SPL-M100 Application
Application Note
SGI-P100
Note

No. AS211105

高速GC/MS【Intuvo9000GC-5977MSD】とオンライン固相誘導体化を用いたメタボローム分析の最適化(5)短鎖脂肪酸

はじめに

SPL-M100
SGI-P100for SPE-GC system

従来GC/MSにおけるメタボローム分析は、サンプルの抽出後、乾固に4時間～1晩、誘導体化に2時間を要していましたが、オンライン固相誘導体化を使うことで前処理時間が飛躍的に短縮でき、誘導体化からGC/MSの分析Sampleまでの時間が一定化され、安定したデータ取得が期待されます。
また、GC/MSにおいては、前処理の高速化に合わせ、高速分析が可能かつ初心者でも扱いやすい装置が望まれます。今回、オンライン固相誘導体化装置SPL-M100と高速分析が可能なIntuvo 9000GCとシングル四重極5977B MSDを接続したシステムで短鎖脂肪酸の分析条件の最適化を行いました。

分析装置メリット
高速GC/MS・
オンライン固相誘導体化システム

Information【Intuvo9000GC】
・高速分析可能・取扱が容易【SPL-M100】
・前処理時間は飛躍的に短縮・誘導体化から分析までの時間が一定化

Intuvo 9000GCと5977B MSおよびSPL-M100

オンライン固相誘導体化SPE-GC：SPL-M100

前処理フロー

添加 水 100 µL
添加 ACN 800 µL

Flash-SPE AXs

杉立久仁代1,佐々野僚
一2,佐久井徳広1,大塚
剛史1,中村貞夫1
1アジレント・テクノロジー
株式会社、2株式会社
アイスティサイエンス

Automation
前処理：12.3分

バイアル
試料採取 100 ㎎

第15回 メタボロ―ムシンポジウム「高速GC/MSとオンライン固相誘導体化を用いたメタボローム分析の最適化」

コンディショニング
ACN-水(1/1)
ACN

負荷[保持] 抽出上澄液 50 µL 分取

振とう 37 ℃, 30 min

洗浄 ACN-水(1/1)
遠心分離 14,000 rpm, 5 min

脱水 ACN分取 上澄液 200 µL

含侵 MTBSTFA-Toluene(3/1)

添加 ACN-水(4/1) 600 µL
pH調整 pH8～9(0.1N NaOH)※ 10%メトキシアミン塩酸塩/ピリジン(脱水)によるオキシム化なし

固相誘導体化反応 t-BDMS化, 1 min

溶出 ヘキサン

抽出上澄液
GC-MS

測定条件

Product
オンラインSPE-GC

SPL-M100

GC Intuvo9000C
カラム
オーブン温度※1
注入口(MMI)温度
ライナー
注入方法
ガードチップ温度※2
キャリアガス流量
トランスファーライン温度

AiSTI SCIENCE

MS 5977B

DB-5MS, 15m×0.25mm I.D. , 膜厚0.25µm
40 ℃(3 min)-10 ℃ /min-80 ℃ -20 ℃ /min-150 ℃ -30 ℃ /min-310 ℃(2 min)150℃(0.5min)-25℃/min-290℃
ウルトライナートライナー、シングルテーパ、低圧力損失、 ガラスウール入り
スプリット (50:1)
150 ℃(0.5 min)-25 ℃ /min-290 ℃
1.0 mL/min (コンスタントフロー)
290℃※1 初期温度60℃ではギ酸、酢酸のピーク形状が崩れた
ため40℃に変更

