ごあいさつ
この度コスメトロジー研究振興財団として、22 冊目の研究報告書を刊行いたしました。
設立以来 20 年以上にわたって、化粧品科学及び関連分野に貢献する研究テー
マに対し助成活動を滞りなく継続できたことは、多くの関係者の皆様のご理解ご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
当財団の助成領域は医学、化学、薬学、生理学、心理学、文学、社会学など多岐にわたり、それぞれの分野の研究者のお力添えにより、コスメトロジーという分野が発展してきたといっても過言ではありません。助成させていただいた研究
テーマは、新素材設計、ライフサイエンス、化粧心理、文化論など多種多様であり、化粧品学の発展に少なからぬ貢献ができたものと考えております。また、当財団の活動が社会貢献の一助になっていることを幸いに思っております。
今回の報告書では平成 23 ～ 24 年度に助成を受けられた方の中から 32 名の方の研究成果を掲載いたしました。
素材、物性に関する分野では、素材の有用性、機能設計に注目した応用性の高いテーマ、香りや匂いに着目した解析研究が特徴的であったと思われます。
生体作用、安全性に関する分野では、メカニズムとエビデンス、評価系を多面的に捉えた研究が多くみられました。
精神、文化に関する分野の研究につきましては、感覚生理学の観点から化粧の本質を解明する独創的な内容であったと考えています。精神、文化に関して、応募・採用件数が他分野に比べて少なかったことは否めませんが、人々が心の豊かさをより一層強く求める傾向がみられることから、今後は本分野の重要性も高まり、質量ともに充実することが期待されます。
当財団は分野の枠や研究機関の属性などにとらわれることなく、化粧品学の発展のために、優れた研究に対して今後も積極的に助成を行っていきたいと考えております。
今後とも、皆さまのますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 26 年 7 月
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・光学的無機ナノ粒子と金属錯体の紫外線カットと多機能複合化 …………………………………………… 4
東京理科大学理学部第二部化学科 秋 津 貴 城・固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析 ………………………………………………………………………………………………… 9
就実大学薬学部 片 岡 洋 行
・ ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導 …… 15
富山大学大学院医学薬学研究部 黒 崎 文 也
・紫外線遮光ナノ材料の UVB − UVC 光特性評価法の開発 ………………………………………………… 21
大阪大学大学院工学研究科 齊 藤 結 花
・乳化剤フリー油中水滴型（W/O）エマルションの分散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発 …… 26
信州大学工学部物質工学科 酒 井 俊 郎
・環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出……………………………………………………… 32
信州大学繊維学部 藤 井 敏 弘・芍薬に含まれるコラーゲンの AGEs 化を阻害する化合物の探索とその皮膚老化改善作用の検討 ……… 37
熊本大学大学院生命科学研究部細胞病理学分野 藤 原 章 雄
・表面が制御された徐放性ナノチューブカプセルの化粧品への応用 ……………………………………… 44
産業技術総合研究所・ナノシステム研究部門・形態機能ナノシステムグループ 増 田 光 俊
・界面活性剤吸着膜の相転移で安定化する「温度応答性エマルション」の研究 ………………………… 49
九州大学大学院理学研究院化学部門 松 原 弘 樹・パウダーエマルションおよびパウダーフォームの安定化要因の解明 …………………………………… 55
良
甲南大学理工学部機能分子化学科 村 上・環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製 …………………………… 62
徹
筑波大学大学院数理物質科学研究科 吉 冨
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・セマフォリン 3A トランスジェニックマウスにおける毛組織や皮膚の免疫環境でのセマフォリン
3A の役割の解明と皮膚炎症に対する新規治療軸の開発 …………………………………………………… 68
浜松医科大学皮膚科学講座 伊 藤 泰 介
・脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築 …… 72
北里大学薬学部衛生化学 今 井 浩 孝
・口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立 ……………………………………… 78
宏
東北大学大学院歯学研究科分子・再生歯科補綴学分野 江 草・ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発 …………………………………………………… 84
学
慶應義塾大学医学部皮膚科学教室 大 山
・皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子 MafB の役割 …………………………………… 90
横浜市立大学生命医科学研究科 片 岡 浩 介
・スキン伝達物質 ATP と皮膚のアンチエイジングに関する研究 ………………………………………… 95
山梨大学医学部薬理学 小 泉 修 一・コラーゲンの線維形成を調節するプラチナ錯体に関する研究 ………………………………………… 99
早稲田大学理工学術院 小 出 隆 規

・ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析 ………………………… 106
弘 太
物質・材料研究機構 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点 柴・接触抑制シグナルによるケラチノサイトのホメオスタシスとその破綻病態 …………………………… 112
聡
九州大学生体防御医学研究所ゲノム腫瘍学 鈴 木
・皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明 ……………… 118
元 洋
九州大学大学院理学研究院化学部門 谷・皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割 ………………………………… 123
大阪大学大学院医学系研究科皮膚科学講座 寺 尾 美 香
・創傷治癒における細胞外マトリックスの一つであるバーシカンの関与、RNAi による検討 ………… 130
元
長崎大学病院皮膚科アレルギー科 冨 田
・放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討 ………………………………………………………… 134
独立行政法人放射線医学総合研究所重粒子医科学センター 中 山 文 明
・加齢に伴う皮膚 17 型コラーゲン切断動態の解析………………………………………………………… 139
渉
北海道大学病院皮膚科 西 江

・皮膚組織において紫外線傷害を制御するユビキチン化システムの解析 ………………………………… 143
北海道大学大学院医学研究科生化学講座 畠 山 鎮 次・皮膚の生理機能解明を目指したカルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用 …………………… 147
東京大学大学院薬学系研究科 花 岡 健二郎
・天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用 ……………………………… 152
東北大学大学院薬学研究科生活習慣病治療薬学分野 平 澤 典 保・化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築
─物理・化学的性状と安全性との関連─ …………………………………………………………………… 158
産業医科大学産業生態科学研究所 堀 江 祐 範・発汗能を制御し皮膚恒常性保持能力を回復させる試み …………………………………………………… 168
大阪大学大学院医学研究科情報統合医学皮膚科学教室 室 田 浩 之
Ⅲ．精神、文化に関する分野
・交通渋滞中のドライバーの精神的ストレスおよび肉体的ストレスに対する芳香物質の影響
─パイロットスタディ─ ……………………………………………………………………………………… 174
桂
東京農工大学大学院工学府機械システム工学専攻 佐 藤・女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔の部分的化粧の影響について
─機能的磁気共鳴画像法を用いた検討─ …………………………………………………………………… 180
東北福祉大学感性福祉研究所 藤 井 俊 勝■記念講演・第 24 回表彰・贈呈式記念講演「角層を科学する」 ……………………………………………………………………………………………… 189慶應義塾大学医学部皮膚科教授 天 谷 雅 行■コスメトロジー研究雑感■付……………………………………………………………………………………………… 195

録

事業報告書

……………………………………………………………………………………………………………… 215

平成 25 年度

研究助成を受けられた方々

役員一覧………………………………………………………………………… 216………………………………………………………………………………………………………………… 218

●Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

光学的無機ナノ粒子と金属錯体の紫外線カットと多機能複合化

東京理科大学理学部第二部化学科

秋 津

貴 城

In order to develop UV filtering optical materials for cosmetology applications, we have prepared several multifunctional
hybrid materials composed of titanium (IV) oxide particles (typical photo-catalyst) and optically active L-amino acid Schiffbase copper (II) complexes. By photo-induced reactions between organic/inorganic hybrid dyes of copper (II) complexes andtypical face powder materials, absorption of additional UV light could be observed successfully.

１．緒

会うことで初めて起こる光誘起電子移動反応を、金属錯体

言の分子設計などから詳細に検討して、コスメトロジーに応

化粧品にも古くから使用されている酸化チタンなどの無用可能な知見（紫外線カットや多機能複合化）を得るため

機ナノ粒子は、光学的には光の散乱ならびに紫外部の光のの探索を目的とする。新たにアミノ酸にバリンを用い、サ吸収が顕著である。セレン化カドミウムのようにナノ粒子

リチルアルデヒドの置換基を変えた、いくつかの新規キラの粒径を調整することによって、吸収および発光する光のルシッフ塩基アミノ酸銅 Ⅱ 錯体を合成し、銅Ⅱ 錯体と波長を制御することも可能である。物質・材料面からのコ

TiO 2 複合系において紫外光の照射による銅Ⅱ 錯体の還元

スメトロジーの基礎的分野の研究として、皮膚の損傷の原反応について分光測定や電気化学等の評価を行うことによ因となる紫外線をカットする素材や諸条件の探索が広く行って比較、検討した。

われてきた。従来の研究は、無機酸化物では、ナノ粒子の２．実

均一な合成法や紫外線の吸収や、化学的な安定度（すなわち、還元すると活性酸素など皮膚に有害な化学種を生じな

２．
１

いこと）
などに重点が置かれたといえる。一方、金属錯体は、
紫外部の光を強く可視部の光を弱く吸収する特性を容易に

験

合成と同定

我々は、４つのイミダゾール配位子を有するバリン残基の新たな銅 Ⅱ 錯体を合成した。

調整できる。さらに有機色素としての性質に関しては、無図１に示すキラルシッフ塩基銅 Ⅱ 錯体は、メタノール溶液

機酸化物では吸収が困難な波長領域の光の吸収（換言すれ中で置換基を変えたサルチルアルデヒド類（salicylaldehyde,

ば、皮膚への有害光遮蔽剤として、あるいは色彩を与える

5 -chlorosalicylaldehyde, 5 -bromosalicylaldehyde,

化粧品として）が期待されている。加えて生物・医学面か

5 -methoxysalicylic acid）の脱水縮合反応で配位子を合成

らのアプローチとの融合領域では、蛋白質（ポリペプチド

し、酢酸銅 Ⅱ を添加し３時間反応させた。さらにエタノやアミノ酸）との適合性・不適合性（疎水性・親水性）や、ールおよびイミダゾールを添加し、２時間反応させた後、遺伝情報を担う核酸などの生体分子との反応性（化学的安エバポレーションと濾過により、緑がかった生成物を得た。

定性）など人体への無害性が着眼点の一つと言えよう。

この粗結晶を再結晶により精製した。化合物の同定は、収ところで、近年のグリーン・ケミストリーや生物無機化学・光化学等の融合分野を目指した我々の基礎研究の成果

率、元素分析、IR、ESR、UV-Vis、CD スペクトル、X 線
結晶構造解析等で行った。

では、いくつかの L- アミノ酸成分をもつ適切なシッフ塩
基銅Ⅱ 錯体を酸化チタンと複合化させたとき、紫外光を２．２余計に吸収する光誘起電子移動反応を示すことを見いだした 1）, 2）。

サイクリックボルタンメトリー（CV）測定RRDE- 3 A 回転リングディスク電極装置を用いた RRDE
法により、測定を行った。測定方法は、GC 電極にサンプ

そこで、本研究では、酸化チタンと適切な金属錯体が出

UV filtering and multifunctional hybridizationof optical inorganic nanoparticles andmetal complexes
Takashiro Akitsu
Department of Chemistry, Faculty of
Science, Tokyo University of Science

−4−

図１

アミノ酸シッフ塩基銅 Ⅱ 錯体

光学的無機ナノ粒子と金属錯体の紫外線カットと多機能複合化

ルを 1 . 5 × 10−8 mol 塗布し、更にナフィオン膜を塗布し固３．結定した。電解液にはクエン酸ナトリウム緩衝溶液（pH 5）を用い、測定範囲は−0.2〜0.5V vs. Ag│AgCl│NaCl（3M）とした。

３．
１

果

合成と同定

合成した錯体の同定結果は以下のとおりである。

２．
３

ZINDO 計算1

IR: 1615 cm−1（C=N）．ESR g= 2 . 007 .

（Gaussian, Inc.）の PM 6 を用いて行った。垂直励起エネルギ
ーを一重項基底状態の幾何学的形状に基づいて、ZINDOYield : 50 . 5 %. Anal.Found:C, 51 . 35 ; H, 4 . 88 ; N, 11 . 98 .%.
Calc for C 15 H 17 CuN 3 O 3 :C, 51 . 50 ; H, 4 . 61 ; N, 12 . 01 .%.

構造最適化計算はGaussian 09 W software Revision A. 022法を用いて計算した。

Yield: 55 . 5 %. Anal.Found:C, 46 . 76 ; H, 4 . 19 ; N, 11 . 03 .%.
Calc for C 15 H 16 ClCuN 3 O 3 :C, 46 . 93 ; H, 4 . 07 ;N, 10 . 82 .%.
IR : 1623 cm−1（C=N）．ESR g= 2 . 034 .

２．４ 錯体単一系と酸化チタンとの複合系の紫外光照射による UV-Vis スペクトル変化

3Calc for C 15 H 16 BrCuN 3 O 3 :C, 41 . 92 ; H, 3 . 75 ; N, 9 . 78 .%.
IR: 1630 cm−1（C=N）g= 2 . 028 .

まず、合成した銅 Ⅱ 錯体単一系をメタノール溶液中で、ある一定時間での紫外光照射による UV-Vis スペクトルのYield: 42 . 2 %. Anal.Found:C, 41 . 99 ; H, 3 . 44 ; N, 9 . 05 .%.

4

Yield : 44 . 8 %. Anal.Found:C, 50 . 56 ; H, 4 . 88 ; N, 10 . 92 .%.

変化を測定した。さらに、アナターゼ型酸化チタンとの複Calc for C 16 H 19 CuN 3 O 4 :C, 50 . 45 ; H, 5 . 03 ; N, 11 . 03 .%.

合系を調整し、同様にして UV-Vis スペクトル変化を測定

IR: 1621 cm−1（C=N）．ESR g= 2 . 033 .

した。

また、結晶構造解析の結果を表１に示す。3 の錯体に関しては、結晶を得ることが出来なかった。

２．
５

六配位八面体型キラルシッフ塩基銅 Ⅱ 錯体

分子の配位子による修飾だけでなく、分子構造に着目し３．２て研究を進めるため、我々は新たに六配位八面体型キラル
シッフ塩基銅 Ⅱ 錯体の合成を行った。カリウム塩としてサイクリックボルタンメトリー（CV）測定RRDE 法を用いたサイクリックボルタンメトリーの測定
結果を表２に示す。

析出させるために、アミノ酸には極性アミノ酸であるアス

３．３

パラギンを選択した。
合成方法としては、まずメタノールに溶かした salicylal
dehyde と、水に溶かしたアスパラギンの脱水縮合反応でUV-Vis・CDスペクトル及び ZINDO 計算

錯体単一系の UV-Vis と CD スペクトル測定結果を図２に、ZINDO 計算結果を図３に示す。

配位子を合成した。常温に戻し、カリウムを加え１時間撹
拌した後、塩化銅 Ⅱ を添加し更に２時間加熱反応させた。
エバポレーションと濾過により、緑がかった生成物を得た。

３．４ 銅 Ⅱ 錯 体 単一系と酸 化チタンとの 複合系の
UV-Vis スペクトル変化

化 合 物 の 同 定 は、 収 率、 元 素 分 析、IR、ESR、UV-Vis、
CD スペクトル等で行った。

錯体単一系の紫外光照射による UV-Vis スペクトル変化を図４に、酸化チタンとの複合系における UV-Vis スペク

また、錯体単一系と酸化チタンとの複合系による紫外光照射による UV-Vis スペクトル変化を測定した。

表１

トル変化を図５に示す。この時、錯体＋酸化チタン複合系
は懸濁液であった。

結晶構造解析（1. 2. 4）−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

表２ CV 測定による酸化還元電位 vs Ag│AgCl│KCl（sat., aq）

図２

10 . 078 V

2

0 . 014 V

30 . 011 V

4−0 . 001 V

UV-Vis, CD スペクトル比較

図４

図３

錯体単一系のスペクトル変化−6−

ZINDO 計算

光学的無機ナノ粒子と金属錯体の紫外線カットと多機能複合化

図５

図６

錯体＋酸化チタン複合系のスペクトル変化

六配位八面体型キラルシッフ塩基銅 Ⅱ 錯体

図７

３．
５

六配位八面体型キラルシッフ塩基銅 Ⅱ 錯体

錯体単一系のスペクトル変化➡

合成した錯体はカリウム塩として析出した（図６）。同
定結果は以下のとおりである。
Yield: 30 . 5 %. Anal.Found:C, 43 . 22 ; H, 3 . 19 ; N, 9 . 09 .%. Calc
for C 22 H 20 CuK 2 N 4 O 8 :C, 43 . 11 ;H, 3 . 30 ;N, 9 . 18 .%. IR:
1623cm−1（C=N）．ESR g= 2 . 057 .
四配位平面型錯体と同様に、錯体単一系の紫外光照射による UV-Vis スペクトル変化を図７に、酸化チタンとの複合系における UV-Vis スペクトル変化を図８に示す。この時、錯体＋酸化チタン複合系は懸濁液であった。

図８

−7−

錯体＋酸化チタン複合系のスペクトル変化

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

４．考
４．
１

察

UV-vis・CDスペクトル及び ZINDO 計算

ZINDO 計算により算出された 1，4 の UV-vis スペクトルは実験で得られた結果と定性的に一致した（図３）。導入した電子供与基であるメトキシ基は π-π* バンドの長波長シ
フトと酸化還元電位の負のシフトをもたらしていることが示唆される。また、バンドは計算結果に基づいて割り当て

図９られている。

４．２ 銅 Ⅱ 錯 体 単一系と酸 化チタンとの 複合系の
UV-Vis スペクトル変化

光誘起電子移動反応（概念図）

５．総括

錯体単一系に紫外光を照射したところ、スペクトル変化

我々は酸化チタンと適切な金属錯体とを複合化してはじは見られなかった（図４）。しかし、酸化チタンとの複合

めて紫外光を余計に吸収する電子移動反応が起こる場合を系に紫外光を照射した場合には配位子によって変化が見ら見いだした（図９）。その光誘起電子移動反応は、僅かなれた（図５）。1・2・3 の錯体については、π-π* バンドと分子修飾により制御されることが明らかとなった。また、

d - dバンドの強度減少を示しており、銅 Ⅱ が銅 Ⅰ へ還元

分子設計の再検討により、より機能性を有する（紫外線カされていることが示唆された。しかし、4 の錯体について

ット・色彩変化・化学種の安定性等）材料への応用が期待は π-π* バンドの強度減少がみられたものの、d-d バンドされる。

の強度については変化が見られなかった。
4 の錯体は電子供与基であるメトキシ基を有し、酸化還（参考文献）

元電位は負の値を示している（表２）。このことから、配１）Kurata M, Yoshida N, Fukunaga S, and Akitsu T: Proposed

位子による錯体の酸化還元電位が、光誘起電子移動反応に

mechanism of photo-induced reactions of chiral threonine

よる錯体の還元反応に影響を及ぼしていることが示唆されSchiff base Cu Ⅱ complexes with imidazole by TiO,

る。

Contemporary Engineering Sciences, 6 , 255 - 260 , 2013 .
２）Yoshida N, Akitsu T: Reaction of Hybrid Systems

４．
３

六配位八面体型キラルシッフ塩基銅 Ⅱ 錯体

Composed of Cu Ⅱ Complexes Having Chiral Schiff Base1 〜 3 の錯体と同様に、紫外光照射による UV-Vis スペ

Amino-Acid Ester Derivatives and TiO 2 , In Integrating

クトルにおいて d- d バンドの強度減少が見られた。しかし、Approach to Photofunctional Hybrid Materials for Energy

π-π* バンドの吸収強度の変化がほぼ見られないことから、

and the Environment, Nova Science Publishers, Inc.（NY,

配位子の劣化が抑えられていることが示唆された。

USA），2013 , chapter 5 , 111 - 124 , and references therein.

−8−固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析
就実大学薬学部

片 岡

洋 行

Since the odors and emanations released from human body can include essential information about the state of healthand diseases, chemical analysis of their components is attracting attention as an objective quantitative evaluation. In thisstudy, we developed a non-invasive analytical method for the determination of 2-nonenal as a body odor component byheadspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry (SPME/ GC-MS). 2-Nonenal in skinemissions and secretions collected by gauze wiping were easily extracted onto the SPME fiber, and then analyzed sensitively
by GC-MS. Using this method, we analyzed body odor changes by use of cosmetics, food intake, cigarette smoking andstress load.

１．緒や定量性に問題がある。そこで、我々がこれまでに開発し言てきた固相マイクロ抽出（SPME）法5 − 7）

を用いれば、簡

近年、清潔志向が高まり、口臭や体臭、加齢臭を気にす単な器具でサンプリングと同時に抽出濃縮ができることかる体臭恐怖症（自臭症）が増加しており、消臭化粧品やデら、皮膚ガス及び皮膚滲出液中の体臭成分を生体から直接オドラント関連製品が開発されている。また、体臭は健康

サンプリングして定量評価できると考えられる。

状態を示すバロメーターであり、ストレスや生活習慣病の本研究では、サンプリング ･ 前処理の重要性に着目し、サインとも言われ、心身症とも関連して社会生活の障害とファイバー SPME 法を用いて皮膚ガス ･ 皮膚滲出液中の揮なっている 。しかし、体臭は周囲の指摘が困難で判断基

発成分を非侵襲的かつ簡便迅速にサンプリング、抽出濃縮

準も曖昧であることから、体臭の客観的な定量評価法の開し、ガスクロマトグラフ－質量分析（GC−MS）法との連結発が望まれている。体臭にはスパイシー臭、脂肪酸臭、硫により高感度分析する方法を開発した。また、本法を用い黄臭などがあり、汗腺や皮脂腺などの分泌物が皮膚細菌にて、体臭成分の一つである 2 -Nonenal をバイオマーカーとよって分解された揮発成分や体外から摂取された化合物成した皮膚ガス ･ 滲出液サンプリング分析法を検討し、さら分に由来すると考えられている。特に、皮脂腺から分泌さに香粧品使用や食品摂取、ストレスや喫煙など内的、外的

れ る 9 -Hexadecenic acid が 酸 化 ･ 分 解 さ れ て 生 成 す る

要因による体臭への影響を解析した。初年度は不飽和アル

2 -Nonenal などの不飽和アルデヒド類が加齢臭の原因の一

デ ヒ ド 類 の SPME/GC−MS 法 の 開 発、 最 終 年 度 はつとなっている（図１） 。しかし、体臭成分分析の鍵と2 -Nonenal に的を絞って体臭分析を行った。

1）

2）

なるサンプリング器材や分析手法が確立されてないため、

２．実

それらの発生の実態や動態については、十分解明されていない

1 − 4）。特に、皮膚表面から発生する“におい”は複雑

2 .1

試

験

薬

で極微量であるため、官能的に感知できても分析機器で検

体臭関連の分析対象標準物質として、2 -Nonenal（ナカ

出困難な場合があり、成分を分離同定 ･ 定量するためには、

ライテスク製）を用い、LC-MS 用メタノールに溶かして１

サンプリングや前処理を効率化した高感度分析法の開発がmg/mL とし、密栓して冷蔵（４℃）保存した。これを用時、重要な課題となっている。従来、皮膚ガスサンプリング法

LC−MS 蒸留水で希釈して用いた。

として、手のひらを PVF バッグに入れて採取する方法が報告されているが、気密性や定量性に問題がある。また、

2.2

装置及び測定条件

体臭成分の分析法として、ヘッドスペースサンプリングや

GC−MS 分 析 は、島 津 QP−2010 GC−MS 装 置 を 用 い、

溶媒抽出後、GC 分析する方法が報告されているが、感度

SPME/GC−MS 法 に よ り、SIM モ ー ド（2 -Nonenal：m/z= 55 , 83 , 111）で 分 析 し た。GC 分 離 は、DB−1（60 m×

Development of sensitive analytical methodof body odor components using solid-phasemicroextraction, and analysis of theirchanges by use of cosmetics, food intake
and stress load
Hiroyuki Kataoka
School of Pharmacy, Shujitsu University

0 . 25 mm i.d.）キャピラリーカラムを用い、190℃（２分間保持）から 230 ℃まで５℃ /min の昇温で行った。

2.3

ファイバー SPME 操作法

SUPELCO 社製の SPME ホルダー及びファイバーアッセ
ンブリーからなる SPME ユニットを使用した。ファイバ−9−コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ーアッセンブリーとして、次の異なる固定相を固定化したを「抽出時間」と表記する。一定時間放置後、ファイバー

７種のファイバーを使用した。

を収納して針を抜き、GC − MS の試料気化室に導入し、＜吸収型＞抽出された化合物を加熱により脱離する（図２）。SPME① PDMS（Polydimethylsiloxane、膜厚 100 mm）

による抽出条件は本研究により最適化した。

② Polyacrylate（膜厚 85 mm）

2.4

＜吸着型＞
③ Stable Flex PDMS/DVB（PDMS/divinylbenzene、 膜
厚 65 mm）

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング方法として、図３に示す４つの方法を比較検討した。皮膚を石鹸で洗浄し④ CAR/PDMS（Carboxen/PDMS、膜厚 75 mm）て３時間後にサンプリングを行った。

⑤ Stable Flex CAR/PDMS（膜厚 85 mm）

2.5⑥ CW/DVB（Carbowax/DVB、膜厚 65 mm）⑦ DVB/CAR/PDMS（膜厚 50 / 30 mm）

拭き取り法または貼り付け法による体臭分析

本学研究倫理安全委員会の承認のもと、20 歳代から 50＜操作手順＞

歳代の男女４名の被験者に対して、実験の趣旨を説明し、試料溶液をホットプレートスターラーに乗せ、試料を加同意を得て皮膚ガス ･ 皮膚滲出液をサンプリングした。図熱する。この時の加熱温度を「抽出温度」と表記する。次３の③または④の方法に従い、0 . 1ｇの乾燥ガーゼを用いにバイアルのセプタムに SPME 針を貫通させ、続いてフて、額、腕、耳裏、腋は拭き取り法、胸部、背中からは貼ァイバーをヘッドスペース（HS）中に露出し、加熱によりり 付 け 法 に よ り サ ン プ リ ン グ し、2 -Nonenal を HS−気化した物質を吸着させる。この時のファイバー露出時間

SPME/GC −MS 分析した。

図１

脂質過酸化反応による 2-Nonenal の推定生成機構 2）（A）ヘッドスペース ー SPME による抽出

図２（B）GC 気化室での熱脱離ヘッドスペースファイバー SPME/GC − MS 法の概要

− 10 −

固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析

また、香粧品の使用、食品摂取、喫煙やストレスなどにたが、特徴的なフラグメントイオンとして、m/z= 55、83、

よる体臭変化を解析するために、これらの事前 ･ 事後にお111 が検出されたことから、これらを選択して SIM モード

ける皮膚ガス ･ 皮膚滲出液を上記の方法によりサンプリン

で測定を行うこととした。また、図５に示すように同濃度

グし、2 -Nonenal を HS−SPME/GC−MS 分析した。

の溶液をヘッドスペース法による直接注入（MeOH 溶液 ,

３．結
3 .1

１mL）と、ファイバー SPME 法を用いて比較したところ、

果

SPME 法により効率よく濃縮できることがわかった。

GC− MS 分析法の確立

ス キ ャ ン モ ー ド（m/z：30−150）GC−MS 法 に よ り、

3.2

HS−SPME 条件の最適化

2 -Nonenal（分子量 140）標準溶液のマススペクトルを分析

SPME 法は分配係数に従った化合物の移動による抽出法

した結果、図４に示すように分子イオンは検出されなかっであるため、迅速かつ高い抽出率をあげるためには化合物

①

③、④

②

図３

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法①ガラス容器に蒸留水２mL を入れ、水が手のひらの皮膚に接するよう５分間片方の手で押さえ、皮膚
滲出液を蒸留水中に抽出し、この溶液をバイアルに入れて HS−SPME 抽出する。
②吸引カップを用いて、セプタムを通して SPME ファイバーを手のひらの上部に挿入し、直接 HS −SPME 法で５分間抽出する。
③脱脂綿またはガーゼ 0.1ｇで手のひら２cm 角の範囲を１分間拭き取り、バイアルに入れて、直接 HS−SPME 抽出する。
（拭き取り法）④脱脂綿またはガーゼ 0.1ｇを手のひらにテープで貼り付け、３時間後にバイアルに入れて、直接 HS−SPME 抽出する。
（貼り付け法）図４

図５2-Nonenal 標準溶液のマススペクトル

ヘッドスペース法と SPME 法により得られたクロマトグラム− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014のファイバー固定相への分配率を上げることが重要である。

の回収量を測定した。図７に示すように、脱脂綿では回収

そこで、７種のファイバーを検討したところ、65 mm Stableにばらつきが見られ、ガーゼを使用することにより安定しFlex PDMS/DVB ファイバーを用いるとき、2 -Nonenal をて回収できることから、拭き取り法及び貼り付け法ではガ

効率よく抽出できることから、以後の実験ではこのファイーゼを使用することにした。
ガーゼを用いた拭き取り法による 2 -Nonenal の回収率をバーを用いることにした。
また、ガーゼ 0 . 1ｇに５ng の 2 -Nonenal を染みこませて、求めるために、５ng の 2 -Nonenal をシャーレにとり、ガ40 mL バイアル中で 65 mm Stable Flex PDMS/DVB ファ

ーゼ 0 . 1ｇで拭き取ってバイアルに入れ、HS−SPME/GC−

イバーを用いて HS−SPME 抽出条件を最適化したところ、

MS 分析した。直接５ng の 2 -Nonenal をバイアルに入れて抽出温度 50℃で 45 分間ファイバーをヘッドスペース中に測定した場合と比較して、約 60％の 2 -Nonenal が回収でき曝露することにより、効率よく抽出濃縮できることがわかることがわかった。
また、ガーゼでサンプリングした皮膚ガス ･ 皮膚滲出液った。

中の 2 -Nonenal の安定性を調べるために、2 -Nonenal １

3.3

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法の検討

mg/mL 標準溶液を 40 mL バイアルに入れて、密栓して室

図３の①～④の方法に従い、0 . 1ｇの脱脂綿またはガー

温、冷蔵、冷凍で保存し、24 時間後に 2 -Nonenal の抽出、ゼを用いて、手のひらから皮膚ガス ･ 皮膚滲出液をサンプ測定を行った。図８に示すように、冷凍保存することによ

リングし、HS−SPME/GC−MS 分析したところ、図６にり 2 -Nonenal の減少率は低かったことから、ガーゼでサン示すように、拭き取り法が最も効率よく 2 -Nonenal を回収

プリングした後、直ちにセプタム付バイアル瓶に入れて凍できることがわかった。そこで、拭き取りに用いる脱脂綿

結保存すれば、2 -Nonenal の分解を防ぎ安定した結果が得とガーゼからの 2 -Nonenal の回収を比較するために、脱脂られることがわかった。

綿またはガーゼ 0 . 1ｇをバイアル瓶に入れ、2 -Nonenal を

そこで、ガーゼを用いた拭き取り法による 2 -Nonenal の

５ng 添加して、経時的にこれらの素材からの 2 -Nonenal

検量線、検出限界及び再現性について検討した。ガーゼ

図６

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法の比較

図８

図７

サンプリング素材の比較

サンプリング後のガーゼの保存条件の検討− 12 −

固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析

0 . 1ｇに 1 ～ 50 ng の 2 -Nonenal を滴下し、HS−SPME/GCに、脂肪酸と過酸化脂質の反応によって生成すると言われ−MS 分析した結果、表１に示すように、相関係数は 0 . 991ており、脂肪や脂肪酸を多く含む食品の摂取や、脂質過酸と良好な直線性を示し、検出限界は 171 pg（S/N= 3）と高化に関与する活性酸素の発生が大きな要因となっている。

感度に検出できることがわかった。また、日内及び日差変

従って、飲酒や喫煙、ストレスなども体臭変化に影響する

動 に お け る 相 対 標 準 偏 差 RSD は、 そ れ ぞ れ 9 . 6 % 及 びと考えられる。また、化粧や体臭を消すと言われている消3 . 6 % と再現性良く定量できることがわかった。

臭石鹸の使用も体臭変化に影響すると考えられる。そこで、本研究で開発した方法を用い、2 -Nonenal をバイオマーカ

3.4

体の各部位からの 2 -Nonenal 分泌量と日内変化

ーとして香粧品使用や食品摂取、ストレスや喫煙など内的、被験者３名（A：20 代女性 , B：20 代男性 , C：30 代男性）

外的要因による体臭への影響を解析した。

について、体を石鹸で洗浄後、６時間の通常の生活におい表２に示すように、低脂肪食（肉を含まない）と高脂肪て分泌される 2 -Nonenal を、額、腕、耳裏、腋からガーゼ

食（牛焼肉 500ｇ）の後、12 時間後にガーゼ拭き取り法に拭き取り法（0 . 1ｇ）により採取し、また、胸部、背中、枕より額からサンプリングし、HS−SPME/GC−MS 分析したか ら は ガ ー ゼ 貼 り 付 け 法（0 . 1ｇ）に よ り 採 取 し、HS −ところ、高脂肪食で有意に 2 -Nonenal が増加することがわ

SPME/GC − MS 分析した。図９に示すように、個人差はかった。また、化粧水使用の有無や喫煙の前後においては、あるものの、2 -Nonenal は額、腕、耳裏から比較的多く分

若干の 2 -Nonenal の増加が認められたが有意な差ではなか泌されていることがわかった。

った。ストレス負荷として、会議の前後（精神的ストレス）

そこで、洗浄した額（２cm×２cm 四方）の４箇所につや 運 動 前 後（ 肉 体 的 ス ト レ ス ）に お い て は、 有 意 にいて、３時間毎にガーゼ拭き取り法（0 . 1ｇ）により皮膚ガ

2 -Nonenal が増加し、特に運動後は大量の 2 -Nonenal が発

ス ･ 皮膚滲出液を採取し、HS−SPME/GC−MS 分析した生していることがわかった。これは、運動による発汗で皮ところ、2 -Nonenal は 13 ～ 16 時の午後の時間帯に比較的脂腺から脂肪酸や過酸化脂質の分泌が増加し、体表中の常多く分泌されていることがわかった。

在細菌によって 2 -Nonenal への酸化分解が促進されたものと思われる。

3. 5 香粧品使用、食品摂取、ストレスや喫煙などによる体臭への影響

石鹸による消臭効果を 50 歳代男性で調べた。普通の石け

体臭成分の一つである 2 -Nonenal は、緒言に述べたようん水（無添加）及び柿渋石鹸（柿タンニン配合）でそれぞれ

表１

一方、最近デオドラント製品として市販されている柿渋

ガーゼ拭き取り法によるファイバー SPME/GC− MS 法のバリデーション

図９

体表の各部位における 2-Nonenal 検出量の比較− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

表２

様々な生活習慣による体臭変化の解析

体を洗浄後、ガーゼ貼り付け法により、胸部及び首にガー（引用文献）

ゼを貼り、一晩睡眠後、起床時にガーゼを回収し、HS −１）Kataoka H., Saito K., Kato H., Masuda K., Non-

SPME/GC−MS 分析したところ、柿渋石鹸使用により、

invasive analysis of volatile biomarkers in human

2 -Nonenal の発生がほとんど認められなかった。これは、

emanations for health and early disease diagnosis.

柿渋エキスによる殺菌効果によるものと思われる。

（Review）Bioanalysis, 5（11），1443 − 1459 , 2013 .

４．考２）Haze S., Gozu Y., Nakamura S., Kohno Y., Sawano

察

K., Ohta H., Yamazaki K., 2 -Nonenal newly found in
human body odor tends to increase with aging. J.

本研究により、体臭成分の一つである 2 -Nonenal を HS

Invest. Dermatol., 116 , 520 − 524 , 2001 .

−SPME/GC−MS により簡便かつ高感度に分析できることがわかった。皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法

３ ）P a n d e y S . K . , K i m K . - H . , H u m a n b o d y - o d o r

については、ガーゼ拭き取り法が効果的ではあるが、拭き

components and their determination. Trends Anal.

取り方を一定にする必要があり、回収率や定量性に関して

Chem., 30 , 784 − 796 , 2011 .

もまだ検討の余地がある。また、体臭は複合臭であり、

４）Jiang R., Cudjoe E., Bojko B., Abaffy T., Pawliszyn

2 -Nonenal だけでなく他の体臭成分との相互作用や、前駆J., A non-invasive method for in vivo skin volatile

物質である 9 -Hexadecenic acid の動態についても解析する

compounds sampling. Anal. Chim. Acta, 804 , 113 − 119 ,2013 .

必要がある。今後、さらに効率的かつ簡便なサンプリング
手法に改良し、2 -Nonenal や他の体臭成分の生成及び分解

５）Kataoka H, Recent developments and applicationsのメカニズムを明らかにして、食習慣や生活習慣の改善に

of microextraction techniques in drug analysis. Anal.

よる効果的な体臭対策法を検討していく予定である。

Bioanal. Chem. 396 , 339 − 364 , 2010 .
６）Kataoka H, Saito K. Recent advances in SPME

（謝

辞）techniques in biomedical analysis. J. Pharm. Biomed.
Anal. 54 , 926 − 950 , 2011 .

本研究を行うにあたり、多大なるご援助を賜りました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたし

７）Kataoka H., Solid-phase Microextraction: Biomedical
Applications. in Chemistry, Molecular Sciences andます。

Chemical Engineering. Edited by Jan Reedijk（Elsevier,Academic Press: Oxford, UK），2014 , in press.

− 14 −

ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変による
フレグランス構成成分生合成活性の誘導
富山大学大学院医学薬学研究部

黒 崎

文 也

Several lines of evidence suggested that Rac/Rop GTPases in Aquilaria microcarpa play roles in jasmonates-induced
activation of sesquiterpene biosynthesis in the plant cells. The expression of farnesyl diphosphate synthase gene of A.
microcarpa was markedly increased even in the absence of methyl jasmonate in the cells over-expressing a calmodulin gene
and a Rac/Rop GTPase gene. These findings suggest that calmodulin and Rac/Rop GTPase proteins should function as a key
mediator in jasmonate-signaling in higher plant cells.

１．緒

今回の研究の材料として用いたのは東南アジア原産のジ言

ンチョウゲ科木本植物である Aquilaria microcarpa で、機Jasmonic acid（JA）及びそのメチルエステル体である

械的傷害や微生物の感染といったストレスにさらされるこ

methyl jasmonate（MJ）は「jasmonate」と称される植物とにより、幹の内部に芳香性セスキテルペンを多く含む樹ホルモンの一種で、植物の成長、発達ならびに乾燥、傷害、脂状の「沈香」を形成する。通常の状態ではマスクされて微生物の感染等の多彩な外的ストレスに対する防御応答にいる Aquilaria 植物のセスキテルペン生合成能を発現させおいて重要な役割を担うメッセンジャー分子である 。まるために様々な試みがなされているが、最近 Okudera 等

た、jasmonate を細胞外から人為的に添加することによっによって MJ 刺激を与えることでセスキテルペン群の生合て、様々な二次代謝産物の生合成が活性化することが良く成が誘導されることが示された。 本研究では、jasmonate

知られている 。最近の研究によれば、JA は植物細胞内を引き金とする A. microcarpa のセスキテルペン生合成発に 取 り 込 ま れ た 後 isoleucine と 接 合 体 を 形 成 し、SCF

現に関わる細胞内情報伝達機構を解明し、その応用として、

ubiquitin E 3 ligase の構成成分である COI 1 タンパクに認Aquilaria 細胞内に潜在的に存在している二次代謝能を顕識される。 その後、転写抑制因子である JAZ がユビキチ在化させるための方法論を開発することを目的とした。

1）2）

ン化され、次いでプロテアソームによる分解を引き金とし

2．実てカスケードに関わる様々な因子の転写が開始されること
3）

5）

験

が示されている 。しかしながら、その後、どのような機

2 .1 RACE法によるFaPS 並びに Am-racのクローニング

構によって多様な細胞の反応が誘導されるかについては殆

A. microcarpa のカルスからRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）

んど知見が無い。我々のグループはこれまでの研究で MJによって total RNA を抽出し、次いで逆転写反応によってをはじめとする外部刺激に呼応した二次代謝産物生合成能

cDNA を合成した。3’-RACE のための cDNA については

活性化には Ca カスケードの活性化が必須であり、更に、

GeneRacer Kit（Invitrogen）、 ま た、5’-RACE の た め の

こ れ ら の プ ロ セ ス に は Ca 結 合 タ ン パ ク で あ る

cDNA は 5’/ 3’RACE Kit 2 nd Generation（Roche）をそれ

calmodulin（CAM）や monomer 型 GTP 結合タンパクの一ぞれ用いて作製した。データベースを検索して設計したプ種である Rac/Rop GTPase などの機能分子が関与するこライマーを組み合わせて PCR を行い、増幅された DNA 断とを報告している 。また、これらの現象が、植物種や化片を精製した後に pGEM-T Easy Vector（Promega）に組合物種に依存せず幅広く保存されていることに着目して、み込んだ。その後、One Shot Top10 Chemically Competent

情報伝達関連因子の遺伝子を植物に導入・発現させ、細胞Cell（Invitrogen）を形質転換して、目的の遺伝子の存在が内情報伝達機構を人為的に操作することで、二次代謝能を確認できたプラスミドの塩基配列を決定した。

2+

2+

4）

4）

活性化させうる可能性を提案している 。

2.2
Induction of biosynthetic activity ofsesquiterpene compounds by artificial
modif ication of sig na l-transduct ion
processes of Aquilaria plant cells
Fumiya Kurosaki
G r adu at e S cho o l of Med ic i ne a nd
Pharmaceutical Sciences for Research
University of Toyama

RT-PCR による発現解析

Murashige-Skoog（MS）寒天培地上に A. microcarpa のカルス（100 mg）をとり、yeast extract（Difco、
１mg/mL）、
2+

MJ（和光純薬、100 μM）、Ca -ionophore A 23187（和光
純薬、10 μM）の溶液（100 μL）を滴下することで刺激を加え、25℃、暗所でインキュベートした。外部刺激を与えた後、経時的にカルスを回収し、前述の方法で total RNA を調製− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014した。 得られた RNA を逆転写し、次いで、目的遺伝子の凍 結 融 解 法 に よ っ て Agrobacterium tumefaciens 4404

翻訳領域及び 3’
側非翻訳領域に対応するプライマーで PCR（Invitrogen）に導入した。

を行い、生成物を電気泳動で分析して発現量を解析した。

植 物 へ の 遺 伝 子 導 入 に あ た っ て は 形 質 転 換 し た A.

コントロールには total RNA あるいは恒常的に発現するこtumefaciens 菌液にカルスを３分間浸漬し、次いで菌液をとが確認されている Am-cam 2 を用いた。

濾紙に吸収させた後、2 , 4 - dichlorophenoxyacetic acid ３
6μM、N -benzyladenine ３μM を 含 む MS 寒 天 培 地 上に 静

2. 3 阻害剤存在下での MJ 刺激に対する Am-FaPS1の発現解析
プロテアソーム阻害剤である MG- 132（Calbiochem、10

置 し た。 こ れ ら を 25 ℃、 暗 所 で ３ 日 間 共 培 養 し た 後、
cefotaxime（和光純薬、500 μg/mL）、kanamycin（和光純薬、50 μg/mL）、2 , 4 -dichlorophenoxyacetic acid6

３μM、or 2 . 5 μM）、rac 阻 害 剤 で あ る NSC 23766（Calbiochem、

N -benzyladenine ３μM を含む MS 培地上に 25℃暗所で４100 or 25 μM）、Ca チ ャ ネ ル 阻 害 剤 で あ る verapamil

日 間 静 置 す る こ と で 殺 菌 を 行 っ た。GFP、Am-cam 1、hydrochloride（Sigma、100 or 25μM）、また、CAM阻害剤でAm-rac 2、CArac 2、DNrac 2 を組み込んだ A. microcarpa

あるN（6 - aminohexyl）-5 - chloro-1-naphthalenesulfonamideのカルス（100 mg）から前述の手法で total RNA を抽出し、（W- 7、BIOML. Res. Lab.、100 or 25 μM）をそれぞれ含ん

逆転写によって cDNA を得て PCR を行い、生成物の電気

だ2,4-dichlorophenoxyacetic acid、３μM、N -benzyladenine

泳動によって発現量を解析した。定量的評価にあたっては、

３μM 入りの MS 寒天培地を作製し、その上にA. microcarpa

Image J を用いてバンドの濃度を数値化し相対値として表のカルスを静置して、25℃、暗所で４日間プレインキュベ

した。

2+

6

ーションを行った。次いで MJ（100 μM）100 μL を滴下し

3．結

６時間インキュベーションを行い、total RNA の逆転写によって得た cDNA を鋳型として PCR を行った。また、コン

3.１

トロールには Am-cam 2 を用いた。

3.1.1

果

FaPS のクローニングと諸性質の解析
FaPS のクローニング

A. microcarpa のセスキテルペン生合成活性を評価する

2. ４

Am-rac2 への変異の導入にあたり、まず前駆物質であるファルネシル二リン酸生合

Am-rac 2（GenBank accession no. JF 922915）を用いて、成酵素、FaPS、をコードする遺伝子を単離することを試み

植物に恒常的活性型、恒常的不活性型の Am-rac 2 タンパ

た。これまでに報告されている FaPS 遺伝子配列中でよくクを発現させるために Am-rac 2 の ORF に 1 塩基置換を行保存されている領域からプライマーを設計し、RACE 法にった。

よりクローニングを行った。縮重プライマーにより、まず

2.4.1

恒常的活性型 Am-rac 2 の作製

コア構造を得た後に 3’側および 5’側の配列をそれぞれ決Am-rac 2 の GTP の加水分解を担う領域にある G 15 を V定した。得られた配列をデータベースに報告されている配に置換するためのプライマーを設計し、Quick Change Ⅱ

列と比較検討してところ、既知の FaPS 遺伝子配列と高い

Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を 用 い て プ

相同性を示し、新規の FaPS 遺伝子であることを確認した。

ロトコールに従い反応を行った。得られた恒常的活性型

Am-FaPS 1 と 名 付 け た 遺 伝 子（GenBank accession no.

Am-rac 2 を CArac 2 とした。

HM 067872）は全長 1310 塩基であり、342 アミノ酸をコー

2.4.2

ドしていた。

恒常的不活性型 Am-rac 2 の作製

Am-rac 2 の GDP/GTP 結合領域である D 121 を A に置換

3.1.2

アミノ酸配列の特徴と比較するためのプライマーを設計し、CArac 2 と同様の手法でAm-FaPS 1 と他の植物の FaPS のコードするアミノ酸配恒常的不活性型Am-rac2を得て、これを DNrac 2 とした。

列を比較したところ、いずれの対象に対しても高い相同性を示し、FaPS として機能するために必要とされている鎖

2.5

2+

形質転換植物体の作成

長決定領域や活性部位覆部領域、Mg 結合部位も確認さ

A. microcarpa より単離した CAM 遺伝子 Am-cam 1、並れた。アミノ酸配列の系統樹解析ではいずれの FaPS も高びに、Am-rac 2、CArac 2、DNrac 2 を発現させた形質転い相同性を示し、Am-FaPS 1 は特にトウダイグサ科のタカ

換植物を作るにあたり、CMV 35 S プロモーター支配下にトウダイ（E. pekinensis）と最も高い相同性を示した（Fig. 1）。

そ れ ぞ れ の 目 的 遺 伝 子 を 配 置 し た pBI-OX-GW（GFP

3.1.3

RT-PCR による発現解析

selective）（Inplanta Innovations）を構築した。コントロ

外部刺激に対する Am-FaPS 1 の発現応答についての知ールとしては GFP のみを発現するものを用いた。エント

見を得るために、A. microcarpa のカルスを様々な試薬でリーベクター内の ORF 部分を LR clonase（Invitrogen）を処理し、発現変化を RT-PCR を用いて経時的に観察した。

用いて pBI-OX-GW に組み入れ、これを、37℃、５分間の本実験で用いた試薬の中で MJ がもっとも顕著な転写活性− 16 −

ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導の活性化を誘導し、処理後 3 時間から発現の上昇が観察さ

Scoparia dulcis のジテルペン化合物の生合成をモデルとしれ高いレベルに維持されていた（Fig. 2）。Yeast extractて、MJ 添加による植物二次代謝能活性化の細胞内情報伝

は植物の防御応答に関連する二次代謝産物の生合成を誘導

達機構についての提案を行なっている。しかしながら、することが知られているが、処理後 3 時間から MJ と同様

MJ による S. dulcis のジテルペン生合成活性化は、いわば2+に転写活性の上昇が観察された。 Ca -ionophore A 23187「既存の生合成活性の上昇」というべきものであるが、本処理では転写活性の上昇は見られたものの、処理後６時間

研究の対象とした A. microcarpa のセスキテルペン生合成をピークとして 24 時間には処理前と同程度にまで減少しの誘導は「高等植物が潜在的に保有している二次代謝活性

た 。

の顕在化」であり、S. dulcis の場合とは区別すべきものと6）考えられる。この「潜在的生合成能の顕在化」においても、

3 . 2 MJ 誘導性 Am-FaPS 1の発現に及ぼす様々な情報伝達阻害剤の効果

我々が既に提案した機構と類似する細胞内イベントが関与するか否かを検討するために、様々な情報伝達関連因子阻

今回のこれまでの実験で、MJ が A. microcarpa におけ害剤の存在下で A. microcarpa のカルスに MJ 外部刺激をる Am-FaPS 1 の発現を顕著に活性化させることが明らか

与え、Am-FaPS 1 の発現変化を RT-PCR によって観察しとなった。我々のグループはゴマノハグサ科植物である

た（Fig. 3）。その結果、Rac/Rop GTPase、Ca - チャンネ

Fig. 1 FaPS アミノ酸配列の系統樹による比較。カッコ内は GenBank
accession number を示す。

Fig. 2 RT-PCR に よ る Am-FaPS1 の 発 現 解 析。MJ、yeast extract、
Ca2+-ionophore 処理による発現量の変化。Control は H2O による処理。

− 17 −

2+

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ル、CAM、ユビキチン - プロテアソームの阻害剤で処理を

Am-rac 1 及 び 2 が コ ー ド す る タ ン パ ク と 他 の 植 物 の行なったいずれの場合においても、これらの試薬の濃度にRac/Rop G タンパクのアミノ配列を比較したところ、ほ依存して、MJ 添加による Am-FaPS 1 発現が阻害されるこ

とんどの対象に対して非常に高い相同性を示し、また G タとが明らかとなった 。

ンパクとして機能するために必須とされている４つの7）

GTP 結合部位やエフェクター結合領域も確認された。一3 . 3 Am-rac のクローニングと諸性質の解析

般に small GTPase は、原形質膜への移行・局在のための3.3.1

プレニル化を受けるコンセンサス配列である C-X-X-L を C

Am-rac のクローニング

MJ 刺激に応答した植物細胞の二次代謝物産生に到るシ末端に持つとされている。Am-rac 翻訳産物のアミノ酸配グナル伝達経路の中で Rac/Rop 型 GTPase が重要な因子と列を見ると、Am-rac 2 にはプレニル基との結合のためのして機能している可能性が示唆されたことから、情報伝達

コンセンサスなモチーフが含まれているのに対し、Am-にこれをコードする遺伝子を A. microcarpa より単離する

rac 1 にはこれが含まれていないことが明らかとなった。

ことを試みた。縮重プライマーによってコア構造を得た後したがって Am-rac 1 がコードするタンパクは、他の Rac/に、3’側および 5’側の配列をそれぞれ決定して２つのク

Rop GTPase とは異なる活性化機構をもつ可能性が示唆さ

ローンを単離した。 Am-rac 1 と名づけた遺伝子（GenBank

れた。

accession no. JF 922914）は全長 1235 塩基であり 210 アミノ

3.3.3

RT-PCR による発現解析

A 23187、yeast extract、MJ で A. microcarpa を刺激し酸をコードし、Am-rac 2（GenBank accession no. JF 922915）
は全長 1124 塩基であり 198 アミノ酸をコードしていた。

た際の Am-rac 遺伝子の発現活性を RT-PCR で確認したと

3.3.2

ころ、A 23187 では発現に変化がなく、yeast extract の添

アミノ酸配列の特徴と比較

Fig. 3 MJ 誘導性 Am-FaPS1 発現に対する様々な阻害剤の添加効果。NSC 23766(rac 阻害剤 )、verapamil (Ca2+ チャネル阻害剤 )、W-7 (CAM 阻害剤 )、MG-132 ( プロテアソーム阻害剤 ) の存在下で MJ 刺激を与えた際の Am-FaPS1 の発現変化。

Fig. 4 RT-PCR による Am-rac1、Am-rac2 の発現解析。 MJ、yeast extract、
Ca2+-ionophore 処理による発現量の変化。Control は H2O による処理。

− 18 −

ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導加においては３時間にわたって発現が緩やかに上昇した。

４．考

また、MJ 処理の場合は、30 − 60 分で発現レベルが最大となり、その後低下することが確認された（Fig. 4）。

察

沈香の基源植物の一つである A. microcarpa のセスキテ
ルペン生合成に寄与する FaPS をコードした遺伝子 Am-

3 . 4 組換え A. microcarpa におけるAm-FaPS 1の発現解析

FaPS 1 をクローニングし、外部刺激に対する発現応答を次に、MJ 応答性 CAM 遺伝子である Am-cam 1、同じくとにより Am-FaPS 1 の強い転写活性の誘導・上昇が見ら

MJ 応 答 性 Rac/Rop GTPase 遺 伝 子 で あ る Am-rac 2 を A.

れ、セスキテルペン生合成の活性化が強く示唆された（Fig.

microcarpa で過剰発現させることにより、Am-FaPS 1 の2）。また、植物の防御応答に関わる二次代謝産物の生合成

発現レベルを高く維持できる可能性を検討した。また、を誘導することが知られている yeast extract で処理した

Rac/Rop GTPase は 1 アミノ酸を置換することにより恒常場合も同様に Am-FaPS 1 の発現が顕著に上昇することが活 性 型（CA）、 及 び、 恒 常 不 活 性 型（DN）の Rac/Rop

明らかとなった。MJ のシグナル伝達に関わっている因子

GTPase を作製することが可能であるとされているが、今について更なる知見を得るために、以前の研究で関与が示回の実験では CA 型と DN 型 の Rac/Rop GTPase の導入に唆された様々な情報伝達関連因子の阻害剤を用いて、MJよる効果についても検討した（Fig. 5 ）。その結果、Am-

刺激に対する Am-FaPS 1 の発現量の変化を観察した。そcam 1 を導入した組換え体では MJ 非存在下においてもの結果、ユビキチン - プロテアソーム、Rac/Rop GTPase、

Am-FaPS 1 転写活性の顕著な上昇が見られ、CAM 遺伝子

Ca - チャンネル、CAM の阻害剤を用いたいずれの実験系とその翻訳産物が MJ 刺激によるセスキテルペン生合成誘においても Am-FaPS 1 の発現量は control と比べて用量依

導のシグナル伝達のなかで大きく寄与していることが示唆

存的に減少していた（Fig. 3 ）。これらのことから、MJ のされた。また、Am-rac 2 を過剰発現させた組換え体では細胞内シグナル伝達には上記の諸因子が関与しており、

control と比べて Am-FaPS 1 の転写活性の上昇は見られた

Am-FaPS 1 の転写活性の活性化にはユビキチン−プロテ

ものの、CAM の組換え体ほど顕著な活性化は観察されなアソームと Rac/Rop GTPase が関与する Ca の細胞内流かった。更に、CArac 2 を導入した組換え体においても、入、更には CAM の活性化が不可欠であることが示唆され変異を導入していない Am-rac 2 と比較して大きな差は認めた。

RT-PCR によって検討した。その結果、MJ で刺激するこ2+2+

られなかった。また、DNrac 2 組換え体では Am-FaPS 1 転7）

写活性がやや抑制されることが見出された 。

植物二次代謝能の誘導あるいは活性化におけるこれらの因子を物質生産に応用することを目的として、Am-cam 1

Fig. 5 4 つの組換え体につき、それぞれ Am-FaPS1 の発現量の平均値と標準偏差を求め、MJ (+) を 1.0 とした相対値で表した。

− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

遺伝子、Am-rac 2 遺伝子、CArac 2、DNrac 2 遺伝子を A.

３）Creelman RA, Mullet ME,: Biosynthesis and action

microcarpa のカルスに組み込み、Am-FaPS 1 の発現の変of jasmonates in plants, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant

化 を RT-PCR に よ り 解 析 し た（Fig. 5）。 そ の 結 果、Am-

Mol. Biol., 48 , 355 - 381 , 1997 .

FaPS 1 の 発 現 量 は Am-cam 1 を 導 入・ 過 剰 発 現 さ せ た

４）Asano K, Lee JB, Yamamura Y, Kurosaki F,:

mutant で最も大きくなり、MJ 刺激を与えた場合と同等あEnhanced accumulation of atropine in Atropa

るいはそれ以上の転写活性の上昇が認められた。一方、

belladonna transformed by Rac GTPase gene isolated

Am-rac 2、CArac 2 の mutants では MJ（−）と比べて発現from Scoparia dulcis, Transgenic Res., DOI. 10 . 1007 /量は上昇しているものの MJ（+）や CAM 遺伝子を導入しs 11248 - 013 - 9733 - 4 .

たものほどではないことが認められた。これより、MJ に

５）Okudera Y, Ito M,: Production of agarwood fragrantよるシグナル伝達経路には Rac/Rop GTPase 関与の機構

constituents in Aquilaria calli and suspension cultures,以外にも複数の経路が存在し、これら別の転写制御機構とPlant Biotechnol., 26 , 307 - 315 , 2009 .

Rac/Rop GTPase 系とが複雑に相互作用して Am-rac 導入

６）Kenmotsu Y, Ogita S, Katoh Y, Yamamura Y, Takao

変異体での Am-FaPS 1 の発現に影響を与えた可能性が考Y, Tatsuo Y, Fujino H, Kadota S, Kurosaki F,: Methyl

えられる。

jasmonate-induced enhancement of expression activityof Am-FaPS- 1 , a putative farnesyl diphosphate（引用文献）

synthase gene from Aquilaria microcarpa, J. Nat. Med.,

１）Shan X, Yan J, Xie D,:Comparison of phytohormone

65 , 194 - 197 , 2011 .

signaling mechanisms, Curr. Opin. Plant Biol., 15 , 84 -７）Kenmotsu Y, Asano K, Yamamura Y, Kurosaki F,:
Cloning and expression of putative Rac/Rop GTPase

91 , 2012 .
２）Gundlach H, Muller MJ, Kutchan TM, Zenk MH,:genes, Am-rac 1 and Am-rac 2 , involved in methyl

Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced

jasmonate-induced transcriptional activation of farnesyl

plant cell cultures, Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 89 , 2389 -

diphosphate synthase in cell cultures of Aquilaria

2393 , 1992 .

microcarpa, Plant Mol. Biol. Rep., 31 , 539 - 546 , 2013 .

− 20 −

紫外線遮光ナノ材料のUVB−UVC光特性評価法の開発

大阪大学大学院工学研究科

齊 藤

結 花

In this research, we have established the microscopic system capable to measure the UVB to UVC white light extinction
spectra. The colors in UV lights can be visualized through the spectroscopic techniques. As an example of the UV sensitive
materials, alminum nanostructures, which has been considered as a new candidate of plasmonics, were evaluated by our
microscopic system. This microscope provide us with a versatile knowledge for UV functionalized nanomaterials.
Recently, the field of “plasmonics” have been the focus of intense interest as a new method to design UV functionalized
nanomaterials. In plasmonics light couples with metal free electrons in nanometric structures, exhibiting a localizationand enhancement effect. One of the fascination applications of plasmonics in UV is to help to enhance the photocatalyst
which is used for sterilization in organic solar cells. Another example is to increase the sensitivity of spectroscopic signal
in UV region especially in protein or DNA detection which is essential for bioscience. The plasmonic nanoparticles canalso be used for cosmetics e.g. sunglasses or sunscreens. The optical-electric properties of plasmonic nanostructures andnanoparticles are often evaluated by white light extinction spectroscopy under dark field microscope. The nanoparticles canbe seen in variety of colors due to the different electric properties caused by the shape effect. However, in spite of the strong
needs, the microscopic evaluation of these small structures are limited in visible region because the standard microscope isapplicable only to the wavelength longer than 350 nm.
We have developed the spectroscopic measurement for quantitative measurements and analysis of the refractive index
from UVB to UVC region to assign colors in this wavelength range. The system has been designed for better understandingof the relationship between the local structures and the optical properties through the microscopic technique. In this research,
we will present the analysis of plasmonic nanoparticles made of aluminum by our microscopic system, which can work bestin the wavelength range from 250 to 350 nm. Our newly established microscopic methods holds promise for the investigationof plasmonic nanoparticles and will contribute to develop the new type of UV-sensitive materials for semiconductor industry,
biosciences, as well as cosmetics.

１．緒

しても、材料の基本的な光学特性である誘電率は、UVB

言

1）から UVC 域で敏感に波長依存性を示すので 、これらの本提案では、顕微鏡下において紫外光に敏感なナノ材料

光源を用いると急激な誘電率変化を示す試料の箇所は、周の UVB−UVC 域の光学特性を評価することのできる顕微囲に対して高いコントラストを持って観測される。しかし鏡を開発した。ここで作製した紫外顕微分光システムを用

単純にコントラストをつけただけでは、測定対象のモノク

いて、紫外プラズモニクス材料として注目されているアルロ画像を得るにすぎない。白色散乱分光法により誘電率波

ミニウムナノ構造を対象に実際に UVB─UVC 域で分光分

長依存性の定量的な評価を行うことで初めて、紫外光を用析を行った結果を報告する。

いて観察した画像に可視光と同様の段階的な“色”情報を

誘電率は材料の電子物性と深い関係にあるため、高い感

のせることができる。ここで開発した技術を基礎研究から

度で定量性をもって誘電率を測定することが材料開発にお発展させることで、医薬化粧品をはじめ、ワイドギャップ

いて最も簡便でかつ本質的な手法となる。光源として紫外半導体やポリマー等の新規材料探索に、これまでにない新光を用いると、可視光に比べて格段に高い感度で誘電率イ

しい分析ツールを提供することができる。

メージングを実現することができる。光学顕微鏡を用いて顕微分光システムの開発と平行して、紫外域の UVB─細胞やポリマーなどを可視光で観察すると、多くの試料はUVC 光に感度を持つプラズモニック・ナノ粒子を作製し透き通って見える。もしここで紫外光を照射すると、ブラた。金属のナノスケールの構造物に光をあてると、光と金ックライトを照射したときのように紫外発光材が含まれて属表面の自由電子の固有振動が結合して、光電場を増強しいれば含有箇所が明るく光って観測される。発光しないとたり局在化させたりすることができる 。この現象は局在

2）プ ラ ズ モ ン 共 鳴（Localized Surface Plasmon Resonance
LSPR）と呼ばれ、LSPR の原理を利用して化学センサー
4）

3）

5）

や光触媒 、分光分析ツール などの幅広い応用が実現しCharacterization of UVB-UVC sensitive
nanomaterials
Yuika Saito
Graduate school of engineering, Osaka
Universityている。近年プラズモニクスの研究は可視から紫外光へ拡張しており、金や銀にかわり紫外光に感度を持つ物質がプ
6）

ラズモニクス媒体として検討されている 。プラズモニク
スのみならず、紫外光を積極的に利用しようという試みは− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

する遮光材あるいは有益な機能を発現する物質が開発され

2 . 2 UVB-UVC に感度を持つプラズモニック• ナノ構造の作製と評価ている。ここでは紫外プラズモニクス材料として注目され

紫外光に感度を持つナノ材料として、プラズモニックなているアルミニウムのナノ構造を中心に、開発した紫外顕特性を有するアルミニウムナノ構造を作製した。紫外域の微分光システムを用いて評価を行った。

光を金属自由電子とカップリングさせるためには、波数ベ

近年広くなされており、医薬化粧品の分野でも紫外線に対2．実クトルの整合の要請から数十ナノメートルという微細な構験

7）

造物を形成する必要がある 。材料として、紫外域で金属

2 .1 UVB─UVC域の光学特性を評価する顕微分光システム

1，6，7）性を有するアルミニウムを用いることが有効である。

図１は本研究で作製した装置のレイアウトである。光学

アルミニウムはナノ粒子を化学合成することが困難である

系は暗視野顕微鏡と散乱光分光システムから構成されていため、ナノ粒子リソグラフィー法（NSL 法）を用いて微細る。可視から 200 nm 付近まで良好なスペクトル分布を持加工を行う方法を採用した。図２に示すように NSL 法は

つ Laser-Driven Light Source（LDLS Ushio Electric Co.）

サイズの揃ったポリスチレン・ナノ粒子をテンプレートと光源を光ファイバーに導入して倒立型顕微鏡上にセットしして基盤上に自己集積化させて、空隙に金属を蒸着した後た試料に暗視野照明を実現する浅い角度で入射する。入射にテンプレートを取り除くという方法で、安価に大面積に光を除いた散乱光を、反射対物レンズで回収する。信号光

ナノスケールのパターンを作製することができる。NSL

はアクロマートレンズ一枚を介して最短の光路で分光器ス法においてテンプレートとして用いられるポリスチレン球

リットまで導入する。ブロードバンド白色光散乱による分のサイズは 300 nm 程度が限界とされ球のサイズが小さく

光測定を実現するために、分光器は紫外特殊撮影レンズをなるとサイズのばらつきが大きくなり自己集積能力が低く組み込み紫外光 200 nm から 400 nm まで収差をおさえてなってくる。申請者はポリスチレン球のサイズを変えずに

CCD 検出器上に結像するように設計した。

溶媒で膨張させることによって、より小さい構造を作製し照射系は広帯域照射になっているので、試料上の特定位た。本手法では、加熱処理を行う時間によってテンプレー

置における分光情報を取り出す目的で、分光器入り口にはトのサイズをコントロールすることができる。加熱時間がステッピングモーターにより位置制御が可能な稼働 xy ス

長いものほど空隙のサイズは小さくなり、やがて完全に塞リットを付属した。さらに、回折格子を介さずにスリットがってしまう。テンプレートであるポリスチレン球の空隙

像を検出用 CCD カメラ上に投影する機構を設けた。こののサイズがコントロールされたことで、アルミニウムの構方法により、分光 CCD ピクセル位置が光学画像のどの位造の制御が可能となった。本成果の詳細は論文 に報告し置に対応しているかを、明確に捉えることができるようにた。ここで作製したアルミニウムナノ構造を対象に、新規なっている。広視野での光学像を取得した後に、分光器のに開発した紫外顕微分光システムで評価を行った。

7）

スリットを開閉し、試料上の狙った一点で白色散乱光スペクトルを測定することができる。

図 1 UVB-UVC 域紫外顕微分光システム。LDLS 光源から暗視野広帯域照明で紫外白色光を導入、対物レンズで散乱光を集光して、紫外顕微鏡へ導入する。分光器はスリット像を回折格子を経ずに分光 CCD 上で観察する機能を有する。

− 22 −

図 2 ナノ粒子リソグラフィー法の概要：自己集積
したポリスチレン球の空隙に金属を蒸着して、後にこのテンプレートをはがす。右図ではテンプレー
トを加熱してふくらませている。

紫外線遮光ナノ材料の UVB ─ UVC 光特性評価法の開発

３．結

４．考

果

図３⒜は、２章で述べたアルミニウムナノ構造体の４.１

察

ナノ材料と光学特性

UVB−UVC 光散乱スペクトルである。視野を単一ナノ粒

ナノ材料の物性を議論するうえで、構造の評価は欠かす

子に絞り、申請者が試作したシステムで観測した。散乱強ことのできない重要なファクターである。３章で示したと度は紫外域における誘電率を反映しており、ミクロスコピ

おり、実験結果の図３のナノ粒子はすべてアルミニウムでックにはアルミニウム表面の自由電子の固有振動が紫外光構成されているが、形状のちがいによって異なる光学的性と結合する様子を表している。各散乱スペクトル A─D は質をもっている。集合的な粒子の情報は、既存の紫外可視

図３⒝ ─ ⒠の原子間力顕微鏡（AFM）像に示したアルミニ

吸収スペクトルから得ることができるが、個々の粒子の個

ウムナノ粒子から得られた。スペクトル A では単一の散性を見ることは本研究で開発した顕微鏡でのみ観測するこ乱ピークが 350 nm 付近に得られた。対応する AFM 画像図とができる。ここで観測したスペクトル情報は、可視域で３⒝ には。球形のナノ構造が確認された。球形の粒子は言うところの“色”に対応しており、これらの各粒子が異高い対称性により単一のプラズモン共鳴ピークを示すことなる色をもっていることがわかった。

から、散乱スペクトルの形状を説明することができる。ス

近年、プラチナや金など、プラズモニクスを利用した金ペクトル B では、350 nm 付近のピークの分裂が確認でき

属ナノ粒子がコスメトロジーの分野で利用されはじめている。対応する AFM 画像図３⒞では非対称な粒子が確認さる。ナノ材料は皮膚への浸透性が良く、かつ吸収や散乱効れた。これは対称性の低下により、プラズモンモードが分率がバルクとは全く異なる場合があり、研究対象として興裂していると説明することができる。スペクトル C では味深い。このようなナノ材料を利用する際には、粒子形状

320 nm と 420 nm 付近に顕著なモードが現れている。AFM

によって光学特性が異なることに注意を払う必要がある。

画像図３⒟では鋭角を持つ三角形の構造が観測された。三

既存の材料においても、クラックや厚みなどの構造のパラ角形の粒子は球形の粒子とは異なり複数のプラズモンモー

メータを変えながらの光散乱スペクトル測定を行い、物性ドを持つことが知られており 、これらの３つのピークはと構造との関係についての基礎データを取得すると、これ三角形を仮定した場合のプラズマ振動に対応していると考まで集合体としてのみ測定されてきた材料の個々の微小構えることができる。最後にスペクトル D において、320 nm

造について、構造と電子状態の関係について系統的にデーと 360 nm に顕著な２つのピークが観測された。AFM 像図タを取得することができて、材料設計に新たな切り口が生

３⒠より、楕円形の粒子が確認された。従ってこれら２つ

まれる。

6，
8）

のプラズモンピークは、楕円粒子の長軸と短軸のプラズモ
9）ン共鳴に対応すると考えられる 。

A

B
C
D

図３ アルミニウムナノ構造の UVB-UVC 領域の光散乱スペクトル (a) と対応する AFM 画像、(b) スペクト
ル A に対応するナノ粒子、 (c) スペクトル B、(d) スペクトル C、(e) スペクトル D− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 20144.2

紫外プラズモニクスとコスメトロジー

も、高い空間分解能で観察すると不均一な構造が存在し、本研究では、測定対象として UVB − UVC 域でプラズモ

これらの微細構造が物性と深く関係していることが明らか

ニック効果を有するアルミニウムナノ粒子を用いた。プラになる場合がある。誘電率の空間分布を測定するために、

ズモニクスは近年まで、可視光の波長域に限定されており、暗視野顕微鏡下で散乱分光測定が行われている。この測定

紫外光を用いたプラズモニクスは未開拓であった。その理法は可視域では大きな成功を納めた。しかしこれらの暗視由として、可視光域において安定で良好な金属性を示して

野顕微鏡システムが許容する波長は 350 nm 以上の可視域

いた自由電子金属（主に金または銀）が紫外光に対して金に限られており、紫外光には対応していない。紫外光を導属性を示さないため、用いる材料を再考する必要があるこ

入することのできる顕微鏡システムは実験室レベルで存在とが挙げられる。アルミニウムは、化学的に安定で 300 nm

するが、色収差等の問題からこれまでの用途は単色光源で以下の深紫外域で良好な金属製を示すため 、金や銀にかあるレーザー分光に限られ、白色光源を用いた分光測定はわって紫外プラズモニクスの材料として用いることができ行われていない。従って紫外光に対応しながら、顕微鏡下る。近年いくつかの研究グループにより、アルミニウムので誘電率分布測定を行うことのできる装置はいまだ未開拓

LSPR 特性についての研究が行われており、これまで報告であった。本研究では、紫外可視吸光光度計に空間分解能されている共鳴波長ピークは可視域から〜 240 nm 程度とを持たせ、簡便に微小領域の分光を実現する装置を作製しなっているた。本装置は、紫外域の白色光源を顕微鏡に導入して分光

1）

8−11）

。LSPR において自由電子媒体である金属の構造を変化させると、結合効率と周波数が変化するため、測定する挑戦的な試みで、材料の誘電率に立脚した感度の結合させたい光の波長に共鳴する構造を設計することが求高い測定と、レーザー分光に比べてランプ光源によるダメめられている。波数ベクトル整合の条件から、媒体となるージの小さい測定を実現した。また紫外光に固有の電子状

金属構造は光の波長よりも十分に小さいことが要求される態に関するユニークな情報を得ることができるのが特徴でため、深紫外域においては 100 nm を下回る金属ナノ構造ある。

を作製することが必要である。サイズのみならず構造の対作製した装置を用いて、紫外プラズモニクス材料として称性によっても LSPR は変調を受ける。例えばアスペクト

期待されているアルミニウムを対象に UVB−UVC 領域の比を変化させれば LSPR の波長変換を行うことができる。

光学特性を観測した。作製したナノ粒子はすべてアルミニ

ナノ構造の幅を一定にして高さを変化させると、LSPR 波ウムという同じ素材で構成されていが、形状のちがいによ長が顕著に青色シフトすることが著者らによって観測されって異なる光学的性質をもっていることがわかった。集合ている 。このように、構造を変化させるだけで光の吸収的な粒子の情報は、既存の紫外可視吸収スペクトルから得や散乱を制御できるアルミニウムは、紫外機能性材料としることができるが、個々の粒子の個性を見ることは本研究て期待されている。ここで作製したアルミニウムナノ構造で開発した顕微鏡で初めて明らかにすることができた。本で構成されたフィルムは、可視光で観察するとほぼ透明な顕微鏡の開発は、紫外光遮光材料としてのプラズモニクス

薄膜である。紫外光と相互作用する物質は非常に多く存在の可能性を広げ、コスメトロジーへの応用を拓くと考える

するが、可視域で透明性を保持したまま紫外光を吸収することができる。

8）

物質は限られている。可視における透明性と紫外光との強い相互作用という特性は、有効な紫外遮光材料としてサン（参考文献）

グラスや日焼け止め等への利用が見込まれる。表面物性に

１）Palik E. D.: Handbook of Optical Constants of Solids:
Academic Press, San Diego（1991）．

限らず、紫外光の吸収域には、DNA やタンパク質等の生体を構成する分子が含まれるため、紫外線が生物に有害な

２）Kawata S.: Near-field Optics and Surface Plasmon

影響を与えることが知られているが皮膚表面における紫外

Polaritons, Topics in Applied Physics 81 , Springer,

線の影響を測定するためには、顕微鏡によるミクロスコピ

Berlin（2001）．

ックな観察が有効である。今後は皮膚表面を対象にした観３）Stewart M. E., Anderton C. R., Thompson L.
B., Maria J., Gray S. K., Roger J. A., Nuzzo R. :察に、本顕微鏡を応用したい。

５．総

Nanostructured Plasmonic Sensors., Chem. Rev., 108 ,括

494 - 521（2008）．

誘電率測定を簡便に行う市販の装置として、220 nm 付

４）Zhang X., Chen Y. L., Liu R. S., Tsai D. P. : Plasmonic

近から近赤外領域までをカバーする紫外可視吸光光度計がphotocatalysis, Rep. Prog. Phys. 76 , 046401（2013）．

存在する。しかしこの装置は、大凡１cm 四方の領域に広５）Saito Y., Verma P. : Imaging and spectroscopy

く光を照射するために、試料の空間的な分布を測定するこ

through plasmonic nano-probe, Eur. Phys. J. Appl.

とができない。一般的に均質であるとされる試料において

Phys. 46 , 20101（2009）．

− 24 −

紫外線遮光ナノ材料の UVB ─ UVC 光特性評価法の開発

長シフトの観察 , 本金属学会誌 77 , 27 - 31（2013）．

６）Chan G. H., Zhao J., Schatz G. C., Van Duyne R. P. :Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy of９）Jha S. K., Ahmed Z., Agio M., Ekinci Y., Löffler J.

Triangular Aluminum Nanoparticles, J. Phys. Chem. C,

F. : Deep-UV surface-enhanced resonance Raman

112 , 13958 – 13963（2008）．

scattering of adenine on aluminum nanoparticle arrays,
J. Am. Chem. Soc., 134 , 1966 − 1969 ( 2012 ).

７）Taguchi A., Saito Y., Watanabe K., Song Y., Kawata
S. : Tailoring plasmon resonances in the deep-10）Ekinci Y., Solak H. H., Löffler J.F. : Plasmon

ultraviolet by size-tunable fabrication of aluminum

resonances of aluminum nanoparticles and nanorods, J.

nanostructures, Appl. Phys. Lett. 101 , 081110（2012）,．

Appl. Phys. 104 , 083107 ,（2008）．

８）齊藤結花 , 本田光裕 , 渡邊晃一 , 田口敦清 , 宋怡健 , 河11）Honda M., Kumamoto Y., Taguchi A., Saito Y.,

田聡 : 深紫外光増感作用を目的としたアルミニウムナノ

Kawata S. : Plasmon-enhanced UV photocatalysis,

構造のデザイン〜高さ制御によるプラズモン共鳴の短波

Appl. Phys. Lett. in press− 25 −

乳化剤フリー油中水滴型（W/O）エマルションの分散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発
信州大学工学部物質工学科

酒 井

俊 郎

Colloidal stability of emulsifier-free water-in-oil (EF-W/O) emulsions prepared by ultrasonication was examined
to evaluate the mechanism on the colloidal stabilization of water droplets dispersed in organic media. We found thatthe colloidal stability of paraffin-based EF-W/O emulsions became higher with longer hydrocarbon chain of paraffin.
Furthermore, we revealed that the vegetable oil-based EF-W/O emulsions were much more stable than the paraffin-based
EF-W/O emulsions.

１．緒は調製された。パラフィン油としてヘキサン、オクタン、言

デカン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカンを使用し油と水が過渡的に混合したエマルションは、
液滴の浮上・

た。また、植物油として大豆油、コーン油、オリーブ油を沈降、凝集・合一、オストワルドライプニングなどを経て使用した。使用した油の物性値を Table 1 にまとめる。調２相に分離する。このエマルションの不安定化機構・液滴製された EF-W/O エマルション中の水滴径は、粒度分布の成長過程の本質を理解するため、筆者らは、乳化剤を使測定装置（LA- 950 , HORIBA）により測定された。また、用しない（Emulsifier-free; EF）水中油滴型（O/W）エマル

EF-W/O エマルションの分散安定性は、波長 700 nm におション（以下、EF-O/Wエマルションと略す）中の油滴の成長

けるエマルションの透過率（T@ 700 nm）を紫外可視分光

過程・分散安定性・界面特性について検討してきた 1 − 21）。

光度計（V- 630 , JASCO）を用いて測定することにより評

その結果、超音波を用いて直鎖炭化水素（油）を水中に分価された。

散した場合、炭化水素鎖が長い油ほど水中分散油滴の分散

３．結果および考察

安定性が高いことが分かった。また、短鎖炭化水素からな
水素からなるエマルションではオストワルドライプニング

３.１ パラフィン油を分散媒としたEF-W/Oエマルショ
ンの分散安定性が優先的に起こることを明らかとした。さらに、短鎖炭化

まず、超音波洗浄機を用いて調製された EF-W/O エマ

水素（ベンゼンなど）に少量の長鎖炭化水素（ヘキサデカン、

ル シ ョ ン の 経 時 変 化 を 目 視 に よ り 観 察 し た（Fig. 1）。

スクワラン）を混合すると、乳化剤を一切使用しなくてもEF-W/O エマルションの濁度は分散媒がヘキサン＜オク

１年間以上もの長期間、油滴分散状態を維持できることをタン＜デカン＜ドデカン＜テトラデカン＜ヘキサデカンの明らかとした。また、超音波のタンデム照射によって、順に増していることが観察される。また、その EF-W/O

EF-O/W エマルションの長期分散安定化に成功した。そこ

エマルションの濁度は時間経過とともに低下していく様子

で、本研究では、これまでとは逆相となる油中水滴型（W/も観察される。分散媒がヘキサン、オクタン、デカンのO）エマルションの分散安定化機構や油中分散水滴の界面

EF-W/O エマルションは、調製後３〜４時間程度で透明と化学的特性を解明し、EF-W/O エマルションの長期分散安なったが、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカンを分散定化技術の確立を目指す。

媒とした EF-W/O エマルションは、調製後 24 時間経過しるエマルションでは凝集・合一過程が優先的に、長鎖炭化２．実た後でも乳濁状態を維持していた。この変化は EF-W/O験エ マ ル シ ョ ン の 透 過 率 変 化 か ら も 確 認 で き る（Fig. 2）。

油 に 少 量 の 超 純 水（18 . 2 MΩ cm at 25 ℃，Millipore-

EF-W/O エマルションの T@ 700 nm は時間経過と共に上filtered water）を混合して、超音波（28 kHz, 300 W）を５昇した。EF-W/O エマルションの T@ 700 nm の上昇はエ分間照射することにより油中水滴型（W/O）エマルション

マルションの濁度の低下を意味している。調製後６時間の
EF-W/O エマルションの透過率（T@ 6 h）は、分散媒がヘキサン＞オクタン＞デカン＞ドデカン＞テトラデカン＞ヘMechanism on Colloidal Stabilization ofEmulsifier-free Water-in-Oil Emulsions
Toshio Sakai
Department of Chemistry and Material
Engineering, Faculty of Engineering,
Shinshu University

キサデカンの順に低くなった（Fig. 3）。すなわち、分散媒がヘキサン＜オクタン＜デカン＜ドデカン＜テトラデカン＜ヘキサデカンの順に EF-W/O エマルションの分散安定性は高くなることが明らかとなった。

− 26 −

乳化剤フリー油中水滴型（W/O）エマルションの分散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発

Table 1

Properties of water and oils that we used in this experimet

Molecular
formulaMolecular
weight(g mol −1 )Density(g cm −3 )Viscosity(mPa s)Surfacetension(mN m −1 )Solubility,
oil in water(mol m −3 )Solubility,
water in oil(mol m −3 )

Water

H2 O

18 . 02

0 . 99705

0 . 7973

71 . 96──HexaneC 6 H 1486 . 18

0 . 6603

0 . 290

17 . 91 . 1 × 10

OctaneC 8 H 18

114 . 29

0 . 7026

0 . 480

21 . 145 . 8 × 10 −3

3 . 703

DecaneC 10 H 22

142 . 29

0 . 7300

0 . 835

23 . 37

3 . 6 × 10 −4

2 . 916

Dodecane

C 12 H 26

170 . 34

0 . 7511

1 . 257

24 . 91

2 . 4 × 10 −6

2 . 709

Tetradecane

C 14 H 30

198 . 39

0 . 7624

1 . 783

26 . 13

1 . 4 × 10 −6

15 . 55

Hexadecane

C 16 H 34

226 . 45

0 . 7734

2 . 571

27 . 05

9 . 8 × 10 −8

2 . 317

Soybean──

0 . 91643 . 627 . 22

─

─

Corn

─

─

0 . 91246 . 334 . 8

─

─

Olive

─

─

0 . 669

55 . 632

─

−1

3 . 273

Fig. 1 Paraffin-based EF-W/O emulsions prepared with an ultrasonic cleaner.

Fig. 2 Time course changes in transmittance at 700 nm（T@700nm）of EF-W/O emulsions.（○）Water/hexane,（●）
water/octane,（□）water/decane,（■）water/dodecane,（△）
water/tetradecane and（▲）water/hexadecane emulsions.

− 27 −

Fig. 3 Transmittance at 700 nm of EF-W/O emulsions
measured at 6 h（T@6h）after preparation.

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

EF-W/Oエマルションの分散安定化機構の粘度が大きくなると、EF-W/O エマルション中の水滴の前述したように、EF-W/O エマルションの分散安定性は沈降速度が低下して、EF-W/O エマルションの分散安定性

長鎖炭化水素からなるパラフィン油を分散媒として使用しが向上したものと考えられる。また、高粘度の分散媒（パた場合に高くなることが明らかとなった。そこで、EF-W/

ラフィン油）は分散している水滴の凝集・合一を抑制してO エマルションの不安定化（解乳化）機構について Stokes

いるものと考えられる。Smoluchowski の式（式２）によの式（式１）を用いて検証した。Stokes の式は媒体中に分れば、凝集・合一の速度は分散媒の粘度に反比例する。

散している粒子（液滴）の浮上・沈降速度（v）を表した式

Smoluchowski の式（式２）は油滴の衝突頻度をもとに見であり、以下のように与えられる。

積もられる油滴の凝集・合一速度であり、油滴サイズの時３. ２間変化（dr 3 /dt）は、（1）（2）
a は液滴半径、ρ0−ρ は分散媒と分散質の密度差、η は分散媒の粘度、g は重力加速度である。まず、EF-W/O エと表わされる。r, t, k, T, η, N, v は、それぞれ油滴半径（m）、

マルションの分散安定性に及ぼす分散媒（パラフィン油）、絶対温度（K）、分散
時間（s）、ボルツマン定数（J K −1）と水との密度差（ρ0−ρ）の影響を検証した。T@ 6 h をパラ媒（水）の粘度（Pa s）、油滴の数（m−3）、油滴一個の体積（m3）

フィン油と水との密度差（ρ0−ρ）に対してプロットしてみである。このことから、分散媒の粘度の増加は水滴の沈降

ると、密度差（負の値）が小さくなると EF-W/O エマルシを抑制すると同時に、凝集・合一を抑制していることが示

ョンの分散安定性が向上（T@ 6 h が低下）することが分か唆された。

った（Fig. 4）。これは、Stokes の式からも分かるように、

一方で、EF-W/O エマルションの分散安定性と水滴径と分散媒（パラフィン油）と水との密度差が小さくなると、の関係を見てみると、水滴径が大きいほど EF-W/O エマ

EF-W/O エマルション中の水滴の沈降速度が低下して、ルションの分散安定性が向上している（Fig. 6）。Stokes の

EF-W/O エマルションの分散安定性が向上したものと考式によれば、水滴の沈降速度は水滴径の２乗に比例するた

えられる。

め、EF-W/O エマルションの分散安定性は水滴径が大きい

また、EF-W/O エマルションの分散安定性に及ぼす分散ほど低下するはずである。しかし、本実験で得られた媒（パラフィン油）の粘度の影響を検証した。T@ 6 h をパ

EF-W/O エマルションの分散安定性は反対の傾向を示し

ラフィン油の粘度に対してプロットしてみると、粘度が大ている。これらのことから、EF-W/O エマルションの分散

き く な る と EF-W/O エ マ ル シ ョ ン の 分 散 安 定 性 が 向 上

安定性は、分散媒と水との密度差や分散媒の粘度などの分（T@ 6 h が 低 下 ）す る こ と が 分 か る（Fig. 5）。 こ れ も、散媒の物性に強く依存していることが示唆された。

Stokes の式からも分かるように、分散媒（パラフィン油）

Fig. 4 Transmittance at 700 nm of EF-W/O emulsions
measured at 6 h（T@6h）after preparation plotted as afunction of density difference（ρ0 −ρ）of alkane.

