接着分子シグナルを利用した皮膚老化防止の新戦略
群馬大学

的生体調節研究所

崎尚SHPS-1 is a transmembrane protein whose extracellular region interacts with CD47 and whose cytoplasmic region
undergoes tyrosine phosphorylation and thereby binds the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Formation of thiscomplex is implicated in regulation of cell migration by an unknown mechanism. A CD47-Fc fusion protein or antibodies
to SHPS-1 inhibited migration of human melanoma cells or of CHO cells overexpressing SHPS-1. Overexpressionof wild-type SHPS-1 promoted CHO cell migration, whereas expression of the SHPS-1-4F mutant, which lacks thephosphorylation sites required for SHP-2 binding, had no effect. Antibodies to SHPS-1 failed to inhibit migration ofCHOcells expressing SHPS-1-4F. SHPS-1 ligands induced the dephosphorylation of SHPS-1 and dissociation of SHP2. Antibodies to SHPS-1 also enhanced Rho activity and induced both formation of stress fibers and adoption of a lesspolarized morphology in melanoma cells. Our results suggest that engagement of SHPS-1 by CD47 prevents the positive
regulation of cell migration by this protein. The CD47-SHPS-1 system and SHP-2 might thus contribute to the inhibitionof cell migration by cell-cell contact.

１．緒子 CD47 と相互作用することにより新しい細胞間シグナル

言伝達系（CD47-SHPS-1 系）を形成していることを明らか

皮膚は、年令変化が最も顕著に認められる組織の１つでにしつつある３）。

ある。皮膚老化のバイオロジーを研究することは、生命科

SHPS-1 は、その細胞外領域に３個の免疫グロブリン様学における老化の基本メカニズムを明らかにする上におい構造をもち、さらにリン酸化を受ける複数のチロシン残基ても、また皮膚の老化を防止あるいは遅延させて美容に役を細胞内領域にもつ蛋白質である。一方、CD47 は、細胞立つ薬剤の開発を行う面においても、極めて意義深い成果接着分子であるインテグリンに関連する分子として同定さをもたらすと考えられる。私共は、これまで蛋白質チロシれ、組織普遍的に発現する５回細胞膜貫通型の蛋白質であンリン酸化を介した細胞内シグナル伝達系の役割を中心とる。CD47 は、その細胞外領域に１個の免疫グロブリン様して、細胞の増殖と接着の制御機構につき研究を継続して構造をもち、これが SHPS-1 の N 末端側の免疫グロブリいる。特に、私共は、SH2 ドメインを有しているチロシンン様構造に結合する。

ホスファターゼ SHP-2 が、増殖因子刺激による Ras 低分

SHPS-1 と CD47 は相互作用することにより双方向性に子量 G 蛋白質の活性化に重要な役割を果たしていることシグナルを伝えると考えている。そこで本研究では、将来

１）を明らかにした 。また、SHP-2 の脱リン酸化基質蛋白質

皮膚の再生や老化の防止につながる手法や薬剤の開発の端として、イムノグロブリンファミリーに属する受容体型の緒を得ることを目的として、細胞接着や細胞運動の制御に蛋白質 SHPS-1

２）およびドッキング蛋白質 Gab-1 を見い出しており、SHPS-1/SHP-2 系や Gab-1/SHP-2 系が細胞接着おける CD47-SHPS-1 系によるの機能を分子レベルでさらに詳細に検討しようと試みた。

装置であるインテグリン系やカドヘリン系と相互作用して、２．実

Rho 低分子量 G 蛋白質の活性化を介して細胞運動をも制御することを示した。即ち、SHP-2 は、増殖因子と細胞接

2．1

験

細胞、抗体および融合蛋白質着の両方のシグナル経路の下流に位置し、２つの異なる低細胞として、ヒト悪性黒色腫細胞 W M239a と CHO 細胞

分子量 G 蛋白質 Ras と Rho を制御する多機能なシグナルを用いた。CHO 細胞には外来性にヒトまたはラット SHPS-1分子であることを明らかにした。私共は、最近、SHPS-1

