接触皮膚炎におけるマスト細胞活性化反応の解析
工昭和大学

薬学部

藤一郎

Mast cells contribute to allergic inflammation by releasing chemical mediators in response to activation
with cytokines and/or lgE/antigen. Here we report that when mouse bone marrow-derived mast cells wereactivated with lgE/antigen in the presence of interleukin (IL)-10 and IL-1(3 , but not other cytokine
combinations, there were two phase of prostaglandin (PG) D, generation, in which the first phase occurred
within 1 hr and the second phase from 2 to 10 hr. The delayed phase PGD, generation paralleled the de nova
induction of cyclooxygenase (COX)-2 protein irrespective of the constant expression of COX-1 and wasabrogated by COX-2 specific inhibitor. Detailed examination of individual effect of IL-10, IL-1(3 and lgE/
antigen on COX-2 expression revealed that lgE/antigen or IL-10 each initiated and stabilized COX-2 mRNA
expression, whereas IL-1/3 stabilized COX-2 protein without affecting its mRNA level. Whereas expression ofcytosolic phospholipase A, (cP凶） was unchanged under any culture condition, expression of type II secretory
P凶(sP凶） transcript was induced by 5 hr in cells treated with IL-10 + IL-1(3 independent of lgE/antigen,accompanied by increase in sPL.A, activity. Substantial suppression of delayed phase PGD, generation byanti-sP凶antibody suggests the functional linkage of the two induced prostanoid-biosynthetic enzymes,sP凶and COX-2, to provide PGD2 in the delayed phase.

緒て、 最近、lgE/抗原刺激により活性化した肥満細言

胞による多種多様なサイトカインの発現誘導と放肥満細胞は骨髄中の多能性血液幹細胞を起源と出が注目を集めている。

する組織性の細胞であり、 組織微小環境で産生さマウス 骨髄細胞をインタ ー ロイキン 3 (IL- 3)

れる種々のサイトカインに応答して増殖し、 組織存在下数週間培養すると、 均 ー な肥満細胞集団

固有の形質を持つ肥満細胞サプタイプに分化成熟(B M M C)が 得 ら れ る こ と が知 ら れ て い る 。

する。 肥満細胞表面上に存在する高親和性lgE受BMMCはその培養が容易で大量調製が可能なこ

容体がlgEを介して特異抗体で架橋されると、 肥と、 機能的IgE受容体を発現していること 、 及び満細胞は急速に活性化し、 顆粒内容物であるヒス多種多様のサイトカインに応答すること等の理由

タミン、 セロトニン等を放出すると同時に、 膜リから、 肥満細胞研究のモデル系としてよく用いらン脂質から遊離されたアラキドン酸からPGD2やれている。 我々は慢性アレルギ ー の原因を解明す

LTC4 を産生する。 これら肥満細胞由来の化学伝べく、 肥満細胞の活性化に伴う長期応答について

達物質は即時型アレルギ ー 応答、 アナフィラキシ着目し、 BMMCを用いて、 特に脂質代謝の視点ーショックの主要因となるものの、 気管支喘息やから解析を行った。 その結果、 ある特定のサイトアトピーーの臨床的知見にカイン存在下に BMMCをlgE/ 抗原刺激すると、頻繁に見られる慢性化した病変を説明し得るもの

即時応答で見られる迅速な PGD2の産生に続い性皮膚炎等のアレルギではない。 慢 性のアレルギ

ー

炎症像の要因としStudies on activation of mast cells incontact dermatitisて、 刺激後数時間の間に第二相のPGD2産生が 起こることを見い出した。

2

Kudo Ichiro
2. 1

Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Sh owa uruvers1ty

実験

BMMCの調製

雄のBALB/cJマウスから採取した 骨髄細胞を、50%RPMI 1640 (10%FCS)- 43 -+ 50% WEHI- 3 細胞培養上清液中で3から6週間培養した。 3週間原刺激した場合でも同程度のPGD2産生が見られ後には98%以上がBMMCとなった。

た（約1 ng/106cells)。抗原刺激を行わず、サイトカイン単独では、PGD2産生はほとんど見られ2.2

BMMCのサイトカインおよび抗原抗体なかった。一 方、刺激5時間後に上清のPGD2を測定したところ、 ほとんどの場合1時間後とはぼによる処理
1度メディウムで洗ったBMMCを1X 10 cells /同じ値を示したのに対し、IL-l+ IL-10共存下にmeの猥度になるようメディウムに縣濁し、 lOmg/抗原刺激したBMM C の 場合のみ 、 PGD2量はme抗TNP (Trinitrophenyl) IgE抗体で 30 分間、5.6ng/106cells に増加していた（表1)。

