ヒト水棲型嗅覚受容体の機能解析と新たな水溶性匂い分子の探索

廣田

東京工業大学バイオ研究基盤支援総合センター

緒順二准教授の生理機能を明らかにすることを目的として、新たな水言
嗅覚は、外部環境中の匂い情報を感知・識別し、動物溶性匂い分子の探索を行った。の生命維持のために必要な行動を誘導する重要な感覚である。
ヒトやマウスの嗅覚神経系は、嗅覚受容体（odorant

方法receptor: OR）によって数十万もの匂い分子を識別して本研究課題の最終的な目的はヒト水棲型 OR の生理機いる。近年アロマテラピーに代表される “ 香りの効果 ” な能を明らかにし、新たな水溶性匂い分子を同定すること

ど、嗅覚を介した生体への作用に関心が高まりつつある。

である。しなしながら水溶性匂い分子の有無をふくめ、匂い分子感知の鍵となる OR は、動物の進化の過程に水棲型 OR の機能は未知であることから、まずマウス水おいて、水棲から陸棲への生活環境の変化に伴って分子棲型 OR を対象とした研究を行うこととし、その結果を進化を遂げ、また社会の複雑さに対応するためにその遺もとにヒトへと発展させることとした。水溶性匂い分子伝子数を増加させてきた。その結果、OR 遺伝子はゲノの探索には、哺乳動物唯一の水棲環境である羊水に着目

ム上最大の遺伝子ファミリーを形成し、その総数はヒし、以下のつ２の実験を行った。

トにおいて約 400 個（全遺伝子の約２％）、マウスにお実験１1)

いては約 1300 個（全遺伝子の約５％）に及ぶ 。OR

羊水中になんらかの行動を誘導する水溶性匂い分子が遺伝子は、系統発生学的に大きく２つのクラス（Class存在するかどうかを明らかにするために、行動解析実2, 3)。Class I OR は、系験をおこなった（図１）。C57 BL/6 マウスを 1 個体ず

統発生学的により古く魚類由来の OR に類似しており、つクリーンケージで 2 日間飼育し、ケージの匂いに馴水溶性の匂い分子を感知すると考えられている。一方、れさせた。羊水サンプル 20 μ l をろ紙小片（約 1cm ×Class I から進化したと考えられる Class II OR は、陸棲2cm）にしみこませ、ピンセットを用いてケージ内中央動物特異的な遺伝子であり、揮発性の匂い分子を感知すに静置し、約 10 分間マウスの行動をビデオカメラで撮ると考えられている。従来、水棲型 OR は魚類 OR に類影・観察し、行動を解析した。対照実験としてイオン交似していることから、進化の名残と考えられてきた。し換水を用いた実験を行った。C57BL/6 マウスは、３週かし最近のゲノム解析の進展によって、魚類からヒトに齢（未成熟）もしくは６週齢（成熟）の雌と雄マウスで、至るほぼすべての脊椎動物に存在することが明らかとないずれも交尾経験のない個体を用いた。

I と Class II OR）に分類されるり、何らかの重要な生理的機能をもつのではないかと考えられるようになってきている。これまで OR 遺伝子のC57BL/6 ♂♀

機能と遺伝子発現の分子機構ついての研究をおこなってきた。揮発性匂い分子を受容する OR について、機能的な遺伝子発現に必須な領域と構造を明らかにし、さらに必須転写因子を同定した 4, 5)。一方、OR 遺伝子ファミリーのうち、水溶性の匂い分子を受容するサブファミ
リー遺伝子発現制御領域の解析をおこない、揮発性匂い

