チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用
北里研究所メディカルセンター病院

亀山孝一郎

Using antibodies that recognize either tyrosinase, tyrosinase-related protein 1(TRPl) , or tyrosinase-related protein-2 (TRP2, DOPAchrome tautomerase) , thequantities of those melanpogenic enzymes were analyzed in five melanoma cell lines thatpossess various degrees of melanin production. There was a positive correlation between
quantities and synthetic rates of those melanogenic enzymes and thier melanin forma­tion. Surprisingly, pigmented cells showed higher levels of melanogenic inhibitors activ­
ity. These results clearly suggest that melanin production is regulated by a subtle bal­ance between the activities of these enzymes and other factors such as the melanogenicinhibitor.

効率であった。 また各細胞が有している熱耐性型

概 要

チロジナ ー ゼの抑制因子の量を検討したところ、驚くべきことに 、メラニン産生の高い細胞のほうメラニン産生に関与する3つの酵素、すなわち、が低い細胞よりも、大量のチロジナ ー ゼ抑制因子

チロジナ ーゼ、チロジナ ーゼ関連蛋白l、チロジナ ーを有していた。 MSH処理をした際にはメラニンゼ関連蛋白2 (DOP Achrome tautomerase)産生が上昇するが 、 この際にはチロジナ ー ゼ活性を認識する抗体を用いて 、これらメラニン産生にの上昇とメラニン産生の抑制因子の活性の低下が関与する酵素の量とメラニン産生の関係について観察された。 興味深いことには熱耐性型のチロジ検討した。 なお使用した細胞はメラニン産生能のナ ー ゼ抑制因子はチロジナ ー ゼの活性だけでなく 、異なる5つの細胞株である。 JB/MS-Wを除くチロジナ ー ゼ関連蛋白2 (DOP Achrome tau­

すべての細胞は 4 日間のMSH処理にてメラニンtomerase)の活性も抑制した。 これらの結果は産生能を 4 倍から30倍まで増加した。 JB/MS­

Wのメラニン産生能はMSHの処理の有無にかかメラニン産生がチロジナ ー ゼ、チロジナ ー ゼ関連蛋白 1 、 2 およびそれらの抑制因子により微妙にわらずバックグラウンド以下であった。 これら3制御されていることを強く示唆する。 さらに熱耐

つの酵素の量ないしは合成速度と細胞のメラニン性型の抑制因子のメラニン産生後期に及ぼす影響産生能の間には正の相関関係が認められた。 JB/を人由来のメラノ ー マを用いて検討したところ、MS-Wを用いて熱耐性型のチロジナ ー ゼ抑制因

抑制因子は5,6-dihydroxyindole (DHI)の酸子の精製を行ったところ、20,000倍以上の精製化反応をチロジナ ー ゼの存在下、あるいは非存在Purification of melanogenic inhibitor
Koichiro Kameyama下にて抑制した。 このことはこの抑制因子がメラニン産生の各種段階にてメラニン産生を制御していることを示唆している。

Kitazato Institute
Medical Center Hospital-77-

を添加し、 40,000G、 20分遠心、 上澄みを採取

材料および方法した。 そ し てクロロホルムを添加し40,000G 、20分遠心し、 脱塩の後に順相シリカゲルを通過させチロジナ ー ゼ抑制活性 を有する部分を採取し1. 培養細胞C57/BL6マ ウス由来のJB/MS メラノ ー マ細た。

胞およびそのサプクロ ー ン、 B16F10 メラノー マ
7.

細胞を用いた。 培養は10%の牛の血清を添加しGelfiltration Chromatography
細 胞成 分 を1 % NP 40に て抽出し た後にたDulbec cos'modifie d Eagle's medium を用しヽた。

SephadexG75を通過させた。

2. 抗

8. チロジナ ー ゼの精製

休

チロジナー ゼのC末端を認識するAnti-PEP 7

B16 メラノ ーマを用いて 、 カラム電気泳動法

抗体、 チロジナー ゼ関連蛋白1を認識するTMHl
モノクロ ー ナルにて精製を行った。

抗体 、 チロジナ ゼ関連蛋白2をー認識するAn ti-PEP 8 抗体を用いた。

9. 抑制因子のOHiに及ぼす影響生成したDHIは東 ‘ノ ーの4mm X 25 cm RP-18

3. フロー

サイトメトリー

カラムを用いて HPLCにてモニタ ー し た。 溶媒ールにて固定しは0.15 M Naふ01/methanol (75 % :25 %) ,た後に50µ1の抗体を加え、 4℃にて1時間 反応さpH2.5を用い、毎分 0.5叫にて流した。 DHIの検せた後にFITCをラベルした2次 抗体を反応させ

