株式会社アイスティサイエンス1

定量結果がおかしいと感じた時どうしていますか？
例えば低回収率、高回収率、ピーク形状、ばらつきetc…

ミスがあったのだろうか・・・
初めての検体だったし・・・
試薬が古かったのかな・・・

よし、もう一回やってみよう！

その再検査ちょっと待った！

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「おかしい」の例・・・異常回収率（低、高）マトリクスの影響あり

マトリクスの影響なし

マトリクスの影響を抑える

試験法の見直し例えば回収率異常→まずは、マトリクス検量線による、マトリクスの影響の確認

マトリクスの影響あり → マトリクスを抑える
マトリクスの影響なし → 試験法の見直し※「マトリクスの影響」は、低・高回収率、両方をさします。

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簡単①注入量を減らす（LC-MS/MS）
測定液を希釈する②擬似マトリクスを使う（GC-MS）③精製で固相への負荷を減らす（負荷量減量や抽出液希釈）

難しい④マトリクスを予想し精製アレンジ

5原因は抽出？精製？分解？
多段標準添加抽出

抽出前添加（A）
抽出後添加（B）

精製（抽出操作での回収率がわかる）

回収率からわかること

A÷添加濃度＝添加回収試験
C÷添加濃度＝マトリクスの影響
A÷C＝抽出・精製工程の回収率（マトリクスの影響相殺）
B÷C＝精製工程の回収率

測定液

精製後添加（C）

A÷B＝抽出工程 〃（精製操作での回収率とマトリクスの影響がわかる）

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ガラス器具の精度と用途例
計量精度
かなり高い
まずまず高い低い

器具例
ホールピペット
メスフラスコ
メスピペットメスシリンダービューレット
駒込ピペット
ビーカー

使い勝手

用途例

農薬分析では△分取、定容検量線作成△～○

添加、滴下膨潤用の水添加
固相溶出液計量○

大まかに量る、溜める固相コンディショニング
溶媒小分け

試薬の調整と保管
要事調製…定量値におよぼす影響が大きい
密閉保管…揮発性
冷蔵保管…常温で不具合
冷凍保管…常温・冷蔵で不具合
暗所保管…光により不具合
ガラス保管…有機溶媒
プラスチック瓶保管…酸、アルカリ

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各工程がおよぼす結果への影響～STQ法を例に～

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①試料調整②抽出③精製（GC-A法） ④精製（GC-B法） ⑤精製（LC法）⑥測定（GC-MS） ⑥測定（GC-MS）⑦測定（LC-MS/MS）9原因と要素

症状

対策例

ばらつき

凍結粉砕、ミル、超遠心粉砕、ふるいなど

ばらつき

凍結粉砕、複数凍結保管

均一不足

試料中の偏り凍結・解凍の繰り返し

変性

分解

酵素
加水分解
熱分解

低回収率

酸・アルカリ添加、凍結粉砕、発熱防止、温度調整など

吸着

物性特性

低回収率

吸着防止剤添加など

10抽出・塩析フロー
試料 10g (穀類 5g + 水 10mL)①
アセトニトリル

10mL②

ホモジナイズ③
NaCl（食塩） 1g
クエン酸3Na2水和物 1g
クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5g
MgSO4（無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ）4g
撹拌（手で振とう 1分間）⑤
遠心分離（3000rpm
アセトニトリル層5分間）⑥

留意点①水が少なすぎると最適にpHが調整されない→アセトニトリル層に分配されない可能性あり②ある程度高精度の器具を推奨
共洗いとをすると抽出液が希釈され低回収率へ（複数回抽出後、定容する場合は可）④ ③サンプル自体からの抽出④試薬量を間違えると、pH調整、塩析が期待通りにならない可能性あり⑤抽出、塩析を兼ねている。粘性が帯びるものはしっかり振とう。振とうスピードの影響は比較的低い。試薬を溶かす意味も。
⑥上澄みが取れればよい。
回転スピードは比較的影響は低い。
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精製フロー
分取 1 mL （試料 1g相当）①
Smart-SPE C18-50 mg：精製
洗液 アセトニトリル 0.2mL
流出液

添加 トルエン 0.4mL

無水硫酸Mg 0.3g ②
Smart-SPE GCS-20mg/PSA-30mg：精製③
流出液
溶出 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-ﾄﾙｴﾝ(3/1) 0.6mL④
定容（2 mL, ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-ﾄﾙｴﾝで調製）⑤

