化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

早稲田大学

木野邦

理工学部

器、桐村

光 太 郎

In generally microorganisms, L-cysteine is synthesized from sulfide and O-acetyl-L-serine (OAS) by O-acetylserine
sulfhydrylase (OASS). On the other hand, tryptophan synthase (TS) consist of α-subunit and β-subunit forming α2β2complex. An α-subunit and β-subunit can exist as α monomer and β2 homodimer in cell, respectively. It is known threedimensional structure of TSβ is similar to that of OASS-A which is an isozyme of OASS, although nucleotide sequences
are identified only 20%. And TSβ can recognize not only OAS but also L-serine as substrate and synthesize L-cysteinefrom L-serine and sulfide. β2 complex has the activity of β-replacement and β-elimination reaction, and it catalyzes
β-elimination reaction more than the other one. However α2β2 complex catalyzes β-replacement reaction more.
We attempt to synthesize L-cysteine from L-serine and sulfide by using the enzyme reaction of TS overexpression
organism. At first trpB and trpA gene were cloned into an expression vector pTrc99A and the constructed plasmiddesignated pTTS. We identified that L-cysteine was synthesized from L-serine and sulfide by enzyme reaction of cellfree extract of Escherichia coli JM109 carrying plasmid pTTS. And L-methionine was detected in this reaction mixture.

１．緒の遺伝子配列と 20％程度しか一致していないにも関わら言ず、お互いの立体構造は酷似している４, ５）。また、TSβ は含硫化合物は生体において重要な機能を持つことが多OAS だけでなく、L −セリンも基質とすることが報告され

く、化粧品・医薬品・食品などの原料として広く用いられている６）。しかし、TSβ だけでは β 置換反応よりも β 脱ている。特にＬ−システインは化粧品原料として用いられ離反応をより強く触媒するため、β 置換反応を必要とするているが、その製法は専ら毛髪等タンパク質からの抽出法

L −システイン合成を行うには、TS は α2β2 四量体の状態に依存しており、発酵法による工業的製法が確立されていで用いることが望ましいと考えられる。

ないアミノ酸の一つである。また、最近はその需要増や環本研究では、TS の β 置換反応によって L−セリンとスル境問題から従来の主製法である抽出法からの脱却も望まれフィドから L−システインを合成する効率的な生産系の確立ている。

を目的とした。そこで TSα、TSβ をコードする大腸菌由一般的な微生物において L −システインは、硫酸還元経路

来の遺伝子 trpA と trpB を高発現プラスミドにクローニングの最終産物のスルフィドと O −アセチルセリン（以下 OAS）してプラスミド pTTS を構築した。まず、トリプトファンから O −アセチルセリンスルフヒドリラーゼ（以下 OASS）要求性（trpBA 欠損変異）大腸菌を pTTS で形質転換したの触媒する反応によって合成される 。この生合成経路は時の L−トリプトファン要求性相補の可否を確認し、次に L複雑な制御を受けており２）、また L −システインは多くの含−システイン要求性（cysE 欠損変異）大腸菌を当該プラスミ硫化合物の生合成中間体であるため代謝されやすく、高収ドで形質転換した時、L−システインの代わりに L−セリンと率の発酵生産プロセスを構築することは極めて難しい。こスルフィドを添加した培地で生育するかどうかを確認した。のような背景を踏まえ、我々はビタミン B6 依存性酵素ト

さらに、pTTS で形質転換した大腸菌の粗酵素抽出液を用いリプトファンシンターゼ（以下 TS）の特性に着目した３）。て L−セリンと Na ２S からの L−システイン合成を試みた。

１）

TS は α サブユニットと β サブユニットの２種類から成２．実り、α2β2 複合体として L −トリプトファン生合成の最終段階を触媒する多機能酵素であり、それぞれ α 単体、β2 複２. １験

