慢性掻痒性皮膚疾患における表皮内末梢神経伸展因子の探索

富山大学大学院医学薬学研究部応用薬理学

安 東嗣 修In addition to epidermal hyperplasia, chronic pruritic skin diseases (e.g., atopic dermatitis, dry skin) show theincreased number of nerve fibers in epidermis. However, the characteristics and the mechanisms of sprout of nerve fibers
are still unknown. In the present study, we investigated the characteristics of the nerve fibers in epidermis by using theimmunohistochemical analysis and proteomics analysis of epidermal protein for identification of the factor for sprouting
in the dry skin mouse model with itch. For preparing the mouse model, the rostral back was treated daily with cutaneous
application of acetone/ether (1:1) mixture (AE), water following AE (AEW). The stratum corneum hydration decreased in
AE- and AEW-treated mouse skin, but not non-treated skin. The treatment with AEW induced the spontaneous scratching as
an itch-associated response, and increased the number of protein gene product 9.5-positive nerve fibers, which were calcitonin
gene-related peptide-positive C-fiber neurons. However, these alterations were not shown in non- and AE-treated mice. The
proteomics analysis showed a lot of epidermal proteins that the expression altered by treatment with AE and AEW, comparedwith non-treatment. We are doing the identification of these proteins by using MALDI-TOF/MS.

１．緒

２. ２

言

乾燥性皮膚掻痒症モデルマウスの作製

乾燥性皮膚掻痒症モデルマウスは，Miyamoto ら7）の方「痒み」は，皮膚と一部の粘膜において認められ，掻き法により作製した。実験開始 5 日前に，ジエチルエーテルたいという衝動を引き起こす不快な感覚である。痒みの発

麻酔下，マウス吻側背部を 2 ㎝四方にバリカンで除毛後，生は，皮膚内における痒みのメディエーターの産生に起因さらにシェーバーで剃毛した。角質細胞間脂質を抽出するするものだけでなく，特に乾皮症やアトピー性皮膚炎患者目的でアセトンとジエチルエーテルの 1：1 混液を 2 ㎝四では，皮膚が痒覚過敏（痒み刺激に対する反応の増大）あ方の脱脂綿に染み込ませ，これをジエチルエーテル麻酔下，るいはアロネーシス（通常は痒みを生じない刺激で痒みが剃毛部位に 15 秒間適用した（AE 処置），直後に蒸留水を起こる状態）の状態になっていることが報告されている

２㎝四方の脱脂綿に染み込ませ，30 秒間適用した（AEW1, 2）。

この様な病態では，痒みのシグナルを伝える一次感覚神処置）。この操作を 1 日 2 回 8 時間以上の間隔をあけ，5経の表皮内への伸展が報告されている日間行った。

3−6）。しがしながら，この様な病理学的変化は観察されるものの，その伸展神経の特徴や痒み発生との関連に関して明らかになっていな

２. ３

い。そこで，本研究では，乾燥性皮膚掻痒症マウスモデル

7）

角質水分量の測定

毎朝の皮膚バリア破壊処置前，および行動実験開始前に，を用いて，表皮内伸展神経の特徴を免疫組織学的に解析

Moisture Checker®MY707S（SCALAR Corporation，東し，表皮における変化タンパクのプロテオミクス解析を行京）を用いて測定した。電気伝導率を指標として測定されない，末梢神経伸展因子の同定を試みた。

た角質水分量は，測定値として表示される単位（%）で示

２．実
２. １

した。

験実験動物

２. ４8）

実験には，
雄性 ICR 系マウス
（7 ～ 8 週齢，日本 SLC，静岡）を用いた。

行動実験

5 日間の AEW 処置の翌日に Kuraishi ら の方法でマウスの自発的掻き動作数を計測した。すなわち，動物の行動を無人環境下で８㎜ビデオカメラにて撮影した。行動観察
はビデオの再生により行い，後肢による皮膚バリア破壊処

Identification of sprouting factor for
peripheral nerve fibers in the epidermis
with chronic pruritic skin disease
Tsugunobu Andoh
Department of Applied Pharmacology,
G r adu at e S cho o l of Med ic i ne a nd
Pharmaceutical Sciences, University ofToyama

置部位（剃毛部位）に対する自発的な掻き動作回数を数えた。マウスは，1 秒間に数回掻くので後肢を挙げてから降ろすまでの一連の動作を１回として数えた。

２. ５

免疫組織化学染色5 日間の AEW 処置の翌日に，マウスを４% パラホルムアルデヒド溶液にて灌流固定後，バリア破壊した吻側背− 74 −

慢性掻痒性皮膚疾患における表皮内末梢神経伸展因子の探索部皮膚を採取した。続いて厚さ 30 ㎛の凍結切片を作製後，一方，自発的掻き動作数は，AE 処置群では無処置群と定法により抗 protein gene product 9.5（PGP9.5）および比較して有意な差は認められなかったが，AEW 処置群は抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）抗体を用い無処置群および AE 処置群のいずれに対しても有意に自発て免疫染色を行なった。染色した皮膚切片は共焦点レー的掻き動作回数が増加した（Fig. 2B）。

