皮膚の老化によるⅦ型コラーゲンの代謝及び遺伝子発現調節機構について
弘前大学

医学部生化学第１講座

今淳Type Ⅶ collagen is the major component of anchoring fibrils, attachment structures stabilizing the association ofcutaneous basement membrane to the underlying dermis. Previous studies have shown that the reduction of type Ⅶ
collagen expression and anchoring fibril formation may involve intrinsic-/photo-aging of the skin, including wrinkle
formation, laxity, and roughness. In order to understand the molecular mechanisms underlie these clinical features, I
investigated 1)the transcriptional mechanisms of type Ⅶ collagen gene (COL7A1) and 2)the effects of ultraviolet (UV)radiation-induced cytokines (TNF-α, IL-1β) on COL7A1 expression. 1)Transient cell transfection assays with COL7A1
promoter/luciferase reporter gene construct into epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts revealed that a GCbox (-155/-150) as well as a GT box (-512/-505) previously published are crucial for the high basal activity of COL7A1
promoter. Electrophoresis mobility shift assays revealed that transcription factors Sp1 and Sp3 bind to this region. Cotransfection experiments of COL7A1 promoter constract with Sp1 and Sp3 expression vectors demonstrated that Sp1
is essential for high COL7A1 expression, whereas Sp3 represses Sp1-mediated transcriptional activation. However,point mutation into -155/-150 site markedly reduced the activity of the promoter, suggesting -155/-150 is an Sp1-familymediated cis-acting element involved in transcription of COL7A1. 2)Northern blot analyses demonstrated that both
TNF-α and IL-1β reduced COL7A1 mRNA levels in epidermal keratinocytes in a dose- and time-dependent manner,
whereas they enhanced the expression of COL7A1 in dermal fibroblasts. The inhibitory effects were also observedat the protein level as well as at the mRNA level. In addition, nuclear run-on assays revealed that TNF-α and IL-1β
reduced the COL7A1 transcripts, suggesting that the inhibitory effects of TNF-α and IL-1β on COL7A1 expression wasoccurred, at least in part, at the transcriptional level. Thus, COL7A1 regulation by these inflammatory cytokines is cell
type-specific. Down-regulation of COL7A1 expression in epidermal keratinocytes may contribute to the reduction ofanchoring fibrils formation, resulting in intrinsic- /photo-aging of the skin, characterized by wrinkle formation.

１．緒

言
表皮

皮膚のⅦ型コラーゲンは，表皮角化細胞及び真皮線維芽細胞により生合成され，細胞外に移動した後，基底膜（BM）表皮角化細胞に結合してアンカーリングフィブリル（AF）を形成する（図1）。そして，このⅦ型コラーゲン /AF は，基底膜と真皮LL 基底膜LD基底膜との結合を強固にし，皮膚の構築を維持する重要な役割をアンカーリングフィブリル担っていると考えられている１）。
皮膚の老化には，加齢に伴い全身の皮膚に生じる自然老真皮化と，紫外線暴露により生じる露光部の光老化が存在するが，何れの老化した皮膚においても AF の減少が認めら，しかも光老化皮膚ではその程度が更に増強していることから２），所謂 “皺” など皮膚の老徴出現にはⅦ型コラーゲンが何らかの関与をしていると考えられる。

真皮線維芽細胞図 1. 皮膚基底膜領域へのアンカーリングフィブリルの結合
表皮角化細胞と真皮線維芽細胞で生合成されたⅦ型コラーゲンは，lamina lucida（LL）及び lamina densa（LD）からなる基底膜領域に移動・結合し，アンカーリングフィブリルを形成する。

本研究完了報告では，最終的に，いつまでも “皺” を生じない若々しい皮膚を保つ方法の確立を目的とし，その一COL7A1 の発現と老化との関係について報告する。特に，端としてⅦ型コラーゲンタンパク質及びコードする遺伝子

1）皮膚の COL7A1 基本転写調節機構，2）光老化に関与

Metabolism and gene regulation of type
VII collagen in skin aging.