試薬合体としても存在しうる。また、β サブユニットの遺伝子本研究で使用した制限酵素は全て日本ジーン社製であ

配列は、OASS のアイソザイムで主活性体である OASS-Aり、プラスミド pTrc99A はアマシャムファルマシアバイ

Development of Novel Process forProducing Sulfur-containing Compound asCosmetics Material
Kuniki Kino, Kohtaro Kirimura＊

School of Science and Engineering Waseda
University＊

オテク社製である。Polymerase Chain Reaction（PCR）
で用いた DNA Polymerase には TaKaRa 社製 Ex Taq を用い、その他の試薬は全て関東化学社製のものを使用した。

２. ２

使用菌株

本研究では、DNA 供試菌および宿主として Escherichia
coli JM109 を用いた。L −トリプトファン要求性大腸菌は−8−

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

E.coli CAG12202（trpB::Tn10Kan,thi-1,relA1）を、L −シピリドキサールリン酸 0.1 mM、誘導物質であるイソプ

ステイン要求性大腸菌は E.coli KY14182 を用いた。なお、ロピルチオガラクトシド（IPTG）0.1mM を含んだ平板

CAG12202 株は国立遺伝学研究所より分譲され、KY14182培地上に、pTTS を導入した L −システイン要求性大腸菌

は協和発酵工業株式会社より分譲された株である。

E.coli KY14182 を接種し、L −システイン要求性の回復をその生育の可否で判断した。

２. ３ 実験方法

また、pTTS を導入した E.coli JM109 を 200mL の LB

２. ３. １

trpA、trpB のクローニング培地で 18 時間培養し、集菌した菌体を 50 mM リン酸緩trpA、trpB のクローニングは PCR 法にて実施した。

衝液（pH7.0）20mL で懸濁し、ホモジナイザーにより細既に報告されている大腸菌由来の t r p A、t r p B の塩基胞膜を破砕、その後遠心分離により細胞膜を除去して粗配 列 か ら、 ２ 種 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー、5'

酵素抽出液を調製した。L −セリン 50 mM、Na2S 30 mM、− CGCCATGGAAGGAAAGGAACAATGAC − 3' と 5' −ピリドキサールリン酸 0.1 mM、さらに L −システインのGGCTGCAGTTAACTGCGCGTCGCCGC-3' を設計し収率が上がると報告されている SDS を 1 g/L になるようた。E.coli JM109 の染色体 DNA を鋳型として PCR 法にに添加した溶液を用い、37℃、24 時間反応を行った。分て trpA、trpB を含む DNA 断片を増幅した。PCR の条件

析は TLC により実施した。展開溶媒は前述と同様である。

は、95℃
72℃

60 秒（１サイクル）、95℃

120 秒（30 サイクル）、72℃60 秒、56℃60 秒、３．結300 秒（１サイクル）で行った。その後、得られた DNA 断片（約 2.1kb）とプ

３. １

ラスミドベクター pTrc99A を NcoI と Pst I で制限消化し、両者を連結してプラスミド pTTS を構築した。

果trpBA のクローニング

E.coli JM109 の染色体 DNA から単離、増幅した trpBA（2.1kb）を高発現ベクター pTrc99A(4.6 kb）の NcoI-Pst I サイトにクローニングし、目的プラスミド pTTS（6.7 kb）を得た（Fig. １）。

２. ３. ２形質転換

形質転換はバイオラッド社製ジーンパルサーを用いたエ

３. ２

SDS-PAGE による TSα、TSβ の発現の確認

pTTS を導入した E.coli JM109 において、pTTS の持つレクトロポレーション法（初期電圧 25V、抵抗 400Ω、キtrpA と trpB の発現の程度を調べるため、E.coli JM109/ャパシタンス 25FD）にて実施した。

pTTS の粗酵素抽出液に対して SDS-PAGE を行った。

２. ３. ３29kDa の TSα の大きさ一致する強いバンドが 30 kDa 付菌体の培養

菌体の培養は、500mL 容三角フラスコに LB 培地（バ近に、45kDa の TSβ の大きさと一致する強いバンドがクトトリプトン 10 g/L、イーストエキストラクト５g/L、45 kDa 付近に認められ、TSα、TSβ 両遺伝子の高発現NaCl 10 g/L）を 200mL 入れたものに接種し、37 ℃で 18が各々確認できた（Fig. ２）。

