ヒト毛細胞特異的ペプチジルアルギニンデイミナーゼのcDNA クローニングと毛髪新生における生理機能の解析
近畿大学

川医学部皮膚科学教室

田暁

Peptidylarginine deiminase (PAD) catalyzes the post-translational modification of proteins through the conversion of arginine
to citrulline in the presence of calcium ions.
In rodents, PAD has been classified into four isoforms, types I, II, III, and IV, which are distinct in their molecular weights,substrate specificities, and tissue localization. Of these isoforms, only type III was detected in epidermis and hair follicles.
Although the role of this enzyme in these tissues is not yet clear, indirect data have shown that several structural proteinssuch as filaggrin, trichohyalin, and keratin are substrates for PAD. In this study, we cloned the full-length cDNA of human
PAD type III (3,142 bp) from cultured human keratinocytes by the reverse transcription-polymerase chain reaction and by
rapid amplification of cDNA ends methods. This cDNA contained a 1,995 bp open reading frame encoding 664 amino acids(Mr = 74,770). To explore the physicochemical and enzymatic properties of human PAD type III, we constructed a plasmid for
producing a recombinant human PAD type III in bacteria. The enzymatic characteristics of the recombinant enzyme werevery similar to those of the rodent PAD type III. Based on the enzyme's activity towards human filaggrin and trichohyalin,
it appears that the enzyme prefers catalyzing the modification of arginine residues in filaggrin. These data imply that humanPAD type III may function as a modulator of filaggrin in these tissues.

１．緒を用いた大腸菌での大量発現系の構築が極めて重要である。

言本研究では、ラット・マウスの PAD type III cDNA の塩

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ［英名；Peptidylarginine

基配列に基づくホモログ PCR による cDNA クローニング

deiminase, EC 3.5.3.15］（以下 PAD と略記）は、蛋白質のから研究に着手した。これまでに得られた研究成果を項目

Arg 残基を脱イミノ反応により Ci t 残基に変換する極めに分けると、１）ヒト PAD type III の cDNA クローニンてユニークな蛋白質修飾酵素であるが、その生理機能につグとその塩基配列の決定

いては未だ不明の点が多い。しかし、最近、表皮・毛嚢組ベクターの構築と組換え型酵素の精製方法の確立

織に存在するケラチンならびにケラチン結合蛋白質に Ci t組換え型酵素の蛋白質化学的並びに酵素化学的性質の解明残基が存在することやこれら蛋白質の脱イミノ化に伴いトである。以下にこれらの成果の内容について紹介する。

ランスグルタミナーゼによる分子間架橋反応が著しく促進

２．実されることが明らかとなった。これらの知見は、PAD が表皮・毛嚢細胞の角質分化に大変重要な役割を果たすこと

２）同 cDNA の大腸菌での発現
３）同験

１）ヒト PAD type III の cDNA クローニングとそのを示唆している。我々は、以前より表皮・毛嚢組織特異的塩基配列の決定に発現する PAD（PAD type III）が存在することを見出し

まず、培養ヒト表皮細胞から poly（A）+mRNA を調製、ており、本酵素の上記表皮・毛嚢蛋白質の脱イミノ化へのランダムプライマー法により一本鎖 cDNA を合成、これを関与を推定している。

鋳型として PCR を行い、DNA 断片を増幅した。尚、プラ

我々は、同酵素の生化学的並びに分子生物学的な研究をイマーはＮ末端側最上流の相同アミノ鎖配列（ILLVNCD）

まずラット・マウスの実験動物から開始し、その cDNAとＣ末端側最下流配列（HCGTVRR）からデザインした合成

クローニングとその全一次構造を解明した１、２）。ついで、DNA を用いた。ついで、増幅 DNA をＴ -plasmid にクロー

これらの知見を参考にし、ヒト PAD type III の表皮・毛ニングし、得られたクローンの塩基配列分析を行った。さ嚢組織ならびに細胞内局在と分化に伴う発現変化、さらにらに、未決定の 5 ' 並びに 3 ' 領域については RACE 法を用は表皮・毛嚢蛋白質への作用とその機能変化を通じ、本酵いてクローニングし、得られたクローンの塩基配列分析を素の生理機能を解明を目指すこととした。そのためには、行った。以上の実験により同 PADcDNA の全塩基配列を決本酵素の cDNA クローニングが不可欠であり、同 cDNA定した。

