Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価
千葉大学大学院薬学研究院

東顕二郎

We investigated the formation and stabilization mechanisms of drug/poloxamer 407 (P 407 ) nanosuspensions bysuspended-state NMR spectroscopy. Indomethacin (IMC) and piroxicam (PXC) used as models of poorly water-soluble
drugs are nonsteroidal anti-inflammatory drugs. For IMC, the three different polymorphs of γ-form, α-form and amorphous
form were used to evaluate the effect of initial crystal form of drug. P 407 , a tri-block copolymer composed of polyethylene
glycol (PEG) 101 -polypropyleneoxide (PPO) 56 -PEG 101 , was used as a stabilizer. Mean volume diameter in every suspension
prepared with wet-milling was 240 - 270 nm with unimodal size distribution. Cryogenic transmission electron microscopy
images of nanoparticles obtained using γ-form IMC indicated a rhombic-plate shape. In contrast, needle-like nanoparticles
were observed in the nanosuspensions of α-form and amorphous IMC. The nanoparticle obtained with PXC showed anirregular shape. Suspended-state cross polarization 13 C NMR measurements directly detected the molecular states of drugin nanosuspensions. IMC existed in its initial crystal form when γ-form and α-form IMC were used; amorphous IMC
transformed into crystalline α-form IMC. The PXC in the nanoparticle existed as the mixture of amorphous and crystalline
states. Suspended-state 13 C pulse saturation transfer NMR measurements revealed the molecular state of P 407 in thenanosuspensions. P407 could only adsorb to the surface of the IMC nanoparticles because IMC existed as crystals in the GM
suspension. Conversely, the larger numbers of P 407 were involved in the PXC nanoparticles where some of PXC existed as
amorphous state. The difference between the nanoparticle structures in the IMC and PXC systems could be a consequenceof the interaction strength of each drug with P 407 . The peaks of the PPO chains of P 407 in the spectra of GM suspensions
were split at lower and higher magnetic fields. The equilibrium of P 407 between micelle and nanoparticle was slower thanthe NMR time scale, which could stabilize the dispersion of the nanoparticles in water.

1. 緒ある。薬物粒子をナノ化することにより、薬物溶解速度の言

向上、薬物溶解度の上昇、消化管粘膜への付着性の増加が近年、スクリーニング技術の発展に伴い多数の医薬品・見込まれる。これにより、薬物経口吸収性改善が期待できる。

化粧品の新規候補薬物が見出されている。一方、それら候

懸濁液のナノ粒子内部あるいは固液界面の薬物と安定化剤

補薬物の 70 ％以上は難水溶性であり、その低い薬物吸収の状態を分子レベルで評価できれば、ナノ粒子製剤の処方

量のため薬効を最大限発揮できず、開発が断念されるケー設計及び品質評価・制御において有用な指針となる。しかスもある。今後も、薬物の分子量の増大・化学構造の複雑し、懸濁液は液相（溶解成分）と固相（ナノ粒子）の 2 相から化により溶解性が低い候補化合物は益々増えていくと予想なるため、固体試料と同様に評価するのは困難である。そされる。そのため、難水溶性薬物の溶解性改善技術の開発

こで、懸濁液を乾燥して試料を固化した後、固体試料の測は製剤研究における重要な課題の 1 つであり、これまでに、定法（粉末 X 線回折測定、熱分析、各種分光測定等）を適

結晶形の制御、塩や共結晶、シクロデキストリン包接化合用して評価がなされている。しかし、乾燥後において、ナ物及び非晶質固体分散体の調製などが広く適用されている。

ノ粒子内部あるいは固液界面にある薬物と安定化剤が懸濁

また 2000 年以降、薬物ナノ粒子化も溶解性改善手法とし状態の物性をそのまま保持しているかどうかは疑問であて注目されている 1）。薬物ナノ粒子は、その界面はポリマ

