【研究報告】（自然科学部門）

動脈硬化発症におけるコレステロールの「質」に関するトランスクリプトミクスによる検証とフラボノイドによる抑制効果小林東京大学大学院農学生命科学研究科
緒言彰子

准教授

ラ ボ ノ イ ド の 効 果 を 検 証 す る ま ず 第 一 段 階 と し て、

コレステロールは、生体膜の構成成分や、ビタミン D

COP 摂取が生体へ与える影響を、ラットを用いたトラやステロイドホルモンの原料になることから生体に必須ンスクリプトーム解析により明らかにすることを目的とな栄養素である。しかし近年、食の欧米化に伴い食事かした。

ら摂取する脂質の量が増加し、高コレステロール血症患者が増加している。高コレステロール血症は動脈硬化発方症のリスクが高まることから、日本人の食事摂取基準に

1.

法
COP を含むコレステロール試料の作製おいても一日の上限量が定められている。近年、コレス

定 法 に 従 い 5）、 コ レ ス テ ロ ー ル（和 光 純 薬 工 業、テロールは摂取量だけでなく、質も重要視されている。

Osaka, Japan）を 200℃で 6–12 時間熱して COP を含むコ

特に食品加工の過程において生成する酸化コレステロー

レステロール試料（COP 試料）を作製した。

ル（COP）は、生体に悪影響を及ぼす可能性が報告さ
COP 試料の GC-MS による組成分析

2.

れているが、そのメカニズムについてはほとんど明らかにされていない。

明治大学の長田恭一准教授のご協力を得て測定を食品に含まれるコレステロールの 1 割は COP になる行った。ULBON HR-1 カラム（0.25 mm×50 m, 0.25といわれている。また、油の長期保存や電子レンジによm,る繰り返し、長時間の加熱は、COP を増大させる。上Shimazu GC-MS-QP5050A にて測定した。

信 和 化 工 株 式 会 社（Kyoto, Japan）） を 用 い て述のように日本人のコレステロール摂取量は増加してお3.

り、それに伴い COP の摂取量も増大していることが予動物および飼育測される。ヒト動脈硬化巣に 27-ヒドロキシコレステ

7 週齢 Wistar ラット（日本クレア、Tokyo, Japan）18

ロールや 7-ケトコレステロールといった COP が存在す

匹を AIN-93G を基本とした普通食で 5 日間予備飼育を行1）ることや 、7-ケトコレステロールがヒトマクロファー

い、その後 6 匹ずつ 3 群に分けて 21 日間本飼育を行っジにおいて炎症性シグナルを増幅させることが報告された。群分けは普通食群（non-cholesterol, NC）、コレスていることから 2）、COP の動脈硬化発症への関与も示唆

テロールを 0.3％（w/w）添加したコレステロール食群

されている。しかしその関係性は明確ではない。

（high cholesterol, HC）、COP 試料を 0.3％（w/w）添加

我々は、腸管に発現するコレステロールトランスした COP 食群（high oxycholesterol, HO）の 3 群とした。

ポーターである NPC1 L1 を制御することにより、腸管飼育期間は自由摂食・摂水とし、2 日に一回、16:00 に摂からの過剰なコレステロール吸収を特異的に防ぐ数種の餌量および体重の測定を行った。各群の餌の組成は

3）フラボノイドを見出した 。COP はコレステロールと同Table 1 に示した。本飼育 1、3、10、17、21 日目の 10:00

様に NPC1 L1 を介して腸管から吸収されることが報告に尾静脈採血によって血液を回収した。本飼育 22 日目

4）

されており 、我々の見出したフラボノイドは COP のの 13:00 に解剖を行い、頸動脈血液を採取し、肝臓を摘吸収も同様に阻害し、高コレステロール血症ならびに動出した。

脈硬化を予防する可能性がある。
本研究では、腸管からのコレステロール吸収抑制フ1小Table 14.

