サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門

善本隆之

In contact hypersensitivity (CHS) induced by haptens such as 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), CD8+ T cells producingIL-17 (Tc17) are important effecter cells. Tc17 cells also produce IL-22, which promotes dermal inflammation, and IL27 is an inhibitory cytokine for the differentiation to helper T-17 cells. The present study suggests that IL-22 producedby Tc17 cells is essential for the CHS reaction at the elicitation phase and that IL-27 inhibits it by suppressing the Tc17differentiation.

１．緒言

２．実

接触過敏症
（CHS）
は、化粧品や漆によるかぶれなどで炎験

2. 1．IL-22 欠損マウスにおけるCHS 反応の解析症が起こるⅣ型アレルギー疾患で、原因となるアレルゲン

2 日前に背部の皮膚の毛剃りをした野生型および IL-22

は、化粧品や漆などに含まれる特定の化学物質である 1, 2）。

欠損マウスの背部皮膚にハプテンとして DNFB を塗布しこの比較的分子量の小さい化学物質（ハプテン）は、体内に感作した。5 日後同じハプテンを片方の耳介に、溶媒のみ侵入し皮膚組織の蛋白質と結合し、この修飾蛋白質に対すを反対の耳介に塗布しその厚さを 24、48、72 時間と経時る免疫応答が誘導される。CHS のエフェクター T 細胞と的に測定した。24 時間後には、それぞれの耳介を切除し+し て 以 前 か ら ヘ ル パ ー CD4 T（Th）1 や 細 胞 傷 害 性+CD8 T（Tc）1 細胞が考えられていたが、最近は、ハプホルマリン固定し、病理組織標本を作製しヘマトキシリン・エオジン（HE）染色し、炎症の程度を比較検討した。

テンが Fluorescein isothiocyanate（FITC）の場合は IL-4の場合は IL-17 を産生する Tc17 細胞が重要なことが明ら

2. 2．IL-22 欠損マウスにおけるDC の所属リンパ節への遊走能の検討かになってきている 3）。IL-22 は、炎症反応により CD4+/

IL-22 の作用機序を調べるため、まず、ハプテンとしてを産生する Th2 細胞が、2,4-Dinitrofluorobenzene（DNFB）+CD8 T 細胞やナチュラルキラー（NK）/NKT 細胞、g dT蛍光を発するハプテンである Fluorescein isothiocyanate細胞などの免疫細胞より産生され、表皮角化細胞などの非（FITC）で感作後、表皮の DC であるランゲルハンス細胞

免疫細胞に作用し、抗菌ペプチドの発現誘導や角化細胞のが抗原を捕らえ所属リンパ節へ遊走する能力を比較検討し増殖、表皮肥厚を引き起こすサイトカインで、Tc17 細胞かた。感作を直接耳で行うため、野生型および IL-22 欠損マらも産生されるが、CHS 反応における役割に関する報告はウスの片方の耳介にハプテンを塗布し、反対の耳介に溶媒4）未だない 。一方、
IL-27 は、マクロファージや樹状細胞（DC）のみを塗布し、24 時間後、それぞれの耳介の所属リンパから産生され、初期の Th1 分化誘導を促進するが、後期の節である顎下リンパ節を取り出した。次に、リンパ節細胞

Th1 分化や Th2 および Th17 分化は抑制するのみならず、の懸濁液を調製し、MHC クラス II と DC に対する抗体でIL-10 を産生する制御性 T 細胞である Tr1 細胞分化を増強染色し、それぞれのダブルポジティブ細胞中の FITC 陽性

し、炎症性サイトカイン産生も抑制する作用を有する多機細胞の割合を FACS を用いて解析した。

能性サイトカインである5−7）。そこで、本研究では、IL-22遺伝子欠損マウスと IL-27 を高発現しているトランスジェニック（Tg）マウスを用いて、CHS 反応における IL-22 の役割とさらに IL-27 の効果について検討を行った。

2. 3．感作した IL-22 欠損マウスの所属リンパ節細胞の再刺激後のサイトカイン産生の検討
次に、IL-22 の Th 分化への影響を調べるため、野生型および IL-22 欠損マウスの耳介を DNFB で感作 5 日後、所属リンパ節である顎下リンパ節を取り出し、in vitro で同じStudies on the regulation of contact
hypersensitivity reaction by cytokines
Takayuki Yoshimoto
Department of Immunoregulation, Instituteof Medica l Science, Tokyo Medica l
University

抗原性を有する水溶性化合物 2,4-dinitrobenzene sulfonate,sodium salt（DNBS）で再刺激し、24、48、72 時間後の培養上清を回収した。その上清中の IL-22、IL-17、IFN- g のサイトカイン量を、それぞれの ELISA により定量した。

