低分子量 G 蛋白質 Rab27A による
メラノソーム輸送制御メカニズムの解明
東北大学大学院生命科学研究科

伊 藤敬

Rab27A is responsible for melanosome transport in melanocytes tethering melanosome to myosin Va, an actindependent motor protein, through Slac2-a/Melanophilin. For understanding the precise mechanism of melanosome transport,
it is important to clarify how Rab27A is activated/inactivated. Furthermore, the regulatory mechanism of Rab27A is also
important based on the clinical standpoint, since mutation in Rab27A causes an inherited disease of human "Griscelli
syndrome". Exhaustive screening among TBC domain containing proteins revealed that EPI64 is the GAP (GTPase
activating protein; inactivator) of Rab27A. EPI64 inactivates Rab27A in vivo and in vitro and overexpression of EPI64
results in melanosome aggregation in melan-a cells probably through intactivation of Rab27A. Interestingly, there are two
close homologues of EPI64, FLJ13130 and mFLJ00332, in mammalian genome including human. Therefore, I investigatedfunctional difference among these three TBC proteins.
As a consequence, I found that FLJ13130 and mFLJ00332 have other functions than EPI64. FLJ13130 inactivatedand mislocalized Rab3A in PC12 cells. mFLJ00332 was involved in formation of immunological synapse in T cells.
Furthermore, in vitro GAP assay revealed that FLJ13130 exhibited somewhat broad specificity and that mFLJ00332 showed
specific GAP activity toward Rab35. These data indicate that there are significant differences even in the closest members
among TBC proteins. These basic data will be useful for application to medical care like a drug discovery against EPI64.

１．緒

オルガネラの中で合成され、貯蔵される。メラノソームは

言

核周辺で作られ、その成熟とともにメラニン色素を蓄え黒日本人の女性に対する美意識の中では、黒い髪、白い肌

色化し、細胞周辺部に輸送される。輸送されたメラノソーというものが古来より重要であった。現代女性にとってもムはそのまま角質化細胞へ受け渡されると考えられている。

シミのない白い肌を保つことが美容の中でもっとも重要な

逆にこの輸送が行なわれないと、メラニン色素は角質化細ことであると言っても過言ではないだろう。また男女問わ胞に受け渡されない 。現在、この輸送の過程には低分子ず、白髪は老化を感じさせるために敬遠される傾向が強い。

量 G タンパク質である Rab27A が関与することが明らか

このように日本人の美的感覚の中で重要な役割を担っていになっており、実際、Rab27A 変異マウスや、Rab27A にる「黒」という色はメラニンと呼ばれる色素がもとになっ変異を持つヒト遺伝病 Griscelli 症候群の患者から単離したている（実際にはメラニン色素は黒色一種類ではないが）。

色素細胞では、メラノソームが核周辺に凝集するという表

このメラニン色素の合成や、いかに肌や髪を黒くするかの現型が観察され、その結果、毛髪の白色化が起こると考えメカニズムの解明はコスメトロジーの観点から非常に重要られているなテーマであると考えられる。

によるメラノソーム輸送制御メカニズムを明らかにするこ肌であれ、髪の毛であれ、メラニン色素は色素細胞とい

１）

２，３）

。以上のような背景から、筆者は Rab27Aとで、コスメトロジーに貢献できると考えた。

う特殊化された細胞によって産生されている。例えば皮膚一 般 的 に、 低 分 子 量 G 蛋 白 質 の 不 活 性 化 は GAP

では、肌を構成している角質化細胞へ色素細胞からメラニ（GTPase-activating potein）が GTP の加水分解を促進す

ン色素が受け渡されることで皮膚全体が黒色化する。実は、る こ と で、 活 性 化 は GEF（guanine nucleotide exchang

皮膚における色素細胞は、数としては少なく表皮全体の 2

factor）が結合している GDP を GTP に変換することで行〜 3％のみであるため、角質化細胞へのメラニン色素の受うと考えられているが、Rab27A に関してはそのどちらもけ渡しという過程は肌の色を決めるのに重要な役割を果た