Fig. 5 Transmittance at 700 nm of EF-W/O emulsions
measured at 6 h（T@6h）after preparation plotted as afunction of viscosity of alkane.

− 28 −

乳化剤フリー油中水滴型（W/O）エマルションの分散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発

３. ３ 植物油を分散媒としたEF-W/Oエマルションの分散安定性

度差が小さく、分散媒の粘度が大きな植物油（大豆油、コ

これまで、パラフィン油を分散媒とした EF-W/O エマ

された EF-W/O エマルションの分散安定性を評価した。

ルションの分散安定性と分散媒の物性との相関性について

その結果、調製後 24 時間を経過してもエマルションの乳検討してきた。その結果、特に、分散媒と水との密度差が濁状態はほとんど変化せず、維持されることが明らかとな

小さく、分散媒の粘度が大きな油を分散媒として使用したった（Fig. 7）。T@ 700 nm の値も調製 24 時間後においても場合に、EF-W/O エマルションの分散安定性が向上するこ

ほぼゼロであり、EF-W/O エマルションは極めて安定であとが明らかとなった。これは、分散媒と水との密度差が小ることが確認された（Fig. 8）。以上のことから、植物油をさく、分散媒の粘度が大きな油を分散媒として使用するこ分散媒とした EF-W/O エマルションは、パラフィン油をとにより、分散安定性の高い EF-W/O エマルションが調分散媒とした EF-W/O エマルションに比べて分散安定性

製できることを意味している。そこで、分散媒と水との密が高いことが明らかとなった（Fig. 9）。

ーン油、オリーブ油）（Table 1 参照）を分散媒として調製

Fig.6 Transmittance at 70 0nm of EF-W/O emulsions
measured at 6h（T@6h）after preparation plotted as afunction of droplet diameter.

Fig.8 Time course changes in transmittance at 700 nm（T@700nm）of EF-W/O emulsions.（○）Water/hexane,（●）
water/octane,（□）water/decane,（■）water/dodecane,（△）
water/tetradecane and（ ▲ ）water/hexadecane，（ ▽ ）water/
soybean oil,（▼）water/corn oil and（◇）water/olive oil emulsions.

− 29 −

Fig. 7 Vegetable oil-based EF-W/O emulsions preparedwith an ultrasonic cleaner.

Fig. 9 Transmittance at 700 nm of EF-W/O emulsions
measured at 6 h（T@6h）after preparation.

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

180 , 41 - 53 , 2001 .

４．まとめ５）酒井俊郎 , 加茂川恵司 , 酒井秀樹 , 阿部正彦 : 界面活性剤無添加系エマルションの新しい展開 , オレオサイエン

本研究では、パラフィン油、植物油を分散媒とした乳化

ス , 1 , 33 - 46 , 2001 .

剤フリー油中水滴型（EF-W/O）エマルションの分散安定性 に つ い て 検 討 し た。 パ ラ フ ィ ン 油 を 分 散 媒 と し た

６）阿部正彦, 酒井俊郎: 疎水性物質の添加によるサーファク

EF-W/O エマルションの分散安定性は、分散媒がヘキサン

タントフリーエマルションの分散安定化 , FRAGRANCE＜オクタン＜デカン＜ドデカン＜テトラデカン＜ヘキサデ

JOURNAL, 29 , 21 - 29 , 2001 .

カンの順に向上することが分かった。さらに、植物油（大７）Sakai T., Sakai H., Abe M.: Dimpled Polymer

豆油、コーン油、オリーブ油）を分散媒とした EF-W/O エ

Particles Prepared by a Single - Step Method in an

マルションは極めて分散安定性が高いことが明らかとなっ

Acoustic Field, Langmuir, 18 , 3763 - 3766 , 2002 .

た。この分散安定性の違いは、分散媒である油の物性に強８）Sakai T., Kamogawa K., Nishiyama K., Sakai H., Abe

く依存していることが分かった。特に、分散媒（油）と分

M.: Molecular Diffusion of Oil/Water Emulsions in

散質（水）との密度差および分散媒（油）の粘度に強く依存

Surfactant-Free Conditions, Langmuir, 18 , 1985 - 1990 ,

していることが明らかとなった。このように乳化剤を使用

2002 .

しなくても W/O エマルションを調製することが可能であ９）Sakai T., Kamogawa K., Kwon K. O., Sakai H., Abe

り、分散媒の物性により分散安定性も制御可能であること

M.: Pyrene Fluorescence Measurements of Metastableが示された。また、植物油を分散媒とした EF-W/O エマ

Oil Droplets in Surfactant-Free Oil-in-Water Emulsions,

ルションは高い分散安定性を有していることから、化粧品、Colloid Polym. Sci., 280 , 99 - 106 , 2002 .

食品などへの応用の可能性が示唆された。今後、さらに10）Sakai T., Takeda Y., Mafune F., Abe M., Kondow T.:

EF-W/O エマルション中の水滴の凝集・合一、オストワル

Dye Transfer between Surfactant-Free Nanodroplets

ドライプニングについても検討を進め、EF-W/O エマルシ

Dispersed in Water, J. Phys. Chem. B, 106 , 5017 - 5021 ,ョンの不安定化機構の本質に迫っていきたい。

2002 .
11）Sakai T., Takeda Y., Mafune F., Abe M., Kondow T.:

謝Monitoring Growth of Surfactant-Free Nanodroplets

辞

Dispersed in Water by Single- Droplet Detection, J.

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団より

Phys. Chem. B, 107 , 2921 - 2926 , 2003 .

ご支援いただきましたことを深く感謝申し上げます。

12）Kamogawa K., Kuwayama N., Katagiri T., Akatsuka（引用文献）

H., Sakai T., Sakai H., Abe M.: Dispersion and

１）Kamogawa K., Sakai T., Momozawa N., Shimazaki M.,

Stabilization in Water of Droplets of Hydrophobic

Enomura M., Sakai H., Abe M.: Evolution and Growth

Organic Liquids with the Addition of Hydrophobicof Oil Droplets in Emulsifier-Free, Metastable Aqueous

Polymers, Langmuir, 19 , 4063 - 4069 , 2003 .

Solutions: A Light Scattering and Conductive Probe

13）Okudaira G., Kamogawa K., Sakai T., Sakai H., Abe

Study, J. Jpn. Oil Chem. Soc., 47 , 159 - 170 , 1998 .

M.: Suspension Polymerization of Styrene Monomer
without Emulsifier and Initiator, J. Oleo Sci., 52 , 167 -２）Kamogawa K., Matsumoto M., Kobayashi T., Sakai

170 , 2003 .

T., Sakai H., Abe M.: Dispersion and Stabilizing Effects
of n-Hexadecane on Tetralin and Benzene Metastable14）Sakai T., Abe M., Momozawa N.: An Analysis ofDroplets in Surfactant-Free Conditions, Langmuir, 15 ,Multi-Step-Growth of Oil Droplets Dispersed in Water,

1913 - 1917 , 1999 .

J. Oleo Sci., 52 , 681 - 684 , 2003 .

３）Sakai T., Kamogawa K., Harusawa F., Momozawa N.,

15）Kamogawa K., Okudaira G., Matsumoto M., Sakai

Sakai H., Abe M.: Direct Observation of Flocculation/T., Sakai H., Abe M.: Preparation of Oleic Acid/Water

Coalescence of Metastable Oil Droplets in Surfactant-Emulsions in Surfactant-Free Condition by Sequential

free Oil/Water Emulsion by Freeze-Fracture Electron

Processing Using Midsonic - Megasonic Waves,

Microscopy, Langmuir, 17 , 255 - 259 , 2001 .

Langmuir, 20 , 2043 - 2047 , 2004 .

４）Kamogawa K., Akatsuka H., Matsumoto M.,16）Sakai T., Takeda Y., Mafune F., Kondow T.: Surface

Yokoyama S., Sakai T., Sakai H., Abe M.: Surfactant-

Properties of Surfactant-Free Oil Droplets Dispersed in

Free O/W Emulsion Formation of Oleic Acid and its

Water Studied by Confocal Fluorescence Microscopy,

Esters with Ultrasonic Dispersion, Colloids Surf. A,

J. Phys. Chem. B, 108 , 6359 - 6364 , 2004 .

− 30 −

乳化剤フリー油中水滴型（W/O）エマルションの分散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発

酸滴の粒子径に及ぼす長鎖脂肪族アルコールの添加効

17）Akatsuka H., Seto T., Hayashi M., Sakai T., Sakai

果，J. Jpn. Soc. Colour Mater., 81 , 111 - 116 , 2008 .

H., Abe M.: A Study on Droplet Growth in andStabilization of Surfactant - Free Emulsions, Mater.

20）酒井俊郎 : サーファクタントフリーエマルションの分

Tech., 26 , 22 - 31 , 2008 .

散安定化機構の解明と分散安定化技術の開発 , オレオサ
イエンス , 8 , 17 - 25 , 2008 .

18）Sakai T.: Surfactant - Free Emulsions, Curr. Opin.
Colloid Interface Sci., 13 , 228 - 235 , 2008 .

21）酒井俊郎 : 高純度オレイン酸を油としたサーファク19）赤塚秀貴 , 瀬戸匡人 , 林真理子 , 酒井俊郎 , 酒井秀樹 ,阿部正彦 : 界面活性剤無添加水溶液中におけるオレイン− 31 −

タントフリーエマルション , FRAGRANCE JOURNAL,
37 , 46 - 53 , 2009 .

環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出

信州大学繊維学部

藤 井

敏 弘

Human hair is mainly composed of cysteine-rich proteins such as keratin and keratin-associated proteins (KAPs). Whena keratin solution was incubated with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), the zero-length
cross linker between amino and carboxyl groups, the solution changed to opaque white/light beige color gel in appearance.
The gel was formed according to the EDC and protein concentrations. Electrophoresis showed that the cross-linked proteins
were free of KAPs and composed of keratin only. Thus, the gel was named “keratin gel”. The keratin gel could both retain
various proteins and release some of them. Ovalbumin (MW=45 kDa; pI=5.2) incorporated into EDC/keratin gel was
continuously released for 24 h. This time-release was suppressed when the incorporated gel was treated with oxidative
treatment such as H2O2, while the release was slightly increased after reductive treatment of the gel. The keratin gels will beavailable for the controlled-release of macromolecules corresponding to oxidation-reduction environment.

１．緒スキャホールド機能を有していることが報告されている

言

6 , 7）。

これらのことは、毛髪タンパク質は生体適合性に優れたバ

光、温度、pH などの変化に反応する環境応答型ゲルは、イオマテリアルであることを示唆している。

次世代の高機能性マテリアルとして注目されている。医学

再生医療を含めた自然科学の最近の最大トピックスとしから工学までの広い分野で利用が想定されており、生体親て、人工多機能性幹細胞（iPS）の樹立とその応用があげら

和性や環境低負荷性が求められている。

れる。これは「自分由来の細胞で、自分を治療する技術」

私たちは 2002 年から“セルフリサイクル”の概念を提であるため、移植医療に代わる再生医療として注目され多唱して、これを実証する研究・開発を進めている。これか額の予算が投入されている。これは、新しい産業創出にもら生まれてくる製品を“セルフリサイクル製品”と名付け、繋がるため、国民の期待は高い。一方では、「国民医療費」「動物や他者の生体組織・材料を使わず、本人由来の生体物

は 40 兆円におよぶと報道されており、毎年 1 兆円もの増加

1 , 2）。

となっている。この要因としては高齢化が進んだことに加この生体物質として毛髪組織に注目した。この理由として、

えて、CT、MRI、内視鏡などの診断や治療に使用してい血液と比べて、毛髪は採取する負担が小さく、大量に入手る「高度医療技術」が挙げられてきている。iPS 細胞からが可能で、フィルム、ゲルなどへと加工する技術を開発す作られるセルシートや組織などが治療に利用できるようにれば、安全・安心なマテリアルとなるものと考えている。

なれば移植医療にとっては福音となるが、さらなる高額な

硬ケラチンを抗原としてマウスに投与して免疫原性を調べ医療費を国民に負担させることになる。このため、今後、たところ、マウス体毛ケラチンはヒト毛髪および爪ケラチ

低コストで品質の高い医療用の材料と診断・治療技術を社ンと比べて、100 〜 200 倍も免疫応答性が低いことを報告会が求めてくることを確信している。

質を原料として、本人が使用するための品」と定義した

3）

している 。またヒト毛髪タンパク質フィルムはプロテア

私たちは、ケラチンを原材料としたフィルムへの加工技ーゼにより分解を受けることや、ヒト毛髪および爪タンパ術は開発しているが、ゲルへの加工技術は未だ確立していク質とそれらのフィルムはラット腹腔由来の肥満細胞を刺ない。本研究では、簡便な技術を組み合わせて、スマート

激しないことを私たちは見出している材料でかつ生体適合性にも優れたケラチンゲルを開発する

4 , 5）。また、羊毛およびヒト由来の硬ケラチンフィルムやスポンジは細胞培養ことを目的とする。

の足場として期待されており、線維芽細胞などとの接着性、

2．実生存、増殖などにおいて問題がなく、コラーゲンに匹敵する

2 .1

験

毛髪タンパク質溶液の調製とケラチンゲルの作製

化学処理が施されていないボランティアから提供された頭髪を用いた。毛髪を信大法溶液（５M 尿素 , 2 . 6 M チオ
Creation of the keratin gel : an environmental
response type smart material
Toshihiro Fujii
Faculty of Textile Science and Technology,
Shinshu University

尿素 , ５% 2 -メルカプトエタノール , 25 mM Tris-HCl, pH
8 . 5）に浸し、50℃で３日間抽出を行った。ろ過と遠心操8）

作により毛髪残渣を取り除き、タンパク質溶液を得た 。
この溶液は蒸留水に透析後、不溶物を遠心で取り除き使用− 32 −

環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出した。タンパク質濃度は牛血清アルブミンを標準として

3．結

9）

Bradford 法で測定した 。
ゲル形成は小試験管中の毛髪タンパク質溶液にゼロ距離

3 .1

果

EDC 濃度がゲルの形成に与える影響

化 学 架 橋 剤（EDC；1 - ethyl- 3（3- -dimethylaminopropyl）

EDC による架橋は近距離のアミノ基とカルボキシル基

carbodiimide hydrochloride）を加えてインキュベートし、の間にペプチド結合を作り、副産物は尿素で未反応 EDC

一定時間後に倒立試験により確認した。ゲルの還元処理はとともに水洗により除去ができる。このため生体適合性のチオグリコール酸、酸化処理は過酸化水素を用いた。

保持が期待できる。EDC はタンパク質間の相互作用を調べるために多用されている。ケラチンと同類の筋肉に含ま

2.2

電気泳動

れている中間径フィラメントであるデスミンがカルポニン

倒立試験の 1 / 10 のスケールでタンパク質と試薬を加えて反応させ、可溶化成分を Tricine/SDS- ポリアクリルアなどの細胞骨格タンパク質と EDC により架橋することを
11）

報告している 。

ミドゲルの電気泳動（トリシン /SDS - PAGE）によって分

可 溶 化 し た 毛 髪 タ ン パ ク 質 溶 液（10 mg/ml）に 0 −析した。泳動後のゲルは、0 . 1％ クマシーブリリアントブ

100 mM まで EDC 濃度を変えて加えた。37℃、30 分間イ

ルー R - 250、10 % 酢酸、40 % エタノールで２時間染色後、ンキュベーション後に小試験管を倒立させたところ、0 −10％酢酸溶液で脱色処理を行った 。

５mM EDC においてはタンパク質溶液の操作直後に落下10）することが観察されたが、20 mM 以上の EDC 濃度では試

2.3

遊離（放出）試験

験管の底にゲル状の凝集体が形成され、これらは倒立してゲルへの高分子量成分の保持と遊離は、６種のタンパクも落下せずに底部に保持されていた（Fig. 1 A）
。中間の 7

質のブレンドを毛髪タンパク質に混ぜ、100 mM EDC を加− 10 mM EDC においては試験管の底から壁に半固体の物

えてゲル化した。ゲル化されなかったものを 0 . 5 ×PBS に質が残存していることから、倒立試験に耐えられるまでのより洗浄後、0 . 5 ×PBS を加え 37℃下で遊離してくるタンゲルとなっていないことが示された。これらの結果、毛髪パク質量と成分を Bradford 法と電気泳動で分析した。

タンパク質は EDC により架橋が生じゲル凝集体が形成すFig. 1

ケラチンゲル形成における EDC の影響− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ることが示された。また半透明なタンパク質溶液は、ゲルpH が６の時のみにゲルが形成していた。ケラチンの等電化により不透明で白色〜淡ベージュ色を呈していた。

点は type Ⅰが 4 . 8 − 6、type Ⅱが 5 . 9 − 7 . 8 であることから、上記した条件を 1 / 10 のスケールでおこない、可溶化タ
ンパク質をトリシン /SDS - PAGE で分析した（Fig. 1 B）。

等電点に近い条件下では凝集性が高まりゲル化しやすいことが考えられる。

毛髪タンパク質溶液は高分子量成分（> 90 kDa）
、ケラチン
（40 − 65 kDa）
、 ケ ラ チ ン 結 合 タ ン パ ク 質（KAPs; 6 −3.3

タンパク質のケラチンゲルへの保持と放出

20 kDa）から構成されていた。１mM EDC の添加によりケラチンゲルへのタンパク質の保持と放出性を調べるた

ケラチンバンドが減少し、スタッキングゲルの上部が強くめ、phosphorylase b（97 kDa），bovine serum albumin

染色されることから、超高分子量成分が形成されたことが（66 kDa），ovalbumin（45 kDa），carbonic anhydrase示された。EDC 濃度が 10 mM 以上となると、ケラチン、（30 kDa），
trypsin inhibitor（20 kDa），
（14 kDa）
α-lactalbumin

高分子量成分、超高分子量成分のバンドは見かけ上ほぼ完からなるタンパク質カクテル（LMW - ST）を用いた。

全に消失していた。このことは、架橋がさらに進み、スタ

ケラチンゲルの形成は外部タンパク質の添加により抑制

ッキングゲルにすら入らないぐらいまでの高分子となってされるため、ここでは毛髪タンパク質の 1 / 10 濃度のタンいることが示唆された。一方、低分子量タンパク質のパク質カクテルと 100 mM EDC を加え、37℃、60 分間放KAPs は 100 mM EDC の添加条件下でも残存していること

置してゲルを作製した。形成したゲルは簡単に洗浄した後、から、ほとんど架橋されないことが示された。この結果、

37℃、0 . 5 ×PBS 溶液にインキュベーションして 24 時間まEDC 誘導の毛髪タンパク質ゲルはケラチンを主成分としでの放出試験を行った（Fig. 2 A）
。２時間ぐらいまでは放ているため、ケラチンゲルと呼ぶことにした。

出タンパク質は見られないが、３時間後から経時的な放出が検出できた。24 時間後においては、加えたタンパク質

3.2

EDC 依存性ゲル形成の諸性質の約 30 % が外液中に回収された。一方、カクテルを加え

EDC/ ケラチンゲルの形成はタンパク質濃度に依存しててないケラチンゲルからの放出はほとんど見られなかった。

いた。これは毛髪タンパク質溶液のロットあるいは保存期

次に、外液に放出されたタンパク質の成分を電気泳動で間により変動した。ここでは、５mM EDC 添加時におけ調べたところ、bovine serum albumin, ovalbumin, carbonic

るケラチンゲル形成について、処理時間、温度、pH の影
響を倒立法で調べた（Table 1）。処理温度が 37℃において、60 分以上のインキュベーションでゲル形成が見られた。
このため、60 分間の処理時間で温度変化を調べたところ、35℃以下ではゲル形成は見られないが、40 − 50℃ではゲル形成が観察された。50℃においては、30 分以内でもゲルが生じていた。反応溶液の pH の影響を調べたところ、

Table 1

各種条件がケラチンゲル形成に与える影響

Fig. 2− 34 −

ケラチンゲルからのタンパク質の放出環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出

anhydrase は有意に、trypsin inhibitor は僅かに検出がでTable 2

封入タンパク質の性質と放出性き た。 一 方、phosphorylase b と α-lactalbumin は 24 時 間
後の外液中にも検出できなかったことから、有意に放出がなされないことが明らかとなった（Fig. 2 B）。
タンパク質カクテルを構成している６種類のタンパク質の分子量、等電点、システイン含量を Table 2 に示す。このカクテル自体とカクテルに毛髪タンパク質溶液を加えた
条件で EDC 処理したところ、trypsin inhibitor は見かけ上減少するが、他のタンパク質のバンドには影響を与えないため化学的に結合は生じていないことが示された。これらの結果は、ケラチンゲルからのタンパク質の放出は分子量13）だけに依存しているのではないことが明らかとなった。ま

軸に整列してコルテックス部位を作り上げている 。しかた、平均的な電荷状態をあらわす等電点においては、放出

しながら、ケラチンと KAPs 間の EDC- 複合体は形成されされない a-lactalbumin がケラチンの等電点に近いことかなかった（Fig. 1 ）。

ら関連することが推測できるが、例数を増やす必要がある。

私たちは、ヒト毛髪から効率の高いタンパク質の抽出方法（信大法）と、この溶液に含まれているケラチンの自己3.4

還元− 酸化処理が放出反応へ与える影響

集合を誘発させてフィルム形成をする技術を独自に開発し毛髪ケラチン分子の特徴として、システインを多く含んてきている

8 , 14）。このフィルムは淡ベージュ色を帯びた不でおり、これから作られる− SS −結合は髪の毛がもつし透明なフィルムであるが、チオグリコール酸などの還元剤

なやかさと硬さを作り出す基本と考えられている。還元剤の処理により、半透明なフィルムに変化する。半透明フィ存在下で抽出された毛髪タンパク質はシステインの状態でルムは臭素酸などによる酸化剤で処理すると、元の不透明あると考えられる。そこで、ケラチンゲルをパーマ施術でなフィルムに戻る。還元−酸化状態に伴い、フィルムの微多用されている還元剤のチオグリコール酸と酸化剤の過酸細構造もダイナミックに変化が生じていることを見出して化水素を用いて処理した後、放出試験を行った。これらのいる。不透明−半透明−不透明の変化は数回繰り返すこと

処理は、肉視レベルにおいて影響を与えなかった。100 mMが可能である。つまり、還元、酸化といった環境状態におチオグリコール酸で処理をしたケラチンゲルは未処理ゲル

いてケラチンフィルムおよびその素材であるケラチンは環と比べて、放出量の増加が見られるのに対して、過酸化水

境応答性をもつタンパク質であることが示された

15 , 16）。

素で処理したケラチンゲルは放出量の顕著な減少が見られ毛髪ケラチンは約９% ものシステインを含み、ジスルフ

た。還元と酸化処理がゲルに与える違いは、保水量においィド結合により高強度を示し、階層的な構造体と合わせて、ても見ることができた。

毛髪のしなやかな物性を生み出している。一方、KAPs の４．考

システイン含量は 20 % 以上もあり、両者間のジスルフィ

察

ド結合を利用すれば、新しいタイプのゲルの作製が可能で毛髪の主成分のケラチンは細胞骨格タンパク質の中間径あると思われる。EDC −ケラチンゲルを還元剤および酸

フィラメントに分類されており、デスミン、ビメンチンな化剤で処理すると、ゲル内に封入したタンパク質の放出量

どと同じく、ケラチン単量体は自己集合し、直径 10 nm のが変化するため、ケラチンネットワークの網目密度が変化

枝分かれがないフィラメントとなる。私たちは、平滑筋のすることが示された（Fig. 3 ）。このことは、ケラチンゲル

デスミンがカルポニンと EDC により架橋されることを以が EDC により架橋されてゲル形成した場合においても、前に報告している 。ケラチンを含む中間径フィラメント

酸化および還元状態で性能が変化する環境応答型のスマーの分子間相互作用の解明に化学架橋剤は有効なツールであ

ト材料であることが示された。さらに、①化学架橋剤を使ることを示している。EDC はコラーゲンを高分子化する

用しない条件下でのゲルの形成 . ②ケラチン単独ではなく、のにも使用されており、この方法で作製したコラーゲンゲ

KAPs を含んだケラチンゲルの形成 . ③網目構造を変化さ

ルの生体適合性は高いことが知られている

せ、強度などの物性や分子ふるい効果が調整できるゲルの

11）

12）

。本研究において、毛髪ケラチンは EDC により架橋されてゲル化する

形成 . の可能性が示された。

ことが明らかとなった。毛髪組織の構築は、ケラチンフィ

美容師や理容師は他人の髪と長時間接触するにも関わらラメントからなるミクロフィブリルがマトリックスと呼ばず、これが原因とする職業病の発生は知られていない。頭れる KAPs を介して長軸に整列し、マクロフィブリルを形

髪は１日 150 − 300 mg 合成され、その質量の 70 − 80 % は成する。このマクロフィブリルは、細胞膜複合体により長タンパク質である。毛髪同様に再生される血液やリンパ液− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Fig. 3

酸化 / 還元がタンパク質放出に与える影響

は、生体に不可欠で多様な生体成分と多様な細胞を含んでof scaffolds from human hair proteins for tissue-

いる長所をもつ。しかしながら、血液やリンパ液を原料とengineering applications, Biomed Mater 3 , 1 - 12 , 2008 .

した場合と比べ、毛髪は安全面、保存面、採取負担などに

８）Nakamura, A, Arimoto, M, Takeuchi, K, Fujii, T, :A

おいて優れている。特に、本人由来の毛髪組織を使用してrapid extraction procedure of human hair proteins and化粧品・医用材料などに適用できるようになれば、私たち

identification of phosphorylated species, Biol. Pharm.
Bull., 25 , 569 - 572 , 2002 .

にとっては安全・安心な生体資源となる。

９）Bradford, MM, :A rapid and sensitive method for謝辞

the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

本研究にご助成頂きました公益財団法人コスメトロジー

Biochem., 72 : 248 - 254 , 1976 .

研究振興財団に深謝申し上げます。また、本研究の遂行にあたり、共同研究者の伊藤弓子さんに厚く御礼申し上げま10）Schagger, H, von Jagow, G, :Tricine-sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for theす。

separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.
（参考文献）

Anal. Biochem., 166 : 368 - 379 , 1987 .

１）藤井敏弘，：セルフメディケーションに向けたヒト毛

11）Fujii, T, Takagi, H, Arimoto, M, Ootani, H, Ueeda,

髪蛋白質フィルムの創製と販売，バイオインダストリー，

T,: Bundle formation of smooth muscle desmin

19 , 22 - 27 , 2002 .

intermediate filaments by calponin and its bindingsite on the desmin molecule. J. Biochem., 127 , 457 - 465 ,２）藤井敏弘 , 小林俊一 , ：セルフ - リサイクルに向けたヒ2000 .

ト毛髪タンパク質からの個人対応材料の開発，日本香粧12）井原慶児 , 永井展裕 , 柚木俊二 , 森一生 , ：鮭皮コラー

品学会誌 , 30 , 5 - 9 , 2006 .

ゲンのバイオマテリアル化技術の開発と商品化 , 生物工

３）井出裕介，藤井敏弘 , : 硬ケラチンを含有する毛髪タン

学会誌 , 85 , 126 - 131 , 2007 .

パク質の免疫原性 , 繊維学会誌 , 60 , 276 - 279 , 2004 .
４）井出裕介，藤井敏弘 , : ヒト毛髪タンパク質およびフィ13）松崎貴 , 新井幸三 , 上甲恭平 , 細川 稔 , 中村浩一，: 最新の毛髪科学，フレグランスジャーナル社 , 2003 .

ルムのプロテアーゼによる分解 , 高分子論文集 , 61 , 153 -14）Fujii T, Ogiwara D, Arimoto M, :Convenient

156 , 2004 .
５）Fujii, T, Murai, S, Ohkawa, K, Hirai, T, :Effects ofprocedures for human hair protein films and properties

human hair and nail proteins and their films on ratof alkaline phosphatase incorporated in the film, Biol.
Pharm. Bull., 27 , 89 - 93 , 2004 .

mast cells, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 19 , 2335 - 2342 ,15）Kawasoe T, Takayama S, Ito Y, Fujii T, :Effects

2008 .
６）Katoh, K, Tanabe, T, Yamauchi, K, :Novel approachof reductive and/or oxidative treatment during

to fabricate keratin sponge scaffolds with controlled

permanent wave procedure on human hair keratinpore size and porosity, Biomaterials, 25 , 4255 - 4262 ,films, J. Jpn. Cosmet. Sci. Soc., 35 , 306 - 311 , 2011 .
16）藤井敏弘 , : 毛髪ケラチンフィルムによるパーマ処理損2004７）Verma, V, Verma, P, Ray, P, Ray, AR, :Preparation− 36 −

傷評価 , Fragrance J., 39 , 46 - 52 , 2011 .

芍薬に含まれるコラーゲンのAGEs 化を阻害する化合物の探索とその皮膚老化改善作用の検討
熊本大学大学院生命科学研究部細胞病理学分野

藤 原

章 雄

Advanced glycation end-products (AGEs), were known as major hydrolysate of glycated collagen. Subsequently, AGEs
was also detected in human serum, and its level in patients with diabetes was found to be higher than in normal subjects.
Furthermore, it is known that AGEs-collagen induces apoptosis in fibroblasts through activation of reactive oxygen species
and MAP kinases. Therefore, treatment with AGEs inhibitors may be a potential strategy for the prevention of clinicaldiabetic complications and skin aging. In the present study, we investigated the inhibitory effect of Syakuyaku extract andω
compounds contained in Syakuyaku on N -(carboxymethyl) arginine (CMA) formation to discover the candidate agents forthe new AGEs inhibitor. As a result, Syakuyaku extract and pentagalloylglucose isolated from Syakuyaku extract showedsignificant inhibitory effect on CML and CMA formation during incubation of collagen with ribose, thus Syakuyaku andpentagalloylglucose may be candidate agents for the new AGEs inhibitors.

１．緒ており、例えば、AGEs 化コラーゲンは骨を形成する骨芽

言細胞のアポトーシスを誘導することで骨形成を阻害し、こ我々は、健康維持や疾病予防に有効な「機能性天然薬物」

9）の現象は骨粗鬆症の原因の一つであると考えられている 。

の探索研究を行なっており、これまでに抗動脈硬化作用を

また、コラーゲンの AGEs 化は、表皮に存在するケラチノ

有する天然化合物やマクロファージの活性化制御作用を有サイト（角化細胞）の遊走やコラーゲンへの接着能を低下することでガン免疫療法に有効な天然化合物を発見してきさせることから、糖尿病患者の創傷治癒の遅延にはコラー

た

ゲンの AGEs 化が関与していることが示唆されている 。

1− 6）

。

10）

さらに近年、この研究の一環として、糖尿病合併症や動コラーゲンは、皮膚の真皮において線維芽細胞から産生

脈硬化症、皮膚老化などの老化性疾患の発症や進展に関与され、真皮の 70 % 以上を構成するタンパク質であり、こする advanced glycation end-products（AGEs）の生成をのコラーゲンが線維芽細胞に引っ張られることで肌の張り阻害する天然化合物の探索を行なっている。AGEs とは還が保たれている。しかし、コラーゲンが AGEs 化すると、

元糖とタンパク質の非酵素的な反応であるメイラード反応

AGEs コラーゲンによる RAGE（receptor for AGE）を介によって生じる最終生成物の総称であり、このメイラード

した signaling により線維芽細胞のアポトーシスが引き起反応はグルコースなどの還元糖とタンパク質のアミノ基がこされ反応してアマドリ転位物を形成する前期反応と、アマドリが促進すると考えられている。

9 , 11）、その結果、肌の張りの低下といった皮膚老化

転位物が酸化、脱水、縮合、転位などの反応を経て AGEs

そこで、本研究では、皮膚老化予防に対する新たなター構造体へと変化する後期反応からなる。現在、様々なゲット分子として AGEs に注目し、生薬「芍薬」の AGEs

AGEs 構造体が知られており、その中でも、様々なタンパ

生成阻害作用の検討および芍薬に含まれる AGEs 生成阻害

クで生成する主要なAGEs構造体である N -（carboxymethyl）

化合物の探索を行なった。

εlysine（CML）は、糖尿病合併症の病変部位や動脈硬化症

２．実のみならず、肺線維症の肺胞マクロファージなどでも蓄積7）することが知られている 。また、コラーゲンに特異的に

2 .1

ω

験

試験サンプル

生 成 す る AGEs と し て は N -（carboxymethyl）arginine

本研究で用いた生薬抽出エキスは、各種生薬を MeOH

（CMA）が知られている 。さらに、コラーゲンに生成すで 24 時間温浸することで調製した。また、試験化合物はる AGEs と病態との関連についても、様々な報告がなされ生薬「芍薬」から各種クロマトグラフィーにて単離・精製8）したものを用いた。
Identification of compounds inhibiting
AGEs formation in Syakuyaku
Yukio Fujiwara
Department of Cell Pathology, Graduate
School of Medical Sciences, Kumamoto
University

2.2

AGEs 生成阻害試験

リボース（30 mM）とゼラチン（2 mg/ml）もしくは、Ⅰ型コラーゲン（1 . 5 mg/ml）の混合溶液を 37℃で７日間インキュベートすることで、AGEs である CML と CMA が生成する条件下に、DMSO で溶解した試験サンプルを添加− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

し、CML 生成および CMA 生成に対する阻害作用を、抗を用いた免疫染色を行った。

CML 抗体ならびに抗 CMA 抗体を用いた ELISA 法にて評

３．結

価した。

2.3

3 .1 芍薬エキスおよび芍薬抽出画分のAGEs 生成阻害
作用

ELISA

ELISA に よ る CML お よ び CMA 含 量 の 評 価 は、Nagai
らの方法に準じて行った果

12）

芍薬の AGEs 生成阻害作用を評価するために、芍薬の。リボース−ゼラチン混合液

MeOH 抽出エキスを調製し、まずは、コラーゲンに特異（10 mg/ml）を 96 穴 プ レ ー ト に コ ー テ ィ ン グ し、0 . 05 %的に生成する AGEs である CMA に対する阻害作用を評価

Tween 20 を 含 む PBS（washing buffer）で ３ 回 洗 浄 後、した。その結果、Fig. 1 A に示すように MeOH 抽出エキス

0 . 5 % ゼ ラ チ ン に て ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た。 各 well を

は CMA の生成を有意に抑制した。また、MeOH 抽出エキ

washing buffer にて洗浄し、抗 CML 抗体もしくは抗 CMA

スを Diaion HP- 20 カラムにて分画した画分を用いて評価

抗 体 を 添 加 後、 １ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。 各 well をを行なったところ、50 % MeOH 溶出画分にのみ顕著な

washing buffer にて洗浄後、HRP 標識抗マウス IgG 抗体にて１時間インキュベートし、最後に OPD にて発色反応後、
１M 硫酸にて反応を停止した。各 well の 450 nm における吸光度を micro-ELISA plate reader により測定した。

2.4

線維芽細胞の３次元培養

ヒト真皮線維芽細胞は、JCRB 細胞バンクより購入した。
5

ヒト真皮線維芽細胞（4 . 0 × 10 cell/well）を培地で懸濁させた溶液に、Ⅰ型コラーゲン溶液を加え、培養チャンバー
内で培養することで、Ⅰ型コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋した。２日後に凝固したマトリックスを培養
チャンバーより剥離し、８日間培養することで、正常に収縮するマトリックスを形成させた。

2.5

ウエスタンブロット法

ウエスタンブロットによる MAP キナーゼの活性化の評
11）

価は、これまでの報告に準じて行った 。37℃で７日間インキュベートした各種コラーゲン溶液（Ⅰ型コラーゲン溶液、リボース−Ⅰ型コラーゲン溶液、天然化合物を添加したリボース−Ⅰ型コラーゲン溶液）にて、３時間刺激した
ヒト真皮線維芽細胞を回収し、lysis buffer を用いて細胞を溶解させた。電気泳動には、10 % ポリアクリルアミド
ゲ ル を 用 い た。 ま た、 １ 次 抗 体 は、Rabbit monoclonalanti-Phospho-p 38 antibody,

Rabbit polyclonal anti-

Phospho-（JNK 1 +JNK 2）antibody, Mouse monoclonalanti-β-actin antibody を用いて行った。

2.6

免疫組織化学染色37℃で７日間インキュベートした各種コラーゲン溶液（Ⅰ型コラーゲン溶液、リボース−Ⅰ型コラーゲン溶液、
天然化合物を添加したリボース−Ⅰ型コラーゲン溶液）にて刺激したヒト真皮線維芽細胞を４% パラホルムアルデヒ
ドにて固定後、パラフィンにて包埋した。続いて、パラフ
ィン切片を作成後、定法により抗 CML 抗体、抗 CMA 抗体および Rabbit polyclonal anti-cleaved caspase- 3 antibody

Fig.1 Inhibitory effect of Syakuyaku (SY) on CMA formation.
G elatin a n d rib ose we re in cu b ate d with 5 0 µ g /ml
Syakuyaku (SY) extract (A), 50µg/ml fractions isolated by
Diaion HP-20 column (B) and 10µg/ml fractions isolated
from 50%MeOH eluted fraction by Wako gel column (C) in
phosphate buffer for 7 days followed by determination of
CMA by noncompetitive ELISA as described under Materialand Methods. Data are presented as the mean±SD. *,P<0.01 versus control.

− 38 −

芍薬に含まれるコラーゲンの AGEs 化を阻害する化合物の探索とその皮膚老化改善作用の検討

CMA 阻害作用が認められた（Fig. 1 B）
。続いて、阻害効果

AGEs 生成阻害試験系にて、単離した化合物の阻害作用をの認められた 50 % MeOH 溶出画分を Wako gel カラムを用評価した。その結果、すべての化合物に有意な CMA の生いて分画し、得られた４つの画分の阻害作用を評価したと成阻害作用が認められ、GP を除く、すべての化合物にころ、Fraction 1 ならびに Fraction 3 に顕著な CMA 阻害

CML の生成阻害作用が認められた（Fig. 3 A）。次に、リボ作用が認められた（Fig. 1 C）
。ゆえに、これらフラクショースとⅠ型コラーゲンを用いた AGEs 生成阻害試験系にてンに活性本体が含まれていることが示唆された。

同様に評価を行った。その結果、すべての化合物に有意なCMA の生成阻害作用が認められ、TRGG, TEGG, PGG に

3 . 2 芍薬抽出画分からの化合物の単離

有意な CML の生成阻害作用が認められた（Fig. 3 B）。また、

Fig. 1 C で 顕 著 な CMA 生 成 阻 害 作 用 が 認 め ら れ た
fraction 1 および fraction 3 を各種クロマトグラフィー（シこれら化合物は CML よりも CMA の生成をより強く抑制
することが明らかとなった（Fig. 3）。

リカゲルカラム、逆相シリカゲルカラム、HPLC）によりおよび質量分析により構造解析を行なったところ、Fig. 2

3 . 4 線維芽細胞の三次元培養を用いた AGEs 阻害作用を有する芍薬由来化合物の評価の検討に 構 造 を 示 す 化 合 物（Methylgallate, Galloylpaeoniflorin,

肌の張りは、真皮中に存在する線維芽細胞がコラーゲン

Trigalloylglucose, Tetragalloylglucose, Pentagalloylglucose）

を引っ張ることで保たれている。通常、正常なコラーゲンを同定した。

マトリックス中で線維芽細胞を培養すると、線維芽細胞が分離精製を行なった。単離した化合物を核磁気共鳴（NMR）

I 型コラーゲンを引っ張り引き締めることで弾力のある真3.3

芍薬由来化合物のAGEs 生成阻害作用

皮類似構造を形成し、マトリックスの収縮が観察されるが、AGEs 生成を阻害する芍薬の活性本体を同定する目的で、
まず、リボースとゼラチン（可溶性コラーゲン）を用いた

Fig.2

AGEs 化コラーゲンマトリックス中では、その収縮率が低下 す る。 そ こ で、CMA 生 成 阻 害 作 用 の 認 め ら れ た

Chemical structure of compounds isolated from fractions possessing inhibitory effect on CMA formation.

− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Pentagalloylglucose（PGG）を添加したコラーゲンを用いし、その収縮率の低下は PGG により改善した（Fig. 4）。

て、マトリックスの収縮に対する効果を検討した。方法と前述したように、PGG は、コラーゲンの CMA 化によりしては、ヒト線維芽細胞を培地で懸濁させた溶液に、native-

低下したマトリックスの収縮率を改善したため、その改善

collagen溶液、AGEs-collagen 溶液（riboseとnative-collagenの作用が CMA 生成阻害作用によるものであるかを確認する

混合液を７日間インキュベートしたもの）もしくは、PGG をために、マトリックス中の CMA 含量を、抗 CMA 抗体を添加した collagen 溶液（AGEs-collagen 溶液を調製する際に用いた免疫染色により評価した。その結果、マトリックス

PGG を添加したもの）を加え、培養チャンバー内で培養すの収縮率が低下したコントロールでは CMA の蓄積が確認ることで、コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋しでき、その蓄積は PGG の添加により抑制された（Fig. 5 A）。

た。２日後、凝固したマトリックスを培養チャンバーよりゆえに、PGG によるマトリックス収縮改善作用は、これ剥離し、８日間培養後にマトリックスの収縮を観察した。

ら化合物の CMA 生成阻害作用によることが示唆された。

そ の 結 果、AGEs-collagen を 用 い た マ ト リ ッ ク ス で はまた、マトリックス中の線維芽細胞の形態を、HE 染色に

native-collagen を用いた場合に比べて、その収縮率が低下より確認したところ、CMA 化コラーゲン中では、線維芽細胞の形態が丸くなり Native collagen と比較して、明らかに細胞死が誘導されていた（Fig. 5 B）
。一方、CMA 生成
阻害化合物である PGG を添加したマトリックス中の線維芽細胞は、Native collagen と比較して、変化のない正常な形態であった（Fig. 5 B）
。さらに、カスパーゼ 3 の活性化を免疫染色により評価したところ、CMA-collagen では、
カスパーゼ３の活性化が認められ、その活性化は PGG により抑制された（Fig. 5 C）
。ゆえに、CMA 生成阻害化合物
である PGG によるマトリックスの収縮率の改善は、PGG
がコラーゲンの CMA 化を阻害したことによる線維芽細胞のアポトーシスの抑制であることが示唆された。

Fig.3 Inhibitory effect of compounds isolated from
Syakuyaku on AGEs formation.
Gelatin and ribose were incubated with indicatedconcentration of compounds (GP; Galloylpaeoniflorin, MG;
Methylgallate, TRGG; Trigalloylglucose, TEGG;
Tetragalloylglucose, PGG; Pentagalloylglucose) in phosphatebuffer for 7 days followed by determination of CMA and CML
by noncompetitive ELISA as described under Material andMethods (A). Type-I collagen and ribose were incubated withindicated concentration of compounds (GP;Galloylpaeoniflorin, MG; Methylgallate, TRGG;
Trigalloylglucose, TEGG; Tetragalloylglucose, PGG;
Pentagalloylglucose) in phosphate buffer for 7 days followed
by determination of CMA by noncompetitive ELISA as
described under Material and Methods (B). Data arepresented as the mean ± SD. *, P<0.01; **, P<0.005; #,P<0.05; ##, P<0.01 versus control.

− 40 −

Fig.4

Effect of PGG on contraction of collagen matrix.

芍薬に含まれるコラーゲンの AGEs 化を阻害する化合物の探索とその皮膚老化改善作用の検討

3 . 5 CMA 生成阻害化合物による線維芽細胞のアポトーシス抑制メカニズム

は CMA 化コラーゲンによる p 38 および JNK の活性化を次に、CMA 阻害化合物である PGG が線維芽細胞のアポ

コラーゲンの CMA 化を抑制することで、CMA 化コラー

トーシスを抑制するメカニズムを解明することにした。こゲンによる p 38 および JNK の活性化を抑制し、結果的にれまでに、CMA の類似構造を有する AGEs 構造体である

線維芽細胞のアポトーシスを抑制することで、三次元培養

CML 化したタンパクは、RAGE を介して JNK や p 38 など

におけるマトリックスの収縮率の低下を改善したものと考の MAP kinase を活性化させることで、細胞をアポトーシ

えられた。

スに導くことが報告されている

9 , 11）

顕著に抑制した（Fig. 6）。ゆえに、CMA 生成阻害化合物は、。そこで、本研究では

４．考CMA 化コラーゲンによる JNK や p 38 の活性化ならびに
PGG の JNK や p 38 の活性化に対する作用を検討した。方察

本研究により芍薬の AGEs 生成阻害作用が明らかとなり、法としては、ヒト線維芽細胞に CMA 化コラーゲンまたその活性本体は化学構造中にガロイル基を有するは PGG で 処 理 し た コ ラ ー ゲ ン を 3 時 間 添 加 後 のMethylgallate, Galloylpaeoniflorin, Trigalloylglucose,

phosphorylated-p 38 お よ び phosphorylated-JNK の 発 現

Tetragalloylglucose, Pentagalloylglucose であることが明

量をウエスタンブロット法にて評価した。その結果、PGG

らかとなった。また、構造活性相関として、ガロイル基をFig.5 Effect of PGG on CMA Accumulation and Cell Viability in Collagen Matrix.
CMA accumulation（A）．HE staining of Fibroblast（B）．Caspase-3 activation（C）．

− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

多くもつ Pentagalloylglucose（PGG）が最も阻害活性が強く、ガロイル基の数が減少していくにつれ活性が低下する
傾向が認められたことから、ガロイル基の数が CMA の阻
害活性に関与する可能性が示唆された。また、PGG は線
維芽細胞の三次元培養において、コラーゲンの CMA 化に伴うコラーゲンマトリックスの収縮率の低下を改善した。
この収縮率改善メカニズムは、CMA 生成阻害化合物がコラーゲンの CMA 化を抑制することで、結果的に CMA コ
ラーゲンにより誘導されるアポトーシスシグナルの一つである MAP kinase（JNK, p 38）シグナルの抑制を介した線
維芽細胞のアポトーシス抑制によるものであることが明らかとなった。本研究にて、生薬「芍薬」および、芍薬に含まれる成分の皮膚老化改善作用および、その作用メカニズ
ムを解明したことで、CMA が皮膚老化改善作用における新たなターゲット分子として重要であることが示された。
本研究では CMA コラーゲンが引き起こすと考えられる病
態や老化症状のうち、特に皮膚老化に注目して研究を行っ

Fig.6 Effect of PGG on MAP Kinase（p38 and JNK）
Activation.
Human dermal fibroblasts were incubated for 3 hours with
400 µg/ml CMA-collagen, native collagen or PGG（30µM）- treated collagen. The phosphorylation of p38 and JNK wereanalyzed by western blotting analysis.

たが CMA コラーゲンは皮膚老化のみならず骨粗鬆症や糖尿病合併症の原因物質であることも考えられているため、今後さらに CMA の生体に及ぼす影響が明らかになること

４）Fujiwara Y, Komohara Y, Ikeda T, Takeya M, :で、CMA 阻害剤の重要性が高まり、本研究で得られた知Corosolic acid Inhibits Glioblastoma Cell Proliferation

見や CMA 阻害化合物の社会的利用価値が高まることが期

by Suppressing the Activation of STAT 3 and NF-κ

待される。

B in Tumor Cells and Tumor-associated Macrophages.,
Cancer Sci. 102 , 206 - 211 , 2011 .

謝辞５）Fujiwara Y, Komohara Y, Kudo R, Tsurushima K,

当該研究テーマおよび関連テーマの実施に際して、グラOhnishi K, Ikeda T, Takeya M, : Oleanolic acid inhibits

ントサポートを賜りました公益財団法人コスメトロジー研

macrophage differentiation into the M 2 phenotype

究振興財団に深謝します。

and glioblastoma cell proliferation by suppressing theactivation of STAT 3 . Oncol Rep, 26 , 1533 - 1537 , 2011 .

（引用文献）

６）Horlad H, Fujiwara Y, Takemura K, Ohnishi K,

１）Fujiwara Y, Kiyota N, Hori M, Matsushita S, Iijima

Ikeda T, Tsukamoto H, Mizuta H, Nishimura Y,

Y, Aoki K, Shibata D, Takeya M, Ikeda T, Nohara T,

Takeya M, Komohara Y : Corosolic acid impairs tumor

Nagai R, : Esculeogenin A, a new tomato sapogenol,

development and lung metastasis by inhibiting theameliorates hyperlipidemia and atherosclerosis in

immunosuppressive activity of myeloid-derived suppressor

ApoE-deficient mice by inhibiting ACAT., Arterioscler

cells. Mol Nutr Food Res. in press.
７）Matsuse T, Ohga E, Teramoto S, Fukayama M,

Thromb Vasc Biol, 27 , 2400 - 2406 , 2007 .
２）Fujiwara Y, Hayashida A, Tsurushima K, Nagai

Nagai R, Horiuchi S, Ouchi Y, : Immunohistochemical

R, Yoshitomi M, Daiguji N, Sakashita N, Takeya M

localisation of advanced glycation end products inTsukamoto S, Ikeda T, : Triterpenoids Isolated from

pulmonary fibrosis. J Clin Pathol. 51 , 515 - 519 , 1998 .

Zizyphus jujuba Inhibit Foam Cell Formation in８）Shimasaki S, Kubota M, Yoshitomi M, Takagi

Macrophages. J Agric Food Chem, 59 , 4544 - 4552 , 2011 .

K, Suda K, Mera K, Fujiwara Y, Nagai R, : N３）Fujiwara Y, Kiyota N, Tsurushima K, Yoshitomi-(carboxymethyl) arginine Accumulates in GlycatedM, Horlad H, Ikeda T, Nohara T, Takeya M, Nagai

Collagen and Klotho-deficient Mouse Skin. Anti-Aging

R, : Tomatidine, a tomato sapogenol, ameliorates

ωMedicine, 8 , 82 - 87 , 2011 .

hyperlipidemia and atherosclerosis in apoE-deficient９）Alikhani Z, Alikhani M, Boyd CM, Nagao K,

mice by inhibiting ACAT. J Agric Food Chem. 60 ,Trackman PC, Graves DT, : Advanced glycation end

2472 - 2479 , 2012 .

products enhance expression of pro-apoptotic genes− 42 −

芍薬に含まれるコラーゲンの AGEs 化を阻害する化合物の探索とその皮膚老化改善作用の検討

and stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic

end products induce apoptosis in fibroblasts throughand mitochondrial pathways. J Biol Chem, 280 , 12087 -

activation of ROS, MAP kinases, and the FOXO 1

12095 , 2004 .

transcription factor. Am J Physiol Cell Physiol. 292 ,C 850 - 856 . 2007 .

10）Morita K, Urabe K, Moroi Y, Koga T, Nagai R,
Horiuchi S, Furue M, : Migration of keratinocytes is12）Nagai R, Ikeda K, Higashi T et al, Hydroxy radical

impaired on glycated collagen I. Wound Repair Regen.

mediates N epsilon-(carboxymethyl) lysine formation

13 , 93 - 101 . 2005 .

from amadori product. Biochem Biophys Res Commun.

11）Alikhani M, Maclellan CM, Raptis M, Vora S,
Trackman PC, Graves DT, : Advanced glycation− 43 −

1997 ; 234 : 167 - 172 .

表面が制御された徐放性ナノチューブカプセルの化粧品への応用

産業技術総合研究所・ナノシステム研究部門・形態機能ナノシステムグループ

増 田

光 俊

We reported encapsulation of synthetic perfumes (eugenol and d-limonene) into cylindrical nanospace of organic
nanotubes, so called “ONTs”. ONTs are self-assembled from tube forming glycolipids, their hydrophobized analogues,
and these mixtures. As results, we prepared ONTs with both – COOH, – COOMe, and hydrophobic carbobenzoxy groups
localized on cylindrical nanochannels. The ONTs are able to capture the perfumes in their hollow cylinders by capillary
force upon addition of ethanolic perfume solutions. The ONT having inner surface covered with – COOH or with – COOMe
exhibited high encapsulation efficiency for eugenol. On the other hand, the ONT showed moderate encapsulation efficacy
for limonene. These results indicated the efficiency should be relevant to hydrogen bond formation between – OH groupsof eugenol and oxygen atoms of the – COOMe on inner surface. The release of eugenol from the ONT was accelerated byhydrophilic inner surface of the nanochannels and also by high humidity of atmosphere, indicating suitable for functional
release of perfumes. All these results showed that ONTs with optimized inner surface are promising nanocapsules forcosmetic applications.

１．緒

性ナノカプセルとしての利用にも期待できるものである。

言本研究では ONT の化粧品用ナノカプセルへの用途の可化粧品をはじめ医療、製薬、食品、農薬、畜産などの幅能性を探るため、まずは香料成分のカプセル化特性を検討

広い産業分野において、有効成分を必要な場所で必要に応した。次に得られた香料／ ONT カプセル体からの香料放じて放出する技術の重要性が注目されはじめており、この出挙動について、ONT 内表面の親水／疎水性、また放出ための機能性ナノカプセルやマイクロカプセルなどが数多

雰囲気の湿度とともに評価した（図１）。

1）

く報告されてきた 。この様なカプセルの多くは球状の微

従来のナノカプセルの代表例として界面活性剤が形成す粒子やミセル、そして中空のリポソームなどであった。一るミセルや大環状分子のシクロデキストリン（CD）が挙げ方、我々は脂質が自己集合してチューブ状ナノ構造（有機られる。ミセルは流動的な集合体であり、化合物によってナノチューブ、Organic nanotube、以降「ONT」と記述）

は低温で結晶化・沈殿するなどの課題がある。また厳密にを形成することに着目した研究を行っている

2−4）

。この

は中空構造を持たない。一方、CD は安定な空孔を持つが、ONT はナノカプセルとして理想的な中空ナノ空間と開端

そのサイズが１nm 以下であるため、カプセル化される分部を持つため、薬物の包接や放出に優れていると考えられ、子に限界があった。ONT は固体状のカプセルで、CD の約

これまでに以下の点について明らかにしている。

10 倍以上のサイズを持つ。また用いる分子の構造によっ①水に良分散で長期安定性に優れる。

てチューブ口径やチューブ内表面も制御できるため、疎水②外表面が異なる官能基で被覆された非対称なチューブ構性で水に難分散性の化粧品有効成分のカプセル化にも最適

造では、内径（約 6 ～80 nm）、長さ（約 100 nm ～数 mm）、

であると考えられる。

内外表面の電荷（正負）や疎水性を制御できる。

２．実③薬物、タンパク質、DNA 等のゲストを混合するだけで静電相互作用などにより効率的にカプセル化し、これらを安定化する。

験

カプセル化する香料成分として d- リモネン（LN）、オイ
ゲノール（EL）を用いた。またカプセル化に用いる有機ナ④上記③のカプセル化物において外部刺激等に応じてゲスノチューブ（ONT）として、チューブ形成脂質１、２、おトを放出できる。

よび１と３の混合物（モル比 = 10 / 2）の自己集合によってこれらの特性は、香料等の化粧品有効成分のための機能

それぞれ ONT- 1、ONT- 2、ONT- 1 / 3 を得た。用いた脂質は既報より合成した 5 , 6）。これらの脂質をジメチルスルホ

Cosmetic application of sustained-releasenanotubes capsules via surface control
Mitsutoshi Masuda
Morphofunctional Nanosystem Group,
Nanosystem Research Institute（NRI），
National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology（AIST）

キシド（DMSO）に加熱溶解後、冷却することで自己集合
によって ONT を形成させた。得られた分散液を透析してDMSO を除去し、その後の凍結乾燥によって ONT を単離し以降の実験に用いた。
香料カプセル化− 44 −

香料成分のカプセル化は ONT への毛細管現象によって

表面が制御された徐放性ナノチューブカプセルの化粧品への応用行った 7）。すなわち凍結乾燥した ONT（0 . 03 mmol）に LN

いて ONT をよく洗浄し、外表面の EL を除去した。これ

あるいは EL のエタノール溶液（20 mmol / EtOH 0 . 3 mL）

を 22 ℃で湿度８%、55 % に制御したデシケーターに入れ、を加え 30℃で 20 時間、あるいは 72 時間放置した。遠心分

一定時間毎に ONT を取り出し、EtOH に分散し遠心分離

離により過剰のエタノール溶液を除去し、残渣を真空乾燥によって ONT を分離後、UV により残存する EL を定量ししながらその重量をモニターした。この乾燥は EL（沸点た。以上により放出量を求めた。なおデシケーター内の相

254 ℃）の場合 80 ℃で、LN（沸点 176 ℃）は 23 ℃（室温）

対湿度はそれぞれ NaOH 飽和水溶液と 55 % Ca（NO 3）2 水溶で行った。最終的に得られた香料／ ONT カプセル体につ液によって制御した。

いて、核磁気共鳴スペクトル測定によりそのカプセル化量３．結を求めた。すなわち脂質分子と香料のプロトンシグナルの果

積分より両成分のモル比を求め、カプセル化量とした。な

チューブ形成脂質１、２、および１と３の混合物（モルお測定時（60℃、重 DMSO 中、5 mg/mL）に ONT が完全

比 = 10 / 2）より、それぞれ ONT- 1、ONT- 2、ONT- 1 / 3 をに溶解することを確認している。また上記カプセル化後の得た（図１）。チューブ外表面はいずれも親水性の１－グ

有 機 ナ ノ チ ュ ー ブ に つ い て、 走 査 型 電 子 顕 微 鏡（ 日 立

ルコサミド残基で被覆されている。チューブ内表面はS - 4800）を用いて形態観察した。つまり TEM 用カーボン

ONT- 1 ではカルボキシル基（−COOH 基）、ONT- 2 ではメ

グリッドにナノチューブを滴下乾燥後、pH 5 に調製したリ

チルエステル基（−COOMe）、ONT- 1 / 3 では−COOH 基

ンタングステン酸（２%）を滴下することでネガティブ染色とカルボベンゾキシ基（−Cbz 基）で被覆されていること

し、透過像（Scanning transmission electron microscopic

が既報を参考にして明らかにした 5）。
単離後の ONT- 1 の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。

image, STEM image）によってチューブ形態とその内空間などの微細構造を可視化した。

いずれの ONT でも内空間が染色剤によって黒いコントラ

香料放出実験

ストを与え、既報通り内径約８nm、外径約 12 ～ 15 nm、香料として EL をモデル化合物として用いた。それぞれ

壁厚約３～４nm、長さ約 100 nm ～１mm 程度のチューブのONT（15 mg）にELのエタノール溶液（ 5 mmol EL / 0 . 75 ml

構造を形成することを確認した。また上記の壁厚が伸びき

EtOH）を加え、室温で３日間放置しカプセル化を行った。

った脂質分子の長さに相当していることから、ONT は１

その後、100 nm 孔の PC 濾過膜上でろ過、エタノールを用枚の単分子膜で形成されていることが判った。

図１ 左図：自己集合により内表面がカルボン酸性の有機ナノチューブを形成する脂質 1,
内表面が疎水性の ONT を形成する 2, および 1 と混合して自己集合することで内表面を部分的に疎水性に変換する誘導体 3。右図：自己集合による ONT 合成とカプセル化や放出に用いた d -リモネン（LN）とオイゲノール（EL）。

− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

えて ONT- 1 / 3 では、EL の芳香環とチューブ内壁の Cbz

香料のカプセル化
毛細管現象を利用した香料成分の ONT へのカプセル化

基間の π-π 相互作用も寄与している可能性もある。

を検討した。20 時間のカプセル化工程によって香料成分

上述の減圧乾燥において重量がほぼ一定になった時点を導入後、真空下での重量減少特性を図３に示す。乾燥温度

カプセル化された香料として定量した。すなわち核磁気共（LN は 23℃、EL は 80℃での真空乾燥）が異なるため比較

鳴スペクトル測定により、それぞれの ONT へのカプセルは困難ではあるが、カプセル化量が比較的多い EL（図３

化量をチューブ形成脂質に対する LN と EL のモル比やそ

右図。カプセル化の結果は表１）では、LN に較べて ONT

れ ら を 重 量 比 に 換 算 し た 値 を 表 1 に 示 し た。 い ず れ のからの揮発による重量減少が遅いことがわかる。これはONT でも EL のカプセル化量が多い。特に内表面が疎水性

EL 分 子 中 の 水 酸 基 と ONT 内 表 面 の −COOH 基、 −の−COOMe 基で被覆された ONT- 2 では、最大のカプセ

COOMe 基とが水素結合を形成するためと考えられる。加ル化量（約 1 . 4 モル等量）を示した。一方、親水性の ONT- 1

図２ 左図：調製した ONT-1（左図）および EL カプセル化後の ONT-1/3 の走査型透過電子顕微鏡像（右図）。いずれもネガティブ染色後の形態。

図３ リモネン（LN、左図）およびオイゲノール（EL、右図）の真空乾燥時の重量減少特性。LN は室温（23℃）
、
EL は 80℃での乾燥。
表１

ONT にカプセル化された LN、EL の量− 46 −

表面が制御された徐放性ナノチューブカプセルの化粧品への応用（内表面が−COOH 基）と部分的に疎水性の ONT- 1 / 3（内ると、ONT に対してそれぞれ約 33 wt%、51 wt% の EL を

表面が−COOH 基と Cbz 基）を較べると、後者のカプセル保持できることになる。別途得られる類縁体の結晶構造か化が若干多いが、それでもチューブを形成している脂質分ら得た分子の充填パラメーターや STEM 像から得たチュ子に対し 1 . 1 モル等量、すなわち内表面に約１分子程度がーブ径を基に、大まかな空孔率を求めると、１g の脂質か

吸着した量であった。なおカプセル化の前後での重量変化

ら ONT が形成できる内空孔の体積は 0 . 3 ～ 0 . 5 mL であっからカプセル化量を求めた場合も、上述の NMR 法と良くた。もし脂質と EL のモル体積（したがって密度）がほぼ一致していることを確認している。

同じであると仮定すれば、72 時間のカプセル化ではほぼ

また ONT- 1 や ONT- 2 について、カプセル化時間を 20

全ての内空間を EL で充填出来ていることが推測できる。

時間から、72 時間にするとそのカプセル化量がさらに多

また今回は固体として単離後のカプセル化量を求めたが、くなった（表１、括弧内の値）。この様にカプセル化には、化粧品への用途を考えると水溶液中でのカプセル化量や保かなり長い時間を要することがわかる。

持能力の検討も今後必要であろう。

香料／ ONT カプセル化体の形態について STEM による同様の検討例として吉井らは b - および g - シクロデキス

観察を行ったところ、全ての場合においてカプセル化後もトリン（b - および g -CD）による LN の包接で得られるカプチューブ構造を保持していることが判った（図２、右図）。

セ ル 化 粉 末 に お い て、 １g の CD が 保 持 で き る LN は

オイゲノールの徐放

0 . 078 g、0 . 126 g で あ る こ と を 報 告 し て い る 8）。 表 １ の内表面が親水性の ONT- 1 および疎水性の ONT- 2 を用い

ONT に対する LN の重量比と比較すると、ONT- 1 が b -CDて EL の放出特性を異なる相対湿度下（5 %、55 %）で検討とほぼ同等（0 . 069 g）であることが判る。一方、阿部らはした（図４）。その結果、外部の相対湿度が低いほど、まドデシル硫酸ナトリウム（SDS）からなるミセル水溶液へた内表面が疎水性であるほどその放出量が抑制されることの香料の可溶化を検討している 9）。その結果、１モルのがわかった。放出が一番早い親水性内表面の ONT- 1 でもSDS 水溶液に可溶化される LN のモル量（本報告のモル等

１週間で約 90％の EL を放出した。一方、徐放性に最も優量と同義）は 0 . 11（ONT- 1 では 0 . 37 モル量）
、EL では 1 . 9

れた疎水性内表面の ONT- 2 では１週間後でも約 50 %、湿（ONT- 2 では 2 . 2 モル量）となり、ONT が若干多い。しか度が低い場合では約 40 % 程度にまで放出が抑制されていし阿部らの可溶化は水溶液中であり、ONT 系も同様な条た。

件で検討するべきである。

４．考

一方、ONT からの EL の放出はチューブ内表面を疎水性

察から親水性に変化させることによって放出速度を抑制する

香料カプセル化ではエタノール溶液を凍結乾燥したことが出来た。また内表面が親水性の ONT- 1 では外部雰

ONT に毛細管現象で導入することにより、特に EL では

囲気の相対湿度の上昇と共に EL の放出速度が加速される

20 時間のカプセル化でチューブ形成脂質に対し等モル量ことがわかった。これは ONT- 1 が毛管現象で雰囲気中の程度、さらにカプセル化時間を 72 時間にすると２モル等水分を取り込む結果、内包していた EL を放出し易くなる

量程度までの封入が可能であった。これを質量比に換算すことに起因している可能性が考えられる。この特性は発汗時の香料の加速的放出につながるため、化粧品ナノカプセ
ルとしても適している。

５．総

括

本研究では ONT の包接化を評価するため、毛細管現象
によるオイゲノールやリモネンのカプセル化を検討し、効率的な香料のカプセル化を達成した。しかしその効率はゲ
スト化合物や用いる ONT の種類、またカプセル化条件によって大きく変化するため、他の化合物についても最適化を含めた検討が必要である。これら香料の放出では、発汗時を想定した高湿度下での香料の放出加速が出来た。今後は、使用前の香料保持技術が必要となるであろう。また今回はゲストカプセル化によるその安定化効果が未検討であり、これらの点も今後の課題である。
今回の研究では、ONT が香料をカプセル化し、その放出
図４

ONT-1 と ONT-2 からの EL の放出特性の湿度依存性制御も出来ることを明らかにしてきた。化粧品への本格的− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

島剛編 , フロンティア出版 : 東京 , 2008 .

な実用化には、上述の保持技術に加え、安全性、安定性、コストなどの多くの課題を克服する必要がある。我々が開５）Ding, W.; Kameta, N.; Minamikawa, H.; Wada, M.;

発してきた表面の特性やその内径サイズが異なる様々な

Shimizu, T.; Masuda, M., Hybrid organic nanotubes

ONT の一部について、現在、試薬会社を通じた研究用試with dual functionalities localized on cylindrical

薬としての販売に加え、試料提供も行っている。これらを

nanochannels control the release of doxorubicin. Adv.

呼び水とした共同研究によって、化粧品分野への実用化を

Healthcare Mater. 2012 , 1 , 699 - 706 .
６）Kameta, N.; Ding, W.; Masuda, M.; Minamikawa, H.;

加速してきたい。

Wada, M.; Shimizu, T. PCT/JP 2012 / 058724、「 内 表 面（文献）

疎水化有機ナノチューブ、および同ナノチューブを用い

１）マイクロ ／ナノ系カプセル・微粒子の応用展開 . シーエ

た薬剤カプセル化物」.
７）Yui, H.; Shimizu, Y.; Kamiya, S.; Yamasita, I.; Masuda,

ムシー出版 : 2003 .
２）K a m e t a , N . ; M i n a m i k a w a , H . ; M a s u d a , M . ,M.; Ito, K.; Shimizu, T., Encapsulation of Ferritin within

Supramolecular organic nanotubes: how to

a Hollow Cylinder of Glycolipid Nanotubes. Chem. Lett.

functionalize the inner nanospace and the outer space.

2005 , 34 , 232 - 233 .
８）Ysohii, H.; Kometani, T.; Furuta, T.; Watanabe,Soft Matter 2011 , 7 , 4539 - 4561 .
３）亀田直弘 ; 増田光俊 ; 清水敏美 , 高分子論文集 2010 ,Y.; Linko, Y.-Y.; Linko, P., Formation of inclusion
complex of cyclodextrin with ethanol under anhydrous

67 , 560 - 573 .

conditions. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 , 62 , 2166 -４）亀田直弘 ; 増田光俊 ,「第三章脂質ナノチューブの合成

2170 .

と応用、非対称型内外表面をもつ脂質ナノチューブと包接機能」、「有機・無機・金属ナノチューブ～非カーボン

９）徳岡由一； 阿部正彦 , 香料を水に溶かすには . 表面

ナノチューブ系の最新技術と応用展開～ 」, 清水敏美 ; 木− 48 −

1995 , 33 , 397 - 404 .

界面活性剤吸着膜の相転移で安定化する「温度応答性エマルション」の研究
九州大学大学院理学研究院化学部門

松 原

弘 樹

In this study, we demonstrated that the adsorbed film of hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) shows a novel
first-order phase transition between expanded and condensed films at the oil-water interface by using interfacial tensiometry
and ellipsometry. The analysis of obtained experimental data indicated that the penetration of alkane molecules into the
CTAB adsorbed film realized the condensed film formation of cationic surfactant due to the enhancement of dispersion
interaction of hydrophobic chains without increasing electric repulsion between hydrophilic groups. Furthermore, it wasalso revealed that the condensed film formation was accompanied with the strong preferential adsorption of longer chain
alkanes if the oil phase was composed of the mixture of alkanes. We extended these findings to control the stability of theoil-in-water (O/W) emulsions and found that the volume of the O/W emulsion was reduced to about 1/4 at the temperaturevery close to the expanded-condensed phase transition point, indicating that the condensed film formation remarkably
unstabilized the O/W emulsions.

１．緒
九州大学

にくいということが挙げられます。乳化への応用を考える

言

場合、吸着膜の密度はある程度高くないといけないので、界面物理化学研究室では、独自の熱力学的手法を用いた界面吸着膜の研究をおよそ 30 年に渡って積み相転移を安定性のスイッチとするには膨張膜と凝縮膜を研究の対象にできなければいけません。

上げてきました。近年は、熱力学で得られた知見をもとに、今回の研究のアイデアは、陽イオン性界面活性剤を長鎖①分光学的な研究手法を取り入れて分子レベルで吸着膜のアルカンと一緒に界面に吸着させ、吸着膜をアルカンと界描像を明らかにする、②吸着膜の状態制御を積極的に利用

面活性剤の混合吸着膜と考えるというものです 2 − 4）。つましてコロイド化学の様々な分野で新しいアプローチを試み

り、界面活性剤の吸着量としては膨張膜程度の密度しかなる方向へも研究を展開しています。今回、コスメトロジー

い場合でも、アルカン分子が疎水性相互作用によって吸着研究助成に提案させていただいた、界面活性剤吸着膜の相膜にうまく取り込まれれば、全体の炭化水素鎖密度は凝縮転移で安定化する「温度応答性エマルション」の研究もそ膜に近い状態を実現できるのではないか？と考えたのです。

のような取り組みの一つです。

結論から述べると、この方法は鎖長の異なるアルカンが混吸着膜相転移とは、温度、圧力、界面活性剤濃度などを合して油相を形成している場合に特に有効であることが分変数として、吸着膜の物性が大きく変化することをいいまかりました。また、混合吸着膜の相転移の前後で可溶化量1）

す 。吸着膜の状態には、大きく分けると３次元の気体、に大きな変化が現れることも分かってきました。以下、こ液体、固体に対応する気体膜、膨張膜、凝縮膜の 3 つの状

れらの実験の詳細についてご紹介したいと思います。

態が存在することが分かっています。不溶性単分子膜の相２．実転移はこれまでにも沢山の研究例がありますが、
“可溶性”

験

界面活性剤の吸着膜相転移を用いるメリットは、温度など

陽イオン界面活性剤には臭化ヘキサデシルトリメチルアの実験条件をわずかに変えるだけで転移的に界面の状態をンモニウム（鎖長 16、以下 CTAB と略記）を用いました。

制御できる点にあります。これは乳化系の安定性をコント

これは炭化水素鎖がある程度長い方が疎水性相互作用でアロールするという目的には大変魅力的だと思われます。

ルカンを吸着膜に取り込むという目的に合っているだろう

しかし一方で、吸着膜のデメリットとして、一般に乳化という期待からです。長鎖アルカンとしては、ドデカン（鎖に用いられる水（油）への溶解性が高い界面活性剤は、そ長 12）、テトラデカン（14）、ヘキサデカン（16）を用いまの高い溶解性のために界面に吸着しにくく凝縮膜を形成しした。CTAB はアセトンとエタノールの混合溶媒から再結晶し、アルカンは減圧蒸留しました。純度はそれぞれ界面張力測定とガスクロマトグラフィーで確認しました。

Condensed film formation of cationicsurfactant at the oil-water interfaces andits application to emulsion stability
Hiroki Matsubara
Department of Chemistry, Faculty of
Sciences, Kyushu University

具体的な実験は次のように行いました。
まず初めに、それぞれのアルカンと水の界面に CTABを吸着させ、CTAB 濃度 m を一定にして界面張力 γ を温度の関数として測定しました。界面活性剤の吸着挙動を研究する場合、温度（と圧力）を一定にして界面活性剤の濃− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

このとき第二成分は混合したアルカンの内、鎖長の長いも度を変えるのが一般的です。これはのを取っています。実験の操作はアルカンを単独で用いた場合と同じですが、アルカン混合系ではの関係から界面活性剤の吸着量ΓH を求めるのが主な目的ですが、界面活性剤とアルカンの混合吸着膜の相転移では、アルカンが吸着膜に侵入することによって凝縮膜が形成さという関係式を使うことができます 8）。これは相対吸着量れると予想しているので、実際に相転移が起こったとしてと呼ばれ混合した二種類の溶媒成分の内、どちらが優先的も CTAB 自身の吸着量にはほとんど変化が現れない可能（相対的）に界面領域に分布しているかを測る指標です。

性が考えられます。そこで今回は吸着膜状態の変化は、吸ただしこの式は溶媒成分の活量を考慮しない形になってい着にともなうエントロピー変化

ることに加え、熱力学で求まる吸着量が過剰量という性質を持っているため、必ず x 2 = 0 と 1 ではΓ2H, r= 0 とならなけ
ればならないという制約があり、溶媒の吸着量の定量的な評価には使えません。
5）から確認する方がよいと判断しました 。

最後に、アルカン単独系、アルカン混合系における吸着

また、アルカンと界面活性剤を合わせた吸着量について

膜相転移のデータをもとにして、膨張膜領域と凝縮膜領域、

大まかな見積もりを得るためにアルカン / 水界面での位相それぞれの温度で作成したエマルションにどのような違い

変調エリプソメトリーも行いました。この手法は、アルカがあるのかを調べました。この実験は、同じ体積のアルカ

ン / 水界面に位相に変調をかけながら p 偏光を入射し、反ンと CTAB 水溶液をある決められた温度に設定した恒温

射光の強度を測ります。これをブリュースター角で行うと、槽に浸けて１時間放置し、ボルテックスミキサーで１分間

6）

撹拌、恒温槽に戻して乳化相（層）の体積が時間とともにエリプティシティーという実験量が求まります 。

どう変わっていくかを観察するという方法で行っています。
この実験では CTAB の濃度は臨界ミセル濃度（１mmol kg−1）のおよそ３倍としました。
ここで ε1 と ε2 は溶媒の誘電率で、λ はレーザーの波長で３．結果と考察す。エリプソメトリーでは η に吸着膜の密度（厚み）に関する情報が含まれます。もし吸着膜が誘電率 ε、厚さ d の等方的な膜だとすれば、これは

図１はアルカン単独系の界面張力とエリプティシティー
の測定結果を示しています。CTAB の濃度はいずれも 0 . 6mmol kg −1 です。これをみると、ドデカン / 水界面では
2 . 7℃、テトラデカン / 水界面では 10 . 7℃で界面張力―温度曲線に明確な折れ曲がりが現れ、ほぼこれに対応する温となります。この仮定は吸着膜が膨張膜の状態にあるとき

度でエリプティシティーが不連続に減少することが分かりに良く成り立ちます。一方、凝縮膜のように界面垂直方向ます。界面張力―温度曲線の傾きに（2）式を適用すると、と水平方向で誘電率に違いが生じるような場合には、誘電高温側で～− 0 . 1、低温側では−0 . 9 kJ K−1 mol−1 という値

率の異方性を考慮してが得られます。吸着にともなうエントロピー変化は、界面活性剤が吸着膜にある場合と水溶液中にある場合の部分モ
ルエントロピーの差に相当しますので、低温側でこの値がより大きな負の値であることは、折れ曲がり点を境にして7）という式を用います 。
（4）、（5）いずれの場合でも、吸着秩序性の高い吸着膜が形成されたことを示唆しています。

膜の誘電率に主に寄与しているのは界面活性剤とアルカン

これらの値を以前に得られた文献値と比較すると、確かにの炭化水素鎖部分であると仮定すれば、d が吸着膜内での前者は膨張膜、後者は凝縮膜に対応していることが確認で炭化水素鎖の総量を反映していると考えることができます

きます 2 , 4）。

−（より正確に ρの内容を検討したい場合には、親水基や対（3）～（5）式を使ってエリプティシティーの値を解釈す

イオンの層について別個に ε と d を定め、これを差し引るには、吸着膜の誘電率や厚みとしてどのような値を採用

くこともできます）。

するかという点で任意性が生じます。特に混合膨張膜の場

二成分のアルカンを混合して油相に用いた実験では、油合、バルクのアルカン相と吸着膜の炭化水素層の誘電率は相でのアルカン組成 x 2 を新たに変数として設定しました。

かなり近い値であると予想されますので、説得力のある説− 50 −

界面活性剤吸着膜の相転移で安定化する「温度応答性エマルション」の研究明をするのは難しいと思われます。しかし、（4）式と（5）くなることによって吸着膜内での分子間相互作用が強くな

式の第１項がキャンセルすると考えれば、混合膨張膜と混っていることを示しています。これに則って考えるとヘキ合凝縮膜のエリプティシティーの差 Δη に関してはある程

サデカン系が最も凝縮膜形成に有利であるはずなのですが、度正確な見積もりができます。例えば、固体のアルカンのこの場合は吸着膜が相転移を起こす前にヘキサデカンの融データを使って ε0 とεd を決め、実験で得られた Δη を与点（～ 17℃）に到達してしまうために、ヘキサデカン単独

えるように d を決めると、これがオールトランス配向のド系では相転移を観測することができません。

デカンとヘキサデカンの長さの範囲にきちんと収まります。

図２にはテトラデカンとヘキサデカンの混合物を溶媒に以上の実験データから、長鎖アルカンと陽イオン界面活用いた場合の、吸着膜の相転移温度と混合物の融点をプロ性剤水溶液の界面では予想した通り、アルカンと界面活性ットしています。二つの曲線は x 2 = 0 . 8 で交わっており、剤の混合凝縮膜が出来ることが明らかとなりました。相転

この組成まではヘキサデカンを加えることで単調に相転移移温度がドデカン系よりもテトラデカン系で８℃程度高く温度が上昇しています。これを踏まえるとやはり界面活性なることは、CTAB との炭化水素鎖長のマッチングが良剤とアルカンの炭化水素鎖長が等しい場合が最も凝縮膜形

図１ アルカン /CTAB 水溶液界面での界面張力とエリプティシティーの温度変化。（a），（b），（c）はそれぞれ C12、C14、C16をアルカン相に用いた場合の結果を示している。

図２ C14 − C16 混合系における CTAB 吸着膜の相転移温度を油相中のC16 の組成に対してプロットしたもの。CTAB 濃度は下から上に行く順番に 0.2、0.4、0.6、0.8 mmol kg − 1。一番下の曲線は油相の融点曲線を示す。

− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

デカンは、ドデカンと混合した場合、およびテトラデカン

成には有利であると言えそうです。
そこで次に、アルカン混合物を溶媒に用いた場合には、と混合した場合の両方で、凝縮膜には優先的に取り込まれ混合凝縮膜はどのような組成で構成されるのか？という疑ています。やはり、界面活性剤と鎖長が等しいアルカンが問 が 生 じ る こ と に な り ま す。 図 ３ は CTAB 濃 度 を 0 . 6

凝縮膜形成に有利であると言えそうです。アルカン混合系−1mmol kg で一定とし、アルカンの混合組成を変えて界面で一方のアルカンが優先的に界面活性剤と混合凝縮膜を形張力を測定した結果です。この図を使って、ほぼ全てのア成する傾向は、界面活性剤との鎖長の差が最も大きくなる

ルカン組成で吸着膜が混合膨張膜の状態である 18℃と、ドデカンとヘキサデカンの混合系で最も大きくなります

混合凝縮膜である２℃（テトラデカンとヘキサデカンの組（図４中央）。

合せの場合は 10℃）の界面張力について、（6）式の関係を

ただし、実験でも述べたように、相対吸着量はアルカン

適用したものが図４です。図４をみると、２種類のアルカの吸着量の大小関係に関する定性的な情報しか与えません。

ンの吸着膜内での分布には、混合膨張膜の状態ではほとん

そこでここではこの問題をエリプティシティーが炭化水素

ど偏りが見られませんが、混合凝縮膜の状態では鎖長が長鎖の全量を表すことから考えてみたいと思います。図５がい方の成分に大きく偏っていることが分かります。また、

アルカン混合系のエリプソメトリーの結果です。ここでは単成分で用いたときには混合凝縮膜を作らなかったヘキサ

例としてテトラデカン─ ヘキサデカン混合系の結果だけ

図３

界面張力のアルカン組成依存性。（a），（b），（c）はそれぞれ C12 − C14、C12 − C16、C14 − C16 混合系を示す。

図４

C12 − C14、C12 − C16、C14 − C16 混合系の相対吸着量。

− 52 −

界面活性剤吸着膜の相転移で安定化する「温度応答性エマルション」の研究を示していますが、他の組合せでも定性的には同じ結果が（O/W）エマルション、の物性に影響を与えるのか？とい得られています。アルカン単独系の結果は図１で見た通り

う問題を考えたいと思います。図６はテトラデカンと３です。重要な点はアルカン混合系の凝縮膜状態でのエリプ

mmol kg−1 の CTAB 水溶液、それぞれ５ml を試験管に入ティシティーが、x 2 = 0 から 0 . 2 の間で大きく減少し、それ、ボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、恒温槽にれ以降はアルカン組成によらずほとんど一定になっている

静置したときの乳化相の体積（高さ）の時間変化を表してことです。凝縮膜は炭化水素鎖がほぼ細密に充填された状います。O/W エマルションは 25℃では膨張膜、10℃では−2態で、その炭化水素鎖密度はおおよそ８μmol m です。こ凝縮膜によって表面が覆われていると考えることができまの値はオールトランス配座をとったときの炭化水素鎖の断す。図６からは、膨張膜状態では乳化相の体積が 24 時間

面積で決まるので、界面活性剤やアルカンの鎖長にはほと後までほぼ一定であるのに対し、凝縮膜状態では連続的にんど依存しません。したがって、x 2 = 0 から 0 . 2 の間で観乳化相の体積が減少し、24 時間後には 25％程度になって察されたエリプティシティーの減少は、炭化水素鎖長の長いることが分かります。

いアルカンが吸着膜に取り込まれたか、CTAB の吸着量

O/W エマルションの安定性の変化と相転移温度との対がこの組成を境に大きく増加したか、そのいずれかで説明

応関係をより正確に確かめるために、いくつかの x 2 を選されるはずです。

んで、1 ～２℃の刻みで静置する温度を変え、調整から 24

ここではデータを示していませんが 18℃と２℃で（1）−2

時間後の乳化相の体積を調べたものが図７です。図中の矢式を使って見積もった CTAB の吸着量は 0 . 2μmol m し

印はそれぞれの条件での相転移温度を表しています。いずか違いませんでした。つまり、ここでのエリプティシティ

れの条件でもほぼ矢印と対応する温度で乳化相の体積に大ーの減少は、炭化水素鎖長の長いアルカンが凝縮膜に優先きな変化が表れています。以上を総合すると、O/W エマ

して吸着することが原因であると結論できます。しかも、ルションを覆っている膜が膨張膜から凝縮膜に相転移する

エリプティシティーの値が x 2 = 0 . 2 以降はほとんど変わらと、O/W エマルションは大きく不安定化するといえます。

ないという事実は、バルク中に界面活性剤と鎖長のマッチ

今回の研究結果は、従来の陽イオン界面活性剤は膨張膜

ングのよいアルカンが少量含まれているだけでも凝縮膜がしか作らないという常識を、界面活性剤がアルカンと混合形成できるということを示しています。

吸着膜を作るという発想で克服した点に大きな意義があり

そこで最後に、ここで見てきた陽イオン界面活性剤の凝ます。また、凝縮膜形成が O/W エマルションを不安定化

縮膜形成は現実的にコロイド分散系、ここでは水中油滴型

する大きな要因にもなりえるという事実は、O/W エマル

図５ C14 − C16 混合系のエリプティシティーのアルカン組成依存性。

図６ 乳化相の体積（高さ）の時間変化。油相には C14 を用いた。仕込みの水溶液相と油相の体積は共に５ml、CTAB 濃
度は３mmol kg− 1。撹拌前の液体全体の高さは約 45 mm。

− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図７ 温度と油相の組成を変数として調整から 24 時間後の乳化相の体積を記録したもの。CTAB 濃度は３mmol kg−1。図中の矢印は CTAB 吸着膜の相転移温度。

ションの安定性を考える上でこれまで気づいていなかった

H: Takiue T: Aratono M: Matsubara H, Thin-Thick

視点として重要かもしれません。特に混合溶媒系で、界面Transition of Foam Film Driven by Phase Transition

活性剤と鎖長のマッチングがよいアルカンが含まれているof Surfactant-Alkane Mixed Adsorbed Film, Chem.

場合には凝縮膜形成を疑ってみる価値はあるのではないか

Lett., 2012 , 41 , 1300 .

と思います。現在は、①界面活性剤の種類を変える、②界

４）Lei Q: Bain CD, Surfactant-induced surface freezing

面活性剤が２成分混合した系で凝縮膜形成が起こるとき界

at the alkane-water interface, Phys. Rev. Lett., 2004 ,面活性剤自身の優先吸着は凝縮膜形成にどのような影響を92 , 176103 .

及ぼすのかなどの点について研究を進めています。

５）荒殿

誠：界面吸着、日本化学会編：コロイド化学 II．

（参考文献）

６）Drude, P: The Theory of Optics; Dover: New York,

会合コロイドと薄膜、東京化学同人、1995，10 － 47 頁
1959 ; p 292 .

１）Matsubayasi N: Motomura K: Aratono M: Matuura
R, Thermodynamic Study on the Adsorption of７）Casson BD: Bain CD, Determination of the Optical

1 -Octadecanol at Hexane/Water Interface, Bull. Chem.

Properties of Monolayers on Water, Langmuir, 1997 ,Soc. Jpn., 1978 , 51 , 2800 .

13 , 5465 .

２）Ohtomi E: Takiue T: Aratono M.: Matsubara H,８）Motomura K: Iyota H: Ikeda N: Aratono M,

Freezing transition of wetting film of tetradecane

Thermodynamic Study on Adsorption at Interfaces.

on tetradecyltrimethylammonium bromide solutions,

VI. Interface between Cyclohexane-Benzene Mixture

Colloid Polym. Sci., 2010 , 288 , 1333 - 1339 .

and Water, J. Colloid Interface Sci., 1988 , 126 , 26 .

