物質の輸送・代謝リズムの分子時計機構の解明と操作要因の開発

九州大学大学院薬学研究院薬剤学

大 戸茂 弘Mammalians circadian pacemaker resides in the paired suprachiasmatic nuclei (SCN) and influences a multitude ofbiological processes. Clock genes are the genes that control the circadian rhythms in physiology and behavior. Not only
disease but also the effectiveness and toxicity of many drugs vary depending on dosing time. Identification of a rhythmic
marker for selecting dosing time will lead to improved progress and diffusion of chronotherapy. The mechanisms underlying
chronopharmacological findings should be clarified from viewpoint of clock genes. On the other hand, several drugs havean effect on molecular clock. Furthermore, to produce new rhythmicity by manipulating the conditions of living organs
appears to lead to the new concept of chronopharmacotherapy. The knowledge of interactions between molecular clock anddrug should be very useful for the clinical practice. In the present study, we demonstrated the circadian rhythm of CYP andtransporter transcription in mice and in vitro cell culture system. Then we clarified the regulatory mechanisms underlying
the rhythmicity of CYP and transporter transcription from viewpoints of molecular clock. Furthermore, we produced new
rhythmicity by manipulating the conditions of living organs or culture cell by using rhythmic administration of alteredfeeding schedules or serum shock. The monitoring of rhythm and manipulation of rhythm from viewpoints of molecularclock are essential to improved progress and diffusion of chronopharmacotherapy. Therefore, we show the regulatory systemof biological rhythm from viewpoints of clock genes and the possibility of chronopharmaceutics based on molecular clock.

１．緒

関与しており、その発現をリズミカルに制御している。

言

一方、薬物の体内動態を規定する吸収・分布・代謝・排生体リズムは生物界に広く普遍的に存在する生命現象で泄の各過程に関わる生体機能にも日周リズムが認められる。

あり、近年、一連の遺伝子群（時計遺伝子）が約 24 時間周体内動態を規定する因子の一つであるトランスポーターは、期で発現の増減を繰り返すことが、リズム発振の中心機構生体内において、医薬品の輸送に関与しており、吸収、分であることが明らかになってきた。哺乳類における生体リ

布、排泄の各過程において重要な役割を担っている。小腸ズム中枢（体内時計）は視床下部の視交叉上核に位置し、は経口投与された薬物の主な吸収部位であり、薬物の体内神経の活動やホルモン分泌、免疫機能など多くの生体機能への移行を制限している。薬物の消化管吸収におけるトラの日周リズムを制御している。哺乳類における生体リズム

ンスポーターの役割は大きく、消化管腔からの血中への移中枢は、視神経が交差する視交叉上核（SCN；suprachiasmatic

行や消化管腔への排出など薬物の膜透過に重要な役割を担nucleus）に位置し、神経伝達物質や液性因子などを介してっている。近年、マウスの小腸での mdr1a/abcb1a および末梢組織における時計遺伝子の発現リズムを制御している

pepT1/slc15a1 の発現は日周リズムを示すことが報告され、（図１）。概日リズム発振の本体は、CLOCK、BMAL1 を薬物の吸収にも影響を及ぼすことが指摘されている。しか初めとする時計遺伝子間で起こる発現の促進、抑制によるしながら、これらトランスポーターの発現に何故日周リズ

フィードバックループ機構であることが明らかとなっていムが生じるのか、その分子機構は解明されていない。一方、る（図２）。すなわち、CLOCK/BMAL1 の複合体が Period

代表的な薬物代謝酵素である P450（CYP）は大部分の医（Per）および Cryptochrome（Cry）遺伝子の各転写を促進薬品の代謝に関与するため、薬物の体内動態を規定する重する。産生された PER、CRY の各蛋白質は複合体を形成し、要な因子と位置づけられている。中でも、CYP3A4 は薬物

CLOCK/BMAL1 による自らの転写活性を抑制することに代謝への寄与が大きいこと、また、肝臓における含有量がより、その遺伝子および蛋白質の発現に日周リズムが生じ最も多いことなどから高い注目を集めてきたが、ヒトにおる。また、これらの時計遺伝子群は他の遺伝子の転写にもける CYP3A4 の酵素活性にも日周リズムが認められることが報告された。しかしながら、その酵素活性の日周リズ

Molecular clock mechanisms oftransporter and metabolic enzyme andthe manipulation of biological rhythm
Shigehiro Ohdo
Department of Pharmaceutics, Graduate
School of Pharmaceutica l Sciences ,Kyushu University

