オリゴ糖による皮膚の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究
東京工業大学

井上生命理工学部義夫

The molecular mechanisms of protective effects of oligosaccharides, such as trehalose,maltose,andsucrose,on the cells under highly dehydrated conditions, have been studied by using model phospholipid
membrane as well as yeast cells. From the thermal and NMR analysis, and molecular dynamics
simulation,anomalously high hydration ability of trehalose was elucidated.

を解明することは、皮膚の乾燥保護・保湿剤など

１ 緒 言の化粧品素材、生体材料を長期安定保存する際の生体内で糖質は、グリコーゲン／ブドウ糖など保存剤などとしてオリゴ糖を今後幅広く応用してとして糖質のみで存在するものから、核酸や糖蛋
白質などでの糖単位の場合のように分子の構造成分として存在するものまで様々な形態で存在し、エネルギー源、構造構築要素、分子認識相互作用要素などとして幅広い機能を担っている。
一般に、生物が生命活動を維持するためには水は不可欠と考えられるが、一方で高度脱水の状態で長期間経過後、加水すると生命活動を再開する微生物が存在する。また凍結しても細胞が破壊されず生命を保持する微生物が存在する。この様な極度乾燥あるいは凍結という物理化学的ストレスの存在する環境下で生命活動を維持するためには何らかの防御機構が必要である。パン酵母、原始的甲殻類 Artemia をはじめとする種々の微生物は、乾燥あるいは凍結という極限環境下に置かれると２分子のぶどう糖（D−グルコース）が結合したオリゴ糖トレハロース（Gluα1− α1Glu；図１参照）を多量に産出することが最近わかった。細胞に耐乾燥性・耐凍結性を付与するトレハロースの機能
Studies on Molecular Mechanisms ofProtective Effects of Oligosaccharides
on Skins and Cells in the Dry State
Yoshio INOUE
Faculty of Bioscience and Biotechnology
Tokyo Institute of Technology

図１ トレハロース、マルトース、スクロース（上から）− 11 −

いくため、さらにはより優れた乾燥保護機能を持算機上で行った。トレハロースとマルトースの初つ新規オリゴ糖誘導体を開発するために極めて重期構造として結晶構造を使用した。糖水溶液とし要なことと考えられる。しかし、トレハロ−スがて１糖分子と 414 〜 419 水分子とから成る系を使細胞を保護する分子機構はまだほとんどわかって用した。

いない。

３ 結果と考察

本研究の目的は、トレハロースおよび関連する種々のオリゴ糖と生体膜との相互作用を調べ、オ

３. １ オリゴ糖の水和特性
トレハロースが、細胞の乾燥による破壊を防ぎ、リゴ糖、特にトレハロースが乾燥および凍結の際の細胞の破壊を防止する機構を分子レベルで解明

保護剤として働く作用機構については、モデル生するとともに、皮膚や細胞の耐乾燥保護能力がよ

体膜を使用した実験に基づいて現在二つの仮説がり優れた新たな糖誘導体を開発するための基礎的提案されている１、２）。一つは水置換仮説であり、研究を行うことである。トレハロースの特異な耐完全脱水状態においてトレハロースが細胞膜に直乾燥細胞保護活性の機構を解明するためにはトレ接結合し、含水状態での結合水の代役を果たすとハロース、細胞および水の３者間の分子レベルでいう説である。もう一つはガラス状態仮説である。の相互作用を検討し、さらに結果を他のオリゴ糖

これは、糖‐水混合系が脱水、濃縮、乾燥に進むについて得られる結果と比較する必要がある。そ過程でガラス化し、その結果細胞膜はマイクロカこで本研究では、「オリゴ糖と水の相互作用の研プセルともいうべき状況の中に閉じ込められ、そ究」と「モデル生体膜の耐乾燥安定性に対するオの時点での状態が固定・凍結されてしまうというリゴ糖の効果の研究」の二つを重要研究項目とし、説である。

おもに示差走査熱量計と超伝導核磁気共鳴法（Ｎ乾燥状態でトレハロースが細胞膜モデルであるＭＲ）を使用した実験および分子動力学計算によ

リン脂質二分子膜の表面に直接結合することを示る理論的方法により研究を行った。

す多くの実験事実がすでにあるが、すべての結果が水置換仮説を必ずしも支持しているわけではな

２ 実 験い。例えば、リン脂質二分子膜のゲル−液晶転移温

市販のトレハロースとジパルミトイルホスファ

度 Tm の乾燥に伴う上昇を抑える添加糖の効果をチジルコリン（DPPC）を水分散状態で混合後、凍糖‐膜間相互作用の強さの一つの指標として使用

結乾燥することにより種々の含水率のトレハローし、凍結乾燥後の DPPC リポソームの Tm を比べス含有リポソームを調製した。てみると、DPPC 単独時の 112℃は単糖グルコース、トレハロースを菌体内に含有する、および含有ガラクトースを添加するとそれぞれ 44.9、44.1℃しない酵母菌体は旭化成工業㈱より提供された。に、二糖トレハロース、マルトース、スクロース（図示差走査熱 計（DSC）測定は SEIKO ／ DSC20 高１参照）を添加するとそれぞれ 25.4、26.0、28.7感度装置を使用し、昇温速度５℃／分、温度範囲℃になる３）。すなわち、二糖は単糖に比べると優０〜 100℃にて行った。

