ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響
九州大学大学院薬学研究院薬物動態学分野

廣田豪

Membrane transporters have broad specificity and facilitate the uptake and efflux of their substrates across plasma membranes. Two major superfamilies, the ATP-Binding Cassette (ABC) and Solute Carrier (SLC) families, strongly influence theabsorption, distribution, and excretion of drugs. Although the skin penetration of xenobiotics was previously attributed topassive diffusion, increasing evidence indicates that transporters have a function in the biochemical barrier of skin epithelial
cells beneath the stratum corneum. The identification of drug transporters expressed in human skin and inter-individual differences in gene expression are important for understanding the role of drug transporters in human skin. Twenty-two ABC
and 15 SLC transporters were expressed at detectable levels in human skin, and ABCC3, SLC22A3, SLCO3A1, SLC16A7,
ABCA2, ABCC1, and SLCO2B1 were strongly expressed in skin. The expression of ABCC3 (MRP3) and SLC22A3(OCT3) mRNAs showed large inter-individual variabilities. None of the SNPs tested (−1767G>A, −1328G>A, −1213C>G,−897delC, −260T>A, and −211C>T) in the promoter region of the ABCC3 gene showed a significant change in ABCC3mRNA levels. ABCC3 expression levels negatively correlated with the methylation status of the CpG island (CGI) locatedapproximately 10 kbp upstream of ABCC3 (Rs: −0.323, P < 0.05). As a result of systematic screening in the 5’-flanking
region of SLC22A3, fourteen SNPs were identified; of these variants, 4 were novel. Of the 14 SNPs the variant, −1603G>A
suppressed transcriptional activity in reporter assays and was associated with lower expression levels of SLC22A3 in skinsamples obtained from Caucasian female origin. In humans, the concentration of squalene in samples taken from the back atbaseline was significantly lower in homozygotes for −1603A/A than in homozygotes for −1603G/G. These results suggestthat the genetic mutation contributes to the variation in the expression and activity of the drug transporter in human skin.

1．緒

制御機構は、ゲノム中で CpG ジヌクレオチドの出現頻度

言が高い CpG islands と呼ばれる領域内のシトシンがメチル

薬物トランスポーターは薬物の生体への取り込み及び生化を受ける DNA メチル化であり 5）、特に癌等の疾患にお体からの排泄を担う膜タンパク質の総称で、薬物吸収を司ける遺伝子発現の変動とエピジェネティック修飾との関連

る小腸、薬物排泄を担う肝臓及び腎臓、薬物の膜透過を制研究については多数報告されている 6）。

限する血液脳関門等、広範な組織に発現している。薬物ト

皮膚は、成人で表面積 1 . 4～1 . 7 m 2、総重量 3 . 2 ～ 4 . 8

ランスポーターは薬物の吸収、分布及び排泄の支配要因に

kg にも及び、人体で最大の臓器である肝臓よりも大きいなることが明らかになっている 1）。実際、近年では臨床上組織と言える。皮膚は皮膚表面から角質層を有する表皮、重要な薬物間相互作用の原因についても、一部又は全てを真皮及び皮下組織から成り、経皮水分蒸散量の制御や微生薬物トランスポーターにより説明できることが報告されて物及び化学物質侵入の防御といった両方向性バリアとしている 2）。また、薬物トランスポーターの発現量・活性の個機能している。皮膚は薬物の投与部位の一つでもあり、初人差が薬物の体内動態に影響する事例も数多くの研究で報回通過効果を回避できること、投与及び投与中止が簡便で3）

告されており 、その個人差要因を解明する研究も個別化あること、非侵襲的な投与が可能であること、頻回投与す医療を実現する上で重要となる。

ることなく血中薬物濃度を維持できる可能性があること等、

遺伝子発現の個人差に影響する要因としては一塩基多型

他の投与経路にはない利点が数多くある。しかし、元来皮（SNPs）が広く知られており、薬物の体内動態及び薬物応

膚は外部環境から生体を保護する役割を担っており、消化答を担う数多くの遺伝子についても、SNPs が個人差の原管等からの吸収に比べると皮膚からの薬物の吸収は極めて因となることが報告されている 1 , 3 , 4）。また、近年では遺少なく、吸収速度や効果発現に要する時間も遅い。また、伝子の塩基配列の変異を伴わない遺伝子発現制御機構であ長らくの間、薬物の皮膚透過は受動拡散によるものと考える「エピジェネティクス」も注目されている。その代表的なられてきたため、これまでの経皮吸収に関する研究では、