ムの制御メカニズムは解明されておらず、CYP3A4 の活性リズムと体内時計の分子機構とを結びつける因子の存在についても、何ら明らかにされていない。こうした状況の中で、時計遺伝子の機能と役割が生理学的側面より明らかにされつつあるが、今後の重要な課題として医薬品、化粧品、食品など社会応用があげられる。そこで本研究では、まず− 88 −

物質の輸送・代謝リズムの分子時計機構の解明と操作要因の開発

図１ 生体リズムの制御図。生体には体内時計が存在し、その本体は視神経が交差する視交叉上核（suprachiasmatic nucleus、SCN）に位置し、時計遺伝子により制御されている。
この機構により多くの生体機能や疾患症状に 24 時間周期のリズムが認められる。

２．実

験

自由摂食摂水・明暗周期（明期：07 : 00 − 19 : 00）条件下で飼育した Clock 遺伝子変異マウス（Clk/Clk）および野生型（Wild-type）マウスを対象に 09 : 00､13 : 00､17 : 00､21 : 00、
01 : 00、05 : 00 の６時点に種々の細胞を採取した。物質輸
送および代謝関連遺伝子および時計遺伝子を含む周期的に変動する遺伝子 mRNA の日周リズムを RT-PCR 法で測定する。物質輸送および代謝関連遺伝子リズムの存在と時計遺伝子リズムとの相互関連を明らかにする。mRNA の定量は、上記６時点において、Wild-type および Clk/Clk マウス
図 2 哺乳類における体内時計の分子機構。時計振動遺伝子の転写は負のフィードバック機構で制御されている。例えば、
Per 遺 伝 子 の 転 写 は ポ ジ テ ィ ブ 因 子 で あ る CLOCK とBMAL1 のヘテロ二量体が Per 遺伝子上流に存在する E-box配列（CACGTG）に結合することによって活性化される。
また Per 遺伝子産物がネガティブ因子となり、自らの転写を抑制する。

から小腸を摘出後、DNA を抽出した。GAPDH を内部標準として、Real time RT-PCR 法により Abcb1a mRNA の相対的な発現量を測定した。ルシフェラーゼレポーター解析は、
マウス Abcb1a 遺伝子の 5’上流域を含むルシフェラーゼレポーターベクターを各時計遺伝子の発現ベクターと共にNIH3T3 細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから 24 時間後のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。また、時計遺伝子応答配列を変異させたルシフェ
ラーゼレポーターベクターを作成し、同様の検討を行った。

動物実験系で、物質の輸送・代謝リズムの分子時計機構をゲルシフトアッセイは、マウス Abcb1a 遺伝子 5’上流域に解明する。次に動物実験系および in vitro 細胞培養系で、おける時計遺伝子応答配列およびその変異配列を含むビオ物質の輸送・代謝リズムの分子時計機構の操作要因を開発

チンラベル化 DNA プローブを合成し、各プローブと inする。なお本研究では、種々の分子について検討したが、vitro translational system を用いて合成した各転写因子

mdr1a/abcb1a、CYP3A4、CYP2E1 などを中心に紹介する。 （HLF、E4BP4）を反応させ、ゲルシフトアッセイ法で各− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

転写因子の時計遺伝子応答配列への結合能を検討した。

ンパク質量測定は、Western bloting 法で測定した。mRNASmall interfering RNA は、BLOCK-iTTM RNAi Designer量測定は、RT-PCR 法により測定した。ルシフェラーゼ活を用いて、HLF および E4BP4 に対する siRNA を合成し、性測定は、Mouse CYP2E1 の promoter 領域を対象に HNF-colon26 細胞にトランスフェクトした。細胞を 50％血清を1a 及び時計遺伝子による影響を測定した。CYP2E1 プロモ含む培地に２時間曝露後、Abcb1a mRNA 発現量の経時ーターへの転写因子結合測定は、クロマチン免疫沈降法で的変化を Real time RT-PCR 法で測定した。ウエスタンブ測定した。CYP2E １プロモーター領域における転写因子ロッティングは、Wild-type および Clk/Clk マウスの小腸の相互作用は、ChIP 再免疫沈降法で測定した。
培養細胞はヒト新生児線維芽細胞（NB1RGB）を、a‐MEMまたは Colon26 細胞における、HLF および E4BP4 のタンパク発現をウエスタンブロッティング法で測定した。クロ培地中、37℃、５％ CO2 条件下で培養した。またヒトケラ

