アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果
京都大学大学院薬学研究科

山下富義

Allergic contact dermatitis is a delayed hypersensitivity reaction triggered by contact with particular substances or
haptens. Molecular mechanisms of the inflammatory disorder are yet to be well established, but in recent years have beensuggested to involve activation of natural immunity via Toll-like receptors (TLRs) or Nod-like receptors (NLRs). We havepreviously developed a glycol-split heparin-sphingosine conjugate and found that it forms self-assembling nano-sized
micelles and exhibits an anti-inflammatory effect associated with down-regulation of TLR 4 signaling pathway. The present
study was initiated to apply self-assembling heparin derivatives to treatment and prevention of contact dermatitis disorders.
Firstly, we synthesized the derivatives of glycosaminoglycans (heparins, chondroitin sulfates, and hyaluronic acids),
and found that glycol-split low-molecular-weight heparin-stearylamine conjugate (gs-LHST) was the greatest inhibitory
effect against lipopolysaccharide-induced TNF-α production in primary cultured murine peritoneal macrophages. Then,
we prepared polyethylene glycol ointment containing nano-dispersed gs-LHST, and applied it to a dinitrofluorobenzene(DNFB)-sensitized mouse contact dermatitis model. DNFB-induced ear thickening was significantly suppressed when gsLHST-containing ointment was applied 2 hours prior to every DNFB sensitization. The anti-inflammatory effect of gsLHST-containing ointment was comparable to that of prednisolone-containing ointment. However, the effect of gs-LHSTcontaining ointment was not observed in the genetically TLR 4 -mutated strain C 3 H/HeJ, suggesting that blockade of TLR 4
signaling pathways by gs-LHST might be attributed to suppression of DNFB-induced ear thickening. Real-time polymerase
chain reaction (PCR) analyses indicated that gs-LHST-containing ointment can reduce elevated mRNA expression levels ofanti-inflammatory cytokines (TNF-α and IL- 1 β) and oxidative stress-responsive gene (HO- 1 ). These results suggested that
gs-LHST might be effective to inhibit cyclic inflammatory chain reactions involving TLR 4 and reactive oxygen species.

1. 緒

合させたヘパリン誘導体が、水溶液中でナノミセル粒子を言形成するとともに、LPS 活性化マクロファージからの炎症

接触性皮膚炎は種々の化学物質や金属などのハプテン

性サイトカインの産生を強力に阻害することを明らかにしにより引き起こされる遅延型のアレルギーである 。そた 9, 10）。さらに、本ヘパリンナノ粒子は、マクロファージの症状は丘疹や発赤など外見の変化を伴うため、患者のを LPS で刺激した後の IRAK- 1 のリン酸化や IκBα の分解

Quality of Life（QOL）を大きく損なうことも少なくない。

および NFκB の核内への移行を抑制したことから、TLR4

接触性皮膚炎が発症する詳細なメカニズムは依然不明で

シグナル伝達経路を抑制することが示唆されている 9）。

1）

あるが、その一部で Toll 様受容体（TLR）や Nod 様受容体

そこで、本研究では、ヘパリンナノ粒子の接触性皮膚炎（NLR）などを介した自然免疫の活性化と、それに伴う炎症治療への応用を最終的な目的として、次に示す実験を行っ。これまた。まず、種々のグリコサミノグリカンがヘパリンと同様

でに、TLR4 リガンドである LPS や熱ショックタンパク質に抗炎症作用を有する点に着目し 11, 12）、グリコサミノグリ

により接触性皮膚炎が増悪することや 5, 6）、接触性皮膚炎

カンに脂肪族アミンを縮合させた結合体を合成し、高い抗を引き起こす代表的な金属であるニッケルがヒトの TLR4

炎症効果を持ったグリコサミノグリカンナノ粒子を創製しを直接刺激することが報告されてきた 7）。また、TLR の刺た。次に、そのスクリーニングによって見出された低分子激で産生される TNF-α や IL -1β などの炎症性サイトカイ