Analysis of genetic polymorphisms andexpression of drug transporter genes in
hu m a n s k i n a nd t hei r e f fe c t s o ntransdermal absorption
Takeshi Hirota
Department of Clinical Pharmacokinetics,
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kyushu University

物理的バリアである角質層の克服に主眼が置かれ、薬物をいかに効率よく透過させ、標的部位に運ぶかという製剤的な技術開発が中心であった。そうした中、近年、皮膚にも薬物トランスポーターが発現し、皮膚において生化学的バリアとして機能することを示す研究が報告されるようになった。正常ヒト角化細胞を用いた研究では、MRP ファミリー及び OATP ファミリートランスポーターが構成的に− 170 −

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響

発現することが報告されている 7 , 8）。本研究では、ヒト皮メチル化シトシン及び非メチル化シトシン由来のバンド強膚組織における薬物トランスポーターの発現プロファイル、度に基づき、以下に示す相対メチル化頻度を算出した。

発現量及び個人差に関する情報を整理するとともに、個人

非メチル化シトシン由来バンド強度

差要因並びに皮膚における機能解明を試みた。

２．方

相対メチル化頻度 = メチル化シトシン由来バンド強度 /法

2. 4. 臨床試験によるヒト皮脂量及び皮脂成分に対す
るトランスポーターの遺伝子多型の影響

2. 1. ヒト皮膚組織
ヒト皮膚組織は、白人の女性由来であり、部位は腹部又本試験は、九州大学病院臨床研究倫理審査委員会の審査、は胸部からなる 48 例である。本研究は、九州大学ヒトゲ

承認を得て実施した。同意の得られた 20 歳以上 60 歳未満

ノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会による審査を経て、の健康成人男性 91 名より全血 2 mL を採取した。血液か承認を得たものである。

ら genome DNA を抽出し、ダイレクトシークエンス法により SLC 22 A 3 遺伝子の - 1603 G>A の遺伝子診断を実施

2. 2. 遺伝子多型解析した。診断結果に基づき、- 1603 G ホモ型及び - 1603 A ホ

ヒト皮膚組織で最も高発現であり個人差も大きかった分

モ型それぞれ 10 及び 6 名を選択した。額及び背部に正中子種について、5’ 上流域の遺伝子多型解析を実施した。対線を挟んで左右対称に 3 × 3 cm の皮脂評価部位を 2 カ所設

象は皮膚組織検体 48 例とした。ヒト皮膚組織約 20 ～ 30

定し、一方を皮脂量、もう一方を皮脂成分評価用とした。

mg より genome DNA の抽出及び精製を行った。変異の有３．結

無をスクリーニングした後、ダイレクトシークエンス法に果

3. 1. ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーターの探索より遺伝子型を決定した。

2. 3. DNAメチル化解析

白人女性皮膚組織由来 cDNA のプール試料（n= 20）を用

トランスポーター遺伝子周辺の CpG island 内のシトシ

い、ABC ファミリートランスポーター 26 種（ABCA 1 ~ 10、ン に つ い て、Combined Bisulfite Restriction Analysis

12、ABCB 1、ABCC 1 ~ 6、8、10 ~ 12、ABCG 1、2、5、8）（COBRA）法によりメチル化頻度を解析した。転写開始点

及び SLC ファミリートランスポーター 25 種（SLC 15 A 1、2、を起点に前後 20 , 000 bp の領域に存在する CpG island を、

SLC 16 A 1、3、7、8、SLC 22 A 1 ~ 8、10、11、SLC 46 A 1、CpG island searcher（http://cpgislands.usc.edu/）を用いて

SLC 4 7 A 1、2、SLCO 1 A 2、1 B 1、1 B 3、2 B 1、3 A 1、検索した。調製したbisulfite変換genome DNAを鋳型とし、

