モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究
広島大学大学院医系科学研究科薬学分野

山野喜In Europe, animal testing on cosmetics has been banned without exception since 2013, and globally, animal testingtends to be avoided. The international trend of conducting animal experiments based on the concept of the 3Rs (Reduction,
Replacement, Refinement) is becoming more and more established, and when conducting animal experiments, it is required
to use animal species with as little or no sensation as possible. Meanwhile, in the process of searching for new cosmetic raw
material candidates, it is desirable to discover more effective and safer ones at an early stage.
In this study, we used zebrafish, a well-known vertebrate model organism, to search for new cosmetic materials fromnatural resources and to verify the usefulness of zebrafish as a method for evaluating new cosmetic material candidates. Zebrafish from the embryonic stage to just after hatching were used to screen for natural resource samples that inhibit melaninpigment production in zebrafish, and a total of five compounds were isolated from two microbial culture extracts. Of these,
compounds S2 and F1 effectively inhibited melanin pigment production in zebrafish without any obvious toxicity. For the
purpose of comparison, a search study was performed from plant extracts that show tyrosinase inhibitory activity in vitro but
not melanin pigment inhibitory activity in zebrafish. As a result, 20 compounds were isolated, three of which were new compounds. None of the obtained compounds showed melanin pigment inhibitory activity in zebrafish, and some of them showedhatching inhibitory activity. These results suggest that the search for melanin production inhibitors using zebrafish is a usefulapproach for early evaluation of the efficacy and potential toxicity of candidate materials for cosmetics to the living body.

1．緒としてのゼブラフィッシュを用いた研究開発手法の有用性

言の検証を行った。

EU では 2013 年から化粧品開発における動物実験が全ゼブラフィッシュは体長 4 ~ 5 cm 程度のインド原産の小面禁止となり、世界的にも同様に動物実験は忌避されるよ型熱帯魚で、コイ科コイ目に属し、金魚やコイに近い種でうになってきている。毒性試験や研究開発において必要なある（Fig. 1）。丈夫で飼育、繁殖が容易であり、一つの水動物実験に関しても “動物実験の 3 R（Reduction（削減）、槽で多数飼育ができ、多産で、卵が透明であることからそReplacement（置き換え）、Refinement（苦痛の軽減）” の考の発生過程を顕微鏡で観察できるなどといった、実験動物

えに則って行うという国際的な流れがあり、できる限り合として用いる上で重要な多くの利点を有しており、脊椎動

理的かつ生体に対する苦痛の少ない実験手法を選択し、可物のモデル生物として長く用いられてきた歴史がある。当能な限り意識や感覚の少ない低位の動物種を使用すること

初は発生生物学と分子遺伝学の分野において用いられていが求められている。そのため、ヒトに近い動物であるから

たが 1 , 2）、その後哺乳類との生理学的類似性の高さが確認というだけの理由で安易にラット等を用いて毒性や効能のされ 3 , 4）、その利便性が認められたことで様々な分野で用評価を行うことは避けるべき状況となっている。

いられるようになり、現在では創薬や毒性研究にも利用さ

しかし、化粧品や医薬品の開発過程において、製品に用れている 5 , 6）。

いる可能性のある化合物がもつ生体への潜在的な毒性や効

メラニン色素産生抑制活性の評価のためのモデル生物と能をできる限り早い段階で評価することは、安全で高品質して、ゼブラフィッシュは多くの利点を有している。まず、な化粧品や医薬品を作り出す上で重要であり、何かしらのゼブラフィッシュを用いた実験は、メラニン合成に関わる方法でそれらを行う必要がある。

酵素の阻害活性試験や細胞培養などの in vitro 系とは異な

そこで本研究では、脊椎動物モデルであるゼブラフィッ

り、生体全体を用いた in vivo 評価系であることから、複シュを用い、天然資源由来のメラニン色素産生抑制物質の雑な生体内環境においても被験物質が実際に期待した効果

探索を行うことを通して哺乳類を用いた動物実験の代替法
Drug discovery research for a safe
melanin production inhibitor using
zebrafish as a vertebrate model
Yoshi Yamano
Department of Pharmacognosy, Graduate
School of Biomedical and Health Sciences,
Hiroshima University− 49 −

