東京衛研年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 52, 22-25,2001

東京都におけるデングウイルス検出状況
田部井由紀子＊，吉平

田子＊，長谷川田靖

一郎＊，諸角道弥＊，長島真美＊

聖＊＊

Surveillance of Dengue Virus in Tokyo
Yukiko TABEI＊, Yasuko YOSHIDA＊, Michiya HASEGAWA＊, Mami NAGASHIMA＊
Ichiro HIRATA＊ and Satoshi MOROZUMI＊＊
Keywords： デング熱，dengue fever，デングウイルス，dengue virus，酵素抗体法，ELISA,RT-PCR法，reverse
transcription polymerase chain reaction，中和抗体，Neutralizing antibody
緒

２．抗体検査言

デング熱は，デングウイルス（以下DEV）を保有した

DEV抗体検査は，スクリーニング試験としてイムノク

蚊（ネッタイシマカ，ヒトスジシマカ）によって媒介されロマト法によるRapid Immunochromatographic Test forる急性の熱性疾患である．一般に症状は軽く予後は良好でDengue feverキット（PanBio社）を用いてIgMおよびIgGあるが，稀に出血傾向，ショック症状を伴うデング出血熱抗体の検出を行った．また，確認試験としてELISA法にやデングショック症候群を起こし重症疾患になることがあ

よるDengue IgM capture ELISAキット（PanBio社）を用る．

いてIgM抗体の検出を行った．

近年，デング熱の流行地域は広く拡大し，熱帯，亜熱帯に位置するアジア，アフリカ，アメリカ大陸，南太平洋地域の100カ国以上で流行している．また，デング熱患者数は劇的に増加しており，1999年のWHOの報告

1）

では患者数は年間120万人以上にも達し，デング熱は世界の公衆衛
1, 2）

生上の重要な問題の１つとなっている

３．病原体検査１）RT-PCR法によるウイルス遺伝子の検出
RNA抽出は，患者血清50μLからセパジーンRVR（三光純薬）を用いて行い，滅菌蒸留水50μLで再浮遊して供試RNAとした3)．
RCR法は，既報4, 5）に準じて行った．すなわち，４本の．

日本におけるデング熱の流行は，1940年代に関西以西のPCRチューブに供試RNAを10μLづつ分注し，DEV1およ一部地域でみられたが，その後は国内感染によるデング熱

び３型はE蛋白からNS1領域のプライマー，DEV2型はE蛋の発生や流行はみられなかった．しかし近年，海外旅行者

白領域のプライマー，DEV4型はNS2AからNS2B領域のプの増加に伴って，現地でDEVに感染して日本で発病する，ライマーをそれぞれに加え，53℃，10分間の逆転写反応後，いわゆる輸入感染例が多くなってきている．

92℃，１分間，53℃，１分間，72℃，１分間の増幅反応を

平成11年４月に施行された「感染症新法」では，デング40回行った．増幅産物は，0.01%エチジウムブロマイドを

熱は「四類感染症・全数届出疾患」に定められ，デング熱加えた２%アガロースゲルで電気泳動し，それぞれの血清を診断した医師は，診断した日から７日以内に当該保健所型に特異的なバンドの有無を確認した．に届け出ることが義務となったことから，感染症発生動向

２）ウイルス分離試験調査においても，デング熱疑いの検査依頼がみられるよう組織培養ボトル（75cm 2，IWAKI製）で単層培養したになった．当研究科では，平成11年度よりDEVの検査をC6/36細胞に，２%牛胎児血清および１%非必須アミノ酸開始し，平成12年度はデング熱疑いの患者18名の検査を実を加えたイーグルＭＥＭ培地で10倍希釈した患者血清100施したので，それらの検査結果を報告する．

μLを接種し，１時間吸着後，28℃で７日間培養した．培
養上清5μLからRNAを抽出してRT-PCR法を行い，特異的材料と方法

バンドの有無によってウイルス分離試験の判定および血清型別の同定を行った6）．

１．検査材料
検査材料は，平成12年度に都内病院から搬入されたデング熱疑いの患者18名から採取された血清である．
＊ ＊ 東京都立衛生研究所微生物部ウイルス研究科

