地中海アロマ植物からの白髪予防生理活性物質の探索
およびその機能探索筑波大学大学院生命環境科学研究科

礒 田博 子Recently, people are experiencing more stress and some have problems regarding hair growth as a part of the aging
process. Resolving this hair growth problem is important for the aging society in the future. This is because not only bodily
health but also mental health is important for a healthy life. Thus, we attempted to find plants having hair growth regulation
activity. We collected plant extracts from Tunisia for bioprospecting purposes. Among them, we investigated the Erica
multiflora extract to evaluate the hair growth promotion activity. MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thyazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) assay and cell cycle assay on human dermal papilla cells in vitro and administration assay on mousedorsal skin in vivo were performed. As a result, the Erica multiflora extract promote the dermal papilla cell growth and cellcycle, and induced hair growth in vivo. We show that the Erica multiflora extract has a high activity for promotion of hair
growth cycle, or induction of anagen phase from telogen phase.

１．緒ー効果を評価するという三段階に分かれた評価系の構築を言目指した。

毛の成長周期の制御に関する研究は、現在世界中で盛ん

２．実に行われており、年々分子生物学的手法を取り入れたものが数多く見られるようになってきた。しかしながら、ごく

２．１

験

地中海アロマ植物

最近までは医学系の研究者が主に研究を行っていた背景も本研究において実験に使用したサンプルとして、環あり、分子生物学的コントロール下のデータは少ない。ま地中海半乾燥地域に生育するアロマ植物である、Erica

た逆に分子生物学者が行っているデータを眺めると、皮膚multiflora、Thymelaea hirsuta、Pistacia lentiscus、Lycium

科学としてのコントロールが正確になされていないものもeuropeum、Thapsia garganica の５種を用いた少なくない。したがって、現在までに報告されているもの

ジアにおいて、これらの植物の乾燥重量 10g を 100 ㎖ののうち、分子生物学的・皮膚科学的信頼性の高いものはご

70％エタノールに 7 − 10 日間浸して抽出したもの、またく限られた研究室から出た報告に限定されると言わざるを植物の乾燥体は生物多様性条約に基づいて、北アフリカ研得ない。

究センターを通じて入手した。その抽出液を 0.22 ㎛フィ

また、白髪の改善にも注目した毛成長周期制御に関する

２）
−４）

。チュニ

ルター（Millipore, USA）で濾過したものをサンプルとした。

研究についてはほとんど進んでおらず、本研究課題が皮膚科学分野へ与える影響は大きいと言える。これまでは、実２．２

E. multiflora の分配・分離際に皮膚に発現している分子をターゲットとして研究が行

葉 の 乾 燥 体（100g） を 100 ％ メ タ ノ ー ル（500 ㎖ 及 び

われてきており、毛成長に関与するもの、白髪の抑制に関800 ㎖）に浸して暗所で 1 週間静置した。この抽出液を吸与するものを分けて考えざるを得ず、白髪を抑制し尚且つ引濾過後、濾液をロータリーエバポレーターにて減圧下発毛も促進するようなものへの期待が高いことが明らかで30℃で濃縮・乾固し、メタノール抽出物（22.68 g）を得た。

あったにも関わらず、その実験系の構築までは至っていな得られたメタノール抽出物を、酢酸エチル（400 ㎖ × ３）

１）と水（400 ㎖ × ３）で２層分配し、酢酸エチル層・水層をい 。
本研究では、北アフリカ乾燥地域原産生物資源をターゲ得た。酢酸エチル層をロータリーエバポレーターで濃縮・ットし毛成長促進・メラニン合成促進を探索する。その後、乾固し酢酸エチル層（EMEA）を得た。その後水層を n-

正常皮膚の色素沈着へ貢献しないものをさらにスクリーニブタノール（500 ㎖ × ３）で２層分配し、ブタノール層・ング、毛成長促進作用とメラニン合成促進作用とのシナジ水層を得た。それぞれをロータリーエバポレーターで濃縮・Hair growth regulation by the extract of
aromatic plant Erica multiflora
Hiroko Isoda
Alliance for Research on North Africa(ARENA), Graduate School of Life andEnvironmental Sciences, University ofTsukuba,

