妊娠期における食事時間が子の体内時計機能およびその発達に及ぼす影響に関する研究

守屋

東北大学大学院薬学研究科・細胞情報薬学分野

緒孝洋准教授に PER タンパク質の発現レベルは低下する。それによ言睡眠・覚醒やホルモン分泌など多くの生体機能は１日り CLOCK・BMAL1 タンパク質による転写活性化が再の中で変動しており、これらは体内時計によって制御さ開し、これらの転写・翻訳のフィードバックループがれている。哺乳類では、視床下部に存在する視交叉上約 24 時間で繰り返され、これが細胞内で概日リズムが核（Suprachiasmatic nucleus; SCN）が体内時計のセン形成される駆動力になるものと考えられている。一方、ターとしてはたらき、身体の様々な組織に細胞単位で存

CLOCK・BMAL1 タンパク質自身の発現も Rev-Erbαな在する末梢時計を階層的に制御することが最近の研究にどの働きによって日内変動するため、フィードバックより明らかになってきた。体内時計による時刻発振は細ループによる概日リズムはより頑強に形成されていると胞レベルで観察され、時計遺伝子と総称される一連の転いえる。

写調節因子によって構成される転写・翻訳のフィード

ところで体内時計が正常に働くためには、自身の位相バックループによって生み出されることが最近 10 年間を外界の時間と同調させる必要があるが、我々は、「食事」の研究によってわかってきた（図１）。すなわち、Per1が光に匹敵する強い同調因子として全身の体内時計をリおよび Per2 遺伝子のプロモーター上には転写因子認識セットすることを明らかにした １）。また、食事によるエレメントである E/E’ ボックスが存在し、これらのシ全身の体内時計の同調メカニズムの一部として、視床下スエレメントを介して CLOCK と BMAL1 タンパク質の部背内側核（Dorsomedial hypothalamic nucleus; DMH）ヘテロダイマーが Per 遺伝子の転写を活性化する。そが食事に速やかに反応することを報告したの結果、産生された PER タンパク質は核内に移行し、ち、Per 遺伝子の発現を指標にして、食事に反応するマCLOCK・BMAL1 タンパク質による転写を抑制し、次第ウス脳部位を網羅的に検索したところ、18 時間の絶食

図1

時計遺伝子による細胞自律的な概日リズム形成メカニズム
1２）

。すなわ

守屋孝

洋

後の給餌は、唯一、視床下部背内側核において Per1 及ウスをオーバーナイトで交配させ、Timed pregnant マび Per2 mRNA を一過的に上昇させ（図２）、この一過的ウスを作成した。交配直後からマウスを個別飼育し、焦な発現上昇が引き金として食事は DMH 時計を速やかに電型赤外線センサー（秋月電子製）によって 5 分ごと同調することを明らかにした。の自発運動量を 24 時間連続で記録した。マウスは実験を通して明暗サイクル（明期 12 時間、暗期 12 時間）

一方、体内時計は胎生期より働いていることが成長後下で飼育した。の行動リズムの解析から推定されていたが、時計遺伝子の発現解析により、マウスの体内時計は出生 3 日前には機能し始めていることが報告された３）。さらに最近、【制限給餌スケジュール】

我々は妊娠時の母の食事が胎仔の体内時計を強力に同調させることを見出し妊娠 7 日目の暗期開始 1 時間前から絶食させ、翌日（妊４）、子の体内時計の発達における食娠 8 日目）から、明期開始 5 時間後（zeitgeber time 5;事の重要性を明らかにした。しかしながら、妊娠中の食ZT5）から 9 時間後（ZT9）までの 4 時間の間だけ給事による子の体内時計の同調機構は十分に明らかにされ餌を行う制限給餌を 11 日間連続で行った。妊娠 19 日ていない。そこで本研究では、妊娠期の食事による子の目の ZT5 にエーテル深麻酔下でマウス胎仔を取り出し、体内時計同調作用における神経機構ならびに分子機構を胎仔脳を摘出した。対照群は実験期間を通して自由に摂明らかにすることを目的とした。

