皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復による皮膚バリア機能増強とアトピー・アレルギーの発症予防
徳島大学先端酵素学研究所

木戸博

Enhancement of skin barrier function by activation of granular layer cells and restoration of tight junction are important
for the prevention of atopic and allergic dermatitis. We recently established a highly sensitive method for detection ofallergen specific immunoglobulin class switching by the densely carboxylated protein (DCP) chip microarray. DCP chipprovides sensitive quantitative measurement of allergen-specific IgGs, IgA and IgE by using limited amount of serumand also provides allergen-affinity of each immunoglobulins. By using the DCP chip, we measured the enhancement ofskin barrier function after sensitization of allergen from skin. We analyzed the effects of pyruvate dehydrogenase kinase 4(PDK 4 ) inhibitor on activation of mitochondria in the granular layer cells of skin. Treatment of PDK 4 inhibitor from theskin effectively inhibited dinitrochlorobenzene-induced skin inflammation and proliferated granular layer cells. Treatmentof PDK 4 inhibitor also block skin sensitization of ovomucoid. These results suggest that PDK 4 inhibitor plays a role forprevention and/or treatment of allergy induced by skin-sensitization.

1. 緒

消える生後 4 ヶ月以後に、湿疹を介して抗原が経皮感作さ言れると、乳児の食物アレルギーの発症に繋がることを明らアレルギー・アトピーの発症病理学的研究の中で、抗かにした（Manuscript in preparation）。このように微量抗原経皮感作の重要性に関する目覚ましい研究成果が近年原の経皮感作によって、体内免疫系が大きく影響されるこ相次いで発表され、これまで有効な予防と治療法のなとから、これを高感度に感知して予防と対策を講ずる必要かったアレルギー・アトピー領域が注目されている。そがある。本プロジェクトでは、食物アレルギーの予防との発端となった日本の研究者グループによる２報の論文

治療のために、１）低侵襲性にしかも高感度に抗原特異的が注目される。１つは、国立成育医療センターグルー

IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA を測定する検査シス

プ の Horimukai 等 に よ る “Application of moisturizer toテムを開発するとともに、２）抗原の経皮感作を防ぐ皮膚neonates prevents development of atopic dermatitis”

1）

で、のバリア機能を増加させる方法の一つとして、細胞間を繋生後 32 週間保湿剤によるスキンケアをすることで、アトぐタイトジャンクションがミトコンドリア機能に密接に依ピーの発症が 32 % 抑制されたことを記載した画期的な論存していることに注目して、ミトコンドリア機能活性化剤

文である。他は、慶応大学医学部皮膚科学教室のグループを皮膚に塗布した場合の抗原感作抑制効果を検討した。なによる “ Distinct behavior of human Langerhans cells andお、申請者等のグループは、血管内皮細胞の透過性をコン

inflammatory dendritic epidermal cells at tight junctions

トロールするタイトジャンクションの修復の重要性をこれ

in patients with atopic dermatitis”

2）

で、アトピー性皮膚炎では抗原提示細胞の突起がタイトジャンクションの隙間までに明らかにしており 3）、これらの研究を遂行する基盤を有している。

を介して伸展して、抗原提示に関与する機序についての論文である。この２報は、アトピーの発症とタイトジャンクション崩壊、保湿剤による角質層とタイトジャンクション保護との関係を示唆している。

2. 実験方法
2. 1. 高感度抗原特異的 IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 測定システム

我々は、国立成育医療センターグループとの前記の共同

高感度抗原特異的 IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA研究論文において、各種抗原特異的抗体価を測定して発測定システムとして、我々はこれまでに開発してきた表してきたが、続いて行った最近の乳児コホート研究かDensely carboxylated Protein（DCP）-chip を用いた 4，5）。

