アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科

原博満

A variety of small reactive organic compounds, called haptens, induce allergic contact dermatitis (ACD), which iscaused by T cells reactive to haptens. In the previous study, we identified that IL-1 secretion through immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-Syk-CARD9 signal activation is essential for dendritic cells to prime hapten-reactive
T cells during the sensitization of contact hypersensitivity (CHS), an experimental model of ACD in mice. This finding
implicates the presence of ITAM-coupled innate immune receptors that sense haptens. In this study, we sought to identify
ITAM-coupled receptors expressed on myeloid cells that are responsible for CHS sensitization. We have identified two candidate receptors, IgSFR2 and IgSFR6, by screening for hapten-binding capacity using receptor-Ig fusion proteins and for
ITAM-NFAT signal-activating capacity using receptor-expressing NFAT-GFP reporter cells. To evaluate the requirement ofIgSFR2 and IgSFR6 for the induction of CHS, we performed TNCB-induced CHS using mice deficient for either IgSFR2 orIgSFR6, or both. However, deficiencies of these receptors did not affect the induction and severity of CHS as compared towild-type mice. These results suggested that innate immune activation through IgSFR2 and IgSFR6 is not sufficient for CHS
sensitization and other relevant ITAM-coupled receptors might exist and cooperatively act for hapten recognition and CHS
sensitization together with IgSFR2 and IgSFR6.

1．緒るためには、抗原を提示する樹状細胞（DC）が Toll 様受容言体（TLR）などのパターン認識受容体（PRRs）を介して病原

接触皮膚炎は職業現場において最も頻発する皮膚疾患で体成分（PAMPs）や内因性危険因子（DAMPs）を認識し、活ある。中でも、アレルギー性接触皮膚炎（Allergic contact性化（成熟）すること必要である。これは TLR による微生dermatitis: ACD）は日用品、医薬品や化粧品に含まれる物成分の認識を例に考えると理解しやすいが、構造的、化様々な化合物が T 細胞を感作することによって引き起こさ学的に多種多様なハプテンがどのような自然免疫受容体をれる疾患であり、社会的にも大きな問題となっている。接介して DC を活性化、成熟させるのかについては明らかで

触アレルゲンとなる感作性化合物（ハプテン）は宿主の蛋白はなかった。

質と結合することで抗原性を獲得するが、これまで 3000

DC やマクロファージなどの自然免疫細胞が発現する C種類近くの化合物がハプテンとして報告されている。化粧型レクチン受容体（CLR）やIgスーパーファミリー受容体（Trem、品や医薬品の開発過程で、配合成分の化合物の感作性を適CD 300 ファミリーなど）の一部は、Immunoreceptor tyrosine-切に評価することが必要となるが、現状では動物を用いたbased activation motifs（ITAM）を介して細胞内シグナルアレルギー性試験が主流である。その煩雑性や、環境や個を活性化する ITAM 共役型受容体である 1）。骨髄系細胞の体差から生じるデータの不安定性もさることながら、近年

ITAM の下流では Syk キナーゼの活性化が誘導され、さらでは動物愛護の倫理的観点から、その使用が量的にも質的に CARD 9 シグナル経路が活性化することでサイトカインにも制限されている。従って、これに替わる信頼度の高いなどの遺伝子発現が誘導される。近年、これらの ITAM

in vitro 評価系が求められている。特に、EU を中心に拡大共役型受容体が様々な PAMPs や DAMPs を認識して様々なしつつある「動物実験をして開発した製品の販売禁止」の世疾患の病態形成に関わることが明らかになってきている。

界的動向への対応は、我が国の産業界に迫られている喫緊我々は、ハプテンが DC の ITAM-Syk-CARD 9 シグナルをの課題でもある。

活性化し、これによって DC から分泌された IL- 1 が T 細胞

免疫学の一般的理論として、ナイーブ T 細胞が抗原によ受容体の副刺激となって働くことで、ハプテン反応性の Tってプライミングされ、エフェクター T 細胞へと分化す細胞がプライミングされることを見出した 2）。この結果は、ハプテンを感知して DC を活性化する未知の ITAM 共役型