− 130 −

サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究2. 4. 惹起時に抗 IL-22 抗体投与の検討

体で刺激 48 時間後の培養上清中の IL-17 や IL-22、IFN-g、IL-22 の 惹 起 相 で の 役 割 を 調 べ る た め に、 ハ プ テ ン

IL-4 などのサイトカイン産生量を ELISA で測定した。

DNFB で感作した野生型マウスの耳介に DNFB を再塗布

３．結する際、抗 IL-22 抗体を投与し耳介厚を測定した。さらに、惹起 24 時間後それぞれの耳介をホルマリン固定し、病理組織標本を作製し HE 染色を行い、炎症の程度を比較検討

果3. 1. IL-22 欠損マウスにおけるCHS 反応が低下するハプテンとして DNFB を用い、野生型マウスおよびIL-22 欠損マウスの CHS 反応への感受性の違いを検討したした。

ところ、IL-22 欠損マウスでは耳介肥厚が約半分に減弱し2. 5. 惹起 24 時間後の耳介でのエフェクター分子の発現解析た（図 1）。さらに、感作 24 時間後の病理組織解析より、ハプテンで惹起 24 時間後のエフェクター分の mRNA 発潤や表皮の肥厚、浮腫などの炎症症状が軽減していた。こ現を比較するため、野生型および IL-22 欠損マウスをハプれより、IL-22 欠損マウスでは DNFB に対する CHS 反応がテン DNFB で感作 5 日後、片方の耳介を DNFB で、反対低下することがわかった。

野生型マウスに比べて IL-22 欠損マウスではリンパ球に浸の耳介を溶媒だけで塗布し惹起した 24 時間後に、耳介よりRNA を抽出し cDNA を調製し、リアルタイム PCR によりIL-22 およびそのシグナル伝達の下流分子 CXC3 や CCL3、3. 2. IL-22 欠損マウスにおけるDC の所属リンパ節への遊走能には影響ない
IL-22 の作用機序を調べるために、まず耳皮膚にハプテ

S100A7 などの発現を比較検討した。

ンとして FITC を感作後 24 時間後、抗原である FITC を捕2. 6. IL-27Tg マウスでの CHS 反応の解析

らえた DC の所属リンパ節への遊走能を比較すると、IL-22

次に、IL-27 の CHS 反応への影響を調べるため、我々が欠損マウスでも野生型マウスと同様に FITC ＋ MHC クラス以前に作製した血清アミロイド P 成分のプロモーターの下II ＋ CD11c ＋ 細胞の所属リンパ節への遊走が見られた。こ流に IL-27 の 2 つのサブユニット EBI3 と p28 をリンカー

れより、IL-22 欠損マウスでは、DC の所属リンパ節へのを挟んで繋いで 1 本鎖 IL-27 を血中に多量に有しているト遊走能には影響がないことが示された。

ランスジェニック（Tg）マウスを用いた 8）。野生型マウス
およびこの IL-27Tg マウスに、上述同様に DNFB をハプテンとして用い感作と惹起を行い、耳介厚を経時的に測定した。また、その際惹起 24 時間後の耳介をホルマリン固定し、3. 3. 感作したIL-22 欠損マウスの所属リンパ節細胞の再刺激後のサイトカイン産生の検討
次に、DNFB で感作後所属リンパ節細胞を in vitro でDNBS で再刺激し、その培養上清中のサイトカイン産生量病理組織学的解析も同様に行った。

を ELISA で測定した。IL-22 欠損マウスでは、IL-22 産生

2. 7. 感作したIL-27Tg マウスの所属リンパ節の再刺激後のサイトカイン産生の検討は全く検出されなかったが、IL-17 産生や IFN-γ 産生にはIL-27 の作用機序を調べるため、上述と同様に感作したマウスは、DNFB に対する T 細胞分化には影響しないこと+マウスの所属リンパ節細胞から CD8 T 細胞を AutoMACS有意な差は見られなかった（図 2）。これより、IL-22 欠損が示された。

Pro を用いて精製し、in vitro で抗 CD3 抗体と抗 CD28 抗

図1

IL-22 欠損マウスでは、CHS 反応で耳介厚と炎症反応が低下する− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図2

図3

IL-22 欠損マウスでは、Th17 や Th1 分化には影響しない

IL-27Tg マウスでは、CHS 反応で耳介厚と炎症反応が低下する

3. 4. 惹起時に抗 IL-22 抗体投与によるCHS 反応が低下する

3. 6. IL-27Tg マウスでの CHS 反応の低下
次に、IL-27Tg マウスを用いて IL-27 による CHS 反応へDNFB で感作した野生型マウスに惹起直前に抗 IL-22 抗の効果を調べると、IL-27Tg マウスでは野生型マウスに比体を投与し、DNFB で惹起すると、コントロール抗体を投べ耳介の肥厚が顕著に減少し、病理組織学的解析よりリン与したマウスに比べ耳介厚が有意に半減し、さらに病理組パ球の浸潤や表皮の肥厚、浮腫などが減弱していた（図 3）。

