合成糖脂質の超分子集合体に関する研究
早稲田大学

武岡理工学部

真司

Amidic glycolipids, 1,5-bis-O-alkyl-N-maltooligonoyl-L-glutamate (1), having various lengths of two hydrocarbon
chains (carbon number,m: 14, 16, 18) and maltooligotose (glucose unit,n: 3, 5, 7) and N-glycosidic lipid; 1,5-bis-Ooctadecyl-N-maltopentaonosyl-L-glutamate 2 were synthesized. The assembling structures were analyzed by
microscopic observation such as negatively stained TEM, cryo-TEM, and AFM. The glycolipid 1a (m,n: 14,5)
showed a fiber-like structure, while 1b (16,5) showed a fiber-like structure when the hydrating temperature wasabove the gel-to-liquid crystalline phase transition temperature (Tc) and a large disk-like structure when incubatedbelow the Tc. The glycolipid 1c (18,5) took a large disk-like structure by hydrating the powder above the Tc. The
glycolipids 1d (18,3) and 1e (18,7) showed the mixture of large disks and large vesicles and the mixture of small
disks and micelles, respectively. While, N-glycoside lipid 2 made vesicular structure only.
Preparation procedure using high shear stress such as extrusion or sonication converted the large disk of 1c tothe smaller assemblies such as small disk-, cone-, and granule-like assemblies, having low molecular packing states.
The glycolipid molecules in the plane part of the disk were packed so tight that the segmental mobility was very
low even above the Tc, and the reactivity of the saccharide chain against Concanavalin A(ConA) was also very
low. These data indicate that high reactivity should come from the loose packing of saccharide chains around theedge part of the assemblies.
The disks make a unique supramolecular assembling structure by complex formation with ConA. The stackingof several disks forms a rouleaux-like structure, and the structures further assemble to construct hyperbranchedthree-dimensional aggregates. This supramolecular assembly would be a model of an extracellular matrix, aneffective matrix to keep bound water, or a material which releases hydrophilic or hydrophobic substances with
controllable rates.

水部のアルキル鎖長や糖鎖との結合）の異なる一１ 緒 言連の糖脂質を合成，これがリン脂質小胞体の分散

細胞表面に局在する糖鎖は，生体系において情安定度の向上や凍結融解操作に対する安定度向上報の担持と伝達の役割を担っている．例えば，抗に寄与することを報告している１〜３）．更に糖脂質

原抗体反応，細胞間認識（接着と融合，接触阻害），集合体をレセプター蛋白質（ConA）と複合させて細胞の分化などにおいて，その情報伝達機能が分超分子集合体を形成させることができた４）．これ

子レベルで明らかにされてきている．本研究ではは細胞外マトリックスや新しい薬物保持 ･ 徐放材

分子構造と分子認識からその生理活性を追及する料の構築に対して工学的な手法を与えることが期

糖鎖工学的手法に対して，糖脂質自体の物理化学待される．

的な性質に焦点を当て，単純構造の合成糖脂質が２ 実 験形成する分子集合形態に関する基礎知見を得ることを目的としている．既に，オリゴ糖の還元末端

２. １ 試 料に疎水基を導入して構造の明確な糖脂質の簡便合実験に用いた２種類の糖脂質構造を Figure 1 に成法を確立し，構造（糖鎖の長さや結合様式，疎示す５）．ここで，アルキル鎖がグルタミン酸のカResearch on Supramolecular
Assemblies of Synthetic Glycolipids
Shinji Takeoka
School of Science and Engineering,
Waseda University

ルボン酸基とエステル結合した中間体が糖鎖末端とアミド結合した amidic glycolipid 系を１，アミ（Figureノ結合した N−glycosidic lipid 系を２とした
１）．1 に関してグルコース単位数 3，5，7，アルキル鎖炭素数 14，16，18 を組み合わせた糖脂質を合成した．

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体を形成する（Figure 2（a））が，1bでは静置温度が T c 以上の場合に繊維状（幅 8.4nm，厚さ 10nm）の集合体を形成し，T c 以下の場合には大きな円盤型（直径約 180nm）の集合体（Figure 2（b））となる．AFM 観察に

Figure １ Structure of synthetic glycolipids.

