老化マウス klotho における皮膚変化の検討
群馬大学

医学部第２内科

倉林正彦

The klotho mouse is a novel presenile mouse strain developed by insertional mutagenesis. The homozygous mutant
klotho mice (KL-/-), which have a defect in klotho gene expression, present a short life span and a syndrome resembling humanaging. Skin atrophy and hair loss are observed in KL-/-, in addition to pulmonary emphysema, arteriosclerosis, osteoporosis,
and ectopic calcifications.
The goal of the present study is to understand the pathogenesis of the skin changes observed in KL-/-, and to developa new strategy to prevent the skin change during aging. We have generated some experimental tools for the study: (1)Adenovirus has been generated, which expresses the mouse klotho cDNA, has been generated. (2) Two transgenic rat strains
have been established, which overexpress the klotho gene. Regarding the function of the klotho gene, we have shown that
apoptosis of the type II pneumocytes is much more frequently observed in the KL-/- lung when compared with that in the wildtype lung. Further study is now under progress to show the pathogenesis of the skin lesion in the klotho mutant mice, withspecial reference to the apoptosis of the epidermal cells.

１．緒

２．実

言

皮膚の老化防止はコスメトロジーの最も重要な課題の一２. １つである。著者らは黒尾・鍋島らと共同で、老化に密接にKL-/-験

創傷治癒過程の観察および野生型マウス（以下 KL+/+）を用いる。それ関わる klotho という新規遺伝子を発見した 1）。klotho 遺伝

ぞれの背部を剃毛後、同部位ににパンチ生検を行い、皮膚子は分子量が約 14kDa で、β-glucosidase と 40％のホモロに全層性の創傷を与える。その治癒過程を観察する。

ジーを示す膜蛋白または分泌蛋白をコードする。klotho 遺伝子ホモ欠損マウス（以下 KL-/- と記載）は、寿命の短縮、

２. ２

K L -/- の皮膚へのアデノウイルスベクターを用い動脈硬化、異所性石灰化、骨粗鬆症、肺気腫、皮膚真皮層

た klotho 遺伝子の局所導入の菲薄化、皮下脂肪層の消失、脱毛などヒト老化に見られまず第一に、klotho 遺伝子を発現するアデノウイルスをる多彩な変化を早期に表現する。著者らはコスメトロジー作製する。アデノウイルスベクターにマウスの klotho 遺伝研究振興財団の第９回（平成 10 年度）助成により、KL -/-子（膜貫通ドメインを含む全長の cDNA）を組み込む。

は生後４週より肺気腫を発現すること 、７〜９週令の2）

KL -/- 肺では ､ 型コラーゲンと SP-A 遺伝子の発現が増強

２. ３klotho 遺伝子過剰発現ラットにおける皮膚傷害

していること 、飢餓状態の線維芽細胞に klotho 遺伝子をの検討導入することにより、その飢餓による DNA 合成能の低下準備として、klotho 遺伝子過剰発現ラットの系を確立すを抑制しうること 3）を明らかにし、KL -/- における老化徴る。本ラットの系の中で、導入 klotho 遺伝子の発現量が多候の早期発現には、線維芽細胞をはじめとする結合織細胞いと考えられる系を選択する。さらに導入 klotho 遺伝子にの機能障害が関与すると推測した。

関してホモ接合体である個体を選別し、その個体同士を交2）

本研究の目的は、klotho マウスにおける老化類似の皮膚変化の出現機構を明らかにし、皮膚老化の予防法を開発す配することによって、klotho 遺伝子の発現量の多い個体を安定して利用できるよう系を確立する。

ることである。

２. ４

線維芽細胞の培養実験

細胞は KL -/- および KL +/+ から採取する。それぞれの皮Investigation on the Skin Change of theaging model mouse "klotho".
Masahiko Kurabayashi
Second Department of Internal Medicine,Gunma University School of Medicine

膚および肺を摘出し細切したのち、細胞培養用プレートに固着させる。これに 10％ FBS 加 DMEM 培地を加えて培養し、線維芽細胞を培養する。この線維芽細胞を利用し、各種の実験に用いる。

２. ５

肺組織におけるアポトーシスの解析

２週齡の KL -/- および KL +/+ から肺を取り出し、10％− 50 −

老化マウス klotho における皮膚変化の検討

４．考

ホルマリンを用いて定圧固定したのちパラフィン包埋する。この肺組織を TACS

TM

察

2 TdT-DAB In Situ Apoptosis

Detection Kit を用いて TUNEL 染色する。さらに細胞レ本研究を進めていく上で重要なツールとなる（1）マウベルの酸化ストレスの指標としてベルリン青染色を行う。

ス klotho 遺伝子（膜貫通ドメインを含む全長の cDNA）をそれぞれ陽性細胞の比率を KL３．結
３. １
KL-/-と KL+/+とで比較する。

発現するアデノウイルス、（2）klotho 遺伝子を過剰に発現するラットの系統、を確立することができた。これらのツ果ールは、KL -/- に認められる皮膚真皮層の菲薄化、皮下脂

