紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節
熊本大学

山発生医学研究センター

泉

克Cell strains from a subset (Ddb-) of individuals carrying XP complementation group E (XPE) lack a damagespecific DNA binding (DDB) activity. Because DDB was reported to recognize many types of DNA lesions and isinducible by treatment with DNA- damaging agents in a p53-dependent manner, DDB was originally expected toplay a role in damage recognition prior to nucleotide excision repair. However, recent studies have reported thatDDB is not required for nucleotide excision repair in vitro. Thus, its function is still remaining uncertain. Here,
we reinvestigated the classification of three Ddb+ XPE cells and found that they belong to other complementationgroups of XP and UVsS. We analyzed the putative p53 responsive element in the intron 4 of the DDB2 gene,and found that it has a week binding activity to p53 as determined by a gel-shift assay, and that it stimulates
transcription of a reporter gene containing the element when co-expressed with wild type p53.

１．緒

p 53 RE） に 適 合 す る 配 列 を 見 出 し て い る。 本 研 究 は、

言

XPE と DDB 2 との関係を明らかにした上で DDBp 48 の調

太陽紫外線の被爆により、皮ふ細胞の DNA にはピリミ節機構を解明し、これを基盤としてその発現を人為的にコジン２量体や（6 - 4）光産物に代表される傷が生じる。こントロールすることで皮ふの老化等の防止に応用可能かどれらの傷の蓄積が加齢に伴う皮ふ老化の重要な要因と考えうかを検討するために企画された。

られる。DDB（Damaged DNA binding protein）は太陽

２．実光による DNA の傷のうち、主として（6 - 4）光産物に高い親和性で結合するタン白として見つかり、p 127（DDB 1）

２. １

験

DNA 修復異常の検出と p 48（DDB 2）のヘテロ２ 体であることが既に報告さ既に XPE と診断された患者のうち、DDB 活性（+）のれている。このうち DDB 1 は DNA 上の損傷部 への結合細胞株３株について、DNA 修復異常の指標ではある不定に関与し、一方 DDB 2 は DDB 1 の結合活性化に関与し期 DNA 合成能（UDS）、RNA 合成能の回復（RRS）、Ｓているといわれている。DNA 修復異常症である色素性乾期 DNA 合 成 能（RDS）、 及 び 複 製 後 修 復 能（PRR） を皮症のＥ群（xeroderma pigmentosum E : XPE）の一部

細胞レベルでのオートラジオグラフィー（UDS、RRS、に DDB 2 欠損が見つかることから、DDB は DNA 修復にRDS）ならびにアルカリ庶糖密度勾配遠心法（PRR）で１）関与していると考えられてきた 。しかし、DNA 修復反解析した。また紫外線に対する感受性はコロニー形成法

応を解析するために開発された in vitro での再構成系にで調べた。DDB 2 遺伝子の変異はゲノム DNA の各部分

DDB は不要なことから、その機能はごく最近まで不明でを PCR で増幅した後、センス鎖・アンチセンス鎖についあった。我々はこのタン白が欠損すると（6 - 4）光産物のて塩基配列を決定して調べた。一部の細胞については既知修復効率が低下し、長時間にわたって傷が残存することを相補性群に属する細胞との融合細胞を用いて UDS、RRS、２）見出した 。興味深いことに DDB は細胞周期の G 1 期かRDS を指標として相補性テストを行った。

ら S 期への移行に重要な役割を たす転 因子 E 2 F と結合してその転 活性を調節していること、更にがん抑制遺伝２. ２

紫外線照射後の DDB2 の転写活性化

子 p 53 により p 48 自身の発現が調節されていることが相正常ヒト繊維芽細胞に 20 J/m 2 の UVC を照射し、そ次いで見つかり、その発現調節機構が注目されている。我々の後の DDB 2 mRNA の転写量の継時的変化を Northern

は DDBp 48 遺伝子の全塩基配列を決定する過程で、インblot により検討した。陽性コントロールとして p 53 によトロンの１つに p 53 結合配列（p 53 responsive element:

