カイコを用いた化学物質の毒性評価方法の確立

東京大学大学院薬学系研究科

関 水

微生物薬品化学教室

和 久

Silkworm is less ethical and low cost animal model compared to mammals. We found metabolic pathway in silkworm isequivalent in mammals and LD50 values of several compounds in silkworm is also similar that in mammals. It is suggestingsilkworm would be good alternative model for toxicity evaluation of chemicals. In this study, we analyzed cytochrome P450
function, which is important factor on drug metabolisms, and established human metabolism mimic model by transgenic
technique. Furthermore, massive toxicity evaluation was performed in silkworm model.

１．緒はカイコを化合物の毒性評価系として利用できるのはない

言かと考え、本研究において、カイコにおける薬物の体内動

動物愛護の視点から、動物実験を規制する動きが国際的に強まっており、3 R と呼ばれる動物実験の規制について

態、及びシトクローム P 450 反応の詳細な解析、及びさらに多数の化合物の毒性評価を実施した。

の国際基準化がなされるようになった 1）。化粧品へ添加す

２．実る化合物の開発について、哺乳動物を犠牲にする実験についての法律による規制が欧米各国で進んでいる。従来の代

２.１

験

薬物の体内動態の解析

替モデルとしては、細胞を利用した毒性試験が行われていHu・Yo×Tukuba・Ne 系統のカイコの卵を愛媛蚕種かるが、このモデルでは代謝経路を有さないため、実際の個ら購入し、５齢幼虫まで抗生物質含有人工飼料（片倉工業）

体における毒性を評価することができない。従って、個体を与えて飼育した。薬液をその５齢幼虫（1 . 8 – 2 . 0 g）に注でも倫理的な問題がない非脊椎動物を利用した毒性評価方

射し、一定時間後に腹肢を切断し体液を採取した。50 %法が必要と考えられる。そこで我々は、倫理的な問題がな

アセトンにて薬剤の抽出を行い、HPLC（PEGASIL ODS

い昆虫であるカイコに着目した。カイコは、養蚕業から購SP 100（4 . 5 φ 250 mm）， 流 量 1 mL/min）に て 解 析 し た。

入でき、飼育も容易で、ほどよい大きさがあるため注射もHPLC のクロマトグラムのピーク面積から検量線を作成し、

簡便である

1，2）

。この特長を活かして、我々は、カイコをサンプル中の化合物を定量した。移動相はバンコマイシン

感染症のモデル動物として利用し、細菌の病原性の評価や、 （アセトニトリル：20 mM リン酸二水素ナトリウム＝ 92：
抗生物質の評価系として利用している 3，4）。このカイコ細8）、テトラサイクリン（メタノール：5 mMEDTA ＝ 30：

菌感染モデルにおいて、臨床で使用されている抗生物質は、

70）、クロラムフェニコール（メタノール：20 mM リン酸

体重あたりに換算したとき、哺乳動物と同様な用量で治療

カリウム緩衝液＝ 45：55）、フルコナゾール（アセトニト効果を示した。さらに、我々はこの治療効果を指標とした

リル：25 mM 酢酸緩衝液＝ 1：4）、リファンピシン（40 %探索を行い、新規抗生物質カイコシンの発見に成功していアセトニトリル 0 . 05 % ギ酸）、ミカファンギン（40 % アセ

る。また、カイコの薬物動態についても解析を行い、モデトニトリル 0 . 1 % トリフルオロ酢酸）、ケトコナゾール（30 %ル化合物であるエトキシクマリンはヒトと同様なシトクロ

アセトニトリル 0 . 05 % ギ酸）、クロトリマゾール（40 % ア

ーム P 450 による第一相反応による代謝に続く、第二相のセトニトリルリン酸溶液 pH 3）のアイソクラティックで行

5）抱合反応を受け排泄されることを見いだしている 。さらった。

に、カイコでの典型的な細胞毒性を示すいくつかの化合物の個体の半数を殺傷するのに必要な用量（LD 50 値）が、哺

２. ２

シトクローム P 450 反応の解析

代謝の場の検討

5）

乳動物と一致することを見いだしている 。そこで、我々

５齢４日目以降のカイコを緩衝液（10 mM HEPES 0 . 9 %Establishment of the toxic evaluation
method of the chemical substance using
the silkworm model
Kazuhisa Sekimizu
Laboratory of Microbiology, Graduate
School of Pharmaceutical Sciences, The
University of Tokyo.

