概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析
秋田大学大学院医学系研究科

齋藤康太

Proteins synthesized within the ER is exported via COPII-coated vesicles to the Golgi for secretion. We have found thatTANGO1 is not only collagen cargo receptor at ER exit sites but it organizes the formation of ER exit site via interactingwith Sec16. In this analysis, we have found that TANGO1 is phosphorylated by casein kinase 1 and dephosphorylated by
PP1 in a cell-cycle dependent manner and the phosphorylation regulates the organization of ER exit sites. CK1 activity isinvolved in the regulation of circadian rhythm, so that our analysis would lead to the future investigation on the regulation ofcollagen secretion with circadian rhythm.

１．緒

明らかにした 4）。また、cTAGE 5 に低分子量 G タンパク言質 Sar 1 の活性化因子である Sec 12 が結合することで、ER受容体の脱感作をはじめ、シグナルによるエンドサイト

exit site における Sar 1 の効率的な活性化を介し、ER exitーシス経路の制御については盛んに研究が行われている。

site からのコラーゲンの分泌を担っていることを見出し

一方で全タンパク質の約 3 割が関与する小胞体からの分泌た（図 2）5 - 7）。続いて脊椎動物において TANGO 1 に長鎖に関しては、シグナルによる制御機構はほとんどわかっていない（図 1）。分泌は、細胞内で合成されたタンパク質が細胞外や細胞表面に出るまでの一連の過程である。インスリンなどのペプチドホルモンや、コラーゲンをはじめとする細胞外マトリックスなど、生体内の多くの因子は分泌されて機能する。これらのタンパク質は、小胞体内で合成された後、ゴルジ体へ輸送され、トランスゴルジ網を経由して最終的に細胞膜表面へ到達する（図 1）。
これまでわれわれは、分泌経路の初期段階である小胞体 - ゴルジ体間のタンパク質輸送に着目してきた。小胞体からゴルジ体へ分泌タンパク質を輸送する COPII 小胞は、小胞体上の特殊な領域である “ER exit site” で形成される。
ER exit site には COPII 小胞の被覆因子である Sec 23 / 24複合体、Sec 13 / 31 複合体が Sec 16 依存的に集積してい図 1 細胞内分泌経路る 1）。われわれはこれまで、高等真核生物の ER exit siteに局在する新規因子 Transport and Golgi organization 1（TANGO 1）の機能解析を行ってきた。TANGO 1 はショ
ウジョウバエ由来の S 2 細胞を用いた分泌スクリーニン
グによって単離された膜貫通型タンパク質である 2）。われわれは TANGO 1 が ER exit site において、コラーゲンの積荷受容体として機能することを見出した 3）。さらに
TANGO 1 が cTAGE 5 と共受容体として機能することをMecha n isms of col lagen secret ion
regulated by circadian rhythm
Kota Saito
Akita University, Graduate School ofMedicine

図 2 cTAGE5/TANGO1/Sec12 複合体によるⅦ型コラーゲン分泌モデル− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

（TANGO 1 L）と短鎖（TANGO 1 S）の 2 つのアイソフォー
ムが存在することを明らかにし、両者が Sec 16 と結合することで、協調して ER exit site の場を決定するオーガナ

2 . 4 . 細胞周期の同調
細胞周期の同調は、ダブルチミジン法あるいはノコダゾール法を適宜用いた。

イザーとしての役割を有することを明らかにしてきた 8 , 9）。

3．結

また ER exit site を超解像顕微鏡により観察することにより、ER exit site の構成因子がドメインを形成して存在することを明らかにした 10）。

果3 . 1. TANGO1 の PPS 領域におけるリン酸化修飾
は TANGO1とSec16 の結合親和性を減弱させ、ER exit site を崩壊させる

最近われわれは CK 1 δ, ε による TANGO 1 のリン酸化によって、ER exit site が崩壊することを見出した。CK 1 δ,TANGO1 の各アミノ酸残基におけるタンパク質修飾についε は概日リズムの制御に関与し、CK 1 δ, ε を阻害したマウて、PhosphositePlusを用いて調べた結果、TANGO 1 の細スでは概日リズムが障害されることが明らかになっている。

胞質側領域の一部にリン酸化報告が多数存在する残基を見以上のことは、TANGO 1 によるコラーゲン分泌が CK 1 δ,出した。この領域（TANGO 1 L: 1651 - 1750 , TANGO 1 S:ε によって制御されている可能性を強く示唆している。事529-628 aa.）をphosphorylation predicted sequences（PPS）

