新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発
信州大学大学院医学系研究科循環病態学講座

新藤隆 行、桜 井敬 之、神 吉昭子

Adrenomedullin (AM), originally identified as a vasodilating peptide, is now recognized to be a pleiotropic molecule
possessing various bioactivities. We have reported that knockout mice deficient in AM or RAMP2, an AM-receptor
accessory protein, show embryonically lethal, and proved that RAMP2 is the critical determinant of the vascular functionsof AM. However, not only in the vascular system, AM and RAMP2 are highly expressed in adipose tissue. To clarify thepathophysiological roles of AM-RAMP2 system in adult, we performed conditional gene targeting of RAMP2. Using genetargeted mice, we found that AM-RAMP2 system plays critical roles of maintaining homeostasis in adult. AM-RAMP2system can thus be a novel therapeutic target of anti-aging.

１．緒

我々はこれまでに、AM と AM の受容体活性調節タンパ

言クである RAMP 2 のノックアウトマウスを樹立し、AM ホ

生体は、健康な状態を維持していく上で、様々な恒常性モノックアウトマウス（AM-/-）と RAMP2 ホモノックア維持（ホメオスターシス）の制御システムを有している。生ウトマウス（RAMP 2 -/-）では、共に血管形成異常や浮腫体内生理活性物質とその受容体システムは、元来生体が備が認められ、胎生致死となることを明らかにした。このこえたホメオスターシス制御システムの一つであるが、一方とから、AM の血管における機能が RAMP2 によって規定でその調節異常は、老化現象の進行や様々な生活習慣病のされていることがはじめて明らかとなった 4, 5）。

原因となる。こうしたホメオスターシス制御システムを統本研究では、通常のジーンターゲティングの方法に加合的に理解し、人為的に介入・操作することができれば、えて、Cre-loxP システムを用いたコンディショナルター

様々な病気の予防やアンチエイジング法の開発につながるゲティングの方法により、血管あるいは脂肪組織特異的ことが期待される。

な RAMP2 ノックアウトマウスを作成し、成体におけるアドレノメデュリン（adrenomedullin:AM）は、ヒト褐色1）細胞腫から分離された生理活性ペプチドである 。AM は

AM-RAMP2 システムによる、ホメオスターシス制御機構の詳細なメカニズムについて検討を行った。

血管、心臓、腎臓など様々な臓器で産生・分泌され、血管２．実拡張作用、抗酸化作用、抗炎症作用、臓器保護作用など多験

彩な生理活性を有する因子である。AM は脂肪組織にも由RAMP2 のエクソン 2 〜 4 の両側に loxP サイトを配置し来し、血中の 1/4 は脂肪組織由来とされている。また、ヒた RAMP2flox マウスを樹立し、CAG-Cre トランスジェ

トの血中 AM 濃度は肥満に伴い上昇し、Body mass index

ニックマウスと交配することで、全身で RAMP2 を欠損2）に相関することも報告されており 、AM はメタボリックシするマウス（RAMP 2 -/-） を作成した。ホモノックアウト

ンドロームの病態にも重要な役割を持つと考えられている。

マウス（RAMP 2 -/-） は胎生致死となるため、成体が得ら一方、AM 受容体は G タンパク共役型受容体である CLRれるヘテロノックアウトマウス（RAMP 2 +/-） を用いて検（calcitonin receptor-like receptor）という 7 回膜貫通型討を行った。次に血管における RAMP2 の病態生理学的受容体であるが、CLR には、RAMP（receptor activity-

意義を明らかとするために、RAMP2 flox マウスと、血管modifying protein）という 1 回膜貫通型タンパクが結合し、内皮細胞特異的に Cre リコンビナーゼを発現する vascular受容体機能を制御している 3）。RAMP には 1、2、3 の 3 種

endothelial（VE）-cadherin Cre トランスジェニックマウス

類のサブアイソフォームがあり、CLR が RAMP2 またはを交配し、Cre-lox P システムにより、血管内皮細胞特異RAMP3 と結合することにより AM 受容体として機能する。

