生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究東京医科歯科大学 医ff! 附材研究所

石

原

一

彦

The amount of plasma proteins adsorbed on a phospholipid polymer having a 2-methacryloyloxyethyl
phosphorylcholine (MPC) moiety was reduced compared to poly (2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)],
poly [n-butyl methacrylate (BMA)J, and BMA copolymers with acrylamide (AA.in) or N-vinyl pyrrolidone
0/Py) moieties having a hydrophilic fraction. To clarify the reason for the reduced protein adsorption on the
MPC polymer, the water structure in the hydrated polymer was examined with attention to the free water
fraction. Hydration of the polymers occurred when they were immersed in water. The differential scanningcalorimetric analysis of these hydrated polymers revealed that the free water fractions in the poly (MPC-co­
BMA) and poly (MPC-co-n-dodecyl methacrylate (DMA)) with a 0.30 MPC mole fraction were above 0.70. On
the other hand, the free water fractions in the poly (HEMA), poly (Ai油1-co-BMA) and poly 0/Py-co-BMA)
were below 0.42. The conformational change in proteins adsorbed on the MPC polymers and poly (HEMA)
was determined using ultraviolet and circular dichroism spectroscopic measurements. Proteins adsorbed onpoly (HEMA) changed considerably but those on poly (MPC-co-BMA) with a 0.30 MPC mole fraction were
almost the same as in the native state. We concluded from these results that little proteins are adsorbed anddo not change their original conformation on the polymer surfaces which possess a high free water fraction.

緒

水の動態や構造を解析することは、 生体反応さら言には生体そのものを理解する上で有効な手段であー

本研究では生体膜類似表面を持つポリマ 材料

る。 一方、 生体を対象とした場合における系の複を用いて、 その周囲に存在する水の構造を解析す雑さがこれらの研究の大きな障害となっているこるとともに 、 タンパク質の吸着、 活性化あるいはとも事実である。 ここでは単純な生体膜のモデル

構造変化の過程を詳細に追跡することにより、 生として、 細胞表面に多いホスファチジルコリンを体分子と材料との反応を理解することを目的とし

極性碁として有する両親媒性の合成高分子を用ている。

い、 その膜内及び近傍の水の状態とタンパク質の生体膜はリン脂質 、 糖質及び細胞に情報を与え機能、 構造変化との相関を見いだす。

ているタンパク質で構成されている非共有結合性

医用デバイスを生体内あるいは生体と接触させの分子集合体であり、 この構造維持には周囲に存て使用する場合 、 血栓形成や炎症反応などデバイ

在する水の状態が極めて重要な役割を果たしていスが生体に与える影響はもとより、 生体がデバイる。 生体膜の表面は細胞の機能発現 、 制御を中心スに与える影響についても充分に考慮しなければとした反応場となっており、 この特異的な生体反ならない。 タンパク質は生体内においで情報伝達

応も水を媒体として進行していることは言うまで及び生理活性物質の産生や運搬など生命の維持にもない。 すなわち、 生体を取り巻く環境において欠かせない重要な役割を担っているが、 一方、 医用デバイスを使用する際には、 タンパク質の吸着

Studies on water sはte in polymer withbiomembrane-like structure andbioreactions on the polymer

ば、 タンパク質の不可逆的な吸着はクロマトグラ

Kazuhiko Ishihara

フィ ー カラムやコンタクトレンズにおける汚れのInstitute for Medical and Dental
Enginnering
Tokyo Medical and Dental University

