皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門

大矢根

綾 子、中 村真紀

Submicron spheres of calcium phosphate have potential as biocompatible and functional cosmetic materials. In thepresent study, we developed surfactant-free techniques for the synthesis of submicron-sized calcium phosphate-basedspheres. In our techniques, pulsed laser irradiation was applied to dispersions of calcium phosphate integrated with various
light-absorbing agents: ferric (Fe3+) ions, ferrous (Fe2+) ions, and carbon nanopowders.
For the integration of calcium phosphate and ferric/ferrous ions, FeCl 3 or FeCl2 was supplemented to a calcium
phosphate reaction mixture. Pulsed laser irradiation was performed to the reaction mixture during spontaneous precipitationof calcium iron phosphate. After irradiation, submicron- and micron-sized spheres of amorphous calcium iron phosphate
were fabricated. In this process, ferric/ferrous ions integrated in the nano-sized precipitates induced melting andspheroidization of the precipitates via selective laser heating in the reaction mixture. Nucleation-growth process and Ostward
ripening under supersaturated condition might be involved in the sphere growth.
For the integration of calcium phosphate and carbon nanopowders, hydroxyapatite nanopowders as the calcium
phosphate source and carbon nanopowders were mixed using a ball mill. Pulsed laser irradiation was performed to adispersion of the carbon-integrated hydroxyapatite nanopowders in ethanol. After irradiation, submicron spheres ofamorphous calcium phosphate were fabricated. In this process, carbon nanopowders integrated with the hydroxyapatite
nanopowders induced melting, spheroidization, and amorphization of the hydroxyapatite nanopowders via selective laser
heating in the ethanol solvent. The carbon nanopowders were decomposed and/or evaporated during laser irradiation; hence,
there was hardly any carbon remaining in the final spheres.
Our laser fabrication techniques would provide a new way to produce submicron-sized calcium phosphate-based spheres.
The resulting spheres have a potential as biocompatible and functional cosmetic materials.

１．緒

ョン法など）が挙げられる。しかし、化学合成により得ら言れる界面活性剤には、細胞毒性や製造コストなどの課題がリン酸カルシウムはヒトの歯や骨の主要無機成分であり、あった。これに対して最近 Koshizaki らは、界面活性剤を身体に優しい安全・安心素材として、ファンデーション添必要としない簡便・迅速なサブミクロン球状粒子の合成法

加剤などのコスメトロジー素材や、人工骨などの生体材として、液中レーザー溶融法を報告している 1）。液中レー料に応用されている。また、リン酸カルシウムはタンパク

ザー溶融法は、液相中に分散させた不定形ナノ粒子原料に質、抗体、DNA などの生体分子を吸着する特性を有して低エネルギー密度のパルスレーザー光を非集光で照射するいることから、薬剤送達システム（Drug delivery system:ことで、サブミクロン球状粒子を合成する手法である。こDDS）用担体としての応用も期待されている。本研究では、の手法は、様々な金属や金属酸化物に適用されてきたもの

DDS 機能を有するコスメトロジー素材への応用を目指し、の、レーザー光吸収性に乏しいリン酸カルシウムへの適用

細胞内への取り込みに適したサブミクロン球状構造を有すは困難であった。

るリン酸カルシウムを合成するための技術開発を行った。

そこで我々は、リン酸カルシウムを種々の光吸収剤と複DDS 機能を有するリン酸カルシウムサブミクロン球状粒合化することによって、液中レーザー溶融によるサブミク子は、健常な皮膚の美容・保全だけでなく、創傷・皮膚炎・ロン球状粒子の合成を試みた。リン酸カルシウムと光吸収瘢痕などの治療・予防にも有効な高機能コスメトロジー素剤の複合化手法としては、鉄イオン共沈法およびカーボン材として有用と期待される。

ミリング法の 2 種について検討した。鉄イオン共沈法（2.

