染毛剤成分の代謝に関する研究帥食品薬品安全センター

秦野研究所

中 尾 美津男

Regioselectivity in N-acetylation of nitro-p-phenylenediamne(NPDA, 2-nitro-1,4-diammobenzene), a widely used hair dye component, by rat liver cytosolic N-acetyl­transferases was studied in relation to its substituent effects on enzymatic N-acetylationof mono-substituted anilines. NPDA was acetylated specifically at the N'-position toafford the N'-monoacetate, a maior urinary metabolite in the rat, when incubated with
rat liver cytosol fortified with acetyl-coenzyme A. N'-Acetylation of NPDA did nottake place even when the N'-monoacetate was used as a substrate, suggesting a strong
steric hindrance effect of the ortho nitro group on the enzymatic N'-acetylation. The
steric hindrance effect of the nitro group on the cytosolic N-acetylation of the orthoamino group was revealed by a comparative study carried out by using aniline, three re­spective regioisomers of nitroanilines and phenylenediamine(PD)s as model substrates.
The comparative study also indicated the enzymatic N-acetylation of the mono-substi­
tuted anilines to be strongly influenced by the electronic effect of the substituents.
Regioselective N-acetylation in the hepatic cytosol was also investigated with N'­
and N'-monoacetates of 1,2,4-triaminobenzene(TAB). The monoacetates yielded theN', N'-diacetate, another major urinary metabolite of the hair dye component, in therat, without concomitant formation of the N', N'-diacetate or the N', N', N'-triac­
etate. The triacetate was formed only from the N', N'-diacetate in the enzymatic reac­
tions. A comparative study, carried out by using N-mono-acetates of three regioiso­
metric PDs, indicat.ed that the N-acetyl group had a potent steric hindrance effect on the
primary amino group at the ortho position.
Thus, the present in uitro study strongly suggested that the two major urinary
metabolites, NPDA N'-acetate and TAB N',N'-diacetate, of the hair dye component
could be formed, at least in the rat liver, by the enzymatic N-acetylation of the corre­
sponding amines.

1. 緒 言しかし， 染毛剤構成成分の生体内動態， 特に代謝に関する報告はあまり多くな い 6

染毛剤は古くから広く使用されて き たに もかかわらずその安全性に関してはあまり検討されてI)- 1 0)

研究は染毛剤の安全性に関する研究のセミパーマネントヘアカラー。 そこで本一環としての主要な構成成分でによって市あり， 変 異原性 I, 11, l 2l , 染色体異 常誘発性 13),

販の酸化型染毛剤の中に微生物に対して変異原性か認められるも のがあり， その 変異原性の本体は姉妹染色分体交換誘発性 14) , 不定期 DNA 合成
誘発性 I 5 >等が認 められ， 発癌性 16, l 7) も報告さ

染毛剤構成成分の芳香族アミン類である ことが報れている nitro-p-phenylenediamine(NPDA,告された。 以来染毛剤およびその構成成分の安全性評価のための試験が数多く実施されてきた2 - 5 >。

2-nitro-1,4-diaminobenzene) の代謝について

いな かった。 1975年B. N. Ames ら検討した。 我々は既に NPDA を投与したラット

Metabolism of the Hair Dye Component
Mitsuo Nakao-2-染毛剤成分の代謝に関する研究の 尿中から ， 2種類の代謝物を検出した。 一つは4

NPDA N -acetateであり もう

2. 2

一

肝可溶性画分の調製

つは1, 2, 4-

動物には6週齢 ， 体重200-210gの Sprague­triaminobenzene CTAB) N 1 , N 4 -diacetateでDawley系雄性ラット（日本チャ ー ルス ・ リバ ーあった1 8)。 NPDA N', N 4 -diacetateはその前

闊 Crj:CD(SD))を使用した。

4

駆体と考えられる NPDA N -acetateあるいは4

動物を断頭放血死させ ， 直ちに肝臓を摘出しTAB N -acetateを投与した尿中からも検出さた。 3倍量の 1.15%塩化カリウム溶液を加え， 氷冷れた。 しかし ， TAB N 1 , N 4 -diacetateを投与

下 テフロンペスル付ホモジェナイザ ーでホモジェした尿中からはTAB N1 , N2 , N4 -triacetateはナイズした。 ホモジェネ ートを105,000X g, 60

