網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞
ⅩVII 型コラーゲン発現制御機構の解析
北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室

西江渉

Collagen XVII (COL17) is one of the major components forming hemidesmosomes in basal keratinocytes, whichfunctions adhesion between the epidermis and the dermis. Loss of function of COL17 due to gene mutations coding
COL17A1 or autoimmunity to COL17 both read to blistering diseases including epidermolysis bullosa and bullous
pemphigoid. In addition, COL17 is known to play important roles for keeping stemness in keratinocytes. Therefore,
identification of genes regulating COL17 expression must be helpful for developing new therapies for blistering diseases
and elucidating regulation mechanisms of keratinocyte stemness. In this study, we tried to identify key genes upregulating
COL17 expression by CRISPR/Cas9-mediated genome-wide screening. First, as a positive control study, collagen VII(COL7) promoter was introduced upstream of the destabilized GFP (dscGFP) gene in HaCaT immortalized keratinocytes.
This method was able to visualize COL7-related GFP expression in HaCaT keratinocytes. However, COL17 gene expression
was not high enough for performing FACS-sorting when COL17 promoter was introduced upstream of the dscGFP gene in
HaCaT keratinocytes. Therefore, we are analyzing HaCaT keratinocytes in which COL17 promoter was introduced upstreamof the hygromycin resistant gene.

１．緒胞集団を作製し、COL 17 プロモーター活性が増加した細言胞集団を解析しノックアウトされた遺伝子を同定する手法

皮膚の表皮基底細胞ヘミデスモゾーム構成分子のひとつを計画した。最初に、lentiCas 9-Blast ベクター（Addgene、である XVII 型コラーゲン（COL 17）は、表皮真皮間接合にBlasticidin 耐性）を 293 TN 細胞へ遺伝子導入し作成したレ重要な生理機能を担っている。先天的な遺伝子変異に伴うンチウイルス粒子を不死化表皮角化細胞である HaCaT 細COL 17 の機能障害によって容易に水疱を生じる接合部型胞へ感染させ、Cas 9 タンパク安定発現 HaCaT 細胞株を作表皮水疱症を発症し、COL 17 に対する後天的な自己免疫成する。次に、COL17 プロモーター領域（− 1251 to +379）反応が生じると水疱性類天疱瘡を発症する。また COL 17をクローニング後 pGreenFire lenti-reporter ベクター（SBI、は、色素幹細胞の維持や皮膚の老化にも関与する分子であpuromycin 耐性）へ導入し、COL17 遺伝子プロモーター下り、皮膚における COL 17 発現量を制御し増加できると水で destabilized GFP（dscGFP）と Luciferase を 発 現 す る ベ疱性皮膚疾患だけでなく皮膚の抗老化など様々な応用がクターを作成する。その際、VII 型コラーゲン（COL7）遺期待できる。さらに COL 17 は皮膚表皮細胞の幹細胞マー伝子プロモーター領域（− 1351 to + 145）も同様にクローニカーのひとつであるため、COL 17 発現量の増加は表皮幹ングし、陽性コントロールとして作成した（図 1、A）
。さ細胞の効率的な培養法確立へ発展する可能性も予想されらに中間報告の結果を踏まえ、ヒグロマイシン耐性遺伝る。遺伝子の発現量はプロモーター活性に依存するため、子（HygR）を同様に COL 17 プロモーター下に導入したコ

COL 17 プロモーター活性の制御分子の同定は様々な応用ンストラクトも作成した。網羅的ゲノム編集で用いる約性と発展性が期待できる。そこで、COL 17 発現を亢進す

20 ,000 種の遺伝子を標的とする gRNA 発現コンストラクる分子を、ゲノム編集を応用した網羅的スクリーニング法 1）

トは、レンチウイルスで導入後 puromycin によるセレクで同定する研究を計画した。

ションが必要なため 1）、作成した COL 17 あるいは COL7

２．実

発現レポーターコンストラクトと Cas9 タンパクを同時験発現する HaCaT 細胞へ、puromycin を標的とする gRNA

網羅的ゲノム編集によって 1 細胞あたり 1 遺伝子（合計（5’-ATCCGGACCGCCACATCGAG- 3’）を 遺 伝 子 導 入 し

約 20 ,000 遺伝子）を網羅的にノックアウトした表皮角化細puromycin 感受性株を得る。最後に、ノックアウト gRNAライブラリー（GeCKO v2 , Addgene）を低濃度（MOI= 0.2〜 0 .4）のレンチウイルスで感染させ、puromycin でセレク

