皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明
近畿大学薬学総合研究所

森山博由

We have shown that skin tissue aging is caused by normalized chronic skin stress, such as exposure of the skin toultraviolet light in sunlight and repair (wound healing) of the skin from abrasions and lacerations. Ultraviolet rays (UV)from sunlight exposure can cause cell apoptosis in the skin epidermis, resulting in the disruption of the barrier. Previously,
we have demonstrated that BNIP 3 stimulates autophagy in epidermal keratinocytes and has a protective effect in these cells
upon UVB irradiation. In this study, we found that the accumulation of reactive oxygen species (ROS) by UVB irradiation
was sufficient to trigger the activation of JNK and ERK mitogen- activated protein kinase (MAPK) in human primaryepidermal keratinocytes. In turn, activated JNK and ERK MAPK mediated the upregulation of BNIP3 expression. Treatment
with an antioxidant reagent or a specific inhibitor of MAPK, U 0126 , and a JNK inhibitor significantly attenuated theexpression of BNIP 3 triggered by UVB, followed by the induction of cell death by apoptosis. Furthermore, UVB-inducedapoptosis was significantly stimulated by chloroquine or bafilomycin A 1 , an inhibitor of autophagy. Moreover, BNIP 3 wasrequired for the degradation of dysfunctional mitochondria upon UVB irradiation. These data clearly indicated that BNIP 3 induced autophagy, which occurs via UVB-generated ROS-mediated JNK and ERK MAPK activation, has a crucial role in
the protection of the skin epidermis against UVB irradiation.

1. 緒組みの鍵となるメカニズムの提示には至っていない。そこ

言で我々は、皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制

加齢とともに物理的ストレスは蓄積し、体を構成する組御機構を解明すべく、UV ストレスや創傷などの皮膚の恒織にダメージを与え続ける。その影響を最も受け続けてい常性を破綻させうる各種ストレス暴露における、Notch-る組織の一つが体表面を被う皮膚である。皮膚は加齢ととHes 1 の発現パターンの解析をおこない、ストレス暴露時もに構造変化をきたし変容する、いわゆる老化する組織でにおける Notch-Hes 1 経路のオートファジー誘導能に与えある。その皮膚構造の変化・変容そのものが外見に反映さる影響および Hes 1 ノックアウトマウスにおける表皮ストれる唯一の臓器といえる。加齢とともに表層化し易くなるレス耐性解析をおこなった。その結果、Notch-Hes 1 経路

皮膚ダメージは、心身快活な長寿ライフを阻害する直接的は UVB の照射量が強くなるほど活性化し、それにともなな発現要因（悩みの種）として捉えることができる。それゆってアポトーシスによる細胞死が増えること、また、生体え、皮膚の正常な新陳代謝メカニズム（皮膚恒常性）をポイにおける全損欠損創ストレス下では、創傷部位の表皮におントアウトすることが嘱望されている。

いて Hes 1 の発現が上昇していることを見出した。これら

我々はこれまで、太陽光に含まれる紫外線の皮膚へのの結果は、皮膚恒常性を破綻させる日常ストレスに対する照射、皮膚が擦過傷や裂傷から修復（創傷治癒）などの常皮膚が有する恒常性維持メカニズムについての新知見であ態化した慢性皮膚ストレスにより皮膚組織の老化が引きる。これらの知見は、皮膚恒常性維持の分子機構に基づく起こされることを明らかにしてきた。このとき、皮膚を新たな機能性香粧品研究開発にも活用が可能であり、老い構成する細胞間のシグナル伝達に必要な Notch シグナルのに付帯する不安要因の緩和や老化にともなう皮膚脆弱性か標的分子（Hes 1 転写因子）の発現が上昇することも報告しらの寛解・堅牢性の再獲得など、これからの長寿社会にもてきた。また、Hes 1 が細胞内の恒常性を司ると考えられ大きく寄与できるものと考えられる。

るオートファジーを促進する因子（Bnip 3）の発現を抑制す

2. 方ることで、オートファジーが抑制されることも見出してきた。しかしながら、これらの役者が寄与する皮膚老化の仕法

2 . 1. ヒト 表 皮ケ ラ チノサ イト に お ける NotchHes1 および関連因子の解析
初代ヒト表皮ケラチノサイトは CELLnTec 社より購入

Elucidation of the novel regulation
mechanism in autophagy that contributes
to the prevention of skin aging
Hiroyuki Moriyama
Pharmaceutical Research and Technology
Institute, KINDAI University

し、CnT-PR（CELLnTec 社）で培養した。培養にて安定化させたヒト初代表皮ケラチノサイトに UVB の照射強度を変化させ照射した後、4 時間後にタンパク質を回収してウェスタンブロッティング法をおこない、活性化型
Notch 1、Hes 1、Bnip 3、Cleaved Caspase 3 の発現量を確− 154 −皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明認した。また、Bnip 3、Hes 1 発現用アデノウイルスベク

