アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構
北海道大学大学院薬学研究院

木原章雄

Acylceramides are lipids that play an essential role in the formation of the permeability barrier in the skin, and the impairment of their synthesis causes the skin disorder ichthyosis. However, the acyl-CoA synthase (ACS) that converts ω-hydroxy fatty acid to ω-hydroxy acyl-CoA in the acylceramide synthesis pathway still remained unidentified. In the present
study, we examined the possibility that ACSVL4 (ACS very long-chain, member 4), which is the causative gene for ichthyosis prematurity syndrome, is the unidentified ACS involved in acylceramide production. Acsvl4 knockout (KO) mice exhibited neonatal lethality and severe skin barrier defect phenotype. Histological analyses showed hyperkeratosis and abnormal
lipid lamellar formation in Acsvl4 KO mouse epidermis. The amount of acylceramides in Acsvl4 KO mice was reduced toabout 10% of that in wild-type mice. In addition to the role as an ACS, ACSVL4 has been implicated in a fatty acid transporter, and reduced fatty acid uptake has been assumed to be a cause of the ichthyosis pathogenesis. However, the amountof fatty acids and triglycerides were not decreased in the epidermis of Acsvl4 KO mice. In vitro experiments revealed thatACSVL4 indeed exhibits ACS activity toward ω-hydroxy fatty acids. From these results, we conclude that the skin symptomof ichthyosis prematurity syndrome is not caused by decreased fatty acid uptake, but by impaired acylceramide synthesis.
Our findings contribute to the elucidation of the molecular mechanism of skin barrier formation and the pathogenesis of hereditary ichthyosis.

1．緒

化した特殊なセラミドクラス，アシルセラミド（オメガ -O-言

アシルセラミド）が存在する。アシルセラミドはセラミド

皮膚は強力な透過性バリアを有し，外界からの病原体やの脂肪酸部分（炭素数（C）30 ‒ 36）のオメガ位にリノール酸

アレルゲン，化学物質などの異物の透過を阻止することで，が結合した３本鎖構造をもつ（図 1）。アシルセラミドの特感染症やアレルギーの防止に重要な働きを担っている。ま

殊な構造は脂質ラメラを形成し，維持するために重要であた，この皮膚の透過性バリアは体内からの水分の損失も防る。アシルセラミドは皮膚バリア形成に必須であり，アシ

いでおり，この機能は陸上動物の生命維持に必須である。

ルセラミド産生に関わる遺伝子の変異はヒトでは魚鱗癬の皮膚の透過性バリアは極めて強力なため，通常皮膚からの中でも重症なタイプの魚鱗癬（常染色体潜性先天性魚鱗癬）

感染はほとんど起きない。しかし，火傷により皮膚バリアを引き起こし，マウスでは皮膚バリア異常によって新生致が損なわれると感染症のリスクは大幅に上昇する。また，死を引き起こす 1 , 2）。また，ヒトのアトピー性皮膚炎患者

先天的に皮膚バリア異常を示す疾患として乾燥，肥厚，鱗ではアシルセラミド量の減少が観察されている 3）。

屑を主徴とする魚鱗癬がある。アトピー性皮膚炎患者ではアシルセラミドの皮膚バリアにおける重要性にも関わら皮膚バリア機能が低下して，アレルゲンが侵入しやすくな

ず，アシルセラミド産生の分子機構が解明され始めたのはっている。

最近のことである。アシルセラミド中の C 30 - 36 脂肪酸の脂質の高い疎水性は物質の透過を阻むことから，脂質は伸長には脂肪酸伸長酵素 ELOVL 1 および ELOVL 4，アミ

透過性バリアの形成に適している。実際，表皮の最外層（角ド結合形成にはセラミド合成酵素 CERS 3，脂肪酸オメガ質層）には脂質の多層構造体（脂質ラメラ）が存在し，皮膚水酸化にはシトクローム P 450 の 1 つである CYP 4 F 22，

