ヒトiPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

慶應義塾大学医学部皮膚科学教室

大 山

学

In the present study, we successfully established a protocol to induce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into
keratinocyte precursor cells, expressing keratin 18 and 14. By co-culturing hiPSC-derived keratinocyte precursor cells withhuman dermal papilla cells, we were able to, at least partially, recapitulate bidirectional crosstalk between hair matrix cells
and the dermal papilla in the hair follicle, which may provide a valuable tool for future investigation.

１．緒づく in vitro 毛包誘導モデルの開発を試みることとした。

言計画初年度となる昨年度は hiPSC からケラチノサイトへ

毛髪とそのスタイルは個人の印象を左右し、時として職の分化誘導と分化度調節のための条件確立を試みた。その業までも連想させるなど我々の社会生活に影響を与える。

結果、１）上皮系への分化には胚様体形成をした後、レチ

そのため、毛髪の維持、発育に関わる物質に対する社会的ノイン酸（RA）を添加した条件で培養する必要がある

ニーズは大きい。従って毛包細胞に対し生理活性を示す分コラーゲンでコートした培養ディッシュとケラチノサイト子を効率よくスクリーニングする方法の確立はコスメトロ

無血清培地を使用して hiPSC を培養した時のみケラチンジーにおいて重要な意味をもつ。

14、18 の発現がみられる

２）３）効率よくケラチノサイトへ

本 研 究 の 目 的 は、 ヒ ト induced pluripotent stem cellの分化を誘導するためには BMP 4 の添加が必要である（hiPSC）を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発である。

ことが判った。また、分化誘導に適した RA と BMP 4 の濃毛包自体の発生、毛幹（毛髪）の形成・伸長には毛母細胞（毛度はそれぞれ 1 µM RA、25 ng/ml BMP 4 であろうと結論幹形成に特化した毛球部のケラチノサイト）と毛乳頭細胞された。また、hiPSC のラインごとに試薬に対する反応性間の上皮─間葉系相互作用が重要である。毛包の維持、発が異なることも示唆された。

育促進に関与する因子を効率よく選択するには、この相互計画最終年度となる本年度は昨年度評価した山中４因子作用を再現するモデルを開発する必要がある。特に inを導入した 201 B 7、WD 39 の二つの hiPSC ラインに加え４vitro の系はスクリーニングなどに有用であり、これまで因子のうち MYC を導入していない WDT2 を加えた３つのも確立が試みられてきた 1 , 2）。

ラインについてケラチノサイト前駆細胞への誘導を試みる

従来のヒト細胞を用いたモデルは、ヒト細胞の供給の限界の点から相互作用を実現する能力が低い成人由来の分化とともに、得られた細胞をヒト毛乳頭細胞と共培養し invitro 毛包誘導モデルの確立を目指した。

したケラチノサイトと継代数が高く特性を失いつつある毛２．実

乳頭細胞を組み合わせる方法をとらざるを得なかった 1）。
これまでのヒト細胞を用いた毛包再構成実験で、成人ケラ

２.１

験

細胞と試薬チノサイトよりも新生児由来のケラチノサイトの方が毛乳本研究においてはヒト真皮線維芽細胞にレトロウイルス頭細胞とクロストークし毛包を再現する効率が高いことがを用いて山中３または４因子（POU 5 F 1、SOX 2、KLF 4、知られており 3 , 4）、幼若なケラチノサイトを用いれば毛包MYC+/−）を 導 入 し て 確 立 し た ３ つ の hiPSC ラ イ ン

での上皮─間葉系相互作用を再現できる可能性はより高く（201 B 7 5）、WD 39 6）、WDT 2［３因子のライン］7））を使なることが予想される。そこで、本研究では hiPSC からケ用した。前年度の報告で記載した如く、hiSP 細胞はマイラチノサイトへ誘導する過程で得られる幼若な分化段階のトマイシン処理したマウス胎児線維芽細胞（MEF）をフィhiPSC 由来ケラチノサイトとヒト毛乳頭細胞の共培養に基ーダーとして使用し、ヒト iPS 細胞培地（20 % KnockoutSerum Replacement（Life technologies）、２mM L-glutamine（Sigma）、1×10 −4 M nonessential amino acids（Sigma）、1

Development of in vitro hair follicle
induction model using human induced
pluripotent stem cells
Manabu Ohyama
D epa r t ment of D er mat olog y, Keio
University School of Medicine

×10−4 M 2-mercaptoethanol（Sigma）、４ng/ml FGF2（Wako,Osaka, Japan）、0 . 5 % penicillin and streptomycin（Lifetechnologies）含有 DMEM/Ham’s F12培地）で継代培養した。
共培養で使用するヒト毛乳頭細胞は慶應義塾大学倫理申請 2005−0075 に従って同意の上で採取された頭部良性腫瘍の− 84 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