３）Ohtomi E: Ikeda N: Tokiwa Y: Watanabe I: Tanida− 54 −

パウダーエマルションおよびパウダーフォームの安定化要因の解明

甲南大学理工学部機能分子化学科

村 上良

Colloidal particles can be irreversibly adsorbed at fluid interfaces, such as oil-water and air-water interfaces. The particle
adsorption leads to stabilization of dispersed systems of two immiscible fluids and particle-stabilized, that is, Pickering-type
emulsions and foams can be prepared. These materials show some unique properties as a result of adsorption of the particles
at the fluid interface. One of the striking phenomena is that liquid drops can be dispersed in air with the liquid-air surfaces
coated by liquid-repellent particles. When the liquid is water, a water-in-air material, named dry water, is produced byaerating water in the presence of extremely hydrophobic silica particles. The dry water is a free-flowing powder which cancontain significant quantities of water as micron-sized drops. A powdered oil-in-water (o/w) emulsion, that is, oil-in-waterin-air (o/w/a) material is a dispersed system in which the continuous phase of a particle-stabilized o/w emulsion is dispersed
in air by encapsulating the water globules with hydrophobic particles. During their preparation, oil droplets in water globules
are forced to move due to high-shear mixing, leading to creaming of the oil droplets and possible wetting of the oil dropletson the hydrophobic particles which induces destabilization. In order to prepare powdered o/w emulsions efficiently, theextent of creaming of the oil droplets has to be suppressed. We describe how to achieve this by mixing two oils of different
density and prepare powdered o/w emulsions from oil mixtures exhibiting a decreasing density difference with water. As theextent of creaming is reduced, enhanced stabilization of the powdered emulsions occurs. By applying the strategy used tostabilize the powdered o/w emulsions, a powdered aqueous foam, that is, air-in-water-in-air (a/w/a) material can be prepared.

１．緒

純水中に有用物質を溶解させることにより、ドライウォ

言ーターを化粧品や医薬品において使用することが可能であ

ナノ・マイクロサイズの微粒子は、界面活性剤と同様にる 7）。しかし、油溶性の有用物質を溶解させるためには、

油 / 水や空気 / 水界面などの流体界面に吸着し、エマルシ

ドライウォーター中に疎水的な場を構築する必要がある。

ョンや泡などの分散系の安定化剤として働くことが知られ一方、水相を連続相とする o/w エマルションを疎水的な

ている

1−3）

。微粒子で安定化された分散系において重要な因子は、微粒子の流体界面に対する濡れ性である。例えば、微粒子の存在下で空気と撹拌混合を行った場合に、oil-inwater-in-air（o/w/a）型の分散系が形成されることが期待

油と水を乳化する際に、比較的親水的な微粒子を乳化剤として用いた場合、oil-in-water（o/w）エマルションが形成され、比較的疎水的な微粒子を用いた場合は water-in-oil（w/o）エマルションが形成されることが知られている（Fig. 1 上段）1− 4）。一方、微粒子の存在下で水を空気と撹拌混合する際においても、比較的親水的な微粒子が用いられた場合は、air-in-water（a/w）型の分散系（すなわち泡）が、比較的疎水的な微粒子が用いられた場合は、water-inair（w/a）型の分散系が形成されることも示されている（Fig. 1 下段）2−5）。w/a 分散系はドライウォーターに代表され、流動性の高い粉体として振る舞うが（Fig. 2 a）、多量の水を数 μm から数百 μm の水滴として含む分散系である（Fig. 2 b）。さらに、液体が油の場合でも同様の原理が成り立つことが示されている 6）。

Studies on stabilization mechanisms of
powdered emulsions and foams
Ryo Murakami
Department of Chemistry of Functional
Molecu les , Facu lty of S cience a ndEngineering, Konan University

Figure 1 Dispersed systems prepared from fluid mixturesand colloidal particles. For oil–water mixtures (upper),emulsion drops of oil in water or water in oil are stabilizedwith hydrophilic or hydrophobic particles respectively. For
air–water mixtures (lower), air-in-water foams or water-in-air
powders can be likewise stabilized, as demonstrated here.
The particle wettability is described by the contact angle
θthe particle makes with the interface, measured throughwater. Reprinted from Ref. 4 .

− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Figure 2 (a) Digital photograph of dry water. (b) Optical micrograph ofdry water. Reprinted from Ref. 4 .

Figure 3 Preparation of oil-in-water-in-air materials. An oil-in-water emulsion stabilized bypartially hydrophobic particles (blue) can be aerated by mixing with very hydrophobic
particles (red). Oil-in-water-in-air materials consist of oil drops dispersed in water globules
themselves dispersed in air, with very hydrophobic particles adsorbing at the air-water
surfaces. Excess particles that are not adsorbed retain their powdery nature. Reprinted
from Ref. 8 .

される。Fig. 3 に o/w/a 分散系の作製プロトコールを示す。

ダーエマルションと呼んでいる。

o/w/a 分散系の作製における問題点として、撹拌時に生じ

本研究では、o/w/a 分散系の安定化における決定的な因る遠心力により o/w エマルション液滴中の油滴間の合一子が、作製時における油滴の移動の抑制であることを実証

および油滴とエマルション滴の表面（空気 / 水表面）とのするために、未検討の因子である油と水の密度差 Δρ の o/

合一が生じる可能性が挙げられる。したがって、エマルシ

w/a 分散系の安定化に及ぼす効果について検討を行う。Δρョン液滴中の油滴の移動を抑制することが、o/w/a 分散系を調節するために、相溶性があるが密度の異なる２種類のの安定化における決定的因子であることが予想される。遠油を混合し、エマルションおよびo/w/a 分散系を作製する。さ心力場（g）での水相中での油滴の移動速度（v）は、Stokes

らに、air-in-water-in-air（a/w/a）分散系（パウダーフォ

2の式、v = d Δρg/（18η）で見積もることが可能である。こーム）の安定化に対して同様の研究を行うことにより、エ

こで、d、η、Δρ は、それぞれ油滴の直径、水相の粘度、

マルションや泡の粉体化についての基礎原理の一般性を検

油と水の密度差を表す。我々は、g および d の減少、また討することを本研究の目的とする。

η の増加に伴う v の減少により、o/w/a 分散系がより効果

2．実的に安定化されることを示した 8）。o/w/a 分散系は、10 〜
20 μm の油滴を含む疎水性微粒子に覆われた数百μm の水

2 .1滴から成るが、流動性の高い粉体として振る舞うためパウ− 56 −

験

試薬

微粒子として、３種類の疎水性の異なる WACKER 社のパウダーエマルションおよびパウダーフォームの安定化要因の解明

ヒュームドシリカ（HDK N 20 シリカおよび HDK H 18 シリカ（Wacker 社より購入）、37 % SiOH シリカ（Wacker 社
試 供 品 ））を 使 用 し た。HDK N 20 の 一 次 粒 子 直 径 は 約
20 nm であるが、一次粒子が凝集し、融着した数百 nm の凝集物がこの微粒子としての最小単位である。比表面積は約 200 m 2 g−1 である。HDK N 20 は、微粒子表面の SiOH 基に由来して水に容易に分散することから、非常に親水的なシリカ粒子である。HDK N 20 をアルキルシランで疎水処理を行ったヒュームドシリカが、HDK H 18 である。疎水化されていない製造されたままのシリカ粒子の単位表面積当たりの表面 SiOH 基の数を基準として、疎水化されたシリカ粒子に残存している単位表面積当たりの表面 SiOH 基の数の比は、% SiOH として表される。HDK N 20 は 100 %SiOH を示すヒュームシリカ粒子であり、HDK H 18 は約25 % SiOH を示すヒュームシリカ粒子である。HDK H 18
シリカは、o/w エマルション滴をカプセル化するために用Figure 4 Density difference between water and oil mixtures（Δρ）as a function of volume percent of silicone oil in mixtureswith dodecane measured at 25℃. Reprinted from Ref. 10 .

いられた。HDK N 20 は、a/w/a 分散系を作製する際に、前駆体の泡に加えられ、水相の粘度を増加させるために用いられた。37 % SiOH シリカは、アルキルシランで HDK

2.2.2

a/w/a 分散系の作製

N 20 の表面の疎水化処理が行われた適度に疎水的なヒュー撹拌装置（ワーリング J-SPEC ブレンダー 7010 BUJ タイ

ムドシリカ粒子であり、油と水を乳化し、o/w エマルショ

マー , 大阪ケミカル社）の容積に対しての水の体積分率がンの安定化を行う際に用いられた。

60%になるように水を加え、疎水的なヒュームドシリカ（HDK

密度が異なるが相溶性のある油として、n-ドデカン、

H18）を0.408g加えた。その後、撹拌速度 22500 rpm で３100 cst のシリコーンオイルを用いた。n -ドデカンは、塩基分間連続で撹拌混合を行うと、catastrophic 転相に基づき性アルミナが充填されたカラムに二回通されることにより泡が形成された。泡を 300 mL のプラスチック製ボトルに精製された。シリコーンオイルは精製せずそのまま用いた。

入れた後、親水的なヒュームドシリカ（HDK N 20）を水と

Fig. 4 に振動管式密度計により測定された n -ドデカンとシ粒子の総量に対して 0 ～８wt% となるように加え、水相のリコーンオイルの混合油の密度と純水の密度の差（Δρ）を、粘度を調節した。泡を親水的な粒子の量を考慮した上でシリコーンオイルの体積分率の関数として示す。シリコーン

25 mL 測り取り、撹拌装置（Labo Milser LM-PLUS, 大阪−3

オイルの体 積 分 率 の 増 加に伴い、Δρの値は、0 . 248 g cm

ケミカル社）のガラス容器に入れ、疎水的なヒュームドシ

（純粋な n -ドデカン）から 0 . 033 g cm−3（純粋なシリコーン

リカ（HDK H 18）を 3 . 0 g 加えた後、撹拌速度 6000 rpm でオイル）に減少する。

撹拌・曝気を 15 秒間行った。
2.2.3

2.2

実験方法

2.2.1

o/w/a 分散系および a/w/a 分散系のキャラクタリ

ゼーション

o/w/a 分散系の作製

撹拌・曝気により調製された試料をスライドガラスに載16 mL のガラスバイアル瓶に、粒子濃度が１wt% である

せ、油（n -ドデカン）を加え、光学顕微鏡（BX 51 , オリン

37 % SiOH シリカ粒子水分散液を５mL 加えた。さらに、パス社）より観察した。o/w/a 分散系および a/w/a 分散系

様々な混合比のドデカンとシリコーンオイルの混合油を５に油を加えた場合、連続相が空気から油に置き換えられる

mL を加え、全体積を 10 mL とした。この混合物を、ホモことが予想される。したがって、油の添加により、o/w/a

ジナイザー（ULTRA-TRRAX T 25 digital, IKA 社）を用い分散系が形成される場合は、oil-in-water-in-oil（o/w/o）型て 24000 rpm で２分間の撹拌を行うことにより o/w エマルのマルチプルエマルションが形成され、a/w/a 分散系が形ションを調製した。10 mL の o/w エマルションに純水を成される場合は、air-in-water-in-oil（a/w/o）型のマルチ

15 mL 加え、全量を 25 mL にした。この希釈された o/w エプルエマルションが形成されることが期待される。この手

マルションを撹拌装置（Labo Milser LM-PLUS, 大阪ケミ法により、もとの分散系の構造を推定した。また、光学顕カル社）のガラス容器に入れた。さらに疎水的なヒューム

微鏡による観察に基づき、平均油滴直径や平均水滴直径な

ドシリカ（HDK H 18）を 3 . 0 g 加えた後、6000 rpm の撹拌

らびに変動係数（C.V. / %）を求めた。o/w/a 分散系に対速度で撹拌・曝気を 15 秒間行った。

しては、粉体の流動性の尺度となる安息角を測定した。

− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Fig. 7 に示される光学顕微鏡写真は、Δρ の減少に伴い、

３．結果および考察
3 .1

o/w/a 分散系内の水滴中の油滴の数が増加する傾向を示し

密度差調節によるo/w/a 分散系の安定化ている。この光学顕微鏡写真から油滴径および変動係数を

光学顕微鏡写真から求められた o/w エマルションの油測定した（Fig. 8 ）。Δρ の減少に伴い、o/w/a 分散系の油滴径とその変動係数の値を Fig. 5 に示す。Δρ を調節し、滴径がもとの o/w エマルションの油滴径に近づくことか

エマルションを作製した場合、形成される o/w エマルシ

ら、Δρ の減少に伴い o/w/a 分散系がより効果的に安定化

ョンの油滴径に差が生じないことが確認された。o/w エマ

されることが示唆される。

ルションの油滴径が Δρ に依存しないことは、シリコーン

o/w/a 分散系を漏斗から落下させ、安息角を測定した。

オイルとドデカンの表面張力が同程度であるために、乳化安息角を測定する際に用いた写真を Fig. 9 a および b に示剤である 37 % SiOH シリカ粒子が油 / 水界面で成す接触角

す。これらの写真から測定された安息角は、Δρ の減少にが、両方の油について同程度であるために生じることが予伴い減少した（Fig. 9 c）。Δρ の減少に伴い、油滴の移動速想される。実際、油相の中に置かれた疎水化されたガラス度が減少し、o/w/a 分散系中の疎水的な粒子と油滴の接触上に静置された水滴が成す接触角は、油がドデカンおよびが抑制されることが示唆される。

9）

シリコーンオイルの場合、ほぼ等しいことが示されている 。

以上の油滴径と安息角の測定結果から、Δρ の減少に伴o/w エマルションのクリーミングの程度を目視観察によい、油滴の移動速度が減少し、o/w/a 分散系内の油滴間おり求めた。完全にクリーミングしたときの水層の溶出量をよび油滴と水滴表面の合一が抑制されることが示唆された。

基準とし、その基準値に比べ 50 % および 80 % の水層の溶したがって、本研究と先行研究 8）により、撹拌速度および出が起こるために要する時間を算出した（Fig. 6）。Δρ の

油滴の直径の減少、水相の粘度の増加、油と水の密度差の減少に伴い、同程度のクリーミングが生じるための時間は減少に伴うエマルション液滴中の油滴（分散相）の移動の増加する。Stokes の式から予想されるように、Δρ の減少抑制が、o/w/a 分散系の安定化における決定的因子であるに伴い o/w エマルション中の油滴の移動速度が減少する

ことが明らかにされた。

ことが、この現象の原因と考えられる。
的な粒子の存在下で撹拌・曝気を行った。すべての Δρ の

3 . 2 泡の粉体化（a/w/a 分散系）と基礎原理の一般性についての検討値に対して、ドライウォーターと同様な粉体状の物質が形

泡は o/w エマルションと同様に水相が連続相であるの成された。この粉末状の物質を油（n -ドデカン）に分散さで、疎水性微粒子の存在下で泡を空気と撹拌混合を行う場

せると、数百 μm 程度の水滴中に数十μm 程度の油滴が観合、a/w/a 分散系が得られることが期待される。しかし、察されたことから、これらの粉末状物質は o/w/a 分散系

空気と水の密度差は非常に大きい（Δρ= 0 . 997 g cm−3）。

（パウダーエマルション）であると示唆された（Fig. 7 ）。

そのため、撹拌時の遠心力場で気泡は油滴と比べて高速で

Figure 5 Dependence of average diameter (filled points)
and average C.V. (open points) for oil droplets in o/w
emulsions on Δρ. Reprinted from Ref. 10 .

Figure 6 Time required for 50 % (diamonds) and 80 %(triangles) of creaming relative to maximum creaming foro/w emulsions versus Δρ. Reprinted from Ref. 10 .

混合油を用いて作製された o/w エマルションを、疎水− 58 −

パウダーエマルションおよびパウダーフォームの安定化要因の解明

Figure 7 Optical micrographs of powdered o/w emulsions prepared using oil mixtures ofdifferent density. (a) Powdered o/w emulsion as is with Δρ= 0.033g cm-3 . (b) − (f) Powderedo/w emulsions dispersed in dodecane for Δρ= (b) 0 . 248 , (c) 0 . 194 , (d) 0 . 143 , (e) 0 . 089
and (f) 0 . 033 g cm- 3 . Scale bar refers to 500 μm on each. Reprinted from Ref. 10 .

Figure 8 Dependence of average diameter (filled points) and average C.V.
(open points) for oil droplets in water globules in powdered o/w emulsions on
Δρ. The dotted line represents the average oil droplet diameter in precursor
o/w emulsions. Reprinted from Ref. 10 .

− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Figure 9 Digital photographs of powdered o/w emulsions prepared using o/w emulsions withΔρ= (a) 0.248
and (b) 0 . 033 g cm−3 , which were piled on a cylindrical base showing different angles of repose.
Diameter of cylindrical base is 45 mm. (c) Angle of repose of powdered emulsions as a function of Δρ．
The dotted line shows the angle of repose for dry water (no oil). Reprinted from Ref. 10 .

Figure 10 Optical micrographs of a/w/a materials prepared using aqueous foams with different waterphase viscosity: W 100 % SiOH / wt % = (a) 0 , (b) 8 . 0 . Scale bar refers to 500μm on each.

移動し、気泡間での合一ならびに疎水性微粒子で覆われたシリカ粒子（HDK H 18）とともに撹拌・曝気したところ、

水滴（泡）表面と合一を起こし、気泡が消失することが予

ドライウォーターと同様な粉体状の物質が形成された。こ想される。本研究では、泡を作製後、空気 / 水表面に対しの粉末状の物質を油（ドデカン）に分散させると数百μmて非吸着性の非常に親水的なシリカ粒子（HDK N 20 シリ程度の水滴中に数十μm 程度の気泡と思われる物体が観察カ）を添加することにより水相の粘度を増加させ、撹拌中されたことから、これらの粉末状物質は a/w/a 分散系（パの気泡の移動速度の抑制することにより a/w/a 分散系のウダーフォーム）であることが示唆された（Fig. 10）。また、安定化を試みた。

水相の粘度の増加（水相に添加する HDK N 20 シリカの濃泡に親水的なシリカ粒子（HDK N 20）を加え、疎水的な度 W 100 % SiOH の増加）に伴い、a/w/a 分散系内の水滴中の気− 60 −

パウダーエマルションおよびパウダーフォームの安定化要因の解明

泡の量は増加した。したがって、a/w/a 分散系においても

５）Binks, B. P., Duncumb, B., Murakami, R.: Effects of

水滴中の分散相（気泡）の移動速度の抑制が、安定化の決

pH and salt concentration on materials derived from

定的因子であることが示唆され、基礎原理の一般性が示さ

air-water-silica particles, Langmuir 23 , 9143 - 9146 ,れた。

2007 .
６）Murakami, R., Bismarck, A.: Particle-stabilized謝辞materials: dry oils and (polymerized) non-aqueous
foams. Advanced Functional Materials 20 , 732 - 737 ,公益財団法人コスメトロジー研究振興財団のご援助によ2010 .

り、本研究の一部の内容が、アメリカ化学会の学会誌に掲載されました（引用文献 10）。ご援助いただきましたこと

７）五十嵐啓二 , 相良圭祐 , 江川淳一郎 : W/P 構造を有す
るパウダー製剤の開発とその有用性 , 粧技誌 , 42 , 313 -を心より感謝いたします。

318 , 2008 .
（引用文献）

８）Murakami, R., Moriyama, H., Yamamoto, M. Binks,

１）B. P. Binks, T. S. Horozov, in Colloidal Particles

B. P., Rocher, A.: Particlestabilization of oil-in-water-in-

at Liquid Interfaces, Eds: B. P. Binks, T. S. Horozov,

air materials: powdered emulsions, Advanced Materials,

Cambridge University Press, Cambridge, U.K. 2006 ,24 , 767 - 771 , 2012 .

Ch. 1 .

９）Binks, B. P., Lumsdon, S. O.,: Effects of oil type and２）村上 良 : 微粒子による空気 - 液体分散系の安定化 , オ

aqueous phase composition on oil–water mixtures

レオサイエンス 10 , 9 - 14（2010）．

containing particles of intermediate hydrophobicity,
Phys. Chem. Chem. Phys., 2 , 2959 - 2967 , 2000 .

３）村上 良 : ドライリキッド/リキッドマーブルの形成挙動 ,微粒子安定化エマルションおよびフォーム（野々村美宗

10）Murakami, R., Moriyama, H., Noguchi, T.,Yamamoto,
M. Binks, B. P.: Effects of the density difference

監修），情報機構（2012）．
４）Binks, B. P., Murakami, R.:“Phase inversion ofparticle-stabilized materials from foams to dry water,
Nature Materials 11 , 865 - 869 , 2006 .

− 61 −

between water and oil on stabilization of powdered oilin-water emulsions, Langmuir, 30 , 496 - 500 , 2014

環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製

筑波大学大学院数理物質科学研究科

吉 冨徹

In this study, a redox nanoparticle (RNP), which is consist of polymeric micelle containing nitroxide radicals, wasdeveloped as nano-sized ROS scavenger for treatment of ultraviolet (UV)-induced skin damage. When RNP was applied
to the skin by iontophoresis, UV-induced damage and melanin production in the skin were prevented. In addition, a redox
injectable hydrogel (RIG) with prolonged drug retention time in the skin was developed for enhancing the ROS scavenging
efficacy, using a redox polyion complex flower micelle containing nitroxide radicals. Both RNP and RIG are anticipated ashigh performance ROS scavengers for treatment of UV-induced skin damage.

１．緒化ストレス疾患に対する RNP の治療・保護効果を明らか言にしてきた 1 − 9）。そこで、これらの成果をベースに RNP

紫外線によって多量に発生する活性酸素種（ROS）は、によるスキンケアの効果に着目した。興味深いことに、肌皮膚を絶えず攻撃している。この過剰な ROS 産生によっの角質層の pH は、酸性（pH 4 . 5 − 7 . 0）であることが知らて、メラニン生成、皮膚癌や炎症などが引き起こされる。

れているため、この RNP を角質層に導入することができ

この皮膚近傍に産生される ROS の消去は、まさにコスメ

れば、ナノ粒子が崩壊し、抗酸化能が向上することが期待

トロジーの大きな課題の一つである。そこで、効果の高いできる。本研究では、荷電性ナノ粒子の経皮投与法として抗酸化ストレス作用を示すためには、材料を創り込み、最注目を集めているイオントフォレシスを用いて RNP を皮

適な素材を提供していくことが非常に重要となる。これま下に導入し、紫外線により惹起されるメラニン生成に対すで各種ビタミンやコエンザイム Q 10 などの抗酸化剤を含る RNP の保護効果を検証した。

んだ薬粧品が市販されている。しかしながら、ROS と反さらに、我々は、次世代のスキンケア素材として、レド応した後、抗酸化能が弱まってしまい、効力が長続きしなックスインジェクタブルゲルを考案した。ナノ粒子の皮下いという問題があった。また近年、触媒的に ROS を消去

投与は、低分子化合物に比べ長い滞留性を示す。しかしなする白金ナノ粒子・フラーレンなどの抗酸化ナノ粒子が注がら、粒子径が約 40 nm であるため、最終的にはリンパ系

目を集めている。しかしながら、これらの粒子も特有の着へと移行してしまう。治療などを考えた場合には、一度の色や汗による皮膚からの脱離などの問題を有している。そ

処置で、治療効果が数週間持続することが好ましい。そこ

こで、我々は、高機能性スキンケア薬粧品を開発するためで本研究では、皮下で長期に滞留し、機能する ROS 消去に、触媒的に ROS を消去するニトロキシルラジカル（2,2,6,6剤を開発するため、ニトロキシドラジカル含有ポリイオン‐テトラメチルピペリジン‐1‐オキシル：TEMPO）が結

コンプレックス（PIC）フラワーミセルを作製し、生体内合したレドックスポリマーを新規に合成した（図１）。こ

環境に応答してゲル化するレドックスインジェクタブルゲのレドックスポリマーは、生体適合性を有するポリエチレル（RIG）を開発した（図２）。

ングリコール（PEG）と TEMPO が結合した疎水性セグメ

２．実ントから成る両親媒性ポリマー（PEG-b-PMNT）であり、水中で自己組織化し、レドックスナノ粒子（RNP）を形成

2 .1

験

紫外線誘発性メラニン生成に対するRNP の効果する。この RNP は、疎水性コアにアミノ基が導入されて本実験では、メラニン生成を惹起するため、メラニン保

い る た め、 癌 や 炎 症 組 織 の よ う な 低 pH 環 境 で 崩 壊 し、

有ヘアレスマウス（HOS: HRM2, ♂ , ４週齢）に UV 照射（１

ROS を効果的に消去することができる。これまでに、我々−５日目に2 60 mJ/cm2, 5−10 日目に 450 mJ/cm 2）を行った。

は、脳および腎臓虚血再灌流障害や脳出血などの様々な酸照射後、皮膚切片を作成してマッソン・フォンタナ染色（核：
赤色、メラニン保有細胞：黒色）を行い、メラニンの生成

Development of skin care medicine
using environmental-sensitive redox
nanoparticles
Toru Yoshitomi
Depa rtment of Mater ia ls S ciences ,Graduate School of Pure and Applied
Sciences, University of Tsukubaを観察した。また、回収した皮膚を 2 M の水酸化ナトリウ
ムを用いて細胞融解し、450 nm におけるメラニン由来の吸収を測定することによりメラニンを定量した。1，4，7
日目に、イオントフォレシスによって RNP を経皮投与し、メラニン生成に対する RNP の効果を観察した。

− 62 −

環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製

図1

図２

2.2

pH 低下に伴い崩壊するレドックスナノ粒子（RNP）

皮下投与後ゲル化するレドックスインジェクタブルゲル（RIG）

新規 RIG の開発と皮下炎症に対する効果の検証

60 mg/ml（イオン強度 150 mM）に調整し、37℃の水浴中

まずはじめに、両末端にメルカプト基を有するポリエチ

で加熱を行い、ゲル化時間を試験管反転法により測定した。

レングリコールをテローゲンとして用いたクロロメチルス

皮下におけるゲルの滞留性は電子スピン共鳴法（ESR）を

チレンのラジカルテロメリゼーションにより、両末端に反用いて測定した。また、皮下炎症モデルとしてカラギーナ

応性ポリクロロメチルスチレン（PCMS）を有するトリブ

ン誘発性炎症をマウスの足底に作製し、RIG の抗炎症効果

ロックポリマーの合成を行った（PCMS-PEG-PCMS）。次を痛覚過敏試験、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性及に、4 - アミノ -TEMPO を用いてクロロメチル基のアミノび炎症性サイトカイン量を測定した。

化反応を行い、疎水性 PCMS セグメントに２級アミンを

３．結果及び考察

介して TEMPO を導入した（PMNT-PEG-PMNT）。得られた PMNT-PEG-PMNT をプロトン化し、アニオン性ポリア

3 .1

紫外線誘発性メラニン生成に対するRNP の効果

クリル酸（PAA）水溶液と混合することによりフラワーミ

はじめに、UV 照射によるメラニン生成を確認した。図

セ ル を 得 た。 得 ら れ た フ ラ ワ ー ミ セ ル 溶 液 の 濃 度 を

3 a に示すように、UV 照射によって基底層を中心とした表− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

皮の肥厚化が確認された。またメラニン量は UV 照射によが活性化されて、急速に重合が進行する。本研究で得られり増加し、メラニン生成関連遺伝子であるチロシナーゼはた結果は、イオントフォレシスによって経皮投与された約 4 倍に増加した（図 3 b および c）。これらの結果により、

RNP が、この皮膚内で ROS を効率的に消去したことによ

本実験で用いた UV 照射条件によって、マウス皮下にメラり、メラニン生成を抑制したものと考えられる。

ニンが生成することが確認された。ここで、RNP を角質層に導入するため、イオントフォレシスを用いた。イオン

3.2

新規 RIG の開発と皮下炎症に対する効果の検証

トフォレシスは、電気の力で荷電性ナノ粒子を皮内に導入

新規 PMNT-PEG-PMNT トリブロックコポリマーの合成することができるため、疎水性コアにアミノ基が導入されは、ゲル濾過クロマトグラフィーと 1 H NMR の結果によており正電荷を帯びている RNP を角質層へ導入することり確認された。表１に示すように、モル比１: １で調製しができる。そこで、RNP をイオントフォレシスにより投た粒子の粒子径およびゼータ電位は、それぞれ 79 nm およ

与し、RNP の効果を観察したところ、コントロールとしび −0 . 119 mV で あ っ た。 こ れ は、 カ チ オ ン 性 PMNT-て用いた正電荷リポソームに比べ、RNP を投与した皮膚PEG - PMNT とアニオン性 PAA との間に静電相互作用がではメラニンの沈着が抑制される傾向が観察された（図働き、ポリイオンコンプレックスコアを有する PIC フラワ

4 a）。また、メラニンの生成量を定量したところ、同様に、

ーミセルが形成されたことを示す。このミセルは PEG のRNP がメラニンの生成を抑制していることが明らかとな高い運動性によりミセル同士の凝集を防ぐため、沈殿が生った（図 4 b）。

じない。よって、高濃度でも体内に注射可能である。得ら

皮膚に強い紫外線に当ると、ROS が発生し、表皮細胞れたフラワーミセルをモル比１: １、濃度 60 mg/mL、pH６、がインターロイキンなどのメラニン生成・放出の情報伝達

イオン強度 150 mM の条件下で 37℃に加温したところ、ミ物質を生成することが知られている。この情報伝達物質がセルが２分間以内に不可逆的にゲル化することが明らかとメラノサイトというメラニンを発生させる場所に届くと、なった（図５）。この結果は、温度の上昇によりミセルが必須アミノ酸の一つであるチロシンが酸化され、チロシン

エントロピー的に不安定となり崩壊し、ゲルを形成したとがドーパーに変化し、次いで、ドーパーがキノン、キノン

考えられる。そこで、このミセル溶液をマウス皮下に注射がインドールへと反応し、このインドールが重合してシミ、したところ、同様にゲル化することが確認された。RIG は、

ソバカスのメラニン色素へと変化する。この反応はすべて

ESR で検出可能な安定ニトロキシドラジカルを有してい

酸化反応であり、ROS が存在すると、酵素チロシナーゼる。よって、体内の RIG 濃度を ESR を用いて調べること

図３ UV 照射によるメラニン生成(a) マッソン・フォンタナ染色（核：赤色、メラニン保有細胞：黒色）矢印はメラニン保有細胞を示す。
(b) メラニン生成量(c) チロシナーゼ量

図４ イオントフォレシスによる RNP の経皮投与後のメラニン
生成(a) マッソン・フォンタナ染色（核：赤色、メラニン保有細胞：黒色）矢印はメラニン保有細胞を示す。
(b) メラニン生成量− 64 −

環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製ができる。低分子化合物（4 - アミノ- TEMPO）または RNP

れらの結果は、RIG 自身が炎症惹起を引き起こすことなく、

では、それぞれ 1 時間と 12 時間以内に投与部位から消失し安全であることを示している。さらに、RIG は、カラギー

たのに対し、RIG は 72 時間後にも 40 % 残存していること

ナン投与により誘発される炎症も、有意に抑制することがが明らかとなった（図６、上図）。また、ニトロキシドラジカルは、確認された。また、RIG は、炎症性サイトカインである

ESR イメージングや MRI を用いて画像化することができ

TNF- a と IL- 1 b の発生も有意に抑制し、カラギーナン誘るため、図６（下図）に示すように RIG の経時変化を非侵

発性痛覚過敏を効果的に予防した。この結果は、RIG 中の襲的に観察することもできる。この結果は、本研究で開発

ニトロキシドラジカルが好中球やマクロファージの産生す

した RIG の高い滞留性を示す。そこで、カラギーナン誘発

る ROS を効果的に消去していることを示している。

性炎症モデルマウスを用いて RIG の抗炎症効果を評価した。

４．総

まず、ニトロキシドラジカルを含有しないフラワーミセル
溶液を皮下投与し ROS 消去能がないゲル（ノンレドックス括

本研究では、高機能性スキンケア薬粧品の開発を目指し、

インジェクタブルゲル：nRIG）を形成させたところ、好紫外線誘発性メラニン生成に対する RNP の効果の検証を

中球の浸潤の指標である MPO の活性化が確認された。一行った。RNP をイオントフォレシスによって経皮投与す

方で、RIG は、その活性化を有意に抑制した（図７）。こることにより、紫外線照射によって生じるメラニン生成を

表１ ニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックス（PIC）フラワーミセルの粒子径と表面電荷（モル比 r ＝ PAAのカルボキシル基のモル量：PMNT-PEG-PMNT のアミノ基のモル量）
Molar ratio
r

kcps

Pdl

Size
/nm

Zeta potential
/mV

4：1

207

0 . 2548− 3 . 73

２：1

274

0 . 2555− 2 . 24

１：１

685

0 . 2379− 0 . 119

１：２

724

0 . 2589+ 1 . 43

図５ ニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックス（PIC）フラワーミセルのゲル化時間 ( 60 mg/ml, イオン強度
150 mM, r= 1 : 2 , 1 : 1 , 2 : 1 , 4 : 1 )

図６ （上図）皮下投与後のニトロキシドラジカル残存量（下図）
皮下投与後の非侵襲的 ESR イメージング画像。低分子量の
4 - アミノ -TEMPO, RNP と RIG 残存量を ESR イメージング装置を用いて評価した。

図７ 皮下投与した後の RIG の炎症抑制能試験。MPO の活性を測定した。Carr は、カラギーナン投与を示す。

− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

抑制することが明らかとなった。さらに、長期皮下滞留性

Toh K, Tsurushima H, Hirayama A, Matsumura A,:を有する RIG の開発に成功した。低分子化合物やナノ粒子

Newly Synthesized Radical-Containing Nanoparticlesに比べ、RIG は高い局所滞留性を有し、炎症モデルに対し(RNP) Enhance Neuroprotection After Cerebralて高い効果を示すことが明らかとなった。これは次世代のIschemia-Reperfusion Injury, Neurosurgery, 68 , 1418 –
1425 , 2011 .

皮下の ROS を長期間消去するスキンケア薬粧品として期待

５）Yoshitomi T, Hirayama A, Nagasaki Y,: The ROSされる。

scavenging and renal protective effects of pH謝辞responsive nitroxide radical-containing nanoparticles,

本研究は、筑波大学数理物質科学研究科

Biomaterials, 32 , 8021 – 8028 , 2011 .

長崎幸夫教授の御指導のもと、研究を行った成果である。イオントフォ

６）Vong LB, Tomita T, Yoshitomi T, Matsui H,

レシスによる RNP の経皮投与およびメラニン生成の実験

Nagasaki Y,: An Orally Administered Redoxに関しては、京都薬科大学

小暮健太朗教授、塩田佳菜子

Nanoparticle that Accumlates in the Colonic Mucosa

氏らとともに行った結果であり、また RIG の実験に関してand Reduces Colitis in Mice, Gastroenterology, 143 ,は、筑波大学数理物質科学研究科

1027 - 1036 , 2012 .

博士前期課程２年プアミンリー氏とともに行った結果である。ここに深く感謝致

７）Chonpathompikunlert P,

Fan CH, Ozaki Y,

Yoshitomi T, Yeh CK, Nagasaki Y,: Redox Nanoparticle

します。

Treatment Protects Against Neurological Deficit（参考文献）in F o c us e d U lt r a s o und-I nduc e d I nt r a c e r ebral
Hemorrhage, Nanomedicine, 7 , 1029 – 1043 , 2012 .

１）Yoshitomi T, Miyamoto D, Nagasaki Y,: Design ofCore-shell-type Nanoparticles Carrying Stable Radicals

８）Chonpathompikunlert P, Yoshitomi T, Han J, Tohin the Core, Biomacromolecules, 10 , 596 – 601 , 2009 .

K, Isoda H, Nagasaki Y,: Chemical nanotherapy:２）Yoshitomi T, Nagasaki Y,: Nitroxyl radical-containing

Nitroxyl radical-containing nanoparticle (RNP) protects

nanoparticles for novel nanomedicine against oxidative

neuroblastoma SH-SY 5 Y cells from aβ- induced

stress injury, Nanomedicine, 6 , 3 , 509 – 518 , 2011 .

oxidative stress, Ther. Deliv, 2 , 585 – 597 , 2011 .

３）Yoshitomi T, Suzuki R, Mamiya T, Matsui H,９）Chonpathompikunlert P, Yoshitomi T, Han J,

Hirayama A, Nagasaki Y,: pH-Sensitive Radical-

Isoda H, Nagasaki Y,: The use of nitroxide radical-

Containing-Nanoparticle (RNP) for the L-Band-EPR

containing nanoparticles coupled with piperine to

Imaging of Low pH Circumstances, Bioconjugate

protect neuroblastoma SH-SY 5 Y cells from aβ- induced

Chemistry, 20 , 1792 – 1798 , 2009 .

oxidative stress, Biomaterials, 32 , 8605 – 8612 , 2011 .

４）Marushima A, Suzuki K, Nagasaki Y, Yoshitomi T,− 66 −

セマフォリン3 Aトランスジェニックマウスにおける毛組織や皮膚の免疫環境でのセマフォリン3 Aの役割の解明と皮膚炎症に対する新規治療軸の開発
浜松医科大学皮膚科学講座

伊 藤

泰 介

Semaphorin 3A (Sema3A) is originally found the nerve guidance molecule. Sema3A can induce growth cone collapse
and axon repulsion through interaction with a neuropilin-1/plexin-A receptor complex. In AD patients, Sema3A expression
is decreased in epidermis that allows higher skin innervation. In addition to the role of nerve guidance, recent studies indicate
sema3A as the immunomodulator in several immune reactions.
In this study, we found the novel role of sema3A in trichoimmunology via mast cell stimulation. We established B6Tg(pK14-Sema3a)/UOEH mouse that express excess Sema3A in epidermis under K14 promotor. Interestingly, this mouseshow hair loss lesion mainly on back skin. Histological analysis revealed a large number of mast cells in dermis and aroundhair follicles of hair loss lesions compared to healthy control and non hair loss lesion. Non hair loss lesion also shows
significant infiltration of mast cells in dermis and around hair follicles compared to healthy control. On the other hand,
MCP-1+ basophils are rarely found in dermis and around hair follicles. Next, we generate murine bone-marrow (BM)derived mast cells. The presence of Neuropilin-1/Plexin A1 expression was analyzed on FACScan. Furthermore, histamine
releasing was studied in BM derived mast cells cultured with sema3A or PBS by ELISA. Sema3A was injected into the backskin after the induction of depilation induced murine hair cycle in order to know the affect of sema3A on murine hair cycle.
In wild type C57BL/6 mice, sema3A is strongly expressed on Day8 in the depilation murine hair cycle that indicates thecatagen induction by sema3A. In conclusion, sema3A may induce increasing and activation of mast cells with releasing ofhistamine that result in alopecic lesions in B6-Tg(pK14-Sema3a)/UOEH mouse. This study shows unique face of sema3A intrichoimmunology and skin immune systems, especially to mast cell.

１．緒てシグナルを伝達する。しかしセマフォリンと受容体の結言合は複雑であり、様々な結合が考えられている。plexin

セマフォリンはもともと中枢神経の発達に関わる神経のが細胞や組織によって様々に結合し、受容体と受容体複合

アクソンのガイドをする因子として報告されてきた 1）。そ体を形成することで心臓の発生過程における心臓形成、弁れだけでなく、細胞走化性、細胞増殖やアポトーシス、心形成に関与している 2）。また骨代謝において破骨細胞の分臓や腎組織、眼組織の形態形成に関与することが報告され化に関与する 3）。

ている。セマフォリン分子群は、膜型と分泌型があり、各

アトピー性皮膚炎では、Sema 3 A の発現量が、健常人群で共通の構造である細胞外領域の Sema ドメインがあり、と比較して表皮内において低下しており、その結果、表皮それに続く C 末端領域の構造上の特徴によって８つのサブ内に末梢神経が延長しているため、神経密度が健常人と比クラスに分類されている。Ⅰ、Ⅱ型セマフォリンは無脊椎較して有意に高いとされる 4）。そのため、かゆみ過敏や掻動物に、Ⅷ型はウイルスにコードされ、ほ乳類はⅢからⅦ

爬によるサブスタンス P などの神経伝達物質の分泌がされ型のセマフォリンが同定されている。分泌型はⅡ型、Ⅲ型、やすい。よって Sema 3 A はアトピー性皮膚炎の新たな治Ⅷ型セマフォリンであり、それ以外は１回膜貫通型蛋白で療薬の候補として考えられている。

ある。

しかしながら、Sema 3 A の皮膚における詳細な働きはセ マ フ ォ リ ン の 主 な 受 容 体 は、plexin フ ァ ミ リ ー と未だ不明な点が多い。よって我々は、Sema 3 A を過剰発

Neuropilin（Nrp）ファミリーが知られている。plexin フ

現している B 6 -Tg（pK 14 -Sema 3 a）/UOEH を用いて皮ァミリーは、plexin-A から D までの４つのサブクラスに分膚の毛髪免疫に対する Sema 3 A の影響を検討することとかれ、細胞外にセマドメインを有している。セマフォリンした。

の多くは Sema ドメインを介して plexin と結合するが、Ⅲ

２．実型セマフォリンの多くは Nrp/plexin 受容体複合体を介しAnalysis of the role of Semaphorin 3 A
in the skin and hair follicle immune
systems of Sema 3 A transgenic mouseand exploration of novel treatments with
Semaphorin 3 A
Taisuke Ito
Department of Dermatology, Hamamatsu
University School of Medicine

験

2 .1 マウス：Sema 3 A 過剰発現マウスB 6 -Tg（pK14 Sema 3 a）/UOEH の樹立
K14 promoterとmouse Sema3A cDNAを含むtrancegeneを
C 58 BL/ 6 マウスの FI の受精卵の前核に注射した。

2.2− 68 −

皮膚組織

B 6 -Tg（pK 14 -Sema 3 a）/UOEH の背部皮膚病変より皮セマフォリン 3A トランスジェニックマウスにおける毛組織や皮膚の免疫環境でのセマフォリン 3A の役割の解明と皮膚炎症に対する新規治療軸の開発

膚組織を採取し、HE 染色、免疫染色に供出した。

2.3

３．結

IL- 3、SCF産生量

mRNA レベルでの産生量を Realtime PCR 法にて検討し果

3 .1 B 6 -Tg（pK14 -Sema 3 a）/UOEH に お ける皮 膚
症状た。

背部や後頚部に脱毛斑を観察した（図 1 a）。また同部位における Sema 3 A 発現は減弱していた（図 1 b）。

2.4

フローサイトメトリー

肥満細胞における Neuropilin 1 発現をフローサイトメト

3.2

リーにて検討した。

肥満細胞浸潤の検討

脱毛病変部の組織検討では毛組織は萎縮し、その周囲に肥満細胞浸潤を観察した。ギムザ染色にて脱顆粒や大型の2.5

マウス毛周期誘導肥満細胞を観察した（図２）。

C 57 BL/ ６週齢マウスを外科用アロンアルファにて強制

3.3

抜毛することで毛周期を誘導した。

IL- 3、SCF 発現の検討

Wild type の C 57 BL/ 6 マウスと比較して B 6 -Tg（pK 14 -

2.6

ギムザ染色

Sema 3 a）/UOEH では有意に発現が亢進していた（図３）。

肥満細胞を検討するため、ギムザ染色、MCP- 3 染色を行い、浸潤する肥満細胞数、好塩基球数を検討した。また

3.4

好塩基球の浸潤を MCP- 3 染色にて検討した。

表皮細胞におけるNrp1発現の検討

フローサイトメトリーによって肥満細胞は Nrp 1 発現をみた。よって Sema 3 A のリガンドである Nrp 1 は肥満細胞上に発現していることから、Sema 3 A が肥満細胞に何等かの影響を与えていることが示唆された（図４）。

図１ a. TG マウスの背部に観察される脱毛症状、
b. Sema 3 A 発現

図３

Realtime PCR 法

図２

脱毛病変部への肥満細胞の浸潤

図４ Neuropilin A 1 expression on normal murine keratinocytes and mast cells− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 20143.5

マウス毛周期におけるSema 3 A 発現の検討

４．考健常 C 57 BL/ ６マウスにおける Sema 3 A 発現の組織における検討では、成長期においてその発現が減弱していた。
一方、休止期ではその発現が亢進していた（図５）。

察

我々の実験から、Sema 3 A が過剰発現することによって毛周期が乱れることが示唆された。その原因として肥満細胞の増殖による影響が考えられた。

3 . 6 毛周期における肥満細胞の変化とSema 3 Aの影響

つまり、Sema 3 A が過剰発現することによって、Nrp

強制抜毛による毛周期において、肥満細胞は成長期では１発現をしている肥満細胞に影響を与え増殖することがわ

その浸潤数が減弱するが（図 6 a）
、そこに Sema 3 A を投与

かった。その理由として、直接的な増殖誘導とともに、表するとその減弱が阻止された（図 6 b）。

皮細胞からの Stem cell factor など肥満細胞増殖因子が影響を与えていると考えられた。

3.7

肥満細胞の Sema 3 Aによる増殖誘導

実 際、 強 制 誘 導 し た 毛 周 期 に お い て も 成 長 期 に は

マウス骨髄由来の肥満細胞に対して Sema 3 A を投与す

Sema 3 A 発現が減弱していることからも想定される。また Sema 3 A を投与することによっても肥満細胞の成長期

ると、その増殖数は有意に上昇した（図７）。

図５ Immunohistochemical staining revealed that sema 3 A immunoreactivity was reduced in hairmatrix at D 3 and D 8

図６a

図６b

抜毛による毛周期と肥満細胞数の変化（黄色バー：Sema 3 A 投与群）

− 70 −

図７

Sema 3 A による肥満細胞の増殖効果

セマフォリン 3A トランスジェニックマウスにおける毛組織や皮膚の免疫環境でのセマフォリン 3A の役割の解明と皮膚炎症に対する新規治療軸の開発

neuronal growth cones. Cell 1993 ; 75 : 217 - 227 .

における減数が阻止されることも合わせてそれを示唆して

２）Toyofuku T, Zhang H, Kumanogoh A, et al. Dual

いる。
以上から、皮膚疾患においてはアトピー性皮膚炎のみな

roles of Sema 6 D in cardiac morphogenesis throughらず、脱毛症においても Sema 3 A が深く関与しているこ

region-specific association of its receptor, Plexin-A 1 ,とが大いに示唆された。

with off-track and vascular endothelial growth factor
receptor type 2 . Genes Dev. 2004 ; 18 : 435 - 447 .

ヒトにおいては、アトピー性皮膚炎と円形脱毛症の合併が知られているが、Sema 3 A 発現が表皮において減弱し

３）Takegahara N, Takamatsu H, Toyofuku T, et al.

ているアトピー性皮膚炎との整合性が問われる所であるが、Plexin-A 1 and its interaction with DAP 12 in immune

表 皮 の み に 限 っ て 減 弱 し て い る と す れ ば、 真 皮 で のresponses and bone homeostasis. Nat Cell Biol 2006 ; 8 :Sema 3 A の動態は異なるものと理解される。

615 - 622 .
４）Tominaga M, Ogawa H, Takamori K. Decreased（文

献）production of semaphorin 3 A in the lesional skin of

１）Luo Y, Raible D, Raper JA. Collapsin: a protein
in brain that induces the collapse and paralysis of− 71 −

atopic dermatitis. Br J Dermatol 2008 ; 158 : 842 - 844 .

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物のIn vivo 評価系の構築
北里大学薬学部衛生化学

今 井

浩 孝

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) is an important antioxidant enzyme that could directlyreduce phospholipid hydroperoxide in biomembrane induced by oxidative stress. In this study we found that disruptionof PHGPx by treatment of tamoxifen in skin of tamoxifen- inducible PHGPx KO mice could induce loss of hair follicle
morphogenesis without damage of skin tissue. And co-treatment of vitamin E with tamoxifen could suppress the delay of
hair follicle morphogenesis, indicating that generation of phospholipid hydroperoxide in skin might affect the hair follicle
formation in adult mice.

１．緒

我々は最近、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損

言

マウス（図１）の作製に成功し、時間及び部位特異的にリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダ

PHGPx を欠損させられるマウスを得た。このマウスを用ーゼ（PHGPx）は、酸化ストレスなどによる活性酸素によいて剃毛後、皮膚に直接タモキシフェンを塗布し、皮膚でり酸化された生体膜リン脂質の１次生成物であるリン脂質

PHGPx の遺伝子を破壊した際、どの様なフェノタイプがヒドロペルオキシドをグルタチオン依存的に直接還元でき出るのかを検討したところ、外見上、皮膚細胞に異常はみ

1）る主要な抗酸化酵素である 。申請者はこれまで PHGPx

られなかったが、発毛に異常が見られることを見いだした。

の個体及び細胞レベルでの機能の解析を一貫して行っておこのことは内在性に生じる脂質ヒドロペルオキシドが毛包り、全ノックアウトマウスが初期発生過程で致死となるこ細胞等に作用し、発毛を阻害していると考えられた。そこ

2）と 、精巣特異的及び網膜特異的 PHGPx 欠損マウスが不3 , 4）

で本研究では、この PHGPx 欠損による内在性に生じた脂、肝臓特異的 PHGPx 欠損マウス

質酸化による発毛阻害の詳細を明らかにすることを目的には肝細胞死をひきおこし出生直後死となること、ビタミン研究を行った。また脂質の酸化を抑えるビタミンＥがこの妊及び失明となること

5）Ｅの餌への投与により個体死がレスキューできること な

発毛の阻害に対して効果を有するのかについて、In vivo

どを明らかにしてきた。また MEF 細胞でも PHGPx を欠で検証することにより、In vivo における脂質ヒドロペル損させると約３日後に細胞死が誘導され、その細胞死のメオキシドによる発毛阻害保護作用のある化合物のスクリー

カニズムはこれまで報告のある細胞死とは異なることを見

ニング系の構築を目指した。

6）

出している 。この MEF 細胞死もビタミンＥの添加によ２．実り抑制される 7）。このように様々な細胞において PHGPxを欠損させると内在性にリン脂質ヒドロペルオキシドが蓄

2 .1

験

全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損マウスの交配と産出積し細胞死が誘導される。
皮膚は紫外線などにより最も脂質酸化が起きる組織のひ図１に示す様に、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠

とつであるが、PHGPx の皮膚組織での発現部位やその機損マウス（Cre TG KO マウス；Cre+/− : TG+/− : PHGPx

能 に つ い て は ほ と ん ど 明 ら か に な っ て い な か っ た。

−/−）は、 申 請 者 が 作 成 し た 内 在 性 PHGPx 欠 損 マ ウ ス

PHGPx は活性中心に微量元素セレンを含むセレノシステ（PHGPx−/−）が胚発生致死となるところ 1）、LoxP 遺伝子

インを有するが、ヒトの遺伝病でこのセレノシステインをで 挟 ん だ マ ウ ス PHGPx ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク TG 遺 伝 子

導入できなくなった患者では、PHGPx を含む 25 種類のセ

（PHGPx-F-Lox）によりトランスジェニックレスキュー法によレン蛋白質の発現量が減少し、紫外線に対する感受性が増って作成したコントロールマウス（TG+/+, PHGPx −/−）3 , 7）

大することが報告されている 8）。

と b アクチンプロモーターによって制御された CreER 遺伝 子 が ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク さ れ た マ ウ ス（Cre+/− ,Analysis of mechanism of inhibition of
hair growth by depletion of phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase inmice and rescue effects of vitamin E.
Hirotaka Imai
School of pharmaceutica l Sciences ,Kitasato University

PHGPx +/+）と PHGPx ヘテロマウス（PHGPx+/−）を交配して得られた W- Cre へテロマウス（Cre+/+, PHGPx+/−）を交配することで得られた。この交配で生まれてくる子供のジェノタイプは、CRE TG KO（Cre+/−: TG+/−: PHGPx−/−）、CRE TG ヘ テ ロ（Cre+/−: TG+/− : PHGPx+/−）の２種類である。CRE TG ヘテロマウスは内在性の PHGPx− 72 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築によって毛を刈り取り、次にシェービングクリームとシェーバーを用いて皮膚を傷つけないように剃毛した。完全に剃ったのち、翌日完全に剃毛した皮膚に右２ヶ所左２ヶ所の計４ヶ所ずつ塗布した。塗布の回数の検討としては、３日連続（上）あるいは１日のみ（下）１回軟膏を塗布した。
毎日マウスを麻酔し、写真を撮影した。ビタミンＥの添加の条件としてはビタミンＥ（VE）500 µM（mol/w）＋５
mg タモキシフェン /g 軟膏となるように調整し、タモキシ
フェンと同条件で塗布した。

2.4

HE 染色、抗体組織染色、TUNEL 染色

タモキシフェンを塗布した初日を１日目とし、３日後、
図１ 全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損マウス（CRE/
TG/KO）におけるタモキシフェン添加による PHGPx 欠損のしくみ

４日後と 14 日後にマウスを解剖し皮膚を凍結切片にし、各染色を行った。マウスを頸椎脱臼した後、脱血後、皮膚のみをはぎ取った。はぎ取った皮膚を、PBS に 30 分浸した の ち、PBS で よ く 洗 い 流 し、10 mL チ ュ ー ブ の 中 に
4 %PFA を満たし、その中に切片を入れ 24 時間４℃で保存

ゲノム遺伝子を１本持つため、タモキシフェン投与によりした。翌日 15 % スクロース溶液に浸し、さらに翌日 15 %PHGPx は欠損されない。本実験では、CRE TG ヘテロマ

スクロース溶液に再度浸し、４℃で保存した。置換が終了

ウスをコントロールマウスとして用いた。

した切片を OTC コンパウンドに浸し、30 分程度なじませたのち、ドライアイスの上で凍結させた。この凍結させた

2.2

マウスのジェノタイプの判定

皮膚を 10 µm の厚さで切片とした。抗体染色は切片のスラ

離乳時期（３〜４週齢）のマウスの尾 0 . 5 〜１cm を切断

イドガラスを室温で１～２時間風乾させた後、次の操作をし、1 . 5 mL チューブに入れ 50 mM NaOH 180 µl 加え、95行った。T-PBS（0 . 3 % TritonX- 100 /PBS）で３回洗浄を℃で 10 分間インキュベートした。その後、1 M Tris - HCl

行ったあと、ブロッキング液を加え室温で１時間反応させ（pH 8 . 0）を 20 µl 加え、12000 rpm、10 分間、室温で遠心した。 次 に 目 的 の １ 次 抗 体（PHGPx 6 F 10 500 倍 希 釈 9），た。上清をサンプル DNA とし KOD - FX DNA Polymerase

HNE：４倍希釈，AIF：100 倍希釈）を室温で 4 時間反応さ（TOYOBO）を用いて PCR を行った。Cre 遺伝子、内在性せた。次に T - PBS で洗浄し、２次抗体（FLUORESCWIN

PHGPx 遺 伝 子 の WT は WT 用 プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い

200 倍希釈 , Cy 3 200 倍希釈）をつけ、アルミホイルで遮光

1 . 4 kbp のバンドが増幅される。KO は KO 用プライマーセ

しながら室温で３時間反応させた。プレパラートはオールットを用い 1 . 6 kbp のバンドが増幅される。TG 遺伝子はインワンの蛍光顕微鏡にて撮影した。HE 染色、TUNEL

内在性の PHGPx と内部配列は全く同じなので、3’側のマ染色は常法に従って行った。

ーカー配列を利用して TG 用プライマーセットを用いで増３．結幅し、1 . 7 kbp のバンドで判定した。Cre 遺伝子は Cre 用プ
ライマーセットを用いて約 600 bp のバンドを増幅した。論果3 .1 PHGPx 欠損によって毛包が減少し発毛が遅延する

3）

文 を参照。

図 １ に 示 し た 様 に、 全 身 性 タ モ キ シ フ ェ ン 誘 導 型
PHGPx 欠損マウス（CRE/TG/KO）マウスでは、タモキシ

2.3

タモキシフェンの調製と皮膚への塗布方法の検討

フェンをマウスに塗布あるいは投与するとタモキシフェン

タモキシフェン 10 mg を 99 . 5 % エタノール 10 mL に完全を取りこんだ細胞ではタモキシフェンがエストロジェン受に溶解し、軟膏 10 g と混ぜ合わせ作成した。タモキシフェ

容体（ER 部分）に結合し、核移行シグナルが露出すること

ン 5 mg/g 軟膏を１回に 0 . 01 g 相当を塗布した。コーン油

により、細胞質にあった CreER が核に移行し、PHGPx-F-の場合では直接タモキシフェンを１mg/ml となるように

Lox 遺伝子を破壊することにより、PHGPx 遺伝子が欠損

溶かして 50 µ l 相当を塗布した。マウスはメスの全身性タする。コントロールマウス（CRE/TG/ ヘテロ）では内在

モ キ シ フ ェ ン 誘 導 型 PHGPx 欠 損 マ ウ ス、Cre/TG/KO

性 PHGPx ゲノム遺伝子が１本残っているので PHGPx-F-（Cre+/− TG+/− PHGPx −/−）と コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス、Lox 遺伝子が破壊されても PHGPx は欠損しない。この２

CreTG ヘ テ ロ（Cre+/− TG+/− PHGPx+/−）を 用 意 し た。

つのマウスの背中の毛を剃毛した後、翌日に皮膚にタモキ

マウスにジエチルエーテルを用いて麻酔をかけ、バリカン

シフェンを塗布することにより、どのようなフェノタイプ

− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014がみられるのかについて、毎日観察した。本実験では、図

スではほぼ正常に戻った。一方、KO マウスではタモキシ２に示すようにタモキシフェンの塗布の方法および回数にフェンを塗布した場合、13 日目ぐらいまでは発毛が見らついても同時に検討した。背中の右側には軟膏に溶かした

れず、15、16 日後に皮下が黒くなり、以後 22 日以降でほタモキシフェンを塗布した。一方、左側にはコーン油に溶

ぼ正常に戻った。タモキシフェンの塗布回数は３日連続塗

かしたタモキシフェン（Tam）を塗布した。コーン油は液

布と１日のみの塗布では特に違いがみられなかった。また体状であるため非常に塗布しにくいことがわかり、本実験

コーン油と軟膏入りのタモキシフェンでもどちらでも効果

以降は軟膏に溶かしたタモキシフェンを用いることとした。

はみられたが、コーン油は液体であるために塗布時に表面図２に示す様に、６日目まではコントロールマウスもＫＯから流れるなどするために均一性、再現性には適していなマウスも剃毛した部分に変化はみられなかった（コントロ

いと考えられたため、以後は軟膏に溶かしたタモキシフェ

ールマウスの背中の一部はすでに発毛がはじまっているのンで塗布実験を行った。

でこの部分は除外している）。10 日目頃からコントロール

次にタモキシフェン塗布後、３日目と 14 日目の皮膚組

マウスの背中は皮下が黒くなり 13 日目ではすでに発毛の織の HE 染色像を比較した。図３に示すように、タモキシ

回復状態が見られた。また 16 日後にはコントロールマウ

フェン塗布後３日目では、コントロールマウスと PHGPx

図２ Tam を塗布後の CRE/TG/ ヘテロ（コントロール）、CRE/TG/KO（PHGPx 欠損）マ
ウスの発毛への影響

図３

タモキシフェン塗布後の毛包形成の変化（HE 染色）− 74 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築欠損マウスでは大きな違いは見られなかったが、14 日目

そこで、PHGPx 欠損により酸化脂質の蓄積がみられる

では、PHGPx 欠損マウスにおいて、コントロールマウスのかについて、酸化脂肪酸の分解物である４- ヒドロキシに比べ著しい毛包細胞の数の減少が見られることが明らか

ノネナール（4 -HNE）に対する抗体を用いて免役染色を行となった。このことから、皮膚へのタモキシフェンの塗布った。その結果、図５に示すようにタモキシフェン添加にによる PHGPx の発現低下は毛包形成に異常をひきおこし、より、コントロールマウスの皮膚に比べ、PHGPx 欠損マ

発毛が遅れると考えられた。

ウスの皮膚組織における 4 -HNE の染色強度の増加が観察された。特に毛包において強いシグナルが観察された。こ3 . 2 PHGPx の減少により毛包での内在性脂質酸化が亢進するのことから PHGPx 欠損により内在性の脂質酸化反応が亢

次に抗 PHGPx 抗体を用いて皮膚の組織染色を行った。

PHGPx 欠損マウスにおいて細かいドット状の染色像の増図４に示すようにコントロールマウスの皮膚では毛包の部加が観察された。毛包組織部位にも観察されたが、コント位に PHGPx の比較的強い染色がみられたが、タモキシフ

ロールマウスの毛包組織にもみられたため、この染色像のェン塗布４日後の PHGPx 欠損マウスでは毛包での PHGPx

特異性については明らかとはならなかった。以上の結果かの発現がみられなくなっていた。PHGPx は生体膜脂質のら、毛包における PHGPx の欠損により生じるリン脂質の酸化により生成したリン脂質ヒドロペルオキシドを還元す

酸化が毛包形成阻害のひとつの要因であると考えられた。

進 し て い る こ と が 示 さ れ た。 一 方、TUNEL 染 色 で はる。

図４

タモキシフェン塗布４日後の毛包での PHGPx の発現変化（抗体染色）

図５ タモキシフェン塗布後４日後の毛包皮膚組織における抗 HNE 抗
体染色および TUNEL 染色− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3 . 3 ビタミンＥ添加は PHGPx 欠損による発毛の遅延を回復する

が、活性化カスパーゼ抗体を用いた組織染色ではコントロ

そこで次に、脂質ヒドロペルオキシドの生成を抑制できた。このことからも毛包細胞においてもカスパーゼ非依存ると考えられるビタミンＥをタモキシフェンを塗布する際的な細胞死が起きていると考えられた。MEF 細胞ではドに軟膏に同時に混入し、PHGPx 欠損による発毛遅延を抑ット状の TUNEL 染色像が得られたが、毛包ではタモキシ

制できるのかについて検討を行った。図６に示した様に、フェンを塗布しなくても染色像が観察されたことから非特ビタミンＥを加えたタモキシフェンでは投与回数に関わら異的な染色像をみている可能性が考えられた。この点につず、12 日目には皮下に発毛がみられ 16 日目には正常に戻いては今後の課題である。ビタミンＥ添加により PHGPx

り、図１のコントロールマウスと同様な時期に発毛がみら欠損による発毛の遅延を抑制できたことからも、この発毛れた。このことからビタミンＥはタモキシフェン添加によ遅延が脂質ヒドロペルオキシド依存的であることを強く示る PHGPx 欠損による内在性の脂質ヒドロペルオキシド由唆している。今回、LC - ESI - MS/MS による酸化脂質の解来の発毛阻害を抑制出来ることが明らかとなった。

析はできなかったが、毛包をマイクロダイジェスチョン法

ールマウスと PHGPx 欠損マウスでは違いが見られなかっ

本方法は、今後 In vivo における脂質ヒドロペルオキシにより抽出してどのような酸化脂質が蓄積しているかの解

ド依存的な発毛阻害を抑制する化合物のスクリーニング系

析を行うことが重要であろう。最近、ケラチノサイト特異として有効であると考えられた。

的 PHGPx 欠損マウス 10）が報告され、興味深いことに、出４．考

生後３週齢までは毛包形成が遅延するがその後は回復する

察ことが報告された。本実験においては、胎児ではなく大人

本研究では、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損のマウスで起きる現象をみている。タモキシフェン塗布にマウスを用いて、酸化リン脂質の還元酵素である PHGPx

よる成体での PHGPx 欠損による毛包形成遅延がケラチノを欠損させることによりおきる発毛阻害のメカニズムにつサイトを介したものなのか、それとも直接的な毛包障害にい て 解 析 し た。 こ れ ま で に 我 々 は MEF 細 胞 を 用 い てよるものなのかは今後慎重に検討する必要があると考えら

PHGPx 欠損による細胞死のメカニズムについて詳細に検れる。しかしながら、我々のマウスではケラチノサイトを討してきた。PHGPx を MEF 細胞で欠損させると内在性の含む皮膚の細胞の大きなダメージはみられていない。なぜ

リン脂質ヒドロペルオキシドが 24 時間後に生成し、２日

皮膚の細胞は PHGPx が欠損しても細胞死が誘導されない

後から３日後にカスパーゼ非依存的な新規細胞死を誘導すのか、また毛包細胞が特に内在性で生じる脂質ヒドロペルることを見出している。本実験においてもタモキシフェン

オキシドに弱いのかが解明できれば、新たな脱毛のメカニ

塗布後４日目の皮膚組織において酸化脂質の生成を

ズムを明らかにできる可能性も秘めていると考えている。

4 -HNE 抗体を用いて検出できた。データは示していない

図６

ビタミンＥ添加による PHGPx 欠損マウスにおける発毛阻害の抑制効果− 76 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築

５．総XV, 68 - 72 , 2012 .

括６）今井浩孝 , : 生体膜脂質酸化ホメオスタシスの破綻による新規細胞死と疾患 , オレオサイエンス , 11 , 15 - 23 ,本研究では成体の皮膚および毛包での内在性の脂質ヒド2011 .

ロペルオキシド生成が毛包形成に遅延を引き起こすこと、
ビタミンＥは強い抑制効果を示すことを明らかにした。ま７）Imai H, : New strategy of functional analysis of

た本実験系は、In vivo における新たな治療薬のスクリー

PHGPx knockout mice model using transgenic rescue

ニング系にも利用できると考えられる。

method and Cre-loxP system., J. Clin. Biochem. Nutr.,
46 , 1 - 13 , 2010 .

謝辞８）S c h o e n m a k e r s E , A g o s t i n i M , M i t c h e l l C ,Schoenmakers N, Papp L, Rajanayagam O, Padidela

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団より

R, Ceron-Gutierrez L, Doffinger R, Prevosto C,

ご援助いただきましたことを深く感謝申し上げます。

Luan J, Montano S, Lu J, Castanet M, Clemons N,（引用文献）

Groeneveld M, Castets P, Karbaschi M, Aitken S,

１）Imai H, Nakagawa Y, : Biological significance ofDixon A, Williams J, Campi I, Blount M, Burton H,

phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase

Muntoni F, O'Donovan D, Dean A, Warren A, Brierley(PHGPx, GPx 4 ) in mammalian cells, Free Radic Biol

C, Baguley D, Guicheney P, Fitzgerald R, Coles A,

Med., 34 ( 2 ), 145 - 169 , 2003 .

Gaston H, Todd P, Holmgren A, Khanna KK, Cooke M,２）Imai H, Hirao F, Sakamoto T, Sekine K, Mizukura Y,

Semple R, Halsall D, Wareham N, Schwabe J, Grasso

Saito M, Kitamoto T, Hayasaka K, Nakagawa Y, : Early

L, Beck-Peccoz P, Ogunko A, Dattani M, Gurnell M,

embryonic lethality caussed by targeted disruption

Chatterjee K.:Mutations in the selenocystein insertionof the mouse PHGPx gene, Biochem. Biophys.Res.

sequence-binding protein 2 gene lead to a multisystem

Commun, 305 ( 2 ) , 278 - 286 , 2003 .

selenoprotein deficiency disorder in humans, J. Clin.
Invest., 120 , 4220 - 4235 , 2010 .

３）Imai H, Hakkaku N, Iwamoto R, Suzuki T, Tajima
Y, Konishi K, Minani S, Ichinose S, Ishizaka K, Shioda

９）Imai H, Suzuki K, Ishizaka K, Ichinose S, Oshima H,

S, Arata S, Nishimura M, Naito S, Nakagawa Y, :Okayasu I, Emoto K, Umeda M, Nakagawa Y, : Failure

Depletion of selenoprotein GPx 4 in spermatogenesisof the expression of phospholipid hydroperoxidecauses male infertility in mice, J.Biol. Chem., 284, 32522-

glutathione peroxidase (PHGPx) in the spermatozoa of

32532 , 2009 .

human infertile males, Biol. Reprod., 64 , 674 - 683 , 2001 .

４）Ueta T, Inoue T, Furukawa T, Tamaki Y, Nakagawa

10）Sengupta A, Lichti UF, Carlson BA, Cataisson C,

Y, Imai H, Yanagi Y, : Glutathione peroxidase 4 is

Ryscavage AO, Mikulec C, Conrad M, Fischer SM,

required for maturation of photoreceptor cells, J. Biol.

Hatfield DL, Yuspa SH, : Targeted disruption ofChem., 287 , 7675 - 7682 , 2012 .

glutathione peroxidase 4 in mouse skin epithelial cells５）今井浩孝 , 松岡正城 , 中西広樹 , 田口良 , 石田規子 , 七

impairs postnatal hair follicle morphogenesis that I

里元督 , 吉田康一 , 二木悦雄 , 清水孝彦 , 新井洋由 , 中川

partially rescued through inhibition of COX-2., J Invest

靖一 , : ビタミンＥは肝臓特異的 PHGPx 欠損マウスのDermatol, 133 ( 7 ), 1731 - 1741 , 2013 .

出生直後死をレスキューする，ビタミンＥ研究の進歩 ,− 77 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

東北大学大学院歯学研究科分子・再生歯科補綴学分野

江 草宏

The aim of this project is to develop bioengineered safety evaluation tools for oral care reagents using patient-derived
stem cells, which mimics structure and function of oral mucosa and tongue in vitro. We first generated iPS cells fromhuman gingival fibroblasts via transduction of Oct3/4, Sox2, Klf4 without using c-Myc oncogene. By this method, gingival
fibroblasts demonstrated a higher reprogramming efficiency than the skin fibroblasts, which have been conventionally used
for the generation of iPS cells. We also generated dendritic cells from mouse iPS cells which showed antigen-presenting cellfunction. To fabricate tongue structure in vitro, we applied cyclic strain to mouse bone marrow-derived mesenchymal stem
cells. We found that application of cyclic strain greatly enhances the skeletal myogenesis of these stem cells with an aligned
structure. These findings would be important step toward the further application of these methods to apply development ofsafety evaluation tools for oral care reagents.

１．緒

がある。

言

また，味覚器である舌は口腔内で外来刺激を繊細に感じ

近年，国民の歯や口腔内への関心の高まりに伴い，雑誌とる。特に口腔乾燥症（ドライマウス）の患者では，一般やインターネット上では口臭予防や歯を白くする効能を謳的な洗口液であってもこれに含まれるアルコール等の刺激った歯磨材やデンタルリンス（洗口液）などの商品が数多によって舌痛症を引き起こすため，舌に対する口腔化粧品

く販売されている。これら商品の多くは，植物エキスなどの刺激を試験管内で評価するシステムは有用と思われる。

を配合して他の商品と区別化を図っているが，薬事法のもしかしながら，舌を構成している主な細胞は，細胞増殖能と医薬部外品の承認を得るには時間とコストがかかるため，力が乏しい骨格筋細胞や味蕾細胞であるため，必要な数の“口腔化粧品”として販売されている実態がある。このよ

細胞を用意することは困難である。

うな状況下，口腔内に用いる化粧品や医薬品材料の安全性

これに応えるべく，近年では生物の巧妙な機能と構造をを，動物や健常者由来の細胞を用いるだけでなく，アレル

基にして工業技術を創り出す生物工学（Bioengineering）

ギーなどの疾患を有している患者の細胞を用いて確実に評の研究が急速に進展している。また，複雑な構造をもつ粘価する技術の開発は重要な課題である。

膜や舌を試験管内で構築するためには，iPS 細胞や間葉系

口腔粘膜は免疫応答が活発に起こる軟組織である。その幹細胞のように発生学的により未分化な幹細胞を用いるこ

ため，本来ならば口腔化粧品の安全性評価は，個人に由来とが有用である 1）。iPS 細胞は，体細胞に数個の遺伝子をする口腔粘膜細胞を用いることが望ましい。口腔粘膜は，導入することでその記憶を初期化した人工多能性幹細胞で粘膜の最表層を覆う上皮層および線維芽細胞や樹状細胞，あり，将来的な組織工学の幹細胞源として大いに期待されT 細胞などを含む粘膜固有層から構成されており，これらている。我々は，歯科治療の過程で切除される機会の多いの細胞が外来刺激に対する免疫応答を担当している。した組織である，口腔粘膜歯肉の細胞を用いることで容易にがって，試験管内で口腔化粧品に対する口腔粘膜の応答を

iPS 細胞が樹立可能であることを見出しており 2），この細再現するためには，患者由来の上皮細胞，線維芽細胞ある胞が歯科医学研究や歯科医療技術に有用なツールになり得

いは樹状細胞などの免疫を制御する細胞を用意する必要がるものと期待している 3）。

ある。特に，患者個人の細胞から抗原提示細胞として機能

一方，骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）は，骨芽細胞，する樹状細胞を作製する技術は，口腔化粧品などの材料に軟骨細胞，脂肪細胞，筋細胞，神経細胞等様々な組織細胞

対する粘膜の免疫応答の個人差に重要な知見を導く可能性に分化することが可能である。BMSC は，患者の骨髄液から比較的容易に採取でき，患者への侵襲も少ないため，現実的な組織再生の幹細胞源として期待されている 4）。しかDevelopment of safety evaluation tools
for oral care reagents using gingivaderived iPS cells

しながら，通常の培養条件では幹細胞を成熟した組織細胞

Hiroshi Egusa
Division of Molecular and Regenerative
Prost hodont ics , Tohoku University
Graduate School of Dentistry

因子や足場の要素に加えて，細胞配向や外的刺激などの生に分化誘導することは容易ではないため，近年では，成長体内における擬似環境を用いて，幹細胞を目的の組織細胞に確実に誘導する技術が注目されている 5 , 6）。

− 78 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

これらを背景に，本研究課題では，歯肉から採取した線た後，培地を交換し OVA を除去した。その後，樹状細胞

維芽細胞から作製した iPS 細胞を，口腔粘膜を構成する細様細胞を OVA 特異的な OT-II マウス由来の CD 4 + T 細胞

胞（上皮細胞，線維芽細胞，樹状細胞など）に分化誘導で（FACSAriaTM にて分離）と共に３日間培養し，細胞増殖

きれば，個人由来の培養口腔粘膜として口腔化粧品などのを評価した。

安全性評価に用いることが可能ではないかと考えた。また，さらに，作製した iPS 細胞由来樹状細胞様細胞による抗BMSC から舌組織の細胞を誘導するために，骨格筋の特異

原特異的な抗体産生の誘導を評価するため，iPS 細胞由来

な細胞配向を試験管内で再現する方法に着目した。本研究

樹状細胞様細胞を雄性 C 57 BL/ 6 マウスの腹腔内に１週間の目的は，歯肉由来 iPS 細胞あるいは BMSC を用いて試験毎に３回注射した。さらに１週間後に OVA を経鼻投与し，管内で口腔粘膜あるいは舌を構成する細胞を作り出し，患その２週間後に血清および唾液中の抗体価を測定した。

者個人の体質を反映した細胞培養システムを構築し，口腔化粧品が口腔粘膜や舌に及ぼし得る為害作用を評価する技

2 . 3 BMSCを用いた骨格筋細胞への分化誘導技術の開発

術に繋げることである。

２．実
2 .1

C 57 BL/ 6 マウスの大腿骨内腔より取り出した骨髄細胞から BMSC を分離培養し，単一細胞株を樹立する目的で

験

長期継代培養による自然不死化を誘導した。この不死化細患者歯肉を用いたiPS 細胞の樹立

胞からシリンダー法および限界希釈法を用いた細胞クロー

これまでに我々は，山中４因子（Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4，

ニングによって単一細胞株を作製した。これらの細胞株のc-Myc）7）を用いた初期化効率は，マウス歯肉線維芽細胞

中で，著明な骨，軟骨および脂肪細胞への分化能が確認さの方が皮膚線維芽細胞よりも 7 倍以上高いことを明らかにれた多分化能細胞株を実験に使用した。BMSC の骨格筋分2）している 。ただし，これら初期化因子に含まれる c-Myc

化誘導には，Muguruma ら 11）の報告にある培地を用いた。

は癌遺伝子であるため，これを用いずに iPS 細胞を作製す

細胞に反復伸展刺激を与えるための細胞伸展装置を，カ8）ることが望ましい 。そこで，本研究課題ではヒト歯肉組

スタムメイドで作製した。この細胞伸展装置では，細胞培織を用い，山中４因子から c-Myc を除いた３因子を導入す

地中に設置されたシリコンシートの両端がクランプで挟まることで iPS 細胞の樹立を試みた。

れている。片方のクランプは固定され，もう一方のクラン

歯科治療の過程で切除された患者歯肉由来の線維芽細胞

プが付属のモーターによって一軸方向に牽引を繰り返すこに，pMXs レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て Oct 3 / 4，とにより，シリコンシート上に播種した細胞に対して周期

Sox 2，Klf 4 遺 伝 子 を 導 入 し，mitomycin C で 処 理 し た

的伸展刺激が加えられる構造になっている。シリコンシー

SNL フィーダー細胞上に播種した。形成された胚性幹細ト上に BMSC を播種し，骨格筋分化誘導培地中にて 10 %，胞（ES 細胞）様コロニーをクローニングし，その ES 細胞

0 . 17 Hz（10 回 / 1 分）の周期的伸展刺激を与え，骨格筋分様の性質を，RT-PCR 解析およびテラトーマ形成実験にて化を骨格筋細胞分化に特異的な遺伝子発現（RT-PCR 法）評価した。また，ヒト皮膚線維芽細胞を用いて同様の初期および蛋白質発現（免疫染色法）について検討した。

化誘導を行い，歯肉線維芽細胞の初期化効率と比較検討し３．結た。初期化効率の評価では，初期化誘導 50 ～ 60 日目に未分化 iPS 細胞のマーカーのひとつであるアルカリフォスフ
ァターゼ（ALP）について染色を行い，ALP 陽性の ES 細果

3 .1 c-Myc 癌遺伝子の導入を伴わないヒト歯肉由来
iPS 細胞の樹立

胞様コロニーの数から初期化効率を算出した。

患者歯肉から樹立したヒト歯肉線維芽細胞を，Oct 3 / 4，
Sox 2，Klf 4 の 3 因子の導入によって初期化を誘導した結果，歯肉由来 iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導

誘導 50 日後に ES 細胞様のコロニーが出現した（図 1 -A）。

マウス ES 細胞から樹状細胞に分化誘導した報告 9 , 10）をこれらのコロニーから樹立した３つの iPS 細胞クローン株

参考に，iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導を試みた。実は，いずれも ES 細胞のマーカー遺伝子である，NANOG，

験には，我々がこれまでに，マウス歯肉線維芽細胞から癌OCT 3 / 4，REX 1，SOX 2，TERT を ES 細胞と同程度に発2.2

遺伝子 c-Myc を用いずに樹立した iPS 細胞 を用いた。誘現していた（図 1 -B）。テラトーマ形成実験の結果，樹立し導実験では，iPS 細胞を OP 9 細胞フィーダーと共培養し，た iPS 細胞株はマウス精巣に移植した 10 週間後に著明な腫CM-CSF を加えた。また，より成熟した樹状細胞様細胞を瘍形成を示し，腫瘍内部には神経組織（外胚葉由来），軟骨，

得るために，TNF- α，IL- 4 および anti CD 40 を加えた。

筋肉，脂肪組織（中胚葉由来）および腸管上皮様組織（内2）歯肉由来 iPS 細胞から得られた樹状細胞様細胞が抗原提胚葉由来）の存在を認めた。以上の結果から，樹立した示能を示すか否かを検討する目的で，iPS 細胞由来樹状細

iPS 細胞は三胚葉に由来する様々な細胞組織に分化するこ

胞様細胞に卵白アルブミン（OVA）を添加して一晩培養しとが可能な多能性幹細胞であることが示された（図 1 - C）。

− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

また，３名の患者から採取したヒト歯肉線維芽細胞およ

群 は，OVA 非 添 加 群（ コ ン ト ロ ー ル 群 ）と 比 較 し て，びヒト皮膚線維芽細胞を用いて初期化効率の検討を行った

OVA 特異的 T 細胞受容体遺伝子導入マウスとして知られ結果，ヒト歯肉線維芽細胞は Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4 の３因ている OT-II マウス由来の CD 4 +T 細胞の数を増加させた子を導入した 60 日後に約 0 . 02 − 0 . 07 % の初期化効率を示（図 2 -B）。さらに，OVA を添加した iPS 細胞由来樹状細胞したのに対して，ヒト皮膚線維芽細胞は ES 細胞様のコロ様細胞をマウス腹腔内に投与することで，血清および唾液

ニーを形成しなかった（図 1 -A）。

中における抗原特異的な抗体産生が著明に亢進した。

3.2

3 . 3 反復伸展刺激が BMSC の骨格筋細胞分化に及ぼす影響

iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導

iPS 細胞を OP 9 細胞フィーダーと共培養し，CM-CSF を加えた結果，位相差顕微鏡下にて多くの樹状細胞特有の形

3.3.1

細胞配向

態を示す細胞を認めた。また，FACS 解析の結果，これら

カスタムメイドの細胞伸展装置（図 3 -A）を用いて周期の iPS 細胞由来樹状細胞様細胞には，樹状細胞に特異的な的伸展環境下でマウス BMSC を 48 時間培養した結果，細細胞表面マーカー（CD 11 c 陽性）の発現を認めた（図 2 -A）。

胞および細胞骨格であるアクチン線維は伸展方向に対して

iPS 細胞由来樹状細胞様細胞に OVA を添加した共培養

並行に一様に配向した（図 3 -B）。一方，静的培養細胞では，

図１ c-Myc 導入を伴わないヒト歯肉線維芽細胞由来 iPS 細胞の樹立
A：初期化誘導 60 日後の ALP 染色像
B：RT-PCR 解析（GAPDG：内在性コントロール）
C：テラトーマ形成実験（HE 染色像）

図２ iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導
A：樹状細胞マーカー（CD11c）陽性細胞の検出（FACS 解析）
B：抗原（OVA）提示後の iPS 細胞由来樹状細胞による OVA 特異的 CD4+ T 細胞の増殖− 80 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

細胞およびアクチン線維の配向は観察されなかった。また，

小胞体ストレスに関連する Glucose-regulated protein 78

周期的伸展刺激は BMSC を配向させる一方でその増殖を（BIP/GRP 78）の遺伝子発現を経時的に促進した（図 4 -A）。

抑制し，骨格筋細胞が成熟する過程の細胞融合に必要な細リアルタイム RT-PCR の結果，周期的伸展を与えて培養し胞同士の緊密な接触を促した。

た 5 および 7 日後における Myf 5 および MRF 4 の遺伝子発

3.3.2

現は，静的培養の場合と比較して有意に増加していること

骨格筋分化

RT-PCR 解析の結果，周期的伸展刺激は骨格筋細胞分化が確認された（図 4 -B）。

に特異的な遺伝子である Myf 5，myogenin，MRF 4 の発

また，周期的伸展刺激を 5 日間与えて培養した BMSC は，現を促進した。周期的伸展を与えて培養した BMSC は，細胞が融合した多核の骨格筋細胞様の像を示した（図 4 - C）。

平滑筋に特異的な遺伝子である myocaldin は発現しなかっ静的および周期的伸展培養５日後の細胞を，骨格筋関連タた。また，他の平滑筋マーカー遺伝子である a smooth

ンパク質 myogenin および myosin で免疫蛍光染色した結muscle actin（a - SMA）の発現は，周期的伸展培養によっ果，周期的伸展を与えた細胞は，静的に培養した細胞と比て低下した。一方，周期的伸展刺激は Tension-induced /較して，これらのタンパク質を強く発現している像が観察

inhibited proteins - 1（TIP 1）遺 伝 子 の 発 現 を 促 進 し，された（図 4 - D）。

TIP 3 遺伝子の発現を抑制した。また，周期的伸展刺激は

図３

反復伸展刺激が BMSC の細胞配向に及ぼす影響 12）

A：細胞伸展装置
B：伸展刺激 48 時間後の BMSC（左図：位相差顕微鏡像，右図：ファロイジン染色像）

図４ 反復伸展刺激が BMSC の骨格筋細胞分化に及ぼす影響 12）
A：RT-PCR 解析（static：静的培養。strain：伸展刺激培養）
B：リアルタイム RT-PCR 解析（*P<0.05，**P<0.01: ANOVA）
C：伸展刺激５日後（位相差顕微鏡像）
D：伸展刺激５日後（myosin 免疫蛍光染色像）− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014４．考用できる可能性に着目し，周期的伸展刺激が BMSC に及察

ぼす影響を検討した。その結果，10 %，0 . 17 Hz の周期的

iPS 細胞を口腔化粧品の安全性評価ツールに応用するた

伸展刺激は，マウス BMSC を伸展方向に配向し，骨格筋

めには，iPS 細胞の資源となる組織の採取が容易で，患者特異的遺伝子およびタンパク質の発現を促すことにより骨にとって安全・低侵襲でなければならない。また，iPS 細格筋分化を促進することが明らかとなった。また，周期的胞を効率よく作製するためには，その資源となる組織の細伸展刺激による BMSC の骨格筋分化促進作用には，細胞胞は初期化されやすい性質を有していることが望ましい。

配向による細胞間の緊密な接触および機械的刺激に誘発さ歯肉は歯科治療の過程で切除される機会の多い組織であり，れた TIP 1 / 3 あるいは小胞体ストレス関連遺伝子などが関切除による創傷は良好な治癒経過をたどる。本研究によっ与している可能性が示唆された 12）。本研究で明らかとなって，従来 iPS 細胞作製に用いられている皮膚線維芽細胞でた周期的伸展刺激の骨格筋分化誘導作用は，これまで困難

は Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4 のみによる初期化誘導は困難であであった BMSC の効率的な骨格筋分化誘導を可能とする

るが，ヒト歯肉線維芽細胞を用いることで癌遺伝子 c-Myc

新たな技術として，組織工学に貢献することが期待される。

を用いないでも iPS 細胞の樹立が可能であることが示唆さ５．総れた。歯肉線維芽細胞は皮膚線維芽細胞と比較してテロメ

括

ラーゼ活性に関与する Tert 遺伝子を高発現している 2）。しこの度のコスメトロジー研究の成果として，ヒト歯肉線

たがって，歯肉線維芽細胞が初期化され易い一因として，維芽細胞を用いることで，癌遺伝子 c-Myc を用いずに iPS

内在性の Tert の発現が関与している可能性が考えられる。

細胞を容易に樹立することが可能であることを明らかにし臨床現場で日常的に切除して捨てられている歯肉は，優れた。今後，この技術を基盤にして患者由来 iPS 細胞を用いた iPS 細胞の資源であり，将来の医療や薬剤の安全性評価

た口腔粘膜および舌の構築を目指す予定である。また，マに利用される可能性のある魅力的な組織と言えるであろう。

ウス歯肉由来 iPS 細胞から抗原提示能を有する樹状細胞を樹状細胞は，口腔粘膜を含む様々な組織に常在する白血

誘導することに成功した。今後は，ヒト iPS 細胞を用いて球の一種であり，抗原タンパク質を T 細胞に提示する機能

同様の樹状細胞を作製し，口腔化粧品の生体安全性評価にをもつ細胞である。樹状細胞は，外来抗原に対する獲得免応用したいと考えている。さらに，周期的伸展刺激を用い疫応答を開始させるだけでなく，自己に対する免疫応答をて生体内の環境を模倣することにより，BMSC から効率的抑制する免疫学的自己寛容の維持，あるいは過剰な免疫応に骨格筋細胞を作製することが可能であることを明らかに

答を抑制する上でも重要な役割を果たしていると考えられした 12）。今後は，この技術を用いて，三次元的な骨格筋配10）ている 。したがって，口腔粘膜に存在する樹状細胞が，向細胞の積層化を試みると共に，患者由来 iPS 細胞を用い口腔化粧品などに対するアレルギー反応に関与している可ても同様の誘導が可能か否かを検討したい。本研究成果が，能性は否定できないため，患者由来の樹状細胞を用いて口

将来的には患者個人から作製した培養口腔粘膜，樹状細胞腔化粧品に対する応答を評価することには意義があると思あるいは舌組織を用いて，口腔化粧品などに対する患者個われる。しかしながら，成熟した樹状細胞は増殖能をもた

人の寛容性を評価するシステムの構築に繋がり，コスメト

ないため，患者から十分な数の樹状細胞を得ることは困難

ロジー研究の発展の一助となることを期待する。

である。iPS 細胞は自己複製能を有するため，多能性を保ったまま無限に増殖させることが可能である。したがって，謝

辞

無限に増殖できる iPS 細胞を材料として樹状細胞を作製す

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりることが可能になれば，必要な数の患者由来の樹状細胞をご援助いただきましたことを深く感謝申し上げます。また，作製できるようになる。本研究において，マウス歯肉由来

共同研究者として多大なる御協力を頂いた大阪大学大学院

iPS 細胞から抗原提示能を有する樹状細胞を誘導できるこ

歯学研究科・予防歯科学教室の関根伸一先生に深甚の謝意とが明らかとなった。今後，抗原提示細胞として機能するを表します。

樹状細胞を患者由来 iPS 細胞から作製することで，口腔化粧品などに対する患者特有の免疫応答の評価に重要な知見（引用文献）

が導かれることが期待される。

１）Egusa H, Sonoyama W, Nishimura M, Atsuta I,

多分化能を有する BMSC を，舌を構成する骨格筋細胞

Akiyama K,: Stem cells in dentistry- Part I: Stem cellに効率的に分化誘導する技術はいまだ確立されていない。

sources, J. Prosthodont. Res., 56 , 151 - 165 , 2012 .

