グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討-第２報-〇佐々野僚一、島三記絵、小西賢治、斎藤勲（株式会社アイスティサイエンス）【目的】
演者らはメタノール-水（1/1）で抽出を行ったグリホサートおよびグルホシネートの分析法の自動化を報告したが、目的農薬の水溶性が高いことから、水抽出を行っている分析例も多く報告されている。しかしながら、水抽出のみで固相に通すと、目詰まりを起こすことがある。そこで、本研究では水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする一連の流れの抽出法を検討した。また、測定におけるマトリックスの影響についても調査した。それらの結果を基にほうれん草と大豆を用いて添加回収試験を行い、良好な結果を得られたので報告する。

図１ 前処理フロー【方法】
１．装置および条件
前処理装置：全自動固相抽出装置 ST-L400（アイスティサイエンス）
固相カートリッジ：Smart-SPE シリーズ（アイスティサイエンス）
測定装置：UHPLC(Nexera X2)及び LCMS-8045 (島津製作所)【LC 条件】分析カラム：TSKgel

SuperIC-AP（4 級アミン基）,（4.6 mmID × 75 mm）

移動相 A 液：2 mM ギ酸アンモニウム-水B 液：0.5 ％ ギ酸-水
流速：0.8 mL/min
グラジエント：B.Conc 5 ％(0.5 min)→95 ％(2-11 min)→5 ％(12-14 min)
注入量：5 µL
カラム温度：40 ℃【MS 条件】
イオン化モード：ESI positive
ネブライザーガス流量：3 L/min
ドライングガス流量：10 L/min
ヒーティングガス流量:10 L/min
インターフェース温度：400 ℃
DL 温度：150 ℃
ヒートブロック温度：350 ℃

２．実験方法
試料 10 g（穀類 2 g）を 50 mL 用の遠沈チューブに採取し、その試料の水分量と合わせて約 25 mL になるように水を添加し、振とうして水抽出（※1）を行った。続けて、全駅量が 50 mL になるようにアセトニトリルを添加して、5 分間静置後、遠心分離し、除タンパク（※2）を行った。次にその抽出上澄み液を 0.5 mL 分取し、水を 1.5mL 添加して試料液とし、前処理装置で精製（詳細は前回報告：参考資料 1））を行った。

抽出液 50 mL

図 2 前処理フロー【結果および考察】
１． タンパク質除去効果の確認実験
アセトニトリル添加によるタンパク除去効果を確認することを目的として、前処理
フローの水抽出したところで遠心分離し試料の固形物を取り除いた。そして、その上澄み液 3mL を 15mL の遠沈チューブに分取し、アセトニトリル 3mL を加え、5 分間静置後、遠心分離した。

① 水抽出液から 3mL 分取② アセトニトリル 3mL を加え
5 分間静置③ 遠心分離後

図 3 前処理フロー
アセトニトリルを加えたところで、一時すると、変性したタンパク質が析出してきた（写真図 3-②）。次に遠心分離し、変性したタンパク質が下に沈殿した（写真図 3-③）。
これらの結果から、アセトニトリル添加による除タンパクの効果の確認ができた。本法の場合、遠心分離により、試料の固形物と変性したタンパク質が一緒に下に沈殿していると考えられる。
２．連続測定におけるマトリックスの影響
スタンダードと添加試料の再現性を確認するために各々を連続的に測定したところ、添加試料において数回目から急にピーク面積値が上昇しその後安定し、さらにその直後のスタンダードも高い値で推移したが、同じように数回目から元の面積値に戻るという現象がみられた。そこで、スタンダードと添加試料を数回ずつ連続測定し、その挙動の確認を行った。その結果、ほうれん草のグルホシネートにおいて、先に述べた現象が再現された（図 4-上）。添加試料を測定し始めて、4 回目でピーク面積値が上昇し、そして、その直後のスタンダードも高いピーク面積を得るが、4 回目には元の値に戻った。これにより、添加試料に含まれている何らかのマトリックスが LC カラムからの溶出に 4 測定分かかり、その 4 測定目の溶出されるときにちょうどグルホシネートと重なり、エンハンス効果を起こして、ピーク強度が上昇しているものと考えられる。しかしながら、大豆は影響を受けておらず、ほうれん草由来のマトリックスの影響と思われる。その対策として、測定順序において試料抽出液をダミーとして 4 回以上測定し、続けて試料測定を行い、最後に検量線用のスタンダードを 3 測定内に行う。または、マリックス検量線を使用する。今後の課題として、マトリックスを取り除くための前処理条件の検討が挙げられる。
表 1 連続測定におけるマトリックスの影響■ほうれん草試料名順番
12
スタンダード
3バイアル
45ppb
56789
添加試料
10バイアル
115ppb121314151617
スタンダード18バイアル
195ppb202122

■大豆
試料名

順番
1
スタンダード2バイアル
310ppb
456
添加試料
7バイアル
810ppb91011
スタンダード 12バイアル
131410ppb
15（面積値）

GLU
44,79848,084
48,18348,86347,86049,942
46,884
46,59046,13369,041
63,70367,60968,65370,38175,18070,07865,65048,92050,27054,42750,28750,468GLY
34,30534,88037,13936,05534,96035,93336,17538,53935,96837,05337,022
39,64437,68037,86137,37436,67836,31336,131
36,25937,24836,444
36,144（面積値）■ほうれん草スタンダード

