【研究報告】（自然科学部門）

ビタミン D を用いた統合失調症発症予防

牧 之 段

公立大学法人奈良県立医科大学
緒言学助教に着目した研究は数多くなされているが､ 同マウスを用

統合失調症は人口の約 1％を占める主要な精神疾患でいて統合失調症の予防という観点での研究報告はほとんある｡ その症状は､ 妄想や幻覚などの陽性症状､ 思考のどないのが現状である｡ 今回、妊娠中の感染を模した貧困などの陰性症状および認知機能障害などによって特polyIC による免疫反応の亢進がもたらす PPI の障害なら徴づけられる｡ その病因・病態については疫学､ 遺伝びに統合失調症様行動異常の出現を、抗炎症作用をもつ学､ 死後脳や画像､ 動物モデルを用いた研究などで幅広

ビタミン D 投与によって予防できると仮説を立て、検く行われ､ これまでのところ複数の脆弱性遺伝子が複合討した。

的に作用して遺伝的基盤を形成し､ 環境要因と相互作用しながら発病に至ると考えられているがいまだその解明

実験方法には至っていない。

1.

動物の調整環境要因の一つに母体感染症が考えられている｡ 妊

生後 10〜12 週齢の C57B6/J 系雌マウスを妊娠させ、娠中に母体が感染症に罹患し､ その母から生まれた児で妊娠 9.5 日目（E9.5）の時期に経腹的に polyIC（20 mg/は統合失調症や他の精神病性障害の罹患率が高くなるこkg, Sigma-Aldrich）を投与した｡ また polyIC 投与に先1–4）｡ そして､ 妊娠中にインフルエ

立 ち E7.5 か ら E13.5 ま で 活 性 型 ビ タ ミ ン D3（1α,ンザウイルスを感染させたマウスから産まれた児では､

25-dihydoroxyvitamin D3: vitD3, Sigma-Aldrich）を経感覚情報処理制御機能の指標である prepulse inhibition

口的に 100 ng/d で投与した。polyIC または vitD3 のコン（PPI）が統合失調症患者と同じように障害されており､トロールはともに PBS（phosphate buﬀered saline）を行動異常がみられる 5）｡ 同様にインフルエンザウイルス経腹・経口胃的に投与した。つまり、経腹的–経口胃的感染に類似した免疫反応を引き起こす dsRNA である

投 与 の 組 み 合 わ せ か ら、PBS–PBS 群、PBS–vitD3 群、polyinosinic–polycytidiylic acid （polyIC）を妊娠マウス

polyIC–PBS 群、polyIC–vitD3 群の四群となり以下このに投与しても､ その児（polyIC マウス）で PPI の障害が組み合わせを用いて解析を行った。とが報告されている

5）みられる ｡ さらに炎症性サイトカインである IL-6 や他2.のサイトカインを母体ラットに投与し生まれた児でも処置マウスから産まれた各群のマウスを用いて、生PPI の障害や統合失調症様行動異常がみられるという報告がある

行動実験

6, 7）

後 56 日から 63 日の間に以下の行動学的解析を行った。

｡ これらの知見に共通する病態として感染によって母体で産生された炎症性サイトカインが胎盤をopen ﬁeld test（OF）通じて移行し､ 胎児脳に影響を及ぼし統合失調症様行動40 cm 四方のアクリルボックス中心に被験動物を置異常や PPI の障害を引き起こしていることが推測される｡

き、30 分間の行動を録画し、画像解析ソフト TopScan

また動物モデルや疫学から､ 妊娠中､ 発達期のビタミSuite（Clever sys）を用いて活動量を測定した。また不ン D 欠乏によって統合失調症発症リスクが上昇し､ PPI安評価については、20 cm 四方の中央分画への進入時間の障害が生じることが示されている

