生活習慣病時における血管内皮由来因子シグナル障害に対するポリフェノールの効果松本

貴

星薬科大学薬学部緒

言之助教

様々なステージにおける血管機能障害の成因・メカニズムの解明等、未だ課題が集積されている。

食品中に含まれるポリフェノールは、抗酸化作用を始め、様々な作用を持ち、動脈硬化・癌・アレルギー等の血管内皮細胞由来因子は血管緊張性調節に重要な役割種々の疾病予防に効果があるというエビデンスが構築さを果たしており、弛緩因子・収縮因子が存在する。弛緩

れつつある。我が国で古くから愛飲されている緑茶に因子は、一酸化窒素（nitric oxide; NO）、プロスタサイ

は、ポリフェノールの一種である茶カテキンが多く含まクリン、内皮由来過分極因子があり、大血管におけるれ、中でもエピガロカテキンガレート [epigallocatechin弛緩因子は主として、NO が担っており、糖尿病時におgallate（EGCG）] が茶類で最も多いカテキンで、強いいては、NO バイオアベイラビリティーの低下が生じて抗酸化作用が知られている。EGCG は、抗糖尿病作用、いることが報告されている 3, 4）。一方、収縮因子はアラコレステロール・中性脂肪低下作用などが知られ、また、キドン酸代謝物、エンドセリン -1（ET-1）などがあり、心血管系において、血圧降下作用、抗炎症作用などが報これらの因子のバランスによって血管緊張性が調節され告されているている。しかしながら、糖尿病病態時におけるこれらの。

1,2）

因子によるシグナルに対する EGCG の影響についての糖尿病は近年、世界中で増加しており、高脂血症、高報告は少ない。

血圧、肥満と共に生活習慣病の一角をなす臨床上最も注

本研究では、2 型糖尿病を長期的に罹患した状態に目される疾患の一つとなっている。糖尿病の罹患が長期に及ぶと、糖尿病性血管合併症が発症・進展し、患者のおいて、EGCG の長期間投与が血管機能に有益な効果quality of life を著しく低下させる。糖尿病性血管障害を持つかどうかを調べることを目的に、2 型糖尿病モは、主に、動脈硬化性病変を特徴とする大血管症（脳・デル動物である Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty

心・末梢血管系の動脈硬化症）と細小血管障害（網膜症・（OLETF）ラット（43 週齢）に対し EGCG を 2 ヶ月間腎症・神経障害）に大別されるが、共に血管内皮細胞の投与したモデルを作成し、胸部大動脈、総頚動脈を用い機能障害が初期に認められ、血管病の発症・進展に血管て血管反応性の検討を行った。

内皮細胞の機能変化が大きく関与している。

3, 4）

実験方法

糖尿病は、1 型糖尿病と、2 型糖尿病に大別されるが、本邦では 2 型糖尿病の患者が約 95％と圧倒的に多く、

1.

実験動物

その最終的障害（糖尿病性合併症）は 1 型糖尿病、2 型

実験には、雄性 2 型糖尿病動物（OLETF ラット）と糖尿病に共通の障害として全身性に現れる。この合併症同週齢の対照動物（LETO ラット）を用いた。 動物実は血管障害から始まると言っても過言ではないが、詳細験は、星薬科大学動物実験規定に基づき、動物愛護に配な機序は十分には解明されていないのが現状である。2慮して行った。43 週齢の OLETF ラット及び、LETO ラッ型糖尿病は、複雑な要因によってインスリン分泌低下やトをランダムに 4 群に分け、EGCG（200 mg/kg/day, p.o.,感受性低下を原因とする糖尿病であり、その長期的罹患for 2 months）投与群（OLETF/EGCG、LETO/EGCG 群）は、血管機能障害を惹起し、合併症へと進展する 。モと非投与群（OLETF、LETO 群）にて検討を行った。

4）

デル動物においては、古くから 1 型糖尿病モデルにおけるエビデンスが構築されてきたが、2 型糖尿病モデルにおけるエビデンスは近年になって蓄積されつつあり、
1

松

2.

