米タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定およびその美白効果
新潟大学工学部機能材料工学科

谷 口正 之Rice bran, which is the residue from brown rice in the production of white rice, is one of the most abundant agricultural
by-products in Japan. After squeezing rice oil, the residual defatted rice bran powder contains a lot of proteinaceous
fractions as well as starchy and cellulosic polysaccharides. In this study, we investigated the purification and identificationof tyrosinase-inhibitory peptides obtained by hydrolyzing enzymatically the protein of rice bran.  The tyrosinase-inhibitory
peptides were purified from the enzymatic hydrolyzate by size-exclusion and hydrophobic chromatography. Three kinds oftyrosinase-inhibitory peptide were identified by MALDI TOF-MS analysis. The peptides showed the same monophenolaseinhibitory activity as that of arbutin as a control. In future, the tyrosinase-inhibitory peptides obtained from rice bran areexpected to be utilized as a cosmetic material.

１．緒

ラニン形成阻害機構に関する研究を継続する必要がある。

言

我々は最近、米糠タンパク質の酵素加水分解物から得た大豆、小麦などの穀類のタンパク質やその分解物中には、ペプチドに、チロシナーゼ阻害活性を見出した。本阻害成タンパク質分解酵素阻害作用、アンジオテンシン変換酵素

分は、鎖長 10 残基程度のペプチドと推定され、粗精製物阻害作用（血圧降下作用）、コレステロール低下作用、抗のサンプルはタンパク質量として 2 µg 当たり約 10 % のチ菌作用などの生理活性成分が存在することが報告されていロシナーゼ活性を阻害した。一般によく利用されるチロシる。精白米や米糠のタンパク質中には、タンパク質分解酵ナーゼ阻害剤であるコウジ酸は、1 µg 当たり 10 % のチロ素阻害作用を示すオリザシスタチンが存在することが報告

シナーゼ活性を阻害する。したがって、米糠タンパク質由されているが、一般的な酵素やアンジオテンシン変換酵素

来のチロシナーゼ阻害ペプチドは、現段階の粗精製物でも阻害剤以外の生理活性を示すタンパク質やペプチドに関す十分に商品化が可能な活性を有していると考えられる。
そこで本研究では、米糠タンパク質由来チロシナーゼ阻る報告はほとんどない。
一方、チロシナーゼは、メラニン合成経路における律速害ペプチドを化粧品素材として実用化することを目指した酵素であり、L- チロシンから L- ドーパ、さらには L- ドー

基礎研究として、次 の ２ 点 に つ い て さ ら に 検討した7 − 9）。

パキノンへの２段階の反応を触媒する。メラニンの過剰生

すなわち、１）本チロシナーゼ阻害ペプチドの精製法を実

産は色素増加症を招くため、チロシナーゼ阻害剤は美白効験室規模で確立した。より効率的な手法を確立するために、果をもたらす化粧品などに利用されている。既存のチロシ

特に、プロテアーゼを用いた加水分解反応条件を最適化しナーゼ阻害剤として、ハイドロキノン、コウジ酸、アルブた。また、チロシナーゼを阻害するペプチドを精製し、質チン、グルタチオンなどが一部実用化されている。これら

量分析計（MALDI TOF-MS）を用いて同定した。２）本の低分子化合物は、顕著なチロシナーゼ阻害活性を示すが、チロシナーゼ阻害ペプチドのチロシナーゼ阻害活性を明らそれらが有する強い細胞毒性や水分存在下での酸化によるかにした。また、本チロシナーゼ阻害ペプチドをマウス由活性低下に起因する問題点が指摘されている。近年、天然

来メラニン形成細胞（B 16 および B 16 F 10）などに添加し、物である植物、真菌、海藻由来の低分子有機化合物やペプ細胞毒性とメラニン形成量について検討した。

チドがチロシナーゼ阻害活性を有することが、国内外にお２．実

いて報告されている 1−6）。これらの新しい化合物は、上記の多くの問題点を解決する候補として期待されているが、２.１

研究段階であり、さらに、細胞毒性の有無と程度およびメ験

米タンパク質の酵素加水分解酵素を用いた米糠タンパク質の加水分解条件を、酵素の種類と濃度、反応時間、可溶化 ･ 分解の程度などについて

P u r i f ic at i on a nd Ident i f ic at i on of
Tyrosinase-inhibitory Peptides from RiceProteins and Their Whitening Effects
Masayuki Taniguchi
Department of Materials Science andTechnology, Faculty of Engineering,
Niigata University

検討した。

２. ２

チロシナーゼ阻害ペプチドの精製とその同定

米糠タンパク質を、図１に示すようにキモトリプシンとトリプシンを用いて加水分解した後、遠心分離によって上澄液を得た。この上澄液を凍結乾燥して得られたサンプル− 24 −

米タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定およびその美白効果

図１

米糠タンパク質の酵素加水分解とペプチドの精製の方法

同じように、酵素としてマッシュルームチロシナーゼ、基を米糠タンパク質酵素加水分解物とした。
次に、米糠タンパク質酵素加水分解物からチロシナー質として L- ドーパを用いて、次のようにして測定した。図ゼ阻害ペプチドを、図１に示すように精製した。最初３に示す反応溶液を調製し、チロシナーゼ溶液を最後に添に 酵 素 加 水 分 解 物 を BioGel P- 6 Gel カ ラ ム と Superdex

加することによって酵素反応 を 開 始 し た。 反応開始後、

Peptide 10 / 300 GL カラムを用いたサイズ排除（ゲル濾過）

L- ドーバキノンが生成するに伴って 475 nm における吸光クロマトグラフィーによって粗精製し、次に Cazenda CD-度が、図３に示すようにほぼ直線的に上昇した。この際にC 18 カラムを用いた逆相クロマトグラフィーによって精密得られる直線の傾きをジフェノラーゼ活性と定義した。まに精製した。逆相クロマトグラフィーによって得られた各た、阻害剤のジフェノラーゼ活性に及ぼす影響は、図３中ピークを分取し、同一のカラムを用いて再度精製し、それの式で示すように残存活性として表した。

ぞれほぼ単一のピークを得た。各ピークに含まれる阻害ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時２. ４間型質量分析（MALDI TOF-MS）を用いて同定した。

メラニン形成抑制効果の評価

メラニン形成細胞（B 16 および B 16 F 10）への細胞毒性とそのメラニン形成量に及ぼすチロシナーゼ阻害ペプチ

２. ３

チロシナーゼ阻害活性の測定

ドの影響を評価した。細胞毒性を検討するために、最初モノフェノラーゼ活性は、酵素としてマッシュルームチにメラノーマ細胞を 96 ウェルプレートに 1 . 0 × 104 cells/

ロシナーゼ、基質として L- チロシンを用いて、次のようにwell となるように播種した。培養には 10％の FBS を加えして測定した。図２に示す反応溶液を調製し、チロシナー

た DMEM 培地を用いた。培養は、メラニン含量の測定

ゼ溶液を最後に添加することによって酵素反応を開始した。の場合と同じように行い、72 時間目に cell counting kit- 8反応開始後、L- ドーパキノンが形成し 475 nm における吸を用いて、450 nm における吸光度を測定することによっ

光度が図２のように上昇するが、モノフェノラーゼが阻害て生細胞数を測定した。メラニン含量の測定では、最初された場合には、吸光度の上昇が遅れた。この遅延時間をにメラノーマ細胞を 12 ウェルプレートに 1 . 0 × 104 cells/ラグタイムとして図２に示すように求めた。阻害剤を添加

well となるように播種した。培養には 10％の FBS と 2 µMしない場合のラグタイムの逆数をモノフェノラーゼ活性との a-Melanocyte stimulation hormone（a-MSH） を 加 えして定義し、阻害剤のモノフェノラーゼ活性に及ぼす影響た DMEM 培地を用いた。24 時間、培養を行った後に培地を、図２中の式で示す残存活性として表した。

交換し、サンプルを添加した。さらに 72 時間培養した後、次にジフェノラーゼ活性は、モノフェノラーゼの場合と細胞を回収して NaOH で細胞を溶解し、405 nm における− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

吸光度を測定することによってメラニン含量を測定した。

３．結
３.１

プシンを組み合わせた場合に、チロシナーゼ阻害活性が高い加水分解物が得られた。本研究では、図１に示すよう

果に各 60 mg のキモトリプシンとトリプシンを組み合わせて米タンパク質加水分解物の調製

3 . 0 ｇの米糠タンパク質を 50℃で 6 時間加水分解したサン

各種プロテアーゼを用いて米糠タンパク質を加水分解しプルを調製し、以下の実験に用いた。

た結果、サーモライシン単独およびキモトリプシンとトリ

図２

図３

モノフェノラーゼ阻害活性の測定方法

ジフェノラーゼ阻害活性の測定方法− 26 −

米タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定およびその美白効果

３. ２

チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定

フェノラーゼ阻害活性が検出されたが、No. 72 から No. 83

BioGel P- 6 Gel カラムを用いたサイズ排除クロマトグラの画分に比較的強いジフェノラーゼ阻害活性が検出でき加水分解物を精製したた。そこで、No. 72 から No. 83 の画分をプールして、次の結果を図４に示す。得られた No. 60 から No. 100 の画分のSuperdex Peptide 10 / 300 GL カラムを用いたサイズ排除ク

