分子量および官能基を制御した新規キトサン系界 活性剤の機能化に関する研究─市販ペクチナーゼとその化学修飾酵素によるN-アセチル化キトサンの加水分解に及ぼすN-アセチル化度の影響─
東京工業大学大学院

梶内理工学研究科

俊夫

Three types of N-acetylated chitosans (NACs) with different degree of acetylation (DA) were prepared and used as a
substrate for enzymatic hydrolysis with a commercially available pectinase and a modified one. Pectinase modification
was conducted using polyalkyleneoxide-maleic anhydride copolymer (PEO-MA copolymer). The effects of DA on
enzymatic reaction with native and modified pectinases were investigated experimentally. Initial hydrolysis rate andMichaelis-Menten kinetic parameters were measured by analysis of reducing sugars. DA of NAC strongly affected thehydrolytic characteristics of native and modified pectinases. N-acetylation of chitosan increased the initial hydrolysis rate
and the enzyme-substrate affinity with respect to both pectinases: NACs with DA over 0.3 showed high initial hydrolysis
rate and strong affinity between enzyme and substrate. Especially when NAC with DA over 0.3 was treated withmodified pectinase, the affinity became much stronger than the native pectinase.

１．緒

至っていない．

言

近年，数種類の加水分解酵素，例えばリゾチーム，セルキトサンは甲殻類，昆虫，カビなどの外骨格に存在するラーゼ，パパイン，リパーゼ，ペクチナーゼなどがキトサ

天然多糖類キチンの脱アセチル化物である．キチン類は固ン高分子中のグリコシド結合を加水分解することが明らか

体廃棄物として水産加工場などから得ることが出来る．になってきた２−４）．これらの酵素は現在工業的に広く利用

キトサンは D －グルコサミン（GlcN）と N －アセチル－ Dされており，安価に利用することができる．さらに，我々－グルコサミン（GlcNAc）のβ－ 1,4 －結合によって出来るはポリエチレンノキシド - 無水マレイン酸共重合体（PEO

直鎖状のヘテロ多糖類である．市販のキトサンは主にキチ－ MA）で化学修飾したペクチナーゼが高い熱安定性を有ンの不均一系 N －脱アセチル化によって得られ，GlcNAc

し，酵素とキトサンとの間の親和性が高いことを報告した５）．

含量は 0 から 0.3 程度であり，GlcNAc 残基はブロック状

本研究では，異なる N －アセチル化度（DA）を持つ３に分布している．このようなキトサンは酸性水溶液にのみ種類の N －アセチル化キトサン（NAC）を用いて酵素的加１）可溶であり，中性あるいは塩基性水溶液には溶解しない ．

水分解を行い，NAC の酵素的加水分解に及ぼす DA の影

近年キトサン類は興味深い生理活性を多く持つことから

響を未修飾酵素および修飾酵素を用いた場合について明ら注目を集めている．生理活性と重合度の関係からみると，かにした．

低分子化キトサンはキトサン高分子に匹敵する生理活性を２．実持つことが明らかになっている．さらに，キトサンの低分子化によってその水溶性は向上し，溶液粘度は低下する．

２. １

このため，キトサンの低分子化によってキトサン類を広範な分野で応用可能にすることが期待されている．

験

実験材料

キトサン 10B（フナコシ（株））を NAC を調製するために使用した．市販のペクチナーゼ（MERCK）を NAC の酵素的加水分解はキトサンの低分子化を行う方法として酵素的加水分解に使用した．ペクチナーゼの修飾剤として，期待されている．酵素的加水分解は化学的加水分解よりも日本油脂（株）から提供していただいた PEO-MA を用いた．

通常穏和な条件で行われる．しかしながら，キトサンの酵
素的加水分解は，キトサナーゼやキチナーゼなどの特異的２. ２

酵素が高価であることから，工業的規模では利用されるにNAC の調製

異なる DA を持つ NAC は Kubota 等の報告したキトサンの均一系 N －アセチル化法にしたがって行った６）．最終

Development of Novel Chitosan-based Surfactant
with Controlled molecular weight and functionalgroups: Effect of N-Acetylation Degree on
N-Acetylated Chitosan Hydrolysis with
Commercially Available and Modified Pectinase
Toshio KajiuchiGraduate School of Science and Engineering,Tokyo Institute of Technology

的に得られた NAC の DA は Hirai 等の報告した 1H － NMR法によって決定した７）．

２. ３

ペクチナーゼの化学修飾

ペクチナーゼの化学修飾は，我々が以前報告した方法にし た が っ て 行 っ た ５）． 使 用 し た PEO － MA の 分 子 量 は15,000 であり，その構造を Fig. １に示した．本研究で使− 47 −

