ドレイズ試験代替法の開発 ー
ヒト細胞、 昆虫細胞を用いた高感度迅速試験法の開発研究
大理化学研究所野忠夫

As a partial alternative to the Draize eye irritation test for detergents which are usedm shampoos or rinses and general chemicals which have been known toxic to human, wedeveloped a sensitive assay protocol for measuring release of lactate dehydrogenase(LDH) activity into the medium from cultured human cells. Results suggest that somecommonly used detergents have relatively high cytotoxicity at low concentrations thanthe cytotoxicity assumed from their ED 印. This method was applied to commercial eyedrops. We found that 8 of 9 eye drops tested were apparently cytotoxic to human cells
because of undescribed component. One of these eye drops stimulated LDH release intotears 10 second after application to human eyes
Insect cell lines, instead of human cells, were tested their sensitivity to anti-tumor
drugs. Although some of the cells showed high sensitivity to the drugs, patterns of thesensitivities to the drugs were different from those of human cell lines.

言緒．

.
＇—

サギ眼に対するドレイズ試験法は残虐性が高いため， 動物愛護の立場からは国際的にも最大の攻撃

現在， 化粧品， シャンプー，リンス等， 体表に目標になっている。

適用する化成品の毒性•安全性試験は， ウサギ眼ドレイズ試験法の本質をなすものは細胞に対す・皮膚に当該品を直接投与し， 生じた炎症反応をる試験物質の障害性である。 本研究は ， in vitro

指標にして経時的に観察評価点を与えていくと細胞培養法を応用し， ドレイズ試験法の欠点であいうドレイズ試験法によって行われている。 このる客観性， 迅速性， 経済性， 残虐性を大幅に改善

方法は，した試験法を開発することを目的とし， 2 年間のヒト眼・皮膚の代替としてウサギを使用するものであるが， 刺激性の評価には客観性に難計画で実施したものである。

があり高度の熟練を要する。 しかも， 障害の多くは非可逆性のため， ウサギの繰り返し使用はでき
l,ない 2)。 このため， 多種多様な化成品を対象に行わなければならない毒性• 安全性試験法として

2. ヒト細胞からの遊離酵素を指標にしたシャンプー， リンスに利用される界面活性剤の安全性試験法の開発

は， 迅速性， 経済性にも問題がある。
衆知のように， 欧米における熾烈な動物実験反2. 1

はじめに対運動はわが国にも波及してきており動物実験の安全性試験法のなかで， 培養細胞を利用する場廃止を求める会などの団体が結成されている。 ウ合 その指標のとりかたにもいろいろあるが特An Alternative Method to the Draize Eye Irritation Test - Development of Highly Sensitive Test Methods
with Human and Insect Cell Lines
Tadao Ohno-12-ドレイズ試験代替法の開発

定の代謝反応をねらわず， できるだけ広く一般的な毒性を知ろうとする場合現在では， 細胞の生昆虫細胞の場合は昆虫細胞用培地を使用したが，他の条件はヒト細胞とほとんど同じである。
LDH活性測定には臨床検査用LDH測定キッ

死増殖性を指標にするのが最も単純で， 大量かつ迅速な検体処理に適する。 さらに， 細胞からトを使用した。

遊離されてくる酵素活性を指標とする方法により，極めて低濃度の界面活性剤のヒト細胞膜破壊の程2.3

結果度が実測できる。 これを多種類の界面活性剤に適表1にあげた界面活性剤についてヒト細胞を使用

ニング方法としての実用性， 限界，した結果はToxicology in Vitro誌に発表した4) 0

ドレイズ試験法との平行性などを綿密に測定する

簡略に述べると ， 表1に示した界面活性剤C, D,こととした。

Iにつ いて， 低用 量 領 域 で詳細に 検討したと用し， スクリーAnuforo訊は， tetracyclin 処理で遊離されころ， 界面活性剤CのEDs。は0.023%, Dではてくる細胞内酵素活性は対照に対する相対量で0.032%, Iでは0.020%で ， 相対的に言えば DはA SAL (arginosuccinate lyase) > LDH Oac­C, Iょりも安全性が高く ， CとIはほとんど同tate

