香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科

柏谷英樹

To reveal the central neuronal circuit underlying the odorant-X induced analgesia, I examined the contribution of
hypothalamic orexin neurons, one of the higher centers for the intrinsic analgesia-system. Formalin test revealed that theodorant-X induced analgesia was not observed in orexin mutant mice, indicating that the orexin neurons are essential for theodorant-X induced analgesia.

1．緒

言

世界には多様な香気が存在するが、その中の一部は鎮痛効果を持つことが予想されており、一部の民間療法では香気療法が取り入れられている。実際、いくつかの香気分子は末梢組織において鎮痛効果を持つことが証明されている。
例えばウィンターグリーン（ツツジ科）
由来の香気分子であるサリチル酸メチルは独特の香気を持つが、体内に摂取されるとサリチル酸へ代謝され、末梢で COX-2 を阻害しプロスタグランジン生成を阻害することで鎮痛効果を発揮する。しかしながら、香気成分が「香り」として、言い換えれば嗅覚系を介した嗅覚入力として鎮痛効果を持つのか、もし持つならばそれはどのような神経回路メカニズムが介在するのか、については明らかになっていない。
本申請者は、この嗅覚系を介した鎮痛効果を検証しようと考え、種々の匂い暴露下で 疼痛行動（ホットプレートテスト及びホルマリンテスト）を観察し、鎮痛効果を持つ匂い分子 odorant-X（テルペノイドの一種。未発表データであるため仮称）を見出した。図 1 は、ホルマリンテストにおける odorant-X の鎮痛効果を調べたデータである。ホルマリンテストでは特徴的な 2 相性の疼痛行動を示すが、図1

odorant-X 香気暴露により両相で有意に疼痛行動が減少しodorant-X 香気誘発性鎮痛（ホルマリンテスト）ている（p<0.05；マンホイットニー U 検定）。この鎮痛効
果は嗅覚遮断マウス（嗅上皮破壊マウス及び嗅球破壊マウとが知られているオレキシンペプチドに着目し、オレキシンス）では消失することから、嗅覚入力を介して鎮痛効果が含有神経が香気誘発性鎮痛に関与するかどうかを検討した。

現れることが明らかになった。

2．実

本研究では、この香気誘発性鎮痛がどのような中枢神経回路により発現するかを明らかにすることを目的としてい験

2. 1. 香気暴露及びホルマリンテスト

る。申請者は鎮痛を含む多様な自律神経反応に関与するこ

自作のオルファクトメーターにより定流量・濃度の気化
odorant-X を作成し、0.5 L の観察チャンバー内を換気した。換気は 1 L/min で行った。室温は 25±1 ℃とした。マウスを予め 5 分間観察チャンバー内で odorant-X に暴露しO r e x i n neu r o n s i n hy p ot h a l a mu scontribute to odor-induced analgesia
Hideki Kashiwadani
Graduate School of Medical and Dentalsciences, Kagoshima University

た後、左後肢足底に 20 µL の 2 % ホルマリン液を皮内注入し、観察チャンバー内に戻した後、ホルマリン誘発性疼痛行動を観察した（ホルマリンテスト）。疼痛行動は注入側後肢のlicking, lifting, flinching, biting に費やした時間の計測で行− 90 −

香り誘発性鎮痛の視床下部オレキシン神経による調節

い、5 分間毎の疼痛行動量としてあらわした 1）。匂い暴露す作業を 4 回行った。馴化後、マウスを同型のケージに移群のコントロールとして、無臭空気暴露群の疼痛行動量をし、匂い分子 20µL を染み込ませた 2×2 cm のろ紙を静置測定し、疼痛行動量差を検証した。ホルマリンテストでは、した同型のケージにマウスを移し、ろ紙の嗅探索行動時間ホルマリンによる侵害受容器刺激性疼痛と中枢シナプス感を計測した。