的 RAMP2 ノックアウトマウス（E-RAMP 2 -/-）を作成した。さらに脂肪細胞特異的に Cre リコンビナーゼを発現す*

る aP2Cre トランスジェニックマウスと RAMP2flox マウ
Anti-aging based on a novel system
maintaining homeostasis in the body
Takayuki Shindo*, Takayuki Sakurai,Akiko Kamiyoshi
Department of Cardiovascular Research,Shinshu University Graduate School ofMedicine

スを交配し、脂肪細胞特異的 RAMP2 ノックアウトマウス（A-RAMP 2 -/-）を作成した。
これらの遺伝子改変マウスを用いて、野生型（WT）マウスと表現型を比較検討することで、RAMP 2 欠損に伴う生体内ホメオスターシス破綻と老化との関係について検討を行った。

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新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発

３．結様の形態変化が認められた（図 2）。肝臓組織の Sirius red

果染色による検討では、通常の肝硬変とは異なり、線維化は全身型の RAMP2 ヘテロノックアウトマウス（Conventional

肝細胞側ではなく、血管の走行に沿って進行していた。

RAMP 2 +/-） は成体まで成長し、外見上の変化は認めな

E-RAMP2-/- の腎臓では、水腎症と多発性嚢胞腎が自いが、1 年齢を超える加齢マウスでは、肺、腎臓、肝臓と然発症し、嚢胞の周囲には線維化が著明であった（図３）。

いった主要な臓器に血管炎様の細胞浸潤が自然発症し、胸糸球体も拡大しており、糸球体硬化症を伴っていると考え部大動脈では、早期老化マーカーである SA-β-gal 染色陽られた。電顕像からは、糸球体において、足突起の融合、性の所見が認められた。さらに、炎症性接着因子である基底膜の肥厚、内皮細胞と基底膜の部分的離開などが確認

ICAM-1,VCAM-1 が、8 週齢の若年期から発現が亢進しされた。ていた。一方、E-RAMP2 -/- では、RAMP2 +/- より、病以上の結果から、血管内皮細胞の RAMP2 が失われると、変がさらに早期に出現した（図 1）。血管炎様の所見は若年血管の恒常性が障害を受け、加齢と共に、各臓器の機能不期でも認められ、6 ヶ月齢程になると、より著明となった。

全の原因になると考えられた。

浸潤細胞は、CD3 や F4/80 陽性細胞が多いことから T リ

一方。A-RAMP2 -/- マウスは、普通食投与下においンパ球やマクロファージの浸潤による慢性炎症が生じていて 5 週齢の若年期より WT マウスと比較して体重が有意ることが示唆された。に増加した（図 4）。A-RAMP 2 -/- は、白色脂肪組織にこれらの炎症細胞浸潤のメカニズムを検討するため

お い て RAMP2 遺 伝 子 が WT マ ウ ス の 約 30 ％ に 低 下 しに、WT と RAMP2+/- マ ウ ス か ら、 肝 臓 類 洞 内 皮 細ていることが確認された。エネルギー消費を調べるた胞を初代培養し、マクロファージの接着実験を行った。

め、呼吸代謝測定を行った結果、普通食投与下において、RAMP2+/- 由 来 の 内 皮 細 胞 で は、WT と 比 較 し て、 マ

A-RAMP2 -/- は WT マウスと比較して、明期、暗期ともク ロ フ ァ ー ジ の 接 着 性 が 亢 進 し て い た。 ま た、Real-に酸素消費量の低下と呼吸商の上昇が見られた（図 5）。呼time PCR 法により内皮細胞の遺伝子発現を検討したとこ

吸商が上昇していることから、脂肪を消費しにくく、肥満ろ、RAMP 2 +/- の肝臓類洞内皮細胞では、VCAM-1 のになりやすいと考えられた。

発現亢進、eNOS の発現低下が認められた。これらのこと

次に、病理解析を行った。A-RAMP2-/- は WT マウス

から、RAMP2 発現が低下したマウスでは、加齢と共に血と比較して、個々の脂肪細胞が肥大化し（図 6A）、間質に管の恒常性が失われ、炎症性接着因子の発現が亢進するこ