る。NMR は、分子を構成する原子 1 つ 1 つを区別して観ーや界面活性剤などの安定化剤で被覆されているが、その察する方法であり、他の測定法では得られにくい原子核レ

コア部分は主に薬物相から形成されている。薬物ナノ粒

ベルの情報を取得できる。また、NMR ではピークの線幅

子製剤のアプリケーションとして、筋肉内投与、静脈投与、や緩和時間測定などから、分子運動性に関する情報も得ら

経肺投与、経皮投与、経眼投与などがあるが、最も論文報れる。我々は固体 NMR で用いられているマジック角回転告が多くまた市販されている製品数が多いのは経口投与で（magic-angle spinning：MAS）及び双極子デカップリング（dipolar decoupling：DD）の 2 つの手法を応用して（Fig. 1）、
水に分散したナノ粒子中の薬物と安定化剤の分子状態を

Evaluation of molecular state of cosmetic
nanoparticles dispersed in water bysuspended-state NMR spectroscopy
Kenjirou Higashi
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Chiba University

直接評価する試みを行っており、これを suspended-state
NMR と称している 2-4）。Suspended-state NMR では、試料の漏洩がないように工夫されたカプセル型容器に薬物ナノ懸濁液を封入し、これを固体 NMR の試料管にセットする。そして、外部磁場（B0）に対して 3cos2θ-1=0 を満たす

− 40 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

2. 方

MAS

Drug nanosuspension

法

2. 1. 薬物ナノ懸濁液の調製

zP407 を濃度 50 mg/mLとなるよう蒸留水に溶解させP407

B0

溶 液 を 得 た。 薬 物（γ 形 IMC、α 形 IMC、 非 晶 質 IMC、
PXC）を仕込み濃度 100 mg/mL で P407 溶液中に分散し、ボルテックスミキサーを用いて 3 分間混合し、物理的混合物（physical mixture：PM）懸濁液を得た。PM 懸濁液と直NMR signalyDD

径 5 mm のジルコニアボール 100 個を容量 50 mL のジルコ
ニ ア 製 粉 砕 ジ ャ ー（Verder Scientific Co. Ltd., Tokyo,
Japan） に 入 れ、 遊 星 型 ボ ー ル ミ ル（PM 100：Verderx

Scientific Co. Ltd., Tokyo, Japan）により回転速度 400 rpm

Capsule-type container
Solid-state NMR sample tube

Fig. 1 A schematic representation of suspended-state NMR

で粉砕を行うことにより、混合粉砕物（ground mixture
suspension：GM）懸濁液を調製した。

2. 2. 粒子径測定
θ＝ 54.7 °の角度（マジック角）で、試料管を数 kHz ～数十

MICROTRAC 9340-UPA（MicrotracBEL Corp., Japan）

kHz で高速回転させる MAS を適用する。さらに、NMR 信を用いて動的光散乱法により、ナノ粒子の体積平均径
（mean

1

号を取得する時に、 H 核の共鳴周波数の強い高周波数のvolume diameter; MV）を算出した。

ラジオ波を連続的に照射する DD を適用する。MAS と DDの併用により、固体試料のスペクトルの広幅化の原因と1

13なっている化学シフト異方項及び H- C 双極子相互作用

2. 3. 極低温透過型電子顕微鏡（Cryo-transmission
electron microscopy：Cryo-TEM）測定の両方を消去・軽減する。結果として、溶液 NMR では観

JEM-2100F（JEOL Co., Ltd., Japan）を用い、加速電圧察できない運動性の低い固体成分でも高分解能 13C NMR

120 kV で cryo-TEM 測定を行った。マイクログリッド膜

スペクトルの取得が可能となる。従って suspended-state

貼付グリッド（Cu200, Nisshin EM Co. Ltd., Japan）のフィ

NMR では、懸濁液中にある運動性の低いナノ粒子のコア

ルム被膜側を HDT-400（JEOL Co., Ltd., Japan）により 40にある薬物や固液界面にある安定化剤の NMR スペクトル

秒間親水化処理した後、各試料液 2 µL を吸着させた。過を、乾燥工程なしに直接得ることができる。

剰な溶液を濾紙で吸い取った後、液体窒素の自動供給に

本稿では、suspended-state NMR 法を用いて、湿式粉より温度を約 ‒170 ℃にコントロールした液体エタン内で砕により調製した 2 種類の薬物ナノ懸濁液について評価