作及び末梢炎症性疼痛の表出時間の異なる 2 相性の疼痛行動を示すことが知られている。Odorant-X 香気誘発鎮痛

2. 6. innate odor avoidance test

がどちらの疼痛行動に影響与えるかを検証するため、疼痛

マウスの odorant-X に対する生得的な嫌悪を判定する
ため、innate odor avoidance test（IOA test）を行った 4）。

行動量差は 1 相、2 相に分けて検証した。

実験は 3 室の連なった手製のテストチャンバーを用い、両2. 2. 動物（マウス）側のチャンバーは無臭空気または香気で換気（１L/min）で香気誘発性鎮痛に対するオレキシン神経の関与を検証
2）きるよう設定した。実験 2 日前、無臭空気で換気したテスするため、オレキシン神経除去マウス 、及びオレキシントチャンバー内にマウスを静置し、60 分間自由にチャンペプチド欠損マウス 3）における匂い誘発性鎮痛を検証した。

バー内を探索させ装置に馴化させた。翌日、両側のチャンこれらのミュータントマウスは、共同研究者である桜井武

バーを無臭空気で換気した状態でマウスを中央チャンバー教授（金沢大学大学院医薬保健学総合研究科）より提供をに静置し、両側のチャンバーへの侵入回数及び滞在時間を受けた。実験は雄マウス（25−32g）を用いて行った。複数10 分間測定し、両側チャンバーの好悪に関してバイアス回実験による学習効果を除外するため、全ての動物は 1 度がかかっていないことを確認した。実験当日、片方の匂いのみ疼痛実験に用い、ホルマリンテスト終了後直ちに麻酔

チャンバーを無臭空気で、他方のチャンバーにオルファク薬の過剰投与により安楽死させた。オレキシン神経活性化

トメーターから導入した香気で還流し、それぞれのチャンを c-Fos 発現により検証する際は、ミュータントマウスのバーへマウスが探索した回数及び滞在時間を 10 分間計測

background strain である C57BL6 マウスを用いた。

した。

2. 3. 匂い分子2. 7. 血中コルチコステロンの ELISAによる定量

Odorant-X は東京化成工業より入手した。匂い分子のOdorant-X 暴露によるマウスのホルモン性ストレス応劣化を防ぐため、odorant-X は 4 ℃で保存し、実験毎に分答を計測するため、匂い刺激60分後のコルチコステロン（ス注して用いた。

トレスホルモンの一種）の血中濃度を ELISA 法により計測した。オルファクトメーターを用いて 60 分間匂い暴露し2. 4. 免疫抗体染色た後、素早く（15 秒以内）断頭を行い、EDTA 管に全血採オレキシン神経の c-Fos 活性化を検証するため、抗オレ血した。ELISA には corticosterone ELISA kit（ADI-900-

キシン A 抗体と抗 c-Fos 抗体による免疫抗体蛍光二重染

097, ENZO, NY, USA）を用い、添付のプロトコルに従い色を行った。1 時間の匂い暴露後、ウレタン水溶液（1. 5g/計測を行った。

kg, i.p.）により深麻酔し、4%PFA により灌流固定を行っ3．結た。抜脳後 40 µm 切片を作成し、floating staining methodを用いて染色を行った 4）。c-Fos の可視化にはウサギ抗果3. 1. オレキシン神経除去マウスでは匂い誘発性鎮痛

c-FosA 抗血清（1/1000, oncogene）、ビオチン化抗ウサギが消失する

IgG 抗体（1/250, Jackson ImmunoResearch）及びストレプ

Odorant-X 香気誘発性鎮痛に対するオレキシン神経のト ア ビ ジ ン 結 合 AlexaFluor488 抗 体（1/200, Invitrogen）

寄与を検証するため、オレキシン神経を選択的に除去したを、オレキシン神経の可視化にはヤギ抗オレキシン抗血清マウス（ORX-AB）を用い、odorant-X 暴露下及び無臭空（1/100, Santa Cruz）
及びCF568結合抗ヤギIgG抗体（1/200,気暴露下でのホルマリン誘発性疼痛行動量を測定した。

