オリーブ二次代謝産物の微生物変換によって得られる新規抗酸化物質の性状解析
岡山大学大学院自然科学研究科（農学系）

神 崎浩

Development of novel drugs has been achieved sometimes by microbial conversion of secondary metabolites. For
example, hydroxylations of compactin and vitamin D3 by microbial cytochrome P450s generated well-known commercial
medicines, pravastatin and calcitriol, respectively. Thus, novel materials with useful functions for cosmetics or food additives
will be possibly developed by bioconversion of secondary metabolites. We found that bakers’ yeasts catalyzed the reductionof an aldehyde form of oleuropein agylcon (the substrate) in olive leaf extract. We isolated the substrate and its enzymaticallyconverted product and determined their structures by instrumental analyses. Both of the substrate and the product, a novel
alcohol, exhibited a pronounced antioxidative activity in a DPPH test. It was found that contents of oleuropein and its
aglycon in olive leaf extract vary with variety. One pot conversion of oleuropein to compound B catalyzed by a combinationof b-gucosidase and yeast cells was achieved.

1．緒

薬企業による臨床開発研究が行われている。

言

その結果を踏まえ，植物成分に含まれる二次代謝産物に二次代謝産物の利用法として，微生物による構造変換

ついても微生物の処理により，高機能化合物に変換が可能

で化合物を高機能化し，医薬品に応用する例が知られてであると考え，研究を行った。植物として，岡山大学の周いる。図１に，医薬品として開発あるいは利用が期待さ辺地域，すなわち香川県小豆島，岡山県牛窓地区で日本でれている微生物変換の例を示した。三共が開発したプラの生産のほとんどが行われているオリーブを選んで研究をバスタチン（Pravastatin）は，スタチン系の高脂血症治実施した。その結果，オリーブ葉抽出物をパン酵母で処理療薬として 1987 年から世界中で販売されている薬剤であすることにより，新規の抗酸化化合物が生成することを明るが，青カビ Penicillium citrinum が生産するコンパクチらかにした。この新規化合物はオリーブ葉に大量に含まれン（Compactin）を Streptomyces carbophilus の 酵 素 を 用る配糖体オレウロペイン（Oleuropein）のアグリコン（脱いる微生物変換によってより有効な化合物に変換させるグルコース体）のアルデヒド基がヒドロキシメチル基に還ことで製品化に至った

1, 2）。カルシトリオール（Calcitriol）

元変換された化合物であり，オリーブの代謝産物としてはは骨粗鬆症などの低カルシウム症状の患者に投与されて知られていない新規化合物である（図２）。また本化合物

いる化合物であるが，ビタミン D3 からの化学合成にはは抗酸化活性を有しており，そのユニークな構造から，化複数のステップが必要であったのに対し，大正製薬 - メ

粧品素材等としての有効性を有している可能性が高い。

ルシャンが１ステップでの微生物変換法を確立したこと
3, 4）

従って，本研究においては，この新規化合物の化粧品素。我々のグループでも，抗ガン剤材としての開発の可能性を探るべく，抗酸化活性の詳細をとしての開発が期待される細胞分裂阻害活性物質の探索検討するとともに，有効な調製方法の検討を加えることをの過程で，カビが生産する新規化合物フェニラヒスチン目的として実施した。

で注目されている（Phenylahistin）を放線菌 Streptomyces albulus 由来の新２．実

規酸化酵素で処理することにより，デヒドロフェニラヒスチン（Dehydrophenylahistin）へと変換できること，さらにその変換により細胞分裂阻害活性が飛躍的に上昇し，既存の抗ガン剤レベルに達することを明らかにした5, 6）。現

在，本化合物の類縁体について，アメリカのベンチャー製

験（1）抗酸化活性測定
抗酸化活性は 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）法および BioVision 社の Total Antioxidant Capacity（TAC）
Assay kit により行った。
（1）- １DPPH 法

水溶性抗酸化物質の代表例であるアスコルビン酸ナト
Characterization of novel antioxidative
compound produced by microbialconversion of olive secondary metabolite
Hiroshi Kanzaki
Graduate School of Natural Science andTechnology, Okayama Universityリウム（Sodium ascorbate, ビタミン C）と脂溶性抗酸化物質の代表例であるa-トコフェロール（a-tocopherol, ビタミンE）を比較物質として用いた。1200 mM DPPH 25 mL（final100 mM），50％ MeOH 225 mL，超純水 25 mL，試料 in 50 %MeOH（添加時の濃度：10, 20, 30, 40, 50, 60 mg/mL）を 96 穴