8–10）が短いほど不安が強いと評価した。

｡ そして､ ビタ

Y-maze test

ミン D は骨代謝に関わるだけではなく､ 全身ならびに3 方向 120 度の角度毎にアーム（長さ：34 cm、幅：中枢の免疫反応制御に関わり炎症を抑制することがわ
かっている 11, 12）｡6 cm、 深 さ：14.5 cm、 各 ア ー ム を A、B、C と し て 標識）が突き出している Y-maze 装置を用いた。マウスを以上の様に polyIC マウスを用いて統合失調症の病因1

牧 之 段学

迷路中心に置き、各アームへの侵入する様子を録画す

めノンパラメトリック解析を行い、Krukal–Wallis の検る。画像解析ソフト TopScan Suite（Clever sys）を用定、さらに各二群間の解析に Man–Whitney のいて 3 連続して異なるアームへの侵入した組み合わせを行った。多重比較の 値の補正に Ryan の方法を用いた。

求め、これを総侵入数−2 で割り、交替行動率として評全ての検定において 値が 0.05 以下を有意差ありと判断価する。これはマウスが探索行動で自発的に異なるアーした。

検定をムに入る性質を利用した試験で、空間認知・記憶能力が保たれていると交替行動率が高くなり、空間記憶能力が結果低下すると低下する。

OF テストOF テストでは活動量または不安状態を評価した。活受動的回避反応試験
記憶障害評価に用いたステップスルー型受動的動 量 は 各 群 の 比 較 に お い て polyIC–PBS 群 と polyIC–

回 避 反 応 試 験 装 置（MPB-M010、ST-10、SG-1000E、vitD3 群で有意な差を認めた（ ＝0.018）（Fig. 1）。また

MELQUEST、富山）は明室（○×△×□ mm､ 透明ア

不安状態を呈するマウスは中央部での探索行動が低下すクリル板）と暗室（○×△×□ mm、遮光アクリル板）るが、各群の比較において有意な差は認められなかったの 2 つの区画からなり、ギロチンドアにより連結されて（Fig. 2）。

いる。まず記憶獲得試行を行う。マウスを明室に入れY-maze テスト

10 秒後にギロチンドアを開けるとマウスは暗室に入る。
動物が暗室に入ったところでギロチンドアを閉じ、暗室統合失調症では認知機能障害の 1 つとして短期記憶ののグリッド床に5 秒間通電（強いフットショック：0.5 mA）保持の障害が知られている。今回、Y-maze テストを用する。次に記憶獲得試行の翌日から連続して 4 日間、記い、各群の空間認知・記憶について解析を行った。試験

憶保持の程度を評価するためマウスが明室から暗室に入の結果、polyIC 処置、また vitD3 投与による交替行動率るまでの明室滞在時間を反応潜時（Latency time）として測定した。反応潜時の測定は 300 秒とした。反応潜時が長いほど回避記憶が保たれていると判断する。
聴覚性驚愕反応および PPI 試験
聴覚性驚愕反応および PPI 測定は驚愕反応測定装置（SR-LAB systems、サンディエゴ社、米国）を用いて測定した。マウスを透明アクリルケージ（7 cm×7 cm×16.5 cm）に入れ、驚愕反応測定装置内の圧電位加速度計上に設置し、5 分間 65 dB のバックグラウンドノイズで馴化させる。驚愕反応および PPI 測定に 120 dB、Fig. 1

40 msec、バックグラウンドノイズと、バックグラウン

open ﬁeld test（distance traveled）

PBS–PBS ＝16, PBS–vitD3 ＝19, polyIC–PBS ＝16, polyIC–vitD3 ＝22* ＜0.05

ドノイズから 4 dB、8 dB、16 dB 高いプレパルス（69 dB、73 dB、81 dB） を 用 い た。120 dB で 40 msec、20 msecの プ レ パ ル ス 刺 激 の 150 msec 後 に 120 dB で 40 msec、バックグラウンドノイズのみ（未刺激）を合計 64 試行
行 っ た。 驚 愕 強 度 の PPI は 次 の 様 に 計 算 し た。100−［（プレパルス刺激のあるときの振動強度−未刺激の振動強度）/（120 dB のみの刺激時の振動強度−未刺激の振動強度）］×100。
3.

