両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

国立研究開発法人産業技術総合研究所健康工学研究部門

茂里康

Twelve novel peptides (Pxt-1 - Pxt-12) were isolated from the skin of Xenopus tropicalis using topological mass
spectrometry analysis. Among them, Pxt-8, Pxt-9, and Pxt-10 were N-terminus of Pxt-1, N-terminus of Pxt-3, andC-terminus of Pxt-11, respectively. The Pxt-3 and Pxt-11 peptides shared significant sequence homologies with magainins
1, 2 and levitide, respectively that were all isolated from X. laevis. Pxt-12 was identical to the X. tropicalis XT-6-likeprecursor previously isolated by ESI-MS/MS. None of the Pxt peptides contained any Cys, Asp, Tyr or Trp, while Ile, Leu
and Lys were frequently found as typical frog-skin peptides. RT-PCR analysis confirmed the gene expressions of Pxt-2,
Pxt-3, Pxt-4, Pxt-5, Pxt-7 and Pxt-11 in X. tropicalis skin. Several ion peaks corresponding to all identified Pxt peptides,
were observed with MALDI-MS analysis of X. tropicalis secretory fluids, collected after in vivo stimulation which suggested
that Pxt peptides were definitely secretory molecules. Circular dichroism studies and the Schiffer-Edmundson helicalwheel projections suggested that Pxt-5, as well as mastoparan, at least, could form a typical amphiphilic a-helix without aphospholipid or a membrane-mimetic solvent. Moreover, Pxt-2 showed growth inhibitory effects on both E. coli (Gramnegative) and S. aureus (Gram-positive), at MIC values of 50 and 9.7 (μg/ml), respectively. Measurements of dynamic lightscattering and the surface tensions of Pxt peptides solutions suggested that both Pxt-2 and Pxt-5 could form associations as
micelles and behave like a general surfactant, affording critical association concentrations (CAC) of 38.1 and 57.3 μM, with
γCAC of 46.9 and 38.3 mN/m.

１．緒

質量分析計（MALDI-MS）や Electrospray イオン化質量分

言

析計（ESI-MS）が登場した。そこで、これら分析機器の応

両生類の代表格であるカエルは乾燥に弱いため、水辺等用を試行錯誤しているうちに、組織切片を用い MALDI-の湿った環境が生息の中心である。産卵場所は多様である

MS を行うと、細胞内分泌顆粒の中に存在しているペプチが、幼生はえら呼吸を行い、水中で生活している。成体にド等の生体成分を分子量プロファイルとして選択的に検なると肺呼吸を開始し、陸上の生活が可能となり、陸上・出できることを見出し、「Topological Mass Spectrometry

水中を行き来しながら生活している。このように陸上及びAnalysis（Direct tissue MALDI–TOF MS）」と命名した 2）。

水中の両方の環境が生息に必要であるが、カエルツボカビ

本手法は質量分析法を駆使し、バイオアッセイや余計な精病をはじめとする感染症等により、近年生息数は激減して製プロセス無しに機能性分子の単離を可能とした。その結いる。

果、希少な動物からの生体分子の単離や不安定な生体成分

一方、生体適応・防御・内分泌系の観点から、カエルはの分析が可能である。

絶好の研究材料として用いられてきた。陸上・水中の異なそこで本申請において、両生類を代表するカエルの皮る生活環境を行き来することから、微生物等の攻撃に曝さ膚 を 用 い て、Topological Mass Spectrometry Analysis

れ易いと考えられる。その様な環境にも関わらず生き続け（Direct tissue MALDI–TOF MS）を駆使し、ペプチド等ていることから、特殊な能力を保持していると考えられの新規生体分子を網羅的に探索することを実施した。