従来のリン酸カルシウムサブミクロン球状粒子の合成法

1. 節）においては、光吸収剤として鉄（Ⅲ）イオンおよび鉄としては、界面活性剤を用いる手法（ミセル法、エマルジ（Ⅱ）イオンを用いた。リン酸イオンとカルシウムイオンの混合反応液に鉄（Ⅲ）イオンまたは鉄（Ⅱ）イオンを添加し、*同反応液に低エネルギーのパルスレーザー光を非集光でFabrication of calcium phosphate spheresfor skin tissue repair and regeneration
Ayako Oyane*, Maki Nakamura
Nanomaterials Research Institute, National
Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology（AIST）

照射した。また、カーボンミリング法（2. 2. 節）においては、Li らの報告 2）に倣ってカーボンナノ粒子を光吸収剤として用いた。リン酸カルシウム原料として水酸アパタイトの不定形ナノ粒子原料を用い、光吸収性のカーボンナノ粒子をミリング混合によって複合化した。得られた複合粒子をエ− 14 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

タノール中に分散させ、低エネルギー密度のパルスレーザ

エネルギー密度を 67、133、200 mJ/pulse/cm2（それぞれ 2、ー光を非集光で照射した。

4、6 W/cm2）と変化させた。

以上の 2 つの手法において、反応条件（レーザー光のエ照射後、遠心操作（6000 rpm、10 分）により生成物を回ネルギー密度、照射時間など）を変化させ、得られた生成収、超純水で洗浄し、試料を得た。得られた試料は更なる物の形態、化学組成、および構造を評価することによって、遠心操作により、大粒径の分画Ｌ（500 rpm、5 分で沈降さリン酸カルシウム系サブミクロン球状粒子を得るための基せた分画）、および小粒径の分画Ｓ（分画Ｌを沈降させた後礎的条件を追求した。さらに、反応液中におけるレーザーの上澄液から、さらに 1000 rpm、10 分で沈降させた分画）

光ならびに光吸収剤の役割・相互作用を基礎的に追及し、に分けた。

粒子の生成機構について考察した。

２．実5）

2. 2. 試料作製［カーボンミリング法］

験

カーボンミリング法における試料作製スキームを図 2 に

2. 1. 試料作製［鉄イオン共沈法］

3, 4）示す。水酸アパタイトの不定形ナノ粒子（1.5 g、一次粒子

鉄イオン共沈法における試料作製スキームを図 1 に示径約 100 nm、太平化学産業株式会社提供）およびカーボンす。まず、カルシウムイオン水溶液、リン酸イオン水溶ナノ粒子（0.3 g、粒子径 500 nm 以下、Sigma-Aldrich 製）を液、鉄（Ⅲ）イオン水溶液、および鉄（Ⅱ）イオン水溶液と遊星型ボールミルで 10 分間混合（600 rpm）することによして、それぞれ 200mM CaCl2（ナカライテスク製）水溶り複合化した。得られた複合粒子（0.005 g）をエタノール（4液、200 mM K2HPO4・3H2O（ナカライテスク製）水溶液、mL）に分散させ、同分散液に攪拌下、2. 1. 項と同じナノ秒

200 mM FeCl3・6H2O（ナカライテスク製）水溶液、およパルスレーザー光（30 Hz、355 nm）を非集光で 20 分間照射

び FeCl2・4 H2O（和光純薬工業製）水溶液を、各々の試薬2した。レーザー光のエネルギー密度は 200 mJ/pulse/cm（6を超純水に溶解して調製した。

W/cm2）とした。照射後、遠心操作（6000 rpm、10 分）によ

上記の原料溶液ならびに超純水をガラス製容器内に所定り生成物を回収、超純水で洗浄し、試料を得た。得られたの容量比で添加、混合・攪拌することによって、種々の鉄試料は更なる遠心操作を行い、1000 rpm、10 分で粒子をイオン濃度（Fe（Ⅲ）: 0、1、2、5、7、10mM、Fe（II）: 0、1、沈降させた後の上澄液から、さらに 2000 rpm、10 分で沈2、5、10、20 mM）を有する反応液（4 mL）を調製した。反降させた粒子を回収した。

