ごあいさつ
明治 34 年（1901 年）の年初に報知新聞が「21 世紀への予言」を特集し、23 の予言を紹介しています。その中の「遠距離の写真」「7 日間世界一周」「自動車の世」「暑寒しらず」などの工業技術に関するものの予測が多く、その殆どが実現していますが、「人と獣の会話」「大砲で暴風を飛ばす」「人の身体６尺以上」などの生物、自然に関するものは実現していません。この事は20 世紀は科学技術の発展が人の夢の実現に直結するとの期待が高かった事、そして「20 世紀は戦争の世紀」と言う人もいますが、戦争を介して発展した技術の世紀とも言うことができるかもしれません。
これからの 100 年に関して「21 世紀の科学技術の展望とあり方」というアンケートを科学技術施策研究所が 11 分類にまとめたものがあります。それによると、“遺伝子技術の発展で疾病因子の少ない人類が可能となるが、多型性が乏しく感染症が死因の 1 位となる。
” “脳科学の発展により①脳へ直接情報を記憶・消去が可能となる。②ロボットが人間並みに創造活動が行なえる。③倫理観、道徳観の欠落や衝動的犯罪行動と脳の関係が解明し、その対応策が確立して犯罪が殆どなくなる。” “バイオマスによる素材産生やエネ
ルギーの創生。また、ナノテクノロジーによる原子レベルへの分解による完全リサイクル技術の実現” “生活の場としては宇宙空間を活用する一方で地下利用が進む。
” などが予測されており、生物、自然そしてその環境への言及が特徴的に感じられます。生体の本質の解明が進むにつれ、地球上で “人だけが特別視される存在ではなくなり、「人の本質」「自然環境の中での生のあり方」が重視され “やってはならない研究・技術応用” が大事になると訴える人もいるように「生命の本質究明」の進展が技術の活用の意味を問い直し、「自然界 ( 地球全体 ) の調和」の重要性を誘導することとなり、総合科学の視点での研究遂行・解明が要求される時代となると思われます。
コスメトロジー研究振興財団では、化粧品学との限定された分野ではありますが、設立当初よりこの総合科学研究を指向して助成を行なってきました。
今世紀も引き続きこの方針を堅持し、化粧品学の体系化を目指したいと考えております。
関係各位の益々のご協力・ご支援をお願い申し上げます。
平成 13 年 8 月
財団法人

コスメトロジー研究振興財団
理事長

目

次

■ ごあいさつ■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究………………………………………………… 2

静岡県立大学経営情報学部
・古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究

綾子…………………………………14

東京工業大学大学院理工学研究科
・森林生物資源からの育毛活性成分の探索

五 島
江 口

正

……………………………………………………………………21
九州大学大学院農学研究院 近 藤 隆一郎

・含フッ素非対称置換トレハロース誘導体の合成と皮膚に対する保湿性と親和性の検討
北里大学看護学部
・匂いの感性計測を行うセンサーシステムの開発………………26

森 島直彦……………………………………………………………31

九州大学大学院システム情報科学研究院

都 甲潔

・分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・ 合一過程の解明…………………………………37

東京理科大学理工学部

阿 部

正彦

・分子量および官能基を制御した新規キトサン系界面活性剤の機能化に関する研究−市販ペクチナーゼとその化学修飾酵素による N- アセチル化キトサンの加水分解に及ぼす N- アセチル化度の影響−
東京工業大学大学院理工学研究科…………………47

梶 内俊夫

Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・日光老化について—とくに日光弾性線維症の発症機構ならびに UV Ｓ症候群の病態に関する研究—……………………52

熊本大学医学部 小 野友道

・紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用
放射線医学総合研究所
・ヒト角層細胞の cell envelope の発生とその機能障害を来す病態の解析……………………56

小 澤…………………………………62

帝京大学医学部

秋 山・微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立

均……………………………………77

静岡県立大学薬学部
・アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

真志……………69

長崎大学医学部 佐々木・接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交通」の関与

俊彦

今 井

康之

…………………………………………………84

目

次東北大学大学院薬学研究科

鈴 木巌・ 創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定…………………………………90

京都大学大学院医学研究科 高 橋
・ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロール代謝調節機構

健造……………………………………97

東京大学大学院農学生命科学研究科
・ヒト脂腺細胞に代るハムスター脂腺細胞を用いた皮脂代謝に関する基盤研究

佐藤

隆一郎

………………………101

東京薬科大学薬学部 佐 藤・紫外線照射で生じる DNA 損傷部位に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節

隆…………………106

熊本大学発生医学研究センター 山 泉

克・サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析
昭和大学薬学部 吉 田・白血球分画が皮膚の健康状態と関連するメカニズム武美……………………………………………………116
新潟大学医学部 安 保

・UVA による酸化的遺伝子損傷の細胞内修復機構

……110

徹

…………………………………………………………121
広島大学大学院理学研究科 井 出・太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果

博………………………………………127

放射線医学総合研究所 古 澤佳也

Ⅲ．精神、文化に関する分野
・化粧における非対称性………………………………………………………………………………………136
神戸松蔭女子学院大学文学部 藤 本

・口唇口蓋裂患者の顔面の改善に対する化粧の効果浩一………………………………………………………142
大阪大学歯学部 飯 田

征二

■記念講演
平成 12 年度記念講演 『細胞の老化と個体の老化』 …………………………………………………………151
静岡県立大学大学院健康科学研究科 加 治■コスメトロジー研究雑感■ 付和彦………………………………………………………………………………………………163

録
平成 12 年度事業報告 ……………………………………………………………………………………………179
役員一覧……………………………………………………………………………………………………………186

研究助成課題一覧…………………………………………………………………………………………………187

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究
静岡県立大学

経営情報学部

五綾

島子

Reversed micelles can control the size of water pools and the physical property of water by changing
Wo(=[water]/ [surfactant]). The property of bound water and its function were studied based upon the enzymatic
catalysis and the dimerization of cysteine by the irradiation in water pools. Sodium bis(2-ethylhexyl)
sulfosuccinate (AOT), hexadecyltrimethyl ammonium chloride(HTAC) and octaethylene dodecylether(C 12E8)
were used as anionic, cationic and nonionic surfactants, respectively. Hexokinase(HK) and polynucleotide
phosphorylase(PNPase) were used as enzymes. The electrostatic effect due to the inner surfaces of AOT and
HTAC reversed micelles increased with increasing Wo, leading to the suppression of the HK activity. On theother hand, high HK activity was revealed in hydrated ethyleneoxide chains of C12E8. The PNPase could also
polymerize ADP in C12E8 reversed micelles by using a small amount of Fe3+ in stead of Mg2+. Furthermore, it was
found that the formed poly(A) was precipitated with increasing temperature. This means that the formed poly(A)can be isolated easily from the reversed micellar solution. This phenomenon is closely related with appearance of
free water molecules due to elevation of temperature.
The effect of bound water on the conversion of cysteine by UV irradiation was studied. It was assumed thatthe solubilized cysteine in water pools was easily converted into cystine in bound water by UV irradiation. The
results suggested a long life time of activated oxygens produced by UV irradiation in bound water region.

１．緒

紫外線、放射線によるラジカル発生の関係についても成果言が現在期待されている。

肌の保水効果を維持する化粧品の研究開発とともに、近本報告書においては水の構造化と機能を逆ミセルの年では水自体の性質が紫外線照射による皮膚の生理機能とwater pool を用いて二つの視点で捉えた研究成果を報告すの関連も推測され、一層水と化粧品との関わりが深くなりる。一つは逆ミセルの water pool に酵素を溶解し、水のつつある。水は大きく分けて自由水と構造化された結合水構造化が酵素活性に及ぼす影響を明らかにする。酵素としに分けられる。結合水は自由水に比べ、蒸発しにくいなどては細胞に幅広く存在し、糖代謝に深く関わる基本的な酵

その一般的な性質はよく知られている。しかし結合水は総素、ヘキソキナーゼ（Hexokinase, HK）と著者らのグル称であり、構造化の程度や性質は親水基やイオンの種類にープが研究対象として検討してきたポリヌクレオチドフオ

より異なることが予測されているが、系統的な研究はなさ

スフォリラーゼ（Polynucleotide phosphorylase, PNPase）

れていない。その理由として水溶液中では自由水が多量にを用いた８〜 10）。さらにもう一つの研究は紫外線や放射線存在するので、結合水の性質を直接特定できないからであの照射により活性酸素が発生するが、この発生と水の構造る。

化との関係を明らかにするため、逆ミセルの water pool

油の中で界面活性剤と少量の水により形成される逆ミセにシステインを溶解し、その重合化から検討した。

ルにはその内殻の界面活性剤の親水基近傍に構造化された

２．実験の部

結合水が存在し、Wo（＝［水］／［界面活性剤］）を変えることにより、結合水／自由水の割合を調整することがで

２. １

きる。一方、界面活性剤の親水基の構造を変えたり電荷を試薬

ヘキソキナーゼを用いた実験持たせたりすることで、逆ミセル界面に構造化された結合界面活性剤として Sodium bis（2—ethylhexyl）sulfosuccinate

水の直接的な情報を得ることができる１〜７）。水の構造化と（AOT, Sigma）、Hexadecyltrimethyl ammonium chloride（HTAC, Merck）及び Octaethylene glycol dodecyl ether

Study of Hydration and its Function by
Using Reversed Micellar Systems
Ayako Goto
School of Administration and  Informatics（C12E8, 日光ケミカルズ）を用いた。HTAC はアセトンーメ
タノール混合溶媒で再結晶した。ヘキソキナーゼ（Hexokinase,
HK、Boeringer Mannheim）は酵母由来である。Adenosine
5'—diphosphate trisodium salts（ATP, Fluka）, 2—Deoxy—D—（＋）glucose（DG, Sigma）やその他の反応基質は Fluka や関東から購入した。

−2−

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

実験％アガロースゲルで行い、各々のゲルの断片中の放射能

逆ミセル溶液の調製；Isooctane に乾燥した AOT を適量を液体シンチレーションカウンターで測定した。キャ

当量溶解した溶液に Wo に応じて 50mMTris ／HCl 緩衝

ピラリー電気泳動は充填剤に Oligonucleotide Polymer液（pH8.0）を溶解する。HTAC 逆ミセルの調製は有機溶

Solution A、泳動緩衝液として Oligonucleotide 緩衝液を媒として Isooctane/octanol（85：15v/v）を、C12E8 逆ミ

用いて、HP 3DCapillary Electrophoresis System（Hewlett

セルの調製は Isooctane/octanol（90：10v/v）を用いた。

PACKARD 社）で 30 分測定した。

酵素反応；逆ミセル系の酵素反応は AOT 及び Wo が同じ溶液を二つ調製し、一方には DG と HK を、他方には逆ミセルのサイズ分布の測定は２. １で述べたものと同じであった。

ATP と MgCl2 を溶解し、両者を 0.5 mL づつ混和後、37℃で反応を開始した。ATP 及び DG の water pool におNMR は 500MHzFT—NMR17O プ ロ ー ブ（ 日 本 電 子、
GSX500）で測定した。

ける最初の濃度は 10mM 及び 30mM であり、MgCl2 のwater pool における濃度は 20mM であった。なお HK の２. ３

water pool における濃度は AOT 及び HTAC に関して試薬

は 1.74 mg/mL であり、バルク水溶液及び C12E8 の場合は界面活性剤は２. １と同様なものを用いた。Cysteine は0.0174 mg/mL であった。酵素活性は反応溶液 0.1mL を緩システインの光重合反応

Sigma 製を用いた。

衝液と CHCl3 で抽出し、遠心分離後、水層中の ADP 及び
ATP を HPLC で測定した。HPLC は Shim—packWAX—1

実験方法と Shim—pack プレカラム Doil を用いグラディエント法に

逆ミセルは２. １と同様な方法に従い調製した。逆ミセより検出した。なお HK のみかけの Kinetic parameter はルに可溶化する緩衝液は 50mMTris 溶液（pH ９）を用いた。

Eadie Hofstee plots に従った。

water pool における cysteine 濃度は主に 50mM であった。

ミセルの大きさの測定；逆ミセルの大きさは動的光散乱

UVA、UVB の照射にはアトー社製 HP—30LM、UVC はア（DLS700, 大塚電子）により測定した。

トー社製 HP—50C を用いた。SH 基の変化は蛍光試薬であ２. ２—4500, HITACHI）で測定した。逆ミセル溶液の試料の場

る N—（9—acridinyl）maleimide を用いて、蛍光高度計（Fフォスフォリラーゼを用いた実験

試薬

合はメタノール／水混合溶媒で希釈し測定した。

Polynucleotidephosphorylase（PNPase, E.coli. 由来、Sigma）、

３．結果と考察ADP（Fluka）、14C—Adenosine  5'—diphosphate trisodium salt
（14C—ADP、NEN）などを使用した。NMR 測定には H217O,

３. １

逆ミセルの water pool に溶解した酵素活性と水の構造化との関係

d-octane を用いた。その他は２. １と同じであった。

３. １. １
実験

ヘキソキナーゼについて 11）

ヘキソキナーゼ（Hexokinase；HK）は細胞における糖２. １と同様に AOT は Isooctane に、C12E8 は 12％ v/v

代謝に重要な酵素である。この HK は Mg2+ イオン存在

1—Octanol/Isooctane に溶解し、逆ミセル溶液とした。基下、りん酸基のドナーとして ATP を用いてグルコースの本 的 に は ２. １ で 述 べ た 方 法 に 従 う。ADP を 溶 解 し た

りん酸化を触媒する酵素である 12）。この HK の活性は酵50mM Tris 緩衝液（pH9.5）を 0.2M 逆ミセル溶液に各々素のまわりの微視的環境に大きく依存する。例えば HK はの Wo になるように溶解した。同様に PNPase を同じ Wo

NH2- を末端につけた疎水基を持ち、この疎水基をミトコになるように溶解し、同量の 150μL づつ混和し、反応

ンドリアの生体膜に貫入し、その活性を制御していると言を開始した。14C-ADP と ADP を合わせた濃度を 2.0 mM

われる。またこの HK はグルコースと結合すると、HK の構（1.85kBq）とし、PNPase は 2.5unit を使用した。反応後、造はドラマチックに変化し、水分子が外に追い出されること

反応液を上清と沈殿に分け、それぞれに 0.2％アルブミンも推測されている。すなわちこの HK の活性は水の性質や媒と 10％トリクロロ酢酸を加え、反応を停止した。エタノ体の電場や極性に大きく依存することが推測される 13 〜 16）。

ール 1000μL を加え、ガラスフィルターでろ過し、Tris 緩

そこで界面活性剤として陰イオン性で最もその逆ミセル

衝液とエタノールそれぞれ 1000μL で２回洗浄し、ろ過後、のキャラクタリゼーションが判明している AOT とともに、

液体シンチレーションカウンターでガラスフィルター上の荷電効果を調べるために、陽イオン性の界面活性剤として HTAC、非イオン性の界面活性剤として C12E8 を用いた。

放射能量を測定した。
生成 poly（A）の確認はアガロース電気泳動及びキャFig. １は AOT 逆ミセル溶液における HK の活性に対する

ピラリー電気泳動を行った。アガロース電気泳動は 1.8

Wo の影響を示している。Wo ＝ 10 のところで極大値が認−3−

められる。しかし全体としてバルク水溶液における HK のれ自由水が出現し極性が高くなり、一層電場効果が顕著に活性と比較すると低下し、バルク水溶液のそれをを１とす

現われ、酵素と ATP の距離は離れ HK の活性にマイナス

ると W0 ＝ 10 で 0.015 であった。このように Wo に最適に働く。一方、HK はバルク水溶液中で活性を高く示すので、値が出現する理由として以下のように推測される。反応基

water pool が大きくなり、Wo ＝ 10 を超えると自由水が出

質の ATP は負電荷を持ち、一方、AOT 逆ミセルの内側の現すると有利に作用すると推測される。この相反する二つ界面も—SO3—基の負電荷で覆われ、相互に電気的反発力がの効果により Wo に最適値が出現すると推測される。これ

働き、ATP は water pool の中央に局在するであろう。一は water pool の KCl の濃度の増加させると、HK の活性が方、HK は NH2- 基を疎水基の先端に持っているので、静電増加し、最適 Wo が消えることからも支持された。すなわ

力と疎水結合で AOT 単分子膜層近くに局在あるいは埋め

ち負電荷の AOT 単分子層に K+ イオンが十分吸着され、塩込まれている可能性もある。しかし Wo が大きくなるにつ析効果も働き、HK は膜から追い出され、water pool の中央に局在するようになり、ATP と HK の距離を縮めて触媒

0.45

効果が高まると推測される。

●

0.4

このように AOT 逆ミセル中では HK の酵素活性は低下
するが、Fig. ２に示すように種々の糖を用いた基質特異性

0.35の実験で AOT 逆ミセル中で HK が基質特異性を保持してVo (μmol/mg ・min）

0.3

いることが判明した。それぞれの基質特異性の比率はバル●0.25ク水溶液と同じであった。しかし AOT 逆ミセル中では至●0.2

適 pH はバルク水溶液系のそれに比べ 0.5 アルカリ方向へシ
フトしていた（Fig. ３）。これは AOT の陰イオンの電荷に0.15より H+ が吸着され、water pool 中で H+ の分布が不均一に●0.1なったためであると思われる。

●

Fig. ４は HTAC 逆ミセル溶液における HK の活性に対0.050する Wo の影響を示している。AOT 逆ミセルと同様に Wo
0

10

20

30

＝ 10 付近で極大値を示すが、HK の活性は AOT 逆ミセ

40

ルの活性に比べ、全体にわたり２倍高い。これは陽電荷のWo
Fig.1 Effect of Wo on HK activity in 0.1M AOT/isooctane reversed micelles at 37℃

表面は負電荷の表面に比べ HK 活性の発現に有利に働くと推測される。水溶液中で陰イオン性界面活性剤ミセルにより HK は容易に可溶化されるが、陽イオン性界面活性剤ミセルには HK は可溶化されないことが知られているので 17）、

1

0.8

0.5

0.6

■

0.4

0.2

●
▲
●
▲

■

■ ▲
●
●
▲
◆
◆
○ □
○
■ □
●
▲
◆
0 ○
0
10

◆
□
○
20
30
40
50
Incubation time (min)

◆
□
○
60

0.3

●

●

6.5

7

●

●

●

0.2

0.1

70

Fig.2 Substrate specificity of HK in 0.1M AOT/isooctane reversed micelles (Wo=10) at 37℃■ , D-(+)Glucosamine;●

0.4
Vo (μmol/mg・min)

ADP/(ADP+ATP) ratio■● ,1-Thio-D-glucose; ▲ ,2-Deoxy-

D-glucose; ◆ ,Fructose; □ , D Mannose; ○ , N-Acetyl-Dglucosamine

−4−

0

6

7.5
pH

8

8.5

9

Fig.3 Effect of pH on HK activity in 0.1M AOT/isooctane
reversed micelles (Wo=10) at 37℃

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

同様に HK の—NH2 により HTAC 逆ミセルの膜界面に HK

いて pH 効果を検討した結果、至適 pH はバルク水のそれは深く貫入せず、HK のコンフォメーションが変化しやすと等しく H + の分布はバルク水の H + の分布と等しいと推測いことがあげられる。また HTAC 逆ミセルの方が AOT 逆された。しかし C12E8 の濃度効果を検討した結果、HK の活

ミセルに比べ、そのサイズが大きいことも HK の活性発現

性は濃度の増加とともに増加した（Fig. ６）。通常 Wo を一に有利に働くように思われる。

定にしておけば、界面活性剤の濃度を変化させても、water

C12E8 逆ミセル系では Wo が 20 まで徐々に HK 活性は上pool の状態は変わらないはずである。界面活性剤の濃度と昇し、その後なだらかに増加し、Wo ＝ 30 で最大値を示しともに活性が低下する場合は、酵素が逆ミセルの膜と結合た（Fig. ５）。C12E8 逆ミセル中の酵素活性は AOT 逆ミセル

している場合が多い 18）。AOT 系での HK の活性に対するや HTAC 逆ミセルのそれらに比べ非常に高く、ほぼバルク

AOT 濃度の効果はこれに相当する（データは示されてい水のそれと等しかった。また極大値を示した Wo ＝ 30 におない）。しかし反対に界面活性剤濃度とともに活性が増加する場合は、逆ミセルや水の構造の変化が起きている場合

1.4

で、酵素は膜と結合していないと推測される。C12E8 逆ミ●

Vo (μmol/mg・min)

1.2

セルの場合は後者に相当する。
表１は AOT、HTAC 及び C12E8 逆ミセル、バルク水

1溶液の見かけの Vmax 及び Km を示している。見かけのVmax は AOT<HTAC<<C12E8 逆ミセル < バルク水溶液

0.8の順であった。みかけの Km は C12E8 逆ミセル中ではバル●ク水溶液のそれと等しいが、AOT や HTAC 逆ミセルの

0.6

HK と基質の相互作用がバルク水溶液とほぼ等しく、AOT や
HTAC 逆ミセルの場合と大きく異なることを示している。

0.2
0

それらよりかなり低かった。これは C12E8 逆ミセル中では

●

0.4
●
0

10

20

30

25

40

●

Wo
Fig.4 Effect of Wo on HK activity in 0.1M HTAC/isooctane-octanol reversed micelles at 37℃

30

25

●
●

20

Vo (μmol/mg・ml)●

Vo (μmol/mg・ml)

20

15
●
10

5

●

15
0

●
0

0.05

10

0

0.15

0.2

0.25

0.3

Fig.6 Effect of C12E8 concentration on HK activity in C12E8 /isooctane-octanol reversed micelles (Wo=30) at 37℃

●

0

0.1

Concentration of C12E8

●
5

●

10

20

30

40

Table 1 Apparent kinetic parameters of HK in three kinds ofreversed micellar solution

Wo
Fig.5 Effect of Wo on HK activity in 0.1M C12E8 / isooctaneoctanol reversed micelles at 37℃−5−bulk water

AOT

HTAC

C12E8

km（μmol/ml）

0.99

3.69

2.79

1.02

Vmax（μmol/min）

26.81

5.11

13.48

18.93

HK は前述したようにミトコンドリア表面に疎水結合と質と結合し、反応が進行していくと推測される。in vivo に

静電力で結合し、HK がグルコースを抱き込むと、そのコおいて脂質膜はポリサッカライドとその結合水で覆われ、ンフォメーションが大きく変化すると推測されているが、この状態はエチレンオキサイド層からなるマントルと類似

三種類の逆ミセルの中での酵素活性から、HK の活性は微していると考えられる。HK の活性は HK の微視的環境例

視的環境に大きく依存することが判明した。上記の結果かえば、疎水性、静電効果、結合水のような因子に影響を受ら、AOT、HTAC、C12E8 逆ミセルにおける酵素反応のス

けることが判明した。C12E8 逆ミセルの場合は、Wo ＝ 30

キーム（Fig. ７）を示す。AOT 逆ミセルの場合は HK のアぐらいまでは結合水からなると推測されるが、Wo ＝ 30 をルキル基とその末端のアミノ基により HK が膜に結合し、超えると、活性が低下するのでエチレンオキサイド層から埋め込まれたような状態となり、HK のコンフォメーショ

なるマントルにおいては結合水が有利に働くと推測された。

ンが変化しにくく反応が進行しにくいことがまず第一にあ
３. １. ２ ポリヌクレオチドフオスフォリラーゼについて 21)

げられる。HTAC 逆ミセルの場合は、HTAC の陽電荷とHK のアミノ基の電気的反発力により比較的 water pool の

逆ミセルの water pool の中に酵素、ポリヌクレオチドフオ

中央に位置するとともに、動的光散乱の測定から、AOT 逆スフォリラーゼ（Polynucleotide Phosphorylase, PNPase）、

ミセルの大きさに比べ、HTAC 逆ミセルの大きさは大きい

FeCl3、ADP を溶解し、RNA 合成を検討し、water pool のので、酵素がコンフォメーションが変化しやすいことが考水の性質との関係を検討した。通常は ADP の酵素的重合えられる。さらに陰イオン性、陽イオン性の界面活性剤かには Mg2+ イオンが有効であるが、今回は低濃度の Fe3+ イ

らなる逆ミセルの water pool は静電力が強く、特に Wo がオンを用いたことが特徴的である。その理由の一つとして、大きくなると自由水が増加しその傾向は強くなる傾向にあBeljanski22）が PNPase による核酸塩基の重合化は Fe3+ イオる。従って反応基質の ATP や H+ の water pool における分ンの方が Mg2+ イオンに比べ効果があることを報告してい布が電荷のある表面膜に強く影響を受け、反応基質と酵素るからである。二つ目の理由は、微量の二価、三価鉄塩をの距離や pH を変化させることになり、HK の触媒の作用

含む πWater は実体は不明であるが、特異な生理活性を持を抑制する。

つと言われ、その点でも興味深いからである。

他方、非イオン性 C12E8 逆ミセルは HK の触媒活性に有Fig. ８は 0.2MC12E8 逆ミセル溶液の酵素的 ADP 重合化に利であった。その理由として二つあげられる。１）静電場

対する Fe3+ と Mg2+ イオンの存在下における 25℃及び 37℃

効果がないので、反応基質、HK、H + の分布が逆ミセルのの結果である。ここで water pool の Fe3+ イオン濃度として中で比較的均一に分布する。２）C12E8 逆ミセルの特異的なFeCl3 の飽和濃度の 0.05mM を用いているが、Mg2+ イオン

構造が挙げられる。C12E8 逆ミセルははっきりした境界領域

濃度が water pool において 10mM 濃度を用いた。その理由が分かれた water pool を持っているのではなく、殆どの水は Fe3+ イオン濃度と同じ Mg2+ イオン濃度が 0.05mM にお分子は Wo ＝ 30 ぐらいまでは、エチレンオキサイド鎖に水いては殆ど反応が進行しなかったので、最も反応が進行し和している。エチレンオキサイド基はアルキル基より

19、20）

た 10mM の濃度を用いた。縦軸の重合率は最初に加えた
C—ADP の全放射能量に対する生成された重合体の放射長く、エチレンオキサイド鎖と水和水からなるマントル層14であり、この中に酵素も反応基質も存在し、容易に反応基能量の割合である。Fig. ８の結果が示すように poly（A）

AOT

HTAC
+
+
+

+

+ + +

H12E8
+

+
+
+

：ATP

：Enzyme

+

+ + +

：AOT

+

+
+
+
+
+
+

+

：HTAC

Fig.7 Models of reversed micelles containing HK and ADP−6−：C12E8

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究[Fe 3+ ]80[Mg 2+ ]=0.05mM

w

=10mM

80

37℃

70

25℃

37℃

70

60

60

50

50

Yield of poly A (%)

Yield of poly A (%)

w

40
30
20

25℃

40
30
20

10

10

0

0

24

0
Incubation time (h)

0

24

24

supernatantFig. 8precipitate

Effect of Metal Ions and Temperature on ADP Polymerization in C12E8 Reversed Micellar Solution

生成物は沈殿物と逆ミセル溶液の上澄み液の両者に存在し80た。この時の逆ミセルの大きさや water pool の特徴を示

70

すでに報告してある AOT 逆ミセル系で Mg2+ イオンを用60いた場合、Wo ＝ 20 の場合が最も重合化が進行したから。結果は示していないが、Beljanski

９〜 11）

がすで22）に報告したように、Tris 緩衝液中では Fe3+ イオンは Mg2+
イオンに比べ２倍効果を示しており、37℃では重合化の程度はほぼ 10％であることが確認された。しかし結果は示

Yield of poly A (%)

す Wo（＝［水］／［界面活性剤］）は 20 である。これは

である

0
24
Incubation time (h)

○
●
○

40
30
20

Fe3+ イオンに比べ圧倒的に効果が高く、しかも 37℃に比100

それに対して Fig. ８に示されるように、C12E8 逆ミセル系●● precipitate

50

していないが、AOT 逆ミセル系では Mg2+ イオンの方がべ 25℃の方が生成した poly（A）が沈殿する割合が高い。

○ supernatant○
05

では Mg2+ イオンに比べ約２倍 Fe3+ イオンの方が効果的

●
10

●
15

20

●
25

○
○

30

35

40

45

Temperature (℃）

であった。また Fe3+ イオンの場合、C12E8 逆ミセル系の重Fig.9 Effect of temperature on polymerization after 24h

合率は水系に比べ６倍の 60％の重合率を超え、しかも 37℃で poly（A）が沈殿し、生成された生成物を容易に分取

ト状でないかと推測される。水溶液中の通常のエチレンオ

しやすくなることが判明した。

キサイド系非イオン性ミセル系においては、Fe3+ イオン

AOT 逆ミセル系においては Fe イオンがほとんど効果

はエチレンオキサイド鎖の水和水と置換してエチレンオキを示さなかったのは、AOT 逆ミセルの water pool のミク

サイド基に結合することが知られているので、逆ミセルにロ界面が陰イオン性で、特に Fe イオンは３価のために、おいても Fe3+ イオンはエチレンオキサイド基の親水層にSchultz—Hardy の法則に従い、そのミクロ界面に吸着されADP とともに存在し、反応が進行すると推測される。こやすくなり、water pool の中央は Fe イオンの濃度が極のように C12E8 逆ミセル系では Fe3+ イオンの方が活性があめて低くなるためと推測される。一方、反応基質の ADPり、かつ 37℃で沈殿しやすいので、この現象をさらに詳

は負電荷を持つため、AOT 逆ミセルの陰イオン界面と反細に検討した。

3+

3+

3+

発し、むしろ water pool の中央に存在する割合は高くな

Fig. ９と Fig.10 はそれぞれ C12E8 逆ミセルの poly（A）

り、重合化が進行しにくいと推測される。前述したように生成に及ぼす温度と反応時間の影響を調べたものである。

C12E8 逆ミセル系では AOT 逆ミセル系に比べ電場効果は

低温の 10℃では重合化は殆ど進行しないが、反応温度がなく、８ケのエチレンオキサイド基の親水層がアルキル鎖

30℃以上になるとほぼ 60％重合し、それ以上温度を上昇より長く、水素結合により水分子が水和している厚いネッ

させても総重合率は変化しなかった。しかし 37℃以上で−7−は急激な沈殿量の増加が認められた。一方、反応時間の効

15 では重合化は速やかに進行する。すなわちある程度の果を調べると（Fig.10）、６時間以上で重合化は 60％に達し、逆ミセルの大きさと自由水の存在が重合に好ましい。しかそれ以後変化しない。しかし６時間から９時間の間に生成し Wo ＞ 15 で沈殿した poly（A）と上澄み液中の poly（A）

物は沈殿した。すなわち重合化にはある程度の熱が必要でを併せた総重合率はほぼ一定であり、自由水が多けれれあるが、生成物の沈殿には熱とともにある程度の時間が必ば多いほど、重合化が進行するとはいえない。データは要であった。エチレンオキサイド鎖をもつ界面活性剤の水示していないが、0.2MC12E8 逆ミセルの Wo に対して水の溶液における通常のミセルは温度の影響を強く受け、温度

H2 17O の NMR の半値幅をプロットすると、Wo が 10 付近を上昇していくと相分離し、水溶液全体が濁ることはよく

で屈曲点を示し、Wo ＜ 10 では、逆ミセル中の殆どの水知られている。これはエチレンオキサイド鎖が脱水和するはエチレンオキサイド基に水和している。しかし Wo>10

ため、疎水性と親水性のバランスが変化し、疎水性の性質

で自由水が増加してくることが推測される。すなわち Woが高まり、相分離するのである。従って逆ミセルのエチレ＜ 10 では水が強く構造化され、重合化に対して不利に働

ンオキサイド鎖の結合水が温度上昇に伴い、脱水和によりくようである。

逆ミセルの構造が変化し、その結果、酵素反応に影響する

以上より C12E8 逆ミセル中においては Wo ＞ 15 においと推測された。言い換えればエチレンオキサイド鎖をもつて 37℃で６時間以上の反応時間で poly（A）の重合化が界面活性剤の逆ミセルの water pool は温度制御可能な酵最も高くしかも圧倒的に沈殿することが判明した。この沈素の反応場であることを示唆している。

殿現象は重合体の単離に都合がよい。そこでこの沈殿現象

次に 37℃で 24 時間後の重合化に及ぼす Wo の影響をの機構を検討した。

調べた。Wo の増加とともに逆ミセルのサイズとともに

Fig.12 は Wo ＝ 20 の 場 合 の C12E8 逆 ミ セ ル 中 の 水 のwater pool のサイズが増加することはよく知られている

H2 17O の NMR の半値幅を温度に対してプロットしたもの

１）。よく研究されてきた AOT 逆ミセル系については、特である。温度の上昇とともに H217O の NMR の半値幅は低に Wo が 10 以下では結合水が存在し、Wo が 10 以上では下し、水の運動性が増加するが、約 35℃以上で H217O の

water pool の中央に自由水が出現してくることが知られ

NMR の半値幅は一定値に近づく。データは示していな。すでに報告したように、AOT 逆ミセル系でいが、温度が上昇すると、逆ミセルのサイズは大きくな

は Mg2+ イオン存在下、poly（A）の生成は Wo が 20 で極り、特に water pool に Fe3+ が存在すると、逆ミセルはさ大を示し、ある大きさの water pool が必要であり、結合らに大きくなった。我々はすでに AOT 逆ミセル系につい。すなて Wo が増加し、水の運動性が増加すると、逆ミセルが集

わち Wo ＝ 20 では、結合水と自由水が半々ぐらいの状態合する Flocculation の現象が起こることを Cryo- 電子顕微

ている

１、
６）

水だけでは重合化は進行しないことが判明した

10）で存在し、これが重合に有利に働くと推測された。しかし
Fig.11 が示すように、C12E8 逆ミセルの poly（A）生成は

100

Wo ＜ 10 では重合化はわずかにしか進行しないが、Wo ＞

90

supernatant80

precipitate

70

70

Yield of poly A (%)●
50

Yield of poly(A) (%)

60
●

○
○

40
30

○ supernatant

50
40
30
20

● precipitate

20

60

10
10
●
0

0

3

●

○

6

9

○
12

21

24

Incubat ion t ime ( h)Fig.10 Time course of polymerization at 37℃

0
27

10

10

15

15

20

20

25

25

30

30

W
0
Fig.11 Effect of W0 on the precipitation of poly(A) in C12E8 reversed micellar solution at 37℃−8−逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

鏡で観察したが７）、C12E8 逆ミセル系についても、温度が現象を示すことが知られているが、この現象はエチレンオ

上昇と Fe の存在が逆ミセルの Flocculation を引き起こ

キサイド系界面活性剤逆ミセルの水もその効果を示し、温している可能性が推測される。これが温度が 37℃以上で、度を変化させることにより逆ミセルの水の性質を制御し、かつ Fe が存在すると、PNPase により生成された poly

高分子生成物の単離が可能であることを示した。

3+3+（A）が沈殿する現象の一つの要因として推測された。
逆ミセル系での酵素反応に関する多くの研究は AOT 逆

３. ２

膜界面におけるチオール化合物の光重合 23）

ミセル系についてであった。ここに述べた研究例はエチレ

環境中に存在する紫外線は UVA 及び UVB で、UVC は

ンオキサイド基をもつ非イオン性界面活性逆ミセルは系全殆ど存在していないが、近年のオゾン層破壊にともない体が油の系であるにもかかわらず、酵素反応に有利である

UVB の増加が観察されており、さらに破壊が進行し UVC

ことを示している。特にエチレンオキサイド基のまわりのが増加することも懸念されている。紫外線は細胞膜の膜

結合水は温度感受性で温度の上昇とともに脱水和して曇点

タンパク中の SH 基の酸化（主に S—S 結合の生成）をきた
し、レセプターの clustering や膜酵素の不活性化さらに紫外線の情報伝達にも関与している可能性が報告されている300。本研究では膜タンパク中の SH 基の変化に膜界面の24、25）■

近傍の水の状態（結合水や自由水）と静電場の影響を検討

250するため逆ミセルを用い、cysteine の SH 基は容易に酸化され、二量化する性質に着目して以下の仮説を立てた。紫Half width(Hz)200

外線の照射により脂質膜近傍で産出される活性酸素によ■り cysteine が cystine に酸化されやすいという仮説の基に■
150

AOT 逆ミセルを中心にしてその water pool 中に cysteine■を溶解し、紫外線照射後の cysteine の変化量を蛍光法に

■

■

100

■

より検討した。特に逆ミセルの単分子膜を膜モデルと考え、■Wo を変化させて膜界面の水の性質を連続的に変化させて検討した。
cysteine バルク水溶液および water pool 中に cysteine50を溶解した逆ミセル溶液に紫外線（20J/cm2）を照射後のSH 基減少率を測定した（Fig. 13）。バルク水溶液と逆ミ

0
25

30

35
Temperature(℃)

17

Fig.12 Plots of O line of the H2
micelles against temperature4045セル溶液では SH 基の減少（酸化）に顕著な差が観察された。バルク水溶液においては UVA では SH 基の変化はほ17

O signal of C12E8 reversed

とんど見られなかったが、UVB では約 20％、UVC では
約 60％の減少であった。この減少は cysteine の SH 基がResidual cysteine (% of control)

120
100

UV-A:20J/cm 280

UV-B:20J/cm2

60

UV-C:20J/cm 2

40
20
0
AOT

HTAC
HTAC

C12E8
C 12 E 8

Aqueous
Aqueousbulk
bulk
solutionsolutionFig. 13 Conversion of cysteine in reversed micellar solution and in aqueous solution by UV-irradiation−9−

Residual cysteine (% of control)

AOT
100
80

■

60

●

100

■ UV-A● UV-B▲ UV-C

1

2

3

4

■
▲
●

●

5

▲

▲
■
●

0

0

■
●
▲

60

■

20

●
▲

■
●
▲

80

40

20
▲

100

60

■
▲

C12E8

■
●
▲

80

■
●

40

0
0

HTAC

■
●
▲

1

■

40

●
▲

20

■
●
▲

2

3

●
■
▲
4

■
●
▲
5

0

0

■

1

●

■

▲

●
▲

2

3

■
●
▲
4

■
●
▲
5

2

Irradiation dose (J/cm )Fig.14 Conversion of cysteine as a function of irradiation dose

酸化されたことを意味するが、バルク水溶液に比べ、Wo ＝ 20 の AOT 逆ミセル系では顕著に進行
cystine への酸化であることを薄層クロマトグラ
フィーにより確認した。また紫外線の種類による減少率の違いは個々の紫外線がもつエネルギーの差によると考えられる。すなわち、UV のエネル
ギーが大きいほど酸化しやすいことを示している。
また逆ミセルでは 20J/cm2 照射で３種類の紫外線とも SH 基減少率が 90％以上となったが、線量依存性があることも確認した。この結果は cysteineの変化に AOT 逆ミセルの water pool が重要であることが示唆された。
Fig. 14 に示したように 0.2MAOT 逆ミセル（Wo＝ 20）では UVA および UVB2J/cm2 照射時にほぼ 50％の減少率となり、UVC に対してはさらにResidual cysteine (% of control)

することは大変興味深い。この反応が cysteine の

100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0

UV-A:2J/
UV-B:2J/
UV-C:0.5J/

AOT

HTAC

C12 E 8

3

5

7

10

15

20

30

Wo
Fig.15

Conversion of cysteine in reversed micellar solution of various Wo
by UV-irradiation

0.2MHTAC 逆ミセル（Wo ＝ 20）の場合は 2J/cm2 照射時が大きくなるすなわち自由水の割合が増加するとともにに UVA で約 60％、UVB では 90％以上の減少率を示した。

cysteine の SH 基減少率が低くなり光重合が進行しにくい

UVC 照射では 1J/cm 照射でもかなり反応が進行していた。

ことが判明した。これは逆ミセル溶液は圧倒的に有機溶媒

非イオン性の 0.2MC12E8 逆ミセル（Wo ＝ 20）の場合は 2J/が多い状態であるにもかかわらず、内殻水の状態により SH

cm 照射時に UVA は約 40％、UVB では約 70％の減少率

基減少率に差があったことを意味する。このことよりこのを示し、UVC ではほとんど cysteine が酸化されていた。こ反応は有機相より水相が重要であること即ち結合水が重要の結果より、紫外線の場合 HTAC ≧ AOT >C12E8 の順にであることが確認された。従って Wo の増加とともに反応

cysteine の変化が起こりやすいと言える。この反応が静電率が低下するのは cysteine が自由水中に多く存在すること

場により影響を受けていることを示唆した。

により、反応が進行しにくくなるためと推測された。同じ減少率が高くなり、1J/cm2 照射でほぼ反応が終了
していることが観察された。一方、陽イオン性の22

このように cysteine の UV による酸化には膜界面の関Wo 値でも検討した界面活性剤によっても SH 基減少率に差与が示唆されたので、さらに膜界面の水の状態および膜が確認された。全体的に見て HTAC ≧ AOT >C12E8 の順に電荷の影響について検討した。以下の実験では UVA およ

反応が起こりやすいことが観察された。この結果も前述しび UVB では 2J/cm 、UVC では 0.5J/cm の線量で行った。

たように電荷が関与していることを示しており、cysteine22

Wo 値を変えて水の状態の影響を、AOT、HTAC、C12E8 界の逆ミセル界面での配向の仕方が影響していると推測され面活性剤の逆ミセルについて膜電荷の影響を検討した（Fig.

る。また紫外線で同じ Wo 値の UVA と UVB を比較した場

15）。界面活性剤の種類、紫外線の種類に関係なく、Wo

合には UVB の方がより反応を進行させた。

− 10 −

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

逆ミセルの内殻水中の cysteine の存在場所は、

100
UV-A:2J/いると考えられるが、逆ミセルの界面の電荷により cysteine の配向は若干異なっていると推測される。いずれにしても SH 化合物が膜界面に多く存在すればより反応は進行しやすいと考えられる。そこで長いアルキル側鎖による疎水性のために逆ミセルの膜界面に多く存在すると推測される n—dodecanethiol を用いて検討した（Fig.
16）。紫外線によって cysteine とは逆に Wo が大Residual cysteine (% of control)

両性の電荷を持つためおそらく均一に存在してUV-B:2J/80

UV-C:0.5J/

60

40

20

きくなると SH 基減少率が高くなった。これはWo が小さい場合は膜界面に出ている SH 基が少0ないために反応率が低下し、Wo が大きくなると
内殻水のサイズが大きくなり、膜界面の SH 基が増加したために反応率が高くなったと考えら

3

5

7

10

15

20

30

Wo

Fig. 16 Conversion of 1-dodecanethiol in AOT reversed micellar solution ofvarious Wo by UV-irradiation

れた。n—dodecanethiol の反応率が cysteine に比機溶媒（Isooctane）中に存在しているためと考えられる。
このことは n—dodecanethiol を Isooctane または Methanolに溶解させて、同様に紫外線や放射線を照射して SH 基の変化を検討したが、ほとんど SH 基の減少は見られなかったこのことからも確かめられた。これらの結果はさらに結合水の存在の重要性とともに膜界面の必要性を示した。
以上より逆ミセル中 cysteine の SH 基がで紫外線によって酸化され、主として cystine が生成することが明らかとResidual cysteine (% of control)

べて相対的に低いのは n-dodecanethiol のかなりの量が有control80

素が生成することが報告されている 26 〜 29）。活性酸素の生成には溶存酸素が必要であると考えられるので、まず使N2 substitution

**

*

*

**

**

60

*

***

40

**

20

なった。紫外線照射によって一重項酸素、過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、水酸化ラジカルなどの活性酸

Wo=20

Wo=7

100

0

UV-A UV-B UV-C γ-Ray

UV-A UV-B UV-C γ-Ray*:p<0.001**:p<0.01

Fig.17 Effect of nitrogen substitute on conversion of cysteine
in AOT reversed micelles by UV irradiation

用する溶媒を窒素置換して溶存酸素の影響を調べた。Fig.

100
Residual cysteine (% of control)

17 から明らかなように Wo が 7 および 20 のいずれにおいても、SH 基減少率の低下が確認された。従ってこの
cysteine の変化に酸素が関与していることが示唆された。
また一般的に膜界面には溶存酸素が安定的に存在するとされているので、Wo ＝７のとき回復の割合が Wo ＝ 20 に比べて低いのは、今回行った窒素置換条件では十分に溶存酸素が除去できなかったものと考えられた。
次に一重項酸素の関与をクエンチャーである NaN3 を用いて検討した。UVA、UVB、UVC 共に Wo ＝７および

80

UVC、放射線照射によって一重項酸素は生成しないと考

Wo=20

100

H2O
NaN3 50mM

80

60

60

40

40

20
0

20 で SH 基減少率の低下が観察された（Fig. 18）。UVB、

Wo=7

20

*
UV-A

UV-B

*

UV-C

0

UV-A

UV-B UV-C*:p<0.05

Fig.18 Effect of NaN3 on conversion of cysteine in AOT
reversed micelles by UV irradiation

えられているので、NaN3 による SH 基減少率の低下はこの試薬が他の生成した活性酸素種を阻害したことによるものと推測している。一例としてハイドロキシラジカル

紫外線でも SH 基減少率が低下した。Wo ＝ 7 と 20 では（OH ラジカル）を阻害することが報告されている。そこ

Trolox の作用に差は認められなかった。これらの結果はでその他の活性酸素の影響をまず親水性の抗酸化剤であ

逆ミセル内殻水に存在する抗酸化剤はある程度活性酸素のる Trolox の作用について検討した（Fig. 19）。いずれの発生を抑制することを示した。さらに疎水性の抗酸化剤− 11 −

Wo=7

Residual cysteine (% of control)

100

control
80

Trolox 5mM

80

明した。
*
*

２）PNPase の酵素活性発現には膜の電荷により、金属触媒の作用は強く依存し、エチレンオキサイド鎖をもつ*

C12E8 逆ミセル系では、Fe3+ が有効に作用し、さらに温

60

60

*

40

度を上昇することにより、エチレンオキサイド鎖の結合

*

40

*
20
0

傍の結合水は HK の酵素活性発現に有利に働くことが判

Wo=20

100

UV-A

UV-B

UV-C

水の状態を制御し、高分子の poly（A）を沈殿させ、単離しやすくできる系であることが判明した。

200３）膜界面の結合水は紫外線により発生した活性酸素の寿命を長くしチオール化合物を容易に酸化することを明ら
UV-A

UV-B

かにし、in vitro のモデル実験は膜蛋白質の SH 基が紫UV-C*:p<0.001

外線により容易に酸化され、膜蛋白質の構造や生体膜のFig.19 Effect of Trolox on conversion of cysteine in AOT reversed
micelles by UV irradiation

状態を変化させ、情報伝達などに影響を与えることを支持した。

である vitamine E は有機溶媒中あるいは膜界面近くに存在すると考えられる。Fig. 19 から明らかなように、UVA、

謝辞

UVB、UVC に対して顕著に SH 基減少率の低下を示した。

本研究は静岡県立大学大学院生活健康科学研究科五島廉

特に Wo ＝ 7 においては Trolox より強く作用している傾輔教授、伊吹裕子助手とそのグループとの共同研究でな向が観察された。従って活性酸素は主として膜界面近傍でされたものであり、ここに謝意を表する。

多く発生すると推測された。
無生物系への紫外線照射によっても活性酸素が発生する
ことが観察され、その発生には膜界面、結合水、電荷など（参考文献）
１）五島綾子 , 逆ミセル内殻水の性質 , 表面 , 32,96(1993).

が重要な点であることが示された。このことは生体膜にお２）A. Goto and H. Kishimoto, J. Chem. Soc. Perkin Trans.

いても膜界面に存在する SH 基を持つ蛋白質成分が、紫外

2, 1990, 73.

線照射によって影響を受けやすいことを示唆した。

３）A. Goto and H. Kishimoto, J. Chem. Soc. Perkin Trans.  

４．結2, 1990, 891.

論４）A. Goto, H. Yoshioka, H. kishimoto, T. Fijita, Langmuir,8, 441(1992).

in vivo の脂質界面の水の性質や電場効果が生理作用とどのように関わるかは重要な課題であるが、in vitro でそ５）A. Goto, S. Harada, T. Fujita, Y. Miwa, H. Yoshioka, andH. Kishimoto, Langmuir, 9, 86(1993).

のモデル実験を構築することはむずかしい。我々グループの研究対象である逆ミセルの water pool の水分子は動６）A. Goto, H. Yoshioka, M. Manabe, and R. Goto,  Langmuir, 11, 4873(1995).

的な柔らかい単分膜に包まれ、Wo が低い領域では界面活性剤の親水基とその対イオンの結合水として存在するが、

７）A. Goto, Y. Kuwahara, S. Suzuki, H. Yoshioka, R. Goto,

Wo がある大きさを超えると、water pool の中央に自由水

H. Iwamoto, and T. Imae, J. Mol. Liquid, 72, 137(1997)が出現するようになる。従って Wo を連続的に変化させる

８）P. Walde, A. Goto, p-A. Monnard, M. Wessicken, and P.
L. Luisi, J. Amer. Chem. Soc., 116, 7541-7547(1994).

と結合水と自由水の割合を制御でき、その上、極性や電場も制御可能であり、脂質界面の水の性質や電場効果が生理

９）A. Goto, K. Hakamda, Y. Kuwabara, R. Goto, P. Walde,

機能との関わりについての知見が期待される。本研究ではP. L. Luisi, and T. Imae, Prog. Colloid & Polymer Science,

脂質界面の水の性質や電場効果が酵素反応に与える影響と106, 245(1997).

紫外線照射に活性酸素の発生への影響を逆ミセルを用いて

10）A. Goto,   R. Goto, Y. Kuwahata, H. Hakamada, Y.
Ibuki, P. Walde, P. L. Luisi, and T. Imae, Langmuir, 14,

検討した。

3454(1998)

その結果、以下の点が明らかにされた。
１）in vivo の研究で膜界面や水の性質に大きく依存する11）Y. Kuwahara, A. Goto, Y. Ibuki, K. Yamaguchi, and R.
Goto, J. Colloid Interface Sci., 233, 190(2001).

と推測される HK については、逆ミセルを用いて明らかにすることができた。すなわち強い電場は基質や酵素の12）K. C. Pedley, G. E. Jones, M. Magnani, R. J. Rist, and R.
J. Nabtalin, Biochem. J. 291, 515(1993).

局所的位置を大きく変化させ、特に負電荷の膜は HK の活性発現に好ましくない。またエチレンオキサイド鎖近13）P. G. Plokis, J. E. Wilson, Arch. Biochem.   Biophys.

− 12 −

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

236, 328 (1985).

Yamada Conference L. 1999.

14）R. M. Lynch, K. E. Forarty, F. S. Fay, J. Cell Biology,
112, 383(1991).

22）K. Beljanski, J. Mol. Evol., 42, 493(1996).
23）R. Goto,   H. Goto Y. Ibuki, A. Goto, 13th International

15）A. E. Aleshin, H. J. Fromm, R. B. Honzatko, FEBS

Congress on Photobiology and 28th Annual Muting

Letter 434, 42(1998).

American Society for photobiology, July, 2000, San16）D. Ardail, J-P. Privat, M. Egret-Charlier, C. Levrat, F.
Lerme, and P. Louisot, J. Biol. Chem. 265, 18797(1990).

Francisco24）Rossette, C. and Karin, M., Science, 274, 1194(1996).

17）E. A. -Foucher, B. Fonte, D. C. Gautheron, Arch.  

25）Knebel, A., Rahmsdorf, H. J., Ullrich, A. and Herrlich, P.,

Biochem. Biophys. 232, 391(1984).

EMBO J., 15,        5314(1996).

18）K. Martinek N. L. Klyyacho, A. V. Kavanov, Y. L.

26）McCormick, J. P., Fischer, J. R., Pachlatko, J. P. andKhmelnitsk, A. V. Levasov, Biochim. Biophys. Acta, 981,
161(1989)

Eisenstark, A., Science, 191, 468(1976).
27）Horio, T. and Okamoto, H., J. Investi. Dermat., 88,19）Z. M. Zhu, K. I. Feng, Z. A. Schelly, J. Phys. Chem. 96,
2382 (1992).

699(1987).
28）Tyrrell, R. M. and Pidoux, M., Photochem. Photobiol., 49,20）S. P. Moulik, M. L. Das, P. K. Bhattacharya, A. R. Das,
Langmuir, 8, 2315(1992).

407 (1989).
29）Masaki, H., Atsumi, T. and Sakurai, H., Biochem.

21）A. Goto, H. Suzumori, Y. Ibuki, K. Yamazaki, and R.
Goto, "Polyelectrolytes" edited by I. Nodaand E. Kokufuta,− 13 −

Biophys. Res. Commun., 206, 474(1995).

古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究
東京工業大学大学院

江

理工学研究科物質科学専攻

口正Archaeal membrane lipids are structurally unique and are consisted of isoprenoid chains linked to glycerol withether bond in contrast to the ester linkage of eubacterial and eukaryotic membrane lipids.   The most striking
feature of archaeal membrane lipids is the presence of macrocyclic structures as large as 36-membered rings ofmethanogens.
An objective of this research is to develop synthetic methodology of these extreme macrocycles and the uniquearchaeal ether lipid, which are useful for studies on physico-chemical properties as membrane lipid and to develop
new materials with intriguing properties.
For this purpose, we have succesfully synthesized archaeal 36-membered macrocyclic membrane lipids ans its
acyclic congener.  Described in this report is the biophysical significance of the archaeal 36-membered macrocyclic
diether phospholipid 36MPC as a function of temperature, which was studied by measuring of membrane fluidity,
liposomal proton permeability, and liposomal thermostability in comparison with its acyclic counterpart, DPhyPC,egg yolk lecithin eggPC, and a mixed lipid of DMPC-cholesterol (2:1).   Fluorescence anisotropy measurements
indicated that the macrocyclic structure led to a decrease in the fluidity in the inter-membrane hydrophobic partmore than in the membrane surface by limiting the motional freedom of the alkyl chains.  The proton permeability
was also significantly reduced by introducing a macrocyclic structure.  Liposomal thermostability measurements
using 6-carboxyfluorescein (CF) suggested that 36MPC formed liposomes with greater thermal stability than theseof DPhyPC.  The presence of glycolipids to the corresponding phospholipids greatly reduced the CF leakage fromliposomes.   Most importantly, DMPC-cholesterol liposome showed less leakage than 36MPC at 40℃ .   However,by raising the temperature, this situation was completely reversed.   This suggested that the cyclic structure
contributed to the formation of stable liposomes, especially at higher temperatures.   These findings clearly
demonstrate that the 36-membered macrocyclic lipid membrane plays an important role for the thermophilicarchaea to adapt to extreme environments.

１．緒た構造を持っている（Figure １、化合物１、２）２）。そ言の中でも極めて特徴的なものとして、イソプレノイド鎖のすべての細胞は細胞膜によって外界から自己を確立し、末端が結合し、36 員環を形成した大環状エーテル型脂質

生命活動を営む。すなわち細胞膜こそ「生きている」ことの存在が挙げられる２）。古細菌は過酷な生息環境にこれらの証である。微生物 ･ 動物 ･ 植物を問わず、大部分の細胞の特異な膜脂質によって、適応していると考えられてはい

膜は脂肪酸とグリセロールを主構成要素とするリン脂質のるが、その機能は明確にはされていない。

集合体から成る脂質二重膜によって作られている。細胞膜

一方、レシチンに代表されるリン脂質は、界面活性機能

脂質は生命の根幹ともいえる生体成分であるので、地球上に優れ、保水剤、乳化剤、乳化安定剤やリポソーム剤としの生物すべてに構造的に普遍的なものと考えられてきた。

て使用されている。しかしながら、安定性の面で問題点が

ところが、通常の生物の生育環境とは大きく異なった、温あり、熱や酸化、加水分解などに不安定である。この不安泉、海底火山、塩湖などのように高温、高圧、高酸性、ま定性の原因は化学構造的に見るとレシチンが脂肪酸とエス

たは高塩濃度等の苛酷な環境下で棲息している古細菌と命テル結合しており、また、不飽和脂肪酸が存在しているこ名された微生物の一群が存在し 、自己と外界を分ける細とに基因している。これらの古細菌の脂質の化学的な構造

胞膜が特異であることが明らかとなってきた。古細菌の細の特徴及びその生育環境を考えると、高温や乾燥など厳し

胞膜はイソプレノイド鎖とグリセロールがエーテル結合しい下で安定した機能を保持する化粧品基剤として注目すべ

１）き新素材であると考えられる。
Fuctional Role of Archaeal Ethereal
Phospholipids
Tadashi Eguchi
Department of Chemistry and Materials
Science, Tokyo Institute of Technology

本研究では、古細菌の膜脂質、特に大環状膜脂質の機能を解明することを目的として研究を進めている。そこ
で、培養等の手段では純粋に得ることが難しい古細菌の大環状脂質を、合成によって純粋かつ十分量得て、それから調製される脂質膜の性質について種々の測定法を用いて検討することとした。既に我々は、McMurry 反応およびオ
レフィンメタセシス反応による環化を鍵とした至適生育温− 14 −

古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究

Figure 1

Figure 2 Image by differential interference
contrast fluorescence optical microscopy of
36MPC（T ＝ 298 K, pH ＝ 7.0, l ＝ 551 nm,
Nile Red 1％ mol.）. Scale bar 10m.

Sturcture of Lipids

度 85℃のメタン生成細菌 Methanococcus jannaschii が有す

ソーム（GUV）を形成していることが分かる。これは大る 36 員環脂質２の全合成に成功している 。それら研究

環状脂質が単独でリポソームを形成することが分かった初の成果は既に総説として発表したので、本報告書では詳細

めての例である。

３）を省略させていただき、それらの膜脂質の性質を中心とし

２. ３て述べさせていただく。

２
２. １

熱分析（DSC）

古細菌型リン脂質 36 MPC、DiPhyPC の水分散液及びコ

実験、結果および考察

ア脂質１、２の乾燥試料の DSC を測定した。

実験で使用した脂質【実験】リン脂質分散液 : 脂質（7 mg）をエチレングリ

古細菌ジエーテル型リン脂質の膜としての性質を検討す

コール−水（50 mg；4：1 v/v）に溶かし、70 µL のアルミるにあたり、通常生物のエステル型脂質との比較も行った。

ニウム製パンに入れ、何度か昇温，降温を繰り返した後１

本研究で用いた脂質は Figure １に示した我々が合成した℃ /min の速度で走査した（− 40 〜 60℃）。

36 員環脂質２およびその非環状類縁体１のホスホコリン

コア脂質乾燥試料 : 脂質（ca. 10 mg）をそのまま 20 µL

誘導体（DiPhyPC および 36 MPC）を用いた 。また、エのパンに入れ、何度か昇温，降温を繰り返した後２℃ /ステル型脂質はニワトリの卵黄レシチン（eggPC）及びジmin の速度で走査した（− 120 〜 0℃）。

ミリストイル− sn −グリセロ− 3 −ホスホコリンとコレステロ【結果】古細菌型リン脂質 36 MPC、DiPhyPC の DSC をール（２：１）の混合脂質（DMPC − cholesterol）の二種

水−エチレングリコール（4：1）中に分散して測定した。

類である。

両方の脂質とも測定温度範囲では相転移の存在は見出せな３）かった。従って、常温では液晶状態をとっていることがわ

２. ２

光学顕微鏡によるリポソームの観察

かる。

４）

【実験】GUV は静置水和法を用いて調製した。まず脂一方、古細菌型コア脂質２、１の DSC を Figure ３に示

質１mg をクロロホルム−メタノール 360 µL（２：１）にす。古細菌 72 員環テトラエーテル型コア脂質の乾燥試料

溶解し、そのうちの 1 . 5 µL をカバーグラス上に滴下する。

では− 53℃付近にラメラ相の融解と思われる吸熱ピークが10 分間乾燥させて得たラメラ状のサンプルを顕微鏡上に観測されたが、ジエーテル型コア脂質でも同様に低温領域

載せ、50 µL の緩衝液で希釈する。そうするとサンプルがに吸熱ピークが観測された。その熱力学的データについて、緩衝液に浸ったところから巨大ベシクルの形成がみられる

環状脂質２の方が非環状脂質１に比べて T c は高く、ΔH c、ようになる。なお、染色剤には脂質二重膜に取り込まれる

ΔS c は小さいことが分かった。この傾向はリン酸ジエステ

蛍光物質 Nile Red を用い、脂質二重膜の発光イメージをル型モデル化合物５）及び Menger らのジエーテル型モデ

逐一観察した（励起波長 485 nm、蛍光波長 525 nm）。

ル化合物６） での結果と同じものであった。すなわち環状【結果】36 員環リン脂質 36 MPC の蛍光顕微鏡像の写真

脂質における T c の上昇は相転移により大きな熱運動を必を Figure ２に示す。明らかに 36 MPC は単独で巨大リポ要としたためであり、ΔH c 及び ΔS c の低下は各々相転移− 15 −

Figure 3 DSC thermograms of archaeal core lipids 1 and 2,
and the kinetic parameters of phase-transition.

Figure 4 The π-A isotherms of 36MPC and DiPhyPC, andthe characteristic data derived from π-A isotherms.

前後でのトランス−ゴーシュ変化が生じる部位の減少，炭化水素鎖の自由運動の抑制に起因すると考えられる。これ
ら観測された相転移は層状に重なったラメラ相の融解によるものと考えられる。

２. ４

Figure 5単分子膜の分子占有面積７）Structure of DPH and TMA-DPH.

【実験】20℃の蒸留水上に脂質溶液を滴下して 10 分間静r ＝（F || − F ┴）/（F || + 2 F ┴）置した後、0 . 32 mm/sec の一定速度で可動バリアを押していき π− A 曲線を得た。

ここで F || は励起光の振動方向と平行に振動する偏光強度【結果】測定結果を Figure 4 に示す。常温で液晶状態に成分であり、F ┴は励起光の振動方向と直角に振動する偏ある古細菌型脂質 36 MPC、DiPhyPC の分子占有面積は、

光強度成分である。

分岐メチル基を有さない脂質と比較して大きな値をとって蛍光プローブは DPH（ジフェニルヘキサトリエン）と、いた 。これは一概には比較できないが、古細菌型脂質でDPH にカチオン性極性基を有した TMA − DPH（1 −［4 −（トの大きな値はイソプレン鎖のかさ高さに起因するものといリメチルアミノ）−フェニル］− 6 −フェニルヘキサ− 1 , 3 , 5える。環状脂質 36 MPC と非環状脂質 DiPhyPC との比較

−トリエン）を用いた（Figure ５）。DPH は脂質分子の疎では 36 MPC の方が分子占有面積が小さいことが分かった。

水基末端から中央部分の流動性、TMA − DPH は脂質分子

すなわち炭化水素鎖末端が結合していることにより単分子の極性基付近の流動性を求めるのに各々利用した。

５）

膜面での広がりが DiPhyPC よりも抑制されていると考え【実験】脂質 3 〜 4 mg に緩衝液（20 mM Tris − HCl、られ、環状脂質は非環状脂質よりも密なパッキングを有し200 mM NaCl、pH 7 . 5）9 mL を加え、超音波処理法でた単分子膜を形成することが分かった。

SUV 分 散 液 を 調 製 し た。 得 ら れ た 分 散 液 3 mL に 3 µLの DPH 及び TMA − DPH（ともに 0 . 5 mM in DMF）を

２. ５

蛍光偏光解消各々加えた。励起側、蛍光側に各々偏光板を取り付けた

７）

脂質二重膜に垂直に取り込まれた蛍光プローブが、膜の流動化によりその配向が乱され蛍光偏光の解消が生じ、そ蛍光光度計により蛍光強度（励起波長 350 nm、蛍光波長
460 nm）を測定した。

の結果蛍光偏光度 P 及び蛍光の異方性パラメーター r 値【結果】測定結果を Figure 6 に示す。ほとんどのサンプが低下するので、間接的に脂質膜の流動性を見出すことがルについて温度が上昇するにつれて r 値が減少、すなわ出来る。これらは以下の式で求められる。

ち流動性が向上している。環状脂質 36 MPC は非環状脂質

P ＝（F || − F ┴）／（F || + F ┴）DiPhyPC と比べてあらゆる温度で流動性が低かった。疎− 16 −

古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究

Figure 6 Temperature dependence of the fluorescence anisotropy of A, DPH, B; tma-DPH incorporated in
the bilayers of the lipids; 36MPC, ● ; DPhyPC, ■ ; eggPC, ▲ ; DMPC-cholesterol（2:1）; △ . The concentrations of lipid and probe were 0.5 mM and 0.5 M, respectively.

水部でその差が大きかったことを考えると、炭化水素鎖末端の結合が脂質二重膜の流動性低下に大きく寄与していることを示しているといえる。また親水部でもその傾向がみられたことは、環状構造が疎水部のみでなく脂質分子全体の流動性，運動性を低下させていることを示している。

Figure 7

eggPC はこれらの中でもっとも流動性が高かった。屈曲Structure of CF.

した炭化水素鎖を有する eggPC では脂質分子の間隔が疎となっていて、そのために蛍光プローブが活発なブラウン

少の割合を見積もることでリポソームのプロトン透過性を運動をすることが出来たと考えられる。コレステロールで検討した。

膜を補強したリポソームは逆にもっとも流動性が低かった。

【実験】脂質 3 〜 4 mg に１mL の CF 含有緩衝液（50 mM

エステル脂質とコレステロールとが強固に疎水性相互作用

Na 4 P 2 O 7 −クエン酸、150 mM NaCl、4 mM CF、pH 7 . 5）をしていることで蛍光プローブの運動が抑制されたと考えを加えて凍結融解法で LUV を調製し、エクストルーダーられる。以上のことを考えると古細菌型脂質はイソプレン

で 200 nm にサイジングした。得られた分散液は現段階

鎖の分岐メチル基により分子同士で適度に疎水性相互作用

では外水相にも CF を含んでいるため、セファデックス

をし、その結果 eggPC よりも流動性が低くなったと考え

G − 50（1 . 5 × 30 〜 45 cm）担体を用い、緩衝液（50 mMられる。

Na 4 P 2 O 7 −クエン酸、150 mM NaCl、pH 7 . 5）で溶出して以上より環状脂質は非環状脂質と比べて流動性が低いこ

ゲル濾過をし、外水相の CF を除去した。

とが分かった。疎水部，親水部の両者で同様の傾向を示し

アッセイは次のようにして行った。すなわち、蛍光セル

たことにより、環状構造をとることで脂質分子全体の運動

ホルダーで各温度にインキュベートした 3 mL の酸性緩衝性，流動性が低下することを明らかに出来た。

液（50 mM Na 4 P 2 O 7 −クエン酸、150 mM NaCl、pH 2 . 5）
中に CF 含有 LUV 懸濁液（20 µL）を加えたとき（t ＝ 0）

２. ６

リポソームのプロトン透過性の蛍光強度を F 0 とし、各時間 t での蛍光強度 F t を逐次測

８）小型の水溶性物質である 6 −カルボキシフルオレセイン

定した（励起波長；480 nm、蛍光波長；520 nm）
。このと

（CF）
（Figure 7）は 490 nm 付近に励起波長を、520 nm

き得られる蛍光強度相対比 F t /F 0 の減少割合はプロトン透付近に蛍光波長をもつ蛍光色素である。これは低濃度でも過速度を示す。すなわち F t /F 0 の減少率が高ければプロト蛍光を検出可能なだけでなく、pH 感受性であり、pH がン透過速度の高いリポソームであるといえる。

低下するにつれてその蛍光強度も減少する。そこでこの性【結果】各温度での測定結果を Figure 8 に示す。リポソ質を利用し、リポソームのイオン透過性について検討した。

ームへのプロトン透過は非常に速く、数分以内で平衡に達pH ７〜８付近で調製したリポソーム分散液を酸性緩衝液

した。

に浸すとリポソーム内にプロトンが流入する。その結果内まず古細菌型脂質の比較で、環状脂質 36 MPC は非環状水相に封入された CF の蛍光強度が減少するので、その減脂質 DiPhyPC と比べてあらゆる温度で F t /F 0 の減少率が− 17 −

Figure 8 Proton permeability of large unilamellar vesicles of the phospholipids（36MPC, DPhyPC, eggPC,
DMPC-cholesterol）. Plots of fluorescence intensity of CF F t /F0 vs. incubation time t. A, at 25℃ ; B, at 40℃ ; C,
at 50℃ ; D, at 60 ℃ ; 36MPC, ● ; DPhyPC, ▲ ; eggPC, ■ ; DMPC ﾐ cholesterol (2:1), △ . Initial pH gradient; pH 7.5 (inner), pH 2.5 (outer).

小さい、すなわちプロトン透過速度が遅いリポソームを形て凍結融解法で LUV を調製し、エクストルーダーで 200

成することが分かった。DMPC − cholesterol は特に低温・nm にサイジングした。得られた分散液に対しセファデッ

中温領域において、プロトン流入に強い抵抗性を示した。

クス G − 50（1 . 5 × 30 〜 45 cm）担体を用い、緩衝液（20高温領域（> 60℃）では 36 MPC 及び DMPC − cholesterolmM Tris − HCl、200 mM NaCl、pH 7 . 5）で溶出してゲル

ともに瞬間的にプロトン流入が進行した。

濾過を行い、外水相の CF を除去した。

また DiPhyPC は eggPC リポソームに匹敵するプロト

アッセイは次のようにして行った。すなわち、蛍光セン透過速度を有しており、この結果プロトン透過にイソ

ルホルダーで各温度にインキュベートした 3 mL の同じ緩プレン鎖はほとんど影響しないことが分かった。つまり

衝液中に CF 含有 LUV 懸濁液（5 〜 20 µL）を加えたとき36 MPC におけるプロトン流入速度の低下は環状構造によ（t ＝ 0）の蛍光強度を F 0 とし、各時間 t での蛍光強度 F t

るものが大きいといえる。

を逐次測定した（励起波長；480 nm、蛍光波長；520 nm）。
一定時間測定した後、非イオン性界面活性剤 10％ Triton

２. ６

リポソームの熱安定性

X − 100 を 10 µL 加え、蛍光物質の全強度 F max を測定した。

９）

蛍光物質はその濃度が 100 mM 以上になると自己消光

リポソームからの CF の漏出量は次式から算出できる。

で蛍光強度は著しく減少する。つまり、リポソーム内に高Leakage extent of CF［％］＝（F t − F0）/（F max − F0）×100

濃度に封入した CF が温度変化により外水相へ漏れ出して測定したサンプルは 36 員環リン脂質 36 MPC、非環状くることで希釈されてはじめて蛍光が検出されるようにな

リン脂質 DiPhyPC、DMPC − cholesterol（2：1）、eggPCるので、この性質を利用して蛍光強度を測定すれば漏出しの計４種類であり、各々 40、50、60、70℃で測定した。

てきた蛍光物質の量を見積もることが出来る。

【結果】各温度における測定結果を Figure ９に示す。ま

【実験】脂質 3 〜 4 mg に１mL の CF 含有緩衝液（20 mM

ず古細菌型リン脂質の比較で、環状脂質 36 MPC は非環状

Tris − Cl、200 mM NaCl、200 mM CF、pH 7 . 5）を加え

脂質 DiPhyPC と比べてあらゆる温度で蛍光物質の漏出量− 18 −

古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究

Figure 9 Thermostability of large unilamellar vesicles of the lipids（36MPC, DPhyPC, eggPC,
DMPC-cholesterol）. Plots of the leakage extent of CF vs. incubation time t. A, at 40℃ ; B, at
50℃ ; C, at 60℃ ; D, at 70℃ ; 36MPC, ● ; DPhyPC, ■ ; eggPC, ▲ ; DMPC ﾐ cholesterol (2:1), △ .

が少ない、物質保持能に優れたリポソームを形成するこ３．結とが分かった。一方、エステル型脂質において、eggPC論は測定サンプル中で最も蛍光物質の漏出速度が高いこ古細菌 36 員環ジエーテル型脂質の脂質膜の性質についとが分かった。コレステロールで膜を補強した DMPCて得られた知見を総合すると以下のようにまとめられる。

− cholesterol リポソームは中温領域では非常に高いバリ

１）様々な形状に変化する、流動性に富んだリポソームの形成が観察された。

アー能を有していたが、高温になるにつれて蛍光物質の漏出速度が上昇し、36MPC よりも物質保持能は低下した。

２）リン脂質の相転移温度は− 40℃以下である。

36 MPC は DMPC − cholesterol と比べて、温度変化による

３）コア脂質は低温領域に相転移温度を有し、非環状脂質

漏出速度の変化量が小さく、高温でも高バリアー能リポソと比べて高い相転移温度、小さい相転移エンタルピー及びエントロピー値をとる。

ームを形成することが示唆された。古細菌型脂質は中温領域でも測定初期に若干 CF を放出するのだが、これは古細

４）密なパッキングを有した単分子膜を形成する。

菌型脂質リポソームの高い膜流動性により放出されたもの

５）脂質膜の流動性が低い。

であろうと考えている。

６）プロトン透過速度が遅いリポソームを形成する。

従って、環状脂質は非環状脂質と比べて非常に物質保持

７）高温でも安定なリポソームを形成する。

能に優れたリポソームを形成することが分かった。また、以上の結果、古細菌 36 員環ジエーテル型脂質の脂質膜

高温ではコレステロールで補強したリポソームをも凌駕すの性質については、モデル化合物での知見及び非環状脂質

るバリアー能を有することも見出すことが出来た。よって、との比較から環状構造のもたらす影響を総合的に評価でき

大環状脂質が好熱性古細菌の高温環境への適応に寄与してたと考えている。運動性，流動性，充填度，リポソームのいることを明らかにすることが出来た。

プロトン透過性・熱安定性といった諸性質が密接に絡み合うことで、古細菌 36 員環ジエーテル型脂質の興味深い膜− 19 −

２） ⒜ 古 賀 洋 介 , 亀 倉 正 博 ,「 古 細 菌 の 生 物 学 」, 東機能を発現していることが明らかとなった。
第一に脂質分子における環状構造が、膜機能へ多大な影

京大学出版会 ( 1998 ). ⒝ Takashina, T.; Hamamoto,

響を与えていることを明らかに出来た。環状構造が脂質分T.; Otozai, K.; Grant, W. D.; Horikoshi, K. Syst. Appl.

子の運動性を低下させることで膜流動性の低下が生じ、そMicrobiol. 1990 , 13 , 177 .

の結果物質透過・熱に対する高いバリアーを発現したと考３）Eguchi, T.; Arakawa, K.; Terachi, T.; Kakinuma, K. J.
Org. Chem. 1997 , 62 , 1924 .

えられる。
第二に古細菌脂質に特徴的なイソプレン鎖は、リポソー

４）Pozzi, G.; Birault, V.; Werner, B.; Dannenmuller, O.;

ムの熱安定性に直接的にはそれほど関与せず、古細菌 36

Nakatani, Y.; Ourisson, G.; Terakawa, S. Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 1996 , 35 , 177 .

員環脂質からなるリポソームの安定性が環状構造に由来す

５）Taguchi, K.; Arakawa, K.; Eguchi, T.; Kakinuma, K.;ることを強く示唆するものである。
メタン生成細菌 Methanococcus jannaschii において培養

Nakatani, Y.; Ourisson, G. New J. Chem. 1998 , 22 , 63 .

温度が上昇するにつれて環状脂質の割合が増加すること

６）Menger, F. M.; Chen, X. Y.; Brocchini, S.; Hopkins, H.

、好熱性古細菌において培養温度が上昇するにつれてシP.; Hamilton, D. J. Am. Chem. Soc. 1993 , 115 , 6600 .

10）、絶対嫌気性真正

７）⒜寺田 弘 , 吉村 哲郎 ,「ライフサイエンスにおけるリ細菌の脂質膜においても温度及び有機溶媒・抗生物質の添

ポソーム 実験マニュアル」, シュプリンガー・フェアラー

加などの外的ストレスで橋かけ構造をした脂質や大環状脂

ク東京 ( 1992 ). ⒝村上 幸人 ,「超分子化学の基礎と応用」,

質が生成すること 12）などを考え合わせると、古細菌大環

エヌ・ティー・エス ( 1996 ).

クロペンタン環の数が増大すること

11）状脂質が好熱性古細菌の高温環境への適応に大きな役割を

８）Komatsu, H.; Chong, L. -G. Biochemistry 1998 , 37 ,107 .

果たしているといえる。
このように高バリアー能かつ安定なリポソームを形成

９）Yamauchi, K.; Doi, K.; Kinoshita, M.; Kii, F.; Fukuda,
H. Biochim. Biophys. Acta 1992 , 1110 , 171 .

する古細菌 36 員環脂質は、機能性リポソームへの応用も期待できる。単純なイソプレン鎖より更なる高バリアー

10）Choquet, C. G.; Patel, G. B.; Beveridge, T. J.; Sprott, G.
D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994 , 42 , 375 .

能かつ膜安定化作用を有する古細菌 36 員環脂質について
も、ドラッグデリバリーシステム（DDS）や生理作用の11）De Rosa, M.; Esposito, E.; Gambacorta, A.; Nicolaus,
B.; Bu'Lock, J. D. Phytochemistry 1980 , 19 , 827 .

あるペプチド，糖鎖で修飾した機能性リポソームの開発など、将来的に医学・材料科学分野への幅広い利用価値を見

12）⒜ Clarke, N. G.; Hazlewood, G. P.; Dawson, R. M.
Biochem. J. 1980 , 191 , 561 . ⒝ De Rosa, M.; Gambacorta,

出すことが出来よう。

A.; Huber, R.; Lanzotti, V.; Nicolaus, B.; Stetter, K. O.;（参考文献）

Trincone, A. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1988 , 1300 .

１）⒜ Woese, C. R.; Fox, G. E. Proc. Natl. Acad. Sci.

⒞ Carballeira, N. M.; Reyes, M.; Sostre, A.; Huang, H.;

U.S.A. 1977 , 74 , 5088 . ⒝ Woese, C. R.; Kandler, O.;

Verhagen, M. F. J. M.; Adams, M. W. W. J. Bacteriol.

Wheelis, M. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990 , 87 ,1997 , 179 , 2766 . ⒟ Lee, J.; Jung, S.; Lowe, S.; Zeikus,

4576 . ⒞ Delong, E. F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

J. G.; Hollingsworth, R. I. J. Am. Chem. Soc. 1998 , 120 ,1992 , 89 , 5685 .

5855 .

− 20 −

森林生物資源からの育毛活性成分の探索
九州大学大学院

近農学研究院森林資源科学部門

藤

隆 一 郎

The investigation of bioactive natural products has, in recent years, assumed a greater sense of urgency in responseto the expanding human population and its subsequent demands for food, cosmetics, good health, and increasing areasof land on which to live. It has so far been known a lot of hair regrowth promoters of that the efficacies are mainly thestimulation of blood circulation and the vasodilatation. Recently the basic researches for hair growth and hair follicle
cycle have been rapidly improved by the progress of cell culture technique and genetic engineering. In general thefollowing factors have been mentioned as probable causes on hair loss: the hormonal effect of androgen, the inactivationof hair matrix cells, the reduction of blood circulation around hair follicle and so on. The purpose of this investigation is
to identify extracts or components form plants having proliferating effects on mouse hair epithelial cells.
The proliferation activity of 49 samples prepared from extract of heartwood was examined. The extracts from
Cercidiphyllum japonicum showed proliferation activity on hair epithelial cells by [3H] thymidine uptake assy. Structureactivity investigation suggested that catechol structure is important for expressing ability of proliferation activity on
hair epithelial cells.