遺 伝 子を導入し、 安 定 発 現 株とした。 抗 体 は、 抗ヒトがその細胞外領域の生理的なリガンドである受容体型の分SHPS-1 抗体（SE12C3）および抗ラット SHPS-1 抗体（2F34,A new strategy for protection ofskin senescence by utilizing adhesionmoleclues9F10）を用いた。さらに、C D47 の細胞外領域と Ig- Fc との融合タンパク質（CD47-Fc）を分泌する CHO 細胞株を樹立し、この細胞培養上清より CD47-Fc を回収し Protein-Aを用い精製して、これを SHPS-1 リガンドとして用いた。

Takashi Matozaki
Biosignal Research Center, Institutefor Molecular and Cellular Regulation,
Gunma University

2．2− 58 −

SHPS-1 および CD47 の発現の検討

悪性黒色腫細胞および CHO 細胞での SHPS-1、CD47 の接着分子シグナルを利用した皮膚老化防止の新戦略

発現は、Flowcytometry またはウェスタンブロッティン

2．6

グ法で検討を行った。

Rho 活性の測定

GST 融合 Rhotekin を用いて活性化 Rho を沈降させ、Rho の活性化状態の検討を行った。

2．3

細胞運動の測定

３．

細胞運動の測定には、Transwell apparatus (Corning社 ) を用い、既報４）に基づき行った。また同様に Wound

3．1

healing assay 法によっても検討を行った。

結果細胞運動に対する SHPS-1 リガンドの効果

CD47-SHPS-1 系による細胞運動の制御機構を詳細に解析するために、SHPS-1 を発現する種々の培養細胞の運動能を2．4

SHPS-1 リガンド処理による細胞形態への影響解析できるシステムを構築した（図１）。特に、ヒト悪性黒色腫細胞に SHPS-1 を発現することを確認し、これをモデ

蛍光免疫染色法で細胞形態の観察を行った。

ル細胞として用い、この系における CD47 と SHPS-1 の相2．5

シグナル分子のチロシンリン酸化の検討

互作用による細胞運動への影響を検討した。悪性黒色腫細各種分子のチロシンリン酸化を免疫沈降法と抗チロシン胞に SHPS-1 抗体あるいは CD47-Fc を作用させると、細胞運動の抑制が観察された（図２、３）。この効果は、２次抗リン酸化抗体を用いて検討した。

図１

図２

Ａ細胞運動測定系の概念図
Ｂヒト悪性黒色腫細胞上での CD47，SHPS-1 の発現細胞運動に対する SHPS-1 リガンドの効

図３− 59 −SHPS-1 リガンドによる細胞運動抑制

体の添加によりさらに増強された。すなわち、SHPS-1 抗体あるいは CD47-Fc による細胞運動の抑制は、細胞表面3．2 細胞内シグナル分子への SHPS-1 リガンドの効果上の SHPS-1 の ligation によるものと考えられた。

ヒト悪性黒色腫細胞に、抗 SHPS-1 抗体をリガンドとしSHPS-1 抗体あるいは CD47-Fc による細胞運動の抑制て用い、処理したところ、SHPS-1 が脱リン酸化され、同は、SHPS-1 を外来性に発現させた CHO 細胞においても時に SHP-2 との結合も見られなくなった（図５）。この効認められ、この効果は SHP-2 を結合しないタイプの変異果は抗体処理後 15 分後より著明となり、60 分後も持続し型 SHPS-1 発現 CHO 細胞では観察されなかった（図４）。

た。同様の結果が、CD47-Fc 処理によっても得られた。

図４ 細胞運動抑制に対する SHPS-1 細胞内領域
チロシンリン酸化部 の役割
SHPS-1 4F（リン酸化をうけるチロシンをフェニルアラニンに置換した変異体）では SHPS-1リガンドによる細胞運動抑制効 を認めない。

図５

SHPS-1 リガンド処理による SHPS-1 リン酸化への影響
Ａ：SHPS-1 抗体処理により SHPS-1 は脱チロシンリン酸化され、SHP-2 との結合も解除される。
Ｂ：この効 は 15 分後より著明となり、60 分後も持続する。
Ｃ：可溶性 CD47 処理によっても脱リン酸化が認められる。

