（社）日本食品衛生学会第 95 回学術講演会
2008 年 5 月 15-16 日（銀座ブロッサム）

GC/MS 大量注入を用いた食品中残留農薬の迅速一斉分析法の評価

株式会社アイスティサイエンス【目的】ＧＣ大量注入法の利点として、感度向上のみならず、試料量の少量化や濃縮操作の省略などによる前処理における簡易化や迅速化が挙げられる。そこで従来の食品中残留農薬分析において、簡易化および迅速化を目的としたＧＣ大量注入法による前処理法を評価することを目的とした。例として QuEChERS 法と通知法を組み合わせた前処理法１）を従来法とし、ＧＣ大量注入法を用いて改良した前処理を本法として評価を行った。
【方法】1. 対象農薬：ポジティブリスト制度 GC/MS 対象50 種（農薬混合標準液 22）、85 種（農薬混合標準液31）、GC/MS 対象 46 種（農薬混合標準液 34）、GC/MS対象 61 種（農薬混合標準液 48）、GC/MS 対象 26 種（農薬混合標準液 51）、GC/MS 対象 13 種（農薬混合標準液 1111）（関東化学）、合計 281 種。固相カートリッ
ジ：SAIKA-SPE（アイスティサイエンス）
2. 試料：ほうれん草、他
3. 添加濃度：0.01ppm、0.05ppm
4. 試料調製
試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 20mL
ホモジナイズ
食塩 1g
クエン酸3Na2水和物1g
クエン酸水素2Na1.5水和物0.5g
無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ 4g
攪 拌（手で振とう、1分）
遠心分離（5分, 3000rpm）
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層を全量分取定容（20mL , ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙで調製）
分取 1mL （試料0.5g相当）
固相C18-30mg（精製）
洗液 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 0.2mL
流 出液
添加 トルエン 0.4mL
固相G CS-20mg+PSA-30mg（精製）
洗液 ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ:ﾄﾙｴﾝ（3:1) 0.3mL
流 出液
添加 ﾌｪﾅﾝﾄﾚﾝ-d + ﾎﾟﾘｴﾁﾚﾝｸﾞﾘｺｰﾙ300
定容（2mL：試料0.5g相当 ）G C/MS（SCAN+SIM）測定
大量注入法：20mL注入（試料0.5mg相当）
Scheme 1. 試 験溶液の調製法○佐々野僚一、谷澤春奈

5. 測定条件LVI-S200（アイスティサイエンス）、胃袋型ｲﾝｻｰﾄ
100℃(0.4min)-120℃/min-240℃（1min）-50℃/min-270℃（30min )Q1000GC(日本電子)
0.25mm i.d.×0.5m
ENV-5ms 0.25mm i.d. ×30m, df 0.25mm
0.25mm i.d.×0.5m
60℃(4min)-20℃/min-160℃-5℃/min-220℃3℃/min-235℃-7℃/min-310℃(8min)
コンスタントフロー：1ml/min
150ml/min(0.38min)-0ml/min(4min)-30ml/min
20μl【結果と考察】
１．前処理方法：抽出操作は従来通りに行い定容した。
その定容液から1mL を分取し、固相 C18 に通した。次にその固相 C18 からの流出液（アセトニトリル 100%）にトルエン 0.4mL を加えることで溶媒環境をｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ/トルエン（3/1）とし、固相 GCS（グラファイトカーボンン）+PSA に通すことで通知法と同様の操作状況にした。そしてその流出液をそのままメス試験管で定容した。大量注入法を用いることで分取量を少量化できるため精製のための固相量が少量化でき、コンディショニングや洗液に必要な溶媒量も少量化できて、迅速化へ導くことができた。
２．精製について：ほとんど従来法を小型化した操作になっていることから、従来法とほぼ同じ精製効果であることが予想される。
３．回収率について：通常エバポレーターを使用すると揮発性の高いＤＤＶＰの回収率が低下することがあるが、本法では使用していないこともありＤＤＶＰの回収率は90%以上と良好であった。
４．前処理時間：分取後から定容するまでの前処理は10 検体でわずか 15 分で終了した。
５．測定機器の耐久性：本法は従来法と比較してＧＣへ注入する試料の絶対量がほぼ同じになるように分取量と注入量を調整しているため、測定機器の耐久性も従来法と同等であると考えられる。
従来の前処理法に大量注入法を組み込むことで、その前処理の簡易化および迅速化が期待できることがわかった。
【参考文献】１）Masahiro Okihashi, Food 1 (2007)101-110,

GC/MS大量注入を用いた
食品中残留農薬の迅速一斉分析法の評価
株式会社アイスティサイエンス○佐々野僚一 谷澤春奈

目的
従来の前処理をGC大量注入を用いて改良した前処理法の評価
評価項目①前処理の操作性と迅速性②固相ミニカラムによる精製効果③回収率と精度④測定機器の耐久性⑤コストパフォーマンス