１．緒

言

２．実

樹木は化学的にはセルロース、ヘミセルロース、リグニ

２. １ン及び抽出成分に分類できる。特に、抽出成分は樹種により質的、量的に多種多様であり、これまでに様々な生理活性物質が報告されており毛根由来上皮系細胞の培養

毛根由来上皮系細胞の単離および培養は Tanigaki ４）らの方法を一部改良して行った。

、これらから有用な機能を備

４日齢マウスより背部皮膚片を採取した。皮膚片を幅１、２）えた物質が見つかる可能性は高いと考えられる。

験

２〜３mm 程度の短冊状にし、その皮膚片を 500 unit/mL

また育毛剤の需要は年々高まってきている。従来、育毛ディスパーゼ入り５％ FBS － DMEM に移し、４℃で 17 . 5剤のターゲットは中高年の男性であったが、近年の社会的時間静置した。この際に抗生物質（GIBCO、Antibiotic-

環境の変化に伴い若年層や女性にまでその需要が拡大して

antimycotic）を１％ v/v となるように添加した。

いる。以前の育毛剤は頭皮の環境整備や栄養補給、経験的

ディスパーゼ処理した皮膚片を、ピンセットを用いてな民間薬が主であった。しかし近年、毛の成長や脱毛症に表皮を剥離除去し、真皮を 0 . 25％コラゲナーゼ入り５％

関する基礎的研究の進展により見いだされた知見に基づく

FBS － DMEM に移した。これを 37℃で１時間インキュベ

新しい観点からの育毛活性成分の開発が試みられるようにートした。インキュベート後、真皮の固まりが見えなくなっている 。本研究で着目した毛根由来上皮系細胞は最なるまでピペッティングを行い、1000 rpm で 5 分遠心し、終的に毛に分化する細胞であり、同細胞の増殖促進活性を

真皮繊維芽細胞および毛根組織を得た。

３）有する物質は育毛剤原料の候補となり得る。

遠心後、ペレットに PBS（－）を加え、十分に懸濁させそこで本研究では豊富な生理活性成分を有している樹木

た後、真皮繊維芽細胞を取り除くために 400 rpm で１分遠抽出物からの育毛活性成分の探索として、毛根由来上皮系

心処理し、上清を吸引除去した。この操作を４回繰り返し

細胞増殖促進物質を見出すことを目的とした。

た。さらに真皮繊維芽細胞を取り除くために 70 µm のフィルターを通し、フィルター上に残ったものをバックウオ
ッシュし、これを毛根組織とした。
得られた毛根組織を遠心処理で集め、0 . 25％トリプシン

Investigation on active compounds ofhair growth from forest bioresources
Ryuichiro Kondo
Laboratory of Systematic Forest andForest Products Sciences, Faculty ofAgriculture, Kyushu University/ 0 . 1％ EDTA 溶液を加え、５分間ピペッティンした。FBSをトリプシンと同量加え、さらに PBS（－）を 10 倍量加えた。
この細胞懸濁液をシリコンメッシュで濾過し、シリコンメ
ッシュを通過してきたものを毛根由来上皮系細胞とした。
得られた毛根由来上皮系細胞を遠心後、上清を吸引除去
し、５％ FBS － DMEM に懸濁した。血球計算盤にて細胞数を計測し、所定濃度となるように５％ FBS － DMEM（0 . 5− 21 −

％抗生物質を含む）にて細胞を希釈した。type １collagen

３．結でコートした 24 well plate（FALCON）に５× 105 cells/
well の細胞密度で播種した。播種した細胞は 37℃、５％

３. １

果

毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価系の確立CO 2 条件下で 17 時間培養した。
17 時間培養後、5 %FBS-DMEM を吸引除去し、PBS

細胞増殖促進活性評価系の確立の際にポジティブコント

（－）で洗浄後、培地を MCDB 153（SIGMA）（insulin：５

ロールとして毛根由来上皮系細胞増殖促進効果ならびにµg/mL、hydrocortisone: 1 . 4 µM、EGF: 5 ng/mL、BPE：

発毛効果が報告されている minoxidil（70 ppm）を用いた。

50 µg を含む）に交換し、培養を続けた。培養は 37℃、５

よって minoxidil と control の間に顕著な [ 3 H]thymidine％ CO 2 条件下で行った。なお MCDB 153 に培地交換した取り込み量の差が観察される系の構築を目的とした。

日を培養初日と定義した。

培養 2 日目以降の [ 3 H]thymidine 取り込み量を経時的に測定した結果培養４日目に control と minoxidil 添加

２. ２

毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価法

系に差が観察された（Fig. １）。この結果から control と所定期間培養した毛根由来上皮系細胞に [ 3 H] thymidine

minoxidil 添加系に差が観察されるのは培養４日目前後で溶液（8 KBq/well）（statistic ability、1 . 81 TBq/mmol）

あることが判明した。また control の取り込み量は経時的（Amersham）を添加し一定時間取り込ませた。その後、に減少していくのに対し、minoxidil 添加系では培養 4 日

各 well を冷 PBS（４℃）で２回洗浄、冷 10％トリクロロ目以降から取り込み量が減少している。Control は分化酢酸で１回洗浄した。さらに冷 10％トリクロロ酢酸を加し、その結果、増殖能が失われ取り込み量が減少している

え、４℃で 30 〜 60 分静置した。トリクロロ酢酸を除去後、と考えられる。一方 minoxidil は毛根由来上皮系細胞の分1 N の NaOH を添加し１時間以上 37℃で静置した。その後、化を遅延、増殖期間を延長するために培養４日目から [ 3 H]

数回ピペッティングし液体シンチレーションカウンターに

thymidine 取り込み量に差がでていると考えられる。

て放射活性を測定した。

よって minoxidil と同様の効果を持つ物質の探索を行う
ことを目的に、スクリーニングでは培養初日にサンプルを

２. ３

サンプル調製およびスクリーニング

添加し、培養４日目に [ 3 H]thymidine を添加しその取り込

国産樹木（主に落葉広葉樹）は九州大学演習林よりサンプリングした。直径が 20 cm 以上の幹もしくは枝を伐採

み量を測定することで各サンプルの毛根由来上皮系細胞増殖促進効果を評価することとした。

し、心材部と樹皮に分けた。心材部、樹皮それぞれを木粉（# 80 pass）にし、室温でメタノールに浸して１日静置を

３. ２

３回繰り返すことによりメタノール抽出物を得た。

樹木抽出物のスクリーニング

49 種の樹木抽出物をスクリーニングした結果、アカマ

タイ産樹木は葉部、茎部、花部に分けそれぞれをアセトン抽出した。

ツ心材メタノール抽出物、カツラ心材メタノール抽出物、ニセアカシア樹皮メタノール抽出物、Albizia myriophylla

調製した抽出物を毛根由来上皮系細胞培養初日に添加（1/ 1000 v/v、エタノール溶液）した。４日間培養後、葉部アセトン抽出物に minoxidil と同等の細胞増殖促進活性が観察された（Fig. ２）。

[ H]thymidine を添加し細胞増殖促進活性を評価した。な

最も再現性よく、また入手が容易であるカツラ材部メタお溶媒のみを加えたものを control とし、control を 100％

ノール抽出物について培養 2 日目以降の [ 3 H]thymidine 取

3として各サンプルの細胞増殖促進活性を評価した。

２. ４

1500

カツラ（Cercidiphyllum japonicum）に含ま**れる成分の探索
カツラ材部メタノール抽出物 2474 mg を n －ヘキサン、エーテル可溶部、酢酸エチル可溶部、水層残渣を得た。各

1000

DPM

エーテル、酢酸エチルで逐次分配し、n －ヘキサン可溶部、

controlminoxidil

500

可溶部の重量を測定し、分配比を算出した後、各可溶部の細胞増殖促進活性について試験した。さらにエーテル可溶
部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン→

0酢酸エチル→メタノール）により８つに分画した。各画分に含まれる成分を逆相分取 HPLC により単離し、NMR、MS、旋光度により同定した。

234
培養日数（日）5

Fig.1 ［3H］thymidine取り込み量の経時変化
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control− 22 −

6

森林生物資源からの育毛活性成分の探索

り込み量を経時的に測定した結果、カツラ材部メタノール

quercetin、（2 R, 3 R）－（+）－ ampeloptin、myricetin、gallic

抽出物にも minoxidil と同様に毛根由来上皮系細胞の増殖

acid に有意な活性が観察された（Fig. ６）。これら活性を期間の延長効果が観察された（Fig. ３）。このことからカ示した化合物のどのような構造が活性発現に寄与している

ツラ材部メタノール抽出物に minoxidil と同様の効果を有の検討するために、共通構造に着目した構造－活性相関をする物質が含まれると考えられる。

行った。

３. ３

３. ４ フラボノイドおよび関連化合物の細胞増殖促進

カツラ材部メタノール抽出物に含まれる成分

の探索

活性

カツラ材部メタノール抽出物に着目し、これに含まれる細胞増殖試験に供した化合物の一部を Fig. ７に、試験成分の探索を行った。有機溶媒分配後の各可溶部の細胞試結果を Fig. ８に示す。フラボノイド化合物では flavone、

験結果（Fig. ４）を示す。細胞試験の結果より、エーテ（±）－ 4 ' － hydroxyflavanon、（±）－ naringenin、apigenin

ル可溶部に１ppm、0 . 1 ppm 両濃度において高い毛根由来に活性が観察されなかった。B 環の水酸基パターンに注

上皮系細胞増殖促進活性が観察された。そこでエーテル可

目するとカテコール構造を有するもの（luteolin、（±）－

溶部に含まれる成分の探索を行った。その結果（2 R, 3 R）

eriodictyol、（+）－ catechin、（－）－ epicatchin、（－）－－（+）－ aromadendrin、kaempherol、sexangularetin、

epigallocatechin（EGC））に活性が観察された。またフラ（2 R, 3 R）－（+）－ taxifolin、quercetin、（2 R, 3 R）－（+）

ボノイド以外の化合物でもカテコール構造を有している－ ampeloptin、myricetin、gallic acid を同定した（Fig. ５）。
1 ppm
0.1ppmkaempherol、sexangularetin 以外の単離・同定した化合物を細胞試験に供したところ（2 R, 3 R）－（+）
－ taxifolin、
ヘキサン可溶部

1 ppm
0.1ppm
エーテル可溶部**

酢酸エチル可溶部**

アカマツ心材MeOH抽出物*

カツラ心材MeOH抽出物

*

水層残渣

*

ニセアカシア樹皮MeOH抽出物

0

50

100

150

200

Relative cell growth（%）*

Albizia myriophylla
0

50

100

150

Fig.4 カツラ材部メタノール抽出物各可溶部の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05

200

Relative cell growth（%）
Fig.2 樹木抽出物の毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価系を用いたスクリーニング結果
mean±SD，n=3，*p<0.05

10μM
1μM

(+)-aromadendrin*(+)-ampeloptin

2500

*

2000

*

1500
DPM

*

myricetin**

controlminoxidil：70ppm
カツラ：心材，1ppm*(+)-taxifolin

quercetin

*

1000

*

gallic acid
500

0
0

2

3

4

5
培養日数（日）

6

50

100

150

200

250

Relative cell growth（%）

7

Fig.3 カツラ材部メタノール抽出物添加系の［3H］thymidine取り込み量の経時変化。
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control

Fig.6 カツラ材部メタノール抽出物エーテル可溶部より単離した化合物の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05− 23 −

R1
R3

R1
OH

HO

OH

O

HO

R2

C

O

R2

OH
OH

HO

O

O

OH

kaempferol (R1: H, R2 : H, R3 : H)
quercetin (R1: OH, R2 : H, R3 : H)
myricetin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)
sexangularetin (R1: H, R2 : H, R3 : CH3)

OH

HO

OH

OH

O

(2R, 3R)-(+)-aromadendrin (R1: H, R2 : H)
(2R, 3R)-(+)-taxifolin (R1: OH, R2 : H)
(2R, 3R)-(+)-ampeloptin (R1: OH, R2 : OH)gallic acidFig.5 カツラMeOH抽出物エーテル可溶部より単離・同定された化合物
R3

R3

R2
R1

R2

O

R1

OH

O

OH
O

HO

R1

R1

O

(±)-4' -hydroxyflavanon (R1: H, R2 : OH, R3 : H)(±)-naringenin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)(±)-eriodictyol (R1: OH, R2 : OH, R3 : OH)

O

R
OH

OH
(+)-catechin

OH

OH
OH

CH3

OH

HO
catechol (R : H)
4-methylcatechol (R : CH3)
caffeic acid (R : -CH=CHCOOH)
L-DOPA (R : -CH2CH (NH2) COOH)(R)-(-)-epinephrine (R: -CH (OH) CH2NHCH3)

OH
OH
resorcinolOH

flavone (R1, R2, R3 : H)
apigenin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)luteolin (R1: OH, R2 : OH, R3 : OH)OH
3-methylcatechol

Fig.7

O
OH
OH
(-)-epicatechin

フラボノイドおよび関連化合物*(-)-EGC
10μM
1μM

flavone

10μM
1μM

resorcinol(±)-4'-hydroxyflavanone

catechol**(±)-naringenin
4-methylcatechol**

apigenin
3-methylcatechol
luteolin*(±)-eriodictyol(+)-catechin(-)-epicatechin

*
0

50

100

*

caffeic acid**(-)-epinephrine*

L-DOPA

150

200

Relative cell growth（%）

*
*
*
0

100

200

300

Relative cell growth（%）

Fig.8 フラボノイドおよび関連化合物の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control− 24 −**

400

森林生物資源からの育毛活性成分の探索

もの（catechol、4 － methylcatechol、3 － methylcatechol、

唆された。

caffeic acid、L － DOPA、（－）－ epinephrine）に活性が観

今後は今回見出された活性化合物の活性発現機構の解明察された。カツラより単離された活性化合物も分子内にカを行うとともに活性化合物をリードとした新規育毛剤の開テコール構造を有している。これらの結果から活性発現に発が期待される。

はカテコール骨格の存在が重要であることが示唆された。

４．考（引用文献）

察１）C . P o l o t t i , R . K o n d o , K . S h i n m i z u e t a l : A n
examination of the anti fungal components in the

今 回、 毛 根 由 来 上 皮 系 細 胞 の 培 養 系 お よ び [ H]3thymidine 取り込み法を用いた細胞増殖促進活性評価系

heartwood extracts of Pterocarpus indicus. Mokuzaiを構築した。また minoxidil が毛根由来上皮系細胞の増gakkaishi, 41 , 593 - 597 ( 1995 )

殖期間を延長していることが示され、樹木抽出物より

２）K. Shimizu, R. Kondo, K. Sakai: The inhibitoryminoxidil と同様の効果を有する物質を探索した結果、カcomponents from Artocarpus incisus on melanin

ツラ材部メタノール抽出物を選抜した。カツラ材部メタノ

Biosynthesis. Planta Medica, 64 , 408 - 412 ( 1998 )ール抽出物は毛根由来上皮系細胞に対し、minoxidil と同

３）Takahashi T, Kamiya T, Yokoo Y: Proanthocyanidinsfrom grape seeds promote proliferation of mouse hair様に同細胞の増殖期間の延長が観察された。

follicle cells in vitro and convert hair cycle in vivo.

カツラ材部メタノール抽出物の活性成分として gallic

Acta Derm-venereol, 78 , 428 - 432 ( 1998 )acid、taxifolin、quercetin、myricetin、ampeloptin などのポリフェノール類を同定した。これらの化合物をもとに

４）Tanigaki N, Ando H, Ito M, Hashimoto A, Kitano Y.

構造 - 活性相関を検索したところ、分子内にカテコール構Electron microscopic study of cultured cells from the

造を有するポリフェノール類に活性が観察された。このこ

murine hair tissues: cell growth and differentiation.

とから毛根由来上皮系細胞増殖促進活性の発現には分子内Arch Dermatol Res  282 , 402 - 407 ( 1990 )にカテコール構造を有していることが重要であることが示− 25 −

含フッ素非対称置換トレハロース誘導体の合成と皮膚に対する保湿性と親和性の検討
北里大学

森

島

看護学部

直

彦

α,α-Trehalose derivatives are known to have a moisture-holding ability and has already been used as anadditive for cosmetics. As a trial to enhance the moisturizing effect of α,α-trehalose without introducing anyhydrophillic functional groups, substitution of hydroxyl groups with fluorine atoms and/or introduction of one or two
glucopyranosyl residues to α,α-trehalose were performed to give the following oligosaccharides: 1) 6,6'-Difluoro-2-O-αand β-D-glucopyranosyl-α,α-trehaloses were synthesized through the reductive cleavage of 2,2';4,6;4',6'-tri-O-benzylideneα,α-trehalose giving the 2,3,4,3',4'-penta-O-benzyl derivative, against which selective fluorination at the 6- and 6'-positions
with DAST, and then α- or β-glycosylation. 2) 3-Deoxy-α-D-mannnopyranosyl 3-deoxy-α-D-glucopyranoside wassynthesized from 2,2',3-tri-O-tosyl-α,α-trehalose with epoxidation at 2'- and 3'-positions followed by the simultaneous
ring-opening and reduction. 3) Tri- and tetrasaccharides including α,α-trehalose moiety were prepared with theglycosylation of partially benzylated derivatives of 4,6;4',6'-di-O-benzylidene-α,α-trehalose. Remarkable increase inmoisture content after being exposed in wet atmosphere was observed for some trisaccharides.

１．緒

トレハロースの大量合成法が確立され，容易に入手可能と言なり，その利用も盛んになってきている．

長時間，直接皮膚に接触している化粧品については，近α,α- トレハロースは通常二水和物として存在している

年，皮膚に対する安全性とともに乾燥防止効果が要求されが，それ自身に保水性は見出されてはいない．糖は，そのている．保湿剤の化粧品への利用においては，基剤との混分子内に多くのヒドロキシル基をもつので高い親水性を有合性に加えて皮膚との適合性や親和性も重要である．保湿するが，保水性については，単糖や二糖のような単純な構剤として用いられる物質として，天然物からの抽出物質を造のものよりも，三次元的に複雑な構造をもつオリゴ糖に用いるのが１つの方法であるが，それらをさらに化学修飾期待すべきであろう．

あるいは化学変換してより適切な配合添加物を得る手段も

α,α- トレハロース分子の化学構造は，その核磁気共鳴

有効であろう．その１例として，α,α- トレハロースの硫

スペクトルにおいて２つのグルコース分子のスペクトルが酸化誘導体には保水効果が認められており，クリーム，ロまったく重なり合った単糖のようなパターンがみられるこーションなどの化粧品に保湿剤としてすでに利用されていとからも解るように，グリコシド酸素に対して対称である．

る．

したがって，一般には，その誘導体もやはり対称形をしてトレハロースは，グルコース２分子が互いに（１→１）
グリコシド結合した二糖の総称であり，α,α-，α,β- おいるものが多いが，これまでに酵素による非対称グリコシル化２）や部分置換の例３, ４）もいくつか報告されている．

よび β,β- の３つの異性体があるが，天然に存在するのはまた，医薬品の分野でその有効性が認められている含フα,α- トレハロースのみである．したがって，α,α- トレハ

ッ素有機化合物では，フッ素原子のもつ高い水素結合形成

ロースはしばしば単にトレハロースと表される．α,α- ト能が活性発現に寄与していると考えられている．したがっレハロースは化学的に極めて安定で，スクロースの約 45て，オリゴ糖のヒドロキシル基のいくつかをフッ素原子に％の良質な甘味を有している ．また，還元末端をもたな置換した誘導体は，その優れた水素結合形成能により水分

いため，甘味料として用いる場合にアミノ酸やタンパク質子を包含しやすくなることが考えられる．フッ素置換のもとともに加熱しても着色しないという利点をもち，さらに，

う１つの興味ある点は，分子内水素結合による部分的な疎食品や医薬の分野においても安定化剤として利用されてい水化ができることである．保湿剤がその分子中に疎水部分る．近年，デンプンを酵素的に分解することによる α,α-をもつということは一見矛盾しているように思えるが，こ１）Synthesis of Fluorine-Containing
Unsymmetrically Substituted Trehalose
Derivatives and their Moisture-Holding
Ability and Affinity for Skin
Naohiko Morishima
School of Nursing, Kitasato Universityの疎水部分は脂質やタンパク質と疎水結合を形成できるため，フッ素を含むオリゴ糖は基剤との混合性や皮膚との親和性に優れていることが予想される．
そこで，本研究では，ターゲット物質をフッ素を含む非対称置換トレハロース誘導体とし，皮膚への保湿効果と親和性の両者を有する保湿剤としてコスメトロジーにおける評価と化粧品における有効利用が期待される物質の合成を行った．

− 26 −

含フッ素非対称置換トレハロース誘導体の合成と皮膚に対する保湿性と親和性の検討

２．実験

α,α- トレハロースを基本構造とするオリゴ糖の合成には純粋な有機合成化学的手法を用いた．目的とする化合物
として，［１］フッ素を含むオリゴ糖，［２］デオキシ糖からなる α,α- トレハロース型のオリゴ糖，および［３］三次元的に込み入った構造が考えられる α,α- トレハロースを含む三糖ならびに四糖を選んだ．
［１］は，α,α- トレハロースの糖残基間ベンジリデン
アセタールの還元的開裂反応により生成する部分保護 α,α- トレハロースの遊離ヒドロキシル基のフッ素置換とグリコシル化により合成した．
［２］の合成には，α,α- ト
レハロースの 4 , 6 ; 4 ', 6 '- ジ -O- ベンジリデン誘導体の非対称部分トシル化とその還元反応を利用した．
［３］は，α,α- トレハロースまたはその 4 , 6 ; 4 ', 6 '- ジ -O- ベンジリデン
誘導体の部分ベンジル化を利用して得られる部分保護体のグリコシル化により合成した．

３．結
３. １

果

α,α- トレハロースから誘導される含フッ素オリ

ゴ糖の合成
α,α- トレハロース（１）を N,N - ジメチルホルムアミド中，４倍モルの 1 , 1 - ジメトキシトルエンと 120℃で２時間反応
させると，2 , 2 '; 4 , 6 ; 4 ', 6 '-tri-O-benzylidene-α,α-trehalose（２）が主生成物として得られた．２の遊離ヒドロキシル基をベンジル保護したのち，３つのベンジリデンアセタールを，
エーテル中水素化アルミニウムリチウムと塩化アルミニウ
ムを作用させる５, ６）ことにより還元的に開裂させると，１の非対称部分保護誘導体３が生成した（Scheme 1）．化合物３の 6 および 6 ' のヒドロキシル基のみを選択的にフッ素置換したのち，2 ' に α- および β- グリコシル化を行い，生成物を脱保護することにより４および５を得た．α- グリコ
シル化には，2 , 3 , 4 , 6 - テトラ -O- ベンジル -D- グルコピラノースをグリコシル供与体とし，塩化 p - ニトロベンゼンスル
ホニル，トリフルオロメタンスルホン酸銀，N,N- ジメチル
アセトアミドおよびトリエチルアミンを作用させる方法７）を用いた．また，β- グリコシル化には，アセトブロモグル
コースを供与体とし，トリフルオロメタンスルホン酸銀とテトラメチル尿素を用いる方法を適用した．
３. ２

デオキシ糖からなる α,α- トレハロース型オ

リ

ゴ糖の合成
１のベンジリデンアセタール化を，用いる 1 , 1 - ジメト
キシトルエンの量を 2 . 4 倍モルに減じて行ったところ，
4 , 6 ; 4 ', 6 '- ジ -O- ベンジリデン誘導体６を収率よく得ることができた．６にピリジン中，過剰量の塩化トシルを加え，40℃で 20 時間反応させてもテトラ -O- トシル誘導体はほ− 27 −

とんど生成せず，主生成物は 2 , 2 ', 3 - トリ -O- トシル誘導

デオキシ化を同時に起こさせて 4 , 6 -O- ベンジリデン - 3 -体７であった．このほかに，2 , 3 , 3 '- トリ -O- トシル誘導体

デオキシ -α-D- マンノピラノシル＝ 4 , 6 -O- ベンジリデン

８，2 , 2 '-，2 , 3 '- および 3 , 3 '- ジ -O- トシル誘導体（９，10- 3 - デオキシ -α-D- グルコピラノシド（13）を得，これをおよび 11）も単離された．しかし，塩化トシルの量を多脱ベンジリデン化することにより 14 を合成することがで少増減させても７の優位は変化しなかった．そこで，７にきた（Scheme 2）．

メタノール中，ナトリウムメトキシドを作用させることによりモノエポキシド 12 とし，12 にエーテル - テトラヒド

３. ３α,α- トレハロースを構造中に含む三糖ならびに四糖の合成ロフラン混合溶媒中，水素化アルミニウムリチウムを作用

α,α- トレハロースを，塩化ベンジルと水酸化アルカリ

させ，エポキシドの開環と２位の立体配置を保持した 3 -によりベンジルエーテル化８, ９）する方法により部分保護誘導体を得る試みを行ったところ，15 - 17 のような化合物が単離できた（Scheme 3）が，収率は極めて低く実用的な方法ではなかった．その原因は，塩化ベンジルに対する
α,α- トレハロースの溶解性の乏しさにあると思われたので，次に α,α- トレハロースのジ -O- ベンジリデン誘導体
６のベンジル化を試みた．
６を塩化ベンジルと水酸化アルカリを用いてベンジル化したところ，三置換体 18 および 19，二置換体 20，21，
22 および 23 がすべて生成した（Scheme 3）が，それらの生成比は反応条件や用いるアルカリの種類により著しく変化した．すなわち，水酸化ナトリウムを６倍モル用いて反応させると 22 が主生成物として収率 36％で得られ，水
酸化カリウム４倍モルでは 18 が，水酸化ルビジウム４倍
モルでは 20 が，６倍モルでは 19 がそれぞれ約 40％の収率で得られた．
このようにして調製した α,α- トレハロースの部分保護
誘導体 18 および 19 に対し，前述の α- および β- グリコシル化反応を適用し，続いて脱保護することにより，それぞれ三糖 24 , 25 および 26 , 27 を合成した．また，二置換体 20 および 22 に対し，同様にグリコシル化を行い，対称型四糖 28 , 29 および非対称型四糖 30 および 31 を合成
した．
３. ４

保水性の検討

皮膚に対する保湿性を検討するための予備試験として，合成したオリゴ糖を湿潤空気中に放置し，質量の経時変化を調べたところ，α,α- トレハロースではほとんど増加が認められなかったが，三糖 24 - 27 については顕著な質量の増加がみられた（図１）．

４．考察

保湿効果をもつことが期待される化合物として，α,αトレハロース型の種々のオリゴ糖をターゲットに選び，それらの合成について検討した．基本的な考え方として，市販の α,α- トレハロースを原料に用い，これの化学修飾やグリコシル化を組み合わせた方法を採用した．大別して３種のオリゴ糖を合成したが，いずれにおいてもまず原料の− 28 −

含フッ素非対称置換トレハロース誘導体の合成と皮膚に対する保湿性と親和性の検討

20
吸
水
率
︵ 10
％
︶

●
□
○
■

2

■

△

△
0

●
□
○

●
□
○
■

4
時間（％）

△
6

図１ 吸水率の経時変化（△:1，○:24，●:25，□:26，■:27）

接フッ素置換を試みた．DAST の使用量を制限すること

部分保護誘導体の調製を必要とした．
３・１に述べた合成では，糖残基間にベンジリデンアセ
タールが結合した誘導体の単離とそれの還元的開裂反応にで２位のフッ素化を起こさず，6 , 6 ' 位のみを選択的にフッ素置換することができた．

よる部分ベンジル保護誘導体の合成が問題となった．2 , 2 'α,α- トレハロースは対称型分子であるため，これに対位間のアセタールの形成には，グリコシド結合まわりの回する反応も両方のグルコース残基に同等に進行すると考え転が必要となり，化合物は極めて不安定であるが，シリカがちであるが，実際には不均等に反応し非対称の化合物をゲルクロマトグラフィーを行う際に溶出溶媒にトリエチル

与えることがある．α,α- トレハロースのジ -O- ベンジリ

アミンを 0 . 1％混在させることで単離を可能にすることがデン誘導体６のトシル化では，40℃で 20 時間反応させるできた．2 , 2 '-O- ベンジリデン基の還元的開裂反応は短いと 2 , 2 ', 3 - トリ -O- トシル誘導体７が選択的に収率よく得反応時間でスムーズに完結し，２位にベンジル基，2 ' 位にられたが，テトラ置換体が主生成物となるためには１週間

ヒドロキシル基をもつ部分保護体３へと変換できた．３のを要した．この非対称置換体７を利用し２位と 2 ' 位の立フッ素化に，6 , 6 '- ジ -O- トシル誘導体のフッ素イオンによ体化学の異なるデオキシ糖 14 を合成した．13 が生成する

る置換反応を用いると不飽和化合物の生成が主反応になる

際，副生成物としてエポキシドが逆方向に開環して生成し10）と予想されたので，フッ素化剤として三フッ化ジエチ

ルアミノ硫黄（DAST）

11 - 13）た 3 , 3 '- ジ - デオキシ誘導体も得られた．

を用いるヒドロキシル基の直− 29 −

結晶水をもつ α,α- トレハロースの有機溶媒に対する溶解性は極めて乏しく，塩化ベンジルと水酸化アルカリによ（参考文献）

る α,α- トレハロースのベンジル化は容易ではなかった．

１）日本化学会編，“化学総説 No. 40，味とにおいの分子15 - 17 のような部分保護体を単離することができたが収率は高々 10％であった．そこで，溶媒への溶解性の向上と認識”，学会出版センター , 1999 , pp 50 - 60 .
２）Kurimoto M, Nishimoto T, Nakada T, Chaen H,

未保護のヒドロキシル基の位置を限定する目的でジ -O- ベ

Fukuda S, Tsujisaka Y, Biosci. Biotch. Biochem., 61 ,ンジリデン誘導体６の部分ベンジル化を行った．結果の項

699 - 703 , 1997 .

に述べたように，用いる水酸化アルカリや反応条件を選ぶ

３）Wallace PA, Minnikin DE, Carbohydr. Res., 263 , 43 -ことにより，選択性よく部分保護体 18，19，20，22 を得

59 , 1994 .
４）Boucha M, Gelas J, Carbohydr. Res., 305 , 17 - 25 ,ることができた．

1997 .

これらの部分保護 α,α- トレハロース誘導体の α- グリ
コシル化には，報告者が以前に開発した選択的 α- グリコ
シル化法

7）

５）Liptak A, Jodal I, Nanasi P, Carbohydr. Res., 44 ,1 - 11 , 1975 .

を試みた．その方法は，反応性に乏しいヒド

ロキシル基にも適用可能であるので，良好な収率で目的と６）Mori Y, Morishima N, Bull. Chem. Soc. Jpn., 66 ,
2061 - 2067 , 1993 .

する三糖および四糖の保護体を得ることができた．また，
β- グリコシル化は汎用されている Koenigs-Knorr 反応を７）Koto S, Morishima N, Owa M, Zen S, Carbohydr.
Res., 130 , 73 - 83 , 1984 .

利用し収率よく目的物を得た．保護基は，ナトリウムメト
キシドによるエステル交換反応および水酸化パラジウムを８）Morishima N, Koto S, Oshima M, Sugimoto A, Zen S,
Bull. Chem. Soc. Jpn., 56 , 2849 - 2850 , 1983 .

触媒とする接触還元により定量的に除去し，遊離のオリゴ

９）Koto S, Takenaka K, Morishima N, Sugimoto A, Zen

糖を得た．

S, Bull. Chem.Soc. Jpn., 57 , 3603 - 3604 , 1984 .

含水率の経時変化をいくつかのオリゴ糖について調べた
ところ，顕著な増加傾向を示したが，α,α- トレハロース

10）Mori Y, Morishima N, Bull. Chem. Soc. Jpn., 67 , 236 241 , 1994 .

ではほとんど増加しなかったことから，α,α- トレハロー
スの２ または３ にグルコース残基が結合した形のオリゴ

11）Middleton WJ, J. Org. Chem., 40 , 574 - 577 , 1975 .

糖には保水作用が期待できそうである．これはあくまで予

12）Tsuchiya T, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 48 ,91 - 277 , 1990 .

備実験の結 であり，さらに精密な保水性の測定を要することはいうまでもない．

13）Mori Y, Morishima N, Chem. Pharm. Bull., 40 , 826 828 , 1992 .

− 30 −

匂いの感性計測を行うセンサーシステムの開発
九州大学大学院

都

システム情報科学研究院

甲潔

An odor sensor was developed using a surface polarity controlling method. In this method, changes of electric potentialsof the electrode show the different surface electrical polarity, and hence the interaction between odor substances and theelectrode surface is different in each electric potential. Thus the response ability and information about chemicals can beobtained through controlling surface polarity. Pt electrode was adopted and the surface polarization of the Pt electrode
was controlled by sweeping electrode potential from negative to positive values (e.g. -0.7V to 0.3V) through a potentiostat.
Chemicals with electrical charge and high polarity interact with polarized surface, and nonpolarized and hydrophobic
substances interact with nonpolarized surface. Thus various chemicals can be detected with one electrode. Electrochemical
impedance was measured at each electrode surface potential to detect the interactions between the electrode surface andchemical substances. Frequency dependencies of the surface impedance of the electrode were measured by superimposing
small amplitude sinusoidal signal. Equivalent circuit of the electrode impedance was based on a surface roughness model. The
equivalent circuit was determined by curve fitting procedures.
The sensor can detect various chemical substances; both electrolytes and nonelectrolytes (hydrophobic and hydrophilic
substances) with high sensitivity. As a result, various odor substances can be detected using this sensor, and much information
can be obtained through surface polarity control. Electrode potential profiles of the surface impedance had various patterns
according to the characters of chemicals. Adsorption of chemicals to the surface altered the surface resistance and capacitance.
Hydrophobic substances affected the surface resistance in the negative region and the surface capacitance in the potential
area where the neutral surface was attained. Furthermore, response patterns to odor substances, especially hydrophobic
odorants, could be modified by replacing base solutions in which the electrode was immersed; used base solutions were KClsolution with additive of acetone and triton X-100. Principal component analysis was carried out to response patterns, and theprincipal component map was able to be categorized into some groups by the quality of used odorants. Thus the informationfrom the electrode can be utilized to distinguish the odor quality. The present method was simple and bio or organic materials
were not used. So the results denote that odor sensations are dominated by physicochemical characteristics of chemicals
interacting with the electrochemical surface. These results suggest that the surface polarity controlling method can be utilized
for the mechanism of sensor transducers for odor sensor.

１．緒

センサの開発は匂いを扱う様々な分野に対する影響・貢献

言は非常に大きいと考えられる。さらに、物質が持つ分子物

匂いの客観的な計測手段が欠けている現在、匂いの評価

理化学的な特性と匂いの感性的な特性の結び付きを明らかはガスクロマトグラフィなどの機器分析を補助とした官能にすることは、人がどのようにして良い香り、心地好い香検査に依存している。機器分析の結果は匂いの質的な評価

り、不快な香りといった感情を引き起こすのかを物質レベ手段としては非力であり、感性的な情報を必要不可欠とす

ルで客観的に数値化できる可能性がある。人と人のコミュる匂い計測は実質的に人の嗅覚に頼らざるを得ないのがニケーションにおいて重要な意味を持つコスメトロジーに現状である。優れた嗅覚と経験を持つ人的な資源は限られ対し、その重要な要素である匂いの立場から匂いのセンシており、単純な匂い計測にそのような資源を用いることは、ングが貢献する役割は大きい。

本来、創造的な目的に使われるべき人の能力を無駄にして匂いのセンシングが困難である要因の一つに、対象とないると言える。一方、人の嗅覚は疲労や感度のばらつきな

る化学物質の種類や数の多さと性質の多様性がある。匂い

どがあるため計測手段としては極めて不安定であり、一般物質の中には非常に不快であったり刺激をもたらしたりすには人の嗅覚に頼った様々な工業製品の生産管理、環境計

る有機酸のような極性の強い物質から、極性がほとんど無測では十分に目的を達成することはできない。

く水への溶解度が非常に低い芳香をもたらす各種香料まで、

このような状況にあって、感性の測定を可能とする匂い
Development of sensor system for odor
sensation measurements
Kiyoshi Toko
Graduate School of Information Scienceand Electrical Engineering, Kyushu
University

化学物質として広い性質の幅を持っている。このように極性が強い物質と疎水性が強い中性物質を同時に検出することは難しい。また、匂いの質を決定する物質の要素は、官能基、分子の大きさと形、電気双極子、立体構造などであり、分子が感覚刺激をひき起こす濃度領域は物質ごとに大きく異なる１、２）。このような物質の性質のうち、匂いとしての特性を反映させるようなセンシング方法を用いることが、感性としての匂い測定を可能にする直接的な方法である。

− 31 −

表面分極制御型センサは、このように物質の性質が異な２に用いた白金電極の電極インピーダンスのベクトル軌跡

り、広い範囲に渡る匂い物質を検出することを目的としてを示す。電極インピーダンスの等価回路として電極表面のいる。さらに、匂いや味といった化学感覚を検出する場合

ラフネスを考慮したモデルを採用し、周波数応答の軌跡かに重要となるセンサから物質に関する情報をいかに取り出らカーブフィッティングにより電極抵抗（R 45）とそれとすか、という点に着目している。その際、化学物質が持つ

並列につながるキャパシタンス（C dl）、および直列につな匂いに関する属性が物質のどのような特性に依存しているがる抵抗（R s）に分解した。R s は主に溶液と電極表面近かに着目する。既に実用的な領域に入りつつある味を計測

傍を含んだ抵抗に起因する。一方、電極表面の抵抗成分はするマルチチャネルセンサも多くの情報をパターンとして電極表面のラフネスのために周波数に依存するため、その引き出し、処理することで化学感覚情報に変換している

。

３- ６）

ここで取り上げる表面分極制御型化学感覚センサはトラ
ンスデューサの情報を多重化させること、化学物質に関する連続的な情報を入手することに主眼点を置いている。
単一のトランスデューサでその特性を連続的に変化させ、様々な化学物質と相互作用させ、物質に関する情報を連続的に入手し、センサの情報を多重化する。電極の特性を変化させる方法として、電極の表面分極制御を行った。これは極性の強い電解質と同時に、電気的に検出の困難である
疎水性が強く水になかなか溶け込まない中性物質などの匂い物質の高感度な検出をめざしたものである。表面分極の制御方法としては、電極電位規制を用いた。この方法は電極表面の分極特性を変調することで、匂い物質と電極界面の相互作用を変化させ７、８）、様々な極性の匂い物質を検出しようというものであり、物質識別に有効な手段になり得ると考えられる。化学感覚はそのレセプターの存在が明らかになるにつれ、分子認識的手法の重要性が強調される傾

図１

測定系

向があるが、実際には分子が持つ部分構造や物理化学的な特性がその質の発現には重要な要素を占める。このような感覚情報の測定において単なる分子認識的な手法は現状では工学的にも有利な手段とは言えない。本研究では、物質が持つ特徴や部分構造を反映した応答を大まかにとらえることで、その化学感覚としての質との対応付けが行なえるかどうかにも着目した。

２．実

験

表面分極は水溶液中の化学物質と表面との相互作用を決める重要な要素である。一方、化学物質が持つ極性が匂いの質を大きく左右する事から、電極表面の分極を制御する
事で、物質が持つ化学感覚刺激の質に関する情報を捉える事ができる可能性がある。表面分極の制御は直接、電極電位を変化させることで行なった。この場合、電極インピー
ダンスが測定量とした８- 10）。
測定系を図１に示す。トランスデューサとして用いる白金電極はポテンシォスタットにより電位規制され、発振器とロックインアンプあるいはデジタルボルトメータにより微小振幅の正弦波と直流電圧を印加する。電極電位は水の電気分解反応など正味の反応電流が流れないように− 0 . 7 V から 0 . 3 V まで 0 . 05 V ステップで変化させる。図− 32 −

図２

電極インピーダンスのベクトル軌跡と等価回路匂いの感性計測を行うセンサーシステムの開発

45 Hz における値を推定して R 45 とする。C dl は電気２重層を持つ。電極キャパシタンスについては味の種類による差部分の静電容量である。図には匂い物質を測定する場合のは小さく、吸着性の有無に大きく依存する。ここでは示さ

電極系のセットアップを示しているが、水溶液中の化学物

ないがそれぞれの基本味物質に類似の味を示す味物質につ質を直接検出する場合は電極を水溶液に浸漬した状態で測いてもそれぞれの味の質に依存した類似パターンが得られ定する。

る。これは本方法で測定される単純な物理化学現象である

実験はまず基準液である 100 mM KCl を測定し、その値

化学物質の吸着などによる電極の電気化学インピーダンス

をベースラインとし、匂い物質による変化を匂い物質への変化が物質の味としての特徴を大きく反映していることを応答値とする。ベースラインとなるインピーダンスの電極意味する。逆に物質が持つ味としての属性のかなりの部分

電位依存性は白金電極表面への水素イオンの吸着と脱着が単純な物理化学現象に依っている事を示唆すると言える。

（負電位領域）と酸素の吸脱着（正電位領域）により生じる。

電極表面がゼロ電荷状態になる電位は本実験系では匂い物質の検出はこの基本特性が匂い分子の電極表面への0 . 05 V 付近であると考えられるが、この電位では物質の吸脱着により変化することにより行うことになる。

添加により電極キャパシタンスに大きな変化が現れる。こ

３．結
３. １

のようにキャパシタンスに影響を及ぼすのは吸着性を示

果す物質と考えられる。単純で特異吸着性が無い電解質では

化学物質応答変化が現れない。特に、キニーネなどの吸着性味物質では

本研究で開発を目指す表面分極を制御し、情報を増やす

大きな変化がゼロ電荷点のキャパシタンスに現れる。一センサの特徴の１つは電解質や極性が強い物質だけでなく、方、電極抵抗についてはゼロ電荷点以外で多くのピークが中性および疎水性の化学物質の検出が可能である事であ現れるが、これは水素イオンと酸素の吸着をプローブとしる。本研究で開発を行ったセンサは電極電位を変化させる

た表面状態測定と考えられ、化学物質の吸着を鋭敏に反映

事で化学物質応答パターンを引き出す。水溶液に浸漬したする。例えばベンゼン環などの疎水部分を持つ物質は電極

電極の電気化学インピーダンスと、その電極電位依存性を

電位が負の領域で応答のピークが現れる傾向がある。カプ

調べることで、様々な化学物質、特に匂い物質の検出を行

サイシンやピペリンなどの辛味物質、さらには環境ホルモう。図３は化学物質により引き起こされる感性として代表

ン様物質などもこの部分で高感度な検出が可能である。分

的な味に関する物質への応答例である。応答を電気化学イ

極制御による化学物質の検出は、従来の電気化学的手法のンピーダンスの変化（電極電位プロファイル）として示し

ベースにあった酸化還元反応などに着目している訳では無ている。電極電位依存のパターンが現れることから分かる

く、表面分極による表面と水溶液中の化学物質との相互作

ように、電極電位プロファイルは電極電位により変化する

用を変化させ検出する事に基本的な考えを置いている。そ領域、すなわち主に電極の表面近傍での状態変化を反映しして、この方法が物質と表面との相互作用を検出し、物質ている。電極抵抗は味物質の吸着性を示すと考えられ、味の極性を反映する事から、化学感覚のセンシングに有効で物質の種類によりそのプロファイルは大きなバラエティーあり、この考えは、匂い測定においても成り立つと考える。

図３

味物質応答

− 33 −

りピークの数は少なく単調である。味物質場合と同じよ

３. ２

匂い物質応答

うに 0 . 05 V ステップで電極電位プロファイルを得ている

この電極を匂いセンサに応用した結果を示す。図４にエが、味物質の場合とは異なり細かなピークは現れない。良タノールへの応答を示す。５% エタノール水溶液をバブく知られている通り、匂い物質の種類と質の数は非常に多リングすることで匂いを発生させ、無臭の空気との混合比

く、匂いセンサはその識別を可能とする多くの情報を出力を変えることで匂い濃度を変化させた。電極インピーダン

できる能力が要求される。今回は、電極表面に存在する基スの電極電位プロファイルは味物質の場合に比べると単純

準溶液の組成を変化させることで応答プロファイルを変化である。なお、匂い物質については電極インピーダンスをさせ、匂い物質に対する応答性を変調させた。味の場合と成分に分けずインピーダンスの絶対値で示した。様々な匂異なり匂い物質は気体として作用させるため基準溶液の変い物質について応答を調べたが、応答感度は親水性の物質

更は容易であり、物質を作用させた際に基準溶液の組成へについては人より高いものが得られたが疎水性物質についの影響は小さい。基準溶液にトリトン X- 100 およびアセては人には及ばなかった。これは本方法が匂い物質を一旦トンを混合した場合の応答を図５にエタノールを、図６に水溶液に溶かし、電極への影響を調べるため疎水性物質にベンズアルデヒドを示す。なお図中には応答の標準偏差もついては水溶液への分配が小さく、応答速度も遅い事が原示している。エタノール応答に対する基準溶液の効果は小因であると考えられる。

さく、ベンズアルデヒドの電極電位プロファイルへの影響

匂い物質への電極電位プロファイルは図４に示した通は大きい。エタノールのように親水性が強く主に水酸基により白金電極と相互作用する物質は基準溶液の影響を大き
くは受けない。一方、アルコール類でも炭素鎖が長くなると基準溶液により電極電位プロファイル（応答パターン）が変化する。図に示したベンズアルデヒドもそのような物質であり、香料など多くの疎水性の匂い物質では基準溶液
により情報を増やすことが可能であり、これは匂いセンサ
ーでは有効な方法であると言える。
基準溶液に混合された物質は味物質の場合と同じように表面に吸着すると考えられる。これは実質的な電極の表面修飾に相当する。修飾電極は化学物質センシングでは応答特異性を変える有効な手段であるが一般に修飾に要する手間、修飾電極の安定性や再現性などが問題となることが多い。本研究で用いた方法は基準溶液に電極表面の特性を変化させる物質を添加するだけで、容易にしかも安定に電極

図４

図５エタノール応答の特性を変化させることができる。さらに、気体中の匂い

基準溶液によるエタノール応答の変化

図６− 34 −

基準溶液によるベンズアルデヒド応答の変化

匂いの感性計測を行うセンサーシステムの開発

物質の基準溶液への分配も変化すると考えられるが、電極質へは非常に大きな応答が得られ、この主成分マップの同電位プロファイルが変化することから考えて分配が影響す

一面上には描けないため省いた。このように物質の極性がるのは応答感度に対してであり、匂い物質情報には基準溶

大きく異なる場合、応答の差は人の嗅覚においても応答メ液の組成は大きな寄与はしないと考えられる。

カニズムに違いがあるものと考えられる。今回用いたトラ
ンスデューサは物質が持つ極性をその応答に大きく反映さ

３. ３

匂い物質の質の推定せることができ、極性による化学物質が持つ化学感覚情報

図 7 に 12 種類の様々な質を持つ匂い物質への応答を主への質の差を検出することができる。

成分分析した結果を示す。用いた応答データは３種類の基図から分かる通り、匂い物質は第２主成分により親水性準液を用いた場合の電極インピーダンスの電極電位プロフと疎水性に大きく分られる。第３主成分は匂いの質を反映

ァイルである。なお、酢酸やアセトアルデヒドといった物しており軽質でどちらかと言えば良い匂いの物質が第 3 主
成分軸の中央付近に集まる。なお、第１主成分は応答の大きさを反映しており、主成分分析の結果として得られるサイズファクターとなっており質を表す軸とはなっていない。
この場合、第２主成分以降の軸が質に関連するシェイプフ
ァクターであるが、さらに高次の成分が匂いの質とどのような相関があるかが重要であるが、これについては再現性などを考慮して解析を進める必要がある。

４．考察

本研究では匂い物質の検出の手がかりとして匂い物質の持つ極性に着目し、トランスデューサの表面分極規制による電極インピーダンスの測定が、匂い物質をはじめとして化学物質の検出とその感性量の推定に有効であることを示した。実験の結果から、親水性物質のエタノール等は人よりも高い感度で応答することが分かったが、疎水性物質については人の応答感度には及ばなかった。これは今後のもっとも大きな課題である。
この分極制御型センサは表面での化学物質との相互作用を捉えるもので、そのため一般的な電気化学的な手法と異なり、広く化学物質を測定可能である。これは生物の化学受容が行なっている機構にも近い。しかも、その応答パターンが匂いの質に関する情報を含んでいることは、このセンサが匂いの感性量を測定できる可能性を示唆している。
このような化学物質の測定方法は化学感覚のセンサとしてだけでなく、広く化学物質検出に用いることができる。また、特に匂いセンサのように化学物質の検出手法から派生した化学物質検出由来の化学感覚センサとは異なったアプ
ローチである 11）。
匂い測定では水溶液を介することで、より生物に近い応答機構で匂い物質を検出し、生物の嗅覚に近い応答特性を得ることを目指しているが、現段階では匂い物質への感度が不足しており、特に疎水性の匂い物質に対する実用的なセンサの構築には電極材料の選択や電極表面の改質など
図７ 匂い物質の主成分マップ（A: エタノール、
B: プロパノール、
C: ブタノール、D: フェニルエチルアルコール、E: アセトン、F:
メントン、G:β イオノン、H: ベンズアルデヒド、I: シトラール、
J: ベンゼン、K: クロロホルム、L: テトラヒドロフラン）

電極系の改良が必要である。本方法が基準溶液を用いる事を活かし、基準溶液中に様々な物質をあらかじめ溶解させておくことで化学物質への応答特性が変化する事を示した。
この方法は特に気体を基準液に溶かし込むことで応答させ− 35 −

る匂い物質の場合に有効である。応答感度に関しては、全

Multichannel taste sensor using lipid membranes, Sens.

般的に生物の嗅覚に対して劣っているが、電極系と測定手

Actuators, B 2 , 205 - 212 , 1990 .

順により変更可能であることは、感性計測を目的としたセ

４）都甲編 : 味覚センサ、朝倉書店 ( 1993 ).

ンサとしては重要である。そのため、応答濃度範囲が広く、

５）T. Nakamoto, K. Fukunishi and T. Moriizumi:

しかも検出閾の幅も広い生物の嗅覚に合わせる事ができる。

Identification capability of odor sensor using quartz-

本方式はトランスデューサ材料という点では生物由来のresonator array and neural network pattern recognition,
Sens. Actuators, B 1 , 473 - 476 ( 1990 ).

ものは全く用いていないが、応答メカニズムという点では匂い物質を生物と似た方法で捉えている。このような方法

６）K. Toko: Biomimetic Sensor Technology, Cambridge
Univ. Press. 2000 .

は実用化の上で常に困難がつきまとう有機材料を用いない
新しいタイプのバイオセンシング方式の一つとして有効な

７）J. N. Israelachivili: Intermolecular and Surface Forces,
Academic Press, 1985 .

手段であると考えられる。

８）田村 , 松田 : 現代電気化学 , 培風館 , 1977 .
（参考文献）

９）玉虫 : 電気化学 , 東京化学同人 , 1991

１）E. アムーア : 匂いーその分子構造 , 恒星社恒星閣 , 1972 .

10）藤嶋 , 相澤 , 井上 : 電気化学測定法 , 技報堂出版 , 1984 .

２）日本化学会編 : 味と匂いの科学、学会出版センター ,11）C. Ziegler, W. Gopel, H. Hammerle et al.: Bioelectronic
noses, Biosensors and Bioelectronics, 13 , 539 - 560 , 1998 .

1976 .
３）K. Hayashi, M. Yamanaka, K. Toko and K. Yamafuji:− 36 −

分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明
東京理科大学

理工学部

阿

正

部

彦

We have investigated surfactant-free O/W emulsions (SFEs), which can be prepared without addition of
surfactant with ultrasonicator at extremely low oil concentrations ( 〜 0.1 vol%) slightly above oil solubility.    SFEis relatively unstable compared with ordinary emulsion stabilized by surfactant, however, it keep dispersion for acertain time under surfactant-free condition.     For example, when droplet size was observed by dynamic lightscattering (DLS) measurement for benzene SFE, droplet size distribution changed from 〜 30 nm (S class), to 〜
300 nm (M class) and to 〜 3000 nm (L class) with lapse of time during one or two hours, while for n-hexadecane
SFE, droplet size around 50 nm in diameter grew up to 200 nm during 3 days.    Summarizing the droplet sizes ofseveral kinds of hydrocarbon SFEs observed by DLS, SFE consisting of hydrocarbon with longer chain length wasmore stable than shorter one.    Furthermore, we found that hydrocarbon having longer chain length and branch
like glyceroltrioreto makes significantly stable emulsion under absence of surfactant.    Larger molecules is able toform rigid surface of droplet and prevent molecular diffusion from droplet surface.

１.

緒ァクタント・フリー・エマルション（界面活性剤無添加エ

言マルション）の物性を十分に理解することができれば、エエマルションおよび乳化技術は、化粧品分野を初めとし医薬品分野、食品分野など種々多岐に渡る分野で活用されマルション溶液などの液 / 液分散系の本質の解明に大いに寄与できるものと考えている。

ている。ここで用いられているエマルションとは、水と油

２．実のように均一に溶解しない二種類の液体の一方を微粒子（分散質）とし、もう一方の液体（分散媒）中に分散させ

２. １

験

試料

ている系を指し、当然の事ながら分散質表面には界面活性油相として、炭素鎖長が６から 16 の偶数のアルカン、剤分子などが吸着している。このようなエマルションは概環状構造を有するシクロヘキサン、芳香族であるベンゼン、

して熱力学的に不安定な系であるため、さまざまな不安定

長鎖かつ分岐構造を有するスクワラン、カルボキシル基を化要因や機構、例えば、重力による分離（比重差）、凝集、有するオレイン酸、メチルオレート、エチルオレート、グ合一、オストワルド熟成により時間が経過すると必然的にリセロールトリオレートを使用した。水相には注射用蒸留１〜５）

崩壊する（水と油との２相に分離する）。このような水を用いた。

エマルションの複雑な不安定機構を解明するために、これまでに様々なアプローチがなされてきているが ６〜 10）、界

２. ２

調製と測定

面活性剤（乳化剤）などの安定化剤が共存するために液 /サーファクタント・フリー・エマルションは、水相に液分散系における液滴の分散安定性の理解を分かりにくく

所定量の油相を滴下し、超音波発振機（ブラウンソニ

しているのが現状である。また、エマルションの本来の目

ッ ク 220 型、125 W、45 kHz） を 用 い て 分 散 処理 を 施 す

的は、水あるいは油だけの一液相では決して得られない高ことにより調製した。油滴の粒子径の測定は動的光散

付加価値を両者を任意に混合することにより作り出すこと

乱法（Malvern サブミクロンパーティクルアナライザ

であり、乳化剤を添加することが目的な訳ではない。さらー MODEL 4700 と NICONP MODEL 380 ZLS）、表面電に、エマルション本来の姿である分散相や分散媒の特性は、位は電気泳動レーザードップラー法（NICONP 製 Model

界面活性剤自身の乳化能力に依存するあまり、見落とされ380 ZLS）、直接観察には、凍結割断レプリカ法—TEM（日ている可能性もある。そこで、シンプルな系であるサーフ

立製作所）を用いた。

The Establishment of a Preparation of
Stable Emulsion under Surfactant-free
Condition and Explication of flocculation/
coalescence processes
Masahiko Abe
Faculty of Science and Technology,
S c i e n c e U n i v e r s i t y o f T o k y o , 2641,
Yamazaki, Noda, Chiba 278-8510

３．結果および考察
３. １

動的光散乱法による粒子径測定

まず、水中における分散安定性が悪いと言われている炭化水素鎖長が６の油（ベンゼン、ｎ—ヘキサン、シクロヘ
キサン）を強力な外的因子を印加した場合（超音波照射）の水中油滴の粒子径の経時変化を動的光散乱法（DLS）を− 37 −

用いて測定した 11）。ベンゼンの場合、Fig. 1 ⒜に示すように、粒子数が減少して、M クラスの粒子数が増加した。最終

分散の初期段階では主として数十 nm 径（S クラス）の粒

的には粒子径は数千 nm 径（L クラス）を有する油滴へと子が多数存在し、少数の数百 nm 径（M クラス）を有す成長した。一方、ｎ—ヘキサン、シクロヘキサンの場合（Fig. 1

る粒子が観測された。約 20 分が経過すると、S クラスの⒝、⒞）
、超音波照射直後でも数十 nm 径（S クラス）の油滴は観測されず、数百 nm 径（M クラス）のみが観測された。その粒子径分布はベンゼンの場合と同様に時間とともに不連続に数千 nm 径（L クラス）へと成長した。
さらに、飽和炭化水素類の炭素鎖長を増加させて同様の検討をしてみた（Fig. ２）。Fig. ２から明らかなように、炭化水素
鎖長の増加とともに初期粒子径が減少すると同時にその粒子径の経時安定性も向上している（）。

炭化水素数 16 のヘキサデカンを用いた場合には、約３日間Ｓクラスの油滴を観測することができた 12）。また、油の種類、初期粒子径、成長過程を分類すると、Table １のような３つのタイプに大別できる 13）。
タイプ A：ヘキサンやオクタンのような炭化水素鎖長の短い油は、M クラスから L クラスへ速やかに成長する。
タイプ B：ヘキサデカンのような炭化水素鎖長の長い油は、
S クラスから M クラスへ緩やかに成長する。
タイプ C：ベンゼンのような芳香族炭化水素は、S クラス、
M クラス、L クラスへと速やかに成長する。
これらのことから、初期粒子径、粒子径の維持（安定性）、
成長過程などは油の種類により特異的な挙動を示すことが分かった。そこで、油滴の生成や成長過程を油の物性との関係から検討した 14）。

Figure 1 Size distributions at various elapsed times of benzene droplets at 25℃ measured by dynamic light scattering (Sub-micron particle analyzer system 4700 : Malvern
Instrument Co.) after ultrasonication Concentration of oils :(a) benzene; 30mM, (b) n-hexane; 4mM and (c) cyclohexane; 3mM. Ultrasonic treatment time 2 min.

Figure 2 Temporal change of mean droplet size as a function of time for hydrocarbons. Benzene; 30mM( ＊ ), cyclohexane ｰ ; 3mM( ◆ ), n-hexane; 4mM( ● ), n-octane;
1mM( ■ ), n-decane; 1mM( ▲ ), n-dodecane; 1mM( △ ), ntetradecane; 1mM( □ ), and n-hexadecane; 1mM( ○ ).

− 38 −

分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明

Table 1

Table 2

Types of hydrophobic oils

Evolution pattern and stability of fine particle

炭化水素数６から 16 までの偶数のアルカン（飽和炭化たこのことは、ヘキサンの場合に見られる微細油滴の成長

水素）およびベンゼン、シクロヘキサンの物性と油滴の過程は分子拡散（オストワルド熟成）が支配的であること

成長パターンを Table ２に示す。物性を比較してみると、も示唆している。得られた粒子径の経時変化をこの２つの油／水の界面張力は炭化水素鎖長が増加してもほとんど変因子（粘度、蒸気圧）から分析すると以下のようになる。

であったが、粘度および蒸気圧タイプ A の油：炭化水素鎖長の短いヘキサンやオクタンは大きく異なっている。炭化水素鎖が６と 16 を比べた場のような油は、粘度が低いため水中に分散させ

わりなくほぼ 50 mN m

−１

５

合、粘度では約 10 倍、蒸気圧では約 1 / 10 倍である。こるのは容易であるが、分子拡散が起こりやすいのことから、粘度と蒸気圧は油滴の安定性や粒子の大きさ（蒸気圧が大きい）ので分散安定性に劣る。ヘを決定する重要なファクターであることが示唆される。まキサンのような極めて粘度の小さな油は、かな− 39 −

り大きな蒸気圧（ヘキサデカンの約 10 ５倍）を

L クラス）などを視覚的に捉えることができる魅力をも持持つため、その状態（小粒子）を維持できずにっている。

速やかに大粒子へと成長する。また、水に対す

まず、調製直後の動的光散乱法（DLS）による粒子径分

る溶解度が極めて小さいため、分子状態で水中布（数分布）と FFEM 像を Fig. ３に示す 15）。Fig. ３⒜にに存在することができない。そのため M クラ示すように、20 〜 100 nm（S クラス）の主な粒子径分布

ス以上の油滴では分子拡散は期待されない。数と 300 〜 500 nm（M クラス）の小さな粒子径分布が観察

十 nm 径（S クラス）の油滴については、超音された。FFEM 像（Fig. ３⒝）を見ると、30 〜 200 nm の波照射により一時的に形成されたとしても、極油滴が観察されている。その中でも特に、30 〜 100 nm のめて速い分子拡散あるいは合一（小粒子 S →油滴（DLS での S クラスの粒子径分布に相当）が多数観

大粒子 M）が起こるため、事実上、観測され察された。また、200 〜 500 nm の凝集体（白矢印）を数ないものと考えられる。

個観察することができた。これらのサイズもまた、DLS

タイプ B の油：炭化水素鎖長の長いヘキサデカンのようで得られた M クラスの粒子径分布とよく一致している。

な油は、粘度が大きいため破砕しにくいが、超これらの FFEM 結果は、DLS によって観測された離散的音波によっていったん微細化されてしまえば、な粒子径分布を支持していることが分かった。

蒸気圧が小さいために分子拡散を起こしにくくなるので成長は緩やかとなる。

次に、調製 60 分後における DLS から得られた粒子径分
布（数分布）と FFEM 像を Fig. ４に示す。Fig. ４⒜から

タイプ C の油：タイプ A と同様に、粘度が低いため水中明らかなように、DLS では S クラスの粒子径分布は観測に分散させるのは容易であるが、分子拡散が起されず、200 〜 400 nm（M クラス）の小さな分布と 3000

こりやすい（蒸気圧が大きい）ので分散安定性〜 4000 nm（L クラス）の大きな分布を観測することがでに劣る。しかし、疎水性分子の中でベンゼンのきた。Fig. ４⒝の FFEM 像によって M クラスに相当する

ような極めて溶解性の高い油は、他の油に比べ200 〜 500 nm の油滴が観察された。またこの FFEM 像の水中に溶解した分子が多数存在するため、分子なかで、隣接する M クラスの 2 つの油滴が合一している

拡散は溶解状態で律速段階（小粒子 S →溶解→大粒子 M）をとるものと考えられる。そのため、溶解度の極めて小さなタイプ A のへキサンなどに比べ、S クラスから M クラスへの成長が明確に観測されたものと考えられる。

３. ２

ベンゼン油滴の凝集・合一過程のフリーズフ
ラクチャー TEM（FFEM）による直接観察

これまで述べてきたように、油の種類を替え、系統的に油滴の成長過程をまとめると３つのタイプ（A B C）に大別されることが分かった。その中で、特に分子拡散が成長過程に大きく起因していることが示唆された。しかし、成長過程には、もう一つのプロセスである凝集・合一過程がある。動的光散乱法ではこれらの成長過程の違いを明確に区別することは困難であるため、ベンゼン油滴をフリーズフラクチャー TEM（FFEM）を用いて、直接観察す
ることを試みた。フリーズフラクチャーレプリカ法は、液体試料を液体プロパンや液体窒素中に投入して、1000 〜
10000℃ /s の凍結速度で試料を急速に凍結して溶媒である
水分子をアモルファス状態で固定化することができる。ベンゼン油滴のような調製後約 30 分という短い時間で S ク
ラス、M クラス、L クラスへと刻々と変化するような試料からなる分散液内部の状態をより正確に捉えるためには、
瞬間凍結によって固定化できるフリーズフラクチャー法は極めて有効である。さらに、階層構造（S クラス、
M クラス、

Figure 3 (a) Size distribution measured by dynamic lightscattering (Sub-micron particle analyzer system 4700 :Malvern Instrument Co.), and (b)FFEM image of benzene
droplets dispersed in water, immediately after sonication.

− 40 −

分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明

FFEM 像（白矢印）を得ることができた。一方、Fig. ４

前述の飽和炭化水素類よりも分散安定性は劣るが、分岐の⒞から明らかなように、60 分後においても小さな油滴はある飽和炭化水素であるスクワランを用いた場合 13、14）にお互いに凝集している様子も捉えることができた。このこは（Fig. ６）、数十 nm の極めて小さい粒子径が少なくととから、サイズの小さな S クラスの油滴は “凝集” してもも３日間存在できることが分かった。そこで、スクワラン

合一しないが、サイズが大きな M クラスの油滴は、油滴のように疎水基鎖長が長く、かつ分枝構造を有し、さらにが接触すると速やかに “合一” して成長しており、Fig. ５カルボキシル基という弱い極性部位を持つ脂肪酸や脂肪酸

15）

エステルなどの油脂類を用いてサーファクタント・フリー・に示すような凝集・合一成長モデルを示すことができる。

エマルションの調製を試みた 16、17）。

３. ３

油滴としての分散安定性に優れた油の探索

まず、油脂である脂肪酸エステルの共通骨格であるオレ

測定した直鎖飽和炭化水素の中でヘキサデカン油滴が最イン酸について検討してみた。水中に分散させたオレイン

も安定性に優れていたことは前述した通りであるが、さら酸滴の粒度分布を Fig. ７に示す。なお、分散はボルテッに安定性に優れた油の探索を試みた。不飽和炭化水素類

クスミキサーで１分間撹拌した後、超音波発振機（ブラである１—デセンや１—ヘキサデセンを用いた場合 18）には、

ウンソニック 220 型 125 W）で８分間、超音波を照射する

Figure 5 Schematic illustration of different steps in droplet growthfrom S to M and M to L class droplets obtaine by FFEM．

Figure 4 (a) Size distribution measured by dynamic light scattering (Sub-micron particle
analyzer system 4700 : Malvern InstrumentCo.), and (b)FFEM image of coalescence ofbenzene droplets dispersed in water, and (c)FFEM image of small aggregate of benzen
droplets 60 min after sonication.

Figure 6 Size distributions at various elapsed times of squalane
droplets at 30℃ measured by dynamic light scattering method. Squalane concentration is 1mM. Sonication time is 8min.

− 41 −

ことにより行った。Fig. ７から明らかなように、油滴調製

間はエステル鎖長の増加に伴い鈍くなる傾向にあった。次10 分後では、数十 nm にピークを持つ S クラスと数百 nmに、用いた脂肪酸エステルの中で大きな分枝構造を持ってにピークを持つ M クラスの粒度分布が観察され、時間のいるグリセロールトリオレート滴の粒度分布を Fig. ９に示

経過とともに離散的（不連続）に成長した（ベンゼン滴す。ここで注目すべきことは、調製 10 分後に観察された11）と同様）。一方、アルコール部分のアルキル鎖長がS クラス（数十 nm）の粒子径が、少なくとも 24 ヶ月間保

短い脂肪酸エステルのメチルオレート滴の場合（Fig. ８）、持され続けていることである。ちなみに、この粒子径は現調製直後では数十 nm にピークを持つ S クラスだけのピー

在もなお持続している。表面電荷（ζ 電位）も粒子径の変クが観察され、その M クラスへのシフトは連続的に起こ化に対応して経時変化を示し（Fig. 10）、油滴を調製した直った。この傾向は、アルキル鎖長をより長くしたデシルオ

後の場合、油滴の表面は油の種類に依存せずに約マイナス

レートとオレイルオレートの場合にも観察され、また L ク

32 mV の ζ 電位を持っていたが、分散安定性の悪い油であラスの粒子は数分布で表現すると無視できるほど少なかっるオレイン酸は時間とともにその絶対値を減少させた。

などた。さらに、メチルオレートの場合、その粒子径が２〜３ここで用いた脂肪酸エステルの界面張力および密度倍成長するのに２〜３日間要したが、デシルオレートやオは、種類によって大きな違いはないが、粘度はアルコール

レイルオレートの場合は２〜４週間要し、粒子径の成長時部分のアルキル鎖長などの増加に伴い、メチルオレート

Figure 7 Size distributions at variious elapsed times of oleic
acid droplets in water at 30℃ measured by a dynamic lightscattering method.

Figure 8 Size distributions at various elapsed times of methyl oleate droplets in water at 30℃ measured by a dynamic
light scattering method.

Figure 9 Size distributions at various elapsed times of glycerol trioleate droplets in water at 30℃ measured by a dynamic light scattering method.

Figure10 Changes in zeta potential of oil-droplets dispersed
in water as a function of time. oleic acid ( ○ ), methyl oleate ( ● ), decyle oleate ( □ ), oley oleate ( ■ ), and glycerol triolete ( △ )− 42 −

分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明（4 . 88 mPas）、デシルオレート（12 . 7 mPas）、オレイルオレ

分散安定性の悪いオレイン酸およびメチルオレート、分ート（24 . 0 mPas）、グリセロールトリオレート（56 . 0 mPas）

散安定性が最も良いグリセロールトリオレート滴の r ３値と増加する。つまり、アルキル鎖長の長い油、また分枝構の経時変化をプロットした（Fig. 11）。なお、測定時間は造を有する油ほど粘度は大きくなり、分散安定性に優れた

オレイン酸、メチルオレート油滴の M クラスへの成長

油滴を調製できるものと考えられる。

が観察された３時間である。オレイン酸油滴の r ３の値は、

ところが、油の種類によっては、油滴の分散安定性が油時間の経過に伴い、直線的に増加した。一方、油滴の安の粘度と比例関係にないものも存在した。例えば、前述し定性が悪いメチルオレートの場合も r ３の若干の増加が認たように、脂肪酸エステルと共通の骨格を持つオレイン酸
は高粘度を有している（23 . 0 mPas）にも関わらず、油滴の分散安定性は悪かった。そこで、これらの分散油滴の成長過程を比較してみることにする。エマルションが物理化
学的に破壊分離していく過程の違いについてには、前述したように、粒子同士が凝集・合一を起こす現象と、分子拡散による成長の２つが考えられる。後者は、オストワルド
熟成と呼ばれ、物質が微小になるほど溶解度が増大するという事実に起因する現象であり、小さい粒子を形成している物質が分散媒中に溶解し、拡散によって大きい粒子に吸収あるいは吸着され、粒度分布が変化するというものである。Lifshitz 18）らは、次式で表される微粒子のオストワルド
熟成の理論（LSW 理論）を提唱した。また、Taylor 19）やKabalnov 20）はこの式を用いて、液滴のオストワルド熟成を証明している。
３∞M
ω = dr = 9 ･ DCdt
8 ρ２ RT⑶

ここで、D は分散媒中に溶解した分散相の拡散係数、C∞は分散相の水に対する溶解度、γ は油／水 2 相間の界面張力、M と ρ はそれぞれ分散相の分子量と密度、ｒは系の平均粒子半径である。
Figure 12 Size distributions ; (a) volume and (b) number distribution, at various elapsed times oleic acid droplets in water at 30℃ measured by a dynamic light scattering method.

Figure11 Plots of the cube of droplet size s a function of time.
Oleic acid ( ● ), methyl olete ( △ ), and glycerol trioleate ( □ ).

Figure 13 Size distribution (volume distribution) at various
elapsed time of methl oleate droplets in water at 30℃
measured by a dynamic light scattering method.

− 43 −

められたが、メチルオレートの ω 値はオレイン酸の ω 値支持するものである。つまり、小さい粒子の分子拡散によの 40 分の１であった。したがって、オレイン酸の場合のり大きい粒子の成長が起こり、クリーミングしたことが考オストワルド熟成の成長速度はメチルオレートの場合とえられる。一方、Fig. 13 に示すメチルオレート油滴の場合、必ずしも同じではない。一方、グリセロールトリオレート

オレイン酸の場合とは異なり、その体積分布からも小粒子

３の r 値はほとんど経時変化を示さなかった。この測定時の連続成長が確認される。すなわち、メチルオレートをは間（10 分から 180 分）におけるオレイン酸滴の粒子径のじめとする脂肪酸エステルの場合の微小油滴の成長は凝集

体積分布と数分布の挙動を Fig. 12 ⒜および⒝に示す。体･ 合一によるものであると考えられる。

積分布で表現すると大きな粒子に属する分子の割合の変化が分かり、また数分布で表現すると小さな粒子の位置がよ

３. ４

別の油の共存による油滴の安定性の向上

り正確にわかるので、Fig. 12 ⒜からは S クラスの微小粒

また我々は、分散安定性が悪いベンゼンやテトラリン滴子が時間経過に伴い小さくなっていく傾向、さらに⒝からに、それ自身で分散安定性が極めて良い n—ヘキサデカン

は L クラスの大粒子が 90 分以降観測されなくなる傾向があるいはスクワランを少量添加すると、分散安定性が向上分かる。これは、オストワルド熟成による成長プロセスをすることを見出した 12）。テトラリンにヘキサデカンを添加した場合の平均粒子径の経時変化を Fig. 14 に示す。図から明らかなように、テトラリンのみの分散油滴は数十分程度で成長するが、ヘキサデカンを添加すると粒子径はほとんど変化しなくなった。油／水界面張力を測定したところ、テトラリン中のヘキサデカンの濃度が増加していくに従って増加することが分かった（Fig. 15）。このことは、疎水性の高いヘキサデカンが油／水界面に配向していることを示し、あたかも界面活性剤のように作用していることがわかった。また、ベンゼンにヘキサデカンを少量添加した場合の目視による経時変化の観察結果を Fig. 16 に示す。
写真から明らかなように、ヘキサデカンを少量添加すると安定性が飛躍的に向上している。そこで、グリセロールトリ

Figure 14 Temporal change of droplet size in tetralin dispersion as a function of time on n-hexane addition. Mixing
ratio to 1mM tetralin is 1:1000 ( ○ ), 1:100 ( ▲ ), and 1:10
( △ ). Tetralin alone ( ● ).

Figure15 Interfacial tension (γ) for tetralin-water boundary
at various contents of n-hexadecane (30℃ ).

Figure16 Photographic recording of droplet stabilization for
n-hexadecane/benzene mixture in water at 30℃ .

− 44 −

分散安定性に優れたサーファクタント・フリー・エマルションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明さは小さくなる。
３．水中において生成した油滴は必然的に経時変化して大きくなるが、そのプロセスには２通りある。一つは、水に対する溶解度をほとんど無視できる油を用いた場合に観察されるプロセスで連続的な成長である。二つ目は水に対する溶解度がある程度ある油、あるいは粘性の小さな油を用いた場合に観察されるプロセスで離散的に成長する。
４．これらの不安定な油滴に、粘性が大きく、かつ、相互溶解性のない油を少量添加すると、それらの粒子径は安定化されてあたかも粘性の高い油が界面活性剤のような振る舞いをして、言い換えれば、“油が油を乳化する”
興味深い現象を引き起こす。
油そのものの物性を十分理解した上で、エマルションの調製を行うことは、界面活性剤の使用の低減など、現
Figure17 Plots of the cube of droplet size at various contents ofglycerol trileate as a function of time at 30℃ . Oleic acid/glycerol trioleate=25% ( ○ ), 50% ( ■ ), 75% ( ▲ ), and 100% ( ● ).

在、大きく取り上げられている環境問題の解決の糸口となるものと考えられる。
（参考文献）
１）Evans DF, Wennersrrom H,: THE COLLOIDAL

オレートにも同様な作用があるのか確かめてみた

DOMAIN SECOND EDITION: Wiley-VCH, Inc., New

17）。Fig. 17

York, 1999 .

に示すように、少量のグリセロールトリオレートを添加することでオレイン酸の ω 値の経時変化に対する傾きは極

２）McClements DJ, : Food Emulsions: Practice andTechniques: CRC Press, Boca Raton, FL, 1998 .

端に小さくなった。この場合も、n—ヘキサデカンの場合と同様に、オレイン酸滴の表面近傍にグリセロールトリオ

３）Hunter RJ, : Foundations of Colloid Science: Vol. 1 ,Oxford University Press, Oxford, 1986 .

レートが局在化し、油滴を安定化させているものと考えら

４）Hiemenz PC, Rajagopalan R, : Principles of Colloidれる。

and Surface Chemistry, 3 rd ed.: Marcel Dekker: New

これまで述べてきたように、油単独、混合油のいずれのYork.

場合においても、長鎖かつ分岐を有する分子を用いた場合の方が水中における油滴の分散安定性は向上している。こ５）Davis SS, Smith A, : Theory Practice Emulsion
Technol: Academic Press, London, 1976 .

れは一見すると、疎水性／親水性のバランスから考えた場
合には異常な現象に思われるが、実際には油／水界面に配６）Weiss J, McClements DJ, Langmuir, 16 , 2145 , 2000 .

向するとは考えにくい疎水性の高い油分子が油滴表面近傍７）Mukesh D, Das AK, Ghosh PK, Langmuir, 8 , 807 ,1992 .

に局在化することにより、短鎖炭化水素の分子拡散を抑制

８）Bolzinger-Thevenin MA, Grossiord JL, Poelman MC,

して粒子が安定化されているとみなせる。

４．総

Langmuir, 15 , 2307 , 1999 .

括９）Strey R, Colloid and Polymer Science, 272 , 1005 ,1994 .

現時点までに得られた結果を整理すると、以下のように10）Bernheim-Groswasser A, Tlusty T, Safran SA, et al.,なる。

Langmuir, 15 , 5448 , 1999 .

１．界面活性剤が存在しない多量の水と少量の油からだけなる系に、超音波などを用いて強力な機械的な外力を印11）Kamogawa K, Sakai T, Momozawa N, Shimazaki, M.,

加すると、ある特定の時間範囲内でエマルション状態を

Enomura, M., Sakai, H., Abe, M., J. Jpn. Oil Chem. Soc.,

維持できる。油の選択により１年以上も安定なサーファ

47 , 159 , 1998 .
12）Kamogawa K, Matsumoto M, Kobayashi T, Sakai, T.,

クタント・フリー・エマルションを調製できる。

Sakai, H., Abe, M., Langmuir, 15 , 1913 , 1999 .

２．水中において生成する油滴の大きさは、通常言われている油と水との界面張力の値よりもむしろ油の粘性と密13）Kamogawa K, Abe M, : Encyclopedia of Surface and接に関係し、粘性が大きい油の方が生成する油滴の大き

Colloid Science: Marcel Dekker, New York, in press.

− 45 −

Surfaces : Physicochemical and Engineering AspectsA,14） 阿 部 正 彦 , フ レ グ ラ ン ス ジ ャ ー ナ ル , 1998 - 8 , 29 ,

180 , 41 ( 2001 ).

1998 .
15）Sakai T, Kamogawa K, Harusawa F, Momozawa, N.,18）Lifshitz IM, Vslezov V, J. Phys. Chem. Solids, 19 , 35 ,1961 .

Sakai, H., Abe, M., Langmuir, 17 , 255 ( 2001 )16 ) 阿部正彦、機能性化粧品 III、鈴木正人監修、シーエ

19）Taylor P, Advances in Colloid and Interface Science,
75 , 107 , 1998 .

ムシー , 316 - 325 , 2000 .
17）K a m o g a w a K , A k a t s u k a H , M a t s u m o t o M ,20）Kabalnov AS, Langmuir, 10 , 680 , 1994 .

Yokoyama S., Sakai, T., Sakai, H., Abe, M., Colloids and− 46 −

分子量および官能基を制御した新規キトサン系界 活性剤の機能化に関する研究─市販ペクチナーゼとその化学修飾酵素によるN-アセチル化キトサンの加水分解に及ぼすN-アセチル化度の影響─
東京工業大学大学院

梶内理工学研究科俊夫

Three types of N-acetylated chitosans (NACs) with different degree of acetylation (DA) were prepared and used as a
substrate for enzymatic hydrolysis with a commercially available pectinase and a modified one. Pectinase modification
was conducted using polyalkyleneoxide-maleic anhydride copolymer (PEO-MA copolymer). The effects of DA on
enzymatic reaction with native and modified pectinases were investigated experimentally. Initial hydrolysis rate andMichaelis-Menten kinetic parameters were measured by analysis of reducing sugars. DA of NAC strongly affected thehydrolytic characteristics of native and modified pectinases. N-acetylation of chitosan increased the initial hydrolysis rate
and the enzyme-substrate affinity with respect to both pectinases: NACs with DA over 0.3 showed high initial hydrolysis
rate and strong affinity between enzyme and substrate. Especially when NAC with DA over 0.3 was treated withmodified pectinase, the affinity became much stronger than the native pectinase.

１．緒

至っていない．

言

近年，数種類の加水分解酵素，例えばリゾチーム，セルキトサンは甲殻類，昆虫，カビなどの外骨格に存在する

ラーゼ，パパイン，リパーゼ，ペクチナーゼなどがキトサ

天然多糖類キチンの脱アセチル化物である．キチン類は固ン高分子中のグリコシド結合を加水分解することが明らか

体廃棄物として水産加工場などから得ることが出来る．

になってきた２−４）．これらの酵素は現在工業的に広く利用

キトサンは D －グルコサミン（GlcN）と N －アセチル－ D

されており，安価に利用することができる．さらに，我々－グルコサミン（GlcNAc）の β － 1,4 －結合によって出来るはポリエチレンノキシド - 無水マレイン酸共重合体（PEO

直鎖状のヘテロ多糖類である．市販のキトサンは主にキチ－ MA）で化学修飾したペクチナーゼが高い熱安定性を有ンの不均一系 N －脱アセチル化によって得られ，GlcNAc

し，酵素とキトサンとの間の親和性が高いことを報告した５）．

含量は 0 から 0.3 程度であり，GlcNAc 残基はブロック状

本研究では，異なる N －アセチル化度（DA）を持つ３に分布している．このようなキトサンは酸性水溶液にのみ

種類の N －アセチル化キトサン（NAC）を用いて酵素的加１）

可溶であり，中性あるいは塩基性水溶液には溶解しない ．

水分解を行い，NAC の酵素的加水分解に及ぼす DA の影

近年キトサン類は興味深い生理活性を多く持つことから

響を未修飾酵素および修飾酵素を用いた場合について明ら注目を集めている．生理活性と重合度の関係からみると，かにした．

低分子化キトサンはキトサン高分子に匹敵する生理活性を２．実持つことが明らかになっている．さらに，キトサンの低分子化によってその水溶性は向上し，溶液粘度は低下する．

２. １

このため，キトサンの低分子化によってキトサン類を広範な分野で応用可能にすることが期待されている．

験

実験材料

キトサン 10B（フナコシ（株））を NAC を調製するために使用した．市販のペクチナーゼ（MERCK）を NAC の

酵素的加水分解はキトサンの低分子化を行う方法として酵素的加水分解に使用した．ペクチナーゼの修飾剤として，期待されている．酵素的加水分解は化学的加水分解よりも日本油脂（株）から提供していただいた PEO-MA を用いた．

通常穏和な条件で行われる．しかしながら，キトサンの酵
素的加水分解は，キトサナーゼやキチナーゼなどの特異的

２. ２

酵素が高価であることから，工業的規模では利用されるにNAC の調製

異なる DA を持つ NAC は Kubota 等の報告したキトサンの均一系 N －アセチル化法にしたがって行った６）．最終

Development of Novel Chitosan-based Surfactant
with Controlled molecular weight and functionalgroups: Effect of N-Acetylation Degree on
N-Acetylated Chitosan Hydrolysis with
Commercially Available and Modified Pectinase
Toshio Kajiuchi
Graduate School of Science and Engineering,Tokyo Institute of Technology

的に得られた NAC の DA は Hirai 等の報告した 1H － NMR
法によって決定した７）．

２. ３

ペクチナーゼの化学修飾

ペクチナーゼの化学修飾は，我々が以前報告した方法にし た が っ て 行 っ た ５）． 使 用 し た PEO － MA の 分 子 量 は15,000 であり，その構造を Fig. １に示した．本研究で使− 47 −

用した PEO － MA 修飾ペクチナーゼの修飾率は 88％であしているものと考えられる．NAC の DA の調整は添加す

った．

る無水酢酸の量を変化させることによって行った．得られた NAC の DA を Table １に示す．すべての NAC は酵素

２. ４

キトサンの酵素的加水分解反応に使用する酢酸緩衝液に溶解した．

2.5g/L 酵素溶液
（0.50mL）
を 1w％キトサン溶液（0.50 mL）に加えることにより酵素反応を開始した．ただちに反応液

３. ２

異なる DA を持つ NAC の初期加水分解速度を 40℃の恒温槽に移し，120rpm による振とうを行った．

ヘテロ多糖類としてのキトサンに作用する酵素は２種類

初期基質濃度および初期酵素濃度はそれぞれ 0.5w％およに分類することができる．一つは GlcN 還元末端での加水

び 1.25g/L とした．反応液の pH は 5.9 とした．反応開始

分解を触媒するキトサナーゼ型の酵素であり，もう一つはから２時間後に 0.5mol/L Na2CO3 水溶液（1mL）を反応

GlcNAc 還元末端での加水分解を触媒するキチナーゼ型の液に添加し反応を停止させた後，生成還元糖を定量した．

酵素である．このように DA はキトサンに対する酵素の生成還元糖の定量は D －グルコサミンを標準物質として作用において重要な役割を果たす．キトサナーゼの場合はSchales 変法によって行った８）．

DA の増加とともに初期活性は増大する 10）．キチナーゼの酵素反応速度論量を求めるためには，
初期 NAC 濃度（S0）場合は DA の増加とともに初期活性は減少する 11，12）．

を 0.5 g/dm3 から 5.0g/dm3 の間で変化させて，初期加水

本実験では酵素反応を 40℃，pH5.9 の条件下でキトサン

分解速度（v0）の測定を行った．ミカエリス定数（K m）の均一溶液を用いて行った．Fig. ２に NAC の DA と初期と最大速度（Vm）の値は S0/v0 対 S0 プロットの勾配（Vm-1）

加水分解速度の関係を示す．未修飾酵素を用いた場合には，と切片（Km/Vm）より求めた．

キトサン 10B（DA ＝ 0.022）の初期加水分解速度はほとんど 0 であったが，DA ＝ 0.3 までの範囲では DA の増大

３．結果と考察３. １

とともに初期加水分解速度は増大した．DA ＝ 0.3 以上で調製した NAC の DA

は初期加水分解速度は変化しなかった．この結果は未修飾

NAC の DA と N －アセチル基の分布はキトサンの溶液

酵素が NAC 分子中の GlcNAc 残基を認識していることを

６，９）．これによって NAC の酵示している．また，キトサンの N －アセチル化によってペ素的加水分解も影響を受けることが予想される．本実験でクチナーゼによる初期加水分解速度を増大させることがではキトサンの N －アセチル化を均一系で行った．したがっきることがわかった．

物性に著しい影響を及ぼす

修飾酵素の場合には，DA の値にかかわらず未修飾酵素て，N －アセチル基はキトサン分子鎖中でランダムに分布

より初期加水分解速度は若干低くなった．これは PEO －MA 共重合体による酵素の化学修飾によって，部分的に酵素活性が失われたためと考えられる．一方，修飾酵素の場
合も，DA の増大とともに初期加水分解速度は増大しており，修飾酵素も NAC の GlcNAc 残基を認識していることがわかった．
Fig.1 Structure of polyethyleneoxide-maleic anhydride copolymer.

