皮膚老化における11b -hydroxysteroid dehydrogenase type 1の役割

大阪大学大学院医学系研究科皮膚科学講座

寺 尾

美 香

Glucocorticoids (GCs) are one of the most effective anti-inflammatory drugs to treat acute and chronic inflammatory
diseases. However several studies show that GCs alter collagen metabolism in the skin and induce skin atrophy. Cortisol isthe endogenous GC that is released in response to various stressors. Over the last decade, extraadrenal cortisol production
in various tissues is reported. Skin is also known to synthesize cortisol though de novo pathway and through activating
enzyme. 11b-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11b-HSD1) is the enzyme that catalyzes the conversion of hormonallyinactive cortisone into active cortisol in cells. We previously found that 11b-HSD1 is negatively regulating proliferation of
keratinocytes. To know the function of 11b-HSD1 in dermal fibroblast and collagen metabolisum, the effect of selective
11b-HSD1 inhibitor was studied in mouse tissues and dermal fibroblasts. The expression of 11b-HSD1 increased with age
in mouse skin. Subcutaneous injection of selective 11b-HSD1 inhibitor increased dermal thickness, and collagen content of
the mouse skin. Proliferation of dermal fibroblasts significantly enhanced in cells derived from 11b-HSD1 knockout micecompared with cells derived from wildtype mice. Taken together, these data suggest that 11b-HSD1 is involved in collagenmetabolism in the skin possibly by decreasing the proliferation of dermal fibroblasts. Our findings suggest that 11b-HSD1
inhibition may reverse the decreased collagen content observed in intrinsically and extrinsically aged skin and in skin
atrophy that is induced by GC treatment.

１．緒言

コルチゾールは身体的・精神的ストレス時に副腎から産生され、代謝・血圧・血糖をコントロールする生体に必須のホルモンである。血中のコルチゾール濃度は組織中の濃度を反映すると考えられているが、局所コルチゾール修飾酵素の発見より必ずしも組織中の濃度が血中の濃度と反映しないことが明らかにされつつある。近年、我々のグループと他グループより表皮ケラチノサイトもコルチゾールの再活性化酵素とde novo 合成酵素をもつことが報告された 1−4）。
局所コルチゾール修飾酵素の一つである11β-hydroxysteroid
dehydrogenase（11β-HSD）は細胞内でコルチゾールを再活

図１

性化する酵素（図１）であり、2001 年に脂肪細胞に特異的

局所コルチゾール制御機構

な発現上昇がメタボリック症候群を引き起こすと報告されて以降、肥満・高血圧やメタボリック症候群の原因の一つ
5）ており、組織中の11 β - HSD 1 の上昇が発症に関与することとして研究が進んでいる酵素である 。特に、肥満の予防は興味深く、皮膚などの他臓器で同様の現象がおきている薬・高血圧の治療薬といった観点より、現在・多施設におことを推測させる。

い て、11 β-HSD 1 阻 害 薬 の 開 発 が な さ れ て い る。 ま た、

皮膚老化には内因性の老化（生理的老化）と外因性の老2010 年に高齢マウスにおける11 β-HSD 1 発現の上昇が骨粗化があり、内因性の老化は遺伝的変異、外因性の老化は紫鬆症にも関与することが報告されており、緑内障の発症病

外線、喫煙、アルコール摂取などの影響をうける 7）。生理態に関わるという報告もある 6）。肥満や骨粗鬆症、緑内障

的老化により、肉眼的には、皺、たるみ、乾燥などが認めはその発症の原因の一つとしてコルチゾールが良く知られられ、表皮―真皮の接合力が弱くなり、軽微な外傷や摩擦で両者が開離し容易に水疱やびらんが形成される。機能的には創傷治癒の遅延、刺激に対する炎症応答の減弱、易感
染性などがみられる。病理組織学的には、表皮突起の短縮

The role of 11 b- hyd roxysteroid
dehydrogenase type 1 in skin aging
Mika Terao
Department of Dermatology Osaka
University Graduate School of Medicine

がおき、表皮―真皮の境界が扁平化する。また、真皮線維芽細胞の数が減少し、基質を形成するグリコサミノグリカ
ンも減少する 8）。高齢者の真皮線維芽細胞は若年者に比べてコラーゲン産生量が低いことも報告されている 9 , 10）。

− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

我々はこれらの生理的老化に伴う変化がグルココルチコイ

sodium dodecyl sulphate, 100µg/ml phenylmethylsulphonyl

ド過剰に伴う皮膚変化と類似することに注目した。

fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, protease inhibitor

グルココルチコイド剤は強力な抗炎症作用のために、内

cocltail）で皮膚組織のタンパク質を４度 over night で撹拌

服薬としても外用薬としても頻用される薬剤である。しかしながら溶解させた。遠心分離した後、上清の蛋白溶解液

し、短期的にはグルココルチコイドの増加は組織の生存にをサンプルとした。

働くが、ストレスに伴う慢性的な内因性のコルチゾール増調製したサンプルを 10％のポリアクアミドゲルにて加や外因性のグルココルチコイドは、糖尿病や高脂血症、0.02A で 80 分間電気泳動した。電気泳動後のゲルを用いて、白内障、骨粗鬆症を引き起こすことが知られている。また、

PVDF メンブレンへの転写を 0 . 15 A で 45 分間行った。転長期間のグルココルチコイド剤の内服や外用の副作用の一写後のメンブレンを３% スキムミルクにて 60 分間ブロッ

つとして、皮膚の萎縮、脆弱化、易感染性、創傷治癒の遅キング後、一次抗体を４度 over night で反応させた。メン延が引き起される。皮膚の萎縮は主にコラーゲン合成とグ

ブレンを３% スキムミルクで３回洗浄した後、HRP 標識

11）

リコサミノグリカン合成の低下によるものであり 、ヒト

二次抗体 anti-rabbit lgG、anti-rat IgG、anti-mouse lgG をの皮膚において、グルココルチコイドの全身投与や外用は60 分間反応させた。TBS-T で洗浄した後、Pierce Western

タイプ１コラーゲンとタイプ３コラーゲン合成を低下させ

Blotting Substrate Plus（Thermo Fisher Scientific Inc）

12）

ることが報告されている 。このように、長期間のグルコを用いて発色した。

コルチコイド過剰に伴う皮膚萎縮は病理組織学的、分子生

2.4

物学的に生理的老化と共通するところが多い。

MTSアッセイ

本研究では、マウス皮膚における 11 β-HSD 1 発現が年齢

96 well plate に皮膚線維芽細胞を１well あたり細胞数１と と も に 上 昇 す る こ と に 着 目 し、 皮 膚 老 化 に お け る

× 103 個ずつ 10 %FBS 添加 DMEM で培養した。培養した翌

11 β-HSD 1 の役割を 11 β-HSD 1 阻害薬及び、ノックアウト

日を１日後とし、２日後、３日後、６日後にMTS試薬（Promega,

マウス、表皮角化細胞・真皮線維芽細胞を用いて検討した。

Madison, WI, USA）を１well あたり 20 µl ずつ添加し、２

２．実
2 .1

時間インキュベートした後、吸光計（Bio-Rad, Hercules,

験CA, USA）を用いて吸光度（490 nm）で測定した。

細胞培養

生後１日のマウスから採取した皮膚組織を４mg/ml

2.5

免疫組織学的染色

PBS で調整した Dispase（GIBCO, Carlsbad, CA）に浸し、ヒト健常皮膚組織（パラフィン包埋）を薄切し、キシレ

37 度１時間インキュベートの後、真皮から表皮を剥離しンで脱パラフィン、エタノールで脱水を行った。クエン酸

た。得られた真皮を 0 . 05 % collagenase 内で 37 度の恒温槽

バッファー（pH 6 . 0）による熱処理（oil bath 110 度）で抗に 40 分間浸して振揺させた後、70 µm filter を用いてろ過し、原賦活処理を 10 分間行ったのちに常温まで冷却、蒸留水

10% FBS 添加 Dulbecco’s Modified Eagle medium（DMEM）

で洗浄した後、DAKO Protein Block Serum Free（Dako,を用いて培養した。

Carpinteria, CA）で室温 15 分 blocking を行った。Antibody
Diluent（Dako）で１次抗体 rabbit anti- 11 β-HSD 1（Abcam）

2.2

RNAの抽出と逆転写反応・リアルタイム PCRおよび mouse anti-keratin 14（Abcam）を 100 倍希釈し、４ST Total RNA Isolation System（Promega, Madison,

度 で 12 時 間 反 応 さ せ た。TBS-T（50 mM Tris-HCl,

WI）を用いて、プロトコールに従いマウスから得た皮膚組

pH 7 . 6 , 150 mM NaCl, 0 . 1 % v/v Tween- 20）で５分間２回

織 か ら mRNA を 回 収 し た。RT-MLV（invitrogen, Lincoln

洗浄した後に二次抗体を反応させた。

Center Drive Foster City, CA）を用いて mRNA の逆転写を３．結行い、cDNA を得た。cDNA を template とし、試薬 PowerSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystem）に て

