皮膚の老化予防を目的としたコラーゲンのAGE化阻害物質の探索

熊本大学医学薬学研究部

藤 原章 雄e

N - (carboxymethyl) lysine (CML) is a advanced glycation end-products (AGEs) that was known as one of major AGEs
in hydrolysate of glycated collagen. Subsequently, CML was also detected in human serum, and its level in patients withdiabetes was found to be higher than in normal subjects. Furthermore, it is known that AGE-collagen induces apoptosis
in fibroblasts through activation of reactive oxygen species and MAP kinases. Therefore, treatment with AGEs inhibitors
may be a potential strategy for the prevention of clinical diabetic complications and skin aging. In the present study, weinvestigated the inhibitory effect of natural compounds on CML formation to discover the candidate agents for the newAGE inhibitors. In this screening, rutin, astragalin, quercetin and gallic acid showed significant inhibitory effect on CML
formation during incubation of collagen with ribose, thus those compounds may be candidates for the new AGE inhibitors.

3）

１．緒の現象は骨粗鬆症の原因の一つであると考えられている 。

言

また、コラーゲンの CML 化は、表皮に存在するケラチノ

我々は、当研究室が保有する天然化合物ライブラリーをサイト（角化細胞）の遊走やコラーゲンへの接着能を低下用いて、健康維持や疾病予防に有効な「機能性天然薬物」させることから、糖尿病患者における創傷治癒の遅延には、の探索研究を行っており、これまでに、抗動脈硬化作用をコラーゲンの CML 化が関与していることが示唆されてい有するトマト新規配糖体や、メタボリックシンドロームをる 。

改善するリンゴ由来トリテルペン、高血圧を予防する杜仲1）

4）

コラーゲンは、皮膚の真皮において線維芽細胞から産生され、真皮の 70％以上を構成するタンパク質であり、こ葉由来イリドイド配糖体などを発見してきた 。
さらに近年、この研究の一環として、糖尿病合併症や動のコラーゲンが線維芽細胞に引っ張られることで肌の張り脈硬化症、皮膚老化などの老化性疾患の発症や進展に関与が保たれている。しかし、CML がコラーゲンに蓄積すると、する Advanced glycation end products（AGEs）の生成をCML 化コラーゲンが RAGE（receptor for AGE）を介し阻害する天然化合物の探索を行っている。AGEs とは、還て Caspase 経路や MAP kinase 経路を活性化し、線維芽細元糖とタンパク質の非酵素的な反応であるメイラード反応胞をアポトーシスさせることが報告されているによって生じる最終生成物の総称であり、このメイラード

わち、AGEs は線維芽細胞のアポトーシスを誘導すること

反応は、グルコースなどの還元糖とタンパク質のアミノによって肌の張りの低下といった皮膚老化を促進すると考基が反応してアマドリ転位物を形成する前期反応と、アえられる。

3, 5）

。すな

マドリ転位物が酸化、脱水、縮合、転位などの反応を経そこで、本研究では、皮膚老化予防に対する新たなターて、AGEs 構造体へと変化する後期反応からなる。現在、ゲット分子として CML に注目し、当研究室が保有する天AGEs 構造体としては、約 20 種が知られており、その中然化合物ライブラリーを用いて、CML 生成阻害化合物のeでも主要な AGEs 構造体である N（carboxymethyl）
lysine探索を行った。

（CML）は、糖尿病合併症の病変部位や動脈硬化巣のみな

２．実験方法らず、肺線維症の肺胞マクロファージなどでも蓄積する
2）ことが報告されている 。さらに、コラーゲンに生成する

２-１．試験化合物

CML と病態との関連についても、様々な報告がなされて本研究で用いた天然物化合物は、当研究室が保有するラおり、例えば、CML 化コラーゲンは骨を形成する骨芽細イブラリー化合物に含まれる代表的な植物由来二次代謝産胞のアポトーシスを誘導することで骨形成を阻害し、こ物（アルカロイド、テルペノイド、フラボノイドなど）であり、計 96 種を選出して用いた。

