アレルギー性接触皮膚炎成立の必要条件となるハプテンによる成熟分化機構の解析
東北大学

相医学部皮膚科場

節也

After application of haptens to the skin, Langerhans cells (LCs), i.e., immature dendritic cells (DCs) in the skin,move to secondary lymphoid organs to sensitize naive T cells. During this process, LCs become mature DCs withaugmented expression of various co-stimulatory molecules and class II MHC antigens. In this scenario, however,critical questions remain as to what kind of chemicals can induce this maturation process through what kind ofmechanisms. To clarify these questions, we used monocyte-derived CD1a+ DCs instead of LCs since LC maturated
in in vitro culture, spontaneously. After we confirmed that monocyte-derived DCs showed at least phenotypiccharacteristics and a response to TNFa similar to LCs, we added various chemicals, i.e., dinitrochlorobenzen (DNCB),trinitrochlorobenzen (TNCB), NiCl2, ZnCl2, sodium lauryl sulfate (SLS), or benzalkonium chloride (BC), to a cultureof purified monocyte-derived CD1a+ DCs. Among them, only NiCl2 and DNCB significantly increased the surface
expression of CD54, CD86, HLA-DR antigen, and IL-1b production, while SLS, BC, or ZnCl2 could not augment
them, except for weak augmentation of CD86 expression by SLS. Among these three molecules, the increase in
the expression of CD86 induced by NiCl2 or DNCB was most remarkable, being observed in DCs from almost all
the subjects we examined. TNCB could also induce responses similar to those with DNCB, but the number of thesubjects whose DCs responded to it was far less than that of the subjects whose DCs responded to NiCl2 or DNCB.
In spite of the augmented CD86 expression on DCs treated with DNCB or NiCl2, they induced different responsesof DCs in their expression of CD54 and HLA-DR and the production of IL-6 and TNFa. In addition, the up-regulationof CD86 expression on DCs treated with DNCB was significantly suppressed by either anti-IL-1b or anti-TNFa
antibody, while that by NiCl2 was relatively insensitive to these antibody treatments. Finally, the protein kinase C
inhibitor, H7, but not staurosporin, could suppress the augmentation of CD86 expression on DCs induced either byNiCl2 or by DNCB. These data suggest that DCs respond to some haptens by changing their expression of several
co-stimulatory molecules and their production of cytokines with a resultant change in potency of antigen presenting
function. They also suggest that these chemicals stimulate DCs by different mechanisms. By these responses, DCs
may modulate the final immune response to chemicals.

ス細胞が表皮から所属リンパ節に遊走する事を

１ 緒 言報告した。これらの報告により、生体内の非リン骨髄の幹細胞に由来する樹状細胞は、分化成熟

パ組織のいたるところに分布している樹状細胞に伴い、種々の co-stimulatory molecules, class IIが、そこに侵入してくる抗原を取り込み、その後MHC 抗原の発現を増強させることが知られてい所属リンパ節に遊走しＴ細胞を感作するという

１−６）。この樹状細胞の分化成熟にともなう変化は、るシェーマが完成した。

７−８）

はじめ、試験管内での培養後に観察され、その後、

しかし、このシェーマの中には、非リンパ組織同様の現象が、皮膚にハプテンというある種の化に分布するランゲルハンス細胞がどのような刺学物質が塗布された際にも起こることが我々の激を、どの様な機序で認識し、また、どの様な機９）研究により明らかにされた 。一方、Macatoniら

10）や、Kripke ら

11）

は、その際、ランゲルハン

Dendritic cells differently respondto haptens and irritants by theirproduction of cytokines and expressionof co-stimulatory molecules.
Setsuya Aiba
Department of Dermatology, Tohoku
University School of Medicine

序で分化成熟するのかという未解決の問題が存在する。当然、この問題を明らかにするためには、樹状細胞を試験管内で培養する必要があるが、上述したように、ランゲルハンス細胞は試験管内で培養したのみでは、未刺激で分化成熟してしまうため、我々の明らかにしたい問題の解決には利用できない。しかし、最近、Sallustro ら 12）、および、Romani ら 13）により、末梢血 CD 14 陽性細− 72 −

