ヒト汗に存在する核酸分解酵素を含有させた化粧品や医薬品軟膏が有する生理作用や薬理作用の推定
島根大学医学部法医学

竹 下治 男Human and porcine recombinant deoxyribonucleases I (DNases I) were expressed in COS-7 cells, and purified
by a single-step procedure. Since affinities for concanavalin A (Con A) and wheatgerm agglutinin (WGA) werestrong in these recombinant DNases I, purification using Con A-WGA mixture-agarose column was performed. By
this method, the enzymes in culture medium could quickly be isolated to apparent homogeneity in approximately
ten minutes. From 1 ml of culture medium, about 20~30 μg of purified DNase I with a specific activity ranging
from 22000 to 41000 units/mg were obtained. The purified DNases I were subjected to enzymatic deglycosylationby either Peptide N-glycosidase F (PNGase F) or endoglycosidase H (Endo H). The recombinant enzyme wascleaved by PNGase F, not by Endo H, indicating that the recombinant enzymes are modified by N-linked complextype carbohydrate moieties. In the human recombinant DNase I, activity was decreased by PNGase F-treatment,
while that of the porcine DNase I remained unaffected. The thermal stability of the human enzyme was extremely
susceptible to heat following PNGase F-treatment, as was the porcine enzyme to a lesser extent. This study
suggests that N-linked complex-type carbohydrate moieties may contribute to the enzymatic activity and/or thermal
stability of recombinant DNases I. Moreover, we developed a method for the simultaneous genotyping of SNP(A2317G) and 56-bp VNTR polymorphism within DNase I gene, and using this method, we determined the allele
frequencies of both polymorphisms in Ovambo, Turk, Mongolian, Korean and Japanese populations and revealed
wide differences between these ethnic groups.

１．緒

標準定量法となっている、single radial enzyme diffusion

言（SRED）法を開発した。この方法は極めて感度の高い微我々はヒトの核酸分解酵素である、デオキシリボ核酸量定量法であり、各種臓器及び体液中の核酸分解酵素の活分解（DNase）およびリボ核酸分解酵素（RNase）の生化性測定が可能になり、この途上において、汗中に当該酵素学、酵素学、化学、人類遺伝学、分子生物学などに関するが存在することを見出しえた。最近、発生や老化に深く研究に従事してきた。両酵素は遺伝的多型形質であり、ま関与しているアポトーシスの生化学的マーカーであるヌ

たヒト汗中には極めて活性の高い両酵素が存在することか

クレオソーム断裂化に DNase や RNase が関与するというら、我々は、微量な汗からでも実施可能な個人識別法を確

報告が目立つが、皮膚組織の損傷再生機構等にも当該酵素立して法医鑑識の実際に応用している。しかし、汗に含まが関わっているのではないかと考えられる。さて、哺乳類れる高活性な核酸分解酵素の生理学的および薬理学的作用

DNase I は 3 型に分類され、膵臓型は、耳下腺型及び膵は不明である。この研究では、汗に含まれる高活性な核酸臓・耳下腺（混合）型に比して酸性下で不安定である。今分解酵素の生理学的および薬理学的な役割や意義を解明し回、耳下腺と膵臓の抽出物及び DNase I cDNA を哺乳類たい。これによって、ヒト核酸分解酵素を含有させた医薬細胞に導入・発現させた組み換え型酵素のレクチン親和性品軟膏（化粧品等を含む）が有する生理作用や薬理作用を精査を行い、これら試料より DNase I のワンステップ精推定することができる。核酸分解酵素は、単なる消化酵素製を行った。さらに、DNase I を含有させた化粧品や医薬と考えられてきたので、多くの研究者の興味の対象ではな品軟膏が有する生理作用や薬理作用の個人感受性差異の調かった。しかし、最近になって、
１）アポトーシスへの関与、査を併せて行い、５民族の血痕由来 DNA から、等電点電２）全身性エリテマトーデスとの関連性、３）難治疾患の気泳動に基づく蛋白多型検出ではなく、新たな同時 PCR治療薬、４）心筋梗塞の早期診断マーカー、５）遺伝的多法に基づく DNA 多型同時検出法を開発し、従来からある型の存在などが解明され脚光を浴びてきつつある。我々は、

DNase I（DNASE1）多型および最近新たに DNase I 遺伝

現在、ヒト核酸分解酵素 DNase および RNase の国際的な子内に見い出された DNase I（HumDN1）多型の頻度分布調査を行い、データベースの構築に着手した。

Fundamental study of the function on
endonuclea s e（DNa s e I）i n hu ma nsweat
Haruo Takeshita, M.D. Ph.D
Department of Legal Medicine, Facultyof Medicine, Shimane University

２．実験

２・１ 組み換え型酵素のレクチン親和性精査およびDNase I のワンステップ精製
ラットの耳下腺・下顎腺、ウサギの耳下腺・膵臓及びブタの膵臓を用いた。さらに、ヒトおよびブタ DNase I− 38 −

