食品ペプチドによる GLP-1 分泌／分解制御機構の解明

比良北海道大学大学院農学研究院応用生命科学部門食品科学分野

緒言

徹助教

本研究においては、GLP-1 分泌促進作用と GLP-1 分解抑制作用（DPP-IV 活性抑制作用）を併せ持つ Zein

消化管ホルモン Glucagon-like peptide-1（GLP-1）は、ペプチドについて、両作用機構の解明を目的とした。

食事摂取により、主に下部小腸に多く分布する消化管内分泌細胞 L-cell より血中に放出される。インスリン分泌増強作用、膵β細胞増殖、保護作用を有することか

実験方法

ら、そのアナログや分解抑制剤｛Dipeptidyl peptidase-

1. GLP-1産生細胞株を用いたGLP-1分泌試験

IV（DPP-IV）阻害剤｝の糖尿病治療薬としての臨床応

マ ウ ス 大 腸 由 来 の GLP-1 産 生 細 胞 株 GLUTag を、用が国内でも広まりつつある。

10% FBS を含む Dulbeccoʼs modiﬁed Eagleʼs medium

一方で、内因性 GLP-1 の分泌、産生を高めることの、糖にて、37℃、5% CO2 存在下で培養した。トリプシン

尿病の病態改善、予防における有効性が期待されており、処理により培養フラスコより回収した GLUTag 細胞を、アミノ酸の一つであるグルタミン

48 ウェルプレートにサブコンフルエントになるまで 2-3や、L 細胞に発現する

1）

日間培養した。

GPR119 の特異的アゴニストの経口投与による GLP-1 分2）

試 料 溶 液 添 加 前 に、Hepes バ ッ フ ァ ー（140 mM

泌、血糖上昇抑制が確認されている。
食品成分の中でも、グルコースや脂肪酸が GLP-1 分泌NaCl, 4.5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1.2 mM CaCl2, 1.2を強く刺激することが知られており、GLP-1 産生細胞株をmM MgCl2, 10 mM D-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4）にて用いた研究により、これら栄養素による GLP-1 分泌機構がウェルを洗浄し、同バッファーに溶解した試料溶液を 80明らかになりつつある 3）。糖や脂肪酸の認識機構については、µL 添加、37℃にて 60 分間インキュベーションした。上GPCR やトランスポーターの関与が近年報告されている。

清を回収後、遠心分離（800g for 5 min at 4 C）し、食品たんぱく質、ペプチドが GLP-1 分泌を刺激する

その上清 70 µL を回収、凍結保存した。上清中の GLP-1という報告があるが、L 細胞がどのようにこれらを認識濃度を市販の Enzyme immuno assay kit（YK-160、矢しているかについては、未だ不明である。

内原研究所）にて測定した。

我々は、マウス大腸由来 GLP-1 産生細胞株 GLUTagを 用 い、 各 種 食 品 た ん ぱ く 質 加 水 分 解 物 の 中 か ら

2. Zeinペプチドの分画GLP-1 分泌を強く刺激する Zein ペプチド（トウモロコ

イソプロパノールを用いて、溶媒分画を行った。Zeinシたんぱく質 Zein の加水分解物）を見出し、ラット消ペプチドを水に溶解し、これに終濃度 70％となるよう化管での GLP-1 分泌促進を確認した。にイソプロパノールを加え、充分に撹拌後、遠心分離にさらに、この Zein ペプチドは、ラット腸管に投与するより上層と沈殿を得た。沈殿を 70% 沈殿画分として回ことで、GLP-1 分泌促進に加え、血中での DPP-IV 活性収し、上清には終濃度 80% となるようにさらにイソプを抑制することにより、分泌された GLP-1 の分解（不活ロパノールを添加し、同様に遠心分離し、80% 沈殿画性化）を防ぐという、２つの生理作用を併せ持つことを分と、上清画分を得た。上清のイソプロパノール濃度見出した。これにより Zein ペプチドは GLP-1 分泌促進、を段階的に高め、90% 沈殿画分、95% 沈殿画分、95%

GLP-1 分解抑制によるインスリン分泌促進を介した血糖上清画分を得た。これらを凍結乾燥後、10 mg/mL の上昇抑制作用を持つことを明らかにした 。

Zein ペプチドに含まれる濃度にて Hepes バッファーに4）1

比良

再溶解し、上述の GLP-1 分泌試験に供した。

次に、腸管でのペプチド吸収を担う、ペプチドトラ

Zein ペプチドの分画物をさらに分離するため、C18カラム（4.6

徹ンスポーター PepT1 の関与を検討した。PepT1 の阻害250 mm）を用いた逆相 HPLC に供した。

剤 4-aminomethyl benzoic acid（AMBA）存在下でも、アセトニトリルのグラジエント溶出により５つの画分をZein ペプチドによる GLP-1 分泌は維持された（図２）。