アレルギー性接触皮膚炎成立の必要条件となるハプテンによる成熟分化機構の解析

胞を、IL − 4、GM − CSF の存在化に培養すると未２. ４ 産生された IL− 1a、IL− 1b、TNFa、IL− 10、熟な樹状細胞が誘導できることが報告され、我々

IL− 12 などのサイトカインの市販の Enzyme-は、この培養系を利用してハプテンの樹状細胞へ

linked immunosorbent assay（ELISA）キットの影響を試験管内で検討した。

による定量樹状細胞培養上清を回収し、市販の ELISA キ２ 実験方法ットにて IL − 1 a、IL − 1 b、TNFa、IL − 10、IL −２. １ 樹状細胞、ランゲルハンス細胞の培養12 の産生量を定量した。

樹状細胞の純粋培養は、末梢血バフィーコー
トから比重遠心にて分離した白血球分画を、抗２. ５ reverse transcriptase polymerase chain

CD 14 標 識 ビ ー ズ と magnetic activated cellreaction（RT − PCR）

sorter（MACS）にて処理し CD 14 陽性細胞を単以上の細胞表面マーカー、サイトカインの産離した後に、IL − 4 と GM − CSF の存在下に培養生が mRNA の発現増加を伴っているか reverseすることにより得た。また、ランゲルハンス細胞

transcriptase polymerase chain reaction（RT −は、手術などに際し余った皮膚を dispase、トリPCR）により半定量した。

プシンなどで処理した後比重遠心を行い、ランゲルハンス細胞の含有率の高い表皮細胞浮遊液を

２. ６ 抗原提示
樹状細胞の機能的変化に関しては、アロＴ細胞作成し、それを用いた。

刺激能力を指標にして検討した。
２. ２ 化学物質の添加と樹状細胞に対する生物

３ 結果と考察

学的効果の検討
可能な限り多くの化学物質の影響を検討したい

３. １ ランゲルハンス細胞と単球由来樹状細胞と考えたが、主に、本研究では、ニッケル、コバの比較（図１）

ルト、dinitrochlorobenzen、trinitrochlorobenzen

ランゲルハンス細胞と CD 14 陽性単球由来のなどのハプテンと分類される化学物質、sodium

樹状細胞を、いかなるサイトカインも加えていな

lauryl sulfate、benzalkonium chloride、phenol など

い状態、あるいは、TNFa を添加した状態で培養

皮膚一次性刺激物質、ハプテンとはなりにくい亜し、その細胞表面マーカーの変化を比較検討し鉛、銅などを中心に検討した。これらの物質を種々た。ランゲルハンス細胞は、TNFa を加えない培の濃度で培養系に加えて以下のアッセイ方法にて養でも活性化し、CD 86 分子の発現を増強してしその影響を調べた。

まい、樹状細胞を分化成熟させることが明らかな
TNFa 12、14）を添加してもその影響が観察られなか

２. ３ flow cytometry を用いた class II MHC 抗った。

原、CD54、CD80、CD86 などの co-stimulatory

一方、単球由来の樹状細胞では、TNFa 無添加

molecules の発現量の定量

では、分化が抑制され CD 86 の発現が弱く抑え

培養樹状細胞に、種々の濃度の化学物質を添られており、それに、TNFa 添加することにより加後、経時的に樹状細胞を回収し、抗 class II

CD 86 の発現が著明に増強され、その影響が明ら

MHC 抗原、CD 54、CD 80、CD 86 抗体にて免かに観察された。

疫染色を施行後、flow cyotometry（FACScan）
にて解析した。

− 73 −

３．２

化学物質による樹状細胞表面の class II

まず，培養系にそれぞれを種々の濃度で添MHC 抗原、CD54、CD80、CD86 などの co-加したところ、採取した白血球により個体差

stimulatory molecules の発現増強（図２、３、４）がみられたが。今回の検討した試薬のなかでは

そ こ で、 こ の 細 胞 を 用 い、 ７ 種 類 の 化 学

DNCB、TNCB、NiCl 2 が明らかに樹状細胞の活物 質（DNCB、TNCB、NiCl 2、ZnCL 2、SLS、性化を促した。また、この３種の化学物質の間Benzalkonium、DMSO）が樹状細胞の分化成熟にでも相違が認められ、NiCl 2 は CD 86 のみなら与える影響を検討した。