検出されなかったI 9) 。 したがって ， NPDAの代

分間冷却遠心分離した上清を酵素反応に使用した。

謝経路はNPDA→ NPDA N4 -acetate → TAB

Lowryらの方法 2 6 lによってタンパク質の定量を

N4 -acetate→ TAB N1 , N4 -diacetateであると行った。

考 え ら れ る 。 こ の経 路 の中 で NPDAおよびTAB N4 -acetateのアミノ基のNー アセチル化にインキュベ ー ションおよび高速液体クロ2. 3

位置選択性 が認められた。 そこで， このアミノ基マトグラフィ ー (HPLC)試料の調製の選択的N アセチル化 がラット肝を用いてもinLowerらの方法 27 l を改良してインキュベ ー

vivoと同様の結果を与えることを確認すると共ションを行った。 反応液の組成は0.05叫のプロピに nitroaniline, phenylenediamine CPD )等 のレングリコ ー ルに溶解した基質（芳香族アミン） 1.0

モデル化合物を基質として 用いてin vitroにおけµmol ,

ーる選択的N アセチル化についても検討した。

セチル

ー

1.0µmol アセチルコエンザイム A(アーCoA), 100µMトリ ス塩酸緩衝液(pH7 .5)および肝可溶性画分(4.3mg タンパク質相2

実験材料および方法

当）であり ， 全量を1.0叫とした。 反応液に 基質を加えることによって 反応を開始し， 37℃, 30分間

2. 1

試

インキュベ ートした。 反応終了後， 氷冷下lN水薬

NPDA N 1 -acetateをAtkinsonらの方法 20 l ,421

酸化ナトリウムを0.1叫を加えた。 次いで ， 反応

NPDA N -acetateをBulowらの方法 )にした液に HPLC 用の内部標準物質を加えた後 ， 3倍量がって合成した。 TAB N1 -acetate, TAB N2-の 酢酸エチルIn-ブタノー ル(1:1, v/v; 使用 前にacetate, TAB N4 -acetateをKehrmannらの方

水で飽和した）で 2回抽出した。 Anilineおよび法22にしたがって合成した。 合成したTAB N­

nitroaniline類の代謝物の抽出には酢酸エチルをmonoacetateには無水プロビオン酸を加え， N,使用した。有機層を50℃以下で減圧下濃縮乾固し ，N ' -dipropionate 誘 導 体 と し た 。 TAB N­

50%メタノー ル溶液に溶解し ， HPLC試料とした。

lmonoacetateのN, N' -dipropionate誘導体のそれぞれの融点は，

TAB N 1 -acetate 204℃,

なお， 芳香族アミン類のアセチル化合物の反応液からの回収率は85%以上であった。

TAB N 2 -acetate 200℃および TAB N4 -ac­etateは200℃で あった。 また，

2.4

a-PD N ac­

HPLC, 紫外吸収スペクトルおよび質量
スペクトル

2

etateをM acallumの方法 3>, a-PD N, N' ­diacetateをRugheimerの方法 24> , m-PD N,

代謝物の分離を高速液体クロマトグラフ（（松島N' -diacetateをPhillipsの方法 lにしたがっ津製作所，て それぞれ合成した。 その他の試薬については東

カラムにはShim-pack CLC-ODS((樹島津製作

京化成工業（樹等から購入して使用した。

所 ）を用い， 流速 0.6叫/min , 検出には紫外分光

25

-3-

LC-6Aシステム ）によって 行った。

Table1.

Chromatographic and Spectral Data of Nitro-p-phenylenediamine, Its N-Acetates, and1,2,4-

Tri aminobenzeneN-Acetates
IIPLC'
Retention ti●cs (oin)Co ●pouod

65744666--● ,Hass spectra1 data•'乙(relatl,o intensity, $)n● （ヽ）

mmoasoo>
09100>
253 (2刀00)
253 (23500)

153 (H', JOO), 107 (73), 80 (47), 53 (39)105 (H', 20), 153 (JOO). 107 (78), 80 (27), 53 (ZO)
195 (H', 47), 153 (JOO), 107 (88), 80 (33), 53 (42)237 (H', 24), 195 (邸), 153 (100), 107 (43), 53 (15)

o.sa
0.51
0.52
0.52

232 (21600), 261 (18100)
23 2. S (20900), 260 (17300)
231 (25400), 262 (21800)
232 (21600), 261 (18100)

