【研究報告】（自然科学部門）

食品成分アピゲニンのマイクロ RNA 抑制機構を介した抗 C 型肝炎ウイルス効果の検討

大野元子

東京大学大学院医学系研究科内科学専攻（消化器内科学） 博士課程
緒

イルス量を減らすことが確認されている6）。慢性 C 型肝言ポリフェノールは分子内にフェノール性ヒドロキシ炎は治療法が進歩しつつあるものの、いまだに我が国のル基をもつ植物性成分の総称で、多彩な生理学的作用を肝癌の主要な原因であり、また抗ウイルス療法の治療効持つことが知られているが、その作用機構の大部分は明果はウイルス量によって規定されているという側面もあらかにされていない。一方、microRNA は 20〜25 塩基り、miR122 の機能調整・発現調整は肝臓関連疾病の管程度の小分子 RNA で、現在ヒトで 2,000 種ほど報告され理に有用な可能性がある。本研究ではこれまでに見出しているが、ひとつの microRNA が複数の mRNA を標的たアピゲニンの microRNA 合成・機能阻害効果の知見として結合し、それらの遺伝子からの蛋白発現を負に制を元に、miR122 の合成阻害を介した C 型肝炎ウイルス御することで様々な生理機能を発揮することが近年明ら増殖抑制効果について検証した。

1）かになってきた 。我々は microRNA が多彩な生理作用を持つという点でポリフェノールと類似していることに方法・結果着目し、「ポリフェノールの持つ生理作用の多様性は、1.

アピゲニンは miR122 の産生を抑制する多彩な生理作用をもつ microRNA の機能変化によってヒト肝癌細胞株である Huh7 細胞にアピゲニンを添加惹起されている可能性がある」という仮説を立ててこれ

後 5 日目の細胞中の成熟 miR122 発現量を RT-PCR 法でを検証した。その結果、ブロッコリー・パセリなどの緑定量した。TRBP が関与しない microRNA の一つ let-7g

色野菜やカモミール茶に多量に含まれるポリフェノールを Control として用いたところ、let-7g の発現量は変化の 中 の フ ラ ボ ノ イ ド 属 の ひ と つ ア ピ ゲ ニ ン が、しなかったものの、miR122 はアピゲニン濃度依存的にmicroRNA の成熟過程に関与する TRBP というタンパク有意な低下を認めた（図 1a）。また、Northern blottingのリン酸化を MAPK 経路依存性に抑制し、TRBP に依でもアピゲニン存在下での miR122 の発現低下を確認し存して合成される一群の microRNA の産生を低下させた（図 1b）。 一 方、miR122 の 前 駆 体 で あ る miR122その機能を抑制するということを見出した。その具体的

precursor はアピゲニン濃度依存的に増加しており（図な効果として、耐糖能異常に関与することが報告されて1c）、アピゲニンが precursor から miR122 への成熟の過いた microRNA-103（miR103）2）に着目し、アピゲニン程を阻害していると考えられた。

が miR103 の生成を抑制することによって耐糖能異常を次に、miR122 のターゲット領域を 3′-UTR に持つルシ改善する効果があることをマウスモデルで検証し報告

フェラーゼレポーターを細胞に導入し、miR122 の機能3）し た 。 ア ピ ゲ ニ ン は TRBP を 介 し て 生 成 さ れ るをルシフェラーゼアッセイで評価した。この系においてmicroRNA の一群の機能を抑制すると考えられるが、そmiR122 はルシフェラーゼの発現を抑制するが、アピゲの中で microRNA-122（miR122）もアピゲニンによっニンの濃度依存的にルシフェラーゼ活性の上昇を認め、て合成が阻害される microRNA のひとつであった。

アピゲニンが miR122 の機能を抑制していると考えられた（図 1d）。また、miR122 のターゲット領域に変異をmiR122 は肝細胞特異的に発現し、脂質代謝や鉄代謝4）など肝臓の多彩な機能に関わる microRNA である とと導入したレポーターではルシフェラーゼ活性の変化はな

もに、C 型肝炎ウイルス（HCV）の複製を「正」に促す

く、活性変化は miR122 の特異的な作用を反映していることが示されており5）、実際に miR122 のアンチセンスと考えられた。なお、アピゲニン濃度は 5 μM まで上げ

核酸が小規模の短期臨床試験（Phase 2）で C 型肝炎ウても有意な細胞毒性を認めず、50 μM ではわずかに細胞1大図1野元子

アピゲニンの miR122 産生抑制効果数の低下がみられた（図 1e）。
2.