じと推定された。

dehydrogenase) > GPT(glutamatepyruvate transaminase) > GOT (glutamate

しかし. CとIの用量反応曲線は途中でクロスoxaloacetate transaminase) > AP (alkaline

してい たため わ ず か1%の 細胞死を引き起こ すphosphatase)の順であったと報告している。
我々は細胞質にあって， 測定しやすく相対的に安用量ED1を比較すると， C では0.0091%, I では0.015%となり， EDsoで見られていたCとIの関定なLDHを指標とした。 臨床検査用に市販され係とは異なり， 低用量領域では I に比較して C のている血清LDH活性測定用キットを利用すれば毒性がより強く残存していること が判明した。

EDsoでははっきり差があるDとIのED1は 同

LDH活性測定は極め て単純である。 LDHは ，一AS AL やGPT に比べて， どの細胞でも 般に活ーであった。

性が高く測定しやすい酵素である。 細胞の前培養

Watanabeらによる ドレイズ試験法の結果計さえできていれば， 検体処理， 培養上清分離，算されたドレイズスコア20を与える用量(w/v%)

LDH測定の自動化も容易である。

で表示したDS20 値 5) と， 計算されたEDs oの相関関係をみたところ， 被験物質がわずか10検体で2.2

実験

表1

我々は主にヒト肺癌細胞SQ-5 を使用した。 またヒト正常2倍体線維芽細胞NBlRGB を含め他のヒト細胞についても検討した。 培養用培地はMEMに10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したものである。 96穴培養プレ ー トにlOOOcells/well播種
し， 0.1叫の培地で3日間培養後， PBSで洗浄し試験に供した。 試験の対象とした界面活性剤は表1に示した。 添加後， 20分間室温でインキュベ ートし培養上清に漏出したLDH活性を測定した。
その後0.3%の界面活性剤CC表1)を加えて細胞も含めて溶解し測定した全LDH活性を100 %とし，試験対象界面活性剤

ChemicalAbbreviation

Nonionic detergents
Polyoxyethylene (10) nonyl phenyl ether
Polyoxyethylene (9) lauryl ether
Polyoxyethylene (IO) launc acid

BFIAnionic detergents
Cl-olefinic sodium sulfonate
Polyoxyethylene (2) laurylether sodium sulfonate

AJ

Cationic detergents
Alkyl benzyl dimethyl ammonium chloride
Pentaetoxy stearyl ammonium chloride
Stearyl trimethyl ammonium chloride

GHK

Amphoteric detergents
Laury! dimethyl methyl amino betame acetate
Alkyl imidazolin

CD

細胞毒性を％で表示した。

-13-

あるにもかかわらず ， 高い相関関係が観察された

本研究により， 一部の界面活性剤は， 弱い細（図1)。

胞毒性を示す用量領域CE且領域）で ， それらのED5o値の順から期待されるよりも ， 相対的に見2.4考て強い細胞毒性が残存していることが判明した。

察

現在では多くの酵素活性の測定が高感度で可能

しかし， 酵素測定法も，なため， 細胞内酵素を測定する方法は ， 比較的少

1)確実に死んだ細胞を測定できる反面 ， 細胞膜数の細胞があれば試験可能であり， 試験系全体を破壊が起こらなければ酵素は遊離してこない高感度化しやすい利点をもっている。 酵素の高いため， 膜破壊以前の状態で死んでいる細胞は基質特異性を利用すれば ， 特定の代謝反応をねら測定できない，2)酵素の種類によっては細胞内でも不安定なもい打ちにした毒性試験系の設計も可能であるが，大量迅速処理を旨とする動物実験代替法の立場かのがあり， 細胞のわずかな生理状態の変動にらはそのような場合はむしろ精製酵素による生大きく影響されやすい，
3)酵素自体に直接作用する化合物は， 細胞毒性化学的検査法か有利となり， 一般毒性試験の目的試験が容易ではなく， 複雑な補正計算を必要から離れてくる。
細胞の生死をマーカーとする， 等の問題点をもっている。とする毒性試験の観点から見ると ， 特に遊離酵素測定法は， 死細胞を直接本法ではLDHを選択したため， 上記2)の点は測定できるというMTT法 6) やneutral red Z去 ”

避けられるものの ， 汎用されている界面活性剤でにない特徴を持ち， 試験対象物質の低濃度領域にあるsodium dodecyl sulfateはLDH活性を 直接阻害するため， 本法を適用するためには直接阻害が起きない低用量領域をあらかじめ選択して生存細胞数の測定も同時に可能となる。

