アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発
東京医科歯科大学難治疾患研究所

清水重臣

We aimed to elucidate the role of autophagy in skin development. There are two types of autophagy, namely canonicalautophagy and alternative autophagy, and we generated various skin-specific autophagy gene-knockout mice. Althoughsimple knockout mice of canonical autophagy and alternative autophagy did not show any remarkable abnormalities, double-knockout (Beclin1-knockout) mice died within a day after birth owing to impairment of epidermal barrier. Furthermore,
we found that Beclin 1 deficiency causes mislocalization of integrins, abnormal cell detachment of basal cells and their immature differentiation, and abnormal skin development.
We also screened a low–molecular weight compound library to identify chemicals with alternative autophagy-inducing
activities and successfully identified candidate compounds. By the application of these compounds to atopic dermatitis model mice, we obtained TMD-AD129 compound which exhibited strong anti-dermatitis activity. At present, we are optimizing
this compound for development as drugs.

1．緒言

ヒトの皮膚には 200 種以上の菌が共生しているが、皮膚には、角質層などによる「物理的バリア」、表皮角化細胞から分泌される抗菌ペプチドによる「自然免疫バリア」、細胞内に侵入した細菌を殺菌するオートファジー機構「ゼノファジー」の３種のデフェンス機構が備わっており、微生物による侵入を阻止し恒常性を保っている。しかし、宿主側の変調や微生物叢のプロファイルに変化が生じると、恒常性が破綻し（dysbiosis）、アトピー性皮膚炎などの疾患発症へとつながっていく。
オートファジー（自食現象）とは、細胞内の自己構成成分（例えば、不要なタンパク質や傷害を受けたオルガネラなど）を分解する細胞機能であり、細胞内浄化作用を有す

図1 全ての細胞は、Atg 5依存的オートファジーと新規オートファジーの２つの機能を有している。両者は、①膜の由来、②実行分子、③分解基質を異にしている。

るため、その変調は様々な疾患や病態の原因となる。皮膚細胞においても、オートファジー機構は存在しており、紫き上がる。オートファゴソームが形成されると、その後に外線を浴びたときなどにオートファジーが活性化されるこリソソームが直接融合し、リソソームの消化酵素によってとが知られている。皮膚細胞を含めて、全ての細胞は 2 種その内容物が消化される。リソソームには、カテプシンな類のオートファジー機構を有している。即ち、Atg 5 分子どのタンパク質分解酵素、酸性リパーゼ、DNA 分解酵素に依存して小胞体膜に由来する通常型オートファジーとなど様々な種類の消化酵素が含まれているため、内容物はAtg 5 分子を利用せずゴルジ体膜に由来する新規オートフほぼ完全に消化されることとなる。２種類のオートファジァジーである

1 , 2）（図 1）。両者ともに、初期段階では、隔ーは、これらのオートファジー形態に関しては、ほとんど離膜と呼ばれる小さな２重膜構造物が形成される。この隔差異が認められない。一方、２つのオートファジーは、⑴離膜は伸長すると共に湾曲し、細胞質やオルガネラを囲い誘導する刺激の種類、⑵オートファジー膜の由来、⑶実行込み、最終的には両端が融合したオートファゴソームがで分子の種類、⑷分解する基質の種類が異なっており、細胞内では、全く異なる役割を果たしている 3 - 5）。
前述のごとく、アトピー性皮膚炎の発症には、宿主側のThe role of alternative autophagy inatopic dermatitis and its therapeutic
use
Shigeomi Shimizu
Tokyo Medical and Dental University,
Medical Research Institute

変調が大きく関わっているため、オートファジーの変調はその原因のひとつとなりうる。そこで、本研究では、まず皮膚においてオートファジーがどのような役割を果たしているかを明らかにした。次に、新規オートファジーを活性化できる化合物を探索して、アトピー性皮膚炎の治療への− 131 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021応用を目指した。