本

貴

各種パラメータ測定之ACh（10−5 M）投与で弛緩反応が消失することで確認した。

血中パラメータ（plasma cholesterol, HDL, triglyceride,insulin, NEFA）は、各種市販キットを用いて測定した。
血圧は tail-cuff 法（BP-98A; Softron, Tokyo, Japan）を4.

Western blotting法による蛋白発現の検討用いて測定した。血中グルコースは、動脈摘出前に麻酔下各動脈における蛋白発現は、western blotting 法を用で、尾静脈より血糖測定器（OneTouch Ultra, LifeScan,いて検討した。胸部大動脈、総頚動脈を摘出し、脂肪組

a Johnson & Johnson Company, Milpitas, CA, USA）を織や結合組織を除き、液体窒素を用いて凍らせ、-80℃用いて測定した。

で保存した。その後、常法 5） にて、ETA receptor、ETBreceptor、eNOS 並びにβ -actin の蛋白発現を検討した。

3.

胸部大動脈、総頚動脈における血管反応の測定
ラットより摘出した胸部大動脈及び総頚動脈は、顕微統計

5.

鏡下で脂肪組織・結合組織を剥離した後、長さ2 mmのデータは means ± SEM で表示し、統計学的検討にリング標本とした。標本は 95% O２ + 5% CO２の混合ガ

は analysis of variance（one-way or two way ANOVA

スを通気し 37℃に保温した Krebs-Henseleit Solution

with a post-hoc Bonferroni）を用いた。P<0.05 を統計中に懸垂し、22 mN（胸部大動脈）及び9.8 mN（総頚的有意とした。

動脈）の静止張力をかけて等尺性に反応を記録した。
ET-1（10−10–10−7 M）、PE（10−10–10−4 M）による収縮結反応、ACh（10 –101.

−9−5M）による内皮依存性弛緩反応、

果各種パラメータの検討

SNP（10−10–10−5 M）による内皮非依存性弛緩反応を観Table 1 に示すとおり、LETO ラットと比 較し、OLETF察した。弛緩反応は、PE（10−6 M）で前収縮した後に、ラットにおいて、glucose、total cholesterol、triglyceride、累積投与を行い検討した。内皮除去標本は、胸部大動HDL、NEFA 並びに収 縮期血 圧が有意に増加していた脈に対しては、内腔をgently rubbingすることにより剥（Table 1）。LETO 群と比較して LETO/EGCG 群において、離し、総頚動脈に対しては、3-［（3-cholamidopropyl）

体重、血圧の有意な低下が認められた。OLETF 群と比較して、

dimethylammonio］-1-propanesulfonate solution

OLETF/EGCG 群において、triglyceride の有意な低下が認（CHAPS, 0.1%, for 60 s）でinfusionして作成した。内皮められた。

除去標本の確認は、PE（10−6M）で前収縮した後、Table 1

Various parameters of four experimental groups

Parameters

LETO

LETO/EGCG

OLETF

OLETF/ EGCG

BW（g）

550.3±7.2（17）489.0±5.8（17）**553.6±16.1（17）538.8±13.9（17）SBP（mmHg）

126±2（17）108±3（17）***154±2（17）***146±4（17）***

Glucose（mg/dl）

118.9±1.8（17）119.1±3.9（17）471.6±22.7（17）***439.1±28.1（17）***

Insulin（ng/ml）

2.52±0.2（16）1.87±0.1（17）1.79±0.4（16）1.32±0.1（17）Cholesterol（mg/dl）

102.2±4.1（17）87.0±2.6（17）129.0±7.0（17）**130.0±5.1（17）**

Triglyceride（mg/dl）

98.2±9.1（17）81.3±7.2（17）495.9±59.3（17）***340.1±30.2（17）***,#HDL（mg/dl）

65.4±2.4（17）70.7±2.2（17）97.6±6.0（17）***96.9±4.2（17）***

NEFA（mEq/l）

0.48±0.03（17）0.42±0.02（17）0.82±0.07（17）***0.67±0.04（17）*BW, body weight; SBP, systolic blood pressure; HDL, high-density lipoprotein; NEFA, nonesterified fatty acid; LETO, LongEvans Tokushima Otsuka; OLETF, Otsuka Long-Evans Tokushima fatty; EGCG, epigallocatechin gallate. Values are means±SEM. Number of determinations within parentheses. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. LETO. #P<0.05 vs. OLETF.