よると膜厚は 9nm であり，糖脂質の２. ２ 分子集合形態の観察

二分子長（10nm）とほぼ一致し，これが二分子膜，透過型電子顕微鏡（TEM，JEOL JEM− 100CX）であることを確認した．1c では T c 以上で分散さ，原子間力顕微鏡
Cryo− TEM（Philips，CM12）

せると静置温度に関係なく大きな円盤型二分子膜（AFM，Digital Instruments Nanoscope Ⅱ）についを形成した．また，1d と 1e は各々，大きな円盤て各々の常法に従って試料を作成し，集合体形態型二分子膜と大きな二分子膜小胞体の混合系，小を観察した．透過型電子顕微鏡観察ではリンタンさな円盤型二分子膜と球状ミセルの混合系であっグステン酸あるいはモリブデンアンモニウムをネた．この様に集合形態はアルキル鎖長の伸長に伴ガテイブ染色剤とした．

い繊維状→円盤型二分子膜へと変化し，糖鎖長の伸長に伴い小胞体→大きな円盤型二分子膜→小さH− NMR 測定による分子充填状態の解析

な円盤型二分子膜，ミセルへと変化する傾向が認D２O に糖脂質を分散させて集合体（2mM）を形められた（Table １）．これは，糖脂質の糖鎖部の成，DMSO を糖脂質に対し 2mol％を外部参照と割合が相対的に大きくなるに従って，曲率の小さして添加し， H− NMR（JEOL JNM− LA500）にてな円盤や小胞体から曲率の大きな集合形態（小さ25℃から 70℃までの各温度にて測定した．

な円盤，繊維，ミセルなど）へ変化することを示

２. ３１１している．他方，N− glycoside lipid ２では二分子２. ４ 等温型滴定熱量分析による ConA との結膜小胞体構造のみが確認された．

合解析

更に調製方法（分散エネルギーの大きさ）によ

等温型滴定熱 分析には Microcal 社の MCS ITCってとり得る集合形態が異なることを見出した．

を用いた．Concanavalin A（ConA）（0.812mM）

例えば，糖脂質 1c では（ⅰ）T c 以上での分散静溶液を糖脂質分散液（0.8mM）に滴下した際の熱置にて大きな円盤状二分子膜（平均直径 400nm）から会合定数（K），エンタルピー変化（ΔH），結合数（ｎ）を計算した．

３ 結 と考察３. １ 糖脂質分子構造と集合形態
アミド結合糖脂質 1 の粉末に純水を添加してゲル−液晶相転移温度 T c 以上で静置すると，自発的に分散し集合体を形成する．1aは静置温度に関係なく繊維状集合

Figure ２ Microscopic observation of glycolipid assemblies.（a）Cryo-TEM of fiberlike assemblies（1a）（, b）TEM of large disk-like assemblies（1b）below Tc.

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合成糖脂質の超分子集合体に関する研究

Table １ The areas per molecule, collapse pressures of glycolipids, and physical properties of the glycolipid assemblies.

A を形成，（ⅱ）これを均一孔径のメンブランフィ

鎖軸にほぼ沿った構造（Figure ４（a）−（ⅱ））がルター（孔径 0.1µm）に強制的に透過させると小6.9kcal/mol のわずかな差でこれに続いた．これさな円盤状二分子膜（平均直径 50nm）B，あるいは疎水部に結合している糖が開環しており糖鎖配は楕円状，棒状形態が観測されるが、同一視野の向の自由度が大きいためである．他方，閉環構造傾斜観察から楕円状、棒状体は小さな円盤状集合の 2 はほぼアルキル鎖軸に沿った構造（Figure ４体の縁部であることが明らかになった（Figure ３）をとった．次に 1 の屈曲構造分子（ⅰ）（a）−（ⅲ）（a））．
（ⅲ）B に超音波照射を行なうと顆粒状（長を 40 分子水中に分散させて動力学計算を行った

