皮膚の老化に伴うテロメア短縮化とフリーラジカル障害に対する、細胞内アスコルビン酸のエンリッチング化による防御効果
横尾誠

広島県立大学

生物資源学部生物資源開発学科一、長尾則男、三羽信 比古

Genuine degrees of cellular senescence of human skin are not necessarily in accordance with calender ages, and wereshown in the present study to be potently evaluated by measurement of length of telomeric DNA for a trace amount of
human skin trash prepared with the ordered instrument rasp. Telomeric DNA was shortened in a manner dependent on
calender ages (0-72 years old, n=28) of donors as shown by Southern blot using epidermal DNA isolated from human skin.
Prevention of age-dependent telomere shortening was achieved by pro-vitamin C, ascorbate-2-O-phosphate (Asc2P), but notby ascorbic acid(Asc) itself administered to human skin epidermal keratinocytes NHEK-F, which also acquired an elongatedlife span by 5.1 population doubling levels when administered with Asc2P but not Asc. UV-B induced cell mortality in humanskin epidermal cells HaCaT was prevented by Asc2P but not Asc. Thus, Asc2P but not Asc is shown to protect humanskin keratinocytes against telomere shortening, cellular senescence and UV-B injury.

１

緒④マウスでの皮膚癌転移の阻害効果。

言

この技術蓄積を活かして本研究では、次の点を解析する：

年齢を経るに伴って皮膚に各種の「老化症状」を生じる①ヒト皮膚表皮の角化細胞を用い、老化に伴うテロメア短が、この根本的な原因の一つとして、皮膚を構成する細胞縮化を解析し、皮膚老化の新規の指標になりうるかを明の「分裂速度」の低下が重要である

１−３）

らかにする、｡ この細胞老化や細胞寿命を規定する要因として、細胞分裂に伴う「テロ②老化に伴うテロメア短縮化を細胞内アスコルビン酸エンメア（46 本の染色体の両端を保護する DNA 繰り返し構造）リッチングによって人為的に防御できるかを調べる、の短縮化」が極めて本質的であるとして、近年急速に着眼③この作用機序として細胞内フリ−ラジカルの消長と皮膚老化との相関性を明確にするされ始めた。テロメアが短くなると、染色体が不安定となり、細胞寿命が尽きることが知られている４）｡２

一方、アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、36 億年もの生物進化の過程で淘汰選抜されてきた優れた抗酸化性の体内

２. １

実験

皮膚老化の新規の指標としての、テロメア長とテロメラーゼ活性の定量分子であるが、それにも関わらず、従来の研究では、外来的に動物に投与しても劇的な生物学的効果は少なかった。

①テロメア長は、（TTAGGG）4 を DNA プローブとして用このため我々は、アスコルビン酸に酸化抵抗性を付与した

い て、Southern blot を 行 な い、TRF（telomere誘導体を用いて、各種の動物細胞の細胞内アスコルビン酸ristriction fragment）として求める。我々は既にヒト臍

濃度を、細胞外濃度よりも 67 〜 120 倍もの「高濃度化」（エ帯静脈の血管内皮 HUVE 細胞でテロメア長を求めた４）。

ンリッチング効果）することを可能にした１−９） が、未修

②テロメラーゼは、癌細胞と生殖細胞では強い活性である飾のアスコルビン酸では９〜 21 倍に過ぎなかった。我々ため、僅か 10 〜 100 細胞でも検出できるが、正常な体はこの酸化抵抗型アスコルビン酸誘導体によって、従来は細胞では従来 10 ５〜 10 ６細胞でも検出できないことが多見られなかった顕著なフリ−ラジカル制御効果の幾つかをく、殆ど活性がないと見なされてきた。我々は、Shay

下記の通り見出した：博士による TRAP 法を改良して 10 ４個の正常細胞でも４−９）測定できる高感度な測定系を確立済みである４）｡①ウシ血管内皮細胞の過酸化脂質障害の防御、②ラット肝臓・心臓の虚血障害の防御、③これらの方法により、ヒト皮膚表皮の角化細胞で加齢（継③ヒト皮膚角化細胞の UV 障害の防御、代培養）に伴ってテロメアが短縮化し、テロメラーゼ活

Preventive effects of enrichment of
intracellular ascorbate on age-dependent
telomeric DNA shortening and free
radical injury in the skinSeiichi YOKOO, Norio NAGAO, Nobuhiko
MIWA＊＊性が消失することを示せると予想する。