乾固させ、ブタノール層（EMBU）・水層（EMWA）を得た。
酢酸エチル層をシリカゲルクロマトグラフィー（φ2.2×30 ㎝、n-hexane：EtOAc ＝ 5：1 → 3：1 → 1：
2 → CHCl3：MeOH ＝ 8：2 → 5：5 → 2：8 → 0：10）で分離を行い、酢酸エチル層を 15 画分（EMEA1 〜 15）に分離した（図 1）。

− 18 −

地中海アロマ植物からの白髪予防生理活性物質の探索およびその機能探索

２．
３

毛乳頭細胞増殖率測定実験

３．結果と考察

ヒト毛乳頭細胞（human dermal papilla cell）を播種し、37℃、５% CO2 インキュベーターで一晩培養した後、サ

３．１

毛乳頭細胞増殖率測定実験

ンプルを含む培地と交換し、96 時間培養した。そのあと、毛 乳 頭 細 胞 を 用 い て、 ア ロ マ 植 物 Erica multiflora、細胞生存率を調べるため、MTT 手法を用いて測定した。

Thymelaea hirsuta、Pistacia lentiscus、Lycium europeum、Thapsia garganica の毛乳頭細胞増殖率に及ぼす影響を調べ

２．
４

細胞周期測定た。その結果、Erica multiflora に最も毛乳頭細胞増殖活性

Erica multiflora で 処 理 し た 細 胞 に Cell Cycle Reagentが見られた（表１）。

（Millipore, USA）を加える。フローサイトメトリー（GuavaPCA; Millipore, USA）を用いて、細胞周期測定用ソフト
ウエア Guava CellCycle により、細胞周期を測定した。

３．２

毛乳頭細胞周期測定実験

Erica multiflora で 12、24、36、48 時間処理した毛乳頭細胞の細胞周期を調べた。その結果、24、36、48 時間処

２．
５

メラニン産生量測定実験

理において弱いが細胞周期進行の停止が見られたが、12B16 メラノーマ細胞を播種し、37℃、５％ CO2 インキ

時間処理においては細胞周期促進が見られた（表２）。以ュベーターで一晩培養した後、サンプルを含む培地と交換

上のことは Erica multiflora の成分が毛乳頭細胞の細胞周期し、72 時間培養し、メラニン産生量を測定した。培地をを制御することを示唆する。

除去した後、トリプシン処理により細胞を採取した。0.1％ Triton X-100 を用いて細胞の膜タンパク質を可溶化し、３．３マウスの毛髪成長促進効果

10％トリクロロ酢酸を用いて産生されたメラニンを沈殿

C3H ／ He マウスにおける Erica multiflora の毛髪成長促させ精製を行った。その後 8N 水酸化ナトリウムを添加し、進効果を調べた。Erica multiflora を毎日皮下注射して３週80℃設定のヒートブロック中で 2 時間処理することでメラ間後マウスの毛を剃った皮膚から毛の成長が確認でき、血ニンを溶解させ、410 nm の波長で吸光度を測定した。産管拡張も確認した（図２）。Erica multiflora によるマウス

生されたメラニンの量は濃度既知のメラニンで作製した検毛髪成長促進効果は血管拡張効果による毛根までの血流が量線を用いて算出し、さらに細胞数で除法することで１細増加したことによると思われる。

５）胞あたりのメラニン産生量とした 。

２．
６

３．４ E. multiflora メタノール抽出物分配成分が B16
メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響

動物実験

C3H ／ He マウス（16 週齢、雄）の背部を剃毛し、１B16 メラノーマ細胞に、E. multiflora メタノール抽出物、日に１回、500 ㎍ /㎖の Erica multiflora 抽出物を含む PBS

またメタノール抽出物を分配して得られた酢酸エチル層、溶液、PBS をそれぞれ 0.1 ㎖ずつ、21 日間皮下注射した。

ブタノール層、水層を 1 ㎍ / ㎖の濃度で添加し 72 時間後のメラニン産生量を測定した結果、酢酸エチル層においてメFigure 1.