応液のカルシウムイオン濃度（16.7mM）およびリン酸イオン濃度（10 mM）は一定とした。なお、原料溶液混合後の反2. 3. 試料評価

応液は直ちに白濁した。

得られた試料（遠心操作後、超純水中に分散）の粒径分布

攪拌下、調製直後の上記反応液にナノ秒パルスレーザーを、動的光散乱法（DLS: Zetasizer Nano-ZS、Malvern 製）

光（Nd:YAG, Quanta-Ray LAB-150-30, Spectra-Physics 製，により調べた。また、試料の形態、化学組成、ならびに結ビーム径 8mm）を集光せずに、30 分までの種々の時間照晶構造を、電界放射走査型電子顕微鏡（SEM: XL30、FEI 製）射した。レーザー光の周波数は 30Hz、波長は 355 nm とし、観察、エネルギー分散型 X 線分光法（EDX、Genesis2000、

図１

鉄イオン共沈法による試料作製スキーム（鉄（Ⅲ）
イオンの例）

図２

カーボンミリング法による試料作製スキーム− 15 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

EDAX 製）、透過型電子顕微鏡（TEM: JEM-2010、JEOL 製）＝ 30 °を中心にブロードなハローが検出された（図 4 下）。

観察、および薄膜 X 線回折法
（XRD: M18X、MAC Science分画Ｌに得られた粒子についても、同様の EDX スペクト製）により調べた。SEM 観察および EDX においては、試ルおよび XRD パターンが得られた。以上の結果から、分料をシリコン基板上にマウントし、表面にカーボンあるい画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子はいずれも、アモルファスのは金を蒸着した。また、XRD においては CuKa 線を用いた。

鉄含有リン酸カルシウムであると考えられた。
球状粒子の生成過程においては、反応液中の鉄（Ⅲ）
イオ３．結果と考察

ン濃度、およびレーザー光照射条件（エネルギー密度、照３. 1. 鉄イオン共沈法
3. 1. 1. 光吸収剤として鉄（Ⅲ）
イオンを用いた場合射時間）が重要な要素であると考えられた。そこで、レー3）

ザー光照射条件（200 mJ/pulse/cm2、30 分）を固定し、鉄鉄（Ⅲ）
イオンを光吸収剤として用いて検討を行った。ま（Ⅲ）イオン濃度を変化させて試料を作製した。分画Ｓおよず初めに、鉄（Ⅲ）イオン濃度 5mM、レーザー光のエネび分画Ｌの球状粒子生成の有無を SEM 観察により調べた2

ル ギ ー 密 度 200 mJ/pulse/cm 、 照 射 時 間 30 分 の 条 件 下

結果を表 1 に示す。鉄（Ⅲ）イオン濃度 1 mM 以下の反応液で作製された試料について、構造と組成の評価を行った。

からは、リン酸カルシウムの不定形沈殿物のみが生成し、SEM 観察の結果、分画Ｌに得られた試料は、主としてミいずれの分画にも球状粒子は確認されなかった。一方、鉄クロンサイズ（DLS による平均粒子径＝ 800nm）の球状粒（Ⅲ）イオン濃度 2 mM の反応液からは、分画Ｓにサブミク子群であった（図 3 上）。一方、分画Ｓに得られた試料は、ロン球状粒子が確認された。反応液の鉄（Ⅲ）イオン濃度をサブミクロンサイズ（DLS による平均粒子径＝ 450 nm）の5 mM に高めると、分画Ｓのサブミクロン球状粒子（図 3球状粒子群であった（図 3 下）。以上の結果から、本法によ下）に加え、分画Ｌのミクロン球状粒子（図 3 上）の生成もって、サブミクロンからミクロンサイズの球状粒子を合成認められた。さらに鉄（Ⅲ）イオン濃度を高めていくと、7できることが確認された。

