小分子化学物質によるアトピー性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究
岐阜薬科大学

永井薬理学

博

弌

The purpose of the present study is to investigate whether or not simple chemicals are able to introduce
atopic dermatitis like symptoms in mice. An another purpose of the present study is to investigate thepharmacological and immunological prevention of such symptoms. For the first purpose, we tried to make a goodmodel for atopic dermatitis in mice by using dinitrophenylbenzene (DNFB) on the ear skin. Consequently, we haveestablished two different kinds of models for atopic dermatitis in mice.
In the first model, mice were passively sensitized by an intravenous injection of monoclonal anti-dinitrophenol(DNP) IgE, and their ears challenged epicutaneously with dinitrofluorobenzene (DNFB) 24 h later. The cutaneous
reaction estimated by ear thickness reached a peak 1 and 24 h after the antigen challenge. Histopathologicalstudies indicate that eczemous skin lesion (24 h) in mice is similar to that in human atopic dermatitis. Prednisolone
at doses of 3 to 10 mg/kg clearly inhibited the IgE-mediated cutaneous reaction.
In the second model, DNFB was painted on the mice ear five times. The thickness due to dermatitis reacheda maximum 24 hr after the second, third and fourth paintings. The strong expressions of INF-γ and IL-2 but not
IL-4 and IL-5 mRNAs in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in the skin lesions indicated theparticipation of Th1 cells in the ear delayed type hypersensitivity reaction. Simultaneously, hapten specific IgE (sIgE)
was detected in serum from the immunized mice. These results indicate that five topical applications of DNFB
to the mouse ear produces eczematous dermatitis in the ear and hapten sIgE in the serum. This model shows
typical atopic dermatitis symptoms in the skin and IgE production. Regarding second project, the effect of anti-IL-4
monoclonal antibody on this hapten-induced contact dermatitis and IgE antibody production are studying now.
The results will be reported in near feature.とそれらの予防法について検討を行なってきた。

1 目 的

アトピー性皮膚炎はその中でも最も重要な課題の

近年の化学工業の発展に伴いアレルギー疾患の一つである。これまで、アレルゲンとしてはダニ患者が増加している。この主な原因は生活環境の抗原に代表される室内アレルゲン、食物および化変化と同時に精神衛生面の環境変化が挙げられて粧品に含まれる小分子化合物などが知られているいる。アレルギー疾患発症の大きな要因は遺伝的が、近年、我々は小分子化合物によるアトピー性要素と環境因子であることは多くの研究者によっ皮膚炎様症状を発症するマウスモデルの作成に成て指摘されている。本研究の目的は化粧品などに功したのでそれらを用い、小分子化合物による皮含まれる小分子化学物質によるアトピー様皮膚炎膚炎の発症機序の解明を行ない、さらに予防法にの発症機序と予防法について動物モデルを用いてついての検討を行った。

検討することである。近年、アトピー性皮膚炎の２ 実 験

患者数は増加の一途を辿っている。特に、成人の患者数が増加し、社会問題にもなっている。これ

２. １ 実験材料
実験動物は体重 16 〜 21g の９〜 10 週令雌性まで、教室では種々のアレルギー疾患の発症機序
Basic studies on the onset andprevention of atopic dermatitis
with simple chemicals
Hiroichi Nagai
Department of Pharmacology, GifuPharmaceutical University

BALB/c 系マウスを、日本 SLC より購入して使用した。マウスは温度 22±1℃、湿度 60±5％の恒温恒湿飼育室にて、自由給水下に固形飼料（ラボ MR ストック、日本農産）を用いて飼育した。抗原として 2,4− dinitrofluorobenzene（DNFB,Nacalai Tesque）を用いた。DNFB は、acetone− 60 −

小分子化学物質によるアトピー性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究（Nacalai Tesque）：olive oil（東海製薬）= ３：１の症状を示したのち、やがて血清 IgE 値の上昇を（v/v）溶液に 0.15％となるように溶解した。抗体伴う皮膚炎が発症し、その組織像、サイトカイン

は Monoclonal mouse anti− DNP IgE 抗体（MMCE）

発現パターンおよび治療薬の薬効から両モデルとを用いた。MMCE は、DNP 化ブタ回虫抽出物

もアトピー性皮膚炎の類似モデルであると考えらで免疫した Balb/c 系マウス脾細胞から樹立したれた。

マウス IgE 抗体産生細胞株（EC1）を培養して作これらのモデルを用いて発症に関与する炎症細製し上清を回収して MMCE とした。MMCE は胞および組織細胞の役割をサイトカイン、リピッ− 80℃で凍結保存し、実験には培養上清をそのドメディエーターを中心に検討し、それぞれの発まま使用した。MMCE 中の力価は、ラット 48hr症における役割を明らかにした。

heterologous passive cutaneous anaphylaxis を用１） DNFB による二相性皮膚反応

い 1：512−1024 であった。また、enzyme linked

図１に各系統のマウスにおける二相性皮膚反immunosorbent assay によって測定した IgE の濃応の成績を示す。ddY、ICR および Balb/c 系マ度は、2914.52ng/mL であった。