統計学的解析

Fig. 2

各試験の結果は平均±標準偏差あるいは箱ひげ図でopen ﬁeld test（duration in central area）

PBS–PBS ＝16, PBS–vitD3 ＝19, polyIC–PBS ＝16, polyIC–vitD3 ＝22示した。各群間の優位性は、サンプル数が少なかったた2

ビタミン D を用いた統合失調症発症予防

Fig. 3Y-maze test

PBS–PBS ＝17, PBS–vitD3 ＝14, polyIC–PBS ＝16, polyIC–vitD3 ＝19
Fig. 5startle response

PBS–PBS ＝17, PBS–vitD3 ＝25, polyIC–PBS ＝27, polyIC–vitD3 ＝22

Fig. 4

passive avoidance test

PBS–PBS ＝17, PBS–vitD3 ＝12, polyIC–PBS ＝21, polyIC–vitD3 ＝22* ＜0.05

Fig. 6

prepusle inhibition testの変化は見られなかった（Fig. 3）。

PBS–PBS ＝17, PBS–vitD3 ＝25, polyIC–PBS ＝27, polyIC–vitD3 ＝22

受動的回避反応試験

考察

受動的回避反応試験の結果を Fig. 4 に示した。獲得施

我々の研究室では polyIC マウスの解析を行い､ 母体

行後、1 日目で反応潜時は各群で有意な差は認められなの免疫反応による炎症が発達期に海馬の髄鞘化を遅延さかった。しかし、4 日目では polyIC–PBS 群と比べ PBS–せ､ 神経軸索の直径が縮小させることを報告している 13）｡

vitD3 群で反応潜時の有意な短縮（ ＝0.036）、polyIC–また発達期に脱髄をおこしたマウスは統合失調症様の行

vitD3 群 で 短 縮 傾 向（ ＝0.076） を 認 め た。 な お PBS–動異常を生じる 14）ことから､ 髄鞘を形成するオリゴデPBS 群と polyIC–PBS 群で差はみられなかった。

ンドロサイトの正常な発達が極めて重要であることを報告している｡ また脱髄疾患の動物モデルを用いた研究か

聴覚性驚愕反応および PPI 試験

らは、ビタミン D3 はその重症度を低下させ､ 脱髄の程聴覚性驚愕反応試験において、各群に有意な差を認度を弱めることが示されている 12, 15）｡ これらの知見かめなかった（Fig. 5）。PPI 試験でも 69 db、73 db、81 db

ら､ polyIC マウスでみられる発達期での髄鞘化の遅延刺激いずれにおいて、各群に PPI の有意な差は認められをビタミン D3 によって予防または軽症化できると仮説なかった（Fig. 6）。69 db で PBS–PBS 群と PBS–vitD3 群を立て、検討した。

で ＝0.084（Man Whitneytest）と PPI の改善傾向が動物モデルで妊娠中の polyIC 投与によって生まれたみられた。

児に PPI の障害が生じることが報告されているが、今回polyIC–PBS 群、PBS–PBS 群で比較し PPI の障害をもたらすことを確認できなかった。一方、69 db では PBS–3

牧 之 段学

PBS 群 と 比 べ、PBS–vitD3 群 で ＝0.084、polyIC–PBS

正確に評価できていない可能性が大きいと考えられた。

群 と PBS–vitD3 群 で ＝0.058 と PPI の 改 善 傾 向 を 認 め

今後、ビタミン D 投与方法を、水または食餌に混ぜるなた。また passive avoidance test において PBS–PBS 群とど、よりストレスの少ない方法に変更し、行動解析また

polyIC–PBS 群は vitD3 投与群に比べて latency の短縮を組織学的解析を行っていく予定である。

認め、恐怖記憶の保持が障害されていることが示唆され要た。これらの結果から PBS–PBS 群が polyIC–PBS 群と約同程度行動学的な変化を生じた理由について考察を行っ

