タイトジャンクションの形成を促進するシグナル伝達経路の解明
九州大学理学研究院生物科学部門

池ノ内順一

Epithelial cells define the boundary between the outside and the inside of our body by constructing the diffusion barrier.
Tight junctions (TJs) of epithelial cells function as barriers against invasion of harmful microorganisms into the humanbody and free diffusion of water or ions from the body. Therefore, formation of TJs has to be strictly controlled in epithelialcells. However, the molecular mechanisms governing this regulation are largely unknown. In this study, we identified Ca 2 +/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) as a regulator of the barrier function of TJs. CaMKII inhibition led toenlargement of TJ-areas and up-regulation of the barrier function. CaMKII inhibition induced excess TJ formation in partby the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and subsequent phosphorylation of claudin- 1 . As up-regulationof epithelial barriers is essential for the prevention of chronic inflammatory diseases, the identification of CaMKII as amodulator of TJ function paves the way for the development of new drugs to treat these diseases.

1. 緒

また Claudin-1 の発現が低下したマウスでは、アトピー性言皮膚炎に類似した症状を示すことが近年明らかになった 2）。

私たち多細胞生物のからだは、数兆個の細胞から構成さこのことは、皮膚顆粒層に存在するタイトジャンクションれており、細胞同士はタイトジャンクションと呼ばれる細が外来抗原に対するバリアとして機能し、タイトジャンク胞接着装置によって密に結合している。タイトジャンクシションの破綻が慢性炎症の原因になっていることを示唆す

ョンを構成する細胞接着分子として、4 回膜貫通タンパクる。

質の Claudin が同定された。しかしながら一方で、タイトこのようにタイトジャンクションやその主たる構成因子ジャンクションの形成がどのような仕組みで制御されていである Claudin が生理的なバリアとして機能し、その破綻るかについては、殆ど明らかになっていない。

が病態発症につながることが明らかになった。しかしなが本研究では、タイトジャンクション形成の分子メカニズ

ら、タイトジャンクションの形成がどのように制御されるムを明らかにすることにより、皮膚のタイトジャンクショかはこれまで全く明らかになってこなかった。タイトジャンの形成促進を可能とする化粧品・外用薬・医薬品の開発

ンクションの機能を人為的に制御することは医学的に重要の基礎となる知見を得ることを目的としている。

な試みであるが、Claudin タンパク質の発現量を人為的にタイトジャンクションは、上皮細胞や血管内皮細胞など制御するだけでは不十分である。Claudin-1 を過剰に発現の細胞が持つ細胞接着装置であり、特に皮膚においては、しても余剰のタイトジャンクションは形成されない。私は、タイトジャンクションは、体内からの水分の蒸散を防ぐ上タイトジャンクションの形成に関わる分子機構を明らかにで必須の構造である。皮膚の上皮細胞が持つタイトジャンする目的で、小分子化合物ライブラリーのスクリーニング

クションを構成する膜タンパク質 Claudin-1 をノックアウを行い、タイトジャンクションの形成を促し、上皮細胞のトしたマウスでは、水分が蒸散して、生後すぐに脱水を呈バリア機能を亢進させるシグナル伝達経路の解明を試みする 1）。これまで皮膚において保湿を担うのは、角質のセた。

ラミド層であるとされていたが、上記の知見は、タイトジャンクションもセラミド層と同様に皮膚の保湿において重要な役割を果たすことを意味している。従って、タイトジ

2. 方法

2. 1. 細胞培養実験に用いたマウス唾液腺由来培養上皮細胞であるャンクションのバリア機能を強化することは、保湿効果をCSG1 細胞は、最終濃度 10 ％ Fetal Bovine Serum（FCS）高めることが期待できる。

を添加した DMEM を用いて 37 ℃、5 ％ CO2 で培養した。
Elucidation of molecular mechanisms
involved in t he for mat ion of t ight
junction
Junichi Ikenouchi
Kyushu University Faculty of Science
Department of Biology

2. 2. 蛍光抗体染色
顕微鏡観察に用いる細胞は ϕ35 mm glass-base dishes ま
たは ϕ15 mm カバーガラス上でコンフルエントになるまで培養した。これを 2 ％ PFA/PBS（-）で 10 分間固定処理を行い、続いて 50 μg/mL Digitonin/PBS（-）を用いて 10 分− 42 −