ザー顕微鏡（Bio-Rad，Radiance 2100）を用いて観察した。
一部の実験では，マウス 1 匹当り 5 ヶ所の表皮内伸展末梢神経終末数を数え，幅 1 ㎜当りの本数の平均値を個体値とした。

３. ３ AE 処置及び AEW 処置による表皮内伸展末梢神経の変化
PGP9.5 は， 神 経 の マ ー カ ー で あ る。AE 処 置 お よ び
AEW 処置を 5 日間行った部位の表皮における，PGP9.5

２. ６

二次元電気泳動陽性神経線維の分布を Fig. 3A-C に示した。無処置マウス

無処置，AE 処置及び AEW 処置マウス皮膚を摘出後， （Fig. 3A）および AE 処置（Fig. 3B）マウスの皮膚では表皮を剥離し，タンパク質を抽出した。IPG ストリップ（pH末梢神経終末のほとんどが表皮−真皮接合部までしか達し

３− 10）を用た等電点電気泳動に続いて，SDS-PAGE にておらず，表皮内への伸展は少なかった。一方，AEW 処よる電気泳動を行なった。ゲルをクマシーブリリアントブ

置マウスの皮膚では無処置マウスの皮膚に比べ，多くの末ルー染色後，画像解析を行なった。変化したスポットに対梢神経終末が表皮内へ伸展しているのが観察された（Fig.

して MALDI-TOF/MS によるタンパクの同定を試みた。

3C）。

３．結３. １

また，無髄 C 線維が痒みの伝達に関与していることが果知られている。また，その C 線維のほとんどがカルシト9）

AEW 処置マウスにおける皮膚症状

ニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）含有神経である 。そ剃毛した無処置マウスの皮膚は鱗屑等の乾皮症に類似すこで，AEW 処置を行った皮膚部位における CGRP 含有神る症状は認められなかた（Fig. 1A）。一方，1 日 2 回 5 日

経線維の分布を Fig. 4 に示した。AEW 処置マウスの皮膚

間 AE 処置（data not shown）あるいは AEW 処置（Fig.

では，数多くの CGRP 含有神経終末が表皮内へと伸展し1B）を行ったマウスでは，顕著な鱗屑を認める典型的なていた。

角化亢進を伴う乾皮症に類似する皮膚症状が観察された。
本モデル皮膚の病理組織学的変化として，無処置マウス皮膚と比較して，AEW 処置マウス皮膚では明らかな表皮の肥厚，顕著な角化亢進の像が観察され，炎症性細胞の顕著な浸潤は認められなかった（data not shown）。

３. ４ AE 処置及び AEW 処置による表皮内タンパク質のプロテオミクス解析
無処置，AE 処置及び AEW 処置マウス皮膚より表皮を剥離し，抽出したタンパクを用いて二次元電気泳動を行っ

３. ２ AE 処置および AEW 処置による角質水分量と自発的掻き動作数の変化
角質水分量は，無処置群では変化しなかったが，AE 処置群において処置開始後 2 日目から，AEW 処置群においては処置開始後 1 日目から有意に減少した（Fig. 2A）。また，AEW 処置群はどの時点においても AE 処置群よりも有意に低い値を示した（Fig. 2A）。

Fig. 1 Skin condition of AEW-treated mouse skin. The skinconditions in non-treated mouse skin (A) and in AEWtreated mouse skin (B).

Fig. 2 Time-dependent changes in stratum corneum (SC)hydration and scratching behavior in mice treated with AEor AEW. (A) SC hydration was measured daily before AE
or AEW treatment. (B) The number of scratching for 2h wasmeasured the day after 5-days AE or AEW treatment.
Values represent the mean±SEM for 8 animals. *p < 0.05
and #p < 0.05 compared with control and AE-treatment,respectively (Dunnett’s multiple comparisons).

− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

た。それぞれの処置により発現が増加，減少したタンパクが多く見つかった。現在，それぞれスポットを抽出して解析している。現在までに同定できたタンパクで，機能がわかっているものの一つで filaggrin あり，無処置，AE 処置及び AEW 処置と発現が減少していった。

4．考察

本研究において，AE 処置では皮膚は乾燥するものの自発的掻き動作や末梢神経の表皮内伸展は観察されず，AEW 処置マウスにおいてのみ自発的掻き動作の有意な増加や表皮内伸展神経線維数の増加が認められた。これらのことから，AEW 処置マウスにおける痒みが表皮内伸展末梢神経の増加に付随して誘導されていることが示唆される。皮膚の乾燥を伴うようなアトピー性皮膚炎などの掻痒性皮膚疾患の皮膚でも，表皮内に一次感覚神経が伸展している

3 − 6）。この様な皮膚疾患の皮膚は，痒覚過敏あるいはアロネーシスの状態になっていることが報告されている1, 2）。

したがって，表皮内に伸展した末梢神経は，痒みの伝達に重要な役割を担っていると考えられる。と こ ろ で，AEW 処 置 マ ウ ス 皮 膚 の 表 皮 内 伸 展 神 経
Fig. 3 PGP9.5-immunoreactive nerve fibers in the mouseskin. The skin sections obtained from non-treated (A), AEtreated (B) and AEW-treated (C) mice were immunostainedwith anti-PGP9.5 antibody. The dashed line in each panel
indicates the border between the epidermis and the dermis.
Arrows indicate nerve fibers in epidermis. Scale bar=50 ㎛ .