生体内の骨格筋組織は伸展，弛緩を繰返しており，組織内

２）Egusa H, Okita K, Kayashima H, Yu G, Fukuyasuの細胞はそれによる力を受けている。本研究では，試験管

S, Saeki M, Matsumoto T, Yamanaka S, Yatani H,:

内における周期的伸展刺激が骨格筋細胞への分化誘導に応Gingival fibroblasts as a promising source of induced− 82 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

S, Ikeda T, Takahashi K, Okita K, Yamanaka S,

pluripotent stem cells, PLoS One, 5 , e 12743 , 2010 .

Nishimura Y,: Characterization of dendritic cells and３）Egusa H,: iPS cells in dentistry, Clin. Calcium, 22 , 67 -macrophages generated by directed differentiation

73 , 2012 .

from mouse induced pluripotent stem cells, Stem Cells,４）Egusa H, Sonoyama W, Nishimura M, Atsuta I,

27 , 1021 - 1031 , 2009 .

Akiyama K,: Stem cells in dentistry- Part II: Clinicalapplication, J. Prosthodont. Res., 56 , 229 - 248 , 2012 .

10）Senju S, Hirata S, Matsuyoshi H, Masuda M, Uemura５）Martin I, Wendt D, Heberer M,: The role ofY, Araki K, Yamamura K, Nishimura Y,: Generationbioreactors in tissue engineering, Trends Biotechnol.,and genetic modification of dendritic cells derived from

22 , 80 - 86 , 2004 .

mouse embryonic stem cells, Blood, 101 , 3501 - 3508 ,2003 .

６）Matsumoto T, Sasaki J, Alsberg E, Egusa H, Yatani
H, Sohmura T,: Three-dimensional cell and tissue11）Muguruma Y, Reyes M, Nakamura Y, Sato T,

patterning in a strained fibrin gel system, PLoS One, 2,

Matsuzawa H, Miyatake H, Akatsuka A, Itoh J, Yahatae 1211 , 2007 .

T, Ando K, Kato S, Hotta T,: In vivo and in vitro

７）Takahashi K, Yamanaka S,: Induction of pluripotent

differentiation of myocytes from human bone marrow-stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast

derived multipotent progenitor cells, Exp. Hematol., 31 ,1323 - 1330 , 2003 .

cultures by defined factors, Cell, 126 , 663 - 676 , 2006 .
８）Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K,12）Egusa H, Kobayashi M, Matsumoto T, Sasaki J,

Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N,

Uraguchi S, Yatani H,: Application of cyclic strain for

Yamanaka S,: Generation of induced pluripotent stem

accelerated skeletal myogenic differentiation of mouse

cells without Myc from mouse and human fibroblasts,bone marrow-derived mesenchymal stromal cells withNat. Biotechnol., 26 , 101 - 106 , 2008 .

cell alignment, Tissue Eng. Part A, 19 , 770 - 782 , 2013 .

９）Senju S, Haruta M, Matsunaga Y, Fukushima− 83 −ヒトiPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

慶應義塾大学医学部皮膚科学教室

大 山

学

In the present study, we successfully established a protocol to induce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into
keratinocyte precursor cells, expressing keratin 18 and 14. By co-culturing hiPSC-derived keratinocyte precursor cells withhuman dermal papilla cells, we were able to, at least partially, recapitulate bidirectional crosstalk between hair matrix cells
and the dermal papilla in the hair follicle, which may provide a valuable tool for future investigation.

１．緒づく in vitro 毛包誘導モデルの開発を試みることとした。

言計画初年度となる昨年度は hiPSC からケラチノサイトへ

毛髪とそのスタイルは個人の印象を左右し、時として職の分化誘導と分化度調節のための条件確立を試みた。その業までも連想させるなど我々の社会生活に影響を与える。

結果、１）上皮系への分化には胚様体形成をした後、レチ

そのため、毛髪の維持、発育に関わる物質に対する社会的ノイン酸（RA）を添加した条件で培養する必要がある

ニーズは大きい。従って毛包細胞に対し生理活性を示す分コラーゲンでコートした培養ディッシュとケラチノサイト

子を効率よくスクリーニングする方法の確立はコスメトロ

無血清培地を使用して hiPSC を培養した時のみケラチン

ジーにおいて重要な意味をもつ。

14、18 の発現がみられる

２）３）効率よくケラチノサイトへ

本 研 究 の 目 的 は、 ヒ ト induced pluripotent stem cellの分化を誘導するためには BMP 4 の添加が必要である（hiPSC）を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発である。

ことが判った。また、分化誘導に適した RA と BMP 4 の濃毛包自体の発生、
毛幹（毛髪）の形成・伸長には毛母細胞（毛度はそれぞれ 1 µM RA、25 ng/ml BMP 4 であろうと結論

幹形成に特化した毛球部のケラチノサイト）と毛乳頭細胞された。また、hiPSC のラインごとに試薬に対する反応性間の上皮─間葉系相互作用が重要である。毛包の維持、発が異なることも示唆された。

育促進に関与する因子を効率よく選択するには、この相互計画最終年度となる本年度は昨年度評価した山中４因子

作用を再現するモデルを開発する必要がある。特に inを導入した 201 B 7、WD 39 の二つの hiPSC ラインに加え４

vitro の系はスクリーニングなどに有用であり、これまで因子のうち MYC を導入していない WDT2 を加えた３つのも確立が試みられてきた 1 , 2）。

ラインについてケラチノサイト前駆細胞への誘導を試みる

従来のヒト細胞を用いたモデルは、ヒト細胞の供給の限界の点から相互作用を実現する能力が低い成人由来の分化とともに、得られた細胞をヒト毛乳頭細胞と共培養し invitro 毛包誘導モデルの確立を目指した。

したケラチノサイトと継代数が高く特性を失いつつある毛２．実

乳頭細胞を組み合わせる方法をとらざるを得なかった 1）。
これまでのヒト細胞を用いた毛包再構成実験で、成人ケラ

２.１

験

細胞と試薬

チノサイトよりも新生児由来のケラチノサイトの方が毛乳本研究においてはヒト真皮線維芽細胞にレトロウイルス

頭細胞とクロストークし毛包を再現する効率が高いことがを用いて山中３または４因子（POU 5 F 1、SOX 2、KLF 4、知られており 3 , 4）、幼若なケラチノサイトを用いれば毛包

MYC+/−）を 導 入 し て 確 立 し た ３ つ の hiPSC ラ イ ン

での上皮─間葉系相互作用を再現できる可能性はより高く（201 B 7 5）、WD 39 6）、WDT 2［３因子のライン］7））を使なることが予想される。そこで、本研究では hiPSC からケ用した。前年度の報告で記載した如く、hiSP 細胞はマイ

ラチノサイトへ誘導する過程で得られる幼若な分化段階のトマイシン処理したマウス胎児線維芽細胞（MEF）をフィ

hiPSC 由来ケラチノサイトとヒト毛乳頭細胞の共培養に基ーダーとして使用し、ヒト iPS 細胞培地（20 % KnockoutSerum Replacement（Life technologies）、２mM L-glutamine（Sigma）、1×10 −4 M nonessential amino acids（Sigma）、1

Development of in vitro hair follicle
induction model using human induced
pluripotent stem cells
Manabu Ohyama
D epa r t ment of D er mat olog y, Keio
University School of Medicine

×10−4 M 2-mercaptoethanol（Sigma）、
４ng/ml FGF2（Wako,
Osaka, Japan）、0 . 5 % penicillin and streptomycin（Lifetechnologies）含有 DMEM/Ham’s F12培地）で継代培養した。
共培養で使用するヒト毛乳頭細胞は慶應義塾大学倫理申請 2005−0075 に従って同意の上で採取された頭部良性腫瘍の− 84 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

周辺部の頭皮サンプルから実体顕微鏡下でマイクロダイセ

た値（ΔCT値）はglyceraldehyde- 3 -phosphate dehydrogenase

クションによって得た毛乳頭を Amniomax-C 100 Complete（GAPDH）の ΔCT 値を基準に標準化し比較検討した。
タンパクレベルでの解析は解析対象となるケラチノサイ

medium（Life Technologies）にて培養したものを使用した。

ト前駆細胞をコラーゲンコートしたカバースリップに 4 %２. ２ 前年度の検討で決定した条件を用いた３つの異なるhiPSCラインを用いたケラチノサイト前駆細胞へ

paraformaldehyde を 用 い て 固 定 し、 一 次 抗 体 と し てmouse anti-human monoclonal keratin 18（KRT 18）（1 : 100 ,の分化誘導

ab 668 , Abcam, Cambridge, UK），mouse monoclonal anti-

前年度決定した RA および BMP 4 の濃度を用いて hiPSC

human tumor protein p 63（P 63）（1 : 100 , ab 735 , Abcam）orをケラチノサイト前駆細胞へ分化誘導した。hiPSC をフィ

mouse monoclonal anti-human keratin 14（KRT 14）（1 : 100 ,ーダーから遊離させ胚様体形成を行い、２日追加培養した後、

ab 7800 , Abcam）を４℃一昼夜反応させた後、PBS にて洗

1 µM RA（Sigma）および 25 ng/ml BMP 4（R&D Systems）

浄して 30 分間 Goat anti-mouse IgG Alexa 488（1 : 200 , Lifeを培地に追加、３日間培養の後、ゼラチンコートディッシ

Technologies）と反応させ観察した。

ュ を 用 い て ケ ラ チ ノ サ イ ト 培 地 defined-KC serum free
medium（DKSM, Life technologies）にて付着培養し合計11 日間培養し hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞を得た。

２. ４ hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞とヒト毛乳頭細胞の共培養系
hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞または、コントロー

２. ３ ケラチノサイト前駆細胞のケラチノサイトマーカ
ー発現の解析

ルとしてのヒトケラチノサイトとヒト毛乳頭細胞の共培養
は、Inui ら の 方 法 1） を 改 変 し て 用 い た。2 . 5 × 105 個 の

２. ２の段階で得られた hiPSC 由来ケラチノサイト前駆

hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞または、コントロール

細胞について、遺伝子発現レベル、タンパク発現レベルのとしてのヒトケラチノサイトを透過性のあるメンブレンがそれぞれについてケラチノサイトマーカーの発現を解析した。

底 に 張 ら れ た ト ラ ン ス ウ ェ ル イ ン サ ー ト（Corning,

前年度同様に遺伝子発現レベルの解析にはリアルタイム

Corning, NY）にまき、80 % コンフルエントに到達した２

PCR 解析を用いた。具体的には RNeasy Mini または Micro

継代目のヒト毛乳頭細胞を培養中のディッシュに培養液をキ ッ ト（Qiagen）を 用 い て 解 析 対 象 と な る 細 胞 か ら共有するように重ねた。共培養の培養液として DMEM とtotalRNA を分離。Superscript III First Strand Synthesis

F 12 を３ : １の比率で混合したものを用いた。共培養開始

SuperMix（Life Technologies）を用いて cDNA を合成 し後２日目に totalRNA を回収し遺伝子発現解析を行った。

た 後、Primer Express software（Life Technologies）を３．結用いて作成したプライマーを使用し、Power SYBR Green果

Technologies）を 用いて解析した。PCR の条件 は、95 ℃

３.１ 胚様体形成させRAとBMP4を作用させたhiPSC
はラインを問わずケラチノサイト系への分化を示す形
態をとる

10 分、95℃ 15 秒、60℃ 60 秒を 40 サイクル行った。得られ前年度確立したプロトコール（図１）8）を用いて 201 B 7、

PCR Master Mix（Life Technologies） と Applied
Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system（Life

図１ 本研究で確立された hiPSC からケラチノサイト前駆細胞を得るためのプロトコール（文献 8）より改変）− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

WD 39、WDT 2 の全ての hiPSC ラインの分化誘導を試みするため、共培養システムの確立を試みた（図３、文献 1）たところ、全てのラインで分化誘導開始後 11 日後にはケを参考）。まず、このシステムにおいてコントロールとし

ラチノサイトに類似した上皮系の形態を有する細胞に変化て正常ケラチノサイトが毛乳頭細胞と相互作用することをしていることが明らかになった。

確認した。

３. ２ 分化誘導されたhiPSC 由来細胞は幼若ケラチノ
サイトに類似したマーカー発現パターンを示す

遺伝子の発現を評価したところ、共培養しない場合と比較

上記のプロトコールによって分化誘導された hiPSC 由来系が上皮─間葉系相互作用の評価に有用であることが示さ

２日間の共培養の後、ケラチノサイトにおける毛包関連

ケラチノサイト前駆細胞をケラチノサイト系統のマーカーして発現が有意（p< 0 . 05）に上昇しており（図４）、このれた。

（ケラチン 14、18、p 63）に対するモノクローナル抗体を発現するケラチンで比較的幼若なケラチノサイトで発現し３. ４ hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞と毛乳頭細胞を用いた共培養系の確立ており、ケラチン 14 は分化したケラチノサイト（特に基底次いで前述のプロトコールで分化誘導した hiPSC が共培膜）で発現しているケラチンである。図２に示すように、養系でヒト毛乳頭細胞と相互作用しヒトケラチノサイトとどのラインから誘導したものでも、ケラチン 18、p 63 を強同様に毛包関連遺伝子発現を増強するかどうかについて検く発現し、コロニーの周囲ではケラチン 14 が発現してい討した。

用いて蛍光染色した。ケラチン 18 は主として単層上皮にた 8）。これは幼若な分化段階のケラチノサイトでみられる

興味深いことにヒト毛乳頭細胞と共培養するとパターンであり、目的とするケラチノサイト前駆細胞を

201 B 7 hiPSC 由来のケラチノサイト前駆細胞は正常ケラチ

hiPSC から誘導することができたことを示す所見である。

ノサイトより毛包関連遺伝子を強く発現した（図５）。毛球部における上皮─間葉系相互作用は双方向である。そこ

３. ３ ヒトケラチノサイトと毛乳頭細胞を用いた共培養系の確立

で、hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞が共培養した毛乳

in vitro で毛球部における上皮─間葉系相互作用を再現すると 201 B 7 由来ケラチノサイト前駆細胞は正常ケラ

頭細胞に影響を与えるか否かを検討した。

図２ ３つの異なる hiPSC ラインから得たケラチノサイト前駆細胞はケラチン 18、p63 陽性、ケラチン 14
弱陽性を示す（文献 8）より改変）− 86 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

図３ 本研究で用いられた in vitro でヒト毛球部の上皮─間葉系相互作用を評
価する共培養モデル（in vitro 毛誘導モデル）

図４ 共培養システムにおける正常ケラチノサイトでの毛包関連遺伝子の発現増強（文献 8）より改変）

図５

共培養系による hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞における毛包関連遺伝子の発現の増強（文献 8）より改変）− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

チノサイトよりも強くヒト毛乳頭細胞に働きかけ毛乳頭細今回の検討では、hiPSC からケラチノサイトへの分化誘胞のバイオマーカーである ALPL、BMP 4、LEF 1 の発現導の程度が均一ではなく、ヘテロな細胞集団を使用したたを 増 強 す る こ と が 明 ら か に な っ た（ 図 ６）
。 つ ま り、め、どの分化段階の細胞が良好な反応を示したのか判断し

201 B 7 hiPSC 由来ケラチノサイト前駆細胞と毛乳頭細胞かにくい。今後はケラチノサイトの表面マーカーなどを用いらなる共培養の系は、毛球部で起きている上皮─間葉系細

て事前にソーティングすることにより、より効率のよいシ

胞間相互作用の少なくとも一部を再現しており、本研究でステムの構築が可能になることが期待される。
本研究で確立されたシステムに関しては、どの程度毛球目指した in vitro 毛包誘導モデルとして使用することがで部の生物学的イベントを再現しているのか十分に検討でききる可能性があることが示された。

４．考ていない。今後はマイクロアレイなどを用いた網羅的遺伝察

子解析を行うなどしてさらに厳密にシステムを定義してい検討した３種類の hiPSC ラインの全てがほとんど同じケ

くことが必要であると考えられる。

ラチノサイト分化マーカーの発現を示していたにもかかわ様々な改善点が考えられるものの、本研究は hiPSC の活らず、共培養の系では 201 B 7 由来の細胞のみがコントロ

用法の一つの方向性を示唆するものであり、今後さらなるールとして使用したヒト正常ケラチノサイトと比較して毛改良により、毛包に作用する薬剤のスクリーニングシステ

乳頭細胞からのシグナルに対して優れた反応性を示した。

ムなどへの発展が期待できると思われる。

少なくとも本研究の開始時に予測した「幼若な性質を示す

５．総

ケラチノサイトは毛乳頭からの毛誘導シグナルに対する反応性が高い」という仮説は部分的には支持されたことになる。

括hiPSC から幼若なケラチノサイトの特性をもつケラチノ
サイト前駆細胞を作成するプロトコールを確立するととも

201 B 7 hiPSC ラインがその他のラインと比較して有意なに、ヒト毛乳頭細胞との共培養することにより in vitro 毛

差をもって優れた反応性を示した理由としては、１）初期

包誘導モデルのプロトタイプを作成した。
（本研究は文献 8）化の程度が他のラインより優れていたの一部として行われた）上皮系に分化しやすい

２）デフォルトでなどの理由があると思われ今後さらなる比較検討が必要と考えられた。また、今回の結果か（引用文献）

ら、hiPSC のラインごと特性が大きく異なり、使用目的に

１）Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, Yoshikawa K, Itami

合うラインを決定するために、応用ごとに数種のラインを

S. Androgen-inducible TGF-beta 1 from balding dermal

比較検討する必要があることも明らかになった。

papilla cells inhibits epithelial cell growth: a clue to

図６

共培養系による毛乳頭細胞におけるバイオマーカーの発現の増強（文献 8）より改変）− 88 −

ヒト iPS 細胞を用いた in vitro 毛包誘導モデルの開発

by defined factors. Cell 2007 ; 131 : 861 - 872 .

understand paradoxical effects of androgen on human６）Ohta S, Imaizumi Y, Okada Y, et al. Generation of

hair growth. FASEB J 2002 ; 16 : 1967 - 1969 .

human melanocytes from induced pluripotent stem２）Ohyama M, Veraitch O. Strategies to enhancecells. PLoS One 2011 ; 6 : e 16182 .

epithelial-mesenchymal interactions for human hairfollicle bioengineering. J Dermatol Sci 2013 ; 70 : 78 - 87 .

７）I m a i z u m i Y , O k a d a Y , A k a m a t s u W , e t a l .

３）Ehama R, Ishimatsu-Tsuji Y, Iriyama S, et al. Hair

Mitochondrial dysfunction associated with increased

follicle regeneration using grafted rodent and humanoxidative stress and alpha-synuclein accumulation incells. J Invest Dermatol 2007 ; 127 : 2106 - 2115 .

PARK 2 iPSC-derived neurons and postmortem brain
tissue. Mol Brain 2012 ; 5 : 35 .

４）Thangapazham RL, Klover P, Wang JA, et al.
Dissociated Human Dermal Papilla Cells Induce Hair

８）Veraitch O, Kobayashi T, Imaizumi Y, et al. Human

Follicle Neogenesis in Grafted Dermal-Epidermal

induced pluripotent stem cell-derived ectodermal

Composites. J Invest Dermatol 2013 .

precursor cells contribute to hair follicle morphogenesis５）Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Inductionof pluripotent stem cells from adult human fibroblasts− 89 −

in vivo. J Invest Dermatol 2013 ; 133 : 1479 - 1488 .

皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子MafB の役割

横浜市立大学生命医科学研究科

片 岡

浩 介

Natural Moisturizing Factor (NMF) in the skin epidermis is a complex mixture of water-soluble compounds such asamino acids. Filaggrin protein is one of the major components of NMF and is digested to amino acids through multi-stepprocessing and modifications. In this study, we focused on the transcriptional regulation of the filaggrin gene expression
during skin epidermal development. We identified an enhancer element upstream of the filaggrin gene and found thata transcription factor MafB activates it. Further elucidation of the mechanism of the filaggrin expression may help tounderstand how NMF are formed and maintained in skin epidermis.

１．緒

く不明である。

言

そこで本研究では、フィラグリンの転写制御やプロセシ

皮膚において水分保持の機能を担っているのは、主としング調節の分子機構を探ることによって、皮膚の水分保持て天然保湿因子（Natural Moisturizing Factor：NMF）と機能の調節機構の一端を明らかにすることを目的とする。

呼ばれる、いわゆる「うるおい成分」である。NMF は、

２．実

フィラグリンなどのタンパク質の分解生成物から複雑な過験

NMF の主たる成分であるフィラグリンタンパク質は、繰

２.１ MafB 欠損マウスの皮膚におけるフィラグリンタ
ンパク質の異常り返し構造を持った巨大なポリペプチド鎖（プロフィラグ

皮膚の角化細胞で発現する転写因子 MafB を欠損するマリン）として合成されたのちに、その繰り返し構造の単位

ウスの皮膚を組織学的に解析し、またフィラグリンに注目へと切り離され、さらにアミノ酸へと分解されて NMF をしてその発現レベルやプロセシングを調べた。

程 を 経 て 形 成 さ れ る こ と が 近 年 明 ら か に な っ て き た。

構成する。NMF は保湿だけでなく皮膚のバリア機能・恒常性維持にも必須であり、例えばフィラグリン遺伝子の変

２. ２

MafB 過剰発現マウスの作製と解析異によって皮外界からの異物・細菌の侵入の防禦能が低下

転写因子 MafB が皮膚の形成とフィラグリンタンパク質

して、アトピー性皮膚炎の発症リスクが増大することもわの発現に及ぼす影響をさらに調べる目的で、MafB を過剰かっている 1）。

発現するマウスを作製し、その表現型を解析した。

フィラグリンタンパク質のプロセシングの過程には、各種の切断酵素（プロテアーゼ）が関与しており、さらに、

２. ３

MafB 欠損マウスにおける遺伝子発現解析

フィラグリンタンパク質のリン酸化やシトルリン化などの野生型および MafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角修飾も必要とされるなど、複雑で精妙に制御されている。

化細胞より RNA を抽出し、フィラグリン遺伝子 mRNA の

これまでに、内外の精力的な研究によって、プロセシング

発現レベルを、定量 PCR 法を用いて検討した。また、網に関わる酵素（プロテアーゼ）などが同定されて、少しず羅的に遺伝子発現の変化を調べる目的で、野生型およびつその過程の分子機構があきらかになりつつあるが 2）、まMafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角化細胞から抽出だ全容の理解には至っていない。特に、フィラグリンの合した mRNA を用いて、マイクロアレイ解析を行った。

成過程（遺伝子発現）の制御機構については、普遍的な転る他には、あまりよく分かっていないのが現状であり、皮

２. ４ フィラグリン遺 伝 子座 周辺の in silico 解 析とECR の同定

膚を構成する角化細胞でのみ特異的に発現する仕組みは全フィラグリン遺伝子座周辺の in silico 解析を行い、発現写因子 Activator Protein 1（AP- 1）の関与 3）が知られてい調節に関わるエンハンサーとして機能する可能性が高い領域（Evolutionally conserved non-coding region; ECR）のRoles of transcription factor MafB in theformation of natural moisturizing factor（NMF）of skin epidermis
Kohsuke Kataoka
Graduate School of Medical Life Science
Yokohama City University

同定を試みた。

２. ５ フィラグリン遺伝子 ECRを介したMafB による転写の活性化− 90 −

同定された ECR を含む DNA 領域をヒト・ゲノム中から

皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子 MafB の役割

クローニングし、
ルシフェラーゼ遺伝子を持つレポーター・

3.2

MafB 過剰発現マウスの作製と、その皮膚の解析

プラスミドに組み込んで、このレポーター・プラスミドと転写因子 MafB が皮膚の形成とフィラグリンタンパク質

MafB 発現ベクターを培養細胞 BHK 21（ハムスター腎繊維の発現に及ぼす影響をさらに調べる目的で、MafB を過剰芽細胞由来）に共発現させ、ルシフェラーゼ活性を測定す発現するマウスを作製することにした。皮膚角化細胞の基ることによって、MafB が ECR 配列を介して転写を活性化

底層で発現するケラチン 14 遺伝子のプロモーター支配下

しうるかどうかを検討した。

で MafB を過剰発現するトランスジェニック・マウスを作３．結

製し、３系統を得ることができた。そのうちの１系統（Tg 2）

果の８日齢の外観を示す（図１）。これらの過剰発現マウス

３.１ MafB 欠損マウスの皮膚におけるフィラグリンタ
ンパク質の異常では、皮膚の過剰な角化が観察され、組織学的な解析から

私たちはこれまでに、bZip タイプの転写調節因子 MafB

し、この表現型は週齢が上がり成体になると次第に消失し、が皮膚の角化細胞で発現していることを見出だしていた。

野生型マウスと違わない外観となった。その一方で、成体

MafB は、マクロファージ 4）や副甲状腺 5）などの組織・細においてはおよそ半分の頻度でパピローマの形成が見られ、胞の分化を司ることがこれまでに明らかにされていたので、それらのパピローマではフィラグリンタンパク質が過剰に角化細胞の分化にも深く関与している可能性が考えられた

産生されていた。

も、角質層が過剰に生成されていることがわかった。ただこれらの MafB 欠損および過剰発現マウスの皮膚の解析ため、MafB 遺伝子を欠損するマウスの皮膚を解析するこから、MafB は皮膚の角化細胞の分化を正に制御することとにした。
組織学的な解析から、MafB 欠損マウスの皮膚では、角が示唆された。

質層の減少と層板顆粒の減少が見られたことから、フィラ
抗フィラグリン抗体を用いた免疫組織染色により、実際に3 . 3 MafB 欠損マウスにおける遺伝子の発現レベルの解析

フィラグリンタンパク質の発現レベルと分布の異常が起き次に、フィラグリンタンパク質の発現低下が、転写調節ていることがわかった。そこで、マウス皮膚よりタンパクのレベルで生じているかどうかを調べるため、野生型およ質 を 抽 出 し、Western blot 法 に よ り 解 析 し た と こ ろ、び MafB 欠 損 マ ウ ス（ 胎 生 18 . 5 日 ）の 皮 膚 角 化 細 胞 よ り

MafB 欠損マウスの皮膚ではフィラグリンタンパク質の発

RNA を抽出し、それぞれにおけるフィラグリン遺伝子

現量とプロセシングが明らかに低下していることが判明しmRNA の発現レベルを、定量 PCR 法を用いて検討したと

グリンタンパク質の量が低下している可能性が予想された。

た。このことは、MafB がフィラグリンから NMF を形成

ころ、野生型マウスのおよそ５分の１にまで低下していたする複数のステップを制御する重要な役割を担っているこ（図２）。フィラグリン遺伝子以外のさまざまな皮膚の角化とを示唆している。

過程に関与する遺伝子について、インヴォルクリン、ロリ
クリンなどの構造タンパク質を中心に調べたが、これらの遺伝子の発現レベルに変化はなかった。

図１ MafB 過剰発現マウスの作製と解析
ケラチン 14 遺伝子プロモーター支配下で MafB を発現する
トランスジェニック・マウスを作製した。得られた３系統のうちの１つ（Tg ２）の外観を野生型（WT）と比較した。

図２ MafB 欠損マウスの皮膚角化細胞における定量 PCR 解析
フィラグリン遺伝子の発現量を、コントロールとした gapdh
遺伝子の発現量によって補正し、野生型マウス（WT）における発現レベルを１とした場合の MafB 欠損マウス（KO）における発現量をグラフ化した。

− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

さらに網羅的に遺伝子発現の変化を調べる目的で、野生域（Evolutionally conserved non-coding region; ECR）の型および MafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角化細胞同定を試みた。このような保存領域は、近傍の遺伝子（こから抽出した mRNA を用いて、マイクロアレイ解析を行の場合フィラグリン遺伝子）の発現調節に関わるエンハンった（図３）。用いたアレイにはフィラグリン遺伝子は含サーとして機能する可能性が高いからである。

まれていないが、フィラグリン以外にもレペチン（フィラ

図４に示すように、フィラグリンタンパク質はこれまで

グリンタンパク質と構造的に類似している）などの角化にに指摘されている通りに動物種間の相同性は低いため、エ

関与する構造タンパク質をコードする遺伝子のいくつかのクソン領域での相同性はほとんど見られない。一方で、遺発現が MafB 欠損マウスでは低下していることがわかった。

伝子の 5’
上流領域には進化的な保存性の高い領域が３カ所

また、意外なことに脂質代謝に関連する酵素などをコードほど見いだされた。このことは、フィラグリン遺伝子の発する遺伝子の発現が上昇していることも判明した。MafB

現調節機構が哺乳類の皮膚形成において重要な役割を担っは転写制御因子として脂質代謝系遺伝子の発現を負に制御ているため、進化を通じて保たれてきたことを示唆していする活性も併せ持つ可能性が考えられた。

る。私たちはこれらの保存領域を、プロモーター近傍側から ECR 1 〜 3 と命名した。

3 . 4 フィラグリン遺伝子座周辺のin silico 解析とECRの同定
次に、フィラグリン遺伝子の発現制御機構を解明する手

3 . 5 フィラグリン遺伝子 ECRを介したMafB による転写の活性化がかりを得るため、フィラグリン遺伝子座周辺の in silico

ECR 1、ECR 2、ECR 3 はそれぞれエンハンサー活性を担解析を行うことにより、進化的に保存度の高い非コード領っている可能性が高いので、これらの領域をヒト・ゲノム

図３ MafB 欠損マウスの皮膚角化細胞のマイクロアレイ解析
MafB 欠損マウス（KO）における mRNA の発現量を野生型
マウス（WT）と比較し、Gene Ontology（GO）解析を行った。

図４ フィラグリン遺伝子上流領域の動物種（哺乳類）間での保存性の in silico 検索
ヒトのフィラグリン遺伝子座（exon1 〜 3）とその上流領域（約 13kb）を、マウス、ラット、ウシ、イヌの相同な領域と ECR ブラウザ（http://ecrbrowser.dcode.org/）を利用して比較した。保存性の高い領域を、
転写開始点の近傍から順に ECR1 〜 3 とした。

− 92 −

皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子 MafB の役割

中からクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子を持つレポ

４．考ーター・プラスミドに組み込んだ。このレポーター・プラ

察

スミドと MafB 発現ベクターを培養細胞 BHK 21（ハムス以上の解析より、転写因子 MafB は、フィラグリン遺伝

ター腎繊維芽細胞由来）に共発現させ、ルシフェラーゼ活

子上流に同定した ECR 2 領域中の MARE - like - 1 配列に結性を測定することによって、MafB が ECR 配列を介して転合することによって、フィラグリン遺伝子の発現を活性化

写を活性化しうるかどうかを検討した（図５）。ECR 1（フすることが推測される。MafB は、皮膚においては角化細ィ ラ グ リ ン 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 近 傍 ）の み で は、胞のうちの有棘細胞に特異的に発現しており、これはフィ

MafB による活性化はほとんど見られなかったが、ECR 1

ラグリン遺伝子の発現が開始する領域であって、フィラグと 2 を連結すると、MafB による顕著な活性化が観察されリンと MafB の発現パターンは一致している。このこととた。ECR 1 と３の組み合わせではそのような活性化は見ら併せて、MafB 欠損マウスの皮膚ではフィラグリン遺伝子れなかった。したがって、MafB は ECR 2 を介してフィラの発現が顕著に低下していることからも、MafB がフィラ

グリン遺伝子の発現を促進すると考えられた。

グリン遺伝子の転写を直接活性化することが示唆される。

さらに、MafB が直接結合する DNA 配列を同定するた

MafB が生体内で直接フィラグリン遺伝子上流に結合するめ、MafB 結合配列に類似した DNA 配列を ECR 中から検かどうかを、今後クロマチン免疫沈降法などを用いて調べ

索 す る と、MafB が 結 合 す る 可 能 性 の あ り そ う な 配 列る必要がある。

（MARE 類似配列）が３つ見つかった。そこで、これらのまた、MafB がフィラグリン以外の遺伝子の発現も制御

配列に塩基置換を導入したレポーター・プラスミドを作成しているかどうかを調べることも、今後検討すべき重要なし、同様にルシフェラーゼ・アッセイによって MafB によるポイントのひとつである。興味深いことに、マイクロアレ活性化を検討した。すると、３つの MARE 類似配列のうイ解析から、MafB は脂質代謝系の酵素をコードする遺伝ちの１つ（MARE - like - 1）を変異させた場合に MafB によ子群の発現を負に制御することが示唆された。脂質代謝は、る 活 性 化 が 低 下 し た。 し た が っ て、MafB は ECR 2 内 のフィラグリンをはじめとする NMF 成分とともに皮膚の保MARE - like - 1 配列に結合することによってフィラグリン

湿 や バ リ ア 機 能 に と っ て 重 要 で あ る こ と を 考 え る と、遺伝子を活性化すると考えられた。

NMF と脂質がバランスよく供給されるような仕組みが存在することが予見され、今後新しい研究分野となりうるだろう。
本研究では、フィラグリン遺伝子の発現に重要だと思われるエンハンサー領域として ECR 2 を同定したが、ECR 2
内には MafB が結合する配列のみならず、皮膚の形成に重要な役割を担っていると考えられるいくつかの転写制御因子が結合しうる配列も見出だされた。組織特異的な遺伝子の発現は、いくつかの転写因子が組み合わさることによって協調的に活性化されることがしばしば見出だされるので、フィラグリンの発現制御においても、MafB がこれらの転写因子群と協調して機能している可能性が充分に考えられる。このようなエンハンサー解析から、NMF の形成や皮膚バリア機能の獲得を担う新規因子（特に転写制御因子）が特定される可能性が見えてきた。近年、フィラグリンの発現を遺伝子レベルで亢進させるような薬剤が発見され、アトピー性皮膚炎の治療薬として期待されていることからも 6）、フィラグリンを含めた皮膚 NMF 関連因子の転写制
御機構の解明は今後ますます重要になると考えられる。

図５ MafB によるフィラグリン遺伝子 ECR の活性化
図中に示す ECR を含むルシフェラーゼ発現プラスミドを、
MafB 発現プラスミドと共に培養細胞 BHK21 にトランスフェ
クションにより導入し、ルシフェラーゼ・アッセイを行った。
ECR1 のみを含むプラスミドを導入した場合のルシフェラーゼ
活性を 1 とした相対値を示す。＊; p<0.01（引用文献）
１）Palmer CNA, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A,− 93 −

Zhao Y, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A,
Campbell LE, Smith FJD, O’Regan GM, Watson
RM, Cecil JE, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ,

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Fleckman P, Lewis-Jones S, Arseculeratne G, Sergeant

Hasegawa K, Zhang C, Yokomizo T, Esaki R, Kuroda

A, Munro CS, Houate BE, McElreavey K, Halkjaer

E, Yoh K, Kudo T, Nagata M, Greaves DR, Engel JD,

LB, Bisgaard H, Mukhopadhyay S, and McLean WHI.

Yamamoto M, and Takahashi S. MafB is essential

Common loss-of-function variants of the epidermal

for renal development and F 4 / 80 expression in
macrophages. Mol. Cell. Biol., 26 , 5715 - 5727 , 2006 .

barrier protein filaggrin are a major predisposing
factor for atopic dermatitis. Nat. Genet., 38 , 441 - 446 ,５）Kamitani-Kawamoto A, Hamada M, Moriguchi T,
Miyai M, Saji F, Hatamura I, Nishikawa K, Takayanagi

2006 .
２）Matsui T, Miyamoto K, Kubo A, Kawasaki H,

H, Hitoshi S, Ikenaka K, Hosoya T, Hotta Y, Takahashi

Ebihara T, Hata K, Tanahashi S, Ichinose S, Imoto

S, and Kataoka K. MafB interacts with Gcm 2 andI, Inazawa J, Kudoh J, and Amagai M. SASPase

regulates parathyroid hormone expression andregulates stratum corneum hydration throughparathyroid development. J. Bone Miner. Res., 26, 24632472 , 2011 .

profilaggrin-to-filaggrin processing. EMBO Mol. Med.,

６）Otsuka A, Doi H, Egawa G, Maekawa A, Fujita T,

3 . 320 - 333 . 2011 .
S-I, Steinert PM, and Markova NG. Activator

Nakamizo S, Nakashima C, Nakajima S, Watanabe T,

protein 1 activity is involved in the regulation of

Miyachi Y, Narumiya S, and Kabashima K. Possible

the cell type-specific expression from the proximal

new therapeutic strategy to regulate atopic dermatitis

promoter of the human profilaggrin gene. J. Biol.

through upregulating filaggrin expression. J. Allergy

Chem., 271 , 24105 - 24114 , 1996 .

Clin. Immunol., 133 , 139 - 146 , 2014 .

３）Jang４）Moriguchi T, Hamada M, Morito N, Terunuma T,− 94 −

スキン伝達物質 ATPと皮膚のアンチエイジングに関する研究

山梨大学医学部薬理学

小 泉

修 一

Skin cells release ATP that affects a big variety of functions of adjacent cells. However, the mechanisms underlying its
release remain largely unclear. Here, focusing on VNUT (vesicular nucleotide transporter), we show that skins release ATPby a mechanism of Ca2+-dependent exocytosis in normal human epidermal keratinocytes.

１．緒

ンチエイジング効果を有する薬物の開発に直接結びつく基言

礎データを提示することを目的とする。

老化は避けられない問題であるが、適切な処置で老化を２．実遅らせる所謂「抗老化（アンチエイジング）」により、生活の質（QOL）を格段に高めることができる。皮膚は体を

2.１

験

細胞培養

覆う最も大きな臓器であり、体内、細胞内を外界から守る

ヒト正常表皮ケラチノサイト（NHEK）の培養は既報に重要な役割を果たすが、最外層に位置することから美容の従った 1 , 2）。ATP 放出は、既報によるルシフェリンルシフ

側面からも、その老化は重要な問題となる。皮膚は老化にェラーゼ法 3）により行った。また、ATP 開口放出は、蛍より、表皮の代謝回転、角質層の機能不全によるバリア機

光 ATP（MANT-ATP）及び quinacrine をプローブとして能及び水分保持機能が低下し、さらに皮脂の分泌が減少す

用い、それぞれ共焦点レーザー顕微鏡及び全反射蛍光顕微る。こうした皮膚の質的な変化等により皮膚の乾燥、シミ、鏡（TIRF）解析により可視化した。

シワ及びたるみが生じる。現在、アンチエイジング効果を

3．結果及び考察呈するとして頻用される外用剤に、レチノイドがある。レチノイドによるアンチエイジング効果の分子メカニズムに

3 .１ スキン伝達物質 ATP 放出の分子メカニズムの解明は不明な点が多く、また、レチノイドによる、色素沈着、申請者らは既に、NHEK を用いた研究から、NHEK は炎症等の負の作用も少なからず報告されている。申請者は各種刺激に応じて ATP を細胞外に放出することを明らか

これまでに、細胞外 ATP 及びその受容体である P 2 受容体とした（Koizumi et al. 2004）。そこで、先ず Ca 2 + イオノ

が表皮ケラチノサイト間の情報連絡で最も重要な因子の一フォア（ionomycin）により惹起される NHEK からの ATP

つであること、さらに、ATP/P 2 Y 2 受容体シグナルが各放出を luciferine-luciferase 法により観察した。図１のよう

種刺激及び炎症時に劇的に亢進すること、レチノイドがに、NHEK は ionomycin の濃度依存的に、細胞外に ATP

P 2 Y 2 受容体の発現を亢進させることをこれまでに明らかを放出した。この放出は、細胞内 ATP キレート剤であるとしてきた。レチノイドの副作用に、ATP/P 2 Y 2 受容体

BAPTA-AM に よ り 消 失 し、 小 胞 型 H+ATPase の阻害剤

シグナルの亢進が示唆されているが、これらのシグナルと

bafilomycin A 1 によっても有意に抑制された（図２）。こ皮膚の機能、老化にどのような影響を与えるかについては、

れらは、NHEK からの ATP 放出が Ca 2 + 依存的であること、殆ど解っていない。また、ATP シグナルの引き金となる

酸性小胞依存的であることを意味し、ATP 放出が開口放

ATP 放出のメカニズムは全く明らかとされていない。本

出であることを強く示唆する。そこで、開口放出に関係す研究では、皮膚から放出される「スキン伝達物質」である

る SNARE 蛋白質をボツリヌス毒素により切断したところ、

ATP 放出の分子メカニズム、さらに皮膚 ATP/P 2 Y 2 受

やはり ATP の放出は有意に抑制された（データは示さず）。

容体活性化が表皮ケラチノサイトの生理機能に与える影響

従って、NHEK は開口放出のメカニズムにより ATP を細及びその分子機序を精査することにより、新しい皮膚のア

胞外に放出していることが明らかとなった。

Anti-aging of skin mediated by skintransmitter ATP
Schuichi Koizumi
Department of Neuropharmacology,
Interdisciplinary Graduate School of
Medicine and Engineering, University of
Yamanashi

3.2

スキン伝達物質 ATP 開口放出の可視化

次に、NHEK における ATP 含有小胞の有無、またこのATP 小胞が開口放出により放出される様子を可視化し、皮膚における ATP の開口放出の存在を直接明らかとした。
NHEK を蛍光 ATP アナログである MANT-ATP と８時間
インキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡（ex. 405 nm）− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Figure 1 The effects of BAPTA-AM and bafilomycin A1 on ionomycin (IM)-induced release of ATP from
NHEKs
Ionomycin evoked an increase in extracellular ATP in a concentration-dependent manner. The ionomycin（5µM）-evoked release of ATP was significantly decreased by BAPTA-AM, an intracellular Ca2+ chelator
or bafilomycin A1, an inhibitor of vesicular H+-ATPase. ***P<0.001 vs. Basal; ###P<0.001 vs. ionomycin（5µM）．

Figure 2 Visualization of exocytosis of ATP
ATP vesicles were visualized by the fluorescent ATP analogue MANT-ATP (A) and quinacrine (B) in
NHEKs. MANT-ATP and quinqcrine signals were obtained from confocal laser microscopy and TIRF
microscopy, respectively. (C) Schematic cartoon of exocytosis of quinacrine-positive vesicles. (D) The
time course of the de-staining of quinacrine-fluorescence by ionomycin in single-vesicles in the absence(left) and presence of BAPTA-AM (right).

− 96 −

スキン伝達物質 ATP と皮膚のアンチエイジングに関する研究を用い、蛍光 ATP のシグナルを観察した。図 2 A のように、

3.3

スキン伝達物質 ATP 開口放出の責任分子同定

蛍光 ATP は小胞状の形態を呈し、細胞膜近傍に多く観察

ATP が開口放出されるためには、細胞内で細胞質のさ れ た。 次 に、 こ の キ ネ テ ィ ッ ク ス を 解 析 す る た め、ATP を小胞に取り込む小胞型 ATP トランスポーターの存

NHEK をよりキネティックス解析に適した quinacrine と在が必要である。2008 年、森山らのグループは、このトラ

15 分間インキュベートし、全反射顕微鏡（TIRF）にてそンスポーターとして SLC 17 A 9 を見出し、VNUT（vesicularの挙動を観察した。図 2 B のように、quinacrine シグナル

nucleotide transporter）と命名した 4）。先ず、我々は皮膚も小胞状の形態を呈した。もし開口放出が惹起される場合に VNUT が存在するか否かを確認した。VNUT 抗体を用には、図 2 C にしめすように、この quinacrine 蛍光が、細いた免疫染色法により皮膚切片（図 3 a）及び NHEK（図胞膜（PM）に移動・ドッキング・開口することにより細3 b）に VNUT 陽 性 シ グ ナ ル を 見 出 し、 ま た こ れ は胞外に出て行くため、quinacrine 蛍光の消失が惹起されるWestern blotting によっても特異的バンドとして確認できはずである。Ionomycin を添加すると、quinacrine 蛍光は、た（ 図 3 c）。 こ の VNUT を RNA 干 渉 法（VNUT siRNA）

小 胞 毎 に こ と な る キ ネ テ ィ ッ ク ス で 消 失 し、 こ れ はによりノックダウンすると（図 4 a）、NHEK からの ATP 放BAPTA-AM によりほぼ消失した（図 2 Ｄ）
。以上、NHEK

出は有意に抑制された（図 4 b）5）。従って、VNUT が上述

は ATP を放出すること、その放出メカニズムは開口放出した皮膚の ATP 開口放出の責任分子であることが明らかであること、さらにその開口放出を可視化することが可能

となった。

となった。

Figure 3 Expression of VNUT in the human epidermis andepidermal keratinocytes.
Immunohistochemical and immunocytochemical staining offrozen section of human skin (a) and NHEK (b), respectively,
with an anti-VNUT antibody. For western blot analysis, total
cell lysates were prepared and separated by SDS-PAGE.
The antibody that specifically recognizes VNUT protein
detected major bands at 65 kDa and 68 kDa (c).

Figure 4 Inhibition of ionomycin-induced ATP release by
VNUT siRNA.
(a) VNUT mRNA was significantly reduced in a timedependent manner in cells transfected with VNUT siRNA（n=3, black bar）．(b) Transfection with VNUT siRNA for 72
hr（n= 3, black bar）significantly decreased ionomycinevoked ATP release versus scrambled RNA-transfection atconcentrations of 2 and 5µM of ionomycin. *p<0.05,***p<0.001 vs. scrambled siRNA.

− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

細胞外 ATP が種々の疾患と関連すること 3）、シワやシミの治療に用いられるレチノイン酸が ATP 受容体発現に（参考文献）
１）Koizumi S, Fujishita K, Inoue K, et al.: Ca2+waves in

影響すること 6）等、これまで ATP/P 2 受容体シグナルとkeratinocytes are transmitted to sensory neurons: the

皮膚の機能制御に重要な役割を果たすことを示してきた。

involvement of extracellular ATP and P 2 Y 2 receptor
activation. Biochem J. 2004 ; 380 : 329 - 338 .

今回、この ATP が放出されるメカニズムの一端を明らかにすることが出来た。また、この ATP 放出の責任分子

２）Inoue K, Denda M, Tozaki H, et al.: Characterization

VNUT は、これまでの我々の脳における研究により、種々

of multiple P 2 X receptors in cultured normal humanの炎症時に発現が著しく亢進することが明らかとなっていepidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 2005 ; 124 :7）

756 - 763 .

る 。今後、VNUT を切り口としてスキン伝達物質 ATP が、老化や疾患とどのように関連性を明らかにする予定である。

３）Kawamura T, Ogawa Y, Nakamura Y, et al.: Severedermatitis with loss of epidermal Langerhans cells in

謝辞human and mouse zinc deficiency. J Clin Invest. 2012 ;122 : 722 - 732 .

本研究遂行にあたり、御助成頂いた公益財団法人コスメ
トロジー研究振興財団に心から感謝申し上げます。また、

４）Sawada K, Echigo N, Juge N, et al.: Identification of a

山梨大学医学部薬理学講座、井上かおり、小松龍平、柴田

vesicular nucleotide transporter. Proc Natl Acad Sci U
S A. 2008 ; 105 : 5683 - 5686 .

圭輔、藤下加代子の各氏に感謝致します。

５）Inoue K, Komatsu R, Imura Y, et al . : Mechanism
Underlying ATP Release in Human Epidermal Keratinocytes.

本研究の一部は、すでに以下の様に公表した。

J Invest Dermatol. 2014 ; in press:

Inoue, K., Komatsu, R., Imura, Y., Fujishita, K., Shibata, K.,( 2014 ) Mechanisms

６）Fujishita K, Koizumi S & Inoue K: Upregulation ofunderlying ATP release in human epidermal keratinocytes.

P 2 Y 2 receptors by retinoids in normal human epidermal

J. Invest. Dermatol., in press.

keratinocytes. Purinergic Signal. 2006 ; 2 : 491 - 498 .

Moriyama, Y. and Koizumi, S.

７）Imura Y, Morizawa Y, Komatsu R, et al.: Microglia
release ATP by exocytosis. Glia. 2013 ; 61 : 1320 - 1330 .

− 98 −

コラーゲンの線維形成を調節するプラチナ錯体に関する研究

早稲田大学理工学術院

小 出

隆 規

Excessive deposition of collagen fibers in tissues causes various fibrotic diseases. Inhibition of the collagen fibrilformation is thus regarded as a promising mechanism for the development of antifibrotic drugs. A cisplatin-DMSO complex,
which was obtained as a potential inhibitor of the in vitro collagen fibril-formation, was revealed to interact with specificsites on the collagen triple helix. Collagen fibril-deposition in a cell culture system was inhibited by the treatment with thecisplatin-DMSO complex. The cisplatin-DMSO complex was revealed to be less toxic to cultured cells than cisplatin.

１．緒る。この抗体は in vitro でⅡ型コラーゲンの細線維形成を言阻害するが、Ⅰ型コラーゲンに対する阻害能は有していな

コラーゲンは生体内で最も多量に存在する、３重らせん

かった 10）。また、テロペプチドのアミノ酸配列を模した合構造を持つ細胞外マトリックスタンパク質である。コラー

成ペプチドもコラーゲン細線維形成を阻害することが報告

ゲンには 28 種類の異なる型が存在し、高次構造により複されている。この実験では、Ⅰ型コラーゲンの C 末端のテ数のサブファミリーに分類される。その中でも全コラーゲ

ロペプチドを模したペプチドがⅠ型コラーゲンの細線維形ンの９割を占めるⅠ型コラーゲンに代表される、線維形成成を阻害することが示されている 1 , 4）。

型コラーゲンに着目する。線維形成コラーゲンの３重らせ

本研究の目的は、低分子量のコラーゲン細線維形成阻害

ん分子は、長軸方向に約４分の１ずつずれながら自己集合

物質を探索し、得られた化合物を線維化疾患治療薬のリーし、細線維を形成する。細線維はさらに集合してコラーゲ

ドとして応用することである。我々は、以前報告したハイン線維を形成する。コラーゲンの規則正しい自己集合におスループットスクリーニングシステム 11）を用いて探索を行い、いて、コラーゲン分子が全て同じ方向を向いていること、

コラーゲンの細線維形成を阻害する化合物として、抗がんコラーゲンの N および C 末端に存在する非３重らせん領域

剤 で あ る、cis-diamminedichroloplatinum（II）（cisplatin）（テロペプチド）のアミノ酸配列の重要性などが報告されてを見出した。しかし、コラーゲン細線維形成阻害効果を有1−4）しているのは、cisplatin そのものではなく、溶媒であるジコラーゲン線維は組織や臓器の強度を維持するだけでな

メ チ ル ス ル フ ォ キ シ ド（DMSO）と 反 応 し て 生 成 し た

いるが、その詳細なメカニズムは未だ解明されていない。

く、細胞の接着・移動・分化などの制御など生体維持にも

cisplatin 誘導体であることが示唆された。

重要な機能を発揮している。しかし、コラーゲン線維が過本報告では、cisplatin 誘導体のコラーゲン細線維形成阻剰に生成されると、肝硬変、肺線維症、強皮症などの線維害効果の解析、cisplatin 誘導体とコラーゲン間の相互作用、化疾患を引き起こす。これまでに、コラーゲンの線維形成

他のプラチナ系抗がん剤を用いた構造活性相関、cisplatinを阻害する戦略として、（1）コラーゲンの生成を促進する誘導体の活性本体の推定、および培養細胞系を用いた検討

5 − 7）

8）、（2）コラーゲンの合成を阻害する 、についてその結果を述べる。なお、以下では cisplatin と（3）コラーゲン分子間のクロスリンクを阻害する 9）など、

DMSO を混合して生じた活性物を cisplatin（DMSO）と表

いくつかのメカニズムが提示されている。 本研究では、記する。

因子を阻害するコラーゲン分子に直接働いてその細線維形成を阻害する方２．実法に着目した。

験

これまでに、コラーゲンの分子間の自己集合を阻害する

2 .1 コラーゲン細線維の走査型電子顕微鏡
（SEM）
観察

物質として、Ⅱ型コラーゲンに対する抗体が報告されていⅠ型コラーゲン溶液 20 µl をカバーガラスにコートし、自然乾燥させた。コラーゲンをコートしたカバーガラスを、
buffer（20 mM sodium phosphate（pH 7 . 4）、100 mM
NaCl、10 µM cisplatin（DMSO））２ml に入れて、37℃で

A platinum complex that inhibits thecollagen fibril-formation
Takaki Koide
Faculty of Science and Engineering,
Waseda University

２時間インキュベートした。室温で２% グルタルアルデヒ
ド水溶液にて１時間固定した後に、濃度の異なるエタノー
ルで段階的に脱水した。次に t -ブタノール溶液にて置換し、凍結乾燥した。白金を約３ nm 蒸着した後に SEM（HITACHI− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

2 . 5 HUVEC の タンパク 質 産 生 に お けるcisplatin（DMSO）の影響（Western Blotting）

S- 3000 N）装置を用いて加速電圧 15 kV にて観察した。

2.2

コラーゲン細線維化阻害アッセイ

HUVEC を EGM- 2 培 地 中 100 µM cisplatin（DMSO）
、
11）

。

0 . 1 % DMSO、0 . 2 mM L - アスコルビン酸リン酸エステル

吸光度測定には Greiner 384 well UV-star plate を用いた。

マグネシウム塩 n 水和物となるようにサンプルを加え、37

プレート上で、コラーゲン溶液を含む反応溶液の調製を行℃で３日間培養した（毎日培地交換とサンプルの添加を行い、プレートリーダーを用いて、37℃で 2 . 5 時間、５分ごい、回収した培地は４℃で保存した）。この際、cisplatinとに 313 nm における吸光度を測定した。

（DMSO）なしで 0 . 1 % DMSO、0 . 2 mM L- アスコルビン酸

アッセイは、Okano-Kosugi らの論文に従って実施した

細線維化阻害能評価は、コラーゲンのみの場合の最終測

リン酸エステルマグネシウム塩 n 水和物のみとなるように定点（145 分）における 313 nm の吸光度の値を線維形成 100

サンプルを加えたものをコントロールとして作製した。イ％とし、サンプル存在下での吸光度を線維形成（%）で表

ンキュベート後、PBS で細胞を洗浄し、抽出バッファー

すことにより評価した。

（50 mM Tris-HCl（pH 8 . 0）、150 mM NaCl、5 . 0 mM

線維形成（%）= A× 100 /Δ

EDTA、１% NP- 40、2 . 0 mM N- ethymaleimide、2 . 0 mM

（A : サンプル存在下の吸光度変化、Δ: コラーゲンのみ

4（- 2 - aminoethyl）benzensulfonyl fluoride、1 µg/mlの吸光度変化）

leupeptin、1 µg/ml pepstatin）を１ml 加えて４℃で 15 分

特に記述がない場合、濃度はすべて仕込み終濃度とした。

間放置した。細胞を剥離回収し、1 . 5 ml tube に溶液を移して遠心分離を行い（13 , 000 min−1、４℃、15 分間）、上

2.3

ペプチド合成清（コントロール、cisplatin（DMSO）添加サンプル共にペプチド鎖の合成は、Rink amide resin を担体として通1 . 45 ml）と沈殿に分けた。以下、ⅰ上清、ⅱ沈殿、ⅲ保存

常の Fmoc 固相法により行った。ペプチドの脱保護及び固していた培地の SDS - PAGE のサンプル作製法を示す。

相担体からの切り出しは、水 : m- クレゾール : チオアニソ

ⅰ上清：上清の全量（1 . 45 ml）に２% デオキシコール酸ナール : エタンジチオール : TFA（2 : 2 : 2 : 1 : 33 , v/v, ５トリウム 10.3µl、100% トリクロロ酢酸 124.7µl を加えて、ml）中で１時間（Arg がペプチド鎖に含まれている場合は４℃で 30 分間放置した後に遠心分離（13 , 000 min−1、４

4 時間）振とうすることにより行った。ペプチドの精製お℃、５分間）を行い上清と沈殿に分けた。沈殿をアセトよび純度の確認は逆相 HPLC を用い行い、MALDI-TOF

ンで３回洗浄した後に、デシケーターで乾燥させた。乾型質量分析により目的物であることを確認した。

燥した沈殿を 145 µl の 1 ×SDS- サンプルバッファーに溶解し、SDS- サンプルとした。

2.4細胞が分泌したコラーゲンの共焦点顕微鏡観察

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を EGM- 2 培地を用い

ⅱ沈殿：沈殿を 145 µl の 1 ×SDS- サンプル buffer に溶解し、SDS- サンプルとした。

てガラスベースディッシュ上でコンフルエントになるまで

ⅲ培地：回収した培地 10 ml に２% デオキシコール酸ナト

培 養 を 行 っ た 後 に、100 µM cisplatin（DMSO）、0 . 1 %リウム 71 µl、100 % トリクロロ酢酸 860 µl を加えて、４

DMSO、0 . 2 mM L -アスコルビン酸リン酸エステルマグネ℃で 30 分間放置した後に遠心分離（13 , 000 min−1、４℃、シウム塩 n 水和物となるようにサンプルを加え、37℃で３５分間）を行い上清と沈殿に分けた。沈殿をアセトンで日間培養した（毎日培地交換とサンプルの添加を行った）。

３回洗浄した後に、乾燥させた。乾燥した沈殿を 500 µl

この際、cisplatin（DMSO）なしで 0 . 1 % DMSO、0 . 2 mMの 1 ×SDS- サンプルバッファーに溶解し、電気泳動用サ

L -アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩 n 水和物

ンプルとした。

のみを加えたものをコントロールとした。培養後、PBS（+）

ⅰ、ⅱ、ⅲで作成した SDS - サンプルを５% ゲルにて電（1 . 0 mM CaCl 2、0 . 5 mM MgCl 2）で 細 胞 を 洗 浄 し、 ４%気泳動し、PVDF に３時間トランスファーを行った。トラホルムアルデヒド /PBS にて４℃で 15 分間固定した。PBS

ンスファー後、メンブレンを５% スキムミルク /TBS に浸（+）で洗浄した後に 10 % FBS、５% スキムミルク /PBS

け、終夜４℃でブロッキングを行った。メンブレンをにて室温で 30 分間ブロッキング処理を行った。PBS（+）

TBS -T（１% Tween 20）で洗浄した後に、1 / 1000 anti-

で 洗 浄 後、1 / 100 anti-collagen type I, rabbit polyclonalcollagen type Ⅰ , rabbit polyclonal antibody/ １% スキム

antibody/ 10 % FBS、５% BSA/PBS を添加し、室温で１

ミルク /TBS を５ml メンブレンに乗せて室温で 50 分間静時間静置した。PBS（+）で洗浄後、1 / 20 FITC-goat anti-

置した。TBS - T で洗浄した後に、1 / 2000 goat anti-rabbit

rabbit IgG antibody/ 10 % FBS、５% BSA/PBS を添加し

IgG-AP antibody/１% スキムミルク /TBS を５ml メンブ

室温で１時間静置した。PBS（+）で洗浄後、共焦点顕微

レンに乗せて室温で 30 分間静置した。TBS -T で洗浄した鏡にて観察を行った。

後に、alkaline phosphatase conjugate kit（BIO RAD）を− 100 −

コラーゲンの線維形成を調節するプラチナ錯体に関する研究

存在下で形成したコラーゲン細線維（Fig. 1 B）は線維の直用いて、バンドを可視化した。

径が小さく、また線維の全体量が減少していることがわか

2.6

Cisplatin（DMSO）の細胞毒性の検討った。この結果より、cisplatin（DMSO）はコラーゲンの

HeLa 細 胞 を 96 穴 マ イ ク ロ プ レ ー ト に 無 血 清 培 地
HFDM- 1 を用いて 100 µl ずつ播種し（3000 cells/well）、37集合を阻害し、細線維の形成を抑制していることがわかった。

℃で 24 時間培養した。培地を新しいものに交換した後に、各濃度の cisplatin（DMSO）（あるいは cisplatin（saline））、
１% DMSO（saline に 溶 解 し た サ ン プ ル の 場 合 は 0 %3 . 2 Cisplatin（DMSO）がコラーゲン３重らせん構造に与える影響DMSO）となるようにサンプルを加え、37℃で 48 時間培養

Cisplatin（DMSO）と反応させたコラーゲンの円偏光二した。その後、cell counting kit- 8 を 10 µl 加え 37℃で１時

色性（CD）スペクトルを測定した。その結果、３重らせん

間インキュベートして生細胞を呈色し、450 nm における構造に特有の 225 nm 付近の正のコットン効果が観察され吸光度を測定することにより生細胞数を定量した（n= 3）。

た（Fig. 2 ）。算出した Rpn 値（CD 極小絶対値と極大絶対値の比）は 0 . 11 であり、天然のコラーゲン（0 . 13）と同程度

３．結果と考察の値であった 12）。このことから、cisplatin（DMSO）を作

3 .1 Cisplatin（DMSO）存在下で形成したコラーゲン
細線維の形態用させたコラーゲンは、元の３重らせん構造をほぼ保持しCisplatin（DMSO）存在下でコラーゲンの細線維を形成のコラーゲン細線維形成阻害効果は、コラーゲンの３重らさせ、それを SEM にて観察した。その結果、正常なコラ

せん構造を変性させることによるものでないことが強く示

ーゲン細線維（Fig. 1 A）と比較して、cisplatin（DMSO）

唆された。

A

ていることがわかった。これにより、cisplatin（DMSO）

B

Fig. 1 SEM images of the collagen fibrils. A, Type I collagen only; B, Type I collagen plus
cisplatin（DMSO）．Scale bar = 2 µm.

Fig. 2

CD spectrum of cisplatin（DMSO）-bound type I collagen.

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3 . 3 コ ラ ー ゲ ンとcisplatin（DMSO）と の 結 合 の
stoichiometry

るために cisplatin（DMSO）と相互作用するアミノ酸を調

コラーゲン１分子に結合する cisplatin（＝ Pt）の数を定

らせんペプチドを合成した（Table 1）。合成したペプチド量した。Ⅰ型コラーゲンと cisplatin（DMSO）を溶液内でが ３ 重 ら せ ん 構 造 を 保 持 で き る よ う に、Gly-Pro-Hyp

べた。そのために用いるツールとして、コラーゲン様３重相互作用させ、限外濾過により遊離の cisplatin を分離した。 （Hyp= 4 -hydroxyproline）繰り返しをホスト配列として用遊離の cisplatin を原子吸光測定により定量し、仕込んだい、プラチナ原子に対して配位能を有する側鎖を持つアミcisplatin 量から差し引くことにより、コラーゲンに結合しノ酸（Met, His, Ser, Thr, Glu, Asp, Lys, Arg）をそれぞれている cisplatin の数を見積もった。その結果、未変性コラ

ホスト配列ではさんだ。これらペプチドが 37℃で、３重ーゲン１分子に対して cisplatin は約３〜４個結合しうるもらせん構造をとっていることは CD スペクトル測定によりのと見積もられた（Fig. 3）。一方、熱変性させたコラーゲ

確認した。

ン（ゼラチン）を用いた場合には、明確な結合飽和曲線をペプチドと cisplatin（DMSO）を中性バッファー内でプ描かず、非特異的吸着が示唆された。これにより、コラー

レ イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 に コ ラ ー ゲ ン 溶 液 と 混 合 し、ゲンが３重らせん構造を取ることによって特異的な結合部

cisplatin（DMSO）のコラーゲン細線維形成阻害効果を実位がコラーゲン上に生じ、そこに cisplatin（DMSO）が結験 2 . 2 に示した方法によって調べた。このアッセイで、合合するものと考えられた。

成したペプチド自身がコラーゲンの細線維形成に影響を及
ぼさないことは別途確認した。Fig. 4 に示すように、Met

3 . 4 コラーゲン上におけるcisplatin（DMSO）結合部
位の推定及び His を含んだペプチド pep-H、pep-M の共存によって、

次に、cisplatin のコラーゲン上の特定結合部位を推定すわかった。これは、cisplatin（DMSO）が３重らせんペプ

cisplatin（DMSO）の線維形成阻害効果が減弱することがTable 1 Collagen-like peptides tested for the cisplatin（DMSO）- binding.

Fig. 3 Binding of platinum to native and denatured type I
collagen.

Fig. 4 Identification of amino acids responsible for the cisplatin（DMSO）- binding.

− 102 −

コラーゲンの線維形成を調節するプラチナ錯体に関する研究

チド上のペプチドに含まれた Met 及び His に結合し、コラ

NH 3 の２つが DMSO に置換した２置換体錯体が生成する

ーゲンと結合することができなくなったためであると考えことがわかった。

られる。この結果から、コラーゲン上の cisplatin（DMSO）

Cisplatin の構造異性体であるtransplatin、そしてcisplatin と結合部位には Met あるいは His 残基が含まれるものと推定

同 様 に プ ラ チ ナ 系 抗 が ん 剤 で あ る carboplatin とされた。

oxaliplatin（Fig. 6 ）の DMSO 溶液および水溶液について
もコラーゲン細線維形成阻害効果を有するかを、同様の方

3.5

Cisplatin（DMSO）に含まれる活性本体の推定法によって調べた。その結果、transplatin の DMSO 溶液

Cisplatin と DMSO との反応による生成物を調べるため

のみが、cisplatin（DMSO）と同程度の阻害効果を有するに、cisplatin（DMSO）を ESI-TOF MS によって分析した。

ことがわかった（Table 2 ）。次に cisplatin と同様に、化合その結果、m/z = 257 , 288 , 307 , 343 , 367 , 403 の６つのピ

物 の DMSO 溶 液 を ESI-MS に よ り 分 析 し た。 そ の 結 果、ークが検出された（Fig. 5）。解析の結果、m/z = 288 , 307 ,Fig. 5 に 示 し た 構 造 と 推 定 さ れ る ピ ー ク が 検 出 さ れ た

343 , 367 , 403 それぞれのピークは、［Pt（NH 3）（DMSO）］， （data not shown）。この結果より、阻害能を持つ cisplatin［Pt（NH 3）］，［Pt（NH 3）（DMSO）］+，［Pt
2（DMSO）
2（Cl）と transplatin の DMSO 溶 液 に は 共 通 し て Cl − の 1 つ が+（NH 3）（DMSO），［Pt（NH 3）（Cl）（DMSO）
2］2］ に相当した。

DMSO に 置 換 し た 錯 体 が 検 出 さ れ た。 こ の 結 果 よ り、

今回得られた MS の結果は以前報告されたものと同様であDMSO の １ 置 換 体 で あ る［Pt（NH 3）（Cl）（DMSO）］+ が2

13）

った 。これにより、cisplatin は DMSO と反応すると少活性本体の候補として考えられた。

なくとも、Cl − が DMSO に置換した１置換錯体と、Cl − とFig. 5

ESI-MS analysis of cisplatin after incubation in DMSO.

Table 2 Inhibitory activity of platinum-containing cancer drugs
against collagen-fibril formation.

Fig. 6Structures of platinum-containing anticancer drugs.

− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3 . 6 HUVEC が分 泌するコラーゲン細線 維に対するcisplatin（DMSO）の影響を 知 る た め に、cisplatin（DMSO）が 含 ま れ た 培 地 で

培 養 細 胞 が 分 泌 す る コ ラ ー ゲ ン に 対 す る cisplatin

画分および培地の３種類に関して Western Blotting を行（DMSO）の 細 線 維 形 成 阻 害 効 果 の 作 用 を 評 価 し た。

い、コラーゲンの含有量を評価した（Fig. 8）。その結果、

Cisplatin（DMSO）を含んだ培地で HUVEC を培養し、細cisplatin（DMSO）を添加した場合と添加していない場合

胞外のコラーゲンを免疫染色した後に共焦点顕微鏡にて観における cell layer の可溶性画分、不溶性画分および培地察を行った。その結果、層状に蓄積したコラーゲン線維がに含まれるコラーゲン量はほぼ変わらないことが示された。

染 色 さ れ て い る コ ン ト ロ ー ル（Fig. 7 A）と 比 較 し て、したがって、cisplatin（DMSO）のコラーゲン細線維形成

cisplatin（DMSO）を作用させた場合、細胞付近に細い線

阻害効果は、細胞のコラーゲン産生阻害によるものではな

維が凝集し、ドット型の染色が見られた（Fig. 7 B）
。つまく、分泌後の細線維形成阻害によることが明らかになった。

HUVEC を３日間培養し、cell layer の可溶性画分、不溶性

り細胞が分泌したコラーゲン分子に cisplatin（DMSO）が作用することで、正常なコラーゲン細線維形成が阻害されたと考えられる。

3.8

Cisplatin（DMSO）の細胞毒性

Cisplatin（DMSO）の細胞毒性を調べるために、HeLa細胞を cisplatin（DMSO）および生理食塩水に溶解した

3 . 7 培 養 細 胞 のタンパク質 産 生に 対 するcisplatin（DMSO）の影響

cisplatin を含んだ培地で 48 時間培養し、細胞の生存率を

3 . 6 で示した cisplatin（DMSO）による細線維形成阻害

存的な細胞毒性が、cisplatin（DMSO）では大幅に低くなっ効果が細胞によるコラーゲン産生阻害によるものかどうかていることが示された（Fig . 9）。Cisplatin の DMSO 溶液測定した。その結果、cisplatin（saline）に見られる濃度依

Fig. 7 Confocal microscopic images of collagen fibrils secreted by HUVEC. A,
control; B, treated with 100 µM cisplatin（DMSO）．Scale bar = 30 µm

Fig. 9Fig. 8 Collagen production by HUVEC is
not inhibited by the treatment with cisplatin（DMSO）．

Cytotoxicity of cisplatin（saline）and cisplatin（DMSO）to HeLa cells.

− 104 −

コラーゲンの線維形成を調節するプラチナ錯体に関する研究の細胞毒性が減少する例は以前に報告されているが 13 − 15）、

J.Cell Sci., 108 , 985 - 1002 , 1995 .

本実験では無血清培地を用いることにより、血清に含まれ６）Serra R, Crowley MR,: Mouse models of transforming

るアルブミン等のタンパク質への cisplatin の非特異的な結growth factor beta impact in breast development and合の可能性を排除した条件で行ったため、より正確な

cancer, Endocr.Relat.Cancer, 12 , 749 - 760 , 2005 .

cisplatin（DMSO）の細胞毒性についての結果を得ること

７）Rhett JM, Ghatnekar GS, Palatinus JA, O’
Quinn

ができたものと考えられる。以上の実験結果より、cisplatin

M, Yost MJ, Gourdie RG,: Novel therapies for scar

は DMSO に 溶 解 す る こ と で DMSO と 反 応 し、 低 毒 性 のreduction and regenerative healing of skin wounds,

cisplatin 誘導体を生成することが推定された。

Trends Biotechnol., 26 , 173 - 180 , 2008 .

４．総８）Riley DJ, Berg RA, Edelman NH, Prockop DJ,:

括Prevention of collagen deposition following pulmonary

In vitroでのランダムスクリーニングから得られたcisplatin（DMSO）は、コラーゲンの細線維化を培養細胞レベルでoxygen toxicity in the rat by cis- 4 -hydroxy-L-proline,
J.Clin.Invest., 65 , 643 - 651 , 1980 .

抑 制 す る こ と が 明 ら か に な っ た。 そ の 活 性 発 現 に は９）Chang K, Uitto J, Rowold EA, Grant GA, Kilo

DMSO がプラチナ原子に配位していることが必須であっ

C, Williamson JR,: Increased collagen cross-

た。また、この誘導体化によって cisplatin の細胞毒性がほlinkages in experimental diabetes: reversal by beta-と ん ど 消 失 し た。 デ ー タ は 示 さ な か っ た が、cisplatinaminopropionitrile and D-penicillamine, Diabetes, 29 ,（DMSO）は、コラーゲンだけでなく他のタンパク質にも778 - 781 , 1980 .

作用するとの知見を得ており、このままのかたちで個体に10）G r a y R E , S e n g N , M a c k a y I R , R o w l e y M J , :応用することは困難であると予想される。一方、cisplatin

Mesurement of antibodies to collagen II by inhibition（DMSO）がコラーゲン３重らせん上の特異なアミノ酸配of collagen fibril formation in vitro, J. Immunological

列部位に結合することから、本プラチナ錯体は、コラーゲ

Methods, 285 , 55 - 61 , 2004 .

ン細線維化過程における分子間での相互認識の機構を研究

11）Okano-Kosugi H, Matsushita O, Asada S, Herr
AB, Kitagawa K, Koide T,: Development of a high-

する上で有用なツールになるものと考えられる。

throughput screening system for the compounds
謝辞that inhibit collagen-protein interactions, Analytical

本研究に協力いただいた全田未悠氏、大石真也博士、安Biochemistry, 394 , 125 - 131 , 2009 .
12）Feng Y, Melacini G, Taulane JP, Goodman M,: Acetyl-

井裕之博士に感謝します。

terminated and template-assembled collagen-based（引用文献）

polypeptides composed of Gly-Pro-Hyp sequences. 2 .

１）Fertala A, Prockop DJ,: Inhibition of the self-assemblyof collagen I into fibrils with synthetic peptides, J.Biol.

J.Am.Chem.Soc., 118 , 10351 - 10358 , 1996 .
13）Fischer SJ, Benson LM, Fauq A, Naylor S, Windebank
AJ,:Cisplatin and dimethyl sulfoxide react to form an

Chem., 273 , 15598 - 15604 , 1998 .
２）Orgel JPRO, Irving TC, Miller A, Wess TJ,:
Microfibrillar structure of typeI collagen in situ, Proc.

adducted compound with reduced cytotoxicity andneurotoxicity, Neurotoxicology, 29 , 444 - 452 , 2008 .
14）Garrone O, Rosso R, Dini D,: Topical dimethylsulfoxide

Natl.Acad.Sci.U.S.A., 103 , 9001 - 9005 , 2006 .
３）Chung HJ, Steplewski A, Chung KY, Uitto J, Fertalafor the prevention of soft tissue injury afterA, : Collagen Fibril Formation, J.Biol.Chem., 283 , 25879 -extravasation of vesicant cytotoxic drug : A prospective

25886 , 2008 .

clinical study. J. Clinical Oncology 13 : 2851 - 2855 , 1995 .

４）Kunii S, Morimoto K, Nagai K, Saito T, Sato K,

15）Dernell WS, Straw RC, Withrow SJ, Powers BE, Fujita

Tonomura B,: Actinidain-hydrolyzed type I collagen

SM, Yewey GS, Joseph KF, Dunn RL, Whitman SL,

reveals a crucial amino acid sequence in fibril formation,

Southard GL,: Apparent interaction of dimethylsulfoxide

J.Biol.Chem., 285 , 17465 - 17470 , 2010 .

with cisplatin released from polymer delivery devices５）Shah M, Foreman DM, Ferguson MW,: Neutralisationof TGF-beta 1 and TGF-beta 2 or exogenous addition of

injected subcutaneously in dogs. J. Drug Targeting
5 : 391 - 396 , 1998 .

TGF-beta 3 to cutaneous rat wounds reduces scarring,− 105 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析
物質・材料研究機構 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点

柴弘 太

Recently, the effect of nanoparticles on living things has attracted much attention because of the increasing opportunities
to use the nanoparticles in such areas as environmental purification, biology, medicine, cosmetology, and so on. As
nanotechnology advances, the nanoparticles with desired properties have become available. On the other hand, nanoparticleinduced toxicity has been reported. Therefore, it is important to quantitatively understand risks of the nanoparticles before
using them, though the effect of the nanoparticles, especially in the case of an uptake through skins, is still not yet unclear. In
this study, we synthesize monodispersed titania-based nanoparticles with controlled size (70-500 nm) as a model material toinvestigate the nanoparticle effect. In addition, a characterization system for such effect is developed using a membrane-typesurface stress sensor (MSS), which can detect surface stress applying on its surface with high sensitivity and in real-time.
Taking advantage of the photoactivatable cell-culturing substrate reported before (J. Nakanish et al., J. Am. Chem. Soc. 129,6694-6695 (2007).), we demonstrate that cell-culturing only on top of the MSS is possible.

１．緒

言

２．実

近年、トイレタリー・化粧品分野において、例えば「白

2 .1

験

試薬

金ナノコロイド」などの名称で、ナノ粒子の利用が一般にモデル粒子として、チタニアをベースとしたハイブリッ

認知される機会が増加している。PM 2 . 5 問題の深刻化を

ド粒子を合成するため、チタニウムテトライソプロポキシ

一つのきっかけに、ナノ粒子が生体に及ぼす影響にも関心

ド（TTIP）、イソプロピルアルコール（IPA）、オクタデシが集まりつつあることからも、ナノ粒子が引き起こす効果

ルアミン（ODA）を用いた。

の定量的な評価と、摂取可能量に関する指標確立は喫緊の課題と言える。現在のところ、経口や経鼻によるナノ粒子
摂取に関する研究が着実な進展を見せる一方、経皮に着目した研究は少ないのが現状である 1−3）。

2.2

モデル粒子の合成

サイズの揃ったチタニア− ODA ハイブリッド粒子の作
製には、マイクロリアクタを組み込んだフロー式の合成系

そこで本研究では、経皮によるナノ粒子曝露の影響を定6−8）を利用した（図１）。

量評価するための第一歩として、モデル粒子の合成に加え、粒子合成手順の一例を以下に示す。TTIP（0 . 595 mL）

これら粒子が真皮中の線維芽細胞に与える影響を調べるたの IPA（12.26 g）溶液（溶液 A）と、IPA（12.65g）水（0.100 mL）

めの測定系を構築した。検出部として、表面に生じる応力をリアルタイムに精密測定可能な、膜型表面応力センサー（MSS）を 用 い 4）、 こ の 表 面 上 で の 細 胞 培 養 を 試 み た。
MSS の検出限界はおよそ 0 . 2 mN/m であり、細胞が膜表面で集合的に振動した場合に生じる応力がおよそ２mN/mであることから 5）、検出は原理的に可能であると考える。
細胞の挙動を MSS により確実に検出するため、膜表面に位置選択的に細胞を培養するための条件も検討した。

Real-time and quantitative analysis of
the effect of nanoparticles on fibroblasts
in the dermis
Kota Shiba
WPI Center for Materials Nanoarchitectonics（MANA），National Institute for Materials
Science（NIMS）

図 1 マイクロリアクタを利用した核形成・粒子成長分離型合成システムの概要。マイクロリアクタチップ内で核形成が起こり、形成した核が別の原料溶液中へ吐出され、そこで粒子成長が起こる。動的光散乱測定の結果、マイクロリアクタ内での核形成が示唆された− 106 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

溶液（溶液 B）を、シリンジポンプを用いて流速 20 mL・−1・ナノ粒子のサイズが揃っているmin で送液し、Y 字型の混合部を有する PTFE 製マイク

・ナノ粒子の形状が揃っている

ロリアクタ内で混合した。混合液を別途調製しておいた・ナノ粒子のサイズを制御できるODA（0 . 0684 g）を含む IPA（49 . 32 g）水（0 . 300 mL）溶以上が求められる。筆者はこれまで、チタニア、シリカを液（溶液 C）へ吐出し、溶液 A および B の全量を吐出する

はじめとする種々の酸化物系ハイブリッドナノ粒子の合成

までの約 40 秒間、撹拌を続けた。室温で 24 時間静置したに従事し、単分散粒子合成についてのノウハウを確立して後、吸引濾過あるいは遠心分離による固液分離、IPA によきた。その概要を図１に示す。本手法は、マイクロメート

る洗浄、60 ℃で一晩の乾燥過程を経て、試料粉末を得た。

ルサイズの微小な空間を化学反応に利用可能な、いわゆる「マイクロリアクタ」を組み込んだフロー式の合成法であ2.3

MSSチップの作製

り、大きく２つの段階から構成される。それは、マイクロ

MSS チップは、既報にしたがい、SOI 基板を利用して一4）

般的な半導体プロセスにより作製されたものを用いた 。

リアクタ内での原料の１次混合と、１次混合後の反応液をさらに別の原料と混合することによる２次混合である。チ
タニア系粒子の合成には、原料として TTIP を用いること

2.4

MSSチップ上への光応答表面の作製が多く、この加水分解・縮重合反応により、粒子の形成・

MSS チップ上への位置選択的な細胞培養は、図２に示
9）

成長を誘起する。しかし、TTIP の加水分解はきわめて短

すような光応答表面を利用した方法により行った 。光照

時間に進行することが知られており、一つの容器に順次原射によって脱離する官能基を備えたシランカップリング剤

料を加えて、閉鎖系で反応させるようなバッチ合成では、によって、シリコン製の MSS の表面を被覆し、蛍光顕微

局所的に反応が進行してしまい、結果として多分散粒子が鏡を用いて局所的に UV 光を照射する。その後、細胞吸着

形成するという問題が生じやすい。これを回避するための剤を適用することで、任意の位置に細胞を配置することが方法として、加水分解に必要な水をごく少量ずつ加えるこ可能になる。

とにより（多くの場合、TTIP：水のモル比が１：３程度）、
反応をゆっくり進行させることが有効とされてきたが、こ

2.5

細胞培養

の場合は未反応の原料が残存しやすく、収率の低下が問題

MSS 表面への培養可能性を探る予備的な検討を行う目となる。そこで本手法においては、１次混合時の TTIP：的で、まずは一般に広く使用されている HeLa 細胞を用い水のモル比を１：３程度とし、ここで粒子の「核」のみをた。培地は RPMI- 1640 を用い、37 ℃、５%CO 2 下で培養し形成させることを試みた。動的光散乱測定により、１次混た。

合直後の反応液中にはおよそ２～３nm 程度の微細な粒子が存在しており、核の形成に成功したことが示唆された。

３．結果および考察
3.1

次いで、この核を含む反応液を、ODA および１次混合時

単分散チタニア − ODA ハイブリッド粒子の合成と比較して多量の水を含む原料液と２次混合することで、ナノ粒子曝露が細胞に与える影響を定量的に調べるため粒子の成長を期待した。その結果、図１右下の SEM に示の前提条件として、

図 2 光応答表面を利用した細胞配置・操作技術の模式図。光照射によって脱離するニトロベンジル基を備えた NPE-TCSP などの
シランカップリング剤によって、表面応力センサーのシリコン表面を被覆する。これを BSA などで被覆し、細胞の吸着を阻害す
る表面を作製する（a）。蛍光顕微鏡を用いて、局所的に紫外光を照射することで、ニトロベンジル基を脱離させた後（b）、細胞吸着剤である Fibronectin などを被覆することで、任意の位置に細胞を配置し、さらにその成長を誘導することが可能になる（c）。
（d）
生きた細胞の配置・誘導の例− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

すようなサイズの揃った粒子を得ることができた。核形成

相互作用（凝集）して、球状粒子を形成している可能性がと粒子成長の過程を分離することが、単分散粒子を得る上ある。水の量が少なければ、個々の粒子は大きく成長できできわめて重要であることは古くから指摘されているが 、るはずであり、これらのことは実験結果と一致している。

合成条件をランダムに振るなどして最適条件を探していく

アルキルアミンを用いたチタニア−アルキルアミン複合体

以外、具体的な指針は得られていなかった。本手法を用い形成に関する以前の報告において、アルキルアミン中のアることで、１次混合で核を作りさえすれば、２次混合以降

ミノ基と、チタニア表面の水酸基が水素結合により相互作の反応環境を工夫することにより、最終生成物のサイズを用することが指摘されており 11）、本系においても、同様の調整できる可能性が示された。

現象が起こっているものとみられる。水 /IPA モル比を調10）次に、サイズ制御の可能性を明らかにするため、２次混節することにより、チタニア− ODA 粒子のサイズは 70 nm

合時の条件を検討した。２次混合前の段階では、未反応の～ 500 nm 程度の範囲で制御可能であることが分かった。

TTIP が存在していると考えられるため、まずは原料を完

他の実験パラメータに関しても検討を進めており、予備実

全に消費することに焦点を絞り、２次混合時の水 /IPA モ

験の結果、既に 10 nm 程度から 1200 nm 程度までの広い範ル比の影響を検討した。その結果、水 /IPA モル比を大き囲でサイズ制御できること見出している。今後、結果をまくしていくことにより、段階的にサイズの小さな粒子が生とめて報告する予定である。

成することが分かった（図３）。Ti ベースの収率は、いずれの場合も 90 % 以上であった。ODA を添加せずに合成し3.2

MSS の構造と基本性能た場合、不定形の凝集粒子が得られたこと、Ti ベースでMSS は、「ナノメカニカルセンサー」4 , 12 , 13）と呼ばれる計算した収率が約 50 % 程度であったことも考慮すると、タイプのセンサーの一種であり、代表的なカンチレバー型

粒子の成長機構には疎水性相互作用が関係していると考えのセンサーを構造最適化することで、性能の飛躍的向上にられる。つまり、ODA はアルキル鎖を外側に向けてチタ成功したものである 4）。これは、センサーチップに埋め込

ニア粒子と相互作用しており、反応系に存在する水の量がまれているピエゾ抵抗を用いた読み取り方法に基づくセン増えるほど、最表面が疎水的なチタニア− ODA は、表面サーであり、図４にその基本的構造を図示した。MSS は「カ

エネルギーを小さくするために周囲のチタニア− ODA とンチレバー」構造と異なり、４つのピエゾ抵抗「検出ビー

図3

溶液 C 中の水 /IPA モル比を変えて合成したチタニア − ODA 粒子の SEM 像とサイズ分布− 108 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

ム」によって支持された「吸着メンブレン」から成り、そ・導電性液体中でも安定な動作が可能（1 ヶ月以上の安定な測定を確認済み）

れら４つのピエゾ抵抗が完全ホイートストンブリッジを構成する。吸着メンブレン上に表面応力が印加されることに・センサー内の完全ホイートストンブリッジ構成により
熱ドリフトが少ない

よって生じるメンブレンの変形が、増幅された一軸性の応力としてピエゾ抵抗ビームに効率的に変換される。プロト

MSS のプロトタイプ（1 G - MSS）は、１cm×１cm のシリ

タイプ MSS の評価実験によって、標準のピエゾ抵抗カン

コンチップ上に８つのメンブレンが一次元に配列した構造

チレバーの 20 倍以上の感度が得られることが明らかになを 有 す る。1 G - MSS の 最 小 検 出 可 能 表 面 応 力 は 0 . 2 ～り、光学的読み出しカンチレバーセンサーと同等の感度が0 . 3 mN/m であり、これまでに報告された細胞牽引力が２実証された。このセンサーは、本研究を遂行するにあたっ

mN/m 程度であることから 5）、さらなる感度の向上が必要て、以下のような様々な長所を有する。

であった。そのため、シリコンの特性や微細加工技術を踏

・超高感度（吸着メンブレン上のサブナノメートルの変形も検出可能）まえた最適化を各構成要素に適用することで、感度向上を試みた。構造最適化を行う上で、チップサイズが大きくな

・光学系が不要（細胞による屈折率変化の影響が無い）

ると、測定チャンバーも大きくする必要があり、より多く

・高濃度・不透明溶媒（細胞培養環境）中で測定可能の試料が必要になるだけでなく、チップ上の各メンブレン

・静的な測定のため、液体によるダンピングの問題が無において、試料や培養条件の不均一化が懸念される。そのいため、チップサイズを小さく保つために、３× ３の合計
９チャンネルの二次元配列 MSS（2 G - MSS）チップを作製した（図５⒜）。さらに、各 MSS チャンネルの感度を向上させるために、以下の通り、各構成要素の最適化を行った
14）。
1）検出ビームと吸着メンブレンの両方の厚みを薄く（3 . 2 µm → 2 . 5 µm）2）ピエゾ抵抗部分の保護膜を薄く（CVD SiO 2 650 nm +LPCVD Si 3 N 4 100 nm → 熱酸化 SiO 2 80 nm + LPCVD
80 nm）
3）ピエゾ抵抗部のホウ素ドープを浅く（〜 500 nm →〜300 nm）
4）ピエゾ抵抗部の負の領域を排除（電流と応力の方向を

図4

MSS の構造と電気配線の模式図

図 5 （a）2G-MSS チップの写真。MSS センサー素子が 3×3 の合計 9 個、二次元配列されている。下部は 0.5mm ピッチの電極であり、これを標準の 0.5 mm ピッチコネクタに差し込むことで、ワイヤーボンディングなどをすることなく、すぐに測定が開始できる。
（b）2G-MSS、1G-MSS、およびピエゾ抵抗カンチレバーからのシグナル。2G-MSS は、1G-MSS、ピエゾ抵抗カンチレバーと比べて大幅に感度が向上していることが確認できる。poly（sodium 4-styrenesulfonate）（PSS）をインクジェットにより 1µm 被覆し、100 mL/min で水蒸気を含む窒素ガスと純窒素ガスを 3 分間ずつ曝露− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014のメンブレンにのみ細胞が培養されている様子が確認でき考慮して最適化）
これらの構造最適化の効果を、有限要素解析によって確る。これにより、MSS チップに光応答表面を適用するこ

認したところ、1 G - MSS チップと比較して、約 2 . 8 倍の感とによって、任意のメンブレン上にのみ細胞を配置するこ度向上が見込めることが明らかになった。これらの最適化とが可能であることが実証された。

を行った 2 G - MSS チップの感度を実験的に検証してみた

４．総ところ、1 G - MSS の約４倍のシグナルを示した（図 5 ⒝）。

括

これはピエゾ抵抗「カンチレバー」センサーと比較して、マイクロリアクタを組み込んだフロー式の合成装置を用

約 100 倍の感度であり、一般的に使用されている光（レーいて、オクタデシルアミン存在下、チタニウムテトライソ

ザー）読み取り型のカンチレバーセンサーと比較しても、プロポキシドの加水分解・縮重合反応を行うことにより、数倍高い感度を有していることが確認された 14）。

サイズの揃った真球状のチタニア−オクタデシルアミンハ
イブリッド粒子を得た。粒子形成反応の開始に必要な水に3 . 3 光応答表面作製技術を利用したMSSチップ上への HeLa 細胞の位置選択的培養

着目し、合成時の水 / イソプロピルアルコールのモル比を光応答表面修飾 MSS チップは、以下の手順で作製した。

った粒子を得られることが分かった。また、表面に生じる

まず、MSS チップ上の９つのメンブレンの表面を、末端応力変化を高感度かつリアルタイムに測定可能な膜型表面変えることにより、70 nm から 500 nm の範囲でサイズの揃に活性エステルを有する光分解性シランカップリング剤

応力センサー上に、HeLa 細胞を培養する条件を検討した。

（TMS- 2 NP-NHS）によって修飾し、アミノポリエチレン

紫外光照射により分解するシランカップリング剤を用いてグリコール（PEG、分子量 12 , 000）と反応させた。その後、表面修飾し、その上に細胞の吸着を抑制するアミノポリエ

いくつかのメンブレンにのみ蛍光顕微鏡を用いて紫外光をチレングリコールを反応させた後、センサー表面にのみ紫照射し、シランカップリング剤の分解に伴って PEG を除外光照射することでポリエチレングリコールを除去した。

去することにより、細胞吸着メンブレンを作製した。他のこれにより、位置選択的な細胞培養が可能であることを実

メンブレンは PEG で被覆されているため、細胞の吸着が証した。今後はセンサーによる測定と、顕微鏡による直接抑制される。ここに HeLa 細胞を播種し、24 時間培養した観察が可能な測定システムを構築することにより、ナノ粒

後、正立顕微鏡を用いて観察した結果を図６に示す。特定子が細胞に与える影響に関して、詳細な検討を進めていく
予定である。

図 6 光応答表面修飾 2G-MSS チップ上に成長した細胞の顕微鏡写真。（b）（d）（e）（f）は紫外光を照射し、PEG を除去した細胞吸着メンブレンであり、
（a）
と
（c）
は、PEG 被覆されているメンブレンである。細胞吸着メンブレンにのみ細胞が吸着していることが確認できる− 110 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

謝辞through Microfluidic Approach, Ind. Eng. Chem. Res.,MSS チップを用いた実験全般は、物質・材料研究機構

49 , 8180 - 8183 , 2010 .