Reg ulation mecha nism of collagen
XVII: elucidation by CRISPR/Cas 9 mediated genome-wide screening
Wataru Nishie
Department of Dermatology, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

ション後 GFP 蛍光が増強した細胞群を FACS ソーティング
する。HygR を COL 17 プロモーター下に導入したコンストラクト導入細胞では、FACS ソーティングではなくヒグロマイシンを培地へ添加し耐性株をセレクション可能である。COL 17 プロモーター活性が上がった細胞群から抽出し− 136 −網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞 XVII 型コラーゲン発現制御機構の解析

3．結果

コントロールとして COL 7 レポーターコンストラクトをレンチウイルスで導入した Cas 9 発現 HaCaT 細胞では、コロニーの辺縁に dscGFP 発現が増強した細胞群が確認された（図 1、B）。一方、COL 17 レポーターコンストラクトを導入した Cas 9 発現 HaCaT 細胞では、予想に反し明瞭なGFP 蛍光を発する細胞は認めなかった。作成した COL 17
レポーターコンストラクトを 293 細胞へ一過性にトランスフェクションしたところ GFP 蛍光を確認したため、可視下で確認可能な発現量ではない可能性を考えた。FACS ソー
ティングでの細胞分離が困難と判断し、抗生剤でのセレクションを考えた。そこで COL 17 プロモーター下に HygRを発現する系を新たに作成し（図 2、A）lentiCas 9 -Blast 発
現 HaCaT 細胞へレンチウイルスで導入したところ、比較的高濃度のヒグロマイシン下でも耐性となるクローンを複Fig. 1 GFP 蛍光下で COL17 および COL7 プロモーター活性を可視化するコンストラクト（A）。COL7 プロモーター活性を可視化した HaCaT 細胞。細胞辺縁で発現量が増加している（B）。

数認め薬剤でのセレクションが可能と判断した（図 2、B）。

4．考察

今回クローニングした COL 17 プロモーター領域は、HaCaT 細胞では GFP 蛍光を目視できない程度の低レベルた DNA をテンプレートに用い、導入された GeCKO v 2 のであると予想された。そこで薬剤耐性遺伝子（ヒグロマイgRNA 配列領域を PCR 法で増幅後、次世代シークエンサーシン耐性遺伝子）を用い、COL 17 プロモーター活性が増強（Miseq）でアンプリコンシーケンスを行う。シーケンスデーした細胞を採取する新たな手法を検討したところ、複数の2）

タ（FASTQファイル）をMAGeCKFlute で解析し、COL17薬剤耐性クローンの樹立に成功した。薬剤耐性遺伝子を用あるいは COL7 発現増強に関与する遺伝子を同定する。

いるとセレクション濃度を最適化が容易なため、COL 17

Fig. 2 COL17 プロモーター下でヒグロマイシン耐性遺伝子（HygR）を発現するコンストラクト（A）。ヒグロマイシン耐性クローンを複数確認した（No.6, 10, 12、B）。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

プロモーター活性が上がった細胞群を FACS ソーティング

量を蛍光で確認できるため非常に有用と思われる。既により簡便に分離できることが期待できる。本研究期間内でCas 9 タンパクを発現しているため、標的となる遺伝子のは細胞群の採取まで至らなかったが、今後機会があれば実gRNA を導入するだけで網羅的ゲノム編集が可能である。

験を継続したいと考えている。一方、COL 7 レポーターコ

予想に反して COL 17 プロモーター活性は GFP 蛍光を可視ンストラクトを導入した HaCaT 細胞ではコロニー辺縁の化可能なほど十分ではなかったが、抗生物質耐性遺伝子を細胞群で発現が増強していた（図１、B）。本所見は COL 7発現することは可能であった。今後、ヒグロマイシン濃度遺伝子発現が TGF-β で制御されるという過去の報告に矛を最適化した後に COL 17 発現を制御する新規遺伝子が同3）

盾せず 、培養下で COL 7 の発現量を間接的に可視化可能定されることを期待している。

な画期的な実験系である。今後、細胞の遊走や創傷治癒における COL 7 の機能解析など、様々な研究に応用されることが期待される。

（引用文献）
1） Joung J, et al. Nat Protoc 12: 828-863, 2017.
2） Wang B, et al. Nat Protoc 14: 756-780, 2019.

５．まとめ

3） Akasaka E, et al. J Invest Dermatol 141: 1450-1460,

今回作成した遺伝子改変 HaCaT 細胞は、遺伝子の発現2021.

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