表皮ケラチノサイトにおけるヒト細胞老化因子の研究
愛媛大学

橋本

医学部皮膚科公二

Senescent cells are blocked in the G1 phase of the cell cycle. The proteins p21 and p16 are inhibitors of cyclindependent kinase and affect cell cycle progression and senescence. We have studied whether p21, p53 andp16 was associated with cultured keratinocytes senescence. Keratinocytes were isolated from normal humanskin obtained from individuals aged from 1 to 70 years, and cultured under serum free condition. The cultures
have been continued until the cell growth arrest. The expression of p21, p16 and p53 in the growing cells andthe senescent cells was analyzed by Western blot. The keratinocytes obtained from the individuals aged 1
and over 40 years tend to survive longer periods than the cells from the other ages. The p21 expression has
not been changed compared to the early passage while the cells were growing, but increased just before thegrowth arrest. The p16 expression on the 8th passage has been increased compared to the third passage in bothgrowing cells and senescent cells. These data suggest that increased p21 followed by p53 play an important rolein the growth arrest of senescent keratinocytes. Increased p16 is a co-factor for the growth arrest.

期で停止する４）。

１ 緒 言

細胞周期を制御し、老化細胞の細胞増殖を抑え表皮ケラチノサイトは皮膚における重要な構成ると考えられている p 21 が、1993 年に、いくつか細胞であり、その老化機構の解明はコスメトロジの独立した研究グループから報告された５−８）。sdi

ーにおける生物学的基礎研究の根幹をなすと言っ

１（senescent cell derived inhibitor １）は Noda ら５）ても過言でない。1961 年に、ヒト胎児繊維芽細胞が老化細胞由来の分裂抑制因子として、遺伝子をを in vitro で継代培養すると常に決まった分裂回単離した。そのタンパク質の分子量は 21kd で 164数の後に、増殖を停止してしまうことが見い出さ個のアミノ酸からなる。線維芽細胞を用いた実験

れた 。このことより in vitro における培養細胞により、継代数の増加に伴い、sdi1mRNA が増加の有限増殖能は、細胞レベルでの老化であると考すること、あるいは、sdi １を細胞に過剰に発現えられるようになった２）。正常ヒトケラチノサイ

させると細胞増殖の抑制がおこることが報告され

トでも同様に、20 − 50 代で増殖が停止し３）、まている。一方、Harper ら８）はサイクリン依存性キた他の多くのヒトの細胞でも、同様に老化するこナーゼ（cdk ２）の阻害物として働く制御物質を見とが知られている。細胞の老化は、細胞死の一種

いだし cip １（cdk-interacting protein）と名付け、であるアポトーシスへと向かう過程とは全く異なその塩基配列を決定したところ、sdi １と同一でっており、細胞は老化するにつれて細胞周期をまあった。また、El-Deiry ら７）は、野生型 p 53 で発わる時間が長くなり、完全に老化した細胞は G １

現が誘導され、変異型 p 53 では発現が誘導されな

１）

Senescence of cultured keratinocytes
and the expression of p21, p53 andp16
Koji Hashimoto, M.D.
Department of Dermatology
Ehime University School of Medicineい遺伝子を単離し waf １（wild type p53-activatedfragment）と名付け、その塩基配列を決定したと
ころ、sdi １と同一であった。彼らはさらに waf１上流に p 53 結合部位を見つけた。
細胞が G1 期から S 期へ移行する際に癌抑制遺伝子産物である RB タンパク質のリン酸化が必要− 44 −

表皮ケラチノサイトにおけるヒト細胞老化因子の研究であるが、p 21 はリン酸化を行う種々の cdk と収・分散を行った。播種密度は 100mm シャーレ

cyclin の複合体に結合することによりその活性をにつき 0.5 〜 1.0×10 ６細胞 /10mL medium。な阻害し、さらに癌抑制遺伝子産物 p 53 により誘導

お、アミノ酸添加 MCDB153 培地にはインスリンされる。また、p16 は cdk と免疫沈殿で共沈する

5.0µg/mL、モノエタノールアミン 0.1mM、ホスタンパク質として、見い出された 。cdk と結合

ホリルエタノールアミン 0.1mM ハイドロコーチ

することにより cyclin との複合体形成を競合的にゾン 0.5µM、牛脳視床下部抽出液 50 〜 150µg 蛋阻害し、その活性を抑え、細胞周期制御・細胞老白 /mL を加えた。CaCl ２の最終濃度は 0.1mM に化に関与していると考えられている。

調整。

９）

そこでこの研究では、正常ヒトケラチノサイトを無血清培地で可能なかぎり継代し、細胞の老化

２. ２ Western blot 法抽出したタンパク質 70µg を 15％ SDS− PAGEと p 21、p 53、p 16 が関連しているかどうか調べた。