バリア形成において中心的な役割を果たしている。脂質ラ

リノール酸とのエステル結合形成にはトランスアシラーゼ

メラは主にセラミド，脂肪酸，コレステロールで構成され

PNPLA 1 が関わっている 2 , 4 - 6）。表皮は四層で構成されてている。セラミドは生体膜脂質スフィンゴ脂質の疎水骨格

おり，内側から基底層，有棘層，顆粒層，角質層である。

であり，長鎖塩基と脂肪酸の２本の疎水鎖から構成される。

ケラチノサイトは基底層で増殖後，分化しながら外側に向表皮にはこの通常のセラミドに加え，皮膚バリア形成に特Skin barrier formation by the acyl-CoA
synthetase ACSVL 4
Akio Kihara
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Hokkaido University− 109 −

図1

アシルセラミドの構造

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

けて移動する。有棘層から顆粒層にかけてアシルセラミド

２．方は産生される。アシルセラミドはグルコースの付加を受け，アシルグルコシルセラミドへ変換後，層板顆粒内に蓄えら法

2. 1. マウスの作製と飼育れる。アシルグルコシルセラミドはその後顆粒層と角質層

本実験では C 57 BL/ 6 J マウスおよび CRISPR/Cas 9 シの境界部で細胞外へ放出され，グルコースが除去されて再ステムを用いて作成した Acsvl 4 KO マウスを使用した。

度アシルセラミドとなり，脂質ラメラの構成成分となる。

マウスの飼育は，室温 23 ± 1 ℃，湿度 50 ± 5 ％，明／暗 12

我々は上述のアシルセラミドの C 30 ‒ 36 脂肪酸のオメガ

時間サイクルに維持された飼育室において，摂餌は自由に位を水酸化する脂肪酸オメガ水酸化酵素遺伝子CYP4F22

摂取できる条件下で行った。

5）を同定した 。CYP 4 F 22 は先天性魚鱗癬の原因遺伝子であり，CYP 4 F 22 遺伝子変異をもつ患者ではアシルセラ

2. 2. 皮膚透過性バリアアッセイ

ミド量が大きく減少していた。また，我々は in vitro にお経 皮 水 分 蒸 散 量（TEWL）は 経 皮 水 分 蒸 散 量 測 定 器

ける解析から CYP 4 F 22 の基質が脂肪酸であることを見出

VAPO SCAN（Asch Japan）を用いて胎生 18 . 5 日（E 18 . 5）

した。脂肪酸はアシル CoA の状態で脂肪酸伸長酵素によのマウスの背中に密着させることで測定した。トルイジンって伸長される。そのため，脂肪酸伸長酵素によって産生

ブルー染色は E 18 . 5 マウスをメタノールに 5 分間浸し，された超長鎖アシル CoA が CYP 4 F 22 の基質になるために

PBS で洗浄後，0 . 1 % トルイジンブルー PBS 溶液に 4 ℃では，一旦 CoA が加水分解される必要がある。一方，脂肪2 時間浸すことで行った。

酸と長鎖塩基間のアミド結合を形成するセラミド合成酵素の基質はアシル CoA であるため，CYP 4 F 22 によって産

2. 3. 形態学的解析生されたオメガヒドロキシ超長鎖脂肪酸は再度 CoA 体へ

E 18 . 5 マウスから採取した皮膚を 3 . 7 % ホルムアルデヒ

変換される必要がある。しかし，この反応に関与するアシドで固定し，アルコールで脱水後，パラフィンに包埋した。

ル CoA 合成酵素
（ACS）
は未だ不明なままである。

マイクロトームで厚さ 4 µm のホルマリン固定パラフィン包

アシルセラミドの皮膚バリア機能における重要性を考えると，アシルセラミド産生経路上の未同定 ACS 遺伝子の埋切片を作成し，Tissye-Tek DRS 2000（Sakura Torrance）
を用いてヘマトキシン／エオジン（H/E）染色を行った。