これまで同定されていなかった（図１）。筆者は、色素細している。

胞内での Rab27A の不活性化がメラノソーム輸送を阻害

色素細胞中でメラニン色素は、メラノソームと呼ばれる
Ana lysis of mela nosome t ra nsportmechanism by small GTPase Rab27A
Takashi Itoh
Department of Developmental Biology
and Neurosciences, Graduated School ofLife Sciences, Tohoku University

することに着目し、メラノソーム輸送阻害を指標にヒトゲ
ノム上に存在する Rab-GAP/TBC タンパク質の網羅的ス
クリーニングを行った。そして、このスクリーニングで同定された TBC タンパク質の一つ（TBC1D10A/EPI64、以下 EPI64 と表記）が、実際に Rab27A を不活性化していることを明らかにし、Rab27A の GAP を世界で初めて同４）定することに成功した 。
ヒトを含むほ乳類では EPI64 と極めて相同性の高いタ− 100 −

低分子量 G 蛋白質 Rab27A によるメラノソーム輸送制御メカニズムの解明

GAP = TBC タンパク質
不活性化型

ファミリーのそれぞれのタンパク質に関して機能解析を行なった。それぞれ独立した仕事なっているが、興味深いデ

活性化型

Rab GDPRab GTPータが得られたので報告したい。

２．実
2．1

結合

験

免疫沈降

T7 タグや FLAG タグを融合した目的タンパク質を発現

エフェクターするベクターを構築、アカゲザル由来の COS-7 細胞に導入することでタンパク質を発現させた。細胞抽出液から、GEF

T7 タグを認識する抗体が付加されたアガロースビーズに

図１ Rab の機能メカニズムと活性サイクル
Rab の活性化サイクルをその制御因子を含めて示した。多くの低分子量 G 蛋白質に共通するメカニズムであるが、Rab は
GTP 型と GDP 型をサイクルする事で膜輸送を制御している。
GEF によって活性化した Rab はエフェクターと結合する事により機能を果たす。機能を果たした Rab は適切なタイミング
で GAP により不活性化を受ける。現在、Rab-GAP は TBC タ
ンパク質によって担われていると考えられている。

より T7 タグ付きタンパク質を沈降させ、同時に FLAG
タグ付きタンパク質が沈降してくるかどうかでタンパク質同士の結合の有無を評価した。

2．2

細胞観察

EGFP や mRFP を融合した目的タンパク質を発現するベクターを構築、melan-a、PC12、Jurkat 細胞に導入した。

ン パ ク 質 TBC1D10B/FLJ13130（ 以 下 FLJ13130 と 表 記 ）、細胞をパラフォルムアルデヒドで固定後、Rab3、Rab27

TBC1D10C/mFLJ00332（ 以 下 mFLJ00332 と 表 記 ） が 存への特異的抗体で染色を行ない、共焦点顕微鏡にて観察を在し、TBC1D10 ファミリーを形成している（図２）
。こ

行なった。

の 3 者は TBC ドメインにおいて非常に高い相同性を持ち、2．3全体の構造も良く似ているため、機能的な相関の可能性

in vitro GAP assayが示唆された。実際、筆者は FLJ13130 が Rab27A を不活

大腸菌用発現ベクターに Rab 遺伝子を導入したベクタ性化し、メラノソーム輸送を負に制御していることを示しーを構築。Rab タンパク質を大腸菌から精製して用いた。

ている 。しかしながら、最近他のグループから、複数のTBC タンパク質は COS-7 細胞に発現させたものを精製

Rab に対して活性を持つ TBC タンパク質が報告されておして用いた。Rab タンパク質に放射性ラベルされた GTP

り 、EPI64, FLJ13130、mFLJ00332 が Rab27A の不活性（
［a-32P］GTP）を結合させ、その後 TBC タンパク質と反化という共通の機能のみならず、それぞれが更に個別の機応させた。反応後の GTP/GDP の量比を TLC 展開を行な能を持つという可能性が考えられた。そこで、TBC1D10

