ヒト皮膚線維芽細胞における I 型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構
神奈川歯科大学

畑隆

歯学部口腔生化学

一郎

Previously we have shown the presence of two polymorphic dinucleotide repeats in the human type I collagen
α2 (COL1A2) gene, one in the 5' flanking region (upstream repeat) and the other in the 1st intron (1st intronrepeat) and that the co-presence of these two repeats stimulates expression of the gene, and a specific haplotype ofthe two microsatellites of the human COL1A2 gene correlates with susceptibility to systemic sclerosis.
A major part of the DNA double helix within cells exists in the right-handed B-form conformation. Structuraltransition from the B-form to the left-handed Z-form DNA at dinucleotide repeats is proposed to play an importantrole in the transcriptional regulation of various genes.
To investigate the association of the change of higher-order structure such as the transition from the B- toZ-form DNA (B-Z transition) with the two repeat regions and its role in transcriptional regulation, we performed
two-dimensional (2D) gel electrophoretic analyses of constructs containing or not containing the repeat regions. Theresults indicated that constructs containing both of the repeats led to a structural transition from B- to Z-form butthat the construct lacking either of them did not. Additional 2D gel analyses using several constructs containing
either of the two repeats showed that this structural transition occurred only in the upstream repeat, but not in
the 1st intron repeat. Total number of supercoil relaxation was measured among the constructs with different
combinations of several repetitions of the two repeats. The result supported the idea that B-Z transitions occurred
only in the upstream repeat regions. Our findings therefore indicate that the upstream repeat region has theability to convert its conformation from B- to Z-DNA but that the 1st intron repeats did not, although both of thedinucleotide repeats are indispensable for enhancing transcriptional activity of the COL1A2 gene.

１

緒トを PCR 法で作製し、塩基配列を確認した（Fig. １）。こ

言れらのコンストラクトの溶液に種々の濃度（0 〜 7µM）の我々は先に I 型コラーゲン α2 鎖（COL1A2）遺伝子のエチジウムブロミドを添加して負の超ラセンをリラックス

転写性制御領域である遺伝子の上流及び第一イントロンにした条件でトポイソメラーゼ I で 25℃、16 時間処理した４）。

２つの反復配列を見い出し１）、この反復配列の組み合わせにより、COL1A2 遺伝子の転写活性が制御されているこ

２. ２

２次元電気泳動によるトポアイソマーの分離と２）、及び、高い転写促進活性を示す反復配列の組み合わ

上記の各種コンストラクトのトポアイソマー混合物を精せ（ハプロタイプ）が全身にⅠ型コラーゲンが異常に蓄積

製後、0.7％アガロースゲル , トリス / ホウ酸緩衝液（TBE）

３）

する疾患である強皮症に対する感受性に関与していること

中で一次元目の電気泳動を 110V で 16 時間行い、ついでを報告した。本研究ではこの転写制御機構を明らかにする

１µM のクロロキンで処理しラセンをリラックスさせた

ために各種コンストラクトのトポアイソマーを二次元電気後、１µM のクロロキン存在下で二次元目の泳動を 100V泳動法で分離し、転写制御領域の高次構造、特に右巻きので 18 時間行った。クロロキンを除いた後、エチジウムブ

B 型構造から左巻きの Z 型ラセンへの転移を解析した。

ロミドで染色し、写真撮影を行い、二次元電気泳動後のト２
２. １

実

ポアイソマーの移動距離から超ラセン構造を解析した４）。

験コンストラクトとトポアイソマーの作製

２. ３

COL1A2 遺伝子の上流の反復配列（上流反復配列）及び第一イントロンの反復配列（イントロン反復配列）の二DNA ラセンの B-Z 転移に伴う超ラセンのリラクセーシ
ョンは以下の式により計算した。

つの反復配列を含む各種の COL1A2 遺伝子コンストラク
Topological analysis of the transcriptional
regulatory regions of the human type I
collagen α2 chain (COL1A2) gene

B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移の測定５- ８）

i/10.4+i/12
この式で i は反復配列の塩基数、10.4、12 は各々右巻きおよび左巻きラセンの一回転当たりの塩基数を示す。
また、
B-Z 転移における超ラセン密度は以下の式で算出した。
-10.4y/z

Ryu-Ichiro Hata
Department of Biochemistry and MolecularBiology, Kanagawa Dental College

この式で y は二次元電気泳動の一次元目の泳動で泳動距離のシフトを示したトポアイソマーの番号、z は用いたコンストラクト（プラスミド）の総塩基数を示す。

− 51 −

Fig. 1 Schematic diagrams of the 5' region of the COL1A2 gene (uppermost)and gene fragments (lower diagrams) that were contained in the plasmid
clones used for the study. Arrows indicate the transcriptional start site of thegene. Crosshatched and hatched boxes indicate the dinucleotide repeat in
the upstream and in the 1st intron of the gene, respectively. Names of plasmid clones containing the DNA fragments are indicated on the right side.