２. ２

皮膚老化モデルとしての、ヒト皮膚表皮の角化細胞 NHEK-F の継代培養２、４）①この正常細胞（2 倍体の染色体）は，細胞分裂する積算

Laboratory of Gene Control Technology,
Department of BioTechnology, Hiroshima
Prefectural University School of BioSciences− 53 −

回数（populatio doubling lebel）が 27 〜 29 に達すると、それ以上は分裂できなくなり「分裂寿命」となる（Hayflick'slimit）。この１ラウンドに３〜４か月を必要とする。
②各継代培養ごとに一部の 細 胞 を 冷 凍 保 存 し、後 日 一 括 し て 解 凍 し、テロメア長とテロメラーゼ（テロメア伸長酵素）活性を測定する。

図１AlkPhos 標識プローブ／化学発光法によるテロメア計測の原理
制限酵素（HinfI）はサブテロメアの特定の塩基配列の部 で切断するが、テロメア部 では切断しないので、取得された DNA 断片（TRF：terminal restriction fragment）はテロメア全長を含む。
⑴ TRF の中のテロメア部分を認識する DNA プローブである（TTAGGG）4（分子 、約 7900）に酵
素 AlkPhos（分子 、約 80000）を架橋剤 FA で結合させて、AlkPhos で標識した DNA プローブを作製する。⑵この場合に、DNA プローブによるテロメア認識力も、AlkPhos の酵素活性も，いずれをも低下させないような結合反応条件が求められる。⑶架橋剤の添加 が多過ぎると、特に酵素の側の多数の部 で分子内架橋を引き起こすので不適切である。⑷と同時に、酵素と DNA プローブとは結合反応での混合比や添加濃度によっては、１：１（mol/mol）から逸脱した結合比となってしまい、テロメア検出に不適切となる。⑸発色団を含むリン酸エステル基質が酵素によって加水分解されてテロメアの 置で化学発光を生じる。

③各継代培養ごとに、細胞の継代直前密度（飽和細胞密度の 75％）と細胞サイズ分布をコールター・カウンターとチャネライザーで定量する。

２. ３

細胞内アスコルビン酸エンリッチング（高濃度化）による皮膚老化の人為的防御４、５、６）①各種の酸化抵抗型アスコルビン酸誘導体を細胞に投与し続けて、細胞内フリ−ラジカルを消去した場合、テロメア短縮化を防御して、細胞寿命を延長するかを調べる。
②この逆に、細胞死を起こさない程度のＨ２O ２や紫外線Ｂ波を弱いストレスとして負荷し続けた場合、テロメア短縮化が促進して、細胞寿命を縮めるかも、併せて調べる。

３
３. １

結果

テロメア計測技術の高感度化

従来のテロメア測定法はテロメアを識別する（TTAGGG）４
DNA プローブの 5 ' 末端を［32 P］標識してサザンブロットで検出していた。著者らは 300 bp 未満の DNA には不向きとされてきた AlkPhos/FA 標識を 24 bp のプローブでも高率化でき、これに適した ECL で強い化学発光を生じさせ従来の 15 〜 100 倍ほど高感度に初めて非放射能（NonRI）法での検出を可能とした（図１）２）｡DNA 20 ng（従来の検出限界は 300 〜 2000 ng）を用いて AlkPhos/FA—
ECL サザンブロットで定量できた（図２）。
テロメア測定工程としては①皮膚擦過屑を回収②界面活性剤による細胞膜の溶解、RNA と蛋白の除去でDNA を抽出③ DNA をサブテロメア部分で制限酵素（HinfI）で切る④ DNA 断片の混合液をアガロースゲル電気泳動で分離

図２ AlkPhos 標識プローブ／化学発光法によるテロメア計測の感度
左 か ら 順 に 各 々 約 71000、43000、29000、14000、7100 個のヒト皮膚表皮細胞からの抽出に相当する 100、60、40、20、10 ng の DNA を制限酵素 HinfI で切断してテロメアを化学発光法で検出した。20 ngDNA（14000 細胞）で検出できることが示された。従来の放射能標識法は 100 万細胞が必要だった。

⑤ DNA 断片を別の膜に転写
４DNA プローブが⑥ AlkPhos 結合させた（TTAGGG）⑦酵素作用で化学発光を生じる反応物を与えるとテロメア部分だけが化学発光し、これをＸ線フィルムで感光。