実、最近コラーゲンの分泌が概日リズムによって制御されと命名し、種間保存性を調べた結果、PPS 領域内の配列はている可能性が見出されつつあるが、分子メカニズムの全他の領域に比較して種間保存性が高いことが明らかになっ貌は未解明であった。

た。また PPS は Sec 16 と TANGO 1 の相互作用領域である２．方SIR（Sec 16 Interaction Region）の近傍に存在した。

法

次に、TANGO 1 S の PPS 内にリン酸化候補残基をアラ2 . 1. 免疫染色

ニンに置換した非リン酸化変異体（SA 変異体）および、グ冷メタノール固定した細胞を 5% BSA/PBS/0 . 1% Triton

ルタミン酸に置換したリン酸化模倣変異体（SE 変異体）

X- 100 にてブロッキング後、一次抗体および Alexa Fluorを作出し、Sec 16 との結合について検討した。その結果、標識した二次抗体によって染色した。核染色には DAPI を

SE 変異体においては、野生型 TANGO 1 S に比べ Sec 16 と用いた。観察は共焦点顕微鏡 LSM 700（Zeiss）によって行の結合が減弱していた一方で、SA 変異体は野生型よりもった。

結合が増強していた。したがって TANGO 1 の PPS 領域がリン酸化されることで Sec 16 と TANGO 1 の結合親和性が2 . 2 . in vitro キナーゼアッセイ減弱することが明らかになった。

GST-TANGO1 PRDリコンビナントタンパク質に CK 1 δ（1 -次 に、 内 在 の TANGO 1 L お よ び TANGO 1 S を 発 現 抑351 aa.）を 添 加 し、20 mM Tris-HCl（pH 7 . 4）、150 mM

制 し た 細 胞 に、TANGO 1 S 各 変 異 体 を そ れ ぞ れ 発 現 さNaCl、0 . 1 % Triton X- 100、2 mM MgCl 2、25 mM［γ- 32 P］

せ ER exit site の形成能を評価した。TANGO 1 L およびATP 水溶液中で 30 ℃、1 時間反応させた。リン酸化反応

TANGO 1 S を発現抑制した細胞においては、以前報告しは Laemmli Sample buffer と混合し加熱することで停止さたように Sec 16 と Sec 31 が一部乖離して存在するが、野せた。SDS-PAGE 後、オートラジオグラフィーにてリン生型 TANGO 1 S や SA 変異体を発現した細胞においては酸化を検出した。

Sec 16 , Sec 31 の共局在が回復した。一方で SE 変異体を発現した細胞においては、Sec 16 と Sec 31 は一部乖離した

2 . 3 . 免疫沈降実験およびウエスタンブロットままとなった。また、SE 変異体を発現する細胞では小胞

293 T 細胞へのトランスフェクションは PEI を用いた。

体からの VSVG の輸送が遅延していた。以上の結果から、

2 0 mM Tris-HCl（pH 7 . 4）
、1 0 0 mM NaCl、1 mM EDTA、TANGO 1 の PPS 領域がリン酸化されることで、Sec 16 と1 % TritonX- 100 およびプロテアーゼ阻害剤によって破砕の結合親和性が減弱し、ER exit site の崩壊と分泌の阻害した細胞を 15 , 000 rpm、15 min 遠心した上清を細胞抽出が生じることを示唆している。

液とし、抗 FLAG 抗体による免疫沈降した。TBS/ 0 . 1 %TritonX- 100 で 5 回洗浄後、0 . 2 mg/ml FLAG ペプチドに

3 . 2 . CK1δ は TANGO1 を直 接リン 酸化し、ERよって溶出した。サンプルは Laemmli Sample buffer と混

exit site を崩壊させる

合し、5 分間煮沸後、SDS-PAGE し、PVDF 膜に転写後、次に、TANGO 1 の PPS 領域をリン酸化するキナーゼを各抗体によってウエスタンブロットを行った。二次抗体は探索した。先行知見として CK 1 δ が小胞体 - ゴルジ体間のHRP 標識されているものを用い、ルミノール・ペルオキタンパク質輸送に関与することが明らかになっていたため、シド基質を用い LAS 4000 mini（cytiva）によって検出した。

CK 1 δ が TANGO 1 を直接リン酸化するかを γ 32 P-ATP を用いた in vitro の評価系で検証した。TANGO 1 は PPS 領− 132 −概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析として調製し、CK 1 δ は自己リン酸化による活性減弱を防

3 . 4. 細胞分裂期におけるTANGO1 のリン酸化亢進によって ER exit site は崩壊する

ぐため、触媒ドメイン部分のリコンビナントを調製して用細胞分裂期において、分泌の停止に伴って ER exit site

いた。結果、
TANGO 1 は CK 1 δ 存在下でリン酸化されたが、も崩壊し、Sec 16 と Sec 31 は分裂前期から後期にかけて域を含む C 末端 257 アミノ酸領域部分をリコンビナント