てきた。特にカエルは皮膚の分泌腺や毒腺が多いことから、

２．実

これまで各種機能性分子（抗菌ペプチド等）
が皮膚から単離されてきた。これらの機能性分子は、皮膚組織の破砕、抽出、

2. 1. カエルバイオアッセイ、精製を繰り返し、単離、同定、遺伝子配1）

験

実験に使用したカエル（トノサマガエル、ヌマガエル）に列解読等が行われてきた 。一方 1990 年代になり新たなついては、大阪府池田市、箕面市周辺の田畑で捕獲した。

分析ツールとしてマトリックス支援レーザー脱離イオン化

またアマガエルについては、広島大学両生類研究施設 髙瀬稔先生から供与して頂いた。ネッタイツメガエル（Xenopus
tropicalis）は東京大学・産業技術総合研究所が維持していGlobal exploration of functional biomoleculesfrom amphibian skin
Yasushi Shigeri
National Institute of Advanced Industrial
S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y, H e a l t hResearch Institute

る Nigerian 系統を使用した。

2. 2. Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct
tissue MALDI–TOF MS）− 41 −

トリス緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水など生化学

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

や組織学の実験でよく使われる緩衝液は、MALDI-MS に解法で分析した。プロテインシークエンサー及び質量分

おいて試料のイオン化を阻害する。一方、質量分析法で析から得られたアミノ酸予想配列データは、データベー

推奨されるギ酸や酢酸溶液を組織切片に応用すると、浸ス検索（http://www.xenbase.org/genomes/blast.do）及び透圧の関係で細胞形態が維持できない。そこで切片調製（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を随時実施して、アミノ法として、生理食塩水による凍結包埋を試みた。摘出し酸配列を確定した。

た皮膚組織（カエル及びオタマジャクシ）を 0.4％食塩水で凍結包埋し、－20 ℃でクリオスタット（CM1850 cryostat,

2. 4. 同定されたペプチドの固相合成

Leica Microsystems, Germany） を 用 い、30 ～ 40 μm の同定されたペプチドの性質解明のため、化学合成する事

厚さの切片を作成した。作成した切片は MALDI-MS 用を試みた。ペプチドの化学合成は Fmoc 固相合成を利用し、サンプルプレートに置き、マトリックス溶液（10 mg/ml

PSSM8 自動ペプチド合成装置（島津製作所）を用いて行っ

CHCA in 50% acetonitrile + 0.1% trifluoroacetic acid）を添た。合成ペプチドの精製は逆相 HPLC（Waters 600）を使加した後、直ちに吸い取った。次にマトリックス溶液を再用し、カラムは 5C18 -AR-II（Cosmosil, nacalai tesque）を度添加し、真空下で素早く結晶化し、MicroflexAI mass

使用し、0.1% trifluoroacetic acid に acetonitrile のグラジ

spectrometer（Bruker Daltonics）を用い、リニア、ポジ

エントを用いて精製を行った。精製品の確認は MALDI-MS

ティブイオンモードで MALDI-MS 測定を行った。

（MicroflexAI mass spectrometer）を用い、マトリックスは（10mg/ml CHCA in 50 % acetonitrile+0.1 % trifluoroacetic

2. 3. ネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis）皮膚由来ペプチドのアミノ酸配列決定acid）を使用した。

tissue MALDI–TOF MS）を用いて、得られた分子量を指2. 5. 円二色性分散計（Circular Dichroism, CD）
を用いたペプチドの性質解明