うことで定量し、GAP 活性の有無を評価した。

４）

５）

A

EPI64
FLJ13130mFLJ00332

508

DTYL

TBC

533

60 %

DAYF

TBC
TBC

81 %

447

59 %

DTRF

B

図２ TBC1D10 ファミリーの構造と配列の比較
A. それぞれのタンパク質の構造と同一のアミノ酸の割合を示している。
B. TBC ドメインの配列のアライメント。活性中心であることが明らかになっているア
ルギニンとグルタミンを矢印で示してある。

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

３．結
3．1

（図３Ｂ）。これらのデータは、過剰発現された EPI64 と果

FLJ13130 は Rab27A を不活性化する事によってメラノソ

TBC1D10A/EPI64

ーム凝集を引き起こしていると考えられる。EPI64 は実際

メ ラ ノ ソ ー ム の 核 周 辺 へ の 凝 集 と い う Rab27A の 機に melan-a 細胞に発現していることが確認されたため、実能 不 全 に よ る 表 現 型 を 指 標 に、TBC タ ン パ ク 質 の 中際の細胞内での輸送にも EPI64 が機能している可能性はで Rab27A を不活性化するものを探索した結果、EPI64、高いと考えている 。

４）

FLJ13130 を含む 5 種類の TBC タンパク質の過剰発現によってメラノソームの凝集が引き起こされた（図３Ａ）。

3．2

TBC1D10B/FLJ13130

この中から実際に Rab27A に活性を示すものを明らかに

Rab3A は Rab27A と 近 縁 の Rab で あ り、 一 次 構 造 やするために、共発現させた時に活性化型の Rab27A の量

局在などが他の Rab と比べて非常に似ている。しかしなを減少させるものを調べてみると、EPI64 と FLJ13130 をがら、Rab3A に関しては TBC タンパク質に属する GAP

共発現している時のみ活性型 Rab27A の量が顕著に減少しが同定されていなかった。そこで、EPI64 を同定したもていることが明らかになった。実際、EPI64 と FLJ13130のと同様の手法を用いて、Rab3A に対する GAP の同定を用いて in vitro GAP assay を行なうと in vitro においを試みた。副腎髄質クロマフィン細胞由来の PC12 細胞ても EPI64 と FLJ13130 は Rab27A に GAP 活性を示した

では、Rab3A は細胞突起先端の小胞上に局在し（図４Ａ）、ホルモン分泌を制御している。Rab3A に活性を持A

つ TBC タンパク質を過剰発現させることで、この Rab3Aの局在が失われるものがあれば、その TBC タンパク質はRab3A の GAP であると考えられる。実際にスクリーニン
グを行なった結果、FLJ13130 の発現により Rab3A の局
在が失われることが明らかになった（図４Ａ）
。興味深い

GFP

ことに mFLJ00332 は若干の活性を持つものの、EPI64 の発現では Rab3A の局在は全く影響を受けなかった（図４Ａ ）。In vitro GAP assay の 結 果、FLJ13130 は 弱 い も のの Rab3A への GAP 活性を示した（図４Ｂ）。しかしながら 他 の Rab（Rab22A、Rab27A、Rab35） に も 活 性 を 示

GFP-EPI64

B

し、上記したように Rab27A への活性がもっとも強かった。

GTP-Rab27A (%)

FLJ13130 は EPI64 や mFLJ00332（ 後 述 ） と 異 な り、 か
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

*

なり緩い特異性を持った酵素であると考えられ、更に色素*６）細胞とは異なる細胞でも機能していることが示唆された 。

3．3

TBC1D10C/mFLJ00332

ヒトを病気から守る免疫システムのなかで、T 細胞と抗原提示細胞とが形成する免疫シナプスは T 細胞が抗原を認識する過程で重要な役割を果たしている。この免疫シナプスを形成するためには極性に従った膜輸送が必要

BS

A

EP

I6

4

BS

A

FL

となるが、それに関わる Rab や Rab-GAP はまだ同定されJ1ていなかった。mFLJ00332 は末梢血 T 細胞に豊富に発現3130しており、その候補と考えられた。また、mFLJ00332 の