にて分離後、nitrocellulose 膜に転 した。以下

２ 実 験の、膜の洗浄・抗体の希釈には 20mM tris− HCl

２. １ 表皮ケラチノサイト培養

pH 7.4、150mM NaCl、0.05％ Tween − 20 を用

形成外科手術で、15 人の１才〜 70 才の人よりいた。膜を５％ BSA にて１時間ブロックした後、得られた正常皮膚由来ケラチノサイトを下記のご洗浄し、10µg/mL のモノクロナル抗 p 21（6B6;

とく無血清培地で培養し、増殖が停止するまで培Pharmingen Co., San Diego, CA）、p53（Pab1801;養を続けた。細胞継代時には、細胞抽出物を− 80

Oncogene Science Co., Cambridge, MA）、p16℃で保存した。

（G175-405; Pharmingen Co.）中で２時間インキ正常皮膚片を 250PU/mL Dispase−ダルベッコ

ュベートした。洗浄後、１：600 fluorescein 標

変法イーグル培養液に浸し、４℃で一晩静置。翌

識抗マウス IgG（Amersham, Buckinghamshire,

日、表皮を真皮から剥離した。表皮片を、0.25％England）中にて、１時間インキュベートした。洗トリプシン液液中にひたし、37℃、５分間静置し浄後、さらに１：2500 AP 標識抗 fluorescein 抗体

た。表皮片を、プラスチックシャーレに移し、ほ（Amersham）中で１時間インキュベートした。洗ぐした。ほぐし終えたら表皮・溶液ともに遠心管浄後、AttoPhos（Amersham）と約 20 分間反応さに移し入れ細胞浮遊液をつくり、細胞数を数えた。

せ、蛍光は FluoroImager（Molecular Dynamics,

遠心した後、細胞を無血清培地である MCDB153

Sunnyvale, CA）にて検出し、それぞれのバンドのに以下のアミノ酸を添加した培地（最終濃度：強度を測定し、定 化を試みた。３代目の細胞でのisoleucine 7.5×10M、histidine 2.4×10−４methionine 9.0×10M、−４発現を１としたときの８代目の値を示した。

M、phenylalanine 9.0×10−５３ 結 果M、tryptophan 4.5 ×10 −５M、tyrosine 7.5×−５10 −５M）で懸濁し、100mm プラスチックシャー

３. １ 細胞増殖

レ（コラーゲンコートのシャーレ）当たり２〜３

図１は７種類のケラチノサイトの 100 日目まで×10 細胞 /10 mL medium の割合で播種した。の細胞増殖を示した。50 日目頃、継代数で 10 代翌日培地交換を行い、以後、培地交換は２〜３日前後で増殖を停止するものが多かった。

６に一度おこなった。細胞密度が 70 〜 80％程度あさらに、増殖を続けるものがあったので、培養

るいは１週間毎に継代培養を行った。継代するとを続けた。15 種のケラチノサイトのうち、２種はきは、0.25％トリプシン、0.05％ EDTA 混合用液

約半年間増殖を続け、継代数で 27 代まで、培養を用い、37℃、５分間処理を行い血清で、トリプすることができた（図２）。それぞれ、１才、45 才

シン・EDTA のはたらきを中和した後、細胞の回− 45 −の人より得た、ケラチノサイトであった。

得られたケラチノサイトの方が、それ以外の年齢

図３に、増殖停止時の計算上の総細胞数と年齢のヒトより得た細胞より長期間増殖を続けることの関係を示した。１才および中年以降のヒトからができる傾向があった。

図１ 100 日目までの細胞増殖。15 種のケラチノサイトのうち ７種を示す。縦軸には計算上での総細胞数を示す。

図２ 200 日目までの細胞増殖。15 種のケラチノサイトを増殖停止時まで示す。縦軸には計算上での総細胞数を示す。

図３ 増殖停止時の総細胞数と年齢との関係。

− 46 −

表皮ケラチノサイトにおけるヒト細胞老化因子の研究３. ２ p21、p53、p16 の発現
p 21 の発現を western blot 法にて調べた。３代目と８代目のケラチノサイトを調べた（図４）。
#16、#34、#39 は８代以降も増殖を続けている細胞、#18、# １、# ７は８代目直後に増殖停止した。増殖を続けている細胞では p 21 の変化はみられないが、増殖停止直前の細胞では、それぞれ、3.5、2.0、1.9 と増加していた。
次に p 21 を誘導するとされている p53 の発現をWestern blot 法にて調べた。増殖停止した細胞を図５に示す。８代目の細胞では p 53 は増加しており、p 21 の発現増加と平行していた。増殖中の細胞では p 53 の発現は一定しなかった（結果は示さ

