各種有効成分の効率的な皮膚内送達方法の開発

大阪大学大学院薬学研究科

近 藤

昌 夫

Claudin, a 24-kDa integral membrane protein with four transmembrane domains, plays a pivotal role in barrier-functionof epithelial cell sheets. There are more than 20 members of the claudin family with different tissue-specific expression
and barrier-function. The epidermis consists of several cell layers of strata corneum, granulosum and spinosum. Recently,
Tsukita’s group found that claudin-1 is expressed in the strata granulosum and is responsible for epidermal barrier. Thisfinding indicates that a claudin-1 modulator may be a promising candidate for trans-epidermal delivery of cosmetics, such as
anti-aging compounds and radical scavengers. However, a method to modulate claudin-1-barrier has never been developed.
A C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin (C-CPE) is the only claudin modulator, and C-CPE
disrupts barrier-function of claudin-4 in epithelial cells. We previously showed that modulation of claudin-4 is a novel
strategy for intestinal absorption of drugs using C-CPE as a claudin modulator, and we also found that deletion of the
C-terminal 16 amino acids of C-CPE lost its ability to modulate claudin-4. Taken together, we started to develop a claudin-1
modulator using C-CPE as a prototype. Previously, substitution of Tyr310 with Cys reduced binding of Clostridium
perfringens enterotoxin to its receptor. Until now, we investigated roles of the tyrosines (Tyr306, Tyr310, and Tyr312) of the
C-terminal 16 amino acids of C-CPE in claudin-4 binding and modulation of epithelial barrier by site-directed mutagenesis.
Single mutations of Tyr306, Tyr310 and Tyr312 to alanine resulted in partial reduction of claudin-4-binding. Double mutants
Tyr306Ala/Tyr310Ala and Tyr306Ala/Tyr312Ala lost the ability to bind to claudin-4 and to modulate epithelial barrier.
These data provide us useful information in the development of claudin-1 modulator based on C-CPE.

細胞層透過を亢進できる可能性を示唆しているものの、未１．はじめにだ claudin を利用した皮膚内物質透過方法の開発研究は皆最近、皮膚の生理学が進展し、しみやそばかすの要因や無である。

老化に伴うしわなどの生成メカニズムが明らかになりつつClaudin のバリア機能を阻害する分子としては、ウェルあり、色素沈着を阻害する物質、抗酸化活性物質、コラーシュ菌が産生する Clostridium perfringens enterotoxin（CPE）

ゲン合成促進物質などが美白成分やアンチエージング成分の C 末ペプチド断片（C-CPE）が claudin-4 阻害分子としてとして注目されている。

唯一知られていた 。そこで当グループでは、claudin-4 阻

２）

これらの美白成分やアンチエージング成分の作用部位

害分子である C-CPE を用いて、claudin の薬物送達におけは、皮下に存在するメラノサイト細胞や真皮領域などである標的分子としての有用性について解析を試み、C-CPE がり、単に皮膚表面にこれら成分を塗布しただけではメラノ

ラット腸管においてカプリン酸の 400 倍もの吸収促進作用

サイト細胞や真皮に到達する成分は極めて少なく各種有を示すこと、この吸収促進作用には C-CPE と claudin-4 と効成分の効果を期待することができない。皮膚内への物質の相互作用が関与していることを見出し、claudin が薬物送透過は、角層ばかりでなく表皮下部に位置する重層上皮細達の標的分子として有用であることを見出した 。さらに、胞層により制御されており通常外部からの物質の侵入は抑C-CPE の C 末端側 16 アミノ酸領域を欠損させることによ

制されている。この重層上皮細胞層の物質透過抑制機構

り、claudin-4 結合性および吸収促進作用が完全に消失しては長年不明であったが、2002 年に京都大月田グループにいたことから、これら C 末 16 アミノ酸中に機能ドメイン

より細胞と細胞の間隙に存在する claudin-1 蛋白質によっが存在するものと推察されたて細胞間隙がシールされ重層上皮細胞層の物質の漏れ（移において、Tyr310 を Cys に置換することにより CPE の受動）が阻害されていることが明らかにされた 。この報告