原因となり、 また血液透析膜や血液ろ過膜などでにより大きな問題が発生することが多い。 たとえは本来の膜透過性が著しく低減し、 物質交換など- 15 -

の機能が充分に発揮されなくなる。 さらに 、 細胞

ニトリルより再結晶して用いた I )o n-プチルメの活性化や好ましくない免疫反応を誘起し、 たち

タクリレ ー ト(BMA)、 n— ドデシルメタクリレ ー

まちデバイスが異物認識を受けることになる。

ト(DMA)、 N ー ビニルピロリドン ( VPy)及び2

従来の医用デバイス材料が血液や血漿と接触すーヒドロキシエチルメタクリレ ー ト (HEMA)は

ると必ずタンパク質の吸着が生じる。 タンパク質

市販試薬を減圧蒸留により精製して用いた。 アク

分子はアミノ酸の重合物であり、 分子内で のアミリルアミド(Mm)は市販品をベンゼンより再結

ノ酸残基の相互作用により血液や緩衝溶液など水晶して用しヽた。 2,2' ー アゾピスイソブチロニト

一定のコンホメ ー ションを維リル(AIBN)はメタノ ー ルより再結晶して用い持しているが 、 界面活性剤や 変性剤の添加によりた。 タンパク質類は市販品をそのまま用いた。 そを溶媒とした系ではの他の溶媒は常法により生成し用いた。

ー

そのコンホメ ションが変化することが知られている。 また、 油ー

水界面に吸着（接触）した場合においても、 著しいコンホメ ー ション変化を起こ2 . 2

ポリマ ー の合成

す。 前者はタンパク質分子内の水素結合の破壊 、MPC とBMA との共重合体(PMB)は対応す

後者はタンパク質分子内の疎水性アミノ酸残基にるモノマ ー をエタノ ー ル中 AIBN を開始剤とし起因する疎水性相互作用のパランスの変化に対応

60℃で反応することにより得た。 反応液を大凪のする。 すなわち、 タンパク質分子を取り巻く環境

ジエチルエ ー テル中に滴下してポリマ ー を再沈殴

が僅かに変化するだけで 、 微妙な分子間力のバラ精製した。 MPCとOMAの共重合体(PMD)、 AAm

ンスで規定されているコンホメ ションの変化が(PAB)あるいは VPy (PVB) とBMA の共重合体生じるのである。 このコンホメ ー ション変化が不も同様な方法で 合成した。 またHEMAを2 ー プロ

可逆的な材料表面へのタンパク質吸着という現象

パノ ー ル中で単独重合した (Poly (HEMA))。 共につながる。 したがって、 本質的にタンパク質と重合体中のモノマ ー ユニット組成は元素分析によの相互作用の弱く、 吸着させない材料により医用り求めた。 ポリマ ー の構造を図lに 、 合成結果をデパイスを作成するか、 表面をこのような材料で表lに示す。

ー

修飾したデパイスを用いなければならない。
研究代表者 らは、 新しい血液適合性高分 子 と し て生 体
膜表面に着目し、 リン脂質構造を有するポリマ

ーを合成した I) 。 このポリマ ー の血液適
合性 を細胞及びタンパク質、脂質などの生体分子レベルで解析していくと 、 優れたタンパク質吸着抑制効果を見いだ
した Z)oTHJ一(CH2-C)3I
9=0

Homopolymer system

Hydrophobic unit

- - - - - -r+
OCH2CH20POCH2CH2N(CH3)3t

THJ

CH2-C后I
C=O
I
O(CH2)nCH3

n=3: BMA
n=ll: OMA

MPC
ーにH2-Cffla­
I
C=O
I
NH2

実

験

試薬の調製

MPCは研究代表者 が確立した方法により合成し 、 アセト

�CH2-CH后

心

CJ:=o

VPy
図1

St「ucture of amphiphilic polymers.

- 16 -

伊3---iCH2-C柑一

AAm

2
2 . 1

一

Amphiphilic copolymer system
Hydrophilic unit

C=O
I
OCH2CH20H

Poly(HEMA)

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究

表1

Synthetic results of polymers used in this study

Hydrophilic
monomer

Hydrophobic
monome『

PMBIO

MPC

PMB30

Code

Mole fraction ofhydrophilic unit

Time a)Conversion b)c)
Mw

in feedin polymer

(h)

（％）

Io5

BMA

0.10

0.07

10

40.1

1.3

MPC

BMA

0.30

0.28

10

52.6

2.1

PMDIO

MPC

DMA

0.10

0.12

6

41.)