図３ TBC1D10A/EPI64
A. GFP（上）もしくは GFP-EPI64（下）を発現させた melan-a細胞を示している。GFP を発現させた細胞では何も発現させていない細胞と同様に、メラノソームは細胞辺縁部に輸送されているが、GFP-EPI64 を発現した細胞では核周辺に凝集しているメラノソームが観察される。
B. In vitro GAP assay の結果。コントロール（白）に対し、TBC
タンパク質を加えることで（黒）GTP 型の Rab の量がどのよう に 変 化 す る か を 調 べ て い る。EPI64 と FLJ13130 は
Rab27A に GAP 活性を示した。

標的を同定するため、mFLJ00332 と共局在を示す Rab を探索したところ、Rab35 がもっとも強く共局在する Rab
だ と 同 定 さ れ、 実 際、mFLJ00332 が Rab35 に GAP 活
性を持つことを明らかにすることが出来た。またこの時、
mFLJ00332 は Rab3A や Rab27A には GAP 活性を示さなかった（図５）。更に、mFLJ00332 やドミナントネガティ
ブ型の Rab35 の発現や mFLJ00332 のノックダウンによって、免疫シナプスの形成が著しく阻害され、同時に、リサ− 102 −

低分子量 G 蛋白質 Rab27A によるメラノソーム輸送制御メカニズムの解明

イクリング経路の機能障害、極性を持った TCR（T Cell
Receptor）の輸送に異常を示したことなどから、Rab35

以上のデータから TBC1D10 ファミリーのメンバーがそれぞれに固有の機能を持つということが示された。

と mFLJ00332 は T 細胞においてリサイクリング経路を制T 細胞で機能することが明らかになった mFLJ00332

御することで免疫シナプスの形成に寄与していると考えらは、Rab27A に GAP 活 性 を 持 た な か っ た が、 実 際、れた 。

mFLJ00332 を Melan-a 細胞に発現させてもメラノソーム

７）

４．考

の凝集は起こらず、EPI64 と機能的に離れていることが示察唆された。一方、FLJ13130 は EPI64 と同様メラノソーム輸送にも関与するが、ホルモン分泌を制御する Rab3A の局在の制御という EPI64 には無い機能も持つことが明らかになった（図６Ａ）。構造の極めて良く似た TBC タン
パク質間でこのような機能のバリエーションが存在するこ

mFLJ00332

BSA

EPI64

A

FLJ13130とは想像しておらず、非常に驚く結果となった。

GDP
GTP
time (min) 0 12 24 48 0 12 24 48 0 12 24 48 0 12 24 48

GST-Rab35

B

0.8

*

0.7

GTP/GTP + GDP

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
mFLJ00332
図４ TBC1D10B/FLJ13130
A. GFP（上）、GFP-EPI64（中）、GFP-FLJ13130（下）を発
現 さ せ た PC12 細 胞 を 示 し て い る。 細 胞 は 固 定 後、 抗Rab3A 抗 体 を 用 い て 染 色 し て い る。GFP も し く は GFPEPI64 が発現している細胞では、Rab3A の突起先端における局在は影響を受けていないが（矢頭）、GFP-FLJ13130が発現している細胞では、突起先端の Rab3A のシグナルが有為に減少していることが観察される（矢印）。
B. In vitro GAP assay の結果。コントロール（白）に対し、TBC タンパク質を加えることで（黒）GTP 型の Rab の量がどのように変化するかを調べている。FLJ13130 は複数の Rab に対し GAP 活性を示した。

+

Rab3A

+

+

Rab27A GST-Rab35

図５ TBC1D10C/mFLJ00332
A. Rab35 に結合していたグアニンヌクレオチドを TLC 展開したもの。下のドットが GTP、上のドットが GDP の量を示している。時間経過とともに GDP の量が増えて行くが、
mFLJ00332 が存在している場合の方がその速度が速い。つまり、mFLJ00332 は Rab35 に対して GAP 活性を示している。
B. In vitro GAP assay の 結 果。 コ ン ト ロ ー ル ( 白 ) に対し、TBC タンパク質を加えることで ( 黒 ) GTP 型の Rab の量がど の よ う に 変 化 す る か を 調 べ て い る。mFLJ13130 は
Rab3A, Rab27A には GAP 活性を示さなかった。

− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009A

この結果はどのようなことを意味しているのであろうか。上記した T 細胞や PC12 細胞、色素細胞での機能はRab27A

かなりかけ離れているため、TBC1D10 ファミリーがどのEPI64ように機能分化してきたのかは現在のところ全く明らかでRab3Aない。しかし、想像の域を出ないが、以下のようなモデル

FLJ13130も考えられるのでないだろうか。Rab3A、Rab27A は色素

Rab22A細胞では細胞膜付近のメラノソームに局在するが、神経細mFLJ00332

胞ではシナプス小胞、特に細胞膜直下で放出を待つ小胞に

Rab35

B

局在している。Rab22A は細胞膜からエンドサイトーシス
により形成されるリサイクリングエンドソームに局在することが明らかになっている。Rab35 は数多く存在する Rab

Rab5A
Rab5C
Rab5B
Rab22A
Rab22B
Rab21
Rab24
Rab17
Rab20
Rab2A
Rab2B
Rab4A
Rab4B
Rab14
Rab11A
Rab11B
Rab25
Rab39A
Rab39B
Rab42
Rab19
Rab41
Rab30
Rab1A
Rab1B
Rab35
Rab8A
Rab8B
Rab10
Rab13
Rab15
hRab40A
Rab40B
Rab40C
Rab12
Rab26
Rab37
Rab3A
Rab3C
Rab3B
Rab3D
Rab27A
Rab27B
Rab33A
Rab33B
Rab18
Rab9A
Rab9B
Rab7
Rab41
Rab32
Rab38
Rab29
Rab34
Rab36
Rab23
Rab28
Rab6A
hRab6C
Rab6Bの中で唯一細胞膜に局在するという特徴を持つ。アミノ酸
配列上はかなり異なる Rab 達であるが、細胞膜付近で機能すると言う共通項が存在する。TBC1D10 ファミリーは細胞膜付近の Rab を不活性化するように進化してきており、その後それぞれの Rab への特異性を獲得したのかもしれない。
Rab3A、Rab27A は Rab の中でも非常に配列も似ているが、Rab22A や Rab35 に関しては離れたサブファミリーに属している（図６Ｂ）。TBC ドメインの配列によって分類された TBC1D10 ファミリーのメンバーがこれほど広い範囲の Rab に対して活性を示すのは生化学的観点から非常に興味深く、TBC ドメインにおけるわずかな塩基の違いが、その基質特異性に大きな違いをもたらしている可能性がある。TBC ドメイン -Rab 複合体の立体構造を解き明かすことでその基質認識への普遍的なメカニズムが明らかになるかもしれない。

５．総括

本研究成果のコスメトロジーへの応用の一つは、EPI64を標的とした創薬であろう。EPI64 を活性化することで、
メラノソームの輸送を阻害し、美白へとつなげることが出来る。EPI64 を標的にするような薬剤の作成を行なう場合、極めて相同性の高い分子である FLJ13130 や mFLJ00332の機能を同様に活性化、または不活性化する可能性が十分に考えられる。今回示したデータの通り、FLJ13130 や
mFLJ00332 は EPI64 にはない Rab3A、Rab35 を標的とするような機能を持つ。そのため、FLJ13130 や mFLJ00332の活性に影響を与えないと言うセカンドスクリーニングを行なう事によって、事前に副作用の危険性を回避することが出来るようになるのではないだろうか。本研究がコスメ
トロジーに応用されることを期待したい。

図６ まとめA. TBC1D10 ファミリーと Rab の関係図。EPI64 と mFLJ00332
は強い特異性を持つが、FLJ13130 は緩い特異性を示した。
B. Rab の系 統 樹。Rab3A、Rab22A、Rab27A、Rab35 を反転して示してある。Rab3A と Rab27A は近縁だが、Rab22A、Rab35 はかなり離れたところに位置する。

（参考文献）
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Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8, 786-797, 2007

− 104 −

低分子量 G 蛋白質 Rab27A によるメラノソーム輸送制御メカニズムの解明

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