おく必要がある。
I 9Dー＞．

J9AiーFi

k9G\・lH↓、ーc\
B

おける直接的な細胞傷害活性が正確に測定可能である。 細胞内残存酵素量を同時に測定できれば，3. 昆虫細胞株を指標にした制癌剤の迅速細胞毒性試験法の開発か， 特に制癌剤を対象にして検討した。 また ， 細3(OSQ 3 )8012

前項で開発した安全性試験法を， 界面活性剤のみならず ， 一般的な化学合成品に適用できるか否胞としてはヒト細胞に比べ ， 培養がはるかに容易で， 炭酸ガスインキュベータ ー を必要とせず， 室

゜
2.4

温で増殖する昆虫細胞株を対象とし， 制癌剤に対1Log(DS20)

0ロ

SQ-5

N B IR B
ごごご：•& KATO-IIIG

ニニ：芯悶11y = - 2.741 + 0.666x
y = - 2.698 + 0.556x
y = • 2.771 + 0.569x
y = • 3.162 + 0.727x
y = • 2.970 + 0.582x

しヒト細胞と同等な反応を示すものを探索した。
表2にその結果をまとめたものを示す。
この結果は ， ヒト子宮頚部癌 細 胞 株 で あ る

R=0.663
R=0.666
R=0.690R=0.628
R:0.534

HeLa細胞に比べ ， 各種昆虫細胞株の制癌剤に反応するパタ ー ンは異なり， これらの細胞株をうまく組み合わせればヒト細胞株と同様の結果が得ら

図1

In vivoドレイズ試験法によるデータとin vitro
安全性試験法(LOH法）との相関関係れるが， 組み合わせの分だけ試験回数が増え， ヒ卜細胞を用いる場合に比べ ， 必ずしも有利な試験-14-

ドレイズ試験代替法の開発

表2 各種制癌剤の昆虫細胞に及ぼす影響。
表の最上段は細胞名， 左側カラムは薬剤名である。 NIH-SaPe-4からBM-Nまでは各種昆虫細胞株名，
HelaS3, Y79, HL60はヒト癌細胞株， FM3Aはマウス癌細胞株。 数値は3日間培養時の各薬剤の最小増殖阻
害濃度(µg/m2)を表す。
HIH-SaPe —り

NIAS-PX-58

BH-N

HeLa SJY79(RCB280)(RCB556)(RCSり12)(RCBり30)(RCB457)(RCB271)(RCBり27)l 0000

10000

10000

5000

5000

25

25

25

12.5

12.5

0.78

6.3

0. 78

3.1

500

250

250

250250

10qo

1. 25

り0

methotrexate>5000>5000>5000>5000>5000>5000>5000>5000

diethylstilbestrol>25000

391

25000

98

く12787820391600

100200

り00

100

98200

2416005000

5000

cyclophosphamide
carboquoneTESPA・5-fluorouracil

NIAS-PX-64 SES-BoHo-15A

5000

10000

HL60

FHJA
(RCB086)

2500

5000

>5000

tegafur

2500

625

5000

1250

625

5000

l0000

ancitabin

10000>10000>10000

10000

10000

5000

5000

<4.9

9.8

bleomycin

125

125

250

250

62.5

125

500

2.0

62.5

mitomycin C

12.5

100

200

200

100

3.1

3.1

0.20

6.J

neocarzinostacin

0. 78

25>200

12.5

6.3

0.63

10

0.31

20

daunomycin

0.39

6. 3

25

100

6.3

0.31

0.63

く0,02

2. 5

adriamycin

0. 78

l.6

12.5

200

6.3

a. 125

8.0

0.016

>8.0

actinomycin D

く0.0020.00390.063

0.063

0.031

く0.0020.0039<0.002

1.0

chramamycin A3

く0.002

く0.0020. 0039

0.031

0.063

<0.002o.0039o.00392.0:;;: = ;; =:;;:;: =::;;::: = :;:; :;= =:; = ===== == = =:; = =::; == = =;; ==:::; = =;; =::; ===== ==::;:;:;;::;:;;: = =;::;;;::;=:;:;:;:;;:;;;;:; = = ==:::;:;;:;:; ====:;;;;;::;=:; ==== == ==;;;:; = = = = = = = == = = ==;=-・ trietbylenetbiophosphoramide

