表皮細胞接着因子のバイオイメージング法の開発

慶應義塾大学医学部皮膚科学教室

天 谷雅 行In this study we attempted to develop a bioimaging analysis for epidermal cell-cell adhesion molecules, desmoglein (Dsg),
as well as intermediate keratin cyteskeleton network. We used Dsg3, which is an autoimmune target antigen of pemphigus
vulgaris, and keratin 14 and fused them with green fluorescence protein (GFP) or red fluorescence protein (RFP). When thesechimeric molecules were introduced into cultured keratinocytes, we could observe time-lapse changes of Dsg3 and keratin aslive images without killing or fixing cells. This approach has allowed us to overcome the limitations inherent in establishinga temporal sequence of events from fixed specimens, and to study the assembly and fate of desmosome precursors in living
cells during junction assembly. We demonstrated the fate of Dsg3 and keratin after binding of AK23 pathogenic monolconal
IgG antibody. After binding of AK23 IgG, Dsg3 diminished on the cell surface and tended to be internalized into cytoplasma.
The insertion of keratin filaments was also obscured and its retraction into cytoplasma was also observed. We are under way
to generate transgenic mice with Dsg3-GFP to perform in vivo bioimaging analyses. These new technique for live image of
epidermal cell adhesion molecules will provide a valuable tool to understand molecular mechanisms of normal skin, that willin turn contribute to cosmetic science.

１．緒Dsg3 は重層扁平上皮における角化細胞間の接着に重要な言役割を示すと考えられている。

本研究では、組換え蛍光蛋白質を用いて、表皮細胞間接天疱瘡は、Dsg1 および Dsg3 に対する自己抗体が体内着において重要な役割をするデスモゾーム関連蛋白のリアで産生された結果、重層扁平上皮のデスモソーム同士の接ルタイムイメージング法を開発することである。細胞間接着が障害されて表皮や口腔粘膜などに水疱やびらんを生じ着に関与する蛋白の空間的情報（細胞内局在）及び時間的る自己免疫疾患である。自己抗体の標的となる Dsg の組情報（経時変化）を解析し、全く新しい観点からデスモ織内分布と天疱瘡の表現形との関連についてはこれまでにゾーム関連蛋白の機能解析を行うことである。正常な細胞詳細に解析されてきた。これに対し、自己抗体結合後にど間接着を保つことは、皮膚を健康に保つ基礎となっており、のような機序で表皮細胞間の接着が障害され水疱が形成さその分子基盤を解析するリアルタイムイメージング法は、れるのかは未だ不明である。天疱瘡の病態を詳細に解明す化粧品学の進歩に大きく貢献するものと考えられる。

る上で、表皮細胞に自己抗体が結合する際、抗原蛋白を含2．実め周囲のデスモゾーム関連蛋白がどのような挙動を示すか

験を、空間的情報（細胞内局在）ならびに時間的情報（経時デスモソームは、全身の上皮組織、心筋、肝臓などに分的変動）の両面から解析することが現在求められている。

布する主要な細胞間接着装置の一つであり、隣接する細胞従来まで細胞内の蛋白質の局在を解析する方法として同士を強固に接着させるとともに、ケラチンなどの中間径は、特異的な抗体を用いた免疫染色が主体であった。しか線維と結合することで各組織の形態を安定化させる役割をし、免疫染色は、ホルマリン、アセトンなどの種々の固定もつ。デスモソームの構成蛋白には、膜貫通蛋白であるデ剤により組織、細胞を固定した後に蛋白の局在を検討する

スモグレイン（Dsg）およびデスモコリン（Dsc）、ならびため、細胞が生きている状態での蛋白の局在を反映していに細胞内の裏打ち蛋白であるプラコグロビン（PG）、デスるかは不明である。また、細胞を固定してしまうため同じモプラキン（DP）、プラコフィリン（PKP）などの蛋白が細胞内での蛋白の経時的変化を観察することは不可能であある。これらの蛋白のうち、Dsg には Dsg1-Dsg4 の４種った。近年、蛍光蛋白質（Greenのアイソフォームが存在するが、その中でも Dsg1 およびGFP など）を目的の蛋白と融合させた融合蛋白を作製し、Development of bioimaging analysis for
epidermal cell adhesion molecules
Amagai Masayuki
D epa r t ment of D er mat olog y, Keio
University School of Medicine