急速凍結させ cryo-TEM 試料とした。Cryo-TEM 試料をした結果を報告する。難水溶性薬物のモデルとしてイン

Gatan 626 cryo-holder（Gatan, Inc., CA, USA）に液体窒素

ドメタシン（indomethacin：IMC、非ステロイド性抗炎症

中で装着し、‒170 ℃以下の温度を維持して TEM 測定を行薬）及びピロキシカム（piroxicam：PXC、非ステロイド性った。

抗炎症薬）を用いた。IMC には 7 つの結晶多形が報告されている 5）。ここでは、最安定形の γ 形 IMC に加えて準安定

2. 4. Suspended-state NMR 測定

形の α 形 IMC 及び非晶質 IMC を使用し、粉砕前の IMC 結

JNM-ECA 600（JEOL Resonance Co., Ltd., Japan： 外晶形が湿式粉砕より得られるナノ粒子の形態や IMC 分子

部磁場強度：14.01 T）を用い、suspended-state 13C NMR

状態に及ぼす影響を評価した。また、安定化剤として、ポ測定を行った。測定シークエンスは、MAS 5 kHz 条件下

リエチレンオキサイド（polyethyleneoxide：PEO）101 －ポ

において、交差分極（cross polarization：CP）及びパルス

リプロピレンオキサイド（polypropyleneoxide：PPO）
56 －飽和移動（pulse saturation transfer：PST）測定を行った。

PEO101 からなるトリブロックコポリマーであるポロキサ

また、spinning sideband を消去するため total suppression

マー 407（P407）を用いた。薬物と P407 を水に分散させてof spinning sideband 測定を合わせて用いた。Suspended-

湿式粉砕することで、薬物ナノ懸濁液を調製した。そして、

state NMR 測定では、MAS 下における試料の漏出を防ぐ

得られた薬物ナノ懸濁液中の薬物及び P407 の分子状態をため、特殊カプセル内に試料を封入した後、NMR サンプ

suspended-state NMR 測定により評価し、各薬物ナノ粒

ル管内に挿入した。MAS による高速スピニングの影響で、子の構造について考察した。

測定試料のサンプル管壁への偏析が認められた。しかし、この試料は再分散が可能であり、平均粒子径も MAS 回転− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018前とほぼ同等であった。このことから、MAS による試料の変化は起こらないと判断し、以降の解析を行った。

3. 結果・考察
3. 1. 粒子径及び形態評価
Fig. 2 左に各 GM 懸濁液の動的光散乱法による粒子径測定結果を示す。GM 懸濁液の MV は 240-270 nm であり、その粒子径分布は単峰性であった。この結果より、いずれの結晶形の IMC 及び PXC を用いた場合でも湿式粉砕により薬物ナノ懸濁液が形成されることが明らかとなった。一方、cryo-TEM 測定の結果（Fig. 2 右）、初期の薬物結晶形
及び薬物の種類に依存して得られる薬物ナノ粒子の形態は異なった。γ 形 IMC を用いて調製した GM 懸濁液では、菱形板状の形態が観察された。これに対して、α 形 IMC 及
び非晶質 IMC を用いて調製した GM 懸濁液では、針状のナノ粒子が認められた。各 IMC 粉末について走査型電子顕微鏡測定を行った結果、γ 形 IMC 結晶は菱形板状、α 形
IMC 結晶は針状の形態を呈した（data not shown）。この結果より、γ 形 IMC 及び α 形 IMC を用いて調製した場合、それぞれの初期結晶に特徴的な形態を保持したままナノ粒子化したのに対して、非晶質 IMC を用いた場合ではナノ粒子化に伴い形態が変化することが示された。さらに、
PXC を用いた系では IMC の系とは異なり、粒子の形態は不定形となり、またナノ粒子と水の固液界面に P407 に由来すると考えられる厚い表面層が認められた。
Fig. 2 (left) Particle size distribution patterns and (right) cryoTEM images of a GM suspensions prepared with (a) γ form
IMC, (b) α form IMC, (c) amorphous IMC and (d) PXC

