皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索
同志社大学生命医科学部

野口範子

PARK 7 /DJ- 1 is a multifunctional protein which is involved in gene transcription regulation and anti-oxidative defense. DJ- 1
plays an important role in protection against UV irradiation and oxidative stress in the skin. Although DJ- 1 lacks the secretory
signal sequence, it is secreted and plays important physiological and pathophysiological roles. Whereas secretory proteins lacking
the endoplasmic reticulum-targeting signal sequence are secreted from cells by the unconventional secretion mechanism, thespecific processes responsible for DJ- 1 secretion across the plasma membrane have remained unclear. In the present study, we
found that DJ- 1 secretion was increased by treatment with 6 -hydroxydopamine ( 6 -OHDA) via the unconventional secretory
pathway in human neuroblastoma SH-SY 5 Y cells and mouse embryonic fibroblast (MEF) cells. We also found that 6 -OHDAinduced DJ- 1 secretion was suppressed in Atg 5 -, Atg 9 -, or Atg 16 l 1 - deficient MEF cells or ATG 16 L 1 knockdown SH-SY 5 Y
cells, indicating that the autophagy-based unconventional secretory pathway is involved in DJ- 1 secretion. We moreover observedthat 6 -OHDA induced decrease in glutathione levels, which was suppressed by pretreatment with antioxidant N-acetyl-L-cysteine(NAC), and that NAC treatment suppressed autophagy and DJ- 1 secretion. We also observed that 6 -OHDA-induced autophagy
was associated with activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and ULK 1 (unc- 51 like autophagy activating kinase 1 )via a pathway which was independent of mechanistic target of rapamycin kinase (mTOR). Collectively these results suggest that
6 -OHDA enhances oxidative stress followed by AMPK-ULK 1 pathway activation and induction of secretory autophagy for theunconventional secretion of DJ- 1 .

１．緒する細胞は UV や活性酸素による障害に強い抵抗性を示す

言

ことを明らかにしてきた 2）。さらにヒトの皮膚レベルで観DJ- 1 は生体の酸化ストレス防御に重要な因子であり、察したところ、角層中 DJ- 1 レベルの高い被験者のほうが、

DJ- 1 の発現量が低下すると細胞は酸化ストレスに脆弱に

UV により変化した皮膚の色素沈着が早期に回復し、赤みなる。逆に発現量が増加すると、高レベルの酸化ストレスや紅斑が早期に低下することを見出しており、皮膚におけ下でも細胞は生存できる。また、DJ- 1 は酸化ストレス下

る DJ- 1 レベルが酸化ストレス耐性を示す優れたバイオマ

で自身が酸化され、酸化 DJ- 1 を生じる。DJ- 1 は全身のーカーとなることが明らかとなっている 2）。

どの細胞にも広く発現分布するタンパク質であり、その機

DJ- 1 は主に細胞質に存在するが、細胞外に分泌される能にはほかにも、転写調節能、シャペロン活性、プロテア

ことも知られている。細胞外では抗酸化因子やシグナル伝ーゼ活性等、多機能タンパク質として知られる。さらに達等のはたらきを示すと考えられている。通常、細胞外にDJ- 1 をコードする遺伝子 PARK 7 は家族性パーキンソン

分泌されるタンパク質はアミノ末端側にシグナル配列をも

1）

病の原因遺伝子として注目されており 、国内外で盛んにち、小胞体やゴルジ体を経由して、小胞輸送により細胞外研究されている。パーキンソン病の発症・進展には酸化スへと分泌される典型的経路をたどる。一方で、サイトカイトレスが関与すると考えられているが、DJ- 1 はドーパミンであるインターロイキン - 1β（IL-1 β）や IL - 12 等のシグン産生神経細胞の酸化ストレスの緩和に働き、その機能喪ナル配列をもたない細胞質局在タンパク質も、細胞外へ分失はパーキンソン病の発症に関与すると考えられている。

泌されることが知られており、これらの分泌経路は非典型

皮膚は、紫外線（UV）等の外因性因子により障害を受け的経路と呼ばれている 3 , 4）。非典型的経路により分泌されやすく、酸化ストレス障害の多い臓器の一つに挙げられる。

るタンパク質には生理的に重要な役割を果たすタンパク質

くり返し UV を浴びることで皮膚老化が促進するが、UV にが多く含まれているにもかかわらず、水溶性である細胞質より発生した活性酸素種（Reactive Oxygen Species：ROS）