7

37度で感作させる。メディウムで2回洗った後、そこで IL- l+IL-10共存下にlgE/杭原刺激し様々なサイトカイン(IL-1 (3、IL-3 、 IL-10) がた時のPGD淮生の経時変化を細かく解析したと単独あるいは組み合わさって入っているメディウ

ころ、 刺激後1時間以内にピ ー クに達する第一相

ムに縣濁させ、 抗原で刺激した。

（即時相）と刺激後2時間から上がり始め5時間から10時間後にピ ー クに達する第二相（遅発相）

2. 3 PGD2量の測定から成ることがわかった（図1)。抗原剌激なし

アマシャム社のPGDグッセイキットを用いて測定した。にIL-l+IL-10で培養した場合、 即時相でのPGD2産生は見られず 、 遅発相のPGD2産生がわずかに観察された。

2.4ノーザンブロッティング

RNA は T Rlzol試薬( GIBCO BR L)を用い 、

3 . 2 シクロオキシゲナ ー ゼ(COX)の発現

guanid inium th ioc yanate法により細胞より抽出し

IL- l+IL- lO+lgE/ 抗原刺激によるBMMCの遅RNAはアガロ ー スゲルにより分離後、 ナイロ発型PGD痒生がどのように調節されているかにした。COX-1、ついて、 まずアラキドン酸をプロスタノイドに変たoンメンブレンにトランスファー換する酵素である cox に注目して調べた。cox

COX-2、 cPLfu 、 sPLfuあるしヽは(3-Ac t inプロブを ランダムプ ライマ ー 法により32pラベルし、には、 広い組織に恒常的に発現している COX-1ブロッティングを行った。と、 炎症刺激や増殖因子刺激により誘導される

2. 5

表1 Effect of various cytokines and lgE/Ag on PGD2
generation by BMMCーイムノブロティング

刺激後の細胞 ライセートをSDS- Polyacryla­

mide gel電気泳動にて分離し、 ニ トロセルロ ー ス
膜にトランスファ ー した。COX-1、 COX-2、cPLAz
または sPLAzに対する抗体でブロッティングし、ECLシステムにて蛍光発色させた。

33. 1

結

果lgE/抗原剌激による二相性PGD2産生

lgEで感作したBMMCを、様々なサイトカイン(IL-1 、 IL-3、IL-10)存在下に抗原により刺激した。刺激l時間後に上清に放出されたPGD2を定量したところ、どのサイトカイン共存下に抗Cytokines
No cytokine
IL-3IL-10
IL-1 /3
IL・1 /3 +IL-10
IL-3+1L-10
IL-1 /3 +IL-3

PG西generation (ng/1o6cells)
Without lgE/antigen
With lgE/antigen
<0.1
<0.1
<0.1<0.1
0.37土0.1s·
0.14土0.08<0.1

1.03 士 0.15 t
1.14土0.11 t
1.27土0.21 t
1.02 士 0.13 t
5.60土1.18 ・ t
1.40土0.48 ・ t
1.05 士 0.18 t

BMMC was cultured for 5 h with the indicated stimuli,
and the PGD 2 released into the supernatants was as­
sessed as described in the experimental section. Means
土S.E.M. for three independent experiments are shown.
•p < 0.05 compared with no cytokine: t P < 0.05 com­pared with each group without lgE/antigen.

-44-

接触皮膚炎におけるマスト細胞活性化反応の解析

IL-l+IL-lO+lgE/ 抗原刺激した BMMC のライ

ゼ ー トを経時的に採取し 、 抗COX-1、 抗 cox-cox 阻害剤の PGD2 産生に対する効果
即時相及び遅発相における2種の cox アイソ
ザイムの役割を更に明らかにするため、 cox 阻2 抗体でそれぞれイムノブロットして両酵素の発害剤の PGD産生に対する効果を検討した。 アス現を調べたところ、 COX-1 蛋白の発現は刺激後ピリンは、 cox を不可逆的に阻害することが知48時間まで一 定であったのに対し、 COX-2蛋白られている。 BMMC をアスピリンで 5 時間前処COX-2が存在することが知られている。