変異は先天性魚鱗癬を引き起こすと予想される。哺乳類には 26 種 の ACS が 存 在 す る。 そ の 中 で ACSVL 4（ 別 名FATP 4，SLC 27 A 4）は症候性魚鱗癬である魚鱗癬未熟児

2. 4. プラスミド
N 末端に 3×FLAG タグを融合したタンパク質を発現さ

7）症候群の原因遺伝子である 。魚鱗癬未熟児症候群は魚鱗

せ る 哺 乳 類 発 現 用 ベ ク タ ー pCE-puro 3×FLAG- 1 の癬症状に加えて早産および新生児の呼吸停止を特徴とし，

Bam HI‒Not I 切 断 部 位 へ ACSVL 4 遺 伝 子 を 導 入 し，Acsvl 4 KO マウスは無気肺および皮膚バリア異常を伴っpCE-puro 3× FLAG-ACSVL 4 を作製した。

8）て新生致死となる 。我々はこのヒトとマウスにおける症状／表現型から，ACSVL 4 こそがアシルセラミド産生経

2. 5. 脂質解析

路上で働く未同定 ACS 遺伝子であると考えた。これまで，

脂質の解析は液体クロマトグラフィー（LC）連結タンデ

ACSVL 4 遺伝子変異が魚鱗癬未熟児症候群の魚鱗癬症状

ム質量分析（MS/MS）によって行った。LC には逆相カラムを引き起こすメカニズムは不明であった。ACSVL 4 がア

（AQUITY UPLC CSH C 18 column：粒径 1 . 7 µm，内径シルセラミド合成へ関与することは考えられたことがなく，

2 . 1 mm，長さ 100 mm；Waters）を用いた。カラム温度はAcsvl 4 KO マウスの表皮において通常のセラミドクラス

55 ℃に設定し，イオン化はエレクトロスプレーイオン化の短鎖化は観察されているものの，アシルセラミドの測定法を用い，三連四重極型質量分析計（Xevo TQ-S；Waters）

はなされていない。これまではむしろ，ACSVL 4 の別名を用いて検出した。各脂質分子種は，多重反応モニタリン

である FATP 4（Fatty acid transporter 4）の名前が示す通グ（MRM）モードで分子種ごとに特異的な親イオン（Q 1），

り，ACSVL 4 が脂肪酸の取り込みに関与し，その異常が娘イオン（Q 3）の質量電荷比，コリジョンエネルギーを設魚鱗癬未熟児症候群の症状を引き起こすという説が有力で定し，ポジティブイオンモードで検出した。データの解析あった。

には MassLynx software（Waters）を使用し，定量は内部

本研究では，ACSVL 4 変異による魚鱗癬未熟児症候群

標準との割合を計算して行った。

の皮膚症状発症の原因がこれまで提唱されてきた脂肪酸のトランスポート活性低下なのか，我々が新たに提唱したア
シルセラミド産生不全によるものかを明らかにするために
Acsvl 4 KO マウスの解析を行った。

2. 6. In vitroアシルCoA合成アッセイ
HEK 293 T 細胞に pCE-puro 3×FLAG- 1（ベクター）または pCE-puro 3 × FLAG-ACSVL 4 をトランスフェクシ− 110 −

アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構

ョンして 24 時間後，膜画分を回収した。酵素反応は膜画大きく減少しており，野生型マウスの 9 . 1 %であった。一方，分（20 µg）に基質である脂肪酸（1 µM リグノセリン酸，