４．中和抗体測定によるDEV血清型別
患者血清100μLをPBS(−)で10倍希釈し，56℃で30分間

169-0073

東京都新宿区百人町3-24-1＊ ＊ The Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health＊ ＊ 3-24-1, Hyakunin-cho, Shinjuku-ku, Tokyo, 169-0073 Japan＊ ＊ 微生物部

東京衛

研

年

報

52,

232001

非働化した．これを１%牛胎児血清を加えたイーグル

比べて，50%以上の抑制を示す血清希釈倍数を中和抗体価MEM培地で４倍希釈（40倍希釈）し，さらに２倍段階希とした．中和抗体価による感染DEV血清型別の判定は，釈（80倍から10,240倍）して希釈患者血清とした．100pfu

得られた中和抗体価が最も高く，かつ他の血清型の中和抗/100μLに調製したDEV1から３型（1型：Hawaii株，２体価よりも４倍以上高い価を示したものを陽性とした．

型：New Guinea C株，３型：H-87株）および50 pfu/100
結μLに調製したDEV4型（H-241株）と希釈患者血清を等量混合し，37℃で１時間，中和反応を行った．次に，1×105

果１．抗体検査個/mLのVero細胞浮遊液1.5 mLを12穴平底プレートに播デング熱疑いの患者18名の血清を対象に実施したDEV

き，５%CO2存在下で35℃，２日間単層培養したものに中抗体検査の結果を表１に示した．イムノクロマト法による和反応後の混合液200μLを接種し，37℃で１時間吸着しスクリーニングテストでは，患者No.1（６病日血清），患た．吸着後，１%メチルセルロースおよび１%牛胎児血清者No.6（10病日血清），患者No.7（９病日血清），患者を加えたイーグルMEM培地２mLを重層した．これをNo.10（11病日血清），患者No.11（７および９病日血清），５%CO2存在下で35℃，７日間培養後，10%中性緩衝ホル

患者No．17（16病日血清）の計６名からIgMまたはIgG抗マリン液で固定，メチレンブルー染色を行い，プラック数体が検出された．ELISA法による確認検査によっても，を数えた．ウイルスコントロールは１％牛胎児血清を加えこの６名からはIgM抗体が検出され，デング熱と診断されたイーグルＭＥＭ培地と調製したDEV1から４型を等量混た．

合してVero細胞に接種し，患者血清と同様に培養後，プ抗体検査によってデング熱と診断された患者６名の海外ラック数を数えた．ウイルスコントロールのプラック数と渡航歴および臨床症状は表１に示すように，スリランカ，

表１．デングウイルス検査成績
患者

検査

結抗体検査

血清

果備

病原体検査

考

イムノクロマト法

ELISA法

IgM

IgG

IgM

６病日

(＋)

(−)

（＋） （−） （−） スリランカ・インド 発熱（39℃）発疹，関節痛，筋肉痛，肝脾腫，上気道炎

男

８病日(−)(−)（−） （−） （−）

中国

発熱（40.5℃），筋肉痛，発疹

31

女

47病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

インドネシア

発熱（39.5℃），筋肉痛，関節痛

４20

女

10病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

メキシコ

発熱（38.5），発疹

５20

女

不明

(−)

(−)

（−） （−） （−）

メキシコ

発熱（38.5），発疹

６43

男

10病日

(＋)

(−)

（＋） （−） （−）

フィリピン

発熱（40℃）発疹，出血傾向

(−)

(−)

24

４病日

（−） （−） （−）

７

女
９病日

(＋)

(±)

（＋） （−） （−）

フィリピン

発熱（39℃），発疹，関節痛，筋肉痛

No.

年齢

性別

１22

男

２31

３

採取日

PCR法

ウイルス分離

海外渡航歴

主要症状

８16女

10病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

マレーシア

発熱（39℃），発疹，関節痛，筋肉痛

９40

女

６病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

マレーシア

発熱（39℃），発疹，関節痛，筋肉痛

1052

男

11病日

(＋)

(＋)

（＋） （−） （−）

インド

発熱（39℃），発疹，関節痛，筋肉痛，肝機能障害

(＋)

33

７病日

(±)

11（＋） （−） （−）

女

インドネシア

発熱（40℃）関節痛，発疹，筋肉痛，出血傾向，脾腫，肝機能障害

９病日

(±)

(＋)

