【研究報告】（自然科学部門）

新しい食品添加料の開発を目指したランチビオティックの探索

小谷真

静岡大学大学院農学研究科
緒言也

助教

acetone を加えて前述と同様に操作を行い、再度抽出を本研究の目的は、食品保存料としての利用を目指し行った。得られた上清を減圧濃縮にて濃縮を行い、得らた放線菌の新しいタイプのランチビオティックの探索でれた抽出物をH2Oに溶解した。この後、疎水性樹脂 CHP-ある。現在利用されている食品保存料の中には、熱や酸20Pを 用 い て 逆 相 オ ー プ ン カラ ム に 供 し10％ MeOH、に不安定で、食品に影響を与えるものがあるなど実際の60％ MeOH、100％ MeOH で溶媒分画を行った。HPLC利用において制約がある。従来の食品保存料の代替としおよび ESI-MS 分析の結果、100％ MeOH 画分に新規ラて注目されているのが、乳酸菌などのグラム陽性菌の生ンチビオティックを得た。

産するペプチド性抗菌物質ランチビオティック

る。ランチビオティックの中でも Nisin

であ1, 2）は世界 50 ヵ

国以上で実際に食品添加料として用いられている。一方で長期的な Nisin の使用によって耐性菌が出現することが予期されており、対策が望まれている。このような背景から新しい化学構造を有したランチビオティックの開発は食品衛生学において重要な課題である。これまで、主に乳酸菌から数々のランチビオティックが発見されたが、放線菌からは数種のランチビオティックしか発見されていない。筆者は、これまで放線菌から 2 つの新しいランチビオティックを単離し、その構造が多様性に富むことを発見した。そこで本研究において、新しい食品保存料の開発を目指し、各種微生物を用いたスクリーニングを行い、ランチビオティックの探索を行った。さらに得られたランチビオティックに関し食品防腐効果試験などの応用に向けた抗菌活性試験を行った。
実験方法
1.

ランチビオティックのスクリーニングおよび培養と単離研究室において保持している微生物に関して、抗菌活性および、HPLC、ESI-MS を用いた分析から
NBRC 101234 株が新規ランチビオティックを生産していることを見出した。そこで、の培養を JCM302 寒天培地で行い、菌体を回収した。菌体量に対して 2 倍量の acetone を加え 30 min 室温にて静置した後、遠心分離（4000 rpm, 5 min）を行い上清である粗抽出液を得た。その後、菌体量に対して等量の図11100％ MeOH 画分の HPLC クロマトグラム

小谷真

抗菌活性試験

2.

也

600 を用いて測定した。

抗菌活性試験は、ペーパーディスク法を用いて行っ結た。 ペ ー パ ー デ ィ ス ク は、 直 径 6 mm の 薄 手 タ イ プ

果HPLC 分析によって得たピークを分取後、抗菌活性試（Merck）を用いて、ペーパーディスク周辺に現れる阻験および、ESI-MS 分析を行った。その結果、図 1 の保止円の直径を測定することにより評価した。

持時間 15 分のピークに抗菌活性が見られ、また ESI-MS用いた試験菌を以下に示した。

において

細菌

1179.6 に二価のモノアイソトピックイオンピークが見られた。それにより、分子量は約 2357 Da（NBRC 1002203）であることが示唆された（図 2）。

（NBRC 12689）

NBRC 101234 に関してはすでにゲノムの DNA 配列の解（NBRC 1002204）

析が終了しており3）、その配列情報を参照することがで（NBRC 13719）（NBRC 100910）きる。そこで、検索を行ったところ、lantibiotic である
streptin4）に類縁の遺伝子である WP̲006639978.1 がヒッ（NBRC 3333）（NBRC 3117）

トした。図 3 のように 6 残基存在するセリンもしくはス

酵母

レオニンがランチビオティック脱水酵素により脱水され（NBRC 2376）ると仮定すると、分子量が一致する。そこで、化学構造（NBRC 0340）

を同定するために、NMR を用いた構造解析を行った。
重 DMSO 中において 1H-NMR（図 4）、13C-NMR（図 5）、（NBRC 0154）
カビ

COSY、NOESY、HSQC、HMBC スペクトラムを含む（NBRC 33023）

各種二次元 NMR の測定を行った。その結果、Dhb が 3（NBRC 4290）モル含まれていることが明らかとなった。さらに現在詳（NBRC 9405）

細な化学構造の解析を行っている。また、単離したランチビオティックに関して、ペーパーディスク法を用いた

3.