FluorescenceProtein、それを機能プローブとして用いることで、生きた状態での細胞内局在を可視化する技術が可能となり、従来とは全く異なる視点で分子の細胞内動態を観察することができるようになった。
本研究では、デスモソーム関連蛋白のリアルタイムイメージング法を開発し、細胞間接着におけるそれぞれの蛋白の挙動をリアルタイムで解析すると共に、天疱瘡の自己抗− 40 −

表皮細胞接着因子のバイオイメージング法の開発

体が結合してから水疱形成に至るまでの分子メカニズムに結果それぞれの融合蛋白が導入細胞の細胞質に発現して認関する基礎的知見を得ることにある。デスモソーム関連められたものの、Dsg3 が本来発現する場所となる細胞膜蛋白ならびに表皮角化細胞の中間径線維であるケラチンに表面での発現は認められなかった。

蛍光蛋白質を融合した発現ベクターを作製し、それぞれを培養角化細胞に導入して融合蛋白の発現を試みた。続いて

３）リアルタイムイメージング法による動態解析

細胞接着における発現蛋白の細胞内動態を経時的固定後の過去に我々は、単独でマウス表皮に水疱を誘導する抗観察ならびにリアルタイムイメージング法により解析した。

Dsg3 マウスモノクローナル抗体（AK23 mAb）を単離しさらに培養角化細胞に抗 Dsg3 IgG 抗体を反応させ、抗体た。EGFP-K14 導入 KU8 細胞株を、ガラスベースディッと Dsg3 とが結合した後の発現蛋白の細胞内動態を経時的シュでコンフルエントになるまで培養した後、100 ㎍ / ㎖固定後の観察ならびにリアルタイムイメージング法によりの AK23 mAb を反応させ、その後 AxioVision 社の Delta試みた。

Vision 撮影装置を用いて EGFP-K14 の細胞内動態を 12 時３．結間まで観察した。その結果、AK23 mAb 反応後 0.5 時間よ果り EGFP-K14 のごく一部で接着面の細胞膜への insertion１）蛍光蛋白質融合ケラチン 14（K14）およびケラチン 5（K5）の発現が消失し、ケラチン線維が細胞の中心へと retract している像が見られたが、ほとんどのケラチン線維は反応後

ヒ ト K14 お よ び K5 翻 訳 領 域 全 長 の cDNA を PCR 法

12 時間においてもそのまま膜に insertion した状態で認により増幅し、これを Clontech 社の蛍光蛋白質発現ベクめられ、keratin retraction は認められなかった。その理

ター pEGFP-C1 ( 緑 ) に挿入して２種類の発現ベクター

由として、株化された角化細胞が単層培養下で Dsg2 を（pEGFP-K14, pEGFP-K5）を作製した。またヒト K14 の発現するため、Dsg2 を裏打ちする部分で EGFP-K14 のcDNA については、同じく Clontech 社の GFP 変異蛋白

retraction が認められなかった可能性が示唆された。そこ

質発現ベクターである pEYFP-C1（黄）、pECFP-C1（シで細胞培養下で Dsg2 を発現しない正常ヒト表皮角化細胞アン）にも挿入して２種類の発現ベクター（pEYFP-K14,（NHEK）を今後の実験に用いた。

pECFP-K14）を作製した。
を発現しない細胞株である CHO 細胞にそれぞれ FuGENE４）NHEK 細 胞 に お け る 抗 Dsg3 IgG 抗 体 結 合 後 のK14、Dsg3 の動態解析（Roche Applied Science）を用いて遺伝子導入したところ、

pEGFP-K14 を FuGENE（Roche）を用いて NHEK 細胞に遺発現した蛋白は細胞内で核周囲に凝集して認められ、正常伝子導入し、GFP 融合 K14 の発現を試みたが、融合蛋白なケラチンと同様の網状の構築を形成することはなかっの発現は遺伝子導入後 72 時間まで認められなかった。そた。そこで４種類のベクターを培養ヒト表皮細胞株である

