植物組織培養法を用いたクチナシ植物(Gardenia jasm加泣les Ellis)からの橙黄色色素crocinと青色色素イリドイド配愧附刃生成に関する研究
東京理科大学総合研究所

生田

基礎科学研究部l"J安喜良

Callus tissues were induced from the fruit of Gardeniajasminoides Ellis on basal MS medium suplimented
with 2,4--D (3 mg/ e) -K (0.1 mg/ e) and N (3 mg/ e) -K (0.1 mg/ e). Callus on subcultured onto MS medium
supplemented with N (3 mg/ e) -K (0.1 mg/ e) induced yellowish pigmented callus. The MeOH extract ofyellowish callus tissues showed the presence of crocin when analysed by HPLC. However, crocin was at low
levels in callus as compared to fruit. It have maintained the crosin producibility through subcultures overOmonth. Further, triterpene, phytosterol and their glycosides were also identified from the MeOH extract of}he callus tissues

目い、クチナシ(Gardenia jasmonoides Ellis 、 アカ的ネ科）の植物から誘導したカルスを使い、色素生化粧品あるいは食品の着色に用いられる色素素成の条件検討を行い、安定した水溶性のカロチノ材は、現在化学合成品に依存している部分が多イド系橙黄色色素の crocin及びイリドイド配糖い。しかし、最近化学合成系色素に発ガン性など体を植物組織培養法により、季節に関係なく供給の副作用の危険が指摘されるようになり、それに代る危険性の少ない天然物由来の色素素材が再認識されてきた。植物天然色素は、色調が合成品に比べ鮮やかで、けばけばしさがなく、しかも人体への安全性が一般に高いと考えられている。しかし、植物を原料として製造する場合、自然環境による制約、或いは、資源の枯渇などの問題があり、原料確保の面から も不安定さがある。
この最近の天然物指向による消費者の要求に答えるべく、安定した供給法として最近注目されている植物組織培養法を用いて大量に供給が出来るようになれば、現在使われている天然色素は植物由来の色素が多いことから大きな期待がもたれる。現在これらの色素の内、代表的な橙黄色系色
素はクチナシの果実から得られるcrocinがある。
(Plant、Fig. 1)、本研究は植物組織培養法を使Studies on pigments and monoterpene
glucosides from culturedtissues of
Gardeniajasminoides Ellis (Rubiaceae)
駆ra Ikuta
Research Institutes for science andtechnology,lnstitute Fundamental
Science, Science University of Tokyo-2-Plant and Fruit of Gardenia jasmonoides Ellis

植物組織培養法を用いたクチナシ植物(Gardenia jasminoides Ellis)からの橙黄色色素crocinと青色色素イリドイド配糖体の生成に関する研究する事を目的とする研究である。 この方法によりの種々の植物生長調節物質の組み合わせてcrocin

季節に関係なく植物色素の原料供給が容易になりの生成を目的に検討を行った。

化粧品、 食品添加色素の分野で四季折々の自然のその結果 N(3 mg/.e) -K(O.lmg/.e) のホル色が人工的に得られるようになるなら、 色彩豊かモン組成を添加した M&S 培地で継代培養したな文化生活が約束されるであろう。

所、 一部に橙黄色に色づくカルスの生成が観察さ植物組織培養法による植物色素の生成の報告例れた。 このカルス細胞がcrocinを生成しているこは現在アントシアニン系、 フラボノイド系化合物とが推測され、 色素生成の多い細胞部分を選抜しについて生成した報告例はある。 しかし、 工業的て繰り返し継代培養を行った。 その結果 、 濃い橙なレベルでの色素生成の例はムラサキの培養組織

黄色callus細胞が得られた(Fig.2)。 しかしcallus！）からシコニンの生成の報告例以外にない 。 クチの成長が遅く、 しかも約10 カ月間繰り返し継代

ナシのカルスから色素の生成の成功例は今のとこ培養を行ったが急速に色素生成が減少し始めた。

ろcrocin様化合物の生成、 あるいは微量のcrocin

た め に、 その時点で カ ル ス を収穫し（生重量の生成が報告されている。2. 3. 1) 又、 微量成分

0.85g 、 乾燥重量 0.02 g)、 MeOHで徹底的に抽出として 、 青色色素を生成するモノテルペン系のイを行った。 その濃縮エキスについてHPLC(60%リドイド化合物の生成及びその構造解析についてMeOH) を用いて crocinの標品との比較によりの報告はある。sJ(Fig. 1 ) このクチナシの果実

crocin と同定した(tR: 3 .0lmin.)。 さらに HPLCは、 生薬名山栃子と呼ばれ古来より飲食物の黄色を用いて定量を行った結果 crocinは 0 .22 X 10-6g着色料として使用され、 貴重な黄色天然着色料と(D ry wt. 0.001%)を得た。 原植物の果実では、 最して現在でも使用されている。 クチナシ黄色色素