局在タンパク質がどのように脂質二重層である細胞膜を通は、脂質の過酸化やタンパク質の変性等の酸化障害を引過して細胞外に分泌されるか、その分泌機構は未知な点がき起こす。これまで我々は、角層中で DJ- 1 が高濃度存在多い。DJ- 1 はシグナル配列をもたないことから、小胞を介さない非典型的な経路によって分泌されると考えられるが、その分泌機構は不明であった。そこで本研究において

The secretion mechanism of skin cellprotecting protein
Noriko Noguchi
Faculty of Life and Medical Sciences,
Doshisha University

我々は、皮膚の酸化ストレス防御において重要な役割を果たすと考えられる DJ- 1 の細胞外分泌メカニズムについて解析することを目的とした。また、その分泌を促進する化合物を見出すことで、細胞防御タンパク質の分泌促進による皮膚の健康増進法を開発することを目指した。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．方２．３．細胞内還元型 Glutathione（GSH）量の測定

法

6 ウェルプレートで培養した細胞に対して、刺激を行い、

２．
１．細胞とその培養法回収した細胞を 0 . 2 M 過塩素酸溶液で溶かし、氷上で 30

ヒト神経芽細胞種（SH-SY 5 Y）細胞は ECACC から購入-/-

5）

分インキュベートした。遠心後、上清を 1 M CH 3 COONa

した。マウス野生型 MEF 細胞および atg 5 MEF 細胞 は、を用いて pH 3 付近になるよう調整し、フィルターろ過後、水島昇教授（東京大学）からご供与いただいた。atg 9 -/- とSC- 5 ODS カラムを用いて HPLC により定量した。エレン-/-

atg 16 l 1 MEF 細胞

6 , 7）

は、審良静男教授（大阪大学）からトとして 99 % 0 . 1 M sodium phosphate buffer, pH 2 . 5 , 1 %

ご供与いただいた。基礎培地として DMEM/F 12 培地を用

methanol, 100 mg/L sodium octanesulfonate, and 50 mg/L

い、10 % FBS と抗生物質を添加した。培養は 37 ℃、5 %EDTA- 2 Na 溶液を用い、標品として還元型 GSH を用いた。

CO 2 環境下で行った。

２．４．免疫細胞染色、電子顕微鏡観察

２．２．細胞処理と分泌評価法

カバーガラス上で培養した細胞を、冷メタノールで固定、分泌誘導刺激として、6 -hydroxydopamine（6 -OHDA）

BSA でブロッキング後、一次抗体として抗 DJ- 1 抗体、抗を用いた。6 ウェルプレートで培養した細胞に対して、

LC 3 抗体、二次抗体として Alexa 標識抗体を用いて染色

50 - 100 µM 6 -OHDA で 3 時 間 処 理 し、 さ ら に serum-

後、Zeiss LSM 710 共焦点顕微鏡を用いて、細胞を観察した。

free 培地で 2 時間培養した。N-acetylcysteine（NAC）処

また、電子顕微鏡観察の場合、細胞は 2 % グルタルアルデ

理は、2 mM NAC で 2 時間前処理を行った。処理後、細ヒドで固定し、JEM- 1200 EX による TEM 観察を行った。

胞と培養上清をそれぞれ回収し、細胞から可溶化バッファ３．結ー（1 0 mM Tris-HCl, pH 7 . 4 , 1 5 0 mM NaCl, 1 % NP- 4 0 ,果を用いて、whole cell lysate を回収した。培養上清は、遠３．１．6 -OHDA 処 理 は、 酸 化 ストレス 依 存 的 にDJ-1 の分泌を促す

心 後、 回 収 し た 上 清 1 mL に 1 mg の BSA と 終 濃 度 10 %細胞からの分泌メカニズムを明らかにするため、評価

Trichloroacetic acid（TCA）
を加え、TCA 沈殿により濃縮系が確立している SH-SY 5 Y を用いた。分泌誘導刺激としを行い、サンプルバッファーに溶解し、SDS-PAGE 用サて、内在性のカテコールアミン作動性神経毒であり、パンプルとした。タンパク質は BCA 法により定量し、SDS-

ーキンソン病発症モデル化合物として広く用いられていPAGE、二次元 PAGE、ウエスタンブロット法により解析

る 6 -OHDA を用いた。その結果、6 -OHDA の濃度依存的

0 . 1 % SDS, 5 mM EDTA- 2 Na, protease inhibitor cocktail）

した。また、Lactate dehydrogenase（LDH）法を用いて、 （0 - 100 µM）に DJ- 1 の細胞外分泌が亢進した（図 1 A）
。ま
培養上清中の LDH 活性を測定することにより、細胞膜破