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コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

図１

図２

天然有機化合物の生物変換による有用物質生産例

パン酵母により触媒されるオリーブ葉成分の生物変換反応

少の割合から抗酸化力を評価した。

（2）品種の異なるオリーブ葉のオレウロペイン関連化合物含有量の比較（1）- ２

ペインおよびその関連化合物の量を測定した。当初の実験

アッセイプレートに添加して吸光度を測定し，吸光度の減

日本で栽培されているオリーブ品種に含まれるオレウロTAC 法
2++

本方法では，抗酸化物質により Cu が Cu に還元され，+で用いていたルッカー種に加え，マンザニロ種，ミッショ

その Cu をキレートした試薬が示す吸光度を測定することン種の葉を材料として用いた。採取した生葉を細断し，エにより活性を評価する。評価は a -トコフェロール様化合タノールに浸漬して抽出物を調製した。得られた抽出物物である Trolox 相当量（nmol）を求めることで行った。尚，中に含まれるオレウロペインおよびそのアグリコン（化1 nmol の Trolox は２nmol の Cu を還元する活性を有する。

合物 A）含有量を ODS-HPLC で測定した。HPLC 分析条件

2+− 18 −オリーブ二次代謝産物の微生物変換によって得られる新規抗酸化物質の性状解析は次に示す通りである。カラム：Inertsil ODS-3（５mm），19 mM オレウロペイン 72.5 mL（final 11 mM）に 30 mg

φ4.6×250（nm），カラム温度：35ºC, ポンプ：HITACHI/mL b - グルコシダーゼ 13.75 mL（final 3.3 mg/mL）と蒸Pump L-710， 検 出 器：HITACHI Diode Array Detector

留水 38.75 mL を加えて脱グルコシル化を行った。パン酵母

L-7455（200 〜 400 nm），溶離液：60% MeOH ＋ 0.1% TFA， （日清フーズ社製）は 1.875 mg（final 15 mg/mL）添加した。
それぞれの反応区を 37℃，160 strokes/min で 24 h or 48 h

流速：1.0 mL/min

インキュベートし，遠心分離によってパン酵母と上清を分（3）オレウロペインからの化合物Ｂのワンポット合成法の検討離させた後，上清を HPLC 分析に供した。

３．結① β- グルコシダーゼ活性測定
b - グルコシダーゼ活 性 はp-nitrophenyl-b -D-glucopyranoside（pNPG）を基質とする pNPG 分解活性で判定した。酵素活

果（1）抗酸化活性（1）- １DPPH 法で評価した抗酸化活性性１unit の定義を pH 5.5 の酢酸緩衝液，37℃の条件下で５

図３に示すように，化合物 B，化合物 A，オレウロペイ

mM pNPG を基質として 30 分間反応させた時，1 分間に１ンは a-トコフェロール以上の抗酸化活性を示した。さらに，

mmol の pNP を生成する酵素量とした。

オレウロペインと化合物 A はアスコルビン酸ナトリウム②オレウロペインから化合物 A への脱グルコシル化反応と同程度，化合物 B はアスコルビン酸ナトリウム以上の抗基質にオレウロペイン，酵素にアーモンド由来b -グルコシ酸化活性を示した。DPPH ラジカルを 20% 消去する濃度

ダーゼを用いた。19 mMオレウロペイン（EXTRASYNTHESE（nM）はアスコルビン酸ナトリウムが 8.88，oleuropein が社製）14. 5 mL（final 11 mM）と30 mg/mLアーモンド由来b -グ

7.66，化合物 A が 9.02，化合物 B が 5.11 であった。

ルコシダーゼ（TOYOBO社製）2.75 mL（final 3.3 mg/mL）に蒸留水を添加して全体で25 mLとし，37℃，160 strokes/minで 24（1）- ２h 反応させ，ODS-HPLC 分析（条件は表１に示した）によTAC 法により求めた活性を Trolox 相当量（nmol）で示って化合物 A 生成の定量を行った。pH の効果を検討する

