ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制に関する研究
東京薬科大学生命科学部

柳茂

We previously identified a mitochondrial ubiquitin ligase MITOL, whose dysfunction causes production of reactive
oxygen species from mitochondria. Here, we generated keratinocyte–specific MITOL-deficient mice and examined therelationship between MITOL and ageing. Interestingly, MITOL-deficient mice revealed typical senescence-associated skinphenotypes. Our results provide novel insight into how mitochondrial function controls ageing.

1．緒in vivo における生理的機能を明らかにすることが課題で言ある。

ミトコンドリアの主な生理的役割は脂肪酸の β 酸化

皮膚は紫外線（UV）などの環境要因の影響により、皮膚や、電子伝達系による酸化的リン酸化によるエネルギー細胞、色素細胞、真皮結合細胞、血管などにダメージが蓄（ATP）産生である。この ATP の産生の過程では、生体内積することで老化が進行する。紫外線（UV）は表皮細胞内酸素の 90 ％以上を消費するが、その一方で消費酸素のうにおいて細胞老化の原因とされる ROS のレベルを上昇さちの数％を活性酸素種（ROS : reactive oxygen species）とせるため、皮膚老化現象と ROS の関係性が注目されておして漏出する。これらの活性酸素は種々の要因によりミトり、実際に表皮細胞増殖に関与する表皮ケラチノサイト成コンドリア自身にも影響を与え、細胞内に遊離して様々な長因子が UV によって引き起こされる表皮ケラチノサイト

1）

生物現象（老化、がん、アポトーシスなど）を誘起している 。

内の ROS のレベルの上昇を抑えていることが報告されてまたミトコンドリアは絶えず融合分裂を繰り返しながらそいる 11）。ミトコンドリアは生体内の主要な ROS の産生源の機能を維持している。ミトコンドリアの分裂には通常細であり、近年ではミトコンドリアダメージによる ROS の胞質に存在している分裂因子である Drp1 がミトコンドリレベルの上昇が皮膚老化を進行させるという報告がされてアにリクルートされることにより行われ 、この過程においる 12）。今回、皮膚老化とミトコンドリア機能維持の関

いては、ミトコンドリアの外膜に局在する hFis や Mff など係性に着目し、MITOL がミトコンドリアダメージによる2）の Drp1 結合分子が関与する

3, 4）。また、ミトコンドリアの細胞内の ROS のレベルの上昇を防ぐことで、皮膚老化を融合にはミトコンドリア外膜に局在する Mitofusin5）や、ミ制御するという仮説を立て、表皮ケラチノサイトにおける6）

トコンドリア内膜に局在する Opa1 などの融合因子が関MITOL のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、わっている。

この仮説を検証した。

MITOL はミトコンドリア外膜に局在する E3 ユビキチ

2．実験
（材料と実験方法）

ンリガーゼであり、ミトコンドリア分裂因子である hFis1,
Drp1 をユビキチン化し、分解を促進する 7）。また、ミトマウスを用いた実験

コンドリアに蓄積する変性タンパク質を分解することで細▼動物

胞内毒性を軽減し、ミトコンドリアの品質管理に関与す

・C57BL/6N mouse（日本 SLC）

る8, 9）。さらに、我々は MITOL の基質として微小管関連タンパク質である MAP1B-light chain 1（LC1）を同定し、MITOL が一酸化窒素（NO）によって修飾された LC1 を選択的にユビキチン化しその分解を促進することで細胞内における毒性を回避することを報告した

10）。今後 MITOL の・MITOL Flox mouse（理研）
・STOCK Tg（KRT1 4-cre）1Amc/J（The JacksonLaboratory）▼ゲノム PCR/ アガロースゲル電気泳動
・ゲノムサンプルは mouse tail を 50 mM NaOH で可溶化したものを使用
・DNA マーカー：ΦX174-Hinc Ⅱ digest（TaKaRa）
・アガロースゲル : 2 % Agarose（ニッポン・ジーン）in