2

生活習慣病時における血管内皮由来因子シグナル障害に対するポリフェノールの効果

2.

群とOLETF/EGCG間に変化が認められなかった。一ET-1による収縮反応の検討
OLETF群と比較して、胸部大動脈、総頚動脈いずれ方、LETO群と比較してLETO/EGCG群にて胸部大動脈においてもOLETF/EGCG群でET-1による収縮反応曲でPE収縮の減弱が認められたが、総頸動脈では変化が線が右にシフトしていた（Figure 1A & 1C）［胸部大認められなかった（data not shown）。

動脈 pD2: 8.24 ± 0.06, n=10（OLETF）vs. 7.98 ± 0.08,n=10（OLETF/EGCG）, p<0.05; 総頚動脈pD2: 8.15 ±

3.

内皮依存性弛緩反応の検討

0.06, n=10（OLETF）vs. 7.95 ± 0.07, n=10 （OLETF/

次に、胸部大動脈、総頚動脈における、ACh 誘発内EGCG）, p<0.05］。また、LETO群と比較して、胸部皮依存性弛緩反応並びに、SNP 誘発内皮非依存性弛緩

大動脈においてLETO/EGCG群でET-1による収縮反応反応について検討を行った（Figure 3）。ACh による曲線が右にシフトしていた（Figure 2A）が、総頸動脈

内皮依存性弛緩反応において、OLETF 群と、OLETF/では変化が認められなかった（Figure 2C）［胸部大EGCG 群とを比較して、胸部大動脈（Figure 3A）、総動脈 pD2: 8.42 ± 0.07, n=10（LETO）vs. 8.19 ± 0.06,頚動脈（Figure 3C）いずれにおいても、EGCG 投与群

n=10（LETO/EGCG）, p<0.05; 総頚動脈pD2: 8.21 ±で、弛緩反応の増強が認められた。一方、SNP による0.05, n=10（LETO）vs. 8.18 ± 0.09, n=10 （LETO/

内皮非依存性弛緩反応は、胸部大動脈（Figure 3B）及EGCG）］。内皮除去標本においては、OLETFとび総頚動脈（Figure 3D）において、OLETF、OLETF/OLETF/EGCG間の胸部大動脈（Figure 1B）、総頚動

EGCG 間で変化が認められなかった。

脈（Figure 1D）、LETOとLETO/EGCG間の胸部大動
胸部大動脈におけるET receptors及びeNOSタン脈（Figure 2B）、総頚動脈（Figure 2D）でET-1収縮

4.に変化が認められなかった。また、α1アゴニストであパク発現の検討

Figure 4 に 示 す 通 り、 胸 部 大 動 脈 に お け る ETA 受るPE収縮において、胸部大動脈、総頚動脈共にOLETF

Figure 1

OLETF ラット及び OLETF/EGCG ラット摘出胸部大動脈及び総頚動脈における ET-1 収縮反応と内皮除去 (-EC) の影響（各群 n=10）*P<0.05 vs. OLETF group.

3

松Figure 2

本貴之

LETO ラットおよび LETO/EGCG ラット摘出胸部大動脈及び総頚動脈における ET-1 収縮反応と内皮除去 (-EC) の影響（各群 n=10）*P<0.05 vs. LETO group.

Figure 3

OLETF ラット及び OLETF/EGCG ラット摘出胸部大動脈及び総頚動脈における内皮依存性及び内皮非依存性弛緩反応の検討（各群 n=7-10）*P<0.05 vs. OLETF group.