図４ Western blot 法による３代目と８代目の細胞での p21の発現。上段（#16、#34、#39）が ８代目以降も増殖を続けている細胞、下段（#18、# １、#7）が ８代目直後に増殖停止した細胞を示す。蛍光は FluoroImager にて検出し、それぞれのバンドの強度を測定し、定 化した。３代目の細胞での発現を 1 としたときの８代目の値を下端に示した。

ない）。
次に、p21 と同様に cdk inhibitor である p16 の発現を調べた（図 6）。増殖停止した細胞では８代目で p16 は増加していたが、増殖を続けている細胞でも、８代目では同様に p16 は増加した。

４ 考 察
p21、p53、p16 の変化のまとめを表１に示す。
p 21 は増殖中の細胞では変化はなく、老化した細胞で増加していた。このことより、ケラチノサイ
トの老化に伴う細胞増殖停止には p 21 が関与して

図５ Western blot 法による増殖停止細胞（#18、# １、# ７）
での p53 の発現。それぞれのバンドの強度は図４と同様に定 化した。

いると考えられる。p 53 は老化した細胞で増加しており、p 21 の増加と平行していた。p21 は p53により誘導されるとされており、老化ケラチノサイトでも増加した p53 により p 21 が誘導されたものと考えられる。p 21 は cyclin dependent kinaseに結合してキナーゼ活性を阻害し細胞周期を G1期に停止させるものと考えられており、ケラチノサイトの老化による細胞増殖の停止は、増加した
p 21 による細胞周期の G1 期への停止が原因と考えられる。
p16 は、増殖中あるいは老化した細胞、いづれでも継代を経るにしたがって増加しており、老化に伴う細胞増殖停止には直接は関与していないものと考えられる。

図６ Western blot 法による３代目と８代目の細胞での p16の発現。上段（#16、#34、#39）が ８代目以降も増殖を続けている細胞、下段（#18、# １、#7）が 8 代目直後に増殖停止した細胞を示す。それぞれのバンドの強度は図４と同様に定 化した。

− 47 −

strains of human epidermal keratinocytes: the表１ p21、p53、p16 の発現のまとめ		

formation of keratinizing colonies from single

増殖中

増殖停止

p21→↑p53

不定↑４）Yanishevsky R, Mendelsohn ML, Mayall BH:

p16

↑

↑

Proliferative capacity and DNA content of aging

cells, Cell, 6, 331-344, 1975.

human diploid cells in culture: a cytophotometric

図 4、5、6 の結 をまとめた。８代目の細胞での発現を３代目の細胞と比較した。

and autoradiographic analysis, J Cell Physiol, 84,

１才、および中年以降の個体より得た、ケラチ165-170, 1974.

ノサイトは、より長期間細胞増殖を続けることが

５）Noda A, Ning Y, Venable SF, Pereira-Smith

できる傾向があった。若い個体より得たケラチノ

OM, Smith JR: Cloning of senescent cell-derived

サイトの方が長期間培養が可能であるという報告

inhibitors of DNA synthesis using an expressionはあるが、今回の実験のように中年以降の個体

screen, Exp Cell Res, 211, 90-98, 1994.

３）から得た細胞で再び長期間培養が可能になるとい

６）Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, Casso D,

う報告はない。その原因はよくわからないが、サ

Kobayashi R, Beach D: p21 is a universal

ンプル数を増やす必要がある。

inhibitor of cyclin kinases, Nature, 366, 701-704,
1993.

５ 結 論

７）El-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy

in vitro における、老化ケラチノサイトでは p 53

DB, Parsons R, Trent JM, Lin D, Mercer WE,により誘導された p 21 が細胞周期を G1 期に停止

Kinzler KW, Vogelstein B: WAF1, a potential

させて細胞増殖を停止させているものと考えられmediator of p53 tumor suppression, Cell, 75, 817-

る。p16 は増殖中の細胞でも増加しており、細胞825, 1993

増殖停止の co− factor としては働く可能性がある

８）Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K,

が、直接は関与していないと考えられる。

Elledge SJ: The p21 Cdk-interacting protein
Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent

文 献kinases, Cell, 75, 805-816, 1993

１）Hayflick L, Moorhead PS: The serial cultivation

９）Serrano M, Hannon GJ, Beach D: A newof human diploid cell strains, Exp Cell Res, 25,

regulatory motif in cell-cycle control causing

585-621, 1961.

specific inhibition of cyclin D/CDK4, Nature, 366,

２）Hayflick L: The limited in vitro lifetime ofhuman diploid cell strains, Exp Cell Res, 37, 614636, 1965.
３）Rheinwald JG, Green H: Serial cultivation of− 48 −704-707, 1993.