【研究報告】（自然科学部門）

高度侵入警戒病害ペピーノモザイク病に対する分子耐性機構を利用した予防技術の確立

山次

東京大学大学院農学生命科学研究科
緒康幸特任准教授害を与える 4）。特にヨーロッパで猛威を奮っており、

言
植物ウイルスは世界中で多様な作物生産に甚大な被1999 年にオランダのトマトに発生したのを皮切りに、害を与えている。植物ウイルスによる世界の作物生産の2011 年までにヨーロッパ全域に感染範囲を拡大した。

損失額は年間約 6 兆円に及ぶと考えられている。植物ウ

さらに、ペピーノモザイク病は北米、アジア、アフリカ

イルス病の最も深刻な課題は根本的な治療法がないことにも感染域を拡大しつつある。我が国への侵入も高度にである。菌類病や細菌病のように病原が生物ではないた警戒されており、侵入時に備えて既にペピーノモザイクめ、病原菌独自の代謝系を阻害するような化学物質の合病を検出する診断キットが国内向けに販売されている。

成は極めて困難であり、これまでに植物ウイルスに対す

ペ ピ ー ノ モ ザ イ ク 病 の 病 原 で あ る pepino mosaicる化学農薬は開発されていない。

virus（PepMV）はポテックスウイルスというグループ

現状のところ植物ウイルスに対する最も効果的な防に含まれる植物ウイルスである。ポテックスウイルスに除法のひとつが抵抗性育種である。抵抗性育種によりウ対する抵抗性遺伝子はこれまでに Rx と JAX1 の 2 つがイルス抵抗性品種が得られれば、ウイルス病による被害報告されている 2）。Rx 遺伝子はジャガイモ由来の NB-が劇的に軽減される。しかし、抵抗性育種にもいくつかLRR 遺伝子の 1 種であり、ポテックスウイルスに幅広く1）の課題がある 。その一つは利用できる抵抗性遺伝子の抵抗性を示すが、約 10％の頻度で抵抗性打破ウイルス

種類に限りがあるため、ウイルスの素早く多様な変異にが発生する 5）。また、Rx 抵抗性打破ウイルス変異株で対応することができず、たびたび打破されてきた点であは外被タンパク質（CP）遺伝子に変異が認められるこる。したがって、ウイルスに対して打破されにくく、強とから、Rx タンパク質による CP の認識が阻害されるこ

固な抵抗性を維持するためには作用機序の異なる多様なとにより抵抗性が打破されると考えられている 5）。一方抵抗性遺伝子を準備することが重要である。

で、JAX1 はアブラナ科由来のレクチン遺伝子の 1 種であらゆる植物は病害抵抗性を備えており、それらをあり、ポテックスウイルスに幅広く抵抗性を示す 3）。

総称して植物免疫と呼ぶ。植物免疫には様々な作用機序

JAX1 は細胞レベルでウイルス増殖を阻害する強固なウのものがあることが知られており、植物ウイルスに対すイルス抵抗性を示すが、抵抗性打破の有無や程度、メカる抵抗性育種には NB-LRR 遺伝子が抵抗性遺伝子資源ニズムについては不明である。そこで、本研究では2）として用いられてきた 。NB-LRR 抵抗性遺伝子は植物JAX1 によるウイルス抵抗性の打破とそのメカニズムにウイルスタンパク質を認識することにより防御応答経路関する解析を行った。

を活性化し、プログラム細胞死を誘導してウイルスを死結細胞に閉じ込める。筆者らは新たにレクチンをコードす果
まず、JAX1 を恒常的に発現する形質転換

る JAX1 が植物ウイルスに抵抗性を示すことを明らかに3）し、レクチン抵抗性と名付けた 。JAX1 による抵抗性（35S::JAX1）にポテックスウイルスの 1 種の作用機序は不明であるものの、従来型抵抗性の様々なである potato virus X（PVX）を通常接種法であるアグ指標が観察されないため、レクチン抵抗性は新たな作用ロインフィルトレーション法により接種したが抵抗性を機序を持つウイルス抵抗性であると考えられる。

打破するウイルスは現れなかった（図 1）。そこで、より効率よくウイルスを接種するために、接ぎ木を利用しペピーノモザイク病はトマトに果実の奇形、葉のモた接種法を試みた。野生型

