ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発
東北大学大学院医学系研究科

樋浦仁

Recently mouse embryonic stem cells have been applied as system for toxicity testing in Europe. However, a mouse EScell test (EST) may not be sufficiently rigorous for human toxicity testing, while the use of human ES cell presents an ethicalproblem. Tests using human trophoblastic stem (TS) cells, which are derived from the placenta, sidestep a potential to theseissues. A test based on human TS cell would have relevance to the human embryo during pregnancy and could therefore be
useful in testing low-dose toxic substances, which may alter the epigenome. The purpose of this study is to establish whether
human TS cell have relevance to epigenetic teratogenicity testing. We have developed a new toxic screening methods using
human TS cells to evaluate the effect of the synthetic perfume Hydroquinone (HQ) , 1,3,4,6,7,8-Hexahydro-4,6,6,7,8,8hexamethylcyclopenta[g]- 2 -benzopyran solution (HHCB) and Methyl P-Hydroxybenzoate (MP) 1 ) the rate of cell growth:
human TS cells were more sensitive in growth rate than human ES cells (IC 50 ). 2 ) the rate of trophoblast differentiation:
the differentiation marker, hCGB was increased with dose-dependent manner. 3 ) mRNA expression: micro RNAs (miR1323 , miR- 518 b) are sensitive, with the substance. 4 ) DNA methylation: DNA methylation of imprinted genes (H 19 ,PEG 3 ) are increased with dose-dependent manner. We concluded that we have first establishment human TST method andestablishment of bioassay system of TST. We next will apply the TST method to human disease-specific TS cells.

1. 緒法を確立することを目的とした。

言

2. 方

合成香料は、難分解性で環境中に残出し、食物連鎖を介法し、ヒト体内に蓄積される傾向にある。また、エストロゲ

2 . 1. 合成香料

ン作用により、胎児の涙腺、肝臓、骨などの奇形の増加も・標準品：多環リスク（HHCB：Sigma-Aldrich 社製）、メ報告されている 1 , 2）。これらの物質は、妊娠中胎盤を通して、チルパラベン（MP：Sigma-Aldrich 社製）、ハイドロキ長期間蓄積し、胎児に移行することで、胎児の発育や出生ノン（HQ：㈱和光純薬製）。

後の成長および精神・神経学的な発達に影響を及ぼす可能性もある。従来、動物実験で人体への有毒性を予測してい・標準溶液：標準品を精秤し、エタノール溶液に溶解、標準原液を調整した。

たが、新法の制定に伴い、ヒト正常培養細胞等を用いて毒性試験を行う必要性が高まっている。しかしながら、ヒト胎児への細胞毒性機序や代謝動態を in vitro において評価

2 . 2 . ヒト未分化幹細胞株
正常ヒト TS 細胞（男児由来）を供した。

するための、国際基準に基づく毒性試験は未だ確立してい2 . 3 . 細胞へのばく露濃度ない。
最近我々は、世界で初めてヒト胎盤由来未分化幹（TS）
3）

HHCB の場合は、血中濃度 0 倍（溶媒のみ、対照区）、（5細胞の樹立に成功した 。ヒト TS 細胞は、通常分娩後破nM） の 100 倍（500 nM）、500 倍（2 . 5 µM）、1 , 000 倍（5棄される胎盤組織を細胞源とするため、入手に伴う倫理的µM）、5 , 000 倍（25 µM）、10 , 000 倍（50 µM）について検討な問題、量的問題は比較的少ない。そのため、分化誘導系した。の確立したヒト TS 細胞の特性を生かし、短期間に低コスMP、HQ の 場 合 は、0（ 溶 媒 の み、 対 照 区 ）、0 . 01、トで正確な細胞毒性を評価すること（TST 法（図 1））が可能

