ヒアルロン酸で表面を修飾したリポゾ ー ムからの内容物の温度による放出制御
東京理科大学薬学部

牧野公子

We prepared liposomes containing 5,6-CF, the surface of which was coated withcarboxymethyl cellulose or hyaluronic acid. Above the phase transition temperature of
the lipids composing the liposomes, almost 100% of 5,6-CF was released from the lipo­
somes within 30mins, although little release of 5,6-CF was observed at and below thephase transiいon temperature. Surface charge density of the liposomes was changed by
the adsorption of hyaluronic acid or carboxymethyl cellulose on liposome surface. Also,
we measured the zeta potential values of DMPC, DPPC or DSPC liposomes at varioustemperatures. Neutral liposomes were found to exhibit non-zero zeta potentials in an
external electric field even when dispersed in solution at pH7.4. A model for the orienta­tion of lipid head groups was proposed to explain the observed non-zero zeta potentials.
The dependence of the zeta potential on temperature and ionic strength was analyzed via
this model to obtain the information on the direction of the lipid head groups in the lipo­
some surface region. The direction of the lipid head group was found to be sensitive tothe temperature and the ionic strength of the medium. At low ionic strengths, the phos­
phaいdyl groups locate at the outer portion of the head group region. With increasingionic strength, the choline groups move outward to the outer region of the bilayer sur­face. At constant temperature, as the ionic strength decreases, the choline group ap­
proaches the surface while the phosphatidyl group hides behind the surface. At the phasetransition temperature of the lipid, the phosphatidyl group lies in the outer-most regionof the surface and the choline group is in the inner-most region.

要旨

量を比較すると ， ヒアルロン酸の表面への吸着によってリポソ ー ムからの5,6-CF放出が抑制されカルボキシメチルセルロ

スまたはヒアルロンること が明らかになった。 次に， リポソ ー ムの酸を表面に吸着させたリポソ ー ムに5,6-CFを内

ゼ ー タ電位を測定した結果 カルボキシメチルセ包して種々の温度において5,6-CFの放出挙動をルロ ー スまたはヒアルロン酸が表面に吸着するこ検討した。 このリポソーームはそれを構成するリンとによって表面電荷密度が変化するという結果を脂質の相転移温度付近以下の温度ではほとんど5,得た。 さらに我々はこのリポ ノ ー ムからの温度に6-CFを放出しないが相転移温度以上では30分依存した内容物の放出挙動を知るために， リン脂以内に放出量がその最終値のほぼ100%に達した。

質の動きの温度依存性に注目して種々の温度にお‘‘‘

この時表面に多糖類を持たないリポ ノ ー ムと表けるゼ ー タ電位の値からリポ ノ ー ムのリン脂質の面にカルボキシメチルセルロ ー スまたはヒアルロ

頭部の運動性を見積った。 その結果， リン脂質のン酸を吸着させたリポソ ー ムからの5,6-CF放出

相転移温度付近でリン脂質の頭部は最も広がった

Temperature-controlled release from hyaluronic acid-coated hposomes.
Kimiko Makino-46-リポソ ー ムからの内容物の温度による放出制御

2. 実形を取りうると考察された。

1. 緒言

験

リポソ ー ムの調製

2. 1

水または5,6-CF水溶液を内包し， ジミリスト
リポソ ー ムからの内容物の放出制御は薬物放出

イルフォスファチジルコリン(DMPC)または ，あるいは化粧品へのリポソ ー ムの配合に関連してジパルミトイルフォスファチジルコリン(DP­

多くの研究者によって検討されてきた。 その1つPC)または ， ジステアロイルフォスファチジルコ

はリポソー

ムの安定性の制御の問題であり， 我々‘の研究室において多糖類でリポ ノ ー ム表面を被覆することによってリポソー‘リンCDSPC)を構成成分とするリポ ノ ー ムを調製した。
DMPC, DPPC,DSPCをクロロホルムに溶解ムの安定性を増すという結果を得た。 即ち，リン脂質リポソームを界面し， この溶液に各リン脂質の相転移温度の10度下活性剤を含む溶液中に再分散すると ， 界面活性剤の温度において蒸留水または5,6-CF水溶液を乳によってリポソ ー ムからの内容物放出は促進され化分散してW/0エマルションを調製した後 ， リるが表面をカルボキシメチルキチン ， カルボキン酸緩衝液中(pH7.4,イオン強度0.154 )にこのエ

シメチルセルロ ー ス， ヒアルロン酸（ヒアルロンマルションを加え ， 10分間攪拌し， さらにリン酸酸は剌激性が低く ， 保湿性が高いことから医薬品，緩衝液を加えて3時間攪拌してクロロホルムを蒸香粧品の原料として注目されている。）で被覆す散させた。 調製されたリポ ‘ノ ー ムを遠心機上で3るとリポソ ー ムからの内容物放出は抑制される。