Table 1 Characteristics of N-acetylated chitosans prepared
under homogeneous condition.
Rm* [-]

DA** [-]

Solubility***

0
2.06
6.17
25.7

0.022
0.153
0.328
0.540

solublesolublesolublesoluble*) Rm, Molar ratio of acetic anhydride to D-glucosamine unit in
Chitosan 10 B.
**) DA, Degree of N-acetylation, was determined by 1H-NMR
method.
***) Solubility, Solubility in acetate buﬀer (pH 5.9)

Fig.2 Effect of DA on v0. Open and closed circles show thev0 value of native and modified pectinases, respectively.

− 48 −

分子量および官能基を制御した新規キトサン系界 活性剤の機能化に関する研究と基質の親和性が変化することが予想される．Fig. ４に示

３. ３ 速度論量に及ぼすDAおよび酵素の化学修飾の影響したように，DA ＝ 0.15 の NAC に対しては酵素を化学修

基質の DA によって酵素と基質との間の親和性が変化

飾した場合も K m 値は変化しなかった．一方，DA ＝ 0.3 以

することが予想される．そこで初期基質濃度（S0）を 0.5

上の NAC に対しては酵素を化学修飾した場合には Km 値はg/dm から 5.0 g/dm の範囲で変化させて，初期加水分解

著しく低下し，酵素と基質との親和性が高まることがわか

速度（v0）を測定し，速度論量 K m と V m を S0 ／ v0 対 S0

った．このような修飾酵素と基質の親和性が増大する理由

プロットより求めた（Fig. ３）．

として，疎水的相互作用，静電的相互作用，水素結合など

33K m と基質の DA の関係を Fig. ４に示す．K m 値は酵素

により酵素表面の微小環境が変化したことが考えられる 13）．

と NAC との間の親和性を表す指標と考えることが出来る．

V m と DA の関係を Fig. ５に示す．未修飾酵素，修飾酵

未修飾酵素を用いた場合，NAC の DA が高いほど K m 値

素どちらの場合も，DA が 0 から 0.3 の範囲では DA の増は小さくなり，酵素と NAC との間の親和性が増大した．こ加とともに Vm 値は増大し，DA が 0.3 以上では Vm 値は変の結果から，未修飾酵素による NAC の加水分解は GlcNAc

化しなかった．

残基を認識することによって起こることがわかった．

４．総PEO － MA によるペクチナーゼの化学修飾によって酵素括

未修飾ペクチナーゼおよび修飾ペクチナーゼを用いて異なる DA を持つ NAC の加水分解を行った．実験結果から，どちらの酵素の場合も NAC の DA によって加水分解特性が影響を受けることが明らかになった．さらに，修飾酵素を用いた場合には未修飾酵素とは異なる加水分解特性を示し
た．
未修飾酵素を使用した場合，DA が 0.3 までの範囲ではDA の増加とともに初期加水分解速度は増大し，DA が 0.3以上の範囲では初期加水分解速度は変化しなかった．一方，修飾酵素を使用した場合，DA が 0.5 までの範囲で DA の増加とともに初期加水分解速度は増大した．また，修飾酵素の初期加水分解速度は未修飾酵素より若干低い値であった．
未修飾酵素および修飾酵素による NAC 加水分解におけFig. 3 Examples of S0/v0 versus S0 plots for the determination of kinetic parameters. Open circle, triangle and squaremean the data of NACs with DA of 0.153, 0.328 and 0.540,
respectively, used as substrate. Enzyme, native pectinase.

Fig. 4 Relationship between Km and DA. Open and closed
circle show the Km value of native and modified pectinases, respectively.

る K m 値はどちらの場合も DA の増加とともに減少した．
すなわち，DA の増加とともに NAC と酵素の親和性が増大することがわかった．DA が 0.3 以上の範囲では修飾酵
素は未修飾酵素より低い K m 値を示した．これによって，Fig. 5 Relationship between Vm and DA. Open and closed
circle show the Vm value of native and modified pectinases, respectively.

− 49 −

ペクチナーゼの PEO － MA による化学修飾が酵素と NAC

６）N. Kubota, Y. Eguchi, Polym. J. 29 (1997) 123-127の親和性を向上させる働きがあることが明らかになった．

７）A. Hirai, H. Odani, A. Nakajima, Polym. Bull. 26,(1991) 87-94

な お， 本 研 究 の 成 果 は Biochemical Engineering
Journal, 7, 85-88（2001）に報告した．

８）T. Imoto, K. Yagishita, Agr. Biol. Chem. 35 (1971)（引用文献）

９）M.W. Anthonsen, K. M. Varum, O. Smidsrod,

1154-1156
Carbohydr. Polym. 22 (1993) 193-201

１）K.M. Varum, M.H. Ottoy, O. Smidsrod, Carbohydr.

10）N. Hutadilok, T. Mochimasu, H. Hisamori, K. Hayashi,

Polym. 25 (1994) 65-70

H. Tachibana, T. Ishii, S. Hirano, Carbohydr. Res. 268

２）D. Pantaleone, M. Yalpani, M. Scollar, Carbohydr.

(1995) 143-149

Res. 237 (1992) 325-332
３）R.A.A. Muzzarelli, W. Xia, M. Tomasetti, P. Ilari,11）S. Hirano, H. Tsuchida, N. Nagao, Biomaterials 10(1989) 574-576

Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) 541-545
４）M. Yalpani, D. Pantaleone, Carbohydr. Res. 256 (1994)

12）S. Aiba, Int. J. Biol. Macromol. 15 (1993) 1-5
13）H.F. Gaertner, A.J. Puigserver, Enzyme Microb.

159-175
５）Y. Shin-ya, T. Kajiuchi, H. Hinode, J.W. Park, J.
Chem. Eng. Japan 31 (1998) 930-935− 50 −

Technol. 14 (1992) 150-155

日光老化について ─とくに日光弾性線維症の発症機構
sならびに UV 症候群の病態に関する研究─
熊本大学

小医学部皮膚科野友道Long-term incubation of proteins with glucose leads to the formation of advanced glycation end products (AGEs), which arecharacterized by fluorescence, brown color, and cross-linking.  AGEs are thought to be involved in aging and age-enhanced
diseases.  Chronic exposure of the skin to sunlight induces hyperplasia of the elastic tissue in the upper dermis known as
actinic elastosis.
   Herein we used a monoclonal anti-AGE antibody (6D12) and a rabbit polyclonal anti-AGE antibody, which are shown torecognize Nε-(carboxymethyl)lysine (CML) as those epitope.  Fifty-seven skin samples of sun-exposed and -unexposed areas
were obtained from 51 patients aged 9 − 100 years.   Immunohistochemically, CML deposition was observed in the elastic
materials from all these specimens showing actinic elastosis with marked elastic-tissue changes.  In contrast, CML deposition
was not found in the specimens from sun-unexposed areas without significant actinic elastosis.  Immunoelectron microscopic
examination demonstrated that CML accumulated predominantly in elastic fibers especially in the amorphous electron-densematerials corresponding to photo-induced degenerated area rather than the electron-lucent region.  Immunochemical analyses
with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of elastase-soluble fractions demonstrated that the CML levels of the sunexposed area were significantly higher than those of the sun-exposed area.
    These results indicate that elastin in actinic elastosis lesions of photoaged skin is modified by CML which has been
proposed as a potential biomarker of oxidative damage of tissue proteins in vivo.   Although it is not clear whether AGE
accumulation in the skin per se is a cause of the disease or simply its effect, it could at least serve as a biomarker for theduration and severity of oxidative damage to the skin in vivo.  To support this idea, further studies are needed to elucidate
direct effects of UV irradiation on the formation of AGEs in vivo and in vitro.

１．緒

今回は日光弾性線維症の発症機作について検討する。

言

２．実

太陽から限り無い恩恵を享受され、その太陽を神と崇めて来たヒトが、太陽の陰の部分を認識しはじめたのはそう

２. １

日光弾性線維症について

２. １. １

古い話ではない。1970 年代のオゾン層の破壊と皮膚がん

験

材料および方法の関連が指摘され、急速に紫外線による皮膚への障害が注腫瘍などの外科的に切除された皮膚の周辺正常部を、ホ目を浴びたのである。我々はこの紫外線の皮膚への影響を、

ルマリン固定ならびに− 80℃で凍結保存された９歳から二つの観点に焦点を当てて研究を進めている。すなわち慢100 歳の 51 名 57 件体を用いた。免疫組織学的検索に用い性日光障害としての日光弾性線維症の発症機構、そして遺た抗体は堀内らが開発した抗 AGE ポリクローナル抗体３）、

伝性日光過敏性疾患の発症解明と診断システムの開発であ抗 CML 抗体（６D 12）４）を用いた。
免疫組織学的観察：凍結切片を用いて AGE の存在およる。
日光弾性線維症については、皮膚真皮の弾性線維の変化

び分布を検索した。新鮮凍結組織に凍結組織包埋剤（OCT-が主体であるが、その変性にメイラード反応が関与する事

compound, TISSUE-TEK 社）を加えた後、クリオスタッ

を我々ははじめて明らかにした１）。すなわち、メイラード

トで、６µm に薄切し、gelatin-coated glass slide に貼付、反応後期反応生成物（AGE: Advanced Glycation Endprod-

室温で２４時間風乾した。その後４℃アセトンで 10 分固ucts）の弾性線維への沈着を確認し、現在種々の抗 AGE 抗定、メタノール処理後３％過酸化水素水に 10 分浸し、内２）体を作成し 、その詳細を検討している。 また後者に関

因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。PBS で 10 分

しては、新しい疾患概念 Uv s 症候群を確立し、また遺伝間、３回洗浄後、一次抗体として５％ウマ血清アルブミン

性日光過敏性疾患診断フローチャートの作成を試みている。

を含んだ PBS で 1000 倍に希釈した CML（carboxymethyl
lysine protein）をエピトープとした polyclonal、および

Phtoaging − Studies on the pathogeneisisof actinic elastosis and the diagnostic
method for UVs syndrome −た mono-clonal anti-bovine alpha-elastin antibody（Elastin

Tomomichi Ono

Product Company）を用いて、４℃で一昼夜反応させた。

Department of Dermatology, Kumamoto
University School of Medicine

次に PBS で 10 分間、３回洗浄後ビオチン化抗マウス IgG,

monoclonal anti-AGE antibody、および 4000 倍に希釈し抗体にて 30 分間反応させた。さらに PBS で５分間３回洗浄後 avidin-biotinylated peroxidase complex（Vectastain− 52 −

日光老化について−とくに日光弾性線維症の発症機構ならびに UVS 症候群の病態に関する研究−社）にて 45 分間反応させた。DAB・H 202 にて発色、He-

pornent 抗体５）ならびに抗 HB- ８抗体陽性６）、４）電顕的matoxylin で核染色を行い脱水封入した。対照試験にはに弾性線維構造を示す部分があること、また酸オルセイン

monoclonal

染色陽性であることなどから本物質が弾性線維由来である

anti-AGE antiboidy を AGE-BSA で吸収して用いる吸収試験を行った。

ことが示唆され、elastotic material とも呼ばれている。そ電顕観察： 通常電顕用は Karnovsky 液で前固定、PBの産生機序として、既存の弾線維の変性あるいは紫外線の洗浄後２％オスミウム酸で固定した。エタノール系列で脱影響で変化した線維芽細胞が異常な弾性線維前駆物質分泌

水、Epon 812 で包埋した。薄切後クエン酸鉛と酢酸ウラにより、異常な弾性線維形成などの説７）がある。また elas-

ニウムで二重染色および一部の切片についてはタンニン酸

totic material がその  の増加が顕著なのは、lysozyme によ染色を行った。免疫電顕用には post-embedding 法を用いる elastase の分解抑制がおこるとの説８）もある。いずれにた。LR White resin 包埋後超薄切片を、金コロイド法で、せよ elastotic material 形成の機序は全く不明である。

抗 CML 抗体を 15 nm, 抗エラスチン抗体には６nm で標識

３. ２ 日光弾性線維症とメイライード反応後期生成物した。
動物実験：ヘアレスマウス（Hos:Hr- 1 , 雄、試験開始時（AGE）７週齢）を用いた。紫外線照射はタイマーを用いて 8：00

３. ２. １

〜 20 時の間、15 週、30 週および 45 週毎日照射した。紫cationメイラード反応後期生成物（advanced glyendproducts, AGE）について９）外線強度は紫外線照度計（UVR 305 / 365 D Ⅱ, TOPCON 製）

多くの蛋白質が生体内で非酵素学的修飾、メイラードで一ヶ月ごとに補正した。肉眼的観察、病理組織学的およ（Maillard）反応を受ける。この反応は古く 1912 年 Mail-

び免疫組織学的検討を行った。

lard 10）が、アミノ酸と還元糖を加熱すると黄褐色色素が生成されることを発見したことから始まる。蛋白質のアミノ３．結果と考察
３. １

背酸と還元糖のカルボニル基とが反応し、シッフ塩基、さら景にアマドリ転位生成物を形成する前期反応と、これらの紫外線は長波長（320−400 nm）、中波長（290−320 nm）

前期反応生成物がさらに酸化、脱水、縮合、環状化などのおよび短波長に区分されている。それぞれ UVA、UVB そ反応を経由して、メイラード反応後期生成物（advanced

して UVC と略記される。UVC はオゾン層が破壊されな

glycation end-products，AGE）にいたる後期反応がある。

ければ地上に届くことはない。一方、UVA はその地表へ

すなわち、AGE は蛋白の非酵素的糖付加反応によって不の到達量は UVB の 10 倍以上である。幸い UVA の光生

可逆的に生成された構造の総称である。現在迄に明らかに物学的効果は UVB の 1 / 1000 とみなされている。つまりされてきた AGE 構造体は、CML（カルボキシメチルリジ

UVA は安全な紫外線と思われて来たのである。小麦色にン）、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、X 1、ピロピ

焼けた肌が健康のシンボルとされていたのである。いわゆ

リジンなどである。当初、本反応は食品化学領域で重視さる「日焼けサロン」はその一つの現象である。しかし、最れてきた。しかし、1960 年代に入りアマドリ転  生成物と近 UVA の皮膚への影響が注目され始めている。一つはしてのヘモグロビン A 1 c が血糖コントロールの指標とし

UVB との相乗的に作用し、それは日光発がんと関係するて応用されるようになり、生体でのメイラード反応が注目こと。もう一方で UVA が真皮深く到達するために、線維されるようになった。すなわち、老化あるいは粥状動脈硬芽細胞にまでその影響をおよぼし、光老化のフリーラジカ化症、糖尿病などとの関連が知られて来た。特に CMLル説からも、その影響を無視できないことである。さらに形成において、酸化がが重要な意義を有することが明かと高齢社会の今日、日光老化による発がんと皮膚の老化が社なるにつれ、CML が glycoxidation products（GOP）と会生活において、その QOL を著しく低下させていることして提唱され、生体蛋白質の糖化および酸化を反映する指が認識されねばならない。

標となることが示唆されて来た。CMLs はその産生過程で、我々はこのような観点から、日光老化、なかんずくそのもっとも顕著な病理学的変化である「日光弾性線維症」の活性酸素が産生され、それが生体分子を損傷し、またさらに AGE 形成を促進したりするのである。

について検討している。
３. ２. ２

さて、日光弾性線維症は病理組織学的に真皮網状層に好塩基性に染まる彎曲・ちじれ・膨化した線維として観察さ日光弾性線維症における AGE 局在光顕・免疫組織学的レベルでの局在：我々は堀内らが作れる。高度になるとそれは一塊となり、無均質な塊状物質成したポリクローナルおよびモノクローナル抗 AGE 抗体

として観察される。この断列した線維あるいは塊は、１）（６D 12、CML をエピトープ）を用いて、日光弾性線維症

光顕的に弾性線維染色陽性、２）
抗エラスチン抗体陽性、３）病変部に AGE が局在することを免疫組織学的に確認した。

弾性線維周囲 micro-fibril を認識する抗 amyloid P   com-

そして、抗エラスチン抗体局在部とその沈着がほぼ一致す− 53 −

ることを共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。すなわち９た 13 検における群間比較でも、露光部に優  に CML レベ

歳から 100 歳までの 51 人からの露光部あるいは非露光部

ルは高いことが判明した。

皮膚５７検体を材料として検討を行った。HE 染色で明ら

免疫電顕レベルでの局在：通常日光老化部の真皮に観察

かに日光弾性線維症の所見を認めた 28 検体は 53 歳以上でされる高電子密度部の増加した弾性線維においては、エラあったが、それらはいずれも凍結切片で免疫組織学的に、スチンをを示す６nm 金粒子は弾性線維低電子密度の部に病変部に一致して CML 陽性であった（図１）。28 歳から限局する傾向がみられた（図２）。一方、CML の局在を示

42 歳の５検体においては、HE 染色にて明らかな日光弾性す 15 nm 金粒子は高電子密度部に存在した。なお同一症

線維症所見は見られなかったが、免疫組織学的に僅かに線例の非露光部弾性線維には、高電子密度部がほとんど観察

状に CML 陽性が認められた。10 代４検体では完全に陰性

されず、CML の局在も認められなかった。

であった。非露光部 20 検体は年齢に関わらず HE 染色で

なお、電顕的にも明確に弾性線維と断定できない amor-

陰性であった。免疫組織学的には２例で僅かな陽性を呈しphous material には、CML がエラスチンと混在して認めた。さらに皮膚組織内における CML の存在を確認するたられた。一方、コラーゲン線維には明らかな CML の局在

めに、薄切した凍結組織をエラスターゼで消化後、エラスは確認できなかった。

ターゼ可溶性分画を CML を用いた ELISA 法で測定した。

以上の結   から日光老化皮膚に認められる日光弾性線維

71 歳から 91 歳の５例の、それぞれの露光部および非露光症病変部の elastotic material は弾性線維が CML の修飾を部皮膚での比較では全例露光部の値が非露光部より高値を受けていること、日光により変化した弾性線維の高電子密示した。また露光部あるいは非露光部の一方から採取され度部の発現には CML が関与していることが明らかにされたと考えている。
マウスにおける日光老化と AGE: UVA,UVB および
UVA+UVB 照射をそれぞれ５匹ずつ行った。UVA+UVB
群が肉眼的に顕著なしわ、皮膚肥厚がみられ、日光老化の所見を呈したが、それでもヒトにみられる日光弾性線維症
は確認できなかった。また免疫組織学的にも AGE の局在は確認できなかった。

３. ３

今後の展望

前述したように AGE, なかんずく CML の生成には酸化過程は活性酸素産生をともなうことが明らかになって来た。
このことは日光老化が紫外線誘発の酸化ストレスと深く関

図１ 日光弾性線維症： A）HE；真皮に好塩基性に染色される塊状の物質（←）が認められる、 B）抗 elastin 抗体での免疫染色；日光弾性線維症部に一致して陽性、 C）抗 CML
抗体での免疫染色；日光弾性線維症部に一致して陽性

図２ 日光弾性線維症；二重免疫染色電顕像：弾性線維の高電子密度部に一致して 15nm の金粒子（←）が存在し、CMLの局在を示す。また６nm 金粒（ ）は低電子密度部に認められるエラスチンの局在を示す（Bar：100nm）− 54 −

日光老化について−とくに日光弾性線維症の発症機構ならびに UVS 症候群の病態に関する研究−

ence of a common structure,  J. Biol. Chem., 266 , 7329 -

わっていることの傍証にもなる。この点で我々の研究は日7332 , 1991 .

光老化のきわめて重要なポイントを捉えている可能性が強い。
今後、他の AGE, たとえばペントシジンなどについても

４）I k e d a K , H i g a s h i T , S a n o H , e t a l . :εN -(carboxymethyl)lysine protein adduct is a major

検討を予定しているが、我々は光顕レベルではやはり日光

immunological epitope in proteins modified with ad-

弾性線維症部にその局在していることを確認している。なvanced glycation end products of the Maillard reaction,  

お、我々の観察ではコラーゲ線維には CML は確認されなBiochemistry, 35 , 8075 - 8083 , 1996 .

かった。その理由が判明すると、さらに日光老化の解明が５）Mera SL, Lovell CR, Jones RR, et al. : Elastic fibers in

進むと考えている。またマウスでの実験で日光弾性線維症

normal and sun-damaged skin; an immunohistochemi-が発症しにくいことの原因を解明することも、動物側の因

cal study,  Br. J. Dermatol, 117 , 21 - 27 , 1987 .

子のみならず、日光弾性線維症の発症に紫外線のみならず、

６）Matsuta M, Izaki S, Ide C, et al. : Light and electron

他の日光成分の影響も含めて検討されねばならないと考え

microscopic immunohistochemistry of solar elastosis; aている。

study with cutis rhomboidalis nuchae,  J. Dermatol, 14 ,364 - 374 , 1987 .
７）Bouissou H, Pieraggi MT, Julian M, et al. : The elas-（文

tic tissue of the skin, a comparison of spontaneous献）and actinic (solar) aging,  Int. J. Dermatol, 27 , 327 - 335 ,１）Mizutari K, Ono T, Ikeda K, et al. : Photo-enhanced

1988 .

modification of human skin elastin in actinic elastosisεby N -(carboxymethyl)lysine, one of the glycoxidation

８）Albrecht S, From L, Kahn HJ, : Lysozyme in abnor-

products of the Maillard reaction,  J. Invest. Dermatol.,mal dermal elastic fibers of cutaneous aging, solar elas-

108 , 797 - 802 , 1997 .

tosis and pseudoxanthoma elasticum,  J. Cutan. Pathol,
18 , 75 - 80 , 1991 .

s２）Itoh T, Fujiwara Y, Ono T, et al. : UV syndrome, a
new general category of photosensitive disorder with９）Horiuch S, : Advanced glycation end products

defective DNA repair.  Is distinct from xeroderma pig-(AGE)-modified proteins and their potential relevancementosum variant and rodent complementation groupto artherosclerosis,   Trends Cardiovasc. Med, 8 , 163 ,1996 .

1 ,  Am. J. Hum. Genet., 56 , 1267 - 1276 , 1995 .
３）Horiuchi S, Araki N, Morino Y, : Immunochemical

10）Maillard LC, : Action des acides amines sur les su-

approach to characterize advanced glycation end prod-

cres ; formation des melanoidines par voie methodique,  ucts of the Maillard reaction ; evidence for the pres-

CR. Acad. Sci. (Paris), 154 , 66 - 68 , 1912 .

− 55 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用
放射線医学総合研究所

小

澤

俊

彦、竹

下

啓

蔵

There have been little reports about direct evidence of generation of free radicals including oxygen radicals duringexposure to ultraviolet (UV) light, although free radicals may be involved in various injuries caused by UV light.   In thisstudy, generation mechanism of oxygen radicals during photodynamic reaction was examined precisely with in vitro spin
trapping technique, and then induction of radical reaction in skin of living mouse was examined under UV light by using
in vivo electron spin resonance (ESR) spectroscopy.  ESR signal of hydroxyl radical (・OH) adduct of spin trapping agent,
DMPO, formed during uroporphyrin photosensitization increased in the presence of NADPH.  This increase was suppressedby addition of scavengers of ・OH and singlet oxygen (1O2), and enhanced in deutrated solvent. The appearance of 1O2, as
determined by the oxidation of TEMPD, was delayed with an increase in the concentration of NADPH, while the productionof  ・OH was upregulated.  Addition of H2O2 did not increase the signal.  These results suggest that the ・OH was produced
1O2-dependently, and that its production involves neither superoxide anion radical nor H2O2.   An aqueous solution of
carbamoyl-PROXYL was injected intravenously as a redox probe to an anesthetized mouse, and ESR spectrum of the probe
was measured at the dorsal region of hair-removed ddY mice and hairless mice using an L-band ESR spectrometer with asurface-coil-type resonator.  The rate of signal decay increased during irradiation of UV light.  The increase was statisticallysignificant.  The increase of signal decay rate was suppressed by pre-administration of spin trapping agent, PBN, while PBN
did not change the decay rate of non-irradiated mouse.  These observations suggest that the estimation of radical generation
under UV-irradiation may be possible by using in vivo ESR spectroscopy with a nitroxyl redox probe./

１．緒ルが関わっていることが十分考えられる。

言

最近、UVA 照射によりウミホタル・ルシフェリンアナ

400 nm）と UVB（280 - 320 nm）で、これらの過剰の曝露はログ（CLA）を塗布したマウス皮膚で発光が起こることが報告された８）。CLA はスーパーオキシドラジカル（O 2・-）

皮膚に日焼け、炎症、老化、免疫抑制、発がんなどを起こ

や一重項酸素（1 O 2）に特異的に反応すると考えられていす。最近の研究では、これら障害の一因として生体構成成ることから、これは活性酸素生成を比較的特異的に、しか分（核酸、脂質、タンパク質）の酸化や、ある種の遺伝子も非侵襲的に検出した最初の報告である。しかし、この場発現の促進による細胞内シグナル伝達の変化が関係してい合発光は紫外線照射をやめた直後から増加し始め、照射中

ることがわかってきている 1 - ４）。さらに、紫外線照射によに生きた動物皮膚でどのような活性酸素あるいはラジカル

る生体構成成分の酸化が活性酸素消去剤により抑制されるが生成されているかは不明である。

太陽光に含まれ地上にまで達する紫外線は UVA（320 -ことや生体内抗酸化物質の量が変動すること、培養細胞系

本研究では、まずウロポルフィリン光増感反応によるや切除皮膚の紫外線照射でスピントラップ -ESR 法により酸素ラジカルが確認されたことなどから、紫外線照射によO 2 発生系を利用して 1 O 2 が NADPH 等の存在で強力な酸素ラジカルである ･ OH に変換されることを in vitro でり活性酸素やフリーラジカルが生成することが示唆されて示した。さらに、生体内ラジカル反応の無侵襲測定が可能。また、電離放射線についても皮膚がんなどをな生体計測 ESR（電子スピン共鳴）と試料表面のラジカいる

1 , 2 , 5 - 7）1発生させ、また、in vitro の実験では水の電離分解によりヒドロキシルラジカル（･OH）などの活性酸素を生じさせル検出に最適なサーフェイスコイル型検出器を組み合わせ、ることが古くから知られている。活性酸素・フリーラジカ

ル反応を解析した。

生きた動物皮膚において紫外線等により惹起されるラジカ

ルは遺伝子の損傷や転写調節に関与することが培養細胞を２．実用いた実験等で示唆されていることから、紫外線・電離放射線による細胞内シグナル伝達に活性酸素・フリーラジカ

In vitro の光増感反応における活性酸素の測定

酸素ラジカルの生成は 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide

Non-invasive measurement of radical
reactions in skin induced by UV and ionizing
radiation and its application to evaluation ofantioxidants for protection of skin injury.

（DMPO）を用いたスピントラップ法による DMPO 付加体

Toshihiko Ozawa, Keizo Takeshita

により調べた。ウロポルフィリン（UP）と DMPO あるい＊

National Institute of Radiological Sciences
＊

２. １

験

の生成により、また 1 O2 の生成は TEMPD の酸化による
2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidone-N-oxyl（TEMPON）の生成
は TEMPD を含み 20mM リン酸緩衝液（pH7.4）で調製した試料溶液を ESR 測定用の石英製フラットセルに入れ、室− 56 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用

温で可視光線を照射し、X- バンド ESR（JEOL JES RE-1X）

ミ箔で覆った後、マウスの上方からラジカルリサーチ社製で測定した。過酸化水素（H2 O2）は Frew らの方法

でRUVF- 203 S 型紫外線照射装置に 290 nm カットフィルター測定した。この方法では H2 O2 は 4-aminoantipyrine およびを装着して行った。この装置は光源に水銀キセノンランプ

phenol と反応し、505nm に吸収極大をもつ quinoneimine

を用いており、365 nm、410 nm 及び 435 nm にピークを持つ。

９）chlomogen を生成する。いずれも、可視光源として反射板

３．結と集光レンズを装備したタングステンランプを用いた。光
照射はスピントラップ法では 0.7W/m 2 で、H2 O2 の定量に

３. １

O2 依存的酸素ラジカルの生成

1

3．1．1

は 10W/cm で行った（SL021/FQI 検出器を装着した IL
2

1400A 光量計（International Light, Inc.）による計測）。

果

NADPH 存在下の ･OH の生成

UP を NADPH と DMPO の存在下光照射したところ、4 本線のESR スペクトルが観測された（図 1A）。このスペクトルはピ

２. ２

紫外線照射によるラジカル生成の in vivo 検出

除毛した ddY 系マウス（雄性 , ４週齢）あるいはヘアーク比（1:2:2:1）と超微細分裂定数（a N=a H=1.49mT）から、DMPO の ･OH 付加体（DMPO-OH）のスペクトルと同レスマウス（雄 , ５週齢）をペントバルビタールナトリウ

定された。このスペクトルのシグナル強度は NADPH を省ムで麻酔し、ESR マグネットの間にうつ伏せに固定した。

いたときには小さく（図 1B）、また暗所に同じ時間おいたと尾静脈より 3 -carbamoyl- 2 , 2 , 5 , 5 -tetramethyl-pyrrolidine-N-

きにはシグナルが検出されなかった。この反応系にエタノー

oxyl（carbamoyl-PROXYL）水溶液（280 mM、60 µL）をルあるいはぎ酸ナトリウムを存在させたところ、DMPO-OHのシグナルは小さくなり、代わりに DMPO の ･CH（OH）

投与し、直ちにサーフェイスコイル型共振器を背部皮膚に当てて ESR を測定した。ESR 測定装置は、直径 5 mm

CH3 付 加体（aN=1.59 mT, aH=2.29 mT）あ るいは ･CO 2 −付の電子同調サーフェイスコイル型共振器 10、11） 並びに磁場加体（aN=1.57 mT, aH=1.87 mT）に由来する 6 本線シグナ

変調コイルを日本電子製 L- バンド ESR 測定装置に接続しルが観測された。エタノール、ぎ酸ナトリウム、あるいはて用いた。紫外線照射はマウスの照射部以外の部位をアル

dimethylsulfoxide（DMSO）を添加した場合には DMPO-OHのシグナルが３− 30% に減少した（図１、表１）。これらの・ことから検出されたDMPO-OH の 70% 以上は O2 の DMPO
付加体の分解などによるものではなく、遊離の ･OH と DMPOとの反応によるものであることが示唆される。
3．1．2 ･OH の生成における 1O2 依存性
NADPH 存 在 下 の DMPO-OH の シ グ ナ ル は 1 O 2
消 去 剤 で あ る ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム、L- ヒ ス チ ジ ン、
1 , 4 -diazabicyclo[ 2 . 2 . 2 ]octane（DABCO）の添加で完全に消失した（表１）。アジ化ナトリウムを添加した場合には、･ OH とアジ化ナトリウムとの反応で生じる ･ N 3 の DMPO
付加体のシグナルはほとんど検出されなかった（図 1 E）。
1

O 2 の寿命は溶媒を重水素化することで延長されることが

表１ NADPH 存在下 UP 光増感反応で生成する DMPO-OHに及ぼす活性酸素消去剤の影響

図 1 UP 光増感反応で生成した DMPO 付加体の ESR スペクトル(A) UP+NADPH+DMPO 2 分間照射 , (B) UP+DMPO 2 分
間照射 , (C) UP+NADPH+DMPO+ エタノール 2 分間照射 ,(D) UP+NADPH+DMPO+ ぎ酸ナトリウム 2 分間照射 , (E)
UP+NADPH+DMPO+ アジ化ナトリウム 2 分間照射 , ( ○ )DMPOの ･OH付加体, (△) DMPOの ･CH(OH)CH3 付加体 , (◇)
DMPO の ･CO2− 付加体 .

− 57 −

知られているため、･ OH の生成における 1 O 2 の関与を確認するために、反応溶媒を重水素化して同様に DMPO-OH の生成を調べた。97 % の水を重水に置き換えると DMPO-OHの生成速度と生成量が共に増加した（図２）。これらのこと
1･
は、 O 2 が OH の生成中間体であることを強く示唆する。

･OH の生成と 1 O 2 の関係を調べるために、･OH と 1 O 2 を別々に測定し重ね描きした（図３）。NADPH の存在しない
ときには TEMPON のシグナルが時間と共に増加した。このシグナルは 1 O 2 の消去剤であるアジ化ナトリウムや Lヒスチジンの存在で減少したが、･ OH 消去剤、カタラー
ゼ、およびスーパーオキシド・ジスムターゼ（SOD）の存
在はシグナル強度に影響しなかった（表２）。このことはTEMPD から TEMPON への酸化はこの条件下では 1 O 2 に特異的であることを示している。この系に NADPH を存在させると TEMPON のシグナルの出現にラグタイムが生じた。このラグタイムは NADPH の濃度が増加するに従い

図2

重水素化溶媒中での DMPO-OH の増加
UP+NADPH+DMPO を H2O ( ○ ) あるいは 97 % D2O -3%H2O ( ● ) 中で調製し、光照射した。

表 2 NADPH 非存在下 UP の光増感反応で生成する TEMPON に及
ぼす活性酸素阻害剤の影響

図 3 UP 光増感反応での DMPO-OH および TEMPON 生
成における NADPH の効
UP+DMPO に NADPH を (A) 0M, (B) 7M, (C) 33 M,
and (D) 167M を添加して光照射した。

− 58 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用延長された。一方、DMPO-OH の生成速度は NADPH のの生成における H 2 O 2 の役割を確認するために、UP およ

濃度が増加するに従い増加した。このことは、NADPH 依
存的に 1 O 2 が ･ OH に変換されることを意味する。このとOH の生成を調べた。図４に示すように DMPO-OH のび UP-NADPH 系に 0 . 63 mM の H 2 O 2 を添加し DMPO-は、 O 2 と NADPH との反応が O 2 と TEMPD との反応

生成は H 2 O 2 の存在下でも増加しなかった。このことは、
H 2 O 2 から ･ OH への変換はたとえ H 2 O 2 が生成されてもこに比べてはるかに速いためと推測される。

の反応系では起こりにくいことを示している。またその結き TEMPON のシグナルの出現にラグタイムが見られるの
1

3．1．3
1

1

果は同時に、DMPO-OH の生成を SOD が増加させ、DFO

O2 依存的 ･OH の生成経路が減少させたのは ･OH 生成が H 2 O 2 の鉄触媒反応に由来

1O 2 は NAD(P)H により一電子還元あるいは二電子還元

されてそれぞれ O 2 ･- 12、13）、H 2 O 2 へ変換されること 14） がすでに報告されている。O 2 ･- や H 2 O 2 は金属触媒下 ･ OHしたためではなく、SOD および DFO の別の反応によるものであることを示唆する。SOD は Cu 触媒 ･ OH 生成反応を起こし 15）、DFO は ･ OH を消去することが報告されてを生成することがわかっている。NADPH 存在下の UP 光増感反応で検出された ･ OH が O 2 ･- や H 2 O 2 を経由してでいる 16）。

きたものか否かを調べるため、DMPO-OH の生成に及ぼ

３. ２

In vivo におけるラジカル反応の検出

す desferrioxamine（DFO）、SOD およびカタラーゼの影

3．2．1

サーフェイスコイル型共振器で測定された響を調べた（表１）。その結果 DFO およびカタラーゼはESR シグナル

DMPO-OH の生成を減少させなかった。SOD は DMPO-

Carbamoyl-PROXYL をヘアレスマウスに静脈内投与

OH の生成をわずかに増加させたが、ここにカタラーゼをした後、背部にてサーフェイスコイルを用いて ESR を存在させても増加は抑えられなかった。このことは SOD

測定すると、ほぼ等強度の３本線シグナルが観測されにより DMPO-OH の量がわずかに増加した結果が SOD
による O 2 ･- の不均化により H 2 O 2 の生成が増加したた

た。そのシグナルの時間変化を図 5 A に示す。シグナルはめではないことを示している。カタラーゼは存在濃度をた。一度剥離したマウスの皮膚を再びもとの場所へ戻し、21000 U/mL まで増加させても影響無かったが、DFO はその上にサーフェイスコイルを当てて、静脈内投与した

0 . 7 mM まで濃度を増加させると DMPO-OH のシグナルがcarbamoyl-PROXYL の ESR を測定すると、シグナル強度減少した。

は未処理のマウスの場合の約 2 / 3 となった。このことか

carbamoyl-PROXYL 投与２- ３分後まで増加した後減少し反応経路をさらに明らかにするために NADPH 存在下ら皮膚表面でサーフェイスコイル型共振器によって検出さUP の光増感反応で生成する H 2 O 2 を定量した。その結果れたシグナルのうち約 1 / 3 は皮膚に存在する carbamoyl-

約 50 µM の H 2 O 2 が生成された。カタラーゼおよびアジ化ナトリウムは完全に H 2 O 2 生成を抑えたが、SOD は影響なかった。DFO は H 2 O 2 の生成を少し増加させた。･ OH

図 4 UP 光増感反応による DMPO-OH 形成に及ぼす H2O2 添加の影響
UP+DMPO ( △ ), UP+DMPO+H2O2 (0.63 mM) ( ▲ ),UP+NADPH+DMPO ( ○ ) ,UP+NADPH+H2O2 (0.63mM)+DMPO ( ● )図 5 サーフェイスコイル型共振器により皮膚表 で測定された carbamoyl-PROXYL の ESR シグナル強度の時間推移と紫外線照射の影響
A. ヘアレスマウスに carbamoyl-PROXYL を尾静脈内投与し、背部においてサーフェイスコイル型共振器を装着した Lバンド ESR でシグナルの消長を追跡した。
B. Carbamoyl-PROXYL 投与 5 分後から紫外線を照射しながら測定した。

− 59 −PROXYL に由来するものと推定される。
3．2．2

表 3 ESR シグナル消失速度（/min）に及ぼす UV 照射の影響

シグナルの消長に及ぼす紫外線照射の影響

図 5 B は carbamoyl-PROXYL の投与５分後から紫外線を照射しながら測定したときのシグナル強度の時間推移を示す。明らかに照射してからのシグナルの消失が照射しない場合（図 5 A）に比べて増加した。剥離した皮膚を再び元の場所に戻したマウスを用いて同様の実験を行ったとこ
ろ、紫外線照射によるシグナル消失速度の増加は見られなかった。このことは、紫外線によるシグナル消失速度の増加は皮膚に存在するプローブの消失によることを示唆する。
シグナル消失速度を１次反応速度定数として求め、紫外線照射の有無で比較した結果を表３に示す。この実験はヘアレスマウス並びに除毛した ddY 系マウスを用いて行ったが、いずれの場合にもシグナル消失速度の増加は統計的に有意であった。
3．2．3
ラ

紫外線照射によるシグナル消失速度の増加とジカル反応の惹起

紫外線照射による carbamoyl-PROXYL のシグナル消失
速度の増加とラジカル反応惹起との関係を調べるためにス
ピントラップ剤 N-t-butyl-α-phenylnitrone（PBN）の投与
効果を調べた。図６に示す様に紫外線照射によるシグナ
ル消失速度の増加は PBN の投与により見られなくなった。
一方、紫外線照射しない場合には PBN はシグナル消失速

図 6 紫外線照射による ESR シグナル消失速度の増加に及ぼす PBN の影響
PBN は照射 35 分前に腹腔内投与した。

度に影響しなかった。このことから紫外線照射下では何ら(i) 反応系に H 2 O 2 を添加しても DMPO-OH の生成量の増かのフリーラジカルが生じ、それが carbamoyl-PROXYL

加は見られなかったこと、(ii) カタラーゼ、DFO はいずれのシグナル消失を促進した可能性が考えられる。

も NADPH 存在下の UP 光増感反応における DMPO-OH

４．考の生成に影響しなかったことから経路 ( 1 ) によるのではな

察

In vitro の光増感反応で得られた結果は、NADPH 存在
下で 1 O 2 を介して ･OH が生成することを示している。1 O 2
依存的 DMPO-OH の生成は様々な系で報告されており、次の経路が推定されている。

O2

1

O2

1

e-

[DMPO- O2 ]
1

H+

O2

1

-SH

-SOOH

17）

DMPO-OH (2)こで得られた結果はこれまでに報告されている経路とは異なる経路で ･OH が生成している可能性を示唆している。
NADPH はシステインと同様に生体内で絶えず turn over

DMPO
-SO• + •OH
DMPO-OH (3)NADPH の存在下で 1 O 2 依存的に O 2 ･- や H 2 O 2 の生成が起こることが報告されているも除去されよう。Buettner 18）はシステイン存在下ヘマト
ポルフィリン誘導体の光増感反応で ･ OH が生成すること

反応で同様な反応が起きているか否かは不明であるが、こDMPO-OH + •OH
DMPOたことから経路 ( 2 ) により DMPO-OH が生成された可能性を見いだし、-SH と 1 O 2 との反応による -SOOH がホモリ
ティカルに解裂して ･ OH が生成したと推定した。今回のeMetals •
DMPO
H2O2
O2•OH
DMPO-OH (1)DMPO

いことが明らかである。また、70 % 以上の DMPO-OH のシグナルがエタノールなどの ･ OH 消去剤の存在で失われされている物質である。本研究で得られた結果は皮膚で1O 2 が生成すれば ･ OH の様な傷害性の強い酸素ラジカルに即座に変換される可能性を示唆するものである。
一方、紫外線で生じるラジカル反応の in vivo 測定では、。NADPH 存在下の UP

12 - 14）

光増感反応では H 2 O 2 が生成することが確認されたため、もし遷移金属がこの反応系に存在すれば ･ OH が生成する

紫外線照射下で惹起されるラジカル反応を in vivo でモニ可能性が考えられる。しかし、本研究で見られた現象は、

ESR シグナル消失速度の増加が如何なる活性酸素あるいタリングできる可能性を示した。Carbamoyl-PROXYL の− 60 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用

はフリーラジカルの生成によるものかは、今後様々なラジ

determination of hydrogen peroxide and organic

カル消去剤を用いてそのシグナル消失への影響を調べるこhydroperoxides at low concentration in aqueousとにより明確になるものと思われる。また、更にこのラジ

solution, Anal. Chim. Acta, 155 , 139 - 150 , 1983 .

カル反応のモニタリング系が確立されれば、抗酸化剤ある

10）Hirata H, Walczak T, Swartz HM, : Electronically

いはサンスクリーン剤のラジカル反応の抑制に基づく intunable surface-coil-type resonator for L-band EPR

vivo における評価法として有用となるものと思われる。

spectroscopy, J. Magn. Reson.., 142 , 159 - 167 , 2000 .
11）高城徳子 , 竹下啓蔵 , 平田

拓 ほか 2 名 , : ポルフィ

（引用文献）リン症モデルマウスの光照射により皮膚で生じるラジ１）Fuchs J, : Potentials and limitations of the natural

カル反応の in vivo ESR 解析 , 磁気共鳴と医学 , 10 , 135 -antioxidants RRR-alpha-tocopherol, L-ascorbic acidand beta-carotene in cutaneous photoprotection, Free

138 , 1999 .
12）Peters G, Rodgers MAJ, : Single-electron transfer

Radic. Biol. Med., 25 , 848 - 873 , 1998 .

from NADH analogues to singlet oxygen, Biochim.

２）Ryter SW, Tyrrell RM, : Singlet molecular oxygen( 1 O 2 ): a possible effector of eukaryotic gene expression,

Biophys. Acta, 637 , 43 - 52 , 1981 .
13）Inoue K, Matsuda T, Saito I, : A convenient method

Free Radic. Bio. Med., 24 , 1520 - 1534 , 1998 .

for detecting the superoxide ion from singlet oxygen３）Hattori Y, Nishigori C, Tanaka T, et al., : 8 -hydroxy-reactions of biological systems. Superoxide formation

2 '-deoxyguanosine is increased in epidermal cells of

from hydrogenated nicotinamide adenine dinucleotide

hairless mice after chronic ultraviolet B exposure, J.

and 5 -hydroxytryptophan, J. Photochem., 25 , 511 - 518 ,Invest. Dermatol., 107 , 733 - 737 ,  1997 .

1984 .

４）Saliou C, Kitazawa M, McLaughlin L, et al., :14）Bodanes RS, Chan PC, : Singlet oxygen as a mediator

Antioxidants modulate acute solar ultraviolet

in the hematoporphyrin-catalyzed photooxidation ofradiation-induced NF-kappa-B activation in a human

NADPH to NADP + in deuterium oxide, J. Biol. Chem.,
10 , 8554 - 8560 , 1977 .

keratinocyte cell line,  Free Radic. Biol. Med., 26 , 174 -15）Yim MB, Chock PB, Stadtman ER, : Copper, zinc

183 , 1999 .
５）Connor MJ, Wheeler LA, : Depletion of cutaneous

superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical

glutathione by ultraviolet radiation, Photochem.

production from hydrogen peroxide, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87 , 5006 - 5010 , 1983 .

Photobiol., 46 , 239 - 245 , 1987 .
６）Taira J, Mimura K, Yoneya T, et al., : Hydroxyl16）Halliwell B, : Protection against tissue damage inradical formation by UV-irradiated epidermal cells, J.

vivo by desferrioxamine; what is its mechanism ofaction?., Free Rad. Bio. Med., 7 , 645 - 651 , 1983 .

Biochem. 111 , 693 - 695 , 1992 .
７）Masaki H, Atsumi T, Sakurai H, : Detection of17）Feix JB, Kalyanaraman B, : Production of singlet

hydrogen peroxide and hydroxyl radicals in murine

oxygen-derived hydroxyl radical adducts during

skin fibroblasts under UVB irradiation, Biochem.

merocyanine- 540 -mediated photosensitization: Analysis
by ESR-spin trapping and HPLC with electrochemical

Biophys. Res. Commun., 206 , 474 - 479 , 1995 .
８）Yasui H, Sakurai H, : Chemiluminescent detection

detection, Arch. Biochem. Biophys., 291 , 43 - 51 , 1997 .

and imaging of reactive oxygen species in live18）Buettner GR, : Thiyl free radical production withmouse skin exposed to UVA, Biochem. Biophys. Res.

hematoporphyrin derivative, cysteine and light: a spin-Commun., 269 , 131 - 136 , 2000 .

trapping study, FEBS Lett., 177 , 295 - 299 , 1985 .

９）Frew JE, Jones P, Scholes G, : Spectrophotometric− 61 −

ヒト角層細胞の cell envelope の発生とその機能障害を来す病態の解析
帝京大学医学部附属市原病院皮膚科学教室

秋

山

真

志

Terminally differentiated stratified squamous epithelium forms a lining of the plasma membrane called the cornified
cell envelope (CCE), a thick layer of several covalently cross-linked precursor proteins including involucrin, small prolinerich proteins (SPRPs) and loricrin. Their cross-linking isodipeptide bonds are formed by epidermal transglutaminases(TGases) 1, 2 and 3. The formation of CCE and sequential expression of major CCE precursor proteins, TGases, and25-kD lamellar granule-associated protein (LGP) were studied in human embryonic and fetal skin. Ultrastructurally,
membrane thickening has already started in periderm cells of the two-layered epidermis and an electron dense,
thickened cell envelope similar to CCE in adult epidermis is observed in periderm cells at the three-layered and laterstages of skin development. In the two-layered epidermis (49-65 days EGA), immunoreactivities of involucrin, SPRPs,
all the TGases and LGP were present only in the periderm. In the three-layered epidermis and thereafter (66-160
days EGA), loricrin became positive in the periderm cells, TGases extended to the entire epidermis, and LGP was
detected in intermediate cells as well as periderm cells. Immunoelectron microscopy demonstrated that all three major
CCE precursor proteins, involucrin, SPRPs and loricrin, were restricted to the CCE in periderm cells at this stage ofdevelopment. After 160 days EGA, the periderm had disappeared and CCE proteins and LGP were expressed in the
spinous, granular and cornified cells and TGases were detected in the entire epidermis. These findings indicate that
CCE precursor proteins, TGases, and LGP are expressed in coordination in periderm cells during human epidermal
development and suggest that periderm cells form CCE in the process of regression.
As a next step, five patients with non-bullous congenital ichthyosiform erythroderma (NBCIE), one patient withlamellar icthyosis and two patients with mutilating palmoplantar keratoderma (MPPK) were studied.
In one patient out of five NBCIE cases, expression of TGase 1 molecule was markedly reduced in the patient’ s
epidermis. Electron microscopy revealed incomplete thickening of CCE during keratinization in the epidermis.
Sequencing of the entire exons and exon-intron borders of TGase 1 gene (TGM1) revealed that the proband was acompound heterozygote for two novel mutations, 9008delA and R388H. These findings indicate that the compound
heterozygote for missense mutation (R388H) in the core domain and the frameshift mutation (9008delA) resulting in apremature termination codon at the tail of the TGase 1 peptide leads to the NBCIE phenotype. TGM1 mutations werealso found in the lamellar ichthyosis patient.
In the patients with MPPK, ultrastructural, immunohistochemical, and immunoelectron microscopic analyses revealed
malformed CCE and reduced deposition of loricrin to CCE. Sequencing of the entire exons and exon-intron borders ofloricrin gene of the patients excluded a mutation in loricrin DNA sequence. These data confirm the presence of MPPK
phenotype with abnormal loricrin cross-linking at the final stage of CCE formation that is not caused by mutations in theepidermal differentiation complex region.

１．緒子生物学的解析により，cornified cell envelope は表皮細胞が言分化し角化する際に，細胞膜に loricrin, small proline-rich

皮膚の角層は，角化細胞と呼ばれる高度に分化した細胞より成っているが，角化細胞は，cornified cell envelopeという非常に厚い膜状物質に覆われている 。この cornified
１）cell envelope は，角化細胞のバリアー機能，相互接着，剥離において重要な役割を果たすと考えられており，魚鱗癬
等、角化細胞の剥離の障害によって起こる過角化を主症状とする疾患の発症に関与している可能性が示唆されている。
さらに，“肌荒れ” を来す角層のバリアー機能の障害にも

proteins, involucrin 等の複数の cornified cell envelope 前駆蛋
白が結合して形成されることが明らかになってきた。この前
駆蛋白間の結合は表皮に発現している transglutaminases（TGases）によって形成される２）３）。
ヒトの胎生期皮膚は、胎生 40 日以前では、表皮に特徴的な形態的所見を有さない単層の上皮細胞層として認められる。胎生 40 日を過ぎると、表皮は最上層の periderm とその下の基底細胞層の２層性となる４）。periderm は、胎生期密接に関与しているものと思われる。近年，生化学的，分の皮膚にのみ認められる細胞層であり、periderm を形成す

Studies on the developmental processesof human cornified cell envelope and thepathogenesis of its dysfunction

量しか持たず、細胞辺縁には大小の多数の突起を有するなる細胞は、細胞質内小器官に乏しく、ケラチン線維束を小ど、他の表皮細胞とは異なった形態的特徴を示す２）３）。胎

Masashi Akiyama

生 65 日を過ぎる頃より、periderm と基底細胞層の間に、

Department of Dermatology, Teikyo
University School of Medicine,
Ichihara Hospitalintermediate cell layer が認められるようになり、表皮は３層性となる。胎生 95 日を経ると、表皮は４層以上となり、
periderm は、次第に退縮傾向を示すようになる。それにつ− 62 −

ヒト角層細胞の cell envelope の発生とその機能障害を来す病態の解析

れて、下方の細胞層は、成人の表皮細胞に近い形態を示す

い，供与されたものである。今回は，胎生 49 日齢からようになり、胎生 160 日を過ぎると、periderm は消失し、163 日齢までの，皮膚疾患以外の障害により死亡，または，それと同時に、下層の細胞層は角化する。この時期の表皮

妊娠中絶されたヒト胎児よりの皮膚組織が用いられた。

には、既に成人の表皮に認められる基底層、有棘層、顆粒

２. ２層、角層の各成分がそろっている。

形態学的観察：periderm について多くの研究がなされてきたが、いま

ヒト胎児皮膚組織を２％グルタ−ルアルデハイドにて固だに、この細胞層の本態は明らかにされておらず、その機

定、オスミウム酸にて後固定、型通り脱水後エポキシ樹脂

能、および、この細胞層の退縮、消失するメカニズムも不中に包埋、光顕観察用に厚さ１µm の切片、電顕観察用に明である。この periderm について、明らかなことは、は

は、厚さ 70 nm の切片を作製観察した。

じめは、単層上皮として生じ、細胞表面、および、細胞内小器官の一連の形態学的変化をへて、表皮の角化が始まる

２. ３のと時を同じくして消失することである 。

抗体：

本研究に用いた一次抗体は、以下のものである：モノク

４）loricrin, small proline-rich proteins, involucrin 等のロ−ナル抗ヒト SPRPs 抗体（mouse）７）、ポリクロ−ナル

cornified cell envelope 構成蛋白それぞれの，ヒト皮膚に抗ヒト involucrin 抗体（rabbit）（Biomedical Technologies,

おける発現様式，および，超微形態学的分布には，未だ不Inc.）、ポリクロ−ナル抗ヒト loricrin 抗体（rabbit）８）、ポ

明な点が多く，ヒト皮膚における cornified cell envelope

リクロ−ナル抗ヒト TGase 1 抗体（goat）９）、ポリクロ−の機能の解析，その機能障害を来す病態の解明に際して大ナル抗ヒト TGase 2 抗体 (rabbit) 10）、ポリクロ−ナル抗ヒきな障害となっている。今回の研究の第１の目的は，ヒト

   モノクロ−ナル抗ヒト LGP
ト TGase 3 抗体（rabbit）10）、胎生期皮膚の periderm を含む表皮における cornified cell

抗体、AE 17（mouse）11）。

envelope の形成のメカニズムを明らかにすることである。
さらに、最近、葉状魚鱗癬の患者家系において、分子遺伝
学的に、表皮の transglutaminase の異常が報告されたが２. ４

免疫蛍光抗体法、免疫電顕法：

免疫蛍光抗体法は，皮膚組織より未固定の厚さ６µm の

５）

６）、 こ の 表 皮 の transglutaminase は、cornified cell

凍結切片を作成、FITC 飽合二次抗体を用いて染色した。

envelope の構成蛋白を表皮細胞膜へ結合させる際に働く

必要に応じて propidium iodide にて核染色を施行した．

ことが知られている。以上の事実より、葉状魚鱗癬の発症

免疫電顕用には、皮膚組織を液体プロパンを用いて凍結固に、cornified cell envelope の構成蛋白の細胞膜への結合

定、エタノ−ルによって凍結置換し、Lowicryl K 11 M 中障害を含めた、cornified cell envelope の形成異常が関与に包埋したブロックを用いた。超薄切片を作製後、免疫反している可能性が強く示唆されている。さらに、非水疱型応を施行、１nm ゴ−ルド粒子飽合二次抗体を用い、silver

先 天 性 魚 鱗 癬 様 紅 皮 症（non-bullous congenitalenhancement 法を行ない一次抗体の沈着部位を観察した。

ichthyosiform erythroderma）の症例においても、表皮のtransglutaminase の活性の低下が報告されている。以上の

２. ５

先天性角化異常症患者：

事実より、cornified cell envelope の形成異常が葉状魚鱗

非水疱型魚鱗癬様紅皮症５例（４家系）、葉状魚鱗癬１

癬、非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症の発症において、重要

例
（１家系）
、
mutilating palmoplantar keratoderma ２例（１な役割を果たしている可能性が考えられる。

家系）について、完全な informed consent に基づき、皮本研究の第２の目的は、先天性魚鱗癬などの角化異常症

膚生検を施行した。遺伝子変異の検索のため、末梢血を採の病変部皮膚における cornified cell envelope 構成蛋白の取、genomic DNA を抽出した。同時に、家系内の健常者発現および分布様式を解析することにより，involucrin,

からも、可及的に DNA を得た。

loricrin, small proline-rich proteins 等の cornified cellenvelope 構成蛋白がヒト角層細胞の cell envelope の機能２. ６維持に果たす役割を解明することである。

２．実
２. １

遺伝子変異の同定

患者ならびに家族の末梢血より得られた genomic DNA
について、上記の形態学的検討の結果、発現、分布に異常の験みられた蛋白（今回は、transglutaminase 1 および loricrin）

ヒト胎児皮膚検体：について遺伝子変異の検索を行った。genomic DNA を鋳型

本 研 究 に 用 い ら れ た ヒ ト 胎 児 組 織 は 全 て，Central

として、PCR にてその遺伝子のすべての exon ならびにLaboratory of Human Embryology，University ofexon-intron 境界部分を増幅し、自動シークエンサーにて解Washington（Seattle）より，Human Subjects Review

析 し た。 遺 伝 子 変 異 が 見 い 出 さ れ た も の に つ い て は、Board の認可のもと，United States DHEW policies に従

enzyme digestion 法あるいは allele specific oligonucleotide− 63 −

hybridization 法により、遺伝子変異を確認した。

３．結
３. １

loricrin、SPRPs などの、cell envelope の構成蛋白は、intermediate cell、基底細胞には、まだ、発現が見られな

果かった。層板顆粒の成分蛋白は periderm と intermediate

ヒト胎児表皮における cornified cell envelopeの発生

３. １. １cell に発現がみられ、特に、強い線状の分布が、peridermと intermediate cell が接する部分にみられた。

12）２層性の表皮（胎生 40 ー 65 日）：
３. １. ３ ４層性、および、それ以降の表皮（胎生 96 −２層性の表皮（胎生 40 − 65 日）の時期のヒト胎児皮膚160 日）：

は最表層の periderm と、その下方の基底膜上の基底細胞層の２層からなっている（図１）。この期間の初期には、４層性、さらに、それ以上の多層性の表皮（胎生 96 −電顕上、Periderm の細胞は、厚さ 7 - 9 nm の平坦な細胞膜

160 日）になると（図１）、電顕的には periderm の細胞膜を有していた（図２）。後期に入ると、Periderm の細胞のは３層性の時期よりさらにその厚さと電子密度を増し、こ細胞膜が次第に厚くなってくるが、同時期の基底細胞の細の時期の後期の periderm の細胞膜は成人の角化細胞の胞膜には肥厚は認められなかった。免疫組織学的には、

cell envelope と同様、約 15 nm の厚さの高電子密度の層

involucrin、および、SPRPs が、periderm の細胞に陽性になった（図２）。３層性の表皮から引き続いて、この時であり、細胞辺縁により多く存在していた。他方、この時期 の 早 期 か ら、periderm に は、 免 疫 蛍 光 抗 体 法 で は、期、involucrin、SPRPs ともに、基底細胞は、発現していTGases 1 , 2 , 3、involucrin、SPRPs、および、loricrin は、なかった。TGases 1 , 2 , 3 は、periderm に陽性であり、基全て陽性であった。この periderm における TGases 1 , 2 , 3、底細胞にも、弱い発現が認められた。loricrin はこの時期、

involucrin、SPRPs、および、loricrin の発現は、表皮の角

periderm の細胞、基底細胞ともに陰性であった。層板顆

化にともない periderm が消退するまで、常に認められた。

粒の成分蛋白も、periderm の細胞のみに、発現がみとめられた。

cell envelope の構成蛋白が、実際に、periderm の細胞膜近傍で cell envelope を、形成しているのかどうかを知るため、免疫電顕を用いて調べると、平坦な部分、細胞突

３. １. ２３層性の表皮（胎生 66 ー 95 日）：起を形成している部分ともに、involucrin, SPRPs、および、

３層性の表皮（胎生 66 − 95 日）になると、periderm

loricrin は、periderm の細胞膜の厚くなっている部分に局の下層には、基底細胞と periderm の間の intermediate

在して認められた（図３）。periderm 直下の intermediatecell が見られる（図１）。この時期、電顕的には periderm

cell では、involucrin の発現が見られるものの、その他のの細胞膜はさらにその厚さと電子密度を増しいた（図２）。
免疫蛍光抗体法では、TGases 1 , 2 , 3、involucrin、SPRPs、
および、loricrin は、全て periderm に陽性であった。それらの蛋白は、すでにこの時期に、蛍光顕微鏡レベルでも、
periderm の細胞辺縁に分布していることが分かった。cell
envelope の構成蛋白の periderm の細胞膜への局在は、免疫電顕によって確認された。periderm より下方の基底細胞、intermediate cell でも、TGase の発現は認められるものの、periderm と比較すると非常に弱い発現であった。

図１. ヒト胎児表皮の発生の模式図(a) 未分化な単層の上皮より成る表皮 (<40 days estimated gestational age (EGA)). (b) ２層性の表皮 (40-65 days
EGA). (c) ３層性の表皮 (66-95 days EGA). (d) ４層以上の表皮 (96-160 Days EGA). (e) 毛嚢間表皮の角化を示す表皮(>160 days EGA). 矢尻 , periderm.（文献 12 より引用）。

図２. ヒト胎児表皮の発生過程における cornified cell envelopeの形成の電顕像(a) ２層性の表皮 (51-65 days EGA). (b) ３層性の表皮(66-95 days EGA). (c) ４層以上の表皮 (96-160 Days EGA).
(d) 毛嚢間表皮の角化を示す表皮 (>160 days EGA). (a) periderm cell の細胞膜の肥厚は、２層性の時期の表皮において既に始まっている。３層性の表皮 (b) および ４層以上の表皮 (c) では、periderm cell の細胞辺縁には高電子密度の厚いcell envelope が既に見られる。 (d) periderm が退縮したあとの表皮では角化した表皮細胞の細胞辺縁に cell envelopeが形成されている。 Bar; 0.3μm.（文献 12 より引用）。

− 64 −

ヒト角層細胞の cell envelope の発生とその機能障害を来す病態の解析

cell envelope の構成蛋白（loricrin、SPRPs など）は、基始めた細胞は、厚さおよそ 15 nm の、成人の皮膚の角層の底細胞、および、intermediate cell では陰性であった。

cell envelope と類似の厚く、電子密度の高い細胞膜を形成

TGase の発現はこの時期の表皮の全層に認められるが、していた（図２）。cell envelope の構成蛋白、involucrin,

角化において最も重要な TGase の subtype である TGase

SPRPs, loricrin, ならびに層板顆粒の成分蛋白のすべてが、

1 の発現は、基底細胞層では弱かった。層板顆粒の成分蛋

この時期の顆粒細胞層および角化細胞層に陽性であった。

白は、３層性の表皮におけるのと同様に、periderm と層板顆粒の成分蛋白は，角層と顆粒層の間に特に強く線状

intermediate cell に認められた。periderm とその直下のに分布していた．TGase 1 , 2 , 3、の発現は，表皮全層にみintermediate cell とが、接する面にみられる強い線状の発られ，TGase 1 および 3 の分布は細胞辺縁に膜状に認めら

現は、３層性の表皮の時期より、さらに、強調されてきてれた．これらの所見は、成人の皮膚で見られるものと同様いた。これは、periderm の下床の細胞層が、この後の時であった。

期に、最初の角化を始める予兆とも言える。

３. ２

先天性角化異常症患者における cornified cellenvelope の形成

３. １. ４ Periderm 退縮後の角化を示す表皮（胎生 161

３. ２. １日以降）：

５例中４例の非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症患者におい

毛嚢間表皮が角化を示す胎生 160 日以降の表皮では、
periderm は完全に消失している（図１）。最上層の角化し

非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症て、involucrin, loricrin, TGases １, ２, ３の分布は正常であった 13）。１例の非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症患者においてのみ、TGase １の発現に低下が見られた 14）。超微形
態学的には、前者４例では、cornified cell envelope の正常な形成が認められたが、TGase １の発現に異常がみられた１例では、cornified cell envelope の形成不全が観察された（図４）14）。
３. ２. ２

葉状魚鱗癬

今 回 検 索 し た １ 例 の 葉 状 魚 鱗 癬 患 者 に お い て、
involucrin, loricrin, TGases ２, ３の分布は正常であったが、TGase １蛋白の発現に低下が見られ、TGases １活性も低下していた。超微形態学的にも、cornified cell envelopeの形成不全が確認された。

図３. 免疫電顕像：ヒト胎児表皮の periderm における cornified
cell envelope の形成
Colloidal gold を用いた immunoelectron microscopy にて、
periderm の細胞膜に involucrin (b,c)、および、loricrin (d) が結合していることが示された。(a) は、正常成人皮膚における角層細胞の細胞膜への involucrin の沈着（文献 12 より引用）。

図４. TGase 1 活性の低下を認めた非水疱型魚鱗癬様紅皮症症
例における皮膚の病理組織像、および電顕像(a) 著明な hyperkeratosis と中等度の acanthosis が患者皮膚には見られた (toluidine blue stain)。(b) 電顕的には顆粒細胞内の keratin clump や脂肪滴は認められなかった。(c) 顆粒層の細胞では、薄い cell envelope ( 矢尻 ) が正常に形成されていた。(d) 角層では、cornified cell envelope ( 矢尻 ) は、患者皮膚では著明に薄く、低形成を認めた。 (e) 正常皮膚における cornified cell envelope ( 矢尻 )。Bars, 50μm(a), 1
μm(b), 0.3μm(c-e).（データは文献 14 より引用）。

− 65 −

３. ２. ３ Mutilating palmoplantar keratoderma 15）
２例（１家系）の患者病変部皮膚において免疫蛍光抗体法では、involucrin および SPRPs は、病変部では正常皮膚に比して、より広い範囲で、正常の顆粒層の部分より下方においても発現していた。光顕レベルでも involucrin および SPRPs の顆粒細胞における細胞膜への局在が認められた．loricrin の発現は，病変部皮膚において著明に減弱しており，顆粒細胞においても細胞質内に弱い染色性が認められるのみであり，細胞膜への沈着は認められなかった．超微
形態学的には角化細胞内に異常な脂肪滴が認められた。 移 行 細 胞 か ら 上 方 に お い て、cornified cellenvelope の形成がみられたが、正常ヒト皮膚で認められる顆粒細胞から角化細胞にかけての，電子密度の高い物質の沈着による cornified cell envelope の肥厚が見られなかった（図５）．免疫電顕法では、病変部皮膚においても、正常皮膚と同様に、involucrin
および SPRPs は cornified cell envelope の形成に伴い cornified cell envelope 部分に局在していた。しかし、loricrin の cornified cell envelope への沈着は正常皮膚と比べて減少していた（図６）．

３. ３

先天性角化異常症患者における遺伝子解析結果
３. ３. １

図５. mutilating palmoplantar keratoderma 病変部皮膚の電顕像(a) 顆粒層の細胞は、正常なケラチン束とケラトヒアリン顆粒を形成していた。(b) 正常な、薄い cornified cell envelope ( 矢尻 ) が、顆
粒層の細胞には見られた。(c) 患者病変部の角層では cornified cell envelope ( 矢尻 ) の低形成があり、cornified cell envelope ( 矢尻 ) は正常
皮膚 (d) におけるものとくらべて著明に薄かった。薄い cornified cellenvelope と desmosome からなるリング状の構造が、顆粒層上部の細胞に見られた (e)。矢尻 , cornified cell envelope; 矢印 , lipid droplets。
Scale bars, 2μm (a), 0.2μm (b-d), 0.5μm (e).（文献 15 より引用）。

非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症：

TGase １ の 発 現 に 異 常 を 認 め た １ 例 で、direct
sequencing の 結 果、TGase 1 gene（TGM1） に、
heterozygous な２つの変異、9008 delA (paternal) とR 388 H（maternal）、が認められた（図７）。これらの変異は、コントロールとした正常日本人 50 人のDNA には、認められなかった。 TGM 1 のすべてのexons、exon-intron borders に つ い て direct
sequencing を行ったが、この変異の他には、病因となり得る変異は見られなかった。
３. ３. ２葉状魚鱗癬：

今回検索した１例で、direct sequencing の結果、

図６. 免疫電顕像：mutilating palmoplantar keratoderma の症例における cornified cell envelope の形成不全患者皮膚 (a) では、正常人皮膚 (b) と比べて loricrin の細胞膜への結合が少ない。他方、患者皮膚 (c) での involucrin のラベルは、正常人皮膚 (d) より強い（文献 15 より引用）。

TGase 1 gene (TGM 1 ) に、heterozygous な２つのミスセンス変異、L 204 Q と R 306 W、が認められた。
これらの変異は、コントロールとした正常日本人 50
人の DNA には、認められなかった。GM 1 のすべての exons、exon-intron borders について direct
sequencing を行ったが、この変異の他には、病因となり得る変異は見られなかった。
３. ３. ３

Mutilating palmoplantar keratoderma：

loricrin gene の２つの exons には、調べ得たかぎ

図７．TGase 1 活性の低下を認めた非水疱型魚鱗癬様紅皮症症例に見られた TGase 1 遺伝子の変異、9008delA および R388H
本家系の父方の変異、9008delA は、TGase 1 蛋白の c 末に 置する β-barrel 2 domain 内にある。母方の変異、R388H は、TGase 1蛋白の酵素活性部位を含む core domain 内にある
（文献 14 より引用）。

− 66 −

ヒト角層細胞の cell envelope の発生とその機能障害を来す病態の解析

り、mutation は発見されなかった。

４．考TGase 1 の遺伝子変異が原因である可能性が示された。また、 本 研 究 の 対 象 と な っ た mutilating palmoplantar

察

keratoderma の症例では cornified cell envelope の形成不本研究の結果，主な cornified cell envelope 前駆蛋白で全がありながら、既知の cornified cell envelope 関連蛋白ある involucrin, SPRPs，および，loricrin は，ヒト皮膚の遺伝子に変異がある可能性は否定的であった。このことか発生過程において periderm の細胞に存在していることがら、今回の mutilating palmoplantar keratoderma の症例

明らかになった。さらに，胎生期に，TGases 1 , 2 , 3，については、その病因として、他のまだ明らかにされていLPG が，やはり，periderm の細胞に発現していることがない cornified cell envelope 関連蛋白等が想定された。

示された。これらの免疫蛍光所見と，超微形態学的に出生時に最も重篤な症状を呈する葉状魚鱗癬などの場合、

periderm の細胞膜に肥厚が認められることとを考え合わ

病像の形成に胎生期の cell envelope の形成異常などが関せると，ヒト胎児の発生過程にある表皮の periderm は，与している可能性が考えられ 18）19）、ヒト胎生期表皮のその退縮過程において，成人皮膚の角化細胞が形成するもperiderm の退縮、ケラチノサイトの角化などの過程は、のと類似の cornified cell envelope を形成することが推測

表皮細胞の発達、分化のメカニズムを理解するという意味される。免疫電顕による検討の結果，主な cornified cellのみでなく、重症型魚鱗癬の病態の解明という点からも今

envelope 前駆蛋白である involucrin, SPRPs，および，後の興味深い研究対象である。

loricrin は，ヒト皮膚 periderm の肥厚した細胞膜に結合

近年、腫瘍発生のメカニズム、遺伝性皮膚疾患とその出した形で存在していることが確認された。これは，上記仮生前診断、遺伝子治療と関連した幹細胞の生物学、各種の説，すなわち，periderm が cornified cell envelope を形成

分化、増殖の制御因子の研究等、様々な分野で発生学的なするという考えを支持するものである。以上の今回得られアプローチは、盛んに行われている。今後、ますます、皮たデータより，cornified cell envelope の形成という点か

膚発生学が皮膚科学、皮膚の生物学の領域で占める役割は

らみると，periderm の退縮過程は，成人皮膚表皮のケラ大きくなるものと考えられる。この発生学的アプローチとチノサイトの角化過程と類似したものであるといえるであ

角化異常症の患者皮膚を対象とした研究によって、さらに
他の cell envelope 構成蛋白の分布，役割が明らかなり、ろう。
periderm の細胞は、胎芽から胎児へと発達する時期か

他の cornified cell envelope 関連蛋白と角化症の病因の関ら、毛嚢間表皮が角化を始める時期までの間に、顕著な形

係、さらには、cornified cell envelope 本体、ならびに個々

態学的変化を示す。この periderm の細胞の形態的変化のの構成蛋白の機能が明らかになることが期待される。

なかで、後期（退縮期）の変化と、表皮細胞の角化との間には、類似点が見られる。periderm の細胞も、退縮期には、 （参考文献）
中間径繊維をのこして、細胞内小器官を失い、核は凝集し１）Hohl D: Cornified cell envelope. Dermatologica 180 : 201 211 , 1990てくる。これらの所見から、periderm は、「普通とは異なる角化様式を示す角化細胞層」とも考えられるわけである。

２）G r e e n b e r g C S , B i r c k b i c h l e r P J , R i c e R H :periderm の退縮から表皮の角化への、角化様式の転換は、

Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzyme

羊水中から出生後の環境へと、急激に変化する外部環境に、that stabilizes tissues. FASEB J 5 : 3071 - 3077 , 1991

胎児が適応するように、胎児の体表面を変えることになる。

３）Steinert PM, Marekov LN: The proteins elafin, filaggrin,

periderm の存在意義，及び，その退縮のメカニズムを解

keratin intermediate filaments, loricrin, and small proline-

明するためには，さらなる今後の研究が必要と思われる。

rich proteins 1 and 2 are isodipeptide cross-linked
components of the human epidermal cornified cell

近年、cell envelope 前駆蛋白のなかで重要なものである

envelope. J Biol Chem 270 : 17702 - 17711 , 1995

loricrin の 異 常 に よ る cell envelope の 形 成 不 全 が、Vohwinkel syndrome 16）や erythrokeratoderma 17）等の遺４）Holbrook KA, Odland GF: The fine structure of

伝性角化異常症の病因であることが明らかになり、また、

developing human epidermis: light, scanning, andloricrin 分子の異常以外にも、cell envelope の異常が掌蹠transmission electron microscopy of the periderm. J

角化症等の原因となり得ることが示唆されている 15）。葉

Invest Dermatol 65 : 16 - 38 , 1975

状魚鱗癬の一部の家系でも、TGase 1 の異常による cell５）Huber M, Rettler I, Bernasconi K, et al.: Mutations ofenvelope の形成不全がその病因であることが報告されてkeratinocyte transglutaminase in lamellar ichthyosis.

いる５）６）。今回の研究の結果からは、検索した１例の日本

Science 267 : 525 - 528 , 1995

人葉状魚鱗癬患者において、TGase 1 遺伝子に変異が認め

６）Russell LJ, DiGiovanna JJ, Rogers GR, et al:: Mutations

られた。さらに、非水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症でも、

in the gene for transglutaminase 1 in autosomal recessive− 67 −

lamellar ichthyosis, Nature Genet 9 : 279 - 283 , 1995

168 , 1997

７）Hohl D, de Viragh PA, Amiguet-Barras F, et al:: The

14）Akiyama M, Takizawa Y, Kokaji T, et al.: Novelsmall proline-rich proteins constitute a multigene family

mutations of TGM 1 in a child with congenitalof differentially regulated cornified cell envelope

ichthyosiform erythroderma. Br J Dermatol  144 : 401 - 407 ,precursor proteins. J Invest Dermatol 104 : 902 - 909 , 1995

2001

８）Mehrel T, Hohl D, Rothnagel JA, et al:: Identification of15）Akiyama M, Christiano AM, Yoneda K, et al:: Abnormala major keratinocyte cell envelope protein, loricrin. Cellcornified cell envelope formation in mutilating

61 : 1103 - 1112 , 1990

palmoplantar keratoderma unrelated to epidermal９）Kim I-G, McBride OW, Wang M, et al:: Structure anddifferentiation complex. J Invest Dermatol 111 : 133 - 138 ,organization of the human transglutaminase 1 gene. J
Biol Chem 267 : 7710 - 7717 , 1992

199816）Maestrini E, Monaco AP, McGrath JA, et al:: A10）Tarcsa E, Marekov LN, Andreoli J, et al:: The fate ofmolecular defect in loricrin, the major component of thetrichohyalin: sequential post-translational modifications bycornified cell envelope, underlies Vohwinkel syndrome.

peptidyl-arginine deiminase and transglutaminases. J Biol

Nature Genet 13 : 70 - 77 , 1996

Chem 272 : 27893 - 27901 , 199717）Ishida-Yamamoto A, McGrath JA, Lam H-M, et al:: The

11）O'Guin WM, Manabe M, Sun T-T: Association of a basic

molecular basis of autosomal dominant

25 K protein with membrane coating granules of humanerythrokeratoderma: a frameshift mutation in the loricrin

epidermis. J Cell Biol 109 : 2313 - 232 , 1989

gene. Am J Hum Genet 61 : 581 - 589 , 199712）Akiyama M, Smith LT, Yoneda K, et al:: Periderm cells18）Akiyama M: Severe congenital ichthyosis of theform cornified cell envelope in their regression processduring human epidermal development. J Invest Dermatolneonate. Int J Dermatol 37 : 722 - 728 , 1998
19）Akiyama M: The pathogenesis of severe congenital

112 : 903 - 909 , 1999

ichthyosis of the neonate. J Dermatol Sci 21 : 96 - 104 , 1999

13）Akiyama M, Shimizu H, Yoneda K, et al:: Collodion
baby: ultrastructure and distribution of cornified cellenvelope proteins and keratins. Dermatology 195 : 164 -− 68 −

微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立
長崎大学

佐 々 木

医学部附属病院薬剤部

均、中

嶋

幹

郎

Microdialysis is a relatively new technique for sampling tissue extracellular fluid that is gaining popularity inkinetic and dynamic studies of drugs in experimental animals. Intradermal microdialysis permits us to measure
directly the concentration in dermis of test substances applied to the skin without loss of fluid volume. In thisstudy, we have attempted to use this technique for characterizing the kinetic behavior in dermis of cosmetic
compounds applied to living skin and evaluating the effect of cosmetic compounds permeated through the skin on
biological elements in the surrounding dermal tissue of the rats. In general, several cosmetic compounds showing
pharmacological activity were formulated in commercially provided cosmetics with various additives. It is importantto evaluate the adequacy of intradermal microdialysis to quantify the interest cosmetic compound in cutaneous
tissue following the topical application of its commercial product including various the other cosmetic compounds.
Therefore, first we used Sandimmun that is 10% oily pharmaceutical preparation of cyclosporin (CYA), a low skinpermeable peptide, as the model product reflecting commercial cosmetics and measured the dermal concentrationof CYA applied topically alone or with absorption enhancers. As the results, intradermal microdialysis enabled
us to monitor cutaneous CYA quantitatively in proportion to its applied concentration to the skin. In addition, we
found suitability of glycerin as an enhancer in the cutaneous penetration of CYA from its commercial product.
Subsequently, the effect of barrier perturbation by delipidization on the cutaneous penetration of salicylic acid (SA)and the effect of SA permeated through the skin on the dermal endogenous homovanillic acid (HVA) were examined.
SA was chosen as the model cosmetic compound because it is extensively used in the commercial cosmetics. As theresults, enhanced cutaneous penetration of SA was correlated with the increase in barrier perturbation activity bydelipidization. However, the dermal endogenous HVA levels were virtually unaffected by the increase in cutaneous
penetration of SA in the various delipidized skins. A correlation between the dermal endogenous HVA levels andthe cutaneous concentrations of SA was not found in the barrier-damaged skins.
This technique must become an available tool for kinetic analysis in dermis of cosmetic compounds and evaluationof their effects on biological elements in the surrounding dermal tissue.

