 2022
新技術説明会【SPL-M100】【メタボローム/におい/アミノ酸,有機酸,糖類等】
前処理から測定まで全自動分析.精製と誘導体化を併せ持つ「固相誘導体化」技術
2022年09月07日
株式会社アイスティサイエンス
佐々野僚一

メタボロミクスの課題と目的
従来のメタボローム分析の課題■ 前処理操作について■ 多検体の測定について

遠心濃縮・凍結乾燥・誘導体化等

多検体の誘導体化をバッチ処理した場合、前処理工程が煩雑で、時間を要し、各々の検体において誘導体化後から測定熟練された技術や経験が必須

までの時間が異なってしまう。

固相誘導体化法による迅速化・自動化

SPE-GCによる誘導体化から測定までのオンライン化

本研究の目的
固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC/MSシステムの開発

固相誘導体化法：アミノ酸/有機酸

STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

STEP ⑥

試料負荷＆保持洗浄

脱水／１分

誘導体化／３分誘導体化／1分

溶出

アミノ酸と有機酸をイオ
ン交換相互作用により固相に保持

水-ACNで固相に残存している非イオン性化合物を除去

ACN で 固 相 に 残 存 している水分を除去

メトキシアミンを固相に含侵させて、目的成分を固相中でメトキシム化

MSTFAを固相に含侵させて、目的成分を固相中でTMS化

試料

水-ACN

ACN

メトキシアミン

MSTFA

アミノ基

-SO3 ⊝⊕NH3-R-SO3 ⊝⊕ NH3-Rカルボキシル基-N ⊕ ⊝OOC-R

-N⊕
(CH
3)3

(CH3)3-N ⊕ ⊝ OOC-R-SO3 ⊝-N ⊕ ⊝ OOC-R

-N⊕
(CH
3)3

-N⊕
(CH
3)3

非イオン性化合物（糖類、グリセリド）

H2O(CH3)3⊕ NH3-R(CH3)3-SO3 ⊝⊕ NH3-R-N ⊕ ⊝ OOC-R

-N⊕
(CH
3)3

(CH3)3-SO3 ⊝ヘキサン
TMS-NH-R-N ⊕ TMS-OOC-R

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3-SO3 ⊝

-N ⊕

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3
R-NH-TMS
R-COO-TMS

特許登録：（株）アイスティサイエンス

アミノ酸と有機酸のTMS (Tri Methyl Silyl) 化
TMS化：反応する官能基 –OH>-Phenol>-COOH>-NH2反応するアミンについて：R-NH2 > R-NH-R

参考文献：
小川茂, ぶんせき, 2006, 7, 332-336

TMS : Tri Methyl Silyl
F

O

NH2
C

HO

＋

H3C

アラニン

O
C

リンゴ酸

CH 3

TMS O

CH 3

OH

F

＋

TMS O
CH 3

F
N

F

MSTFA

CH 3

アラニン-2TMS

O

H3C

HO

Si

MSTFA

HO

C

N

F

NH TMS

O

CH 3

F

CH 3

O

O

Si
CH 3

O

O
CH 3

O TMS
TMS O
リンゴ酸-3TMS

アミノ酸のTMS化について
O

O

NH2

α炭素にRが結合している場合

NH TMS

α炭素に結合しているアミンには

C

C
HO

R

アミノ酸

TMS O

１つのTMSしか結合しない。

R

アミノ酸-2TMS+側鎖のTMS

TMS
O

α炭素に結合しているアミンには

N TMS

O

NH2

α炭素にRが結合していない場合
２つのTMSが結合する。

C

C

TMS O

HO
グリシン

グリシン-3TMSNH2

HN TMS

O
C
OH

リシン

NH2

O

TMS
C

TMS O

リシン-4TMSN
TMS

メトキシム化について
R
C

＋

O

R
H2N

O

O
C

CH3

R

CH3

N

R

ケトン基

メトキシアミン

メトキシム化CH3

CH3メトキシム化

O
O

C

O

O

O

ピルビン酸

O

O
OH

O

O

TMS

TMS

α-ケトグルタル酸-MO

α-ケトグルタル酸-MO-2TMS

CH3

O

CH3

C

C
HO

C
OH

α-ケトグルタル酸

CH3

TMS化

N

OH

O

N
O

O

OH

O

O

HO

N

TMS O

O

ピルビン酸-MO

CH3

N

O

ピルビン酸-MO-TMS

CH3

従来法と本法の前処理比較
◼ 従来法

◼ 本法
血清 50µL

血清 50µL

添加：H2O/ACN 1000µL

添加：MeOH/H2O/CHCl3 1000µL

振とう抽出（37℃, 30分）

振とう抽出（37℃, 30分）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

１ 時間

分取：上澄み 600µL

添加：超純水 250µL

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

バイアル

精製
0.5 時間装置にセットしてスタートボタンを押すだけ！

２０ 時間

オンライン固相誘導体化SPE-GC-MS

減圧濃縮遠心分離（1600rcf, 4℃）

脱水

凍結：液体窒素
凍結乾燥（一晩：16時間）

１ 時間

分取：上澄み 250µL

添加：超純水 300µL

分取：上澄み 400µL（MeOH/水の混液）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

自動前処理時間

10～25 分SGI-M10017 時間

誘導体化試薬添加
メトキシアミン/ピリジン溶液 100µL
誘導体化反応（30℃, 90分）

誘導体化反応（37℃, 30分）

誘導
体化

遠心分離（1600 rcf, 4℃, 3分）

3 時間

誘導体化試薬添加：MSTFA 50µL

分取：上澄み 100µL

→

バイアル

測定：GC/MS：注入1µL（スプリット 25:1)

