デコイ・メラノソームを用いたメラノサイトからケラチノサイトへのメラニン移送阻害の研究
名古屋市立大学大学院薬学研究科

平 嶋

尚 英

To inhibit melanin transfer from melanocytes to keratinocytes, we attempted to use nano-particles that mimicmelanosomes. We found that negatively charged polystyrene particles are up-taken by melancytes. To investigate theeffects of particles on melanin transfer, we constructed 3D-coculture system of melanocytes and keratinocytes. However,no significant effects of particles on melanin transfer. Further improvements such as higher uptake of particles and surface
modification by melanosomal proteins are required.

１．緒

たが、マスト細胞の分泌顆粒はメラノソームと同じくリソ言ゾーム関連顆粒であり、その細胞内輸送やエクソサイトー

色素細胞であるメラノサイトは、メラニンを産生し、さシスの機構が類似している 2−5）。一方で、我々はリポソーらにそれを周囲のケラチノサイトへ引き渡し、皮膚の色素ムやポリ乳酸・グリコール（PLGA）粒子のようなマイク沈着をコントロールしている。この色素沈着を抑制するこロ・ナノ粒子を用いた高効率遺伝子導入法の研究を行ってとで美白効果をもたらすことができるため、化粧品開発にきた 6−8）。これらの研究の過程で、細胞をマイクロ・ナノおいて、メラニンの産生から色素沈着にいたるまでの過程粒子とともに培養すると、これらの粒子が細胞内に取り込を研究することは極めて重要である。

まれ、さらに細胞内で分泌顆粒用の挙動をとり、エクソサメラニンは脂質二重膜で囲まれたメラノソームと呼ばれイトーシスによって放出されることを見出した 9）。取り込る小胞中で産生され、さらにメラノサイトの突起先端までまれた粒子がリソゾーム関連の顆粒と同様の挙動をとるこ輸送され、ケラチノサイトへ移行する。この移行機構につとは、細胞内に取り込まれたマイクロ・ナノ粒子がメラノ

1）

いては、おおまかに次の４つの仮説がある 。①メラノソソームと同様の挙動を示すことを示唆する。

ーム内のメラニン顆粒がエクソサイトーシス（開口放出）

そこで、本研究では、このメラノソームを模倣したマイによって、細胞外に放出され、それをケラチノサイトが貪クロ粒子を作製、デコイ（おとり）メラノソームとし、そ食する。②メラノサイトの突起先端に集まってきたメラノれをメラノサイトやケラチノサイトにとりこませ、メラノソームを突起ごとケラチノサイトが貪食する。③メラノササイトが本来もつメラノソームの代わりにデコイメラノソ

イトからフィロポディア様の突起が伸び、その先端がケラームがケラチノサイトに移行することで、美白作用を発揮

チノサイトの細胞膜と融合し、形成されたチューブ状の構する可能性を検証する。

造の中をメラノソームが輸送される。④メラノサイトの細２．実胞膜で囲まれ、内部に数個のメラノソームを含む小胞（エクソソーム）として細胞外に放出され、それがケラチサイ
トと膜融合するか、あるいはケラチノサイトによる貪食に

２.１

極めて重要な過程である。

細胞

２. １. １

マウスメラノサイト株 melan-a 細胞およびマウスケラチノサイト細胞株 SP- 1 の培養

よって、ケラチノサイトにとりこまれる。いずれにしても、ケラチノサイトへのメラニンの移行過程は色素沈着の上で験

マウスメラノサイト株であるmelan-aは、Dorothy Bennett
博士（St. George's University of London, London, UK）よ

我々は代表的な分泌細胞であるマスト細胞の分泌顆粒のり 御 提 供 い た だ い た。 細 胞 は、10 %FBS を 含 む RPMI-

細胞内輸送やエクソサイトーシスについて研究を行ってき1640 培地（WAKO Pure Chemicals, Japan）で、CO 2 濃度
10 % 下、37℃にて培養した。また、マウスケラチノサイ
ト 細 胞 株 SP- 1 は Stuart H. Yuspa 博 士（National CancerInhibition of melanin transfer frommelanocyte to keratinocyte by decoymelanosomes
Naohide Hirashima
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, Nagoya City UniversityInstitute, Bethesda, USA）より御提供いただいた。細胞培養は、SMEM 培地に L-glutamine（0 . 29 mg/ml）、CaCl 2（0 . 05 mM）、Penicillin（20 U/L）、Streptomycin（20 mg/L）を混合し、Chelex- 100 でキレート処理した 8％ FBS を添加したものを用い、10％ CO 2 存在下 37℃で培養した。

