脂肪酸合成酵素遺伝子の新規発現調節機構に関する研究白川東北大学大学院農学研究科緒言仁准教授

答配列結合タンパク質 1c（SREBP1c）、炭水化物応答肥満は糖尿病をはじめとした代謝異常疾患の原因のひ配列結合タンパク質（ChREBP）、肝臓 X 受容体α（LXR

とつであるが、我が国において、成人男性の 3 人に１人、α）などの転写調節因子の関与が明らかにされている。

成人女性の 5 人に 1 人が肥満者（BMI が 25 以上）で細胞中の mRNA 量は、転写と分解により決定されるが、ある（平成 21 年度国民健康・栄養調査結果より）。肥

FASN mRNA の分解、特に近年明らかになった RNA

満者数の増加は先進国だけではなく、発展途上国におい分解に関わる低分子 RNA（miRNA）との関連についてても見られ、世界的な社会問題となっている。増加の原は、ほとんど解析が行われていない。そこで本研究では、因は、それぞれの国によって異なっているが、我が国でFASN の遺伝子発現制御、特に摂食後増大した mRNA

は、ライフスタイルの変化が主因と考えられている。つが急速に低下する現象（転写後制御）に着目して、新しまり、食事の質の変化と、運動量の低下によるとされてい制御機構の検索を行った。

いる。近年の健康ブームで、積極的に運動を行う人が増実験方法

えてきているにもかかわらず、肥満者が減少していない。

1. 動物実験

また、1 日あたりの摂取カロリーが昭和 25 年以降増加していないにもかかわらず、男性の肥満者は、30 年前（昭実験動物は、SD 系ラット（雄 6 週齢）を使用した。

和 55 年）に比べ、1.5 倍以上に増加し、平成 13 年以降、ラットを 24 時間絶食させた後、高炭水化物無脂肪食を成人男性肥満者は 30％前後で推移している。食事の質

2 時間給餌した。その後、再び絶食させた。給餌前（絶の変化については、「食の欧米化が原因」とされてきた食群）、給餌後 2 時間（摂食群）、6 時間（摂食 6 時間群）、が、動物性の脂質摂取量は、1 日あたり 26 グラムであり、10 時間（摂食 10 時間群）に解剖し、血清および肝臓を昭和 55 年の摂取量と同水準であることから、必ずしも、採取した。

動物性の脂質の摂取によって肥満者が増加している訳で
2. 血清マーカーの測定はない。以上のことから、肥満者数の増加の根本的な原因は未だ明らかではなく、解決すべき問題として残って血清グルコース濃度は、酵素発色法により測定した。

おり、脂質以外の食事成分（糖質、タンパク質など）やまた、血清インスリン、コルチゾール濃度は、ELISA食事の摂取タイミング（欠食など）が肥満を促進させて法により測定した。

いる可能性が考えられる。
3. 脂肪酸合成酵素、ならびに関連因子のmRNA量の測脂肪酸合成酵素（FASN）は、エネルギー代謝中間体定である acetyl-CoA と malonyl-CoA からパルミチン酸を合成し、余剰のエネルギーを脂肪酸へと変換させること肝臓から定法に従い、トータル RNA を精製した。吸から、脂肪量の増大（肥満）にも大きな影響を与えている。

光度、電気泳動により、得られた RNA の質、量を確認

本酵素活性は、食事やホルモンの影響を受けることが多した後、これを鋳型として cDNA を合成した。cDNA

くの研究で明らかにされている。すなわち、グルコースを便宜希釈し、定量 RT-PCR 法で各 mRNA の発現量をやインスリンは、FASN の酵素活性を上昇させるとと測定した。なお、各 mRNA 量は、真核生物伸長因子 1

もに、その mRNA 量を増大させる。グルコースやイン

α1 mRNA 量を内部標準として、相対発現量で表した。

スリンに依存した転写活性化については、ステロール応1白川

4. 転写因子のタンパク質量の測定

仁群 の 約 90 倍 ）（ 図 1A）。 ま た、FASN 遺 伝 子 と 同 様

肝臓の全抽出液、または肝臓核画分の抽出液を調製し、の制御を受けると考えられている SREBP1c、Stearyl-ウエスタンブロット法で FASN の発現制御に関わる転CoA desaturase-1（SCD-1）mRNA も、摂食群で有意写調節因子のタンパク質量を測定した。なお、各タンパに上昇し、摂食 6 時間群でピークとなった（図 1B）。