こで NHEK 細胞をガラスベースディッシュでコンフルエ

KU8 細胞に遺伝子導入したところ、発現した蛋白は細胞ントになるまで培養し、その後培養液を高 Ca 培地（1.2mM内で網状の構築を形成するとともに、一部では隣接する細Ca 含培地）に変更してさらに 12 時間培養した。培養後胞にむかってネットワーク状に伸張する像が認められ、この NHEK 細胞に対し、10 0 ㎍/ ㎖の AK23 mAb を0. 5 ～ 24の部位におけるデスモソームの裏打ち蛋白との結合が示唆時間反応した。固定後、ケラチン線維をウサギ抗ケラチンされた。これらの発現蛋白のうち EGFP-K14 については、抗体ならびに緑色蛍光色素（Alexor Fluor 488）で標識し安定形質導入 KU8 細胞株をネオマイシンで選択し、細胞た抗ウサギ IgG 抗血清（Molecular Probes 社）を用いて間接着におけるケラチンの細胞内動態の解析に用いた。

染色すると共に、膜状に結合した AK23 mAb を Alexor

作製した４種類の発現ベクターについて、デスモソーム

Fluor 546 標識抗マウス IgG 抗血清（Molecular Probes 社）

２）蛍光蛋白質融合 Dsg3 の発現を用いて染色した。その結果ケラチン線維の retraction 像

ヒト Dsg3 翻訳領域全長の cDNA を pEGFP-N1 に挿入

は、EGFP-K14 発現 KU8 細胞を使用したときよりも明瞭して発現ベクター pEGFP-hDsg3 を作製した。作製した発に観察された。しかしこの方法では、ケラチン線維が点状現ベクターを KU8 細胞ならびに培養マウスケラチノサイの蛍光として認められたこと、ならびに一部のケラチン線ト細胞株 Pam212 細胞に遺伝子導入したが、２種類の細胞維では AK23 mAb 反応後 24 時間が経過しても細胞膜かにおいて融合蛋白の発現は全く認められなかった。

らの retraction が認められなかったことなどの問題を伴っ続いてマウス Dsg3 翻訳領域全長の cDNA を pEGFP-N1、ていた。

pEYFP-N1、pECFP-N1、ならびに赤色変異蛋白質発現ベ

後者については Ca シフトにより重層化した NHEK 細クターである pDsRed（Clontech 社）に挿入し、これらを胞が Dsg1 を発現するため、Dsg1 を裏打ちする部分でケKU8 細胞ならびに Pam212 細胞に遺伝子導入した。そのラチン線維の retraction が認められなかった可能性が考え− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009られた。そこで NHEK 細胞を AK23 mAb と反応する直を用いて作製した。すなわち pEGFP-K14 より EGFP-K14前に、Dsg1 の細胞外を切断することでその接着機能を障の cDNA を制限酵素を用いて切断し、末端を平滑末端処害する黄色ブドウ球菌産生表皮剥脱毒素（ETA）1 ㎍ / ㎖

理した後にコスミドベクター pAxcw に挿入した。作製しを反応させ、その後 AK23 mAb 反応後のケラチン線維おた cDNA 挿入コスミドベクターを STRATAGENE 社のよび AK23 mAb の細胞内動態を経時的に観察した。そのGIGAPACK III XL を用いて Lambda Phage にパッケー

結果、AK23 mAb 反応後 6 時間より、角化細胞同士の接ジングし、コスミドベクターを増幅した。増幅したコス着面においてケラチン線維の細胞膜からの retraction ならミドベクターを制限酵素処理済み DNA-TPC とともに 293

びに AK23 mAb の internalization が明瞭に観察された（図細胞に co-transfect し、出現した組換えアデノウイルスを１）。

回収した。ウイルス液を４回以上継代して高力価ウイルス以上の結果より、AK23 mAb との反応によってケラチ液を作製し、これを NHEK 細胞に感染させて EGFP-K14ンの retraction および Dsg3 の internalization が生じるこの発現の有無を観察した。その結果、感染後 24 時間よりとが示唆された。しかしケラチン線維が点状の蛍光としてEGFP-K14 が NHEK 細胞質内で高率に発現し、かつ線維認められる問題については解決が得られないため、アデノ状の蛍光パターンとして観察された（図２）。

ウイルス発現系を用いた EGFP-K14 cDNA の NHEK 細胞

低濃度のカルシウムの培養液中で角化細胞を培養するへの遺伝子導入、ならびにその融合蛋白の発現を試みた。と、デスモゾーム蛋白は産生されるものの、デスモゾームは形成されない。しかし、培養液中のカルシウムの濃度を５）アデノウイルス発現系による EGFP-K14 の NHEK細胞での発現上昇させると、比較的短時間で、細胞と細胞が接着し、デEGFP-K14 の cDNA を挿入した組換えアデノウイルス

