新規な化粧品素材としてのコウジ酸、β- ツーヤプリシン、p-アミノ安息香酸、及び、アルブチンのさらなる高機能化を目的とした酵素的分子設計
岡山県立大学

中

保健福祉学部栄養学科

島

伸

佳

Kojic acid, β -thujaplicin, and p -aminobenzoic acid were glucosylated to their monoglucosides by UDP-glucosyltransferase
reaction. Arbutin and polyphenol glucosides (naturally occurring plant pigments) were acylated with aromatic acids to theiracylated forms by lipase or acyltransferase reactions. As the results, further stabilization and functionarization of the naturalbioactive compounds as the cosmetic materials has been achieved by the enzymatic-modification method.

１.

緒ール）グルコシドの芳香族酸エステル化を行なった。

言

また、アシル CoA 合成酵素とフラボノイド：アシル転

近年、自然環境の破壊や環境汚染、生活習慣の変化や食移酵素を含むムラサキイモ培養細胞由来の無細胞抽出液

生活の多様化により、「人類を取り巻く地球環境に関わる（粗酵素液）を生体触媒として、ATP と Coenzyme A の諸問題」が注視されるに至っている。このような状況下に存在下、フラボノイドグルコシドの糖部分への遊離の芳香

おいて、天然資源の大量消費による有用な植物資源の枯渇

族酸によるアシル（エステル）化について検討した。

にも伴い、天然由来の生薬成分や生理機能性物質の価値がこれらの機能性物質の中で、広義の植物性（ポリ）フェ

2．2 化粧品素材としての（ポリ）フェノール性化合物の酵素的グルコシル化

ノール関連化合物は、抗菌作用、抗酸化作用やラジカル消（ポリ）フェノール類 10µmol、UDPglucose 70µmol、及び、去能などを有し、さらには免疫力の向上効果、抗ウイルス100 µmol Tris-HCl buffer（pH 7.8）を含む１ml の反応液作用や制癌作用などの様々な有用生理機能を示すことか

中に、ユーカリ培養細胞由来の UDP- グルコシルトランス

ら、最近では、化粧品、食品添加物、医薬品などとしてもフェラーゼ含有膜画分 0.1g（湿潤状態、培養細胞 0.5g に注目されている。

相当）を加え、30℃で緩やかに撹拌しながら、一昼夜グル

見直されてきた。

本研究では、
植物色素類を始めとした天然由来の（ポリ）コシル化反応を行なった。

フェノール化合物の、「化粧品素材」としての使用上の安さらに、ユーカリ膜画分を用いて連続的にグルコシル化

全性と有効性を拡大させること、すなわち、安定化と高機反応を行う「膜型バイオリアクターシステム」の開発や、能化を通して、これらの機能性物質の薬理・生理活性を向パン酵母による UDP- グルコース発酵を同時進行させた

上させ、有効に活用できる新機能性成分へと「分子設計」

UDP- グルコシルトランスフェラーゼ共役反応系による効を行うことを主目的に、「グルコシル化とアシル化を介し果的なグルコシル化について検討した。

た酵素的機能改変」の方法を開発した。

２.
2．1

実

３.

験

化粧品素材としての（ポリ）フェノールグルコ

シド類の酵素的アシル化

結果と考察

3．１ 化粧品素材としての（ポリ）フェノールグル
コシド類の酵素的アシル化による機能改変
3．1．1

アルブチンの芳香族酸エルテル化

リパーゼ（主に、Chirazyme L-2、10mg）のエステル交

天然植物色素（ポリフェノールグルコシド類）は、ある換反応を利用して、ポリフェノールグルコシド 10mg、及種の植物細胞中において、そのグルコシド糖の一部が様々

び、
芳香族酸ビニル 100mg を、アセトン 10ml 中で、数日間、な芳香族酸によりエステル化された「アシル化植物色素」

37℃で撹拌しながら反応させ、フラボノイド（ポリフェノとして、光や熱に対して安定に存在し、抗酸化性を始めとEnzymatic Stabilization and Functionarization of Natural-Bioactive Compounds
as the Cosmetic Materials

した有用な生理機能を発揮していると考えらている。そこ
で、本研究においては、リパーゼのエステル交換反応を応用して、（ポリ）フェノールグルコシド類の安定化と高機Nobuyoshi Nakajima

能化（機能改変）を主目的に、アルブチンや天然植物色素

Department of Nutritional Science,
Okayama Prefectural University

類（フラボノイド系、並びに、アントシアン系植物色素）の、芳香族酸（桂皮酸や p- クマール酸）ビニルによる酵素的エステル（アシル）化を可能にした。

− 45 −

まず、美白作用を有することが報告されているハイドロ
キノンの β - グルコシドであるアルブチンをアシル基受容おり、他の水酸基はエステル化されていないことが確認された４, 15）。

