神経細胞が分泌する酸化ストレスに対する保護因子の同定

同志社大学生命医科学研究科

野口範 子、斎 藤芳郎

The protection of neurons from cell death is a vulnerable strategy to prevent neurodegenerative diseases such as
Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease, since neuronal cell death is one of the major events in pathology of thesediseases. PC12D cells are subspecies of PC12 cells which have been used for a variety of neuronal studies. We found that
PC12D cells were resistant against 6-hydroxydopamine (6-OHDA) -induced cell death and that PC12D cell-cultured medium
had abilities to decompose hydrogen peroxide (H2O2). The molecular weight of H2O2 decomposing active compounds wasestimated at about 1,000 Da by gel chromatography analysis. The study using ion exchange resin column showed that thecandidate compounds are not charged. The activity was not abolished by a metal ion chelater, EGTA but siginificantly
suppressed by a polphyrin inhibitor, NaCN. These data suggest that PC12D cells secrete polphyrin-like compounds
possessing H2O2 decomposing activities, by which cells are protected from cell death induced by 6-OHDA.

１．緒間や細胞濃度によって、6-OHDA などによる酸化ストレス

言刺激に対する耐性が変化することが明らかにされていた

アルツハイマー病やパーキンソン病は代表的な神経変性（未発表）。つまり、PC12D 細胞は酸化ストレス誘導性細疾患として知られ、その名前が示すように神経細胞が変性胞死に対して抵抗性を示すことがわかっていた。この結果し死滅することが病気の発症に深く関わっている 1, 2）。こから、PC12D 細胞から培養液中に酸化ストレスから神経れらの疾患では、認知機能や運動機能の低下が深刻である細胞を保護する物質が分泌されている可能性が考えられた。

が、加えて患者の表情は硬く乏しくなり、コスメトロジー

本研究は、PC12D 細胞から分泌される神経細胞保護因子の観点からも問題となる。従って、神経細胞死のメカニズの性質を明らかに、その因子を同定することを目的としてムやそれを防止する方法の開発に関する研究は重要である。

おこなった。

我々は、神経細胞が特異的に産生するオキシステロールの２．実１種である 24S-hydroxycholesterol が、高濃度では細胞死を 3, 4）、低濃度では神経細胞に適応反応を誘導して酸化ス

験

2. 1. PC12 細胞 / PC12D 細胞

トレスに対する抵抗性を獲得させること 5）を示した。1976

実験に用いたラットの副腎髄質由来褐色細胞腫の PC12

年に Green らによって樹立された PC12 細胞は、ラット副細 胞、 そ の 亜 種 で あ る PC12D 細 胞 は、37 ℃、5% 二 酸 化

腎髄質クロム親和性細胞腫から樹立された細胞株である。

炭 素 の 環 境 下 で 培 養 し た。Dulbecco’s Modified Essential

神経成長因子（NGF）非存在下の培養では副腎髄質クロムMedium（DMEM）、10 % 非 働 化 Horse Serum（GIBCO）、親和細胞の形質を示すが、NGF を作用させることにより、5% 非 働 化 Fetal Bovine Serum（Hyclone） と 抗 生 物 質

神経突起を伸長して交感神経細胞様に分化する。そのため、Streptomycin 0.05 mg/ml（GIBCO）を添加して、実験に用いた。

PC12 細胞は、神経細胞における分化機構の解明や NGF の作用機構解明の研究などに広く用いられている 6）。本研究2. 2. 培養上清の作成 FM、CM 作成

で注目する PC12D 細胞は PC12 細胞の亜種であり、NGF

DMEM に 5 % N2 サプリメント（GIBCO）と 1 % 抗生物やスタウスポリンなどの刺激に素早く反応し神経突起を伸質 0.05 mg/ml を加えた培養液を Fresh Medium（FM）とし長する。また、RNA 合成阻害剤の存在下でも、神経突起た。PC12D 細胞を 10 cm dish に 70 % コンフレントの状態伸長が誘導されることが知られている細胞である

7, 8）。先から 16 時間 FM で培養後、培養液を回収して 1,000 rpm 5行の研究により、PC12D 細胞は細胞を播種してからの時分 24 ℃で遠心して得た上清を Cultured Medium（CM）とし、使用時まで−80 ℃で保存した。FM とCMは必要に応じて遠心濃縮機を用いて 20 倍まで濃縮し、使用時まで−80℃で保存した。

Identification of neuron-derived protecting
factors against oxidative stress
Noriko Noguchi
Faculty of Life and Medical Sciences,
Doshisha University

2. 3. 細胞死誘導とその評価
細胞死の誘導は 100 〜200 mM の 6 - OHDA あるいは H2O2を用いた。細胞生存率の測定は MTT アッセイ法を用い− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