径 18nm，短径９nm）のミセル C が得られた（Figureところ，曲率の高い楕円ミセル様集合構造を形成

３（b））
．

した（Figure ４（b））．また，伸長構造（ⅱ）では二分子膜を形成した．従って，1 では屈曲構造の３. ２ 分子動力学計算による集合形態の考察

分子の集合が二分子膜縁部の安定化に寄与できる

分子力学計算（Discover 97.0, msi 社）による 1

ために，円盤状の集合形態 A，B が可能であり，の分子構造は，螺旋状オリゴ糖鎖がアルキル鎖か更にこれを高エネルギーにて分散させると全てのらみた分子軸に対して大きく屈曲した構造が最分子が屈曲構造となり顆粒状ミセル C として安定）．アルキルも安定であった（Figure ４（a）−（ⅰ）

化する機構が考察される．また，円盤状集合体に水素結合を切断する尿素を添加するとミセル状に形態変化することから，この円盤形態の安定化には糖鎖間の水素結合も寄与していることが示唆された．
３. ３

H− NMR による分子セグ

１

メント運動の測定
１c の３種類の集合体について，1 H− NMR のピーク強度（半幅Figure ３ Microscopic observation of glycolipid assemblies（1c）（. a）Two TEMs ofsmall disk-like assemblies changing the observation angle with 45 degree. Arrows
C and D in the pictures indicate cone- and disk-like assemblies, respectively.（b）TEM of granule-like assemblies.

− 13 −値）の測定から各集合体における糖脂質分子各部の運動状態（これは分子充填状態に関係する）を検され，温度上昇に伴いピーク強度は増大，縁部の乱れが中心部まで及んでいることが示唆された（Figure 5（b））．C では低温域でも糖鎖，アルキル鎖のピーク強度は大きく，温度上昇に伴いアルキル鎖のピーク強度が大きく増大した（Figure5（c））．従って，分子充填状態は大きな円盤状二分子
Figure ４ Simulation of glycolipid structure and its molecular assembly.（a）Structure of（ⅰ）1 c bending,（ⅱ）1 c stretching,（ⅲ）2 .（b）A part of granule-like assembly of 1 c with the bending structutre.

膜→小さな円盤状二分子膜→楕円球状ミセルの順に低下し，高エネルギーで分散討した（Figure 5）．A では相転移温度（58℃）以した系ほど分子充填状態が悪く親疎水部共セグメ

下では糖鎖（3.2 〜 4.0ppm），アルキル鎖（0.8，ント運動の高い集合体が形成されていることを明1.2ppm）プロトンのピークは観測されず，相転移らかにした．

温度以上でアルキル鎖プロトンのピークが僅かに観測されたのみであった（Figure 5（a））．これは

３. ４ 等温滴定型微小熱量分析による糖鎖認識

分子充填状態が高くセグメント運動が著しく抑制の解析されていることを示している．B では相転移温度

分子充填状態の異なる糖脂質集合体 A，B，C

以下でも糖鎖，アルキル鎖の幅広なピークが観測について，分子内に４つ糖認識部位を持つ蛋白質

Figure ５ Temperature dependence of segmental motion in glycolipid assemblies obtained from
1H-NMR spectra of their D2 O dispersions.（a）Large disk-like assembly A,（b）small disk-like assembly B,（c）granule-like assembly C.

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合成糖脂質の超分子集合体に関する研究

Table ２ Thermodynamic parameters of the binding of Con A to various glycolipid assemblies at 25℃ .