体に、桂皮酸ビニルをアシル基供与体として、リパーゼのまた、そのアグリコンであるクエルセチンやグルコシド

エルテル交換反応を利用することによりアルブチンシンナ

であるイソクエルシトリンと比較して、イソクエルシト

メートを合成した。本エステル化反応は、アルブチンのグ

リン p- クマレートやイソクエルシトリンシンナメートが、ルコシド糖であるグルコースの C6 位の一級 OH 基に位置

熱や光に対して最も安定であることが確認された（図３）。

１）

特異的であった（図１） 。

しかも、ラジカル消去能も保持していた（表１）13,15）。

3．1．2 イソクエルシトリン（フラボノイド系植物
色素）の芳香族酸エルテル化

3．1．3 クリサンテミン（アントシアン系植物色素）の芳香族酸エステル化

リパーゼのエルテル交換反応を利用して、フラボノイド

リパーゼのエルテル交換反応を利用して、アントシア

系植物色素のひとつであるイソクエルシトリン（クエルセ

ン系植物色素のひとつであるクリサンテミン（シアニジ

チン -3-O-β - d - グルコピラノシド）と各種の芳香族酸ビニ

ン -3-O-β -d- グルコピラノシド）と各種の芳香族酸ビニル６）ル（桂皮酸ビニルや p - クマール酸ビニル等）６）を原料に、を原料に、そのグルコシド糖への位置特異的な芳香族酸エ

そのグルコシド糖への芳香族酸エステル化を行った（図ステル化を行った４,13）。

２）。

これらの酵素的に合成したアシル化クリサンテミン類

各種のアシル化イソクエルシトリンの収量は、30 〜の中で、クリサンテミン p- クマレートやシンナメートが、60% であった。単離精製した芳香族酸エステル誘導体に

熱や光に対して最も安定であることが確認され（図３）、

13

ついて、 C-NMR 測定を行い、糖の一級アルコール（C6）ラジカル消去能も保持していた（表１）13,15）。

部位由来のシグナルにおいて高磁場側へのシフトが認められた。また、芳香族酸の酸部分のカルボニル炭素由来のピークの低磁場側へのシフトも観測された。しかし、ポリフ

3．1．4 植物培養細胞由来の酵素反応系を用いたフラボノイド系植物色素のアシル化

ェノール骨格のフェノール性水酸基やグルコシド糖の二級

ムラサキイモ細胞由来の酵素反応系を用いて、遊離の芳

水酸基の炭素については、ピークのシフトは全く確認され香族酸を原料としたフラボノイド系植物色素のアシル化法なかった。以上の結果から、イソクェルシトリンの糖部分を開発した。

の一級水酸基に芳香族酸が位置特異的にエステル化されて

図1

図2

Reaction scheme for lipase-catalyzed regioselective transesterification to synthesize arbutin cinnamate.

Reaction scheme for lipase-catalyzed regioselective transesterification to Synthesize isoquercitrin cinnamate.

− 46 −

新規な化粧品素材としてのコウジ酸、β - ツーヤプリシン、 p- アミノ安息香酸、及び、アルブチンのさらなる高機能化を目的とした酵素的分子設計

図3

Comparison of the Light-resistance of the Flavonoid Compounds.
The acylated flavonoid gulucosides were systhesized from their non-acylated forms with vinyl cinnamate or vinyl pcoumarate in dry acetone by Chirazyme L-2, and their structures were elucidated by NMR(1H-and13C-) and MS analyses
as described previously. The residual amounts of the plant pigments without incubation are expressed as 100%. A:
anthocyanins(450mM) were incubated at room temperature in 1 ml of a 100mM McI vain buffer (pH6.0) under illuminationby white fluorescent light (one side, 5,000 lx) for various times; chrysanthemin p-coumarate (500nm, ● ), chrysanthemin
cinnamate (500nm, ▲ ); chrysanthemin (530nm, △ ), cyanidin (580nm, ○ ). B: flavonols (40mM) were incubated under illumination by light (one side, 20,000lx) in 1 ml of the buffer (pH7.0); isoquercitrin p-coumarate (350nm, ● ); isoquercitrin
cinnamate (350nm, ▲ ); isoquercitrin (350nm, △ ); quercetin (350nm, ○ ).
表１

Radical-scavenging abilities of plant pigments and their derivatives

本反応に用いたムラサキイモ培養細胞由来の無細胞抽出
液中には、芳香族酸からアシル -Coenzyme A を合成する
酵素（アシル -CoA リガーゼ）と、アシル -CoA をアシル

