ごあいさつ
日本経済は低迷を続け、デフレという戦後はじめての経験の中、その脱出法を模索する状況にあります。このような環境下、世界に伍して戦える力量を回復するには、大学等が持つ知識を産業界に移管する社会システム構築に向けた構造改革が必要であると言われています。科学技術会議は、「21 世紀初頭科学
技術政策の指針」を提言し、わが国の目標として「知の創造と活用により世界に貢献できる国」「国際競争力があり持続的発展ができる国」「安心、安全で快適な生活のできる国」という３つの国家像を目指すべきであり、その為の社会構造の改革を提案しています。そして文部科学省は「大学（国立）の構造改革の方針」の中で、21 世紀を「知の時代」と定め、大学の再編・統合を推進し、①教育研究体制の充実強化②地域貢献、社会貢献の機能強化③経営基盤の強化を挙げ、大学の個性化、統合による学際的領域研究の促進などを目指しています。
これらの方向は当財団が研究助成を通じて目指す方向と一致しており、特に学際領域の研究がより促進されることは喜ばしい方向付けであり、期待を持ちつつ今後も「化粧品学」の体系化に向けた助成活動を堅持していく努力をしていきたいと考えております。
今後とも皆様方の益々のご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 14 年 8 月
財団法人

コスメトロジー研究振興財団
理事長

目

次

■ ごあいさつ■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・ 植物由来のクロロゲン酸代謝産物を用いた化粧品素材としての配糖体の合成とその美白効果に関する研究……………………………………………………… 2
近畿大学工学部

・ 化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

正人………………………………………………………… 8
早稲田大学理工学部

・ 微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大量生産

木 野

邦器

…………………………………………………12
筑波大学応用生物化学系

・ 酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発

野 村

小 林

達彦

……………………………………………………………………………16
大阪大学大学院工学研究科

・ 化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

増 井

敏行

……………………………………………………………20
東北大学多元物質科学研究所

白 井

誠之

Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・ 高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用………………………………………………26
広島大学医学部

・ 糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

政則………………………………………………………………30
大阪大学大学院医学系研究科

・ ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

谷 口

直之

………………………………36

東京医科歯科大学難治疾患研究所
・ 皮膚色素性病変の新しい診断法の開発

杉 山

堀

久枝

…………………………………………………………………………42
北海道大学大学院医学研究科

松 村

哲理

・ A、B 領域紫外線の直接照射により SCID マウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防
大阪大学医学部・ ヒト皮膚線維芽細胞における I 型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

本 行

……46

忠志

…………………………51

畑

神奈川歯科大学歯学部

隆一郎

・皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究 ……………………………………………56
東北大学大学院薬学研究科
・ 爪の形状に対する VII 型コラーゲンの変異がかかわる影響について

中 畑

則道

………………………………………62

北海道大学医学部附属病院
・ 上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化
東北大学大学院医学系研究科

松 村

和子

………………………66

大和田

祐二

目

次

Ⅱ．精神、文化に関する分野＊■ 記念講演平成 13 年度記念講演 『美人研究』 ………………………………………………………………………………73
国際日本文化研究センター 井 上■ コスメトロジー研究雑感■付章一………………………………………………………………………………………………83

録
平成 13 年度事業報告
役員一覧………………………………………………………………………………………………95……………………………………………………………………………………………………………98（＊本号にはこの分野の報告はありません）

植物由来のクロロゲン酸代謝産物を用いた化粧品素材としての配糖体の合成とその美白効果に関する研究
近畿大学 工学部化学環境工学科、近畿大学

野

村

正

人、澤

辺

昭

農学部農芸化学科♯
♯

義 、藤

原

義

人

Research in the areas of medical and cosmetic treatments has progressed rapidly though the use of plants andherbs. As soon as an evident biological activation substance is extracted independently from a natural ingredient,research of all its chemical synthesis of similar compounds, exchange of microorganisms, and biological metabolism isalso studied, for research and development in hope of a stronger biological activation. On the other hand, because ofenvironmental destruction on a global scale is a problem with the effect on the human body. The ubiquitous use of flongas and the resulting destruction of the ozone layer was led do increasing ultraviolet radiation reaching the surface ofthe earth and the consequential thus led to an increase to melanin which causes the formation of stains and freckles.
The investigation of natural products have bee increased expecting the effectiveness and safety. Caffeic acid
（3,4-dihydroxy cinnamic acid）（2）, ferulic acid（trans-4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid）（3）and isoferulic acid（trans3-hydroxy- 4-methoxy cinnamic acid）（4）may be readily obtained by hydrolysis of chlorogenic acid（1）．
（1）was isolated
from green coffee beans. In this report, we synthesized three compounds（2）（- 4）form 3, 4-dihydroxy benzoic aced（5）, 4-hydroxy-3- methoxy benzoic acid（6）and 3-hydroxy-4-methoxy benzoic acid（7）by reduction（LiAlH4）, Jones
oxidation and condensation with malonic acid.
We conducted tests targeted at the tyrosinase activity, superoxide scavenging activity and hyaluronidase activity
inhibitor for compounds and made evaluation in the direction of practical use. Of the compounds（3）and（4）showedstrong tyrosinase inhibitory activity and superoxide scavenging activity. Some of these compounds are only effectivein the tyrosinase stage, while the compounds（3）and（4）in this report are show a high inhibition effect in both thetyrosine and DOPA stage. We found favorable results daggering from cosmetic whiteners that originate from naturalingredients that have been reported in the past.

１．緒

気中への放出により，オゾン層の破壊が起こり，地表に届

言

く紫外線が増加し，シミおよびソバカスの生成をもたらす

古来から，人間が病気にかかったときに，それを治そう

原因であるメラニンの生成が増加するなど紫外線の人体へとして昔から頼ってきたものに，日常ごく身近な植物があ及ぼす影響が問題となっている３）。こうした現状から，美った。植物を用いる治療方法が人類の歴史の古い時期から

白化粧品に対する消費者の要求はその機能と効果に注がれ自然に行われてきたことは，今日病気にかかった野生動物ている。そこで，自然界に広く分布している植物性食品中が特定な植物を食する行動によってもおしはかることがでに含有されるクロロゲン酸⑴の生物活性に注目した。すな

きる。世界各地に文明が栄え始めた頃から，薬用植物に関

わち，活性酸素抑制効果および人体での変異性病原性物質する知識も芽生え，その後，数多くの薬物書が生まれ，今の生成を阻害するなどの薬理効果がある⑴を含有する植物

日の生薬学に至っている。現在，天然有機物質が医薬品なの摂取により，生体内で分解され最終代謝物としてカフェ

らびに化粧品開発の分野における宝庫であることは，今も酸⑵，フェルラ酸⑶，イソフェルラ酸⑷およびバニリン酸

昔も変わらず，これらに関する研究が盛んに行われてい（4- ヒドロキシ -3- メトキシ安息香酸）⑹などになることる。ひとたび天然有機物質から顕著な生物活性物質が単離が知られている４）。

されれば，その化学的全合成，化学構造の修飾，類似化合

本研究では⑵，⑶および⑷を基質にとり，アセトブロモ

物の合成，微生物変換，生化学的代謝の研究が行われるな-α-D- グルコースなどの多糖類との縮合反応により，水ど，より強い生物活性を期待した研究開発が実施されてい溶性配糖体を効率的かつ経済的に合成する手法を確立した。

る

１，
２）

得られた配糖体については，酵素レベルでの美白効果試験

近年地球規模での環境破壊問題の一つとして，冷蔵庫，と B-16 細胞に対する毒性試験を実施し，機能性化粧品材

エアコンなどの冷媒として使用されているフロンガスの大料化学への展開について検討する。また，植物性食品中に。

Studies on the Synthesis of the Glycoside andWhitening Effects as a Cosmetics Material Using the
Chlorogenic acid its Metabolite Contained in the Plants.

性物質の生成を阻害するなどの薬理効果がある⑴からの代謝物であり，生体内で分離される最終代謝物の⑵，⑶およMasato Nomura, Akiyoshi Sawabe , and＊Yoshihito Fujihara

び⑷を，それぞれ 4- ヒドロキシ -3- メトキシ安息香酸（バDepartment of Chemistry and Environmental Technology,
Faculty of Engineering, Kinki University, Department ofAgricultural Chemistry Faculty of Agriculture, Kinki University ♯ヒド⑺および 3,4- ジヒドロキシ安息香酸⑸から効率よく♯＊広く含有し活性酸素抑制効果ならびに人体での変異性病原ニリン酸）⑹，3- ヒドロキシ -4- メトキシベンズアルデ
合成する手法の確立と同時に，これらを含む数種の関連化−2−

植物由来のクロロゲン酸代謝産物を用いた化粧品素材としての配糖体の合成とその美白効 に関する研究

合物⑹ , ⑻および⑼についての美白効果ならびに任意のドロキシケイ皮酸⑵を収率 58.2％で得た。

割合で混合した試料 A 〜 J についても美白効果を検討し，個々の化合物間での相乗効果による美白効果向上について

２. ３. ３も明らかにした。

脱水ジクロロメタン 5mL にアセトブロモ -α-D グルコー

２．実
２. １

グリコシド体（配糖体）の合成

ス 0.617g（1.5×10-3mol），トリフルオロメタン酸スズ（II）

験

0.625g（1.5×10-3mol）を入れ，室温下で撹拌した後，こ試薬の混合溶液に常法どおりの操作により誘導したフェルラ酸

出発原料である 4- ヒドロキシ -3- メトキシ安息香酸⑹，メチル 0.208g（1.0×10-3mol）の脱水ジクロロメタン溶液

3- ヒドロキシ -4- メトキシベンズアルデヒド⑺および 3,4-5mL と，1,1,3,3- テトラメチル尿素 0.2g（1.7×10-3mol）をジヒドロキシ安息香酸⑸は，市販品（和光純薬製および東加え，18 時間撹拌した。反応終了後，炭酸水素ナトリウム

京化成工業製）を使用した。

水溶液 100mL を加え，ジクロロメタンで抽出（100mL×2）した。ジクロロメタン層を飽和塩化ナトリウム水溶液

２. ２

機器分析

にて洗浄した後，無水硫酸ナトリウムで乾燥，溶媒を留去

各縮合生成物の構造については，既報５）に記載した方し，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 n- ヘ
キサン：酢酸エチル＝ 1：1）により精製し，フェルラ酸メ

法により確認した。

チルテトラアセチルグリコシドを収率 79.5％で得た。つい

２. ３

合成方法

２. ３. １

で，フェルラ酸メチルテトラアセチルグリコシド 0.271g（5フェルラ酸（4- ヒドロキシ -3- メトキシケイ

×10-4mol）をナトリウムメトキシドを用いて，脱アセチル皮酸）⑶およびイソフェルラ酸（3- ヒドロキシ -4- メ

化した後，イオン交換樹脂（DOWEX-50W）を用いて中和

トキシケイ皮酸）⑷の合成した。イオン交換樹脂をろ別した後，減圧下に溶媒を留去し，-2

水素化アルミニウムリチウム（LiAlH4）0.4g（1.05×10

シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホmol）をテトラヒドロフラン（THF）30mL に懸濁し，4- ヒ

ルム：メタノール＝ 5：1）により精製し，フェルラ酸メチ

ドロキシ -3- メトキシ安息香酸⑹ 1.0g（5.95×10 mol）をルグリコシド（3-Glc）を 01.22g（収率 65.9％）得た。同

溶解した THF 溶液 15mL を 1 時間を要して滴下した。そ様の操作をイソフェルラ酸⑷について行い，イソフェルラの後，室温で 4 時間撹拌した。反応終了後，油分をエー

酸メチルグリコシド（4-Glc）0.097g（収率 52.6 ５）を得た。

-3

テル抽出し水洗したのち，無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
溶媒を留去し 4- ヒドロキシ -3- メトキシベンジルアルコー

２. ４

生物活性試験

ルを収率 86.5％で得た。ついで，このアルコール 1.0g（6.49

２. ４.１ チロシンを基質としたチロシナーゼ阻害活性試験

×10-3mol）をジクロロメタン 30mL に溶解したのち，PDC

それぞれの化合物を所定の濃度（0.1mM）に調製したの試薬（CrO3：H2O：Pyridine：Acetone = 4g：4mL：3.2g：

ち，チロシナーゼ（Sigma chemical 社製，EC1.14.18.1）

16g）2.3g を溶解したジクロロメタン混合溶液 15mL を冷を用いて，前報６）に従って操作し 475nm に設定した分

却下に 1 時間を要して滴下した。その後，室温で 48 時間

光光度計で測定した。

撹拌した。反応終了後，油分をエーテル抽出し水洗した後，無水硫酸ナトリウムで乾燥，溶媒を留去し，4- ヒドロキ

２. ４. ２ DOPA を基質としたチロシナーゼ阻害活性試験

シ -3- メトキシベンズアルデヒドを収率 72.2％で得た。次

3,4- ジヒドロキシ -L- フェニルアラニン（DOPA）（和にマロン酸 1.25g（1.20×10 mol）を溶解したピリジン溶

光純薬社製）を所定の濃度（1.66mM）に調製したのち，液 10mL に，このアルデヒド 1.5g（9.87×10 mol）を加え，

２. ４. １項に示した前報６）に準じて行った。

-2-3

油浴上（70 〜 75℃）で 2 日間加熱撹拌した。反応終了後，油分を常方通り後処理を行い 4- ヒドロキシ -3- メトキシケ

２. ４. ３

活性酸素消去効果試験

イ皮酸⑶を収率 62.4％で得た。また，3- ヒドロキシ -4- メ

それぞれの化合物を所定の濃度（0.714mM）に調製したトキシベンズアルデヒド⑺についても同様な操作を行い 3-

後，Superoxide dismutase（SOD），ワコーテスト試薬（和ヒドロキシ -4- メトキシケイ皮酸⑷を収率 60.8％で得た。

光純薬社製）を用いて前報６） に従って操作し，生成するジホルマザンを 560nm に設定した分光光度計で測定した。

２.３. ２ カフェ酸（3,4- ジヒドロキシケイ皮酸）⑵の合成
２. ４. ４3,4- ジヒドロキシケイ皮酸⑸ 1.0g（6.49×10-3mol）をヒアルロニダーゼ阻害活性試験

用いて，２. ３. １の項に示した LAH 還元，PDC 酸化お

0.4％のヒアルロン酸を含むリン酸緩衝液（pH 6.0）をよびマロン酸縮合の操作方法に従って順次行い，3,4- ジヒ

調製したのち，ヒアルロニダーゼ（Sigma chemical 社製，−3−

EC3.2.1.35）を用いて前報 ６） に従って Ostwald 粘度計

合わせのみで合成可能な出発原料として市販品 ( 和光純薬

（No.4）で測定した。

製および東京化成工業製 ) である⑸，⑹および⑺用いて行った結果，⑹から⑶を 39％の収率で，⑺から⑷を 60.8％

３．結果および考察の収率で得ることができた。また，⑸から⑵を 25.5％のクロロゲン酸⑴は植物性の食品原料中に存在するが，と収率で得ることができた。

くに嗜好品の一つであるコーヒー中には比較的多量に存在

つ ぎ に， こ れ ら 合 成 し た 化 合 物 ⑵ , ⑶ お よ び ⑷し，その供給源として重要であり，コーヒー製品が人体にと⑴からの分解生成物として可能性のある化合

与える生理学的影響についての研究物⑻および⑼について，化粧品配合剤の美白効果を期待し，も盛んに行われて

７, ８）。たとえば，⑴は胃腸管内に吸収されると血清中

チロシナーゼ阻害活性，活性酸素消去効果ならびにヒアルや胆汁中には検出されず，キニン酸とカフェ酸⑵に分解さロニダーゼ阻害活性試験を検討した結果を表１に示す。まれ，さらに代謝される。⑵は腸内バクテリアにより m - ヒ

た，比較物質として用いた⑽〜⑿についても表１に示す。

いる

７，８）

ドロキシプロピオン酸に変換されたのち，脱炭素され，ごシミおよびソバカスの生成原因であるメラニンの生合成

く一部は肝臓中でメチル化⑶，⑷および⑹になる（Scheme

経路における酵素チロシナーゼはチロシンをヒドロキシル1）。そこで，これら化合物を簡便で収率よく得る合成方法

化して DOPA に変化し，さらに DOPA を酸化してドーパの確立とともに高付加価値的利用の一つとして化粧品美白

キノンに変化する段階で触媒として作用するため，チロシ剤への検討を行った。まず，これら化合物の合成方法としナーゼを阻害することでこれらを抑制することが可能とさて，Scheme 2 に示した酸化 ･ 還元 ･ マロン酸縮合の組みれている。このことをふまえて，チロシナーゼ阻害活性をScheme 1

Scheme 2−4−植物由来のクロロゲン酸代謝産物を用いた化粧品素材としての配糖体の合成とその美白効 に関する研究検討したところ，とくに，⑴および⑴の分解生成物であるどがある。このようなことから，その活性を抑制する⑶および⑷はチロシン基質と DOPA 基質において，いずれことで，小じわやカサツキなどの老化を防ぐことがでも良好な阻害を示す数値が得られ，美白効果が期待される。

き，機能性化粧品の特徴の一つとして重要であることから，つぎに，DNA の攻撃，皮膚老化の促進あるいはメラニン生

今回の化合物についても検討したところ，いずれも著しい−

成に影響を及ぼすなどの有害作用がある活性酸（O2 , O2,1阻害活性を示す数値は得られなかった。

H2O2, LOOH, ･OH）に対する消去効果について検討したとこ

以上，3 つの阻害活性試験の結果から，それぞれの化合

ろ，⑴ , ⑵および⑷に良好な消去効果を示す数値（いずれも物を単独で使用するよりも混合物として使用する方が，生70％以上）が認められ，これらの症状に対する働きのある化薬あるいは漢方に見られるような相乗効果が生じて，よ粧品配合剤としての利用も可能であるものと思われる。

り良い阻害効果が期待できるものと考え，表１に示した

一方，動物の様々な組織，間接液あるいは皮膚などに結果から⑴〜⑷，⑹，⑻および⑼の化合物を表２に示し存在するヒアルロン酸の分解酵素として考えられていたそれぞれの任意の割合で調合し，美白効果（チロシるヒアルロニダーゼの働きとしては，細胞間隙の水分保持，ナーゼ阻害活性試験および活性酸素消去効果）を検討した。

細菌感染の防止あるいは皮膚の潤滑化と柔軟性の保持な

その結果を表３に示す。
チロシナーゼ阻害活性試験では化合

表１

化合物⑴〜⑿の美白効果試験結表２

化合物⑴〜⑼試料の混合割合

−5−

表３

混合試料 A 〜 J 美白効果試験結Scheme 3

Scheme 4

物⑶および⑷の調合割合が阻害活性に大きな影響を及ぼす

入した化合物（3-Glc）および（4-Glc）の合成を行ったとことが認められ，
いずれも DOPA 基質において，その阻害活

ころ，収率よく合成（Scheme 4）することができた。こ性が向上（40％以上の数値）した。
その中でもとくに，
試料番

れら 2 種類のグリコシド体の美白効果試験を実施した結号 B および C ではチロシンを基質とした場合においても，果を表４に示す。それぞれの阻害活性は測定する試料濃度

良好な阻害活性が認められた。また，活性酸素消去効果試にも依存することが明らかであり，しかもこれら化合物は

験においても著しい抑制効果を示す数値（90％前後）がいずれも高い水溶性を持たせることができたことから，今得られたことから，さらに測定濃度を希釈（0.1％）した

回の測定実験においても同様に，最終濃度を 0.1mM で行場合にも，良好な消去効果を示す数値が得られた。

った。その結果，とくに前駆体である化合物⑶および⑷のつぎに，著者らはチロシナーゼ阻害活性および活性チロシナーゼ阻害活性が比較的高い値を示したのに対し酸素消去効果試験でそれぞれ高い阻害効果が認められて，誘導したグリコシド体（3-Glc）および（4-Glc）では，た化合物⑶および⑷について，実用的使用を考慮し水いずれも阻害活性値が小さくアルブチンと同等の値を示すに可溶な化合物に誘導することにより，皮膚浸透性を高め，ことがわかった。また，著者らもこれらマッシュルーム由

同時に美白効果も保持されるものと思い，グルコースを導来のチロシナーゼに対する阻害活性機序は，拮抗阻害があ−6−植物由来のクロロゲン酸代謝産物を用いた化粧品素材としての配糖体の合成とその美白効 に関する研究

表４

配糖体（3-Glc）および（4-Glc）の美白効果試験結ることを明らかにしており，今回の測定濃度は細胞増殖に値は得られなかった。しかし，市販品であるアルブチンと影響のない濃度であると思われることから，フェニルプロ

同等の値を示すことを明らかにすることができた。

パノイドがメラノサイトに作用することなくメラノサイトに対するチロシナーゼ阻害または，整合性阻害が生起して（参考文献）

いるものと考えている。

１） C. H. Muller, W. H. Muller, B. L. Haines, Science,
143, 471（1964）．

このようなことから母格のフェニルプロパノイドのベンゼン環にヒドロキシル基とメトキシ基が存在し，側鎖に α２） H. Okudaira, Medicam News, 1323, 20（1991）．

,β- 不飽和カルボン酸が存在しているそれぞれの化合物を

３） W. H. Eaglstein, Cosmetic and Perfumery, 90, 25

任意の割合で混合することにより，相乗効果が著しく発現（1975）．

し，美白剤として重要であるチロシナーゼ阻害活性およ４） A. N. Booth, O. H. Emerson, F. T. Jones, J. Biol.
Chem., 229, 51（1957）．

び活性酸素消去効果を期待どおり向上させることができた。また，著者らは比較物質として用いたオイゲノールの

５） 野村正人 , 立花伸哉 , 山田康裕 , 藤原義人 , 農化 , 73,
605（1999）．

グルコース配糖体としてアフリカ産食用葉のノゲイトウ（Celosia Argentea L.）に含まれるシトラシン C（Scheme 3）６） 野村正人 , 西村和彦 , 藤原義人 , 多田貴広 , 服部文弘
, 下村健次 , 油化学 , 49, 143（2000）．

の合成に成功するとともに，非常に高い美白効果があることについても明らかにすることができたことから，クロロ

７） M. P. Lachance, J. Food Safety, 4, 71（1982）．

ゲン酸分解生成物である⑶および⑷の配糖体合成を行い美８） P. W. Curatolo, D. Robertson, Ann. Int. Med., 98, 641

白効果を検討したが，シトラシン C よりも高い阻害活性（1982）．

−7−

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

早稲田大学

木

野

邦

理工学部

器、桐

村

光 太 郎

In generally microorganisms, L-cysteine is synthesized from sulfide and O-acetyl-L-serine (OAS) by O-acetylserine
sulfhydrylase (OASS).  On the other hand, tryptophan synthase (TS) consist of α-subunit and β-subunit forming α2β2complex.  An α-subunit and β-subunit can exist as α monomer and β2 homodimer in cell, respectively.  It is known threedimensional structure of TSβ is similar to that of OASS-A which is an isozyme of OASS, although nucleotide sequences
are identified only 20%.  And TSβ can recognize not only OAS but also L-serine as substrate and synthesize L-cysteinefrom L-serine and sulfide.   β2 complex has the activity of β-replacement and β-elimination reaction, and it catalyzes
β-elimination reaction more than the other one.  However α2β2 complex catalyzes β-replacement reaction more.
We attempt to synthesize L-cysteine from L-serine and sulfide by using the enzyme reaction of TS overexpression
organism.   At first trpB and trpA gene were cloned into an expression vector pTrc99A and the constructed plasmid
designated pTTS. We identified that L-cysteine was synthesized from L-serine and sulfide by enzyme reaction of cellfree extract of Escherichia coli JM109 carrying plasmid pTTS.  And L-methionine was detected in this reaction mixture.

１．緒の遺伝子配列と 20％程度しか一致していないにも関わら言ず、お互いの立体構造は酷似している４, ５）。また、TSβ は含硫化合物は生体において重要な機能を持つことが多OAS だけでなく、L −セリンも基質とすることが報告され

く、化粧品・医薬品・食品などの原料として広く用いられている６）。しかし、TSβ だけでは β 置換反応よりも β 脱ている。特にＬ−システインは化粧品原料として用いられ

離反応をより強く触媒するため、β 置換反応を必要とするているが、その製法は専ら毛髪等タンパク質からの抽出法

L −システイン合成を行うには、TS は α2β2 四量体の状態に依存しており、発酵法による工業的製法が確立されていで用いることが望ましいと考えられる。

ないアミノ酸の一つである。また、最近はその需要増や環本研究では、TS の β 置換反応によって L−セリンとスル境問題から従来の主製法である抽出法からの脱却も望まれフィドから L−システインを合成する効率的な生産系の確立ている。

を目的とした。そこで TSα、TSβ をコードする大腸菌由

一般的な微生物において L −システインは、硫酸還元経路

来の遺伝子 trpA と trpB を高発現プラスミドにクローニングの最終産物のスルフィドと O −アセチルセリン（以下 OAS）

してプラスミド pTTS を構築した。まず、トリプトファン

から O −アセチルセリンスルフヒドリラーゼ（以下 OASS）

要求性（trpBA 欠損変異）大腸菌を pTTS で形質転換したの触媒する反応によって合成される 。この生合成経路は

時の L−トリプトファン要求性相補の可否を確認し、次に L

複雑な制御を受けており２）、また L −システインは多くの含−システイン要求性（cysE 欠損変異）大腸菌を当該プラスミ

硫化合物の生合成中間体であるため代謝されやすく、高収

ドで形質転換した時、L−システインの代わりに L−セリンと率の発酵生産プロセスを構築することは極めて難しい。こスルフィドを添加した培地で生育するかどうかを確認した。

のような背景を踏まえ、我々はビタミン B6 依存性酵素ト

さらに、pTTS で形質転換した大腸菌の粗酵素抽出液を用いリプトファンシンターゼ（以下 TS）の特性に着目した３）。

て L−セリンと Na ２S からの L−システイン合成を試みた。

１）

TS は α サブユニットと β サブユニットの２種類から成２．実り、α2β2 複合体として L −トリプトファン生合成の最終段
階を触媒する多機能酵素であり、それぞれ α 単体、β2 複

２. １

験

試薬

合体としても存在しうる。また、β サブユニットの遺伝子本研究で使用した制限酵素は全て日本ジーン社製であ

配列は、OASS のアイソザイムで主活性体である OASS-A

り、プラスミド pTrc99A はアマシャムファルマシアバイ

Development of Novel Process for
Producing Sulfur-containing Compound as
Cosmetics Material
Kuniki Kino, Kohtaro Kirimura＊

School of Science and Engineering Waseda
University＊

オテク社製である。Polymerase Chain Reaction（PCR）
で用いた DNA Polymerase には TaKaRa 社製 Ex Taq を用い、その他の試薬は全て関東化学社製のものを使用した。

２. ２

使用菌株

本研究では、DNA 供試菌および宿主として Escherichia
coli JM109 を用いた。L −トリプトファン要求性大腸菌は−8−

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

E.coli CAG12202（trpB::Tn10Kan,thi-1,relA1）を、L −シ

ピリドキサールリン酸 0.1 mM、誘導物質であるイソプ

ステイン要求性大腸菌は E.coli KY14182 を用いた。なお、

ロピルチオガラクトシド（IPTG）0.1mM を含んだ平板

CAG12202 株は国立遺伝学研究所より分譲され、KY14182

培地上に、pTTS を導入した L −システイン要求性大腸菌

は協和発酵工業株式会社より分譲された株である。

E.coli KY14182 を接種し、L −システイン要求性の回復をその生育の可否で判断した。

２. ３ 実験方法

また、pTTS を導入した E.coli JM109 を 200mL の LB

２. ３. １

trpA、trpB のクローニング培地で 18 時間培養し、集菌した菌体を 50 mM リン酸緩trpA、trpB のクローニングは PCR 法にて実施した。

衝液（pH7.0）20mL で懸濁し、ホモジナイザーにより細既に報告されている大腸菌由来の t r p A、t r p B の塩基胞膜を破砕、その後遠心分離により細胞膜を除去して粗配 列 か ら、 ２ 種 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー、5'

酵素抽出液を調製した。L −セリン 50 mM、Na2S 30 mM、− CGCCATGGAAGGAAAGGAACAATGAC − 3' と 5' −ピリドキサールリン酸 0.1 mM、さらに L −システインの

GGCTGCAGTTAACTGCGCGTCGCCGC-3' を設計し収率が上がると報告されている SDS を 1 g/L になるようた。E.coli JM109 の染色体 DNA を鋳型として PCR 法にに添加した溶液を用い、37℃、24 時間反応を行った。分

て trpA、trpB を含む DNA 断片を増幅した。PCR の条件

析は TLC により実施した。展開溶媒は前述と同様である。

は、95℃
72℃

60 秒（１サイクル）、95℃

120 秒（30 サイクル）、72℃

60 秒、56℃

60 秒、

３．結

300 秒（１サイクル）で行った。その後、得られた DNA 断片（約 2.1kb）とプ

３. １

ラスミドベクター pTrc99A を NcoI と Pst I で制限消化し、両者を連結してプラスミド pTTS を構築した。

果

trpBA のクローニング

E.coli JM109 の染色体 DNA から単離、増幅した trpBA（2.1kb）を高発現ベクター pTrc99A(4.6 kb）の NcoI-Pst I サイトにクローニングし、
目的プラスミド pTTS（6.7 kb）を得た（Fig. １）。

２. ３. ２形質転換

形質転換はバイオラッド社製ジーンパルサーを用いたエ

３. ２

SDS-PAGE による TSα、TSβ の発現の確認

pTTS を導入した E.coli JM109 において、pTTS の持つレクトロポレーション法（初期電圧 25V、抵抗 400Ω、キ

trpA と trpB の発現の程度を調べるため、E.coli JM109/

ャパシタンス 25FD）にて実施した。

pTTS の粗酵素抽出液に対して SDS-PAGE を行った。

２. ３. ３29kDa の TSα の大きさ一致する強いバンドが 30 kDa 付菌体の培養

菌体の培養は、500mL 容三角フラスコに LB 培地（バ近に、45kDa の TSβ の大きさと一致する強いバンドがクトトリプトン 10 g/L、イーストエキストラクト５g/L、

45 kDa 付近に認められ、TSα、TSβ 両遺伝子の高発現

NaCl 10 g/L）を 200mL 入れたものに接種し、37 ℃で 18が各々確認できた（Fig. ２）。

時間液体振とう培養した。

３. ３
２. ３. ４

TS の活性確認

組換え TS が活性を保持しているか確認するために、組換え TS の活性確認

pTTS を導入した L−トリプトファン要求性大腸菌 E.coli

pTTS を導入した TS 欠損株 E.coli CAG12202（CAG12202

CAG12202 を最少平板培地に接種し、その生育の可否で／ pTTS）を L −トリプトファンを含まない最少平板培地

pTTS による L−トリプトファン要求性の相補を確認した。

に接種し、その生育の可否により L −トリプトファン要求

また、組換えトリプトファンシンターゼを用いて L−トリ性の相補を観察した。期待通り宿主の L −トリプトファン

プトファン合成を検討した。pTTS を導入した E.coli JM109
を 200mL の LB 培地で 18 時間培養し、集菌した菌体に50mM リン酸緩衝液（pH 7.0）20mL を加え、さらに L−セリン 50 mM、インドール 10mM、ピリドキサールリン酸 0.1
mM になるように添加した溶液で、37℃、24 時間反応を実施した。分析は薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて行い、展開溶媒は 99.5％エタノール：H ２O ＝ 63：37 とした。

２. ３. ５

組換え TS による L −システインの合成

最少培地に L −システイン合成における基質となる L −セリン 50mM、Na2S 30mM を含み、さらに補酵素である

Fig.1 Physical map of constructed plasmid pTTS carring trpB
and trpA gene.

−9−要求性は相補され、E.coli CAG12202 ／ pTTS は生育した。
さらに、休止菌体反応による L −トリプトファンの合成活性も検討した。その結果 、収率は低いものの L −トリプ
トファンの合成が TLC により確認でき（Fig. ３）、組換え TS が活性を保持していることが示された。

３. ４

L −システイン要求性の相補

pTTS のコードする TS が活性を維持していることを確認したので、続いてこれを用いて L−システインの合成を試みた。pTTS を導入した L−システイン要求性大腸菌 E.coli
KY14182（KY14182 ／ pTTS）を、L−セリン、Na ２S、ピ
リドキサールリン酸、IPTG を添加した L−システインを含まない最少平板培地に接種した。その結果 、E.coli KY14182／ pTTS は生育し、L−セリンと Na ２S から L−システインが合成されていることが示された。また、そのコロニーの大きさは L−システインを含んだ最少平板培地に接種した宿主

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the cell-free extracts of eachstrain.
Lane1, Protein size marker ; lane2,cell extract of E.coli
JM109;lane3, cell extract of E.coli CAG12202/pTTS.

が形成するコロニーと同程度かそれ以上の大きさであった。

３. ５

粗酵素抽出液による L −システインの合成

L−トリプトファン合成反応は休止菌体反応で行ったが、L−システイン合成反応は粗酵素抽出液により実施した。この理由は２点あり、１点目は L−システインが酸化により容易に二量 体（L−シスチン）となり沈殿を生じるため、あらか
じめ細胞膜を除去し反応後に遠心分離することで簡便に L−
シスチンの回収が可能であると考えたからである。２点目は大腸菌の細胞膜には粘着性があり、休止菌体反応では菌体同士の接着により収率が低下する可能性があり、それを回避するためである。そこで粗酵素抽出液を用い、基質となる L−セリンと Na2S の最適条件を検討した。
Na2S は高濃度では酵素活性を阻害する。検討の結果 、酵
素活性を保持することができる上限はおよそ 30mM である

Fig.3 Thin-layer chromatogram of L-tryptophan synthesis
reaction products using TS.

ことがわかった。そこで、L−セリン 50mM、Na2S 30mM、ピリドキサールリン酸 0.1mM、SDS 1 g/L を粗酵素抽出液を用いる場合の最適条件とし、L−システイン合成反応を実施した。反応液の TLC 分析では、収率が低いものの L −システイン生成を確認できた。ところが、他にも生成物が検出され、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分
析の結果 、L−メチオニンの位置にピークが見られた。再度
TLC により検討したところ、L−システインと L−メチオニンの 置にスポットが確認でき（Fig. ４）、L−システインとL−メチオニンが上記反応系において生成していることが明らかになった。

４．考察

TS を用いた L −セリンと Na2S からの L −システインの合成が確認できた。しかし、収率は低かった。これは、反応条件の最適化がなされていないことと、含硫アミノ酸のFig.4 Thin-layer chromatogram of L-tryptophan synthesis reaction products using TS.
Lane1, L-serine ; lane2,L-cysteine ; lane3, L-methionine ;lane4, reaction product by enzyme reaction of cell-free extract of E.coli JM109/pTTS.

− 10 −

化粧品素材としての含硫化合物の生産に関する研究

Fig.5. Biosynthesis pathway of L-methionine

代謝中間体である L −システインは分解代謝されやすく、る報告は従来なく、L −メチオニンの新たな酵素合成法を提

安定に保持されなかったからではないかと考えられる。こ示するものとして今後詳細に検討する価値があると考える。

の場合、L −システインから分解代謝系を抑える必要があるが、その主分解産物として L −メチオニンを検出したこ（引用文献）とは極めて興味深い。

１） Kredich N.M. : Biosynthesis of cysteine, In :Neidfardt

また、スルフィドとして加える Na2S は不安定な物質で、FC,Ingraham JL, Magasanik B. (eds) : Escherichai coli

簡単に H2S になり気中に放出されてしまう。例えば反応

and Salmonella typhimurium, : Cellular and Molecular

溶液の pH を調整するときはこの傾向が激しく、かなりのBiology, 1, American Society for Microbiology, 1987,

量の Na2S が H2S になり気中に放出される。また、培養中

419-428.

は 37℃と比較的高温状態であるのでこの傾向は益々増大

２） Kredich N.M. : Regulation of cysteine biosysnthesis in

する。したがって反応溶液内ではスルフィド量が律速とな

Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 115-132.

り、十分な反応を行なうためにはその不足分を逐次補う必In K.M.Herrmann, R.L.Somerville (eds), Amino Acids:

要があると考えられる。しかし、反応溶液中の残存硫黄イ

Biosynthsesis and Genetic Regulation. Addison-Wesley

オン濃度を計測することはできないので、Na2S の最適添

Publishing Company, 1983
３） Miles E.W. : Tryptophan synthase : Structure,

加量を判断するのは難しい。

function, and subunit interaction, Adv. Enzymol. Relat.

L −メチオニンは微生物では Fig. ５に示す経路により生Areas Mol. Biol., 49, 127-186, 1979.

合成されている。今回の研究では、L −セリンに対する L −メチオニンの収率は約 20 〜 30％であった。仮に L −メチ

４） Hyde C.C., Ahmed S.A., and Davies D.R., : Three-

オニンへの代謝経路を遮断した菌体で L −システインの合dimensional structure of the tryptophan synthase α2β2成反応を行うと、40 〜 50％以上の高収率で L −システイmultienzymecomplex from Salmonella typhimurium, J.

ンを得ることができると期待される。L −メチオニンはもBiol. Chem., 263, 17857-17871, 1988.

っぱら化学合成法から得られるメチオニンラセミ体からの５） Burkhard P., Rao G.S., and Hohenester E. : Three-

分割法で生産されているが、安価な L −メチオニン供給のdimensional structure of O-acetylserine sulfhydrylase from

可能な発酵生産プロセスは未だ確立されていない。今回、Salmonella typhimurium, J. Mol. Biol., 283, 121-133, 1998.

L −システインだけでなく L −メチオニンの生成も確認する

６） 嶋田正雄 , 中村武史 , 石渡健一 , ほか１名 , : 特開昭ことができた。L −セリンからの L −メチオニン合成に関す− 11 −

61-242589

微生物代謝工学に基づく必須および 新規脂肪酸の大量生産

筑波大学

小

応用生物化学系

林

達彦

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) play important roles as structural components of membrane phospholipids, andas precursors of the eicosanoids of signaling molecules including prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes.   Theprincipal PUFAs are dihomo-g-linolenic acid (n-6 PUFA; ∆8, ∆11, ∆14-20:3), arachidonic acid (n-6 PUFA; ∆5, ∆8, ∆11, ∆1420:4), and eicosapentaenoic acid (n-3 PUFA; ∆5, ∆8, ∆11, ∆14, ∆17-20:5).  All mammals synthesize eicosanoids which are
involved in the inflammatory response, reproductive function and so on.   Therefore, studies on PUFAs are importantin both the medical and pharmaceutical fields.   We have studied the fatty acid metabolism in the filamentous fungus,
Mortierella, which produces some C-20 PUFAs (e.g., dihomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid).  
In this study, at the gene level, we investigated desaturase and elongase involved in PUFA metabolism of this strain.  We
cloned ∆9-desaturase b gene from the gene library of this Mortierella strain.  The predicted amino acid sequence showedsimilarity to those of other ∆9-desaturases including stearoyl-CoA desaturase from several living organisms including
yeast, rat and so on.  This sequence also contained a cytochrome b5-like domain at the C-terminus, being different from
the Mortierella ∆6-desaturase which has the corresponding domain at the N-terminus.    This finding suggests that thisdomain in the desaturase would play the role of a unique electron transport system, binding a heme group.  We also cloned
a part of the elongase gene from the Mortierella strain for the first time.  Further works would lead to the overproduction ofvarious PUFA through gene manupulation in the Mortierella strain.