特異的毒性はないはずの低濃度にしてある）

法とならないことを示している。

はずで，

4. 市販目薬の安全性試験

4) LDH活性は涙中でも測定 できるため ， もし，何らかの細胞毒性が発見されたら， in vivo

4. 1に目薬を適用してその毒性を検証できる可能

はじめに本研究で開発した遊離LDH活性測定法（以下 ，性がある，LDH法と略称する）は前述したようにneutralからである。

red法やMTT法に比較して高感度であり， わず
4.2

かの量の細胞破壊が被験物質によって起こっても実験

方法は前述の2.の場合と同様である。 目薬とし検出可能である。
この高感度という特性によって． 実際に人間にては， 市販品9品目をランダムに選び， ス ー パ ー適用されており実用化していて， しかもすべてのマ ー ケット内の薬店で購入した。 これをそのまま人が安全であると信じている（はずの）製品が本当PBSで希釈し ， 検体とした。に細胞破壊を引き起こさないか． 我々は市販の目薬を対象にLDH法を適用してみた ” 。

4.3

結果

市販目薬を対象とした理由は．

市販目薬の能書に記載されていた有効成分は表3

1)目薬に含まれている成分はすべてドレイズ試のとおりである。
3種のヒト癌細胞株を標的細胞にしてLDH法

験を適用された物質のはずであり，
2)ヒトの眼に直接適用するため ， 最終製品としてもドレイズ試験を通過しているはずであり．
3)安全性は保証されていなければならない（少を適用した結果を表4にまとめた。 試験した9種の目薬のうち ， 7種までが明かな細胞毒性を示し ， 1種(TG)はHL60細胞にのみ細胞毒性を示した。

なくとも期待される成分の薬用効果に比べ非-15-

そこで ， 目薬の成分のうち毒性を示すものを検表3
Eye Drops (abbreviation)
Lot No.

市販目薬の能書に記載されていた有効成分
PVRN

RP

RSSN

TATETG

TM

16727

0040

021

11771

NU391

12052

03181

OIIBI

AOS3

AB

BCDEFFG

3.5

IO

sMaker Code
Reported content (mg/ml)
Panthenol
L-Asparatic acid potassium salt
Glycyrrhizic acid potassium salt
Naphazoline hydrochloride
Neostigmine methyl sul『ateChlorpheniramine maleate
Aminoethanesulfonic acid
Sodium chondroitin sulfate
Allantoin
Zinc sulfate
Tetrahydrozoline hydrochloride゜゜゜゜゜゜゜゜゜゜゜゜゜゜

0.5

Lysozyme
Flavine-adenine dinucleotide
Pyridoxine
Cyanocobalamin゜゜
゜
゜゜
゜゜
゜゜I10

゜゜
゜
゜゜
゜
゜゜゜゜
゜

101
0.03

O.oJ

0.05

0.05

゜゜
゜゜
゜゜
゜゜

0.1

II

0.02

10I

゜゜

0.03

゜
゜

0.5

゜゜
゜゜
゜゜
゜゜
゜

0.5

0.02

O.oJ

0.02

0.1

0.3

0.2

02

55

゜゜
゜゜
゜゜II

0.5

0.5

゜゜

II0.1

゜゜
゜゜
゜
゜゜
゜5I

゜゜
゜゜゜II0.5

゜I

゜゜
゜゜
゜
゜゜
゜゜
゜

0.02

03I出するため， 能書にしたがって各成分をPBSに感度であり， それ故にin vitroでは毒性が検出で溶解した再構成目薬を作成し， LDH 法にかけたきるが， その細胞毒性の程度はin vivo(つまりヒところ， すべての再構成目薬は全く細胞毒性を示

卜裸眼）では問題にならない少なさなのかもしれさなかった。 したがって． 細胞毒性を示す成分はなしヽ。

能書に記載されていないものであることが判明し筆者らの試験では ， 調査した市販目薬のなかには， 細胞に添加してわずか1 分で明らかに LDHた。

を遊離させるものがあり， それは実際にヒト裸眼
4.4

考に適用すると涙中の LDH 活性を上昇させた（未察

市販目薬は我国では百種以上が販売されている表4といわれており， それぞれの最終製品の毒性試験結果は公表されていない。 目薬に添加できる各成分についての毒性はドレイズ試験法で調べられているはずで（現時点で筆者らにこのデータは入手

ASSAY
CELL
EYE UROl'Sl'VTG

SQ-5EU50(%)
24.2(2.1 0 -25 4)•55.2( 514 - 593)
65.5(r.2R - 6R 4)
42.3(JR I• 465)
52.2( 452-572)
62.8( 55.6 - 722)
38 8(34 5 - 4J 0)
Undet. ••TMUndct.