分取した。これらを凍結乾燥後、10 mg/mL の Zein ペ細胞内情報伝達経路の探索として、cAMP 経路の関与

プチドに含まれる濃度にて Hepes バッファーに再溶解を検討するため、cAMP を産生する酵素であるアデニルし、GLP-1 分泌試験に供した。

酸シクラーゼの阻害剤 MDL-12,330A（MDL）を用いたところ、Zein ペプチドによる GLP-1 分泌は維持された。また、細胞内カルシウムシグナルの関与を検討するため、細3. ZeinペプチドによるDPP-IV活性への影響
Zein ペプチド（Zein をパパインで 60 分間加水分解し胞膜透過性のカルシウムキレート剤 BATA-AM を用いてたもの）を、ペプシンで１時間、さらにパンクレアチンも Zein ペプチドによる GLP-1 分泌は阻害されなかった。

で１時間加水分解したものを Zein ペプチド人工消化物とした。ラットより採取した血漿を DPP-IV の酵素液とし、

果

1. ZeinペプチドによるGLP-1分泌機構

0.2b

ウムを含まない Hepes バッファー（カルシウム不含、2Blk0mM EDTA 添加）に Zein ペプチドを溶解し、GLP-1 分泌試験を実施した。その結果、細胞外のカルシウム除去により、Zein ペプチドによる GLP-1 分泌はやや低下したが、基礎分泌も同様に低下した（図１）。

bc0.4

2. Zeinペプチド中の活性ペプチドの探索

c解したペプチド混合物であり、この中のどのペプチドがZein ペプチド
Ca freeBlk
Ca freeBlk0

Zein ペプチドは、Zein タンパクをパパインで加水分
Zein ペプチド

GLP-1（nM）

0.80.6

PepT1 阻害剤存在下での Zein ペプチドに対するGLP-1 分泌応答

AMBA（20 mM）含有または不含の Hepes バッファ―（Blk）に Zein ペプチドを 10 mg/mL にて溶解した。これらの溶液にGLUTag 細胞を 60 分間暴露し、上清中の GLP-1 濃度を測定。値は平均値 ± 標準誤差（n=3-4）。同じアルファベットを有さない平均値間に有意差あり（Tukey’s test, P < 0.05）。

ab0.2

図1

図2a1

ab0.1

細胞外のカルシウムの関与を検討するため、カルシ

1.2

a0.3

AMBA

結GLP-1（nM）プチド（4.8 mg/mL）共存下での DPP-IV 活性を測定した。

aZein ペプチド+AMBA

人工基質として Gly-Pro-p-nitoroaniline を用い、Zein ペ

Zein ペプチド0.4

GLP-1 分泌を促進するのかを明らかにするため、Zeinペプチドを分画して活性成分の単離同定を検討した。
Zein ペプチドをイソプロパノールにより段階的に分画し、GLP-1 の分泌活性を検討したところ、95% イソ

GLUTag 細胞における細胞外カルシウム除去下でのZein ペプチドに対する GLP-1 分泌応答

プロパノール上清（可溶性）画分に GLP-1 分泌活性が見られた（図３）。

カルシウム含有または不含の Hepes バッファ―（Blk）に Zeinペプチドを 10 mg/mL にて溶解した。これらの溶液に GLUTag細胞を 60 分間暴露し、上清中の GLP-1 濃度を測定。値は平均値± 標準誤差（n=3-4）。同じアルファベットを有さない平均値間に有意差あり（Tukey’s test, P < 0.05）。

この画分をさらに逆相 HPLC により分画したところ、比較的後半に溶出してきた画分４に GLP-1 分泌活性が確認された。

2

食品ペプチドによる GLP-1 分泌／分解制御機構の解明

伝達経路についての知見は限られている。食品ペプチド0.1

全般に共通の機構があるのか、個々のペプチド断片に特0.08異的な認識機構が働くのかについても、よく分かってい0.06ない。ここでは、Zein ペプチドを GLP-1 分泌促進ペプ0.04

チドのモデルとして、GLP-1 産生細胞がどのようにこ0.02のペプチド（混合物）を認識するのかを検討した。

図3

ペプチドホルモンや神経伝達物質の分泌に、細胞内カ95％上清

095％沈殿いる。しかしながら、その認識機構ならびに細胞内情報0.1290％沈殿

0.1480％沈殿

化管内分泌細胞株の導入により、多くの報告がなされて70％沈殿0.16

Blank

GLP-1（nM）

管ホルモンを放出することは、本研究でも用いている消ルシウムシグナルがセカンドメッセンジャーとして機能し、この供給源として細胞外液、小胞体等の細胞内カルシウムストアが知られている。細胞外カルシウム除去下Zein ペプチド分画物に対する GLP-1 分泌応答

でも Zein ペプチドに対する GLP-1 分泌応答が消失しな

イソプロパノールを用いた段階分画により得られた Zein ペプ
チド分画物を、それぞれ Zein ペプチド 10 mg/mL に含まれる濃度で Hepes バッファーに溶解し、GLP-1 分泌試験に供した。値は平均値 ± 標準誤差（n=3-4）。

かった（図１）ことより、細胞外カルシウムは基礎分泌に必要であるが、Zein ペプチドによる GLP-1 分泌誘導には関与しないことが考えられた。
腸管でのペプチド吸収を担う PepT1 がペプチドの3. ZeinペプチドによるDPP-IV活性への影響センサーとして機能することを示唆する報告がある 5）