− 60 −

接着分子シグナルを利用した皮膚老化防止の新戦略

3．3細胞形態に対する SHPS-1 リガンドの効果

3．4

SHPS-1 リガンド処理による Rho 活性への影響

ヒト悪性黒色腫細胞を抗 SHPS-1 抗体処理することにアクチンストレスファイバーの増強を認めたため、細胞より、紡錘形を示す悪性黒色腫細胞が多角化し、アクチ骨格系の制御に関与する Rho 活性への影響を検討したとンストレスファイバーの増強を認めた（図６）。Vinculin、ころ、抗 SHPS-1 抗体処理により Rho 活性の上昇を認め

Paxillin といった接着斑関連蛋白質には著明な変化を認めた。また Rho のエフェクターである p160ROCK の阻害剤なかった。

Y-27632 処理により、SHPS-1 リガンドによる細胞運動抑制の部分的な解除を認めた（図７）。

図６

SHPS-1 リガンドによるアクチン及び細胞形態の変化
SHPS-1 抗体処理により悪性黒色腫細胞は、多角化し、アクチンストレスファイバーの増強を認める。

図７

SHPS-1 リガンドによる Rho 活性への影響
Ａ：SHPS-1 抗体処理５分後より、Rho の活性化を認めた。
Ｂ：ROCK 阻害剤（Y-27632）処理により、SHPS-1 リガンドによる細胞運動抑制が部分的に解除された。

− 61 −

４．考察

本研究では CD47-SHPS-1 系が、普遍的な細胞運動の負の制御に関与していることを明らかにした５）。
CD47-SHPS-1 系はこれらの分子を各々発現する細胞同士の接触により双方向性に細胞運動を抑制すると想定され、CD47-SHPS-1 系が接触阻害の分子機構に関わっている可能性が高い（図８）。この結果から、例えば CD47-SHPS-1系のがんにおける異常が、浸潤・転移の分子機構に関与する可能性が考えられる。皮膚においては、メラノサイ
ト以外にケラチノサイトにも SHPS-1 の発現が観察される。
CD47 は、かなり普遍的に発現しており、CD47-SHPS-1 系が皮膚を構成する細胞群の増殖、接着、運動の制御に重要図８な役割を果たしていることが想定される。最近、T 細胞上CD47-SHPS-1 系による細胞運動抑制機構のモデルの CD47 が、樹状細胞上の SHPS-1 と相互作用することにより互いの細胞機能を負に調節することも報告されている

regulation of platelet clearance and of the macrophage

６）。皮膚のランゲルハンス細胞には SHPS-1 の高い発現がphagocytic response by the transmembrane

あることから、CD47-SHPS-1 系が皮膚の免疫系においてglycoprotein SHPS-1. J Biol Chem 277: 39833-39839,も重要である可能性が高い。今後、これらの点につき詳細

2002.

な検討を行う予定である。

４） Longo N, Yanez-Mo M, Mittelbrunn M, et al.:R e g u l a t o r y r o l e o f t e t r a s p a n i n C D9 i n t u m o r -（参考文献）

endothelial cell interaction during transendothelial

１） Noguchi T, Matozaki T, Horita K, et al.: Roleinvasion of melanoma cells. Blood. 98: 3717-3726, 2001.

of SH-PTP2, a protein-tyrosine phospha-tase with５） Motegi S, Okazawa H, Ohnishi H, et al.: Role of theSrc homology 2 domains, in insulin-stimulated Ras

CD47-SHPS -1 System in Regulation of Cell Migration.

activation. Mol Cell Biol. 14: 6674-6682, 1994.

EMBO J. 22: 2634-2644, 2003

２） Fujioka Y, Matozaki T, Noguchi T, et al.: A novel６） Latour S, Tanaka H, Demeure C, et al.: Bidirectional

membrane glycoprotein, SHPS-1, that binds the SH2

negative regulation of human T and dendritic cells bydomain-containing protein tyrosine phosphatase SHP-

CD47 and its cognate receptor signal-regulator protein-

2 in response to mitogens and cell adhesion. Mol Cellalpha: down-regulation of IL-12 responsiveness andBiol. 16: 6887-6899, 1996.

inhibition of dendritic cell activation. J Immunol. 167:

３） Yamao T, Noguchi T, Takeuchi O, et al.: Negative− 62 −

2547-2554, 2001.