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

２. ２

RT-PCR

２. ６. ２共培養系を用いたケラチノサイトへのメラニン移行の定量化

710 個の melan-a 細胞から Poly A +RNA を得た後、逆転写酵素 SuperScript Ⅲ RT を用いて cDNA を合成した。得

上述の共培養系を用いて 3 日間共養したメラノサイトとられた cDNA を鋳型にして、メラノソームに発現していケラチノサイトを別々にトリプシン処理することで、各細る可能性のある膜蛋白質について、特異的プライマーを用胞懸濁液を作成し、試料とした。メラノソームに特異的ない PCR を行った。得られた PCR 産物は、DNA シークエン抗体を用いて各細胞内のメラニンを定量し、メラノサイトサーを用いて配列を決定した。

からケラチノサイトへのメラニンの移行率を評価した。

２. ３

３．結

メラノソーム精製

メラノソームの精製はWatabe らの方法を参考に行った10）。
Melan-a の ホ モ ジ ネ ー ト を 1000 xg、4 ℃ で 10 分 間 遠 心果

３.１ melan-a 細胞のメラノソーム膜に発現するタンパク質の同定

後、 ペ レ ッ ト を 10 mL の Cell homogenization medium に

本研究では、メラノソームを模倣したマイクロ粒子を作再懸濁させ、細胞を氷上でホモジナイズ後、1000 xg、4℃製し、デコイ（おとり）メラノソームとし、それをメラノで 10 分間遠心し、上清をスクロース勾配（1 . 0 M、1 . 4 M、サイトやケラチノサイトにとりこませる。そこで、メラノ1 . 6 M、1 . 8 M、2 . 0 M）に重層し、100000 xg、4℃で 1 時間ソーム表面に発現している蛋白質でマイクロ粒子をコート遠心した。1 . 8 M と 2 . 0 M との界面層を回収し、メラノソする。そのために、まずメラノソームに発現している蛋白ームを得た。

質の同定を試みた。
メラノソームは、マスト細胞の分泌顆粒と同様リソゾー

２. ４

Western Blotting

ム関連顆粒である。そこで、マスト細胞の分泌顆粒にもライセートに 2 ×sample buffer を加えて SDS-PAGE を発現している膜蛋白質として VAMP（vesicle associated行い PVDF 膜（Bio Rad）に転写した。5％スキムミルク

membrane protein）の発現を RT-PCR で調べた。その結果、でブロッキング後、一次抗体で 16 時間処理した。さらに

VAMP- 2、VAMP- 7、VAMP- 8 が発現していることが明horseradish peroxidase 標識した二次抗体で処理後、ECLらかとなった（図１A）。このことは、単離メラノソームの（Amersham Bioscience）で検出した。

ウエスタンブロッティングによっても確認された（図１B）
。

２. ５

３. ２

蛍光顕微鏡観察melan-a 細胞へのナノ粒子の取り込み

蛍光標識したナノ粒子は、直径 200 nm の蛍光ポリスチ本研究では、マイクロ粒子をデコイメラノソームとしてレ ン 粒 子（ex. 505 nm/em．515 nm）を Molecular Probes

メラノサイトに取り込ませる。そこで、効率的にメラノサより購入した。蛍光粒子を 2 mg/ml になるように PBS でイトにマイクロ粒子をとりこませるために、マイクロ粒子希釈し、使用する前に 30 秒間超音波処理をしてから用いの物性と取り込み効率について検討を行った。マイクロ粒た。蛍光標識ナノ粒子を細胞とともに培養し、８時間後子としては、将来的にはリポソームやポリ乳酸・グリコーに細胞と蛍光ナノ粒子を共焦点レーザー顕微鏡 LSM 510

ル（PLGA）粒子のような生分解性のものを導入する予定（Zeiss）を用いて観察した。

であるが、まずは、ポリスチレン粒子を用いて基本的な検討を行った。

２. ６ メラノサイトからケラチノサイトへのメラニン移行活性の定量化
２. ６. １

メラノサイトとケラチノサイトの共培養系

メラノサイトからケラチノサイトへのメラニン移行活性の定量化には、Kasraee B らの方法に従った11）。ポア

粒子径としては 200 nm のもの、表面電荷としては、表面をカルボキシル基で修飾した負電荷をもつ粒子と、アミノ基で修飾した正電荷をもつ粒子について調べた。
正電荷をもつ粒子は、図２に示すように、多数の粒子が melan-a 細胞の表面に吸着するのが見られた。しかしな

