【研究報告】（自然科学部門）

食習慣のメタボ化におけるマクロファージ表現型の変化に着目した尿路結石治療法の開発

田口

名古屋市立大学大学院医学研究科腎・泌尿器科学分野
緒言和己

博士課程

実験方法
脂肪細胞・マクロファージ・腎尿細管細胞のパラク

1.

尿路結石の生涯罹患率は食生活の欧米化に伴い上昇

ライン環境による尿路結石形成機序の解析し、100 人中 15 人に達している。またその 5 年再発率は40 〜 50％と高く、医療のみならず経済を圧迫する社会マウス尿細管上皮細胞（M-1）、脂肪細胞（3T3-L1）、問題になっている。尿路結石患者は、肥満、高血圧症、マクロファージ細胞（RAW264.7）を共培養し、パラク糖尿病、高脂血症を合併する人が多く、「尿路結石は、ライン環境において、結晶が尿細管上皮細胞に及ぼす炎メタボリックシンドローム（MetS）の一病態」と考え症・作用を解析した。① control 群：M-1、②脂肪細胞られる。しかし、現在の尿路結石の治療法は、内服薬に群：M-1、3T3-L1 の共培養、③ Mϕ 群：M-1、RAW264.7

よる排石促進や、外科的治療による結石破砕であり、分の共培養、④脂肪細胞–Mϕ 群：M-1、3T3-L1、RAW264.7

子生物学的観点からの治療法は確立されていない。の共培養の 4 群を準備した。シュウ酸カルシウム一水化

私たちは、横断研究やモデルマウスを用いた研究に物（COM）結晶を M-1 に添加し、48 時間後の付着量をおいて、尿路結石が、MetS の 1 つである動脈硬化病変定量化した。また、各群の M-1 の Spp1、Ccl2、Tnf、Il61）と類似していることを発見した 。またこの現象の中の発現を定量 PCR で比較した。さらに、細胞間のパラで、結石の形成に伴い腎間質のマクロファージ（Mϕ）

クライン因子を調べるため、各群の培養液中の OPN、数が増加し、結晶を貪食している像を発見した。これらMCP-1、TNF-α、IL-6 の濃度を ELISA で比較した。の結果から、私たちはマイクロアレイ解析を行い、腎結高脂肪食の投与によるメタボリックシンドロームモ

2.

石の形成と消失には①腎尿細管細胞への結晶の付着、デルにおける尿路結石形成の評価②結晶塊の間質移行、③ケモカイン・サイトカインなどの発現、④単球の走化・分化・血管内皮細胞との接着、MetS 環境下において、MetS の表現型およびアディポ⑤ Mϕ の成熟・貪食・細胞内消化・抗原提示という、結サイトカインが尿路結石の形成に及ぼす影響を、MetS2）モデルマウスを用いて分子生物学的に解析する。MetS

石の貪食処理メカニズムを推測した （図 1）。

モデルマウスとして ob/ob マウス（B6.Cg-Lepob/J）を

一方 Mϕ には、炎症に促進的に働く M1 型と、抑制的に働く M2 型があると言われており3）、MetS 環境下など
M1 は脂肪細胞と関連があり、M2 は組織修復に関係することがわかっている 4, 5）。私たちは脂肪細胞と腎尿細管細胞の共培養システムを用い、尿細管上皮への結晶付
着時は M1 関連遺伝子が高く発現し、脂肪細胞がそれを促進すること6）、M2 が機能不全となり相対的に M1 有意となったマウスでは、腎結石形成量が増加することを発見した7）。
これらの研究成果を踏まえ、本研究では MetS と Mϕ
表現型との関連に着目し、尿路結石形成機序の解析を行い、分子生物学的な治療法の確立を目指した基礎研究を図1行った。
1

メタボリックシンドロームに類似した尿路結石形成にかかわるマクロファージの働き田口和己2.