E. multiflora の分離スキーム− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

ラニン産生を促進する活性が示された（図３）。酢酸エチが促進された。またメラニン産生量測定時と同条件で E.

ル層にて処理した細胞ではコントロールと比較して 138.5

multiflora の分離・分配成分による細胞生存率を評価した％とメラニン産生が促進された。

（図４B、５B）。その結果、E. multiflora の分離・分配成分による処理は B16 メラノーマ細胞の生存率に影響を与え３．５ E. multiflora メタノール抽出物酢酸エチル層の分離成分が B16 メラノーマ細胞に与える影響ないことが明らかとなった。

４．総

E. multiflora のメタノール抽出物分配画分である酢酸エ括

チル層にメラニン産生促進活性があることが明らかとな

北アフリカのチュニジアのアロマ植物から、発毛制御ったので、この画分をさらに 15 の画分に分離し、同様の活性がある植物の探索を試みた。その植物抽出物の中か方法で、メラニン産生に与える影響を評価した。その結ら、発毛促進活動を評価するためにアロマ植物を選び、in果、画分 2 において最も強いメラニン産生促進活性を示

vitro 系ではヒト毛乳頭細胞（human dermal papilla cell）した（図４A）。図３より E. multiflora 酢酸エチル層画分 2を用いて MTT アッセイ及び細胞周期分析を、in vivo 系はメラニン産生促進活性を示したので、同様の実験を３

ではマウスの背側の皮膚における発毛促進実験を行った。

回行い、結果を平均値 ±SD にて表した（図５A）。そのその結果、Erica multiflora 抽出物はヒト毛乳頭細胞にお結果 E. multiflora 酢酸エチル層画分２にて処理した細胞でいて細胞増殖促進効果と細胞周期促進効果が、マウスにはコントロールと比較して 172.7% と有意にメラニン産生おいては発毛促進効果が見られた。このような結果から、Table 1. Growth promotion activity of the Erica multiflora extract on humanfollicular dermal papilla cells (HFDPCs). Symbols represent means±SD
of n=4 samples. Asterisks (* and **) indicate statistically significant
difference (p<0.05 and p<0.01, respectively) between the extract-treatedand control cells.
Plant name
Erica multiflora
Thymelaea hirsta
Pistacia lentiscus
Lycium europeum
Thapsia garganica
Gloria alypum

Growth promotion activity（% of control）
Concentration（㎍ / ㎖）
5505005000
103±18106±11109±8*
144±9**
81±1690±1788±13105±992±2298±797±15112±6*
97±11102±9101±1393±1878±381±978±1083±596±1793±1585±1191±13Table 2. Human dermal papilla cell cycle promotion activity of the Erica
multiflora extract. Human follicular dermal papilla cells (HFDPCs) weresubcultured at density of 4 x 105 cells in collagen type I-coated 100 mmdish. After overnight culture, HFDPCs were starved for 48 h, and thenthe cells were treated with the Erica multiflora (500 ㎍ / ㎖ ) for 12, 24,
36 and 48 h. The treated cells were harvested and washed with PBS,
and then fixed in 75% Ethanol. The fixed cells were evaluated about cell
cycle status using Guava cell cycle system according to themanufacture's instructions. Cont. means control.

12h
24h
36h
48h

Cont.
Extract
Cont.
Extract
Cont.
Extract
Cont.
Extract

G0/G1
72.6%
68.5%
69.2%
77.7%
74.4%
76.2%
75.6%
79.7%

− 20 −S
4.9%
4.8%
6.8%
3.1%
6.0%
4.7%
4.4%
4.3%

G2/M
8.2%
10.0%
7.8%
7.2%
6.0%
7.3%
8.9%
5.4%

地中海アロマ植物からの白髪予防生理活性物質の探索およびその機能探索Figure 2. Hair growth effect of the Erica multiflora extract. A, Skin surface hair growth was detectedon the dorsal skin of mice injected with the Erica multiflora extract. Seven-seek-old male C3H/He
mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of pentobarbital and dorsal hair shafts
were trimmed to maintain the telogen phase. Erica multiflora extract (+sample) or PBS (control)
was injected subcutaneously into the trimmed telogen phase skin (n=5 in each group). B, On thereverse side of the skin. After gray color skin was detected, their skin was isolated and the reverse
side was photographed to evaluate anagen induction. C, Hair growth score. The hair growth wasevaluated by the skin reverse side gray or black colored area (%).