3 .1

果

皮膚における11β-HSD 1の発現サンプルを調整した。ハウスキーピング遺伝子として表皮角化細胞における 11 β-HSD 1 発現を図 2 A に示す。

GAPDH（glyceraldehyde- 3 -phosphate dehydrogenase） を健常皮膚では 11 β-HSD 1 は有棘細胞を中心に発現しており、用いた。

基底層ではその発現はほとんどみられなかった 13）。また、
表皮角化細胞における 11 β-HSD 1 発現は IL- 1 β や TNFa な

2.3

ウエスタンブロット

どの炎症性サイトカイン、ハプテンや紫外線などの炎症刺マウスから背部の皮膚組織を採取し、液体窒素を用いて激により誘導されることがわかった（図２）14）。

皮膚組織を粉砕し、更に超音波処理を行ったのちに、Lysis
Buffer 2ml（0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidetp40, 0.1%

− 124 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

3.2

マウス皮膚における11β-HSD 1の発現ていた（図 3 B）。

新生マウス、３週マウス、２ケ月マウス、８ケ月マウスの皮膚組織の 11 β -HSD 1 発現をウエスタンブロットで検討したところ、成長とともにその発現の増加がみられた（図3 . 3 11β-HSD 1阻害により表皮角化細胞および真皮線維芽細胞の増殖能が亢進した

3 A）。また、真皮線維芽細胞を単離し培養後 RNA を抽出し、マウスより表皮角化細胞、真皮線維芽細胞を単離し、増mRNA レベルでの 11 β-HSD 1 発現を検討したところ、１

殖能を MTS アッセイで検討したところ、11 β-HSD 1 阻害

年マウスより単離した真皮線維芽細胞では新生マウスよりにより細胞増殖が有意に亢進することより、11 β-HSD 1 は単離した真皮線維芽細胞に比べてその発現が有意に上昇し細胞増殖を負に制御していると考えられる（図４）。

図２ ヒト健常皮膚における 11β-HSD1 発現
免疫蛍光染色像。11β-HSD1：赤、 K14：緑
Bar = 50μM
B 表角化細胞に IL-1β、TNFα 添加後の 11β-HSD1
発現量（ウエスタンブロッティング）
A

図３ マウス皮膚における 11β-HSD1 発現新生マウス、３週マウス、２ケ月マウス、８ケ月マウスの皮膚の11β-HSD1 発現量（ウエスタンブロッティング）
B 生後４日および１年マウス皮膚線維芽細胞における 11β-HSD1
発現量（RT-PCR）A

図４ 11β-HSD1 阻害は表皮角化細胞、真皮線維芽細胞の増殖を促進した
11β-HSD1 阻害薬を投与 72 時間後に BrdU アッセイ（表皮角化細胞）、
MTS アッセイ（真皮線維芽細胞）で細胞増殖能を測定した。

− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3.4

11β-HSD 1阻害は表皮過剰増殖を引き起こした

3.5

11β-HSD 1阻害により真皮コラーゲンが増加した

ヘアレスマウス（Hos : HR-1）に 11β-HSD1 阻害薬（50 µM）

真 皮 に お け る 11 β-HSD 1 の 役 割 を 検 討 す る た め に、を５日間外用後の表皮を観察したところ、表皮の肥厚およC 57 BL/ 6 マ ウ ス に 21 日 間 11 β-HSD 1 阻 害 薬 を 皮 下 投 与び、Ki- 67 陽性の増殖細胞の増加がみられた（図５）。この（10 µM）し、最終投与日の翌日に皮膚を回収し解析した。

結果より、in vivo においても 11 β-HSD 1 は表皮角化細胞

11 β-HSD 1 阻害薬を投与した皮膚では真皮の厚さが著明にの増殖を負に制御していることがわかる。

亢進しており、ウエスタンブロットでコラーゲンタイプ
1 a 1 の発現量が有意に上昇していた（図６）。これらの結図５ 11β-HSD1 阻害薬の外用は表皮を増殖させた
A, C ヘアレスマウス（Hos : HR-1）に 11β-HSD1 阻害薬（50μM）を５日間外用後の HE 染色像（A) と Ki-67 免疫染色像（C) Bar=100μM
B 表皮の厚さ（N=5）
D Ki-67 陽性細胞数（％）（N=5）

図６ 11β-HSD1 阻害により真皮コラーゲンが増加した
11β-HSD1 阻害薬（10μM）
を 21日間皮下投与後の HE 像とマッソントリクローム染
色像 Bar=100μM
B 真皮の厚み（N=6）
C, D コラーゲン 1α1（Col1A1）の発現量（ウエスタンブロッティング）
A− 126 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

