黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明
名古屋市立大学大学院薬学研究科医療機能薬学専攻 衛生化学分野

伊藤佐生智

Staphylococcus aureus (S. aureus) colonizes approximately 30% of the population asymptomatically but causes various diseases such as food poisoning, suppurative disease, sepsis, or systemic infections. S. aureus is associated with atopic
dermatitis (AD); it frequently colonizes in the skin of atopic dermatitis. S. aureus is notorious for producing a series ofexotoxins and immune disturbing proteins, however none of the staphylococcal exotoxins except with δ-toxin and phenol
soluble modulins had been reported to activate mast cells and basophils, critical immune cells involved in the developmentof Th2 cell-mediated allergic inflammation such as atopic dermatitis. In this study, we aimed to identify staphylococcal exotoxins that activate mast cells and basophils. We found that α-hemolysin, a principal small β-barrel pore-forming toxin, did
not activate mast cells individually, but it augmented the degranulation induced by other stimuli. We showed that among 14
members of staphylococcal superantigen-like protein, SSL12 induced the degranulation and cytokine production of mast cellin an IgE-independent manner, and SSL12 evoked local inflammation in vivo. We also showed that SSL12 induced the production of IL-4 in bone marrow derived basophils and freshly isolated murine basophils in bone marrow cells. These results
propose the novel immune regulatory activity of α-hemolysin and SSL12 by activating mast cells and basophils that contributes to the development of allergic inflammation disorders such as atopic dermatitis.

1.

緒胞の脱顆粒を引き起こすことが示され 1 , 2），これらのペプ

言

チド性毒素がアトピー性皮膚炎増悪因子の一つであるとい

アトピー性皮膚炎は皮膚の炎症を伴う疾患であり，そのう考えが受け入れられている．しかしながら他の黄色ブド炎症においてはマスト細胞が中心的な役割を果たしている．

ウ球菌毒素もアトピー性皮膚炎の発症増悪に関与している

また血液中の存在割合は少ないが多量の IL- 4 を産生する可能性は依然残されている．本研究ではマスト細胞と好塩好塩基球もアトピー性皮膚炎の病態形成に関与している．

基球を活性化する黄色ブドウ球菌毒素を探索し，その生理一方，黄色ブドウ球菌は一部の健常人においても検出され機能を解析することで，黄色ブドウ球菌とアトピー性皮膚る常在菌であるが，食中毒，化膿性疾患や敗血症の起因菌炎の毒素を介した関係を明らかにすることを目指した．

でもある．黄色ブドウ球菌はアトピー性皮膚炎患部で高頻２．方度に検出されることが知られており，本菌とアトピー性皮膚炎との関連が指摘されている．黄色ブドウ球菌は溶血毒法

2. 1. 組換え黄色ブドウ球菌毒素の調製

素ヘモリジンや白血球崩壊毒素ロイコシジン，MHC と黄色ブドウ球菌毒素，免疫かく乱タンパク質は大腸菌をTCR を非特異的に架橋して T 細胞の非特異的活性化を引用いた組換えタンパク質として調整した．黄色ブドウ球菌

き起こすスーパー抗原，スーパー抗原活性も示す腸管毒素

ATCC 27733 株のゲノムより Primestar GxL（Takara）をエンテロトキシンなど多彩な外毒素を産生する．さらに本用いて増幅後，発現プラスミド pCold-II（Takara）にクロ菌は IgG の Fc 部に結合し，抗体の機能を阻害する Protein

ー ニ ン グ し た 後， エ ン ド ド キ シ ン の 産 生 能 を 欠 い た

A をはじめとする，多彩な免疫かく乱タンパク質を産生す

ClearColi（Lucigen）に形質転換した．続いて IPTG 及びコる．以前より黄色ブドウ球菌由来タンパク質がアトピー性ールドショックにより組換え毒素を N 末端 6 xHis 融合タン

皮膚炎の発症・増悪に関与している可能性が指摘されていパク質として発現誘導した．大腸菌を回収し，超音波処理たが，マスト細胞や好塩基球を活性化する毒素は見出されにより破砕後，Ni セファロース 6 FF（GE healthcare）を用ていなかった．最近黄色ブドウ球菌のペプチド性溶血毒素

