HGF による皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究
大阪大学医学部

バイオメディカル教育研究センター

松

本

邦

腫瘍生化学研究部

夫

Hepatocyte growth factor (HGF), originally discovered and identified as a powerful mitogen for hepatocytes, has
mitogenic, motogenic, and anti-apoptic activities for a variety of cells. HGF has organotrophic roles for regenerationof the liver, kidney, lung, etc. In skin tissues, we previously showed that HGF has mitogenic and motogenic activities
for normal human epidermal keratinocytes and melanocytes. We here studied a mechanism of epidermal woundhealing by HGF. HGF is produced by normal human skin fibroblasts and HGF production is up-regulated byinterleukin-1, platelet-derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-α, and prostaglandins. Using in vitro epidermal wound healing model, we found that HGF but not PDGF stimulated
healing of cultured keratinocyte sheet. Importantly, addition of the conditioned medium of PDGF-treated fibroblasts
but not non-treated fibroblasts stimulated in vitro epidermal wound healing, indicating that PDGF-treated fibroblasts
produce a soluble factor(s) which stimulates epidermal wound healing. The fibroblast-derived soluble factor was
identified as HGF. Since PDGF is secreted from activated platelets in wounded skin tissues, the results implicate
the presence of a paracrine cascade for epidermal wound healing: PDGF secreted from platelets activates HGF gene
expression in dermal fibroblasts, while fibroblast-derived HGF stimulates both migration and cell growth in epidermal
keratinocytes, leading to rapid wound healing after skin injury. In addition, HGF can induce growth and migrationof dermal endothelial cells, which are essentially involved in wound healing as well. We recently found that HGF
potently prevents apoptic cell death in many types of cells and has therapeutic effects on various fibrotic diseases
such as liver cirrhosis, renal fibrosis, and lung fibrosis. Taken together, HGF may well become therapeutic tool fortreatment of skin injury and fibrotic skin diseases.

子の１つとなった１、２）。HGF のもつ増殖促進、細１ 緒 言

胞運動性促進、形態形成促進活性はいずれも機能再生現象は古くから多くの発生生物学者の関心

的な細胞社会の構築には必須の生物活性であり、を集めてきた。ヒトを含め哺乳類においても組織・

今や HGF は器官再生や器官形成過程において組臓器は活発な再生能を有しており、とりわけ肝臓織化を担う実行分子であることが明らかになった。

は旺盛な再生力をもつことが古くから知られてい一方、われわれはリコンビナント HGF を実験動る。例えば生体肝移植によって移植された 400g

物に投与する実験から、HGF が肝臓のみならず腎の肝臓は１カ月後には約 1kg にまで再生する。

臓や肺の再生を強力に促進することを明らかにし、

HGF はわれわれによって 1984 年に初代培養肝細HGF の臨床応用への可能性を示した。さらに最近

胞に対する増殖因子として発見され、1989 年分子では根本的治療法の確立されていない難治性臓器

クローニングにより全構造が解明された。HGF は疾患に対し、HGF がその発症を防止するのみなら

長らく実体の不明であった肝再生因子の本体であず、積極的に組織の再構築を促し機能改善をもたり、さらに現在では、HGF はさまざまな細胞を標らすことを見出した。
ところで私達は HGF がヒト正常皮膚組織より的とし、多様な生理活性を有する代表的な増殖因
Roles of HGF in Wound Healing
and Prevention of Skin Aging

分離した正常ケラチノサイトやメラノサイトに対する強力な増殖促進因子であること、また HGF

Kunio Matsumotoが正常ケラチノサイトの遊走を促進することを報Division of Biochemistry,
Biomedical Research Center,
Osaka University Medical Schoolても創傷治癒促進、再生促進機能を担う重要な因告した３、４）。この結果は HGF が皮膚組織におい子である可能性を示唆している。また HGF は脂− 61 −

質代謝を改善する作用や育毛促進作用を有してい

２. ２ ヒト正常線維芽細胞における HGF 発現のる。本研究においては HGF による皮膚の再生促進、

解析

発毛促進、老化防止を目指し、皮膚組織を標的と線維芽細胞を 48 well plate にて 24 時間培養後、した in vivo、in vitro における HGF の生理活性を