果より、真皮のコラーゲン増生を 11 β-HSD 1 は負に制御していることがわかる。

3 . 8 11β-HSD 1による低濃度コルチゾールの誘導は炎症を正に制御した
培 養 表 皮 角 化 細 胞 の 11 β-HSD 1 を ノ ッ ク ダ ウ ン し、

3.6

11β-HSD 1阻害により創傷治癒が促進した

IL- 1 β、TNFa 誘導性の向炎症性サイトカインである IL- 6、

11 β-HSD 1 阻害によるマウス皮膚の創傷治癒を検討した。

IL- 8 を ELISA で測定したところ、11 β-HSD 1 ノックダウ

C 57 BL/ 6 マ ウ ス 背 部 に 作 成 し た ８mm 大 の 創 傷 にン細胞では向炎症性サイトカイン産生が低下していた（図11 β-HSD 1（10 µM）を２日毎に投与し、創傷面積を測定

９）14）。この結果より、11 β-HSD 1 による低濃度コルチゾしたところ、阻害薬投与群では有意に創傷治癒の促進がみールの誘導は炎症を正に制御していることがわかる。

られた（図７）
。

3.7

４．考

コルチゾールの濃度と炎症察

本研究では、マウス皮膚における加齢に伴う 11 β-HSD 1

グルココルチコイドは強い抗炎症作用を持つことより、増加が皮膚老化に及ぼす影響を 11 β-HSD 1 ノックアウトマ

様々な炎症疾患の治療に用いられているが、低濃度では、

ウスおよび 11 β-HSD 1 阻害薬を用いて検討した。マウス皮向炎症作用を持つことが報告されている。表皮角化細胞に

膚ではヒトの非露光部皮膚と同様に、加齢とともに真皮の−10おいても、低濃度コルチゾール（10M）
は IL- 6 産生を誘導

ひ薄化がみられコラーゲンが疎となる。加齢とともに

−5

14）

11 β-HSD 1 発現が上昇すること、加齢皮膚がコルチゾール

したが、高濃度コルチゾール（10M）は抑制した（図８） 。

図７ 11β-HSD1 阻害は皮膚創傷治癒を促進した
マウス皮膚に８ mm 大の創傷を作成し、11β-HSD1 阻害薬（10μM）を２日毎に外用した。
A, B C57BL/6 マウス創傷作成後 10 日目の写真（A）と創傷面積（％）（B）
。

図８ コルチゾール濃度と炎症
培養表皮角化細胞を様々な濃度のコルチゾールで培養し、IL-1β 誘導性 IL-6 を ELISA で測定した。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

図９ 11β-HSD1 阻害は炎症を抑制した
培養表皮角化細胞の 11β-HSD1 を siRNA でノックダウンし、IL-1β、TNFα 誘導性の IL-6、IL-8 を ELISA で測定した。11β-HSD1siRNA : 11β-HSD1 ノックダウン細胞、Neg.siRNA :コントロール細胞投与に伴う副作用でみられる皮膚委縮と類似することより、

11 β-HSD 1 阻害が有効ではないかと期待される。さらに、

11 β-HSD 1 発現の上昇に伴う細胞内におけるコルチゾール

最近の我々の結果より、11 β-HSD 1 は皮膚の炎症応答にも濃度の上昇は、加齢でみられる真皮のひ薄化、コラーゲン

重要な役割を果たしていることがわかり、加齢に伴う炎症の減少に影響を及ぼしているのではないかと考えさらに解の増幅に関与している可能性が示唆される。

析をすすめた。まず、真皮線維芽細胞の増殖に及ぼす
11 β-HSD 1 の影響をノックアウトマウス由来の真皮線維芽細胞で検討したところ、野生型マウス由来真皮線維芽細胞に比べて有意に上昇していたことより、11 β-HSD 1 の発現謝

辞本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団より研究助成を頂きましたことを深謝致します。

上昇は真皮線維芽細胞の増殖に抑制的に働くことが示唆された。次に、11 β-HSD 1 阻害薬を皮下投与したところ、真（引用文献）

皮の厚みが増加し、コラーゲン 1 a 1 発現量が上昇したこ

１）Terao M, Murota H, Kimura A, et al. 11 beta-

ろより、11 β-HSD 1 を阻害すると真皮のひ薄化、コラーゲ

Hydroxysteroid dehydrogenase- 1 is a novel regulator

ンの減少が改善、すなわち、加齢に伴う変化を改善するこof skin homeostasis and a candidate target forとがわかった。

promoting tissue repair. PLoS One 2011 : 6 : e 25039 .

