正常皮膚角化における蛋白質脱イミノ化の役割解明
─ 瑞々しい肌をいつまでも保つために ─
東京都老人総合研究所

石神

加齢臓器障害研究グループ

昭人

Peptidylarginine deiminases (PADs) are a group of enzymes which convert protein arginine residues to citrulline residues
in the presence of calcium ion. Enzymatic deimination abolishes positive charges of protein molecules inevitably causing
significant alteration in the structure and function of native proteins. In mammalian tissues, PADs are found as four different
isoforms (type I, type II, type III and type IV), which differ in specificity for various synthetic substrates and in tissuedistribution. We have previously reported that multiple deiminated proteins, composed largely of keratins and filaggrin, which
is a keratinocyte terminal differentiation marker synthesize in granular cell layers, were present and localized in the granularand cornified cell layers of the epidermis. The presence of deiminated proteins in such a restricted region of the epidermis
strongly suggests that PAD enzyme is involved in the cornification of epidermal keratinocytes.
In this study, we analyzed the localization of deiminated proteins in psoriatic epidermis and atopic epidermis.
Immunostaining based on chemical modification of citrulline residues showed that both the psoriatic epidermis and atopicepidermis had no detectable levels of deiminated proteins. On the other hand, immunostaining with polyclonal antibody
against filaggrin showed no significant change in psoriatic epidermis and atopic epidermis. These results indicated that thecauses of psoriasis vulgaris and atopic dermatitis may be defective in protein deimination.

１．緒

蛋白質脱イミノ化反応は、蛋白質脱イミノ化酵素（ペプ言チジルアルギニンデイミナーゼ、PAD）により触媒され蛋白質翻訳後修飾は情報伝達、遺伝子発現、細胞分化やる。遺伝子解析により生体内には、４種類の異なるアイソ老化に深く関与している。特に、蛋白質中のアルギニン残フォーム（I, II, III, IV 型）が存在し、表皮では、I, II, III,基がシトルリン残基に変わる脱イミノ化反応は、アルギニ

IV 型全ての PAD が発現している４−６）。同じ活性を持つ４ン残基の塩基性が失われる分、蛋白質の等電点が酸性側に種類の酵素がどうして皮膚で発現しているのか、その生理シフトするなど、蛋白質の本来の電化や高次構造に著しい的意義については現在明らかではない。

変化をもたらすことから機能解明が急がれている。ヒトの本研究は、正常皮膚角化における蛋白質脱イミノ化の役

皮膚角層や毛嚢には脱イミノ化蛋白質が多く存在する。プ

割解明を目的としている。特に、乾癬と同じように皮膚炎

ロテオーム解析により中間径フィラメント蛋白質のケラチ症症状を呈するアトピー性皮膚炎での脱イミノ化蛋白質のン K1 や K10、皮膚水分保湿に重要なフィラグリンやトリ動態を詳細に解析した。歳をとってもしわのない瑞々しいコヒアリンが高度に脱イミノ化していることを明らかにし肌をいつまでも保ち、化粧と健康とのバランス良い関係をた１−３）。興味深いことに、炎症性角化症の１つである乾癬保つことを最終目的とした基礎的研究である。

では脱イミノ化蛋白質がまったく検出されなかった。乾癬

２．実

は、表皮の角層と有棘層が肥厚し、少し盛り上がった赤い皮疹（紅色局面という）ができるのが特徴である。また、

2.1

験

皮膚組織

皮膚表面には、白くてかさかさした乾燥した厚い垢（鱗屑

正常なヒト皮膚組織は、整形外科時に患者同意を得て採−りんせつという）が付着する。乾癬の原因の１つは、不取した。また、乾癬やアトピー性皮膚炎の皮膚組織は、外完全な角化にあると考えられている。乾癬では、脱イミノ科的処置時に患者同意を得て採取した。本研究は、東京都化蛋白質がほとんど検出されないことから、蛋白質脱イミ

老人総合研究所倫理委員会、東京都老人医療センター倫理ノ化反応は、正常な表皮角化に重要な役割を果たしている委員会の承認を得ている。本研究では、個人の情報は、公ことが推察される。

表しない。個人や病院の承諾書を得る。研究により生じた

Role of the protein deimination
during the cornification of epidermal
keratinocytes

対象者への不利益及び危険性はない。など倫理面において最大の配慮をしている。

2.2

Akihito Ishigami
Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology（TMIG）Organ Disorder andAging Research Group