チロシナーゼ阻害活性をモノフェノラーゼとジフェノラーロマトグラフィーによって、さらに精製した結果を図５にゼ阻害活性に分けて測定した。その結果、各画分にモノ示す。得られた各ピークを 11 の画分に分け、それぞれのフィーによって、米糠タンパク質

図４

サイズ排除クロマトグラフィーによるペプチドの精製

図５

疎水性クロマトグラフィーによるペプチドの精製− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

画分のモノフェノラーゼ阻害活性を測定した結果、No. 9を示す。それぞれの画分がほぼ単一ピークになったことがの画分に強い阻害活性が検出された。この画分は、分子量わかった。そこで、各単一ピークに含まれる阻害ペプチドマーカーであるビタミン B 12（MW 1855 Da）とグリシン三を、MALDI TOF-MS を用いて同定した結果、6 種類のペ量体（MW 189 Da）の溶出位置から、おおよその分子量がプチド（E、F、G、H 1、H 2 および J）を同定することがで200 − 2000 Da であると推定された。

きた。それぞれのペプチドは 7 ～ 9 残基のアミノ酸から構次に、Cazenda CD-C 18 カラムを用いた逆相クロマトグ成されるペプチドであった。

ラフィーによって、得られた No. 9 の画分を精密に精製した結果を図５に示す。この逆相クロマトグラフィーにおい３. ３

米糠由来ペプチドのチロシナーゼ活性て、A から O までの 15 のピークが得られた。そこで、各同定した 6 種類のペプチドを化学合成し、チロシナーゼピーク画分のモノフェノラーゼ阻害活性を測定した結果、阻害活性を測定した。コントロールとしてチロシナーゼ

E、F、G、H、および J の画分に強い阻害活性が検出され活性を阻害することが既に報告されているコウジ酸、アた。それぞれのピーク画分を分取して、再度 Cazenda CD-ルブチン、および TH 10 を用い、それらの阻害活性と比C 18 カラムを用いた逆相クロマトグラフィーによって精製較した。我々が報告した TH 10 は、Abu Ubeid らによっした。図６と図７はそれぞれピーク E と F の精製結果の例て報告された 10 残基のアミノ酸から構成されるペプチド

図６

画分 E の疎水性クロマトグラフィーによる精製

図７画分 G の疎水性クロマトグラフィーによる精製− 28 −

米タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定およびその美白効果

P 4（YRSRKYSSWY）1）と 7 残基が同一であるチロシナー

トール、オリザノール、フィチン酸などの生理活性物質のゼ阻害ペプチドである。各成分のモノフェノラーゼとジフ生産のための原料として利用されているが、大部分は有効ェノラーゼに対する阻害活性を、比較した結果を図８に示に利用されていない。本研究では、米糠タンパク質の有効す。コウジ酸は、低濃度でモノフェノラーゼとジフェノラ利用を最終目的として、その酵素加水分解物からチロシナーゼ活性を阻害した。アルブチンは、モノフェノラーゼ活ーゼ阻害ペプチドを探索した。

性を阻害したが、ジフェノラーゼ活性を阻害しなかった。

チロシナーゼは、L- チロシンから L- ドーパ、さらには L-TH 10 は、モノフェノラーゼ活性をアルブチンと同程度にドーパキノンへの２段階の反応を触媒するメラニン合成経阻害し、ジフェノラーゼ活性も阻害した。一方、ペプチド路における律速酵素である。このメラニンの過剰生産は色E、G、および H 1 は、モノフェノラーゼ活性を阻害した素増加症を招くため、ハイドロキノン、コウジ酸、アルブが、その阻害活性は、アルブチンや TH 10 に比べて低かっチン、グルタチオンなどのチロシナーゼ阻害剤は美白効果た。また、ペプチド E、G、および H 1 は、ジフェノラーをもたらす化粧品素材として利用されている。これらの低ゼ活性をアルブチンと同様に阻害しなかった。

分子化合物は、顕著なチロシナーゼ阻害活性を示すが、それらが有する強い細胞毒性や酸化による活性低下などの問

３. ４

米由来ペプチドのメラニン形成阻害活性題点が指摘されている。そこで、国内外において、新しいチロシナーゼ活性を阻害することが既に報告されている

チロシナーゼ阻害成分が、天然物である植物、真菌、海藻コウジ酸、アルブチン、および TH 10 の細胞毒性を比較しなどから探索されており、いくつかの低分子有機化合物やた。100 mM 濃度で添加した場合には、コウジ酸によってペプチドがチロシナーゼ阻害活性を有することが報告され細胞は、約 40％増殖を阻害されたが、アルブチンや TH 10ている 1− 6）。

