全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測東北大学大学院薬学研究科

中林

孝和

Recently, Raman microscopy has attracted much attention as a label-free technique for observing living cells. We
have focused on intracellular water, an intracellular molecule that cannot be labeled, as a label-free detection by Raman
microscopy. This study investigated water molecules around biomembrane interfaces using Raman microscopy. The states ofwater molecules around biomembranes are proposed to be important for membrane functions; however, the detailed natureof water around membranes is still unknown because of insufficient measurement techniques. In this study, we constructed a
total internal reflection (TIR) Raman microscope that can selectively observe molecules around membrane interfaces. Only
molecules near the interface can be monitored using evanescent light generated under a TIR condition. The microscope
was constructed with an objective lens-type configuration using an inverted confocal microscope and a high NA objective
lens, which enables the measurement of a living cell incubated in a glass-bottomed dish. The absence of spectral distortion
associated with the TIR condition was confirmed by the fluorescence of the nanoparticle. The constructed microscope wasapplied to the observation of water on a self-assembled monolayer fabricated on a cover glass, and the C-H stretchingbands of the monolayer were observed to be enhanced under the TIR condition. We then measured TIR Raman spectra of acultured HeLa cell and the obtained results were discussed based on the previous report on the TIR spectra of water using a
prism-type configuration.

１．緒

密度変化、水分子の O‒H 伸縮振動ラマンバンドの形状解

言析から細胞内温度の測定ができることも提案した。これら

近年、ラマンイメージングを用いた細胞計測が広く行われている。分子の振動をラマンバンドとして直接観測するの研究を通して、「細胞内の水」が細胞を理解する新たなパラメータとなり得ることを示すことができた。

ラマンイメージングは、細胞内にある分子やタンパク質を本研究は、ラマン顕微鏡を用いた O‒H 伸縮振動バンド

蛍光色素や蛍光タンパク質で染色することなく観測できるの測定を界面水 7）に応用し、細胞膜や皮膚界面にある水分特徴を持つ。細胞内にある脂質やタンパク質、または細胞子の選択的計測および水素結合様式の解明を目的とする。

内に導入した分子の細胞内分布や細胞内での反応・代謝にラマン分光法の皮膚計測の応用は古くから行われており、関する情報をラベルフリーで得ることができる

1 ‒ 3）

水のラマンバンドから皮膚の水分量なども求められてい。

我々は，ラマンイメージングによる細胞内ラベルフリー

る。しかし、深さ分解能は 2 µm 程度が限界であり、界面検出として、ラベル化できない細胞内分子、「細胞内の水水と呼ばれる皮膚表面や細胞膜の近傍の水の選択的測定は4 ‒ 6）。水は最も重要な細行うことができなかった。脂質膜近傍の水分子の O‒H 伸

胞内成分であるが、細胞内での水の理解は未だ十分ではな

縮振動バンドについては、和周波発生法（Sum frequency

く、オルガネラ間での水の密度の差も不明であった。我々

generation, SFG）によって測定されているが 8）、SFG では

は、3400 cm‒ 1 付近にある水分子のブロードな O‒H 伸縮振高強度のパルスレーザーを用いるために、細胞膜などの生動バンドのラマンイメージングから、細胞内の水の密度の体膜に適用することが難しい。生体膜界面の水の振動バン

定量が行えることを提案し、核の方が細胞質よりも水の濃ドを観測する適切な分光法がないのが現状である。

分子」に着目した研究を進めている

度が高く、また O‒H 伸縮振動バンドの形状も核、細胞質、そこで本研究では、生細胞や皮膚組織を対象とした全反細胞周囲の水で異なることも示した。水分子の O‒H 伸縮

射ラマン顕微鏡を製作し、膜界面の水測定を行うことを目

振動バンドの形状は、水分子間の水素結合様式を反映して指す。全反射ラマン顕微鏡は、エバネッセント波と呼ばれおり、我々の結果は、細胞内外で水素結合様式が異なる可る微弱光によって、表面近傍のみのラマン散乱光を測定す