時間液体振とう培養した。

３. ３
２. ３. ４

TS の活性確認

組換え TS が活性を保持しているか確認するために、組換え TS の活性確認

pTTS を導入した L−トリプトファン要求性大腸菌 E.coli

pTTS を導入した TS 欠損株 E.coli CAG12202（CAG12202

CAG12202 を最少平板培地に接種し、その生育の可否で／ pTTS）を L −トリプトファンを含まない最少平板培地

pTTS による L−トリプトファン要求性の相補を確認した。に接種し、その生育の可否により L −トリプトファン要求

また、組換えトリプトファンシンターゼを用いて L−トリ性の相補を観察した。期待通り宿主の L −トリプトファンプトファン合成を検討した。pTTS を導入した E.coli JM109
を 200mL の LB 培地で 18 時間培養し、集菌した菌体に50mM リン酸緩衝液（pH 7.0）20mL を加え、さらに L−セリン 50 mM、インドール 10mM、ピリドキサールリン酸 0.1
mM になるように添加した溶液で、37℃、24 時間反応を実施した。分析は薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて行い、展開溶媒は 99.5％エタノール：H ２O ＝ 63：37 とした。

２. ３. ５

組換え TS による L −システインの合成

最少培地に L −システイン合成における基質となる L −セリン 50mM、Na2S 30mM を含み、さらに補酵素である

Fig.1 Physical map of constructed plasmid pTTS carring trpB
and trpA gene.

−9−要求性は相補され、E.coli CAG12202 ／ pTTS は生育した。
さらに、休止菌体反応による L −トリプトファンの合成活性も検討した。その結果 、収率は低いものの L −トリプトファンの合成が TLC により確認でき（Fig. ３）、組換え TS が活性を保持していることが示された。

３. ４

L −システイン要求性の相補pTTS のコードする TS が活性を維持していることを確認したので、続いてこれを用いて L−システインの合成を試みた。pTTS を導入した L−システイン要求性大腸菌 E.coli
KY14182（KY14182 ／ pTTS）を、L−セリン、Na ２S、ピリドキサールリン酸、IPTG を添加した L−システインを含まない最少平板培地に接種した。その結果 、E.coli KY14182／ pTTS は生育し、L−セリンと Na ２S から L−システインが合成されていることが示された。また、そのコロニーの大きさは L−システインを含んだ最少平板培地に接種した宿主

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the cell-free extracts of eachstrain.
Lane1, Protein size marker ; lane2,cell extract of E.coli
JM109;lane3, cell extract of E.coli CAG12202/pTTS.

が形成するコロニーと同程度かそれ以上の大きさであった。

３. ５

粗酵素抽出液による L −システインの合成

L−トリプトファン合成反応は休止菌体反応で行ったが、L−システイン合成反応は粗酵素抽出液により実施した。この理由は２点あり、１点目は L−システインが酸化により容易に二量 体（L−シスチン）となり沈殿を生じるため、あらかじめ細胞膜を除去し反応後に遠心分離することで簡便に L−シスチンの回収が可能であると考えたからである。２点目は大腸菌の細胞膜には粘着性があり、休止菌体反応では菌体同士の接着により収率が低下する可能性があり、それを回避するためである。そこで粗酵素抽出液を用い、基質となる L−セリンと Na2S の最適条件を検討した。
Na2S は高濃度では酵素活性を阻害する。検討の結果 、酵
素活性を保持することができる上限はおよそ 30mM である

Fig.3 Thin-layer chromatogram of L-tryptophan synthesis
reaction products using TS.