一価不飽和タイプではアシルセラミドの時とは異なって

1 µM ネルボン酸，または 30 - ヒドロキシトリアコンタン

KO マウス中での減少が小さく，合計量は野生型マウスの酸）と 0.5mM CoAを加えて，インキュベート（37℃ , 1 時間）

46 % であった。以上のことから，ACSVL 4 がアシルセラすることで行った。生成されたアシル CoA は LC-MSMS

ミド合成に関与することが明らかとなった。

で解析した。

３．結果

3. 1. Acsvl4 KOマウスにおける皮膚バリア機能と表皮形態の異常3. 3. Acsvl4遺伝子欠損は表皮への脂肪酸の取り込みを低下させない
脂肪酸の組成を LC-MS/MS によって解析したところ，
Acsvl 4 KO マウスでは C 24 以下の鎖長の殆どの脂肪酸のAcsvl 4 KO マウスは，野生型（WT）マウスに比べて皮膚量が WT マウスに比べて増加していた（図 5 A）
。一方，にしわが少なく張っており，新生致死であった。E 18 . 5 日

C 26 以上の飽和脂肪酸の量は差が見られず，一価不飽和に帝王切開により得られたマウスの生存率を経時的に調べ

脂肪酸では増加していた。脂肪酸総量では Acsvl 4 KO マ

たところ，KO マウスは摘出後 2 時間以内に全て死亡した。

ウスでは WT マウスに比べて約 2 . 1 倍増加していた。これ

親元から離してミルクが飲めないこの条件では WT マウス

まで，ACSVL 4 の脂肪酸トランスポーターとしての機能は摘出後 22 時間まで生存していた。このように，Acsvl 4が想定されてきたが，Acsvl 4 KO マウスでの脂肪酸量のKO マウスは出生後極めて短時間で死亡することが明らか

増加はこの可能性を否定した。アシルセラミドの構成要素となった。帝王切開によって得られた E 18 . 5 の KO マウス

であるリノール酸（C 18 : 2）は，哺乳類の生体内では合成では WT に比べて体重が軽く，体内から体外への皮膚透過性

きない必須脂肪酸であるため，表皮の細胞は外部から取りバリア機能の指標である TEWL は WT マウスの 4 . 4 倍高込む必要がある。リノール酸の量に関しても Acsvl 4 KO

い値を示した（図 2 A）
。次にトルイジンブルー染色により

マウス表皮中で増加していた。

体外から体内への皮膚透過性バリア機能を調べたところ，

アシルセラミド中のリノール酸はトリグリセリドに由来

WT マウスでは色素の浸透は見られなかったのに対し，

し，トランスアシラーゼ PNPLA 1 がトリグリセリド中のKO マウスでは強い色素の浸透が見られた（図 2 B）
。これ

リノール酸をオメガ水酸化セラミドに転移する 6）。Acsvl 4

らの結果から，Acsvl 4 KO マウスでは皮膚バリア機能がKO マウスの表皮におけるリノール酸含有トリグリセリド

低下していることが確認された。

量を調べた結果，いずれの分子種も WT マウスよりも増加

次に Acsvl 4 KO マウスの表皮の形態学的な変化を調べしていた（図 5 B）。これらの結果は Acsvl 4 KO マウスにおるため，H/E 染色を行った。WT マウスの角質層では，脂ける皮膚バリア形成不全とアシルセラミド量の減少がリノ質ラメラの存在を示す角質細胞間の間隙が観察され，10ール酸の取り込み異常に起因するのではないことを示して層未満の角質層が存在していた（図 3）。一方，KO マウス

いる。

では角質層の数の増加が観察され，角質細胞間の間隙は不明瞭であった。このことは，過角化と脂質ラメラ形成不全を示していた。また，KO マウスでは有棘層が顕著に肥厚していた。

3. 4. ACSVL4はオメガ水酸化脂肪酸に対してACS
活性を示す
ACSVL 4 はアシルセラミド合成経路上でオメガ水酸化
脂肪酸をオメガ水酸化アシル CoA へ変換させる ACS であ3. 2. Acsvl4 KOマウス表皮におけるアシルセラミド
量の低下
Acsvl 4 のアシルセラミド産生への関与を調べるために，ると考えられる。これまで，ACSVL 4 は長鎖から極長鎖の非水酸化脂肪酸に対して活性を示すことは報告されているが，アシルセラミドに使用されるオメガ水酸化超長鎖脂