いて精製し，PBS に対して透析して調製した．

である δ 毒素や PSM（phenol soluble modulin）がマスト細2. 2. 好塩基球・マスト細胞の調製
マスト細胞は BALB/c マウス骨髄細胞を 10 ％ FBS，ペInvolvement of staphylococcal immunedistubing proteins in atopic dermatitis

ニシリン，ストレプトマイシン , 2 - メルカプトエタノール

Saotomo Itoh及びマウス IL- 3 を添加した RPMI 1640 培地で存在下 4 週

Department of Molecular and Cellular
Health Science, Graduate School of
Pharmaceutical Science, Nagoya CityUniversity

間培養することにより調製した．好塩基球はマウス骨髄細胞を上述の条件で 2 週間培養したのち，c-Kit 陽性細胞をビオチン化抗 c-Kit 抗体（BioLegend）とストレプトアビジ− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021ンを共有結合した磁気ビーズ（IMAG Streptavidin Particlesは検証されていなかった．そこで Hla のマスト細胞の活性

Plus DM，BD Bioscience）を用いて除去することにより調化に対する影響を解析した．先行研究と同様に，Hla は製した．調整したマスト細胞，好塩基球の確認は c‒Kit 及

30 µg/mL 以下の濃度でマスト細胞を傷害せず，脱顆粒もび FcεRI の発現をフローサイトメーター（FACD Verse，誘導しなかった．一方でマスト細胞を IgE- 抗原複合体，BD Bioscience）で解析することにより行った．

イオノフォアで処理した際に誘導される脱顆粒は Hla 存在下で 2 倍程度に増強された（図 1 AB）．この脱顆粒増強作

2. 3. マスト細胞，好塩基球細胞機能に対する組換え毒素の影響

用は Hla の濃度依存的であり，10 µg/mL 以上の Hla の存在下で増強作用が観察された（図 1 C）
．また Hla による脱顆

組換え毒素のマスト細胞の脱顆粒誘導活性及び細胞傷害

粒増強作用はカリウムイオンとナトリウムイオンの濃度を活性は各々顆粒酵素 β‒ ヘキソサミニダーゼ（βHex），細胞細胞内の濃度に一致させた緩衝液中では観察されなかった

質酵素乳酸脱水素酵素（LDH）の放出により評価した．タ（図 1 D）
．膜孔形成能を欠いた二つの Hla の変異体｛Hla5

イロード液に懸濁したマスト細胞（1 × 10 /well）を毒素存（H 35 L）；溶血不全変異体，Hla（PSGS）；膜孔の本体であ在下で 37 ℃，30 分インキュベート後，遠心して上清を回る β-ステムに相当する領域を PSGS の 4 アミノ酸に置換し収した．上清中の βHex の酵素活性を p- ニトロフェニル ‒た変異体｝では脱顆粒増強能が認められなかった（図 1 E）．

N‒ アセチル ‒β‒D‒ グルコピラノシド（富士フィルム）を基

以上より Hla は単独ではマスト細胞の脱顆粒を惹起しない質として測定することで脱顆粒誘導活性を評価し，LDHが，他の刺激によるマスト細胞の脱顆粒を増強すること，の酵素活性を Cytotoxicity LDH Assay Kit‒WST（同仁化この脱顆粒増強作用には Hla による膜孔形成が必要である学）を用いて測定することで細胞傷害活性を評価した．好ことが示された．

塩基球およびマスト細胞のサイトカイン mRNA の発現はし，3 時間後に細胞を回収し，RNA を抽出した．全 RNA

3. 2. Staphylococcal superantigen-like 12によるマスト細胞の活性化作用を Primescript RTMastermix（Takara）を用いて逆転写し黄色ブドウ球菌のStaphylococcal superantigen-like（SSL）

