腸内フローラのシグナル伝達による細菌病原性抑制機構の解明

西野

大阪大学産業科学研究所

緒言

邦彦

准教授

生しない。これまでの私達の研究により、インドールやインドールが大腸菌から産生されることは、20 世紀

大腸菌培養上清は、サルモネラに存在している RamA初頭に発見され、以来、大腸菌等を他の細菌から区別す制御因子の遺伝子発現に影響をおよぼすことが分かってるための指標とされていた。しかしながら、最近の研究

きた２, ３）。この事実は、インドールが同種細菌細胞間だによって、微生物コミュニティーにおける情報伝達物質けではなく、異種細菌間情報伝達物質として機能していとしてのインドールの機能が注目されている。多くのグることを示している。
しかしながら、これまでにインドー

ラム陰性・陽性菌が、微生物コミュニティーにおけるルがサルモネラ遺伝子発現全体にどのような影響をおよ

細胞間情報伝達シグナルとしてインドールを産生していぼすのかは明らかではなかった。

る。これまでの私達の研究から、大腸菌において、イン

私達は、インドールが広い範囲で、サルモネラの遺伝ドールは細胞内情報伝達物質として大腸菌自身の遺伝子子発現に影響をおよぼし、その結果、病原細菌の生理機発現を制御することを明らかにしてきた 。一方で、サ能を制御していることを予想した。
これを検証するため、ルモネラ等の病原性細菌は、インドール合成に必要と本研究では、インドールによるサルモネラ遺伝子発現のなるトリプトファン代謝酵素 TnaA を保持しないため、網羅的解析をマイクロアレイによって行う。また、予想インドールを産生しない。しかしながら、腸内には、大された運動性・病原性抑制効果について、フェノタイプ腸菌以外にも、Proteus vulgaris, Providencia spp., andの解析を行う。さらには、腸内フローラ中でのサルモネ

Morganella spp. 等のインドール産生菌が存在しておラ遺伝子発現やフェノタイプの解析を行い、腸内フローり、これら腸内フローラによって産生されるインドールラがサルモネラ病原性を抑制していることを実証する。

１）が、サルモネラをはじめとした病原細菌の病原性を抑制実験方法している可能性が考えられる。
腸管には、大腸菌を含め、10 の細菌が生息してい本研究では、Salmonella enterica serovar Typhimuriumると考えられている。腸内には、上述した様に多くのイATCC14028s を野生株として用いた。また、FLAG タグンドール産生菌が存在している。大腸菌を培地中で培養を染色体上の ramA 遺伝子に融合させた NES114 株、すると、培養上清中には 600 µM という高い濃度でインramA プロモータ活性を測定するためのレポータープドールが検出される。また、ヒトの糞便中にも 250 ～ラスミドを保持した NES84 株を用いた。遺伝子欠損株

1,100 µM の濃度でインドールが認められる。最近の研として、14028s ∆ ramA と 14028s ∆ ramR 株、そして究により、インドールは大腸菌において、大腸菌自身のram 領域を全て欠損させた株を用いた。

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アミノ酸取り込み・合成・分解や、プラスミド維持機能、ATCC14028s 株を 1 mM から 4 mM のインドール存

細胞分裂、バイオフィルム形成、そして酸耐性といった在下で増殖させた後、RNA を回収した後、NimbleGen

フェノタイプを制御していることが明らかになってき社の S. typhimurium array により遺伝子発現解析をた。

行った。マイクロアレイの遺伝子発現解析の結果の一部
は、半定量的 RT-PCR と定量的リアルタイム RT-PCR

サルモネラは、ヒトに対して胃腸炎・菌血症・チフス法により確認した。

等の症状を引き起こす病原細菌である。大腸菌がインドールを産生するのに対し、サルモネラは TnaA 酵素

インドールが、ramA プロモーター活性に与える影響をコードする遺伝子を保有しないため、インドールを産については、レポータープラスミドを用いたβ - ガラク1

西野

邦彦

トシダーゼアッセイにより測定した。また、RamA 蛋

多剤排出蛋白質をコードしている acrAB と tolC 遺伝子

白質発現レベルをウェスタンブロッティング法により確の発現上昇が引き起こされることがこれまでに知られて認を行った。

いる。半定量的 RT-PCR 法やレポーターアッセイによインドールがサルモネラの鞭毛形成におよぼす影響にり、インドールによる ramA 発現上昇を確認した。また、

ついては、透過型電子顕微鏡を用いた形態観察によりおRamA 蛋白質発現もインドールによって上昇することこなった。また、その運動性を軟寒天培地により観察しをウェスタンブロッティングにより確認した。これらのた。

結果は、定量的リアルタイム RT-PCR 法によっても確認され、ramA と acrB は野生株において、インドールサルモネラの細胞侵入性については、Caco-2 細胞をによりその発現が上昇しているが、ramA の上流に存在用いて計測した。

する抑制制御遺伝子 ramR を欠損させた株ではインドー結果

ルの影響が無いことが分かった。
このことから、インドー・インドールはサルモネラ遺伝子発現に影響をおよぼすルによる多剤排出系遺伝子の発現上昇には RamR/A が関与していることが考えられた。

サルモネラ野生株 ATCC14028s を 1 もしくは 4 mMのインドールで処理した後、遺伝子発現を DNA マイク

・インドールはサルモネラの運動性を抑制するロアレイにより解析した。両濃度でインドールによりインドールによりサルモネラ運動性に関与する遺伝子24 遺伝子の発現が上昇し、53 遺伝子の発現が抑制されの発現量が減少したことが分かった。鞭毛合成に関与すた。
インドールにより発現上昇が確認されたものとしてるマスターレギュレーターである FlhC をコードしていは、ramA, ydiP, yhiB, bglJ といった制御に関係するもる遺伝子発現量変化について調べたところ、インドールのがあった。これら遺伝子の発現量は、インドール添加は本遺伝子の発現を抑制することが分かった（図１A）。

