大豆イソフラボンの乳癌の予防薬や治療薬としての可能性の探索

千葉奈

東北大学加齢医学研究所

緒方言
家族性乳癌原因遺伝子 BRCA1 1 は、1994 年にポジ津子

准教授

法細胞核局所レーザー照射

ショナルクローニングによって三木らにより同定された

Saos-2 細胞を 35 mm のガラスボトムディッシュに撒1)

癌抑制遺伝子である 。BRCA1 はその後の解析によりき、DMEM 培地で 37 度、5％ CO2 存在下で一晩培養

家族性乳癌卵巣癌の 80％、家族性乳癌の 30％の原因遺した。その後 FuGene (Roche) を用いて GFP-BRCA1 ま伝子とされ、BRCA1 の生殖細胞変異による乳癌は、散たは GFP-Ku80 発現ベクターを導入し、48 時間培養し発性癌に比較して若年発症で、両側乳癌や多臓器重複癌た。DMSO またはゲニステインで処理後スキャンレーの頻度が高いとされている。

ザーシステム (Olympus) を用いて細胞の核の一部に線一方、散発性癌では BRCA1 遺伝子変異をほとんど認状に 405 nm 波長のレーザーを照射し、共焦点レーザーめないが、散発性乳癌の 30％、散発性卵巣癌のほとん顕微鏡で観察した。

どで BRCA1 の mRNA やタンパク発現が減少し、その頻siRNA 安定発現細胞の樹立度は悪性度の高いものほど高いとされている。また、こsiRNA-Ready pSIREN-RetroQ ベクターにコントロール

れらの癌で BRCA1 遺伝子がメチル化されていることがと BARD1-interacting protein (BIP) の siRNA の配列を挿2)報告された 。また、BRCA1 遺伝子変異による家族性入し、HeLa 細胞に導入し、puromycin でベクターがゲ乳癌が、散発性癌の 10 〜 15％を占める Basal-like 乳癌

ノム内に組み込まれた細胞を選択した。クローン化した3)と酷似した遺伝子発現プロファイルを示し 、散発性癌細胞の BIP の発現抑制はウェスタンブロットにより確認の中に BRCA1 変異による家族性乳癌に近いサブグルーした。

プが存在することが明らかになり、BRCA1 が散発性乳免疫染色癌の発症機構にも関与することが推察される。

HeLa 細胞は、DMSO またはゲニステインで処理後、以前より大豆食品の摂取は乳癌や前立腺癌のリスクをphosphate-buffered saline (PBS)/ 3% paraformaldehyde/減少させることが知られており、大豆イソフラボンによ

2% sucrose solution で室温にて 10 分間処理をして固るこれらの癌の予防や治療の効果が期待されている。代定した。PBS で 3 回洗浄し、1% Bovine serum albumin

表的な大豆イソフラボンであるゲニステインは、エスト(BSA) 含 有 PBS (1 % BSA-PBS) で 希 釈 し た ロ ー ダ ミ

ロゲンと類似した構造をしており、エストロゲン受容体ン フ ァ ロ イ ジ ン を 加 え 37 ℃ で 20 分 間 反 応 さ せ た。

結合能をもち、そのために癌抑制作用を示すと考えられ

PBS-T（0.05% Tween 20 含有 PBS）で 3 回洗浄した後、てきたが、一方でエストロゲン受容体非依存性の癌抑制

VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with4)効果を示すことも報告されている 。また最近、BRCA1

DAPI（VECTOR）で封入した。約 500 個の細胞を観察し、欠損細胞のゲニステイン処理で DNA 損傷チェックポイ多核細胞をカウントした。

ントの活性化、細胞周期停止、細胞分裂の異常が引き起5)こされ、細胞増殖が抑制されることが報告された 。

結果と考察

本研究では、ゲニステイン処理による BRCA1 やその１．BRCA1 のレーザー照射部位への集積に対する関連分子の細胞内応答の影響を検討することにより、大ゲニステインの影響

豆イソフラボンの乳癌の予防薬や治療薬としての可能性

既に、我々は生細胞の核内の一部にレーザーを照射しを探索した。

DNA 損傷を作成し、DNA 修復因子の応答をリアルタイ
1千葉奈

6, 7, 8）津子

、BRCA1 の DNA 損

そこで、次に GFP-Ku80 を Saos-2 細胞に導入し、同様傷に対する応答を解析し、BRCA1 の N 末端領域と C 末に 40μM のゲニステインで 6 時間処理し、GFP-Ku80端領域がそれぞれ独立に DNA 二本鎖切断部位に集積し、発現細胞にレーザーを照射したところ、Ku80 のレー

さらに、BRCA1 の N 末端領域の集積は速く Ku80 依存性

ザー照射部位への集積も BRCA1 と同様にゲニステインで、腫瘍由来の変異体ではその集積能が著しく低下し、処理により抑制された（図２）。

ムで解析できる実験系により

9)

DNA 二本鎖切断修復経路には、非相同末端再結合とC 末端領域の集積は遅いことを明らかにしている 。
そこでこのレーザー照射部位への BRCA1 の集積に対相同組み換え修復の 2 経路があることが知られており、するゲニステイン処理による影響を検討した。GreenKu80 は Ku70 とへテロダイマーを形成し、DNA 二本鎖fluorescence protein (GFP) を BRCA1 に 融 合 さ せ た 融切断部位に集積し、非相同末端再結合において働く。そ合タンパク質である GFP-BRCA1 を発現するベクターをこで、同様に GFP-Ku70 についても検討したところ、ゲSaos-2 細胞に導入し、40μM のゲニステインで 6 時間

