【研究報告】（自然科学部門）

腸内細菌の情報を生体内で伝達する細胞間コミュニケーション

園

山

北海道大学大学院農学研究院
緒慶准教授

材料および方法

言

実験動物

腸内細菌叢は宿主の生理に影響をおよぼすとともに、さまざまな疾患の発症・進展に関与する。筆者らはこれ

C57BL/6 マ ウ ス（雌 性、5 週 齢） を 精 製 飼 料（AIN-までに、腸内細菌叢の改変によってアレルギーや肥満な93G）で馴化後、実験 1 では精製飼料にフラクトオリゴどの疾患が予防できる可能性を動物実験によって示して糖を 6％添加した飼料あるいは無添加試料を 4 週間自由きた。例えば、難消化性オリゴ糖を摂取したマウスでは、腸内細菌叢の構成が変化するとともに、アトピー性皮膚炎（I 型アレルギー）や接触皮膚炎（IV 型アレルギー）などの症状が抑制されることを観察した 1 6）。ま–た、乳酸菌株

No. 14 を肥満マウスに投与することにより、脂肪組織の増大が抑制されると同時に脂肪組織の炎症およびインスリン感受性が改善されることを示した 7, 8）。これらの知見は、難消化性オリゴ糖はアレルギーを抑制するプレバイオティクスであり、No. 14 株はメタボリックシンドロームを抑制するプロバイオティクスであることを示唆している。しかしながら、これらの細胞・分子メカニズムはいまだ明らかになっていない。
ところで、エキソソームは、さまざまな細胞が細胞外へ分泌する直径 50–100 nm の脂質二重膜で覆われた小胞で、その膜には接着分子やサイトカイン受容体などのタンパクが存在し、また内部にもさまざまなタンパクならびに mRNA および miRNA などの遺伝物質が含まれている。エキソソームは体液に含まれており、疾患や老化などのさまざまな生命現象における細胞間コミュニケーションに役割を担っている。そこで本研究では、プレバイオティクスやプロバイオティクスが宿主の生理におよぼす影響をエキソソームが媒介するという仮説を立て、これを検証するために、1）プレバイオティクスを図1摂取したマウスの血清エキソソームがマクロファージの活性化に影響をおよぼすか否か、2）プロバイオティク

フラクトオリゴ糖摂取マウスの血清エキソソームがマクロファージ活性化におよぼす影響

フ ラ ク ト オ リ ゴ 糖 添 加 飼 料（FOS（＋）） お よ び 無 添 加 飼 料（FOS（−））を 4 週間摂取したマウスの血清エキソソームをマウ
スマクロファージ細胞株 RAW264.7 に添加し、6 時間後に LPSを添加してさらに 18 時間培養した後の培養上清中 TNF-α濃度。
A は LPS を添加しなかった場合で、B は LPS を添加した場合。
血清を超遠心分離した後の沈殿にもとの血清と等容量のリン酸緩衝生理食塩水を添加したものを 100％エキソソームとした。

スを摂取したマウスの血清エキソソームがマクロファー
ジの活性化に影響をおよぼすか否か、3）腸上皮細胞および脂肪細胞がエキソソームを放出するか否か、について検討した。
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摂取させた。実験 2 では、精製飼料に山慶

細胞培養

基準

GG 株のいずれかを添加しマウス由来マクロファージ細胞株 RAW264.7 を培養た飼料（いずれも 10 cfu/日）あるいは無添加飼料を 1し、16 時間の血清飢餓の後、エキソソーム画分を添加週間自由摂取させた。実験 3 では、SPF あるいは無菌のして 6 時間培養し、さらに LPS（0.5 ng/mL）を添加し

C57BL/6 マウス（雌性、5 週齢）を納入後、ただちに後て 18 時 間 培 養 し た。 こ の 後、 培 養 上 清 を 回 収 し て、述する方法によりエキソソーム分離に供した。

ELISA によりサイトカイン濃度を測定した。

エキソソームの分離および分析

小腸クリプトオルガノイドの作成

株、No. 14 株、8マウスを一夜絶食後にエーテル麻酔下で頸動脈よりC57BL/6 マウス（雌性、5 週齢）をエーテル麻酔下で全採血して血清を分離し、超遠心分離を用いてエキソ頸椎脱臼により安楽死させ、小腸を摘出して Sato et al.