ら、胎盤を介して母子移行した IgG 抗体が乳児の体内から

このデバイスは、僅か 20 - 50 µL の血清で、10 ～ 33 種類の抗原特異的抗体のクラススイッチパターンと、約 100 µL

Enhancement of skin barrier function
by activation of granular layer cells
a nd re st or at ion of t ig ht ju nct ion ,and prevention of atopic and allergic
dermatitis
Hiroshi Kido
I nst itute for Enzy me Resea rch ,Tokushima Universityの血清で抗原親和性の測定が可能なデバイスである。図1 に、抗原蛋白質を共有結合で高密度に固定化する DCPチップの概要を示す。DCP チップは、シリコン基板にDiamond-like carbon（DLC）コート後、静電層カルボキシル基修飾を施したチップと、ガラススライドに静電層カルボキシル基修飾を施したチップ（IgSensor AMERIC®）− 72 −皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復による皮膚バリア機能増強とアトピー・アレルギーの発症予防量が可能である。さらにアレルギーの発症と予防の観点か
ら抗原特異的抗体の抗原親和性が注目されている 6）が、抗原親和性を抗原の IC50 値で測定可能な唯一のデバイスとなっている。

2. 2. 抗原経皮感作をモニターするモデルシステム
実験動物としてマウスを使用して抗原経皮感作をモニタ測定原理ーするモデルシステムとして、これまで広く使用されてきた Dinitrochlorobenzene（DNBC、Sigma-Aldrich）で誘導したアトピー・皮膚炎モデル 9）と、皮膚を金ブラシで機械的に掻破することで比較的自然に近い穏やかな皮膚炎を起こす２系統のモデルを用いて、抗原感作とミトコンドリア活性化剤による感作ブロックを検討した。DNBC は皮膚蛋白質と共有結合する比較的強力な化学修飾薬剤で短時間に激しい皮膚炎を生じる。6 週齢の BALB/C 雌マウスを脱小児に負担の少ない微量測定の実施例

毛した後、エタノールに溶解した 2 % DNBC を朝、夕の１

図 1 DCP チップを用いた高感度、低侵襲性抗原特異的抗体価定量の概要

日２回、３日間塗布して皮膚炎を誘発した。その後皮膚顆粒細胞のミトコンドリアを標的にした Pyruvate Kinase 4（PDK4）阻害剤を皮膚ローションに溶解して１日２回の塗があり、性能はほぼ同等で現在 10-36 種類のアレルゲン布を７日間実施し、実験開始から 11 日目にマウスを屠殺を搭載したチップが汎用されている。本研究では DCP チして、皮膚組織の状態を観察した。
一方、皮膚を機械的に掻破した群では、初日に金ブラシップとして、当研究室で開発したガラススライド基板の®

で 30 回掻破した後、翌日より PDK4 阻害剤添加（+、−）IgSensor AMERIC が使用された。
図２にこのアレルゲンチップの特色を示す。このアレル®の皮膚ローションを１日２回、７日間塗布し皮膚の治療をゲンチップ IgSensor AMERIC は、これまでにない極微実施した。１週間の治療後、卵白抗原のOvomucoid（OVM）量検体で、抗原特異的各種抗体価を定量測定が可能である。

1 mg/60µL 4% SDS 溶液を１日 1 回、10 日間塗布するこ

そのため低侵襲的に乳児の抗体価の測定が可能となった。とで、抗原の経皮感作を実施した。金ブラシでの皮膚掻破

このシステムでは、1 人分の枠内に各種食物抗原や環境中から３週後、即ち経皮抗原感作の 4 日後に、OVM の経口の経気道感作抗原、各種リコンビナント単一抗原が搭載さブースト感作を実施して、血液中の OVM 抗原特異的 IgEれており、同時に 33 種類の抗原に対する特異抗体価の定抗体誘導を２週間モニターした。

図 2 高感度 DCP チップの特徴− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017ってきたことから 11，12）、今後本研究課題と密接に関係し3. 結果と考察た解析研究が望まれている。人工乳と混合栄養児の場合、

3. 1. 高感度抗原特異的 IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 測定システムの開発®

IgSensor AMERIC を用いた出生時の母体血、臍帯血、乳児は牛ミルクの特異的抗原、Beta-lactoglobulin（BLG）に対する抗体を産生する。しかも乳児にとっては唯一の食物栄養源であることから、大量のミルク抗原に経口感新生児血の鶏卵、ミルク抗原、杉抗原（Cedar pollen）、ハ作されることになる。一方、母乳栄養児の場合は、BLGウスダストと２種類のダニ抗原（Dp, Df）に対する抗原特に対する抗体産生は見られなかった。図４に示すよう