ヒト汗に存在する核酸分解酵素を含有させた化粧品や医薬品軟膏が有する生理作用や薬理作用の推定

cDNA を発現ベクターに挿入し、得られた construct をリ

WGA により強固な親和性が認められ、膵臓型酵素の精製

ポフェクション法により、COS-7 細胞に導入・発現させたには、組み換え体の利用が有用であると考えられた。

培養上清を用いた。親和性精査には、レクチンカラム 4 種（Con ALCA

RCA 120WGA）を用い、DNase I のワ

ンステップ精製には、Con A-WGA 混合カラムを用いて行った。

３・２ワンステップ精製

ConA-WGA 混合カラムによりラットとウサギの耳下腺、ラットの下顎腺、ブタの膵臓の精製を行ったところ、いずRecombinant peptide N-glycosidase F（PNGase F）とれからも電気泳動上単一なバンドが得られた。また、ブタ

endoglycosidase（endo H）による脱グリコシル化について、およびヒトの組み換え体酵素は天然酵素と同一な移動度各試料に希釈した PNGase F あるいは endo H を等量添加を示し、単一のバンドを形成する活性酵素が得られた。こ後 37℃で酵素反応を行い、DNA-casting

れら酵素の分子量、金属イオン要求性などは、既報の精製

PAGE により分析した。さらに、脱グリコシル化後の DNase I の安定

DNase I のものと一致した。

性について精査した。

２・２

３・３ 脱グリコシル化を受けた DNase I の活性染
色による検出DNase I 多型データベースの構築

島根県の日本人 114 名、ブサンの韓国人 379 名およびウPNGase F はアスパラギン結合型糖鎖のうち、高マンノランバートルのモンゴル人 220 名の血液、ナミビアのオース鎖、混成型糖鎖、複合型糖鎖のアスパラギン残基とバンボス人 176 名およびトルコ北部アダナ地方のトルコ最も近い GlcNAc の間を切断し、Endo H は、アスパラギ人 136 名の血痕から DNA を抽出した。DNASE1 多型にン結合型糖鎖の高マンノース鎖、混成型糖鎖の一部を切断ついて、１型〜４型の検出は既法に従った。５型の検出する。すべての native 試料で PNGase F 処理により対照は、ARMS（amplification refractory mutation system）と比べて低分子の位置に一本のバンドがみられた。一方、法に拠り、６型の判定は mismatched PCR-RFLP 法に拠

Endo H 処理では、native 酵素において二つのパターンをった。今回調査した DNASE1 多型において、最初の検索示した。すなわち、ラットとウサギの耳下腺、ラットの下からいずれのサンプルからも３型‐６型のマイナーアレル

顎腺およびブタの膵臓では二本バンドが見られ（対照の位は検出されなかったので、DNASE1 多型の主要対立遺伝

置と PNGase F のバンドより高分子の位置）、また ラット子（DNASE1*1 および DNASE1*2）と HumDN1 多型の同の下顎線、ウサギの膵臓では PNGase F 処理と同じ位置に時検出を試みた。両多型を同一のゲル上で同時検出するた一本のバンドがみられた。組み換え体酵素では、ブタ及びめ、次のような塩基配列の DNASE1 プライマーを用いた。
forward（5’-ATCGTGGTTGCAGGGATGCTGCCTC-3’）

ヒトともに PNGase F 処理により、脱グリコシル化を受および reverse（5’-AGTTCAACAGGTGTGGGGAG-3’）。

った。これらの結果から、DNase I には臓器特異的な糖鎖他付加の相違が認められるとともに、native 酵素と組み換え

方 HumDN1 プライマーには、forward（5’- GAGCGCTACCTGTTCGTGTACAG-3’） お よ び

けたが、Endo H 処理では脱グリコシル化は認められなか体酵素においても糖鎖付加の相違が示唆された。

reverse（5’- CACCGCAGACACCTGGTCAGGC-3’）を用いた。上記の PCR 産物は XhoI による制限酵素処理を行った。各サンプルを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、銀染色によりバンドを検出した。

活性染色像に強弱が認められたため、酵素による脱グリコシル化処理時間と DNase I 活性の関係を調べた。脱グリコシル化処理により、12 時間で、native 及び組み換３．結果と考察
３・１