３結必要無いことが判明した。一方、イントロン反復配列を含果

むコンストラクト及び同様のコンストラクトで反復配列を３. １ 二つの２塩基反復配列を持つコンストラクトの高次構造解析
溶液中で遺伝子 DNA は一般に右巻きラセンの B 型構持たないものは共に泳動距離の負に変化する点が存在せず（Fig.3B and 3D）、イントロン反復配列は同じ条件で Z 型構造を形成しないことが判明した。

造をとっている。今回のアガロースゲル二次元電気泳動の解析結果では COL1A2 遺伝子の二つの２塩基反復配列を持つコンストラクトでは一次元目の泳動で泳動距離が負に

３. ３ 反復配列の長さと Z 型構造の存在量との関係の解析変化する点が検出され（Fig.2A）、反復配列を持たないコさらに、上流反復配列の長さと Z 型構造の形成能とのンストラクトではこの変化が検出されなかった（Fig.2B）。

関係を調べるために、種々の長さの上流反復配列を含む

この結果は少なくとも二つのの反復配列を持つコンストラ

コンストラクトを作成し、上記と同様に二次元電気泳動

クトには高次構造の異なる（Z 型構造）領域が存在してい法で Z 型構造の形成量を調べた。その結果、Z 型構造のることが示された。

形成量は上流反復配列の反復数の総和にのみ比例すること（Fig.4A,4B and 4C）、また、上流反復配列とイントロ

３. ２ンの組み合わせによっては影響されないことが判明した

Z 型構造の局在部位の解析

ついで上流反復配列とイントロン反復配列の両者が Z（Fig.4C and 4D）。

型構造を形成しているのか、あるいは反復配列のどちらか４片方が Z 型構造を形成しているのか、または、Z 型構造

考察の形成に二つの反復配列の共存が必要かを調べるために、

最近 DNA の高次構造が DNA の一次構造（塩基配列）各々の反復配列を持つコンストラクト（Fig.3A and3B）、と同様に生物情報を持っていることが明らかになってきたおよび反復配列を含まないコンストラクト（Fig.3C and９）3D）を作成し、上記と同様に二次元ゲル電気泳動法で高に二つの２塩基反復配列が存在し、この二つの反復配列の次構造を解析した。その結果、上流の反復配列を含むコン組み合わせにより COL1A2 遺伝子の転写活性が促進されストラクトは一次元目の泳動で泳動距離が負に変化する点

ること２）、及びこの配列の組み合わせのうち（13,6,8）-12が存在し、上流反復配列を含まないコンストラクトではトの組み合わせをホモに持つものはⅠ型コラーゲン遺伝子のポアイソマーが連続して分離され、泳動距離の負に変化す転写活性が促進されている強皮症患者ゲノムにのみに存在る点が存在しなかった（Fig.3A and 3C）。これらの結果し、対照の正常な個体由来のゲノムでは存在しないことをから上流反復配列が Z 型構造を形成していることが示さ報告した３）。そこでこれらの反復配列による COL1A2 遺れた。さらに、Z 型構造の形成に二つの反復配列の共存は伝子の転写促進機構を明らかにするために二つの反復配列。我々は先に COL1A2 遺伝子の上流と第一イントロン− 52 −

ヒト皮膚線維芽細胞におけるⅠ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

Fig. 2 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4/+1.4DR, containing (19, 7, 8) of
the upstream repeat and x=12 of the 1st intron repeat (A), and pCOL1A2-1.4/+1.4ΔDR, which does not contain either repeat (B). Electrophoretic patterns of the respective plasmids are shown on the right side of the figure, and schematic diagrams of the results, on the left side. The directions of each dimension of electrophoresis
are indicated in the figure. Positions I and II correspond to the minima in electrophoretic mobility in the 1st and2nd dimension, respectively, and relative topoisomer numbers counted from the minima in the first dimension
are indicated. N indicates the position of nicked DNA.