ニステイン処理によりレーザー照射部位への集積が抑処理後、GFP-BRCA1 発現細胞の細胞核にレーザーを照制された。一方、DNA 二本鎖切断修復経路の非相同末射し、BRCA1 の集積を観察し、kinetics も解析したと端再結合と相同組み換えの両経路で働くとされる別のころ、ゲニステイン処理により、BRCA1 の集積は著し

DNA 修復因子についても検討したところ、ゲニステイく抑制された（図１）。

ン処理によりレーザー照射部位への集積は変化が認められなかった。
以上より、ゲニステインは DNA 二本鎖切断修復経路

２．他の DNA 修復因子のレーザー照射部位への集積にの非相同末端再結合を抑制する可能性が示唆された。こ対するゲニステインの影響

これまでの研究により我々は、BRCA1 の N 末端領域のメカニズムをさらに解析するため、ゲニステイン処理の集積が Ku80 依存性であることを明らかにしている。

が、Ku80 と Ku70 とのへテロダイマーの形成に影響を

図1

図2

BRCA1 のレーザー照射部への集積に対するゲニステインのKu80 のレーザー照射部への集積に対するゲニステインの影響

影響
A. Saos-2 細胞における BRCA1 のレーザー照射部位への集積に対

A. Saos-2 細胞における Ku80 のレーザー照射部位への集積に対すするゲニステインの影響。左；ゲニステイン処理なし。右；ゲニるゲニステインの影響。左；ゲニステイン処理なし。右；ゲニステインで 6 時間処理後にレーザー照射。 B. GFP- Ku80 のレーザーステインで 6 時間処理後にレーザー照射。 B. GFP- BRCA1 のレー照射部位への集積の Kinetics に対するゲニステインの影響。

ザー照射部位への集積の Kinetics に対するゲニステインの影響。
2

大豆イソフラボンの乳癌の予防薬や治療薬としての可能性の探索与えるのかどうかを免疫沈降法にて検討したが、ゲニス乳癌や前立腺癌のリスクを減少させることが報告されてテイン処理はこれらのへテロダイマー形成には影響を及いるが、最近、大豆イソフラボンの１つであるゲニステぼさなかった。

インが BRCA1 欠損細胞の増殖を抑制することが報告された。本研究は、ゲニステイン処理による、BRCA1 やその関連分子の細胞内応答を検討し、大豆イソフラボン

３．BRCA1 関連分子の発現抑制時の多核細胞形成にの乳癌の予防薬や治療薬としての可能性を探索することおけるゲニステインの影響
また、最近、我々は BRCA1 とヘテロダイマーを形成を目的とした。我々は既に生細胞の核内の一部にレーする BARD1 に結合する新規分子として BIP を同定しザーを照射することにより、リアルタイムで分子応答をた。BRCA1 を発現抑制すると多核細胞が増加すること解析できる実験系を用いて、BRCA1 の DNA 二本鎖切断が知られているが、この分子の発現抑制した細胞株で部位への集積について解析し、BRCA1 の集積が BRCA1

は、ゲニステイン処理により、多核細胞が著しく増加しの N 末端領域による Ku80 依存性の速い集積と C 末端ていた（図３）。よって、ゲニステイン処理は、BRCA1領域による遅い集積からなることを明らかにしている。の DNA 修復機構に関与する経路に影響するだけでなく、この BRCA1 の DNA 損傷部位への集積に対するゲニス

BRCA1 の細胞分裂制御機構にも影響を及ぼすことが明テイン処理による影響を検討したところ、BRCA1 の集らかになった。

積が著しく抑制され、他の DNA 修復因子では抑制されるものとされないものが見られた。また、最近、我々は要

BRCA1 とヘテロダイマーを形成する BARD1 に結合する

約
家族性乳癌原因遺伝子 BRCA1 の生殖細胞系列変異に新規分子を同定した。BRCA1 発現抑制すると多核細胞よる乳癌発症リスクは約 80％、卵巣癌発症リスクは約が増加するが、この分子の発現抑制した細胞では、ゲニ40％で、若年発症で、両側乳癌や多臓器重複癌の頻度ステイン処理により、多核細胞が著しく増加した。これが高いとされる。近年、散発性癌にも BRCA1 変異によらの結果は、BRCA1 が関与する細胞応答にゲニステイる家族性乳癌に近いサブグループが存在することが示さン処理が影響することを示すものであり、今後の研究のれ、BRCA1 が散発性癌の発症にも関与することが示唆

進展により、大豆イソフラボンの乳癌の予防薬や治療薬とされている。
以前より大豆食品やイソフラボンの摂取が、しての可能性を明らかにすることができると考えられる。

図3

BIP を発現抑制した細胞株での多核細胞の形成に対するゲニステインの効果
3

千謝葉奈

辞津文子

献1) Miki Y et al. Science , 266, 66-71, 1994.

本研究の実施にあたり、研究助成を賜りました財団法

2) Turner N et al. Nat Rev Cancer ; 4:814-819, 2004.

人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。
また、レー

3) Sorlie T et al. Proc Natl Acad Sci USA ,100, 8418-8423, 2003.

ザー照射実験、プロテオミクス解析は、東北大学加齢医

4) 松岡洋一郎 , 塚本麗子 : 大豆たん白質研究 , 8, 127-132, 2005.

学研究所、加齢ゲノム制御プロテオーム寄附研究部門、

5) Tominaga T et al. Cell Death and Differentiation ,14, 472-479, 2007.

安井明教授、菅野新一郎博士との共同研究にて行われま

6) Lan L et al. Proc Natl Acad Sci USA , 101,13738-13743, 2004.

した。ご協力賜りましたことを感謝申し上げます。

7) Lan L et al. J Cell Sci ., 118,4153-4162, 2005.
8) 蘭利ほか : 実験医学 , 24, 364-370, 2006.
9) Wei L et al. Mol. Cell. Biol. , 28,7380-7393, 2008.

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