2.0

PMD30

MPC

OMA

0.30

0.31

6

51.7

3.1

PAB70

AAm

BMA

0.70

0.58

4

30.7

1.8

PVB90

VPy

BMA

0.90

0.81

7

22.9

1.1

Poly(HEMA)

HEMA

1.0

1.0

2

18.7

4.2

a) [Monomer]= 1.0 M, [AIBN] = 5 mM at 60 °C.
b) Polymerization was carried out in ethanol for PMBIO, PMB30 and PMD30, in chloroform/ethanol(3n)for PMDIO, in DMF for PAB70 and PVB90, and in 2-propanol『or poly(HEMA).
c) Determined by gel permeation chromatography with polyoxyethylene standard for the MPC polymers,
with polystyrene standards for PAB70, PVB90 and poly(HEMA).

ポリマ ー 膜の調製と含水膜中の水の解析

牛血漿フィブリノ ー ゲン(BPF)を用 い た。 これ

ボリマ ー を溶媒に溶解して 10wt% 溶液を調製

らをリン酸緩衝液 (PBS 、 pH7.4) に溶解して生2.3した。 これをポリエチレン板上に流延し、 溶媒を蒸発させてポリマ
マ

ー

膜を

一

ー

膜を調製した。 得られたポリ

定重量秤量（乾燥祖量）し、 25 ℃にて体濃度の 1 /10 の溶液を調製した。

図 2 にタンパク質の吸着量と吸着したタンパク質の構造を解析する、 紫外(UV) 一 円偏光二色スペクトル法の測定手順を示す。 ポリ

純水中に浸漬した。 膜を取りだし表面の水分を軽性＜濾紙で拭い直ちに重量（膨潤重量）を測定しマ ー を石英板にスピンコ ー トした。 これをタンパた。 含水率を重量増加を膨潤重量で除することにク質溶液に浸漬し、 37 ℃にて 60分間放置した後、より算出した。

PBS でリンスした。

(CD)

直ちに 350nm から 205nmの範平衡膨潤に達した膜を 定重量熱分析用のアル囲で CD スペクトル測定（日本分光、 J-720W) を

ミニウム容器に入れ、 示差走査熱量計 (DSC、 セ行った。 測定は5回繰り返した。 その後、 石英板

一

イコ

ー

電子、 DSC-100) にて一

50 ℃より 50 ℃までの範囲で冷却速度 2.5 ℃／分にて熱量の変化を測定した。

nm の吸光度を測定した。

0 ℃付近の熱量変化を純水の値と比較の含水率を 0.36 に一ー

平均分子楕円率は CD スペクトル及びUVスペ

膜

クトル測定の結果より算出し、 タンパク質の二次定とし、 同様の測定を行っ構造の尺度となるa — ヘリックス含量はポリ(L

して自由水の分率を求めた。 さらに、 ポリマーリジン） の値を参考にして計算した。

た。
2.4をUV分光計（日本分光、 V-560) にセットし 280

3タンパク質吸着量の測定と吸着したタン

結果

表 2 にポリマ ー 膜の含水率を示す。 MPC ポリ

パク質の二次構造の解析
タンパク質として牛血清アルブミン(BSA)及び

マ ー の場合、 MPC ユニットの増加にともない含- 17 -

Polymer coatingby solvent
evaporation method

Proteinadsorption

Rinse withbufferedsolution

Measurement with
spectroscopy
Amount of adsorbed
protein

□巴］
□王］

↑

Conformation ofadsorbed protein

Test polymer
Buffered solution\
Quartz plate
Protein solution(40 x 9 x 1 mm3)
図2

Procedure for measurement of amount and conformation of protein adsorbed on polymer surface by UV-CD method
表2 Characteristics of hydration state of polymers and protein adsorption on polymer surfaces.