量ヘパリン（以下、LHP）由来ナノ粒子の皮膚疾患への応用

反応の関与が近年の研究から示唆されている

1 ‒4）

ンが角化細胞の増殖や T 細胞の浸潤に関与することも示さを目的に軟膏剤を調製し、2, 4 - ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）誘発接触性皮膚炎モデルに対する治療効果を検討

8）

れている 。
我々はこれまでに、ヘパリンのウロン酸部位を開環したした。以下、これらの研究成果について報告する。

低抗凝固作用ヘパリンに D- エリスロスフィンゴシンを縮

2. 方

法

2. 1. グリコサミノグリカン－ステアリルアミン結合体の合成

Suppressive effect of self-assembling nanosized heparin on allergic dermatitis
Fumiyoshi Yamashita
Kyoto University, Graduate School of
Pharmaceutical Sciences

各種グリコサミノグリカン 1 g を 0.1 M 過ヨウ素酸ナト
リウム溶液 20 mL に溶解し 4 ºC で 72 時間反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムをグリセロールで分解、透析、凍結乾燥して得られた白色粉末を 0.2 M 水素化ホウ素ナト− 122 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

を蒸留水中で 2 日間透析した後凍結乾燥することで、各種

2. 5. 接触性皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症作用の評価

グリコール開裂グリコサミノグリカンを得た。次に、こ重量比 4：1 の割合で混合したアセトン ‒ オリーブオイの 20 mg をホルムアミド 1.5 mL に溶解し、EDC 10mg でル混合液に、2, 4 - ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）をリウム溶液に溶解し、4 ºC で 72 時間反応させた。反応液活性化した後、ステアリルアミン 5 mg を添加し、25 ºC で0.5% の濃度で溶解した。6 週齢の BALB/c 系雌性マウス

24 時間反応させた。反応終了後、エタノール沈殿法によ（ 一 部 の 実 験 で は、C3H / HeJ、C3H / HeN マ ウ ス を 用 い

り生成物を回収し、蒸留水中で 2 日間透析することによりた）の腹部を除毛し、0 日目および翌日に 0.5% DNFB 溶液

精製し、凍結乾燥することによって、目的のグリコサミノ

25 µL を塗布した。5 日目から 3 日間に渡って 0.3%DNFB

グリカン－ステアリルアミン結合体を得た。

溶液 10 µL をマウスの右耳介に塗布することで再感作し炎症を惹起させた。コントロール群として、DNFB を含ま

2. 2. グリコサミノグリカンナノ粒子の物性測定ない溶液のみを塗布した。抗炎症実験では、0.3%DNFB

各種グリコサミノグリカン─ステアリルアミン結合体を溶液を耳介に適用する 2 時間前に、0.2 % もしくは 0.5%

0.01 mg / mL の濃度で蒸留水に溶解し、37 ºC で 5 分間、の gs - LHST を含有するポリエチレングリコール水性軟膏

42 KHz の超音波を照射することで微細化を行った。粒子10 mg を塗布した。ネガティブコントロールとしては薬物

径およびゼータ電位は Malvern 社製ゼーターサイザーナノを含有しない軟膏基剤、ポジティブコントロールとしては

ZS を用いて測定した。各種グリコサミノグリカン─ステア

0.5% プレドニゾロン軟膏を用いた。各軟膏の抗炎症作用

リルアミン結合体の臨界ミセル濃度は、ピレンを用いた蛍は、0.3 % DNFB 溶液を適用 24 時間後の耳介厚をデジタル

光プローブ法 13）により測定した。各種グリコサミノグリ

シックネスゲージにより測定するとともに、最終日（8日目）

カン ‒ ステアリルアミン結合体の水分散溶液を異なった濃に耳介を摘出し、各種炎症マーカー遺伝子の発現をリアル度で調製し、ピレン溶液と混和した。ピレンの最終濃度は

タイム PCR 法により測定することによって評価した。

7.5 × 10 -8 M であった。混合液は 12 時間静置して平衡化し、3. 結

励起波長 339 nm、発光波長 390 nm で蛍光測定を行った。

2. 3. LPS 刺激マウス腹腔マクロファージに対する抗炎症効果の評価果

3. 1. 各種グリコサミノグリカンナノ粒子の物性評価
未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸の 4 つのグリコサミノグリカンに対して、

