能動的標的化技術を搭載した新規ドラッグデリバリーシステムキャリア「バイオナノカプセル」の次世代化粧品分野での応用可否の検討
名古屋大学

黒 田俊 一Bio-nanocapsule (BNC) is a hollow particle consisting of liposome and hepatitis B virus (HBV) surface antigen(HBsAg) L proteins. Due to the high similarity in surface structure between HBV and BNC, BNC is considered to harbor
three functions like HBV: active targeting activity (originally to human liver), membrane fusogenic activity, and stealthactivity (escaping from reticuloendothelial system in body). Recently, we have developed in vivo pinpoint drug and genedelivery system using BNC as a platform by replacing the human liver-specific recognition region (pre-S region) on BNC
surface to the targeting molecules of interest. In this study, I have evealuated the applicability of BNC technology for thetransdermal delivery, which would be useful technology in the forthcoming cosmetic field.

１．緒

酵母小胞体膜由来脂質二重膜に HBsAg L タンパク質約言

100 分子が膜タンパク質として存在している。これは既に化粧品は、有効成分を作用させる部位（標的部位）が皮30 年に亘って世界的に臨床応用されている B 型肝炎ワク

膚や毛髪の細胞であり、それらが外部に直接露出するか、チンの抗原と同様の構造であるため、ヒトにする安全性が外部から至近距離にあることから、長年、有効成分の投与高いと考えられており、実際に動物を用いた安全性試験で方法は表皮部分に直接塗布するのみで、特に大きな工夫はも安全性が認められている。また、近年では臨床応用されなされていなかった。しかし、その方法では、有効成分のているガーダシルやサーバリスクという子宮頸部癌ワクチ物性（極性に基づく皮膚浸透性等）により非特異的に生体ンの抗原提示用足場タンパク質としても用いられている。

内に吸収されており、また、生体内に吸収された有効成分

本キャリアは「リポソーム（liposome, LP）とウイルスベクのごく一部のみが標的部位に到達すれば良しとされていた。

ターのハイブリッド（The Lancet 誌（2003 年 7 月）
、Nature

正確な計測値は利用可能ではないが、皮膚表面での有効成Materials 誌（2003 年 8 月））」と称され、今は複数の医薬品分の捕捉、表皮及び真皮組織内での標的部位以外への有効に搭載され、臨床研究に使用されている程、安全性と有効成分のリーク（漏れ）などは当然起きるはずで、我々の医性が高い。本研究では、表皮、真皮、毛髪部位における任薬品の体内動態解析等の経験から、ベストコンディション意の細胞に対して、外部から直接投与して効率よく到達すでも有効成分の全投与量の数％程度しか標的部位に到達しる BNC の開発を行う。ていないのではないか？と考えている。

２．実

そこで我々は、2005 年に Fragrance Journal 誌１）で指摘
し た よ う に、 近 年 著 し く 進 歩 し て い る DDS（drug２．
１

験

実験材料

delivery system : 薬物送達）技術を、世界に先駆けて化粧

BNCは、HBsAg Lタンパク質発現プラスミドpGLDLIIP39-

品分野に応用し、上記問題を改善し、次世代の化粧品開発

RcT を保有する Saccharomyces cerevisiae AH22R- 株 ３）かに資することを目的としている。具体的には、我々が開発

ら既報４）に従い精製し、凍結乾燥して保存した。

した B 型肝炎ウイルス（HBV）の感染機構とヒト肝臓特異的な細胞及び臓器認識機構を有する非ウイルス性ベクター

２．２

蛍光標識アニオン性 LP の作製であるバイオナノカプセル（bio-nanocapsule,BNC）を用いCholesterol（SIGMA, St.Louis, MO, USA）、DPPCる２）（Fig. 1）
。BNC は HBV 表面抗原（HBV surface antigen,（Dipalmitoylphosphatidylcholine, 日 油 株 式 会 社 , 東 京 ）、HBsAg）L タンパク質を出芽酵母内で過剰発現させること

DPPE（Dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 日油株式会３）で得られる 直径約 70 nm の中空ナノ粒子である。BNC は社）、DPPGNa（Dipalmitoylphosphoglycerol, sodium salt, 日油 株 式 会 社 ）、NBD-PE（7-nitrobellzo-2-oxa-1, 3-diazole,
dihexacanoylphosphothanolamine, trithylammonium salt,