の吉川元起博士の協力を得て行いました。また、光応答表

８）Shiba K, Onaka K, Ogawa M, : Preparation of mono-

面を利用した位置選択的な細胞培養は、物質・材料研究機

dispersed titanium dioxide-octadecylamine hybrid

構の中西淳博士の協力を得て行いました。ご多忙中にもか

spherical particles in the submicron size range, RSC

かわらず、快くお力添え下さったお二方に、心より感謝申Adv., 2 , 1343 - 1349 , 2012 .
９）Nakanishi J, Kikuchi Y, Inoue S, Yamaguchi K,

し上げます。

Takarada T, Maeda M, : Spatiotemporal control of（参考文献）

migration of single cells on a photoactivatable cell

１）Medina C, Santos-Martinez MJ, Radomski A,

microarray, J. Am. Chem. Soc., 129 , 6694 - 6695 , 2007 .

Corrigan OI, Radomski MW, : Nanoparticles:10）LaMer VK, Dinegar RH, : Theory, Production andharmacological and toxicological significance, Br. J.

Mechanism of Formation of Monodispersed Hydrosols,

Pharmacol., 150 , 552 - 558 , 2009 .

J. Am. Chem. Soc., 72 , 4847 - 4854 , 1950

２）Sharifi S, Behzadi S, Laurent S, Laird Forrest M,

11）Wang YD, Ma CL, Sun XD, Li HD, : Synthesis andStroeve P, Mahmoudi M, : Toxicity of nanomaterials,

characterization of mesoporous TiO 2 with wormhole-

Chem. Soc. Rev., 41 , 2323 - 2343 , 2012 .

like framework structure, Appl. Catal. A: Gen., 246 ,３）H o e t P H M , B r u s k e - H o h l f e l d I , S a l a t a O V , :Nanoparticles – Known and unknown health risks, J.

161 - 170 , 2003 .
12）Gimzewski JK, Gerber C, Meyer E, Schlittler
RR, : Observation of a chemical-reaction using a

Nanobiotechnol., 2 , 2 - 12 , 2004 .
４）Yoshikawa G, Akiyama T, Gautsch S, Vettiger P,
Rohrer H, : Nanomechanical membrane-type surface

micromechanical sensor, Chem. Phys. Lett., 217 , 589 594 , 1994 .
13）Thundat T, Warmack RJ, Chen GY, Allison DP, :stress sensor, Nano Lett., 11 , 1044 - 1048 , 2011 .
５）Bischofs IB, Schmidt SS, Schwarz US, : Effect ofThermal and ambient-induced deflections of scanning

Adhesion Geometry and Rigidity on Cellular Force

force microscope cantilevers, Appl. Phys. Lett., 64 ,Distributions, Phys. Rev. Lett., 103 , 048101 - 1 - 048101 - 4 ,2894 - 2896 , 1994 .
14）Yoshikawa G, Akiyama T, Loizeau F, Shiba K,

2009 .
６）Shiba K, Ogawa M, : Microfluidic syntheses of well-

Gautsch S, Nakayama T, Vettiger P, de Rooij NF,

defined sub-micron nanoporous titania spherical

Aono M, : Two Dimensional Array of Piezoresistive

particles, Chem. Commun., 6851 - 6853 , 2009 .

Nanomechanical Membrane-Type Surface Stress７）Shiba K, Kambara K, Ogawa M, : Size Controlled
Syntheses of Nanoporous Silica Spherical Particles

Sensor(MSS) with Improved Sensitivity, Sensors, 12 ,
15873 - 15887 , 2012 .

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

接触抑制シグナルによるケラチノサイトのホメオスタシスとその破綻病態

九州大学生体防御医学研究所ゲノム腫瘍学

鈴 木聡

Mice deficient in one or both copies of Mob1a and carrying a trapped mutation in Mob1b developed various cancers.
Most frequent cancers in these mice resembled trichilemmal carcinomas. Keratinocyte-specific homozygous null mutationsof Mob1a and Mob1b (kDKO) mice showed hyperplasia of keratinocyte progenitors. kDKO keratinocytes exhibited
hyperproliferation, apoptotic resistance, impaired contact inhibition, enhanced progenitor self-renewal, and increased
centrosomes. In addition, loss of Mob1a/b, or activation of downstream YAP1 were replicated in human trichilemmal
carcinomas.

１．緒に、今後各 Hippo 経路構成分子の生体における機能解析が言必須である。Hippo 経路のうち、MST キナーゼとそのア細胞間の接触により増殖が抑制される‘接触抑制現象

ダプター分子 SAV 1 , LATS キナーゼとそのアダプター分（Contact Inhibition）’は古くからその存在が知られてお子 MOB 1 の４つがこの経路の コアコンポーネントである。

り、この現象は創傷治癒、皮膚幹細胞維持、皮膚形態形成

MOB には７つの相同分子があるが、このうち MOB 1 A となどに重要である。しかしながら、接触抑制に関わる細胞

MOB 1 B の ２ つ の み が LATS キ ナ ー ゼ と 結 合 で き る。

内シグナル活性化機構には、いくつかの細胞表面分子の関LATS キナーゼはそのキナーゼ活性は非常に弱いものの、与が報告されているのみで、依然多くが不明であった。

MOB 1 が結合することによって、非常に強いキナーゼ活近年ショウジョウバエにおいて、接触抑制や器官サイズを制御する新たなキナーゼ経路として、Hippo 経路が報告性を獲得する。しかしながら MOB 1 の生体における役割は未だ不明であった。

された。哺乳類 Hippo 経路は、MST キナーゼと LATS キ

皮膚がんのうち最も頻度の高いものは基底細胞がんであナーゼの２つのキナーゼカスケードから構成され、この経り、結節型の基底細胞がんは毛包由来である。外毛根鞘細路は細胞接触などの細胞外力、細胞外基質、ストレス刺激

胞の増多を特徴とする皮膚外毛根鞘がんは、基底細胞がんにより活性化されて、下流の転写共役因子 YAP 1 をリンと同様に毛包由来の腫瘍であるが、生検が必要な皮膚腫瘍

酸化し、YAP 1 を核外に排除するとともに蛋白質を崩壊さ例の 0 . 05 % と非常に稀な腫瘍で、発症は高齢者に多く、せ、細胞増殖などを負に制御する 1）。Hippo 経路はこのよ

頭部や顔面、四肢に好発することが知られている 6）。基底うに細胞増殖、細胞死、細胞未分化性、細胞遊走、平面極

細胞がんは今や SHH シグナルの異常によることが判明し性などを制御して、器官のサイズや腫瘍形成を制御するこてきたが 7 , 8）、外毛根鞘がんの原因遺伝子についてはこれ

2）とが、近年わかってきた 。また、Hippo 経路のいくつか
3）まで全くわかっていなかった。

の遺伝子改変マウスにがんの発症の報告があること 、ヒ

今回我々は、ケラチノサイト特異的な MOB 1 欠損マウ

トがん患者では高頻度に Hippo 経路分子の発現低下や遺伝スを作製したところ、このマウスに外毛根鞘がんが発症す

子変異をみとめ、これらの有無が悪性度と相関することなることを見出した。

どから 4）、Hippo 経路はがん抑制遺伝子としても注目され、

２．実験・結果

今後のがん治療の標的経路として期待されている。しかしながら、これまでに作製された Hippo 経路分子欠損マウス

MOB 1A/MOB 1B は初期発生に必須であるの多くは胎生致死であったために 5）、Hippo 経路分子の成我々はまず MOB 1 A 及び MOB 1 B 単独遺伝子欠損マウ体における役割は多くが依然不明のままである。また、哺スをそれぞれ作製した。しかしながら、これらの２分子は乳類各 Hippo 経路構成分子には相同分子が極めて多いため相同性が極めて高く互いにその機能を代償するためか、
MOB 1 A、MOB 1 B 各単独欠損マウスは正常に生育し、表現型を見いだせなかった。

Keratinocytes homeostasis by contact
inhibition signaling and its disorders
Akira Suzuki
Division of Cancer Genetics, Medical
I nst itute of Bioreg u lat ion , Kyushu
University

そこで次に MOB 1 A/MOB 1 B を二重に完全欠損（ホモ欠損）するマウスを作製したところ、着床直後に致死となった。これらの胚では PDGFR a や GATA 4 の顕著な発現低下をみとめたことから、原始内胚葉への分化障害が致死の一因であると考えられた。

− 112 −

接触抑制シグナルによるケラチノサイトのホメオスタシスとその破綻病態

MOB 1A/MOB 1B 部分欠損による腫瘍の発症

週以内に発症し、特に皮膚外毛根鞘がんは全例にみられた

MOB 1 A/MOB 1 B 二重完全欠損マウスが胎生早期に致（図１、２）。また、これら部分欠損マウスにみられた腫瘍死であったことから、MOB 1 A/MOB 1 B 部分欠損マウスには、残された野生型アリルの欠失（LOH）をみたことか（MOB 1 A ヘテロ MOB 1 B ホモ欠損、あるいは MOB 1 A ホら、MOB 1 が古典的ながん抑制遺伝子として作用するこモ MOB 1 B ヘテロ欠損マウス）を長期観察したところ、ことが示唆された。

れらマウスでは皮膚外毛根鞘がん、骨肉腫、筋線維肉腫、その他 MOB 1 A/MOB 1 B 部分欠損マウスには、腫瘍形

唾液腺腫瘍、乳がん、肝がんなどの様々な腫瘍を全例 70

成の他に、歯芽の形成異常や骨梁数の増加、内耳有毛細胞

図１

Mob1A/Mob1B 部分欠損マウスにみられる腫瘍形成（JCI 20129）より引用）

図２ Mob1A/Mob1B 部分欠損マウスの全例にみられる Keratin 17 陽性の皮膚外毛根鞘がん（JCI
20129）より引用）− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014の整列障害による平衡障害などの表現型も観察された。

減少したことから、MOB 1 は LATS 1 / 2 蛋白質の安定化にも関与していることが示唆された。さらに、予想通り

ケラチノサイト特異的 MOB 1A/MOB 1B 欠損マウスやMOB 1A/MOB 1B 欠損ケラチノサイトの表現型

YAP 1 のリン酸化は減少し、細胞密度が高いにも関わらず
YAP 1 が核に集積していた。

前述のように MOB 1 A/MOB 1 B 部分欠損マウスに全例
皮膚外毛根鞘がんが発症したため、次にタモキシフェン誘

ヒト外毛根鞘がんの原因遺伝子としての MOB 1

導性・ケラチノサイト特異的 MOB 1 A/MOB 1 B 二重ホモ

前述のように MOB 1 A/MOB 1 B 部分欠損マウスの全例

欠損マウスを作製した（タモキシフェンは生後１日目に投にみられた腫瘍は Keratin 17（外毛根鞘細胞マーカー）陽与）。ケラチノサイト特異的 MOB 1 A/MOB 1 B 二重ホモ欠性の外毛根鞘がんであった（図２）。

損マウスは体が小さいものの、皮膚が顕著に肥厚し、毛髪そこで次にヒト外毛根鞘がん組織を用いて MOB 1 やそのは細くかつ彎曲していた。これらマウスは口腔粘膜上皮の下流の YAP 1 の発現を検討したところ、約半数の症例で肥厚による嚥下障害をきたし、生後３週齢までに全例栄養

MOB 1 の発現低下を、3 / 4 で YAP 1 の発現亢進や核局在の不良で死亡した。組織学的には毛嚢や毛嚢間上皮の顕著な増強を認めたことから、MOB 1 を含む Hippo 経路の異常が肥厚、皮膚上皮の退縮障害による第一毛髪周期の不明瞭化

ヒト外毛根鞘がんの原因の一因であることを示した（図８）。

を 示 し た（ 図 ３）。 ま た 不 全 角 化 が 顕 著 で、Keratin 15 ,３．考察と統括

Keratin 14 , Keratin 5 , SOX 9 等が陽性の未分化なケラチ
ノサイトが増加する一方、Keratin 10 , Filaggerin 等が陽本研究によって MOB 1 は初期発生に必須であること、性の分化したケラチノサイトの比率は顕著に減少し、未分

種々のがんの発症に関与し、特にヒト外毛根鞘がんの一因

化性や自己複製能が亢進していた（図 4、５）。

となること等を個体レベルで世界ではじめて示すことがで

細胞生物学的には、MOB 1 A/MOB 1 B 二重欠損ケラチノ

きた 9 − 11）。

サイトは、細胞増殖亢進、細胞死抵抗性、接触抑制障害（図Hippo 経路は細胞接触や細胞外基質からの刺激をうけて

６）、中心体数、染色体数異常、細胞分裂時間短縮（図７）な活性化するが、Hippo 経路の異常によって高頻度に皮膚発どを認め、これらががんの発症に寄与したものと思われる。

がんに至ることから、今後新たに開発する化粧品の安全性

生化学的には、MOB 1 下流の LATS 1 / 2 のリン酸化減少

は、Hippo 経路の活性化程度を測定することによってスクに加え、予期せぬことに LATS 1 / 2 は総蛋白質量も顕著にリーニングできる可能性がある。

図３ ケラチノサイト特異的 Mob1A/1B 二重完全欠損マウスにみられる毛嚢や毛嚢間上皮の肥厚と毛髪周期の不明瞭化（JCI
20129）より引用）− 114 −

接触抑制シグナルによるケラチノサイトのホメオスタシスとその破綻病態

図４ ケラチノサイト特異的 Mob1A/1B 二重完全欠損マウスの毛嚢間上皮細胞にみられる未分化細胞の増加（JCI 20129）より引用）

図５ ケラチノサイト特異的 Mob1A/1B 二重完全欠損マウスの毛嚢上皮細胞の未分化細胞の増加と自己複製能亢進（JCI 20129）より引用）− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図６ Mob1A/1B 二重完全欠損ケラチノサイトにみられる細胞増殖亢進、細胞死抵抗性、接触抑制障害（JCI
20129）より引用）

図７

Mob1A/1B 二重完全欠損ケラチノサイトにみられる細胞分裂期異常（JCI 20129）より引用）− 116 −

接触抑制シグナルによるケラチノサイトのホメオスタシスとその破綻病態

図８ ヒト皮膚外毛根鞘がんにおける MOB1 や YAP1 の異常の頻度（JCI 20129）より引用）

我々は Hippo 経路を標的とする新たな抗腫瘍薬の開発に

Shehabeldin A, Matysiak-Zablocki E, Lemmers B,も着手しており、今回作製したマウスは、腫瘍モデルマウ

Salmena L, Hakem A, Fish J, Kassam F, Squire J,

スとして薬効評価の良いツールとなる。

Bruneau BG, Hande MP, Hakem R. Lats 2 /Kpm is

今後は皮膚創傷治癒における MOB 1 の役割等を明示す

required for embryonic development, proliferation

るとともに、MOB 1 の遺伝子変異がヒトメラノーマで報

control and genomic integrity. EMBO 23 : 3677 - 8 , 2004

告されていることから、メラノサイトにおける MOB 1 の

６）Headington JT. Tumors of the hair follicle. A review.

役割も明示したい。さらに MOB 1 以外の Hippo 経路構成
分子の機能も解析し、総じて Hippo 経路の皮膚における機Am J Pathol 85 ( 2 ): 479 - 514 , 1976 .
７）Fan H., Oro AE, Scott MP, Khavari PA Induction ofbasal cell carcinoma features in transgenic human skin

能の全貌と、その破綻疾患を明示したい。

expressing Sonic Hedgehog. Nat Med 3 ( 7 ): 788 - 792 , 1997 .
謝辞８）Oro AE, Higgins KM, Hu Z, Bonifas JM, Epstein EH Jr,

研究助成を賜りました公益財団法人コスメトロジー研究

Scott MP. Basal cell carcinomas in mice overexpressing
sonic hedgehog. Science 276 ( 5313 ): 817- 821 , 1997.

振興財団に心から御礼申し上げます。

９）Nishio M, Hamada K, Kawahara K, Sasaki M,（文献）Noguchi F, Chiba S, Mizuno K, Suzuki SO, Dong Y,１）Zeng Q, Hong W. The emerging role of the hippo

Tokuda M, Morikawa T, Hikasa H, Eggenschwiler J,

pathway in cell contact inhibition, organ size control,

Yabuta N, Nojima H, Nakagawa K, Hata Y, Nishina

and cancer development in mammals. Cancer Cell

H, Mimori K, Mori M, Sasaki T, Mak TW, Nakano T,

13 : 188 - 92 , 2008

Itami S, Suzuki A. Cancer susceptibility and embryonic２）Zhao B, Tumaneng K, Guan KL. The Hippo pathway
in organ size control, tissue regeneration and stem celllethality in Mob 1 a/ 1 b double-mutant mice. J Clin
Invest. 122 ( 12 ): 4505 - 18 , 2012 .
10）Nishio M, Otsubo K, Maehama T, Mimori K, Suzuki

self-renewal. Nat Cell Biol 13 : 877 - 83 , 2011
３）Edgar BA. From cell structure to transcription:

A. Capturing the Mammalian Hippo: Elucidating Its
Role in Cancer Cancer Sci 104 ( 10 ), 1271 - 1277 , 2013

Hippo forges a new path. Cell 124 : 267 - 73 , 2006
４）Harvey K, Tapon N. The Salvador-Warts-Hippo

11）西尾美希、三森功士、森

正樹、板見

智、鈴木

聡．

pathway - an emerging tumour-suppressor network.

Hippo 経路分子 MOB 1 によるがん発症・進展制御とがん

Nat Rev Cancer 7 : 182 - 91 , 2007

治療戦略 次世代がん戦略研究 update

５）McPherson JP, Tamblyn L, Elia A, Migon E,－革新的シーズ育成に向けて－− 117 −

がん基盤生物学南山堂 2013 in press

皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明
九州大学大学院理学研究院化学部門

谷

元 洋

Ceramide, the backbone of membrane sphingolipids, is now recognized as an intracellular lipid second messenger that
regulates various signal transduction systems including apoptosis. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, accumulationof intracellular ceramide causes strong growth defect. In this study, we screened yeast mutant strains showing abnormal
sensitivity against ceramide accumulation. It was found that deletion of IRA2 gene encoding GTPase-activating protein or
PDE2 gene encoding cyclic AMP phosphodiesterase, which negatively regulate Ras-cAMP-PKA signaling pathway, causes
high sensitivity against the growth inhibition induced by ceramide accumulation. On the contrary, deletion of RAS2 geneencoding small GTPase causes resistance against the growth inhibition. These results suggested functional relationshipbetween ceramide signaling and Ras-cAMP-PKA pathway.

１．緒

その特異的阻害剤である Aureobasidin A（AbA）、または言

Aur 1 p の発現抑制によって、強力な生育阻害が引き起こ

皮膚表皮の角質層には、水分漏出を防止する脂質バリアされることが知られている。この生育阻害の原因は、①中が存在する。この脂質バリアの構成成分の半分以上を占め

間代謝産物であるセラミドの細胞内蓄積と、②複合スフィているのがセラミドであり、セラミドは近年では化粧品成

ンゴ脂質（IPC, MIPC, M（IP）
2 C）の減少であると考えられ分としても大変注目されている（セラミドは、生体膜脂質ている。研究代表者らは、以前に AbA が誘導する生育阻

二重層を構築するスフィンゴ脂質の疎水性部分に相当する害に対して、高感受性を示す酵母遺伝子変異株を 18 株、構造である（Fig. 1））。一方で、セラミドは細胞内におい及び抵抗性を示す酵母遺伝子変異株を１株同定している2 , 3）。

て微量に生成されることによって、細胞死（アポトーシス）、

これらの変異株の解析を通して、セラミドの脂肪酸鎖の鎖細胞分化、細胞増殖を制御する細胞内脂質シグナリング分

長が変化することで、その細胞毒性が顕著に変化すること子として機能することが、多くの文献によって報告されてを明らかにした 3）。また、セラミドの長鎖塩基部分の C 4

いる 1）。しかしながら、セラミドのシグナリング分子とし位の水酸基が消失することで、セラミドの毒性が減少するての分子レベルでの作用メカニズムに関しては、不明瞭なこと、一方で脂肪酸部分の a-水酸化がなくなるとセラミ点が多く混沌としているのが現状である。本研究では、セドの毒性が上昇することを明らかにした 4）。このように、ラミドシグナリングの分子メカニズム解明を目的とし、出特定の酵母変異株の Aur 1 p 阻害剤に対する感受性の変化

芽酵母 Saccharomyces cerevisiae をモデル生物として用いを調べることで、セラミドの構造と生理機能の相関関係がた解析を試みた。

明らかとなってきた。

２．実

本研究で研究代表者らは、テトラサイクリン調節プロモ験ーター 5）を組み込むことでドキシサイクリンによって出芽酵母の複合スフィンゴ脂質は、イノシトールリン酸

Aur 1 p の発現抑制が可能な酵母変異株（tet-AUR 1 株）をを頭部に持ったイノシトールホスホリルセラミド（IPC）
を用いて、Aur 1 p 発現抑制が誘導する生育阻害に対して、基本構造としており、これにマンノース、さらにイノシト

高感受性を示すような変異遺伝子の探索を試みた。探索にールリン酸が付加した MIPC, M（IP）（Fig. 2）。
2 C が存在するは、酵母非必須遺伝子約 4800 個がそれぞれ破壊された酵

これらは哺乳動物におけるスフィンゴミエリンやスフィン
ゴ糖脂質に相当すると考えられている。酵母においてセラ
ミドを IPC に変換する酵素（Aur 1 p）は生存に必須であり、

Molecular mechanism of moisturizing
factor, ceramides, as a lipid signaling
molecule
Motohiro Tani
Department of Chemistry, Faculty of
Sciences, Kyushu University− 118 −

Fig. 1

スフィンゴ脂質の基本構造

皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明

母遺伝子ノックアウトライブラリー 6）を用いた。酵母遺伝

え継ぎには、384 ピンのレプリケーターを用いた。これに子ノックアウトライブラリーのそれぞれの株に tet-AUR 1

よって１枚の寒天プレート上で最大 384 株の菌株の操作をの変異を導入した二重変異株（tet-AUR 1 xxx D 株（xxx は任行うことが可能となる。このようにして作製された二重変

意の非必須遺伝子））を網羅的に作製した。網羅的作製は、異株（tet-AUR 1 xxx D 株）のドキシサイクリンに対する感

7）

Tong and Boone の方法 に従って行った。具体的には、受性を調べた。

Mata 型 tet-AUR 1 株と Mata 型の酵母遺伝子ノックアウ

３．結

トライブラリー株をかけ合わせ、二倍体を作製、その後胞果培地にて単離するという方法である（Fig. 3）。一度に 4800

3 .1 Aur 1p 発現抑制に対して高感受性を示す遺伝子の探索

株のすべてに関して二重変異株を作製するために、菌の植酵母非必須遺伝子 4800 個のそれぞれが欠損した株に tet-

子形成を誘導し、二重変異が導入されている一倍体を選択

Fig. 2出芽酵母のスフィンゴ脂質の生合成経路

Fig. 3

tet-AUR1 xxxD 二重変異株の網羅的作製− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

AUR 1 を導入した二重欠損株を網羅的に作製し、384 ピン

Ras 2 p は、アデニル酸シクラーゼである Cyr 1 p を活性化

レプリケーターを用いて、これらの株をドキシサイクリン

す る こ と で 細 胞 内 cAMP 量 を 増 大 さ せ PKA（Tpk 1 ,０または 0 . 1 mg/ml を含む合成培地に植え継ぎ、生育の観Tpk 2 , Tpk 3）を活性化させる（Fig. 5）。Ras-cAMP-PKA

察を行った（ドキシサイクリン 0 . 1 mg/ml は、tet-AUR 1 単

シグナル伝達経路は、酵母の細胞周期の調節による増殖制

独変異株が顕著な生育阻害を示さない濃度である）。その御、グルコース応答、ストレス応答等において重要な役割

結果、低濃度ドキシサイクリン処理によって顕著にコロニを果たしている 8）。

ーサイズが小さくなる二重変異株を最終的に 10 個同定しtet-AUR 1 ira 2 Δ の二重変異株は、tet-AUR 1 単独変異た。これらの高感受性変異株の変異遺伝子には、小胞輸送

株が非常に弱い生育阻害しか示さないドキシサイクリン濃に関与する遺伝子が 4 個、スフィンゴ脂質の構造修飾に関度（0 . 7 mg/ml）で生育が殆ど観察されなくなった。このよわる遺伝子が１個（SCS 7）、細胞内情報伝達系に関わる遺うな高感受性は Aur 1 p 阻害剤 Aureobasidin A を用いた時伝子が１個（IRA 2）、ホスホイノチシド脱リン酸化酵素がにも同様に観察されたことから、Aur 1 の機能阻害に対し１個（SAC 1）、機能未知遺伝子が３個、含まれていた。

て IRA 2 欠損株は高感受性を示すことが明らかになった。

SAC 12）、SCS 7 4） に 関 し て は、 以 前 に Aur 1 p 阻 害 剤

次に Ras-cAMP-PKA シグナル経路に関わるその他の因子

Aureobasidin A に高感受性を示す遺伝子としても同定さの 欠 損 株 に 関 し て も 同 様 の 解 析 を 行 っ た。 そ の 結 果、れたものである。今回は、この中で低分子量 G タンパク質

RAS 2 欠損は tet-AUR 1 株のドキサイクリンによる生育阻

活性化 GTPase（GAP）をコードする IRA 2 遺伝子に注目

害に対する抵抗性を引き起こすことがわかった（Fig. 6）。

をした。

また cAMP のホスホジエステラーゼをコードする PDE 2
欠損によって、IRA 2 欠損と同様に、Aur 1 p 発現抑制に対

3. 2 Aur1p 発現抑制による生育阻害とRas-cAMP-PKA
シグナル経路との関連性

して高感受性を示すことが判明した（Fig. 6）。これらの結Ira 2 p は、低分子量 G タンパク質である Ras 1 p, Ras 2 p

cAMP-PKA 経路が活性化されると、Aur 1 p 発現抑制に対を GTP 結合型から GDP 結合型の不活性型へと変換する

し て 高 感 受 性 と な る が、 逆 に RAS 2 欠 損 に よ っ て Ras-GAP として知られている（Fig. 5）。酵母において Ras 1 p,cAMP-PKA 経路が抑制されると抵抗性となることが考え

Fig. 4 tet-AUR1 株の 10µg/mlドキシサイク
リン（Dox）添加による生育阻害

Fig. 5 出芽酵母の Ras-cAMP-PKA シグナ
ル伝達経路

Fig. 6

果 よ り、IRA 2 あ る い は PDE 2 が 欠 損 す る こ と で Ras-

Ras-cAMP 経路因子の欠損株の Aur1p 発現抑制に対する感受性− 120 −

皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明られた 9）。

ルチコピーサプレッサー）の同定を試みた。Aur 1 p 発現抑Aur 1 p の発現抑制あるいは活性阻害は、複合スフィン

制株、tet-AUR 1 株、に酵母染色体 DNA 断片がランダム

ゴ脂質の減少及びセラミドの蓄積を誘導することで生育阻にマルチコピープラスミドに挿入された酵母染色体 DNA

害を誘導する。そのため IRA 2 あるいは PDE 2 遺伝子欠損

ライブラリーをトランスフォーメーションし、高濃度のドによる高感受性が、このどちらのスフィンゴ脂質代謝異常

キシサイクリン（10 mg/ml（tet-AUR 1 株が殆ど増殖できに起因するものなのか不明瞭である。一方で、長鎖塩基ない濃度（Fig. 4）））に暴露した。生育が確認された株を（pyhtosphingosine, dihydrosphingosine）に脂肪酸を転移

Aur 1 p 発現抑制に対する抵抗性株とし、導入されていた

してセラミドを合成する酵素（Lag 1 p, Lac 1 p）を阻害する

酵母染色体 DNA ライブラリーの配列の解析を行った。そと、セラミドの生合成が抑制され、複合スフィンゴ脂質のの 結 果、 ス ト レ ス 応 答 転 写 因 子 を コ ー ド す る MSN 2 を量が減少することで、酵母の生育が抑制される（Fig. 2）。

Aur 1 p 発現抑制に対するマルチコピーサプレッサーとしそこで、セラミド合成酵素の調節サブユニットであるて同定した（Fig. 7 A）
。MSN 2 のマルチコピーサプレッサ

Lip 1 p の発現抑制株、tet-LIP 1 株、tet-LIP 1 ira 2 D 株、及ー効果は、Aur 1 p 特異的阻害剤 Aureobasidin A が誘導すび tet-LIP 1 ras 2 D 株を用いて、複合スフィンゴ脂質減少

る生育阻害に対しても確認された。一方で、セラミド合成が誘導する生育阻害に対する IRA 2、RAS 2 遺伝子欠損の抑制株（tet-LIP 1 株）の生育阻害は、レスキューしないこ

影響を調べた。tet-LIP 1 株は、ドキサイクリン 10 mg/mlとから、MSN 2 はセラミド蓄積に対するサプレッサー遺を作用させることで弱い生育低下を示したが、同様の生育

伝 子 あ る こ と が 考 え ら れ た。 さ ら に、tet-AUR 1 株 に低下パターンは tet-LIP 1 ira 2 D 株、tet-LIP 1 RAS 2 D 株に

MSN 2 及びそのパラログである MSN 4 が欠損した三重変

おいても観察された。この結果より、IRA 2 あるいは RAS 2

異株（tet-AUR 1 msn 2 D msn 4 D 株）は、ドキシサイクリ

欠損は、複合スフィンゴ脂質減少による生育阻害に対してンによる Aur 1 p 発現抑制に対して高感受性を示すこともは 影 響 し な い こ と が わ か っ た。 す な わ ち、Ras -cAMP-

判 明 し た（Fig. 7 B）
。 こ れ ら の 結 果 よ り、Msn 2 p 及 び

PKA 経路の活性化によって、Aur 1 p 抑制が誘導するセラ

Msn 4 p がセラミド蓄積に対して、細胞をプロテクトする

ミド蓄積に対して高感受性を示すことが示唆された。

ための転写因子であることが強く示唆された。

４．考察

3 . 3 Aur 1p 発現抑制に対して抵抗性を示すマルチコピ
ーサプレッサーの探索と解析

今回、出芽酵母を用いて Aur 1 p 発現抑制に対する高感

Aur 1 p 発現抑制に対する高感受性株に続いて、逆に抵

受性及び抵抗性株の網羅的探索を行った結果、Ras-cAMP-

抗性を示す株の探索を行った。具体的には過剰発現によっ

PKA シグナル伝達経路が、セラミド代謝異常が誘導するて Aur 1 p 発現抑制に対する抵抗性を引き起こす遺伝子（マ生育阻害と密接に関連することを示唆された。すなわち、Fig. 7 MSN2 過剰発現、MNS2, MSN4 欠損が Aur1p 発現抑制による生育阻害に及ぼす影響− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Ras-cAMP-PKA 経路が活性化されるような変異を導入す

３）Tani M, and Kuge O, : Defect of synthesis of very long-

ると Aur 1 p 抑制が誘導するセラミド蓄積に対して高感受chain fatty acids confers resistance to growth inhibition

性を示すが、Ras-cAMP-PKA 経路が抑制されるような変by inositol phosphorylceramide synthase repression in

異を導入した場合、逆に抵抗性を示すことが確認された。

yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biochem. 148 , 565 - 571 ,Ras-cAMP-PKA 経路は、生育維持に必須であり、ストレ2010

ス応答、細胞周期の調節に関与する重要なシグナル伝達系

４）Tani M, and Kuge O, : Hydroxylation state of fatty acidである。セラミド代謝異常によって、実際に Ras-cAMP-and long-chain base moieties of sphingolipid determine

PKA 経路が活性化されているのか、抑制されているのか

the sensitivity to growth inhibition due to AUR 1

に関しては今後の重要な課題である。一方で、Aur 1 p 発

repression in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys

現抑制に対するマルチコピーサプレッサーを探索した結果、

Res Commun. 417 ( 2 ), 673 - 678 , 2012

ストレス応答転写因子をコードする MSN 2 を同定した。

５）Belli G, Gari E, Aldea M and Herrero E, : Functional

ま た、 予 備 的 な 実 験 で は あ る が、Aur 1 p 特 異 的 阻 害 剤

analysis of yeast essential genes using a promoter-

Aureobasidin A で 細 胞 を 処 理 す る こ と で、GFP 融 合

substitution cassette and the tetracycline-regulatable dual

Msn 2 p が核移行することが観察されている。このことをexpression system. Yeast. 14 , 1127 - 1138 , 1998

併せると Aur 1 p 発現抑制が誘導する生育阻害の際に、ス

６）Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H,

トレス応答因子である Msn 2 p が活性化されることで生育

Anderson K, Andre B, et al, : Functional characterization

阻害を抑制していることが考えられる。さらに興味深いこof the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallelとに、Msn 2 p は PKA でリン酸化されることでネガティブ

analysis. Science. 285 , 901 – 906 , 1999

な調節を受けることが報告されている 。今後、セラミド

７）Tong AH, and Boone C, : Synthetic genetic array

代謝異常下における Ras-cAMP-PKA 経路と Msn 2 p によるanalysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol.

ストレス応答の役割を更に詳しく明らかにすることで、セ

313 , 171 - 192 , 2006

10）

ラミドの細胞内シグナル伝達系に及ぼす影響を詳細に解明

８）Vandamme J, Castermans D, and Thevelein JM, :していきたい。また、今回調べた変異株以外に、スクリー

Molecular mechanisms of feedback inhibition of protein

ニングで見つかって来たその他の変異株に関しても、詳細

kinase A on intracellular cAMP accumulation. Cell

な解析を順次進めて行きたい。

Signal. 24 , 1610 - 1618 , 2012９）川口 諒太郎、久下 理、谷 元洋 . IPC 合成酵素発現抑制（引用文献）に対して高感受性を示す酵母変異株の同定と解析 , 2012

１）Hannun YA, and Obeid LM, : Principles of bioactive

年度 日本生化学会大会講演要旨集 .

lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol10）Görner W, Durchschlag E, Martinez-Pastor MT,
Estruch F, Ammerer G, Hamilton B, Ruis H, and Schüller

Cell Biol. 9 , 139 - 150 , 2008
２）Tani M, and Kuge O, : Requirement of a specific group

C, : Nuclear localization of the C 2 H 2 zinc finger proteinof sphingolipid-metabolizing enzyme for growth of yeast

Msn 2 p is regulated by stress and protein kinase A

Saccharomyces cerevisiae under impaired metabolism ofactivity. Genes Dev. 15 , 586 - 597 , 1998

glycerophospholipids. Mol Microbiol. 78 , 395 - 413 , 2010

− 122 −

皮膚老化における11b -hydroxysteroid dehydrogenase type 1の役割

大阪大学大学院医学系研究科皮膚科学講座

寺 尾

美 香

Glucocorticoids (GCs) are one of the most effective anti-inflammatory drugs to treat acute and chronic inflammatory
diseases. However several studies show that GCs alter collagen metabolism in the skin and induce skin atrophy. Cortisol isthe endogenous GC that is released in response to various stressors. Over the last decade, extraadrenal cortisol production
in various tissues is reported. Skin is also known to synthesize cortisol though de novo pathway and through activating
enzyme. 11b-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11b-HSD1) is the enzyme that catalyzes the conversion of hormonallyinactive cortisone into active cortisol in cells. We previously found that 11b-HSD1 is negatively regulating proliferation of
keratinocytes. To know the function of 11b-HSD1 in dermal fibroblast and collagen metabolisum, the effect of selective
11b-HSD1 inhibitor was studied in mouse tissues and dermal fibroblasts. The expression of 11b-HSD1 increased with age
in mouse skin. Subcutaneous injection of selective 11b-HSD1 inhibitor increased dermal thickness, and collagen content of
the mouse skin. Proliferation of dermal fibroblasts significantly enhanced in cells derived from 11b-HSD1 knockout micecompared with cells derived from wildtype mice. Taken together, these data suggest that 11b-HSD1 is involved in collagenmetabolism in the skin possibly by decreasing the proliferation of dermal fibroblasts. Our findings suggest that 11b-HSD1
inhibition may reverse the decreased collagen content observed in intrinsically and extrinsically aged skin and in skin
atrophy that is induced by GC treatment.

１．緒言

コルチゾールは身体的・精神的ストレス時に副腎から産生され、代謝・血圧・血糖をコントロールする生体に必須のホルモンである。血中のコルチゾール濃度は組織中の濃度を反映すると考えられているが、局所コルチゾール修飾酵素の発見より必ずしも組織中の濃度が血中の濃度と反映しないことが明らかにされつつある。近年、我々のグループと他グループより表皮ケラチノサイトもコルチゾールの再活性化酵素とde novo 合成酵素をもつことが報告された 1−4）。
局所コルチゾール修飾酵素の一つである11β-hydroxysteroid
dehydrogenase（11β-HSD）は細胞内でコルチゾールを再活

図１

性化する酵素（図１）であり、2001 年に脂肪細胞に特異的

局所コルチゾール制御機構

な発現上昇がメタボリック症候群を引き起こすと報告されて以降、肥満・高血圧やメタボリック症候群の原因の一つ
5）ており、組織中の11 β - HSD 1 の上昇が発症に関与することとして研究が進んでいる酵素である 。特に、肥満の予防は興味深く、皮膚などの他臓器で同様の現象がおきている薬・高血圧の治療薬といった観点より、現在・多施設におことを推測させる。

い て、11 β-HSD 1 阻 害 薬 の 開 発 が な さ れ て い る。 ま た、

皮膚老化には内因性の老化（生理的老化）と外因性の老2010 年に高齢マウスにおける11 β-HSD 1 発現の上昇が骨粗化があり、内因性の老化は遺伝的変異、外因性の老化は紫鬆症にも関与することが報告されており、緑内障の発症病

外線、喫煙、アルコール摂取などの影響をうける 7）。生理態に関わるという報告もある 6）。肥満や骨粗鬆症、緑内障

的老化により、肉眼的には、皺、たるみ、乾燥などが認めはその発症の原因の一つとしてコルチゾールが良く知られられ、表皮―真皮の接合力が弱くなり、軽微な外傷や摩擦で両者が開離し容易に水疱やびらんが形成される。機能的には創傷治癒の遅延、刺激に対する炎症応答の減弱、易感
染性などがみられる。病理組織学的には、表皮突起の短縮

The role of 11 b- hyd roxysteroid
dehydrogenase type 1 in skin aging
Mika Terao
Department of Dermatology Osaka
University Graduate School of Medicine

がおき、表皮―真皮の境界が扁平化する。また、真皮線維芽細胞の数が減少し、基質を形成するグリコサミノグリカ
ンも減少する 8）。高齢者の真皮線維芽細胞は若年者に比べてコラーゲン産生量が低いことも報告されている 9 , 10）。

− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

我々はこれらの生理的老化に伴う変化がグルココルチコイ

sodium dodecyl sulphate, 100µg/ml phenylmethylsulphonyl

ド過剰に伴う皮膚変化と類似することに注目した。

fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, protease inhibitor

グルココルチコイド剤は強力な抗炎症作用のために、内

cocltail）で皮膚組織のタンパク質を４度 over night で撹拌

服薬としても外用薬としても頻用される薬剤である。しかしながら溶解させた。遠心分離した後、上清の蛋白溶解液

し、短期的にはグルココルチコイドの増加は組織の生存にをサンプルとした。

働くが、ストレスに伴う慢性的な内因性のコルチゾール増調製したサンプルを 10％のポリアクアミドゲルにて加や外因性のグルココルチコイドは、糖尿病や高脂血症、0.02A で 80 分間電気泳動した。電気泳動後のゲルを用いて、白内障、骨粗鬆症を引き起こすことが知られている。また、

PVDF メンブレンへの転写を 0 . 15 A で 45 分間行った。転長期間のグルココルチコイド剤の内服や外用の副作用の一写後のメンブレンを３% スキムミルクにて 60 分間ブロッ

つとして、皮膚の萎縮、脆弱化、易感染性、創傷治癒の遅キング後、一次抗体を４度 over night で反応させた。メン延が引き起される。皮膚の萎縮は主にコラーゲン合成とグ

ブレンを３% スキムミルクで３回洗浄した後、HRP 標識

11）

リコサミノグリカン合成の低下によるものであり 、ヒト

二次抗体 anti-rabbit lgG、anti-rat IgG、anti-mouse lgG をの皮膚において、グルココルチコイドの全身投与や外用は60 分間反応させた。TBS-T で洗浄した後、Pierce Western

タイプ１コラーゲンとタイプ３コラーゲン合成を低下させ

Blotting Substrate Plus（Thermo Fisher Scientific Inc）

12）

ることが報告されている 。このように、長期間のグルコを用いて発色した。

コルチコイド過剰に伴う皮膚萎縮は病理組織学的、分子生

2.4

物学的に生理的老化と共通するところが多い。

MTSアッセイ

本研究では、マウス皮膚における 11 β-HSD 1 発現が年齢

96 well plate に皮膚線維芽細胞を１well あたり細胞数１と と も に 上 昇 す る こ と に 着 目 し、 皮 膚 老 化 に お け る

× 103 個ずつ 10 %FBS 添加 DMEM で培養した。培養した翌

11 β-HSD 1 の役割を 11 β-HSD 1 阻害薬及び、ノックアウト

日を１日後とし、２日後、３日後、６日後にMTS試薬（Promega,

マウス、表皮角化細胞・真皮線維芽細胞を用いて検討した。

Madison, WI, USA）を１well あたり 20 µl ずつ添加し、２

２．実
2 .1

時間インキュベートした後、吸光計（Bio-Rad, Hercules,

験CA, USA）を用いて吸光度（490 nm）で測定した。

細胞培養

生後１日のマウスから採取した皮膚組織を４mg/ml

2.5

免疫組織学的染色

PBS で調整した Dispase（GIBCO, Carlsbad, CA）に浸し、ヒト健常皮膚組織（パラフィン包埋）を薄切し、キシレ

37 度１時間インキュベートの後、真皮から表皮を剥離しンで脱パラフィン、エタノールで脱水を行った。クエン酸

た。得られた真皮を 0 . 05 % collagenase 内で 37 度の恒温槽

バッファー（pH 6 . 0）による熱処理（oil bath 110 度）で抗に 40 分間浸して振揺させた後、70 µm filter を用いてろ過し、原賦活処理を 10 分間行ったのちに常温まで冷却、蒸留水

10% FBS 添加 Dulbecco’s Modified Eagle medium（DMEM）

で洗浄した後、DAKO Protein Block Serum Free（Dako,を用いて培養した。

Carpinteria, CA）で室温 15 分 blocking を行った。Antibody
Diluent（Dako）で１次抗体 rabbit anti- 11 β-HSD 1（Abcam）

2.2

RNAの抽出と逆転写反応・リアルタイム PCRおよび mouse anti-keratin 14（Abcam）を 100 倍希釈し、４ST Total RNA Isolation System（Promega, Madison,

度 で 12 時 間 反 応 さ せ た。TBS-T（50 mM Tris-HCl,

WI）を用いて、プロトコールに従いマウスから得た皮膚組

pH 7 . 6 , 150 mM NaCl, 0 . 1 % v/v Tween- 20）で５分間２回

織 か ら mRNA を 回 収 し た。RT-MLV（invitrogen, Lincoln

洗浄した後に二次抗体を反応させた。

Center Drive Foster City, CA）を用いて mRNA の逆転写を３．結行い、cDNA を得た。cDNA を template とし、試薬 PowerSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystem）に て

3 .1

果

皮膚における11β-HSD 1の発現サンプルを調整した。ハウスキーピング遺伝子として表皮角化細胞における 11 β-HSD 1 発現を図 2 A に示す。

GAPDH（glyceraldehyde- 3 -phosphate dehydrogenase） を健常皮膚では 11 β-HSD 1 は有棘細胞を中心に発現しており、用いた。

基底層ではその発現はほとんどみられなかった 13）。また、
表皮角化細胞における 11 β-HSD 1 発現は IL- 1 β や TNFa な

2.3

ウエスタンブロット

どの炎症性サイトカイン、ハプテンや紫外線などの炎症刺マウスから背部の皮膚組織を採取し、液体窒素を用いて激により誘導されることがわかった（図２）14）。

皮膚組織を粉砕し、更に超音波処理を行ったのちに、Lysis
Buffer 2ml（0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidetp40, 0.1%

− 124 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

3.2

マウス皮膚における11β-HSD 1の発現ていた（図 3 B）。

新生マウス、３週マウス、２ケ月マウス、８ケ月マウスの皮膚組織の 11 β -HSD 1 発現をウエスタンブロットで検討したところ、成長とともにその発現の増加がみられた（図3 . 3 11β-HSD 1阻害により表皮角化細胞および真皮線維芽細胞の増殖能が亢進した

3 A）。また、真皮線維芽細胞を単離し培養後 RNA を抽出し、マウスより表皮角化細胞、真皮線維芽細胞を単離し、増mRNA レベルでの 11 β-HSD 1 発現を検討したところ、１

殖能を MTS アッセイで検討したところ、11 β-HSD 1 阻害

年マウスより単離した真皮線維芽細胞では新生マウスよりにより細胞増殖が有意に亢進することより、11 β-HSD 1 は単離した真皮線維芽細胞に比べてその発現が有意に上昇し細胞増殖を負に制御していると考えられる（図４）。

図２ ヒト健常皮膚における 11β-HSD1 発現
免疫蛍光染色像。11β-HSD1：赤、 K14：緑
Bar = 50μM
B 表角化細胞に IL-1β、TNFα 添加後の 11β-HSD1
発現量（ウエスタンブロッティング）
A

図３ マウス皮膚における 11β-HSD1 発現新生マウス、３週マウス、２ケ月マウス、８ケ月マウスの皮膚の11β-HSD1 発現量（ウエスタンブロッティング）
B 生後４日および１年マウス皮膚線維芽細胞における 11β-HSD1
発現量（RT-PCR）A

図４ 11β-HSD1 阻害は表皮角化細胞、真皮線維芽細胞の増殖を促進した
11β-HSD1 阻害薬を投与 72 時間後に BrdU アッセイ（表皮角化細胞）、
MTS アッセイ（真皮線維芽細胞）で細胞増殖能を測定した。

− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3.4

11β-HSD 1阻害は表皮過剰増殖を引き起こした

3.5

11β-HSD 1阻害により真皮コラーゲンが増加した

ヘアレスマウス（Hos : HR-1）に 11β-HSD1 阻害薬（50 µM）

真 皮 に お け る 11 β-HSD 1 の 役 割 を 検 討 す る た め に、を５日間外用後の表皮を観察したところ、表皮の肥厚およC 57 BL/ 6 マ ウ ス に 21 日 間 11 β-HSD 1 阻 害 薬 を 皮 下 投 与び、Ki- 67 陽性の増殖細胞の増加がみられた（図５）。この（10 µM）し、最終投与日の翌日に皮膚を回収し解析した。

結果より、in vivo においても 11 β-HSD 1 は表皮角化細胞

11 β-HSD 1 阻害薬を投与した皮膚では真皮の厚さが著明にの増殖を負に制御していることがわかる。

亢進しており、ウエスタンブロットでコラーゲンタイプ
1 a 1 の発現量が有意に上昇していた（図６）。これらの結図５ 11β-HSD1 阻害薬の外用は表皮を増殖させた
A, C ヘアレスマウス（Hos : HR-1）に 11β-HSD1 阻害薬（50μM）を５日間外用後の HE 染色像（A) と Ki-67 免疫染色像（C) Bar=100μM
B 表皮の厚さ（N=5）
D Ki-67 陽性細胞数（％）（N=5）

図６ 11β-HSD1 阻害により真皮コラーゲンが増加した
11β-HSD1 阻害薬（10μM）
を 21日間皮下投与後の HE 像とマッソントリクローム染
色像 Bar=100μM
B 真皮の厚み（N=6）
C, D コラーゲン 1α1（Col1A1）の発現量（ウエスタンブロッティング）
A− 126 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

果より、真皮のコラーゲン増生を 11 β-HSD 1 は負に制御していることがわかる。

3 . 8 11β-HSD 1による低濃度コルチゾールの誘導は炎症を正に制御した
培 養 表 皮 角 化 細 胞 の 11 β-HSD 1 を ノ ッ ク ダ ウ ン し、

3.6

11β-HSD 1阻害により創傷治癒が促進した

IL- 1 β、TNFa 誘導性の向炎症性サイトカインである IL- 6、

11 β-HSD 1 阻害によるマウス皮膚の創傷治癒を検討した。

IL- 8 を ELISA で測定したところ、11 β-HSD 1 ノックダウ

C 57 BL/ 6 マ ウ ス 背 部 に 作 成 し た ８mm 大 の 創 傷 にン細胞では向炎症性サイトカイン産生が低下していた（図11 β-HSD 1（10 µM）を２日毎に投与し、創傷面積を測定

９）14）。この結果より、11 β-HSD 1 による低濃度コルチゾしたところ、阻害薬投与群では有意に創傷治癒の促進がみールの誘導は炎症を正に制御していることがわかる。

られた（図７）
。

3.7

４．考

コルチゾールの濃度と炎症察

本研究では、マウス皮膚における加齢に伴う 11 β-HSD 1

グルココルチコイドは強い抗炎症作用を持つことより、増加が皮膚老化に及ぼす影響を 11 β-HSD 1 ノックアウトマ

様々な炎症疾患の治療に用いられているが、低濃度では、

ウスおよび 11 β-HSD 1 阻害薬を用いて検討した。マウス皮向炎症作用を持つことが報告されている。表皮角化細胞に

膚ではヒトの非露光部皮膚と同様に、加齢とともに真皮の−10おいても、低濃度コルチゾール（10M）
は IL- 6 産生を誘導

ひ薄化がみられコラーゲンが疎となる。加齢とともに

−5

14）

11 β-HSD 1 発現が上昇すること、加齢皮膚がコルチゾール

したが、高濃度コルチゾール（10M）は抑制した（図８） 。

図７ 11β-HSD1 阻害は皮膚創傷治癒を促進した
マウス皮膚に８ mm 大の創傷を作成し、11β-HSD1 阻害薬（10μM）を２日毎に外用した。
A, B C57BL/6 マウス創傷作成後 10 日目の写真（A）と創傷面積（％）（B）
。

図８ コルチゾール濃度と炎症
培養表皮角化細胞を様々な濃度のコルチゾールで培養し、IL-1β 誘導性 IL-6 を ELISA で測定した。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図９ 11β-HSD1 阻害は炎症を抑制した
培養表皮角化細胞の 11β-HSD1 を siRNA でノックダウンし、IL-1β、TNFα 誘導性の IL-6、IL-8 を ELISA で測定した。11β-HSD1siRNA : 11β-HSD1 ノックダウン細胞、Neg.siRNA :コントロール細胞投与に伴う副作用でみられる皮膚委縮と類似することより、

11 β-HSD 1 阻害が有効ではないかと期待される。さらに、

11 β-HSD 1 発現の上昇に伴う細胞内におけるコルチゾール

最近の我々の結果より、11 β-HSD 1 は皮膚の炎症応答にも濃度の上昇は、加齢でみられる真皮のひ薄化、コラーゲン

重要な役割を果たしていることがわかり、加齢に伴う炎症の減少に影響を及ぼしているのではないかと考えさらに解の増幅に関与している可能性が示唆される。

析をすすめた。まず、真皮線維芽細胞の増殖に及ぼす
11 β-HSD 1 の影響をノックアウトマウス由来の真皮線維芽細胞で検討したところ、野生型マウス由来真皮線維芽細胞に比べて有意に上昇していたことより、11 β-HSD 1 の発現謝

辞本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団より研究助成を頂きましたことを深謝致します。

上昇は真皮線維芽細胞の増殖に抑制的に働くことが示唆された。次に、11 β-HSD 1 阻害薬を皮下投与したところ、真（引用文献）

皮の厚みが増加し、コラーゲン 1 a 1 発現量が上昇したこ

１）Terao M, Murota H, Kimura A, et al. 11 beta-

ろより、11 β-HSD 1 を阻害すると真皮のひ薄化、コラーゲ

Hydroxysteroid dehydrogenase- 1 is a novel regulator

ンの減少が改善、すなわち、加齢に伴う変化を改善するこof skin homeostasis and a candidate target forとがわかった。

promoting tissue repair. PLoS One 2011 : 6 : e 25039 .

このように加齢や肥満に伴う機能的変化に 11 β-HSD 1 が２）Tiganescu A, Walker E A, Hardy R S, Mayes A E,

関与していることが考えられるが、加齢に伴う形態的変化

Stewart P M. Localization, age- and site-dependentにおける 11 β-HSD 1 の関与は定まった見解がない。最近、expression, and regulation of 11 beta-hydroxysteroid

11 β-HSD 1 ノックアウトマウスにおいて、加齢に伴う真皮

dehydrogenase type 1 in skin. J Invest Dermatol 2011 :15）

コラーゲン量の減少が抑制されたと報告されたが 、我々

131 : 30 - 36 .

が作成した 11 β-HSD 1 ノックアウトマウスでは６ケ月マウ

３）Cirillo N, Prime S S. Keratinocytes synthesize andス皮膚、１年マウス皮膚においてそのような結果は得られ

activate cortisol: first characterisation of a novel

なかった。

epidermal glucocorticoid system. J Cell Biochem 2011 .

５．総４）Vukelic S, Stojadinovic O, Pastar I, et al. Cortisol

括synthesis in epidermis is induced by IL- 1 and tissue

皮膚の生理的老化はグルココルチコイド過剰状態による

injury. J Biol Chem 2011 : 286 : 10265 - 10275 .

皮膚変化と類似するために、細胞内コルチゾール再活性化

５）Masuzaki H, Paterson J, Shinyama H, et al. A酵素である 11 β-HSD 1 の皮膚老化における役割を解析した。

transgenic model of visceral obesity and the metabolic

高齢者や肥満に伴う細胞増殖能の低下や創傷治癒の遅延

syndrome. Science 2001 : 294 : 2166 - 2170 .

には 11 β-HSD 1 に伴う局所コルチゾールの上昇が関与して

６）Weinstein R S, Wan C, Liu Q, et al. Endogenous

い る と 考 え ら れ、 高 齢 者 に み ら れ る 難 治 性 の 潰 瘍 にglucocorticoids decrease skeletal angiogenesis,− 128 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

vascularity, hydration, and strength in aged mice. In:

12）Oikarinen A, Haapasaari K M, Sutinen M, Tasanen
K. The molecular basis of glucocorticoid-induced skin

Aging Cell, 2010 : 147 - 161 .
７）Uitto J. Understanding premature skin aging. N Engl

atrophy: topical glucocorticoid apparently decreases
both collagen synthesis and the corresponding collagen

J Med 1997 : 337 : 1463 - 1465 .
８）Naylor E C, Watson R E, Sherratt M J. MolecularmRNA level in human skin in vivo. Br J Dermatol
1998 : 139 : 1106 - 1110 .

aspects of skin ageing. Maturitas 2011 : 69 : 249 - 256 .
９）Fisher G J, Quan T, Purohit T, et al. Collagen13）Terao M, Itoi S, Murota H, Katayama I. Expression

fragmentation promotes oxidative stress and elevates

profiles of cortisol-inactivating enzyme, 11 beta-matrix metalloproteinase- 1 in fibroblasts in agedhydroxysteroid dehydrogenase- 2 , in human epidermal

human skin. Am J Pathol 2009 : 174 : 101 - 114 .

tumors and its role in keratinocyte proliferation. Exp

10）Varani J, Dame M K, Rittie L, et al. Decreased

Dermatol 2013 : 22 : 98 - 101 .

collagen production in chronologically aged skin: roles

14）Itoi S, Terao M, Murota H, Katayama I. 11 beta-of age-dependent alteration in fibroblast function andHydroxysteroid dehydrogenase 1 contributes to thedefective mechanical stimulation. Am J Pathol 2006 :pro-inflammatory response of keratinocytes. Biochem

168 : 1861 - 1868 .

Biophys Res Commun 2013 : 440 : 265 - 270 .

11）Haapasaari K M, Risteli J, Koivukangas V, Oikarinen

15）Tiganescu A, Tahrani A A, Morgan S A, et al.

A. Comparison of the effect of hydrocortisone,

11 beta-Hydroxysteroid dehydrogenase blockadehydrocortisone- 17 -butyrate and betamethasone on

prevents age-induced skin structure and function

collagen synthesis in human skin in vivo. Acta Derm

defects. J Clin Invest 2013 : 123 : 3051 - 3060 .

Venereol 1995 : 75 : 269 - 271 .

− 129 −

創傷治癒における細胞外マトリックスの一つである
バーシカンの関与、RNAiによる検討
長崎大学病院皮膚科アレルギー科

冨 田

元

Traumatic injury leaves disfiguring scar and pigmentation, which provide significant reduction of QOL. Adequate skinwound healing leads to beautiful scar. Therefore, there is a need for a better treatment approach. Skin wound healing is acomplex biological event as a result of the interplay of epidermis and dermis. Formed good dermis wound bed performs
an essential function for epidermal cell migration and re-epithelization. Although, extracellular matrix existing dermis
has relations with cell adhesion, cell migration, cell differentiation, and cell proliferation, little is known about a role ofextracellular matrix in wound healing. To clarify a role of extracellular matrix in wound healing, we investigated mouse
fibroblast cell using suppression of versican, which is a hyaluronan-binding, extracellular chondroitin sulfate proteoglycan.
The levels of versican expression were measured over time after mouse cutaneous wounding. On day 4 and 5, mRNAlevel of versican were significantly increased in day 4 and 5 relative to day 1 to 3. By contrast, mRNA level of versican weresignificantly decreased in day 6 and 7. Therefore, versican may regulate the wound healing process.
The mRNA expression of Srpx2, Ccl6, and Smoc2 was increased in versican suppressed mouse embryonic fibroblast.
Previous reports showed that these factors regulated the inflammatory cell infiltration and angiogenesis. These results suggestthat versican may regulate the wound healing through Srpx2, Ccl6 and Smoc2.
Blockade of versican changed the various factors in mouse embryonic fibroblast. These effects of versican blockade may
occur in this wound study on day 1 to 3, 6, and 7. Taken together, it is possible that versican regulate the wound healing by
the Srpx2, Ccl6 and Smoc2 at some stated periods.

１．緒で炎症期となり、好中球、マクロファージ、リンパ球など

言が創部に浸潤してくる。これら炎症細胞は侵入病原体を除外傷などで損傷された皮膚は難治な場合に醜い瘢痕や色去するのみならず、サイトカインや細胞成長因子を放出す

素沈着を残し、著しく QOL を低下させる。そのため、瘢ることによって、表皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞を痕や色素沈着が少なく美しく治るような適切な治療が常に活性化させ、次に続く増殖期を誘導する。増殖期では、表求められている。皮膚潰瘍の治療には真皮側、表皮側の両皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞などが増殖し、その結方の再生が必要であり、良好な真皮側のウンドベッド（創果再上皮化、肉芽組織の形成が起こる。その後に、いった床）形成が表皮細胞の遊走、再上皮化の前提条件である。

ん生じた瘢痕組織などを正常の組織構築に置き換える再構

この真皮側のウンドベッド形成には新生血管や線維芽細胞

築期という、比較的長く続く過程が生じる。

の増殖が必須の条件となっている。今回、それらの細胞間

今回、バーシカンが創傷治癒の過程において経時的な発に存在する皮膚細胞外マトリックスに焦点をあてた。皮膚

現の変化をとることが示され、創傷治癒過程のそれぞれの細胞外マトリックスは、細胞の接着、分化、増殖などに深時期によって異なった役割を果たしている可能性があるこく関わっていることが知られているが、創傷治癒におけるとが示唆された。線維芽細胞におけるバーシカンの発現を個々の成分の役割は未だ解明されていない点が多い。本研

調節することで、創傷治癒におけるバーシカンの詳細な役

究はこれまで注目されてこなかったグリコサミノグリカン割を検討することを本研究の目的とした。

（コンドロイチン硫酸）を糖鎖に持つバーシカンの創傷治

２．実癒における役割をさぐる。
創傷治癒の過程は大きく分けて 4 つの過程から成ると考

2 .1

験

マウスの創傷皮膚におけるバーシカンの発現

えられている。最初の過程は血液凝固期であり、創ができマウスの背部皮膚にメスを用いて長径２cm の全層性のると血小板・フィブリンが凝集し、まず創部を塞ぐ。次い皮膚潰瘍を作成し、テガダーム ®にて創を被覆した。創傷の２mm マージンで創部の皮膚を採取し、全 RNA を単離

Study t he ext racel lu la r mat r i x ,especia l ly versica n involvement ofwound healing by use of RNAi
Hajime Tomita
D ep a r t ment o f D e r m at o l og y, a ndA l lerg o l og y, Na g a s a k i Un iver s it y
Hospital

した。RNA を cDNA に逆転写し、バーシカンの転写産物
を Glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase（GAPDH）の PCR 産物と比較することで相対発現量を算出した。以上の RT-PCR 法をもちいて創作生後の１日目から７日目までのマウス創傷部皮膚におけるバーシカンの発現を検討した。

− 130 −

創傷治癒における細胞外マトリックスの一つであるバーシカンの関与、RNAi による検討

2 . 2 RT-PCRを用いたマウス胚線維芽細胞（MEF）のsmall interfering RNA（siRNA）導入によるバーシカ

変化を網羅的に観察した。

2.5

ン産生抑制の確認
胎生 10 日のマウスより皮膚線維芽細胞を摘出し、MEF
TMを培養する。Lipofectamin

バーシカンの抑制によって変化した分子の検討

マイクロアレイにて変化を起こしていた分子に対して実RNAiMAX®を用いて MEF

際に MEF で変化がおきているかを RT-PCR を用いて確認にバーシカンの siRNA を導入した。その５日後、７日後、した。サンプルとしてはバーシカンの siRNA を導入した

10 日後、14 日後の MEF から全 RNA を抽出し、RT- PCR を

MEF を用い、導入後７日目のサンプルを用いた。コント

用いてバーシカンの発現を検討した。コントロールとしてロールとしてはネガティブ siRNA を導入した MEF のメデ

ネガティブ siRNA を同様の方法で導入した MEF を用いた。

ィウムを用いた。また、siRNA 導入の３日目、５日目にそまた、siRNA 導入の３日目、５日目にそれぞれメディウム

れぞれメディウムの変更を行った。

の変更を行った。

３．結果

2 . 3 ドットブロットを用いたMEFの siRNA 導入による
バーシカン産生抑制の確認

3 .1 経時的に変化するマウス創傷皮膚のバーシカンの発現（図１）

siRNA 導入７日目のメディウムを用い、バーシカンがタ

創作成の１−３日目ではバーシカンの発現は認められなンパクレベルにおいても抑制されているかを確認した。採かった。しかしながら創作成４−５日目でバーシカンは過取したメディウム 4 µl をメンブレンに滴下し、バーシカン

剰に発現した。しかしながら、創作成６−７日目ではバーの抗 IgG 抗体及び蛍光抗体を用いてバーシカンの発現を確

シカンの発現は４−５日目と比較して著明に抑えられた。

認した。コントロールとしてはネガティブ siRNA を導入

創傷治癒の過程の一部でバーシカンが著明に発現し、そのした MEF のメディウムを用いた。また、siRNA 導入の３後に抑制されていることが示された。

日目、５日目にそれぞれメディウムの変更を行った。

2.4

3 . 2 siRNA 導入によるバーシカン産生の経時的変化（図２）

DNAマイクロアレイ

MEF にバーシカンの siRNA を導入して７日後の MEF サ

MEF にバーシカンの siRNA を導入することによってンプルとネガティブ siRNA を導入した MEF サンプルそれMEF のバーシカン産生の変化を確認した。導入５日目、ぞれの DNA を抽出し、マイクロアレイを用いて DNA の７日目ではネガティブコントロールと比較して、著明にバ

図１

図２

経時的に変化するマウス創傷皮膚のバーシカンの発現

リアルタイム RT-PCR によるバーシカン発現の変化− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ーシカンの産生は減少していた。siRNA 導入 14 日目にはに何らかの役割を担っている可能性が高いと考える。本研

ネガティブコントロールとほぼ変わらない結果となった。

究では創傷作成後２−３日で上皮化することから、５日目
は創傷治癒における増殖期から再構築期であり、その時期

3 . 3 タンパクレベルにおけるバーシカン発現の確認（図３）にバーシカンが発現していることが示唆される。またそのMEF にバーシカンの siRNA 導入の後７日目において、MEF のバーシカンを抑制する実験では、本研究の創傷治

メディウム中のバーシカンの発現は著明に減少していた。

癒過程において６−７日目の状態を観察することができた

タンパクレベルでも siRNA 導入によってバーシカンの産可能性がある。

後バーシカンの発現が低下していることから、今回のMEF の バ ー シ カ ン を 抑 制 す る と Srpx 2 が 上 昇 し た。

生が抑制されていることが確認された。

Srpx 2 は細胞外マトリックス蛋白の一つであり、セレクチ

3 . 4 バーシカンが抑制されることで変化した細胞外マトリックスやサイトカイン（図４）

ンファミリーとともに働くことによって血管新生と血管内マイクロアレイを用いて MEF のバーシカンを抑制したーシカンの抑制により Srpx 2 が上昇することで、血管新生

際に、上昇した３つの因子を実際に RT- PCR を用いて評価の促進、血管内皮細胞の遊走を介して創傷治癒を調節してした。バーシカンのsiRNAを導入した７日目のMEFにおいいるのかもしれない。

皮細胞の遊走を調節していることが報告されている 1）。バて、コントロールと比較してSushi repeat- containing protein,

同様の実験で MEF のバーシカンを抑制した際に Ccl 6 がX-linked 2（Srpx 2）と CC Chemokine Ligand- 6（Ccl 6）、上昇した。Ccl 6 はマクロファージや CD 4 陽性リンパ球、Secreted modular calcium-binding protein-2（Smoc2）の発現

好酸球の遊走因子である事が知られている。また、Ccl 6がネガティブコントロールと比較して有意に上昇していた。

はマクロファージの遊走を促すことで創傷治癒を促進する

４．考ことが報告されている 2）。実際の創傷治癒ではどの時期に察働いているのかは不明であるが、バーシカンが抑制されたマウス皮膚創傷治癒の過程において、バーシカンが一過性に発現し、その後に抑制されていることから、創傷治癒

図３

図４

状態では Ccl 6 を介して創傷治癒を促進していることが予想された。

ドットブロットによるバーシカン発現の確認

MEF のバーシカンを抑制した際の Srpx2、Ccl6、Smoc2 の発現− 132 −

創傷治癒における細胞外マトリックスの一つであるバーシカンの関与、RNAi による検討

同様に、MEF のバーシカンを抑制した際に Smoc 2 が上昇した。Smoc 2 は細胞外マトリックスの１つであり、腫カンの細胞に働きかける役割をさらに検討する必要があると考えた。

瘍の新生や創傷時の組織の修復に関与している事が知られ５．総ている。具体的には Smoc 2 は血管新生やケラチノサイトの遊走などを促進することが報告されている 3 , 4）。バーシ

括

創傷治癒は様々な過程を経ているため非常に複雑であり、カンが抑制されると Smoc 2 の経路も介して創傷治癒を促バーシカンが経時的に発現、抑制されていることは非常に進することが予想された。

興味深い。特に肉芽形成を反映する増殖期に過剰発現し、バーシカンを抑制することでこれら３つの因子が上昇しその後に抑制されていることは意味があると考えられた。

た。それぞれが創傷治癒を調節することが報告されており、今後は実際に血管新生、炎症細胞遊走、線維芽細胞や表皮

これらの因子を介してバーシカンは創傷治癒を調節してい細胞の遊走に与える変化を in vitro にて検討していくことる可能性がある。よって in vivo でバーシカンを抑制するとなる。さらに、マウスを用いた in vivo の創傷治癒過程

ことが出来た場合は創傷治癒に何らかの変化が起こることにおいてバーシカンを RNAi 法にて抑制した際の創傷治癒が予想された。

過程の変化を検討し、さらに Srpx 2 や Ccl 6、Smoc 2 の発本研究では正常の創傷治癒においてバーシカンが発現す現の変化を検討する必要性があると考える。これらの結果

る時期は４−５日目と限られていたことがわかった。バーからバーシカンが創傷治癒に与える影響を検討していく。

シカンの抑制実験が実際に本研究の創傷治癒における１−

また、マイクロアレイ法にて変化があったサイトカインや

３日目、６−７日目を反映しているかどうかは確かめてお細胞外マトリックスに関しても in vitro、in vivo それぞれらず、in vivo での定量が今後必要であると考えた。

にて発現の検討を行い、バーシカンの線維芽細胞、マウス

創傷治癒過程において一過性に発現するバーシカンにはの皮膚に与える影響を詳細に検討していく必要がある。

創傷治癒を調節する役割があることが予想された。受傷１−３日目ではバーシカンが抑制されており、Srpx 2 や Ccl 6、 （引用文献）
Smoc 2 などが発現し、炎症細胞の浸潤や血管新生を促進

１）Miljkovic-Licina M, Hammel P, Garrido-Urbani S et

して、肉芽の形成を促進している可能性がある。さらに言al. Sushi repeat protein X-linked 2 , a novel mediator of

えば、これまでの報告で肉芽組織には過剰にバーシカンがangiogenesis. FASEB J 2009 ; 23 : 4105 - 16 .

5）

発現していることが知られており 、受傷４−５日目では２）Kaesler S, Regenbogen J, Durka S et al. The healing

形成された肉芽を反映してバーシカンが上昇していると思skin wound: a novel site of action of the chemokine

われる。受傷６日目以降ではバーシカンの発現は再度抑制

C 10 . Cytokine 2002 ; 17 : 157 - 63 .

されており、再度 Srpx 2 と Ccl 6、Smoc 2 が上昇している

３）Maier S, Paulsson M, Hartmann U. The widely

事が予想される。よって受傷６日目以降は肉芽組織が減少

expressed extracellular matrix protein SMOC- 2する再構築期である可能性が高い。

promotes keratinocyte attachment and migration.

MEF に対して RNAi 法を用いることでバーシカンを抑Experimental cell research 2008 ; 314 : 2477 - 87 .

制すると非常に様々な変化を起こしていることが示唆され

４）Rocnik EF, Liu P, Sato K et al. The novel SPARC

た。MEF から発現するバーシカンを抑制することで MEF

family member SMOC-2 potentiates angiogenic growthの周囲の環境が変化し、Srpx 2 や Smoc 2 などの細胞外マ

factor activity. The Journal of biological chemistry

トリックス、Ccl 6 などのサイトカインに影響を及ぼして2006 ; 281 : 22855 - 64 .

いた。その詳細なメカニズムは不明であり、今後のさらな

５）Hakkinen L, Westermarck J, Kahari VM et al.

る検討が必要であると考える。マイクロアレイ法にて変化

Human granulation-tissue fibroblasts show enhanced

した因子は Srpx 2 と Ccl 6、Smoc 2 以外にも多数変化した

proteoglycan gene expression and altered response to

ものが認められ、他の分子においても検討を行い、バーシ

TGF-beta 1 . J Dent Res 1996 ; 75 : 1767 - 78 .

− 133 −

放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

独立行政法人放射線医学総合研究所重粒子医科学センター 先端粒子線生物研究プログラム

中 山

文 明

The influence of radiation therapy on skin barrier functions remains unknown. In this study, skin barrier-associatedproteins were examined after irradiation. As a result, skin moisture and the expression of skin barrier-associated protein
loricrin were decreased after irradiation at a relatively low dose, whereas filaggrin proteins increased in skin after irradiation.
These findings suggest that decreased loricrin proteins play an important role in the pathogenesis of radiation skin injuries.

１．緒る。そして、放射線療法後の皮膚障害に有効な治療法や新た言なスキンケア製品の開発に有用な動物モデル指標を見出す。

重粒子線治療などの新しい放射線療法や、IVR を使った

２．実

血管内治療など、医療現場における放射線の利用がますま
す盛んになっている。今日では病巣へ放射線を集中させる

2 .1

験

各毛周期における放射線脱毛の線量の検討技術が発達し、正常組織への影響は少なくなっており、皮７週齢のオスBALB/cマウスを日本クレアより購入しSPF

膚潰瘍などの重篤な皮膚障害も極めて稀である。しかしなで飼育した。７週齢マウスの毛はすべて休止期（Telogen）でがら、脱毛や乾性落屑などの比較的軽度な放射線皮膚障害あるが、抜毛によりすべて成長期（Anagen）に同調・誘導では依然として発生し、美容的な問題として患者に大きな負きる。そこで背部より抜毛後６日目、毛包がAnagenVIの毛担となっている。また、放射線皮膚障害の病態は十分に解包周期になった時に、セシウム線源（Gammacell 40, Atomic

明されておらず、有効な治療法も確立していない。一方、Energy of Canada, Ottawa, Canada）を使ってガンマ線を全身

これらの研究に必要な放射線皮膚障害の評価方法も存在し照射した。照射方法は、マウスを無麻酔でプレキシガラスのなかった。そこで、我々は、放射線脱毛における毛包障害

円形容器に入れ、0.57Gy/分の線量率で4 ～ 12Gyを１回照を検討し、化学療法による毛包障害と同様の組織学的なパ射した。抜毛後14 日まで背部皮膚を観察し、発毛を認める

ラメーターを使って評価できることを明らかにし、放射線線量を決定した。

1）

毛包障害の評価方法を確立した 。
皮膚バリア機能に関係する構造として、cornified cell envelope

2.2

放射線毛包変性の組織学的検討

は角質細胞の細胞膜を裏打ちし、loricrin や involucrin な

マウスは皮膚を 10 % 中性緩衝ホルマリンで固定後、パどで構成されている。filaggrin もその構成蛋白質の一つだ

ラフィン包埋切片を作成し、HE 染色を行った。そして、が、表皮の顆粒層で profilaggrin として生合成された後、以前報告した 1）放射線毛包障害の評価方法に基づき、これ脱リン酸化や限定加水分解により filaggrin となり、さらにらの組織標本から各放射線障害パラメーターを測定した。

分解されて天然保湿因子となる。最近、filaggrin 異常と尋

すなわち、表１は、化学療法による変性毛包の分類 4）を参2）

3）

常性魚鱗癬 やアトピー性皮膚炎 の病因との関連性が明考に、AnagenVI の毛包に 12 Gy を照射し、3 . 5 日までの経らかになった。一方、放射線皮膚障害においても皮膚の乾時的な毛包変性に対して、その特徴を明らかにしたもので燥傾向が顕著だが、放射線と皮膚バリア機能の関係は未だある 1）。特に、（1）
毛包の dermal papilla と bulb の直径比、（2）

不明である。

bulb の直径、（3）毛包の長さの比較が変性毛包の評価に有

本研究では、放射線毛包障害の評価に基づき、マウスモ用であった。すなわち、初期変性成長期（early dystrophic

デルの照射線量を検討する。そのモデルを用いて皮膚バリア

anagen）では、bulb 径がわずかに縮小する程度で、他に機能に対する放射線による影響を組織・分子レベルで解析す

変 化 は 認 め ら れ な か っ た。 中 期 変 性 退 行 期（middystrophic catagen）では、bulb 径がさらに縮小する一方、Basic Study of Skin Injury Care afterRadiotherapy
Fumiaki Nakayama
Advanced Radiation Biology Research
Program, Research Center for Charged
Particle Therapy, National Institute ofRadiological Sciences

DP/bulb 比と毛包の長さが増大した。晩期変性退行期（latedystrophic catagen）では、DP/bulb 比がさらに増加するが、毛包の長さは急速に短縮した。

2.3

皮膚水分率の測定

マウス背部より抜毛６日後、毛周期が成長期となった背− 134 −

放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

部皮膚に対して、６Gy のガンマ線全身照射を行い、肌湿2.5

Western Blotting

度計（SR- 101、ロゼスター）で４点３回ずつ 24 時間おきにマウス背部より抜毛６日後、12 Gy のガンマ線全身照射

４日間測定し、皮膚水分率の平均値を算出した。なお、実を行い、照射 24、48、84 時間後に皮膚を採取し液体窒素

験中のマウスの飼育環境は室温 22 . 9 ～ 23 . 0℃、湿度 50 ～にて凍結した。約５mm 3 の凍結皮膚組織片を BioMasher

51 % と一定であった。

III（Nippi, Tokyo, Japan）で電動攪拌機（Nippi）を用いてホモジナイズし、100 µl の lysis バッファーに溶解させた。

2.4

皮膚バリア機能関連蛋白の免疫組織化学染色

そ の lysate を Bio-Rad Protein Assay（BioRad）で 蛋 白 定

マウス背部より抜毛６日後、６Gy のガンマ線全身照射

量 し、30 µg の 皮 膚 lysate を ミ ニ プ ロ テ ィ ア ン TGX ゲ ル

を行い、照射後３日の皮膚を採取した。採取した皮膚は（any KD、BioRad）で１次元蛋白質電気泳動を行った。

10 % 中性緩衝ホルマリンで固定後、パラフィン包埋切片を作成

PVDF 膜に転写後、５% スキムミルクでブロッキングし、抗し、HE染色を行った。さらに、パラフィン包埋切片を脱パラ

filaggrin 抗 体、 抗 loricrin 抗 体 及 び 抗 b- actin 抗 体（4967、

フィン後、２% 過酸化水素／メタノール溶液に室温で 30

Cell Signaling）を反応させ、２次抗体として抗ウサギ IgG-

分反応させて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックさせ

HRP（NA 934、GE Healthcare）を反応させた。最後に ECL

た後、0 . 01 M クエン酸に浸して 120℃ 15 分のオートクレ

select Western Blotting Detection System（GE Healthcare）

ー ブ で 抗 原 賦 活 処 理 を 行 っ た。 組 織 中 の マ ウ ス IgG をで発光させ、LAS - 4000 mini（Fujifilm）で検出した。

VECTOR M.O.M. immunodetection kit を用いてブロック

３．結した後、抗 loricrin 抗体（PRB - 145 P、Covance）を反応させ、抗ウサギ IgG-biotin 抗体を２次抗体として反応させた後、

3 .1

果

成長期における6 Gy 照射後の発毛障害

VECTASTAIN Elite ABC キット（Vector Laboratories）を抜毛により誘導された成長期の毛包は、抜毛後 6 日目に使って DAB で発色させた。一方、抗 filaggrin 抗体（PRB -は AnagenVI となっている。この成長期毛包に４, ６, ８

417 P、Covance）による免疫組織化学染色では、コンパウ

Gy のガンマ線照射を行い８日後の発毛を観察した（図１）。

ンドで包埋した皮膚凍結切片を４% パラホルムアルデヒド

その結果、非照射マウスでは著明な発毛が観察され、４で固定し、上記と同様に染色した。

Gy 照射マウスでも非照射群と比べて短いながらも発毛が

表 1 放射線毛包障害のパラメーターと毛包変性の分類− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

認められた。一方、６Gy と８Gy の照射では発毛が認めら

ラメーターの数値と矛盾しなかった。３日目の変性毛包のれず、その背部皮膚に多数のしわを認め、点状の紫斑が散状態は、表１の３つのパラメーターに基づいて判定すると、発していた。

10 ～ 12 Gy は晩期変性退行期、６～８Gy は中期変性退行
期、４Gy は初期変性退行期と同程度の数値だった（図２）。

3 . 2 成長期毛包に対する放射線照射後の障害パラメー
ターの変化

3.3

照射後の皮膚水分量低下

今回、抜毛後６日目の AnagenVI の毛包に対して４～

６Gy 照射後の皮膚にしわが発生していることから、皮12 Gy のガンマ線照射し、照射後８日（抜毛後 14 日）まで観膚水分量の低下が疑われた。そこで、抜毛後６日目の察し、その背部皮膚組織標本を、表１の毛包変性のパラメ

AnagenVI の毛包に対して、６Gy のガンマ線を照射し、ーターに基づき解析した。その結果、照射後４日目まで、24 時間ごとに皮膚水分率を測定した。

（1）DP/bulb 比は１日目には非照射では減少するのに対しその結果、皮膚水分率はガンマ線６Gy 照射後３日まではて、４～ 12 Gy のすべて照射群では線量依存性に増加した。

不変であったが、４日目に有意に低下した（図３）。

３日目には 10 ～ 12 Gy ではさらに増加したのに対して、
４～ 8 Gy では減少に転じ、４Gy と６Gy は８日目には０
Gy と同じ値になった。

3 . 4 照射後のバリア機能関連蛋白質の皮膚における発現変化（2）bulb 径は１日目に０Gy では不変だったのに対して、４

６Gy 照射３日後の皮膚に対する HE 染色では、表皮構造～ 12 Gy のすべての照射群でほぼ同程度に低下した。３に大きな変化を認めなかった。しかしながら、loricrin は非

日目には 10 ～ 12 Gy ではさらに減少したが、４～８Gy で照射皮膚では表皮顆粒層付近に限局して強発現していたが、は 3 日目には横ばいとなった。そして、４Gy と６Gy では照射によりその発現が著明に減少し、ほぼ消褪していた。

８日目には増加に転じ、４Gy の群は０Gy と同じ値にな

一方、皮膚バリア機能関連蛋白質である filaggrin は、非照った。８Gy 照射群は、８日目でも横ばいであった。

射皮膚では表皮顆粒層付近に限局して発現していたものが、（3）毛包の長さは、３日目には 10 Gy と 12 Gy 群は減少した。

照射によりその発現が基底層と有棘層、および角層の一部

４Gy と６Gy 群は増加してゆき、８日目には０Gy の長さに及び、filaggrin の発現部位が著しく拡大していた（図４）。

と同じになった。
３つのパラメーターは、４～８Gy 照射群は０Gy 群と 10

3 . 5 照射後のバリア機能関連蛋白質発現の経時的変化～ 12 Gy 照射群の中間の値を取る傾向にあった。４Gy 照

マウスに 12 Gy 照射し、経時的にサンプリングを行い

射群では８日目までに３つのパラメーターすべてが０Gy

western blotting で検討した。その結果、profilaggrin 及び群と同じになり、４Gy 群で発毛を認めていることは、パその中間体は 48 時間まで減少していったが、84 時間で増図１

成長期毛包の放射線障害

図２− 136 −

成長期毛包の放射線障害指標の推移

放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

加に転じていた。一方、filaggrin の発現量は 48 時間で軽度増加し、84 時間でむしろ著明に増加していた。保湿成分になる filaggrin 分解産物も照射後徐々に増加していった。loricrin の発現は western blotting でも非照射では強発現しているのが示されたが、照射後 24 時間でも明らかな減少を認め、その後も経時的に減少を続け、今回検討した 84 時間では著減していた（図５）。

４．考察

本研究のマウスモデルでは、毛包成長期に対して４Gyのガンマ線照射では照射８日後で発毛が認められるが、６
Gy 以上の線量では発毛を認めなかった。我々が提案した
図３

照射後皮膚水分量の減少

変性毛包の組織学的パラメーターに基づいて照射３日目の毛包を評価すると、４Gy は初期変性退行期、６～８Gy は

図４

照射後のバリア機能関連蛋白質の皮膚免疫組織化学染色

図５

照射後の皮膚バリア機能関連蛋白発現の western blot 解析− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

中期変性退行期と分類され、６～８Gy 照射群の方が４Gy（引用文献）

群より後期の変性毛包であったが、10 ～ 12 Gy 照射群の晩

１）Nakayama F, Hagiwara A, Kimura M, Akashi M,

期変性退行期よりは早期の変性であった。この中期変性退Imamura T: Evaluation of radiation-induced hair行期を誘発する６Gy 以上の照射条件では、皮膚にしわもfollicle apoptosis in mice and the preventive effects of

生じ皮膚の水分量の減少が示唆された。実際に皮膚水分率

fibroblast growth factor- 1 , Exp Dermatol, 18 , 889 - 892 ,は、６Gy 照射後４日目より有意な減少が認められた。

2009 .