5 週齢の ICR 系雌性マウスに 2.9% チオグリコレート培

過ヨウ素酸酸化によるグリコール開裂を行い、ステアリル

地を 1 mL 腹腔内投与し、4 日後に RPMI 1640 培地 5 mL を

アミンとの結合体を合成した（以下、それぞれを gs-HPST、用いて腹腔マクロファージを採取した。採取された腹腔マ

gs - LHST、gs - CSST、gs - HAST と称する）。各グリコサ

クロファージは 10 % ウシ胎児血清を含有する RPMI 1640

ミノグリカン誘導体を分散して得られるナノ粒子の粒子径培地に再懸濁した後、96 well マイクロプレートに 1.0 ×

は 100 〜 150 nm 程度、ゼータ電位は−20 〜−40 mV であり、105 cells /well で播種し、37 ºC、5% CO2 の条件で培養し臨界ミセル濃度も 0.014 - 0.018 mg/ mL と各誘導体間で大た。2 時間後に培地交換して非接着細胞を取り除いた。24

きな差は認められなかった。

時間後培地を OptiMEM に交換し、異なる濃度の各種グ
後、LPS を最終濃度 20 ng/mL で添加した。24 時間培養後、3. 2. LPS 刺激マウス腹腔マクロファージに対する抗炎症効果

上清中の TNF -α 量を murine TNF- α ELISA Kit を用いて

LPS 刺激時にマクロファージから産生される TNF- α 量定量した。細胞毒性の評価は WST-1 アッセイ法により評を ELISA 法により定量したところ、コンドロイチン硫酸価した。

を除いてグリコサミノグリカン存在下 TNF- α 産生がわず

リコサミノグリカン─ステアリルアミン結合体を添加した

かに減少した。グリコサミノグリカンをグリコール開裂す2. 4. グリコール開裂低分子量ヘパリン －ステアリル
アミン結合体含有水性軟膏の調製

ると TNF -α の産生抑制効果は完全に消失したが、ステア

グリコール開裂低分子量ヘパリン─ステアリルアミン結

ミノグリカンに比べて強力に TNF- α の産生を抑制できる合体（gs- LHST）は、前述の方法により合成した。水性軟ようになった。各グリコサミノグリカン ‒ ステアリルアミ

膏は、ポリエチレングリコール 4000、ポリエチレングリ

ン結合体の TNF- α 産生抑制効果に関して用量依存性を評

コール 400、および水を重量比 4：4：1 の割合で加熱混合

価し、IC50 値を算出したところ、gs-LHST で最も効果がした溶液に gs -LHST を添加し、ホモジナイザーで攪拌し高 く（0.010 mg/ mL）、 次 い で gs - HPST（0.018 mg/mL）、ながら徐々に冷却することによって調製した。

gs - CSST（0.033 mg / mL）、gs -HAST（0.113 mg/mL）のリルアミンと縮合させることによって、通常のグリコサ− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

Figu re 1 C o n c e ntratio n - d e p e n d e nt ef fe ct of glyc ol - s plit
glycosaminoglycan（G AG）-stearylamine conjugates on TN F- α
production from lipopolysaccharide（LPS）-stimulated mouse peritoneal
macrophages.

