皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発
順天堂大学大学院医学研究科アトピー疾患研究センター

北浦次郎

Recently, it was reported that many cationic drugs (e.g., antibiotics) directly activate connective tissue mast cells, whichleads to drug-induced pseudo-allergy via Mas-related G-protein coupled receptor X2 (MRGPRX2) in humans and Mrgprb2
in mice. On the other hand, a variety of cationic peptides/proteins (e.g., host defense peptides and neuropeptides) havebeen identified as endogenous ligands of MRGPRX2/Mrgprb2. Of these, many show a significantly lower EC50 againstMRGPRX2 than against Mrgprb2. Accordingly, we hypothesize that unknown cationic molecules contained in cosmetics
or foreign matters which can come into contact with skin could activate connective tissue mast cells via MRGPRX2,
resulting in skin pseudo-allergy. The objective of the current study is to develop a screening method for the identification ofmolecules that can induce pseudo-allergy in skin. For this end, we used newly-bred MRGPRX2 knock-in (MRGPRX2-KI)
and Mrgprb2 knock-out (Mrgprb2-KO) mice as well as wild-type (WT) mice. We found that peritoneal mast cells from WTand MRGPEX2-KI mice, but not from Mrgprb2-KO mice, degranulated in response to stimulation with compound 48/80,a known MRGPRX2/Mrgprb2 ligand, although MRGPEX2-KI mast cells more strongly activated than WT mast cells. Inaddition, WT and MRGPEX2-KI mice, but not Mrgprb2-KO mice, exhibited skin pseudo-allergic reactions in response tointradermal injection of compound 48/80. Moreover, skin pseudo-allergic reactions were stronger in MRGPRX2-KI micethan in WT mice. Thus, we were able to develop both in vitro and in vivo methods to identify MRGPRX2 ligands, which
will help uncover the molecular mechanisms underlying skin pseudo-allergy and test the safety of cosmetics and therapeutic
drugs.

１．緒性を向上させることである。

言Mrgprb2 ノックア ウト（Mrgprb2-KO）マ ウスの 解 析 は非常に多くのカチオン性薬剤（抗菌薬など）が皮膚の結MRGPRX 2 の 機 能 を 想 定 す る の に 役 立 つ が、 ヒ ト合組織型マスト細胞を直接活性化（脱顆粒）させて皮膚のMRGPRX 2 の生体内機能を解明するには不十分である。

炎症やかゆみを誘導することが知られている。これが偽ま た、MRGPRX 2 と Mrgprb 2 に 共 通 す る 既 知 リ ガ ン ドアレルギーと呼ばれるのは、その症状が IgE と抗原によるに対する MRGPRX 2 の EC 50 は Mrgprb 2 と比較して低いマスト細胞の活性化（脱顆粒）に依存する即時型アレルギことから、MRGPRX 2 はヒトの皮膚で多くのリガンドをーの症状と類似するためである。最近、マウスの結合組鋭敏に認識してより重要な役割を担うと考えられた。そ織型マスト細胞に発現する G タンパク共役型受容体 Mas-こで、申請者は、世界に先駆けて MRGPRX 2 ノックイン

related G protein-coupled receptor b 2（Mrgprb 2）（ヒト（MRGPRX 2 -KI）マウス（Mrgprb 2 の代わりに MRGPRX 2

では MRGPRX 2）がカチオン性薬剤により活性化して偽を発現するマウス）を作製した。本研究では、野生型（WT）、1）アレルギーを引き起こすことが判明した 。また、ヒト

Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスから結合組織型マMRGPRX 2（マウス Mrgprb 2）は多くの内因性リガンド（カスト細胞を分離・誘導して、マスト細胞の脱顆粒を指標チオン性の抗菌ペプチドや神経ペプチドなど）を有することして MRGPRX 2 リガンドを in vitro でスクリーニングとも明らかになった 2 - 7）。これらの結果は、皮膚に塗布さする系の確立を目指した。さらに、WT、Mrgprb 2 -KO、れる化粧品や皮膚に付着する動植物成分の中にも偽アレルMRGPRX 2 -KI マウスの耳介における偽アレルギー反応をギーを誘導する分子が存在する可能性を示唆した。