１％ FCS を含む DMEM 培地に交換し、増殖因子、解明することを目的としている。

サイトカインを添加後 24 時間培養した。培養上清（conditioned medium）を回収し、培養上清中の２ 実 験

HGF 量を酵素抗体法（ELISA）によって定量した７）。

２. １ ヒト正常皮膚由来ケラチノサイト、線維また、線維芽細胞における HGF の発現を Western

芽細胞ならびに血管内皮細胞の培養

blotting ならびに Northern blotting 法によってもヒト正常皮膚よりディスパーゼ処理によって表解析した。

皮を分離し、さらにトリプシン処理によってケラ
チノサイトを分散させた。高アミノ酸 MCDB153

２. ３ ケラチノサイトの in vitro 創傷治癒解析

培地にてケラチノサイトを培養し、初代培養後２ケラノサイトを 12well plate にコンフルエン。一方、トになるまで培養後 10％ FCS を含む DMEM 培地

皮膚組織を 10％ FCS を含む DMEM 培地にて組織に交換し 24 時間培養した。直径 7mm の角膜移植

培養し、組織片より増殖する線維芽細胞を継代培用の円形メスを用いて培養ケラチノサイトシート

養した。皮膚微小血管内皮細胞は岩城硝子社よりに創傷処理を施した。ケラチノサイトを 48 時間

購入、付属プロトコールに従って培養した。

培養し、創傷位置からの修復された長さを指標に回継代培養したものを実験に用いた５、６）

して創傷治癒を評価した。
２. ４ HGF の血管内皮細胞に対する増殖・運動能促進効果の検討
皮膚微小血管内皮細胞を 24well
plate 上、またはコラーゲンゲル・
チャンバーにて 24 時間培養後、１％ FCS を含む DMEM 培地に交換し、増殖因子を添加して 72 時
間後の細胞数ならびに遊走細胞数を測定した。
２. ５ 表皮で HGF を高産生するトランスジェニックマウスの作
製とその表現型の解析
ケラチン ･ プロモーター下に
HGF cDNA を繋いだ construct をマウス受精卵に顕微注入し、表皮
図１ HGF の構造と代表的な生活物性。

− 62 −

特異的に HGF を高産生するトラ
ンスジェニック（Tg）マウスを作HGF による皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究製し、その皮膚組織を組織学的に調べた。

AB ならびに PDGF− BB はほぼ同等の HGF 産生促進活性を有し、30ng/mL の濃度で HGF 産生を

３ 結 果

約 10 倍促進した。また皮膚線維芽細胞の培養上

３. １ ヒト正常線維芽細胞における HGF 産生

清を回収し、Western blotting 法によって HGF 蛋

ヒト線維芽細胞における HGF の発現調節因子

白質の発現を調べたところ（図３）、線維芽細胞はを調べるため、線維芽細胞の培養系に各種因子を85kDa の native type HGF を産生・分泌しており、添加し、24 時間後の HGF 産生量を ELISA により

PDGF ならびに IL− 1β は native type HGF の産生定量した（図２）。その結果、IL− 1α（interleukin− 1 α）、IL− 1β、PDGF（platelet− derived growth
factor）、bFGF（basic fibroblast growth factor）、、PGE1
TGF− α（transforming growth factor− α）を著しく誘導することが明らかになった。さらに、
PDGF による HGF 産生誘導が HGF 遺伝子の発現誘導を介したものであるか調べるため、線維芽細胞より RNA を調製し、Northern hybridization に（prostaglandin E1）、PGE2 など複数の因子が HGF

よって HGF mRNA の発現を調べた（図４）。そのの産生を促進する positive regulator であることが結果、PDGF− AA、PDGF− BB、ならびに IL− 1。これら複数の因子の中で、β は HGF mRNA の発現を強く誘導し、HGF 蛋