１． 緒須のステップを担う（炭素鎖 18 から 20 へ鎖長を延長する）

言

鎖長延長酵素を対象とし、分子レベルでの検討を行った。

必須脂肪酸である γ- リノレン酸はアトピー性皮膚炎

これらの PUFA の生合成に関わる酵素・タンパク質遺伝

等アレルギーの軽減作用があり、また、アラキドン酸は子を遺伝子工学の手法を用いて親株の Mortierella で特異的

皮膚の乾燥抑制効果がある。これらの高度不飽和脂肪酸に発現させることや遺伝子破壊などの方法を組み合わせる（PUFA）は、これらの作用だけでなくコスメトロジーにことによって、様々な PUFA を選択的に生産あるいは新おける重要な素材である。近年、これらの PUFA を化粧規な PUFA を代謝工学的に生産できる可能性がある。

品分野で利用せんとする試みが世界的規模で進行している

２． 実 験 ・結果・考 察が、これらの油脂類の供給源に目を向けると、魚介類以外には有効な供給源すら知られていない。また、我が国では

３. １

不飽和化酵素遺伝子の解析

有効な生産手段を持たず、海外からの供給に対する依存度

SuperCos 1 cosmid vector を 用 い て 作 製 し た 糸 状 菌が高く、気候などの変動による供給量、品質などの変動をMortierella のゲノムライブラリーに由来する大腸菌ライ受けやすいこと、また、海洋汚染による資源自体の汚染もブラリーに対して、（本研究者らによって）既にクローン問題となりつつある。

化している ∆9-Desaturase cDNA a をプローブとした指標

Mortierella 属糸状菌はアラキドン酸などの炭素鎖が 20によってポジティブクローンを取得した。本クローンにの PUFA を生産することができる１）。本研究者らは現在、対して、上記のプローブを用いて切り縮めを行った結果、糸状菌 Mortierella における PUFA 生合成に関わる酵素・タ

4,988 bp から成る一つのオープンリーディングフレームを

２- ７）

ンパク質を分子レベルで検討しつつある。本研究では、認めた（図１）。また、真核生物に一般的な転写開始部位

脂肪酸の ∆9 の位置に二重結合を導入する ∆9 不飽和化酵の近傍によく見られ、RNA ポリメラーゼの転写効率を上素、および、炭素鎖が 20 以上の PUFA の生合成において、昇させると考えられる特異配列である CAAT box と TATA

C18 脂肪酸生産微生物の C20 脂肪酸生産株への変換に必box を検索した結果、TATA box は認められなかったが、Overproduction of essential and new
fatty acids through microbial metabolicengineering

CAAT box に類似の配列（ATCCAAT）が開始コドン ATGの 359 bp 上流に存在することが判明した。
得 ら れ た 遺 伝 子 か ら 推 定 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は、Michihiko Kobayashi∆9-Desaturase a や（ラットや Saccharomyces などの）のUniversity of Tsukuba

真核生物由来の Stearoyl-CoA desaturase と高い相同性を示し（図２）、従って、∆9-Desaturase b 遺伝子と命名した。
他の生物由来の Stearoyl-CoA desaturase とは相同性は低− 12 −

微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大 生産

図１ ポジティブクローンの制限
酵素地図
矢印は、Δ9-Desaturase b ゲノム遺伝子

図２ Δ9-Desaturase b と各生物由来の不飽和化酵素のアミノ酸配列上の比較
DES9b, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase b
DES9a, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase a
YEAST, Saccharomyces cerevisiae の Stearoyl-CoA desaturase
MOUSE, マウスの Stearoyl-CoA desaturase
RAT, ラットの Stearoyl-CoA desaturase− 13 −

図３

Δ9-Desaturase b のアミノ末端領域と各生物由来の Cytochrome b5 の部分アミノ酸配列の比較
DES9, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase b
Cb5M, Mortierella sp. の Cytochrome b5
Cb5M, ラットの Cytochrome b5
Cb5M, Saccharomyces cerevisiae の Cytochrome b5
矢印は、高度に保存されているヒスチジン残基

いものの、ヘム鉄が配位結合すると考えられる２ヶ所のヒスチジン残基とヘム鉄を包み込む領域はよく保存されていた。本 ∆9-Desaturase b のアミノ酸配列は、植物の脂肪酸不飽和化酵素と相同性がなく、ラットや Saccharomycesの Stearoyl-CoA desaturase と相同性を示したことから、∆9-Desaturase b はアシル -ACP やリン脂質ではなくアシル-CoA を基質とすることが推測された。
さらに、∆9-Desaturase b は、∆9-Desaturase a や酵母のStearoyl-CoA desaturase と同様に、カルボキシル末端領域はラットや Saccharomyces の Stearoyl-CoA desaturaseより 110 アミノ酸残基ほど長く、また、互いによく保存されており、他生物由来の Cytochrome b5 の一部と相同性を示した。ラットや Saccharomyces の Cytochrome b5と、∆9-Desaturase b のカルボキシル末端領域とは約 30%の低い相同性であったが、ヘム鉄が配位結合すると考えられる２ヶ所のヒスチジン残基と、ヘム鉄を包み込む領域
はよく保存されていた（図３）。さらに、Cytochrome b5
family に属する Nitrate reductase とも相同性を示したが、∆9-Desaturase b が Cytochrome b5 様ドメインを含んでいることも鑑みると、脂肪酸不飽和化の際に独自の電子伝達を行っている可能性が示唆された。続いて、Hydropathy
プロット解析を行った結果、上記のいずれのタンパク質を比較しても疎水パターンの形状は似通っており、特に、
Stearoyl-CoA desaturase に関しては、小胞体膜に結合していると考えられる疎水性の高い領域もよく保存されていた（図４）。
また、∆9-Desaturase b の遺伝子には 5' 末端が GT で 3'
末端が AG の 94 bp から成るイントロンが一つ存在することが推察された。∆9-Desaturase a は Δ9-Desaturase bと同様に唯一一つのイントロンを持つが、イントロンの塩基配列は互いに相同性が低く、∆9-Desaturase b のイントロンが 94 bp であるのに対し、∆9-Desaturase a のイン
トロンは 153 bp であり塩基数も異なっていた。しかしながら、興味深いことに、イントロンの挿入部位は、ラ

図４ 各生物由来の Δ9 不飽和化酵素のアミノ酸配列の Hydropathy プロットの比較
DES9b, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase b
DES9a, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase a
YEAST, Saccharomyces cerevisiae の Stearoyl-CoA
desaturase
MOUSE, マウスの Stearoyl-CoA desaturase
RAT, ラットの Stearoyl-CoA desaturase
丸囲みは、小胞体膜に結合していると考えられる領域− 14 −

微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大 生産

ットや Saccharomyces の Stearoyl-CoA desaturase でよく謝保存されている最も N 末端側のヒスチジンに富む領域の辞同じ部位に挿入されており、これらを鑑みるに、２つの本研究を遂行するに当り、ご支援をいただきました（財）∆9-Desaturase の起源は同じであるが進化の過程で非翻訳

コスメトロジー研究振興財団および共同研究者に深く感謝部位であるイントロンの修飾が独自に行われたのではない

申し上げます。

かと推察された。
（引用文献）

３. ２

１） Shimizu, S., Ogawa, J., Kataoka, M. and Kobayashi,

鎖長延長酵素遺伝子の解析（炭素鎖 18 から 20 へ鎖長を延長する）鎖長延長酵素の

M. : Screening of novel microbial enzymes for the

遺伝子クローニング実験に関しては、まず、鎖長延長酵

production of biologically and chemically useful

素欠損変異 Mortierella 株の変異の相補性を指標とし、本酵compounds, In : Scheper, T. (ed):素遺伝子のクローン化を目指したが、うまくいかなかっ

Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.58, Springer-た。従って、以下のように戦略を変えた実験を行い、本酵

Verlag. Berlin, 45-87, 1997.

Advances in素遺伝子の一部のクローン化に成功した。一般に脂肪酸

２） Kobayashi, M., Sakuradani, E. and Shimizu, S. :の C 鎖長延長反応は、アシル -CoA とマロニル -CoA から

Genetic analysis of cytochrome b5 from arachidonic

3- オキソアシル -CoA を生成する 3-Oxoacyl-CoA 合成酵素、

acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4: Cloning,

3- オキソアシル -CoA を D-3- ヒドロキシアシル -CoA に変

RNA editing and expression of the gene in Escherichia

換する 3-Oxoacyl-CoA 還元酵素、D-3- ヒドロキシアシル

coli, and purification and characterization of the geneproduct. J. Biochem., 125: 1094-1103, 1999.

-CoA をエノイル -CoA に変換する 3-Hydroxyacyl-CoA 脱水
酵素、エノイル -CoA をアシル -CoA に変換する Enoyl-CoA

３） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S. :還元酵素から成る。初発酵素である 3-Oxoacyl-CoA 合成酵∆6-Fatty acid desaturase from an arachidonic acid-素の一部を、他生物の脂肪酸合成に関わる本酵素のアミノ

producing Mortierella fungus: Gene cloning and its

酸配列の情報を基に合成オリゴヌクレオチドプライマー

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Gene,（センスプライマーおよびアンチセンスプライマー）を作

238: 445-453, 1999.

製し、Mortierella のゲノム DNA を鋳型として Polymerase

４） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S. :chain reaction（PCR）法を用いて、本酵素遺伝子のクロー∆9-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-

ニングを試みた。

増幅した DNA 断片を電気泳動ゲルか

producing fungus: Unique gene sequence and its

ら回収し、ベクターにサブクローニングし、DNA シーク

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Eur. J.

エンサーで本 DNA 配列を決定した結果、大腸菌などの他Biochem., 260: 208-216, 1999.

生物由来の 3-Oxoacyl-CoA 合成酵素遺伝子と高い相同性を

５） Sakuradani, E., Kobayashi, M., Ashikari, T. and示し、本遺伝子の一部がクローン化できたことが示唆されShimizu, S. : Identification of ∆12-fatty acid desaturase

た。しかしながら現在のところ、完全長の遺伝子クローニ

from arachidonic acid-producing Mortierella fungus by

ングには至っていない。

heterologous expression in the yeast Saccharomyces
cerevisiae and the fungus Aspergillus oryzae. Eur. J.
Biochem., 261: 812-820, 1999.

一方、以下の実験を併せて行ったが、成果を挙げること

６） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S. :ができなかった。
（ıÀ）∆6-Desaturase 遺伝子を導入した Mortierella 株は本酵

Identification of an NADH-cytochrome b5 reductase gene

素を発現することができず、γ- リノレン酸（∆6, ∆9, ∆12-from an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella18:3）生産が増強されなかった。

alpina 1S-4, by sequencing of the encoding cDNA and（ıÃ）Mortierella 株から既に本研究者らが取得している各

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Appl.
Environ. Microbiol., 65: 3873-3879, 1999.

不飽和化酵素遺伝子に対して亜硝酸法によってランダム変異を行い、（産業的に重要な微生物である）Aspergillus

７） Certik, M., Sakuradani, E., Kobayashi, M. andoryzae 産に導入し、得られた形質転換体とコントロール

Shimizu, S. : Characterization of the second form ofに対して各 PUFA の含量の変化を検討したが、特に生産

NADH-cytochrome b5 reductase gene from arachidonic

量の変化は見られず、また、新規な脂肪酸と思われる物質

acid-producing fungus Mortierella alpina 1S-4. J. Biosci.

は検出されなかった。変化を与える変異に至らなかったこ

Bioeng., 88: 667-671, 1999.

とが示唆された。

− 15 −

酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発

大阪大学大学院

増

井

工学研究科

敏

行

A reaction using condensation between boric acid and 2,2'-iminodiethanol (diethanolamine) has been applied
to cover the surface of CeO2 particles. A mixture of cerium oxide particles and the condensed viscous polymer
was heated in an ammonia flow at 1073 K followed by calcination at 923 K in air. Formation of turbostratic boron
nitride (tBN) layer was identified with an electron microcopy, infrared spectra, and x-ray photoelectron spectra
measurements. The new coating process was more effective in reducing catalytic activities of cerium oxide than theconventional one using urea instead of 2,2'-iminodiethanol. The new tBN-coated CeO2 particles showed good UVblocking properties and more natural white color than those of the conventional tBN-CeO2. The feature of the newmaterial will be preferable for new UV blocking materials especially for cosmetics.

１緒であった。このため酸化セリウムを紫外線遮断剤として化言

粧料に応用した例は数少ない９）− 13）。

近年、紫外線の害が一般に広く認知されるようになり、そこで本研究では、ホウ酸とジエタノールアミンの縮合

またその害が皮膚がんを誘起したり人体の免疫システムに反応により得られる高分子状の前駆体を経由する方法によ障害を起こしたりなどの深刻なものであることから、紫外り、酸化セリウム微粒子表面を滑沢性（すべり性）に優れ、線から皮膚を防御するための紫外線防御剤に対する高機能

しかも化学的に安定である窒化ホウ素（白色）で被覆し、化の要望は強いものとなっている 。特に最近では、短波触媒活性ならびに淡黄色の着色を抑制し、紫外線遮断効果

長紫外線（280 〜 320nm）に加え、比較的線量が多く、皮が高く、安全性、透明性に優れた紫外線遮断剤の合成を目

膚透過力が大きい長波長紫外線（320 〜 400nm）について

指した。

１）

も同時に防御効果を示す新しい材料が求められているが、２

現在紫外線防御剤として用いられている有機系紫外線遮断剤は、その安全性から高濃度の使用には問題があり、一方、

２. １

合

実

験

成

酸化チタン、酸化亜鉛などの無機系紫外線遮断剤では、紫0.1mol･dm − 3 の塩化セリウム水溶液を３mol･dm − 3 のア

外線の防御作用や化粧品としての適性において一長一短でンモニア水に加え、得られた沈殿物に対し窒化ホウ素に換あり、新しい高性能紫外線防御剤の開発が求められている。

算して 50mol％になるように計算した量のジエタノールア

ルチル型酸化チタンと酸化亜鉛のバンドギャップエネル

ミン、ホウ酸を加えた。よく攪拌して完全に溶解した後、ギーはそれぞれ 3.0 eVである。希土類酸ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、乾燥さ

化物のひとつである酸化セリウムは、バンドギャップエネ

せ前駆体を得た。その後、前駆体をまずアンモニア流通下、ルギーが 3.1 eVであり、酸化チタンや酸化亜鉛と同様

773K で６時間、次いで空気中 923K で６時間、それぞれに比較的長波長（400ı◊ 付近）から吸収が始まることが知

加熱処理することにより窒化ホウ素を形成させた。得られられている。さらに屈折率が 2.1 程度た試料は脱イオン水によって充分に洗浄した後、エタノー

５）、3.2 eV２）, ３）

４）６）であるので酸化チタンの屈折率 2.6 よりも小さく７）、また酸化亜鉛の 2.0 と
ほぼ同じ値

８）

ルで洗浄、乾燥した。

を示すことから、化粧仕上がりも自然なものとなることが期待できる。しかしながら、酸化セリウム

２. ２

キャラクタリゼーション

は淡黄色であり、また高い触媒作用のために配合されてい得られた試料について、赤外吸収スペクトル測定、X 線

る他の成分を分解してしまい、そのままでの実用化は困難

光電子分光（XPS）測定、高分解能透過型電子顕微鏡観察、ならびに紫外可視反射スペクトル測定を行った。粉体の色

Development of a New UV Filter Based on
Cerium Oxide.
Toshiyuki Masui
Department of Applied Chemistry, Facultyof Engineering, Osaka University

は色彩色差計を用いて L ＊ a ＊ b ＊ 表色法により評価した。
触媒活性の評価は CDM（Conductmetric Determination
Method）法 14）により行った。即ち、ひまし油 5.0 g 中に試料 0.3 g を分散させ、16 dm3・h − 1 の空気流通下 403K で３時間加熱した。流通後の空気を 50cm3 の脱イオン水中へ導き、捕集した揮発性の分解生成物による水の導電率変化を測定し、その大きさを触媒活性の大きさとすることで− 16 −

酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発評価した。また光触媒活性の測定は 403K で加熱する代わりに太陽光シミュレーターで９時間照射し、同様に水の導電率変化を測定して評価した。

３
３. １

結果 と考察合成粒子のキャラクタリゼーション

窒化ホウ素被膜が形成されているかどうか、赤外吸収ス
ペクトル測定により検討したところ、Fig. １に示すように
酸化セリウムにおいては見られない吸収ピークが新たに出現した。これらのピークは市販の六方晶型窒化ホウ素において観測される吸収とその位置が一致したことから、合成した試料にはホウ素−窒素結合が存在することが明らかとなった。

Fig.1 FTIR spectra of the samples: (a) boron nitride, (b) tBNcoated CeO2, and (c) CeO2.

次に得られた被覆試料の表面を XPS により検討したところ、Fig. ２に示すように、ホウ素、窒素の双方の領域において被覆処理前に存在しないピークが被覆後に新たに出現したことがわかった。また、ホウ素のピークは 190.6 eV付近、窒素のピークは 397.6 eV 付近にあり、これらは窒化ホウ素のホウ素ピーク 190.3 eV、窒素ピーク 397.9 eV に極めて近く 15）、試料において観測されたピークは原料のホウ酸や酸化ホウ素ではなく窒化ホウ素に由来するものであると考えられる。
Fig. ３に得られた試料の高分解能透過電子顕微鏡観察像を示す。酸化セリウム超微粒子の 1 次粒子径はおよそ50nm であり、0.3nm 間隔の規則正しい干渉縞を示す粒子
内部と、その表面に粒子内部と明らかにコントラストの異なる層が形成されていることがわかった。この相の結晶性は低く、赤外吸収スペクトル測定、XPS 測定の結果と合わせて考察すると、被膜を形成している物質は非晶質の乱層
構造窒化ホウ素（turbostratic boron nitride; tBN）と考えられる 16,17）。また、被覆処理により形成された被膜は１〜２nm 程度の厚みで均一に存在していることがわかった。

３. ２

Fig.2 XPS spectra of the tBN-coated CeO2 particles: (a) B1s
and (b) N1s.

光学特性及び色彩の評価

次に色彩色差計によって得られた試料の色彩を Table １に L ＊ a ＊ b ＊ 表色法で示す。すべての色はこの三つの値によって定義される三次元座標によって表現可能で（L ＊ ,a ＊,b ＊）＝（100,0,0）が理想的な白色を示し、L ＊ a ＊ b ＊ 表色
系において測定された色を色座標として表わした時の座標と理想的な白色を表わす座標との座標空間における距離が色差となる。したがって白色との色差が小さいほど白色化されていると言える。
表１に本研究によって得られた試料、及び参照試料について色彩色差計で測定した結果、および白色からの色差 Δ Ｅを示す。色差は試料の色彩測定結果
が L ＊ a ＊ b ＊表色系において（L ＊ ,a ＊ ,b ＊）＝（x,y,z）という座標で表わされるとき、次式で与えられる量である。
ΔE =（（100 − x）2 ＋（0 − y）2 ＋（0 − z）2）1/2     
（１）Fig.3 High-resolution electron micrograph of the tBN-coated
CeO2 particles.

− 17 −＊＊

Table 1 Actual color of the samples measured in the L a b
system＊表より、本研究によって得られた試料の黄色度を市販酸化セリウムと比較すると黄色度 b ＊は三分の一程度に減少していることがわかった。また、色差 Δ Ｅを比較しても本研究によって得られた試料はその値が小さく、白色により近いことが明らかとなった。

Fig.4 Reflectance spectra of the UV blocking powders:（●）tBNcoated CeO2,（○）CeO2,（……）ZnO, and（——）TiO2（rutile）

また、得られた試料の紫外可視反射スペクトルを測定しTable 2 Comparison of thermal and photocatalyses of the samples

たところ、
Fig.4 のような反射率曲線が得られた。ここから、
酸化セリウムを窒化ホウ素によって被覆処理することによって、わずかではあるが紫外線防御能の低下が観測されることがわかった。これは窒化ホウ素自身に紫外線吸収能力がないためであり、被覆層を新たに導入したことで紫外線防御に有効な成分である酸化セリウムの希釈が生じたものと考えられる。

３. ３の紫外線防御能を有していた。また、窒化ホウ素で被覆す

触媒活性の評価

２. １で示した方法で、試料とひまし油を加熱し、生成ることにより、粒子の色は白色に近づき、酸化触媒活性がした分解生成物による脱イオン水の導電率変化 σ Sample を抑制されることが明らかとなった。以上の結果から、本研測定した。ここから、ひまし油自身の加熱による自発的な究で得られた窒化ホウ素被覆酸化セリウム超微粒子は新規分解の影響を除くため、ひまし油のみで同様の実験を行な

な化粧用紫外線遮断剤として期待できる。

った際の脱イオン水の導電率変化値 σ ひまし油を元に次式を５用いて指数化し、触媒活性指数 I ca として Table ２に表わ
した。

謝

辞

本助成金によって得られた研究成果に関する学術論文は

Ica=（σSample − σ ひまし油）/σ ひまし油（２）

以下の３報である。ここに謹んで御礼申し上げる。

この方法ではひまし油の分解とともに導電率が上昇する

１） T. Masui, R. Hamada, G. Adachi, T. Sakata, andので、指数が小さいほど触媒活性は抑制されていると考え

H. Mori: A New Method to Synthesize BN-coatedてよい。今回新たにエタノールアミンを用いて被覆した試

Cerium Oxide Using Condensation of boric Acid and料では酸化セリウムに比べて 20 分の１以下に触媒活性が2,2'-Iminodiethanol, J. Alloys. Compd., in press.

抑制されており、また市販酸化チタン、市販酸化亜鉛と比

２） T. Masui, H. Hirai, N. Imanaka, G. Adachi, T. Sakata,較してもその触媒活性は低いものであった。同様に光照射

and H. Mori: Synthesis of Cerium Oxide Nanoparticles by

時の触媒活性についても評価したが、本研究による試料はHydrothermal Crystallization with Citric Acid, J. Mater.

もともと光照射時の触媒活性のない材料の組み合わせであSci. Lett., 21, 489-491（2002）.

るため、予測されたように光触媒活性はほとんど観測され

３） T. Masui, K. Fukuhara, N. Imanaka, T. Sakata, H. Mori,and G. Adachi: Effects of Titanium Oxide on the Optical

なかった。

４

総

Properties of Cerium Oxide, Chem. Lett.,474-475（2002）

括.

ジエタノールアミンとホウ酸の縮合反応を利用し、酸化セリウム粒子表面を非晶質の乱層構造窒化ホウ素で被覆で（参考文献）

きることを明らかにした。酸化セリウムに比較して、より

１） N. J. Lowe, N. A. Shaath, and M. A. Pathak eds. :

白色、低酸化触媒活性であり、また酸化セリウムと同程度"Sunscreens - Development, Evaluation, and Regulatory− 18 −

酸化セリウム系紫外線遮断剤の開発

Aspects 2nd Edition," Marcel Dekker (New York), (1997).
２） J. Pascual, J. Camassel, and H. Mathieu: Fine Structure(2000).
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Photocatalytic Hydrogenation of CH3CCH with H2O
on Small-Particle TiO2: Size Quantization Effects and12） 矢部信良 : 酸化セリウム系紫外線遮断剤とその応用 ,
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５） C. A. Hograrth and Z. T. Al-Dhhan: Optical Absorption

14） 町野泰久 , 亀山浩一 : CDM 試験法による顔料の油脂
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− 19 −

化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

東北大学

白

多元物質科学研究所

井誠之Micro-mesoporous smectite-type materials containing magnesium cations in octahedral sheets were preparedfrom water glass and magnesium chloride by a hydrothermal treatment and calcination at 873 K without templatematerials.  The pore structure (surface area, pore volume and pore diameter) can be controlled by the hydrothermal
conditions (temperature, time and pH).  The pore structure was also changed by additives.  The mesopore size ofsmectite-type materials is enlarged by adding dialkyldimethyl ammonium chloride after the hydrothermal synthesis.

１．緒ズはその合成条件（沈殿 pH，成 pH，合成温度，金属塩

言

化物カチオン種とその量）と深く関わっている，合成条件

スメクタイトは４面体構造をもつ４価のシリコンイオンのパラメータが多いため，現在のところ，スメクタイトのからなる層（４面体層）と８面体構造をもつ２価と３価の合成条件と機能との関係が十分に理解されるにはいたってカチオンからなる層（８面体層）が，４面体層−８面体層いないのが現状である。本研究では合成条件と物性との関−４面体層という３層を基本結晶構造とする板状鉱物の総係を明らかにし，化粧品としての付加価値の高いスメクタ

称である。スメクタイト層間にはイオン吸着サイトが存在

イトを開発することを目的としている。

し，種々の化合物を電気的に吸着する特長をもつ。またス

２．実

メクタイト層間には水が入り込み，自分の体積の十数倍に膨れあがる特長（膨潤性）を持つ。

験

２．１．スメクタイトの調製本研究ではマグネシウムカチオンを八面体層内に含むス

スメクタイトは工業的に多岐に用いられている。化粧品
関係として，
板状構造とイオン交換能を利用した洗浄剤（石メクタイトを水熱法により合成した。

鹸，練り歯磨き，シャンプー，シェービングクリーム等），

水ガラス（日本化学工業３号，SiO2

膨潤作用とイオン交換能を利用した保湿剤（泥パック，ボ

29.04％ , Na2O 9.4％）を蒸留水に溶かし，25％アンモニア水を加えた（Aディクレイ，ローション，スキンクリーム等）に使われて液）。塩化マグネシウム（和光純薬）を蒸留水に溶かしたいる。

（B 液）。A 液に B 液を 5 分ほどかけて滴下し，沈殿物を得

天然の岩石であるベントナイトにはスメクタイト系鉱物

た。このときシリコン原子とマグネシウム原子の比は 8：の一種であるモンモリロナイトを主成分としている。しか6 とした。沈殿物を濾過し蒸留水で洗浄した。得られた沈しながらベントナイトには石英，カルサイト，石膏，有機殿物に蒸留水を加え，25％アンモニア水と蒸留水を加えた腐植などの不純物を含む。このため化粧品としての天然の（このスラリーをスラリー C とする）。スラリー C の pH

ベントナイトを直接用いることはできず，天然物を生成しを合成 pH とする。スラリー C をオートクレーブ（内容積て用いたり，合成のスメクタイトを用いたりなどしている。

100mL）で，窒素雰囲気下，水熱処理（473 〜 523K）した。

合成スメクタイトは水ガラスと種々の金属塩化物を前駆

水熱処理により得られた前駆体を濾過し，蒸留水で洗浄し，体として水熱法により合成できる

1 − 15）。水熱法で合成したスメクタイトは出発原料を変えることで化学組成を大き重量 変化が無くなるまで乾燥し，873K で２時間焼成した（以後この試料を MST（Mg）と名付ける）。
調製の際ジアルキルジメチルアンモニウムクロライド

く変えることができる。また出発原料を有さないことから（C18d）を添加する試料も調製した。添加は以下の二通りも化粧品として使用するのに優れている。
合成のスメクタイトのイオン交換能，膨潤性，結晶サイ
The enhancement of the cosmetic functionsof trioctahedral magnesium-smectite
materials

行った。一つはアルキルアンモニウムクロライドを水熱合成時にスラリー内に添加する方法である。スラリー C に
C18d を添加し水熱合成後，十分に濾過し，357K で重量変化がなくなるまで乾燥した。C18d を除くために 873 Ｋ

Masayuki Shirai

で２時間焼成した（これにより得られた試料を以後 MST

Institute of Multidisciplinary Research for
Advanced Materials, Tohoku University（Mg+C18d）とする）。もう一つの方法は，水熱合成後にスラリーにアルキルアンモニウムクロライドを添加する方法である。スラリー C を水熱処理後，そのスラリーへの− 20 −

化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

アルキルアンモニウムクロライドを添加し撹拌後，濾過しも安定な高表面積，大細孔容量の多孔体となった。細孔径十分に洗浄し，重量変化がなくなるまで乾燥した。その後が調製条件により大きく変化した。MST（Mg）では 20ÅC18d を除くために 873 K で２時間焼成した（これにより以下のマイクロ細孔と約 40Å のメソ細孔を持つマイクロ得られた試料を以後 MST（Mg）+C18d とする）
。上記のーメソ多孔体となっていることが分かった。523K, 4h で合どちらの方法もアルキルアンモニウムクロライド添加量は成した MST（Mg）にアルキルアンモニウム塩を添加した

シリコン原子と C18d 分子の比が 8：0.7 とした。

MST（Mg）+C18d では MST（Mg）に比較して，比表面
積，細孔容積が共に増大した。細孔径分布も大きく変化した。マイクロ細孔は消失し 20 〜 80 °のメソ細孔を持つ多２．
２．スメクタイトのキャラクタリゼーション
調製した試料の構造は X 線回折法（Shimazu XD-D1）に孔体ができた。合成の際にスラリー C にアルキルアンモ

より調べた。細孔構造（表面積，細孔容積，細孔径）はニウムクロライドを添加した MST（Mg+C18d）では MST

窒素吸着法（ユアサアイオニクス，Autosorb 1）で調べた。 （Mg）に比較して，比表面積はそれほど増加せず，細孔容試料のイオン交換サイトはメチレンブルー吸着法により行積は増大した。細孔径分布も大きく変化した。マイクロ細った。

孔は消失し，20 〜 100°のメソ細孔をもつ多孔体となった。

３．結

水熱温度が高く，水熱時間が長い試料ほどメチレンブル

果ー吸着量が増加し，イオン交換容量が増加した。

523K, 4h で水熱合成した調製した試料の XRD パターン

４．考を示す（図１）。19.7，35.2，60.6°付近にスメクタイト構

察造の（02, 11）,（13, 20）,（06, 33）に由来するピークが８°

水熱合成時に生成するシリケート結晶子が縮合する時に付近に（001）,   28°付近に（003）に帰属されるピークがその隙間に細孔が形成されるものと考えられる。合成後ス観測された。このスメクタイト構造に起因する XRD パタ

ラリー中にあるスメクタイトのシリケート片は，乾燥，焼ーンは合成温度，アルキルアンモニウムクロライドの添加

成により脱水縮合する。調製した試料は 873 K 焼成後でもの有無に関わらず観測された。本研究で調製した試料は全高表面積，高細孔容積を示すこと，XRD パターンでは 001てスメクタイト構造をもつことが分かる。

面はそれほど発達していないことから，basal 面が積み重調製した試料の比表面積，細孔容積を表１に，脱離等温
線，細孔径分布を図２に示す。調製した試料では高温でなっているのではなく比較的ランダムに集合し，シリーケ
ート片の重なりの隙間に細孔ができると考えられる。
またシリケート片の大きさは水熱合成条件に依存するものと考えられる。合成温度が高いほど，合成時間が長いほ
ど大きなシリケート片の生成する割合が大きくなると考えられること，473 K, 2 h 調製の試料の方が 573 K, 4 h 合成に比較して，マイクロ細孔が多いことは，比較的小さなシリ
ケート片同士の隙間にマイクロ細孔ができるものと考えられる。また，生成する細孔はシリケート片の隙間に形成するために周期性はなく，細孔に由来するピークは XRD では観測されなかった。
MST（Mg）+C18d は MST（Mg）と水熱処理条件が同じなので，焼成前の個々のシリケート片の大きさはより
MST(Mg) と同じと考えられる。均一な細孔構造を有する
MCM-4116） や FSM-1617） では合成時に存在するアルキル

図1

合成スメクタイトの XRD パターン（水熱合成温度 523K）

表１

合成スメクタイトの合成条件と比表 積，細孔容積− 21 −

して形成されたものではない。ジメチルジステアリルアン
モニウムクロライド分子はアンモニア分子よりもかさ高く，乾燥時のシリケート片の分散状態は両系で異なっていると考えられる。アルキルアンモニウムクロライドよりも大きなメソ細孔が形成されることを考慮すると，シリケート片
が大きさのかさ高さにより，シリケート片の配向状態がよりランダムになると考えられる。873K で焼成した際には，乾燥時のシリケート片のランダムな配向状態が維持されてシリケート片の配向が変わり，より高いピラーとして働く
ため，隙間が大きくなりメソ細孔ができたものと考えられる。
MST（Mg+C18d）では MST（Mg）+C18d よりも大きな
メソ細孔が形成されたこと，水熱合成中にアルキルアンモ
ニウムクロライドが添加されると個々のシリケート片のまわりにアルキルアンモニウム塩が吸着することでシリケー
トの分散性が良くなり，水熱処理でできるシリケート片の大きさが MST（Mg）や MST（Mg）+C18d よりも大きくなること，また乾燥焼成の際にもアンモニウムクロライド
は共存するために，大きなシリケート片がランダムに配向
し，ピラーとして働くシリケート片のサイズも大きくなり，
より大きなメソ細孔が形成するものと考えられる。
本粘土の研究では水熱温度，時間，ジステアリルアンモ
ニウムクロライドの添加およびその順序により合成スメク
タイトの細孔構造が制御できることが分かった。これらの調製パラメータがスメクタイトの膨潤性に与える効果について今後調べる予定である。
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図２

Synthesized Smectite Containing Several Divalent Cations

合成スメクタイトの窒素吸着等温線と細孔径分布

during Hydrogen Reduction, Japanese Journal of Applied
Physics, 38, 69-72 1999.
アンモニウムクロライドのミセルの大きさによりメソ細孔４）Shirai M., Aoki K., Torii K., 他 1 名 , Acidity andのサイズが変化することが報告されている。本研究で調製

1-Butene Isomerization of Synthesized Smectite-type

した合成スメクタイト試料ではアルキルアンモニウムクロ

Catalysts Containing Different Divalent Cations, Catalysis

ライドを使用しなくてもメソ細孔が形成されたこと，アルA: General, 187, 141-146, 1999.

キルアンモニウムクロライドの添加順序により細孔径が制５）荒井正彦 , 白井誠之 , 合成スメクタイト系メソポア多御できることから細孔はアンモニウム塩のミセルを鋳型と− 22 −

孔体の触媒への応用 , 表  , 37, 223-231, 1999.

化粧品素材としての合成スメクタイトの高機能化

６）鳥居一雄 , 白井誠之 , 荒井正彦 , スメクタイト系メソ

Study on the Formation of Smectite-type Clays Containing

ポア多孔体の合成と機能，Materials Integration, 13, 57-

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８）Shirai M., Aoki K., Minato Y., 他２名 , Porous Smectitetype Materials Containing Catalytically Active Divalent14）Shirai M., Aoki K., Guo S. 他 2 名 , Structure and CO

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Catalyst Containing Iron Cations in Octahedral Sheets,
Analytical Sciences, accepted.

９）Shirai M., Torii K., and Arai M., Hydrogenation of
Acrylonitrile-Butadiene Rubbers with Palladium Loaded15）Shirai M., Aoki K., Torii K., 他 １ 名 , Control of

Mesopore-size Controlled Clay Materials, Studies in

Mesopore Structure of Smectite Type Materials

Surface Science and Catalysis, 130, 2105-2110, 2000.

Synthesized with a Hydrothermal Method, Studies in
Surface Science and Catalysis, accepted.

10）Shirai M., Torii K., Arai M., Synthesis and Size-selective
Application of Palladium Metal Particles Intercalated in16）Yanagisawa T., Shimizu T., Kuroda K., 他１名 ,The

Mesopore-size Controlled Smectite, Molecular Crystals

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CO Hydrogenation Activities of Smectite-type Catalysts
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12）Shirai M., Aoki K., Torii K., 他１名 ,In situ EXAFS− 23 −

712, 1999.

高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

杉山

広島大学 医学部総合薬学科 1、広島大学附属病院
１
１

政

則 、熊

谷

孝

則 、森

皮膚科 2

田

栄

伸２

Streptomyces（S.）castaneoglobisporus HUT6202 produces a large amount of diffusible melanin-like pigment. We havecloned an operon, designated mel, which is responsible for the synthesis of melanin pigment, from the chromosomal DNA
of S. castaneoglobisporus. The sequence analysis revealed that the mel operon consists of two genes: the tyrosinase gene（tyrC）consisting of 819 bp and a gene, designated orf378, consisting of 378 bp. The orf378 was located just upstreamof the tyrC gene. Although the precise function of the orf378 product remains unclear, its functuion is thought to be
involved in the transfer of copper ion which is essential for tyrosinase.
The present study has the following aims: the first is to express the microbial mel operon in human epidermis or in
albino mouse hair follicle cells. This approach will be applicable for the gene therapy of pigment disorders. The second
is to establish a cell line that expresses mel constitutively. The cell line can be used to screen inhibitors of melaninsynthesis, which will be applicable for the cosmetology.
In the present study, we tested whether the microbial mel operon is expressed in mammalian cells using COS-7 cells
as host cells. The orf378 and tyrC genes, contained in the operon, were PCR-amplified and independently inserted into
downstream of the cytomegalovirus promoter, respectively. When COS-7 cells were co-transfected with the mammalian
expression vectors, the transfectants expressed tyrosinase activity, suggesting that the microbial mel is expressed in
mammalian cells. A human keratinocyte A431 cell was also used for constitutive expression of the mel operon.

１．緒

髪を黒髪に再生するための遺伝子治療へ応用できるものと言考えられる。もうひとつは、mel 遺伝子を恒常的に発現す

筆者らは 200 種以上の放線菌を検索した成果として、る細胞株を樹立することである。樹立した細胞株はチロシ

Streptomyces（S.）castaneoglobisporus HUT6202 が、既ナーゼ活性を阻害する物質を検定する細胞として利用できにメラニン色素を産生することが知られている他の放線菌ることから、美白成分を検索するための新規スクリーニン

S. antibioticus に比べ、100 倍以上高いメラニン色素産生

グ系が構築可能になると考えられる。

能を有することを見出した。そこで、ショットガンクロー

上記に掲げた最終目標を達成するためには、微生物由来

ニング法を用いて、本菌の染色体 DNA からメラニン色素の mel 遺伝子が真核細胞で発現可能か否か調査する必要

産生遺伝子（mel ）をクローニングした。mel 遺伝子の構がある。そこで、本研究では、COS-7 細胞およびヒト角化造を調べた結果、S. castaneoglobisporus の mel 遺伝子は、細胞（keratinocyte）A431 株を用いて mel 遺伝子の発現

チロシナーゼをコードする 819 bp から成る遺伝子（tyrC）

を検討した成果について報告する。

とそのすぐ上流に存在する 378 bp から成る遺伝子（orf378）

２．実とでオペロンを形成していることが明らかになった１〜３）。
orf378 によってコードされるタンパク質の機能について

２. １

は、未だ不明な点が多いが、チロシナーゼ活性に必須な銅イオンの輸送に関与しているものと考えられている。

験

使用細胞と培養条件

COS-7 細胞は、10％ fetal bovine serum（FBS, PAA
laboratories）を含む Dulbecco's modified Eagle medium

本研究は、以下に述べる 2 つを最終目標としている。そ（DMEM, Gibco BRL）を用いて、37℃、5％ CO2 -95％ airのひとつは、ヒトケラチノサイトおよびアルビノマウスの条件下にて培養した。ヒト角化細胞（keratinocyte）と毛穴細胞（albino mouse hair follicle cells）において、S.