標に、ネッタイツメガエルの皮膚から、抽出、ゲル濾過ク

同定されたペプチドの溶液中での二次構造を測定するた

ロマトグラフィー、HPLC による精製、ESI-MS/MS 解析、めに、日本分光円二色性分散計 J- 820 を用いて測定を行っ

デ ー タ ベ ー ス 検 索（http://www.xenbase.org/genomes/

た。合成ペプチドを 10 mM Tris-HCl（pH 7.2）の緩衝液に

blast.do）、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列

50 μM の濃度に希釈し、光路長が 1 mm の角型石英セルを決定を行った。

用いた。測定条件のバンド幅は 1 nm、レスボンスは 4 sec、

前述の Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct

ネッタイツメガエルの皮膚を、
クリオスタット（CM1850 cryostat）

測定範囲は 190 ～ 255 nm、データ取込間隔は 0.5 nm、走を 用 い 10μm に スライスし た 後、50% acetonitrile+0.1%

査速度は 20 nm/min、積算回数は 4 回に固定して測定した。

trifluoroacetic acid 溶液で、4℃、5 時間抽出を行った。そ

測定温度は 10，25，37 度の三つの異なる温度で測定を行の 後 上 清 を、30% acetonitrile +0.1% trifluoroacetic acidった 3）。

溶 液 で 平 衡 化 し た Superdex-30 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ
ィ ー（GE Healthcare, 500×3mm i.d.） で 分 離 し た。500

2. 6. 同定されたペプチドの抗菌及び溶血活性の測定～ 3000Da の 分 子 量 の mid fraction を さ ら に 逆 相 HPLC

Escherchia coli DH5a（グラム陰性）と Staphylococcus（Gilson HPLC system, 東ソー , TSK gel ODS 120T, 5 μm

aureus JCM2151（グラム陽性）を用いて同定されたペプ

particle size, 250×4.6mm i.d.）
で 0.1% trifluoroacetic acid をチドの抗菌活性の測定を行った。まず 5 ml の LB（Luria-

含む acetonitrile のグラジエントを用いて精製を行った。

Bertani ’ s broth）培地で 37℃、15 時間、160 rpm で前培養精製したフラクションは随時、MALDI-MS（MicroflexAIを行った。その後 100 μl の培地溶液を取り、本培養の培地（5mass spectrometer）で分子量の確認を行った。また ESI-ml LB 培地）に植菌した。37℃、2 ～ 3 時間、160 rpm でMS/MS 解析は、HPLC で精製したサンプル、あるいは精培養し、OD610nm が 0.5 付近にまで培養した。その培養液製したサンプルをトリプシン消化した物を使用し、LCQ

を生理食塩水で 100 倍希釈し、その内 50 μl をあらかじめFleet（Thermo Scientific, MA） を 用 い て 行 っ た。LCQ

ペプチドを希釈して 50μl ずつ入れてあった 96 well plate

Fleet には、LC-10 ADVPμ ポンプ（島津製作所）を使用して、に添加して 37℃、24 時間培養した。ペプチドは最終濃度0.05（ml/min） の 流 速 で 50% acetonitrile + 0.1% formic

150 μg/ml の 8 段階の 2 倍希釈、最小濃度 0.6 μg/ml に調acid 溶液でサンプルを負荷した。イオンスプレーの電圧製した。培養後の生菌数はマイクロプレートリーダーを使は 5000V、MS/MS の分析の際の衝突エネルギーは 30V

用し、OD595nm の吸光度で測定した。

で 3 価の前駆イオンの検出のために固定し、ポジティブイ
オンモードで測定を行った。プロテインシークエンサー

ラットの全血に対する同定されたペプチドの溶血活性は、稲垣らの方法に従って行った 4）。

は PPSQ-21（島津製作所）を用い、常法であるエドマン分− 42 −

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2. 7. 同定されたペプチドの界面物性測定

7717.5 m/z）、ヌマガエルでは（2174.0, 4998.3 m/z）
、アマ

固相合成したそれぞれのペプチドを約 15mg 測り取り、ガエルでは（1101.9, 1845.8, 2327.2, 3265.9, 4977.7, 6537.4 m/

超純水 15 ml を添加した後、弱く撹拌することにより溶解

z）等の分子イオンピークが検出された。しかしながらいずさせた。次に、この水溶液を適宜希釈することによって、れの国産カエルもゲノム解析が行われておらず、それぞれ各種濃度のペプチド水溶液を得た。各種ペプチド水溶液ののピークのアミノ酸配列を解析するのは困難が予想された。