291 CH', 49), 235 (34), 176 (66), 122 (66), 57 (100)277 (H', 67), 221 (36), 179 (56), 165 (44), 122 (100)277 (H', 58), 221 (40), 179 (38), 165 (57), 122 (100)277 (H", 69), 221 (51), 179 (19), 165 (100),122 (96)

11.0

〇.23
0.33

14.0
39.6
16.0

o. 27
0.37

223 (18800), 255 (10900),
300 (2300)
225,5 (29600), 255 (12000),
302 (5100)
213 (15900). 260 (12000)
230 (19300), 260 (16000)

107 (H', 39), 147 (51), 123 (46), 111 (100), 95 (45)

11.1

18.2
16.2
25.8
29. 2
32.8

1, 2,4·Tr iaainobcnzcne ・N'·acetalc ・N'·acctate ・N'-acetate ・e·Pheny1 enedia●ine
N,N'·diacetate'

UV :l!!:"

0．
0．
0．
0．

Nitro·e·phenylenediaoinef·acctateN'・acetate
N',N'・diacctatc
一ーAcetanilide 0

TLC'
Rr valuo

9.8
15.2
16.4
19.6
22.8

1,2, 4·Tr iaainobenzcne
N',N'·diacctate- N',N'- diacetate-N',N'·diacctate
N',N',N'·triacctate- - ・り'·Acetylsulfani la● ide'107 (H', 66), 147 (57), 123 (81), 111 (100), 95 (51)107 (H', 72), 147 (76), 123 (88), 121 (100), 95 (52)249 (H', 61), 165 (62), 147 (63), 123 (64), 112 (]OD)• 1: Nobile phase, acetonitrile·vater (15:85, v/v); colu口n Shia·pack CLC·ODS; flov rate, 0.6 al/ain. 2: Nobile phase, chlorofora·ethanol (95:5, v/v);
column Shi,·pack CLC·SIL; flov rate, 2.0 ,l/ain. 3: Hobile phase, aethanol·vater (10:90, v/v); colu●n Shia·pack CLC·OOS; flov rate, 0.6 ml/min.
• Hobile phase, chlorofor● ● ●ethanol·25%a●oonia water (60:JO:l, "v/v).
0 Internal standard for IIPLC. Plates: Slica ,cl 60 P,, (E. Herek).
. �. り'·Dipropionatc drivative.
●

Table 2.

Chromatographic and Spectral Data of Nitroani Ii nes, Ani Iine and Their N-Acetates

Compou n d

HPLC8Retention
times (min)
2

゜

15.8

o-Nitroaniline N-acetate

11.2

竺-Nitroaniline

1 1 .6

旦ーNitroanillne !!_—acetate

14. 2

J!:-Nitroaniline

9.6_Jl. Nitroaniline N-acetate

15.2

2, 4-Dinitroaniline b

UVEthanol
nm(E)入max

地ss spectral data
旦位(relative intens! ty, %)23J (17000)

1so (W, 15), 138 oooJ, 92 (40), 65 (41), 63 (20), 52 (21)241 (22900)

180 (炉 ， 22), 138 (100), 92 (52), 65 (37}, 64 (14), 63 (16)315 (14400),

180 (W, 25), 138 (JOO), 108 (56), 92 (29), 65 (42), 63 (24)224 (10860)
19.8

Aniline12.0

Acetanilide

14.6

m-Nitroaniline N-ocetateb

241 (16000)

135 (ず, 25), 93 (100), 66 (23), 65 (20)22.0

8 1: Hobile phase, methano l-water (1:1, v/v), 2: mobile phase, methanol-water (4:6, v/v), and other con dition s as described in
the text.
b Internal standard for high pressure liquid chromatography.

光度計検出器（（樹島津製作所 ， SPD-6A)を使用

島津製作所 ， QP-1000)を用いて， イオン化電圧

し， 検出波長254nmで行った。 紫外吸収スペク

70eV, イオン源温度290℃で直接導入法によって

ル溶液を自記分測定した。 標準品の HPLC によって測定した保光光度計（（樹島津製作所 ， UV-201A)を用いて測ー
持時間紫外吸収および質量スペクトルデ タを定した。 また ， 質量スペクトルを質量分析計（（悧Table

トルについては各試料のエタノー-4-

1, 2および3に示した。

染毛剤成分の代紺に関する研究

Table 3.

