超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製
東京医科歯科大学生体材料工学研究所

田村篤志

In order to fabricate collagen microparticles with high water content and chemical stability, the collagen microparticles
cross-linked with carboxylmethylated α-cyclodextrin (α-CD)-threaded polyrotaxanes (CMPRs) were prepared. First, thecross-linking of collagen hydrogels with CMPRs were tested. CMPR-cross-linked collagen hydrogels showed higher
mechanical and swelling properties than those of EDC/NHS-cross-linked and carboxymethyl cellulose (CMC)-crosslinked collagen hydrogels. These results suggest that the mobility of cross-linking points in CMPR-cross-linked collagenhydrogels contributed to improving mechanical and swelling properties. Additionally, the chemical compositions of CMPR
greatly affected mechanical and swelling properties of CMPR-cross-linked collagen hydrogels, and CMPR comprisinghigh molecular weight axle polymer and high α-CD threading ratio was suitable for improving the functions of collagenhydrogels. Moreover, CMPR-cross-linked collagen hydrogels showed high adhesiveness of mouse fibroblasts comparedwith EDC/NHS-cross-linked and CMC-cross-linked collagen hydrogels, presumably due to the high elasticity of CMPRcross-linked collagen hydrogels. Finally, CMPR-cross-linked collagen microparticles with 3 . 38 ± 1 . 42 μm in diameter
were successfully prepared. These cross-linked collagen microparticles showed excellent chemical stability. Altogether withthese results, the cross-linking of collagen with CMPR is an effective method to modulate the mechanical properties andcytocompatibility, and CMPR-cross-linked collagen microparticles would be applied as a cosmetic ingredient.

1.

緒従するようなしなやかさは失われ、硬くて脆い構造になる。

言

また、架橋方法や条件によっては細胞毒性が生じるといっ

真皮などの生体組織を構成するコラーゲンは、医療、食た問題も指摘されている 3）。

品、美容製品など様々な分野で利用されている生体由来高このような従来の化学架橋ヒドロゲルの力学特性を改善分子である。コラーゲンはヒドロゲルなどへの成型加工もすることを目的に、当研究室ではこれまでに鎖状高分子が容易であり、組織適合性や保水性（保湿性）に優れることか多数の環状糖類 α -シクロデキストリン（α-CD）空洞部に貫。

通した超分子ポリロタキサンによるゼラチンの架橋を検討

このような目的で用いるコラーゲンは角質層に留まり、肌した 4 , 5）。ポリロタキサン中の α-CD は軸高分子上を自由表面の保湿剤として機能すると考えられる 2）。また、コラーに移動するといった特徴があり、α-CD 同士を架橋するこ

ゲンのヒドロゲルは医療分野では再生医療や癒着防止膜なとで、可動性の架橋構造を有するヒドロゲルが得られる 6）。

どの外科的な利用まで幅広く研究されている。コラーゲン

本ゲルは架橋点が滑車のように軸高分子を移動するため、ゲルは単体で使用される場合も多いが、医療目的では力学

伸張しても滑車様の運動により高分子の切断が回避され、1）的な強度を増大させる目的で化学架橋が検討されている 。

破壊エネルギーの蓄積を防ぐといった特徴がある 6 , 7）。実

これまでに検討されている代表的なコラーゲンの架橋法と際に、ポリロタキサンを用いてゼラチンを架橋した結果、して、グルタルアルデヒドや縮合剤によるコラーゲン分子破断強度が増大するとともに低応力高歪な力学特性を示す鎖同士の架橋、ポリエチレングリコールなど親水性ポリマことを見出している 1）。そこで本研究では、ポリロタキサーを用いた架橋が挙げられる 1）。これらの架橋により破断ンによるコラーゲンの化学架橋を行い力学特性、細胞接着強度の増大は達成されるが、コラーゲン本来が有している性を明らかにするとともに、美容分野への応用に向けたポJ 字型の応力−歪み特性（低歪み時には応力が小さく、J 字リロタキサン架橋コラーゲンマイクロ粒子の調製を検討しのように応力が増加）は喪失し、プラスチックのような Sた。