32

TANGO 1 の SA 変異を含むリコンビナントにおいて P は局在が乖離することが報告されている。しかし、この一ほとんど検出されなかった。以上の結果より、CK 1 δ によ

時的な ER exit site 崩壊の分子メカニズムは不明だった。って TANGO 1 の PPS 領域が直接リン酸化されることが明Sec 16 と Sec 31 の乖離は TANGO 1 のリン酸化模倣変異体

らかになった。

発現時や、CK 1 δ の過剰発現時、PP 1 の活性抑制時においさらに、CK 1 δ が ER exit site の構成や形態に与える影ても観察されたこと、PP 1 は細胞分裂期に一時的に活性低響を評価した。CK 1 δ を過剰発現させた細胞では Sec 16 と下することから、我々は細胞分裂期において TANGO 1Sec 31 は乖離し、TANGO 1 S の SE 変異体を発現させた際の PPS 領域におけるリン酸化が亢進し、Sec 16 との結合がと同様の表現型が観察された。一方、キナーゼ活性を有さ外れることが ER exit site の崩壊の契機となる仮説を考え、ない CK 1 δ K 38 R 変異体を発現させた細胞では、ER exit

その検証を行った。まず、間期と分裂期それぞれにおけるsite の乖離は認められなかった。また、CK 1 δ の阻害剤でTANGO 1 S のリン酸化量を phos-tag により定量した。そある IC 261 を添加した細胞および CK 1 δ および CK 1 ε をノの結果、nocodazole で細胞分裂期に同調させた培養細胞にックダウンした細胞において、ER exit site は肥大化しておいて野生型 TANGO 1 S のリン酸化量は増加していたが、いた（図３）。以上の結果より、CK 1 δ がキナーゼ活性によ

一方で TANGO 1 S SA 変異体は細胞分裂期においてもリり ER exit site の形態に影響を与え得ることが明らかになン酸化量が変化しなかった。したがって、細胞分裂期にはった。

TANGO 1 の PPS 領域においてリン酸化が亢進することが明らかになった。

3 . 3 . TANGO1 は PP1 によって脱リン酸化される

さ ら に、 野 生 型 TANGO 1 S あ る い は TANGO 1 S SAH 61 株の抗酸化作用がどのような生体経路を介するか変異体を発現する安定発現株での細胞分裂期におけるを調べるために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子

ER exit site の 様 子 を 観 察 し た。 野 生 型 TANGO 1 S を群を RNA-seq 法で探索した。浮かび上がった遺伝子群を発現する細胞では、親株の HeLa 細胞と同様に、分裂中用いてパスウェイ解析を行ったところ、ミトコンドリアタ期において Sec 16 /Sec 31 の局在が乖離していた。一方、ンパク質をコードする遺伝子群の多くが発現亢進していた。

TANGO 1 S SA 変異体を発現する細胞では、分裂中期にお検証のために、いくつかのミトコンドリアタンパク質遺伝いても Sec 16 と Sec 31 が共局在する点が多数認められた。

子に対して qPCR 解析を行ったところ、弱いながらも H 61

この結果は、細胞分裂期における ER exit site の崩壊には株により発現誘導される傾向があることがわかり（図 3）、TANGO 1 の PPS 領域におけるリン酸化が必要であることミトコンドリア生合成が亢進している可能性を示唆された。

を意味している。

図 3 CK1δ/ε のノックダウンにより ER exit site が肥大化する− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

ε は細胞分裂中期における ER exit site の崩壊に重要である
図 4 CK1δ，
CK1δ および CK1ε をノックダウンした細胞をダブルチミジン法により同調させた後、細胞分裂期の細胞を免疫染色した（スケールバー：10µm）。箱ひげ図は Sec16/Sec31 の細胞ごとの共局在率を示す。

さ ら に、 細 胞 分 裂 期 に お け る ER exit site の 崩 壊 にズムに応じた TANGO 1 のリン酸化状態等を検証していく

CK 1 δ が関与する可能性を検討するため、CK 1 δ/ε を発ことにより、今後、さらに ER exit site のシグナルによる現抑制した細胞での ER exit site を観察した。その結果、形成制御機構を明らかにすることができると考える。

TANGO 1 S SA 変異体安定発現株と同様、CK 1 δ/ε を発現抑制した細胞においては Sec 16 と Sec 31 が共局在する点（引用文献）が認められた（図 4）。以上の結果から、細胞分裂期におけ