Evaluation of novel drug delivery system
carrier“bio-nanocapsules” possessing active
targeting machinery in the forthcoming
cosmetics field
Shun’ichi Kuroda
Nagoya Univerisity

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）
（ 励 起 光 波 長：470nm，蛍光波長：530 nm）を使用して水和法により（最終モル比は Cholesterol：DPPC：DPPE：DPPG ＝ 40：15：13：30：2（mol/mol））NBD 標識アニオン性 LP を得た。

− 44 −

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Fig.1 HBV と BNC の構造

２．３ 第 2.5 世代 BNC 技 術を用いた BNC-LP 複合体の作製UK）を用いて測定した。具体的には、ブラウン運動中のLP 溶液 700 ml（脂質量 3mg 分）を 15ml ファルコンチュて検出する DLS 法（動的光散乱法）による粒子径測定と、M3ー ブ に 分 注 し、Britton Robinson buffer（0.1 M ホ ウ 酸，

（mixed mode measurement）測 定 技 術 と PALS（Phase.

0.1 M 酢酸，0.1 M リン酸，0.5M NaOH により pH 3 に調整）

Analysis Light Scattering）法をあわせた M3 -PALS によを 800ml、BNC を 300 ml（タンパク質量として 300 mg）添る z 電位測定を行った。

粒子群にレーザー光を当て、その散乱光を光電子倍増管に加し、37℃、30 分間インキュベートした後、5%、10%、15 %、20 %、30 % 及び 40%（w/v）の塩化セシウム溶液を２．５イオントフォレシス

それぞれ 6.5 ml、6.5ml、5ml、5ml、5ml、5ml ずつ P28ST

ラット（8 〜 10 週齢のオス Sprague-Dawley）背部皮膚の用遠心管（日立工機，東京）に重層し、調製したサンプル

毛を剃り、首もとの脊柱を挟んで左右（1cm 間隔）の皮膚

溶液 1800 ml を重層して全量 34.8 ml とし、分離用超遠心機表面において、BNC-LP 複合体を不織布に HEPES（pH7.4）

CP100MX（日立工機 , 東京）を用いて 24,000 rpm、室温、300 ml を用いて含浸させ、銀−塩化銀電極を使用して、イ16 時間の条件で塩化セシウム密度勾配超遠心を行った。

オントフォレシス（TTI エルビュー、TCCR-3005、東京）

超遠心終了後、上層から 1ml ずつ分取した各フラクション

により 0.3 mA/cm2 の条件で１時間行って皮膚内に投与しを 0.1%（w/v）SDS（sodium dodecyl sulfate）を含む 10%（w/た。イオントフォレシス後、３時間遮光して放置して、投v）ポリアクリルアミドゲル（SDS - PAGE）（ゲルサイズ

与部位の凍結皮膚切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡

10 cm×10 cm）に負荷し、80V、80mA、30 分泳動した後、FV1000D（ オ リ ン パ ス、 東 京 ）に よ り 皮 膚 内 に お け る

160V、80mA、60 分泳動した。電気泳動後、ゲルを銀染

BNC - LP 複合体の動態を評価した。

色して BNC が存在するフラクションを特定した。また、

３．結

各フラクションの NBD 蛍光標識 LP の定量は、NBD 由来果

蛍 光 強 度（ 励 起 光 波 長：470nm， 蛍 光 波 長：530 nm）を

３．
１ 蛍光標識アニオン性 LP と BNC との複合体作製

1mg/ml の NBD 蛍光標識 LP を標準物質として Varioskan

第 2.5 世代型 BNC 技術は本来 DNA 送達の為に開発され（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に よ り

た も の で、 カ チ オ ン 性 LP と DNA を 複 合 体（lipoplex、評価し、BNC に約 80％（重量比）含まれるタンパク質成分

LPX）化した後に、酸性条件下で BNC と融合させて、塩の定量はMicro BCA Protein Assay Kit（Thermo SCIENTIFIC，化セシウム密度勾配超遠心法で BNC-LPX 複合体を精製しRockford，IL，USA）を用いて 1mg/ml の BSA を標準物質とた（Fig. 2）。そこで、本研究では薬剤をアニオン性 LP にして定量した。目的のフラクションをまとめた後、500 ml の封入して、第 2.5 世代型 BNC 技術により、酸性条件下でPBS（Phosphate buffered saline ; 140 mM NaCl, 3 mM