れた Tm 抑制効果を持つが、トレハロースが二糖核磁気共鳴（NMR）スペクトルと磁気緩和時間は日本電子 製 JEOL ／ GSX270 装置を使用して測の中で際立った抑制効果を示しているとは言えない。
二糖の水溶液系のガラス転移温度 Tg はスクロ定した。
トレハロースとマルトースの水溶液の分子動力ース＜マルトース＜トレハロースの順に高くなり、学シミュレーションは Amder4.0 プログラムを使濃縮が進むとトレハロースの場合 Tg 値は室温付用し、分子科学研究所（岡崎）の TITAN3000V 計近まで上昇する４）。Tg が高いことはガラス化がよ− 12 −

オリゴ糖による皮膚の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究り容易に起こることを示し、乾燥保護剤として有ースが最も大きな値を示している。すなわち、３利であることを示す。

種の二糖の中でトレハロースは水和殻の水分子の水置換仮説とガラス状態仮説のいずれが正しい動的状態を安定化する能力が最も高い。熱分析とにせよ、糖の生体膜保護作用は糖と膜、糖と水お磁気緩和の実験から、トレハロースは静的にも動よび膜と水の間の相互作用が密接に関与する現象的にも水を強く束縛し、構造形成させる能力の高である。生体膜の乾燥保護でのトレハロースの特い糖であると言える。

異性に注目するならば、これら３相互作用の中でトレハロースの特異的な水和特性を分子レベルも特に糖−水間相互作用を重視することは妥当でで理解するために、マルトースとトレハロースのあろう。本研究では水和という観点からトレハロ水溶液について分子動力学シミュレーションを行ースを含む数種のオリゴ糖の性質を調べた。

った６）。モデル水溶液を平衡化後 40ps にわたり分

DSC により決定した１分子当たりの不凍水量は子動力学シミュレーションを行い、この間 10fs 間

トレハロース、マルトース、スクロースでそれぞ隔でトラジェクトリィを追跡し，糖分子の構造揺れ 7.95、6.50、6.33 であり３糖のなかでトレハロらぎと糖極性基周辺の水の動径分布関数を調べた。

５）ースが一番大きかった 。不凍水は、糖と相互作結果の一例として、グルコース単位の各Ｏ原子と用するためにバルク水が作る水素結合網に参加で近接水分子の酸素原子の間の動径分布関数においきない水分子のことを示す。て 2.8 オングストローム付近に現れる第一水和ピ

さらに、糖水溶液中の水分子の 17Ｏ核スピン−格ークの強度を表１に示した。Ｏ６の第一水和ピー

子 NMR 緩和時間を測定し、糖水和殻の水の動的クの強度はマルトースよりもトレハロースの方が５）水和数を評価した 。動的水和数は糖分子のまわ明らかに大きい。糖分子の全酸素原子の動径分布りで運動を制限されている水分子の数を示す。動関数の第一ピーク強度の平均を計算した結果、ト的水和数はトレハロース、マルトース、スクロー

レハロースでは 4.22 であり、これはマルトースのスでそれぞれ 48.3、27.2、36.8 となり、トレハロ4.17 よりも大きい。図２はシミュレーション開始

表１ グルコース単 の各酸素原子の周りの水の動径分布関数における第一水和ピークの強度− 13 −

20ps 経過後について、糖グリコシド結合酸素原子

この結果は第一水和殻に存在する水分子の運動がから５オングストローム以内の距離に存在する水純水中に比べて束縛されていることを示す。水和分子をスケッチしたスナップショットである。ト

水分子の束縛は存在位置に大きく依存するが、平レハロースではグリコシド結合領域にはマルトー

均するとマルトースよりもトレハロースの場合のスに比べてより多くの水分子が存在することが分方が強いことも分かった。
分子動力学シミュレーションから、マルトースかる。
分子動力学シミュレーションから糖 OH 基酸素よりもトレハロースの方が周囲の水構造に及ぼす原子の第一水和殻に存在する水分子の自己拡散係摂動が少し大きく、また水和能力が高いことが分９2かった。マルトースに比べてトレハロースでは分）の平均はトレハロースで 1.85、マルトース子内水素結合を作る確率が低く、トレハロースので 1.90 であり、いずれも純水のＤ値よりも小さい。