して A431 細胞を用いた。

castaneoglobisporus 由来 mel 遺伝子の発現系を構築することである。この系は、将来的に白斑病の遺伝子治療や白Application to cosmetology of the highly
expressed melanin-synthesizing gene
operon from a microbial source

mel 遺伝子発現用ベクターの構築

orf378 発現用ベクターは、PCR 法により増幅した orf378
遺伝子を真核細胞用ベクター pcDNA3.1/Hygro（-）（Invitrogen）に挿入することにより作製した。修飾を加えない orf378 遺伝

Masanori Sugiyama , Takanori Kumagai ,＊Eishin Morita2

子は、sense primer 5'-CACGGATCCATGCCCGAGATCAC

Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of
Medicine, Hiroshima University1 and Departmentof Darmatology, Hiroshima University Hospital2

anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTCAGTTGGCGGGGAA

1

＊

２. ２

1

CCGCCGC-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）およびCGGCAG-3'（ イ タ リ ッ ク は HindIII サ イ ト を 示 す ） を− 26 −

高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

用 い て 増 幅 し た。orf378 の 4 番 目 の 塩 基 を C か ら G にた遺伝子（tyrCKG）は、sense primer 5'-CACGGATCCGCC

変 異 さ せ た 遺 伝 子（orf378G ） は、sense primer 5'-CAC

GCCACCATGGCCGTACGCAAG AACCAG-3'（イタリック

CTCGAGATGGCCGAGATCACCCGCCGC-3'（ イ タ リ

は BamHI サイトをアンダーラインはコザック配列をそれぞッ ク は XhoI サ イ ト を 示 す ） お よ び anti-sense primer

れ示す）および anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTTAGG

5'-CACAAGCTT TCAGTTGGCGGGGA-ACGGCAG-3'

CGTCGAACGTGTAGTA-3'（イタリックは HindIII サイト（イタリックは HindIII サイトを示す）を用いて増幅しを示す）を用いて増幅した。なお、上記に述べた 4 種の遺た。orf378 の ス タ ー ト コ ド ン の す ぐ 上 流 に コ ザ ッ ク 配

伝子の PCR 反応は全て、1 サイクル目は 96℃ 4 min、65℃ 1

４）を 挿 入 し た 遺 伝 子（orf378K） は、sense primer

min、72℃ 2 min の条件で行い、その後、96℃ 1 min、62℃

5'-CACCTCGAGGCCGCCACCATGCCCGAGATCAC-

1 min、72℃ 2 min の条件で 30 サイクル行った。また、鋳型

CCGCCGC-3'（イタリックは XhoI サイトをアンダーライン

DNA としては、orf378 の増幅に用いたものと同様のフラグ

はコザック配列をそれぞれ示す）および anti-sense primer

メントを使用した。

列

5'-CACGGATCCTTAGTTGGCG-GGGAACGGCAG-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）を用いて増幅した。orf378

２. ３

COS-7 細胞への遺伝子導入のスタートコドンのすぐ上流にコザック配列を挿入し、さらCOS-7 細胞への遺伝子導入は、Lipofectamine（GIBCOに 4 番目の塩基を C から G に変異させた遺伝子（orf378KG）

BRL）を用いたリポフェクション法により行った。φ9cm

は、sense primer 5'-CACCTCGAGGCCGCCACCATGGCCのディッシュ当たり、Lipofectamine 試薬は 80µL、COS -7

GAGATCACCCGC-CGC-3'（イタリックは XhoI サイトをア

細胞は 1×10 ６細胞となるように調整した。また、遺伝子

ンダーラインはコザック配列をそれぞれ示す）および anti-

導入は 37℃にて 5 時間行った。

sense primer 5'-CACGGATCCTTAGTTGGCGGGGAACGG
CAG-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）を用いて増幅

２. ４

チロシナーゼ活性測定

した。なお、上記に述べた 4 種の遺伝子の PCR 反応は全て、

mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞を 37℃にて 66 時間培

1 サイクル目は 96℃ 4 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min の条件

養した後、0.1M phosphate buffer（pH 6.2）を用いて洗浄した。

で行い、その後、96℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min の条

洗浄後、細胞を同 buffer 中に懸濁し、超音波破砕を行った

件で 30 サイクル行った。また、鋳型 DNA としては、プラ

後、15,000×g、20 min、4℃の遠心により得た上清をチロ

スミド pUCM1

１）の mel 遺伝子を含む約 2.3 kb の KpnI フラ

シナーゼ活性測定用の試料として用いた。チロシナーゼ活性測定は、Horowitz らの方法５）に基づいて行った。すなわ

グメントを用いた。
tyrC 用発現ベクターは、PCR 法により増幅した tyrC 遺ち、10 mM の L-DOPA および 5 M の CuSO4 を含む 0.1 M

伝子を真核細胞用ベクター pcDNA3.1（-）（Invitrogen）に

phosphate buffer（pH 6.2）1.5mL に 100µL のタンパク質試

挿入することにより作製した。修飾を加えない tyrC 遺伝子料を加えた後、475 nm の吸光度を 10 分間測定し、その初は、sense primer 5'-CACGGATCCATGACCGTACGCAAG

速度よりチロシナーゼ活性を求めた。なお、1 分間に 1 nmol

AACCA G-3'（イタリックは BamHI サイトを示す）およびの dopaquinone を生成させる酵素量を 1 U（unit）と定義した。

anti-sense primer 5'-CACAAGCTTTCAGGCGTCGAACGTGTAGTAG-3'（イタリックは HindIII サイトを示す）を用い

２. ５

mel 遺伝子の安定形質発現株の作成て増幅した。tyrC 遺伝子の 4 番目の塩基を A から G に変異

orf 378 および tyrC を保有するベクターをそれぞれ 8 µgさせた遺伝子（tyrCG）は、sense primer 5'-CACCTCGAG

ずつ、リポフェクション法により表皮細胞である A431 に

ATGGCCGTACGCAAGAACCAG-3'（イタリックは XhoI サ

co-transfect した。この際、A431 は φ9 cm のディッシュ

イトを示す）および anti-sense primer 5'-CACGGATCCTCA

当たり、1×10 ６細胞になるように調整した。遺伝子導入後、

GGCGTCGAACGTGTAGTAG-3'（イタリックは BamHI サ

geneticin 500µg/µL および hygromycin 50µg/µL にて二イトを示す）を用いて増幅した。tyrC 遺伝子のスタートコ

重選択を行った。

ドンのすぐ上流にコザック配列を挿入した遺伝子（tyrCK）

３.

は、sense primer 5'-CACGGATCCGCCGCCACCATGACCGTACGCAAGAACCAG-3'（イタリックは BamHI サイトをア

３. １

結果と考察

COS-7 細胞における mel 遺伝子の発現性

ンダーラインはコザック配列をそれぞれ示す）および anti-

まず、mel 遺伝子の真核細胞での発現性を COS -7 細胞

sense primer 5'-CACAAGCTTTTAGGCGTCGAACGTGTA

を用いて調査した。mel 遺伝子に含まれる tyrC および

GTA-3'（イタリックは HindIII サイトを示す）を用いて増幅

orf378 をそれぞれ PCR で増幅した後、真核細胞用ベクタ

した。tyrC 遺伝子のスタートコドンのすぐ上流にコザック

ー pcDNA 3.1（-）および pcDNA 3.1/Hygro（-）にそれ配列を挿入し、さらに 4 番目の塩基を A から G に変異させぞれ挿入し、それらの発現ベクターを構築した。構築した− 27 −

ベクターを用いて COS -7 細胞への遺伝子導入実験を行った

組み合わせにおいては、それぞれの遺伝子の 4 番目の塩基結果、orf378 を保有するベクターのみ、あるいは、tyrC をが G に置換されているため、本来の遺伝子によってコー保有するベクターのみを transfect した COS-7 細胞においてドされるタンパク質と比較すると、2 番目のアミノ酸が置は、チロシナーゼ活性は全く認められなかった。一方、tyrC

換することになる（図１）。しかしながら、これらの組みを保有するベクターと orf 378 を保有するベクターを co-

合わせを導入した COS-7 細胞においてもチロシナーゼ活transfect した COS-7 細胞においては、チロシナーゼ活性が性が認められたことから、このアミノ酸置換がチロシナー認められた。以上の結果から、S. castaneoglobisporus 由来の

ゼ活性に影響を及ぼす可能性は否定できないものの、活性mel 遺伝子は真核細胞において発現可能であることが明らか自体を失わせることはないものと考えられた。A 〜 D のになるとともに、チロシナーゼの活性発現には tyrC のみで組み合わせについて、それぞれの遺伝子を保有するベクタは不十分であり、
orf378 の存在が必須であることがわかった。

ーを 16µg ずつ用いて COS-7 細胞に導入した際、それらの導入細胞で発現したチロシナーゼ活性を図２に示す。各々

３. ２

mel 遺伝子の発現量の検討

高く、コザック配列の挿入と 4 番目の塩基を G に置換す

orf 378 の発現量に依存するものと考えられる。本研究のることが、チロシナーゼ活性を上昇させるのに有効に働い最終目標を達成するためには、発現するチロシナーゼ活性ているものと考えられた。ただし、コザック配列のみを挿は高ければ高いほどよい。Kozak は、真核細胞内において、入した C の組み合わせの場合、本来の遺伝子の組み合わ遺伝子からタンパク質への翻訳効率を網羅的に調べた結果

せである A と比較して活性が減少していること、および、

４）、遺伝子配列に以下のような特徴がある場合、効率的に4 番目の塩基を G に置換したのみの B の組み合わせでは、タンパク質に翻訳されることを明らかにしている。⑴スタ

A と比較して活性が若干高いことを考慮すると、4 番目のートコドン（ATG）の直前に 5'-GCCGCCACC-3'（コザック

塩基置換のほうがチロシナーゼ活性の上昇に有効に働くも配列）が存在する。⑵スタートコドン直後の塩基が G である。

のと考えられる。次に、導入するベクター量のチロシナー

そこで、このような特徴を導入した orf 378 および tyrC

ゼ活性への影響を調べるため、A 〜 D の組み合わせにつ遺伝子を PCR 法により増幅し（図１および実験の項を参いて、それぞれの遺伝子を保有するベクターを 8 µg ずつ照）、orf378 系については pcDNA 3.1/Hygro（-）
、tyrC

用いて同様の実験を行った。その結果、A 〜 D の組み合系については pcDNA 3.1（-）に挿入し、発現ベクターをわせ全てにおいて、16 µg ずつ用いた場合に比べ活性が上構築した。構築後、それらを以下の組み合わせにしたがっ昇した。また、A 〜 D の組み合わせ間の比較では、16 µgて COS-7 細胞に導入し、導入細胞におけるチロシナーゼずつ用いた場合と同様に、D の組み合わせがもっとも活性orf378K/tyrCK
orf378�� orf378G�� orf378K�
�orf378KG�
�

tyrC�

�

tyrCG�

�

tyrCK�

� tyrCKG�

B）orf378G/tyrCGD）orf378KG/tyrCKG。B および D の

5' --- --- --- ATG CCC GAG --- --Met Pro Glu
5' --- --- --- ATG GCC GAG --- --Met Ala Glu
5' GCC GCC ACC ATG CCC GAG --- --Kozak
Met Pro Glu
5' GCC GCC ACC ATG GCC GAG --- --Kozak
Met Ala Glu
5' --- --- --- ATG ACC GTA --- --Met Thr Val
5' --- --- --- ATG GCC GTA --- --Met Ala Val
5' GCC GCC ACC ATG ACC GTA --- --Kozak
Met Thr Val
5' GCC GCC ACC ATG GCC GTA --- --Kozak
Met Ala Val

300

C）

3'
3'
3'
3'
3'
3'

Specific activity (U/mg protein)

活性を比較した：A）orf378/tyrC

�のチロシナーゼ活性を比較すると D の組み合わせが最もCOS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性は、tyrC および

3'

100

0

3'

図 1 PCR で増幅した mel 遺伝子の 5' 末端配列
下線部はコザック配列を示す。塩基配列中の太字 G は、置換した塩基を示す。この塩基置換により、orf378 によりコードされるタンパク質の 2 番目のアミノ酸は Pro から Alaに変異し、tyrC によりコードされるタンパク質では Thr からAla に変異する。

200

A

B

C

D

図 2 各種組み合わせの mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性
各 種 orf378 お よ び tyrC 遺 伝 子 を 保 有 す る ベ ク タ ー を
16µg ずつ、A 〜 D の組み合わせにしたがって COS-7 細胞に導入し、チロシナーゼ活性を測定した。
A：orf378/tyrC B：orf378G/tyrCG C：orf378K/tyrCK
D：orf378KG/tyrCKG− 28 −

高発現型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用

Specific activity (U/mg protein)2500

子治療に応用可能であることを示唆する。さらに、本研究において、mel 遺伝子を構成的に発現する候補細胞が１株取得できた可能性がある。この株が実際にメラニン色素を2000

産生することが視覚的に判別できれば、チロシナーゼ活性の阻害物質をスクリーニングするための検定細胞となり得1500るとともに、その阻害剤が美白剤として利用できることを示唆するものである。

1000（引用文献）
１） Ikeda, K., Masujima, T., Suzuki, K. and Sugiyama, M.:

500

0Cloning and sequence analysis of the highly expressedmelanin-synthesizing gene operon from Streptomyces
A

B

C

castaneoglobisporus. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 80-

D85, 1996.

図 3 各種組み合わせの mel 遺伝子を導入した COS-7 細胞におけるチロシナーゼ活性
各種 orf378 および tyrC 遺伝子を保有するベクターを 8 µg
ずつ、A 〜 D の組み合わせにしたがって COS-7 細胞に導入し、チロシナーゼ活性を測定した。
A：orf378/tyrC B：orf378G/tyrCG C：orf378K/tyrCK
D： orf378KG/tyrCKG

２） Ikeda, K., Masujima, T. and Sugiyama, M.: Effects ofmethionine and Cu2+ on the expression of tyrosinase
activity in Streptomyces castaneoglobisporus. J. Biochem.,
120, 1141-1145, 1996.
３） Ikeda, K., Suzuki, K., Yoshioka, H., Miyamoto, K.,
Masujima, T. and Sugiyama, M.: Construction of a
new cloning vector utilizing a cryptic plasmid and theが高く、コザック配列の挿入と 4 番目の塩基を G に置換

highly expressed melanin-synthesizing gene operon

することが、チロシナーゼ活性を上昇させるのに有効であfrom Streptomyces castaneoglobisporus. FEMS Microbiol

ることが改めて確認された。本研究では、導入するベクタ

Lett., 168, 195-199, 1998.

ー量のチロシナーゼ活性に及ぼす影響を調べたのみである

４） Kozak, M.: The scanning model for translation: an
update. J. Cell Biol., 108, 229-241, 1989.

が、遺伝子導入に使用する細胞数や遺伝子導入時間を至適化することにより、さらにチロシナーゼ活性を上昇させる

５） Horowitz, N.H., Fling, M. and Horn, J.: Tyrosinase

ことが可能であると考えられる。

（Neurospora crassa）. Methods Enzymol., 17, 615-620,
1970.

３. ３

mel 遺伝子の安定形質発現株の樹立

mel 遺伝子を構成的に発現する細胞株は、チロシナーゼ
活性を阻害する物質を検索するための検定細胞として利用可能である。本研究では、Keratinocyte A431 細胞を用いて mel 遺伝子の安定形質発現株の樹立を試みた。orf378
用発現ベクターは hygromycin 耐性遺伝子を、tyrC 用発
現ベクターは geneticin 耐性遺伝子を有することから、それぞれのベクターを A431 細胞に導入した後、2 つの薬剤を用いて二重選択を行った。その結果、1 つのクローンを得ることができた。現在、このクローンを増殖中であり、今後、本クローンのチロシナーゼ活性を測定する予定であ
る。

４.

総

括

本研究において、放線菌 S. castaneoglobisporus 由来のメラニン色素産生遺伝子 mel は真核細胞内で発現できることを示した。この成果は、微生物由来のメラニン産生遺伝子が白斑病の遺伝子治療や白髪を黒髪にするための遺伝− 29 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

大阪大学大学院

谷

口

医学系研究科直之The biological roles of asparagine-linked oligosaccharides（N-glycans）on glycoproteins are thought to beplayed through the interaction of terminal glycan structures and their receptors. The diversity and avidity ofthe terminal structures are, however, regulated by the core structure of N-glycans. In vertebrates, six different
N-acetylglucosaminyltransferases（GnT-I through GnT-VI）are involved in initiating the synthesis of highly branchedN-glycan core structure. Among them, we have purified and cloned four GnTs（GnT-III, IV, V, VI）for the first time.
GnT-VI catalyzes the transfer of N-acetylglucosamine（GlcNAc）to position 4 of the Manα1,6 arm of the core structureof N-glycan, forming the most highly branched pentaantennary glycans with a bisecting GlcNAc. The human GnT-VIhomolog（hGnT-VIh）gene was originally identified in the region commonly deleted in pancreatic cancer, but its functionis unknown. hGnT-VIh shows no GnT-VI activity, although its primary structure is very similar to that of chicken GnTVI（galGnT-VI）（50％ identity）. In order to elucidate the biological role of chicken GnT-VI and human GnT-VIh, thegalGnT-VI and hGnT-VIh genes were introduced into a mouse melanoma cell line B16F1. Melanin production wasenhanced in hGnT-VIh gene-introduced cells, accompanied by increased tyrosinase activity. In contrast, it was reducedin galGnT-VI transfectants, accompanied by a decrease of tyrosinase activity level. To investigate the molecular mechanismof these phenomena, tyrosinase mRNA levels in the cells were examined. The mRNA level in hGnT-VIh transfectants waselevated, while that in galGnT-VI transfectants was reduced compared to control cells. To study alterations in carbohydrate
chains induced by the expression of hGnT-VIh and galGnT-VI genes, oligosaccharides on cell-surface were examined by
flowcytometry using DSA and L-PHA lectins, which recognize poly N-acetyllactosamin and β1,6GlcNAc branch, respectively.
The reactivity against DSA and L-PHA was increased in hGnT-VIh-transfectants but decreased in galGnT-VI-transfectants.
Taken together, it is suggested that the expression of the hGnT-VIh and galGnT-VI genes regulates melanin production via
the regulation of tyrosinase expression accompanied by alterations in carbohydrate chain structures.

１．緒

cDNA クローニングを行ってきた１、５〜７）。GnT- Ⅰ〜Ⅴは言

ヒトに存在し、ヒト遺伝子が同定されているが ６、８〜 12）、

タンパク質に付加された糖鎖は、様々なタンパク質の機

GnT- Ⅵは魚類や鳥類では見つかっているが、哺乳動物で能を調節することにより、細胞の分化と増殖を制御するこはまだ見つかっていない４、７）。トリ GnT- Ⅵの cDNA クとが知られている。糖タンパク質糖鎖には、アスパラギン

ローニングにより、従来 GnT- Ⅳの相同遺伝子として知ら

結合型（N 型）糖鎖とムチン型（O 型）糖鎖があり、Nれていたヒト GnT- Ⅳホモローグ（hGnT-IVh）13）が、実型糖鎖をもつものが多い。N 型糖鎖は、タンパク質のアスは GnT- Ⅳよりも GnT- Ⅵにより相同性が高いことがわか

パラギン（Asn）残基に結合しており、N- アセチルグルり７）、以降 hGnT- Ⅵ h と改名した。hGnT- Ⅵ h は、GnT-

コサミン（GlcNAc）とマンノース（Man）より成る特徴

Ⅵおよび GnT- Ⅳとアミノ酸配列でそれぞれ 50％および的な分岐コア構造を有する（Fig. 1）。この糖鎖付加により27 ％ 一 致 し て い る が、hGnT- Ⅵ h に は GnT- Ⅵ 活 性 もタンパク質が機能分子として成熟するようになる。糖鎖は、GnT- Ⅳ活性もみられなかった７）。

単糖が非還元末端側に一つずつ付加して伸長するが、このGnT- Ⅳあるいは GnT- Ⅴで合成される高分岐糖鎖構造

反応は糖転移酵素で触媒される。N 型糖鎖のコア分岐構造
は６つの N- アセチルグルコサミン転移酵素（GnT- Ⅰ〜Ⅵ）
によって合成される（Fig. 1）。
われわれはこれまで、GnT- Ⅲ、- Ⅳ、- Ⅴ、- Ⅵについて精製を行い １〜４）、精製酵素のアミノ酸配列に基づいてRegulation of Melanin Production by
Glycosyltransferases.
Naoyuki Taniguchi
Department of Biochemistry, Osaka
University Medical School

Fig. 1. Structure of the pentaantennary N-linked core oligosaccharide containing the bisecting GlcNAc residue.
Location at which the GlcNAc transferases (GnT-I through VI) are
involved in the branch formation.

− 30 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

は、癌細胞の転移 14）や受精 15）、受容体機能 16）、免疫反応 17）など に 関係している。GnT- Ⅵ は、GnT- Ⅴ の産物である β1,

２. ３ ニワトリ GnT- Ⅵ（galGnT- Ⅵ）遺伝子導入
メラノーマ細胞の作成

6GlcNAc 分岐構造を認識して４）、さらに β1, 4 結合で GlcNAc

pSV-GnT- Ⅵ７）から galGnT- Ⅵの ORF を、pcDNA3.1 にを転移してより複雑な分岐構造を形成する（Fig. 1）。糖鎖が挿入し、pcDNA-galGnT-VI を作製した。トランスフェクシ

高分岐化すると、多価性が付与されて糖鎖受容体との親和性

ョン、スクリーニング、クローン化の方法は hGnT- Ⅵ h とが非常に高まることから 18）、GnT- Ⅵの導入によりさまざま

同様である。

な生物作用が生じることが予想された。また、hGnT- Ⅵ h
に関しては、試験管内で糖転移酵素活性はみられていないが、

２. ４

ノーザンブロッティング

各細胞から total RNA を Trisol を用いて抽出した。得

未知の糖鎖修飾反応を触媒する可能性が考えられた。
メラニン細胞のメラニン産生のキー酵素であるチロシナ

られた total RNA 10µg をホルムアルデヒド変性ゲルで電気ーゼは、チロシン加水分解活性とドーパ酸化活性を同時に泳動し、陽性荷電ナイロンメンブレン（Roche）にブロッ

もつが、その活性には N 型糖鎖が必須であることが知ら

ティングした。galGnT- Ⅵ遺伝子の mRNA レベルの発現をれている 19 〜 21）。また、α-MSH 等による cAMP 産生刺激

見る場合には、GnT- Ⅵ遺伝子の後半部分の配列を元にしてによってメラノーマ細胞のメラニン産生が増加する際、さ作ったジゴキシン標識 RNA プローブを、チロシナーゼ遺22）。

伝子の mRNA レベルでの発現をみる場合には、チロシナ

このように、メラニン細胞におけるメラニン産生には Nーゼ遺伝子の配列全長を元に作成したジゴキシン標識 DNA型糖鎖が深く関わっていることがわかっているが、実際どプローブをハイブリダイズさせ、アルカリフォスファターのような糖鎖構造が関与しているのか、また、どのようなゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Roche）にて検出した。

まざまなタンパク質の N 型糖鎖の合成が促進される

糖転移酵素が関与しているのかは不明である。われわれは、最近、GnT- Ⅲ遺伝子をマウスメラノーマ細胞 B16 細

２. ５

RT-PCR胞に発現させると、チロシナーゼの糖鎖構造が変化すると

total RNA 1µg を用いて、random primer と逆転写酵素 Su-

ともに、その活性が上昇して、メラニン産生が増大するこ

perscript Ⅱによって逆転写反応（RT）を行った。PCR は、変とを見出した23）。そこで他の糖転移酵素の影響を調べるた性を 94℃で 30 秒、アニーリングを 55℃で 30 秒、伸長反応をめに、トリ GnT- Ⅵと hGnT- Ⅵ h の cDNA をマウスメラ

72 ℃ で 1 分 間 の 条 件 で、hGnT- Ⅵ h 遺 伝 子 の 場 合 は、

ノーマ細胞 B16F1 に導入してその効果を調べた。

Gn4H5S：5'-AACGTTCTACAGTGTCATTC-3' と GnT4H5A：

２．実
２. １

5'-GGATGCAATGACTTTCTTGA-3' を用いて 28 サイクル、験

チロシナーゼ遺伝子の場合は、TYRinB F：5'-GAGTATAATAGCCATCAGGT-3'、と TYRinB R：5'-CTTGGGACATT-

材料

哺乳動物用発現ベクター pcDNA3.1/Zeo（+）は、Invitro-

GTTCCATTC-3' を用いて 29 サイクル、コントロールの β- ア

gen 社より購入した。ビオチンで標識された Datura stra-

クチン遺伝子の場合は、βactinF：5'-TTACCAACTGGGAC-

monium agglutinin（DSA）、leucoagglutinating Phaseolus

GACATG-3' と reverse primer βactinR：5'-AGGAGCCAGAG-

vulgaris agglutinin（L-PHA）は、EY laboratories 社より購

CAGTAATCT-3' を用いて 21 サイクル増幅させた。

入 し た。RNA 抽 出 試 薬 Trizol、Superscript Ⅱ、LipofectAmine は GIBCOBRL 社より購入した。抗生物質 Zeo-

２. ６

チロシナーゼ活性測定、タンパク定

cell は InvivoGen 社より購入した。BCA プロテインアッセ

チロシナーゼの活性測定は、細胞溶解液 50µL に 1 mM

イキットは Pierce 社より購入した。マウスメラノーマ細胞の β-L-dehydroxyphenylalanin（L-DOPA）を 950µL ずつ

B16F1 は、10％牛胎児血清を加えたダルベッコ改変イーグ

加えて、37℃で 30 分間反応させた後、475 nm で DOPA-

ル基礎培地を用いて、5％ CO2 下、37℃で培養を行った。

chrome の吸光度を測定した 20）。タンパク質定は牛血清アルブミンを標準として用いて、BCA プロテインアッセイ

２. ２ ヒト GnT- Ⅵホモローグ（hGnT- Ⅵ h）遺伝
子導入メラノーマ細胞の作成
pSV-hGnT- Ⅵ h13）から hGnT- Ⅵ h の open reading frame

キットによって行った。

２. ７

フローサイトメトリー（ORF）を pcDNA3.1 ベクターに挿入し、pcDNA-hGnT- Ⅵ

各細胞を 0.25％ EDTA を含むリン酸緩衝生理食塩水

h を作製した。B16F1 細胞に、LipofectAmin を用いてメー（PBS）で剥がし、20µg/mL のビオチン化レクチンと氷上カーのマニュアルに従い、pcDNA-hGnT- Ⅵ h をトランス

で 30 分間反応させた後、PBS で洗い、さらに FITC 標識

フェクトし、100µg/mL の zeocell を添加してスクリーニン

ア ビ ジ ン を 氷 上 で 30 分 間 反 応 さ せ、PBS で 洗 っ た 後、グし、限界希釈法により細胞をクローン化した。

FACScan（Beckton Dickinson 社製）にて解析した。

− 31 −

３．結チロシナーゼ活性変化のメカニズムを明らかにするため

果に、まず、mRNA レベルの発現をノーザンブロッティング

ニワトリ GnT- Ⅵ遺伝子 galGnT- Ⅵをマウスメラノーマで解析した。hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞ではチロシナーゼ

細胞 B16F1 にトランスフェクトして、zeocell 耐性株を得た。

の転写物が検出されたが、親株、Moc トランスフェクタン

これらの Zeocell 耐性株における導入 GnT- Ⅵ遺伝子の発現

ト、galGnT-VI 遺伝子導入細胞では検出されなかった（Fig.

を、ノーザンブロッティングで解析したところ、転写物が5）。次に、親株、Moc トランスフェクタント、galGnT- Ⅵ

確かに発現していた（data not shown）。

遺伝子導入細胞におけるチロシナーゼ mRNA の発現をよ同様に、ヒト GnT- Ⅵホモローグ遺伝子 hGnT- Ⅵ h につり高感度の RT-PCR で解析したところ、galGnT- Ⅵ遺伝子

いても B16F1 細胞にトランスフェクトして Zeocell 耐性株

導入細胞では、親株、Moc トランスフェクタントと比べてを得た。hGnT-VIh 遺伝子の発現は、転写物量が非常に少発現が低下していた。
チロシナーゼは糖タンパク質であり、糖鎖の付加が酵素活

くノーザンブロッティングでは検出できなかったが、RT-性の発現に必要であることが報告されている 19 〜 21） ので、

PCR で転写物を確認した（data not shown）。
galGnT- Ⅵおよび hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入メラノーマ細hGnT- Ⅵ h 遺伝子あるいは galGnT- Ⅵ遺伝子の強制発現に胞は、親株や Mock トランスフェクトと比べて、特に目立よりチロシナーゼの糖鎖が改変されて酵素活性を変化させる

った増殖速度の変化はみられなかった（data not shown）が、可能性が考えられた。そこで、まず、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導

galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞は、対照細胞より白くなり、反入細胞および galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞における GnT- Ⅵ活

対に hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞は黒くなった（Fig. 2）。光学顕微鏡で観察すると、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞は、細胞間あるいは細胞 - 基質間の接着が増強したためと思われるが突起を出して伸展した細胞形態をとるとともに、メラ
ニン色素を多量に含有している細胞が多数みられた（Fig.
3）
。一方、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞は明らかな形態学的な差異はみられなかった。
次にメラニン産生のキー酵素であるチロシナーゼの発現を調べた。hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞のチロシナーゼ活性は、対照細胞と比べて約２倍高く、一方 galGnT- Ⅵ遺伝子
導入細胞は約４分の１に低下していた（Fig. 4）。この結果から、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入メラノーマ細胞および galGnT- Ⅵ遺伝子導入メラノーマ細胞におけるメラニン産生の変化は、チロシナーゼ活性で制御されていると思われた。
Fig. 3. Microscopic observation of parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.

Fig. 2. Comparison of cell-pellet color between parent
B16F1 cells, mock transfectants, galGnT-VI transfectants,
and hGnT-VIh transfectants.

Fig. 4. Tyrosinase activity levels in parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.

− 32 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

Fig. 5. Tyrosinase mRNA levels in parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.
Tyrosinase mRNA expression levels were examined by
Northern blotting (panel a) and RT-PCR (panel b).

性を測定したが、親株同様いずれも活性が検出されなかった（data not shown）。何らかの阻害物質の混入による活性

Fig. 6. Reactivities of cell surface glycoproteins to DSA and
L-PHA lectins.
Mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VI
transfectants were examined by flow cytometry analysis using DSA (panel a) and L-PHA (panel b) lectins.

抑制も考えられたので、次に、細胞内における糖鎖変化を

我々は N- アセチルグルコサミン転移酵素 GnT- Ⅲ（図１参レ ク チ ン を 用 い て 調 べ た。 直 接 に GnT- Ⅵ 産 物 で あ る照）遺伝子をマウスメラノーマ B16 細胞に導入するとチロ

GlcNAcβ1-4（GlcNAcβ1-6）Manα 構造を認識するレクチ

シナーゼ活性の上昇に伴いメラニン産生が増加することをンは知られていないので、GnT-V 産物である β1,6GlcNAc

見出した 23）。本研究では、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞では

ブラ ンチ 構造 を認識するとされる DSA レクチン 24） とチロシナーゼ活性の低下に伴ってメラニン産生が抑制され、

L-PHA レクチン 25）を用いて、フローサイトメトリーで細一方、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では逆にチロシナーゼ活

胞表面の糖鎖構造との反応性について調べた。DSA に対す性の上昇に伴いメラニン産生が亢進することを見い出した。

る反応性は、対照として用いた mock トランスフェクタン

Gn- Ⅵは N 型糖鎖の分岐形成に与り、また、hGnT- Ⅵ h もトと比べて、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では増加し、gal-

未知ではあるが糖転移酵素である可能性が高いので、これGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞では不変あるいは若干低下したらの遺伝子導入は、チロシナーゼを含む糖タンパク質糖鎖（Fig. 6a）
。L-PHA の反応性も DSA レクチンの反応性と一の構造を改変し、活性に影響を及ぼすことが予想された。

部異なるものの、mock トランスフェクタントと比べて、

しかし両者のトランスフェクタントにおいて、導入した遺hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では増加し、galGnT- Ⅵ遺伝子

伝子が発現していることを mRNA レベルでは確認できる導入細胞では不変あるいは若干低下した（Fig. 6b）。したがものの、GnT- Ⅵの活性は検出できなかった。何か試験管内って、hGnT- Ⅵ h 遺伝子と galGnT- Ⅵ遺伝子の導入は細における GnT- Ⅵ活性を阻害する細胞内物質が混入したの胞表面の N 型糖鎖の構造を変化させ得ることがわかった。

かもしれない。糖転移酵素は、発現量が非常に少なく試験

４．考管内で活性が検出されなくても、実際に細胞内では糖鎖の察生合成を行う場合があるので、導入遺伝子が細胞内で糖転

チロシナーゼの活性を規定する因子は複数あり、糖鎖も移酵素として働いているかもしれない。

その一因と考えられる 19、20）。実際、チロシナーゼについ一方、ポリ N- アセチルラクトサミンと β1,6GlcNAc 分岐ている N 型糖鎖は分子シャペロンとの結合に関わり、酵部を認識する植物レクチン DSA と L-PHA を用いたフロー

素活性の発現に必要であることが証明されている

21）

。以前、

サイトメトリーにより細胞表面の糖鎖構造の変化を調べた− 33 −

ところ、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞と hGnT- Ⅵ h 遺伝子[GlcNAc to Man]-β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase VI

導入細胞における細胞表面の糖鎖変化は逆に動いた。このfrom hen oviduct. J. Biol. Chem. 275 : 32598-32602, 2000

レクチンとの反応性が、導入遺伝子産物の直接的な糖転移

５） Minowa MT, Oguri S, Yoshida A, Hara T, Iwamatsu

酵素活性に基づくものであるか、それとも他の糖転移酵素

A, Ikenaga H, Takeuchi M: cDNA cloning and expres-

群の撹乱に基づくものであるかは不明である。いずれにしsion of bovine UDP-N-acetylglucosamine : β1,3-D-

ろチロシナーゼの糖鎖自体も変化している可能性も高い。

mannoside α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase IV. J.
Biol. Chem. 273：11556-11562,1998

チロシナーゼの活性変化とチロシナーゼの mRNA の発現が相関していたことから、本研究で観察された galGnT-６） Saito H, Nishikawa A, Gu J, Ihara Y, Soejima H,

Ⅵあるいは hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入によるメラニン産生量

Wada Y, Sekiya C, Niikawa N, Taniguchi N: cDNAの変化は、一つにはチロシナーゼ遺伝子の発現が変化した

cloning and chromosomal mapping of human N-acetyl-ためと思われる。この原因としては、galGnT- Ⅵと hGnT-

glucosaminyltrans-ferase V. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 198 : 318-327, 1994

Ⅵ h の mRNA が直接チロシナーゼ遺伝子の転写あるいは
チロシナーゼ mRNA の安定性に干渉した可能性が考えら

７） Sakamoto Y, Taguchi T, Honke K, Korekane H,れる。別の可能性としては、細胞表面の糖鎖変化が、チロ

Watanabe H, Tano Y, Dohmae N, Takio K, Horii A,

シナーゼ遺伝子の発現に影響を及ぼしたか、あるいは別のTaniguchi N: Molecular cloning and expression of

分子を介してチロシナーゼ mRNA の安定性を調節していcDNA encoding chicken UDP- N -acetyl-D-glucosamine

ることが考えられる。

（GlcNAc）: GlcNAc β 1-6（GlcNAc β 1-2）-Man_1-R[GlcNAc to Man] β 1,4N -acetylglucosaminyltransferase

以上をまとめると、トリ GnT- Ⅵ遺伝子およびヒト GnT-VI, J. Biol. Chem. 275 : 36029-36034, 2000

Ⅵ h 遺伝子のマウスメラノーマ細胞における発現は、チロ
シナーゼの発現変化を介して、メラニン産生を制御するこ

８） Kumar R, Yang J, Eddy RL, Byers MG. Show TB,
Stanley P: Cloning and expression of the murine geneとが明らかとなった。

and chromosomal location of the human gene encoding謝辞N-acetylglucosaminyltransferase I. Glycobiology 2:383393, 1992

本研究を遂行するにあたりご支援いただきましたコスメ

９） Tan J, D'Agostaro AF, Bendiak B, Reck F, Sarkar

トロジー研究振興財団に深謝いたします。

M, Squire JA, Leong P, Schachter, H.: The human（参考文献）

UDP-N-acetylglucosamine：α-6-D-mannoside β-1, 2-N-

１） Nishikawa A, Ihara Y, Hatakeyama M, Kangawa K,

acetyltransferase II gene（MGAT2）-cloning of ge-

Taniguchi N: Purification, cDNA cloning, and expres-nomic DNA, localization to chromosome 14q21, expres-sion of UDP-N-acetylglucosamine : β-D-mannosidesion in insect cells and purification of the recombinant

β-1,4N-acetylglucosaminyltransferase Ⅲ from rat kid-

protein. Eur. J. Biochem. 231 : 317-328, 1995
10） Yip B, Chen SH, Mulder H, Hoppener J, Schachter H

ney. J. Biol. Chem. 267 : 18199-18204, 1992
２） Oguri S, Minowa MT, Ihara Y, Taniguchi N, Ikenaga: Organization of the human β-1,2-N-acetylglucosaminyl-

H, Takeuchi M: Purification and characterization oftransferase I gene（MGAT1）, which controls com-

UDP-N-acetylglucosamine : α1,3-D-mannoside β1,4-N-

plex and hybrid N-glycan synthesis. Biochem. J. 321 :acetylglucosaminyltransferase（N-acetylglucosaminyl-465-474, 1997

trans ferase - Ⅳ）from bovine small intestine, J. Biol.

11） Ihara Y, Nishikawa A, Tohma T, Soejima H, Niikawa
N, Taniguchi N: cDNA cloning, expression, and chro-

Chem. 272;272 : 22721-22727, 1997
３） Gu J, Nishikawa A, Tsuruoka N, Ohno M, Yamagu-

mosomal localization of uman N-acetylglucosaminyl-

chi N, Kangawa K, Taniguchi N: Purification and char-transferase III（GnT-III）. J. Biochem. 113 : 692-698,
1993

acterization of UDP-N -acetylglucosamine:α-6-Dmannoside β1-6N-acetylglucosaminyltransferase（N-12） Yoshida A, Minowa MT, Takamatsu S, Hara T,

acetylglucosaminyltrans-ferase V）from a human lungOguri S, Ikenaga H, Takeuchi M: Tissue-specific expression and chromosomal mapping of a human UDP-N-

cancer cell line. J. Biochem. 113 : 614-619, 1993
４） Taguchi T, Ogawa T, Inoue S, Inoue Y, Sakamoto Y, Ko-a c e t y l g l u c o s a m i n e : α1,3- D - m a n n o s i d e β1,4- N -rekane H, Taniguchi N：Purification and characterization ofacetylglucosaminyltransferase. Glycobiology 9 : 303-310, 1999

UDP-GlcNAc:GlcNAc β1-6（GlcNAc β1-2）Manα1-R13） Furukawa T, Youssef EM, Yatsuoka T, Yokoyama− 34 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

1994-2002, 1982

T, Makino N, Inoue H, Fukushige S, Hoshi M, Hayashi
Y, Sunamura M, Horii A: Cloning and characterization

20） Petrescu SM, Petrescu AJ, Titu HN, Dwek RA, Plattof the human UDP-N-acetylglucosamine:α-1,3-D-

FM:Inhibition of N-glycan processing in B16 melanoma

mannoside β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase IV-

cells results in inactivation of tyrosinase but does nothomologue（hGnT-IV-H）gene. J. Hum. Genet. 44 : 397-

prevent its transport to the melanosome. J. Biol.