は未刺激の BMMC には存在せず、 IL- l+IL­

lO+lgE/ 抗原刺激後2時間後から発現が認めら

3. 3

理した後、 細胞を洗浄し、 アスピリン非存在下にlgE/ 抗原で刺激すると、 いずれのサイトカイン｀れ、 5時間から 10 時間後に最大に達し、 その後存在下においても即時相の PG圧産生は完全に消培養した場合、 弱いCOX-2蛋白の発現が認めら性のCOX-1により調節されていることを意味しれた。 他のサイトカイン存在下では、 COX-2蛋ている。 これに対し 、 遅発型 PGD2産生はアスピ減少した（図 2) 。 抗原非存在下にIL-l+IL-10 で白の発現は殆ど認められなかった。 以上の結果から、 遅発相におけるPGD2産生は、 経時変化及びサイトカイン特異性においてCOX-2蛋白の発現失した（表2)。 これは 、 即時型 PGD2産生が常在リン前処理の影響を全く受けなかった事から 、 新規に誘導された cox によって制御されているものと考えられた。 実際、 遅発型PGD通を生はcox-2 特異的 阻害薬である NS- 398 により完全に抑と相関していた。

制された（表2)。

この結果から、 IL- l+IL- lO+lgE/ 抗原刺激によって惹起される遅発相の PGD2 産生は、 cox-—゜•""'''し2によって制御されているものと結論された。

-i2

一-Ag2―x0c1―x0c2488Culture Periods (h)+Ag． ．

！;•25102510 h10

図1 Time course of PG店generation in BMMC after
stimulation with IL-10, IL-1 (3 and lgE/antigen

図2 Time course of COX-2 expression in BMMC after
stimulation with IL-10, IL-1 /3 and lgE/antigen

lgE-sensitized BMMC were cultured for the indicatedperiods after stimulation with 100 i.u./ml IL-10 and 5 ng/ml IL-1/3 in the presence or absence of antigen (Ag). ThePGD2 released into the supernatants were assessed asdescribed in the Experimental section. Values are ex­pressed as means土S.E.M. for four independent experi­ments.

lgE-sensitized BMMC were cultured for the indicatedperiods after stimulation with 100 i.u./ml IL-10 and 5 ng/
ml IL-1/3 in the presence or absence of antigen (Ag). The
expression of proteins for COX-1 and COX-2 were as­
sessed as described in the Experimental section. A rep­resentative result of three independent experiments.

-45-表2
Aspirinpretreatment

Inhibition of the delayed phase of PG応generation by NS-398
PG西generation (ng/1o6 cells)
11士0.2
10士03<0.1 t<0.1 t＋＋＋

5Incubation time (h) 1NS-398 treatment＋

35士0.8*09士0.3
2.7土1.1*<0.1 :j:

BMMC, pretreated for 5 h with or without 1 mg/ml aspirin, were sensitized with lgEand activation with antigen in the presence of IL-10 and IL-1/3, either with or without
10 ng/ml NS-398. Immediate and delayed PG店generationwas assessed at 1 and 5
h respectively. Values are expressed as the means士S.D. fo「three independentexperiments. •p < 0.05 compared with PG店generation at 1 h afteバhe same
treatment: t P < 0.01 compared with PG応generation at 1 h without aspirin
pretreatment: t P < 0.05 compared with PGD2 generation after pretreatment withaspirin, and in the absence of NS-398.

cox- 2発現誘導におけるサイトカインった。 sPLA:iの発現量は cPLfuに比べて少なく、の役割

イムノブロットや通常のRNAプロットでは 検出

COX- 2発現誘導におけるIL-1、IL-10、lgE/できなかった為 、 Rr-P CRによりそのmRNAの抗原各々の役割について、RNAブロット及びイ発現レベルを検討した。 その結果、IL- l+IL-10

ムノブロットにより詳細に検討した。IL-10 は刺激後、 2時間から10時間にかけて、 5時間をCOX-2 mRNAの発現誘導に不可欠の因子であピ ー クにsPlJ知乃発現が上昇することがわかった

3 . 4

り、IL-10非存在下(IL- l+lgE/抗原）では cox（図3)。 COX-2の場合とは異なり、IgE/抗原刺-2 mRNAの発現は弱いものであった。lgE/抗原