指標として MRGPRX 2 リガンドを in vivo でスクリーニン

研究の目的は、ヒト MRGPRX 2 に着目して偽アレルギグする系の確立を目指した。多くの医薬品・化粧品の成分ーを誘導する分子を in vitro 及び in vivo でスクリーニングや皮膚に付着する動植物成分をスクリーニングすることする系を確立して、皮膚に塗布する医薬品・化粧品の安全により、偽アレルギーを誘導する分子の同定が可能になる。
また、動植物成分の中から MRGPRX 2 リガンドが同定さDevelopment of a screening method forthe identification of molecules that caninduce pseudo-allergy in skin
Jiro Kitaura
Atopy (A l lerg y) Resea rch C enter,
Juntendo University Graduate School ofMedicine

れれば、皮膚における炎症やかゆみの新規病態機序の解明につながる。最終的な目標は、in vitro 及び in vivo のスクリーニング系を利用して MRGPRX 2 リガンドを同定して、皮膚における偽アレルギーの予防法を開発することである。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

２．方漏出量を定量化した（通常の受動的皮膚アナフィラキシー法

反応の評価法と同様）8）。色素漏出量は、マスト細胞の脱2 . 1. マウスから腹腔マスト細胞や骨髄由来マスト細胞の誘導顆粒により上昇する血管透過性と比例するので、偽アレルギーの程度を評価できる。

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウス の 腹 腔 を

3．結PBS で 洗 浄 し て 採 取 し た 腹 腔 細 胞 を IL- 3（10 ng/mL）と SCF（100 ng/mL）の 存 在 下 で 10 日 間 培 養 し た。flow
cytometry に よ り、 細 胞 の 90 ％ 以 上 が FcεRIα 陽 性・果3 . 1. MRGPRX 2 リガンドをin vitroでスクリーニングする系の確立

c-Kit 陽性の腹腔マスト細胞であることを確認した。WT、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスから誘導しMrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスの脛骨から採取した腹腔マスト細胞表面における FcεRIα や c-Kit の発現レベた骨髄細胞を IL- 3（10 ng/mL）の存在下で 5 週間培養した。

ルに有意な差はなかった（図 1）。抗 MRGPRX 2 抗体によflow cytometry により、細胞の 95 % 以上が FcεRIα 陽性・る細胞表面染色により、MRGPRX 2 -KI マウス由来腹腔マc-Kit 陽性の骨髄由来マスト細胞（bone marrow-derived

スト細胞表面に MRGPRX 2 の発現が確認された。IgE と8）mast cell: BMMC）であることを確認した 。

抗原で刺激したときの腹腔マスト細胞の脱顆粒率に有意な差は認められなかった。他方、compound 48 / 80（既知の2 . 2 . マスト細胞の脱顆粒率のin vitro測定法

MRGPRX 2 /Mrgprb 2 リガンド）で腹腔マスト細胞を刺激

既知の Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リガンドを含む種々の分すると、WT 及び MRGPRX 2 -KI 腹腔マスト細胞は濃度依子（ 薬 剤 な ど ）で、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI存的に脱顆粒した。しかし、Mrgprb 2 -KO 腹腔マスト細マウス由来の腹腔マスト細胞あるいは BMMC を刺激した。

胞の脱顆粒は認められなかった。また、WT 腹腔マスト細また、上記のマスト細胞を anti-TNP IgE（0 . 5 µg/mL）で胞と比較して、MRGPRX 2 -KI 腹腔マスト細胞は同じ濃度感作（24 h）した後、TNP-HSA（10 ng/mL）で刺激した。刺の compound 48 / 80 に対してより強く脱顆粒した（図 2）。

激 1 時間後のマスト細胞の脱顆粒率を β-hexosaminidase

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス か ら 誘assay（細胞内から細胞外に放出された β-hexosaminidase

導 し た BMMC 表 面 に お け る FcεRIα や c-Kit の 発 現 レ ベの割合を解析する）や flow cytometry（マスト細胞表面にルに有意な差はなかった。抗 MRGPRX 2 抗体による細CD63 を発現する細胞の割合を解析する）により測定した 8）。

胞 表 面 染 色 に よ り、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス 由 来 BMMCに MRGPRX 2 の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た。 つ ま り、

2 . 3 . 皮膚における偽アレルギーのin vivo評価法

MRGPRX 2 は結合組織型マスト細胞表面に発現するが、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスの耳介に既未熟な粘膜型マスト細胞（BMMC）表面に発現しないこと

知の Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リガンドを含む種々の分子（薬が確認された。IgE と抗原で刺激したときの BMMC の脱剤など）を皮下注射し、その直後に、色素（エバンスブルー）顆粒率に有意な差は認められなかった。また、compoundを静脈注射した。1 時間後に採取した耳介に含まれる色素48 / 80 でこれらの BMMC を刺激しても脱顆粒しないこと