脱イミノ化蛋白質の免疫組織化学的染色

皮膚組織は４% パラホルムアルデヒド固定し、OCTcompound 4583（Miles）で包埋した。次に、6µm 厚に切片化し、スライドガラスに接着させた。脱イミノ化蛋白質− 82 −

正常皮膚角化における蛋白質脱イミノ化の役割解明の検出は、以下のように行った７）。

３．結果と考察

皮膚切片を 2.5% グルタルアルデヒドで後固定した。次に、誘導体化溶液 * を切片にかけ、37℃の保温器で３時間3.1保温してシトルリン残基を誘導体化した。１次抗体には、ウサギ抗誘導体化シトルリン抗体８）

皮膚での脱イミノ化蛋白質の役割

ヒト皮膚における脱イミノ化蛋白質の局在を免疫組織化を用いた。呈色には、学的検出法を用いて調べた。脱イミノ化蛋白質の検出は、Elite ABC kit（Vector Laboratories）と発色基質として我々が独自に開発した化学修飾したシトルリン残基に特異ジアミノベンチジンを用いた。組織観察のため、ヘマトキ的な抗体、組織切片上でのシトルリン残基の化学修飾法をシリン染色を行った。

用いている。この方法では、シトルリン残基の前後のアミ＊誘導体化溶液は、蒸留水と下記の保存溶液１および２を、ノ酸配列に拘わらず、微量の脱イミノ化蛋白質を高感度に容積比で１: １: ２の割合で使用時に混合して使用。

検出できる。ヒト正常皮膚では、表皮顆粒層上部から角層保存溶液１（２% ジアセチルモノキシムと１% アンチにかけて脱イミノ化蛋白質が陽性であった（図 A）。特に、ピリンを含む 1N 酢酸）。

角層下部には脱イミノ化蛋白質が多く存在しており、基底保存溶液２（0.025% FeCl3 を含む水と 85% リン酸およ層や有棘層ではまったく検出されなかった。また、真皮び 95% 硫酸を 55 : 20 : 25 の容積比で混合した溶液）。

においても脱イミノ化蛋白質は陰性であった。一方、フィラグリンは有棘層上部から角層下部にかけて陽性であった

2.3

フィラグリンの免疫組織化学的染色（図 D）。
表皮では、I, II, III, IV 型全ての PAD が発現している 4 −皮膚組織を OCT compound 4583 で包埋し、6µm 厚に切片化した。１次抗体としてウサギ抗ラットフィラグリン抗体１）6）。免疫組織染色により、I, II 型 PAD は基底層から有棘層、を用いた。呈色には、Elite ABC kit（Vector

顆粒層に分布しており、角層では検出されなかった。何れLaboratories）と発色基質としてジアミノベンチジンを用の PAD も酵素活性発現にカルシウムイオンを必要とする。

いた。組織観察のため、ヘマトキシリン染色を行った。

図

ヒト皮膚における脱イミノ化蛋白質、フィラグリンの免疫組織染色
A, D : 正常、B, E : 乾癬、C, F : アトピー性皮膚炎
A, B, C : 脱イミノ化蛋白質、D, E, F : フィラグリン

− 83 −

表皮は、基底層から表層に移行するに連れ、カルシウム歳をとってもしわのない瑞々しい肌を維持することは、女濃度が高くなるよう濃度勾配が形成されている。PAD は、性のみならず男性でも望みである。皮膚における脱イミノ

基底層、有棘層、顆粒層の細胞で発現し、そのほとんどが化蛋白質、PAD の役割がもっとはっきりすれば、様々な活性化されない状態で蓄積し、顆粒層上部まで移行する。

皮膚疾患の治療のみならず、瑞々しい肌を保つための美容顆粒層の外側では、細胞核消失、ケラチン繊維の凝集、辺療法に新しい光を浴びせかけるものと期待している。

縁帯形成を含む急激な形態変化（角化）が起こり角層を形成する。顆粒層上部では、細胞内カルシウム濃度が臨界点謝に達し、一気に蛋白質脱イミノ化反応が進行すると考えられる。この時、脱イミノ化される蛋白質は、角層のケラチ