MS導入量
試料 4µg相当

試料
負荷
40µL

精製
脱水

誘導
体化

MS導入量
試料 25µg相当

LVI-S250
Spiral Insert
スプリット 50:1

GC-MS

抽出と精製について
メタノール-水-クロロホルム 抽出

アセトニトリル-水 抽出（本法）アミノ酸・有機酸
MeOH-水CCl3

MeOH-水

短鎖脂肪酸
クロロ
ホルム

抽出
除タンパク後






液液分配
による精製

アミノ酸・有機酸

糖類

糖類
ACN-水

短・中・長鎖脂肪酸

中鎖脂肪酸

油脂

長鎖脂肪酸

油脂

抽出
除タンパク後

固相抽出による精製

中鎖脂肪酸が両方に分配してしまう。
MeOH-水には糖類が残る。
クロロホルムには油脂が残る。
短鎖脂肪酸は凍結乾固時に気化損失の恐れがある。

保持
固相
ACXｓ

本法では目的物質を固相に保持でき、油脂や糖類そして水を除去できる。

アミノ酸・有機酸
短・中・長鎖脂肪酸

油脂
糖類
水
非イオン性物質除去・脱水

オンラインSPE-GC-MSシステム
前処理ユニット

送液ユニットSPL-M100とアジレント社製GCMS

SPL-M100と島津社製GCMS

測定条件：アミノ酸/有機酸、糖類
SPE-GC Interface SPL-M100 (AiSTI Science)
SPE Cartridge
Flash-ACX
Sampling Volume 50 µL
PTV Injector
Insert Type
Injector Temp.

LVI-S250 (AiSTI Science)
Spiral Insert
220℃(0.5min)-50℃/min-290℃(16min)

GC
Inlet Mode
Split 1:50
Flow Mode
Constant Flow, 1 ml/min
Pre-Column
0.25mm i.d. x 1m
ColumnVf-5ms, 0.25mm i.d. x 30m, df;0.25µm
Oven Temp.
100℃(2min)-10℃/min-220℃-30℃/min-310℃(4.7min)
Trans. Line Temp. 290℃
MS
MS Method

SCAN, m/z;70-470本法による標準溶液のSCANトータルイオンクロマトグラム

Fig. 3. The SCAN total ion chromatogram of standard solution using SPE-GC-MS system with
automated SPE-based derivatization method.
＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL本法による標準溶液の再現性
Table Reproducibility of peak area with standard solution using SPE-GC-MS system.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

CompoundAlanine-2TMS
Valine-2TMS
Phosphate (3:1)-3TMS
Norleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Proline-oxo-2TMS
Cytosine-2TMS
Aminobutyric acid-3TMS
Ketoglutaric acid-3TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Asparagine-3TMS
Putrescine-4TMS
Aconitic acid-3TMS
Citric acid-4TMS
Ornithine-4TMS
Adenine-2TMS
Lysine-4TMS
Tyrosine-3TMS
Guanine-3TMS

1
2,780,202
3,231,804
1,980,261
3,860,754
3,166,213
3,326,569
2,170,649
3,020,526
1,768,634
2,012,774
1,040,407
485,209527,945
1,317,135
1,972,283
1,164,055
1,903,218
179,954
486,088
1,553,897
264,587
1,097,163
1,068,411
2,509,279
948,801
1,791,455
438,332
2,290,304
1,276,608

2
2,814,678
3,290,271
1,945,488
3,995,800
3,281,486
3,445,278
2,352,541
3,101,538
1,813,725
2,110,285
1,085,291
496,725
521,172
1,376,552
2,178,513
1,199,619
2,080,359
187,293482,193
1,642,952
293,568
1,143,662
1,095,208
2,585,329
1,074,181
1,859,990
487,673
2,415,910
1,325,553

32,805,838
3,270,689
1,842,146
3,961,145
3,263,756
3,452,215
2,219,378
3,047,906
1,790,816
2,078,505
1,075,400
505,695
605,941
1,320,877
2,188,232
1,211,399
1,832,270
167,292
528,880
1,616,874
269,785
1,022,892
1,085,018
2,551,370
928,962
1,930,628
411,966
2,339,399
1,372,469

42,570,446
2,966,049
1,762,489
3,572,341
2,942,720
3,055,493
2,118,024
2,891,328
1,626,601
1,857,176
963,085
464,603439,870
1,165,099
2,213,001
1,081,564
1,718,333
138,034
375,004
1,422,103
215,342
1,069,833
973,865
2,326,885
889,675
1,670,688
389,2632,070,195
1,201,496＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL

52,663,543
3,107,653
1,746,163
3,750,253
3,112,611
3,264,503
2,229,077
2,874,284
1,697,384
1,969,420
1,019,290
471,484
548,152
1,233,662
2,171,464
1,154,429
1,911,954
169,160
494,429
1,528,499
260,091
1,140,680
1,026,875
2,437,909
963,445
1,831,552
423,849
2,220,032
1,273,918

6
2,676,876
3,132,760
1,658,840
3,798,730
3,105,804
3,272,235
2,288,729
2,677,718
1,608,388
1,978,512
1,028,004
446,942
689,805
1,299,449
2,218,260
1,179,900
1,983,878
156,600
585,775
1,564,042
264,791
1,218,672
1,009,638
2,410,546
1,025,487
1,839,583
469,2632,300,204
1,292,009

7
2,632,581
3,054,963
1,585,771
3,712,869
3,057,182
3,230,054
2,328,562
2,840,826
1,635,905
1,918,379
988,509451,563
622,430
1,267,142
2,414,150
1,130,354
1,952,195
151,045
510,207
1,507,985
258,735
1,113,605
1,007,640
2,372,287
1,049,537
1,690,694
485,851
2,231,995
1,214,782

8
2,692,127
3,085,131
1,679,471
3,729,371
3,062,330
3,247,932
2,291,359
2,917,558
1,710,549
1,950,455
997,181459,884
590,812
1,274,606
2,348,929
1,140,346
1,884,295
147,256
483,426
1,508,373
249,746
1,075,243
1,025,144
2,395,838
1,005,050
1,722,793
449,843
2,184,577
1,217,067

Ave.
9
RSD, %
2,718,118 2,706,045
3.0
3,160,769 3,144,454
3.4
1,991,253 1,799,098
8.3
3,834,508 3,801,752
3.4
3,129,208 3,124,590
3.4
3,297,886 3,288,018
3.6
2,432,007 2,270,036
4.3
3,180,044 2,950,192
5.2
1,825,272 1,719,697
4.9
1,968,792 1,982,700
3.9
1,024,209 1,024,597
3.8
497,251475,484
4.5
358,848544,997
18.3
1,279,034 1,281,506
4.6
2,386,591 2,232,380
6.1
1,191,227 1,161,433
3.5
2,036,145 1,922,516
5.6
178,112
163,861
10.1
320,272
474,03016.8
1,520,941 1,540,630
4.2
263,337
259,998
7.9
1,130,409 1,112,462
5.0
1,085,668 1,041,941
4.1
2,470,814 2,451,140
3.5
1,047,923
992,5626.3
1,876,276 1,801,518
5.0
475,516
447,9517.8
2,239,834 2,254,717
4.4
1,316,201 1,276,678
4.5

濃度とピーク面積値の関係（直線性）：検量線

3.E+06
2.E+06

4.E+06

R² = 0.9985

3.E+06
2.E+06

1.E+06

1.E+06

0.E+000.E+000
5 10 15 20 25
Concentration (pmol/μL)

R² = 0.99520

7.E+06
6.E+06
5.E+06
4.E+06
3.E+06
2.E+06
1.E+06
0.E+005
10 15 20 25
Concentration (pmol/μL)

Succinic acid-2TMS

Citric acid-4TMS

6.E+06
5.E+06

R² = 0.9972

Peak Area

4.E+06

Tyrosine-3TMS

5.E+06

Peak Area

Peak Area

5.E+06

Alanine-2TMS

Peak Area

6.E+06

R² = 0.9956

4.E+06
3.E+06
2.E+06

1.E+06
0.E+000

5 10 15 20 25
Concentration (pmol/μL)

05
10 15 20 25
Concentration (pmol/μL)

バイアル中濃度：アミノ酸, 有機酸：2, 5, 10, 20 pmol/µL（μM）★ 検量線を作成する時の注意点
濃度が高すぎると・・・・（頭打ちになる）

イオン交換樹脂は保持できるイオン数が決まって

混合成分数が多すぎても・・・（頭打ちになる）

おり、椅子取りゲームとなります。

アミノ酸の混合標準溶液は0.1N HClが含有している場合が多く、pH調整が必要。
有機酸の濃度が高いと溶液が酸性となって、解離しなくなるので、pH調整が必要。

前処理フロー：農作物中アミノ酸/有機酸の一斉分析【ドライアイス凍結粉砕】
農作物の可食部100~200 g にドライアイスを加えて凍結粉砕した。

【抽出】◼ アミノ酸/有機酸
コンディショニング
ACN-水(1/1)（50 mLの遠沈チューブ）

試料採取 10 g 凍結粉砕した試料

Automation

バイアルFlash-SPE ACXs

添加 水 10 mL
負荷[保持] 抽出上澄液 50 µL

手振とう
添加 ACN 20 mL
振とう抽出 10 min
遠心分離 3500 rpm, 3 min
分取 抽出上澄液 500 µL
添加 ACN 500 µL
振とう (37 ℃, 1 min)
遠心分離 14000 rpm, 3 min
添加 0.1N NaOH
抽出上澄液