0 . 05、0 . 1、0 . 5、1 µM を、それぞれ TS 細胞培養液に添加であると期待される。本研究では、化学物質の低濃度かつした。

長期間ばく露による子宮内の有害性評価法として、TST2 . 4 . 培養条件
ガ ラ ス 4 -well プ レ ー ト は、2 種 類（BD Falcon 社 製、Development of cosmetics safety test
using human trophoblast stem cells.
Hitoshi Hiura
Graduate School of Medicine, Tohoku
UniversityNunclon Surface 社製）で検討した。培養液には蒸散防止のため Sydney IVF culture oil（Cook 社）を無血清積層し、37 ℃、5 %CO 2 条件下で細胞培養を実施した。1 ウェルあたり 5 × 104 個の TS 細胞を、TS 細胞培養液にて播種後、翌日に化学物質を含んだ TS 細胞培養液に培地交換し、培− 124 −ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発

図 1 TST 法の概要
細胞増加抑制と化学物質濃度などの相関について検討し、安全域と危険域を設定する。

養を行った。

（倫理面への配慮）

2 . 5 . 培養条件

「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」
および各

ヒトゲノム・遺伝子解析研究にあたっては、関係法令と培養液は血清無添加で、増殖因子は必要最小限とした。

研究機関の規程に従い、東北大学大学院医学系研究科ヒトゲノム・遺伝子解析倫理審査委員会の審査を経たのち、実2 . 6 . バイオアッセイ系の検討施した。ヒト胎盤幹（TS）細胞は、試料提供者の利益・不2. 6. 1.

利益を十分に説明した上で同意書を取得して実施した。法

細胞増殖能

血球計算盤を用いて細胞数を計測し、50 % 阻害濃度

心の注意を払い、本研究を実施した。

（IC 50）を算出した。
2. 6. 2.

令、指針、規定を遵守し、試料管理・個人情報保護には細細胞分化能

3. 結10 視野における巨細胞（合胞体性栄養膜細胞）の出現数を測定した。また、分化マーカー遺伝子（TP 63、HLA-G、

3 . 1. バイオアッセイ系の検討（急性毒性試験）

hCGB）の発現量を定量化した。
2. 6. 3.

果ヒ ト TS 細 胞（46 XY） に 血 中 濃 度 を 参 考 に 化 学 物 質

遺伝子発現の解析（HHCB、MP および HQ）を 5 段階の濃度で培養液に添加し、インプリント遺伝子および低分子 RNA（miRNA）の遺ガラス製培養ディッシュにて、3 日間培養した。培養終了

伝子発現量を定量化した。H 19 , IGF 2 , MEST, PEG 3 お

時に細胞形態を観察および細胞数を計測し、micro RNA

よびヒト 19 番染色体上の miRNA クラスター C 19 MC をを含む total RNA およびゲノム DNA を抽出した。以下の構成し、インプリンティングを受ける miRNA（miR- 520 h,4 つのバイオアッセイ系で評価し、プロトタイプを開発した。

miR- 1323 および miR- 518 b）の発現量を検討した。イン3. 1. 1.

細胞増殖能

プリント遺伝子には GAPDH を、miRNA には snoRNA でTS 細 胞 に お け る 50 % 阻 害 濃 度（IC 50） は、HHCB：ある RNU 44 を用いて内部補正した。インプリント遺伝子0 . 06 µM、HQ：3 . 80 µM であった。また、ヒト ES 細胞のの発現アレルについては、gDNA および cDNA を用いてHHCB の IC 50 は 0 . 5 µM で あ り、HQ 50 µM で、TS 細 胞

PCR-RFLP（制限酵素多型解析）を用いて定量解析した。の方が高感変性であることが判明した。細胞の細胞数は対2. 6. 4.

照区と比較して 25 . 6 ％しか減少しなかった（図 2）。

DNA メチル化解析

5 種類のインプリントを遺伝子の制御領域であるアレル 特 異 的 メ チ ル 化 領 域（DMR）（H 19 , PEG 3 , MEST,

3. 1. 2.