大乾燥重量あたり約10%程度の crocinが生成すは、 色調が鮮やかで、 耐熱、 対光性に優れたるたることが報告されており 7 )、 それに比べると今回め、 その利用分野は広範囲である。 又、 漢方ではの定量結果は非常に低かった。

重要な生薬として使われ、 その薬効としては潟下、 解毒、 消炎、 解熱鎖痛、 利胆作用などが知ら

2 . 2

れ、 特に充血、 吐血、 黄疸、 不眠を治す目的で用の構造
mo noterpene系配糖体を検索のためにcallusのいられている。 日本では年間300tが中国、 韓国か

成長の良い2 , 4 - D(1 mg/.e) -K(0.1 mg/.e)

ら輸入されている。 6)

22 . 1Triterpene,phytosterol及びその配糖体結のホルモン組成を含むM&S培地用いて培養を行

果

い生重量約4 kgをMeOH抽出を行い、 そのエキ

黄色色素crocinの同定及び定量スについて、 CHCh、 n-BuOHにより分配を行い

NAA(N)、1AA 、 K inetin(K)、 B enzyl a denine

得られたそれぞれのエキスについて 、 カラムクロごRO-oc·vvvvvv�

.CO-OR

マトにより精製を繰り返し 、 CHCb層から5種(c o m p o u n d s 1 - 5)、 B u O H層から4種(compounds 6 - 9) の化合物が得られた(Fig.

croconR: gentioboo沢3)。 これらの化合物について機器('H 、 13CNMR、crocetin

R: HMS)デ ー タをもとに構造を解析した。

HO2 . 2

R= I』
gcmpm
geniposide R = Gk

Fig. 1 Main Compounds from Gradenia jasminoides

1Ulsolic acid.

C ompound 1は白色粉末、1LC上で 10%H心01を噴霧後加熱する と赤紫色を呈しL ieberma n-3-

Fig. 2

Production of Crocin from Callus tissue

Iweight 4012 ·14 gCallus Tissue of Gardenia jasminoides Ellis (freshdry weight 86. 90 g)
txld. withヽ1,011

hot MrOJI / ArOEt
hot Ar〇EtEヽlra<Iadd. H20I

CIICIJ laJ·tr，〗�『1『勺�utd. with CHCl3

I:,:、冒戸□��I�こtS,.lnntFI

Compound 4(Soh·cnt D)

lbOI●)·,rlluOH I●�·er
JHP-20 column chroma!

�leOH layer

I

SIU? column chrnmat.

IIP-20 column rlu omat

(Soh-.nt G)

MeOH layer

Compound 5(Solnut I)

Lll-20 column
rhromat.

(Solnnt Iう）

Compound I Compound 2

Solヽ·,nl B; CIICll: �1,011 = I : I

extd. ,vltJ1 n-BuOII:.::':�"�:·;『:0�!,0H a 10·I

Compound 3
Lll-lO(Solvent II)
SK'1 ,olumn
dorumat.

Soh·rnt ,\; CIIC'll: M,011 =JO; I1110 la)"tl"

Compound 6

Solrn1t ll; 11,xan,; MOEi =I : ISolヽ•,nlE: ll<X●11<: Act>Et; Cll,CN =2: 10; 0.5

So�-.nl C; lltx●nt; A,OEI =20; 1 Solヽ·,nt F: lltx●m: AcOEI: C'l l,C'N = J: 10; 0.5
Fig. 3Compow1d 7

Compound 8

Solnnt G; CIICI�: �lrOH: 1110 = 20: 10: I
Solヽ·rnt II; 1120: Cll:JCN = S.5: 4.5

Solnnt I ; 1120: Cil:JCN = S.8: 4.2

Extraction of Gardenia jasminoides Ellis callus tissue-4-

Com 11ound 9

植物組織培養法を用いたクチナシ植物 (Gardenia jasminoides Ellis) からの橙黄色色素 crocin と青色色素イリドイド配糖体の生成に関する研究

較から同定した(Fig. 5)。 8)

B ur c h a r d 反応に より赤紫を呈する事から、triterpene化合物が推定され、 MSよりm/z 45 6にBrassica sterol, stigmasterol, f3[M汀を示し、 レトロディ ー ルスアルダ ー 開裂に2 . 2 . 3z 24 8,203が更に、 m/z 207にA/B環由来のフラC o m p o u n d 4、 5 は淡黄色の粉末で、よ るDIE環由来 のフラグメン トイオンmlグメントが観察された。

- sitosterol

1 HNMRにより、 2個分

Liebermann-Burchard反応により深緑色を示し、
M S より、 糖鎖 脱離のフラグメントイオンmlの2級Meを含む7個のMe基更に、12位のオレフィニックプロトンがo5 .47(1H、t、J=3.3Hz)に観察される事から、 ulsolic acidが推定され、 標
品 との比較により同定した(Fig. 4)。
2 . 2 . 2z 398、 396、 382 (Fig. 6 - 8)が観測され 、 3種の混合物と 推定された。 同時にsterol化合物に特徴的な側錐と糖鎖の脱離によるフラグメントイオンm/z 255が観察された。 又、 文献値との比較か

Stigmasterol.

