リン過剰摂取によるラット腎臓における遺伝子発現変動の網羅的解析

中井東京大学大学院農学生命科学研究科緒雄治特任准教授

高リン食摂取時のラット腎臓における遺伝子発現変動を言
リンは、生体内でカルシウムに次いで 2 番目に多く網羅的に解析することにより、高リン食摂取時の生体応含まれるミネラルであり、骨などを形成するのに必須で答を遺伝子レベルで解明することを目的として行った。

ある。食品中にも植物性食品、動物性食品ともに豊富に含まれている。生物の体液中にもリン酸イオンとして存

実験方法

2−

在し、その多くは HPO4の形をとっている。ほぼ全て

1.

動物実験の食品に含まれているため、欠乏症状がでることはほと4 週齢の Wistar 系雄性ラット 10 匹を 7 日間の予備んどない。その一方で、近年、インスタント食品や清涼飼育後、平均体重がほぼ等しくなるように 2 群（各群 n

飲料水などに含まれるリンによる過剰摂取が問題となっ= 5）に分けた。1 つの群は AIN93G 食（リン含量としている。過剰摂取による症状としては骨成長不良や副甲て 0.3％）摂取群（C 群）、もう 1 つの群は高リン食（リ状腺機能の異常亢進などが知られている。
しかしながら、ン含量 1.2％）摂取群（HP 群）として、代謝ケージで意外なことにリン過剰摂取時の生体応答について、遺伝24 日間飼育した。飼料の組成は表 1 に示した。体重、子発現レベルでの解析は腎臓におけるオステオポンチ

摂餌量を測定するとともに、尿および糞を採取し、リン1)ンの発現上昇 、ナトリウム依存性リン酸トランスポーの出納試験を行った。糞は湿式灰化を行うことでミネラ

2)

ター（Npt / NaPi）IIa の発現低下 、大腿骨におけるルを抽出し、尿はそのまま希釈し、サンプルとして用い

receptor activator of nuclear factor- κ B ligand（RANKL）た。リン定量はホスファ C- テストワコーを用いて行っの発現上昇3)た。飼育終了後、ネンブタール麻酔下で頸動脈より採など数例の報告があるのみである。網羅血を行い、安楽死させた。また、採血後直ちに腎臓を的解析はほとんど行われていない。

採取し、右腎はリンおよびカルシウムの測定、左腎はそこで、本研究では、DNA マイクロアレイを用い、
表1Casein

飼料組成

Control diet (P: 0.3% )High-phosphorus diet (P: 1.2% )200200

L-Cystine

33Corn Starch397.486

357.936

Maltodextrin 10132132

Sucrose100100

Cellulose, BW2005050

Soybean Oil

7070

t-Butylhydoroquinonone

0.0140.014

Mineral Mix S10022G

3535

Vitamin Mix V10037

1010

Choline Bitartrate

2.52.5

KH2PO40.039.55

Total1000

11000

中井雄

治

DNA マイクロアレイ解析（後述）に供した。腎臓中の伝子の選抜は、DFW と相性がよいとされている Rank

ミネラルの測定は、糞同様湿式灰化を行った後、リンはproducts 法

糞と同様に、カルシウムは ICP 発光分光法で行った。動

上昇あるいは発現低下する遺伝子群において、どのよ物実験は、東京大学大学院農学生命科学研究科動物実験

うな機能持った遺伝子が多く濃縮されているかについ委員会の承認のもと、東京大学動物実験実施規則に従って、DAVID (http://niaid.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) のて行った。

gene functional enrichment analysis に よ っ て、Gene2.

Ontology（GO）に基づいて解析した。

マイクロアレイ解析5,6)

で 行 っ た。 次 に、HP 群 で 有 意 に 発 現凍結保存しておいた組織より TRIzol (Invitrogen) にて total RNA を抽出し、RNeasy mini kit (QIAGEN) にて結果total RNA を精製した。得られた total RNA をもとに、24 日間飼育した結果、C 群と HP 群の間に、体重・Affymetrix 社の 3’ IVT Express Kit を用いてターゲット摂餌量・摂水量いずれも有意差は認められなかった（表の調製を行った。GeneChip Rat Genome 230 2.0 にハイ2）。一方、当然のことながら、摂餌量から計算されたブリダイズを行い、Hybridization, Wash and Stain Kit

リン摂取量は HP 群で有意に高かった。また、解剖直前にて染色・洗浄後、スキャンして DNA マイクロアレイ

3 日間の糞と尿を採取し、リンの出納試験を行った（表データを取得した。DNA マイクロアレイ解析に供した３）。その結果、リンの吸収量、尿排泄ともに HP 群で検体は、腎臓中のリン含量を基に平均に近い 4 個体を有意に高い値を示した。しかし、吸収量から尿排泄を差選抜した。

し引いたリンの体内保留量については、HP 群でわずかに高い値を示したものの、有意な差としては認められなスキャンして得られたマイクロアレイデータ（CELかった。

ファイル）は、統計解析言語環境「R」（フリーソフトウェア ） お よ び Bioconductor (http://www.bioconductor.

