創薬のための毛嚢を有する in vitro 人工皮膚モデルの開発
岡山理科大学理学部臨床生命科学科

片岡健

The skin has a complex tissue architecture composed of a large variety of cell types of ectodermal and mesodermal
origins. Most of these cells are produced from corresponding progenitor/stem cells by tightly regulated mechanisms. In
our previous studies, we have demonstrated the utility of in vivo skin reconstitution assay. The characteristics of this assay
system we used are that the cells in a mixed suspension segregate from each other and actively form tissue architecture
through cell-cell and cell-environment interactions.
However, few studies have succeeded in generating a three-dimensional ( 3 D) tissue-like structure. During
embryogenesis, the cells accumulate and form complicated organ structure. Cellular interactions of epithelial, mesenchymal
and endothelial progenitors are very important steps of this early organogenesis.
In this study, we have generated a 3 D tissue-like structure in vitro using mouse skin epidermal and dermal cells mixed
with human umbilical vein endothelial cells and mesenchymal stem cells. These cells formed a 3 D spheroid within 72 hours
after inoculation on a Matrigel-coated dish. Epidermal keratinocytes were mainly located at the surface of the spheroids
and endothelial cells were positioned inside of the spheroids. Mixed cell spheroids formed hair follicles 3 weeks after
subcutaneous transplantation into the back skin of nude mice.

1. 緒ている浅い損傷であれば、バルジから供給される表皮幹細言胞や周囲の細胞の進展によって速やかに治癒に至る。しか皮膚は身体の表面を覆う最大の組織であり、微生物や抗し、皮下組織の脂肪組織や筋層まで損傷が達し付属器が残原などによる身体への侵入を防ぐための被覆・防御機能が存していない時、周囲の細胞による完全な治癒には非常に発達した組織の 1 つでもある。皮膚の構造は表面より表皮長い時間がかかる。その場合、患者の皮膚を採取して移植層、真皮層、脂肪や筋層などの皮下組織に分類される。さする自家植皮法が行われる。さらに広範囲な損傷においてらに付属器と呼ばれる毛嚢、汗腺、皮脂腺などを有するこは自家植皮に使用できる皮膚が不足するため、代わりに同とにより、体温調節や乾燥予防、排泄などの複合機能を発種・異種の培養皮膚シートを利用した治療が現在行われて揮する。これらの機能を維持するために、表皮に存在するいる 5）。この皮膚シートは表皮ケラチノサイトと真皮線維幹細胞が絶えず体細胞分裂を繰り返している。この幹細胞芽細胞により構成され、皮膚の被覆・防御機能は有していはバルジと呼ばれる皮脂腺の根元部分に存在し、上下方向る。しかし、毛嚢、汗腺、皮脂腺などの付属器を欠損してに分化することで皮膚表面と付属器の両方へ表皮細胞を供いる。このように創傷治癒した皮膚が付属器を欠損してい給していることが知られている。このバルジには毛嚢の幹ることは、皮膚の美容や体温調節など生理的に大きな問題細胞と色素幹細胞も存在していることより、皮膚は幹細胞であり、付属器を有する正常により近い皮膚の供給が望ま1）に富んだ組織でもある 。また容易に採取することもできれている。

るため、皮膚は組織細胞を用いた治療が最も進んだ組織でこれまでの研究において我々は、移植したマウスの表皮もある。初めてヒト表皮細胞の培養に成功したのは 1970細胞と真皮細胞に由来するほぼ完全な皮膚組織が形成され年代である 2, 3）。その後、重症熱傷患者から採取した表皮る in vivo 皮膚付属器形成モデルを開発した 6）。これは胎細胞を培養して表皮細胞シートを作製し、その患者へ移生 16 日目 ICR マウスより単細胞として回収した表皮細胞植したことが 1981 年に報告されている 。これが組織工と真皮細胞を 1.0 × 107 cells ずつヌードマウスの背側部に学の手法を用いた再生医療による世界初の治療症例であっシリコンチャンバーを用いて移植する方法である。この方た。通常、真皮に到達していない、または付属器が残存し法により移植 3 週間後には、ICR マウスに由来する毛嚢や4）皮脂腺などの付属器を有したほぼ完全な皮膚組織が形成されていた。一方で、このような付属器を有する皮膚組織をin vitro で作製することは非常に困難である。
In Vitro Artificial Skin Model withAppendages for Drug Discovery
Ken Kataoka
Department of Life Sciences, Okayama
University of Science