用いた。野生型である Lean を対照に、8 週齢から普通高脂肪食の投与によるメタボリックシンドロームモ
デルにおける尿路結石形成の評価食を与えた群（Ctl 群）、高脂肪食（HFD-60）を与えた群（HFD 群）、シュウ酸前駆物質であるエチレングリ

HFD+EG 群の Ob/Ob マウスでは、腎皮髄境界部を中コール（EG）を自由飲水された群（EG 群）と高脂肪食心にびまん性に、尿細管腔内に嵌頓するシュウ酸カルシと EG を与えた群（HFD+EG 群）（各 =6）に分け、2 週ウムの結晶の沈着を認めた。Lean およびその他の群で後に血清、24 時間尿、腎を採取した。腎組織中の結石は腎結石形成は認められなかった（図 5）。

形成量を偏光顕微鏡と、シュウ酸カルシウム染色である

Ob/Ob マウスは遺伝子の欠損に伴う過食によPizzolato 染色にて評価し、画像解析ソフトにて定量化り、すべての群で Lean よりも1.7〜2.0 倍の体重を示した。

を行った。また結石および Mϕ 関連遺伝子とアディポサ

Ctl 群の Ob/Ob マウスは、Lean と比べ、血中の Ca およイトカインを PCR、Flow cytometry を用いて定量、評び TC 濃度、尿中の Ca、P、および Mg 排泄量が高値で価した。

あ っ た。HFD+EG 群 の Ob/Ob マ ウ ス で は、Lean と 比べ、血中 Cr 濃度が 2.59 倍、血糖値が 1.91 倍、中性脂肪統計学的解析®

が 6.53 倍に増加していた。また、EG および HFD+EG 群SAS ver9.1 を使用し、各群間の有意差（ <0.05）は、Mann–Whitney

では、Lean と Ob/Ob マウスとも、尿中のシュウ酸排泄

検 定 お よ び ANOVA に よ り 検 定 を量が有意に高値を示した（data not shown）。

行った。

腎組織中のアディポサイトカインの発現では、Ctl お結果

1.

よ び HFD+EG 群 の Ob/Ob マ ウ ス で は Lean に 比 べ、脂肪細胞・マクロファージ・腎尿細管細胞のパラク

Adipoq の 発 現 が 有 意 に 低 値 で あ っ た が、Ccl2、Il6、ライン環境による尿路結石形成機序の解析

Spp1、Tnf は他の群と比較しても有意に高値を示した（図 6A）。 免 疫 組 織 化 学 染 色 か ら は、MCP-1、IL-6、M-1 への COM 付着量は、control 群と比較し、脂肪細胞群 2.06 倍、Mϕ 群 1.98 倍、脂肪細胞–Mϕ 群 3.24 倍といずれも有意に高値を示した（図 2）。
定量 PCR による M-1 細胞の発現解析は、control 群と比較し、脂肪細胞群では Ccl2 と Tnf、Mϕ 群では Spp1、脂肪細胞–Mϕ 群では Spp1、Ccl2 および Tnf がそれぞれ有意に高値を示した（図 3）。
また ELISA による培養液中のタンパク濃度の解析は、control 群と比較し、脂肪細胞群では MCP-1、TNF-α、Mϕ 群ではOPN、脂肪細胞–Mϕ 群では4因子すべて（OPN、MCP-1、TNF-α、IL-6）が有意に高値を示した（図 4）。

図3

図2

腎尿管上皮細胞 (M-1）へのシュウ酸カルシウム 1 水和物
結晶の付着量

腎尿管上皮細胞 (M-1）中の遺伝子発現解析

図42

培養液中の発現タンパク濃度解析

食習慣のメタボ化におけるマクロファージ表現型の変化に着目した尿路結石治療法の開発

図5

腎結石形成量図 6A

腎組織中のアディポサイトカイン (mRNA）の発現

図 6B

腎組織中のアディポサイトカイン ( タンパク）の発現

3

田

図7

図8

口和

己

腎組織中の Mϕ(M1/M2）数Ob/Ob マウスにおける尿細管上皮細胞内の超微細構造の観察

OPN、TNF-α は Ob/Ob マウスの結晶沈着した尿細管上りこれらの変化が促進されることが結石形成につながる皮細胞の管腔側を中心に、周囲の間質でも強胃発現を認ことが示唆された。これらのめ、APN では発現の低下を認めた（図 6B）。

管上皮細胞への結晶の付着を介した結石形成には、MϕFlow cytometry による腎組織中の M1 および M2 の比の研究から腎尿細および脂肪細胞からの炎症性アディポサイトカインが重較では、HFD+EG 群の Ob/Ob マウスでは M1 および総要な働きを担っていることがわかった。