Fig. 1

ゼブラフィッシュコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

用いて室温抽出し活性評価用の抽出物を得た。微生物は液体培地（Seed broth）で 2 週間静置培養後、ポテト培地に移しさらに 2 週間静置培養したものを、acetone にて抽出し、得られた粗抽出物をさらに水と 2 -butanone を用いて分配
し、2 -butanone 層を活性評価用抽出物とした。すべてのFig. 2

受精後72時間におけるゼブラフィッシュのメラニン産生を示すかどうかという本質に関わる点を評価することがで抽出物は DMSO によって濃度調整しスクリーニングに用いた。

2. 2. チロシナーゼ阻害活性試験法

きる。ゼブラフィッシュの卵は受精後 24 時間で器官形成

酵素は Mushroom tyrosinase（Sigma）を用いた。96 wellが見られ、48 時間で尾部におけるメラニン産生（黒い斑点

プレートの各 wellに、濃度調整した被験サンプル溶液 10 μLとの形成）が見られるようになる（Fig. 2）。卵は 96 well プレ

0 . 25 mg/mLに調整したL-tyrosine 入りK-phosphate bufferートの各 well にピペットで複数個ずつ入れることができ、 （0 . 05 M, pH 6 . 8）を 40 μL ず つ 加 え、475 nm に お け る
その飼育水に被験物質を添加しておくだけで、比較的短い

backgroundの吸光度を測定した。続いて 100 units/mLに調時間（2 ~ 3 日）でメラニン産生抑制活性を顕微鏡で確認す

製 し た mushroom tyrosinase 溶 液（K-phosphate buffer）

ることができる。また、ゼブラフィッシュは卵から発生初を 50 μL ず つ 加 え て、25 ℃ で 10 分 間 反 応 さ せ た の ち、期を通して 7 日間までは、飼育水に含まれる物質を主に皮475 nm における吸光度を測定し、この値から background膚から吸収するため、その吸収様式がヒトの皮膚吸収のモの吸光度を引いた値を基に、酵素反応阻害率を算出した。

7 , 8）

デルに近いといわれている。

各サンプルの試験は少なくとも 3 回行い、その平均値と標

一方、ゼブラフィッシュの発生過程において、被験物質

準偏差値を示した。half maximal inhibitory concentration

が正常な器官形成プロセスを阻害するような作用を有して

value（IC 50 値）は阻害率 50 % を跨ぐ 2 点のサンプル濃度といると、孵化阻害や生育遅延、奇形の発生などを誘発する阻害率の値から 2 点直線法を用いて算出した。

ことから、ゼブラフィッシュは被験物質の有害性を確認する手段としても用いられている。そのため、ゼブラフィッ

2. 3. ゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性試験法

シュを用いてメラニン色素の産生抑制活性を評価すること

ゼブラフィッシュは 14 hours/ 10 hours の明暗サイクル

で、同時に被験物質の潜在的な毒性も評価することが可能

下、水温 26 ℃で飼育した。採卵日の前日に雄と雌を同じであり、被験物質の生体への効能と安全性を一度に評価で水槽にいれておき、次の日に水槽の底から受精卵を採取しきる優れた手法であると考えられる。

た。 滅 菌 蒸 留 水 で 受 精 卵 を よ く 洗 浄 し た の ち Embryo

本研究では、微生物や植物などの天然資源からメラニン

medium 中に分散させた。続いて 96 well プレートの各ウ

色素合成阻害活性をもつ化合物を探索することで、ゼブラェルに被験サンプル溶液を 1 μL 添加しておき、そこに受フィッシュを評価系に用いた探索手段の有用性の検証を行