1

対象農薬
ポジティブリスト制 GC/MS対象農薬
製品名

農薬数

濃度

農薬混合標準液 2250種

10ppm

農薬混合標準液 31

85種

10ppm

農薬混合標準液 34

46種

10ppm

農薬混合標準液 48

61種

10ppm

農薬混合標準液 51 （未発売）

26種

10ppm

農薬混合標準液 1111

13種

10ppm

合計

（アセフェート、メタミドホスは50ppm）

281種＊いずれも関東化学社製

通知法とQuEChERS法の比較（抽出）■通知法■ QuEChERS法（起橋法を参考）

試料 20g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 50mL
ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ★作業時間：40分
吸引ろ過

試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10 mL

操作性！

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 20mLで洗い込み＜

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙで100mLに定容

迅速性！

定容
分取 20mL（試料4g相当）
NaCl 10g
Ⅰ法：リン酸緩衝液（pH7) 20mL
Ⅱ法：0.01mol/L 塩酸（pH2) 20mL
液液分配（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ/水）
10分静置後、ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層を分取＜ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ★作業時間：8分

NaCl 1g, MgSO4 4g
ｸｴﾝ酸3Na2水和物 1g
ｸｴﾝ酸水素2Na1.5水和物 0.5g
撹拌（手で振とう 1分間）
遠心分離（3000rpm 5分間）

★メリット
●液液分配を抽出時に同時にできる●使用溶媒量が少ない●使い捨て容器の使用により、ガラス器具・分液ロートが不必要●多数検体を同時に作業できる2

通知法とQuEChERS法の比較（精製）■QuEChERS法■通知法

Centrifuge (5min at 3000rpm)

アセトニトリル層 分取（C18カラム）★バッチ精製

精製効果

溶出液
無水硫酸ナトリウム（脱水）濃縮

Mix an aliquot with MgSO4 & PSA/(GCB)＞

Shake (1 min)Centrifuge (5min at 3000rpm)

ENVI-Carb/NH2カラム

迅速性！

溶出 ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ(1:3) 20mL
溶出液

Acidify extract to pH～5 with 5% formic acid(to protect base- sensitive pesticides)≪濃縮Multireidue Analysis
by GC/MS, LC/MS/MS

定容（2 mL）
GC/MS

★メリット
●濃縮操作が無く、前処理が速い！

★メリット●固相ミニカラムによる、精製効果が大従来法とGC大量注入を用いて改良した本法
■従来法

■本法

QuEChERS・起橋法

QuEChERS・起橋法

試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10mL
ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10mL
ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ

液液分配・遠心分離

液液分配・遠心分離
通知法

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層分取（5mL: 試料5g相当）

大量注入を取り入れた前処理法

少量化！

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層分取（0.5mL: 試料0.5g相当）（C18-1000mgカラム）

C18-50mgカラム

ENVI-Carb-500mg/NH2-500mgカラム

ENVI-Carb-20mg/PSA-30mgカラム

溶出 ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ(1:3) 20mL

溶出 ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ(1:3) 0.6mL

濃縮（エバポレーター）
定容（2 mL：ｱｾﾄﾝ・ﾍｷｻﾝ）

定容（2 mL：ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ）

GC/MS（2uL注入：試料5mg相当）

GC/MS（20uL注入：試料5mg相当）

3本法前処理フロー
抽出★分析時間：30分／4検体

精製★分析時間：15分/10検体

アセトニトリル層分取 0.5mL （試料 0.5 g 相当）

試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10 mL

C18-50mg

ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ
洗液 アセトニトリル 0.5mL

NaCl（食塩） 1g

流出液
添加 トルエン 0.3mL

ｸｴﾝ酸3Na2水和物 1g
ｸｴﾝ酸水素2Na1.5水和物 0.5g
MgSO4（無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ）4g
撹拌（手で振とう 1分間）

GCS-20mg/PSA-30mg
洗液 ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ（1/3） 0.6mL
添加 ﾌｪﾅﾝﾄﾚﾝ-d＋1%PEG300 4uL

遠心分離（3000rpm 5分間）定容（2 mL）

分液ロートによる液液分配やエバポレーターなどによる濃縮操作を省略化

GC/MS（大量注入20uL注入：試料5mg相当）

1. 抽出
試料 10g
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 10 mL
ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ
NaCl 1g
ｸｴﾝ酸3Na2水和物 1g
ｸｴﾝ酸水素2Na1.5水和物 0.5g

塩 4種類
①ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ

MgSO4 4g
撹拌（手で振とう 1分間）

②撹拌

42. 液液分配
遠心分離★ 除去物質水溶性の高い植物成分
糖類
水

遠心分離

（3000rpm 5分間）

塩析効果により農薬をｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層へ移行させ、水溶性成分や水を除去する。