表面張力は、協和界面科学株式会社製の DropMaster500

そこで、両生類で唯一ゲノム解析が完了しているネッタを用いて、ペンダントドロップ法を用い、25 度で測定した。

イツメガエル（Xenopus tropicalis）（図 1）5）の皮膚を用いてなお、この方法では、キャピラリーに形成させた液滴のTopological Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue

形状を解析して、表面張力値を得るが、解析には Young-

MALDI–TOF MS）を実施することにした。
図 2 に示すように、ネッタイツメガエルのオタマジ

Laplace 法を用いた。

３．結

果・4．考

ャクシ（tadpole, stage49 - 51）を用いて Topological Mass察

Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–TOF MS）

3. 1. ペプチドの配列決定を行っても、有意な分子イオンピークはほとんど検出され大阪府池田市、箕面市周辺の田畑で捕獲したトノサマガ

なかった。

エル、ヌマガエル及び、広島大学両生類研究施設から供一般的にカエルから得られた抗菌ペプチド等の生理活

与して頂いたアマガエルの皮膚組織を用いて Topological性ペプチドは、成体に由来するものである 6）。カエルのMass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–

皮膚は幼生（オタマジャクシ）と成体では大きく異なって

TOF MS）を実施した。その結果、トノサマガエルではおり、皮膚腺（顆粒腺）は変態が進まないと形成されない。

（1611.2, 2811.4, 3105.9, 3769.4, 4601.1, 5149.8, 5652.5, 6952.5,

そこで成体のネッタイツメガエルの皮膚組織を使用して、Fig. 1

Xenopus tropicalis

Fig. 2 Direct tissue MALDI–TOF MS spectrum of the hormones fromthe skin in Xenopus tropicalis tadpoles− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue

Pxt-7 の 6 つの新規ペプチドを同定した。また Topological

MALDI–TOF MS）（リニアー、ポジティブイオンモード）を

Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–行った。その結果、ネッタイツメガエルでは 1000 ～ 3000

TOF MS）とエドマン分解法を併用し、Pxt-6 の新規ペプ付近の m/z に各種分子イオンピークが検出された（図 3）。

チドを決定した。Pxt-6 についてはデータベース検索でも次に Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct

ヒットしないことから、ゲノム解析でも DNA 配列が解読

tissue MALDI–TOF MS）で得られた分子イオンピークをされていない配列であることが示唆された（Table 1）。ま指標に、ネッタイツメガエルの皮膚から、有機溶媒によるた RT-PCR を用いて、各ペプチドの遺伝子発現を検討し抽出、ゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex-30）、逆たところ、顕著に皮膚に遺伝子発現が認められた。また

相 HPLC による精製、ESI-MS/MS 解析、データベース検

ネッタイツメガエルは、接触刺激等により粘性かつ泡状索を実施した。その結果、Pxt-1, Pxt-2, Pxt-3, Pxt-4, Pxt-5,の分泌液を出すことが知られている。その分泌液を直接Fig. 3 Direct tissue MALDI–TOF MS spectrum of the hormones from theskin in Xenopus tropicalis adults
Table 1

Sequence, monoisotopicmass, and molecular charges of Pxtpeptides from X. tropicalis skin

− 44 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

Fig. 4MALDI–TOF MS spectrum of Xenopus tropicalis secretory fluids

MALDI–TOF MS で解析したところ、Pxt peptides が同の濃度まで微生物の生育阻害は認められなかった。また様に検出出来た（図 4）。つまり Pxt peptides は何れも分泌Pxt-5 については、培地に添加したところ顕著な沈殿が認されていることが確認できた。

められたことから、抗菌活性の測定は出来なかった。ただし、Pxt-5 は純水や Tris 等の緩衝液には溶解した。一3. 2. 同定されたペプチドの固相合成

方 Pxt-2 の大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対する MIC（最同定されたペプチドの固相合成は、Fmoc 固相合成法