精卵 3 個と 99 μL の Embryo medium を分注した。72 hourった。研究手順としては、まず当研究室が保有する植物・

後に顕微鏡観察およびメラニン色素の吸光度測定によりメ

微生物培養抽出物ライブラリーを用いて、メラニン色素生

ラニン産生抑制活性を評価した。メラニン色素の定量には合成を担う酵素であるチロシナーゼの阻害活性を in vitro

被験サンプルに晒したゼブラフィッシュを 10 匹用い、において評価し、続いてその阻害活性を示したサンプルか

PBS で洗浄後、1 % Triton X- 100 を含む PBS 中でホモジ

らゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示すサンプ

ナイズした。遠心分離により上清を取り除いたのち、100ルを選別し（微生物 BLS- 1 - 3 - 3 , BLS- 1 - 4 - 4）
、その活性μL の 1 N NaOH/ 10 % DMSO を加え、よく攪拌後、80 ℃を指標に化合物を探索した。また、対照実験として、チロ

で 2 hour おくことでメラニンを溶解させた。続いて遠心

シナーゼ阻害活性は見られたがゼブラフィッシュのメラニ

分離後上清をとり、405 nm の吸光度を測定し Control の吸ン産生抑制活性は見られなかったハウチワノキ材部から、光度の値との比較からメラニン色素産生抑制活性を算出しそのチロシナーゼ阻害活性を指標に化合物を探索し、それた。各化合物の試験は少なくとも 3 回行い、その平均値とぞれの天然資源から得られる化合物の構造と活性の関係を

標準偏差値を示した。IC 50 値は阻害率 50 % を跨ぐ 2 点のサ比較した。

ンプル濃度と阻害率の値から 2 点直線法を用いて算出した。

２．方法

2. 4. 微生物の簡易同定

2. 1. 植物および微生物の活性評価用抽出物の調整

スクリーニングの結果メラニン産生抑制活性を示した微植物は主に沖縄県で採集したものを用い、methanol を生物を、16 S rRNA 配列をもとに簡易同定した。まず各微− 50 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

生物株を MH broth 中で増殖させたのち、CTAB 法を用い害活性試験を行った。研究室に保有するおよそ 1000 サンて genome DNA を単離した。続いてその genome DNA を

プルをスクリーニングし、そのうち 23 サンプルが 100 μg/

テ ン プ レ ー ト に 27 F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）

mL の濃度で 50 % 以上のチロシナーゼ阻害活性を示した

および 1492 R（GGYTACCTTGTTACGACTT）プライマ（Fig. 3）。

ーを用いて 16 S rRNA 領域を PCR で増幅し、精製後、サ続いてこの 23 サンプルを用いて、ゼブラフィッシュにンガー法により塩基配列を解析した。得られた塩基配列を対するメラニン産生抑制活性試験を行った結果、8 サンプ

GenBank のデータベースで Blast 検索することにより、微ル が 100 μg/mL の濃度で明確な抑制活性を示し、そのう生物を同定した。

ち 特 に 再 現 性 に 優 れ て い た 2 サ ン プ ル（BSL 1 - 3 - 2 ,2. 5. 抽出物からの化合物の精製・構造解析

対照実験として、ゼブラフィッシュに対するメラニン産生

1 - 4 - 4 株）を本研究の探索源に決定した（Fig. 4 b, c）。また、
ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性もしくはチロ抑制活性は見られなかったが（Fig. 4 d）チロシナーゼ阻害

シナーゼ阻害活性が確認された抽出物をヘキサン、酢酸エ

活性を示したサンプルである沖縄産植物ハウチワノキ材部

チル、ブタノール、水の各種溶媒を用いて分配した後、シから、チロシナーゼ阻害活性化合物を探索し、ゼブラフィ

リカゲルカラムクロマトグラフィー、ODS カラムクロマ

ッシュメラニン産生抑制活性をもつ抽出物から単離される

トグラフィー、HPLC を用いて順次精製を行った。単離し化合物との機能と構造の比較を行った。

た化合物の構造は、MS、NMR、IR などの各種物理化学

3. 2. BSL1-3-2株の同定と単離した化合物

データを解析することにより決定した。

３．結同定：BSL 1 - 3 - 2 株は広島県広島市の宇品海岸で採取し果た海水から分離培養した細菌である。微生物種の同定のため

3. 1. 探索サンプル決定のためのスクリーニングに本細菌の 16 S rRNA 領域の塩基配列を解析し、GenBank

当研究室が保有する微生物および植物の抽出物ライブラに登録されている微生物 16 S rRNA からBlast 検索を行ったとリーを用いて、一次スクリーニングとしてチロシナーゼ阻ころ、Staphylococcus sp. strain H 62 の 16 S rRNAと100 %Fig. 3 チロシナーゼ阻害活性スクリーニングの結果（100μg/mL，赤線：50％以上の阻害活性を示したサンプル）