細胞分化能

分化マーカーの遺伝子発現は、HHCB 添加 TS 細胞では、C 19 MC, IG-DMR）について、COBRA 法にて DNA メチル

hCGB（合胞体性栄養膜細胞マーカー）は濃度依存的に発化レベルを定量した。また、ゲノムレベルの DNA メチル

現が亢進し、対照区と比較して hCGB は最大 4 . 62 倍まで化解析には、LINE- 1 のメチル化について解析した。

亢進していた（図 3）。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 2 細胞増殖能
50％阻害濃度（IC50）：0.06µM（HHCB）, 3.80µM（HQ）

図 3 細胞分化能
濃度依存的に分化能は亢進している。

3. 1. 3.

3 . 2 . 遅発性効果試験の検討

遺伝子発現

インプリント遺伝子の発現では、HHCB 添加 TS 細胞でヒト未分化幹細胞（TS 細胞）に化学物質（HHCB, MP,は、miR- 1323 および miR- 518 b は濃度依存的に発現減少HQ）を血液濃度を参考に 100 倍濃度までの単独で 5 段階希し、miR- 1323 は対照区と比較して最大 0 . 35 倍まで減少し、釈法により培養した。TS 細胞は、3 日目、7 日目、14 日目、miR- 518 b は対照区と比較して最大 0 . 52 倍まで減少した。

21 日目に回収し、ゲノム DNA を抽出した。細胞形態学

一方、HQ 添加 TS 細胞では、miR- 1323 は濃度依存的に発的特性と 5 種類のインプリンティングを受ける遺伝子のア現亢進し、対照区と比較して最大 2 . 33 倍まで亢進していレル特異的メチル化領域（H 19 , PEG 3 , MEST, C 19 MC,た（図 4）。また、ヒト TS 細胞の遺伝子多型がいずれもホIG-DMR）を対象としたエピゲノム（DNA メチル化）の定量モ接合型であったため、発現アレルについては明らかにす解析を行い、TST 法による細胞毒性評価の有用性についることができなかった。て検討した。基準値の 100 倍濃度の化学物質の添加では、

3. 1. 4.

顕微鏡学的に細胞形態の変化や増殖能に著しい変化はみら

DNA メチル化解析

HHCB 添 加 TS 細 胞 で は LINE-1 , H 19 , IG-DMR,れなかった。DNA メチル化の定量解析では、血中濃度おPEG 3 , C 19 MC が濃度依存的にメチル化はわずかに亢進しよび 10 倍濃度で培養の期間に関わらず、インプリント遺ていた。一方、HQ 添加 TS 細胞では LINE-1 , H 19 および伝子に顕著な変化はみられなかった。しかし、血中濃度のPEG 3 が濃度依存的にメチル化はわずかに亢進していた。

100 倍濃度の HHCB を添加した場合には、培養期間が長期に及ぶと IG-DMR のメチル化が低下することが確認された（図 5）。

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ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発

図 4 遺伝子発現解析
一部のインプリント遺伝子の発現は濃度依存的な変化を示す。

図 5 遅発性効果試験
血中濃度の 100 倍濃度のハイドロキノン（HQ）を添加した場合には、培養期間が長期に及ぶと IG-DMR のメチル化が低下することが確認された。

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4. 考

表１

察

化学物質による DNA メチル化への影響

最近の毒性評価試験では、動物実験の代替法として、invitro 発生毒性試験法が求められている。本研究では、分化誘導型ヒト胎盤幹（TS）細胞を用い、単一な化学物質ばく露ではなく、低濃度でも長期間および複合ばく露による細胞毒性について、様々な異常に対する毒性評価法を確立することを目的とし、TST 法のプロトタイプを開発した。

三角（▲）は、メチル化の変化（15% 以下）を示す。

特に、エピゲノム変異検出系は、低用量でも残留性、遅発性の有害事象の指標として、有用な子宮内環境評価法となれている開発品品目数は 2004 年度末で 576 品目（医薬産業る可能性がある。

政策研究所ニュース No. 19 2006 年）であることから、年間急性、遅発性効果試験のメチル化の変化の結果のまとめ

5000 億円以上の市場が見込まれる。加えて、動物福祉のを表 1 に示す。化学物質ばく露における急性、遅発性効果観点からも現行の動物実験に代わるシステムの実用化が求について、インプリント遺伝子のメチル化に変化がみられめられている。2007 年時点で、動物実験代替システムのたことから、本法の有用性について確認することができた。