た の ち，Thermal cycler Dice Real-Time System 及 びファミリーはスーパー抗原と類似の立体構造をとりながら，SYBR Green Premix Ex Taq Kit（Takara）を用いて個々スーパー抗原活性を示さない 14 種からなる分泌毒素であのサイトカイン mRNA 発現量を測定した．サイトカインる．私たち及び海外のグループにより，SSL ファミリーは定量的 RT-PCR により評価した．106 の細胞を毒素で処理

6

タンパク質は ELISA により測定した．10 の細胞を毒素で種々の免疫関連分子を標的とし，その機能を阻害すること処理し，24 時間後に培養上清を回収し，上清中のサイトで免疫回避に働く免疫かく乱タンパク質であることが示さ

カ イ ン 量 を eBioscience ELISA Ready-SET Go（Thermoれている 3）．しかしながら SSL ファミリーのマスト細胞にfisher）を用いて定量した．

対する作用は解析されていなかった．そこで SSL ファミリーがマスト細胞を活性化するか否かを検討した．14 種の2. 4. 組換え毒素による局所炎症誘導作用

SSL のうち，SSL 1 から SSL 11 及び SSL 13 はマスト細胞毒素による局所炎症惹起作用はエバンスブルー漏出試験の脱顆粒を誘導しなかったが，SSL 12 はマスト細胞の脱により評価した．BALB/c マウスに 1 % エバンスブルー溶

顆粒を惹起し，SSL 14 も SSL 12 に比べ 1 / 20 程度である液を尾静脈より投与し，耳介に組換え毒素を皮内投与した．

が脱顆粒を誘導した（図 2 AB）．SSL 12 によるマスト細胞30 分後，血管からのエバンスブルーの漏出を観察した．の脱顆粒の誘導は濃度依存的であり，1 . 1 µg/mL 以上の写真撮影後，耳介をホルムアルデヒドで抽出し，620 nm

SSL 12 によって有意に脱顆粒が誘導された（図 2 C）
．先にの吸収を測定することでエバンスブルー漏出量を評価した．

報告されている δ 毒素はマスト細胞に対し βHex と同時に

３．結LDH の漏出を引き起こしたが，SSL 12 は 30 µg/mL まで

果の 濃 度 に お い て LDH の 漏 出 を 引 き 起 こ さ な か っ た（ 図3. 1. 溶血毒素αヘモリジンによるマスト細胞の応答増強作用

mRNA の発現とタンパク質分泌を誘導した（図 2 E~H）．

α ヘモリジン（Hla）は黄色ブドウ球菌の産生する代表的さらにあらかじめエバンスブルーを静脈投与したマウスのな溶血毒素であり，標的細胞表面でホモ 7 量体からなる膜

耳介に 10 µg の SSL 12 を投与したところ，エバンスブルー孔を形成し，標的細胞を傷害する．Hla はマスト細胞の活の血管外への漏出が認められた（図 3）．以上より SSL 12 は性化を惹起しないことがすでに報告されているが 2），免疫直接マスト細胞を活性化し，局所炎症を惹起することが示複合体など他の刺激によるマスト細胞活性化に対する影響された．

2 D）． ま た SSL 12 は マ ス ト 細 胞 の IL- 6 及 び IL- 13 の− 72 −

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明

図1

Hlaによるマスト細胞の脱顆粒増強作用− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図2

SSL 12によるマスト細胞の活性化− 74 −

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明られた（図 4 B）
．この IL- 3 処理骨髄細胞から c-Kit 陽性細胞を除去して好塩基球を調製し（図 4 C），SSL 10，SSL 12，
SSL 14 による IL- 4 産生を評価したところ，SSL 12 のみが好塩基球からの IL- 4 産生を誘導した（図 4 D）．また熱処理した SSL 12 では IL- 4 誘導能は認められなかった（図4 D）．SSL 12 による好塩基球からの IL- 4 産生は濃度依存的であり，0 . 1 µg/mL 以上の SSL 12 によって有意な IL- 4産生が認められた（図 4 E）．SSL 12 による IL- 4 産生はマウスより単離した直後の骨髄細胞においても認められた．
以上より SSL 12 は好塩基球からの IL- 4 産生を誘導することが示された．