能性を示唆している。また、細胞周期に伴う細胞内の水のることができる。そのために、試料の損傷を最小限に抑え、膜近傍の約 100 nm の範囲の水分子や生体分子の挙動を選択的に議論できる 9 , 10）。全反射ラマン顕微鏡は、染色を行

Selective Observation of Water near
Biological Membranes using AttenuatedTotal Reflection Raman Microscopy
Takakazu Nakabayashi
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Tohoku University

わずに分子情報を得ることができ、主成分分析などの統計解析手法と組み合わせることで生体膜界面の分子構造を知る有用な手法になることができる。本研究を通して、全反射ラマン顕微鏡が皮膚や細胞膜近傍の構造を観測する適切な手法であり、コスメトロジーを発展させる汎用な手法と− 62 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測

共焦点光学系を用いて励起光源を回折限界まで絞ったときなり得ることを提案したい。

２．方の照射領域は軸長 1 ‒ 2 µm 程度の円筒となるため、全反射法

照明では回折限界を超えた深さで分子を励起できる。

2 . 1. 全反射

全反射照明とするには、基板と試料の間に相応の屈折率

全反射とは、屈折率が高い媒質から低い媒質へと光を入の差が必要である。顕微鏡においては、屈折率の高いプリ射する際に、入射角が臨界角を超えると光が屈折すること

ズムを利用して光学系を組むプリズム型と、開口数の大きなくすべて反射される現象を指す。この全反射過程においな対物レンズの辺縁部から励起光を導入し、基板と試料のて、界面からはエバネッセント波と呼ばれる光が染み出し、境界面で全反射を起こす対物レンズ型がある。プリズム型

界面近傍の物質と相互作用する。界面からの深さ z におけ

全反射顕微鏡は屈折率の高いプリズムを用い、比較的安価

るエバネッセント波の強度 I（z）
は以下の式で与えられる。

に構築できる。しかし、細胞の測定においては細胞をプリズム上で培養する必要があり、汎用性は低い。そこで本研
究では対物レンズ型を用いた。対物レンズ型は、開口数のd はエバネッセント波の強度が入射光（I 0）に対して 1 /e

高い対物レンズが必要であるが、試料操作が容易でありガとなる深さであり、しみ出し深さといわれる。d の値は入ラスベースディッシュ上で培養した生細胞の測定を行うこ

射光の波長を λ、屈折率が高い媒質の屈折率を n 1，屈折率とができる。対物レンズ型の試料部分を図 2 A に示す。

が低い媒質の屈折率を n 2，入射角を θ として，次式で求め

2 . 2 . 全反射ラマン顕微鏡られる。

製作した装置の概略図を図 2 B に示す。測定配置は通常の倒立顕微鏡と同一であり、ディッシュ上の皮膚組織、培養細胞など、様々な生体試料のラマンイメージングを行う
図 1 に全反射としみ出し深さの模式図を示す。このエバ

ことができる。励起光には現有の 532 nm の cw Nd:YAG

ネッセント波を励起光としてラマンスペクトルを得る手法

レーザーを用い、倒立顕微鏡（OLYMPUS）上で試料が励を全反射ラマン分光法と呼ぶ。励起光を可視光の領域とす起される構成とする。試料からのラマン散乱光は、ポリク

ると，エバネッセント波の染み出し深さは約 100 nm とな

ロメーター（ACTON）によってエネルギー分散され、電子り、100 nm の深さの範囲のみのラマン散乱光が得られる。

冷却 CCD（ANDOR）によって検出される。顕微鏡に XY 自動ステージ（Physik Instrumente）を組み込み、サンプル側
を二次元走査することでイメージング測定も行えるようにした。ガラスベースディッシュ上に水溶液や高分子を入れ、またはディッシュ上に細胞を培養させ、倒立型の配置でラマン測定を行った。対物レンズには、100 倍 , NA 1 . 49 の
油浸対物レンズ（UAPON 100 XOTIRF，OLYMPUS）を用い、入射光に角度をつけて全反射条件での測定を行った。
図 2 B において、Mirror 1 の角度をマイクロメーターによって微調整できるようにし、試料に照射される励起光の角度を変化させられるようにした。この角度を変化させ、

