天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明
新潟大学工学部機能材料工学科

落合秋人

Tyrosinase is a rate-limiting enzyme in melanin biosynthesis. Thus, many inhibitors against tyrosinase have been
proposed to be skin-lightening agents. However, many of the existing inhibitors cannot be widely used in the cosmeticindustry owing to their high cytotoxicity and low activity. In this study, we isolated new naturally derived peptides from theenzymatic hydrolysate of rice bran protein that exhibited inhibitory activity against tyrosinase. Furthermore, mutational andstructural analyses were tried for elucidating the structure-function relationship of these peptides.

1. 緒

されている 4）。また、チロシナーゼ阻害活性を持つアルブ

言チン、グルタチオン、アスコルビン酸は、比較的安全では紫外線から皮膚を保護する生体防御反応として、我々のあるものの、その活性が相対的に低く、化粧品向けの有用身体はメラニンと呼ばれる褐色色素を生産する。通常、皮な美白素材にはなっていない。申請者は、過去に合成ペプ

膚のターンオーバー（皮膚細胞の新陳代謝）によってメラチド TH10 がチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、ニンは自然に肌から排出されるが、色素の過剰生産もしくC 末端のチロシン（Y）残基がこの阻害活性に必須であるこはターンオーバーの低下などの理由で “しみ” や “そばかす”とを明らかにした 5）。そこで、芳香族アミノ酸のカルボキ1）などの色素沈着を起こす 。ターンオーバーが乱れる要因

シル基側のペプチド結合を切断するキモトリプシンで米糠として、過度な紫外線の暴露、栄養バランスの崩れ、疲労、タンパク質を消化した結果、消化産物中には多数のチロシストレス、ホルモンバランスの崩れなどが挙げられるが、ナーゼ阻害成分が派生することを見出した。また、この酵一般的には加齢に伴う新陳代謝の衰えが原因である。また、

素消化産物からチロシナーゼ阻害ペプチド CT-1, CT-2 を最近の研究では、お年寄りが継続的にスキンケアと化粧を単離同定した。これらは、それぞれ 9 残基もしくは 6 残基行うことで日常生活動作（ADL）が向上することが明らかのペプチドであり、共通して C 末端にチロシン残基を含む。になっている。これらのことから、若い世代においてのみ一方で、これらのペプチドの阻害の強さ（IC50）には大きなならず、10 年後には 65 歳以上の高齢者が 30 ％近くに達相違が確認され、阻害活性の発現には様々な要因を考慮すするとされる超高齢化社会を迎える中で、生活の質を高める必要があることがわかった 6）。

るためのスキンケア、特に美白については多くの人々が望これらの背景を踏まえ、本研究では、チロシナーゼを阻む皮膚ケアであり、生き生きとした生活を支えるためにま害するペプチドのさらなる網羅的な単離・同定を行い、構すます重要な課題であると言える。

造生物学的手法や阻害ペプチドの派生ペプチドを用いてチメラニン色素の沈着は、主にメラニン形成の出発段階に2）

ロシナーゼ阻害活性を与える構造要因を明らかにする。こ関わるチロシナーゼ酵素の働きによる 。チロシナーゼは、れらの結果と合わせて、ペプチドの一次構造とチロシナー

図１に示すように、メラニン形成の出発段階に関わる中核

ゼ阻害活性との相関解析を行い、チロシナーゼ阻害ペプチ酵素である 2, 3）。そのため、これまでに多くのチロシナードの高い活性の発現に必要な構造要因を明らかにする。

ゼ阻害成分が色素沈着防止剤や美白剤として提案されてい2. 実る 4）。現在、色素沈着防止剤や美白剤として、様々な化学合成品や天然物成分が用いられているが、近年の白斑問題

験2. 1. チロシナーゼ活性の測定に象徴されるように、コウジ酸やハイドロキノンなどの既チロシナーゼの酵素活性は、L- チロシンまたは L-DOPA

存物質はアレルギー性や毒性が強く、その安全性が問題視を基質として、チロシナーゼのモノフェノラーゼ反応またはジフェノラーゼ反応を波長 475 nm における光吸収を測