とりわけ PDGF は血小板中に存在し、皮膚の創傷

白 質 の 産 生 促 進 活 性 と 同 様 に、PDGF − BB は治癒に関与することが予想された。そこで、今回

PDGF− AA よりも強い HGF 発現誘導活性をもっ

PDGF による皮膚線維芽細胞の HGF 発現誘導にていた。したがって、PDGF は HGF 遺伝子の転注目し解析を進めた。

写レベルでの活性化を介して HGF の産生・分泌明らかになった

７〜９）を促進しているものと考えられる。
３. ２ PDGF による HGF 発現誘導
皮膚線維芽細胞の培養系に PDGF（PDGF− AA、

３. ３ TGF−β1 ならびにグルココルチコイドに

PDGF− AB、PDGF− BB）を添加すると濃度依存よる HGF 産生抑制

的に HGF 産生を強く促進した（図２）。PDGF−

上記のように PDGF を含む複数の因子が HGF

図２ PDGF によるヒト皮膚線維芽細胞の HGF 産生促進作用。

図３ PDGF によるヒト皮膚線維芽細胞の HGF 産生促進の Western blotting による解析。

− 63 −

の positive regulator として作用するのに対して、

びにグルココルチコイドは HGF の産生を抑制す

TGF−β1（transforming growth factor− β1）ならる negative regulator であることがわかった 10）。
皮膚線維芽細胞の培養系に PDGF を添加するとHGF 産生は促進されるが、このとき PDGF 存在
下に TGF− β1 あるいはグルココルチコイドと同様の活性をもつ dexamethasone を添加したところ、
TGF− β1 ならびに dexamethasone は PDGF によって促進される HGF 産生を濃度依存的に抑制した（図５）。とりわけ TGF− β1 の抑制活性は強く、5ng/mL の濃度において PDGF の HGF 産生促進
活性を約 90％阻害した。したがって TGF−β1 ならびにグルココルチコイドは HGF 産生に対するnegative regulator といえる。
３. ４ PDGF による HGF 産生誘導を介した invitro 創傷治癒促進
PDGF は血小板中に存在し、創傷に伴い血小板から分泌され治癒過程に関与すると予想される。
そこで培養ケラチノサイトのシートに創傷処理を施し、その治癒に対する HGF ならびに PDGF の

図４ PDGF ならびに IL−１β によるヒト皮膚線維芽細胞
における HGF mRNA 発現誘導。

作用を調べた（図６）。培養ケラチノサイトシートに創傷処理を施した後 48 時間培養すると、創傷

図５ ヒト皮膚線維芽細胞の HGF 産生に対する TDGF− β1 ならびに dexamethasone の濃度依存的抑制作用。

− 64 −

HGF による皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究

図６ ヒト正常皮膚ケラチノサイトの in vitro 創傷治癒に対する HGF、PDGF、ならびにヒト皮膚線維芽細胞由来
培養上清（CM）の作用。HGF ならびに PDGF で処理した線維芽細胞由来培養上清（PDGF− CM）は培養ケラチ
ノサイトの治癒を促進する。また、PDGF で処理した線維芽細胞由来培養上清（PDGF− CM）の創傷治癒促進活性は抗 HGF によって中和された。

− 65 −

部先端よりケラチノサイトシートの伸展が認めら

３. ５ HGF による皮膚微小血管内皮細胞の増殖・れる。一方、HGF 存在下に同様の処理を行い培養

遊走能促進効果したところ、HGF は創傷部の修復を強く促進した。

上述の様に HGF はケラチノサイトに対して強これに対して、PDGF は培養ケラチノサイトの修力にその増殖能や遊走性を亢進させるが、皮膚組復には無効であった。PDGF は主に線維芽細胞や織において HGF のレセプターである c− Met は血血管平滑筋細胞など間質細胞に作用し、上皮系細管内皮細胞でも発現が認められ、HGF の標的細胞胞に対して生物活性を示さないことが知られておとなることが考えられる。そこで皮膚微小血管より、ケラチノサイトは PDGF レセプターを発現しり単離した内皮細胞を用いて HGF の効果を検討ていないものと考えられる。一方、私達は既にした。まず増殖に及ぼす影響を調べたところ、HGF がケラチノサイトの増殖ならびに遊走を強く

HGF は著しい促進活性を示し、その効果は血管内促進することを報告しており、HGF はケラチノサ

皮細胞の強力な増殖因子である bFGF に勝るとも

イトの増殖ならびに遊走を促進することによって

劣 ら ず、VEGF（vascular endothelial growth

培養ケラチノサイトの修復を促進したものと考え

factor）より有意に強かった（図７Ａ）。またコラーられる。

ゲンゲルへの浸潤能を指標に検討したところ、ところで PDGF はケラチノサイトに対し直接生物活性を示さないものの間質線維芽細胞に対して

HGF は血管内皮細胞の遊走性を bFGF や VEGF
よりも顕著に促進した（図７Ｂ）。

強力な HGF 産生誘導因子として作用することから、PDGF は線維芽細胞における HGF 産生誘導

３. ６ HGF の過剰発現が皮膚組織の発生・形成を介して表皮の創傷治癒に関与する可能性が示唆に及ぼす影響された。そこで、次に皮膚線維芽細胞を PDGF のケラチノサイトに対する HGF の増殖促進因子

存在下ならびに非存在下で 24 時間培養し、そのならびに創傷治癒促進因子としての機能を in vivo

培養上清をケラチノサイトシートの培養系に添加において確認するため、表皮特異的に HGF を高し、修復に対する影響を調べた。その結果、無処産生する Tg マウスを作製し、その皮膚組織構築