NMR および ESI-MS スペクトラム

抗菌活性試験を行った。試験菌は、

ESI-MS は日本電子・Accu-TOF T100LC を用いて測、定を行った。また NMR スペクトルは、日本電子 ECA-

図2を用いた結果、食品腐敗性細菌の生産するランチビオティックの ESI-MS スペクトラム
2、等の細菌にの新しい食品添加料の開発を目指したランチビオティックの探索

み顕著な抗菌活性が見られた。
考察
今回の研究で、NBRC 101234 の生産するランチビオティックの部分構造を明らかにすることができた。ランチビオティックの構造的な特徴とし
図3てランチオニン環構造を有することが挙げられる。構造において生産が予測されるランチビオティックの分子量推定

ペプチドの 6 つのセリンもしくはスレオニンが脱水され

図4のランチビオティックの 1H-NMR スペクトラム

図5のランチビオティックの 13C-NMR スペクトラム
3小谷真也ていることは推定できたが、そのうち 3 つがシステイン

今回の研究で得られたと結合しチオエーテルを形成していることが推定され101234 由来ランチビオティックもNBRCた。重 DMSO 中において非常にブロードなシグナルを抗菌活性を有することから応用の可能性も十分考えられ与えたために、NMR による構造解析が困難であった。

る。に今後、NMR 測定の重溶媒の変更を行い、良いシグナル要を与える条件を探したい。また、X 線結晶解析を試み、構造を明らかにしたい。

約
ランチビオティック生産のスクリーニングを行い、属細菌の多くはグラム陽性を示す真正細NBRC 101234 がランチビオティッ菌であり形状は球状で単体あるいは集塊を成し芽胞を作クを生産することを見出した。また、ゲノムマイニングらないことが知られている。この属の細菌は比較的高いと ESI-MS の 情 報 か ら 構 造 ペ プ チ ド 部 が塩濃度での生育が確認されており、乾燥に耐え中には耐VGSRYLCTPGSCWKWVCFTTTA で あ り、 下 線 部 の塩性、耐乾燥性、耐熱性、耐低温性を示す菌種も存在す

セリンまたはスレオニンが脱水され、そのうち 3 つがシる。浮遊菌として一般的な種類の菌であり栄養要求が比ステインと結合し、ランチオニンを形成していることが較的簡単であり好気的環境化において著しい増殖を示

示 唆 さ れ た。 ま た、 活 性 試 験 で は、 食 品 腐 敗 性 細 菌す。食品および食品製造工場にて分布することの多い菌に顕著な抗菌活性が見られたことかであり属が原因による変敗の原因菌となるら有望な化合物であると考えられる。今後、全化学構造場合もあるが、他の微生物や酵素と共存して変敗の原因の決定を行う予定である。

菌となる場合が多いと報告がなされている。つまり
謝属細菌に対する抗菌活性を有することは食辞本研究の遂行に当たり、助成金を賜りました公益財品の変敗を防ぐまたは遅延させる食品添加物となる可能

団法人三島海雲記念財団に厚く御礼申し上げます。

性がある。多くのランチビオティックに特徴的な耐熱性、低 pH 域での安定性、プロテアーゼによる分解への文耐性また低濃度での効果を示すことから耐性菌の発生を低下させる可能性もあり従来の抗菌物質に比べての優位

献1） K. Fukase, et al.:2） G. W. Buchman, et al.:1988.
3） D. B. Adimponga, et al.:e00097-13, 2013.
4） P. A. Wescombe, J. R. Tagg:
69, 2737–2747, 2003.

性に期待がなされている。しかしながら抗菌活性を示す標的菌への幅が狭く単体では多くの食品変敗の原因菌に対応できない。このことから様々な標的菌に活性を持つランチビオティックをはじめバクテリオシンを複数用いて幅広い菌種に対応しようという構想がなされている。

4., 29, 795–798, 1988.
, 263, 16260–16266,, 1,,