ザイクなどの病徴を引き起こし、トマト生産に甚大な被1（WT）を台山次康

幸

図3
図1JAX1 による抵抗性を打破したウイルス分離株は 2 種類の変異を生じていた（変異塩基は白抜きで表示）。いずれも複製酵素
336 番目のグルタミン酸 Q がヒスチジン H に変異していた。

JAX1 による抵抗性は通常のウイルス接種により打破されない

A. 通常接種法による JAX1 形質転換植物へのウイルス接種。
B. ウイルス接種 5 日後の写真。ウイルス病徴は観察されない。

図2

抵抗性打破株のシークエンス解析

JAX1 による抵抗性はウイルスの接ぎ木接種により打破される

A. 接ぎ木接種法によるウイルス接種。野生型植物（台木）にJAX1 高発現植物（穂木）を接いだうえで、台木部分にウイルスを接種した。B. ウイルス接種 4 週間後の写真。ウイルス病徴が観察されなかった植物（NS）と観察された植物（1–5）。C.
ウイルス RNA と JAX1 RNA の RT-PCR による検出。

木として 35S::JAX1 を接ぎ木し、台木の WT にウイルスを接種する接ぎ木接種を行った（図 2A）。その結果、
図4

JAX1 を発現する上位葉にモザイク症状を呈するウイル

Q336H 変異体は JAX1 形質転換体に感染した

A. PVX 複製酵素の 336 番目のアミノ酸を Q から H に置換した変異体の模式図。変異導入塩基に下線。B. 変異 PVX を接種した野生型および JAX1 形質転換体の 14 日後の病徴。C. RT-PCR
による各接種植物の上葉におけるウイルス RNA と JAX1 RNAの検出。

ス株が複数認められた（図 2B）。これらから全 RNA を抽出し RT-PCR を行った結果、病徴が観察されたいずれの植物体からもウイルスが検出された（図 2C）。これ
らの抵抗性打破ウイルス株の全塩基配列を解読したとこ
ろ、複製酵素遺伝子に変異をもつ 2 種類の PVX 変異体酸がヒスチジンに変異する非同義置換を生じていた。

（JB1、JB2）が得られた（図 3）。JB1、JB2 ともに 1092

JB2 はさらに 549 番目の塩基が変異していたがアミノ酸番目の塩基が変異して複製酵素の 336 番目のグルタミンの変異を伴わない同義置換であった。
2高度侵入警戒病害ペピーノモザイク病に対する分子耐性機構を利用した予防技術の確立ることで広くポテックスウイルスの感染を阻害している

これらの変異体に生じた変異が JAX1 抵抗性の打破にと考えられた。

関与するかどうかを調べるため、JB1 と JB2 に相当する
PVX 変異体（それぞれ 1092C、549A1092T）を作出した

考（図 4A）。また、1092 番目の塩基を T に置換した変異体

察1092T も作出した。これらを野生型および JAX1 形質転これまでに 10 以上の植物ウイルス抵抗性遺伝子が単離換植物に接種した結果、それぞれ JB1 と JB2 に相当するされているが、抵抗性打破ウイルスの出現頻度は大きく

1092C と 549A1092T はいずれの植物においても全身感異なる 1）。例えば tomato mosaic virus に対するトマト由染した（図 4B）。一方で、1092T はいずれにおいても全来の抵抗性遺伝子 Tm-1 は打破されやすく、同じくトマ身感染しなかった。これらの結果は RT-PCR によってト由来の Tm-22 は打破されにくい。ポテックスウイルス確認された（図 4C）。以上の結果より、Q336 の変異にに対する抵抗性遺伝子である Rx も打破されにくいタイ

より JAX1 抵抗性が打破されることが示唆された。

プの抵抗性遺伝子だとされているが、Rx 形質転換植物にPVX 複製酵素の Q336 付近の領域をポテックスウイル

汁液接種によりPepMV を接種すると約 10％の割合で打スの間でアラインメントしたところ、Q336 がポテック破株が出現した 5）。本研究では汁液接種よりも効率のよスウイルスの間で広く保存されていることがわかった