サイズ１µm のメンブレンフィルター（Cell culture insert,

がら細胞内に取り込まれる粒子はそれほど多くはなかった。

FALCON、6 -well 1 . 0 µM pore size）の片面に、ケラチノ

一方、図３に示すように、負電荷をもった粒子は、細胞にサイトを定着させ、1 日後に反対面にメラノサイトを定着吸着する数は少ないもの、ある程度は細胞内に取り込まさせ、メンブレンフィルターの上下それぞれにメラノサイれることが明らかとなった。また、正電荷の粒子と培養しトとケラチノサイトを共培養した。培地は SP- 1 培養用のた場合は、図４に示すように、細胞の形が紡錘形ではなく、SMEM 培地を用い、10％ CO 2 存在下 37℃で培養した。

丸くなり、正常なメラノサイトとは異なる形状を示すものが多く、正電荷粒子による毒性が現れていることが示唆された。

− 110 −

デコイ・メラノソームを用いたメラノサイトからケラチノサイトへのメラニン移送阻害の研究

VAMP- 2A

VAMP- 2BA
B

VAMP- 7

VAMP- 8

VAMP- 7

VAMP- 8

図１ メラノサイトにおける v-SNARE の発現
RT-PCR に v-SNARE
単離メラノソームのウエスタンブロットによる v-SNARE の発現

図２ 正電荷蛍光粒子とメラノサイトの共培養
正電荷をもつ粒子は洗浄後も多数細胞に吸着したが、細胞内への取込みはさほど多くなかった。

図３ 負電荷蛍光粒子とメラノサイトの共培養
負電荷をもつ粒子は、洗浄後細胞への吸着はほとんど見られないが、細胞内への取込みが見られた。

図４ 正電荷蛍光粒子の細胞毒性
正電荷をもつ粒子は多数細胞に吸着し、細胞が変形して正常な場合の形態とは異なるものが多かった。

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

電荷をもつ粒子は細胞表面への吸着は少なかったが、メラノサイト内には負電荷粒子の方がよくとりこまれた（図３）。多数の粒子が吸着しながら、細胞内に取り込まれる粒子が少ない理由はよくわからないが、正電荷の粒子によって細胞の形状が変化したことは（図４）、正電荷粒子の細胞毒性を示唆し、その結果、正電荷粒子の取り込みが阻害されたと考えられる。
そこで、細胞への毒性がなく、細胞内に取り込まれた負電荷粒子について、メラノサイトからケラチノサイトへのメラニンの移行への影響を調べたところ、特に有意な影響は見られなかった（図５）。原因としては、今回用いたポリスチレンビーズは、VAMP 等で表面修飾をしていないため、本来メラノサイトがもつメラノソームを模倣するに
図５ メラニン移行に対する微粒子の影響
メラノサイトからケラチノサイトへのメラニン顆粒の移行は、メラノサイトを負電荷ポリスチレン粒子存在下で培養することによって、有意の影響を受けなかった（mean±SD，n ＝ 4）。

十分でないことやポリスチレン粒子の取り込みが少ないこと、があげられる。一方、最近、メラニン顆粒のケラチノサイトへの移行が、エクソサイトーシスではなく、メラノサイトの細胞膜で囲まれた数個のメラノソームがエクソソームとして細胞外に放出され、それがケラチノサイトによって貪食されることを示す結果が報告された 12）。このエ

３. ３ ケラチノサイトへのメラニン移行に対するナノ粒子の影響
負電荷をもつ粒子が、細胞内への取込みが見られたので、クソソームによるメラノソームの移行が、全体のメラニン顆粒の移行においてどの程度寄与しているか不明であるが、エクソサイトーシスによる寄与が低いために、微粒子を取この粒子のケラチノサイトへのメラニン移行に対する影響り込ませ、それをエクソサイトーシスで放出させても、メを調べた。ポアサイズ１µm のメンブレンをもつセルカルラニン顆粒の阻害がみられなかった可能性も考えられる。

チャーインサートの片面にケラチノサイトを培養し、さら我々は予備的な研究で、VAMP がメラニン顆粒の移に反対面に、メラノサイトを負電荷をもった 200 nm のポ行に関与していることを示唆する結果を得ており、エクリスチレン粒子とともに培養した。メラノサイトから移行ソサイトーシスによる移行以外のメラニン移行の機構にしたメラニン顆粒を定量し、ポリスチレン粒子の影響を調VAMP が関与している可能性がある。もしエクソソームべた。その結果、図５のようになり、ポリスチレン粒子のによる機構が主たる移行機構であるとすると、エクソソー存在により、有意な影響は認められなかった。