Figure 3. E. multiflora の画分成分が B16 メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響
B16 メラノーマ細胞を 100-mm ディッシュに 5.0×105 cells/dish の濃度で播種し、一晩培養後、E. multiflora メタノール抽出物を酢酸エチル層、ブタノール層また水層に分配したサンプルを 1 ㎍ / ㎖の濃度で添加し、72 時間後のメラニン産生量を測定した。

− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009（A）（B）

Figure 4. E. multiflora の分離成分が B16 メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響（A）メラニン産生量（B）細胞生存率
B16 メラノーマ細胞を 100-mm ディッシュに 5.0×105 cells/dish の濃度で播種し、一晩培養後、E.
multiflora メタノール抽出物の酢酸エチル層を分離した 15 画分をそれぞれ 1 ㎍ / ㎖の濃度で添加し、72 時間後のメラニン産生量及び細胞生存率を測定した。
（A）

（B）

Figure 5. E. multiflora メタノール抽出物の酢酸エチル層分離画分 2 が B16 メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響（A）メラニン産生量（B）細胞生存率
B16 メラノーマ細胞を 100-mm ディッシュに 5.0×105 cells/dish の濃度で播種し、一晩培養後、E.
multiflora メタノール抽出物を酢酸エチル層、ブタノール層また水層に分配したサンプルを 1 ㎍ /㎖の濃度で添加し、72 時間後のメラニン産生量を測定した。n=3、**P ＜ 0.01 vs control

Erica multiflora 抽出物による発毛促進効果は発毛周期の促

２）Sassi AB, Harzallah-Skhiri F, Bourgougnon N, et al.:

進、或いは発毛周期の休止期（telogen phase）から成長Antiviral activity of some Tunisian medicinal plants期（anagen phase）への誘導によるものだと思われる。

against Herpes simplex virus type 1. Nat Prod Res., 22(1): 53-65, 2008

E. multiflora はメラニン産生促進物質を含むと示唆されたことから、その活性物質を同定するために E. multiflora３）Harnafi H, Bouanani Nel H AM, Serghini CH, etをメタノールにて抽出、さらに分配・分離して得られた画

al.: The hypolipidaemic activity of aqueous Erica

分についてメラニン産生促進活性を評価した。その結果、multiflora flowers extract in Triton WR-1339 induced

活性物質は E. multiflora メタノール抽出物の酢酸エチル層

hyperlipidaemic rats: a comparison with fenofibrate. J.
Ethanopharmacol., 109 (1): 150-160, 2007から分離された画分にあることが明らかとなった。この画分による細胞生存率への影響は見られなかった。従って、

４）Bnouham M, Merhfour FZ, Legssyer A, et al.:

この画分にメラニン産生を顕著に促進する活性物質が含まAntihyperglycemic activity of Arbutus unedo,れると示唆された。

Ammoides pusilla and Thymelaea hirsute, Pharmazie.,
62 (8): 630-632, 2007

（参考文献）

５）Ohguchi K, Akao Y, Nozawa Y: Stimulation of

１）Kawano M, Imamura T, Isoda H: Methods formelanogenesis by the citrus flavonoid naringenin

searching and evaluating effective hair growth

in mouse B16 melanoma cells. Biosci. Biotechnol.

regulation factors from Tunisian samples. Journal of

Biochem., 70 (6): 1499-1501, 2006

Arid Land Studies 15: 443-446, 2006

− 22 −