Chromatographic and Spectral Data of Phenylenediamines and Their N-Acetates
IIPU:8Retention times(min)Compound1

E_-Pheny1 enediamine

5.6

N-monoaceta te

I1.6

N,N'-dlacetate
22.8
jl_ -Phenylenediamine !!,!!'-diacetate b 31.6_!!!-Phen ylenediam1ne_!!-monoacetate

8.0
12.4

_tl_,_tl_'-diacetate.1<-Phenylenediamine !!,!!'-diacetateb

26.4
20.4

且ーPhenylenediamine

6, 4N-monoacetate.t!,.t!'-diacetate
旦 -Phenylenediamine .t!,せ'-diacetateb

8.8
20.4
26.4

UV
Ethanolnm(£)
入max

Hass spectral dato.'!'.I三(relative intensity, %)292 (2870)
208 (24100)
214 (20700)

150 (寸 ， 46), 133 (26), 108 (JOO), 107 (39), 80 (56), 53 (25)296 (2580)
223 (26900)
234 (29300)

ISO (寸 ， 54), 108 (100), 81 (22), 80 (29), 53 (14)192 (寸 ， 22), 150 (34), 108 (100), 81 (12), 80 (21)260 (15000)
265 (23000)

150 (W-, 47), 108 (100), 107 (38), 80 (33), 53 (23)192 (炉, 32). 150 (22), 108 (100) 、 107 (31), 80 (23), 53 (16)192 (寸, 20), 133 (35), 132 (36), 108 (100), 107 (31), 80 (32)

8 l: Hobile phase, methanol-water-acetic acid (15 :85: 0. I, v/v), 2: mobile phase, methanol-IQ m卜I phosphate buffer, pl! 7.5 (2:8,v/v), and other conditions as described in the text.
Internal standard for high pressure liquid chromatography.

3. 結 果3. 2

TABN-mono ー およびN,N' ­di acetate のN

3. 1

NPDA およびその N 4-acetate のN ー アI

2

中で NPDA をインキュベートし ，

条件でインキュベ ー トした場合にも起こった。 つまり，

HPLC 用内部標準物質を添加した後， 酢酸エチルIn-プタ
ルで抽出し，TAB のN-acetate およびN -acetate を NPDA と同様のアセチル ー CoA 存在下， ラット肝可溶性画分

ノ

アセチル化反応

4位のアミノ基のNー アセチル化は，セチル化反応ーー

HPLC によって代謝物を検索

TAB N'-acetate および TAB N -ac­2etate を基質とした反応液に内部標準物質を添加した後， 酢酸エチルIn-プタノ ー ル 抽出液には，した。 クロマトグラム上には基質の他に 保持時間

クロマトグラム上にそれぞれ唯一の代謝物である

25.8分にピ(100 ℃, 5 分間）した可溶性画分およびアセチル21.2分）および TABN , N -diacetate( 保持時間 14.0 分）

ークが検出された。 このビ ー クは加熱

CoA 不存在下には検出されなかった。

ーTABN , N -diacetate (保持時間
4

1

4

2

この代謝

のビ ークが認められた (Table 1) 。 各々の代謝物

物を高速液体クロマトグラムの保持時間， 紫外吸を HPLC の再クロマトグラフィ ー， 紫外吸収お収スペクトルおよびマススペクトルを標準品と比よ び マ ス ス ペ ク ト ル の検討に より確認し た較した結果 ，

(Table 1および4) 。

NPDAN -acetate であることが4

明らかになった。 しかし，

しかし ， それぞれの抽出液

NPDAN -acetateには TABN , N , N4 -triacetate に相当するクおよびNPDAN , 炉-diacetate は検出されな

ロマ ト グ ラ ム 上 のピ ー クは認められなかった

かった(Table 4) 。

(Table 4) 。

1

1

1

NPDAN -acetate を基質とした場合も NP­
4

DA N

1

, N 4 -diaceate は 検 出 さ れ な か っ た

2

1 位のアミノ基のNー アセチル化は ，

4

TABN

-acetate を前述の条件でインキュベ ー トした場

(Table 4) 。

合に起こった。

-5-

TABN -acetate を基質とした
4

Table 4.