ら¢ — sitosterol (3 D- - glycopyranoside, stigmasterol(3 - D- glycopyranoside, brassicastrol (3 - D­

Com p ound 2は無色粉末でLieberm a n n -，glycopyranosideの混合物と 同定した。 8)

Burchad反応により深緑色を呈し、 MSより、 ml

z412、[M汀を示した。 更に 1

H,13CNMR からstigmasterolが推定され、 標品のデ/3 ー D- glycopyranoside.

ー タ ー

これらの化合物は原植物からまだ報告の無い

triterpeneあるいはphytosterol及びその配糖体でとの比□十弓→；良。 →�0�

HOm/z 248

m/z 203、批

虚Ursolic acidHOm/z 207

Fig. 4 Mass fragmentation of Ursolic acid
R2122+'.!7HOLM ]HO
6Stigmasterol

Fig. 5 Mass spectrum and fragmentation of stigmasterol-5-[M-(R+H20)]
255

：}82-1+ 560

[M ]

2625

[M - (R+180)]
255

Aー82/l9-[M-glc]

gglc-0Brassicasterol f3 -D-glycopyranoside

Fig. 6 Mass spectrum and fragmentation of Brassicaterol /3 -D-glycopyranoside+[M ] 574
[M-glc]27[M ・ (R+180)]
255

glc-0
Stigmasterol f3 -0-glycopyranoside
Fig. 7 Mass spectrum and fragmentation of /3 -0-glycopyranoside[M打. 576[M-gk127[M・(R+180]
255
6glc-013 - Sitosterol /3 -D-glycopyranoside
Fig. 8 Mass spectrum and fragmentation of /3 -Sitosterol /3 -0-glycopyranoside
あった。compounds 6 - 9は構造は検討中であ形成が観察され、 そのshoot の部分を光照射下る。

(12/12hr 、 6000L)継代培接を行った所、 葉が緑化して、 地上部、 及び地下部を形成した小植物が2. 3callusからの再分化による植物体の生成得られた(Fig. 9)。 今回は移植は行なわなかっN(3 mg/£) - K (0.1 mg/£)ホルモン組成でたがこの再分化植物が種苗として使用出来る可能

色素生成を検討中に色素生成と同時に 、 shootの性を示した。
-6-

植物組織培養法を用いたクチナシ植物(Gardenia jasminoides Ellis)からの橙黄色色素crocinと青色色素イリドイド配糖体の生成に関する研究

生成について time course を取り 、・カルスの収穫時期を設定したい。しかしながら、クチナシのカルスから、カルス化後、約1年近くcrocinを生成していたが、10カ月目位から急激に色素形成能が低下する事が観察された。この様に色素生成が継続しないため、カルスがcrocinを生成する能力を持続及び生産性の向上する条件を検討する必要がある。この色素形成能力の維持が今後の課題となろう。現在 、 再度同じ条件でカルスを誘導して、色素形成株を大量に選択中である。
更に、一般的 に カルス培養において酵母エキス、あるいは重金属などエリシタ ー 処理を行うことにより、二次代謝産物の生成量を増加する事が知られいる。今後、このクチナシのカルスについFig. 9 Differenciation from Gardenia jasminoides
Callus Tissueても、このようなエリシタ ー 処理を加え 、 目的の色素化合物が生成されるかどうかについても検討

3

考を加える。一方 、 原植物で生成するmonoterpene

察系iridoid配糖体類が得られず、原植物から報告さ色素生成の少ない原因として、今回カルスの収れていないtriterpeneあるいはphytosterol類が得穫時期を逸し 、 色が薄くなり始めた時期に抽出られた事は、著者等9)が既にボタン科のカルスのし、定量を行ったことが考えられる。現在 、 前回生 成 成分の 検索の結果、 原 植 物 で 主成分のと同じ条件でクチナシの果実からN(3mg/.e)­monoterpene配糖体の paeonifloin類が生成されK(O.lmg/.e) を用いてカルスを誘導したところ 、ず 、 triterpene類を主生成成分として生成した現

callus化の過程で特に色素生成細胞を選抜する事

象に類似しており、カルスにおける terpenene生なく色素生成が観察された。そこで今後は 、 色素合成の能力の観点から興味ある(Fig. 10)。

HMG-CoA

Acelyl-CoA／

GPP (C10)