4 A 1）の発現をリアルタイムPCR法により探索した（Table

各 CpG island 領域を増幅した。得られた PCR 産物に対し1）。ヒト皮膚には、ABC ファミリー 8 種（ABCA 1、2、5、7、て制限酵素処理を用い、アガロースゲル電気泳動を行い、ABCC 1、3、5、ABCG 1）及 び SLC フ ァ ミ リ ー 8 種

Table 1

ABC and SLC transporter expression in human skin

Gene

Ct MeanGene

Ct MeanGene

Ct MeanGene

Ct Mean

ABCA 1ABCA 2ABCA 3ABCA 4ABCA 5ABCA 6ABCA 7ABCA 8ABCA 9ABCA 10ABCA 12ABCB 1
ABCC 128 . 929 . 131 . 1> 35
29 . 032 . 330 . 731 . 232 . 131 . 231 . 832 . 129 . 3

ABCC 2
ABCC 3
ABCC 4ABCC 5ABCC 6
ABCC 8ABCC 10ABCC 11ABCC 12ABCG 1
ABCG 2
ABCG 5ABCG 833 . 427 . 032 . 228 . 432 . 2> 35
33 . 233 . 6> 35
29 . 932 . 934 . 4> 35

SLC 15 A 1
SLC 15 A 2
SLC 16 A 1
SLC 16 A 3
SLC 16 A 7
SLC 16 A 8
SLC 22 A 1
SLC 22 A 2
SLC 22 A 3
SLC 22 A 4
SLC 22 A 5
SLC 22 A 6
SLC 22 A 7

30 . 632 . 529 . 733 . 330 . 0> 35
32 . 9> 35
28 . 633 . 030 . 2> 35> 35

SLC 22 A 8
SLC 22 A 10
SLC 22 A 11
SLC 46 A 1
SLC 47 A 1
SLC 47 A 2
SLCO 1 A 2
SLCO 1 B 1
SLCO 1 B 3
SLCO 2 B 1
SLCO 3 A 1
SLCO 4 A 1

> 35
> 35
> 35
32 . 529 . 230 . 4
> 35
> 35
> 35
30 . 128 . 933 . 7For easy comparison（1 st screening）, mean cycle threshold（Ct）values of each transporter were calculated. Sixteenth ofthe pooled cDNA was used as template for real-time PCR. Pooled cDNA was prepared by mixing identical volume ofcDNA（n= 20）． The Ct values of > 35 , in the range 31 to 35 and < 31 were interpreted as absence of gene expression,presense of gene expression but being below the limit of quantitation and presence of gene expression being at thequantitative level, respectively.

− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Table 2 Absolute expression levels of ABC and SLC transporter mRNAs in human skinshowing the lowest and highest values, means and standard deviations
Gene

Minimuma)

Maximuma)

Meana)

SDa)

Fold Changeb)

ABCA 1ABCA 2ABCA 5ABCA 7ABCB 1
ABCC 1
ABCC 3
ABCC 5ABCG 1
ABCG 2
SLC 15 A 1
SLC 16 A 1
SLC 16 A 7
SLC 22 A 3
SLC 22 A 5
SLC 47 A 2
SLCO 2 B 1
SLCO 3 A 1

2 . 052 . 690 . 837
0 . 546
0 . 664
3 . 155 . 11
1 . 231 . 110 . 0370
BD
1 . 482 . 652 . 96
0 . 894
0 . 2212 . 388 . 767 . 7310 . 86 . 323 . 664 . 4312 . 147 . 7
6 . 96
6 . 27
0 . 635
15 . 34 . 9217 . 526 . 97 . 8020 . 8
11 . 730 . 84 . 81
6 . 462 . 791 . 83
1 . 995 . 4220 . 13 . 572 . 52
0 . 338
4 . 002 . 97
6 . 957 . 84
3 . 082 . 455 . 3517 . 91 . 672 . 12
1 . 290 . 830 . 91
1 . 9912 . 6
1 . 731 . 190 . 182
4 . 44
1 . 064 . 265 . 491 . 654 . 71
2 . 41
7.2