食させる自由摂食群とした。

実験方法【時計遺伝子 Per2・ルシフェラーゼ発光リズムの測定】

妊娠 19 日目に摘出したマウス胎仔脳からビブロスラ【妊娠および非妊娠マウスの行動リズムの測定】

マウスは時計遺伝子レポーター導入マウス（Period2::イサーを用いて SCN または DMH を含む厚さ 200μm

Luciferase knockin mice; Per2::Luc KI マウス）を用いた。雄の脳スライスを作成し、Millicell 膜上で長期器官培養を性 Per2::Luc ホモ KI マウスと雌性 Per2::Luc ホモ KI マ行った。培養直後から培養液にルシフェリン（0.1 mM）（A） mPer1 mRNA

対象群

食事１時間後（B） mPer2 mRNA

対象群

食事２時間後図２

成体マウスの視床下部背内側核における食事誘発性の mPer1 および mPer2 mRNA 発現上昇

成体の雄性マウスを前日の暗期開始 1 時間前より絶食させ、翌日の明期開始 5 時間後から給餌を行い、その 1 時間後（Ａ）または 2 時間後（B）に脳をサンプリングした。In situ hybridization 法（エマルジョン法）によって mPer1 および mPer2 mRNA 発現を可視化した。対照群の写真中の点線の囲みは視床下部背内側核（DMH）を示す。
DMH：Dorsomedial hypothalamic nucleus（視床下部背内側核）．VMH：Ventrolateral hypothalamic nucleus（視床下部腹外側核）．ARC：Arcuate nucleus（弓状核）．

2妊娠期における食事時間が子の体内時計機能およびその発達に及ぼす影響に関する研究を添加し、光電子増倍管（PMT）を検出器とした生物

記録開始から 24 ～ 48 時間後にあらわれるピーク位相

発光連続測定システムによって時計遺伝子 Per2・ルシが生体内でのリズム位相を反映していることが報告さフェラーゼ発光を記録した。時計遺伝子 Period2 の発れているので５）、このピーク位相を SCN あるいは DMH

現は、そのプロモーター領域に存在する転写因子応答の生体内でのリズム位相の指標とした。

配列 E-box を介して約 24 時間周期で制御されるため、

Per2::Luc ノックインマウス由来の組織培養からの生物結果および考察

発光を記録すると、約 24 時間周期の生物発光リズムが【妊娠および非妊娠マウスの行動リズムに対する制限給餌の影響】観察される。記録したデータから前後 24 時間の移動平妊娠および非妊娠マウスの行動リズムに対する制限給均値を減算し、detrended data を計算し、さらにコサイ

餌の影響を焦電型赤外センサーによって記録した自発運ナー法によって発光リズムの振幅、周期、位相を求めた。

動リズムの記録から解析した（図３）。自由摂食条件下(A) 非妊娠マウスa) 自由摂食群b) 制限給餌群(B) 妊娠マウスa) 自由摂食群b) 制限給餌群(C) 行動リズム（％ of 24 時間行動量）

図３

妊娠および非妊娠マウスの行動リズムに対する制限給餌の影響

非妊娠マウス（Ａ）および妊娠マウス（Ｂ）の行動リズムに対する制限給餌の影響．代表的な行動リズムのダブルプロットアクトグラムを示した。各アクトグラム上の上段の白黒カラムは明暗サイクルを、下段の黒カラムは制限給餌時間を表す。制限給餌は明期開始 5 時間後（ZT5）から明期開始 9 時間後（ZT9）までの 4 時間行い、妊娠 8.5 日目から妊娠 18.5 日までの 11 日間行った。対照群は自由に餌を与えた。
（Ｃ）サンプリング前日の行動リズムを 24 時間の行動量を 100%として表した。
3守屋孝

洋

では、妊娠および非妊娠マウスのいずれも暗期に行動レ時間周期の発光リズムを示したが、そのリズム強度はベルが高くなる夜行性型の行動リズムを示したが（図３

SCN に比較すると弱かった（図４Ｂ）（R2 係数＞ 0.66）。

Ａ、Ｂ）、非妊娠マウスの行動量が暗期後半に高くなる発光リズムのリズム周期について対照群と制限給餌群のに対して、妊娠マウスの行動量が暗期前半に高くなるの間に有意な差は観察されなかった（対照群；22.154