マチン免疫沈降は、Wild-type および Clk/Clk マウスからチノサイト細胞（HaCat）を、DMEM（high glucose）培地、小腸を摘出し、氷冷した１％パラホルムアルデヒド溶液に37℃、５％ CO2 条件下で培養した。50% 血清刺激による時浸すことでタンパク -DNA のクロスリンクを形成させた。

計遺伝子のリズムを再構築する目的で、NBR1RGB を 2×クロスリンクを形成させた小腸の組織片から核タンパクを10 cells/well になるように６well plate に播種した。播種抽出し、抗 HLF 抗体および抗 E4BP4 抗体を用いて、これ24 時間後に無血清培地に交換し 12 時間培養した。その後

ら各タンパクと結合した DNA 断片を免疫沈降法で精製し50％血清培地に２時間暴露後、１％血清培地に交換し細胞た。各転写因子と DNA との結合量は、PCR 法で定量した。

内時計遺伝子のリズムを再構築した。細胞は、４時間ごと

次に、in vitro で物質輸送および代謝関連遺伝子の日周血清刺激後 52 時間にわたり回収した。mRNA 量測定は、リズムの制御機構を検証した。数種の細胞を対象に 50%

real time RT-PCR 法および RT-PCR 法により測定した。

5horse serum を添加することにより時計遺伝子など周期的統計解析は、独立多群の比較には一元配置分散分析法（One-変動遺伝子のリズムを形成する。すなわち生体で認められway ANOVA）およびTukey multiple comparison testを用いるリズムを in vitro で再現する実験系を構築する。Serumた。また、独立２群の比較にはStudent’s t-testを用い、５％shock 後、経時的に細胞を採取する。上記の物質輸送、代謝、以下を有意な差とした。

薬効関連遺伝子および時計遺伝子を含む周期的に変動する

３．結遺伝子の mRNA を RT-PCR 法で測定し、物質輸送、代謝および薬効関連遺伝子リズムの存在と時計遺伝子リズムとの相互関連を明らかにする。

果

Wild-typeマウスの小腸におけるAbcb1a mRNAの発現量は、明期後半から暗期前半にかけて高値を示す有意な日周生体内環境の操作方法として、in vivo では摂食条件、inリズムが認められた（図３）。一方、Clk/Clk マウスの小腸vitro では serum shock、ステロイド shock を用いる。時における Abcb1a mRNA の発現量には、有意な日周リズ計遺伝子を含む周期的に変動する遺伝子の中からリズム操ムは認められなかった。転写調節領域に E-box や D-site を作要因を抽出した。上記と同様の手法を用いて、in vivo有する遺伝子の多くは、時計遺伝子群によって構成される

および in vitro で要因の妥当性を検証した。コンフルエン

フィードバックループ機構によって、その遺伝子発現に日ト状態のヒト由来肝癌細胞（HepG2）を、高濃度（50％）血清培地に２時間暴露させ、処置後経時的に RNA および蛋白を抽出した。RNA は TRIZOL 試薬 を用いて抽出した。
GAPDH を内部標準とし、RT-PCR 法により各遺伝子のmRNA の相対的な発現量を測定した。CYP3A4 の酵素活性の測定は、P450-GloTM Glo Assays を用いて、高濃度血清処理後、経時的に CYP3A4 の酵素活性を測定した。ヒト CYP3A4 遺伝子の 5’上流域の塩基配列を含むルシフェラーゼレポーターベクターを作成し、各時計遺伝子の発現ベクターと共に、HepG2 細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト 48 時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。
自由摂食群は、自由摂食摂水、明暗周期（明期：07 : 00− 19 : 00）条件下で２週間飼育した７週齢 ICR 雄性マウスを 使 用 し た。 時 間 制 限 摂 食 群 は、 摂 食 時 間（09 : 00 −17 : 00）、自由摂水、明暗周期（明期：07 : 00−19 : 00）条件下で２週間飼育した 7 週齢 ICR 雄性マウスを使用した。タ

図 3 マウス小腸細胞における Abcb1a mRNA の日周リズム。
野生型マウス（○）の Abcb1a mRNA の発現は日周リズムを示したが、clock 変異型マウス（●）のリズムは消失した。
（N=3、mean±SE、6 時 点 P<0.01;ANOVA、 ＊＊P<0.01：
Tukey-Kramer’s test）− 90 −