Fig. 4 メラニン産生抑制活性スクリーニングの結果（100μg/mL） a：Control，b：BSL1- 3 - 2，c：BSL1- 4 - 4，
d：ハウチワノキ材部− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の相同率を示したことから、本菌種をStaphylococcus sp. であacid（F 3 . 3 . 0 mg）、monomethyl succinate（F 4 . 9 . 0 mg）をると推定した。

単離同定した（Fig. 6）。

培養：本株を SMS 寒天培地上で培養し得られたコロニーを液体培地 Seed broth 500 mL に植菌し 2 週間培養後、3. 4. 沖縄産植物ハウチワノキから単離した化合物固体培地であるポテト培地 5 kg に移し 2 週間培養した。

2004 年に沖縄県中頭郡にて採取した植物ハウチワノキ

化合物の精製：菌体抽出物を分配し、各画分のうちゼブ（学名 Dodonaea viscosa）の材部 900 g の抽出物 58 . 9 g から

ラフィッシュのメラニン色素産生抑制活性が最も強かった化合物の探索を行った。その結果、3 個の新規ジテルペン化

酢酸エチル層 5 . 7 g から化合物の精製を行った。その結果、合物（D 1 . 4 . 4 mg, D 2 . 138 mg, D 3 . 7 . 5 mg）（Fig. 7）と、173 つの化合物 maltol（S 1 . 7 . 0 mg）、5 -hydroxymaltol（S 2 .

個の既知化合物として 4 つのジテルペン labd- 13（E）-en- 8 ,21 . 3 mg）、monomethyl succinate（S 3 . 14 . 5 mg）を単離同

15-diol（D4. 12.3mg）10, 11）、
ent-15, 16-epoxy-9αH-labda- 13

定した（Fig. 5）。

（D 16 . 27 . 5 mg）、14 -diene- 3 α, 8 β-diol（D 5 . 970 mg）12）、
hutriwaic acid（D 6 . 26 . 9 mg）13 , 14）、6 -hydroxyhardwickjic

3. 3. BSL1-4-4株の同定と単離した化合物

acid（D 7 . 4 . 1 mg）15）、4 つのフラボ ノ イ ド viscosine（D 8 .

同定：BSL 1 - 4 - 4 株は B 1 - 3 - 2 株と同様に広島県広島

5 3 . 3 mg）1 6）、7 , 4 ′-trihydroxy- 3 ′- （4 -hydroxy- 3 -市の宇品海岸で採取した海水から分離培養した細菌である。

methylbutyl-5′-（trimethylbut-2-enyl）-3, 6-dimethoxyflavone

同様に 16 S rRNA 領域の塩基配列を解析し、GenBank に（D9. 48.4mg）10, 17）、alizarin（D10. 31.8mg）17, 18）、dodovisone

お い て blast 検 索 し た と こ ろ、Francisella uliginis strain

19）
20）
C（D11. 6.0mg）、3 つのクマリンscopoletin（D 12 . 25 . 0 mg）、

TX 07 - 7310 の 16 S rRNA と 99 % の相同率を示したこと

isofraxidin（D13. 4.3mg）21, 22） 、fraxetin（D 14 . 15 . 6 mg）23）、から、本種を Francisella uliginis もしくはその近縁種であ

1 つのリグナン（+）-pinoresinol（D 15 . 8 . 0 mg）24）、そして他ると推定した。培養・精製方法も BSL- 1 - 3 - 2 と同様の手の 5 つの化合物 protocatechuic acid（D 16 . 27 . 5 mg）25）（、E）