3or6 週齢

きれいな床敷に交換

Paper Cover

２日後

Mesh lid

羊水 or 蒸留水をしみ込ませたろ紙（１cm × 2cm）

Plastic cage

観察（録画）、行動解析

Clean bedding

図１

分子の受容体とは異なる遺伝子発現制御機構を有するこ

マウス行動実験の概略図

マウス行動実験には、交尾経験のないマウス（雌雄、３週齢6)とを明らかにしてきた 。本研究課題では、水棲型 ORもしくは６週齢）を用いた。
1廣田順

二0.05 % DAB/0.01 % H2O2 を 用 い て 発 色 さ せ、Entellan

実験２により封入し、観察した。

羊水中に含まれる水溶性匂い分子に対する嗅神経細胞応答を調べるために、神経活動マーカーである c-Fos を特異的に認識する抗体を用いて免疫組織化学を行った。

結実験には C57BL/6 マウスの性成熟前後のオスとメスを実験１果用いた。マウスはあらかじめ麻酔下で右側鼻腔を外科的羊水提示に対する行動実験の結果、マウスは性差、成に閉塞し、匂い分子に暴露しないネガティブコントロー

熟度によって異なる行動を示した（表１）。成熟メスでは、ルとした。実験は以下の手順に従って行った。1 個体

匂い提示直後からろ紙片に近づき、積極的に抱えて匂いずつクリーンケージで 2 日間飼育し、ケージの匂いにを嗅ぐ、ろ紙を齧るなどの行動を示し、またろ紙を巣へ馴れさせた後、羊水サンプル 20 μ l をしみこませたろ持ち帰る等の母性行動様の行動を示した。一方、成熟オ

紙小片をピンセットを用いてケージ内中央に静置した。

スでは、ろ紙片に近づくものの、すぐに顔を背け、離れc-fos の発現ピークである 90 分後に麻酔下で 4% PFA/る等の嫌悪行動が見られた。また未成熟のオス、メスでPBS により灌流固定した。嗅球と大脳を摘出した後には、ろ紙片の匂いを嗅ぐ行動は見られるが特徴的な行動

4% PFA/PBS で 1 時間後固定し、15%スクロース /PBSは認められなかった。

で約 3 時間、30%スクロース /PBS で約 20 時間置換し以上の結果から、羊水中にはなんらかの匂い分子が存た。OCT コンパウンド（Sakura Finetechnical）中に包在し、さらに成熟メスと成熟オスに特徴的な行動を誘導埋、凍結した後に、クライトスタットを用いて 30 μ mする匂い分子が含まれることが示唆された。の冠状断凍結切片を作製した。免疫組織化学は ABC 法

実験２によって行い、以下の試薬を用いた。ブロッキング試薬：

嗅神経細胞は匂い分子を受容するとその情報を投射先

Avidin/Biotin Blocking Kit（Vector Laboratories、 １ 次である主嗅球の特定の糸球体に伝達する。そこで匂い刺抗体：Anti-c-Fos (Ab-5)(4-17) Rabbit IgG（Calbiochem）、激に応答した神経活動を c-Fos を指標にして、免疫組織

検出試薬 : VECTASTAIN ABC Kit（Vector Laboratories）。

化学的に検出した。解析の結果、羊水刺激によって成熟

表１

メスでは主嗅球の背側領域・内側領域・外側領域の特羊水刺激によって誘導されるマウスの行動 *性別・週齢定の位置で、c-Fos 陽性の糸球体が存在することが確認誘導される行動（ろ紙に対する行動）
抱える

６週齢

すぐに接近し匂いを嗅ぐ

♀

３週齢

匂いを嗅ぐ

♂

６週齢

すぐに接近し匂いを嗅ぐが、顔を背けるの投射先は主嗅球背側領域に分布することが知られてい♂

３週齢

匂いを嗅ぐる。これらの領域で c-Fos 陽性細胞の一部が認められるもしくは無反応もしくは無反応齧る

された（図２）。成熟オス・未成熟メス・未成熟オスの♀

巣に持ち帰るc-Fos 陽性細胞数は、成熟メスに比して少ないことがわかった。水棲型嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞の軸索