ソーム画分を得た 9）。また別の実験で、OptiPrep を用い（2009）11）の方法によりクリプトを分離・培養することにた不連続密度勾配遠心分離法によりさらに分離した 10）。

より、オルガノイドを誘導した 11）。培養 6 日目の培養上分離したエキソソームは透過型電子顕微鏡により観察し清から、血清の場合と同様に超遠心分離法によりエキソた。また、ウェスタンブロッティングおよび ELISA をソームを分離し、透過型電子顕微鏡により観察した。

用いて、エキソソーム画分中のアディポサイトカインを分析した。

図2

乳酸菌株摂取マウスの血清エキソソームがマクロファージ活性化におよぼす影響

基準株（LP type）、No. 14 株（LP14）、GG 株（LGG）を添加した飼料および無添加飼料（Non）を 1 週間摂取したマウスの血清エキソソームをマウスマクロファージ細胞株 RAW264.7 に添加し、6 時間後に LPS を添加してさらに 18 時間培養した後の培養上清中 TNF-α濃度（A、B）および IL-6 濃度（C、D）。A および C は LPS を添加しなかった場合で、B および D は LPSを添加した場合。TNF-α濃度は相対値で示し、アスタリスクは Non に比較して ＜0.05 で有意差あり。IL-6 は代表的な一回の結果を示した。血清を超遠心分離した後の沈殿にもとの血清と等容量のリン酸緩衝生理食塩水を添加したものを 100％エキソソームとした。

2腸内細菌の情報を生体内で伝達する細胞間コミュニケーション

統計解析

レバイオティクスやプロバイオティクスの摂取によって結果は平均値±標準誤差で表し、Studentʼs -test ある減少するか、あるいはそのような因子のマクロファージ

いは一元配置分散分析の後の多重比較 （Dunnetʼs test）

活性化作用を阻害するような別の因子がエキソソームににより平均値の比較を行った。 値が 0.05 未満の場合に存在し、それがプレバイオティクスやプロバイオティク統計的に有意と認めた。
結果および考察実験 1 において、フラクトオリゴ糖添加飼料および無添加飼料を摂取させたマウスの血清エキソソームを
RAW264.7 細胞に添加したところ、LPS 無添加条件下ではエキソソームの添加量依存的に TNF-α 濃度が上昇したが、無添加飼料群に比してフラクトオリゴ糖添加飼料群で低い傾向にあり、LPS 添加条件でもほぼ同様であった（図 1）。また実験 2 において、乳酸菌株添加飼料を摂取させたマウスの血清エキソソームを RAW264.7 細胞に添加した結果、やはりエキソソームの添加量依存的にTNF-α 濃度および IL-6 濃度が上昇し、さらに乳酸菌株無添加飼料群および基準株添加飼料群に比して No. 14 株添加飼料群および GG 株添加飼料群において有意な低値を示した（図 2）。これらの結果は、過去に筆者らが観察したフラクトオリゴ糖のアレルギー性炎症抑制作用および No. 14 株の脂肪組織炎症抑制作用の少なくとも一部はエキソソームが媒介することを示唆する。
RAW264.7 細胞における炎症性サイトカイン産生がエキソソームの添加量依存的に増加したことに関して、腸図3内細菌叢が関与するか否かを実験 3 において調べた。その結果、SPF マウスおよび無菌マウスの血清エキソソー

SPF マウス（SPF）および無菌マウス（GF）の血清エキソソー
ムをマウスマクロファージ細胞株 RAW264.7 に添加し、6 時間後に LPS を添加してさらに 18 時間培養した後の培養上清中
TNF-α濃度。A は LPS を添加しなかった場合で、B は LPS を添加した場合。血清を超遠心分離した後の沈殿にもとの血清と等容量のリン酸緩衝生理食塩水を添加したものを 100％エキソソームとした。

ムは同様に添加量依存的に RAW264.7 細胞の TNF-α 産生を増加させた（図 3）。この結果は、血清エキソソー
ムに含まれる宿主由来の因子がマクロファージを活性化することを示唆する。したがって、そのような因子がプ

図4

SPF マウスおよび無菌マウスの血清エキソソームがマクロファージ活性化におよぼす影響

マウスの小腸から誘導したクリプトオルガノイド

11）

マウスの小腸から Sato et al. （2009） の方法にしたがってクリプトを分離・培養し、培養 1、2、3、4、および 6 日目のオルガノイドを位相差顕微鏡下で撮影した。
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図5

山慶

マウスの血清およびクリプトオルガノイド培養上清中のエキソソームマウスの血清（A）およびクリプトオルガノイドの培養上清（B）から超遠心分離法によりエキソソーム画分を分離し、透過型電子顕微鏡下で撮影した。

表1

C57BL/6 マウスの血清およびエキソソーム画分の総タンパクおよびアディポサイトカイン濃度

総タンパク（mg/mL）
アディポネクチン（ng/mL）
レプチン（ng/mL）
レジスチン（ng/mL）

血清

エキソソーム画分

48.1±0.83745±2415.89±0.12
39.73±1.55

0.47±0.06
154±28N.D.
0.36±0.05

エキソソーム画分は、超遠心分離後の沈殿をもとの血清と等容量のリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。N.D. 検出されず。