近年、武部らは、iPS 細胞に由来する肝臓細胞を血管内皮細胞と間葉系幹細胞と共に培養しマウスへ移植すると、機能を有する肝臓組織を形成する肝臓の組織原基の作製に成功した 7）。これは複数種の細胞が 3 次元構造を形成しな− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

がら分化できる環境を保証することで、発生初期のプロセに混ぜ合わせた。

スを培養環境内で再現し組織を形成させる方法である。この方法を皮膚の組織原基へ応用した。また Chih-Chiang ら

2. 3. 免疫染色は付属器の再生過程においてマクロファージが重要な役割8）を果たすと報告した 。

混合培養 72 時間後の細胞塊を OCT コンパウンドで包埋し、液体窒素を用いて凍結ブロックを作製した。薄切以上より、我々は武部らの方法を参考に in vitro におけはクリオスタットを用いて 7 µm の厚さに調整し、蛍光免る組織原基形成実験を行い、混合培養に使用した各細胞の疫染色に用いた。一次抗体には抗体 Pan-Cytokeratin 抗局在を調べた。並びにマクロファージを加えて作製した組体（Sigma）、CD31 抗体（DAKO）を用い、二次抗体には抗織原基をマウスへ移植する皮膚組織形成実験を行い、付属

Anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 抗体と Anti-mouse IgG器を有する正常により近い皮膚組織の形成を目指し検討しAlexa Fluor 594 抗体を用いた。

た。

2. 方

2. 4. 細胞のラベリングとその観察法

混合培養に使用する細胞をあらかじめ蛍光色素でそれぞ2. 1. 細胞の調製れラベリングした。このラベリングには molecular probes

妊娠 16 日目 ICR マウス（日本クレア）胎仔より採取したキット（Life technologies）を利用した。混合培養に使用す

背部皮膚を、ディスパーゼ II 溶液に浸して４℃で 24 時間る細胞をあらかじめ PKH67（真皮細胞）、PKH26（hMSC）、処理し表皮層と真皮層に分離した後、トリプシン・EDTACLARET（HUVEC）でラベリングし混合培養した後、凍溶液処理（15 分）により単細胞とした。ヒト血管内皮細結ブロックを作製しクリオスタットを用いて 7 µm に薄切胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、し蛍光観察した。

ヒ ト 間 葉 系 幹 細 胞（Human Mesenchymal Stem Cells：

3. 結hMSC）の初代培養細胞（クラボウ）を推奨されている培地を用いて培養し、3 次元培養用に調製した。マクロファー

果3. 1. in vitro 組織原基の形成

ジは ICR マウス（8 週齢メス、日本クレア）の腹腔へ 3.84 g/

我々が武部らの手法を参考にマウス胎児由来の表皮細胞、dL に調整したチオグリコレート培地 2 mL を投与し、72真皮細胞を hMSC、HUVEC と混合してマトリゲル上で培時間後に腹腔より回収した。

養したところ、散在していた細胞は徐々にまとまり始めた。
培養 24 時間後には播種した細胞はほぼまとまり、72 時間

2. 2. in vitro 組織原基形成実験

後には１つの球状な細胞塊を形成していた（図 1）。

あらかじめマトリゲルでコーティングした 24well プレー
トに表皮細胞、真皮細胞、HUVEC、hMSC を 2：2：3：1

3. 2. 形成された組織原基の免疫染色6の割合で総数 2.0 × 10 cells/well となるように播種し、表3 次元混合培養により形成された細胞塊において、構皮細胞用培地と血管内皮細胞用培地を等量混ぜ合わせた培成細胞であるマウス表皮細胞、マウス真皮細胞、HUVEC、地を用いて 3 次元混合培養を行った。マウスへ移植する実hMSC の配置を明らかにするために蛍光免疫染色を行った。