まれるかを検討するため、ラット血漿を酵素源として阻が、PepT1 阻害剤の影響がなかった（図２）ことより、害試験を行った。Zein ペプチド共存下で、DPP-IV 活

Zein ペプチドは PepT1 非依存的に GLP-1 分泌を誘導性は大きく低下した。また、Zein ペプチド人工消化物することが示唆された。PepT1 の基質となるのは低分共存下でも同程度の DPP-IV 活性低下が見られた（図子のペプチド（ジ、トリペプチド）であり、Zein ペプ４）。

チドの平均分子量は約 1600 であることから、Zein ペプ
チドに含まれる比較的鎖長の長いオリゴペプチドが活性100本体である可能性も考えられる。
細胞内情報伝達経路として主要な、cAMP、カルシウ

80

ムシグナルの関与を検討したが、いずれの阻害剤処理下

60

でも Zein ペプチドによる GLP-1 分泌促進は維持され40た。このことより、これらの経路は関与しないことが考えられた。

20

食品ペプチド、すなわち食品たんぱく質の加水分解物

図4

中のどのようなペプチド断片が、高い消化管ホルモン

Zein ペプチド
人工消化物

Zein ペプチド0ControlPlasma DPP-IV activity（％）

Zein ペプチド中に DPP-IV 活性を阻害する成分が含分泌促進作用を有するのかについて、特定された例は少ない。Zein ペプチドのイソプロパノール分画により、95% イソプロパノール可溶性画分に高い GLP-1 分泌活

Zein ペプチドおよびその人工消化物共存下での血中DPP-IV 活性性が見られた（図３）ことより、この画分に活性ペプチラット血漿中の DPP-IV 活性を、Zein ペプチドおよびその人工消化物（各 4.8 mg/mL）共存下で測定。値は、ペプチド非共存下での DPP-IV 活性に対する相対値（％）で、３回測定の平均値。

プチド、すなわち比較的疎水性のペプチドが活性を担うドが濃縮された。95% イソプロパノールに可溶性のペことが考えられた。これをさらに逆相 HPLC で分画し、アセトニトリル濃度が高まる比較的後半に溶出して来た考察画分４に GLP-1 分泌活性が見られたことは、疎水性のペプチドが GLP-1 分泌活性を持つことを支持する結果

消化管内分泌細胞が食品ペプチドを直接認識して消化3

比良

徹ルシウムやペプチドトランスポーターは関与しないことと言える。
今後、この画分に含まれるペプチドを単離、同定するが示唆された。種々の分画法を検討した結果、Zein ペことで Zein ペプチドに含まれる GLP-1 分泌促進ペプチ

プチド中の活性成分を簡便な有機溶媒分画で濃縮するこドを特定できると考えられる。とを可能とし、さらにそれに含まれる疎水性のペプチド

In vitro での DPP-IV 阻害試験において、Zein ペプチ画分に GLP-1 分泌活性があることを明らかにした。Inドが DPP-IV 活性を低下させることが示された（図４）。

vitro において、Zein ペプチドおよびその人工消化物共また、ペプシンとパンクレアチンによる人工消化処理存下でラット血漿中の DPP-IV 活性が低下したことよ

後も DPP-IV 活性を低下させる作用は維持されており、り、Zein ペプチド中に DPP-IV の活性を抑制する成分

Zein ペプチドに含まれる消化耐性のペプチド、あるいが存在することが示唆された。

は低分子ペプチドが DPP-IV の活性を阻害することが謝示唆された。この結果より、ラット回腸管腔内に Zein

本研究の遂行にあたり、公益財団法人三島海雲記念財ペプチドを投与した際に見られた回腸静脈中の DPP-IV活性の低下

4）

辞団より学術研究奨励金を賜りましたことを深く感謝申しは、Zein ペプチド由来成分によるものであることが考えられた。しかしながら、本試験で用いた上げます。

Zein ペプチドの濃度は生理的濃度より高く、また、膜文消化を受けて吸収されたペプチド断片の作用とは異なることも考えられるため、さらなる検討が必要である。
要献1）J. R. Greenﬁeld, et al,: Am. J. Clin. Nutr., 9（1）, 106113,2009.
2）Z. L. Chu, et al,: Endocrinology, 149（5）, 2038-2047,
2008.
3）G. Tolhurst, et al,: J. Physiol., 587（1）, 27-32, 2009.
4）T. Mochida, et al,: Endocrinology, 151（7）, 3095-3104,
2010.
5）N. P. Darcel, et al,: J. Nutr., 135（6）, 1491-1495,
2005.

約

GLP-1 分 泌 を 促 進 す る Zein ペ プ チ ド に つ い て、GLP-1 産生細胞での認識機構、活性画分の探索、血中DPP-IV 活性抑制機構の解明を目的とした。
GLP-1 産生細胞株を用いた試験において、Zein ペプチドが、消化管内分泌細胞に認識される際に、細胞外カ4