SPE-LC-SPE-GC/MS システムを用いたクロロタロニル分析法の検討〇浅井 智紀、斎藤 勲、佐々野 僚一
株式会社アイスティサイエンス【目的】食品中残留農薬分析において、クロ10 g に 10% リ ン 酸 1 mL を 加 え て 酸 性 に し た

ロタロニル(TPN)は試料調製時の分解を抑制

後、TPN標準液を添加、QuEChERS法を参考にするため、酸性条件で抽出を行う個別分析法

抽出した試料をSPE-LC-SPE-GC/MSシステムにが用いられる。演者らは、個別分析の迅速・供した。

簡便かつ自動化を目的とした装置システムを【結果】TPNの添加回収試験の結果を表1に示開発した。本演題ではQuEChERS法を参考に抽した。検討した5作物において、0.01 ppmで出した試料をシステムに供し、TPN分析の検の添加回収試験でいずれも回収率80-110%と討を行った結果について報告する。

なり、再現性評価についても良好な結果であ【方法】SPE-LC-SPE-GC/MSシステムの概要をった。硫黄性成分を含むアブラナ科の白菜、図1に示した。SPE-LC-SPE-GC/MSシステムは大根、キャベツおよびアリウム属である玉ね

自動固相抽出装置 LGI-X100(アイスティサイ

ぎにおいて良好な回収率結果が得られた。まエンス)-LC2030(島津製作所)-大量注入口装

た、H30において検出事例 が報告 1) されてい置LVI-S250(アイスティサイエンス)を搭載しるナス科のピーマンにおいても回収率結果はたGCMS TQ8040(島津製作所)をオンライン化良好であった。

したシステムにより構成した。抽出液を固相

表1 添加回収試験結果

カラムで精製した試料をLCへ導入・分画し、ターゲット溶出画分を固相へ再濃縮した後に溶出液をGC/MSへ注入して測定を行った。

【考察】今回の検討においては、予冷式ドラ
イアイス凍結粉砕および抽出時のリン酸添加によりTPNの分解を抑制することができたと考えられた。また、複数の作物において安定した結果が得られたことから、開発したオンラインシステムは汎用的に使用可能であると
図1 SPE-LC-SPE-GC/MSシステムの概要考えられた。今後、他の農薬成分についても検討を行う。

試料は玉ねぎ、白菜、大根、キャベツ、ピー

参照文献 1)国内産農産物における農薬の使用状

マンの5作物を使用し、予冷式ドライアイス

況 及 び 残留 状 況 調 査 の 結 果 に つ いて （ 平 成30年

凍結粉砕法により均一化した。粉砕した試料

度 ） 別表3, 農林水産省HP

（公社）日本食品衛生学会創立60周年記念第116回学術講演会(WEB開催)

演題16

SPE-LC-SPE-GC/MSを用いたクロロタロニル分析法の検討○浅井 智紀、斎藤 勲、佐々野 僚一
株式会社アイスティサイエンス目的
新規に開発したSPE-LC-SPE-GC/MSシステムを用いて、個別分析の迅速・簡便かつ自動化が可能な装置システム開発を行っている。食品中残留農薬分析において、クロロタロニル(TPN)は、試料調製時の分解を抑制するため、酸の添加によりpHを調整する分析法が用いられている。今回、クロロタロニルの分析法として、ドライ
アイス凍結粉砕、QuEChERS法を参考とした抽出法で抽出した試料を、SPE-LCSPE-GC/MSシステムで分析する方法を検討した。
SPE-LC-SPE-GC/MSシステムの概要
1st stepSPE

固相カートリッジによる精製(LCカラムに吸着する低極性成分の除去)

2nd stepLC

逆相HPLCで目的物質の極性付
近の画分を分取(LCカラムによる精製)

3 rd step

SPE

LCで精製した試料を固相へ保持し、乾燥させる(水を除去する)