mM では分画Ｓのサブミクロン球状粒子のみが生成し、10分画Ｓの球状粒子の EDX スペクトルを図 4 上に、XRDパターンを図 4 下に示す。EDX スペクトルでは、試料マ

mM ではいずれの分画にも球状粒子は生成しなくなった。
この理由については、3. 1. 2. 項で考察する。

ウント用のシリコン基板およびカーボン蒸着膜に由来する

次に、鉄（Ⅲ）イオン濃度（5 mM）およびレーザー光照射ピークの他に、カルシウム、リン、鉄、および酸素のピー時間（30 分）を固定し、レーザー光のエネルギー密度を変クが検出された（図 4 上）
。XRD パターンでは、回折角 2θ

化させて試料を作製した。SEM 観察の結果（表 2）、レー

図３ 鉄イオン共沈法で得られた分画Ｌ（上）と分画Ｓ（下）の試料の SEM 像（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分照射）

図４ 鉄イオン共沈法で得られた分画Ｓの球状粒子の EDX スペ
クトル（上）と XRD パターン（下）（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分照射）− 16 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

ザー光のエネルギー密度 67mJ/pulse/cm2 の条件では、いは調製直後に（レーザー光照射前）、波長 355 nm の紫外光ずれの分画にも球状粒子は確認されなかった。エネルギー吸収性（図 5）を示すナノ粒子を自発析出する。この反応液2密度を高めていくと、133 mJ/pulse/cm の条件では分画2にパルスレーザー光を照射すると、初期析出ナノ粒子の凝Ｓにサブミクロン球状粒子が、200 mJ/pulse/cm の条件集体がレーザー光エネルギーを吸収し、加熱溶融されて球では分画Ｓのサブミクロン球状粒子と分画Ｌのミクロン球状液滴となる。球状液滴は、レーザーパルスの間隔におい状粒子の両方が生成するようになった。て周囲の水溶媒によって急冷され、アモルファス球状構造続いて、鉄（Ⅲ）イオン濃度（5mM）とレーザー光のエネを保ったまま固化する。以上のような溶融・急冷反応がパ2ルギー密度（200 mJ/pulse/cm ）を固定し、照射時間を変化ルスレーザー光照射下で繰り返されるのに並行して、生成させて試料を作製した。SEM 観察の結果（表 3）、照射時間粒子が反応液中のカルシウムイオン、リン酸イオン、鉄イ10 ～15 分の条件では分画Ｓにサブミクロン球状粒子が確オン、クラスターを取り込み成長していくことで、サブミ認され、照射時間 20 ～ 30 分の条件ではさらに分画Ｌのミクロンおよびミクロンサイズの鉄含有リン酸カルシウム球クロン球状粒子も確認された。この結果から、レーザー光状粒子が生成したと考えられる。の照射開始後 10 分以内にサブミクロン球状粒子が生成し、

4）

20 分以内に一部の粒子がミクロンサイズにまで成長する

3. 1. 2. 光吸収剤として鉄（Ⅱ）イオンを用いた場合と考えられた。

続いて、鉄（Ⅲ）イオンに代えて鉄（Ⅱ）イオンを光吸収球状粒子の生成過程は以下のように考察される。反応液剤として用い、検討を行った。初めに、鉄（Ⅱ）イオン濃度 5 mM、レーザー光のエネルギー密度 200 mJ/pulse/cm2、

表１ 鉄イオン共沈法における鉄（Ⅲ）
イオン濃度と粒子生成の関係（200mJ/pulse/cm2、30 分照射）

Fe（Ⅲ）
（mM）
粒子生成

0×

1×2
S5S+L7S

10×

照射時間 20 分の条件下で試料を作製した。SEM 観察の結果、鉄（Ⅱ）イオンを用いた場合にも、3. 1. 1. と同様、サブミクロンからミクロンサイズの球状粒子を合成できることが確認された（図 6）。また、EDX および XRD の結果から、分画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子はいずれも、アモルファ

