新しい生体親和性材料としてのペプチド性人工コラーゲンゲル

早稲田大学理工学術院

小 出隆 規We have developed a peptide-based collagen-like gel utilizing the self-assembling property of collagen-like peptides,
i.e. (Pro-Hyp-Gly)n. In order to functionalize the hydrogel, we incorporated Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg sequence, whichis recognized by integrin, to the peptide building blocks. When human fibroblasts are cultured on the material, integrindependent cell attachment and spreading are observed.

１．緒

用いた人工コラーゲンは、デザイン・合成したヘテロ３言

量体コラーゲンペプチドの自発的な分子間フォールディン

これまでの多くの研究から、数十種におよぶタンパク質グを利用して作製した。採用したペプチドは、コラーゲンが、長さ 300 nm におよぶコラーゲン３重らせん領域に多様 Gly-Pro-Hyp（Hyp, 4-Hydroxyproline） 繰 り 返 し 配 列数結合していることが知られている。その中には、直接コを持つ３本のペプチド鎖を、ジスルフィド結合によってラーゲン３重らせんを認識して細胞内に直接シグナルを入相互にずらせて架橋した３量体ペプチドである。このペ力するインテグリン、Discoidin domain reseptor（DDR）

プチドは、自発的な分子間フォールディングにより、３のような膜レセプターや、コラーゲンに結合して機能が重らせん構造が長軸方向に伸長し、コラーゲン様超分子制御されるコラーゲン結合タンパク質（例えば、Pigmentとなる（Yamazaki CM, Asada S, Kitagawa K, Koide T.

epithelium-derived factor（PEDF） な ど ） が 含 ま れ る。

Biopolymers. 2008 ; 9（6）:816-23）。

それぞれのコラーゲン結合タンパク質は、３重らせん上に２．実提示された特異な配列（コラーゲンの機能エピトープ）に結合し、その機能を発揮する。したがって、天然のコラー2-1験

３量体ペプチドのデザイン

ゲンは、多数の機能エピトープと多数のコラーゲン結合タ

細胞表面に存在するコラーゲンレセプターのひとつでンパク質との結合によって惹起される多様なシグナルを、ある a2b1 インテグリンは、コラーゲン３重らせん構造様々なターゲット細胞に入力している。また、個々のター

上 の Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg（GFOGER） 配 列 を 認 識

ゲット細胞は、コラーゲンより直接的・間接的に複数のシして結合することがすでに知られている。この GFOGER

グナル入力を受け、それらシグナルの総和としてのレスポ配列を含む３量体ペプチドをデザインした。しかし、こンスを示す。の GFOGER 配列を３量体ペプチドのコラーゲン様 Gly-

しかし現状において、コラーゲンは常に「バルク材料」

Pro-Hyp 繰り返し配列中に組み込むことで、そのペプチとして利用されており、コラーゲンが分離可能な多数の機ドが形成する３重らせん構造の熱安定性の低下が懸念され能的アミノ酸配列を内包した多機能タンパク質であるといる。そこでまず、経験的パラメータをもちいたコンピューう認識は、生命科学に携わる研究者においても低い。また、タプログラムを利用して、コラーゲン様配列中の一部を天然のコラーゲンをソースとしている限り、コラーゲンのGFOGER 配列に置換することで３重らせん構造の熱安定個々の機能を分離して利用することは原理的に困難である。

性をどれくらい変化させるかについて解析した。この結果

そこで本研究では、細胞膜上のレセプターを活性化するを基に、３量体ペプチド中のどの位置に GFOGER 配列を特定のアミノ酸配列を組み込んだ人工コラーゲンを作成し、組込むか、また、３量体ペプチドを構成する３本のペプチ

これを新規な機能性生体材料として応用するための技術基

ド鎖の長さを決定し、機能化人工コラーゲンの原料となる盤を築くことを目的として研究を行った。

３量体ペプチドを考案した。

A peptide-based collagen-like gel as anovel biomaterial

2-2a2b1 インテグリンの結合配列を組込んだ３量体ペプチドの合成

Takaki Koide
Faculty of Science and Engineering,
Waseda University

３ 量 体 ペ プ チ ド を 構 成 す る ３ 本 の 各 ペ プ チ ド 鎖 は、Fmoc 固相法により合成した。次いで、分子中に導入したシステインのチオール基を利用した段階的かつ位置選択的なジスルフィド結合形成反応を用いることで、各ペプチド− 30 −

新しい生体親和性材料としてのペプチド性人工コラーゲンゲル鎖を３量体化した（Figure 1）。合成したペプチドは、逆相 HPLC 分
析 お よ び MALDI-TOF MS 測 定 により同定した。合成した３量体ペプ
チドの３重らせん構造の形成およびその熱安定性を、円二色性（CD）測定により確認した。

2-3 機能性人工コラーゲンへの細胞接着の顕微鏡観察
３量体ペプチドをコーティングした 96 well dish-plate 上でヒト皮膚繊維芽細胞（HDF）を培養し、細胞接着の有無を顕微鏡で観察した。
ペ プ チ ド 水 溶 液（10 µg/ ㎖ ） を各 well に入れ４℃で 12 時間静置し、ペプチドをプレートにコーティングした。BSA で各 well をブロッキングした後、ヒト皮膚繊維芽細胞（HDF） を 播 種し、37℃でインキュベートした。２時間後、細胞を４％ p-formaldehyde で固定、２％crystalviolet で染色し、細胞接着の有無を顕微鏡にて観察した。

３．結果と考察3-1デザインと合成デザインした３量体ペプチドを純度良く得た。CD スペクトル測定の結果、合成した３量体ペプチドがコラーゲン様３重らせん構造を形成することを確認した。また、３重らせん構造の変性温度を測定したところ、細胞培養温度である 37℃においてその３重らせん構造を安定に維持できることを確認した。

3-2

人工コラーゲンの機能化

３量体ペプチドでコーティングしたプレート上での HDF の接着を、コラーゲン、または BSA をコーティングしたプレート上での接着と比較した。
GFOGER 配列を組み込んだ３量体ペプチドをコーティングしてある
プレート上では、コラーゲンの場合と同様に HDF は接着した。一方、

Figure 1 位置選択的なジスルフィド結合形成反応を利用したペプチドの３量体化
矢印は、コラーゲン様 Gly-Pro-Hyp の単純繰り返し配列を示す。
ⅰ）固相合成用ビーズからの切り出し、脱保護、およびチオール基のピリジルスルフェニル化（活性化）反応。
ⅱ）ジスルフィド結合形成反応（２量体化）。
ⅲ）アセトアミドメチル基（保護基）からニトロピリジルスルフェニル基（活性化基）への変換反応。
ⅳ）ジスルフィド結合形成反応（３量体化）− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

Figure 2 プレートにコーティングした基質依存的な HDF の接着
プレートのコーティングに要した Collagen I, BSA, ３量体ペプチド、各水溶液の濃度は、いずれも 10µg/㎖。

GFOGER 配列をもたない３量体ペプチドでは接着が見らa2b1 インテグリンの認識配列であるが、今回確認したれなかった。本実験で示した細胞接着が、GFOGER 配列

HDF の接着が a2b1 インテグリンによるものかどうかを依存的に起こるものであることを明らかにした。

示すには至っていない。今後解析していく必要がある。

コラーゲンの３重らせん上における GFOGER 配列は、

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