マウス表皮中のアシルセラミド量を LC-MS/MS によって肪酸に活性があるかは調べられていない。そこで，本実験解析した。Acsvl 4 KO マウスではすべてのアシルセラミ

ではヒト ACSVL 4 のオメガ水酸化 C 30 脂肪酸に対するド分子種が WT マウスに比べて減少しており，総量では約

ACS 活性を，ACSVL 4 を過剰発現させた HEK 293 T 細胞

9 . 8 % にまで低下していた（図 4 A）
。飽和と一価不飽和のの膜画分を用いた in vitro の実験によって調べた。その結アシルセラミドは共に同程度減少していた（飽和，7 . 4 %；果，コントロールに比べ，ACSVL 4 過剰発現によってオ

一価不飽和，11 %）。次にアシルグルコシルセラミドを測

メガ水酸化 C 30 : 0 脂肪酸に対する ACS 活性は 9 . 8 倍増加

定したところ，Acsvl 4 KO マウス中の総アシルグルコシ

した（図 6）。また，ACSVL 4 過剰発現により，C 24 : 0 脂肪

ルセラミド量は野生型マウスの約 37 % であった（図 4 B）。

酸への ACS 活性は 6 . 6 倍，C 24 : 1 脂肪酸への ACS 活性は

特に飽和タイプではアシルセラミドと同様に KO マウスで

3 . 6 倍増加した。これらの結果から ACSVL 4 は，アシル− 111 −

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図2

Acsvl 4 KOマウスにおける皮膚バリア異常

A. TEWLの測定（n = 4 ; Studentʼs t - test; **P< 0 . 01）。
B. トルイジンブルー染色。

図3

Acsvl 4 KOマウスにおける過角化と脂質ラメラ形成不全

図4

セラミド組成A. アシルセラミド量，B. アシルグルコシルセラミド量（n = 3 ; Studentʼs t -test;*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01）。

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図5 脂肪酸とトリグリセリド量
A. 脂肪酸量，B. トリグリセリド量（挿入は総量; n = 3 ; Studentʼs t-test; *P< 0 . 05 ,**P< 0 . 01）。

図6

アシルCoA合成酵素活性

セラミド合成に必要なオメガ水酸化アシル CoA の合成活

エステラーゼによる C 30 ‒C 36 脂肪酸への変換，脂肪酸オ性を示すことが明らかになった。また，ACSVL 4 は非水

メガ水酸化酵素 CYP 4 F 22 によるオメガ水酸化脂肪酸への酸化／オメガ水酸化に関わらず，長鎖から超長鎖に至るま変換，ACS によるオメガ水酸化アシル CoA への変換ステッでの幅広い脂肪酸に対して活性を示すことも示された。

プが含まれる。これらのうち，チオエステラーゼと ACS は

４．考

未同定であった。本研究ではアシルセラミド合成に関わる

察ACS として ACSVL 4 を同定した。

アシルセラミドは皮膚透過性バリア形成に必須な脂質分

Acsvl 4 KO マウスは 15 年以上前に作成され，激しい皮子であり，その産生異常はヒトにおいては魚鱗癬，マウス

膚バリア異常を示すことが報告されたが，その原因は不明

においては新生致死を引き起こす。しかし，アシルセラミ

なままであった 8）。これまでは ACSVL 4 /FATP 4 の脂肪ドの産生に関わる遺伝子の全ては明らかになっていない。

酸トランスポーター活性の低下が皮膚バリア異常の原因でアシルセラミド産生経路には C 30 ‒C 36 アシル CoA がチオあるという説が有力であった。近年，多くのアシルセラミ− 113 −

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ド関連遺伝子の同定が同定され，その KO マウスが作成さ