膚の COL7A1 発現調節機構の解析結果を報告し，老化にKon Atsushi

する各種炎症性サイトカイン（TNF—α, IL—1β）による皮よる皮膚の老徴との関連についても考察する。

Department of Biochemistry, Hirosaki
University School of Medicine

２．実
２．１

験

ルシフェラーゼアッセイ法

培養ヒト表皮角化細胞及び真皮線維芽細胞における− 63 −

胞に導入して co—t ra nsfect ion 実験を行った結果，Sp1 はCOL7A1 の転写制御領域の解析・同定は，ルシフェラーゼア
３）ッセイ法を用いて行った 。尚，
ルシフェラーゼコンストラクト（—ルシフェラーゼ活性を促進し，Sp3 は Sp1 の作用を抑制し1804COL7A1—Luc）は，PCR 法により増幅した COL7A1 プた。そこで，上記 GT box 及びこの GC box に変異を入れたロモーター領域（− 1804/ ＋ 108）をインサートとし，これを− 524COL7A1/ Luc を各細胞に導入して，同様にルシフェルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み調整した。また，イラーゼアッセイ法を行った結果，活性は著しく低下するもの

ンサートの 5' 末端からプロモーター領域を順次欠失させた各の完全には消失しなかった。即ち，これら GT/G C box は種欠失変異体も同様にして調製した。

COL7A1 転写の initiation を制御する領域ではなく，エンハンサーとして互いに協同しながら COL7A1 の転写を制御して２．
２ゲルシフトアッセイ法

いた（図 3）。

COL7A1 の転写制御領域に結合する転写因子の解析・同３．２ 各種サイトカインによる皮膚の COL7A1 発現調節機構

定は，ゲルシフトアッセイ法を用いて行った３）。

２．
３

ノーザンブロット法

皮膚が紫外線に暴露されると，“皺” などの老徴に代表炎症性サイトカイン（TNF—α, IL—1β）による，培養ヒト表される光老化が生じる。この光老化の生じた皮膚では，皮角化細胞及び真皮線維芽細胞の COL7A1 mRNA の発現AF の形成が低下しており，この機構にⅦ型コラーゲンが４）変化は，ノーザンブロット法で解析した 。
Antibodies−Sp1Sp3Ap-2JunB12345２．
４ ウエスタンブロット法
炎症性サイトカイン（TNF—α, IL—1β）による，培養ヒト表Supershifted

皮角化細胞及び真皮線維芽細胞のⅦ型コラーゲンタンパク質の発現変化は，ウエスタンブロット法で解析した５）。

Shifts２．
５

核 run-on アッセイ法

2134

炎症性サイトカイン（TNF—α, IL—1β）による COL7A1 の転写産物量の変化を，核 run—on アッセイ法によって解析した６）。

３．結果及び考察
３．
１

COL7A1 の基本転写調節機構

既に約 3.8kb のヒト COL7A1 プロモーター領域がクローニングされ，解析された。しかし，（1）COL7A1 が TATA—less遺伝子であること，（2）プロモーター領域− 512/− 505（転写開始点を＋1 とする）の GT box が基本転写の cis—element であり，Sp1 の結合する，こと以外明らかにされておらず３），皮膚の COL7A1 基本転写調節機構の詳細を更に解析した。
− 1804COL7A1/ Luc 及びその欠失変異体を培養ヒト表Free Probe

皮角化細胞及び真皮線維芽細胞にそれぞれ導入して，ルシフェラ−ゼアッセイ法を行った結果，両細胞とも，− 458 まLaneで欠失させると活性が 40％にまで低下した。これは，上記

図 2. -155/-150 の領域への Sp1 及び Sp3 の結合
GC box である -155/-150 領域をプローブとしてスーパーシフトアッセイ法を行った結 ，Sp-family の Sp1 及び Sp3 のスーパーシフトのバンド（Supershifted bands, ★印）を認めた。

− 512/ − 505 の GT box が欠失したためであった。更に−230 までは変化しなかったが，− 144 まで欠失させると活性が消失した。以上から，− 230/ − 140 にも cis—element が存在すると考えられた。コンピューターによるモ

COL7A1 promotorチーフ解析を行った結果，− 155/ − 150 に Sp1の結合し得る G C box が存在していた。ゲルシ
フトアッセイ法で確認したところ，この領域には-512-505
Sp1/Sp3-155

150
Sp3/Sp1Sp1—family の Sp1 及び Sp3 が結合していた（図+12）。次に，Sp1 及び Sp3 の発現ベクターを各細図 3. Ⅶ型コラーゲン遺伝子 COL7A1 の基本転 調節機構

− 64 −

皮膚の老化によるⅦ型コラーゲンの代謝及び遺伝子発現調節機構について関与するのではないかと考えられている

表皮角化細胞２）。 最 近， 紫 外 線 UVA に よ る COL7A1

control

TNF-α

真皮線維芽細胞
IL-1βcontrol

TNF-α

TNF-1βの発現調節に関する報告がなされ，表皮角化細胞における COL7A1 の発現を抑制し， COL7A1
逆に真皮線維芽細胞は促進することが明らかになった５）。更に，紫外線により誘導される炎症性サイトカイン TNF—α, 及び IL— GAPHDH
1β も，COL7A1 の発現を制御していることが報告され４），真皮線維芽細胞におけるCOL7A1 の発現を促進し，特に TNF—α はNF—κB を誘導して，これが COL7A1 プロモ

