老化抑制遺伝子 klotho の結合織細胞老化における病態生理学的意義の解明と治療法開発への応用
１）東京大学医学部循環器内科

２）群馬大学医学部第二内科

永 井 良 三１）、須賀達夫２）、山洞善恒２）、倉 林 正 彦２）
Homozygous mutant klotho（KL-/-）mice exhibit multiple phenotypes resembling human aging. In the present study, we focusedon examining the pathology of the lungs of klotho mice and found that it closely resembled pulmonary emphysema in humans
both histologically and functionally. Histology of the lung of KL-/- mice was indistinguishable from those of wild-type littermates
up to 2 wk of age. The first histological changes appeared at 4 wk of age, showing enlargement of the air spaces accompanied bydestruction of the alveolar walls, and progressed gradually with age. In addition to these changes, we observed calcium deposits intype I collagen fibers in alveolar septa and degeneration of type II pneumocytes in 8- to 10-week-old KL-/- mice. Pulmonary function
tests revealed prolonged expiration time in KL-/- mice, which is comparable with the pathophysiology of pulmonary emphysema.
The expression level of messenger RNA for type IV collagen, surfactant protein-A was significantly increased in KL-/- mice, which
may represent a compensatory response to alveolar destruction. The starvation of human lung fibroblast cells（MRC-5）for 96
hours decreased their 3H-thymidine uptake up to 75%. The transfection of the klotho gene into MRC-5 cells using adenovirus vector,
however, prevented their decline in 3H-thymidine uptake. These results implied that connective tissue including fibroblasts played
an important role in the pathogensis of pulmonary emphysema in KL-/- lung.

１

緒化を早期に表現する。

言

肺は皮膚と同様に、直接外気と接し、しかも結合織の老現在、日本は高齢社会へと急速に変貌しつつある。個体化が肺胞破壊（肺気腫）として形態的・機能的に敏感に反の老化機構の解明は、医学的のみならず社会学的にも最も映されうる臓器である。そこで、本研究では klotho 遺伝

重要な課題のひとつとなっている。個体の老化は、全身の子欠損マウスにおける肺の変化を生理学的、形態学的にま諸臓器における老化のインテグレーションとも考えられるず検討した。次に、肺培養線維芽細胞にアデノウィルスベ

が、各臓器の老化はある程度、歩調を合わせて進行するのクターを用いて klotho 遺伝子を導入し、導入前後の細胞が普通である。この臓器間の老化の同時進行性には結合織増殖能の変化を観察した。

が深く関与していると考えられる。なぜなら、線維芽細胞

２をはじめとする結合織細胞は、全身臓器に遍く存在し、形態の維持ばかりでなく、器官形成、炎症、創傷治癒機転な

2.1

実

験

klotho 遺伝子欠損マウス肺の容積測定

どにおいて中心的な役割を果たしているからである。した肺気腫では気管支を外側に引っ張る elastic recoil の力

がって、個体老化機構の解明には、結合織細胞の老化を細が減少するため、胸腔内が陽圧になる呼気時に気道は狭窄・

胞生物学的に解明することが不可欠である。

閉塞してしまう。そのため air trapping が起き、肺は過膨

我々は黒尾・鍋島らと共同で、個体老化に密接に関わる
klotho という新規遺伝子を発見した（１）。klotho 遺伝子は張所見を呈する。そこで、klotho 遺伝子欠損マウスの肺容積を測定し、過膨張所見があるか否かを検討した。
、
対象は 6 − 8 週令の klotho 遺伝子ホモ欠損マウス（KL-/-）

分子量が約 14 kDa で、β-glucosidase と 40％のホモロジー
を示す膜蛋白または分泌蛋白をコードする。klotho 遺伝子、野klotho 遺伝子ヘテロ欠損マウス（以下 KL +/- と記載）

ホモ欠損マウス（以下 KL -/- と記載）は、寿命の短縮、動生型マウス（以下 KL +/+ と記載）を用いた。マウスをウレ

脈硬化、異所性石灰化、骨粗鬆症、皮膚真皮層の菲薄化、タンで麻酔後、脱血屠殺した。気管内に４% パラフォルム

皮下脂肪層の消失、脱毛などヒト老化に見られる多彩な変アルデヒドを20 cm 水柱の一定圧で 24 時間注入し、肺を進展固定した。進展固定後の肺を水没させ、肺容積を測定しBiological Role of Klotho Protein in
Ageing of Connective Tissue and Its
Therapeutic Application to Skin Diseases
Ryozo Nagai １）, Tatsuo Suga ２）,