織学的にもリンパ球の浸潤や表皮の肥厚、浮腫などが減弱

これより、IL-27 は CHS 反応を抑制することが抑制するこしていた。これより、IL-22 は、CHS 反応の惹起時に作用とがわかった。

していることが明らかになった。

3. 7. 感作したIL-27Tg マウスの所属リンパ節の再刺激
3. 5. 惹起 24 時間後の耳介でのエフェクター分子の発現解析

IL-27 による CHS 反応の抑制の作用機序を調べるため、さらに、DNFB で感作・惹起 24 時間後の耳介皮膚での感作した IL-27Tg マウスの所属リンパ節細胞の CD8+T 細エフェクター分子の発現を調べると、IL-22 欠損マウスで胞を、in vitro で抗 CD3 抗体で刺激した上清中のサイトカは IL-22 発現は、ほぼ検出されず、IL-22 シグナルの下流イン産生を ELISA で調べると、IFN-γ 産生は野生型マウに位置するエフェクター分子である CXCL3 や CCL3 など

スと変わらなかったが、IL-17 や IL-22 産生は顕著に減少のケモカインや、抗菌ペプチドで好中球などの遊走にも関していた。IL-27 は、Tc17 分化を抑制し CHS 反応を阻害

与 す る S100A7 発 現 が 低 下 傾 向 に あ っ た。 こ れ よ り、することが示された。

後のサイトカイン産生の検討

IL-22 欠損マウスでは、惹起時に IL-22 の下流のシグナルが低下していることが示された。

− 132 −

サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究

図 4 IL-22 は惹起相でのエフェクター機構に重要で、IL-27 は Tc17 分化を阻害し CHS 反応抑制する

４．考JF. Effector and regulatory mechanisms in allergic

察contact dermatitis. Allergy, 64, 1699-714, 2009.

以上より、DNFB をハプテンとして用いた CHS 反応に３）Kish DD, Li X, Fairchild RL. CD8 T cells producing

おいて、IL-22 は感作相である Tc/Th 分化には強くは影響

IL-1 7 and IFN-gamma initiate the innate immune

しないが、惹起相においてケモカインなどのエフェクター

response required for responses to antigen skin

分子の発現を増強し、CHS 反応の誘導に重要な役割を担

challenge. Journal of immunology, 182, 5949-59, 2009.っていることが明らかになった（図 4）。さらに、IL-27 は、

４）Zheng Y, Danilenko DM, Valdez P, Kasman I,この DNFB で誘導される CHS 反応において、Tc/Th17 分

Eastham-Anderson J, Wu J, Ouyang W. Interleukin-22,化を阻害し IL-17 や IL-22 産生を低下することで抑制効果

a T(H)1 7 cytokine, mediates IL-2 3-induced dermalを発揮することが示された。IL-27 による阻害効果の作用

inflammation and acanthosis. Nature, 445, 648-51, 2007.

機序としては、IL-27 が CD8+T 細胞中の Tc17 分化に重要

５）Hall AO, Silver JS, Hunter CA. The Immunobiology

な RORgt や RORa などの転写因子発現を低下させている

of IL-27. Adv Immunol, 115, 1-44, 2012.

可能性が考えられる。本研究より、接触過敏症において、

６）Hunter CA, Kastelein R. Interleukin-2 7: balancing

IL-22 発現や機能の阻害剤やその中和抗体、さらに、IL-27

protective and pathological immunity. Immunity, 3 7,投与が治療効果を示す可能性が示唆された。

960-9, 2012.
７）Mizoguchi I, Higuchi K, Mitobe K, Tsunoda R,

謝辞

Mizuguchi J, Yoshimoto T. Interleukin-2 7: Regulation

本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団よof immune responses and disease development by a

りご支援頂きましたことに心より感謝感謝申し上げます。

pleiotropic cytokine with pro- and anti-inflammatory

また、共同研究者として多大なるご協力を頂いた兵庫医科properties. In: Yoshimoto T, Yoshimoto T, eds.

大学免疫学・医動物学講座教授・善本知広先生に深謝致し

Cytokine frontiers: Regulation of immune responses inます。

health and disease. Springer, 2013; 353-75.
８）Seita J, Asakawa M, Ooehara J, Takayanagi S,（引用文献）

Morita Y, Watanabe N, Fujita K, Kudo M, Mizuguchi

１）Kaplan DH, Igyarto BZ, Gaspari AA. Early immune

J, Ema H, Nakauchi H, Yoshimoto T. Interleukin-2 7

events in the induction of allergic contact dermatitis.

directly induces differentiation in hematopoietic stem

Nat Rev Immunol, 12, 114-24, 2012.

cells. Blood, 111, 1903-12, 2008.

２）Vocanson M, Hennino A, Rozieres A, Poyet G, Nicolas− 133 −