異的 IgE の感作パターンを図３に示す。胎盤を通過できるに、乳児はイムノグラブリンクラススイッチのルール

IgG、IgG4 は、母体血、臍帯血、新生児血間で相違は見らに従って、出生後 0 ヶ月から 6 ヶ月までの間に経時的に、れず、同一の感作パターンを示した。一方で胎盤を通過でIgG3 → IgG1 → IgG2 → IgG4 と IgG1 → IgE へ の ク ラ ス ス

きない IgA と IgE では、母体血と臍帯血、新生児血間に大イッチの順番で進んでいることが判る。IgM から最初にきな違いが観察された。胎児及び新生児では IgA 産生ができる抗体が IgG3 であるが、IgG3 は速やかに IgG1 にク見られないことから、臍帯血、新生児血では抗原特異的抗ラススイッチされ、乳児は異物反応として大量の IgG1 抗体は全く観察されない。しかし抗原特異的 IgE の場合、母体を産生する。その後、アレルギー発症抑制に関与する体血と臍帯血、新生児血間で違いのあることが観察され

IgG1 → IgG2 → IgG4 へのクラススイッチが進む（この図でた。胎児期より胎児は抗原特異的 IgE を産生するが、そのは IgG2 が省略されている）とともに、アレルギーの発症に抗原の由来は、胎盤を通過して胎児にもたらされる母体関与する IgG1 → IgE へのクラススイッチが進む。の IgG・抗原複合体に由来する主に食物抗原で、この抗原上記の高感度イムノグラブリンクラススイッチの測定系に対する IgE 抗体が産生される。食物抗原以外の環境抗原ができたことから、今後経皮感作による IgG1 → IgE へクによって感作される頻度の高い母体血との違いが生じるとラススイッチの高感度モニターが期待される。

推定している。以上の結果は、胎児と臍帯血で見られる見られる IgE ではないことが明らかになった。一方、胎児

3. 2. 抗原経皮感作をモニターするモデルシステムの開発は IgE を産生しているが、胎児期にアレルギーの発症がな

上記のように高感度イムノグラブリンクラススイッチのい理由として、胎児と臍帯血で見られる抗原特異的 IgE は、測定系ができたことから、抗原経皮感作をブロックする薬抗原との親和性が低くヒスタミン遊離を誘発しない低親和剤のスクリーニングが可能になった。本研究は、これまで性 IgE 抗体であることが判明している 10）。に我々が実施してきた研究からの仮説、「細胞間のタイト抗原特異的 IgE は胎児由来であり、母体血が混入した結果出生後 0 - 6 ヶ月までの乳児期の乳児を対象として、ミジャンクション機能がミトコンドリア機能に密接に関係しルク抗原特異的イムノグラブリンクラススイッチのモニており、ミトコンドリア機能の低下がタイトジャンクショ

ターが行われた。特に乳児期の湿疹、アトピー性皮膚炎

ン機能の低下や、皮膚バリア機能の低下を引き起こし、逆が食物アレルギーの発症の原因になることが明らかになにミトコンドリア機能の上昇がタイトジャンクション機能

図 3 母体血と臍帯血、新生児血間の抗原特異的各種イムノグロブリンの比較− 74 −

皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復による皮膚バリア機能増強とアトピー・アレルギーの発症予防