１．緒

しかし、吸収促進剤の応用には、それら自身が皮膚内に浸言

透し、刺激性や毒性を発現する可能性も懸念される。この

近年、美白剤など様々な新しい化粧品素材が開発されてように、市販の化粧品には様々な薬用成分や添加剤が配合いるが、市販の化粧品には、香料や色素のほか、薬理活性されているにもかかわらず、皮膚内における化粧品成分のを示す化合物が保湿剤や血行促進剤として配合され、経皮動態や相互作用、化粧品使用時における皮膚内生体成分の的な適用が行われている。しかし、皮膚表面の最外層に位変動に関する情報は極めて少ない。従来、化粧品成分の皮置する角質層が、外部から皮膚内への物質の透過に対す

膚内濃度や生体成分への影響などに関しては、動物レベル

るバリアー機能として働いているため、経皮適用された物

で放射性物質を用いた研究が行われてきた。それらは被験

質が皮膚内へ浸透するには、著しい制限が加えられてい物質を経皮適用した後、動物を屠殺して皮膚組織を採取し、る。この透過障壁においては、角質細胞間隙脂質が重要な

皮膚内濃度を測定する方法が主なもので、通常、１試料に因子であることが明らかとなってきた１）。そこで、市販の１個体を必要とするため、実験には多くの動物が必要とさ化粧品に含有されている薬用成分の経皮吸収性を向上される。このことがこの分野の系統的な研究の妨げとなってせる試みとして、角質層と親和性の高い油性基剤の利用

２）

きた。
微小透析法は、血管または任意の組織中に、先端に半透や、従来、薬物の皮膚透過性改善の目的で利用されてきた
経皮吸収促進剤の化粧品への応用

３）等が報告されている。

膜のついた小型の透析プローブを挿入することにより、非侵襲的に近い状態で、血液や組織の細胞外液中に存在する

Application of Microdialysis to In Vivo
Kinetic Analysis in Dermis of Cosmetic
Compounds and Biological Elements

グ法である（Fig. １）４）。
本法は、主として神経薬理学研究の領域で、脳内の薬物

Hitoshi Sasaki, Mikiro Nakashima

濃度や内因性神経伝達物質の検出に用いられてきた５）。しDepartment of Hospital Pharmacy,
Nagasaki University School of Medicine

かし、実験動物を屠殺せずに１個体から多数の試料を採取＊＊

物質の濃度を連続測定できる独創的な in vivo サンプリン

することが可能で、被験物質の非結合型濃度を直接測定できるといった優れた利点を有しているため、近年では、様々− 69 −

動態との関連性の解析を試みた。

２．実
２. １

験

試料ならびに試薬

市販医療用製剤としては、主成分であるシクロスポリン（CYA）に種々の添加剤を加え、エタノールとオリーブ油に混合し 10％油性溶液とした
Sandoz Pharma 製のサンディミュン
内用液を用い、オリーブ油で希釈することにより CYA の 0 . 5、２および８％濃度油性溶液を調製した。化粧品に適用可能な吸収促進剤の候補として、広く化粧品に用いられているグリ
Fig.1 Schmatic representation of solute recovery in vivo and in vitro during microdi- セリンと、経鼻吸収型カルシトニン製
alysis. Cited from reference 4.
剤に吸収促進剤として添加されている

ピロチオデカン（久光製薬より供与）な組織中における薬物濃度の測定に用いられるようになっ４）

12、13）を選び、それらを種々の濃度（１、３、６、10 およてきた 。著者らもこれまで微小透析法を用いて、各種薬

び 20％）で加えた２％ CYA 油性溶液を調製した。化粧品

物動態の詳細な解析に成功している６〜 11）。経皮吸収動態

成分のモデルである SA はナカライテスクの特級試薬を用の解析においては、皮膚内から抜去可能なガイドカニュー

い、皮膚に適用する際にはエタノールに混合し５％ SA 溶

レを利用した透析プローブのみの皮膚内挿入法を世界に先液とした。角質細胞間隙脂質の除去溶媒として用いたアセ

駆けて試み、ラットへ経皮適用した抗炎症薬の皮膚組織中

トン、ジエチルエーテル、クロロホルムならびにメタノー濃度の連続測定に、本法が適用できることを明らかにした

ルは全てナカライテスクの特級試薬を用いた。CYA の蛍

11）。組織中物質濃度の in vivo 定量法として本法を適用す

光偏光免疫測定用試薬キットはダイナボットから購入しる際には、被験物質の組織細胞外液中からプローブ灌流液

た。カテコールアミン類（ドーパミン塩酸塩、ノルエピネ

中への回収率（透過率）を厳密に算出することが必要であ

フリン塩酸塩、DOPAC、ホモバニリン酸；HVA）は全てる。しかし、その回収率の正確な測定は難しく、本実験法

Sigma の特級試薬を用いた。オクタンスルホン酸ナトリウ

は、組織における被験物質動態の相対的変化を検討する方

ムは Aldrich の特級試薬を用いた。過塩素酸、塩酸、リン法としては極めて高い有用性を示すが、絶対量を検討する

酸一カリウム、リン酸ならびにエチレンアミン四酢酸二ナ

方法としては限界があるとも考えられる。

トリウム（EDTA・2 Na）は全て和光純薬の特級試薬を用

今回著者らは、様々な薬用成分を含有する市販化粧品をいた。その他の試薬についても全て特級品を使用した。

皮膚表面へ適用した際の被験成分の皮膚内動態や他成分との相互作用、皮膚内生体成分への影響等を in vivo の状態

２. ２

微小透析装置で定量的に評価する簡便な実験系として、この微小透析法

Carnegie Medicin 製の CMA/ 100 微量注入ポンプにを応用することを考案した。本研究では、まず最初に、市CMA/ 10 透析プローブ（透析膜の長さ 10 mm）を接続し、販化粧品のモデルとして、被験化合物に加えて他の化合物

リンゲル液を 2 . 5 µL/min の微小速度で灌流した。

が添加剤として配合されている医療用油性製剤を選び、ラット皮膚表面へ製剤適用後の被験化合物の経皮吸収動態を

２. ３

動物実験

経皮微小透析法により種々検討し、市販化粧品を皮膚適用

Wistar 系雄性ラット（体重 250 〜 270 g）をウレタンした際の皮膚内における特定成分濃度定量法としての本法

1 . 5 g/kg の腹腔内投与による麻酔下、腹部皮毛を電気バリの有用性について評価した。さらに、化粧品成分として繁カン（動物用 900 型、大東電気工業）で除毛した。透析プ用されているサリチル酸（SA）をモデルに選び、ラット

ローブを皮膚から抜去可能な自製の経皮用ガイドカニュー

皮膚表面へ SA を適用した際の SA の経皮吸収速度に及ぼレ（ポリエチレン製）を用いてラットの皮膚内へ挿入し、す角質層の脱脂方法の影響と、その時の内因性カテコール

自製のガラスリザーバー（内径 20 mm）をプローブ挿入部

アミン濃度の変動を本法により検討し、物質浸透性が変化

位の皮膚上にアロンアルファＡ（三共）にて固定した 11）。

した皮膚における化粧品成分の吸収動態と皮膚内生体成分

CYA 油性溶液を用いた実験では、ガラスリザーバー固− 70 −

微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立

定１h 後に種々の CYA 油性溶液２mL をその中に充填し、で pH を 2 . 95 に調整した 0 . 05 M リン酸カリウム緩衝液を適用６h 後まで透析液を１h 毎に皮膚内より回収し、全量移動相とし、室温で、ポンプ流速を 1 . 0 mL/min に設定しを CYA 濃度測定用に供した。

て行った。

SA エタノール溶液を用いた実験では、ガラスリザーバーを固定した後、アセトン、ジエチルエーテルまたはクロ２. ５

速度論的解析

ロホルム / メタノール（２：１）混合液２mL をそれぞれ皮膚内から回収された透析液中における CYA および SA

リザーバー中に加え、１h にわたって角質層の脱脂を行っの累積回収量を時間に対してプロットし、各プロットの直た。コントロールについては生理食塩水を加えた。脱脂溶

線部分の傾きおよび時間軸に対する切片より、透析液中へ媒除去１h 後に５％ SA エタノール溶液２mL をリザーバの CYA および SA の回収速度およびラグタイムを算出しー中に充填し、適用６h 後まで透析液を１h 毎に皮膚内よた。なお、皮膚透析液中での物質の時間変化は皮膚内へのり回収し、100 µL を SA 濃度測定用に、40µL をカテコー

物質の累積吸収量の時間変化と等しいと仮定できるため 15）、

ルアミン測定用に供した。なお、カテコールアミン測定用

上述の回収速度とラグタイムは、CYA および SA のみかの試料には酸化を防ぐ目的で 1 M 過塩素酸 10 µL を加えた。

けの経皮吸収速度と経皮吸収のラグタイムに相当する。

２. ４

２. ６

定量

透 析 液 中 の CYA は、TDX 自 動 測 定 装 置（Abbott
Laboratories）を用いた蛍光偏光免疫測定法により定量した。

統計処理

得られた実験値の有意差の検定は Student の t 検定を使用した。

透析液中の SA は、先に報告した方法 14）を参考にし、得３．結果と考察られた試料にアセトニトリルを等容量加えた混合物を調製した後、高速液体クロマトグラフィー蛍光検出法により定

種々の添加剤が配合されている市販品から調製した量した。高速液体クロマトグラフは LC- 6 A 型ポンプ
（島津）

CYA の油性溶液を、ラット皮膚表面へ適用した後の CYAを用い、RF- 535 型蛍光検出器（島津）を励起波長 300 nm、の経皮吸収動態を経皮微小透析法を用いて種々検討するこ

測定波長 410 nm において用いた。カラムは Cosmosil 5 C 18 -とにより、市販化粧品を皮膚適用した際に皮膚へ吸収さMS（4 . 6 × 150 mm、ナカライテスク）を用いた。溶出は、れた特定成分の定量法としての本法の有用性を評価した。

水─メタノール─酢酸（58：38：4）の混合液を移動相とし、CYA 油性溶液を単独で皮膚適用した際に、経皮微小透析

室温で、ポンプ流速を 1 . 0 mL ／ min に設定して行った。

法により得られた皮膚内 CYA 濃度とその累積量の経時変

透析液中のカテコールアミン類は、高速液体クロマトグ

化を Fig. ２に示す。いずれも適用直後から皮膚内に CYA

ラフィー電気化学検出法により定量した７）。高速液体クロが検出され、その濃度は速やかにプラトーに達した。また、マトグラフは LC- 6 A 型ポンプを用い、L-ECD- 6 A 型電皮膚表面に適用した油性溶液中の CYA 濃度を増加させる

気化学検出器（島津）を設定電位 800 mV において用いた。

と、皮膚内の CYA 濃度も増大した。

カラムは TSK‒GEL ODS‒ 80 TM（4 . 6 × 150 mm、東ソー）

そこで、皮膚内累積量の経時変化から、みかけの経皮吸を用いた。溶出は、1 . 1 mM オクタンスルホン酸ナトリウム、

収速度とラグタイムを算出した結果（Table １）、皮膚表

1 mM EDTA・2 Na および 15％メタノールを含みリン酸面に適用した CYA 濃度の上昇と CYA のみかけの経皮吸

Fig.2 Level A and cumulative amount B profiles of CYA in the skin dialysate after topical application of 0.5％（●）, 2％（▲）
and 8％（■）CYA oily solutions in rats. Data represent the mean±SE of 5 rats.

− 71 −

収速度の増加には良好な正の相関が認められた（Fig. ３）。

する分子量約 1200 の皮膚透過性の極めて低い環状ポリペ

このことより、経皮微小透析法は、皮膚内へ浸透した被験プチドである。Hermann ら 16） は、ヒト摘出皮膚を拡散

物質の吸収量の変化を in vivo の状態で正確にモニターでセル装置に装着し、in vitro で透過性を検討する実験を行きる方法であることが立証された。

い、CYA 自身の皮膚透過性の低さは、アルコール類、非CYA は、11 個のアミノ酸からなる免疫抑制作用を有

プロトン性極性溶媒、Azone など既存の経皮吸収促進剤を併用した場合においても改善されなかったと報告している。一方、Duncan ら 17）および Cole ら 18）は、本研究とTable 1 In vivo skin apparent absorption parameters
for CYA after topical application of CYA oily solutions
in rats.
CYA
concentration（w/v%）
0.5
2.0
8.0

Apparent absorption
rate in skin dialysate（ng/h）
0.85±0.39
2.78±0.89
19.02±2.08

同様、種々の添加剤が配合されている CYA の市販品から試験製剤を試作し、ヒト摘出皮膚を用いた種々の検討を行い、CYA が皮膚透過性を示すことを報告している。しLag time（h）

かし、CYA の皮膚透過性に関して、Duncan ら 17）はアルコール類と Azone の添加により改善されると報告してい0.21±0.14
0.18±0.22
0.06±0.05

るが、Cole ら 18）は吸収促進剤としてアルコール類を添加しても改善されなかったと報告している。これら CYA の
経皮吸収性における研究結果の相違は in vitro での実験条

Values represent the mean±SE of 5 rats.

件の違いに起因するものと考えられる。従来、物質の経皮吸収性を評価する実験法としては、除毛した実験動物の摘出皮膚を拡散セル装置に装着し、in vitro でその透過性を検討する方法が繁用されてきた 19）。しかし、同法は、非生理的条件下での実験法であるため、摘出皮膚間の含水量の違い 20）、や微生物の繁殖 21）などの問題点があり、実際の生体での経皮吸収状態を反映することが難しい。経皮微小透析法による in vivo 経皮吸収実験法においては、皮膚内で微小灌流を行うため水分含量も一定で、生理的条件に近い状態で被験物質の経皮吸収性を検討できる利点がある。
そこで次に、化粧品にも適用可能な吸収促進剤の候補として、実際に化粧品に広く用いられているグリセリンと医療用製剤の添加剤として実用化されているピロチオデカンをFig.3. Correlation between topically applied CYA concentration and in vivo skin apparent absorption rate of CYA.
Data represent the mean±SE of 5 rats.

選び、CYA の経皮吸収性に及ぼす促進効果を経皮微小透析法により測定し、得られた結果を比較した。
２％ CYA 油性溶液の皮膚適用６h 後までの皮膚内 CYA
蓄積量に対する種々の濃度でピロチオデカンまたはグリセ

Fig.4. Ratio of total CYA recovery in the skin dialysate for 6 h after topical application of 2％ CYA oily solutions with pirotiodecane A and glycerin B at various concentrations to that without them in rats. Control value was 16.5±5.1 ng. Data represent
the mean±SE of 3-5 rats.

− 72 −

微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立

リンを添加した２％ CYA 油性溶液の適用６h 後までの皮溶媒を用いる方法が報告されているが、大きく分類すると、

膚内 CYA 蓄積量の割合を Fig. ４に示す。ピロチオデカン

メタノール、エタノールおよびアセトン等の水と混和性のは、添加濃度が６％以下では経皮吸収性の改善を認めなか

溶媒を使用する方法と、ヘキサン、ジエチルエーテルおよったものを、10％まで上げると CYA の皮膚内への吸収量

びクロロホルム等の非混和性の溶媒を使用する方法であるは著しく増大し、みかけの経皮吸収速度は 4 . 9 倍有意に増22）

大した（Table ２）。しかし、添加濃度を 20％まで上げる

混和性、非混和性の溶媒の混合系についても、クロロホとその効果は消失した。これらの結果より、油性溶液中

ルム／メタノール（２：１）混合液が報告されている 23）。

CYA の経皮吸収性改善の目的でピロチオデカンを用いる

これら種々の溶媒の脱脂効果については、水の透過性の変場合には、その効果発現に至適濃度が存在することが示唆化を指標とした報告があり、エタノール＜アセトン＜ジエ

された。一方、グリセリンの場合は、添加濃度が３〜 10

チルエーテル＜クロロホルム＜クロロホルム／メタノール％の範囲でその濃度上昇に比例した経皮吸収性の改善効果（２：１）混合液の順であることが確認されている 22）。一方、が認められ、10％を超えるとその効果が飽和するといっ

経皮微小透析法による皮膚内生体成分の検出は、一酸化窒

た一般的な吸収促進剤の特性が認められた。油性溶液中

素 24）、ヒスタミン 25）およびグリセロール 26）等が、ヒトま

CYA のみかけの経皮吸収速度は、６％のグリセリンの添たはラットの正常皮膚を用いて報告されている。しかし、

加で 3 . 0 倍、10％以上の添加では 6 . 4 〜 6 . 9 倍有意に増大

化粧品成分浸透の障壁となる角質細胞間隙脂質を脱脂したした（Table ３）。今回の研究結果から、広く化粧品に用皮膚を用いて、皮膚内生体成分量の変化を測定した報告はいられているグリセリンが、皮膚透過性の低い物質の経皮見当たらない。著者らは、これまでラットの血液中、脳内吸収性改善のためにも利用できることが示唆された。

および胎仔組織中等において内因性カテコールアミン量を。その他、より脂質の脱脂効果の強い溶媒として、水と次に、化粧品成分として繁用されている SA の５％エタ

測定し、その結果を報告してきた７、27）。そこで、本研究でノール溶液を用いて、皮膚内への化粧品成分の吸収速度とは、脱脂効果の異なるアセトン、ジエチルエーテル、クロ

皮膚内生体成分動態に及ぶす角質層の脱脂方法の影響を経

ロホルム / メタノール（２：１）混合液の３つの溶媒によ

皮微小透析法により検討した。一般に物質の皮膚浸透性は、り脱脂したラット皮膚を用いて、５％ SA エタノール溶液

正常皮膚に比べて、角質層除去皮膚（stripped skin）およ

適用後に、物質浸透性が変化した状態の皮膚から吸収され

び脱脂皮膚（delipidized skin）では上昇することが知らた SA 動態を求めると同時に、皮膚内の内因性カテコールれている。角質細胞間隙脂質を脱脂するには、種々の有機

アミン量を測定し、それらの関連性を解析した。

Table 2 In vivo skin apparent absorption parameters for CYA after topical application of 2% CYA oily solutions
with various concentration of pirotiodecane in rats.
Parameter

Pirotiodecane concentration （w/v%）
0

1

3

Apparent absorption
2.78±0.89
rate in skin dialysate（ng/h）

2.09±0.21

3.27±0.65

5.40±1.93 13.67±5.17* 2.64±0.71

Lag time（h）

0.10±0.10

0.18±0.16

0.15±0.04

0.18±0.22610

0.14±0.1920

0.18±0.13

Values represent the mean±SE of 3-5 rats. *P<0.05 compared with value obtained without pirotiodecane（Student s t -test）.

Table 3 In vivo skin apparent absorption parameters for CYA after topical application of 2% CYA oily solutions
with various concentration of glycerin in rats.
Parameter

Glycerin concentration（v/v%）
0

1

3

Apparent absorption
2.78±0.89
rate in skin dialysate（ng/h）

2.93±0.50

4.78±1.67

8.39±2.78* 17.67±4.46* 19.21±1.37*

Lag time（h）

0.04±0.05

0.19±0.24

0.21±0.11

0.18±0.22610

0.05±0.05

20

0.01±0.01

Values represent the mean±SE of 3-5 rats. *P<0.05 compared with value obtained without glycerin（Student s t -test）.

− 73 −

５％ SA エタノール溶液を正常皮膚または脱脂皮膚の表

らびに脱脂皮膚に表面適用する検討を行っているが、アセ面に適用した際、いずれも適用直後から皮膚内に SA が検トンによる脱脂皮膚からの SA の経皮吸収量は、正常皮膚

出され、その濃度は２h 以降からプラトーに達した。そこでの結果と変化なかったと報告している。SA の経皮吸収で、SA の皮膚内累積量の経時変化から、みかけの経皮吸性に関するアセトンの脱脂効果についての我々と Benfeldt

収速度とラグタイムを算出した結果（Table ４）、脱脂皮ら 29）の研究結果の相違は、使用した実験動物の違いに起膚では正常皮膚に比べて、みかけの経皮吸収速度が、アセ因するものと考えられる。

トン＜ジエチルエーテル＜クロロホルム / メタノール（２：

内因性のカテコールアミン類は、一般にストレスにより

１）混合液の順番で増大した。特に、クロロホルム / メタ

大きく濃度が変動することが知られているが、著者らは、

ノール（２：１）混合液による皮膚脱脂後には、SA のみ

ラットの脳内へ透析プローブ挿入後、１h 以上経過すると、かけの経皮吸収速度は正常皮膚に比べて 3 . 7 倍有意に増大

ドーパミンをはじめ、ノルエピネフリン、DOPAC およびした。この結果は、溶媒の脱脂効力の強さの順番

22）

と一

HVA いずれも内因性物質量は安定することを報告してい致するもので、SA の皮膚吸収量は、角質細胞間隙脂質がる７）。また、ラットの血液中や胎仔組織中でも、透析プロ脱脂される程度に依存し、増大することが示唆された。一ーブ挿入１h 後には HVA の内因性物質量が安定すること

方、SA の経皮吸収ラグタイムに関しては、有意差は認めを報告している 27）。そこで、本研究では、ガラスリザー

られなかったものの、溶媒の脱脂効力の強さの順番 22）に

バー中から皮膚脱脂用の溶媒または生理食塩水を除去した

符号し、減少する傾向が示された。これらの結果は、洗顔直後から、皮膚透析液中のカテコールアミン量の測定を用化粧品等の使用により皮膚が脱脂された場合には、化粧開始した。その結果、ドーパミン、ノルエピネフリンおよ

品成分の皮膚浸透性が、容量的および時間的に変化するこび DOPAC はいずれの透析液中でも検出されなかったが、とを示唆するものである。

HVA は検出された（Table ５）。しかし、正常皮膚へ SA

微小透析法を用いた SA の経皮吸収性に関する検討は、
28）

29）

エタノール溶液を適用する前のコントロールに比べて、皮によっても報告され膚透析液中の HVA 量が有意に変化したのは、クロロホルている。前者は、種々の基剤による SA の軟膏剤を試作

ム / メタノール（２：１）混合液による脱脂皮膚へ SA エ

し、除毛したラットの正常皮膚と角質層除去皮膚に塗布す

タノール溶液を適用した後のみであった（1 . 7 倍有意な上る実験を行い、除去皮膚での SA 吸収量の変化は、水溶性

昇）。このことより、表面を溶媒で脱脂するストレスを加基剤を用いた軟膏剤の場合が最も大きかったと報告していえられ、物質の角質層浸透性が変化した皮膚では、SA のる。また後者は、本研究と同様、５％ SA エタノール溶液

経皮吸収量は有意に変化するものの、皮膚内カテコールアを試作し、へアレスラットの正常皮膚、角質層除去皮膚な

ミン量の変動は小さいことが示唆された。

Murakami ら

および Benfeld ら

Table 4 In vivo skin apparent absorption parameters for SA after topical application of 5% SA ethanol
solution to normal skin and verious delipidized skins in rats.
Parameter

Apparent absorption ratein skin dialysate（μg/h）
Lag time（h）

Normal skin

Delipidized skin
AcetoneDiethyl ether

Chloroform/methanol（2:1）

0.16±0.05

0.19±0.03

0.36±0.06*

0.59±0.21*

0.85±0.41

0.64±0.22

0.45±0.25

0.46±0.31

Values represent the mean±SE of 3 rats. *P<0.05 compared with value obtained normal skin（Student s t -test）.

Table 5 Endogenous HVA levels obtained in skin dialysates after topical application of 5% SA ethanol
solution to normal skin and verious delipidized skins in rats.
Parameter

Level before applicationof SA (pmol/h)Level after applicationof SA (pmol/h)1)

Normal skin

Delipidized skin
AcetoneDiethyl ether

Chloroform/methanol（2:1）

0.46±0.18

0.54±0.16

0.58±0.25

0.68±0.13

0.48±0.14

0.54±0.17

0.63±0.31

0.78±0.08*

Values represent the mean±SE of 3 rats. 1) average value for 6 h. *P<0.05 compared with value obtainedlevel before application of SA in normal skin（Student s t -test）.

− 74 −

微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立

４．総

into brain tumour tissue after intracarotid infusion in括rats with 9 L malignant glioma, J. Pharm. Pharmacol.,49 , 777 - 780 , 1997 .

以上、経皮微小透析法を用いることにより、皮膚内へ浸透した化粧品成分の吸収量の変化を in vivo の状態で正確10）Tokunaga Y, Nakashima M, Sasaki H, et al., ：Localにモニターできることが明らかとなった。さらに、本法をdistribution into brain tumor and pharmacokinetics

用いて、ラットの脱脂皮膚表面へ適用した化粧品成分の経of 4 -pyridoxate diammine hydroxy platinum, a novel

皮吸収動態の定量を行うと同時に、皮膚内生体成分量の変cisplatin derivative, after intracarotid administration

動を測定することにより、角質層透過性が変化した皮膚でin rats with 9 L malignant glioma : simultaneous brainの化粧品成分吸収性と生体成分動態との関連性を解析する

microdialysis study, Biol. Pharm. Bull., 23 , 1491 - 1496 ,ことができた。経皮微小透析法による in vivo 経皮吸収実

2000 .

験においては、皮膚内で微小灌流を行うため水分含量も一11）Matsuyama K, Nakashima M, Nakaboh Y, et al., ：定で、生理的条件に近い状態で化粧品成分の経皮吸収性をApplication of in vivo microdialysis to transdermal

検討できる利点がある。経皮微小透析法を用いた評価法でabsorption of methotrexate in rats, Pharm. Res., 11 ,は、化粧品成分の皮膚内動態を、皮膚内生体成分動態と関

684 - 686 , 1994 .

連づけながら解析できるため、安全性と障害性の検討が同

12）Yano T, Higo N, Furukawa K, et al., ：Evaluationof a new penetration enhancer 1 -[ 2 -(decylthio)ethyl]-時にできる利点がある。

azacyclopentan- 2 -one (HPE- 101 ), J. Pharmacobio-Dyn.,（参考文献）

15 , 527 - 533 , 1992 .

１）Proksch E, Holleran WM, Menon GK, et al., ： Barrier

13）井戸田義弘、林正弘、大竹宏、ほか２名：吸収促進剤

function regulates  epidermal lipid and DNA synthesis、

ピロチオデカンによるウサギ鼻粘膜吸収における作用機

Br. J. Dermatol., 128 , 473 - 482 , 1993 .

構の検討、薬物動態、14、S 188、1999 .

２）西坂崇宏、山崎誠司：経皮吸収油剤の探索、DDS、

14）Shibasaki J, Inoue Y, Kadosaki K, et al., ：Hydrolysis
of salicyluric acid in rabbit intestinal microorganisms,

13、347 - 351、1998 .

J. Pharmacobio-Dyn., 8 , 989 - 995 , 1985 .

３）季梅花、上田秀雄、杉林堅次、ほか１名：角質保湿剤
ヒアルロン酸ナトリウムの皮膚浸透に及ぼす超音波照射

15）Hashimoto Y, Murakami T, Kumasa C, et al., ：In vivo calibration of microdialysis probe by use ofの影響、DDS、12、415 - 419、1997 .
４）E l m q u i s t W F , S a w c h u k R J：A p p l i c a t i o n o f

endogenous glucose as an internal recovery marker :microdialysis in pharmacokinetic studies, Pharm. Res.,

measurment of skin distribution of tranilast in rats, J.

14 , 267 - 288 , 1997 .

Pharm.  Pharmacol., 50 , 621 - 626 , 1998 .

５）Stahle L, Segersvard S, Ungerstedt U：Theophyllin16）Hermann RC, Taylor RS, Ellis CN, et al., ：Topicalconcentration in the extracellular space of the rat

cyclosporin for psoriasis : in vitro skin penetration andbrain : measurement by microdialysis and relation toclinical study, Skin Pharmacol., 1 , 246 - 249 , 1988 .
17）Duncan JI, Payne SNL, Winfield AJ, et al., ：behaviour, Eur. J. Pharmacol., 185 , 187 - 193 , 1990 .
６）Nakashima M, Takeuchi N, Hamada M, et al., ：In

Enhanced percutaneous absorption of a novel

vivo microdialysis for pharmacokinetic investigation : a

cyclosporin A formulation and assessment of its

plasma protein binding study of valproate in rats, Biol.

immunosuppressive activity, Br. J. Dermatol., 123 , 631 640 , 1990 .

Pharm. Bull., 17 , 1630 - 1634 , 1994 .
７）Nakashima M, Zhao MF, Nakashima MN, et al.,18）Cole GW, Shimomaye S, Goodman M：The effect of：In vivo microdialysis to determine the relative

topical cyclosporin A on the elicitation phase of allergic

pharmacokinetics of drugs, Biol. Pharm. Bull., 19 , 988 -contact, Contact Dermatitis, 19 , 129 - 132 , 1988 .
19）Sasaki H, Kojima M, Mori Y, et al., ：Enhancing effect

994 , 1996 .
８）Nakashima M, Sasaki H, Ohira A, et al., ：In vivoof pyrrolidone derivatives on transdermal penetration

ocular microdialysis to monitor ocularly appliedof 5 -fluorouracil, triamcinolone acetonide, indomethacin,
and flurbiprofen, J. Pharm. Sci., 80 , 533 - 538 , 1991 .

cyclosporin in the anterior chamber of rabbits,

20）Hinz RS, Hodson CD, Lorence CR, et al., ：In vitro

Pharmaceutical Sciences, 3 , 179 - 182 , 1997 .
９）Nakashima M, Shibata S, Tokunaga Y, et al., ：Inpercutaneous penetration : evaluation of the utility ofvivo microdialysis study of the distribution of cisplatin

hairless mouse skin, J. Invest. Dermatol., 93 , 87 - 91 ,− 75 −

measurements of interstitial histamine in the rat, Life

1989 .

Sci., 65 , 1765 - 1771 , 1999 .

21）Sloan KB、Beall HD, Weimar WR, et al., ：The effectof receptor phase composition on the permeability of26）Dodt C, Lonnroth P, Fehm HL, et al., ：Intraneural

hairless mouse skin in diffusion cell experiments, Int. J.

stimulation elicits an increase in subcutaneousinterstitial glycerol levels in humans, J. Physiol., 521 ,Pharm., 73 , 97 - 104、1991 .

545 - 552 , 1999 .

22）Matoltsy AG, Downes AM, Sweeney TM：Studiesof the epidermal water barrier. II. Investigation of27）岩永宏、中嶋幹郎、佐々木均、ほか３名：マイクロダ

the chemical nature of the water barrier, J. Invest.

イアリシス法を用いたレボドパの胎盤移行性と胎児内動態の検討、薬物動態、13、S 185、1998 .

Dermatol., 50 , 19 - 26 , 1968 .
23）B l a n k I H , S c h e u p l e i n R J , M a c F a r l a n e D J：

28）Murakami T, Yoshioka M, Okamoto I, et al., ：Mechanism of percutaneous absorption. 3 . The effect

Effect of ointment bases on topical and transdermalof temperature on the transport of non-electrolytesdelivery of salicylic acid in rats : evaluation by skinacross the skin, J. Invest. Dermatol., 49 , 582 - 589 , 1967 .

microdialysis, J. Pharm. Pharmacol., 50 , 55 - 61 , 1998 .

24）Clough GF, Bennett AR, Church MK：Measurement29）Benfeldt E, Serup J：Effect of barrier perturbationof nitric oxide concentration in human skin in vivo

on cutaneous penetration of salicylic acid in hairlessusing dermal, Exp. Physiol., 83 , 431 - 434 , 1998 .

rats : in vivo pharmacokinetics using microdialysis and25）Rizell M, Naredi P, Lindner P, et al., ：Validationof the internal reference technique for microdialysis− 76 −

non-invasive quantification of barrier function, Arch.
Dermatol. Res., 291 , 517 - 526 , 1999 .

接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交通」の関与
静岡県立大学今薬学部微生物学教室

井康之

During the sensitization phase of contact hypersensitivity through skin, it is widely accepted that Langerhans cells
pick up antigens within epidermis and then migrate to the draining lymph nodes to present antigens to recirculating
T lymphocytes in association with major histocompatibility complex class II molecules.   We discovered traffickingof connective-tissue macrophages from dermis to draining lymph nodes during skin sensitization as an independent
phenomenon from Langerhans cell trafficking using FITC as an antigen.   We could differentiate trafficking ofmacrophages from that of Langerhans cells using monoclonal antibodies specific for macrophage calcium-type lectin(MMGL) that is a connective-tissue specific macrophage marker.   The extent of dermal macrophage migration was
greatly influenced by the selection of vehicles to dissolve FITC.   Using several kinds of vehicles, we observed apositive correlation between the efficiency of skin sensitization and the extent of macrophage migration.   These
results indicated that chemicals in the vehicles may exhibit an adjuvant activity through the induction of tissue
macrophage trafficking.   We directly demonstrated macrophages migration upon skin sensitization by local celltransfer experiments.  Interestingly, the migration was induced by vehicle alone, such as acetone/dibutyl phthalate(AD), without FITC.  These results also confirmed the critical role of vehicles with adjuvant activity.  
We observed the initiation of dermal macrophage trafficking using mouse skin after epicutaneous application ofAD.  Thus, we immunohistochemically detected that MMGL-positive dermal macrophage density was transiently andreversibly decreased after epicutaneous application of AD.   We also developed an organ culture system, in whichskin fragments taken from the site of AD application were subjected to a short term organ culture.   The densityof MMGL-positive dermal macrophage decreased irreversibly in this system.   Using the organ culture system, wediscovered that AD treatment induced local production of pro-inflammatory cytokines during skin sensitization.  
Furthermore, we also found the activity that induces dermal macrophage exit was mediated by pro-inflammatory
cytokines, such as IL-1β, using recombinant cytokines and antibodies against cytokines.   A possibility that IL-1βtreatment down regulates MMGL expression in macrophages has been excluded.  
In conclusion, our studies revealed importance of connective tissue macrophage trafficking during skin sensitization
as a mechanism of adjuvant activity of chemicals.   Our ex vivo organ culture system using skin fragments will be
useful to examine chemicals that might enhance skin sensitization.  

１．緒

皮膚からの接触感作では、表皮に存在する抗原提示細胞

言であるランゲルハンス細胞が経皮的に侵入した抗原を拾い

接触性皮膚炎は、遅延型アレルギー反応の一種であり、上げ、自ら所属リンパ節の T 細胞領域に移動し、リンパ化粧品に限らず生活環境にある様々な化学物質の抗原性が節に再循環してきた T 細胞に対して主要組織適合遺伝子

原因となっている場合がある。化粧品の安全性を確保する複合体（MHC）クラスⅡ分子を介して抗原提示を行い感上でも、接触による抗原感作がどのようにして起こるのか

作が成立すると一般に考えられている。リンパ節に移動しを正しく理解することが重要である。また、シックハウス

たランゲルハンス細胞は、相互連結性樹状細胞とも呼ばれ症候群として問題となっているアレルギーでは、複数の化ている。我々は、マクロファージ細胞表面に存在するカル

学物質による感作や、ある種の化学物質がそれ自身の抗原シウム依存性レクチン（MMGL）の研究を通じて１〜３、５、７）、性とは別に何らかの作用機構を通じて抗原に対する感受性

この分子が表皮のランゲルハンス細胞と真皮の組織マクロを高めている可能性が推察される。すなわち、化学物質のファージを区別しうる、特異性の高いマーカーであること

アジュバント活性について、その実態を明らかにすると共を見出してきた４）。すなわち、MMGL は、真皮の組織マに、作用メカニズムを解明する必要がある。

クロファージに発現しているが、表皮のランゲルハンス細胞には発現していない。
我々の作製した MMGL に対するラットモノクローナル

Involvement of Macrophage Trafficking
in Contact Dermatitis during Skin
Sensitization

胞の所属リンパ節への移動とは別に、真皮マクロファージ

Yasuyuki Imaiの所属リンパ節への移動が起こることを発見した６）。本研

Department of Microbiology, Universityof Shizuoka School of Pharmaceutical
Sciences

究では、接触性感作を増強する化学物質自体が、真皮から抗体を使って２、８）、接触性感作においてランゲルハンス細所属リンパ節へのマクロファージの細胞交通を誘導することを明らかにしたうえで、細胞交通の誘導活性と接触性感− 77 −

作を増強する活性との間の相関を検討した。また、該当す植した（106 個／ 20 µL）。16 時間後、移植部位の皮膚にる化学物質が皮膚局所から組織マクロファージの細胞交通

FITC ／ AD または AD のみを塗布した。さらに 24 時間を開始させる活性があるかどうかを、皮膚局所を直接観察後に所属リンパ節である上腕（brachial）リンパ節を採取し評価する実験系を構築して解析した 。さらに、この過して凍結切片を作製し、トレーサー陽性細胞を赤色蛍光に程において、炎症性サイトカインが関与することを明らかて検出するとともに、抗原である FITC を緑色蛍光、細胞にした 10）。

の同定をモノクローナル抗体 LOM—14 /Cy 5 標識抗ラット

９）

２．実
２. １

IgG による深赤色蛍光によって、３重標識蛍光を検出可能験

なレーザー共焦点顕微鏡にて解析した。

接触感作と感作成立の評価

マウス（ICR または BALB/c、雌）の上腕部の毛を刈

２. ６

皮膚小片の器官培養９、10）

り、溶媒に溶解した FITC（0 . 5％、w/v）を 80 µL 塗布しマウス皮膚の小片（1 cm× 1 cm）を直径１µm の小孔のた。６日後に、アセトン／フタル酸ジブチル（AD）に溶あるポリエチレンテレフタレート膜上に、表皮側を上に解した FITC 20 µL をマウスの右の耳介外面に塗布して惹して設置した（図１）。これを、細胞培養用の６穴プレー起を行い、その 24 時間後の耳介の厚さをダイヤルシック

トに置き、無血清培地 ASF 104（味の素）を加え、皮膚小ネスゲージで計測した。左耳介を対照とした。

片が液相と気相の界面に来るように培養液の量を調整し２. ２を用いて 37℃で培養した。また、マウス皮膚小片を 24 時

た。５％ CO 2 ／ 95％空気の条件で CO 2 インキュベーター

接触感作における溶媒の効果

感作時に FITC を溶解した溶媒は、以下の通りであ間培養し、培養上清を調製した。培養上清中の IL—1β 量る。AD：アセトン／フタル酸ジブチル（１：１）、AO：

を ELISA で測定した（R&D Systems）。組換え型マウス

アセトン／オリーブオイル（４：１）、EtOAc：酢酸エチ

IL—1 α、IL—1 β、TNF—α およびハムスター抗マウス IL—

ル、EtOH：エタノール、DMF：ジメチルホルムアミド、

1 α、抗マウス IL—1 β、抗マウス TNF—α を Genzyme よDMSO：ジメチルスルホキサイド、SDS：30％ラウリル硫り購入し、皮膚器官培養系で用いた。

酸ナトリウム水溶液。惹起には、すべて AD を用いた。

２. ３

３

MMGL 陽性組織マクロファージの免疫組織化

３. １

学的検出

結果および考察

FITC を用いた接触性皮膚炎モデルの評価

接触性皮膚炎の実験モデルにおいては、いかなる溶媒をリンパ節および皮膚の凍結切片を作製し、アセトン固定

用いて動物を感作するかが実験の成否をわける重要なポイ

後、MMGL に対するラットモノクローナル抗体 LOM—14ントであることが従来より指摘されていた。FITC を抗原を用いて、免疫組織染色を行なったとして用いたマウス接触性皮膚炎のモデルにおいては、ア

。

３、４）

セトン / フタル酸ジブチル（１：１）を溶媒として用いる

２. ４

皮膚からの MMGL 陽性マクロファージの分離・のが最適であることが報告されている。まず、この実験モ

精製と蛍光トレーサー標識

デルにおいて、FITC 自身が抗原性を担っており、溶媒とマウス皮膚（腹部、背部、前後肢）の毛を刈ったのち細して用いた AD が抗原として相加的に働いてはいないこ

切し（１辺２mm 程度）、コラゲナーゼ消化によって皮膚とを確認するため、感作時および惹起時に AD に溶解し細胞を単離した。MMGL に対するラットモノクローナル

た FITC、もしくは AD を単独でマウス皮膚に塗布し、耳抗体 LOM—8 . 7 を反応させた後、抗ラット IgG の結合した介を用いた常法にしたがって遅延型過敏症の発症を観察しマグネチックビーズを反応させ、抗体の結合した細胞をマた（図２）。その結果、感作時および惹起時に FITC が存

グネチックセルソーターを用いて回収した。MMGL 上の別の抗原決定基に対する抗体 LOM—14 を用いて評価した
結果、皮膚細胞浮遊液中に２〜３％程度含まれる MMGL
陽性細胞が 90％以上にまで濃縮精製されることが分かった。精製した皮膚由来の MMGL 陽性マクロファージを、
蛍光トレーサー CMTMR で標識した。

２. ５

マクロファージ細胞交通の検出６）

CMTMR 標識した BALB/c マウスの皮膚由来 MMGL
陽性マクロファージを BALB/c マウスの前肢に皮内移− 78 −

図１

皮膚小片の器官培養法

接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交 」の関与在しているときにのみ、有意な耳介の膨らみが観測された。

AD が最も有効な溶媒であり、他方 DMSO を用いた場合

FITC の抗原性が確認され、AD の抗原としての貢献度は全く感作が成立しなかった。

低いことが示された。

３. ３
３. ２

感作時に用いた溶媒中の化学物質の感作成立

所属リンパ節における MMGL 陽性マクロファージの増加におよぼす影響

FITC を抗原として経皮的感作に用いる一つの利点は、次に、抗原 FITC を溶解する溶媒を変えて感作を行い、抗原としてランゲルハンス細胞に取り込まれた FITC を蛍

感作における溶媒の効果を比較検討した。なお、耳介にお光で容易に追跡できる点である。実際、マウス上腕部にける惹起時の溶媒としては、AD を用いた。免疫系がどのFITC を塗布した 24 時間後、上腕リンパ節の凍結切片を程度強く感作されるのかは、感作に用いた溶媒によって違作製して蛍光顕微鏡下観察すると、リンパ節の T 細胞領

うことが示された（図３）。従来から知られていたように、域に FITC を取り込んだ細胞が観察された。
一 方、上 腕 リ ン パ 節 の 凍 結 切 片 を 経 時 的 に 作 製 し、
MMGL に対するモノクローナル抗体を用いて免疫組織化
学的に検出すると、感作後 24 時間をピークとして一過性にリンパ節内で MMGL 陽性細胞数の増加が観察された。
ランゲルハンス細胞は、表皮において MMGL 陰性である
ため、この増加した MMGL 陽性細胞はランゲルハンス細胞由来ではなく、真皮の組織マクロファージ由来ではないかと考えられたが（この証明は、３. ５項参照）、これを支持する別の実験結果として、FITC を保有する細胞のうちMMGL 陽性である割合が 10％未満に過ぎなかったことがあげられる。このことは、表皮からリンパ節に抗原を運ん

図２ フルオレッセイン（FITC）を抗原として用いたマウス
接触皮膚炎モデル。FITC の溶媒としてアセトン／フタル酸
ジブチル（AD）を用いている。耳介における遅延型過敏症
応答には、感作／惹起とも FITC が必要であり、AD 単独では抗原として有効ではない。

できた抗原提示細胞（ランゲルハンス細胞／相互連結性樹状細胞）とは独立に、真皮から組織マクロファージの細胞交通が存在することを示唆する。さらに、MMGL 陽性細胞の増加が FITC を溶解していない AD 単独で起こることがわかった。したがって、この過程は、抗原である FITCのランゲルハンス細胞への取り込みやプロセッシングとは別の現象としてとらえることが出来る。

３. ４

リンパ節内の MMGL 陽性細胞の増加と抗原感作成立との関係
そこで、様々な溶媒を用いて感作を行なったとき、感作の成立の程度と⑴ランゲルハンス細胞の細胞交通の誘導能および⑵所属リンパ節における MMGL 陽性マクロファー
ジの一過的増加を比較検討した。その結果、強力に感作を成立させる溶媒（例えば AD）の場合、ランゲルハンス細胞の細胞交通の促進および MMGL 陽性細胞の増加ともに大きいことが判明した。一方、典型的には SDS の場合であるが、FITC を提示したランゲルハンス細胞の移動は少ない場合でも、ある程度の有効な感作が成立する場合があり、この場合 MMGL 陽性細胞の増加が顕著に認められる
図３ FITC を抗原としたマウス接触皮膚炎モデルにおける溶媒の効果。FITC を様々な溶媒（横軸）に溶解しマウスを感作した。AD に溶解した FITC を耳介に塗布して惹起後、耳介の膨らみを測定した。AD で感作した場合の応答を 100 として標準化した。

ことが分かった。
そこで、リンパ節における MMGL 陽性細胞の増加をリ
ンパ節内のコンパートメントごとに整理して観察し、それをスコアー化した。すなわち、⑴ T 細胞領域（とくに傍皮質とリンパろ胞の境界）での分布、⑵皮膚から輸入リン− 79 −

パ管経由で細胞やリンパ液が入ってくる辺縁洞での分布、⑶未感作の状

表１ 感作時に用いた様々な溶媒による感作成立の程度と所属リンパ節における
MMGL 陽性細胞の皮膚からの移動との関係態において最も MMGL 陽性細胞の密度が高い髄質での分布にわけて整理した。その結果、T 細胞領域でMMGL 陽性細胞の増加がみられる
こと、および髄質で MMGL 陽性細胞の枯渇が起きていないことが有効な感作成立のための条件であることが示唆された（表１）。MMGL 陽性細胞のリンパ節内での分布のスコア
ーの合計点と抗原で惹起した後の耳介の厚さにより評価した感作成立の程度との間には、良好な相関が認められた（図４）。このことは、所属リンパ節において MMGL 陽性細胞を増加させる溶媒中の化学物質の働きが、接触性皮膚炎の感作成立に重要な役割を担っていることを示唆している。

３. ５

アジュバント活性のある化学物質による皮膚組織マクロファージの細胞交通の誘導：in vivo での証明
所属リンパ節において MMGL 陽性細胞が増加することが、真皮からの組織マクロファージの細胞交通によっていることを証明するために、以下の実験を行った。皮膚から MMGL 陽性細胞を単離し蛍光トレーサーで標識した
後、レシピエント動物の皮内に移植し、移植部位より経皮的に感作した。感作 24 時間後に所属リンパ節の凍結切片を作製し、T 細胞領域の任意の視野における蛍光トレーサ
ー陽性細胞の分布密度をレーザー共焦点顕微鏡を用いて計数した（図５）。FITC ／ AD により経皮的感作を行なうと、所属リンパ節の T 細胞領域に蛍光トレーサー陽性細胞が観察された。抗体を用いた多重染色によって蛍光トレーサ

図４ 感作時に用いた様々な溶媒による感作成立の程度と所属リンパ節における MMGL 陽性細胞数変動との相関性。リン
パ節での MMGL 陽性細胞の存在程度をスコアー化した overall index（表１参照）を横軸にとり、耳介反応の強度（相対値）
を縦軸にとって、各溶媒を用いたときの結果をプロットした。
各点の近くに、感作時に用いた溶媒の種類を示した。

ー陽性細胞に MMGL が発現していることを確認した。さらに、蛍光トレーサー陽性細胞の出現は、抗原 FITC を加LOM—14 で免疫組織染色後、MMGL 陽性組織マクロファ

えずに AD のみを塗布した場合にも同様に見られたが、全ージの真皮内での分布を調べた。結果をヒストグラムとく感作していない場合には認められなかった。この結果は、して整理した（図６）。AD 塗布４時間後より、真皮内の真皮から所属リンパ節への MMGL 陽性細胞の細胞交通が、

MMGL 陽性細胞の分布密度が減少し、８時間後に最も低溶媒である AD によって開始されたことを示唆している。

密度となった。この変化は可逆的で、24 時間後には ADを塗布する前の状態に復帰した。

３. ６

化学物質による組織マクロファージ細胞交通

次に、真皮からの MMGL 陽性細胞の減少を試験管内での開始：皮膚局所での証明再現することを試みた。すなわち、マウスの腹部皮膚に真皮の組織マクロファージは、組織中にとどまっており、

AD を塗布後、塗布した部位の皮膚を採取し、図１に示

ランゲルハンス細胞の様に移動しないと一般には信じられした方法によって器官培養した。経時的に皮膚サンプルている。そこで、この常識に反論するためには、皮膚局所の凍結切片を作製した後、MMGL 陽性細胞の密度の多いで組織マクロファージの移動が AD などの化学物質の塗布領域（＞ 15％）の数と観察した領域の総数との比率を求によって実際に開始されていることを示す必要がある。

めた。すなわち、MMGL 陽性細胞の分布の多い領域の出

まず、ICR マウスの前肢皮膚に AD を塗布後、皮膚の現頻度を比較したことになる（図７）。その結果、生体内

凍結切片を作製し、MMGL に対するモノクローナル抗体（in vivo）で AD を塗布した場合、24 時間後には塗布以前− 80 −

接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交 」の関与

図５ 経皮的感作によって誘導された真皮組織マクロファージの所属リンパ節への移動。皮膚より単離した MMGL 陽性マ
クロファージを蛍光トレーサーで標識し、レシピエントマウ
スの皮内に移植した。24 時間後、FITC/AD あるいは AD 単
独を移植局所の表皮に塗布した。Control は未処置群。所属リンパ節の T 細胞領域内に出現した蛍光トレーサー陽性細胞の密度を縦軸に示した。

の頻度に復帰したが、器官培養によって生体から切り離した皮膚組織片の場合（ex-vivo）分布密度は回復せずに一方的に減少した。このことは、生体内では MMGL 陽性組
織マクロファージが常に血液循環によって補充されている

図６ マウス皮膚へのアセトン／フタル酸ジブチル (AD) 塗布
後の、MMGL 陽性細胞の真皮中での密度の変化。任意の長方形（75×95μm）の領域内の全細胞数に対する MMGL 陽性細胞数の割合を、AD 塗布後の時間経過をおって調べた。
合計 50 領域を計測し、MMGL 陽性細胞の密度についてのヒストグラムを作製した。横軸が、MMGL 陽性細胞の密度、縦軸がその細胞密度を有する領域の出現頻度を表す。AD 塗
布後 MMGL 陽性細胞の密度の多い領域（＞ 15%）が減少し、
24 時間後に塗布前の状態に復帰した。

が、宿主から切り離した皮膚片では補充が起こらないためと解釈できる。また、AD を塗布していない皮膚片を器官培養しても、MMGL 陽性細胞の分布密度に変化がなかったことから、この変化が皮膚への AD の塗布によって誘導されたことが明かとなった。
以上の結果より、AD による皮膚への刺激によって真皮から MMGL 陽性細胞の移動が開始されることを、直接皮膚局所の観察によって明らかにすることができた。

３. ７

化学物質による皮膚組織マ

クロファージ細胞交通の開始機構
AD のような化学物質が組織マクロ
ファージの移動を開始させる機構の一
図７ マウス皮膚器官培養による MMGL 陽性細胞密度の変化。AD を塗布した 30 分後
表皮から所属リンパ節に移動する場合、 （黒丸）、あるいは未処置 ( 白丸）のマウスの皮膚を図１の方法で器官培養した。経時的に皮膚サンプルを採取し、真皮内の MMGL 陽性細胞の分布を計測した。図６と同局所で産生された炎症性サイトカイン
様な方法でヒストグラムを作製し、AD 塗布後 MMGL 陽性細胞の密度の多い領域（＞が関与していることが報告されている。
15%）の出現頻度をプロットしてある。比較として、AD をマウスに塗布し、一定時
また、ランゲルハンス細胞の所属リン
間後に皮膚を採取した場合（in vivo）を示した（黒三角）。図７の右側のヒストグラムは、
パ節への移動には、ケモカイン SLC
AD 塗布 24 時間後の MMGL 陽性細胞の密度についての例である。

端を解析した。ランゲルハンス細胞が− 81 −

（図９）。また、抗マウス TNF—α にも同様に効果が認めの関与を示した報告もある。
組織マクロファージの細胞交通の開始における可溶性

られた（not shown）。さらに、組換え型サイトカインの効因子の関与を調べるため、まず、AD を塗布したマウス皮果を調べた。マウス IL—1α、マウス IL—1β、マウス TNF

膚を組織培養してその培養上清を回収した。未処置マウ—α は、正常マウス皮膚の器官培養系において、真皮からスの皮膚器官培養系に AD 塗布したマウス皮膚の培養上の MMGL 陽性細胞の減少を誘導した（図 10）。

清を添加し観察すると、培養上清の添加量に応じて真皮

次に、AD 塗布マウス皮膚の培養上清に、実際にサイトの MMGL 陽性細胞の分布密度の低下が観察された。次に、カインが含まれているかどうかを調べた。ELISA によっ

培養上清をセントリコンフィルターを用いて分画すると、て、AD 塗布したマウス皮膚の培養上清中に IL—1 β が検活性は分子量 10 , 000 以上の画分に保持された。このこと出された（表２）。さらに、AD を塗布した皮膚におけるは、活性の本体がケモカインではなく、それ以外のサイト

IL—1 β の産生細胞を免疫組織学的に調べると、表皮のラカインであることを示唆している。さらに、ケモカイン受

ンゲルハンス細胞が主要な産生細胞であることがわかった。

容体は G タンパク共役型であり百日ぜき毒素によってシ

これらの観察結果は、AD の塗布によって皮膚局所で IL

グナル伝達が阻害されることが知られているが、AD 塗布
したマウス皮膚の器官培養系に百日ぜき毒素を共存させても、真皮の MMGL 陽性細胞の分布密度の低下を阻止しなかった。
AD 塗布したマウス皮膚の器官培養系に炎症性サイトカインに対する抗体を共存させて影響を調べた。抗マウス IL—
1α、抗マウス IL—1 β 抗体の共存によって、AD 塗布後の真皮からの MMGL 陽性細胞の減少が有意に阻害されたが、対照のハムスター IgG では影響がなかった（図８）。また、抗マウス TNF—α にも同様に効果が認められた（notshown）。次に、正常マウス皮膚の器官培養で、AD 塗布
したマウス皮膚の培養上清中の因子の活性を調べる実験系
を用いて、抗体の作用を調べた。培養上清の効果は、抗マ
ウス IL—1 α、抗マウス IL—1 β 抗体によって解除された

図８ AD 塗布マウス皮膚器官培養における抗サイトカイン抗体の効果。AD を塗布したマウスの皮膚を器官培養する時に100μg/mL の抗体を共存させた。24 時間後の MMGL 陽性細胞の真皮中での密度を図７と同様に求めヒストグラムを作製した。横軸が、MMGL 陽性細胞の密度、縦軸がその細胞密度を有する領域の出現頻度を表す。AD 塗布後 MMGL 陽性細胞の密度の多い領域（＞ 15%）が減少するが (medium)、IL-1β や IL-1α に対する抗体を共存させるとその減少が抑制された。対照のハムスター IgG には効果がなかった。

図９ 正常マウス皮膚器官培養における AD 塗布マウス培養上清の効果と、抗体による中和。AD 塗布したマウス皮膚を培養し培養上清を作製した。正常マウス皮膚を器官培養する際に培養上清を添加するとともに、サイトカインに対する抗体も共存させた。縦軸に、器官培養 24 時間後の皮膚片の真皮における MMGL 陽性細胞の細胞密度の平均値を示した。培
養上清添加によって減少した MMGL 陽性細胞密度が IL-1β
や IL-1α に対する抗体によって回復したが、対照のハムス
ター IgG には効果がなかった。

図 10 正常マウス皮膚器官培養における炎症性サイトカインの効果。縦軸に、器官培養 24 時間後の皮膚片の真皮における MMGL 陽性細胞の細胞密度の平均値を示した。マウス
IL-1β、IL-1α および TNF-α は、正常マウス皮膚片の真皮
中の MMGL 陽性細胞密度を減少させた。

− 82 −

接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交 」の関与

表２マウス皮膚片培養上清中に検出された IL—1β（引用文献）
１）Imai, Y. and Irimura, T.   Quantitative
measurement of carbohydrate binding
activity of mouse macrophage lectin. J.
Immunol. Methods., 171 : 23 - 31 , 1994 .
２）Kimura, T., Imai, Y. and Irimura, T.  
Calcium-dependent conformation of a mouse—1 などの炎症性サイトカインが産生され、その作用によmacrophage calcium-type lectin.   Carbohydrate bindingって MMGL 陽性マクロファージの移動が開始されること

activity is stabilized by an antibody specific for a calcium-を強く示唆しているが、AD がマクロファージの MMGL

dependent epitope. J. Biol. Chem.,   270 : 16056 - 16062 ,

分子の発現自体を細胞レベルで下方調節している可能性

1995 .

を完全には否定できていない。そこで、マウス皮膚から

３）Imai, Y., Akimoto, Y., Mizuochi, S., Kimura, T., Hirano,

MMGL 陽性細胞を単離し IL—1 β 存在下で培養した後、細H. and Irimura, T.   Restricted expression of galactose/

胞を界面活性剤で可溶化した。可溶化した膜タンパク質をN-acetylgalactosamine-specific macrophage C-type lectin

電気泳動しウエスタンブロッティングを行った後、mAb

to connective tissue and to metastatic lesions in mouse

LOM—14 を反応させて MMGL を検出した。その結果、IL—1 β は、42 kDa の MMGL の発現量に細胞レベルでなん

lung.  Immunology, 86 : 591 - 598 , 1995 .
４）Mizuochi, S., Akimoto, Y., Imai, Y., Hirano, H. andら影響を与えないことがわかった。

４．総

Irimura, T.   Unique tissue distribution of a mouse
macrophage C-type lectin. Glycobilogy, 7 : 137 - 146 , 1997 .

括５）Hosoi, T., Imai, Y. and Irimura, T.  Coordinated binding

皮膚を介した感作において、ランゲルハンス細胞の移動

of sugar, calcium, and antibody to macrophage C-typeとは別に、真皮内の組織マクロファージが所属リンパ節に

lectin. Glycobiology, 8 : 791 - 798 , 1998 .

移動することを、組織マクロファージ特異的な細胞表面マ６）Sato, K., Imai, Y. and Irimura, T.   Contribution ofーカーを用いて明らかにした。この現象は、抗原である

dermal macrophage trafficking in the sensitization phase

FITC を溶解した溶媒中の化学物質によって誘導されるこ

of contact hypersensitivity. J. Immunol., 161 : 6835 - 6844 ,とが分かった。また、マクロファージの移動を誘起する能1998 .

力の高い化学物質は、FITC による抗原感作を強めるアジ

７）Akimoto, Y., Imai, Y., Hirabayashi, J., Kasai, K. andュバントとして働くことを見出した。皮膚から単離した組

Hirano, H.   "Histochemistry and Cytochemistry of織マクロファージを蛍光トレーサーで標識し、細胞移植実Endogenous Animal Lectins"   Progress in Histochem.

験によって細胞が実際に移動することを証明した。さらに、

Cytochem., vol. 33 , number 1 , Gustav Fischer Verlag, pp.

皮膚局所の観察および皮膚片の器官培養によって、溶媒中

1 - 92 , 1998 .

の化学物質が真皮からマクロファージの移動を開始させる

８）Kimura, T., Hosoi, T., Yamamoto, K., Suzuki, N., Imai,

ことを直接明らかにした。また、マクロファージ移動の開Y. and Irimura, T.   Epitope mapping of monoclonal

始過程で IL—1 をはじめとした炎症性サイトカインが関与

antibodies specific for a macrophage lectin:   a calcium-

していることを発見した。

dependent epitope is in the carbohyudrate recognition

本研究により、真皮をはじめとする結合組織性マクロフ

domain. Molec. Immun. 37 : 151 - 160 , 2000 .

ァージの細胞交通が、抗原感作の局面で重要な役割を果た

９）Chun, K-H., Imai, Y., Higashi, N. and Irimura, T.  

していることが明かとなり、化学物質のアジュバント作用

Migration of dermal cells expressing a macrophageの発現メカニズムとして重要であると考えている。また、

C-type lectin during the sensitization phase of delayed-

試験管内の皮膚器官培養系は、化学物質アレルギーを誘発

type hypersensitivity. J. Leukocyte Biol. 68 : 471 - 478 ,あるいは補助する恐れのある化学物質の検索に有用と思われる。

2000 .
10）C h u n , K - H . , I m a i , Y . , H i g a s h i , N . I r i m u r a , T .  
Involvement of cytokines in the skin-to-lymph nodetrafficking of cells of the monocyte-macrophage lineage
expressing a C-type lectin.  Int. Immunol. 12 : 1695 - 1703 ,2000 .

− 83 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求
東北大学大学院

鈴

薬学研究科

木

巌

We synthesized lipophilic cyclodextrins (CDs) having ionizable amino groups to investigate their abilities to form
ion pair compounds with a biologically important reducing agent of ascorbic acid (vitamin C, AsA).   Although permethylation on the hydroxy groups of hydrophilic CD derivatives to make them lipophilic is unsuccessful, peracetylation affords lipophilic CD derivatives having amino groups with excellent yields.  The preliminary studies usinghydrophilic amino-CDs revealed that the amino group introduced to the β-CD platform is able to form an ion pair with
AsA.  The binding constants of two  monoamino-β-CDs, one of which has an amino group at the primary hydroxy side(1) and the other has it at the secondary hydroxy side (2), for AsA are 140 and 220 M − 1, respectively, indicating thesuperiority of the secondary hydroxy side modification.   β-CD itself may bind AsA, but the binding constant for the
β-CD-AsA complex cannot be obtained spectroscopically.  Guest binding studies with adenine nucleotides, which have
similar negative charges support the ion pair formation between amino-CDs and AsA even in the highly polar aqueous
solutions.   Binding AsA by the amino-CDs is also supported by the retardation effect on the oxidative degradation of
AsA.  Ion pair formation between lipophilic CDs having amino groups and AsA is indicated by liquid-liquid extraction
and liquid membrane transportation experiments.  When the hydroxy groups of 1 and 2 are acetylated (Ac1 and Ac2,
respectively) to make them lipophilic, they successfully extract AsA dissolved in aqueous phase into ethyl acetate phase
where the lipophilic amino-CDs exist.  The extraction abilities of Ac1 and Ac2 are greater than tetrabutylammnonium
bromide, a well know ion pair agent, indicating that both amino group and CD framework are critical for the uptake of
AsA from aqueous to organic phases.  As the binding strength difference observed for the corresponding hydrophilicCDs, 1 and 2, the secondary hydroxy side modification is superior to the primary hydroxy side modification indicated by
the greater extraction ability of Ac2.  The results obtained in this study suggest that (1) lipophilic amino-CD derivatives
may be useful in uptake of AsA across an organic layer, especially those which have amino groups at the secondaryhydroxy side, and (2) the transmembrane permeation abilities of lipophilic CD derivatives for AsA may be estimatedfrom simple binding studies in aqueous solutions using corresponding hydrophilic CD derivatives.

１．緒

がら，脂溶化 AsA 誘導体は脂質膜中に滞留する傾向が高言く，細胞内への AsA の導入には AsA を直接吸収させる

アスコルビン酸（AsA; Fig. １）はその標準酸化電 E'º

方が効率が良いといえる．本研究では，AsA 同様，生体が 0 . 127 V（vs. NHE, pH 5 . 0）であり，容易に酸化されるに対する毒性が著しく低いシクロデキストリン

物質，すなわち還元剤であり，生体に対する著しい低毒性（CD; Fig. 2）３）に正電荷を持たせ，かつ脂溶化することで，とあわせ，生体内で発生する酸化作用を有するラジカル種

AsA と脂溶性のイオン対を形成させ，AsA の膜透過を実を還元することで抗酸化作用の主要な部分を担っている物

現可能か否かについての検討を行うこととした．

質である ．一般に AsA のような高い親水性を有する化
１）２．実合物の場合，生体はそれらの物質が必要とされる標的細胞

験に，それらに対する輸送タンパクを生体膜上に具備し，そ２．１の膜輸送を行っている．しかしながら，輸送タンパクがな

水溶性 β-CD の過アセチル化：β-CD あるいは既報４- ６）にい細胞や，AsA を積極的に外部か投与しその優れた抗酸より合成したアジ化 -β-CD あるいは 2 , 3 - マンノエポキシ化作用を発揮させる場合には，細胞表面にて親水性物質を

ド -β-CD をピリジンに溶解させ無水酢酸を加え，50℃にて

本質的には透過させない生体膜の存在は大きな障害となる．

２日間反応させた後，溶媒溜去．残滓にクロロホルムを加AsA の経皮投与などを考慮する場合，疎水性の細胞膜やえ，硫酸水素ナトリウム溶液，炭酸水素ナトリウム溶液，

細胞間脂質を透過させる必要があり，この観点から AsA

および飽和食塩水にて洗浄後，シリカゲルカラムクロマトに脂溶性側鎖を導入する試みがなされている ．しかしな

グラフィーに附し（溶媒は酢酸エチル - メタノール系），

２）

Development of Carrier Molecules Capableof Transmembrane Permeation of Ascorbic
Acid and Exploration of Its Mechanism

合成

目的物を収率 83 〜 92％で得た．
Ac 1 の合成：上で得られた過アセチル化 - アジ化 -β-CD を
メタノール - 酢酸溶媒中，水素雰囲気下でパラジウム触媒

Iwao Suzuki

による接触還元を常温，常圧で行い目的物を収率 75％で得た．

Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Tohoku University

Ac 2 の合成：上で得られた過アセチル化 - 2 , 3 - マンノエポ
キシド -β-CD に，ベンジルアミンを作用させ，シリカゲル
ショートカラムクロマトグラフィーにて精製（溶媒は酢酸− 84 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

エチル - メタノール）した後，このベンジル基を Ac 1 での濃度になるよう，各種水溶性 β-CD 誘導体を添加し，円行ったのと同じ条件下，パラジウム触媒による接触還元に二色性スペクトルを測定し，265 nm 付近の円二色性強度て除去し，目的物を収率 44％で得た．

変化より，ベネジ - ヒルデブランドプロット８）より，結合定数を算出した．

２．
２

AsA の安定性

AsA 1 . 0 mM と各種水溶性 CD 誘導体と 5 . 0 mM 含むリ

２．４

液 - 液抽出実験

ン酸緩衝液（100 mM; pH 7 . 2）を恒温槽中に放置し，定期

AsA 1 . 0 mM リ ン 酸 緩 衝 液（5 . 0 mL） と 各 種 脂 溶 性

的にサンプルを採取し，HPLC（UV 検出，波長 284 nm；

β-CD 誘導体を 1 . 0 , 2 . 0 , 3 . 0 mM になるよう溶解させた酢

ODS カラム 4 . 6 × 150 mm；溶離液 pH 5 . 0 リン酸緩衝液：

酸エチル溶液をマグネチックスターラーにて 900 rpm の角

アセトニトリル（８：２），5 mM の臭化テトラエチルア

速度にて 10 分間攪拌し，２相に分離後，水相および有機

ンモニウム（TBAB）を含む）にて AsA を定量し ，擬２に同じ）にて AsA を定量，相を採取し，
HPLC（条件は２．

一次反応速度式に従い AsA の見かけの消失速度定数 k を分配係数 Kp（=[AsA] 有機相 /[AsA] 水相）を求めた．

７）算出した．温度は７，15，25，35，45℃の各温度で行い，アレニウスプロットおよびアイリングプロットより活性化‡

２．５

エネルギー Ea，頻度因子 A，活性化エンタルピー ΔH ，‡および活性化エントロピー ΔS を求めた．

液膜輸送実験AsA の液膜輸送には内径 20 mm，高さ 70 mm，連結部の長さ 50 mm，連結部の内径 20 mm の H 型セルを用いた．
送 出 相 と し て 10 mM の AsA の pH 5 . 0 リ ン 酸 緩 衝 液

２．
３

結合定数の算出

5 . 0 mL，受取相として pH 5 . 0 リン酸緩衝液 10 . 0 mL を用い，

AsA の 7 . 5 × 10 M 水溶液（pH 5 . 0 リン酸緩衝液）に種々-5

有機相には各種脂溶性 β-CD 誘導体を 5 . 0 mM 含む酢酸エ
チル溶液 30 mL を用いた．定期的に２つの水相から 10 mL

２をサンプリングし，適宜希釈した後，HPLC（条件は２．
に同じ）にて AsA を定量した．なお，実験中，２つの水相はマグネチックスターラーにて 100rpm の角速度にて攪
拌した．

３．結
３．１

果

CD 誘導体の合成

本研究で用いた，あるいは合成を試みた β-CD 誘導体をTable 1 に示した．CD の１つの水酸基にを常法によりトシル化した後，アジドあるいはエポキシドに導き，これら中間体の残存する水酸基をピリジン中で無水酢酸を用いる
Fig.1 Structures of ascorbic acid (AsA), its deprotonatedform, and dehydroascorbic acid.

Fig.2

アセチル化７）あるいは DMF 中 NaH- ヨウ化メチルを用いるト
Table 1

Structures and space filling model of β-CD.

− 85 −

Structures of β-CD Derivative Used in This Studyリメチル化，あるいは DMF-DMSO 混合溶媒中 Ba（OH）
2 -BaO

β-CD およびその誘導体について，AsA の包接が起こるか共存下でジメチル硫酸で処理するジメチル化により脂溶化

否かを検討した．Fig. ４に AsA の円二色性スペクトルとを試みた．最後にアジド基は還元し，エポキシ基はベンジそれに及ぼす各種水溶性 β-CD 誘導体の影響を示す．AsA

ルアミンによる環解裂後，接触還元によりアミノ基へと変と β-CD との包接化合物形成は，すでに AsA の吸光度と換した．メチル化した場合には，副生物が多く中間体の精電極反応に及ぼす β-CD の影響よりその結合定数が pH １

製が困難であった．一方，アセチル化を施した Acb，Ac 1，

で K= 1200 M - 1 と報告されている９）が，われわれが行った

Ac 2 では，一般に良好な収率で目的とする CD 誘導体を

円二色性ならびに NMR の結果では pH 5 および 7 で β-CD得ることができた．CD に複数のアミノ基を導入した Ac 3が AsA を包接しているという確証は得られなかった．しは，副生物が多く目的物を純品で得ることはできなかった

かしながら，Table 2 に示したように，AsA の酸化分解をが，予備的に実験に用いた．

抑制するため，弱いながらも包接は起こっている可能性が高い．一方，アミノ化した β-CD である１および２では，

３．
２

水溶性 CD 誘導体による AsA の包接の確認

AsA の円二色性スペクトルが１および２の添加により変

脂 溶 性 CD 誘 導 体 を 用 い る 前 に， 脂 溶 化 し て い な い化したことから，１と２は AsA を包接していることが示唆された．この円二色性スペクトルの変化より，結合定数が算出可能であり，１は K= 140 M - 1，2 は K= 220 M - 1 にて
AsA を包接することが明らかとなった．
AsA の水溶液中（pH 7 . 2）での安定性に及ぼす各種 CD
誘導体の効果をみたところ，円二色性スペクトル上にて包接が示唆された１と２では，顕著に AsA の安定性を増大させた（Table 2）．また，AsA の分解過程の DH と DS に及ぼすこれら CD 誘導体の影響は小さく（Table 3）10），
AsA の酸化分解祖素反応には CD は関与しない，すなわち，
包接することで AsA の酸化分解を抑制していることが強く示唆される．
β-CD のメチル化体である 2 , 6 - ジメチル -β-CD（DM）と 2 , 3 , 6 -トリメチル -β-CD（TM）は両親媒性物質であり，水溶性を具備していることから円二色性による包接の確認を行ったところ，AsA の円二色性スペクトルに影響を与え，包接化合物形成が示唆された．しかしながら，結合定
数解析では，１：１の包接を仮定しても，結合定数が得られず，他の化学両論比の包接化合物の形成が考えられるが，現時点ではその詳細は不明である．また，他の β-CD 誘導体とは異なり，DM と TM は AsA の安定性を減少させたことから，あるいは溶存酸素を含んだ形の包接化合物を形成している可能性も考えられる．
水溶液中におけるイオン対形成が可能なことは，AsAと同様の負電荷を生理学的 pH において負電荷を有し，かつ５炭糖部分を持つアデニンヌクレオチドを用いて，さらに検討した．円二色性スペクトルによる検討から，各種ア
デニンヌクレオチドと１および２との間の包接化合物の結合定数を得ることができた（Table 4）．その結果，やはり
CD 上にアミノ基を導入することにより，ゲストアニオンとの間の効果的なイオン対形成が起こり，電荷を持たない
β-CD よりも各種アデニンヌクレオチドを強く認識できる

Fig.4 Circular dichroism spectra of AsA (7.5×10-5M) in phosphate buffer solutions (pH7.4), alone or in the presence of
5.0mM of β-cd (top), 1 or 2 (middle), and DM (bottom).

ことが明確に示された．さらに，1 H-NMR スペクトルを検討したところ，リボースのアノマープロトンが CD 誘導
体添加によって大きくシフトし，アデニンヌクレオチドで− 86 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

Table 2. Apparent Pseudo-First Order Rate Constants for Auto-Oxidation of AsA in at
Various Temperaturea,b)でより効果的なイオン対形成が期待された．そこで，有機相に酢酸エチルを用い，その中に各種脂溶化 CD 誘導体を溶解させ，水相中に存在する AsA の抽出能を検討した．なお，有機相の溶媒として酢酸エチル以外にもクロロホルム
や n- ブタノールを用いたが，その場合には混合・振とう時にエマ
ルジョン形成が起こったため，抽出能を評価することは不能であった．液 - 液抽出の結果を Table 5に示す．β-CD の過アセチル化体である Acb は AsA の有機相へのTable 3. Activation Eneregy (Ea), Activation Enthalpy (∆H‡), and Activation Entropy(∆S‡) for the Auto-oxidation of AsA

抽出には何ら効果を示さなかったの に 対 し， ア ミ ノ 基 を 有 す る
Ac 1 では小さいながらも抽出能が認められた．さらに，Ac 2 は
Ac 1 よりも効果的に AsA を有機相へと移行させることがわかった．
両親媒性物質である DM およびTM はアゾ色素の液膜輸送に有効であることが報告されているが，AsA の液 - 液抽出においては，

11）

全くその効果を示さなかった．これらは上述の通り，水溶液中でTable 4 Binding Constants of β-CD Derivatives for Adenine Derivatives in pH 7.4
Aqueous Solutions at 25℃

AsA を包接することが示唆されており，かつ有機溶媒に可溶であるにもかかわらず，AsA の有機相への移行を行いえなかったことから，有機相への AsA の移行には CD の空洞のみではなく，正荷電を持ちうるアミノ基の存在が重要であること，したがって，水相- 有機相の界面でのイオン対形成が必要であることが示唆された．
このことは対照実験として行った
TBAB をイオン対形成剤として用いた場合に，わずかではあるが，はアデニン環ではなく，リボース部分が包接されることが有機相への移行を観察できたことからも支持される．また，判明した．

TBAB と Ac 1 や Ac 2 の AsA に対する分配係数 Kp を比較すると，Ac 1 で約２倍，Ac 2 では約４倍の抽出能が認

３．
３

脂溶性 CD 誘導体による AsA の液 - 液抽出められた．このことから，単なるイオン対形成ではなく，水溶性 CD 誘導体による結果から，アミノ基を導入した

界面での包接に CD 空孔も関与していることが示唆された．

β-CD 誘導体はイオン対形成を補助駆動力として AsA を包接することが示唆された．したがって，より疎水的な環境

３．４

下では Ac 1，Ac 2 などの脂溶化した β-CD 誘導体との間− 87 −

脂溶性 CD 誘導体による AsA の液膜輸送

前節での結果をふまえ，H 型セルを用いる AsA の液膜

Table 5 Partition Co-efficient (Kp) of AsA between Aqueous and Ethyl Acetate Layersa)

４．考察

AsA は 親 水 性 物 質 で あ り，
主として疎水性相互作用を駆動力とする β-CD とは包接化合物を形成しにくい物質である．しかしながら，CD は安息香酸ア
ニオンを包接する際に，極めて親水的であるはずのカルボキシ
ラート部分を疎水性空孔内に取り込んでいることが知られており 12），AsA についても，すでに 報 告 さ れ て い る よ う に，Table 6 Transmembrane Transportation Rates (unit in mM h-1) at 25℃ for AsA Mediated by Lipophilic CD Derivativesa)

β-CD に包接される可能性は否定できない．それが AsA の安定性改善に対する要因であると思われるが，他の分光学的手法
では包接化合物形成を確認できず，その結合定数値は小さいもの と 推 定 で き る． 対 照 的 に，

輸送について検討した．ここでも有機相として酢酸エチル

pH ５あるいは pH 7 . 2 にてプロトン化し，正電荷を有するを使用した．その結果を Table 7 に示す．液 - 液抽出にて

１および２では，水溶液中においても AsA を包接しうる効果のなかった Acb と DM, TM は，予想通り AsA の液ことが示唆された．これは，ホスト側に正電荷，ゲストで膜輸送を行い得なかった．これに対し，液 - 液抽出にて効ある AsA に負電荷があり，その間でイオン対形成が起こ果を示した Ac 1 および Ac 2 は，おそいながらも液膜輸送

り，AsA が β-CD 空孔に包接されたものと考えることがでを行いえた．すなわち，Ac 1 は 0 . 0146 mMh の速度で，きる．このことは，AsA と同じく生理学的 pH にて負電

また Ac 2 は 0 . 0201 mM h の速度で送出相から受取相へ荷があり，かつ５炭糖構造を有するアデニンヌクレオチドと AsA を輸送した．Ac 1 および Ac 2 は本来，荷電を持に対する CD 母核上のアミノ基のイオン対形成に基づく包たない形であり，プロトン化することで正荷電を獲得する．

接力の増強からも確認することができる．

-1-1

したがって，Fig. 3 に示したように，界面で AsA ととも

ここで，CD の修飾位置に関する違いを見てみると，１にプロトンを送出相から受け取り，受け取り相との界面に

級水酸基側にアミノ基を導入したものより，２級水酸基側て AsA とプロトンとを放出する機構が考えられる．また，にアミノ基を導入したものの方が，AsA の安定性の増大

精製が不充分ではあるが，２つのアミノ基を有する Ac 3に対する効果が大きい．このことは，２倍の水酸基が存在を液膜輸送の単体として用いたところ，界面が時間の経過

し，より親水的な環境であると考えられる CD の２級水酸とともに白濁し，長時間での測定は不能であったが，初期

基側に正電荷を導入することで，より効果的な AsA の包の輸送速度は 0 . 0226 mM h であり，この結果は複数のア接を行うことが可能になることを示している 13）．

-1

ミノ基の CD への導入により，より効果的な AsA の膜輸

この２級水酸基側への正電荷の導入の優位性は，CD を送担体とすることができる可能性を示唆するものである．

脂溶化した Ac 2 においても，液 - 液抽出ならびに液膜輸送実験にも現れた．すなわち，対応する１級水酸基側修飾体である Ac 1 に比べ，液 - 液抽出能で約２倍，液膜輸送能で約 1 . 4 倍の効果を AsA の有機相移行に対して示した．
また，イオン対試薬として汎用されている TBAB とも比較して，Ac 2 は約４倍の液 - 液抽出能，および約 2 . 5 倍の液膜輸送能を AsA に対して示した．このことは，液 - 液
界面にて AsA と Ac 1，そして特に Ac 3 は単なるイオン

Fig.3 Proposed mechanism for Ac1- or Ac2-mediated transportation of AsA across liquid membrance.

対形成によって AsA を有機相に移行させるのみでなく，
AsA の形状を認識して包接することを示唆している．し− 88 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

かしながらアミノ基のない Acb や，水溶液中でも AsA を

Extracellular Matrix Construction: Nippon Rinsho, 57 ,包接することが示唆された DM および TM では界面でのAsA の捕捉を行い得なかったことから，界面における2223 - 9 , 1999 .
２）

For example; Schmid E, Figala V, Roth D, et al.,

AsA 認識の主たる駆動力はイオン対形成であり，CD 空孔:Antioxidant and Nuetrophil-Inhibiting Properties ofの関与する認識力（おそらくは van der Waals 力であろう）

New 2 -O-Methyl- 6 -(alkylthio)ascorbic Acid Derivatives:

は補助的な役割を担っていると考えられる．

J. Med. Chem., 36 , 4021 - 4029 , 1993 .

アミノ基を有する CD 誘導体について，本研究から得ら３）れた示唆の１つとして，水溶液中で AsA を包接しうるも

Supramolecular Chemistry, Volume 3 , Cyclodextrins:のは，界面においても有効なホストとして機能し，水溶液中での包接の強さと界面での捕捉力にはある程度の相関がPergamon, Oxford, 1996 .
４）認められたことである．まだ例数が少ないため，確定的な18 , 29 - 37 , 1971 .
５）の AsA 輸送キャリアーをスクリーニングする手段として，簡便である水溶液中での各種分光的手法による包接化合物

戸田不二緒監修・上野昭彦編集，：シクロデキス

トリン−基礎と応用−：産業図書，東京，1995，第４章．
６）

形成を確認することで代用できる可能性がある．

５．総Melton LD, Slessor KN, :Synthesis of

Monosubstituted Cyclohexaamylose: Carbohydr. Res.,

ことはいえないが，仮に水溶液中での結果と界面での捕捉力とがパラレルな関係にあるとすると，今後，このタイプ

Szejtli J, Osa T (eds), :Comprehensive

Teranishi K, Watanabe K, Hisamitu M. Et al.,:Efficient Regioselective Synthesis of Mono- 2 -O-SulfonylCyclodextrins by the Combination of Sulfonyl

括

Imidazole and Molecular Sieves: J. Carbohydr. Chem.,

本研究でこれまでに得られた成果は上述の通りである．
すなわち，β-CD にわずか１つのアミノ基を導入すること

17 , 489 - 494 , 1998 .
７）Pappa-Louisi A, Pascalidou S, :Optimal

で，水溶液中での AsA の安定性を向上させることが可能

Conditions for the Simultaneous Ion-Pairing HPLCであった．これはこれら CD を基盤とする分子がホスト分

Determination of L-Ascorbic, Dehydro-L-Ascorbic,

子として AsA を包接し，溶存酸素による酸化を抑制する

D-Ascorbic, and Uric Acids with On-line Ultraviolet

機能を有していること示すものである．さらに，これらのAbsorbance and Electrochemical Detection: Anal.

水溶性 β-CD を過アセチル化により脂容化することで，少Biochem., 263 , 176 - 182 ( 1998 ).

なくとも酢酸エチル相への AsA の移行を促進することが８）

Benesi HA, Hildebrand JH, :A Spectrophotometric

可能であった．予備的に行った２つのアミノ基を有する脂Investigation of the Interaction of Iodine with

溶性 β-CD 誘導体は１つのアミノ基のみを有する β-CD 誘

Aromatic Hydrocarbons: J. Am. Chem. Soc., 71 , 2703 -導体よりも効率的に AsA の有機相への移行を促進する結2707 ( 1949 ).

果が得られており，今後，２つのアミノ基を有する β-CD

９）Manzanares MI, Sol s V, de Rossi RH, :Effect of

誘導体の効率的合成法および精製法を確立することで，あCyclodextrins on the Electrochemical Behaviour of

るいはより効果的なキャリアー分子を開発できる可能性がAscorbic Acid on Gold Electrodes: J. Electroanal.

ある．

Chem., 407 , 141 - 147 ( 1996 ).

本研究では，AsA の脂質膜透過を促進するキャリアー

10）

分子を，生体に対する毒性の低い CD 誘導体にて実現させる系についての検討を行う予定であったが，肝心の脂質膜中間報告に記載のデータに誤りがありました．謹

んでお詫びいたします．
11）

Harada A, Takahashi S, :Transport of Neutral

透過性を検証するには至らなかった．この点については，

Azobenzene Derivatives by Methylated Cyclodextrins:

今後も引き続き検討する予定である．

J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1987 , 527 - 528 .
12）

引用文献
１）

Suzuki I, Obata K, Anzai J, Ikeda H, Ueno A,:Crown Ether-tethered Cyclodextrins: Superiority of

Kaneko K, Nagao N, Miwa N, :Vitamin C:

the Secondary Hydroxy Side Modification in Binding

Atructure-activity Correlation and Cytoprotective

Tryptophan: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 , 2000 , 1705 -Actions through Free Radical Scavenging and1710 .

− 89 −

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定
京都大学大学院

高

橋

医学研究科

健

造

Injury to the skin tissue elicits a repair response aimed at restoring the epithelial continuity, which is essential to anormal skin barrier function.   Epidermal keratinocytes at the wound edge are recruited for the re-epithelialization of
the wound site.  However, the mechanism of the re-epithelialization is not easily understood compared with the simple
epithelia.   While the migration of keratinocytes occurs in the form of a stratified sheet, the relative contribution andultimate fate of progenitor and differentiating keratinocytes during this vital process remains unclear.   In this study,
we use the transgenic technology to induce the wound specific gene recombination.   We prepared two kinds of thetransgenes to introduce the injured epidermis specific gene expression at the suprabasal keratinocytes, one for the
wound specific expression of the cre recombinase and the other for the expression of the marker proteins.    We usedthe double transgenic mice to trace the migration of the suprabasal keratinocytes activated at the wound edge.   Bythis transgenic work we might be able to conclude the long term question, whether the suprabasal keratinocytes could
recover the mitogenic property and migrate into the ulcerative surface or not.