Poly(HEMA)

PMD

PMB

PAB70

PVB90

0.70

0.36

0.41

0.70

0.42

0.39

0.62

0.42

0.31

10

30

10

0.40 c)(0.39)

0.23

0.84

0.19

0.34 c)(0.34)
0.28

0.25

0.84

0.22

BSA

1.7士0.7

0.50士0.2*

0.22土0.1:. 0.51士0.2*

0.3 5士0.1:. 1.3士0.2 **1.8士0.3 **BPF

3.4士0.1

2.0士0.5*l.l 士0.2:* 2.0 士0.4*

1.2 士0.3:* 23士0.4*

2.6士0.3 *

Heq3)

30

Free water fraction
at Heqat H =0.36

0.69

Equilibrium amount ofadsorbed protein (µg/cm2)b)a) Heq = (weight o『water in the polymer membrane)/ (weight or polymer membrane saturated with water) at 25 ° C.
b) Initial concentration of proteins in PBS : [BSA]= 0.45 g / dL, [BPF] = 0.03 g / dL.
c) The values in literature (ref. 34).
The values indicated here are mean土S.D. for three experiments. *p<0.01 vs poly((郎MA), **p<0.01 vs PMBIO.

水率が増加することがわかる。 また 、 AAmやVPyあった。 このピ ー ク面積よりポリマ ー 膜中の水のユニットと比較して MPC ユニットの親水性が大融解に起因する熱鼠を求め、 純水の値と比較しきいことが確認できた。

て、 膜に含まれる自由水含率を求めた。 結果を表ー 膜のDSC曲線を示す。

2 に示す。 MPC ボリマ ー の自由水含率は他のポ0℃付近に氷の融解に起因するピ ー クが見られ

リマ ー に比較して大きいことが明らかとなった。

図3に含水したポリマ

20℃から 一 40℃の範囲に

タンパク質の吸着量に関して結果を表 2 に示す。

クが認められる。 一方 、 MPC

MPC ポリマ ー では Poly (HEMA)に比較してタる。 PABやPVB では
゜
ブロ ー ドな発熱ヒ ー

ポリマ

ー

一

では 0 ℃付近の発熱ピ ー

クがシャ

ー

プで

ンパク質 の吸着凪が少ない。 MPC ユニットが多- 18 -

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究

図 5 にタンパク質の二次構造の変化についてa

くなると吸着量の低下が見られた。
図 4 に PBS 中での BSA 及びポリマ

着した BSAの CD スペクトルを示す。

ー—ヘリックス含量に着目してポリマ ー 間で比較し表面に吸PBS 中に溶た。

はそれぞれ54% と 19% であった。

存しているBSAでは222nmに大きな負の分子楕円PMB30 に吸着している BSAでもほぼ同じ CD スペクトルが見られた。 MPC ポ

リマ

した BSA 及び BPFのa ヘリックス含量は PBS 中

でのそれぞれの値と有意差がない。 一方、 Poly

において MPC ユニット組成が小さくなる(HEMA) では有意に低値を示した。 このことはと 222 nm の負の楕円率が 0 に近くなり、 さらにPoly

PMB30 に吸着—率が観察される。

ーPBS 中の BSA 及び BPF のa — ヘリックス含量

大きな構造変化が生じていることを示している。

(HEMA) ではこの領向が顕著になった。

1.0

。

(1
ow p ap/zW :>l!ap �01 )A

Free water region

Intermediatewater region

弓 ndm a l801-

3P
E 』;
nn ox3.

-25-50-·BSA in PBS(Native)- 3· 0
2 os

240

220

Wavelength (nm)

260

10

。

。

10

2

H ·Xl
JcO:>X!l.)$ ） JU .))n
日 ilJUO:>X!(ilH,

40

( S

20

BPF

。

50

30

*p > 0.01 vs Native**p < 0.01 vs poly(HEMA)

30

BSA

＊
＊＊

PMB30 ヽ�

図4 CD spectra of BSA adsorbed on polymer surface
and in PBS

DSC curves of hydrated polymer.