タイトジャンクションの形成を促進するシグナル伝達経路の解明

間透過処理を行った。次いで、1 ％ BSA/PBS（-）
を加え 15分間ブロッキング処理を行った。一次抗体を 1 ％ BSA/PBS（-）に適切な濃度で希釈したものを加え 1 時間、その後、同様に希釈した二次抗体を加え 30 分間静置し、よく洗浄を行ってから観察した。

2. 3. Western Blotting
ウエスタンブロッティング用に作製したサンプルを
SDS-PAGE により分離後、ウェット法によりニトロセルロース膜に転写した。転写した膜を5％スキムミルク/PBS（-）に浸し、室温で 30 分間振盪しブロッキングした。続いて

図１ GFP-Claudin-1 を安定発 現する L 線 維芽細胞に KN-93を最終濃度が 10 µ M になるように添加した。DMSO を培地に添加した対照群に比べて KN-93 を培地に添加した細胞ではGFP-Claudin-1 が顕著に細胞間接着部位に集積している。スケールバーは、5 µm。

一次抗体を 5 ％スキムミルク /PBS（-）に適切な濃度で希釈したものを加え 1 時間、その後、5 ％スキムミルク /PBS（-）に 1/2000 に希釈した二次抗体を加え 30 分間室温で振盪した。その後 PBS（-）で 30 分間振盪洗浄し、Super Signal
west Dura 発色試薬を用いて検出した。

2. 4. 経上皮電気抵抗値（TER）の測定
CSG1 細胞を 12 well のトランスウエル（Corning）に細胞数が 1 × 106 個になるように播種し、2 日ほど培地を交換してコンフルエントになるまで培養した。培養後、電気抵抗値を測定した。

3. 結果

3. 1. タイトジャンクションの形成を促進する化合物の同定
タイトジャンクションの形成を促進するシグナル伝達経路を同定する目的で、標的の明らかになった小分子化合物のライブラリーを用いて、上皮細胞のタイトジャンクション領域を拡大する化合物を探索した。具体的には、タイトジャンクションの構成分子である Claudin-1 に GFP を融合させた GFP-Claudin-1 遺伝子を安定的に発現する L 線

図２ マウス唾液腺由来の培養上皮細胞に KN-93 を最終濃度が 10µM になるように添加し、固定後、抗 Claudin-1 抗体と抗 ZO-1 抗体で二重染色した。DMSO を培地に添加した対照群に比べて KN-93 を培地に添加した細胞では Claudin-1 の細胞間接着部位への集積がラテラル膜まで拡大している（白矢印）。
Claudin-1 に結合する裏打ちタンパク質の ZO1 の染色は拡大していない。

維芽細胞を樹立し、化合物の添加によって、細胞間接着部位に Claudin-1 の集積を促す化合物をスクリーニングした。

た。その結果、ラテラル膜に余剰なタイトジャンクション

その結果、カルシウム - カルモジュリン依存性キナーゼ IIストランドが形成されていることを確かめた（図３）。
このことから、KN-93 処理によってタイトジャンクショ（CaMKII）の阻害剤である KN-93 で処理すると、Claudin1-GFPの細胞接着部位への集積が顕著に促進されることをンの形成量が拡大するということが明らかになった。
KN-93 の効果について、上記の形態学的な評価に次いで、見出した（図１）。
次に、KN-93 によるタイトジャンクションの形成促進効上皮細胞のバリア機能に対する評価を行った。経上皮電気果が、上皮細胞でも観察されるか検討を行った。マウスの抵抗測定（Trans-epithelial electrical resistance：TER）は、唾液腺由来の培養上皮細胞である CSG1 細胞に KN-93 を添上皮細胞シートに一定の電圧をかけた際に流れる電流を測加し Claudin-1 に対する抗体で固定染色を行った。その結ることにより、タイトジャンクションを介して上皮細胞の果、培養上皮細胞においても Claudin-1 が細胞接着部位の間隙を通るイオンの通しやすさを測定する。TER が高いラテラル膜に過剰に集積する様子が観察された（図２）。

ほど、イオンを通しにくく、したがって上皮細胞のバリアさらにこのような Claudin-1 のラテラル膜の集積がタイ機能が高い状態であると言える。KN-93 を培地に添加したトジャンクション構造の拡大を反映しているかを確かめる

上皮細胞では対照群に比べて高い TER 値を示すことから、ために、凍結割断レプリカ法による電子顕微鏡観察を行っ

KN-93 の添加によってタイトジャンクションのバリア機能− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図３ マウス唾液腺由来の培養上皮細胞に KN-93 を最終濃度が 10 µM になるように添加し、凍結割断レプリカ法による電子顕微鏡観察を行った。DMSO を処理した群に比べて、タイトジャンクションの形成領域が拡大している様子が観察された。
スケールバーは、200 nm。