テロメア含有 DNA 断片だけと結合− 54 −

皮膚の老化に伴うテロメア短縮化とフリ−ラジカル障害に対する、細胞内アスコルビン酸のエンリッチング化による防御効果

３. ２

ヒト皮膚表皮のテロメアの年齢依存性短 縮化し 72 才までほぼ直線的に短縮化していることを

Cooke のグループはヒト皮膚片が年齢に伴ってテロメア

AlkPhos 標識プローブ法で見出した（図３、４）。ヒト皮短縮化を受けると報じたが、表皮・真皮の他に皮下組織も膚表皮がテロメア短縮化を伴って老化していることを初め含みその含有率も不揃いだった。著者らは各年令のヒト皮て示し、日本人の基準となる皮膚表皮テロメアの年齢依存膚片から表皮側を単離して DNA 抽出した結果、TRF（テ性の１次方程式も算出した。

ロメア全長含有 DNA 断片）は０才の 11 . 6 kb から次第に

図３

ヒト皮膚表皮のテロメア長の年齢依存的な短縮
サザンブロットでの TRF（テロメア全長含有 DNA 断片）の電気泳動パターンにおいてスミア（ホウキ星状の感光部分）の「位置」が上であるほどテロメアが長いことを示す。したがって、若年→中年→老年……と老化するに伴ってテロメアの位置が下になってきているが、これはテロメア短縮化を意味する。テロメアは０才の 11.6kb から次第に短縮化し 70 才までほぼ直線的に短縮化していることを AlkPhos 標識プローブ法で見出した
図４ ヒト皮膚表皮のテロメア年齢における診断シ
ステムの検 基準線の作成
サザンブロットをデンシトメトリによってピーク 置と半値幅を求めてグラフ化した。年齢に伴ってテロメアが直線的に短縮化するが、10 才ほど年を取るとテロメアは約 1kb ずつ短くなることを示す。日光への露出部 と非露出部 との皮膚で短縮化率に違いがあるかは未確定だが、少なくとも圧倒的な差異があることはなかった。

− 55 −

３. ３

ヒト皮膚表皮の角化細胞 NHEK—F のテロメア短縮化
ヒト表皮角化細胞 NHEK—F は細胞分裂回数を経るに伴ってテロメアが短縮化していた。我々は既にヒト静脈血管内皮細胞が細胞分裂回数を経るに伴ってテロメア短縮化が見られることを見出した４）が、これと同様な結果だった。
ところがプロビタミン C の Asc 2 P を継続的に投与しておくと、テロメア短縮化が抑制され、細胞寿命も増大した。
NHEK—F は 9 . 0 回まで細胞分裂して分裂停止した。プロ ビ タ ミ ン Ｃ の ascorbic acid—2—O—phosphate—Mg 1 . 5（Asc 2 P）を添加しておくと、13 . 7 回まで細胞分裂できるようになり細胞寿命が延長されたが、Asc（未修飾ビタミン C）添加では 8 . 9 回の分裂に止まった（図５）。これは通常１mm 2 にしか細胞増殖しない皮膚細胞が Asc 2 P による細胞寿命延長で、24 mm 2 の皮膚面積にまで達する生涯細胞供給能をもたらすことを意味する（図６）。Asc 2 P 添
加は細胞増殖速度の点でも対照の 2 . 6 倍に増大させ、皮膚の細胞供給速度も供給細胞数も向上させると示唆された（図７）。テロメア長（TRF）は分裂停止前の対照細胞が6 . 8 kb、Asc は 6 . 3 kb であるのに比し、7 . 3 kb と維持することが示された（図８）。

３. ４

皮膚の近い将来の老化度を予測する先行指標

皮膚テロメア診断は「肌の今の外見は良いが、今後は急

図６ 正常ヒト皮膚表皮由来の角化細胞 NHEK—F の生涯細胞供給力（Life-long Cell Supplying Ability）
ヒト新生児の皮膚 1mm2 の表皮細胞 NHEK—F は、細胞寿命が尽きるまで 477mm2 相当（「切手」サイズ）の 算 積分にまで増殖する。しかし、Asc2P 投与によるテロメア維持を介して、54％多くの回数分、細胞分裂するので 算 積 13300mm2（一万円札サイズ）にまで増殖し、生涯での細胞供給総数を 27.9 倍に増大したことになる。

変するのか、維持されるか」を明確にする。このため化粧

図５ 正常ヒト皮膚表皮由来の角化細胞 NHEK—F の細胞分裂
寿命
この角化細胞は 8.9 回まで細胞分裂してその後に分裂停止した。プロビタミンＣの ascorbic acid—2—O—phosphate—
Mg1.5（Asc2P）を添加しておくと、13.7 回まで分裂できるようになり細胞寿命が延長されたが、Asc（未修飾ビタミンＣ）添加では 8.9 回の分裂までに止まった。