小 発 育 阻 止 濃 度 , Minimum Inhibitory Concentration）

を使用した（PSSM8 自動ペプチド合成装置、島津製作所）。

は 50 μg/ml, 9.7μg/ml で あ っ た。 ま た ReversePxt-5 は、

逆 相 HPLC で 精 製 後、MALDI-MS（MicroflexAI mass

150 μg/ml の濃度まで大腸菌に対する生育阻害は認めら

spectrometer）を用いて精製品の確認を行ったところ、ほれなかったが、黄色ブドウ球菌に対する MIC は 150 μg/

ぼ純品であることを確認した。

ml であった。最後に Mastoparan については、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対する MIC はそれぞれ、9.7μg/ml,

3. 3. 同定されたペプチドの 2 次構造解析

19.3 μg/ml であった。またラット血球に関する溶血活性は同定されたペプチド及び、比較のために、Pxt-5 の逆

0.1%（Pxt-1），0.4%（Pxt-2），0.2%（Pxt-3），0.1%（Pxt-4）

配 列 の ReversePxt-5、 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 皮 膚 よ り 単, 10.5%（Pxt-5），0.3%（Pxt-6），0.4%（Pxt-7），0.3%（Pxt-

離された抗菌ペプチドで有名な Magainin 1

7, 8）

及びスズ

11）であった。

メバチ毒素の一種で典型的な両親媒性ペプチドであるMastoparan9）を合成し、均一にまで精製した。これらのペ

3. 5. 同定されたペプチドの界面物性測定

プチドの二次構造解析を詳細に実施するために、円二色性同定されたペプチドの界面物性を測定するために、ペン

分散計 J - 820（日本分光）を用いて測定を行った。その結ダントドロップ法を用い、表面張力の測定を行った。その果 Pxt-2 及び Pxt-5 は両親媒性のアルファーヘリックスを結果、Pxt-2、Pxt-5 及び ReversePxt-5 については、顕著形成することが判明した（data not shown）。

な表面張力の低下が認められ、有力なバイオサーファクタ
ントとして機能することが示唆された（図 5, 6）。

3. 4. 同定されたペプチドの抗菌活性測定

５．総Escherchia coli DH5a（ グ ラ ム 陰 性・ 大 腸 菌 ） と括

Staphylococcus aureus JCM2151（グラム陽性・黄色ブド今回両生類では唯一ゲノム解析されているネッタイツメウ球菌）の微生物を用いて、Pxt-1, Pxt-2, Pxt-3, Pxt-4, Pxt-

ガエル（Xenopus tropicalis）の皮膚を使用して、Topological

5, Pxt-6, Pxt-7, ReversePxt-5, Magainin 1, Mastoparan にMass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–TOF

対する抗菌活性を測定した

10, 11）。その結果、Pxt-1, Pxt-

MS）で解析を行った。その結果 7 種類の新規ペプチド

3, Pxt-4, Pxt-6, Pxt-7, Magainin 1 については、150 μg/ml（Pxt1, 2, 3, 4, 5, 6, 11）を発見し、その物理的特性及び生物− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 5

Surface tension of Pxtpeptides（I）

Fig. 6

Surface tension of Pxtpeptides（II）− 46 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

学的な活性の測定を実施した。特にその界面活性剤として

５）Hellsten U, ほ か 47 名 :The genome of the westernclawed frog Xenopus tropicalis, Science, 328, 633-636,の特性や泡特性からスキンケア素材への可能性が示唆される。今後はどのような組織に発現されているか。またどのような生育時期から機能発現するのか、さらに物理特性を詳細に解析したいと考えている。本成果は文献 12 として印刷中である。

謝2010.
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７）Zasloff M,:Magainins, a class of antimicrobial peptides
from Xenopus skin: isolation, characterization of two
forms and partial cDNA sequence of a precursor, Proc.

辞本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団に深く感謝します。

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８）Zasloff M, Martin B, Chen H,:Antimicrobial activity
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