出 は東ソ ーの紫外線検出器にて波長280nmにてた。 2回i先浄の後に解析を行った。

行った。

2Xlが個の細胞を7 0%エタノ

結 果

4. メラニン産生能の評価
1 4C- tyrosineを用いメラニン産生 を測定した。

1. メラニン産生能とMSHの効果
5. 免疫沈降法

チロジナ ー ゼが触媒する 反応であるty rosine

3 5S-methionineを用いて型どおり行った。

h yd roxylase 、 メラニン産生、 DOPAchrome
tautomeraseの活性の間には正の相関関係が認

6. チロジナ ー ゼ抑制因子の精製められた（表1)。

JB/MS-Wメラノー マ 細胞をヌ ー ドマウスに植え込み 採取した。 腫瘍500グラムあたり 2.5
リッタ

表1各種細胞のメラニン産生能(pMOL/10 5 cells/h)

ーの純水を加えPol yt ron di sruptorにて細胞を粉砕した。 酢酸にて pH5.3として 65℃ 1時間処理した。 40,000G 、 10分遠心し、 上澄みを採取した。 次に0.45µm のミリポアを通過させUlt ra - fi l trationにて分子量1,000以下を採取

メラニン

JB/KS
JB/MS P
JB/US ,JB/MS B
Bl6fl0した。 NH心HにてpH8.5としD EAE 25を通過した後に酢酸にてpH を3.5として Dowex50w-8を通過させた。 Evaporationの後にメタノ ー ル-78-＋＋＋＋＋＋＋in 杓Tyrosinehydroxy lase137101→69807251914DOPAchrotautomerase13248275
32148
I 16メラニンi/)i.ljこ能2

血—:"

チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用

a1aqw nu

ヒニコ： mos叫SE
Ea:m,0906SN3!NI30N30S3•oni;
A←1I円
―3(-)

: ,-MSH(-)(+): o-MSH(+)

04。2fluorescence intensity』qaw nu1
0=::>bー中-�-·.,

JB/MS

図2_ ... _,,,_中JB-MS-P_ ... 日由← ...

JB/MS-W_,,,_出-田JB/MS-8_,,,_,,,_816F10

Flow cytometric analysis of tyros1nase,
TRP1 and TRP2,ooo0009"
i.eodeOONI〔S ) �dQS1130•O-X '1N01

c0002

fluorescence intensity0009

aqu nu =a31』,,-i...,•一→— -+-+JB/MS

図3Synthesis of tyrosinase, TRP1 and TRP2

3. チロジナ ー ゼ抑制因子の精製
fluorescence intensity
図1

Flow cytometric analysis of tyros1nase
a. JB/MS tyrosinase, b. JB/MS-W
tyrosinsse 、 c. Negative control

100グラムのJB/MS-W細胞を100叫の純粋を用いて 精製を行った際の代表的なデ ー タを示す
（表2)。 Dowex50WX - 8以降の段階は蛋白濃度が低く測定限度以下のため実際の精製効率は判定不能であった。 しかしその後順相クロマトグラ

2. メラニン産生に関与する酵素の量および合成速度

フィ ー の精製法を加えることに より、 ほぼシング
ルピ ークの活性を得ることができた。

フロ ー サイトメトリ ー の結果を図1に 示す。 メ

異なるメラニン産生能を有する細胞よりチロジラニン産生の異なる細胞間においてメラニン産生

ナ ー ゼ抑制因子を精製しその活性を比較したとこ

量とチロジナ ー ゼの量との間には正の相関関係がろ、 驚くべきことにメラニン産生能とチロジナ ー認められた（図1、 2)。 またチロジナ ー ゼ、 チロ

ゼ抑制因子の活性との間には正の相関関係が認め

ジナ ー ゼ関連蛋白1、 2の合成速度とメラニン産られた。

生能の間にも正の相関関係が認められた（図3)。

-79-

nり1の伯ill紋

80. 024.5

pRS. S.65.C迅J'I.

UI trafi I trnllon

4.5
<0.1
<0.1

Do,e,501X·8chlo,ofor● fj]flj<0.1lllhlftPLC

65675

8.H

205515l20430
HO5抑割·�7660

280.0110005382196) 50.00) 10000)1000095.56) 50.00

3>50.00

3II25kD

I

匹SH

21.96

430
570kD

1n,:i1� ホ9556)10000

Gel filtration chromatography

血心，B

4.

450(11)500

Ag I UO!>!Q'4"1器 色 澄 ピ ←DF.AEScphadox

u介仰討汗ヤt(unit)↑年11"1lfll;1(\)

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3U一
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Tc .. J
100.000kD
I
6iiJIIJIIll附A

表2チロジナ ー ゼ抑制因子の精製効率,.

JB/MS 細胞の1 %NP40抽出液をSephade xG

20"'30,.

Fraction"''500

図4A75を通過させて分子量別に分けて、 精製したチ
ロジナ ー ゼに加えメラニ1

り低分子の分画はメラニン産生を抑制した（図4•25kD,cm'""A点線）。 しかしながら細胞を4日間MSHにて刺た場合には分子量7万前後の分画のメラニン産生A実線）。 また 分子量別に分けた ものを65℃1時

� ·--"Y'.· , . .
·.