ム内に取り込まれるような修飾を微粒子に施すことによっ４．考て、デコイメラノソームによるメラニン移行阻害が可能に察なる可能性があり、メラノソームのエクソソーム内への取今回の研究によって、メラノサイトには分泌顆粒蛋白質り込み機構の解明を進める必要がある。

である VAMP のうち、VAMP- 2、VAMP- 7、VAMP- 8 が発現していることが明らかとなった（図１）。したがって、マイクロ粒子の表面をこれらのタンパク質（あるいは、その一部分のペプチド）で修飾することによって、メラノソ謝辞本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団より研究助成をいただきました。ここに感謝いたします。

ームを模倣し、かつメラノソームの移行にも関与すると思われる VAMP によって、メラノソームの移行と競合でき（引用文献）るような粒子を作成することができる。

１）Van Den Bosche, K., Naeyaert, J.-M., Lambert, J. The

一方、作成した粒子をデコイメラノソームとして機能させるためには、なるだけたくさんのマイクロ粒子を細胞内quest for the mechanism of melanin transfer Traffic, 7 ,769 - 778 ( 2006 )に取り込ませる必要がある。今回の研究によって、負電荷

２）Hibi, T., Hirashima, N., and Nakanishi, M. Ratをもつ粒子がメラノサイト内へよく取り込まれた。細胞表

basophilic leukemia cells express syntaxin- 3 and

面は負に帯電しているので、静電相互作用を考慮すると、VAMP- 7 in granule membranes. Biochem. Biophys.

正の粒子がよく取り込まれると考えられる。実際、正電荷Res. Commun., 271 , 36 - 41 ( 2000 )をもつ粒子が細胞表面に多く結合した（図２）。一方、負３）Tadokoro, S., Mamoru Nakanishi and Naohide− 112 −デコイ・メラノソームを用いたメラノサイトからケラチノサイトへのメラニン移送阻害の研究

Hirashima Complexin II facilitates exocytotic release intransfection efficiency with chitosan modified PLGA

mast cells by enhancing Ca

nanospheres prepared by the emulsion solvent

2+

sensitivity of the fusion

diffusion method, for gene delivery Chem. Pharm. Bull.

process J. Cell Sci., 118 2239 - 2246 ( 2005 ).
４）Tadokoro, S., Kurimoto, T., Nakanishi, M. and59 , 298 - 301 ( 2011 )Hirashima, N. Munc 18 - 2 regulates exocytotic

９）Tahara, K., Tadokoro, S., T., Yamamoto, H.,

membrane fusion positively interacting with syntaxin

Kawashima, Y. and Hirashima, N. The suppression

3 in RBL- 2 H 3 cells Mol. Immunol. 44 , 3427 - 3433 ( 2007 )of IgE-mediated histamine release from mast cells５）Tadokoro, S., Nakanishi, M., and Hirashima, N.

following exocytic exclusion of biodegradable polymericComplexin II regulates degranulation by interactingwith SNARE complex containing syntaxin- 3 in RBL-

nanoparticles Biomaterials 33 , 343 - 351 ( 2012 )10）Watabe, H., Kushimoto, T., Valencia, J.C., Hearing,V.J. Isolation of melanosomes Curr. Protoc. Cell Biol.

2 H 3 cells Cell. Immunol., 261 , 51 - 56 ( 2010 )６）Tahara, K., Sakai, T., Yamamoto, H., Takeuchi, H.,

Chapter 3 :Unit 3 . 14 .( 2005 )Hirashima, N. and Kawashima, Y. Improved cellular11）Kasraee, B., Pataky, M., Nikolic, D.S., Carraux, P.,

uptake of chitosan-modified PLGA nanospheres byPiguet, V., Salomon, D., Sorg, O., Saurat, J.H. A new

A 549 cells Int. J. Pharmaceut., 382 , 198 - 204 ( 2009 )spectrophotometric method for simple quantification of７）Tahara, K., Sakai, T., Yamamoto, H., Takeuchi, H.,melanosomal transfer from melanocytes to keratinocytes.

Hirashima, N. and Kawashima, Y. Chitosan modifiedExp. Dermatol. 20 , 938 - 942 ( 2011 )poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanospheres for12）Ando H, Niki Y, Yoshida M, Ito M, Akiyama K,improving siRNA delivery and gene silencing effects

Kim JH, Yoon TJ, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi M.

Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 , 421 - 426 ( 2010 )Involvement of pigment globules containing multiple８）Tahara, K., Sakai, T., Yamamoto, H., Takeuchi, H.,melanosomes in the transfer of melanosomes from

Hirashima, N. and Kawashima, Y. Improvements inmelanocytes to keratinocytes. Cell Logist. 1 , 12 - 20 ( 2011 )− 113 −