皮膚バリア機能に関係するloricrinは、cornified cell envelope２）Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A,（CE）構成蛋白質の一つで、表皮ではそれに由来する部分がSandilands A, Campbell LE, Zhao Y, Liao H, Evans

CE成分の70%を占めるなど、主要成分となっている。しかAT, Goudie DR, Lewis-Jones S, Arseculeratne G,

しながら、loricrin欠損マウスでは、出生時には赤い半透明

Munro CS, Sergeant A, O'Regan G, Bale SJ, Comptonの光沢のある皮膚となるものの、他のCE成分が短期間にJG, DiGiovanna JJ, Presland RB, Fleckman P, McLean

loricrinの機能を補うことにより、皮膚バリア機能低下の所

WH: Loss-of-function mutations in the gene encoding

見に乏しい 5）。今回、放射線照射により、マウス表皮におけfilaggrin cause ichthyosis vulgaris, Nat Genet, 38 , 337 -るloricrin蛋 白 の 著 明 な 減 少 が 明 ら か に な っ た。 一 方、

342 , 2006 .

filaggrinが増加している所見は、照射後４日目に認められた

３）Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao

皮膚水分率の軽度低下が、loricrinの減少に由来することをY, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A, Campbell示唆した。loricrin欠損マウスのwestern blottingでは、大きLE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM, Cecil JE, Baleなfilaggrinの変化は認められていないと報告されているが、

SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-

新たなprofilaggrinのバンドが検出されていることから 、Jones S, Arseculeratne G, Sergeant A, Munro CS,

filaggrinもloricrin減少に補完的に作用している可能性がある。

El Houate B, McElreavey K, Halkjaer LB, Bisgaard

ヒトの放射線皮膚障害では３～ 10 Gy で紅斑が生じ、８

H, Mukhopadhyay S, McLean WH: Common loss-of-5）～ 12 Gy で乾性落屑と呼ばれる皮膚症状が生じる 。一方、

function variants of the epidermal barrier protein

ヒトの脱毛は３Gy 以上で生じることから、今回マウスモ

filaggrin are a major predisposing factor for atopic

デルで示した６Gy 照射による毛包障害と皮膚症状は、ヒdermatitis, Nat Genet, 38 , 441 - 446 , 2006 .

6）

トの脱毛と紅斑に相当する軽度の障害と考えられた。ヒト４）Hendrix S, Handjiski B, Peters EM, Paus R: Aの紅斑は乾性落屑より軽い病態であり、今回のマウス皮膚

guide to assessing damage response pathways of the

モデルでは、明らかな発赤は認められなかったものの、皮hair follicle: lessons from cyclophosphamide-induced

膚水分率の低下と loricrin 減少という皮膚バリア機能の低alopecia in mice, J Invest Dermatol, 125 , 42 - 51 , 2005 .

下が認められた。よって、皮膚バリア機能関連蛋白は、軽５）Koch PJ, de Viragh PA, Scharer E, Bundman D,

度の放射線皮膚障害でも変動し、その発症に関与している

Longley MA, Bickenbach J, Kawachi Y, Suga Y, Zhou

可能性が考えられた。

Z, Huber M, Hohl D, Kartasova T, Jarnik M, Steven

５．総AC, Roop DR: Lessons from loricrin-deficient mice:括compensatory mechanisms maintaining skin barrier

軽度の放射線皮膚障害でも、皮膚バリア機能関連蛋白でfunction in the absence of a major cornified envelope

ある loricrin の著明な発現低下が認められ、皮膚水分量のprotein, The Journal of cell biology, 151 , 389 - 400 , 2000 .

低下に関与していることが示唆された。そして、皮膚バリ

６）IAEA. Diagnosis and treatment of radiation injuries.

ア機能の変化は、放射線皮膚障害の潜在的な病因であるこIn: Safety Reports Series No. 2 . Vienna: The Agency;とが示唆され、放射線皮膚障害に有効な治療法や新たなス1998 . p. 10 .

キンケア製品の開発のための有用な指標となることが示された。

− 138 −

加齢に伴う皮膚 17 型コラーゲン切断動態の解析

北海道大学病院皮膚科

西 江

渉

Bullous pemphigoid (BP) is the most common autoimmune blistering disorder, which affects elderlies. IgG
autoantibodies from BP patients target the transmembrane collagen XVII (COL17), a major component of hemidesmosomes
in basal keratinocytes. Hemidesmosomes plays a vital role for keeping stable adhesion between the dermis and theepidermis, thus, autoimmunity to COL17 results in blistering phenotype. However, the pathogenesis for breaking thetolerance to COL17 is still uncertain. The major epitopes for IgG autoantibodies from BP patients are clustering within thejuxtamembranous non-collagenous (NC) 16A domain, and interestingly, extracellular domain of COL17 is physiologicallycleaved within the NC16A domain. In addition, certain autoantibodies from BP patients preferentially react with theshed ectodomain but not with the full-length form. Furthermore, cleavage of COL17 can induce neoepitopes around thecleavage-sites on the NC16A domain. These findings suggest the ectodomain shedding of COL17 is closely related withthe development of autoimmunity to COL17, and non-physiological ectopic cleavage of the molecule due to aging may berelated with the autoimmunity development. To address these issues, we tried to identify non-physiological cleavage sites
within the NC16A domain and to produce a novel cleavage site-specific antibody which can detect the non-pathologicalcleavage site. We first identified Ser508 to be N-terminal cleavage site of COL17 ectodomain which is cleaved by plasmin,a potential serine protease expressing in lesional skin as well as blister fluid of BP. Second, we generated rabbit antibodies
which specifically target pathological N-terminal cleavage site of cleaved COL17 ectodomain by immunizing short peptides
corresponding to the identified cleavage site. The antibody demonstrated that COL17 is cleaved at Ser508 in lesional skin ofsome BP patients, however, the cleavage was not observed physiological setting even aged skin.

１．緒

メイン内で切断することも報告されている 5）。従ってプラ

言

スミンによる COL 17 の切断部位が判明され、同部位に対水疱性類天疱瘡（bullous pemphigoid、BP）は、高齢者する切断部特異抗体の作成が出来ると、BP の病変部に於に好発し、自己免疫性水疱症のなかで最も頻度の高い疾患

ける COL 17 の非生理学的切断の有無が明らかになる可能である。BP 患者 IgG の多くは、表皮真皮境界部に存在す性が高い。更に、切断部が判明すると切断部を特異的に認る 17 型コラーゲン（COL 17）の細胞膜近傍の NC 16 A 領域

識する抗体を作成することが可能となるため 1）、加齢に伴に強く反応する。近年、申請者らは COL 17 の NC 16 A 領

い COL 17 が非生理学的部位で切断されるかどうかについ

域内で COL 17 の細胞外領域が生理的に切断され、切断後ても解明可能となる。BP は高齢者に好発する疾患である1）に新しい抗原エピトープが生じることを明らかにした 。

ため、BP の発症機序解明に迫る可能性がある。

従って、COL 17 の切断は、BP における自己抗体の発症に

本 研 究 の 目 的 は、COL 17 の 切 断 部 特 異 抗 体 を 用 い、

大きく関与することが予想されるが、その病態生理は未だ

COL 17 の切断によって生じる抗原エピトープの出現と BP十分に解明されていない。生理的な条件下では、COL 17との関連について解明することである。本研究の特徴は、は ADAM 9、10、17 によって NC 16 A ドメイン内の複数個

各種年齢の皮膚における COL 17 の切断動態を解明し、高2 , 3）、申請者らは、BP の水疱内容液中に齢者皮膚の一部において、BP 病変部と同様に COL 17 が切含まれるセリンプロテアーゼによって生理的切断部とは異断され、切断部に新規エピトープが生じているかを明らか

所で切断されるが1）なる部位で切断を受ける可能性を示した 。しかし、実際にする点である。

の BP 病変部で、生理学的切断部位と異なる部位で COL 17

２．実が切断されているかは不明である。一方、BP の病変部では、
プラスミンの発現が亢進していることが知られており 4）、
実際に、プラスミンが COL 17 の細胞外領域を NC 16 A ド

2 .1

験

プラスミンによるCOL17の切断部位の同定

FLAG タグを組み込んだ COL 17 A 1 cDNA を pcDNA 5 /FRT ベクター（Invitrogen）へ導入し、pOG 44 ベクターと共に Flp-In 293 細胞へコトランスフェクション後、ヒグロ
マイシンによって安定発現株をクローニングする。安定発

Non-physiological cleavage of collagen ⅩⅦ
in aged skin
Wataru Nishie
Department of Dermatology, Hokkaido
University Hospital

現株細胞に COL 17 が正しく発現していることを、ウェス
タンブロット等にて確認後、ライセートタンパクから、
FLAG に対するマウスモノクローナル抗体（M 2、Sigma）
を用い、アフィニティー精製する。精製された全長のリコ− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ンビナント COL 17 タンパクをリコンビナントプラスミン

これまで申請者が作成した生理的な COL 17 の切断部位をで消化し、SDS-PAGE を行い、COL 17 の細胞外領域に該特異的に認識する抗体を用い 1）、各種年齢の正常ヒト皮膚当する 120 kD のバンドをクマシー染色後に切り出し、トを染色し、BP の病変部と同様の病的な切断が年齢や部位

リプシンで処理後、マススペクトロメトリー（nano - LC/

特異的に生じているか検討する。

LC - MS）にて切断部を同定する。その際、トリプシン処理

３．結によって生じるアミノ末端断片とプラスミンによって生じた断片を鑑別する目的で、SDS - PAGE 施行直前にサンプ

3 .1

果

プラスミンによるCOL17の切断部位の同定

ル 中 の 全 タ ン パ ク の ア ミ ノ 末 端 を ア セ チ ル 化 し（Sulfo

リコンビナント COL 17 は、抗 FLAG 抗体によって極め

NHS - Acetate、Pierce）、nano - LC/LC - MS 結 果 を Mascotて高純度に精製できた。コラーゲンは３本鎖を形成するが、で解析する際、アセチル化条件でペプチド配列を算出する 1）。

精製 COL 17 は非還元状態では 540 kD（180 kD× 3 本）
、還元状態では 180 kD 付近に一本鎖として確認出来た（図１）。

2 . 2 プラスミン切断部位に対する切断部特異抗体の作成

さらに精製リコンビナント COL 17 をプラスミンで処理す同定された切断部から８アミノ酸程度のペプチド（シスると、COL 17 の細胞外領域に相当する 120 kD と 97 kD のテインを C 末端に結合）を合成し、MBS を用い KLH に共断片を生じることを確認した（図１）。120 kD の切断断片

有結合後、抗原として２匹の兎へ免疫する。抗原ペプチドを切り出し、マススペクトロメトリーで解析したところ、

カ ッ プ リ ン グ ア ガ ロ ー ス を 作 成 し（SulfoLink Coupling

生理的切断部位とは異なる、NC 16 A 領域内の 508 番目セResin and immobilization kit、Pierce）、得られた抗血清

リン（Ser 508）のアミノ末端で切断されることが判明した。

から切断部位特異抗体をアフィニティー精製する。得られ
COL 17 タンパクおよび正常ヒト皮膚を基質として用い、

3 . 2 プラスミンによって生じる切断部に対する特異抗体の作製それぞれウェスタンブロットと蛍光抗体法で確認する。最Ser 508 から８アミノ酸のペプチドを合成し、２匹の野兎

後に、得られた切断部特異抗体を用い、各種年齢の正常ヒへ免疫した。抗原ペプチドカップリングカラムによってアト 皮 膚 を 染 色 し、BP の 病 変 部 と 同 様 の 病 的 な 切 断 がフィニティー精製した切断部特異抗体は、プラスミンによCOL 17 に生じているかについて検討する。

って消化された COL 17 断片に反応することをウェスタンた 切 断 部 特 異 抗 体 の 特 異 性 は、 プ ラ ス ミ ン 消 化 し た

ブロットで確認した。次に、凍結正常ヒト皮膚切片を薄切

2 . 3 各種切断部特異抗体を用いた COL17の切断動態の解明
プラスミンによって切断された切断部特異抗体に加え、切片上でプラスミンと反応させ、作成した切断部位特異抗体で染色したところ、表皮真皮間境界部に線状に沈着することを確認した（図２）。

図１ 精製 COL17 は非還元状態では 540kD（180kD×3 本）、還元状態では 180kD 付近に一本鎖として確認出来た（A、矢印）。さらに精製リコンビナント COL17 をプラスミンで処理すると、COL17 の細胞外領域に相当する 120kD と 97kD の断片を生じた（B、赤矢印）。

− 140 −

加齢に伴う皮膚 17 型コラーゲン切断動態の解析

図２ 凍結正常ヒト皮膚切片を薄切切片上でプラスミンと反応させ、作成した切断部位特異抗体で染色したところ、
表皮真皮間境界部に線状に沈着することを確認した。上方の配列は、プラスミンによる切断部位を図示した COL17
cDNA 中の NC16A 領域のアミノ酸配列。下線：抗原ペプチド。

3 . 3 各種切断部特異抗体を用いた COL17の切断動態の解明ることが予想される。BP は高齢者に好発するため、高齢

新たに作成した抗体は、COL 17 の非生理学的な切断部したが今回の研究では確認出来なかった。しかし BP は一を正しく認識することが判明した。この抗体を用い BP の部に高齢者に生じる疾患であり、一部の皮膚で COL 17 の病変部皮膚を観察した結果、15 例中４例の病変部におい非生理的切断が生じるだけで COL 17 に対する自己免疫反て非生理的な切断が生じていたことが判明した。一方、10応が誘発される可能性も想定される。今後、更なる研究に例の 80 歳以上の高齢者（正常部）皮膚において同様に検討

よって BP が高齢者に好発する機序が解明されることが期した結果、いずれの検体でも非生理的な切断は認めなかっ待される。

者皮膚において非生理的な切断が生じている可能性を検討

た。

４．考

（引用文献）

察１）Nishie W, Lamer S, Schlosser A, Licarete E, Franzke

BP は、IgG クラス自己抗体が自己抗原である COL 17 に

C W, Hofmann S C, Jackow J, Sitaru C, Bruckner-

結合し、補体活性化に伴う炎症反応の惹起により発症する

Tuderman L: Ectodomain shedding generatesと考えられているが、自己抗体が生じるメカニズムは未だ

Neoepitopes on collagen XVII, the major autoantigen

不明である。本研究により、COL 17 はプラスミンによっfor bullous pemphigoid, J Immunol. 185 ., 4938 - 4947 ,て NC 16 A ドメイン内の生理学的部位とは異なる箇所で切2010 .

断を受けることが明らかになった。同定された切断部に対

２） Franzke C W, Tasanen K, Schacke H, Zhou Z,する抗体（切断部特異抗体）の作成にも成功し、実際の BP

Tryggvason K, Mauch C, Zigrino P, Sunnarborg

患者皮膚においても病変部特異的な切断が COL 17 で生じS, Lee D C, Fahrenholz F, Bruckner-Tuderman L:ていることが本研究によって解明された。BP の病変部特Transmembrane collagen XVII, an epithelial adhesion

異的な COL 17 の切断は生理的条件下では生じないため、

protein, is shed from the cell surface by ADAMs,

健常人で生じると、同切断部への自己免疫反応が惹起されEMBO J., 21 , 5026 - 5035 , 2002 .

− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014３）Franzke C W, Bruckner-Tuderman L, Blobel C P:
Shedding of collagen XVII/BP 180 in skin depends on
both ADAM 10 and ADAM 9 , J Biol Chem., 284 , 23386 -fluid indicates plasmin generation in lesional skin, J
Clin Invest., 92 , 978 - 983 , 1993 .
５） Hofmann S C, Voith U, Schonau V, Sorokin L,
Bruckner-Tuderman L, Franzke C W: Plasmin plays

23396 , 2009 .
４）Kramer M D, Reinartz J: The autoimmune blistering

a role in the in vitro generation of the linear IgA

skin disease bullous pemphigoid. The presence ofdermatosis antigen LADB 97 , J Invest Dermatol., 129 ,plasmin/alpha 2 -antiplasmin complexes in skin blister1730 - 1739 , 2009 .

− 142 −

皮膚組織において紫外線傷害を制御するユビキチン化システムの解析

北海道大学大学院医学研究科生化学講座

畠 山

鎮 次

Ataxia-telangiectasia (AT) is an autosomal recessive genetic disease characterized by immunological deficiencies,
neurological degeneration, developmental abnormalities and an increased risk of cancer. Cells isolated from AT patientsshow hypersensitivity to ionizing radiation, cell cycle abnormalities and aberrant cytoskeletal organization. The ataxiatelangiectasia group D (ATDC/TRIM29) gene was identified by its ability to suppress radiosensitivity of the cell line
AT5BIVA from the D group complementation group of the AT. Recently, we showed that TRIM29 suppresses apoptosis
induced by UV irradiation in HCT116 cell lines. In this study, we performed biochemical analysis of TRIM29 to clarify thefunction of TRIM29 under UV-irradiation or other DNA damages.

１．緒により、AT の異常による表現型を相補する遺伝子として

言

TRIM 29（ATDC）遺伝子が同定されている 1 , 2）。TRIM 29

紫外線（UV）は太陽から放射される電磁波であり、波長（ATDC）遺伝子は、染色体 11 q 23 に存在し、588 アミノ酸の長いものから、UVA、UVB 及び UVC の３種類に分けをコードしている 3）。TRIM 29（ATDC）タンパク質はジられる。日焼けで皮膚が赤くなり炎症を起こすのは UVB

ンクフィンガーモチーフを有し、tripartite motif（TRIM）

であり、シミやソバカスの原因にもなる。さらに皮膚のタ ン パ ク 質 の 亜 系 の ひ と つ と し て も 報 告 さ れ て い る。

DNA を傷つけ、後に皮膚癌を生じさせるのも主に UVB とTRIM タンパク質群の多くは、RING ドメインを有してお考えられている。UVA は、波長が長いため、UVB より皮り、ユビキチンリガーゼ E 3 活性を示すことが推測される

膚の深部（皮膚真皮）まで到達するため、皮膚のシミやたが、TRIM 29 の構造的特徴としては、RING ドメインを欠

るみの原因になると考えられている。紫外線を受けた皮膚損している。したがって、ATDC は酵素機能欠損型とし細胞の遺伝子（DNA）は通常 DNA 修復酵素系によって治て生理的にドミナントネガティブ的な機能をしている可能されるが、長年にわたり遺伝子を傷つけられることで修復性がある。最近においては、皮膚を含む扁平上皮細胞に特の際にミスを生じることがある。このようにして突然変異

異的に発現し、かつ UV 照謝などで誘導される p 53 の活性が起きると、皮膚の扁平上皮細胞は老化を起こしたり、悪制御をつかさどるタンパク質として、ユビキチン化関連酵性細胞（癌細胞）へと変化してしまうことがある。

素 TRIM 29 が報告されている 4 , 5）。

毛細血管拡張性運動失調症（AT : Ataxia telangiectagia）

ユビキチンは 76 個のアミノ酸からなるタンパク質で、は協調運動不能、毛細血管拡張、感染症などを引き起こす

タンパク質の翻訳後修飾（ユビキチン化）に用いられ、タ

遺伝性の免疫不全疾患であり、ATM（AT mutated）がそ

ンパク質分解、DNA 修復、翻訳調節、シグナル伝達などの原因遺伝子である。AT は常染色体劣性遺伝性疾患で臨さまざまな生命現象に関わる。ユビキチン化はミスフォー

床的には進行性の小脳運動失調（ataxia）を起こすのみでルドタンパク質や不要になったタンパク質を細胞から除去

なく、毛細血管拡張（telangiectagia）、精神遅滞、免疫不全、するためにも重要な役割を持っており、このシステムはタ

早老症状、発癌率の増加など幅広い症状を呈する。実際、ンパク質の品質管理と呼ばれている。

AT 患者由来の細胞は放射線高感受性や染色体不安定性を本申請において、皮膚細胞で TRIM 29 が DNA 傷害防御示すことが知られている。今日，癌治療の領域において、やタンパク質品質管理に関していかなる機能を有している

ATM タンパク質（リン酸化酵素）が細胞周期のチェックかを検証することを進めた。本研究成果により、ユビキチ

ポイント制御に重要な役割をしていることが判明している。

ン化という新たな防御システムが皮膚の老化に関すること

さらに、AT 患者由来の細胞を使用した細胞遺伝学的実験が明らかとなれば、今までとは異なった角度から開発される薬剤や化粧品の発想につながることが期待できる。

２．実
Analysis of ubiquitin system regulating
UV-damage in skin
Shigetsugu Hatakeyama
Department of Biochemistry, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

2 .1

験

TRIM 29 結合タンパク質の同定のための遺伝学的及び生化学的スクリーニング
皮 膚 扁 平 上 皮 細 胞 特 異 的 TRIM タ ン パ ク 質 で あ る
TRIM 29 に注目し、それの結合タンパク質の同定を試みた。

− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

TRIM 29 結合タンパク質を同定するために、酵母ツーハイ

細胞生物学的実験を行った。

ブリッド法もしくはプルダウン法による結合タンパク質の３．結精製による質量分析解析を行った。
酵母ツーハイブリッド法：TRIM 29 の全長もしくは基質認

3 .1

果

TRIM 29 結合タンパク質の同定

識部位と考えられるＣ末端側の部分を bait として使用し、TRIM 29 の機能を解明するために、新たに TRIM 29 に各種の酵母内発現ライブラリーから、結合タンパク質の結合するタンパク質の同定を試みた。酵母ツーハイブリッ

cDNA の同定を試みた。

ドを使用したスクリーニングでは新たに注目すべき遺伝子

プルダウンアッセイを用いた質量分析解析（図１）：結合の 同 定 に は で き な か っ た。 次 に 生 化 学 的 解 析 に よ りタンパク質同定のため、まずは FLAG タグ付き TRIM 29

TRIM 29 結合タンパク質の同定を試みた。まず、レトロウ

タンパク質を恒常的に発現した HeLa- S 3 細胞株を樹立

イ ル ス 発 現 ベ ク タ ー 系 を 使 用 し て、FLAG タ グ 付 き のした。安定発現細胞株樹立に際して、レトロウイルス発TRIM 29 の遺伝子が恒常的に発現する HeLa - S 3 細胞を樹

現ベクター系を利用した。FLAG タグを使用した高度に立した。この細胞が樹立できたことで、安定的に TRIM 29

調整された方法により、結合タンパク質を分離した。

が発現する状態が実現でき、HeLa - S 3 細胞は浮遊培養が可

SDS-PAGE によりタンパク質を分離し、バンドとして能なので大量培養が可能となった。次に TRIM 29 抗体を確認できるものはMALDI - TOF/TOF を使用してタンパ

使って、細胞質及び核分画のどちらに発現しているかを調ク質を同定する。もしくは SDS-PAGE のバンドに関係べたところ、TRIM 29 のほとんどが核に発現していることなくゲルを数 10 に均等に切り出し、すべてを ESI- LC-が判明した（図２）。したがって、この安定発現細胞を大MS/MS により解析する。

量培養し、核分画のみを選択的に精製し、その溶解液に対して抗 FLAG 抗体を使用して FLAG-TRIM 29 及びその結2 . 2 扁平細胞株を使ったTRIM 29 に関する生化学的及び細胞生物学的解析

合タンパク質を網羅的に精製した（図１）。精製したタン

TRIM 29 による細胞機能に対する影響を調べるために、

ると、結合タンパク質と思われる多数のバンドが検出されパク質を SDS-PAGE により分離し、銀染色を試みた。すた（図３）。質量分析により同定されたタンパク質を機能

以下の実験を行った。
扁平上皮細胞株である HaCaT 細胞、PAM 細胞、HSC 2

的に分類すると、DNA 修復に関係するタンパク質複合体

細胞、HSC 4 細胞及び CAS - 22 細胞等を使用した。特にの構成成分に分類されるものとクロマチンリモデリング

RNAi によってノックダウンさせた SiHa 細胞株を作製し、（染色体構造変化）の関与するタンパク質複合体の構成成

酵素 - 基質対応から推測される細胞機能に対して検討を試分に分類されるものであることが判明した（図４）。いく

みた。実際には、フローサイトメーターを使用し TRIM 29

つかの同定されたタンパク質に関しては、TRIM 29 と実際による細胞周期もしくは細胞死、及び細胞増殖等に関するに細胞内で結合してするかを確認した。

図１

TRIM29 結合タンパク質の同定のフローチャート

図２

細胞内分画による TRIM29 の発現部位の確認

図３− 144 −

精製された TRIM29 結合タンパク質の銀染色

皮膚組織において紫外線傷害を制御するユビキチン化システムの解析

図４

図５ TRIM29 遺伝子をノックダウンさせた
SiHa 細胞株の樹立。抗 TRIM29 抗体を使ったイムノブロット解析で発現を確認した。

同定された TRIM29 結合タンパク質の機能の可能性

3 . 2 扁平細胞株を使ったTRIM 29 に関する生化学的及び細胞生物学的解析
これまでの報告から、TRIM 29 は癌抑制遺伝子 p 53 依存性に機能することが示唆されている。そこで、扁平上皮細胞株の中で p 53 が野生型、かつ TRIM 29 が発現している細胞株として、SiHa 細胞株を細胞生物学的解析に利用した。まず、レトロウイルス発現系による shRNA を使用し、TRIM 29 遺伝子の発現をノックダウンさせた SiHa 細胞株を樹立した（図５）。この細胞株に対して、抗癌剤シスプ
ラチン（CDDP）を作用させた際の細胞周期及び、アポトーシス細胞の比率を解析した。すると、対照細胞株と比較して、TRIM 29 ノックダウン細胞株では CDDP に対して、アポトーシスを起こす細胞数が増加していることが判明した（図６）。したがって、CDDP を含む DNA 傷害剤に対し

図６ TRIM29 ノックダウン SiHa 細胞株に CDDP を作用させた際の FACS 解析て、TRIM 29 は防御的な働きを有していることが示唆された。

最近、申請者らは TRIM 29 が p 53 のアセチル化酵素 Tip 60

４．考と結合することで、p 53 の機能を抑制することを示唆する

察結果を報告した 5）。これまでの内外の報告を総合的に考え皮膚細胞の老化の防御システムの研究を進める際に、ると、TRIM 29 は癌遺伝子的機能、すなわち外来刺激によDNA 傷害に対して異常を示す表現型をもつ疾患群をモデる細胞死（放射線感受性）を抑制する機能を有しているこルとして想定することは有効である。皮膚扁平上皮細胞株とが考えられる。紫外線等の刺激（傷害）に対して、一過に TRIM 29 は高発現しており、EGF 刺激により発現が減性に上皮細胞を防御する機構として TRIM 29 は重要な働

6）少することが知られている 。最近においては、Wnt シグ

きをしていると考えられるが、持続的に機能し続けると癌

ナルにおける Dvl に TRIM 29 が作用することで、Wnt シグ

化を誘導させることになる可能性もあるので、細胞自体のナルを活性化させることが報告されており、さらには膵臓

傷害レベルに合わせた発現が重要になると思われる。また、

7）

癌と TRIM 29 との関係が示されている 。また、TRIM 29

EGF などの刺激に対して TRIM 29 は発現量変化を受ける

は癌抑制遺伝子産物 p 53 に結合しその機能を抑制することことが報告されているので、TRIM 29 の機能解析とともにで、癌遺伝子的振る舞いをすることが報告されている 4）。

TRIM 29 の発現変動のメカニズムを検討することも重要な

さらには、ヒストン脱アセチル化酵素 HDAC 9 の作用で課題と思われる。

8）

TRIM 29 の機能が制御されていることが報告されている 。

− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

５．総

Rev Cancer, 11 , 792 - 804 , 2011 .

括４）Yuan Z, Villagra A, Peng L, Coppola D, Glozak M,

本 研 究 に よ り、DNA 障 害 を 起 こ す CDDP に 対 す る

Sotomayor EM, Chen J, Lane WS, Seto E.: The ATDC

TRIM 29 の機能が明らかとなった。さらに生化学的解析に(TRIM 29 ) protein binds p 53 and antagonizes p 53 -より、さまざまな DNA 修復関連遺伝子産物が TRIM 29 とmediated functions, Mol. Cell. Biol., 30 , 3004 - 3015 , 2010 .

相互作用することも判明した。CDDP と同様に、紫外線照

５）Sho T, Tsukiyama T, Sato T, Kondo T, Cheng J,

射によっても DNA 障害が起きることが知られているので、

Saku T, Asaka M, Hatakeyama S: TRIM 29 negatively

皮膚上皮細胞にも高発現する TRIM 29 は皮膚で重要な働

regulates p53 via inhibition of Tip60, Biochim. Biophys.

きをしている可能性が高い。今後は DNA 修復における

Acta, 1813 , 1245 - 1253 , 2011 .

TRIM 29 のメカニズムを分子レベルで解明するために、今

６）Laderoute KR, Knapp AM, Green CJ, Sutherland

回同定した多くの結合タンパク質に関して詳細な生化学的RM, Kapp LN: Expression of the ATDC (ataxia

解析を進めることが重要となる。

telangiectasia group D-complementing) gene in A 431
human squamous carcinoma cells, Int. J. Cancer., 66 ,（引用文献）

772 - 778 , 1996 .

１）Kapp LN, Painter RB, Yu LC, van Loon N, Richard７）Wang L, Heidt DG, Lee CJ, Yang H, Logsdon CD,

CW 3 rd, James MR, Cox DR, Murnane JP: Cloning of aZhang L, Fearon ER, Ljungman M, Simeone DM:

candidate gene for ataxia-telangiectasia group D, Am

Oncogenic function of ATDC in pancreatic cancer

J. Hum. Genet. 51 , 45 - 54 , 1992 .

through Wnt pathway activation and beta-catenin

２）Hosoi Y, Kapp LN: Expression of a candidate ataxia-

stabilization, Cancer Cell, 15 , 207 - 219 , 2009 .

telangiectasia group D gene in cultured fibroblast cell８）Yuan Z, Peng L, Radhakrishnan R, Seto E: Histonelines and human tissues, Int. J. Radiat. Biol. 66 , 71 - 76 ,deacetylase 9 (HDAC 9 ) regulates the functions of the1994 .

ATDC (TRIM 29 ) protein. J. Biol. Chem., 285 , 39329 -３）Hatakeyama S: TRIM proteins and cancer, Nature

39338 , 2010 .

− 146 −

皮膚の生理機能解明を目指した
カルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用
東京大学大学院薬学系研究科

花 岡

健 二 郎

The development of sophisticated fluorescence sensor probes has contributed to elucidation of the molecularmechanisms of many complex biological phenomena. In particular, calcium ion (Ca2+) is a pivotal second messenger inside
cells, and fluctuation of intracellular Ca2+ works together with various biomolecules in biological systems. So, we expectthat simultaneous visualization of Ca2+ and other biomolecules, i.e., multicolor imaging, brings us many biological findings.
However, color choices are not sufficient at present, that is, reported long wavelength fluorescence probes for Ca2+ havesome disadvantages. For example, AM ester form of Rhod-2, one of the most widely used red fluorescence probe for Ca2+,
often localizes into mitochondria and monitors mitochondrial Ca2+ concentration change, although cytoplasmic Ca2+ ismuch more important for the research of Ca2+ signaling. Thus, we set out to develop a red fluorescence probe for Ca2+ withexcellent properties including the cytoplasmic distribution to elucidate cytoplasmic Ca2+-related biological phenomena suchas hydraulic pressure stimulation in skin and epithelial wound-healing.
So far, we have developed a novel fluorescein analogue, TokyoMagenta (TM), in which the O atom at the 10 positionof the xanthene chromophore of fluorescein is replaced with a Si atom. The absorption and emission wavelengths of TM
were about 90 nm longer than those of TokyoGreen (a fluorescein derivative). In this study, we introduced chlorine into thefluorophore and developed dichloro TokyoMagenta (DCTM). Then, by utilizing DCTM, we developed a red fluorescenceprobe for Ca2+, CaTM-2, and its activation ratio of the fluorescence intensity reaching 16-fold was practically useful. The
chlorination of the fluorophore was also advantageous, and the pKa value of CaTM-2 was greatly shifted to the acidic region
compared with that of TM, and was sufficiently low (pKa = 5.1) for practical use. For cellular application, we synthesized
CaTM-2 AM, an AM ester form of CaTM-2. CaTM-2 AM diffused into cytosol uniformly in living cells, and showed thechange in its fluorescence intensity by the histamine stimulus, monitoring the change of the cytoplasmic Ca2+ concentration.
As a further demonstration of the usefulness of CaTM-2 AM, we confirmed that it could be applied to rat hippocampal slice
cultures for monitoring activities of neurons. Thus, CaTM-2 and CaTM-2 AM would provide an innovative approach forresearchers to work on many challenges related to Ca2+.

１．緒

組んでおり 1−4）、本研究では皮膚の生理機能の解明を目指

言し、新たなカルシウムイオン蛍光プローブの開発を行った。

我々生物を構成する細胞の内側では、タンパク質や金属

近年、皮膚の表面電位は表皮が起こしていること、また、イオンなどの無数の生体分子がその濃度、局在、活性を連

表皮が正常に機能する上でイオンポンプの働きが重要であ続的に変化させ、細胞の機能や恒常性を制御している。つることが分かっている。この表面電位において、カルシウ

まり、それら分子の協奏によって、個々の細胞は情報伝達

ムイオンは角層の直下に分布し、皮膚の正常な機能の維持を行い、アポトーシスなどの多岐に渡る生体応答を引き起において重要な役割を担っていることが報告されている。

こしている。そのため、細胞内におけるそれら生体分子のこのように、皮膚の生理機構とカルシウムイオンは深く関挙動を継時的に時々刻々と解析することは生物学研究におわっている 5−7）。そこで、培養細胞レベルのみならず、動いて極めて重要であり、これまでに多くの研究が行われて物個体レベルおよび組織レベルでの応用をも視野に入れて、きた。その中でも、蛍光分子や蛍光タンパク質を用いたバ

赤色光領域でのカルシウム蛍光プローブの開発を行った。

イオイメージング技術は細胞内における様々な生体分子のこれまでに汎用されている緑色領域（500 nm 程度）より更挙動をリアルタイムに観察する手法として有用であり、今に長い赤色の蛍光波長を有する蛍光プローブを開発するこ日の生命科学研究の進展に大きく貢献している。我々は近とで、より低い自家蛍光および高い組織透過性、マルチカ

年、さらに高度な蛍光イメージングを可能とすべく、有機

ラーイメージングへの応用が期待され、より詳細にカルシ

小分子を基礎とした新たな蛍光団の開発とその応用に取り

ウムイオンの役割を解明できると期待される。

２．実験・結果
Development of a red fluorescence probe
for monitoring dynamics of cytoplasmic
calcium ion to elucidate physiologicalmechanism in skinKenjiro Hanaoka
Graduate School of Pharmaceutica l
Sciences, The University of Tokyo

2 .1 赤色蛍光を有するフルオレセイン類似蛍光色素
TokyoMagenta 類の開発
蛍光イメージングにおいて、蛍光団を特定の標的分子を検出できるようにセンサー化した化合物、すなわち、蛍光プローブが汎用されており、有機小分子をもととした蛍光− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

プローブの蛍光団母核として、「フルオレセイン」というレセイン類似蛍光色素 TokyoMagenta 類について説明さ

緑色蛍光色素が特に汎用されている（図 1 a：TokyoGreenせて頂く。

はフルオレセインの誘導体である）。これはフルオレセイ

長波長蛍光を有するフルオレセイン類似色素を、フルオ

ンが、高い水溶性、高い蛍光量子収率、確立した蛍光制御

レセインにおけるキサンテン環の 10 位 O 原子を他の原子機構など蛍光プローブの蛍光団母核として多くの長所を有に置換することにより開発することを試みた。これまでに、しているためである。例えば、生細胞染色に用いられていキサンテン環上の π 共役系近傍に Si –Me 結合が存在する

る Calcein AM や、カルシウムプローブ Fluo- 3、Fluo - 4 な

ことで、キサンテン環上の π* 軌道および、Si –Me 結合のどはフルオレセインを蛍光団母核として用いた蛍光プロー

σ* 軌道とが結合性相互作用を起こし、LUMO が安定化す

ブの代表例であり、実際に、現在多くの生物学研究に応用ることが報告されている 10 , 11）。これをもとに、我々は 10されている 8 , 9）。このようなフルオレセイン骨格を用いて

位 Si 置換フルオレセイン類 TokyoMagenta（TM）の設計、開発された蛍光プローブは生物学研究に必要不可欠なもの

開発を行った（図 1 a, b）12）。その結果、狙い通りに水溶液となっているが、それらは全て緑色光の波長領域に蛍光波

中での TM の吸収波長、蛍光波長が共に、フルオレセイン

長を有するため、例えば、汎用される緑色蛍光タンパク誘導体である TokyoGreen（TG）と比較して 90 nm もの大GFP を発現させた細胞や動物に応用することや、他の緑

きな長波長化を示した（図 1 c, d）。さらに、分子軌道計算

色蛍光プローブとの共染色を行うことは不可能である。そによって TM、TG の HOMO および LUMO エネルギーレ

こで我々は、フルオレセインの蛍光プローブの蛍光団母核

ベルを計算したところ、TG と比較して TM の LUMO エネ

としての優れた特性を保持したまま、長波長蛍光を有する

ルギーレベルは大きく低下しており、この LUMO エネル

新たな蛍光団を開発し、それによってマルチカラーイメー

ギーレベルの安定化が波長変化の主な要因であると考えてジングなど蛍光イメージングの可能性をさらに大きく広げいる（図 1 e）。

ることを目指している。このような蛍光波長を赤色光や近赤外光の波長領域へと移動させることは、自家蛍光を低く

2.2

β-ガラクトシダーゼ活性検出蛍光プローブの開発

抑え、かつ、高い組織透過性をも得ることができる。以下

光学特性を精査する中で、TM に特徴的な光学特性を見にこれまでに開発に成功している赤色蛍光団であるフルオ出した。TG および TM には pH 依存的にアニオン型、ニ

図 1 （a, b）TokyoGreen（a）、および TokyoMagenta（b）の分子構造、
モル吸光係数（ε）
、蛍光量子収率（Φfl）（ε、
Φfl は、
共に R = 2-Me 体を用いて測定）。（c, d）2-Me TokyoGreen（緑）、および 2-Me TokyoMagenta（赤）のリン酸ナトリ
ウムバッファー（pH 9）中での吸収（c）、蛍光（d）スペクトル。（e）Gaussian 09 を用いた時間依存密度汎関数法（TDDFT）による分子軌道計算により算出した HOMO および LUMO エネルギーレベル。

− 148 −

皮膚の生理機能解明を目指したカルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用ュートラル型の平衡が存在し、アニオン型は強蛍光性、ニを選択的にアニオン型での最大吸収波長で励起することで、ュートラル型は弱蛍光性を示す（図 2 a）
。それら構造変化

酵素反応前後での大きな蛍光強度上昇を実現した（図 3 c）。

に伴う最大吸収波長の変化は、TG では 53 nm であるのにこのように励起波長を適切に選択することでアニオン型の対し、TM では 111 nm と非常に大きな値を示した（図 2 b）。

プローブ分子を選択的に励起することができたのは、アニ

この実験結果から、キサンテン環の酸素原子上の構造変化

オン型とニュートラル型の 111 nm もの非常に大きな吸収をスイッチとすることで、高い S/N を示す蛍光プローブ

波長の変化に因るものである。さらに、2 -Me TM b gal をの開発が可能であると考えた。つまり、ニュートラル型とHEK 293 b - ガラクトシダーゼ高発現細胞（lacZ+）および

キサンテン環上の酸素原子がアルキル化された化合物とが非発現細胞（lacZ−）にロードしたところ、高発現細胞か類似の光学特性を示すと推測し、例えば、アルキル化されらのみ強い蛍光が観察された（図 3 d, e）。これまでに TG

た TM 誘導体が標的分子とする特定の酵素などにより脱アを母核とした b - ガラクトシダーゼプローブも報告されてルキル化を受けることでアニオン型の TM が生成し、そのいるが、これはベンゼン環部位の酸化電位を厳密に制御し際、アニオン型のプローブ分子のみが励起されるよう励起

光誘起電子移動によって蛍光強度の大きな変化を実現して波長を適切に選択することで、大きな蛍光強度上昇が実現

いる 13）。そのため、TG を用いたプローブではベンゼン環

できると考えた。実際に、この蛍光プローブの分子設計戦部位の分子構造が大きく制限されている。一方で TM を用略が可能であるか検証するため、我々は β-ガラクトシダー

いた波長変化型プローブでは、ベンゼン環部位の酸化電位

ゼの基質となる蛍光プローブ、2 -Me TM b gal の設計、開の厳密な制御が不必要であり、水溶性官能基や細胞内局在発を行った（図 3 a）
。2 -Me TM b gal の吸収スペクトルは制御構造などをベンゼン環部位へと付与できるため、様々

2 -Me TM のニュートラル型のスペクトルと類似しており、な目的に応じた自由度の高い分子設計が可能であり、より

b- ガラクトシダーゼとの酵素反応により吸収波長は大き個々の研究目的に適合した蛍光プローブの開発が可能であなレッドシフトを示した（図 3 b）
。さらに、プローブ分子ると考えている。

図 2 （a）TG、TM の pH 依存的な平衡。（b）TG、TM の酸性および、塩基性水溶液中での吸収スペクトル。

図 3 （a）2-Me TM βgal の分子構造および、β-ガラクトシダーゼとの反応。
（b, c）2-Me TM βgal の β-ガラクトシダーゼとの反応前後での吸収（b）および、蛍光（c）（励起波長は 582 nm）スペクトル。
（d, e）2-Me TM βgal を HEK293 細胞の β-ガラクトシダーゼ高発現株 lacZ+（d）および、非発現株 lacZ–（e）にロードし、共焦点顕微鏡にて撮影した透過光像および、蛍光像。
励起波長、検出波長はそれぞれ 580 nm、600ー620 nm。

− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

2 . 3 細胞質におけるCa 2 + をモニターする蛍光プローブの開発 14）（1,2-bis（o-aminophenoxy）ethane-N,N,N',N '-tetraacetic acid）

カルシウムイオン（Ca 2 +）は生体の重要なセカンドメッ

団に塩素原子を導入することで CaTM-1 の Ca 2 + 濃度依存

センジャーとして多くの生命現象に関与し、特に細胞内的な蛍光強度変化を改善したプローブ CaTM- 2 を開発した

構造と TM を用いた Ca 2 + プローブ CaTM-1、さらに蛍光2+

Ca 濃度変動は様々な生体応答を惹起している。そのため、 （図４）。塩素原子導入により蛍光強度変化が改善した理由
細胞内 Ca 2 + 濃度変動の可視化は、蛍光イメージングの分は、塩素原子が蛍光団の HOMO エネルギーレベルを低下野において最も注目されている研究領域の一つとなっていさせ、Ca 2 + 非存在下において光誘起電子移動による蛍光る。現在、緑色蛍光を有する Fluo-3 や Fluo- 4 などの Ca 2 +の 消 光 効 率 が 高 ま っ た た め と 考 え て い る。 さ ら に、

蛍光プローブが広く用いられているが、長波長を有する

CaTM- 2 の細胞膜透過性体 CaTM- 2 AM を合成し、これをCa 2 + プローブは限定的な応用に留まっている。例えば、用いることで HeLa 細胞におけるヒスタミン刺激による細2+

赤色蛍光を有する Ca プローブで最も有名な Rhod- 2 は、

胞質 Ca 2 + 濃度変動の可視化に成功した（図 5 a−c）。一方、そのカチオン性のためミトコンドリアに局在しやすい特性

Rhod- 2 AM は同様の実験を行った結果、ミトコンドリアがあり、主にミトコンドリアにおける Ca 2 + イメージングににおける Ca 2 + 濃度変動を可視化した（図 5 d−f）。また、用いられているが、細胞質における Ca 2 + の挙動解析には適

CaTM- 2 AM の生物学研究における更なる有用性を示すた

2+

していない。一方で、細胞質における Ca はセカンドメ

め、ラット脳スライス切片へと応用した結果、神経細胞のッセンジャーとして多くのタンパク質に作用し、その濃度活動を発火に伴った細胞質 Ca 2 + 濃度変動として捉えるこ

変動が様々な生体応答を引き起こすため、その可視化は非とに成功した（図６）。このように、皮膚の生理機能の解常に重要である。そこで本研究において、TM を用いて幅明研究を含めた生命科学研究に有用な Ca 2 + 蛍光プローブ

広い応用が可能な細胞質 Ca 2 + をモニターできる蛍光プロの開発に成功した。

ーブの開発を行った。Ca2+ 選択性の高いキレーター、BAPTA

図 4 （a）新規赤色カルシウムプローブ CaTM-1 および CaTM-2 の分子構造と、Ca2+ が配位することによる蛍光強度変化の模式図。
（b, c）CaTM-1（b）および CaTM-2（c）の Ca2+ 依存的な蛍光スペクトル変化。励起波長は 550 nm。

図 5 （a–c）CaTM-2 AM を HeLa 細胞にロードし、ヒスタミン刺激を行った時の蛍光像（a, b）および、蛍光強度の時間変化（c）。
（d–f）Rhod-2 AM を用いて（a–c) と同じ実験を行った結果。

図 6 CaTM-2 AM を用いたラット脳スライス切片における神経細胞の自然発火の可視化。（a–c）CaTM-2（a）、細胞体を同定するために用いた Acridine orange の蛍光像（b）および、
重ね合わせた蛍光像（c）。
（d）CaTM-2 の蛍光強度変化。

− 150 −

皮膚の生理機能解明を目指したカルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用

Calcium ion propagation in cultured keratinocytes and３．考察・総括

other cells in skin in response to hydraulic pressure

複数の蛍光プローブを同時に用いるマルチカラーイメー

stimulation, J. Cell. Physiol., 224 , 229 - 233 , 2010 .

ジングは、複数の生体分子の同時解析や、細胞種、細胞内

６）Leiper LJ, Walczysko P, Kucerova R, Ou J, Shanley

小器官など同定した上でのイメージングなどに有用とされ

LJ, Lawson D, Forrester JV, McCaig CD, Zhao M,

る。同時に赤色領域の光は、低い自家蛍光および、高い生

Collinson JM: The roles of calcium signaling and

体組織の透過性など生体組織での蛍光イメージングに適し

ERK 1 / 2 phosphorylation in a Pax 6 +/− mouse modelている。また、蛍光プローブの蛍光団母核として汎用されof epithelial wound-healing delay, BMC Biology, 4 , 27 ,ているフルオレセインを、その分子構造の多くを保存した

2006 .

まま長波長化した新規赤色蛍光団 TokyoMagenta は、今７）Denda M, Denda S: Air-exposed keratinocytes

後、マルチカラーイメージングの可能性を大きく広げるこ

exhibited intracellular calcium oscillation, Skin Res.

とが期待される。これまでに、b- ガラクトシダーゼプロー

Technol., 13 , 195 - 201 , 2007 .

ブ 12）および、カルシウムプローブ 14）の開発に成功してい８）K a o J P Y , H a r o o t u n i a n A T , T s i e n R Y :るが、これらの蛍光制御原理を用いることで、フルオレセ

Photochemically generated cytosolic calcium pulses

インを母核とした他の緑色蛍光プローブも赤色領域にて再and their detection by fluo- 3 , J. Biol. Chem., 264 , 8179 –

現できると考えている。今後、開発した赤色カルシウム蛍
光プローブによって、皮膚の生理機構の解明が進展することを期待している。

8184 , 1989 .
９）Johnson I, Spence MTZ, Ed., The Molecular Probes®
Handbook: A guide to fluorescent probes and labelingtchnologies 11 th Ed., Molecular Probes, Inc., 2010 .

（引用文献）

10）Yamaguchi S, Tamao K: Silole-containing σ- and π

１）Egawa T, Hanaoka K, Koide Y, Ujita S, Takahashi N,
Ikegaya Y, Matsuki N, Terai T, Ueno T, Komatsu T,-conjugated compounds, J. Chem. Soc., Dalton Trans.,
3693 – 3702 , 1998 .

Nagano T: Development of a far-red to near-infrared11）Fu M, Xiao Y, Qian X, Zhao D, Xu Y: A design

fluorescence probe for calcium ion and its application

concept of long-wavelength fluorescent analogs of

to multicolor neuronal imaging, J. Am. Chem. Soc., 133 ,rhodamine dyes: replacement of oxygen with silicon

14157 - 14159 , 2011 .

atom, Chem. Comm., 1780 – 1782 , 2008 .

２）Koide Y, Urano Y, Hanaoka K, Piao W, Kusakabe M,12）Egawa T, Koide Y, Hanaoka K, Komatsu T, Terai

Saito N, Terai T, Okabe T, Nagano T: Development ofT, Nagano T: Development of a fluorescein analogue,

NIR fluorescent dyes based on Si-rhodamine for in vivo

TokyoMagenta, as a novel scaffold for fluorescenceimaging, J. Am. Chem. Soc., 134 , 5029 - 5031 , 2012 .

probes in red region, Chem. Commun., 47 , 4162 – 4164 ,３）Kushida Y, Hanaoka K, Komatsu T, Terai T, Ueno

2011 .

T, Yoshida K, Uchiyama M, Nagano T: Red fluorescent13）Urano Y, Kamiya M, Kanda K, Ueno T, Hirose K,

scaffold for highly sensitive protease activity probes,

Nagano T: Evolution of fluorescein as a platform for

Bioorg. Med. Chem. Lett., 22 , 3908 - 3911 , 2012 .

finely tunable fluorescence probes, J. Am. Chem. Soc.,

４）Piao W, Tsuda S, Tanaka Y, Maeda S, Liu F,

127 , 4888 – 4894 , 2005 .

Takahashi S, Kushida Y, Komatsu T, Ueno T, Terai

14）Egawa T, Hirabayashi K, Koide Y, Kobayashi C,

T, Nakazawa T, Uchiyama M, Morokuma K, Nagano

Takahashi N, Mineno T, Terai T, Ueno T, Komatsu

T, Hanaoka K: Development of a new class of azo-

T, Ikegaya Y, Matsuki N, Nagano T, Hanaoka K:

based fluorescence probes to detect different levels of

Red fluorescence probe for monitoring dynamics ofhypoxia, Angew. Chem. Int. Ed., 52 , 13028 - 13032 , 2013 .

cytoplasmic calcium ion, Angew. Chem. Int. Ed., 52 ,５）Goto M, Ikeyama K, Tsutsumi M, Denda S, Denda M:

3874 - 3877 , 2013 .

− 151 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸によるTSLP 産生とアレルギー誘発作用

東北大学大学院薬学研究科生活習慣病治療薬学分野

平 澤

典 保

Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) plays critical roles in the induction and exacerbation of allergic diseases. We
found that medium-chain fatty acid such as nonanoic acid induced the production of TSLP in vivo. Nonanoic acid promoted
sensitization to ovalbumin, resulting in an enhancement of the cutaneous anaphylactic response. In this report, we clarified
that the exposure to nonanoic acid after the sensitization augmented picryl chloride-induced thickening of the ear, which
was reversed in TSLP receptor-deficient mice. However, coconut oil, which includes medium-chain fatty acids, did not
induced TSLP production. To clarify the molecular mechanisms by which free fatty acid induced TSLP production, mouseepithelium cell line PAM212 was used. We found that valeric acid potently induced TSLP production. Isovaleric acid but
not the related compounds showed the activity. The agonists to GPR120, GPR84, GPR43 (FFA2R), GPR41 (FFA3R), andGPR40 were not induced TSLP production. PTX did not inhibit TPA-induced TSLP production but inhibited valeric acidinduced one. Valeric acid-induced TSLP production was inhibited by U0126 and TACP-1, suggesting that ERK and NF-κB
were involved in the production. These findings suggested that valeric acid induced TSLP production via G protein-coupled
receptor and mediated by ERK and NF-κB.
Conclusion: Low and medium-chain fatty acids have the activity to produce TSLP via unidentified receptors and TSLP
exacerbated allergic inflammation. Although coconut oil shows no activity, our findings suggested that the natural soap,
which includes medium-chain fatty acids, might be a risk to induce allergic dermatitis.

１．緒IL- 4、IL- 5、IL- 13などのTh2サイトカイン、tumor necrosis

言factor- a（TNF- a）などの炎症性サイトカインを産生する

近年、手湿疹など、アレルギー性の湿疹、皮膚炎が増加

炎症性 Th 2 細胞へと分化誘導し、さらに樹状細胞からのしている。この原因の一つに、石鹸や化粧品に含まれる化

thymus and activation-regulated chemokine（TARC）お学物質による影響が示唆されている。特に天然由来の石鹸

よび monocyte-derived chemokine（MDC）の産生を誘導には、界面活性作用による皮膚バリア機能の低下とともに、することで Th 2 型のアレルギー反応を増強し 4）、IgE の産同時に含まれる種々の化学物質が免疫機能に影響を与える

生を高める。

可能性がある。本研究では、特に天然油脂に多く含まれる

アトピー性皮膚炎患者の病変部位 5）や、重度の気管支喘
息患者の気道上皮細胞 6）では、TSLP が高発現しておりア

低・中鎖脂肪酸のアレルギー誘発活性に着目した。
石鹸や化粧品などの化学的因子の影響を直接的に受ける

レルギー疾患における TSLP の関与が示唆された。遺伝子細胞としては皮膚上皮細胞があげられる。上皮細胞はこれ

組み換えマウスを用いた実験によって、皮膚に特異的なまで、バリア機能を担う細胞として認識されてきたが、近TSLP の過剰発現により湿疹、紅斑といった アトピー性

年では外的刺激に対してサイトカイン等の炎症性メディエ

皮膚炎様皮膚症状が自然発症する 7）こと、また OVA を抗ーターを産生し、免疫応答の制御にも寄与する 1）ことが明原としたアトピー性皮膚炎モデル 8）や喘息モデル 9）におけらかとなり、アトピー性皮膚炎の病態への寄与が示唆されるアレルギー炎症は TSLP 受容体欠損マウスにおいて顕著ている 2）。

に抑制されることから、TSLP はアレルギー炎症においてThymic stromal lymphopoietin（TSLP）は、主に上皮細胞から産生される interleukin（IL）-7 様サイトカインで3）ある 。産生された TSLP は TSLP 受容体を介して、未成
熟な樹状細胞を活性化させて成熟樹状細胞へと分化させる。
+

成熟樹状細胞はリンパ節に遊走し、naïve CD4 T細胞を必要かつ十分なマスタースイッチとして働くと考えられている 10）。
TSLP の誘導因子については、Toll like receptor（TLR）のリガンド、TNF-a や IL- 4 などのサイトカイン、タバコの煙（Cigarette smoke extract）等、さまざまな刺激因子が報告されているが、これらによる TSLP 産生誘導メカニズム

Effects of short- and medium-chain fatty
acids on TSLP production and inductionof allergy
Noriyasu Hirasawa
Laboratory of Pharmacotherapy of Lifestyle Related Diseases, Graduate Schoolof Pharmaceutcal Sciences, Tohoku
Universityについてはいまだ不明な点が多い。また、これらの誘導因子に加えて、12 -O-tetradecanoylphorbol 13 -acetate（TPA）
や dibutyl phthalate といった化学物質も TSLP 産生を誘導することが報告されている 11）。当研究室では、環境因子によるアレルギー増悪化の機序の一つとして、TSLP の関与を仮定し、身近に存在する化学物質による TSLP産生を解− 152 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用析した結果、m-xylene や1 , 2 , 4 -trimethylbenzene といったより身近な化合物が TSLP 産生を誘導する

12）

ことを明らかにしている。特に、ヤシ油（ココナツオイル）など天然由した。PiCl で感作を行って 12 日後、感作した右耳介皮膚
表裏に１%（w/v）PiCl 溶液 20 µl を塗布することにより惹起を行った。その後経時的に耳介の厚さを測定した。

来石鹸等に多く含まれる低・中鎖脂肪酸に TSLP 産生を誘ーを増強する活性（図２）がある事を見いだした 13）。そこ

2 . 3 マウスケラチノサイト株 PAM 212 細胞におけるTSLP 産生で本研究では、低・中鎖脂肪酸の TSLP 産生誘導機構と、PAM 212 細胞を 10 % FBS 含有 MEMa 中、１× 105 cells/

アレルギー誘発作用について、マウスのアレルギーモデル、

ml になるように調製した。各濃度の阻害薬を添加して、導する活性（図１）、更には外来蛋白質に対するアレルギ

ならびにマウスケラチノサイト細胞株の PAM 212 細胞を37℃、５% CO 2 存在下で任意の時間前処理した後、BSA用いて検討した。

存在下各種濃度の fatty acid で刺激した。24 時間培養後、

２．実
2 .1

培養液上清中の TSLP を ELISA で測定した。細胞毒性は験

MTT 法で評価した。

マウス耳介塗布モデル

３．結

Balb/c 雄性マウスをジエチルエーテル麻酔し、耳介皮果

耳介皮膚組織を切り取った後、皮打ち抜きパンチ（直径3 .1 PiCl 誘発性接触皮膚炎モデルにおける耳介浮腫に対するnonanoic acid の影響

10 mm）で一定面積を打ち抜き、耳介皮膚組織を電子天秤

Picryl chloride（PiCl）を抗原とした接触皮膚炎モデル

にて重量を測定した。耳介組織は、破砕用ビーズを用いてにおいて、感作と惹起の間に nonanoic acid を塗布するこ破砕した。遠心上清中の TSLP 量は Mouse TSLP DuoSetRとで、惹起時の反応に対する影響を解析した。PiCl で感作

ELISA を用いて測定した。また mRNA 測定のためには耳を行い（day 0）、12 日後惹起を行った。その後、30 分、１介 組 織 20−30 mg を ５% Proteinase K 含 有 RNAiso Plus

時間、２時間、３時間、６時間、12 時間、24 時間後に耳500 µl 中で同様に破砕し、Real time PCR 法で解析した。

介の厚さを計測した。各々の耳介の厚さから惹起前の厚さ

膚の表裏に種々の化合物計 20 µl 塗布した。一定時間後、を引き、耳介皮膚の厚みの変化として表した。野生型

2 . 2 塩化ピクリルによるアレルギー性慢性皮膚炎様病
態マウスの作製

C 57 BL/ 6 マ ウ ス で は、 惹 起 後 に 耳 介 肥 厚 が み ら れ、

C 57 BL/ 6 お よ び TSLP 受 容 体 欠 損 マ ウ ス（C 57 BL/ 6）

肥厚が増強された（図 3 A）。一方、TSLP 受容体欠損マウを用いた。Cyclophosphamide 溶液（30 mg/ml）を 150 mg/

スにおいて、同様の実験を行った結果、惹起後の耳介肥厚

kg となるように腹部皮下に投与した。２日後、マウスのはみられたが、nonanoic acid 塗布による耳介肥厚の増強作

右耳介皮膚に７%（w/v）PiCl 溶液 50 µl を表裏均等塗布す

用は著しく減弱した（図 3 B）13）。この結果から、nonanoic

ることにより感作を行った。感作５日後と 10 日後に、感acid は PiCl による接触皮膚炎を増強すること、そしてこの作を行った右耳介の表裏均等に nonanoic acid を 20 µl 塗布

作用は TSLP 産生を介していることが示唆された。

図１ マウス耳介モデルにおける脂肪酸の TSLP 産生誘導活性 13）
マウス耳介に各脂肪酸 20 µl を塗布し、24 時間後の耳介組織
ホモジネート中の TSLP 量を測定した。*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図２ Nonanoic acid による外来蛋白に対するアレルギー増強 13）
BALb/c マウスに nonanoic acid（B, D）あるいは vehicle（A, C）
を塗布し 24 時間後に同部位に ovalbumin（OVA）を皮内注射して感作した。９日後、0 . 05 % Evans blue 溶液を静脈内注射した後、vehicle（矢頭）および OVA 溶液（矢印）を皮内注射した。30 分後、皮内に漏出した色素を抽出し定量した（E）。**P< 0 . 01

nonanoic acid を感作と惹起の間に 2 回塗布することで耳介− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 20143.2

中鎖脂肪酸を含むココナツオイルの作用

生誘導活性には炭素数による違いがみられ、炭素数５の中鎖脂肪酸を多く含む天然成分として、ヤシ油（ココナ

valeric acid が最も強い活性を示した（図４）。また valericツオイル）が注目されている。ココナツオイルは炭素数 12acid の 類 似 化 合 物 の 活 性 に つ い て 解 析 し た と こ ろ、のラウリン酸などの中鎖脂肪酸を多く含み、天然由来石鹸

isovaleric acid には同程度の TSLP 産生誘導活性が認めら等に用いられている。そこでまず、ココナツオイルをマウれたが、pivalic acid、2 -methyl butanoic acid、1 - pentanol、

ス耳介に塗布し、24 時間後の TSLP 産生を解析したが、

2 -pentanone、γ - aminbutanoic acid（図５）は２mM 濃度

TSLP の産生は認められなかった（data not shown）。

で活性は認められなかった。

3.3

3.4

PAM 212 細胞におけるTSLP 産生誘導

ATP の作用マウス耳介への脂肪酸刺激により TSLP 産生誘導がみら上皮細胞は物理的刺激により ATP を放出し。この ATPれたことから、マウスケラチノサイト細胞株である PAM 212

がサイトカイン産生を誘導する可能性も報告されている。

細胞を用いて、in vitro における短鎖および中鎖脂肪酸のそこで、TSLP 産生に物理的刺激により放出される ATPTSLP 産生誘導活性を解析した。PAM 212 細胞を BSA 存が関与しているかどうか明らかにするために、
ATPのTSLP

在下各種脂肪酸で 24 時間刺激し、培養上清中 TSLP 濃度

産生効果を検討した。その結果、ATPは１mMまでの濃度を ELISA により測定した。その結果、脂肪酸の TSLP 産

範囲で TSLP 産生を誘導しなかった（data not shown）。

図３ Nonanoic acidによる塩化ピクリルによる接触アレルギーの増強 13）
野生型マウス（A）あるいは TSLPR 欠損マウスを 2 . 2 の方法で感作惹起した。感作と惹起の間（５日と 10 日）に nonanoic acid（黒丸）あるいは vehicle（白丸）を塗布した。惹起後経時的に耳介浮腫を計測した。
*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図４ PAM212細胞における脂肪酸によるTSLP産生
PAM 212 細胞を各炭素数の飽和脂肪酸１mM で刺激し、24 時間後の培養液 上清中の TSLP を測定した。
*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図５ Valeric acid 類似構造化学物質
Valeric acid および isovaleric acid（A）には TSLP 誘導活性が見られたが、その他の化合物（B）には２mMで活性は認められなかった。

− 154 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用

3.5

G 蛋白質連関受容体（GPCR）の関与

FFA 2 R（GPR 43）お よ び FFA 3 R（GPR 41）の 関 与 を 検Valeric acid による TSLP 産生誘導メカニズムの解析に討した。さらに上皮細胞の化学物質に対する核内受容体

あたり、初めにこの反応が受容体を介する反応か否かにつAhR についても検討した。GPR 84 のアゴニストである

いて明らかにするため、Giタンパク質共役型 GPCRの関与の3 , 3’- diindolylmethane（DIM）、GPR 40 のアゴニストであ有無を検討した。百日咳毒素（PTX）は Gタンパク質の一つ

る troglitazone、GPR 40 および GPR 120 のアゴニストであの Giの a サブユニットをADPリボシル化することで受容体とる GW 9508 はアゴニスト作用を十分発現する濃度 10 µM まの相互作用を阻害する。PAM 212 細胞を50 , 100 nMのPTX

で TSLP 産生を誘導しなかった（data not shown）。またで１時間前処理後、２mMの valeric acidあるいは 受容体を

FFA 2 R アゴニストである tiglic acid、FFA 3 R アゴニスト

介さない刺激 薬として 30 nMの12 -O-tetradecanoylphorbol

である 2 -methylbutylic acid は valeric acid とおなじ 2 mM

13 -acetate（TPA）で刺激し、24 時間後の培養上清中 TSLP

でも TSLP 産生を誘導しなかった。さらに PAM 212 細胞を

濃 度をELISAにより測 定した。 そ の 結 果、TPA に よ る

AhR のアゴニストである β- naphthoflavone（BNF）で刺激

TSLP 産生は PTX の影響をほとんど受けないのに対し、した場合にも TSLP産生は増加しなかった（data not shown）。

Valeric acid による TSLP 産生は PTX の前処理により半分程度に抑制された（図６）。この結果は、valeric acid の作
用の少なくとも１部は GPCR を介したものであることを示唆している。

3.7

TSLP 産生誘導シグナル

TSLP 産生誘導に関与する細胞内シグナルの同定のために、各種阻害薬の効果を検討した。PAM 212 細胞を MEK阻害薬の U 0126（１µM）、p 38 阻害薬の SB 203580（10 µM）、

3.6

FFAR 関連の関与

JNK 阻 害 薬 の SP 600125（30 µM）、PI 3 K 阻 害 薬 のこれまで結果から、valeric acid の作用はカルボン酸がwortmannin（100 nM）で１時間前処理後、2 mM の valeric

必要であること、受容体を介した作用であることが示唆さacid で刺激し、24 時間後の培養上清中 TSLP 濃度を ELISA

れたため、次に中鎖−長鎖脂肪酸受容体 FFA 1 R（GPR 40）により測定した。その結果、U 0126 の前処理によってのみ、

お よ び GPR 120 , 中鎖脂肪酸受容体 GPR 84 , 短鎖 脂 肪 酸

valeric acid による TSLP 産生は抑制された（図７）。また、

図６ 百日咳毒素の作用
百日咳毒素 50 , 100 nM で 16 時間処理した後、valeric acid（C 5）あ る い は TPA で 刺 激 し、24 時 間 後 の 培 養 液 上 清 中 の
TSLP 量を測定した。**P< 0 . 01

図７ Valeric acid による TSLP 産生に対する各種阻害薬の効果
PAM212細胞をU0126（U, 1µM）, SB203580（SB, 10µM）,
SP600125（SP, 30µM）, およびwortmannin（wort, 100nM）（A）あるいは各濃度のU0126（B）で １ 時 間 処 理 し た 後、valericacid 2 mM で刺激し、24 時間後の培養液上清中の TSLP 量を測定した。**P< 0 . 01

− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

る事が示唆された。
一方、中鎖脂肪酸が多く含まれるとされるココナツオイ
ルをマウス耳介に塗布しても TSLP 産生活性は認められなかった。したがって、通常の状態では、ココナツオイルが添加されても、アレルギー誘発のリスクはさほど大きくな
いと考えられる。これは中鎖脂肪酸がグリセロールにエス
テル化されているためであること、あるいは濃度が活性を示すまでに達していない事が考えられるが、感染等、付加的な環境要因が加わると加水分解等により中鎖脂肪酸濃度が亢進して、アレルギーを増幅する可能性は否定できない。
図８ Valeric acid による TSLP 産生における NF-κB の関与
各 濃 度 の TPCA- 1 で １ 時 間 前 処 理 し た ち、valeric acid ２
mM で刺激し、24 時間後の培養液上清中の TSLP 量を測定した。
**P< 0 . 01

石鹸は、皮膚バリア機能を低下させるため、外来抗原の侵入を促進する可能性がある。
「茶のしずく」のように、蛋
白成分が石鹸に含まれる場合には抗原の侵入が容易になるとともに、石鹸成分の脂肪酸が TSLP 産生を増大させて、アレルギーを増大させる可能性も考えられる。

I- kB kinase- 2 阻 害 薬 の TPCA- 1（0 . 3 , 1 , 3 , 10 µM）も、

５．総

valeric acid に よ る TSLP 産 生 を 濃 度 依 存 的 に 抑 制 し、
NF-k B が関与している事が示唆された（図８）
。

４．考

括

本研究により、天然油脂に多く含まれる低・中鎖脂肪酸には、皮膚上皮細胞において、TSLP 産生をしめすことが察

明らかになり、これらの成分を含む石鹸、化粧品にはアレ

石鹸は脂肪酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩が主成

ルギー誘発のリスクがある事が示唆された。そのリスクは分となり、天然油脂として牛脂、ヤシ油（ココナツオイル）

大きいものではないと考えられるが、今後新しい製品を開などが加えられることがある。ヤシ油には炭素数 12 のラ

発する上では、TSLP 産生について評価する事が望まれる。

ウリン酸などの中鎖脂肪酸が多く含まれている。炭素数が脂肪酸の受容機構は、GPCR が関与している事が示唆され少ない脂肪酸で作った石鹸は親水性が強いが親油性が弱い。

たが、その同定にはいたらなかった。今後更に、上皮細胞

今 回、 マ ウ ス 耳 介 塗 布 モ デ ル で は 炭 素 数 ９ の nonanoicの化学物質受容機構について解析を加える予定である。

acid が最も強い活性を、また PAM 212 細胞を用いた系では炭素数５の valeric acid が最も強い活性を示したが、こ（引用文献）

れは組織浸透性や培地への溶解性に基づくものであると考

１）Esche C, De Benedetto A, and Beck L: Keratinocytes

えられる。いずれの場合も、カルボン酸である事が必要で、

in atopic dermatitis: inflammatory signals. Cur. allergy

アルデヒドやアルコール、ケトンでは活性が認められなか

asthma reports 4 , 276 – 284 , 2004 .

った。これまでマウス耳介において、TSLP 産生を誘導す

２）Holgate ST: The epithelium takes centre stage in

ることが明らかになっている nonanoic acid は外来抗原に

asthma and atopic dermatitis. Trends Immunol 28 ,対する IgE 抗体産生を増大させるだけでなく、今回、接触

248 – 251 , 2007 .

抗原による皮膚アレルギーも増強する事が明らかになった。

３）R a y R . J , F u r l o n g e r C , W i l l i a m s D E , P a i g e

低・ 中 鎖 脂 肪 酸 の 作 用 機 構 を 明 ら か に す る た め に

CJ: Characterization of thymic stromal-derived

PAM 212 細胞を用いて解析した。最も活性が強かったも

lymphopoietin (TSLP) in murine B cell development inのは炭素数５の valeric acid および isovaleric acid であっvitro. Eur. J. Immunol 26 , 10 – 16 , 1996 .

た。Isovaleric acid は足などの臭いの原因化合物である。

４）Liu Y-J: Thymic stromal lymphopoietin: master

類似化合物、ならびにこれまで明らかになっている脂肪酸

switch for allergic inflammation. J. Exp. Med. 203 , 269 –受容体アゴニストはいずれも TSLP 産生を誘導しないこと、

273 , 2006 .

GPCR を介する事、物理的刺激で放出される ATP にも活５）Soumelis V, et al. : Human epithelial cells trigger性が認められない事から、脂肪酸は未同定の受容体に作用

dendritic cell mediated allergic inflammation by

している可能性が示唆された。化学構造のわずかな相違により活性が大きく異なる事から、特異性の高い受容体を介producing TSLP. Nature Immunol. 3 , 673 – 680 , 2002 .
６）Ying S, et al.:Thymic stromal lymphopoietin

しているものと推測される。各種阻害剤の効果を検討した

expression is increased in asthmatic airways and

結果、PKC、ERK ならびに NF-kB の活性化が関与していcorrelates with expression of Th 2 -attracting− 156 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用

chemokines and disease severity. J. Immunol. 174 ,susceptibility to bronchial asthma. Am. J. Resp. Cell

8183 – 8190 , 2005 .

Mol. Biol. 44 , 787 – 793 , 2011 .

７）Yoo J, et al. : Spontaneous atopic dermatitis in mice11）Segawa R, Hirasawa N: Exacerbation of allergic

expressing an inducible thymic stromal lymphopoietin

diseases by chemical s: roles of thymic stromaltransgene specifically in the skin. J. Exp. Med. 202 ,lymphopoietin. J. Pharmacol. Sci. 2015 , in press
12）Satou N, et al. : Induction of thymic stromal

541 – 549 , 2005 .
８）He R, et al. : TSLP acts on infiltrating effector T cells

lymphopoietin production by xylene and exacerbation

to drive allergic skin inflammation. Pro. Natl. Acd. Sci.

of picryl chloride-induced allergic inflammation in mice.
Int. Archs Allergy Immunol. 157 , 194 – 201 , 2012 .

USA 105 , 11875 – 11880 , 2008 .
９）Al-Shami A, Spolski R, Kelly J, Keane-Myers A,13）Yamashita S, Segawa R, Satou N, Hiratsuka M,

Leonard WJ: A role for TSLP in the development of

Leonard WJ, Hirasawa N: Induction of thymic stromal

inflammation in an asthma model. J. Exp. Med. 202 ,lymphopoietin production by nonanoic acid and

829 – 839 , 2005 .

exacerbation of allergic inflammation in mice Allergol.

10）Harada M, et al. : Thymic stromal lymphopoietin

Int. 62 , 463 - 371 , 2013 .

gene promoter polymorphisms are associated with− 157 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした
in vitroスクリーニングシステムの構築
─物理・化学的性状と安全性との関連─
産業医科大学産業生態科学研究所

堀 江

祐 範

Nanoparticles, particularly TiO2, ZnO and SiO2 are frequently used for cosmetics such as foundation and sunscreen.
Although the nanoparticles are useful materials for cosmetics, toxic effect are also reported. In the present study, cellular
influences of TiO2, ZnO and SiO2 nanoparticles were examined. ZnO nanoparticles showed strong cytotoxicity on humankeratinocyte HaCaT cells. ZnO nanoparticles also caused oxidative stress, induction of cytokines and cell membrane
damage. On the other hand, cellular effect of TiO2 and SiO2 nanoparticles were small. Zn2+ released from ZnO nanoparticles
was most important factor for cytotoxicity of the ZnO nanoparticles. Gene expression of metallothionein (MT) was enhancedby ZnO nanoparticle exposure in HaCaT cells and 3D skin model. ZnO nanoparticles caused induction of cytokines on 3D
skin models. These results suggest that ZnO nanoparticles have cytotoxic potential. And the MT gene expression may bepromising biomarker for toxic effect of nanoparticles on cosmetics.