Biotium）を用いた。c-Fos 陽性細胞のカウントは、1 匹あたり視床下部を含む 3 枚の脳切片から行った。

図 2A は ORX-AB においてホルマリン性疼痛の 1 相及び2 相の総疼痛行動量を odornat-X 暴露群と無臭空気暴露群で比較している。1 相、2 相両相で疼痛行動量は両群で大差

2. 5. innate odor preference testがなく、野生型マウスで観察された odorant-X 暴露によるマウスの odorant-X に対する生得的な好悪を判定する

疼痛行動量減少は観察されなかった（p>0.05 ; マンホイット

ため、innate odor preference test（IOP test）を行った 5）。

ニー U 検定）。この結果から、odorant-X 誘発性鎮痛の発現動物を実験環境及び手順に慣らすため、プラスチックケーには視床下部オレキシン神経が必要不可欠であることが示

ジ（20×15×13 cm）に静置し、30 分毎に新しいケージへ移唆された。

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3. 2. オレキシンペプチド欠損マウスでは匂い誘発性鎮痛が消失するかを検証するため、野生型マウスでホルマリンテスト時

オレキシン神経は、神経伝達物質としてオレキシンの他カーである最初期遺伝子産物 c-Fos を発現するオレキシにグルタミン酸等を含有することが知られている。そこで、ン神経の割合を定量化した。その結果、コントロール群

香気誘発性鎮痛にはオレキシンペプチドによる神経伝達が及び odorant-X 暴露群の両群で視床下部オレキシン神経必須であるのか、あるいはオレキシン神経に含まれる他ので c-Fos 発現細胞が観察されるが、odorant-X 暴露群で有神経伝達物質による神経伝達が必須であるのかを検証する

意に c-Fos 陽性オレキシン神経の数が増加していた（図 3）。

ことを目的とし、オレキシンペプチドを選択的に欠損させこれらの結果は、odorant-X 香気暴露により活性化されるたマウス（ORX-KO）を用いて、odorant-X 香気誘発性鎮視床下部オレキシン神経が増加し、その結果 odorant-X 香痛を検証した。

気誘発性鎮痛が発現することを示唆している。

同様 1 時間の odorant-X 香気暴露を行い、神経活性マー

図 2B は ORX-KO においてホルマリン性疼痛の 1 相及びで比較している。1 相、2 相両相で疼痛行動量は両群で大3. 4. Odorant-X 刺激はマウスに強いストレス応答を引き起こさない差がなく、野生型マウスで観察された odorant-X 暴露によOdorant-X 香気暴露はマウスに有意な鎮痛効果をもたる疼痛行動量減少は観察されなかった（p>0.05; マンホイッ

らすが、これは odorant-X 暴露がマウスに強いストレスをトニー U 検定）。この結果から、odorant-X 誘発性鎮痛の引き起こし、その結果ストレス誘発性鎮痛が惹起された可発現にはオレキシンペプチドによる神経伝達が必要である能性が考えられる。odorant-X がマウスに強いストレスをことが示唆される。

引き起こすのであれば、マウスは odorant-X に対して忌避2 相の総疼痛行動量を odornat-X 暴露群と無臭空気暴露群行動をとることが予想されるため、innate odor preference

3. 3. Odorant-X 刺激によりオレキシン神経は活性化するtest（IOP test）及び innate odor avoidance test（IOA test）