添加試料

スタンダード

測定順番
（面積値）

■大豆

（面積値）

GLU
93,87891,974
94,05092,157
93,154
94,712
94,80897,48399,02995,903
97,96997,303
97,481
95,35997,390GLY
68,66974,62371,563
72,34378,513
79,19078,56577,80678,25976,937
72,901
72,592
71,81974,19273,798

測定順番

図 4 連続測定におけるマトリックスの影響
上：ほうれん草,下：大豆３．多段階添加回収試験
ほうれん草と大豆を用いて多段階添加回収試験を行った。ほうれん草および大豆における基準値がほうれん草：GLY 0.2／GLU 0.1, 大豆：GLY 20／GLU 2 ppm であることから、ほうれん草：0.1ppm, 大豆：1ppm 添加することとした。添加位置は抽出前（通常の添加）、抽出後、前処理後の段階に分けて添加した。また、連続測定におけるマトリックスの影響を考慮して、測定順序は未知試料を 6 回連続で分析し、その最初の 4 回はダミーとして測定結果には入れず、続けて添加試料を測定していき、最後にスタンダードを測定した。そのピーク面積値を表 2 に示す。
表 2 多段階添加回収試験結果（面積値）■ほうれん草■大豆（ピーク面積値）

試料名

No.

GLU

U1-01-82（ピーク面積値）
試料名

GLY

No.
U1-01

194

未知試料GLU

GLY-176

181

U1-028147

Ave.

-168

328

前処理後添加

K1-01

88,16072,52036,972（試料中:1ppm）

K1-0287,32070,42564,57437,644（バイアル中:10ppb）

Ave.

87,74071,473C1-01

57,596

36,833

抽出後添加

C1-01

82,332

72,613（試料中：0.1ppm）

C1-02

62,797

37,173（試料中:1ppm）

C1-02

86,22371,939（バイアル中：5ppb）

Ave.

60,19737,003（バイアル中:10ppb）

Ave.

84,27872,276

A167,119

36,139A192,564

79,514

A266,622

37,112A2

94,57981,385

A369,725

37,349A393,280

81,201

A464,684

37,669A495,624

78,931

A568,952

39,422

A590,239

82,037

Ave.

67,42037,538Ave.

93,25780,614

RSD(%)

3.0

3.2

未知試料

U1-02

298

381

Ave.

216

575

前処理後添加K1-01

65,781

38,315（試料中：0.1ppm）

K1-02

63,367（バイアル中：5ppb）

Ave.

抽出後添加

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度：0.1ppm（バイアル中：5ppb）

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度:1ppm（バイアル中:10ppb）

RSD(%)

2.2

1.6

36,586

スタンダードS1-01

90,78474,66737,403バイアル中濃度

S1-0292,00275,02067,47536,995：10ppb

Ave.

91,39374,84433,304

18,245：5ppb

S245,102

37,658スタンダードS1-0170,192

バイアル中濃度

S1-0264,757

S1：5ppb

Ave.

S2：2.5ppb

S2

表 3 多段階添加回収試験結果（回収率）
ほうれん草, 0.1 ppm添加
添加位置

大豆, 1 ppm添加

GLU

GLY

GLU

GLY

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

抽出前（n = 5)

A/S

100

3.0

101

3.2

102

2.2

108

1.6

抽出後C/S

89ー

100ー

92ー

97ー

前処理後K/S

96ー

102ー

96ー

95ー

（単位, %）

S1-01. スタンダード：バイアル中濃度 5 ppb

A1. 抽出前添加試料：試料中濃度 0.1 ppm, バイアル中濃度 5 ppb

U1-01. 未知試料

1. グルホシネート

2. グリホサート

図 5 ほうれん草の添加回収試験で得られた MRM クロマトグラム

S1-01. スタンダード：バイアル中濃度 10 ppb

A1. 抽出前添加試料：試料中濃度 1 ppm, バイアル中濃度 10 ppb

U1-01. 未知試料

1. グルホシネート

2. グリホサート

図 6 大豆の添加回収試験で得られた MRM クロマトグラム

多段階添加回収試験による回収率の結果を表３に示す。ほうれん草および大豆とも良好な回収率（89～110 %）と再現性（RSD：5 %未満）の結果を得ることができた。
また、それぞれの MRM クロマトグラム（図 5, 6）もきれいなピークを得ることができた。ただし、大豆の抽出前添加試料のグルホシネートの MRM クロマトグラム
では、グルホシネートの前に夾雑物ピークが検出したが、未知試料ではそのピークが存在せず、その夾雑物の有無が不明であった。

【まとめ】
グリホサートおよびグルホシネートの分析法において、水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする一連の流れの抽出法を検討した結果、水溶性の高いグリホサートなどを効率よく抽出し、前処理に悪影響を及ぼすタンパク質を効率よく除去することがこれまでの抽出法を大きく変えることなく容易にできた。また、連続測定におけるマトリックスの影響について調査した結果、試料によっては、数回分の測定後にそのマトリックスの影響を受けて感度が変動することが分かった。現時点では、試料抽出液をダミーとして 4 回以上測定し続けて試料測定し、その直後にスタンダードを測定するか、マトリックス検量線を使用することで対応することとした。そして、ほうれん草と大豆を用いて本法による多段階添加回収試験を行った結果、回収率、再現性ともに良好な結果を得るこができた。
本抽出法と前処理の自動化を組み合わせることで、グリホサートおよびグリホシネートが簡便かつ精度よく分析できることが分かった。

【参考資料】
1) 小西賢治ほか：グリホサートおよびグリホシネートの分析の自動化の検討, 第 36
回農薬残留分析研究会講演要旨集, P110-124