このように加齢や肥満に伴う機能的変化に 11 β-HSD 1 が２）Tiganescu A, Walker E A, Hardy R S, Mayes A E,

関与していることが考えられるが、加齢に伴う形態的変化

Stewart P M. Localization, age- and site-dependentにおける 11 β-HSD 1 の関与は定まった見解がない。最近、expression, and regulation of 11 beta-hydroxysteroid

11 β-HSD 1 ノックアウトマウスにおいて、加齢に伴う真皮

dehydrogenase type 1 in skin. J Invest Dermatol 2011 :15）

コラーゲン量の減少が抑制されたと報告されたが 、我々

131 : 30 - 36 .

が作成した 11 β-HSD 1 ノックアウトマウスでは６ケ月マウ

３）Cirillo N, Prime S S. Keratinocytes synthesize andス皮膚、１年マウス皮膚においてそのような結果は得られ

activate cortisol: first characterisation of a novel

なかった。

epidermal glucocorticoid system. J Cell Biochem 2011 .

５．総４）Vukelic S, Stojadinovic O, Pastar I, et al. Cortisol

括synthesis in epidermis is induced by IL- 1 and tissue

皮膚の生理的老化はグルココルチコイド過剰状態による

injury. J Biol Chem 2011 : 286 : 10265 - 10275 .

皮膚変化と類似するために、細胞内コルチゾール再活性化

５）Masuzaki H, Paterson J, Shinyama H, et al. A酵素である 11 β-HSD 1 の皮膚老化における役割を解析した。

transgenic model of visceral obesity and the metabolic

高齢者や肥満に伴う細胞増殖能の低下や創傷治癒の遅延

syndrome. Science 2001 : 294 : 2166 - 2170 .

には 11 β-HSD 1 に伴う局所コルチゾールの上昇が関与して

６）Weinstein R S, Wan C, Liu Q, et al. Endogenous

い る と 考 え ら れ、 高 齢 者 に み ら れ る 難 治 性 の 潰 瘍 にglucocorticoids decrease skeletal angiogenesis,− 128 −

皮膚老化における 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 の役割

vascularity, hydration, and strength in aged mice. In:

12）Oikarinen A, Haapasaari K M, Sutinen M, Tasanen
K. The molecular basis of glucocorticoid-induced skin

Aging Cell, 2010 : 147 - 161 .
７）Uitto J. Understanding premature skin aging. N Engl

atrophy: topical glucocorticoid apparently decreases
both collagen synthesis and the corresponding collagen

J Med 1997 : 337 : 1463 - 1465 .
８）Naylor E C, Watson R E, Sherratt M J. MolecularmRNA level in human skin in vivo. Br J Dermatol
1998 : 139 : 1106 - 1110 .

aspects of skin ageing. Maturitas 2011 : 69 : 249 - 256 .
９）Fisher G J, Quan T, Purohit T, et al. Collagen13）Terao M, Itoi S, Murota H, Katayama I. Expression

fragmentation promotes oxidative stress and elevates

profiles of cortisol-inactivating enzyme, 11 beta-matrix metalloproteinase- 1 in fibroblasts in agedhydroxysteroid dehydrogenase- 2 , in human epidermal

human skin. Am J Pathol 2009 : 174 : 101 - 114 .

tumors and its role in keratinocyte proliferation. Exp

10）Varani J, Dame M K, Rittie L, et al. Decreased

Dermatol 2013 : 22 : 98 - 101 .

collagen production in chronologically aged skin: roles

14）Itoi S, Terao M, Murota H, Katayama I. 11 beta-of age-dependent alteration in fibroblast function andHydroxysteroid dehydrogenase 1 contributes to thedefective mechanical stimulation. Am J Pathol 2006 :pro-inflammatory response of keratinocytes. Biochem

168 : 1861 - 1868 .

Biophys Res Commun 2013 : 440 : 265 - 270 .

11）Haapasaari K M, Risteli J, Koivukangas V, Oikarinen

15）Tiganescu A, Tahrani A A, Morgan S A, et al.

A. Comparison of the effect of hydrocortisone,

11 beta-Hydroxysteroid dehydrogenase blockadehydrocortisone- 17 -butyrate and betamethasone on

prevents age-induced skin structure and function

collagen synthesis in human skin in vivo. Acta Derm

defects. J Clin Invest 2013 : 123 : 3051 - 3060 .

Venereol 1995 : 75 : 269 - 271 .

− 129 −