エラスチン類似ポリペプチドの合理的設計による温度応答性ゲルの創製
名古屋大学大学院工学研究科応用物質化学専攻

鳴瀧彩絵

Elastin-like polypeptides (ELPs) are functional polymers that show elasticity and lower critical solution temperature(LCST) as native elastin. We have developed a novel class of “double-hydrophobic” block ELPs named GPG and its
derivatives with added functional motifs. A series of GPG comprises proline-rich (VPGXG) 25 and glycine-rich (VGGVG) 5 ,both of which dehydrate at higher temperature but form distinct secondary structures, β-turn and β-sheet respectively. GPG
initially assembles into nanoparticles, which further connect into beaded nanofibers. In this study, a new derivative GPPG,
where (VPGXG) 25 is repeated twice via a short linker sequence, has been constructed for the purpose of obtaining a physicalgel of ELP. The longer proline-rich sequence of GPPG might bent more freely than that of GPG, resulting in the formation ofbranching nanofibers. GPPG ( 20 μM, 0 . 034 wt%) assembled into nanoparticles and aggregates of nanoparticles while GPG( 20 μM, 0 . 055 wt%) organized into nanofibers in water at 37 ºC. When the concentration of polypeptides was increased
to 0 . 3 wt%, both GPG and GPPG precipitated from aqueous solution. However, when GPG and GPPG was mixed at 9 : 1
weight ratio the mixture formed a physical gel at the polypeptide concentration of 0 . 3 wt%. The gel formation at such a low
concentration is unprecedented in the field of ELP. The homogeneous nanofiber formation with suitable branching might
be responsible for the gelation. This work will open up the possibility of ELPs for use in the cosmetology and biomedical
research fields.

1. 緒

告した（図 1 ⒝）4-8）。ナノファイバーは粒子が数珠状に連言結したユニークな構造を持ち、分岐をほとんど持たない。

エラスチンは、その名のとおり elasticity（弾性）に関与

GPG は、プロリンに富む P 配列を分子中央部に、グリシする細胞外マトリクスタンパク質であり、皮膚・血管・靭ンに富む G 配列を分子両末端に有する。20 ℃付近に LCST帯などにおいて線維状の弾性組織を形成し、組織に伸縮を持つ P 配列が疎水的に凝集してナノ粒子を形成したのち、性を与える 1）。そのユニークな力学特性や生体適合性から、

G 配列が粒子間で β-sheet 構造を形成して数珠状ファイバ

エラスチンは化粧品や医療材料への応用が期待されるが、ーを形成するモデルをこれまでに提案している（図 1 ⒞）1）。

他の細胞外マトリクス成分であるコラーゲンやヒアルロン

ナノファイバーが分岐を生じない理由は、P 部位の剛直性2）酸に比べ、その利用は大幅に遅れている 。これは、生体にあると考えられる。つまり、P 部位は β - turn 構造が集積由来エラスチンが高度に架橋され不溶化しており、均質でした β -spiral というらせん構造をとりやすく、ランダムコ扱いやすい素材を得るのが困難なためである。

イル状の分子鎖と比較して長い持続長を持つ。このため P

本研究は、使いやすく、制御性のよいエラスチン材料を部位に連結した G 部位は粒子の両極に位置しやすくなる。

生み出すことでコスメトロジーの発展に寄与することを大ナノファイバーに適切な絡み合いを持たせて自立性のあきな目的とする。エラスチン由来のアミノ酸配列を含み、るゲルへと展開できれば、エラスチンの粘弾性特性を活か人工的に作製されるエラスチン類似ポリペプチド（Elastin-した細胞培養基材や創傷治療剤の開発につながる。本研究Like Polypeptide；ELP）は、天然エラスチンの特色であるでは、ELP 配列の合理的なデザインを通じて自己集合性エントロピー弾性と下限臨界共溶温度（LCST）を再現できナノファイバーに分岐構造を導入することを目的とした。

3）

る機能性高分子として注目されている 。筆者らはこれま本研究で新しく作製するポリペプチドである GPPG のアミでに、エラスチン由来の 2 種類の配列モチーフを組み合ノ酸配列を図 1 ⒜に示す。GPPG は GPG にさらに P 配列をわせた新規なブロック ELP である GPG（図 1 ⒜）を作製し、挿入し、P 配列間をフレキシブルなリンカー配列（KLGSG）