順となった（Figure 1）。

が、0.3% DNFB 溶液で再感作すると経日的にマウス耳介の肥厚が生じた。一方、0.3% DNFB 溶液で再感作する 2

3. 3. 各種 Toll 様受容体リガンド刺激によるサイトカ
イン産生に対する抑制効果

時間前に 0.2% gs-LHST 軟膏を耳介部に塗布したマウスにグリコサミノグリカン ‒ ステアリルアミン結合体の抗炎肥厚が有意に軽減された。軟膏中の gs-LHST 濃度を 0.5%症効果が LPS 特異的かどうか確認するために、TLR2 のリに増加させたところ、0.2% に比べやや増強傾向にあったが、ガンドである Pam2CSK4 と TLR3 のリガンドである Poly

有意な差は認められなかった（Figure 2）。

おいては、0.5% プレドニゾロン軟膏と同程度に、耳介の（I:C）を用いて、前項と同様の実験を行った。Pam2CSK4

8 日目にマウス耳介を摘出し、マウス耳介の組織学的評の刺激に対しては、LPS の場合とは異なり、いずれのグ価を行った。DNFB で感作することによって、表皮・真皮

リコサミノグリカン ‒ ステアリルアミン結合体も TNF-αの厚みが増し、細胞の浸潤が認められた。一方、0.2% gs-

産生抑制効果を示さなかった。一方、Poly（I:C）の刺激に

LHST 含有軟膏を前投与した群では、0.5% プレドニゾロン

対しては gs - HAST を除くすべてにおいて、LPS に比べ弱軟膏塗布群と同様、DNFB による組織学的異常が軽減されいものの TNF-α 産生が抑制される傾向にあった。ただし、ることが確認された（Figure 3）。

Poly（I : C）の添加により細胞毒性が認められたことから、

DNFB 誘 発 接 触 性 皮 膚 炎 モ デ ル に お け る gs-LHST の

この TNF -α 産生抑制は Poly（I:C）の細胞傷害性と関連する治療的効果が TLR4 を介するか否かを検討するために、可能性もあり、TLR3 経路に対する効果については結論でTLR4 遺伝子に変異のある C3H/HeJ マウスを用いて同様きなかった。

の検討を行った。その結果、C3H/HeJ マウスでも DNFB
感作による耳介肥厚は観察されたが、gs-LHST による抑3. 4. DNFB 誘発接触性皮膚炎モデルにおける耳介制作用は認められなかったのに対し。野生型の TLR4 が発肥厚抑制効果現している C3H/HeN マウスでは、BALB/c マウスの場合

先の検討において、低分子量ヘパリンの誘導体すなわと同様、0.5% gs-LHST 軟膏による耳介肥厚の抑制効果がち gs- LHST からなるナノ粒子ミセルが最も強力な抗炎症認められた（Figure 4）。

作用を示すことが明らかになった。そこで、gs-LHST をるマウス耳介肥厚に対する抑制効果を検討した（Figure 2）。

3. 5. DNFB 誘発接触性皮膚炎モデルでの炎症性遺伝子マーカー発現に対する影響

DNFB を含まないアセトン：オリーブ油（4：1）溶液で再炎症性サイトカインおよび酸化ストレスマーカー遺伝子の感作しても、マウスの耳介厚はほとんど変化しなかった発現に対する gs - LHST 含有軟膏塗布の影響について、リ含有する水性軟膏を調製し、DNFB 刺激により誘発され− 124 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

Figure 2 Inhibitory effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate (gsLHST)-containing ointment on 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced ear
thickening in BALB/c mice.

Figure 3 Histological assessment in a 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced mouse
contact dermatitis model.
At 24 h post the last DNFB stimulation (day 8), mouse pinnae were excised and fixed with
10 % formalin neutral buffer solution and embedded in paraffin. Paraffin-embedded pinnae
were sectioned at 5 µm and stained with hematoxylin and eosin. (A) Non-treatment, (B)
DNFB plus drug-free ointment base, (C) DNFB plus 0.5% prednisolone, and (D) DNFB plus
0.2% gs-LHST.