すとアスコルビン酸ナトリウムは 2.55，オレウロペインは際には，50 mM MES buffer（final 10mM）５mL を使用した。

2.30，化合物 B は 7.10 であった。

③オレウロペインから化合物 A を経た化合物 B へのワンポ

TAC 法で評価した抗酸化活性

DPPH 法，TAC 法 の 両 者 で の 評 価 値 は 類 似 し て お り，ット酵素合成

アスコルビン酸ナトリウムとオレウロペインはほぼ同程度

下記の３つの反応区での変換を試みた。の活性を，化合物Ｂはそれより高い活性を示すことが判明

Ⅰ．初めから b - グルコシダーゼとパン酵母で 24 h 反応さした。

せた反応区
Ⅱ．b - グルコシダーゼで 24 h 反応させた後，パン酵母を添加してさらに 24 h 反応させた反応区
Ⅲ．パン酵母のみで 24 h 反応させた反応区（2）品種の異なるオリーブ葉のオレウロペイン関連化合物含有量の比較
オリーブには 500 以上の品種があるとされており，日本

図３ DPPH 法で評価した抗酸化活性ラジカル消去率は試料無添加区と試料添加区の吸光度の差の試料無添加区の吸光度に対する比を百分率に換算した値として求めた。

− 19 −

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でも数種類が栽培されている。論文などの報告ではオリーなるが，それをワンポットで実施可能か市販のオレウロペ

ブにはオレウロペインが著量含まれているとされており，インを基質として検討した。

今回の抽出物に含まれていた化合物 A がオレウロペイン

この手法を用いることにより，のアグリコンであったことから，この基質の品種間の差を・工程を簡略化することができる調べることにした。品種としては，前回使用していたルッ・中間体の単離・精製をすることがないので収率の低下をカー種に加え，岡山で栽培されている，マンザニロ種，ミ防ぐことができるッション種を加えた３種を用いた。という利点が挙げられる。

表１から判るように，全ての品種由来の抽出物中にオレ①パン酵母の β- グルコシダーゼ活性pNPG 分解活性測定試験より，現在使用しているパン酵ウロペインと化合物 A が含まれていた。３種のオリーブ-4を比較すると，オレウロペインと化合物 A の両者ともに母の b - グルコシダーゼ活性は 5.08×10

マンザニロ種由来の抽出物に最も多く含まれていることが求められた。アーモンド由来 b - グルコシダーゼ（TOYOBO判った。データを示していないが，抽出の際の条件を変更社製）の pNPG 分解活性は，6.99×10することにより，オレウロペインと化合物 A の比率が変次の実験で示すが，オレウロペインの脱グルコシル化には化することが判っており，化合物 B の効率的調製を行うた

5.77×10

めには抽出条件も重要であることが判明した。

すると反応液 25 mL に対してパン酵母を 1.14 mg 添加しな

-4-3units/ 酵母 mg とunits/mg であった。

units 必要であり，これをパン酵母で賄おうとければならないので現実的ではない。そこで，オレウロペ（3）オレウロペインからの化合物 B のワンポット合成法の検討
様々な論文の報告および（2）で示した結果から，オリーインから化合物 A への変換にはパン酵母ではなく，市販精製 b - グルコシダーゼを用いることにした。
②オレウロペインから化合物 A への脱グルコシル化反応

ブ葉には配糖体オレウロペインが著量含まれており，化合アーモンド由来 b - グルコシダーゼ（TOYOBO 社製）で物 B を効率よく生成するためには，オレウロペインからのオレウロペインを処理したところ，オレウロペインの減少，変換系を確立することが望ましい。この反応は配糖体加水化合物 A の生成が確認でき，オレウロペインの脱グルコ分解，化合物 A の化合物 B への還元という 2 ステップからシル化の進行が判明した。
そこで，その反応について b - グルコシダーゼの反応に適した pH とされる 5.5 と中性付近の pH 7.0 で反応の経時

表１ オリーブ葉抽出物中に含まれるオレウロペインおよびそのアグリコンの量231nmで検出した各化合物のPeak area を生葉新鮮重 1グラム当たりに換算した。
オリーブ品種オレウロペイン
化合物 A
99peak area（×10 ） peak area（×10 ）

酸性領域において化合物 A が多く生成された。これは使用した b -グルコシダーゼの最適反応 pH が 5.5 であったためだと考えられる。また，化合物 A の生成量は，pH 7.0 では反応開始から９h をピークに急激に減少しているのに対1.13し，pH 5.5 では反応開始から 72 h をピークに緩やかに減少8.853.01している。このことより，化合物 A は酸性条件で安定で12.65.25ある可能性が示唆された。