傾向が観察された（図３Ｃ）。

± 0.363 hr、制限給餌群；22.065 ± 0.005 hr）。一方、明期の 4 時間にのみ給餌を行う制限給餌は、妊娠おピーク位相については自由摂食群（対照群）および制限よび非妊娠マウスのいずれにおいてもその行動リズムは給餌群の間で有意な差が観察された。すなわち、対照群明期に集中する昼行性の行動リズムを惹起し（図３Ａ、の DMH のピーク位相は ZT21.6 に見られるのに対して、Ｂ）、その時間分布に、妊娠マウスと非妊娠マウスの間制限給餌群の DMH のピーク位相は ZT14.2 に観察されに顕著な差は認められなかった（図３Ｃ）。また、妊娠

（図４Ｂ、Ｃ）、制限給餌はピーク位相を 7.4 時間前進さおよび非妊娠マウスのいずれにおいても給餌開始時刻のせることが明らかになり、制限給餌は SCN よりも DMH2 時間前から行動レベルが上昇していることから（図３の体内時計を強く同調することがわかった。

Ｃ）、制限給餌による昼型の行動パターンは給餌自体によって受動的に惹起される生体応答ではなく、自律的な【胎仔と成体マウスの体内時計に対する制限給餌の同調作用リズムを発振する体内時計によって駆動されていることの比較】が考えられる。

本研究によりマウス胎仔脳において、母への制限給餌は SCN および DMH の体内時計の位相を変化させる効【時計遺伝子 Per2・ルシフェラーゼ発光リズムに対する制限果を示し、その同調作用は DMH に対してより強力にあ給餌の影響】

らわれることが明らかになった。

妊娠 19 日目（胎生 19 日目）に摘出したマウス胎仔

我々は成体マウスを対象にした研究により、SCN にの体重を計測したところ、自由摂食群と制限給餌群の間おける時計遺伝子の発現リズムは光刺激によってリセッに有意な差は認められなかった（data not shown）。しトされる一方６）７）、明期 4 時間の制限給餌によってはたがって、本研究で採用した制限給餌スケジュールはマ全く影響を受けないことを報告しておりウス胎仔の身体的発達に障害を及ぼさないことが確認で究で明らかになった胎仔マウスの SCN に対する同調効きた。

果と対照的である。成体マウスの SCN は網膜神経節細１）、これは本研

次に、胎生 19 日目のマウス胎仔脳から SCN を含む胞からの直接的な神経投射を受けているのに対して、胎脳スライスを作成し、Per2・ルシフェラーゼ発光リズ

仔 SCN は網膜からの神経投射も未完成であり、また網ムを 3 日間連続測定したところ、自由摂食群（対照群）

膜自身が十分に光感知能をもたないと考えられるため、および制限給餌群の母マウスから摘出した胎仔 SCN はこのような差異が SCN の食事に対する反応性の違いをいずれも約 24 時間周期の明瞭な発光リズムを示した（図生み出しているのかもしれない。母での食事がどのよ

2４Ａ）（R 係数＞ 0.800）。発光リズムのリズム周期にうなシグナル分子を介して胎仔 SCN を同調しているのついて対照群と制限給餌群の間に有意な差は観察されかについてはメラトニンやドパミンなどいくつかの候なかった（対照群；24.298 ± 0.990 hr、制限給餌群；補分子が考えられるが、今後、これらのシグナル経路

22.495 ± 0.845 hr）。一方、ピーク位相については自に関与する遺伝子の欠損マウスなどを用いて解明する

由摂食群（対照群）および制限給餌群の間で有意な差が必要がある。

観察された。すなわち、対照群の SCN のピーク位相は一方、DMH においては、食事は成体マウスおよび胎ZT14.3 に見られるのに対して、制限給餌群の SCN のピー

仔マウスに対しても同様に強力な同調作用を示すことがク位相は ZT9.8 に観察され（図４Ａ、Ｃ）、制限給餌はピー明らかになった。これは食事による DMH 時計の同調がク位相を 4.5 時間前進させることが明らかになった。