量MVA

PP(C5)/

臭FPP(C15)FPP synthasemonoterpene
paeoniflorin

II•
.
9

FPP synthase_, diterpene
Aibberellin

IPP isomerase
ー→�I

IPP

IPP，

DMAPP(Cs)

HMG-CoA
reductasc

GGPP(C2o)

GG p p synt ase

triterpcne

Fig. 10 Biosynthesis of Terpenoids

ーー ＇�

steroleiridoid-7-IPP... —・・carotinoid44. 1

実BuOH で分配し n-BuOH可溶画分を得た。 これ

験ら画分について順相•逆相のオ ー プン、 中圧カラムクロマトグラフィ ー およびセファデックスカラ

カルス誘導及び継代培養

ムクロマトグラフィ ー を繰り返し行い 、 Compound

カルスは、 結実後の果実及び茎を水道水で良く1 - 5を CHCJ3可溶画分から、 Compound 6 -洗った後、 Tween20を数滴たらした蒸留水中で、撹拌しながら徐菌後、 20% Na0Cl により数分間9をBuOH可溶画分から単離した。

をM&S培地上に置床し、 25士l ℃ 、 暗所下で文 献1 ) Fukui H, Yoshikawa N, TabataM, Phytochem­
istry, 22, 241 - 2453,1983.

滅菌し洗浄した後 、 1 -1.Scmに切り分けたもの

2週間D (3mg/E)-K (O.lmg/E), N (3mg/E)-K (O.lmg/E)のホルモン組成のそれぞれの組み合わせを 含むM&S培地を用いて培養を行い力2)奈女良、 田田中、 小山、 ほか1名、 クチナシルスを誘導した。 継代培養はD(lmg/E)-K(0.1培養細胞による有用色素生産、 生薬学雑誌 、42、 252 - 255 (1988)梅谷、 福井、 田端、 薬mg/E) 、 N (3 mg/ E)- K (0.1mg/ E)の組み合わせを用いて行った。
4.2

誌、 100, 920 - 924, 1980.

3) Nawa Y, Ohtani T,: Induction of callus fromcrocinの同定及び定量

3NKで培養したクチナシのカルスから燈黄色

Flesh of Gardenia jasminoides ELIS Fruit andFormation of Yellow Pigment in the callus,に色づいたものを特に選抜してメタノ ー ルで乳鉢

Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1732 - 1736,（検量線の作製）

4) George P. S, Ravishamkar G. A,: Induction ofを用いて抽出を行った。

メタノ ー に溶かして 0.125 mg/ meに調整した

crocinの標品を用いて 、 HPLCにより検量線を作製した。crocinを 、 2.5、 5.0、 10.0µeの3種類の濃度について測定し、 最小二乗法により回帰方程式を算出した。

〈HPLCの条件〉

1992.

crocin and crocetins in callus cultures of Garde­niajasminoides ELUS. Food Biotecnology, 9, 29-38, 1995.

5 ) Ueda S, Kobayashi K, Muramatsu T, 他l名：

Studies on monoterpene glycosides and related

natural products. Planta Medica, 41, 186-91,(UV) 382nm、（流速） l.Ome/min、（温度） 30℃、19981.

6) 日本薬局方第二部広川書店、 東京、 1991, D（移動相溶媒系） 60%MeOH

クチナシのカルスからの成分抽出及び構- 389- D- 392.
7) 梅谷、 福井、 田端、 クチナシ果実の発育にとを用いてカルスの大量培養を行いクチナシのカル

924,1980.
8)児島：ウツボグサ(Purunella vulgaris L.var.

中ポリトロンにより磨砕し 、 吸引ろ過後、 残漆にド成分に関する研究 ． 博士論文pp39- 48,1983.

4.2

造決定
D (1mg//!)-K (0.1 mg//!) のホルモン組成ス(fr. wt. 4.1kg、 dry、 wt. 86.9g)を収穫し、MeOH

もなう成分含量 の変化、 薬学雑誌 、 100,920 -lilacina Nakai)のトリテルペノイド及びステロイMeOHを加え同様の操作を3回繰り返した。 更に

9) Ikuta A, Kamiya K, Satake T, そのた1名 ：エキスを水に懸濁した後、 CHCI 3 で分配してPaeonia species.Phytochemistry,38,1203-1207,

その後、 MeOHで還流抽出を3回行い、 その濃縮CHCl:i可溶画分を得た。 水層は更に水飽和n-8-Triterpenoids from callus tissue cultures of1995.