BNC を混合して融合を促し、塩化セシウム密度勾配超遠KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4）を用いて室温で 2心法に供して BNC-LP 複合体の生成を試みた。超遠心後，時間透析した後、同量の PBS に交換して、さらに室温で上層より 1 ml ずつフラクションを回収し、全フラクション一晩透析したものを BNC-LP 複合体として、４℃で一晩保について NBD（LP）の蛍光強度、BNC のタンパク質濃度、存した。

密度を測定した（Fig. 3）。その結果、フラクション番号８において LP の単一ピークが形成された。また、各フラク

２．
４

性状解析

ションを SDS- PAGE で展開して銀染色し、デンシトメト

BNC - LP 複合体の粒子径と z 電位は、ゼータサイザーナ

リー解析を行った結果、大部分の BNC はフラクション番ノシリーズ ZS（Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire,号 17 をピークとして集約していたが、一部はフラクショ− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig. 3 第 2.5 世代型 BNC 作製法による蛍光標識アニオン性
LP と BNC の融合パターン（左）及び塩化セシウム超遠心分離パターン（右）Fig. 2 BNC 内部への遺伝子封入法の変遷

ン番号８においてピークを形成していた。以上の結果から、酸性条件下でアニオン性 LP は BNC と効率よく BNC -LP 複合体を形成することが判明した。

３．
２

BNC-LP 複合体の性状得られた BNC-LP 複合体は、薬剤を LP 内に封入することが可能であり、本研究の目的に対してモデルキャリアとして考えることができる。そこで、DDS 分野において重要な物性を決定した。まず、BNC 濃度（タンパク質として）は 200 mg/ml で、LP 濃度は 700mg/ml であった。第２世代

Fig. 4 BNC-LP 複合体の粒子径（上、Intensityモード；中、Number モード）と z 電位（下）型 BNC 作製法までの BNC-LP 複合体は BNC 濃度は LP 濃度の５％程度であったことから、今回は 30％程度なので幾分 BNC 濃度が高かった。また、粒子径は DLS 法で測定すると 200 nm 前後であった（Fig. 4）。ただし、PDI（多分散係数）は 1 であり、粒度分布が不均一であることを示していた。また、表面電荷（z 電位）は−69.2 mVであり、生体内での非特異的吸着が起こりにくいアニオン性であったが、粒度分布が均一でないことにより電荷分布も均一でなかった。

３．
３

イオントフォレシス

本来であれば、BNC 自身が有する膜透過活性により、皮膚表面に BNC-LP 複合体が接触すれば、ある程度は皮膚内に浸透するものと期待されたが、まずは強制的にどこまで皮膚内に浸透できるかイオントフォレシス５）を行ってみた。その結果、BNC-LP 複合体の皮膚内への顕著な浸透は見られなかった（データ示さず）。そこで、BNC 単体で皮膚内に浸透できるか検討するために、蛍光色素 Cy5 で標識した後、粒子径及び z 電位を測定した（Fig. 5）。その結果、

Fig. 5 Cy5 標識 BNC の粒子径（上、Intensity モード）と z 電位（下）− 46 −

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粒子径は 102 nm で PDI が 0.228 と均一な粒子を形成していようになった（Fig. 8）。特に、60℃で生成させた BNC - LPた。次に、z 電位を測定すると、粒度分布が均一なために複合体を透過型電子顕微鏡で観察したところ、40℃ 30 分シャープな電位を示しており、− 4.54mV と生体内投与に間（37℃と同じ）で生成した同複合体と同じ形状を示して好適な弱アニオン性であった。