ク質量は、α−チューブリン（全抽出液の場合）、ラミA

ン A/C（核抽出液の場合）を内部標準として、相対発現B

5. ラットFASN mRNAの3ʼ-非翻訳領域を有するレポーター遺伝子の作成

ルシフェラーゼ遺伝子を有するレポータープラスミド
pGL4.12 のルシフェラーゼ遺伝子上流に、サイトメガ

150
100500

ロウイルス初期プロモーター／エンハンサー（pCI プラスミド由来）を、また下流に、ラット FASN mRNA 3ʼ

Relative expression

Relative expression

量で表した。

Fasting
Feeding 2hFeeding 6h
Feeding 10h

60200

FASN50403020100

SREBP1cSDC-1

図 1 Postprandial enhancement of mRNA levels ofFASN (A),SREBP1c and SCD-1 (B) in rat liver.

- 非翻訳領域（7493 〜 9009 塩基領域）を挿入した。構築したプラスミドをラット肝癌由来 Fao 細胞へカチオニックリポソーム法で導入した。24 時間後にグルコー

SREBP1c mRNA は 摂 食 10 時 間 群 で、 絶 食 時 と 同ス濃度の異なる培地へ交換し、2.5 時間培養した。その程 度 ま で 低 下 す る の に 対 し て、FASN お よ び SCD-1

後、細胞を回収し、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性mRNA では、摂食群と同程度までの低下であった。こをルシフェリン発光法で測定した。なお、各ルシフェのことから、SREBP1c の発現は、FASN、SCD-1 に比べ、ラーゼ活性は、レポータープラスミドとともに共導入し摂食後、より短い時間内で制御されることが示唆された。

た pCH110 プラスミド由来のβ−ガラクトシダーゼ活FASN の転写制御に関わる転写調節因子の発現量をウエスタンブロットで測定した結果を図 2 に示した。

性により標準化し、相対活性で表した。

成熟型の SREBP1c は、摂食 6 時間群で絶食群に比べ、結果

有 意 に 上 昇 し て い た（ 図 2A）。 こ の こ と は、FASN、

1. 血清生化学マーカーの解析

SREBP1c、SCD-1 の mRNA 発現量の上昇と相関して解剖時に得られた血清を用いて、グルコース、インスいた。また、核内のグルココルチコイドレセプター（GR）リン、コルチゾール濃度を測定した。その結果、グルコーは、摂食 6 時間、10 時間群で有意に低下しており（図ス値、インスリン値、ともに、絶食群に比べ摂食群で有2B）、血清コルチゾール濃度の低下と相関していた。有意に上昇し、ここをピークとして減少した（表 1）。また、

意な差ではないが、ChREBP、LXR α量が摂食群で上コルチゾール濃度は、摂食群で絶食群に比べ、有意に上昇傾向であった。

昇し、摂食 6 時間群、摂食 10 時間群で、有意に減少していた。

3. FASN mRNAの不安定化部位の推定

2. FASNおよび脂質合成関連遺伝子mRNAの発現変化

FASN mRNA の 分 解 に 関 わ る mRNA 上 の 部 位 を

FASN mRNA は、絶食群に比べ、摂食群で 11 倍にプライマー伸長法によって検索した。肝臓から得られ上昇し、さらに摂食 6 時間群でピークを迎えた（絶食たトータル RNA から cDNA を合成する際に、FASN

表 1 Serum levels of glucose, insulin and cortisol before and after feeding of the diet.
Fasting

Feeding (2h)Feeding (6h)Feeding (10h)Glucose (mg/dl)

116.5 ± 7.0

172.3 ± 10*167.0 ± 3.0*

154.7 ± 7.0*

Insulin (ng/ml)

0.18 ± 0.03

0.65 ± 0.06*

0.41 ± 0.05

0.55 ± 0.06*

Cortisol (ng/ml)

24.1 ± 1.1

36.4 ± 0.4*

13.7 ± 1.1*

6.16 ± 0.2*

Values are means SE. (n = 4) * P < 0.05 vs fasting group.

2脂肪酸合成酵素遺伝子の新規発現調節機構に関する研究

A

Fasting

3ʼ-UTRFASN mRNA

Feeding 2h Feeding 6h Feeding 10hORF

5ʼSREBP1c①②

AAAAA 3ʼ③ ④ ⑤ ⑥⑦⑧ GSPPPARα100

Relative expression

LXRαα-tublin
76

Relative expressionFastingFeeding 2hFeeding 6hFeeding 10h*54*1010.1①②③④⑤⑥⑦⑧* P＜0.053

図 3 Prediction of RNA degrading point of FASN
mRNA by RT-PCR.