これが水中で温度刺激によって自己集合し、生体エラスチで連結している。リンカーの効果により、GPPG では P 配ンのような線維構造（ナノファイバー）を形成することを報列の接続部分で分子鎖の柔軟な折れ曲がりが可能となり、分岐構造を生じると予想した。

Development of temperature-responsivegels through the rational design ofelastin-like polypeptides
Ayae Sugawara-Narutaki
Department of Materials Chemistry,
Graduate School of Engineering, NagoyaUniversity2. 実

験

2. 1. GPPG の合成と精製
GPG をコードするプラスミド DNA である pET22b（+）- GPG4） の BamHI 制限酵素サイトに P 配列をコードするDNA 断片をライゲーションし、pET22b（+）-GPPG を得た。

− 16 −

エラスチン類似ポリペプチドの合理的設計による温度応答性ゲルの創製（アメリカ化学会より許可を得て
図 1 ⒜ GPG および GPPG のアミノ酸配列，⒝ GPG ナノファイバーの原子間力顕微鏡（AFM）像 1）転載），⒞予想される GPG 自己集合のモデル図．

図2

GPPG の ⒜ SDS-PAGE および ⒝ MALDI-TOF-MS の結果．

DNA シーケンサーを用いた配列解析により GPPG をコー

3. 結ドする遺伝子の存在を確認した。pET22b（+）-GPPG を用いて大腸菌 BLR 株を形質転換し、GPPG タンパク質を発果

3. 1. GPPG の合成と精製現させた。タンパク質を金属アフィニティークロマトグラ

DNA シーケンサーを用いた配列解析の結果、pET22b

フィーにより回収し、純水に対して透析して塩類を除去し（+）-GPPG には GPPG をコードする遺伝子が正しく挿入さたのち、凍結乾燥して試料粉末を得た。ドデシル硫酸ナト

れていた。発現したポリペプチドについての SDS-PAGEリウム－ポリアクリルアミド電気泳動（SDS -PAGE）とマ

および MALDI - TOF - MS の結果を図 2 に示す。GPPG の理

トリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析

論分子量は 27,700 Da である。SDS-PAGE において分子量（MALDI- TOF - MS）により精製を確認した。

27 kDa のマーカー付近に最も濃いバンドが出現し、そのほかに複数本の薄いバンドが観察された。MALDI-TOF-

2. 2. 自己集合体の形成

MS で観測された生成物の分子量は 27,732 Da であった。

GPG と GPPG をそれぞれ 20 µM（それぞれ 0.034 および0.055 wt%）となるように冷水に溶解させたのち、37 ℃で以上のことより、GPPG を主成分とする生成物が得られたと言える。

7 日間インキュベートした。この間、円二色性（CD）分散計で 190 〜 260 nm の吸光度を測定することにより、タン3. 2. 自己集合体の形成

パク質二次構造の変化を調べた。7 日後の試料溶液をマイ

GPG および GPPG を、濃度が 20 µM となるように冷水カ基板に滴下し、37 ℃で自然乾燥したのちに、原子間力に溶解させた。15 ℃の条件で CD スペクトルを測定したと顕微鏡（AFM）で形態を観察した。

ころ、どちらのポリペプチドにおいても 200 nm に負のバ

さらに、ポリペプチド濃度を 0.3 あるいは 0.4 wt% に増ンド、224 nm 付近に負のショルダーが現れた（図 3）。これ加させて 37 ℃に昇温し、1 日後に溶液の外観の変化を観らはそれぞれ、ランダムコイル構造および ㌼ -turn 構造に由察した。総ポリペプチド濃度を 0.3 wt% に固定し、GPG と来しており、（VPGXG）n 配列を有する ELP に特徴的なスGPPG を所定量混合した試料についても観察を行った。

ペクトルである 4，9）。この溶液を 37 ℃に加温すると、スペ− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図3⒜ GPG および ⒝ GPPG の CD スペクトル．