回リン酸緩衝液で洗浄してサンプルとした。

ムからの内容物の調製中にカルボキシメチルセルロ ー ス(CMC)‘

放出制御の点に関して， 1980年代にリポ ノ ー ムの溶液またはヒアルロン酸(HA)溶液を加えること内容物（例えば5,6-CFのような蛍光物質）の放出によって表面にこれらの多糖類を吸着した DM­

一方 ， 温度に依存したリポソ速度がリポソーームの相転移温度付近で急に大きく‘PC,DPPC,DSPCリポ ノ ー ムを調製した。

なるかあるいは最大値を示すことが報告されている。 我々はこの結果はリポ ‘ノ ー ムの構造が温度に2. 25,6-CFを含むヒアルロン酸またはカルボキシ依存して変化することを示唆すると考え，このリポソームの構造を制御することによってリポソー5、6-CFの放出速度の測定

メチルセルロ ー スで表面を被覆したリポ ‘ノ ー ムを‘ムの内容物の放出制御が可能になると推察した。

pH7.4のリン酸緩衝液中に分散後， リポ ノ ー ムを

本研究は ， リポ ‘ノ ー ムリン脂質の頭部および炭構成しているリン脂質の相転移温度の前後5,10素鎖の運動性が温度によって受ける影響を知り ，‘度と相転移温度において振盪し， 経時的にサンプム表面に吸着しているカルボリングしてlOOOOrpmで遠心して上澄の蛍光強度

キシメチルセルロ ー スとヒアルロン酸の吸着量とを測定 した。 対照としてlOmM SLSを含有する

これらの多糖類の構造とリポソ ー ム全体の構造のリン酸緩衡液中に分散して相転移温度において3

温度依存性を検討して ， これらの多糖類がリポ時間振盪したリポ ‘ノ ー ムの上澄の5,6-CF濃度をソ ー ムを補強する機構と内容物の放出機構を解明100%とした。

さらにこのリポ ノーすることを目的としている。
2. 3

DMPCリポソ ー ム ，‘

CMC-DMPCリポソ ー ム ，DSPCリポ ノ ー ム ，‘

CMC-DPPCリ ポ ノ ー ム ，
ソ-47-ーム，

DPPCリポ ‘ノ ー ム ，

HA-DMPCリポソ

CMC-DSPC リ ポーム，

HA-DPPC

100

HA-DSPCリポソ ー ムを調製し，存性を評価した。
2.4

60 40 20定した。 測定には PEN KEM System 3000を用いた。 ゼ ー タ電位の値から表面電荷密度の温度依IJUJasua（ぶ Oー38を再分散し， 種々の温度においてゼ ー タ電位を測゜゜

リ ポ ソ ー ム表面に吸着したCMCとHAの量の測定
DPPC リ ポ ‘ノ ー ム，

180150180(cl04゜2H。：時間0におけるサンプルの蛍光強度
H,0096: SLSで処理したサンプルの蛍光強度

120

06

且：時間tにおけるサンプルの蛍光強度

lC」3St（3Pa
ぶ o

*100

90

Time (min)8H 10096-H。

60

゜

経時的な5,6-CFの放出率を次式によって求め放出率（％）＝

llO(b)

30

1. 経時的な5、6-CFの放出

H,-H。

120

一結 果た。

90

Time (min)60 40 20

ラフィ ーを用いて評価した。

nc」asca38（ぶ oに分散し， 種々の温度における吸着量を分散液中に残った CMC磯度と HA濃度を液体クロマトグ

608DSPCリポ ‘ノ ー ムを CMC水溶液と HA水溶液中JO

゜

DMPC リ ポ ソ ー ム ，(a)8種々のイオン強度のリン酸緩衝液中にリポソ ー ム゜

リボ ‘ノ ー ム ，

図1に示すように DSPCリポソ ー ムからの5,6CFの放出率は45度と50度では低いが ， 55度以上
では30分以内にほぼ100%に達している。 ヒアル
ロン酸で表面を被覆することによって5,6-CFの30Fig.

放出率は45度と50度において低下した。 カルボキ
シメチルセルロ ー スによる被覆は5,6-CFの放出率に影響を与えない。 このような5,6-CFの放出率の温度依存性はDSPCリポ ‘ノ ー ムの相転移温度 が 55度付近にあることと対応している。 他のたDPPC. DMPCリポソ ー ムからの5,6-CFの放出に関しても同様の傾向が見られ た。

90Time (min)120150180

1 5,6-CF leakage from DSPC l1posomes(a), from DSPC liposomes coated withcarboxymethyl cellulose(b), and fromDSPC liposomes coated with hyaluronicacid(c) at vari ous t e叩面at ures: (0)45℃,（●） 50℃、（口） 55℃, （◇）60℃, （●）65℃

