【研究報告】（自然科学部門）

食品由来のアミロイド凝集阻害成分探索のためのNMR スクリーニング技術

廣明秀名古屋大学大学院創薬科学研究科基盤創薬学専攻
緒一教授

言
アミロイド線維とはタンパク質の規則的な凝集体の一種で、タンパク質の種類に関わらず特定の条件下で形成される難溶解性の直径数十ナノメーターの線維である。人体において、20 種類以上のタンパク質がアミロイド線維を形成することが知られており、病変部にアミロイド線維の沈着が観察される疾患を総称して「アミロイドーシス」と呼ぶ。わが国では、アルツハイマーβペプチド（Aβ（1-40/1-42））の蓄積が認められるアルツハイマー病や 1,2）、透析治療の結果、大量に蓄積するβ2ミクログロブリンが原因となる透析アミロイドーシスなどがよく知られている。また、微小管結合タンパク質タウが原因となり、アミロイドとは異なる線維（PHF）

図1を形成して神経細胞死を発症するタウオパシーも、同じ食品成分・食品添加剤成分に存在するアミロイド凝集阻害活性を有する化合物カテゴリーに属する疾病である。不溶性線維を形成するもととなるタンパク質の中には、Aβ（1-42）やタウのよを阻害する化合物の多くは、構造科学的に弱いアフィニ

うに、水溶液中で安定な立体構造を持たない、天然変性ティーしか持たないと予想される。そのため、アミロイド3）形成阻害剤は、血中に比較的大量に存在していても、副アミロイド形成の分子的特徴は、クロスβ構造と呼ば作用や毒性を示さない化合物から探索されねばならない。

れるβシートからなる特異な線維が形成されること、難もともと生体内にある成分、栄養素やビタミンなどの食品溶解性で生理的に除去されにくいこと、線維形成時に多成分からの探索研究が必要である。こうした背景のもと、様な中間体やオリゴマーが形成されること、の 3 点であ近 年、 茶 カテキン 成 分 の 一 つ epigallocatechin-3-gallate

る。形成されたアミロイド線維は、元となるペプチドの（EGCg）4）ならびにウコンの芳香成分クルクミン 5）の Aβアミノ酸配列にはあまり依存せず、共通の構造的特徴を（1-42）の凝集阻害活性とそのメカニズムが注目されてい有する。例えば、色素チオフラビン T（ThT）による蛍る。本研究では、既知の食品成分・食品添加剤成分（図光検出が可能である。多くのアミロイド性ペプチドは、1）を安定同位体標識を施した Aβ（1-42）に添加し、その天然変性タンパク質であり、単量体は構造を持たず、しNH の NMR シグナルの変化を系統的に分類することで、たがって低分子が結合するポケットも存在しない。その各化合物の作用機構の特徴づけを行いつつ、新たな化合ため、立体構造に基づいた合理的創薬手法を適応しにく物のスクリーニング法を開発することを目的としている。

タンパク質が含まれている 。

い。
実験方法

本研究では、アミロイド病、とくにアルツハイマー安定同位体標識 Aβ（1-42）の調製症の予防に焦点を当てた活性成分の探索を合理的に行うために、NMR スクリーニングの手法を開発することを

Aβ（1-42）は、6 残基連続で並んだヒスチジン（以下、めざす。Aβ（1-42）ペプチド単量体に作用して、線維化

6×His）とユビキチン（以下、Ub）タグを不可した融
1

廣明

秀

一合タンパク質として、大腸菌 BL21（DE3）により組換5％ D2O）を用いシゲミ微量試料管を用いて測定した。

え発現することで得た。15N 標識された M9 培地を用い

NMR 装 置 は Bruker 社 AVANCE ま た は AVANCE - IIて大腸菌 BL21（DE3）に封入体として発現させ、破砕、600 MHz デジタル NMR 装置を使用した。温度は 283 K,洗浄、グアニジン溶液による可溶化、アフィニティー精288 K, 298 K, 303 K, 310 K の 5 点の温度で、1H-15N-HSQC製、タグ切断を経て、最終的に逆相 HPLC による精製を測定を行った。化合物添加実験については、75 μM の15行うことで、 N-Aβ（1-42）を得た。6×His-Ub タグを15