ミッション

6.00

ルッカー
マンザニロ

図４

変化実験を行った。

β-グルコシダーゼにより触媒されるオレウロペインからアグリコンへの変換反応− 20 −

オリーブ二次代謝産物の微生物変換によって得られる新規抗酸化物質の性状解析③オレウロペインから化合物 Aを経た化合物 B へのワンポッ

ダーゼ活性が低く，化合物 B の生成は認められなかった。

ト酵素合成

４．考

オレウロペインから化合物 B への変換をワンポットで行察うにあたり，オレウロペインから化合物 A への変換を触オレウロペインアグリコン（化合物 A）からパン酵母処媒する b - グルコシダーゼと化合物 A から化合物 B への変

理により新たに生成した化合物 B はアスコルビン酸ナトリ換を触媒するパン酵母の２種の触媒を，同時に添加する方ウムや a -トコフェロールといった抗酸化物質より強い活法（反応区Ⅰ），触媒を継時的に連続添加する方法（反応区性を保有していることから，その作用をさらに詳細に検討Ⅱ），パン酵母のみの触媒能で反応する方法（反応区Ⅲ）のすることにより，化粧品素材等としての開発が期待される。

３種で検討を行った。各反応区における化合物 B の生成量

化合物 B の生成が，オレウロペインからのワンポット合を図５に示した。このことより，Ⅱのステップワイズ方式成により達成できることが判明したので，この手法によるで酵素反応を行った方が化合物 B の生成に適していること変換率の向上が達成できれば，化合物 B を含むエキスの経が示唆された。また，反応区Ⅱにおけるクロマトグラムを済的な調製が可能となり，素材開発への道が開けることが

図６に示した。このクロマトグラムから，オレウロペイン期待される。

から化合物 A，化合物 B が生成されたことが明らかとなっさらに，オリーブ葉の抽出物中には著量のオレウロペイた。なお，当初の予想通り，パン酵母のみでは b グルコシンとそのアグリコンが含まれており，日本の栽培品種では

図５ ワンポット変換による化合物 B の生成量
Ⅰ : β- グルコシダーゼとパン酵母を同時添加し，24 h 反応させた反応区
Ⅱ : β- グルコシダーゼで 24 h 反応させた後，パン酵母を添加してさらに 24 h 反応させた反応区
Ⅲ : パン酵母のみで 24 h 反応させた反応区

図6

ワンポット変換（反応区Ⅱ）で得られる反応溶液の HPLC 分析クロマトグラム
検出波長 : 231nm− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

チンの開発研究，藥學雜誌 , 111, 469-487, 1991

マンザニロ種由来抽出物に最も含量が多いことが判明した。
以上のことから，オリーブ葉抽出物を直接生物変換処理す３）Sasaki J, Miyazaki A, Saito M, et al.: Transformation

る手法を上記のワンポット合成も含めて検討することによof vitamin D 3 to 1a, 25-dihydroxyvitamin D 3 via

り，より有効な化合物 B 含有エキス調製法の確立が期待さ

25-hydroxyvitamin D 3 using Amycolata sp. strains,Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 152-157, 1992

れる。

４）Takeda K, Asou T, Matsuda A, et al.: Application of（引用文献）

cyclodextrin to microbial transformation of vitamin D3

１）Matsuoka T, Miyakoshi S, Tanzawa K, et al.:to 25-hydroxyvitamin D3 and 1a, 25-dihydroxyvitamin
D3, J. Ferment. Bioeng., 78, 380-382, 1994

Purification and characterization of cytochromeP-450sca from Streptomyces carbophilus. ML-236B５）Kanzaki H, Yanagisawa S, Kanoh K, et al.: A novel(compactin) induces a cytochrome P-450sca inpotent cell cycle inhibitor dehydrophenylahistin--

Streptomyces carbophilus that hydroxylates ML-

enzymatic synthesis and inhibitory activity toward sea

236B to pravastatin sodium (CS-514), a tissue-selective

urchin embryo, J. Antibiot., 55, 1042-1047, 2002

inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A６）Kanzaki H, Kanoh K, Yanagisawa S, et al.: Cell

reductase, Eur. J. Biochem., 184, 707-713, 1989

division inhibitors and process for producing the same,２）岸田有吉，内藤敦，岩藤誠吾，ほか２名：プラバスタ− 22 −PCT Int. Appl., 2001, WO 2001053290