N-Acetylation of N itro-p-phenylenediamine, 1,2,4-Triaminobenzene N-Mono-and N, N'-D 1 ーacetates by Rat Liver CytosoI
SubstrateaPossible metabolite

Metabolite formed(nmol/mg protein/30 min)
7
0 8 0
2

Nitroコ�-phenylenediamine JiI -monoacetate

Nitro-�-phcnylenediam1ne

N -monoacetate,2,4-Triaminobenzene N 1 -monoacetate.
.
l , 2 , 4 - Tnaminobenzene N 1 ,N 2 -diacetate

1

N l ,N 4 -diacetate
N 1 , N 2 , N 4 -tnacetate

1,2,4-Triaroinobcnzene N 1 ,N 2 -diacetate
N 2 ,N 4 -diacetate

N I N 2,N 4 -triacetate

1,2,4-Triarninobcnzene N I ,N 4 -diacetate

3
.o o
7

N 4 -monoacetate

0

0 .o

N 2 -monoacetate

ヽ.

Nitro-1とーphenylenediamine !il ,!i4 -diacetate

0

Nitro-且:-Phenylenediam1ne .!!_4 -monoacetate

ーー
゜q
， ー

N I ,N 4 -diacetate

N 2 ＇ N 4 - d·1acetate1

N 1 ,N 4 -diacetate,2,4-Triomlnobenzcne N 1 ,N 2 ,N 4 -triacetate

7
2

1 2
l, 2, 4-Tr iomi11obcnzcne l!_心—diucetate

N 1 , N 2 , N4 -triacetate

N 2 ,N 4 -diacetate

，.o o

．

N l N 2 N 4 -tnacetate

N I N 2 N 4 -triacetate

a Each substrate (1 mM) was incubated at 37 ° C for 30 min with rat liver cytosol (4.J mg protein/ml) in the pre咋nee,of acetyl-CoA (l mM) in 0.1吋I Tris-l!Cl buffer, pll 7.5, containing propylene glycol (5%, v/v). Propylene glycol
which had no effect on the enzymatic reactions was used for dissolution of the substrates.

反応液中から唯一の代謝物である TABN1 ,Nし合のアミノ基のNー アセチル化に及ぽす影響を検diacetateをHPLCにより分離し ，

紫外吸収およ討するためにアセチル ― C oA存在下， ラット肝びマススペクトルによって確認した(Table 1お

可溶性画分を用いて， o ― , m-, およびp-ni­

2

TAB N , N -diac­

よび4)。 しかしな がら，
1

4

2

4

etateおよびTABN , N , N -triacetateは検出されなかった(Table 4)。

troanilineを基質としてNPDAと同様の条件でインキュベートした。 反応液中のN—アセチル化
代謝物 nitroaniline N-acetateを， 内部標準物

TABN□ N2 , N4 -triacetateが代謝物として質を添加した後， 酢酸エチルで抽出 ，HPLCに反応液中から検出され たのは， TAB N1 , N2 -より溶出し， 再クロマトグラフィ ーを行い， そのdiacetate を 基 質 と し た 場 合 のみで あっ た 。

保持時間および紫外吸収， マススペクトルを標準

TAB N1 , N4 -diacetateおよび炉 ， N4 -diac­

品と比較 検討し確認した(Table 2)。

etateを基質とした場合にはTABN1 , N2 , N4 -Anilineのベンゼン環にニトロ基を導入するこ

triacetateは検出されなかった(Table 4)。

とによってその酵素的Nー アセチル化率はani­

3. 3

Nitroaniline類のN ー アセチル化反応

3種の nitroanilineの中でm-nitroanilineの酵

Anilineのベンゼン環にニトロ基を導入した場

素的Nー アセチル化率が最も高かったが ， その被lineのそれに比較して著しく減少した(Table 5)。

-6-

染毛剤成分の代謝に関する研究

Table 5.

N-Acetylation of Aniline and Nitroanilines by Rat Liver Cytosol

Substrate 3

包—Acetate formed(nmol/mg protein/
30 min)Relative acetylat1.on

Aniline38.6

o-Nitroaniline
m-Nitroaniline
且-Nitroaniline

0.0

0.00

19.5

0.51

4.8

0. 12

1.00

a Incubations were carried out under the same conditions as describedin Table 4.