切断は酵母由来 Ub 加水分解酵素を用いた。非標識 Aβ

1％ d6-DMSO, 10％ D2O, 283 K）に各化合物を添加した（1-42）についても同様に調製した。精製された Aβ（1-42）

ものをシゲミ微量試料管に封入して測定した。測定したは凍結乾燥後、TFA/アセトニトリルによる再溶解→凍

データはソフトウェア NMRPipe および SPARKY を用

N-Aβ（1-42）を含む試料溶液 300 μl（0.5×PBS, pH 7.4,いて解析した。さらに、得られたシグナルの位置を、結乾燥→HFIP 処理を行い、最終精製物とした。

15N と 1H のシグナルごとに正規化して連結して一次元のアミロイド形成阻害反応アッセイベクトルとしたのち、主成分分析を行った。主成分分析

凍結乾燥された 50 nmol の Aβ（1-42）を、20 μl の DMSO

は、octave 3.8.0 を用いた。

で溶解した後、速やかに 0.5×PBS 1 ml で希釈することによりアミロイド化反応を開始した。その後、図 1 の各結果化合物を溶かした 0.5×PBS 1 ml と混合し、1 mM ThTアミロイド線維形成反応の確認（図 2）
本研究で使用した Aβ（1-42）はすべて大腸菌発現系にを 10 μl 添加した。ただし RA は、PBS には直接溶解でき な か っ た た め、DMSO に 2.5 mM と な る よ う に 溶 解し、この RA/DMSO 溶液に Aβ（1-42）を溶解した。反
応液をスターラーバー入りの石英セルに入れ、37℃で撹拌しながら、5 分ごとに蛍光（励起波長 440 nm、蛍光波長 484 nm）を測定した。測定には、日立 F-7000 分光蛍光光度計を用い、フォトマル電圧 700 V、励起側スリット 5.0 nm、蛍光側スリット 2.5 nm で行った。
電子顕微鏡観察25 mM（0.1 mg/μl）の Aβ（1-42）の重合前ならびに 0.5×PBS 中で 60 分間重合させた試料を用いて電子顕微鏡観察を行った。あらかじめ親水化処理を施したグリッド（エラスチックカーボン支持膜 STEM100Cu グリッド、グリッドピッチ 100 μm、応研商事株式会社）に、アミロイド線維を含む試料溶液 5 μl を載せた。負染色は、そこに 5 μl 2％酢酸ウランを加え、余剰の液を吸った後、グリッドを 10 μl の酢酸ウランで洗浄することで行った。
電子顕微鏡は JEM1200 EX-II（日本電子）を、加速電圧 70 kV で使用し、12,000 倍の像を得た。像の記録にはELECTRON-MICROSCOPIC FILM FG（FUJIFILM）を使用した。
NMR によるアミロイド形成阻害剤による Aβ（1-42）の信号変化の観察ならびにデータ処理
NMR温度変化実験については、100 μMの 15N-Aβ（1-42）

図2を含む試料溶液 300 μl（20 mM PB, pH 7.2, 2％ DMSO,2Aβ（1-42）より調製したアミロイド線維の負染色電子顕微鏡画像。（A）重合開始直後、（B）同 60 分後

食品由来のアミロイド凝集阻害成分探索のための NMR スクリーニング技術より筆者の研究室で調製したものである。大腸菌由来のた化合物について、統一的な条件でアミロイド線維形成Aβ（1-42）には凝集核が含まれやすいという報告がある

