。

Writing the Future of
Plant and Animal Genomics
High Throughput and Cost-Efficient Library Prep

Twist 96-Plex Library Preparation Kitは、
集団遺伝学、
疾病遺伝学、
農業、
食品安全、
マイクロバイオーム、
合成生

物学アプリケーションのためのハイスループット・シーケンス・パイプラインを最適化します。少ないシーケンス量でローパスのカバレッジでゲノム全体にわたる高品質のジェノタイピング用途に特化し、一度に最大960サンプルまでの強固なライブラリー構築を可能にします。

x10
96検体を１チューブで調製可能

960検体までプール可能

主な利点

効率的

• 1サンプルあたりわずか15ド
ル未満• 自動化装置不要• 断片化、
修復、
ライゲーション
の工程は不要適応性• 高 GC 含量や低 GC 含量のサンプルに最適化可能• 同一キットで複数のタイプのサンプ
ルに使用可能ハイスループット• １キットあたり最大 960 サンプルまで個別にバーコード化可能• 一度に最大 96 サンプルを処理できる高度なマルチプレックス反応

製品SKU106541 Twist 96-Plex Library Preparation Kit, 5x96 samples, Set A
106542 Twist 96-Plex Library Preparation Kit, 5x96 samples, Set B
106543 Twist 96-Plex Library Preparation, 10x96 samples

問い合わせ先twistbioscience.com
jsalescustomer@twistbioscience.com©2023. All Rights Reserved Twist Bioscience Inc.

大阪大学
微生物病研究所・附属遺伝情報実験センター
元岡 大祐 先生
元岡先生から一言

ゲノム解析室（お問い合わせ E-mail : service[a]ngs.gen-info.osaka-u.ac.jp*）では、本キットの受託分析を受付中です。96検体に満たない場合

でも、プライマーのGC含有量の組み合わせを変えるなど柔軟に対応できます。お気軽にご相談く
ださい。*[a]を＠に変えてご連絡ください。

ご利用の感想Twistの新しい全ゲノム用ライブラリ調製キッ

トは、ゲノム分析を多検体で低コストで行うことを売りにしており、NGS受託解析サービスに加えることにしました。良い点としては、多検体を初めのステップ（ランダムPrimerによる伸長反応）以降、1チューブで操作できるので手間を省くことができます。導入時の評価において、最初の濃度を合わせておくことで、ほぼ均一に目的の細菌ゲノ

ム配列データが取れました。

ライブラリ調製方法は経験者であれば比較的簡単に行うことができますが、異なるPrimerを組合せた伸長反応の条件や、ビーズによるCapture

ステップは初心者には難しいため、もう少し詳しいプロトコルまたは操作説明が必要かもしれま

せん。
また、最初のDNA量や濃度が低い場合が想定されるため、
その対応策＊があればさらに良いと思います（＊Twistより：別途、low input用のプ
ロトコルの評価が進められています）。様々な生物種での論文報告が出てきており、費用対効果の高いハイスループットキットだと感じています。