401, 1999

Chem. 272 : 15796-15803, 199714） Murata K, Miyoshi E, Kameyama M, Ishikawa O,21） Branza-Nichita N, Negroiu G, Petrescu ,AJ, Garman

Kabuto T, Sasaki Y, Hiratsuka M, Ohigashi H, Ishiguro

EF, Platt FM, Wormald MR, Dwek RA, Petrescu SM:

S, Ito S, Honda H., Takemua F, Taniguchi N, Imaoka S:

Mutations at critical N -glycosylation sites reduce ty-

Expression of N-acetylglucosaminyltransferase V inrosinase activity by altering folding and quality con-colorectal cancer correlates with metastasis and poor

trol. J. Biol. Chem. 275 : 8169-8175, 2000
22） Sodi SA, Chakraborty AK, Platt JT, Kolesnikova N,

prognosis. Clin. Cancer Res. 6 : 1772-1777, 2000
15） Kitajima K, Inoue S, Inoue Y : 61 : Isolation and

Rosemblat S, Keh-Yen A, Bolognia JL, Rachkovsky ML,

characterization of a novel type of sialoglycoproteins（hyo-Orlow SJ, Pawelek JM: Melanoma x macrophage fusion

sophorin）from the eggs of medaka, Oryzias latipes:

hybrids acquire increased melanogenesis and meta-

nonapeptide with a large N-linked glycan chain as astatic potential: altered N-glycosyltion as an underlying

tandem repeat unit. Dev. Biol. 132 : 544-553, 1989

mechanism. Pigment Cell Res. 11 : 299-309, 1998

16） Ihara Y, Sakamoto Y, Mihara M, Shimizu K, Tanigu-

23） Taniguchi N, Jain SK, Takahashi M, Ko JH, Sasai K,

chi N.: Overexpression of N-acetylglucosaminyltrans-

Miyoshi E, Ikeda Y: Glycosyltranferases: cell surface

ferase III disrupts the tyrosine phosphorylation of Trk

remodeling and regulation of receptor tyrosinase ki-

with resultant signaling dysfunction in PC12 cells

nases-induced signaling. Pure. Apple. Chem. 71 ; 719-

treated with nerve growth factor. J. Biol. Chem. 272 :

728,199924） Yamashita K, Totani K, Ohkura T, Takasaki S, Gold-9629-9634, 199717） Buckhaults P, Chen L, Fregien N, Pierce M: Tran-stein IJ, Kobata A: Carbohydrate binding properties ofscriptional regulation of N-acetylglucosaminyltransfer-comprex-type oligosaccharides on immobilized Datura
stramonium lectin. J. Biol. Chem. 262 : 1602-1607, 1987

ase V by the src oncogene. J. Biol. Chem. 272 : 19575-

25） Cummings RD, Kornfeld S: Characterization of the19581, 1997
18） Rademacher TW, Parekh RB, Dwek RA: Glycobiolo-

stuructual determinants required for the high affinity
interaction of asparagine-linked oligosaccharides withgy. Annu. Rev. Biochem. 57 : 785-838, 1988
19） Imokawa, G, Mishima Y: Loss of melanogenic prop-

immobilized Phaseolus vulgaris leukoagglutinating anderties in tyrosinases induced by glycosylation inhibi-

erythroagglutinating lectins. J. Biol. Chem. 257 : 11230-

tors within malignant melanoma cells. Cancer Res. 42 :11234, 1982

− 35 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

東京医科歯科大学 難治疾患研究所

堀

成人疾患研究部門

久

分子病態分野枝

Anaphylactic reactions to measles, mumps and rubella vaccines and the combined measles-mumps-rubella (MMR)
vaccines have been suggested to be caused by allergy containing bovine gelatin in the vaccines as a stabilizer. Since
gelatin can be derived from collagen molecules present in all multicellular animals, it has long been believed to be
nonimmunogenic and thought to be weakly allergic in human. Therefore, gelatin has been widely used as a stabilizer
in vaccines. The present study was designed to investigate the reactivity of IgE in bovine gelatin-sensitive children
to gelatins from various animals by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The IgE in the children reacted
to mammalian gelatins including kangaroo and mouse gelatins, to which they had little or no exposure as a foodor a vaccine stabilizer. Most of the children who displayed sensitivity may be due primarily to the antigenic crossreactivity between mammalian gelatins.
Gelatin, obtained from bone and skin, consists mainly of denatured type I collagen, which is composed of two
α1 and one α2 chains.  Furthermore, the study was designed to elucidate the IgE reactivity to α1 and α2 chains ofbovine type I collagen in gelatin-sensitive children. Purified α1 and α2 chains of bovine type I collagen were obtainedby separation of column chromatography. All serum samples which were reacted with bovine type I collagen showed
positive reaction to α 2 chain. In our previous study, we reported that homology (98%) between α1 chains of humanand bovine type I collagen is higher than homology (93%) between α2 chains of them. These homology data mightsuggest that the α2 chain has higher allergenicity than the α1 chain. To analyze IgE-binding sites of   α2 chain,recombinant proteins covering 100 kDa collagenous domain of α2 chain were expressed by pRSET vector. One offive recombinant proteins located in central portion of collagenous domain showed strong reactivity for patients sera.
To further determine epitope, several small recombinant proteins covering the central collagenous domain wereprepared. The 4 kDa recombinant protein spanning from 461Pro to 500Glu was shown cross-reactivity to patients sera
but the protein from 431Ala to 475Gly was not shown. Taken together these data, a major epitope in the α2 chain ofbovine type I collagen was suggested to locate in 25 amino acid residues with 475Gly to 500Glu.
In the future, our analyzed data of IgE-binding epitope in the α2 chain of bovine type I collagen may become toolfor developing a gelatin which has no or low allergenicity to humans

１．緒

こえて広く保存されていることから、これまで、コラーゲ

言

ンの免疫原性は非常に低いと考えられてきた。しかしワク

近年小児において麻疹、ムンプス、風疹ワクチン接種

チン添加剤中のウシゼラチンがアレルギー原因物質である

後、副反応としてアナフィラキシーを起こす例があり、卵ことが明かとなったことから、本研究はウシコラーゲンに成分がアレルギーの原因と考えられてきた。これまでこの代わる種特異性の低いコラーゲンの開発を目的とし、種々

アナフィラキシーの原因アレルゲンがワクチン添加物としの動物由来コラーゲンとの反応性を検討した。さらにⅠ型

１, ２）

。こ

コラーゲンの抗原性の検索を行うため、構成鎖 α1 鎖およのゼラチンはコラーゲンの変性物であり、主にウシコラー

び α2 鎖を単離精製し、また α2 鎖をカバーする組み換え

ゲンがその由来となっている。コラーゲンは現在ワクチン

タンパクを作成し、抗原部位の局在を明らかにした。ゼラの添加剤みならず、他の薬剤の安定化剤および止血用膜なチンは優れた安定性と安価で多量供給できることから、さどの医薬品、美容形成用剤および化粧品、またゼリーとしらに需要は拡大するものと推測される。今後安全なゼラチての食料品など、生活密着した用途に広がっている。一方ンを開発するために、エピトープ分解除去の方法の確立を

コラーゲンは人体の全タンパク量の 1/3 を占め、特徴的な予定している。

て含まれるゼラチンであることを明かにしてきた（Gly-Pro-X）の繰り返し配列をしており、３本の α 鎖が２．実

３重ヘリックスを構成している。これらの構造は動物種をEpitope analysis of gelatin allergy anddevelopment of low-allergic gelatin
Hisae Hori
Department of Molecular Pathogenesis,
Division of Adult Diseases, Medical
Research Institute, Tokyo Medical and
Dental University

２. １

試

験

料

安定剤としてゼラチンを含んでいるワクチン接種後、アナフィラキシーを含む即時型アレルギー反応を惹起した小児 15 例から得られた血清およびゼラチン含有の菓子（グミ）を食べた後即時型アレルギー反応を惹起した小児１例から得られた血清。

− 36 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

２. ２ ウシⅠ型コラーゲンおよび各種動物由来コラーゲンの作成３． 結

Ⅰ型コラーゲンはウシ皮膚真皮層を細切後 0.5M 酢酸で

３. １

果

ゼラチン中のアレルゲンの同定抽出し、食塩沈殿法にて精製した。各種動物由来コラーゲ

ゼラチン特異的 IgE 抗体の測定は共同研究者阪口雅弘

ンも同様に皮膚組織から 0.5M 酢酸またはペプシン消化で博士の開発した蛍光 ELISA を用い１）、ワクチン接種後ア３）

ナフィラキシーを起こした患者血清と熱変性コラーゲンを抽出後上記と同様に単離精製した 。

用い反応性を調べた。

２. ３

ウシⅠ型 α1 鎖および α2 鎖の調製

ウシ皮膚よりペプシン消化で可溶化し、食塩分別法で精３. １. １ 市販ゼラチンと精製コラーゲンに対する反応性

製したⅠ型コラーゲンから、Piez らの CM（カルボキシメ

の検討

４）

チル）クロマトグラフィー分離法にて各鎖を単離した 。

ワクチンに添加されている市販ゼラチンのアレルゲン性

α2 鎖はさらにアミノ酸特異的な分解（CNBr によるメチの有無を確認する目的で精製コラーゲンとの反応性を比オニンの分解、リジルエンドペプチダーゼ）を行い、抗原較検討した。ウシ皮膚由来精製コラーゲンを加熱変性後性の変化を検討した。

ELISA にて反応性を調べた。10 例の患者血清 IgE はワク
チン含有のゼラチンと同様ウシⅠ型コラーゲンに強い反応性を示した（Fig. １）。

２. ４ ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖の組み換えタンパ
クの作製
アレルギー患者血清中のエピトープを系統的に分析す
５）

３. １. ２ ゼラチンアレルギー反応の種特異性の検索

より、Fig. ３に示した

ゼラチンによるアレルゲン性の種特異性について検索す

数種の組み換えタンパクに対応する cDNA フラグメントる目的で６種の哺乳動物、鳥類、両生類、魚類、頭足類（200 アミノ酸残基）を作製した。バクテリア発現ベクタなどの皮膚よりコラーゲンを抽出精製し、上記と同様各ー（pRSET、
His-Tag）に組み込み , 融合タンパクを作製し、種動物コラーゲンを熱変性後 ELISA にて反応性を調べた

ニッケル吸着カラムで精製した。

（Table １）。ウシコラーゲンに対する反応性と比較するとるためにウシⅠ型 α2 鎖 cDNA

ブタ等の哺乳類由来のコラーゲンに幅広い交差反応性を認

２. ５

めたが、これまで摂取されたことの無いマウス、カンガル

ゼラチン特異的 IgE 抗体との反応

上記ウシおよび各種動物由来コラーゲン、ウシ α2 鎖、ーのコラーゲンにも反応することから、ウシコラーゲンに組み換えタンパクに対する IgE 抗体の測定はマイクロプ

よるアレルギー反応は動物種を越えて共通の抗原決定基にレートに抗原（10µg/mL）をコートし、アレルギー患者

由来することが推測された。一方、これまでに多く摂取さ血清（1：10 希釈）と蛍光 ELISA にて行った。

れているニワトリのコラーゲンとは低い反応性を示し種特異性反応が認められた。またサカナコラーゲン単独で陽性

Table １

Reactivity of anti-gelatin IgE to gelatin from various animals.

Fig.1 IgE reactivity to bovine gelatin and denatured type Ⅰ collagen. Each child's serum wasdiluted to approximately1 Ua/mL as level of specific IgE to gelatin.

− 37 −

を示す例も認められたが、その後の研究の結果、いわゆるクを作成し同定を行った。

サカナアレルギーの患者血清では類似のサカナコラーゲンと反応するもののウシゼラチンとは反応しないことが明か６）となった 。

３. ２ ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖組み換えタンパクによる抗原性部位の検出
ウシⅠ型コラーゲン α2 鎖のアミノ酸配列はこれまで部分

３. １. ３ Ⅰ型コラーゲン構成鎖のアレルゲン性について

配列の報告であったため、ウシ大動脈由来の cDNA ライブ

コラーゲンは十数種の型が知られているが、抽出時に混ラリーより全 cDNA をクローニングし、全アミノ酸配列を入する可能性のあるⅡ型コラーゲンからⅤ型コラーゲンに明かにした５）。そのウシⅠ型 α ２鎖 cDNA を鋳型として 200

対する反応性を調べたところ、Ⅰ型コラーゲンに特異的でアミノ酸配列に相当する cDNA フラグメントを作製し、発あった。したがってこのアレルギー反応がⅡ型からⅤ型コ

現ベクターに組み込み融合タンパクを作製した（Fig. ３）。

ラーゲンの混在に由る可能性は低いと考えられた。そこで
Ⅰ型コラーゲン構成鎖の α1 鎖 , α2 鎖を単離精製し、それ

３. ２. １ ウシ α2 鎖をカバーする 5 個の組み換えタンパ

ぞれの反応性を調べたところ、ヒトとのホモロジーが 98

クとの反応性％の α1 鎖とは全く交差性は認められず、α2 鎖（ホモロジ

α2 鎖のヘリックス構造部位に相当する 100kDa（約 1000

ー 93％）に特異的であることが明らかになった（Fig. ２）。

アミノ酸残基）に対応する５個の組み換えタンパク、Ⅰ

エピトープはウシ α2 鎖の特定部位に局在すると考えられ、（1NGln -9NPro/1Gly - 224Leu）、Ⅱ（213Asn - 417Ala）、Ⅲ（418Gly

さらに詳細な抗原部位を特定するために、組み換えタンパ- 662Pro）、 Ⅳ（663Val -880Glu）、 Ⅴ（879Val - 1014Ser/1C Gly15CAla）を用いて患者血清との反応性を検索した（Table ２）。

患者血清 16 例中 14 例がⅢに、６例がⅡに、３例がⅣ、１
例がⅤに陽性反応を示し、抗原部位は複数あることが示唆されたが、主要なエピトープはヘリックス構造中央部Ⅲ（418Gly - 662Pro）にあると判明した。
３. ２. ２

主要エピトープの局在部位の解明

さらに組み換えタンパクⅢ（418Gly - 662Pro）について
３つの部位、Ⅲ a（418Gly - 510Ala）、Ⅲ b（491Leu - 588Pro）、Ⅲ c（572Leu - 675Ser）に対応する cDNA フラグメ
ントを作成し、融合蛋白を発現、精製した。これら組み換えたんぱくに対する反応性を調べたところ、Ⅲ（418Gly 662

Fig.2 IgE reactivity to α1 and α2 chains of bovine type Ⅰ
collagen. Each child's serum was diluted to approximately
1 Ua/mL as level of specific IgE to gelatin.

Pro）に陽性の 14 検体はすべてⅢ a に反応し、抗原部位は 418Gly - 510Ala の 93 残基に局在することが明らかになった（Fig. ４）。ただし１症例 no.4 においてⅢ b にも反応性

Fig.3 A schematic representation of the collagen α2（Ⅰ）chain and its recombinant proteins. Reco ｍ binant proteins Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ ,Ⅲ a, Ⅲ b, Ⅲ c and Ⅲ a-1 to a-3 are prepared from bacterial expression vector pRSET.

− 38 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

がみとめられた。さらにⅢ a 中の抗原の局在を検索するた
408

めにⅢ a-1（ Lys -

444

431

475

三重ヘリックスを構成しており、コラーゲンに特異的なアGly）、Ⅲ a-2（ Ala - Gly）および

ミノ酸である Hydroxyproline, Hydroxylysine は、コラー

Ⅲ a-3（461Pro-500Glu）を作成し、その反応性を調べたところ、ゲンの高次構造の安定化に寄与している。これらの構造は

Ⅲ a-3 に明らかな反応性が認められた（Fig. ５）。これらの動物種をこえて広く保存されており、ウシとヒトとの相同タンパクを CNBr 分解、lysylendopeptidase 処理しても抗性は α1 鎖で 98％、α2 鎖で 93％と高く、コラーゲンの免原性に変化は認められないことから、メチオニンおよびリ

疫原性は非常に低いと考えられてきた。しかし、近年コラ

ジン残基は抗原部位に含まれないと推測された。

ーゲンのヘリックス構造を認識し、種特異性を示すモノク

４．考

ローナル抗体のエピトープが明かとなり、コラーゲンも免察

疫原性は高いことがわかった７）。今回ゼラチンアレルギー

Ⅰ型コラーゲンは特徴的な（Gly-Pro-X）の繰り返し配の抗原物質がウシⅠ型コラーゲンであり哺乳動物のコラー列をしている分子量 100kDa の α1 鎖２本と α2 鎖１本がゲンと共通の抗原性を保持していること、さらにⅠ型コラ

Table ２ Reactivity of anti-gelatin IgE to recombinant proteins for α2 chainof bovine type Ⅰ collagen.

Fig.4 Reactivity of the sera from children with systemic allergic reaction to recombinant proteins of 418Gly to 675Ser
in bovine α2 (Ⅰ) chain. Ⅲa, 418Gly - 510Ala; Ⅲb,491Leu 598
Pro; Ⅲc, 578Leu - 675Ser

Fig.5 Reactivity of the sera from children with systemic allergic reaction to recombinant proteins of 408Leu to 500Glu
in bovine α2 (Ⅰ) chain. Ⅲa-1, 408Lys - 444Gly; Ⅲa-2,431Ala 475
Gly; Ⅲc: 461Pro - 500Glu− 39 −

ーゲンの２本の分子鎖（α1 鎖および α2 鎖）のうち α2 鎖を減弱させる方法を検討中である。

に特異性があり、一次構造を認識していることが判明した
８）, ９）。さらに α2 鎖の部分組み換えタンパクを作成し、そ（参考文献）の抗原性を調べたところ、すくなくとも４個所の抗原性部

１） Sakaguchi M., Ogura H., and Inoue S.: IgE antibody

位がみとめられた。さらにエピトープは主要な反応性を示

to gelatin in children with immediate-type reactions toすⅢ（418Gly - 662Pro）のうちⅢ a-3（461Pro-500Glu）の 40 残

measles and mumps vaccines. J. Allergy and Clinical基にあり、さらにオーバーラップ

Immunology. 96, 563-565, 1995.

を除くと

475

しているアミノ酸配列

500

Gly- Glu の 25 アミノ酸残基配列中に局在する

２） K e l s o J . M . , J o n e s R . T . a n d Y u n g i n g e r J . W .

ことを明かにした（Fig. ６）。またヒトと異なるアミノ酸配Anaphylaxis to measles, mumps and rubella vaccine

列部位を考慮すると、Ⅱでは 271Gly-300Ala 近傍に、Ⅲ a では

mediated by IgE to gelatin. Journal of Allergy and467

Clinical Immunology, 91, 867-872, 1993.

500

Leu- Glu 近傍にウシゼラチンアレルギー抗体 IgE の結合部位が局在すると推測され（Fig. ６）、上記の組み換えタ３） Miller E.J. and Rhodes R.K., Preparation and

ンパクを用いた抗原部位の検索結果と一致した。本実験はcharacterization of the different types of collagen.

バクテリアでの発現系であることから、前述のコラーゲン

Methods Enzymol ., 82, 33-64, 1982.

特異的なアミノ酸（Hydroxyproline, Hydroxylysine）の４） P i e z K . A . , E i g n e r E . A . , L e w i s M . S . , T h e

水酸化とその糖付加修飾は行なわれていないにもかかわらchromatographic separation and amino acid

ず、組み換えタンパクとの反応性が認められた。したがっcomposition of the subunits of several collagens.

て、コラーゲン特異的アミノ酸は抗原決定部位には関与しBiochemistry , 2, 58-66, 1963.

ていないことを示唆しているが、詳細は動物細胞培養系に

５） Shirai T., Hattori S., Sakaguchi M., et al: Theて修飾された融合タンパクを作製し、アレルギー患者血清

complete cDNA coding sequence for the bovine

中 IgE のエピトープを系統的に分析する系を確立する必

proα2(I) chain of type I procollagen. Matrix Biology,

要がある。今後アレルゲン性のないコラーゲンの開発には

17,85-88, 1998.

本研究により特定されたエピトープのアミノ酸配列を参考

６） Sakaguchi M., Toda M., Ebihara T., Irie S., Horiにし、感受性の高いプロテアーゼ処理によりアレルゲン性

H. Imai A, Yanagida M, Miyazawa H, Ohsuna H,

Fig.6 Amino acid sequence in bovine α2 chain of putative epitope for spacific IfE anitibody from children with anaphylaxis to vaccines.

− 40 −

ゼラチンによるアレルギー反応のエピトープ解析と安全なゼラチンの開発

Ikezawa Z, Inouye S.: IgE antibody to fish gelatin (type８） Sakaguchi M., Hori H., Ebihara T., et al: Reactivty of

I collagen) in patients with fish allergy. Journal of

the IgE in bovine gelatin-sensitive children to gelatins

Allergy and Clinical Immunology, 106, 579-584, 2000

from various animals. Immunology 96, 286-290, 1999.

７） Hori H., Keene D. R., Sakai L. Y., et al: Repeated９）Sakaguchi M., Hori H., Hattori S., et al: IgE reactivity

helical epitopes of defined amino acid sequence into α1 and α2 chains of bovine type I collagen inhuman type III collagen identified by monoclonal

children with bovine gelatin allergy. Journal of Allergy

antibodies. Molecular Immunology, 29, 759-770, 1992.

and Clinical Immunology, 104, 695-699, 1999.

− 41 −

皮膚色素性病変の新しい診断法の開発

北海道大学大学院

松医学研究科皮膚粘膜病学分野

村

哲

理

The management of skin pigmentation is an important field in cosmetology. Usually, management of pigmentation incosmetology deals with benign skin conditions like lentigines, freckles, and post-lesional pigmentation. Among thesebenign pigmentary conditions, one must differentiate malignant lesions such as melanomas. Eary diagnosis of melanoma
is important because advanced melanoma has poor prognosis. Recently, our group developed a personal computer-based
three-dimensional (3D) reconstruction system, which can visualize 3D structure of dermatopathological specimens. In
this report, I employed this method to a pigmentary skin lesion, nevus pigmentosus, combined with clinical detailed
observation of the lesion by digital microscopy, to investigate if this method is useful in the diagnosis of pigmentarylesions. Thirty serial sections from each block were stained with H&E. Serial images were registered using a graphics
program Photoshop. After extracting the region of interest, three-dimensional images were projected using NIH-Image
program. Biopsy specimens obtained from normal shoulder skin showed net-like structure of rete ridges and dermal
papillae fit to each opening of the net, and biopsy specimens from normal palmar skin showed wide incurved structureof epidermis, which corresponded to the skin surface creases. In nevus pigmentosus of the sole, dermoepidermal
junction area was irregularly depicted corresponding to the presence of junctional nevus cell nests. Relationship between
the distribution of nevus nests and surface structure of the epidermis was also visualized. Further study is now underinvestigation to show the relationship between detailed clinical observation with digital microscopy and the histological
three-dimensional structures of nevus pigmentosus.

１．緒ードバックが十分に得られていなかったという問題があっ言た。

コスメトロジー分野において，いわゆる「シミ・そばか発疹の臨床像については，近年デルマトスコープやデジす」などの皮膚色素性病変への対応は大きなテーマの一つ

タルマイクロスコープなど，病変をより詳細に観察できるである。しかし，一口に色素性病変といっても，その中に手段が得られるようになってきており，その有用性も報告

は色素性母斑，肝斑や老人性色素斑などの良性病変に混じされてきている１）２）。

って，皮膚メラノーマという悪性病変があることを忘れてはならない。

病理組織学的手法については，臨床像の一部分の断面しか見られないという点を克服するためのひとつの試みとし

皮膚メラノーマは，最も悪性度の高い悪性腫瘍の一つでて，我々はコンピューターを用いた三次元再構築法を開発ある。オゾン層の破壊などに伴う紫外線量の増加がメラノした 3。これまでも三次元再構築の試みはあったが，これーマの発生頻度を高める可能性が指摘されており，実際，らの報告では専用の三次元再構築システムを用いており，

近年増加傾向にある。進行したメラノーマは外科的切除・どこの施設でも手軽に行えるものではなかった４）−６）。そ化学療法・放射線療法などあらゆる治療を尽くしても治癒こで，我々は一般的に手に入るパーソナルコンピューター

させることは困難であり，現在のところ，早期発見・早期および汎用グラフィックソフトを用いて三次元再構築を行

治療が最善の治療手段である。早期メラノーマであれば，った。この方法を用いると，通常の病理組織では二次元の十分な外科的切除により治癒させることが可能であり，実断面としてしかとらえられない病変を，比較的容易な手順

際当施設では５年生存率は 100％となっている。

で三次元的にとらえることができる。

メラノーマの早期診断のためには，臨床的像と病理組織

そこで，メラノーマの診断にこの方法を応用し，デジタ

学的所見を加味して総合的に診断することが必要である

ルマイクロスコープにより詳細に記録された臨床像と対応が，病理組織標本は臨床像の一部分の断面を見るという性させることにより，臨床像と病理組織像のギャップを埋

格上，臨床像との関連が十分検討できず，臨床像へのフィめ，より正確な早期メラノーマの診断法を確立しようと考A new method for diagnosis of pigmentaryskin lesions.
Tetsuri Matsumura

えた。本研究では，足底の色素性母斑の病変について，病理組織学的にみられる母斑細胞巣と，肉眼的に見られる皮
膚表面の皮溝との関連を，三次元的に画像化した。

Department of Dermatology, Hokkaido
University
Graduate School of Medicine

２．実験

材料として正常皮膚を含めて切除された色素性母斑の手術標本を用いた。切除前に病変を 10 〜 50 倍の倍率でデジ− 42 −

皮膚色素性病変の新しい診断法の開発

タルマイクロスコープ（キーエンス社 VH-6300）に記録し; slice spacing, 2.0; initial angle, 0; rotation angle increment,

た。切除標本は型通りホルマリン固定，パラフィン包埋し，

5; lower transparency bound, 0; upper transparency bound,

厚さ６µm の連続切片を 24 〜 40 枚作成し，ＨＥ染色した。

254; surface opacity, 0; surface depth-cueing, 100; interior

染色標本の画像をそれぞれデジタルマイクロスコープを

depth-cueing, 50; axis of rotation, x-axis; projection method,

用いて JPEG 画像に変換し，パーソナルコンピューター（アnearest point。

ップル社 Power Macintosh G3）に取り込んだ（図 1a）。取また，凍結標本から連続切片を作成し，その連続切片にり込まれた画像をフォトレタッッチソフトウエア（アドビ

対して S-100，HMB45，PCNA，Ki-67，CD34，CD35 に対社 Photoshop）の各レイヤーに配置した。隣り合うレイヤ

する免疫染色および TUNEL 法によるアポトーシスの検出

ーの画像を不透明度 50％で合成し，それぞれの画像の主なを試み，陽性細胞分布の三次元再構築を試みた。

部分（画像により表皮真皮境界部，
毛包，
比較的大きな血管，

３．結母斑細胞巣等）が最も一致するように画像を動かして位置果あわせ（registration）を行った（図１ｂ→ｃ）。この方法

まず，正常皮膚の表皮真皮境界部の三次元画像化を行っではＺ方向の完全な alignment は保証されないが，様々なた。肩の正常部では，網状の形態をとる表皮突起と，その方向に変化する主な部分を最も一致するように registration

網の孔の部分に一致する真皮乳頭の形態を三次元的に画像するため，Ｚ方向が大きくずれる可能性は低い。さらに，化することができた（図２a）。一方，手掌の皮膚では，表各画像を自動レベル調整した後に一定量のぼかしを入れ，皮側が溝になっている部分では表皮真皮境界部も真皮側に自動選択ツールを用いて表皮を選択し切り出した（図１d）。

凹になっており，表皮真皮境界部の形態が表皮の表面側の切り出した表皮を白に，その他の部分を黒に塗り，画像

皮野・皮溝の構造と対応する様子が画像化できた（図２b）。

をモノクロ２階調に変換した（図１e）。次に，それぞれの次に，同様の方法を用いて，足底の色素性母斑の三次元画像をパブリックドメインの画像解析ソフトウエア（NIH-

再構築を行った。この方法では，表皮のコントラスト差をImage：developed at the U.S. National Institutes of Health

用いて表皮を切り出すため，色素性母斑の母斑細胞巣は真and available on the Internet at http://rsb.info.nih.gov/nih-

皮側として認識される（図３a）。
表皮側を真皮側から見ると，

image/）に読み込み，projection により三次元画像を作成

母斑細胞巣が入り込んでいるため，真皮表皮境界部は不規した（図１f）。パラメーターとしては以下のものを用いた

則になっている（図３b）。真皮側を見ると，この部分で

図１ 三次元再構築の方法
連続切片の画像をそれぞれコンピューターに取り込む（ａ）。隣り合う画像を不透明度 50％で合成し，それぞれの画像の主な部分が最も一致するように画像を動かして 置あわせを行う（ｂ→ｃ）。さらに，自動選択ツールを用いて表皮を選択し切り出す（ｄ）。切り出した表皮を白に，その他の部分を黒に塗り，画像をモノクロ２階調に変換する（ｅ）。最後に，それぞれの画像を NIH-Image に読み込み，三次元画像を作成する（ｆ）。

− 43 −

図２ 三次元再構築の例
ａ）肩の正常皮膚。網状の形態をとる表皮突起と，その網の孔の部分に一致する真皮乳頭の形態が三次元的に示されている。ｂ）手掌の皮膚。表皮真皮境界部の形態が表皮の表 側の皮野・皮溝の構造と対応している様子が画像化されている。

図３ 色素性母斑の三次元再構築像
再構築した色素性母斑のＨＥ像（ａ）。表皮を真皮側から見た画像（ｂ）および真皮側の画像（ｃ）のみでは，
母斑細胞巣の分布にははっきりとした規則性を見ることは難しい。しかし，表皮側を上から見た画像（ｄ）に，母斑細胞巣だけを切り出した画像（ｅ）を重ねると，主に皮溝の部分に沿って母斑細胞の細胞巣が分布していることがわかる（ｆ）。

図４

色素性母斑のデジタルマイクロスコープ像− 44 −

皮膚色素性病変の新しい診断法の開発

は母斑細胞巣の分布にははっきりとした規則性を見ること

イクロスコープで色々な色素性母斑を観察すると，色の付は難しかった（図３c）。そこで，表皮側を上から見た画像

いた部位が皮膚表面構造と関連している様子がしばしば観（図３d）に，母斑細胞巣だけを切り出した画像（図３e）

察される（図４）。このような関連性が色素性母斑とメラを重ねてみたところ，表皮を表面から見た皮野・皮溝の状

ノーマの鑑別に有用であるという報告があり 7，デジタル

態と母斑細胞巣分布の関連がわかるようになった（図３f）。

マイクロスコープで観察した臨床上の特徴が，組織学的にこの方法により，部分的に例外はあるものの，主に皮溝のどのように関連しているかをとらえることは，興味のある部分に沿って母斑細胞の細胞巣が分布していることがわか研究テーマであると考えられる。今後は症例を増やし，デり，皮膚の表面構造と母斑細胞巣の分布に関連を見ること

ジタルマイクロスコープによる画像と，組織学的三次元再ができた。

構築法を組み合わせて，病理と臨床のギャップを埋め，色免疫染色標本については，多くの正確な連続切片を得る

素性病変の診断への応用へと発展させたいと考えている。

ことが難しく，現在までのところ満足のいく画像は得られていない。切片の変形が少なく，脱落しにくく，染色が一（文献）定の条件で行えるような技術的な問題の解決が必要と考え

１） Kittler H, Seltenheim M, Dawid M et al. Morphologicられた。

changes of pigmented skin lesions: a useful extension

４．考of the ABCD rule for dermatoscopy. J Am Acad案

Dermatol 1999; 40: 558-62.

本研究では，病理組織の三次元再構築という方法を用い

２） Carli P, de Giorgi V, Palli D et al. Preoperative

た。本法を用いると，通常は二次元の断面でしか見られな

assessment of melanoma thickness by ABCD score ofい病理組織切片を，連続切片からの画像をコンピューター

dermatoscopy. J Am Acad Dermatol 2000; 43: 459-66.

処理することにより，三次元形態として観察することがで

３） Matsumura T, Sato-Matsumura KC, Yokota T et al.

きる。例えば，通常の二次元の切片では，表皮突起は真皮Three-dimensional reconstruction in dermatopathology

乳頭と同様に「突起」として捕らえられるが，三次元再構- A personal computer-based system. J Cutan Pathol
1999; 26: 197-200.

築することにより表皮突起は「突起」ではなく，網状の「稜」
であり，表皮稜という言葉が正しいことを画像として示す

４） Nakayama M, Takahashi H, Okamoto M et al.
Three-dimensional computer-reconstructed image for

ことができる。

studying cancer extension within the hypopharynx.

今回は，この方法を色素性母斑に応用した。色素性母斑

Acta Otolaryngol (Stockh) 1997; 117: 764-8.

はメラノーマとの鑑別が問題になることがあり，臨床所見上の鑑別点として，対称性，境界，色調，大きさ等が参考

５） Griffini P, Smorenburg SM, Verbeek FJ et al.

になるとされているが，中には肉眼的な臨床所見だけではThree-dimensional reconstruction of colon carcinoma
metastases in liver. J Microsc 1997; 187: 12-21.

鑑 の難しい症例もあり，非侵襲的でより精度の高い鑑 法が必要とされている。最近では，色素性病変の臨床的な

６） Bacharach-Buhles M, el Gammal S, Panz B et al. In

鑑 に，デルマトスコープやデジタルマイクロスコープな

psoriasis the epidermis, including the subepidermal

どの機器が応用されるようになってきており，その有用性

vascular plexus, grows downwards into the dermis. Br
J Dermatol 1997; 136: 97-101.

１）２）が報告されている。将来的にこれらの方法が一般的に臨床に応用されるようになれば，色素性病変の鑑別はより

７） Oguchi S, Saida T, Koganehira Y et al. Characteristic

精度の高いものになることが期待される。その際には，臨

epiluminescent microscopic features of early malignant

床的な所見と，病理学的所見の相関関係を明らかにするこ

melanoma on glabrous skin. A videomicroscopicとが必要不可欠である。

analysis. Arch Dermatol 1998; 134: 563-8.

本研究では，病理組織の三次元再構築法を色素性病変に応用することにより，色素性母斑の母斑細胞巣が，主に皮溝の部分に存在することを示すことができた。デジタルマ− 45 −

A、B 領域紫外線の直接照射によりSCID マウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防
大阪大学

本

行

医学部

忠

志

To study the mechanism and risk of human skin cancer from solar light, we exposed human skin transplanted to severe
combined immunodeficient mice to daily doses of UVA and UVB (dose rate of 2.8 J/m2/sec) for period of approximately 2
years and investigated morphological and genetic changes of human skin tissues.  Of 18 normal skins, 14 actinic keratoses(77.8%) and 4 skin cancers (3 squamous cell carcinomas and 1 undifferentiated carcinoma) developed, wheras neither
actinic keratosis nor cancer was observed in 15 human skins not exposed to UVA and B.   This is the first success ininducing cancer and solar (actinic) keratosis in human skin by UVA , B.  
Among p53 mutations at various sites, mutation at codon 242 (cTGC → cCGC; Cys → Arg) was specifically observedin both skin cancers and actinic keratoses.  Furthermore, double or triple mutations were induced in all UVA , B-induced
skin cancers and in three of eight actinic keratoses.  As well as p53 mutations, 2 of 3 squamous cell carcinomas had also
K-ras and c-kit mutations.  So far as we know, c-kit mutation has not been reported in the skin cancer except melanoma.  
Mutations of β-catenin gene occurred in 7 human skins, but these were non- specific mutations.

１

緒との相関を解析することにより太陽紫外線によるヒト皮膚言に実際に誘発される障害を確証した。また、これまで考えヒト発がんの実験的研究は、限られた、あるいは不自然られなかった新しい観点からヒトの前癌病変から癌に至るな条件下（ヒト培養細胞、動物実験など）でしか成され得特性とその悪性化機構を明らかにすることを目的とした。

なかった。現在米国で使われている T 細胞、B 細胞の欠損

２した SCID（Severe Combined Immunodeficiency）マウス
は、若年で白血病を多発し（約 30％）
、また、T、B 両細

２. １

実

験

ヒト正常皮膚の継代・維持胞ともに一部正常に戻ってしまうため（約 30％）
、マウス

ヒト正常皮膚は、大阪大学附属病院およびその関連病院

皮膚の allograft すら生着しにくいことがわかっている。野の外科、皮膚科、泌尿器科および神戸大学大学附属病院皮村らは、1986 年より IgG, IgM が検出限界以下の C.B17-scid

膚科において、乳がん患者、包茎患者および老人性角化症

マウスを 20 代以上 Selective Inbreeding（ホモ交配）した患者の手術切除片で廃棄されるものを了解を得て用いた。

改良 SCID マウスに、最も観察の容易なヒト正常皮膚を移ヒト正常皮膚は、我々の改良 C.B17/N-scid に加え、我々の植し、長期間にわたり太陽紫外線類似の A, Ｂ領域紫外線作成した C3H/HeJ/N-scid を用い、ヒト正常皮膚のより健（UVA, UVB）を連日照射したところ、ケラトーシスが高率常な継代・維持を行った。

にヒト皮膚に発生し、１〜２年間の連日照射により、ヒト皮膚がんを世界で初めて実験的に誘発するのに成功した１）。

２. ２

A, B 領域紫外線（UVA, B）照射

また、本行らは、放射性同位元素を使わず、従来の方法

TOSHIBA 健康ランプ FL-20 S.E（20W）４本を用い、に比べ、迅速・簡便・高感度・安価に遺伝子変異を検出しKodacel TA407 (Eastman 社 ) にて 290nm 以下の波長の得る独創的な Cold SSCP 法を開発しており２）、キャピラ

紫外線を全面的にカットし、地上に到達する太陽光と類似

リーシークエンサーと共に普通の実験室で容易に遺伝子変させた。月、水、土曜日に 8000 J/m2、火、木、金、日曜

異解析が可能となっている。

日に 2000 J/m2 を線量率約 2.8 J/m2/sec で照射した。

本研究では、ヒト皮膚組織移植 SCID マウスを用い、UVA, B によりヒト皮膚に誘発された全ての突然変異のシー

２. ３

クエンスを行い、UV 照射、時間的変化、病理組織学的経過
Gene mutations induced by UVA, B light inhuman skin maintained in severe combined
immunodeficient mice

病理組織学的検索

ヒト正常皮膚を改良 SCID マウスに移植し、UVA, B 照
射を行い、継代移植時に biopsy をとり、パラフィン包埋切
片の H-E 染色にて病理組織学的検索を行った（Fig. 1 参照）。

Tadashi Hongyo

２. ４

遺伝子変異検索Department of Medical Genetics andRadiation Biology, OsakaUniversity,
Graduate School of Medicine.