-MSH，8められたメラニン産生抑制作用は消失した（図4• MSH8'

I能は 約2 0倍増加した。 さらに低分子の分画に認

1rsruluIeg) UOO,,Q!4Ues

激しながら培養した後に抽出液を作成し、 分画し

a n(% )utgmnasaStiiyrosT70kD

ラニン産生を促進するビ ー クが認められ、 またよkDI6検討した。 その結果、 分子量約 7 万のところにメBン産生能に対する効果を,o間熱処理した場合にはMSH処理をしていない場

3035Fraction

<O45”

図48

合にはチロジナ ー ゼのビ ー クもチロジナ ー ゼの抑制因子のビ ー クも残るが（図4B点線）、 MSH処の活性を も抑制した（図5中段）。 またメラニン理をしている場合には驚くべきことに、 低分子分産生は1280倍まで抑制因子を希釈しても 認めら画に認められたチロジナ ー ゼに対する抑制因子はれた（図5下段）。

逆に促進因子となった（図4B実線）。

次に抑制因子のDHIの酸化に及ぼす影響を検討したところ37 ℃ 、 6 0分の処理にて10%のDHI

5. チロジナーゼ抑制因子のチロジナーゼ、 チロが失われた（図6a,b)。 DHIをチロジナ ー ゼのジナ ー ゼ関連蛋白2、 メラニン産生に及ぼす存在下にて同処理をしたところ50%のDHIが失効果われた（図6c)。 し か し な が ら DHIをチロジ

チロジナ ー ゼの抑制因子をチロジナ ー ゼが触媒

ナ ー ゼと抑制因子の存在下にて処理したところ

するtyrosine hydroxylase activity に対する効

DHIの低下率はわずか25%であった（図6d)。

果を検討したところ1280倍までチロジナ ー ゼ抑

興味深いことには DHIを抑制因子の存在下のみ制因子を希釈しても酵素反応を抑制した（図5上にて処理した場合に は DHIの量は全く不変で段）。 メラニン産生についても 1280倍まで希釈しあった（図6e)。ても抑制効果が観察された。 また興味深いことには1 0倍希釈までの高濃度においてはチロジナ ーゼ関連蛋白2 (DOPAchrome tautome rase)-80-チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用岳0'-Tyrosine

8000
6000

-MSHHydroxylase1

メラニン産生の盛んな細胞ほどチロジナ ー ゼの、::i.
·4000
E

C.

C.

900

�

600

C.

300

゜E

C:•�一e

い結果であった（表3)。 またこの抑制因子が

゜
1200

en'l.

抑制因子をよりたくさん有していることは興味深

2000

C:·ぎ-

MSH処理にて活性を失い、さらに熱処理をする
1:2

1:10

DOPAchrome

Tautomerase

1:50

1 :250

1:1250soo l DH I Production4600

�
20:l[]. _0 1:2 1.10 1:50 1 匹00 !

I°"_ジナ ー ゼ抑制因子 ー 中性因子 ー チロジナ ー ゼ促進因子と変化することでメラニン産生を制御していることを明らかにした。 またよりたくさんのメラニン産生を制御するためにはよりたくさんの制御因子（抑制因子）が必要とされることを明らかにしたところ抑制因子は DHI の特発的な酸化のみ

1:2

1:10

1:50

1:250

1:1250Melanin

ならず、チロジナ ー ゼ依存性の酸化を抑制した。
以上の結果はチロジナ ー ゼの抑制因子として我々が追っていたものが、チロジナ ー ゼが触媒するメFormation

ラニン産生初期の tyrosine hydroxylase だけでなく DOPAchrome tautomerase 、 そして DHI

sooooxidation をも制御していることを示唆する。

'l.

゜Eことによりメラニン産生を逆に刺激した（図4)。
以上の結果はチロジナ ー ゼの抑制因子が実はチロした。 また抑制因子の DHI に及ぼす影響を検討

゜ ゜8000 1

考 察● +MSH

さて精製の結果であるが従来の方法に順相クロ｀｀ ｀マトグラフィ ー の手段を加えることにより、紫外゜線 235nm にてほぼシングルピ ー クの分画が採取
1:2

1:10

1:501:250

1:1250

Enzyme:lnhibitor Concentration

された。 このメラニン産生の制御因子の構造決定を行うことにより、生体内におけるメラニン産生の制御機構が明らかになることが期待される。 現

図5段階での精製効率は 20,000 倍であった。
表3メラニン産生能に対するチロジナーゼ抑制因子の効果
粗精製分画
コントロ ー ル

JB/NS

86%

JB/MS-W

60%

JB/MS-P

Control

37℃, lh''"●'"●M'"''tyroStnase
inhibitor

ihibitor only

JB/MS-B

Bl6FIO

図6-81 一8011>
88%

86%

16士2 pmol/16h

低分子分画
73%

70%
42%

76%

72%