21

プライマー対⑥と⑤で有意な差が見られた。また、プラ0Mature
SREBP1cPPARα

イマー対③と②の間でも有意な減少が観察された。

LXRα

このことから、プライマー対⑤⑥間（8194 〜 8352

* P＜0.05 vs fasting group.

塩基）、および、プライマー対②③間（7184 〜 7441 塩基）

図 2 Measurement of transcription factors involved
in lipid metabolism in liver before and after
feeding of diet.
B

で、FASN mRNA が分解される可能性が示唆された。
一 方、 同 様 の 解 析 を、SREBP1c、SCD-1 mRNA について行ったが、FASN mRNA で見られた cDNA の消Feeding 2h Feeding 6h Feeding 10h

Fasting

失部位は検出できなかった。

GRFASN mRNA の 8194 〜 8352 塩基領域を標的とする

CREB

miRNA の発現量を定量 RT-PCR 法で測定した。そのChREBP

結果、摂食後に発現量が変化する miRNA が数種有り、Lamin A/C

これらの miRNA を通じて FASN mRNA 量が制御される可能性が考えられた（図 4）。

Fasting
Feeding 2hFeeding 6h
Feeding 10h

3.0

Relative expression*Fasting
Feeding 2hFeeding 6hFeeding 10h2.5

4. レポーター遺伝子解析

2.0

ラット FASN mRNA の 3ʼ- 非翻訳領域を有するプラスミド、および含まない対照プラスミドを Fao 細胞に1.5導入し、24 時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。

1.00.50*GR

その結果、対照プラスミドに比べ、非翻訳領域を含むプ*

ラスミドを導入した場合、ルシフェラーゼ活性が低下しCREBており、FASN mRNA の 3ʼ- 非翻訳領域が RNA の不安ChREBP定化に関与することが示唆された。

* P＜0.05 vs fasting group.

続いて、3ʼ- 非翻訳領域を有するプラスミドを細胞へ

図 2 Measurement of transcription factors involved
in lipid metabolism in liver before and after
feeding of diet.

導入後、培地グルコース濃度を変化させた場合の影響にmRNA に特異的なプライマーを用いた。本 cDNA をmM）と比較して、11 mM、25 mM では、ルシフェラー鋳型として、FASN mRNA の各部位を PCR 法で検出

ゼ活性の低下傾向、および有意な低下が観察された（図した（図 3 上）。その結果、プライマー対⑥、⑦、⑧で5）。以上のことから、FASN mRNA の 7493 〜 9009 塩

増幅した PCR 産物量に大きな差は見られなかったが、基の領域には、グルコースに応答して本 mRNA の分解ついて観察した。その結果、生理的グルコース濃度（5.53Relative expression

白5Fasting

4Feeding 2hFeeding 6hFeeding 10h

川仁3210abaaabbbabb

miR-16 miR-103-1 miR-195 miR-27a miR-27b

miR-107

miR-24

Relative luciferase activity

図 4 Measurement of microRNA levels in liver before and after feeding of the diet.

餌 2 時間後に再絶食させたが、mRNA の上昇は摂食開1.21.0

始 6 時間後まで続き、FASN、SREBP1c、SCD-1、それぞれ 88、28、52 倍に上昇した。10 時間後では、い*ずれの遺伝子の mRNA 量は低下したが、SREBP1c で0.80.6は絶食時と同じレベルまで著しく減少した。成熟型

0.4

SREBP1c タンパク質は摂食群ではほとんど変化が見0.2られず、摂食 6 時間群で顕著に増加した。一方、核内0ChREBP 量は摂食群で上昇傾向であったが、群間で大5.5 mM 11 mM 25 mMきな変化が見られなかった。また、LXR α量は摂食後* P＜0.05 vs 5.5 mM.

2 時間、6 時間で上昇傾向にあり、FASN mRNA 量の

図 5 Reporter activity derived from FASN 3ʼ-UTRconstruct was reduced by high glucose mediumin rat hepatoma Fao cells.