容体結合活性が著しく低下するとの報告がなされていた 。

は、claudin-1 を制御することにより美白成分の重層上皮

これらの CPE 研究および当研究グループの研究成果を

１）

Development of a novel method fortrans-epidermal delivery of cosmetics
Masuo Kondoh
Graduate School of Pharmaceutica l
Sciences, Osaka University

３）

3, 4）

。また、過去の CPE 研究
５）

踏まえ、本研究では、C-CPE の機能解析を試み（Fig. 1）、
ファージライブラリを作製し、claudin-1 binder のスクリーニングを試みた。

２．材料と方法
２−１．変異型 C-CPE の作成
C-CPE 遺伝子（大阪大学微生物病研究所− 68 −

堀口安彦博

各種有効成分の効率的な皮膚内送達方法の開発

C-CPE
184

C-CPE303
184

Binding
to claudin-4289

Decreasein TER

319aa

a)
289

303

319aa

b)

Figure 1 Diagram of C-CPE structure.
C-CPE is the C-terminal fragment of CPE. C-CPE binds toclaudin-4 and decreases TJ barrier function as indicated by adecrease in TER (2). The C-terminal 30 amino acids of CPE
and C-CPE mediate interaction with the CPE receptor andclaudin, respectively a)(6). Further analysis shows that the
C-terminal 16 amino acids are responsible for the interactionof C-CPE with claudin and for its ability to decrease the TJ
barrier function b)(4).

Ser Ser 305 Tyr Ser Gly Asn Tyr310 Pro Tyr Ser Ile Leu 315 Phe Gln Lys Phe 319

Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis.
The underline in forward primer and in reverse primer is NdeI site and BamHIsite,
respectively. The italic letters in the reverse primer indicated the site of mutation.

士より供与）を鋳型とし、Table 1 に示した各種 primer発現細胞）を播種し、一昼夜培養した。変異型 C-CPE 添を用いて PCR 法により目的のアミノ酸をアラニンに置

加 1 時間後に claudin-4 指向性のタンパク質合成阻害タン

換した変異型 C-CPE をクローニングした。変異型 C-CPE

パク質 C-CPE-PSIF（7）（0.2 ㎍ /㎖）を加え、C-CPE-PSIF

DNA 断片を His タグ融合タンパク質発現プラスミド pET-

添加 36 時間後に CytoTox96®
（Promega）
を用いて培地中に

16b に挿入することにより変異型 C-CPE 発現プラスミド

放出された乳酸脱水素酵素（LDH）量を測定した。各種を作製した。大腸菌 BL21（DE3）（Novagen）を用いて各変異体の細胞傷害性抑制作用は、C-CPE による LDH 放出

種タンパク質を発現・産生させた後、HisTrap

抑制率を 100% とした各種変異体の阻害率（%）として算TM

Kit（GE

Healthcare）を用いたアフィニティークロマトグラフィー

出した。

により各種変異型 C-CPE を精製した。

２−２．変異型 C-CPE による C-CPE-PSIF 拮抗阻害
作用
Claudin-4 を強制発現させたマウス線維芽細胞（claudin-4２−３．変異型 C-CPE と claudin-4 との結合性評価（pull down assay）
Caco-2 細胞を回収し、lysis buffer（１% Triton X-100,
１% protease inhibitor cocktail 含有 PBS）を用いて細胞− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

TMを溶解させ、予め Ni-NTA Agarose（Invitrogen ）に作

３−２．変異型 C-CPE と claudin-4 との相互作用

用させることで非特異的な吸着物質を除去した。Caco-2

C-CPE-PSIF 拮抗阻害実験において claudin-4 結合性の細胞溶解液と各種変異型 C-CPE を 37℃で 30 分間反応さ低下が観察された変異体について、Caco-2 細胞溶解液をせた後、Ni-NTA Agarose を加え４℃、３時間反応させ用いた pull down assay により claudin-4 結合性を評価した。遠心分離した沈澱画分を lysis buffer で洗浄した後、たところ、Y306A，Y310A の claudin-4 結合性は低下してウェスタンブロッティングにより claudin-4 および変異型