母胎感染によって統合失調症の発症率が高くなるこた。行動に影響を与える因子として vitD3（対象に PBS）とが知られており、その機序として母体免疫反応が関与投与方法が考えられた。本研究で用いた経口胃投与とはしていることが考えられている。そしてビタミン D はゾンデを経口的に胃まで挿入し薬剤を注入する方法であ免疫調節作用を持ち、特に抗炎症性作用が注目されている。E7.5 から E13.5 まで連続して 7 日間この投与法を用る。本研究において、母胎感染によって生じる児の行動いて vitD3 または PBS を与えた。投与を繰り返すことで異常がビタミン D 投与により軽減されることが示され母獣は忌避反応、攻撃性を示すため、比較的侵襲性が高た。また母胎ストレスによる行動異常にもビタミン Dい処置であることがわかった。Bronson らは、妊娠中のが保護的効果を持つことが示唆された。

母獣に連続して 7 日間異なるストレスを与えることで、謝胎盤での IL-1β、IL-6、IL-2Rα などの炎症性サイトカイ

辞ン、ケモカインの mRNA の上昇がみられると報告して本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲いる。また、同様の母獣へストレスを与えたモデルで記念財団のご支援をいただきましたことを感謝申し上げ

は、過活動、記憶の低下などの行動異常を呈することがます。

報告されている16, 17）。
文以上から本研究における薬剤の経口胃投与自体が生まれた児の行動に多大な影響を及ぼすことが推測され

献1） S. A. Mednick, et al.:
, 45, 189–192, 1988.
2） N. Takei, et al.:
, 151, 117–119, 1994.
3） A. S. Brown, et al.:, 61, 774–780,2004.
4） S. L. Buka, et al.:
, 63, 809–815, 2008.
5） L. Shi, et al.:
, 23, 297–302, 2003.
6） S. E. Smith, et al.:, 27, 10695–10702, 2007.
7） M. Tohmi, et al.:
, 50, 67–75, 2004.
8） D. K. Kinney, et al.:
, 35, 582–595,2009.
9） T. H. Burne, et al.:., 81, 651–655, 2004.
10） J. McGrath:., 41, 892–893; author reply894, 2011.
11） C. Lefebvre dʼHellencourt, et al.:., 71,575–582, 2003.
12） S. Wergeland, et al.:
, 6, e26262, 2011.
13） M. Makinodan, et al.:., 86, 2190–2200,2008.
14） M. Makinodan, et al.:
, 33, 978–985, 2009.
15） M. T. Cantorna, et al.:
, 93,7861–7864, 1996.
16） S. L. Bronson, T. L. Bale:en20141040,2014.
17） B. R. Mueller, T. L. Bale:., 91, 55–65,2007.
18） T. H. Burne, et al.:., 157, 299–308,2005.
19） L. Lieben, et al.:
, 57, 123–131, 2013.

た。この点を配慮し、vitD3 の保護効果について検討した。ビタミンD の欠乏またはビタミンD 受容体ノックアウ
トマウスが PPI の障害をもたらすと報告されている 9, 18）。
一方、母獣の高ビタミン D3 血症によって児の骨塩量低下や致死性が報告されているが 19）、ビタミン D 過剰投与による PPI への影響については報告されていない。特に今回のモデルは妊娠中にビタミン D を投与するため、児に与える影響について評価する必要があった。PBS–PBS 群と PBS–vitD3 群の比較からは、本実験で用いたビタミン D の投与量では感覚情報処理制御機能の障害を生じず、むしろ PPI の改善傾向がみられた。またビタミン D 投与が、open ﬁeld test において polyIC による活動量の増加を軽減し、passive avoidance test で polyICによる記憶保持の低下を防いでいることが示された。これらの結果からは、母胎ストレスまたは母胎感染モデルで生じる行動異常にビタミン D は保護的な効果を持つことが示唆された。
今回、経口胃投与が母胎ストレスとなり行動学的に影響を及ぼし、polyIC とビタミン D のもたらす影響を4