BNIP 3 の発現量を調べたところ、10 mJ/cm 2 で発現量のターを感染させた後、UVB 照射をおこない、LC 3 B に対ピークを迎えることがわかった（図 1）。また、Cleavedする免疫染色をおこない、オートファジー活性を測定した。

Caspase 3 の発現量は 20 mJ/cm 2 から急激に増加することが判明した（図１）。つまり、Notch-Hes 1 経路は UVB の2 . 2 . 生体でのストレス応答時におけるHes1 の発現解析

照射量が強くなるほど活性化し、それにともなってアポト全損欠損創は以下のように作成した。マウスはイソフル

一方、BNIP 3 と HES 1 のオートファジー活性について

ランによる麻酔下のもと、背部皮膚に直径 5 mm の生検ト調べたところ、HPEK に BNIP 3 を強制発現させると、我々レパンで全損欠損創を作成し、シリコンリングを創の周辺の以前の報告どおりオートファジーが誘導された 1）（図 2）。に縫い付けた。創はテガダーム™トランスペアレントフィ

しかし、HES 1 を強制発現させると、オートファジーのルム（3 M）と包帯で保護し、5 日ごとに創を撮影した。創誘導が抑制されていることが明らかとなった（図 2）。以前

傷治癒率は Image J で傷の大きさを測定し、算出した。の結果より、UVB 照射時による BNIP 3 の発現増加は、オーシスによる細胞死が増えることが示唆された。

マ ウ ス 皮 膚 は 4 %PFA/PBS で 固 定 し た 後、20 % シ ョートファジー誘導による損傷ミトコンドリアの除去によ

糖 /PBS 溶液に一晩つけてから OCT compound で包埋しり、抗アポトーシスとして働くことが示唆されている 1）。

た。10 µm 厚で凍結切片を作成した後、PBSMT（2 % ス

また、Notch-Hes 1 経路の活性化は、BNIP 3 の発現を抑キムミルク, 0 . 1 % TritonX- 100 含有 PBS）でブロッキング制する働きがあることも突き止めている 2）。このことから、し、１次抗体としてラット免疫抗 Hes 1 抗体、ニワトリ免10 mJ/cm 2 の UVB 照射量では、BNIP 3 の発現が優位に働

疫抗ケラチン 14 抗体、ウサギ免疫抗ケラチン 10 抗体をくため、紫外線照射によるアポトーシスがあまり誘導され使用した。２次抗体として Alexa 488 標識抗ラット IgG 抗ないものの、20 mJ/cm 2 の UVB 照射量では Notch-Hes 1体、Alexa 555 標識抗ウサギ IgG 抗体を用いた。封入には経路の活性化により BNIP 3 の発現量が抑制され、オートProlong Gold Antifade Kit with DAPI（LifeTechnologies

ファジーも抑制されることからアポトーシスによる細胞死社）を用いた。撮影は LSM 800 共焦点顕微鏡（Zeiss）でおこが増えていることが示唆された。また、損傷ミトコンドリなった。

アの除去により、活性酸素も除去されていることが予想さ

3. 結れる。このことから、Notch-Hes 1 経路の阻害が、抗老化果につながることも期待される。このように皮膚恒常性をヒト表皮ケラチノサイト（HPEK）を用いて、UVB 照射

脅かすストレスは、Notch-Hes 1 経路に影響を及ぼしていにおける Notch-Hes 1 経路の活性化についての発現解析ることがわかる。このことは、皮膚恒常性ストレスにおいをおこなった。まず、UVB 照射後 Notch-Hes 1 経路が活て、Notch-Hes 1 経路が重要な役割を担うことを大いに示

2性化する UVB 照射量を調べたところ、20 mJ/cm で活性唆するものである。そうであれば、それは他のストレス要化のピークを迎えていることがわかった（図 1）。対して、因でも観察される現象に他ならない。そこで、生体におけ

図1

図2− 155 −コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020も抑制されることからアポトーシスによる細胞死が増えていることを示唆する。またこの時、損傷ミトコンドリアの除去により、活性酸素などの細胞老化因子も除去されていることも予想されるため、Notch-Hes 1 経路は抗老化作用の主要な細胞内シグナル伝達経路と捉えられ、この経路の効果的な阻害が新たな抗老化の作用点となることが期待される。
このように、Notch-Hes 1 経路には皮膚の恒常性に広範に寄与する新たなキーメカニズムの可能性が見出された。
皮膚の恒常性を即座に脅かす外的ストレス要因の筆頭は、皮膚が傷ついて破綻する作用、いわゆる創傷作用である。

図3

そこで、生体における Hes 1 のストレス応答を観察するためにマウスに全損欠損創を作成し、Hes 1 の発現解析をおる Hes 1 のストレス応答を観察するために、マウスに全損こなったところ、創傷部位の表皮において Hes 1 の発現が欠損創を作成し、Hes 1 の発現解析をおこなった。全損欠大きく上昇していることがわかった。創傷早期に誘起され損創を作成した 2 日目に皮膚を回収し、Hes 1 に対する免る Hes 1 の発現上昇とその生理的・分子生物学的メカニズ