いたものの、Y312A では C-CPE と同程度の結合性が認め

C-CPE を検出し、変異型 C-CPE の claudin-4 結合性を評価られた（Fig. 2B）。

した。

３−３．変異型 C-CPE の膜電気抵抗値に及ぼす影響
２−４．変異型 C-CPE の膜電気抵抗値に及ぼす影響

次に、Caco-2 細胞の単層膜培養系を用いて各種アラニ

ヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞を Transwell®
（Corning）にン置換体の TER 低下作用（バリア機能低下作用）を検討

播種し、Transwell 上に単層膜を形成させた。一定期間培した結果、Y306A でのみ TER 低下作用の有意な減弱が観養後、各種変異型 C-CPE を作用させ、TJ のバリア機能の察された（Fig. 3A）。

指標である膜電気抵抗値（TER）を測定した。添加 18 時
間後の C-CPE の TER 低下作用を 100% として、各種変異

３−４．変異型 C-CPE の吸収促進作用

体の TER 低下率（%）を算出した。

ラット腸管 in situ loop assay により吸収促進活性を評
価 し た と こ ろ、Fig. 3BC に 示 す よ う に Y306A、Y312A

２−５．変異型 C-CPE の吸収促進作用

では C-CPE と比較して吸収促進作用は著しく低下していモ デ ル 薬 物 と し て FITC-dextran（FD-4, Mw:4000,

た。C-CPE-PSIF および pull down assay の結果を考え合Sigma）を用いて、吸収促進剤の評価法として汎用されてわせると、Y306A では claudin-4 結合性の低下に伴い吸いるラット in situ loop assay により変異型 C-CPE の吸収収促進作用が減弱したと考えられる。Y312A では C-CPE

促進作用を評価した。

と同程度の claudin-4 結合性が認められているにも関わら変異型 C-CPE（0.2 ㎎ / ㎖）および FD-4（10 ㎎ / ㎖）をず、吸収促進作用の低下が観察されていた。ラット小腸

空腸（5 ㎝）に投与し、頸静脈より経時的に採血した。その上皮細胞層溶解液を用いた pull down assay を行ったとの後、血漿中 FD- 4 濃度を蛍光光度計（励起波長；485 nm,

ころ、claudin-4 との結合が観察されたことから（data not

蛍光波長；538 nm）を用いて測定し、投与後 4 時間目までshown）、Tyr312 は claudin-4 との結合には必須ではなくの濃度−時間曲線下面積（AUC

吸収促進活性に関与しているものと考えられる。

0→4）を算出した。

２−６．C-CPE 誘導体ファージライブラリの作成および claudin-1 binder のスクリーニング

３−５．２、３アミノ酸変異型 C-CPE の吸収促進作用

過 去 の 報 告 に 準 じ て pCantab5E を 用 い て C-CPE のTyr310，Tyr312 が関与している可能性が示された。そclaudin-4 結 合 残 基 を ラ ン ダ ム な ア ミ ノ 酸 に 置 換 し た

こで次に、これらアミノ酸残基の 2 アミノ酸アラニン置

C-CPE 誘導体ファージライブラリを作成し、claudin-1

換体を作成し各種活性を評価した。Pull down assay およ

発現 L 細胞を用いて claudin-1 binder のスクリーニングを

び C-CPE-PSIF 拮抗阻害実験ではいずれの変異体におい試みた。

ても相加的な結合性の低下が観察された（Fig. 4AB）
。さ

7, 8）

Alanine scan に よ っ て C-CPE の 各 種 活 性 に Tyr306，

らに in situ loop assay により吸収促進効果を評価したと

３．結果および考察

ころ、Fig. 3BC に示してあるようにいずれの変異体にお３−１．C-CPE-PSIF の細胞傷害性に及ぼす変異型
C-CPE の阻害作用

いても著しい吸収促進作用の低下が観察された。さらに、

当研究室では、C-CPE にタンパク質合成阻害因子 PSIF

置換体では、claudin-4 結合性、TER 低下作用、吸収促進を 融 合 さ せ た C-CPE-PSIF を 作 製 し、C-CPE-PSIF がTyr306, Tyr310, Tyr312 をいずれもアラニンに置換した 3作用が消失していた（Fig. 5A-E）。