洗浄 ACN-水(1/1)
脱水 ACN
含侵 0.5% メトキシアミン-ピリジン
固相誘導体化反応 メトキシム化, 3 min
含侵 MSTFA-トルエン(3/1)
固相誘導体化反応 TMS化, 1 min
溶出 ヘキサン or トルエン

GC/MS スプリット 1:50

予冷式ドライアイス凍結粉砕
常温粉砕

凍結粉砕

凍結乾燥ではなく、水分を含んだまま凍結して
粉砕する。
きゅうり
食品全体の成分を均一化する。
水分を含んだ成分濃度の分析。
ぶどう

大がかりな装置を必要としない。

ささみ肉
15

各農作物のSCAN-TIC◼ ほうれん草A. ほうれん草
ホウレンソウにはシュウ酸が多く含まれており、体内でカルシウムと結合し腎臓や尿路に結石を引き起こすことがある。
B. トマトグルタミン酸の濃度が非常に高いためうま味があること、酸味・水分があることから、ケチャップ、トマトソース、ピザソースなどに用いられる。
C. うめ
強い酸味が特徴であり、クエン酸をはじめとする有機酸などを多く含む。

◼ トマト

◼ うめ

各農作物の成分量比較

HOU：ほうれん草
TOM：トマト
UME：うめ代謝マップオキサロ酢酸

クエン酸

HOU TOM UME

HOU TOM UME

アスパラギン酸
アスパラギン

リンゴ酸

クエン酸回路HOU TOM UME

イソクエン酸HOU TOM UME

スクシニル
HOU TOM UME
CoA
2-オキサグルタル酸

HOU TOM UME

フマル酸
HOU TOM UME

コハク酸

Rocheの代謝マップ
http://biochemical-pathways.com/#/map/1

グルタミン酸
グルタミン
アルギニン
ヒスチジン
プロリン

追加資料
Rocheの代謝マップ

抽出：血清/血漿試料採取 50 µL
添加 水 150 µL【 アミノ酸/有機酸 短・中・長鎖脂肪酸 】
分取 抽出上澄液 500 µL
添加 水 500 µL

振とう

添加 0.1M NaOH
約pH8に調整

添加 アセトニトリル 800 µL
振とう (37 ℃, 30 min)
遠心分離 14000 rpm, 3 min
抽出液

検液

マウス血清のSCAN-TIC① Lactic acid-2TMS② Alanine-2TMS③ Valine-2TMS④ Leucine-2TMS⑤ Phosphoric acid-3TMS⑥ Isoleucine-2TMS⑦ Proline-2TMS⑧ Glycine-3TMS⑨ Succinic acid-2TMS⑩ Glyceric acid-3TMS⑪ Serine-3TMS⑫ Threonine-3TMS⑬ Malic acid-3TMS⑭ Aspartic acid-3TMS⑮ Pyroglutamic acid-2TMS⑯ Glutamic acid-3TMS⑰ Phenylalanine-2TMS⑱ Ornithine-4TMS⑲ Citric acid-4TMS⑳ Lysine-4TMS㉑ Tyrosine-3TMS㉒ Gluconic acid-6TMS

血清の添加回収試験
No.

成分名

1
2
6
9
10
11
12
14
15
16
17
18
20
21
22
23
25
27
28
31
33
36
37
38
41
43

Lactic acid-2TMS
Alanine-2TMS
Valine-2TMS
Leucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
4-Hydroxyproline-3TMS
GABA-3TMS
Threonic acid-4TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Putrescine-4TMS
Citric acid-4TMS
Lysine-4TMS
Histidine-3TMS
Tyrosine-3TMS
Tryptophan-3TMS
Cystine-4TMS

Standard

操作Blank

マウス血清

マウス血清＋STST
2,641,331
2,526,424
3,223,917
3,806,169
3,483,014
3,349,273
2,822,020
5,442,569
1,886,256
1,763,290
584,437
610,728
2,929,674
321,4032,400,683
808,381
331,4482,350,172
1,457,813
4,356,542
911,581
1,587,702
2,194,472
4,650,501
230,794
2,142,088

B
2,044,267
84,451
8,177
9,760
5,009
6,613
38,90351,2603,365
19,550
2,454
1,773
5,116
1,578
122
5,804
417
2,555
1,404
1,610
660
1,259

M
14,805,790
4,971,432
2,224,994
3,940,497
958,6813,008,108
3,192,716
607,407
11,533
1,451,277
484,176
18,302784,543
77,62754,733
9,875
27,1253,437,586
690,541
9,512
216,437
940,190
10,446
1,175,034
29,096
14,728A
11,895,241
6,847,093
5,182,605
7,217,079
4,444,077
5,928,827
5,175,424
6,159,930
1,967,128
3,032,036
957,064
629,151
3,822,406
321,294
1,997,473
776,441
202,330
6,150,075
2,098,341
4,597,459
1,160,422
2,675,748
3,240,581
5,939,201
398,017
2,196,172