用した PEO － MA 修飾ペクチナーゼの修飾率は 88％であしているものと考えられる．NAC の DA の調整は添加すった．

る無水酢酸の量を変化させることによって行った．得られた NAC の DA を Table １に示す．すべての NAC は酵素

２. ４

キトサンの酵素的加水分解反応に使用する酢酸緩衝液に溶解した．

2.5g/L 酵素溶液
（0.50mL）
を 1w％キトサン溶液（0.50 mL）に加えることにより酵素反応を開始した．ただちに反応液

３. ２

異なる DA を持つ NAC の初期加水分解速度を 40℃の恒温槽に移し，120rpm による振とうを行った．

ヘテロ多糖類としてのキトサンに作用する酵素は２種類

初期基質濃度および初期酵素濃度はそれぞれ 0.5w％およに分類することができる．一つは GlcN 還元末端での加水び 1.25g/L とした．反応液の pH は 5.9 とした．反応開始

分解を触媒するキトサナーゼ型の酵素であり，もう一つはから２時間後に 0.5mol/L Na2CO3 水溶液（1mL）を反応

GlcNAc 還元末端での加水分解を触媒するキチナーゼ型の液に添加し反応を停止させた後，生成還元糖を定量した．

酵素である．このように DA はキトサンに対する酵素の生成還元糖の定量は D －グルコサミンを標準物質として作用において重要な役割を果たす．キトサナーゼの場合はSchales 変法によって行った８）．

DA の増加とともに初期活性は増大する 10）．キチナーゼの酵素反応速度論量を求めるためには，初期 NAC 濃度（S0）場合は DA の増加とともに初期活性は減少する 11，12）．

を 0.5 g/dm3 から 5.0g/dm3 の間で変化させて，初期加水本実験では酵素反応を 40℃，pH5.9 の条件下でキトサン分解速度（v0）の測定を行った．ミカエリス定数（K m）の均一溶液を用いて行った．Fig. ２に NAC の DA と初期と最大速度（Vm）の値は S0/v0 対 S0 プロットの勾配（Vm-1）

加水分解速度の関係を示す．未修飾酵素を用いた場合には，と切片（Km/Vm）より求めた．

キトサン 10B（DA ＝ 0.022）の初期加水分解速度はほとんど 0 であったが，DA ＝ 0.3 までの範囲では DA の増大

３．結果と考察
３. １とともに初期加水分解速度は増大した．DA ＝ 0.3 以上で調製した NAC の DAは初期加水分解速度は変化しなかった．この結果は未修飾

NAC の DA と N －アセチル基の分布はキトサンの溶液

酵素が NAC 分子中の GlcNAc 残基を認識していることを６，９）．これによって NAC の酵示している．また，キトサンの N －アセチル化によってペ素的加水分解も影響を受けることが予想される．本実験でクチナーゼによる初期加水分解速度を増大させることがではキトサンの N －アセチル化を均一系で行った．したがっきることがわかった．

物性に著しい影響を及ぼす修飾酵素の場合には，DA の値にかかわらず未修飾酵素て，N －アセチル基はキトサン分子鎖中でランダムに分布より初期加水分解速度は若干低くなった．これは PEO －MA 共重合体による酵素の化学修飾によって，部分的に酵素活性が失われたためと考えられる．一方，修飾酵素の場合も，DA の増大とともに初期加水分解速度は増大しており，修飾酵素も NAC の GlcNAc 残基を認識していることがわかった．
Fig.1 Structure of polyethyleneoxide-maleic anhydride copolymer.

Table 1 Characteristics of N-acetylated chitosans prepared
under homogeneous condition.
Rm* [-]

DA** [-]

Solubility***

02.06
6.17
25.7

0.022
0.153
0.328
0.540

solublesolublesolublesoluble*) Rm, Molar ratio of acetic anhydride to D-glucosamine unit inChitosan 10 B.
**) DA, Degree of N-acetylation, was determined by 1H-NMR
method.
***) Solubility, Solubility in acetate buﬀer (pH 5.9)

Fig.2 Effect of DA on v0. Open and closed circles show thev0 value of native and modified pectinases, respectively.