ご利用のきっかけとなった課題は何でしたか？

大阪大学・微生物病研究所・ゲノム解析室では、遺伝情報解析技術と大型計算機システムを融合させ、次世代シー

クエンサーを用いて得られたデータの包括的・網羅的な解析を中心に研究支援を行っています。
また、
イルミナ株

式会社のPropel認証、Twist Bioscience社のProLab認証を取得し、均質なデータを提供できるサービスプロバイ

ダーとして、全世界の研究者を対象としたNGS受託解析を行っています。近年はシーケンスコストが飛躍的に低下

し、より安価に多くのゲノム解析ができるようになりましたが、ライブラリ調製のコストが課題でした。

(図）
プールした24検体のシークエンスデータ量
Library_name total_number_of_bases

q30_bases

frac_q30_bases

primer_plate_well

140,265,826

37,009,181

0.919

A01

2

43,362,468

39,944,185

0.921

B01

3

46,688,052

42,841,754

0.918

C01

4

36,544,452

33,411,266

0.914

D01

5

43,413,660

39,898,359

0.919

E01

6

35,119,134

32,227,936

0.918

F01

7

36,914,172

33,897,033

0.918

G01

8

39,720,252

36,462,597

0.918

H01

9

41,056,932

37,700,970

0.918

A02

10

38,984,130

36,015,317

0.924

B02

11

39,792,300

36,548,598

0.918

C02

12

50,527,452

46,479,500

0.920

D02

13

41,118,552

37,787,459

0.919

E02

14

40,827,990

37,498,991

0.918

F02

15

39,749,640

36,358,064

0.915

G02

16

33,516,540

30,823,932

0.920

H02

17

34,295,322

31,473,530

0.918

A03

18

33,586,218

30,822,047

0.918

B03

19

34,238,442

31,612,755

0.923

C03

20

42,966,204

39,416,376

0.917

D03

21

37,415,664

34,377,298

0.919

E03

22

34,079,652

31,390,780

0.921

F03

23

35,989,398

32,884,735

0.914

G03

24

33,994,332

31,188,206

0.917

H03

Results are specific to the institution where they were obtained and may not reflect the results achievable at other institutions©2023. All Rights Reserved Twist Bioscience Inc.

東京大学大学院農学生命科学研究科
附属水産実験所
細谷 将 先生
ご利用のきっかけ

私の研究対象である水生生物でもローカ
バレッジリシーケンスの利用が増えてきています。特に集団ゲノミクス分野では適
応遺伝子座の探索などで注目されています。
このような解析において、大規模の検体からゲノムワイドにシーケンスデータを取る手法は開発途上にありますが、そんな中でも本キットは作業工程の簡便さや価格で特に優れている印象があり、試してみることとしました。

細谷先生のご利用方法

DNBSEQ上で2回のシーケンスを行いました。1回目はライブラリー調整の際に濃度測定を分光光度計で行いました。
リー
ド数のばらつきが大きくなり、横着してはいけないと改めて実感しました。2回目はUV 測定を行いました。
リード数のばらつきは低減しましたが、依然、ばらつきは発生しました。測定サンプルとライブラリー
調整に用いたサンプルが異なる希釈系列であったことも理由として考えられます
が、DNA質に起因する増幅効率の差や、プール後のビーズ精製、サイズセレクショ
ンなどのステップなど、いくつかの複合要因があったとも考えられます。
サンプル毎にライブラリー濃度を測ってからプールするわけではないので、ある程度のばらつきが発生するのは致し方ないかなという印象です。作業工程については、
ライブラ
リー調整の上流でプールできるので、96サンプルでもほとんどの工程を1チューブで行えるので、ハンドリングが非常に楽でした。

ご利用の感想2回のシーケンスで得られたデータ量が異なっていたので、直接的な比較は難しい面もありましたが、データ間で問題視されるような齟齬は無いように感じました。8bpのindexで特定できなかった
リードは全体の3%程度でシーケンスのqualityに依存しているようでした。
データがそれなりに取れた個体に関しては、
ライブラリ
ー間で同一個体の特定が上手くいきました。
すなわち、同一個体の2回のデータを別個体とみなし、全個体間で血縁度を算出した
ところ、全個体において2回のデータが一卵性双生児あるいは同一個体程度とされた一方で、異なる個体ペアが同様の高い血縁度を示すことはありませんでした。ゲノムのカバー率は均一ではな
く、リードが得られなかった領域も少なくありませんでした。
これはマッピングの際に複数個所にマップされるようなリードを除外した
ことが一因と考えられます。一方で、リピート以外でも coverageが高い領域が散見され、特定の配列から増幅が開始されやすい傾向があるような印象もありました。下流の解析については、得られたBAMファイルを使って ANGSDで性に関するGWASを行ったところ既知の性決定遺伝子座が同定されることが確認できました。
また、特定の配列から増幅が開始されやすいというのを逆利用して、GBSとして使えるか試してみました。6~8x depth 以上のサイトを集めると3万座程度のSNPが得られ、PLINKで行った GWASの結果がANGSDと（ほぼ）同じということを確認しました。
以上の結果から、本キットは、作業工程の簡便さに優れ、ローカバ
レッジリシーケンスとGBSの両方のアプリケーションに利用できる
汎用性に優れたキットと言えるかと思います。