Searching for the naturally derived
peptides having a skin whitening effectand elucidation of its action mechanism
Akihito Ochiai
Department of Materials Science andTechnology, Faculty of Engineering,
Niigata University

定することにより測定した。酵素阻害は、モノフェノラー
ゼ反応に対する各ペプチドの 50 % 阻害濃度（IC50）を求めることにより評価した。また、本研究においては、マッシュルーム由来のチロシナーゼ（Tyrosinase from Agaricus
bisporus, AbTyr, Sigma）を使用した。AbTyr は真核生物のモデル系として、チロシナーゼ阻害試験に一般的に使用− 16 −

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明

図1

ヒト細胞におけるメラニン形成機構タカラバイオ株式会社）を用いて生存細胞数を測定し、ペされている。

プチド添加後の 3 日目までに細胞増殖に与える影響を観察

2. 2. 新規チロシナーゼ阻害ペプチドの単離と同定した。

新規のチロシナーゼ阻害ペプチドは、米糠タンパク質の2. 4. AbTyr の結晶化とＸ線回折実験酵素加水分解物から単離・同定した。
まず、3.0 g の米糠タンパク質（RBP55, 築野食品工業株

結晶化には高純度のタンパク質が必要であるため、式会社）を秤量して超純水中に懸濁した。ホモジナイザー

AbTyr の市販品（Sigma 社）をゲルろ過クロマトグラフィを用いて米糠タンパク質を均一に撹拌した後、透析によりーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに低分子物質を除去し、Trypsin と Chymotrypsin をそれぞ高純度化した。AbTyr と CT-2 との複合体の結晶は、過去れ 60 mg 加えて 50 ℃, 6 時間インキュベートすることによに報告されている AbTyr の結晶化条件 7）を参考にして、9り加水分解反応を行った。得られた加水分解物から、チロ% PEG 4000, 0.1 M NaAc（pH 4.5），5 mM HoCl, 1.56 mM

シナーゼ阻害活性を有する画分を 2 種類のゲルろ過クロマ

CT-2 を含む条件において、蒸気拡散法を用いて調製した。

トグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを使用して分X 線回折実験は、高エネルギー研究機構（つくば市）の放射離し、均一なペプチド成分を単離した。単離したペプチド光を利用した。の MS/MS ス ペ ク ト ル を MALDI-TOF MS（Auto Flexし、Mascot プログラム（マトリクスサイエンス株式会社）

2. 5. AbTyrとチロシナーゼ阻害ペプチドとのドッキ
ングシミュレーション解析を利用してイネゲノムデータベースと照合することにより

AutoDock Vina（version 1. 5. 4）ソフトウェアを使用

III, BRUKER DALTONICS）を用いた質量分析により収集その配列を同定した。

して、AbTyr と各チロシナーゼ阻害ペプチドとの結合をまた、これらペプチドの派生ペプチドは、ペプチド合成シミュレーション解析した。解析には短鎖ペプチド SWY,装置（PSSM-8、島津株式会社）を用いて Fmoc 固相法によSWW, もしくは YWS を使用した。AbTyr の立体構造は既り化学合成し、逆相クロマトグラフィーによって高純度化

7）に報告されているものを使用した（PDB ID : 2y9w）。それして使用した。

ぞれのシミュレーション解析において、AbTyr の活性中心を構成する 3 つのアミノ酸残基（Asn-260, His-244, Glu-

2. 3. B16 マウスメラノーマ細胞を用いたメラニン合成抑制試験
チロシナーゼ阻害ペプチドによるメラニン合成抑制試験322）を柔軟性を持つ残基として指定し、グリッドマップサ
イズは 16×18×18、グリッドセンターを x=7, y=27, z=99に設定した。