成体マウスおよび胎仔マウスにおいて同様のメカニズ

一方、マウス胎仔脳から DMH を含む脳スライスを作ムが働いている可能性を示唆している。前述したよう成し、Per2・ルシフェラーゼ発光リズムを 3 日間連続に我々は Per 遺伝子の発現を指標にして、食事に反応す測定したところ、自由摂食群（対照群）および制限給餌るマウス脳部位を網羅的に検索したところ、18 時間の群の母マウスから摘出した胎仔 DMH はいずれも約 24

絶食後の給餌は、唯一、DMH において Per1 及び Per24妊娠期における食事時間が子の体内時計機能およびその発達に及ぼす影響に関する研究

mRNA を一過的に上昇させ、さらに制限給餌は DMH に能性を報告した。DMH の食事同調リズムにおける役割

おける時計遺伝子の発現リズムを速やかにリセットするについてはいくつかの研究グループ間で見解が一致してことを報告しているが２）

８）おらず、同時に DMH の局所破壊は自発運動および深部体温で観察される食事同調性リズムに仔においていずれの DMH の体内時計も食事によって強２）、DMH は高い食く同調するという性質を有していることは興味深い。時

事反応性時計を有しているが、食事誘発性リズムはその計遺伝子ノックアウトマウスなどを用いたさらなる研究他の脳部位あるいは末梢組織によって駆動されている可が必要である。

Detrended bioluminescence ( % )影響を与えないことを見出しており、さらなる検討が必要と思われるが、成体と胎対照群
制限給餌群

Detrended bioluminescence ( % )Days after recording

対照群制限給餌群

Days after recording

図４

胎仔の Per2 発光リズム・ピーク位相に対する母の制限給餌の影響

妊娠 8.5 日目から 17.5 日目までの 10 日間、Per2-luc ノックインマウスに 1 日 4 時間（ZT5 ～ ZT9）、制限給餌を行い、妊娠 18.5 日目に胎仔脳を摘出し、視交叉上核（SCN）および視床下部背内側核（DMH）を含む脳スライス（厚さ 200 μm）を作成し、Millicell 膜上で培養を行った。
培養直後から発光基質 luciferrin (0.1 mM) をメディウムに添加し、生物発光連続測定システムにより時計遺伝子 Per2 の発現変化を記録した。
（Ａ）制限給餌あるいは自由摂食条件下での SCN および DMH の発光リズムの代表例．白三角および黒三角はコサイナー法によって算出されたピーク位相を示す。
（Ｂ）SCN および DMH の発光リズム・ピーク位相に対する制限給餌の影響．N = 3.
5

守要

屋孝洋謝約辞母への食事時間が胎仔脳の体内時計の位相に対する影本研究は、財団法人三島海雲記念財団の平成 21 年度

響を時計遺伝子・ルシフェラーゼ発光リズムを指標にし学術研究奨励金により行われたものです。助成していたて検討した。その結果、妊娠マウスへの 11 日間の制限だきました財団法人三島海雲記念財団に深く感謝申し上

給餌は胎仔マウスの SCN および DMH の体内時計の位げます。また、本研究を遂行するにあたり、多大なご支相を変化させたが、制限給餌が、SCN 時計のピーク位援をご助言をいただきました東北大学大学院薬学研究相を 4.5 時間前進させるのに対して、DMH 時計に対し科・細胞情報薬学分野の中畑則道教授に深く御礼申し上てはピーク位相を 7.4 時間前進させることが明らかになげます。

り、制限給餌は SCN よりも DMH の体内時計を強く同調することがわかった。DMH は成体げっ歯類において文献も食事時間に強く同調する性質を有していることが明ら

１）Hara et al.: Gene to Cells , 6 :269-278. 2001.

かになっているため、DMH の食事同調性時計としての２）Moriya et al.: Eur. J. Neurosci ., 29 :1447-1460. 2009.
３）Shimomura et al.: Eur. J. Neurosci ., 13 :687-693. 2001.

機能は発達過程を通して共通にみられる現象であること

４）Ohta et al.: PLoS ONE , 3 :e2601. 2008.

が明らかになった。

５）Akiyama et al.: Tohoku J Exp. Med ., in press.
６）Shigeyoshi et al.: Cell , 91:1043-1053. 1997.
７）Akiyama et al.: J. Neurosci ., 19 :1115-1121. 1999.
８）Mistlberger et al.: J. Circadian Rhythms , 7 :11. 2009.

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