測定モード
イオン源温度
四重極温度

スキャン (m/z 70-470)
250℃
150℃

※2 ガードチップの温度が低いと溶出の早いギ酸、酢酸でピーク形状が悪化するためMMIと同条件に設定

固相カートリッジ

Flash-SPE
GC大量注入装置

LVI-S250

株式会社アイスティサイエンス
TEL: 073-475-0033
E-mail：as@aisti.co.jp

www.aisti.co.jp

No. AS211105

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結果と考察

短鎖脂肪酸の標準溶液とヨーグルトのTICクロマトグラムを示します。ヨーグルトでは乳酸が大量に検出しました。そこで抽出液に1ppmの標準溶液を添加しました。その結果レスポンスが非常に低く、おそらく固相が飽和状態となり、短鎖脂肪酸の検出ができなかった可能性が考えられました。そこで10倍希釈、100倍希釈を行い、短鎖脂肪酸を添加して検討したところ、10倍希釈で測定できることが分かりました。このように試料によっては固相負荷量の検討が必要であることがわかりました。
1. Formic acid TBDMS
2. Acetic acid TBDMS
3. Propionic acid TBDMS
4. Isobutyric acid
(Methyl propionic acid) TBDMS
5. Butyric acid TBDMS
6. 2-Methyl butyric acid TBDMS
7. Isovaleric acid
(3-Methyl butyric acid) TBDMS
8. Valeric acid TBDMS(Pentanoic acid)
9. 2-Methylvaleric acid
(2-Methylpentanoic acid) TBDMS
10. 3-Methylvaleric acid
(3-Methylpentanoic acid) TBDMS
11. Isocaproic acid TBDMS(4-Methylvaleric acid, 4-Methylpentanoic acid,Isohexanoic acid) TBDMS
12. Caproic acid (Hexanoic acid) TBDMS
13. Lactic acid 2TBDMS
14. Succinic acid 2TBDMS
1. 2-Hydroxybutaoic acid (2TBDMS)
2. 2-Hydroxy-3-methylbutyric acid (2TBDMS)
3. 2-Hydroxyisocaproic acid (2TBDMS)
4. Glyceric acid (3TBDMS)
5. 3-Phenyllactic acid (2TBDMS)
6. 2-Hydroxyglutaric acid (3TBDMS)
7. Orotic acid (3TBDMS)
8. 4-Hydroxyphenyllactic acid (3TBDMS)
9. Citric acid (4TBDMS)

図1 標準溶液とヨーグルトのTICクロマトグラム

標 準 溶 液 1ppm の n=5 の 再 現 性

表1 標準溶液1ppmの再現性(RSD)(RSD)とTICクロマトグラムを表1及び図2

化合物名%RSDに示 します 。 再現 性 は いずれ の 成分もFormic acid TBDMS*
Acetic acid TBDMS*
Propionic acid TBDMS
Isobutyric acid TBDMS
Butyric acid TBDMS
2-Methylbutanoic acid TBDMSIsovaleric acid TBDMS
Valeric acid TBDMS
2-Methylvarelic acid TBDMS
3-Methylvarelic acid TBDMS
Isocaproic acid TBDMS
Caproic acid TBDMS
Lactic acid 2TBDMS*
Succinic acid 2TBDMS

1.7
4.2
2.0
1.7
1.0
2.5
1.7
2.2
2.1
3.1
2.9
2.6
1.7
1.1

5％未満のと良好な結果が得られました。
ギ酸、酢酸、乳酸についてブランクから検出されました。
ヨーグルトの10倍希釈液に標準溶液を添加したn=3の再現性(RSD)を表2に示します。青字は標準溶液添加なしのヨーグルトに含まれる成分です。ほとんどの成分でRSD10％未満の良好な結果が得られました。

短鎖脂肪酸はTBDMS, 乳酸及びコハク酸は2TBDMS*ギ酸、酢酸、乳酸はブランクあり

図2 標準溶液1ppmのTICクロマトグラム

表2 ヨーグルト1ppm標準溶液添加の再現性(RSD)

短鎖脂肪酸のみの分析時間は、標準※ヨーグルトは10倍希釈溶液に添加
化合物名%RSD

化合物名%RSD溶液を用いて検討した際には13分程度

Formic acid TBDMS

0.82-Hydroxybutanoic acid 2TBDMS

で終了し、また前処理時間も12分と短い

Acetic acid TBDMS

2.42-Hydroxy-3-methylbutyric acid 2TBDMS

ことから、高速化を前提にメソッドを作成しPropionic acid TBDMS

2.22-Hydroxyisocaproic acid 2TBDMS

7.6

Isobutyric acid TBDMS

2.3

Glyceric acid 3TBDMS

18.4ていましたが、実試料を測定した際に、試Butyric acid TBDMS

2.8

3-Phenyllactic acid 2TBDMS

12.8

料中に含まれる他の有機酸のt-BDMS

2-Methylbutanoic acid TBDMS

1.4

2-Hydroxyglutaric acid 3TBDMS

6.3

Isovaleric acid TBDMS

2.8

Palmitic acid TBDMS

8.1

Valeric acid TBDMS

2.5

Orotic acid 3TBDMS

12-Methylvarelic acid TBDMS

1.5

Oleic acid TBDMS

4.1

3-Methylvarelic acid TBDMS

1.74-Hydroxyphenyllactic acid TBDMS

8.9

Isocaproic acid TBDMS

1.2

Citric acid 4TBDMS

2.9

Caproic acid1.8

Lactic acid 2TBDMS

1.6

Succinic acid 2TBDMS

0.3化体が検出されたため分析時間を長めに設定する必要があることがわかりました。
このことからGC測定時間を17.8と設定しました。

5.7

青字は標準溶液の添加なし、ヨーグルトに含まれる成分