5

験にのみマクロファージを 2.5 × 10 cells/well となるよう細胞塊の蛍光免疫染色では細胞塊の表層にケラチン陽性の

図 1 形成された皮膚組織原基（培養 3 日目）− 76 −

A. 位相差顕微鏡像、B. H&E 染色像

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表皮細胞が局在しており、内部には CD31 陽性の血管内皮

3. 4. 組織原基の移植による組織形成実験細胞が存在していた（図 2）。

さらにこの細胞塊をヌードマウス皮下に移植したところ、数は少ないが移植部分に毛嚢形成が観察された（図 3）。さ3. 3. ラベリングした細胞の追跡

らにマクロファージを加えて作製した細胞塊をヌードマウ播種する細胞をラベリングした後に 3 次元培養を行い、スの背側部へ皮下移植し、その 3 週間後に組織形成能を評組織原基を形成した。形成された組織原基（細胞塊）を蛍光価するために移植部位の皮膚を採取して HE 染色を行った。

観察したところ、真皮細胞と HUVEC が共局在し、hMSC

興味深いことに、マクロファージが細胞塊中に存在していは細胞塊中に散在していた。

た方が移植細胞の定着率がよかった。これらの実験結果か

図 2 形成された皮膚組織原基の免疫染色像

緑：Pan-cytokeratin、赤：CD31

図3 皮膚組織原基移植3週後のヌードマウス皮膚組織（翻転して真皮側より観察している）
矢頭：形成された羽毛芽原基− 77 −

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らこの細胞塊は培養内で作成された人工的な皮膚付属器原（引用文献）
1） Nishimura E. K. et al: Mechanisms of hair graying:

基と考えられた。

incomplete melanocyte stem cell maintenance in the4. 考察とまとめ

niche. Science 307: 720-724, 2005

in vitro 組織原基形成実験において、細胞塊を構成して

2） Rheinwald JG and Green H: Serial cultivation of

いる 4 種の細胞の局在をほぼ明らかにした。細胞塊の表層

strains of human epidermal keratinocytes: the formationが表皮細胞、内部が血管内皮細胞により構成されている理of keratinizing colonies from single cells. Cell 6: 331-343,

由として、身体の表面を覆う役割に特化した表皮細胞の特1975性が大いに影響していると思われた。また真皮細胞と血管

3） Green H et al: Growth of cultured human epidermal

内皮細胞が局在していた理由として、真皮中には毛細血管

cells into multiple epithelia suitable for grafting. Natureが網状に張り巡らされており、生体環境の組織構造をそのscience 76: 5665-5668, 1979
4） O’ Connor NE et al. The Lancet 317: 75-78, 1981

まま反映しているのではないかと想定された。
ヌードマウスに移植した細胞塊から形成された毛嚢が少5） 井家益和 : 生物工学 92: 110-114, 2014

数であった原因として、生体細胞を培養系に移すことによ

6） Kataoka K et al: Participation of adult mouse boneって皮膚幹細胞の多分化能が失われたことが考えられる。

marrow cells in reconstitution on skin. Am J Pathol
163: 1227-1231, 2003

この問題を克服するためには、生体の微小環境に近い培養環境内で 3 次元混合培養し細胞の能力の低下を最小限に抑7） Takebe T et al: Vascularized and functional human

えた状態で移植するのが良いと考えられる。今後この原基

liver from a iPSC-derived organ bud transplant. Nature499: 481-484, 2013のヌードマウスへの移植効率を改善する方法を開発したい。

8） Chih-Chiang C et al: Organ-level quorum sensing
directs regeneration in hair stem cell populations. Cell
161: 277-290, 2015

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