特に行動を示さない

特に行動を示さないたことから、水棲型 OR の一部が羊水刺激に応答してい* 対照実験として同一個体に水をしみ込ませたろ紙を提示し、比較した。

図２

羊水刺激後の成熟メスマウス主嗅球における抗 c-Fos 抗体陽性細胞

匂い提示９０分後の主嗅球における抗 c-Fos 抗体による免疫組織化学染色。（a）対照側の主嗅球の免疫染色像。鼻腔を外科的に閉塞させているため、c-Fos 陽性細胞は検出されない。（b）主嗅球で匂い刺激に応答して認められる c-Fos 陽性細胞。背側領域の糸球体のまわりに強いシグナルが認められる。（c,d）（a, b）破線内の拡大像。スケール（a）500 μ m、（c）100 μ m。
2

ヒト水棲型嗅覚受容体の機能解析と新たな水溶性匂い分子の探索される。

ることが示唆される。同時にこれ以外の領域でも応答が見られることから、水棲型 OR のみならず、陸棲型 ORも羊水匂い成分に応答することが示唆された。

要

約
本研究では、水棲型 OR の生理機能の解明と新たな水考

溶性匂い分子の探索を目的とし、マウス羊水を対象とし察
水棲型 OR の機能はこれまであまり知られていない。

た匂い応答の検出をおこなった。行動実験から羊水中に本研究では、哺乳動物唯一の水棲環境である羊水に着目は特徴的な行動を誘導する匂い匂い分子が含まれ、そのし、新たな水溶性匂い分子の探索を行った。その結果、影響はメスにおいてとくに強いことが明らかとなった。

成熟雌雄マウスにそれぞれ特徴的な行動を誘導する匂い

また交尾経験のない雌マウスに母性行動様の行動が認め分子の存在が明らかとなり、その匂い成分の一部の応られることから、先天的な行動を誘導したものと考えら

答に水棲型 OR が関与していることが示唆された。行動

れた。さらに、主嗅球における神経活動の検出によって、実験では、交尾経験のない雌マウスに母性行動様の行動

羊水中には成熟メスの背側領域の糸球体を特異的に活性が誘導されたことから、羊水には個体に先天的な行動を化する匂い分子が含まれることがわかった。今後、初代誘導する分子が含まれるものと考えられる。特に性差に培養嗅神経細胞のカルシウムイメージングによって羊水よって誘導される行動が異なり、羊水匂い成分に応答す刺激に対して応答のみられた細胞を選択し、single-cellる神経回路が先天的に異なる可能性が考えられ、匂い応

RT PCR による OR の同定と、クロマトグラフィー法に答を示す受容体遺伝子ならびにマウス遺伝学的手法によよるリガンド分子同定を行う。

る OR 特異的神経回路の可視化実験が今後の課題となる。
本研究課題では、初代培養嗅神経細胞を用いたカルシ謝辞本研究を遂行するにあたり研究助成を賜りました財団

ウムイメージングによる匂い成分へ応答する嗅神経細胞法人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。の単離と OR 遺伝子のクローニングを行っている。OR遺伝子同定後、培養細胞への OR 遺伝子導入を行い、再構築系を用いた匂い応答の再確認を行う。さらにクロマ

文献トグラフィーによる匂い成分の単離と同定とヒト水棲型

1) Zhang, X. et al.: Genomics , 89, 441-450, 2007.

嗅覚受容体遺伝子の機能解析へと研究を展開する予定で

2) Glusman, G. et al.: Genome Res , 11, 685-702, 2001.
3) Zhang, X., Firestein, S.: Nat Neurosci 5, 124-133, 2002.

ある。魚類からヒトに至る長い動物の進化の過程で保存

4) Hirota, J., Mombaerts, P.: Proc Natl Acad Sci USA , 101, 8751-8755,

されてきた水棲型 OR は、陸棲型 OR にはない生理的役

2004.

割を持つものと予想され、そのリガンド探索からはこれ

5) Rothman, A. et al.: Mol. Cell. Neurosci . 28, 535-546, 2005.

までにない機能を持つ新たな “ 匂い分子 ” の同定が期待

6) Hirota, J. et al.: Mol. Cell. Neurosci ., 34, 679-688, 2007.

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