疫染色をおこなったところ、図 3 に示すように、創傷部位

ムについては、解析を進めているところであるが、Notch

では非創傷領域と比べ、表皮での Hes 1 の発現が優位に上シグナルや Hes 1 およびその関連分子が皮膚恒常性に係る昇していることを見出すに至った（未発表データ）。

現象をいくつか発見するに至っている。これらを総じて、

4. 考

今回の研究成果は、基礎皮膚科学や臨床皮膚研究などの医察療の観点はもとより、人々の心身の健康をひろく支える香UVB 照射が皮膚に与える分子制御機構について、ヒト粧品の評価機材の開発 3）や新規機能性香粧品の創製、さらの表皮ケラチノサイトでは Notch-Hes 1 経路の活性化が起には長寿社会を支える新たな社会基盤研究の一助に通じるこり、それにともないアポトーシス細胞の増加が顕著とな萌芽的成果として捉えることができる。

2った。これらを誘起する UVB 照射量は 20 mJ/cm でピー5. 統クを迎えることもわかった。これは日常生活で受ける照射括量の範疇であり、特に夏場には UVB 照射量はこれを大き

昨今の一億総活躍社会実現の積極的推奨の観点からも拙く超える時間帯もあることから、皮膚構成細胞のうち特に速に進みつつある使役勤労長寿社会化において、心身のス

表皮ケラチノサイトにおける Notch-Hes 1 経路が、その後トレスを背景にした老化の問題はつぶさに喫緊に対処すべに引き起こされるアポトーシスによる細胞死の抑制に寄き深刻な社会的課題である。唐突ではあるが、この課題に与することが考えられる。面白いことに、一般にアポトー踏み込む切り口のひとつが「皮膚の恒常性と老化」、その科シス誘導などに関連する BNIP 3 の発現は、UVB 照射量が学的探究と考える。体表を被う皮膚は、多様な外部環境や210 mJ/cm でピークを迎えることもわかった。これらのストレスに速やかに応答する直接的な防御壁である。皮膚分子間での発現制御機構とバランスが、皮膚のターンオーは身体的健康を維持する生体恒常性を維持するバリア装置

バーにおける皮膚恒常性を制御する鍵となるかもしれない。

である。それとともに、外見として他者の視覚的意識にもそれゆえ、我々は皮膚恒常性にとって鍵となる生命現象反映される臓器ゆえ、精神的な健康にも影響を及ぼす心理を広く捉え、その因子のひとつとしてオートファジー制御的なバリア装置ともなり得る。老化に伴う皮膚機能の破綻機構に着目した。実際、BNIP 3 と HES 1 のオートファジは、理想とする容貌や容姿の破綻だけでなく、生体内部のー活性について調べたところ、HPEK に BNIP 3 を強制発機能破綻、強いては生命の破綻までつながるトリガーでも1 , 2）現させるとオートファジーが誘導される（図 2） 。しかし、ある。圧倒的な長寿人口社会の負の問題のリスクヘッジとHES 1 の強制過剰発現は、オートファジー誘導を抑制した

して「皮膚の抗老化」は極めて重要な研究課題として捉える（図 2）。さらに、我々のこれまでの研究成果より、UVB 照ことができる。

射時に引き起こされる BNIP 3 の発現増加は、オートファ

我々の求める研究成果は、老いに付帯する不安要因の緩ジー誘導による損傷ミトコンドリアの除去を誘導するなど和や老化にともなう皮膚脆弱性からの寛解・堅牢性の再獲抗アポトーシス作用因子として働くことも示している 1 , 2）。

得など、これからの長寿社会に寄与できるものと考えられこれらの結果は、紫外線照射による Notch-Hes 1 経路の活る。これらの観点は終局的に、⑴ 我が国が初となるオー性化により BNIP 3 の発現量が抑制され、オートファジー

トファジー皮膚恒常性機構の解明、⑵ 長寿社会での社会− 156 −皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明

保障費・医療費の削減、⑶ 予防医療受診への啓蒙、⑷ 褥Y, Goto A, Morita T, Hayakawa T. BNIP3 upregulation

瘡や加齢皮膚疾患等に対する特効薬開発や治療法の開発に

via stimulation of ERK and JNK activity is required

波及的な効果を及ぼすことが期待できるものと考えている。

for the protection of keratinocytes from UVB-inducedapoptosis. Cell Death Dis, 2017. 8（2）: p. e2576.

（引用文献）

3） Moriyama M, Sahara S, Zaiki K, Ueno A, Nakaoji

1） Moriyama M, Moriyama H, Uda J, Matsuyama A,K, Hamada K, Ozawa T, Tsuruta D, Hayakawa T,Osawa M, Hayakawa T. BNIP3 plays crucial roles

Moriyama H. et al., BAdipose-derived Stromal/Stemin the differentiation and maintenance of epidermal

Cells Improve Epidermal Homeostasis. Sci Rep, 2019. 9

keratinocytes. J Invest Dermatol, 2014. 134（6）: p.1627-35.

（1）: p. e18371.

2） Moriyama M, Moriyama H, Uda J, Kubo H, Nakajima− 157 −