クトルは経時的に変化した。どちらの場合にも、198 nmの楕円率が正の方向へ増大する一方、218 nm の楕円率は負の方向に増大した。これらは、㌼ -sheet 構造の割合が 1週間にわたり増加し続けていることを示している。1 モル残基当たりの楕円率を比較すると、㌼ -sheet 構造に由来する楕円率の強度は GPG のほうが GPPG よりも大きかった。
37 ℃で 1 週間静置したサンプルをマイカ基板に滴下したのち乾燥させ、AFM で観察した結果を図 4 に示す。
GPG はナノファイバーへと組織化しており、ファイバー径は 42.3 ± 7.5 nmであった。45 ℃で自己集合させた場合 4）

図4⒜ GPG および ⒝ GPPG が形成する集合体の AFM 像．と比較するとやや不明瞭ではあるが、数珠状のモルフォロジーを有していた。これに対し、GPPG は直径 25.6 ± 7.4nmのナノ粒子を形成しており、その凝集体も多く見られた。
ポリペプチド濃度を 0.4 wt% に上昇させ、37 ºC で 1 日間インキュベートすると、GPG は半透明のハイドロゲルを形成した。一方、GPPG は同じ条件で沈殿を生じた。ポリペプチド濃度を 0.3 wt% として 37 ºC に昇温すると、GPG、GPPG の両方において沈殿を生じた。これに対し、総ポリペプチド濃度を 0.3 wt% に固定した条件で GPG と GPPG を9：1（w/w）の割合で混合すると、1 日後に半透明のハイドロゲルを形成した（図 5）。GPG と GPPG を 8：2，7：3

図 5 GPG と GPPG を 9：1（w/w）
で混合して得られるハイドロゲルの写真（ポリペプチド濃度 0.3 wt%）．

で混合した場合には、粘調な液体が得られた。

4. 考た（図 4）。GPG においては、分子中央の P 配列が㌼ -turn の察集積構造である㌼ - spiral 構造をとるため、棒状分子としてポリペプチド濃度が 20µM の条件における CD スぺク振る舞うと推測される。疎水的な P 配列は水中で集合してトル測定の結果から、GPG と GPPG はともに 37 ℃の水中ナノ粒子を形成するとともに、棒状の形態により互いに配で、経時的に㌼ - sheet 構造を形成することがわかった（図 3）。

列する。P 配列に結合した G 配列は粒子の両極に位置する

GPPG において 1 モル残基当たりの㌼ -sheet 構造形成割合ようになり、他の粒子と㌼ - sheet 構造を形成して数珠状ナが低いのは、㌼ -sheet 構造を形成しうる G 配列が分子中でノファイバーへと組織化すると考えられる。一方、GPPG占める割合が、GPG（26 %）> GPPG（15 %）であること

においては P 配列がフレキシブルなリンカー配列で接続さに起因すると考えられる。両ポリペプチドが、生理学的温れており、容易に曲がることができる。このため、G 配列度に応答して分子間自己集合の駆動力となる㌼ -sheet 構造は粒子中でよりランダムに配置し、粒子内部で㌼ - sheet 構を形成したものの、GPG はナノファイバーへと組織化し、造を完結させたり、あらゆる方向に粒子間㌼ - sheet 構造をGPPG はナノ粒子およびナノ粒子の凝集体へと自己集合し形成することが可能となる。この結果、GPPG はナノ粒子− 18 −

エラスチン類似ポリペプチドの合理的設計による温度応答性ゲルの創製状、あるいはナノ粒子の凝集体へと自己集合したと考えら助的に利用されているにすぎない。シルクエラスチンの場れる。今回検討を行った 20 µM の濃度において、GPPG は合、ゲル形成に必要な濃度は 4 wt% と報告されている 15）。

当初の狙いであった分岐を持つナノファイバーへと組織化

いずれにしても、1 wt% 以下での物理ゲル形成は ELP 研究することはなかったが、高度に分岐した極端な状態としてでは報告されておらず、本研究にて達成された 0.3 wt% でナノ粒子の凝集体を形成したとも言える。のゲル化は画期的であると言える。本 ELP ゲルは、均一GPG が分岐の少ない数珠状ナノファイバーへ、GPPG がなナノファイバーであり、水との接触界面積が大きい数珠ナノ粒子凝集体へと集合するのであれば、両者を適切な割状のモルフォロジーを持つことが、低濃度でのゲル化につ合で混合することにより、分岐構造を持つナノファイバーながったと考えられる。本研究で開発した ELP は制限酵が得られるのではないかと考えた。ファイバーの分岐構造