ことがわかった。そこで、L−セリン 50mM、Na2S 30mM、ピリドキサールリン酸 0.1mM、SDS 1 g/L を粗酵素抽出液を用いる場合の最適条件とし、L−システイン合成反応を実施した。反応液の TLC 分析では、収率が低いものの L −システイン生成を確認できた。ところが、他にも生成物が検出され、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分析の結果 、L−メチオニンの位置にピークが見られた。再度
TLC により検討したところ、L−システインと L−メチオニンの 置にスポットが確認でき（Fig. ４）、L−システインとL−メチオニンが上記反応系において生成していることが明らかになった。

４．考察

TS を用いた L −セリンと Na2S からの L −システインの合成が確認できた。しかし、収率は低かった。これは、反応条件の最適化がなされていないことと、含硫アミノ酸のFig.4 Thin-layer chromatogram of L-tryptophan synthesis reaction products using TS.
Lane1, L-serine ; lane2,L-cysteine ; lane3, L-methionine ;lane4, reaction product by enzyme reaction of cell-free extract of E.coli JM109/pTTS.

− 10 −

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

Fig.5. Biosynthesis pathway of L-methionine

代謝中間体である L −システインは分解代謝されやすく、る報告は従来なく、L −メチオニンの新たな酵素合成法を提安定に保持されなかったからではないかと考えられる。こ示するものとして今後詳細に検討する価値があると考える。の場合、L −システインから分解代謝系を抑える必要があるが、その主分解産物として L −メチオニンを検出したこ（引用文献）とは極めて興味深い。

１） Kredich N.M. : Biosynthesis of cysteine, In :Neidfardt

また、スルフィドとして加える Na2S は不安定な物質で、FC,Ingraham JL, Magasanik B. (eds) : Escherichai coli

簡単に H2S になり気中に放出されてしまう。例えば反応and Salmonella typhimurium, : Cellular and Molecular

溶液の pH を調整するときはこの傾向が激しく、かなりのBiology, 1, American Society for Microbiology, 1987,

量の Na2S が H2S になり気中に放出される。また、培養中

419-428.

は 37℃と比較的高温状態であるのでこの傾向は益々増大

２） Kredich N.M. : Regulation of cysteine biosysnthesis in

する。したがって反応溶液内ではスルフィド量が律速とな

Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 115-132.

り、十分な反応を行なうためにはその不足分を逐次補う必In K.M.Herrmann, R.L.Somerville (eds), Amino Acids:

要があると考えられる。しかし、反応溶液中の残存硫黄イ

Biosynthsesis and Genetic Regulation. Addison-Wesley

オン濃度を計測することはできないので、Na2S の最適添

Publishing Company, 1983
３） Miles E.W. : Tryptophan synthase : Structure,

加量を判断するのは難しい。

function, and subunit interaction, Adv. Enzymol. Relat.

L −メチオニンは微生物では Fig. ５に示す経路により生Areas Mol. Biol., 49, 127-186, 1979.

合成されている。今回の研究では、L −セリンに対する L −メチオニンの収率は約 20 〜 30％であった。仮に L −メチ４） Hyde C.C., Ahmed S.A., and Davies D.R., : Three-オニンへの代謝経路を遮断した菌体で L −システインの合dimensional structure of the tryptophan synthase α2β2成反応を行うと、40 〜 50％以上の高収率で L −システイmultienzymecomplex from Salmonella typhimurium, J.

ンを得ることができると期待される。L −メチオニンはもBiol. Chem., 263, 17857-17871, 1988.

っぱら化学合成法から得られるメチオニンラセミ体からの５） Burkhard P., Rao G.S., and Hohenester E. : Three-分割法で生産されているが、安価な L −メチオニン供給のdimensional structure of O-acetylserine sulfhydrylase from

可能な発酵生産プロセスは未だ確立されていない。今回、Salmonella typhimurium, J. Mol. Biol., 283, 121-133, 1998.

L −システインだけでなく L −メチオニンの生成も確認する

６） 嶋田正雄 , 中村武史 , 石渡健一 , ほか１名 , : 特開昭ことができた。L −セリンからの L −メチオニン合成に関す− 11 −

61-242589