はマウス B16 メラノーマ細胞を使用して以下のように行3. 結った。5 % FBS を含む E-MEM 培地を用いて 1×104 cells/mL の培養細胞溶液を調製し、6well マイクロプレートに果3. 1. 新規チロシナーゼ阻害ペプチドの探索

1.5 mL/well ずつ分注して 37 ℃, 5 % CO2 雰囲気下で 24 時

米糠タンパク質加水分解物を 2 種類のゲルろ過クロマト間培養した。その後、上清培地を各種濃度のペプチドを含グラフィーによって分離し、各画分のチロシナーゼ阻害活

む 5 % FBS 含有 E-MEM 培地と交換し、さらに 3 日間培養性を測定した。高い阻害活性を有するピーク画分を回収し、した。培養後の細胞を 0.25 % トリプシンおよび 1 N NaOH

逆相クロマトグラフィーによってさらに精製を行った。得により剥離・溶解させ、420 nm における吸光度を測定すられた複数の主要ピークをそれぞれ分取し、同一のカラムることにより細胞内に蓄積したメラニン量を定量した。

を用いた再クロマトグラフィーによって、それぞれのピまた、96 well マイクロプレートにおいて、同様の条件にークに含まれるチロシナーゼ阻害ペプチドを単離した。質てペプチド処理および培養を行った。その後、生細胞測定量分析とイネゲノムデータベースにおける照合検索を行い、キット（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System,2 種類のチロシナーゼ阻害ペプチド CT-3, CT-4 を同定し

− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

た。CT-3 および CT-4 は、それぞれ 7 残基と 9 残基のアして、マウス B16 メラノーマ細胞におけるメラニン合成抑ミノ酸から構成されており、CT-3 は C 末端にチロシン残制試験を行った（図 3）。CT-1 と CT-3 では、むしろメラ基を有している一方で、CT-4 はチロシン残基を有していニン合成量を増大させる結果となった。一方で、最も強いなかった。これらのペプチドを化学合成してチロシナーチロシナーゼ活性阻害を示した CT-3 は、0.5 mM で 60 %ゼ阻害活性を測定した結果、CT-3 は 400µM の濃度でモ程度のメラニン合成抑制効果を示した。既存のメラニン合ノフェノラーゼの活性を 35% 程度抑制することがわかっ成抑制剤であるアルブチンを濃度 0.5 mMで処理した場合た（図 2）。この阻害活性は、過去に同定した阻害ペプチドは約 70 % 程度の抑制効果を示すことから、CT-3 はアルCT-1 と同等であった。一方で、CT-4 は CT-1~CT-3 のブチンと同等の効果が期待できると考えられた。また、こペプチドと比較してやや低い阻害活性（400µM の濃度でモれらのペプチドは全て、1 mM の濃度範囲において全く細ノフェノラーゼの活性を 10 % 程度抑制）を示した（図 2）。

胞毒性を示さなかった。

阻害活性の強い 3 種類のペプチド（CT-1~CT-3）を使用

3. 2. チロシナーゼ阻害活性に関わるペプチド中の各アミノ酸残基の役割の解明
強いチロシナーゼ阻害活性を示した CT-1~CT-3 およびTH10 は、その配列の C 末端に共通してチロシン残基を有することがわかった。過去の研究においても、TH10 の C末端チロシン残基がそのチロシナーゼ阻害活性に必須であることを明らかにしている。これらのペプチドは、L- チロシンのアナログ基質としてチロシナーゼの酵素反応を阻害していると推測された。そこで我々は、過去に報告されているチロシナーゼ阻害ペプチドのなかから、TH10 の10 残基の配列のうち 7 残基が一致し、かつ同等のチロシ
図2

米糠加水分解物から見出したチロシナーゼ阻害ペプチド

図3

ナーゼ阻害活性を示すペプチド P48）に着目した（表 1）。P4

マウス B16 メラノーマ細胞におけるメラニン形成抑制試験− 18 −

天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明と TH10 は、配列中にそれぞれ 3 残基と 1 残基のチロシン