２．方３．結法

果課題 1：皮膚におけるオートファジーの役割を明らかにする

2. 1. 皮膚におけるオートファジーの役割を明らかにする

スを複数種類作成した 6）。

方法 1：

１：通常型オートファジー欠損マウス：Atg 5 flox マウス、上記課題のために、皮膚特異的オートファジー欠損マウオートファジー分子を欠損したマウスを複数作製し、Atg7 floxマウス、Atg14 floxマウスを、それぞれ keratin 5neonate ならびに adult mice においてその表現系を観察し（K 5）- cre マウスと交配して、皮膚特異的通常型オートた。皮膚に異常が見られた場合には、皮膚からの水分蒸散

ファジー欠損マウスを作製した。しかしながら、皮膚に量（TWEL）を TWEL 測定器を用いて計測した。また、皮明らかな異常を認めるマウスはなかった。

膚 の 組 織 を 採 取 し、 免 疫 組 織 染 色 な ら び に western

２：新規オートファジー欠損マウス：Wipi 3 flox マウスをblotting による解析を行った。基底細胞の分裂方向の測定

K 5 -cre マウスと交配して、皮膚特異的新規オートファには、survivin 染色法を用いた。

ジー欠損マウスを作製した。しかしながら、皮膚の顕著な異常は認められなかった。

2. 2. アトピー性皮膚炎に有効な新規オートファジー誘導天然物／化合物を開発する
方法 2：３：両オートファジー欠損マウス：両方のオートファジーに共通して機能する Beclin 1 の flox マウスと K 5 -cre マウスと交配して、皮膚特異的両オートファジー欠損マウ

約 20000 種類の低分子化合物と約 5000 種類の天然物かスを作製したところ、当該マウスはすべて生後 1 日以内

ら、新規オートファジー誘導化合物／天然物をハイスルーに死亡した。また、死因は皮膚のバリア形成機構の不全プットアッセイにより同定した。

による多量の水分蒸散量が原因であると思われた（図 2）。

ダニ抗原塗布による皮膚炎を作製し、各化合物を塗布

さらに、皮膚の詳細な解析を行ったところ、K 5 の発現（n= 5、1 日おき、200 µL 患部に塗布 / 匹）し、8 日後に皮量が多い一方、K 10 や Filaggrin の発現量が低く、基底層膚炎の程度をスコア化した。

からの皮膚細胞分化に異常があることが判明した（図３）。

図２：皮膚特異的Beclin1欠損マウスは、皮膚のバリア形成機構の不全によって、水分蒸散量が多く、生後1日以内に死亡した。

図3 皮膚特異的Beclin1欠損マウスは、K 5の発現量が多く、一方、K10の発現量やFilaggrinの発現量が低く、基底層からの皮膚細胞の分化に異常があることが判明した。

− 132 −

アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発

このため、基底層細胞の分裂方向を、Survivin 染色に償しながら、基底細胞の細胞分化を正常に保っているこて観察したところ、正常よりも垂直方向の分裂が多く、と、これにより、正常な皮膚が形成されることが明らか

細胞が十分に分化しないまま基底層から上層に上がってとなった。

いるものと思われた（図 4）。また、この原因が細胞接着に機能するインテグリンの局在異常に起因する可能性が

課題２：約 20000 種類の低分子化合物と約 5000 種類の天考えられた。即ち、本来細胞膜に存在して細胞外マトリ然物を新規オートファジーモニター細胞に投与し、ハイックスと結合するインテグリンが細胞内にとどまっていスループットスクリーニングにて、約 110 種類の新規オたため、これが原因であると思われた（図 5）。

ートファジー誘導化合物／天然物を見いだした（図 6）。

以上より、皮膚において、２つのオートファジーは代ビオスタ AD 誘発 NC/Nga マウス皮膚炎モデルを作製

図4 Survivin染色により、基底層細胞の分裂方向を解析したところ、皮膚特異的Beclin1欠損マウスでは、水平方向より垂直方向の分裂が多く、未分化のまま上層に上がっていることが示された。