おける F4/80 免疫染色陽性のマクロファージ浸潤も増加しとで、炎症細胞が接着しやすくなり、各臓器内の血管炎症ていた（図 6B）。さらに加齢マウスでは、脂肪組織間質のの原因になると考えられた。

著明な線維化の亢進が認められた（図 6C）。また、皮下脂一方で、E-RAMP2 -/-のほとんどは、周産期に致死であ肪組織において、若年期より皮下脂肪層の肥厚と（図 7A）、ったが、一部のE-RAMP2 -/-では成体が得られ、これらを用いて病理学的解析を中心に解析を進めた。E-RAMP 2 -/の肝臓においては、6 ヶ月齢以上の加齢マウスで、肝硬変

図 1 6 ヶ月齢 E-RAMP2-/- マウスの肝臓と腎臓の病理像（Scale bars =100μm）− 113 −

図2

6 ヶ月齢 E-RAMP 2 -/- マウスの肝臓の外観

図3

6ヶ月齢 E-RAMP 2 -/- マウスの腎臓の断面像

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図4A-RAMP 2 -/- マウスの外観と体重増殖曲線

図5

図6A-RAMP 2 -/- マウスの呼吸代謝測定

A-RAMP2 -/- マウスの白色脂肪組織の病理像
A: HE 染色B: F4/80 免疫染色
C: Masson Trichrome 染色

図7− 114 −A-RAMP2 -/- マウスの皮下脂肪組織の病理像
A: HE 染色B: Masson Trichrome 染色新しい生体内ホメオスターシス維持機構に基づくアンチエイジング法の開発

線維化の亢進が認められた（図 7B）。A-RAMP2 -/- では、ことが予想された。E-RAMP2-/- の肝臓、腎臓における、皮下組織において、ビメンチン免疫染色陽性の線維芽細胞

superoxide、酸化脂質、NADPH oxidase の亢進が確認さの数も増加しており、トルイジンブルー陽性の肥満細胞のれた。AM には、強力な酸化ストレス抑制効果があること数も増加していた。Real-time PCR 法により皮膚におけるから、酸化ストレスの亢進が、E-RAMP2-/- において臓遺伝発現を検討したところ、A-RAMP2 -/- では RAMP2器障害を促進した、もう一つの原因と考えられた。の発現が WT の 4 割程度まで低下し、一方で AM は代償一方、脂肪組織は様々なアディポカインを産生する臓性に約 3 倍に増加していた。A-RAMP2 -/- の皮膚では器であり、生体の恒常性維持に重要な役割を担うが、AMTNF-α, IL-1β, MCP-1 といった炎症性サイトカイン、ケモも脂肪組織から多く分泌されている。A-RAMP2-/- では、

カインの発現が WT の 2 倍程度まで発現亢進しており、一普通食下でも肥満を発症し、酸素消費量の低下を認めるこ方で、IL-10 といった抗炎症性サイトカインは 2 割程度まとから AM はアディポカインの一つとして、生体内の代で発現が抑制されていた。

謝恒常性を直接制御していると考えられた。興味深いのは、脂肪細胞には、エネルギーを蓄積する白色脂肪細胞の他

A-RAMP2-/- では、皮下脂肪組織においても、若年期よにも、熱産生を行う褐色脂肪細胞、白色脂肪組織中に存在

り皮下脂肪層の肥厚と、線維化の亢進を認め、老化現象にし、熱産生を行うベージュ脂肪細胞が存在し、それぞれが似た組織像を示したことである。RAMP2 は皮膚の恒常性異なる機能を有する。

維持にも係わっていることから、美容上のアンチエイジン

そこで次に、褐色脂肪組織の解析を行った。褐色脂肪

グについても、重要なターゲットとなりうる可能性がある。

組織においては、白色脂肪組織と同様に A-RAMP2 -/- で５．総は RAMP2 遺伝子が野生型マウスの約 20 ％に低下してい括ることが確認された。褐色脂肪組織のリアルタイム PCR