1,959
0
0

回収率,%
(A-M)/(ST-B)
77
92
86
100
87
71
103
104
91
81
100
104
76
81
96
53
116
97
105
104
109
147
102
160
102

本システムによるマウス血清の再現性
ピーク面積値（絶対値）の結果です。
内標による補正はしていません。

オンライン固相誘導体化法：尿■ 負荷量試験：固相への負荷量を25, 50, 75μLでのピーク面積値【抽出】
試料採取 尿 10 µL

50μL採取×2倍希釈

10μL採取×希釈無し

添加 アセトニトリル 800µL
振とう (１ min)

ピーク面積値

添加 水 190µL

頭打ちしてる

遠心分離 14000 rpm, 2 min
負荷量（μL）

添加 0.1N NaOH
抽出上澄液

負荷量（μL）

Maleic acid 2TMS

350000300000250000200000150000100000

50000
0
0

20

40

60

80

尿のSCAＮ-TIC
Phosphate-3TMS

拡大
Citric acid-4TMS

拡大
Norleucine-2TMS; IS

尿から高濃度のリン酸とクエン酸、そしてアミノ酸・有機酸を含めた多くの成分が検出された。
尿 n=4 の重ね書きのピークの再現性もよく、良好なクロマトグラムを得られた。

Glycine-3TMS

尿：n=4 の重ね書き操作ブランク：茶線

Serine-3TMS
Succinic acid
-2TMS

2,3-Dihidroxybutanoiic
acid-3TMS

尿のアミノ酸・有機酸メソッドによる再現性
化合物名

Alanine-2TMS
Valine-2TMS
Leucine-2TMS
Isoleucine 2TMS
Proline 2TMS
Glycine 3TMS
Serine 3TMS
Threonine 3TMS
Glutamic acid 3TMS
Phenylalanine 2TMS
Norleucine 2TMS-IS
Oxalic acid 2TMS
Maleic acid 2TMS
Succinic acid 2TMS
Citric acid 4TMS
Adipic acid 2TMS-IS

1
2
3
4
Ave.
RSD, %
454,237 451,129 467,421 477,468 462,564
2.6
63,87759,89062,08364,86762,6793.5
45,276
41,09940,934
43,39842,676
4.8
20,45019,162
17,851
18,61519,0205.8
26,797
22,81424,906
20,50823,756 11.4
1,111,414 1,098,354 1,120,950 1,174,577 1,126,324
3.0
405,652 415,183 389,251 412,685 405,693
2.9
67,052
69,451
66,368
69,104
67,994
2.2
16,21914,083
12,825
13,43414,140 10.5
37,86036,97834,96636,53236,584
3.3
1,898,393 1,876,725 1,870,739 1,984,343 1,907,550
2.8
457,287 449,275 451,207 494,352 463,030
4.6
243,527 245,430 242,421 256,388 246,941
2.6
102,348 104,567 110,125 118,507 108,887
6.6
2,952,604 2,887,417 2,989,869 3,091,864 2,980,438
2.9
319,500 307,471 314,777 324,318 316,516
2.3

ピーク面積値（絶対値）の結果です。
内標による補正はしていません。

固相誘導体化法：糖類
STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

試料負荷＆保持脱水／１分

誘導体化／15分

誘導体化／1分

溶出

試料をアセトニトリルで希釈して水濃度を下げて、固相に負荷する。

ACN で 固 相 に 残 存 している水分を除去

メトキシアミンを固相に含侵させて、目的成分を固相中でメトキシム化

MSTFAを固相に含侵させて、目的成分を固相中でTMS化

試料

ACN

メトキシアミン

MSTFA

ヘキサン

糖類メトキシム化
-N⊕
(CH
3)3
-TMS
(CH3)3-N⊕(CH3)3(CH3)3-N ⊕(CH3)3

-N⊕

糖類

-N ⊕

糖類

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3糖類メトキシム化
-N⊕
(CH
3)3
（→直鎖）
(CH3)3