た。

2.2

Yoshichika Sando ２）,
Masahiko Kurabayashi ２）＊

klotho 遺伝子欠損マウス肺の組織学的検討

対象は 2、4、8 − 10 週令の KL-/-、KL+/+ である。2 . 1 と＊同様の方法で肺の進展固定を行った。進展固定した肺標本

１）The Department of Cardiovascular
Medicine, Graduate School of Medicine,
University of Tokyo
２）The Second Department of Internal
Medicine, Gunma University, School of
Medicineはパラフィンに包埋し、4 µm の厚さの切片を作成、ヘマト
キシリン・エオジン染色を施した。また、連続切片にコッ
サ染色を行い、石灰化病変を確認した。肺胞の破壊の程度の指標である Destructive index（D.I.）を Saetta らの方法（２）− 59 −

に準じて計算した。さらに、隣接する肺胞間の平均距離でcitrate（SSC）（0 . 15 M NaCl and 0 . 015 M sodium citrate,

ある Mean linear intercept を計測し、肺胞腔の拡大の程pH 7 . 0）/ 0 . 1 ％ SDS で 二 度 室 温 で 10 分 間 洗 浄 し た 後、度を評価した（３）。

0.1× SSC/0.1％ SDSで二度 42℃で 10 分間洗浄し、Kodak
XR film に− 80℃で 48 時間オートラジオグラフィーを行った。

2.3 klotho 遺伝子欠損マウス肺の電子顕微鏡による検討
８週令の KL -/- と KL +/+ を対象とした。サンプル肺は４2.6 線維芽細胞への klotho遺伝子導入による細胞増殖の変化℃の２％グルタールアルデヒドで前固定を、室温の１％オ

klotho 遺伝子が線維芽細胞の増殖能に及ぼす影響につい

スミウム酸で後固定を行った。緩衝液で洗浄後、エタノーて検討した。klotho 遺伝子の発現が予め確認されているヒルで脱水し、エポキシレジンに包埋した。厚さ 60 nm の超ト肺線維芽細胞（MRC- 5）に、adenovirus vector を用い薄切片を作成し、酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色をして klotho 遺伝子または LacZ 遺伝子を導入・過剰発現させた後に電子顕微鏡で観察した。

た。 導 入 24 時 間 後 よ り 飢 餓 状 態 と し、96 時 間 後 に
3

2.4

klotho 遺伝子欠損マウスの肺機能検査

H-Thymidine 取り込みを測定し、klotho 遺伝子導入群、

LacZ 遺伝子導入群、コントロール群で比較した。

6 − 8 週令の KL -/-、KL +/-、KL +/+ を対象とし、ウレタン（1 . 5 g/kg）を腹腔内注射した麻酔状態で自発呼吸下に

2.7

統計処理

肺機能を測定した。すなわち、短いポリエチレン製チュー

各測定値は、平均 ± 標準偏差の形式で記載した。また

ブを気管内に挿入し、Lilley 型ニューモタコグラフ（日本

群間の有意差の検出には analysis of variance（ANOVA）

光電社製 TV- 241 T と TP- 602 T）を用いて呼吸気流を測分析を用いた。

定した。胸腔内圧は下部食道内圧を代用し、肺容積はコン３ピュータを用いて気流を電気的に積算し求めた（４, ５）。実
験中のマウス体温は 37℃の一定に保ち、呼吸状態が 10 分

3.1

結

果

klotho 遺伝子欠損マウス肺の容積以上安定するのを待って、呼吸回数、一回換気量、分時換

6 − 8 週令における KL-/-、KL+/-、KL+/+ の平均体長はそ

気量、呼気時間、動的コンプライアンス、総肺抵抗を測定

れぞれ、68 . 3 ± 4 . 7 mm、91 . 8 ± 2 . 4 mm、91 . 5 ± 1 . 0 mm で、した。動脈血液ガス分析も併せて行った。

。KL-/-、
KL-/- は他に比べ有意に体長が短かった（ｐ < 0 . 05）
KL +/-、KL +/+ の 平 均 肺 容 積 は そ れ ぞ れ、703 ± 306 µL、