3．1．5 ポリフェノールジグルコシドの芳香族酸エ
ステル化基供与体として、ポリフェノールグルコシド類の糖の一級リパーゼのエステル交換反応を利用して、植物性ポリフ

OH 基に対してアシル基転移反応を触媒するトランスフェェノールジグルコシドのひとつであるルチン、及び、ナリラーゼが存在すると考えられ、イソクェルシトリンの、特ンギンへの芳香族酸エステル化を行った。

にカフェー酸、及び、p- クマール酸によるそれぞれのアシその結果、ナリンギン（図５）の場合は、ジグルコシド

ル化が可能となった。本アシル化反応においても、ポリフ構造のグルコースの C6 位の一級 OH 基がアシル化されたェノールグルコシド糖の一級 OH 基に対して位置特異的でが、グルコシド糖に一級 OH 基が存在しないルチン（クェ７）あることが確認された（図４） 。

− 47 −

図4

Structure of acylated flavonoid glucosides (isoquercitrin aromatic acid esters).
R1=R2=OH: isoquercitrin caffeate; R1=H, R2=OH: isoquercitrin p-coumarate;
R1=OMe, R2=OH; isoquercitrin ferulate; R1=R2=H; isoquercitrin cinnamate.

図 5 Reaction scheme for lipase-catalyzed regioselective acylation for synthesis of naringin cinnamate.

ルセチンルチノシド）（図６）においては、主としてグルコースの C3 位の二級 OH 基へのアシル化が生じていることが確認された 11）。

3．2 化粧品素材としての（ポリ）フェノール化合物の酵素的グルコシル化による機能改変
3．2．1 グルコシルトランスフェラーゼによる β-thujaplicinのグルコシル化

図 6 Regioselectivity of the enzymatic acylation to rutin.

グルコシル化は、様々な外来物質の効果的な構造改変法の一つであり、不安定で疎水性の高い、すなわち水への溶

3．2．2

グルコシルトランスフェラーゼによる p- アミノ

解度が低い化合物を、より安定で、かつ親水性の高い化合

安息香酸のグルコシル化物に変換することができる。

次に、ユーカリ培養細胞由来の UDP- グルコシルトラン

本研究においては、有用な生理機能を持つ様々な難溶性

スフェラーゼ反応系を用いて、「UV プロテクター」としフェノール化合物の β - グルコシル化を可能にした。そのて用いられている p- アミノ安息香酸のモノグルコシル化

具体例として、ユーカリ培養細胞由来の膜結合型 UDP- グを可能にした。

ルコーストランスフェラーゼを用いた、β- thujaplicin（ヒ

本法により可能となったグルコシル化は、p- アミノ安息

ノキチオール）、p - アミノ安息香酸、サリチルアルコール、

香酸の COOH 基への位置特異的なモノグルコシド化であ

コウジ酸、ダイゼイン、及び、フラボノイド化合物等の酵った。変換率は上記のヒノキチオールの場合とほぼ同様で

素的グルコシル化による機能改変を行った。

あった２, ５）。

まず、天然の抗菌成分であるヒノキチオールの酵素的モ
ノグルコシル化を可能にした。ヒノキチオールモノグルコ

3．2．3

シドへの変換率は約 45％であった。本反応系では、ユーアルコールのグルコシル化

カリ培養細胞由来の膜結合型 UDP- グルコシルトランスフ
ェラーゼが、糖供与体である UDPglucose の存在下、（ポリ）

グルコシルトランスフェラーゼによるサリチル

さらに、サリチルアルコールのサリシンへのグルコシル化も可能であった２）。

フェノール類の「フェノール性 OH 基」へのグルコシル化を位置特異的に触媒していると考えられる。また、糖供与3．2．4

体は CDPglucose を用いても同様に進行した。

グルコシルトランスフェラーゼによるコウジ酸のグルコシル化

さらに、ユーカリ膜画分を用いて連続的にグルコシル化

メラニン沈着を防ぐ働きを保持し美白作用を示すと考え反応を行う「膜型バイオリアクターシステム」を開発した

られているコウジ酸の酵素的グルコシル化を可能にした（図７） 。
２）− 48 −

新規な化粧品素材としてのコウジ酸、β - ツーヤプリシン、 p- アミノ安息香酸、及び、アルブチンのさらなる高機能化を目的とした酵素的分子設計

図 8 Structures of kojic acid glucosides. (A) Kojic acid 7-O-β-dglucopyranoside; (B) kojic acid 5-O-β-d-glucopyranoside.