解剖時に腎臓を体軸方向に切断し、断面を観察した結org/) よりダウンロードしたマイクロアレイデータ解果、HP 群において、皮質と髄質の境界付近に明確な石析用パッケージ群を用いて解析を行った。データは灰化が認められた（データ示さず）。図 1 に示したように、

Distribution free weighted method (DFW) ア ル ゴ リ ズ

腎臓中のリンおよびカルシウム濃度は HP 群で有意に高ム4)く、解剖時の所見が裏付けられた。

で正規化を行った後、サンプル間の階層的クラス腎臓中のリン含量を指標に、各群から平均に近い 4タリングを行った。C 群と HP 群で発現に差がある遺個体ずつを選抜し、DNA マイクロアレイ解析を行った。

体重、摂餌量、摂水量C群

HP 群

最終体重 (g)243.38 ± 4.67

236.75 ± 5.31

体重増加 (g / day)

4.87 ± 0.16

4.57 ± 0.11

摂餌量 (g / day)

15.75 ± 0.40

15.11 ± 0.21

P 摂取量 (mg / day)47.26 ± 1.20

181.27 ± 2.57*

摂水量 (g / day)19.00 ± 2.24

23.26 ± 0.80

階層的クラスタリングの結果、C 群、HP 群それぞれが明確なクラスタを形成し（図 2）、C 群と HP 群で腎臓における遺伝子発現プロファイルが大きく異なっている
35

データは平均±標準誤差 (n =5) で示した。*: p < 0.05

表3

リン出納試験C群

HP 群

A. 摂取量 (mg / day)

53.94 ± 1.81

197.95 ± 3.51*

B. 糞排泄 (mg / day)18.82 ± 0.87

30.89 ± 1.04*

35.13 ± 1.39

167.06 ± 2.62*

4.68 ± 1.10

133.11 ± 3.08*

C. 吸収量 (mg/day)[A － B]D. 尿排泄 (mg / day)
E. 体内保留量 (mg / day） [C － D]

30.45 ± 0.74

33.95 ± 2.53

吸収率 (% )[C / A]

65.10 ± 1.19

84.41 ± 0.30*

体内保留率 (% )[E / A]

56.59 ± 1.49

17.16 ± 1.24*

C群
ＨＰ群
＊＊＊

30

腎臓乾燥重量１g あたりの含有量 (mg)表2＊＊＊2520151050

図1CaP

腎臓中のカルシウムおよびリン含有量***: p < 0.001

データは平均±標準誤差 (n =5) で示した。*: p < 0.052リン過剰摂取によるラット腎臓における遺伝子発現変動の網羅的解析

い遺伝子は 646 個であった。これら発現変動遺伝子にことが明らかとなった。
次に、Rank products 法によって C 群と HP 群で発現ついて、GO Biological Process のアノテーションに基づの異なる遺伝子を抽出した。False discovery rate（抽出き gene functional enrichment analysis を行った結果はした遺伝子セットにおける擬陽性の割合）が 0.05 未満

表 4 に示した。発現上昇した遺伝子セットには、オスである遺伝子を有意に発現が異なるとした。その結果、テオポンチンを含む Ossification（骨化）、炎症・免疫関HP 群で発現が高い遺伝子は 981 個、HP 群で発現が低連の GO term などが顕著に濃縮されていた。一方、発現低下した遺伝子セットでは、カルボン酸代謝に関わる
GO term が濃縮されていたが、具体的な機能を示す GOterm はほとんど抽出されなかった。
考察
通常飼料の 4 倍量のリンを含む高リン食で 24 日間飼育しても、体重や摂餌量・摂水量はコントロール食と有意差がなかったことから、今回の条件（リン含量・飼育期間）はラット全体の代謝に大きな影響を及ぼすほど厳しいものではなかったといえる。このことは、リン体内保留量に有意差が認められなかったことからもわかる。
しかしながら、HP 群では飼育期間中に大量のリンが吸収され、かつ排泄されていたことから、大量のリンがラット体内を通過したことになる。保留量に差が認められな
図2