Search for natural compounds inhibiting
AGE formation for preventing skinaging

２- ２．CML 生成阻害試験

Yukio Fujiwara型コラーゲン（1.5 mg/ml）の混合溶液を 37℃で７日間イン

Department of Cell Pathology, Graduate
School of Medical and PharmaceuticalSciences, Kumamoto University

リボース（30mM）とゼラチン（２mg/mL）もしくは、Ⅰキュベートすることで CML が生成する条件下に、DMSOに溶解した天然化合物（100 mM）を添加し、CML 生成に− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

対する阻害作用を、抗 CML 抗体を用いた ELISA 法にて評３．結価した。

果

３-１．CMA 生成阻害作用を有する天然化合物のスクリーニング

２- ３．ELISAELISA に よ る CML 含 量 の 評 価 は、Nagai ら の 方 法 に1 次スクリーニングとして、リボースとゼラチン（可溶準じて行った 。リボース - ゼラチン（10 mg/ml）を 96 穴性コラーゲン）を用いた CML 生成阻害試験系にて、96 種プレートにコーティングし、0.05%Tween 20 を含む PBSの天然化合物の CML 生成阻害作用を評価した。方法とし（washing buffer）で３回洗浄後、0.5% ゼラチンにてブロては、リボース（30 mM）とゼラチン（２mg/mL）の混合ッキングを行った。各 well を washing buffer で洗浄し、抗溶液を 37℃で７日間インキュベートすることで CML が生

CML 抗体（6D12）を添加後、１時間インキュベートした。

成する条件下に、天然化合物（100 mM）を添加し、CML 生

各 well を洗浄後、HRP 標識抗マウス IgG 抗体と１時間イ成に対する阻害作用を、抗 CML 抗体を用いた ELISA 法にンキュベートし、最後に OPD にて発色反応後、1M の硫酸て評価した。その結果、rutin, astragalin, chlorogenic acidにて反応を停止した。各 well の 492nm における吸光度をを含む 10 種の化合物が有意な CML 生成阻害試験作用を示

micro-ELISA plate reader により測定した。

した（Fig. 1A）。次に、2 次スクリーニングとして、リボ6）ースとⅠ型コラーゲンを用いた CML 生成阻害試験系にて、２- ４．繊維芽細胞の 3 次元培養

１次スクリーニングで阻害作用の認められた 10 種の化合ヒト真皮線維芽細胞は、JCRB 細胞バンクより購入した。
5物の効果を同様に評価した。その結果、rutin, astragalin,ヒト真皮線維芽細胞（4.0×10 cells/well）を培地で懸濁さquercetin, gallic acid の４種類の化合物に顕著な CML 生成せた溶液に、Ⅰ型コラーゲン溶液を加え、培養チャンバー阻害作用が認められた（Fig. 1B and C）。

内で培養することで、Ⅰ型コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋した。２日後、凝固したマトリックスを培養チャンバーより剥離し、８日間培養後することで、正常に３- ２．線維芽細胞の三次元培養を用いた皮膚老化予防作用の検討収縮するマトリックスを形成させた。

肌の張りは、真皮中に存在する線維芽細胞がコラーゲンを引っ張ることで保たれている。通常、正常なコラーゲン

２- ５．ウエスタンブロット法

マトリックス中で線維芽細胞を培養すると、線維芽細胞ウエスタンブロットによる MAP キナーゼの活性化の評

がⅠ型コラーゲンを引っ張り引き締めることで弾力のあ5）価は、これまでの報告に準じて行った 。37℃で７日間イる真皮類似構造を形成し、マトリックスの収縮が観察されンキュベートした各種コラーゲン溶液（Ⅰ型コラーゲン溶るが、CML 化コラーゲンマトリックス中では、その収縮液、リボース -Ⅰ型コラーゲン溶液、天然化合物を添加し率が低下する。そこで、上記のスクリーニングで得られたたリボース - Ⅰ型コラーゲン溶液）にて、３時間刺激した４種（rutin, astragalin, quercetin, gallic acid）の CML 生成