-N ⊕

-N ⊕

-N ⊕

(CH3)3
H2O
グリセリド

糖類メトキシム化-TMS

特許登録：（株）アイスティサイエンス

糖類の異性体とメトキシム化■フルクトースの場合
HO

OH

HO
OH

O
H

H

HO
OH

H
OH

五員環

H

OH

H

H

OH

OH

OH

OH

H

HO

HO

HO

六員環

OH

O
OH

N

O

OH

H

糖類は多くの異性体を持つため、そのままTMS化するとピークがいくつも出現してしまう。

CH3

OH

メトキシム化

フルクトピラノース

環状構造

O

メトキシアミン

HO

OH

OH

OH

H

OH

H

OH

O

O

HO

H
H

HO

H

フルクトフラノース

H

HO

HO

OH

直鎖構造（開環構造）

メトキシム化することで環状構造になることを防ぎ、直鎖構造に絞り込むことができる。

メトキシアミンによる誘導体化反応時間

本システムによる糖類のSCAN-TIC
13

15
14

10 11
5

9

8
1

7

2
3

4 6

12

1

Xylose-MO-4TMS

6

Fucose-MO-4TMS

11 Glucose-MO-5TMS

2

Arabinose-MO-4TMS

7

Fructose-MO-5TMS-1

12 Glucopyranose-5TMS

3

Ribose-MO-4TMS

8

Fructose-MO-5TMS-2

13 Sucrose-8TMS

4

Rhamnose-MO-4TMS

9

Mannose-MO-5TMS

14 Lactose-MO-8TMS

5

Ribitol-5TMS

10 Galactose-MO-5TMS

15 Maltose-MO-8TMS

糖類を多く含む試料の分析の課題と対策

２段階試料負荷による野菜ジュースの分析◼ アミノ酸/有機酸/糖類
試料採取 野菜ジュース 50 μL
添加 水 150 μL

Flash-SPE ACXs

手振とう
添加 ACN 800 μL

１回目負荷

添加 0.1N NaOH
抽出上澄液

コンディショニング
ACN-水(1/1)

負荷[保持] 抽出上澄液 40 µL
洗浄 ACN-水(1/1)

振とう (37 ℃, 1 min)
遠心分離 14000 rpm, 3 min

Automation

脱水 ACN
2回目負荷

負荷[保持] 抽出上澄液 3 µL
混合 ACN
脱水 ACN
含侵 10% メトキシアミン-ピリジン
固相誘導体化反応 メトキシム化, 15 min
含侵 MSTFA-トルエン(3/1)
固相誘導体化反応 TMS化, 1 min

溶出 ヘキサン or トルエン
GC/MS スプリット 1:50

32

本システムによるアミノ酸/有機酸/糖類のSCAN-TIC

野菜ジュースのSCAN-TIC

短鎖脂肪酸の t-BDMS誘導体化
t-BDMS(t-Butyl DiMethyl Silyl)化
F

＋ F

O
H3C

C

OH

脂肪酸

O

O

CH 3 CH 3

CH 3 CH 3
N

F
H3C

Si

C

CH 3 CH 3

MTBSTFA

CH 3

H3C

O

Si

C

CH 3 CH 3

t-BDMS化⚫ t-BDMS化はTMS化より質量数が大きくなり、分析しやすくなる。
⚫ TMS 誘導体は加水分解されやすいのに対し，t-BDMS 誘導体は加水分解に対し安定している。
⚫ 分子量に近いところでのフラグメントイオンを得られるため解析し
やすい。

CH 3

抽出液のpH調整について

相対ピーク面積値⚫ 抽出液にNaOH水を添加してpHを8（7～9）ぐらいに調整する

140

1 Formic acidpKa = 3.7120

2 Acetic acidpKa = 4.6

100

3 Propanoic acidpKa = 4.8

4 Butanoic acidpKa = 4.880

5 Pentanoic acidpKa = 4.8

60

6 Hexanoic acidpKa = 5.1

40

7 Heptanoic acidpKa = 5.1

8 Lactic acidpKa = 3.8

9 Octanoic acidpKa = 5.2

10 Maleic acidpKa = 3.1

11 Succinic acidpKa = 3.5

12 Fumaric acidpKa = 3.6

13 Malic acidpKa = 3.2

20
0
pH4.5
Formic acid-tBDMS
Propanoic acid-tBDMS
Pentanoic acid-tBDMS
Heptanoic acid-tBDMS
Lactic acid-tBDMS
Succinic acid-2tBDMS
Malic acid-3tBDMS
Tartaric acid-4tBDMS

pH5.5

pH6.5
Acetic acid-tBDMS
Butanoic acid-tBDMS
Hexanoic acid-tBDMS
Octanoic acid-tBDMS
Maleic acid-2tBDMS
Fumaric acid-2tBDMS
a-Ketoglutaric acid-tBDMS
Citric acid-4tBDMS

pH7.5

pH8.5

酸性

アルカリ性

R-COOH

R-COO⊖ H⊕

14 a-Ketoglutaric acid
15 Tartaric acidpKa = 2.7

16 Citric acidpKa = 3.0

測定条件：短鎖脂肪酸
SPE-GC Interface SPL-M100 (AiSTI Science)
SPE Cartridge
Flash-ACX
Sampling Volume 50 µL
PTV Injector
Insert Type
Injector Temp.