図5

皮膚特異的Beclin 1欠損マウスでは、インテグリンの局在が異常であった。

図６

ハイスループットを用いた新規オートファジーの計測

新規オートファジーモニター細胞に化合物ライブラリーを投与して、その後の、新規オートファジー誘導をCell Imagerで定量測定する。

− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

未分化細胞が分化されないまま脱接着して上層に上がり（図 4）、皮膚の形成不全が起こる（図 1）ものと考えられた。新規オートファジーの機能不全は通常型オートファジーによって代用されうるので、両者のオートファジーを欠損させたときにのみ皮膚形成異常が出現するものと考えられる。
このように、オートファジーは皮膚形成に関わっているために、皮膚炎等の病態においても何らかの関与があるものと思われた。実際に、アトピー性皮膚炎の皮膚に新規オートファジー誘導化合物を塗布することによって、劇的な皮膚症状の改善ならびに脾臓重量の改善が認められている。今後、インテグリンの局在を含めて、新規オートファジー誘導化合物の作用メカニズムを明らかにすることが重要である。

５．総括

本研究により、２つのオートファジーは代償しながら、正常な皮膚形成に機能していることが明らかとなった。また、新規オートファジーの誘導

図７ TMD-AD 129を隔日に塗布したマウスは皮膚炎が改善した。

により、アトピー性皮膚炎の改善が期待できることが明らかとなった。
し、各化合物（200 µL）を隔日に塗布し、8 日目に皮膚の性状をスコア化した。その結果、化合物 TMD-AD 129を塗布したマウスにおいて、皮膚炎の顕著な改善を認めた（図 7）。また、このマウスにおいては、脾臓の重量も謝辞

本研究の遂行にご支援いただきました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げます。

0 . 1032 ± 0 . 032 g（対照は 0 . 142 ± 0 . 024 g）と腫大が顕（引用文献）

著に抑えられていた。
これらの結果より、新規オートファジー誘導化合物の1）Nishida, Y.; Arakawa, S.; Fujitani, K.; Yamaguchi, H.;

塗布により、アトピー性皮膚炎が改善することが示されMizuta, T.; Kanaseki, T.; Komatsu, K.; Otsu, K.;

た。

Tsujimoto, Y.; Shimizu, S. Nature 2009, 461, 654-658.

４．考2）Honda, S.; Arakawa, S.; Nishida, Y.; Yamaguchi, H.;

察Ishii, E.; Shimizu, S. Nature Commun. 2014, 5, 4004.

本研究によって、皮膚形成を正常に行うために、２つの

3） Yamaguchi, H.; Arakawa, S.; Kanaseki, T.;

オートファジーが代償的に機能していること、その主な機

Miyatsuka,T.; Fujitani,Y.; Watada,H.; Tsujimoto,Y.;

序が、インテグリンの細胞膜への局在制御によることが明Shimizu, S. EMBO J. 2016, 35, 1991-2007.

らかとなった。新規オートファジーは、ゴルジ体から細胞4）Torii, S.; Yamaguchi, H.; Nakanishi, A.; Arakawa, S.;

外あるいは細胞膜にタンパク質を輸送する際に、その量のHonda, S.; Moriwaki, K.; Nakano, H.; Shimizu, S. Nature

調節を行っている。即ち、過剰な分子が輸送されようとす

Commun. 2020, 11, 17544.

るときに、新規オートファジーが活性化されて、これらを

5） Yamaguchi, H.; Honda, S.; Torii, S.; Shimizu, K.;分解するのである。皮膚においては、インテグリンが新規

Arakawa, Katoh, K.; Miyake, K.; Miyake, N.; Fujikake,

オートファジーの分解基質となっているため、新規オートN.; Sakurai, H.; Arakawa, S.; Shimizu, S. Nature

ファジーが破綻すると、インテグリンが細胞内に異常に蓄Commun. 2020, 11, 5311.

積する（図 5）。すると、新たなインテグリンが合成されず

6）Noguchi, S.; Honda, S.; Saitoh, T.; Matsumura, H.;に細胞膜上のインテグリン量が減少し、細胞接着性が低下Nishimura, E.; Akira,S,; Shimizu, S. Commun. Biol.

するものと考えられる。さらに、細胞接着性が低下すると、

2019, 2, 37.

− 134 −