物質の輸送・代謝リズムの分子時計機構の解明と操作要因の開発

周リズムが生じることが知られている。マウス Abcb1a 遺的に変化し、それぞれ約 24 時間周期のリズミカルな変動

伝子の 5’
上流域約 1,000bp 内の塩基配列について解析を行を示した。また、同一条件下において、CYP3A4 遺伝子ったところ、E-box および D-site が数カ所存在することがの mRNA の発現量およびその酵素活性にもそれぞれ 24 時確認された。そこで、これら塩基配列を含むルシフェラー間周期の変動が認められ、本酵素活性の日周リズムは転写ゼレポーターベクターを作成し、その転写活性に及ぼす各レベルで制御されている可能性が示唆された（図４）。転時 計 遺 伝 子 の 影 響 に つ い て 検 討 し た 結 果、PAR basic

写調節領域に E-box（CANGTG）や D-site（TTA［C/T］［A/leucine zipper（bZIP）転写促進因子によって Abcb1a の転G］TAA）を有する遺伝子の多くは、時計遺伝子群によっ写活性は上昇し、その転写活性は PAR bZIP 転写因子のて構成されるフィードバックループ機構によって、その遺リプレッサーである E4BP4 によって抑制された。また、伝子発現に日周リズムが生じることが知られている。ヒト

ゲルシフトアッセイによる解析の結果から、これらタンパ

CYP3A4 遺伝子の 5’
上流域約 1,800bp 内の塩基配列についクは、Abcb1a 遺伝子上の D-site 様配列に直接結合するこて解析したところ、E-box および D-site が数カ所存在するとで、その転写活性を制御している可能性が示唆された。

ことが確認された。そこで、これら塩基配列を含むルシフ

また、マウス小腸における HLF、E4BP4 の蛋白発現量のェラーゼレポーターベクターを作成し、その転写活性に及経時的変化をウエスタンブロッティング法で検討した結果、ぼす各時計遺伝子の影響について検討した結果、CYP3A4HLF の発現リズムは Abcb1a mRNA と同位相を、E4BP4遺伝子の転写活性リズムは DBP および E4BP4 の各時計遺発現リズムは逆位相を示した。さらに、クロマチン免疫沈伝子により、制御されていることが明らかになった。また、降による解析の結果、Abcb1a mRNA の発現量が低下する

この転写活性の調節には 5’上流域−45 〜−38bp 内に存在時間帯に E4BP4 のプロモーター領域への結合量の増加がする D-site 配列が重要な役割を担っている可能性が示唆さ認められた。これらの結果から、マウス小腸におけるれた。同様の所見は、高濃度血清処理した培養 colon26 細Abcb1a 遺伝子の発現は、HLF と E4BP4 の働きによりリズ胞においても、Abcb1a mRNA の発現量に約 24 時間周期ミカルに制御されていることが示唆された。すなわち、のリズミカルな変動が認められた。すなわち、高濃度血清CLOCK、BMAL1、PER、CRY により構成されるフィー処理した培養 colon26 細胞においても、Abcb1a mRNA のドバックループ機構により、HLF および E4BP4 タンパク発現量には約 24 時間周期のリズミカルな変動が認められの 発 現 に は そ れ ぞ れ 逆 位 相 の 日 周 リ ズ ム が 生 じ る。

た。しかしながら、siRNA 法によって HLF または E4BP4

Abcb1a 遺伝子は、これら PAR bZIP タンパクの発現リズの各タンパクの発現を抑制した細胞では Abcb1a mRNAムにより、転写の「促進」と「抑制」の切り替え調節を交の発現リズムは観察されず、本遺伝子の発現リズムの形成互に受ける結果、その発現に日周リズムが生じると考えらに HLF と E4BP4 とが関与していることが示唆された。

れた。

マウスの肝臓において、CYP2E1 活性および mRNA 発高濃度血清処理後の HepG2 細胞内における Bmal1、現量に日周リズムが認められた（図５）。その機序とし

Per2、Dbp および E4bp4 の各時計遺伝子の発現量は経時

HNF-1a が転写促進因子とし作用し、時計遺伝子（CRY1）

図 4 高濃度血清刺激後の HepG2 細胞における CYP3A4 の mRNA（○）および酵素活性（●）のリズム。
（N=3、mean±SE、P<0.01 ;ANOVA）− 91 −

図５ マウス肝臓における CYP2E1 mRNA の日周リズムに及ぼす摂食条件の影響。自由摂食時（○）に認められる CYP2E1 mRNA の日周リズ
ムは、時間制限摂食（●）によりリズムの位相が 大きくシフトした。
（N=10、mean±SE、6時 点 P<0.01;ANOVA、 ＊＊P<0.0 １：TukeyKramer's test）