彰子のと定義した。発現変動した遺伝子はウェブツール

試料組成

Composition of diets（g/kg）
Cornstarch
CaseinDextrinized cornstarch
SucroseSoybean oil
Fiber
Mineral mix（AIN93G-MX）
Vitamin mix（AIN93G-VX）
L-cystine
Cholesterol
Cholesterol oxidation products

林NCHC

HO

DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp）

397.5
200.0
132.0
102.5
70.0
50.0
35.0
10.0
3.0

397.5
200.0
132.0
102.5
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3.0
3.0

397.5
200.0
132.0
102.5
70.0
50.0
35.0
10.0
3.0

による機能解析に供した。
8.

オリゴヌクレオチドプライマー配列
脂肪酸合成酵素（FASN）、SREBP1、メバロン酸キナーゼ（MVK）をエンコードするプライマーは、ソフト ウ ェ ア Primer3Plus（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）を用いて設計し、3.0

シグマアルドリッチ（Tokyo, Japan）に合成を依頼した。

血液生化学検査9.

リアルタイム PCR

尾静脈血の総コレステロールおよびトリグリセリド

500 ng の total RNA を 5×PrimeScript RT Master

は、それぞれ、コレステロール E-テストワコー（和光Mix（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社） と 混 合 し、GeneAmp

純薬工業）およびトリグリセライド E-テストワコーをPCR System 9700（PE Applied Biosystems（Foster用いて行った。また、頸動脈血は、総コレステロール、city, CA））により逆転写反応を行った。なお、total

遊離コレステロール、コレステロールエステル、LDL-RNA はプールせず個体ごとのものを使用した。生成しコレステロール、HDL-コレステロールについて、オリた cDNA サンプルを、TaKaRa Thermal Cycler Dice

エンタル酵母（Shiga, Japan）に測定を依頼した。

Real Time System（タカラバイオ株式会社）に供した。
結果は個々の遺伝子の fold change を B2M の fold change

5.

肝臓コレステロールおよびトリグリセリドの測定で補正した。

肝臓を 100 mg 量りとり、ホルチ法にて肝臓脂質抽出結液を得た。抽出液中のコレステロールおよびトリグリセ

果
GC-MS 測定の結果、作製した COP 試料の組成はコレ

リド量は 2.5. と同じ手法で測定した。

ステロールが 96.91％、COP が 2.50％、その他が 0.59％
6.

RNA 抽出であった。

肝臓の total RNA を NucleoSpin RNA（タカラバイオ

普通食群（non-cholesterol, NC）、コレステロールを株式会社（Tokyo, Japan））を用いて同社のプロトコル0.3％（w/w） 添 加 し た コ レ ス テ ロ ー ル 食 群（highに従い抽出した。Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilentcholesterol, HC）、COP 試料を 0.3％（w/w）添加したTechnologies（Santa Clara, CA））により RNA の質をCOP 食群（high oxycholesterol, HO）の 3 群間の体重増確認した。

加量、累積摂餌量、肝臓重量に有意な差は認められなかった。

7.

マイクロアレイ

尾静脈血の総コレステロール濃度は NC では変化がな得られた total RNA をもとに、GeneChip 3 ′ IVTかったのに対し、HC と HO では経日的に上昇し、HC でExpress Kit（Aﬀymetrix）を用いてターゲットの調整は本飼育 17 日目と 21 日目において NC との間に有意なを行った。GeneChip Rat Genome 230 2.0 Array上昇を示した（Fig. 1）。また、HO では有意な差は認め（Aﬀymetrix（Tokyo, Japan）） に ハ イ ブ リ ダ イ ズ し、られなかった。一方、トリグリセリド濃度は 3 群間に顕Hybridization、Wash and Stain Kit にて染色・脱色後、著な差は見られなかった。解剖時頸動脈血の総コレステスキャンして DNA マイクロアレイデータを取得した。

ロール、コレステロールエステル、遊離コレステロー

デ ー タ の 正 規 化 に は Aﬀymetrix Microarray Suite

ル、および LDL-コレステロールは、HC が NC に対し有Version 5.0（Aﬀymetrix）を用いた。発現変動遺伝子は意に上昇した一方で、HO と NC との間に有意な差は見群 間 の 比 較 に お い て logFC（log fold change; foldられなかった。
肝臓中のコレステロール量は NC に対し HC と HO のchange を log2 変換した値）の絶対値が 0.5 より大きいも2動脈硬化発症におけるコレステロールの「質」に関するトランスクリプトミクスによる検証とフラボノイドによる抑制効果