図7

Continuous enzymatic glucosylation of β -thujaplicin to
the monoglucoside in a membrane reactor system. (A)Schematic diagram of repetitive batch system; (B) Continuous conversion of β-thujaplicin to the monoglucoside. The
glucosylation reaction was performed at 30℃ with gentle
stirring in a stirred cell (10ml, Filtron Co., USA) equippedwith an ultrafilration membrane (M.W. 100,000 cut).

図9

Structures of daidzein glucosides. (C) Daidzein; (B)daidzin(daidzein 7-O-β -d-glucopyranoside).

（図８）。コウジ酸の約 40％がモノグルコシドへと変換さ並びに、エキナチン（カルコン）や上述したダイゼイン（イれた。また、5-O-β - d - グルコピラノシドが、7-O-β- d - グル

ソフラボン）の位置選択的なモノグルコシル化が確認され

９）

コピラノシドよりも圧倒的に優位に生産された 。

た２）。

3．2．5

3．2．7

グルコシルトランスフェラーゼによるダイゼイ

ン のグルコシル化

せ同様の方法により、植物エストロゲン、イソフラボンの

パン酵母による UDP- グルコース発酵を共役さ

UDP- グルコシルトランスフェラーゼ反応系によるグ

ルコ

シル化

ひとつであるダイゼインも本酵素反応を用いて、約 20％

マグネシウムイオンとリン酸イオンの存在下、AMP との変換率でダイジン（ダイゼイン 7-O-β -d- グルコピラノシ

グルコースを原料に、「パン酵母」による UDPglucose 発ド）に変換することが可能であった（図９）９）。

酵により生産させた UDPglucose を糖供与体として、ユー
カリ培養細胞由来の UDP- グルコシルトランスフェラーゼ

3．2．6

グルコシルトランスフェラーゼによる各種のフラボノイド化合物のグルコシル化

によるモノグルコシル化を行う「共役反応系」を構築した（図 10）５）。

フラボン類、フラボノール類、イソフラボン類、並びに、カルコン類等の植物性ポリフェノール類を基質として、ユ3．2．8

植物培養細胞変換法と酵素法によるカプサイシーカリ培養細胞由来の UDP- グルコシルトランスフェラー

ン関連化合物のグルコシル化

ゼによるグルコシル化を検討した。

ヨウシュヤマゴボウ培養細胞によるカプサイシン関連化

その結果、本酵素反応によるグルコシル化は、アピゲニ

合物のフェノール性 OH 基へのモノグルコシル化（図 11）

ンやルテオリン（フラボン類）のモノグルコシド化、ケンを経て、さらに、デンプンを糖供与体とした CGTase に

フェロール（フラボノール類）のアストラガリンへのモ

よるカプサイシンオリゴサッカライド類の合成を可能にしノグルコシル化、クェルセチン（フラボノール類）のモ

た 10,12）。

ノグルコシドであるイソクェルシトリン（クェルセチン
-3-O-β-d- グルコピラノシド）やクエルシメリトリン（クェルセチン -7-O-β- d - グルコピラノシド）へのグルコシル化、− 49 −

４.

総

括

以上、
「化粧品素材」として有用な天然植物色素を始め

図 10 Reaction scheme for systhesis of β -d-glucosides by the coupled enzymatic reaction
with UDP-glucosyltransferase and yeast cells.

図 11 Synthesis of capsaicin β -d-glucopyranoside (3) and 8-nordihydrocapsaicin β-d-glucopyranoside (4)from 1 or 2 by the cultured cells of P.americana.

とした（ポリ）フェノールグルコシド類の安定化と生理機

S. Mizobata, and H. Hamada, Effective Production

能の高機能化を目指して、微生物由来のリパーゼのエステ

o f β - T h u j a p l i c i n 2- O - β - d - g l u c o s i d e b y U D P -ル交換反応や植物細胞由来の酵素共役反応系を利用した、

glucosyltransferase Fraction from Cultured Cells of

ポリフェノールグルコシド類の芳香族酸エステル化（アシEucalyptus perriniana in a Membrane Reactor. J.

ル化）のための方法を開発した。

Ferment. Bioeng., 84(5), pp. 455-460, 1997.

さらに、抗酸化性（ポリ）フェノール化合物等の機能改

３） H. Hamada, Y. Miyamoto, N. Nakajima, and T.

変と「化粧品素材」としての有効利用方法のさらなる拡大

Furuya, High Selective Transformation by Plantを主目的に、植物や微生物由来の酵素反応を利用した、各Catalysts. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 5, pp. 187-189,

種のフェノール性化合物やフラボノイド類のグルコシル化

1998.