3. 3. AbTyr の結晶化とＸ線回折実験を有している。これらのチロシン残基を中心に変異を導入

チロシナーゼ活性阻害に関わるペプチドの詳細な阻害機し、合計 12 種類の派生ペプチドを設計して（表 1）、配列構を明らかにするため、Ｘ線結晶構造解析により AbTyrと阻害活性との相関を解析した。とその阻害ペプチドとの複合体立体構造の解明を試みその結果、チロシン残基を欠失させた派生ペプチドた。阻害ペプチドとして、CT-1, CT-2, CT-3, TH10, およ（TH10-1, TH10-2, TH10-3）において完全にチロシナーゼ

び P4 を使用した。1.56 mM の CT-2 を含む 9 % PEG4000,阻害活性が喪失したことから、チロシナーゼ阻害活性の発0.1 M NaAc（pH 4.5），5 mM HoCl の組成から成る結晶化

現にはチロシン残基が必須であることが立証された。興味条件において、AbTyr/CT-2 複合体の結晶を得た（図 4深いことに、P4 の C 末端以外に配置されたチロシン残基左）。得られた結晶を用いて、高エネルギー加速器研究機の欠失（P4-1, P4-2, P4-3）は、その阻害活性に影響を及ぼ構の Photon Factory の放射光を使用して回折実験を行っさなかった。また、C 末端のチロシン残基のみを欠失させた。その結果、最大分解能 2.4 Å 程度の回折像を得ることた派生ペプチド（P4-4）においては完全に阻害活性が喪失ができた（図 4 右）。しかしながら、結晶の重なりが原因としたことから、C 末端に配置されたチロシン残基のみがチみられる回折像の光暈が特定の振り角において生じ、立体ロシナーゼの阻害に関与することが明らかになった。一方構造の決定には至らなかった。TH10 および P4 との複合で、C 末端から 2 番目に配置されたトリプトファン残基に体結晶も得られたが、同様に構造決定には至らなかった。

変異を導入すると、その阻害活性は顕著に低下した。従って、チロシン残基周辺のアミノ酸配列も阻害活性の強弱に影響することが示唆された。

3. 4. ドッキングシミュレーション解析を用いた AbTyrと阻害ペプチドとの結合様式の解明
前述の「3. 2.」の結果から、C 末端に配置されたチロシン

表 1 TH10 および P4 と設計したそれらの派生ペプチドのチロシナーゼ阻害活性ペプチド
TH10P4
TH10-1
TH10-2
TH10-3
TH10-4
P4-1
P4-2
P4-3
P4-4
P4-5
P4-6
P4-7
P4-8ab

アミノ酸配列MRSRERSSWYYRSRKYSSWYMRSRERSSW–MRSRERSSWFMRSRERSSWWYWSSRERSRM–RSRKYSSWY–RSRKRSSWYYRSRKRSSWYYRSRKYSSW–YRSRKRSSW––RSRKYSSW––RSRKRSSRYYWSRKRSSW–

残基のみがチロシナーゼの阻害に関与することを明らかにした。AbTyr とその阻害ペプチドとの複合体立体構造の解析が不調に終わったため、シミュレーションソフトウェ

aIC50102 µM
123 µM–b–b–b–b123 µM
133 µM
122 µM–b–b–b400 µM–bア AutoDock Vina を用いて AbTyr と阻害ペプチドとの結合様式の解明を試みた。計算を容易にするため、TH10 のC 末端側 3 残基と一致する SWY、その C 末端のチロシン残基をトリプトファン残基に置換した SWW, および SWYの配列を逆順に配列した YWS の 3 種類のペプチドを使用した。
シミュレーション解析を行った結果、3 つの短鎖ペプチドはいずれも AbTyr の活性クレフトに結合していた。触媒残基および銅イオンが近接する Binding Pocket 1（BP1）

チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性に対する 50% 阻害濃度
決定不能（IC50 > 400µM）