理の線維芽細胞の培養上清はケラチノサイトシーに及ぼす影響を検討した。３系統の Tg マウスをトの修復をわずかに促進した程度であったが、得ることに成功したが、これらのマウスの表皮はPDGF 処理を行った線維芽細胞の培養上清を添加

正常に形成され、過剰増殖等の組織秩序の乱れはしたところ、ケラチノサイトシートの修復は強く全く認められなかった。しかし興味深いことにこ促進された。この結果は PDGF 存在下で培養した

れらの Tg マウスでは全身性に（耳や唇、鼻、尾

皮膚線維芽細胞は表皮の創傷治癒を促進する液性因子を産生・分泌していることを示唆している。
そこで、線維芽細胞由来の表皮創傷治癒促進因子
が HGF ではないかと推定し、HGF に対する抗体存在下にて PDGF 処理線維芽細胞由来培養上清の作用を調べたところ、培養上清の表皮創傷治癒促
進活性は HGF に対する抗体によってほぼ完全に阻害された。この結果は PDGF によって刺激された皮膚線維芽細胞が産生する表皮修復因子の実体
は HGF であることを示している。

図７ HGF の皮膚微小血管内皮細胞に対する増殖（A）ならびに（B）促進効果。

− 66 −

HGF による皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究などにも）著しい色素の沈着が認められ（図８）、

殖促進、細胞遊走促進活性を介して皮膚の創傷治

組織学的には異所的かつ過剰なメラノサイトの存

癒促進に関与することが予想される。今回の研究

在が観察された。このことは表皮で産生されたから明らかになった PDGF− HGF ループを介した

HGF が過剰なメラノサイトの増殖または移動・遊皮膚創傷治癒機構を図９に示す。皮膚の創傷に伴走をもたらした結果と考えられる。

い血小板が活性化され、血小板からは創傷部における血胼の形成を促すプロテアーゼに加え PDGF

４ 考 察が分泌される。血小板に由来する PDGF は表皮ケ

４. １ PDGF− HGF ループを介した皮膚創傷治癒

ラチノサイトには無効であるが、間質線維芽細胞機構の増殖や遊走を促し、真皮組織の修復を促すと同PDGF ならびに HGF などの増殖因子は細胞増時に間質における HGF の発現を強力に促す。一方、間質線維芽細胞に由来する HGF は表皮ケラチノ
サイトに作用し、ケラチノサイトの遊走ならびに増殖を促し、その結果表皮の修復を促進していると考えられる。すなわち、PDGF− HGF ループは皮膚の創傷治癒促進を支える重要な細胞間ネット
ワークとして機能しているものと思われる。
４. ２ 上皮−間葉（間質）相互作用と組織再生
腎臓、肺、肝臓、消化器官などを含む多くの臓器・

図８ 表皮特異的に HGF を高産生するマウスの作出とその表現形質。１番左が野生型で他の３匹は HGF トラン
スジェニックマウスである。

組織の形成は上皮−間葉相互作用と呼ばれる組織
間相互作用に依存することが知られている。HGF
は発生過程においては間葉に由来する因子として肝臓、腎臓、肺、消化管など様々な臓器における上皮系細胞（肝細胞、腎尿細管細胞、肺気管支上皮細胞、胃粘膜上皮細胞など）の増殖、遊走形態形成（例
えば管腔形成など）を促進し、これら臓器の形成を担っている１、２、。一方、成体においても様々な

11）臓器の傷害にともない、HGF の発
現は間葉系細胞（間質細胞）で高まり、上皮組織の再生を駆動している。皮膚はその発生学的起源か
らケラチノサイトやメラノサイトなど上皮系細胞によって構成され
図９ HGF− PDGF ループ機構を介した皮膚創傷治癒機構。血小板に由来する
PDGF は間質線維芽細胞の増殖や促進を促し、真皮組織の修復を促す一方、間質線維芽細胞における HGF の産生を誘導する。この HGF は表皮ケラチノサ
イトの遊走ならびに増殖を促し、その結果、表皮の修復を促進している。

− 67 −

る表皮と線維芽細胞や血管系細胞などによって構成される真皮からなる。今回の実験結果より HGF

は皮膚微小血管の新生を促す因子であることが示

持、老化防止に機能することが期待される。

唆され、表皮組織の再生に加え、皮膚血管新生促進を介して皮膚の創傷治癒を促していることが予引用論文想される。さらに HGF は毛根の発育をも促進す

１）K. Matsumoto and T. Nakamura（1997）

ることが知られている。皮膚組織における表皮ー

Hepatocyte growth factor（HGF）as a tissue

真皮相互作用は皮膚組織の再生・形成を支える重organizer for organogenesis and regeneration.