１を有する。表皮組織の創傷治癒過程においては、いずれのはじめに分化段階の細胞がそれぞれどのような役割を担っているの

皮膚はヒトの体の最も外側に位置し、生体内部の臓器をかはわかっていない。すなわちどの層の細胞が潰瘍部に遊保護する重要なバリアーとして働いている。外傷などによ走し、再生し上皮化した新生表皮を構築しうるのはどの細る皮膚の欠損は、きわめてすばやい治癒反応を引き起こす。

胞に由来しているのかなどは、いまだ決定されていない。

この創傷治癒反応は、秒単位で現われる血小板や血管内皮

表皮に代表される重層偏平上皮の創傷治癒機転のモデ細胞の関与する凝固・止血反応にはじまり、真皮線維芽細ルとして、従来より２つのモデルが提唱されている（図１）

胞による創傷部の収縮・肉芽の形成、表皮欠損部への表皮（文献７, ８, 10 - 12）角化細胞の遊走・増殖とこれらによる潰瘍表面の再上皮化皮と同様に、基底細胞の増殖と遊走のみが重要な役割を担から最終的には新生表皮組織の再構築へと続く（文献２, ３, ８,10）。

い、基底層より上に位置する有棘細胞は補助的な役割のみ

外胚葉性の上皮組織であり体表を取り巻く表皮細胞は、を持つか、あるいは積極的な関与がないとする考えである

消化管や肝臓・腎臓などの内胚葉由来の単層上皮より構。１つは重層上皮の再上皮化においても単層上（スライデイング仮説）（図１上）。

成される組織とは異なり、重層化した数層よりなる偏平組

一方、別のモデルであるローリング仮説によると、表皮織により構成する。すなわち皮膚は基底細胞（Basal Cell）

組織においては創傷外縁の有棘細胞が、基底層へと転がりと基底細胞の上層に位置する有棘細胞（Suprabasal Cell）、

落ちキャタピラのように次々と欠損した上皮を覆っていく

顆粒細胞（Granular Cell）さらに最外層をなす角質層の数というものである。この考えによると基底層上層の有棘細ー十数層の細胞より形成され、単層上皮と比較して遙かに複雑な構成成分よりなる（文献３）。
基底細胞が順次上層の細胞へと分化し、充分な保護能力を獲得しつつアポトーシス類似のシステムにより死滅し脱落していくこの過程は角化と呼ばれ、表皮や口腔粘膜、角膜などの重層扁平上皮に特有な分化形態である。各角化段
階の細胞層はそれぞれ固有の機能やそれに伴う細胞生物学
的・生化学的な特徴を有する。このため表皮組織の創傷治
癒過程は、単層上皮組織のものよりもはるかに複雑な段階
Injury specific gene marking to follow the
wound healing process under the injured
epidermis specific gene recombination
Kenzo Takahashi
Department of Dermatology, Kyoto
University Graduate School of Medicine

図１ これまでに提唱されている重層上皮組織の創傷治癒過程のモデル
創傷近傍の基底層の細胞のみが潰瘍面に直接遊走すると考えるスライディング仮説と、有棘層の細胞も潰瘍面に転がり落ち、上皮化に参加するとする２説が提唱されてきた。

− 90 −

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定胞も表皮の再生に積極的な役割を果たしていることになる層よりも上層の細胞にのみ発現することを確認した。

（図１下）。しばしば創傷治癒過程の皮膚においては、有棘

そこでさらに創傷治癒過程後期あるいは潰瘍局面が再上層の細胞が基底細胞を乗り越え潰瘍面へと落ち込んでいる

皮化された後の再生表皮細胞が基底細胞あるいは有棘細胞

かのような組織像が観察され、このローリング仮説はこののどちらの細胞に由来するのかを決定するために、創傷表ような組織学的所見にはうまく合致する。しかしながら正皮に特異的な遺伝子組み替えシステムを用意した。バクテ

常な皮膚組織においては、有棘層より上層の細胞は基底細リオファージ由来の Cre/LoxP の組み替えシステムを用い胞より分化し分裂能を失った細胞であると考えられている。

創傷表皮に特異的な遺伝子の組み替えを誘導し、導入した

実際、マウスや人の摘出皮膚を短期間 BrdU や放射性サイ

遺伝子自体をマーカーとすることで、潰瘍面に遊走する有ミジンの存在下で標識しても正常な有棘層の細胞はラベル

棘細胞を追跡することを目指した。マーカーとして導入遺されてこない。このようにローリング仮説は、有棘細胞が伝子自身を活用することで、レポーターとなる蛋白質が細創傷などの刺激により、再び増殖・分裂能を回復し基底細胞内で変性され追跡が困難になることなく、治癒過程の後胞の性格を取り戻す脱分化を起こしうるのかという問題に期における細胞の遊走の様子や由来の観察が可能となると直面する。このように、重層上皮の創傷治癒機転を考える

考えた。創傷治癒過程の完了後に新たに再上皮化された表上で、創傷治癒後に再上皮化した新生表皮組織が創傷部近皮細胞がどのレポーターを発現しているのかを観察するこ傍の基底細胞にのみ由来するのか、あるは基底層上層の有とで、新生表皮は表皮基底細胞あるいは基底層上層の有棘棘細胞にも由来するのかは、皮膚の創傷治癒研究における細胞のどちらに由来するのかを観察し、創傷治癒過程にお長年の解決すべき大きな命題である。
今回我々は、近年の遺伝子導入マウスの技術を応用し、創傷治癒にかかわる表皮角化細胞、特に有棘層の細胞にマーキングをすることで、創傷部位近傍の有棘細胞が実際の治癒過程においてどう遊走し、表皮の再生にどのような役割を担っているのかを決定したいと考えた。

２

実験方法

図２

ヒトケラチン 6 遺伝子同位体群の構造
ヒトの染色体上には少なくとも６種以上のケラチン６同位体が存在し、そのいくつかは互いに隣接して存在する。エク
ソンーイントロン構造や大きさなど極めて類似した構造を示す。

創傷表皮に特異的に遺伝子を誘導するために、創傷部近傍の有棘細胞に強く発現することの知られているヒトケラ
チン６遺伝子を利用することから始めた。我々はこれまでにヒトのケラチン６遺伝子には６種以上の同位体が存在し、それぞれ異なった発現調節をなされていることを同定している（図２）。その中より創傷やフォルボールエステル、

表１

レチノイン酸などの刺激により最も強く誘導される同位体であるケラチン６a の発現活性（表１）をトランスジェニ
ックマウスの作製に用いることにした。
今回の研究ではすでに単離し解析を加えてきたヒトのケ
ラチン６a 遺伝子の 5 ' 側非翻訳領域の（約５kbp）をプロ
モーターとして利用した発現ベクターを開発した。まず始めに、この発現ベクターを用いてレポーターとなるガラク
トシダーゼ蛋白質を繋げた遺伝子を構築し、この導入遺伝子を持つトランスジェニックマウスを作成し、（図３上）
このプロモーターの誘導活性を様々な刺激を加えたマウスの表皮組織において検討を加えた。
この導入遺伝子を持つマウスでは実験結果（図４）に示すように創傷表皮にのみ特異的にガラクトシダーゼ遺伝子
を強く発現することが観察された。このマウスを用いて創傷治癒実験を行い、治癒過程を組織学的に追跡することで、創傷治癒過程の早期における有棘細胞の遊走のようすの観察が可能となり、またこのプロモーターが創傷表皮の有棘− 91 −

ヒトケラチン 6a 遺伝子同位体群の発現様式
ケラチン６同位体は極めて類似した遺伝子構造を保持するが、発現活性は同位体間で大きく異なっている。ケラチン
6a 同位体がいずれの部位においても有意に発現している。

図３

導入遺伝子の構造
上段 (K6a-LacZ) がヒトケラチン 6a遺伝子プロモーターの下流にガラクト
シダーゼ遺伝子を有する。この導入遺伝子によりケラチン 6a 遺伝子を用いた発現ベクターの in vivo での転写活性を詳細に検討し、創傷治癒反応の初期における角化細胞の遊走の様子を検討した。中段 (K6a-Cre) はこのヒト
ケラチン 6a 遺伝子の発現ベクターにCre リコンビネースを連結した導入遺伝子である。下段 (CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ) はサイトメガロウイルス
プロモーターにより転写されるレポー
ター遺伝子を表す。第一のレポーター
である緑色蛍光蛋白 (GFP) はその両端に LoxP 配列を有し、その下流には第二のレポーターであるガラクトシ
ダーゼ遺伝子が結合する。

いては有棘層の細胞が実際に分裂能を取り戻しうるのかを決定できる。
このために、次の２種類の導入遺伝子を構築した。１つ目の導入遺伝子は、バクテリオファージ由来の Cre リ
コンビネースを創部表皮の有棘細胞にのみ特異的に誘導するためのもので、上記のヒトケラチン６a 遺伝子由来の5 kbp のプロモーターの下流に Cre リコンビネースを連結させた（図３中）。さらに導入遺伝子をマウスの生体内でマーカーとして使うためのレポーター遺伝子の組み合わせをもう１つの導入遺伝子として用意した。第一のレポーターである緑色蛍光蛋白（GFP）の両端に、Cre リコンビネ
ースによって認識される LoxP 配列を配置しておく（図３下）。この第一レポーターの下流には第二のレポーター遺伝子としてガラクトシダーゼ遺伝子を繋げ、これらは上流に存在するウイルスのプロモーターにより、全ての細胞に発現されように構築した。これらの導入遺伝子を染色体上に導入されたトランスジェニックマウスをそれぞれ作成し、両者をかけ合わせ、両方の導入遺伝子をもつダブルトラン

図４

K6a-LacZ 導入マウスを用いた創傷治癒実験。
創傷やフォルボールエステル，レチノイン酸塗布によりガラクトシダーゼ遺伝子は創傷近傍の有棘層の細胞に強く誘導されるが、内在性のケラチン 6a が恒常的に発現する毛嚢などの表皮付属器には、全く転写活性はない。

スジェニックマウスを創傷治癒実験に用いた。
この実験系において、創傷特異的な発現活性をもつケラ
チン６a のプロモーターに誘導される Cre リコンビネース
は、健常な上皮組織に発現されることはなく、LoxP 配列を認識した組み替えは起こらない。しかし、ひとたびこののなら、再上皮化が完了したのちの新生表皮細胞は依然とダブルトランスジェニックマウスの皮膚に創傷刺激を加えして、第一のレポーターである緑色蛍光蛋白（GFP）のみ

ると、近傍の有棘細胞においてケラチン６a 遺伝子によるを発現している。一方ローリング仮説が予言するように、Cre リコンビネースの発現が誘導され、この働きにより基底層上層の有棘細胞が再上皮化にかかわるのならば、新LoxP 配列を介した第一のレポーター遺伝子の組み替えが生した表皮細胞はすでに Cre リコンビネースによるレポ起こりマウスの染色体より切り離される。その結果、創傷ーター遺伝子の組み替えが起こった後なので、第二のレポ

刺激を受けた有棘細胞では第二のレポーターであるガラクーターであるガラクトシダーゼ遺伝子が基底細胞から有棘

トシダーゼ遺伝子の発現が誘導されると考えた。

層の細胞まで全ての表皮細胞層で新生表皮において観察さもし創傷部位への遊走に基底細胞のみがかかわっているれるはずである。

− 92 −

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定

３

結

遺伝子組み替え作用を有する Cre リコンビネースを上で果検討したケラチン 6 a の発現ベクターを用いて誘導する。

図３に示した３種類の導入遺伝子を染色体上に組み込ま

創傷特異的な発現活性をもつケラチン６a のプロモータ

れたトランスジェニックマウスをそれぞれ数系統ずつ作製

ーに誘導される Cre リコンビネースは、健常な上皮組織した。その中で発現活性の強く子孫への導入遺伝子の伝搬に発現されることはなく、第二の導入遺伝子に存在するの良好な２−３系のマウスに代表させ以下の実験に用いた。

LoxP 配列を認識した遺伝子の組み替えは起こらない。そまずは今回の実験系の基礎となるケラチン６a 遺伝子をのため健常な表皮組織においては、基底細胞から有棘層、用いた発現ベクターの転写活性を詳細に検討するために、

顆粒層のすべての細胞に上流に位置するレポーターである

ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター（図３上）とした導緑色蛍光蛋白（GFP）の発現のみが観察される。しかし、入遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いて創傷治

ひとたびこのダブルトランスジェニックマウスの皮膚に切癒実験を行った。

開を加えると、その近傍の有棘細胞においてケラチン６遺ヒトのケラチン６蛋白質はケラチン６a 同位体蛋白を含伝子による Cre リコンビネースの発現が誘導され、このめ、健常な皮膚においては、毛嚢や脂腺などの付属器の恒働きにより LoxP 配列を介した第一のレポーター遺伝子の常的に発現しているが、表皮角化細胞には基底層から有棘遺伝子の組み替えが生じ、マウスの染色体より切り離され層、顆粒層のいかなる細胞にも発現していない。しかし創る。その結果、創傷刺激を受けた有棘細胞では第二のレポ

傷やフォルボールエステルなどによるの刺激を表皮に加えーターであるガラクトシダーゼ遺伝子の発現が誘導される

るとケラチン６の蛋白質は急速にそして大量に基底層よりと考えた。もし創傷部位への遊走に基底細胞のみがかかわ

も上層の有棘層・顆粒層の細胞に誘導される（図４）。

っているのなら、再上皮化が完了したのちの新生表皮細ヒトケラチン６a 遺伝子の 5 kbp の非翻訳領域をプロモ胞は依然として、第一のレポーターである緑色蛍光蛋白

ーターとして利用することにより、ガラクトシダーゼ遺伝（GFP）のみを発現している。一方ローリング仮説が予言

子は創傷刺激やフォルボールエステル、レチノイン酸によするように、基底層上層の有棘細胞が再上皮化にかかわるる刺激をうけた表皮や舌、口腔粘膜などの扁平上皮組織ののならば、新生した表皮細胞はすでに Cre リコンビネー

基底層より上層の有棘細胞に強く発現誘導されたが、本来スによるレポーター遺伝子の組み替えが起こった後なので、ケラチン６が恒常的に発現している毛嚢などの皮膚の付属

第二のレポーターであるガラクトシダーゼ遺伝子が基底細器での転写活性は全く失活していた（図４）。このマウス

胞から有棘層の細胞まで全ての表皮細胞層で新生表皮におでは、創傷をうけた表皮などの重層扁平上皮においてのみ

いて観察されるはずである。

ガラクトシダーゼ遺伝子が誘導されるが、その他の健常なまずは、今回開発した発現ベクターを用いた Cre/LoxP

表皮や他の上皮組織においては、発生、成長の段階をとおの遺伝子組み替えシステムが、表皮角化細胞において有効して導入遺伝子は発現されない。また創傷部においても基に働くことを示すために培養表皮細胞株（DJM- 1）の形

底層の細胞はガラクトシダーゼ遺伝子の発現は見られない。

質転換に用い、これらの２つの導入遺伝子を in vitro の系

これらの結果より 5 kbp のケラチン６a 遺伝子プロモータ

で強制発現させた。GFP とガラクトシダーゼ遺伝子の連ーは創傷表皮の有棘層のマーキングに大変有用な発現ベク

結したレポーター遺伝子のみの形質転換では、第一のレポターとなることが証明された。実際、創傷治癒過程の早期ーターである GFP の発現のみ観察され、ガラクトシダー

において、創部近傍の表皮角化細胞が潰瘍部へと遊走する

ゼ遺伝子の発現は全く認められなかった。しかし Cre リ

様子が観察された（図４）。しかしながらこの組織像よりコンビネースの遺伝子と共発現させた際には GFP の発現

直接に有棘層の細胞が潰瘍表面を覆い再上皮化した皮膚をは消失しガラクトシダーゼ遺伝子の発現が確認された（図構成しているとは決定できない。有棘層の細胞同様基底層５）。これらの事実は、少なくとも培養表皮細胞においての細胞も潰瘍面へと遊走し、その後の分化過程により基底はこの遺伝子組み替えシステムが働いていることを証明す

層上層へと角化した細胞がガラクトシダーゼ遺伝子を発現るものである。

するに至ったとも考えられるためである。また再上皮化がこれら２種類の導入遺伝子（図３中、下）をもつ遺伝子終了した後の再生表皮においては一旦発現したガラクトシ

導入マウスを作成し、それぞれについて５- １０系統のマダーゼ蛋白は遺伝子の発現がなくなり、蛋白の分解によりウスのラインを獲得した。この中より発現の強く子孫へと観察されなくなる。

導入遺伝子を伝搬する効率の高い系統を選び、これらを掛

そこで我々はこの発現ベクターのアイデアを進め創傷部

け合わせることで創傷治癒後期の表皮角化細胞の遊走の様位に誘導されるガラクトシダーゼ蛋白ではなくて、遺伝子子を観察した。耳にパンチにより付けた創傷後の組織をそのものを追跡マーカーとして用いる導入遺伝子のシステ

４８時間後に X-Gal 染色したところ、Cre と LoxP の両者ムを構築した。上の実験方法にあげたように部位特異的なの導入遺伝子を持つダブルトランスジェニックマウスも創− 93 −

傷周囲にガラクトシダーゼ遺伝子を誘導しているのが観察

ー遺伝子の発現を検討した。体幹表皮を用いたこの創傷治された（図６）。そこで、マウスの尾に細長い創傷を作り、癒実験においても、創傷初期においては第二のレポーター

経時的に再生上皮におけるガラクトシダーゼ遺伝子の発現であるガラクトシダーゼ遺伝子の発現が観察されたが、治を追跡した。マウスの尾は下床直下に尾骨があり、創傷治

癒反応の終了した後の再上皮化した表皮においては、ガラ

癒過程に真皮の創傷収縮が関与する率が少なく、上皮の遊クトシダーゼ遺伝子を発現する細胞は僅かにしか観察され走・再生が大きな役割を示すために用いた。

ない（図８）。

創傷治癒が完了し再上皮化の終了した後の尾皮膚の新生

しかしながら、この事実が直ちに有棘層の細胞が創傷治

上皮においてはガラクトシダーゼ遺伝子は僅かの孤立的な癒に貢献していないことの証明であるとは断定できない。

細胞においての発現しか観察されなかった（図７）。

このマウスの創傷部の表皮の病理像を蛍光抗体法により観さらに体幹部の皮膚に直径２−３cm 程の皮膚全層の切察したところ、創傷表皮における Cre リコンビネースの除を加え、経時的な生検によりさまざまな段階でのマーカ発現は、比較的高いレベルの有棘層あるいは顆粒層に相当する細胞にのみ限られ、基底層の近傍の細胞には発現誘導されていない。このため Cre リコンビネースによって引き起こされる遺伝子組み替えは、さらに遅れ最終的なガラ
クトシダーゼ遺伝子の発現は顆粒層から角層に近い層に限局するものとして観察された（図９）。そこでヒトケラチ

図５

培養表皮角化細胞での導入遺伝子の発現活性
CMV-LoxP-GFP-LoxP-LacZ 遺伝子単独では、GFP 蛋白のみが発現するが、K6a-Cre と CMV-LoxP-GFP-LoxP-LacZ の共導入においては、GFP 蛋白は切り出され発現が消失する
が、LacZ が誘導されている。

図７

マウス尾部での創傷治癒実験
創傷治癒面近傍の細胞のみ青く染色され、再生された表皮（２５d）においては、染色性は消失している。

図６

マウスの耳の創縁
イアーパンチ後のマウスの耳を X-Gal で染色し、導入遺伝子の転写活性を検討した。K6a-Cre と CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ のダブルトランスジェニックマウスと K6a-LacZ
マウスとも創傷局面に青く染色される。

図８− 94 −

マウスの体幹での創傷治癒実験
治癒過程の遊走面では青く染色されるが、再生表皮組織はLacZ 蛋白の発現は見られない。

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定

ン 6 a 遺伝子により転写される Cre リコンビネースの活性コンビネースをあらかじめ有棘層へと誘導しておいて切開を強く基底層直上付近まで誘導されるように、トランスジを加える治癒実験を行った。創傷治癒過程の早期においてェニックマウスをかけ合わせ、Cre リコンビネース導入遺は上記の実験同様に潰瘍面や遊走する細胞にガラクトシダ

伝子のコピー数を増加させたマウスを創傷治癒実験に用いーゼ遺伝子の発現が観察される。さらに健常な尾部表皮全た。さらにこのマウス尾部に創傷を加える前処理としてフ体にもガラクトシダーゼ遺伝子が発現するがこれは全処理ォルボールエステル（PMA) を尾部に連日塗布し、Cre リのフォルボールエステル塗布により創傷刺激を加える前よりガラクトシダーゼ遺伝が誘導されていたことを示す（図10 上）。治癒過程後期の尾部においても、潰瘍面へと遊走していく角化細胞にはガラクトシダーゼ遺伝子の発現が観察されるが、その遊走面と健常表皮の間の再上皮化の完成
した再生表皮においてはガラクトシダーゼ遺伝子の発現は見られない。なおこのころには健常表皮のガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現は消失している（図 10 下）
。

４

結

語

これまで上記の導入遺伝子を持つマウスの尾部や体幹の皮膚に大きめの切開を加え、さまざまな段階でのマーカー
図９

マウス創傷表皮の免疫染色像
創傷表皮において Cre 蛋白は有棘層上層から顆粒層にかけて発現しているが、LacZ 蛋白はさらに表層の角化層に近い細胞にのみ発現している。

遺伝子の発現を検討してきた。創傷初期から早期においては第二のレポーターであるガラクトシダーゼ遺伝子の発現は潰瘍へ遊走する細胞に発現する様子が観察されたが、治癒反応の終了した後の再上皮化した表皮細胞においてはガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現する細胞は僅かにであった。
この結果は創傷の前処理としてフォルボールエステルによる誘導を試みたマウスにおいても同様であった。
これらの事実を考えると重層上皮においても、ローリング仮説の予想するような有棘層の細胞が再び基底層の細胞へと脱分化し、再生・分裂能を回復するとする考えは証明され得なかった。今後は、単層上皮同様に、表皮組織においてもスライディング仮説が予測するように基底層のみが創傷治癒に重要であるのか、あるいはこの実験系では充分に検証できない欠点があるのかを検討していきたい。
謝辞
この研究のためご支援いただきましたコスメトロジー研

究財団に心より感謝いたします。
（文献）１）P a u l i n e W o n g , E m m a C o l u c c i - G u y o n , K e n z oTakahashi, Changhong Gu, and Pierre A Coulombe.
"Introducing a Null Mutation in the Mouse K 6 a andK 6 b Genes Reveals Their essential Structural Role
図 10 フォルボールエステルによる前処理を加えたマウスの創傷治癒実験
PMA を連日塗布後に尾部に切開を加え、経時的に X-Gal
で染色した。左の２ヶが、K6a-Cre と CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ のダブルトランスジェニックマウスで、右の尾がK6a-LacZ マウスのものである。傷面へむかう遊走表皮細胞は青く染色されるが、再生表皮は青く染まらない。

in Oral Mucosa Epithelia."  J. Cell Biol.  150 , 921 - 928
2000２）Reiko Inada, Masato Matsuki, Keiko Yamada,− 95 −

Yoichi Morishima, Shen-Chun Shen, Nobuo Kuramoto,
Hirokazu Yasuno, Kenzo Takahashi, Yoshiki Miyachi
and Kiyofumi Yamanishi "Facilitated Wound Healing

by Activation of the Transglutaminase 1 Gene." Am J
Pathol. 157 ( 6 ), 1875 - 1882 , 2000
３）

Biol. 132 , 381 - 398 , 1996８）

Kenzo Takahashi. and Pierre A. Coulombe. "The

Kenzo Takahashi, Pierre A. Coulombe andcellular mechanisms of keratinocyte migration into

Yoshiki Miyachi. "Using transgenic models to study thea skin wound site: An open question with important

pathogenesis of keratin-based inherited skin diseases."  

implications"   Cell Vision, J Analytical Morphology   J. Dermatol. Sci. 21 ( 2 ), 73 - 95 1999

3 ( 3 ), 217 - 223 , 1996

４）

Kenzo Takahashi, Bing Young, Kiyofumi

９）

Yamanishi, Sadao Imamura and Pierre A. Coulombe.

Kenzo Takahashi, Rudy Paladini and Pierre A.

Coulombe. "Cloning and characterization of multiple"Two functional keratin 6 genes of mouse show ahuman genes and cDNAs encoding highly-related type

differential regulation and evolved independently fromII keratin 6 isoforms."   J. Biol. Chem.   270 ( 31 ), 18581 -their human orthologs." Genomics 53 ( 2 ), 170 - 183 ,18592 , 1995

1998
５）

10）

Pierre A. Coulombe, Nicola S. Bravo, Rudolph

Kenzo Takahashi and Pierre A. Coulombe.

D. Paladini, Diem Nguyen and Kenzo Takahashi.

"Defining a region of the human keratin 6 a gene that

"Overexpression of human keratin 16 produces aconfers inducible expression in stratified epithelia of

distinct skin phenotype in transgenic mouse skin."  

transgenic mice."   J. Biol. Chem.    272 ( 18 ), 11979 11985 , 1997
６）

Biochem. Cell Biol.  73 ( 9 - 10 ), 611 - 618 , 1995
11）

Kenzo Takahashi and Pierre A. Coulombe.

Rudolph D. Paladini, Kenzo Takahashi, Tracey

M. Gant and Pierre A. Coulombe. "cDNA cloning and"A transgenic mouse model with an inducible skinbacterial expression of the human type I keratin 16 "blistering disease phenotype."   Proc. Natl. Acad. Sci.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 215 ( 2 ), 517 - 523 ,USA
７）

93 , 14776 - 14781 , 1996

1995

Rudolph D. Paladini, Kenzo Takahashi, Nicola

12）

Kenzo Takahashi, Janet Folmer and Pierre A.

S. Bravo and Pierre A. Coulombe "Onset of Re-

Coulombe. "Increased expression of keratin 16 causes

epithelization after skin injury correlates with aanomalies in cytoarchitecture and keratinization inreorganization of keratin filaments in wound edgetransgenic mouse skin."   J. Cell Biol.    127 ( 2 ), 505 -keratinocytes: defining role for keratin 16 "    J. Cell

520 , 1994

− 96 −

ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロール代謝調節機構
東京大学大学院

佐農学生命科学研究科・応用生命化学

藤

隆 一 郎

In an attempt to identify unknown target genes for SREBP-1, total RNA from a stable CHO cell line (CHO-487) expressing
a mature form of human SREBP-1a (amino acids 1 to 487) with a LacSwitch Inducible Mammalian Expression System
was subjected to a PCR subtraction method.  One of the fragments was found to have 90 and 86% homology with rat andhuman ATP citrate-lyase (ACL) cDNA, respectively.  When Hep G2 cells are cultured under either sterol-loaded or -depleted
conditions, expression of the gene is induced approximately 2 to 3-fold by sterol depletion.  To investigate the direct effect of
SREBP-1a on transcription, luciferase assays using the promoter of the human ACL gene were performed.  These deletion
studies indicated that a minimum 160-base pair segment contains the information required for the transcriptional regulation
brought about by enforced expression of SREBP-1a.  Luciferase assays using mutant reporter genes revealed that SREBPdependent transcriptional regulation is mediated by two nearby motifs, the SREBP-binding site (a TCAGGCTAG sequence)and the NF-Y-binding site (a CCAAT box).  It was confirmed by gel mobility shift assays that recombint SREBP-1a binds tothe sequence.  Data from studies with transgenic mice and reporter assays show that the ACL gene promoter is activatedby SREBP-1a more strongly than SREBP-2 in contrast to the HMG CoA synthase and LDL receptor gene promoters, which
exhibit the same preference for the two factors .  Therefore, SREBPs transcriptionally regulates ACL enzyme activity, which
generates the cytosolic acetyl CoA required for both cholesterol and fatty acid synthesis.

１．緒

言

２．実

皮膚表面は皮脂によりコーティングされた表皮角質層、

２. １

験

ヒト活性型 SREBP—1 を一過的に発現する

CHO 細胞株の樹立

その下層に表皮細胞由来の脂質が多層構造をなし、水分バリヤー機能を担っている。この恒常性が破壊されたとあらかじめ Lac I を安定発現する CHO 細胞株を樹立しき、種々の皮膚疾患が発症することを考えると、皮膚組織（CHO—Lac）、これに Lac I により発現が抑制される発現での脂質代謝調節維持が疾患予防、治癒にとり重要である

プラスミドにヒト活性型 SREBP—1 を組み込んだものを遺ことがうかがわれる。本研究課題では、脂肪酸合成・コレ伝子導入し、IPTG 含有培地で一過的に発現が認められるステロール代謝調節の中心的役割を担う転写因子 SREBP細胞株 CHO—487 を獲得した。

（Sterol Regulatory Element Binding Protein）の機能を、
分子細胞生物学的アプローチにより明らかにすることによ２. ２

り、皮膚細胞における脂質代謝調節解明の基礎研究になることを目的とした。

subtract PCR 法による応答遺伝子の単離CHO—Lac ならびに CHO—487 細胞をコレステロールを過剰に含む培地に、1 mMIPTG を添加し、19 時間培養し、SREBP は 互 い に 47 ％ の 相 同 性 を 持 つ SREBP—1 と総 RNA を回収した。定法に基づき、CHO—487 細胞で発SREBP—2 の２種類の蛋白質から成るファミリーを形成

現が亢進している遺伝子のフラグメントを獲得した。そのするが、その機能的役割分担について不明な点が多い。

フラグメントを用いて、双方の細胞から回収した RNA を

SREBP—1 が主として脂肪酸代謝関連遺伝子、SREBP—2 が用いて Northern hybridization を行い、確かに CHO—487

コレステロール代謝関連遺伝子を転写制御するものと考え

細胞で発現の亢進が認められたクローンについてそれらのられているが明確な知見は少ない

１〜３）。我々は、それぞれ塩基配列を決定した。

を一過的に発現する細胞株を樹立し、SREBP—1、—2 のそれぞれに応答する遺伝子を subtract PCR 法にて同定する

２. ３

４）

ことを試みた 。

Luciferase assay 法による応答領域の決定応答遺伝子として新たに見出された ATP クエン酸リア
Regulation of fatty acid and cholesterol
metabolism in human fibroblast cells
Ryuichiro Sato
Department of Applied Biological
Chemistry,
Graduate School of Agricultural and Life
Sciences, University of Tokyoーゼ（ACL）について、ヒト遺伝子の転写開始点から上流 300 bp から下流 29 bp を含む領域をクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した ACL—300 を構築した。PCR 法により− 251 から＋ 29 を含む ACL—251、以下同様にして種々の長さのプロモーター領域を含むレポータ
ー遺伝子を構築した。レポーター遺伝子と活性型 SREBP—1 発現プラスミドを HEK 293 細胞に遺伝子導入し、２日− 97 −

発現により観察される人為的な現象なのか、細胞内コレ後にルシフェラーゼ活性を測定した。

ステロールの増減に応じて起こる SREBP の活性化によっ

３．結果と考察ても引き起こされるのかについて、ヒト肝細胞 Hep G 2 にCHO—487 細胞で SREBP—1 を一過的に過剰発現させ転よる解析を行った。Hep G 2 細胞をコレステロール過剰培

写が亢進した遺伝子を subtract PCR 法により単離し、そ地もしくはコレステロール合成阻害剤を含む培地で培養の塩基配列を決定した。その結果、これまで報告のある

し、RNA を回収し、Northern Blot 解析を行った（Fig. ２）。

SREBP 応答遺伝子の他に ACL 遺伝子が見出された。エ

ACL は細胞内のコレステロールの増加に伴い発現が低下

ネルギー過剰状態でミトコンドリア内で生成されたアセチ

し、減少に伴い発現増加が認められた。以上の知見は、生ル CoA は、そのままの形では細胞質へと移行できず、ク

理的条件での細胞内コレステロール量の変動に伴う内因性

エン酸へと変換後細胞質へ移行し、細胞質で ACL の働き

SREBP の活性化、不活性化に伴い、本遺伝子が転写調節により再びアセチル CoA へと変換される。このアセチルを受けうることを意味している。

CoA は脂肪酸、コレステロール合成の基質となる。従っ続いてヒト ACL 遺伝子のプロモーター領域をクローて、脂肪酸、コレステロール合成経路を調節する SREBP

ニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポがその初発酵素の転写を制御することは、十分にあり得ーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイを行い、ることと言える。そこで新たな応答遺伝子として同定さ

SREBP—1 による転写調節応答領域の同定を試みた。転写れた ACL、SREBP の制御を受ける HMG CoA synthase

開始点から 131 bp 上流までは SREBP—1 による調節を受けmRNA の変動をそれぞれの CHO 細胞株を用いて検討したが、94 bp まで短くするとその調節は失われた（Fig. ３）。

た。CHO—Lac 細胞、CHO—487 細胞をコレステロールを

そこで、131 から 94 bp の塩基配列中、SREBP の応答

過 剰 に 含 む 培 地 に IPTG を 添 加 し、19 時 間 培 養 し、 総配列の候補部位を３ヶ所、SREBP 結合部位の近傍に存在

RNA を回収し、アガロースゲルにて電気泳動し、それぞし協調的に働く NF—Y の結合部位１ヶ所にそれぞれ変異

れのプローブを用いて Northern Blot 解析を行った（Fig.

を入れたレポーター遺伝子を構築し、ルシフェラーゼア１）。いずれの細胞でも過剰のコレステロールのために内ッセイを行った。その結果、上流 110 bp 付近の配列に応因性の SREBP は不活性化状態であり、CHO—487 細胞で、それに近接する
答するとともに（ACL—131 SREbKO）

のみ IPTG により外因性のヒト活性型 SREBP—1 が発現さ

CCAAT 配列も調節に必須であることが明らかになった

れている。この状況下で、HMG CoA synthase mRNA は（Fig. ４）
。SREb 配列への SREBP の結合はゲルシフトア

CHO—Lac 細胞では検出限界以下まで減少し、一方 CHO—

ッセイにより確認した。

487 細胞では外因性 SREBP—1 によりバンドが検出された。

ACL は脂肪酸合成、コレステロール合成の出発物質でACL については HMG CoA synthase mRNA と同様な濃あるアセチル CoA 生成を触媒する酵素であり双方の経路

淡のパターンは認められたものの、コレステロール過剰状に重要であるが、インスリンへの応答等これまでの知見か

況下の CHO—Lac 細胞でも発現が確認され、SREBP—1 はらエネルギー過剰状況下で脂肪酸合成等を誘導するリポジ

転写の一部を調節していることが推察された。

ェニック酵素として認識されている。従って、コレステ

この様な ACL 遺伝子の転写制御が、SREBP—1 の過剰
Fig.1 Northern blot analysis for the ACL
and HMG CoA synthase gene in CHO-Lac
and CHO-487 cells. CHO-LacA and CHO487B cells were cultured with 1μg/mL of
25-hydroxycholesterol, 10μg/mL of cholesterol and 1 mM IPTG for 19 h. Twenty
μg total RNA samples were fractionated
on 1％ agarose gel, transferred to nylon
membrane, and hybridized with a DIGlabeled riboprobe for ACL, HMG CoA
synthase or S17. The fold change in ACL
mRNA, relative to that in CHO-Lac cells,
was calculated after correction for loading
differences with S17. Signals were quantified with a FluorImager 595. In three
separate experiments the same relative
mRNA levels were obtained.

ロール代謝関連遺伝子の転写調節に主に機能する SREBP—2 に比べて脂肪酸代謝関連遺伝子の転写調節に関与する
SREBP—1 による支配を強く受ける可能性がある。そこでルシフェラーゼアッセイの系にヒト SREBP—1、SREBP—2 発現プラスミッドをそれぞれ導入し、応答を検討した− 98 −

Fig. 2 ACL mRNA expression is regulated
by cellar cholesterol levels. Hep G 2 cells
were cultured with medium containing
5％ LPDS supplemented with either 1
μg/mL of 25 -hydroxycholesterol plus
10μg/mL of cholesterol (sterol-loaded
conditions) or 50μM of a HMG CoA
reductase inhibitor, pravastatin plus
50μM of sodium mevalonate (steroldepleted conditions) for 48 h. Northern
blo t a n alysis wa s c a r rie d o u t a s
described in the legend to Fig. 1.

ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロール代謝調節機構

Fig. 3 Regulation of ACL promoter-luciferase reporter genes by SREBP-1a(1-487). HEK 293 cells were transfected with one of human ACL promoter reporter genes (200 ng), a plasmid encoding b-galactosidase (100 ng),
and an expression plasmid (10 ng), pSREBP1(1-487) for 4 h. The cells were incubated for 48 h and then lysed,
and enzyme activities were determined. The ratio of luciferase activity in relative light units (RLU) is divided by
the β-galactosidase activity (U, units) to give a normalized luciferase value (RLU/U). The values given are theaverage of data from more than three experiments performed in triplicate.

Fig. 4 Effect of the mutation of the SRE or the NF-Y binding site on the expression of reporter gene. HEK 293
cells were transfected and cultured as described in the legend to Fig. 3. The fold activation (luciferase activity
with SREBP-1 versus without SREBP-1) is shown. The luciferase activities obtained by the reporter genes werein the range of 400 to 1000 RLU/U. The values given are the average of data from more than three experiments performed in triplicate.

（Fig. ５）
。その結果、ACL は SREBP—1 により高い感受mRNA 量を測定したところ、HMG CoA synthase、LDL

性を持って反応した。一方、コントロールで用いた HMG

受容体 mRNA は両トランスジェニックマウス間で差が認CoA synthase、LDL 受容体遺伝子は双方に対してほぼ同められなかったのに対し、ACL mRNA は SREBP—1 トラ等の反応を示した。さらに SREBP—1、SREBP—2 を過剰

ンスジェニックマウスで高値を示し、ルシフェラーゼアッ

発現するトランスジェニックマウス肝臓中でのそれぞれのセイの結果と一致した。

− 99 −

Fig. 5 Differential sensitivity of the ACL, HMG CoA synthase and LDL receptor promoters to overexpressed SREBP1 a or SREBP- 2 . HEK 293 cells were transfected with one of reporter genes (ACL- 131 , pHMG S and pLDLE;
200 ng), a plasmid encoding β-galactosidase ( 100 ng), and an indicated amount of expression plasmid, pSREBP 1 a（1 - 487）or pSREBP 2 ( 1 - 481 ), for 4 h. The cells were incubated for 48 h and then lysed, and enzyme activities
were determined. The fold activation (luciferase activity in the presence of SREBP- 1 a or SREBP- 2 versus in theabsence) is shown. The values given are the average of data from three experiments performed in triplicate.

４．総２）Sato, R., Inoue, J., Kawabe, Y., 他３名：Sterol-括dependent tr ans c r i pti onal r egul ati on of s t er ol

脂質代謝関連遺伝子の転写を調節する SREBP の新規応答遺伝子として ACL を初めて同定し、その転写調節機構

regulatory element-binding protein- 2 . J. Biol. Chem.
271 , 26461 - 26464 , 1996 .

を明らかにした。同様な調節機構は皮膚線維芽細胞でも存

３）Sato, R., Miyamoto, W., Inoue, J., 他３名：Sterol

在し、皮膚における脂質代謝のダイナミズムに深く関与し

regulatory element-binding protein negativelyている可能性がある。今後この様な基礎知見を積み重ねる

regulates microsomal triglyceride transfer protein gene

ことにより、皮膚細胞での脂質代謝の恒常性維持を目指したコスメトロジー研究の発展が期待される。

transcription. J. Biol. Chem. 274 , 24714 - 24720 , 1999 .
４）Sato, R., Okamoto, A., Inoue, J., 他 5 名：Transcriptional
Regulation of the ATP Citrate-lyase Gene by Sterol（引用文献）

Regulatory Element-binding Proteins. J.Biol.Chem. 275 ,

１）佐藤隆一郎：膜結合型転写因子 SREBP 蛋白質核酸酵

12497 - 12502 , 2000 .

素 , 45 , 2612 - 2623 , 2000 .

− 100 −

ヒト脂腺細胞に代るハムスター脂腺細胞を用いた皮脂代謝に関する基盤研究東京薬科大学佐薬学部第１生化学教室

藤隆

Sebaceous gland is one of important skin appendages and sebum exertion is considered to associate withmaintaining normal cutaneous functions. Development of sebaceous glands is dependent on androgens in vivo andsebocytic differentiation sequentially occurs with accumulating abundant cytoplasmic lipids. In addition, the abnormal
augmentation of lipogenesis causes the sebaceous gland disorder such as acne vulgaris. However, the regulation of lipid
metabolism in sebaceous glands remains unclear. We have recently established the culture system of hamster sebocytes
from the auricles, and investigated the regulation of lipid metabolism in the cultured hamster sebocytes. Insulin,interleukin 6 (IL-6) and prostaglandin F 2α(PGF2α) were found to augment the accumulation of intracellular lipid droplets,
whereas epidermal growth factor (EGF) suppressed in hamster sebocytes. The regulation of lipogenesis by these factors
was due to the alteration of intracellular triglyceride (TG) level. On the other hand, perilipin, which is located exclusively
at the surface of intracellular lipid, mainly TG, and may participate in the lipid metabolism in adipocytes, was found to
be expressed on the surface of lipids accumulated in hamster sebocytes. Furthermore, the expression of perilipin wasaugmented by insulin and IL-6 along with the lipid formation. These results suggest that insulin, IL-6 and PGF2α are
endogenous modulators for lipogenesis in hamster sebocytes, and that perilipin may be involved in the formation of lipid
droplets and the regulation of lipid metabolism in hamster sebocytes.

１．緒であると考えている。一方、多様な皮膚機能調節には増殖

言因子、サイトカインやホルモンなど種々の生理活性物質が皮膚は生体の最も外側に位置する器官であり、外界の寄与することが示唆されており８〜 10）、これら因子が皮脂

刺激から体を保護するためのいくつかの機能を備えてい

産生調節に対しても何らかの作用を示すことが推察される。

る。皮脂腺からの皮脂の分泌も皮膚機能のひとつに挙げら

そこで、本研究ではハムスター脂腺細胞を用いて、１）上れ、皮膚表面を覆う弱酸性の脂質層を形成し、外的物質の皮成長因子（EGF）、インスリン、インターロイキ 6（IL—

侵入防止や脂溶性有害物質の排泄など重要な役割を担って6）やプロスタグランジン（PG）類の皮脂産生に対する影いると示唆されている 。また、皮脂はその過剰分泌によ響を検討した。また、脂肪細胞において同定された細胞内り，脂漏性皮膚炎やニキビの発症、肌のてかりといった健

２）の脂質蓄積の調節分子であるペリリピン 11、12）に着目し、康および美容上の好ましくない現象を引き起こすことが知脂腺細胞における皮脂の蓄積とペリリピンの発現制御につられている 。一方、皮脂腺における脂質生合成調節に関いて検討した。

１）

２）

しては、脂腺細胞の単離培養が困難なことから、動物実験

２．実を用いた組織学的検討や皮表脂質の組成分析がなされてきた３〜５）。最近になり、ヒトおよびラットの脂腺細胞が単離

２. １

験

細胞調製と処理方法、細胞レベルでの研究が進みつつある。しかハムスター脂腺細胞を定法 13）により５週齢の雄ゴールしながら、脂腺細胞における皮脂産生調節の詳細に関して

デンハムスターの耳介部より単離し、６％ウシ血清と２は、ほとんど明らかにされていないのが現状である。

％ヒト血清を含む DMEM/F—12 培養液において培養した。

培養され

６、７）

我々は、ハムスターの耳介部より自発的に脂質を細胞内細胞を播種後，翌日に EGF（10 ng/mL）、インスリン（20に蓄積し、継代かつ長期培養が可能な脂腺細胞を樹立した。

nM）、IL—6（5 ng/mL）または PGF 2α（10 µM）を添加しまた、その細胞特性がヒト脂腺細胞と類似していることかた培養液で培養した。培養液は３日ごとに交換し、11 日

ら、皮脂腺の研究においてヒト脂腺細胞に代る有用な細胞間培養した。

Molecular mechanism of intracellularlipid metabolism in hamster sebocytes in
vitro

２. ２

Oil red O 染色とペリリピンの免疫染色法

細胞内に脂質を蓄積した細胞を４％中性ホルマリン溶液で固定して、oil red O 染色液で細胞内脂質を染色した。

Takashi Sato

また、細胞内のペリリピン局在は、同様に固定した細胞にDepartment of Biochemistry, Tokyo
University of Pharmacy and Life Science,
School of Pharmacy

おいてマウスペリリピン抗体（愛媛大学医学部 澄田道博
博士より供与）を用いて蛍光抗体法により検出した。

− 101 −

２. ３

細胞内トリグリセリド量の定量
ハムスター脂腺細胞の細胞内脂質の組成としては、トリグリセリド（TG）
が総脂質量の約 70％を占めることを確認していることから、薬物処理した細胞中の TG 量を測定した。すなわち、
0 . 25％トリプシン / 0 . 02％ EDTA 溶液を用いて回収した細胞を超音波細胞粉砕装置により細胞を破壊して試料とし、細胞内の TG 量を市販の TG 測定
キットを用いて定量した。

２. ４

ウエスタンブロット法によるペリリピン発現調節の解析
薬物処理した細胞を１％ nonidant P ─
40 10 . 1％ SDS で溶解し、10 , 000 rpm
で遠心した後の上清を試料として、マ
ウスペリリピン抗体を用いて ECL—ウ
エスタンブロット法によりペリリピン
発現調節を解析した。また、試料中のタンパク質量を Lowry 法 14）により定量した。さらに，ペリリピンは脂肪細胞でその発現が報告されていることから、インスリン処理により分化させた
マウス 3 T 3 L 1 細胞の試料をペリリピ
ンのポジティブコントロール 15）とした。

３．結
３. １

図１

果

ハムスター脂腺細胞の皮脂産生調節

培養ハムスター脂腺細胞の脂質産生調節

ハムスター脂腺細胞は自発的に脂質を細胞内に蓄積し（図１A）、その割合は全細胞数の約 40％であることをフローサイトメトリーにより確認している。細胞をインスリン（20 nM）で処理すると細胞内脂質の蓄積に依存して oil
red O 染色陽性細胞数の増加が観察された（図１B）。また、IL—6（5 ng/mL）および PGF 2α（10 µM）の処理においても同様の結果が観察された（図１D および E）。しかしながら、EGF（10 ng/mL）を処理した細胞では細胞内脂質の減少が観察された（図１C）。一方、各処理における細胞内 TG 量を測定したところ、インスリン（20 nM）処理により細胞内量は 3 . 3 倍に増加し、IL—6（5 ng/mL）および PGF 2α（10 µM）処理においてもそれぞれ 2 . 0 倍増加することが明らかとなった。また逆に、EGF（10 ng/mL）処
理では細胞内 TG 量は未処理群の 10％まで減少した（図２）。

３. ２

ハムスター脂腺細胞におけるペリリピン発現

細胞内脂肪の代謝に寄与するペリリピンは、脂肪細胞

図２ インスリン、EGF、IL-6 および PGF２α によるハムスター
脂腺細胞の皮脂産生調節
Lane 1, 未処理群；lane 2, インスリン（20nM）；lane 3,
EGF（10ng/mL）；lane 4,IL-6（5ng/mL）および lane 5,
PGF2α（10 M）. ***p<0.001（vs control）.

− 102 −

ヒト脂腺細胞に代るハムスター脂腺細胞を用いた皮脂代謝に関する基盤研究

11、12、15）や副腎皮質細胞 16、17）においてのみその発現が認めた、IL—6（5 ng/mL）処理においてもペリリピン発現は促られているが、脂腺細胞の皮脂形成にも寄与するか否かに進される傾向を示した（図４）。しかしながら、
EGF（10 ng/

ついては全く不明である。そこで、ハムスター脂腺細胞にmL）処理では皮脂産生抑制に比例してペリリピン発現はおけるペリリピン発現を蛍光染色法により検討した。その抑制された（図４）。一方、皮脂産生を促進した PGF 2α は

結果、インスリン処理により皮脂産生を促進させた細胞にインスリンおよび IL—6 とは異なり、ペリリピン発現にはおいて、細胞内脂肪滴の周囲にリング状のペリリピンの染全く影響を及ぼさなかった（図）。これらの結果より、ハ色が認められた（図３）。この結果より、ハムスター脂腺

ムスター脂腺細胞のペリリピン発現はインスリンおよび細胞において細胞内の脂質蓄積とともにペリリピンが発現

IL—6 により促進されること、また EGF 処理により抑制さすることが初めて明らかとなった。また、そのタンパク質のれることが初めて明らかとなった。

局在が脂肪細胞と同様に脂肪滴周囲であることが判明した。

３. ３

４．考

察

ハムスター脂腺細胞のペリリピン産生調節

皮脂腺における皮脂の産生は、男性ホルモンにより促進

ハムスター脂腺細胞の皮脂産生調節に寄与するインスリ

的に、ビタミン A（レチノイン酸）により抑制的に調節さン、EGF、IL—6 および PGF 2α のペリリピン産生に対するれることが周知の事実である１、３、４）。また、ヒトおよび作用を検討した。その結果、ハムスター脂腺細胞においラット脂腺細胞においても同様の報告がなされている６、７）。

て恒常的にペリリピンが発現しており、分化したマウス

皮膚機能調節にはホルモンやサイトカインといった様々な

3 T 3—L 1 脂肪細胞に発現されたペリリピンと免疫学的に同生理活性物質が寄与すると示唆されることから８〜 10）、皮脂

一であることが判明した（図４および５）。また、この脂腺の脂質代謝調節にもこれら因子が関与することが推察さ

腺細胞のペリリピンはウエスタンブロット法により分子量れる。本研究において、インスリン、IL—6 および PGF 2α がが約 57—kDa であることから、現在報告されている４つのハムスター脂腺細胞の皮脂産生を促進すること、また EGF

ペリリピンアイソタイプのペリリピン A 12、16） であること

は皮脂産生を抑制することが判明した。したがって、イが明らかとなった。一方、インスリン（20 nM）処理によ

ンスリン、IL—6 および PGF 2α は皮脂産生促進因子として、りその発現は 1 . 4 〜 2 . 0 倍増加した（図４および５）。まEGF は皮脂産生抑制因子として機能するものと示唆される。
ペリリピンの機能は十分に明らかにされていないが、脂肪細胞においてその発現促進と細胞内の脂質蓄積が相関することが報告されている 11、15 〜 17）。また、ペリリピンはcAMP 依存性プロテインキナーゼ A（PKA）によりリン酸化
されることが知られており 18）、このペリリピンのリン酸化によりホルモン感受性リパーゼによる細胞内脂質の分解が促進されることが報告されている 19、20）。すなわち、ペリリ
ピンは脂肪細胞の細胞内脂質の蓄積と代謝を制御する機能
タンパク質であると示唆される。本研究において、ハムス
ター脂腺細胞内に形成された脂肪滴の周囲にペリリピンが発現していることを初めて明らかにした。このことは、脂肪細胞と同様にハムスター脂腺細胞においてもペリリピンが細胞内の脂質代謝に関与することを示唆するものである。
ペリリピンの発現調節に関しては、脂肪細胞において

図３

ハムスター脂腺細胞におけるペリリピン発現

腫瘍壊死因子（TNF—α）がその発現を抑制し、それに伴い細胞内脂質分解が誘導されるという報告のみである 20）。
本研究において、脂質合成を促進するインスリンや IL—6 が

図４ インスリン、EGF および IL-6 によるハムスター脂腺細胞のペリリピン発現調節
Lane 1, 未処理群；lane 2, インスリン（20nM）；lane 3,
EGF（10ng/mL）および lane 4, IL-6（5ng/mL）. 3T3，分化誘導したマウス 3T3 細胞 .

図５ PGF 2α によるハムスター脂腺細胞のペリリピン発現調節
Lane 1, 未処理群；lane 2, インスリン（20 nM）；および
lane 3, PGF2α（10M）.

− 103 −

ペリリピン発現を促進すること、逆に脂質合成を抑制する
EGF ではその発現が抑制されることを初めて明らかにしkeratin expression of cultured human sebocytes invitro, J. Invest. Dermatol., 96 , 792 - 797 , 1991 .

た。すなわち、ハムスター脂腺細胞において、これらサイ

７）Rosenfield RL, Eplewski D, Kentsis A, et al., :トカインや増殖因子によるペリリピン発現制御に起因してMechanisms of androgen induction of sebocyte

皮脂産生が調節されているものと示唆される。

differentiation, Dermatology, 196 , 43 - 46 , 1998 .

一方、ハムスター脂腺細胞において PGF 2 α は皮脂産生

８）Birnbaum JE, Sapp TM, Moore JB, : Effects ofを促進したもののペリリピン発現には影響を及ぼさないこ

reserpine, epidermal growth factor, and cyclicとが判明した。ペリリピンは、その発現制御のみならず

nucleotide modulators on epidermal mitosis, J. Invest.

PKA 依存的リン酸化による分子修飾により脂質分解が促

Dermatol., 66 , 313 - 318 , 1976 .

進される 18）。逆に、細胞内脂質分解を制御する分子機序９）Kupper TS, Min K, Sehgal P, et al., : Production

として、プロテインホスファターゼによるペリリピンの脱of IL- 6 by keratinocytes. Implications for epidermal

リン酸化機構が存在することも報告されている ）。した

inflammation and immunity, Ann. NY Acad. Sci., 557 ,がって、現時点では皮脂産生を促進する PGF 2 α がペリリ

454 - 465 , 1989 .

21

ピン発現に影響を及ぼさない理由は不明であるが、PGF 210）Sato T, Kirimura Y, Mori Y, : The co-culture of

α がペリリピンのリン酸化機構を制御することで皮脂産生

dermal fibroblasts with human epidermal keratinocytesを調節している可能性が示唆される。

５．総

induces increased prostaglandin E 2 production andcyclooxygenase 2 activity in fibroblasts, J. Invest.

括

Dermatol., 109 , 334 - 339 , 1997 .

ハムスター脂腺細胞の皮脂産生は、インスリン、EGF

11）Greenberg AS, Egan JJ, Wek SA, et al., : Perilipin,

および PGF 2 α により促進的または抑制的に制御されるこ

a major hormonally regulated adipocyte-specificとが示唆される。また、ハムスター脂腺細胞において細胞

phosphoprotein associated with the periphery of lipid

内脂質の代謝調節分子であるペリリピンが細胞内脂肪滴周storage droplets, J. Biol. Chem., 266 , 11341 - 11346 , 1991 .

囲に発現していることを初めて明らかにした。さらに、こ12）Greenberg AS, Egan JJ, Wek SA, et al., : Isolation ofのペリリピン発現がインスリンや EGF により促進的また

cDNAs for perilipin A and B: Sequence and expressionは抑制的に制御され、その結果、脂腺細胞の皮脂産生が調of lipid droplet-associated proteins of adipocytes, Proc.

節されるものと示唆される。

Natl. Acad. Sci. USA, 90 , 12035 - 12039 , 1993 .
13）I t o A , S a k i g u c h i T , K i t a m u r a K , e t a l . , :（引用文献）

Establishment of a tissue culture system for hamster

１）Thody AJ, Shuster S, : Control and function of

sebaceous gland cells, Dermatology, 197 , 238 - 244 , 1998 .

sebaceous glands, Physiol. Rev., 69 , 383 - 416 , 1989 .

14）Lowry OH, Rosebrough NJ, Lewis Farr A, et al., :２）北村謙始，小山純一，：オイリースキンの発生要因とその特徴／乳液，クリーム，保湿剤，宮地良樹編，：臨
床医のためのスキンケア入門，先端医学社，東京，1997，
146 - 155 頁

Protein measurement with the Folin phenol reagent, J.
Biol. Chem., 193 , 265 - 275 , 1951 .
15）Blanchette-Mackie EJ, Dwyer NK, Barber T, et al., :Perilipin is located on the surface layer of intracellular３）Strauss JS, Kligman AM, Pochi PE, : Effects ofandrogens and estrogens on human sebaceous glands,
J. Invest. Dermatol., 39 , 139 - 155 , 1962 .

lipid droplets in adipocytes, J. Lipid Res., 36 , 1211 - 1226 ,1995 .
16）Servetnick DA, Brasaemle DL, Gruia-Gray J, et al., :４）Thody AJ, Cooper MF, Bowden PE, et al., : Effect ofPerilipin are associated with cholesteryl ester droplets

alpha-melanocyte-stimulating hormone and testosterone

in steroidogenic adrenal cortical and Leydig cells, J.

on cutaneous and modified sebaceous glands in the rat,

Biol. Chem., 270 , 16970 - 16973 , 1995 .

J. Endocrinol., 71 , 279 - 288 , 1976 .

17）Brasaemle DL, Barber T, Kimmel AR, et al., :５）Plewig G, Luderschmidt C, : Hamster ear model for

Post-translational regulation of perilipin expression:sebaceous glands, J. Invest. Dermatol., 68 , 171 - 176 ,Stabilization by stored intracellular neutral lipids, J.

1977 .

Biol. Chem., 272 , 9378 - 9387 , 1997 .

６）Zouboulis ChC, Korge B, Akamatsu H, et al., :18）Egan JJ, Greenberg AS, Chang M-K, et al., : Control

Effects of 13 -cis-retinoic acid, all-trans-retinoic acidof endogenous phosphorylation of the major cAMP-and acitretin on the proliferation, lipid synthesis anddependent protein kinase substrate in adipocytes by− 104 −

ヒト脂腺細胞に代るハムスター脂腺細胞を用いた皮脂代謝に関する基盤研究

insulin and beta-adrenergic stimulation, J. Biol. Chem.,

necrosis factor-?: a potential new insulin-sensitizing

265 , 18769 - 18775 , 1990 .

mechanism for thiazolidinediones, Diabetes, 47 , 691 -19）Londos C, Brasaemle DL, Gruia-Gray J, et al., :695 , 1998 .

Perilipin: Unique proteins associated with intracellular21）Clifford GM, McCormick DKT, Londos C, et al., :neutral lipid droplets in adipocytes and steroidogenic

Dephosphorylation of perilipin by protein phosphatases

cells, Biochem. Soc. Trans., 23 , 611 - 615 , 1995 .

present in rat adipocytes, FEBS Lett., 435 , 125 - 129 ,20）Souza SC, de Vargas LM, Yamamoto MT, et al.,: BRL 49653 blocks the lipolytic actions of tumor− 105 −

1998 .

紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節熊本大学

山

発生医学研究センター

泉

克Cell strains from a subset (Ddb-) of individuals carrying XP complementation group E (XPE) lack a damagespecific DNA binding (DDB) activity. Because DDB was reported to recognize many types of DNA lesions and is
inducible by treatment with DNA- damaging agents in a p53-dependent manner, DDB was originally expected toplay a role in damage recognition prior to nucleotide excision repair.  However, recent studies have reported that
DDB is not required for nucleotide excision repair in vitro.  Thus, its function is still remaining uncertain.  Here,
we reinvestigated the classification of three Ddb+ XPE cells and found that they belong to other complementationgroups of XP and UVsS.   We analyzed the putative p53 responsive element in the intron 4 of the DDB2 gene,and found that it has a week binding activity to p53 as determined by a gel-shift assay, and that it stimulates
transcription of a reporter gene containing the element when co-expressed with wild type p53.

１．緒

p 53 RE） に 適 合 す る 配 列 を 見 出 し て い る。 本 研 究 は、

言

XPE と DDB 2 との関係を明らかにした上で DDBp 48 の調

太陽紫外線の被爆により、皮ふ細胞の DNA にはピリミ節機構を解明し、これを基盤としてその発現を人為的にコジン２量体や（6 - 4）光産物に代表される傷が生じる。こントロールすることで皮ふの老化等の防止に応用可能かど

れらの傷の蓄積が加齢に伴う皮ふ老化の重要な要因と考えうかを検討するために企画された。

られる。DDB（Damaged DNA binding protein）は太陽

２．実光による DNA の傷のうち、主として（6 - 4）光産物に高い親和性で結合するタン白として見つかり、p 127（DDB 1）

２. １

験

DNA 修復異常の検出と p 48（DDB 2）のヘテロ２ 体であることが既に報告さ既に XPE と診断された患者のうち、DDB 活性（+）のれている。このうち DDB 1 は DNA 上の損傷部 への結合細胞株３株について、DNA 修復異常の指標ではある不定に関与し、一方 DDB 2 は DDB 1 の結合活性化に関与し期 DNA 合成能（UDS）、RNA 合成能の回復（RRS）、Ｓているといわれている。DNA 修復異常症である色素性乾期 DNA 合 成 能（RDS）、 及 び 複 製 後 修 復 能（PRR） を皮症のＥ群（xeroderma pigmentosum E : XPE）の一部

細胞レベルでのオートラジオグラフィー（UDS、RRS、に DDB 2 欠損が見つかることから、DDB は DNA 修復にRDS）ならびにアルカリ庶糖密度勾配遠心法（PRR）で１）

関与していると考えられてきた 。しかし、DNA 修復反解析した。また紫外線に対する感受性はコロニー形成法

応を解析するために開発された in vitro での再構成系にで調べた。DDB 2 遺伝子の変異はゲノム DNA の各部分

DDB は不要なことから、その機能はごく最近まで不明でを PCR で増幅した後、センス鎖・アンチセンス鎖についあった。我々はこのタン白が欠損すると（6 - 4）光産物のて塩基配列を決定して調べた。一部の細胞については既知

修復効率が低下し、長時間にわたって傷が残存することを相補性群に属する細胞との融合細胞を用いて UDS、RRS、

２）

見出した 。興味深いことに DDB は細胞周期の G 1 期かRDS を指標として相補性テストを行った。

ら S 期への移行に重要な役割を たす転 因子 E 2 F と結合してその転 活性を調節していること、更にがん抑制遺伝２. ２

紫外線照射後の DDB2 の転写活性化

子 p 53 により p 48 自身の発現が調節されていることが相正常ヒト繊維芽細胞に 20 J/m 2 の UVC を照射し、そ次いで見つかり、その発現調節機構が注目されている。我々の後の DDB 2 mRNA の転写量の継時的変化を Northern

は DDBp 48 遺伝子の全塩基配列を決定する過程で、インblot により検討した。陽性コントロールとして p 53 によトロンの１つに p 53 結合配列（p 53 responsive element:

り転写活性化を受ける p 21 /WAF 1 の mRNA 転写量の変Regulation of expression of   the UVinduced damage -specific DNA binding
protein, DDBp48化を観察した。

２. ３

DDB2 の p53RE と GST-p53 との結合

ゲルシフトアッセイにより放射性同位元素で標識した（RI

Masaru Yamaizumi
Institute of Molecular Embryology andGenetics, Kumamoto University標識）DDB 2 の p 53 RE と大腸菌で作製した GST-p 53 融
合 蛋 白 質 と の 結 合 を 検 討 し た。RI 標 識 し た DDB 2 のp 53 RE をプローブとして、GST-p 53 と混合した後、ゲル− 106 −

紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節

電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー上で GST-p 53

加のあることから XPV と判定された。XP 89 TO は RRS、と DDB 2 p 53 RE との特異的結合の有無を調べた。陽性コ

RDS は正常で UDS の低下があり、相補性テストの結果

ントロールとしては既に p 53 との結合が明らかになって

XPF と判定された。従来 XPE には DDEB（+）のもの

いる p 21 /WAF 1 遺伝子に含まれる p 53 コンセンサス配と DDB（-）の明らかな生化学的な多様性があることから、

列（p 53 CON）を用いた。

DDB と XPE 遺伝子との対応が大問題となってきたが、今回得られた解析結果より、少なくとも我々の調べた範囲内

２. ４

DDB2 の p53RE の転写活性化能

ではすべての XPE については DDB 2 遺伝子に異常が見つ

ルシフェラーゼアッセイにより DDB 2 の p 53 RE の転写

かり、DDB(+) の XPE については診断のまちがいによる活性化能を検討した。このため p 53 を発現するプラスミ

可能性が高まった。このことは今後 XPE の原因及び病態

ドと、minimal heat shock promoter で制御されるホタルを考える上で極めて重要な結果と考える。

ルシフェラーゼの発現プラスミドの 5 ' 側上流に DDB 2 のp 53 RE を組み込んだものを骨肉腫由来細胞株 Saos 2（内３. ２

紫外線照射後の DDB2 の転写活性化

因性の p 53 を欠損する）に一過性に共発現させ、p 53 にDDB 2 mRNA の転写活性化は UVC 照射 16 時間後よりよる転写活性をルシフェラーゼの発光強度としてルミノメ認められた（図１）。対照として p 21 /WAF 1 mRNA の転ーターで計測した。この時、内部コントロールとしてウミ写量を同時に観察したが、UVC 照射 8 時間後より増加がシイタケルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼとは発光観察され、DDB 2 は紫外線照射後、p 21 /WAF 1 より遅れ

基質が異なる）を発現するプラスミドを同時に導入して、て転写が活性化されることがわかった。DDB 2 の転写量が遺伝子導入効率のサンプル間での誤差を補正した。p 53 は

p 21 /WAF 1 と同じく p 53 によって制御されるのであれば野性型及び 273 番目のアルギニンをヒスチジンに置換しどのようにしてその転写活性化の遅延がもたらされるのかたもの (R 273 H; 転写活性を欠損する ) を対照として用いた。

興味深い。

p 53 転写調節を受ける陽性コントロールとしては p 21 /WAF 1 遺伝子の p 53 RE を DDB 2 と同様に組み込んだプ

３. ３

DDB 2 遺伝子のほぼ全域にわたるゲノム塩基配列を決定

ラスミドを用いた。

して、p 53 結合配列（p 53 RE）を検索したところ、第４イ

３．結果と考察３. １

DDB2 の p53RE と GST-p53 との結合

ントロン内に１ケ所 p 53 RE に合致する配列を見出した（図DDB(+) の XPE 群について

２）。ゲルシフトアッセイではこの DDB 2 の予想 p 53 RE とこれまで DDB(+) の XPE 細胞として報告されていた３

GST-p 53 との結合、及び抗 p 53 ( 421 ) 抗体によるスーパー株（XP 24 TO、XP 43 TO、XP 89 TO）について、再度のシフト、
非 RI プローブによる競合阻害が確認された（図３）。

３）

詳細な細胞生物学的解析を行った 。表１に示すように、し か し な が ら DDB 2 の p 53 RE と p 53 と の 結 合 は p 21 /XP 24 TO については UDS、RDS いずれも正常で、RRS

WAF 1 の p 53 CON と比較して明らかに弱かった。

の著明な低下が認められ、相補性テストの結果 UVsS と判定された。XP 43 TO は UDS、RRS は正常で RDS の低３. ４

下が認められ、カフェイン存在下での紫外線感受性の増表１

DDB2 の p53RE の転写活性化能

ルシフェラーゼアッセイにより DDB 2 の p 53 RE は p 53

Ddb+ を示す XPE 細胞の特長と相補性テストのまとめ− 107 −

の発現に伴い転写が増大することがわかった。しかしながらその活性化能は p 21 /WAF 1 の p 53 CON による転写活性化能よりかなり弱かった（図４）。さらに DDB 2 のp 53 RE の 5 ' 側の近傍に p 53 CON の片側に合致する 10 塩基の配列が見つかるが、この部分まで含む配列を用いた場
合には p 53 RE が全く挿入されていないルシフェラーゼ発

図１ 紫外線照射後の DDB2 の転写活性化
ヒト繊維芽細胞に 20J/m2 の UVC を照射し、各時間毎に回収した total RNA による Northern blot により観察される DDB2,
p21 のバンド濃度をデンシトメーターで測定したもの。

図２ ゲルシフトアッセイ、ルシフェラーゼアッセイに用いた
DDB2, p21 由来の p53-responsive element (p53RE)。DDB2
では p53 consensus に相当するショートプローブとその近傍の配列も含むロングプローブを用いた。参考のため p53 コン
センサス塩基配列と p21/WAF1 の p53RE(p53CON) を示す。

図３ DDB2・p21/WAF1 の p53RE をプローブとして用いた
ゲルシフトアッセイ。非 RI プローブによる競合、抗 p53 抗体 (421Ab) 添加によるスーパーシフトが観察される。

図４ DDB2 由来の p53RE をエンハンサーとして用いた場合のp53 による転写活性化をルシフェラーゼ活性として測定した。
陽性コントロールは p21/WAF1 由来の p53CON。陰性コン
トロールはエンハンサーを持たないルシフェラーゼ発現プラ
スミドを使用している。p53 は野生型 (wt) の他、転写活性化能が低下する変異体 (R273H)、p53ORF を持たないベクター
のみ (pRC-CMV) を同時に Saos-2 に導入している。

図５ DDB2 由来の p53RE の周辺領域をエンハンサーとして用いた場合の p53 による転写活性化をルシフェラーゼ活性として測定。

− 108 −

紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節

現プラスミドを陰性コントロールとして用いた場合以下のルシフェラーゼ活性を呈した（図５）。

４．総タイムコース及び E 2 F 1 制御下の DNA ポリメラーゼ α、dihydrofolate reductase 等の mRNA、もしくは蛋白の発現のタイムコースを調べ、DNA 傷害の有無により DDB 2

括発現や E 2 F 1 活性が p 53 により誘導されるタイムコース

紫外線照射後の DDB 2 の転写活性化は、同じく p 53 にに違いが生じないか確認する。

より転写の活性化を受ける p 21 /WAF 1 よりかなり遅れて

２）DDB 2 転写調節機構の解析：

起こっていた。DDB 2 遺伝子のイントロン 4 に存在する

１.  細胞周期や DNA 損傷で DDB 2 の転写が正・負に調節

p 53 RE の p 53 結合性はゲルシフトアッセイにより確認さされている事がわかれば、これに関与するシス・及びトラれ、その転写活性化能もルシフェラーゼアッセイにより確

ンスエレメントの解析を行う。すなわち DDB 2 遺伝子の認されたが、その活性化能は p 21 /WAF 1 の p 53 CON とプロモーター領域の紫外線照射前後の細胞抽出液を用いた比較すると相当弱く、更に DDB 2 遺伝子の p 53 RE 近傍

フットプリント解析、サウスウェスタン法によりその発現の配列も含めてルシフェラーゼアッセイを行うと陰性コを制御する p 53 以外の転写因子の同定を試みる。

ントロール以下の転写活性化能を示した。これらのこと

２.  Yeast two-hybrid system により DDB 2 と結合する蛋から、DDB 2 遺伝子のイントロン 4 に存在する p 53 RE は、白質を検索し、その中から DDB 2 の E 2 F 1 転写活性化能活性化した p 53 により弱い活性化を受け、しかも p 53 近に影響を与える転写調節因子を同定する。指標には E 2 F 1

傍の配列により抑制的な調節を受けていることが考えら

プロモーターにより制御されるルシフェラーゼ活性を用いれた。p 21 /WAF 1 の p 53 CON と比較した場合、DDB 2て、DDB 2 と共発現させた場合にその活性が修飾されるもの p 53 RE としての活性は弱く、しかもその周辺の配列にのを探す。

より抑制的な調節を受けていることが、紫外線照射後の３）細胞周期に伴う発現パターンの解析：

DDB 2 mRNA 転写量の増加が p 21 /WAF 1 の場合と比較

ヒト初代培養線維芽細胞の血清除去による同調系を用いして微弱で、しかもかなり遅く起こることの原因である可て、細胞周期特異的な UV-DDB 活性の変動がないか、特能性が考えられる。

に G 1 /S 期での増加の有無を検討する。

DDB 2 は E 2 F 1（DNA 合 成 関 連 遺 伝 子 の 発 現 をといった研究が必要と思われる。

positive に制御する転写因子）の co-activator であることが報告されている４）。細胞周期の進行を止める方向に働く（参考文献）

p 53 により何故 E 2 F 1 の co-activator といわれる DDB 2

１）

Nichols A.F, itoh T, Graham J.A, Liu W.,の転写が誘導されるのか、一見矛盾しているようであるが、Yamaizumi M, Linn S: Human damage-specific DNA

DNA 損傷後の p 53 と DDB 2 の発現のタイムコースのズ

binding protein p 48 .   J. Biol. Chem., 275 , 21422 - 1428 ,レがここで重要なのかもしれない。DDB 2 による E 2 F 12000 .

の活性化は、E 2 F 1 の抑制機能を持つ Rb 蛋白の共存下で

２）

Itoh T, Mori T, ohkubo H, Yamaizumi M: Aも認められる事より、通常の細胞周期中でも何らかの役割

newly identified patient with clinical xerodermaを果たしている可能性が考えられる。

pigmentosum phenotype has a non-sense mutation

ヒ ト 培 養 細 胞 に お い て 紫 外 線 で 傷 害 さ れ た DNA のin the DDB 2 gene and incomplete repair in ( 6 - 4 )global genomic repair に p 53 が要求されるが、そのメカ
ニズムの詳細は不明である。本研究は独自に得た DDB 2

photoproducts.  J. Invest. Derm., 113 , 251 - 257 , 1999 .
３）

遺伝子の塩基配列情報をもとに、その CON 配列の機能をItoh T, linn S, ono T, Yamaizumi M;

Reinvestigation of the classification of five cell

解析する事でヌクレオチド除去修復系の制御に於ける p 53

strains of xeroderma pigmentosum group E withの役割を明らかにする足がかりを与えるものと考える。

reclassification of three of them.  J. Invest. Derm., 114 ,今後の課題としては、

1022 - 1029 , 2000

１）DDB 2 転写調節機構の解析：

４）

Hayes S, Shiyanov p, Chen X, Raychaudhuri P;

ヒト初代培養線維芽細胞に DNA 損傷を伴わない細胞

DDB, a putative DNA repair protein, can function as

ストレス（熱ショック、浸透圧ショック等）で p 53 を誘

a transcriptional partner of E 2 F 1 .  Mol. Cell. Biol., 18 ,導した場合と、逆にテトラサイクリンで p 53 の発現を誘240 - 249 , 1998

導できる培養細胞に UV 照射した場合の DDB 2 発現の− 109 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析
昭和大学

吉薬学部毒物学教室

田武

美The induction of contact sensitization is associated with the movement of epidermal Langerhans cells (LC) from the skinand their migration to draining lymph nodes where they accumulate as immunostimulatory dendritic cells (DC). It has
been reported that interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor α(TNFα)   are key cytokines for LC migration and/or
maturation. This study has determined the effect of 2,4,6-trinitrochlorbenzene (TNCB) on contact sensitization in IL-1α/βgene
deficient (IL-1KO) and TNFαdeficient (TNFαKO) mice. IL-1KO mice showed weak ear swelling response (about 85% ofwild). LC existed in IL-1KO epidermis appeared to be morphologicaly similar to that observed in wild. The migration ratio of
LC in IL-1 was almost the same as that seen in wild. These results suggest that IL-1 may not be a key factor of the contact
sensitization in mouse skin. Additionally, we preliminary found that functional changes in immune reaction in TNFαKO mice,
however, the findings will be required further study.
Ultraviolet A (UVA) is known to induce the expression of many stress responsive genes due to the generation of reactive
oxygen species (ROS). However, UVA's role in inducing metallothionein (MT) gene expression has not been studied.
Furthermore, Ishizaki et al. (1996) demonstrated that UVA enhanced 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-mediatedinduction of ornithine decarboxylase (ODC) activity in mouse skin1). Considering these facts, we examined the interaction of
UVA, TPA and antioxidants on the induction of MT and ODC mRNA in mouse skin. UVA (19J/cm2 ) induced MT mRNAin mouse skin. The study using antioxidants suggest that ROS produced by UVA exposure may contribute to its ability to
induce MT mRNA. UVA enhanced TPA-mediated ODC enzyme activity and TPA-mediated MT mRNA induction. Alphatocopherol pretreatment inhibited the induction of ODC enzyme activity by TPA treatment combined with UVA exposure(TPA+UVA). In addition, pretreatment of mouse skin with curcumin resulted in the almost complete inhibition of TPA- and/or UVA-mediated gene expression. These results demonstrate that UVA can induce MT gene expression and enhance TPAinduced ODC and MT gene expression. The data further suggest that these effects are partially mediated by ROS.

１．緒

きく関与していることがそれぞれのサイトカインに対する

言

抗体を用いた研究などで報告されている２）。しかしながら、皮膚は生体内外からの様々な刺激に対する防御機能を果

その詳細については不明な点もあり、サイトカイン遺伝子

たすと共に、生体内の生理的病的症状の表現の場でもある。

欠損動物モデルを用いた研究によりその役割に関する情報

皮膚組織には、インターロイキン１（IL- 1）をはじめ多くが得られると予想される。そこで、本研究では Il- 1 α ／ βのサイトカインが存在し、生体内外からの刺激に対し生理ノックアウトマウス（IL- 1 KO マウス）および TNFα ノ

的かつ防御的応答の情報伝達に重要な役割を果たしている

ックアウトマウス（TNFαKO）を用いてアレルギー性接と考えられている。例えば、遅延性アレルギーを獲得する

触皮膚炎や感作の成立過程におけるサイトカインの役割を上で重要な感作の過程においては、IL- 1 β と TNFα がト検討した。

リガーとなりその主要な役割を果たしていると言われている

UV による細胞障害や数々の毒性反応は良く知られた事２）実である。しかしながら、UVA はその光毒性は比較的弱く、は成されていない。

作用機序も UVA により産生された活性酸素に起因する事。しかしながら、遺伝子欠損マウスを用いた詳細な研究
アレルギー性接触皮膚炎は、皮膚に存在するランゲルハ

から、UVB や UVC とは光毒性の強さも性質も異なるとンス細胞（LC）が抗原を局所リンパ節に提示することが発報告されている。また、毒性の強い UVB や UVC には古症メカニズムの第一段階であると言われているが、このラくから数多くの研究報告があるが、UVA はそれに比べる

ンゲルハンス細胞の遊走及び成熟に IL- 1 β や TNFα が大と報告も多くない。さらに、UVA は活性酸素を産生する
事から、活性酸素により発現するストレス応答タンパク質The study on immune reaction and stressresponse in cytokine knockout mouse skin.
Takemi Yoshida
Department of Biochemical Toxicology,
School of Pharmaceutical Sciences, Showa
Universityに影響を及ぼすのではないかと考えた。そこで本研究では、UVA により発生した活性酸素が皮膚におけるストレス応
答タンパク質、特にストレス応答タンパク質としてよく研
3）やオルニチン脱炭
究されているメタロチオネイン（MT）

酸酵素（ODC）の遺伝子発現にどの様に影響しているかについて皮膚研究に比較的多く用いられている CD- 1 マウスを用いて検討した。

− 110 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

２．実
２. １

305 / 365 Dradiometer（クリニカルサプライ社）を用いて

験

測定した。

アレルギー性接触皮膚炎の実験

２. １. １

実験動物および繁殖２. ２. ３
４）

UVA 照射および抗酸化物質処置

及び本研究で用いた抗酸化物質は、1 , 4 -diazabicyclo-[ 2 , 2 , 2 ]-Wild マウスを用いた。サイトカイン遺伝子欠損マウスは、、α- ト コ フ ェ ロ ー ル（ ２×octane（DABCO；10 - 4 M）

東京大学医科学研究所、岩倉洋一朗教授より供与された親、クルクミン（10 - 4 M）であり、いずれもアセト
10 - 4 M）

株を当大学実験動物研究施設内で交配させ、PCR によるンに溶解し、脱毛したマウス背部皮膚に 100 µL 塗布した。

遺伝子チェックを行ってそれぞれのサイトカイン遺伝子欠12 -O-tetradecanoylphorbol- 13 -acetate（TPA）は、ジメチ

損マウス株および Wild マウス株を得、系統維持繁殖を行

ルスルフォキシドに溶解した後アセトンで 40 倍希釈したもった。本研究では、雌雄マウスを使用した。

のを 100 µL（８nmol TPA）塗布した。対照動物には同量

実験には 10 週齢前後の IL- 1 KO

、TNFαKO５）の溶媒を塗布した。UVA は固定したマウスに 19 J/cm 2 照
２. １. ２

Ear Swelling Test

射した。また、UVA 照射開始時間を 0 時間と表示した。

マウスの腹部の毛を刈り 3％ 2,4,6-trinitrochlorobenzene
２. ２. ４（TNCB；アセトン：オリーブ油＝４：１の溶媒に溶解）

RNA 調製およびノーザンブロット法

溶液を 100 µL 塗布した。その６日後に片方の耳に１％処置一定時間後のマウス背部皮膚を取り、グアニジン

TNCB をもう片方の耳に溶媒を 25 µL ずつ塗り、24 時間

チオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出法 ６） に後に耳厚をダイアルシックネスゲージ（㈱ミツトヨ）で測て total RNA を採取した。total RNA（20 µg）を 1 . 2％ア

定しその耳厚差を表示した。

ガロース - ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ノーザンブロット法に用いたプローブは、オルニチン脱炭

２. １. ３

マウスの耳介表皮シートの免疫染色酸酵素（ODC；0 . 72 kb, pMK 934 mODC cDNA の EcoRI

0 . 5％ TNCB と溶媒をマウスの耳それぞれに 25 µL ずつ

fragment）、メタロチオネイン - 1（MT- 1；0 . 4 kb, マウ

塗布し、その約 16 時間後に耳介を採取した。試薬を塗布

ス pMT- 1 cDNA の HindIII ／ EcoRI fragment）、グリ

した側の耳介を 20 mM EDTA 含有 PBS 処理した表皮シ

セルアルデヒド -3- フォスフェートデヒドロゲナーゼートを得、冷アセトン溶液で固定した後、ビオチン化抗（GAPDH；0 . 5 kb, GAPDH cDNA の Pst 1 fragment）
である。

マウス IAd 抗体（ファーミンジェン社）で一次染色した。
抗体はペルオキシダーゼ標識した後、DAB により発色さ

２. ２. ５

せ立体光学顕微鏡で写真撮影（対物 × 20、接眼 × 2 . 5；

定法

0 . 336 mm 2）を行い、その写真を用いて LC 数を数え、１
mm 2 当たりの LC 数を求めた。

表皮サンプル採取法および ODC 酵素活性測

マウス表皮は、O'Brein 等の方法により採取した７）。す
なわち、採取したマウス皮膚を冷水に 60 秒間浸漬した
後、55℃の温湯に 30 秒間浸し、再び冷水に浸漬した。こ２. １. ４

リンパ節細胞（LNC）増殖反応の皮膚より表皮を片刃カミソリでかき取り、50 mM リン

0 . 05 〜３％ TNCB をマウスの両耳に 25 µL/ear 塗布し、酸ナトリウム緩衝液（pH 7 . 2 , 1 mM ジチオスレイトール、

その 72 時間後に耳下腺リンパ節より LNC を採取し、トリ

0 . 1 mM ピリドキサールリン酸、0 . 1 mM EDTA 含有）に

チウムチミジンの取り込みを測定した。

集め、ソニケーターでソニケート（19 W, 2 分）した。これを遠心した（30000 g, 20 分間）上清を用いて ODC 酵素

２. ２

UVA によるストレス応答タンパク質の遺伝子活性測定を行った。

発現への影響の実験
２. ２. １ODC 活性は、Russell と Snyder の方法により測定した８）。

実験動物および処置

３．結果と考察

日本チャールスリバーラボラトリーズ㈱より購入した雌性 CD- 1 マウスを用いた。マウスは、実験に用いる２〜３

３. １

IL- 1 KO マウスを用いたアレルギー性接触皮膚

日前に背部の毛をバリカンで刈った後、ヘアリムーバー（資炎の研究生堂㈱）にて完全に毛を取り除いた。

３. １. １

Ear swelling test の検討

アレルギー性接触皮膚炎が IL- 1 KO マウスで生じるか否２. ２. ２

光源

か検討する目的で、アレルギー性接触皮膚炎の指標として

蛍光 Black Blue ライト（FL15 BL-B、ナショナル㈱；300-

汎用されている ear swelling test を行った（Fig. １）。こ

400 nm）を用い、ガラス板にて UVB を除いた。光量は UVRの結果、IL- 1 KO マウスの耳厚差は、Wild マウスのそれ− 111 −

の約 80％と、わずかながら減少した。

が認められなかった。また、TNCB 塗布により、表皮から明らかに LC が減少している事が認められた。実際に

３. １. ２免疫染色による LC 遊走の比較検討

LC 数を計測して比較したところ、IL- 1 KO マウスの方が次に、0 . 5％ TNCB 塗布 18 時間後の耳表皮 LC を抗マ

もともと持っている LC 数が多い傾向にあった。TNCB 処

ウス IAd 抗体で免疫染色を行い、溶媒処置のものと比較

置により LC は、Wild、IL- 1 KO 共に溶媒処置に比較してすることにより LC 遊走を検討した（Fig. ２）。まず、抗約 20％減少した。これらのことは、IL- 1 が存在しなくてIAd 抗体による免疫染色の結果、IL- 1 KO マウスにも LC

も LC は発現し、ハプテンの刺激にも反応して遊走する事が存在し、形態学的観察では Wild の LC と特に大きな差を示している。そこで、次に近位リンパ節で LNC がハプ
テンの信号を受け取って増殖しているかどうかを LNC 増
殖反応により検討した。
３. １. ３

LNC 増殖反応

感作性物質の検出試験法の一つである LNC 増殖反応を0 . 05 から 3％ TNCB で検討したところ、0 . 1％ TNCB の
場合は IL- 1 KO マウスでの LNC 増殖反応は Wild より弱くなる傾向が認められたが、高濃度の TNCB では Wild とほぼ同様に増殖反応が起きていることが明らかになった（Fig. ３）。
本研究の結果、IL- 1 が不在でも LC の遊走や感作は正常
動物と同程度に生じ、IL- 1 を介さない LC 遊走や感作成立の系が存在することが示唆された。しかしながら、遺伝子欠損動物は生まれながらにして特定の遺伝子産物が欠損しFig. 1
Ear swelling response induced by TNCB in IL1KO and wild mice. Three percent of TNCB was painted
on mouse abdomen and one percent of TNCB or vehicle
was applied on each ear 6 days after the sensitization. Ear
thickness was measured 24 hr after the challenge.