4 th step

GC/MS

固相溶出液をGC注入、目的物質の定性、定量(GCカラムでの沸点差による分離)2

SPE-LC-SPE-GC/MSシステムのフロー図② LC分離① 固相抽出(LC分画前)
試料吸引

固相負荷

ターゲットを溶出してサンプルループに注入。
低極性の夾雑物を固相で除去。

バルブを切り替え、ループ内の試料をLCカラムへ導入。
ターゲットをLCで分離する。

サンプルループ④ GC/MS測定③ 固相抽出(LC分取後)
ターゲットが溶出されたら、混合注入バルブ内で希釈水と混合し、溶媒濃度を下げ、固相へ保持させる。

窒素パージにより固相を乾燥。

溶出溶媒を流し、固相からの溶出とGC注入を同時に行う (溶出溶媒約40µL大量注入)。

溶出溶媒
シリンジポンプ

3

抽出および精製フロー
抽出フロー(QuEChERS法参考)

SPE-LC-SPE-GC精製フロー

予冷式ドライアイス凍結粉砕

Flash-SPE C18: 精製(農薬はスルー)

試料 10 g採取

負荷[通液] ACN層抽出液 25 µL ※添加 10%リン酸aq 1 mL

通液 90%ACN 40µL

添加 TPN標準溶液/5%リン酸ACN 100 µL

LC分画

アセトニトリル(ACN) 10 mL

ホモジナイズ (13,000rmp 1分)
NaCl 1 g

振とう溶解 10秒
MgSO4（無水）4 g

振とう 1分遠心分離（3,500rpm 5分）
ACN層抽出液

超純水で希釈(3倍希釈)
Flash-SPE C18: 農薬を保持
固相を乾燥(窒素パージ, 90秒)
溶出・GC注入ヘキサン 40 µL

GC/MS測定※検量線用標準液は1%リン酸ACNにTPN標準溶液を添加したものを25 µL 固相へ負荷4装置条件装置構成
自動固相抽出装置:

LGI-X100 (アイスティサイエンス)

LC:

LC2030 (島津製作所)

大量注入口装置:

LVI-S250 (アイスティサイエンス)

GCMS:

TQ8040 (島津製作所)

LC条件
移動相A:

H2O

検出波長:

移動相B:

ACN

カラム:

Inertsil ODS-3 [内径3 mm×長さ100 mm, 粒子
径5 µm (GLサイエンス)]

タイムプログラム:

Bconc. 10%(1min hold), 10→50%(1-2min),
50→60%(2-9min), 60→95%(9-10min),95%(5min hold), 95→10%(15-16min), 10%(4minhold) [total 20min]

流速:
オーブン温度:

0.6 mL/min
40°C

254 nmGCMS条件カラム:
キャリアガス:
カラム流量:

VF5-MS[20 m×0.25 mm (0.25 µm)]

スプリットタイム
プログラム:

スプリット 1:100 (0.42minhold)→スプリットレス(0.424min)→スプリット 1:50

昇温プログラム:

80°C(4min)-35°C/min310°C(3min) [total 14min]

MS測定モード:

SCAN (m/z 50-480)ヘリウム
1.0 mL/min

IF温度:

290°C

イオン源温度:

260°C

注入口条件
タイムプログラム:

70°C(0.42min)-120°C/min-240°C-50°C/min-290°C(9min) [total 11 min]5

抽出時のリン酸添加濃度の検討
各濃度のリン酸水溶液を1 mL加えてから抽出→SPE-LC-SPE-GC/MSシステムに供して検討を行った。
リン酸水溶液 1mLを添加して振った様子

リン酸添加量と時間経過による回収率変動
100

回収率(%)

8060

抽出後6h以内
抽出後12h経過

402000%

10%

30%

50%

試料: 玉ねぎ(添加濃度0.1 ppm)
12時間後でも回収率の低下が見られず、酸の添加量が少ない10%リン酸添加
条件を採用した。

6LC分画による精製効果
サンプル:254nm

LCクロマトグラム (ACN添加標準液との重ね書き)
1300000

uV
データ1:ﾀﾞｲｺﾝ_01.lcd 検出器A Ch1:254nm
データ2:ﾀﾞｲｺﾝ_01.lcd 検出器A Ch2:230nm
データ3:10ppmTPN-RTcheck_04.lcd 検出器A Ch1:254nm