Identification of innate immune receptors
that sense allergic compounds for thedevelopment of novel assay systems toevaluate allergenicity
Hiromitsu Hara
Kagoshima University Graduate Schoolof Medical and Dental Sciences

受容体の存在を示唆するものであった（図 1）。そこで本研究では、アレルギー性化合物を感知する ITAM 共役受容体の同定を試み、その受容体の ACD 発症における役割を明らかにすることを目指した。ACD 発症に関わる受容体が同定された場合、その反応性を指標として化合物のアレルゲン性を評価する in vitro システムの開発が期待される。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図1 アレルギー性化合物は、ITAM-Sykシグナルを介してNLRP 3インフラマゾームとCARD 9経路を活性化し、T細胞のプライミングに必須なIL-1を樹状細胞から分泌させる

図３ IgSFR 2とIgSFR 6はハプテンを認識
ITAM-NFATシグナルを活性化する

図2 TNCBに結合性を示すITAM共役受容体（受容体名は通し番号であり、分子名ではない）

２．方2. 3. ハプテン誘導性contact hypersensitivity法

2. 1. ITAM共役受容体-Igライブラリーを用いたハプ（CHS）試験

ハプテン結合性を示した候補 ITAM 共役受容体をそれ

テン結合試験

ぞ れ、 あ る い は 両 方 欠 損 す る マ ウ ス（IgSFR 2 -KO、ハプテンに結合する ITAM 共役受容体の探索を行うた

IgSFR 6 -KO、IgSFR 2 / 6 -DKO）を 用 い て、ACD の マ ウ

め、これまで報告されている 22 種類の骨髄系 ITAM 共役スモデルであるハプテン誘導性 contact hypersensitivity

受 容 体（CLR、Ig ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー 受 容 体（TREM,（CHS）試験を実施した。CHS 試験は、ハプテン TNCB をLMIR など）の細胞外ドメインと human IgG 1 -Fc 領域とのマウスの腹部に塗布して感作させ、5 日後に耳に TNCB を融合蛋白（ITAMR-Ig 蛋白）を作製した。このライブラリチャレンジして、48 時間後の耳介の肥厚を測定した。

ーを用い、ELISA システムを用いて数種類のハプテン

３．結（TNCB、DNCB、Oxazolone、FITC）との結合性を調べた。

2. 2. NFAT-GFPレポーター細胞株を用いたハプテン反応性試験

果3. 1. ハプテンを認識するITAM共役受容体の同定
ITAM 共役受容体 -Ig ライブラリーを用いたハプテンとの結合スクリーニングの結果、異なるハプテンに対して結ハプテン結合性を示した候補 ITAM 共役受容体とその合性を示し（図 2）、さらに ITAM-NFAT シグナルを活性会合 ITAM アダプター分子を安定発現した NFAT-GFP リ化する（図 3）受容体として、IgSFR 2、IgSFR 6 の二つを同ポーター T 細胞株（43 . 1）を作成し、これらの細胞のハプ定した。これらはいずれも Ig スーパーファミリーに属し、テン反応性を、GFP 発現量あるいは上清中の IL- 2 産生量

DAP 12 に会合して活性化シグナルを伝達することが報告を指標として評価した。

されている。これらの候補受容体がハプテンと結合するこ− 168 −アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立とで ITAM シグナルを活性化できるかを調べるため、各受容体と DAP 12 を安定発現する 43 - 1 細胞を作成し、これをハプテンで刺激して NFAT 活性化（GFP 発現）あるい
は IL- 2 産生を解析した。その結果、IgR 2 および IgR 6 の両方とも NFAT 活性化や IL- 2 産生を誘導できることがわかった。さらに、これら二つの受容体の反応性は試験した
ハプテン毎に異なることから、それぞれが異なる化学構造を認識していることが推測された。

3. 2. 候補受容体のCHS発症における役割の検討
IgSFR 2 および IgSFR 6 の ACD 発症における役割を調べるため、これら受容体の遺伝子欠損マウス（IgSFR 2 KO、IgSFR 6 -KO）を用いて TNCB 誘導性の CHS 試験を実施した。また、コントロールマウスとして野生型マウス