3. 2. Suspended-state NMR 測定
3. 2. 1 CP 測定
Suspended-state NMR 測定により各 GM 懸濁液中の薬物と P407 の分子状態を評価した。Fig. 3 には各 GM 懸濁液の形態の相違が、ナノ粒子中の IMC 結晶形の違いに由来について、CP 法を用いて測定した NMR スペクトルを示す。

することを確認できた。PXC を用いた GM 懸濁液におい113

CP 法は双極子相互作用を介して H 核から C 核へ磁化をては、PXC ピークが先鋭化なピークと広幅なピークの重移動させる手法である。分子運動性の高い成分は双極子相ね合わせとして観察された。この先鋭なピークと広幅なピ互作用が平均化されるため CP スペクトルに反映されにくークはそれぞれ結晶と非晶質状態の PXC を反映しており、いのに対して、分子運動性の低い成分は CP スペクトルにGM 懸濁液においては PXC が結晶状態のみならず非晶質

強調されて観察される。すなわち、懸濁液では運動性の高状態で存在することが示された。湿式粉砕により調製したい溶解成分は CP スペクトルに反映されにくいのに対して、ナノ粒子中の薬物は通常結晶状態であることから、ナノ粒

運動性の低い粒子成分は強調して観察される 6）。γ 形 IMC

子中の PXC 非晶質化は興味深い事象と言える。

及び α 形 IMC を用いて調製した GM 懸濁液の IMC ピークは、

さらに、いずれの GM 懸濁液の CP スペクトルいずれにそれぞれ γ 形 IMC 及び α 形 IMC 結晶の化学シフト値と一致

おいても、P407 に由来するピークが 20 及び 70 ppm 付近した。一方、非晶質 IMC を用いて調製した GM 懸濁液のに認められた。CP 法は運動性の低い成分を強調して観察

IMC ピークは、α 形 IMC 結晶と同様であった。すなわち、する手法であることから、GM 懸濁液中には運動性の抑制

結晶性 IMC より調製した GM 懸濁液では粉砕過程で初期された P407 成分が存在することが明らかとなった。すな

結晶形を維持したまま IMC がナノ粒子化した一方、非晶

わち、この P407 ピークはナノ粒子と水の固液界面に吸着

質 IMC を用いた GM 懸濁液ではナノ化する過程で α 形 IMC

した成分あるいはナノ粒子に取り込まれた成分に由来するへと転移して結晶化したことが明らかとなった。また、本と考えられる。また、P407 のピーク強度は PXC を用いた結果より Fig. 2 の cryo-TEM 像で観察された IMC ナノ粒子

GM 懸濁液の方が、各結晶形の IMC を用いた GM 懸濁液よ− 42 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

13

Fig. 3 C CP/MAS NMR spectra of (a) γ-form IMC, (b) α-form IMC, (c) amorphous IMC, (d) GM suspension preparedwith γ form IMC, (e) GM suspension prepared with α form IMC, (f) GM suspension prepared with amorphous IMC,(g) PM suspension prepared with γ form IMC, (h) crystalline PXC, and (i) GM suspension prepared with PXCりも顕著に大きくなった。このことから、PXC を用いたに評価する目的で、PST 法による評価を行った。PST 法