り転写活性化を受ける p 21 /WAF 1 の mRNA 転写量の変Regulation of expression of the UVinduced damage -specific DNA binding
protein, DDBp48化を観察した。

２. ３

DDB2 の p53RE と GST-p53 との結合

ゲルシフトアッセイにより放射性同位元素で標識した（RIMasaru Yamaizumi
Institute of Molecular Embryology andGenetics, Kumamoto University標識）DDB 2 の p 53 RE と大腸菌で作製した GST-p 53 融合 蛋 白 質 と の 結 合 を 検 討 し た。RI 標 識 し た DDB 2 のp 53 RE をプローブとして、GST-p 53 と混合した後、ゲル− 106 −紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節

電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー上で GST-p 53加のあることから XPV と判定された。XP 89 TO は RRS、と DDB 2 p 53 RE との特異的結合の有無を調べた。陽性コ

RDS は正常で UDS の低下があり、相補性テストの結果ントロールとしては既に p 53 との結合が明らかになってXPF と判定された。従来 XPE には DDEB（+）のもの

いる p 21 /WAF 1 遺伝子に含まれる p 53 コンセンサス配と DDB（-）の明らかな生化学的な多様性があることから、列（p 53 CON）を用いた。

DDB と XPE 遺伝子との対応が大問題となってきたが、今回得られた解析結果より、少なくとも我々の調べた範囲内

２. ４

DDB2 の p53RE の転写活性化能

ではすべての XPE については DDB 2 遺伝子に異常が見つ

ルシフェラーゼアッセイにより DDB 2 の p 53 RE の転写

かり、DDB(+) の XPE については診断のまちがいによる活性化能を検討した。このため p 53 を発現するプラスミ可能性が高まった。このことは今後 XPE の原因及び病態

ドと、minimal heat shock promoter で制御されるホタルを考える上で極めて重要な結果と考える。

ルシフェラーゼの発現プラスミドの 5 ' 側上流に DDB 2 のp 53 RE を組み込んだものを骨肉腫由来細胞株 Saos 2（内３. ２

紫外線照射後の DDB2 の転写活性化因性の p 53 を欠損する）に一過性に共発現させ、p 53 にDDB 2 mRNA の転写活性化は UVC 照射 16 時間後よりよる転写活性をルシフェラーゼの発光強度としてルミノメ認められた（図１）。対照として p 21 /WAF 1 mRNA の転ーターで計測した。この時、内部コントロールとしてウミ写量を同時に観察したが、UVC 照射 8 時間後より増加がシイタケルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼとは発光観察され、DDB 2 は紫外線照射後、p 21 /WAF 1 より遅れ基質が異なる）を発現するプラスミドを同時に導入して、て転写が活性化されることがわかった。DDB 2 の転写量が遺伝子導入効率のサンプル間での誤差を補正した。p 53 は

p 21 /WAF 1 と同じく p 53 によって制御されるのであれば野性型及び 273 番目のアルギニンをヒスチジンに置換しどのようにしてその転写活性化の遅延がもたらされるのかたもの (R 273 H; 転写活性を欠損する ) を対照として用いた。

興味深い。

p 53 転写調節を受ける陽性コントロールとしては p 21 /WAF 1 遺伝子の p 53 RE を DDB 2 と同様に組み込んだプ

３. ３

DDB 2 遺伝子のほぼ全域にわたるゲノム塩基配列を決定

ラスミドを用いた。

して、p 53 結合配列（p 53 RE）を検索したところ、第４イ

３．結果と考察３. １

DDB2 の p53RE と GST-p53 との結合

ントロン内に１ケ所 p 53 RE に合致する配列を見出した（図DDB(+) の XPE 群について

２）。ゲルシフトアッセイではこの DDB 2 の予想 p 53 RE とこれまで DDB(+) の XPE 細胞として報告されていた３GST-p 53 との結合、及び抗 p 53 ( 421 ) 抗体によるスーパー株（XP 24 TO、XP 43 TO、XP 89 TO）について、再度のシフト、非 RI プローブによる競合阻害が確認された（図３）。