今後のご利用計画

今後は、サバ・マサバの集団解析に利用する予定です。
また、GBSとして利用できることも活かしてゲノミックセレクション法（ゲノムワイドSNPを利用した選抜育種法）にも使えるようにしていく予定です。

（図）GWASによるマサバ性決定遺伝子座の同定

本稿の内容は生研支援センター・イノベーション創出強化研究推進事業ならびにJST未来社会創造事業の成果の一部です。

©2023. All Rights Reserved Twist Bioscience Inc.

名古屋大学大学院生命農学研究科
土井 一行 先生
ご利用のきっかけとなった課題は何でしたか？

私たちは、イネの大規模分離集団を用いた研究を行っています。
これまでに、いわゆるRAD-seqにより数千個体をジェノタイピングしてきました。RAD-seqの原理上、ことなる解析集団でも同じサイトにマーカーが得られる可能性が高く、私たちの用途にはアドバンテージがあります。一方、遺伝子単離のための変異サイト探索の用途には、両親の配列を別途解析する必要がありました。NGSの高性能化を考えると、skim-seq的な手法の導入により、分離集団のジェノタイピングと両親のリシーケンスを同時に行ったほうが良いと考えていました。
このような状況でTwistさんの96-Plex Library Prep Kitを試用する
機会をご提案いただき、代表となるイネ品種をシーケンスしていただきました。

ご利用の感想今回、ライブラリ作製は私たち自身で行っていない
のでライブラリ作製の手間は評価できませんでした。
ランダムプライマーを使う方法であるため、読まれるサイトがどの程度限定されるか分からない状態でしたが、思ったよりもショットガンライブラリに近いカバレッジのパターンが得られ、代表品種のリシ
ーケンス情報が得られました。
ランダムプライマーは選ぶ余地があると伺っていますので、期待される結果のシミュレートを事前にできると有用と思います。
また、植物でありがちな、分子量が小さくなってしま
ったDNAからでも十分なデータが得られるのはありがたいです（図）。Skim-seqを仮想し、リード数を減らしてアライメントしてみたところ、今回の条件ではリードの重なりはほとんどなく、RAD-seqではなくショットガンライブラリに近い印象です。交配組合せにもよりますが、
イネ1個体あたり20万-50万リードのショートリードで私たちには十分なジェノタイプ
情報が得られると見込まれました。植物のジェノタ
イピングでは、遺伝解析・品種改良のどちらの用途
でもほとんどの材料は一回きりの解析後に捨てられてしまうため価格が問題になりますが、システム自体は信頼できると感じました。