図１ WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウス由来腹腔マスト細胞における FcεRIα と c-Kit の（細胞表面）発現レベル− 118 −

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図 2 WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウス由来腹腔
マスト 細 胞 の compound 48/80 に 対 する 脱 顆 粒 率（β-hexosaminidase assay）が確認された。
こ の よ う に、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI
マウスから誘導した腹腔マスト細胞の脱顆粒を指標に、

図 3 WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウスの耳介にcompound 48/80 を皮下投与したときの偽アレルギー反応

MRGPRX 2 リガンドを同定するための in vitro スクリーニング法が確立された。Mrgprb 2 リガンドとして作用しな
いが MRGPRX 2 リガンドとして作用する分子、Mrgprb 2

4．考リガンドとしての作用は弱いが MRGPRX 2 リガンドとしての作用が強い分子を in vitro で同定することが可能になった。

察

マウスやヒトのマスト細胞（株）の解析、Mrgprb 2 やMRGPRX 2 を一過性に過剰発現させた細胞の解析などか
ら、（compound 48 / 80 を含む）多くの共通リガンドに対す

3 . 2 . MRGPRX 2 リガンドをin vivoでスクリーニ

る MRGPRX 2 の EC 50 は Mrgprb 2 より低いことが報告さ

ングする系の確立れた。今回、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウス

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス の 成 長・由来の腹腔マスト細胞を利用する in vitro スクリーニング発達に差は認められなかった。また、定常状態におけ法により、同じ条件下で容易に Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リる（マスト細胞を含む）血球系細胞の組織分布や数に有意ガンドの同定及びリガンドとしての強さの評価が可能になな差は認められなかった。次に、WT、Mrgprb 2 -KO、った。腹腔マスト細胞における脱顆粒の強さが、MRGPRX 2 -KI マウスの耳介に compound 48 / 80 を皮下① MRGPRX 2 -KI ≒ WT＞Mrgprb 2 -KO

注射した直後に色素を静脈注射し、1 時間後の耳介にお② MRGPRX 2 -KI ＞WT＞Mrgprb 2 -KO

ける色素漏出量を定量化した。その結果、WT マウスの③ MRGPRX 2 -KI＞ WT≒Mrgprb 2 -KO

耳介で認められた色素漏出は Mrgprb 2 -KO マウスでほの場合などが想定される。いずれも MRGPRX 2 リガンド

とんど認められなかった。また、WT マウスと比較してであるが、③の場合はヒトでのみ重要な作用を有すると考MRGPRX 2 -KI マウスの耳介における色素漏出量は多かえられる。また、腹腔マスト細胞の脱顆粒を誘導しないが、った（図３）。これらの結果は、compound 48 / 80 による

BMMC の脱顆粒を誘導する場合、その分子は Mrgprb 2 /（耳介の）組織型マスト細胞の脱顆粒による偽アレルギー反MRGPRX 2 とは異なる受容体（粘膜型マスト細胞に発現す応が Mrgprb 2 /MRGPRX 2 依存的であること、生体内でる）のリガンドとしてマスト細胞を脱顆粒させると想定さ

MRGPRX 2 は Mrgprb 2 より鋭敏に compound 48 / 80 を認れる。Mrgprb 2 や MRGPRX 2 の発現とは無関係に腹腔マ識して偽アレルギーを誘導することが示された。このようスト細胞が脱顆粒する場合、その分子は（結合組織型マスに、MRGPRX 2 リガンドとして作用する分子を in vivo でト細胞に発現する）Mrgprb 2 /MRGPRX 2 とは異なる受容同定することが可能になった。

体のリガンドとして作用すると想定される。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

さらに、MRGPRX 2 リガンドの in vivo スクリーニング法の確立により、上記の in vitro スクリーニング法で同定されたリガンド分子が生体内で MRGPRX 2 依存的な偽アレルギーを誘導するか否かを評価することが可能になった。
偽アレルギーの強さが MRGPRX 2 -KI ＞ WT≒Mrgprb 2 KO の場合、その分子はヒトでのみ MRGPRX 2 依存的な偽アレルギーを誘導する可能性が高い。他方、MRGPRX 2 KI 腹 腔 マ ス ト 細 胞 を 脱 顆 粒 さ せ な い 分 子 が in vivo でMRGPRX 2 依存的に偽アレルギーを誘導する場合、この