GM 懸濁液では IMC を用いた GM 懸濁液と比較して、よりでは、運動性の高い成分（溶解成分）及び低い成分（ナノ粒

多くの P407 がナノ粒子成分として存在していると考察し子成分）の両方がスペクトル上に観察される。Fig. 4 に、γた。

形 IMC/P407 PM 懸濁液と各 GM 懸濁液のスペクトルを、

3. 2. 2 PST 測定

70 ppm 付近の PEO のメチレンピークに対してノーマラ

各 GM 懸濁液中に存在する P407 の分子状態をより詳細イズした結果を示す。PM 懸濁液のスペクトルでは、PEO− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 201813

Fig. 4
C PST/MAS NMR spectra of GM suspension prepared with γ form IMC(orange line), GM suspension prepared with α form IMC (blue line), GM suspension
prepared with amorphous IMC (red line), PM suspension prepared with γ form IMC(black line), and GM suspension prepared with PXC (green line). Solid and dottedarrows indicate the P407 forming polymeric micelles, and immobilized on the surfaceof nanoparticles, respectively.

鎖と PPO 鎖のメチレンピークは共に先鋭であった。PM分子ミセル間の吸着・脱着は NMR のタイムスケールより懸濁液においては P407 はほぼすべてが高分子ミセルとしも遅いことが示された 6）。溶液中における粒子への吸着はて存在しており、その速い等方性回転（相関時間 10 µs）の高分子と低分子の界面活性剤で大きく異なる。低分子界面

6）ため、先鋭なピークが観察されたと考えられた 。GM 懸活性剤では粒子界面とミセル間での吸着・脱着は極めて速濁液においては、PEO ピークの線幅と化学シフトは PM 懸い。一方、高分子界面活性剤では、多数あるモノマーが粒濁液のものとほぼ一致した。GM 懸濁液においては P407

子界面でそれぞれ相互作用するため、高分子鎖の部分的なは薬物ナノ粒子（200-300 nm）と高分子ミセル（10-20 nm）

吸着・脱着は起きるものの高分子鎖全体の吸着・脱着は抑の両方に存在する。薬物ナノ粒子と高分子ミセルでは、そ制される 8）。特に、粒子がナノサイズの場合には、高分子のサイズ及び拡散速度は大きく異なるにも関わらず、PEO

鎖の脱着は顕著に抑制される。よって、本 GM 懸濁液におピークの形状は同程度に先鋭であった。この理由として、

いても、P407 の疎水部である PPO 鎖のモノマーがそれぞ

ナノ粒子の PEO 鎖は主にナノ粒子と水の固液界面に存在れナノ粒子中で薬物と多数の疎水性相互作用を形成しておしており、水和層を形成しているため分子運動性が高く、り、この疎水性相互作用が協同的に働く。そのため、ナノ高分子ミセルの PEO 鎖と同様の分子状態にあることが考粒子に強く吸着した P407 の脱着は極めて抑制されている

えられる 7）。これに対して、74 ppm 付近の GM 懸濁液中と推察された。

の PPO のメチレンピークでは、低磁場側の高分子ミセル

Fig. 5 に suspended-state NMR より考察した IMC/P407に由来するピーク（実線矢印）に加えて、高磁場側にナノ粒

GM 懸濁液（Fig. 5a）及び PXC/P407 GM 懸濁液（Fig. 5b）の子成分である P407 に由来すると考えらえる肩ピーク（破線

模式図を示す。湿式粉砕により、γ 形 IMC を用いた GM 懸矢印）が観察された。PPO 鎖のピークが低磁場側と高磁場

濁液では γ 形 IMC ナノ結晶が、α 形 IMC 及び非晶質 IMC側に分裂して観察された結果より、P407 のナノ粒子と高を用いた GM 懸濁液では α 形 IMC ナノ結晶が形成された。

− 44 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

Fig. 5 Schematic representations of (a) IMC/P407 and (b) PXC/P407 GM suspensions

各 IMC/P407 GM 懸濁液中においては、液相成分として方、MAS による遠心力の影響を考慮する必要があり、まP407 の高分子ミセル、固相成分として IMC ナノ結晶及びた NMR の感度の低さから測定に時間を要し、適用が薬物