市場は 6 億円（日経バイオ年鑑 2007 年）と見積もられていしかし、複数の細胞での確認や、複合ばく露の影響についるが、今後急速な伸長が見込まれている。したがって、本ては、さらなる検討を行う必要がある。TST 法は、細胞研究開発により、TST 法を用いた有用な毒性試験システを分化誘導することで異常が生じる過程を培養下に詳細にムを構築することで、新有効成分含有医薬品の承認にかか観察し、評価することが可能であるため、動物実験代換シる費用や期間が削減できることに加え、動物代替システムステムとして、医薬品、食品、化粧品開発においての毒性として広く利用可能であり、今後、様々な研究の発展への評価に大変有用であると期待される。

貢献が期待できる。

国内の新有効成分含有医薬品の承認数は、2005 年で 17

5. 総件であり、1994 年のピーク時から半分以下に減少してい括る。一方、研究開発費は 1990 年以降、年々上昇しており、ヒト未分化胎盤幹細胞は、低用量でばく露された有害物

2005 年は、1990 年時の 2 . 5 倍の約 9 , 000 億円に達してい質の影響を検出するための、新たな薬物毒性評価法の細胞る（日本製薬工業協会

DATE BOOK 2007）。これは、臨源を提供する。同時に、ヒト疾患との関連性を解明してい床段階における安全性や優位性の評価が問題となることがく上でも有用であると考えられる。さらに、エピゲノム変原因といわれており、世界的にも同様の傾向を示している。

異は、先天性疾患に限らず、乳幼児の行動や発達障害（自この問題を解決するためには、化学物質の安全性、有効性閉症、ADHD 等）にも影響を与えるため、TST 法は、疾患を早期に確認することが重要であり、臨床試験の前段階との発症予防のための国際基準に適合する重要な解析法とななる非臨床試験の結果により、薬剤の安全性が十分に確りうる。今後はさらなる性能評価を行うとともに、EST保される必要がある。非臨床において、ヒト TS 細胞を用法との比較を行う。また、可能であれば機能未知の化学物いた評価を行うことで、動物実験や従来のマウス ES 細胞質についても TST 法による評価を加えていく。の試験

4 , 5）とは異なり、種による薬物反応の違いを解消し、ヒト胎盤幹細胞を用いたエピゲノム変異検出系による化より生体内の反応を反映した検査を行うことが可能となる。

学物質毒性評価法は、多様な非特定化学物質の影響を単一

また、ヒト ES 細胞など、ヒト由来細胞を使用する場合は、細胞の分化・形態変化および遺伝子修飾機構として鋭敏に入手の難しさや倫理的問題が想定されるが、通常分娩後に反映するため、短時間かつ容易に解析が可能な信頼性の高廃棄される胎盤より作り出される TS 細胞の場合は、これい試験法と期待できる。また、単に個別物質の安全性評価らの問題が解消され、短時間で測定が可能となることからを行うものではなく、低用量でかつ長期間ばく露された有コスト面でも有用である。

害物質や複合ばく露汚染などの影響も検出可能な、体系的、医新有効成分医薬品の場合、毒性試験は ⑴ 単回投与毒統合的な胎児・胎盤の評価手法となる可能性が高い。今後、性試験、⑵ 反復投与毒性試験、⑶ 遺伝毒性、⑷ 生殖発生

妊娠中の様々な基礎化粧品や植物オイルなどが胎児に及ぼ毒性試験を実施することが求められる。1 つの開発品におす影響についても、応用することが可能となると考える。

けるこれらの毒性試験に要する費用は、最低でも 10 億円といわれている（平成 16 年度～平成 17 年度調査報告「ヒト（引用文献）等の細胞を使った化学物質の影響評価試験手法の現状と課

1） Eisenhardt S et al. Nitromusk compounds in women

題に関する調査（バイオ分野）」）。国内で臨床開発が進めらwith gynecological and endocrine dysfunction. Environ− 128 −

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