新規細胞膜上、女性ステロイドホルモン受容体を介した生理・病態機能の解明
東京農工大学大学院農学研究院応用生命化学専攻

木村郁夫

Sex steroid hormones are involved in not only reproductive functions but also aggression, maternal behavior, learning,memory, moods, feeding, and so on. Some of these actions are related to unknown rapid non-genomic action, as whichcannot be currently explained by the genomic action of nuclear receptors. Recently, several sex steroid receptors werefound on the plasma membrane. Hence, it implies that these membrane receptors may be related to the non-genomicactions. In these receptors, a progesterone membrane receptor (mPR), a putative G-protein coupled receptor, is activated byprogesterone and abundantly expressed in the brain. Here, we examined neurotrophic effects of mPR and the intracellularsignaling in central nervous system. In the future, further functional analysis of mPR will provide new insights into not
only understanding of neurotrophic activity but also physiological function by progesterone in brain and may represent an
important avenue of research for drug development for the treatment of infertility, metabolic disorders, and dysrhythmia
targeting this receptor.

1．緒ていると予想される。しかしながら、詳細な機能に関して言は未だ明らかにされていない。我々は MAPR ファミリー性ステロイドホルモンは核内受容体を介して働き、遺伝に属する neudesin、neuferricin を世界で初めて単離・同子発現調節を介した性成熟等の長期的な機能に関与するこ定し 4, 5）機能解析を進める一方で、もう一つのプロゲステとが知られてきた。しかし近年、攻撃性や摂食、睡眠、そロン細胞膜上受容体ファミリーであるmPRファミリーの解して記憶や学習といった高次脳機能に至るまで、性機能以析にも着手した。mPRファミリーは 7 回膜貫通型と予測さ外の様々な作用にも性ステロイドホルモンが関与することれており、GPCR である可能性が高いと考えられていた 6）。

が明らかになった。これらは核内受容体による転写調節をまた、mPR ファミリーのうちいくつかの受容体は中枢神介した genomic な反応では説明づけられない作用が多数で経系に高発現することが報告されており 2）、これらの受容あり、その分子実体は近年まで明らかにされていなかった。

体を介したプロゲステロンによる即時的作用が生体にとっ近年、性ステロイドホルモンの細胞膜上受容体として重要な役割を果たしている可能性が示唆された。そこで

1）て、エストロゲンに対し GPR30 、プロゲステロンに対

我々は、これらプロゲステロン細胞膜上受容体のうち、特し mPR（membrane progesterone receptor）ファミリー 2）、に中枢神経系に高発現すると報告されている受容体に着目MAPR（membrane- associated progesterone receptor）した。そしてその詳細な発現解析、プロゲステロンによるファミリー3）が同定され、これらが性ステロイドホルモン細胞内シグナル伝達機構解析を行った。

による即時性作用に関与する可能性が示唆された。これら

2．実の細胞膜上ステロイドホルモン受容体は一般的に知られている核内受容体を介した genomic な作用に対し、即時性の験

2. 1. 定量 RT-PCR

non-genomic な作用（MAPK 経路の活性化、細胞内 Ca 濃マウスの各組織から total RNA を抽出し、逆転写後、度の上昇等）を有する。そのために、ステロイドホルモンSYBR green を用いたインターカレーター法により PCR 産が関与する乳癌細胞等の増殖の直接的な原因であると予想物を定量した。
In situ hybridization

され、創薬開発の観点からも非常に有用な標的として注目

マウス胎児全身、成体脳の凍結切されている。加えて、これらの受容体は卵成熟期だけでは片を作製し、35S- 標識アンチセンス RNA プローブを用いなく、成体においても種々の組織において高い発現が確認て切片中の mRNA を標識した。その後 X 線フィルムに感されていることから成体においても重要な生理機能を担っ光させシグナルを検出した。

2. 2. 細胞培養
P hy s i o l o g i c a l f u n c t i o n v i a n o v e lprogesterone membrane receptor
Ikuo Kimura
Department of Applied Biological Science,
Tokyo University of Agriculture andTechnology Graduate School of Agriculture

Flp-in mPR T-REx HEK293 細胞は 10 % FBS、ハイグロマイシン、ブラストサイジンを添加した DMEM 培地を用い培養した。ラット副腎褐色細胞腫由来 PC12 細胞
は 10 % HS、5% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地で培養した。全ての細胞は 37 ℃、− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