１．緒

ナノ粒子の生体影響においては、粒子投与による細胞応答

言と共に、溶解性の把握が重要である。化粧品におけるナノナノ粒子は、直径が 1 − 100 nm の範囲にある粒子と定粒子の利用では、皮膚への塗布が最も主要な曝露ルートで義される（ISO/TS 27687 : 2008）。粒径が微小であるナノある。皮膚は表皮のバリアが存在するが、ナノ粒子と細胞

粒子は光の散乱が小さく、ファンデーションや日焼け止めとが直接出会う機会が考えられることから、化粧品に利用などに配合し肌に塗布した場合に滑らかに肌になじみ、いされるナノ粒子の細胞影響の把握は、より有効な利用のた

わゆる粉っぽさを生じない事や、紫外線吸収効果など化粧めに必須である。本研究では、化粧品に多く用いられるナ

品として有用な機能をもつ。ナノ粒子のなかでも、従来かノ粒子のうち、TiO 2、ZnO、SiO 2 について特に溶解性にら化粧品材料として利用されてきた二酸化チタン（TiO 2）

着目して細胞影響を検討した。さらに、皮膚３次元モデル

や酸化亜鉛（ZnO）、二酸化ケイ素（SiO 2）のナノ粒子は、を用い、より実際の皮膚に近い状態での実験も行い、ナノさらなる機能付加の余地もある有望な化粧品材料である。

粒子の影響を推測する有効なマーカーを検討した。

一方で、ナノ粒子には毒性を含む生体影響も報告されてい２．実る。ナノ粒子による生体影響を細胞レベルで見ると、多くの場合酸化ストレスを生じる。酸化ストレスにより細胞の

2 .1

験

細胞および皮膚３次元モデル

抗酸化系が活性化されるが、抑制しきれない場合にはアポヒトケラチノサイト由来 HaCaT 細胞（German Cancer

トーシスやネクローシスによる細胞死に至る。これらナノResearch Center より入手）を用いた。HaCaT 細胞は 10％粒子の細胞影響因子として、ナノ粒子からの金属イオンの

ウシ胎児血清（FBS）添加ダルベッコ変法イーグル培地

溶出が最も重要である。ナノ粒子の特徴の一つに「溶けや（DMEM）中で、５% CO 2 条件下、37℃で培養した。コラすい」
ことが挙げられる。従来不溶性とされてきた物質でも、ーゲンビトリゲルは AGC テクノグラスから購入し、取扱

ナノ粒子とすることで大きな溶解性を示す場合がある 1）。

説 明 書 に 従 っ て 片 面 に HaCaT 細 胞 を 10 % FBS 添 加

例えば、皮膚に塗布されたナノ粒子が、「金属イオンの供

DMEM 中、２×105 個 /ml の濃度で植え、培養した。皮膚給源」として持続的に金属イオンを溶出し、皮膚細胞に対

３次元モデルとして、EPI- 200 SIT を倉敷紡績（大阪）からして影響を及ぼすかもしれない。一方ですべてのナノ粒子

購 入 し、 取 扱 説 明 書 に 従 い 使 用 し た。 培 地 は EPI- 100 -が大きな溶解性を示すわけではなく、ナノダイアモンドな

NMM-SIT/Assay Medium（MatTek Corporation）を用い

2）

ど「溶けない」ナノ粒子の細胞影響は小さい 。そこで、

Safety evaluation of nanoparticles used
for cosmetics; Association of physical/
chemical properties and safety
Masanori Horie
I nst it ut e of I ndu st r i a l E c o l og ic a lSciences, University of Occupational andEnvironmental Health, Japan

た。

2.2

ナノ粒子

本研究では５種類のナノ粒子を使用した。TiO 2 は水酸
化アルミニウム（Al（OH）
3）によって処理された化粧品グ
レードのルチル型ナノ粒子を用いた。また、ZnO ナノ粒
子を石原産業（大阪）より購入した。SiO 2 コーティング
ZnO ナノ粒子は、昭和電工より購入した。SiO 2 ナノ粒子

− 158 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築―物理・化学的性状と安全性との関連―は電気化学工業より購入した。これらのナノ粒子の一次粒価した。12 穴マルチウェルプレートに細胞を 2 × 105 個 /

子径・比表面積等の物性を表１に示す。以下、各粒子は表ml で植え、37℃で一晩培養しウェル底面に接着させた。

１に示した略号で表記する。培養上清中の Zn 2 + 濃度は、６時間および 24 時間培養した後に、上清を回収した。ビ

3）と 同 様 に 2（5- -Bromo- 2 -pyridylazo）- 5［N-n-トリゲルでは、細胞側の培地を回収した。皮膚３次元モデpropyl-N-（3 -sulfopropyl）amino］phenol, disodium salt,

ルでも培養液を回収した。これらの培養液を 13000 rpm、

dihydrate（5 -Br-PAPS）を用いた比色法によって測定した。

５分の遠心し、大部分の粒子を除去したのち、LDH 活性各培地中での溶解度の測定は以下の様に行った。ZnO おを測定した。LDH 活性の測定は、細胞障害性検出キット

よび ZnO-S をそれぞれ 1 . 0 および 10 mg/ml の濃度で蒸留

PLUS（LDH）（ロシュダイアグノスティクス）を用い、プ

水、DMEM（FBS を含まない）、10 % FBS 添加 DMEM お

ロトコルに従って行った。マイクロプレート、ビトリゲル

よび EPI- 100 -NMM-SIT/Assay Medium 中に２分間の超音による試験では、漏出 LDH は下記の式により算出した。

先の報告

波処理後、37℃で６時間保持した。その後、13000 rpm で
10 分間の遠心後、上清を Nanosep Centrifugal Devices 3 K（Pall Life Sciences）を用いた限外ろ過によって粒子を除（陽性対照の吸光度－陰性対照の吸光度）
細胞毒性（％）＝（サンプルの吸光度－陰性対照の吸光度）去した。通過液について、Zn 2 + 濃度を測定した。先行研

ここで陰性対照は非投与細胞の吸光度、陽性対照はキッ

究により、本研究で用いた TiO 2 および SiO 2 は培地中でほト添付の細胞溶解液で強制的に溶解させた細胞の吸光度と4）する。皮膚３次元モデルではウサギ筋肉由来 LDH（オリとんど溶解しないことを確認している 。

エンタル酵母）によって検量線を作成し、漏出した LDH

2.3

ナノ粒子分散液の調製活性を測定した。

ナノ粒子は、使用前に 180℃、２時間の乾熱滅菌を行った。マイクロプレート及びビトリゲルを用いた試験では、

2.5

細胞内 ROSレベルの測定

ナノ粒子粉体を、滅菌した 50 ml 容ガラス瓶中、1 . 0 mg/

細胞内 ROS レベルの測定は DCFH 法により行った。６ml ウシ血清アルブミン（BSA、ナカライテスク）水溶液中

穴マルチプレートまたはビトリゲル上に培養した HaCaTに 10 mg/ml の 濃 度 と な る よ う に 懸 濁 し、 超 音 波 槽

細胞の培養液をナノ粒子分散液に交換し、６時間および（Bioruptor、コスモバイオ）内で２分超音波処理を行って24 時 間 培 養 し た。 そ の 後 分 散 液 を 除 去 し、10 µM の分散した。その後、10 % FBS 添加 DMEM でマイクロプレ- Dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA） を 含 む
2’, 7’

ー ト 用 は 1 . 0 mg/ml お よ び 0 . 1 mg/ml、 ビ ト リ ゲ ル 用 は

FBS 非添加 DMEM を 1 ml/well 添加、37℃、５％ CO 2 条件

1 mg/ 3 ml となるように希釈した。ビトリゲル上部には下で 30 分インキュベートした。PBS で１回洗浄し、0 . 25 %300 µl（約 100 µg の ZnO となる）
、下部には２ml の分散液

トリプシン処理により細胞を回収した。細胞を PBS で１を投与した。皮膚３次元モデルによる試験では、ナノ粒子回洗浄し、再度細胞を 500 µl の PBS に懸濁し、フローサイ

超音波処理後の分散液を PBS で 10 倍及び 100 倍希釈し、トメーター（ソニー EC 800 セルアナライザー）で蛍光強度

50 µl ずつ皮膚モデル上に添加した。また、粉体としてを測定した。

10 mg のナノ粒子を皮膚モデル上に添加し、37℃で 24 時間

2.6 ヘムオキシゲナーゼ（HO -1）、メタロチオネイン（MT）およびサイトカインの測定

培養した。

2.4

細胞膜損傷の測定

６穴マルチウェルプレートに細胞を 2×105 個 /ml で植え、培養上清への LDH 漏出の測定により、細胞膜損傷を評
表１

37℃で一晩培養しウェル底面に接着させた。培養上清をナ

本研究に用いたナノ粒子の物性− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ノ粒子分散液に交換し、24 時間培養した後に上清を回収し3.1.2

酸化ストレスの誘導

Human IL- 6および IL- 8 ELISA Ready- SET- Go! ®（eBioscience）

多くの場合、ナノ粒子の細胞影響には酸化ストレスが関を用いて上清中のIL - 6 および IL - 8 濃度をELISA 法により測与する 5）事から、ナノ粒子投与細胞における細胞内活性酸定した。細胞からは、RNeasy kit（キアゲン）を用いてRNAを素 種（ROS）を 測 定 し た（ 図 2 A）。 投 与 ６ 時 間 の 細 胞 内抽出した。RNAはHigh Capacity cDNA Revers Transcription

ROS レ ベ ル は、100 µg/ml の ZnO お よ び ZnO - S 投 与 群 に®

kit（Applied biosystems）によりcDNAとしたのち、TaqMan

おいて非投与細胞の 1 . 6 ～ 2 倍程度の上昇を示した。TiO 2

Gene Expression Assays（Applied biosystems）を用いたリでも 1 . 2 倍程度の若干の上昇が認められた。SiO 2 投与細胞

アルタイムPCR 法によりHO - 1，MT，IL - 6 および IL - 8 遺伝では、細胞内 ROS レベルの上昇は認められなかった。一方、®

子の発現を解析した。標的遺伝子の TaqMan プローブは投与 24 時間後においては、いずれのナノ粒子でも細胞内Applied biosystems か ら購入した。Assay IDを以下に示す。

ROS レベルの上昇は認められなかった（100 µg/ml の ZnO

MT 1 H : Hs 00823168 _g 1、MT 2 A: Hs 02379661 _g 1、HO-および ZnO-S 投与群では、細胞の損傷が激しく、正確な1 : Hs 01110250 _m 1、IL - 6 : Hs 00985639 _m 1、IL - 8 :測定を行うことができなかった）。さらに、ナノ粒子投与

Hs 00174103 _m 1、IL - 1 b：Hs 01555410 _m 1、IL- 12 B：

細胞におけるヘムオキシゲナーゼ－１（HO - 1）の遺伝子

Hs 01011518 _m 1。

発現レベルを検討した（図 2 B）
。HO - 1 は抗酸化に機能す

３．結
3 .1

る酵素で、その遺伝子発現は ROS 産生などの酸化ストレ

果

スに鋭敏に反応する。なお粒子投与 24 時間後の HO - 1 の発
現レベルは、100 µg/ml の ZnO および ZnO - S 投与群においマルチウェルプレートによる試験

はじめに、マルチウェルプレート上に培養した HaCaTて著しく上昇した。遺伝子発現レベルは ZnO で非投与細細胞を用いて試験を行った。

胞の 64 倍、ZnO - S で 215 倍であった。一方、10 µg/ml の3.1.1

ZnO および ZnO - S 投与群では、それぞれ 1 . 3 および 1 . 2 倍細胞膜損傷

TiO 2、ZnO、SiO 2 ナ ノ 粒 子 を 10 お よ び 100 µg/ml の 濃であった。SiO ではいずれの濃度においても 1 . 2 倍程度の度で培地に分散し、ヒトケラチノサイト HaCaT 細胞に投上昇が認められた。TiO 2 では発現上昇は認められなかっ

与、６時間および 24 時間後に培養上清に漏出した LDH 活

た。ZnO による細胞影響には、溶出した Zn 2 + が関与して性を測定した（図１）。細胞内酵素である LDH の培養上清いるとの報告がある事から、水溶性の ZnCl 2 を投与した細への漏出は、細胞膜の損傷を示唆する。この結果、投与６

胞でも HO - 1 の発現レベルを検討した。この結果、濃度依

時間後では顕著な細胞膜の損傷は認められなかった。投与

存的な HO - 1 遺伝子の発現上昇が認められた。発現レベル

24 時間後では、ZnO および ZnO - S で顕著な細胞膜の損傷

は、Zn 2 + 濃度として 10、30 および 50 µg/ml のとき、それが認められた。細胞内の全 LDH 活性を 100 % としたとき、ぞれ非投与細胞の約 16、46 および 31 倍であった。

24 時間後において TiO 2 投与群（100 µg/ml）の培養上清中

3.1.3

サイトカイン産生の LDH 活性が 3 . 0 % であったのに対し、ZnO 投与群ではナノ粒子投与細胞について、IL - 1 b、IL- 8 および IL- 12

75 . 2 %、ZnO - S 投 与 群 で は 85 . 3 % で あ っ た。 ま た、SiO 2の遺伝子発現を検討した。IL- 1 b 遺伝子の発現は、TiO 2 ,では 21 . 9 % であった。

ZnO お よ び SiO 2 を 投 与 し た 細 胞 で 有 意 に 増 加 し た（ 図

図１ ナノ粒子の細胞膜に対する影響
各ナノ粒子を 10 および 100µg/ml の濃度で HaCaT 細胞に投与し、24 時間後に培養上清中の LDH 活性を測定した。*p< 0.05,**p< 0.01（vs 非投与細胞 , ANOVA, Dunnett）− 160 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築―物理・化学的性状と安全性との関連―

3 A）。IL- 8 遺 伝 子 の 発 現 は、100 µg/ml の ZnO お よ び

ZnO ナノ粒子で強い細胞毒性が認められたことから、分ZnO - S を投与した細胞でそれぞれ非投与細胞の 3 . 6 および

散液中の Zn 2 + 濃度を測定した。その結果、細胞への投与

4 . 8 倍上昇した。TiO 2 および SiO 2 では IL- 8 遺伝子の発現

24 時間後の培養上清中で Zn 2 + の溶出が認められた。ZnO

上昇は見られなかった。IL - 12 の発現上昇はいずれのナノおよび ZnO - S について、培養上清中の Zn 2 + 濃度は、ZnO粒子の投与によっても上昇しなかった。ZnCl 2 の投与では、10 µg/ml：3 . 5 µg/ml、ZnO 100 µg/ml：2 . 6 µg/ml、Zn 2 + が 10 µg/ml の濃度背 IL - 1 b、IL - 8、IL - 12 すべての遺ZnO - S 10 µg/ml：11 . 1 µg/ml、ZnO - S 100 µg/ml：7 . 2

2+

伝子発現が上昇した。これらの遺伝子発現に Zn 濃度依µg/ml であった。さらに、ナノ粒子投与細胞において、存性は見られなかった。さらに、ELISA 法により培養上

Cu や Cd，Zn などの金属イオンに応答し、金属毒性と酸

清中の IL - 8 および IL - 1 b タンパク質の濃度を測定したと化ストレスに働くメタロチオネイン 1（MT 1）遺伝子の発ころ、ZnO および ZnO - S の投与により有意に上昇した（図現を検討した（図 4 B）。この結果、ZnO および ZnO - S 投与3 B）。また、上清中の IL - 1 b の濃度はいずれの投与群にお細胞において有意な MT 1 の発現上昇を認めた。これらのいても検出限界近くであり、ほとんど検出することができ

結果は、ZnO および ZnO - S による細胞影響が、Zn 2 + の溶なかった。

出による可能性を示した。

3.1.4

亜鉛イオンの溶出

ZnO ナノ粒子の細胞影響には、ZnO ナノ粒子から溶出
2+

6）

3.2

ビトリゲル

した Zn が関与していることが知られている 。ZnO お

試験に供したナノ粒子のうち ZnO で強い細胞影響が認

よび ZnO - S について、蒸留水および本研究で用いた２種

められたこと、また溶出した Zn 2 + が細胞影響に関与して類の培地中での Zn 2 + の溶出を検討した。37℃で６時間保いることが示唆されたこから、さらに ZnO ナノ粒子から2+持した後、液中に溶出した Zn 濃度を測定したところ、
2+

液中の Zn 濃度は分散媒により著しく異なった（図 4 A）。
2+

蒸留水中よりも、培地中でより多くの Zn が溶出した。

溶出した Zn 2 + が結合組織に浸透することによる影響を検討した。結合組織のモデルとしてコラーゲンビトリゲルを用いた。ビトリゲル上に HaCaT 細胞を培養し、ビトリゲ

図２ ナノ粒子の細胞内酸化ストレスに対する影響（A）細胞内 ROS レベル。（B）HO-1 遺伝子発現。各ナノ粒子を 10 および 100µg/ml の濃度でHaCaT 細胞に投与し、６時間または 24 時間後に細胞内 ROS および HO-1 遺伝子発現を測定した。10, 30, 50µg/ml の Zn2+ を含む ZnCl2 溶液でも同様の試験を行った。値は非投与細胞を 1としたときの相対値として示した。**p<0.01（vs 非投与細胞 , ANOVA, Dunnett）− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図３ ナノ粒子のサイトカイン遺伝子発現に対する影響（A）サイトカイン遺伝子発現。
（B）培養上清中IL-8 タンパク質濃度。各ナノ粒子を 10 および100µg/ml の 濃 度 で HaCaT 細 胞 に 投 与 し た。
24 時間後に遺伝子発現及びタンパク質濃度を測定 し た。**p< 0.01（vs 非 投 与 細 胞 , ANOVA,
Dunnett）

図４ ナノ粒子の細胞影響における亜鉛イオンの影響（A）酸化亜鉛ナノ粒子からの Zn2+ の溶出。ZnO および ZnO-S をそれぞれ
1.0 および 10mg/ml の濃度で蒸留水（DW）、DMEM（FBS を含まない）、
10% FBS 添 加 DMEM お よ び EPI100-NMM-SIT 培 地 中 に 分 散 し、37℃で６時間保持した後、液中に溶出した Zn2+ 濃度を測定した。
（B）ナ
ノ粒子のメタロチオネイン遺伝子発現。各ナノ粒子を 10 および 100µg/
ml の濃度で HaCaT 細胞に投与した。
24 時間後に遺伝子発現及びタンパク質濃度を測定した。値は非投与細胞を 1 としたときの相対値として示した。*p< 0.05, **p< 0.01（vs 非投与
細胞 , ANOVA, Dunnett）− 162 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築―物理・化学的性状と安全性との関連―

ルの上部あるいは下部に ZnO 分散液を投与し、HaCaT 細胞

4 . 7 倍 増 加 し た（ 図 9 A）
。HO - 1 遺 伝 子 の 発 現 は ZnO/に与える影響を検討した。投与の概要と略称を図５に示す。

DMEM では非投与細胞に対し 1 . 6 倍上昇したが有意差は

3 . 2 .1

認められなかった（図 9 B）。DMEM/ZnO では非投与細胞

亜鉛イオンの溶出投与時の ZnO 分散液（ZnO 濃度１mg/ ３ml）中の Zn2+

濃度は、9 . 0 µg/ml であった。ZnO/DMEM におけるビトに対し 85 倍上昇した。
3.2.4

サイトカイン

リゲル上部及び下部の Zn 2 + 濃度は、それぞれ 4 . 1 µg/ml お

ZnO/DMEM および DMEM/ZnO 双方で培地中への IL- 8

よび 2 . 9 µg/ml であった。DMEM/ZnO では、ビトリゲルの分泌が認められた（図 10）。さらに、DMEM/ZnO では

2+

上部及び下部の Zn 濃度は、それぞれ 9 . 5 µg/ml およびIL - 6 の分泌も認められた。これらのサイトカインについて、

7 . 6 µg/ml であった（図６）。分散液投与 24 時間後の細胞内のメタロチオネイン遺伝子の発現は、MT 1 A、MT 2 A ともに ZnO/DMEM および DMEM/ZnO 双方で非投与細胞の約３～６および 10 倍に増加した（図７）
。
3.2.2

細胞膜損傷

ZnO/DMEM では培地への LDH 漏出は若干の増加傾向にあったが、有意差は認められなかった。DMEM/ZnO では、培地中への LDH 漏出は有意に上昇した（図８）。
3.2.3

酸化ストレスZnO 投与細胞の細胞内 ROS レベルは、24 時間後で非投与細胞に対し ZnO/DMEM で約 1 . 5 倍、DMEM/ZnO で約

図５ ビトリゲルを用いた ZnO ナノ粒子の投与実験の概要

図６ ZnO ナノ粒子を投与したビトリゲルにお2+ける Zn 濃度図７ ナノ粒子のメタロチオネイン遺伝子発現に対する影響（ビトリゲル）
投与 24 時間後に測定。*p< 0 . 05 , **p< 0 . 01（vs 非投与細胞 ,ANOVA, Dunnett）− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

遺伝子発現を検討したところ、いずれも DMEM/ZnO で発４．考現の上昇が認められた。ZnO/DMEM では発現の上昇は見ら れ な か っ た。 ま た、DMEM/ZnO で は IL- 1 b お よ び
IL - 12 遺伝子発現が有意に上昇した。

察

本研究では、ナノ粒子のうち化粧品材料としてよく利用される TiO 2、ZnO および SiO 2 の細胞及び皮膚モデルに対する影響を検討した。これらのナノ粒子のうち、ZnO ナ

3.3

皮膚３次元モデルノ粒子で強い細胞影響が認められた。一方で、TiO 2 およビトリゲルによる検討で、ZnO ナノ粒子から溶出したび SiO 2 の細胞影響は小さかった。ZnO を含むいくつかの金

2+

Zn が結合組織に浸透して下部の細胞に影響する事が示属酸化物ナノ粒子については、これまでに細胞影響が報告唆された。そこでさらにより実際に皮膚に近い３次元モデされている 4）。これら細胞影響を示す金属ナノ粒子の最もルを用いて検討を行った。対照として、溶解性を示さない

重要な影響因子として、金属イオンの溶出が挙げられる 5）。

TiO 2 でも試験を行った。

従来不溶性として分類されていた物質でも、ナノ粒子では3.3.1

大きな溶解性を示す事がある。例えば、酸化ニッケル（NiO）

亜鉛イオンの溶出皮膚モデル上に投与した ZnO 分散液中の Zn 2 + 濃度は、は水に不溶とされているが、一部の NiO ナノ粒子は培地中

ZnO 濃度が 0 . 1 および 1 . 0 mg/ml のとき、それぞれ 1 . 0 おで高い溶解性を示した 1）。ZnO ナノ粒子も培地中に Zn 2 +よび 0 . 8 µg/ml であった。培養液中の亜鉛イオンを測定しを溶出し、細胞に強い酸化ストレスを引き起こすことで細2+たところ、ZnO 粉体を投与したものを除き、Zn は検出

胞死をもたらす 4）。また、ラットに ZnO ナノ粒子を気管内されなかった。ZnO 粉体を投与したモデルでは、培養液注入した実験では、肺に酸化ストレスと炎症を引き起こし2+

中に 4 . 9 µg/ml の Zn が含まれていた。メタロチオネイン

たが、このとき、Zn 2 + の溶出が重要であることが示唆さ

遺伝子発現を測定したところ、ZnO 分散液投与によって発現が上昇した（図 11）
。
3.3.2

細胞影響

ZnO および TiO 2 分散液／粉体を皮膚３次元モデルに投与し、24 時間後に培養液中の LDH 活性を測定した。ZnO
および TiO 2 投与による培地中への LDH の漏出は認められなかった。酸化ストレス応答タンパク質 HO - 1 遺伝子発現は、1 . 0 mg/ml の ZnO 分散液の投与によって非投与モデルに対し 1 . 6 倍程度上昇した（図 12 A）。ZnO および TiO 2 ナ
ノ粒子の投与により、24 時間後の時点でのサイトカイン（IL- 1 b、IL- 8、IL- 12）遺伝子発現の上昇は認められなかった（図 12 B）。一方で、ZnO 粉体の投与により、24 時間
後の培地中の IL- 8 タンパク質濃度は有意に上昇した。また、ZnO および TiO 2 粉体を投与し、24 時間後の培地中のIL- 6 濃度も有意に上昇した（図 12 C）。

図８ ZnO ナノ粒子の細胞膜に対する影響（ビトリゲル）投与24時間後に測定。**p< 0.01（vs 非投与細胞, ANOVA, Dunnett）

図９ ZnO ナノ粒子の細胞内酸化ストレスに対する影響（ビトリゲル）（A）細胞内 ROS レベル。
（B）HO- 1 遺伝子発現。投与 24 時間後に測定。値は非投与細胞を 1 としたときの相対値として示した。**p< 0 . 01（vs 非投与細胞 , ANOVA, Dunnett）− 164 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築―物理・化学的性状と安全性との関連―

図 10 ZnO ナノ粒子のサイトカイン発現に対する影響（ビトリゲル）
培養上清中サイトカインタンパク質濃度およびサイトカイン遺伝子発現。各ナノ粒子を 10 および 100 µg/
ml の濃度で HaCaT 細胞に 24 時間投与した。*p< 0 . 05 , **p< 0 . 01（vs 非投与細胞 , ANOVA, Dunnett）

図 11 ナノ粒子のメタロチオネイン遺伝子発現に対する影響（皮膚３次元モデル）
投与 24 時間後に測定。**p< 0 . 01（vs 非投与モデル , ANOVA, Dunnett）− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

れている 3）。TiO 2 ナノ粒子の分散液をラット皮膚に塗布し、ZnO、SiO 2 ナノ粒子が粒子の状態で何層にも重なった細胞

皮下へのナノ粒子の移行を検討したところ、粒子は表皮を間を通過し、真皮にまで到達することはきわめて考えにく

通過せず、皮下への移行は認められなかった 6）。ナノ粒子

い。しかし一方で、ZnO から溶出した Zn 2 + が表皮に浸透し、は凝集体を形成しやすく、通常分散液中で数十～数百 nm

真皮に到達する可能性は否定できない。本研究で、ビトリの二次粒子を形成しており、一次粒子が単独で存在するこゲルを用いた実験により、ビトリゲルによって隔てられ、とはきわめてまれである。化粧品に使用される TiO 2 や

ZnO ナノ粒子と直接の接触がない HaCaT 細胞で、細胞内図 12 ZnO ナノ粒子の HO- 1 およびサイトカイン発現に対する影響（皮膚３次元モデル）
投与 24 時間後に測定。**p< 0 . 01（vs 非投与モデル , ANOVA, Dunnett）− 166 −

化粧品向けナノ粒子の安全性評価を目的とした in vitro スクリーニングシステムの構築―物理・化学的性状と安全性との関連―

ROS の上昇と、メタロチオネインおよび IL- 8 遺伝子の発現上昇が認められた。また、メタロチオネイン遺伝子の発現上昇とサイトカインの誘導は、ZnO ナノ粒子を投与した皮膚３次元モデルでも認められた。メタロチオネインはZn 2 + を含む金属の存在によって発現が誘導される。B 細胞の分化誘導因子である IL - 6 は液性免疫に関わり、IL- 8 は
好中球の走化性活性を示す代表的な炎症メディエーターである。また、IL - 12 はナイーブ T 細胞の Th 1 方向への分化に関与するが、Zn 2 + による発現の上昇が認められた。こ
れらの結果は、ZnO ナノ粒子では分散液の塗布による粒
子自体の皮膚への侵入はないものの、溶出した Zn 2 + が真皮にまで浸透し、上皮細胞に対して炎症誘発や酸化ストレスの誘導、アレルギー反応の惹起が生じる可能性を示唆する（図 13）。本研究ではケラチノサイトである HaCaT 細胞
および皮膚３次元モデル（ヒト正常表皮角化細胞により構成される）を使用したが、金属酸化物ナノ粒子から溶出した金属イオンはランゲルハンス細胞を刺激し、アレルギー性皮膚炎を引き起こす可能性もある。ZnO などの金属酸
化物ナノ粒子からの金属の溶出は、分散媒により異なり、また皮膚への浸透の化学的な定量は困難である。メタロチ
2+

オネインは Zn を含む金属イオンにより誘導され、本研究においても Zn 2 + の溶出に対し鋭敏な発現上昇を示した。
また、影響が小さかった不溶性の TiO 2 ナノ粒子の投与で

図 13 ナノ粒子の皮膚に対する影響の概要
化粧品へのナノ粒子の利用において、ZnO ナノ粒子のように溶解性を示すナノ粒子では、溶解した金属イオンが皮膚に浸透して、サイトカイン遺伝子の発現を誘導することで炎症などを引き起こす可能性がある。

は発現の上昇は認められなかった。ナノ粒子の毒性に金属
イオンの溶出は密接に関連しており、これらの結果から、

small. Diam. Relat. Mater., 24 , 15 – 24 , 2012 .

メタロチオネイン遺伝子の発現解析は、皮膚における金属

３）Fukui H, Horie M, Endoh S, Kato H, Fujita K,

酸化物ナノ粒子毒性を考慮する上で有効なマーカーとなり

Nishio K, Komaba LK, Maru J, Miyauhi A, Nakamura

得る。ビトリゲルと皮膚上皮細胞を組み合わせ、メタロチ

A, Kinugasa S, Yoshida Y, Hagihara Y, Iwahashi

オネインの遺伝子発現を解析することで、有害な可能性の

H,: Association of zinc ion release and oxidative

あるナノ粒子を選別することが可能であろう。今後の課題

stress induced by intratracheal instillation of ZnOとして、アイソザイムが存在するメタロチオネインの発現

nanoparticles to rat lung. Chem. Biol. Interact., 198 , 29 -プロファイルを確立し検出精度を高めること、また溶出し37 , 2012 .

た金属イオンに対するランゲルハンス細胞の応答を検討す
ることが重要である。

４）Horie M, Fujita K, Kato H, Endoh S, Nishio K,
Komaba LK, Nakamura A, Miyauchi A, Kinugasa
S, Hagihara Y, Niki E, Yoshida Y, Iwahashi H,:（引用文献）

Association of the physical and chemical properties

１）Horie M, Nishio K, Fujita K, Kato H, Nakamura

and the cytotoxicity of metal oxide nanoparticles: metal

A, Kinugasa S, Endoh S, Miyauchi A, Yamamoto K,

ion release, adsorption ability and specific surface area.

Murayama H, Niki E, Iwahashi H, Yoshida Y, Nakanishi

Metallomics., 4 , 350 - 360 , 2012 .

J.: Ultrafine NiO particles induce cytotoxicity in vitro５）Horie M, Kato H, Fujita K, Endoh S, Iwahashi H.,:by cellular uptake and subsequent Ni(II) release. Chem

In vitro evaluation of cellular response induced by

Res Toxicol., 22 , 1415 - 1426 , 2009 .

manufactured nanoparticles. Chem. Res. Toxicol., 25 ,２）H o r i e M , K o m a b L K , K a t o H , N a k a m u r a A ,605 - 619 , 2012 .

Yamamoto K, Endoh S, Fujita K, Kinugasa S, Mizuno

６）Adachi K, Yamada N, Yamamoto K, Yoshida Y,

K, Hagihara Y, Yoshida Y, Iwahashi H,: Evaluation

Yamamoto O.,: In vivo effect of industrial titaniumof cellular influences induced by stable nanodiamonddioxide nanoparticles experimentally exposed todispersion; thehairless rat skin. Nanotoxicology., 4 , 296 - 306 , 2010 .

cellular influences of nanodiamond are− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

発汗能を制御し皮膚恒常性保持能力を回復させる試み

大阪大学大学院医学研究科情報統合医学皮膚科学教室

室 田

浩 之

Abnormal sweating has been thought to contribute to pathogenesis of various dermatoses in diverse ways. Explorationof novel sweating-regulating factors may provide a clue to formulate treatment strategies for these patients. Previously,
we reported that decreased sweating contributed to pathogenesis of atopic dermatitis. If we could determine the factor
influencing sweating in atopic dermatitis, it might be applied to treatment for patients with abnormal sweating. Thus,
we explored the factors influence sweating in atopic dermatitis. Firstly, we focused on histamine, which is known as toplay wide range roles in allergic dermatoses. The impact of histamine to acethylcholine-induced sweating response wasmeasured with counting the number of active sweat gland by starch-iodin reaction, dynamic optical coherence tomography,
visualizing sweat by two-photon excitation fluorescence microscopy, and quantitative sudomotor axon reflex test. Histamine
demonstrably inhibited the acethylcholine-induced sweating in both murine and human via H1 receptor-mediated signaling.
These results might provide basis for understanding pathogenesis and formulating novel therapeutic approach for dermatoses
with dysregulated homeostasis.

１．緒

レルギー炎症に関わる化学伝達物質が発汗を抑制するので

言はないかと推察される。本研究では特にヒスタミンが発汗

発汗は温度調節、感染防御、保湿という重要な機能を担に与える影響について検討を行った 2）。

う皮膚の生理機能であり、発汗過多は多汗症や低体温、乏２．実

汗はうつ熱・易感染性・皮膚乾燥に繋がる。発汗機能異常を制御する方法が確立できれば様々な皮膚のトラブルを改

2 .1

動

験

物

善できると想像される。現在のところ塩化アルミニウムに11 − 12 週齢の C 57 BL 6 および H 1 RKO マウスを用いた。

よる汗管閉塞、水道水によるイオントフォレーシスが多汗マウスの全身麻酔はドミトール、ベトロファール、ドルミ症に応用されているが無効例も少なくなく、乏汗は未だ有カム三種混合薬を腹腔内投与することで実施した。動物の効な治療方法がないのが実情である。発汗を制御する方法

管理は大阪大学のガイドラインに基づいて行った。

が確立されればスキンケアはもとより様々な皮膚疾患の治

2.2療に応用できると期待される。

試

薬

発汗はコリン作動性の交感神経支配を受けているが、具ピロカルピン塩酸塩（50 µg/ 20 µl/mice）、ヒスタミン

体的な制御機構は不明の点が多い。少なくともコリン誘導（120 µg/ 20 µl）を用いた。ヒスタミン受容体拮抗薬として性発汗に影響を与える因子の探索は発汗制御因子の同定にピリラミン（700 µg/body）、フェキソフェナジン（600 µg/

繋がると期待される。これまでに私達はアトピー性皮膚炎body）、シメチジン（400 µg/body）を腹腔内投与した。

患者におけるアセチルコリン反応性発汗機能を測定し、その中でアトピー性皮膚炎においてアセチルコリン誘導性発2.3

in vivo 発汗試験

汗量が減少していることを報告してきた 1）。アトピー性皮マウスを用いたミノール法変法（ヨウ素澱粉反応）によ膚炎でコリン性発汗が減少しているメカニズムを解明する

り発汗量を半定量化する試みを行った。ヨウ素澱粉反応にことにより、発汗機能を制御できる因子の同定に繋がるはよる発汗の評価方法は文献３を参照した。

ずだ。先行する研究成果において、アトピー性皮膚炎は外用薬や抗ヒスタミン薬の内服によって症状が改善すると発汗機能も改善することが報告されている。このことからア

2.4

光コヒーレンストモグラフィー（OCT）

マウスの足底の発汗の動態を OCT によって評価した。
OCT のイメージは B モード OCT から得られた x-z plane より作成した。

Maintenance of skin homeostasis via
regulating sweating
Hiroyuki Murota
Department of Dermatology Course ofIntegrated Medicine Graduate School of
Medicine, Osaka University

2.5

二光子顕微鏡マウス足底の生体における汗腺動態は二光子顕微鏡を用いて観察した。方法と条件は文献４を参照した。汗腺はM 3
受 容 体 抗 体、APQ 5 抗 体 を 用 い て、 核 は hoechst 33342、− 168 −

発汗能を制御し皮膚恒常性保持能力を回復させる試み

血管を Texas red ラベルされたデキストランを静脈内投与

表皮内汗管を通る汗も確認されなくなった（図 1 B）
。ヒス

することで可視化した。画像は Volocity 3 D イメージ解析

タミンの発汗抑制作用はどの受容体を介して発揮されるのソフトを用いて作成された。

かを調べるために各種ヒスタミン受容体拮抗薬を投与し、ミノール法変法によって評価した（図２）。この抑制作用

2.6

統計解析

は H 1 受容体拮抗薬（ピリラミン、フェキソフェナジン）Prism 5 ソフトウェアを用いて解析した。Bonferroni ’sで阻害されるが、H 2 および H 4 受容体拮抗薬では阻害さ

multiple comparison testによって評価し、*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001を有意とした。

３．結
3 .1

果

発汗評価方法の妥当性に関する検討

マウスの発汗を評価する方法としてミノール法変法がある。ピロカルピンをマウス足底に皮下注射し数分後のヨード澱粉反応点の数を評価したところ、ピロカルピン投与後に顕著な数の増加が確認された（図 1 A）
。さらに表皮内から皮膚表面への汗の動態を OCT によって観察した。その結果、表皮内汗管に沿って上行し、皮膚表面に間欠泉のように吹き出す汗の様子が観察できた（図 1 B）。

3 . 2 ヒスタミンがピロカルピン誘導性発汗に与える影響
上述した発汗評価法を用い、ヒスタミンが発汗に与える影響を観察した。ピロカルピンとヒスタミンを同時に投与されたマウスではミノール法変法において皮膚表面への発汗が著しく減少しているのが確認された（図 1 A）
。OCTによる観察では、ヒスタミン投与後、皮膚表面はもとより

図１ マウスの足底の発汗動態の解析結果
A. ミノール法変法による発汗評価。Ach: ピロカルピン。
B. OCT による汗の動態観察結果。

図２ ヒスタミン受容体拮抗薬の効果
ミノール法変法を用いて各種ヒスタミン受容体拮抗薬の影響を確認した。AH : antihistamine.
PBS : phosphate buffered saline. Ach : pirocarpin。

− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014れない（図２）。このことからヒスタミンは H 1 受容体を介腺の拡張は数十分続くことから、汗腺分泌細胞から汗管へして抑制すると考えられた。実際に H 1 RKO マウスではヒの汗の移動が損なわれているものと考えられた（図 4 Ｃ）。

スタミンによる発汗抑制作用は著しく減弱していた（dataつまりヒスタミンは汗腺分泌細胞に作用することで汗の分

not shown）。

泌を止めるものと考えられた。

次にヒスタミンはどのように発汗を阻害するのかに疑問

４．考がのこる。ミノール法変法や OCT による観察では表皮内察汗管の汗も確認されなかったことからヒスタミンは汗腺に上述したように私達はアトピー性皮膚炎で乏汗が生じて作用することで発汗を抑止すると想像される。しかし既存いる事をアセチルコリンによる定量的軸索反射発汗試験をの評価方法では汗管よりも表皮側の領域しか観察することができない（図３）。そこで二光子顕微鏡を用いた汗腺の動態観察を試みることとした。

3.3

二光子顕微鏡を用いた汗腺の動態観察

二光子顕微鏡で観察した汗腺の動態観察結果を図４に示す。ピロカルピンを腹腔内投与し約 10 分後から発汗活動が観察される。汗腺に存在する汗腺分泌細胞が腫大し、縮まる際に黒いドット（opaque spot）様の FITC 強度の退色が確認される。FITC の蛍光強度低下は汗の酸性によって生じるのではないかと想像され、この opaque spot が汗をあらわしていると考えた（図 4 Ａ）
。一方、ピロカルピンとヒスタミンを同時に投与した際、汗腺の拡張は確認されたが、opaque spot は確認されなかった（図 4 Ｂ）
。さらに汗

図３

汗腺の微小環境とこれまでの実験結果の小括のシェーマ

図４ 二光子顕微鏡を用いた汗腺の動態観察
A. ピロカルピン投与後の汗腺。緑：汗腺。赤：血管。点線でかこんだ黒い opaque spot は汗を示す。B. ピロカルピンとヒスタミンを同時に投与した際の汗腺の動態。C. ヒスタミン投与後の汗腺分泌細胞の動態に関するシェーマ。

− 170 −

発汗能を制御し皮膚恒常性保持能力を回復させる試み

用いて証明してきた 1）。アトピー性皮膚炎患者でみられる

ドパルス治療抵抗性を示す後天性特発性全身性無汗症症例

発汗量の低下は皮膚の恒常性を損なうことで症状悪化に関の中に抗ヒスタミン薬の有効例があるかもしれないと考えわると考えられる。発汗量が低下する機序として（A）汗た。QSART および全身ミノール法によって無汗症の確認の排出異常、（B）汗腺からの汗の産生および分泌の異常、された後天性特発性全身性無汗症２症例に抗ヒスタミン薬の２つがある。（A）の原因として汗孔の角栓形成に伴うを投与したところ、投与量を通常量から増量していく過程

閉塞、あるいは汗管から組織中への汗の漏出が考えられて

で QSART において検出可能なレベルの発汗が確認されるいる。（B）の原因として、自律神経失調や発汗誘発因子でようになった。その後徐々に入浴や運動等によって患者のあるアセチルコリンへの反応の低下が報告されている。ア

自覚できる発汗を促したところ、日常生活に支障のないレ

セチルコリン応答性発汗は定量的軸索反射性発汗試験

ベルまで発汗が改善した。本研究の成果から着想に至った（Quantitative Sudomotor Axon Reflex Test : QSART）で

後天性特発性全身性無汗症の治療経験から、私たちはステ

詳細な評価が可能である。この試験ではアセチルコリンを

ロイドパルスを行う前に抗ヒスタミン薬の適宜増量と発汗

イオントフォレーシスによって皮膚に浸透させ、末梢神経を促す指導を施行することを推奨している（Suma A et al.

の軸索反射を介して生じた発汗量（軸索反射性発汗量）とActa Derm Venereol, accepted）。発汗を制御することで発汗に要する時間が測定できる。この結果、軸索反射性発

皮膚恒常性維持に貢献できた具体的な事例となり、今後他

汗量はアトピー性皮膚炎で少なく、健常人の約半分である疾患への応用も検討していく予定である。

1）

ことが分かった （図４）
。さらにアセチルコリン投与から５．総発汗までの時間がアトピー性皮膚炎群では健常人よりも長括時間かかる 1）
（図４）
。このように、アトピー性皮膚炎は乏無汗・乏汗症にはまだまだ未知の病態が隠されている。

汗状態にあり、発汗すべき時に少しずつまばらにしか汗が発汗機能を評価する科学的手法も進歩しており、これらを出ていないと想像できる。乏汗は皮膚に熱をこもらせ、乾用いることで臨床現場での皮膚科医の些細な疑問や発見が燥させ、病原体への抵抗性を損なうため皮膚炎症状を悪化

病態の解明につながり、発汗による皮膚のホメオスタシスさせる。乏汗の背景として自律神経の失調、患者の不安性改善が新しい治療のアウトカムになりうるものと期待され

1）

格傾向、アレルギー炎症の関与が考えられている 。より詳る。最後に謝辞として、このような貴重な機会を与えてく細に乏汗のメカニズムが解明されれば、具体的な指導箋のださったコスメトロジー研究振興財団、そして本研究にご確立に有益な情報になろう。私たちはアレルギー炎症の病

協力ご指導をくださった大阪大学保健学

近江雅人先生、態形成に関わる因子が発汗を抑制すると考え、乏汗を引き

大阪大学医学系研究科免疫細胞生物学

優先生に拝

1）

起こす因子の探索を行った 。その結果、ヒスタミンはア

石井

謝する。

セチルコリン誘導性発汗を抑制する事を確認した。この現象はヨウ素澱粉反応と光コヒーレンストモグラフィーを用（引用文献）

2）いた汗そのものの生体内動態イメージングで観察された 。

１）Kijima A, Murota H, Matsui S, Takahashi A, Kimura

さらに二光子顕微鏡を用いたエックリン汗腺の生体内動態

A, Kitaba S, Lee JB and Katayama I: Abnormal axon

解析より、ヒスタミンは汗腺細胞からの汗の分泌を阻害しreflex-mediated sweating correlates with high state ofており、この現象はヒスタミンが汗腺分泌細胞内でグリコ

anxiety in atopic dermatitis. Allergol Int, 2012 ; 61 : 469 -ーゲン合成酵素の活性に影響する結果であることを確認し

473 .

た 1）
（data not shown）。このヒスタミンによる汗分泌阻害

２）Matsui S, Murota H, et al.Dynamic analysis of

作用は H 1 受容体を介しており、抗ヒスタミン薬はヒスタ

histamine-mediated attenuation of acethylcholine-1）ミンの関与する乏汗を改善する効果が期待される 。ヒス

iduced sweating via GSK 3 b activation. J Invest

タミンがアトピー性皮膚炎で見られる乏汗にどのくらい関

Dermatol. 2013 ; 134 : 326 - 334 .

与するかについては懸案事項であるが、これらの知見は原

３）Nejsum LN, Kwon TH, Jensen UB, et al. Functional

因不明とされる後天性特発性全身性無汗症にもヒスタミン

requirement of aquaporin- 5 in plasma membranes ofの関与する症例があるのではないかと想像させる。実際に、sweat glands. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002 , 99 : 511 - 6 .

後天性特発性全身性無汗症の確立された治療方法はないが、

４）Ishii M, Egen JG, Klauschen F, et al. Sphingosine-ステロイドパルス治療の奏功する症例のあることから本治

1 -phosphate mobilizes osteoclast precursors and療が適用されてきた。しかし、ステロイドパルス治療にもregulates bone homeostasis. Nature 2009 , 458 : 524 - 8 .

抵抗性を示す症例も少なくない。本研究成果よりステロイ− 171 −

交通渋滞中のドライバーの精神的ストレスおよび肉体的ストレスに対する芳香物質の影響 ─パイロットスタディ─
東京農工大学大学院工学府機械システム工学専攻

佐 藤桂

The improvement of drivers’ condition is required to reduce traffic accidents. The purpose of this study is to improve
driver’s condition during traffic jams by using aroma compounds. Since it is not clear which kind of stress drivers haveduring traffic jams, the effects of aroma compounds on metal stress and physical stress were analyzed respectively.
Furthermore, the effect of aroma compounds which were supplied during driving a scenario of traffic jam on a driving
simulator was also evaluated.

１．緒

ヒトのストレスの測定には，脳波の測定や唾液中や血中

言に含まれるストレスホルモンの測定，心電図の測定などが近年の車社会において，交通渋滞は大きな問題の一つであげられるが，運転時のドライバの状態の測定には，安全ある．渋滞中の交通事故の発生率は，通常状態におけるそ面の観点から運転の邪魔にならない心電図の測定が有用でれの約８倍であり，特に追突事故に関しては約 16 倍でああると考えられる．実世界の道路環境では同じ交通場面に

1）

る ．高速道路など二車線以上の道路上で渋滞に巻き込ま遭遇することは皆無であり，被験者ごとに実験場面が異なれた場合，目的地に少しでも早く着こうと車線変更をくりってしまうことと，本研究が基礎研究に位置することから，かえすドライバも数多くおり，自車線に進入される側にと現段階では同じ交通環境を再現できるドライビングシミュってそれはさらなるストレスとなる．交通事故の原因の多レータを用いて香りの効果の評価を行ったが，本研究の結くがヒューマンエラーによるものであると言われているこ果をもとに将来は実車実験により評価する予定であるので，とから，ドライバの精神状態や身体状態は運転行動に大き本研究でも心電図の測定を行った．今回は，R 波と R 波のく影響を与えると考えられ，注意力低下状態など不安全行間隔である R−R 間隔（以下 RRI）を指標として用いた．こ動をとりやすい状況にあるドライバの心身状態の改善は交れは心拍の逆数で表され，RRI が大きい場合は拍動が遅く，通事故の低減に重要である．

リラックスしており，小さい場合は緊張またはストレス下

ドライバの状態を改善する方法の一つに香りの提示があにあるとされている．

げられる 2 , 3）．香り，つまり芳香物質は吸引されたのち，血２．実験の部

液中にとりこまれ全身を巡り肝臓で代謝され体外に排出されることから，薬理効果や効果の持続性が期待される．
（−）

2 .1

- linalool はラベンダーオイルなどに含まれる化合物であり，- linalool（ 95 . 0 % GC sum of enantiomers）はシグマ（−）

試薬

その鎮静効果はこれまでにも多くの論文で報告されている 4）．

アルドリッチ社製を，また 1,8- cineol は和光純薬製を用いた．

一方 1 , 8 -cineole はローズマリーオイルやペパーミントオイ
ルに含まれており，これらの刺激作用が報告されている 5）．
本研究の目的は，渋滞中のドライバの精神的ストレスおよび肉体的ストレスの香りによる低減であるが，渋滞中の2.2

心電図測定機器

ニホンサンテク株式会社製の自律神経解析プログラム（Map 1060）を用いた．

ドライバに具体的にどのようなストレスがかかるのか不明
であり，またドライバにとって鎮静させる香りが有効であ

2.3

ドライビングシミュレータ

るのかそれとも刺激する香りが有効であるのか不明である

ドライビングシミュレータ（以下 DS）には，株式会社アため，相反する効果を有する２種の香りの効果を評価した．

ストジェイ製のマルチエージェント交通流シミュレーショ
ン（ASSTranece）を用いた．DS の性能上，シナリオの時

Influence of aroma compounds on thedrivers’
mental and physiological stressduring traffic jam −Pilot study−
Kei Sato
Department of Mechanical Systems
Engineering,Faculty of Engineering,Tokyo University of Agriculture andTechnology

間は最長で 28 分となった．

2.4

被験者

普通運転免許を持つ本学の 23 歳男性８名であり，実験
当日はカフェインを摂取しないよう教示した．また各実験の測定開始時刻は毎回同時刻とした．

− 174 −

交通渋滞中のドライバーの精神的ストレスおよび肉体的ストレスに対する芳香物質の影響−パイロットスタディ−

なお，本研究は，東京農工大学の倫理委員会の承認のもの邪魔をしいらいらさせる作業を行った．このタスクをと実施し，被験者には事前に研究内容を説明し，インフォ

20 回行わせ，１シート分の作業を終えるたびに，①疲れームドコンセントを得た．

ているか，②ストレスがあるか，③いらいらしているか，④気分が明るいか，⑤眠いか，という質問に１−５のスケ

2.5

実験環境

ールで答えさせた．なお，オペレータの作業は毎回同じシ

実験室は換気扇を備えた約 13 . 5 ｍ2 の部屋で，気温を約

ナリオを用いて行った．香りの供給は，14 回目から 18 回目の作業時に行い，一種の香りにつき２条件（供給濃度：高・23℃，湿度を 30 − 40％に設定した．

低）の合計４条件を行った．なお被験者には，香りの効能

2.6

香りの供給装置および濃度の決定

2.6.1等の説明はせず，測定当日に使用する香りの情報も与えな

供給方法

かった．

空気および芳香物質の供給にはエアポンプを用い，被験

肉体的ストレス

渋滞中に身体にかかる肉体的ストレスとして，長時間座者の鼻先から約 10 cm のところに供給した．
2.6.2

2.7.2

濃度の決定

ったままであり，身体を伸ばすことができないなどがある

不快な香りを長時間吸引することは，ストレスになりかが，例えば正座をタスクにするといつ被験者にストレスがねないことと，香りを用いた警報システム等の商品化の際かかっているか不明であり，個人差も大きいことから，コに非現実的であることから，香りの供給濃度として，２条

ールドプレッシャーテスト（以下 CPT）を本実験では用い件をアンケート結果により決定した．なお，空気の流量はた．約３℃の冷水に肘から下を 50 秒間つけさせ，この間変化させず一定とし，芳香物質の量により濃度高（300 µl）

香りを供給した．
またテストの開始前，CPT の直後，テスト終了後に，と濃度低（100 µl）の２条件を調整した．

①疲れているか，②ストレスがあるか，③いらいらしてい

2 .7

実験条件

2.7.1

るか，④気分が明るいかという質問に１−５のスケールで精神的ストレス

答えさせた．図１にプロトコールを示す．この測定は一種

渋滞中のドライバの精神的ストレスとして，①目的地にの香りにつき２条件（供給濃度：高・低）と香りの提示な

早く着きたいのに自分の意に反して進めない，②進もうとし（空気のみ）１条件の下行った．

しているのに横入りにより邪魔される，③退屈するなどの

2.7.3

DS 実験

意見が挙げられたことから，タスクとして，エクセルシー

作成した渋滞のシナリオ A を図２に示す．図中のシナリ

ト上ランダムに縦一行に並んでいる１から 15 までの数字

オの「やや渋滞」と「渋滞」を入れ替えたシナリオ B も作を被験者に順番に１から 15 までとなりの行にマウスを用成し，各芳香物質につき２種類のシナリオを用いた．ただいてできるだけ早く縦に並べさせ，被験者が並べている間

し，これらのシナリオを用いる順番はランダムとした．なにオペレータが，カーソルの移動を邪魔したり等，被験者

お芳香物質はいずれのシナリオにおいても「大渋滞②」の

図１

CPT のプロトコール

図２

渋滞シナリオ A− 175 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ときに供給した．

表１

まず，DS での走行に慣れるために自車両の前後，横方向に他車両が存在しない通常のコースを 10 分ほど走行させた．被験者には通常の運転をするように教示し，車線変
更をしたい場合はしてもよい旨を伝えた．

紙面の都合上，被験者 S 1 のデータを示す．

3 .1

嗜好性
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱

嫌い
弱い
嫌い
弱い

嗜好性
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱

嫌い
弱い
嫌い
弱い

濃度（低）

濃度（低）

３．結果および考察

香りの嗜好性および強弱(ｰ) - linalool
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1
1 , 8 - cineole
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

精神的ストレス

3.1.1

香りの嗜好性RRI の値が高くなっており，香りの供給前後の RRI の値の

まず，被験者の香りの嗜好性（どちらでもないを含む５変動が顕著でない可能性がある．

段階）および被験者が感じた匂いの強弱（どちらでもないを含む５段階）を表１に示す．なおこの嗜好性は実験終了

3.2

直後にたずねた．

3.2.1

3 .1. 2

アンケート結果

肉体的ストレス
香りの嗜好性

被験者の香りの嗜好性および感じた匂いの強弱を表２にアンケートは，１シート毎のタスクが終わる度に行った．
結果の詳細は紙面の都合上割愛するが，各条件下における簡単な結果を以下にまとめる．主に香りを供給した５シー

示す．
3.2.2

アンケート結果

実験開始直前，CPT 直後，実験終了直後に行ったアン

ト分とその前後４シート分の結果を示す．

ケート結果の詳細は紙面の都合上割愛するが，コントロー- linalool の供給条件下
・（−）- linalool を供給した場合は，
ル条件，また低・高濃度の（−）

低濃度：香りの供給後にリラックスさせる傾向にあった．

実験開始直前に比べストレスが増加した．
一方，1 , 8 - cineole を供給した場合はいずれの濃度の場合香りを供給した区間中の眠気が低下した．
高濃度：低濃度と同じくリラックスさせる傾向にあったもストレスは減少した．しかし，低濃度の場合は，いらいが，いらいらも増した．供給後から気分の明るらの度合いが増した．高濃度の場合はいらいらの度合いはさが増加したが，眠気は供給前とは変わらず実- linalool０であった．なお，コントロール条件下および（−）

験の終了まで変化しなかった．

の供給条件下では CPT によるいらいらは発生しなかった．

・1 , 8 - cineole の供給条件下

3.2.3

各条件下における RRI の変動

低濃度：香りの供給後にリラックスの度合いが低下した

図７から図 11 にそれぞれ，コントロール条件下，（−）

が，イライラの度合いは減少した．眠気は減少- linalool（濃度：低）- linalool（濃度：高），1 , 8 -cineole（濃（，−）

し供給終了後からは再度増加した．

度：低），1 , 8 -cineole（濃度：高）の供給条件下の結果を高濃度：リラックスの度合いは変動はなかったが，香り示す．CPT を行った前後２分間における 50 秒ずつのデーの供給直後はいらいらが増加し再度減少した．
3.1.3

タをそれぞれ切り出し，RRI の変化の解析を行った．
- linalool を供給した
図８および図９に示すように，（−）

各条件下における RRI の変動- linalool（濃度：低），図３から図６にそれぞれ，（−）（−）

場合，濃度の高低にかかわらず RRI の変動は図７に示した- linalool（濃度：高），1,8-cineole（濃度：低），1 , 8 -cineole（濃コントロール条件の変動と同様の傾向を示した．従って度：高）を供給した結果を示す．タスクは 20 シート分行っ- linalool により肉体的ストレスは緩和されていないと（−）

たが，香りを供給した５シートの前後４シートの RRI の解考えられる．
- linalool
一方 1 , 8 -cineole を供給した場合は２条件下とも，（−）

析を行った．
- linalool（濃度：高）と 1 , 8 -cineole（濃４条件のうち，（−）と反対の傾向を示した．特に濃度の高い 1 , 8 -cineole を供度：低）を供給した時に RRI の値が上昇したことから，リ

給 し た 場 合，RRI の 値 の 上 昇 が 顕 著 で あ る こ と か ら，

ラックスする傾向にあったと考えられる．特に前者の場合，

1 , 8 -cineole はこの被験者にとって，肉体的ストレスの緩和

嗜好性は−１と低かったが嗜好性の影響はないと考えらえに有用であると考えられる．また香りの嗜好性についても，る．また，1 , 8 - cineole（濃度：高）の条件下では，香りのこの実験条件下では（−）- linalool の嗜好性は両濃度とも低供給まで眠気を感じており，供給により目が覚めたが，再く，高濃度の 1 , 8 -cineole を好んでいることも結果に影響

度眠たくなったという申告が測定後にあったことから，を及ぼしている可能性がある．

1 , 8 - cineole（濃度：低）を供給した時に比べ，全体的に− 176 −

交通渋滞中のドライバーの精神的ストレスおよび肉体的ストレスに対する芳香物質の影響−パイロットスタディ−

図３(−) - linalool（濃度：低）供給条件下の RRI の変動

図４(−) - linalool（濃度：高）供給条件下の RRI の変動

図５

1,8-cineole（濃度：低）供給条件下の RRI の変動

図６

1,8-cineole（濃度：高）供給条件下の RRI の変動

表２

香りの嗜好性および強弱

嗜好性
濃度（低）
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱

嫌い
弱い
嫌い
弱い

嗜好性
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱

嫌い
弱い
嫌い
弱い

濃度（低）

(−) - linalool
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1
1 , 8 - cineole
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

図７

図８

(−) - linalool（濃度：低）供給条件下の RRI の変動− 177 −

図９

コントロール条件下の RRI の変動(−) - linalool（濃度：高）供給条件下の RRI の変動

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図 10

1,8-cineole（濃度：低）供給条件下の RRI の変動

表３

嫌い
弱い
嫌い
弱い

嗜好性
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱

嫌い
弱い
嫌い
弱い

3.3

(−) - linalool
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1
1 , 8 - cineole
−2 −1
−2 −1
−2 −1
−2 −1

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

0
0
0
0

1
1
1
1

2
2
2
2

好き
強い
好き
強い

図12 (−) - linalool（濃度：低）供給条件下の RRI の変動（シナリオB）

DS 実験

3.3.1

らえる RRI の変動は見られなかった．

香りの嗜好性一方 1 , 8 - cineole を供給した場合は２条件下とも，香りを被験者の香りの嗜好性および感じた匂いの強弱を表 3 に供給しなかった前半の「大渋滞①」の時の RRI に比べ，供給した時の「大渋滞②」におけるそれの値は上昇傾向にあ

示す．
3.2.2

1,8-cineole（濃度：高）供給条件下の RRI の変動

香りの嗜好性および強弱

嗜好性
濃度（低）
強弱
嗜好性
濃度（高）
強弱
濃度（低）

図 11

アンケート結果った．従って，被験者 S 1 にとって渋滞シナリオの運転中

走行開始直前，走行直後，実走行終了直後に行ったアンの状態改善に，1 , 8 -cineole は有用であると考えられる．

ケート結果の詳細は紙面の都合上割愛するが，低・高濃度

４．考- linalool を供給した場合は，実験開始直前に比べ疲の（−）
れが増加した．
3.2.3

察

精神的ストレスを与えられた場合，肉体的ストレスを与各条件下における RRI の変動

えられた場合では，香りの嗜好性が異なることが表１と表- linalool（濃度：低）図 12 から図 15 にそれぞれ，
（−）
，
（−）

- linalool（濃度：低）２の結果から示される．特にこれは（−）- linalool（ 濃 度： 高 ），1 , 8 -cineole（ 濃 度： 低 ），の結果が顕著である．肉体的ストレスを与えられた時に，

1 , 8 -cineole（濃度：高）の供給条件下の「大渋滞①」の通嗜好性は低くなり，肉体的ストレスの緩和にこの香りは影

常状態，「大渋滞①」，通常状態，「大渋滞②」の間の RRI

響していない．

の変化を示す．なお，通常状態からは 120 秒間の中間にあ一方 1 , 8 -cineole（濃度：高）の嗜好性は肉体的ストレス

たる 90 秒分のデータを切り出した．また渋滞中からは，を与えられた場合に上昇しており，ストレスの緩和に有効

360 秒間の区間内前後 45 秒のデータを切り捨て，中間の 90であることが RRI の変動よりわかる．精神的ストレスを与秒のデータ３回分を切り出した．

えられた場合も，1 , 8 -cineole を供給した場合に RRI の値が- linalool を供給した
図 12 および図 13 に示すように，（−）
場合，濃度の高低にかかわらず，香りの影響によると考え上昇したことから，この被験者にとっては 1 , 8 -cineole は両ストレスの緩和に有用な香りであると推定できる .

− 178 −

交通渋滞中のドライバーの精神的ストレスおよび肉体的ストレスに対する芳香物質の影響

図 13 (−) - linalool（濃度：高）供給条件下の RRI の変動（シナリオA）−パイロットスタディ−

図 14 1,8-cineole（濃度：低）供給条件下の RRI の変動（シナリオ A）

図 15 1,8-cineole（濃度：高）供給条件下の RRI の変動（シナリオ B）- linalool
また渋滞中に感じるストレスに対しては，（−）
は影響をほとんどおよぼさなかったが，1 , 8 -cineole は解消

４）Hoeferl M, Krist S,Buchbauer G: Planta Medica,72 ( 13 ), 1188 - 1192 , 200

させる傾向にあることがわかった．DS 実験の終了後，こ５）Hongratanaworakit T: Sci Pharm, 77 , 375 - 387 , 2009の香りが供給されたとき，気分がすっきりしたと被験者が本研究内容は下記の学会にて発表いたしました．

答えたことから，この香りが気分に与える影響も大きいと- linalool よりも 1 , 8 -cineole
考えられる．この被験者は（−）１）K. Sato, M. Nagai. “Influence of (−)-linalool and1,8-cineole on physical stress”International conferenceを好む傾向にあり，刺激効果のある物質ではあるが，好きon natural products 2014 , Putrajaya, Malaysia, March

な香りで気分転換もできリラックスしたと考えられる．

2014（要旨提出済み）
２）寺沢拓馬，佐藤桂，永井正夫，“芳香物質が肉体的ス（参考文献）

トレスに及ぼす影響の心電図測定による評価”，日本人

１）http://www.shutokodeikou.jp/kensho/article/ 37 .php

間工学会東海支部 2013 年研究大会，愛知，2013 年 11 月
３）K. Sato, T. Terasawa, M. Nagai.“Influence of aroma

首都高ドライバズサイト：首都高速道路株式会社
２）平松真知子，笠井純一，田口満：自動車技術会論文集，

compounds on the driver’s mental and physical stress”
th

44 International symposium on essential oil, Budapest,

Vol. 26 , No. 2 , 88 - 93 , 1995
３）鈴木桂輔，佐藤桂，太田浩司 : ヒューマンインタフェ

Hungary, September 2013

ース学会学会誌 Vol. 12 , No. 3 , 115 - 124 , 2010

− 179 −

女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔の部分的化粧の影響について
─機能的磁気共鳴画像法を用いた検討─
1

藤 井

2

東北福祉大学感性福祉研究所、 東北大学大学院医学系研究科高次機能障害学分野

俊 勝 1、上 野

彩 2、川 崎伊 織 2、伊 藤

文 人2

We conducted two functional magnetic resonance imaging (fMRI) experiments to explore neural correlates of facialrecognition with cosmetics. In the first experiment, 28 subjects were presented with 144 face photographs (48 withcosmetics, 48 without cosmetics, and 48 scrambled photographs), and were asked to rate each stimulus for attractiveness.
The face photographs with cosmetics were rated more attractive than those without cosmetics. Imaging data showed that facephotographs with cosmetics, compared with those without cosmetics, activated the orbitofrontal cortex and the hippocampus.
In the second experiment, 30 subjects were presented with 180 face photographs (36 with eye, lip, and foundation, 36 witheye and foundation, 36 with lip and foundation, 36 with foundation only, and 36 without cosmetics) and 36 scrambled
images, and were asked to rate each stimulus for attractiveness. Imaging data showed that face photographs with eye makeup compared with those without eye make-up activated the hippocampus. We speculate that orbitofrontal activation isassociated with increased facial attractiveness and hippocampal activation with enhanced memory encoding.

１．緒ていない。本研究では、実験１において、化粧による魅力度

言の上昇がどのように脳内で処理されているか、実験２におい

これまでの心理学的研究から、化粧という行為が魅力度ては化粧の過程を細分化し、各段階における顔を見ている際を上げることが知られている。化粧の各段階について（1）の 脳 活 動 を、 磁 気 共 鳴 画 像（fMRI: functional magnetic

ノーメイクの状態、（2）ファンデーションのみの状態、（3）

resonance imaging）を用いて検討した。

ファンデーションとアイメイクのみの状態、（4）ファンデ

２．実ーションとリップメイクのみの状態、（5）フルメイクの状態の５段階に分類し、それらが魅力度をどのように変化さ

2 .1

せるかについて検討した報告は、フルメイクの顔が、同一

2.1.1

人物のノーメイクの顔に比べ、より魅力的であると評価さ
1）

験

実験１
被験者

被 験 者 は、 精 神 疾 患 お よ び 神 経 疾 患 の 既 往 が な く、れることを明らかにした 。また、評価をする際、女性にEdinburgh 利き手検査 6）の結果、右利きであると確認されとってアイメイクが最も重要であった一方で、男性ではア

た健常被験者 28 名（男性 14 名・女性 14 名、平均年齢 20 . 7 歳、イメイクとファンデーションが最も影響を持っていること

年齢範囲 20−26 歳）であった。全被験者に対し、ヘルシンが明らかとなった。その後の心理学研究では、化粧をしてキ宣言に基づいた本研究の主旨・内容・実験の安全性およいる女性が化粧をしていない女性に比べ、より健康的で自び被験者の権利に関する説明を行い、書面による参加の同信に満ち、高い収入を得る能力を持ち権威のある職業に就意を得た。本研究は東北福祉大学感性福祉研究所倫理委員

2）いていると判断される傾向があることも報告されている 。

会の承認を得て実施した。

これらの報告は、化粧が他者からの印象形成において重要

2 .1. 2

刺激

事前に 48 名の若年女性（平均年齢 21 . 5 歳、年齢範囲 18な役割を担っていることを明らかにしている。
一方、近年の脳機能画像法を用いた研究は、魅力的な顔−25 歳）について顔写真の撮影を行った。顔写真撮影の参を見たときの脳活動や好みの顔に対する脳活動を計測して加者全員に対し、事前に写真撮影の趣旨・内容・プライバ

いる。それらの研究は、眼窩前頭皮質が顔の魅力度や、顔シーの保護について説明を行った。その後、全員から書面に対する好みの処理に関わっていることを明らかにした 3−5）。

による参加の同意を得た。写真撮影の参加者は fMRI 実験

しかしながら、化粧による魅力度の変化がどのように脳には参加していない。顔写真の撮影は顔が正面を向いた状

内で処理されているかについて、その詳細は明らかにされ態で、DMC - FX 7 を使用し行った。また、撮影時にはフラ*

Neural correlates of facial recognition with andwithout cosmetics: an fMRI study*
Toshikatsu Fujii 1 , Aya Ueno 2 , Iori Kawasaki 2 ,Ayahito Ito 2

1

Life Science Research Center, Kansei Fukushi ResearchInstitute, Tohoku Fukushi University, Sendai, Japan2
Department of Behavioral Neurology and Cognitive
Neuroscience, Tohoku University Graduate School of
Medicine, Sendai, Japanッシュを使用し、解像度は 1920 × 1080 とした。参加者には表情が情動的にならないよう教示した。撮影条件はフルメイクをした状態（48 枚）とメイクをしていない状態（48枚）の２条件である。メイクは各々の参加者に行ってもらった。撮影終了後、各々の顔写真は画像編集ソフト（Adobe
Photoshop CS 5 . 1）で色調・コントラストを補正した後、グラフィックソフト（Adobe Illustrator CS 5 . 1）で顔の輪− 180 −

女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔の部分的化粧の影響について－機能的磁気共鳴画像法を用いた検討－

郭に合わせて切り抜き、黒の背景の中心にその顔写真を配置した（図１）。また、それぞれのノーメイク画像を 20 ×
20 ピクセルに切り分けた後、配置をランダマイズし、輝度・
コントラスト情報が全く同一のスクランブル刺激を作成した。このスクランブル刺激も、顔写真と同様に黒の背景の中心に配置した（図１）。すなわち、本研究の実験条件は、フルメイク画像条件（full make-up: FM）、ノーメイク画像条件（no make-up: NM）、スクランブル画像条件（scrambled: SC）
で あ っ た。fMRI 撮 像 時 に は、48 枚 の フ ル メ イ ク 画 像（FM 1 - 48）、48 枚 のノーメイク画像（NM 1 - 48）、48 枚 のスクランブル画像（SC 1 - 48）の、計 144 枚の刺激を使用した。
実験刺激は、List A と List B の２種類の呈示リストに基づいて呈示した。List A は FM 1 - 24、NM 25 - 48、SC 25 - 48の 72 枚 か ら 構 成 さ れ た。List B は FM 25 - 48、NM 1 - 24、
SC 1 - 24 の 72 枚から構成された。それぞれのリストにおいて、刺激呈示順序は完全にランダム化された。被験者の半数は最初の fMRI run で list A、１回目の fMRI run で list
B が呈示され、残り半数の被験者では最初の fMRI run で
list B、２回目の fMRI run で list A が呈示された。この手順により、被験者間でカウンターバランスを行った。
2.1.3

図１ 実験１における実験刺激、及び課題説明図
実験刺激として、48 枚のフルメイク画像、48 枚のノーメイク
画像、ノーメイク画像と同一の輝度・コントラスト情報を持つ
48 枚のスクランブル画像の 3 種類を使用した。
fMRI 撮像中、被験者にはこれらの画像をランダムに 2.5 秒間呈示した。被験者は、フルメイク画像とノーメイク画像に対してはボタン押しによる６段階の魅力度の評価を行い、スクラン
ブル画像に対しては、小指を使った単純なボタン押しを行った。

実験手続き

fMRI 撮 像 は、 １run あ た り 約 11 分 間 の ス キ ャ ン を ２

交 連 を 結 ぶ 直 線 か ら 30 º傾 け て 行 っ た 7）。 構 造 画 像 は、

runs 実施した。刺激呈示と被験者の行動データ取得の記

magnetization prepared rapid acquisition gradient echo

録 は Windows XP 上 で 動 作 す る 刺 激 呈 示 ソ フ ト で あ る（MP-RAGE）法で撮像し、各パラメータは TR= 1900 ms、Presentation（Neurobehavioral Systems, Albany, CA）を

TE= 2 . 99 ms、flip angle= 9 º、matrix size= 256 × 256、用いて行った。fMRI 撮像中、被験者にはプロジェクター

field of view= 256 mm、slice number= 176、slice

からの刺激が鏡を介して呈示された。刺激呈示時間は 2 . 5

thickness= １mm であった。撮像中は、頭部の動きを最小秒であり、各刺激間には固視点を呈示した（図１）。固視限に抑えるためクッションによって頭を固定した。脳機能点の呈示時間については５秒、7 . 5 秒、10 秒を 3：2：1 の画像の各２runs の撮像の最初の４枚（10 秒分）は縦磁化が割合で振り分けた。刺激が呈示された際に、被験者は呈示定常状態でない可能性があるため、解析から除外した。

された顔刺激の魅力度（1：非常に魅力的ではない～６：

本実験におけるデータ解析には、Matlab 7 . 11 . 0（R 2010 b）

非常に魅力的だ）について、左右の手に持ったボタンを押（MathWorks, Natic, MA, USA）ソフトウェア上で実行さすことにより６段階で評定するよう教示された。また、ス

れる SPM 8（Statistical Parametric Mapping 8 ; Wellcome

クランブル画像に対しては、魅力度の評定に使用しない左Department of Imaging Neuroscience, London, UK）を使

右どちらかの小指のボタンを押すように教示された。この用した。まず、機能画像と構造画像の初期位置のずれを補

ボタン押しについても被験者間でカウンターバランスを行正した（Reorientation）。その後、頭部の動きの影響を除外すった。なお、被験者は fMRI 撮像前に、刺激に対するボタるために、動きの検出とその補正を行った（Realignment）。

ン押しについて説明を受け、事前練習を行った。

次に、機能画像のスライス間の撮像時刻のずれを補正した

2.1.4（Slice timing correction）。続いて、同一被験者の動き補

データ取得・解析

脳画像の取得には、静磁場強度 3 . 0 テスラーの MRI スキ

正後の機能画像と構造画像の頭部の位置合わせを行いャナー（MAGNETOM Verio, Siemens, Germany）を使用（Coregistration）、構造画像の灰白質 / 白質 / 脳脊髄液の分した。機能画像は、
T2 ＊ - weighted echo planar imaging（EPI）

離手続きを行った（Segmentation）。各被験者の機能画像デ法で撮像し、各パラメータはrepetition time（TR）=2500ms、ータを標準座標系に変換するため、まず Segmentation がな

echo time（TE）=30ms、flip angle = 90º、matrix size = 80

された構造画像の灰白質の Montreal Neurological Institute× 80、field of view = 240 mm、slice number = 43、slice（MNI）template へ の 解 剖 学 的 標 準 化（re-sampled voxel

thickness= 3 mm、interslice gap = 0 . 5 mm であった。また、

size=３ mm×３mm×３mm）を行い（Spatial Normalization）、

脳底部付近の信号減少を改善するため、撮像は前交連と後この際の変換パラメータを用いて各被験者の全機能画像− 181 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

データの標準化を行った。その後、半値幅（FWHM）８

runs 実施した。刺激呈示と被験者の行動データ取得の記

mm の３次元ガウシアンフィルターを用いて、空間的に標録 は Windows XP 上 で 動 作 す る 刺 激 呈 示 ソ フ ト で あ る

準化された機能画像を平滑化した（Spatial Smoothing）。

Presentation（Neurobehavioral Systems, Albany, CA）を

機能画像の統計解析は、FM 条件、NM 条件、SC 条件の３用いて行った。fMRI 撮像中、被験者にはプロジェクター

条件について行った。課題間の BOLD 信号の解析におけからの刺激が鏡を介して呈示された。刺激呈示時間は 2 . 5

る有意水準は、多重比較補正を行わない p< 0 . 001 とし、ク秒であり、各刺激間には固視点を呈示した。固視点の呈示

ラスターサイズで５ボクセル以上の領域を有意な賦活領域

時間については５秒、7 . 5 秒、10 秒を 3：2：1 の割合で振として同定した。

り分けた。刺激が呈示された際に、被験者は呈示された顔
刺激の魅力度（1：非常に魅力的ではない～ 6：非常に魅力

2.2

実験２

2.2.1

的だ）について、左右の手に持ったボタンを押すことによ

被験者

り６段階で評定するよう教示された。また、スクランブル

被 験 者 は、 精 神 疾 患 お よ び 神 経 疾 患 の 既 往 が な く、

画像に対しては、魅力度の評定に使用しない左右どちらか

Edinburgh 利き手検査 6）の結果、右利きであると確認されの小指のボタンを押すように教示された。このボタン押した健常被験者 30 名（男性 15 名・女性 15 名、平均年齢 20 . 9 歳、についても被験者間でカウンターバランスを行った。なお、

年齢範囲 20−25 歳）であった。全被験者に対し、ヘルシン

被験者は fMRI 撮像前に、刺激に対するボタン押しについキ宣言に基づいた本研究の主旨・内容・実験の安全性およて説明を受け、事前練習を行った。

び被験者の権利に関する説明を行い、書面による参加の同2.2.4

意を得た。本研究は東北福祉大学感性福祉研究所倫理委員

データ取得・解析

脳画像の取得とデータ解析は、基本的に実験１と同様の会の承認を得て実施した。

方法で行った。機能画像の統計解析は、No 条件、Foun 条

2.2.2

件、Lip 条件、Eye 条件、Full 条件の５条件について行った。

刺激

実験１で使用された顔写真の人物に対し、部分化粧（ノ課題間の BOLD 信号の解析における有意水準は、多重比

ーメイク、ファンデーションメイク、リップメイク、アイ較補正を行わない p< 0 . 001 とし、クラスターサイズで 5 ボ

メイク、フルメイクの５条件）を施した場合の顔について

クセル以上の領域を有意な賦活領域として同定した。

撮影を行った。顔写真の撮影は顔が正面を向いた状態で、３．結

DMC-FX 7 を使用し行った。また、撮影時にはフラッシュを使用し、解像度は 1920 × 1080 とした。参加者には表情

3 .1

が情動的にならないよう教示した。メイクは各々の参加者

3.1.1

果

実験１の結果
行動データに行ってもらった。撮影終了後、各々の顔写真は画像編集

fMRI 撮像中に得られた反応時間と顔の魅力度の評定値

ソフト（Adobe Photoshop CS 5 . 1）で色調・コントラストのデータを図２に示す。反応時間において、FM 条件とを補正した後、グラフィックソフト（Adobe Illustrator

NM条件の各平均値とSDは、FM条件で 1711 ms（SD= 488）、

CS 5 . 1）で顔の輪郭に合わせて切り抜き、黒の背景の中心

NM 条件で 1704 ms（SD= 508）であった。次に、これら２にその顔写真を配置した。また、それぞれのノーメイク画

条件間で t 検定を行ったが有意差は認められなかった（t像を 20 × 20 ピクセルに切り分けた後、配置をランダマイ（54）= 0 . 05 , p= 0 . 72）。

ズし、輝度・コントラスト情報が全く同一のスクランブル

顔の魅力度の評定値において、FM 条件と NM 条件の各刺激を作成した。このスクランブル刺激も、顔写真と同様

平均値と SD は、FM 条件で 3 . 6（SD= 0 . 5）
、NM 条件で 3 . 0に黒の背景の中心に配置した。すなわち、本研究の実験条（SD= 0 . 4）であった。次に、これら２条件間で t 検定を行っ件は、ノーメイク画像条件（no make-up: No）、ファンデ

た。その結果、NM 条件に比べ、FM 条件では評定値が有ーションメイク画像条件（foundation make-up: Foun）、リ

意に高いことが明らかになった（t（54）= 4 . 72 , p< 0 . 01）。

ップメイク画像条件（lip make-up; Lip）
、アイメイク画像

3.1.2

脳機能画像データ

条 件（eye make-up: Eye）
、 フ ル メ イ ク 画 像 条 件（fullスクランブル画像を見ている場合と比べ、ノーメイク顔

make-up; Full）、スクランブル画像条件（scrambled: SC）

画像を見ている場合に、中脳、両側紡錘状回、両側側坐核の６条件であった。fMRI 撮像時には、各条件 36 枚、計の有意な賦活が認められた（図３）。ノーメイク顔画像を216 枚の刺激を使用した。実験刺激は、被験者ごとに事前見ている場合と比較して、フルメイク顔画像を見ている場に作成された刺激呈示順序リストに基づいて呈示した。リ合に、左眼窩前頭皮質、右海馬の有意な賦活が認められたスト作成においては、同じ顔が連続しないように留意した。 （図４）。
2.2.3

実験手続き

fMRI 撮 像 は、 １run あ た り 約 11 分 間 の ス キ ャ ン を ３− 182 −

女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔の部分的化粧の影響について－機能的磁気共鳴画像法を用いた検討－

図２ 実験１における行動データの結果
左のグラフは各条件の反応時間の平均値を、右のグラフは各条
件の魅力度評定値の平均値を示す。エラーバーは誤差範囲（標準誤差）を示す。
FM, フルメイク画像条件；NM, ノーメイク画像条件；SC, ス
クランブル画像条件 .

図３ 実験１において、顔を見ている際に有意な賦活が認められた脳領域
スクランブル画像を見ている場合と比較して、ノーメイク画像を見ている場合に、両側の紡錘状回、両側の側坐核、中脳の有意な賦活が認められた。

図４ 実験１において、フルメイク顔画像を見ている際に有意な賦活が認められた脳領域
化粧をしていない場合と比較して、化粧をしている場合に、左眼窩前頭皮質、
右海馬の有意な賦活が認められた。

− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3.2

実験２の結果3.2.1に高いことが明らかとなった（p< 0 . 001）
。Foun 条件に比行動データ

べ Eye 条件、Full 条件それぞれで評定値が有意に高いこと

fMRI 撮像中に得られた反応時間と顔の魅力度の評定値が明らかとなった（p< 0 . 01）。また Lip 条件に比べ Eye 条
件で評定値が有意に高く（p< 0 . 001）
、Full 条件でも評定値のデータは図５に示す。
反応時間において、No 条件、Foun 条件、Lip 条件、Eyeが有意に高いことが明らかとなった（p< 0 . 01）。しかし、

条 件、Full 条 件 の 各 平 均 値 と SD は、No 条 件 で 1606 ms

Foun 条件と Lip 条件の間、Eye 条件と Full 条件の間には（SD= 265）、Foun 条 件 で 1620 ms（SD= 264）
、Lip 条 件 で有意差は認められなかった（p= 0 . 33 , p= 0 . 48）。

1643 ms（SD= 286）
、Eye 条 件 で 1681 ms（SD= 290）
、Full

3.2.2

脳機能画像データ

条件で 1674 ms（SD= 387）であった。次に、これらの条件

目の化粧が施されていない顔を見ている場合に比べ、目間で一元配置分散分析を行った。Greenhouse-Geisser の自の化粧が施された顔を見ている場合に、左海馬の有意な賦由度の補正を行った結果、F（2 . 99 , 86 . 7）= 6 . 47 , p< 0 . 001

活が認められた（図６）。逆に、目の化粧が施された場合

で、反応時間に有意差が認められた。多重比較を行った結に比べ、口の化粧が施された顔を見ている場合には有意に果、No 条件、Foun 条件それぞれに比べ Eye 条件では反応賦活する脳領域は認められなかった。また、口の化粧が施時間が有意に遅く、Foun 条件に比べ Full 条件で反応時間された顔と、口の化粧が施されていない顔を見ている場合が有意に遅いことが明らかとなった（p< 0 . 05）。

の脳活動の比較を行った結果、有意な賦活は認められなか

顔の魅力度の評定値において、各条件の平均値と SD は、った。

No 条件で 2 . 5（SD= 0 . 5）
、Foun 条件で 2 . 9（SD= 0 . 3）
、Lip

４．考

条 件 で 3 . 0（SD= 0 . 3）
、Eye 条 件 で 3 . 2（SD= 0 . 3）
、Full 条察件で 3 . 1（SD= 0 . 6）であった。次にこれらの条件間で一元

実験１では、化粧をしている他者の顔と化粧を全くして

配置分散分析を行った。Greenhouse-Geisser の自由度の修いない他者の顔を見ている際の魅力度についての評定値と正を行った結果、F（2 . 88 , 83 . 5）= 52 . 3 , p< 0 . 001 で、顔の脳活動を比較して、その化粧がもたらす魅力度の変化につ魅力度の評定値に有意差が認められた。多重比較を行った

いて検討を行った。行動データの結果から、化粧をしてい結果、No 条件に比べ、その他全ての条件で評定値が有意る顔は化粧を全くしていない顔に比べ、魅力度が有意に高

図５ 実験２における行動データの結果
左のグラフは各条件の反応時間の平均値を、右のグラフは各条件の魅力度評定値の平均値を示す。エラーバー
は標準誤差を示す。
No, ノーメイク画像条件；Foun, ファンデーションメイク画像条件；Lip, リップメイク画像条件；Eye, アイ
メイク画像条件；Full, フルメイク画像条件 .

図６ 実験２において、目の化粧が施された顔を見ている際に有意な賦活が認められた脳領域
目の化粧を施していない場合と比較して、目の化粧をしている場合に、左海馬の有意な賦活が認められた。

− 184 −

女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔の部分的化粧の影響について－機能的磁気共鳴画像法を用いた検討－

く評定されることが明らかとなった。この結果は先行研究の部分的化粧の影響について、磁気共鳴画像法を用いた検とも一致しており、化粧がそれを施した人物の顔の魅力度討を行った。化粧をしている他者の顔と化粧を全くしていを高めるという過去の知見を支持するものである。

ない他者の顔とを比較して、その魅力度に変化があるかど

脳機能画像データの結果から、スクランブル画像を見てうかを行動データと脳機能画像データから検討を行った結いる場合と比べ、ノーメイク顔画像を見ている場合に、中果、過去の心理実験と同様に、化粧が顔の魅力度を高める

脳、両側紡錘状回、両側側坐核の有意な賦活が認められた。

ことが明らかとなった。脳機能画像データの結果から、化

過去の fMRI 実験では、顔を認知することに右の紡錘状回粧による魅力度の上昇に海馬と眼窩前頭皮質が関わってい8）が関わっていることが明らかにされており 、本研究におることが明らかとなった。更に、部分的な化粧が魅力度にいて認められた紡錘状回の賦活は、先行研究の結果を支持与える影響を検討した結果、口の化粧に比べて、目の化粧するものであると考えられる。また、紡錘状回に加えて中が特に魅力度の上昇に重要であることが示唆された。脳機脳と側坐核の活動も見られた。この二つの領域は「報酬系」

能画像データから、目の化粧が施されていない場合に比べ、と呼ばれるシステムの中核的な部位であることから、顔を目の化粧が施されている場合に海馬の有意な賦活が認めら見ること自体がヒトにとっての報酬となっている可能性をれた。これらの結果は、化粧により魅力度の上昇した顔が示唆するものであると考えられる。

脳内で報酬として処理されていることと魅力度の上昇がそ

また、ノーメイク顔画像を見ている場合と比較して、フの顔の記憶を高めることを示唆している。

ルメイク顔画像を見ている場合に、左眼窩前頭皮質と右海馬の有意な賦活が認められた。化粧をしている顔は化粧を（引用文献）

全くしていない顔に比べ、魅力度が有意に高く評定された

１）Mulhern, R., Fieldman, G., Hussey, T., Leveque, J.L. &ことを考慮に入れると、フルメイク画像を見ている場合にPineau, P. Do cosmetics enhance female Caucasian facial

認められた眼窩前頭皮質の賦活は、顔の魅力度判断に関わattractiveness? Int J Cosmet Sci 25 , 199 - 205 ( 2003 ).

っている可能性が高い。この眼窩前頭皮質の賦活は顔の魅２）Nash, R., Fieldman, G., Hussey, T., Leveque, J.L.

力度判断に関わる神経基盤を検討した過去の研究結果と矛& Pineau, P. Cosmetics: They influence more than

盾しないものであった。海馬は記憶に重要な役割を果たし

Caucasian female facial attractiveness. J Appl Soc Psycholている領域であることから 9）、化粧により魅力度が上昇し

36 , 493 - 504 ( 2006 ).

たことにより、化粧をしていない顔を見た時に比べ記銘が３）Ishai, A. Sex, beauty and the orbitofrontal cortex. Int J
Psychophysiol 63 , 181 - 185 ( 2007 ).

強く行われた可能性が想定される。
実験２では、ノーメイク画像、ファンデーションメイク

４）Lebreton, M., Jorge, S., Michel, V., Thirion, B. &画像、リップメイク画像、アイメイク画像、フルメイク画

Pessiglione, M. An automatic valuation system in the

像を用いて、部分的な化粧が脳内でどのように処理されて

human brain: evidence from functional neuroimaging.

いるか検討した。行動データの結果からフルメイク条件とNeuron 64 , 431 - 439 ( 2009 ).

アイメイク条件で最も魅力度が高まることが明らかとなっ

５）O'Doherty, J., et al. Beauty in a smile: the role ofた。また、ファンデーション条件とリップメイク条件では、

medial orbitofrontal cortex in facial attractiveness.

ノーメイク条件よりも有意に魅力度が高まることが明らか

Neuropsychologia 41 , 147 - 155 ( 2003 ).

となった。しかしながら、フルメイク条件、アイメイク条

６）Oldfield, R.C. The assessment and analysis of

件に比べると魅力度は有意に低いことが明らかとなった。

handedness: the Edinburgh inventory. Neuropsychologia

これらの結果は過去の心理学研究を支持するものであると

9 , 97 - 113 ( 1971 ).
７）Deichmann, R., Gottfried, J.A., Hutton, C. & Turner,

考えられる。
脳機能画像データの結果から、目の化粧が施されていない場合に比して、目の化粧が施されている場合に、海馬のR. Optimized EPI for fMRI studies of the orbitofrontal
cortex. NeuroImage 19 , 430 - 441 ( 2003 ).

有意な賦活が認められた。また、口の化粧の有無に対して、

８）Kanwisher, N., McDermott, J. & Chun, M.M. The

海馬の活動の変化は有意ではなかった。これらのことから、

fusiform face area: a module in human extrastriate cortex

目の化粧が特に魅力度の上昇にとって重要であると考えら

specialized for face perception. J Neurosci 17 , 4302 - 4311

れ、目の化粧により魅力度が上昇することで、その顔の記( 1997 ).
９）Tsukiura, T. & Cabeza, R. Remembering beauty: roles

憶も高まっている可能性が想定される。

５．総of orbitofrontal and hippocampal regions in successful

括memory encoding of attractive faces. NeuroImage 54 ,本研究では、女性の化粧顔の認知に関わる神経機構と顔653 - 660 ( 2011 ).