素サイトや精製用タグ配列を除けば、all-elastin 由来であは、マクロスコピックな溶液の粘弾性に影響を与えると予るため、エラスチンが本来有する力学特性を最大限に再現想し、ポリペプチド濃度を増加させて溶液のゲル化の有できる材料となることが期待される。今後、GPG と GPPG無を調べた。ポリペプチド濃度を 0.4 wt%（GPG：238µM,の混合比を変化させることで、粘弾性特性を連続的に変化

GPPG：144 µM）とし、37 ℃で 1 日インキュベートしたとさせることを試みる予定である。

ころ、GPG を含有する水溶液は流動性を失って半透明の5. 総ゲルを形成した。GPPG は同じ条件で沈殿を生じた。濃度

括20 µM のときの結果から類推すると、GPG ではナノファ

本研究では、新規な ELP である GPPG を遺伝子工学のイバーの絡み合いによってゲルを生じ、GPPG は凝集体を手法を用いて合成した。GPPG は、GPG がナノファイバー生じたと考えられる。ポリペプチド濃度を 0.3 wt% に低下化する温度条件においてナノ粒子状およびナノ粒子の凝させた場合、GPG でも沈殿を生じ、水溶液のゲル化には集体へと自己集合し、当初予想した分岐ナノファイバーは至らなかった。しかし、GPG と GPPG を重量比が 9：1 と得られなかった。しかし、凝集体は数珠状ナノファイバーなるように混合した場合、ゲルを形成した（図 5）。8：2，7：3が多数の分岐を生じた極端な状態であると考え、GPG とで混合した場合には粘調な液体となり、いずれも GPG まGPPG を混合することにより GPG ナノファイバーへ分岐をたは GPPG 単独の場合と異なる結果が得られた。GPG と導入することを試みた結果、GPG と GPPG を 9：1（w/w）

GPPG の混合により、GPG が単独で形成するナノファイバで混合することで、0.3 wt% という低濃度でハイドロゲルーと比較して分岐構造が導入されてネットワーク構造を構を得ることができた。筆者らはこれまでに、GPG の C 末築し、より低濃度でのゲル化が達成された可能性を考えて端に様々な機能性モチーフを付加することより、化学架橋いる。

可能なナノファイバー 6）、あるいは抗菌性 7）や細胞接着性

これまでに、架橋剤を用いて化学架橋されたエラスチ
ン ELP ゲルは報告されているものの10-12）を有するナノファイバーの創製に成功してきた。これらの、疎水性が高くGPG 誘導体を適宜混合したり、さらに新しい GPG 誘導体

不均一に凝集しやすいエラスチンを均一なゲルとすることと組み合わせることで、様々な機能性ゲルが得られるであは根本的に難しく、報告例は少ない。また、化学架橋ゲル

ろう。生理食塩水やリン酸緩衝液等を溶媒とするハイドロ

では刺激に対するゾル－ゲル転移を示さない。エラスチン

ゲル形成など、まだ課題は残されているものの、本研究での LCST を利用して温度応答性の物理ゲルを作製するアイ得られた温度応答性 ELP ゲルは、体温でゲル化する創傷

ディアは以前より存在していたが、実現は容易ではなか被覆材や、各種細胞の 3 次元培養の担体、幹細胞の分化制った。エラスチンや ELP を LCST 以上に加熱すると、ゲ御、人工血管の構成要素をはじめとする幅広い応用展開がル化ではなく相分離を起こして沈殿してしまうからであ期待される。

る。Conticello らは、ELP ゲルの創製に向けて親水性を高めたブロックポリペプチドを合成したが、ゲル形成には25 wt% もの高濃度の ELP が必要であった

謝13）

AFM 観察でご協力をいただいた名古屋大学関隆広先生、。近年ではOlsen らが、（［I0.6V0.4］PAVG）n の配列を持つ ELP が相分辞

永野修作先生、北村一晟氏に深く感謝申し上げます。

離せずに均一なゲルを形成することを報告しているが、この場合にもゲル化には 10 wt% 以上のポリペプチドを要す
る14）。エラスチン配列に、シルク由来配列

ン結合配列

16）

15）

や金属イオ（引用文献）
1） Mithieux SM, Weiss AS,: Elastin, Adv. Protein Chem.,
70, 437-461, 2005.などの機能性配列を結合させた融合ペプチ