（液液分配）

逆さにしても混ざらない!!
ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ層
試料層（ｵﾚﾝｼﾞ）水層（pH 3）

3. ﾐﾆｶﾗﾑ精製①
分取 0.5mL （試料 0.5 g 相当）★除去物質
極性の低い植物成分
高級脂肪酸エステル類
クロロフィルC18-50mg
溶出 アセトニトリル 0.5mL

固相C18

流出液

農薬

分取 0.5mL

無 極 性 の 夾 雑 物 は C18
ミニカラ ムに 吸着させ、農薬はスルーさせる。

C18に通液5

4. ﾐﾆｶﾗﾑ精製②流出液
添加 トルエン 0.3mL
GCS-20mg/PSA-30mg

固相 GCS
固相 PSA

洗液 ﾄﾙｴﾝ・ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ（1/3） 0.6mL
添加 ﾌｪﾅﾝﾄﾚﾝ-d＋1%PEG300 4uL
定容（2mL）★ 除去物質色素★ 除去物質高級脂肪酸
色素

GCSで色素を吸着し、PSAで脂肪酸や色素等を吸着し、農薬はスルーさせる。

C18 50mgに通液

トルエン 0.3mL

GC/MS条件
PTV Injector

LVI-S200（AiSTI Science）； Stomach Insert

Injector Temp.

90℃-120℃/min-240℃（1min）-50℃/min-270℃（30min）

Auto Samplor

Agilent 7683; 50 mL Syringe

Injection Volume

25 mL

GC/MS

JMS-Q1000GC（JEOL）

Pre-column

Deactivated silica capillary tube, 0.25mm ×0.3m

ColumnE NV-5MS, 0.25mm i.d .×30m, d f; 0.25mm

Column Oven Temp.

60℃（ 4min ） -20℃/min-160℃-5℃/min-220℃-3℃/min-235℃-7℃/min-310℃（8min ）Inlet Mode
Vent Flow
Vent Press
Vent End Time
Parge Flow
Parge Time
Gas Saver Flow
Gas Saver Time

Solvent Vent Mode
150 mL/min
70 kPa0.42 min
50 mL/min
4 min
20 mL/min
6 min

Detector Temp.

280℃

MS Method

SCAN; 50 - 450 m/z,SIM6

固相ミニカラムによる精製効果（オレンジ）
SCAN測定従来法(C18, ENVI-Carb/NH2)＊PEG300
＊

＊

＊

＊

＊
＊

本法（C18, GCS+NH2)

本法（C18, GCS+PSA)

固相ミニカラムによる精製効果（ホウレン草）
SCAN測定従来法(C18, ENVI-Carb/NH2)＊＊＊＊＊PEG300＊＊＊＊

本法（C18, GCS+NH2)

本法（C18, GCS+PSA)

7

添加回収試験（回収率分布）
本法（C18, GCS+PSA)
作物

ほうれん草

試料中濃度

0.01 ppm

回収率(%)

ND, 0-50

1750-70

1070-120

212

120合計

42281
（単位：成分）通常エバポレーターを使用すると揮発性の高い農薬ジクロロボス（DDVP）の回収率が低下することがあるが、本法では使用していないため、９０％以上の回収率を得ることができた。
極 性 の 高 い 農 薬 メ タ ミ ドホ ス や ア セフェートなどの回収率も８０％以上の回収率を得ることができた。
回 収 率 50% 以 上 の 農 薬 の 平 均 RSD（n=5）は3.7%であり、少ない分取量ではあるが良好な再現性を得た。

まとめ
GC大量注入法を用いることで分取量を少量化できるため、精製のための固相量が少量化でき、さらにコンディショニングや洗液に必要な溶媒量も少量化でき、迅速化へ導くことができた。また、手間と時間のかかる濃縮操作を省略することができ、簡便で迅速な一斉分析法となった。
分取後から定容するまでの前処理時間は10検体でわずか15分で終了した。
試料中濃度0.01ppm の添加回収試験（ほうれん草）の結果、281種中70-120%の回収率は212種であった。揮発性の高いDDVPや極性の高いメタミドホス・アセフェートなどの回収率も80%以上と良好であった。
分取量が0.5mLで少ない量であるが、回収率50%以上の農薬の平均RSD（n=5）は3.7%であり、良好な再現性を得た。
本法は従来法と比較してGCへ注入する絶対量を同じにしているため、測定機器の耐久性も同等であると考えられる。
従来の前処理法に大量注入法を組み込むことで、その前処理の簡易化および迅速化が期待できる。

8謝辞
日本電子株式会社様
関東化学株式会社様

参考文献
Michelangelo Anastassides,http://www.quichers.com
Masahiro Okihashi, Food 1 (2007) 101-110
永井雄太郎他, 第30回農薬残留分析研究会講演要旨 102-110

9