激 は s P LA2の発現を更に上昇させなかった。

はIL-lI+ L-10によって誘導されるCOX-2 mRNAsPいの酵素活性は BMMC ライゼ ー トでは殆どの半減期を延ばす効果が額著であった。IL- 1 は検出されなかったが 、 これを酸抽出した後、 抗COX-2 mRNAの発現には全く影響を与えず 、sP凶抗体カラムによって精製すると 、 sPLfuのCOX-2蛋白の安定性を増すことにより蛋白レベ
ルでCOX-2の発現を増強することが明らかとな

lgE/Ag
IL-10, IL-1�IL-10, IL-1�

った。
03 . 5

ホスホリパーゼA2 (PL.k)の解析

sPLA2P凶はアラキドン酸代謝の初発反応、 すなわち膜リン脂質からのアラキドン酸遊離を司る酵素であり、 肥満細胞には85kDaの細胞質PLA213-Actin(cP凶）と分泌性のII型PLfu ( sPLfu) が存在することがわかっている。 また、IgE/抗原刺激に伴う即時相でのアラキドン酸遊離に cPL知の活性化が起こることが既に示されている。
BMMCにおける cP凶蛋白の発現をイムノブ

ロットにより調べたところ、IL-lI+ L-lO+IgE/抗原刺激後48時間まで有意な変化は認められなか

25 102 5 10-h

図3 Time course of sPLA2 mRNA expression, assessedby RT-PCR/Southern blotting, in BMMC after activa­tionlgE-sensitized BMMC were cultured for the indicatedperiods after stimulation with 100 i.u./ml IL-10 and 5 ng/
ml IL協in the presence or absence of antigen (Ag). The
expression of sPLA2 mRNA were assessed as describedin the Experimental section.

-46-

接触皮膚炎におけるマスト細胞活性化反応の解析
酵素活性が著しく上昇することを見いだした。 このことから、BMMC中にはsPIAzの活性をマスVehicleクする何等かの因子が存在し、 抗体カラム操作中

Anti-mouse type II sPLA2にこの因子が除かれたものと考えられた。 この方

Control Antibody法によって検出されたsPIAz活性を各サイトカイン処理間で比較したところ、IL- l+IL-10によりNS-398

sP凶蛋白が未刺激の細胞と比べて有意に増加すaることが確かめられた。

さらに、 抗sPIA2抗体を培稲系に添加したところ、遅発相のPGD2産生は有意に抑制された（図4)。 また 、 分泌された sPIA2が基質となる細胞膜に結合するのを妨げるヘパリンによっても遅発型 PGD2産生は強く抑制された。 この結果から、sP凶がBMMCにおける遅発型PGD産生に関与しているものと結論した。

4考察

肥満細胞は、 ある特定の刺激に応答して、 二相性のPG圧産生を起こすことが明らかとなった。

数分以内に起こる即時型応答は、 常在型酵素であるcPLfuとCOX-1 により 、 数時間後に起こる遅12

34sDelayed PGD2 Generation(ng/106 cells}
図4 Inhibition of delayed PG店generation by the Anti­sPLA 2 antibody
Aspirin-pretreated BMMC were activated with lgE/Ag +IL-10 + IL-1/3 for 10 h in the presence or absence of theantibody against mouse type II PLA 2 (10 mg/ml) or theCOX-2 inhibitor NS-398 (10 ng/ml), and PGD2 released
into the supernatant was quantified.

がるものと期待される。
文献1) Ashraf MMD, Murakami M, Kudo I, : Cross­linking of the high-affinity IgE receptor induces
the expression of cyclo-oxygenase 2 and atten­

発応答は誘導型酵索であるsPLfuとCOX-2 によdant prostaglandin generation requiring

り調節されていた。 この様に、炎症刺激によって時間依存的に産生される同 一 の最終産物(PGD2)interleukin 10and interleukin 1(3 in mouse cul­

実は、アレルギー応答の急性期と慢性期とで異な

2) Ashraf MMD, Murakami M, Shimbara S, et

味深い。 また、肥満細胞の遅発応答はサイトカイ

cyclooxygenase-2-mediated delayed prostaglan­

が、 異なる生合成経路により産生されるという事る標的分子を考慮する必要性を意味しており、興ンの発現誘導を伴うことが明らかにされつつあ

tured mast cells, Biochem ]., 320, 965-973, 1996.
al., : Type II phospholipase A2 is linked todin D2generation by cultured mouse mast cells

る。 肥満細胞の機能は周囲の微小環境に存在する

following Fcc: RI- and cytokine-dependent acti­

イトカインの産生を制御することが、慢性アレル726-732, 1996.

サイトカインの影響を強く受けることから、各サギ 疾患の病態に影響を与え、治療や予防につなー-47-vation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 229,