図 1 全反射の模式図

AB

図 2 全反射ラマン顕微鏡の A 試料部分、B 光学系の概略図− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

対物レンズに励起光が垂直に入射すると広視野顕微鏡になり、大きく角度をつけることで全反射条件になる。また広視野顕微鏡の条件で Mirror 2 直後のレンズを外すと共焦点顕微鏡となる。全反射ラマン顕微鏡では、励起レーザー
光の対物レンズ内の光路を精密に制御しなければならず、また広視野や共焦点での測定も行える必要がある。製作したシステムはそれらの要請をすべて満たし、全反射と広視野のスペクトルの比較などを容易に行える。

３．結果

図 3 マイクロメーターの目盛りと入射角度との関係（赤）と回帰直線（青）3 . 1. 励起光の入射角の決定
蛍光色素である Rhodamine 6 G 水溶液をガラスベースデ
ィッシュに加え、Mirror 1 のマイクロメーターの移動メ
モリと励起光の入射角との関係を蛍光から検討した（図 3）。
マイクロメーターのメモリと入射角はほぼ直線関係となる
ことがわかる。細胞の屈折率を 1 . 38 とすると、ガラスと細胞の間の臨界角は 65 . 2 º となる。そのため、細胞を観察するとき、マイクロメーターを 105 以上動かすと全反射条件になる。

3 . 2 . 入射角の変化によるスペクトル歪みの確認
全反射ラマンスペクトルの測定において、比較対象とする広視野や共焦点の測定とは励起光の入射角が大きく異なるため、光軸の違いがスペクトル形の変化として現

図 4 共焦点系と広視野照明、広視野照明からミラーをマイクロメーターのメモリで 85、95、105、115 動かしたときの Qdot
655 の蛍光スペクトル。横軸は上が波長、下がラマンスペクト
ルとした時の波数表示としている。

れる可能性がある。本研究では水の O-H 伸縮振動バンドを検討することから、O-H 伸縮振動バンドと同一の波長域に蛍光を示す蛍光性ナノ粒子（Qdot 655）を用いて、光の照射方法の違いによるスペクトル形の変化を検討した。
Qdot 655 は 655 nm 付近に蛍光の極大波長を持ち、蛍光ス
ペクトルの波長範囲（620 ‒ 680 nm）は 532 nm の光を励起光とした場合の O‒H 伸縮振動バンドの範囲に相当する。
Qdot 655 を Milli-Q に溶解させ、ディッシュ上に導入し、蛍光スペクトルの入射角依存性を測定した。ガラス界面にある粒子からの蛍光がバルク水溶液中の蛍光と異なる可能性を考慮し、共焦点系と広視野照明、複数条件の全反射照
明に加え、全反射直前の条件での測定も行った。図 4 に共図 5 PMMA- 水系のラマンスペクトル
赤：広視野、青：全反射条件

焦点系と広視野照明、広視野照明でミラーを動かしたときの Qdot 655 の蛍光スペクトルを示す。共焦点、広視野照明、
広視野照明でミラーを動かした場合のいずれの蛍光スペク
トルもその形状が一致した。光学系を変えてもスペクトルなどを行った。PMMA（Polymethyl methacrylate）の高分形状が変化しないことがわかった。全反射と共焦点におい子薄膜をカバーガラス上に作成・その上に水滴を載せ、広てスペクトル形状が異なった場合、入射角の違いによるス