養液中の Ca 濃度を高濃度へシフトし、角化細胞表面にを、TAKARA 社 の Adenovirus Expression Vector Kit

デスモゾームが形成されたときに EGFP-K14 の接着面にスモゾームが形成されることが知られている。そこで培向かっての insertion に変化が見られるか解析した。まず
NHEK 細胞を無 Ca 培地で培養したときには、EGFP-K14が細胞質内に網状の構造を形成して認められたが、接着面に向かってネットワーク状に伸張する像は認められず、細胞膜への insertion は認められなかった。これに対し培養液を高 Ca 培地（1.2 mM Ca 含培地）に変更したときには、EGFP-K14 が接着面に向かって insertion する像が観察された（図７）。さらに培養液を再び無 Ca 培地に変更した
ところ、EGFP-K14 が接着面に向かって insertion する像が再び認められなくなった。
以上の結果より、アデノウイルス発現系を用いて発現させた EGFP-K14 は、NHEK 細胞において高率に発現する

図１ AK23 mAb 反応前後の NHEK 細胞におけるケラチン線維および AK23 mAb の細胞内動態。
AK23 mAb 反応前の NHEK 細胞では、ケラチン線維の染色が細胞質全体および接着面の細胞膜表面において点状に認められ（A）、また AK23 mAb の染色も接着面の細胞膜上に点状に配列して認められた（B）。AK23 mAb 反応６時間後より、ケラチン線維の膜表面からの retraction（C）、ならびに AK23 mAbの細胞質内への internalization（D）が認められ、これらの反応は AK23 mAb の反応後 12 時間後でより顕著となった。（E,F）
。

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図２ Adenovirus 発現系で NHEK 細胞に発現したEGFP-K14。
EGFP-K14 が NHEK 細胞の細胞質内で明瞭な線維状の蛍光パターンとして観察された。

表皮細胞接着因子のバイオイメージング法の開発

とともに、正常なケラチンと同様、高 Ca 条件下ではデス

その後 0.5 ㎎ / ㎖ の ETA を 37℃、2 時間反応し、さらにモソームの形成に伴いデスモソームの裏打ち蛋白と結合すDispase（Roche Diagnostics）を15 分間反応して NHEK 細る可能性が示唆された。

胞をディッシュから剥離した。剥離後、角化細胞のシートに対しピペッティングで物理的刺激を加え、固定後断片化

６）水疱形成能の異なる抗 Dsg3 IgG 抗体結合後のK14、Dsg3 の動態解析した角化細胞のシート数を計数した。その結果断片化した

過 去 に 天 疱 瘡 モ デ ル マ ウ ス よ り 単 離 し た 複 数 の AKに対し、AK7 mAb、AK20 mAb を反応したときには断mAb の中で、マウスへの投与により明らかな水疱形成片化は顕著ではなかった。さらに NHEK 細胞を異なる濃を誘導する AK23 mAb と、水疱形成を誘導しない AK7度の AK23 mAb と反応して Dissociation assay を行った

mAb、AK18 mAb、AK20 mAb に つ い て、 そ れ ぞ れ のところ、断片化したシート数は AK23 mAb が増加するに

NHEK 細胞に対する接着障害活性の違いを Dissociation

つれ用量依存性に増加した（図３）。

シート数は、AK23 mAb 反応後に最も多く認められたの

assay を 用 い て 解 析 し た。 さ ら に EGFP-K14 を 発 現

続いてアデノウイルス発現系により EGFP-K14 を発現さ せ た NHEK 細 胞 に そ れ ぞ れ の mAb を 反 応 し た 後

さ せ た NHEK 細 胞 を、 あ ら か じ め 1 ㎎ / ㎖ の ETA での、EGFP-K14 および Dsg3 の挙動について解析を行っ

処 理 し た 後、100 ㎎ / ㎖ の Alexor Fluor 546 で 標 識 した。NHEK 細胞をコンフルエントになるまで培養した後、た AK23 mAb、ならびに新生仔マウスへの投与で明らか培養液を高 Ca 培地へシフトして重層化し、そこに AK7な水疱形成を認めない AK18 mAb と反応させ、その後