Fig. 1

血中総コレステロール濃度の経日変化

本飼育 1、3、10、17、21 日目に尾静脈採血によって血液を回収し、総コレステロール濃度を測定した（ =6, means±S.E.,
diﬀerent letter: <0.05（Tukey s test））。

Fasn、Srebp1、および Mvk の各個体ごとのリアルタ
イム PCR

Fig. 3

子を DAVID に供し、 <0.05 を満たす GO term をグループごとに整理した（Table 2）。グループは上から免疫応
Fig. 2

答、アポトーシス、その他に分類され、HO は HC と比肝臓中コレステロール濃度較し炎症および免疫応答が上昇している可能性が示唆された。

両群で有意に上昇した（Fig. 2）。トリグリセリドは HCが NC に対し有意に上昇した一方で、HO は NC との間に考有意な差は見られなかった。

察DNA マイクロアレイでは HC vs. NC と HO vs. NC とHO に 与 え た COP を 含 む コ レ ス テ ロ ー ル 試 料 のの比較において、HC vs. NC でのみ発現上昇（log FC>96.91％がコレステロールにも関わらず HO の血中コレス0.5）した遺伝子数は 306、HO vs. NC でのみ発現上昇しテロールレベルが HC より有意に低下していたことかた遺伝子数は 560、その両者で発現上昇した遺伝子数は

ら、COP による血中のコレステロール濃度低下作用が400 で あ っ た。 ま た、HC vs. NC で の み 発 現 低 下考えられた。HO は HC と比較し肝臓での MVK の発現（log FC<−0.5）した遺伝子数は 400、HO vs. NC でのみの低下傾向が見られることから、COP がコレステロー発現低下した遺伝子数は 616、その両者で発現低下した

ルとは異なるメカニズムでコレステロール合成を阻害す遺伝子数は 298 であった。HC vs. NC および HO vs. NCることにより血中のコレステロール濃度が低下する可能において発現低下（log FC<−1）した遺伝子について性が示唆された。

DAVID を 用 い て 機 能 解 析 し、 値 が 0.05 未 満 の GO

一方血液のトリグリセリド濃度の経日的な変化では 3（gene ontology）term を抽出した。コレステロール合群間に顕著な差は見られなかった。ばらつきも大きかっ

成および TG 合成に関わる GO term が多く抽出された。

たことからこれについては今後検討する予定である。

HO vs. HC においてコレステロール合成および脂肪酸合肝臓の総コレステロール量は HC と HO が共に NC に成に関わる遺伝子の発現変動を調べたところ、脂肪酸合対し有意に上昇し、HO は HC に対し低下傾向を示した。

成 酵 素（FASN）、SREBP1、 メ バ ロ ン 酸 キ ナ ー ゼ

トリグリセリドに関しては、NC に対し HC で有意な上（MVK）の発現が低下していた。これらの遺伝子の発現昇を示し、HO では有意差は認められなかった。この結を PCR により確認した（Fig. 3）。いずれの遺伝子も HC

果は COP が肝臓中トリグリセリド蓄積量を低下させる群に対し HO 群において発現の低下傾向が見られた。という報告と矛盾しなかった 6）。

HO vs. HC において発現上昇（log FC>0.5）した遺伝

HC および HO において発現が低下した遺伝子の機能
3

小Table 2

林彰子

せることはすでに報告されている 4）。

HC vs. NC において発現低下した遺伝子の DAVIDによる機能解析

一般的に血中コレステロールレベルの増加と動脈硬Term

Count

Immune system process└ Antigen processing and presentation
Immune response└ Adaptive immune response└ Adaptive immune response based on somatic
recombination of immune receptors built from
immunoglobulin superfamily domains
Immune eﬀector process
Leukocyte mediated immunity└ Lymphocyte mediated immunity
Positive regulation of immune response
B cell mediated immunity└ Immunoglobulin mediated immune response
Acute inﬂammatory response to antigenic stimulus└ Hypersensitivity
Type II hypersensitivity└ Type IIa hypersensitivity
Cell killing└ Leukocyte mediated cytotoxicity└ Antibody-dependent cellular cytotoxicity
Response to stress
Innate immune response
Regulation of cytokine production