ていることから、何らかの他の因子によって代償作用が生じている可能性も否定できないことから、今後その点に関する検討が必要である。

３. ２

その他のサイトカイン KO マウスを用いた研究Fig. 2The effect of TNCB on LC migration in wild andIL- 1 KO mice. TNCB ( 0 . 5 %) or vehicle was painted oneach ear and epidermal sheet was prepared 16 hr after
the treatment. LC was stained with a monoclonal antibody
against IAd and number of LC was counted.

Fig. 3The effect of TNCB on LNC proliferation in IL-1KOand wild mice. TNCB (0.05-3%) was painted on both ears anddraining lymph nodes were excised. LNC was isolated and theincorporated radioactivity of 3H-thymidine was measured.

− 112 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

IL- 1 KO マウスにおけるアレルギー性接触皮膚炎に対す

３. ３. ２

UVA による MTmRNA 誘導に及ぼす抗酸化剤

る応答は、Wild マウスと特に大きな相違が認められなかの影響ったことから、TNFαKO マウスを用いて同様の検討を進UVA は活性酸素を生じることから、この活性酸素がめた。現在まで得られている知見は、最終的に詳細な確認

MTmRNA 誘導におよぼしている影響を検討する目的で、を必要とするものであるが、TNFαKO マウスでは LC に抗酸化剤である α- トコフェロール 11）および一重項酸素捕異常が発生している結果が得られている。さらに本条件下（Fig.
獲剤である DABCO 12）を UVA 照射 30 分前に処置したにおいてもアレルギー性接触皮膚炎を正常動物よりは弱い５）。α- トコフェロールは UVA による MTmRNA 誘導をが明らかに成立しているという重要な成果が得られている。

20％、DABCO は 40％阻害した。この事から、UVA によ

本成果は皮膚 LC のアレルギー性接触皮膚炎における役割

る MTmRNA 誘導は部分的に UVA 照射により生じた活に関して重要な話題を提供するものである。現在強力にそ性酸素 13）、特に一重項酸素が関与していることが示唆さの解明の検討を進めている。

れた。活性酸素以外の要因としては、UVA により産生されると報告されており、またエンドトキシンによる MT

３. ３

UVA によるストレス応答タンパク質の遺伝子

誘導の主な要因といわれている IL- 614）が考えられる。

発現への影響９）
３. ３. １

３. ３. ３

UVA による MT 遺伝子発現の経時変化

UVA の TPA により引き起こされる ODC や

MT 誘導の増強効果ならびに α- トコフェロールによ

ま ず 始 め に、UVA が マ ウ ス 皮 膚 MT に 直 接 的 な 作

る防御作用

用を引き起こすかどうか検討した（Fig. ４）。UVA は、
MTmRNA を照射直後ですでに著しく増加させ、照射開TPA は強力な皮膚発ガンプロモーターとして古くから

始 4 時間後には、対照の約６倍の MTmRNA が認められた。

良く知られた化合物であり、ODC １、７）や MT ３）など様々

その後、徐々に mRNA 量は減少し始め、照射 24 時間後にはほぼコントロールレベルに回復した。UVA はマウス
表皮における ODC 遺伝子発現に、本実験で検討した限りにおいては全く影響しなかった。これは、以前の我々の報
告や他のグループの報告と一致している１、10）。

Fig. 4
Time course study of MT and HO-1 mRNA following
UVA exposure in mouse skin. Mouse dorsal skin wasirradiated with UVA (19J/cm2) and the skin was collected
at the times indicated. Time 0 indicates the starting time of
UVA exposure. Each blot was semiquantified and the signalof MT mRNA was normalized with that of GAPDH. Symbols
represent the mean ± SE for three mice. *Significantly
different from controls at p<0.05. ( 引用文献 9 より )Fig. 5
Effect of antioxidant pretreatment on UVA-mediatedexpression of MT gene in mouse skin. Antioxidants wereapplied to the skin and followed with UVA exposure. The
skin was collected 4 hr after starting UVA exposure. Eachblot was semiquantified and the signal of MT mRNA wasnormalized with that of GAPDH. Symbols represent the mean
± SE for three or four mice. *Significantly different fromcontrols at p<0.05. #Significantly different from UVA alone at
p<0.05. ( 引用文献 9 より )− 113 −

なストレス応答タンパク質を誘導することが明らかにされより ODCmRNA レベルではなく、酵素タンパクレベルにている。また、TPA は活性酸素を産生する事も報告され作用していることが示唆された。

ていることから、UVA との相互作用に興味が持たれ検討した（Fig. ６）。UVA 照射は TPA による ODCmRNA 誘

３. ３. ４クルクミンの UVA による ODC や MT 誘導増強効果におよぼす影響

導をさらに増加する傾向が認められたのみであった。しかし、ODC 活性誘導は UVA 照射により顕著に増強され、ターメリックの主要な黄色素成分であり、活性酸素捕TPA 単独処置の約 1 . 7 倍の活性を示した。また、TPA

獲作用を有する 15、16） ことが知られているクルクミンのによる MTmRNA 誘導は UVA 照射により著しく増幅し、UVA による TPA 誘導性 ODCmRNA や MTmRNA 増幅

TPA 単独処置の約２倍になった。

作用に及ぼす影響について検討した（Fig. ７）。クルクミ

ここで認められた UVA 照射の TPA 誘導性 ODC やン前処置は、TPA による ODC および MTmRNA 誘導を

MT 増強作用に、活性酸素が関与しているかどうか知る

ほぼ完全に阻害しただけでなく、UVA 照射によるこれら目的で、α- トコフェロールを TPA 塗布直前に処置した。

の増強作用も阻害した。これらの事実は、クルクミンが活

α- トコフェロールは、UVA 照射による mRNA 増幅作用性酸素を捕獲する 16）だけでなく、TPA によるプロテインにはほとんど影響を与えなかった。興味深いことに、α-キナーゼ C を介したシグナル伝達を直接的に阻害 17）してトコフェロールは、UVA 照射により増幅した ODC 活性

いることを示唆している。

を TPA 単独処置による誘導レベルに回復した。この事は、本研究により UVA 照射は皮膚において MT 遺伝子発UVA 照射の TPA による ODC 誘導増幅効果が、何らかの現を誘導するのみでなく、TPA による ODC や MT 誘導

活性酸素により引き起こされていること、またこの活性酸を増幅する作用があることが明らかになった。UVA は皮素が ODC タンパク質のターンオーバーを遅らせるなどに

膚の IL- 6 を増加させるという報告があるが、本研究で認Fig. 6
Effect of α-tocopherol on UVA-mediated enhancement of ODC activity, ODC and MT gene expression after TPA application in mouse skin. α-Tocopherol and/or vehicle was applied to the dorsal skin just before TPA application on the mousedorsal skin. Two hours after UVA exposure, the skin was collected. (a) Blots of ODC and MT mRNA were semiquantified andnormalized with that of GAPDH. Symbols represent the mean ± SE for three or six mice. *Significantly different from controls
at p<0.05. #Significantly different from TPA alone at p<0.05. (b) The epidermis was obtained from the rest of the skin and
ODC activity was measured as described in "Materials and Methods." Symbols represent the mean ± SE for six or ten mice.
*Significantly different from controls at p<0.05. #Significantly different from TPA alone at p<0.05. ##Significantly different fromthe group without ?-tocopherol treatment at p<0.05. ( 引用文献 9 より )− 114 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

所、ヒト疾患モデル研究センター、岩倉洋一郎教授に深く感謝いたします。
（引用文献）
１）I s h i z a k i , C . , O g u r o , T . , Y o s h i d a , T . , e t a l . , :Dermatology 193 , 311 - 317 , ( 1996 )２）Kimber, I., Dearman, RJ, Cumberbatch, M., et al.,Curr. Opin. Immunol. 6 , 614 - 619 . ( 1998 )３）Klaassen, C. D., Liu, J., and Choudhuri, S.: Annu. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 39 , 267 - 294 . ( 1999 )４）Horai, R., Asano, M., Sudo, K., Kanuka, H., et al.,: J.
Exp. Med. 187 , 1463 - 1475 . ( 1998 )５）Tagawa, Y., Sekikawa, K., and Iwakura, Y. : J.
Immunol. 159 , 1418 - 1428 . ( 1997 )６）Chomczynski, P., and Sacchi, N. : Anal. Biochem. 162 ,156 - 159 . ( 1987 )７）O'Brien, TG., Simsiman, RC., and Boutwell, RK.:
Cancer. Res. 35 , 1662 - 1670 . ( 1975 )８）Russell, D., and Snyder, SH. : Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 60 , 1420 - 1427 . ( 1968 )Fig. 7
Effect of curcumin on UVA-mediated enhancementof ODC and MT gene expression following TPA application.
Curcumin was applied just before TPA application. Skin wascollected 2 hr after UVA exposure. For a group without UVA
treatment, skin was collected 4 hr after TPA application. Blots
for ODC and MT mRNA were semiquantified and normalized with that for GAPDH. Symbols represent the mean ±SE for three or six mice. *Significantly different from controls
at p<0.05. #Significantly different from the equivalent group
without curcumin treatment at p<0.05. ##Significantly different from TPA alone at p<0.05. ( 引用文献 9 より )９）O g u r o , T . , a n d Y o s h i d a , T . : P h o t o d e r m .
Photoimmunol. Photomed. 17 , in press. ( 2001 )10）Hillebrand, GG., Winslow, M. S., Benzinger, M. J., etal. : Cancer Res. 50 , 1580 - 1584 . ( 1990 )11）Jurkiewicz, BA., Bissett, DL., and Buettner, GR.: J.
Invest. Dermatol. 104 , 484 - 488 . ( 1995 )12）Cynshi, O., Takashima, Y., Katoh, Y., et al.: J.
Biolumin. Chemilumin. 10 , 261 - 269 . ( 1995 )13）Wlaschek, M., Wenk, J., Brenneisen, P., et al.: FEBS
Lett. 413 , 239 - 242 . ( 1997 )14）Lee, DK., Carrasco, J., Hidalgo, J., et al.: Biochem. J.
337 , 59 - 65 . ( 1999 )められた作用にどの様なサイトカインが関与しているかは、
今後サイトカインノックアウトマウスなどを用いた検討を15）L u , Y P . , C h a n g , R L . , H u a n g , M T . , e t a l . :Carcinogenesis 14 , 293 - 297 . ( 1993 )進めていく必要がある。

謝16）Nakamura, Y., Ohto, Y., Murakami, A., et al.: Jpn. J.

辞Cancer Res. 89 , 361 - 370 . ( 1998 )本研究を行うに際し、貴重なサイトカインノックアウト17）Lin, JK., Chen, YC., Huang, YT., et al.: J. Cell

マウスを後供与していただきました、東京大学医科学研究− 115 −

Biochem. Suppl. 28 - 29 , 39 - 48 . ( 1997 )白血球分画が皮膚の健康状態と関連するメカニズム新潟大学医学部 免疫学・医動物学

安

保

徹

We, multicellular organisms, must cooperate, to some extent, all cells when we behave for one purpose.  In thisregard, we carry the autonomic nervous system and all cells are cooperated with each other under unconsciousness.  
All cells in our body are under the regulation of autonomic nervous system and leukocytes are not excluded fromthis rule.   Therefore, if the autonomic nervous system becomes unbalanced, the distribution of leukocytes is alsodeviated.  This leads to the disorder of organs, including the skin, and we finally fall victim to disease.
Key words: cooperation among cells, autonomic nervous system, leukocyte, disease

１．緒

皮膚に注目してこれらの変化を述べると、過労や心の悩

言みは末梢の循環不全と顆粒球増多をもたらし、かさかさの全身に分布する他の細胞と同様に、白血球も自律神経支

皮膚から吹き出物がでる皮膚へと進展してゆく。もちろん、配を受けていることが明らかになった１、２）。顆粒球（主なからだ内部の循環障害と顆粒球による組織破壊も伴う。顔ものは好中球）は膜上にアドレナリン受容体を持ち、主にの表情筋は内臓筋由来なので上記した内臓の変化は顔にも交感神経刺激で活性化し、逆に、リンパ球は膜上にアセチ

現われ、容貌の変化としても現われてくる。結局、過労やルコリン受容体を持ち、主に副交感神経刺激で活性化する。

心の悩みは、その人の美しさとも関係してくる。

このため、生体に激しいストレスが加わると次のような連２．白血球の自律神経支配

鎖反応が引き起こされる。ストレス→交感神経緊張→顆粒
球増多→組織（粘膜や皮膚）破壊、の図式である。この考

生体防御系の基本細胞はマクロファ−ジであるが、進化えを導入すると、これまで医学や生物学で解明が難しかっの過程でこれから顆粒球とリンパ球が生じている（図１）。

たいろいろな問題の謎が明らかになってゆく。白血球の日

マクロファ−ジ時代の貪食能に磨きをかけたのが顆粒球で内リズムや年内リズム 、ストレスと組織障害 、新生児あり、マクロファ−ジ時代の接着能を進化させ認識系をつにみられる顆粒球増多 、痛み止めやステロイドホルモン

くったのがリンパ球である。そして、この進化の過程での副作用５）、手術侵襲と多臓器不全、など多数ある。

顆粒球 ( 好中球）は主にアドレナリン受容体を受け継ぎ１）、

１）

３）

４）

もう少し具体的に言うと、精神的ストレスでも身体的ス

リンパ球は主にアセチルコリン受容体を受け継いでいる２）。

トレスでも、多くの場合生体は交感神経緊張状態になり、いろいろな自律神経反応が引き起こされる、例えば、頻脈、高血圧、末梢循環不全、分泌抑制、消化管機能の停止などがある。そして、好中球も膜上にアドレナリン受容体を持つために他の細胞と同様にこの自律神経反応の中に組み込まれる。具体的には、
１）骨髄の好中球プ−ルから末梢への移行
２）好中球の活性酸素放出による皮膚や各種臓器での組
織破壊
３）その後、骨髄での好中球産生の促進である。
Mechanisms underlying the relationshipof leukocyte distribution withhealthyconditions of the skin
Toru Abo
Department of Immunology and Medical
Zoology, Niigata University School of
Medicine− 116 −

図１

白血球の自律神経支配

白血球分画が皮膚の健康状態と関連するメカニズム

この進化は、生物が活動する時に手足から進入する細菌

粒球や単球と同じ日中増加する日内リズムを示した。アセを効率よく処理し、逆に、生物が食物摂取や球速の時にはチルコリン受容体を優位に持つ胸腺由来の CD 3 + CD 5 −通ウイルスや異種蛋白などの貪食には小さ過ぎる物質を効率

常 T 細胞は夜間に増加する日内リズムを示した。
なお、デ−タには示さないが、顆粒球の中でも好中球とよく処理するための合目的なものだったのであろう。
マウスに徐放性にアドレナリン（Epinephrine）を投与

好塩基球は日中増加のリズム、好酸球のみはリンパ球と似すると全身に顆粒球（Gr—１+）増多が出現しているのがわかる（図２）。この反応は骨髄での顆粒球産生の増加によって起こることがその後明らかになっている６）。

３．白血球の生理的変動
白血球の自律神経支配は、ストレスの無い通常状態でも白血球の分布に影響を与えている。我々ヒトの生体は日中が交感神経優位で、夜間が副交感神経優位なために、この自律神経系のリズムに応じた白血球の日内リズムが見られる（図３）。白血球総数はゆるやかではあるが日中多く、
夜間低いという日内リズムが認められる。さらに顆粒球、リンパ球、単球（monocytes）はその膜上の自律神経レセ
プタ−の発現に応じたリズムを示す。アドレナリン受容体が優位の顆粒球と単球は日中増加するリズムで、リンパ球は逆転した夜間増加するリズムである１）。
125

I—シアノピンドロ−ルを用いてヒト白血球分画でのア

ドレナリン受容体の発現量を比較した（図４）。単球（MΦ、
マクロファ−ジ）と顆粒球の他、系統発生学的に古いリンパ球である NK 細胞や胸腺外分化 T 細胞（CD 56 + T 細胞）
もアドレナリン受容体の発現量が高い。進化した T、B 細胞がアドレナリン受容体の発現が低く、逆にアセチルコリ
ン受容体の発現が高い傾向にある２）。
ヒト末梢血でさらにリンパ球サブセットの日内リズ
ムを検索した（図５）。アドレナリン受容体持つ CD 3 −CD 56 + NK 細胞と CD 3 + CD 56 + 胸腺外分化 T 細胞は、顆

図 ３ ヒト白血球総数とその分画のアドレナリン受容体の発現の比較

図２ マウスにアドレナリン（Epinephrine）を投与したときの顆粒球増多− 117 −

図４

ヒト白血球分画のアドレナリン受容体の発現の比較

た夜間増加のリズムを持っていたことを付け加えておきたい。

に胃潰瘍の形成が出現した３）。
このようにストレスは末梢への好中球浸潤を誘導し、組織破壊を引き起こす。好中球は成熟後の寿命が２日と短い。

４．急性ストレスと顆粒球 ( 好中球）

これは好中球が生き続ける遺伝子 bc 1—２を欠損している

徐放性にアドレナリンを与えたり、慢性的ストレスを与ことによる。好中球はアポト−シスで寿命を終えるが、生えたときは、骨髄での好中球の産生が高まり、その後全身きている段階からこの反応が進んでいる。好中球が多核球

性の好中球増多がくる 。では、急性ストレスに対して顆とも言われるように生きた状態で既に核にくびれがはいっ

粒球（好中球）はどのように反応してくるのであろうか。

ているのはこの反応の進行のためであろう。

６）

マウスをメッシュにはさみ、８時間と 24 時間後に各種免

好中球は常在菌も含めた細菌との戦いで、寿命を終え疫臓器にある顆粒球の数の変化を調べた（図６）。顆粒球ることが促進される。ストレスによる組織破壊が常在菌のの著しい減少が見られた。逆に、ストレス開始８時間後に存在する場所に出現するのはこのためである。代表的な末梢血や肝では顆粒球が増加していた。これは骨髄の顆粒ものを挙げるとストレスによる歯周病（歯槽膿漏）（Str.

球プ−ルから末梢への移行が起こったことを示唆している。

mutans）、
胃潰瘍（H. pylori）、
潰瘍性大腸炎（E. coli）、
痔（E.

一方、胃の粘膜ではストレスの時間延長と共にしだいに顆
粒球の数が増加していった。そして、24 時間後には確実

図５

図６

ヒトリンパ球サブセットの日内リズム− 118 −

マウス急性ストレス後の全身の顆粒球数の変化

白血球分画が皮膚の健康状態と関連するメカニズムcoli）などである。ストレスが強い場合は常在菌の存在し制（消化液がでない）と蠕動運動抑制（便秘となる）であない場所でも好中球の標的となる。アルコ−ル過剰摂取時る。このままでは、食事ができず生命が危険にさらされる。

の急性腎炎や肝炎、過労ややけど時の急性腎炎などである。

これを救う反応として副交感神経反射が一過性に起こる。

精神的ストレスや身体的ストレス以外にもストレスと同

これが胃潰瘍や十二指腸潰瘍患者に見られる腹痛と酸分泌様の交感神経緊張を誘導するものがる。１）痛み止め（消である。また、潰瘍性大腸炎や刺激結腸に見られる腹痛と炎鎮痛剤、NSAIDs）の長期使用、２）ステロイドホルモ

下痢である。従って、対症療法ばかりしている医者は患者

ンの過剰使用（湿布や塗り薬として、外用使用したときもを治すことができない。真の原因（ストレスの原因）をつ含む）、３）細菌感染症などである。特に、NSAIDs は顆

きとめて除かなければならない。

粒球の炎症に対しては起炎剤として働くことを知ってほし

内臓の変化は、顔の表情の変化を伴う、顔の表情筋が内い５）。これは、プロスタグランジンがカテコ−ルアミン産

臓筋由来だからである 7）。従って下記のような内臓（消化生の抑制系として働いているためである。もう少し具体的管）が障害を受けている人は苦しい容貌となってくる。健に言うと、NSAIDs によってプロスタグランジン産生が抑

康な人が美しい理由である。

制され、この反応を主体とするリンパ球炎症（カタ−ル性

骨や筋肉の細胞は、白血球と兄弟の関係で進化している。

炎症やアレルギ−性炎症）は抑制されるが、逆にカテコ−

つまり、白血球の元祖であるマクロファ−ジが細胞外マト

ルアミン産生系によって刺激される化膿性の炎症は悪化す

リックスに Ca 2 + PO 43 -（細胞の興奮の時に使われれた老廃ることになる。

物）を OH −と共にため置いたものが骨である（ハイドロ

生理的に放出されるステロイドホルモンや投与初期のス

キシアパタイト）。一方、マクロファ−ジの遊走能（もっテロイドホルモンは、ストレスを軽減しその後に誘導されと具体的には、細胞内骨格や収縮物質を使用）を発達させる好中球増多を消失させる力を持っている。しかし、外用たのが筋細胞である。従って、ストレスが続くと骨は少ななどで使用して生体に残ったステロイドホルモンは酸化コく硬くなる。そして、循環障害によって変形がくる。このレステロ−ルとなり、今度は逆に激しい交感神経緊張、末ようなわけで、過労や心の悩みのある人が手足の骨や、背梢循環器不全、好中球増多を呼び込む。これがアトピ−性

骨、腰や肩の骨が変形してゆくのである。このような状態

皮膚炎の患者がステロイド外用薬を使用した時の病状悪化を多くの医者は、しかたのない老化による骨の変形としてである。ステロイドが酸化した、いわゆる、酸化コレステ診断して、その症状から痛み止めなどを処方するが病気はロ−ルは胆汁酸として肝→胆嚢→腸の経路を通って排泄さ悪化する。逆に、ストレスを除くと痛みはとれ、骨の変形れるが、この能力には限界があるので上記した反応が引きもしだいに元に戻ってくる。当然、ストレスによる骨の変起こされることになる。

形は姿勢を悪くするのでその人の全身的美しさをも乱すこ

５．ストレスと皮膚の状態、容貌、そして全身的な美しさとにつながる。

６

おわりに

ストレスはかならず全身の循環障害を伴うので、ストレストレスは免疫系を変え病気を引き起こすと共に、皮膚スが続くと皮膚の水みずしさが失われ、かさかさしてくる。

のつや、顔の容貌、全身的な姿勢を悪化させ、その人の美また、顆粒球の増多も伴うので化膿性の炎症が起きやすく

しさを決めていることを明らかにした。

なる。若い人に見られるニキビを “青春のシンボル” と言7

うのは危険である。実際は、精神的ストレスによる循環障

結論

害（血液のうっ滞−黒赤い皮膚）と顆粒球増加（常在菌で我々多細胞生物は、一つの目的に向かって行動する時、ある P. acnes と反応して化膿巣を形成している）の病気

細胞全体がある程度協力し合わなければならない。このただからである。年齢がもっと上の人でもストレスによってめに自律神経系があり、無意識の内に協力体制が整う。自突然アトピ−性皮膚炎がくる所以でもある。水みずしい皮

律神経の支配下にあるのは細胞にほとんど例外はなく、血膚を保つには交感神経緊張をもたらすことのないような生

液中を流れる白血球も同様であった。このため自律神経の活をする必要がある。睡眠不足は一日の交感神経緊張状態

バランスが崩れると白血球の分布が変化し、皮膚も含めてを長くすることであるからすぐ皮膚の荒れがくることにな

全身に異常がきてついには病気となる。

る。
ストレスによる皮膚の異常はかならず内臓の変化を伴っ（参考文献）ている。内臓（消化器）のほとんどの働きは副交感神経支１）S u z u k i , S . , T o y a b e , S . , M o r o d a , T . , T a d a , T . ,配である。従って、ストレスによって交感神経緊張の時間

Tsukahara, A., Iiai, T., Minagawa, M., Maruyama,が多くなると消化管の働きは低下する。具体的には分泌抑S., Hatakeyama, K., Ento, K. and Abo, T.   Circadian− 119 −

rhythm of leukocytes and lymphocyte subsets and its

granulocytosis is a postpartum event which is seen inpossible correlation with the function of autonomic

the liver as well as in the blood.  Hepatology 26 : 1567 -

nervous system.   Clin. Exp. Immunol. 110 : 500 - 508 ,1572 , 1997 .

1997 .

５）Yamamura, S., Arai, K., Toyabe, S., Takahashi, E. H.

２）Toyabe, S., Iiai, T., Fukuda, M., Kawamura, T.,

and Abo, T.   Stimiltaneous activation of granulocytes

Suzuki, S., Uchiyama, M., and Abo, T.   Identificationand extrathymic T cells in number and functinof nicotinic acetylcholine receptors on lymphocytes inby excessive administratinof nonsteroidal anti-

periphery as well as thymus in mice.  Immunology 92 :inflammatory drugs.   Cell. Immunol. 173 : 303 - 311 ,

201 - 205 , 1997 .

1996 .

３）Moroda, T., Iiai, T., Tsukahara, A., Fukuda, M.,

６）Tsukahara, A., Tada, T, Suzuki, S., Iiai, T., Moroda, T.

Suzuki, S., Tada, T., Hatakeyama, K. and Abo, T.  

Maruyama, S., Minagawa, M., Musha, N., Shimizu, T.,

Association of granulocytes with ulcer formation in

Hatakeyama, K. and Abo, T.   Adrenergic stimulation

the stomach of rodents exposed to restraint stress.  

simultane-ously induces the expansion of granulocytes

Biomed. Res. 18 : 423 - 437 , 1997 .

and extrathymic T cells in mice.  Biomed. Res. 18 : 237 -４）Kawamura, T., Toyabe, S., Moroda, T., Iiai, T.,

246 , 1997 .

Takahashi-Iwanaga, H., Fukuda, M., Watanabe,７）西原克成H., Sekikawa, H., Seki, S. and Abo, T.   Neonatal

現代医学の盲点と生命科学の統一理論 ( 12）。

容姿・容貌の医学と健康科学。治療 80 : 145 - 159 , 1998。

− 120 −

UVA による酸化的遺伝子損傷の細胞内修復機構
広島大学大学院

井

理学研究科

出

博

Solar ultraviolet radiation with wavelength between 320-400 nm (UVA) passes through stratospheric ozone withoutabsorption and reaches the earth's surface.   When exposed to UVA, reactive oxygen species (ROS) generated byendogenous photosensitizers cause damage to DNA, mostly oxidative base lesions, in living organisms.   In this study,
the damage specificity has been  elucidated of two base excision repair enzymes [endonuclease III homolog 1 (NTH1)
and 8-oxoguanine glycosylase 1 (OGG1)] that are potentially involved in removal of UVA-induced oxidative DNA
lesions.   Duplex oligonucleotide substrates containing unique lesions were incubated with the enzymes and products
were analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Pyrimidine lesions such as urea, thymine glycol,
5,6-dihydrothymine, and 5-hydroxyuracil were efficient substrates for NTH1, and purine lesions such as 7,8-dihydro-8oxoguanine and formamidopyrimidine were also good substrates for OGG1.  Interestingly, further analysis of the damage
specificity revealed that NTH1 recognized formamidopyrimidine, a purine lesion, and OGG1 recognized the pyrimidine
lesions except thymine glycol but in a paired base-dependent manner.  These results suggest that NTH1 and OGG1 may
be able to act as a mutual backup enzyme, albeit not perfectly, in cells. The repair activity for 5-formyluracil, a major
UVA-induced oxidative lesions, was also investigated using mouse tissues.  Incubation with the crude cell extracts fromseveral tissues including brain, heart, lung, thymus, and liver all resulted in incision of a substrate at the 5-formyluracil
site, demonstrating the presence of repair activity for this lesion. Several lines of evidence suggested that the observed
activity for 5-formyluracil resided on a novel enzyme that had not been identified before.

１．緒

す．水素結合による相補的な Watson—Crick 型塩基対形成

言は，遺伝子の複製や発現に中心的な役割を果たすため，構

太陽光には，UVA（320 - 400 nm），UVB（290 - 320 nm），

造変化に伴う塩基対形成能の異常は，生物にとって極めてUVC（190 - 290 nm）の紫外線成分が含まれる（表１）．こ

重大な脅威となる．UVC および UVB は，２つのピリミの波長域に吸収帯を持つ分子が紫外線を吸収すると，分子ジン塩基が連続した dipyrimidine site に cyclopyrimidineの構造が変化したり，活性酸素などの反応種を生じ他のdimer（CPD）と（6 - 4）photoproduct（6 - 4 PP）を生じる

分子を攻撃する．DNA に含まれる 4 種の塩基（A，G，C， （図１A）１）．両損傷は DNA 複製を強く阻害するため細胞T）はいずれも 260 nm 付近に吸収極大を持ち，約 300 nm

致死の原因となるほか，6 - 4 PP では，損傷を乗り越えた

以下の紫外線を吸収する．したがって，UVC および UVBDNA 複製が起こると，新生鎖に相補的ではない誤ったヌは，DNA に吸収され直接的に塩基の構造変化を引き起こ

クレオチドが取り込まれ突然変異が誘発される．ヒトでは，

表１表皮を形成する細胞の失活や突然変異，さらに悪い場合は

太陽光の紫外線と DNA 損傷

皮膚癌の発症にもつながる．幸いなことに，地球を取りまくオゾン層は紫外線を吸収するため，地上に生息する生物は，最も脅威となる UVC のすべて，および短波長領域
UVB による DNA の傷害を免れている．
一方，UVA はオゾン層にまったく吸収されず地表に到達す
る．UVA は UVB に比べ光子エネルギーは小さいが，地表に到達する全エネルギー量は UVB の約 10 倍に達する（表１）．
DNA は UVA の波長域（320 - 400 nm）には吸収帯を持たな
いため，UVC や UVB とは異なり直接的には DNA 損傷を

Cellular repair mechanisms of oxidative
DNA damage induced by UVA
Hiroshi Ide
Graduate School of Science, Hiroshima
University

引き起こさない．しかし，細胞内には UVA 波長域に吸収を持つ多種の色素団分子（たとえば，NAD，FAD，ポルフ
ィリン化合物など）が存在する．これらの分子は，本来細胞内において物質・エネルギー代謝に関連した補酵素として重要な働きをしているが，UVA が細胞に照射されると励起され，エネルギー移動により活性酸素（Reactive oxygen
species, ROS）が発生する（Type Ⅱ reaction と呼ばれる）２）．

− 121 −ROS は，周辺に存在する DNA，生体膜，タンパク質と反ノックアウトマウスが作製され phenotype の解析が行われ応しこれらの分子を酸化する．生体膜の脂質過酸化やタン

たが，マウスは正常に発育し有意に高い発癌率は観察されパク質の分解はこれらを再合成することにより対処できるなかった８，９）．NTH 1 ノックアウトマウスはまだ報告されが，遺伝情報を担う DNA の損傷は，UVC および UVB のていないが，大腸菌の NTH 1 ホモログ欠損株（nth）では，場合と同様に生命活動にとって多大な脅威となる．

明確な phenotype が認められないことから 10），NTH 1 ノッ

細胞内色素団分子が関与する UVA 由来の DNA 損傷としてクアウトマウスでも同様な結果が予想される．したがって，は，
thymine glycol（TG），
5 -formyluracil（FU），
7 , 8 -dihydro- 8 -NTH 1 および OGG 1 は哺乳類の主要な酸化損傷修復酵素とoxoguanine（OG），2,6-diamino-4-hydroxyformamidopyrimidine

して位置づけられているにもかかわらず，これらの酵素に．TG およよる修復欠損が直ちに phenotype として現れない可能性がび FAPY は突然変異性は低いが，いずれも DNA 複製を強高い．DNA の酸化は，UVA のような外的要因だけでなくく阻害する．一方，FU および OG は複製阻害効果は低い

好気的代謝といった内的要因でも生じるため，遍在性の高が，突然変異性を示す．したがって，DNA に生じたこれら

い損傷である．このような損傷に対しては，何らかの原因の損傷は，速やかに除去される必要がある．最近，これらで一つの修復酵素が働かない場合，他の酵素がこれをバッの酸化損傷を認識する哺乳類修復酵素（ヒトおよびマウス

クアップすることにより fail-safe system を形成している可（FAPY）などが同定されている（図１B）

３−５）

NTH 1，OGG 1）が同定され遺伝子がクローニングされた

．

６，
７）

能性が考えられる．

NTH1 は TG，OGG1 は OG および FAPY を認識し，これら

本研究では，以上の観点から NTH 1 および OGG 1 の基質の損傷を DNA から除去する．さらに，OGG 1 については，特異性を詳細に調べ，認識する損傷のオーバーラップによる修復バックアップの可能性をまず検討した．さらに，FUを認識する哺乳類修復酵素はこれまでに同定されていないことから，この活性の検索もあわせて行った．

２．実
２. １

験

オリゴヌクレオチド基質

TG，urea（UR），5,6-dihydrothymine（DHT），5-hydroxyuracil（HOU）は配列１の X の部位，FU は配列２の Y の部位，OGおよび FAPY は配列３の Z の部位に選択的に導入した．
配列 1

ACAGACGCCAXCAACCAGG

配列 2

CATCGATAGCATCCGYCACAGGCAG

配列 3

CATCGATAGCATCCTZCCTTCTCTC

配列１−３の相補鎖はホスホロアミダイト法により合成した．DHT，HOU，FU，OG は，それぞれ対応する損傷
アミダイトモノマーを用いて合成し，導入した損傷塩基が分解しない穏和な条件下で脱保護を行った．TG は対応する位置にチミンを含むオリゴヌクレオチド（配列１，X=T）の KMnO4 処理により合成し，逆相 HPLC により分取精製した．UR を含む基質は，TG を含むオリゴヌクレオチドのア
ルカリ処理（pH11.4）により調製した．FAPY は，前駆体として 7—メチルグアニンを DNA ポリメラーゼ反応により導入し，これを室温下，pH11.4 で処理し FAPY に変換した．

２. ２

修復酵素アッセイ

マウス NTH 1，
ヒト OGG 1，
大腸菌 endonuclease Ⅲ（EndoⅢ），formamidopyrimidine glycosylase（Fpg）およびヒト methylpurine glycosylase（MPG）は，それぞれクロ
図1
り

UVB および UVA により生成する DNA 損傷
A：UVB により生成するピリミジン二 体，B：UVA によ
生成する酸化損傷

ーニングした遺伝子の大腸菌発現系を用いて発現し，イオ
ン交換およびアフィニティークロマトグラフィーによりSDS-PAGE で単一バンドになるまで精製した 11，12）．酵素− 122 −

UVA による酸化的遺伝子損傷の細胞内修復機構

活性アッセイは以下の通り行った．損傷を含むオリゴヌクレ

環開裂生成物（UR），C 5 -C 6 飽和生成物（TG，DHT），

オチドを 5'- P 標識後，相補鎖とアニールし二重鎖基質とし

C 5 水酸化物（HOU）を DNA から同程度の効率で除去すた．基質（5-10nM）を酵素（1-10ng）と 37℃でインキュベることが示された．さらに，NTH 1 の酵素触媒メカニズートした．反応生成物は 16％変性ポリアクリルアミド電気

ムを明らかにするため，反応中間体の解析を行った．この32

泳動（PAGE）で分離し，バンドの放射活性は BAS2000 に目的で，NTH 1 と基質を NaBH 4 存在下でインキュベート

より解析した．NaBH4 トラッピングアッセイでは，標識基し，反応生成物を SDS-PAGE で分析した．その結果，遊質と NaBH4（50mM）を混合し，これに酵素を加え 37℃で離の基質のほかに NTH 1 - 基質複合体が確認された．後１時間インキュベートした．反応生成物は，10％ SDS-PAGE

者は，N—グリコシラーゼ活性により生じた糖のアルデヒ

で分離し，バンドの定量は活性アッセイと同様に行った．

ド基（C 1 ' 位）と NTH 1 の活性中心にある Lys の間に形成された Schiff 塩基（反応中間体）が NaBH 4 により還３．結果および考察
３. １

元され生じたものと考えられる（図３）．また，UR，TG，

NTH1 の損傷特異性

DHT，HOU でトラップされた反応中間体の量は同じであNTH 1 が認識する DNA 損傷を明らかにするために，UR，った．この結果は，活性アッセイの結果とも一致した．

TG，DHT，HOU を同一配列中に含むオリゴヌクレオチド
二重鎖を基質とし基質特異性を検討した．UR，TG，DHT

３. ２

OGG 1 の損傷特異性の対合塩基には A，HOU の対合塩基には G を用いた．基OGG 1 はプリン酸化損傷 OG および FAPY を DNA から

質を NTH 1 とインキュベート後，生成物を PAGE で分析除去する活性を持つことが知られている７，８）．OG についした．４種の損傷はすべて NTH 1 に認識され，損傷部位でては，ホスホロアミダイト法を用いたオリゴヌクレオチド

特異的に切断された生成物バンドが認められた．また，切合成法が確立されているため，多くの研究が行われている．

断生成物のゲルの移動度から，3 '- 末端は hydroxypentenal-

しかし，FAPY を特異的に含むオリゴヌクレオチド基質の5 '-phosphate であり，NTH 1 の AP リアーゼ活性により生じた β 脱離生成物であることが示された．次に，これらの損傷に対する活性を定量的に比較するために，切断バンドの放射活性を測定し切断生成物の量を定量した．UR に対する活性は他の損傷に比べ 2 倍程度高いものの，すべての損傷は NTH 1 のよい基質となることがわかった（図２A）．
原核生物（大腸菌）には，NTH 1 のホモログ Endo Ⅲが存在する６，７，11）．両酵素の基質特異性の差異を明らかにするために，Endo Ⅲの UR，TG，DHT，HOU に対する活性を NTH 1 と同様な方法で定量した．Endo Ⅲは，UR，TG，HOU を同程度の効率で認識したが，DHT に対しては著し
く低い活性しか示さなかった（図２B）．以上の NTH 1 お
よび Endo Ⅲの結果から，両酵素では DHT に対する活性が大きく異なることが示された．この理由を明らかにする
ために，TG および DHT に対する NTH 1 と Endo Ⅲの酵
素パラメータ（K m，k cat）を決定した．NTH 1 の K m は TGと DHT で同じ値であったのに対し（3 nM），Endo Ⅲのそれは TG（K m = 19 nM）と DHT（K m = 510 nM）で 27 倍の差が認められた．この結果は，Endo Ⅲの DHT に対する親和性が極めて低いことを示している．また，NTH 1 の k cat
は TG と DHT で同程度（k cat = 0 . 02 - 0 . 03 min - 1）であったのに対し，Endo Ⅲの値は，TG（k cat= 0 . 78 min - 1）と DHT（kcat= 0 . 07 min- 1）で 11 倍の差があった．これらのパラメー
タから，DHT に対する Endo Ⅲの極めて低い活性は，基質親和性の低下および触媒速度の減少の両因子に由来していることが明らかとなった．
上記の活性アッセイの結果から，NTH 1 はピリミジン

図 2 NTH1 および Endo Ⅲのピリミジン酸化損傷に対する活性urea（UR），
thymine glycol（TG），
5,6-dihydrothymine（DHT），
5-hydroxyuracil（HOU）を含む基質と酵素をインキュベート
し，生じた鎖切断生成物を PAGE 分析により定 した．各基質に対する活性は UR に対する相対値として示す．A：NTH1，B：
Endo Ⅲ− 123 −

合成法はこれまでに確立されていなかったため，OGG 1 の両基質に対する活性の定量的な比較は行われていなかった．本研究では，まず FAPY
導入法を検討した．7 - メチルグア
ニン（7 mG）は，アルカリ処理によりイミダゾール環が開環しメチル
FAPY に変化する．そこで，FAPYの前駆体として，7—メチルデオキシ
グアノシン三リン酸を DNA ポリメ
ラーゼ反応により目的の配列中に導入した．これを室温下，pH 11 . 4 で処理し，7 mG を FAPY に変換した．
ピペリジン処理および種々の酵素処理により 7 mG から FAPY への変換効率を調べた結果，導入した 7 mGは定量的に FAPY に変換されていることが示された．7 mG はデプリ
ネーションを起こしやすい塩基であ

図3

NaBH 4 による NTH 1 反応中間体のトラップ反応
NTH 1 の活性部 にある Lys のデオキシリボース C 1 ' への攻撃により N—グリコシド結合が切断され（a），NTH 1 と基質の間に反応中間体（Schiff base）が形成される．これから β 脱離反応が起こり DNA 鎖が切断される（b）．NaBH 4 存在下では，Schiff baseの imine が還元され，安定な酵素 - 基質クロスリンク複合体が形成される（c）．

るが，実験に用いた条件ではデプリ
ネーションは起こらなかった．
上記の方法により同一配列中に OG および FAPY を含
むオリゴヌクレオチド基質の調製が可能になったことから，
これを用いて OGG 1 の両損傷に対する活性を比較検討した．
OG および FAPY の対合塩基には C を用いた．基質とOGG 1 をインキュベートし，生成物を PAGE で分析した結果，損傷部位で特異的に切断されたバンドが認められた（図４）．両損傷とも生成物は β 脱離により生じた切断生成物であった．大腸菌の OGG 1 機能ホモログ Fpg についても同様な実験を行ったところ，生成物としては δ
脱離生成物が生じた（図４）．したがって，真核生物由来
OGG 1 および原核生物由来 Fpg は，OG および FAPY を認識し N—グリコシラーゼとして作用するが，引き続くAP リアーゼの作用モードは異なると考えられる．次に，種々の基質濃度条件下で生じた生成物を定量し，OGG 1 の酵素パラメータを決定した．OG および FAPY に対する
K m は，それぞれ 23 nM および 15 nM，また k cat は，それぞれ 0 . 034 min - 1 および 0 . 025 min - 1 となり，両損傷で大きな違いは認められなかった．その結果，反応効率（kcat/Km）
もほぼ等しい値となった（OG：FAPY= 0 . 9：１）
．以上の

図4

OGG 1 および Fpg のプリン酸化損傷に対する活性分析
7 , 8 -dihydro- 8 -oxoguanine（OG）および formamidopyrimidine（FAPY）を含む基質を，OGG 1 あるいは Fpg とインキュベートし，生成物を 16％変性 PAGE で分析した．図中の矢印は，β 脱離生成物と δ 脱離生成物を示す．

結果から，OGG 1 が主要プリン酸化損傷 OG および FAPY

び OGG 1（３. ２）の実験では，損傷の対合塩基を A（UR，を同じ効率で DNA から除去することが明らかとなった．

TG，DHT），G（HOU），C（OG，FAPY）としたが，本実験では４種の対合塩基（A，G，C，T）をすべて用いて活３. ３

NTH 1 と OGG 1 の認識基質オーバーラップ性を検討した．活性は，基質と酵素のインキュベーション

NTH 1 と OGG 1 の基質オーバーラップを調べるためにより生成した切断バンドから定量した．NTH 1 は，UR：に， 両 酵 素 の UR，TG，DHT，HOU，OG，FAPY に

N，TG：N，DHT：N，HOU：N（N=A，G，C，T）だけ対する活性を調べた．既に述べた NTH 1（３. １）およ

でなく，これまで OGG 1 のみに認識されると考えられてい− 124 −

UVA による酸化的遺伝子損傷の細胞内修復機構

た FAPY：N（N=A，G，C，T）に対しても活性を示しなかった．一方，OGG 1 は，NTH 1 と異なり，同じ損傷た（図５）．さらに FAPY に対する活性は，NTH 1 の本でも対合塩基により活性が変化した．プリン損傷に対す来の基質の１つである TG に対する活性と同程度であった．

る活性の対合塩基依存性は，OG では OG：C >> OG：T>

しかし，NTH 1 は OG：N に対してはまったく活性を示さ

OG：G>OG：A，また FAPY では FAPY：C > FAPY：
T 〜 FAPY：G 〜 FAPY：A となった．ピリミジン損傷
では，UR：C，DHT：C，HOU：C に対し活性を示したが，他の塩基（T，G，A）と対合した場合は活性は認められなかった．したがって，OGG 1 はこれまで報告されている
プリン損傷ばかりではなく，ピリミジン損傷に対しても潜在的な修復活性を持つが，この活性は特徴的な対合塩基依存性を示すことが明らかとなった．

３. ４

FU 修復活性FU を認識する哺乳類修復酵素を，精製酵素および細胞粗抽出物を用いて検討した．精製酵素を用いた検索では，
酸化損傷修復酵素（NTH 1，OGG 1）のほかに，大腸菌のFU 修復酵素である AlkA の哺乳類機能ホモログ（MPG）
を用いた 12，13）．しかし，NTH 1，OGG 1，MPG いずれもFU に対しては活性を示さなかった．したがって，哺乳類の FU 修復酵素はこれまでに同定されていない新規なものであると考え，細胞粗抽出液中の FU 修復活性を調べた．
マウスの脳，心臓，肺，胸腺，肝臓を摘出し，それぞれの
図5

FAPY に対する NTH 1 の活性分析
4 種の塩基と対合した FAPY（FAPY：N，N = A,G,C,T）を含む基質を NTH 1 とインキュベートし，生成物を 16％変性 PAGE で分析した．図中の矢印は，β 脱離生成物を示す．

細胞粗抽出物を調製した．これを基質とインキュベート後，除タンパクし，反応生成物を PAGE で分析した．その結果，比活性に差はあるものの，用いたすべての臓器で FU 部位で切断された生成物が認められた（図６）．この生成物は，

図6

マウス臓器の FU 修復活性A：マウスから脳，心臓，肺，胸腺，肝臓を摘出し，細胞粗抽出物を調製した．これを5 -formyluracil（FU）を含む基質とインキュベートし，生成物を 16％変性 PAGE で分析した．
図中の矢印は，FU 特異的な切断生成物を示す．B：FU 特異的な切断生成物を定 し，各臓器の比活性を示した．

− 125 −

FU の代わりに未損傷のチミンを含む基質では認められなかったことから，損傷特異的な活性であることが示された．

ozone, Methods in Enzymology, 319 , Academic Press,
New York, 2000 .

活性を精製する目的で，細胞粗抽出物を大量に調製し，こ３）Pouget JP, Douki T, Richard MJ, et al., : DNA

れを陽イオンクロマトグラフィーにより分離した．溶出さ

damage induced in cells by gamma and UVA radiation

れた分画の FU，TG，OG 活性を分析した結果，FU 活性

as measured by HPLC/GC-MS and HPLC-EC andは TG および OG 活性が溶出される分画とは明らかに異なcomet assay. Chem. Res. Toxicol., 13 , 541 - 549 , 2000 .

った分画に溶出された．この結果は，精製 NTH 1 および

４）Decarroz C, Wagner JR, Van Lier JE, et al., :OGG 1 が FU に対して活性を示さなかった結果とよく一致

Sensitized photo-oxidation of thymidine by 2 -methyl-する．今後，この活性を SDS-PAGE で単一バンドになる

1 , 4 -naphthoquinone. Characterization of stable

まで精製し，得られた酵素の性状を詳細に解析していく予

photoproduct, Int. J. Radiat. Biol., 50 , 491 - 505 , 1986 .

定である．

５）Saito I, Takayama M, Kawanishi S, : Photoactivatable４

総DNA-cleaving amino acids: highly sequence-selective括

DNA photocleavage by novel L-lysine derivatives., J.

UVB および UVA は，それぞれ固有の遺伝子損傷を誘発し，前者ではピリミジン二量体（CPD，6 - 4 PP）が重要

Am. Chem. Soc., 117 , 5590 - 5591 , 1995 .
６）Memisoglu A, Samson L, : Base excision repair inであるのに対し，後者では細胞内に存在する種々の色素

yeast and mammals, Mutat. Res., 451 , 39 - 51 , 2000 .

が関与した酸化損傷が重要である．本研究では，UVA に７）Krokan HE, Nilsen, H, Skorpen F, : Base excisionより生じる酸化的塩基損傷の修復に関わる哺乳類修復酵

repair of DNA in mammalian cells, FEBS Lett., 476 , 73 -素 NTH 1 および OGG 1 の損傷特異性を検討した．NTH 1

77 , 2000 .

および OGG 1 は，それぞれピリミジン損傷およびプリン８）Klungland A, Rosewell I, Hollenbach S, et al., :損傷特異的修復酵素と考えられていた．実際，TG およ

Accumulation of premutagenic DNA lesions in mice

び OG は，それぞれ NTH 1 および OGG 1 のみに認識さ

defective in removal of oxidative base damage, Proc.

れ，両酵素の固有な基質であった．しかし，他の損傷（UR，Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 , 13300 - 13305 , 1999 .

DHT，HOU，FAPY）は，対合塩基に依存した形で両酵

９）M i n o w a O , A r a i T , H i r a n o M , e t a l . , : M m h /素の基質となった．活性の対合塩基依存性に関する生物学

Ogg 1 gene inactivation results in accumulation of的意味づけは今後の課題であるが，この結果は，酸化的塩

8 -hydroxyguanine in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,

基損傷修復における NTH 1 と OGG 1 の修復バックアップ

97 , 4156 - 4161 , 2000 .

システム形成を支持するものと考えられる．今後見つかっ

10）Cunningham RP, Weiss B, : Endonuclease III (nth)てくると予想される他の哺乳類酵素についても同様な検討

mutants of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci.

を行い，細胞内における塩基除去修復バックアップシステ

U.S.A., 82 , 474 - 478 , 1985 .

ムの全貌を明らかにしていく必要がある．また，これま11）Sarker AH, Ikeda S, Nakano H, et al., : Cloning andでに真核生物では明らかにされていなかった FU 修復活性

characterization of a mouse homologue (mNthl 1 ) of

がマウスの臓器に存在し，精製酵素を用いた検討およびEscherichia coli endonuclease III, J. Mol. Biol., 282 , 761 -クロマトグラフィーの溶出挙動から，この活性は NTH 1，

774 , 1998 .

OGG 1，MPG のいずれでもないことが示された．今後，

12）M a s a o k a A , T e r a t o H , K o b a y a s h i M , e t a l . , :この新規酵素をさらに精製し，UVA ならびに種々の環境

Enzymatic repair of 5 -formyluracil. I. Excision

因子に対する遺伝子防御における役割を明らかにしていくof 5 -formyluracil site-specifically incorporated必要がある．

into oligonucleotide substrates by AlkA protein(Escherichia coli 3 -methyladenine DNA glycosylase II),

本研究を遂行するあたりご援助を賜りましたコスメトロ
ジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます．

J. Biol. Chem., 274 , 25136 - 25143 , 1999 .
13）Terato H, Masaoka A, Kobayashi M., et al., :Enzymatic repair of 5 -formyluracil. II. Mismatch（引用文献）

formation between 5 -formyluracil and guanine during

１）Friedberg EC, Walker GC, Siede W, : DNA repair

DNA replication and its recognition by two proteinsand mutagenesis, ASM Press, New York, 1995 .

involved in base excision repair (AlkA) and mismatch２）Lester P, Helmut S, : Singlet oxygen, UVA, andrepair (MutS), J. Biol. Chem., 274 , 25144 - 25150 , 1999 .

− 126 −

太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果
放射線医学総合研究所

古

澤

佳

也、青

木

瑞

穂

An outbreak of skin cancer may be caused by exposure of ultraviolet light in the sunlight through induction of apoptosis on
skin cells.  Shielding the skin from the sunlight, especially from the UV-B light by use of sunscreen is thought to be importantto escape the harmfulness.   However, action spectrum for the induction of apoptosis by the ultraviolet light is not wellknown.  To determine the action spectrum of apoptosis upon mammalian cells, L5178Y cells were used, and the wavelength
dependence of the apoptosis exposed to ultraviolet light was investigated using monochromatic lights from the Okazaki
Large Spectrograph (OLS) at the National Institute of Basic Biology (INBB), Okazaki, quasi monochromatic light from filtrated
lights by mercury lamps or fluorescent lamps, and from natural sunlight.  Cells were exposed to ultraviolet light at different
wavelengths in the UV-A, -B, and -C regions, and the frequencies of apoptotic cells in total cells were determined withchromatin condensation after fluorescent staining following adequate post-incubation after UV exposure.  The light-exposurelevel used to induce apoptosis in 10% of the cells were 24 J/m2, 182 J/m2, and 141 kJ/m2 at 280, 300, and 320 nm, respectively.  
The measured action spectrum for apoptosis induction showed a slightly steeper curve to that for the minimum erythemadose (MED).   The peak of the effective action spectrum for induction of apoptosis to sunlight i.e. the products of spectra
for apoptosis induction or MED and solar-light intensity on the ground, was found at 303 nm, which was also took place inshorter wavelengths region than that for MED.  The difference between the effective action spectrum may be caused by theshielding of the skin keratinocytes locating just above the target cells.   

１．緒細胞の増殖が起こる。そして前癌細胞でその部位が置換さ言れることによって、この間違った遺伝情報を持つ細胞が増1980 年代に南極オゾンホールが発見されて全地球的規加するとの考えがあり、太陽紫外線によるアポトーシスの模でのオゾン層の減少が指摘され、モントリオール議定書

誘発が重要な意味を持つ。一方、紫外線による生体影響のをはじめとしてオゾン層の保護政策が始まった。太陽光に指標には、皮膚紅斑の発生を指標にした最小紅斑線量が含まれる紫外線の地表での強度分布はオゾン層に敏感に反用いられることが多いが、アポトーシスとの関連や UV‒B

応して変化し、強い生物影響を与える UV‒B 領域の紫外領域でのアポトーシス誘発の波長依存性や紫外線量依存性

線はその強度が数パーセント変わることで生物効果は何倍

については判っていない。こういったことから紫外線によも異なる事が示唆されている。このためオゾン層の減少にる発癌の危険性や、これを回避するために用いられるサンよる地上での紫外線の増加が懸念され、生態系にもたらさスクリーン剤の効果を評価するために、アポトーシス誘発れる影響も危惧される。これらの影響を受けて 90 年代のの波長依存性や紫外線量依存性を明らかにする事を目的と初期から紫外線に対する興味が高まり、一般公衆にも日焼して研究を行った。

け防止の目的でサンスクリーン剤の使用が一気に普及した。

２．実

しかし国外では発癌など重篤な疾患に敏感であるのに対し、日本での一般の関心は「美白」ブームのようにまだ「美容」

２. １

験

光源

に中心が置かれている。しかし紫外線の増加が確実になる

実験室で紫外線照射実験を行うために、本助成金によっと興味の関心は発癌などにも移って行くものと考えられる。

て UV‒A、‒B、‒C で照射するための照射装置を作成した。

太陽紫外線による癌の発生の機構には、DNA に損傷がこの装置には参照光源として UV‒C 光を照射するための起こりその結果間違った遺伝情報を持つ前癌細胞が増加す

殺菌灯、さらに UV‒B 光を得るために健康線用蛍光ラン

ることが第一である。紫外線誘発アポトーシスによって前プ（FL‒ 20 S･E、
東芝）および UV‒A 光源を内蔵させた（写

癌細胞周辺の正常細胞が消失し、その空間を埋めるために

真１）。UV‒A 領域ではアポトーシスの感受性が低いためSunscreen and Induction of Apoptosis
upon Mammalian cells Induced by
Natural Sunlight

太陽光と同等以上の強度を持つ光源が必要となる。そのため光源としてブラックライト蛍光ランプでは不十分である
ので、400 ワットのブラックライト水銀ランプ（H 400 BL、

Yoshiya Furusawa, Mizuho Aoki東芝）から得られる準単色光を用いて照射を行うための専

National Institute of Radiological Sciences

用照射光学系を作成した（写真２）。微量の UV‒C、‒B 光＊の混入によって生物効果は大きく影響を受けるので、ラン＊プの外球にコートされている紫外線透過青紫フィルター− 127 −

の他に UV‒A 光のみを透過させる紫外線透過フィルターった準連続光源を用いた場合は短波長成分の光が生物効果（U‒ 340、保谷）および短波長カットフィルター（UV‒ 34、の大部分に寄与すると考えられ、分光学的実験とはならな

保谷）を用い不要輻射を出来る限り減少させた。さらに試

いため定性的な参考データを得る場合のみに用いた。UV‒

料位置での光強度を増加させるため２枚の石英レンズ（シB 領域光による波長依存性を明らかにする目的の実験は基グマ光機）を用いて集光を行っている。この光源には可視礎生物学研究所大型スペクトログラフ装置（OLS）を利用

光はほとんど含まれないものの赤外線領域の熱輻射は強い

し純度の高い単色光を得て実験を行った。

ので熱吸収ガラスフィルターを、さらに試料の直前には水フィルターを設置して試料の温度上昇を防ぐ工夫を行った。

２. ２

照射法と線量測定

この装置を用いることで 365 nm の水銀輝線光を 200 W/

OLS では 30 kW の水銀ショートアークランプから取り

m 2 弱の強度で得ることが出来た。これは太陽光に含まれ出された光をダブルブレーズグレーティング分光器で分光る UV‒A 光の 2 倍以上の強度に相当する。UV‒B 光源はし、焦点面に届いた水平光を反射面を 45°に傾けた反射鏡

健康線用ランプを用いた。しかしその輻射波長が UV‒C

で反射させ、６mmφ のカップに入れたサンプル上方よりにも及ぶため、約 305 nm にカットオフを持ち単波長紫外落射光として照射した（写真３）。このとき分光器の入射線を透過しないプラスチックフィルム（100 µm；ダイアフォ

スリットは開口幅を 50 mm にセットして用いた。325 nm

イル、三菱）を管球に巻いて短波長光を除く事が出来た。

より長波長の UV‒A 領域の照射では、光強度が十分で

ただし、アポトーシス誘発の効率が UV‒A と ‒C の中間にはないので 50 × 50 mm（at 325 nm）あるいは 100 mmφ

位置する UV‒B 光領域（280 〜 320 nm）に対しては、そ（> 345 nm）の石英レンズを用いて集光した。線 測定は６の生物効果の波長依存性が急峻１〜４） であるので、こうい× ６mm のシリコンフォトダイオード（S 1332 ‒ 66 BQ；

写真１ 試作した UV—A、—B、—C 照射装置
上部の突出部分に 400 W のブラックライト水銀灯が装置され、庫内上段に懸垂した光学系で集光され、中段のラボジ
ャッキ上の試料に照射される。中段は殺菌灯を設置したとこ
ろで、下段のラボジャッキ上の試料を照射する。中段と下段の棚板を入れ替えることで、UV—B 照射用ブラックライト蛍光ランプが中段に配置できる。最下段には各ランプのスイッ
チとランプの安定器が内蔵されている。

写真２ 試作した照射装置の UV—A 用集光光学系
最上段に配置した赤外線フィルターを透過した光は、石英
レンズ（写真ではレンズは見えない）で平行光となり、もう一枚の石英レンズで集光される。長時間の照射となる場合はこのレンズ間の空隙に水フィルターを挿入してさらに赤外線を吸収させることが出来る。この UV—A 光はさらに短波長吸収フィルター（四角）を通過した後、サンプルに照射される。強度は約 200 W/m 2 程度。

− 128 −

太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果

浜松フォトニクス）を用い、波長毎の量子収率あるいは感するため、本助成金で製作した冷却機能付きの専用照射容

度定数は個々のダイオードの浜松フォトニクスによる校正器を用いた。この容器は試料の温度上昇を防ぐために底面データーを基にして、100 Ω の抵抗負荷に対する誘発電圧

から冷却出来て照射時間毎に光を遮断できる蓋を持つ容器を測定（Model DMM 2000； Keithray）して行った。

で、４× ２列、計８個のサンプルが、２個ずつ順次ある

UV‒A 実験では上記光源の集光部分に 35 mmφ プラス

いは同時に照射出来る（写真４）。サンスクリーン剤の効

チックシャーレを用いた。UV‒B、‒C についても同様の果を調べるためには、蓋とするサンプル毎の石英板に薬剤方法で照射を行った。線量率は光源からの距離を変化させ、を塗布して照射する。細胞を入れた 35 mmφ のプラスチ

線量測定はそれぞれの波長域で校正されている紫外線計

ックディッシュは容器内の個々のホルダーに入れ、サンプ（UVR‒ ２＋ UD‒ 36 /UD‒ 25；トプコン）を用いた。

ル毎に石英板を蓋として被せて雑菌からの細胞の汚染を防

太陽光に対する照射実験では照射中に試料の温度が上昇

いで照射を行う。
太陽光の紫外線量測定のためには、全日射量、UV‒A 紫
外線計、UV‒B 紫外線計及び生物効果荷重型 UV‒B 紫外放射計（MS‒ 802、MS‒ 210 A、MS‒ 212 W、MS‒ 212 D；
英弘精機）を施設の５Ｆ屋上に設置（写真５）し、毎 10
秒毎の太陽光強度データがコンピューターで集計されるシステムとして昼夜連続測定を行っている。この仕様は国立環境研究所地球環境センターの有害紫外線モニタリングネットワークの観測基本的要件に準拠しており、生物荷重型
UV‒B 線量計は筆者らの光学系１）によるものである。

２. ３

細胞実験

細胞はリンパ球系培養細胞（L 5178 Y）を用い、10％牛
胎児血清を含む RPMI‒ 1640 培地中に浮遊させ、５％炭酸
写真３ 大型スペクトログラフ照射時の照射部分
水平ビームとして取り出された単色紫外光は、45°にセットした反射鏡で垂直光に変換され、細菌などの汚染防止を兼ねた短波長吸収フィルターで十分に短波長迷光を取り除いた上で細胞に照射される。サンプル容器は６mmφ のプラス
チックカップ。

写真４

ガスを含む 37℃の湿潤空気中で培養を行った。照射に用いる細胞は遠心分離（1000 rpm、3 min）によって培地を除き、３‒ ６× 106 cells/mL となるよう燐酸緩衝生理食塩
水中に再分散したものを照射試料とした。OLS での実験では、直径６mmφ のイミュノアッセイ用小型プラスチック
カップ（2580；COSTAR）に 0 . 1 mL の細胞浮遊溶液を移太陽光照射のための冷却容器

合計８つのサンプルホルダー（４つだけ見えている）中に 35 mmφ プラスチックシャーレに入れた細胞に石英ガラス（あるいはサンスクリーン剤塗布したもの）を被せ、水平面で太陽光に暴露させる。下部は冷却のための循環水出入り口。時間に従って、上部の蓋をスライドさせて開閉すること
で、４種類の照射量が選べる。

写真５ 研究所屋上に設置した紫外線計測装置
手前から、全日射量計、UV—A 紫外線計、UV—B 紫外線計及び生物効果荷重型 UV—B 紫外放射計（MS—802、MS—
210 A、MS—212 W、MS—212 D；英弘精機）。10 秒毎のデーターがコンピューターシステムで集計される。

− 129 −

してこれを照射試料とした。このカップの上に短波長の迷

ン凝縮の形態を写真７に示す。（上）は非照射の L 5178 Y

光を阻止すると共に雑菌からの細胞の汚染を防ぐ目的で清細胞を Hoechst 33342 で染色後、蛍光顕微鏡観察したもの

浄な短波長カットフィルター（UV‒ 28、UV‒ 30、UV‒ 32、である。核内には網目状のクロマチン構造らしきものが確

UV‒ 34； 保 谷、UV‒ 29、UV‒ 31、UV‒ 33； 東 芝 ） を 被認された。（中）は 280 nm の紫外線を 50 J/m 2 照射後 20せて室温で照射を行った。研究室での照射は OLS での時間培養した細胞像である。アポトーシスに特徴的な核の実験と同様あるいは 35 mm プラスチックディッシュ中に断片化を起こし、凝縮部分で強い蛍光を示す細胞が観察さ

1 . 5 mL の細胞浮遊溶液を入れて行った。太陽光の照射もれた。
（下）は 365 nm の紫外線を 650 kJ/m 2 照射後５時間

35 mmφ のプラスチックディッシュを用いて照射を行った。

培養した細胞像（研究所実験室の結 ）である。280 nm で照射した細胞は 2 mL の RPMI‒ 1640 培地に回収し、５見られたような核の断片化を起こした細胞も観察されたが〜 20 時間培養を行った後、遠心分離（1000 rpm、3 min）
によって回収し、0 . 1 mL の１％グルタルアルデヒド溶液
を加えて冷蔵庫中に放置（4℃、24 hr）して固定し、ヘキ
スト 33342 によって蛍光染色を行ったのち蛍光顕微鏡下で細胞を計数し、観察した全細胞のうちクロマチン凝縮を起こした細胞数を求めてアポトーシスの誘発頻度を求めた。

３．結
３. １

果
アポトーシスの検出

ブラックライト水銀灯から得られる UV‒A 領域の紫外線を L 5178 Y 細胞に照射した後５時間培養し、DNA を抽出後アガロースゲル電気泳動により断片化（DNA ラダー）を検出したものである（写真６）。照射線 を 325 または 650 kJ/m 2（中、右レーン）とした時、アポトーシスに特異的なラダーの形成が見られた。ここで左レーンは陽性対照で UV‒C 光（殺菌灯）を照射したものである。また紫外線照射後フローサイトメトリー法で細胞の DNA 含の変化を調べた（図１）。非照射群では G 1 期、S 期、G 2 /M 期に相当する細胞 DNA 含量に対応したパターンが観察された（左）が、650 kJ/m 2 照射群では照射 5 時間後には
sub‒G 1 に大きなピークが検出された（右）。これは紫外線照射により正常の細胞周期からはずれた細胞がアポトーシ
スの過程に移行し、小さな DNA 分画を持つアポトーシス

写真６ アポトーシスによる
DNA 断片化の電気泳動結果
UV—A 紫 外 線 を L 5178 Y
細胞に照射した後の DNA の断片化像。左から陽性対照（UV—C 照射による 20 時間後の試料）、UV—A で照射線量を 325 または 650 kJ/m 2とし、５時間培養後に DNAを抽出し電気泳動を行ったもの。

小体が形成されたものと考えられる。
これらの結 から 365 nm 付近の紫外線（UV‒A）の照射でアポトーシスが誘発されることが明らかになった。
また positive control でみられるように UV‒C 光でも同様に結 が観察され、波長の異なる紫外線でアポトーシスが誘発されていることが実験室において確認できた。UV‒B に関しては、微量な UV‒C 光の混入によっても UV‒B 光によるアポトーシス
より、その発生頻度が優 である可能性があるので、クロマチン凝縮を指標にして OLS において実験を行った。
UV‒A 及び ‒B 光によるクロマチ

図１

フローサイトメーターによる DNA 含量の変化
非照射細胞（左）では G 1 期、S 期、G 2 ／ M 期に相当する細胞 DNA 含量に対応したパターンが観察され、UV-A を 650 kJ/m 2 照射した細胞（右）では照射５時間
後には G 1 期細胞より DNA 含量の少ない sub—G 1 に大きなピークが検出された。

− 130 −

太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果

写真８ 太陽光によるアポトーシスのクロマチン凝縮
太陽光に約１時間被爆後、５時間培養の細胞像。正常な細胞（上中央と中左）と共に核全体が凝縮して全体に強い蛍光を示す細胞（上方に４つ）とクロマチンが断片化した細胞（下右）などが同時に観察される。

３. ２

波長依存性

図２は L 5178 Y 細胞に各波長の紫外線を照射した際に誘発されるアポトーシスの線量依存性を求めたものである。どの波長でも線量の増加に伴ってアポトーシスの頻度
写真７ アポトーシスによるクロマチン凝縮像
細胞は Hoechst 33342 で蛍光検鏡の直前に染色したもの。上は非照射の正常細胞。中は 280 nm 光によるもので、
20 時間後にクロマチンの断片化（右）が観られる。下は
365 nm 光によるもので、５時間後に細胞核が小さくなって観察（左と中央）され、20 時間後には細胞が消失する。

は増加した。この図では線量を示す軸が対数軸で表してあるように、波長によってその効率は大きく異なり、280と 365 nm では４桁もその効率が異なっていた。図３は本実験による細胞の紫外線照射誘発アポトーシスの感受性とDNA の紫外線吸収５）及び地表での太陽光強度６）を波長ごとにプロットしたものである。ここでの感受性とは 10％の細胞にアポトーシスを誘発する線量の逆数（m 2 /J）でその数は少なく、むしろ細胞全体が収縮して小さくて均一ある。太陽光の強度が大きく変化する UV‒B 領域（280 〜

な強い蛍光を示す単核の細胞像が多数見られた。一方、こ320 nm）
で感受性は長波長になるほど低下し、280 〜 320（〜の細胞を太陽光に約１時間照射後５時間培養した細胞では365）nm では４桁も低下した。これは DNA の紫外線吸収

280 nm で見られたような核の断片化を起こした細胞（写スペクトルとよく一致している。320 nm 以上になると感真８）が多数観察された。さらにこの変化は 280 nm では

受性は波長に依存せずほぼ一定の値を示した。またこの領断片化が観察されるのに 20 時間を要したのに対し、365

域では DNA の吸収スペクトルとアポトーシスの感受性はnm でみられたように５時間程度の培養後に同様の変化が一致しなくなった。

みられた。

アポトーシスの実効スペクトルは入射光量と感受性の積− 131 −

として表されるので、標準的な地表での太陽光強度スペは一致していて、この領域で誘発されるアポトーシスの標と、実験で求めた感受性スペクトルからこれを的は DNA であると考えられる。この事は電離放射線によ求めた（図４）。参考に皮膚紅斑に対する実効スペクトル

るアポトーシス誘発の LET 依存性８）と同様であり、UV‒

は CIE（国際照明委員会）の紅斑スペクトル６、７） を用い

B、‒C 領域でも DNA 上の損傷が原因となってアポトーシて求めたものである。皮膚の最小紅斑の実効スペクトルがスが誘導されていると考えられる。しかし 320 nm 以上で310 nm 辺りにピークを持つのに対し、アポトーシスのピ

両者は異なり、この領域での標的は DNA ではなく、タンークは 303 nm にみられ、皮膚の紅斑スペクトルよりも短

パクではないかと考えられる。

クトル

６）

波長側にシフトしていた。以上の結果を表１にまとめた。

４．考

このように波長によってアポトーシスの誘発が異なることはすでに報告９） されているが、蛍光ランプなどの準単察

色光源を用いているため明確な波長依存性は示されていな

クロマチン凝縮（写真７）、DNA ラダーの形成（写真６）、い。ここでは波長域によって異なるアポトーシスのタイプ

フローサイトメトリー（図１）による sub‒G 1 ピークの形
成などのアポトーシスに特徴的な変化が観察され、UV‒
A 〜 UV‒C 領域の紫外線によって L 5178 Y 細胞にアポトーシスが誘発されることが確認できた。しかし波長ごとにその変化は異なり、短波長型と長波長型に分けることが出来る（表１）。短波長の 260 〜 305 nm 単色光または UV‒C及び UV‒B ではアポトーシスが誘発されるのに照射後 20時間以上を要するのに対して、313 nm 以上の UV‒B 領域
から UV‒A 領域の単色光、あるいは UV‒A の準単色光では５時間以内にアポトーシスが誘発された。またクロマチ
ン凝縮の形態も短波長と長波長領域では異なり、短波長領域では断片化した小さな核が細胞内に多数観察された。これは X 線（電離放射線）照射によって誘発されるアポト
ーシスの場合と同じであった。長波長領域での像は細胞全体が収縮するタイプのものが大部分を占め、小さな断片化した核を持った細胞像は少なかった。
このちがいは短波長と長波長でアポトーシスを誘発する
標的が異なる為であると考えられる。アポトーシス誘発と DNA の紫外線吸収（図３）は 260 〜 320 nm の範囲でアポトーシスの線量—効果関係
図中に示す波長で照射した場合のアポトーシスの誘発頻度。
観察全細胞のうちクロマチン凝縮を起こした細胞の割合を表す。305 nm 以下は 20 時間の培養後、315 nm 以上は５時間
培養後の結果。横軸は対数であることに注意。

図３

アポトーシス誘発の感受性の波長依存性
感受性は 10％の細胞にアポトーシスを誘発する線量の逆数（m 2 /J）。波長によってその効率は大きく異なり、280と 365 nm では４桁もその効率が異なる。参考に DNA 吸収スペクトル（Setlow 1974）と地表での太陽光強度（CIE
1972）をプロットした。

図２

図４ アポトーシスの太陽光に対する実効スペクトル
入射光量と感受性の積として表される実効スペクトルを、
アポトーシスと最小紅斑（MED）形成について求めた。ここで太陽光と MED のスペクトルは CIE（1972）の値を用いた。

− 132 −

太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果

表１
紫外線
UV-C

太陽光

紫外線誘発アポトーシスと波長依存性

波長（nm） 10％誘発線量（J/m 2）
254

誘発時間（hr） 形態

-		

核の断片化

280

24			

300

180

305

750

313

52 , 000320

140 , 000365

180 , 000

連続

タイプ
短波長型

> 20

1 hr

<5

細胞の凝縮

長波長型

<5

混在

相互作用

を３つに分けられている。Ｘ線および紫外線のどの波長

題となっているアポトーシスを研究の系に加えて今回の研（UV‒A、‒B、‒C 領域）によっても照射後４時間以降に引究に発展させ、ここで発癌と関連があるかも知れないと考き起こされるアポトーシスを遅延型、UV‒B および UV‒C

えられているアポトーシス誘発の UV‒B 領域での波長依によって照射後 0 . 5 〜４時間以内に引き起こされる中間型、存性を明らかにさせた 11）が、実効スペクトルは紅斑からUV‒A によって 0 . 5 時間以内に引き起こされる即時型アポ推定される予想よりも短波長側にあり、これは皮膚の角質

トーシスである。本実験で用いた UV‒A 領域の光は強度層による吸収などが考えられ、培養細胞系で波長依存性をが弱いため照射に数 10 分から数時間を要するためにこの求めることの限定条件となっている。

即時型アポトーシスを観察することは出来なかったが、本この研究にさらに引き続き、皮膚上皮系の細胞より適当

実験の結果と類似しており、波長によりアポトーシス誘発なものを検索し実際の生体系に近い実験系を確立する必要の標的は異なることの裏付けとなっている。また単色光をがあり、太陽光紫外線の変動とアポトーシスの発生効率に用いた本研究により、長波長型と短波長型の境界が 305 〜

ついて経時的に調査を行う予定であり、さらにサンスクリ

313 nm の間にあり、連続光である太陽光では誘発時間とーン剤による遮蔽の程度との関連として調べる。これには形態の違い（写真８）から短波長型と長波長型の間に相互

地域差や季節変動１、13） が含まれるので、紫外線の強い時作用がある可能性が示唆できた（表１）。

期や弱い時期あるいは時間帯を考慮して行う。さらにはヌ

５．総ードマウス等実験動物を用いた系の利用の可能性を考えて括いるが、皮膚構造の違いもありヒトのリスク評価に直接的

オゾンホールの発見などにより紫外線の生態系への影響には結びつかないであろう。

の懸念が浸透する以前より、太陽紫外線の影響について分研究目的の項でも述べたように、サンスクリーン剤の効

光学的手法を用いて研究してきた。従来の物理的帯域型線用は一般にはまだ「美容」に中心が置かれている。しかし、量計はその結果は即時に知れるものの、分光感度分布は生すでにオーストラリアの例にもあるように、将来はサンス

物の急峻な感受性に追従出来ず生物影響を正確に評価

10）

クリーン利用に関する興味の内に発癌の防止に対する考慮

できないことと、生物線量計は分光感度分布が優れているが大きな意味を占めてくると考えられる。オーストラリア

ものの取り扱い性と即時性に欠け、さらに対象とする生物での例では南極オゾンホール拡大の心配が大きく作用して、系とエンドポイントによって分光感度分布が異るため、ヒ

政府レベルで特に子供への紫外線被曝の低減が法規化されトの紅斑及び DNA の吸収を基準とした感度分布を持つ狭たが、近い将来において太陽紫外線の被曝による発癌の危

帯域紫外線線量計を開発・評価

１）

し、この線量計の生産険性が科学的にさらによく理解されるようになるであろう。

モデルは気象庁での紫外線測定に用いられている。さらにアポトーシスによって前癌細胞が大量に蓄積する可能性が取り扱い性の良い紅斑誘発のスペクトルを持った生物線量示唆されれば、現在の紅斑スペクトルと紫外線被曝量を基し、特にオゾン層破壊に社会的関心の高い準とした紫外線防護の考えとは異なり、社会医学的見地か

ドイツで実用化されている。これらの線量測定計を、季節・らも発癌防止を視程に入れたサンスクリーン剤の開発など

緯度の異なる地域で太陽光の地表における分光測定結果とが望まれる。

計を開発

３、４）

直接比較する為に野外実験を行い、太陽紫外線の分光強度
分布の変動に対して良く追従すること等を示して３、11） 来（参考文献）た。しかしこれらの生物線量計は DNA の損傷や紅斑の評

１）Furusawa Y, Suzuki K, and Sasaki M: Biological and価には適当であるかも知れないが、発癌のリスクの評価がphysical dosimeters for monitoring solar UV-B light. J

出来るかどうかはさらに研究を要する。そこで、近年の話

Rbdiat Res 31 , 189 - 206 ( 1990 )− 133 −

２）F u r u s a w a Y , F u k u t s u K , a n d Q u i n t e r n L E :Evaluation of a biological solar ultraviolet dosimeter

線量の変化のスペクトル観測による評価 -. 気象庁時報 ,
43 , 213 - 373 , 1991 .

"Biofilm": An action spectrum in the longer ultraviolet８）A o k i M , F u r u s a w a Y , a n d Y a m a d a T : L E T

wavelengths region. Photomed Photobiol 15 , 141 - 144 ,Dependency of heavy-ion induced apoptosis in V 79

( 1993 )cells. J Radiat Res 41 , 163 - 175 ( 2000 ).

３）M u n a k a t a N , M o r o h o s h i F , H i e d a K , e t a l . :９）Godar D E: Light and death: photons and apoptosis.,

Experimental correspondence between spore

J. Investig Dermatol. Symp. Proc., 4 : 17 - 23 , ( 1999 ).

dosimetry and spectral photometory of solar ultraviolet10）F u r u s a w a Y , T a k e s h i t a S , S a k a t a T , e t a l . :radiation. Photochem Photobiol 63 , 74 - 78 ( 1996 )Comparative measurement of performances of six４）Quintern L E, Furusawa Y, Fukutsu K, et al. :Charachterization and application of UV detector spore

commercially available ultraviolet-A radiometers.
Photomed Photobiol 14 , 101 - 104 ( 1992 )films: The sensitivity curve of a new detector system

11）Furusawa Y, Quintern L E, Holtschmidt H, et al.:provides good similarity to the action spectrum for

Determination of erythema-effective solar radiation

UV-induced erythema in human skin. J Photochem

in Japan and Germany with a spore monolayer film

Photobiol; B Biol 37 , 158 - 166 ( 1997 )

optimized for the detection of UVB and UVA.−Results５）Setlow R: The wavelengths in sunlight effective in
producing skin cancer: a theoretical analysis., Proc Natl
Acad Sci USA, 71 , 3363 - 3366 , ( 1974 ).

of a field campaign. Appl Microbiol Biotechnol 50 , 597 603 ( 1998 )12）Aoki M, Furusawa Y, and Soga F: Wavelength６）CIE: Recommendations for the integrated irradiancedependency of apoptosis induction upon mammalian

and the spectaldistribution of simulated solar radiation

cells by monochromatic ultraviolet light. Photomed

for testing purposes., In: Publication CIE No. 20 (TC- 2 .

Photobiol 22 , 25 - 30 ( 2000 )2 )., pp. 1 - 54 , International Commission on Illunination,
Paris, ( 1972 ).

13）Sasaki M, Takeshita S, Furusawa Y, et al.: Groundbased observation of biologically active solar７）伊藤友之、上野丈夫、梶原良一、他 : 地上到達紫外線の監視技術の開発 - オゾン層変化に伴う地上到達紫外

ultraviolet-B irradiance at 35 ºN latitude in Japan. J
Geophys Geomag 43 , 473 - 485 ( 1993 )− 134 −

化粧における非対称性
神戸松蔭女子学院大学

藤本

文学部心理学科浩一

The purpose of this study is to examine the impression of asymmetrical makeup faces compared to faces without
makeup and normal makeup faces.  
  200 female students aged from 19 to 20 years at women's university in Kobe participated in this experiment.  8 facephotographs ( 2 person(A,B) × 4 conditions (non-makeup, normal makeup, two kinds of asymmetric makeup)) were
presented, and subjects rated for each one of them 21scales. The results indicated that asymmetrical makeup was
looked rather eccentric ("preference to novelty", "different from others") while the face without makeup was looked morefriendly and the normal makeup face was looked more attractive. The results also showed that one of the asymmetricalmakeup face was looked more attractive, while another more eccentric.
  It is found from these results that the effect of asymmetric makeup depends both on the person's face itself and thetype of asymmetric makeup.