図 4 母体血と出生後の 0 ヶ月から６ヶ月までのミルク抗原の経口感作とイムノグロブリンクラススイッチを増加させる」に基づいて実施された。図５は、この仮説の基になったこれまでの研究成果である 4, 13）。種々の病原体は体内の防御システムを活性化して各種サイトカインの産生を促す。サイトカインは生体防御系の発動に不可欠であるが、過剰のサイトカインの産生（サイトカインストーム）は、体内の各臓器が微量産生している trypsin（異所性trypsin）の発現を増加させ、そのレセプターの PAR-2 を介して細胞内の Ca2+ の異常増加とそれに伴うタイトジャンクションの崩壊を導く。サイトカインの増加は、体内代謝の中でもミトコンドリアのエネルギー代謝に深く関係しており、ミトコンドリア機能の低下と ATP クライシス、細胞機能の低下を引き起こす。この一連のシグナル伝達の中でサイトカインの増加は、エネルギー代謝の主役を担う糖代謝の調節因子、PDK4 の著しい増加を誘導することが判明した 13）。PDK4 の増加は、その基質であるPDH（Pyruvatedehydrogenase）をリン酸化して、PDH 活性を低下させる。
PDH は、Glucose 代謝の key enzyme で、ミトコンドリアへの糖代謝の流れを調節している酵素である。即ち PDHの活性低下は Glucose のミトコンドリアへの輸送量の低下を招き、その結果 ATP 産生の低下、ミトコンドリア機能の低下と細胞機能の低下を引き起こす。このような観点から、PDK4 阻害剤の開発研究が進んでいる。
図６は、2% DNBC を 3 日間塗布することによって誘発

図５ 細胞間タイトジャンクションの機能に関与するミトコンドリ
アのエネルギー代謝と、これに影響を与える病原体―サイトカ
インー代謝不全サイクル
PPARs, peroxisome proliferator-activated receptors; PDH,pyruvate dehydrogenase; PDK4, pyruvate dehydrogenasekinase 4; PAR-2, protease activated receptor 2; CPT,
carnitine palmitoyltransferase; CF T R , cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator; KCNN4, potassiumintermediate/small conductance calcium-activated channel,
subfamily N, member 4; KCNQ1, potassium channel, voltage
dependent, KCNQ1(IPR005827) ; ZO-1, zonular occludens-1.

されたアトピー・皮膚炎モデルの結果である。DNBC 塗布による皮膚炎を通常のローション基材のみで１週間治療した。これに対して、PDK4 阻害剤を添加したローションでた群では、DNBC を塗布しなかったマウスの皮膚に比べて、治療した群では、明らかに皮膚顆粒層の肥厚が抑制される

皮膚顆粒層が厚くなるとともに、角質層が薄く変化していと共に、角質層の厚みが比較的良く保たれていた。これら− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

発してモニターした。この実験系では、初回の経皮感作（10のことは、PDK4 阻害剤の有効性を示唆している。
一方、皮膚を機械的に掻破した温和な経皮感作実験系で日間の経皮感作）のみでは、OVM 特異的 IgE 抗体産生は観は、高感度 IgSensor AMERIC® を使用することで、OVM察されず、その後の比較的大量の経口抗原ブースト感作す抗原特異的 IgE 抗体の産生がモニターされた。実験系を図ることで、図８に示すように IgE 抗体は 14 日目に急速な７に示す。初回の皮膚掻破の後、１週間皮膚の治療が行増加を見た。一方、機械的掻破後に PDK4 阻害剤を添加しわれたが、その皮膚治療の効果を OVM の抗原経皮感作と、たローションで１週間治療した群では、その後の経皮抗原抗原の経口ブースト感作で OVM 特異的 IgE 産生を増幅誘感作によっても IgE 抗体産生の程度は弱く、経口抗原ブー

図 6 DNBC 皮膚炎モデルにおける PDK4 阻害剤の皮膚顆粒層と角質層の保全効果
皮膚顆粒層（←→）と顆粒層の上部に位置する角質層（➡）を示す。

図 7 皮膚掻破とその治療、これに続く経皮抗原感作スケジュール

図 8 OVM 経皮感作による OVM 特異的 IgE 抗体の産生と、これを抑制する PDK4 阻
害剤添加皮膚ローションの効果− 76 −

皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復による皮膚バリア機能増強とアトピー・アレルギーの発症予防

5） Kido H, Okumura Y, Takahashi E, Pan H-Y, Wang

スト感作による IgE 産生が抑制されていた。

4. 総S, Yao D, Yao M, Chida J and Yano M. Role of host括cellular proteases in the pathogenesis of influenza
and influenza-induced multiple organ failure. Biochim「皮膚顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復にBiophys Acta 1824(1): 186-194,2011.

