摂取行動を制御する大脳基底核オピオイド性神経伝達メカニズムの解明

乾大阪大学大学院人間科学研究科行動生態学講座行動生理学研究分野

緒言

方賢助教

法

実験1：腹側淡蒼球におけるGABAとオピオイドの相互大脳基底核は主に線条体と淡蒼球によって構成される作用が摂取行動に及ぼす影響神経系である。大脳基底核の腹側部に位置する側坐核と腹側淡蒼球が、嗜好性の高い食物や味溶液の摂取に重要

Wistar 系雄性ラットを用いた。腹側淡蒼球へのガイドな役割を果たしている 。腹側淡蒼球には - アミノ酪酸

カニューレ（AG-12、エイコム）留置手術の後、蒸留水1）（GABA）が豊富に存在し、高嗜好性溶液の摂取

2）の摂取トレーニング（14 時～ 16 時）を 5 日間行った。

や経

その後、実験箱にて同様のトレーニングを 2 日間行って験による摂取行動の変化 3）に関与する。
腹側淡蒼球に多くみられるもう一つの神経伝達物質とから、サッカリン溶液（5 mM）を摂取させるトレーニン

して、オピオイドがある。
オピオイドが摂取行動に関わっグを 2 日間行った。2 日目の夕方に、透析プローブ（AI-ていることを示唆する知見が、少数ながらも最近になっ12-015、エイコム）を挿入し、リンゲル液を 2 μ l/min のて報告されている 。しかし、そのメカニズムの詳細は速度で灌流した。翌日の 10 時からサンプル回収を開始

いまだ不明である。また、腹側淡蒼球でβ - エンドルフィした。20 分間で 1 つのサンプルとし、18 時までの 8 時ンを放出するニューロンはどの脳部位から投射している間で 24 サンプルを集めた。実験群では 12 時から 14 時のか、という解剖学的知見が報告されていない。そこでの間は DAMGO（μ - オピオイド受容体作動薬、100 μ

本研究では、動物が摂取行動を表出する際に、腹側淡蒼g/ml）を灌流させた。対照群では 12 時から 14 時の間も球においてβ- エンドルフィンが機能するかどうかを検リンゲル液を灌流させた。14 時から 16 時の間はどちら証し、そのβ- エンドルフィンが腹側淡蒼球においてどの群にもサッカリン溶液を呈示し、トレーニングと同様のように分布しているかを調べることを目的とした。研に摂取量を 20 分毎に測定した。回収したサンプルは高究開始当初はマイクロダイアリシス法（脳内微小透析法）

速液体クロマトグラフィー（HTEC-500、エイコム）をと ELISA 法（酵素免疫測定法）を用いて腹側淡蒼球の用いて GABA を電気化学的に検出し、含有量を測定した。

4）β- エンドルフィン量を測定することを試みた。しかし、
実験2：腹側淡蒼球におけるβ-エンドルフィンの分布

マイクロダイアリシス法で回収されるエンドルフィン量が非常に少なく、ELISA 法による検出が困難であることが判明した。そこで代替実験として、先行研究

5）

腹側淡蒼球を含む厚さ 50μm の脳切片を作製し、免で疫組織化学的実験を行った。β- エンドルフィンの分布

摂取行動に関与することを明らかにした GABA の動態を調べると同時に、β- エンドルフィンが細胞のどこににオピオイドがどのように関与しているかを調べること局在しているかを調べるために、神経細胞核のマーカーを目的とした。これは腹側淡蒼球に投射する GABA 作である NeuN あるいは神経終末のマーカーであるシナ動性ニューロンの神経終末にμ - オピオイド受容体（βプトフィジンを検出し、蛍光 2 重染色法によって、β- エンドルフィンの受容体）が存在し、神経終末からの- エンドルフィンが NeuN とシナプトフィジンのどちGABA 放出をβ- エンドルフィンが調節していることをらと共発現するかを調べた。抗 β- エンドルフィン抗示唆する報告体（AB5028、Chemicon）、 抗 NeuN 抗 体（MAB377、6）があったためである。