図７ 正常ヒト皮膚表皮由来の角化細胞 NHEK—F の細胞増殖速度
Asc2P 投与は無投与の 2.6 倍の細胞増殖速度に増大させ、皮膚の細胞供給速度も供給細胞数も向上させるので、老化防御に働くと考えられる。

− 56 −

皮膚の老化に伴うテロメア短縮化とフリ−ラジカル障害に対する、細胞内アスコルビン酸のエンリッチング化による防御効果①今まで肌の受けた環境要因や肌ケアの良悪を判定する②外見の肌状態からは判らない近い将来に起こる皮膚変化を予測するにある。
テロメア計測の従来技術は、多量の細胞（100 万個以上）が必要なため、人体から外科手術で 5 mm 2 程度の組織を摘出する必要があった。しかし、人体の皮膚などから微量の皮膚擦過屑を苦痛なく採取することは従来は困難だった。
著者らは顔の皮膚のテロメア長を計測して DNA レベルでの肌年齢が判る診断システムを確立した。
①針の形状・材質、植込み密度・角度、植針面に各種の工夫を凝らしたラスプ（極細径ステンレス極短針を高密度に植えたディスポブラシ）で頬の皮膚を無痛、無出血、無痕跡に擦る。テープストリピングは局所的に皮膚を損傷し、DNA が粘着剤に包埋され後工程に支障を来す。
図８ 正常ヒト皮膚表皮由来の角化細胞 NHEK—F の細胞分裂に伴うテロメア短縮化
この角化細胞は細胞分裂に伴ってテロメアが下限（TRF6.8kb）まで短縮化する。一方、Asc2P 投与による細胞寿命延長の場合はテロメア短縮化が緩慢で済んだ。しかし、寿命延長の場合もテロメア下限に近づくと同様に寿命が尽きる。この事実はテロメア短縮化速度が寿命の長短を決めると共に、一定値のテロメア下限までの短縮化が寿命の長短に関わらず寿命限界をもたらすことが示された。無投与細胞が分裂停止する直前の時点で比較すると、無投与細胞のテロメア長（TRF）は 6.8kb、Asc 投与では 6.3kb であるのに比し、Asc2P 投与では 7.3kb と維持されている。

②皮膚擦過屑の付いたラスプ部分を切り離して搬送する。

品消費者は今の肌の手入れ法や使用化粧品が適正かどうか生殖組織で高活性で、正常成人の体細胞は活性がないと見を知る客観的な判断材料となる。「細胞の増殖速度」は死なされていたが、PCR を用いた TRAP 法で測定が高感度んだ皮膚細胞を補充する迅速性に関わるが、細胞増殖速度となった（Methods Cell Sci.' 95）。テロメア長は DNA 複は暦年齢に画一的に規定されるのではなくテロメアの長短製の度に 50 〜 150 bp ずつ短縮する（EMBO J. ' 92）が，によって規定されていることを著者らは示した③ 48 —72 時間後に DNA 肌年齢が分かる。
テロメアとテロメラーゼの実体と生物学的意義の解析は近年、急展開した。老化に伴ってテロメア長が 12 〜 15 kbから５〜８kb に短縮化する（Nature 1990）が、これはヒト肺の繊維芽細胞についてであり、本研究の皮膚の角化細胞ではわかっていない。血管内皮細胞では我々が初めて見出した（Life sci., 1998 ; Fragr. J. 1997）。癌のテロメア長は細胞によって極端に長いか（> 15 kb）、短いか（< ５kb）が多いが、その周辺の正常組織は一定範囲内（６〜13 kb）だった（Int.J. Oncol. 1995）。テロメラーゼは癌と高酸素圧／フリ−ラジカルよる DNA 障害でもテロメア短。

２、４）①テロメア短縮化の急激な進行中で細胞増殖が維持されて縮化が起こる（Exptl. Cell Res. 1995）。この逆に、テロメいてもその直後に細胞増殖が遅延し始めることになる。

ア短縮化への抑制効果は、我々による細胞内アスコルビン②一方、テロメアが維持されていると相当期間に及んで未酸の高濃度化だけが有効例であり２、４）、他に報告例はない。

だ盛んな細胞増殖を維持できることを意味する。よって、

我々は、ヒト臍帯静脈の血管内皮 HUVE 細胞を継代培

見掛けの細胞増殖や外見だけでは「肌の曲がり角」に近養すると、細胞分裂の積算回数（PDL）が 27 で分裂が停

いかまだまだかは判別できず、テロメア計測でだけ判別止したが、細胞に酸化抵抗型できることになる。

ビン酸—2—O—リン酸（Asc 2 P）を 50 〜 130 µM 継続投与

４考

ビタミンＣの L—アスコル

すると、PDL 42 まで延命し、テロメア短縮化も減速させた。

察継代開始で 12 kb あったテロメア長は７kb にまで短縮化

従来は肌年齢を科学的に実証する客観的な方法が殆どなすると、細胞分裂が停止することは違いないが、テロメアかった。皮膚では真皮よりも表皮の方が紫外線Ｂ波・皮脂・短縮化の減速が細胞寿命の延長に直結するを初めて示した。