3.8
4.0
7.6
6.7
6.7
3.8
9.3
5.6
5.7
17 . 140 . 8
3.3
6.6
9.1
8.7
93 . 94.9
3.5a）× 10 - 3 mol/mol GAPDHb）Maximum/Minimum ratio
BD: Below detection（SLC 1 5 A 1、1 6 A 1、1 6 A 7、2 2 A 3、2 2 A 5、4 7 A 2、

ABCC 3 /MRP 3 が 20 . 0 % を 占 め、 次 い で SLCO 3 A 1 /SLCO 2 B 1、3 A 1）が中～高発現していた（Ct < 31）。また、

OATP 3 A 1、SLC 22 A 3 /OCT 3 が そ れ ぞ れ 17 . 8 及 び

ABC ファミリー 14 種（ABCA 3、6、8 ~ 10、12、ABCB 1、

7 . 8 % で続き、上位 3 分子種で約 50 % を占めた。発現量がABCC 2、4、6、10、11、ABCG 2、ABCG 5）及 び SLC フ

多かった上位 3 分子種について、例数を追加して Pfaffl 法

ァ ミ リ ー 7 種（SLC 15 A 2、16 A 3、22 A 1、22 A 4、46 A 1、により発現量の個人差をさらに検討した。ヒト皮膚では

47 A 1、SLCO 4 A 1）は低発現であり（31 ≤ Ct ≤ 35）、それSLC 22 A 3 /OCT 3 の発現量の個人差が最も大きく、変動以外のトランスポーター（ABC ファミリー 4 種及び SLC フ

係数（%CV）は 61 . 8 % を示した。次いで、ABCC 3 /MRP 3ァミリー 10 種）については発現を確認できなかった（35 <の個人差が大きく（%CV：58 . 0）、SLCO 3 A 1 /OATP 3 A 1

Ct）。

は上位 3 分子種の中で最も個人差が小さかった（%CV：
40 . 0）。

3. 2. ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーター
mRNAの定量

3. 3. ヒト皮膚組織におけるABCC3/MRP3発現に対するDNAメチル化の影響

前項で中～高発現に分類された 16 分子種、並びにマウス皮膚で輸送活性が報告されている ABCB 1 /MDR 1 及びABCC 3 /MRP 3 発現に対する 5’ 上流域の遺伝子多型のABCG 2 /BCRP について、個体別の cDNA（n= 18）を用い解析を行ったが、影響を認めなかった。このため次いでて絶対検量線法により発現量を定量した（Table 2）。そのDNA メ チ ル 化 の 影 響 を 検 討 し た。CpG island searcher

結果、ヒト皮膚では ABCC 3 /MRP 3 の発現量が最も多く、 （http://cpgislands.usc.edu/）を用い、CpG island を探索し20 . 1 ± 12 . 6（× 10 - 3 mol/mol GAPDH）を示した。次いで、た結果（%CG：50 % 以上、ObsCpG/ExpCpG：0 . 60 以上、

SLCO 3 A 1 /OATP 3 A 1、SLC 22 A 3 /OCT 3、SLC 16 A 7 /Length：200 bp 以 上、Gap between adjacent islands：

MCT 2、ABCA 2 /ABC 2 及び ABCC 1 /MRP 1 で高い発現100 bp 以上）、10 カ所の CpG island を同定した（Table 3）。

が認められ、それぞれ 17 . 9 ± 7 . 2、7 . 84 ± 5 . 49、6 . 95 ±であった。これらの結果に基づき、ヒト皮膚組織に構成的

3. 4. ヒト皮膚組織におけるABCC3/MRP3発現量とDNAメチル化頻度の相関解析に発現する薬物トランスポーター総量に対する個々の相対DNA メチル化頻度と ABCC 3 /MRP 3 mRNA 発現量と

的発現量比
（平均値）
を算出したところ、最も高発現であるの相関解析を行った。その結果、‒ 19895 位（CpG island

4.26、6.46 ± 2.12 及び 5.42 ± 1.99（×10-3 mol/mol GAPDH）− 172 −

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響

Table 3 Location of CpG islands within 20 kbp up- and down-stream of the TSS
in the ABCC 3 gene
No.