Chemicon）、 抗 シ ナ プ ト フ ィ ジ ン 抗 体（MAB5258,、Chemicon）
を用いた。共焦点レーザー顕微鏡（FV1000-DIX81、オリンパス）で観察・撮影を行った。
1乾

実験1

果細胞外GABA遊離レベル（% of baseline）

結賢

サンプル回収を行った日（テスト日）のサッカリン溶液の累積摂取量を図 1 に示す。溶液呈示開始から 40 分後までは DAMGO を灌流した群（DAMGO 群）とリンゲル液を灌流した群（Ringer 群）の間に差はみられなかった。しかし、40 分後以降は DAMGO 群のみ増加し続けた。群（DAMGO、Ringer）と時間を要因とした二元配置の分散分析を行ったところ、交互作用が有意であり（F[5,55] = 27.22, ｐ < 0.001）、多重比較によって40 分後以降において群間で有意差があることがわかっ

160
DAMGO
Ringer140120100806040200

DAMGOorRingerbaseline
13579た。

11 13 15 17 19 21 23サンプル

図225細胞外 GABA 遊離レベルの変動を示す．最初の 6 つのサンプルを baseline（100％）として、相対値としてデータを表した．エラーバーは標準誤差を表す．* は Ringer 群と比較して有意差があることを示す（*p < 0.05、**p < 0.01）．

DAMGO
Ringer20

累積摂取量（g）

サッカリン溶液

15（A）

10（B）

（C）

500‒2020‒4040‒6060‒8080‒100 100‒120

時間（分）

図3

図1

腹側淡蒼球におけるβ - エンドルフィン（A）と NeuN（B）の発現．（C）は（A）と（B）の二重蛍光画像である．黄色の線は 10μm のスケールバーである．

サッカリン溶液の摂取量を示す．図中のエラーバーは標準誤差を表す．* は Ringer 群と比較して有意差があることを示す（**ｐ <0.01、***p < 0.001）．

（A）

（B）

（C）

細胞外 GABA 遊離レベルを図 2 に示す。最初の 6 のサンプルの平均値を baseline とし、その相対値としてデータを示した。DAMGO の灌流中に GABA レベルが低下した。群（DAMGO、Ringer）、セッション（baseline、DAMGO or Ringer、サッカリン溶液呈示、溶液呈示後）、

図4

サンプル（各セッションの 1 ～ 6）を要因とした三元配腹側淡蒼球におけるβ - エンドルフィン（A）とシナプトフィジン（B）の発現．（C）は（A）と（B）の二重蛍光画像である．黄色の線は 10 μm のスケールバーである．

置の分散分析を行ったところ、群 × セッション × サン
プルの交互作用が有意であった（F[15,165] = 2.21, ｐ <0.01）ため、多重比較を行った。その結果、DAMGO あるいは Ringer を灌流したセッションの 2 番目と 6 番目（サ図 3（C）においてβ- エンドルフィンが神経核の周囲のンプル 8 と 12）において、群間に有意差がみられた。

細胞体に発現している様子が観察できた。
β- エンドルフィンとシナプトフィジンの分布と二重実験2蛍光画像を図 4 に示す。二重蛍光画像より、β- エンド

β- エンドルフィンと NeuN の分布と二重蛍光画像をルフィンとシナプトフィジンの発現部位は重ならないこ

図 3 に示す。二重蛍光画像より、β- エンドルフィンとが分かった。
図 4（C）において、シナプトフィジンが β - エンドルと NeuN の発現部位が重なっている様子が観察された。
2

摂取行動を制御する大脳基底核オピオイド性神経伝達メカニズムの解明られなかった。このことから、β- エンドルフィンは神フィンを取り囲むように発現している様子が観察された。