い た（Fig. 9 上 段 ）。 ま た、60 ℃ 及 び 70 ℃ で 生 成 さ せ た

次に、Cy5 標識 BNC（タンパク質量として 833 mg/ml）

BNC-LP 複合体の粒子径及び表面電荷を測定したところ、

溶液 300 ml を用いて同様にイオントフォレーシスを１時間

特に 60℃で生成した分は粒子径及び表面電荷ともに生体行い、３時間遮光放置して、皮膚切片を観察した（Fig.6）。

内投与に適していた（Fig.9 下段）。

その結果、BNC は皮膚表面から満遍なく入っており、浸４．考透している領域は、表面から数 10 mm から 100mm 弱の「表察皮層」であった。これは、カチオン性 LP を投与した場合５）

今回、化粧品の有効成分を封入したナノキャリアーを効と同じ皮膚内浸透能力を BNC が有していることを示して果的に皮膚内に浸透させるために、我々の開発した BNCいた。

を用いて条件検討を行った。まず、最近、BNC 内部に物質封入する方法が改良された（第 2.5 世代型 BNC 作製法）

３．４ 蛍光標識アニオン性 LP と BNC との複合体作製条件の再検討（今回は蛍光色素）を封入し、BNC と融合させ、BNC-LPので、同方法を用いてアニオン性 LP 内部にモデル化合物

BNC - LP 複 合 体 を 皮 膚 内 に 一 層 浸 透 さ せ る た め に、複合体とした。今回は、能動的標的化は期待していなかっBNC - LP 間の相互作用を高めて複合体の安定性を高めるこたので、ヒト肝臓特異的 BNC を使用した。その結果、同とが必要と考えた。そこで、再度複合体作成条件の検討を複合体の z 電位はアニオン性で生体内非特異的吸着が少な行うことにした。具体的には、３. １で記載した酸性条件いことが期待されたが、粒子径が 200 nm 程度となり、また、下での BNC とアニオン性 LP との融合に際して、脂質膜の粒度分布が不均一なために、単純塗布でもイオントフォレ流動性を高めるために高温条件（37℃ 30 分間から、50℃、シスでも皮膚内に効率的に侵入することはなかった。そこ

60℃、70℃で２時間に変更）で行い、BNC-LP 複合体が効で、BNC 単 独 で 同 様 な 検 討 を 行 っ た と こ ろ、 粒 子 径率よく形成されるか検討した（Fig. 7）。その結果、塩化セ

100 nm で z 電位は弱アニオン性となり、単純塗布では難し

シウム密度勾配超遠心法により分離した BNC-LP 複合体にかったが、イオントフォレシスでは効率よく皮膚内に浸透含まれる BNC 及び LP の回収率が高音になるに従って一段した。その経路は毛根を介して入っているように見えた。と向上した。また、同複合体のバンドも明確に視認できる

今回は、イオントフォレシスの作用時間は１時間であり、Fig. 6

Cy5 標識 BNC のイオントフォレシス結果１（上、明視野；下、蛍光像）− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig. 7 BNC-LP 作製法の改良

Fig. 8

BNC-LP 複合体形成効率に対する温度の影響

Fig. 9高温で形成された BNC-LP 複合体の性質電流値も大きかった（これ以上長いと、皮膚に炎症が起こ５．総る可能性がある）ので、次回からは作用時間及び電流値も括下げて検討を行う必要がある。また、膜透過活性の高いペ従来血液中投与を目的として開発されたナノキャリアープチドを提示させた改良型 BNC についても同様な実験をである BNC は、今回の検討により、少なくともイオント行い、単純塗布でも皮膚内に侵入できる BNC の開発も行フォレシスにより皮膚内に浸透できることが判明した。今いたい。

後は、BNC 表層の改良、粒子径の改良、表面電荷の改良

その後、BNC-LP 複合体の作製法を改良し、皮膚内投与を行い、単純塗布でも皮膚内に浸透できるナノキャリアーしても崩壊しないような強固かつ粒子性状も好ましい複合化を目指したい。また、能動的標的化機構も搭載して、化体の作製に成功した。現在、本複合体のアッセイをおこな

粧品のみならず医薬品まで展開できるグレードのナノキャっており、皮膚内に安定かつ容易に浸透するか否か検討しリアーを目指したい。ている。

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能動的標的化技術を搭載した新規ドラッグデリバリーシステムキャリア「バイオナノカプセル」の次世代化粧品分野での応用可否の検討（引用文献）

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