阻害実験を行った（図 3）。

6）が 、筆者らもその現象が再現できた。本実験で用いた今回の研究でも、高濃度の TRH ならびに EGCg は、Aβ（1-42）は、新たにアミロイド核を添加しなくても、測定範囲内での Aβ（1-42）のアミロイド形成をほぼ完全およそ 30 分後に線維形成が始まるものであった（図 3）。に阻害した。SUC、GLC は TRH に較べて阻害活性はや

また、そのアミロイド形成曲線は、核形成プロセスに対や弱かった（図 3A）。阻害活性をさらに詳細に比較する

応するラグ部分と、線維伸長プロセスに対応する部分のために、100 mM、250 mM の中間的な濃度についても二相からなる、典型的な曲線を示した。図 2 には、0.5×測定した（data not shown）。中間的な濃度では差が顕PBS 添加後すぐの Aβ（1-42）と、線維形成反応開始後 60

著であり、阻害活性は TRH＞SUC＞GLC の順であった。

分後の試料の、負染色電子顕微鏡像を示した。直径のまた、そのような条件下では、核形成阻害とみられる凝揃った直線状の線維が多数観察された。

集の遅延が見られた。一方、古くから知られている凝集阻害剤である Scyllo-inositol は、今回の実験では凝集阻化合物によるアミロイド形成阻害（図 3）害を示さなかった。RA は部分的な凝集阻害を示した。

ついで、このロットの試料を用いて、図 1 に表示した凝集曲線からは、核形成の阻害が考えられた（図 3B）。

化合物によるアミロイド形成阻害効果の評価を行った。

CUR は、化合物の持つ紫外吸収部が ThT の蛍光励起波

今回使用した阻害剤は、それぞれについてすでにアミロ長と重なるため、本アッセイは適用できなかった。

イド形成阻害活性が報告されている。しかし、すべてのAβ（1-42）の NMR 信号の変化（図 4、図 5）化合物の ThT 蛍光アッセイによる連続的時系列データが報告されているわけではなく、また、Aβ（1-42）の初

京都大学の星野らは、Aβ（1-40）の NMR スペクトル期濃度、重合核の添加などの条件も異なるため、文献値が温度変化に応じて特徴的なシグナル移動ならびにシグを互いに比較することができない。そこで、図 1 に示しナル消失を示すこと、またその変化は Aβ（1-40）のランダム構造と局所的なヘアピン構造の平衡移動によるものであることを報告した 7）。一方、EGCg および合成アミロイド阻害剤 CLR01 と Aβ（1-40）の相互作用の NMR 研
究 8）や RA およびフラボノイド myricetin と Aβ（1-42）の相互作用の NMR 研究 9）などの報告で、Aβ ペプチドのNMR シグナルは化合物添加でも大きく変化することが知られている。先行研究では NMR シグナル変化から低分子の相互作用部位を求めようとしているが、Aβ ペプチドが天然変性タンパク質であることを考えると、その解釈の妥当性には限界がある。むしろ、化合物添加による化学シフト変化も、温度変化による化学シフト変化も、Aβ（1-42）の局所構造間の平衡の変化を反映していると捉えるべきである。そこで筆者は、Aβ（1-42）のNMR スペクトルの温度変化（図 4A）および化合物による滴定実験（図 4B）のデータを、化学シフトの数値データとして正規化し、主成分分析にかけて解析した（図5）。
主成分分析は、第一、第二、第三主成分の寄与率がそれぞれ 59.3％、40.4％、0.27％と極めて良好にデータ

図3を分類することができた。第三主成分までを用いて各ThT 蛍光による Aβ（1-42）のアミロイド線維重合アッセ
イ。（A）糖による凝集阻害（B）食品由来成分による凝集阻害