ら美容製品分野では美肌成分として利用されている1 , 2）字型応力−歪み特性（低歪み字に応力が大きく、S 字を描いて応力が増加）を示す。すなわち、生体組織の動きに追Design of collagen microparticles byintroducing supra molecula r cross linkers
Atsushi Tamura
I nstitute of Biomateria ls a nd
Bioengineering, Tokyo Medical andDental University

２．方法

2. 1. カルボキシメチル化ポリロタキサンの合成
環状分子として α-CD（塩水港精糖社製）、軸高分子として 平 均 分 子 量 10 , 000、35 , 000 の カ ル ボ キ シ 末 端 PEG（Sigma-Aldrich 社製）、封鎖基として 1 - アダマンチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）を用いたポリロタキサンは既報に従い合成した 8）。次に、ポリロタキサンを 1 . 5 M
水酸化カリウム水溶液に溶解させ、2 - ブロモ酢酸（東京化− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

成社製）を添加し、室温で 24 時間反応させた。反応終了後、

2. 4. 架橋コラーゲンゲル微粒子の調製と評価

分画分子量 35 , 000 の透析膜を用いて、純水に対して透析

Span- 20 を溶解させた流動パラフィン溶液に、中和しを行うことで精製し、凍結乾燥により粉末状のカルボキシたコラーゲン溶液を添加し、ホモジナイザーによって乳化

メ チ ル 化 ポ リ ロ タ キ サ ン（CMPR）を 得 た。CMPR 中 のさせた。その後、上記と同様に、CMPR、EDC、NHS を

1

α-CD 貫通数、及びカルボキシメチル基修飾数は H NMR

溶解した水溶液を滴下し、24 時間攪拌した。反応修了後、（Avance III 400 , Bruker Biospin）
測定により決定した。

2 - プロパノールを用いて 3 回洗浄し、精製を行った。位相差顕微鏡により観察し、粒径を計測した。

2. 2. コラーゲンゲルの化学架橋と力学特性の評価

３．結

アテロコラーゲン粉末（高研社製）に 1 mM 塩酸を加え、氷冷下で溶解させた。次に、水酸化ナトリウム水溶液でコ果

3. 1. ポリロタキサン架橋コラーゲンゲルの調製

ラーゲン溶液を中和し、テフロン性の鋳型に加え、37 ℃

本研究では、軸高分子分子量、及び α-CD 貫通数の異なで 24 時間静置することでコラーゲンゲルを調製した。次る 4 種類の CMPR を調製した。1 H NMR 測定より求めたに、CMPR をエタノール－純水の混合溶媒（エタノール：各 CMPR の軸高分子分子量、α-CD 貫通数、ならびにカル純水＝ 3：7）に溶解し、縮合剤として 1 - エチル - 3 -（3 - ジボキシメチル基修飾数を Table 1 に示す（ポリロタキサンメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC、東中の α-CD はエチレングリコール 2 ユニットを包接するた

京化成社製）、及び N- ヒドロキシコハク酸イミド（NHS、め、軸高分子の重合度より α-CD 貫通率を計算）。架橋コ東京化成社製）を CMPR 中のカルボキシ基：EDC：NHS =ラーゲンゲル微粒子作成の条件検討に先立ち、コラーゲン

1 : 10 : 10 のモル比となるように加え、15 分攪拌した。そゲルを用いて CMPR による架橋の検討と物性評価を行っの後、コラーゲンゲルを CMPR 溶液に浸漬し、室温で 24た。コラーゲンは分子中にリシンに由来する一級アミノ基時間静置し、化学架橋を行った。反応終了後、コラーゲンを有しているため、カルボキシ基を有する化合物と縮合反ゲルはリン酸緩衝溶液（PBS）に浸漬し、未反応の CMPR、応により結合が可能である。そこで、あらかじめ調製した及び縮合剤を除去した。本操作を計 3 回繰り返すことで精コラーゲンゲルを CMPR 溶液に浸漬することで架橋反応製し、架橋コラーゲンゲルを得た。比較対象として、可動を行った（Fig. 1）。反応後、各架橋コラーゲンゲル中に残性の架橋構造を有していないカルボキシメチルセルロース存するアミノ基を定量した結果、いずれの架橋コラーゲン（CMC、数平均分子量 139 , 000、東京化成社製）で架橋しゲルにおいても残存アミノ基は 20 % 以下であり、アミノたコラーゲンゲル、及び EDC/NHS のみで化学架橋を行っ基の大部分が架橋されたことを確認した。