× : 球状粒子生成せず
Ｓ : 分画Ｓに球状粒子生成
Ｌ : 分画Ｌに球状粒子生成

スの鉄含有リン酸カルシウムであることも確認された。鉄（Ⅲ）イオンと同様、鉄（Ⅱ）イオンが反応液調製直後に析出するナノ粒子に含有されることで、レーザー光吸収と溶融・

表２ 鉄イオン共沈法におけるレーザー光のエネルギー密度と粒子生成の関係（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分照射）

エネルギー密度（mj/pulse/cm2）
粒子生成

67×133
S

球状化を促したと考えられる。
続いて、レーザー光のエネルギー密度（200mJ/pulse/200S+L

表３ 鉄イオン共沈法におけるレーザー光照射時間と粒子生成の関係（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、200 mJ/pulse/cm2）

レーザー時間照射（分） 0
粒子生成
×5×10
S15S

20 30S+L S+L

図５ 鉄イオン共沈法において調製された反応液（［Fe（Ⅲ）］＝5mM）の初期析出ナノ粒子の吸収スペクトル図６ 鉄イオン共沈法により得られた分画Ｌ（上）と分画Ｓ（下）の試料の SEM 像（［Fe（Ⅱ）］＝ 5 mM、20 分照射）− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015cm2）と照射時間（30 分）を固定し、鉄（Ⅱ）イオン濃度を変3. 2. カーボンミリング法

5）化させて試料を作製した。分画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子カーボンミリング法で作製された試料の SEM 像を図 8生成の有無を SEM 観察により調べた結果を、鉄（Ⅲ）イオ上に、EDXスペクトルを図 8 下に示す。SEM観察の結果（図ンの結果（表 1）と合わせて表 4 に示す。鉄（Ⅱ）イオン濃度8 上）、サブミクロンサイズ（100 ～ 400 nm）の球状粒子の2 mM 以上の条件で、分画Ｓにサブミクロン球状粒子の生生成が認められた。EDX スペクトル（図 8 下）では、試料成が認められ、5 mM 以上の条件では、さらに分画Ｌにミマウント用のシリコン基板および金蒸着膜に由来するピークロン球状粒子の生成も確認された。また、鉄（Ⅲ）
イオン

クの他に、カルシウム、リン、酸素、およびカーボンのピを用いた場合（2 ～ 7 mM）と比較して、鉄（Ⅱ）イオンを用ークが検出された。カーボンのピーク強度は、レーザー光いた場合（2 ～ 20 mM）には、より広い濃度範囲において球照射前の複合粒子と比較して大幅に減少した。これは、Li状粒子が生成した。この理由の 1 つとして、調製直後の反らも報告しているように 2）、レーザー光照射により複合粒応液の液性（pH）が考えられる。すなわち、鉄（Ⅲ）イオン子中のカーボンが昇華あるいは分解したためと考えられの原料試薬 FeCl3・6 H2O が酸性物質であることから、添る。生成したサブミクロン球状粒子の多くは、単一孔構

加濃度の増加により反応液のpHが低下する
（図 7）
。鉄（Ⅲ）

造（Type A）または多孔構造（Type B）を有していたが、一イオン濃度の高い反応液中では、リン酸鉄およびリン酸カ部、緻密な構造（Type C）を有する粒子も確認された（図 9）。

ルシウムの溶解度が上昇する結果、球状粒子の生成が抑制

透過電子線回折（TED）分析の結果、いずれの粒子もアモされる。一方、鉄（Ⅱ）イオンの原料試薬 FeCl2・4H2O のルファス構造を有していることが明らかになった（図 9 右