図4調製した AbTyr/CT-2 複合体の結晶（左）とＸ線回折像（右）− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図5AbTyr と 3 種類の短鎖ペプチドとの相互作用（左 : リボンモデル，右 : 分子表面モデル）には SWY の C 末端チロシン残基、SWW の C 末端トリプを介さないチロシナーゼ阻害機構が存在することを示した。

トファン残基、YWS の N 末端チロシン残基がそれぞれ結今回調製した AbTyr と CT-2 の複合体結晶から 2.4 Å 分合していた（図 5 左）。SWY ペプチドの C 末端チロシン残解能までのＸ線回折像を得ることができた。しかしながら、基は BP1 に結合しており、TH10 および P4 の C 末端チロ調製した結晶においては結晶性が極端に悪い格子面が存在

シン残基が AbTyr のアナログ基質として機能している可し、各ペプチドとの複合体立体構造の決定には至らなかっ能性を強く支持した。また、SWW 配列をもつ TH10-2 ペた。そこで、AutoDock Vina ソフトウェアを用いたシミ

プチドはチロシナーゼ阻害活性を持たない（表 1）。この理ュレーション解析により AbTyr と阻害ペプチドとの結合

由は、SWW の C 末端トリプトファン残基と触媒銅イオン様式の解明を試みた。解析の結果、ペプチド中のチロシンとの間には 6 Å 程度の距離があることから（図 5 右）
、基質残基が AbTyr のアナログ基質として機能することにより、（チロシン）の接近を妨げることができず、活性を抑えられチロシナーゼ活性を阻害する可能性を示した。また、そのないからと考えられる。また、YWS 配列をもつ TH10-4

チロシン残基はペプチド中の C 末端に配置される必要があ

ペプチドもチロシナーゼ阻害活性を持たない（表 1）。シミり、同じ芳香族アミノ酸であるトリプトファン残基残基にュレーション解析の結果は、YWS の N 末端チロシン残基よって代替できないことを示した。

が BP1 を塞ぐことが可能であることを示している。一方で、これらの結果は、C 末端にチロシン残基をもつペプチド

このチロシン残基には N 末端アミノ基が残っていることかを網羅的にスクリーニングすることにより、高い阻害活性ら図 1 に示す反応が進み、結果として YWS ペプチドからを有するチロシナーゼ阻害ペプチドを設計することが可能メラニン様物質が生成してしまう可能性を示した。になることを示している。一方で、我々は C 末端チロシン

4. 考残基に隣接するアミノ酸残基もチロシナーゼ阻害活性の強察弱に影響を与えることを明らかにした。より高い阻害活性本研究により、チロシナーゼ阻害活性を示す 2 種類の新規なペプチド（CT-3, CT-4）を見出した。それらの阻害を有するチロシナーゼ阻害ペプチドを設計するには、阻害機構のさらなる解明が必要であると考えられる。

活性は、過去に見出した CT-2 ペプチドに比べてやや低く、それぞれ 400 µM の濃度で 35 %, 10 % 程度の活性を阻害し謝辞た。阻害活性の強い CT-1, CT-2, CT-3 のペプチド配列を本研究を遂行するに当たり、公益財団法人コスメトロジ比較すると、共通して C 末端にチロシン残基を有することー研究振興財団よりご援助頂きましたことに深く感謝申しがわかった。TH10 と相同性の高い P4 の配列をシャッフ上げます。

リングした派生ペプチドの阻害活性を解析することにより、C 末端に配置されたチロシン残基の存在が阻害活性に重要（発表論文）であるという共通則を提示することができた。一方で、今

1） Ochiai A, Tanaka S, Imai Y, Yoshida H, Kanaoka T,

回我々が見出した CT-4 はその配列中にチロシン残基を有Tanaka T, Taniguchi M,: New tyrosinase inhibitory

していないものの、弱い阻害活性を示した。チロシン残基

decapeptide: Molecular insights into the role of− 20 −天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明

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