Barcode_name

Library_nameSample_Namebarcode#reads1

GA445342

GA44535

1

ATCCGGTA

19,346,787

2

GACATCAC

3

12,755,658

GA44536

3

TCGATGGT

30,548,992

4GA44537

4

CTGTCAGA

22,303,474

5GA44538

5

TGGTACGT

15,364,289

6

GA44539

6GATGCATC

11,606,851

7GA44540

7CTTCCAAC

26,316,717

8GA445418

ACACGTGT

33,907,945

9GA445429

TAGGCCAT

32,607,781

10GA44543

10

CTGTACAG

29,957,079

11GA44544

11

TCGAGTTG

18,684,267

12

GA44545

12

AAGGTTCC

26,504,934

13

GA44546

13

GCCGTATA

16,450,719

14GA4454714

ACCTGTTC

19,032,288

15

GA4454815

ACAGTCAC

17,828,957

16

GA44549

16

GAGTTCTG

19,181,774

17

GA44550

17GCTACGAT

23,200,836

18GA44551

18

CTAGAGCT

27,043,592

19

GA44552

19

ACTGACTG

23,427,638

20

GA44553

20

GGAAGCAT

19,953,800

21GA44554

21

CCATATGG

14,828,841

22

GA44555

22

CAGTTGAC

12,536,624

23

GA4455623

ACACGTCA

15,115,028

24

GA44557

24

ACCAACGT

20,929,787

25

GA4455825

GATCAGCT

16,529,384

26

GA4455926

CGTAGCAT

28,985,810

27

GA44560

27

GTGTTGAC

19,541,018

28

GA44561

28

AGTGTCTG

11,691,404

29

GA4456229

TGGTCATG

18,738,660

30

GA4456330

ACTGTGAC

17,565,096

31

GA44564

31

CTTGTCCA

11,127,317

32

GA4456532

CGATCGAT

18,586,005（図）サンプルごとのリード数：
分子量が低め（オレンジで囲んだサンプル）でも問題なく十分なデータが得られた。

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東京大学大学院新領域創成科学研究科 メディカル情報生命専攻
木口 悠也 先生
ご利用のきっかけ

我々はメタゲノム解析によってヒトとマイクロバイオームの関係性を紐解く研究を行っています。我々は研究テーマの一つである腫瘍内マイクロバイオーム解析においてゲノムのGC含量が低いとされる細菌が肺がん組織内に存在する可能性を掴んでいました。
しかし、腫瘍内のメタゲノム解析では>99%がヒトゲノムかつGC含量が偏った配列は一般的なシークエンスプロトコルでは著しくシークエンス深度が浅くなってしまうという技術的制約によって詳細な解析に十分なデータ量を取得できないという課題がありました。
そこで、GC含量が低い配列を選択的にシークエンス
可能なTwist Bioscience社の96-Plex Library Prep Kitを適用することで標的としている細菌ゲノムのシークエン
ス深度を高めることができないか？と考えたのが利用のきっかけです。

木口先生のご利用方法

我々はまずヒトゲノムが大量に混在している状況で96-Plex Library Prep Kitが本当にGC含量に偏りのある細菌ゲ
ノム配列をシークエンスできるのか確かめることとしました。
サンプルとしてヒトゲノムの混入率が70〜90%である唾液サンプルを用いてLow GC, Mix GC, High GCの3パターンのプロトコルでショットガンメタゲノムシークエンスを行い、得られたデータの特性を評価しました。

図1. ContigのGC含量分布

その結果、アセンブル解析によって得られるcontigのGC含量はプロトコル依存的に変動し(図1)、Low GC Kitで構築可能である細菌ゲノムにはGC含量が非常に低い系統が含まれることがわかりました(図2)。
この結果を元に我々は肺がん腫瘍内メタゲノム解析に当キットを適用し、目的細菌のシークエンス深度を増幅させることができました(図3)。
この結果は、GC含量に偏りのある細菌を選択的にシークエンスする目的において96-Plex Library Prep KitのHigh GCおよびLow GCプロトコルが有用である
ことを示唆しています。当手法がメタゲノム解析に広く用いられることによって未知の細菌ゲノムや遺伝性因子が発見できることを期待させる結果となりました。

図2. GC Kitの違いによって構築されるゲノムの違い

図3. 腫瘍メタゲノムにおけるGC含量の低い目的細菌のシークエンス量

Results are specific to the institution where they were obtained and may not reflect the results achievable at other institutions©2023. All Rights Reserved Twist Bioscience Inc.

製品シートTwist 96-Plex Library Preparation Kit

Low-pass シーケンシングやプラスミド QC 用のハイスループット
ライブラリの調製
主な利点

ハイスループット• 1 キットあたり最大 960 サンプル• チューブ 1 本で最大 96 サンプル効率の最大化• 高い費用対効果（1 サンプルあたりわずか10 ドル程度）• 断片化、修復、A-tailing ステップが不要
様々な生物に対応可能• 高／低 GC 含量サンプルの最適化が可能

ライブラリ調製は、多くのラボの NGS ワークフローにおいて、運用および費用の面で最も大きな課題となっています。規模の大きな NGS 検査を実施する場合、または広範なゲノムマッピングを実施する場合、効率的なシーケンシングツールが極めて重要となります。現在使用されているシーケンシングライブラリ調製法の多くは、ハイスループット環境に最適化されておらず、分析サンプルの処理におけるボトルネックになっています。