5% CO2 条件下で培養した。

Lipofectamine 2000 を用いて siRNA を導入した。その後

cAMP assay 細胞を 24well プレートに播種し、HEK293

NGF・プロゲステロンを添加し、3 日後に写真撮影した。

細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には神経成長因子

神経突起が細胞体以上に伸長している細胞の最大突起長のNGF を添加し 24 時間インキュベートした。細胞は各濃度みを imageJ（NIH）で測定した。のプロゲステロンで 10 分間刺激し、0.1N HCl で回収した。
得られたサンプルについて、cAMP kit（cayman）のプロ

2. 6. mPRノックアウト（KO）マウスの作製

トコルに従って cAMP 濃度の測定を行った。

2. 3. Ca

2+mPR のコーディング領域を含む配列の一部を LacZ 配列に置換したターゲティングベクターを設計し、ジーンター

assay

ゲティング法により mPRKO マウスを作製した。

細胞をコラーゲンコート 96well プレートに播種し、3．結HEK293 細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には NGFを添加し 24 時間インキュベートした。FLIPR Calcium 4

3. 1. mPR は中枢神経系に高発現する

assay kit を用いて細胞内 Ca2+ の変動を測定した。
ERK1/2 assay

果各組織における mPR の発現量を RT-PCR により解析す

細 胞 を 24well プ レ ー ト に 播 種 し、ると、mPRは脳、精巣において高発現していた（図 1A）。更に、

HEK293 細胞にはドキシサイクリン、PC12 細胞には NGF

胎児、成体マウス脳切片を用いて in situ hybridization を行を添加し 24 時間インキュベートした。細胞は各濃度のったところ、mPR は胎児期から中枢神経系に発現しており、プロゲステロンで 10 分間刺激し、Lysis buffer で回収し成体脳においては部位特異的に発現が見られることが確認た。各サンプルについて、Western blot 法により ERK1/2、できた（図 1B）。

Phospho-ERK1/2 量を測定した。
突起伸長活性評価

mPR がどの細胞に発現しているか調べるため、神経細リ ジ ン コ ー ト 6 well プ レ ー ト に胞、アストロサイト、神経幹細胞それぞれについての RT-PC12 細胞を播種し、Lipofectamine 2000 を用いて siRNAPCR による mPR 発現量を調べた結果、mPR はアストロサを導入した。その後 NGF・プロゲステロンを添加し、3 日

イトではなく神経細胞、神経幹細胞に発現しており、成熟後に写真撮影した。神経突起が細胞体以上に伸長しているニューロンまたは分化過程のニューロンにおいて何らかの細胞の最大突起長のみを imageJ（NIH）で測定した。

役割を果たしていることが示唆された。

2. 4. ERK1/2 assay

3. 2. 強制発現系を用いた mPR 下流シグナルの検討細胞を 24well プレートに播種し、HEK293 細胞にはドFlp-in mPR T-REx HEK293 細胞にドキシサイクリンキシサイクリン、PC12 細胞には NGF を添加し 24 時間イを添加して mPR を強制発現させ、プロゲステロン刺激ンキュベートした。細胞は各濃度のプロゲステロンで 10による細胞内シグナリングを調べた。mPR ファミリーは分間刺激し、Lysis buffer で回収した。各サンプルについて、GPCR であると予測されていたため、GPCR の下流シグナ

Western blot 法により ERK1/2、Phospho-ERK1/2 量を測ルである Ca2+、cAMP 濃度の測定を行ったところ、どちら定した。

もプロゲステロン刺激によっては反応が見られなかった。
次にプロゲステロン刺激による ERK1/2 のリン酸化を調

2. 5. 突起伸長活性評価

べたところ、mPR 発現下でプロゲステロン濃度依存的にリジンコート 6 well プレートに PC12 細胞を播種し、ERK1/2 の活性化が見られた。したがって、mPR はプロ

図 1 mPR の発現：（A）7 週齢マウスの mPR mRNA 発現量解析（n=3）．
（B）35S 標識アンチセンスmPRプローブを用いたin situ hybridization 法による胎生 15.5 日齢マウス切片（左 , Scale bar : 5 mm）、7 週齢マウス脳切片（右 , Scale bar : 2 mm）の mPR 発現部位確認 .