により、10 倍以上上昇した。その他、インドールによ

また、電子顕微鏡で観察したところ、インドール存在下り発現量が上昇した遺伝子の中で、よくその機能が解析でのサルモネラの鞭毛の数は減少していることが分かっ

entD, fruF, bfd, fxsA などがあっされているものとして、た（図１BC）。軟寒天培地を用いた運動性解析の結果、た。

インドールはサルモネラの運動性を抑制することが明らかになった（図１D）。

発現抑制が確認された 53 遺伝子の内、機能が未知であるものは 10 個あり、その他の遺伝子の機能について・インドールはサルモネラ細胞侵入性を抑制するは同定されている。発現抑制されて遺伝子の機能としては鞭毛合成やケモタキシス、鞭毛モーターの活性調

サルモネラには宿主細胞に侵入する活性があり、本活節因子といった細菌運動能に影響するものが含まれて性はサルモネラ病原性にも深く関係している。細胞侵入いた。また、サルモネラの病原性に深く関与している性に関与する遺伝子は主に SPI-1 領域に存在している。

Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1) 領域にコー

本領域に存在している hilA, sipA, invA, invF 遺伝子発ドされている、細胞侵入性関連の遺伝子 prgJIH, sipB,

現にインドールがおよぼす影響について調査した（図invEF などが含まれていた。また、嫌気的呼吸に関与

２）。全ての遺伝子はインドールの濃度が上昇するにつし て い る napBHGADF や tdcABCD, dmsAB, fumB,れ、その発現量は低下した。0.25 mM 以下のインドー

nrdD, STM4305/4306 等がインドールによりその発現ル濃度領域においては、これら遺伝子発現抑制に ramAが抑制された。また、インドールは ompW や dppFC と遺伝子の存在が寄与していることが分かったが、0.35いった膜蛋白質をコードしている遺伝子の発現を抑制しmM 以上の濃度では、ramA 非依存的に細胞侵入性に関た。

与する遺伝子の発現が抑制された（図２）。
また、インドール 1 mM でサルモネラを処理した時・インドールは多剤耐性に関与する排出系遺伝子の発現の細胞侵入性の活性について Caco-2 細胞を用いて調を上昇させる

べた（図３）。インドールはサルモネラの細胞侵入英を上述したようにインドールは ramA 制御遺伝子の発低下させた。また、この現象は ramR 欠損株ならびに現量を上昇させた。ramA 発現上昇により、サルモネラram 領域欠損株の両方で確認されたことこから、1 mM
2

腸内フローラのシグナル伝達による細菌病原性抑制機構の解明

図1

インドールはサルモネラ運動性を抑制する。（A）鞭毛合成マスターレギュレーター遺伝子 ﬂhCの発現量変化（B）透過型電子顕微鏡によるサルモネラ鞭毛の観察（C）インドールによる鞭毛数の変化（D）軟寒天培地によるサルモネラ運動性アッセイ

図2

インドールはサルモネラ細胞侵入に関連する遺伝子発現を抑制する。（A）hilA（B）sipA（C）invA （D）invF 遺伝子発現量を定量的リアルタイム RT-PCR により解析。

3

西

図3

図4

野

邦彦

インドールはサルモネラ細胞侵入性を抑制する。1 mM のインドール存在下でサルモネラを培養し、Caco-2 細胞に対する各株の侵入性を測定した。

インドールによるサルモネラ遺伝子発現制御ネットワーク。インドールは、RamR/A依存的に多剤排出システム遺伝子 acrAB-tolC の発現を誘導する一方で、病原性に関与する SPI-1 遺伝子群ならびに鞭毛合成遺伝子の発現を RamR/A 部分依存的に抑制する。

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邦

彦

ではramR/A非依存的にインドールによりサルモネラの生している。本研究では、腸内フローラが産生するイン細胞侵入性が低下することが分かった。

ドールがサルモネラ遺伝子発現におよぼす影響を調べるため、マイクロアレイ解析を行った。その結果、
インドー

考

察ルが、サルモネラ細胞侵入性や運動性といった病原性発本研究により、サルモネラの病原性に深く関与してい現に関与する現象を抑制することが明らかになった。こる SPI-1 領域にコードされている遺伝子発現をインドーのことから、微生物間情報伝達によって腸内フローラがルが抑制し、また、運動性や鞭毛合成に関与している遺病原細菌の病原性遺伝子発現を抑制している可能性が示

伝子発現の抑制にも効いていることが分かった（図４） 。

唆された。

４）

これまでに、腸内フローラが産生するインドールが病原謝細菌の病原性を抑制しているという観点から研究が行わ

辞本研究に対して助成を賜りました公益財団法人三島海

れたことはなく、本研究により、微生物間情報伝達によっ雲記念財団法人に心より感謝申し上げます。て腸内フローラが病原細菌の病原性遺伝子発現を抑制しているという新たな観点が生まれるものと考えている。
要文

約献1）A. Kobayashi, et al, : J. Bacteriol., 188, 5693-5703,2006.
2）E. Nikaido, et al, : J. Biol. Chem., 283, 24245-24253,2008.
3）E. Nikaido, et al, : Microbiology, 157, 648-655, 2011.
4）E. Nikaido, et al, : Gut Pathog., 4, 5, 2012.

最近の研究によって、微生物コミュニティーにおける情報伝達物質としてのインドールの機能が注目されている。多くのグラム陰性・陽性菌が、微生物コミュニティーにおける細胞間情報伝達シグナルとしてインドールを産5