生体のホメオスターシス維持において、生体内生理活性による遺伝子発現解析により、普通食投与下において、分子群は重要な機能を有しており、老化現象とは、これら

A-RAMP 2 -/- は野生型マウスと比較して、脂肪酸酸化系の生体内生理活性分子によるホメオスターシス機構が、環遺伝子である ACSL1 とミトコンドリア関連遺伝子である境に応じて適応や変容を繰り返し、徐々に調節異常が蓄積

ATP synthase、COX IV、UCP1 などの発現低下が見られした状態とも考えられる。従って、生理活性分子によるホた。従って、褐色脂肪組織のミトコンドリア機能の維持とメオスターシスのメカニズムの包括的な解析を進めること

エネルギー消費にも、AM-RAMP 2 システムが関与してで、アンチエイジングや、健康長寿のための新しい予防・いると考えられた。

治療法につながることが期待される。

一方、鼠径部皮下脂肪組織は、若年期には褐色脂肪様の今回、コンディショナルターゲティングの手法を用いる脂肪細胞（ベージュ脂肪細胞）が多く見られるが、加齢と共ことで、生理活性ペプチド AM と、その受容体活性調節タに、白色脂肪細胞の割合が増加する。A-RAMP2 -/- マウンパクである RAMP2 の生体内ホメオオスターシス維持にスの鼠径部皮下脂肪組織においては、野生型マウスと比較おける意義を示すことができた。AM-RAMP2 系は、アンして若年期に白色脂肪細胞の割合が多いことから、白色脂チエイジングや、新しい予防・治療法開発のための良いタ肪細胞の分化制御にも AM-RAMP2 システムが関与してーゲット分子として期待される。

いることが示唆された。
以上の結果から、RAMP2 は、脂質の代謝と共に、炎症（引用文献）や線維化抑制など、脂肪組織の恒常性に関与しており、そ

1） Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichikiの破綻は、肥満や皮膚の老化の原因となると考えられた。

Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T: Adrenomedullin:

４．考

a novel hypotensive peptide isolated from human察

pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun

E-RAMP2-/- の主要臓器では、血管炎様の細胞浸潤が1993, 192:553-60.

認められた。これらの血管炎様の所見は、若年期でも認め

2） Nomura I, Kato J, Tokashiki M, Kitamura K: Increased

られるが、生後 6 ヶ月ほど経過した個体において、より広plasma levels of the mature and intermediate forms of範囲に現れた。肝臓では、血管炎様の細胞浸潤のみならず、

adrenomedullin in obesity. Regulatory peptides 2 0 0 9,

肝硬変様の形態変化が確認できた。活性化されたマクロフ

158:127-31.

ァージが多数確認できることから、慢性炎症が起きている

3） McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown

ことが示唆された。また、線維化は中心静脈周辺から広がJ, Thompson N, Solari R, Lee MG, Foord SM: RAMPs

るのではなく、類洞内皮細胞に沿って進行していることか

regulate the transport and ligand specificity of the

ら、類洞内皮細胞の障害が、肝線維化の原因となっている

calcitonin-receptor-like receptor. Nature 1998, 393:333-9.

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コスメトロジー研究報告 Vol.24, 20164） Shindo T, Kurihara Y, Nishimatsu H, Moriyama N,5） Ichikawa-Shindo Y, Sakurai T, Kamiyoshi A, Kawate

Kakoki M, Wang Y, Imai Y, Ebihara A, Kuwaki T, JuH, Iinuma N, Yoshizawa T, Koyama T, Fukuchi J, Iimuro

KH, Minamino N, Kangawa K, Ishikawa T, Fukuda M,S, Moriyama N, Kawakami H, Murata T, Kangawa K,Akimoto Y, Kawakami H, Imai T, Morita H, Yazaki Y,Nagai R, Shindo T: The GPCR modulator protein RAMP2Nagai R, Hirata Y, Kurihara H: Vascular abnormalities

is essential for angiogenesis and vascular integrity. J Clinand elevated blood pressure in mice lacking

Invest 2008, 118:29-39.

adrenomedullin gene. Circulation 2001, 104:1964-71.

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