た。6- OHDA から生成するパラキノン（pQ）の生成は 360

３．結nm の吸光度測定により求めた。培養液中の H2O2 の濃度はスコポレチン蛍光法を用いて測定した。スコポレチン

果

3. 1. PC12D 細胞の培養液の細胞保護作用が H2O2 存在下で西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によPC12D を播種し、6 - OHDA 100 mM で刺激をする２時間り酸化され、蛍光物質が非蛍光物質に変化するため、この前に一旦培養液を FM に交換し、その 10 % 容量の CM を蛍光強度（励起波長 366 nm、発光波長 460 nm）の減少から添加した。24 時間後に MTT アッセイ法により細胞生存率H2O2 を測定した。

を測定したところ、CM を添加した細胞は添加しない細胞と比較して生存率が高かった（図１）。次に、6 - OHDA 誘

2. 4. クロマトグラフィーを用いた分泌因子の特性解析

導細胞死に対する CM の防御作用の容量依存性を調べた。

ゲル濾過カラムクロマトグラフィー：PD-10 カラム（GE

6 - OHDA 100 mM または 200 mM で刺激をする２時間前にHealthcare）を用いて、分子量 5,000 以上の物質と 1,000 以培養液を FM 100 %、FM 50 %/CM 50 %、CM 100 % に下の低分子物質とに分離した。また、分離能が高く高回収交換し、24 時間後に MTT アッセイ法により細胞生存率を率担体である Superdex 30 prep grade（GE Healthcare）測定した。6 -OHDA 誘導細胞死はいずれの濃度の場合も、を用いて分子量 10,000 以下の分画を行った。

CM の量に依存して抑制された（図２）。

イオン交換樹脂：強酸性陽イオン交換樹脂（交換基：−SO3−）Hi Trap SP FF（GE Healthcare）および強塩基性3. 2. 6-OHDA 由来の細胞死誘導物質

陰イオン交換樹脂（交換基：−NR3＋）Hi Trap Q FF（GE6 - OHDAは水溶液中で速やかに分解し、パラキノン（pQ）とスーパーオキサイド（O・2−）を生成し、O・2−は不均化反応

Healthcare）を用いて分泌因子の荷電性質を調べた。の結果 H2O2 が生成する。pQ や H2O2 はいずれも細胞死を2. 5. 阻害剤の添加効果誘導する可能性があるため、6 -OHDA からこれらの生成に対する CM の影響を調べた。pQ は 360 nm に吸収波長をEDTA（2Na, 3Na）（WAKO）を用いた。ポルフィリン阻もつため、この波長の吸光度の経時変化を測定した。pQ害剤として NaCN（WAKO）を用いた。の生成は FM 中と CM 中で差は見られなかった（図 3）。還Cell viability (% control)

鉄をキレートするためにエチレンジアミン四酢酸

9080706050403020100CM0%CM10 %
図２ PC12D 培養液の細胞死抑制効果
FM100%（FM），
FM50%/CM50%（FMCM），CM50%（CM）で培養したときの 6-OHDA による細胞死の抑制効果

図１ PC12D 細胞の生存率に対する CM の添加効果
n=3，**P<0.01, Student t-test

図３ 6-OHDA からの pQ 生成に対する培養液の影響
6-OHDA の分解によって生成する pQ の吸収波長の吸光度をFM，CM，そして GSH を含む FM 中で測定した。

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元型グルタチオン（GSH）は pQ と反応するため吸光度の増考え、ポルフィリンの阻害剤である NaCN を CM に添加し加は著しく抑制された。この結果から CM は 6-OHDA かて H2O2 分解能を調べた。可変量の NaCN を用いて調べたらの pQ の生成には影響を与えないことがわかった。

ところ、5 mM 以上の NaCN によって CM の H2O2 消去活性

次に、FM 中と CM 中で 6 -OHDA から生成する H2O2 濃は抑制されることがわかった（図 5）。

度をスコポレチン法で測定したところ、CM では有意に少４．考なかった。また、既知の濃度の H2O2 を FM および CM に察添加し、37 ℃ 15 分反応後、H2O2 濃度を測定したところ、PC12D 細胞は、6 -OHDA によって誘導される細胞死にCM では FM より有意に減少していた（図 4）。この結果よ抵抗性をもつことが先行の研究により示されていたが、本り、CM 中には H2O2 を分解する物質が含まれていること研究により、PC12D 細胞から培養液（CM）中に細胞保護が示唆された。また、6-OHDA による PC12D 細胞の細胞因子が分泌されていることがわかった。培養液中では、死は、カタラーゼの添加によって抑制される結果も（data6-OHDA から pQ と H2O2 が活性種として生成することがnot shown）、CM 中の保護因子は H2O2 消去によって細胞知られていたが、PC12D 細胞の培養液（CM）は pQ 生成に死を抑制することを示唆している。

影響を与えないことから、細胞死の抑制は H2O2 の分解によるものと考えられた。実際に CM に添加した H2O2 は速3. 3. 神経細胞保護因子の分子量と荷電状態