NaCl pH 7 . 9）中で解剖し、各組織を摘出した。摘出組織
は、10 % 牛血清を含有する TC- 100 昆虫細胞培養用培地を2 ml 中で培養し、7 -ethoxycoumarin を終濃度 6 mM となる
ように加え、27℃で震盪培養した。経時的に培地及び臓器を回収し、ホモジナイズ後、50 % アセトン抽出し蒸発乾固した。この試料を 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液 pH= 6 . 0− 92 −

カイコを用いた化学物質の毒性評価方法の確立に再溶解し、抱合反応により負荷されたグルコースをラム（センシュー科学）を用い、移動相は 0 . 05 % ギ酸を含b-gulcosidase 処理により除去後、緩衝液（1 . 6 M glycine/

む 10％アセトニトリルで分析を行った。また、カフェイ

NaOH pH 10 . 5）と 1：15 で混合し、7 - エトキシクマリンかンの毒性試験は、５齢１日のトランスジェニックカイコをらシトクローム P 450 反応によって生じたヒドロキシクマ

体重測定後、50 mM のカフェイン溶液を 50 ml 注射し餌をリン量を蛍光測定（Ex= 380 nm/Em= 460 nm）によって定与えて飼育し、経時的に体重測定を行った。

量した。

２. ５
シトクローム P 450 反応の検討

カイコを用いた毒性試験

５齢１日目、もしくは２日目のカイコに、それぞれの化

カイコ腸管を用いて上記と同じ手法によって器官培養し合物を腸管内、もしくは体液内に注射した。注射２日後のた。基質を培地に加え培養後、腸管及び培地をホモジナイ

カイコの生存数を測定し、その生存曲線から 50％のカイ

ズし 50 % アセトン抽出し、蒸発乾固した。蒸発乾固した

コの殺傷に必要な化合物の体重あたりの投与量（LD 50 値）

試料を 50 % メタノールに再溶解し、HPLC 分析試料とした。

を求めた。

Luciferin 誘 導 体 については、培地サンプルを Detection

３．結

reagent と混合してルミノメーターにより定量した。

３.１
シトクローム P 450 の発現解析

果

カイコにおける薬物の体内動態の解析

すでに我々は、抗生物質のカイコ感染モデルにおける治５齢のカイコを HEPES/NaCl 緩衝液中で解剖し、腸管・療に必要な用量（ED 50 値）が哺乳類感染モデルでの値と一脂肪体・マルピーギ管を摘出し、mRNA を抽出した。得致することを報告している 3）。この結果は、薬物のカイコ

ら れ た mRNA か ら 逆 転 写 酵 素 に よ っ て cDNA を 調 製 し、における体内動態が哺乳類と共通していることを示唆してそれを鋳型にしてシトクローム P 450 用プライマーとカイいる。この点をさらに検証するために、本研究で我々は、

コアクチン BmA 3 用プライマー

6）で PCR によって増幅し薬物のカイコにおける血中濃度推移を、哺乳類での既存のた。PCR 産物を 1 . 5 % アガロースゲルに供して 100 V で１

報告と比較した。その結果、カイコ血液中における抗生物

時間通電した。4 mg/ml エチジウムブロマイドによって質の濃度推移は哺乳類の血液内におけるそれと同様に a 層染色し、UV 照射下でバンドの有無を確認した。カイコゲ

及び b 層の二相性を示すことが判った（図１）。さらに、
種々

ノム情報データベース KAIKObase（http://sgp.dna.affrc.