DNA 抽出を行い PCR-Cold-SSCP 法 ２）３）（Fig. 2 参照）、

パラフィン包埋切片あるいは凍結保存サンプルよりDirect sequence 法により、p53, K-ras および c-kit 遺伝子− 46 −

A、B 領域紫外線の直接照射により SCID マウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防

Transplantation
to SCID mice

Human skin tissue

Re-transplantation toanother SCID mice

UVA, B exposure

UVA, B exposure

BiopsyPathological check
Genaration 1

UVA, B exposures

Biopsies

DNA analysis

Original

Maintaining human skintissue by SCID mice

Genaration 2

Genaration 3 ﾔ

Fig. 1 Human skin transplantation to SCID mice and UVA, B exposureの変異を経時的に検出し、紫外線によるヒト皮膚のケラ

また、ワイルドタイプ CB17+/+ マウスに UVA, B 照射

トーシス、皮膚がんへの進行過程での関与を調べた。p53,

しても皮膚がんは発生しなかったこと、および、ヒト遺伝

K-ras, c-kit および β -catenin 遺伝子増幅に用いたプライマー

子プライマーにより PCR 産物がえられたことより、がんを Table １に示した。

はマウス皮膚ではなくヒト皮膚より発生したと考えられる。

２. ５

３. ２

皮膚がん高発疾患患者の皮膚の継代・維持

p53 がん抑制遺伝子の特異的変異

各種皮膚がん高発疾患患者の皮膚（ケラトーシス、色素

UVA, B 照射により誘発された突然変異の例（Case 5）性乾皮症他）の継代・維持を行い、UVA、B によるヒト皮を Fig. 3 に示した。また、皮膚移植組織の継代移植時の膚の DNA 損傷と修復をマウスの身体をかりて明らかにし、組織および遺伝子変異の経時的変化の一部を Table ２にケラトーシス、皮膚がんの誘発状況と遺伝子変異を調べた。

示した。誘発されたケラトーシス、皮膚がんでは、p53 遺３

伝子に種々の突然変異が検出されており、そのスペクトラ

結果と考察

ムを Fig. 4 に示した。特に、codon242 に cTGC → cCGC

３. １ ヒト正常皮膚の継代・維持と UVA, B 照射によるヒト皮膚ケラトーシス、皮膚がんの誘発

transition（Cys → Arg）が特異的に誘発されていた。ヒ

改良 SCID マウスへのヒト正常皮膚移植組織の継代・維行 っ た 際 に 発 生 し た 皮 膚 が ん に 高 率 に p53 遺 伝 子 の持は２年以上にわたり可能で、ヒト正常皮膚 110 例中 110

codon242 に全く同じ突然変異が誘発されていることが例（100%）が改良 SCID マウスに生着した。

報告されており（Nataraj, et al., Invest. Dermatol., 1997）、

ト Psoriasis 皮膚に PUVA 療法（Psoralen + UVA）を

UVA, B 照射により、18 例中 14 例に光線角化症（actinic

本実験とよく一致している。codon273 にも変異が多く見keratosis）が見られ、ケラトーシスを経由して皮膚がんへられたが UV 照射とは無関係に発生しており、非特異的と進展が４例に見られた（扁平上皮がん３例、未分化がん１例）。

思われる。

− 47 −

Table 1 The PCR promer pairs for the amplification of p53, K-ras, c-kit and β-catenin genes.

Fig. 3 Cold SSCP and Direct Sequencing of human skin tissue in SCID mouse by UVA,B exposure.

− 48 −UVB unexposed human skinkeratosis (+) ; ●keratosis (-) ; ○n = 6 (15)
○

120

140

○

160

○

○
○

220

240

●○●

180

200

●
●
●
●
●
●
●
○
○
●
●
●
●
●
●
●●

UVB exposed human skinkeratosis (+) ; ●keratosis (-) ; ○n = 9 (19)
○ ●

120

140

●●

160

●

180

200

220

○
○
○
○
○
●
○
○
○ ○

260

280

300

260

280

300

260

280

●
●
●
●
●
○
●

●●

240

UVB-induced human skin cancer
n = 4 (5)
●●
●● ●●

120

140

160

180

●
●

200

Exon 5

Fig. 4

●
●
●
●
●●

220

240

Exon 6●

Exon 7300

Exon 8p53 mutation spectra of human skin tissue in SCID mice

３. ３ UVA, B 照射によるヒト皮膚での K-ras, c-kit
および β- catenin 遺伝子の変異

３. ４ 基底細胞癌におけるヘッジホッグシグナルの特異的異常

上記 UVA, B 照射ヒト皮膚の凍結サンプルを用い、K-ras,

基底細胞母班症候群の原因遺伝子 PTCH はヘッジホッ

c-kit および β-catenin の変異を調べたところ、K-ras codon12

グ蛋白のリセプターであり、一般人に生じる基底細胞癌にに GGT → GCT transversion が２例に起こっており、いず

おいても PTCH の変異が報告されている５）。PTCH 変異

れも UVA, B で誘発した扁平上皮癌であった。c-kit codonを代表とするヘッジホッグシグナルの異常が PTCH の発

561 に GAG → GAA transition が２例に誘発されており、現亢進を伴うことを利用して、神戸大学皮膚科で得られた

これも UVA, B 誘発扁平上皮癌であった。更に、codon559

各種のヒト皮膚腫瘍における PTCHmRNA の発現を RT-に GTT → ATT transition が１例に認められたが、これはPCR 法により解析し、その異常の特異性を検討した。そUVA, B 誘発ケラトーシス皮膚であった。c-kit 遺伝子の変の結果 12 例の基底細胞癌全てに高発現を認めたのに対し、

４）

異は間質系、生殖系や血液系の腫瘍で報告されているが、他の 24 例の腫瘍（有棘細胞癌、メラノーマ、ボーエン病、
日光角化症など）では１例のボーエン病を除いて、発現はメラノーマを除いた皮膚がんでは見られていない。
従って、UVA, B にて SCID マウスに移植したヒト正常
皮膚に誘発したヒト皮膚がんには、p53 癌抑制遺伝子の突低く、ヘッジホッグシグナルの異常は基底細胞癌特異的に生じている可能性が強く示唆された。

然変異（codon242 に加え２〜３重の変異）に加え、K-ras,
c-kit の突然変異も重複して誘発されていることが新たにわ

３. ５

かった。 β-catenin の変異も７例に見られたが非特異的であ
った。

今後の方針

正常 p53 遺伝子導入によるヒト皮膚がん遺伝子治療モデ
ルの作成を目的に、紫外線誘発ヒト皮膚がんの培養細胞系− 49 −

analyses. Nucl Acid Res 21:3637-3642, 1993.

を樹立しおり、皮膚がんの治療のみならず皮膚全体の研究

３） Hongyo T, Buzard GS, Palli D, et al. Mutations ofにも役立てたい。

the K-ras and p53 gene in gastric adenocarcinoma
from a high incidence region around Florence, Italy.

（引用文献）

Cancer Res 55:2665-2672, 1995.

１） Nomura T., Nakajima H., Hongyo T., et al. Inductionof cancer, acnetic keratosis, and specific p53 mutations４） Hongyo T., Li T., Syaifudin M., et al. Specific c-kit

by UVB light in human skin maintained in severe

Mutations in Sinonasal NK/T-Cell Lymphoma in China

combined immunodeficient mice. Cancer Res., 57: 2081-

and Japan. Cancer Res., 60: 2345-2347, 2000.
５） Ahmed, N.U., Ueda, M., Nikaido, O., et al. High2084, 1997.
２） Hongyo T, Buzard GS, Calvert RJ, et al. 'Coldlevel of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine appear in normal

SSCP': a simple, rapid and non-radioactive method forhuman epidermis after a single dose of ultraviolet

optimized single strand conformation polymorphism

radiation. Brit J Dermatol., 140:226-231, 1999.

− 50 −

ヒト皮膚線維芽細胞における I 型コラーゲン遺伝子の
個人依存性発現制御機構
神奈川歯科大学

畑隆

歯学部口腔生化学

一郎

Previously we have shown the presence of two polymorphic dinucleotide repeats in the human type I collagen
α2 (COL1A2) gene, one in the 5' flanking region (upstream repeat) and the other in the 1st intron (1st intron
repeat) and that the co-presence of these two repeats stimulates expression of the gene, and a specific haplotype ofthe two microsatellites of the human COL1A2 gene correlates with susceptibility to systemic sclerosis.
A major part of the DNA double helix within cells exists in the right-handed B-form conformation. Structuraltransition from the B-form to the left-handed Z-form DNA at dinucleotide repeats is proposed to play an importantrole in the transcriptional regulation of various genes.
To investigate the association of the change of higher-order structure such as the transition from the B- to
Z-form DNA (B-Z transition) with the two repeat regions and its role in transcriptional regulation, we performed
two-dimensional (2D) gel electrophoretic analyses of constructs containing or not containing the repeat regions. The
results indicated that constructs containing both of the repeats led to a structural transition from B- to Z-form butthat the construct lacking either of them did not. Additional 2D gel analyses using several constructs containing
either of the two repeats showed that this structural transition occurred only in the upstream repeat, but not in
the 1st intron repeat. Total number of supercoil relaxation was measured among the constructs with different
combinations of several repetitions of the two repeats. The result supported the idea that B-Z transitions occurred
only in the upstream repeat regions. Our findings therefore indicate that the upstream repeat region has theability to convert its conformation from B- to Z-DNA but that the 1st intron repeats did not, although both of thedinucleotide repeats are indispensable for enhancing transcriptional activity of the COL1A2 gene.

１

緒トを PCR 法で作製し、塩基配列を確認した（Fig. １）。こ

言れらのコンストラクトの溶液に種々の濃度（0 〜 7µM）の我々は先に I 型コラーゲン α2 鎖（COL1A2）遺伝子のエチジウムブロミドを添加して負の超ラセンをリラックス

転写性制御領域である遺伝子の上流及び第一イントロンにした条件でトポイソメラーゼ I で 25℃、16 時間処理した４）。

２つの反復配列を見い出し１）、この反復配列の組み合わせ
により、COL1A2 遺伝子の転写活性が制御されているこ

２. ２

２次元電気泳動によるトポアイソマーの分離と２）、及び、高い転写促進活性を示す反復配列の組み合わ

上記の各種コンストラクトのトポアイソマー混合物を精せ（ハプロタイプ）が全身にⅠ型コラーゲンが異常に蓄積

製後、0.7％アガロースゲル , トリス / ホウ酸緩衝液（TBE）

３）

する疾患である強皮症に対する感受性に関与していること

中で一次元目の電気泳動を 110V で 16 時間行い、ついでを報告した。本研究ではこの転写制御機構を明らかにする

１µM のクロロキンで処理しラセンをリラックスさせた

ために各種コンストラクトのトポアイソマーを二次元電気後、１µM のクロロキン存在下で二次元目の泳動を 100V

泳動法で分離し、転写制御領域の高次構造、特に右巻きので 18 時間行った。クロロキンを除いた後、エチジウムブ

B 型構造から左巻きの Z 型ラセンへの転移を解析した。

ロミドで染色し、写真撮影を行い、二次元電気泳動後のト

２
２. １

実

ポアイソマーの移動距離から超ラセン構造を解析した４）。

験

コンストラクトとトポアイソマーの作製

２. ３

COL1A2 遺伝子の上流の反復配列（上流反復配列）及び第一イントロンの反復配列（イントロン反復配列）の二DNA ラセンの B-Z 転移に伴う超ラセンのリラクセーシ
ョンは以下の式により計算した。

つの反復配列を含む各種の COL1A2 遺伝子コンストラク
Topological analysis of the transcriptional
regulatory regions of the human type I
collagen α2 chain (COL1A2) gene

B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移の測定５- ８）

i/10.4+i/12
この式で i は反復配列の塩基数、10.4、12 は各々右巻き
および左巻きラセンの一回転当たりの塩基数を示す。
また、
B-Z 転移における超ラセン密度は以下の式で算出した。
-10.4y/z

Ryu-Ichiro Hata
Department of Biochemistry and Molecular
Biology, Kanagawa Dental College

この式で y は二次元電気泳動の一次元目の泳動で泳動
距離のシフトを示したトポアイソマーの番号、z は用いた
コンストラクト（プラスミド）の総塩基数を示す。

− 51 −

Fig. 1 Schematic diagrams of the 5' region of the COL1A2 gene (uppermost)and gene fragments (lower diagrams) that were contained in the plasmid
clones used for the study. Arrows indicate the transcriptional start site of thegene. Crosshatched and hatched boxes indicate the dinucleotide repeat in
the upstream and in the 1st intron of the gene, respectively. Names of plasmid clones containing the DNA fragments are indicated on the right side.

３

結

必要無いことが判明した。一方、イントロン反復配列を含果むコンストラクト及び同様のコンストラクトで反復配列を

３. １ 二つの２塩基反復配列を持つコンストラクトの高次構造解析
溶液中で遺伝子 DNA は一般に右巻きラセンの B 型構

持たないものは共に泳動距離の負に変化する点が存在せず（Fig.3B and 3D）、イントロン反復配列は同じ条件で Z 型構造を形成しないことが判明した。

造をとっている。今回のアガロースゲル二次元電気泳動の解析結果では COL1A2 遺伝子の二つの２塩基反復配列を持つコンストラクトでは一次元目の泳動で泳動距離が負に

３. ３ 反復配列の長さと Z 型構造の存在量との関係の解析

変化する点が検出され（Fig.2A）、反復配列を持たないコ

さらに、上流反復配列の長さと Z 型構造の形成能とのンストラクトではこの変化が検出されなかった（Fig.2B）。

関係を調べるために、種々の長さの上流反復配列を含む

この結果は少なくとも二つのの反復配列を持つコンストラ

コンストラクトを作成し、上記と同様に二次元電気泳動

クトには高次構造の異なる（Z 型構造）領域が存在してい法で Z 型構造の形成量を調べた。その結果、Z 型構造のることが示された。

形成量は上流反復配列の反復数の総和にのみ比例すること（Fig.4A,4B and 4C）、また、上流反復配列とイントロ

３. ２ンの組み合わせによっては影響されないことが判明した

Z 型構造の局在部位の解析

ついで上流反復配列とイントロン反復配列の両者が Z（Fig.4C and 4D）。

型構造を形成しているのか、あるいは反復配列のどちらか

４

片方が Z 型構造を形成しているのか、または、Z 型構造

考察の形成に二つの反復配列の共存が必要かを調べるために、

最近 DNA の高次構造が DNA の一次構造（塩基配列）

各々の反復配列を持つコンストラクト（Fig.3A and3B）、と同様に生物情報を持っていることが明らかになってきたおよび反復配列を含まないコンストラクト（Fig.3C and９）3D）を作成し、上記と同様に二次元ゲル電気泳動法で高に二つの２塩基反復配列が存在し、この二つの反復配列の次構造を解析した。その結果、上流の反復配列を含むコン

組み合わせにより COL1A2 遺伝子の転写活性が促進されストラクトは一次元目の泳動で泳動距離が負に変化する点

ること２）、及びこの配列の組み合わせのうち（13,6,8）-12が存在し、上流反復配列を含まないコンストラクトではトの組み合わせをホモに持つものはⅠ型コラーゲン遺伝子のポアイソマーが連続して分離され、泳動距離の負に変化す

転写活性が促進されている強皮症患者ゲノムにのみに存在る点が存在しなかった（Fig.3A and 3C）。これらの結果

し、対照の正常な個体由来のゲノムでは存在しないことをから上流反復配列が Z 型構造を形成していることが示さ報告した３）。そこでこれらの反復配列による COL1A2 遺れた。さらに、Z 型構造の形成に二つの反復配列の共存は伝子の転写促進機構を明らかにするために二つの反復配列。我々は先に COL1A2 遺伝子の上流と第一イントロン− 52 −

ヒト皮膚線維芽細胞におけるⅠ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

Fig. 2 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4/+1.4DR, containing (19, 7, 8) of
the upstream repeat and x=12 of the 1st intron repeat (A), and pCOL1A2-1.4/+1.4ΔDR, which does not contain either repeat (B). Electrophoretic patterns of the respective plasmids are shown on the right side of the figure, and schematic diagrams of the results, on the left side. The directions of each dimension of electrophoresis
are indicated in the figure. Positions I and II correspond to the minima in electrophoretic mobility in the 1st and2nd dimension, respectively, and relative topoisomer numbers counted from the minima in the first dimension
are indicated. N indicates the position of nicked DNA.

Fig. 3 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4DR, containing (19, 7, 8) of the
upstream repeat (A), pCOL1A2+1.4DR, containing x=12 of the 1st intron repeat (B), and those not containing
either dinucleotide repeat, pCOL1A2-1.4ΔDR (C), and pCOL1A2+1.4ΔDR (D), respectively.
Diagrams shown at the upper part of the respective figures indicate gross structures of COL1A2 gene segments
contained in these constructs. Arrows indicate the transcriptional start site of the gene.

− 53 −

の高次構造を解析した。上流反復配列、イントロン反復配を起こしたことを支持している。さらに本研究で用いた反列の両者が塩基配列からは Z 型構造を取りうることが推復数の異なるコンストラクトの電気泳動における泳動距定されたが、今回の結果は転写開始点の上流のみに左巻き

離の負へのシフトはトポアイソマー番号 27 で起こっておラセンの Z 型構造をとった領域が存在することが明らかり（Fig.4）、この値から B 型ラセンから Z 型ラセンへの転になった。Z 型構造の存在量は上流反復配列の長さに比例

移における超ラセン密度はおよそ -0.036（-10.4Y/Z, 4 つのすることから、反復配列部分が Z 型構造をとっているとコンストラクトでそれぞれ、27/7742、27/7736、27/7732、思われる。B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移において27/7740）と算出され、これは過去の反復配列による値とは超ラセン密度の減少を伴い、これは２次元電気泳動の１一致する５- ７）。以上の結果は用いたコンストラクトは上流

次元目におけるトポアイソマーの泳動距離の負への変化に

反復配列のみが Z 型構造を取っていることを示す。

よって示される。B 型ラセンから十字架型構造への高次構

しかし、本研究の結果で測定した Z 型構造の存在量と転造の変化によっても超ラセン密度の減少を伴う。上流反復

写促進活性は単純な比例関係を示さないので、COL1A2

配列は CG 反復配列を含むので十字架型構造を取りうる。

遺伝子の反復配列による転写促進活性を制御する因子は十字架型構造をとった時の超ラセンのリラクセーションの

DNA の Z 型構造以外にも存在することが示された。これ

総量は i'/10.4（i' は CG 反復配列の長さ）で示される。
（19,7,8）

らの結果は遺伝子の転写促進において現在の知見では説明-12 の反復配列を持つコンストラクトの上流反復配列が十できない新しい制御機構の存在を示唆しており、COL1A2

字架型を取るとすると超ラセンのリラクセーションの総量

遺伝子の研究はこの転写制御の分子機構の研究に好個の材は CG 反復配列を構成する塩基が２× ７＝ 14 なので 1.35

料となるばかりでなく、遺伝子の転写制御と疾患感受性の（14/10.4）となる。一方、上流反復配列のみが B 型ラセン解明に重要であると考えられる 10-11）。

から Z 型ラセンへの転移に起こす際の超ラセンのリラク
セーションの総量は 13.28（74/10.4 ＋ 74/12、74 は上流反（文献）

復配列の総塩基数）である。後者の値は 2 次元電気泳動に

１） Akai J, Kimura A, Arai K, Uehara K, Hata R:

よる超ラセンのリラクセーションの実測値 13（40-27）とFine structural analysis of the unique 5' region of

一致する（Fig.2A）。この結果から、用いたコンストラク

the human COL1A2 gene containing two regions of

トは上流反復配列が B 型ラセンから Z 型ラセンへの転移

dinucleotide repeats adjacent to the transcriptional

Fig. 4 Two-dimensional gel electrophoresis of topoisomers of pCOL1A2-1.4/+1.4DR, containing the following
combination of the repeats: (15, 7, 8)-12 (A), (13, 6, 8)-12 (B), (11, 6, 8)-12 (C), and (11, 6, 8)-16 (D). The left
side of each figure shows a schematic diagram, and relative topoisomer numbers from minima of the 1st dimension are also indicated.

− 54 −

ヒト皮膚線維芽細胞におけるⅠ型コラーゲン遺伝子の個人依存性発現制御機構

６） Rahmouni AR, Wells RD: Stabilization of Z DNA instart site. Connective Tissue 1998: 30; 1-6

vivo by localized supercoiling. Science 1989: 246; 358-

２） Akai J, Kimura A, Hata R: Transcriptional regulation363

of the human type I collagen α2 (COL1A2) gene by the
combination of two dinucleotide repeats. Gene 1999:

７） Peck LJ, Wang JC Energetics of B-to-Z transition in
DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1983: 80; 6206-6210

239; 65-73.
３） Hata R, Akai J, Kimura A, Ishikawa O, Kuwana M,

８） Blaho JA, Larson JE, McLean MJ, Wells RD :Shinkai H : Association of functional microsatellites

Multiple DNA secondary structures in perfect inverted

in the human collagen α2 chain (COL1A2) gene withrepeat inserts in plasmids. Right-handed B- DNA,systemic sclerosis.

cruciforms, and left-handed Z-DNA. J Biol Chem 1988:

Biochem Biophys Res Commun 2000: 272; 36-40.

263; 14446-14455

４） Akai J, Kimura A, Hata R: Analysis of the higher-

９） Herbert A, Rich A : The biology of left handed
Z-DNA. J Biol Chem 1996: 271; 11595- 11598

order structure of the two dinucleotide repeat regionsthat enhance the transcriptional activity of the10） Hata R, Izukuri K, Furue M, Kato Y, Koshika S

human type I collagen α2 (COL1A2) gene promoter.

: Complex gene diseases of the connective tissue.

Connective Tissue 2000: 32; 259-265.

Connective Tissue 2001: 33;.9-16

５） Haniford DB, Pulleyblank DE: Facile transition11） 畑of poly[d(TG)･d(CA)] into a left-handed helix inphysiological conditions. Nature 1983: 302; 632-634.

− 55 −

隆一郎の複合遺伝子病

I 型コラーゲンの遺伝子多型と結合組織
細胞工学 2001: 20: 592-598

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

東北大学大学院

中

畑

則

薬学研究科

道、大 久 保聡子

It is well known that ceramide forms corneocyte lipid-bound envelop in skin to protect from external stimuli. In order toclarify the other physiological role of ceramide, neurotrophic factor biosynthesis and secretion from Swiss 3T3 fibroblasts
were examined. C-2 ceramide and C-6 ceramide potently augmented the secretion of neurotrophic factors from 3T3 cells,
determined by the differentiation of PC-12 cells when they were cultured under the conditioned medium of 3T3 cells withthe ceramides. Sphingomyelinase and phosphatidylcholine-specific phospholipase C, which produce endogenous ceramides,
also elicited the secretion of neurotrophic factors from 3T3 cells. Stimulation of cannabinoid receptors is known to produce
ceramide through an activation of sphingomyelinase. 3T3 cells express CB1 and CB2 receptors, and the stimulation of
the receptors in the cells by 2-arachidonylglycerol resulted in the secretion of neurotrophic factors. Sphingomyelinase andphosphatidylcholine-specific phospholipase C stimulated the NGF and IL-6 mRNA expressions, which were inhibited by
GF109203X, a protein kinase C inhibitor. In addition, C2-ceramide activated the phosphorylation of MAPK/ERK, p38 MAPK
and JNK. These results suggest that ceramide may have neurogenerative and/or neuroprotective activity in peripheral
tissues including skin by a mediation of the secretion of neurotrophic factors. Therefore, the drugs, which activate ceramide
biosynthesis, inhibit cramide degradation, or activate ceramide-mediated cellular signaling pathway, may be useful forneurotrophic factor secretion. The neurotrophic factor secretion would contribute to the protection of skin from external
stimuli by forming the functional systems of the tissues.

１．緒

神経機能の維持も重要な問題となる。そこで本研究では、

言

セラミドの細胞機能に対する作用、とくに神経細胞の機能

セラミドはスフィンゴミエリンからスフィンゴミエリナ

維持に焦点をあて、神経細胞の再生や機能維持を司る神経ーゼによって生合成される脂質成分であり、皮膚を構成す

栄養因子の生合成よび分泌作用について検討を加えるととる細胞間脂質の中で最も多く存在することが知られている

もに、その生理機構発現のメカニズムの解明を目的とした。

１）。皮膚は生体を構成する臓器の中で最も大きなものであ

２．実り、常に変化する外界と接しており、体内の恒常性を維持するためのバリアとして機能している。このバリアの実質

２. １.

験

細胞培養

的な担い手がセラミドと考えられており、皮膚の表皮細胞

線維芽細胞株 Swiss 3 T 3 細胞は５% 牛胎児血清（fetal

を取り囲むようにして存在しラメラ構造という層状の構造

calf serum, FCS）、ペニシリン（50 unit/mL）およびストをとることが知られている。一方、最近の脂質研究の進展

レプトマイシン（50 µg/mL）を添加したダルベッコ変法

により、セラミドが静的な構造物としてだけでなく、細胞

イーグルスメディウム（DMEM）を用い、150 mm のディ内において、その機能を調節する生理活性を有する物質でッシュで継代培養した４）。3 T 3 細胞は、37℃で、95％ air-あることが明らかになってきた２）。組織全体のバランスを

５% CO 2 で飽和したインキュベーター中で培養し、メデ保持するために特定の細胞が積極的に死を迎えるメカニズ

ィウムは 3 − 4 日間隔で交換した。PC- 12 細胞は 10％ FCS、ムであるアポトーシスや、細胞の分化誘導などに、セラミ

５％ウマ血清（horse serum）および上記抗生物質を添加

３）

ドが関わることが明らかにされている 。したがって、皮した DMEM 中、150 mm のデイッシュで継代培養した５）。

膚に存在するセラミドも静的なバリア形成能に加えて、皮PC- 12 細胞は、37℃で、95％ air- ５％ CO 2 で飽和したイ

膚周辺における細胞間情報伝達を介した、ダイナミックなンキュベーター中で培養し、メディウムは 3 − 4 日間隔で皮膚構造の維持に関与する可能性が考えられる。すなわち、交換した。

皮膚機能を維持するためには、血管新生やその循環作用や神経栄養因子の分泌能の測定

エルプレートに分注し、上記培養液中で３日間培養した後、Norimichi Nakahata, Satoko Ohkubo

0.5％ FCS 含有 DMEM に置換し、薬物を加えて２日間培養

Graduate School of Pharmaceutical Sciences
Tohoku University

した。一方、PC-12 細胞は 4×10 ４個 /mL の濃度で 0.25mL

＊

＊

２. ２.

Research for the mechanism of cellularresponse to ceramides that show skinprotection

3T3 細 胞 を 4×10 ４ 個 /mL の 濃 度 で 0.5mL ず つ 24 ウ

ずつ 48 ウエルプレートに分注し、２日間培養した後、メデ
ィウムを薬物処理を行った 3T3 細胞の培養上清（0 . 25 mL）− 56 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究と 交 換 し、 さ ら に２日間培養した。また、薬物 を 直 接

7 . 4）に２％ BSA を加えたブロッキングバッファーによりPC- 12 細胞に作用させたものを比較実験として行った。

室温で２時間処理した。TBST で洗浄後、ブロッキングバ

PC- 12 細胞は顕微鏡（オリンパス IX- 70）を用いて形態変ッファーで 500 倍に希釈した一次抗体とインキュベートし化を観察し、3 T 3 細胞から分泌された神経栄養因子によた（４℃、overnight）。用いた一次抗体は、抗 phospho-６）

p 42 / 44 mitogen-activated protein kinase（MAPK）抗体、る細胞の分化を調べた 。

抗 phospho-p 38 MAPK 抗体、抗 phospho-JNK 抗体の三２. ３.

種である。TBST で洗浄後、ブロッキングバッファーでRT-PCR3 T 3 細胞（4 × 10 cells/well）を 6 -well のディッシュ

1000 倍に希釈したパーオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG 抗に播き、通常のメディウムで 2 日間培養してから、FCS

体とインキュベートした（室温、２時間）。化学発光検出を含まないメディウムで 1 日間培養した。細胞から総キットを用いて、パーオキシダーゼと基質により生じた化RNA 画分を抽出した後、逆転写反応によって cDNA と学発光を化学発光検出フィルム（Hyperfilm ECL、Amer-し、それを水で４倍希釈して PCR のテンプレートとしsham）に感光させて検出した８）。

5た。PCR 反応は 94℃で２分間加熱したサンプルを、熱変

３.

性を 94℃で 30 秒、アニーリングを 56℃で 30 秒、伸長反応を 72℃で 20 秒行い、このサイクルを 16 − 30 回繰り返し結果た。得られた DNA 断片は 1 . 5％アガロース電気泳動を行

３. １. 外来性セラミドによる 3 T 3 細胞からの神経栄養因子分泌による神経細胞の分化誘導って分離し、エチジウムブロマイドにて染色後、そのバ線維芽細胞は皮膚組織に存在することが知られている

ンドの濃淡を撮影装置（FAS-III, Toyobo）によって記録が、その細胞株である 3 T 3 細胞からの神経栄養因子の分７）した 。Nerve growth factor（NGF）については、セン泌についてバイオアッセイを行った。すなわち、3 T 3 細

スプライマー（CTTCAACAGGACTCACAGGA）および胞を薬物存在下に２日間培養し、その培養上清を用いて神アンチセンスプライマー（GTGCAGTATGAGTTCCAGTG）

経のモデル細胞である PC- 12 細胞を培養し、PC- 12 細胞を用いた。インターロイキン -6（IL-6）については、センスの形態的な分化を観察した（図１）。3 T 3 細胞から神経栄

プライマー（GAGGAGACTTCACAGAGGAT）、アンチセ

養因子が分泌されるとすれば、PC- 12 細胞は形態的な分化

ンスプライマー（TCCTTAGCCACTCCTTCTGT）を用を示すことになる。コントロールの実験として、NGF のいた。カンナビノイド受容体（CB）については、CB 1（セ生合成を促進させることが知られているプロテインキナー

ンスプライマー：ATAAGAGGATCGTCACCAGG、アンゼ C の活性化薬 PMA ９）について検討を加えた。その結果、チセンスプライマー：AGTTCAGCAGGCAGAGCATA）

3 T 3 細胞の培養時に PMA を加えなかったものと相違し、および CB 2（センスプライマー：AAGCCCTCGTACCT-PMA を加えたものの培養上清は PC- 12 細胞を強く分化さ

GTTCAT、アンチセンスプライマー：AGGCACAGCATG-せた（図１）。

GAACAGAA）を用いた。なお、比較のために β- アクチ

本実験系を用いて、セラミドの作用について検討を加え

ンの cDNA も RT-PCR によって測定した（センスプライた。その結果、C 2 - セラミドを 3 T 3 細胞とともに培養しマー：AGGGAAATCGTGCGTGACAT、アンチセンスプ

た培養上清には神経栄養因子が含まれており、PC- 12 細胞

ライマー：TCCTGCTTGCTGATCCACAT）。

を強く分化させた（図２）。同様な作用が C 6 - セラミドにも認められることから、セラミドによって線維芽細胞内の

２．
４．

情報伝達系が活性化され、神経栄養因子の生合成が促進さウエスタンブロッテイング
５細胞（2 × 10 cells/well）を 12 -well のディッシュに播れることが推定された。なお、C 2 - セラミドや C 6 - セラき、通常のメディウムで２日間培養してから、FCS を含

ミドを直接 PC- 12 細胞に作用させても、形態的な分化はまないメディウムで１日間培養した。薬物で刺激した後、認められなかった。

500 µL のサンプルバッファー（75 mM Tris-HCl, 2％ SDS,
15％ glycerol, 3％ 2 -mercaptoethanol, pH 6 . 8）で反応を停止した。サンプルを 95℃で５分間煮沸し、完全にタン

３. ２. 内因性セラミドによる神経栄養因子分泌による神経細胞の分化誘導

パク質を変性させた後、11％の分離ゲルを用いて SDS-

次に、内因性のセラミドの生合成を促進させるスフィン

PAGE を行った。泳動終了後、セミドライ・トランスファ

ゴミエリナーゼとホスファチジルコリン特異的ホスホリー装置（ATTO）を用い、ゲルから PVDF 膜（Immobilon;

パーゼ C を 3 T 3 細胞とともに培養し、その培養上清中でpolyvinylidene difluoride, Millipore）へタンパク質を転PC- 12 細胞の培養を行った。セラミドの生合成を促進す

写した。転写終了後、PVDF 膜を TBST（Tris-bufferedると考えられる、二つの酵素処理は 3 T 3 細胞からの神経

saline; 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 0 . 05％ Tween 20 , pH

栄養因子の分泌を促進し、その結果 PC- 12 細胞の分化誘− 57 −

図 1 神経栄養因子分泌の評価方法（A）と PC- 12 細胞の分化作用（B）
A：3 T 3 細胞を薬物と 2 日間培養し、その培養上清で PC- 12 細胞を培養した。
3 T 3 細胞が神経栄養因子を分泌すると、
PC- 12 細胞の形態的分化が引き起こされる。B：3 T 3 細胞を薬物非存在下（a）あるいは PMA（100 nM）存在下（b）で培養した上清を用いた場合の PC- 12 細胞の形態。スケール：50 μm。

図 2 外来性セラミドによる 3T3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC-12 細胞の分化
3T3 細胞を薬物非存在下（a）、C2- セラミド 10μM 存在下（b）および C6- セラミド 10μM 存在下 (c)で培養した上清を用いたときの PC-12 細胞の分化作用。スケール： 50μm。

図 3 内因性セラミドによる 3 T 3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC- 12 細胞の分化3 T 3 細胞を薬物非存在下（a）、スフィンゴミエリナーゼ 0 . 01 U/mL 存在下（b）およびホスファチジル
コリン特異的ホスホリパーゼ C 0 . 01 U/mL 存在下 (c) で培養した上清を用いたときの PC- 12 細胞の分化作用。スケール： 50 μm。

導が強く引き起こされた（図３）。なお、スフィンゴミエ
リナーゼとホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C

３. ３. カンナビノイド受容体刺激による神経細胞の分化誘導を直接 PC- 12 細胞に作用させた場合には、PC- 12 細胞のマリファナの成分である Δ9 -tetrahydrocannabinol はカン

分化は引き起こされなかった。

ナビノイド受容体を介して作用を現し、時間感覚や空間感覚の混乱、記憶の障害、多幸感、幻覚、離人症などの多彩な精− 58 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

図 4 3T3 細胞におけるカンナビノイド受容体の発現と 2- アラ
キドニルグリセロールによる 3T3 細胞からの神経栄養因子分泌による PC-12 細胞の分化
A：3T3 細胞の CB1 および CB2 受容体の発現を RT-PCR によって調べた。対照として、これらの受容体の発現が知られている
NG108-15 細胞（NG）を用いた。ハウスキーピングジーンとして β- アクチンを用いた。B：3T3 細胞を薬物非存在下（a）および 2- アラキドニルグリセール 10μM 存在下（b）で培養した上清を用いたときの PC-12 細胞の分化作用。スケール：50μm。

図 5 3T3 細胞におけるスフィンゴミエリナーゼおよびホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C
による NGF および IL-6mRNA 遺伝子発現
3T3 細胞を GF109203X 存在下（右）非存在下（左）の条件で、薬物無添加（lane 1）スフィンゴミエリ
ナーゼ 0.5U/mL（lane 2）、ホスファチジルコリン
特異的ホスホリパーゼ C 0.2U/mL（lane 3）および PMA 100nM（lane 4）とともに 3 時間培養し、NGF および IL-6 mRNA を RT-PCR で解析した。ハ
ウスキーピングジーンとしてβ-アクチンを用いた。

神症状が発現する 10）。カンナビノイド受容体には CB1 受容する神経機能変化の検討により、細胞内に増加したセラミ体と CB2 の二つが存在し、中枢神経とともに末梢にも存在

ドは神経栄養因子の生合成を促進し、神経細胞の機能的活することが報告されている

11）。中枢神経系の作用については性化を引き起こすことが示唆された。そこで、3 T 3 細胞

多くの研究が為されているが、末梢におけるカンナビノイド

における神経栄養因子の遺伝子発現について検討を加えた受容体の生理的な意義については不明な点が多い。カンナビ（図５）。内因性のセラミドを増加させることが知られていノイド受容体は Gi と共役し、サイクリック AMP を減少さるスフィンゴミエリナーゼおよびホスファチジルコリン

12）、最近、その細胞内情報伝達

特異的ホスホリパーゼ C は顕著な NGF mRNA の発現をにスフィゴミエリナーゼの活性化を介するセラミドの生成が亢進し、また、インターロイキン - 6（IL- 6）mRNA の発せる作用が認められているが13）。そこで、3T3

現誘導も引き起こした。この作用はプロテインキナーゼ C細胞にカンナビノイド受容体が発現しているか否かをはじ阻害薬の GF 109203 X によって顕著に抑制された。したがめに検討したところ、CB1 および CB2 受容体ともに 3T3って、セラミドは神経栄養因子の遺伝子発現を介した生合細胞に発現していることが見い出された（図 4A）。さらに、成の促進作用を有するとともに、その経路に PKC の介在

内因性カンナビノイド受容体刺激薬である 2-arachidonylglyc-することが示唆された。皮膚などの末梢組織において、細erol（2-AG）は、3T3 細胞に作用して神経栄養因子の分泌

胞内セラミドの増加が神経の伸長作用を促し、機能的な組を促進し、その培養上清中で培養した PC-12 細胞の形態的織へと構築する役割を担うものと考えられる。

重要な役割を担っていることが報告された分化を強く引き起こした（図 4B）。なお、2-AG は PC-12 細胞の分化を直接は引き起こさなかった。

３. ５.

セラミドの情報伝達系

そこで、細胞内に増加したセラミドによってどのような３. ４.

細胞内情報伝達系が活性化されるかについて検討を加えセラミドによる神経栄養因子の遺伝子発現3 T 3 細胞および PC- 12 細胞を用いた神経栄養因子を介た。とくに、mitogen-activated protein kinase（MAPK）− 59 −

ファミリーのうち、p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および保持する作用のあることが知られており３）、本研究におい

JNK のリン酸化について検討した（図６）。その結果、C 2ても、JNK や p 38 などの MAPK 活性化作用が示された。

セラミドは p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および JNK のこれらの結果は、動的な皮膚機能維持においても、セラミ

リン酸化を引き起こすことが明らかになった。

ドは重要な役割を担っているものを示唆するものである。

４.