やかに分解された。また、6-OHDA による PC12D 細胞のPD10 と Sephadex 30 prep grade の 2 種類のゲルクロマ

細胞死は、カタラーゼの添加によって抑制されることから、トグラフィーを用いて CM の分画をおこない、H2O2 消去

CM 中の保護因子は H2O2 消去によって細胞死を抑制する能を指標に保護因子の分子量は約 1,000 Da であることを明ことが示唆された。クロマトグラフィーの結果から、CMらかにした（data not shown）。次に、陽イオン交換樹脂お中の保護因子の分子量は約 1,000 Da であることが突き止め

よび陰イオン交換樹脂を用いてクロマトグラフィーを行い、られた。H2O2 の分解には Fe や Cu などの遷移金属の関与保護因子の荷電状況に依存して吸着することにより H2O2が推測されたが、キレート剤が抑制効果を示さないことや、消去能が失われるか検討したところ、いずれのイオン樹

クロマトグラフィーの結果からもとめられた分子量などか脂を通しても H2O2 消去能には変化がなかった（data notら、ポルフィリンが候補物質として考えられた。ポルフィshown）。この結果から、保護因子はプラスにもマイナスリンの活性阻害剤である NaCN を添加すると、CM の H2O2にも帯電していないことが示された。

分解能が抑制されることから、CM 中の活性物質はポルフィリンもしくはポルフィリン様の化合物である可能性が高

3. 4. H2O2 消去能に対する阻害剤の効果い。ポルフィリン錯体の分子量は約 500 Da であるが、配H2O2 の分解には Fe イオンが関与している可能性が考位している金属イオンを介して、ポルフィリン錯体ダイマえられたため、Fe イオンをキレートする EGTA 2Na とーを形成する。また、ポルフィリン錯体ダイマーは水溶性

EGTA 3Na を CM に 添 加 し て、H2O2 分 解 能 へ の 影 響 をでカタラーゼ活性をもち、H2O2 と反応することが報告さ調べたが、いずれも分解能を抑制しなかった（data notれている 10, 11）。以上より、PC12D 細胞の分泌する細胞保shown）。次に、保護因子がポルフィリンである可能性を護因子は、ポルフィリン様物質であることが示唆された。

図 4 FM と CM の H2O2 消去能の比較
H2O2 もしくは 6-OHDA を FM，CM に添加し，37℃ 15 分後の H2O2 濃度を測定した。 n=5, **P < 0.01, Student t-test

図５ ポルフィリン阻害剤による CM の H2O2 消去活性抑制
n=10, **P<0.01, Dunnett, compared with 0 mM

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謝辞

noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma
cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl.

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりAcad. Sci. U.S.A., 73, 2424-2428, 1976.

ご援助いただきましたことに深謝いたします。

７）Katoh-Semba R, Kitajima S, Yamazaki Y, Sano
（引用文献）

M, : Neuritic growth from a new subline of PC1 2１）Gomez-Isla T, Hollister R, West H, Mui S, Growdon

pheochromocytoma cells: cyclic AMP mimics theJH, Petersen RC, Parisi JE, Hyman BT, : Neuronal loss

action of nerve growth factor. J. Neurosci. Res., 17, 36-

correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in44, 1987.
８）Sano M, Kitajima S, : Activation of mitogen-activatedAlzheimer’s disease. Ann. Neurol., 41, 17-24, 1997.

protein kinases is not required for the extension of２）Forno LS, : Neuropathology of Parkinson’s disease. J.

neurites from PC12D cells triggered by nerve growth

Neuropathol. Exp. Neurol., 55, 256-272, 1996.

factor. Brain Res., 785, 299-308, 1998.

３）Yamanaka K, Saito Y, Yamamori T, Urano Y,Noguchi N, : 24S-Hydroxycholesterol induces neuronal９）Miyama A, Saito Y, Yamanaka K, Hayashi K,

cell death through necroptosis, a form of programmed

Hamakubo T, Noguchi N, : Oxidation of DJ-1 induced

necrosis. J. Biol. Chem., 286, 24666-24673, 2011.

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４）Yamanaka K, Urano Y, Takabe W, Saito Y, Noguchi
N, : Induction of apoptosis and necroptosis by 2 4(S)-1 0）Asayama S, Nakajima T, Kawakami H, : New water-hydroxycholesterol is dependent on activity of acyl-soluble Mn-porphyrin with catalytic activity for

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５）Okabe A, Urano Y, Itoh S, Suda N, Kotani R,11）Ohse T, Nagaoka S, Arakawa Y, Kawakami H,Nishimura Y, Saito Y, Noguchi N, : Adaptive responses

Nakamura K, : Cell death by reactive oxygen species

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neuronal cell death, Redox Biol., 2, 28-35, 2013.

85, 201-208, 2001.

６）Greene LA, Tischler AS, :Establishment of a− 64 −