アピゲニンは miR122 発現抑制を介して HCV 複製を抑制する
miR122 が HCV 複製に促進的に働くことから、アピゲニンが miR122 発現抑制を介して HCV 複製を抑制するという仮説を立て、これを検証した。この際、HCV レプリコンによるレポーターコンストラクト（Huh7-Feo）
を 持 つ Huh7-Feo 細 胞 を 用 い た。 こ の レ プ リ コ ン は、HCV の 5′ IRES の下流にルシフェラーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子による融合遺伝子 Feo を持ち、細胞内の HCV 複製をルシフェラーゼ活性によってモニターできる（図 2a）。この細胞にアピゲニン添加後 5 日目にルシフェラーゼ活性を測定すると、アピゲニン濃度依存的にルシフェラーゼ活性は有意に低下（すなわち HCV 複図2製の低下を示唆）しており、5 μM のアピゲニン処理後アピゲニンの miR122 抑制を介した HCV 複製抑制効果

では miR122 アンチセンスを導入したものとほぼ同程度中の miR122 が増加していることを Western Blotting での低下であった（図 2b）。Western Blotting でも同様に、確認（図 2d）、アピゲニン添加によるルシフェラーゼ活アピゲニンによるルシフェラーゼの発現抑制を確認した性をみると、miR122 高発現細胞ではアピゲニン存在下（図 2c）。

でもルシフェラーゼ活性低下を認めなかった（図 2e）。
以上より、アピゲニンは miRNA 発現抑制を介して HCV

次に、合成 miR122 の導入がアピゲニンの効果に拮抗複製抑制効果を阻害すると考えられた。

するかどうかを調べた。まず合成 miR122 導入後の細胞2食品成分アピゲニンのマイクロ RNA 抑制機構を介した抗 C 型肝炎ウイルス効果の検討して miR122 の成熟過程を阻害し、結果として miR122が促進的に働く HCV 複製が抑制されると考えられる。
考察
慢 性 C 型 肝 炎 の 治 療 に お い て は、 近 年 DAA 製 剤（direct acting antiviral drug）の進歩により治療効果が目覚ましく向上してきており、アピゲニンの HCV 複製抑制効果がどれほど寄与できるかは不明である。しかし、DAA が高価であることから経済性・利便性の問題、
図3

また DAA 耐性株を持つ治療無効な患者などの問題も存

ア ピ ゲ ニ ン の HCV 複 製 抑 制 効 果 に 対 す る リ ン 酸 化
TRBP の拮抗効果在している。我々の見出したこの知見により、例えばアピゲニンと従来の治療を組み合わせるなど、アピゲニン

3.

リン酸化 TRBP はアピゲニンの HCV 複製抑制効果

が HCV の制御に補助的な役割を果たすことができるかを阻害するもしれない。また、miR122 が脂質代謝にも関与しておアピゲニンの microRNA 産生抑制効果が TRBP リンり、miR122 の発現抑制がコレステロールを低下させる酸化抑制によるという以前の実験結果を踏まえ、ﬂag-効果も示唆されることから、アピゲニンのサプリメント

Tag 付き TRBP、および活性型であるリン酸化 TRBP のや補助食品の開発など、新たな予防法・補助治療法とし

mimic（TRBP（SD）: TRBP のセリンをアスパラギン酸て発展することも期待できる。に置換）の発現コンストラクトを作成した。これらのコ謝

ンストラクトを 293T 細胞に導入すると、共に同程度の辞発現を認めた（図 3a）。次に、レンチウイルスを用いて本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益

TRBP および TRBP（SD）安定発現 Huh7-Feo 細胞株を財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

作成し、これらの安定発現株にアピゲニンを添加したと
文

ころ、TRBP（SD）発現株では miR122 の発現が有意に高く、アピゲニン存在下でも miR122 発現は低下しな

献1） D. P. Bartel:, 116, 281–297, 2004.
2） M. Trajkovski, et al.:
, 474, 649–653, 2011.
3） M. Ohno, et al.:., 3, 2553, 2013.
4） A. Takata, et al.:., 59, 187–203, 2013.
5） C. L. Jopling, et al.:
, 309, 1577–1581, 2005.
6） H. L. Janssen, et al.:., 368, 1685–1694,2013.
7） C. Shibata, et al.:
, 462–463, 42–48, 2014.

かった（図 3b）。また、ルシフェラーゼ活性（HCV レプリコンの複製）の低下も認めなかった（図 3c）。つまりTRBP（SD）はリン酸化 TRBP の機能を持ち、アピゲ
ニンの miR122 発現抑制作用をキャンセルしていると思われた。
以上より、アピゲニンは TRBP のリン酸化抑制を介3