順で行い、ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性の最も強か-cinnamic acid（D 1 7 . 1 9 . 6 mg（D 1 8 と の mixture）2 6）、った酢酸エチル層 4 . 8 g から、4 つの化合物 5 -hydroxymaltol

methyl hydrogen azelate（D 18 . 19 . 6 mg（D 17とのmixture）（F 1 . 2 5 . 6 mg）、4 -［formyl- 5 - （methoxymethyl）

2 7）

9）

- 1 H-pyrrol- 1 -yl］butanoic acid（F 2 . 0 . 7 mg） 、succinic

Fig. 5、β-hydroxylpropiovanillone（D 1 9 . 1 1 . 1 mg）2 8）、

4 -hydroxyacetophenone（D 20 . 2 . 7 mg）29）であった（Fig. 8）。

BSL 1 - 3 - 2株から単離された化合物

Fig. 7

Fig. 6

BSL 1 - 4 - 4株から単離された化合物

ハウチワノキ材部から単離された新規化合物− 52 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

なお、D 17とD 18 はmixtureの状態で得られたため、活性試より得られた計 25 種の化合物に対してチロシナーゼの阻

験の対象からは外した。

害活性を評価した（Fig. 9）。ポジティブコントロールには
Arbutin を用いた。それぞれ 1 mg/mL および 100 μg/mL

3. 5. 単離化合物のチロシナーゼ阻害活性の化合物濃度でのチロシナーゼ阻害活性を評価した結果、BSL 1 - 3 - 2 株、BSL 1 - 4 - 4 株およびハウチワノキ材部

S 2 および F 1 が最も強い活性を示した。S 2 および F 1 のFig. 8

ハウチワノキ材部から単離された化合物

Fig. 8

ハウチワノキ材部から単離された化合物− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 10 メラニン色素産生抑制活性試験の結果

a：Control，b：S 2（100μg/mL），c：Kojic acid（2 mg/mL）

IC 50 値はそれぞれ 2 . 76 ± 0 . 32 , 3 . 24 ± 0 . 22 μg/mL であった。
またハウチワノキ由来の化合物としては D 12 , D 13 , D 19
が比較的強い活性を示した。

3. 6. 単離化合物のゼブラフィッシュメラニン産生抑制
活性Fig. 11化合物F 2添加により発生した奇形

チロシナーゼ阻害活性と同様に本研究で得られた計 25
種の化合物を用いてゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性を評価した。化合物濃度は 100 μg/mL とし、十分な孵

1 - 4 - 4 から計 7 個の化合物を単離し、そのうち S 2、F 1

化率（80 % 以上）を示し明確なメラニン産生抑制活性が見が強いゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性を示した。

られた化合物に関しては、ホモジネートの吸光度からその一方、比較のために探索を行った植物ハウチワノキ材部か阻害率も算出した。

ら 20 個の化合物を同定したが、いずれの化合物もゼブラ活性試験の結果、5 -hydroxymaltol（S 2 および F 1）がゼフィッシュのメラニン産生抑制活性を示さなかった。さらブラフィッシュに対し毒性を示さず、メラニン産生抑制活に F 2 , D 2 , D 4 , D 5 , D 8 ~D 13 , D 19 は ゼブラフィッシュ性を示し、溶媒のみを添加したゼブラフィッシュに比べそのふ化阻害や奇形発生といった毒性を示した。

れぞれ 46 . 8 ± 10 . 2 % と 38 . 2 ± 8 . 4 % メラニン色素の産生をスクリーニングの段階でゼブラフィッシュのメラニン産抑制した（Fig. 10）。ポジティブコントロールとして用い

生抑制活性を示したサンプル（微生物株 BSL 1 - 3 - 2 , 1 - 4 -た Kojic acid は 2 mg/mL の濃度で 66 . 2 ± 5 . 5 % の産生抑制

4）からは期待通り in vivo でもメラニン産生抑制活性を示

活性を示した。

す S 2、F 1 が得られた。このことから、本活性試験法は混その他の結果としては、S 1 が阻害率 12 . 0 % と弱い活性合物および単一化合物のいずれの状態においても in vivoを示し、S 1 , S 2 , F 1 以外の化合物では明確なメラニン産で作用するサンプルを評価できることが示された。活性化