たコラーゲンゲルを調製した。

次に、各架橋コラーゲンゲルの力学特性を引張強度よりコラーゲンゲルの力学特性は引張強度測定、及び動的粘評価した（Fig. 2）。NHS/EDC で架橋したコラーゲンゲル弾性測定によって評価した。引張強度はダンベル型に成形や CMC 架橋ゲコラーゲンゲルでは、歪みに対して応力がしたゲルを作成し、RE 2 - 33005 B（山電社製）により測定ほぼ直線的に増加する傾向が認められた。どちらの架橋コした。動的粘弾性は Rheosol-G 3000（UBM 社製）により測

ラーゲンゲルも歪みがおよそ 10 % 程度で破断し、破断時定した。

において 2 MPa 以下の応力を示した。一方、CMPR 架橋ゲルでは、J 字型の応力－歪み曲線を示した。これは、伸2. 3. 架橋コラーゲンゲルへの細胞接着性評価

長時に架橋点となるポリロタキサン部位が異動することに

24 ウェルプレート内に上記と同様に架橋コラーゲンゲ起因すると考えられる。また、破断時の歪みも 1 . 5 ～ 2 倍ルを作成し、マウス線維芽細胞株である BALB/ 3 T 3 細胞程度増大するとともに、破断強度も大幅に向上した。特に、

32を 2 × 10 cells/cm の密度で播種した。所定時間経過後、軸高分子が短く、α-CD 貫通率の低い CMPR（CMPR- 17 %-位相差顕微鏡により細胞を観察し、細胞接着数を計測した。

10 k）ほど低応力高歪みであった。また、軸高分子が長く、Table 1CMPR の化学組成

Sample code

Mn of PEG axle

Number of threading α-CDs onto PRX（threading ratio）

Number of CME groups on PRX（per α-CD）

Mn

CMPR- 17 %- 10 k

10 , 000

19 . 5（17 %）52 . 4（2 . 68）

32 , 300

CMPR- 37 %- 10 k

10 , 000

41 . 9（37 %）122（2 . 92）

58 , 300

CMPR- 20 %- 35 k

35 , 000

82 . 3（20 %）275（3 . 34）

132 , 000

CMPR- 37 %- 35 k

35 , 000147（37 %）495（3 . 35）

208 , 000

− 26 −

超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製

Fig. 1

Fig. 2カルボキシメチル化ポリロタキサン（CMPR）
によるコラーゲンの化学架橋

各架橋コラーゲンゲルの応力－歪み曲線

Fig. 3

各架橋コラーゲンゲルの PBS 中での膨潤特性度が最も高い値を示した。また、各架橋コラーゲンゲルの3. 2. ポリロタキサン架橋コラーゲンゲルへの細胞接着性

動的粘弾性測定を行った結果、破断強度の値と相関して、次に、各架橋コラーゲンゲルの生体親和性を明らかにす貯蔵弾性率が上昇した。以上の結果より、CMPR によるるために細胞接着性を評価した。細胞として、マウス線維

化学架橋によりコラーゲンゲルの力学特性を大きく改善で芽細胞である BALB/ 3 T 3 細胞を使用した。細胞播種直後きるとともに、CMPR の化学組成によって力学特性が変から 24 時間後までは徐々に接着、伸展する細胞数が増加化することを明らかにした。

する様子がどのゲルでも観察された（Fig. 4）。しかしながα-CD 貫通率の低い CMPR（CMPR- 37 %- 35 k）では破断強

各架橋コラーゲンゲルの膨潤特性を明らかにするために、ら、72 時間後にはポリロタキサン架橋コラーゲンゲル上乾燥状態のゲルを PBS に浸漬後の重量変化を調べた（Fig.

で伸展した細胞数が顕著に増加している様子が観察された。

3）。その結果、NHS/EDC で架橋したコラーゲンゲルや実際に、細胞接着数を計測した結果、分子量 35 , 000 のCMC 架橋コラーゲンゲルと比較して、CMPR 架橋コラー

PEG を軸高分子として用いた CMPR 架橋コラーゲンゲルゲンゲルでは膨潤度が大きく増大する様子が観察された。

上で細胞数が有意に増加していることが確認された（Fig.