2.5

klotho 遺伝子欠損マウス肺における肺気腫関連653 ± 180 µL、663 ± 122 µL で３群間に有意差はなかった。

遺伝子の発現状況の検討したがって、KL-/- は KL+/-、KL+/+ に比較し体長が短いに

7 − 9 週令の KL-/-、KL+/-、KL+/+ 肺における以下の遺伝もかかわらず肺容積は不変で、KL -/- 肺は過膨張状態である子の発現をノーザンブロット法により検討した。これらはと推測された。

いずれも肺気腫発症と関連すると考えられている遺伝子である；マンガン superoxide dismutase（Mn-SOD）、グル

3.2

klotho 遺伝子欠損マウス肺の組織変化

タチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、transforming

生後 2 週では KL-/- の肺（Fig. 1 A）は KL+/+ の肺（Fig. 1 B）

growth factor-beta 1（TGF-β 1）、Early growth resonse- 1と組織学的に全く区別不能であった。肺胞破壊の程度を指（Egr-1）、Ⅳ型コラーゲン、サーファクタント蛋白 A（SP-A）、

標する Destructive index（D.I.）にも差がなかった（KL-/-

specificity protein 1（Sp 1）。すなわち、標本肺より全。しかし生後４週になると
1 . 7 ± 0 . 8 vs. KL+/+ 1 . 5 ± 0 . 8）RNA（ribonucleic acid）を抽出し、１レーンあたり 20 µg

KL -/- 肺は肺胞腔の拡大と肺胞壁の破壊所見が認められるの RNA をホルムアルデヒド−１％アガロースゲルで電気ようになった（Fig. 1 C）
。この週令における KL -/- の D.I.

泳動し、ナイロンメンブレン（Hybond-N; Amersham,Arlington（12 . 0 ± 1 . 5）は、KL +/+（2 . 7 ± 0 . 5）に比べ有意に大きかHeights, IL）に転写し、紫外線固定した。18S と 28S リボソームった。明らかな炎症細胞浸潤や間質の線維化の所見は認めRNA をメチレンブルーで染色し、RNA の量と質を評価した。

ず、４週令の KL -/- の肺は組織学的に肺気腫と診断できた。

メンブレン は 50 ％ ホ ル ム ア ミ ド、5 ×saline sodium

8 − 10 週齢になると KL -/- 肺の気腫性変化は更に進行し、

phosphate ethylenediaminetetraacetic acid、10 ×

肺胞壁の石灰化所見も認められるようになった（Fig. 1 D）。

Denhardt's solution、１％ sodium dodecyl sulfate（SDS）、

肺胞腔の拡大の指標である Mean linear intercept は、８0 . 1 mg/mL herring sperm DNA を含む液でプレハイブリ

週 令 の KL -/- で は 104 . 8 ± 28 . 1 µm で あ り、 同 週 令 のダイズした後、[ 32 P]deoxycytidine triphosphate（dCTP）

KL +/+ の 58 . 3 ± 24 . 2 µm と比較して有意に大きかった。

（Amersham）でラベルした DNA プローブで 42℃で 20

KL +/+ 肺の組織像は生後 2 週、4 週、8 − 10 週の間で大き

時間ハイブリダイズした。メンブレンは２×saline sodium

な変化は無かった。

− 60 −

老化抑制遺伝子 klotho の結合織細胞老化における病態生理学的意義の解明と治療法開発への応用

3.3

klotho 遺伝子欠損マウスの電子顕微鏡像

8 週令の KL

3.4

klotho 遺伝子欠損マウスの肺機能

肺の電子顕微鏡による観察では、肺胞壁

6 〜 8 週齡のマウスの肺機能解析結果を Table 1 にまとのⅠ型膠原線維へのカルシウム沈着を認めたが（Fig. ２）、

めた。KL -/- では呼気時間（Te）の延長（p< 0 . 01）と動肺

肺胞基底膜の主要構成成分であるⅣ型膠原線維には異常をコンプライアンス（Ctb）の増大傾向（p = 0 . 09）を認めた。

認めなかった。また、いくつかのⅡ型肺胞上皮細胞の変性

KL-/- の一回換気量（TV）は KL+/+ の TV より小さかった所見を認めた。８週令の KL +/+ 肺では明らかな電顕的異が（p < 0 . 01）、呼吸数や、体重あたりの分時換気量（Ve）