水酸基は水との間の分子間水素結合を作ることに数Ｄを計算した。温度 298 ＫでのＤ値（10 ×m−１ｓより安定化しようとする傾向が強く、そのため周囲の水構造により大きな影響を与える。
３. ２ オリゴ糖と生体膜の相互作用
前節で示した様に、幾つかの関連オリゴ糖の中でトレハロースの水和特性は特異的である。そこ
で、この特異的水和を示すトレハロースが水和系での生体膜の構造安定性に及ぼす効果を調べた。種々の濃度のトレハロースを含む水溶液中の卵黄レシチン単一層ベシクルでの二分子膜の状態を、31 P− NMR での燐脂質 31 P−コリンメチル 1Ｈ
間核 Overhauser 効果（NOE）を測定した７）。NOEは観測核の運動性と核間距離に依存する。NOE のトレハロース濃度依存性から、トレハロース濃度の増加に伴いベシクル内隣接燐脂質分子間の距離が接近すること、言い換えれば脂質膜のパッキング密度が大きくなることが示唆された。この結果は、トレハロースの添加により脂質膜のゲル‐液晶転移温度が上昇するという実験結果８）と矛盾しない。ここで観測された脂質膜の構造安定性に対する効果が膜近傍に存在するトレハロースの特異的水和挙動により膜の水和が摂動を受けた結果であるとするならば、十分な量の水が存在する系でのトレハロース−生体膜間相互作用は水を介した間接的相互作用であると考えられる。
図２ MD シミュレーション開始 20ps 経過後における、糖グリコシド結合酸素原子から５オングストローム以内の距離に存在する水分子をスケッチしたスナップショッ
ト。ａ．トレハロース、ｂ．マルトース

トレハロースの高い水構造形成能力が実際の細胞の中で発現されているかどうかを検証するために、トレハロース高産生性酵母について、細胞内− 14 −

オリゴ糖による皮膚の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究の水の 1Ｈ− NMR スピン−スピン緩和時間Ｔ2 を測９）た水の存在状態がトレハロースのみの効果であ定した 。緩和時間の長さから、細胞内の水を運るとは断言できない。そこで、DPPC モデル生体動性の極めて高い自由水（成分Ｃ）、運動が高度に膜についても同様の NMR 緩和実験を行った結果、抑制された結合水（成分Ａ）、およびこれらの中間結合水の割合はトレハロース無しでは僅か 20％での状態にある水（中間水：成分Ｂ）の３種類に分あったがトレハロースの添加により 80％まで増加けることが可能であった。培養条件を調整するこすることがわかった。とによりトレハロースを全く含まぬ菌体と、乾燥４ 総 括

菌体重量の 8.1％のトレハロースを含む菌体が得られる。これらを凍結乾燥後、調湿し、乾燥菌体

本研究ではオリゴ糖、特にトレハロースについ重量の 1.91％〜 3.53％の水を含む細胞試料として水和特性および生体膜との相互作用を調べた。

た。NMR 緩和時間の解析から、成分Ａ、Ｂ、Ｃ

トレハロースは、関連するオリゴ糖に比べて、静の存在割合（population）を決定した。トレハロー的ばかりでなく動的にも水と強く結合する能力のス欠乏および含有酵母細胞について得られた結果高い糖質であり、このトレハロースの特性は、水をそれぞれ表２と３に示した。また、成分Ｂの存溶液中のみならず生体膜あるいは生体細胞系にお在割合の含水率依存性を調べた結果を図３に示しいても発現されていることが分かった。

た。検討した範囲の含水量では、自由水（成分Ｃ）蛋白質や生体膜などに強く結合した結合水は生は全く存在しないこと、結合水（成分Ａ）の割合体系の高次構造／複合構造を保つために必須な水はトレハロースを含まぬ菌体では約 50％であるがである。トレハロースはこの必須の水分子を生トレハロースを含む菌体では約 80％にもなること体から逃さないということにより乾燥保護剤、あがわかった。

るいは保湿剤としての働きを示すのかもしれない。

菌体は種々の物質を含むので、ここで観測されトレハロースを含有する生体中の結合水の存在部

表２ トレハロース欠乏酵母細胞のプロトン NMR 横緩和時間Ｔ２と細胞水構造の含水率依存性− 15 −

表３ トレハロース含有酵母細胞のプロトン NMR 横緩和時間Ｔ２と細胞水構造の含水率依存性

図３ 酵母細胞中の中間水（表２、３の成分Ｂ）の組成の含水率依存性− 16 −

オリゴ糖による皮膚の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究

位、あるいはこの結合水が乾燥あるいは凍結条件

６）Sakurai M., Murata M., Inoue Y., Hino A., and下の生体の生理に及ぼす効果などの解明は今後のKobayashi S.: Molecular Dynamics Study of

研究課題である。

Aqueous Solution of Trehalose and Maltose.
Implication for the Biological Function of

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