創傷治癒過程の観察

肪層の消失、脱毛などのヒト老化にみられる変化の病態には皮膚損傷を与えた直後に死亡する個体が多かっklotho 遺伝子がどのように関与しているかを解明するうえた。KL -/- がストレスに非常に弱いことは良く知られておで非常に重要であり、今後これらのツールを用いた研究をり、本法を用いて皮膚に全層性の傷害を与えて創傷治癒過行う予定である。

-/-

一方、当初実験計画の柱として期待した KL -/- および程を観察するのは困難と考えられた。

KL +/+ を用いた創傷治癒過程の観察、あるいは同マウスか

３. ２

K L - /- の皮膚へのアデノウイルスベクターを用いた klotho 遺伝子の局所導入マウスの klotho 遺伝子（膜貫通ドメインを含む全長のcDNA）を発現するアデノウイルスを作製した。このアデノウイルスを CHO 細胞に感染させ、Western blot 法を用いて klotho 蛋白が発現していることを確認した。

３. ３

klotho 遺伝子過剰発現ラットにおける皮膚傷害の検討
klotho 遺伝子過剰発現ラットを 2 系統得ることができた。RT-PCR 法を用いた解析では、導入 klotho 遺伝子はFig.1 klotho 遺伝子過剰発現ラットの作製。２系統で導入klotho 遺伝子の発現が認められる（矢印、RT-PCR 法）

Strain1 においては肺・腎・心・脳で、Strain2 においては肝・肺・腎・心・脳で、mRNA 発現を認めた（Fig.1）。現在、
導入 klotho 遺伝子に関してホモ接合体である個体を選別し、交配を行っている。

３. ４
KL-/-

線維芽細胞の培養実験
および KL +/+ の皮膚および肺から線維芽細胞を培養した（primary culture）。しかしながら、培養の条件によって細胞の生育状態にばらつきが生じることが明らかとなった。このため、KL -/- 由来の線維芽細胞と KL+/+ 由来の線維芽細胞の増殖などを単純に比較することは困難であると考えられた。

３. ５

Fig.2 KL +/- の肺では、Ⅱ型肺胞上皮細胞のアポトーシスが認められる（２週齢、TUNEL 染色）。

肺組織におけるアポトーシスの解析

３. ４に示した培養実験系が機能しなかったことから、
KL -/- のヒト老化類似病変形成のメカニズムを解明する別の方法として、組織（in vivo）を用いた病態解析を行うことにした。まず始めに、肺にみられる気腫化病態におけるアポトーシスの関与を検討した。
KL +/+ と比較して KL -/- の肺では TUNEL 染色陽性細胞が高頻度に認められた（Fig.2）。組織学的な特徴から、陽性細胞は II 型肺胞上皮細胞と考えられた。ベルリン青染
色陽性細胞は KL -/- では認められたが、KL +/+ では指摘できなかった（Fig.3）。

Fig.3 KL+/- の肺では、ベルリン青染色陽性細胞が認められる（５週齢）。

− 51 −

らの線維芽細胞の培養（primary culture）実験は、残念発症メカニズムを解明することが、コスメトロジーに大きながら実験系として機能しなかった。このため著者らは、な貢献をしていくものと信じている。

KL -/- において肺気腫と皮膚の萎縮・脱毛所見が認められることに着目し、それらに共通する病態としてアポトー（参考文献）シスが関与するという仮説をたてた。これまでの検討か

１） Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, et al. : Mutation

ら、KL -/- の肺組織においては II 型肺胞上皮細胞のアポト

of the mouse klotho gene leads to a syndrome resemblingーシスが高頻度に認められることが明らかとなった。今後、

ageing. Nature. 390: 45-51,1997.の皮膚組織におけるアポトーシスの関与を解析して

２） Suga T, Kurabayashi M, Sando Y, et al. : Disruption

いく予定であり、本実験計画の一つの柱として、klotho 遺of the klotho gene causes pulmonary emphysema in mice.

伝子がアポトーシスの抑制を介して皮膚の老化を抑制してDefect in maintenance of pulmonary integrity duringいる可能性を追究していくことにしている。

postnatal life. Am J Respir Cell Mol Biol. 22: 26-KL-/-

これまでの解析によって、klotho マウスは外界からのス

33,2000.

トレスに対する反応が異常であることが明らかとなってい３） 田島俊児、須賀達夫、山洞善恒、ほか：klotho 遺伝る。klotho 遺伝子ヘテロ欠損マウスは、若年では肺気腫を子は細胞増殖の調節に関与している可能性がある．日呼発症しないが、タバコ主流煙曝露やブレオマイシン肺傷害吸会誌．37（増刊号）:253, 1999.

に対して気腫化しやすい 。今回のベルリン青染色の結果

４） Maeno Y, Suga T, Sando Y, et al. : The heterozygous

からは klotho マウスの肺は野生型マウスに比べて酸化スト

klotho mice develop pulmonary emphysema after

レス環境下にあることが示唆された。皮膚は外界からのス

exposure to cigarette smoke and intratracheal

トレスに直接さらされ続ける部分であることから、本マウ

instillation of bleomycin. Am J Respir Crit Care Med.

スにみられるヒト老化に類似した皮膚病変（皮膚老化）の159: A447, 1999.

４）− 52 −