スの摂取によって増加するという可能性が考えられる。

図6

血清中に存在するエキソソームはさまざまな細胞が放出したものである。そこで、腸内細菌叢に直接曝露すマウスの血清から分離したエキソソームのウェスタンブ
ロット分析

A. 等容量の血清、エキソソーム画分、および超遠心分離後の上清を還元条件下で SDS-PAGE により分離し、抗アディポネクチン、レプチン、およびレジスチン抗体で検出した。B. マ
ウスの血清を密度勾配遠心分離法により分画後、還元条件下でSDS-PAGE により分離し、抗アディポネクチンおよび CD63（エキソソームのマーカータンパク）抗体で検出した。アディ
ポネクチンおよび CD63 のシグナルはエキソソームの密度と一致する画分に検出された。C. エキソソーム画分を、プロテイ
ナーゼ K、Triton X-100、および両者でインキュベートした後、ウェスタンブロッティングを行った。D. 血清、エキソソーム画分、および超遠心分離後の上清を非変性条件下で SDS-PAGEにより分離し、抗アディポネクチン抗体で検出した。アディポ
ネクチン濃度が等しくなるように試料を調製した。

る腸上皮細胞がエキソソームを放出するか否かを確かめるために、小腸クリプトオルガノイドを用いて調べた（図 4）。小腸クリプトオルガノイドは、小腸粘膜から分離したクリプトを培養することによって誘導される腸上皮組織構造体であり、幹細胞および未分化増殖細胞に加えて分化・成熟した上皮細胞から成っている 11）。透過型電子顕微鏡によりオルガノイドの培養上清にエキソソームが認められ、それらは血清から分離したエキソソームに比較してサイズが均一であった（図 5）。したがって、腸上皮細胞もエキソソームを放出することが確認され、また、クリプトオルガノイドは腸上皮細胞が放ジスチンはほとんど含まれなかったが、アディポネクチ出するエキソソームを解析するためのンの一部（約 4％）が存在し、それはエキソソームの脂実験系と質二重膜に埋め込まれた形で存在することが示唆された

して利用できることが示された。

12）（図 6 および表 1）。非変性条件下の SDS-PAGE の後に脂肪細胞に由来するエキソソームを調べるために、血清エキソソーム画分に含まれるアディポサイトカイン

ウェスタンブロッティングを行ったところ、エキソソーを分析した。エキソソーム画分には、レプチンおよびレム中のアディポネクチンは高分子量のものが主体であっ4

腸内細菌の情報を生体内で伝達する細胞間コミュニケーションた 12）。アディポネクチンはインスリン感受性の亢進作な因子のマクロファージ活性化作用を阻害するような別用や抗炎症作用を有するが、生理的に活性なアディポネの因子がエキソソームに存在し、それがプレバイオティ

クチンは高分子量のものであるので、血清アディポネク

クスやプロバイオティクスの摂取によって増加するといチンの一部がエキソソームに存在するということは、そう可能性が考えられた。また、小腸クリプトオルガノイの生理機能発現と何らかの関係があるかもしれない。アドは腸上皮細胞が放出するエキソソームを解析するため

ディポネクチンは脂肪細胞により産生・分泌されるのので、本研究はアディポネクチンが脂肪細胞に由来するエチンが脂肪細胞に由来するエキソソームのマーカーとなキソソームのマーカーとなりうること、またエキソソーりうることが示唆された。

実験系として利用できること、アディポネク

ムの機能と関連することを示唆している。
謝以上の結果は、プレバイオティクスおよびプロバイ

辞オティクスが腸内細菌叢を介して宿主に対する健康機能本研究を遂行するに当たり、助成を賜りました公益を発揮するときに、腸管から末梢組織への情報伝達にエ財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

キソソームが関与する可能性を示唆する。腸内細菌叢が宿主の生理に影響するときにエキソソームが関わること文については、これまでまったく報告されておらず、生体

1） J. Watanabe, et al.:100, 339–346, 2008.
2） S. Pirapatdit, et al.:71,1901–1907, 2008.
3） K. Sonoyama, et al.:103, 218–226, 2010.
4） R. Fujiwara, et al.:103, 530–538, 2010.
5） N. Sasajima, et al.:103, 539–548, 2010.
6） R. Fujiwara, et al.:56, 260–265,2010.
7） N. Takemura, et al.:235, 849–856, 2010.
8） T. Okubo, et al.:32, 93–100, 2013.
9） C. Théry, et al.:
Chapter 3,Unit 3.22, 2006.
10） S. Mathivanan, et al.:
, 9, 197–208,
2010.
11） T. Sato, et al.:459, 262–266, 2009.
12） W. Phoonsawat, et al.:, in press. doi:10.1016/j.bbrc.2014.04.114.

内における新規の細胞間コミュニケーションシステムである可能性があるので、今後さらに解析を進めていく。
要約
プレバイオティクスおよびプロバイオティクスの生理機能をエキソソームが媒介するという仮説を検証するために、これらを摂取したマウスの血清エキソソームがマクロファージ細胞株における炎症性サイトカイン産生におよぼす影響を調べた。その結果、血清エキソソームにはマクロファージを活性化する宿主由来の因子が含まれ、そのような因子がプレバイオティクスやプロバイオティクスの摂取によって減少するか、あるいはそのよう5献