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012が転写抑制因子とし作用していることが示唆された。これ含まれている。本研究で明らかになった CYP やトランスらのリズムは、時間制限摂食でも認められたが、互いにほポーター発現リズムの制御メカニズムは、投薬時刻の違いぼ逆位相を示した。

による体内動態の変動の原因の理解のみならず、それら薬50％血清刺激後のヒト新生児線維芽細胞およびヒトケラチノサイト細胞における時計遺伝子の mRNA 発現リズム物の至適投薬タイミングを設定する上で重要な知見となりうると思われる。

を測定した結果、約 24 時間を周期とするリズミカルな発次に、本研究では、ヒト培養細胞を用いた生体リズムの現変動を示すことが明らかとなった（図６）。また酵素や再構築を試み、CYP やトランスポーターのリズムの調節トランスポーターにも約 24 時間を周期とするリズミカルメカニズムを解明することに成功した。例えば、ヒトな発現変動が認められ、時計遺伝子の発現リズムとの関連

CYP3A4 の活性リズムは転写レベルで制御され、その遺伝が示唆された。以上の結果より、50％血清刺激後の 1％血子発現は D-site を介して時計遺伝子である DBP と E4BP4清培地存在下で培養した細胞においては、細胞内の時計遺とによってリズミカルに制御されていることが明らかにな伝子リズムの再構築に成功した。他の酵素およびトランスった。これらの結果から、CYP3A4 の基質薬物を用いて治ポーターについても同様の所見が認められた。

療を行う際には、体内時計の分子機構に基づいた至適投薬

４．考タイミングを設定することで、より効率的な治療が可能に察なることが示唆された。また、本研究で構築されたヒト培本研究ではマウスを対象に、CYP やトランスポーター養細胞でのリズム評価系は、これまで困難であったヒトにに日周リズムが存在することを明らかにした。その機序とおける生体リズム研究の分子レベルでの進展にも寄与できして時計遺伝子が関与していることを明らかにした。またるものと考えられた。さらに、摂食条件を操作することにClock 遺伝子の変異マウスにおいてはそれら各遺伝子の発より、CYP やトランスポーターの日周リズムをコントロ現リズムが消失することを見出した。マイクロアレイを用ールできる可能性が示唆された。同様に、皮膚培養細胞をいた解析結果などから PAR bZIP 転写因子は、薬物動態用いた検討においても時計遺伝子の発現に約 24 時間を周に関与する多くの遺伝子の発現制御に関与していることが期とするリズミカルな発現変動が認められた。また酵素や指摘されていたが、本研究における解析の結果から、それトランスポーターの発現にも約 24 時間を周期とするリズら転写制御因子による CYP やトランスポーターの遺伝子ミカルな発現変動が認められた。これらのことから、皮膚の発現リズム制御メカニズムが明らかになった。例えば、細胞においても高血清処理により生体リズムを再現し、リマ ウ ス 小 腸 に お け る Abcb1a 遺 伝 子 の 発 現 は、HLF とズムを操作できることが明らかとなった。

E4BP4 の働きによってリズミカルに制御されていること

本研究により、体内時計の分子機構の所見を効率よく化を明らかにした。現在までに、投薬時刻によって体内動態粧品の適正使用に応用するためのリズム診断法、リズム操に変化が生じる薬物が複数知られているが、その中には今作法を開発できる可能性が示唆された。また生命体がうま回検証した CYP やトランスポーターの基質となるものもく機能していくうえで最重要と考えられている「生体のホメオスタシス機構の維持」に大きく貢献できるものと考える。

５．謝辞

本研究はコスメトロジー研究振興財団の研究助成により行われました。心より感謝申し上げます。また研究の進展にご協力を頂きました共同研究者の皆様に感謝申し上げます。
（文献）
１）Ohdo S: Chronotherapeutic strategy: Rhythm
monitoring, manipulation and disruption. Advanced
Drug Delivery Reviews 62 : 859-875, 2010.
２）Ohdo S, Koyanagi S, Matsunaga N: Chrono-drug図６ 高濃度血清刺激後のヒト新生児線維芽細胞（NB1RGB）における時計遺伝子（○；hBmal1, ●；hPer1）の mRNA の発現リズム。(N=3、mean、P<0.01 ; ANOVA)− 92 −

delivery focused on biological clock: Intra- and interindividual variavility of molecular clock. Advanced
Drug Delivery Reviews 62 : 885-897, 2010.