は、ほとんど細胞毒性を示さなかった。ペプチド E、G、本研究では、米糠タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプ

および H 1 のメラニン形成細胞に対する細胞毒性とそのメチドを化粧品素材として実用化することを目指した基礎

ラニン形成量に及ぼす影響は、現在検討中である。

研究として、本チロシナーゼ阻害ペプチドの調製法を実４．考験室規模で確立した。また、チロシナーゼを阻害するペ察

プチドをクロマトグラフィーなどの手法を用いて精製し、米糠は、精米中に派生する資源であり、食用油やイノシ

図８

MALDI TOF-MS を用いて同定した。同定したアミノ酸配米糠タンパク質由来ペプチドのチロシナーゼ阻害活性− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

J. Agric. Food Chem., 57 , 4124 - 4129 ( 2009 ).

列に基づいて化学合成によって６種類のペプチドサンプルを調製し、それらのチロシナーゼ阻害活性を測定した。そ３）Lien, T.-F., Hsu, Y.-L., Lo, D.-Y. and Chiou, R. Y.-の結果、３種類のペプチドがアルブチンや TH 10 とほぼ同

Y.: Identification of an alkylhydroquinone from

じ程度にモノフェノラーゼを阻害することが明らかになっRhus succedanea as an inhibitor of tyrosinase andたmelanogenesis. J. Agric. Food Chem., 57 , 2200 - 22057−9）。本チロシナーゼ阻害ペプチドのマウス由来メラニ( 2009 ).

ン形成細胞（B 16 および B 16 F 10）に対する細胞毒性とメ

４）Shirasugi, I., Kamada, M., Matsui, T., Sakakibara, Y.,

ラニン形成阻害効果については現在検討中である。
本研究によって、米糠タンパク質由来チロシナーゼ阻害

Liu, M-C, and Suiko, M.: Sulforaphane inhibited melaninペプチドが調製できることが示された。今後、これまでのsynthesis by regulating tyrosinase gene expression

結果を踏まえて、収率を考慮したペプチドの効率的な調製

in B 16 mouse melanoma cells. Biosci. Biotechnol.

法や簡便な粗精製法を確立する必要がある。また、チロシ

Biochem., 74 , 579 - 582 ( 2010 ).

ナーゼ阻害ペプチドとして、現時点では３種類が同定でき

５）Kim, J.-M., Ko, R.-K., Jung, D.-S., Kim, S.-S., Lee, N. H.:ているが、これまでに得られた結果から、さらに多くのペTyrosinase inhibitory constituents from the stems of

プチドが同定できる可能性が高い。米糠タンパク質由来チMaackia fauriei. Phytother. Res., 24 , 70 - 75 ( 2010 ).

ロシナーゼ阻害ペプチドを網羅的に同定し、それらのチロ６）Liang, C.-H., Chou, T.-H., and Ding, H.-Y.: Inhibition of

シナーゼ阻害活性を測定することによって、アミノ酸配列

melanogensis by a novel origanoside from Origanumとチロシナーゼ阻害活性の関係を解明できる可能性も高い。

vulgare. J. Dematol. Sci., 57 , 170 - 177 ( 2010 ).

これらのチロシナーゼ阻害ペプチドのメラニン形成細胞に

７）富谷倫之，池田沙誉子，阿部貴子，落合秋人，田中孝

対する細胞毒性とメラニン形成阻害効果を明らかにできれ

明 , 谷口正之：米タンパク質加水分解物からの酵素阻害

ば、化粧品素材として有望な候補になると考えられる。

成分の精製とその構造解析．平成 22 年度日本食品工学会（東京），講演要旨集 p. 113（2010）.

（引用文献）

８）吉田久志，富谷倫之，落合秋人，田中孝明，谷口正之：

１）Abu Ubeid, A., Wang, Y., Zhao, L., and Hantash,

米由来ペプチドによるチロシナーゼ活性の阻害とメラニ

B. M.: Short-sequence oligopeptides with inhibitory

ン形成の抑制．平成 23 年度日本生物工学会（東京），講

activity against mushroom and human tyrosinase. J.

演要旨集 p. 148（2011）.
９）田中聖也 , 吉田久志，落合秋人，田中孝明，谷口正之：

Invest. Dermatol., 129 , 2242 - 2249 ( 2009 ).
２）Yoon, N. Y., Eom, T. K., Kim, M. M., and Kim, S.

米糠タンパク質酵素加水分解物中のチロシナーゼ阻害ペW.: Inhibitory effect of phlorotannins isolated from

プチドの精製と同定．2012 年度日本生物工学会（神戸），Ecklonia cava on mushroom tyrosinase activity and講演要旨集 p. 168（2012）.

melanin formation in mouse B 16 F 10 melanoma cells.

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