− 185 −

●第 24 回表彰・贈呈式記念講演
●

天谷

雅行

第24回表彰・贈呈式

記念講演（日本薬学会長井記念ホール・平成25年11月28日）

角層を科学する
慶應義塾大学医学部皮膚科 教授

天谷雅行

あまがい・まさゆき
慶應義塾大学大学院医学部研究科博士課程修了後、米国国立衛生研究所（NIH）に留学、愛媛大学医学部皮膚科助手、慶應義塾大学医学部皮膚科専任講師を経て、2005年に同大学皮膚科教授に就任。
2007年10月から2013年の9月まで同大学病院副院長、同年 4月から理化学研究所・総合生命医科学研究センターチームリーダー（非常勤）、10月から慶應義塾大学医学部学部長補佐を兼任。
・専門分野：自己免疫性皮膚疾患（特に天疱瘡を中心とした基礎及び臨床研究）、アレルギー性疾患（特にアトピー性皮膚炎の基礎及び臨床研究）
・その他：日本学術振興会賞、日本免疫学会賞、ベルツ賞ほか数多くの賞を受賞

大変ご丁寧な、また、過分なご紹介ありがとうございまが、もう少し病態がわかってくると、それぞれの項目に上す。また、このような講演の機会を与えていただきました

下関係があり、どれが上流でどれが下流の出来事か明らか

コスメトロジー研究振興財団の皆様に心から感謝いたしまになってくるはずです。でも、わからないときには、こうす。そして、きょう研究助成を受賞なさった皆さん、ほんやって私たち医師は羅列的に理解をし、それぞれに対する

とうにおめでとうございます。私自身も数年前、この賞を対策を立て、治療として提供するわけです。

いただき、研究活動に使わせていただき、大変たすかりました。

私自身、皮膚科医になって30年近く経ちましたが、アト
ピー性皮膚炎というのは難しい疾患だなとずっと思っていきょうは角層という話をしたいと思います。今までは、ました。ところが、2006年、ダンディー大学のマックリー

この角層というのは、どちらかというと皮膚の「あか」とン博士らが大きな発見をしました。私は、この発表を米国かの認識しかなく邪魔もの扱いでした。免疫学の世界です

研究皮膚科学会という学会の会場で、千人以上の聴講者のと、最初に抗原を感作するときに、皮膚に塗ってもなかな

１人として聞いておりました。その発表の内容は、アトピか免疫がつかないので、角層のバリアを越えるために針でー性皮膚炎の患者さんの多くに、フィラグリンという蛋白角層を物理的にぶち抜いて、角層の下に抗原を投与し感作の遺伝子に変異があるという発表でした。

させ、そこから免疫の実験が始まっていました。ところが、遺伝子解析は数多く行われていて、アトピー性皮膚炎はこの角層が今非常に熱く、おもしろいという話を今日はし炎症で、免疫が関与する疾患ですから、当然その原因としたいと思います。

て、免疫に関与する因子、分子が原因としてかかわってく

私は、皮膚科医です。11月12日、皮膚の日というのを、るのではないかということは想像していました。そして、

日本臨床皮膚科医会と日本皮膚科学会が合同で、全国でさ幾つか実際に免疫の関与する分子が発症に関与しているこ

まざまな企画を行っています。それと同時に毎年このようとがわかってきています。ところが、この発見は、アトピなポスターをつくっています。
「いい皮膚」のイメージとー性皮膚炎発症における一番大きな危険因子の１つが、免して、ここ数年、ずっと赤ちゃんの写真が使われています。

疫に関与する分子ではなく、皮膚の構造を決める因子であ

やはり赤ちゃんの皮膚というのはみずみずしく、美しく、るという点です。フィラグリンというのは角層の主要な蛋

健康的で、すばらしいと思います。

白です。つまり、アトピー性皮膚炎の発症には、炎症、免でも、この皮膚を標的としてさまざまな疾患が起こりま疫に直接関与する分子よりも、皮膚の構造の異常が重要です。その１つが本日話題にするアトピー性皮膚炎です。いあることを示しており、今までの考え方を大きく変えてしろんな統計がありますが、現在では、５人に１人はアトピ

まいました。その話を聞いて私は鳥肌が立ちました。そしー性皮膚炎、あるいは、鼻炎、食物アレルギー、喘息を含て、皮膚の構造からアトピー性皮膚炎を攻めれば、自分たむアトピー性疾患にかかると言われており、社会的な問題

ちも何かできるのではないかと感じた瞬間でもありました。

でもあります。非常に健康である皮膚が、炎症を起こしてその時発表された内容が2006年の『Nature Genetics』

しまうと、本来の皮膚の機能を損なうばかりではなく、外という一流誌に掲載されていますが、「News and Views」

観もかなり損なうものになります。

の項目にも取り上げられています。健常な人の場合は角層アトピー性皮膚炎は私たち皮膚科医にとっても大きな課

がバリア機能を果たしており、外来抗原はなかなか体の中題でした。そのアトピー性皮膚炎に関して教科書をひもとに入ってきません。ところが、フィラグリンがなくなると、いてみると、いろいろな病態・成因が複雑に絡み合うこと

角層のバリア機能が傷害され、外来抗原が容易に体の中にが記載されています。その１つ１つの項目は正しいのです

入って来てしまいます。体の中に入ってきた外来抗原とい− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

うのは当然異物ですから免疫系は排除しようと反応します。

正常なマウスでは、この角層の一番外側にとどまっていて、

そして、外来抗原に対する免疫反応が慢性的に起こること

角層内に入っていきませんが、フィラグリンがない角層でによってアレルギー状態になるのではないかと考えられる

は、角層内にどんどんしみ込んでいってしまうのがわかりようになりました。

ました。

今さまざまなアレルギー疾患において抗原が感作する、

TOF-SIMS（time-of-flight secondary ion mass

最初に免疫系が出会う場所は皮膚であるということが注目

spectrometry）という特殊な方法で、角層をさらに詳細にされています。アトピー性皮膚炎だけではなく、アレルギ

観察してみると、角層は機能的に３層に分かれていること

ー性鼻炎、喘息、食物アレルギー、アナフィラキシーなどもわかりました。カリウムイオンと天然保湿因子（NMF）の疾患においても、最初に抗原と免疫が出会うのは皮膚でのひとつであるアルギニンに分布を指標に角層を観察するあり、アレルギー性疾患発症における経皮感作の重要性がと、外側から、カリウムが高くアルギニンがない層、カリ考えられています。一度経皮感作が成立してしまうと、抗ウムがなくてアルギニンが高い層、カリウムもアルギニン

原に消化管で曝露されると食物アレルギーになり、肺で曝もない層の３層があることが示されました。一番外側のカ

露されると喘息になるという考え方です。

リウムが高くアルギニンがない層は、いろんなものが入っ

皮膚は表皮と真皮に分かれます。真皮には、血管、リンてきては出ていくという、スポンジの様な役割をしていま

パ管、神経、付属器などがあります。表皮には、内側からす。２番目の層、３番目の層はバリアとしての異なった機

外側に向かって４層に分かれます。基底層は、表皮細胞が能があることがわかりました。例えば皆さんが長いことお分裂するところです。分裂した表皮細胞が外側に向かって風呂に入ったりすると角層がふやけますが、保湿因子を含分化し、有棘層になります。さらに分化すると、細胞内にんでいる２層目がふやけ、３層目は変化がないことがわか顆粒が目立ってくる顆粒層となります。そして、表皮細胞っています。新しい方法で角層を見てみると、角層は上・中・は自分の核を壊し、細胞死を起こして、細胞体を角層の骨下と、少なくとも３つに分かれ、異なった機能を持ってい格として与えます。この角層は、実に正確に制御されていることがわかりました。

て、人間の場合、12から15層の厚さが保たれています。そ

さて、表皮バリアのひとつとして角層バリアを見てきまして、最上層の15層目になると自然にハラリと剥がれていしたが、次に２つ目のバリアであるタイトジャンクション、

きます。これがどのような機序で、15層目ではがれていく

３つ目のバリアである免疫バリアを見ていきましょう。免のか、いまだにわかっていません。

疫バリアとしては、外来抗原を表皮内で捕捉することが知フィラグリンの話に戻ります。フィラグリンは、顆粒層られているランゲルハンス細胞に注目します。

でフィラグリンユニットが10−12個つながった形のプロフ

タイトジャンクションは主に腸管上皮でその役割が明らィラグリンとして産生されます。角層に移ると１つ１つのかになっています。腸管上皮は単層上皮です。腸管の管腔ユニットが切られ、ケラチンによる細胞骨格のネットワー

内と生体側の間を仕切っているのがタイトジャンクション

クに結合し、その骨格構造を強固なものにします。さらにです。タイトジャンクションは表皮に存在するのでしょう

シトルリン化などの修飾を受けた後、さらに分解されて天か。つい最近の2002年まで、タイトジャンクションは表皮

然保湿因子（NMF）になります。

にはないとか、あっても不完全なものしかできていないと

このフィラグリンの機能を個体レベルで解析するための言われていました。それはなぜでしょうか。私たちは、主有力な手段として、ノックアウトマウスをつくるという方に皮膚の観察を垂直に切った切片で行っています。垂直に法があります。これは、マウスのフィラグリン遺伝子を翻切った切片でタイトジャンクションの分子を染めると、点訳できないように操作することにより、フィラグリン蛋白状にしか見えません。でも、実は、この当たり前の垂直切が全くできない個体を作出することができます。フィラグ

片でいろんなものを検討するという方法論に問題がありま

リン蛋白が完全に欠失した状態で、どのような影響がマウした。

ス個体に出るかということを観察することによって、フィ

その問題を解消するために、皮膚組織を切片にしてから抗体で染色するのではなく、切片にする前の皮膚組織を塊

ラグリンの機能を類推することができるわけです。
フィラグリンを欠損したフィラグリンノックアウトマウの状態で染色して、三次元的に、立体的にタイトジャンクスの角層は、外観上かさかさしており、乾燥皮膚状態を呈

ションを染色して、観察してみました。すると、表皮のタしていました。ヒトでもそうですが、フィラグリンがない

イトジャンクションは顆粒層の２層目に編み目状に形成さとどうやら角層がかさかさするようです。そして、かさかれていることがわかりました。

さした角層では、外来抗原の角層の透過性が更新している

ランゲルハンス細胞は、外から来た抗原を捕捉して、リことがわかりました。外来抗原の１つの例として、今緑にンパ節に遊走して免疫を惹起する機能を持つ抗原提示細胞

光る色素を含んだリポゾームを角層に外から塗ってみると、です。表皮を三次元染色してタイトジャンクションとラン− 190 −

第 24 回表彰・贈呈式記念講演 「角層を科学する」

ゲルハンス細胞を一緒に見てみると、休止期のランゲルハ

しています。哺乳動物の定義でもあります。それ以外に、ンス細胞は、樹状突起を上方に向かって出していますが、毛の役割はあるのでしょうか。

その樹状の先端は決してタイトジャンクションを越えるこ

ランゲルハンス細胞が表皮の中に存在しますが、どこかとはありません。これがこれまで思われていたランゲルハ

ら表皮の中に入ってくるのか、基本的なことがわかっていンス細胞とタイトジャンクションの位置関係です。しかし、ませんでした。私たちの教室の永尾圭介さんが、ある方法活性化したランゲルハンス細胞は、樹状突起を上方に伸ばでランゲルハンス細胞が表皮の中に全くいない状態を作っして、タイトジャンクションを越えて、角層のすぐ下までて、新しいランゲルハンス細胞がどうやって表皮の中に入その突起を伸ばしていることが明らかになりました。バリ

るのかを研究していました。そして、ランゲルハンス細胞

アが壊れて、壊れた後にランゲルハンス細胞は抗原を捕捉

は表皮の中で、コロニーを形成して増えていくのですが、するのではなく、タイトジャンクションの外側に、角層のコロニーがあるところに必ず毛があることに気付きました。

すぐ下まで樹状突起を伸ばして、外来抗原を捕捉している毛とランゲルハンス細胞、あるいはその前駆細胞に何か関ことがわかりました。

係があるかもしれないと考えたわけです。そこで、テープ

このランゲルハンス細胞が樹状突起を伸ばすときにタイストリップにより表皮に物理的ストレスを与えた後に、皮トジャンクションを無理やりこじあけて、タイトジャンク

膚の中でどのような変化が起こるのかを観察しました。そションを壊していくのでしょうか。それともこの樹状突起の際に、生きた生物で様々な細胞の動きや機能をリアルタと角化細胞の間にタイトジャンクションをつくっていくのイムに観察することができるintravital imaging法を用いでしょうか。

ました。すると、テープストリップした30分から4.5時間

普通、タイトジャンクションというのは２つの細胞の間の間に、白血球が毛の回りに集まってくるという現象を見でできます。ところが、必ず３つの細胞が集まったところ

いだしました。私たちは、この映像を見たとき、最初ほんというのが表皮細胞の中にあります。この部分が実はタイ

とうに驚きました。

トジャンクションの機能上一番弱い部分であって、この弱何故、毛の回りに白血球が集まるのでしょうか。毛からい部分を補強するためにトリセルリンという特別な蛋白が何かシグナルが出ているに違いないと考え、ケモカインを出ます。角化細胞の３つが集まったところでは、トリセル

抗体で染色して見ると、CCL8というケモカインは、テーリンが出ています。ランゲルハンス細胞が樹状突起を伸ばプストリップした後、毛根で発現が上昇していることが確してくると、必ず表皮細胞との間に３つの細胞が集まった

認されました。ひっかくという簡単な物理的刺激により、

トリセルラージャンクションができます。すると、そのト毛根からケモカインが出て、白血球を遊走させるというこ

リセルラージャンクションにトリセルリンが発現されていとがわかりました。毛のもうひとつの新しい役割として、るのです。この結果により、ランゲルハンス細胞は、タイ

外的刺激に対する免疫センサーがあることが初めてわかり

トジャンクションを壊すのではなくて、タイトジャンクシました。

ョンを保って、外側に樹状突起を伸ばしていることが明ら

ここで少し切り口を変えます。アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患は、最近先進国で増えています。

かになりました。
ランゲルハンス細胞の樹状突起の先端にはランゲリンと角層機能から何か説明できることがありますでしょうか。

かデクチン１などの細菌、真菌細胞のリセプターが高い濃大手町の気温と湿度を1870年から測定した記録がありま

度で発現しています。さらに、蛍光物質を外来抗原としてすが、高層ビルが建設され都市型になっていくと、外気温角層に塗ったあとを詳細に観察してみると、ランゲルハン

が、100年間で２℃上昇し、外気の湿度は15％以上下がっ

ス細胞の樹状の中に取り込まれて細胞の中心のほうに輸送ていることがわかります。私たちは建物の中で主に生活ししているであろう像をとることもできました。

ていますが、エアコンの使用により内気の湿度はさらに下角層とタイトジャンクションとランゲルハンス細胞の３がります。先進国になると、私たちはかなり低湿度の状態

つの関係は実に秩序立って構成されていることがわかりまで生活していることになります。それからもう一つ、入浴した。ランゲルハンス細胞は、活性化すると、タイトジャの習慣の違いです。イギリスのデータですが、石けんの販

ンクションを抜けて樹状突起の先端を角層のすぐ下まで出売量は1964年から2004年で５倍以上になっています。毎日して抗原を捕捉することが明らかにされました。経皮感作

シャンプーしたり、毎日体を洗ったり、昔の人に比べるとの起こりやすさ、起こりにくさは、角層の性状で決まって相当きれい好きです。１人当たりの水の使用量も５倍以上いると言うことになります。

です。入浴を頻回にする習慣、石けんで角層の脂質を洗いさて、最後にもう一つ話題を提供します。それは、皮膚出してしまう習慣、そういうものが角層にとってはかなりの付属器で最も重要なものの1つの毛です。毛は、何であ

厳しい環境になっているといえます。角層バリア機能を減るんでしょうか。もちろん物理的なバリアとしての役割は弱させる生活環境の違いが、先進国におけるアトピー性皮− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

膚炎の罹患率の上昇に関係しているのかもしれません。

リアケアによるアトピー性皮膚炎の発症予防法、抑制法を

大学の外来でよくこのような患者さんを見かけます。
「若

社会普及させるために情報を発信すること。そして、そのい頃にアトピー性皮膚炎にかかったことはないのだけれど

病態解明、社会へ情報発信するための人材を育成することも、最近やたらと皮膚がかゆくなるんです。皮膚科に行くです。この寄附講座、まだ始まったばかりですが、これかと、軟膏を渡されて、つけると一時改善するけれども、まらこの３つのミッションをしていくべく精一杯努力したい

たすぐ悪くなる。先生、根本から治してください。」と。

と思います。 角層は化粧品領域の中で最も研究が蓄積さその患者さんは、多くの場合、皮脂欠乏性湿疹です。患者

れている分野ですが、その角層に多くの疾患が関与していさんの発疹の分布を見てすぐに、入浴しているときにタオるということが現在新たにわかって参りました。寄付講座

ルでごしごし洗っていませんかということを聞きます。患の活動を通して、今後新たな展開を起こしていければと考者さんを見ると、腕で言えば、外側に発疹はありますが、

えております。

内側には発疹はありません。つまり、タオルでこする部位

本日の講演のまとめです。角層は外来抗原が体内に入らに一致してかゆい湿疹ができていることになります。そうないように大切なバリアの働きをしています。そしてフィ

いう患者さんには、正しい入浴の方法をお教えします。タ

ラグリンは角層機能に重要な蛋白です。フィラグリン遺伝

オルでこすることは止めていただいています。石けんは全子変異があるとアトピー性皮膚炎になりやすくなります。

身に使う必要はありません。石けんは脇の下と股にだけ使そして、角層を通過してきた外来抗原は、ランゲルハンス

い、それ以外の部位は手で軽く流すだけで十分です。角層細胞によりタイトジャンクションの外側で捕捉され免疫系はこすらなくても、自然にはがれてきます。角層の外側３に提示されます。皮膚をひっかくと、毛包周囲に白血球が分の１はスポンジみたいな役割をしているので、あまり熱

４時間以内に集まってきます。スキンケアにより角層機能

くないお風呂にゆっくり入っているだけで自然に汚れは取を正常に保つことが非常に重要です。スキンケア、バリア

れていきます。もともと備わっている角層の力を使ってあケアがアトピー性皮膚炎の予防、再発防止に重要です。

げてください。入浴後には保湿剤を使うこともお勧めです。

アトピーを減らす、アレルギーを減らすためのスキンケ

部屋が乾燥している時は、加湿器を使用してください。こア、バリアケアの大切さを社会に向かってきちっと情報発

れから空気が乾燥してくる季節になりますので、正しい入信をしていく必要があると思います。角層の質がアレルギ浴をすることによって健康な肌を保っていただければと思ーを決めています。本日いらっしゃる皆さんもぜひご自分います。

の角層を大切にしてあげてください。

今年の10月１日から、私たちの大学に寄附講座が立ち上

最後、共同研究者です。多くの人の助けをかりました。

がりました。コーセースキンケア・アレルギー予防医学講

その中でも特にフィラグリンの機能解析をフィラグリンノ座という寄附講座であります。この講座の目的は、今までックアウトマウスを用いて行っている川崎洋さん、タイト述べてきたことを中心に、このアレルギーというものがス

ジャンクションの三次元可視化、TOF-SIMSによる角層機

キンケア、バリアケアで十分対応できるということがわか

能解析を行った久保亮治さん、そしてランゲルハンス細胞ってまいりました。そして、この寄附講座のミッションはの解析から毛嚢の重要性を見つけ出した永尾圭介さんが大

３つあります。アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギ

きな貢献をしてくれています。

ー性疾患の病態を解明すること。そして、スキンケア、バ

ご清聴まことにありがとうございました。

− 192 −

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

女子学生に人気の化粧品研究秋津貴城

多彩な金属錯体の色や電子状態を可視紫外吸収スペクトなようで、その人気ぶりに驚いた。文部科学省主催サイエルや理論を用いて解析する、一昔前ならば物理学の様な地

ンス・インカレに出場したい卒業研究前の学部学生に、本味で硬派な研究テーマに大学院時代から取り組んできた。

研究テーマの「お試し版」を実験してもらったところ、３

意欲的な学生には理論的なテーマも任せることができたが、人の女子学生はレポートに次の様な緒言を書いてきてくれ

大多数の学生には、複合系の光化学反応を色の変化で追跡た。理想的な化粧品とは、どうやら「魔法の粉」らしい。

する実験的なテーマを与えてきた。しかも「酸化チタンは『昔から日本では白い肌が美の象徴とされ、身分問わず

光触媒で有名」とか「色素増感太陽電池の基礎研究」とか、様々な女性の憧れであった。最初に日本で白粉が使われた

学生にとって分かりやすい動機を与えないと、モチベーシのは飛鳥時代であり、その歴史はたいへん長い。かつては

ョンが上がらない。紫外線を吸収する色材としての新応用「塗る」だけであった白粉だが、現在では化粧下地、乳液、を模索していた頃、本助成研究に採択されて、「酸化チタ

UVケアが含まれた「魅せる」ことを重視した多機能 性のンはおしろいで有名」とか「UV カット化粧品の基礎研究」

化 粧品の開発が進められている。特に海 外で人気がでたとか謳って、学生を良い意味で騙しつつ、報告した成果

Blemish Balm（キズ補修クリーム）、通称 BB クリームは日をあげることができた。この 1 年余は自分自身にとっても、本の女性を虜にしている。そこで古来より使われている白粉

界面化学や色素・顔料等の知識も結果的に増え幅も広がり、に着目し、BBクリームの良いところを生かした魔法の粉を目感謝している。

指し、日本から世界へ発信できるような化粧品開発に繋が「化粧品」というキーワードは、女子学生にとって魅力的る基礎研究を試みる。』（東京理科大学理学部第二部化学科）

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
片岡洋行

人間の感覚には、視覚、聴覚、触覚、味覚、嗅覚など五効率化した高感度分析法が必要である。本研究で開発した感と言われるものがあるが、これらは美しく豊かな人間生

固相マイクロ抽出法は、皮膚ガスや皮膚滲出液中の成分の活の実現を目指すコスメトロジーのキーワードとなってい効率的な抽出・濃縮が可能で、分析装置に直接導入できるる。特に、今回の研究で取り上げた“におい”に関しても、ため、痛みや出血を伴わず非侵襲的かつ簡便なサンプリン

人によっては快適な匂いと感じたり、不快な臭いと感じた

グ・分析が可能で、におい成分やその発生部位を特定する

りする場合があり、日常生活を営む上で、健康や安全性と新しい体臭分析技術として注目されている。また、ガスクも密接な関係がある。また、人の嗅覚は敏感であるが、個ロマトグラフ−質量分析法との連結により皮膚ガスや皮膚人差があり、すぐに慣れてしまい、濃度が上がると順応し

滲出液中の微量体臭成分のスクリーニングや同定、高感度て鈍感になるなどの問題がある。一方、最近は清潔志向の定量が容易に行えます。さらに体臭成分相互の反応による高まりから体臭を気にする体臭恐怖症が増加しており、周複合臭の要因の解析から、香粧品や食品に由来する新たな囲の人が体臭を指摘するのは困難で判断基準も曖昧である

体臭成分あるいは香気成分の発見にも繋がり、デオドラン

ことから、客観的にその成分を識別して正確に定量評価で

ト、スキンケア、ヘアケアなどのコスメトロジー関連分野

きる「体臭分析法」の開発が求められている。しかし、体における新製品開発のための基礎研究にも有効な知見を提表から発生する“におい”を定量的に捕集することは簡単

供できるものと期待されます。今後は、第六感を働かせて、ではなく、またその成分は複雑で極微量であるため、官能新たな発想で心や感覚を客観的に捉える分析技術の開発に的に感知できても分析機器で検出困難な場合が多く、成分取り組んでいきたい。

を分離同定 ･ 定量するためには、サンプリングや前処理を− 195 −

（就実大学薬学部応用分析化学研究室）

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー研究振興財団研究助成に採択されて
黒崎文也「新しいことを始めてみよう、と若い人が思った時に、そ

金面でどのくらい力になってくれたか計り知れない。幸いの思いを後押ししてくれる資金があると本当にうれしいでなことに、一連の研究の結果、植物の情報伝達系にかかわすね。」

る Ca2+ 結合タンパクや単量体 GTP 結合タンパクをコード

渋谷の長井記念館で催されたコスメトロジー研究振興財

した遺伝子を植物の培養細胞に導入することによって、普団研究助成贈呈式での記念講演で、講師の方がおっしゃっ段はマスクされている芳香成分の生成能が発現されるといた言葉である。残念ながら自分は「若い人」ではなかった

う結論が得られた。自分たちの予測に近い成果を上げ、財が、ちょうどその頃、植物細胞の情報伝達系を改変して「普団への謝辞を述べさせていただいた論文を公表することが段は表に出ていない潜在的な有用物質生産能」を引き出しできた。新しい研究室を立ち上げる際に助成を受けることてやることができるのではないかと考え、研究に着手したができた幸運に対しては、「感謝」以外の言葉が思い浮かところだった。幸いにも研究助成課題として採択された旨ばない。

の連絡を財団からいただきうれしく思っていた直後に、思今後も、この研究助成によって何人もの研究者が、それいがけなく新しい研究室を主宰するように命じられ、トウ

ぞれ状況は異なるとしても、自分と同じような感謝の念をの立った新米教授として何人かの部下と学生とを養う使命抱くことであろう。コスメトロジー研究振興財団のご厚志を突然負わされることとなった。自分がこれまでいかに上に心より謝意を表させていただくとともに、ますますのご司に保護されていたかを思い知らされながら毎日を送る中、発展をお祈りする次第である。

コスメトロジー研究振興財団からいただいた助成が研究資（富山大学大学院医学薬学研究部）

平成 23 年度

研究助成

ナノ粒子とコスメトロジー
齊藤結花

プラズモニクスの研究をしているので、金や銀、または肉眼で見るわけにはいかないから、同じような観測を行う

アルミなどの金属ナノ粒子（直径 10−100nm）を暗視野顕ために特別な顕微鏡が必要になる。我々が開発した顕微分微鏡で観察することがある。プラズモニクスは金属内の自光システムは、紫外光を擬似的に“見る”ということに匹

由電子とフォトンの結合を利用していて、この結合効率は敵している。

波数ベクトルの整合が関係しているから、粒子のサイズが最近、化粧品の宣伝の中でナノ粒子という言葉を聞くこ重要になっている。サイズを変化させただけで物性が変わとが多くなった。金属の場合もあれば、有機分子の有効成

るということを不思議に思うかもしれないがこれは真実で、分をカプセル化している場合もある。日頃顕微分光の研究

実際に顕微鏡下にある金や銀のナノ粒子は様々な色がついをしているので、ナノ粒子と聞くとサイズや形状や集合状て見える。人間は目で見ると信用したくなるので、肉眼で態が気になって仕方がない。今回の研究で開発した顕微分見えるということはとても重要なことである。可視光に感光システムを、是非コスメトロジー分野の研究者に利用し度がある場合は普通の顕微鏡で観察できるが、紫外光域はてほしいと考えている。

− 196 −

（大阪大学大学院工学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

乳化剤フリーエマルションとコスメトロジー
酒井俊郎

エマルションは、相反する性質を有する二つの液体（水などに関する研究は盛んに行われている。その結果、乳化と油）を同時に含んでいる液体であることから、エマル剤を使用したエマルションに関する多くの有益な情報がション中には無数の界面が存在し、それにより液滴 / 界面

蓄積されて、現在のエマルション製品の処方へとつながっ/ バルクの３つの領域が形成される。それぞれの領域がそている。一方で、油と水は不仲の代名詞とされ、これまで、

れぞれ固有の性質を有しているため、一つの液体がいくつ

油と水のみでエマルションを調製する試みはほとんど行わ

もの機能、また、それらの相乗的機能を発現する。例えば、れてこなかった。そのため、乳化剤を使用しないエマルシ

エマルションは、水溶性物質と油溶性物質を同時に取り込

ョンの調製に関する研究やエマルション製品の処方につな

むことが可能であり、エマルションの機能・価値が一層多がる事例は極めて少ない。今後の“乳化剤フリーエマルシ

元化する。さらには、油の持つ“潤い感（しっとり）”やョン”に関する系統的な研究の蓄積が、乳化剤フリーエマ

水の持つ“爽快感（さらさら）”などの質感へも効果を与ルション製品の実現やコスメトロジーの発展につながるもえる。このようにエマルションは高機能・高付加価値を有のと考えられる。乳化剤フリーエマルション処方の確立は、する液体であるため、化粧品において重要は基材である。

コスメトロジーの新しい領域となりえるとともに、エマル

エマルション製品の処方において、界面活性剤などの乳ション製品の処方技術に革新的な発展をもたらすものと期化剤の役割は大きい。そのため、新規界面活性剤の合成や待される。今後も、エマルションの本質、油と水の界面のその界面化学的物性、混合系による相構造、可溶化、乳化

本当の姿に迫っていきたい。（信州大学工学部物質工学科）

平成 24 年度

研究助成

何故セルフリサイクル技術が必要か
藤井敏弘

毛髪とそのタンパク質の研究をはじめて 10 年以上が過ケラチンフィルムは紫外線に依存した酸化タンパク質をぎている。この頃から“セルフリサイクル”のコンセプト

高感度に検出できるデバイスであることを 2009 年にプレを提唱しており、「動物や他者を使わず本人由来の生体物ス発表した。今までの毛髪損傷は三次元の髪の毛自体を実質（組織、成分）を用いた加工品の創出と適用」と定義した。

験材料としていたのに対して、二次元のフィルムを利用す

また、「健康〜医療に関わる製品をつくり、心身の健康美

る発想の転換もあり、反響は大きかった。さらに、ブリー（QOL）に貢献」を目的とした。これを実証していくため

チ（酸化）、パーマ（還元と酸化）、加熱処理に対してもケには具体的な加工品を創出する必要があり、簡易人工皮膚

ラチンフィルムは代替毛髪として有効であった。応答性にを当面の目標とした。このため、フィルムへの加工と適用

加えて高い利便性をもつため、フィルムの販売と委託分析に向けた研究を必要とした。

の事業化へと繫がってきている。

毛髪主成分のケラチンが属する中間径フィラメントは、

一方で、「国民医療費」は毎年１兆円もの増加となって脱重合後に再重合できる。私たちは「信大法」と名付けたきている。この一因としては「先進医療とその技術」の進

効率的なタンパク質の抽出方法と簡便に自己集合を誘導し歩と負担が挙げられる。安価で高機能な医用材料は今後求てフィルムを作製する手法を独自で開発した。死んだ毛髪

められ、個人対応できる毛髪は絶好の生物資源と考えられ細胞からのタンパク質は意外にも生きていた。ケラチンフ

る。化粧品評価材料としての研究開発は区切りの時期とな

ィルムの分解性、生体適合性、安全性などの試験も実施しってきたので、医療へも適用できる技術開発に再度チャレ

たが、具体的な出口までには至らなかった。

ンジしていきたい。

− 197 −

（信州大学繊維学部）

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 23 年度

研究助成

機能性化粧品開発のためのAGEs生成阻害物質の簡便な探索法の開発を目指して
藤原章雄

AGEs（Advanced glycation end-pruducts） と は 還 元 糖

な AGEs の測定は困難であり、また蛍光性や褐色性を有すとタンパク質の非酵素的な反応であるメイラード反応による化合物共存下では、真の AGEs 含量を評価することは困って生じる最終生成物の総称である。AGEs は糖尿病合併難である。ゆえに、構造特異的な AGEs の検出には、質量症や動脈硬化の発症や進展に関与しており、これらの病態分析や高速液体クロマトグラフィーといった機器分析によの予防・改善のためのターゲット分子として注目されている測定が必要であった。そこで、我々は特定の AGEs 構造

る。さらに近年では、コラーゲンに生成する AGEs が皮膚体を認識する抗体を作製し、ELISA にて迅速かつ簡便に老化の原因物質としても考えられており、我々はコラーゲン特検出することのできる測定系を確立した。さらに、本測定

ω異的に生成するAGEsであるN （carboxymethyl）
arginine

系を用いて、AGEs の生成を制御する化合物や混合物（食（CMA）に着目し、皮膚老化予防・改善を目的とした機品・植物・生薬抽出エキス等）のスクリーニングを可能

能性化粧品の開発を目指した CMA 生成阻害物質のスクリとするアッセイ法を確立した。今回、助成頂いた研究でーニングを行っている。 スクリーニングを行うにあたり、も、本アッセイ法を用いて生薬「芍薬」に含有されてい多くの化合物の中から機能性化粧品に用いる候補化合物

る Pentagalloylglucose などの化合物が CMA の生成阻害すを絞り込むためには、迅速で簡便な AGEs の測定法が必要ることで皮膚老化の予防・改善に有効であることを明らかとなる。AGEs の測定法として広範に用いられている簡便にした。今後、確立したアッセイ系が広く使われることで、な測定法としては、AGEs の蛍光特性や褐色特性を利用し将来的に多くの候補化合物の同定を行うことができるようた分光法、あるいはエピトープ未知の抗体法が用いられになり、皮膚老化予防・改善を目的とした機能性化粧品にていることが多い。しかしながら、これらの定量法では含有される化合物が発見されることを期待している。
（熊本大学大学院生命科学研究部細胞病理学分野）

蛍光特性をもたない CMA のような AGEs や、構造特異的

平成 23 年度

研究助成

有機ナノチューブの魅力増田光俊

有機ナノチューブを電子顕微鏡で観察するたび、その構

最近、これらの研究を振り返って「この様な材料が何に造の美しさと共に、何故このような構造が自発的に出来る展開できて、役に立てるのか？」を明確に示せていなかっのか？と不思議に感じてしまう。すでに理論的なメカニたこともあり、今回のコスメトロジー助成に応募し、化粧ズムは液晶相の形成理論を援用することで理解されてい品分野への基礎展開を検討した次第である。採用いただいる。しかし材料開発屋である我々が、その理論に基づき実たおかげで、化粧品成分を包み、保持し、制御しながら放際の分子を設計・合成し、自己集合を試しても、ある分子出することができるナノの入れ物としての基礎物性をいく

はファイバー状の結晶、また他は無定形な固体になり、とらかは示せたと思っている。研究の醍醐味を感じることが失敗の連続であった。それでも研究を10年以上も続けると、出来た瞬間としては、例えばチューブの構成材料となる脂チューブ内表面だけを修飾したり、内径を数マイクロメー

質分子を僅か一カ所を変化させる（今回はカルボン酸をメトルといった光学顕微鏡レベルのものから、数ナノメート

チルエステルに変換する）だけでそのカプセルとしての機ルの電子顕微鏡でしか見えないものまで作り分けることも能が大きく変化し、香料の放出制御につながったことであできた。またチューブによっては透明な寒天状のマテリア

る。とはいえ実用化には課題は山積しており、まだまだ長ルとして取り扱えることや、チューブ内空間が不安定なタい道のりであることも実感させられた。

ンパク質を守って保持するカプセルになることもわかってきた。

今後の実用化には、如何に多くの方々に有機ナノチュー
ブを触って試して頂けるかが鍵となることを感じた。その− 198 −

コスメトロジー研究雑感ため現在では試薬会社を通じた研究用試薬としての販売や、ってどのような人々との出会いがあるか、楽しみにしてい試料提供も開始している。そして少しずつその広がりを感る。

（産業技術総合研究所ナノシステム研究部門）じて居る。コスメトロジーという新しい分野への展開によ

平成 23 年度

研究助成

界面活性剤はオワコンですか？
松原

弘樹

愚痴を書きます。お許しを。

いますが、いずれにせよ、複数の審査員の平均点を採用す

私が研究室に配属された 1998 年、初めて参加したコロ

る現行システムでは、どちらに応募しても不利ですよね。

イド討論会では界面活性剤の物性研究が大変盛んでした。

科研費の獲得が人事に直結する状況では研究人口が減って会場も一番大きな教室が割り当てられ、質疑応答も活発いくのも致し方ないかもしれません。

であったことをよく覚えています。それからおよそ 15 年、

私も例にもれず科研費には毎年苦労しているのですが、現在はナノ粒子に関する研究が発表の半数近くを占め、界好きで始めた研究なので背に腹は替えない覚悟で（今のと面活性剤の研究は年々減少しています。淋しい限りです。

ころ）頑張っています。そのような状況ですので民間助成

この状況の一因として、「界面活性剤を研究してもお金団体からの支援は大変ありがたいです。コスメトロジー研にならない」ことが挙げられます。例えば科研費の化学分究助成で特に良かった点は、年度毎の採択件数が多いこと

野でキーワードにコロイド・界面を含む細目は、複合化学と、研究期間を２年に延長できるところです。九州大学での機能物性か基礎化学の物理化学ですが、それぞれの審査も校費では研究室のランニングコストも賄えない状況です

員はここ数年、無機化学と構造化学の方が多く、ソフト

ので、２年続けて運営費が＋a になるのはとても心強かっ

マターを専門にされる方が減っているようです。これは多たです。財団のみなさまどうもありがとうございました。

分コロイド・界面というキーワードがその基本物性よりも、 （まあ、科研費通らないのはオマエの申請書がつまんない
むしろ新しいナノ粒子の合成や触媒の開発、界面への種々だけだろ！といわれればそれまでなんですけどね…）（九州大学大学院理学研究院化学部門）の分光手法の適用などを意図して選ばれているためだと思

平成 24 年度

研究助成

分散系についての研究とコスメトロジー
村上良

私は学生のときに、両親媒性物質（界面活性剤）の空気

程終了後、イギリスの Hull 大学および Imperial College/ 水表面や油 / 水界面への吸着や溶液内での分子集合体形

London でのポスドク時代に、エマルションや泡について

成についての研究を行いました。両親媒性物質が形成するの研究に取り組みました。これらの分散系を自分の手で作

吸着膜内での分子間相互作用、吸着膜内における２次元の製してみて、作製条件の僅かな違いにより様々な外観や質

相転移や分子集合体形成の駆動力などを、熱力学・分光学

感を示す分散系の研究に魅了されました。現在行っている的な立場から明らかにすることを目的としていました。こ

研究は、現象の原理を解明することに主眼を置いていますのときは、界面化学を研究しているにも関わらず、界面のが、ときおり生まれてくるユニークな機能を持ったエマル

性質・状態が全体の性質を支配する系、すなわち、分散系

ションや泡が化粧品として応用できるのではないかと胸がもしくはコロイドについては書籍で学ぶ程度でした。した

躍るときもあります。このような研究の遂行をとおして、がって、分散技術が重要な基本技術となる化粧品について

コスメトロジーの発展に貢献していきたいと考えています。

も取り立てて興味はありませんでした。大学院博士後期課（甲南大学理工学部機能分子化学科）− 199 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 24 年度

研究助成

ナノテクノロジーを用いて皮下酸化ストレスを抑制する
吉冨

酸化ストレス障害は癌や循環器疾患、消化器疾患を含め、

徹

活性酸素はそのままに、過剰に産生した活性酸素のみを消極めて多岐にわたることが明らかにされつつある。一方で去する材料設計に成功した。このようなアプローチは世界

酸素による酸化反応はミトコンドリア内での電子伝達系を的に殆ど見られず、「善玉活性酸素」と「悪玉活性酸素」

中心に、エネルギー産生のまさに中枢にあり、生命維持にを見分け、悪玉のみを選択的に消去するナノ治療は極めて極めて重要である。この電子伝達系では取り込んだ酸素か

独創的な材料設計に基づく新たなアプローチである。また

ら活性酸素を通して水が生成するため、すべての活性酸素

次世代の抗酸化剤として、レドックスインジェクタブルゲを消去することは生命維持に反することになる。従って、

ルの合成にも成功した。これは、皮下注射後、皮下に長期

低分子抗酸化剤のように生体内に広く拡散する分子はこの滞在する抗酸化剤として機能するだけでなく、長期の薬物

正常な電子伝達系を妨害しかねず、単なる抗酸化剤では利徐放も可能となる。ここにペプチドやビタミン剤を物理的用に限界があった。近年、新しい素材を皮膚保護に利用すに封入することにより、新しいスキンケアの方法を提案する試みとして白金ナノ粒子やフラーレンを利用する試みもることができる。このように、安全で効果の高い抗酸化作

あるが、特有の着色料や汗による皮膚からの脱離などの問用を有する材料を創り込み、最適な素材を提供していくこ

題があった。本研究では、触媒的活性酸素消去能を有するとにより、新しいスキンケアの構築につながると期待してニトロキシドラジカル化合物をナノ粒子内に閉じ込めるこいる。

（筑波大学大学院数理物質科学研究科）とにより、ミトコンドリアへの取り込みを防ぎ、「正常な」平成 23 年度

研究助成

脱毛症研究に携わって伊藤泰介

私の研究テーマは脱毛症、とくに円形脱毛症である。円ッキョクグマなどでは脱毛症は生命に関わる事態である。

形脱毛症はよくある疾患であり、円形の脱毛斑は１〜数個

男性型脱毛症の分野では、フィナステリドとミノキシジ

ある程度の印象があると思う。しかし実際大学病院に駆けルによって、多くの方が薄毛から回復することが出来る時込んでくる患者は、頭部全体に及ぶ脱毛斑、全身の脱毛、代となった。20 年前には想像出来なかったことである。

眉毛や睫毛がぬけてしまうなど、社会生活に大きな影響を米国生まれのフィナステリドの売り上げは、日本が世界で与える状況に陥り、精神的にも大きなダメージを受けてい最も多い。このように日本人は毛髪への意識が強いといえる方が多い。不登校や鬱状態、失業、恋愛問題からプールる。

や温泉等レジャー活動の制限など「生活の質」も大きく低

一方、円形脱毛症の治療は皮膚疾患の中でももっとも難下する。ヒトにおいては脱毛症で命が直接奪われることが渋する疾患の１つである。脱毛症専門外来には多くの患者

ないにしろ、頭部全体が脱毛すると髪の毛の重要さを感じが相談に訪れている。この不安につけ込むやや問題のあるる患者さんが多く、私もその重要性にあらためて気付くこ業態も散見されるが、これは皮膚科学が患者の悩みを解決と多い。頭部外傷が増えたり日焼けをしたり寒さを強く感出来ていない証拠でもある。毛髪の研究者として今後も邁

じたり、目にゴミが入りやすくなる等いろいろである。ホ

進していきたい。

− 200 −

（浜松医科大学皮膚科学講座）

コスメトロジー研究雑感

平成 24 年度

研究助成

過酸化脂質研究とコスメトロジー
今井浩孝

私はこれまで、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオ

たように紫外線から体内の障害を防御する役割を担っていンペルオキシダーゼ（PHGPx）という酵素の機能の解析るので、PHGPx 以外にも重要な脂質酸化防御系を獲得しから、脂質の過酸化物であるリン脂質ヒドロペルオキシドていると考えられ、過酸化脂質研究者としては、益々コスが細胞や個体においてどのような機能を持つのかというこ

メトロジー研究の奥深さを感じることとなった。また化粧とを 20 年来研究してきた。皮膚は紫外線をあび脂質酸化品の研究では、In vivo での研究から離れる傾向がある一が起きることは周知の事実であるが、PHGPx の皮膚での方で、化粧品成分のヒトでの副作用の問題が大きく社会問

機能解析はほとんど行われていなかったこともあり、タモ題になったことから、動物実験での In vivo での研究もや

キシフェン誘導型 PHGPx 欠損マウスの作成によりようやはり重要なのではと思うこの頃である。

く、皮膚の研究にたどり着いた。これまでコスメトロジー

私は折しも研究助成を頂いた後、昨年４月より研究室をの研究をやっていなかった我々の技術はまだ未熟であり、主宰する立場になり、研究室の立ち上げ時期にこの財団か

コスメトロジー解析の技術レベルをもっと上げなければとらのコスメトロジー研究助成は、非常にありがたく、私だ

痛感させられた。本研究では、PHGPx の毛包細胞での重けでなく若い研究者の研究推進のためにも大きな力の源に

要性や脂質ヒドロペルオキシドが発毛の遅延に関与しそうなりました。この場をかりて厚く御礼申し上げます。私たなことまでは明らかにできたのだが、一方でこれまでいろ

ちの研究成果が今後コスメトロジー研究の発展に役に立て

いろな細胞において PHGPx を欠損させると細胞死が誘導るよう今後もがんばっていきたいと思います。
（北里大学薬学部衛生化学研究室）されるのになぜか皮膚細胞においては細胞死が誘導されてこないということも明らかとなった。皮膚は日常、上述し

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
江草宏

最近、雑誌やインターネットで“口腔化粧品”という言ることで、口腔化粧品に対する患者固有の反応を評価する

葉をよく見かけるようになりました。歯磨材や洗口液のこ技術に繋げることとしました。まだ道半ばですが、患者かとですが、歯科医師である私にとっては口腔の健康づくり

ら採取した歯肉を用いることで iPS 細胞を樹立し、粘膜にを推進すべきこれらの商品が「化粧品」と呼ばれているこ

存在している樹状細胞に分化を誘導する技術にも目処がつとに違和感をもちました。調べてみると、これら商品のいきました。これにあたり，共同で研究を進めていただいた

くつかは，薬事法のもと医薬部外品の承認を得るには時間

大阪大学大学院歯学研究科の関根伸一先生に改めて深く感とコストがかかるため，口腔化粧品として販売する戦略が謝の意を表します。また、周期的伸展刺激が幹細胞の骨格とられているようでした。ただ、これらの商品の中には他筋細胞への分化誘導に応用できることが明らかとなり、今の商品と区別化を図るために植物エキスなどが配合されて後の研究に繋がる成果をあげることができました。この度いるものもあり、アレルギー疾患への取り組みが課題となの研究をきっかけにコスメトロジーの観点でバイオテクノっている昨今、すべての消費者にとって安全性が高いかど

ロジー研究を考える機会が増え、自分の中で学術分野の拡

うかはわかりません。このような背景から、私は患者に由がりを感じることができました。将来、これらの技術がコ来する細胞から作製した口腔粘膜や舌を用いて口腔化粧品

スメトロジー研究の発展の一助となることを期待しておりの安全性評価ができないものかと考え、この度の申請に至ます。最後になりましたが、本研究を進めるにあたりコスりました。研究目的は、患者に由来する iPS 細胞や骨髄由

メトロジー研究振興財団からの助成に心から御礼申し上げ

来間葉系幹細胞を用いて口腔粘膜、舌などの細胞を作製すます。 （大阪大学大学院歯学研究科歯科補綴学第一教室）− 201 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
大山

学

今回の研究を始めるまでは、ヒト iPS 細胞を取り扱った

iPS 細胞から様々な器官を作ることには大きな意義がある

経験がなく、手探りの状態であっただけに何とか結果を出だろうが、組織幹細胞が同定・分離されているような場合

せて正直ほっとしている。実際に実験を進めてみると、十には、その特性を失わせることなく培養する技術を開発す

把一絡げに iPS 細胞と称されているものの、セルラインごるなどして、できるだけそれらを活用する方法を用いた方とにその生物学的特性は大きく異なっている。つまり、事がはるかに臨床応用は早いであろう。iPS 細胞だけに注目前に自分が目的とするものに適した特性を有する iPS 細胞するのではなく、うまくバランスをとりながら再生医療がのラインを上手に選択することが大切であることが実感さ

発展していくことが大切ではないかと思う。

れた。さらに継代数が高くなると未分化な状態を維持する

貴財団から援助いただいたのはちょうど研究費が枯渇し、ことが極めて難しくなる。現在ひろく世間では“夢の万能

財政的に困っている時期であった。本研究費のおかげで遂細胞”と捉えられ、何でもすぐにできてしまうような感覚行できた実験は多い。改めて感謝申し上げたい。貴財団のを抱きがちである。世紀の大発明であることに異論はない

今後益々のご発展をお祈り申し上げペンを置きたい。
（慶應義塾大学医学部皮膚科学教室）

が、実際に取り扱ってみると取り扱いの難しい細胞である。

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
片岡浩介

私が今回、天然保湿因子の形成に関する研究を行うよううことに思い至り、あらためて解析を試みたのが始まりでになったのは全くの偶然からです。従来から遺伝子発現調した。表皮の分化の仕組みについての過去の知見を調べ、節と細胞の分化の仕組みについて、例えば膵臓の β 細胞

まだわかっていない面白そうなことを探る、ということを、などの研究をしていたのですが、まだ分化の仕組みがよく当時所属していた奈良先端大の大学院生と一緒に始めましわかっていない他の細胞や器官はないだろうか、と考え、た。表皮の層構造の名称はおろか、天然保湿因子という言思いついたのが毛髪でした。毛髪・毛包の再生に関わる増葉すら知らないところからの出発でした。一見したところ、殖因子などの研究は多いのですが、転写のレベルではまだあまりはっきりしない表現型のように最初は思われたので未知の領域が多く残っているように思われたので、自分たすが、詳細に調べてゆくと、意外にもフィラグリンというちが対象としていた転写因子の発現パターンを毛髪で調べ重要な因子との関連がわかってきて、貴財団の助成を頂けることから始めたのです。

ることになりました。現在、ひとつの転写因子から出発し幸運なことに、狙ったとおりに毛髪の発生・分化に寄与て、フィラグリン遺伝子のエンハンサーに至り、そこからすることを明らかにできたのですが、いかんせん毛包といまた新たに別の転写因子（群）に辿り着くというやり方で、うのは組織が小さい割に複雑で、得意の生化学に持ち込む

表皮の転写ネットワークが少しずつ垣間見えてきたところことが難しく、詳細なメカニズムに踏み込むことはできまです。解明にはまだ先は長いですし、実用化にはさらに遠せんでした。

い研究ではありますが、ご支援をいただいたことで新しい

一方で、ノックアウト・マウスの皮膚切片の染色像を眺めていて、表皮の角化細胞にもどうやら関与しそうだとい領域を開拓することができました。あらためて御礼申し上げます。

− 202 −

（横浜市立大学生命医科学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
小泉修一

私は、脳科学を専門としています。皮膚の研究は普段は皮膚の複雑さ、不思議さ、美しさに改めて気づくことがであまり行いませんが、神経も皮膚も外胚葉由来だから、ときました。本研究の機会を頂き、有り難うございました。

いった理屈ではなくて、同じ生体を構成する組織として、（山梨大学医学部薬理学）

平成 23 年度

研究助成

コラーゲンの研究まだやっています小出

私はプロの研究者になってからずっとコラーゲンを中心

隆規「じゃあ、ハゲには髪の毛を食べたらいいんですかねえ ??」にすえた研究をおこなってきました。コラーゲンの３重ら「ははは…なるほど〜」

せん構造をみるとゾクゾクします。

と、たいていは納得してもらえます。

昨今のコラーゲンブームについて以前に書きましたが、しかし、ふと不安になり、インターネットで調べてみる

今回はその続きです。巷でのコラーゲンブームはいまだ衰と、え…！それがあったのです。

えるどころかますます元気で、「生搾り」とか「ナノ」と「毛髪をふやすためには、内側からケラチンを補うことがか「ピコ」とか「男の」にいたるまで、わけのわからない

重要です…云々」

さまざまな接頭辞をつけられて、なんだか特別のコラーゲ

羽毛や羊毛由来のケラチンが、発毛のためのサプリメン

ンであるような雰囲気が醸し出されるようになってきまし

トとして商品化されていました。なんとも商魂たくましいた。これらの中にはコラーゲンですらないモノも結構あるです。参りました。でもね、羽とか毛糸とかが頭から生えのですが…。

てきたらどうしてくれるんだい？（想像してみるとなかなというわけで、前にもまして、「コラーゲンを食べたらかシュールで楽しいです）

お肌ぷるぷるになるんですか？」と聞かれるようになりま

そろそろアカデミア発「コラーゲンを食べたらどうなるした。科学的知見にもとづいて、一から真面目な顔つきでねん」という研究に真面目に取り組もうかと考えています。

ご説明申し上げるのも無粋と思われるシチュエーションがまたの機会にご支援をいただけたら幸いです。

おおく、最近では以下のように質問には質問で返すという技をつかうことにしています。

− 203 −

（早稲田大学理工学術院）

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 24 年度

研究助成

助成期間を振り返って
柴弘太

この度は、研究助成の対象者として採択して下さり、研くれる人もいません。そんな中で迫り来る成果報告のプレ究の機会を与えて下さったコスメトロジー研究振興財団に、ッシャーと闘いながら、冷静に研究を展開するという経験

心より感謝申し上げます。

は、間違いなくこれからの研究人生の糧となる、貴重な体助成金をいただいて研究を行ったこの一年間は、私にと験だったと思っております。

って決して忘れることのできない一年となりました。本研

心残りは、申請書に書いた内容を 100% 実現するまでに究助成への申請が採択されたとき、私は学位を取得してまは至らなかったということです。あれこれ調べて、流れをだ半年程度の、駆け出し中の駆け出し研究者でした（今で練って、完璧だと思っていた研究計画も、いざ開始してみも駆け出しに毛が生えたようなものですが）。少し前までると予想外のことばかりで、研究の難しさをあらためて実は学費を払い、学生として研究をしていた私が、一転して感した一年でした。しかし、進めていく中で予想もしなか

お金をいただき、それを好きに使って自分の研究ができるった興味深い事実を発見することができ、これがあるからという事実に、大きな衝撃を受けたのを覚えております。

研究は面白いのかもしれないと、深みにはまっていく感覚研究者として第一歩を踏み出したばかりの私のアイデアをを楽しんでいるところでもあります。

面白いと思い、その実現を期待して助成して下さる方がい

今回助成していただいたことに対し、いつの日か大きな成果をもって恩返しすべく、今日も研究に励んでおります。

るということは、にわかに信じがたいことでした。
大きな喜びを感じる一方で、背負っている責任の存在を感じたのも事実です。主体的・計画的に進めていかなけれ

今後の活躍をご期待いただければ幸いに存じます。
（物質・材料研究機構 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点）

ば、研究期間は瞬く間に過ぎていき、そのことを指摘して

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感鈴木

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択していただきましてどうもありがとうございました。近年

聡より自由となって、昔より生き生きしているように見受けられます。

若手研究育成が叫ばれ、今や若手が応募する研究助成は無一方近年では男性の化粧品もでき、より多様な装いをし数にあるものの、45 歳を超える頃から応募できる数が急た学生が多くなりました。しかしながら、昔に比べるとど激に減少します。このため、教室当たりの教員数が少なく、こか覇気が失われているように思えてなりません。学生紛

また多くの大学院生を抱えている 50 歳超の中堅研究者は、争の頃の男子学生の活力はどこに消えてしまったのでしょ

研究費獲得に非常に苦労しておられるのではないかと類推うか？

します。また近年は、日本経済再生のために、出口の近いをする日本人留学生も少なくなったように聞いています。

応用研究に多くの資金が投入され、基礎研究の資金がとり「元気で hungry な男子学生を増やすこと！」…なかなかにくくなっているのも実情です。しかしながら、優れた基

難しい課題ですが、このことがおそらく少子化対策にもな

礎研究なしには応用研究も花開きません。これらのことかり、今後の日本の繁栄維持に何よりも重要だと思います。

ら、ぜひ中堅研究者や基礎的研究課題にも、今後引続きごぜひ、コスメトロジーを含めた全ての分野が、マスコミを支援をしていただけましたら幸いです。

も巻き込んで、この課題を強く意識する（かつ国民に意識

近年のコスメトロジーの進歩によって、女性がより美し

留学希望者は少ないだけでなく、夜遅くまで研究させる）ことが大切なように思います。

くなり、多くの女性に自信を与えたように感じます。また
女性がより美しくなり、家事から解き放され、職業選択も− 204 −

（九州大学生体防御医学研究所ゲノム腫瘍学）

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感谷

元洋

この度は本研究を進めるにあたりコスメトロジー研究振性物質」という二面性を考慮した時、その使用の安全性に

興財団よりご援助頂きましたことを深く感謝致します。私関して考慮すべき点が多々存在すると考えます。特にセラの研究テーマは、生体膜脂質の一つであるスフィンゴ脂質ミドの細胞死誘導活性は、非常に強力なものですが、そのです。スフィンゴ脂質は細胞表面上でマイクロドメインと作用の分子メカニズムが明確化されていないため、その究いう領域を形成し、細胞間及び細胞内シグナル伝達等にお明は非常に重要です。今回、私は出芽酵母をモデルとして、いて重要な役割を担うことがわかってきています。さらに、セラミドが誘導する細胞死の作用メカニズムに関する基礎

膜のスフィンゴ脂質の一部が分解されることによって生成的知見を得ることを目的としました。研究は、まだまだ未されるセラミドは、細胞内シグナル伝達系を調節し、細胞成熟ではありますが、今後さらなる解析を行うことで、セ死、細胞分化を制御するセカンドメッセンジャーとして機ラミドの作用メカニズムに関する確固たる分子基盤をつく能します。一方で、セラミドは、皮膚表皮の角質層においることを目標としたいです。酵母をモデル生物として用いて水分子の保持を行い、バリヤーとしてはたらくことも知る基礎的な研究が、ヒトの健康に役立つような応用研究にられています。化粧品におけるセラミドの有効性は以前か結びつくには、多くのステップが必要です。が、セラミドら知られていますが、ここ数年で、セラミドは健康食品分のように生化学的に非常に扱いにくい物質を研究するにお野でも盛んに取り上げられるようになりました。セラミド

いて、多彩な遺伝学的アプローチが比較的容易に行える酵含有の健康飲料水まで現れて来ており、スフィンゴ脂質の母が強力な武器になると信じています。今後、セラミドを基礎研究を昔から行ってきた者からすれば、このセラミド基盤とした基礎研究が、化粧品、医薬品、食品等の幅広いの各業界への浸透は驚くべき変化です。しかしながら、セ分野で応用されることを願ってやみません。
（九州大学大学院理学研究院化学部門）

ラミドの「皮膚の保湿成分」、「細胞に対する強力な生理活

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
寺尾美香

私が細胞内コルチゾール活性化酵素の研究を始めたのは、いる研究室があることがわかりました。その後、加齢とと大学院生時代に‘なんとなく’行なった実験に始まります。

もに皮膚で細胞内コルチゾール活性化酵素が上昇してくる

当時、肥満化してくるマウスの研究をしており、肥満の分ことがわかり、生理的老化皮膚はコルチゾール過剰による

野で脂肪細胞における細胞内コルチゾール活性化酵素がト皮膚萎縮とよく似ることより、皮膚老化にもこの酵素が関ピックとなっていたために、脂肪組織での発現を調べるつわっているのではないかと考え始めました。その頃にコスいでに‘なんとなく’皮膚組織や表皮角化細胞も PCR に

メトロジー研究助成に応募させて頂き、研究助成を頂くこ

かけてみました。結果として脂肪組織同様に皮膚でも上昇とができました。まだ、マウスを用いた仕事が中心ですがしており、肥満だからそんなものかと思っていました。し皮膚老化における細胞内コルチゾール活性化酵素の役割をかし、Pubmed で調べてみたところ、皮膚におけるこの酵明らかにできつつあります。今後は細胞内コルチゾール活素の報告はひとつもありませんでした。そこから、私の皮性化酵素をターゲットとした治療が高齢者の難治性皮膚潰膚組織における細胞内コルチゾール活性化酵素の研究が始

瘍の治療やステロイド投与に伴う皮膚萎縮の改善などにつまり、表皮特異的ノックアウトマウスの作成を開始しましながっていくよう、研究を進めて行きたいと考えておりまた。2011 年に皮膚における細胞内コルチゾール活性化酵素

す。最後になりましたが、本研究を支援頂きましたコスメの役割を報告しましたが、同じ年に海外の２つのグループ

トロジー研究振興財団に心より御礼申し上げます。

から皮膚におけるこの酵素の報告があり、他にも注目して− 205 −

（大阪大学医学系研究科皮膚科学）

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 23 年度

研究助成

傷痕をきれいに冨田

元「あの医師は手術の傷痕がとてもきれいできっと名医に違を促進するもの、調節するもの、必要なもの、不必要なもいない。
」「まだ若いのに傷痕が残ることが心配です。
」「名の、逆に遅らせるもの、何も意味がないもの、様々な役割

誉の負傷」など傷痕に関する意見は人それぞれです。ただがあるのだと考えられています。すべての細胞と細胞外マすべての傷痕がきれいに、機能的に修復できるのであるな

トリックス、シグナルが複雑に絡み合い創傷治癒を完成さ

らばより良い生活が送れるようになると思います。しかしせている。なんと神秘的なのだろう。なんと人間らしいのながら創傷治癒のメカニズムは奥深く、非常に完成されただろう。と圧倒される毎日でありました。それぞれの詳細ものであり、我々が介入する余地は少ないように思えます。

な機能の説明は控えますが、複雑に絡み合ったそれぞれの

今回細胞外マトリックスに焦点をあてて創傷治癒を研究す

機能を一つずつ明らかにしていき、いつの日か全体が解明ることになりましたが、それ以外にも創傷治癒には表皮のされる日を願っております。本研究とこれからの活動がよ

角化細胞、毛包上皮、線維芽細胞、血小板、好中球、マク

りよい創傷治癒につながっていくことを信じて研究を続け

ロファージ、リンパ球など様々な細胞が関わっており、そていければと思います。最後になりましたが、貴財団よりれぞれにシグナルを出しては受け取っています。しかも経助成を頂き、研究をご支援頂きましたことに心から感謝申時的に役割が変わっているのです。シグナルには創傷治癒し上げます。

（長崎大学大学病院皮膚科アレルギー科）

平成 23 年度

研究助成

放射線

中山

文明

2014 年の現在でも、放射線という言葉を聞くと、まず実は、放射線治療の進歩は著しく、皮膚潰瘍のような重ネガティブな印象を持つ日本人は多いことでしょう。実際

篤な副作用はもはや稀です。特に、放医研の重粒子線治療に、今回取り組んだ課題も、放射線皮膚障害に関するもののような先進的な治療法ならば、腫瘍部に放射線を集中さで、紛れもなく放射線のネガティブな側面を扱ったものでせ、その他の部位の被ばくを非常に低く抑えているため、す。

副作用はほとんど認めません。それでも、美容的な観点か

ただし、立場が変わると放射線が非常に大事な存在とならは皮膚には異常が生じています。放射線治療は、「切らります。それが、「がん」になった時の放射線療法です。「がずに治す」治療法です。このような治療は、体への負担だん」を克服するために有効な治療法です。ただし、この場

けでなく、精神への負担も軽くしていると思います。ネガ

合でも放射線のネガティブな側面が消えたわけではありま

ティブな印象は変えられませんが、もしきれいに治せたら、せん。放射線に対するネガティブな印象をもったまま、放患者の気持ちにどれだけ役立つことでしょう。

射線治療に臨んでいる人もきっと多くいるはずです。さら「がん治療」に「コスメトロジー」は、とても大事だと思に、程度の差はあれ実際に起きている副作用に目をつぶっっています。

て、我慢している人も多いことでしょう。

（独立行政法人放射線医学総合研究所重粒子医科学センター）− 206 −

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感西江渉

私が皮膚科医として研究する一番の目的は、もちろん目天疱瘡の病変部で 17 型コラーゲンが非生理的切断され通の前にいる患者さんを治したいからですが、実際には直ぐ

常では生じない抗原エピトープが生じることを解明できまに応用可能となるような研究は限られています。そのためした。高齢者の皮膚で 17 型コラーゲンが非生理的切断をどうしても基礎的な内容の研究が多くなってしまいますが、受けている証明には至りませんでしたが、今回助成を頂い常に臨床とのリンクを考える様に心がけています。今回助たことで水疱性類天疱瘡の病変部で抗原タンパクがどうな成を頂いた研究は、自己免疫性水疱症の代表的疾患であるっているか垣間見ることができ、病態解明に大きく貢献し水疱性類天疱瘡がなぜ高齢者に好発するか？という、まさ

たと思います。今後は今回得ることの出来た研究成果をもに臨床から生じた疑問の解明を目指すものです。私は抗原とに、臨床応用可能な研究を目標に研究を発展させていきタンパクである 17 型コラーゲンが加齢に伴い非生理的なたいと考えております。最後になりましたが、研究助成を切断を受けた結果、通常では生じない新しい抗原エピトー

賜りました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に心プが出現するのでは？という仮説を立て、実際に水疱性類より御礼申し上げます。

（北海道大学病院皮膚科）

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
畠山鎮次

コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択していたろ、「皮膚の生理機能や老化機構の解明の研究」も含まれだき、誠に有り難うございました。本研究助成の支援によるということでしたので、研究している遺伝子群のなかで、り、申請課題に提案させていただきました遺伝子の機能解特に皮膚に発現している遺伝子に注目して、研究を申請さ析を進めることができ、誠に深謝しております。

せていただきました。採択していただいたおかげで、皮膚「コスメトロジー」研究振興財団の研究助成の応募を拝見を含む扁平上皮細胞に高発現している本遺伝子に関して、したとき、まず何に関しての研究申請が可能か、戸惑った

DNA ダメージに対する影響に関する知見を得ることがでのが正直な気持ちでした。
「コスメ」であるので、おそらきました。遠い先のことかもしれませんが、本研究成果が、く「お肌のお手入れ？」などの美容に関すること、もしく

今後の薬剤開発や化粧品開発において、少しでも役に立ては化粧品に関することかと思いましたが、門外漢でありまれば幸いと感じております。

したので、最初は申請を提出するかどうかしばらく戸惑い

最後になりますが、貴財団の助成を拝受し、本研究をごを感じました。小生の研究領域は、医学のなかの「生化学」

支援いただきましたことを心より御礼申し上げますとともで、組織や細胞を壊して重要な分子の機能を探ることが専に、貴財団のますますのご発展をお祈り申し上げます。

門です。そこで応募要項を詳細に読ませていただいたとこ− 207 −

（北海道大学大学院医学研究科生化学講座）

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 24 年度

研究助成

蛍光プローブによるコスメトロジー
花岡健二郎

この度は本研究を遂行するにあたりコスメトロジー研究

ぐバリアでなく、表皮からの信号を免疫系や中枢神経系な振興財団よりご援助を頂きましたこと深く感謝申し上げまどに伝えることにも深く関与していると述べています。こす。私は、有機化学を用いて蛍光プローブを開発する研究の複雑で重要な生理機能の解明を通して、それら生理機能を行っております。蛍光プローブとは、体の中の生体分子を維持し、人の健康と美しさが保たれるのではと考えていを選択的に捉えることで初めて蛍光を発する機能性分子のます。同時に、蛍光プローブで目に見えるようにするもの

ことで、例えば、蛍光プローブを溶かした水溶液を生体サ

によっては、単に皮膚の生理機能の解明だけでなく、皮膚

ンプルにふりかけることで、簡単に生体サンプルの中の見の健康状態の評価など様々なことができるかも知れません。

たい生体分子を、リアルタイムで自分の目で見ることがで身近なようでまだまだ分かっていないことが多い皮膚の生きます。実際の研究では、このような蛍光プローブを使う

理機能が、今後更に解明されていくことを期待しておりま

時には蛍光顕微鏡などを使って発せられた蛍光を観察します。

すが、その一方で、蛍光は我々の目で直接見ることができ最後に、我々の開発している蛍光プローブの蛍光の美しるものなので、生命科学研究のみならず、医療診断や分析

さも人の美しさも目で直接見るという点では同じであり、化学にも有用であります。

また、それをうまくコントロールするということも蛍光プ

本研究助成では、皮膚の生理機能の解明に役立つ蛍光プ

ローブの分子設計と共通なものがあると考えています。美ローブの開発を行いました。実際の研究現場で用いること

しさの分子設計というものでしょうか。末尾になりましたができる蛍光プローブを開発することで、多くの生理機能が、コスメトロジー研究の益々の発展をお祈りいたします。
（東京大学大学院薬学系研究科）が解明されることを期待しています。いくつかの文献では、皮膚は一つの臓器のようなもので、単純な体液の漏出を防平成 24 年度

研究助成

皮膚と化学物質平澤典保

近年、皮膚上皮細胞はバリア機能を担うだけでなく、本TSLP の主たる産生細胞は上皮細胞であることから、化粧研究で取り上げた TSLP などサイトカインを産生して免疫品に含まれる化学物質について、TSLP 産生誘導活性を必応答に重要な役割を果たしている事が明らかにされてきた。

ず評価する必要があろう。逆に、上皮細胞を用いた TSLP

また、化粧品による健康被害が問題となってきており、化産生系は、in vitro で化学物質の免疫毒性を評価する１つ

粧品に含まれる化学物質の皮膚上皮細胞に対する作用の研の方法になると考えられる。

究が大きく発展するのではないかと考えている。一方、化皮膚は外界からの様々な刺激に対するセンサーを有して粧品の開発に、実験動物の使用が制限されてきており、inいると考えている。化学物質に対する応答もその一つではvitro の実験だけで本当に免疫毒性を含む安全性が担保さないだろうか。特に今回、臭いのある化学物質が TSLP 産

せるのか心配である。化粧品とはいえ種々の化学物質、ナ生を誘導している事から、嗅覚受容体のような化学物質セノ粒子を含むものがあり、リスクは決して低くない。筆者

ンサーが存在しているのではないかと夢見ており、今後もは化学物質には蛋白と結合して新たな抗原を形成するもの

この観点から皮膚と化学物質について研究を続けていきたと、TSLP の産生を亢進して、他の蛋白質に対するアレル

いと思っている。

ギーを増強するものがある事を明らかにしてきた。特に、− 208 −

（東北大学大学院薬学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 23 年度

研究助成

ナノ粒子の化粧品への応用堀江祐範

私は、最近８年間に亘り工業ナノ粒子の細胞影響評価に品への利用にとって魅力的な特徴を多く持つ素材である。

携わっている。この間、ナノ粒子の生体影響についての研以前は、ナノ粒子を利用していることを惹句として大々的

究は、大きく進んだように思う。研究を始めた当初は、ナに述べている製品も見られたが、近年では消費者のリスク

ノ粒子が生体に対してどのような作用を及ぼすのか、ほと意識の高まりと共に、そのような表記は減っているようだ。

んど何もわからなかった。ナノ粒子については、機能性材

ナノ粒子の利用において重要なことは、有害性を含めたナ

料や素材としての研究が先行し、有害性を含めた生体影響

ノ粒子の性質を理解して、有効に利用することであろう。

の研究は遅れがちで、アスベストのように当初知られてい

特に化粧品への応用は、日々の生活を豊かにするためにとなかった有害性が後から出来するのではないか、という懸ても有効である。そのためにも、ナノ粒子の生体影響を知念が指摘されはじめていた。その後多くの研究によって、り、必要に応じた対策を講じることは必須である。
「デー

ナノ粒子が生体に対してどのような作用を及ぼすのか、そタがない」ということは社会に受け入れられず「市場がなのメカニズムはどのようになっているのか、一つずつ明らい」ということである。今回、助成によって幸いにも多くかになってきた。ナノ粒子の生体影響の研究では、経気曝の知見を得ることが出来たと思う。これらのデータが、ナ露を想定した研究が最も多い。ナノ粒子の化粧品への利用

ノ粒子の生体影響の理解に貢献し、コスメトロジーの発展においては、経皮が最も重要であるものの、その研究はまの一助となれば大きな喜びである。また、さらなる理解のだ途上である。ナノ粒子は、粒子が細かいことから、肌にために努力してゆきたい。
（産業医科大学産業生態科学研究所）

塗布した際に粉っぽさがなく肌が美しく見えるなど、化粧平成 24 年度

研究助成

汗の偉大さを知る
室田汗は人知れず皮膚から放出され、そのほとんどが蒸散し、浩之初めて生体内で汗腺の動態観察に成功した訳だが、汗腺のごく一部は皮膚表面に残る。そうすることで皮膚の恒常性

動きはけなげそのものであった。ヒトは個体あたり 200 万を支えている、けなげな「縁の下の力持ち」といえよう。

〜 500 万個の成熟した汗腺を持って生まれてくる。汗腺の今回の研究助成の好機を得、研究成果を通じて汗の偉大さ

数は生後増えることはないとされる。このはかなく小さなに気づかせていただいた事に改めて御礼申し上げたい。今臓器のかわいらしい動きが生体の恒常性を支えていると考回はマウスの手掌足底の汗腺機能の評価を行った。マウス

えれば、汗腺がより愛おしい存在に見えてくるのは私だけの汗腺は手掌足底にしかないため米粒ほどのわずかな面積だろうか。水は生命維持に必須である。ヒトは汗によってでの検討を強いられた。彼らは汗を滑り止めとして利用す

惜しげもなく水を放出する。それは汗をかくことがいかにるが体温調節には用いない。ヒトのように全身に汗腺をま大切な事かを物語っている。何かと嫌われることの多い汗とっている動物は類いまれだ。それゆえヒトの恒常性維持だが、本研究成果を発信することで汗を理解して汗とうまに必要な機能の多くは発汗活動に頼っている。けなげに見く付き合う糸口が見つかれば幸いである。

えた汗も今やいよいよ輝きを増す。今回、おそらく世界で（大阪大学大学院医学研究科情報統合医学皮膚科学教室）− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 23 年度

研究助成

ヒトは単純なのか複雑なのか佐藤桂

幼少のころから香りの魅力にとりつかれてきた。すっか等を変えなければならなくなった。一つだけ、さしてふだ

り忘れていた昔のことを一瞬に思い出させたり、気持ちをん気にもとめていなかった普通の石鹸の香りが害を及ぼさ明るくしたり暗くしたり。身体をリラックスまたは刺激しずさらには安心させる香りであることに気付いた。その時たり。香りがヒトに及ぼす影響は大きい。

に不快な気分にさせたシャンプーは長年使用してきたもの

香りが及ぼす影響は、ストレスの種類によって異なるよであったが、健康になった今、その香りは去年の辛い日々うである。一過性のいらいらや邪魔されることに対する腹を思い出させるものになり、15 年もの間好きだった商品

立たしさを感じている時は、香りは気分転換になる場合とがあっという間に嫌いになってしまった。

外乱になる場合にわかれるようである。肉体的ストレスを渋滞中のいらいらを解消させる手段の一つとして香りは感じている時は、香りを嗅ぐことによって、それから気持効果的ではないかと考えたが、辛い思い出を引き起こしたちをそらそうとする意識もみられた。被験者の実験に対す

り、余計にいらいらさせたりといった弊害も考えられる。

る感想は RRI の変動と同様、十人十色であり、本実験とは一方、自分の好きな香りを持てば生活の質が向上する可能

別に実験参加者に香りをかがせ嗜好性を聞いてみても、日性もある。たかが香り、されど香り。嗅覚の研究をする人によって異なっており、実験の難しさを痛感した。

はよっぽどの変わり者か、出世を諦めた者だとか。古代から私事であるが、去年不思議な出来事に遭遇した。過労が我々を魅了してきた香りについて今後も研究していきたい。

たたり医者も理由がわからない体調不良が続いた。2 か月

ちなみに石鹸の香りはまたどうでもよい香りに格落ちし目には遂にあれだけ好きだった香りで気分が悪くなるようてしまった。
（東京農工大学大学院工学府機械システム工学専攻）になり、これまで使用してきた洗剤・シャンプー・化粧水

平成 23 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
藤井

我々の研究グループは、今回の研究を開始する前までは、俊勝ってもう少し詳細に結果を見てみた。まず、もともとの魅

主にエピソード記憶・顔や名前の記憶・虚偽記憶やうそ・

力度が結果に影響するかどうかを検討してみたところ、も対象の好き嫌いなどについて脳機能画像法（PET: positron

ともとの魅力度にかかわらず、化粧は魅力度を上昇させて

emission tomography, fMRI: functional magnetic resonanceいた。また、化粧をしている顔は化粧を全くしていない顔

imaging）を用いて研究を続けてきた。今回の研究を始めるに比べ、（被験者平均で）20％くらいの刺激では魅力度がにあたり、今までの研究を概観してみたが、予想していた低下していた（変化なしが約 30％、魅力度上昇が約 50％）。

よりも化粧顔の認知についての脳機能画像法を用いた研究

今回は刺激作成に参加してもらった女性に自分で化粧をしが少ないことに驚いたのが実感である。

てもらったが、化粧の仕方のうまい人と下手な人がいるの

今回の研究では、行動データの結果から、化粧をしていかもしれない。あるいは、その人にあっていない化粧をしる顔は化粧を全くしていない顔に比べ、魅力度が有意に高ている人がいるのかもしれない。その他にも、化粧についく評定されることが明らかとなった。脳機能画像データのてはいくつか考えさせられるところがあり、今後さらに研結果から、ノーメイク顔画像を見ている場合と比較して、究が膨らむ気がしている。

フルメイク顔画像を見ている場合に、眼窩前頭皮質と海馬最後に、今回の研究にあたり研究助成をいただいたコス
メトロジー研究振興財団に深謝申し上げます。

の有意な賦活が認められた。
以上の報告書に記載した結果は被験者全員の平均データを基に解析したものである。いくつか気になるところがあ− 210 −

（東北福祉大学感性福祉研究所）

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

国際交流助成コスメトロジー雑感
日下部

豊寿

人生とは、何がきっかけでその後の未来につながってい国々から、美容外科を受けにソウルを訪れる人が多いそう

くのかは誰にも解りません。私には留学中に知り合った韓です。現に、ソウルの若い人達が集まる、明洞（日本の渋国の一人の先生がいました。ラボは違ったのですが専門分谷的存在？）でもこのようなたくさんの広告が、韓国語、

野が同じ歯科矯正学ということ、また隣国で国民性が似て日本語、中国語等で書かれていました。このようなことはいることもあり息が統合しました。そんなことから、一緒

日本でも時々タウン誌や街角でも見られますが、広告の量に食事をしたり、時には留学先周辺にいらっしゃる著明なは日本に比べるととても多いと感じました。

先生達の歯科医院を訪れ、共に勉強していました。そんな２年前に、コスメトロジー研究振興財団に採択いただい中、時々話していると感じていたのが、日本に一番近い国た助成金により、自己顔について研究をさせていただきまでありながら、審美に対する意識は、美容外科（形成外科）した。その結果は、以下のような興味深いものでした。自の普及をみても、日本人より高いということでした。その己顔は、口元が後方にあり、好みの横顔も口元が後方にあ疑問を解消するにあたり、10 年近く経った後コスメトロ

ったが、一般人は自己顔についてやや不満を感じていた。

ジー財団の支援により再び共に勉強する機会がもてるとは、

そこで、隣国である韓国の女性も同じように感じているの当然ですが当時は全く思っていませんでした。そこで今回、か、それとも審美に対する意識は日本人より敏感でありそ

日本人と韓国人の間で、自己顔の意識にどのような違いがうなので、異なる結果となるのでないかと考えました。結あるか明らかにすることを目的に研究を行いました。

果は、コスメトロジー研究報告 COSMETOLOGY にて。

韓国を訪れてみると、駅の構内はもとより街角でも、美最後になりましたが、本研究を進めるにあたりコスメト

容外科の手術前と手術後の写真が大きくクリニックの広告

ロジー研究振興財団からの助成に心から御礼申し上げます。

として多く見受けられました。日本のマスメディアでも大（北海道大学病院咬合系歯科矯正歯科）

きく取り上げられていましたが、現在は周辺のアジアの− 211 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

平成 25 年度

学術集会支援助成

日本動物実験代替法学会第 26 回大会を終えて
今井弘一

日本動物実験代替法学会は大学、企業や行政の研究者なの Horst Spielmann 教授、大阪大学 薬学部長の堤 康央 教

どから成り立っている日本学術会議の協力学術研究団体の授と京都大学 iPS 研究所副所長の戸口田 淳也 教授の３名一員で 3Rs（実験動物の苦痛軽減：Refinement、使用量のの先生方、さらに教育講演は、公益財団法人食品農医薬品

削減：Reduction、動物実験代替法の使用：Replacement）

安全性評価センター理事長の林 真 先生にお願いしました。

の促進、普及を目的とし、研究、開発、教育、調査等を行シンポジウムは JaCVAM 国際シンポジウムを筆頭に８つっています。この分野では我が国唯一の学術団体で、学術のシンポジウムに加えて最終日には市民公開シンポジウム

大会は毎年冬に定期開催されています。第 26 回大会は「動を開催しました。市民公開シンポジウムはチャレンジコン

物実験代替の基礎科学と新展開」のテーマで、平成 25 年

テストの他、京都市動物園 生き物・学び・研究センター

12 月 19 日㈭～ 21 日㈯に、京都テルサ（JR 京都駅より南約の田中 正之氏、European Commission の Anderson 先生

1.5km）にて開催致しました。昨年の大会は理化学研究所と黒澤先生にお話しをしていただきました。また、学会誌の杉山 雄一先生が慶應義塾大学薬学部 芝共立キャンパス

AATEX の活性化に向けてのワークショップも行いました。

にて大変立派な大会を開催されました。懇親会の内容も大

これらはチャレンジコンテストを除いて招待講演数は計

変すばらしく、次回の大会長を仰せつかった者としては大49 演題にも達しました。さらに、２つのランチョンセミ

きなプレッシャーがありました。

ナー、マンダム動物実験代替法国際研究助成研究報告会な第 26 回大会は組織委員長として㈱ノエビア執行役員のど多彩な企画を行いました。一般演題も過去最大の 75 演

奥村 秀信先生にお願いしましたところ快諾をしていただ

題ありました。発表していただいた方々には誌面をお借りきました。組織委員のメンバーは関西を中心にお願いしして感謝申し上げます。

ました。組織委員は、大森 崇（プログラム委員長、同志

学術大会には 400 名以上の参加者がありました。とくに

社大学 文化情報学部）、山下 邦彦（プログラム副委員長、

第一日目の 19 日には予想より多くの参加者があり、座る㈱ダイセル コーポレート研究所）、石井 宏（マルホ㈱京席がないほど会場が超満員となり、組織委員の先生方には

都 R&D センター 医薬開発研究所）、植木 拓朗（㈱ノエビ

急遽足らなくなった椅子を準備していただきました。通路ア）、加藤 雅一（㈱ J-TEC 研究開発部）、金森 健之（サも満員で夢かと思いました。JaCVAM の協力で海外からンスター㈱ H&B 事業部）
、斎藤 幸一（住友化学㈱生物環の参加者も多く、さらに懇親会でも予想をはるかに超えた境科学研究所）、寒水 孝司（京都大学大学院医学研究科）、参加者がありました。懇親会は京都伝統の京舞や笛などを仲原 聡（㈱マンダム 技術開発センター）、中村 牧（小林楽しんでいただきました。また、懇親会の前には京都府の製薬㈱中央研究所）、森本 隆史（住友化学㈱生物環境科学

協力で、ゆるキャラ「まゆまろ」にも登場していただきま研究所）、山本 裕（㈱ノエビア）（敬称略、順不同）です。

した。当日のスナップ写真は大会ホームページ（http://

とくに㈱ノエビアの植木さん、山本さんにはもの凄い量のjsaae26.jp/）で当分の間ですが公開しております。なお、仕事を１年間以上にわたって献身的にこなしていただきま

京都府、京都市環境政策局、京田辺市にはロゴマークなどした。途中から（㈱ノエビア）杉田 拓也さんはじめ、大の使用許可をいただきました。

阪歯科大学の橋本 典也 講師、本田 義知 講師、岡田 正弘

末筆ではございますが、公益財団法人コスメトロジー研

助教、廖 文 大学院生の各先生方にもお手伝いを賜りまし

究振興財団には貴重な学術集会支援助成金を賜り深謝致した。さらに、元大阪大学医学部で前会長の黒澤 努 先生にます。また、協賛 28 社、展示 22 社、広告５社、ランチョも顧問としてご助言を賜りました。皆さん貴重な時間を割

ンセミナー提供２社、物品提供３社、さらに、懇親会にはいて終始多大な協力をしていただきました。大会当日は写公益財団法人 京都文化交流コンベンションビューローか真撮影やアルバイトをしていただいた方々などさらに多くら補助を頂戴しました。大会成功の基盤となったこれらにの方々の貴重な協力を得ました。

関係者の方々には本当に心から感謝申し上げます。

プログラムは、特別講演をベルリン自由大学名誉教授（日本動物実験代替法学会第 26 回大会長− 212 −

大阪歯科大学）●
事業報告（平成 25 年度）
役員●

事業報告書

事業報告書（自平成 25 年 4 月 1 日

至平成 26 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2013

5

7

公募開始

全国 534 の大学、病院、研究機関等へ公募要領及び推薦書を送付、関連学術雑誌７誌、当財団 HP 他３機関 HP に掲載
7
8
公募締切り
応募数106件
7/19 〜 8/23
各選考委員による個別審査
9
4
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9
5
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9
6
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9 26
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成31課題を選考
11 28
理事会
本選考委員会より答申、助成課題決定
第24回 表彰・贈呈式
研究助成対象31課題の代表者へ、表彰状、助成金目録等を授与
記念講演
演題：角層を科学する
演者：慶應義塾大学医学部皮膚科 教授 天谷 雅行 先生
12 12
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額2,800万円《国際交流助成関連》
2013

6
7

19
16

審査
助成金交付

応募課題の審査
国際交流助成金の交付

50万円《学術集会支援助成関連》
2013

8
9

19
24

審査
助成金交付

応募課題の審査
学術集会支援助成金の交付

平成24年度事業報告及び収支決算報告の承認、補欠理事候補者の選出、補欠選考委員の選出、株主としての議決権行使、報告事項
平成24年度研究助成辞退１件の承認、平成24年度研究助成辞退１件に伴う繰上げ助成課題（次点）の承認
平成25年度（第24回）研究助成者等の承認、平成26年度事業計画及び予算案の承認、報告事項

50万円《理事会関連》
2013

5

30

第一回通常理事会

627

臨時（書面）理事会

1128

第二回通常理事会《評議員会関連》
2013

6

14

第一回定時評議員会

平成24年度事業報告及び収支決算報告の承認、補欠理事１名の選任、役員及び評議員の報酬等並びに費用に関する規程の一部改正に関する承認、評議員１名の辞任願いに関する承認、報告事項《その他》
１）報告書発行201351
研究中間報告集
91
研究完了報告集
２）情報公開（当財団HP）
2013
3 25
事業計画及び収支予算
4 12
公募要領
6 17
事業報告及び収支決算
6 27
役員の変更
9 12
研究報告の要旨
11 29
研究助成者及び課題名

研究業績 中間報告集 第22号
コスメトロジー研究報告 2013 vol.21
平成25年度事業計画及び収支予算書
2013年度「コスメトロジー研究」公募要領
平成24年度事業報告書及び収支決算報告書
二木鋭雄理事の就任、溝口昌子評議員の辞任
コスメトロジー研究報告 2013 vol.21 掲載課題の要旨
平成25年度研究助成者名及び研究課題名− 215 −

コスメトロジー研究報告Vol.22, 2014

平成 25 年度 助成を受けられた方々

１）研究助成（31 課題）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（９課題）
氏

名

所

属

研究課題

荒牧

賢治

横浜国立大学大学院
環境情報研究院落合秋人

新潟大学工学部
機能材料工学科斧田宏明

京都府立大学大学院
生命環境科学研究科

金井俊光

横浜国立大学大学院
工学研究院機能の創生部門

紫外線カットマイクロカプセルの作製齋藤彰

大阪大学大学院工学研究科
精密科学・応用物理学専攻

モルフォ蝶のミステリーに基づく、けばけばしくならない光輝粉体の開
発

佐藤

俊

独）産業技術総合研究所
環境化学技術研究部門

保湿性・抗菌性を有するバイオベースの新しいスキンケア素材の開発

竹岡敬和

名古屋大学大学院工学研究科

林昌彦

神戸大学大学院
理学研究科化学専攻

コスメトロジー素材に向けてのアロエC - グリコシルクロモン類の高機能
化

平田

修造

東京工業大学大学院
理工学研究科

明るい環境でより鮮やかに着色する有機材料の開発

紫外線吸収剤を内包したO/I1型ゲルエマルションの調製
天然由来の美白性ペプチド素材の探索とその作用機序の解明
新規リン酸亜鉛白色顔料の粒子サイズ制御

角度依存性のない構造発色性顔料の調製

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（15 課題）
氏

名

所

属

研究課題

市

育代

お茶の水女子大学大学院
人間文化創成科学研究科

宇都拓洋

長崎国際大学薬学部
薬品資源学研究室

柏谷英樹

鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 統合分子生理学

香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシンニューロンによる調節木村郁夫

京都大学大学院薬学研究科
薬理ゲノミクス分野

新規細胞膜上、女性ステロイドホルモン受容体を介した生理・病態機能
の解明

国定

充

神戸大学大学院医学研究科
内科系講座皮膚科学分野

スピルリナの紫外線皮膚老化抑制効果に対する検討およびそのメカニズ
ムの解明

白井

康仁

神戸大学大学院農学研究科

ケラチノサイト分化におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解明

新藤隆行

信州大学大学院
医学系研究科循環病態学講座

新しい生体ホメオスターシス機構に基づく、皮膚アンチエイジング法の
開発

榛葉

繁紀

日本大学薬学部
健康衛生学研究室

皮膚機能のサーカディアンリズムと時計遺伝子によるその調節機構の解
明

平良

淳誠

国立沖縄工業高等専門学校
生物資源工学科

酸化ストレス応答Nrf2 - Keap1系調節作用物質の探索と薬用化粧品への応用

必須脂肪酸欠乏時における皮膚障害発症のメカニズムの解明
天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究− 216 −

事業報告書

多田

政子

鳥取大学
染色体工学研究センター
染色体医療学研究部門

化粧品成分の安全性評価：CYP誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築

乃村俊史

北海道大学病院皮膚科

フィラグリンをターゲットにしたアトピー性皮膚炎の新規治療法の開発

早川盛禎

自治医科大学医学部
生化学講座病態生化学部門

IL-33デコイ受容体による皮膚炎症の制御

藤原裕展独）理化学研究所
発生・再生科学総合研究センター
細胞外環境研究チーム

皮膚感覚神経 - 毛包幹細胞相互依存における基底膜領域特殊化の役割

細川雅史

北海道大学大学院
水産科学研究院
生物資源化学分野

新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル - パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明

柳茂

東京薬科大学生命科学部

ミトコンドリア活性化による皮膚老化の抑制機序の解明と応用

第３分野：精神、文化に関する分野（7 課題）
氏

名

所

川添

裕子

松蔭大学
観光メディア文化学部
観光文化学科小原克彦

愛媛大学大学院
老年・神経・総合心療内科

中・高年の見た目年齢の解析

東京大学大学院工学系研究科
先端学際工学専攻

顔の魅力度認知における部分情報の統合と自己認知

三枝（安武）
千尋

属

研究課題
グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動－日常生活における宗教規範と美の実践佐藤和人

秋田県立大学
システム科学技術学部
機械知能システム学科

笑顔のリズムが創る印象空間の可視化と化粧効果の測定清水邦義

九州大学農学研究院

睡眠誘導効果をもつ（－）- 酢酸ボルニルの睡眠促進効果ならびに肌質改善効果

八谷 百合子吉永淳

産業医科大学保健センター
東京大学大学院
新領域創成科学研究科

リラックスおよび安眠効果に有用な植物芳香成分の探索
19 ～ 20世紀にわが国で使用された含鉛おしろいに関する研究

２）国際交流助成（１件）
海外派遣（１件）
派遣者
日下部 豊寿所

属

北海道大学病院
咬合系歯科矯正歯科

内容及び招聘者
韓国ウルサン大学 Sung教授
平成25年7月1日～ 12月31日の期間で３回渡航予定
テーマ「自己顔に対する意識に関する研究」

３）学術集会支援助成（１件）
実施責任者
今井

弘一

所

属

大阪歯科大学
歯科理工学講座

内容及び招聘者
日本動物実験代替法学会 第26回大会 平成25年12月19日～ 12月21日
テーマ「動物実験代替の基礎科学と新展開」− 217 −

コスメトロジー研究報告Vol.22, 2014

役

員
平成 26 年７月１日現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

土子

利明

元株式会社コーセー

理

事

宇佐美昭次

早稲田大学

理

事

関根

茂

日光ケミカルズ株式会社

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

廣部

雅昭

東京大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

山㟢

幹夫

元新潟薬科大学

監

事

小田倉正典

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員長

内藤

昇

株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

東邦大学

評議員

上野

芳夫

元東京理科大学薬学部

評議員

齊藤

勲

元厚生省大臣官房審議官

評議員

西岡

清

東京医科歯科大学

評議員

花輪

隆昭

元昭和館

評議員

原田

敬之

東京女子医科大学

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学常勤監査役

名誉教授
代表取締役社長

名誉教授
名誉教授

名誉教授
名誉教授
学長

取締役

名誉教授
教授

名誉教授

館長
名誉教授

名誉教授

− 218 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒 104 — 0032

東京都中央区八丁堀三丁目 11 番８号
ニチト八丁堀ビル五階
電話 03（3206）7721

コスメトロジー研究報告

Vol.22／2014

非売品

2014年９月１日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

土子 利明
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒104−0032 東京都中央区八丁堀三丁目11番８号
電話 03（3206）7721
エイエム企画〒170−0013 東京都豊島区東池袋三丁目15番２号
電話 03（3590）5375
太陽印刷工業

表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2014

商品デザイン部デザイン１課
不許複製

禁無断転載