た、6 -OHDA 刺激下においても、通常小胞体に存在する綻の判定を行った。

ribophorin 1（RPN 1）（図 1 A）や細胞質に存在する LDH

図1（A）SH-SY5Y細胞における6-OHDA刺激によるDJ-1分泌への影響。
（B）6-OHDA刺激によるDJ-1分泌とLDH releaseに対する影響。n=3; mean±S.D.; *, p<0.05.（C）6-OHDA誘導性DJ-1分泌亢進に対する
brefeldin Aの影響。
（D）細胞内GSH含量。n=5; mean±S.D.; **, p<0.01.（E）6-OHDA誘導性DJ-1分泌亢
進に対するNACの影響。

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皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索

活性の培養上清中での上昇が認められなかったことから

ころ、6 -OHDA の濃度依存的に LC 3 -II が増加しているこ（図 1 B）、DJ- 1 分泌が膜破綻によるものではないことがとが確認された（図 2 A）。そこで DJ- 1 分泌に対するオー確認された。分泌経路について、典型的分泌経路の阻害剤

トファジーの関与を明らかにするため、オートファジー研

である Brefeldin A を用いて解析したところ、Brefeldin A

究でよく用いられている野生型 MEF 細胞に 6 -OHDA 刺の共処理は、6 -OHDA 誘導性の DJ- 1 分泌に影響を与えな激を行い、DJ- 1 の分泌に対する影響を調べた。その結果、かった一方で、典型的経路により分泌されることが知られ

6 -OHDA 濃度依存的に DJ- 1 の分泌が亢進した（図 2 B）。

ている fibronectin 1（FN 1）の分泌は顕著に減少していた

また、培養上清中の LDH 活性の上昇は起きていなかったことから、DJ- 1 は非典型的経路により分泌されているこ（data not shown）。さらに 75 µM 6 -OHDA 刺激で、LC 3 -とが明らかとなった（図 1 C）。

II 型の増加が確認された（図 2 C）。そこで、電子顕微鏡観6 -OHDA は速やかに H 2 O 2 と 6 -OHDA quinone に分解察を行ったところ、6 -OHDA 刺激を加えた細胞では、隔され、細胞内酸化ストレスを上昇させることが知られて離膜やオートファゴソーム、オートリソソームと考えられいることから、細胞内の GSH 濃度を測定した。その結果、る構造が観察された（図 2 D）。また、蛍光顕微鏡を用いて100 µM 6 -OHDA 刺激により、GSH 濃度が有意に減少し免疫細胞染色を行ったところ、6 -OHDA 刺激により DJ- 1ていることを確認した（図 1 D）
。そこで細胞内 GSH 濃度をと LC 3 が共局在することが観察された（図 2 E）。以上の結増加させることが可能な N-acetyl cysteine（NAC）で前処果から、DJ- 1 の分泌を促す 6 -OHDA 刺激下では、オー理を行うと、6 -OHDA により亢進した DJ- 1 の分泌が抑制

トファジーも誘導されていることが明らかとなった。

された（図 1 E）
。以上の結果から、6 -OHDA による酸化ス
トレスの上昇が DJ- 1 の分泌を亢進させることが示唆された。

３．３．DJ-1 の分泌は、オートファジー欠損 MEF 細胞で抑制される
次に DJ- 1 分泌に対するオートファジーの関与を明ら

３．
２．DJ-1 の分泌を促す 6 -OHDA 刺激は、オートファジーを誘導する

かにするため、オートファジー進行に必要な因子である
Atg 5、Atg 9、Atg 16 L 1 を そ れ ぞ れ 欠 損 し た MEF 細 胞

さらに詳細な 6 -OHDA 誘導性の DJ- 1 分泌機構を明らを 用 い て、6 -OHDA の 効 果 を 検 証 し た。 そ の 結 果、 野

かにするため、非典型的な分泌機構への関与が指摘されて生型（WT）細胞と比べ、Atg 5 欠損細胞（図 3 A）や Atg 9、いるオートファジーに着目した。オートファジー進行のマAtg 16 L 1 欠損細胞（data not shown）において、LC 3 -IIーカーとして LC- 3 の I 型から II 型への変化を解析したと型 が 減 少 す る と と も に、6 -OHDA 刺 激 に よ る DJ- 1 の