図4 IgSFR 2とIgSFR 6のダブル欠損マウスでもCHS発症に影響しないと DAP 12 欠損マウスを用いた。過去の報告で我々は、
DAP 12 欠損マウスが CHS を発症しないことを報告している 2）。実験の結果、DAP 12 欠損マウスでは TNCB チャレン受容体以外の複数の未知のハプテン受容体が存在し、それジ後の耳介の腫脹がほとんど生じないのに対し、IgSFR 2らが協調してハプテンの認識と自然免疫の活性化に関わっおよび IgSFR 6 欠損マウスは、野生型マウスと同等の腫脹ている可能性が考えられた。

が観察された。この結果から、IgSFR 2 あるいは IgSFR 6

５．総の単独の欠損は CHS 発症に影響しないことがわかった。

括In vitro の結合試験において、IgSFR 2 および IgSFR 6 の本研究は、感作性化合物を認識する宿主受容体を用いた

両方とも TNCB に結合性を示したことから、これらの受容化合物の in vitro 感作性評価試験系の樹立を目指して立案体が協調的に TNCB の認識に関わっていると考え、両方した。しかし、ハプテン結合性の受容体の同定には至ったの受容体を欠損するマウス（IgSFR 2 / 6 -KO）を作成してものの、これらの受容体のアレルギー性接触皮膚炎感作にCHS 試験を実施した。しかしながら、IgSFR 2 / 6 -KO でおける重要性を見いだすことができず、その結果、目標とも野生型マウスと同等の CHS の誘導が観察された（図 4）。

する評価試験系の樹立には至らなかった。ITAM-Syk-４．考CARD 9 経路の活性化を利用した評価試験法として、受容察体を同定し、それを利用するものではなく、何らかの形で本研究において、ハプテン化合物に結合する ITAM 共

この細胞内シグナル経路を検出、定量するシステムを考案

役型受容体のスクリーニングによって二つの候補受容体する方が現実的であるのかもしれない。今後もハプテン受（IgSFR 2、IgSFR 6）を同定した。これらの受容体はそれぞ容体の同定を続けるとともに、有用な新しい感作性試験法

れ TREM ファミリーと CD 300 ファミリーに属する受容体の創出を模索していきたいと思う。

であり、DAP 12 に会合して細胞内シグナルを伝達することが過去に報告されており、レポーター細胞を用いた試験に お い て、 実 際 に ど ち ら の 受 容 体 も DAP 12 を 介 し て（引用文献）
1） Hara H and Saito T: CARD9 vs. CARMA1 in innate

ITAM 下流のシグナルを活性化することを確認した。我々

and adaptive immunity. Trends in immunol. 2009, 30

は過去の報告で、CHS の感作には樹状細胞が発現する（5）: 234-242.

DAP 12 シグナルが必要であることを見出していたことか

2） Yasukawa S, Miyazaki Y, Yoshii C, Nakaya M, Ozaki2）

ら 、今回同定した２つの受容体がハプテン化合物を感知

N, Toda S, Kuroda E, Ishibashi K-I, Yasuda T,する有力な受容体候補であると判断し、それぞれの受容体

Natsuaki Y, Mi-ichi F, Iizasa EI, Nakahara T, Yamazakiの欠損マウスを用いた CHS 試験を実施してその病理的重M, Kabashima K, Iwakura Y, Takai T, Saito T,要性の評価を行った。しかしながら、いずれの受容体を単Kurosaki T, Malissen B, Ohno N, Furue M, Yoshida H,

独で欠損するマウスあるいは両方欠損するマウスにおいてand Hara H: An ITAM-Syk-CARD9 signaling axis

も、TNCB 誘導性の CHS 反応は野生型と遜色がないもの

triggers contact hypersensitivity by stimulating IL-1であった。この結果から、IgSFR 2 と IgSFR 6 がハプテン

production in dendritic cells. Nat Commun. 2 0 1 4, 5:の認識と CHS 感作に全く必要でないか、あるいはこれら

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