辞本研究に対して助成いただきました財団法人コスメトロ
ジー研究振興財団に深謝いたします。

ン模様を構成するケラチン K1 や K10、皮膚の水分保湿因子として働くフィラグリンを同定した１−３）。特に、ケラチ（文ンの脱イミノ化は、ケラチン繊維の凝集や辺縁帯形成に重１） Senshu T, Akiyama K, Kan S, Asaga H, Ishigami A,

要である。また、フィラグリンの脱イミノ化は、ケラチン

Manabe M: Detection of deiminated proteins in rat skin:との電気的相互作用を弱め、ケラチン繊維からの離脱と分

probing with a monospecific antibody after modification

解に働いていると考えられる。フィラグリンは、角層上部

of citrulline residues, J. Invest. Dermatol., 105, 163-169,

でアミノ酸にまで切断されて皮膚の保湿成分として働く。

献）

1995.
２） Senshu T, Akiyama K, Ishigami A, Nomura K: Studies

3.2

皮膚疾患における PAD の関与

on specificity of peptidylarginine deiminase reactions

乾癬では、脱イミノ化蛋白質がほとんど検出されなかっusing an immunochemical probe that recognizes anた（図 B）。しかし、フィラグリンの分布に特に異常は認

enzymatically deiminated partial sequence of mouse

められなかった（図 E）。乾癬は、ウイルスや細菌、かびkeratin K1, J. Dermatol. Sci., 21, 113-126, 1999.

が原因となる皮膚疾患ではないため、ヒトにうつる心配は

３） Ishiga mi A , Asaga H , Ohsawa T, Akiya ma K ,ない。また、乾癬の根本的治療法や有効な医薬品は、未だMaruyama N: Protein deimination and peptidylarginine

確立されていない。従ってその治療法は、対症療法的なもdeiminase expression during cornification of rat epidermalのとなり、症状が良くなっている期間をできる限り長くす

keratinocytes, Biomed. Res., 23, 145-151, 2002.

ることが治療の目的になる。乾癬の角層では、脱イミノ化

４） Ishiga mi A , Asaga H , Ohsawa T, Akiya ma K ,蛋白質が検出されないことからも、表皮角化に蛋白質脱イ

Maruyama N: Peptidylarginine deiminase type I, type

ミノ化反応が非常に重要であることがわかる。では、同じ

II, type III and type IV are expressed in rat epidermis,ような皮膚炎症反応を呈するアトピー性皮膚炎の皮膚でBiomed. Res., 22, 63-65, 2001.

は、脱イミノ化蛋白質は存在するのであろうか。アトピー

５） Ishiga mi A , Ohsawa T, Asaga H , Akiya ma K ,性皮膚炎における脱イミノ化蛋白質の動態を調べた。そのKuramoto M, Maruyama N: Human peptidylarginine

結果、アトピー性皮膚炎では、乾癬同様に角層に脱イミノ

deiminase type II: molecular cloning, gene organization,化蛋白質がまったく検出されなかった（図 C）。また、フand expression in human skin, Arch. Biochem. Biophys.,407, 25-31, 2002.

ィラグリンの分布には、特に異常は認められなかった（図F）。アトピー性皮膚炎での PAD の発現は、未だ明らかで

６） Guerrin M, Ishigami A, Mechin MC, Nachat R ,はない。しかし、フィラグリンの発現に異常が見られない

Valmary S, Sebbag M, Simon M, Senshu T, Serre G:

ことから、PAD の正常な発現が予想される。PAD は、酵cDNA cloning, gene organization and expression analysis

素活性発現にカルシウムイオンを必要とする。アトピー性of human peptidylarginine deiminase type I, Biochem. J.,

皮膚炎では、カルシウム濃度勾配がきちんと形成されてい370, 167-174, 2003.
７） Asaga H, Ishigami A: Protein deimination in the rat

ない可能性がある。

４．総

brain: Generation of citrulline-containing proteins in括

cerebrum perfused with oxygen-deprived media, Biomed.
Res., 21, 197-205, 2000.

今回の研究により、アトピー性皮膚炎の原因が皮膚角層での蛋白質脱イミノ化の機能不全による可能性が強く示唆

８） Senshu T, Sato T, Inoue T, Akiyama K, Asaga H:された。また、アトピー性皮膚炎の治療への可能性として

Detection of citrulline residues in deiminated proteins on

次のように考える。『皮膚軟膏へのカルシウムの添加』でpolyvinylidene difluoride membrane, Anal. Biochem., 203,ある。これは、化粧品への応用も可能であると考えている。

94-100, 1992.

− 84 −