ヒト真皮線維芽細胞を回収し、lysis buffer を用いて細胞阻害化合物を添加したコラーゲンを用いて、マトリックスを溶解させた。電気泳動には、10％ポリアクリルアミドゲの収縮に対する効果を検討した。方法としては、ヒト真ルを用いた。また、一次抗体は、Rabbit monoclonal anti-皮線維芽細胞（4.0×10 cells/well）を培地で懸濁させた溶

5Phospho-p38 antibody, Rabbit polyclonal anti phospho-液に、Native-collagen 溶液、CML-collagen 溶液（ribose と（JNK1 + JNK2）antibody, Mouse monoclonal anti-b-actin

native-collagen の混合溶液を７日間インキュベートしたもantibody を用いて行った。の）もしくは、CML 生成阻害化合物で処理した collagen 溶液（CML-collagen を調製する条件下に CML 生成阻害化合２- ６．免疫組織化学染色物を添加したもの）を加え、培養チャンバー内で培養する

37℃で７日間インキュベートした各種コラーゲン溶液

ことで、コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋した。

（Ⅰ型コラーゲン溶液、リボース - Ⅰ型コラーゲン溶液、天２日後、凝固したマトリックスを培養チャンバーより剥離然化合物を添加したリボース - Ⅰ型コラーゲン溶液）にてし、８日間培養後に収縮したマトリックスの直径を測定す刺激したヒト真皮線維芽細胞を４％パラホルムアルデヒドることで評価した。その結果、CML-collagen を用いたマにて固定後、パラフィンにて包埋した。続いて、パラフィ

トリックスでは native-collagen を用いた場合に比べて、そン切片を作製後、定法により抗 CML 抗体（6D12）およびの収縮率が低下し、その収縮率の低下は、CML 生成阻害

Rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-3 antibody を用い化合物により改善された（Fig. 2）。
前述したように、rutin, astragalin, quercetin, gallic acid

た免疫染色を行った。

は、コラーゲンの CML 化により低下したマトリックスの− 28 −皮膚の老化予防を目的としたコラーゲンの AGE 化阻害物質の探索

Fig. 1 Effect of Natural compounds on CML formation.（A）Gelatin（2 mg/mL）and ribose（30 mM）
were incubated with natural compounds（100μM）in 100 mM sodium phosphate buffer at 37℃ for 7days.（B）TypeⅠ collagen（1.5 mg/mL）and ribose（30 mM）were incubated with natural compounds（30μM）in 100 mM sodium phosphate buffer at 37 ℃ for 7 days. The CMA content was determined bynoncompetitive ELISA.（C）Structures of natural compounds inhibiting CML formation. Data arepresented as the mean±SD. *, P < 0.01, **, P < 0.001 vs. control.

Fig. 2 Effect of Natural Compounds on Contraction of Collagen Matrix. Fibroblasts（4.0×104 cells/well）were cultured in type Ⅰ collagen matrix for 12 days. Data are presented as the mean±SD. #, P
< 0.005 vs. Native-collagen, *, P < 0.005 vs. CML-collagen.

収縮率を改善したため、その改善作用が CML 生成阻害作したところ、CML 化コラーゲン中では、線維芽細胞の形用によるものであるかを確認するために、マトリックス中態が丸くなり、Native collagen と比較して、明らかに細胞の CML 含量を、抗 CML 抗体を用いた免疫染色により評死が誘導されていた（Fig. 4）。一方、CML 生成阻害化合価した。その結果、マトリックスの収縮率が低下したコン物（rutin, astragalin, quercetin, gallic acid）を添加したマトロールでは CML の蓄積が確認され、その蓄積は、rutin,

トリックス中の線維芽細胞は、Native collagen と比較してastragalin, quercetin, gallic acid の添加により抑制されて変化の無い正常な形態であった（Fig. 4）。さらに、カスパいた（Fig. 3）。ゆえに、rutin, astragalin, quercetin, gallicーゼ３の活性化を免疫染色により評価したところ、CML-acid によるマトリックス収縮改善作用は、これら化合物のcollagen では、カスパーゼ３は活性化しており、その活性CML 生成阻害作用によることが示唆された。また、マト化は CML 生成阻害化合物により抑制された（Fig. 5）ゆえリックス中の線維芽細胞の形態を、HE 染色によって確認に、CML 生成阻害化合物によるマトリックスの収縮率の− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

Fig. 3Fig. 4

CMA Accumulation in Collagen Matrix.