4生活習慣病時における血管内皮由来因子シグナル障害に対するポリフェノールの効果

Figure 4胸部大動脈における ET 受容体及び eNOS 蛋白発現の検討（各群 n=7,8）

容 体（Figure 4A）、ETB 受 容 体（Figure 4B） 並 び にトの胸部大動脈及び総頚動脈、また、LETO ラットの胸eNOS（Figure 4C）タンパク発現は、各群で変化が認部大動脈において、EGCG 投与により ET-1 の収縮反応められなかった。

が抑制された。また、これらの反応の差は、内皮除去標本において消失した。OLETF ラットの胸部大動脈・総考察頚動脈において、EGCG 投与により、内皮依存性弛緩本研究によって、2 型糖尿病を長期的に罹患したモデ反応が是正された。また、胸部大動脈における ET-1 受ルラットである OLETF ラットに対して、長期間（2 ヶ容体（ETA 及び ETB 受容体）発現は、EGCG 投与で影月間）EGCG を投与することにより、胸部大動脈や総頚響が認められなかった。これらの結果より、EGCG に動脈において ET-1 による収縮反応の抑制並びに、内皮よる ET-1 収縮抑制効果は、受容体変化ではなく、内皮機能障害の是正に起因することが示唆された。OLETF依存性弛緩反応の改善が認められた。
ET-1 は、強力な血管収縮ペプチドであり、その反応

ラ ッ ト に お い て、EGCG 慢 性 投 与 に よ り、glucose、性は、糖尿病を含む様々な生活習慣病で異常が報告されinsulin、cholesterol、HDL 値には影響しなかったが、ている 。また、NO は、大血管における主要な内皮由NEFA の低下傾向、triglyceride の低下が認められた。

来弛緩因子であり、ET-1 の収縮反応に拮抗的に働くこ

NEFA や、triglyceride は、内皮機能障害との関連性がとも知られている 。本研究においては、OLETF ラッ

報告されているため 7, 8）、EGCG の内皮機能障害の是正

6）

5）

5

松

本

貴之謝に一部関与している可能性が示唆された。
本 研 究 に お い て は、OLETF ラ ッ ト に お い て は、

辞本研究を遂行するにあたって、公益財団法人三島海雲

EGCG 投与による血圧低下は認められなかったものの、記念財団による研究助成を賜りましたことを深く感謝申

LETO ラットにおいては、EGCG 投与によって血圧低し上げますと共に、ご助力いただきました、星薬科大学

下が認められた。この機序に関しての詳細は、血圧調節機能形態学研究室の小林恒雄教授、ならびに研究室のメに関与する抵抗血管における反応性の検討など、今後のンバーに深く感謝致します。なお、本研究報告書の内容検討課題である。

は、現在、投稿準備中であることを申し添えます。

要文

約

本研究により、2 型糖尿病を長期罹患したモデル動物

献1）Babu, P.V., Liu, D.: Curr Med Chem. 15, 1840-1850,
2008.
2）Sae-tan, S., et al, : Pharmacol Res. 64, 146-154, 2011.
3）Kobayashi, T., et al, : J Smooth Muscle Res. 8, J49-J63,
2004.
4）Forbes, J.M., Cooper, M.E.: Physiol Rev. 93, 137-188,
2013.
5）Matsumoto, T., et al, : Am J Physiol Heart Circ Physiol.
296, H1388-H1397, 2009.
6）Pernow, J., et al, : Life Sci. 91, 507-516, 2012.
7）Yasu, T., et al, : Clin Sci. 125, 247-255, 2013.
8）Sokup, A., et al, : Acta Obstet Gynecol Scand. 91, 182188, 2012.

において、EGCG を慢性投与することによって、胸部大動脈や総頚動脈といった大血管において ET-1 による収縮反応が抑制されること、内皮依存性弛緩反応が是正されることが明らかとなった。EGCG の投与によって、動脈における ETA や、ETB receptor の発現抑制ではなく、内皮機能改善が ET-1 収縮抑制に繋がったと考えられる。生活習慣病時における血管機能障害に対する
EGCG の効果・メカニズムの更なる検討が待たれるところである。

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