ず HLA − DR 抗原と CD 54 の発現を、DNCB はCD 86 のみの明らかな発現を増強させた。TNCBは DNCB に 類 似 し た 影 響 を 及 ぼ し たが、実験に用いた白血球による個体差が非常に大きかった。また、RT − PCR を用いた、mRNA の解析によっても、NiCl 2、DNCB 処理樹状細胞では、CD 86 mRNAの発現が増強していた。
３. ３ 樹状細胞によるサイトカインの産生（図５）
次に、NiCl 2、DNCB、TNCB、SLS で刺激された樹状細胞がいかなるサイトカインを産生するかを ELISA にて検討したところ。NiCl2 で刺激された樹状細胞は、IL−1b、TNFa、IL−6 の産生を、DNCB に関しては、IL−1b の産生のみを未処理のコントロールに比べて有意に増加させた。
３. ４ ハプテン刺激により誘導される樹状細胞の成熟過程におよぼす抗 IL − 1 b、TNFa 抗体の影響
NiCl 2、DNCB 刺激により樹状細胞のサイトカイン産生が増強する事が明らかとなったので、次に、樹状細胞の成熟がこれらの産生されるサイトカインにより二次的に誘導されているのか否かを、
NiCl 2、DNCB で刺激された樹状細胞の図１ ランゲルハンス細胞と単球由来樹状細胞の細胞表 マーカーの比較
点線：negative control 抗体、shaded curve : サイトカイン無添加の培養、実線：TNFa 添加培養。ランゲルハンス細胞の培養系では、TNFa の影響がほとんど認められないが、樹状細胞の培養系では、CD86 の発現増強が明瞭に認められる。
（文献 17 より）− 74 −

培養系に抗 IL- 1 b、TNFa 抗体を添加することにより検討した。
その結果、NiCl 2 により誘導される樹状細胞の CD 86 分子の発現増強には、それらの抗体はほとんど影響を及ぼさなかアレルギー性接触皮膚炎成立の必要条件となるハプテンによる成熟分化機構の解析

図２ 種々の化学物質添加による樹状細胞表 抗原（flow cytometry profile）
種々の化学物質添加による樹状細胞表 抗原の変化を flow cytometry にて解析した。その代表的なプロフィール。shadedcurve：化学物質を添加しないコントロール、実線；化学物質添加 48 時間後の発現パターン。
（文献 17 より）

図３ 種々の化学物質添加による樹状細胞表 抗原（前解析例のまとめ）
種々の化学物質添加による樹状細胞表 抗原の relative fluorescence intensity を棒グラフに表した。
（文献 17 より）− 75 −

ったが、DNCB の作用は、抗 TNFa 抗体により３. ５ 化学物質の刺激を受けた樹状細胞の抗原著明に抑制されることが明らかとなった。以上か提示（図６）

ら、樹状細胞が、ハプテンの種類により、異なっ

NiCl 2、DNCB で刺激された樹状細胞は、アロた機構により表面マーカーの発現、サイトカインＴ細胞刺激する抗原提示活性を増強した。また、の産生を変化させることが明らかとなった。すなその活性は抗 CD 54、CD 86 抗体により抑制された。

わち、例えぱ DNCB の場合は IL − 1 b、TNFa を総 括産生し、その autocrine 機構により樹状細胞を活性化させ、NiCl 2 の場合はサイトカインの分泌をアレルギー性接触皮膚炎は、一見、T 細胞が介さず、むしろ、直接、CD 86 の発現を増強させる。

成立過程のすぺてを支配しているようにうけとられがちである。しかし、今回の我々の研究により、実際は、ランゲルハンス細胞あるいは樹状細胞が抗原の侵入を察知し、それを引き金として成熟、分化し、自らの形質を変化させるという過程がきわめて重要なカギを握っていることがあきらかとなった。
化粧品の開発において、添加する化学物質が接触皮膚炎を惹起する物質であるか否かの判定はきわめて重要な過程である。これまでは、その試験を Kligaman、Magnusson ら 15、16）により開