アルタイム PCR 法によって検討した。DNFB の感作によに対し、IL -12 の発現上昇に対しては影響が認められなかり上昇した炎症性サイトカイン TNF - α および IL- 1β の発った（Figure 5）。また、接触性皮膚炎において、ハプテン

現は gs- LHST 含有軟膏塗布によって有意に抑制されたの刺激によって産生される活性酸素種が炎症を進行させるこ− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

Figure 4 Inhibitory effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate（gs-LHST）-containting ointment on 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）-induced
ear thickening in C3H/HeN（left）and C3H/HeJ（right）mice.

Figure 5 Effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate（gs-LHST) on（A) TNF-α,（B）IL-1β, and（C）IL12 mRNA expression in a 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB)-induced mouse contact dermatitis model.
Mouse pinnae were treated for three consecutive days with（upper）0.2% or 0.5% gs-LHST ointment,（lower）
0.2% gs-LHST or 0.5 % prednisolone ointment. The vehicle group was treated with the drug-free ointment base.
After 2 h mouse pinnae were stimulated with solution containing 0.3 % DNFB. At 24 h post the last stimulation with
DNFB, mRNA was extracted from pinnae and analyzed by real-time PCR. Each value represents the mean ±S.E.（n = 7-8）
. *P < 0.05. † P < 0.01.

とから 1, 4）、酸化ストレス応答性転写因子 Nrf -2 によって

LHST 含有軟膏塗布することによって軽微ではあるものの転写活性化されるヘム酸化酵素（HO -1）および NAD（P）

HO - 1 の mRNA 発現が有意に減少した。

H キノン還元酵素（NQO-1）の発現を測定したところ、gs-− 126 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

4. 考ることが知られており 1, 4）、酸化ストレスにより熱ショッ

察

クタンパク質や酸化脂質などのダメージ関連分子パターン

我々の過去の検討では、グリコール開裂ヘパリンに D-（DAMPs）が産生され、DAMPs が TLR4 を刺激し再び活エリスロスフィンゴシンを結合させた誘導体で、LPS 刺激

性酸素種が産生するという炎症サイクルが提唱されていマクロファージにおける抗炎症反応の抑制効果が観察される 4, 18）。本研究においても DNFB 処理によって酸化ストレ

た

9，10）

。しかし、本研究において D - エリスロスフィンゴ

スマーカー遺伝子である HO-1 や NQO-1 の発現上昇が認

シンをステアリルアミンに変更しても有効であり、より安

められており、活性酸素種の産生が起こっていることは確

価にヘパリンナノ粒子による抗炎症効果が期待できること実である。gs - LHST 含有軟膏を投与した際には、NQO-1が示された。また、多くのグリコサミノグリカンが抗炎症では無効であったものの、代表的な酸化ストレス因子で作用をもつということから 14 ‒ 16）、本研究では各種グリコサ

ある HO - 1 の mRNA 発現は有意に抑制されており、gs-

ミノグリカンを用いて検討を行ったところ、脂肪族アミン

LHST による TLR4 シグナル経路の抑制が酸化ストレスをの修飾によるナノ粒子化による抗炎症効果の増大は、ヘパ介した炎症サイクルの活性化抑制に関与している可能性がリンに限らずコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸において示唆された。

も認められ、普遍性をもつことが明らかとなった。ただし、

5. 総抗炎症効果の強さはグリコサミノグリカンの種類によって括異なり、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸の本研究では、各種グリコサミノグリカン－ステアリルア

順であった。その原因の一つとして、グリコサミノグリカ

ミン結合体を合成し、グリコール開裂低分子量ヘパリン

ンの硫酸化度の違いが考えられる。ヘパリンは高度に硫酸－ステアリルアミン結合体 gs -LHST が LPS による炎症反化されたグリコサミノグリカンであり 2 糖繰り返し構造あ応の抑制に最も有効であることを明らかにした。さらに、たり平均 2 〜 3 分子硫酸化されている。これに対し、コンDNFB 誘発接触性皮膚炎モデルに対して、gs - LHST 含有