３・４ 脱グリコシル化が DNase I 活性に及ぼす影響

え体のブタの膵臓では酵素の失活がみられ、ラットの下レクチンカラム親和性顎線では約 60％酵素活性が減少した。種 / 臓器特異的なラットとウサギの耳下腺、ラットの下顎腺では Con A、DNase I の性状が示唆された。また、脱グリコシル化によWGA 両方に強い親和性がみられた。一方、膵臓では、ウってブタ膵臓に脆弱性が認められることから、脱グリコシサギ、ブタともに Con A に親和性が認められたが、WGAル化を受けたブタ及びヒト組み換え体酵素において、熱安親和性は非常に低かった。これらから、唾液腺酵素と膵臓定性を調べたところ、やはり、ヒトに比してブタでは極め酵素の性状の相違はレクチンの認識する糖鎖構造に関連がて高度の熱不耐性が認められた。レクチンカラムにより、あるのではないかと考えられた。膵臓型酵素の親和性の低哺乳類 DNase I の精製が初めてワンステップで可能となさはレクチンカラムを用いた精製に支障を来たす可能性がった。本法は、生体試料および培養上清中の組み換え型酵考えられた。そこで、ブタ及びヒト組み換え体酵素におい素の両方から、迅速・簡便に多量の酵素を得られる有用なて親和性を精査したところ、native 酵素に比して、Con A、ものである。哺乳類 DNase I のレクチン親和性精査およ− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

び脱グリコシル化の結果から、局在の異なる DNase I のanalysis of recombinant human and porcine

性状の差異には糖鎖付加が関係しているのではないかと考

deoxyribonuclease I expressed in COS-7 cells.

えられた。

Biotechnology Letters, 28, 215-221, 2006
２）Fujihara J, Yasuda T, Takeshita H ほか : Frequency

３・５

DNase I 多型データベースの構築

of a single nucleotide（A2317G）and 56-bp variable

今回 DNASE1 および HumDN1 多型同時検出法を新た

number of tandem repeat polymorphisms within theに 構 築 し た。DNASE1 に 関 し て、 こ れ ま で の 日 本 人 集

deoxyribonuclease I gene in five ethnic populations.

団の調査では、９つの表現型が報告されているが、今回Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 44,1188-1191, 2006

調査された５集団においては、いずれも主要表現型の１、1 - 2 および２型のみが観察された。HumDN1 多型に関し

３）Takatsuka H, Fujihara J, Takeshita H ほか : Analysisて、反復数が２回から６回に相当するアレル２からアレof genetic polymorphism of deoxyribonuclease I inル６までが検出された。両多型とも、トルコ人集団では、Japanese from Shimane prefecture using genotyping

DNASE1*2、HumDN1*4 お よ び HumDN11*5 の 出 現 頻 度

method. Shimane Journal of Medical Science, 23, 1-6,は他集団に比べ有意に高かった。アフリカオバンボス人集

2006

団では、DNASE1*1 および HumDN1*3 の出現頻度が他集

４）Fujihara J, Yasuda T, Takeshita H ほ か : Variation

団に比して有意に高かった。アジア人３集団においては、

of interleukin 8 -251 A > T polymorphism in worldwide

両多型とも類似した集団データを示した。DNase I 遺伝子

populations and intra-ethnic differences in Japaneseに存在する DNASE1 多型と HumDN1 多型との間の相関にpopulations. Clinica Chimica Acta, 377, 79-82, 2007

ついて解析したところ、両多型の間に連鎖不平衡が認めら

５）Fujihara J, Xue Y, Takeshita H ほか : CYP1A2

れた。いずれの集団においても、HumDN1*3 は DNASE1*1polymorphism（C>A at position-163）in Ovambos,と、HumDN1*4 および HumDN11*5 は DNASE1*2 と 有 意

Koreans and Mongolians. Cell Biochemistry andに相関していた。

Function, 25, 491-494, 2007

今回得られた DNase I 組み換え型酵素のレクチン親和６）Fujihara J, Takatsuka H, Takeshita H ほか : Two

性精査、DNase I のワンステップ精製、DNase I 型検出法

deoxyribonuclease I gene polymorphisms andおよび DNase I 多型データベースを基に、今後さらに酵

correlation between genotype and its activity in

素活性データを包含させ、ヒト汗に存在する核酸分解酵素Japanese population. Legal Medicine, 9, 233-236, 2007

を含有させた化粧品や医薬品軟膏が有する生理作用や薬理

７）Fujihara J, Kunito T, Takeshita H ほか : Frequencyof two human glutathione-S-transferase omega-1

作用の推定の一助にしたいと考えている。

polymorphisms（E155 deletion and E208K）in Ovanbo（参考文献）and Japanese populations using the PCR-based
genotyping method. Clinical Chemistry and Laboratory

この研究を遂行するにあたり、ご援助いただきました貴Medicine, 45, 621-624, 2007

財団に深謝致します。また、貴財団からのご援助により本研究に関連した以下の成果を達成しました。この事実を以

８）Takeshita H, Fujihara J, Soejima M ほか : Extremely

下の文献に記載して謝意を表明しました。

high prevalence of DNASE1*1 allele in African１）Fujihara J, Okui I, Takeshita H ほ か : Single-steppopulations. Cell Biochemistry and Function, 26, 151-purification by lectin affinity and deglycosylation− 40 −

153, 2008