の体内動態パラメーターを算出したところ（表１）、薬物

7）go.jp/KAIKObase/） においてシトクローム P 450 と分類

が血液以外のコンパートメントに分布する割合の指標となされている遺伝子を 81 種類選抜した。これらの遺伝子をる Vdss 値はカイコと哺乳類で、0 . 4 〜 9 倍の範囲内であっ対象遺伝子とした。

た。また、抗生物質の体内からの消失速度を示す Cltot 値
は、カイコと哺乳類の間で 0 . 1 〜 16 倍の範囲であり、テト

２. ３

ヒト型シトクローム P 450 発現カイコの樹立

ラサイクリンが最も低く、リファンピシンが最も高い値を農業生物資源研究所の瀬筒らのグループとの共同研究示した。それら以外の薬物についてはカイコと哺乳類で一により、カイコ w 1 -PND 系統を用いて、ヒト型シトクロ致が見られた。従って、カイコにおける化合物の薬物動態

ーム P 450 1 A 2 遺伝子発現系統を樹立した。シトクロー

は、哺乳動物の場合とよく一致していると考えられる。

ム P 450 1 A 2 遺伝子は UAS プロモーターの下流に接続されており、GAL 4 遺伝子発現系等と交配することによって、

３. ２

8）

その遺伝子発現が起こるように設計されている 。

カイコにおけるシトクローム P 450 の解析

カイコにおけるシトクローム P 450 反応の場がどこであるかを明らかにするため、カイコ摘出組織を用いて器官培

２. ４

ヒト型シトクローム P 450 発現カイコの解析

養での 7 - エトキシクマリンの代謝を検討した。7 - エトキ

ヒト型シトクローム P 450 1 A 2 の発現は、それぞれの系

シクマリンはヒトにおいてシトクローム P 450 によって脱統のカイコの脂肪体を摘出し、タンパク質を調製した後、エチル化されることが知られている化合物であり、すでに抗ヒトシトクローム P 450 1 A 2 抗体（abcam）によりウェ

カイコ体内において代謝されることを見いだしている 5）。実

スタンブロッティング法により解析した。検出は Western

験の結果、脂肪体、マルピーギ管、絹糸腺においてはほとLightning ECL Plus（PerkinElmer）を用いた。カフェイ

んど代謝物が検出されず、腸管において最も強い活性がンの血中濃度は、5 齢の 2 g のシトクローム P 450 1 A 2 トラ

見出された（図２）。さらに、カイコ腸管培養系における

ンスジェニックカイコに 1 mM のカフェイン溶液を 50 ml 注

7 -ethoxycoumarin の脱エチル化反応はシトクローム P 450

射し、経時的に血液を採取し、50 % アセトン抽出した物の阻害剤であるシメチジン 9）の添加によって用量依存的にを HPLC にて解析した。固相を PEGASIL ODS SP 100 カ抑制を受けた。この結果から、腸管がシトクローム P 450− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013の反応の場になっていると考えられる。次に、カイコのーギ管における発現を同様に検討し、腸管特異的に発現

腸管においてシトクローム P 450 遺伝子が発現しているかしているシトクローム P 450 が５つ見いだされた。従って、を RT-PCR によって解析した結果、ゲノム上に存在するシ

カイコ腸管において、シトクローム P 450 遺伝子が発現し、トクローム P 450 と推定される 81 種類の候補遺伝子のうち、その薬物代謝活性を担っていると考えられる。

28 種類の遺伝子の発現が確認された（表２）。これらの腸そこで、実際にヒトシトクローム P 450 の基質をカイコ管で発現が確認された遺伝子について、脂肪体及びマルピ

腸管培養系に加え、それらが代謝されるか否か検討した。

図１ カイコにおける化合物の体内動態
カイコ５齢幼虫に各抗生物質量を血中内投与した後に、経時的に血液を採取し抗生物質
濃 度 を HPLC に よ っ て 定 量 し た。a.chloramphenicol, b.tetracycline, c.vancomycin, d.
rifampicin, e.micafungin, f. flucomazole.

− 94 −

カイコを用いた化学物質の毒性評価方法の確立

表１ カイコと哺乳類における抗生物質の体内動態パラメーターの比較
各抗生物質のカイコ血液内における濃度推移のデータ（図１）から、全身クリアランス (CLtot), 定常状態における分布容積（Vdss），消失過程における分布容積（t1/2）を算出し、哺乳類における値と比較した。chloramphenicol，vancomycin はヒト 10，11）、tetracycline はウサギ 12）、rifampicin はヒツジ
13）
、micafangin はラット 14）、fluconazole はイヌ 15）のデータを引用した。