その結晶界面に吸着した P407 が存在している。IMC ナ

濃度の高い薬物ナノ懸濁液のみに限られる。そのため、今ノ結晶界面に吸着した P407 は、疎水性の PPO 鎖の疎水

後の suspended-state NMR の汎用的な応用については更性相互作用により IMC 結晶に強く相互作用する一方、親なる発展が必須である。しかし、近年の NMR 技術の目覚

水性の PEO の水和層形成により IMC ナノ結晶の分散安定

ましい発展を背景に、将来的には薬物ナノ懸濁液の物性評化に寄与していると考えられる。PXC/P407 GM 懸濁液

価法として確立され、様々な薬物ナノ懸濁液の分子状態・でも、IMC/P407 GM 懸濁液と同様に、液相成分である

界面構造評価に用いることができると見込んでいる。そしP407 高分子ミセル及び固相成分である PXC ナノ粒子からて、効率的な高品質の薬物ナノ粒子製剤の処方設計及び精なる。そして、固相の P407 は主にナノ粒子界面近傍に存密な品質評価・管理に貢献するものと期待している。

在し、親水性の高い PEO 鎖を液相側に突き出し、また疎水性の高い PPO 鎖は粒子界面で固定された構造を形成す（引用文献）る。IMC/P407 GM 懸濁液では IMC が結晶で存在するのみ

1） M. Malamatari, K. Taylor, S. Malamataris, D.

であるのに対して、PXC/P407 GM 懸濁液では PXC の結晶

Douroumis, K. Kachrimanis, Drug Discov. Today, 2 3,と非晶質が共存する。PXC の非晶質は非常に不安定であ534-547（2018）

り、室温でも速やかに結晶化する。したがって、水溶液中

2） J. Zhang, K. Higashi, W. Limwikrant, K. Moribe, K.
Yamamoto, Int. J. Pharm. 423, 571-576（2012）

で PXC 非晶質が単独で安定に存在するのは困難で、P407
が PXC 非晶質形成に寄与していると予想される。ナノ粒

3） Y. Kuroiwa, K. Higashi, K. Ueda, K. Yamamoto, K.
Moribe, Int. J. Pharm. 537, 30-39（2018）

子界面において、P407 の PPO 鎖が粒子内部を向いていることから、この PPO 鎖が PXC と相互作用を形成し、PXC

4） Y. Hasegawa, K. Higashi, K. Yamamoto, K. Moribe,
Mol. Pharm. 12, 1564-1572（2015）

非晶質を安定化していると考察した。IMC よりも PXC の
方が PPO 鎖との分子間相互作用が強い。そのため、より

5） K. Higashi, K. Ueda, K. Moribe, Adv. Drug Deliv.
Rev., 117, 71-85（2017）

多くの P407 がナノ粒子に取り込まれ、ナノ粒子中の一部

6） C. Mayer, Ann. R. NMR S. 55, 205-258（2015）の PXC が非晶質化したと推察した。

4. 総

7） K. Abe, K. Higashi, K. Watabe, K. Kobayashi, W.

括Limwikrant, K. Yamamoto, K. Moribe, Colloids Surf. A.
474, 63-70（2015）

Suspended-state NMR に よ り、 湿 式 粉 砕 に よ り 調 製
した IMC/P407 及び PXC/P407 ナノ懸濁液中の薬物の結

8） K. Sigfridsson, U. Skantze, P. Skantze, S. Johansson,

晶形やナノ粒子に吸着した P407 の分子状態を評価でき

I. Grant, B. Smedsrød, B. Fuglesteg, K. Elvevold, L.

た。Suspended-state NMR は、薬物ナノ懸濁液中の薬物

Lindfors, Int. J. Pharm. 518, 29-40（2017）と添加剤について原子レベルの詳細な情報が得られる。一− 45 −