LVI-S250 (AiSTI Science)
Spiral Insert
150℃(0.5min)-25℃/min-290℃(16min)

GC
Inlet Mode
Split 1:20
Flow Mode
Constant Flow, 1 ml/min
Pre-Column
0.25mm i.d. x 1m
ColumnVf-5ms, 0.25mm i.d. x 30m, df;0.25µm
Oven Temp.
60℃(3min)-10℃/min-100℃-20℃/min-310℃(4min)
Trans. Line Temp. 290℃
MS
MS Method

SCAN, m/z;70-470

t-BDMS誘導体化による短鎖脂肪酸と有機酸のSCAN-TIC

6
1

7
9

5
3

2

4

13

15

検出器OFF8

1. Methanoic acid-tBDMS
2. Ethanoic acid-tBDMS
3. Propanoic acid-tBDMS
4. Butanoic acid-tBDMS
5. Pentanoic acid-tBDMS
6. Hexanoic acid-tBDMS

11
10 12

16

14

7. Heptanoic acid-tBDMS
8. Lactic acid-2tBDMS
9. Octanoic acid-tBDMS
10. Maleic acid-2tBDMS
11. Succinic acid-2tBDMS
12. Fumaric acid-2tBDMS

13. Malic acid-3tBDMS
14. a-Ketoglutaric acid-3tBDMS
15. Tartaric acid-4tBDMS
16. Citric acid-4tBDMS

長鎖脂肪酸のメチル化とTMS化とt-BDMS化
パルミチン酸
メチル化

オレイン酸

メチル化

メチル化よりTMS化やt-BDMS化の方が高質量域での強度の高いフラグメントイオンが検
出される。

EPA
TMS化
TMS化

t-BDMS化TMS化

t-BDMS化

t-BDMS化ブルーチーズの t-BDMS誘導体化による分析
試料： 100mg
添加 水 100µL

コンディショニング
ACN-水(1/1)

添加 ACN 800µL
振とう （37℃, 30min）
遠心分離（14000rpm, 5min）

Automation

バイアルFlash-SPE AXs
負荷[保持] 抽出上澄液 50 µL
洗浄 ACN-水(1/1)

分取 上澄み液：200µL
添加 ACN-水 600µL
添加 0.1N NaOH水 （pH調製）
バイアル

脱水 ACN
含侵 MTBSTFA-トルエン(1/3)
固相誘導体化反応 t-BDMS化, 1 min
溶出 ヘキサン
GC/MS スプリット 1:20

ブルーチーズ3種のSCANトータルイオンクロマトグラム比較
誘導体化試薬：MTBSTFA
試料：ブルーチーズ３種

C

1
2
3
4
5
7
8
9
11
21
22
24
25
26
27
28
29

B

A

Formic acid-tBDMS
Acetic acid-tBDMS
Propionic acid-tBDMS
Butyric acid-tBDMS
Valeric acid-tBDMS
Enanthic acid-tBDMS
Lactic acid-2tBDMS
Octanoic acid-tBDMS
Succinic acid-2tBDMS
Decanoic acid-tBDMS
Dodecanic acid-tBDMS
Tetradecanoic acid-tBDMS
Aspartic acid-3tBDMS
Glutamic acid-3tBDMS
Hexadecanoic acid-tBDMS
cis-9-Octadecenoic acid
Stearic acid-tBDMS

内標について従来法では2-イソプロピルリンゴ酸（Isopropyl malic acid)やリビトールなどが使用されていますが、固相誘導体化法では、固相の保持に合わせる必要があるため、アミノ酸、有機酸、糖類、短鎖脂肪酸のそれぞれに適した内標が必要となります。

アミノ酸：ノルロイシン
有機酸：アジピン酸

糖類：リビトール
短鎖脂肪酸：ヘキサン酸-d（検討中）ダイゼイン類

DaidzeinDaidzein-2TMS

Genistein

Genistein-3TMS

MW:254.2

MW:398

MW:270.2

MW:486Equol

Equol-2TMS

MW:242.2

MW:386

イソフラボンの一種。ダイゼインやゲニステインのよ
うな他のイソフラボン化合物は、イズや豆腐や植物性
タンパク質大豆製品のような食品にも存在している。
エクオール は、腸内細菌によってイソフラボンの一種であるダイゼインから代謝される.
しかし、約30-50%のヒトしかエクオールを作る腸内細菌を持っていない。（引用：Wikipedia）

オンライン固相誘導体化法：ダイゼイン類
抽出液

約pH9に調整

バイアル

Flash-SPE ACXs

測定条件
Automation

コンディショニング
ACN-水(1/1)
ACN

負荷[保持] 抽出上澄液 50 µL 分取
洗浄 ACN-水(1/1)
脱水 ACN

含侵 MSTFA-トルエン(3/1) 8µL
固相誘導体化反応 TMS化, 3 min
溶出 トルエン
GC-MS LVI-Split;1:5

SPE-GC Interface SPL-M100 (AiSTI Science)
SPE Cartridge
Flash-ACX
Sampling Vol.
50 µL
PTV Injector
LVI-S250 (AiSTI Science)
Insert Type
Spiral Insert
Injector Temp. 120℃(0.5min)-120℃/min-290℃(8min)
GC
Inlet Mode

Split Vent
150mL/min(0.5min) –Split 1:5(2.5min)GasSaver(3min)
Flow Mode
Constant Flow, 1 ml/min
Pre-Column
0.25mm i.d. x 1m
ColumnVf-5ms, 0.25mm i.d. x 30m, df;0.25µm
Oven Temp.
120℃(3min)-40℃/min-280℃-10℃/min-320℃(2min)
Trans. L.Temp. 320℃