サンプル:230nm
uV
1300000 データ1:10ppbﾀﾏﾈｷﾞ-3_01.lcd 検出器A Ch1:254nm
データ2:10ppbﾀﾏﾈｷﾞ-3_01.lcd 検出器A Ch2:230nm
データ3:10ppmTPN-RTcheck_04.lcd 検出器A Ch1:254nm
1200000

大根1200000

ACN添加(10ppm): 254nm

玉ねぎ

1100000

1100000
1000000

1000000
900000900000800000800000700000700000600000600000500000500000400000400000300000300000200000200000100000100000

00

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5min

分画部分(RT 8.1-9.1min)

GCクロマトグラム (m/z 266)
TPNピーク(RT 8.8min)

GCのクロマトに大きな夾雑物ピークの検出はなく、十分な精製効果が得られた。

7直線性および再現性評価①直線性評価ACN添加標準液25 µLを注入した濃度と面積値の相関性
直線性評価
1,400,000
R² = 0.9993

1,200,000
1,000,000

面積値濃度(ppm) 面積値
0.5
1,222,731
0.1
210,9900.05
100,283
0.01
19,9890.005
9,653

800,000
600,000
400,000
200,000
000.2

0.40.6

標準液濃度 (ppm)②再現性評価ACN添加標準液を連続分析した面積値 (n=10, 添加濃度0.1 ppm)
Average RSD
202,598 198,009 192,846 196,471 195,874 186,430 186,669 174,218 187,503 188,383 190,900
4.2

test_01

test_02

test_03

test_04

test_05

test_06

test_07

test_08

test_09

test_10

ACN添加標準液において、良好な直線性と再現性が確認できた。
8添加回収試験結果
添加濃度: 0.01 ppm (n=5)
回収率(%)
RSD(%)

玉ねぎ
82
11.4

白菜
110
7.3

定量イオンクロマトの重ね書き (m/z 266)

大根
キャベツ ピーマン
110
99
108
7.5
3.6
3.6(x10,000)
1.75

玉ねぎ

1.50
1.25
1.00
0.75

作物ごとのTPN回収率

0.50
0.25

110120

100

110
99

108

82

8.6

8.7

8.8

8.9

9.0(x10,000)
1.75

80

回収率(%)

0.00

キャベツ

1.50

60

9.1

1.25

40

1.00
0.75

20

0.50

00.25

玉ねぎ

白菜

大根

キャベツ

ピーマン

8.5

8.6

8.7

8.8

8.9

9.0

9.1

0.01 ppmの添加回収試験において、良好な回収率と再現性結果が得られた。
9まとめ
凍結粉砕法→QuEChERS法を参考とした抽出→SPE-LC-SPE-GCシステムを用いることにより、クロロタロニルの個別分析が可能であった。また、5種の作物において安定した回収率と再現性結果が得られたことから、本システムが汎用的に使用できることが示された。
凍結状態の試料10gに対し10%リン酸 1mLを添加することで回収率の向上が見られた。抽出時にリン酸を添加することにより、硫黄成分を含む玉ねぎ、大根などの作物においても80-110%の良好な回収率が得られた。粉砕時の分解の影響については今後検証が必要であると考えらえた。
本システムを用いることで、固相抽出-LC分画-GC測定までを全自動で操作が可能であった。さらに、GC測定の間に次サンプルの前処理を行うことにより、1サンプルの分析に要する時間を20分程度に収めることが可能であった。
スタート
分析サイクルタイム
イメージ図

固相抽出

固相抽出
LC分画
GC測定

固相抽出
LC分画

固相抽出
LC分画

GC測定

GC測定

LC分画
GC測定

2サンプル目以降は約20分ごとに分析

今後の検討課題
他の農薬成分についても検討を行い、本システムでの分析法の確立を目指していく。

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