− 48 −

分子量および官能基を制御した新規キトサン系界 活性剤の機能化に関する研究と基質の親和性が変化することが予想される．Fig. ４に示

３. ３ 速度論量に及ぼすDAおよび酵素の化学修飾の影響したように，DA ＝ 0.15 の NAC に対しては酵素を化学修

基質の DA によって酵素と基質との間の親和性が変化飾した場合も K m 値は変化しなかった．一方，DA ＝ 0.3 以することが予想される．そこで初期基質濃度（S0）を 0.5

上の NAC に対しては酵素を化学修飾した場合には Km 値はg/dm から 5.0 g/dm の範囲で変化させて，初期加水分解著しく低下し，酵素と基質との親和性が高まることがわか

速度（v0）を測定し，速度論量 K m と V m を S0 ／ v0 対 S0った．このような修飾酵素と基質の親和性が増大する理由

プロットより求めた（Fig. ３）．

として，疎水的相互作用，静電的相互作用，水素結合など

33

K m と基質の DA の関係を Fig. ４に示す．K m 値は酵素により酵素表面の微小環境が変化したことが考えられる 13）．と NAC との間の親和性を表す指標と考えることが出来る．

V m と DA の関係を Fig. ５に示す．未修飾酵素，修飾酵未修飾酵素を用いた場合，NAC の DA が高いほど K m 値

素どちらの場合も，DA が 0 から 0.3 の範囲では DA の増は小さくなり，酵素と NAC との間の親和性が増大した．こ加とともに Vm 値は増大し，DA が 0.3 以上では Vm 値は変の結果から，未修飾酵素による NAC の加水分解は GlcNAc化しなかった．

残基を認識することによって起こることがわかった．

４．総PEO － MA によるペクチナーゼの化学修飾によって酵素括

未修飾ペクチナーゼおよび修飾ペクチナーゼを用いて異なる DA を持つ NAC の加水分解を行った．実験結果から，どちらの酵素の場合も NAC の DA によって加水分解特性が影響を受けることが明らかになった．さらに，修飾酵素を用いた場合には未修飾酵素とは異なる加水分解特性を示した．
未修飾酵素を使用した場合，DA が 0.3 までの範囲ではDA の増加とともに初期加水分解速度は増大し，DA が 0.3以上の範囲では初期加水分解速度は変化しなかった．一方，修飾酵素を使用した場合，DA が 0.5 までの範囲で DA の増加とともに初期加水分解速度は増大した．また，修飾酵素の初期加水分解速度は未修飾酵素より若干低い値であった．
未修飾酵素および修飾酵素による NAC 加水分解におけFig. 3 Examples of S0/v0 versus S0 plots for the determination of kinetic parameters. Open circle, triangle and squaremean the data of NACs with DA of 0.153, 0.328 and 0.540,
respectively, used as substrate. Enzyme, native pectinase.

Fig. 4 Relationship between Km and DA. Open and closed
circle show the Km value of native and modified pectinases, respectively.

る K m 値はどちらの場合も DA の増加とともに減少した．
すなわち，DA の増加とともに NAC と酵素の親和性が増大することがわかった．DA が 0.3 以上の範囲では修飾酵
素は未修飾酵素より低い K m 値を示した．これによって，Fig. 5 Relationship between Vm and DA. Open and closed
circle show the Vm value of native and modified pectinases, respectively.

− 49 −

ペクチナーゼの PEO － MA による化学修飾が酵素と NAC

６）N. Kubota, Y. Eguchi, Polym. J. 29 (1997) 123-127の親和性を向上させる働きがあることが明らかになった．

７）A. Hirai, H. Odani, A. Nakajima, Polym. Bull. 26,(1991) 87-94

な お， 本 研 究 の 成 果 は Biochemical Engineering
Journal, 7, 85-88（2001）に報告した．

８）T. Imoto, K. Yagishita, Agr. Biol. Chem. 35 (1971)（引用文献）

９）M.W. Anthonsen, K. M. Varum, O. Smidsrod,

1154-1156
Carbohydr. Polym. 22 (1993) 193-201

１）K.M. Varum, M.H. Ottoy, O. Smidsrod, Carbohydr.

10）N. Hutadilok, T. Mochimasu, H. Hisamori, K. Hayashi,

Polym. 25 (1994) 65-70

H. Tachibana, T. Ishii, S. Hirano, Carbohydr. Res. 268

２）D. Pantaleone, M. Yalpani, M. Scollar, Carbohydr.

(1995) 143-149

Res. 237 (1992) 325-332
３）R.A.A. Muzzarelli, W. Xia, M. Tomasetti, P. Ilari,11）S. Hirano, H. Tsuchida, N. Nagao, Biomaterials 10(1989) 574-576

Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) 541-545
４）M. Yalpani, D. Pantaleone, Carbohydr. Res. 256 (1994)

12）S. Aiba, Int. J. Biol. Macromol. 15 (1993) 1-5
13）H.F. Gaertner, A.J. Puigserver, Enzyme Microb.

159-175
５）Y. Shin-ya, T. Kajiuchi, H. Hinode, J.W. Park, J.
Chem. Eng. Japan 31 (1998) 930-935− 50 −

Technol. 14 (1992) 150-155