特に、軸高分子の分子量が大きい CMPR- 20 %- 35 k、及び5）。また、接着細胞の形態とアスペクト比を計測した結果、

CMPR- 37 %- 35 k で架橋したコラーゲンゲルにおいて大き2 時間後では CMPR- 37 %- 35 k で架橋したコラーゲンゲな膨潤度を示した。

ルにおいて細胞接着面積の増大が確認され、早期に細胞が− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4

各架橋コラーゲンゲル上に播種した BALB/3T3 細胞の位相差顕微鏡像

Fig. 5

各架橋コラーゲンゲル上における BALB/3T3 細胞の接着数

伸展していることが示唆された。しかしながら、24～ 72を踏襲し、CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子の調製を行時間後の細胞では、各架橋コラーゲンゲル間で接着面積やった。コラーゲン水溶液と流動パラフィンを混合し乳化後、アスペクト比に有意な差は認められなかった。以上の結果

ただちに CMPR 溶液を加えることで架橋反応を行った。

を総合して考えると、力学特性、膨潤度、細胞親和性に優

最終的には、Fig. 6 に示すような球状の粒子が得られた。

れるコラーゲンゲルを調製するためには軸高分子が長く、粒子の平均直径は 3 . 38 ± 1 . 42 μm であった。粒径のヒスト

α-CD 貫通率の高い CMPR が好適であり、微粒子調製の実グラムは単峰性であったものの、変動係数は 0 . 42 と大き験では CMPR- 37 %- 35 k を使用することとした。

く、粒系分布は比較的大きいことが明らかになった。本CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子を PBS 中に分散させ、3. 3. コラーゲンマイクロ粒子の調製

37 ℃で浸透しても 1 週間以上は同様の粒子形状を保持しこれまでに報告されているコラーゲン微粒子の作成方法ていた。一方で未架橋コラーゲンゲル微粒子は 1 週間後に− 28 −

超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製

Fig. 6CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子の位相差顕微鏡像と、粒径のヒストグラム（n=529）

は消失していたことより、CMPR による架橋が施されて率の上昇が確認されており、このような力学的特性の違いいることが確認された。以上の結果より、化学的に安定なによって細胞の早期進展や増殖性に変化が表れたと考えら

CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子が調製されたと言える。

れる 9）。

４．考

また、CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲン微粒子

察では、同様に調製したコラーゲン微粒子（10 ～ 20 μm）より

本研究では、コラーゲンゲルの新たな架橋方法として分も粒径が小さいものが得られた 10 , 11）。コラーゲン微粒子

子可動性を有するポリロタキサンによる架橋を検討した。の粒径は界面活性剤の濃度や攪拌速度によって変化する。

グルタルアルデヒドなどの従来の化学架橋では、コラーゲ架橋剤として添加した CMPR は親水性であり、ただちにンゲルの力学特性や化学的安定性が改善されるが、応力－水層に分配されると考えられるが、親水性の高分子である歪み特性が天然のものから大きく変化してしまう点や、細ため界面活性剤として機能し、粒径が小さくなったと考え胞接着性が低下することが課題であった。
本研究では、種々られる。しかしながら、軸高分子の分子量や、あらかじめの化学組成の CMPR を用いてあらかじめ調製したコラー油層に溶解した界面活性剤の濃度を詳細に検討することにゲンゲルの架橋を行った。予備的な検討としてコラーゲン

よって、コラーゲン微粒子の粒径は制御できると考えられ溶液中で CMPR と反応後、ゲル化を行ったが、ゲル化しる。

ないサンプルがあったことや、力学特性の改善が見られな５．総かった。これは、CMPR の添加によりコラーゲンの分子括間相互作用によるゲル化が阻害されたと考えられる。一方、本研究では、分子可動性を有するポリロタキサンによるあらかじめ調製したコラーゲンゲルの架橋ではゲル化の条コラーゲンゲルの架橋を検討するとともに、架橋コラーゲ