PD類およびそのN-monoacetate類のN ー アセチル化反応
Anilineのベンゼン環にアミノ基あるいはアセ
チルアミノ基を導入した場合のアミノ基のNーア体であるmー およびp-PD のそれらよりも高かった。 しかし， PD N, N' -diacetateの生成については， m-およびp-PDが総酵素的N­
アセチル化率の約 15%であるのに対してo-PDの場合にはN,N' -diacetateは全く生成しなかった。
Anilineのベンゼン環にアセチルアミノ基を導入した場合 o-PD N-monoacetateの酵素的Nー アセチル化率は anilineに比較して著しく減少した。 一方 m-PDN monoacetateのN­

セチル化に及ぼす影響について検討した。
o-, m-, およびp-PDならびにそれぞれのアセチル化率もanilineに比較して僅かに減少したが， p-PDN-monoacetateのNーアセチル化

N-monoacetateを用い ， アセチル ー CoA存在下 ，
肝可溶性画分を加え， 前述と同様の条件でインキュベー トした。 PD類のNーアセチル化代謝物である PDN monoacetate類および PDN, N'-diacetate類の確認 ， PD N-monoacetate類の代謝物 PD N, N ' -diacetate類の確認を前
述 の nitroaniline N-acetateと同様の方法で行った(Table 3)。 Anilineのベンゼン環へのア率は増加した。

Nーアセチル化率は anilineの1/2であった。 p­nitroanilineに対する酵素的N— アセチル化率はm-nitroaniline のそれ の 1/4で あ り ， o-ni­
troanilineのアミノ基は全くN— アセチル化を受けなかった。
3. 4

ミノ基の 導入は ， 酵素的Nーアセチル化率をani­lineの1.7-1.9倍増加させた(Table 6)。 a-PDの酵素的N— モノアセチル化率は ， 他の位置異性

NPDAのN ー アセチル化反応におけるパラオクソンの影響
NPDA N1 ー acetateを基質としてアセチル ー

3.5

CoA存在下 ， ラット肝可溶性画分中でインキュ
ベ ー トした場合反応液中から基質の他にNP­DA , NPDA N4 -acetateおよびNPDAN 1 ,
N 4 - diacetateが検出された。 しかし， 上述の反応液中にO.lMパラオクソン（脱アセチル化酵素の阻害剤）を添加した場合NPDAおよびそのN4-7-

Table 6.

N-Acetylation of Ani Iine, P henylened iam i nes and Their N-Monoacetates by Rat Liver Cytosol
N-Acetates formed(nmol/mg protein/30 min)Total acetylation b

Substratea.!:!.,.!:!.'-Diaceta te

N-Monoacetate

39.4 (1.00)

Aniline39.4.2_-Phenylenediamine

74.1

0.0

74.1 (1.88)

�-Phenylenediamine

64.1

10.4

74.5 (1.89)_£-Phenylenediamine

56.9

10.9

67.8 (1.72).2_-Phenylenediamine _!i-monoacetate

2.3

2.3 (0.06)

町Phenylenediamine位—monoacetate

32.1

32.1 (0.81)

且-Phenylenedia mine _!i-monoacetate

44.0

44.0 (1.12)

aIncuba tions were ca rried out under the same conditions as described in Table 4.
b Numera ls in pa rentheses represent relative acetylation based on the summed values of社一mono- andN,N'-di-acetates.

Effect of P araoxon on N-Acetylation of N itro-p-phenylenediam ine and I ts N'-Acetate by Rat
Liver Cytosol'

Table 7.

Hetabo] itcs for cd (n ol/ t protein/JO•in)●

Substrate

Nitro·e ・phcnylcncdia 口incNitro·e·phcnylcncdia口ine
R'·acclate

50. 7
4.3

1\.6
3.0

Ni tro-e-phenyl cncdiamine�'·acetate
Co pJcte+ Paraoxon (0. I叫）●

Nitro·�-phonyI enediami ne
Co plete+ Parao,on (0.1 mK)●●

Nitro·e·phcnylcncdiaoinc
N'·acetate

Nitro·e ・phcny I cncdia口 1ne
N 1 ,N'·diacclatc

6.0
11.8

28. 7
26.5

●

• Incubations were carried 04t in the absence and in the presence of parao,on under the same.conditions as described in Table 4.

