コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

コラーゲンに正しい構造を取らせる、HSP47 誘導剤の発見

熊本大学大学院医学薬学研究部

水島徹

Since HSP make cells resistant to various stressors, HSP-inducers are effective against various diseases, such as
gastric ulcer. Therefore, we here try to establish the screening system for HSP-inducers. We construct plasmid inwhich the luciferase gene is located downstream of the promoter of HSP gene. Cells transfected with this plasmid
showed phenotype of stimulation of luciferase activity upon heat shock, suggesting that this system is useful forscreening of HSP-inducers. We are now starting such screening from natural products.

１

緒いることが明らかにされ、それらの疾患は“蛋白質フォー言ルディング異常病”と総称されるようになった。代表的な細胞、特に人体を外界から隔てている上皮細胞の傷害（細蛋白質フォールディング異常病は、神経変性疾患、プリオ胞死）は疾患の直接の原因となる。例えば胃を様々なストン病（いわゆる狂牛病）、嚢胞性繊維症などである。ほとレスから守っている胃粘膜細胞の傷害は胃潰瘍を導く。まんど全ての蛋白質フォールディング異常病の根本的な治療

た、気道を保護している気道上皮細胞の傷害は、神経終末法は確立していない。これは蛋白質フォールディング異常の露出により気道過敏症、即ち喘息を起こす。従って、細病の根本的な原因である、蛋白質のフォールディング異常

胞を様々なストレスから守る物質は、疾患治療薬として有の観点からその治療法を開発しようとする研究がほとんど望である。本研究提案は、細胞を保護する蛋白質を誘導すなされてこなかったためである。HSP は蛋白質が正しいる物質を天然物から選択し、疾患治療薬（抗潰瘍薬、抗喘フォールディングをとるのを積極的に助けている。そこで、息薬）として開発することを目的としている。このような安全な HSP 誘導薬は、抗潰瘍薬、及び抗喘息薬としてだ

医薬品は現在なく、本研究は独創的である。

けでなく、蛋白質フォールディング異常病の根本的治療法

我々が注目しているのはストレス蛋白質である。細胞はを確立にもつながると期待されている。

ストレスに対し、適切な蛋白質（ストレス蛋白質）を発現２することによって、自らの生存を保っている。そこでストレス蛋白質を人工的に発現させることによって、細胞をス２．１

実験

プラスミドの構築

トレスから守ることが出来る。実際我々は胃粘膜細胞にプ ラ ス ミ ド、LSNWT を 入 手 し、 そ れ を HaeIII とおいて、代表的なストレス蛋白質である熱ショック蛋白質

BamHI で切断し、human HSP47 プロモーター部分を切（HSP）を人工的に誘導することによって、胃粘膜細胞を様々り出し、それを pGL3-basic Neo Vector plasmid の Bgl II-なストレス（アルコール、酸、ピロリ菌など）に耐性化出Sma I 部位に導入した。作成されたプラスミドを、pGL3-来ること、及びそれによりストレス性胃潰瘍を防御できるpHSP47 と命名した。

ことを初めて見出した。また最近、気道上皮細胞に HSPを人工的に誘導することによって、気道上皮細胞を様々な２．２ストレス（アレルゲン、活性酸素、炎症性細胞傷害因子）細胞への導入

CHO-K1

細 胞 に、pGL3-basic Neo Vector plasmid、に耐性化出来ること、及びそれにより喘息症状を和らげる

pGL3-pHSP47、及び pGL3-pHSP47 をリポフェクトアミンことができることを初めて見出した。

（プロメガ社）を用いて導入した。モノセル化後、G418（400一方最近、蛋白質の高次構造（これをフォールディングµg/ ㎖）で選択した。熱ショックによるルシフェラーゼ活（折り畳み）と呼ぶ）の異常が多くの疾患の原因になって性上昇を指標に候補細胞を選択し、さらに同様の条件でモノセル化を２回行った（モノセル化後、同様の方法で候補Identification of HSP47-inducers

細胞を選択した）。最も誘導効率の高い細胞をストックし、Toru Mizushima

それを起こして、次の項で述べる実験を行った。

Graduate S cho ol of Med ica l a nd
Pharmaceutical Sciences, Kumamoto
University

２．３

ルシフェラーゼアッセイ

24well プレート上で confluent になるまで培養した（HamF12, 10%FCS, 400 µg/ ㎖ G418）。42 度で 1.5 h 熱ショッ

− 42 −

コラーゲンに正しい構造を取らせる、HSP47 誘導剤の発見

クをかけ、その後 37 度で 12 時間培養した。ルシフェラー２）Mima, S., Tsutsumi, S., Ushijima, H., Takeda,

ゼアッセイは、プロメガ社のルシフェラーゼアッセイキッ

M., Fukuda, I., Yokomizo, K., Suzuki, K., Sano,トを用いた。

T., Nakanishi, T., Tomisato, W., Tsuchiya, T. and３

結Mizushima, T. Cancer Res. 65, 1868-1876.（2005）

果３）Tanaka, K., Tomisato, W., Hoshino, T., Ishihara, T.,

熱ショック依存にルシフェラーゼ活性の上昇が顕著に見

Nanba, T., Aburaya, M., Katsu, T., Suzuki, K., Tsutsumi,

られた。この結果は、継代培養を続けても、また一端ストS. and Mizushima, T. J. Biol. Chem. 280, 31059-31067.

ックし、それをまた起こして使用しても、ほぼ同じ結果が（2005）得られている。

４）Ushijima, H., Tanaka, K., Takeda, M., Katsu, T.,

４

考Mima, S. and Mizushima, T. Mol. Pharmacol. 68,

察1156-1161.（2005）

以上の結果から、ルシフェラーゼを用いた、HSP 誘導５）Tsutsumi, S., Namba, T., Tanaka, K., Ishihara, T.,

薬のスクリーニングシステムを確立することが出来たと考Arai, Y., Aburaya, M., Suzuki, K., Hoshino, T. andえている。そこで現在このシステムを用いて、様々な生薬

Mizushima, T. Oncogene 25, 1028-1029.（2006）６）Aburaya, M., Tanaka, K., Hoshino, T. Tsutsumi,

成分から、HSP 誘導薬の検索を行っている。

S., Suzuki, K., Makise M., Akagi, R. and Mizushima,（参考文献）（本研究成果は投稿準備中）

T. Heme oxygenase-1 protects gastric mucosal cells

１）Tsutsumi, S., Gotoh, T., Mima, S., Tomisato, W.,against non-steroidal anti-inflammatory drugs. J. Biol.

Hoshino, T., Hwang, H-J., Mori, M., Tsuchiya, T. andChem. in press.（2006）

Mizushima, T. Cell Death Differ. 11, 1009-1016.（2004）− 43 −