視野条件と全反射条件でのラマンスペクトルの比較を行っ

ペクトル形の変化ではなく、全反射による界面付近の選択た（図 5）。3400 cm‒ 1 を中心とするブロードな水の O‒H 伸

測定による効果であると言える。

縮振動と PMMA 膜に由来する 2900 cm‒ 1 の C‒H 伸縮振動
バンドが観測されている。これらの 2 つのバンドの強度比

3 . 3 . 高分子膜の測定が角度によって異なり、全反射条件では水のラマンバン

実験では初めに高分子薄膜を用いて全反射条件の最適化

ドが大きく減少し、薄膜の C‒H 伸縮振動バンドが選択的− 64 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測に観測された。O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒H 伸縮振のラマンスペクトルの励起光角度依存性を図 6 に示す。プ動バンドの強度は、全反射条件では広視野条件の約 1 / 40

リズム型を用いた自己組織化単分子膜上の水の全反射ラマとなり、全反射条件では PMMA 膜を選択的に観測できる

ンスペクトルは報告されており、本システムで得られた結ことがわかった。PMMA 膜と水との界面で全反射が生じ、果との比較を行った。励起光の角度が増加するにつれて、屈折率の値から界面から約 80 nm までを観測していると考O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒­H 伸縮振動バンドの強度えられる。

が増加し、バルクに存在する水由来の情報が減少し、界面由来の情報が相対的に増加している。Mirror 1 のマイ

3 . 4 . 自己組織化単分子膜の測定

クロメーターが 80 のときのラマンスペクトルを基準とし、次に水の全反射ラマンスペクトルの評価として、自己組

差スペクトルとして全反射ラマンスペクトルを評価する

織化単分子膜をカバーガラス上に作成し、角度依存性の測と、O‒H 伸縮振動バンドの一部にあたる 3500 cm‒ 1 付近が定を行った。自己組織化単分子膜は、カバーガラス上にオ僅かに減少した形で差スペクトルが得られた。プリズム型

クタデシルトリメトキシシランを用いて単分子膜を作成しで報告されている結果 10）では、統計解析の手法の一つでた。

ある主成分分析を行うことで第 2 主成分に C‒H 伸縮振動

観測しているラマンスペクトルには，油浸対物レンズにバンドの変化と同じ方向に 3600 cm‒ 1 付近に比較的鋭いピ

用いるオイル（immersion oil）や基板となるガラスからのークが現れていた。今回の結果では、C‒H 伸縮振動バン

微弱発光成分を含み、これらの寄与が入射角度によってドと逆の方向に 3500 cm‒ 1 付近の変化が現れており、報告

異なり、スペクトルの角度依存性の解析を妨害する。特されたスペクトルとは同一の変化ではなかった。この理由に immersion oil と単分子膜の C‒H 伸縮振動バンドが重なは、考察項で検討する。

っている。そこでこれらの寄与を適切に取り除くために、内部標準としてベンゾニトリルを immersion oil に加えた。

3 . 5 . HeLa 細胞の測定

ベンゾニトリルのニトリル基の伸縮振動バンドは、細胞の‒1

人のがん細胞由来の細胞株である HeLa 細胞を用いて細ラマンスペクトルではバンドが現れない約 2300 cm にピ

胞 ‒ 水界面の全反射ラマンスペクトルを測定した。ガラスークを示す。そのために容易にニトリル基の伸縮振動バン

ベースディッシュ上に HeLa 細胞を培養し、蛍光を示さなドを検出することができ、ニトリル基のバンドが消えるよ

い HBSS に培地を置換して全反射ラマンスペクトルを測定

うにベンゾニトリルを含んだ immersion oil のラマンスペ

した。得られた代表的なラマンスペクトルを図 7 に示す。

クトルをバックグラウンドとして引くことで単分子膜のラO‒H 伸縮振動バンドにあたる 3050 ‒ 3800 cm‒ 1 の積分強度

マンスペクトルを得た。

で規格化し、全反射照明と共焦点系の差をとると C‒H 伸

自己組織化単分子膜／水（ハンクス平衡塩溶液（HBSS））

縮振動バンドに負のピークが現れた。しかしこの傾向の再図 6 自己組織化単分子膜のラマンスペクトルの入射角依存性− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 7 HeLa 細胞のラマンスペクトル（赤）共焦点、（青）全反射、（緑）
差スペクトル