Role of mitochondria in skin senescence
Shigeru Yanagi
Tokyo University of Pharmacy and LifeSciencesTAE▼ウエスタンブロット・SDS-PAGE により分離し、PDVE メンブレン（Millipore）に転写後、各抗体を用いてブロットした。

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コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

・〈 抗 体 〉抗 MITOL 抗 体（ 当 研 究 室 で 作 製 ）、α-tubulin

パク質をサンプルとし、ウエスタンブロットを行った結果、（SIGMA）作製したマウスのサンプルからは MITOL のバンドは確認▼パラフィン切片できなかった。以上の結果より、表皮特異的 MITOL ノッ

・HE 染色：Mayer’ s Hematoxylin Soln（和光純薬工業）

クアウトマウスの作出に成功した。

・1 ％ Eosin Y Solutions（和光純薬工業）
・TUNEL assay：in situ cell death detection kit, TMR
red（Roche）

MITOL cKOマウスの表現系
出生後 1 〜 6 ヶ月では MITOL cKO マウスでは顕著な・DAB 染色：（Dako）

表現型を示さなかったが、7 ヶ月の時点において、オスの▼ サ ザ ン ブ ロ ッ ト（TRFs：Southern blots of terminal

MITOL cKO マウスでは白髪の増加が観察された。この白restriction fragments）

髪の増加は背中や両足を中心に起こっており、白髪は体・フェノール / クロロホルム処理によりゲノムを精製全体の毛の 1/3 程を占めていた。また、白髪だけではなく、・制限酵素処理：Hinf Ⅰ（TaKaRa）、Rsa Ⅰ（TaKaRa）

脱毛および皮膚異常が観察された。その後、この MITOL

5・プローブ telomere 5 repeat：（CCC TAA）

cKO マウスを 1 ヶ月毎に観察した。その結果、時間経過・プローブ合成キット：DIG Oligonucleotide 3' end Labelingとともに白髪が進行した。この白髪の進行は尾部から頭部

Kit, 2nd generation（Roche）、ハイブリダイゼーション：に向かって行われており、白髪は体全体の毛の 2/3 程を占Perfect Hyb（TOYOBO）めた。また、それと同時に脱毛、皮膚の異常も進行してお・抗 DIG 抗体：Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments（Roche）

り、皮膚の一部ははがれ落ちた。メスの MITOL cKO マ・発色液：Amersham CDP-Star（GE Healthcare）

ウスでは出生後 7 ヶ月の時点において、雄の MITOL cKOマウスのような特徴は観察されなかったが、出生後 12 ヶ細胞を用いた実験

月の時点において、白髪や脱毛が観察された。

▼細胞 HaCaT（ヒト表皮角化細胞由来）

MITOL cKOマウスの表皮構造に異常が観察される▼細胞培養・遺伝子導入
・5% CO2 , 37 ℃条件下において 10% Fetal Bovine Serum

オスの MITOL cKO マウスでは 7 ヶ月齢から脱毛および（GIBCO）、100U/mL penicillin, 100mg/mL streptomycin

皮膚の脱落などの表現型が観察された。そこで、皮膚組織を含んだ DMEM（Nissui）で培養した。遺伝子導入は切片を作成し、MITOL cKO マウスの皮膚構造を観察する

lipofectoamine 2000 を用いて行った。

ことにした。コントロールマウスおよび MITOL cKO マウ▼ qRT-PCR

スから皮膚を採取し、皮膚切片を作成し、組織標本の一般・RNAの抽出にはRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を使用した。
®