常を認めなかった。

には KL -/- と KL +/+ の間に差を認めなかった。KL -/- マウ-/-スの動脈血ガス所見は WT マウスと差を認めず、酸素分圧の低下も二酸化炭素分圧の上昇もみられない。したがって、KL-/- マウスの直接死因は呼吸不全とは考えにくい。

3.5

klotho 遺伝子欠損マウス肺における肺気腫関連遺伝子の発現状況
すでに著明な肺気腫が認められる 7 〜 9 週齢の KL -/- マ

Fig.1
A 生後 2 週の KL-/- 肺（ヘマトキシリン・エオジン染色）
B 生後 2 週の KL+/+ 肺（ヘマトキシリン・エオジン染色）
C 生後 4 週の KL-/- 肺（ヘマトキシリン・エオジン染色）
D 生後 10 週の KL-/- 肺（ヘマトキシリン・エオジン染色、
右上挿入図は Kossa 染色（強拡大））
２週令では KL -/-、KL +/+ とも肺胞の破壊は認められない。しかし 4 週令になると KL -/- 肺には肺胞壁の破壊と気腔の拡大を認めた。10 週齢の KL -/- 肺は気腫性変化が更に進行性し、肺胞壁の石灰化も認めた。（石灰化は Kossa 染色で黒色に染色される）（Scale bar=100μm）

Fig.2 ８週令の KL-/- 肺の電子顕微鏡 真肺胞壁のⅠ型膠原線維へのカルシウム沈着を認めた（矢印）（Scale bar=1μm）

Table 1 ６〜８週令のマウスの肺機能検査所見
KL-/- マウスでは呼気時間（Te）の延長所見と動肺コンプライアンス（Ctb）の増加傾向を認めた。

− 61 −

ウスの肺における Mn-SOD、グルタチオンペルオキシダ

は生後約 3 週までは野生型マウス（KL +/+）と同様に発育ーゼ、カタラーゼ、TGF-β1、Egr- 1 の mRNA 発現は、するが、以後発育が停止し、平均寿命は 60 日で非常に短WT マウスと差を認めなかったが、基底膜の構成成分であ命である。加えて、生後 3 〜 4 週頃より動脈硬化、異所性るⅣ型コラーゲンと SP-A の mRNA 発現が増加していた

石灰化、骨粗鬆症、皮膚の萎縮、性腺の萎縮などが出現する。

（Fig. ３）
。反対に転写因子 Sp 1 の発現は明らかに減少しklotho 遺伝子は分子量が約 14 kDa で、β-glucosidase と 40ていた。

％のホモロジーを示す膜蛋白または分泌蛋白をコードしている。その発現は主に腎と脳に限局し、肺での発現は認め

3.6

線維芽細胞への klotho 遺伝子導入による細胞増られていない。

殖の変化

肺気腫は高齢者の慢性呼吸不全・死亡の主要原因であり、非飢餓状態における 3 H-Thymidine 取り込みは、コント

社会の高齢化に伴いその重要性は増している。医学的には肺ロール群、LacZ 遺伝子導入群、klotho 遺伝子導入群で差気腫は、肺胞壁が破壊された結果末梢気腔が病的に拡張するを認めなかった。飢餓状態 96 時間後の H-Thymidine 取疾患で明らかな肺線維化は伴わないと定義されている（６）。

り込みは、コントロール群では非飢餓状態の約 25％に減軽い肺障害では肺胞上皮の変性・脱落が生じるものの肺胞少した。この H-Thymidine 取り込みを１とした場合、壁の修復は可能であるが、肺胞基底膜などの結合織が障害