Molecular cloning of human hair follicle
specific peptidylarginine deiminase
cDNA and its function of hair regeneration２）ヒト PAD type III cDNA の大腸菌での発現ベクターの構築と組換え型酵素の精製
本 cDNA を大腸菌で発現させるために用いた発現ベク

Akira Kawada

ターは、先に報告した独立型 Two-Cistron 発現ベクター３）

Department of Dearmatology, Kinki
University School of Medicineを用いた。翻訳領域にフレームが合うよう制限酵素サイトを付与したプライマーを合成後、上記 cDNA を鋳型として PCR により翻訳領域を増幅、配列を確認後、制限酵素− 78 −

ヒト毛細胞特異的ペプチジルアルギニンデイミナーゼの cDNA クローニングと毛髪新生における生理機能の解析処理し上述のベクターに挿入した。発現酵素の精製は、大cDNA の全塩基配列と推定アミノ酸配列である。本 cDNA

腸菌抽出液を調製後、30-50％飽和硫安分画、ついで DEAE-

は全長 3 , 142 bp から成り、1 , 995 bp のオープンリーディ

Sepharose Fast Flow カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー、

ングフレームから推定されるアミノ酸残基数は 664 残基、Aminohexyl-Sepharose カラムクロマトグラフィーにより分子量は 74 , 770 と計算された。すでに明らかにしている行った。

ラット、マウスの PAD type III １、２）とはそれぞれ 87 . 2％、３．結87 . 3 % の極めて高い相同性を示し、本 PAD が動物種を越果えて保存されている酵素であることが判った。

１）ヒト PAD type III cDNA の全塩基配列と推定ア

２）大腸菌組換え型ヒト PAD type III の性質

ミノ酸配列

精製した大腸菌組換え型ヒト PAD type III を用い、各Figure １は本研究により決定されたヒト PAD type III

種の蛋白質化学的性質ならびに酵素化学的性質を明らかに

Figure １ Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of human PAD
type III. The DNA sequence is numbered from the first nucleotide of the cDNA. The
numbers are on the right of each line. The deduced amino acid sequence is displayedbelow the nucleotide sequence in one letter code starting from the putative initiation
methionine. A putative polyadenylation signal is underlined. The amino acid sequence
indicated by wave line is that of a synthetic peptide for producing antiserum.

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し た。 本 酵 素 は SDS-PAGE で 算 出 さ れ る 分 子 量 が課題である。Table １は、各種のアルギニン誘導体に対す

66 . 0 kDa で あ り、 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら の 推 定 分 子 量る 本 酵 素 の 反 応 性 を 比 較 し た も の で あ る。 本 酵 素 は74 . 77 kDa と大きな隔たりがあった。これに関して質量分benzoyl-arginine-ethylester, benzoyl-arginine-amide には析計を用いて詳しく分析を行った結果、本酵素の分子量は高い活性を示し、また天然のモデル基質であるプロタミンアミノ酸配列からの推定分子量と一致することが確認されには特に強い活性を示すことが判った。これらの性質は、た。

マウスの野生型 PAD type III と共通した性質４）であり、本酵素が SDS-PAGE で示す挙動については今後の研究

本組換え型酵素が野生型酵素と大きな性質の変化が生じてTable １ Substrate specificities of the recombinant human PAD type III towards various arginine derivatives.
Substratea

Recombinant Type III
Native Type IIIb
mol/min/mg Relative activity (%)c Relative activity (%)c

Bz-L-Arg-O-Et
Bz-L-Arg-O-Me
Bz-L-Arg-O-NH 2Tos-L-Arg-O-Me
Ac-L-Arg-O-Me
Bz-L-Arg 0 . 39
Ac-L-Arg 0 . 14
L-Arg-O-Me
L-Arg
0 . 08Protamine

1 . 961 . 13
1 . 430 . 36
0 . 5219 . 77.20 . 11
4.2
4 . 28100 . 057 . 673 . 1
18 . 226 . 5
11 . 6
11 . 6
5.7
8.9
218 . 6

100 . 026 . 888 . 4
27 . 432 . 1

15 . 3141 . 1

Concentration of each arginine derivatives were 10 mM and that of protamine
was 4 mg/ml.
bTerakawa et al, 4）cRelative activity was calculated on the basis of the activity towards Bz-L-ArgO-Et.
aFigure ２ Time course of deimination of filaggrin unit and trichohyalin
by human PAD type III. Each protein was deiminated by the enzyme
as described in Materials and Methods. At the indicated times, thereaction was terminated by EDTA, and the citrulline residues ineach preparations were determined by amino acid analysis. Conversion rate of arginine residues to citrulline residues of each protein (○ -, filaggrin unit; - ● -, trichohyalin) was shown.