１
１. １

緒

気分の覚醒、不安の低減、自信の増大などの効用がある（大言

坊郁夫（高木修監修 1996））。本論では種々の個人内要因

シンメトリーと非対称化粧に対する印象評定との関連を検討することをシンメトリーは安定した形であり情報処理しやすいが、目的の１つとした。

複雑な美的判断において必ずしも最優先されるとは限らな

非対称化粧は外見上人体が左右対称であるというリアリい。一般大学生には対称性などの規則性が好印象を与える

ズムを無視し、日常的でないことから、人々にとって特別（藤本 1984）が、美術大学生は一般大生に比べてより非具な日のためという象徴的な意味を持つと考えられる。

象的で非対称的なものを好んで製作した（藤本 1986、藤本・石田（デズモンド・モリス、石田 1999）は「鏡」をキ

仲谷 1987）。被服の分野では左右の袖の色が互いに異なるーワードにして化粧を考察した。自己のイメージを見つめセーターや、片袖を着脱できる衣服が見られる。もっとも、る「一人称の鏡」、親しい間柄の人の反応を見て自分を振左右非対称の化粧を顔に施すことに人々は慎重であり、今り返る「二人称の鏡」、そして他人にどう見られているか

後このような化粧が採用されるかどうか未知数である。

を気にする「三人称の鏡」という３種類から化粧を論じているが、本論実験Ⅲではその言葉を用いて、非対称化粧に

１. ２

化粧の歴史とアシンメトリー

ついて、自分自身・親しい相手・そして一般他者という 3

アイラインやアイシャドーがはじまった紀元前 530 年頃

種類の眼差しとの関連で非対称化粧を論じる。

以来、化粧は左右対称であり、顔に対する左右非対称の装飾としては、化粧の歴史の中で 17 世紀に流行したパッチ（美斑）が見出される程度で（青木英夫 1979）、顔の化粧

１. ４

本論の目的

本論では３つの調査研究により、非対称化粧の特徴を考察する。まず非対称化粧が他者にどのように評価されるかとしての非対称化粧は見られない。
非対称化粧はこのように歴史の中になく、また、自然界を調べ、素顔や普通化粧顔と比較した非対称化粧顔の印象に起源を持たない。しかし様々な試みが行われつつある新の基礎的データを収集する。次に自己意識や流行を追う心しい世紀に、突如現れないとも限らないのである。

理などの個人内要因と非対称化粧に対する態度との関連を検討する。最後に女性被験者に実際に化粧を行わせて対人

１. ３

化粧の意味と効用場面の体験報告を求めて、非対称化粧の満足度や社会的な化粧には変身や自分の姿の管理・演出といった動機があり、意味づけを問う。

２

Asymmetry in makeup face
Koichi Fujimoto
Department of Psychology, Kobe Shoin
Womenʼ
s University

実

験

Ⅰ

（本実験の詳細は藤本「非対称化粧の印象評定」コスメト
ロジー研究振興財団研究業績中間報告集第９号 Pp 86 - 94
を参照されたい）− 136 −

化粧における非対称性

２. １

目

的

シャドーを施し、左目についてはその上下を逆にしたもの

非対称化粧を施した女性の顔写真の印象を調べた。

（非対称化粧Ｂ２）である。人物を２名にすることで特定人物の影響を少しでも相対化しようと試みた。

２. ２

方

２. ２. １

法
被験者

２. ２. ３神戸の女子大学１、２回生 200 名。年齢平均値 18 歳 11ヶ月。
２. ２. ２

評定尺度

人格的特徴・魅力・知性などを表す２１の項目について４件法で評定させた。

材料

２. ２. ４

２名の人物（Ａ、Ｂ）× ４種類の化粧条件（素顔、化手続き

教材提示装置を用いて授業中に集団で実施した。

粧顔、非対称化粧１、非対称化粧２）の計８画像を用いた。
非対称化粧とは図１のように、人物Ａについては普通程度

２. ３

結

果

の化粧に加えて淡青色のアイシャドーを右目の上だけ少し２. ３. １濃くしたもの（非対称化粧Ａ１）と、同じく普通化粧を施

素顔、化粧顔、２種類の非対称化粧顔、の４種類の化粧した上で左頬骨に小さな三日月型のラメシールを貼ったも条件を通じて 21 尺度の評定値を主因子分析し、バリマッの（非対称化粧Ａ２）である。また、人物Ｂでは右目尻にクス回転を行って固有値が１以上の条件で因子を抽出した。

銀粉ラメを散らしたもの（非対称化粧Ｂ１）と、右目は目得られた３因子を次の通り命名した：の上にピンク系のアイシャドーと目の下にブルー系のアイ

人物Ａに関する因子分析

第１因子（人柄）…友好的・調和的・若々しい・安心した、等
第２因子（女性的成熟度）…セ
クシーな、華やかな、大人っぽい、魅力的、他
第３因子（知的緊張感）…仕事
できそう、知的な、
緊張感のある、等
２. ３. ２

人物Ａの化粧条件別・尺度別平均評定値
人物Ａの平均評定値をほぼ因子
図1

別の順序に従って図 2 に示した。

非対称化粧の例（他と少し違った）、（新しいもの好き）、（二面性のある）、などのいわば「奇抜さ」がその特徴といえる。この人物においては若さや魅力を表すためには普通化粧で十分であり、非対称化粧によって特に好意的な印象が形成されることはなかったといえよう。顔と化粧との相性、および、ここでの非対

図２

称化粧が奇抜すぎたなどの理由がＡさんの化粧印象

考えられる。
２. ３. ３

人物Ｂに関する因子

分析
人物Ａと同様に２１尺度について主因子分析を行いバリマックス
回転したところ、２因子が抽出され、次の通り命名した：
図３

第１因子（女性的成熟度）…セ

Ｂさんの化粧印象

− 137 −

３. ２

クシー、華やか、遊び好き、トレンディ、大人っぽい
第２因子（人柄）…調和的、友好的、安心した、若々し

方

３. ２. １

法
被験者

実験Ⅰとは異なる１回生女子大生 173 名。

い等
２つの因子の分かれ方は人物Ａとほぼ同じ結果であった３. ２. ２が、第３因子は固有値が１以下になるので省略した。

調査項目等①非対称化粧受容度質問紙（事前テスト）…10 項目から
２. ３. ４

人物Ｂの化粧条件別尺度別平均評定値

成る質問紙。

人物Ｂの尺度別平均評定値を人物Ａと同じ尺度順序で図１〜５の項目については「非対称メイクを次の場面で３に示した。片側の目尻にラメを散らした画像について、やってみたいですか」と教示し、４（とてもやってみたより多く（セクシー）、（華やか）、（大人っぽい）と評定さい）から１までの４段階で回答させた。項目は次の通りれた。また、（自信のある）印象を与え、この人物Ｂではである：１. 買い物や通学などの日常生活で、２. 夜の飲非対称化粧が自分の魅力上昇と自己肯定感の形成を印象づ

み会で、３. 異性が集まる合コンで、４. コンサートに出ける上で有効に働いていた。もう１つの非対称化粧である

かける時、５. 部屋の中で 1 人で試しに。

青 ･ 赤系の上下アイシャドー左右逆の画像は、（他の人と６〜９では「このメイクをもしも誰か他の人がやって少し違った）
・（新しいもの好き）
・（二面性）等のいわゆる「奇いるのを見たら貴方はどう思いますか」と尋ねる４段階抜さ」の尺度で高得点であり、この点は人物Ａの非対称化

評定で、項目は以下の通りであった：６. キャンパスで

粧印象と共通する。

見かけた見知らぬ女子学生、7 . 合コンで集まった友達の
１人、８. スポーツクラブのインストラクター、９. 藤原

２. ４

考

２. ４. １察

紀香のような人気女性タレント。

非対称化粧の印象

第 10 項目は「このメイクを仮に同世代の女性の何％Workmann& Johnson 1991（高木 1996 より）の研究では、化粧度に応じて魅力度や女性性が増し、逆に道徳性が低下することを示したが、非対称化粧の印象評定ではさらにそがしていたら貴方もしますか」と尋ねて、５（５％前後）、
４（20％前後）、３（35％前後）、２（50％前後）、１（70％前後）のうち１つを選ばせた。

の傾向が顕著であった。すなわち、「女性的成熟度」や「奇②私的自己意識、③公的自己意識、④対人不安質問項目…

抜さ」の印象を与え、他方、人柄については否定的評価が押見輝男（1992）から引用した 30 項目からなる私的・見られた。適度なズレは好ましく感じられる場合があるが、公的自己意識と対人不安（人がいると神経質になる、自対称化粧からの隔たりは人々に許容される程度のものにと分から視線をそらす、等）を測定するものを原著通り５

どめておく方がよいのであろう。

段階評定させた⑤流行追求度質問項目…「ブランドものが気になる」等の

２. ４. ２

人物間の非対称化粧の効果の違い

11 項目（４段階評定）

幼な顔（Ａ）ではあまり奇抜な非対称化粧は有効ではな⑥自己重要度項目…実験Ⅰの 21 尺度をすべて用いて、「友

く、逆に成熟顔（Ｂ）では適度に目新しい非対称化粧が魅好的な」などについて「自分がそう見えることがどれく

力や自信を引き上げてくれることが示唆される。

らい重要か」を４段階で評定させた。実験Ⅰでの因子分

３
３. １

目

実

験

析結果を踏まえて全項目を人柄・成熟度・仕事・奇抜さⅡに４分類した。

的⑦化粧品購入額…第 63 問は春から実験実施の夏までの化

非対称化粧をやってみたいか、また、他者がやっているの粧品購入額を１（2000 円まで）から５（３万円以上）まをどう思うかなどを調べる非対称化粧受容度と、個人の自での５段階で回答させた。

己意識・流行を追う心理・自己評価重要度などの諸要因の手続き：実験Ⅰで得られた非対称メイク写真のうち１枚（図間の関係を集団調査により検討する。なお、私的自己意識

１−Ｂ２）をＬＬ教室の教材提示装置を用いて被験者２とは、自分の心の動きや気持ちの変化など内面に関心を持

人１組で見られるように提示し、①非対称化粧受容度のち、自己反省したりするはたらきで、他方、公的自己意識

評定を行わせた。その後②〜⑦について質問紙に回答をとは、他人から見られる自分の行動や容姿に注意を向ける求めた。

ことである。仮説としては、化粧への関心が高い人は私的自己意識よりも公的自己意識が高く、より多く流行が気に

３. ３

結

果

なり、自分は友好的よりも魅力的でありたいと思っている、

３. ３. １などが考えられる。

全 10 項目の評定平均値を示した図４の通り、日常生活− 138 −

非対称化粧受容度

化粧における非対称性

メイクをしていると快く思わない。
４．化粧品購入額が高いと、自分自身がやってみたいと思うし（「自己因子」との相関）、特に異性が集まる合コンで自分がやってみたいと思う。
５．私的自己意識の高い人はこのメイクはインストラク
ターなどがやればいいと思っている。
６．公的自己意識の高い人は、流行が気になるが自分に大事なのは人柄であり奇抜さは重視していない。

３. ４
図４

考

３. ４. １

項目別の受容度平均値

察
自己意識との関連

公的自己意識が高い人は、人に見られる自分を強く意識や合コンではやってみたくないという気持ちが強く、コンするので、化粧一般および非対称化粧に対する関心が高く

サートや夜の飲み会でも自分でこうしたメイクをすることなるといえる。他方、私的自己意識の高い人は、いかに見には否定的であったが、「部屋の中で１人試しに」やってられるかを演出する化粧そのものに対して自我関与が低く、みてもよいとする傾向が少し見られた。また、他者がやっ

非対称化粧などはどこかの誰かがやればいいと他人事に思ているのを見てあまり快く思わないものの、第９項目の「藤っている。

原紀香のような人気女性タレント」ならまずまずの印象
３. ４. ２であった。次にこの 10 項目の主因子分析を行ったところ、別の自分を演出することと一般他者の価値観の二重構造

第１因子として第１〜４項目（日常の買い物で・夜の飲み会で・合コンで・コンサートで、各々の場面で自分自身が日常生活で非対称化粧を自分ではしてみたくないし他人やってみたいかどうか）の因子負荷量が高かったので個人がしているのもよいと思わないにもかかわらず、「部屋で別に得点を合計して「自己因子」得点とし、また、第６〜

１人で試しに」なら興味があるという結果が見られた。こ９項目（キャンパスの他学生・合コンでの友達・インストのことから、非対称化粧はおかしい、変だといういわゆるラクター・女優、の各々がやっているのを見てどう思うか）「三人称の鏡」すなわち客観的 ･ 世間的な確固たる価値基を第２因子として「他者因子」としてまとめ、次に述べる

準が被験者の中に存在し、同時に他者の批判的な眼差しを相関の算出に利用した。

逃れたところで密かに変身してみたい願望があるといえる。
三人称の一般他者に承認される「健全な」自分でいたいと

３. ３. ２

自己意識、対人不安、自己重要度その他の諸いう気持ちと、冒険して少し妖しい自己を演出したいという願望の狭間に非対称化粧が位置づけられよう。

要因と非対称メイク受容度との関係

女性的成熟度や奇抜さが自分にとって大事だと思う人や、諸要因間の相関係数を求めた。なお、⑤の流行追求度については、11 項目を主因子分析して第１因子の負荷量が流行が気になる人が、他者が非対称化粧をしていると快く高かった４つの項目（同世代の〜服や小物が気になる、〜

思わないという結果も、上記の二重構造から考察できる。

新商品が気になる、ブランドものが気になる、流行もの〜

自分だけが目新しい・魅力的・流行の先取りをしているとが気になる）の値を平均して個人得点とした。有意差があ

一般他者から見られるためには、その一般他者がありきたった相関係数に基づいておもな結果を以下に文章化した：りで穏当であり特別の自分と差別化されなければいけない。

流行が気になる人は、採用度「同世代の何％がし主として三人称の一般他者との関係について述べたが、次ていたら貴方もしますか」と関係し、このメイクに比のモニター実験報告では二人称の親しい眼差しが重要とな

較的積極的であった。また、コンサートに出掛ける時る。

１.

などにこのメイクをしてもいいと思うものの、キャン

４

パスの見知らぬ女子学生がしていると快く思わない。
２．自分にとって成熟度（魅力的、洗練された等）を重

４. １

目

実

験

Ⅲ

的

視する人は、他学生や合コンで友達が非対称メイクを非対称メイクを施した若い女性が知人や他人の中で数時していると好ましく思わない。また、成熟度を重視し間過ごし、その結果どのような感想を持つかを記録して、ない人ほどこのメイクは他者がやったらいいと思って他者からの眼差しの影響の受け取り方や非対称メイクに関いる（「他者因子」との相関）。

する自己意識の変化を調べる。

３．同様に、奇抜さを重視する人は合コンで友達がこの− 139 −

４. ２

方

法

て０（とても不満）でスタートしたが、「友達の反響がよ被験者かったので落ち着き」３になった。しかしトイレの鏡に写

４. ２. １

共学大学に通学する１回生の女子学生４名。

った自分を見て「誰かになぐられたようだ」と思い、落ち込んで１に下降した。友人がそんなにわからないと言っ４. ２. ２

手続きたので４に上がったが、下を向いた時にアイシャドーがわ

７月の授業期間中に、朝 10 時頃から学内の一室で女性かると言われ少しショックを受ける。通りすがりの人に目

メイク係りにより被験者は順次メイクを施された後に、10が合ってヘンな顔をされたので、「自分のことではなかっ

時 40 分からの授業に出席したり食堂で食事をしたり友人たかも知れないが」気になる。その後３→２→３と推移し、と語らう等して通常の大学生活を過ごし、質問紙や記録紙

友達と普通にしゃべりメイクを忘れてしまうくらいで５にに回答した。

上がるが、知人から下のブルーシャドーがなぐられたように見えると言われショックを受けて終了。

４. ２. ３

調査項目等（カズヨ）モニターを依頼した時にもっとも積極的だっ実験Ⅱの①から⑦までと同じものに、さらに２種類の調たが、メイク前から緊張し（2：やや不満）、スタート直後

査を加えた。

エレベータの中で男子学生がずっと目を見てきて恥ずかし①非対称化粧受容度（事前テスト−メイク前に実施した）、

くなり（1）、友達に「そんなにわからない」と言われてよ②私的自己意識、③公的自己意識、④対人不安、⑤流行追うやく安心した（3）。大学構内の生協で買い物した折りに求度、⑥自己重要度項目、⑦化粧品購入額、⑧モニター記はずっと伏し目がち（1）だったが、友達が普通の反応だ

録票．
．．時刻・状況・心に浮かんだ考え・満足度（５段階ったので恥ずかしくなくなる（4）。しかしある教員に人相評定）の４列 × ５行からなる B 5 用紙の記録票を携帯さを見てもらうもののメイクについてのコメントがなく、寂せて、モニター実施中の少なくとも 30 分以内毎に、またしい思いをする（2）。その後も大勢の中で視線を感じて恥は場面・状況が変わる度に各欄に記入を求めた。記入例とずかしくなる（2）ことと知り合いの反応が普通なので安して、12：35・モニター３名と食堂で談笑中・隣の席の視心する（4）こととが交代して現れる。最後は図書室に行線を感じて〜・３（満足度）、などと用紙の冒頭に例示した。

く時にエレベータや廊下を平気で歩けて「見るなら見ろ」⑨非対称メイク受容度質問紙（事後テスト）…①と同じもと開き直って満足度４で終了した。

の（実験Ⅱ参照）を実験終了後のメイクを落とす直前に行（ユリ）実施前にもっとも難色を示していたが、始まるわせた。

につれて普段あまりメイクをしたことがなかったから「少しおもしろい」という気持ちも湧いた（3）。友達に「あま４. ３

結

４. ３. １

果りわからない」と言われてホッとしたり（4）、「よく見た

非対称化粧受容度の事前・事後テストの比較

ら結構わかる」と指摘され（2）、皆が気づかないかと恥ず

４名中３名は事前・事後でメイク受容度にあまり変化がかしく思う（2）。慣れてきたり（4）、鏡の自分に違和感をなかったが、うち１名についてはメイク後数時間経過した覚えたり（2）、また、「どこかでうったのかと思った」な方がより肯定的に評価するようになった。なお、この１名どと言われてショックを受けたり（2）しながら、最後のと他の３名との間に、私的・公的自己意識や自己重要度そ

安堵感（4）で終了した。

の他の測定値について目立った差異は見られなかった。

４. ４
４. ３. ２

モニター時の時間経過に伴う記録票記載事項

や満足度の変化考４. ４. １察
自己意識等との関連

４名について非対称化粧への関心は、自己意識などの諸（ユカ子）もっとも満足度が高かったユカ子については要因と明確な関係が見られなかったことから、それ以外に

最初３（どちらでもない）でスタートし、知り合いに「パ

自分の容貌に対する自尊心や楽観主義などの要因と関係すリコレみたいでカッコいい」と言われて４に上昇したが、るかも知れず、人格変数や社会的態度と非対称化粧受容度

別の知人に「デビルマンみたい」と言われて１（とても不満）との関係の検討が今後の課題である。

に変わった。しかしその後あまり気にならなくなり、また友達に「かわいい」とほめられるなどして楽しくなり４→

４. ４. ２

一人称（自分自身）、二人称（親しい相手）、

三人称（一般他者）の眼差し

３→５と推移し、「慣れてきて」３→３→４と最後は満足

モニター被験者は、親しい友達に「かわいい」、あるい気味に終わった。
（マミ）親しい相手に直接言われたことばに加えて、自は「デビルマンみたい」などと言われる度に一喜一憂して分で思い込み、反応していた。メイクの最初に不安が募っいた。非対称化粧に対する各場面の満足度は、友達のこと− 140 −

化粧における非対称性

ばや反応によって推移することが多かった。被験者の一人

たい、でも見て欲しいという両方の気持ちがあり、二人称が「パリコレみたいでかっこいい」と言われてうれしくな

だけではこうしたワクワクした体験は味わえないであろう。

ったように、若者たちは他の人と少し違う自分を演出して斬新さと自由と個性を主張しようとする。その時に最も肯（参考文献）

定的な関心を示してほしい相手は、見ず知らずの他人では

１）Rosen,J.（永田雅宜監訳・吉沢保枝訳 1977）シンメト

なく、身近にいる親しい人間なのであろう。また、親しいリーを求めて（紀伊国屋書店）

人間関係だからこそ「殴られたみたい」などと率直な意見

２）青木英夫

1979

西洋化粧文化史 （源流社）も聞ける。

３）押見輝男

1992

自分を見つめる自分自己フォーカス

通りすがりやエレベータに乗り合わせた他学生の冷ややかな視線すなわち三人称の鏡は、非対称化粧によって演出の社会心理学（サイエンス社）
４）高木

された別の自分の姿を振り返らせ、違和感を蘇らせてしま

修（監修）大坊郁夫・神山進（編）1996

服と化粧の社会心理学（北大路書房）

う役目をする。また、自分自身で文字通りトイレの鏡を見

５）竹内久美子

ること（一人称）で、常識的な三人称の視線を先取りする。

６）デズモンド・モリス、石田かおり

2000

シンメトリーな男 （新潮社）

非対称化粧に対する個人の評価（一人称）の中に常識（三は化粧好き（求龍堂）

人称）が内包され、入れ子構造になって被験者自身に批判

７）仲谷洋平・藤本浩一

19841999 「裸のサル」

パターンの良さ及び好み的な視線を浴びせる、しかし、他方で、親しい友が平静に判断について−美術群と非美術群の比較−

ながめる二人称のいつもの眼差しは、被験者に化粧してい会第 96 回大会発表論文集

ることを忘れさせ、満足を与えるのである。自分のメイク

８）藤本浩一や着こなしによほど自信があるならともかく、普段私たち

能力の関係は外出前に、自分の服装や化粧が似合っているかどうかを

９）藤本浩一親しい人に確認する。冒険心のある化粧や服装を取り入れの要因

た時に、親しい人からの肯定的な評価は、、他者の批判的

1984

る

日本心理学会第 48 回大会発表論文集1986

良いパターンの創造における規則性

日本教育心理学会第 28 回大会発表論文集

繊維製品消費科学

11）藤本浩一・仲谷洋平

三人称の視線は自己を演出する上でとても大事である。
少し危ない自分を提示する（露出する）時に、人目を避け− 141 −

−美大生との比較−
文

関西心理学

パターンの良さ及び好み判断と知的

10）藤本浩一・土肥伊都子

な眼差しが内在化して自分を責め立てることから自分を護り、自信を持って前に進むことを支援する役目を持つ。

被

2000

非対称化粧の意味を探

41 , 70 - 79 .
1987

美的パターンの創造過程

日本心理学会第 51 回大会発表論

口唇口蓋裂患者の顔 の改善に対する化粧の効果
大阪大学

飯 田 征 二、小 原

歯学部

浩、古 郷 幹 彦、宮成 典、松 矢 篤 三

Cleft lip and/or palate patients are born with the incidence of 1 for 500 births in Japan. Patients must be
taken some times of surgical operations to develop oral function and aesthetics.
At present, aesthetics has been improving due to progress of the operation technique. Still, because ofwound in the face, and moreover the psychologic influence on these patients can't be avoided in daily clinic.
This research is to investigate how the facial wound and asymmetric, middle facial concaved feeling varied
according to having make-up.
We examined a facial three-dimensional change by wearing foundation and lipstick. And in addition to this,whether the impression received from other people changed by making up.
As results, middle facial concaved feeling, asymmetric and scar impression improved even by using only
foundation. Impression improved more by using lipstick which was dark red.
Though it became clear that facial impression improved by giving make-up, it also became clear that facial
three-dimensional change could be solved only by surgical operation.       

１．緒

言

２．実

口唇口蓋裂とは日本人においては約 500 人に１人と高頻度に発生する１）

顎顔面領域の先天的外表奇形である。本疾患は哺乳、咀嚼、発音（構音などの口腔の機能障害のみ験

検討は、化粧をすることによる顔面の三次元的形態の変化と、化粧の違いによる他者よりの印象の変化を顔面写真
を用いて行った２）。

ならず、口唇、外鼻、などの審美的障害を伴う。加えて上被験者は両側性唇顎口蓋裂患者（23 歳、女性）で、生顎骨の発育不良により中顔面の陥凹感を伴うのが本疾患患

後 2 ヶ月から 19 歳になるまでに計９回の手術を受け、以者の特徴とされている。口唇口蓋裂患者に対して我々は、

降治療は完了となっている。被験者の手術歴は以下のとお

生後まもなくより口唇形成術、口蓋形成術を行い、歯列不りである。

正に対して歯列矯正を行い、また顎裂部腸骨移植術、外鼻昭和 52 年 ３月

出生

形成術、口唇外鼻修正術などの手術を重ね、顔面における同年

５月

口唇形成術（二回法、第一回目）

機能的および審美的な形態の獲得を行っていくのであるが、同年８月

口唇形成術（二回法、第二回目）

機能的な改善を為し得たとしても、顔面の手術創など審美

昭和 53 年 11 月

的には患者ではない人と比較して顔面の多少の非対称感を昭和 56 年 ６月

口唇修正術

認めることは否めない。

平成元年

３月

口蓋ろう孔閉鎖術、舌弁移植術

同年

４月

舌弁切離術

分を美しく見せたいと思うものであるが、口唇口蓋裂患者

平成５年

7月

Abbe's flap 移植術のように審美的障害のある人はなおさらであろうと推察さ

同年８月

Abbe's flap 切離術、外鼻修正術

れる。

平成８年

３月

口腔前庭部形成術

一般的に女性は化粧を施すことが多く、それによって自口蓋形成術

そこで本研究では、口唇口蓋裂患者の顔面が化粧によっ

被験者の顔面においては化粧なしと５パターンの化粧あてどのように改善するのかを知る目的で、化粧による顔面りの計６パターンを設定し、三次元 真を撮影した。６パの三次元形態の変化についての実験と化粧によって顔面かターンの顔  真は次のとおりとした。
番号１：化粧なし

ら受ける第三者の印象の違いについての調査を行った。

２：ファンデーションのみ
３：ファンデーション＋茶系色口紅

Effect of Make -up on the Faces of Cleft
Lip and Palate Patients

４：ファンデーション＋濃桃色口紅
５：ファンデーション＋赤色口紅

Seiji Iida, Hiroshi Kohara, Mikihiko Kogo,＊
Shigenori Miya, Tokuzo Matsuya
Division of Pathogenesis and Controlof Oral Diseases, Graduate School of
Dentistry, Osaka University＊

６：ファンデーション＋薄桃色口紅

１）化粧による顔 の三次元形態の変化研究にはMINOLTA 社製 VIVID700®を用いた。
VIVID700®

− 142 −

口唇口蓋裂患者の顔 の改善に対する化粧の効果

はレーザー光線を用いた高速非接触型三次元形状入力機でおりとなった。図にはカラースケールにて重ね合わせた画ある。その精度は 0 . 3 mm と顔面計測においては十分である。

像の三次元的差異が表示されている。緑色および黄色の表

VIVID 700 ® にて撮影して得られた三次元画像の解析に

示は各三次元座標の差が 1 . 00 mm 以内であることを示し、は解析ソフト Rugle® を用い、各画像を顔面のランドマ

差が大きくなるにつれて＋の場合には赤色へ、−の場合にーク４点（両側内眼角点および両側口角縁）を基準に写真

は濃緑色へ変化する。化粧なしの画像と化粧ありの画像と１と２、写真１と３、写真１と４、写真１と５、写真１とで明らかに三次元的に差異が生じたことを示すカラー表示

６とを各々重ね合わせて三次元的形態を比較検討した。

になっている箇所はなく、化粧を施した領域全体はほぼ均一な緑色の表示となった。このことから、化粧の有無から

２）化粧による顔面の形態に対する他者よりの印象の変化
被験者の６パターンのカラー画像写真を判定者計 20 人

顔面形態の三次元的差異が生じることはなかったと考えられた。

に見せて、アンケート用紙にて白唇部の傷、中顔面の陥凹
感、顔面の左右対称感、口唇の形、鼻の形について 5 段階２）化粧による顔面の形態に対する他者よりの印象の変化

評価をしてもらい、化粧による他者よりの印象の変化を調①白唇部の傷の目立ち具合について（図７）

べて、各評価と人数の関係についてのグラフ（図７から

化粧なしの写真 1 においては目立たない、あまり目立たない、と答えた人がおらず、どちらとも言えないと答えた

11）を作成し分析した。
また５段階評価のよい順に 20 点、15 点、10 点、5 点、人が３人であり、化粧ありの写真に比べて極めて少なかっ

0 点と得点をつけ、各項目の平均得点を出し、総合評価として５項目の総得点（20 点 × ５＝ 100 点満点）を出した。

３．結果

１）化粧による顔面の三次元形態の変化
三次元画像の重ね合わせを行った結果は図１から６のと図１ 左図は化粧なしの写真、右図は化粧ありの写真である。
両画像を Rugle®にて重ね合わせを行った。

図２

写真１と写真２との重ね合わせ− 143 −

図３

写真１と写真３との重ね合わせ

図４

写真１と写真４との重ね合わせ図５

写真１と写真５との重ね合わせ

図６あまり目立たない
目立たない

目立つ
やや目立つ
どちらとも言えない

た。それに対し化粧ありの写真においては目立たない、あまり目立たないと答えた人が多かった。化粧ありの写真同士で比較すると、目立たない、あまり目立たない、どちら20とも言えないと答えた人が最も少なかったのは写真２と写
真５の 12 人で、写真６は 13 人、写真４は 16 人、写真３

15の 18 人、という順に目立たない、あまり目立たない、どちらとも言えないと答えた人が増加した。

写真１と写真６との重ね合わせ

人
数

10

②中顔面の陥凹感について（図８）
全体的に陥凹がないと答えた人は０であった。化粧なし

5の写真１においてはあまり陥凹がないと答えた人がおらず、どちらとも言えないと答えた人が半数の 10 人を占め0た。化粧ありの写真においては、あまり陥凹がない、どち12

らとも言えないと答えた人は写真６に最も少なく 13 人で、

3

4

5

6

写真番号

次いで写真２と写真３の 14 人、写真５の 15 人、写真４の

図７

17 人、という順にあまり陥凹がない、どちらとも言えな傷についての判定（人数）

陥凹あり
やや陥凹ありどちらとも言えない

いと答えた人が増加した。
③顔面の左右対称感について（図９）あまり陥凹ない
陥凹ない

20

化粧なしの写真１においては対称、やや対称、どちらとも言えないと答えた人が 11 人と全体の 55％であった。そ15

れに対し化粧ありの写真においては対称、やや対称、どちらとも言えないと答えた人が写真４、と写真６で 14 人、写真４で 16 人、写真２、写真３、写真５で 18 人と 70％以上を占めた。

人
数

10

5

④口唇形態について（図 10）
美しい、やや美しい、どちらとも言えないと答えた人が
写真６で 12 人と最も少なく、次いで写真２で 14 人、写真
１で 15 人、写真４で 16 人と増加し、写真３と写真５とが19 人と最も多かった。

0

1

2

3
4
写真番号

5

6

図８ 中顔面の陥凹感についての判定（人数）− 144 −

口唇口蓋裂患者の顔 の改善に対する化粧の効果⑤鼻形態について（図 11）
美しい、やや美しい、どちらとも言えないと答えた人が、写真１において 17 人、写真２と写真４とが 18 人、写真３、写真５、写真６とが 19 人であった。

美しくない
あまり美しくない
どちらとも言えない

やや美しい
美しい

2

5

20

⑥総合評価について
各項目の平均点および総合評価を算出すると、図 12 か15

ら 16 のとおりとなった。総合評価（図 17）では写真１は41 . 98、写真２は 51 . 73、写真３は 56 . 98、写真４は 57 . 00、
写真５は 56 . 98、写真６は 47 . 95 となった。

人
数

10

5

0

やや対称
対称

対称でない
あまり対称でない
どちらとも言えない

1

3
4
写真番号

図11 鼻形態についての判定（人数）20

15＊：P＜0.01＊＊：P＜0.05

20

人
数

10
＊

15

5

0

＊

平
均 10
点

1
図９

2

3
4
写真番号

5

＊

＊

＊

＊＊

＊＊

5

6

顔面の左右対称感についての判定（人数）

美しくないあまり美しくない
どちらとも言えない

6

0

1

2

3

4
写真番号

5

6

図12 傷についての判定（点数）

やや美しい
美しい

20

＊＊：P＜0.05＊＊＊：P＜0.1

20
＊＊＊

15
15

人
数

＊＊

10

5

0

＊＊＊

平
均 10
点
5

1

2
図10

3
4
写真番号

5

0

6

口唇形態についての判定(人数）

1

2

3

4
写真番号

5

図13 中顔面の陥凹感についての判定（点数）− 145 −

6

＊＊：P＜0.05＊＊＊：P＜0.1

20
＊＊
15

20
15

＊＊

＊＊＊

平
均 10
点

平
均 10
点

5

5

0

0

1

2

3

4
写真番号

5

15

＊＊
＊＊
＊＊

＊＊

4
写真番号

6

60

点 40

＊

20

平
均 10
点

0

5

1

2

3

4
写真番号
図17

0

5

80
総

＊

3

100

＊：P＜0.01＊＊：P＜0.05＊2

図16 鼻形態についての判定（点数）6

図14 顔面の左右対称性についての判定（点数）

20

1

1

2

3

4
写真番号

5

6

総計

いうのを基準とした。というのも、一般の人が一般的に自6宅などでやっているであろう程度の化粧でどれだけの審美的な回復ができるかを目的としたからである。従って、フ

図15 口唇形態についての判定（点数）４．考5ァンデーションの濃淡をつけず、頬紅なども用いなかっ察た。また検討における見た目の評価において判定者の混

口唇口蓋裂という顎顔面に奇形をもって出生した患者に乱を避けるため写真の枚数をある程度制限しなければならとって、手術及び矯正による顎顔面の機能的及び解剖学的ない。従って、化粧による変化をみる項目は主に口紅のつ形態の回復は第一に重要なことである。これに関しては医け方、色の変化などによって行った。さて、三次元的な顔療技術の進歩によって現在ではかなりの水準で審美的な回

面形態の変化であるが、これは化粧の有無、種類に関わら復が得られるようになった。

ずいずれも差が認められなかった。この事に関しては、結しかしながら、例えば手術による白唇部の傷の状態や骨果については当然といえるかもしれない。特種メイクで三格に起因する中顔面の陥凹感が若干残ることは否めない。

次元的に変化させるものもある３）４） と思われるが、一般

特に両側性裂に関しては中間唇部の口輪筋の欠損、鼻柱の的なメイクで三次元的な座標の変化が出るとは思われにく

短小、鼻中隔軟骨や大鼻翼軟骨の未発達、キューピッド弓い。むしろ、三次元的な変化に関しては手術による形態回が元々の中間唇に存在しないこと、また、中間顎が左右

復が、本疾患にとっては最適であると思われた。言いかえの顎によって固定されておらず手術によって偏位を起こしれば、三次元的な回復は手術が最適であり、それは口腔外やすいことなど、様々な顎顔面形態及び機能に不利となる科医の分野であると思われた。

要素が多い。今回検討に際し、両側性唇顎口蓋裂の患者を一方、他者からの印象による評価においては差が認めら

被験者に用いたのは上記などの理由によるものである。即れた。即ちファンデーションを均一に顔面に塗布したにもち顎顔面形態に対して不利となる要素が多い患者に対して、関わらず中顔面の陥凹感、及び非対称性は改善していた。

化粧によりどの程度の審美的回復がなされるのかを検討す

均一な塗布なので改善は余り見込めないと思われたが予想るためで、本研究の対象に良いと考えられた。

以上の効果が得られた。ファンデーションに濃淡をつける

また今回施した化粧についてであるが、一般的な化粧とことにより、陥凹感がさらに改善できる事が示唆できる。

− 146 −

口唇口蓋裂患者の顔 の改善に対する化粧の効果

白唇部の傷に関してはファンデーションを塗布することべき形態と異なる形態として捉えてしまう。このような効によりマスキングされると思われたので、改善が見られた果の得られる方法の一つが化粧であろう。化粧をすることことは良好な結果と思われた。しかし、外鼻孔底におけるで表情は異なり、そして光や影を利用して本来は見えない

鼻孔内の傷に関してはファンデーションの応用が難しいの形状を創り出すのである。このことを三次元的画像およびではないかと思われるので、今後の課題である。手術によ他者からの印象によって確認したのが本研究である。

る瘢痕除去も一方法であろう。今回、この鼻孔内の傷を指摘する評価者が多かったのも事実である。

本研究の結果、化粧をしても三次元的形態の変化はなかったが、化粧をすることにより口唇口蓋裂患者にしばしば口唇形態については口唇裂をともなう患者にとって心理的には一番気になるところと思われる。これは口紅をつけ見られる顔面の形態の非対称性についての他者よりの見た目が変化した。

ることによりやはり改善が見られた。なかでも写真番号５

今回は一般的な化粧ということで、化粧の施行、特にフの赤系の色の濃い口紅では一番印象が良かった。これは赤ァンデーションを均一としたが、均一なものでも口紅と合系の濃い色により口唇の量感が増したのと同時に評価者わせることによりかなりの改善が得られた。今後はさらに、の心理的な側面も影響していると思われる。“口唇は赤い”

パラメディカル化粧５） という観点に基づいてさらなる検という先入観があるのであろう。これは同じく濃い系の茶討が必要となってくると思われた。

色にはあまり評価が現れてないことより推察できる。これ

現在では、パラメディカル化粧という言葉が存在し、医に対して、薄いピンク系の口紅において評価が低いのは淡療では十分に治せない病気やけがで生じた外見の問題につい色を用いることにより、立体感及び量感が不足していた

いて化粧が役割を果たすという考えが出てきている。またためと思われた。両側性口唇口蓋裂患者は中顔面の発育不欧米では医療とメイクの専門家が協力して患者の社会復帰

全に加え上口唇の絶対的な量的不足がある。淡い色系はそを手助けする機関が存在している。これらの根底にある考れを助長し、口唇形態の判定に悪影響を及ぼしていると考えは、患者の心の問題を大きく捉えているところにある。
口唇口蓋裂患者では、先天的な顎顔面の奇形が存在する

えられた。
鼻形態に関しては、やはり化粧の効果が余りみとめられことで言語の問題も存在することにより、やはり心理面でなかった。原因として、今回の検討ではファンデーションの影響は無視できない要素である。この観点からも手術をを均一に顔面に塗布していることが挙げられる。濃淡をつ施行する側の口腔外科医と医療コスメトロジ—との連携はけることによりより改善するものと思われるので今後の検重要である。

討課題である。しかしながら、やはり限界はあるものと思われるので、手術による鼻形態の改善が口唇口蓋裂患者に（参考文献）

よって最適であると思われた。

１）河合幹他：口唇口蓋裂の疫学的研究、東山書房、7 −23以上のことより、総合評価においてもファンデーションに加えて濃色系の口紅を塗布したものの評価が高いといえ

２）小坂正明他：視覚による顔面非対称性の識別精度、日本形成外科学会誌、19：316 〜 322、1999

る。

５．総

３）B.Hell,etc：Camouflage in head and neck region-括

a non - invasive option for skin lesions,International

人間の顔面形態において全くの左右対称ということはな

Journal of Oral & Maxillofacial Surgery, 1999 ; 28 : 90 - 94

いものであるにも関わらず、日常我々が目にする相手の顔

４）難波雄哉他：メイクアップ、美容形成外科学、南江堂、面形態がほぼ左右対称であると感ずることは多い。その理由として表情と目の錯覚とがあげられよう。表情によって16 − C、220 − 228、1987
５）化粧、ケアの重要な柱、読売新聞社、7 . 9 . 1999

顔の印象はずいぶんと異なり、また錯覚によって通常ある− 147 −

●
平成12年度記念講演●

加治和彦

コスメトロジー研究振興財団
第 11 回表彰・贈呈式記念講演

細胞の老化と個体の老化
静岡県立大学大学院

加治

健康科学研究科和彦
場所 日本薬学会長井記念ホール
日時 平成 12 年 11 月 20 日 ㈪１ 序がそのまま老衰に至るというわけではありません。では細私は４年前に機会があり静岡県立大学大学院の教育に携

胞数はどのようにして減少するのかと言いますと、二つのわる身となりました。静岡に来ましてやはり何と申しまし

過程で細胞数が減少すると考えられます。一つは細胞が死ても一番印象に残ったのは、私の研究室から目の前に見えぬことです。もう一つは細胞が減った場合に、それを補うる富士山でございます。このようなことから、今回の老化作用、つまり細胞が分裂して元の数を回復するという作用の話の枕として老化の研究と富士山の関係についての話しがありますが、その細胞の数を回復させる能力が段々衰えをさせていただきます。

てくる。普通ならばその細胞が死んだことに気づいて細胞ある時、ふと富士の山というのは実は老化の研究と非常が分裂して元に戻すわけですが、どうやらその能力に限界に関係が深いということに気が付きました。ふじのやまとがありそうだということです。このことを我々は細胞老化

いうのは今は “富士山” と書きますが、昔は “不死の山” とという名前で呼んでいます。要するに再生能力を失っていいうことのようです。竹取物語をひも解きますと、その頃くことと細胞が死んでいくことの二つの過程で細胞数が総

富士山は煙を噴いておりました。この煙は一体なにかと言合的に減っていくということです。今日はこの２つの話をいますと、かぐや姫に振られた帝が、折角得られました不

いたしたいと思いますが主に細胞が老化するということを老長寿の薬も、もはやかぐや姫が居ないのではしょうがな

中心にお話します。

いということで、高い山に登り燃やした煙、それが富士山

細胞が死ぬということに関しましては、ここ 10 年位非常の煙であり、その時からこの山に “不死の山” というように盛んな研究が行われてきました。いわゆるアポトーシスに名前が付けられたようです。

（apoptosis）という現象です。ギリシャの大学院の女性にギ

その不老長寿の薬が今で言えば何であろうか、今日の話

リシャ語でアポトーシスというのは本当の発音はどうなのにも出てきますテロメラーゼではないか、などと考えるこ

かと聞きますと、アポプトーシスというのが正式の発音でともあり、老化の研究の中で富士山を時々思い出します。

あるとのことでした。アポトーシスという場合は途中にサ

今日は細胞老化と、細胞が死ぬという二つの現象についイレントのＰがあるのですが、それを発音するかしないかて話したいと思います。田内 久先生、日本における老化のと議論したところ、ギリシャではこれは発音しますと言う研究の大家がいらっしゃいますが、最近「100 寿者、100 歳

ので、日本ではカタカナでアポトーシスと書いてあります

老人」に関する本をお書きになりました。その田内先生のが、私のこれからの細胞死の話に関してはアポプトーシス

数多くのお仕事の中で特に重要なものは何かと申しますと、と発音したいと思います。

加齢の進んだ人と若い人を比較して、老化に伴い組織あたりの細胞数が減るという発見です。肝臓にしろ腎臓にしろ、２ 平均寿命と最長寿命
日本人の平均寿命はご承知のように、現在女性は 84 歳付

老化し、高齢に達した個体では日本人、アメリカ人を問わ

近、男性は 76 歳付近というように伸びてきますが、これがず細胞数が減少するということが明らかにされました。
しかしながら、細胞数が減少した分だけ一つ一つの細胞

将来どこまで伸びるのかという問題があります。明治時代

が大きくなったり、多倍数性の細胞となり、遺伝子であるは平均年齢 40 数歳で亡くなっていたものが昭和に入り急にDNA を増やして代償作用を起こしますから、細胞数の減少

伸びてきました。この主な原因は乳幼児の死亡率の減少です。明治、大正では 10 人生まれますと、1.5 人位が幼いうちにAging in vitro and in vivo
Kazuhiko Kaji

亡くなっていたのが、今では殆ど亡くならなくなりました。

Laboratory of cell and Molecular Biologyof Aging, Department of Food andNutritional  Sciences, Graduate School of
Nutritional and Environmental Sciences,
University of Shizuoka

つまり、乳幼児の死亡率がどんどん減ってきたことが今の平均寿命を押し上げていることになると思われます。
寿命に関するデータを見る時に大切なことは、その信憑性を考慮することです。識字率が非常に高いこと、役場がしっかりしていて、集団の生存を記録できていることです。

− 151 −

すなわち文化程度が高いところで初めて生存曲線を描くこ

３ 老化する細胞とが可能です。コーカサスやアンデスなどで 170 歳や 200

３. １ 寿命とは？

歳の人がいた、というような新聞記事がでますが、このよ

私は生物にとって、寿命は第一義的なものではないかとうな辺境における最長寿命の 200 歳と識字率とは逆相関が思います。寿命がない生物がいてもおかしくないと思います。

あります。150 歳を越える人、200 歳を越える人というのは寿命がある生物は寿命がない生物からある時点で寿命を獲

真実ではないと断言してよいと思います。

得したと考えてよいと思います。無生物の寿命を考えてみます。

18 世紀前半のウィーンと 20 世紀のアメリカの生存曲線

つまり ､どの位長持ちするかということですが、トンカチとかを見ますと、200 年前の多分ハイドンなどの時代と思われ鍋とかフライパンというのはまず寿命がないであろう。それにますが、ウィーンでは乳児の死亡率が非常に高い。10 数人

対して我々はパソコンとか自動車などに寿命を感じます。自動

子供を産んだとしても満足に大きくなったのは２、３人と車を約 10 年くらい乗っていますとやはりガタがくるというのは言うことがあたりまえであったと思われます。しかし、乳一目瞭然です。生物と無生物を問わず、寿命がないものと寿

幼児の頃に大きく下がった生存率は、その後は緩やかな下命があるものの何処に違いがあるか。寿命がないものは単純降カーブとなり 100 歳位まで生存者がいる。アメリカでもなつくりである。寿命があるものは複雑な体制をもっている。

乳児の死亡率は少ないのですが、百歳を越える人は滅多に生物で言えば多分中枢神経系、及び免疫系の発達による中いない。どうやら最長寿命というのは文化・文明が浸透し枢支配というものが鍵になるのではないかと思われます。そても一定していて動かないだろうということです（Fig. １）。

のような中枢支配がでてきて寿命が生じてきた。即ち、寿命

ここで大切なことは平均寿命は変化しますが、最長寿命というは二義的的に生物に備わってきたものである。少し意は変化しないだろうということです。最長寿命が変化しな

外なことかもしれませんが、私はそのように考えた方が寿命といということは、なんらかの意味でプログラムされているいうものがとらえ易いのではないかと思います。寿命のあるもだろうと考えられます。これは老化の研究をやっている上のの特徴は非常に複雑な部品からできているということです。

では心おだやかなことです。老化の研究をやっていて 200

そして、非常に複雑な部品とは細胞動物にとっては細胞とい

歳、300 歳の方々がたくさん出てくるようになりますと、

うことになります。そのようなことから細胞のレベルでの寿命

ただでさえ今問題になっている超高齢者社会を更に推進すを考えてみます。

るということになる。しかし、幸いなことに天寿というの
３. ２ 細胞増殖がどうやらありそうだということです。
97 年８月の朝日新聞に 122 歳の最長寿者ジャンヌ・カ

細胞の寿命を研究する目的でヒトの皮膚組織を採って培養

ルマンさんが大往生されたという記事が載りました。カル

してみます。数日経ちますと皮膚の組織から表皮細胞（ケラ

マンさんは若い頃にゴッホに実際あったことがあり、ゴッ

チノサイト）がはいだしてきます（out g rowt h）。さらに一週

ホはいつも酒臭かったと語ったことがあるという内容です。

間程経ちますとこのケラチノサイトの上をまたぐようにして、こ

現在のところこの 122 歳がヒトの最長寿命です。いかに乳の組織から違うタイプの細胞が出てきます。この細胞が、線幼児の死亡率が減ろうとも今のところ 115 から 125 歳位が維芽細胞（ファイブロブラスト）というものです。これはコラ最長寿命の限界であろうと思われます。人間の最長寿命はーゲンの産生をはじめ細胞が生存する上で必要な、いろいろ種としてこの辺のところに固定されているらしい、プログ

な細胞外基質を分泌する役割を果たしている細胞です。なお、

ラムされているらしい。

培養初期にみられたケラチノサイトは分化し、最後には死んで培養系からみられなくなります。線維芽細胞は他の正常細胞と同様に、必ず堅いガラスとかプラスチックのシャーレの底に貼り付いて増えてきます。シャーレ全面を覆いつくしてしま
うと、正常な線維芽細胞の場合は分裂が停止してしまいます。
停止した細胞をバラバラにして４つに分けて培養し、１週間経
ちますとそれぞれがまた、もとの細胞集団の数になります。つまり、底面に余裕があるうちは細胞が増えて、その間に２回分裂します。これを繰り返すと、その細胞の平均分裂回数を算定することができます。細胞はこの方式で、どこまでも分

Fig.1 時空を隔てて比較した人の生存曲線
18 世紀前半のウィーン（1728 〜 1739）「下側の曲線」と 20 世紀前半（1973）のアメリカ「上側の曲線」の生存曲線

裂増殖し続けることができるのでしょうか。
３. ３ 細胞の増殖限界
かつては個体には寿命があるが、それを構成している細− 152 −

細胞の老化と個体の老化

胞には寿命はないということが一つのテーゼとして信じられてから 100 回しか分裂できない細胞であるということです。

いました。信じられていたというよりも、その当時の実験的事
実に基づいていました。まずはヒーラ細胞という癌細胞が無３. ４ 細胞寿命の確認

限に増えるということが判っていました。ついでパスツールのepidermal growth factor（EGF）という細胞成長因子を添高弟であるカレルは自分が培養している鶏の線維芽細胞は 30

加して、細胞を培養すると、EGF を高い濃度加えた若い細数年間にわたって分裂し続けているので、個体には寿命があ

胞は非常によく増殖する。一方、62 PDL の年取った細胞ではるが、それを構成している細胞には寿命はない、と報告してEGF により増殖は促進されるが、それはわずかである。各年います。ところが 1961 年にヘイフリックとモアヘッドが、何回齢における EGF の必要量は大体 25 ng/mL 程度である。この実験をやっても細胞が活発に増える時期とその後分裂能力を

至適濃度は若くても、年とった細胞でも同じである。要するに失う時期の２つに分かれるという現象を見つけました。要する

年とった細胞にいくら EGF、細胞性のホルモンを加えても、若に正常細胞は無限には分裂できないという非常に奇妙な性質

い細胞ほどは回復しない。年とった細胞を増殖させる良い薬はを持っている。これをヘイフリックの限界仮説と呼んでいます。

ない、という非常に悲観的なことが示されています（Fig. ３）。

ここで注目すべきことは何回か分裂するとそれ以上分裂できなくなる時期が来る。分裂の回数に限界があるということです３. ５ 形質転換する細胞（Fig. ２）。約９ヵ月かけた私の実験でも、細胞を採ってきて先ほどのヘイフリックの話で細胞には分裂回数に限界がシャーレに撒いて１週間経ちますと１対４に分割してまた、培あると言いましたが、癌細胞ではどうか。マウスの線維芽養するということを繰り返しますと、大体最初の内は元の細胞細胞で同じようなことを試みますと、ヒトの場合とは大き密度まで戻りますが段々と戻らなくなります。つまり増殖能がく違っています。増殖する時期のあと分裂能力を失います。

非常に活発な時期と、その後落ちてくる時期があることがた
しかに観察されました。
何回分裂したかということを我々は populat ion doblinglevel（PDL）と言います。細胞の年齢が分裂回数で数えられるわけです。TIG 3 細胞（ヒト線維芽細胞）で 28 . 3 PDL の
若い線維芽細胞と 80 . 5 PDL の年とった線維芽細胞を比較してみますと、若い細胞に対して年とった細胞は大きくなり、細胞の配向性が乱れてくることなどが観察されます。私達の体の中の線維芽細胞はシャーレの中で 50 回から 100 回分裂します。150 回とか 200 回という例はまず出てきません。このよ
うにたいへん意外なことに我々の体の細胞はたかだか 50 回

Fig.2

RELATIVE NUMBER OF CELLS
Hayflick, L. & Noorhead P. S.
Exp. Cell Res., 25, 585（1961）

Fig.3− 153 −EGF DOSE-RESPONSE CURVES OF WI-38 CELLS

Fig.4マウス線維芽細胞の細胞加齢模式図

ここまではヒトのそれと同様です。その後、マウスの線維芽細胞はいつのまにか形質転換して癌細胞になります（Fig.
４）
。癌細胞はこのように正常細胞が一定の経過時間を通った後に生じる。癌細胞と正常細胞はこの全過程に含まれる。この後でも話が出てまいりますが、テロメラーゼがこれらの過程のキーになっている。ただ、マウスの場合は一旦増殖能力を失った後、又 ､ 増殖が再開されるのに対しヒトの場合は増殖能力を失ったら、それっきりで自然には形質転換しない。ヒトの場合、自然には癌化はシャーレの中

Fig.5

動物の最長寿命とその線維芽細胞の細胞寿命の相関では起こってこないということです。最初に細胞増殖が停止する分裂回数、ここまで至るものを細胞寿命と定義します。ヒトの場合ですと 50 から 100 回ですから、ヒトの細胞寿命は 50 PDL から 100 PDL であるということになります。

４ 動物の寿命と細胞寿命
４. １ 動物の最長寿命と細胞寿命
この細胞寿命と個体の寿命がどう相関するかを、横軸に線
維芽細胞の寿命、縦軸に動物の最長寿命をプロットして見てみます。例えばヒトでは最長寿命が約 100 歳で、線維芽細胞の寿命は 50 回です。マウスは最長寿命約３年であり、線維芽細胞はたかだか 10 回位です。他のいろいろな動物、ウマとかコウモリとかウサギについて見てみますと、この線維芽細
胞細胞寿命と動物の最長寿命にはなにか相関がありそうだとFig.6

いうことを、
20 年程前にレーメという人が報告しています（Fig. ５）。

ヒト細胞の供与者年齢と細胞寿命の相関

また、これは 30 年程前のデータです。老齢に達したヒトから採取した線維芽細胞は、その年齢にいたるまでの 90 年、

Ma rt in の仕事です（Fig. ６）。この報告に関しては今から２100 年間に少なからず分裂しているから、分裂する余力がな

年前に反論が出てきました。いろいろ検討しなければいけないだろう。したがって、そこから採った線維芽細胞は細胞寿い時期に来ていますが、今日の話の筋道としてはこのデータ

命が少し下がっているだろう。実際に線維芽細胞は確かに inが正しいということで先に進めたいと思います。

v ivo においても、その分裂する回数を数えていて、年を取ったヒトからの線維芽細胞は有限の回数から今まで分裂した数を差し引いた値がシャーレの中で再現されるという。これは４. ２ 老化の横断型研究と縦断型研究
老化の研究には二つのタイプの研究があります。一つは− 154 −

細胞の老化と個体の老化

横断的な研究であり、もう一つは縦断的な研究です。例え

この 20 年間のデータは来年の３月頃には結果がでると思わばフロリダで一ヵ月の間に人口調査をして老化の研究をすれます。36 歳と 47 歳のところで何回分裂できるかを見ます。

るとします。そうすると結論はこうなります。フロリダはそうしてこれを逆算して、この人が０歳の時にはその細胞

若い時は黒人や白人の肌の色が違う人が沢山いるが、高齢は何回位分裂する能力があるのかということを推定します

者は断然白人が多い。フロリダは高齢化した人たちが余生と、80.5 ということになります（Fig. ７）。それで１年間当を送るところのようです。フロリダにおいて老化を横断的たりの数値は 0.4 回という数値がでてきます。現在この人はに研究すると、ヒトは若い頃にはいろいろな皮膚の色をし57 歳ですが、あと 10 年経った時の数値がとれるとこのデーているが、高齢者になると白くなる、というとんでもない

タはかなり信用ができるものになってくると思われます。

結論がでてくる。横断的研究をする場合、時としてこのよ
うな間違った結論がでてくる。これに対しては縦断的な研４. ３ 回数券型老化究が行われなければいけません。人の一生は約 100 年です

細胞を 20 PDL 位のところで分裂を止め７ヶ月 37℃で代が、100 年にわたって 1 , 000 人以上のボランティアをプール

謝をさせます。分裂させない状態にしますが、長期間（こしておいて、各個人における加齢の進行を調べていく。そこでは７ヵ月）分裂させなかったものをまた分裂させるよのような研究がアメリカのボルティモアで、30 年前あたり

うにします。そうすると分裂回数として貯えていたもの、から蓄積されている。日本においてもそのような研究が少一種の回数券みたいなものがここで使われる。実際に７ヵ

しづつ進んでいます。

月というシャーレの中での環境においても、分裂回数を保この縦断型の老化研究の事例をご紹介します。これは 92持しているということが判りました（Fig. ８）。これが何を年頃、私が学会に発表し、その内容が朝日新聞に記事とし意味しているかというと細胞の老化というのは分裂回数をて紹介されたことがあるものです。年齢が 36 歳２ヶ月の人数える方法で進行している。では分裂回数を数えていものから線維芽細胞を採って、それから約 11 年強経ってから、は一体何か。

もう一回採りました。つまり同じ人の 36 歳と 47 歳のところで線維芽細胞を採りました。更に此の人が 50 代後半にな

４. ４ テロメア仮説

った時点で採取し、現在これを調べています。このように染色体の両端をテロメア（染色体末端粒）といいます。

同じ供与者が年齢を経たところでのデータの比較が世界で

テロメアは最近良く話にのぼるものですが、生物学辞典な殆どされていせん。36 歳と 47 歳ではどう違うかを見ますと、どを開きますと、もうかなり古い時期からテロメアという36 歳で採ったものでは 66 . 5 PDL、47 歳で採ったものではものが知られていて、その頃はテロメアという名前ではな

62 . 1 PDL と 11 年隔てますと最長寿命に４PDL の違いがでく、染色体の末端の構造、染色体末端粒という名前で出ててきました。人の一生は約 100 年ですから 10％程度の加齢います。この両端の同じ構造のものを実際に DNA の配列

進行における PDL の変化です。一生の間に 40 PDL 位の変を調べてみると実は TTAGGG という６つの塩基が繋がっ化が期待されます。現在この仕事は 20 年目にかかっていて、たものの繰り返し配列になっているということが判ってきました。ヒトの場合にはこれが約 2,000 個位繋がっています。

Fig.7 FINITE LIFESPAN OF TWO SKIN FIBROBLAST
LINES DERIVED FROM A SAME INDIVIDUAL

Fig.8 CUMULATIVE POPULATION DOUBLEINGS OF HUMAN FIBROBLASTS AFTER RESING FOR 45 AND 185
DAYS IN CONFLUENT STATE− 155 −

これが染色体上で見られる繰り返し配列ということで回数券に相当するものと思われます。
T TAG G G、T TAG G G の繰り返し配列があると、これが分裂するたびに一定の数で脱落していく。即ち老化が進行するに従ってテロメアが回数券がちぎれるように減っていく。そして、ある程度減ったところで細胞が老化してしまうという考えが出てきた。これは大体 1990 年からここ 10 年位の間でしきりに論議されてきています。
実際に我々はテロメア、つまり、この T TAG G G の配列が短くなっていくのかどうかをサザンブロットという方法で調べました。老化が進むにつれて、このバンドの重心が段々小さくFig.9なっていくのが認められます。細胞が老化するに従って、テロ
メアが小さくなっていくことが確かめられました（Fig. ９）。
つまり、先ほどの 36 歳と 47 歳の人のテロメアの長さを見ますと、14 kbp という長さから８kpb 位の長さまで下がってきていることが確かめられて、DNA の中でテロメアが確実に短くなっていくことがわかりました。今のところ DNA レベルで加齢にともなう変化としてはテロメアだけが知られています。
テロメアが短縮することによって細胞が老化する。つまり
回数券が少なくなる。回数券を自分で作り出したらどうなるか。そういう機構が誘導されると癌化に至る。癌化するときは、
テロメアを元に戻す酵素というものがあって、テロメアの長さを元に戻してしまう。即ち、テロメラーゼがあると死なない。
これが富士山の煙ではないかということです。しかし、このテロメラーゼが誘導されると正常細胞でも癌になってしまうわ
けですから、その辺は難しい話です。
癌細胞になった場合のテロメアはどうなっているのか。ところどころに、とんでもなく長いテロメアが出現することが観察される。即ちこの細胞の中ではテロメラーゼが活性化されていて、ある種の染色体においては非常に長くなってしまう。癌細胞ではこのように異常な長さのテロメアが観察されます。

５ 細胞寿命に影響を与える因子
５. １ テロメア短縮の要因
細胞老化はテロメアが短縮することによって起こる。分
裂するたびにテロメアが短縮していく、ということからテロメアは細胞老化の時計の役割をしているのではないか、と最近いわれている。さて細胞の時計はコチコチと時を刻むので、私たちの人生の長さというのはいかんともしがた
く運命的なものである。年齢がくればそれでバタッといく

Fig. 10

WI-38 細胞の細胞寿命に及ぼす酸素の影響ということになり、なんの取柄もない。しかし、現在私が関心を持っているのは、このテロメアが短縮する時に環境子とか生体内にある因子が関係している可能性があるので因子がテロメアの短縮速度に影響を与えているのではないはないかいうことです。

かということです。その環境因子として代表的なものは活

実際に我々は線維芽細胞ではないのですが、人の正常内性酸素に代表されるもの。また、細胞の中にあるサイトカ

皮細胞に TNA—α（tumor necrosis factor）というある種のインとか growth factor によってその短縮率が変わってく

サイトカインを加えて調べて見ますと、コントロールに対る可能性があるのではないか。つまり、短縮速度に環境因して、TNA—α 100 U 添加では寿命が短縮します。そして、− 156 −

細胞の老化と個体の老化

テロメアも早く短縮される。一回あたりの分裂について TNA—α があると短縮が非常に早く進むということが判りました。ちょっとこれは意外な結果でした。
５. ２ 酸素分圧の影響
次に酸素分圧の話をします。線維芽細胞を普通の酸素分圧で培養したものと、40％で培養したものを調べますと、通常のものでは 60 PDL
付近までいきますが、40％では、それが 30 PDL
強で終ってしまう。高い酸素分圧では細胞寿命が短くなる。酸素分圧２％、７％、40％で培養したものを比較すると酸素分圧が高いところでは速やかに寿命が短くなるということがわかりました（Fig. 10）｡ 現在このテロメアの長さを測定しているところです。同じようなことが平滑筋細胞（smooth muscle cell）でも言えて、酸Fig.11

素分圧２％で培養したものでは一回の分裂にヒト平滑筋細胞の細胞老化−酸素分圧の影響−関してテロメアは約 80 base pair（bp）落ちますが、酸素分圧が高くなると、その倍以上の速さで落ちる（Fig. 11）。要するに酸素分圧が高いところで生活していた細胞は倍の速度で老化するということが判りました。このようにテロメアは老化時計ですが、その老化する速度は、
その環境因子によって大きく変化する。果たして環境因子によって、これだけ大きく変化するものを本当の細胞時計といって良いのかどうかということも逆に問題になってきます。テロメアは必ず一方的に短くなりますが、短くなり
かたは環境因子によってかなり変わり得るということが示されました。
Fig.12

５. ３ 長波長紫外線を起因とした影響

細胞老化における UV-A と薬剤処理の影響 -1

次は皮膚の老化の話になります。ご承知のように太陽光た。また ､ ローズベンガルですが、ローズベンガルという線のうち UV—A が 90％占めています。UV—A を照射するのは UV—A とは関係なく普通の可視光を当てると singlet

ことによって細胞にどういうダメージが出てくるのか。実oxygen を発生します。この３つに注目してみました。

際に人の皮膚由来の線維芽細胞に UV—A を当てて老化を見

UV—A を 10 Ｊ当てると、細胞寿命が短縮します。その時てみました。UV—A が照射されると、活性酸素が発生しまに重水（D 2 O）を加えておくとより早く老化します。D 2 O

すが、この活性酸素のうちどれが一番有効であろうか。活というのは singlet oxygen の寿命を延ばすものですから、性酸素というのは一種類の酸素ではなくて、いくつかの

その D 2 O によって singlet oxygen による老化がより促進さ種類がある。シングレットオキシジェン（singlet oxygen）、

れることが期待される。結果は予想通り短い細胞寿命にな

super oxide それから H 2 O 2、hydroxy radical などあります。

ってきた（Fig. 12）。このことから UV—A を当てることに

UV—A 照射によって、どれが大きな影響を与えるのかといよる寿命短縮の主な原因は多分 singlet oxygen であろうとうのを我々はここ数年検討しています。

いうことが推定されました。また、UV—A を当てるのでは

UV—A で何が出現してくるのか。それを特定する目的

なくて、単に可視光をあてることによってローズベンガル

で、細胞に UV—A を照射すると同時に幾つかの薬剤を加えが singlet oxygen を出すので、実際にローズベンガルを加て実験しました。例えば、ヒスチジンを加えますと singlet

えて、光を当てて培養すると細胞寿命が短くなります。そoxygen がスカベンジャーとして働きます。それから D 2 Oの時にヒスチジンを入れておくとこの作用が消えて、ヒス（重水）は singlet oxygen の寿命を延ばすことに注目しましチジンによって singlet oxygen による細胞短縮が抑制され− 157 −

間で細胞が浮いてきて、アポプトーシスを起こす。つまり細胞が死んでいく。同時にヌクレオソーム単位の切断が進行する。これはアポプトーシスを起こしているものに特徴的にみられるものです。即ち内皮細胞はある種の growth
factor がないと生存できないということです。
これは一つの典型的な例です。内皮細胞は培養系でgrowth factor を必要とするが in vivo ではどうか。実際に我々の体の中で内皮細胞に生存因子を出しているのは近接している smooth muscle cell であろうと思われます。２つのタイプの細胞があった時にお互い同士が相手の細胞に対する生存因子を出し合って、相手がいることを確認してお互いに生きるという。こういうネットワークが生体の中にFig.13

起こってくるのではないかということが考えられます。例

一重項酸素の細胞増殖阻害と薬剤処理の効

えば神経細胞と末端の筋肉であるとします。神経繊維を切る。つまり、rescue 作用があるということがわかりました

断するとこの神経細胞は標的細胞から生存因子を得られな（Fig. 13）
。ローズベンガルに更に先ほどの singlet oxygen

くなる。それによって死んでいく。即ち ､ 筋肉が生存してを長期に保たせる D 2 O で行なうと速やかに老化してしまう。

いれば神経細胞の生存を促すためにある growth factor を

現在のところ UV—A による寿命短縮というのは、それから得ることができる。具体的には何かと言いますと nurve

最終的に得られる singlet oxygen が原因物質であるという

growth factor が筋肉で作られて逆輸送される。したがって、ことが考えられています。その中で L—ヒスチジンという単

ここを断たれた神経細胞はアポプトーシスを起こしていく。

純なアミノ酸が UV—A の細胞障害を回復させるということ

逆も真なりということになると思われます。このようにしがわかりました。

て体の中では、様々な growth factor が生存因子を通してお互いに生存を助け合っているということが言えます。

６ 細胞のアポプトーシス
それでは次に細胞のアポプトーシスの話に移りたいと思７ これからの生命科学います。加齢が進むにつれて心臓病と脳血管病が増えてき

21 世紀を迎えるということですが、これからの医療の分ます。即ち、我々の体の中で一番老化のペースメーカーに野、さらにはコスメトロジーに関しても、栄養学に関してなりうるものは血管の内皮細胞であろう。ということで血も重要な二つのフィールドがあります。その一つが現在ポ管の細胞の研究も進めています。我々の個体というのは表ストゲノム時代と言われていること。もう一つはクローン

皮の部分の細胞群、それから一番内側にある血管の細胞がによる再生医療です。ポストゲノムに関してはご承知のよある。我々の体の老化は外側から皮膚の老化としてわかる

うに、ヒトのゲノムが全て解ったということです。このゲ

し、内部の老化というのはこの内皮細胞が担っているのでノムを用いて何ができるか。これには DNA の問題と遺伝はないか。

子発現の問題の二つがあると思います。DNA 自身の方でまず我々はヒト、へその緒の静脈内皮細胞を単離しましは DNA の多型、個人毎に違った遺伝子を持っているといた。この内皮細胞を培養するためには、ある種の growth

うことからオーダーメイドの化粧品、オーダーメイドの薬

factor が必要です。この growth factor を除くと細胞は死んというような方向性がある。さらに生まれた後に somatic

でいきます。growth factor によって細胞が死んでいくといmutation、突然変異（体細胞突然変異）が起こります。癌

うことは、実は奇妙なことです。本来 growth factor がなの患者さんの DNA のエラーの部分は癌毎に特異的です。

いと細胞は増殖を停止するはずです。しかし、今回の場合

こういう具合にポストゲノム時代の一つの方向性として

この growth factor は生存因子としても働いているらしい。

は、DNA を研究しようということです。もう一つは更に

この死ぬ機構を調べて見ました。

同じように大事なことは DNA がどういう環境で発現する

今から８年前の 92 年頃、丁度アポプトーシスの研究がか。gene expression の問題です。ご承知のようにポストゲ出始めた頃のことです。アポプトーシスの論文は今は年ノム時代の非常に有効な機械として DNA チップとか DNA

間に非常に多くのペーパーがでていますが、その時代ではアレイとか言われるものが、現在動いています。これは今

Apoptosis is not general といわれるくらいにとりあげる研の DNA の問題と、gene expression の問題の両問題を解く

究者も少なかったようです。

ための素晴らしい装置です。ポストゲノム時代はこの２つ内皮細胞の培養系から growth factor を除くと４〜６時の方向で暫くいくのではないかと思いますし、病気の方に− 158 −

細胞の老化と個体の老化関しましても、化粧品に関しても、栄養に関してもオーダ

最後に話の締めくくりとして、超高齢化の時代になり、ーメイドのものが追求されてくるであろう。一方環境因子、

これからどのような生き方が求められるか、を考えてみま

例えば光が当たった場合とか、酸化ストレスがあった場合す。島崎藤村の随筆集を読んでいて、面白いことが書いてに、どのようなゲノムが動いていくのかということ。すなありました。彼は老化に関心を持っていて、100 人のうち

わち gene expression の問題です。

99 人は朽ちる、老衰する。しかし、100 人に１人だけは朽それと同時に現在、とんでもないことが起こった。いわちない、老成する。老衰と老成は全然違うんだという話を

ゆるドリーの事件です。大人の細胞からベビーが生まれた

書いています。いかに我々が老成していくことができるのということです。これで話が終わりになるかと思っていたかというのは、多分これは遺伝的な問題ではなくて、むしのですが、ここ２年位の間に大きな変化がありました。我々

ろ技術的な教育的な、というかテクノロジーの問題ではなには多分化能を持っている細胞が骨髄に大部分揃っている。

いかと私は思います。現在 75 歳を越えた人の中でよく話に骨髄細胞の中には、心臓の細胞にもなれば、肝細胞にもなる、なるのは、老人が老人を支えるということだと言われてい膵臓細胞にもなる。そういうものがワンセット揃っているます。75 歳を越すと老成した人と老衰した人がはっきり分ということがわかってきました。恐らく医療の分野でこれかれてきて、老成した人が老衰した人を助けるということを利用した再生医療、このような我々の体に含まれている、で老人同士が助け合うようになってきているそうです。い

多分化能の細胞をいかに利用していくのかということが大かに老成していくかということが重要で、大きな問題と思きな問題になってきています。今のところ、皮膚の火傷のわれます。一昨日、聖路加病院の名誉病院長の話がありま治療の分野では既に行われている。しかし、これを視野にしたが、この方は 85 歳を超えて今なお名誉病院長であり、入れた日常の生活、即ち化粧品にしろ、栄養学にしろ、こ

平均睡眠時間は５時間、しかも分刻みで実際の医療活動をれから大きな問題になってくる可能性があるのではないか

しているという正に老成した人の典型です。これからは、と思われます。医療の分野はポストゲノムの話と再生医療

いつまでも若くということではなく、年とった人には年とのこの二つの二本立てが大きな車輪になって暫く進むのでった人なりの文化を深めていき、老成という１つの技術をはないでしょうか。コスメトロジーにおいても、これは避開発することが、これから非常に大事になってくるのではけて通れないことではないかと思われますし、大きな期待

ないかと思われます。

が寄せられるところではないかと思われます ｡− 159 −

コスメトロジー研究雑感

平成 10 年度

研究助成

コスメトロジー雑感江口正

本研究で行ったのは、報告書にも書いたように古細菌と古細菌の一群であるメタン菌は、炭酸ガスを炭素源としいう少し他の生物とは違った生き物（細菌）の細胞膜脂質て成育し、メタンを発生します。そのリン脂質がうまく使の基礎的な研究です。この変わった生き物は、
例えば温泉、えることになれば、有用なリン脂質をつくりながら地球温海底火山の噴出口付近などの普通の生き物が住んでいられ

暖化の原因となっている炭酸ガスを消費し、出てきたメタ

ないような pH が１や２という高い酸性度や沸騰水温度近ンは（これも温暖化の原因となりますが）、もう一度燃料

くの環境に暮らしているものもいます。その細胞膜は基本としてエネルギーを取り出し、炭酸ガスにし、リサイクル

的にはリン脂質ですが、少し他の生物のものとは化学的にできると考えられます。本研究の結果は、直接すぐにコス構造が異なります。ご存じの通り、レシチンに代表される

メトロジー分野に還元できるものではなかったかもしれま

リン脂質は、界面活性機能に優れ、保水剤、乳化剤、乳化

せんが、21 世紀に向けて地球環境に優しい物質生産への安定剤やリポソーム剤として使用されていますが、古細菌

夢は広がっていきます。

のリン脂質はその生育環境を考えると、高温や乾燥など厳最後に、本研究に当たり多大なご支援をいただきました

しい下で安定した機能を保持する化粧品基剤として注目すコスメトロジー研究振興財団に厚く御礼申し上げ、この拙べき新素材になるのでは無いかと考えたのが本助成研究の速な文を終わらせていただきたいと思います。
（東京工業大学大学院理工学研究科）

きっかけです。

平成 10 年度

研究助成

コスメトロジーと海外協力
近藤

私は、現在九州大学農学研究院（組織改革でこのような隆一郎

る可能性が極めて高いのです。

名称になりましたが、実質的には農学部）の森林資源科学

私はこれまで、国際協力事業団や大学間拠点校プロジェ部門に所属しております。
本財団の研究助成を頂いた時は、クトなどで、パプアニューギニア、インドネシア、タイを

農学部林産学科の所属で、林産物をいかに有効に利用する

訪問する機会を得ました。各国では、まず現地の研究者

かが、研究の主体となります。樹木成分は、化学的にはセとその国で伝統的に美白や育毛効果があると伝えられていルロース、ヘミセルロース、リグニン及び抽出成分に分類

る、天然物を入手するとともに、色々な樹種の抽出成分をできますが、主成分であるセルロース、ヘミセルロース、集めます。それらを材料として、有用成分のスクリーニン

リグニンは、針葉樹と広葉樹で組成や存在量に違いがありグを行う訳ですが、その作業は共同研究者に私どもの研究

ますが、同じ広葉樹であれば、個々の樹種で大きな違いは室に来ていただき、日本で行います。このような研究の結ありません。一方、抽出成分は樹種により、組成も含量も果、天然物より、いくつかの美白効果が認められる化合物

大きく異なり、ケモタキソノミーとして分類学としても利が見つかってきました。これらは、言わば海外の諸国が有用されており、言わば “樹木の顔” と言えます。

している貴重な遺伝子資源です。これまで、先進国が行っ世界の森林面積の 40 〜 50％は熱帯林であり、特に熱帯てきたような独占は許されません。今回の助成金も、広い

多雨林は蓄積量も多く、かつ構成樹種が極めて多種多様で意味での海外協力に利用させていただきました。今後も海あることを特徴としています。これらの樹種の特徴は、化

外の研究者と協力しながら、貴重な遺伝子資源の機能を明

学成分的にみると、微量成分である抽出成分の量的、質的らかにしていきたと思っています。

な大きな変異としてあらわれます。即ち、熱帯樹木抽出成分は、有用成分の宝庫であり、興味ある成分が見いだされ− 163 −

（九州大学大学院農学研究院）

平成 10 年度

研究助成

妻から学んだコスメトロジー
森島

私の年代の男性がもっている化粧品に対するイメージ，直彦

ケアが必要不可欠であることを理解した．

知識，関心，利用度などは，どれをとってもおよそオソマ

あるとき，私の研究パートナーでもあった妻は，「これツなのが普通であろう．私より１３歳年下の妻は，「女はから新しいプロジェクトを始めるなら化粧品ね，何か思い

いつも美しくなければいけない」という考えの持ち主で，つかない？」「地球上に女がいる限り，化粧品は生き続け

実際外出時など化粧をきちんとすると確かに美しかった．

ていくのよ」と言った．丁度その頃，貴財団の研究助成の当初，私は様々な化粧品を塗って化けることが化粧と思っポスターを目にし，フッ素化糖の研究で学位を取得した妻ていたが，折りにふれて妻の化粧品を見ているうちに，しは，ためらわず私に応募を薦めた．今は向こう岸から静か

ばしば，「moist……」「hydro……」などの言葉が使われに見守ってくれている妻と助成金を交付して下さった貴財ていることに気付いた．土台の表面が粗悪であれば化粧品団に感謝しながら，今後もコスメトロジーに関する研究をはきれいにのらない，つまり塗装と同じ（失礼！）ではな

続け，発展させていきたいと思っている．
（北里大学看護学部）

いか，とも思った．すなわち，美しくなるためには皮膚の平成 11 年度

研究助成

21 世紀のコスメトロジー
都甲潔

今回、私どもの研究「匂いの感性計測を行うセンサーシ色を塗るということ、匂い（香り）を放つということ、ステムの開発」へご支援下さり、貴財団に厚くお礼申し

これは個体と個体の最も生物的ともいえる古今東西共通の上げます。おかげさまで、１年間無事に研究を走らせる

インターフェイスなのでしょう。そして、私たち 21 世紀

ことができ、その成果を近いうちに発表できる段階になに生きる人類は、これを科学の言葉で昇華させ、さらに高っています。この「コスメトロジー雑感」を書くにあた

次の文化を築こうとしているように思います。

り、cosmetology の語源を調べてみました。ギリシャ語の21 世紀は、情報技術をもとに人の医（衣）・食・住の向cosmos に由来するとのこと。混沌（chaos）の中から生ま上を目指す総合科学−ヒューマン・インフォマティクス

れた秩序ある宇宙（cosmos）。どうやらコスメトロジーと（Human-infomatics）−が花開く世紀です。その中核をなは、宇宙に世界に、そして個人に秩序を創りあげる自己組

す学問がコスメトロジーです。何となれば、コスメトロジ

織化（self-organization）の学問と理解できそうです。

ーは人の感性、本質に迫る学問だからです。

コスメトロジー研究振興財団のパンフレットを見ます

本研究を通じて、人の生物としての本質、また万物の尺と、化粧品は約７万年前の旧石器時代から存在していたと

度としての人間の本質について思いを巡らすことができまのこと。想像がつかないほどの大昔です。そのころの人類した。もちろん、当初の目的であった匂いの感性計測に向は、今の私たちとは「生きる」という根元・目的は同じだ

けて大きく前進することができました。貴財団のますますったとしても、ものに対する具体的価値観や生き方は異なのご発展をお祈り申し上げます。
（九州大学大学院システム情報科学研究院）っていたはずです。

− 164 −

コスメトロジー研究雑感

平成 11 年度

研究助成

人生の節目にするために
阿部

正彦

私は、この助成金採択の連絡を、名古屋の病院で聞く羽しまったかとがっかりした。
・・・時間が過ぎ、幾つかの目になった。希望が叶ってうれしいと言う想いと、採択さリハビリのメニューも順調に消化し、目眩もなくなり、１れた研究が遂行できるのかという心配が交錯していた。遠ヶ月も経とうとするとき、親友達の計らいで慎重に自宅にくで誰か自分の知らない人を呼んでいるかのような錯覚か

戻してもらった。寝るのが仕事の生活が１ヶ月程過ぎ、散ら自分のことを呼んでいる執刀医であることに気付くまで

歩を 30 分、１時間、１時間 30 分と徐々に増し、３ヶ月後

そんなに時間はかからなかったような気がしていた。５時には無理をしなければ通常の仕事ができるまでになった。

間以上の手術後、看護婦さんからリハビリは２週間後からでも、尋ねられるたびに全快しましたと言いながら、自分行いますと言われたとき、横になっているのは確かに事実では完全でない想いが長い間していた。半年が過ぎ、８ヶだがこんなに意識がはっきりしているのに何を言っている

月が過ぎようとするとき、体重も増え、本来の自分を取りのか当初は理解できなかった。両手両足をベットにくくり戻したような気がする。締め切りが近づいて原稿を書いてつけられて２夜が過ぎ、頭の向きを替えたとき、天井が回いる今、繰り返すことがないように、また健康であることるのを体験したとき、事の重大さに気が付いた。リハビリの大切さとコスメトロジーとの関係を、改めて考え直してと言う言葉が重くのしかかり、ついに不自由な体になっているところである。

（東京理科大学理工学部）

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
梶内俊夫

この度、貴研究振興財団の研究助成をいただきました。

チン、キトサンをやってみたいというので、それでは生理心からお礼申し上げます。全くの私個人つきましては、コ活性のある適当な糖数のオリゴマーだけを効率よく生産・

スメティックとかコスメトロジーというものは一切関係な分離できるプロセスを開発しよう、というのが発端でした。

いものと思っていました。愚妻も私の方から「少しは美顔

そのために、アセチル化度を種々調整したキトサンと修飾術でも施せ、それが亭主に対するサービスだ」といってい酵素の特異性を組み合わせた反応分離場の構築を行っている位ですから、我が家の洗面台の周辺で目につくのは、歯ます。また、適当な分子量に調整したオリゴマーに種々の磨き道具と髭剃り一式といったところです。それでも、シ官能基を導入して界面活性効果を向上させた新規の界面活ェービングクリーム、白髪を若干緩和させるヘヤクリーム、性剤の開発も同時に行っています。一部の界面活性剤につ女房の口紅、洗顔クリーム程度はあります。業界の皆様、いては抗菌性のテストも続けています。最終的には、我々申し訳ありません。そんな私が助成金をいただけたのですの開発したものが、化粧品の構成物質の一つに加えられて、から恐縮する次第です。