３）

詳細な細胞生物学的解析を行った 。表１に示すように、し か し な が ら DDB 2 の p 53 RE と p 53 と の 結 合 は p 21 /XP 24 TO については UDS、RDS いずれも正常で、RRS

WAF 1 の p 53 CON と比較して明らかに弱かった。の著明な低下が認められ、相補性テストの結果 UVsS と判定された。XP 43 TO は UDS、RRS は正常で RDS の低

３. ４下が認められ、カフェイン存在下での紫外線感受性の増表１DDB2 の p53RE の転写活性化能

ルシフェラーゼアッセイにより DDB 2 の p 53 RE は p 53

Ddb+ を示す XPE 細胞の特長と相補性テストのまとめ− 107 −の発現に伴い転写が増大することがわかった。しかしながらその活性化能は p 21 /WAF 1 の p 53 CON による転写活性化能よりかなり弱かった（図４）。さらに DDB 2 のp 53 RE の 5 ' 側の近傍に p 53 CON の片側に合致する 10 塩基の配列が見つかるが、この部分まで含む配列を用いた場合には p 53 RE が全く挿入されていないルシフェラーゼ発

図１ 紫外線照射後の DDB2 の転写活性化
ヒト繊維芽細胞に 20J/m2 の UVC を照射し、各時間毎に回収した total RNA による Northern blot により観察される DDB2,p21 のバンド濃度をデンシトメーターで測定したもの。

図２ ゲルシフトアッセイ、ルシフェラーゼアッセイに用いた
DDB2, p21 由来の p53-responsive element (p53RE)。DDB2
では p53 consensus に相当するショートプローブとその近傍の配列も含むロングプローブを用いた。参考のため p53 コン
センサス塩基配列と p21/WAF1 の p53RE(p53CON) を示す。

図３ DDB2・p21/WAF1 の p53RE をプローブとして用いたゲルシフトアッセイ。非 RI プローブによる競合、抗 p53 抗体 (421Ab) 添加によるスーパーシフトが観察される。

図４ DDB2 由来の p53RE をエンハンサーとして用いた場合のp53 による転写活性化をルシフェラーゼ活性として測定した。
陽性コントロールは p21/WAF1 由来の p53CON。陰性コン
トロールはエンハンサーを持たないルシフェラーゼ発現プラスミドを使用している。p53 は野生型 (wt) の他、転写活性化能が低下する変異体 (R273H)、p53ORF を持たないベクターのみ (pRC-CMV) を同時に Saos-2 に導入している。

図５ DDB2 由来の p53RE の周辺領域をエンハンサーとして用いた場合の p53 による転写活性化をルシフェラーゼ活性として測定。

− 108 −

紫外線照射で生じる DNA 損傷部 に特異的に結合するタン白 DDBp48 の発現調節

現プラスミドを陰性コントロールとして用いた場合以下のタイムコース及び E 2 F 1 制御下の DNA ポリメラーゼ α、ルシフェラーゼ活性を呈した（図５）。

dihydrofolate reductase 等の mRNA、もしくは蛋白の発４．総現のタイムコースを調べ、DNA 傷害の有無により DDB 2括発現や E 2 F 1 活性が p 53 により誘導されるタイムコース

紫外線照射後の DDB 2 の転写活性化は、同じく p 53 にに違いが生じないか確認する。

より転写の活性化を受ける p 21 /WAF 1 よりかなり遅れて２）DDB 2 転写調節機構の解析：起こっていた。DDB 2 遺伝子のイントロン 4 に存在する

１. 細胞周期や DNA 損傷で DDB 2 の転写が正・負に調節

p 53 RE の p 53 結合性はゲルシフトアッセイにより確認さされている事がわかれば、これに関与するシス・及びトラれ、その転写活性化能もルシフェラーゼアッセイにより確ンスエレメントの解析を行う。すなわち DDB 2 遺伝子の認されたが、その活性化能は p 21 /WAF 1 の p 53 CON とプロモーター領域の紫外線照射前後の細胞抽出液を用いた比較すると相当弱く、更に DDB 2 遺伝子の p 53 RE 近傍