酸性度は FeCl3・6 H2O よりも弱いため、添加濃度の増加

上、Type A の例）。

による反応液の pH 低下が抑えられる。その結果、より高粒子の生成機構については、Li らの報告 2）と同様と考え濃度（～ 20 mM）の鉄（Ⅱ）イオンを添加した場合にも、球られる。すなわち、カーボンナノ粒子がレーザー光エネル状粒子が生成したと考えられる。

ギーを吸収し、それを水酸アパタイトナノ粒子との複合粒以上の結果から、光吸収剤として鉄（Ⅲ）
イオンまたは鉄子に伝えることで、同複合粒子の溶融・球状化を促すと考（Ⅱ）イオンを用いる鉄イオン共沈法により、アモルファスえられる。この際、大部分のカーボンは昇華あるいは分解の鉄含有リン酸カルシウムからなるサブミクロンおよびミし、球状粒子中にはほとんど残らない。また、溶融液滴中クロンサイズの球状粒子を合成できることが確認された。に生じた気泡が、レーザーパルス間隔で急冷・固化される

表４ 鉄イオン共沈法における鉄（Ⅱ）/ 鉄（Ⅲ）
イオン濃度と粒子生成の関係（200mJ/pulse/cm2、30 分照射）

鉄イオン濃度（mM） 0Fe（Ⅱ）×Fe（Ⅲ）
×

1××2
S
S

5
7 10 20
S+L ー＊ S+L S+L
S+L S
× ー＊

図 7 鉄イオン共沈法において調製された反応液の pH（調製直後、レーザー光照射前）

図８ カーボンミリング法により得られた試料の SEM 像（上）とEDX スペクトル（下）− 18 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

図９ カーボンミリング法で得られた試料の TEM 像（左上、下）と TED パターン（右上）

際に脱気できた場合には緻密構造が、脱気できずに残存し謝辞本研究は、平成 24 年度コスメトロジー研究振興財団のた場合に孔構造（Type A、Type B）が形成されると推察さ助成を受けて行われたものである。研究の実施にあたってれる。
以上、光吸収剤としてカーボンナノ粒子を用いるカーボンミリング法により、アモルファスリン酸カルシウムのサは、産業技術総合研究所の清水禎樹博士、坂巻育子氏をはじめ、関係各位にご協力を頂いた。

ブミクロン球状粒子を合成できることが確認された。本手法で得られる球状粒子は孔構造を有することから、様々な（引用文献）

薬剤分子の DDS 担体として有用と考えられる。

１）H. Wang, A. Pyatenko, K. Kawaguchi, X. Li, Z.

４．総

Swiatkowska-Warkocka and N. Koshizaki, Angew.

括Chem. Int. Ed., 2010, 49, 6361.

1）

液中レーザー溶融法 を発展させ、リン酸カルシウムに

２）X. Li, Y. Shimizu, A. Pyatenko, H. Wang and N.
Koshizaki, J. Mater. Chem., 2011, 21, 14406.

種々の光吸収剤を複合化することにより、リン酸カルシウ
ム系サブミクロン球状粒子の合成に成功した。光吸収剤の３）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y. Ishikawa,

複合化手法として、鉄イオン共沈法ならびにカーボンミリ

Y. Shimizu, K. Koga, K. Kawaguchi and N. Koshizaki,
RSC Adv., 2014, 4, 38442.

ング法について検討し、それぞれの反応過程を明らかにするとともに、球状粒子を得るための基礎的条件を明らかに

４）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y.Ishikawa, T.

した。得られたリン酸カルシウム系サブミクロン球状粒子

Shimizu and K. Kawaguchi, Phys. Chem. Chem. Phys.,2015, 17, 8836.

は、DDS 担体として適した構造を有することから、治療効果を付加したコスメトロジー素材としての応用が期待さ

５）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y. Shimizu, K.

れる。今後の課題としては、粒子サイズの精密制御、大量合成技術の開発などが挙げられる。

− 19 −

Koga and N. Koshizaki, RSC Adv., 2015, 5, 22620.