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ヒト毛細胞特異的ペプチジルアルギニンデイミナーゼの cDNA クローニングと毛髪新生における生理機能の解析いないことが確認された。ついで、本酵素のフィラグリン

最近、リュウマチ性慢性関節炎の患者の血中には Cit 化及びトリコヒアリンに対する反応性について解析した。

されたフィラグリンのみを認識する自己抗体が含まれるこFigure 2 は本酵素と各蛋白質を１対 50 のモル比で反応させ５）とが報告され 、慢性関節炎の発症と Cit 化フィラグリンた時の結果である。本酵素はフィラグリンの Arg 残基を最の免疫感作の成立との間の相関性に興味が持たれている。

大 60％修飾して Cit 残基に変換するに対し、トリコヒアリ

本研究により PAD type III がフィラグリンを標的蛋白質ンでは 13％程度であり、本酵素がフィラグリンを効果的にとしている可能性が高くなったことから、本酵素遺伝子の修飾することが明らかとなった。

発現制御機構に関する基礎的研究が今後大変重要であると４．考思われる。

察

本研究では、ヒトの表皮培養細胞から mRNA を得て、（文献）

ホモログ PCR より PAD type III の cDNA のクローニン

１. Nishijyo T, Kawada A, Kanno T, Shiraiwa M, Takahara

グに成功した。今回得た cDNA が実際にヒト PAD type

H: Isolation and molecular cloning of epidermal- and hair

III をコードするものであることは、本 cDNA から推定さfollicle- specific peptidylarginine deiminase（type III）

れるアミノ酸配列がすでに明らかとなっているラット、マfrom rat, J. Biochem., 868 - 875 , 1997 .

ウスのそれらと極めて高い相同性を有すること、また、実

２. Rus'd AA, Ikejiri Y, Ono H, Yonekawa T, Shiraiwa M,

際に本 cDNA を大腸菌で発現させた酵素の基質特異性はKawada A, Takahara H:Molecular cloning of cDNAs of

天然の PAD type III と変わらないことから判断できる。

mouse peptidylarginine deiminase type I, type III and

本酵素のアミノ酸配列の特徴としてＮ末端領域に Cys 残type IV, and the expression pattern of type I in mouse,基が多く存在していることが挙げられる。今回の研究によEur. J. Biochem., 259 , 660 - 669 , 1999 .

り、本酵素は低イオン強度化においても高い安定性を有し

３. Ohsugi I, Takahara H, Shiraiwa M, Sugawara K:ていることが判ったが、本酵素のこのような安定性は、本Expression of mouse uterine peptidylarginine

酵素が常に外的刺激に晒される細胞表層において機能する

deiminase in Escherichia coli: construction of

ために必要であり、そのためにの強固な立体構造の維持にexpression plasmid and properties of the recombinant

Ｎ末端領域の多数の Cys 残基が必要となっているのではenzyme. Arch. Biochem. Biophys., 317 , 62 - 68 , 1995 .

ないかと推測される。PAD type III が表皮・毛嚢組織に４. Terakawa H, Takahara H, Sugawara K: Three types

おいてどのような蛋白質を標的としていることを明らかに

of mouse peptidylarginine deiminase: characterization

することは、本酵素の生理機能の解明のうえで大変重要で

and tissue distribution, J. Biochem., 110 , 661 - 666 , 1991 .

ある。本研究において、PAD type III の標的蛋白質とし

５. Girbal-Neuhauser E, Durieux JJ, Arnaud M, et al: Theて推定されているフィラグリン及びトリコヒアリンに対すepitopes targeted by the rheumatoid arthritis-

る反応性を調べた結果、フィラグリンに対する反応性がト

associated antifilaggrin autoantibodies are

リコヒアリンに比べ迅速に且つ多くの Arg 残基を修飾す

posttranslationally generated on various sites of (pro)ることが判った。このような結果は、トリコヒアリンが本

filaggrin by deimination of arginine residues, J.

酵素の標的蛋白質である可能性が低いことを示唆するもの

Immunol., 162 , 585 - 594 , 1999 .

である。

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