-acetateの生成は著しく減少した(Table 7)。 ­アセチル化への影響は認められなかった。 NP­

方，

DAN -acetateおよびo-nitroanilineを基質と

パ

4

NPDAを甚質とした場合， 上述の条件下 ，

ラオクソンの存在の有無にかかわらずNPDA
4N'-acetateおよびNPDA N', N -diacetateは全く生成せず ，成した。 また ，

4

NPDA N -acetateのみが生し，それぞれのアミノ基は全< N-アセチル化を受けなかった。

その被N アセチル化率にもほと
パ

ラオクソンを添加した場合もNPDAの1位のアミノ基と同様に，

ーんど変化が認められなく(Table 7),

パ

ラオクソ

ンの添加によるNPDAの4位のアミノ基のN--8-

染毛剤成分の代謝に関する研究

クソンによって著しく 阻害を 受けた。即ち ，NPDAN 1 -acetateの脱アセチル化酵素はO.lM

4. 考察

パラオクソンの添加により，約92%の阻害を受けた(Table 7)。そこで脱アセチル化酵素をほぼNPDAのNーアセチル化が4位のアミノ基に選択的に起こることがin vivo同様，アセチルー

完全に阻害する条件であるO.lM パラオクソン存在下，甚質としてNPDA, NPDA N4-acetate
およびo-nitroanilineを用いてアセチル ー CoA

CoA存在下，雄性ラット肝可溶性画分を用いた実験においても明らかになった(Table 4およびFig. 1)。

と共にインキュベートしたが，3種の基質共反
応液中 にN1 -acetateまたはN-acetateは検出されなかった。したがってニトロ基はoー 位のNPDAのモデル化合物 nitroanilineの3種の異t生体を基質として，そのNーアセチル化について検討した結果o-nitroanilineのアミノ基は
全 くNーアセチル化を受けず， m-および p-ni­
troanilineのアミノ基はNーアセチル化を受けたー(m >p)が， anilineの酵素的N アセチル化率に比較して著しく減少した(Table 5)。したがって ，
NPDAの1位のアミノ基がNーアセチル化を受けアミノ基のNーアセチル化を完全に阻害することが明らかになった。
TABN. N'-diacetateのNーアセチル化によるTABN 1 , N2 , N 4 -triacetateの生成は ，肝可溶性画分中TABN 1 , N2 -diacetateを基質とした場合のみ生成した。その他の異性体である
TABN 1 , N4 -diacetateおよびN2, N4 -diac­
etateを基質とした場合にはアミノ基はNーアセ
チル化を受けずTABN 1 , N2 , N4 -triacetate
は生成しなかった(Table 4)。同様の選択的N­
アセチル化はTABN, N'-diacetateを投与した場合のin uivoにおいても認められた。また，
PD類およびそのN-monoacetate類 ， TABN
-monoacetate類およびそのTAB N, N'-

ない原因は，隣接するニトロ基の主に立体障害によるものと考えられる。
Brayら 28 >はラット肝の水抽出物を用いて，数種の芳香族アミンのNーアセチル化合物の酵素
的脱アセチル化について検討し， nitroanilineN-acetateの3種の異性体の酵素的脱アセチル化は，o>>m>pの順であることを報告している。本研
究におけるラット肝脱アセチル化酵素は， パラオ

砥[〉屈

゜一

z 2

NPDA

＋

N N

H C O CH
a
O
,
q

N

H2
NPDA N'-acetate

Fig .1.

N

20
皿[
N C o Hc 3
H

NPDA N•-acetate

＋

ゥN
N

HCO CH,NO,

HCOCH,
NPDA N',N'-<liacetate

N H

l

屈[
N C o
H

c

2
H

TABN'-acelale

＋

N

N N
H

,

3

一

HCOCH,Q'
HCOCH,TABN 2,N項acetate

N
H
: e

．

H
Hc 3

oz 0
c

2

H

3

TABN 1 ,N頃acetate
N C
H

＋

N
『
N

HCOCH,COCH,
�

HCOCH 3TAB N 1 ,N2,N'-lriacelale

亨

NHCOCH 3
HCOCH,NH 2
TABN',N 2-diacctate

RegioselectiveN-Acetylations of NP DA and TAB N'-acetate by Rat Liver Cytosol Fortified with
Acetyl-CoA-9-diacetate類を基質とした場合にも隣接するアセ(1975)

チルアミノ基によってアミノ基のNーアセチル化2 ) T. Wernick, B. M. Lanman and J. L. Fraux,の立体障害によってoー3 ) C. Burnett, M. M. Jacobs, A. Seppala and P.