ドからなる刺激応答性の物理ゲルも作製されている。この

2） Rnjak J, Wise SG, Mithieux SM, Weiss AS,: Severe

場合、架橋点となるのはエラスチン以外の配列であり、エburn injuries and the role of elastin in the design of

ラスチンの LCST は分子の局所的な濃度を高めるために補dermal substitutes, Tissue Eng. B Rev. 17, 81-91, 2011.

− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

Biomacromolecules, 8, 1463-1470, 2007.

3） Urry DW,: Molecular machines: How motion andother functions of living organisms can result from11）T r a b b i c - C a r l s o n K , S e t t o n L A , C h i l k o t i A , :reversible chemical changes, Angew. Chem. Int. Ed.

Swelling and mechanical behaviors of chemicallyEngl., 32, 819-841, 1993.

cross-linked hydrogels of elastin-like polypeptides,Biomacromolecules, 4, 572-580, 2003.

4） D. H. T. Le, R. Hanamura, D.-H. Pham, M. Kato,
D. A. Tirrell, T. Okubo, A. Sugawara-Narutaki,12）Z h a n g Y N , A v e r y R K , V a l l m a j o - M a r t i n Q ,Assmann A, Vegh A, Memic A, Olsen BD, Annabi

Biomacromolecules, 14, 1028-1034, 2013.
5） Le DHT, Okubo T, Sugawara-Narutaki A,: “BeadedN, Khademhosseini A,: A highly elastic and rapidly

nanofibers assembled from double-hydrophobic elastin-crosslinkable elastin-like polypeptide-based hydrogel

like block polypeptides: Effects of trifluoroethanol,

for biomedical applications. Adv. Funct. Mater., 2 5,Biopolymers, 103, 175-185, 2015.

4814-4826, 2015.

6） Le DHT, Kawakami R, Teraoka Y, Okubo T,13）Wright ER, McMillan RA, Cooper A, Apkarian RP,Sugawara-Narutaki A,: Cross-linking assisted

Conticello VP,: Thermoplastic elastomer hydrogels via

stabilization of beaded nanofibers from elastin-likeself-assembly of an elastin-mimetic triblock polypeptide,

double hydrophobic polypeptides, Chem. Lett., 44, 530-Adv. Funct. Mater., 12, 149-154, 2002.
14）Glassman MJ, Olsen BD,: Arrested phase separation

532, 2015.
7） Anh TTH, Xing M, Le DHT, Sugawara-Narutakiof elastin-like polypeptide solutions yields stiff,A, Fong E,: Elastin-based silver-binding proteins withthermoresponsive gels, Biomacromolecules, 1 6, 3 7 6 23773, 2015.

antibacterial capabilities, Nanomedicine, 8, 5 6 7-5 7 5,15）Dandu R, Von Cresce A, Briberb R, Dowell P,2013.
8） 鳴瀧彩絵 ,: 生体模倣ブロックポリペプチドの段階的自Cappello J, Ghandehari H,: Silk–elastinlike protein

己集合 , Colloid & Interface Commun., 40(2), 12-14, 2015.

polymer hydrogels: Influence of monomer sequence on9) Urry DW, Shaw RD, Prasad KU,: Polypentapeptide

physicochemical properties, Polymer, 50, 366-374, 2009.

of elastin: Temperature dependence of ellipticity and16）Ghoorchian A, Simon JR, Bharti B, Han W, Zhao

correlation with elastomeric force, Biochem. Biophys.

X, Chilkoti A,: Bioinspired reversibly cross-linked

Res. Commun., 130, 50-57, 1985.

hydrogels comprising polypeptide micelles exhibit10）Lim DW, Nettles DL, Setton LA, Chilkoti A,:Rapid cross-linking of elastin-like polypeptides with(hydroxymethyl)phosphines in aqueous solution,− 20 −

enhanced mechanical properties, Adv. Funct. Mater.,
25, 3122-3130, 2015.