60

i
、9、

·-:、-�­250Temperature (0C)
図3

｀ �-�--�

\/Native

PMDIO

PMBIO

Poly(HEMA)PMB30

Native
PMD30

Polymers

PMB10

Poly(HEMA)

PMD10
PMB30

PMD30

Polymers

図5
er -Helix content of BSA and BPF absorbed on polymer surface and in PBS. •represents no significant difference
versus the value for protein in PBS (Native) (p>0.01) and ..represents significant difference versus poly (HEMA) case(p<0.01).

-19 -

4

考

いる様子が見られた。

察以上の結果は MPC ポリマ ー とタンパク質との血液適合性の表面として理想的で、 模範となる相互作用が極めて弱いことを強く表わしている。

ものは血管内皮表面と考えられる。 正常な血管内細胞成分の粘着、 活性化及び凝集はタンパク質

皮上では、 細胞はもとよりタンパク質の吸着、 活

吸着層を介して細胞が材料の情報を得ることが引性化は生起しない。 この構造を人工材料の表面にき金となって生じる。 MPC ポリマ ー 表面ではタ構築できれば、 新しい血液適合性材料として期待

ンパク質吸着を効果的に減少させることができるできる。 研究代表者は、 このような観点から、 リために細胞粘着や活性化を抑制したものと考えら

ン脂質極性基をもつ MPC と疎水性のメタクリル

れる。

酸エステルあるいはスチレンとの共重合体を合成

一般に表面自由エネルギ ー の低いまたは界面自した ！ ）。 この MPC ボリマ ー は溶媒に可溶である

由エネルギ ー 差の小さい材料表面では生体適合ために、 従来の医用デバイス表面に被覆すること性、 抗血栓性あるいはタンパク質吸着抑制効果がが容易にでき 、 また血液と接触した場合において発 現 す る と いわれている。 そ こで親水性甚をも表面での血液細胞の粘着や活性化を効果的に阻AAm、VPy及び2 ー アクリルアミド ー 2 ー メチルプ

止することが見いだされている1. 4)。

ロパンスルホン酸 (AMPS) ユニットとした BMA

材料が血液と接触した際に細胞成分が材料と相互作用する前に脂質やタンパク質のような生体分
子成分が表面に吸着し、 この吸着層を介して血栓形成へと進行する。 したがって、 血液適合性材料

共重合体を合成し、 Poly (HEMA) も含めて血液細胞の粘着及び血漿からのタンパク質吸着を含水率がほぼ等しい MPCポリマ ー と比較検討した 5 )0

その結果、AAmや VPy ユニットを親水性基としを設計する場合において、 なるべく血液に近い状た場合はタンパク質の吸着及び血小板の粘着、 活

態からの生体分子成分と材料との相互作用につい性化も著しく起こることがわかった。 AMPS共重合体はヘパリン様のスルホン酸基があり負電荷表て検討することが重要となる。
これまでに MPC ポリマ

ー

ヘのタンパク質吸着について検討してきている叫 MPC ポリマーが面であることから、 良好な血液適合性の発現が期待されたが、 血液細胞の粘着はある程度抑制する

ヒト血漿と接触した際のタンパク質吸着量及び吸ものの、 タンパク質の吸着が多いことが明らかと

着タンパク質の種類をラジオイムノアッセイ法でなった。 一 方、 MPC ポリマ ー ではタンパク質吸解析した結果、 親水性表面であるガラスや疎水性表面であるポリ (EMA) (PBMA) に比較してMPCポリマーびフィブリノではアルブミン、 y グロブリン及ーー