（＋） （−） （−）

12

32

男

４病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

インドネシア

発熱（39℃），関節痛，筋肉痛，肝機能障害

1338

女

７病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

マダガスカル

発熱（39.0℃），発疹

1426

男

１病日

(−)

(−)

（−） （＋） （−）

インドネシア

発熱（39.0℃），発疹

1532

男

４病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

インドネシア

発熱（40℃），筋肉痛，肝機能障
害

1622

男

５病日

(−)

(−)

（−） （−） （−）

タイ

(−)

49

３病日

(−)

17

（−） （＋） （＋）

男

16病日

(＋)

(±)

（＋） （−） （−）

１病日

(−)

(−)

発熱（38.5℃），リンパ節腫脹，（−） （−） （−） タイ，インドネシア 肝機能障害

1827

男

インドネシア

発熱，関節痛発熱（39.6℃），発疹

24Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 52, 2001

図１．PCR法によるDEV遺伝子の検出成績
M：マーカー，N.C：陰性コントロール，P.C.：陽性コントロール，
１：DEV1型，２：DEV2型，３：DEV3型，４：DEV4型
インド，フィリピン，インドネシア等への海外渡航歴があDEV3型で80倍，DEV4型で40倍の中和抗体価を示した．

り，臨床症状は，40℃近い発熱と発疹が６名全員に共通しDEV1型の中和抗体価がDEV2型および３型より16倍高いていた．その他，関節痛，筋肉痛および肝機能障害を呈す抗体価を示したことで，患者No.7はDEV1型感染と判定しる症例も多くみられた．

た．患者No.6は，全ての血清型で中和抗体価が40倍また２．病原体検査は，それ以下であったため，血清型別は判定不能であった．

デング熱疑いの患者18名における病原体検査成績を表１および図１に示した．
PCR法によるDEV遺伝子検査では，18名のうち患者No.14（１病日血清）および患者No.17（３病日血清）の逆に患者No.11は，全ての血清型で640倍以上の高い中和抗体価を示したが，最高値を示した血清型が他の血清型と４倍以上の差を示さなかったために，血清型別は判定不能であった．

２名からDEV遺伝子が検出された（抗体検査は共に陰性）．
考

その血清型は前者がDEV2型，後者がDEV1型であった

察（図１）．なお，患者No.17（３病日血清）からはウイルス

デング熱は，DEV感染３〜７日後に突然の高熱によっ分離試験でもDEVが分離され，PCR法で血清型を確認して発病し，頭痛，眼窩痛，筋肉痛および関節痛を伴うことたところDEV1型であった（図１）．以上の病原体検査のが多く，発病３，４日後には発疹が出現する．しかしなが結果，抗体検査では陰性であった患者No.14が新たにデンら，このような臨床症状はデング熱以外のウイルス性熱性グ熱と診断された．なお，患者No.17は16病日血清の抗体疾患でもみられる症状であり，臨床症状だけでデング熱と検査でもデング熱と診断された．

診断することは困難であるといわれている．今回，感染症

３．中和抗体測定によるウイルス血清型別発生動向調査で当研究科に検査依頼のあったデング熱疑い中和抗体を測定することによりウイルスの血清型別が判の患者18名は，いずれの患者も発病前にデング熱流行地で定できるか否かを，抗体検査のみでデング熱と診断されたある東南アジア等への渡航歴があり，臨床症状も前述の症患者５名（No.1，6，7，10，11）の血清を用いて検討し状を呈していた．これらの患者血清についてDEV検査をた．その結果を表２に示した．

した結果，抗体検査および病原体検査の両法でDEV感染

患者No.1の中和抗体価は，DEV1型で80倍，DEV2型でが確認された患者が１名，抗体検査のみで確認された患者

1,280倍，DEV3型で40倍以下，DEV4型で40倍を示した．

が5名，病原体検査のみで確認された患者が1名の計７名で最高値を示したDEV2型の中和抗体価が，DEV1型より16あった．このことから，デング熱の診断には臨床症状およ倍高い価を示したことにより，患者No.1はDEV２型感染

び発病前の海外渡航歴の有無に加えて，DEV抗体検査おと判定した．同様に，患者No.10は，DEV1型で2,560倍，よび病原体検査を実施することが最も重要であることがわ