変化と相関が見られた。LXR αのリガンドとして、グに関与する領域を含むことが示唆された。の発現上昇に繋がったと推定される。以上のことから、ルコースが同定されていることから、血清グルコース濃度の上昇により、LXR αが活性化され、FASN mRNA
摂食 2 時間後に見られる FASN mRNA の上昇は、血清考察

グルコース濃度の上昇に伴う、ChREBP や LXR αの活

肝臓における FASN mRNA 量の発現制御について性化により引き起こされること、また摂食 6 時間後には、本遺伝子の転写反応とこれを活性化する転写調節見られた顕著な増加については、SREBP1c の活性化に因子を中心に行われてきた。これまでに、SREBP1c、寄るものと推定された。今後、これらの転写調節因子のChREBP、LXR αなどが FASN mRNA の発現上昇に直接的な関与をクロマチン免疫沈降法により示す必要が関与していることが数多く報告されている。mRNA 量ある。の制御に関わるもう一方の機構である、RNA の分解、FASN mRNA 特異的プライマーを使用して cDNA を安定化については、培養細胞での試験報告は見られるが、合成し、FASN cDNA の各部位（特に、3ʼ 末端側半分十分に解析が行われていない。本研究では、絶食−摂食の領域）を横断的に PCR により増幅することにより、−再絶食のサイクルにおける FASN mRNA 量の変化をRNA の分解に関わる領域の有無を検索した。その結RNA 分解、特に miRNA に焦点をあて解析を行った。

果、cDNA 上の 7184 〜 7441 塩基（ORF 内）、8194 〜

絶食後に無脂肪食を再給餌すると、FASN や脂肪合8352 塩基（3ʼ- 非翻訳領域内）の領域で、cDNA の欠失成関連因子の mRNA 量は急激に上昇するが、本試験にが見られ、この部位で mRNA 分解が起こる可能性が示おいても、再給餌開始 2 時間後に、FASN、SREBP1c、唆された。また、FASN mRNA の 3ʼ- 非翻訳領域を有SCD-1 mRNA は 絶 食 時 の 10 倍 以 上 に 上 昇 し た。 給するレポーター遺伝子の解析結果からも、3ʼ- 非翻訳領4

脂肪酸合成酵素遺伝子の新規発現調節機構に関する研究の過剰発現の機構解明の一部に寄与できると考える。

域内に本 mRNA の分解に関わる配列の存在が示唆された。一方、SREBP1c、SCD-1 については、同様の欠失謝が検出されなかったことから、RNA の安定性、分解に辞

お い て、FASN と SREBP1c、SCD-1 は 異 な る 制 御 を本研究は公益法人三島海雲記念財団の平成 23 年度「学受けることが示唆された。8194 〜 8352 塩基領域を標術研究助成金」により行われました。研究助成を賜りま的とした miRNA は、7 種類存在し、そのうち、摂食後した公益法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様にに miRNA 量が変化するものが数種存在していた。こ深く御礼を申し上げます。また、研究の遂行にあたり、れらの miRNA の発現変化により、FASN mRNA の分

東北大学大学院農学研究科の我妻紀代恵氏の協力を得ま解が促進する可能性が考えられるが、今後、これらのした。ここに、感謝申し上げます。

miRNA が直接 FASN mRNA 分解に関与するかどうか
参考文献について確認する必要がある。また、7184 〜 7441 塩
基部位についても、miRNA の関与など詳細に確認す

1）P Ferré P , F Foufelle: Diabetes Obes Metab., Suppl 2,
83 - 92, 2010.
2）M. S. Strable, J. M. Ntambi: Crit. Rev. Biochem. Mol.
Biol., 45, 199 - 214, 2010.
3）A. Katsurada, et al, : Eur. J. Biochem. 190, 427 - 433,1990.
4）N. Iritani: Eur. J. Biochem., 205, 433 - 442, 1992.
5）B. R. Wilfred, et al, : Mol. Genet. Metab., 91, 209 - 217,2007.
6）N. Mitro, et al, : Nature. 445, 219 - 223, 2007.
7）J. H. Park, et al, : Mol. Cells. 31, 33 - 38. 2011.

る必要がある。これまでに、食餌誘導の肥満マウスのmiRNA 変化について報告があり、FASN を標的とするmiRNA が報告されている（miR-107）が、本試験において、miR-107 量は群間で差が見られなかった。
本研究によって、FASN mRNA 分解に関わる部位が推定され、本遺伝子の新しい制御機構の一部を見出すことができた。今後、詳細な機構解析を行うことによって、Ⅱ型糖尿病などインスリン抵抗性下で見られる FASN

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