着及び血液細胞の粘着のいずれも効果的に抑制していた。 このことは材料の血液適合性が表面自由エネルギ ー では議論できない事例である。

ゲンなどの主要タンパク質のみな以上の結果より、 MPC ポリマ ー 表面ではタン

らず微量ではあるが血栓形成に重要な役割を果た

パク質の吸着、 積層化が効果的に抑制されることしている凝固因子 、 補体系 、 細胞接着因子などのが明らかにされた。 これは MPC のホスホリルコ

吸着も抑制することを見い出した。 金コロイド粒
子標識抗体法により特定の吸着タンパク質の吸着

リ ン 基 の親水性に起 因 す る 効果と 考 え ら れ 、

MPC ポリマ ー とタンパク質との相互作用が弱い

分布状態を走査型電子顕微鏡にて調べた。 MPCことを示している。

ポリマ ー 上ではいずれのタンパク質の吸着も少な

水溶性ポリマ ー 濃厚水溶液中の水の状態をポリ

く、 吸着している場合でもまばらであることが認

マ ー 鉗に強く水和した結合水 、 バ ルク中の水と同められた。 これに対してガラスや PBMA では多じ自由水及びそれらの中間水（弱くポリマ ー 銀に一

くのタンパク質が吸着し、 さらに 部が凝集して相互作用している状態）に分けて DSC により解- 20 -

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究析してみたところ 、 同じ含水率の溶液でもポリマ性基が集合し、 高度に配向している表面では生体ーの種類によりこれらの分率が大きく異なること

反応を完全に抑えることができる可能性が示唆さが見いだされた。 その結果 、 MPCポリマ

ではれた。 この知見は今後の人工臓器、 医療デバイス

他の親水性ボリマ に比較して自由水含率が極め

あるいはバイオサイエンス（タンパク質工学 、 遺高＼ヽことがわかった。 タンパク質の吸着はタンパ

伝子工学 、 脳の機能解明など）用のデバイスを製

ク質の持つ結合水と材料表面の結合水の交換反応

作する材料を作る分子設計概念として重要となる（共有化反応）を伴う 、 いわゆる疎水性相互作用

であろう。

ー

ー

が重要な役割を果たしていると考えられているが 、 材料側に結合水がないまたは少ない場合には文交換する水分子が存在しないことにより、 タンパ

1) Ishihara K, Ueda T, Nakabayashi N,: Prepa­

ク質分子はあたかも水溶液中に留まっているかの

ration of phospholipid polymers and their prop­

ような挙動をとる。 すなわち 、 表面への吸着が起

erties as hydrogel membrane, Polym.]., 22, 355-

こり難いものと考えられる。 従来、 MPCポリマ

献

360 (1990).

ーのように親水性にもかかわらず結合水を持たな

2) Ishihara K, Ziats NP, Anderson JM, et al., :いポリマ ー は全く知られておらず 、 MPCポリマ

Protein adsorption from human plasma is re­ーの特異性が示された。

duced

5

結

on

ph o s p h o l i p i d p oly m e r.

].Biomed.Mater.Res., 25, 1397-1407 (1991).

論3) Ishihara K, Oshida H, Ueda T, et al., :ー

Hemocompatibility of human whole blood on

は 、 タンパク質との相互作用が極めて弱く、 例え

polymers with a phospholipid polar group andタンパク質と接触している場合でもタンパク質のits mechanism, ].Biomed.Mater.Res., 26, 1543-

構造変化を引き起こさない性質を持つことがわか

1552 (1992).

生体膜表面を模倣して合成したMPCポリマ

ーの生体適合性 （生体4) Ishihara K, Hanyuda H, Nakabayashi N, :Syn­に優しい）の要因であると考えられる。 MPCポ

thesis of phospholipid polymers having a ure­った。 これがMPCポリマ

リマ のタンパク質吸着 、 構造変化抑制効果には

thane bond in the side chain as coating material

水の構造が天然の状態いわゆる自由水が多いため

on segmented polyurethane and their platelet

であると結論できる。

adhesion-resistant properties, Biomaterials, 16,ー

細胞膜（生体膜） 表面で生物は生命維持のため

873-879 (1995).

の反応を行う場合が多い。 この時に非特異的な反5)上田智子 ， 石原 一彦 ， 中林宣男，：リン脂質応が起こると生命維持が危うくなる。 すなわち 、極性基を親水性甚として有する高分子の血液細胞膜を構成するマトリックスであるリン脂質極適合性，高分子論文集 ， 48, 289-294 (1991) .

- 21 -