４．考図3察本研究により Hla は単独ではマスト細胞の傷害も活性化

SSL 12の局所炎症誘導作用を引き起こさないが，他の刺激による脱顆粒を増強するこ

3. 3. SSL12による好塩基球からのIL-4産生の誘導とが示された．変異型 Hla を用いた解析により，Hla によ好塩基球の存在比率は血液中顆粒球の 1 ％以下であるが，るマスト細胞の脱顆粒増強作用には Hla による膜孔形成を刺激に応答して大量の IL- 4 を産生することが知られてい必要とする．また細胞外のカリウム，ナトリウム組成を変る．好塩基球は IL- 4 産生を介して Th 2 型免疫反応を制御更した条件での解析より Hla による脱顆粒の増強には，することからアトピー性皮膚炎への関与も示されている．

Hla の形成した膜孔を介してのカチオンの流出入が必要でそこで SSL ファミリーが好塩基球を活性化するか否かを検ある．マスト細胞が免疫複合体によって脱顆粒を誘導され討した．骨髄細胞を 14 日間 IL- 3 存在下で培養することで，る際にはカリウムチャネル KCa 3 . 1 を介して細胞内のカリFcεRI（+）c-Kit（-）の好塩基球のフェノタイプを示す細胞ウムが流出し，その後のカルシウムイオンの流出と脱顆粒に分化する（図 4 A）．この IL- 3 処理骨髄細胞を用いて SSLを促進することが知られている 4）．マスト細胞に結合し，ファミリーの IL- 4 誘導活性を検討した．SSL 12 で処理し膜孔形成した Hla はイオンの通り道として機能し，カリウた IL- 3 処理骨髄細胞から IL- 4 の産生が認められ，SSL 10，ムの流出を促進することで脱顆粒を促進していると考えら

SSL 14 も SSL 12 と比して量は少ないが IL- 4 の誘導が認めれる．

図4

SSL 12による好塩基球からのIL- 4産生− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

14 種存在する SSL ファミリーは構造的に類似性のないし活性化作用を示すことを明らかにできた．また SSL 12

種々の免疫関連分子を標的とし，免疫かく乱作用を示すこが好塩基球を刺激して IL- 4 産生を誘導するという知見は，とが知られている．本研究により SSL の一つ SSL 12 がマ黄色ブドウ球菌が毒素を介して免疫応答を Th 2 優位に導スト細胞の脱顆粒とサイトカイン産生を誘導することが示

き，免疫アレルギー疾患の発症増悪に関わる可能性を示すされた．マスト細胞を直接活性化する黄色ブドウ球菌毒素ものである．今回見出した黄色ブドウ球菌毒素によるマスと し て は ペ プ チ ド 性 溶 血 毒 素 δ 毒 素 と Phenol soluble

ト細胞と好塩基球の活性化作用により，アトピー性皮膚炎

modulin が報告されている．δ 毒素はマスト細胞に対し，と疾患患部での黄色ブドウ球菌の常在の関係を説明できる

脱顆粒と同時に膜傷害を引き起こすが，SSL 12 は膜傷害可能性がある．本研究の成果は，アトピー性皮膚炎をはじを引き起こさずに脱顆粒を誘導することから，SSL 12 は δめとする免疫アレルギー性疾患の予防法，治療法の開発に毒素とは異なったメカニズムでマスト細胞を活性化してい寄与し，アレルギー患者の肉体・精神・社会的な健康の獲得・ると考えられる．本研究で行った in vitro の実験は IgE 及維持に貢献すると考えている．なお本報告書に記載した結び抗原が存在しない条件下で行われている．したがって果を含む内容で 2019，2020 年に論文発表を行った 5 - 7）．

SSL 12 によるマスト細胞の活性化は IgE 非依存的経路による．私たちは SSL 12 がマスト細胞の表面に結合すること， （引用文献）
SSL 12 によるマスト細胞からのサイトカイン産生はチロ

1） Nakamura Y, Oscherwitz J, Cease KB, Chan SM,シンキナーゼの阻害薬等で抑えられることを見出しており，

Munoz-Planillo R, Hasegawa M, et al. Staphylococcus

SSL 12 は何らかの受容体を介してマスト細胞を活性化しdelta-toxin induces allergic skin disease by activatingていると考えられる．

mast cells. Nature. 2013; 503（7476）: 397-401.