要な相互作用であり、HGF は主に真皮に由来するBiochem. Biophys. Res. Commun., 239, 639-644.

因子として皮膚組織の再生・維持を支える因子で２）K. Matsumoto and T. Nakamura（1997）HGF:ある。

its organotrophic role and therapeutic potential.
"Plasminogen-Related Growth Factors"（ed. E.

４. ３ HGF の抗線維化、抗アポトーシス作用

Gherardi）, Jhon Wiley & Sons, pp. 198-214.

最近、私達は HGF が in vivo において肝硬変、

３）K. Matsumoto, K. Hashimoto, K. Yoshikawa,

慢性腎不全、肺線維症といった繊維性疾患に対しand T. Nakamura（1991）Marked stimulation ofて発症防止、治癒改善作用を有することを報告し

growth and motility of human keratinocytes by。HGF は組織の線維化を引き起こす TGF

hepatocyte growth factor. Exp. Cell Res.,196, 114-

た12 〜 14）−β1 の発現を抑制するとともに繊維性組織の融解、120.

上皮組織の再構築を促す結果、これら繊維性疾患

４）K. Matsumoto, H. Tajima, and T. Nakamuraに対して強力な治癒改善作用を有している。これ（1991）Hepatocyte growth factor is a potent

ら慢性繊維性疾患はいずれも難治性疾患として知stimulator of human melanocyte DNA synthesis

られ、現在でも根本的治療法は確立されておらず、

and growth. Biochem. Biophys. Res. Commun.,

HGF は根本的治療を可能にする有効な薬剤となろ

176, 45-51.

う。さらに、私達は HGF が劇症肝炎に代表され

５）K. Matsumoto, K. Hashimoto, M. Hashiro, H.

る大量肝細胞死をほぼ完全にブロックすることもYoshimasa, and K. Yoshikawa（1990）Modulation。また HGF の抗アポトーシス作

of growth and differentiation in normal human

用は肝細胞に限らず、尿細管上皮細胞、血管内皮

keratinocytes by transforming growth factor-b. J.

報告している

15）細胞、神経細胞にも及んでいる。

Cell. Physiol. 145, 95-101.

13、16、17）

皮膚疾患においても創傷後の斑痕、慢性皮膚疾

６）K. Matsumoto, Y. Azuma, M. Kiyoki, H.

患に伴う線維化に対して有効な治療法は確立され

Okumura, K. Hashimoto, and K. Yoshikawaていない。皮膚組織の線維化も他の組織と同様に（1991）Involvement of endogenously produced

TGF− β1 の過剰発現によって引き起こされるこ

1,25-dihydroxyvitamin D3 in the growth andとが知られており、HGF は皮膚の線維化をブロッ

differentiation of human keratinocytes. Biochim.

クする薬剤となることが予想される。また、紫外Biophys. Acta., 1092, 311-318.

線・薬剤により表皮ケラチノサイト、メラノサイ

７）T. Nakamura, K. Matsumoto, A. Kiritoshi, Y.

トなどのアポトーシスが引き起こされるが、HGF

Tano and T. Nakamura（1997）Induction of

は表皮においても抗アポトーシス作用を発揮する

hepatocyte growth factor in fibroblasts by tumor-

ことが期待される。すなわち、HGF は皮膚においderived factors affects invasive growth of tumorても皮膚の創傷治癒促進剤としての作用はもとよcells: In vitro analysis of tumor-stromal

り抗線維化、抗アポトーシス活性、毛根の発育促interaction. Cancer Res. 57, 3305-3313

進、など複数の生理活性を介して皮膚の恒常性維

８）K. Matsumoto, H. Okazaki, and T. Nakamura− 68 −

HGF による皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究（1992）Up-regulation of hepatocyte growth factor

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Sakai, T. Abe, K. Satoh, T. Nakamura, T.

９）K. Matsumoto, H. Okazaki, and T. Nakamura.

T a k a h a s h i a n d T . N u k i w a（1997）B o t h（1995）Novel function of prostaglandins assimultaneous and delayed administration of

inducers of gene expression of HGF and putative

hepatocyte growth factor（HGF）repress themediators of tissue regeneration. J. Biochem., 117,

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by bleomycin. Am. J. Resp. & Clit. Care Med. 156,

10）K. Matsumoto, H. Tajima, H. Okazaki, and T.

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