MS
MS Method

SCAN, m/z;70-490, or MRM

ダイゼイン類3種のSCAN-TIC① エクオール-2TMS

ダイゼイン類3種のSCAN-TIC③①②② ゲニステイン3TMS④③ ダイゼイン-2TMS④ ゲニステイン2TMSオンライン固相誘導体化法：胆汁酸抽出液

約pH8に調整

バイアル

Flash-SPE ACXs

Automation
コンディショニング
ACN-水(1/1)
ACN

負荷[保持] 抽出上澄液 50 µL 分取
洗浄 ACN-水(1/1)
脱水 ACN

含侵 MSTFA-トルエン(3/1) 8µL
固相誘導体化反応 TMS化, 2 min
溶出 ヘキサン
GC-MS LVI-Split;1:5

測定条件
SPE-GC Interface SPL-M100 (AiSTI Science)
SPE Cartridge
Flash-ACX
Sampling Vol.
50 µL
PTV Injector
LVI-S250 (AiSTI Science)
Insert Type
Spiral Insert
Injector Temp. 120℃(0.5min)-120℃/min-290℃(8min)
GC
Inlet Mode
Flow Mode
Pre-Column
ColumnOven Temp.

Split 1:50
Constant Flow, 1 ml/min
0.25mm i.d. x 1m
Vf-5ms, 0.25mm i.d. x 30m, df;0.25µm
100℃(2min)-30℃/min-310℃-2℃/min-325℃
Trans. L. Temp. 320℃

MS
MS Method

SCAN, m/z;70-470, or MRM

本法による胆汁酸のSCAN-TICとスペクトル
Cholic acid①

Lithocholic acid

O
Si

Si

Deoxycholic acid
O

O
Si

O

O
Si

Cholic acid-4TMS① のスペクトル

NISTライブラリスペクトル

O

O
Si

O
Si

Si

O

②

O

Si
O

Lithocholic acid-2TMS② のスペクトル

NISTライブラリスペクトルOSi③ のスペクトル

NISTライブラリスペクトル③オンライン固相捕集-溶媒溶出法
捕集

コンディショニング

乾燥

固相からの溶出液をGCに全量導入するオンラインSPE-GC/MSシス
テムによる新しい固相捕集-溶媒溶出法を開発した。

溶媒溶出＆注入

N2ガス
配管

固相に
捕集

固相
数 mg

溶媒

吸
引

ニードル

溶出しながら全量注入
脱水

脱水

測定

◼ 迅速に気相を一定量捕集可能。
◼ 熱に弱い成分を分析可能。
◼ 気相中の水分を除去可能。
◼ オンサイトサンプリングが可能。
◼ 誘導体化が可能。

加温部

前処理時間14分① 試料を一定時間加温（50℃）

【捕集方法】
気相を５ｍL吸引、攪拌し、再び5 mL吸引を繰り返して捕集します。
攪拌

攪拌

５ ｍL
吸引

② 固相を溶媒でコンディショニング③ 窒素ガスで固相を乾燥④ 試料を一定時間攪拌

５ ｍL
吸引

⑤ 試料の気相を固相に一定量吸引⑥ 窒素ガスで固相を乾燥⑦ 注入口へニードルを挿入

加温⑧ 目的物質を溶媒で固相から溶出させながらGCへ全量注入。
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ステーキ醤油：におい分析
Limonene

Caryophyllene

3-Carene
γ-Terpinene

14
2

12

5
9

15
10

1
3 4

13
11
8
67

1. Camphene
2. Terpinolene
3. Cymene
4. Eucalyptol
5. Terpinolene
6. 1-Allyl-2-isopropyldisulfane
7. Fenchol
8. Trisulfide, methyl propyl
9. 4-terpineol
10.Terpineol
11.Elemene
12.Copaene
13.Humulene
14.Zingiberene
15.Bisabolene‹#›

ステーキ醤油：アミノ酸/有機酸分析
4,5

2

19
3

1

6
7 10
8

12

17
18
20

11

9

9
5

1. Lactic acid-2TMS
2. Alanine-2TMS
3. Valine-2TMS
4. Phosphoric acid-3TMS
5. Leucine-2TMS
6. Isoleucine-2TMS
7. Proline-2TMS
8. Glycine-3TMS
9. Succinic acid-2TMS
10.Serine-3TMS

11. Threonine-3TMS
12. Malic acid-3TMS
13. Aspartic acid-3TMS
14. Methionine-2TMS
15. Pyroglutamic acid-2TMS
16. GABA-3TMS
17. Glutamic acid-3TMS
18. Phenylalanine-2TMS
19. Citric acid-4TMS
20. Lysine-4TMS
21. Tyrosine-3TMS‹#›

納豆：におい-誘導体化分析

Isovaleric acid-tBDMS
Valeric acid-tBDMS

Butyric acid-tBDMS

誘導体化試薬 MTBSTFAを溶出溶媒に混液させて、t-BDMS化を行った。

MTBSTFA
酪酸

誘導体化試薬-tBDMS
酪酸 - tBDMS‹#›