Start

End

%GC

Obs/Exp

Length（bp）

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

– 20090– 16357– 15643– 13873– 13448– 9874
– 680
– 429
9717
19852

– 19881– 16153– 15423– 13600– 13221– 9674
– 532
502
10205
20429

53 . 356 . 650 . 760 . 6
57 . 557 . 767 . 170 . 754 . 453 . 60 . 6030.6
0 . 608
0 . 604
0 . 6030.6
0 . 602
0 . 732
0 . 611
0 . 657

210
205
221
274
228
201
149
931
489
578

No. 1）で は CG site の メ チ ル 化 頻 度 と ABCC 3 /MRP 3‒ 1603 G>A との関連について検討を加えた。同意の得らmRNA 発現量に正の相関を認めた（P < 0 . 05）。同様に、れた健康成人男性（20 歳代、86 名）より採取した全血から– 9718 位（CpG island No. 6）で は 負 の 相 関（P < 0 . 05）、

genome DNA を 抽 出 し、SLC 22 A 3 遺 伝 子 5’ 上 流 域– 13222 位（CpG island No. 5）では正の相関傾向（P < 0 . 10）‒ 1603 G>A の遺伝子検査を実施した。解析の結果、野生を 認 め た。 以 上 よ り、 ヒ ト 皮 膚 組 織 に お け る ABCC 3 /ホモ型、ヘテロ型及び変異ホモ型はそれぞれ 55、25 及びMRP 3 mRNA 発現制御に、これら CpG islands 内の DNA6 名で、アレル頻度は 21.5%であった。被験者 16 名（‒1603Gメチル化が関与する可能性が示された。

ホモ型：10 名、‒ 1603 A ホモ型 6 名）について、額及び背部の皮脂量を測定した。測定の結果、皮脂量は背部に比べ3. 5. ヒト皮膚組織におけるSLC22A3/OCT3発現に対する5’上流域の遺伝子多型の影響
白人女性皮膚（n= 48）より抽出した genome DNA を用い、額で多く、また、定常皮脂量の方が回復皮脂量より多い傾向であった。遺伝子型と皮脂量との関係について、背部の定常皮脂量では遺伝子型による差がある傾向であった。

SLC 22 A 3 遺伝子の 5’ 上流域約 2 kbp に存在する遺伝子多４．考察と総括型を網羅的に解析した。その結果、14 種の SNPs を同定し、そ の う ち ‒ 1672 C>T、‒ 632 insGCCCT、‒ 626 ～ ‒ 622 del「ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーターの定量

GCCCT、‒ 295 G>A の 4 種は未報告の変異であった。また、とその個人差要因の解析」と題し、薬物の皮内動態及び皮アレル頻度が 50 % 以上と高頻度で存在する変異が 5 種、内応答性に関与しうる薬物トランスポーターの発現探索及10 ～ 30 % と比較的高頻度の変異が 3 種存在した。

び定量と、その個人差要因並びに機能解明に関する研究を展開した。薬物動態に重要とされる分子種を中心に、ヒト

3. 6. ヒト皮膚におけるSLC22A3/OCT3発現量と5’上流域の遺伝子多型の関係

皮膚組織における発現プロファイルを検討し、定量可能と判断した分子種についてその絶対発現量を評価した。合わ

同定した SNPs がヒト皮膚における SLC 22 A 3 /OCT 3

せて、最も高発現であった ABCC 3 /MRP 3 については、

mRNA 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た。 そ の 結 果、発現の個人差要因の一部を解明した。比較的多数例の皮膚‒ 1603 G>A では変異による有意な発現量の低下を認めた組織を用いて取得できたこれらの知見は、皮膚での毒性・が（P= 0 . 008）
、残りの遺伝子多型では有意な影響は認めな