本研究により SSL 12 が好塩基球からの IL- 4 産生を誘導

2） Hodille E, Cuerq C, Badiou C, Bienvenu F, Steghens

することも示された．好塩基球の IL- 4 産生を誘導する因JP, Cartier R, et al. Delta Hemolysin and Phenol-

子としては IgE- 抗原複合体，IL- 3 などのサイトカイン，Soluble Modulins, but Not Alpha Hemolysin or Panton-

寄生虫由来のプロテアーゼや細菌細胞壁成分などが知られValentine Leukocidin, Induce Mast Cell Activation.ている．本研究で見出した SSL 12 は細菌の外毒素としてFrontiers in cellular and infection microbiology. 2 0 1 6;は初めての IL- 4 誘導因子である． IL- 3 処理骨髄細胞を6: 180.

用いた解析では SSL 12 だけでなく SSL 10，SSL 14 も少な3） 伊藤佐生智 . 黄色ブドウ球菌の産生する免疫かく乱毒

いながら IL- 4 を誘導したが，一方で調製した好塩基球に素ファミリー staphylococcal superantigen-like proteins.

お い て は SSL 12 の み が IL- 4 を 誘 導 し た． し た が っ て生化学 . 2017; 89（6）: 861-5.

IL- 3 処理骨髄細胞における SSL 10，SSL 14 による IL- 4 産4） Shumilina E, Lam RS, Wolbing F, Matzner N,

生は好塩基球の調製過程で除去された c-Kit 陽性細胞によZemtsova IM, Sobiesiak M, et al. Blunted IgE-mediatedるものであると考えられる．SSL 14 はマスト細胞においactivation of mast cells in mice lacking the Ca -て SSL 12 の 1 / 20 程度であるが脱顆粒を誘導したこと，

activated K channel KCa3.1. J Immunol. 2008; 180（12）:SSL 10 は IgG，プロトロンビンとホスファチジルセリンに8040-7.

2++結合することが報告されている．SSL 10 と SSL 14 は好塩5） Nishiyama S, Urabe A, Morikawa A, Kobayashi M,基球以外の細胞に対し，SSL 12 とは異なった細胞に対しOnozaki K, Itoh S, et al. Staphylococcal superantigen-て IL- 4 産生を誘導すると考えられる．SSL 12 は in vitro

like 1 2 induces the production of interleukin 4 inで調製した好塩基球だけでなく，好塩基球をわずか（0 . 5％）murine basophils. Biochem Biophys Res Commun.に含む，単離した直後の骨髄からも IL- 4 産生を誘導した．

2020; 532（2）: 200-4.

したがって SSL 12 は in vivo においても IL- 4 産生を誘導し

6） Hayashi K, Itoh S, Morikawa A, Onozaki K, Taki S,うると考えられる．SSL 12 による好塩基球からの in vitro

Tsuji T, et al. Staphylococcal alpha-hemolysin does not

での IL- 4 産生の解析は IgE 及び抗原が存在しない条件下induce cell damage in murine mast cells but itで行われている．したがって SSL 12 は IgE 非依存的に好augments the degranulation induced by FcepsilonRI

塩基球を活性化すると考えられる．

cross-linking and ionomycin. Biochem Biophys Res

５．総Commun. 2019; 508（1）: 263-9.

括7） Kobayashi M, Kitano T, Nishiyama S, Sanjo H, Onozaki

本研究により，すでに報告されている δ 毒素や PhenolK, Taki S, et al. Staphylococcal superantigen-like 1 2soluble modulin だけでなく，黄色ブドウ球菌毒素 Hla とactivates murine bone marrow derived mast cells.

SSL 12 が炎症のエフェクター細胞であるマスト細胞に対Biochem Biophys Res Commun. 2019; 511（2）: 350-5.

− 76 −