生抑制活性が見られなかった。一方、F 2 , D 2 , D 4 , D 5 ,合物である S 2 および F 1 はいずれも 5 -hydroxymaltol で

D 8 ~D 13 , D 19 はゼブラフィッシュに対して 100 μg/mL のあり、本化合物はチロシナーゼ阻害剤としてすでに化粧品

濃度で強いふ化阻害活性を示し、全てゼブラフィッシュのに用いられているコウジ酸と同じ分子量であり、分子サイ

孵化を 90 % 以上阻害した。また F 2 を添加したゼブラフィ

ズや官能基の位置も似ていることから、類似した細胞内浸ッシュの中で、孵化に成功した個体には、奇形が見られた

透性とチロシナーゼ阻害機構を有すると推定される。ゼブ（Fig. 11）。

ラフィッシュを評価系に用いた探索の結果、実際に市販品４．考に用いられている化合物と似た化合物が得られたことも、

察

本評価系が有効性の高いサンプルを選別するのに適してい

本研究ではゼブラフィッシュをメラニン産生抑制活性のることを示唆している。5 -hydroxymaltol は TA 100 に対機能評価系として用いることで、サンプルの安全性と有効する変異原性を示すことが報告されているという懸念事項

性を正確かつ迅速に評価することができるかどうかを検証があるが 30）、この変異原性は同論文中でコーヒー、紅茶、した。具体的には in vitro でメラニン合成酵素の阻害活性

アルコール飲料や現在医薬部外品の美白剤として承認されを示すサンプルをスクリーニングし、そこからさらにin vivoているコウジ酸も同様に示すことが記されていることから、でゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示すものを

特 別 な 注 意 を 要 す る も の で は な い と 推 定 さ れ る。5 -スクリーニングし、両方の試験において活性を示したサンhydroxymaltol はその構造からだけでも、コウジ酸と同様

プルからその活性化合物の探索を行った。また比較のためにチロシナーゼ阻害活性をもつことが容易に推定されるが、に in vivo でメラニン産生抑制活性は見られなかったが、意外なことに筆者が調べた範囲ではそのチロシナーゼ阻害

in vitro では活性を示したサンプルからもその活性化合物

活性に言及した文献が見当たらないことから、本研究で初の 探 索 を 行 っ た。 そ の 結 果、 微 生 物 株 BSL 1 - 3 - 2 とめてそのメラニン産生抑制効果が示された可能性がある。

− 54 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

BSL 1 - 4 - 4 から単離された F 2 はゼブラフィッシュに対ができる。化粧品はその効能の強さと同時に高い安全性がするふ化阻害および奇形の発生を引き起こすという結果が求められるものであることから、ゼブラフィッシュを用い示された。このような毒性はエキスの段階では見られなかた新規素材開発や毒性評価はそれらの目的に沿ったモデル

っ た が、F 2 の 単 離 量 は 0 . 7 mg と 活 性 化 合 物 で あ る 5 -になるのではないかと期待している。

hydroxymaltol の 25 . 6 mg と比べ微量にしか含まれていな
かったことから、エキスの段階ではその毒性はマスクされ（引用文献）ていたと考えられる。このことからゼブラフィッシュを用

1） Driever, W.; Solnica-Krezel, L.; Schier, A. F.;

いた評価系は、混合物としてのサンプルの有効性を総合的

Neuhauss, S. C. F.; Malicki, J.; Stemple, D. L.; Stainier,に評価できる一方で、各構成化合物の潜在的危険性の評価

D. Y. R.; Zwartkruis, F.; Abdelilah, S.; Rangini, Z.; Belak,にも用いることができることが示唆された。これまでに報J.; Boggs, C. A genetic screen for mutations affecting

告されている F 2 に関する論文

9 , 31 , 32）

embryogenesis in zebrafish. Development, 1 2 3, 3 7-4 6

からは、F 2 はいくつかの細胞に対しての影響が見られているが強い細胞毒性を（1996）

示すという表記は見当たらないことから、in vitro での細2） Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell, 87, 969977（1996）