周辺部の頭皮サンプルから実体顕微鏡下でマイクロダイセた値（ΔCT値）はglyceraldehyde- 3 -phosphate dehydrogenase

クションによって得た毛乳頭を Amniomax-C 100 Complete（GAPDH）の ΔCT 値を基準に標準化し比較検討した。
タンパクレベルでの解析は解析対象となるケラチノサイ

medium（Life Technologies）にて培養したものを使用した。

ト前駆細胞をコラーゲンコートしたカバースリップに 4 %２. ２ 前年度の検討で決定した条件を用いた３つの異なるhiPSCラインを用いたケラチノサイト前駆細胞へ

paraformaldehyde を 用 い て 固 定 し、 一 次 抗 体 と し てmouse anti-human monoclonal keratin 18（KRT 18）（1 : 100 ,の分化誘導

ab 668 , Abcam, Cambridge, UK），mouse monoclonal anti-

前年度決定した RA および BMP 4 の濃度を用いて hiPSC

human tumor protein p 63（P 63）（1 : 100 , ab 735 , Abcam）orをケラチノサイト前駆細胞へ分化誘導した。hiPSC をフィ

mouse monoclonal anti-human keratin 14（KRT 14）（1 : 100 ,ーダーから遊離させ胚様体形成を行い、２日追加培養した後、

ab 7800 , Abcam）を４℃一昼夜反応させた後、PBS にて洗1 µM RA（Sigma）および 25 ng/ml BMP 4（R&D Systems）

浄して 30 分間 Goat anti-mouse IgG Alexa 488（1 : 200 , Lifeを培地に追加、３日間培養の後、ゼラチンコートディッシTechnologies）と反応させ観察した。

ュ を 用 い て ケ ラ チ ノ サ イ ト 培 地 defined-KC serum freemedium（DKSM, Life technologies）にて付着培養し合計11 日間培養し hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞を得た。

２. ４ hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞とヒト毛乳頭細胞の共培養系
hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞または、コントロー

２. ３ ケラチノサイト前駆細胞のケラチノサイトマーカー発現の解析

ルとしてのヒトケラチノサイトとヒト毛乳頭細胞の共培養は、Inui ら の 方 法 1） を 改 変 し て 用 い た。2 . 5 × 105 個 の２. ２の段階で得られた hiPSC 由来ケラチノサイト前駆

hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞または、コントロール細胞について、遺伝子発現レベル、タンパク発現レベルのとしてのヒトケラチノサイトを透過性のあるメンブレンがそれぞれについてケラチノサイトマーカーの発現を解析した。

底 に 張 ら れ た ト ラ ン ス ウ ェ ル イ ン サ ー ト（Corning,

前年度同様に遺伝子発現レベルの解析にはリアルタイム

Corning, NY）にまき、80 % コンフルエントに到達した２PCR 解析を用いた。具体的には RNeasy Mini または Micro

継代目のヒト毛乳頭細胞を培養中のディッシュに培養液をキ ッ ト（Qiagen）を 用 い て 解 析 対 象 と な る 細 胞 か ら共有するように重ねた。共培養の培養液として DMEM とtotalRNA を分離。Superscript III First Strand Synthesis

F 12 を３ : １の比率で混合したものを用いた。共培養開始

SuperMix（Life Technologies）を用いて cDNA を合成 し後２日目に totalRNA を回収し遺伝子発現解析を行った。

た 後、Primer Express software（Life Technologies）を３．結用いて作成したプライマーを使用し、Power SYBR Green果Technologies）を 用いて解析した。PCR の条件 は、95 ℃

３.１ 胚様体形成させRAとBMP4を作用させたhiPSC
はラインを問わずケラチノサイト系への分化を示す形態をとる

10 分、95℃ 15 秒、60℃ 60 秒を 40 サイクル行った。得られ前年度確立したプロトコール（図１）8）を用いて 201 B 7、PCR Master Mix（Life Technologies） と Applied
Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system（Life

図１ 本研究で確立された hiPSC からケラチノサイト前駆細胞を得るためのプロトコール（文献 8）より改変）− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

WD 39、WDT 2 の全ての hiPSC ラインの分化誘導を試みするため、共培養システムの確立を試みた（図３、文献 1）たところ、全てのラインで分化誘導開始後 11 日後にはケを参考）。まず、このシステムにおいてコントロールとしラチノサイトに類似した上皮系の形態を有する細胞に変化て正常ケラチノサイトが毛乳頭細胞と相互作用することをしていることが明らかになった。

確認した。

３. ２ 分化誘導されたhiPSC 由来細胞は幼若ケラチノサイトに類似したマーカー発現パターンを示す遺伝子の発現を評価したところ、共培養しない場合と比較

上記のプロトコールによって分化誘導された hiPSC 由来系が上皮─間葉系相互作用の評価に有用であることが示さ

２日間の共培養の後、ケラチノサイトにおける毛包関連ケラチノサイト前駆細胞をケラチノサイト系統のマーカーして発現が有意（p< 0 . 05）に上昇しており（図４）、このれた。