Twist 96-Plex Library Preparation kit は、一度に 96 サンプルを処理することができるハイ
スループット型の調整キットとして設計されています。ワークフローのほとんどのステップを
1 本のチューブで実施するため、効率的な試薬の使用と無駄のない処理が実現できます。
各ランは、インプットするサンプルの GC プロファイルに合わせて調整でき、作物の lowpass シークエンシングや薬剤デザイン研究のプラスミド QC のどちらにも適したツールとなっています。最終ライブラリは、Illumina シーケンサーに適合し、デマルチプレックス用にバーコードが付いています。

ケミストリー

1. 96 ウェルプレートの変性 DNA テンプレートに、5’ バーコードアダプターがランダムにプライ
ミングします。ポリメラーゼによりプライマーが伸長して DNA テンプレートのコピーを作成します。ビオチン標識 ddNTP で反応が停止します。

2. す べてのサンプルを 1 本のチューブにプールし、ストレプトアビジン磁気ビーズでキャプチャ
します。また、洗浄して過剰な反応物質を除去します。
3. 2 つ目の 5’ アダプターテールプライマーと鎖置換ポリメラーゼにより、キャプチャしたテンプ
レートをデュアルアダプターのライブラリに変換します。磁気ビーズの最も近くに結合したプライマーは伸長し、ビーズ下流のプライマー配列まで合成されます。

4. ビ ーズを洗浄して過剰な反応物質を除去し、デュアルアダプターのライブラリを保持します。
少ない PCR サイクル数で同時にライブラリを増幅し、インデックスリードポジションに任意のプレートバーコードを組み込みます。
DNAテンプレート
バーコード付きランダムプライマー

ビオチン末端製品がストレプトアビジンビーズに結合

ランダムプライマー

96ウェルでのプライマー
伸長反応（A 反応）
ビーズキャプチャ
プライマー伸長反応（B 反応）

PC R
デュアルアダプターのライブラリ分子
DNAライブラリ（サイズ選択前）

FOR RESEARCH-USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

製品シート | TWIST BIOSCIENCE

対象生物のプロファイルに合わせてカスタマイズ

TWIST 96-PLEX LIBRARY PREP による GC 含量が異なる生物の比較
生物／プライマーセット

平均ターゲットカバレッジ

各Twist 96-Plex Library Preparation Kitには、
高 GC 含量用 1 枚、低 GC 含量用 1 枚の計 2 枚のプライマープレートが入っています。
インプットするサンプルのプロファイルに応じて、使用するプレートを選択し、カバレッジが最も均一となる最適なライブラリを生成することができます。

HALOFERAX VOLCANII（GC含量65%）

FUSOBACTERIUM NUCLEATUM（GC含量26%）

24
22
20
18
16
14
12
10
8
6

低GC含量

等量混合

プライマーA

高GC含量

低GC含量

等量混合

プライマーA

高GC含量

高 GC 含量または低 GC 含量の 2 種類の生物で、Twist 96-Plex Library Preparation Kit を用いて調製しました。
いずれの生物でも、高 GC プライマー、低 GC プライマー、および両方のプライマーを 1:1 で混合したプライマーで調製しました。表示したデータセットは、30X のカバレッジで解析するためダウンサンプリングしています。いずれの場合も、最適なプライマーセットを用いることによりターゲットカバレッジが向上しました。

Twist 96-Plex Library Preparation Kit で調製したシーケンシング用ライブラリでは、各プレートのリード数が均一になります。
磁気ビーズベースのサイズ選択で、特定の範囲内の断片をむらなくキャプチャします。

TWIST
96-PLEX のアライメントされたユニークリード数
10M
9M

アライメントしたPF固有リード数

スケールが均一のライブラリ

8M
7M
6M
5M

標準偏差

4M

3M

標準偏差

2M

A01
A02
A03
A04
A05
A06
A07
A08
A09
A10
A11
A12
B01
B02
B03
B04
B05
B06
B07
B08
B10
B11
B12
C01
C02
C03
C04
C05
C06
C07
C08
C09
C10
C11
C12
D01
D02
D03
D04
D05
D06
D07
D08
D09
D10
D11
D12
E01
E02
E03
E04
E05
E06
E07
E08
E09
E10
E11
E12
F01
F02
F03
F04
F05
F06
F07
F08
F09
F10
F11
F12
G01
G02
G03
G04
G05
G06
G07
G08
G09
G10
G11
G12
H02
H03
H04
H05
H06
H07
H08
H09
H10
H11
H12