2. リポソ ー ム脂質の頭部構造の温度， イオン強度依存性

DPPC. DMPCリポソ ー ムおよび， カルボキシメチルセルロ ー ス，ヒアルロン酸で表面を被覆し60

DMPC , DPPC .
ソDSPCで 調 製 し たリ ポー ムはこれらのリン脂質が電気的に中性であるにもかかわらず ， pH7.4 のリン酸緩衝液中で0でないゼ ー タ電位を示した。 また， このゼ ー タ電位の値はイオン強度と温度を変えると変化した。 こ-48-‘リポ ノ ー ムからの内容物の温度による放出制御のように中性リン脂質リポソ ー ムの表面の電荷分布は温度とイオン強度に依存する。 リポソ ー ム表面の脂質頭部の向きが温度とイオン強度に依存して変化すると考え ． この現象を説明するモデルを提出した。
図2に示すように DSPC リポ ‘ノ ー ムのゼ ー タ電- dFig. 3

少して ， あるイオン強度で0を通り ， それ以上高いイオン強度の溶液中では電位が反転して正の値を示した。 また， 温度に関しては50度で最も低い値を示した。 DMPC, DPPC のゼーxン強度が低いときにはより大きな負の値を示すがイオン強度の増加に伴いゼ ー タ電位の絶対値は減

゜位はイオン強度と温度に依存して変化した。 イオ

Schematic representation of the headgroup region.

方向へのこの双極子の写影をd, リボソ ー ムの表タ電位に関面における脂質1個当たりの表面積をSとする（図しても同様のイオン強度および温度依存の傾向が4)リポソ ー ム表面に対する頭部の傾きはdで表さ示された。

れる。 ここで ー R<d<+Pであり ， 頭部がフォ

この実験に用いた脂質が電気的に中性であるにスファチジル基の負電荷が最も表面にありコリンタ電位を示し ， かつー↑ ld — ↓もかかわらず ， 0でないゼー

その値がイオン強度の増加に伴って反転したことを説明するために ， 我々は， 図3に示すような2枚の電荷層を持つモデルを作った。 このモデルでは
ゼ ー タ電位のイオン強度および温度依存性をリポソ ー ム表面のリン脂質頭部の構造変化として説明した。 フォスファチジル基の負電荷からコリン基の正電荷に向かう電気双極子がイオン強度に依存して変化すると考察した。 個々のリン脂質分子については． 双極子の長さを¢とし． 膜面に垂直なf!

10DCO

出CH"

CH 2I。

[AS]
国 god5-100.0Fig. 20.1

Ionic strength

0.2

Ionic strength dependence of the zeta po­
tential of DSPC liposomes at several tern­
peratures:(0)45℃, （●） 50℃,（口）55℃-49-Fig. 4

Lipid head group region.

基の正電荷が最も内側にあるときd=- R,. フォ
スファチジル基の負電荷が最も内側に入りコリン基の正電荷が最も表面にあるときにd=+ R,となる（図5)。 こ こで次式で与えられるパラメー
ター a;rs を導入した。
ゼータ電位の値から a1rs を見積り， 図6 を得た。
図6より． イオン強度が低いとき． フォスファチン酸で表面を被覆することによって， どの温度においてもリポソームのゼー タ電位の絶対値は減少した。
3. リポ ‘ノ ー ム表面へのカルボキシメチルセル
ロースおよびヒアルロン酸の吸着量は現在検討中である。
以上の結果は以下の学会で報告し， かつ学術誌に発表した。
"Temperature- and ionic strength-in­
duced conformational changes in the lipidhead group region of liposomes. "K. Maki­

d=-fld<OFig. 5d>O

d=O

no, H. Ohshima and T. Kondo, 7th Interna­
tional Conference on Surface and Colloid
Science, July 7-13 , '91 Compiegne, France.

d=+g,Model for the conformation of lipid headgroups.

“リポ‘ノーム脂質の頭部構造 一 温度 イオン強ジル基が頭部の外側に位置し， イオン強度が高くなるとコリン基がリポソーム外側に位置する傾向が見られた。 一定の温度において， イオン強度が増加すると， コリン基が表面に位置し， フォス
ファチジル基が内側を向くと推定した。 リン脂質の相転移温度付近の他の温度における状態に比べて， フォスファチジル基が外側にコリン基が内側にあると考えられる。
また ， カルボキシメチルセルロース， ヒアルロ
0.2

度依存性" 牧野公子， 山田 武， 木村真理子， 岡隆史 大島広行， 近藤 保， 第44回コロイドおよび界面化学討論会 9月27日ー 29日埼玉大学"Temperature- and ionic strength-in­
duced conformational changes in the lipid
head group region of liposomes as suggested
by zeta potential data." K. Makino, T. Ya­
mada, M. Kimura, T. Oka, H. Ohshima andT.Kondo, Biophys. Chem., 41(1991)175-183.

0.02。

廻/ 'P-0.4-0.6

0.00.1Ionic strength

0.2

Fig. 6 Ionic strength dependence of d/S of DSPC
liposomes at several temperatures:(0)45℃,（●） 50 ℃,（口） 55℃-50-