Odorant-X 刺激で実際オレキシン神経が活性化される

IOP test で、odorant-X 香気を付着させたろ紙の探索時により odorant-X に対する忌避性を検証した。
間と無臭ろ紙の探索時間を比較した所、有意な差は検出されず、odorant-X 香気付着ろ紙の探索時間が延長する傾向を示した（p>0.99 ; ダン多重比較検定）。一方、マウスに先天的忌避行動を誘発する trimethylthiazolin（TMT）を付着させたろ紙に対する探索行動は無臭ろ紙と比較し有意に減少した（p<0.05 ; ダン多重比較検定）。
次に IOA test で odorant-X 香気灌流チャンバーと無臭空気灌流チャンバーの滞在時間を比較した所、有意な差は検出されなかった（p>0.99 ; ウィルコックソン検定）。一方、TMT 灌流チャンバーでは有意に滞在時間が減少した（p<0.05 ; ウィルコックソン検定）。

図 2 オレキシン神経除去マウス（A) 及びオレキシンペプチド欠損マウス（B) では odorant-X 香気誘発性鎮痛は消失する

図 3 Odorant-X 香気暴露により、視床下部オレキシン神経において c-Fos 蛋白質陽性細胞数は増加する− 92 −

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これらの odorant-X に対する好悪行動テストから、マウの匂い分子しか検証できない。一方、電気生理学的手法をスは odorant-X に対して、TMT 臭気に示す忌避行動を惹用いると、1 細胞あたり 30 程度の候補分子の応答を検証起することはなく、TMT がもたらすような強い忌避性スすることが可能であり、また 1 匹あたり 20 程度の細胞のトレスを引き起こさないことが示唆された。

応答を記録することができる。この新しいスクリーニング

更に、odorant-X がマウスへ与えるストレスをより直接的に検証するため、ストレスホルモンの一種であるコル法を用いることで、より鎮痛効果の高い香気成分の分離同定が容易になることが予想される。

チコステロンの血中濃度変化を ELISA 法により検証した。

これまでに明らかになった odorant-X 香気誘発性鎮痛にげっ歯類に有意なストレス反応を引き起こす TMT 暴露で関するデータをまとめた論文を執筆・投稿したところ、複はコルチコステロン量は有意に増加したが（p<0.0001; テュ数の査読者から機械的痛覚刺激に対する香気誘発性鎮痛ーキー多重比較検定）、odorant-X 香気暴露時にはコルチの効果を付け加えるべき、というコメントがついた。そコステロン量の有意な増加は見られなかった（p>0.20 ; テ

こで古典的な von Frey 法により機械的痛覚刺激に対するューキー多重比較検定）。これらの結果より、odorant-X

応答閾値の測定を試みたが、香気刺激後動物が安静状態暴露はマウスに対して忌避行動を惹起するような強いストに至るまでの経過時間にばらつきが大きく実験手法としレスをもたらすことなく、odorant-X 誘発性鎮痛はストレて不適当であることが判明した。そこで本申請で新たにス誘発性鎮痛とは異なる機序で発現していると考えられる。

pincher test 装置を購入しコントロール実験を行った。そ4．考の結果、非常に高安定度及び高時間分解能でマウスの機械察的痛覚閾値の測定が可能であることが明らかになった。現

本研究により、odorant-X 香気誘発性鎮痛の発現には、オレキシン含有神経が必要であることが明らかになった。

在、pincher test 装置により機械的痛覚刺激に対する香気誘発性鎮痛の効果を検証中である。

オレキシン含有神経は視床下部に局在することが知られて5．統おり、睡眠覚醒、摂食、体温調節、循環調節、鎮痛とい括った多様な自律神経調節に深いかかわりを持つ 6）。これま

本助成による研究で、odorant-X 誘発性鎮痛が視床下部でに、ストレス誘発性鎮痛発現にオレキシン神経が関与すオレキシン含有神経を介して発現することが明らかになっることが示唆されてきた 7）。ストレス誘発性鎮痛と香気誘た。しかしながら、嗅覚情報がどのような神経経路を介し発性鎮痛はオレキシンを活性化する入力経路に差があるが、てオレキシン神経を活性化するのか、あるいはオレキシン共通した出力系により鎮痛効果を発現する可能性が考えら神経からの出力がどのような経路を介して実際鎮痛効果をれる。