留意点①ある程度高精度の器具を推奨②少ないと脱水不充分をなりPSAでの精製効果低下③上グラファイトカーボン＋下PSA
選択性の高い固相を後ろに。
順番を間違えると精製不足の可能性④3:1がグラファイトカーボンの溶出・精製のバランス。トルエン比が高いと平面構造の夾雑が溶出低いと、低回収率を起こす可能性⑤ある程度精度の器具を推奨※コンディショニングは駒込ピペットで2mL以上程度の精度、通液スピードは早くても問題ない。
※溶出液は、メスピペットやマイクロピ
ペット程度
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① 精製
ACN
抽出液

C18-50② 精製
アセトニトリル-トルエン
流出液＋トルエン

GCS-20★除去物質
・無極性夾雑物
・コレステロール・トリグリセリﾄﾞ

PSA-30★除去物質
・色素・平面構造★除去物質
・高級脂肪酸・色素

農薬

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精製フロー

留意点①ある程度高精度の器具を推奨②水は予め混合するか、リザーバー内に入れておき、分取 0.5 mL （試料0.5g相当）①添加 水 0.2mL（事前にリザーバー内に入れておく）② サンプルと混合→抽出液（アセトニトリル100%）のままC18に一Smart-SPE C18-30 mg：精製部でも負荷されると無極性夾雑精製不足の可能性
洗液 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-水(4/1) 1mL③ ③アセトニトリル比が低いと低極性溶出できず農薬回収率低下。（シラフルオフェン、エトフェンプ
流出液
添加 水 2mL④ロックス）④水を忘れると急激に水分量が増えプラスチック器具
Smart-SPE PLS3-10mg：保持に低極性の農薬が吸着、回収率低下
15%食塩水 20mL⑤⑤食塩水が少ないと、中極性の農薬が溶出し廃液されSmart-SPE PLS3-10mg：再保持回収率低下。（高極性はLC-MS/MS対象）⑥水分、水滴が残ると、PSAでの精製効果低下
吸引乾燥：3分⑥
測定液に水が混入すると、測定に悪影響
連結 Smart-SPE PSA-30：精製⑦アセトン比が下がると溶出力低下、回収率低下。
（精製を高めるために比率を下げる場合あり）
溶出 ｱｾﾄﾝ-ﾍｷｻﾝ (15/85) 1mL⑦
ある程度フレッシュな混合溶媒を推奨定容（1 mL, ｱｾﾄﾝ/ﾍｷｻﾝで調製）⑧⑧ある程度高精度の器具を推奨※コンディショニング、溶出溶媒添加器具については
GC-A法と同じ

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① 精製

② 保持

ACN-水流出液＋水抽出液+水C18-30

PLS3-10★除去物質
・無極性夾雑物
・コレステロール・トリグリセリﾄﾞ

無極性農薬

中極性農薬

③ 再保持

④ 溶出・精製流出液＋食塩水 アセトン-ヘキサン

無極性農薬
中極性農薬

PSA-30★除去物質
・高級脂肪酸・色素農薬15

① STQ法の基礎

精製フロー
分取 1mL （試料 1 g 相当）①
Smart SPE C18-30mg＋PSA-30mg
溶出 0.4%ギ酸含有ﾒﾀﾉｰﾙ（pH2.5）1mL②＊酸性農薬が無い場合、メタノール 1mL

流出液
水 0.5mL③
Smart SPE C18-50mg
洗液 メタノール-水（4/1）1mL④
定容（4 mL, 水で調製）⑤

留意点①ある程度高精度の器具を推奨②ギ酸濃度が低下すると酸性農薬が溶出不十分で回収率低下。フレッシュな調製試液を推奨。（酸性夾雑物除去を優先しギ酸を使用しない場合あり）③水を入れることでC18で低極性夾雑を除去。入れ忘れると精製不足によりLCMS/MS測定でサプレッションの可能性④メタノール比が低下すると溶出不足により回収低下⑤ある程度高精度な器具を推奨※コンディショニング、溶出溶媒添加器
具についてはGC-A法と同じ※検量線もサンプルと同じ組成の溶媒で希釈。異なると感度変化、ピーク形状悪化の可能性

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① STQ法の基礎

① 精製

② 精製

ギ酸メタノール（pH2.5）
抽出液

C18-50

C18-30

PSA-30

流出液＋水

★除去物質
・無極性夾雑物
・コレステロール・トリグリセリﾄﾞ★除去物質
・無極性夾雑物
・高級脂肪酸・色素★除去物質
・色素農薬17