女性（男性でもいいのですが）をますます健康で美しくな

そもそもは、廃棄されている有機物の有効利用が大切るのに貢献できればと夢見ております。

だ、として、セルロースの酵素分解のための修飾酵素の開発を細々とやっておりました。研究室の学生（当時）がキ− 165 −

（東京工業大学大学院理工学研究科）

平成 9 年度

研究助成

刺青考

小野
刺青もコスメトロジーの対象であろうか。その身体に対する修飾、その目的、あるいは社会との関わり、それらは友道ある。また高校生達がお互いに針などで刺青を入れると、感染を起こす危険性がある。

やはりコスメトロジーの分野の課題を提供するであろう。

それで、一方でシールを貼ったりする “一過性刺青” が子どもの時、鉛筆の芯で手の甲を刺し、その鉛が皮膚にある。また HENNA の色素を用いて描かれた刺青（？）

残存したかわいい小さな思い出の刺青から、背中一杯の “くがある。いずれも本格的に施行すると、極めて刺青的でありからもんもん” 刺青まで、刺青は広く、深い。

る。このような「消える刺青」は、それこそファッション

あの『魏志倭人伝』にも倭人に入れ墨があることが記載

感覚で楽しめる。腕に痣などがある子どもに、彼らの好きされ、そのことによって、その資料の価値が存在するとさなデザインの「消える刺青」でカバーすることも考えられえ言われている。このように古くからある刺青は、なお今る。小さな手術の後、日光に曝されるのを防ぐための、サ

日も大いに親しまれ、例えば、アメリカのプロバスケット

ンスクリーン剤入りの「消える刺青」はどうであろうか。

ボール選手の逞しい腕にはしばしば刺青がある。子供達があるいはピアスやイヤリングの代わりになりはしないか。

刺青に憧れるのも無理はない。今の時代、ファッション感

いっそ、コスメトロジーの分野で、質の良い副作用のない覚で刺青を入れる若者達にそれを禁じることは恐らくでき「消える刺青」を開発・販売してみたらいかがであろうか。

ない。

その用途は意外に広いのではないだろうか。若者の刺青流

しかし、刺青は一度入れると、その除去は極めて困難で行を案じる余りの愚見を述べた。

（熊本大学医学部）

平成 10 年度

研究助成

活性酸素とコスメトロジー
小澤

COSMETOLOGY の第８巻を拝読いたしました。素材・

俊彦

効果が高いのではないかと考える次第です。

物性に関する分野、生体作用・安全性に関する分野、精神・一方、放射線ですが、我々が通常自然界から浴びている文化に関する分野とコスメトロジーに関する研究分野が極

自然放射能（年間 2.2mSV）では恐らく皮膚にはほとんど

めて広いことをあらためて認識いたしました。また、それ影響しないのではないかと考えられます。しかし、がん治

ぞれにコスメトロジーの捉え方が異なり、この面からもコ療などで放射線を用いる時に、場合によっては放射線皮膚スメトロジー研究の広さを理解した次第です。我々の研究炎（線量が低いときには、発赤、軽い痛み、かゆみなどが、も皮膚に対する放射線や紫外線の障害機構に関する研究の高い線量になるとびらん、潰瘍、色素沈着、色素脱色など）一端を担っており、前記の分類では生体作用・安全性に関が起こることが知られています。この原因も活性酸素・フする分野に属すると考えられます。

リーラジカルの生成による可能性が推測されていますが、紫外線が皮膚に照射されると多くの場合、一重項酸素が未だ実証されていません。今後は更にこの面でも研究を遂

皮膚表面で生成されることが報告されています。我々は、行して放射線皮膚炎の防御などを目指して行きたいと思っ

この一重項酸素が細胞障害性の高いヒドロキシルラジカルております。我々の研究が少しでもコスメトロジーの進歩に変わることを明らかにし、その機構を推測しました。こに役立てれば幸いです。

の結果は、紫外線照射に対する皮膚障害の防御には一重項
酸素捕捉剤だけでなく、ヒドロキシラジカル捕捉剤も必要

最後に本研究の遂行に多大なご支援を賜りましたコスメ
トロジー研究振興財団に深謝いたします。

であることを示唆するものであります。従って、スキンケ
アーを考えた化粧品にもこのような捕捉剤を加えると一層− 166 −

（放射線医学総合研究所）

コスメトロジー研究雑感

平成 10 年度

研究助成

コスメトロジーの観点から見た私の研究展開
秋山真志

今回助成金を頂き有難うございました。助成金によって言えることは、皮膚の最表面の角層の細胞の性状が「肌の行いました研究は皮膚の一番表面にある細胞層、角層の角質」に重要な影響を与えるであろうと言うことです。この化細胞が形成する厚い細胞膜、cornified cell envelope に

角層の状態を左右するものにはいろいろとありますが、例ついての研究です。この細胞層は、人間の体のなかで一番

えば、角層内の脂肪成分の組成、水分量、pH バランスや外側にある部分であり、常に外界と対峙し、外の環境の変角化細胞自身の接着能、強度などが考えられます。これら化に対応しながら、人体の内部環境を一定に保つために働のたくさんの要素がお互いに影響しあって、角層の状態をいているわけです。そのように考えますと、脳細胞も、肝決め、最終的に肌の質に影響を与えると考えられています。

細胞も重要ですが、この角層の細胞も結構重要な役割を担

確かに最近注目されているように、角層内の脂肪成分の組っているわけです。そして、報告書に詳しく述べましたが、成や pH バランスも、非常に重要な要素ではあると思いま

その角層の細胞のはたらきのために重要な構造の一つがす。しかし、角層の細胞の強度や接着能、さらに細胞の形

cornified cell envelope です。化粧品に期待される働きのそのものに微妙な影響をあたえる角化細胞の肥厚した細胞中で重要なものの一つに、肌の質を改善するということが膜（cornified cell envelope）も忘れてはならない肌の質

挙げられます。つまり、きれいな肌、良い肌を手にいれるの決定要素であると予想されます。今後、この cornifiedと言うことでしょうが、この「肌の質」という曖昧で、時

cell envelope をターゲットにした化粧品が出来てくるのに主観的で、漠然としたものを規定する要素には本当に多も、もしかしたら、そう遠い話ではないかもしれません。

くのものが含まれていると思います。しかし、間違いなく（帝京大学医学部附属市原病院）

平成 10 年度

研究助成

私のコスメトロジー観佐々木均

皮膚は体を保護するコンテナであり、固いバリアーを構することもできました。こうした数学的な計算をやってい成し、体の中の水分が蒸散するのを防ぎ、外界からの細菌

ると、しばしば、皮膚が人体の中で、もっとも大きい臓器

や化学物質の侵入を防ぎます。一方、皮膚は体温を調節し、であることを忘れてしまいます。しかし、角質層は表皮や呼吸とともに、外界に対する感覚器官として働いています。

真皮に支持され、外界の環境によって呼吸をし、水を含み、外界から身を守り、外界の状況を鋭敏に把握するために、血管により放熱し、さまざまな生活を営んでいます。従っ人間はワニのように硬くなく、くらげのようにやわらかすて、細胞のターンオーバーにより再構築され、機能の恒常

ぎない、固い柔軟な皮膚を進化の過程で手に入れることに性を維持している臓器として、皮膚を認識する重要性にあ成功したわけです。一方、みずみずしい皮膚は年齢とともらためて気づかされました。皮膚の恒常性を正常に保つこにしわが寄りシミができ変貌してしまいます。このため、とがコスメトロジーのひとつの目的なのでしょう。炎症か

既に紀元前の昔から美顔術が行われていたそうです。

ら皮膚の代謝バランスが破壊され、バリアー能がなくなり薬学の分野から皮膚を扱ってきましたが、まず、薬や化皮膚炎になることもあります。体の全身状態が悪いと臓器粧品の成分の透過バリアーとしての角質層に興味をひかれのひとつとしての皮膚の調子が悪くなることもあります。

ました。皮膚最外層の角質層は、細胞から核が抜け、脂質

また、寝不足やストレスなど、長期にわたる精神的な問題と高分子の塊となって堆積する生命のない鎧のイメージをも、皮膚の調子をおかしくすることがよく知られています。

持っていました。薬の皮膚内挙動を計算し、さまざまな現

そういう意味では、心身の健康維持もコスメトロジーの目

象を物理化学的に捉えていく過程で、皮膚を透過しやすい的のひとつではないでしょうか。

物質の性質や皮膚バリアー能を変化させる物質を明らかに− 167 −

臨床に用いられる薬物に比べると、化粧品成分の皮膚透過が極めて低く、速効的な効果は疑問があります。しかし、今回の私の研究は、マイクロダイアリシスという手法を今後の化粧品は、効き目がおだやかで、副作用がなく、長用い、皮膚内の薬物濃度や皮膚成分の濃度の変動をモニタ期に補充することで、しだいに、皮膚の臓器としての恒常ーする方法論の確立です。薬物の透過だけでなく、皮膚成性のバランスを取り戻させるという意味合いが強くなると分の微量な変化をとらえることで、薬物や化粧品が皮膚と考えます。そのためには、外界からの刺激や、化学成分にいう臓器に及ぼす影響を生化学的に検討することができま

対して、皮膚の深部でどういう反応が生じているかを知るす。本研究が今後のコスメトロジー研究の一助になればとことは極めて重要であると思われます。

願っております。

（長崎大学医学部附属病院）

平成 10 年度

研究助成

コスメトロジーと免疫学今井康之

平成 10 年度、私は静岡県立大学に赴任し、新たな研究あるので、逆に好ましくない免疫反応であるアレルギーが環境の構築の必要性に迫られていました。その時期に、財おきる場所としても重要です。化粧品は、衣装や他の装身団の研究助成を頂くことができ大変感謝しております。私

具よりも直接皮膚に適用する性格が強いため、安全性に関が当初コスメトロジー（化粧学）という言葉から受けた印する研究が重要であり取り組みが進んでいるのは当然とい

象は、文化系の学問分野というものでした。たとえば、もえます。炎症反応が発現するときの分子機構については関ののけ姫というアニメ映画がありましたが、もののけ姫と心も高く研究も進んできたと思いますが、皮膚からの抗原

その敵役の女性の化粧は、記号として映画のなかで高い存

感作がそもそも初めて起きる場合のメカニズムについて在感を発しています。このように、化粧は言葉と同様な意

は、まだまだ解明すべき点が多く残されています。今回の味を人間関係のなかで持つものと思います。ところで、私研究で、皮膚からの抗原感作の過程でも、炎症反応が発現の研究課題も含め研究助成の多くが安全性の分野へ向けらするときと共通した分子が働いていることを明らかにするれています。私の専門領域は免疫学ですが、皮膚は外界のことができました。私たちの問題の切り口は、原因を特定

環境から体を守るバリヤーとして大変重要です。皮膚は細しにくいアレルギーについても解決の糸口を提供しうると菌を通しませんし、皮膚の表面は乾燥していて細菌の繁殖考えています。コスメトロジーは、人間と環境の接点に位に不利な状況を作り出します。皮膚からの抗原の情報は常置する学問分野であり、人間の体や精神の健康に貢献するにモニターされていて、病原体に対する免疫応答の基礎と分野としてさらに発展を続けることを期待しております。

なっています。このように皮膚は免疫器官として活動的で（静岡県立大学薬学部）

平成 10 年度

研究助成

私のコスメトロジー感
鈴木

巌

若い男の子がこぎれいになったのは，いつ頃からでしょ

それまでの長髪・破れた G パン，といった基本アイテム

うか？私が小学生の頃，ちょっと上のお兄さんたちは，むから，遠く離れた，清潔感漂う格好をしていました．もちさ苦しい服装で，やはりむさ苦しいお顔だちであったと記ろん胸毛などその片鱗も見えませんでした．それがとても憶してます．それが格好良かったと思っていました．

新鮮に見えたのです．それ以来でありましょうか，巷から自分が中学生くらいになるころ，どうもそのあたりに異それまでの男臭さが消えたように思えます．年を経るにし変が起きたような気がします．ちょうどそのころ，流行のたがい，私はファッションの世界とは疎遠になってきまし

創造を目指すある雑誌が刊行され，毎号欠かさず眺めていたが，今でも行きつけの床屋さんでは，顔パックされ，恍ました．
ファッション特集号に登場するモデルさんたちは，惚に浸る瞬間を喜んでいます．昔は女性の特権であったい− 168 −

コスメトロジー研究雑感

つまでも美しくありたい，という願望はジェンダーフリー

ことは，人間の欲求を満たすだけでなく，健全な長寿社会の世の中になり，中年に入りつつある私も心のどこかで思を形成するのに必要なことであると感じる今日この頃でっているのでしょう．美しくなること，すなわち上手に齢

す．美白，顔グロ，etc．いろいろ流行はありますが，いを重ねることは，すでに物質的に満たされている（といっろいろなファッションを追求をさせるのもコスメトロジーても研究費は満たされてませんが……．どうもありがとう

であれば，何の思慮もなく追求したツケを拭い去るのもコございました）日本人が思うことなのでしょう．すべすべ

スメトロジーだと思うと，地球環境と現代科学との関係にお肌をキープできれば，心はうきうき．昔からいわれてい似ているなあ，とも思うのでした．
（東北大学大学院薬学研究科）

るように，健康な体は健康な精神に宿るので，結果，長生きに繋がります．学問としてのコスメトロジーを追求する

平成 10 年度

研究助成

どうやって傷はきれいに治るのか高橋健造

ヒト遺伝子ゲノムの概要が、当初の計画よりずいぶんと生して創部を埋めていくのは当然のことのように思われが前倒しとなりこの２月には一般の遺伝子データベース上にちですが、実際には表皮や毛嚢のどの層の角化細胞が、ども公開になりました。まだずいぶんとラフで未確定なデーのように潰瘍底に遊走し、実際の再生表皮の基底層や幹細タも多いようですが、日々新しいデータへと書き換えられ胞を再構成するのか、今のところはっきりした解答はありていますので、数年で実用上問題のないヒトの全遺伝子のません。

完全な情報となるでしょう。このデータを基に個人間や人

これはどうしたら瘢痕や色素沈着が残らずによりきれい

種間での遺伝子のほんの僅かな相違の意義を検討し、単一に傷が治るのか、あるいは創傷治癒のどの過程のどの細胞

遺伝子の異常により生じる遺伝性疾患の解明にはますますを標的とした治療が望まれるのか、などに答える研究とも拍車がかかり（多分この数年間で）、さらには複数の遺伝なります。表皮細胞の再生・分裂能を上手くコントロール的素因が関与するであろう乾癬やアトピー性皮膚炎などのすることは創傷治癒の大きな鍵を握ります。実際、母体内発症機序も着々と解き明かされていくと思われます。

の胎児の皮膚の傷は全く瘢痕を残さずに治癒することが知このようなヒトを含めた生物の遺伝情報に関する研究の爆られていますが、一方で幼児や若年者は容易に肥厚性瘢痕

発的な進歩は、大腸菌からヒトのゲノムに至るまでどの遺を形成しがちでもあります。高齢者では瘢痕を形成するこ

伝子にも共通で、誰が扱っても比較的簡単な方法論と実験とは稀ですが、今度は治癒そのものが遅延しがちで大きな手技が通用し機械化するのが容易であったという遺伝子工

潰瘍や熱傷は将来の発癌母地となってしまいます。
そこで生きたままの状態で、表皮細胞がどのように遊走学の特徴によるところが大きいと考えられます。
しかし個々の疾患に対する治療法となると薬剤の開発やし潰瘍面を埋めていくのかを長期間観察できればと考え、

薬剤導入のための手段が、疾患や臓器あるいは対象となるトランスジェニックマウスを使った実験をしていますが、個々人ごとに大きく異なるために病因の解明ほどには容易

マウスの皮膚と人の皮膚とではずいぶんと違う治癒過程をに運びそうにはありません。

示します。真皮線維芽細胞による創傷の収縮機構がマウス

そこでこれからの臨床医学、特に治療面での期待が大きでは非常に強く働き、体幹面積の２〜３割にもおよぶ人間にとっては致死的な皮膚潰瘍が、２〜３日後には数 mm

いのが、臓器の再生に関する再生医学の研究です。
そんなわけで表皮組織の再生のメカニズムを知る実験をの大きさにまで収縮してしまいます。マウスの傷はあっという間に治りますが、残念ながら実験は思ったほど進みま

続けています。
皮膚科医ならずとも、外傷や熱傷の後に皮膚が自然に再せん。

− 169 −

（京都大学大学院医学研究科）

平成 11 年度

研究助成

21 世紀とコスメトロジー
佐藤隆一郎

アメリカで４年間の留学生活を送った。1990 年代初頭、る「顔グロ」ファッションが話題にもなったが、グローバ

アメリカ経済は低迷していたものの、アメリカ人女性のほル・スタンダードに照らしてもあれは美しくなく、紫外線

とんどが入念な化粧をし、特に香水の香りは強烈で日米の被爆の実害に対する知識も著しく欠如しており、若年齢層差を感じた。その後日本でも化粧をする女性の低年齢化、へのコスメトロジー教育の必要すら感じる。

さらには若年男性までもが化粧をする傾向が見られ、アメ

21 世紀を迎えた現代社会では情報化が一層進み、あらゆるものへの価値観は一元化する方向にあり、グローバル・

リカに 5 年、10 年遅れで近づいている感がある。
アメリカは能力主義社会であり、そのために個人は自らスタンダードが定着して日米間の差も小さくなるだろう。

の能力、個性をアピールする必要がある。また多民族社会

日本でも個人の能力、個性が高く評価される時代が到来すであり、皮膚、髪、眼の色がそれぞれ異なり、その組み合ることは間違いなく、それに伴い化粧への要望、化粧の頻

わせは多様である。この様な中で個人が個性を引き出し、度が高まることが予想される。その様な化粧の質的、量的自らの良さ、美しさを強調するための手段として化粧があな変化を科学的側面から支えるのがコスメトロジーであるのに対し、単一民族社会である日本では流行をみんながり、人々の生活に最も身近な 21 世紀の先端科学としてコ真似る、横並び、均一化の手段として化粧があるように思スメトロジーが大いなる発展をするものと確信すると共にえる。もちろんその様な状況のなかで、奇抜さを好む傾向

期待している。

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

も現れ、真っ黒に日焼けした顔に眼、口の周りは白く縁取

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
佐藤

皮膚は、外部からの刺激や障害から生体を保護するバリアーであるとともに、コスメトロジーの領域では “自己表隆

うちに、実は皮脂の生合成や分泌機構などは十分に理解されておらず、非常に面白いテーマであると実感した。

現の場”、すなわち男女を問わず “美” を表現する “キャン

最近のコマーシャルの影響か、“皮脂は困り者” というパス” として重要であると感じている。それ故、肌荒れや認識が少なからずあるのではないだろうか。“てかり防止

皮膚疾患、または化粧の善し悪しは日々の気分の抑揚に大のファンデーション” が巷では売れているのもこのようなきく影響し、精神的ストレスをもたらす要因にもなる。こ

意識を増長させているのかもしれない。皮脂は皮膚のみなのような自己の美を気にする意識は思春期頃から高揚する

らず生体の機能維持には不可欠なのだが、確かに皮脂の分が、この時期には “にきび” といった大敵も現れる。私も泌量が多い人は、脂性肌や肌のてかりに悩まされ、その防高校の頃、この “にきび” に出会い、何とかして治したい

止に苦慮していることだろう。そういう人のためにも、まと願ったこともあった。やはり、顔にたくさんの “にきび”

た快適な生活を営む上でも、皮脂の重要性を考慮しつつ、ができていると格好が悪いし、女性にとってみれば化粧も皮脂の分泌をほどよく制御できるような化粧品の誕生が望思うにいかなくなると感じた人は多いことであろう。
でも、まれる。今後、脂腺細胞を用いて皮脂の分泌調節機構を詳

その時には “にきびはどうしてできるのか” など考えたこ

細に解明し、将来の化粧品開発に貢献したいと願っている。

ともなかった。ましてや、皮脂の研究に携わるなど思って（東京薬科大学薬学部）もみなかったことである。しかし、皮脂腺の研究を進める− 170 −

コスメトロジー研究雑感

平成 11 年度

研究助成

皮膚の老化と遺伝子
山泉克

皮膚老化の主要な原因が太陽光被爆（日焼け）であるこ復元される。修復のあらましはこんなものであるのだが、とは多くの観察の示す所である。更にその原因を探ってゆ

多くの光線過敏症の患者さんの診断を行っていると、どう

くと、太陽光の中の紫外線が DNA に傷をつけ、それが長しても既存の疾患のいずれにも該当しない場合に遭遇する

い間に少しずつ蓄積することが重要であることが判ってきことが少なくない。しかもこれらの中には兄弟で同じ症状た。一方、喫煙と肺癌・循環器疾患などとの因果関係が疫を示すなど、遺伝的な原因が考えられる場合も多々見つか

学的研究により十分明らかになっている。
にもかかわらず、る。DNA 修復といった基本的な防御システムは、下等生

若い人達における喫煙者数の減少はいっこうに認められな物から高等生物にいたるまで進化の過程を通して共通に保い。将来かなり高い確率で皮膚の老化や発癌・循環器障害

存されているというのが現代生物学の基本的な認識であが起こることがわかっていても日焼けや喫煙がやめられなる。基礎研究の分野では紫外線感受性を示す出芽酵母の変

いのは、凡人にとって 10 年後、20 年後は現在の自分とは異体が多数分離されており、これらの中には上記のヌクレ

全くの別世界であり、現在の延長線上にあることが実感で

オチド除去修復に異常を持つものも当然含まれている。問きないことによるのであろう。対策のむずかしさもこの辺

題はそれ以外の変異体で、近年これらの変異体に対応するにあると思われる。ところで、紫外線による DNA 損傷のヒト遺伝子が続々と単離されてきた。これらの中にはチェ

修復機構は、
代表的な光線過敏症である色素性乾皮症（XP）

ックポイントと呼ばれる、DNA の品質管理にかかわる一の研究を通して明らかになってきた。この修復機構はヌク連の遺伝子も含まれている。今後これらの遺伝子異常がヒ

レオチド除去修復と呼ばれ、複数の XP 蛋白質の協同作用

トの光線過敏症と関係しているのかどうかを明らかにし、で傷のついた DNA 部分が切り出され、その後別の蛋白質

更にこれらを系統的に診断する方法の開発が待たれる。
（熊本大学発生医学研究センター）がその部分を正確に穴埋めすることで傷の部分は元通りに

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジーへの期待吉田武美

今回㈶コスメトロジー研究振興財団より助成金をいただき

コスメトロジーは、今日まで皮膚表面をあらゆる観点からましたことを感謝申し上げます。本研究助成により、実験的

追求し、発展してきております。21 世紀は、この国では高皮膚生化学に関する成果が得られました。本研究助成によ

齢化と少子化がさらに進むことが予想されます。とくに高齢る課題は、皮膚とサイトカインの関係や皮膚のストレス応答

者においては、皮膚機能を常に若々しく保っていたいことをに関するものでしたが、皮膚に多いとされるサイトカインの望んでいると考えられます。コスメトロジーは、このような社

I L—1 に興味をもち、そのノックアウトマウスでのアレルギー会においては、益々発展していかなければならない分野とい反応の研究を開始したのですが、何をしているのか不明なえるでしょう。社会的には、生活改善薬や機能性食品など

結果に終わりましたが、その他のサイトカイン欠損で、L Cが生み出されており、コスメトロジー分野でもその特長の一に大きな影響が出るという重要な成果を得ることができまし

端ともいえる知覚、嗅覚、触覚などを生かした精神的癒した。また、皮膚の紫外線に対するストレス防御に対する抗の世界への展開を期待するところです。極近い将来に皮膚酸化剤とりわけカレーなど食料品として重宝されるウコン成の生理から分子生物学的研究も含めた大きな展開があるこ

分クルクミンの防御効果は目を見張るものがあります。これとでしょう。それにつれてコスメトロジーも益々発展し、皮まで皮膚関連研究を続けてきておりますが、皮膚の外部刺膚機能の維持と改善を約束する方向性を打ち出してくれるこ激に対する機能の解析や防御反応および調節機構など多くとでしょう。コスメトロジーが高齢化社会を彩る分野への展の実験的研究が残されているように思えます。

開を期待しつつ。

− 171 −

（昭和大学薬学部）

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジーと白血球と自律神経系
安保

多細胞生物になって多くの機能の分化した細胞が生じたが、単細胞生物時代の自分自身の性質を変えずに残ったのが白血球である。そして、私たちのからだを守る細胞として働き続けている。

徹

これらを「白血球の神経支配の法則」と呼んでいる。
このような、体調、自律神経、白血球の同調するリズム
は、本来からだにとって合目的なのである。
しかし、これらのリズムが一方に偏ると生体は破綻をき

このように理解すると、いかに白血球が生体にとって大事であるかの謎が解けるように思う。

たす。働き過ぎの交感神経緊張の持続は、顆粒球を増加させ過ぎ、吹き出物が出やすくなったり、皮膚の血流が悪く

もう一つ大事なことがある。白血球を最も効率よく使用するためには、体調に合わせて適切な白血球分画を繰り出さなければならない。

なってかさかさし、不健康になってくる。
逆に、リラックス過剰で副交感神経優位の過剰は、アレ
ルギー反応を起こしやすくなったり、血流がうっ滞してむ

活発な体調（交感神経優位）で手足が傷ついて細菌が侵くみが出て皮膚がぶよぶよになってくる。

入してきたときは、細菌処理にすぐれた顆粒球を準備する

このように本研究では、体調、自律神経、免疫が、健康必要がある。逆に、食べ物を消化・吸収する時（副交感神な皮膚（顔の表情も）や美しさの維持に深く関係すること

経優位）は、
微少抗原処理にすぐれたリンパ球を準備する。

を明らかにすることができたと思っている。

免疫を司るリンパ球は消化管の周りで発生進化している。

（新潟大学医学部）

平成 11 年度

研究助成

本研究とコスメトロジー
井出博

地表に到達する太陽光紫外線は，波長の短い UVB と波かし，この仕組みでは UVA で発生する遺伝子の酸化損傷

長の長い UVA に分けられます．UVB はサンバーンの主は直すことができません．そこで UVA で発生する遺伝子な原因であり，皮膚の炎症，皮膚発癌，皮膚免疫などとのの「きず」がどのような仕組みで直されるのかを明らかに関連から詳しい研究が行われています．さらに，最近の研したいと考え，本研究を行いました．その結果，塩基除去究の進展により，UVB で発生する遺伝子の「きず」が細修復機構という別の仕組みが働き遺伝子の「きず」を直す

胞の中でどのような仕組みで直されるのかということが詳ようだということがわかりました．今後さらに研究を進め，しくわかってきました．UVB はオゾン層でそのほとんど

この機構に関係する酵素の役割や遺伝子を明らかにしたいが吸収されてしまいますが，もう一つの紫外線成分であると考えています．

UVA はまったく吸収されずに地表に到達し，サンタン（皮最近新聞やテレビを賑わせているオゾン層の破壊だけで膚の黒化）を引き起こします．DNA は UVA を吸収しななく，アウトドアレジャーの普及などライフスタイルの変

いため，UVA では遺伝子の「きず」はできないと思われ化により，私たちが太陽光紫外線に曝される機会が増えてていました．しかし，最近の研究から UVA は細胞の中にいます．今後，UVA および UVB にそれぞれ特徴的な遺ある別の物質に吸収され「活性酸素」を発生し，UVB と伝子の「きず」を直す仕組みを明らかにすることができれは全く違ったタイプの遺伝子の「きず（酸化損傷）」を発ば，新しい指標に基づくスキン—タイプの分類や，この指生することが明らかになりました．UVB で発生する遺伝標に応じたサンスクリーン化粧品の使用法および開発も可子の「きず」はピリミジンダイマーとよばれる損傷で，ヌ能になると期待しています．
（広島大学大学院理学研究科）

クレオチド除去修復機構という仕組みで修復されます．し− 172 −

コスメトロジー研究雑感

平成 11 年度

研究助成

紫外線と私と美容のブーム
古澤

佳也

1983

けていた。以外と晴れの日は少なくて１年間やって 50 日

年にこのような趣旨で研究を始めたのは、大学院での本来分のデーターしか取れなかった。こんな経緯で紫外線とのの研究テーマである真空紫外線や超軟Ｘ線の実験が大型のつきあいが始まって 20 年になろうとしている。

太陽紫外線が生物にどの程度影響を与えるか？

加速器を用いた共同利用実験であり、実験の出来る日数が1990 年初頭に、なぜあれほどもサンスクリーンの配合

限られていたからであった。光の仕事は分光スペクトルのが盛んになり、一気に普及したかは未だに首をひねるばか

測定から始まると考えている。折しも、岡崎の基礎生物学りである。確かに紫外線を浴びないことは将来の健康にと研究所の大型スペクトログラフを知り、最も簡単な生き物って良いことではある。しかし、疑問は「なぜブーム」かとしてバクテリオファージを携えて、致死の波長依存性をである。女性の美しくなる願望が日焼けを防ぐことに始ま調べたのが始まりであった。そのころ南極でオゾンホールって、今のブームは美白である。それより前には「小麦色が発見されてにわかに紫外線の影響が心配され始めた。たの日焼け」が健康美と考えられていた。
「ガングロ」とはだ実際には海やスポーツで使うサンスクリーンでなく、サなんだろうか。健康のためにすでに浸透した化粧品へのサ

ンスクリーンがファンデーションなどにも取り入れられる

ンスクリーンの配合が続く事を願うが、「美容」にのみ囚ようになるのには、まだまだ数年を要した。このころは晴われているように見える女性の気持ちを、多少とも「健康」

れた日のお昼前後は大学のキャンパスで、「ひなたぼっこ」のために、と啓蒙する必要がまだまだ不十分のように思え

紛いと冷やかされながらファージの入った容器を太陽に向てならない。

（放射線医学総合研究所）

平成 10 年度

研究助成

コスメトロジーと非対称藤本浩一

当研究助成をいただいて実験計画を立案していた頃は、して一人称についてはどうか。おかしな化粧だけど、自分

右と左で色の違う靴下をはいていた若者をどこそこで見か一人の部屋でこっそりとなら試してみたいと案外多くの人けたなどの「目撃情報」がいくつかあって、さては流行のが思っていた。化粧の心理は入り組んだ多重構造なのだろ

兆しかと浮き立つものがあったが、研究を終える今の時期

う。あたかも徒競走で、自分がフライングぎりぎりで人よになっても非対称の化粧は流行していない。
残念というか、りも有利なスタートを切り、あまり離さず離されず、そこ当たり前なのか、それとも時期尚早だったのか。かなり大そこにゴールしたいという心境のようでもある。もう一つ

胆なものには違いない。

印象に残ったのは、当初実験参加に積極的だった女子学生

女子学生に依頼して非対称の化粧をしてもらい、その日が、いざ化粧を始める時になってとても不安を示し、他方

一日通常のキャンパス・ライフを過ごしてもらった。逐次であまり気がすすまなかった学生が、実験終了後とても満求めた体験報告の中で印象的だったのは、彼女たちが友達足して、また機会があれば声をかけて欲しいとメールしての評判に一喜一憂することだった。親しい友達という二人きたことである。態度（考え）と行為が不一致の時に人が称の相手に、
自分がどのように映るかをもっとも気にする。

どのように行動するかという社会心理学の実験を目の当た

あまり目立ち過ぎないようにと気を配る。かく言う私も朝りにしているようだった。

出がけに、「また靴下の色があってない」などと家族に呼このようなあまり人が手がけない研究の機会を与えて下さび止められるのがその例であろう。そうかと思うと、せっった当財団に深く感謝したい。

かく派手な化粧をしているのだから、誰か注目してよ、という三人称からの賞賛を彼女たちは十分期待している。そ− 173 −

（神戸松蔭女子学院大学文学部）

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
飯田

征二

私が小学生の頃、同級生の弟に口唇口蓋裂患児がいた。

して彼は今どうしているのであろうか、治療は続けたので今にして思えば彼は見た目にそれとわかる、外鼻および口あろうか、などいろいろと考えを巡らし、昔のアルバムを唇の変形した顔貌をしており、言葉は不明瞭で鼻咽腔閉鎖開いてみると 1 枚だけ彼の写っている写真を見つけた。そが十分にはできていなかったのであろう。口唇口蓋裂児はの写真を眺めながら、彼のことを思い、そして自分を振り日本人において約 500 人に 1 人の割合で出生することから、返ってみた。私は自分の理想を描いて歯科医師になり、自学校に 1 人存在しても何ら不思議ではないと今なら思える

分の最も興味のある分野を自分の意志で専攻したつもりでが、当時はそのような病気が存在することなど知る由もなあったが、実はそうではなく、小学生のあの頃彼に出会っ

く、彼はその顔貌と言葉の不明瞭さから、周囲からいじめた時から口唇口蓋裂に関与する仕事に就くように決まってられる絶好の対象となっていた。私は彼が同級生の弟といいたのではないか、などという思いがうかんできた。万がうことでいじめる側にはまわらなかったのであるが、彼の一そうであっても、またそうでなくても彼と出会えたこと

顔貌と言葉の特異性を不思議に感じてはいた。現在、診療は私にとってかけがえのない思い出であり、彼にとってもの場にて多くの口唇口蓋裂患者に接しているため彼らの顔そうであって欲しいと思う。それと同時に口唇口蓋裂の治

貌などを不思議には思わないが、今回このコスメトロジ−

療およびコスメトロジ−に私が関与できるようになったこの研究に着手し筆を手に執りながら記憶の彼方から同級生とに感謝の気持ちでいっぱいである。 （大阪大学歯学部）の弟の彼に関することが脳裏に蘇ってきた。そして、果た− 174 −

コスメトロジー研究雑感

平成９年度

海外派遣助成分子生物学的手法を用いた皮膚角化細胞の分化・増殖に関与する分子の解析及び遺伝子治療の標的細胞としての表皮幹細胞の同定
筑波大学臨床医学系講師

川内康弘

私は 1998 年 12 月から 2001 年６月までの約２年半、米置しており、最高気温が 40℃くらいの夏が 4 月から 10 月

国テキサス州ヒューストン市にありますベイラー医科大くらいまで続き、紫外線の量も尋常ではありません。特に学・分子細胞生物学教室（デニス・ループ教授）において、白人は絶対に紫外線に対する防御が必要だと思うのです

表皮角化細胞の分化・増殖と転写因子との関わりを主なテが、多くの学校では平気で炎天下で子供を無防備に遊ばせーマとして研究を行ってきました。幸い研究はうまく進行ており、多くの白人の子供の頬部には無数の雀卵斑（そばし、Nature Genetics 誌をはじめとしていくつかの論文をかす）が認められます。彼（彼女）らが年をとるに従って、既に発表、もしくは投稿準備中です。しかし、渡米当初は

しわ・しみの増加は必発であり、ひいては悪性腫瘍の発生

英会話能力のなさもあって「このままでは研究で成果を出さえ懸念されます。日本にいるとあまり切実には感じない

すことはおろか日々の生活もままならない…」と途方に暮のですが、白人中心の人口構成と亜熱帯性気候の環境で、れたこともありました。当然のことながらアパートの契約

紫外線がいかに皮膚の健康、美容に悪いかを目の当たりにから、車の購入、電話・電気の契約など全てを「英語」でし、遮光の必要性を再認識した２年半でもありました。ま

行わねばなりません。幸いこれも徐々に慣れて何とか生きた、あれほど厳密に禁煙を励行しているアメリカ人が、なながらえて帰国することができた次第ですが、日本人がいぜ高発ガン性が明らかな紫外線からの防御を真剣に議論しかに英語（特に聞き取りなどの会話能力）ができないことないのか不思議でもありました。

で国際的に不利益を被っているか身をもって体験しまし最後になりましたが、私の今回のアメリカ留学に際しまた。文部科学省にはこの貧弱な日本の英語教育の改革を早して多大な御援助をいただいた㈶コスメトロジー研究振興

急にお願いする次第です。

財団の関係の皆様に厚く御礼を申し上げるとともに、財団

ヒューストンは日本でいえば奄美諸島くらいの緯度に位のますますの御発展をお祈り申し上げます。

− 175 −

●
事業報告書（平成12 年度）
役員
研究助成課題一覧●

− 178 −

事業報告書事 業 報 告 書

（自平成 12 年４月１日

Ⅰ.

至平成 13 年３月 31 日）

平成 12 年度（第 11 回）事業

昨年に引き続き以下のような事業を計画し、実行しました。
自然科学や社会科学の各分野にわたり、ひろくかかわりをもつ化粧品を総合的に体系化することを目的として①化粧品学の調査・研究に関して顕著な成績をあげた研究者や機関に対して功労金をもってこれを表彰する。
（ 1 件あたり 100 万円）②皮膚の生理機能や老化機構の解明、美容に役立つ素材の研究等化粧品学に関連した生命科学、その他の分野の調査・研究に対する助成を行う。
（ 1 件あたり 200 万円、100 万円、又は 50 万円）③化粧品学の調査・研究にたずさわる研究者の海外派遣や招聘に対して資金援助を行う。
（1 件あたり 50 万円まで）

Ⅱ.

募集及び選考の経過

本年度の各事業につきましては平成 12 年 5 月 8 日より募集を開始し、同 12 年 7 月 7 日をもって締め切りました。
研究助成事業は本年度も一   公募を原則とし全国 239 ヶ所の大学・病院・研究機関等にダイレク
トメールで推薦書を送付するほか、関係学術雑誌 8 誌にも広告し、その結   多数の応募をいただきました。応募者の研究分野が多岐にわたったため、選考委員会の中に３分科会を設け、それぞれにおいて予備選考を行い平成 12 年 9 月 22 日㈮ルビーホールにおいて本選考委員会を開催して受賞候補者を決定し、11 月 20 日の理事会及び評議員会の議決を経て、受賞者を最終決定しました。

Ⅲ.

第 11 回功労賞・研究助成等の結以下のとおり合計 17 件が決定され、研究助成金 1,750 万円が交付されました。

Ⅳ.

功労表彰（小林 孝三郎賞）

0件

研究助成

17 件

国際交流援助0件

会議等
第１回 常理事会
開催日時
開催場所

平成 12 年 6 月 20 日 ˆ∏

東京都中央区日本橋３−６−２

理事総数 12 名
監事

午後２時

2名

本人出席

11 名

出席

2名

㈱コーセー
委任状出席

− 179 −

２階会議室
1 名（賛成）

審議事項
第一号議案

平成 11 年度事業報告ならびに収支決算報告を承認する件配付された資料に基づき、平成 11 年度の事業内容が事務局より詳細に説明され、続いて収支計算、財産内容などが詳しく報告された。次いで小田倉監事より、上記内容が適正適法である旨の監査報告がなされた。
慎重審議の結 、本議案は書 表決者を含め全員一致で可決承認された。
第二号議案

評議員の選任に関する件

当財団第 5 期（平成 10 年 4 月〜平成 12 年 3 月）の評議員の任期満了に伴い、第 6 期（平成 12 年 4 月〜平成 14 年 3 月）の評議員候補として、再任 13 名、新任 1 名、退任 1名の提案がなされ、満場一致で可決承認された。次いで、被選任者は即時、就任を承諾した。
理事長及び専務理事互選の件（評議員会で第 6 期理事・監事の選任の可決、承認を受け新理事会として審議）専務理事より議長代行を行うことの了承を求める提案があり、これが了承された後、次郎氏を理事長に、宮澤

小

林

一

致で可決、承認された。

第三号議案

香氏を専務理事とする提案がなされ、新理事の全員選考委員の選任に関する件

当財団第 5 期の選考委員の任期満了に伴い、第 6 期の選考委員候補として、再任 13 名、新任 1 名、退任 1 名の提案がなされ、満場一致で可決承認された。
第四号議案

株主としての議決権行使について㈱コーセーの第 58 回株主総会においての議決権行使を理事長に一任する旨の提案に対し、株主総会議案と併せて検討された結 、満場一致で可決承認された。
報告事項
平成 12 年度の研究助成事業について研究助成事業、国際交流援助事業、功労表彰の実施計画及び事業経過の概要について
説明がなされ、了承された。
その他
本年 9 月中にコスメトロジー研究報告第 8 号（収載論文 18 編）を発行予定であること、また助成金贈呈式を平成 12 年 11 月 20 日に開催予定であることが報告された。最後に株式分割による基本財産の増加が報告され、いずれも了承された。
第１回 常評議員会

開催日時・場所は第１回 常理事会に同じ。
評議員総数

14 名

本人出席

5名

委任状出席

− 180 −

7 名（賛成） 欠席

2名

事業報告書

審議事項
第一号議案

平成 11 年度事業報告及び収支決算報告を承認する件

理事会の決議を全員一致で確認した。
第二号議案

理事及び監事の選任に関する件

当財団第 5 期の理事・監事の任期満了に伴い、第 6 期の理事候補として、再任 12 名、監事候補として、再任 2 名の提案がなされ、満場一致で可決承認された。次いで、被選任者は即時、就任を承諾した。
報告事項
理事会に同じ。
第２回 常理事会
開催日時

平成 12 年 11 月 20 日㈪開催場所

東京都渋谷区渋谷 2 − 12 − 15

午後 2 時 30 分
日本薬学会長井記念館会議室

理事総数

12 名

本人出席

10 名

監事

2名

出席

  2 名

委任状出席

2 名（賛成）

審議事項
第一号議案

平成 12 年度（第 11 回）研究助成者等を承認する件配付された資料に基づき、平成 12 年度の研究助成課題（17 題）の選定経緯に関する説明がなされた。
慎重審議の結 、本議案は書 表決者を含め全員一致で可決承認された。
第二号議案

平成 13 年度事業計画及び予算案を承認する件配付された資料に基づき、平成 13 年度の事業計画及び、平成 13 年度予算案について
詳細説明がなされた。
慎重審議の結 、本議案は書 表決者を含め全員一致で可決承認された。
第三号議案 （評議員会の議案につき省略）
第四号議案

専務理事の互選に関する件

専務理事である宮澤香氏の辞任に伴い、有本亨氏が理事の互選により専務理事として選任された。
第五号議案
坂本

選考委員の選任に関する件
純選考委員の退任に伴い、後任として光岡俊成氏（厚生省医薬安全局審査管理課）を選考委員として選任したい旨の提案がなされた。
本議案は満場一致で可決承認された。

− 181 −

その他
「研究報告第 8 号」よりＢ 5 版からＡ 4 版に変更し、表紙のデザインも新しくしたこと、及びこれを日本化粧品工業連合会の加盟各社に贈呈する予定であることが報告され、了承された。
第２回 常評議員会
開催日時・場所は第２回 常理事会に同じ。
評議員総数 14 名

本人出席 9 名

委任状出席 4 名（賛成）

欠席 1 名審議事項
第三号議案

理事の選任に関する件

理事の宮澤香氏の辞任に伴い、後任として牧野利孝氏（日本化粧品工業連合会専務理事）を理事として選任したい旨の提案がなされた。
本議案は満場一致で可決承認された。尚被選任者は即時就任を承諾した。
その他理事会の決議を全員一致で確認した。
臨時理事会
開催日時

平成 13 年 2 月 22 日㈭開催場所

東京都中央区銀座 3 − 5 − 12

理事総数 12 名

午前 10 時㈶コスメトロジー研究振興財団

本人出席 4 名

委任状出席 8 名（賛成）

審議事項
第一号議案

株式会社コーセーと株式会社ウッドとの合併契約書承認の件

株式会社コーセーの臨時株主総会（平成 13 年 2 月 23 日）における議案「株式会社コーセーと株式会社ウッドとの合併契約書承認の件」に関し、その議決権の行使を小林礼次郎理事長に一任したい旨の提案がなされ、慎重審議の結 、本議案は書 表決者を含め全員一致で可決承認された。

− 182 −

事業報告書

選考委員会
分科会Ⅰ

開催日時

平成 12 年 9 月 14 日㈭開催場所

東京都千代田区大手町 1 − 5 − 1

審議事項

素材、物性に関する分野の選考

午後 6 時トップオブザスクエア会議室

分科会Ⅱ

開催日時

平成 12 年 9 月 5 日㈫開催場所

東京都千代田区大手町 1 − 5 − 1

審議事項

生体作用、安全性に関する分野の選考

午後 6 時トップオブザスクエア会議室

分科会Ⅲ

開催日時

平成 12 年 9 月 13 日㈬開催場所

東京都千代田区大手町 1 − 5 − 1

審議事項

精神、文化に関する分野の選考

午後 6 時トップオブザスクエア会議室

本選考委員会

開催日時

平成 12 年 9 月 22 日㈮開催場所

東京都千代田区丸の内 1 − 9 − 1

審議事項

各分科会の結 を総合的に判断して助成候補者が決定された。

午後 5 時 30 分
ルビーホール会議室

表彰贈呈式

開催日時

平成 12 年 11 月 20 日㈪開催場所

東京都渋谷区渋谷 2 − 12 − 15

午後 4 時日本薬学会長井記念ホール
以上− 183 −

第 11 回 研究助成を受けられたかたがた（J：一  研究助成）
管理番号J-00-01

J-00-02

J-00-03

研

究

課

題

分

A、B領域紫外線の直接照射によりSCIDマウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防
微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大量生産
皮膚老化の分子メカニズムの解明：老化マウスklothoにおける解析

野

実験病理学
皮膚科学
脂質生化学
微生物育種工学

医学

水分子の移動とその速度制御のための分子膜の開発

J-00-05

ヒト皮膚線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

分子細胞生物学

J-00-06

ヒト皮膚における遊離脂肪酸の動態に及ぼす皮膚常在細菌ならびに化粧品の影響に関する研究

生物分析化学J-00-07

４位置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制
効果

天然物化学
生物有機化学J-00-08

酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発

無機材料化学
希土類化学

J-00-09

逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型
ナノカプセルの創製

J-00-10皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究J-00-11

爪の形状に対するⅦ型コラーゲンの変異がかかわる影響についてJ-00-12

表皮角層細胞間脂質形成に対する上皮型脂肪酸結合蛋白（E-FABP）の機能解析−E-FABPノックアウト
マウスを用いた検討−

生化学
分子生物学
組織学

J-00-13

癌患者への「化粧」技術指導プログラムの日本への適用可能性に関する研究

精神腫瘍学

J-00-15

1

表

研

究

者

大阪大学大学院
医学系研究科助教授

本

行

忠

志

筑波大学応用生物化学系教授

小

林

達

彦

正

彦

群馬大学医学部教授

倉林

コロイド、界面化学 九州大学大学院理学研究院教授
反応速度論
師 井 義 清物理化学

J-00-04

J-00-14代

神奈川歯科大学歯学部教授

畑

隆 一 郎

東京薬科大学薬学部助手

小

谷

明

九州大学大学院農学研究院講師

清

水

邦

義

大阪大学大学院工学研究科助手

増

井

敏

行

生物工学、コロイド化学 九州大学大学院工学研究院助手
物理化学、有機化学
小 野
努
溶液化学、化学工学
細胞生理学

東北大学大学院薬学研究科教授

中

畑

則

道

遺伝性皮膚疾患 北海道大学医学部附属病院助手
分子生物学
松 村 和 子細胞外マトリックス他
東北大学大学院
医学系研究科講師

大和田祐二

東京大学大学院医学系研究科助手

高

橋

都

Ｃ4 配座のグルコース環状六量体、反転シクロデキ
ストリンの創製

有機合成化学糖化学

関西学院大学理学部助教授

紫外線及び化学合成化合物のヘアレスラット皮膚に対する障害作用及びその防御

皮膚科学
炎症薬理学

城西大学薬学部教授− 184 −

山
谷

田

英

俊
覺

事業報告書管理番号

研 究 課 題分野

J-00-16

化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

材料化学

J-00-17

化粧文化史の変遷と流行した化粧の受け入れ方の考察

生活美学

代 表 研 究 者
東北大学反応化学研究所助手

白 井 誠 之武庫川女子大学大学院
家政学研究科院生

玉 置 育 子
（敬称略

− 185 −

受付順）

役

員

平成 13 年 3 月 31 日現在

理事長

小林禮次郎

㈱コーセー代表取締役会長

専務理事

有本

亨

理

事

磯邊

律男

理

事

宇佐美昭次

早稲田大学理工学部教授

理

事

内山

充

㈶日本薬剤師研修センター理事長

理

事

小林

保清

㈱コーセー代表取締役社長

理

事

菅原

正文

高砂香料工業㈱代表取締役会長

理

事

橋

久

理

事

西川 武二

慶應義塾大学医学部教授

理

事

花輪

隆昭

昭和館

理

事

廣部

雅昭

静岡県立大学学長

理

事

牧野

利孝

日本化粧品工業連合会専務理事

監

事

小田倉正典

公認会計士

監

事

黒田 節哉

弁護士

評議員

上野

芳夫

東京理科大学薬学部教授

評議員

緒方

宏泰

明治薬科大学教授

評議員

北原

文雄

東京理科大学名誉教授

評議員

近藤

保

東京理科大学名誉教授

評議員

齊藤

勲

㈳東京医薬品工業協会理事長

評議員

長野

哲雄

評議員

西岡

清

評議員

野田 裕充

㈱コーセー常務取締役

評議員

野呂 影勇

早稲田大学人間科学部教授

評議員

福内

靖男

慶應義塾大学医学部教授

評議員

溝口 昌子

聖マリアンナ医科大学教授

評議員

宮

榮三

千歳科学技術大学教授

評議員

山崎

幹夫

千葉大学名誉教授

評議員

渡辺

徹

㈱博報堂取締役相談役

帝京大学名誉教授
館長

東京大学薬学部教授
東京医科歯科大学医学部教授

日本薬剤師会専務理事− 186 −

研究助成課題一覧

１

素材、物性に関する分野
管理番号

J 90-03

J 90-06

研

究

課

題

分

リン脂質膜の表面修飾と分子集合体としての機能発現に関する研究
ヒアルロン酸で表面を修飾したリポソームからの内容物の温度による放出制御

野

界面物理化学

薬品物理化学代表

研

究

筑波大学化学系助教授

古

澤

邦

牧

野

公

高分子合成

J 90-15

皮膚への作用性を有する各種糖脂質の合成

有機合成化学J 90-16

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関
する研究

衛生化学

J 91-02

生体適合性逆型ベシクルの生成、安定化と応用に関
する研究

溶液論
界面化学

J 91-05

新しいDDS剤型としての高分子ミセルの設計と機能
開発

高分子合成
DDS

J 91-06

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の開発

応用生物化学J 91-08

化粧品素材としての竹節人参並びに甘草の組織培養による物質生産並びに大量増殖に関する研究

生薬
薬用生物学

広島大学医学部助教授

J 91-10

界面活性剤を含む溶液混合系の相挙動と濡れの挙動に関する研究界面化学
物理化学

九州大学理学部助教授

J 91-11

超微粒子分散系の構造と物性及び自己制御コロイド
系の開発

高分子物性
コロイド物性京都大学工学部助手

J 91-20

各種界面活性物質によるマクロ及びマイクロエマル
ションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

応用界面化学

ヒトリゾチームタンパク質を高分泌する酵母突然変

分子生物学

広島大学理学部助手

異体を用いた素材生産の効率化研究

遺伝学

鈴

化粧品の紫外線照射による光酸化メカニズムの研究

物理化学
界面化学

− 187 −

子

早稲田大学理工学部教授

皮膚DDSとしての高分子脂質リポソームの基礎研究

J 92-03夫

東京理科大学薬学部助手

J 90-07

J 92-01

者

西

出

宏

之

千葉大学薬学部助教授

中

川

昌

子

国立衛生試験所
環境衛生化学部長

武

田

明

治

横浜国立大学工学部助教授

国

枝

博

信

東京理科大学
生命科学研究所助教授

片

岡

一

則

早稲田大学理工学部専任講師

桐村 光太郎
神
荒
松

田

博

殿
本

史
誠

孝

芳

東京理科大学理工学部講師

阿

部
木

正
克

彦
周

明星大学理工学部教授

日

高

久

夫

管理番号

研

究

課

題

分

野

代

表

研

究

者

昭和薬科大学薬学部講師

J 92-04

水素添加大豆リン脂質を用いた油性ゲル及び水性ゲ
ルの保湿作用に関する研究

JA-93-05

細胞膜の脂質の物性と機能の基礎的な研究−リン脂質物性のコスメトロジーへの応用−

生体物性学
細胞生物物理学

東北大学理学部教授

JA-93-06

化粧品基本素材金属酸化物の酸性大気汚染物質との
相互作用

物理化学
固体界面化学

千葉大学理学部教授

JA-93-08

新規な構造を有するヒアルロン酸類似多糖の開発

糖鎖工学
高分子化学

東京工業大学生命理工学部助教授

JB-93-01

ペプチドシナージストによるビタミンＥの抗酸化能の向上−ヒト血清アルブミン由来のペプチドシナー
ジストの開発−脂質生化学

水産大学校講師

食品化学

幡JB-93-02

層状鉱物を用いたホスト−ゲスト反応による有機色

薬剤学

無機材料化学

藤 井
大
金
畑

ま き 子

木
子
中
手

和
克

一

英

雄

早稲田大学理工学部助教授

粘土科学

菅

ハーダー腺の分泌するアルキルジアシルグリセロー

生化学

東京大学医学部教授

ルの物性解明とその素材としての応用開発

脂質生化学

脊

JA-94-02

植物組織培養法を用いたクチナシ植物からの橙黄色
色素Crocin及び青色色素イリドイド配糖体の生成に関する研究

植物細胞工学

JA-94-04

植物培養細胞・組織による化粧品素材としての活性成分の生産と育種に関する研究

JA-94-07

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸γ−リノレン酸の高等植物における多量生産

JA-94-10遠赤外線の水の構造と物性に及ぼす影響及び遠赤水の保湿効果に関する研究

JB-94-05

弾 性 線 維 蛋 白 質 エ ラ ス チ ン の 自 己 組 織 化 集 合 体の 構
造、物性、機能に関する研究

物理化学
生体物性学

九州大学理学部助手

JB-94-06

バ イ オ シ グ ナ ル 分 子 を 固 定 化 し た 細 胞 成 長 促 進タ ン
パク質ハイブリッド材料の合成

生体材料化学
高分子化学

京都大学工学部助手

JA-95-01

材料表面−生体分子間相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

高分子化学− 188 −

原
山

義
洋

之
右

東京理科大学総合研究所助教授

生田 安喜良九州大学薬学部教授
生薬学
植物細胞・組織培養
正 山 征
植物生理学
植物細胞工学美研

素のカプセル化

JA-94-01

夫

洋

九州大学理学部助教授

射

場

厚

静岡県立大学薬学部助教授
物理化学（薬学・医学系）
片 山 誠 二

甲斐原
伊

藤

梢
嘉

浩

九州大学工学部助教授

高

原

淳

研究助成課題一覧

管理番号

研

究

課

題

分

野

JA-95-06

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究

高分子化学
生体材料学

JA-95-07

オリゴ糖による皮膚の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究

生体分子工学

JA-95-10

両親媒性分子が構築する超分子の構造と機能性に関する研究

超分子物性化学
高分子物性

JB-95-02

光学活性化合物合成を目的とする新規不斉触媒及び新規不斉触媒サイクルの開発研究

有機合成化学

単分散無機顔料粒子のモルフォルジー制御とそのキ

コロイド化学

JA-96-02

ャラクタリゼイション

JA-96-05

合成糖脂質の超分子集合体に関する研究

JA-96-07

高分子経皮吸収促進剤の開発と応用研究

JA-96-08

界面化学
高分子化学
高分子物性
高分子化学
製剤学

新発見の糊代を持ったタンパク質の基礎と応用（タンパク質接着能を有する化粧品素材の開発）

生物化学

代

表

研

究

者

東京医科歯科大学
医用器材研究所助教授

石

原

一

彦

東京工業大学生命理工学部教授

井

上

義

夫

名古屋大学理学部助教授

今栄 東洋子早稲田大学理工学部助教授

中

田

雅

久

大阪教育大学教育学部助教授

神

鳥

和

彦

早稲田大学理工学部助教授

武

岡

真

司

相模中央化学研究所主任研究員

長

瀬

裕

東京工業大学生命理工学部教授

広

瀬

茂

久

食用乳酸菌による化粧品素材としての機能性多糖の生物材料化学

新潟大学工学部教授

生産とその改質

応用生物化学谷JB-96-03

メラニン生合成阻害作用を示す海洋天然物の探索

生薬学
天然物化学

北海道大学薬学部教授

JA-97-01

微粒子酸化チタン上に形成された多鎖型界面活性剤
吸着層への紫外線吸収剤の吸着可溶化

コロイド
界面化学

東京理科大学理学部教授

JA-97-02

新規な機能を有するコラーゲンの創製

JA-97-03

脂質エマルション表面単分子膜とリポソーム表面２分子膜の示す顕著なバイオ機能の差異

界面化学
製剤物理化学

京都大学大学院薬学研究科教授

JB-97-03

植物由来環状ペプチド類のチロシナーゼ阻害活性に
関する研究

生薬
天然物化学

東京薬科大学薬学部助教授

JB-96-02

小
江

口
林
角

正
淳
邦

之
一
男

生物化学
東京工業大学生命理工学部助教授
分子生物学
斎 藤 佑 尚バイオテクノロジー− 189 −

半
竹

田
谷

哲
孝

郎
一

管理番号
JB-97-07

JA-98-03

JA-98-05

JB-98-01

JB-98-07

JB-98-11

JB-98-13

研

究

課

題

分

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

野

コロイド界面化学

古細菌由来のエーテル型リン脂質の物性と機能に関する基礎的な研究

森林生物資源からの育毛活性化成分の探 索

研

究

五

島

綾

森林生物化学

九州大学農学部助教授

天然物化学

近藤

化機構の多面的解析

化学物理者

静岡県立大学経営情報学部助教授

生物有機化学

高分子物性

遺伝子の増殖を制御する人工の脂質膜の開発

表東京工業大学大学院
理工学研究科助教授

動的光散乱法を用いた合成および天然高分子のゲル

化粧品による皮膚かぶれを防ぐ菌類成分の探索

代

江

口

子

正
隆一郎

京都工芸繊維大学繊維学部教授

柴

山

充

弘

薬理活性天然物化 千葉大学薬学部助教授

藤

学
生物化学
脂質化学
界面化学

本

治

宏

九州大学有機化学
基礎研究センター助教授

石

川

雄

発光、電子分光スペクトルによる酸化亜鉛中の表面

酸化物半導体物性 東京工業大学工学部助手

・欠陥の状態解析と発光特性制御（ 粉体の光学的性質）

大

橋

直

一
樹

北里大学看護学部助教授

含フッ素非対称置換トレハロース誘導体の合成と皮糖質生化学

膚に対する保湿性と親和性の検討

有機合成化学

JA-99-01

匂いの感性計測を行うセンサーシステムの開発

感性工学
センサー工学

JB-99-01

新規化粧品素材としての植物由来クロロゲン酸代謝産物の配糖体合成と美白効果ならびに感作性の検討

有機合成化学

JB-99-03

分散安定性に優れたサーファクタントフリーエマル
ションの調製法の確立とその凝集・合一過程の解明

界面化学
コロイド化学
物理化学

JB-99-09

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

応用生物化学

JB-99-14

分子量および官能基を制御した新規キトサン系界面活性剤の機能化に関する研究

糖鎖工学
応用界面化学
生物化学工学

東京工業大学大学院
理工学研究科教授

J-00-02

微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大
量生産

脂質生化学
微生物育種工学

筑波大学応用生物化学系教授

JB-98-14− 190 −

森

島

直

彦

九州大学大学院
システム情報科学研究科教授

都

甲

潔

近畿大学工学部教授

野

村

正

人

東京理科大学理工学部教授

阿

部

正

彦

早稲田大学理工学部教授

木

梶
小

野

内
林

邦

俊
達

器

夫
彦

研究助成課題一覧

管理番号

研 究 課 題分

J-00-04

水分子の移動とその速度制御のための分子膜の開発

J-00-07

４位置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制
効果

天然物化学
生物有機化学J-00-08

酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発

無機材料化学
希土類化学

J-00-09

逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型
ナノカプセルの創製
1

野

コロイド、界面化学 九州大学大学院理学研究院教授
反応速度論
師 井 義 清物理化学
九州大学大学院農学研究院講師

清 水 邦 義大阪大学大学院工学研究科助手

増 井 敏 行生物工学、コロイド化学 九州大学大学院工学研究院助手
物理化学、有機化学
小 野
努
溶液化学、化学工学

J-00-14

Ｃ4 配座のグルコース環状六量体、反転シクロデキ
ストリンの創製

有機合成化学糖化学

J-00-16

化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

材料化学− 191 −

代 表 研 究 者

関西学院大学理学部助教授

山 田 英 俊東北大学反応化学研究所助手

白 井 誠 之

研究助成課題一覧

２

生体作用、安全性に関する分野
管理番号

研

究

課

題

分

野

J 90-01

染毛剤成分の代謝に関する研究

薬物代謝J 90-02

ドレイズ試験代替法の開発−ヒト細胞、昆虫細胞を用いた高感度迅速試験法の開発研究−

組織培養学

J 90-05

胆汁酸生合成のメカニズムに関する研究

生物有機化学J 90-08

皮膚の老化に伴うエラスチン遺伝子発現の動態

皮膚科学

J 90-09

Werner症候群患者皮膚由来培養線維芽細胞のサイト
カイン細胞成長因子に対する応答性

皮膚科学

J 90-10

光化学反応によるフリーラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影響

医科学
生化学

J 90-11色素性皮膚病変に対するレーザー療法の研究

皮膚科学

J 90-12

表皮糖脂質の生化学的、形態学的並びに臨床的研究（エピデルモシド）

皮膚科学
生化学

J 90-13

生体の酸化的障害に対する防御機構の生化学的研究−ビタミンＥの活性発現機構の解析−

生化学

J 90-14

皮膚生理機能賦活物質の経皮吸収に対する評価解析
理論の確立

薬剤学

J 91-01

培養表皮細胞及び線維芽細胞におけるグリコサミノ
グリカン及びコラーゲンの代謝生化学

J 91-03

活性酸素、フリーラジカルによる生体膜障害の防止に関する研究有機生化学

J 91-04

パッチテスト結果のコンピューター処理システムの
開発

皮膚科学
接触皮膚炎

J 91-07

皮膚過敏症に対するマスト細胞の役割−マスト細胞
欠損動物を用いた検定法の開発−

実験病理学− 192 −

代

表

研

究

者

食品薬品安全センター秦野研究所

中尾 美津男理化学研究所副主任研究員

大

野

忠

夫

東京工業大学理学部助教授

藤

本

善

徳

慶應義塾大学医学部講師

多

島

新

吾

横浜市立大学医学部助手

佐々木 哲雄東京大学医科学研究所教授

金ヶ士朗

帝京大学医学部助教授

渡

辺

晋

一

山口労災病院皮膚科部長

浜中 すみ子東京大学薬学部助手

新

井

洋

由

京都大学薬学部教授

瀬仁

東京薬科大学教授

森

陽

東京大学

先端科学技術研究センター教授

二

木

鋭

雄

名古屋大学
医学部附属病院分院皮膚科長

早

川

律

子

大阪大学医学部教授

北

村

幸

彦

研究助成課題一覧

管理番号

研

究

課

題

分

J 91-09

マウス悪性黒色腫を用いたチロシナーゼ抑制因子の精製と応用

J 91-12

光アレルギーのスクリーニング及びサンスクリーン

接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品によるの効果の評価J 91-14

メラニン生合成の調節

J 91-16胞の増殖とコラーゲン代謝調節機構の分子細胞生物学的研究

J 91-18

人工皮膚を用いた皮膚の形成機構及び皮膚の反応性試験に関する研究
サンスクリーンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

代

表

研

究

皮膚科学
メラニン色素北里大学医学部講師

光生物学
皮膚免疫

浜松医科大学教授

分子生物学

ビタミンＣと上皮成長因子によるヒト皮膚線維芽細

J 91-17野

分子細胞生物学
医化学

細胞生物学

皮膚科学

亀山 孝一郎
滝

川

雅

柴

原

茂

畑

隆一郎

広島大学理学部教授

吉

里

勝

古

川

福

実

慶應義塾大学医学部助手

環境科学の老化機構解明に関する研究

毒性学

J 92-02

光熱変換分光法による薬物の組織及び細胞への非侵襲吸収計測法の開発

分析化学

J 92-05

アスパラギン酸プロテアーゼ類の蛋白工学的機能改変によるケラチナーゼの開発

蛋白工学
生化学

東京大学理学部助手

J 92-06

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその
特異的制御

内科学
アレルギー学

千葉大学医学部助手

J 92-07

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

J 92-08

転移因子を用いたアントシアニン色素生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析

分子遺伝学
分子生物学

J 92-09

モノクローナル抗体を用いた紫外線誘発DNA損傷の定量とメラニン色素のサンスクリーン効果の実験的
証明

皮膚科学

− 193 −

利

京都大学医学部講師

フリーラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚生化学

樹

東京医科歯科大学助手

老年病学
動脈硬化

J 91-22浩

東北大学医学部教授

ダイレクトスキンセンサーを用いて測定した皮溝と加齢の関係

J 91-19

者

本

間

聡

起

国立公衆衛生院
労働衛生学部室長市

川勇

東京大学工学部教授

澤
井
岩

田
上
本

嗣
英
逸

郎
史
夫

新潟大学医学部教授

小

野

輝

夫

東京理科大学基礎工学部教授

飯

田

滋

奈良県立医科大学大学院生

小

林

信

彦

管理番号

研

究

課

題

分

野

J 92-10

皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究

細胞生理学

J 92-11

アスコルビン酸２−グルコシドの生物学的有用性研
究−経皮吸収によるビタミンＣ活性発現の評価−

免疫薬理学

JA-93-01

還元型ネオプテリン（NPH−４）の紫外線照射皮膚障害に対する効果

JA-93-02

JA-93-03

JA-93-07

JA-93-09

JB-93-04

放射化学
薬理学

代

表

研

究

理化学研究所主任研究員

花

岡

文

山

本

格

東京理科大学
生命科学研究所講師

小

化粧品による光老化の抗酸化的制御に関する細胞生
物学的及び生化学的研究

皮膚科学
紫外線生物学

群馬大学医学部教授

宮

島
地

周
良

太陽光紫外線でヒトDNA中に誘発される損傷とその放射線生物学

金沢大学薬学部教授

修復に関する研究

細胞生物学

二 階 堂

色素化合物の光照射下での反応の解析

生物物理化学
光化学治療
光増感化学

しみ

（肝斑など）の発症機構とその増悪因子に関する研究
尋常性瘡の発症機序の解明のための皮膚の保湿機

能と脂質代謝に関する研究

皮膚科学

皮膚科学

二
樹
修

東京工業大学生命理工学部教授

大

倉

一

郎

東北大学医学部講師

富田靖

新潟大学医学部助教授

山

本

綾

JB-93-05

哺乳類皮膚細胞のアポトーシスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

糖生物学
発生生物学
生化学

JB-93-06

不飽和脂肪酸とその過酸化生成物の皮膚角質層への作用に関する研究

製剤学

JA-94-03

表皮ケラチノサイトにおけるヒト細胞老化因子の研究皮膚科学

JA-94-06

皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

薬剤学

JA-94-08

リポソーム封入薬剤の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用

生体物理化学
生体医用化学

九州大学薬学部教授

JA-94-09

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝
達

皮膚科学
細胞生物学

岐阜大学医学部教授− 194 −雄

岡山大学薬学部教授

生化学

いわゆる

者

子

九州大学理学部助教授

野

村

一

也

大阪薬科大学薬学部助教授

森

本

一

洋

大阪大学医学部助教授

橋

本

公

二

京都大学薬学部教授

橋
内
北

田
海
島

充
英
康

雄
雄

研究助成課題一覧

管理番号

研

究

課

題

分

野

代

表

研

究

東京工業大学
生命理工学部助教授

JA-94-11

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジーへ
の応用

遺伝子工学
生化学

JB-94-01

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ・トランスジェニックマウスを用いた皮膚の成熟過程の検討

皮膚科学
遺伝子工学

京都大学医学部助手

JB-94-02

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影響

環境生理学
温熱生理学

金沢大学医学部助手

JB-94-03

サンスクリーン剤の光ハプテンとしての性格

皮膚科学

JA-95-02

脂質皮膚モデルを利用した化粧品及び水の浸透と安全性に関する基礎的研究

生物物理化学
高分子物性

JA-95-03

小分子化学物質によるアトピー性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究

免疫薬理学

JA-95-04

ヒト皮膚移植SCIDマウスを用いた新しいコスメトロ
ジー研究

実験病理学

JA-95-08

接触皮膚炎におけるマスト細胞活性化反応の解析

生化学

JA-95-09

放射線照射あるいは制癌剤投与による脱毛の抑制

生化学
放射線生物学

星薬科大学講師

JB-95-01

皮膚表皮細胞におけるリピドバイオファクターの機
能発現機構

生化学
分子生物学

新潟大学医学部助教授

炎症後色素沈着におけるエイコサノイドによるメラ皮膚科学

京都大学医学部助教授

ノサイト活性化機構の解明

生化学

井

細胞生化学

九州大学理学部教授

分子生物学

藤

JB-95-03

JB-95-04

細胞内小器官ペルオキシソーム：エーテルリン脂質の生合成と酸素ラジカルスカベンジャー機能及び欠損症

JB-95-06

多成分油性皮膚浸透促進システムの有効性及び作用機構に関する研究

製剤学

JA-96-01

化粧用生理活性物質の皮膚透過と皮内貯留性及びヒト皮膚と動物並びに培養皮膚との比較

生物薬剤学
皮膚科学

− 195 −

者

中
田
田

村
中

聡
俊

辺

宏
実

浜松医科大学医学部講師

戸

倉

新

樹

東京工業大学工学部助教授

谷

岡

明

彦

博

弌

岐阜薬科大学教授

永井

大阪大学医学部教授

野

村

大

成

昭和大学薬学部教授

工
太
藤

藤
田

一

郎

節

子

井
階
木

博
幸
幸

一
夫

城西大学薬学部助教授

杉

林

堅

次

近畿大学薬学部教授

小木曽 太郎

管理番号

研

究

課

題

分

野

代

表

研

究

者

JA-96-03

酸化ストレスにより生体膜に生成する酸化型リン脂質の代謝機構の解明

生化学
薬学

北里大学薬学部教授

JA-96-06

HGFによる皮膚の再生促進と老化防止の基礎的研究

生化学
細胞生物学

大阪大学医学部助教授

JA-96-09

in vitroヒト樹状細胞培養系を用いた化学物質の感作性試験の可能性についての基礎的検討

皮膚科学
皮膚免疫

東北大学医学部講師

JA-96-10

ケラチノサイトの発現するエラスチンと皮膚老化の関連について

皮膚科学
生化学
分子生物学

防衛医科大学校助教授

JB-96-05

免疫不全マウス再構成皮膚における培養毛乳頭細胞による毛包形成の誘導と関連因子の検討

皮膚科学

JB-96-06

細胞増殖因子および接着分子による皮膚硬化制御に関する分子生物学的研究

皮膚科学
膠原病学

獨協医科大学助教授

JA-97-04

男性ホルモンによる毛の発育制御機序の解析

皮膚科学
内分泌学

大阪大学医学部助教授

JA-97-05

新規蛍光プローブを用いた一酸化窒素（NO）の皮膚における作用解析

有機化学
分析化学
細胞生物学

東京大学大学院薬学系研究科助手

JA-97-06

生体計測工学に基づいた非侵襲的な皮膚の性状の測
定法の開発

皮膚科学
化粧品科学
生体工学
医用工学

JA-97-07

老化による皮膚色素沈着の画像定量自動解析システ
ム確立のための基礎研究

皮膚科学

JB-97-01

接触過敏症の皮膚浸潤細胞に特異的に発現している遺伝子の解析

免疫学
分子生物学

JB-97-02

ノックアウトマウスをもちいたcell envelopeのバリア
ー機能解析

分子生物学
発生工学
遺伝子工学
皮膚科学

JB-97-04

紫外線吸収効果をもつ酸化チタンの光触媒作用と生
体適合性

生体材料

JB-97-05

日光老化について−とくに日光弾性線維症の発症機構ならびにUVＳ症候群の病態に関する研究−− 196 −

皮膚科学
生化学
分子生物学

中
松
相
多

川
本
場
島

靖
邦
節
新

一
夫
也
吾

聖マリアンナ医科大学助教授

窪
山
板
菊

田
蔭

泰
明

見
地

夫
生
智

和

也

東北大学医学部教授

田

上

八

朗

慶應義塾大学医学部専任講師

田

中

勝

東邦大学理学部教授

小

林

芳

郎

京都府立医科大学医学部講師

山

西

清

文

東京理科大学基礎工学部助教授

鈴

木

高

広

熊本大学医学部教授

小

野

友

道

研究助成課題一覧

管理番号

JB-97-06

研

究

課

題

分

眼粘膜への障害を指標とした化粧品素材の安全性評
価 の た め の 基 礎 的 検 討 − 眼 内 動 態 の 定 量 的評 価 法 の

野

薬剤学

確立

代

表

研

究

長崎大学薬学部教授中村純

紫外線誘発DNA損傷および修復酵素の細胞内分布状
態の三次元的表示

放射線生物学JB-97-10

皮膚器官培養系を用いた化学物質の刺激性、抗原性
の検討

免疫学
アレルギー
分子生物学

JB-97-11

皮膚の老化に伴うテロメア短縮化とフリーラジカル
障害に対する、細胞内アスコルビン酸のエンリッチ
ング化による防御効果

皮膚生化学
細胞薬理学

JA-98-01

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした
抗酸化剤評価への応用

生体物理化学

JA-98-02

ヒト角層細胞のcell envelopeの発生とその機能障害を来す病態の解析皮膚科学

JA-98-04

微小透析法を用いた皮膚内の化粧品素材動態および生体成分動態の系統的解析法の確立

臨床薬剤学

JB-98-02

接触性皮膚炎の研究：皮膚刺激とマクロファージ「細胞交通」の関与

免疫学
アレルギー学JB-98-03

老化抑制遺伝子klothoの結合織細胞老化における病態生理学的意義の解明と治療法開発への応用

老化学

JB-98-04

サンスクリーンの皮膚悪性黒色腫発症予防効果の解
析

免疫学
皮膚科学

名古屋大学医学部助手

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構

薬品物理化学

東北大学薬学部講師

探求

生物有機化学鈴

JB-98-06

JB-98-08

JB-98-09

表皮有棘細胞に特異的な遺伝子組み替えを用いた、ダメージスキンの修復機序の研究
太陽光紫外線変異原性の作用スペクトラムとサンス
クリーンの効果ヒト毛細胞特異的ペプチジルアルギニンデイミナーゼのcDNAクローニングと毛髪新生における生理機能の解析− 197 −

皮膚科学
分子生物学
細胞生物学
変異機構学
皮膚科学
生化学
分子生物学

三

奈良県立医科大学助教授

JB-97-08

JB-98-05

者

森

俊

雄

東京医科歯科大学医学部助教授

横

関

博

雄

広島県立大学大学院
生物生産システム研究科教授

三

羽

信比古

放射線医学総合研究所総合研究官

小

澤

俊

彦

慶應義塾大学医学部助手

秋

山

真

志

長崎大学医学部附属病院助教授

佐 々 木

均

静岡県立大学薬学部教授

今

井

康

之

群馬大学医学部教授

永
加

井
藤

良
昌

木

三
志
巌

京都大学大学院医学研究科助手

高

橋

健

造

岡山大学薬学部助教授

根

岸

友

惠

帝京大学医学部
附属市原病院助教授

川

田

暁

管理番号

JB-98-12

JA-99-02

JA-99-03

JB-99-02

研

究

課

題

分

美白剤の紫外線色素沈着抑制機構とその安全性に関する研究
ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロー
ル代謝調節機構
高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用
ヒト脂腺細胞に代るハムスター脂腺細胞を用いた皮脂代謝に関する基盤的研究

野

皮膚科学

分子細胞生物学
生化学

表

研

究

者

神戸大学医学部附属病院講師

船

坂

陽

佐

藤

隆一郎

広島大学医学部教授

生化学
分子生物学

東京薬科大学薬学部講師

JB-99-04

細胞生理学

JB-99-05

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

毒性生化学
皮膚生化学

JB-99-06

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

生化学
糖鎖生物学

JB-99-07

白血球分画が皮膚の健康状態と関連するメカニズム

免疫学
皮膚科学

JB-99-08

UVAによる酸化的遺伝子損傷の細胞内修復機構

生化学
放射線生物学

JB-99-10太陽紫外線による細胞のアポトーシスとサンスクリーンの効果

放射線生物学

JB-99-11

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

細胞外マトリックスの分子医化学

JB-99-13

皮膚色素性病変の新しい診断法の開発〜デジタルマ
イクロスコープと病理組織三次元再構築法を用いた
早期メラノーマ診断〜

皮膚科学

J-00-01

A、B領域紫外線の直接照射によりSCIDマウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防

実験病理学
皮膚科学

J-00-03

皮膚老化の分子メカニズムの解明：老化マウスklothoにおける解析

医学子

大阪大学大学院
薬学研究科助教授

遺伝子治療学
遺伝子工学

紫外線照射で生じるDNA損傷部位に特異的に結合す
るタン白 DDBp 48 の発現調節− 198 −

代

杉
佐

山

政

藤

則
隆

熊本大学医学部附属
遺伝発生医学研究施設教授

山

泉

克

昭和大学薬学部教授

吉

田

武

美

大阪大学大学院
医学系研究科教授

谷

口

直

之

新潟大学医学部教授

安保徹

広島大学大学院
理学研究科教授

井出博

放射線医学総合研究所主任研究官

古

澤

佳

也

東京医科歯科大学
難治疾患研究所助手

堀久枝

北海道大学医学部助手

松

村

哲

理

大阪大学大学院
医学系研究科助教授

本

行

忠

志

正

彦

群馬大学医学部教授

倉林

研究助成課題一覧

管理番号J-00-05

J-00-06

J-00-10J-00-11J-00-12J-00-15

研 究 課 題分

ヒト皮膚線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構
ヒト皮膚における遊離脂肪酸の動態に及ぼす皮膚常在細菌ならびに化粧品の影響に関する研究
皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究爪の形状に対するⅦ型コラーゲンの変異がかかわる影響について野

分子細胞生物学

生物分析化学細胞生理学

代 表 研 究 者
神奈川歯科大学歯学部教授

畑

隆 一 郎

東京薬科大学薬学部助手

小 谷

東北大学大学院薬学研究科教授

中 畑 則 道

遺伝性皮膚疾患 北海道大学医学部附属病院助手
分子生物学
松 村 和 子細胞外マトリックス他

表皮角層細胞間脂質形成に対する上皮型脂肪酸結合蛋白（E-FABP）の機能解析−E-FABPノックアウト
マウスを用いた検討−

生化学
分子生物学
組織学

東北大学大学院
医学系研究科講師

紫外線及び化学合成化合物のヘアレスラット皮膚に

皮膚科学
炎症薬理学

城西大学薬学部教授

対する障害作用及びその防御− 199 −

明

大和田 祐二谷覺

研究助成課題一覧

３

精神、文化に関する分野
管理番号

研

究

課

題

分

野

表

研

究

者

早稲田大学人間科学部教授

J 90-04

化粧が意識性に及ぼす効果の研究

J 91-13

香料に関する定量的解析

感覚生理学

J 91-15

アルツハイマー型老年痴呆症者と、いわゆる ぼけ症状を呈する人々への化粧による情動活性化の研究

感情心理学
臨床心理学

同志社大学文学部教授

J 91-21「色白」の嗜好構造に関する一考察

心理学
色彩心理学
造形心理学

早稲田大学
人間総合研究センター

Js-92-01

病院看護における化粧に関する研究

基礎看護学

Js-92-02

高齢者のおしゃれ行動とその評価に関する研究

人間行動科学

JA-93-04

色彩の心理学的意味空間の研究

計量心理学
認知心理学
行動計量学

JB-93-03

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

社会心理学

JA-94-05

化粧と痴呆老人に関する基礎的研究

脳神経外科学
心理学

産業医科大学名誉教授

JB-94-04

対人魅力の形成にかかわる顔の構造的特徴と化粧行動の影響の研究

社会心理学
対人魅力

北星学園大学文学部教授

JA-95-05

化粧皿を通じた古代ヘレニズム世界における化粧文
化の研究

装飾文化
デザイン

神戸芸術工科大学助教授

JB-95-05

化粧品の表示に関する研究−ことに警告表現につい
て−

社会心理学

JA-96-04

化粧品の香り表現に関する研究

心理学
官能評価

高齢女性における情動活性化の試み：リハビリテー

情動心理学

ション・プログラムへの適用可能性の検討

発達心理学

JB-96-04

心理学

代− 200 −

春木豊

北海道大学薬学部教授

栗

原

浜

齋

堅

三

治 世 子

藤

美

穂

埼玉県立衛生短期大学教授

大河原

千鶴子

北海道教育大学教育学部助教授

藤

森

立

男

金沢大学文学部助教授

岡

本

安

晴

福島大学教育学部助教授

飛
松
大
服

田
岡
坊
部

操
成
郁
等

明
夫
作

筑波大学社会工学系講師

吉

川

肇

子

東京学芸大学教育学部助教授

神

宮

英

夫

同志社大学
文学部学生（博士課程）

伊

波

和

恵

研究助成課題一覧

管理番号

研

究

課

題

分

野

代

表

研

究

者

高齢者の被服行動の変容が、高齢者の自尊感情及び日常生活行動に与える影響

行動学
老年心理学
臨床心理学

京都大学教育学部助教授

JB-97-09

JB-97-12

健康な笑いづくりの方法について

感情心理学
健康心理学

福岡大学人文学部教授

JB-98-10

化粧とよそおいにおける非対称性−アシンメトリー流行の可能性−

造形心理学
社会心理学

神戸松蔭女子学院大学文学部教授

JB-98-15

空間演出における環境芳香の与える心理的影響に関
する研究

人間工学

JB-99-12口唇口蓋裂患者の顔面の非対称感の改善に対する化
粧の効果

J-00-13

癌患者への「化粧」技術指導プログラムの日本への適用可能性に関する研究

精神腫瘍学

J-00-17

化粧文化史の変遷と流行した化粧の受け入れ方の考察

生活美学− 201 −

吉

川
下

藤

本

左紀子
保
浩

幸
一

早稲田大学人間科学部助手

河

合

隆

史

顎顔面口腔外科学 大阪大学歯学部助手
心理学
飯 田 征

二

東京大学大学院医学系研究科助手

高

橋

都

武庫川女子大学大学院
家政学研究科院生

玉

置

育

子

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財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒104− 0061 東京都中央区銀座三丁目 5 番12号
電話 03（3564）6731

コスメトロジー研究報告

Vol. 9 ／2 001

非売品

2001年９月１日発行

編集責任者
発
行

制

作

印

刷

Ⓒ2001

有本 亨
財団法人

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エイエム企画〒170− 0013 東京都豊島区東池袋三丁目15番２号
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