ウスでは反応後１及び 24 時間にピークを示す二相性の反応がみられる。肥満細胞欠損マウスであ２. ２ 実験方法

る WBB6F1-W/Wv マウスでは即時相の反応はみ１）

IgE 依存性二相性皮膚反応は Sakurai ら の方られないが、遅発相の反応がみられた。また、T法に従い惹起した。すなわち、雌性 Balb/c 系マcell 欠損マウスの Balb/c− nu/nu マウスでは Balb/

ウスに MMCE １mL を静脈内注射して受動的にc+/+ 正常マウスと変わらない二相性皮膚反応が感作し、24 時間後に 25mL の DNFB をマウス両みられた。更に、本二相性皮膚反応は IL−１およ耳殻の表裏に塗布して反応を惹起した。反応惹

び TNF に対するモノクローナル抗体により抑制

起後、種々の時間にダイヤルシックネスゲ−ジされるが、IL−５に対する抗体によっては影響さ（Peacock；尾崎製作所、東京）を用いて両耳殻のれなかった（図２）。しかし、抗炎症薬のプレドニ厚さを測定した。成績は、反応惹起直前と反応惹ゾロンは用量依存的に本反応を抑制した（図３）。

起後の耳殻の厚さの差で示した。

図４にその際の組織写真を示す（図４）。すなわち、

抗原反復塗布の実験はマウスの両耳介の表裏に抗原である DNFB の塗布により正常部位 A に比0.15％ DNFB を 25mL 宛、１週間に１回の割合でべ、好中球を中心とする多くの炎症性細胞の浸潤５回塗布して反応を惹起した。

がみられ、表皮の肥厚が観察される B。さらに、血管の著明な拡張がみられた。これに対し、プレ２. ３ 統計学的解析

ドニゾロン投与群では炎症性細胞の浸潤や表皮の成績は平均値 ± 標準誤差で示した。有意差検定

肥厚は少なく、組織学的にも明らかに炎症反応はは、Dunnet multiple range test あるいは Student's

抑制された。これらのことから、本モデルは低分

t-test および Aspin-Welch によって行った。

子化合物とそれに対応する抗体により生じるアレルギー性皮膚炎であり、低分子化合物による皮膚３ 成績および考察

炎症の発症と予防の研究に有用であるものと思わ

これまでにマウスを用いた二種類の in vivo モデルの作成にほぼ成功した。in vivo モデルではれた。
２） DNFB 反復塗布によるアレルギー性皮膚炎

dinitrofluorobenzene（DNFB）を抗原としてそれにDNFB を一週に一回、マウスの耳殻に塗布する対応するモノクロナール IgE 抗体を用いて生じると接触性皮膚炎による炎症反応が観察される（図遅発型皮膚炎、および前述の DNFB を抗原として５）。またこの時血清中には DNP に対する特異的皮膚に反復塗布すると当初、遅延型接触性皮膚炎− 61 −

Fig.1 IgE-mediated cutaneous reaction in ddY, ICR,BALB/c, BALB/c-nu/nu and WBB6F1-W/WVmice. Micereceived an intrevenous injection of 1.0mL of antiDNP IgE antibody 24hr before skin testing with 0.15％
DNFB. Each value represents the mean ±SEM of5-26mice. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

− 62 −

小分子化学物質によるアトピー性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究

Fig.2 Effects of anti-IL-1β, anti-TNF-α and anti-IL-5 on IgE-mediated cutaneous reaction in BALB/c mice. AntiIL-1β and anti-IL-5 were given intradermally and anti-TNF-α was intrevenously 10min before antigen challenge.Each value represents the mean ± SEM of 5-8 mice. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

F i g .3 E f f e c t o f p r e d n i s o l o n e o n I g E mediated cutaneous reaction in BALB/cmice. prednisolone was administered intraperitoncally 2hr before antigen challenge.
Each value represents the mean ±SEM of8mice.