（ConA ）に対する複合体形成能を等温滴定型微小であり，ConA 一分子に相当する . また , 円形構造

熱量分析を用いて解析した（Table 2）．各集合体

は紙面に対して垂直に伸びた連銭構造体と推測さ分散溶液と ConA 水溶液を混合すると直ちにする

れ，これが 3 次元構造物であることを示唆していが，濁度上昇度は C〉B〉A の順で大きかった．結る．側面を結合サイトとする集合体は，前述した合定数と ΔH は A と C でほぼ等しい値を示したが，ように縁部に ConA が多く結合しており，これがA への ConA の結合量は C と比較して 9％程度に架橋構造を取り易い自由度を持っているためと考過ぎなかった．一方，B では結合定数，ΔH は A察される．もし , 平面部に ConA が結合し易い充や C に比較して小さな値であったが，ConA の結填構造をとるのであれば，カラム状の超分子集合合量は A，C の中間値であった（C の 60％程度）．

体が得られるであろう .

以上の結果から，分子充填状態の最も低い C で４ 総 括は集合体全体に ConA が結合できるが，A ではその大部分を占める分子充填状態の高い平板部には単純ではあるが，従来にない親疎水結合構造をConA は結合できず，C と類似の分子充填状態を持つ一連の糖脂質を合成し , 分子構造と分子集合持つ縁部に限定されると推測される．B では縁部形態との間の相関について検討した．親水部が大の乱れが中心部まで及んでおり，縁部だけでなくきく自由度の高い構造の分子では，曲率の大き平板部にも ConA が結合するが，その結合定数，結合量は縁部ほど高くないと考えられる．
３. ５ 円盤型集合体と ConA からなる超分子集合体
小さな円盤型集合体 B に対して，構成糖脂質と当モル量のConA を加えると白濁し沈殿物を形成する．これを TEM 観測すると Figure 6 に示した様に 3 〜 5 個の円盤が連なった連銭構造を一単位として主に側面−平面結合を主とする多分岐状の超分子集合体が観測された . 円盤の間隔は 8 nm

Figure ６ Rouleaux-like structure prepared by the addition of a Con A aqueous solution to the dispersion of disk-like assemblies of 1c.（a）TEM photograph, and（b）
estimated illustration. The structure would be constructed by crosslinking between
the plane sides or between the plane sides and edge parts of the disk by fourbinding sites of ConA for the glycosyl group of 1c.

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な集合形態と充填状態の高い平板状形態の両極端２）Takeoka S, Sakai H, Ohno H, et al., :Inhibitionが可能となるため，円盤型集合体が得られ，これeffect of aggregation of phospholipid vesicles byを分子動力学的にシミュレーションできた．調製incorporation of glycolipids, J. Colloid Interface

時のエネルギーが高くなるほど，より分子充填状

Sci., 152, 351-358, 1992.

態の低い集合形態へと変化し，ConA との結合性

３）Sakai H, Takisada M, Takeoka S, et al.,が高くなった．また，ConA と円盤型集合体を複:Cryoprotection of synthetic glycolipids for合させることにより３次元多分岐状超分子集合体

phospholipid vesicles, Chem. Lett., 1993, 1891-が得られた . これは細胞外マトリックスモデルあ1894.

るいは結合水を有効保持できる新しいマトリック４）Takeoka S, Sou K, Ohgushi T, Tsuchida E,ス，水溶性・疎水性薬剤の徐放材料などの応用が:Disk-like assemblies of a synthetic glycolipid and期待できる .

their association with Concanavalin A, Supramol.
Sci., 5, 159-162, 1998.

引用文献

５）Takeoka S, Sou K, Boettcher C, Fuhrhop J-H,

１）Takeoka S, Sakai H, Takisada M, et al.,Tsuchida E, :Physical properties and packing:Inhibition of intervesicular aggregation ofstates of molecular assemblies of synthetic

phospholipid vesicles by incorporation of dialkyl

glycolipids inn aqueous dispersions, J. Chem. Soc.

oligosaccharide glycerol, Chem. Lett., 1992, 1877-

Faraday Trans., 94, 2151-2158, 1998.

1880.

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