による構造機能改変を可能にした。

４） N. Nakajima, K. Ishihara, T. Itoh, T. Furuya, and H.
Hamada, Lipase-catalyzed Regioselective and Direct

謝辞

Acylation of Flavonoid Glucoside for Mechanistic
Investigation of Stable Plant-pigment. J. Biosci. Bioeng.,

本研究を遂行するにあたり、ご支援をいただきました

87(1), pp. 105-107, 1999.

（財）コスメトロジー研究振興財団に深謝いたします。

５） N . N a k a j i m a , K . I s h i h a r a , H . H a m a d a , S .
（引用文献）

Yamane, K. Nakamura, and T. Furuya, Multi-

１） N. Nakajima, K. Ishihara, S. Matsumura, H. Hamada,enzymatic Glucosylation Using Eucalyptus UDP-

K. Nakamura, and T. Furuya, Lipase-catalyzed

glucosyltransferase Coupled UDPglucose-fermentation

Synthesis of Arbutin Cinnamate in Organic Solvent

by Bakers' yeast. Biosci. Biotech. Biochem., 63(5), pp.
934-936, 1999.

and Application of Transesterification to Stabilize
Plant Pigments. Biosci. Biotech. Biochem., 61(11), pp.

６） K. Ishihara, N. Nakajima, T. Itoh, H. Yamaguchi, T.
Furuya, and H. Hamada, A Chemoenzymatic Synthesis

1926-1928, 1997.
２） N. Nakajima, T. Furuya, K. Ishihara, S. Matsumura,− 50 −of Aromatic Carboxylic Acid Vinyl Esters. J . Mol.

新規な化粧品素材としてのコウジ酸、β - ツーヤプリシン、 p- アミノ安息香酸、及び、アルブチンのさらなる高機能化を目的とした酵素的分子設計

Catal. B: Enzymatic, 7, pp. 307-310, 1999.

11） K. Ishihara, Y. Nishimura, T. Kubo, C. Okada,７） N. Nakajima, K. Ishihara, H. Hamada, S. Kawabe,

H. Hamada, and N. Nakajima, Enzyme-Catalyzed

and T. Furuya, Regioselective Acylation of Flavonoid

Acylation of Plant Polyphenols for Interpretation of

Glucoside with Aromatic Acid by an Enzymatictheir Functions. Plant Biotechnol., 19(3), pp. 211-214,

Reaction System from Ipomoea batatas. J. Biosci.
Biotech., 90(3), pp. 347-349, 2000.

2002.
12） H. Hamada, S. Ohiwa, T. Nishida, H. Katsuragi, T.

８） K. Sanada, A. Kawaguchi, T. Furuya, K. Ishihara,

Takeda, H. Hamada, N. Nakajima, and K. Ishihara, One-N. Nakajima, and H. Hamada, High Production of

step Glucosylation of Capsaicinoids by Cultured Cells

β-Thujaplicin with Thuja dolabrata var. hondai cellsof Phytolacca americana. Plant Biotechnol., 20(3), pp.

in a Semi-continuous Culture System. J. Mol. Catal. B:

252-255, 2003.

Enzymatic, 11, pp. 59-61, 2000.

13） N. Nakajima, M. Sugimoto, H. Yokoi, H. Tsuji, and

９） N . N a k a j i m a , K . I s h i h a r a , a n d H . H a m a d a ,K. Ishihara, Comparison on Acylated Plant Pigments:

Functional Glucosylation of Kojic acid and DaidzeinLight-resistibility and Radical Scavenging Ability.

with the Eucalyptus Membrane-Associated UDP-

Biosci. Biotech. Biochem., 67(8), pp. 1823-1832, 2003.

Glucosyltarnsferase Reaction System. J. Biosci. Biotech.,14） K. Ishihara, H. Hamada, T. Hirata, and N. Nakajima,

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Biotransformation using Plant Cultured Cells. J. Mol.

10） H. Hamada, K. Nishida, T. Furuya, K. Ishihara,

Catal. B: Enzymatic, 23, pp. 145-170, 2003.

and N. Nakajima, Preparation of a New Papper:15） K. Ishihara and N. Nakajima, Structural Aspects of

Chemoenzymatic Synthesis of Capsaicin oligosaccharide

Acylated Plant Pigments: Stabilization of Flavonoid

and 8-Nordihydrocapsaicin oligosaccharide. J. Mol.

Glucosides and Interpretation of their Functions. J.

Catal. B: Enzymatic, 16, pp. 115-119, 2001.

Mol. Catal. B: Enzymatic, 23, pp. 411-417, 2003.

− 51 −