C-CPE を介して claudin-4 発現細胞に特異的に結合するこ７）とにより細胞傷害作用を示すことを見出している 。そ３−６．Claudin-1 binder のスクリーニング

こで、C-CPE-PSIF を用いた拮抗阻害実験により各種ア

C-CPE の claudin-4 結合領域をランダムなアミノ酸に置

ラニン置換体と claudin-4 との結合性を評価したところ、換 し た C-CPE 誘 導 体 ラ イ ブ ラ リ を 作 製 し、claudin-1 発

Y306A，Y310A、Y312A いずれの変異体でも C-CPE と比現 L 細胞を用いて claudin-1 binder のスクリーニングを試較して claudin-4 結合性が顕著に低下していた（Fig. 2A）。

みたところ、得られたクローンはいずれも天然型 C-CPE− 70 −

各種有効成分の効率的な皮膚内送達方法の開発

Figure 2 Effects of Tyr306, Tyr310 and Tyr312 on the interaction of C-CPE with claudin-4.
A) Competitive inhibition of C-CPE-PSIF-induced cytotoxicity by mutants of C-CPE. Claudin-4-expressing L (CL4/L) cells werepretreated with the indicated concentrations of C-CPE or C-CPE mutants for 1 h. The cells were then incubated with 0.2 ㎍ /㎖
of C-CPE-PSIF. After 36 h, LDH release was assessed using a commercially available kit. The results are representative of three
independent experiments, and the values are means ± SD (n=3).
B) Pull-down assay. Confluent Caco-2 cells were harvested and lysed in lysis buffer. The lysate (10 ㎍ ) was incubated with vehicle,
C-CPE, or mutants of C-CPE for 30 min at 37℃ . After addition of Ni-resin, the lysate was incubated for 3 h at 4℃ . The resin wasthen precipitated, and the bound proteins were analyzed by SDS-PAGE followed by Western blotting using anti-claudin-4 or anti-Histag antibodies. The lanes containing Caco-2 lysates (10 ㎍ ), C-CPE (1 ㎍ ), and mutants of C-CPE (1 ㎍ ) were positive controls forclaudin-4, C-CPE, and mutants of C-CPE, respectively. The results are representative of three independent experiments.

Figure 3 Effects of mutants of C-CPE on the TJ barrier function
and jejunal absorption.
A) Effects of mutants on the TJ barrier function of Caco-2 monolayercells. Confluent Caco-2 cells were cultured in Transwell chambers
for 10-14 days. When TER values stabilized, C-CPEs were added
to the basal side of the Transwell chamber at the indicatedconcentrations. TER values were measured after 0 and 18 h.
Values are means±SD (n=4). The results are representative of three
independent experiments.
B) Effects of mutants on jejunal absorption of FD-4 in rat. Rat jejunum
was treated with FD-4 (10 ㎎/㎖ ) in the presence of vehicle, C-CPE(0.2 ㎎/㎖), or mutant C-CPEs (0.2㎎/㎖ ). The FD-4 levels in plasmacollected from the cervical vein were determined at the indicatedtimes. Values are means ± SEM (n=4).
C) The AUC0-4h values were calculated from (B) and are means±
SEM (n=4). The results shown in (B) and (C) are representative of
three independent experiments.