− 96 −

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ゲステロン刺激を受け ERK1/2 を活性化させることが示唆いる性ステロイドホルモンの細胞膜上受容体のうち、プされた。

ロゲステロンをリガンドとする mPR に着目した。mPR フ
ァミリーは 7 回膜貫通型と予測されており、GPCR である

3. 3. 内因性 mPR 発現細胞株を用いたプロゲステロン下流シグナルの検討

う報告もあった 7）。当研究室では脂肪酸受容体を中心とし次に、mPR を内因性に発現する細胞を用いてプロゲスた GPCR の機能解析を行っており 8-10）、その経験を活かしテロン刺激による下流シグナルを調べた。ラット副腎褐色て GPCR 下流シグナルの解析を行うことで mPR が GPCR細胞腫由来 PC12 細胞は神経成長因子 NGF を添加するこであるかどうかについて検討を行った。その結果、mPRとで神経細胞様に分化するため、神経分化のモデルとしを強制的または内因性に発現する細胞において、プロゲスて用いられる。NGF による分化誘導開始後、各時間におテロン刺激によって Ca2+ 動員、cAMP 濃度の変化といったけるプロゲステロン受容体の発現を調べたところ、mPRGPCR下流シグナルは確認されなかった。したがって、
我々の発現のみが細胞の分化に伴い急激に上昇していたため、では、mPR は GPCR とは異なるシグナル伝達に関与してPC12 細胞の分化の過程もしくは分化後に mPR が何らかのいる可能性が高いと考えている。今後更に mPR を介した役割を果たしている可能性が示唆された。

シグナル伝達機構の解明を進めていく予定である。と考えられていたが 6）、GPCR とは異なる構造を持つといmPR の発現が神経分化の初期段階から急激に上昇する

また今回、プロゲステロンが ERK1/2 のリン酸化を亢進ことから、プロゲステロンが mPR を介して神経分化に何させることを示した。しかし PC12 細胞におけるプロゲスらかの影響を与えるのではないかと考え、以下の実験を行

テロン 10 µM による ERK1/2 のリン酸化は各受容体の阻った。PC12 細胞を NGF で分化誘導する際、プロゲステロ害によっては抑制が見られず、今回 PC12 細胞におけるプンを同時添加すると、神経突起の伸長が有意に促進された。

ロゲステロンの ERK1/2 リン酸化亢進作用がどの受容体を更に、mPR に対する siRNA を導入した後に同様の実験を介するものか確かめることはできなかった。強制発現系に行うと、プロゲステロンによる神経突起伸長促進作用が抑おいては mPR 発現時にプロゲステロン 1 µM、10 µM でリ制される傾向が見られた。したがって、mPR がプロゲスン酸化亢進が見られるため、本来プロゲステロンの作用がテロンによる神経分化促進作用に関与していることが示唆

1 µM で現れる可能性を考え、今後 PC12 細胞においてもされた。

この濃度において解析を行う必要があると考えている。

また、NGF で分化誘導し、mPR の発現が上昇した状態

本研究は、中枢神経系に高発現するプロゲステロン受容でプロゲステロン刺激による各シグナルについて検討し

体 mPR が生体において果たす役割の解明において、基礎たところ、強制発現系における結果と同様に PC12 細胞に的データを提供するものである。mPR ノックアウトマウ

おいてもプロゲステロン刺激による GPCR 下流シグナルはスの作製が完了した現在、今後更に mPR ファミリーの機見られなかったが、ERK1/2 のリン酸化はプロゲステロン能解析を進めることにより、性ステロイドホルモンが関与濃度依存的に亢進していた。このプロゲステロンによるする高次脳機能の解明、更にはこれらの受容体をターゲッ

ERK1/2 リン酸化の亢進について、どの受容体を介したもトとする性ステロイドホルモン関連疾患、中枢神経系疾患のか確かめるため、核内受容体 PR の阻害剤 RU486 または領域における新規治療薬開発への新たな知見を提供するもMAPR ファミリーに属する細胞膜上プロゲステロン受容のと期待される。

体 PGRMC-1 の阻害剤 AG205 で前処置したものについて、ERK1/2 のリン酸化を測定した。しかし各受容体の阻害によって ERK1/2 リン酸化亢進の抑制は見られなかった。

（参考文献）
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我々は独自に mPRKO マウスを作製し、その表現型について検討を行うことで in vivo における機能解析も行った。

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た、WT マウスと KO マウスで体重に差は見られなかった

humans and other vertebrates homologous to a fish

が、脳、精巣といった mPR が発現する組織の重量が WT

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マウスに比べて KO マウスで軽かった。

4．考3） M i f s u d W , B a t e m a n A : M e m b r a n e - b o u n d察

progesterone receptors contain a cytochrome

本研究では、近年その存在が明らかになり注目を浴びて− 97 −

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コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

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