薬効発現の個人差を考察する上で重要であり、皮膚におけかった。

る薬物トランスポーターの生理機能等の類推にも役立つと考えている。また、ヒト皮膚における SLC 22 A 3 /OCT 3 発

3. 7. ヒト皮脂量及び皮脂成分に対するSLC22A3遺伝子5’上流域–1603G>Aの影響

現の局在及び個人差要因を検討し、臨床研究にて皮脂量及これまでの検討の結果、ヒト皮膚における発現量の個人

SLC 22 A 1 /OCT 1 及 び SLC 22 A 3 /OCT 2 の paralog で あ差に 5’ 上流域の SNP（‒ 1603 G>A）が寄与する可能性が示

る SCL 22 A 3 /OCT 3 が皮膚で比較的高発現であり、皮膚された。SLC 22 A 3 /OCT 3 はテストステロン及びプロゲにおける局在及び個人差要因を解明できたことは、臨床上ステロンの輸送に関わるトランスポーターであり、両ホル

意義のある知見に繋がる可能性があると考えている。本研

モンは皮脂分泌の促進に関与すると考えられていることか

究では「ヒト皮膚と薬物トランスポーター」について、基礎

ら、皮脂に着目しその個人差と SLC 22 A 3 遺伝子 5’ 上流域

的知見の収集から臨床研究の遂行に至るまで多岐にわたる

び皮脂成分に対する SLC 22 A 3 /OCT 3 の影響を評価した。

− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021検討を実施できた。皮膚は薬物の投与部位としてますます

3） Maeda K and Sugiyama Y.: Impact of genetic

多くの注目を集めているが、薬物の皮内動態及び制御に関

polymorphisms of transporters on the pharmacokinetic,

する研究はまだ始まったばかりである。齧歯動物皮膚及びpharmacodynamic and toxicological properties of

ヒト皮膚由来細胞では、薬物トランスポーターが薬物輸送

anionic drugs. Drug Metab Pharmacokinet. 23, 223-35に寄与することが報告されていることから、ヒト皮膚（臨（2008）．

床）における薬物トランスポーターの寄与について明らか

4） I e i r i I , H i g u c h i S , S u g i y a m a Y . G e n e t i cとしていくことが今後の課題のひとつと考える。また、各polymorphisms of uptake（OATP1B1, 1B3）and efflux

薬物トランスポーターの基質群の特性から、皮膚の恒常性（MRP2, BCRP）transporters: implications for inter-

維持に薬物トランスポーターが重要な役割を果たしている

individual differences in the pharmacokinetics and

ことを類推でき、薬物輸送のみでなく、皮膚の機能維持及pharmacodynamics of statins and other clinically

び疾患発症との関連研究を展開していくことも重要と言え

relevant drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5,る。本研究における成果がそうした研究の駆動力となり、

703-29（2009）．
5） Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in

皮膚科学研究が推進されることを期待する。

mammalian epigenetics. Science. 293, 1068-70（2001）．
謝辞6） Das PM, Singal R. DNA methylation and cancer. J

本研究の遂行にあたり、助成してくださいましたコーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。この場

Clin Oncol. 22, 4632-42（2004）．
7） Baron JM, Höller D, Schiffer R, Frankenberg S, Neis
M, Merk HF, Jugert FK. Expression of multiple

を借りて、厚く御礼申し上げます。

cytochrome p4 5 0 enzymes and multidrug resistance（引用文献）

associated transport proteins in human skin1） Cascorbi I. Role of pharmacogenetics of ATP-binding

keratinocytes. J Invest Dermatol. 116, 541-8（2001）．

cassette transporters in the pharmacokinetics of drugs.

8） Schiffer R, Neis M, Höller D, Rodríguez F, Geier A,
Gartung C, Lammert F, Dreuw A, Zwadlo-Klarwasser

Pharmacol Ther. 112, 457-73（2006）．
2） Schneck DW, Birmingham BK, Zalikowski JA,

G, Merk H, Jugert F, Baron JM. Active influx transport

Mitchell PD, Wang Y, Martin PD, Lasseter KC, Brown

is mediated by members of the organic anion

CD, Windass AS and Raza A. The effect of gemfibrozil

transporting polypeptide family in human epidermal

on the pharmacokinetics of rosuvastatin. Clin

keratinocytes. J Invest Dermatol. 120, 285-91（2003）．

Pharmacol Ther. 75, 455-63（2004）．

− 174 −