データを散布図としたところ、「温度変化」によるデータ系列と「化合物添加」によるデータ系列が、二つのク3

廣明

秀一きた。
考察
今回まず明らかになったのは、Aβ（1-42）のアミロイ

ド 形 成 阻 害 に お い て、 三 種 類 の 糖 類 化 合 物（TRH、SUC、GLC）の阻害効果が、この順で序列化できたことである。これら糖類は、高濃度でしか Aβ（1-42）のアミロイド形成阻害活性を示さない。これは、それぞれの分子が特異的に Aβ（1-42）に作用するのではなく、いわゆる osmolyte として、Aβ（1-42）の構造安定性に影響を与えていると考えることができる。Osmolyte としての性質のひとつに preferential hydration があるが、その効果の強さは、強い順に TRH、SUC、GLC となっており、今回得られた順序と一致した。
また、今回の NMR 研究により、複数の異なる種類の化合物による Aβ（1-42）への効果は、その NMR スペクトルを主成分解析することで整理できることが明らかに図4なった。第一・第二主成分は、化学シフトのパターンにAβ（1-42）の 1H-15N 2D-NMR のシグナル変化の様子。
（A）
温度による変化（B）化合物（ロスマリン酸）添加による変化

顕れた、測定条件の違い（特に Aβ（1-42）の試料濃度とDMSO 濃度）を反映しているのではないかと考えられる。第三主成分軸が、温度変化実験の温度軸にほぼ対応していること、化合物の添加もまた、第三主成分軸にそった Aβ（1-42）のスペクトル変化にのみ反映されるという今回の観察は極めて興味深い。アミロイド形成に不都合な特定の局所コンフォメーションが化合物により安定化され、37℃のポピュレーションの状態からずれた状態で固定されることにより、アミロイド形成が大きく抑制されることが、本解析により示された。今後、さらに多種類の化合物のデータを合わせて統合的に解析するこ

図5とで、Aβ（1-42）のアミロイド形成過程における化合物Aβ（1-42）の 1H-15N 2D-NMR のシグナル変化の主成分解
析による分類の役割を解明していきたい。
要ラスタとして明確に分離できた。それぞれのデータ群

約は、ほぼ同じ第一・第二主成分の組成を持ち、第三主成アルツハイマー型認知症の発症原因物質の一つと考分軸に沿って分布している。ここで、温度変化によるえられる Aβ（1-42）ペプチドについて、アミロイド形成

データ系列を見れば明らかなように、第三主成分は反応阻害活性を持つ食品成分・食品添加剤成分との相互Aβ（1-42）の NMR スペクトルに反映される局所構造の作用を 1H-15N NMR を用いて統一的に解析した。NMR熱安定性に沿った軸と考えられる。さらに興味深いこと

スペクトルを主成分分析することで、それぞれの化合物に化合物添加のデータ系列は、グループ A（凝集阻害がの作用機構を分類することができた。また、分類された起 こ ら な い 群、Aβ-only お よ び sINO（750 μM））、 グ化合物群について、溶液中の Aβ（1-42）の局所構造の安ル ー プ B（凝 集 核 形 成 阻 害 の み が 見 ら れ た 群、RA、定性と関連付けることができた。

GLC、SUC）およびグループ C（ほぼ完全に凝集が阻害できた群、高濃度 TRH および EGCg）の三つに分類で4食品由来のアミロイド凝集阻害成分探索のための NMR スクリーニング技術

謝

文献

辞
本研究を遂行するにあたり、文部科学省科学研究費

1） D. J. Selkoe:
2） J. Hardy, D. J. Selkoe:
3） R. Linding, et al.:
4） D. E. Ehrnhoefer, et al.:566, 2008.
5） F. S. Yang, et al.:6） M. Dasari, et al.:
7） T. Yamaguchi, et al.:
8） S. Sinha, et al.:
9） K. Ono, et al.:

および公益財団法人三島海雲記念財団のご支援をいただ
きました。また NMR 測定に岐阜大学の鎌足雄司博士、電顕測定に名古屋大学の松崎瑞希氏、Aβ（1-42）の試料取扱いに京都大学の星美奈子客員准教授、osmolyte のデータの解釈に九州大学の阿部義人准教授の協力を頂きました。厚く御礼申し上げます。

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