表２ カイコ腸管において発現が確認された遺伝子
カイコ腸管から mRNA を調製し、カイコゲノム情報中のシトクローム P450 候補遺伝子について RT-PCR によって発現を確認した。相同性は BLAST 検索を用いて行った。

− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

その結果、検討した 14 種の化合物のうち、大部分の 13 種いることを示唆している。さらにそれぞれの個体についてが代謝されることが分かった（表３）。ヒトシトクローム

組織脂肪体のミクロソーム画分を調製し、ウエスタンブロ

P 450 1 A 2 で代謝されるカフェインについては、カイコ腸

ッ ト に 供 し た と こ ろ、UAS-hCYP 450 1 A 2 /BmA 3 -gal 4

管培養系で代謝が認められなかった。

特異的にシトクローム P 450 1 A 2 タンパク質の発現が確認された（図 4 A）。以上の結果からシトクローム P 450 1 A 2

３. ２

ヒト型シトクロームP450 発現カイコの樹立と解析

トランスジェニックカイコが作出されたと判断した。次樹 立 し た UAS-hCYP 450 1 A 2 遺 伝 子 を 染 色 体 上 に 有に、カイコにおけるカフェインの血中濃度推移を測定しするカイコと、エンハンサートランプ系統である BmA 3 -た。その結果、12 時間後の血液内濃度は野生型に比べシ

gal 4 遺伝子を染色体上に有するカイコを交配し、スクリー

トクローム P 450 1 A 2 トランスジェニックカイコにおいてニングを行ったところ UAS-hCYP 450 1 A 2 / BmA 3 -gal 4、有意に低い濃度であった（図４B）。また、半減期は野生型

UAS-hCYP 450 1 A 2、BmA 3 -gal 4 を有する個体、およびで 50 時間以上だったのに対しシトクローム P 450 1 A 2 ト

両方持たない個体がおよそ 1 : 1 : 1 : 1 の割合で発生した。こランスジェニックカイコにおいては 16 時間であった。従の結果はそれぞれの遺伝子が染色体上に単独で導入されてって、カイコにおいてヒト型シトクローム P 450 が発現し、

図２ カイコ組織培養系における 7- エトキシクマリンの脱エチル化反応
カイコから各組織を摘出し、in vitro の器官培養系を構築した。7- エトキシクマリンを基質として反応を行い、代謝物である 7- エトキシクマリンの量を蛍光光度計によって定量した。

表３ カイコ腸管培養系におけるヒトシトクローム P450 基質の代謝反応の有無
カイコ腸管培養系にそれぞれの基質を加え、20 分後の薬剤量の減少、もしくは Luciferin の生成による発光量の増大により、代謝の有無を検討した。

図３ カイコ腸管培養系においてカフェインの代謝
カイコ腸管培養系にカフェイン及びオメプラゾールを加えて培養し、経時的に基質量を HPLC によって定量した。オメプラゾールはカイコ腸管培養系において代謝を受けるポジティブコントロールとして用いた。

− 96 −

カイコを用いた化学物質の毒性評価方法の確立

図４ ヒト型シトクローム P450 1A2 トランスジェニックカイコのカフェイン代謝能の獲得
A）カイコ脂肪体における導入したヒト型シトクローム P450 1A2 の発現
B）トランスジェニックカイコにおけるカフェインの血中濃度推移C）トランスジェニックカイコにおけるカフェインの過剰投与による毒性の軽減

表４ カイコにおける毒性試験
腸管内投与（i.m.：intra midgut）は哺乳動物における経口投与（p.o.）と対応しており、体液内投与（i.h.：intra hemolymph）は哺乳動物における血液内投与（i.v.）、腹腔内投与（i.p.）、及び皮下投与（s.c.）に対応している。

− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

代謝の場は、カイコにおいては腸管であると考えられた。
これは、開放血管系であるカイコにおいて、腸管から透過した化合物は、直ちに臓器が接触している体液に移行する
ため、外界との唯一のバリアになっている腸管で化合物が代謝されることは理に適っていると考えられる。さらに、
カイコではできなかったカフェインの代謝が、ヒト型シトクローム P 450 遺伝子の導入によって可能となった。このように、ヒト型のシトクローム P 450 遺伝子を導入したト
ランスジェニックカイコを利用することによって、ヒトを模擬した薬物動態の評価が可能になると考えられる。
さらに、本研究においてカイコを毒性評価の実験動物代
替モデルとして利用可能であるか検討した。その結果、すでに浜本らの論文 5）において述べたように、神経毒性が主たる毒性の作用を示す化合物を除けば、LD 50 値はカイコ
図５ 化合物の LD50 値のカイコモデルと哺乳動物モデルにおける相関
毒性が低く、カイコにおける LD50 値を算出できなかったグ
リセリンを除いた化合物についてプロットした。

と哺乳動物モデルとで一致することが改めて示された。また、相関係数も良好であった。以上の結果から、カイコは薬物動態を反映した毒性試験の実験動物代替モデルとして利用できると期待される。カイコを用いた化合物の毒性試
験方法は、3 R のうちの Replacement に適合するものである。近年の動物愛護の高まりから、その重要性は、我が国機能していると考えられる。さらに、カフェインの毒性がを含めたアジア諸国においても、今後益々強まると予想さ軽減されるか否かについて検討した。野生型のカイコに高れる。

濃度のカフェインを投与し飼育するカイコの体重増加が抑制される（図４C）。しかしながら、ヒト型シトクローム（引用文献）

P 450 1 A 2 発現カイコの場合は、その体重増加の抑制がほ１）Sekimizu, N., Paudel, A. & Hamamoto, H. Animal

とんど起こらず、カフェインの毒性が軽減されていること

welfare and use of silkworm as a model animal. Drug
Discov Ther 6 , 226 - 229 ( 2012 ).

が分かった（図４C）。以上の結果は、ヒト型シトクローム
P 450 1 A 2 トランスジェニックカイコにおいて、シトクロ

２）Hamamoto, H. & Sekimizu, K. Evaluation of theーム P 450 1 A 2 タンパク質が機能し、その代謝活性を評価

therapeutic effects of antibiotics using silkworm

可能であることを示している。

as an animal model. Res Adv in Antimicrob Agents
Chemother 5 , 1 - 23 ( 2005 ).

３. ３

カイコを用いた毒性試験

３）Hamamoto, H. et al. Quantitative evaluation of the

様々な化合物について、カイコに投与し、その LD 50 値

therapeutic effects of antibiotics using silkwormsを求めた。その結果、スチレンと青酸カリウムを除き、ラinfected with human pathogenic microorganisms.

ットにおける結果と比較し 10 倍以内であった（表４）。ス

Antimicrob Agents Chemother 48 , 774 - 779 ( 2004 ).

チレンは中枢神経に対する作用があることが知られてお４）Kaito, C. et al. Silkworm pathogenic bacteria

り、神経系の受容体が哺乳動物と異なるカイコでは毒性がinfection model for identification of novel virulence

低い可能性が考えられる。カイコと哺乳動物でのそれぞgenes. Molecular microbiology 56 , 934 - 944 ( 2005 ).

れの化合物 LD 50 値をプロットし相関係数を求めたところ、

５）Hamamoto, H., Tonoike, A., Narushima, K., Horie,
R. & Sekimizu, K. Silkworm as a model animal to2

R = 0 . 72 であり良好な相関を示すと考えられる（図５）。

４．考

evaluate drug candidate toxicity and metabolism.

察Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 149 , 334 339 ( 2009 ).

本研究より、カイコにおける薬物の分布容積や排泄速度
は、ほぼ哺乳動物における値と一致していた。また、ヒト

６）Kawaoka, S. et al. Functional analysis of fourにおいてシトクローム P 450 によって代謝される大部分のGloverin-like genes in the silkworm, Bombyx mori.

化合物は、カイコにおいても同様に代謝されることが明らArch Insect Biochem Physiol 67 , 87 - 96 ( 2008 ).

かになった。そのシトクローム P 450 による外来化合物の７）Shimomura, M. et al. KAIKObase: an integrated− 98 −

カイコを用いた化学物質の毒性評価方法の確立

silkworm genome database and data mining tool. BMC

of tetracycline in the domestic rabbit following

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intravenous or oral administration. Canadian journal ofveterinary research = Revue canadienne de recherche８）Imamura, M. et al. Targeted gene expression using

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