mAb、AK20 mAb、AK23 mAb を 37℃、24 時間反応した。

Axio 社の Delta Vision を用いて EGFP-K14 ならびに AK

図３ Dissociation assay による AK mAb の接着障害活性の比較。
断片化したシート数は NHEK 細胞を AK23 mAb と反応したとき最も多く認められた（A, B）。また AK23 mAb 反応後の断片化したシート数は、反応に用いた AK23
mAb の濃度を増加することで用量依存性に増加した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

mAb の細胞内動態の違いを 8 時間まで観察した。その正常な細胞間接着を保つことは、皮膚を健康に保つ基礎

結果 AK23 mAb を反応させた NHEK 細胞では、反応後となっており、その分子基盤を解析するリアルタイムイメ

0.5 時間より EGFP-K14 の細胞内への retraction ならびにージング法は、化粧品学の進歩に大きく貢献するものと考AK23 mAb の細胞内への internalization が認められたのえられる。

に対し、AK18 mAb を反応させた細胞では、EGFP-K14５．総の retraction および AK18 mAb の internalization ともに反応後 8 時間まで明瞭ではなかった（図４）。

括

本研究では、表皮細胞間接着において重要な役割をするデスモゾーム関連蛋白のリアルタイムイメージング法を開７）EGFP- K14 トランスジェニックマウスの作製発するとともに、抗 Dsg3 IgG 抗体反応後の細胞間接着にアデノウイルス発現系にて導入に成功した EGFP-K14

おけるそれぞれの蛋白の空間的情報（細胞内局在）及び時の cDNA を、K5 プロモーター（13 kb）の下流に挿入し間的情報（経時変化）を解析し、デスモゾーム関連蛋白のた cDNA コンストラクト pGEM-K5pro-EGFP-K14 を作製機能解析を行った。その結果抗 Dsg3 IgG 抗体の反応後に、した。この cDNA コンストラクトを、マウス角化細胞株

角化細胞同士の接着障害が見られると共に、Dsg3 の細胞

Pam212 細胞に前述の FuGENE（Roche Applied Science）

内への internalization およびケラチン線維の細胞膜からのを用いて遺伝子導入したところ、発現した蛋白は細胞内でretraction が生じることが明らかとなった。またマウス表

網状の構築を形成するとともに、一部では隣接する細胞に皮での水疱形成能の異なる AK mAb を角化細胞に反応さむかってネットワーク状に伸張する像が認められた。

せた際、Dsg3 とケラチンの挙動に違いが見られることを４．考細胞レベルで明らかにした。本研究の成果は、天疱瘡にお察ける水疱形成機序を分子レベルで解明する上での新しい所

本研究は、従来不可能であったデスモゾーム関連蛋白の見を得ただけでなく、表皮細胞間接着の分子機構について生細胞における分子動態を、リアルタイム解析という新しも新しい視点を導入するものと考えられた。また本研究でい観点から解析するものである。その成果は in vivo におは達成できなかったものの、Dsg3、PG、DP 等のデスモける細胞間接着機構を理解する上で新しい視点を導入する

ソーム関連蛋白を蛍光色素により可視化することで、デスものであり、皮膚科学のみならず、細胞生物学を含めた基モソームにおけるこれらの蛋白の動態をリアルタイムで解礎医学に対する多大な貢献が期待される。また本研究にお析することが可能となると考えられた。さらに本研究における解析の結果、天疱瘡の水疱形成のメカニズムが分子動いてその開発に着手した EGFP-K14 トランスジェニック態の観点から明らかにされることで、ステロイド、免疫抑マウスは、in vivo における天疱瘡の分子病態メカニズム制剤などの副作用の多い現行の治療法とは全く異なる新しならびに細胞間接着の分子機構を理解する上で重要なツーい治療法の開発が可能となるかもしれない。

ルとなると考えられた。

図４ AK18 mAb(A) ならびに AK23 mAb(B) を反応させた NHEK 細胞における EGFP-K14 およびDsg3 の細胞内動態。
AK18 mAb を反応させた細胞では、AK23 mAb を反応させた細胞と比べ、EGFP-K14（矢印）およびAK mAb（矢頭）の細胞内への移動は明瞭ではなかった。

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