考

したがって、セラミドの化粧品としての利用方法あるいは察

その価値を考える場合、セラミド自身を化粧品中に加える

細胞膜を構成するリン脂質は、その構造体であるばかり

方法とともに、セラミドの生合成を刺激する薬物、分解をではなく、細胞情報伝達系の基質や情報伝達分子として阻害する薬物、さらにセラミドの情報伝達系を刺激する薬

巧みに利用されている。例えば、リン脂質の分解系とし物を開発し、それらを化粧品として用いると、より生理的て、炎症などに関与するアラキドン酸 / プロスタグランジな機能性に富む化粧品になる可能性が示唆された。

4）ン類の生成を担うホスホリパーゼ A2 、細胞内 Ca

2+

濃度

５.

上昇を引き起こすイノシトールリン脂質特異的ホスホリパ
ーゼ C 15）、さらにコリンリン脂質を分解するホスホリパー
ゼD

16）やホスホリパーゼ C の活性調節機構

17）

などリン脂

総

括

皮膚に多量に存在するセラミドがその周辺細胞にて生合成されると、他の細胞機能に影響を与える可能性があるこ質を利用する多彩な情報伝達系が知られている。すなわち、とから、特に神経機能に影響を与える神経栄養因子の生生体を形成する物質が、単一な役割を担っているのではな

合成に対するセラミドの作用について検討を加えた。線

く、複数の機能を有しているものと考えられる。

維芽細胞株 3 T 3 細胞に外来性の C 2 - セラミドおよび C 6 -リン脂質の１つとして知られているスフィンゴミエリン

セラミドを添加して培養すると、神経モデル細胞であるの代謝物であるセラミドの生理的な役割が、皮膚組織の構

PC- 12 を分化させる因子の分泌を促した。スフィンゴミエ

造維持によって外界の刺激から皮膚を静的に守ることに加リナーゼおよびホスファチジルコリン特異的ホスホリパー

えて、細胞内の情報を動的に伝え、細胞機能に変化を与えゼ C を 3 T 3 細胞に作用させて細胞内セラミドを増加させることが本研究によって明らかになった。すなわち、セると、神経栄養因子の生合成・分泌が促進され、それによ

ラミドには神経栄養因子の生合成・分泌の促進作用があり、って PC- 12 は分化した。カンナビノイド（CB）受容体刺このセラミドの作用は、皮膚組織などの末梢における神経

激はセラミドの生合成を引き起こすことが知られているが、機能維持に重要な役割を担っているものと推定される。ス3 T 3 細胞に CB 1 および CB 2 受容体が発現していること

フィンゴミエリナーゼやホスファチジルコリン特異的ホス

を RT-PCR 法を用いて確認した。内因性 CB 受容体アゴ

ホリパーゼ C による NGF mRNA 発現作用は PKC の阻害

ニストである 2 - アラキドニルグリセロールは 3 T 3 細胞に薬である GF 109203 X で阻害されたことより PKC の介在作用して神経栄養因子の合成・分泌を引き起こし、PC- 12が考えられるが、この作用はセラミドが PKC アイソフォ

細胞を分化させた。スフィンゴミエリナーゼやホスファ

18）とチジルコリン特異的ホスホリパーゼ C は NGF および IL- 6一致する。一方、セラミドには積極的に細胞死を惹起する

mRNA の発現を顕著に増大し、その作用はプロテインキ

アポトーシスを引き起こし、組織全体としてのバランスを

ナーゼ C 阻害薬の GF 109203 X によって減弱された。一方、ームのうち PKC-ζ の活性化を引き起こすという報告

図 6 C2- セラミドによる MAPK 群のリン酸化反応
3T3 細胞に C2- セラミド 50μM を添加した後、240 分まで経時的にサンプリングし、そのリン酸化
p42/44 MAPK（P-p42/44)、リン酸化 p38（P-p38) およびリン酸化 JNK (P-JNK) をウエスタンブロッテイ
ングにて測定した。

− 60 −

皮膚保護作用を有するセラミドの生理作用発現機構に関する研究

セラミドの細胞内情報伝達系について MAPK のリン酸化

ane A ２ stimulates mitogen-activated protein kinaseを検討したところ、p 42 / 44 MAPK、p 38 MAPK および

and arachidonic acid liberation in rabbit platelets. Pros-JNK いずれのリン酸化反応も活性化し、その情報伝達のtaglandins 52 , 403 - 413 , 1996 .

一部には MAPK カスケードの活性化が考えられる。以上

９） Obara Y, Kobayashi H, Ohta T, et al. : Scabronine G-の結果より、セラミドには NGF をはじめとする神経栄養

methylester enhances secretion of neurotrophic factors

因子の生合成・分泌の促進作用があることが明らかになっ

mediated by an activation of protein kinase C-ζ. Mol

た。このセラミドの作用は、皮膚組織などの末梢におけPharmacol 59 , 1287 - 1297 , 2001 .

る神経機能維持に重要な役割を担っているものと推定され、

10） Dewey WL: Cannabinoid pharmacology. Pharmacol

セラミドは皮膚表皮角層に形成されるラメラ構造の形成とともに、皮膚の神経機能維持をも制御している可能性が示

Rev 38 , 159 - 178 , 1986 .
11） Felder CC, Glass M: Cannabinoid receptors and their

唆された。

endogenous agonists. Ann Rev Phrmacol Toxicol 38 ,（引用文献）

12） Howlett AC: Pharmacology of cannabinoid recep-

179 - 200 , 1998 .
１） 内田良一、原真里子、濱中すみ子：表皮角層におけるtors. Ann Rev Pharmacol Toxicol 35 , 607 - 634 , 1995 .

セラミドの役割とその起源 . 生化学 73 , 268 - 270 , 2001 .

13） Guzman M, Galve-Roperh I, Sanchez C: Ceramide: a２） Hannun YA, Luberto C. Ceramide in the eukaryotic

new second messenger of cannabinoid action. Trend
Pharmacol Sci. 22 , 19 - 22 , 2001 .

stress response. Trends Cell Biol, 10 , 73 - 80 , 2000 .
３） De Petrocellis L, Melck D, Palmisano A, et al.: The

14） Nakatani K, Nakahata N, Hamada Y, et al.: Medium

endogenous cannabinoid anandamide inhibits humanchange amplifies mitogen-activated protein kinase-me-breast cancer cell proliferation. Proc Natl Acad Sci

diated prostaglandin E ２ synthesis in 3 T 3 fibloblasts.

USA 95 , 8375 - 8380 , 1998 .

Eur. J. Pharmacol. 356 , 91 - 100 , 1998 .

４） Nakatani K, Nakahata, N, Tsurufuji, S, et al.: Precon-15） Rho M-C, Nakahata N, Nakamura H et al. :Involve-

ditioning of 3 T 3 cells by fresh edium together withment of phospholipase C-γ 2 in activation of mitogen-genistein enhances prostaglandin E ２ release. Eur J

activated protein kinase and phospholipase A ２ by

Pharmacol 432 , 135 - 142 , 2001 .

zooxanthellatoxin-A in rabbit platelets J. Pharmacol.

５） Obara Y, Nakahata, N, Ohizumi Y. A new factor

Exp. Ther. 282 , 496 - 504 , 1997 .

derived from 1321 N 1 human astrocytoma cells causes16） Mizuno K, Nakahata N, Ohizumi Y: Mastoparan-diferentiation of PC-12 cells mediated through mitogen-induced phosphatidylcholine hydrolysis by phospholi-

activated protein kinase cascade. Brain Res 806 , 79 - 88 ,pase D activation in human astrocytoma cells. Brit. J.

1998 .

Pharmacol. 116 , 2090 - 2096 , 1995 .

６） Obara Y, Nakahata, N, Kita T, et al.: Stimulation of17） Kobayashi H, Honma S, Nakahata N, et al. : Involve-

neurotrophic factor secretion from 1321 N 1 human as-

ment of phosphatidylcholine-specific phospholipase C

trocytoma cells by novel diterpenoids, scabronines A

in thromboxane A ２-induced activation of mitogen-and G. Eur J Pharmacol 370 , 79 - 84 , 1999 .

activated protein kinase in human astrocytoma cells J.

７） Ohkubo S, Kimura J and Matsuoka I: Ecto-alkaline

Neurochem. 74 , 2167 - 2173 , 2000 .

phosphatase in NG 108 - 15 cells: a key enzyme mediat-18） Nakanishi H and Exton JH: Purification and charac-ing P 1 antagonist sensitive ATP response. Br J Phar-terization of the zeta isoform of protein kinase C frommacol 131 , 1667 - 1672 , 2000 .

bovine kidney. J Biol Chem 267 , 16347 - 16354 , 1992 .

８） Ohkubo S, Nakahata N and Ohizumi,Y: Thrombox-− 61 −

爪の形状に対する VII 型コラーゲンの変異がかかわる影響について

北海道大学

松

村

医学部附属病院

和子

Nail cosmetics have recently made remarkable progress. However, the basic study related to the nail shape has
not been revealed yet. The etiology of toenail deformity is not fully understood. Shimizu et al and we have previously
reported that certain glycine substitutions in the type VII collagen gene (COL7A1) lead to toenail deformity, in 1999.
We explored the possibility that other patients exist with toenail deformity but without blister formation and that thisis inherited in an autosomal dominant manner.
The eleven pedigrees, which contain more than one dystrophic epidermolysis bullosa patient, were investigatedfrom the clinical point of view and gene mutation. Additionally, five pedigrees of the patient who have familial toe
nail deformity were genetically analyzed. Four out of eleven pedigrees had familial nail deformity. The members who
had nail deformity within the four pedigrees had glycine substitution within the collagenous domain of COL7A1.
The five familial nail deformity pedigrees without dystrophic epidermolysis bullosa familial nail dystrophy were also
investigated for COL7A1 mutation. No mutation was detected within COL7A1 except MspI polymorphism was foundwithin one pedigree. The multiple etiology has been suspected with in familial nail dystrophy.

１.

緒わらず，小さい爪，変形した爪を持つ症例があることがわ

言かった。今回，我々は，小さい爪をもつ表皮水疱症のキャ化粧品学の発達に伴い，爪の化粧が，近年，注目される

リアー，および，表皮水疱症の家族歴がないが，爪が小さようになった。しかしながら，爪の形状に関しての基礎的い患者の VII 型コラーゲンを変異を検索し，VII 型コラー

研究は，あまりなされていない。VII 型コラーゲンの遺伝

ゲンの異常が爪の形状に及ぼす影響を分子生物学的手法を子変異によって発症する表皮水疱症，皮膚 VII 型コラーゲ

用いて遺伝子レベルで検討を行った。

ンに対する自己抗体を形成によって発症する後天性表皮水

２. 実

疱症のいずれもが，爪が脱落したり，萎縮したりすることに注目し，VII 型コラーゲンが爪の形成に深くかかわって

２. １いる可能性を予測した。

ーリング

象

北海道大学医学部附属病院皮膚科の表皮水疱症の患者のVII 型コラーゲンは，皮膚に於いては，真皮を結びつけるアンカーリング対験

フィブリルの主要成分である。アンカ

フィブリルは電子顕微鏡を用いた超微構造解析の結果から，表皮からループ状に真皮則に垂れ下がり，そうち，遺伝子検索の同意を得られた 11 家系ならびに，家族に表皮水疱症患者は見られないが，幼少時から小さい爪，
爪の変形を自覚していた患者のうち，遺伝子検索の同意を得た 5 家系を対象とした。

のループには，真皮のコラーゲン線維束が，ちょうどフック状になった留め金にロープでとめつけるようになって表

２. ２

１）

倫理的配慮

皮と真皮をつなぎ止めていることが明らかになった 。表

患者 DNA の解析にあたっては，北海道大学大学院医学

皮水疱症のなかでも発症頻度が高く，しばしば，重症化す

研究科倫理委員会が定めた規定に準じ，被験者の同意を文る栄養障害性表皮水疱症は，VII 型コラーゲンをコードす書にて得たのちに解析した。プライバシーの保護のため，る COL7A1 遺伝子の変異によって皮膚の脆弱性がおこる

試料と検査結果は匿名化して保管し、また，検索結果を含２）

ことが明らかにされている 。爪母および爪床の真皮接合

む個人情報も，全て匿名化し管理した。

部においても VII 型コラーゲンが果たす役割は大きいと考え，少数の症例で詳細な観察を行った。その結果，表皮水

２. ３

疱症のキャリアーのなかに，他の症状が全くないにもかか
Nail deformity and type VII collagenabnormality
Kazuko Matsumura
Department of dermatology, Hokkaido
University graduate school of Medicine

遺伝子検索

EDTA2Na 入り採血管にて採血した患者末梢血由来の単核球から Sambrook ら ３） による標準的な方法を用いて，DNA を 抽 出 し た。VII 型 コ ラ ー ゲ ン を コ ー ド す る
COL7A1 の全エクソン 118 を intron-exon border の情報をもとに PCR にて増幅した。増幅条件および，プライマーの設定は，既に報告された条件で行った２, ４）。変異の一次スクリーニングのため，Glycerol-tolerant gel buffer を用いた 6.8% アクリルアミドによる Conformation sensitive gel− 62 −

爪の形状に対する VII 型コラーゲンの変異がかかわる影響について

electrophoresis heteroduplex analysis を行った２, ４）。Hetero

り臨床症状をまとめた。臨床的に優性栄養障害型表皮水疱

duplex バンドを検出し得た増幅断片のみ Big Dye terminator症を呈する家系は，３家系，中等度から重度の劣性栄養障

cycle sequence FS（PE applied biosystem）を用いてシー

害型表皮水疱症を呈する家系は９家系あった。そのうち，クエンス PCR を行い，蛍光色素標識した。解読は，ABI

臨床的に水疱が認められない血族に爪甲形状の異常が認

prism 310（PE applied biosystem）を用いた。変異した allele

められた家系は，４家系であった。表皮水疱症 11 家系にについては，制限酵素切断部位の有無により検証した。

ついて共通している所見は，次の通りである。爪の変形は，

3結特に両母趾に強く，遊離縁への伸長が不良で爪襟が消失し，

果

爪床側に埋没した状態になっている。爪甲の厚さは，通常

表皮水疱症家系に見られる爪の臨床症状と変わらない症例と軽度肥厚している症例が混在する。後栄養障害性表皮水疱症家系の 11 家系について表１の通爪郭および爪上皮も萎縮あるい消失している（Fig. 1a, 1b）
。

３. １

表１

表皮水疱症臨床症状のまとめ

３. ２

血族に表皮水疱症をもたない爪の臨床症状

表皮水疱症患者を家系にもたない症例の爪の変形の臨床症状は様々である。そのうち，２家系は，詳細な家族歴の検索および全身症状の検索の結果，膝蓋骨の変形が認められ，
neil patella 症候群に罹患していることが判明した。これらの家系は，小さい爪であることは，表皮水疱症家系の爪の変化と共通するが，爪床側に埋没した爪の変形ではなく，
むしろ，爪甲の分離や，爪の表面に凸凹が形成される変化が認められることが特徴的である（Fig. 2a）。残りの 3 家
系は，表皮水疱症患者を血族にもつ症例に認められる爪のFig. 1a 血族に栄養障害性表皮水疱症がいる遺伝性の足爪の変形Fig. 2a 血族に栄養障害性表皮水疱症がいない
遺伝性の足爪の変形。検索の結 ，Nail patella症候群であった。

Fig. 1b 血族に栄養障害性表皮水疱症がいる遺伝性の足爪の変形。特に第一趾爪に変形が強い。

Fig. 2b 血族に栄養障害性表皮水疱症がいない遺伝性の足爪の変形。
検索の結 ，COL7A1 ポリモルフィズムが存在した。

− 63 −

変化と同様に遊離縁への伸長が不良で爪襟が消失し，爪床

テロで持っている症例については，いずれの個体において側に埋没した状態になっている（Fig. 2b）。いずれの症例

も爪の変形は，認められなかった。

も爪表在性真菌症の既往はなく，手足の表皮および，爪からの真菌直接鏡検検査で真菌は検出されず，同部位の真菌３. ４ 表皮水疱症をもたない家系における Type VII コラ

培養でも真菌は検出されず，爪の変形は，表在性真菌症にーゲン遺伝子検索の結果 nail patella 症候群であったの２よるものではないことが確認されている。

家系については，Type VII コラーゲン遺伝子の変異は，認
められなかった。nail patella 症候群ではない３家系につい３. ３ 表皮水疱症をもつ家系における Type VII コラーゲて，検索したところ，２家系では，特別な変異は認められ

ン遺伝子検索の結果爪の変形を来す家系のうち解析し得たなかった。１家系では，アミノ酸の置換を伴わない一塩基

表皮水疱症の変異を表２に示す。表に示した通り，表皮水

置換，すなわち，exon 21 の MspI ポリモルフィズム６）を

疱症患者を家系に持ち，かつ爪の変形を来した血族は，全検出した。

て VII 型コラーゲン遺伝子の collagenous ドメインのグリ

４シンが，他のアミノ酸に置換していた。今回検索した４

考察

家系のうち爪の変形を来した症例はそれぞれ，G2028E,

表皮水疱症をもつ家系の血族における爪の形状異常におG2064E, G1549R, G1815R の変異のヘテロであることを確いて COL7A1 の変異が大きな影響を与えていることが明５）認し得た。代表的な家系の家系図を Fig. 3 に示す 。しからかになった。今回の検索で，水疱は出現しないが，爪のし，これらの変異の近傍の Collagenous ドメインのグリシ

変形を来した全ての症例で，COL7A1 の collagenous ドメ

ンが他のアミノ酸に置換された変異 G2037E の変異をみとインのグリシンが他のアミノ酸に変異する一塩基置換を見めた症例では，水疱の形成や創傷治癒の遅延など軽症の表いだした。このうち，グリシンがアルギニンに変異する一皮水疱症としての症状は認められたが，爪の変形は，認め塩基置換が２例，グリシンがグルタミン酸に変異する一塩られていない。

基置換が 2 例検出された。グリシンのアミノ酸置換は，従一方，挿入，欠失に伴うフレームシフトやスプライシン

来優性栄養障害型表皮水疱症を来すと知られている。臨床

グ部位の変異，あるいは一塩基置換に伴って，タンパク質

的に全く水疱をつくらず，爪の変形のみが症状である疾患への翻訳の途中で停止コドンを生じてしまう変異のみをヘ群が存在する可能性を Shimizu ら７）が，報告しているが，本研究において複数例の同様の症例を確認することができ

表２た。これらの変異は，臨床的に見落としてしまうほどわず

COL7A1 遺伝子変異

かな変化であるため，以前は silent mutation として気づかれずにいた可能性がある。水疱を形成しない優性栄養障
害型表皮水疱症とみなすか，VII 型コラーゲン collagenous
ドメインにグリシン置換が検出される遺伝性の爪変形症とするかは，まだ議論の余地がある。
さらに VII 型コラーゲン遺伝子 COL7A1 の変異前体においても同じ collagenous ドメインのグリシン置換であっても，出現する症状が違うことが確認された。今回の 11 家系の検索においても，爪を含めて全く症状を示さないいわ
ゆる silent のグリシン置換変異が一家系，機械的刺激で水疱を生じ，容易に潰瘍や瘢痕をつくり皮膚の脆弱性を示す
古典的優性栄養障害型表皮水疱症といえる例が２例あった。
これらの症状の差が遺伝子変異の違いによって簡単には，説明することはできないが，他のアミノ酸へ置換されたグ
リシンが VII 型コラーゲン全体のどこに位置するか，グリシンがどのようなアミノ酸に置換しているかが症状の差を解明する手がかりになる可能性がある。今回検索した例
Fig. 3 血族に栄養障害性表皮水疱症患者がいる遺伝性足趾爪変形症の典型的な家系図○：足趾爪変形無し。●：足趾爪変形有り。矢印：栄養障害性表皮水疱症患者。

においては，VII コラーゲンの N 末端に比較的近いところ，あるいは，collagenous ドメインのなかでヒンジ部分に比較的近いところで置換をおこしている症例では，症状を呈しやすく，C 末端に比較的近い部分での変異では silent 変− 64 −

爪の形状に対する VII 型コラーゲンの変異がかかわる影響について異である傾向が認められた。一方，どのようなアミノ酸にした，北海道大学大学院医学研究科北海道大学大学院医学

置換することで症状が変わるかを検討したところ，今回の研究科・病態制御学専攻・感覚器病学講座・皮膚粘膜病学

検索においては，爪甲異常や，優性栄養障害型表皮水疱分野症の症状を呈する症例で，グリシンがアルギニンあるいは，

力下さいました，北海道大学大学院医学研究科北海道大学

グルタミン酸に変化しているのに対して，症状を示さない

大学院医学研究科・病態制御学専攻・感覚器病学講座・皮silent mutation は，グリシンがセリンあるいはシステイン

膚粘膜病学分野に変化していた。しかし，これまでに，グリシンがアルギ

中村裕之先生，また実験についてご指導を下さいました，

ニンやグルタミン酸以外に変異している優性栄養障害性表中村秀樹技官に厚く御礼申し上げます。

清水宏教授に感謝申し上げます。また，研究に尽

澤村大輔助教授はじめ，安川香菜先生，

皮水疱症が報告されているため，単にアミノ酸の差だけで書状の違いを説明することは難しい。

（文献）

水疱の生成のみならず，爪甲の形状にまで詳細に検討した

１） Shimizu H, Ishiko A, Masunaga T, Kurihara Y, Sato

うえで silent 変異と結論づけている G1812R というグリシン

M, Bruckner-Tuderman L, Nishikawa T. Most anchoringがアルギニンに変異した報告は８），今回検討した爪の変形のfibrils in human skin originate and terminate in the lamina

み生じた 4 家系のうち 1 家系 G1815R と極めて近いグリシン

densa. Laboratory Investigation 1997;76:753-763.

置換である。３つのアミノ酸ごとに生じるグリシンが１つ分

２） Uitto J, Christiano A. Molecular basis for the dystrophicだけずれただけで，臨床症状が違うという事実は，少なくとform is of epidermolysis bullosa: mutation in the type VIIも置換されたグリシンが VII 型コラーゲン全体のどこに位置

collagen gene. Arch Dermatol Res 1994;287:16-22.
３） Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning:

するかということが重要であることを示唆する。

A laboratory manual. ( 2nd ed.). Cold Spring Harbor, NY,

表皮水疱症患者が血族にいない爪変形症の家系の VII 型

USA: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989.

コラーゲンの検索では原因となるような VII 型コラーゲンの遺伝子変異は見いだせなかった。Nail patella 症候群は，

４） Shimizu H, McGrath J, Christiano A, Nishikawa

ケラチン群の遺伝子変異であるということが解明されつつT, Uitto J. Molecular basis of recessive dystrophic

あるためここでは詳しい言及は行わないが，ケラチン群のepidermolysis bullosa: genotype/phenotype correlation

変異が，表皮真皮境界部に発現される VII 型コラーゲンのin a case of moderate clinical severity. J Invest Dermatol

ような蛋白に対しても何らかの作用を及ぼしている可能性

1996;106:119-124.

は十分考えることができる。Nail patella 症候群をもたな

５） Sato-Matsumura KC, Yasukawa K, Tomita Y, Shimizu

い爪変形家系のうち，一例で見いだされた Exon 21 の１塩

H. Toenail dystrophy with COL7A1 glycine substitution

基置換は，アミノ酸変異を伴わず，polymorphism である

mutations segregages as an autosomal dominant trait in

ことが報告されている。しかし，アミノ酸変異は生じなく

two families with dystrophic epidermolysis bullosa. Arch
Dermatol 2001;in submission.

ともポリモルフィズムをもつアレルの転写レートが通常よりも低い可能性は否定できない。また，通常，このポリモ

６） Christiano A, Chung-Honet L, Hovnanian A, Uitto J.

ルフィズムでは，なにも症状は呈さないが，他の遺伝子変

PCR-based detection of two exonic polymorphism in the

異とあわせもつことで疾病の原因となる可能性は否めない。

human type VII collagen (COL7A1) at 3p21.1. Genomics
1992;14:827-828.

これらの 3 家系においては，VII 型コラーゲン以外の表皮
真皮境界部に存在する蛋白に対する検索を今後行わなけれ

７） Shimizu H, Hammami-Hauasli N, Hatta N, Nishikawa
T, Bruckner-Tuderman L. Compound heterozygosity

ばならない。
今回の研究で遺伝性の爪変形症について，VII 型コラー

for silent and dominant glycine substitution mutations

ゲンが占める役割の一端を明らかにした。今後さらなる研in COL7A1 leads to a marked transient intracytoplasmic

究で，爪の形状に関わる蛋白について明らかにしたい。

retention of procollagen VII and a moderately severe
dystrophic epidermolysis bullosa phenotype. Journal of
Investigative Dermatology 1999;113:419-421.

本研究の一部は，Sato-Matsumura et al, Some idiopathic
toenail dystrophies are cause by substitution mutations８） M a s u n a g a T , S h i m i z u H , T a k i z a w a Y , U i t t o J ,in the type VII collagen gene (COL7A1) Archives of

Nishikawa T. Combination of novel premature termination

Dermatology in press, にて報告した。

codon and glycine substitution mutations in COL7A1 leads
to moderately severe recessive dystrophic epidermolysis
bullosa. Journal of Investigative Dermatology

謝辞
本研究全 にわたりましてきめ細かいご指導を下さいま− 65 −

2000;114:204-205.

上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化
東北大学大学院

医学系研究科細胞生物学講座

大 和 田

細胞組織学分野

祐 二

We have generated mutant mice for epidermal type fatty acid binding protein (E-FABP) by the gene targeting techniqueand examined in detail the phenotype. In spite of lack in the expression of E-FABP mRNA and its protein in the skin and othertissues of the mutant mice, the animals appeared normal in gross and histological examination. Northern blot analysis of other
FABPs revealed a distinct elevated gene expression of heart-type FABP (H-FABP) in the skin of the homozygous mice. In
analyses of the skin, differences were not observed in contents of major fatty acids, electron microscopic appearances as wellas inflammatory responses in ear skin between the mutant and wild type mice. Basal transepidermal water loss (TEWL) of
homozygous mice was lower as compared with that of the wild mice. When acetone was applied to the skin for disruption of thewater permeability barrier, the recovery in TEWL was delayed, despite maximum TEWL upon acetone treatment was similar
between the homozygous and wild type mice in terms of the size and time course. The molecular mechanism by which E-FABP
contributes to the water barrier function of the skin remains to be elucidated.

１

緒

TEWL の回復が野生型に比して遅延していた。皮膚の超微言

形態像、構成脂肪酸の測定結果、アラキドン酸に対する炎

表皮角層の細胞間脂質（脂肪酸・セラミド・コレステロ症反応には野生型と比して大きな差異を認めなかった。本ール）は、表皮の保湿（water barrier function: WBF）に

研究結果から、E-FABP 分子の表皮 WBF への関与が示唆

深く関与することが知られている。これらの細胞間脂質は、された。

表皮ケラチノで合成される層板小体（lamellar body）の２形で細胞間隙に分泌され、主に表皮顆粒層の表面に分布する脂質層を形成する１）２）３）。

２．１

脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein：FABP）は、

実

験

E-FABP マウスの作成

Fig. １にマウス E-FABP 遺伝子の構造と、E-FABP 遺伝

これまでにげっ歯類で 11 種類のアイソフォームが同定され子ターゲッティングに用いたベクターおよび recombinationている。FABP は、脂肪酸、胆汁酸、レチノイドなどに結後の変異遺伝子の構造を示す。embryonic stem cell（ES合能を示す細胞内低分子タンパク（14-15kDa）であり、細cell）にターゲティングベクターを遺伝子導入後、陽性 ES

胞機能としては、脂肪酸の細胞内担体として脂肪酸の細胞

クローンをサザンブロット法にてスクリーニングした。遺内取り込み、細胞内貯蔵、核の脂肪酸受容体への情報伝達

伝子組換え ES cell をマウス blast cyst に注入し、これを偽制御、さらにはセラミドやコレステロールなどの代謝制御

妊娠マウスの子宮に注入した。得られたオスキメラマウスに関与することが示唆されている４）５）。このうち上皮型をメス C57B6 マウスと交配し、得られたマウスの遺伝子型

脂肪酸結合タンパク（epidermal-type FABP: E-FABP）は、を確認することによりヘテロ接合型マウスを得た。雌雄へ

表皮のみならず脳、肺、消化管、眼球、胸腺などに広く発テロマウスの交配により得られたマウスを PCR 法およびサ

現することがこれまでの我々の発現解析結果から明らかとザンブロット法により遺伝子型を確認した。本研究で使用なっている６）７）８）９）。今回の解析では、E-FABP の表皮した野生型および E-FABP ノックアウトマウスはこの雌雄における生理機能を明らかにするために、我々が樹立したへテロマウスの交配により得られたものである。

E-FABP 遺伝子欠損マウス（E-FABP マウス）の皮膚における表現型を種々の観点から検討を加えた。WBF の測定

２. ２ サザンブロット、ノザンブロット、ウェスタンブロット

からは、野生型に比べて著明な transepidermal water loss

野生型、ヘテロ接合型、ホモ接合型マウスの皮膚を採取（TEWL）の低下が観察された。また表皮アセトン処理後のし、genomic DNA、total RNA およびタンパクを従ってAltered water barrier function in epidermaltype fatty acid binding protein deficient
mice.

抽出し、それぞれ定法に従って解析した（Fig.1b）。使用
したプローブおよび特異抗体の詳細は、発表論文の中で記載ずみである 10）。

Yuji Owada, MD.PhD
Division of Histology, Department of
Cell Biology,Graduate School of Medical
Science,Tohoku University

２. ３

形態学的解析

野生型および E-FABP マウスの背部皮膚を４％パラホ
ルムアルデヒドにて固定し、凍結切片およびパラフィン切− 66 −

上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化片を作成した。パラフィン切片は、定法に従って E-FABP

定はガスクロマトグラフィー（Hewlett-Packard Model 5890

特異抗体による免疫組織化学染色に付し光顕観察を行った。

gas chromatograph, Avondal, PA, USA）を用いて施行した。

凍結切片はエポン包埋後超薄切片を作成し、電子顕微鏡観察を施行した。

２. ６

２. ４

た。マウス耳介皮膚にアラキドン酸溶液（１mg/10ul）をStandard inframation assay

生後 10 週齢の野生型および E-FABP マウスを使用し表皮 WBF の測定

ヘ テ ロ マ ウ ス の 交 配 に よ り 得 ら れ た メ ス 生 後 10 週
齢、野生型マウスおよび E-FABP ノックアウトマウスを塗布し、塗布１時間後に microruler（Mitsutoyo, Kasugai,
Japan）を用いて耳介皮膚の厚さを測定した。

使用した。transepidermal water loss（TEWL）の測定は、

３

evaporimeter（ServoMed, Stockholm, Sweden）を用いてマ
ウス背部の剃毛した皮膚で施行した。表皮脂質バリアー除結

果

野生型、ヘテロ型、E-FABP マウスの皮膚におけるサザン、

去前後の WBF の相違を評価するために、アセトンを綿球

ノザン、ウェスタンブロットの結果を Fig.1b に示す。ヘテロ型でに浸して２分間皮膚に暴露し、暴露前と暴露後 30 分、２、４、は E-FABP ｍ RNA およびタンパクの発現は野生型に比べ12、36、48、96 時間後に測定を施行した。

て 50％に減少していた。E-FABP マウス皮膚ではｍ RNA、タンパクの発現とも完全に消失していた（Fig. １）。

２. ５

E-FABP マウスは、肉眼的観察および皮膚を含めた各組

脂肪酸成分測定野生型および E-FABP マウスの背部皮膚をサンプリング

織に対する光顕的観察において明らかな発達異常を示さなし、クロロホルム・メタノール溶液にて脂質を抽出後、測かった。体重増加や生殖能にも大きな異常を認めなかった。

Fig. 1 (a) Intron/exon structure of murine E-FABP gene and representation of target construct. Homologies (bold lines) between targeting construct and genomic DNA, and the probe used for Southern blotting are indicated. (b) Southern blot of BamHI-digested
skin DNAs from each genotype mouse. Northern blot of total RNA (30ug) from skins probed with labeled mouse E-FABP cDNA
or GAPDH (glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase) cDNA as a loading control. Western blot of skin lysates with anti-rat EFABP antibody. 10ug of protein from skins of each genotype mice were applied.

− 67 −

３. １ E-FABP マウスにおける表皮水バリアー機能の変化

電子顕微鏡にて観察した。アセトン処理前の表皮顆粒層の電野生型および E-FABP マウスにおけるアセトン塗布

顕像は、野生型と比して E-FABP マウスとも大きな差異を前後の表皮水バリアー機能の時間的変化を Fig. ２に示す。

認めなかった。層板小体の構造、数、分泌像とも明らかな差

アセトン塗布以前では、E-FABP マウスの TEWL 値は野

異は認めなかった。アセトン処理後の層板小体の分泌亢進

生型に比して有意に低下していた。アセトン塗布後は、30も野生型との差異は認められなかった（data not shown）。

分、２、４、12、36、48 時間後の TEWL 値は有意な差異を認めないものの、36 時間後の TEWL 値は野生型ではほ３. ３脂肪酸成分分析

ぼ前値に復しているのに対してノックアウトマウスでは回ガスクロマトグラフを用いた皮膚の脂肪酸測定結果を復の遅れが認められた。96 時間後には野生型、E-FABP

Table １に示す。各種脂肪酸の構成には野生型と E-FABP

マウスともほぼ塗布前の TEWL 値に復していた。

マウスの間に有意な差異を認めなかった。

３. ２ 超微形態像

３. ４

表皮ケラチノサイトの超微形態像をアセトン処理前後で炎症反応

脂肪酸およびその代謝産物であるエンコサノイドは、皮膚の炎症過程に深く関与することが示唆されている。E-FABP
分子の炎症反応に対する関与を明らかにするために、野生型
および E-FABP マウスの耳介におけるアラキドン酸誘発炎
症反応の測定を施行した。耳介厚の測定結果は、野生型とE-FABP マウスの間に有意な差異を認めなかった（Table ２）。

３. ５ 心臓型 FABP（heart-type FABP: H-FABP）の発現増強
E-FABP マウスにおける他の FABP アイソフォームの代償的発現増強を評価するために、ノザンブロットを施行した。野生型では、E-FABP のみの発現が皮膚において認Fig. 2 Chronological changes of TEWL measured in the dorsal
skin of wild type and homozygous mice following acetone treatment. The time of acetone application is indicated by an arrow,the values at this point represent pretreatment levels. Closed
circles: homozygous mice, open squares: wild type mice. Statistical significance in a two-tailed Student's t test comparing

められた。
一方野生型では発現を示さない H-FABP 遺伝子は、ヘテ
ロ型および E-FABP マウスの皮膚において発現増強を示すことが明らかとなった（Fig. ３）。

４

homozygous and wild type mice is indicated by *(P<0.05, n=6).
Table １

Table ２考察

表皮の保湿や WBF については、角質細胞間の脂肪酸、Constituent fatty acid of mouse skin lipids

Tickness of the ear after arachidonic acid treatment
Fig. 3 Northern bolt analyses of E- and H-FABP in the skin of eachgenotype mouse. Note the increased expression of H-FABP in
the skin of heterozygous and homozygous mice of 0.7kb. As theinternal control, the expression of GAPDH mRNA is shown.

− 68 −

上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化

コレステロール、セラミドなどの脂質が重要な役割を担っ

proteins: their function and physiological significance.