図2（A）SH-SY5Y細胞における6-OHDA 刺激によるLC3への影響。
（B、C）MEF細胞における6-OHDA刺激によるDJ-1分泌（B）、LC3（C）への影響。
（D）MEF細胞における6-OHDA刺激時の電子顕微鏡観察。i：コントロール刺激、ii-v:6-OHDA刺激、iii隔離膜、iv:オートファゴソーム、v:オートリソソーム。
（E）MEF細胞における6-OHDA刺激時の免疫細胞染色。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図3（A）WTおよびatg5 -/- MEF細胞における6-OHDA 刺激によるDJ-1分泌への影響。
（B）SH-SY5Y細胞におけるATG16L1ノックダウンによるDJ-1分泌への影響。
（C、D）WT MEF細胞における6-OHDA誘導性
DJ-1分泌亢進（C）、LC3（D）に対するNACの影響。

分 泌 亢 進 が 観 察 さ れ な か っ た。 さ ら に、siRNA に よ り

さらに NAC 前処理は AMPK のリン酸化を抑制したこと

ATG 16 L 1 をノックダウンした SH-SY 5 Y 細胞においても、から、6 -OHDA 誘導性酸化ストレスが mTOR 非依存的に同様に 6 -OHDA 誘導性 DJ- 1 分泌が抑制された（図 3 B）。

AMPK、ULK 1 のリン酸化を引き起こしていることが示

これらの結果から、オートファジーの進行が、6 -OHDAされた（図 4 B）。また AMPK の活性化は、AMP：ATP 比

誘導性の DJ- 1 非典型的分泌に重要な役割を果たすことがにより調節されていることから、AMP と ATP レベルを解

明らかとなった。

析したところ、6 -OHDA 刺激は AMP:ATP 比を上昇させまた、MEF 細胞においても、NAC の前処理は 6 -OHDAていた（図 4 C）。

誘導性 DJ- 1 分泌亢進を抑制し（図 3 C）
、LC 3 -II 型の増加

次に 6 -OHDA 誘導性オートファジーや DJ- 1 の分泌にも抑制していた（図 3 D）ことから、酸化ストレスの上昇が、対する ULK 1 阻害剤 MRT 68921 の効果を検討した。そのオートファジーの誘導や DJ- 1 の分泌に関与していること

結 果、MRT 68921 の 共 処 理 は、6 -OHDA に よ る LC 3 -IIが明らかとなった。

型の増加を抑制するとともに（図 4 D）、DJ- 1 の分泌亢進も抑制した（図 4 E）
。これらの結果から、AMPK-ULK 1

３．４．AMPKとULK1 の活性化が、6 -OHDA 誘導性のオートファジーや DJ-1 分泌亢進に重要である

経 路 の 活 性 化 が 6 -OHDA 誘 導 性 の オ ー ト フ ァ ジ ー や
DJ- 1 の分泌亢進に関与していることが示された。

そこで 6 -OHDA による酸化ストレスの上昇が、なぜ
オートファジーを誘導するのか明らかにするために、オートファジーのシグナル伝達経路と酸化ストレスの双３．５．トレハロースはオートファジーや DJ-1 分泌を促す

方 に 含 ま れ る 制 御 因 子 で あ る AMP 活 性 化 プ ロ テ イ ン

最後に 6 -OHDA 以外の刺激でも DJ- 1 の分泌が亢進す

キナーゼ（AMPK）とその下流の unc- 51 like autophagy

るか検証した。天然の糖質であり皮膚の保湿効果があるこ

activating kinase 1（ULK 1） の 活 性 化（ リ ン 酸 化 ）、 おとが知られるトレハロースは、AMPK-ULK 1 経路を活性よびオートファジーの負の制御因子である mechanistic

化し、mTOR 非依存的にオートファジーを誘導すること

target of rapamycin kinase（mTOR） の 活 性 に 着 目 しが知られていること 8 , 9） から、DJ- 1 の分泌に対する効果

た。その結果、比較対象として用いた mTOR の阻害剤でを検討した。その結果、トレハロース処理は濃度依存的に

あ る rapamycin 処 理 は、AMPK や ULK 1 の リ ン 酸 化 に

LC 3 -II 型の増加を誘導し（図 5 A）、200 mM トレハロース

影響を与えずに、mTOR の標的である p 70 S 6 K のリン酸

は 6 -OHDA と同程度に DJ- 1 の分泌を亢進した（図 5 B）。

化を抑制した（図 4 A）
。一方で 6 -OHDA 刺激は、AMPK

４．考の Thr 172 のリン酸化と ULK 1 の Ser 555 のリン酸化を誘導したが、p 70 S 6 K のリン酸化には影響していなかった。

察

本研究では DJ- 1 の分泌メカニズムを明らかにするため− 116 −

皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索

図4（A）WT MEF細胞における6-OHDA 刺激によるAPMK、ULK1、p70S6Kのリン酸化への影響。
（B）WT
MEF細胞における6-OHDA とNAC共処理によるAMPKのリン酸化とLC3に対する影響。
（C）WT MEF細胞
における細胞内AMP:ATP比。n = 3; mean ± S.D.; *, p < 0.05.（D、E）SH-SY5Y細胞における6-OHDAとMRT68921共処理によるLC3（D）とDJ-1分泌（E）に対する影響。