図 4 MRGPRX2 リガンドの in vitro スクリーニング法

分子は皮膚でマスト細胞以外の細胞に作用して、そこで放出される内因性 MRGPRX 2 リガンドが組織型マスト細胞に作用して脱顆粒を引き起こすと考えられる。実際、ダニに含まれるプロテアーゼが神経細胞に作用し、活性化した神経細胞の放出するサブスタンス P が組織型マスト細胞を脱顆粒させて、皮膚炎症を増悪させることが報告されている 9）。また、MRGPRX 2 リガンドの in vitro 及び in vivo
スクリーニング系において、サブスタンス P は compound48 / 80 と ほ ぼ 同 じ よ う な 傾 向（MRGPRX 2 -KI ＞ WT ＞
Mrgprb 2 -KO）を示すことが確認されている。いずれにせよ、本研究で確立した、MRGPRX 2 リガンドの in vitro 及び in vivo スクリーニング法を活用して、偽アレルギーを誘導する分子の同定及び偽アレルギーの分子機序の解明が期待される（図４、５）。

５．総

図 5 MRGPRX2 リガンドの in vivo スクリーニング法

括WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス 由 来 のAli H. Small-Molecule Host-Defense Peptide Mimetic

腹 腔 マスト細 胞の脱 顆 粒を指 標とする MRGPRX 2 リガ

Antibacterial and Antifungal Agents Activate Human

ンドの in vitro スクリーニング法とWT、Mrgprb 2 -KO、and Mouse Mast Cells via Mas-Related GPCRs. Cells. 8,

MRGPRX 2 -KI マウスの 偽アレルギー反 応を指 標とする311（2019）．

MRGPRX 2 リガンドの in vivoスクリーニング法が開発され

4） Roy S, Chompunud Na Ayudhya C, Thapaliya M,

た。現在、様々な生体内外分子をスクリーニングしており、Deepak V, Ali H. Multifaceted MRGPRX2: New insight

今後、皮膚の偽アレルギーの全貌を明らかにする予定である。

into the role of mast cells in health and disease. J

主に皮膚に塗布される化粧品は美容に貢献し健康的な生

Allergy Clin Immunol. 148, 293-308（2021）．

活に不可欠な存在であるがゆえに、偽アレルギーを誘導す

5） Kühn H, Kolkhir P, Babina M, Düll M, Frischbutter

る成分の混入を避けることは不可欠である。従って、本研

S, Fok JS, Jiao Q, Metz M, Scheffel J, Wolf K, Kremer

究の成果がコスメトロジーの進歩・発展に貢献することがAE, Maurer M. Mas-related G protein-coupled receptor

期待される。

X2 and its activators in dermatologic allergies. JAllergy Clin Immunol. 147, 456-469（2021）．

（引用文献）

6） McNeil BD. MRGPRX2 and Adverse Drug Reactions.

1） McNeil BD, Pundir P, Meeker S, Han L, Undem BJ,

Front Immunol. 12, 676354（2021）．

Kulka M, Dong X. Identification of a mast-cell-specific7） Subramanian H, Gupta K, Ali H. Roles of Mas-related

receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.

G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediatedNature. 2015 519, 237-241（2015）．

host defense, pseudoallergic drug reactions, and2） Bader M, Alenina N, Andrade-Navarro MA, SantosRA. Pharmacol Rev. MAS and its related G protein-chronic inflammatory diseases. J Allergy Clin Immunol.
138, 700-710（2016）．
8） Takamori A, Izawa K, Kaitani A, Ando T, Okamoto

coupled receptors, Mrgprs. 66, 1080-105（2014）．
3） Alkanfari I, Freeman KB, Roy S, Jahan T, Scott RW,Y, Maehara A, Tanabe A, Nagamine M, Yamada H,− 120 −皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発

Uchida S, Uchida K, Isobe M, Hatayama T, Watanabe9） Serhan N, Basso L, Sibilano R, Petitfils C, Meixiong

D, Ando T, Ide T, Matsuzawa M, Maeda K, Nakano

J, Bonnart C, Reber LL, Marichal T, Starkl P, Cenac N,N, Tamura N, Ikeda K, Ebihara N, Shimizu T, Ogawa

Dong X, Tsai M, Galli SJ, Gaudenzio N.

H, Okumura K, Kitaura J. Identification of inhibitory

mites activate nociceptor-mast cell clusters to drive

House dust

mechanisms in pseudo-allergy involving Mrgprb2/

type 2 skin inflammation. Nat Immunol. 20, 1435-1443

MRGPRX2-mediated mast cell activation. J Allergy（2019）．

Clin Immunol. 143, 1231-1235（2019）．

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