フットプリント解析、サウスウェスタン法によりその発現の配列も含めてルシフェラーゼアッセイを行うと陰性コを制御する p 53 以外の転写因子の同定を試みる。

ントロール以下の転写活性化能を示した。これらのこと

２. Yeast two-hybrid system により DDB 2 と結合する蛋から、DDB 2 遺伝子のイントロン 4 に存在する p 53 RE は、白質を検索し、その中から DDB 2 の E 2 F 1 転写活性化能活性化した p 53 により弱い活性化を受け、しかも p 53 近に影響を与える転写調節因子を同定する。指標には E 2 F 1傍の配列により抑制的な調節を受けていることが考えら

プロモーターにより制御されるルシフェラーゼ活性を用いれた。p 21 /WAF 1 の p 53 CON と比較した場合、DDB 2て、DDB 2 と共発現させた場合にその活性が修飾されるもの p 53 RE としての活性は弱く、しかもその周辺の配列にのを探す。

より抑制的な調節を受けていることが、紫外線照射後の３）細胞周期に伴う発現パターンの解析：

DDB 2 mRNA 転写量の増加が p 21 /WAF 1 の場合と比較

ヒト初代培養線維芽細胞の血清除去による同調系を用いして微弱で、しかもかなり遅く起こることの原因である可て、細胞周期特異的な UV-DDB 活性の変動がないか、特能性が考えられる。に G 1 /S 期での増加の有無を検討する。

DDB 2 は E 2 F 1（DNA 合 成 関 連 遺 伝 子 の 発 現 をといった研究が必要と思われる。

positive に制御する転写因子）の co-activator であることが報告されている４）。細胞周期の進行を止める方向に働く（参考文献）

p 53 により何故 E 2 F 1 の co-activator といわれる DDB 2１）

Nichols A.F, itoh T, Graham J.A, Liu W.,の転写が誘導されるのか、一見矛盾しているようであるが、Yamaizumi M, Linn S: Human damage-specific DNA

DNA 損傷後の p 53 と DDB 2 の発現のタイムコースのズ

binding protein p 48 . J. Biol. Chem., 275 , 21422 - 1428 ,レがここで重要なのかもしれない。DDB 2 による E 2 F 12000 .の活性化は、E 2 F 1 の抑制機能を持つ Rb 蛋白の共存下で

２）

Itoh T, Mori T, ohkubo H, Yamaizumi M: Aも認められる事より、通常の細胞周期中でも何らかの役割

newly identified patient with clinical xerodermaを果たしている可能性が考えられる。

pigmentosum phenotype has a non-sense mutation

ヒ ト 培 養 細 胞 に お い て 紫 外 線 で 傷 害 さ れ た DNA のin the DDB 2 gene and incomplete repair in ( 6 - 4 )global genomic repair に p 53 が要求されるが、そのメカニズムの詳細は不明である。本研究は独自に得た DDB 2

photoproducts. J. Invest. Derm., 113 , 251 - 257 , 1999 .
３）

Itoh T, linn S, ono T, Yamaizumi M;

遺伝子の塩基配列情報をもとに、その CON 配列の機能をReinvestigation of the classification of five cell

解析する事でヌクレオチド除去修復系の制御に於ける p 53

strains of xeroderma pigmentosum group E withの役割を明らかにする足がかりを与えるものと考える。

reclassification of three of them. J. Invest. Derm., 114 ,今後の課題としては、

1022 - 1029 , 2000

１）DDB 2 転写調節機構の解析：

４）

Hayes S, Shiyanov p, Chen X, Raychaudhuri P;

ヒト初代培養線維芽細胞に DNA 損傷を伴わない細胞

DDB, a putative DNA repair protein, can function as

ストレス（熱ショック、浸透圧ショック等）で p 53 を誘

a transcriptional partner of E 2 F 1 . Mol. Cell. Biol., 18 ,導した場合と、逆にテトラサイクリンで p 53 の発現を誘240 - 249 , 1998

導できる培養細胞に UV 照射した場合の DDB 2 発現の− 109 −