現性は低く、測定した全ての細胞で現れてはいない。一方、成分で観測していると考察している。C‒H 伸縮バンドとO‒H 伸縮振動バンド領域の差スペクトルの形状に着目す同じ変化方向に現れた 3600 cm‒ 1 付近の鋭いピークにシラ

ると、高波数側で強度低下、低波数側で強度上昇が観測さノール基の寄与があるとし、自己組織化単分子膜に生じたれ、自己組織化単分子膜と似た差スペクトルが得られた。

ナノサイズの間隙に入った水分子の寄与も大きいとしている。今回のような差スペクトルの場合、数十ナノメートル

４．考の範囲の水分子を観測しており、異なる状態の水分子を観察測しているために、Ota の結果を再現できなかったと考え

自己組織化単分子膜の界面測定において、励起光の角度増加に伴い O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒H 伸縮振動バられる。また、自己組織化単分子膜の状態も Ota とは一致していない可能性もある。

ンド強度の上昇が明瞭に観測された。C‒H 伸縮振動バン

プリズム型は変化させる角度範囲が広く、様々な角度でド強度の上昇は、Mirror 1 のマイクロメーターを 100 かの測定が容易に行えるのに対し、対物レンズ型は角度の変ら 105 に動かしたときに大きく増加している。これは 100

化範囲が狭く、主成分分析が行えるほどの角度依存性を測から 105 の間に入射角が臨界角を超えたために、エバネッ

定することが難しい。しかし、界面のみの情報を得るため

セント波で励起されたラマン散乱光だけが観測されたためには主成分分析をはじめとする統計解析手法が必要であるであると考えている。O‒H 伸縮振動バンド領域では、マと考えられ、今後の検討課題である。

イクロメーターを 80 まで動かしたときのスペクトルを基構築した全反射ラマン顕微鏡で HeLa 細胞を測定した結準とし、それぞれのスペクトルとの差をとると 3500 cm‒ 1

果、共焦点系で測定した場合に比べて低波数側の強度上昇

付近に負のピークが見られた。得られた結果は、上述のよが観測された。水の O‒H 伸縮振動バンドは他の振動バン

うに Ota によって報告されたプリズム型の全反射ラマンス

ドに比べて非常にブロードであり、水の多様な水素結合様ペクトルと形状が異なっていた 10）。Ota は主成分分析を用式を反映している。今後、細胞培養を行うディッシュの基

いて全反射ラマンスペクトルを解析し、主成分の第２成分

板依存性などの詳細を検討し、得られたスペクトルが何に‒1

では、C‒H 伸縮バンドと同じ変化方向に 3600 cm 付近の基づいているのかを明らかにする。

鋭いピークが現れている。今回得られた図 7 では、C‒H 伸

５. 総縮バンドと O‒H 伸縮振動バンドの変化の正負は逆であっ括た。再現しない理由として主成分分析と差スペクトルによ全反射ラマン顕微鏡の製作に成功し、装置の特性評価、る解析の違いを上げることができる。Ota は主成分分析で自己組織化単分子膜、HeLa 細胞の全反射ラマンスペクト

得られた結果について、どの程度の厚さの分子を観測してルの測定を行った。界面近傍の分子観測には成功しているいるのか見積もっており、オクタデシルトリメトキシシラ

が、十分には膜界面の水の状態を観測しきれていないと考ンの鎖長に対応する数ナノメートルの範囲の分子種を第 2えている。考察項で記したように、統計解析の手法を組み− 66 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測

合わせ、生体膜界面の水を捉える研究を続けていきたい。

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