1M

Twist 96-Plex Library Preparation Kit を用いて、E.coli から 96 の NGS ライブラリを作成しました。レプリケート
サンプル各 50 ng を同じワークフローで調製し、その後、NextSeq 550 シーケンサーで配列を決定しました。データをプレートレベルのバーコード、次にサンプルのバーコードでデマルチプレックスし、リファレンスゲノムとのアラメント
によりサンプルあたりのリード数を得ました。ドロップアウトを除外したこの結果からは、ほとんどのサンプルがアライメントされたリード数の平均値の 20% 以内に収まることが示されました。

3.00%

3.00%

2.50%

2.50%

2.00%

2.00%

1.50%

1.50%

1.00%

1.00%

0.50%

0.50%

0.00%

高GC含量

マッピングされたリードの
総コンタミネーションの中央値
測定値なし

0.00%

Twist 96-Plex Library Preparation Kit を使用して 384 の NGS ライブラリを作成しました。これらのライブラリでインプットした DNA は、2 名のオペレーターが高 GC 含量および低 GC 含量プライマープレートで調製した 96 種類のプラスミドのセットです。ライブラリを 1 つにプールし、NextSeq 550 シーケンサーで配列を決定しました。コンタミ
ネーションは、プラスミドあたりのコンタミネーションリードとコンタミネーションではないリードとの比率で評価されました。すべてのプラスミドについて、両オペレーターのコンタミネーション率の中央値は、各 GC プライマープレート
で 1% 未満でした。

Twist 96-Plex Library Preparation Kit は、NGS ライブラリ調製のTwist Bioscience ポートフォリオ製品の一部です。
詳しくは、twistbioscience.com/ngs
sales@twistbioscience.com をご覧ください。

低GC含量

マッピングされたリードの
総コンタミネーション率の中央値

Twist 96-Plex Library Preparation kit では、
クロスコンタミネーションを起こすことなく、一度に多くのサンプルをプールすることができます。各ウェルのサンプルは固有のバーコードが付加され、シークエンス時にはウェルからウェルへのコンタミネーションを最小に抑えられます。

TWIST 96 PLEX LIBRARY PREP の総コンタミネーション率
マッピングされたリードの
総コンタミネーション率

コンタミネーションの最小化

注文情報106541: Twist 96-plex Library prep Kit, Set A, 5 x 96 samples
106542: Twist 96-plex Library prep Kit, Set B, 5 x 96 samples
106543: Twist 96-plex Library prep Kit, 10 x 96 samples

Twist Bioscience、Twist の各種ロゴおよび本書で使用する Twist NGS ロゴは、Twist Bioscience Corporation の商標です。他の商標はすべて、その各所有者が所有権を有します。
© 2022 Twist Bioscience Corporation. All rights reserved.

DOC-001279 改訂 1.0

受託解析サービスのご案内
大阪大学 微生物病研究所 ゲノム解析室
06-6879-8323

service@ngs.gen-info.osaka-u.ac.jp
最短10営業日納品
とにかく“早い”

サンプル数
48

ライセンス契約“不要”

96

豊富なオプション192

1Gb/sample

0.5Gb/sample(100PE)

納期2週間*

納期4週間

納期2週間*

納期4週間¥336,000-¥264,000-¥336,000-¥264,000-(¥7,000-)(¥5,500-)(¥7,000-)(¥5,500-)¥384,000-¥336,000-¥364,800-¥316,800-(¥4,000-)(¥3,500-)(¥3,800-)(¥3,300-)¥691,000-¥614,400-¥672,000-¥576,000-(¥3,600-)(¥3,200-)(¥3,500-)(¥3,000-)

ゲノム抽出/データ解析•••

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