が起こらないことから ， アセチルアミノ基は ， そ

Toxicol. Appl. Pharmacol., 32, 450(1975)

位のアミノ基のN アセーShubik, J. Toxicol. Environ. Health, 6, 247

チル化を阻害すると考えられる。
4(1980)TABN - acetateはin vivoと同様にアセチル-CoA存在下 ， ラット肝可溶性画分を用いても ，1位のアミノ基のみ選択的にN— アセチル化を受
14) A. L. Giles, C. W. Chung and C. Kommmem,
J. Toxicol. Environ.Health, 1, 433(1976)

け ， TABN , 炉-diacetateを生成した。 しか5) G. Iyer, K. Kannan and R.R. Khan, J. Sci 一

TABN 2 , N 4 -diacetateおよびTABN 1 , N 2 ,6) P.H. Grantham, L. Mohan, T. Benjamin, P.

し，2位のアミノ基がNーアセチル化を受けた

N 4 -triacetateは生成しなかった(Table 4およびent. Ind.Res., 44, 392(1985)

P.Roller, J.R. Miller and E. K. Weisburger,

4

J. Environ. Pathol. Toxicol., 3, 1490980)

Fig. 1)。 このTABN -acetateの1位のアミノ

7) H. Hofer and E. Hruby, Fd. Chem. Toxicol.,基の選択的N アセチル化は ， 酵素基質相互作用ー

21, 331Cl983)

における立体的な影響によるものと考えられる。

酵素的N アセチル化の立体障害と考えられる

8) Y. M. loannou andH.B.Mattews, J. Toxicol.

性画分を用いて 2, 4-diaminotolueneのN— アセ

9) R. L.Bronaugh and E.R. Congdon, J. Invest.

aminotolueneの特異的 生成 を認めているか ， 210 ) L. J. Wolfram and H. I. Maibach, Archlaminotoluene を 検 出 し て い な い 。 ま た ，

11) Y. Takeda andR. Yoshimura, Eisei Kagaku,

トに投与した尿中から 2, 4-diaminoanisoleの12 ) M. M. Shahin, C. Chopy and N. Lequesne,

検出しているが ， N2 -acetateを検出していない。

13) W. F.Benedict, Nature, 260, 368(1976)

ー

報告として ， Glinsukonら

29

チ ル 化 につい て 検討し ，

4-acetylamino-2-

Environ.Health, 16, 2990985)>は ， ラット肝可溶

Dermatol., 83, 124(1984)

Dermatol.Res., 277, 235(1985)-acetyl-4-aminotolueneおよび 2, 4-diacety­

Granthamら 30) も 2, 4-diaminoanisole をラッ
424, 3220978)

N -monoacetateおよびN , N 4 -diacetateを
2

NPDAは ， 微生物に 対 する変異原性を有すIる . 1 1 - 12 )が その代謝物である NPDAN43

Environ.Mutagen., 7, 535(1985)

14) P. E. Perry and C. E. Searle, Mutat.Res., 56,
2070977)

acetateの変異原性はNPDAに比較して低い 1)'

15) C. N. Martin, A. C. McDermid and R. C.

ーアセチル化酵素によるアミノ基のN アセチル

16) G.Reznik and J.M. Ward, Fd. Cosmet. Toxi­

最後に ， 本研究に対してご援助頂きました（財）コ17) R. R. Maronpot, M. B. Skimkin, H. P.

したがって ， NPDAの不活性化酵素として ， Nーcol., 17, 4930979)

化反応は重要であると考えられる。

Witschi, L.H. Smith and J.M. Cline, J. Natl

スメトロジ ー 研究振典財団に厚くお礼申し上げまCancer Inst., 76, 1101(1986)

す。

引用文献

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ron.Health, 11, 93(1983)19) M. Nakao, Y. Goto, Y.Matsuki, A.Hiratsuka-10-and T. Watabe, Chem. Pharm. Bull., 35, 785

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