図 4. 表皮角化細胞及び真皮線維芽細胞の COL7A1 の発現に対する，炎症性サイト
カイン TNF—α 及び IL—1β の影響
TNF—α（10 ng/mL）及び IL—1β（100 U/mL）で培養ヒト表皮角化細胞を刺激すーター領域の応答配列に結合，転写レベル ると，COL7A1 の発現は抑制された。一方，真皮線維芽細胞では促進され，組織特で発現を促進することが明らかになった７）。 異的発現調節機構が認められた。
しかし，表皮角化細胞に対する機構は全く不明であり，その詳細を解析した。

解・低形成を引き起こしている可能性が否定できない。従っ培養ヒト表皮角化細胞に TNF—α（10 ng/mL）,IL—1βて，皮膚の老徴出現の解析には，Ⅶ型コラーゲンの生合成，（100 U/mL）を添加して 24 時間培養し，次いで細胞を回収，

COL7A1 の発現調節機構のみならず，異化分解系の関与も

COL7A1 の発現をノーザンブロット法で解析した。その結検討する必要があると考えられた。

果，両炎症性サイトカインとも COL7A1 の発現を抑制した（図 4）。しかも，この抑制効果は濃度及び時間依存的（参考文献）であった。培地中にタンパク質合成阻害剤 cycloheximide１） 今 淳： 表皮角化細胞及び真皮線維芽細胞におけⅦ型コを添加すると，この抑制効果が消失したことから，この反ラーゲン遺伝子の発現調節機構について. Connec Tissue 34:

応には de novo のタンパク質新生を必要とした。次に，核127- 135, 2002.

run-on アッセイでにより，各炎症性サイトカインの作用

２） Craven NM, Watson RE, Jones CJ et al.: Clinical featuresが転写レベルで行われているかを解析した。その結果，各of photodamaged human skin are associated with a

炎症性サイトカインの刺激により転写産物量が減少し，抑reduction in collagen Ⅶ . Br J Dermatol 137: 344-350, 1997.

制効果は転写レベルでの調節を受けていた。ウエスタンブ

３） Vindevoghel L, Kon A, Lechlerider RJ et al.: Smad-ロット法で，培地中に分泌されるⅦ型コラーゲンタンパク

dependent transcriptional activation of human type Ⅶ

量を解析したところ，発現が抑制されており，遺伝子レベ

collagen gene（COL7A1）promoter by transforming growth

ルのみならずタンパクレベルでも抑制効果を認めた。この

factor-beta. J Biol Chem 273: 13053-13057, 1998.

様に，炎症性サイトカインの表皮角化細胞及び真皮線維芽４） Chen YQ, Mauviel A, Ryynanen J et al.: Type Ⅶ細胞における COL7A1 発現調節機構は全く異なっており，collagen gene expression by human skin fibroblasts and

組織特異的発現調節機構の存在が示された。

keratinocytes in culture: influence of donor age and cytokine

以上から，光老化の原因となり紫外線で誘導される炎症性responses. J Invest Dermatol 102: 205-209, 1994.

サイトカイン TN F—α 及び I L—1β も，紫外線 U VA の場合と５） Chen M, Petersen MJ, Li HL et al.: Ultraviolet A

同様に表皮角化細胞の COL7A1 の発現を抑制しており，AFirradiation upregulates type Ⅶ collagen expression inの低形成への関与が考えられた。A F の低形成は基底膜領

human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol 108: 125-128, 1997.

域を脆弱にし，そこに外力が掛かることで深い溝ができ，皺

６） Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning.

形成に繋がる可能性が考えられた。しかしながら，真皮線維A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory

芽細胞における効果も U VA と同様促進的であり，発現したPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Ⅶ型コラーゲンがどの様な機構で A F を形成するのか，今後

７） Kon A, Vindevoghel L, Kouba DJ et al.: Cooperation

更なる解析が必要である。事実，表皮角化細胞と真皮線維

between SMAD and NF-kappaB in growth factor regulated

芽細胞の何れが A F を形成するのか，例えば表皮角化細胞

type Ⅶ collagen gene expression. Oncogene 18: 1837-1844,
1999.

由来のⅦ型コラーゲンが優位に形成するのかなど不明な部分が多い。更に，各炎症性サイトカインはⅦ型コラーゲンの異８） Salo T, Makela M, Kylmaniemi M et al.: Expression of

化分解酵素の一つである matrix metalloproteinase-9（MMPmatrix metalloproteinase-2 and -9 during early human８）—9）の発現も促進することが知られ ，このことも A F の分− 65 −wound healing. Lab Invest 70: 176-182, 1994.