9）が， 主 に CGRP を 含 有 す る 無 髄 神 経 で あ っ た。CGRPは，無髄の C 線維に加え，有髄の A 線維にも発現している。しかしながら，有髄の A 線維のマーカーである
neurofilament 200 陽 性 神 経 の 伸 展 は 観 察 さ れ な か っ た（data not shown）。このことから，伸展神経線維は，主にC 線維であることが示唆される。
表皮内への末梢神経伸展には，表皮の大部分を占めるケラチノサイトからの遊離因子が関与している可能性がある。
そこで，表皮を剥離してプロテオミクス解析を試みている。
その中で，AEW 処置により filaggrin の減少が認められた。

Fig. 4 CGRP-immunoreactive nerve fibers in AEW-treatedmouse skin. The skin sections obtained from AEW-treatedmouse mice was immunostained with anti-CGRP antibody.
The dashed line in each panel indicates the border
between the epidermis and the dermis. Arrow heads
indicate CGRP-immunoreactive nerve fibers in epidermis.
Scale bar = 25 ㎛ .

Fig. 5. Comparative analysis of differentially expressed
protein spots in control and AE- or AEW-treatment
epidermis. Zoom of the 2-DE gel on the spot of filaggrin.

− 76 −

慢性掻痒性皮膚疾患における表皮内末梢神経伸展因子の探索

Filaggrin は，脂質成分のセラミドと伴に皮膚の保湿やバfine structure of peripheral nerves in various skin

リア機能に関与している因子である。Filaggrin の遺伝子

lesions of atopic dermatitis, Arch. Dermatol. Res., 289,

変異が魚鱗癬の発症の原因に関係していることが示唆され125-131, 1997.ており，その患者の多くがアトピー性皮膚炎を伴っている
11, 12）５）Urashima R，Mihara M,: Cutaneous nerves in atopic。このように皮膚バリア機能がdermatitis. A histological，immunohistochemical and

破壊されることにより外部からの刺激を受けやすくなって

electron microscopic study, Virchows Arch., 432, 363-

おり，しかもこのことがケラチノサイト活性化に重要であ370, 1998.

ことが報告されている

るかもしれない。現在，AEW 処置によって変化するタン６）Kinkelin I，Motzing S，Koltzenburg M,: Increase

パク質の同定を行っており，直接神経伸展に関与する因子

in NGF content and nerve fiber sprouting in humanと細胞間接着因子など神経伸展に当り細胞間の隙間形成と

allergic contact eczema, Cell Tissue Res,. 302, 31–37,

表皮環境に関与するもの，更には，神経因子だけでなく痒

2000.
７）Miyamoto T，Nojima H，Shinkado T，et al,: Itch-

みに関与する因子も見出されることが期待される。

associated response induced by experimental dry skin

謝辞in mice, Jpn. J. Phamacol., 88, 285–292, 2002.

本研究を遂行するに当たり、ご支援を頂きました財団法

８）Kuraishi Y， Nagasawa T， Hayashi K， et al,:人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたします。まScratching behavior induced by pruritogenic but not

た、本研究にご協力くださいました当研究室 倉石泰教授、algesiogenic agents in mice, Eur. J. Phrmacol., 275, 229-

並びに浅川優太、桑園 崇両氏に感謝いたします。

233, 1995.
９）L a w s o n S N , M c C a r t h y P W , P r a b h a k a r E , :（引用文献）

Electrophysiological properties of neurons with CGRP-

１）Heyer G，Ulmer FJ，Schmitz J，et al,: Histamine-like immunoreactivity in rat dorsal root ganglia, J.

induced itch and alloknesis (itchy skin) in atopic
eczema patients and controls, Acta Derm. Venereol.,Comp. Neurol., 365, 355-366, 1996.
10）Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, etal,: Common loss-of-function variants of the epidermal

75, 348-352, 1995.
２）Simone DA，Alreja M，LaMotte RH,: Psychophysicalbarrier protein filaggrin are a major predisposing

studies of the itch sensation and itchy skin ("alloknesis")factor for atopic dermatitis. Nat. Genet., 38, 441-446,

produced by intracutaneous injection of histamine,

2006.
11）Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, etSomatosens Mot. Res., 8, 271-279, 1991.
３）Tobin D，Nabarro G，Willem A，et al,: Increased

al,: Loss-of-function mutations in the gene encoding

number of immunoreactive nerve fibers in atopic

filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nat. Genet., 38, 337-

dermatitis, J. Allergy Clin. Immunol., 90, 613-622, 1992.

342, 2006.

４）Sugiura H, Omoto M，Hirata Y，et al,: Density and− 77 −