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

で あ っ た（data not shown）。C-CPE は claudin-1 結 合 性Mizuguchi, H., Tsunoda, S., Horiguchi, Y., Yagi, K.,を有していないことから、claudin-1 発現細胞は claudin-1

and Watanabe, Y. Role of Tyr306 in the C-terminal

binder スクリーニング系として不適であると推察された。

fragment of Clostridium perfringens enterotoxin for４．考

modulation of tight junction. Biochem Pharmacol, 73:察824-830, 2007.

以 上、 本 研 究 に よ り、C-CPE と claudin-4 と の 結 合 に２）Harada, M., Kondoh, M., Ebihara, C., Takahashi,

は Tyr306，Tyr310， 吸 収 促 進 作 用 に は Tyr312 が 関 与

A., Komiya, E., Fujii, M., Mizuguchi, H., Tsunoda,

していることが明らかにされ、機能ドメインをランダ

S., Horiguchi, Y., Yagi, K., and Watanabe, Y. Role

ムなアミノ酸に置換した C-CPE 誘導体ライブラリを作

of tyrosine residues in modulation of claudin-4 by

製し、claudin-1 binder のスクリーニングを試みたもの

the C-terminal fragment of Clostridium perfringensの、claudin-1 binder の取得には至らなかった。現在のとenterotoxin. Biochem Pharmacol, 73: 206-214, 2007.

ころ、claudin のバリア機能を制御する分子は C-CPE 以

３）Takahashi, A., Komiya, E., Kakutani, H., Yoshida, T.,

外には報告されておらず、C-CPE を prototype として用Fujii, M., Horiguchi, Y., Mizuguchi, H., Tsutsumi, Y.,

いた claudin modulator 創製には新たな claudin binder ス

Tsunoda, S., Koizumi, N., Isoda, K., Yagi, K., Watanabe,

クリーニング系構築の必要性が示唆された。現在までに

Y. Domain mapping of a claudin-4 modulator, the

当グループでは、claudin 発現細胞に代わる新規 claudin

C-terminal region of C-terminal fragment of Clostridium

binder スクリーニング系を作製し、本系が claudin binder

perfringens enterotoxin, by site-directed mutagenesis.

探索系として機能することを確認している。今後は、本Biochem Pharmacol, 75: 1639-1648, 2008.

検討で構築した C-CPE 誘導体ライブラリ、および新たに構築した claudin binder スクリーニングシステムを用いて、

謝

claudin-1 modulator 創製を図る予定である。

辞

当該研究テーマの実施に際して、グラントサポートを賜

尚、当該研究成果は以下の論文に掲載された。

りました財団法人コスメトロジー研究振興財団に深謝

１）Ebihara, C., Kondoh, M., Harada, M., Fujii, M.,致します。

Figure 4 Interaction of double mutants at residues 306, 310, and 312 of C-CPE with claudin-4A) Competition assay. CL4/L cells were incubated with double mutants at the indicated concentration for 1h and then mixed
with C-CPE-PSIF (0.2 ㎍ /㎖ ). After 36h, LDH release was assessed using a commercially available kit. The results are
representative of three independent experiments. Values are means±SD (n=3).
B) Pull-down assay. Caco-2 lysates (10 ㎍) were incubated with double mutants (Y306A/Y310A, Y306A/Y312A, or Y310A/
Y312A) for 30 min at 37 ℃ . Ni-resin was then added, and the lysate was incubated for 3h at 4 ℃ . Next, the resin was
precipitated, and the bound proteins were analyzed by SDS-PAGE followed by Western blotting.

− 72 −

各種有効成分の効率的な皮膚内送達方法の開発（参考文献）

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Figure 5 Effect of triple mutation on the activities of C-CPE.
Interaction of the triple mutant with claudin-4 was examinedusing competitive assay with C-CPE-PSIF (A) and a pulldown assay (B) as described in Figs. 2A and 2B,
respectively. Effects of the triple mutant on the TJ barrier inCaco-2 monolayer cells (C) and jejunal absorption in rat (D,E) were assayed as described in Fig. 3. The values in (C)are means ± SD (n=4), and those in (D) and (E) are means± SEM (n=4). The results are representative of three
independent experiments.

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