DEV2型で640倍，DEV3型で320倍，DEV４型で640倍の中かった．

和抗体価を示した．DEV1型の中和抗体価がDEV2型およ

今回，DEVに対するIgM抗体検査においてDEVの感染び４型より４倍高い抗体価を示したことで，患者No.10はが確認された患者６名の血清は，全て６病日以降16病日以DEV1型感染と判定した．また，患者No.7は，４病日の血内に採血されたものであった．これに対し，病原体検査で清では全ての血清型で40倍以下の中和抗体価であったが，DEVの感染が確認された患者２名の血清は，１病日と３９病日の血清では，DEV1型で1,280倍，DEV2型および病日の発病初期に採血されたものであった．したがって，

東

京衛研年報52,

252001

表２．中和抗体測定による感染デングウイルス血清型別
患者

血清No.

採取日

DEV1DEV2DEV3

DEV4

１６病日

801280＜4040２型

６10病日＜40＜4040＜40不明

４病日＜40＜40＜40＜40９病日

128080804011病日

2560

640

320640

７病日

12802560

2560

640

9病日

12805120

2560

640

７1011中和抗体価

血清型

１型
１型
不明

DEV感染の有無を正確に診断するには，血清が発病何日され，国内に生育する媒介蚊の１つのヒトスジシマカによ目に採取されたのか調べて，採取時期に適した検査方法って流行したとみられている．現在，国内にはDEVは常（抗体検査または病原体検査）を選択することが大切であ在していないため国内感染例はみられないが，海外渡航歴ると思われた．のある不明熱患者の検査を行ったところ，1/3がデング熱

DEVには４つの血清型があり，感染後に得られる免疫によるものだったという報告もあり7），実際の国内デングは同じ血清型のDEVにのみ感染防御する．したがって，熱患者数は報告されている症例数よりも多いと推定されて一度デング熱に罹患しても，異なる血清型のDEVには感いる．一方，地球の温暖化に伴うデング熱流行地域の拡大，染する可能性がある．また，異なる血清型のDEVに再感流行地域への海外旅行者の増大等，我々がDEVに感染す染することによって，デング出血熱やデングショック症候る機会も多くなっている．また，国内にはDEVを媒介す群に進行し，特に子供では致命率が40〜50%を示す程に重るヒトスジシマカが存在しており，DEV国内感染の可能

8）もあり，DEV感染の有無を確認す性が全くないとは言い切れない状況下にある．今後も，迅るとともに，DEV血清型を検査することも重要となって速かつ正確なDEVの検査を行ってデング熱患者の発生をきている．これまでDEVの血清型別は，病原体検査で監視するとともに，発生予防のために関連各機関へ正確なDEVが検出されたものでしか実施できなかった．そこで検査情報を提供していく必要がある．

症化するという報告

我々は，病原体のDEVが検出されなくとも，患者血清中文の中和抗体を測定することによって，DEVの血清型別が献できるか否か，その可能性を検討した．今回は，抗体検査

１）WHO：Strengthening Implementation of the Global Strategy

のみでDEV感染が診断された５名の血清を対象に，各血

for Dengue Fever/Dengue Haemorrhagic Fever Prevention

清型のDEVに対する中和抗体価を測定した結果，５名のand Control, 1999

うち３名については，感染しているDEVの血清型を明らかにすることができた．また，全ての血清型に対して640倍以上と高い中和抗体価を示した患者No.11については，過去にDEV感染の既往歴があり，今回の感染によって抗体のとも上がり現象が起き，全ての血清型に対する中和抗体価が高い価になったと推測された．しかし，この患者も７病日と９病日の間でDEV2型にのみ２倍の抗体上昇が見られたことから，今回の感染はDEV2型によるものと推測された．このように，病日を追って中和抗体価を測定していくことにより，ある程度は血清型が推測できることも明らかとなった．したがって，中和抗体測定は，感染DEV血清型を判定する方法として有用であることが確認された．
1940年代に起こった国内デング熱の流行は，東南アジアから軍用船で帰国したデング熱患者によって国内にもたら

２）Kurane, I., Takasaki, T., Yamada, K.：Emerg. Infect.
h, 569-571, 2000
Dis., 6h３）田部井由紀子，貞升健志，吉田靖子，他：東京衛研年
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