1） Saito, K.* and Katada, T. Mechanisms for exporting

る ER exit site の崩壊は CK 1 δ による TANGO 1 PPS 領域

large-sized cargoes from the endoplasmic reticulum.のリン酸化によって生じる可能性が強く示唆された。

Cell. Mol. Life Sci. 72（19），3709-20.（2015）

4．考2） Bard, F., Casano, L., Mallabiabarrena, A., Wallace, E.,

察Saito, K., Kitayama, H., Guizzunti, G., Hu, Y., Wendler, F.,

本 研 究 に よ り、TANGO 1 の PPS 領 域 を CK 1 δ が リ ン

Dasgupta, R., Perrimon, N. and Malhotra, V. Functional

酸化し、PP 1 が脱リン酸化することが明らかになった。

genomics reveals genes involved in protein secretion

CK 1 δ の活性は細胞周期を通じて一定であるが、PP 1 のand Golgi organization. Nature, 439, 604-7.（2006）

活性は細胞分裂期に Cdk 1 -CyclinB 1 複合体によってリ

3） Saito, K., Chen, M., Bard, F., Chen, S., Zhou, H.,

ン酸化されることで減弱する。したがって間期においてWoodley, D., Polischuk, R., Schekman, R. and Malhotra,TANGO 1 の リ ン 酸 化 状 態 は、CK 1 δ に よ る リ ン 酸 化 と

V. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic

PP 1 による脱リン酸化の平衡状態にあるが、細胞分裂期においては PP 1 の脱リン酸化活性のみが低下するために、TANGO 1 のリン酸化が亢進すると考えられる 11 , 12）。

reticulum exit sites. Cell, 136, 891-902.（2009）4） Saito, K., Yamashiro, K., Ichikawa, Y., Erlmann, P.,
Kontani, K., Malhotra, V. and Katada, T. cTAGE5

また ER exit site は細胞外環境や概日リズムに応じてそmediates collagen secretion through interaction withの数や大きさを変化させ、分泌を調節することが報告され

TANGO1 at endoplasmic reticulum exit sites. Mol.ている。TANGO 1 と Sec 16 の結合は ER exit site の形成

Biol. Cell, 22, 2301-8.（2011）

起点となることから、細胞分裂期以外の ER exit site の適5） Saito, K.*, Yamashiro, K., Shimazu, N., Tanabe, T.,

応メカニズムにおいても今回得た知見と同様の制御機構がKontani, K. and Katada, T. Concentration of Sec1 2 at関与する可能性が考えられる。特に CK 1 δ, ε は概日リズム

ER exit sites via interaction with cTAGE5 is requiredの制御に関与し、CK 1 δ, ε を阻害したマウスでは概日リズ

for collagen export. J. Cell. Biol., 206（6）, 751-62.（2014）

ムが障害されることが明らかになっている。よって概日リ

6） Tanabe, T., Maeda, M., Saito, K.*, and Katada, T.

− 134 −

概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析

図 5 細胞分裂期における ER exit site の形成と崩壊の分子メカニズム

Dual function of cTAGE5 in collagen export from the10）Maeda, M., Kurokawa, K., Katada, T., Nakano, A. andendoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell, 27, 2008-13（2016）

Saito, K.* COPII proteins exhibit distinct subdomains

7） Saito, K.*, Maeda, M. and Katada, T. Regulation ofwithin each ER exit site for executing their functions.

the Sar1 GTPase Cycle Is Necessary for Large Cargo
Secretion from the Endoplasmic Reticulum. Front. Cell
Dev. Biol. 5, 75（2017）

Sci. Rep., 9 , 7346（2019）11）Maeda M., Komatsu Y. and Saito K. “Mitotic ER
exit site dynamics: Insights into blockade of secretion

8） Maeda, M., Saito, K.*, and Katada, T. Distinct

from the ER during mitosis.” Mol. Cell. Oncol., 7（6）,isoform-specific complexes of TANGO1 cooperatively
facilitate collagen secretion from the endoplasmicreticulum. Mol. Biol. Cell, 27, 2688-96（2016）

1832420（2020）
12）Maeda M., Komatsu, Y. and Saito, K. Mitotic ER
Exit Site Disassembly and Reassembly Are Regulated

9） Maeda, M., Katada, T. and Saito, K.* TANGO1

by the Phosphorylation Status of TANGO 1 . Dev. Cell,recruits Sec1 6 to coordinately organize ER exit sites
for efficient secretion.J. Cell Biol., 216（6）, 1731-43（2017）− 135 −

55 , 237 - 250 , 1731 - 43（2020）