胞毒性では評価できなかった F 2 の生体に対する毒性をゼ
ブラフィッシュを用いることで初めて確認できた可能性が

3） Kimmel, C. B. Genetics and early development ofzebrafish. Trends. Genet., 5, 283-288（1989）

ある。
対照実験として行った、チロシナーゼ阻害活性を示し、

4） Fishman, M. C. Zebrafish genetics : the enigma of

ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示さなかった

arrival. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9 6, 1 0 5 5 4-1 0 5 5 6

ハウチワノキ材部抽出エキスから得られた化合物は、単離（1999）

後もゼブラフィッシュメラニン抑制活性を示さなかった。

5） den Hertog, J. Chemical genetics : drug screens inzebrafish. Biosci. Rep., 25, 289-297（2005）

一方、D 12 , D 13 , D 19 は in vitro においてチロシナーゼ阻
害活性を示したが、in vivo においては卵のふ化阻害を引

6） Pichler, F. B.; Laurenson, S.; Williams, L. C.; Dodd, A.;
Copp, B. R.; Love, D. R. Chemical discovery and global

き起こした。

gene expression analysis in zebrafish. Nat. Biotechnol.,in vitro における酵素阻害活性試験は迅速に結果が得ら

21, 879-883（2003）

れる優れた試験法であるが、細胞内浸透性が低い化合物や生体への毒性が強い化合物、非特異的に多くの酵素を阻害

7） Langheinrich, U. Zebrafish:a new model on theする化合物など実用上問題がある化合物を判別することがpharmaceutical catwalk. BioEssays, 25, 904-912（2003）

できないというデメリットもあり、今回得られた化合物で8） Cha, S.-H.; Ko, S. -C.; Kim, D.; Jeon, Y. -J. Screening ofはそれらの判別されなかった特徴が毒性という形で現れた

marine algae for potential tyrosinase inhibitor : Those

可能性がある。

inhibitors reduced tyrosinase activity and melanin
synthesis in zebrafish. The Journal of dermatology, 38,

本研究結果から、ゼブラフィッシュを用いるメラニン色

354-363（2011）

素産生抑制活性試験法は、生体に対して毒性が低くかつ生体内でメラニン産生抑制活性を示す原料を開発の初期段階

9） Chin, Y. -W.; Lim, S. W.; Kim, S.-H.; Shin, D. -Y.; Suh,
Y. -G.; Kim, Y. -B.; Kim, Y. C.; Kim, J. Hepatoprotectiveから効果的に選別できる可能性が示された。

５．総

pyrrole derivatives of Lycium chinense fruits. Bioorg.

括Med. Chem. Lett., 13, 79-81（2003）

ゼブラフィッシュのタンパク質は、ヒトのオルソログと10）Feliciano, A. S.; Medarde, M.; Lopez, J. L.; Miguel delの同一性は 70 ％以下であるが、基質結合領域（多くの場合、

Corral, J. M.; Puebla, P.; Barrero, A. F. Terpenoids from

薬物結合標的）などの機能ドメインでの保存性はかなり高leaves of Juniperus thurifera. Phytochemistry, 27, 2241-

く、100 ％の類似性に近づいており、これが多くの薬剤が2248（1988）

ゼブラフィッシュとヒトで同等の効果を示すというこれま

11）Zdero, C.; Bohlmann, F.: Niemeyer H.M. Seco -で報告されてきた実験結果の科学的根拠となっている 7）。

Labdanes and other constituents from Ophryosporus

ゼブラフィッシュを用いた評価系では、本研究でも示されfloribundus. Phytochemistry, 29, 3247-3253（1990）

たように、その成分の有効性だけでなく、短期・長期毒性

12）Mata, R.; Contreras, J. L.; Crisanto, D.; Pereda-に関しても同時に評価できるという利点があり、胚発生、Miranda, R.; Castañeda, P.; Del Rio, F. Chemical studies

メラニン色素産生、稚魚の生死、血流、内臓機能、行動量

on Mexican plants used in traditional medicine, XVIII.

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