件は変化しないが、ゲル内部まで均一に架橋できるかが課ン微粒子の調製を行った。適切な化学組成の CMPR を用題である。実際に得られた架橋コラーゲンゲルではほとんいてコラーゲンゲルを架橋することで、力学特性、膨潤度、どのアミノ基が反応していたことより、内部まで十分架橋ならびに細胞接着性に優れる架橋コラーゲンゲルが得られされていると考えられる。

ることを明らかにした。また、本手法を利用してコラーゲCMPR で架橋したコラーゲンゲルでは力学的な強度やン微粒子の調製に成功した。CMPR 架橋コラーゲン微粒膨潤度などの物性が、EDC/NHS 架橋コラーゲンゲルや分子は、化学的安定性、細胞親和性、膨潤度に優れることか子可動性のない CMC 架橋コラーゲンゲルと比較して大幅ら化粧品成分として有用であると考えられ、今後の応用展に向上していた。特に、軸高分子が長く、α-CD 貫通率の開が期待される材料である。

高い CMPR では膨潤度や力学特性に優れることを明らかにした。これは、高分子量の軸高分子を用いることで化学謝

辞架橋の架橋点間距離が延長されたためであると予想される。

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援を頂きました公

また、CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲンゲルは細益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝

胞 の 進 展 や 増 殖 に も 優 れ る こ と が 明 ら か に な っ た。

申し上げます。

CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲンゲルでは、弾性− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

（引用文献）

applications of mechanically interlocked polymers. Nat.
Rev. Mater. in press（2021）DOI : 10.1038/s41578-021-

1） R. Parenteau-Bareil, R. Gauvin, F. Berthod. Collagen-00278-z

based biomaterials for tissue engineering applications.

7） A. B. Imran, K. Esaki, H. Gotoh, T. Seki, K. Ito, Y.

Molecules 3, 1863-1887（2010）．
2） M. I. A. Rodríguez, L. G. R. Barroso, M. L. Sánchez.

Sakai, Y. Takeoka. Extremely stretchable

Collagen: A review on its sources and potential

thermosensitive hydrogels by introducing slide-ringcosmetic applications. J. Cosmet. Dermatol. 17（1），20-26polyrotaxane cross-linkers and ionic groups into the（2018）．

polymer network. Nat. Commun. 5, 5124（2014）．

3） M. A. Awang, M. A. B. Firdaus, M. B. Busra, S. R.

8） J. Araki, C. Zhao, K. Ito. Efficient production ofChowdhury, N. R. Fadilah, W. K. Wan Hamirul, M. Y.

polyrotaxanes from α-cyclodextrin and poly（ethylene

Reusmaazran, M. Y. Aminuddin, B. H. I. Ruszymah.

glycol）.Macromolecules 38, 7524-7527（2005）．

Cytotoxic evaluation of biomechanically improved9） M. G. Haugh, C. M. Murphy, R. C. McKiernan, C.

crosslinked ovine collagen on human dermal

Altenbuchner, F. J. O'Brien. Significantly influence cell

fibroblasts. Biomed. Mater. Eng. 24（4），1715-1724（2014）．

attachment, proliferation, and migration within collagen
glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Eng. Part A 1 7,4） D. H. Lee, A. Tamura, Y. Arisaka, N. Yui. Mechanically

1201-1208（2011）．

reinforced gelatin hydrogels by introducing slidable
supramolecular cross-linkers. Polymers 1 1（1 1）, 1 7 8 710）B. Rössler, J. Kreuter, D. Scherer. Collagenmicroparticles: preparation and properties. J.

（2019）．

Microencapsul. 12（1），49 - 57（1995）．

5） D. H. Lee, Y. Arisaka, A. Tonegawa, T. W. Kang, A.
Tamura, N. Yui. Cellular orientation on repeatedly11）N. Nagai, N. Kumasaka, T. Kawashima, H. Kaji, M.

stretching gelatin hydrogels with supramolecularNishizawa, T. Abe. Preparation and characterization ofcross-linkers. Polymers 11（12）, 2095（2019）．

collagen microspheres for sustained release of VEGF.

6） L. F. Hart, J. E. Hertzog, P. M. Rauscher, B. W. Rawe,M. M. Tranquilli, S. J. Rowan. Material properties and− 30 −J. Mater. Sci. Mater. Med. 21 , 1891 - 1898（2010）．