− 63 −

Fig.4 Effect of prednisolone on the IgE antibody mediated allergic cutaneous in mice.［A］Normal,［B］
control,［C］prednisolone

Fig.5 Ear swelling caused repeatedpainting of DNFB in mice. Ears ofmice received atopical application of
0.15% DNFB in acetone and olive oilor vehicle once a week for 5 times.
Each point indicateds the mean ±SEM of 8mice. hr: Time after eachpainting(houes)

IgE 抗体が証明された（Table １）。このことはこの時の耳介局所およびリンパ節でのサイトカインれまで、単純なハプテンでは接触によっては接触の mRNA 発現を RT− PCR 法で測定すると耳介局性皮膚炎のみの発症であると考えられたことが、所では IFN− γ および IL− 2 の mRNA の発現がみ明らかに、免疫グロブリンの産生を伴う反応が発られ、Th １細胞の関与が示唆された（図６）。こ症できることを示しており、ヒトのアトピー性皮の時、Th ２サイトカインである IL−４および IL−膚炎を考える上で重要な発見であった。また、こ５は耳介では証明されず、頚部リンパ節において− 64 −

小分子化学物質によるアトピー性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究

Table 3

Effect of repeated of DNFB on the serum immunogloblin levels

Fig.6 Expression of cytokine mRNA in the ears and cervical lymph nodes of mice treated with DNFB. Ears of micereceived a topical application of 0.15% DNFB in acetone and olive oil or vehicle once a week for 5 times. The expression of IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 and β-actin mRNAs were examined using RT-PCR.

その発現あるいは発現増強がみられた。更にこの礎検討から本反応の発症は図７に示すような機序ことはリンパ節での IgE 産生を示唆する germlineが想定された。

Cε および productive Cε の mRNA が証明された

すなわち、小分子化合物によるアレルギー性皮ことからも確かめられた。以上のような多くの基膚炎の報告は大半が接触性皮膚炎についてであ− 65 −った小分子化合物によるアトピー性皮膚炎様症状の発症についての研究に有用なモデル系を確立でき、今後、系統的にその発症機序と予防についての免疫薬理学的な検討を行う予定である。
参考文献
１）Sakurai T, Inagaki N andNagai H ; The effect of antitumor necrosis factor (TNF)-a
monoclonal antibody on aller
gic cutaneous late phase reaction in mice. Life Science, 54,
PL291-295, 1994
Fig.7

DNFB 塗布によるアレルギー性皮膚炎モデルの発症機序２ ）N a g a i H , S a k u r a iT, Inagaki N et al. ; Anる。抗原を経皮的に塗布することによる感作では、

immunopharmacological study of biphasic allergic

これまでほとんど皮膚での単核球の浸潤を主体に

skin reaction in mice, Biol Pharm Bull 18, 239-

した組織学的判定により検討してきた。また、最245, 1995

近免疫学の進歩により、T 細胞のうち helper Ｔ細３）Nagai H, Sakurai T, Abe T et al. ; TNF-a胞は、その機能の違いから Th １細胞と Th ２細participates in an IgE-mediated cutaneous胞に分類されることが明らかになった。接触性皮reaction in mast cell deficient , WBB6F1-W/Wv

膚炎の発症は Th １細胞が反応性細胞であること

mice. Inflamm Res 45, 136-140, 1996

も次第に明らかにされてきた。さらに、Th ２細４）Inagaki N, Tsunematu M, Sakurai T et al. ;胞は液性抗体産生に必要な細胞としてとらえられEffect of prednisolone on IgE dependent biphasicている。しかし、小分子化合物による免疫反応に

cutaneous reaction in Balb/c mice. Gen. Pharmac.

ついての解析はほとんど行なわれていない。今回

28, 93-97, 1997の我々のモデルは小分子化合物を皮膚に反復塗布

５）Nagai H, Matsuo A, Hiyama H et al. ;すると皮膚では接触性皮膚炎に類似の症状を呈し

Immunogloblin E production in mice by means

ながら Th １細胞活性化が起き、次第に全身のリof contact sensitization with a simple chemical

ンパ系組織で Th ２細胞が活性化されて免疫グロ

hapten, J. Allergy Clin. Immunol., in press, 1997

ブリン、特に IgE 抗体の産生が始まることを明ら

６）Nagai H, Hiyama H, Matsuo A et al. ; FK-506

かにしたものである。従って、多くの点でヒトのand cyclosporin A potentiate the IgE antibody

アトピー性皮膚炎と類似しており、小分子化合物

production by contact sensitization with haptenによるアトピー性皮膚炎モデルとして有用である

in mice J. Pharmacol. Exper. Ther. 283, 321-327

ものと思われる。

(1997)

以上、本研究ではこれまであまり解析されなか− 66 −