Fig. 3 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4DR, containing (19, 7, 8) of theupstream repeat (A), pCOL1A2+1.4DR, containing x=12 of the 1st intron repeat (B), and those not containing
either dinucleotide repeat, pCOL1A2-1.4ΔDR (C), and pCOL1A2+1.4ΔDR (D), respectively.
Diagrams shown at the upper part of the respective figures indicate gross structures of COL1A2 gene segments
contained in these constructs. Arrows indicate the transcriptional start site of the gene.

− 53 −

の高次構造を解析した。上流反復配列、イントロン反復配を起こしたことを支持している。さらに本研究で用いた反列の両者が塩基配列からは Z 型構造を取りうることが推復数の異なるコンストラクトの電気泳動における泳動距定されたが、今回の結果は転写開始点の上流のみに左巻き離の負へのシフトはトポアイソマー番号 27 で起こっておラセンの Z 型構造をとった領域が存在することが明らかり（Fig.4）、この値から B 型ラセンから Z 型ラセンへの転になった。Z 型構造の存在量は上流反復配列の長さに比例移における超ラセン密度はおよそ -0.036（-10.4Y/Z, 4 つのすることから、反復配列部分が Z 型構造をとっているとコンストラクトでそれぞれ、27/7742、27/7736、27/7732、思われる。B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移において27/7740）と算出され、これは過去の反復配列による値とは超ラセン密度の減少を伴い、これは２次元電気泳動の１一致する５- ７）。以上の結果は用いたコンストラクトは上流次元目におけるトポアイソマーの泳動距離の負への変化に反復配列のみが Z 型構造を取っていることを示す。

よって示される。B 型ラセンから十字架型構造への高次構

しかし、本研究の結果で測定した Z 型構造の存在量と転造の変化によっても超ラセン密度の減少を伴う。上流反復

写促進活性は単純な比例関係を示さないので、COL1A2配列は CG 反復配列を含むので十字架型構造を取りうる。

遺伝子の反復配列による転写促進活性を制御する因子は十字架型構造をとった時の超ラセンのリラクセーションのDNA の Z 型構造以外にも存在することが示された。これ

総量は i'/10.4（i' は CG 反復配列の長さ）で示される。
（19,7,8）

らの結果は遺伝子の転写促進において現在の知見では説明-12 の反復配列を持つコンストラクトの上流反復配列が十できない新しい制御機構の存在を示唆しており、COL1A2

字架型を取るとすると超ラセンのリラクセーションの総量

遺伝子の研究はこの転写制御の分子機構の研究に好個の材は CG 反復配列を構成する塩基が２× ７＝ 14 なので 1.35料となるばかりでなく、遺伝子の転写制御と疾患感受性の（14/10.4）となる。一方、上流反復配列のみが B 型ラセン解明に重要であると考えられる 10-11）。

から Z 型ラセンへの転移に起こす際の超ラセンのリラクセーションの総量は 13.28（74/10.4 ＋ 74/12、74 は上流反（文献）

復配列の総塩基数）である。後者の値は 2 次元電気泳動に

１） Akai J, Kimura A, Arai K, Uehara K, Hata R:

よる超ラセンのリラクセーションの実測値 13（40-27）とFine structural analysis of the unique 5' region of一致する（Fig.2A）。この結果から、用いたコンストラク

the human COL1A2 gene containing two regions of

トは上流反復配列が B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移

dinucleotide repeats adjacent to the transcriptional

Fig. 4 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4/+1.4DR, containing the following
combination of the repeats: (15, 7, 8)-12 (A), (13, 6, 8)-12 (B), (11, 6, 8)-12 (C), and (11, 6, 8)-16 (D). The left
side of each figure shows a schematic diagram, and relative topoisomer numbers from minima of the 1st dimension are also indicated.

− 54 −

ヒト皮膚線維芽細胞におけるⅠ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

６） Rahmouni AR, Wells RD: Stabilization of Z DNA instart site. Connective Tissue 1998: 30; 1-6

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order structure of the two dinucleotide repeat regionsthat enhance the transcriptional activity of the10） Hata R, Izukuri K, Furue M, Kato Y, Koshika S

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− 55 −

隆一郎の複合遺伝子病

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