図４ マウス唾液腺由来の培養上皮細胞にKN-93 を最 終濃 度になるように添 加し、TER の測定を行った。KN-93 で処理した細胞では TER が有意に上昇した。

KN-93 で処理した細胞では、Claudin-1 の 191 番目のスが増加していることが明らかになった（図４）。

レオニンがリン酸化されることによって、モノユビキチ

3. 2. KN-93 処理によるClaudin の翻訳後修飾ン化される Claudin-1 が減少することによって、余剰のKN-93 は細胞質に存在する CaMKII キナーゼの阻害剤でClaudin-1 が形質膜に蓄積した結果、過剰なタイトジャンあるが、これまでタイトジャンクションとの形成についてクションが形成されると考えられる。上記の内容は全く新研究されたことはなく、図に示したような効果をもたらすしいタイトジャンクション形成の制御機構であるため、論機序は全く不明である。タイトジャンクションが体内から文報告を行った 3）。の水分の蒸散を防ぎ皮膚の保湿に重要な構造であること、このように Claudin-1 のユビキチン化による制御が、タまた外界からのアレルゲンや病原菌の侵入に対するバリアイトジャンクションの動的な制御に関わることを明らかにであることを考えると、CaMKII によるタイトジャンクシすることができた。現在は、Claudin-1 のユビキチン化にョンの形成が促進される分子メカニズムの詳細を解明する関わる酵素の探索を進めている。

ことは重要であると考え、分子メカニズムに関する検討を4. 考行った。

察

ま ず、KN-93 で CSG1 細 胞 を 処 理 し た 際 に Claudin-1

皮膚の上皮細胞が持つタイトジャンクションは水分の恒のタンパク量が増加するか否か検討をウエスタンブロッ常性を維持する必須の細胞膜構造である。保湿は皮膚の質

トにより行った。しかしながら KN-93 の処理によって感に大きな影響を与える要素である。一方で、皮膚のタイClaudin-1 のタンパク量は変化していなかった。しかしな

トジャンクションは、我々の体と外界を分け隔てる構造のがら、GFP-Claudin-1 を発現する L 細胞を用いて KN-93 で実体であり、皮膚からの薬剤の吸収を障害する。このよう処理したときに、GFP-Claudin-1 のバンドが 2 本に分離し、なタイトジャンクションの機能を強化もしくは減弱させる

特に高分子量側のバンドが顕著に減弱していることを見出シグナル情報伝達経路を同定し、人体への安全性の高い阻した。

害剤や機能増強剤を開発することに成功すれば、それらをそこで、高分子量側のバンドに相当する Claudin-1 のバ化粧品に添加することによってタイトジャンクションのバンドは、何らかの翻訳後修飾を受けたものである可能性をリア機能を制御することが可能となり、新しい化粧品の機考えて、Claudin-1 の細胞質領域に存在するすべてのセリ能性成分に利用可能であると考えている。本研究で同定しン・スレオニンをアラニンに置換した変異体を作製した。

た CaMKII 阻害剤はそのまま化粧品など人体に使用するこ

191 番目のスレオニンをアラニンに置換した変異体 GFP-とはできないが、CaMKII 阻害によるタイトジャンクショ

Claudin-1（T191A）では、高分子量側のバンドしか出現しンの形成促進の分子機構をさらに詳細に解析することによないことを見出した。さらに、T191A の非リン酸化型のって、薬剤によって人為的に上皮バリア機能を強化させる変異株が高分子量側に移動する原因として、189 番目のリことができるのではないかと考えられる。近年、ヒトにおジンが恒常的にモノユビキチン化を受けていることがわかいて、皮膚の Claudin-1 の遺伝子多型（SNP）とアトピー性った。すなわち 191 番目のスレオニンのリン酸化状態によ皮膚炎の発症の関連に関する論文報告が為された４）。上皮って、189 番目のリジンのユビキチン化状態が変化しておバリアの破綻を原因とする慢性炎症の治療に向けて、さらり、KN-93 で処理した細胞では、191 番目のスレオニンのに上皮バリアの制御に関わる分子機構の解明を引き続き目リン酸化が亢進することによって、モノユビキチン化され指していきたい。

る量が減少することが明らかになった。

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