いアグロインフィルトレーション法によりウイルスを接（図 5）。このことから、JAX1 はこのアミノ酸を認識す種したが、JAX1 抵抗性打破ウイルスを得ることができなかった（図 1）。一方、最も抵抗性打破ウイルスの出現しにくい抵抗性遺伝子として tobacco mosaic virus に対する由来の抵抗性遺伝子 N が知られ1）ているが 、N に対する抵抗性打破ウイルスは接ぎ木接種法により得られている 6）。そこで本研究でも接ぎ木接種法を導入したところ、JAX1 抵抗性打破ウイルスが生じた。以上のことから、JAX1 は N に匹敵するほど抵抗性が打破されにくい抵抗性遺伝子であると考えられる。
JAX1 抵抗性の打破されにくい性質は JAX1 抵抗性の図5特徴と関連すると考えられる。植物ウイルスは感染細胞複製酵素の 336Q はポテックスウイルスで広く保存されている中では、ゲノム配列に様々な変異を持つ膨大なウイルスの集合体として存在すると考えられていて、この集団はポテックスウイルスの複製酵素の Q336 付近の配列のアラインメント。矢頭は Q336 を示す。

図6

quasispecies とよばれている 1）。そのため、抵抗性遺伝

JAX1 抵抗性打破株の発生模式図
3

山次康

幸

要子を打破する変異ウイルスもこの quasispecies の集団中約から派生してくると考えられる。しかし、JAX1 による高度侵入警戒病害ペピーノモザイク病予防技術確立

ウイルス抵抗性は単細胞レベルでウイルス増殖を阻害すを目的として、同病の病原である PepMV を含むポテッる強固なウイルス抵抗性であることが明らかにされていクスウイルスに対する抵抗性遺伝子 JAX1 の抵抗性打破3）る 。したがって、通常の接種法では、JAX1 形質転換に関する研究を行った。通常接種法では打破ウイルスが植物においてウイルスが打破株を生じるのに十分な発生せず、接ぎ木接種法によって初めて打破ウイルスがquasispecies の集団を増殖する前に不活化されてしまう生じたことから、JAX1 は最も抵抗性の打破されにくいために、打破株が生じ得ないと考えられる。一方で、接抵抗性遺伝子にひとつであることを示した。接ぎ木接種ぎ木接種法では野生型植物の台木中でウイルスが十分に法により得られたウイルスは複製酵素遺伝子に変異を生増殖することにより、十分な quasispecies の集団を確保じていたことから、ウイルスの複製酵素が JAX1 抵抗性できるため、JAX1 形質転換植物の穂木中で打破株を生に関わることを明らかにした。本研究により JAX1 がポじ得ると考えられる（図 6）。以上より、JAX1 による細テックスウイルスの防除に有望な抵抗性遺伝子であるこ胞レベルの抵抗性はウイルスに変異する機会を与えないとを明らかにした。既存の抵抗性遺伝子との併用によりほど強力であると考えられる。

打破されにくく強固なウイルス抵抗性の付与が可能になると期待される。

JAX1 はアブラナ科のシロイヌナズナから単離した抵抗性遺伝子であるが、トマトと同じナス科の謝でウイルスに抵抗性を示す。また、JAX1辞がポテックスウイルスの中で系統的に離れている 4 種の

本研究は公益財団法人三島海雲記念財団の平成 25 年

ウイルス全てに対して強固な抵抗性を示すことを明らか

度学術研究助成金により行われました。ご支援を賜りまにしている。そのためトマトにおいて JAX1 を発現させした公益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆ることによりPepMV にも抵抗性を示すことが強く期待様に深く感謝申し上げます。

される。本研究では JAX1 が抵抗性打破株の生じにくい
文

優れた抵抗性遺伝子であることを示したが、JAX1 と Rx
は作用機序が異なる抵抗性遺伝子であるため併用が可能

献1） R. Hull: Plant Virology Fifth Edition. Academic Press,2013.
2） K. K. Mandadi, K. B. G. Scholthof:, 25, 1489–1505, 2013.
3） Y. Yamaji, et al.:
, 24, 778–793, 2012.
4） I. M. Hanssen, B. P. Thomma:, 11,179–189, 2010.
5） T. Candresse, et al.:
, 23,376–383, 2010.
6） M. Zaitlin: Phytopathology, 52, 1222–1223, 1962.

であると考えられる。JAX1 と Rx の両方を持つトマトを作出することにより、より強固な抵抗性をもつトマト品種の作出が可能になると期待され、トマトの安定生産・供給に貢献すると期待される。また、レクチン抵抗性の応用によりNB-LRR 遺伝子による抵抗性にのみ依存していたウイルス病抵抗性育種に新たな選択肢が加えられ、NB-LRR 遺伝子とレクチン遺伝子の併用により打破されにくく強固なウイルス抵抗性が可能になると期待される。

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