LacZ 遺伝子導入群では 0 . 8 ± 0 . 3 と差を認めなかったが、される強い肺傷害では、肺胞壁の修復は最早不可能となり、

klotho 遺伝子導入群では 2 . 5 ± 0 . 3 と有意に取り込みが多肺胞壁は破壊され末梢気腔の病的な拡張が出現する。一般

かった。この値は非飢餓状態の約 80％に相当することかには、過度の喫煙が肺胞壁破壊の原因であり（７）、非喫煙

ら、klotho 遺伝子導入が飢餓状態による細胞増殖能の低下

者における肺気腫の発症は例外的である（８）。

33

今回の組織学的検討から、生後４週以降の KL -/- 肺は肺を抑制している可能性が示唆された。

４

考

胞壁破壊と末梢気腔の拡大を明らかに認め、肺気腫の発症

察が確認された。また、生理学的にも肺気腫に矛盾しない肺老化抑制遺伝子 klotho のホモ欠損マウスに肺気腫の発機能検査結果であった。すなわち、KL -/- は呼気時間の延症を確認した。肺気腫は肺結合織の不可逆的な損傷により長と動肺コンプライアンスの上昇を認めた。しかしながら、生じると考えられること、また、klotho 遺伝子の強制発現

動脈血ガス分析では明らかな酸素分圧や二酸化炭素分圧のは飢餓による肺線維芽細胞の細胞増殖能低下を抑制するこ異常を認めず、KL -/- の寿命短縮は呼吸不全以外の原因にとから、klotho は結合織細胞の老化抑制に重要な役割を果よるものと考えられた。
KL -/- 肺の電子顕微鏡による検討では、肺胞壁のⅠ型コたしていると考えられた。
klotho 遺伝子は我々が黒尾・鍋島らと共同で発見した新ラーゲン線維への石灰沈着とⅡ型肺胞上皮細胞の変性の所（１）。klotho 遺伝子をただ一つ見が得られた。Ⅱ型肺胞上皮細胞は、障害された肺胞の修だけ欠損したマウスは、ヒトの老化に類似した多彩な兆候

復に中心的な役割をすることが明らかにされており（９）、を呈する。すなわち klotho 遺伝子ホモ欠損マウス（KL-/-）

Ⅱ型肺胞上皮細胞の変性は KL -/- における肺修復機能の減

しい老化抑制遺伝子である

弱の可能性を示唆した。
すでに肺気腫が認められる 7 〜 9 週令の KL -/- 肺における遺伝子発現の検討では、基底膜の構成成分であるⅣ型コ
ラーゲンと SP-A の mRNA が著明に増加していた。この二つの蛋白は肺損傷に対し防御的に作用するため（９, 10）、
これらの遺伝子発現の増加は肺損傷に対する代償的反応であると推測された。また、Ⅳ型コラーゲンと SP-A 遺伝子のプロモーター領域には両遺伝子の発現を促進する多数のSp 1 結合部位を有している（11 , 12）。しかし、KL -/- 肺における Sp 1 遺伝子の発現は減少していたため、KL -/- 肺におけるⅣ型コラーゲンと SP- Ａの遺伝子発現増強は Sp 1 以外の経路を介して行われると考えられた。
Fig.3 ７〜９週令のマウス肺における Northern blot 解析
この週令の KL -/- 肺にはすでには著しい気腫性変化が認められる。KL-/- 肺ではⅣ型コラーゲンとサーファクタント蛋白のmRNA 発現の増加を認めた。

klotho 遺 伝 子 の 導 入 は、 飢 餓 に よ る 線 維 芽 細 胞 の3H-Thymidine 取り込み減少を抑制した。したがって KL-/-における肺気腫発症には、線維芽細胞をはじめとする結合織細胞の機能障害が関与している可能性がある。しかし、− 62 −

老化抑制遺伝子 klotho の結合織細胞老化における病態生理学的意義の解明と治療法開発への応用

ヒト肺気腫における結合織細胞の関与についてはいまだ明らかでなく、今後の検討課題である。

５

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の発現が増強しており、これは Sp 1 以外の経路を介して

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維芽細胞の 3 H-Thymidine 取り込み減少を抑制したことか

Rev Med 1989 ; 40 ( 411 ) : 411 - 29 .

ら、KL

-/-

における肺気腫発症には、線維芽細胞をはじめ

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