・cDNA合成にはReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）的手法である HE 染色法を行い双方のマウスの皮膚構造を観察した。その結果、表皮層において、MITOL cKO マウ
スではコントロールマウスに比べ、有棘層の肥厚（表皮過を使用した。
▼ ROS generatin detection assay形成）が観察された。さらに、毛胞に着目すると、コント・CM-H2DCFDA（invitrogen）蛍光プローブで処理し、ロールマウスに比べ、MITOL cKO マウスでは毛胞ひとつに対して肥大化した皮脂腺が増加していることがわかった。

flow cytometry を用いて検出した。

3．結MITOL cKO マウスでは表皮過形成および肥大化した皮脂果腺の数の増加など、表皮構造形成の異常が起こっているこ

表皮特異的MITOL欠損マウス（MITOL cKOマウス）の作製
MITOL Flox マウスに KRT14-cre 遺伝子をもつマウスとがわかった。

MITOL cKOマウスでは細胞死が進行するを掛け合わせ、表皮特異的な MITOL ノックアウトマウス

皮膚組織切片を作成し、TUNEL assay を行うことで細を作製した。今回用いた MITOL Flox マウスは Exon2 が胞死の検定を行った。その結果、MITOL cKO マウスではlox P に挟まれるように設計をした。MITOL 遺伝子がノコントロールマウスに比べ、顕著に TUNEL positive な細ックアウトされていることは、ゲノム PCR 法、ウエスタ胞が多く観察されており、これら TUNEL ポジティブな細ンブロッティング法で確認を行った。マウスの表皮サンプ胞は表皮層の中でも特に有棘層に集中していた。また、こルからゲノムを抽出し、ゲノム PCR を行った。作製したのような TUNEL ポジティブな細胞は MITOL cKO マウ

マウスのサンプルからは欠損バンドである約 600bp にバスの毛包内にも多く観察された。

ンドが確認できたため、このマウスではターゲットとするExon2 が欠損していることがわかった。また、表皮タン− 150 −ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制に関する研究

4．考スは老化の分子機構を解析する良い解析モデルになるだろ察う。

本研究の結果から、MITOL cKO マウスでは、白髪の増加や脱毛、皮膚異常など老化モデルマウスに近似した表現（参考文献）型を示すことがわかった。また、MITOL cKO マウスで観

1） Marchi S, Giorgi C, ：Mitochondria-ros crosstalk in

察された、表皮の肥厚や皮脂腺の肥大化などの炎症症状のthe control of cell death and aging, J. Signal Transduct.,

進行、表皮および毛胞における細胞死の増加、テロメア

2012, 329635, 2012.

鎖の短縮は、MITOL cKO マウスの表皮において老化が進行していることをサポートする結果である

13, 14）。さらに、

HaCaT 細胞に MITOL siRNA を遺伝子導入した実験結果

2） Otsuga D, Keegan BR,：The dynamin-related
GTPase, Dnm1p, controls mitochondrial morphology inyeast, J. Cell Biol. 143, 333-349, 1998.

から、MITOL cKO マウスの示した表現型の原因が、表皮

3） James D, Parone PA,： hFis1, a novel component of

ケラチノサイト内の ROS のレベルの上昇、および分化マ

the mammalian mitochondrial fission machinery, J. Biol.

ーカーであるインボルクリンの減少であることを示唆する

Chem. 278, 36373-36379, 2003.

結果も得ることができた。老化分野におけるミトコンドリ

4） Otera H, Wang C,： Mff is an essential factor

ア研究としては、加齢によるミトコンドリア遺伝子の変異

for mitochondrial recruitment of Drp1 duringの蓄積が細胞機能に悪影響を与える『ミトコンドリア遺伝

mitochondrial fission in mammalian cells, J. Cell Biol.

子変異説』が提唱されており、表皮細胞においては、ROS191, 1141-1158, 2010.

によってミトコンドリア遺伝子の変異が起こることが証明
15）5） Huang P, Galloway CA,：Control of mitochondrial。また、実際にミトコンドリア DNA 修復機

morphology through differential interactions of能不全マウス（PolgD257A/D257A）では脱毛や白髪化、また、細mitochondrial fusion and fission proteins, PLoS One, 6,胞死の増加などの老化現象が進行することが明らかにされe20655, 2011.

されているており、このマウスは早老症のモデルマウスとして確立さ

6） AlexanderC, Votruba M,：OPA1, encoding a。今回、MITOL cKO マウスで観察された白dynamin-related GTPase, is mutated in autosomal

髪の増加や脱毛、皮膚異常、細胞死の増加などの老化を示

dominant optic atrophy linked to chromosome 3q2 8,

す表現型は、表皮ケラチノサイト内のミトコンドリアダメ

Nat. Genet., 26, 211-215, 2000.