ていることは既に知られているものの、これらの代謝・輸Prog Lipid Res 35: 243- 282, 1996

送に関わる分子の生体レベルでの研究は、いまだ数少ない。

５）Coe NR, Bernlohr DA: Physiological properties and

E-FABP はこれまでに、表皮 WBF 形成への関与のみなら

functions of intracellular fatty acid-binding proteins.
Biochim Biophys Acta 1391: 287-306, 1998

ず、乾癬をはじめとする炎症性疾患への関与も示唆されている 11）12）13）。E-FABP の細胞生物学的特性（種々の脂肪６）Owada Y, Yoshimoto T, Kondo H: Spatio-temporally

酸に対する結合能、脂肪酸の細胞内取り込み、脂肪酸を介

differential expression of genes for three members of

した情報伝達制御など）を考えると、我々が世界に先駆け

fatty acid binding proteins in developing and mature rat
brain. J Chem Neuroanat 12: 113-122, 1996て樹立した E-FABP ノックアウトマウスは、WBF 形成機
構の生体レベルでの解明のみならず、炎症や細胞の分裂・

７）Owada Y, Yoshimoto T, Kondo H: Increased expressionof the mRNA for brain- and skin-type but not heart-type

分化などの解明に大きな貢献をするものと思われる。
ノックアウトマウスではしばしば欠損蛋白の機能を、他

fatty acid binding proteins following kainic acid systemicの構造類似蛋白がその機能を補完することが知られている。

administration in the hippocampal glia of adult rats. Mol

事実、既報の脂肪細胞型 FABP（A-FABP）ノックアウト

Brain Res 42: 156-160, 1996

マウスでは脂肪細胞において E-FABP の顕著な発現増強

８）Owada Y, Abdelwahab S, Suzuki R, Iwasa H, Sakagami。E-FABP ノックアウトマウスにおH, Spener F, Kondo H: Localization of epidermal-type

いても、皮膚、肝臓、腎臓などにおいて H-FABP の発現

fatty acid binding protein (E-FABP) in the alveolarが著明に増強していることが確認された（一部未発表デー

macrophages and some of the alveolar type II epithelialが観察されている14）

cells in mouse lung. Histochem J 33: 453-457, 2002

タ）
。E-FABP と H-FABP は、FABP 分子ファミリーの中でも、蛋白構造や脂肪酸との結合能において高い類似性を

９）Owada Y, Suzuki R, Iwasa H, Spener F, Kondo H:

有することが知られている 5）。E-FABP ノックアウトマウ

Localization of epidermal-type fatty acid binding protein

スは、発達期を通じて明らかな形態学的異常を示さなかっ(E-FABP) in the thymic epithelial cells of mice. Histochem
Cell Biol 117: 55-60, 2002

たが、この原因として H-FABP が E-FABP の機能を代償した可能性が示唆された。E-FABP の生体機能を解明する

10）Owada Y, Takano H, Yamanaka H, Kobayashi H,

ため、現在 E-H-FABP ダブルノックアウトマウスの表現

Sugitani Y, Tomioka Y, Suzuki I, Suzuki R, Terui T,

型解析を施行中である。

Mizugaki M, Tagami H, Noda T, Kondo H: Altered water

E-FABP ノックアウトマウスで観察された WBF の変化は、

barrier function in epidermal fatty acid binding protein

１）野生型に比べて basal TEWL が低値を示す。２）ア

deficient mice. J Invest Dermatol 118 : 430-435, 2002

セトン処理による表皮水分バリアーの破壊後に処理前値に11）Yamaguchi H, Yamamoto A, Watanabe R, Uchiyama

回復する時間が延長する。の２点である。これらの原因に

N, Fujii H, Ono T, Ito M: High transepidermal water loss

ついては、E-FABP ノックアウトマウス皮膚の脂肪酸含有

induces fatty acid synthesis and cutaneous fatty acid-率の測定結果や電子顕微鏡による超微形態観察からはそのbinding protein expression in rat skin. J Dermatol Sci 17:

原因を明らかにすることが出来なかった。詳細な脂質成分

205-213, 1998

解析（リン脂質、セラミド、コレステロールなど）あるい

12）Masouye I, Saurat JH, Siegenthaler G: Epidermal fatty-

は初代培養ケラチノサイトを用いた脂肪酸の取り込み解析

acid-binding protein in psoriasis, basal and squamous cellなどを現在施行中である。

cartinomas: an immunohistochemical study. Dermatology
192: 208-213, 1996

（参考文献）

13）Siegenthaler G, Hotz R, Chatellard-Gruaz D, Didierjean
L, Hellman U, Saurat JH: Purification and characterization

１）Landmann L: The epidermal permeability barrier.

of the human epidermal fatty acid-binding protein:

Anat Embryol 178: 1-13, 1988

localization during epidermal cell differentiation in vivo２）Elias PM, Feingold KR: Lipid related barriers andand in vitro. Biochem J 302: 363-371, 1994

gradients in the epidermis. Endocrine, metabolic andimmunologic functions of keratinocytes. Ann NY Acad

14）Hotamisligil GS, Johnson RS, Distel RJ, Ellis R,
Papaioannou VE, Spiegelman BM: Uncoupling of obesity

Sci 548: 4-13, 1988
３）Feingold KR: The regulation and role of epidermal lipid

from insulin resistance through a targeted mutation in
aP2, the adipocyte fatty acid binding protein. Science 274:

synthesis. Adv Lipid Res 24:57-82, 1991
４）Glatz JFC, van der Vusse GJ: Cellular fatty acid-binding− 69 −

1377-1379, 1996

コスメトロジー研究振興財団
第 12 回表彰・贈呈式記念講演

美人研究
国際日本文化研究センター

井

上

章

一
場所
日時

Ⅰ．明治・大正の出版物に見る女性観㈱コーセー２階会議室
平成 13 年 11 月 19 日㈪といけませんので、この話はこの辺りで止めておきます。

①教科書に見る
暫くお付き合いください。井上と申します。先ほど明治②警察出版物に見る時代の女学校の教科書の話を予めしていただいたと伺った

もう一点あります。大正５年に出版された『婦人と犯罪』

ので、そのことを申し上げたいと思いますが、本当に明治という警察が出した出版物に興味を持ちました。恐ろしい時代の道徳の教科書には、美人には勉強ができませんと書研究です。大正５年に刑務所に留置されている 260 人の女

いてありました。

の犯罪者を刑務所の取調官が、顔の良し悪しで美人の美・

驚くべき教科書には、こんなのがありました。
「美人に上・中・下・醜の五段階に分類していました。そして、こは勉強ができません。でも美人もがっかりすることはありの分類に際しては一人の取調官が行うと、その人の好みがません。あなたも心に醜い女の気持ちを持てば、学業はお出過ぎるので、複数の取調官で公平かつ科学的に分析したのずと身につきます。
」と書いてあるのです。これは大正と書いてありました。なんの為にやったのかというと、放時代のはじめ頃になくなります。そして恐らく、現在では

火犯は美・上・中・下・醜の中どの辺に多いのか、殺人犯

顔の良し悪しによって人生がどのように変わるかという道はどうか、詐欺罪はどうか、ということを記録していって、徳の授業はもう無いと思います。では、何故明治期にあっ女の人の犯罪の場合に、顔の良し悪しと犯罪の間にどのよたのでしょうか。私は明治期には本当に美人は勉強ができうな因果関係があるか、ということを調べ上げた研究でしづらかったと考えています。

た。今ではとてもできないし、できても公表はできないと一番端的な例を申し上げます。女学校には授業参観とい思います。

う制度がありました。といっても今のＰＴＡの授業参観で戦前の刑法に姦通罪という罪があったのをご存じでしょはありません。その街の女学校の近隣在郷の有力者が、授うか。現在では、不倫といいますが、当時は不義密通といい、業参観にきて、息子の嫁選びをするのです。もちろん当人

夫を持った奥さんが別の男と浮気をすれば、当時の刑法でと話し合ったりはしません。授業参観で決めますから、綺はその人を姦通罪として訴えることができました。この不麗なお嬢さんから例えば未来の村長夫人にとか、未来の庄義密通を犯す姦通罪の女の人が美・上・中・下・醜のどの屋の奥様という風に選ばれていくわけです。

辺りにいたか、に関しても調べられており、中・下・醜とこのような制度の中で、女学校教育の５年間を無事最後いう平均以下に集中していました。この結果に対して、刑まで全うした人はどうだったでしょうか。明治時代の教育

務所の取調官は次のようなコメントを添えています。

界用語に、無事卒業する人たちのことを、「卒業面」、「卒「美人妻の不義密通に関しては、夫がその妻を失うことを恐業するだろう面」という言い方で表現していた記録がありれて、訴え出ないのでこういう結果になったものと考えられます。「卒業面」を経験した人が師範学校へ進学されたわる。
」

けですから、師範学校はどんな状況だったのだろうなんて

私はこの推測が当たっているかどうかは取り敢えず問いいう会話をはじめると、ひょっとしたら皆様の中で、家のません。私にとって興味深かったのは、このような調査を婆さんもそういえば師範出だったから…のような話になる

警察が公然と行い、あまつさえ、出版物にしても、誰もなにも違和感を唱えない時代があったのだという事実です。

Historical changes of a feminine beauty’sworth
Shoichi Inoue
THE INTERNATIONAL RESEARCHCENTER  FOR  JAPANESE  STUDIES③表現の自由の流れ
私たちは中学校、高等学校で時代が新しくなるに従って、言論は自由になっていくと習いました。本当に言論は自由になったのでしょうか。先の事例のようなものをあからさまに書くことが良いこととは思いませんが、少なくとも、
明治、大正期の文献を読む方が明け透けに好きなことを書− 73 −

いています。この問題に関しては、現代の方が活字では自い。明らかにこれは間違っています。
あのような非リアリズム絵画からは、美人の図像を復元

主規制を要請されることが多い。
これらの点から、私は美人、不美人というテーマについすることはできないと思います。
「お互いにこういう人をて活字で書いてもいいことと、いけないことの範囲は歴史

美しいと思うようにしましょう」という時代の約束事は読的にどのように移り変わってきたのかを調べることが、歴み取れます。しかし、美人そのものの図像が、ああいうも史研究になると考えたわけです。当然こういう研究ですかのから復元できるとは思えません。ですから、私は美人のら、いわゆる進歩的な女性学の人からは蛇蠍のように嫌わ姿がどのように移り変わってきたのかという研究はしませ

れてはいますが、私自身は自分の興味に従って、そういうん。

ことを調べあげました。
宣伝めいて恐縮ですが、朝日新聞の文庫で『美人論』と②美人の産地いうタイトルで 800 円で出ています。興味がおありの方はあと一つ、「秋田美人、新潟美人は本当のところどんなご覧下さい。今日は、堅苦しくなるので、その内容につい風に綺麗なんでしょうか。
」等という話を伺うことがありては申し上げません。美人研究にまつわる、他のさまざまます。私はその手の問題にもあまり興味は持っていません。

なことを申し上げようと思います。

以前、私が『美人論』という本を書いた時のことですが、東京のあるテレビ局の方が興味をもたれて、私のところに

Ⅱ．美人研究への期待（の目）

質問に来られたことがありました。

①歴史美人の復元

彼は仙台出身の人だったんですが、「仙台は日本３大不「美人の研究」というと大概の方は時代によって美人の美人の産地だといわれている。だが、仙台生まれの自分と基準がどのように違うのかを調べるような仕事だろうと思しては、この評判に納得ができない。仙台出身者でも、こわれます。平安時代には引目鉤鼻がいいとされていた。江れだけ綺麗な人がいるんだ、ということを番組でアピール

戸時代には細い目、小さいおちょぼ口がいいとされていて、したい。ついては、仙台出身の美人についての情報を何か

現代とは全然違うといった歴史だと思われる人が多いわけ

貰えないか。」という取材でした。
私はそもそも、仙台が「日本３大不美人の産地だ」と言です。
しかし、そういう歴史ではありません。私は、鎌倉期にわれていること自体を知りませんでした。ですから彼には描かれるような絵巻物の女の人、引目鉤鼻ですが、本当にこういいました。そんな番組は創らないほうが良い。そんあんな女の人がいたのだろうかという疑問をもっています。

な番組を創ったら、視聴者の多くは「仙台は３大不美人の考古学の人に聞いても明らかですが、平安時代・鎌倉時代産地だったのか」という方を学習してしまうとアドバイスの人骨が出土します。その人骨を見てもあんなお結びみたをしました。しかし、私は仙台のことはどうでも良かった

いな顔をした人骨はありません。

のですが、一つどうしても気になることがあって「あのす当時はあれで美人を表現したつもりになっていたと思いいません、他の２つは何処ですか？」という質問を抑えるます。しかし、あれが美人の顔形そのものをストレートにことがでませんでした。彼の言うことをそのまま真に受け本当に表しているといえるのでしょうか。江戸時代の鳥居

れば、他の２つは水戸と、もう一つ名古屋だと言われました。

清長、鈴木春信の浮世絵、確かにあの絵を皆は美人の絵だ

しかし、私が調べたところでは、名古屋は明治時代にはと思っていたのだと思いますが、あんな顔の人が本当に江美人の産地として大変有名だった場所です。今は週刊誌類

戸時代にいたのでしょうか。あれは異様に長い顔をしていによれば、“名古屋を３大不美人の産地に挙げる” というます。あんな小さい口は現実にはあり得ないと思います。

風潮が多いのですが、明治期には名古屋は美人の産地でし

翻って、こういう風に考えてください。ちょっと古い話でた。それも、新潟や秋田などを遥かに凌駕する評判を獲得

恐縮ですが、僕はあまり漫画を見ることはないのですが、していました。

覚えている漫画に美少女戦士セーラームーンという漫画が嘘ではありません。例えば、新橋の芸者の置屋は自分のありました。あれは美少女と謳っています。しかし、あん店に名古屋出身の女の人がどれだけいるかということを自な顔の少女がどこに居るでしょうか。

慢していました。名古屋へリクルート部隊を派遣している

もし何かの事情で日本列島が、海底に埋没して 500 年

置屋もありました。極端な例になると、お互いの置屋同士

か 600 年後の、例えば、中国の図書館に美少女戦士セーラ「あんたの店に居るのは本当の名古屋女と違う、岡崎の女ームーンの漫画が残っていたと仮定してください。そしてやないか。名古屋といいくるめるな…。
」といった批判の500 年か 600 年後の中国の学者が、５・６世紀前に太平洋

しあいもあったようです。

に沈んだ日本列島では、20 世紀末にこういう人が美少女

また、永井荷風という作家が、名古屋美人についてのエと持て囃されていたという論文を書いたとしてみてくださ

ッセイを書いています。その中で、こんなコメントを残し− 74 −

美人研究ています。「名古屋美人なんか、たいしたことはない。彼違いがあるかご存じでしょうか。自動車損害賠償保障法の女たちはただ顔形が美しいだけだ。
」そのこと自体は認定

条文に、体の各パーツの値段が書いてありますが、それでされていたのです。ところが何時の間にか「日本３大不美

対比すると同じような顔の怪我で、女の人は約４ないし人の産地」というレッテルが横行するようになりました。

５倍の弁償金を貰うことができる所にランクされています。

このレッテルの変化をそのまま、真に受ければ、名古屋

基本的人権の平等とか、男女の平等という観念は、何処にの女の人はここ 100 年の間に器量が急降下したことになりいったのだろうと思われる方も多いと思います。しかし、ます。これを真に受けていいのでしょうか。私はそうは思杓子定規な平等論抜きに考えれば、私は実感として、そのいません。要するに無責任なマスコミのレッテルが時代のぐらいの差があるのは無理もないだろうと思います。

風の流れを受けて右往左往しているだけだと、そう考えた

ちなみに、女の人の顔に直径７センチメートル以上に亘ほうがいいと思います。こんなものに根拠は全くないと思る痣が残った時だったと思いますが、弁償してもらえる金います。

額が、男の怪我では何に該当するかという、そんな一覧表

秋田美人という単語が出現するのは、私の見た範囲ではがあります。７センチメートルの痣に該当する男のパーツ

明治 20 年代です。それ以前に、秋田美人という単語はあとして睾丸が明記されていました。お判りいただけるでしりません。明治 20 年代が最初で、言い出したのは秋田のょうか。現行の日本の法律では女の顔と男のなにが同じ値

花柳界です。恐らく、私の憶測ですが、国土開発の重点が、段にカウントされているのです。私は男ですから、あまりどんどん太平洋側に移り、次第に取り残されつつあった日に男のなにに対して気の毒な値段ではないかと思います。

本海側が、起死回生の町興しのイメージ戦略に打って出た「顔は女の命だ」という言い方はあります。しかし、男のときに、「うちには美人がいる」ということをアピールす

なには本当に命に拘わるではありませんか。
これを例えば、世界各国の法律で比較するとしましょう。

るようになったのだと思います。それが日本海側に点々と男の睾丸喪失に該当する弁償金で女の人の顔は世界各国そ続く美人連鎖になったのではないでしょうか。
もう一つ事例をお話します。1980 年代の前半のことでれぞれ何センチだろう。それを比較することによって、日すが、女性団体がミス名古屋コンテストの粉砕に乗り出し

本の法律は男のなにと女の顔を、どのように評価している

たことがありました。ミス名古屋コンテストを、名古屋市のかということがグローバルスタンダードの中で考えられ役所が後援という形でバックアップしていたのですが、こるのではないでしょうか。ところで、こんな研究をして、れに対して地元の女性団体が批判の声を挙げました。税金

この財団から援助金が貰えるでしょうか。多分笑われるだを使って美人選びをするのは許せないというのが批判の主けでしょうね。私はこういう研究を面白いと思っています

な論点だったと思います。これに対して、私は本当に感動

が、さすがにすぐにブラジルの法律書を取り寄せる気になしたのですが、毎日新聞の名古屋版の紙面で、名古屋市役

るかどうかは判りません。日頃、法学系の留学生をつかま所の担当者が弁明をしていたのです。
「ミス名古屋はいわ

えては、このような質問をしていますが、知りませんと答ゆる美人選びのコンテストではありません。それは歴代のえるのが常で、現実的にはよく判っていません。

ミス名古屋をご覧になっていただければ判るはずです。」
これを見て、私はちょっと考え過ぎかもしれませんが、②逸失利益訴訟に学ぶもの②−１ルックス評価の変遷

個人的な感想として次のように思いました。もし、「いわゆる美人選びではありません」というような美人コンテス

次に、逸失利益問題ということに触れたいと思います。

トで選ばれた方が名古屋代表として各地の見本市、各地の逸失利益というのは、例えば交通事故で腕の機能が全く麻物産展に行って、名古屋の商品をアピールされるとしたら、痺したとします。
「もう右腕が使えなくなった。利き腕が他の地方の人は、この人が名古屋代表なのかという疑いの使えなくなった。自分が今している仕事に差し障る。今後目で見るのではないだろうか。そして、その累積が「名古自分はまだ 30 年ほど働くつもりだった。この 30 年の間に屋の日本３大不美人産地」説になったのではないか。いず

総賃金がこれだけある筈だった。だけど、この右腕の機能れにせよ、この手の何処そこ美人とかいうようなレッテル

障害のお陰で、その期待される筈の総収入が何割か減ってに科学的な根拠はないと思います。ですから、私はこうい

しまっている。その減ってしまった分を保障してくれ。」

うのも調べようとする気が起こりません。

という訴えを逸失利益訴訟といいます。これを顔で起こされるケースがままあります。

Ⅲ．私の美人研究

例えば、ものすごく卑近な話ですが、「私は何処そこ大①法令が示す価値評価

学を出た。あるいは出る予定になっている。だけど、理科今、調べだしているのは顔の値段です。顔の値段、女のの実験で、だれそれ君の失敗で顔に薬品がかかって、もの

人と男の人が顔に怪我をしたときに、弁償金額にどの位のすごい痣が残ってしまった。就職の面接の印象が悪くなる。

− 75 −

私の学歴なら当然このぐらいの会社に入れた筈なのに、こせていただきます。昭和 48 年に新潟地方裁判所でキャバの怪我のお陰でこのぐらいの会社にしか入れなかった。年

レーのホステスに対する面白い判決がでました。ホステス

間これだけ差がある。これが後 40 年続いたら、これだけさんが顔に怪我をして、痣が残ったのです。そこで、私はの損害になる。これを弁償してくれ」という訴えを顔で起毎年これだけ稼いでいた。だから生涯賃金これだけ弁償しこされるケースがあります。

てくれ。という訴えなんですが、50、60 歳までホステス

こういう訴訟は 1980 年代中頃までは、基本的に却下ささんとして働けただろうとは裁判所も考えないわけです。

れていました。裁判所は女の人の顔の良し悪しと労働能力

そうすると裁判所はキャバレーのホステスさんはその容の間には因果関係がないという立場を採っていました。こ姿、ルックスを武器にして何歳くらいまでなら、収入があ

れは 70 年代より前、60 年代位ですとキャバレーのホステると考えたらいいかという計算しなければならないわけでスさんでも却下されました。

す。この裁判では「キャバレーのホステスがその容姿をも顔に痣が残ったので、もうホステスとしては働けない。

って収入の糧とすることができるのは、38 歳を以って上ホステスさんは一般女子事務職員より収入がいいですか

限と考えることが妥当だと思われる」という判決がでましら、その分保障してくれ、という訴えを起こす側の気持ちた。

は判りますが、それは却下なのです。何故かといえば、顔一体なにを基準にして、この 38 という中途半端な数字

を怪我しても酒を汲むことはできる、酒を運ぶことはできがでるのでしょうか。私には、全く理解できません。翌々

る、何ら労働に支障はきたさない、だから却下だったので

年の東京地方裁判所では 30 歳という判決がでました。そす。ファッションモデルの方が顔に怪我をしても却下でし

して、昭和 58 年になってファッションモデルの判決が大た。新しい服を着て舞台を歩くのに、顔の怪我は全然かま阪でありました。

わない筈だということです。昔の裁判所はルックスの価値「モデルの容姿のピークは 16 から 25 迄で以後漸次減退を認めなかったのです。

し、35 歳で消滅すると考えられる」これは、判決文そのところが 70 年代から顔も値打ちがあるということを認ままです。品が悪い言い方ですが、なんとなく 30 台半ばめる判例が増えだします。そして、80 年代後半に入って辺りが現行社会での平均値なんだとは思いますが、判例にから、女子高校生、女子大学生の就職の面接の印象が悪く

よって年齢が違うという事情は私には理解できません。

なるので、生涯賃金が減るという訴えを認める判例もでは

そこで一寸考えてみました。お互いに裁判の中で、仮にじめています。今、法廷は女の人の顔には労働能力と商品

これだけしか弁償できないという金額がもう予め決まった。

価値があるということを認める方向で進んでいます。

だから被告と原告の間で妥協が成立している。しかし、裁これに対し面白いことは、昔の新聞の求人欄には「求む判は進行しているので一応判決文は出さねばならない。そ容姿端麗」という広告がたくさんあるということです。私の払える限界から年齢を逆算しているのではないかと考えは昔の大正時代の求人欄に、電話交換手の募集欄に「求むたのです。これは法律の専門家に、「違いますか」と聞い

容姿端麗」と書いてあったのを見て、「何で電話交換の人たところ、「顔による逸失利益なんて、もともとアバウトに容姿端麗が必要なんだろう」と笑ってしまいましたが、なものだから、38 とか 35 とかいう細かい数字に拘わる必

もう容姿端麗というのが紋切り型になっていたのだと思い

要は全くない筈だ」と言われました。では何故そんな数字ます。

になったのかということは、いまだに解せません。
あと一つ気になったことがあります。兵庫県の西宮市で、

しかし、1970 年代になると、「容姿端麗を求む」という言葉は書きづらくなり、男女雇用機会均等法以降は書いてある家庭の奥さんが、道路工事中のパワーショベルに接触はいけない文句になりました。美人が欲しいなどというこして顔に大怪我をされました。その裁判記録を見ていてとを、会社がぬけぬけと言ってはいけないという倫理はど愕然としたのですが、原告側弁護士が法廷で、この奥さん

んどん強くなっているのです。にも拘わらず、女の人が顔は怪我をされる前はすごく綺麗だったということを弁舌しに怪我をしたら、「それは災難だ」ということを認める判ているのです。これが私にはものすごく引っかかりました。

例も増えているのです。美貌は求めるなというプレッシャ

いいですか、もし彼女が綺麗だったということが仮に論証

ーと、やっぱり顔には値打ちがあるという判例と、全く相されたとして、それで保障金額は違うんでしょうか。確か

反するかのような事態が、２つ進んでいます。今後は、こに綺麗な人だった、だからこれだけ弁償しますとか、あなの２つをどのような対応関係で捕らえればよいのかという

たは元々たいしたことないから、この程度で辛抱しなさい

テーマを、歴史に即して調べていきたいと思っています。

とか、そんな判決があり得るでしょうか。これこそ基本的
人権の平等に悖りますよ。しかし、その弁護士は法廷で綺②−２ルックス評価の基準（法理と現場）麗な奥さんだったということを力説しているわけです。

私が調べている途中で見つけた、面白いと感じた話をさ− 76 −

私は伝手を辿ってその弁護士を探し出して、会いに行き

美人研究ました。弁護士さんは、その奥さんが怪我をされる前の写が目立ちさえすればいいのか」といういやな感じがしたわ

真を引き伸ばして、パネルに貼って、法廷に持ち込んだのけです。壁の捻じ曲げ方とか、天井のエッジの切り方とか、です。そして、「こんな綺麗な人が怪我をさせられたんでいろんな所になんと嫌らしい、という思いがしたのですが、すよ」と弁舌したのです。
「それで保障金額は違ってきま

受付のお嬢さんがものすごく素敵な人で、私の好みの人だ

すか」と聞くと、「逸失利益は変わらないと思うが、慰謝ったのです。

料の算定額は若干違ってくる筈だ」と言われました。要す

お昼頃にいっていたのですが、ガラス窓とかを指しながるに裁判官の心証形成にかなり有力なジャブになると彼はら、「夕日はどの辺まできますか。」などと質問をしました。

言うのです。本当ですかと聞くと、「いや自分の同業者も彼女も自分の勤めているビルの悪口は書かれたくないと思同じようなケースを扱うときには自分と同じように振舞うって「この辺までくるんですよ」などと親切に答えてくれ

筈だ」と、彼はそう言っていました。それは差別ではありました。それで、私は１週間くらいは幸せな気分になってませんかと聞いたら、こう返されました。
「確かにやや差いたのです。

別的なところはあるかもしれない。しかし、自分は法廷闘

そして、原稿用紙に向かうときに編集部からは「建築空争を戦うために雇われたプロだ。プロは雇い主の利益にな間の味わいを感じたまま素直に書いてください」という注ることなら何でもやる。
それがプロというものではないか」

文を受けていました。したがって、私が本当に素直に書けと言われたのです。

ば「つまらない建築だけど、受付のお嬢さんは素晴らしか

奥が深いというか、いろいろな考え方があると思いながった」と書くべきだったと思うのですが、なにものか得体

ら、京都大学の法学部にいる民法の不法行為を専門にしての知れない力が私に命令するわけです。
「おまえは本当のいる友達に、どう思うかと聞いたところ、彼は「その弁護ことを書いたらダメだ、絶対嘘をつけよ」と命令するわけ

士は決定的に間違っている。いまの裁判官はそんなことでです。そして、わたしは嘘の作文をするわけです。「建築心証を左右される筈がない」と怒り出しました。しかし、家の斬新な工夫、創意に満ち溢れたなんとか」という嫌ら現場の弁護士は皆そうすると言っているのだが、と言うとしい作文をするわけです。私はそこで自主規制したわけで「自分が説教してやるからつれて来い」とまで言い出したす。権力の軍門に下ったわけです。
それからです。「一体誰なんだ、私に嘘をつけと命令する、のです。とにかくアカデミックなフィールドでは、そうい
う差はないことになっていると思いますが、現場の弁護士

この得体の知れない力は」という疑問から、面食いを抑圧の中には綺麗な人はやはり得をすると考えている人もいる

する倫理の歴史的起源を遡及するという研究テーマに至っようです。しかし、もし仮に差をつけていたとしても、差たのです。

をつけているとは言うわけがありませんから実態は判りま④ミスコンに見る美人の本音せん。
いずれ「ルックスの商品化」という問題、「ルックスの『美人論』という本は、そのための本でした。これはど

金銭的な値打ちに関する歴史」はいずれキチンと追いかけういう人が美人なのかをさぐった本ではありません。美人ていきたいと思っています。さきほど、現行では女の人が及び美人を取り扱う社会の在り方が歴史によってどのよう

約４，５倍になっていると言いましたが、大正時代の工場に左右されているかということを研究したものです。そう

法を見ると女の人が約２倍です。男女の顔の値打ちの格差

いう仕事に目をつけたのは、私は建物を見に歩く時、横をは男女平等が喧伝される現代社会の方がむしろ強くなって通っている女の人に目が向かうことがよくありますが、そいます。こういう問題はどう考えたらいいのでしょう。恐

ういうことの積み重ねです。
実を言うと恥ずかしい話ですが、十数年前、『美人論』

らく女性史の研究者は、この手の問題を無視すると思いまを出す直前だったと思いますが突然電話をいただきました。

すから、私がしっかり考えてみようと思っています。

「ミス京都の事務局ですが、井上さんは美人の研究をやっ③男の本音と建前ておられると聞きましたが、そうですか」と言われたので、私が何故このようなことに拘わるようになったのかと言「誰から聞かれたのかな」とは思いながら、「ハイそうです」

うと、若い頃に建築の勉強をしていて、建築評論を書いたと答えました。すると次に、彼は「まことに僭越ですが学りすることがままありました。そしてある時、雑誌社から問的なお立場から、私どものコンテストに審査員として参竣工建築の評論を頼まれて建物を見にいきました。出来上

加してはいただけませんでしょうか」という依頼をされたがったビル自体は設計した建築家のスタンドプレイが鼻わけです。
こんなものに学問があるのでしょうか。そうは言っても、につく建物で、見た瞬間にいやだなと思いました。つまり、竣工写真が建築雑誌に載ったときの見てくれ以外の何も考

人間には愚かな部分がありますね。正直に言いますが、私えていないという様子がありありと伝わってきて、「自分はその話を聞いて胸が高鳴りました。しかし、いきなり「ハ− 77 −

イ受けます」と言うのは恥ずかしかったので、「あまりにいろいろ貰えるのです。３時間、舞台でニコニコしていた

突然の申し出で困惑しています。
暫く考えさせてください」

ら、50 万円がポンと入ってくるわけですから、あの娘達という嫌らしい答弁をしました。そしてその後、何故あのはミスコンあらしを止められないと思います。しかも、さ時、「ハイ判りました」と素直に答えなかったのかと悔やらに推薦制度というのがあって、ご両親でも、友達でも、みました。しかし、10 日後くらいに「お考えいただけた

親戚でも、誰でもいいのですが、１位になった人を推薦しでしょうか」という電話をいただきました。

た人は５万円、準ミスを推薦した人は３万円貰えるのです。

行かせていただいて感動したのですが、舞台にレオター

そして、ミスとなった８番の方の「偶然だけれども準ミス

ド姿の 30 人のお嬢さんが並んでいらっしゃいました。私に選ばれた誰某さんとお互いに推薦し合っていたので、推は、いわゆるエントリーナンバーでいう８番目の方と 20

薦料まで貰えることができました」という談話が紹介され番目の方がかっこいいなと思い、隣にいる審査員の方達に、ていました。これは私にとっては社会勉強でした。これはその話をしました。そして、私、その隣、またその隣の３

なにも事情を知らない人がそこだけ読むと、「綺麗な娘同人くらいで８番、20 番という盛上りがありました。

士のお友達なんだな」ですみますが、多分各コンテストを多分下品な会話をしていたのではないかと思いますが、あらしていく間に、お互い顔見知りになって、「私、次は西陣の和服でサントリーのコマーシャルに出て、あとで有あれに出たいと思うけど、あなた私のこと推薦してくれな

名になられた市田ひろみさんという方がおられて、僕のこい？」「じゃ、私も出るから、あなた私のこと推薦しておとを肘でつつかれました。助平親父の会話がたしなめられいて」のようなことが続いたのではないでしょうか。このるのではないか、と思ったら違いました。市田ひろみさん

８番の方は、翌年「クィーン神戸」に輝かれたのです。

は、こう言われたのです。
「あなた達は誤魔化されたらいけません。あの２人はミ⑤美人の処世術
私は、世の中はそんなものだろうと思う一方で、フェミ

スコンあらしです。私はこういうコンテストでしょっちゅ

ニズム的な観点ではなしに、なにかやはり、ずるいのではう審査をしていますが、あの娘達は毎回来てますよ」
そういわれて、私は中年男の純情が一寸崩れたような気分が漂ったりもしたのですが、市田さんは質疑応答の時に、ないかという義憤のようなものを抱いて、あるモデルクラブをやっていらっしゃる方に質問をしました。
彼女はミスのタイトルを９つ持っておられ、大変綺麗な

ものすごく意地悪な質問をされたのです。
20 番の娘にたいして、「あなたは今までに、こういうコ方ですが、その方に聞くとこう言われました。
「コンテス

ンテストに出たことがありますか」。ありますかと聞くま

トの会場に行くと、今日のライバルが誰かというのは直ぐでもありません、知っておられるのですから。聞かれたほ判る。あぁ今日はあの娘との戦いだ。舞台が暗転して、準うも「知ってるくせに、なにが・・・」と思われた筈なの

ミスを今から発表しますというアナウンスがあって、そのですが、彼女は全然表情を崩さずに、本当に可愛らしい声

娘にスポットライトが当たった瞬間に、私は勝ったと思う」

で、「ありません」と言い切りました。ここで、
「そうです

そして、
「企業などが主催するイメージガールですと、割

私は常連です」と言ってしまえば、会場中に、なんだといとユニークなところが評価されたりするんですが、地方自う気分が漂うわけです。ここは嘘をついても、白を切った治体がやる富士山とか天橋立を選ぶような凡庸な美人コンほうが得だと瞬時に判断されたのだと思います。

テストではこの予想は外れません」と言われました。

私は国会の証人喚問でも、もう一寸おたおたしている議

それだけの自負心を持った彼女に私が初めてあるパーテ員は居ると思うのです。例えば、自民党の修羅場を潜ってィでお会いした時に、たまたま移動でタクシーに一緒に乗きた宮沢喜一さんでも一寸オロオロしていらっしゃったよ

せていただくことになりました。そして、夕日が当たった

うに思います。
ああいう場所で、二十歳過ぎの女の娘に堂々横顔が本当にクラシックというか、古典彫刻のようなノーたる白の切り方があるとは思いませんでした。これは社会ブルな感じがして、私は滅多にそんなことを言わないので勉強になりました。その後の審査委員会で、嘘を着いたとすが、「やぁお綺麗ですね」と申し上げたら、「私は自分のいうことを問題にする人はいたのですが、他の娘を選んだことをそんな風に思ったことありません、でもありがとう

ら会場が納得しないだろう、ということで、８番と 20 番

ございます」と返事をされて、綺麗なだけではなく、謙虚の娘がミスと準ミスに輝きました。ミスになった彼女にも、な良い人だと思いました。その人が実はコンテストに行け「どうせ私のものだ」という自信もあったのだと思います。

ば、今日は誰が敵か判ると本音で思われる人なんです。

その２、３週間後に京都で出されている、リビング京都

そこから、私はこんな疑問を持つようになりました。美という新聞（サンケイグループ）に、ミス京都の話題が載人の方で「お綺麗ですね」と言われて、「ええ、私綺麗でしょ、っていました。ミスの賞金は 10 数年前の当時で 50 万円と皆様がそう言われるのです。もう私、聞き飽きてしまいま

ロサンゼルス１週間、スポンサーのコスチューム、その他、した」と言われる人が、果たしてどれだけいるでしょうか。

− 78 −

美人研究

大概の人は「いいえ私なんか」とか、或いは「お世辞でもがないのなら、何故モデルになっているんですか」というありがとうございます」とか、できるだけ穏便に処理され突っ込みをしそうな状況だったのですが、「まぁそんなにるようになります。

性急にならないで…」と、なるべく穏便に聞くのに２時間かかりました。

⑥フィールド調査と新たな課題

２時間目に一人の女の娘が、実は中学校の時に皆と一緒

この時、美人の方たちは一体何歳くらいから、なにを切に行った修学旅行で、クラスメートと撮った記念写真を見っ掛けに、自分は美人なんだという自覚を持つようになり、た私の友達のお母さんが、「この娘ものすごく綺麗ね」と私は自分のことを綺麗だと思っているけれど、この自惚れ言っていたと、その友達に言われました。私は胸騒ぎがしはあまり人前に出さないほうが良いという風に、処世術をて、家に帰ってその記念写真を改めて見て「うん、確かに学習していくようになるのだろう、という疑問を持ったわ

皆より勝ってる」と思いました。それが最初ですという、けです。

この一言で約２時間守り続けられた他の方の堤防も音を立

このテーマで以前、大阪にある関西テレビの番組に協力てて崩れていったのです。後はもう、ほんの 10 何分も経をいただいて、実験というものをしたことがあります。大たない間に美貌自慢の洪水みたいに、私は、私は、私はと阪で活躍しておられるモデルのお嬢さん 10 数名にスタジいう状況になりました。

オに集まっていただき、「あなたは何歳くらいから自分の「美人は２時間は嘘をつく」というのが私の社会勉強だ

ことを綺麗だと思うようになりましたか」という質問をしったのですが、私はこれにも歴史があると思います。自分たのです。

の美貌を自覚することが、社会的にどの程度認められるの

これは録画でしたからいくらでも時間を使えたのですが、かというメンタリティの歴史的な推移も、本当に精密には皆が「いいえ、まさか私なんか自分のことを綺麗だと思っ

辿れないとしても、いくつかの文献記録から、ちらほら見たことはことない」と、そういう鉄壁の防御が約２時間続

えてきているような気がしています。いずれ時間があれば、きました。レポータの方も「そんなに綺麗だと思ったこと

そういうことにも挑んでみたいと思っています。

− 79 −

コスメトロジー研究雑感

平成 11 年度

研究助成

私のコスメトロジーと研究
野村

正人

私が現在の研究テーマに関与するきっかけは，1989 年

的に皮膚を して吸収される精油はグルクロン酸と複合しに米国 ･ カリフォルニア大学バークリー校に留学し，そこて排出されるので，体内に蓄積されることはほどんどないで知り合った研究員との交流であった。留学先で何か新しものと考えられている。このような観点に立ち，私は現在

い研究テーマを構築することに重点を置いていたことかの日本ではお茶と同様，毎日の食生活に欠かせない存在でら，自然界に広く存在する植物から得られる化学物質を化あるコーヒーの生豆中に含まれており，精神の安定をもた粧品配合剤で，しかも重要なファクターの一つである美白

らす原因物質の一つであるクロロゲン酸から得られる数種

剤としての利用を目的とした研究を始めた次第である。その分解生成物および合成した化合物にチロシナーゼ阻害活の時期に貴財団の研究助成を頂くことができ，大変感謝し性，活性酸素消去効 などが存在するのではないかと思い，ております。私の専門領域は天然物有機化学ですが，ビタ

本研究を行った。実際に進めると，環境破壊にともなってミン，ホルモン，抗生物質のような医薬品などの開発で重増加する紫外線の影響を無視することができない現状を再要なだけではなく，新しい種類の性質や構造を示す化合物

認識することができた。同時に，消費者のニーズの中心はの発見あるいは合成可能な情報を提供できる有機化学としやはりできたシミ・ソバカスを取り除くことができないかて意味深いものがあります。また，生物活性物質の化学構という声を聞くことがあり，紫外線に対する意識や美容効

造と生理作用の関係を研究する上でも非常に役立つ場合がに対する期待度が新しい素材開発に大きく反映しているこ多い。一方，古くから植物の精油が美容健康などを目的ととを認識することができた。今後，美白化粧品に対するした香粧品原料として用いられており，最近では薬理効

消費者のニーズは化学物質の安全性はもとより，高い効 ・が明らかにされることにより重要性が増大している。ま

効能が求められ，我々としてもより多くの生物実験を行い，た，経皮吸収とその消長ならびに皮膚表 における理学作

それらから得られるデータを評価し新しい美白成分として用などにおいても絶対的な安全性が求められている。一確立できれば幸いと思っています。

（近畿大学工学部）

平成 11 年度

研究助成

美しさの価値観とコスメトロジー
木野邦器

先日、日本を代表するファッションデザイナー川久保玲

振付師やデザイナーなどが彼女の作品を絶賛しているのを取り上げたテレビ番組を観た。彼女は、世界のファッシ

は、そうした彼女の攻撃的な問いかけを評価しているから

ョンの情報発信源であるパリコレでも常に高い評価を受けかもしれない。

ている注目の人である。番組では彼女のファッションにお美しさを演出する手段としては化粧も同様である。美しける美しさへの限りない探究心と、それを具現化しようとさに対するコンセプトや価値観は、確かに時代や社会を反する挑戦的な取り組みを追っていた。

映して流動的で、一部は意図的に作り出されているものも彼女の作品は 常の「美しさの常識」からかけ離れたデある。一方で、美しくなりたいとする願望は、見かけの美ザインを基調としており、従来の「美しさの常識」に敢え

しさではなくその本質を探り出そうとする観点からの化粧て反抗しているような気さえした。美しいものに接すると品開発にもつながっている。例えば、肌の老化のメカニズ

精神的にもそれなりの安らぎを感じるものだが、彼女の提ムを生理的な から解析するアプローチがとられたり、癒示するアンバランスなデザインに私は安らぎを感じることし効 を狙ったり、気持ちを高揚させることで生き生きとはなく、むしろ違和感さえ覚えた。しかし、常の美しいとした若々しさを内 から滲み出すためにはどうしたら良い思えるものとのギャップがむしろ観る人にドキッとするよかなどが多 的に検討されている。こうした考え方は、今うな強烈な印象と緊張感を与えているのは事実で、著名な後さらに強くなるであろう。

− 83 −

価値観の一元化がなされようとしている現代において、しさの本質とは何であるのか、現状を良しとせず異なる観

個性をどのように維持し表現するのかは大きな課題である点から常に見直す姿勢の重要性と価値観の多様性を考えさように思う。その補助手段としての化粧やファッションのせられる番組であった。
美しさを探求するコスメトロジーのさらなる発展・進化

役割はとても大きい。
「もっと美しいものはあるはず」という川久保玲のこだを期待してやまない。

（早稲田大学理工学部）

わりが、新しく強い服を創出する原動力になっている。美平成 12 年度

研究助成

環境問題と老人介護小林
はずかしながら、コスメトロジーという言葉をはっきり

達彦
境に優しい化粧品も既に開発されているのでしょうか？

と意識したのは、貴財団の研究助成公募案内を拝見してか

コスメトロジーをもう１つ意識するようになったのは、らであります。日頃から男性用化粧品など使ったことがな

つい先日、妻からお年寄りの介護の話を聞いてからです。

い私にとって、身近に感じる唯一の？化粧品は日焼け止め

特に女性のお年寄りの方に口紅やマニキュアなどの化粧をクリームくらいでしょうか。といっても、学生の頃はほとしてあげると、とても喜ばれ、生き生きとなられるようでんど１年中、川でカヌーを漕いでいたため、いつも真っ黒す。お年寄りの身の世話をするのは周りの人にとって大変で、日焼け止めを塗る必要はほとんどなかったのでしたが、なことで、化粧まではなかなかできないのが現状だと思川では珍しい女性のカヌーイストはやはり日焼け止めをしいます。また、その後は、化粧品を落としてあげる必要