もたらすのか、いまだに不明である。上述の c-Fos 発現をまた、オレキシン神経は直接脊髄後角に軸索投射し、上7）

指標に本申請者はオレキシン神経の上流、下流の神経回路向する疼痛情報を抑制する可能性が指摘されている 。実の解明に取り掛かっており、いくつかの候補経路が見出さ際、脊髄内にオレキシン受容体アゴニストを局所注入するれている。今後これらの経路の薬理学的、電気生理学的ブことで鎮痛効果が現れることが示されている 8）。また、オロックにより実際香気誘発性鎮痛が遮断されるか検証する

レキシン神経は中脳水道鎮痛回路を賦活化し、下行性抑制予定である。これら香気誘発性鎮痛の神経回路を解明する系を介して鎮痛効果を現すことも、薬理学的方法で示されことにより、香気誘発性鎮痛を臨床応用するための基礎デ

9）ている 。香気誘発性鎮痛は、多機能性ペプチドであるオータを得ることができる。また本研究により odorant-X はレキシンの受容体を直接的に刺激することなく鎮痛を誘発マウスに対して明らかな忌避性ストレス反応を引き起こすできるため、臨床応用への障害がより少ないと考えている。

ことがなく、odorant-X 誘発性鎮痛はストレス誘発性鎮痛

本研究で用いた鎮痛香 odorant-X は、これまでアロマセとは異なる機序で発現することが強く示唆された。これら

ラピーの世界で鎮痛効果を持つと信じられている複数の植の結果は香気誘発性鎮痛の臨床応用へ大きな前進となり、物由来香気成分から、ガスクロマトグラフィ等により分離機能性香気研究の重要な手掛かりとなると予想される。

同定された匂い分子リストを作成し、マウスの行動学的スクリーニングで見出した。本研究によりオレキシン神経が（文献）鎮痛効果発現のハブとなっていることが明らかになったた

1） Miyata M, Kashiwadani H, Fukaya M, et al: Role ofめ、オレキシン神経をターゲットとした麻酔下マウスを用

thalamic phospholipase Cb4 mediated by metabotropic

いた電気生理学的手法により、鎮痛作用を持つ候補香気をglutamate receptor type 1 in inflammatory pain, J.

より効率的にスクリーニングすることが可能となった。ホ

Neurosci., 23, 8098-108, 2003

ルマリンテストを用いると 1 匹あたり 1 時間程度の時間を

2） Chemelli RM, Willie JT, Sinton CM, et al: Narcolepsy

要し、また動物の学習効果等を勘案すると 1 匹あたり 1 つin orexin knockout mice: molecular genetics of sleep− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

Nat. Rev. Neurosci.15, 719-31, 2014

regulation, Cell 98, 437-51, 1999
3） Hara J, Carsten TB, Nambu T, et al: Genetic ablation

7） Kuwaki T: Orexin links emotional stress toof orexin neurons in mice results in narcolepsy,

autonomic functions, Auton. Neurosci. 161, 20-7, 20118） Yamamoto T, Nozaki-Taguchi N, Chiba T: Analgesic

hypophagia, and obesity, Neuron 30:345-54, 20014） Yonemitsu T, Kuroki C, Takahashi N, et al:effect of intrathecally administered orexin-A in theTRPA1 detects environmental chemicals and induces

rat formalin test and in the rat hot plate test, Br. J.

avoidance behavior and arousal from sleep, Sci. Rep. 3,Pharmacol. 137, 170-6, 2002
9） Azhdari Zarmehri H, Semnanian S, Fathollahi Y, et3100, 20135） Kobayakawa K, Kobayakawa R, Matsumoto H, et al:

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Innate versus learned odour processing in the mouseof orexin-A decreases formalin-induced nociceptive

olfactory bulb, Nature 450, 503-8, 2007

behaviors in adult male rats, J. Pain 12, 280-7, 20116） Sakurai T: The role of orexin in motivated behaviors,− 94 −