れている16）ージによって引き起こされたものであり、細胞内において

7） YonashiroR, Ishido S,：A novel mitochondrial
ubiquitin ligase plays a critical role in mitochondrial

MITOL が老化に関与することが示唆された。
今回、メスの MITOL cKO マウスでは、脱毛、白髪の増加、

dynamics, EMBO J., 25, 3618-3626, 2006.

表皮異常、および表皮の肥厚や皮脂腺の肥大化の増加など

8） Yonashiro R, Sugiura A,： Mitochondrial ubiquitinの炎症反応の進行がオスで観察された時期よりも遅れて観ligase MITOL ubiquitinates mutant SOD1 and察され、かつその程度が軽度であることがわかった。生体attenuates mutant SOD1-induced reactive oxygen内での活性酸素の除去にエストロゲンが関わることが報告

species generation, Mol. Biol. Cell., 20, 4524-4530, 2009.

。メスの MITOL cKO マウスの表現型の遅9） Sugiura A, Yonashiro R,：A mitochondrial ubiquitin

れは、エストロゲンの活性酸素の除去機能に起因している

ligase MITOL controls cell toxicity of polyglutamine-

ことが推測される。

expanded protein, Mitochondrion, 11, 139-146, 2011.

されている

17）

MITOL cKO マウスでは表皮肥厚が観察され、さらに、

10）Yonashiro R, Kimijima Y,：Mitochondrial ubiquitin

HaCaT 細胞を用いた MITOL ノックダウンの実験結果よligase MITOL blocks S-nitrosylated MAP1B-light

り、表皮分化マーカーであるインボルクリンの mRNA のchain 1-mediated mitochondrial dysfunction and発現量の低下が観察されている。インボルクリンは表皮分

neuronal cell death, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 0 0,化の過程において、有棘層から角層にかけて発現が強くな

2382-2387, 2012.

る分化マーカーであり、細胞内の Ca 濃度依存的な C キ11）Kovacs D, Raffa S,：Keratinocyte growth factor

ナーゼの活性化により、その発現が促進されることが知ら

down-regulates intracellular ROS production induced

れている。MITOL cKO マウスで観察された表皮の肥厚は、

by UVB, J. Dermatol. Sci., 54, 106-113, 2009.

2+ケラチノサイト内の ROS のレベルの上昇による細胞ダメ12）Velarde MC, Flynn JM,：Mitochondrial oxidativeージだけではなく、Ca2+ の濃度調節異常による分化異常のstress caused by Sod2 deficiency promotes cellular

可能性も考えられる。結論としてミトコンドリア機能低下

senescence and aging phenotypes in the skin, Aging

は老化に直結しており、今回作成された MITOL cKO マウ（Albany NY），4, 3-12, 2012.

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コスメトロジー研究報告 Vol.24, 201613）Pillai S, Oresajo C,：Ultraviolet radiation and skinrecord the effects of UV exposure and oxidative stressaging: roles of reactive oxygen species, inflammation

using human skin as a model tissue, Mutagenesis, 2 5,

and protease activation, and strategies for prevention

101-107, 2010.

of inflammation-induced matrix degradation - areview, Int. J. Cosmet. Sci., 27, 17-34, 2005.

16）Kujoth GC, Hiona A,： Mitochondrial DNA mutations,oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging,14）Kuhn A, Herrmann M,： Accumulation of apoptoticScience, 309, 481-484, 2005.

cells in the epidermis of patients with cutaneous lupus17）Yang XP, Reckelhoff JF,： Estrogen, hormonal

erythematosus after ultraviolet irradiation, Arthritis

replacement therapy and cardiovascular disease, Curr.

Rheum, 54, 939-950, 2006.

Opin. Nephrol. Hypertens. 20, 133-138, 2011.

15）Birch-Machin MA, Swalwell H, ：How mitochondria− 152 −