3） Ishikawa J, Narita H, Kondo N, Hotta M, Takagi Y,れた。それらの KO マウスで観察された激しい皮膚バリア

Masukawa Y, Kitahara T, Takema Y, Koyano S,

異常は，Acsvl 4 KO マウスで見られるものと極めて類似

Yamazaki S, Hatamochi A. Changes in the ceramide

していた。そこで我々は Acsvl 4 KO マウス／魚鱗癬未熟

profile of atopic dermatitis patients. J. Invest. Dermatol.,児症候群で見られる魚鱗癬症状はアシルセラミド合成低下．
130, 2511-2514（2010）に起因すると考え，実際本研究においてこのことを実証し

4） Sassa T, Ohno Y, Suzuki S, Nomura T, Nishioka C,

た。Acsvl 4 KO マウスの表皮ではリノール酸を含む多く

Kashiwagi T, Hirayama T, Akiyama M, Taguchi R,の脂肪酸およびリノール酸含有トリグリセリドの量は低下

Shimizu H, Itohara S, Kihara A. Impaired epidermal

しておらず，むしろ増加していた。これらの結果から

permeability barrier in mice lacking Elovl1, the geneAcsvl 4 遺伝子欠損による脂肪酸の取り込み低下が皮膚バ

responsible for very-long-chain fatty acid production.

リア異常を引き起こされるという説は否定された。

Mol. Cell. Biol., 33, 2787-2796（2013）．

５．総

5） Ohno Y, Nakamichi S, Ohkuni A, Kamiyama N, Naoe

括

A, Tsujimura H, Yokose U, Sugiura K, Ishikawa J,

本研究によって，アシルセラミド産生経路のうちのミッAkiyama M, Kihara A. Essential role of the

シングリンクの１つを解明した。また，魚鱗癬未熟児症候

cytochrome P4 5 0 CYP4F2 2 in the production of

群の原因がこれまで想定されていた脂肪酸の取り込み低下

acylceramide, the key lipid for skin permeability

ではなく，アシルセラミド産生不全であることが明らかと

barrier formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1 1 2,なった。我々の発見は魚鱗癬未熟児症候群の皮膚症状発症

7707-7712（2015）．

の機構を解明しただけではなく，皮膚バリア形成の分子機

6） Ohno Y, Kamiyama N, Nakamichi S, Kihara A.
PNPLA1 is a transacylase essential for the generation

構の解明に寄与した。

of the skin barrier lipid ω-O-acylceramide. Nat.
（本研究助成により得られた成果）

Commun., 8, 14610（2017）．

・Yamamoto H, Hattori M, Chamulitrat W, Ohno Y,7） Klar J, Schweiger M, Zimmerman R, Zechner R, Li

Kihara A. Skin permeability barrier formation by the

H, Törma H, Vahlquist A, Bouadjar B, Dahl N, Fischer

ichthyosis-causative gene FATP4 through formation

J. Mutations in the fatty acid transport protein 4 geneof the barrier lipid ω-O-acylceramide. Proc. Natl.

cause the ichthyosis prematurity syndrome. Am. J.

Acad. Sci. U. S. A., 117, 2914‒2922（2020）．

Hum. Genet., 85, 248-253（2009）．
8） Herrmann T, van der Hoeven F, Gröne HJ, Stewart（引用文献）

AF, Langbein L, Kaiser I, Liebisch G, Gosch I,

1） Akiyama M, Shimizu H. An update on molecular

Buchkremer F, Drobnik W, Schmitz G, Stremmel W.

aspects of the non-syndromic ichthyoses. Exp.

Mice with targeted disruption of the fatty acid transport

Dermatol., 17, 373-382（2008）．

protein 4（Fatp4, Slc2 7a4）gene show features of lethal

2） Kihara A. Synthesis and degradation pathways,
functions, and pathology of ceramides and epidermal

restrictive dermopathy. J. Cell Biol., 1 6 1, 1 1 0 5-1 1 1 5（2003）．

acylceramides. Prog. Lipid Res., 63, 50-69（2016）．

− 114 −