26
61877

Positive regulation of cell death└ Positive regulation of programmed cell death└ Positive regulation of apoptosis

141414

プごとに整理すると、免疫応答、アポトーシス、その他

Cellular process└ Negative regulation of cellular process
Regulation of biological process
Metabolic process└ Primary metabolic process
Nitrogen compound metabolic process└ Cellular nitrogen compound metabolic process└ Nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic
acid metabolic process
Macromolecule metabolic process└ Regulation of macromolecule metabolic process
Cellular macromolecule metabolic process
RNA metabolic process
Notochord formation

202
44129150131595753

Mascia らは腸管のモデル細胞であるヒト結腸癌由来化発症リスクには相関があると考えられているが、本研究では COP を含むコレステロール試料の摂食により、血中コレステロールの低下が示唆された。また、肝臓でのコレステロール合成に関わる遺伝子においても低下傾向が見られた。肝臓でのコレステロール合成関連遺伝子は HC でも低下していた。HC における低下は体内コレ88887722223324269ステロールレベルの上昇に伴った合成の抑制であると考えられる。しかし HO は HC と比較し MVK の発現がさらに低下傾向を示したことから、COP には肝臓でのコレステロール合成抑制作用があり、そのことが血中コレステロール濃度の低下をもたらしたのではないかと考えている。COP のこれらの効果は一見動脈硬化に対し正の効果にもみえるが、生体における脂質の代謝異常ともとれる。今後はこれらの代謝変化がどのように疾病に関わるのかについて解析を進めたい。
HO と HC を比較し発現上昇（log FC>0.5）した遺伝子を DAVID に供し、 <0.05 を満たす GO term をグルーに分類された。したがって HO は HC と比較し、肝臓での炎症免疫応答が上昇している可能性が考えられた。
Caco-2 に COP を添加すると、IL-1αや IL-6 などの炎症性サイトカインの mRNA 発現が上昇することを報告している 6）。今後は肝臓の DNA マイクロアレイでみられた免疫に関する遺伝子変動を精査すると共に、小腸上皮におけるこれらの炎症マーカーについても検討する予定で1046390222ある。
要約COP を 2.5％ 含 む コ レ ス テ ロ ー ル の 摂 食 と 純 品 のコレステロールの摂食では、血中や肝臓の成分および遺解析により、コレステロール合成および TG 合成に関わ伝子発現において違いが見られた。コレステロールる GO term が多く抽出された。これは HC と HO の両方食群（high cholesterol, HC）に対し COP 食群（highでコレステロール合成とトリグリセリド合成が抑制されoxycholesterol, HO）において血中コレステロールの低たことを示唆している。

下および肝臓中コレステロールと肝臓中トリグリセリド脂肪酸合成酵素（FASN）、SREBP1、メバロン酸キの低下傾向が見られたこと、そして脂肪酸合成酵素ナーゼ（MVK）の発現を PCR により確認したところ、（FASN）、SREBP1、メバロン酸キナーゼ（MVK）の発HC に 対 し HO に お い て 発 現 の 低 下 傾 向 が 見 ら れ た。

現の低下傾向が見られたことから、COP は脂肪酸合成

MVK の発現低下はコレステロール合成の阻害に、FASNとコレステロール合成を阻害することが推測された。まと SREBP1 の発現低下は脂肪酸合成の阻害につながる可た HO は HC と比較し肝臓における炎症および免疫応答能性がある。COP が FASN や SREBP1 の発現を低下さが上昇している可能性が示唆された。
4動脈硬化発症におけるコレステロールの「質」に関するトランスクリプトミクスによる検証とフラボノイドによる抑制効果

謝文

辞本研究を遂行するにあたり、研究助成金を賜りまし献

1） 前場良太：オレオサイエンス，2（5）,248–274, 2002.
2） B. Buttari, et al.:
, 86, 130–137, 2013.
3） M. Nekohashi, et al.:
, 23, e97901, 2014.
4） S. Terunuma, et al.:
, 48, 587–595, 2013.
5） T. Sasaki, et al.:
, 59（9）,503–507, 2010.
6） C. Mascia, et al.:, 49, 2049–2057,2010.

た公益財団法人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。

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