よる皮膚バリア機能増強とアトピー・アレルギー皮膚炎の発症予防」を目指して研究が行われた。そのため、高感度6） Suzuki K, Hiyoshia M, Tada H, Bando M, Ichioka

抗原特異的抗体のクラススイッチモニター系の確立と、こT, Kamemura N, and Kido H. Allergen diagnosisのシステムを用いたタイトジャンクション修復による皮膚microarray with high-density immobilization capacity

バリア機能増強効果の検証が、PDK4 阻害剤を候補薬剤とusing diamond-like carbon-coated chips for profiling

して検討された。その結果、PDK4 阻害剤は、タイトジャ

allergen-specific IgE and other immunoglobulins. Anal

ンクション修復に効果のあることが証明された。今後皮膚Chim Acta 706(2): 321-327, 2011.

顆粒細胞の活性化とタイトジャンクション修復に適したさ7）Kamemura N, Tada H, Shimojo N, Morita Y, Kohno

らなる PDK4 阻害剤のスクリーニングが求められる。また

Y, Ichioka T, Suzuki K, Kubota K, Hiyoshi M and

今後イムノグラブリンクラススイッチを高感度にモニター

Kido H. Intrauterine sensitization of allergen-specificすることで、経皮感作を効果的に防止する最適な薬剤使用

IgE analyzed by a highly-sensitive new allergenmicroarray. J Allergy Clin Immunol130:113-121, 2012.の時期を示すバイオマーカーが見いだされると期待してい8） Kamemura N, Kawamoto N, Nakamura R, Teshima

る。

R, Fukao T, and Kido H. Low-affinity allergen-specific（引用文献）

IgE in cord blood and affinity maturation after birth. J
Allergy Clin Immunol 133(3): 904-905, 2014.

1） Horimukai K, Morita K, Narita M, Kondo M,Kitagawa H, Nozaki M, Shigematsu Y, Yoshida K,9） Zhang EY, Chen AY, Zhu BT. Mechanism ofNiizeki H, Motomura K, Sago H, Takimoto T, Inoue E,

dinitrochlorobenzene-induced dermatitis in mice: Role

Kamemura N, Kido H, Hisatsune J, Sugai M, Murota H,of specific antibodies in pathogenesis. PLoS one 4,Katayama I, Sasaki T, Amagai M, Morita H, Matsuda

e7703, 2009.

A, Matumoto K, Saito H, Ohya Y. Application of10）Kamemura N, Kawamoto N, Nakamura R, Teshimamoisturizer to neonates prevents development ofR, Fukao T, Kido H. Low-affinity allergen-specific IgE

atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 134(4): 824-in cord blood and affinity maturation after birth. J830, 2014.

Allergy Clin Immunol 133(3): 904-905, 2014.

2） Yoshida K, Kubo A, Fujita H, Yokouchi M, Ishii

11）Flohr C, Perkin M, Logan K, Marrs T, Radulovic

K, Kawasaki H, Nomura T, Shimizu H, Kouyama K,S, Campbell LE, et al. atopic dermatitis and disease

Ebihara T, Nagao K, Amagai, M. Distinct behavior ofseverity are the main rsik factors for food sensitization

human Langerhans cells and inflammatory dendritic

in exclusively breastfed infants. J Invest Dermatol

epidermal cells at tight junctions in patients with

134:345-50, 2014.

atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 134(4): 856-12）Lack G. Update on risk factors for food allergy. JAllergy Clin Immunol 129: 1187-1197, 2012.

83064, 2014.
3） Wang S, Le TQ, Kurihara N, Chida J, Cissé Y, Yano

13）Yamane K, Indalao IL, Chida J, Yomamoto Y,M, and Kido H. Influenza virus-cytokine-protease cycle

Hanawa M, Kido H. Diisopropylamine dichloroacetate,in the pathogenesis of vascular hyperpermeability ina novel pyruvate dehydrogenase kinase 4 inhibitor, assevere influenza. J Infect Dis 202(7):991-1001, 2010.

a potential therapeutic agent for metabolic disorder4） Kido H. Influenza virus pathogenicity regulated byand multiorgan failure in severe influenza. PLoS One

host cellular proteases, cytokines and metabolites, andits therapeutic options. Proc Jpn Acad Ser B 91: 351368, 2015.

− 77 −9(5):e98032 ,2014.