図４ 化学物質処理樹状細胞の CD80、CD86mRNA の発現化学物質処理樹状細胞から mRNA を取り出し、RTPCR にて CD80、CD86mRNA の発現を比較した。

発された実験動物を用いた maximization test により行ってきた。しかし、この方法には、化粧品というヒトの生命とは関わりのない物の開発に、実験動物の貴重な命を犠牲にしてよいのかと

図５ 化学物質処理樹状細胞のサイトカイン産生樹状細胞を NiCl2、DNCB、SLS にて処理し 48 時間後の培養上清中に含まれるサイトカインを ELISA に定 した。
（文献17 より）− 76 −

アレルギー性接触皮膚炎成立の必要条件となるハプテンによる成熟分化機構の解析

図６ 化学物質処理樹状細胞のアロＴ細胞刺激
化学物質処理した樹状細胞の抗原提示能を、アロＴ細胞刺激活性を指標に比較した。また、その系に抗体を添加し、その抗原提示活性にどの co-stimulatory molecules が重要な役割を たしているか検討した。

いう倫理的問題と、また、実験動物のデーターがGiannetti, A., J Invest Dermatol 1994 . 103 : 54 .

果たしてヒトに当てはまるのかという未解決の５ Ozawa, H., Nakagawa, S., Tagami, H. and問題が存在する。今回我々が詳細に検討した樹Aiba, S., J Invest Dermatol 1996 . 106 : 441 .

状細胞培養系は、化学物質に接触皮膚炎を惹起

６

Yokozeki, H., Katayama, I., Ohki, O.,する必要条件が存在するか否かを明らかにでき、

Matsunaga, T., Watanabe, K., Satoh, T., Azuma,maximization test の代替法としての可能性が示

M., Okumura, K. and Nishioka, K., J Invest

唆される。

Dermatol 1996 . 106 : 147 .

なお、以上の結果は、Eur J Immunol vol 27 ,７ Schuler, G. and Steinman, R. M., J Exp Med

2031 − 2038 に報告した。

1985 . 161 : 526 .
８Inaba, K., Schuler, G., Witmer, M. D.,

文 献Valinsky, J., Atassi, B. and Steinman, R. M., J

１ Steinman, R. M., Annu Rev Immunol 1991 . 9Exp Med 1986 . 164 : 605 .

: 271 .

９ Aiba, S. and Katz, S. I., J Immunol 1990 . 145

２ Romani, N., Lenz, A., Glassel, H., Stossel, H.,
Stanzl, U., Majdie, O., Fritsch, P. and Schuler,: 2791 .
10 Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J.,

G., J Invest Dermatol 1989 . 93 : 600 .

Griffiths, S. and Fryer, P., J Exp Med 1987 . 166

３ Symington, F. W., Brady, W. and Linsley, P.
S., J Immunol 1993 . 150 : 1286 .

: 1654 .
11 Kripke, M. L., Munn, C. G., Jeevan, A., Tang,

４ Girolomoni, G., Zambruno, G., Manfredini,R., Zacchi, V., Ferrari, S., Cossarizza, A. and− 77 −J. M. and Bucana, C., J Immunol 1990 . 145 :2833 .

12 Sallustro, F. and Lanzavechia, A., JEM 1994 .
179 : 1109 .

Immunol 1995 . 25 : 1943 .
15 Kligman, A. M., J Invest Dermatol 1965 . 47 :13 Romani, N., Bruner, S., Brang, D., Kampgen,E., Lenz, A., Trockenbacher, B., Konwalinka, G.,

393 .
16Fritsch, P. O., Steinman, R. M. and Schuler, G., J

Magnusson, B. and Kligman, A. M.,

Idenrification of contact allergens., Springfield,

Exp Med 1994 . 180 : 83 .

Illinois 1970 .

14 Ludewig, B., Graf, D., .Golderblom, H. R.,

17 Aiba, S., Terunuma, A., Manome, H., andBecker, Y., Kroczek, R. A. and Pauli, G., Eur J

Tagami, H., Eur J Immunol 1997 . 27 : 3031 .

− 78 −