ドロイチン硫酸はヘパリンに比べて硫酸化度が低く 2 糖繰

水性軟膏を適用したところ、マウス耳介の肥厚および炎症

り返し構造あたり平均 0 〜 2 分子しか硫酸化されておらず、性サイトカインや酸化ストレスマーカー遺伝子の発現を有ヒアルロン酸では全く硫酸化されていない

14）

。グリコサ

意に抑制することを見出した。その効果には gs-LHST にミノグリカンの硫酸化度はタンパクとの相互作用に影響す

よる TLR4 シグナル経路の遮断が一部関与することが示唆ることが示されており、例えば TGF -1β に対する結合力はされた。これらの結果は、ハプテンによる接触性皮膚炎にグリコサミノグリカンの硫酸化度が上昇するにつれて増大対する治療や予防に有用な知見を提供するものと期待され

する

17）

。今回の検討でも、LPS 刺激に対する TNF -α 産生る。

抑制効果は、グリコサミノグリカンの硫酸化度とよく対応していた。また、我々の過去の研究では、ヘパリン骨格中（引用文献）の 6 位の硫酸基を脱硫酸化した際には抗炎症効果が減弱す

1） Kaplan, D. H., Igyártó, B. Z., Gaspari, A. A., Early

ることを明らかにしている 9）。6 位の硫酸基を持たないヒ

immune events in the induction of allergic contact

アルロン酸において TNF- α 産生抑制効果が著しく低かっ

dermatitis. Nat. Rev. Immunol., 12, 114-124（2012）．
2） Ptak, W., Bryniarski, K., Ptak, M., Majewska, M.,

たのは極めて合理的な結果である。
接触性皮膚炎の惹起相では、ハプテンによる再感作によGamian, A., Lobo, F. M., Szczepanik, M., Toll-like

り T 細胞や顆粒球の浸潤、角化細胞の増殖が起こり、ハ

receptor ligands reverse suppression of contact

8）

プテンが接触した部位で肥厚が生じる 。本研究では、グ

hypersensitivity reactions induced by epicutaneous

リコール開裂低分子量ヘパリン ‒ ステアリルアミン結合体

immunization with protein antigen. Int. Arch. Allergy

gs - LHST を含有するポリエチレングリコール水性軟膏を

Immunol., 139, 188-200（2006）．

投与すると、DNFB で誘発される接触性皮膚炎による肥3） Nakamura, N., Tamagawa-Mineoka, R., Ueta, M.,

厚が有意に抑制された。しかし、TLR4 遺伝子に変異のあKinoshita, S., Katoh, N., Toll-like receptor 3 increases

る C3H/HeJ マウスでは DNFB による耳介肥厚が起こるもallergic and irritant contact dermatitis. J. Invest.

のの、gs -LHST 含有軟膏の効果は観察されなかった。inDermatol., 135, 411-417（2015）．

vitro において gs - LHST の抗炎症反応抑制効果は LPS に特4） Martin, S., Esser, P., Weber, F., Jakob, T., Freudenberg,

異的であり、他の TLR アゴニストでは認められないこと

M., Schmidt, M., Goebeler, M., Mechanisms of chemical-

を併せて考えると、DNFB 誘発接触性皮膚炎に対する抗induced innate immunity in allergic contact dermatitis.

炎症効果は TLR4 を介していることが示唆される。一般に、Allergy, 66, 1152-1163（2011）．

ハプテンによる接触性皮膚炎において活性酸素種が発生す

5） Yusuf, N., Nasti, T. H., Huang, C. M., Huber, B.

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

S., Jaleel, T., Lin, H. Y., Xu, H., Elmets, C. A., Heat

12）Campo, G. M., Avenoso, A., Campo, S., Traina, P.,

shock proteins HSP2 7 and HSP7 0 are present in the

D’ Ascola, A., Calatroni, A., Glycosaminoglycans

skin and are important mediators of allergic contact

reduced inflammatory response by modulating toll-

hypersensitivity. J. Immunol., 182, 675-683（2009）．

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