Mϕ 数が有意に高値であった。また HFD＋EG 群では、

また今回私たちは、MetS モデルである Ob/Ob では抗その他の群と比べ、Lean および Ob/Ob マウスともにシュウ酸尿の惹起により、腎結石形成が引き起こされるM2 数が増加していた（図 7）。

ことを発見した。Ob/Ob マウスは、肥満モデルとして透過型電子顕微鏡による超微細構造の観察では、Ob/用いられ、コレステロール・中性脂肪・血糖などの脂Ob マウスの腎尿細管上皮細胞には、細胞質内に lipid質・耐糖能異常を認めることがわかっている8）。それにfragment が 存 在 し、HFD 群 で は fat droplet が 出 現 し、加え、本研究結果から、Ca、P、Mg などの電解質異常

HFD+EG 群 で は 結 晶 が 沈 着 し て い る 像 が 示 さ れ たも合併することが示された。Ob/Ob マウスでは、高脂（図 8）。

肪食および EG の負荷によって、炎症性のアディポサイトカインと炎症性 Mϕ である M1 の増加を認めており、考察

これらの炎症促進に、生来の代謝異常が合わさり、結晶

本研究の結果より、MetS 環境における腎尿細管上皮の増大と尿細管管腔内での沈着を認めたのではないかと細胞は、脂肪細胞との共存で炎症が惹起され、Mϕ との考えられた。透過型電子顕微鏡からは、Ob/Ob マウス

共存で OPN の発現が亢進すると考えられた。さらに、では、高脂肪食の投与によって脂質の尿細管腔内への沈

脂肪と Mϕ の共存では、IL-6 を介したパラクラインによ着が観察されており、脂質が Mϕ や結晶成分とともに一4食習慣のメタボ化におけるマクロファージ表現型の変化に着目した尿路結石治療法の開発

カイン・Mϕ の関与が促進していることが示唆された。

塊となり、結石化を来すのではないかと推察された。
本研究から、MetS 環境下では脂肪および M1 による今後、これら MetS 環境における炎症応答を抑制するこ炎症反応の増加が尿路結石の形成を促進していることがとで、尿路結石の形成を予防する新規治療の開発が望ま示唆された。今後、抗炎症アディポサイトカイン、M2れる。

への誘導に着目した、脂肪細胞や M1 によるパラクライ
謝ンの抑制が、新たな尿路結石の治療法になりうると考えられた。

辞本研究を遂行するに当たり、助成を賜りました公益財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。
要約

また直接ご指導ご高配を賜りました本学の郡健二郎理事

食生活の欧米化とともに、尿路結石症の罹患率は増長、ならびに大学院医学研究科腎・泌尿器科学分野の安加しており、「MetS の一病態」と考えられるようになっ井孝周教授をはじめとする教室員の先生方に深く御礼申ている。私たちのこれまでの研究から、尿路結石の形成し上げます。には Mϕ がかかわることが示唆されている。そこで本研
文究では、MetS の病態と Mϕ の表現型に着目し、MetS 環境下における尿路結石形成機序を解明し、新規治療法の献

1） R. Ando, et al.:., 189, 1340–1346, 2013.
2） A. Okada, et al.:., 24, 908–924, 2009.
3） A. Mantovani, et al.:., 25, 677–686,2004.
4） M. Z. Zhang, et al.:., 122, 4519–4532, 2012.
5） S. Lee, et al.:
, 22, 317–326, 2011.
6） J. Ichikawa, et al.:, 42, 17–28, 2014.
7） K. Taguchi, et al.:., 25, 1680–1697,
2014.
8） A. J. Kennedy, et al.:., 3, 156–166, 2010.

開発への基礎研究を行った。の研究から、腎尿細管上皮細胞への結晶の付着には、脂肪細胞・Mϕ の共培養によるパラクライン環境での炎症性アディポサイトカインの増加がかかわっていた。MetS モデルである Ob/Ob マウスを用いた研究か
らは、Ob/Ob マウスでは高脂肪食と EG の投与により腎結石が形成され、代謝障害および炎症性アディポサイト

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