HE Staining of Fibroblasts in Collagen Matrix.

Fig. 5

Caspase-3 Activation in Collagen Matrix.

− 30 −

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改善は、それら化合物がコラーゲンの CML 化を阻害した線維芽細胞の三次元培養において、コラーゲンの CML 化ことで線維芽細胞のアポトーシスが抑制されたためであるに伴うコラーゲンマトリックスの収縮率の低下を改善しことが示唆された。

た。その理由として、CML コラーゲンのマトリックスでは、線維芽細胞のアポトーシスが起こるためマトリックスの収３- ３．CML 生成阻害化合物による線維芽細胞のアポトーシス抑制メカニズム縮率の低下が引きおこされたが、CML 生成阻害化合物で次に、CML 生成阻害化合物が線維芽細胞のアポトー抑制されたため、マトリックスの収縮率の改善が認められシスを抑制するメカニズムを解明することにした。CMLた。また、そのアポトーシス抑制メカニズムは、CML コ化タンパクは、RAGE を介して JNK や p38 などの MAPラーゲンにより活性化される MAP kinase（JNK, p38）経kinase を活性化することで、細胞をアポトーシスに導くこ路の抑制によるものであった。つまり、CML 生成阻害化とが報告されている。そこで、本研究では、CML 化コ合物は、コラーゲンの CML 化を抑制することで、CML-ラーゲンによる p38 および JNK の活性化に対する CML 生

collagen により誘導される JNK および p38 の活性化を抑成阻害化合物の効果を検討した。方法としては、ヒト真制し、結果的に線維芽細胞のアポトーシスを抑制したた皮線維芽細胞に CML-collagen または CML 生成阻害化合物

め、三次元培養におけるマトリックスの収縮率の低下を改で処理したコラーゲンを３時間添加後の phosphorylated-善したものと考えられた。本研究において、４種の天然由JNK および phosphorylated-p38 の発現量をウェスタンブ来化合物（rutin, astragalin, quercetin, gallic acid）が有すロット法にて評価した。その結果、CML 生成阻害化合物は、る皮膚老化改善作用および、その作用メカニズムを解明しコラーゲンの CML 化による p38 および JNK の活性化を顕たことで、CML が皮膚老化改善作用における新たなター著に抑制した（Fig. 6）。ゆえに、CML 生成阻害化合物は、ゲット分子として重要であることが示された。さらに、本

コラーゲンの CML 化を抑制することで、CML-collagen に研究では CML-collagen が引き起こすと考えられる病態やより誘導される JNK, p38 の活性化を抑制し、結果的に線老化症状のうち、特に皮膚老化に注目して研究を行ったが、維芽細胞のアポトーシスを抑制することで、三次元培養にCML-collagen は皮膚老化のみならず骨粗鬆症や糖尿病合おけるマトリックスの収縮率の低下を改善したものと考え併症の原因物質であるとも考えられているため、今後さらられた。に CML の生体に及ぼす影響が明らかになることで、CML3, 5）

4．考処理したマトリックスでは、線維芽細胞のアポトーシスが阻害剤の重要性が高まり、本研究で得られた知見や CML察阻害化合物の社会的利用価値が高まることが期待される。

一次スクリーニングにより得られた 10 種の CML 生成阻
害化合物について、Ⅰ型コラーゲンを用いた二次スクリー

謝辞

ニングを行ったところ、rutin, astragalin, quercetin, gallic

当該研究テーマおよび関連テーマの実施に際して、グラacid の４種の化合物が、顕著な CML 生成阻害作用を示しントサポートを賜りました財団法人コスメトロジー研究振た（Fig. 1）。また、これら４種の CML 生成阻害化合物は、興財団に深謝致します。

Fig. 6 Effect of Natural Compounds on MAP kinase（p38, JNK）Activation. Human dermal fibroblasts
were incubated for 3 hours with 400μg/mL CML-collagen, unmodified collagen or natural compounds（30μM）-treated collagen. The phospholyration of p38 and JNK were analyzed by westernblotting
analysis.

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