図 5（A）WT MEF 細胞におけるトレハロース刺激による LC 3（A）と、DJ- 1 分泌（B）に対する影響。

に神経細胞と線維芽細胞を用いた。その結果、6 -OHDAによる細胞内酸化ストレス上昇が AMP：ATP 比率を変化させ、AMPK を活性化させたことで、オートファジーの進行に関わる ULK 1 のリン酸化が起き、分泌性オートフ
ァジーによる DJ- 1 の分泌が起きることを見出した。これ
らの結果から通常細胞質に存在する DJ- 1 の分泌機構として、オートファジー性の小胞に囲まれ、その後小胞が細胞膜と融合することで DJ- 1 の細胞外への非典型的分泌が起こるという可能性が示唆された（図 6）。また、DJ- 1 分泌促進剤として、化粧品原料としても用いられるトレハロー
スを同定した。なお本報告書は文献 10 の内容をもとに作成した。
今回我々が新規に明らかにした分泌性オートファジーによる DJ- 1 の分泌機構が、UV 刺激による酸化ストレスの上昇に伴う皮膚細胞からの DJ- 1 の分泌に関わるか今後明らかにする必要がある。また、本研究で見出したトレハ
ロースをはじめ、DJ- 1 の分泌を促進する化合物の探索や、
DJ- 1 とともに分泌されるタンパク質の同定やその機能が明らかになれば、皮膚細胞の保護タンパク質の分泌促進につながることが期待される。

図6− 117 −

6-OHDA刺激によるDJ-1の非典型的分泌機構の模式図

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

translocation of STING and the innate immune（引用文献）
1） Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O,
Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, Squitieri F,

response. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1 0 6, 2 0 8 4 220846, 2009.

Ibanez P, Joosse M, et al. Mutations in the DJ-1 gene7） Saitoh T, Fujita N, Jang MH, Uematsu S, Yang BG,

associated with autosomal recessive early-onset

Satoh T, Omori H, Noda T, Yamamoto N, Komatsu M,

parkinsonism. Science 299, 256-259, 2003.

et al. Loss of the autophagy protein Atg16L1 enhances

2） Ishiwatari S, Takahashi M, Yasuda C, Nakagawa M,
Saito Y, Noguchi N, Matsukuma S. The protective roleendotoxin-induced IL-1beta production. Nature 4 5 6,264-268, 2008.

of DJ-1 in ultraviolet-induced damage of human skin:8） DeBosch BJ, Heitmeier MR, Mayer AL, Higgins CB,

DJ-1 levels in the stratum corneum as an indicator of

Crowley JR, Kraft TE, Chi M, Newberry EP, Chen Z,

antioxidative defense. Arch. Dermatol. Res. 3 0 7, 9 2 5-

Finck BN, et al. Trehalose inhibits solute carrier 2A

935, 2015.

（SLC2A）proteins to induce autophagy and prevent

3） Zhang M, Schekman R. Unconventional secretion,

hepatic steatosis. Sci. Signal 9, 21, 2016.

unconventional solutions. Science 340, 559-61, 2013.

9） S a r k a r S , D a v i e s J E , H u a n g Z , T u n n a c l i f f e4） Malhotra V. Unconventional protein secretion: an

A, Rubinsztein DC. Trehalose, a novel mTOR-

evolving mechanism. EMBO J. 32, 1660-1664, 2013.

independent autophagy enhancer, accelerates the5） Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakayaclearance of mutant huntingtin and alpha-synuclein. J.

H, Yoshimori T, Ohsumi Y, Tokuhisa T, Mizushima
N. The role of autophagy during the early neonatal

Biol. Chem. 282, 5641-5652, 2007.
10）Urano Y, Mori C, Fuji A, Konno K, Yamamoto
T, Yashirogi S, Ando M, Saito Y, Noguchi N.

starvation period. Nature 432, 1032-1036, 2004.
6） Saitoh T, Fujita N, Hayashi T, Takahara K, Satoh6 -Hydroxydopamine induces secretion of PARK 7 /T, Lee H, Matsunaga K, Kageyama S, Omori H, Noda

DJ- 1 via autophagy-based unconventional secretory

T, et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic

pathway. Autophagy 14 , 1943 - 1958 , 2018 .

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