（ケラチン 14、18、p 63）に対するモノクローナル抗体を発現するケラチンで比較的幼若なケラチノサイトで発現し３. ４ hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞と毛乳頭細胞を用いた共培養系の確立ており、ケラチン 14 は分化したケラチノサイト（特に基底次いで前述のプロトコールで分化誘導した hiPSC が共培膜）で発現しているケラチンである。図２に示すように、養系でヒト毛乳頭細胞と相互作用しヒトケラチノサイトとどのラインから誘導したものでも、ケラチン 18、p 63 を強同様に毛包関連遺伝子発現を増強するかどうかについて検く発現し、コロニーの周囲ではケラチン 14 が発現してい討した。

用いて蛍光染色した。ケラチン 18 は主として単層上皮にた 8）。これは幼若な分化段階のケラチノサイトでみられる興味深いことにヒト毛乳頭細胞と共培養するとパターンであり、目的とするケラチノサイト前駆細胞を

201 B 7 hiPSC 由来のケラチノサイト前駆細胞は正常ケラチ

hiPSC から誘導することができたことを示す所見である。

ノサイトより毛包関連遺伝子を強く発現した（図５）。毛球部における上皮─間葉系相互作用は双方向である。そこ

３. ３ ヒトケラチノサイトと毛乳頭細胞を用いた共培養系の確立

で、hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞が共培養した毛乳in vitro で毛球部における上皮─間葉系相互作用を再現すると 201 B 7 由来ケラチノサイト前駆細胞は正常ケラ頭細胞に影響を与えるか否かを検討した。

図２ ３つの異なる hiPSC ラインから得たケラチノサイト前駆細胞はケラチン 18、p63 陽性、ケラチン 14弱陽性を示す（文献 8）より改変）− 86 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

図３ 本研究で用いられた in vitro でヒト毛球部の上皮─間葉系相互作用を評価する共培養モデル（in vitro 毛誘導モデル）

図４ 共培養システムにおける正常ケラチノサイトでの毛包関連遺伝子の発現増強（文献 8）より改変）

図５

共培養系による hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞における毛包関連遺伝子の発現の増強（文献 8）より改変）− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

チノサイトよりも強くヒト毛乳頭細胞に働きかけ毛乳頭細今回の検討では、hiPSC からケラチノサイトへの分化誘胞のバイオマーカーである ALPL、BMP 4、LEF 1 の発現導の程度が均一ではなく、ヘテロな細胞集団を使用したたを 増 強 す る こ と が 明 ら か に な っ た（ 図 ６）
。 つ ま り、め、どの分化段階の細胞が良好な反応を示したのか判断し

201 B 7 hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞と毛乳頭細胞かにくい。今後はケラチノサイトの表面マーカーなどを用いらなる共培養の系は、毛球部で起きている上皮─間葉系細て事前にソーティングすることにより、より効率のよいシ胞間相互作用の少なくとも一部を再現しており、本研究でステムの構築が可能になることが期待される。
本研究で確立されたシステムに関しては、どの程度毛球目指した in vitro 毛包誘導モデルとして使用することがで部の生物学的イベントを再現しているのか十分に検討でききる可能性があることが示された。

４．考ていない。今後はマイクロアレイなどを用いた網羅的遺伝

察子解析を行うなどしてさらに厳密にシステムを定義してい検討した３種類の hiPSC ラインの全てがほとんど同じケくことが必要であると考えられる。

ラチノサイト分化マーカーの発現を示していたにもかかわ様々な改善点が考えられるものの、本研究は hiPSC の活らず、共培養の系では 201 B 7 由来の細胞のみがコントロ用法の一つの方向性を示唆するものであり、今後さらなるールとして使用したヒト正常ケラチノサイトと比較して毛改良により、毛包に作用する薬剤のスクリーニングシステ乳頭細胞からのシグナルに対して優れた反応性を示した。

ムなどへの発展が期待できると思われる。

少なくとも本研究の開始時に予測した「幼若な性質を示す

５．総ケラチノサイトは毛乳頭からの毛誘導シグナルに対する反応性が高い」という仮説は部分的には支持されたことになる。

括hiPSC から幼若なケラチノサイトの特性をもつケラチノサイト前駆細胞を作成するプロトコールを確立するととも

201 B 7 hiPSC ラインがその他のラインと比較して有意なに、ヒト毛乳頭細胞との共培養することにより in vitro 毛差をもって優れた反応性を示した理由としては、１）初期

包誘導モデルのプロトタイプを作成した。
（本研究は文献 8）化の程度が他のラインより優れていたの一部として行われた）上皮系に分化しやすい

２）デフォルトでなどの理由があると思われ今後さらなる比較検討が必要と考えられた。また、今回の結果か（引用文献）

ら、hiPSC のラインごと特性が大きく異なり、使用目的に

１）Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, Yoshikawa K, Itami

合うラインを決定するために、応用ごとに数種のラインをS. Androgen-inducible TGF-beta 1 from balding dermal

比較検討する必要があることも明らかになった。

papilla cells inhibits epithelial cell growth: a clue to

図６

共培養系による毛乳頭細胞におけるバイオマーカーの発現の増強（文献 8）より改変）− 88 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

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