できていない）， それに十分な安全率を掛けた濃RN度で添加されているはずだからである。 すなわち ，RP目薬は全く安全である（に違いない）という信念にRS基づいて広く市販されていると筆者らも考えていSNTAた。

TE

しかしながら ， これらのうちわずか9種を調べたにもかかわらず その8種までが細胞毒性があり． 明らかに毒性がないのはわずか1種にすぎないといいう結果は驚きであった（表4)。
確かに， 培養細胞を用いた我々の LDH 法は高3種のヒト癌細胞株に対する9種の市販目薬の細胞毒性
LIJ!I
IIL60
ED50(%)
6.4(56-7))
17.2(IJ6-209)
24 5(20 I�2? 6)
11.8(7R-16J)
31.2( OJ 4�.ヽ20)
11.1(8.3-140)
RR{75 - IO2)
14.5
(81•20I)
Undct.

Sjo-Gll
EDSO(%)
8.1(7� �8 4)
27.0(24.8-JO 5)
30.2(2?2-JO'J)
19.1(156-2.1 1)
36.5(Jfi Iー37 0)
27.7
125 I -JO SI
18.1
jl62 .. 202)
Undct.
Undct.

ED50 values were determined「rom the dose-response curves shown in Fig. 2,Fig. Ja and b, and Fig. 4•Figures in parenthese nre confidence limits o「the values shown nn the line ahove…Undetectable-16-ドレイズ試験代替法の開発発表）。 この結果からは ，ヒト眼の外界に接する一部は目薬の滴下によってもちろん， 製品の種類によっては ， 毒性があっ破壊されると想定せざるを得ない。 しかもそれをてもなおかつ有効性のメリットが大きいという有引き起こしている成分は ． 能書に公表されている効性 一 毒性のバランスの問題があろう。 しかし ，いわゆる有効成分ではなく． 未記載の（したがっ目薬のような直接医療現場の制御下で使用されなて従来は誰もその毒性を疑わない安全なはずの）い汎用製品においては ， 最大無毒用量でなお有効成分だとしか考えられないのである。

な効果がないものならば， 販売許可を出すべきで表層細胞の少なくともる。

はないのではなかろうか。

5. 総括文

前項のように わずかな種類の市販製品の細胞毒性を調べただけで一般論を述べるのは時期尚早かもしれないが我々の得た試験結果は ． 従来の毒性試験法の考え方について一種のパラダイムの献

1) Marzulli F. N. and Ruggles, D. I.: J. Ass. off.
Analt. Chem., 56: 905-914, 1973.
2) Weil C. S. and Scala, R. A.: Toxic. appl.
Pharmac., 19: 276-360, 1971
3) Anuforo, D. C., Acosta, D. and Smith, R. V.

変更を求めているように思われる。
すなわち． 少なくともドレイズ試験法を含む局所剌激性試験については ， 従来のようにin vivo

In Vitro., 14: 981-988, 1978.
4) Sasaki, T., Kawai, K., Saijo-Kurita, K., andで調べた毒性試験結果（動物で毒性が発現するまOhno, T.: Toxicol. in Vitro, 6:451-457, 1992.

で用量を増加させていって測定する）に十分な安

5) Watanabe, M., Watanabe, K., Suzuki, K.,

全率を掛け ， それによって最終製品を作成するとNikaido, 0., Ishii, I., Konishi, H.,Tanaka,

いう手順よりも, in vitroの試験法によって検出

N., and Sugahara, T.: Toxic. in Vitro, 3: 329-

しうる最大無毒用量を求め． それをin vivo局所334, 1989.

剌激試験に適用し安全性を確かめた上で製品化するという， 従来とは逆の方法を取るのである。 こ
うすれば不幸にしてin vivoで毒性が出た動物を除いて ほとんどの動物は再使用に耐え得るはずであり， 動物実験を大幅にセープできるはずであ-17-6) Mosmann, T.: J. Immun. Meth. 65: 55-63,1983.

7) Borenfreund, E. and Puerner, J. A.: Toxicol.
Lett. 24: 119-124, 1985.
8) Sasaki, T. and Ohno, T.: in subm1ss10n.