っかりされているようでした。
最近は、環境がキーワードとしがあるので、ケアーされる方は益々おっくうになりますが、てしばしば取り上げられますが、ホテルのプールなどでは、簡単に落とせる化粧などが開発されるようでしたら素晴

日焼け用オイルや日焼け止め用オイルは前もって落としらしいと思います（もし既に開発されているようでしたら、てから利用して下さい、云々、の掲示が出されております。

すみません）。数年前までは我が国で茶髪がここまで広く近い将来、海で泳ぐ場合にも当てはまるようになるかも知

浸透するとは思いもしませんでしたが、思いもかけないコ

れません（最近では川で泳ぐ人はほとんど見かけません

スメトロジー商品が 21 世紀には開発されることと思います。

が、流れのままに泳ぐのも気持ちがいいものです）が、環（筑波大学応用生物化学系）

平成 12 年度

研究助成

無邪気でいられない日焼け
増井
紫外線がシミやしわの原因となる「美容の敵」といわれるようになって久しいが、小生が子供の頃は真っ黒になる

敏行の頃に浴びた が多いと皮膚ガンになる可能性がより高くなるということも最近わかってきた。

まで外でよく遊んだものであった。夏の暑いときには上半

オゾンホールの拡大傾向はよく知られた事実であるが、身裸などはざらであった。ところが今ではこれはとんでも

気象庁の発表によると、北半球における有害紫外線 も 70

ないことのようである。

年代にくらべて４〜７％増えており、日本でも紫外線照射

紫外線は放射線と同様に、細胞内の DNA を直接傷つけは増える傾向にある。黄色人種は白人に比べ皮膚ガンの割る。ほとんどがすぐに修復するが、日焼けがひどいと修復合が少ないものの、30 年前に比べ皮膚ガン患者が非常にしきれずに傷ついたままの細胞が残り、その損傷が何十年増えているのが実情である。

か後にやがてガンを引き起こす可能性が高くなるのであ皮膚科医たちによって現在最も推し進められている予防る。さらには、生涯に浴びる紫外線の が同じ場合、子供

策は、紫外線 が多い時刻はなるべく外に出ず、出来るだ− 84 −

コスメトロジー研究雑感

けつばの長い帽子をかぶり、日焼け止め化粧料をつかうこ

である。市場規模拡大の意味も含め、化粧品メーカー側もとである。ここ２〜３年の間に、子供向けサンケア商品が「親子で紫外線予防」のようなキャンペーン展開をはかっ発売され、市場をのばしているようであるが、幼稚園や保てみてはいかがだろうか。

育園に う子供を持つ母親のなかで日常的なサンケアの必無邪気に外で遊べた時代が終わり、うまく太陽とつきあ

要性を感じている割合はおよそ半分であり、十分に認知さっていかねばならない世の中となった今、紫外線遮断剤のれているとは言い難い。たしかにバラエティー番組や CM

研究はきわめて重要である。心して研究に勤しみたい。
（大阪大学大学院工学研究科）

をみても、成人女性をターゲットとしたものばかりのよう平成 12 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
白井誠之

このたび，コスメトロジー研究振興財団より研究助成を合成を行いました。出発材料、水 、水熱温度、水熱時間、

いただきました。本助成金により多くの結 を出すことが水熱時の pH、乾燥条件など合成パラメータは非常に多く、できました。また財団から本研究が選ばれたことが大変な時間と労力のかかる地味な仕事ですが、合成条件によって励みとなりました。心からお礼申し上げます。

性質が大きく変わることが分かりました。

私は東北大学で合成粘土の研究をしております。粘土は

合成粘土は天然品と異なり、不純物を全く有さないとい

板状の層状化合物で、陽イオン交換能と膨潤能を有しておう特長があります。しかし実際には、自然から学ぶことがり、これらの性質を利用して、様々な分野で用いられてい非常に多く、また未だ持って解明されていない部分も多くます。例えば、化粧品分野では、板状構造とイオン交換能あります。本研究で天然のものよりも高いイオン交換能やを利用した洗浄剤（石鹸，練り歯磨き、シャンプー、シェ

膨潤能の高い粘土がつくれることが分かりましたが、これービングクリーム等）、膨潤作用とイオン交換能を利用しからも高機能化された粘土合成の研究を続けていきます。

た保湿剤（泥パック，ボディクレイ、ローション、スキン本研究で得られた知見がコスメトロジー研究の一助となり、人々が健康で美しくなるために用いられることを夢見

クリーム等）に使われてます。
本研究ではオートクレーブを用い、水熱法により粘土ております。

（東北大学多元物質科学研究所）

平成 11 年度

研究助成

私の研究分野に関連して
杉山

政則

私は、微生物、その中でも特に、抗生物質をつくる放線

スミドを調べた成 として、コピー数の高いプラスミドを菌を実験材料としてきました。今から 20 年ほど前、抗生保有する放線菌（Streptomyces castaneoglobisporus ）を物質をつくる遺伝情報が、染色体以外の遺伝因子、すなわ

見つけたのですが、その菌株が偶然にも多 のメラニン色

ち、プラスミド（plasmid）上に載っているとの仮説が提素をつくる菌株でもあったわけです。

唱されたとき、その仮説にとても興味を抱きました。当時1990 年に医学部に移籍して間もなく、この放線菌株か在籍していた広島大学工学部には菌株保存施設がありましらメラニン色素産生遺伝子のクローニングに成功しましたので、大学院生と共に、そこにストックされていたほとた。これが、今回、貴財団の助成金対象となった『高発現んどすべての放線菌について、プラスミドの有無を調査し型メラニン色素産生遺伝子のコスメトロジーへの応用』にました。ちなみに、今では、抗生物質生合成に関わる遺伝つながったのです。

子は、一部の抗生物質生産菌を除いて、染色体に存在する

最近、私の毛髪に白いものが目立つようになりました。

ことが明らかにされています。200 種ほどの放線菌のプラ年を取ったと言ってしまえばそれまでですが、白髪の占め− 85 −

る割合が増加するにつれ、次第に黒髪への憧れが強まるよ

先日、高３のわが娘に「髪は染めないでね」と言ったところ、

うになりました。黒髪は若さの象徴であり、自分をいつま即座に「私には似合わない」と、安心の言葉が返ってきま

でも若く見せたいのか、それとも、「ストレスなんか受けした。いずれにしても、メラニン色素産生遺伝子は、必ずていないよ」との自己主張が黒髪を保っておきたい要因なやコスメトロジーや再生医療分野に貢献できると信じていのかも知れません。今や、私の周囲の大学生までもが茶色ます。

（広島大学医学部）や金髪に染めているのを見るにつけ、「自分の髪をもっと大切にした方がいいよ」と、嘆き心でつぶやいています。
平成 11 年度

研究助成

糖鎖生物学とコスメトロジー
谷口直之

皮膚は生体と外界の接点です。細胞レベルではこれは細です。翻訳後、さまざまな修飾を受け服を着せられ成熟し胞膜（あるいは細胞壁）にあたります。皮膚と細胞膜は、た機能分子として生まれ変わります。この翻訳後修飾の中

外界から身を守り、内容物が漏出しないように一定の強度で最も普遍的で重要なものが糖鎖修飾です。皮膚がいくらをもったバリヤーとして機能するとともに、外界の情報を丈夫といっても、状況に相応しい服装を着ることが必要な

いちはやく内側に伝えたり、逆に外界に情報を発信する仕のと同じです。近年、ヒトゲノム計画の進展により、ヒト組みも備えています。ちょうど中世の城壁と砦のようなもの設計図が明らかにされようとしています。これを受けて、のです。この重要な役割の一端を担っているのが糖鎖です。

遺伝子機能を解析するポストゲノム研究が始まりました。

糖鎖はこれまで核酸、タンパク質の陰に隠れてあまり注

この中心に置かれているのは遺伝子の直接産物であるタン

目されてきませんでした。これは、糖鎖の構造があまりにパク質の機能解析ですが、上で述べたようにタンパク質だけも複雑多様で、その機能を調べることが非常に困難だったでは裸の王様で、機能の鍵を握るのは糖鎖研究といえます。

からです。我が国の先達たちはこの困難にもめげず、地道

皮膚を構成する多くの生体物質もこの例外ではありませに複雑な糖鎖構造を解きほぐし、生命現象との関係付けをん。糖脂質のグルコシルセラミドも上皮の構成員として、してきました。その甲斐があって、我が国の糖鎖研究は世また情報発信分子として重要な働きをしていることが知ら界を席巻することになりました。糖鎖の生合成に働く酵素

れています。この糖脂質の機能を調べるのも糖鎖生物学とをコードする遺伝子を糖鎖遺伝子と呼んでいますが、これいう学問です。糖鎖生物学の重要性は、ごく最近、首相をまで同定された約 120 種類の糖鎖遺伝子の半分以上を我が議長とする総合科学技術会議でも取り上げられ、万人の認国の研究者が単離いたしました。これは、ヒトゲノム計画

知するところとなりつつあります。今後の糖鎖生物学の発における我が国の貢献度が６−７％であったのと対照的です。

展が必ずやコスメトロジーの発展に繋がると確信しており遺伝子でコードされるタンパク質は裸の未成熟なものます。

（大阪大学大学院医学系研究科）

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジーとの接点の行方
堀

久枝

美容とは全く縁の遠かった私とコスメトロジーとの接点湿性に注目して化粧品に入れることを考えた製薬会社がコとなったのはコラーゲンだと思っています。私が結合組織

ラージュという名前でコラーゲン入りのクリームを売り出の研究を始めた 30 年前は血清タンパクと酵素の構造機能解したのが始まりです。そのころ是非試して下さいとのこと

析研究が主流で、コラーゲンの研究をしていると言ったら、で試供品を一瓶全部使用したものの、シミソバカスは全く

それは何ですかと聞かれた時代でした。コラーゲンが今日改善されず、やめてしまいました。今考えると、美白剤でのように広く使用され始めたのは、コラーゲンの優れた保は無いので、期待するのが可笑しいということでしょうか。

− 86 −

コスメトロジー研究雑感

むしろ、皺の増えた今日この頃使用すると効 があらわれ

上まえからこの問題を重視し対策を講じているとのことでるのでしょう。今では、コラーゲンが成分の主体となり化す。すなわち、安全なウシの生産国から、感染性の最も低粧品には欠かせない貴重品となりました。今回貴財団より

い部 である皮膚を購入し、真皮層を強アルカリ処理（変いただきました助成金のテーマはこのコラーゲンの変性物

異性プリオンの減弱）してコラーゲンを製造しているのでであるゼラチンによるアレルギー反応を惹起する抗原性物

安心しました。それにしても草食動物であるウシに栄養価質の同定でした。お陰様でウシコラーゲン α2 鎖の特定部が高いと言う理由で、ウシの脳、脊髄を与えるなど、自然に抗原性があることを解明でき、ある種のプロテアーゼ消界のルールを無視した生育方法に根本的な問題を感ぜざる化でこの抗原性が激減し、低アレルゲン性ゼラチンの開発を得ません。現代社会が利便性、生産性を重視し、本来のの方向が決まりました。ところが市販のコラーゲン、ゼラ

自然界のルールや環境の破壊、生命にたいする倫理観の喪チンは主にウシ由来で昨今新聞で話題になっている狂牛病

失の方向へ進んでいるのは非常に残念なことです。しかし、の感染性についてその安全性が問題になっており、美しく

私はコスメトロジーとの接点の行方が必ず安全な方向に発ありたいと願う気持ちと狂牛病には感染したくないと複雑展することと確信し、今後を期待しております。

な気持ちであります。ちなみに、多くのメーカーは５年以（東京医科歯科大学難治疾患研究所）

平成 11 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
松村哲理

私は化粧に興味がない。化粧はおろか，服装にも興味が的な欲求の１つであり，音楽や絵画などの芸術を行う行為ない。さすがに服を着ないで外出するのは気がひけるが，と じるものがある。とすれば，化粧をそのような芸術行

毎日同じ服を着ていても全く気にならない。そんな私であ為と同じように評価すればよいのではないだろうか。
音楽や絵画における作品を本当に理解し評価しようと思るから，自分で化粧をしようとは思わないのはもちろん，

えば，その完成した作品を見たり聞いたりしているだけで他人の化粧にも全く無関心である。
化粧に興味がもてない大きな理由は，その目的と評価方は不足で，作品の背景・動機から制作過程を経て完成する

法がわからないからである。いったい化粧は何のためにすまでの時間軸の中でとらえることにより，その作品に作者るのであろうか。例えば，いつも化粧をきちんとしているの訴えたかったものの本質が浮かび上がってくることをし人たちは，この世に自分の他に人間がいなくてもきちんとばしば経験する。同じように，化粧というものを，その人化粧をするであろうか。化粧自体が自己完結的な内 的なの背景・動機から，化粧をし，そして素顔に戻るという時行為となっている一部の少数派を除けば，おそらく多くの間軸の中でとらえるといいのかもしれない。その時間軸の人は化粧はしないのではないだろうか。

中で，化粧によってそこに共に表現されているその人の本

そう考えると，化粧の評価方法というのがある程度見えてくる。化粧というのは，他人に対して自分を表現するた質が浮かび上がってきたとき，化粧というものを本当に理解し，評価できるようになるのかもしれない。

めの手段の１つと考えられる。これは人間にとっての基本− 87 −（北海道大学大学院医学研究科）

平成 12 年度

研究助成

日焼けと教 育本行忠志

本研究では、太陽紫外線類似の紫外線を SCID マウスにところで、太陽紫外線による皮膚がんの発生を述べまし

移植したヒトの皮膚組織に長期にわたり照射したもので、たが、私たちがより気を付けなければならないのは日光角

多くの日光角化症 ( 前がん病変、表皮内がん ) とそれに続化症ではないでしょうか（太陽紫外線による他の害は割愛

く少数の皮膚がんが誘発されました。比較的早期に遺伝子させて頂きます）。小児期の強い日焼けが日光角化症と関変異も見つかっております。

連するとの疫学調査結 を考え合わせると、小児期から過皮膚がんでは p53 遺伝子の変異以外はほとんど報告が度の日焼けを避ける努力を続けることが青年 ､ 老年期の腫ありませんが、幾種類かの遺伝子が多段階的に作用してい瘍のない若々しい皮膚を保つために重要と考えられます

ると考えられます。皮膚がんに対する様々な遺伝子の関与｡「日焼けすれば風邪をひかない」、「小麦色の肌は健康的」を Gine Chip（マイクロアレイ）法等も利用し、追及してなどといった誤った ｢ 定説 ｣ を改め ､ 紫外線の人体への影いく所存です。

響について正しい知識を幼児期や小児期に徹底的に教え込むことが学校教育と同じくらい、あるいは、より重要と思

皮膚は、体の中で最大の免疫器官として感染 ､ 異物等のうのですがいかがでしょうか。

体外の侵入から体を防護していますが、体内に生じた異物

みんなで、この啓蒙の輪をひろげ、小泉首相やマスメデであるがん細胞を排除し、がんの発生を抑制することも知られています。太陽紫外線はこの皮膚の持つ免疫機能をもィアに働きかけてみませんか。

阻害するため、太陽紫外線は DNA 損傷から、細胞のがん

最後に、本研究にあたり多大な御支援を戴きましたコスメ化を誘発するばかりでなく、出現したがん細胞を排除する

トロジー研究振興財団に感謝いたしますとともに貴財団の免疫監視機構を抑制し、よりいっそうがんを発生進展させますますの御発展をお祈り申し上げます。
（大阪大学医学部）るものと思われます。

平成 12 年度

研究助成

Genetic Cosmetology の時代へ
畑

隆一郎

美しくありたいという考えはヒトに備わった本能と考えら

我々が研究対象をしている コラーゲンは我々の身体のれる。心身共に健康であればヒトは美しい。例えば結婚式

中で一番多いタンパク質で全身のタンパク質の１／３を占の花嫁は美しいということがこれを物語っている（見慣れめる。皮膚の表皮を裏打ちし、皮膚の機能を制御しているた我が娘であっても結婚式では美しかった）。逆に老人にのも真皮の主成分であるコラーゲンである。その保湿性か

美しく化粧をすると心身共に若返ると言う事実は、今後のら最近の化粧品にはコラーゲンを添加したものが多いが、高齢化社会における Cosmetology の たすべき役割を示し

表皮から与えるよりは真皮の線維芽細胞を活性化してコラている。

ーゲンの代謝を活発にした方がより効率的と考えられる。

現代医学においては難病の治療に臓器移植、再生医療、我々の研究はこのコラーゲンの遺伝子の発現機構研究であ遺伝子治療が盛んに行われ、マスコミでも話題になっていり、これを明らかにすることにより、将来真皮の線維芽細る。科学技術が進んでこれらの手法が簡単、安全かつ安価胞の遺伝子発現を思うように制御し、十分なコラーゲンをに行えるようになれば、Quality of Life の点からヒトは当合成させ、若々しい肌を作れるのではないかと夢想してい然美しくなるためにもこのような科学技術を応用するようる。私はこのような方法を Genetic Cosmetology と命名になり、現在の美容整形よりも簡単にこれらの手段を用いしたい。

るであろう。

− 88 −（神奈川歯科大学歯学部）

コスメトロジー研究雑感

平成 12 年度

研究助成

くすりと化粧品
中畑則道

ヒトは常に外界の危険にさらされており、最近やウイル

上で、より良い生活を指向したときに使用されるように思スなどの微生物による感染や、複雑な人間関係などから与われる。たとえば、万人の美しくありたいと願う気持ちや、えられるストレスは、時としてヒトを病気に追い込む。こ他人から良く見られたいという願いを表現していく１つのういった病気から健康な身体へ戻す方法の１つにくすりが手段として化粧品があり、ある種の文化としてとらえるこ

あり、くすりとは病気の治療効 を持つもの、あるいは予とも可能である。

防効 を持つものと定義することができる。くすりを物質

化粧品は以前より生体に対する作用を重要視してきた的な側 からとらえると、現在用いられているものの多くが、今後、さらに多種の薬効を有する機能性化粧品が、商は、単一の化合物であるが、漢方薬や民間薬などのように、品開発に新たに道を開いていくように思われる。食品の世

植物の抽出物や鉱物をそのまま用いた多種の化合物を含有界においても機能性を有した食品がブームとなっており、するくすりもある。

くすりと同様な生体機能に影響を与えるような機能性食品

さて、化粧品もヒトに適用する化学物質であり、くすりが多く作られ、人々の支持を得ている。若く、そして美しと類似したところがある。たとえば日焼け止めクリームは

くありたいと願う多くの人々の気持ちに答え、安全でかつその作用として紫外線をカットして、皮膚を守るという薬

機能的な付加価値を有する化粧品を創り出すコスメトロジ

理作用を持っている。しかし、概して言うと、くすりと異ーの更なる発展に期待したい。
（東北大学大学院薬学研究科）

なり化粧品は基本的な生命の維持機構には直接影響を与えることは少なく、むしろ、基本的な生命機構が維持された

平成 12 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
松村和子

遠くクレオパトラの時代から、人間は化粧をしてきまし魅力的になるためとも思えませんし、自分の個性を主張した。化粧の役割は時代とともに変わって、身分をあらわすているとも思えません。皆と同じになろうとするために化ためであったり、
魔よけのためであったりしたそうですが、粧をしているのでしょうか。なんだか表情も同じように思やはり、自分をよりきれいに見せたい，自分のウィークポ

われます。同じような姿かたちの人に会うたびに不思議にイントを隠して、できればチャームポイントにしてしまい

思って考えておりましたが、最近ふと、安心して頼れる心

たいという欲求を満たす手段としての役割をいつの時代でのよりどころがないために、同じような姿をするのではなも担っていると思います。自分のウィークポイントだと思

いかと気づきました。心のよりどころがないウィークポイ

っていたところを心配する必要がないという気持ちがある

ントを同じように化粧をして連帯感をもつ。そう考えると、だけで、たとえ客観的にそれほど差が出ていなくとも、そ化粧は、肉体的、精神的なウィークポイントの他に社会的の人の表情を生き生きとさせてしまいます。特に、性格やなひずみに対して、癒しの手段として役立っているように顔立ちと調和した、その人らしい化粧をしておしゃれして思います。たとえば、茶髪でも、それを自家薬篭中のもの

いる人と話しをする機会に恵まれるとうれしい気持ちになとして個性にしているすてきな人たちも沢山いるのです

ります。しかし、このごろ、一様に同じような化粧をしたが、あえて、色々な人たちが、安心して、個性的な化粧が人たちを見かけることが多くなり、どうも気になります。

できるような、優しい社会が作られていくことを願ってや

ガングロ、茶髪、美白など、流行といってしまえばそれまみません。

でなのですが、皆、同じような姿をしています。他人より− 89 −（北海道大学医学部附属病院）

平成 12 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
大和田
昨年ドイツとの共同研究で 10 ヶ月ほど滞在したドイツ・
ミュンスターのラボは、ドイツ人はもちろんタイ人、カメ

祐二
風物といっても良さそうです。夏の晴天下にスポーツでもすれば彼らの肌はたちどころに火傷してしまいます。

ルーン人、
フィンランド人など国際色豊かな雰囲気でした。

今回の研究で使用したノックアウトマウスを使って、ド各国の気候の違いが個人の性格はもちろん、身なりや生活

イツとの共同研究で紫外線の影響を調べる研究企画が進行

様式に大きな影響をもつことは至極当然であることが実感中です。ディスカッションをしてみると表皮のメラニンができました。無論、気候や肌の色が違えばコスメティック

我々より少ないドイツ人にとっては、紫外線に対する脆弱な嗜好も違ってくることは容易に予想できます。しかし不性と太陽光欲求のパラドクスは結構切実な問題であること

幸にも生来不精な自分には気の利いたコスメトロジー論をが良く理解できます。
今回の研究課題は、これまで神経系の解析を中心に行っ

この場で披露することはできません。
ドイツのミュンスターの緯度は、日本でいえばちょうどてきた自分にとっては全く新しいフィールドであり本当に

樺太の中央にあたります。当然冬ともなれば朝の９時前後

新鮮な知識と感動を得ることができました。これも貴財団に日が昇り、午後４時半には日が暮れてしまいます。気候から研究助成を頂いたのが１つのきっかけと言えます。今も日本に比べれば厳しく、雨や曇りの天気がほとんどで太後は、表皮疾患の病態解明に小さな風穴を開けることがで陽はめったに顔を出しません。小春日和ともなれば、上半

きれば、と考えております。本当にありがとうございまし

身裸で散歩や日光浴をしている風景は北ドイツの典型的なた。

− 90 −（東北大学大学院医学系研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 10 年度

海外派遣助成慢性疲労症候群における自己抗体の研究
SLE における抗 MAP2 抗体の研究
名古屋大学大学院医学研究科生化学第２講座

杉浦一充

私はコスメトロジー研究振興財団の海外交流助成をいた

性疲労症候群に新規自己抗体はあるか検索しました。ヒス

だいて米国スクリプス研究所の分子実験医学の自己免疫セトンＨ 1 に対する抗体とヒストンＨ 3 に対する自己抗体

ンターの Tan 教授の下で慢性疲労症候群患者における自が５割以上の確率で見られました。また神経特異的な蛋

己抗体の研究と SLE における抗 MAP2 抗体の研究を３年白である MAP2 に対する自己抗体を世界で始めて発見し、間おこないました。慢性疲労症候群（CFS）とは、これま

SLE の２割にこの抗体が見られることが分かりました。

で健康に生活していた人に原因不明の強い全身倦怠感、微以上の結 は平成 13 年１月にシアトルで行われた第５回国熱、頭痛、脱力感や、思考力の障害、抑うつ等の精神神経

際慢性疲労症候群学会にて報告し、論文を投稿中です。

症状などが起こり、この状態が長期にわたって続くため、今日、皮膚の病気の原因も多くのものが分子生物学的手健全な社会生活が送れなくなるという病態です。慢性疲労法で解明されることが期待されます。自己免疫の関与して症候群では接触性皮膚炎が高頻度に見られます。SLE はいる皮膚を障害する疾患の病理を分子生物学的手法でひも膠原病の１つで顔 に蝶型紅斑という特徴的な皮疹がみら解いていくことが私のこれからの仕事であると考えていま

れ神経、腎臓、肺等全身の臓器に障害を引き起こします。

す。
今回の留学に際し御助成をいただいたコスメトロジー研ワシントン大学、ハーバード大学、ケンブリッジ大学から約 300 人の患者血清をいただき、100 人の健常者血清と比究振興財団に感謝いたします。

較して既知の自己抗体がどの程度に存在するか、また、慢平成 13 年度

外国人招聘助成

メラノサイトの分化制御機構の解明
招聘研究者：英国

聖ジョージ医科大学病院教授

受入責任者：東北大学大学院医学系研究科教授

Dorothy C. Bennett
柴原 茂樹

去る平成 13 年 12 月１日㈯と２日㈰の両日にわたり第色素細胞研究は今後益々重要になると考えます。

15 回日本色素細胞学会年次学術大会を仙台にて開催させ

今大会初日に招待講演として、メラノサイトの分化研ていただきました。日本色素細胞学会は会員数約 250 人の究でご活躍の Dorothy C. Bennett 先生（ロンドン、聖ジョ

小さな学会（会長：溝口昌子・聖マリアンナ医科大学皮膚ージ医科大学病院教授）がお話しされました。彼女は研究科教授）ですが、会員の専門は化学、生物学、分子生物学、の一環として貴重なメラノサイト系の細胞株を多数樹立し遺伝学、皮膚科学、眼科学、耳鼻科学など多岐にわたってたことでも知られています。特に、マウスメラノサイト株います。３年ごとに開催される国際色素細胞学会が日本国（melan-a や melan-c など）は世界中の研究者に広く利用さ内で開催される年を除き、年次学術大会は毎年開催され、れ、我々の研究の発展に寄与しています。最近では、メラ

色素細胞あるいはメラニン形成に関する最新の研究成 をノサイトの細胞内小器官であるメラノソームの形成と輸送

発表し、活発な議論を展開する場となっています。各分野に関する研究も展開しており、世界的に注目されています。

の研究者が一堂に会し議論するという醍醐味を満喫できる

Bennett 先生の来日に際し、コスメトロジー研究振興財学会です。色素細胞研究は、美白、日焼け、毛包の維持（白団には多大なご支援（国際交流助成）を賜り、深く感謝い髪、脱毛）、網膜変性疾患（先進国における最も多い失明たしております。雑感文というご要望でしたが、報告書もの原因）、老人性難聴などの身近な問題から悪性黒色腫のどきの拙文にて御礼の言葉とさせていただきました。貴財

治療など幅広い領域を包含しています。
高齢化社会を迎え、団のさらなるご発展をお祈り申し上げます。

− 91 −

平成 13 年度

外国人招聘助成

プロスタグランジンおよびロイコトリエン生合成酵素の分子構造と機能「LTC4 合成酵素（LTCS）」
招聘研究者：米国

ハーバード大学医学部免疫学部門副教授

受入責任者：昭和大学薬学部教授

工藤Bing K. Lam

一郎

私が炎症・アレルギーの生化学を専門に研究を始めたのなりシビアにやり合っている。先日、最近まで共同研究をは、厳しかったアメリカ留学から帰国してからなので、すしていたはずの２人のアメリカ人教授から、それぞれ 個に、でに 20 年以上前のことである。生体内でアラキドン酸（炭

相手方の悪口を言いつつ当方との共同研究を提案された。

素数 20、不飽和結合４の不飽和脂肪酸）を材料として生産

正直、対応に困った。

される生理活性脂質に注目して研究を続けている。アスピ

LAM 博士は強力な炎症メディエーターであるロイコト

リンの解熱鎮痛作用は、アラキドン酸からプロスタグラン

リエン C4 の生合成酵素の専門家である。第 74 回日本生ジン H2 と呼ばれる、数種の生理活性脂質が生合成される

化学会大会で講演をしてもらい、広く日本の研究者と交流ための共 中間体の合成酵素の抑制で説明できる。この事実を深めてもらうために、今回来日を依頼した。現在、ロイから明らかなように、私の専門は、製薬会社が大いに興味

コトリエン C4 の受容体拮抗薬が気管支喘息に臨床応用さを持つ。基礎研究をすぐに実用化できそうな魅力を感じされていることから、彼の専門的知識が皮膚疾患を含めて広せる分野である。そのため、幸か不幸か日本国内をはじめ

くアレルギーに応用可能であると判断し、本財団で招聘しとして、世界中に多数の手ごわい研究の競争相手がおられていただくこととした。LAM 博士はホンコンのご出身で、る。それぞれ少しずつ観点を変えて、互いの領分を侵さなアメリカで学 を取った後、免疫アレルギーの大家であるハ

いように配慮しつつ紳士的にお付き合いをしているつもりーバード大学のオースチン教授のグループにポストドクト

であるが、ややもするとニアミスをする。結 として、同一

ラルフェローとして参加された。その後、引き続き副教授の酵素について全く異なった見解を持つこともある。学会として、ハーバード大学で一流の研究成 を出し続けている。

場でやり合うことになる。国内の学会では、それでもなん

LAM 博士は、若い頃の自分自身を含めて多くの日本人とかなる。しかし、国際会議の場合、どうしてもオーバー研究者ができなかったことをした。つまり、彼は米国へのカムできない語学のハンディがゆえに、悔しい思いをする。

永住を決心した東洋出身の研究者であり、現在まで恵まれ「データ勝負では勝っているし論文はこちらが先」「我々がた環境で楽しそうに研究を続けておられる。ホンコンと日数年前から言っていることをやっとアメリカのグループが本の事情の違いが、もちろんあったのかもしれない。いず

最近になって言い出した」などなど、当人以外には言い訳

れにしろ、憧れに似た敬意を彼に感じながら、彼との会話にしか聞こえない愚痴をこぼすことになる。外国人研究者を楽しんだ。

同士でもまた、一見仲がよさそうに見えても、本音ではか− 92 −

− 94 −事業報告書事 業 報 告 書
（自平成 13 年４月１日

至平成 14 年３月 31 日）《研究助成等の選考関連》
2001 5

7

公募開始

全国 253 ヶ所の大学・病院・研究機関等、関係学術雑誌８誌、
当財団 HP、薬学会 HP に掲載

7

6

公募締切り

応募数 72 件

9

3

選考委員会（分科会３） 精神、文化に関する分野の選考

9

5

選考委員会（分科会１） 素材、物性に関する分野の選考

9

14

選考委員会（分科会２） 生体作用、安全性に関する分野の選考

921

本選考委員会

各分科会の結 を総合的に判断して研究助成 21 課題、国際交流援助３課題を選考

11

19

表彰贈呈式

記念講演：｢ 美人研究 ｣国際日本文化研究センター

2002

井上章一氏

11

19 〜

助成課題の公表

関係学術雑誌 7 誌、当財団 HP に掲載

2中旬

持回り企画委員会

平成 14 年度の研究助成課題選考方針に関して

常理事会

平成 12 年度事業報告及び収支決算報告、株主としての議決権《理事会関連》
620

行使について、報告事項
11

19

常理事会

平成 13 年度（第 12 回）研究助成者等の承認、
平成 14 年度事業計画及び予算案、選考委員の選任

2002 1

25

臨時理事会

基本財産の運用（ペイオフ対応）に関して《評議員会関連》
6

20

常評議員会

平成 12 年度事業報告及び収支決算報告、報告事項

11

19

常評議員会

平成 13 年度（第 12 回）研究助成者等の承認、
平成 14 年度事業計画及び予算案《その他》
2001 9コスメトロジー研究報告 「コスメトロジー研究報告」の創刊号から 9 号までを、国会図書館ほか大学図書館数館に寄贈

11
12

20

基本財産関連保有株式が無償分割により 728,353 株から 874,023 株へ

財団活動の情報開示改善 当財団 HP へ会計・事業報告を掲載− 95 −

第 12 回 研究助成を受けられたかたがた
管理番号

研

究

課

題

分

（J：一般研究助成

H：国際交流援助）

野

研

代

表

究

者

J-01-01

日本における「×メーク」* の伝統性に関する研究
視覚と知覚
千歳科学技術大学光科学部助教授−起源と大衆文化への波及−
顔と固有文化
Johnathon John*（極端な化粧、Extreme make-upの意） デコレーションとディスプレー

J-01-02

脂質−高分子界面活性剤混合系による新規分散系
液晶エマルション の形成

界面化学

J-01-03

接着分子シグナルを利用した皮膚老化防止の新戦略

生化学
細胞生物学
皮膚科学

J-01-04

発生再生の分子メカニズムを応用した人工皮膚作製

分子生物学

J-01-05

紫外線防御因子メタロチオネインのヒノキチオール
による合成誘導とその意義

分子毒性学
生化学

J-01-06

日本の化粧意識の近代化をめぐる比較史的考察

生活文化学

J-01-07

ナノ構造配列制御を基盤とする光学活性材料の開発

高分子化学
有機合成化学J-01-08

接触皮膚炎へのp38mitogen-activated protein kinaseの関与機構の解明

分子細胞生物学

千葉大学大学院医学研究院
助教授

J-01-09

再構築機能を有する新規の粘土材料の作製とその吸着特性

無機材料化学

東京工業大学大学院
理工学研究科助手

J-01-10

光で透過制御可能な人工ベシクルを形成する新規多鎖型両親媒性化合物の開発

有機工業化学
界面化学
有機合成化学J-01-11

顔の魅力を規定する要因の実験計量心理学的分析

実験計量心理学

J-01-12

Wntシグナルによるメラニン産生の制御機構の解析

分子生物学

J-01-13

カンキツ精油の有する生体作用の生化学的解析

生化学
食品化学

高知大学農学部助教授

J-01-14皮膚の老化による型コラーゲンの代謝及び遺伝子
発現調節機構について

皮膚科学
分子生物学

弘前大学医学部附属病院講師

J-01-15

皮膚の水チャネルの保水性への役割の解明− 96 −

皮膚の水電解質代謝

京都大学大学院薬学研究科助手

中

野

実

群馬大学生体調節研究所
附属生理活性物質センター教授

的

崎

尚

秋田大学医学部教授

杉

山

俊

博

東北大学大学院薬学研究科教授

永

沼

章

奈良女子大学生活環境学部
専任講師

鈴

木

則

子

山口大学工学部助手

鬼村

粕
亀

謙二郎

谷
島

善
欣

俊
一

大阪大学大学院工学研究科助教授

中

辻

洋

司

東北大学大学院文学研究科助教授

行

場

次

朗

東北大学大学院医学系研究科助手

武
受

田
田

和
浩

今

久
之
淳

自治医科大学講師

石

橋

賢

一

事業報告書

管理番号

研

究

課

題

分

野

代

表

研

究

者

京都大学大学院薬学研究科教授

J-01-16

皮膚表皮細胞への生理活性タンパク遺伝子のデリバ
リーと分泌方向性の制御

遺伝子治療
ドラッグデリバリーシステム

J-01-17

かみ合わせのずれが大きく笑った顔貌の非対称性に
及ぼす影響

審美歯科学
咬合学

大阪大学歯学部附属病院講師

J-01-18

アトピー女性の自尊感情の向上を目指したスキンケ
アと集団認知行動療法の開発

臨床心理学
健康心理学

宮崎大学教育文化学部専任講師

J-01-19

早老性疾患遺伝子による皮膚線維芽細胞の老化とテ
ロメア制御

分子生物学
放射線生物学J-01-20

痴呆高齢者の表情分析と主観的Quality of Lifeの評価手法に関する研究

老人看護学
老年学

J-01-21

独自のチタン反応を利用する、ムスク・ジャスミン
系高級香料の実用的化学合成

有機合成化学H-01-01

スキンケア製品を目的としたリポソームの調製とそ
の物性評価

高
中
富

倉
村
家

喜
隆
直

信
志
明

広島大学原爆放射能医学研究所
教授

小

松

賢

志

浜松医科大学医学部助教授

鈴木

みずえ

関西学院大学理学部教授

田

辺

陽

タイ・チェンマイ大学薬学部助教授
薬学

Yanee Pongpaibul

受入責任者
東京理科大学理工学部教授

阿

部

正

彦

聖ジョージ医科大学病院教授
H-01-02

メラノサイトの分化制御機構の解明

細胞生物学

Dorothy C. Bennett

受入責任者
東北大学大学院医学系研究科教授

柴

原

茂

樹

ハーバード大学医学部免疫学部門助教授
H-01-03

プロスタグランジンおよびロイコトリエン生合成酵
素の分子構造と機能「LTC4合成酵素（LTCS）」

生化学

Bing K. Lam

受入責任者
昭和大学薬学部教授

工

藤

一

郎

（敬称略・受付順）※第１回〜11回の研究助成課題はホームページ（http://www.cosmetology.or.jp/）でご覧下さい。

− 97 −

役

員
平成 14 年 3 月 31 日現在

理事長

小林禮次郎

専務理事
（常勤） 有本亨
律男㈱コーセー代表取締役会長（元厚生省薬務局安全課長）

理

事

磯邊

㈱博報堂相談役（元国税庁長官）

理

事

宇佐美昭次

早稲田大学理工学部教授

理

事

内山

充

㈶日本薬剤師研修センター理事長

理

事

小林

保清

㈱コーセー代表取締役社長

理

事

菅原

正文

高砂香料工業㈱相談役

理

事

髙橋

久

理

事

西川

武二

慶應義塾大学医学部教授

理

事

花輪

隆昭

昭和館 館長（元厚生省援護局長）

理

事

廣部

雅昭

静岡県立大学学長

理

事

牧野

利孝

日本化粧品工業連合会専務理事

帝京大学名誉教授（元厚生省生活衛生局食品化学課長）
監

事

小田倉正典

公認会計士

監

事

黒田

節哉

弁護士

評議員

上野

芳夫

東京理科大学薬学部教授

評議員

緒方

宏泰

明治薬科大学教授

評議員

北原

文雄

東京理科大学名誉教授

評議員

近藤

保

東京理科大学名誉教授

評議員

齊藤

勲

㈳東京医薬品工業協会理事長（元厚生省大臣官房審議官）

評議員

長野

哲雄

東京大学薬学部教授

評議員

西岡

清

評議員

野田

裕充

評議員

野呂 影勇

早稲田大学大学院人間科学研究科教授

評議員

福内

靖男

慶應義塾大学医学部教授

評議員

溝口 昌子

聖マリアンナ医科大学教授

評議員

宮

榮三

千歳科学技術大学教授

評議員

山崎

幹夫

千葉大学名誉教授

評議員

渡辺

徹

東京医科歯科大学医学部教授㈱コーセー常務取締役

元厚生省薬務局審査第二課長（専務理事以外は全員非常勤）− 98 −