微生物の影響を受けて老化が進行するので、表皮角化細胞

我々は HUVE 細胞がテロメラーゼ活性を微弱ながらものテロメア長を測定することが皮膚老化度の評価に有意義つことを、PCR を用いた TRAP 法で見出だし、かつ、細となる。テロメア長は測定時直前の生理状態や気候条件に胞の加齢に伴ってテロメラーゼ活性が次第に消失するが、左右されない真の皮膚老化度（肌年齢）を客観的に算定で延命効果のある Asc 2 P を投与した HUVE 細胞ではテロきる。肌年齢を診断する意義は、メラーゼ活性が長期間に及んで保持できることも示した。

− 57 −

細胞外のアスコルビン酸（Asc）は細胞内に取込まれて、 （参考文献）
細胞外濃度の８〜 22 倍に濃縮蓄積される程度であるが、

１）三羽信比古・編「バイオ抗酸化剤プロビタミン C 〜

Asc 2 P は細胞内取込みに伴って脱リン酸化され Asc の形

皮膚傷害・ガン・老化の防御と実用化研究〜」フレグラ

で 67 〜 120 倍という高濃度に細胞内に濃縮蓄積される

ンスジャ−ナル社（1999）

ことを、各種（血管内皮・線維芽・表皮角化・悪性黒色腫）

２）横尾誠一ら：Fragrance J. 27（7）: 69 - 74（1999）; 日細胞で我々は見出した４〜６、８、９）｡ ヒト・マウス皮膚表皮の角化細胞への紫外線Ｂ波の照射による細胞死は、Asc は本香粧品科学会第 24 回学術大会 ,p. 67（1999）
３）三羽信比古：「ビタミンＣの知られざる働き」、Sci &

抑えないが、Asc 2 P 投与で抑制されることを我々は WST—１法（ミトコンドリア脱水素酵素活性）と Ethidium

Technol Series 第 33 巻、丸善（1992）
４）Furumoto K, Inoue E, Nagao N, Hiyama E & Miwa

homodimer ／蛍光プレートリーダー法（細胞膜障害）で見出した（Cell. Mol. Biol. Res. ' 95）。今回ヒト皮膚表皮のN : Life Sci. 63 : 935 - 948（1998）
５）Fujiwara M, Nagao N & Miwa N : Free Radical Res.

角化細胞でも同様な細胞防護効果を見出したことになる。

27 : 97 - 104（1997）

この時、Asc 2 P は脱リン酸化されて細胞内 Asc を高濃度

６）Kanatate T, Nagao N & Miwa N : Cell.Mol.Biol.Res.,化し、紫外線による DNA 鎖上のシクロブタン型ピリミジ

41 : 561 - 567（1995）; Biomed.Gerontol. 19 : 78 - 81（1995）

ン２量体の形成（Anti—CPD—Ab を用いた Slot blot）、ヌ７）Saitoh Y, Nagao N & Miwa N : Mol. Cell.Biochem.,

クレオソーム間 DNA ２本鎖切断（共焦点レーザー顕微鏡

173 : 43 - 50（1997）を用いた TUNEL 法、アガロース電気泳動）、癌抑制遺伝８）Kageyama K, Nagao N & Miwa N : Anticancer Res.

子 p 53 発現（野生型と変異型 p 53 を識別した免疫染色，19（5）: 4321 - 4326（1999）; J. Cancer Res. Clin. Oncol.

ウエスタン・ブロット）のいずれもを抑えた。紫外線を照122 : 41 - 44（1996）; Cancer Biochem. Biophys. 14 : 273 -

射された皮膚の角化細胞の内部にはフリ−ラジカルが多量生じることは、蛍光色素 CDCF Ｈ／共焦点レーザー顕微280（1995）
９）Liu J-W, Nagao N & Miwa N : Anticancer Res. 20（1）

鏡法、スピントラップ剤 DMPO ／電子スピン共鳴（ESR）法で定量したが、今後 Asc 2 P による防護効果におけるフリ−ラジカル消長をより詳細に解析する予定である。

− 58 −

113 - 118（2000）;Oncol Res. in press（2000）