経終末には局在しないことが分かった。以上のことか
考察ら、腹側淡蒼球で機能するβ- エンドルフィンは、他の

図 2 のグラフにおいて、GABA レベルが低下してい脳部位から投射するニューロンによって運ばれるのではたのは、DAMGO を灌流させていた期間だけであった。

なく、腹側淡蒼球のニューロンによって産生されること

また、GABA レベルは DAMGO 灌流期間の最後（サンが示唆された。したがって、細胞体に接続する神経終末プル 12）で最も低くなっていた。DAMGO が腹側淡蒼との間に形成するシナプス間隙に、細胞体からβ- エン球内で作用するためには、半透膜を通過しなければならドルフィンが放出され、それが神経終末のμ- オピオイない。したがって、DAMGO が拡散するには時間を要ド受容体に作用して GABA 放出量を低下させるというすると考えられる。したがって、図 2 で示した GABA仕組みを予想することができる。今後は、細胞体からのレベルの変動に DAMGO の灌流が何からの影響を及ぼβ- エンドルフィン放出が実際に起こっているのかどうしたと示唆される。

かを検討していく必要がある。

サッカリン溶液の摂取量は DAMGO 群の方が有意に要多いという結果になった。DAMGO によってサッカリン溶液の摂取量が増加するという傾向は、局所微量注入法を用いた先行研究

約摂取行動への関与が示唆されている腹側淡蒼球のオピと一致する。また、GABAA 受オイド系と GABA 系の関連について調べた。また、腹容体の阻害剤であるビククリンを腹側淡蒼球に局所微側淡蒼球におけるオピオイド（β- エンドルフィン）の量注入することで、サッカリン溶液の摂取量が増加する分布を調べた。β- エンドルフィンの受容体であるμ -ことも報告されている 2）。本研究の結果はそれと一致す

オピオイド受容体の作動薬（DAMGO）を腹側淡蒼球るものである。しかし、摂取量が増加していったのはに投与すると、神経終末からの GABA 放出量が減少す

DAMGO の灌流が終了してから 40 分以上が経過してかることがわかった。このような GABA 放出量の現象をらであり、GABA レベルの低下がみられなくなった時引き起こす β- エンドルフィンは腹側淡蒼球のニュー間帯である。したがって、サッカリン溶液の摂取量増加

ロンで産生されることが明らかとなった。腹側淡蒼球と DAMGO の灌流の関連性については慎重に検討するニューロンで産生されたβ- エンドルフィンが何らかの必要がある。本研究の結果の原因として考えられるのは、刺激によって細胞外へ放出され、神経終末の末端にある灌流した DAMGO が腹側淡蒼球内に残留し、それがマμ- オピオイド受容体に結合することで神経終末からのイクロダイアリシス法では検知できない程度に GABAGABA 放出量が減少し、それによって摂取行動が調節の放出量を低下させることで摂取行動が促進されたといされることが示唆される。

2）

う仕組みである。また、先行研究 2）では DMAGO 注入
謝から 1 時間以上が経過してからサッカリン溶液の摂取辞量が増加した。したがって、DAMGO による摂取量の本研究は公益財団法人三島海雲記念財団平成 23 年度

増加は GABA レベルの低下という現象を経てから生じ学術研究奨励金の援助によって行われました。関係者のるのかもしれない。

皆様方に深謝致します。

蛍光二重染色では、NeuN の分布とβ- エンドルフィ
文ンの分布が重なった。NeuN は神経細胞核のマーカーであるが、免疫組織化学的手法では核の周囲の細胞体の領献

1）T. Inui, et al,：Neuroscience, 177, 66-73, 20112）T. Shimura, et al,：Eur. J. Neurosci., 23, 1596-1604,2006
3）T. Inui, et al,：Brain Res., 1164, 117-124, 20074）K. S. Smith, & K. C. Berridge,：J. Neurosci., 25, 86378649, 20055）T. Inui, et al,：Eur. J. Neurosci., 30, 110-115, 20096）M. F. Olive, et al,：J. Neurosci., 17, 7471-7479, 1997

域も染色されるといわれている。図 3（C）をみると、細胞の中心部分、すなわち核が存在すると予想される部分では二重染色はみられなかった。したがって、核の周囲の細胞体の部分にβ- エンドルフィンが存在することが示唆された。一方、シナプトフィジンとβ - エンドルフィンが共存している部分は図 4（C）ではほとんどみ3