くとも、多くのリンが体内を通過することによって、顕DNA マイクロアレイの階層的クラスタデンドログラム著な石灰化は認められた。従って、今回の条件でも、高スケールはクラスタ間の距離を表す。
表4

発現変動遺伝子中に有意に濃縮された主な GO term ( p < 0.05)

高リン食で高発現GO-ID000237600071650007249

GO term

1.83E-04

Signal transduction
I-kappa B kinase / NF-kappa B cascade
Antigen processing and presentation

0006955

Immune response

00508960002526
000695300516740006817

p -value
2.09E-27

Immune system process

00198820006958

FDR-corrected

3.26E-02
1.05E-06
1.32E-23

Complement activation, classical pathway

1.60E-03
9.43E-18

Response to stimulus

5.68E-08

Acute inflammatory response

8.38E-03

Acute-phase response

1.71E-05

Localization of cell

2.14E-06

Phosphate transport

0032502

Developmental process

1.10E-120001503

Ossification

8.37E-03

高リン食で低発現GO-ID
0019742

GO term

FDR-correctedp -value
1.16E-03

Carboxylic acid metabolic process

3

中井雄

治

診断は今後重要となってくるであろう。

リン食摂取による表現型の変化は確認できており、高リン食摂取が遺伝子発現に及ぼす影響は十分解析可能であると考えた。

要

約

事実、DNA マイクロアレイデータの階層的クラスタラットに高リン食を 24 日間投与し、腎臓における遺リングの結果、C 群と HP 群はそれぞれ明確なクラスタ伝子発現プロファイルの変化を、DNA マイクロアレイを形成し、両者の遺伝子発現プロファイルが大きく異なを用いて解析した。高リン食摂取によって体内のリン保ることが示された。Rank products 法によって抽出され留量は増大しなかったが、吸収量・排泄量ともに顕著にた発現変動遺伝子には、これまで報告のあったオステオ増大し、生体内を大量のリンが通過していたことが明ら

1)2)や NaPi-IIa などが含まれ、本実験系の妥当かとなった。高リン食摂取群では腎臓に明確な石灰化が性が示唆されている。また、GO term として骨化が抽出認められた。DNA マイクロアレイによる解析では、高され、オステオポンチン以外にも多くの遺伝子が協調しリン食摂取群の腎臓において、石灰化に関わる遺伝子群て石灰化に寄与している可能性が示唆された。炎症・免だけでなく、炎症・免疫に関わる遺伝子群が顕著に発現疫に関わる遺伝子群も抽出された。石灰化に起因する炎上昇していることが明らかとなった。摂餌量や体重に影症が起きていることも考えられるが、詳細については今響を与えない程度の高リン食でも、遺伝子発現プロファ

後個々の遺伝子レベルや組織学的な解析で明らかにしたイルには変化を与えることが明らかとなった。

ポンチン

い。
本研究では、われわれがこれまで構築してきたニュー謝辞本研究を遂行するにあたり、助成金を賜りました財団

トリゲノミクス的手法を適用することによって、現代的法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

食生活で起こりうるリン過剰摂取状態をラットモデルで解析することができた。今後、他の組織についても精度の高いマイクロアレイ解析を行うことにより、高リン食文

献摂取時の新たな生体応答の発見が期待できる。
また、個々

1）H. Matsuzaki, et al., : J. Clin. Biochem. Nutr ., 41, 179-183, 2007.の遺伝子発現変動を詳細に解析中であるが、将来的には

2）Y. Tani, et al., : J. Clin. Biochem. Nutr. , 40, 221-228, 2007.
3）S. Katsumata, et al., : Br. J. Nutr., 94, 666-674, 2005.

リン過剰摂取状態を早期に診断できるようなバイオマー

4）Z. Chen, et al., : Bioinformatics , 23, 321-327, 2007.

カーの開発につながることも期待できる。食生活の質的5）R. Breitling, et al., : FEBS Lett. 573, 83-92, 2004.

変化によるリンの過剰摂取などは自覚症状として現われ

6）K. Kadota, et al., : Algorithms Mol. Biol . 4: 7, 2009.

ないことが考えられ、このようなバイオマーカーによる4