日光老化について ─とくに日光弾性線維症の発症機構
sならびに UV 症候群の病態に関する研究─
熊本大学

小医学部皮膚科

野友道

Long-term incubation of proteins with glucose leads to the formation of advanced glycation end products (AGEs), which arecharacterized by fluorescence, brown color, and cross-linking. AGEs are thought to be involved in aging and age-enhanced
diseases. Chronic exposure of the skin to sunlight induces hyperplasia of the elastic tissue in the upper dermis known as
actinic elastosis.
Herein we used a monoclonal anti-AGE antibody (6D12) and a rabbit polyclonal anti-AGE antibody, which are shown torecognize Nε-(carboxymethyl)lysine (CML) as those epitope. Fifty-seven skin samples of sun-exposed and -unexposed areas
were obtained from 51 patients aged 9 − 100 years. Immunohistochemically, CML deposition was observed in the elastic
materials from all these specimens showing actinic elastosis with marked elastic-tissue changes. In contrast, CML deposition
was not found in the specimens from sun-unexposed areas without significant actinic elastosis. Immunoelectron microscopic
examination demonstrated that CML accumulated predominantly in elastic fibers especially in the amorphous electron-densematerials corresponding to photo-induced degenerated area rather than the electron-lucent region. Immunochemical analyses
with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of elastase-soluble fractions demonstrated that the CML levels of the sunexposed area were significantly higher than those of the sun-exposed area.
These results indicate that elastin in actinic elastosis lesions of photoaged skin is modified by CML which has been
proposed as a potential biomarker of oxidative damage of tissue proteins in vivo. Although it is not clear whether AGE
accumulation in the skin per se is a cause of the disease or simply its effect, it could at least serve as a biomarker for theduration and severity of oxidative damage to the skin in vivo. To support this idea, further studies are needed to elucidate
direct effects of UV irradiation on the formation of AGEs in vivo and in vitro.

１．緒

今回は日光弾性線維症の発症機作について検討する。

言

２．実

太陽から限り無い恩恵を享受され、その太陽を神と崇めて来たヒトが、太陽の陰の部分を認識しはじめたのはそう

２. １

日光弾性線維症について

２. １. １

古い話ではない。1970 年代のオゾン層の破壊と皮膚がん

験

材料および方法の関連が指摘され、急速に紫外線による皮膚への障害が注腫瘍などの外科的に切除された皮膚の周辺正常部を、ホ目を浴びたのである。我々はこの紫外線の皮膚への影響を、

ルマリン固定ならびに− 80℃で凍結保存された９歳から二つの観点に焦点を当てて研究を進めている。すなわち慢100 歳の 51 名 57 件体を用いた。免疫組織学的検索に用い性日光障害としての日光弾性線維症の発症機構、そして遺た抗体は堀内らが開発した抗 AGE ポリクローナル抗体３）、伝性日光過敏性疾患の発症解明と診断システムの開発であ抗 CML 抗体（６D 12）４）を用いた。
免疫組織学的観察：凍結切片を用いて AGE の存在およる。
日光弾性線維症については、皮膚真皮の弾性線維の変化び分布を検索した。新鮮凍結組織に凍結組織包埋剤（OCT-が主体であるが、その変性にメイラード反応が関与する事

compound, TISSUE-TEK 社）を加えた後、クリオスタッを我々ははじめて明らかにした１）。すなわち、メイラード

トで、６µm に薄切し、gelatin-coated glass slide に貼付、反応後期反応生成物（AGE: Advanced Glycation Endprod-

室温で２４時間風乾した。その後４℃アセトンで 10 分固ucts）の弾性線維への沈着を確認し、現在種々の抗 AGE 抗定、メタノール処理後３％過酸化水素水に 10 分浸し、内２）体を作成し 、その詳細を検討している。 また後者に関因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。PBS で 10 分しては、新しい疾患概念 Uv s 症候群を確立し、また遺伝間、３回洗浄後、一次抗体として５％ウマ血清アルブミン性日光過敏性疾患診断フローチャートの作成を試みている。

を含んだ PBS で 1000 倍に希釈した CML（carboxymethyl

Phtoaging − Studies on the pathogeneisisof actinic elastosis and the diagnostic
method for UVs syndrome −lysine protein）をエピトープとした polyclonal、およびmonoclonal anti-AGE antibody、および 4000 倍に希釈した mono-clonal anti-bovine alpha-elastin antibody（ElastinTomomichi OnoProduct Company）を用いて、４℃で一昼夜反応させた。

Department of Dermatology, Kumamoto
University School of Medicine

次に PBS で 10 分間、３回洗浄後ビオチン化抗マウス IgG,抗体にて 30 分間反応させた。さらに PBS で５分間３回洗浄後 avidin-biotinylated peroxidase complex（Vectastain− 52 −

日光老化について−とくに日光弾性線維症の発症機構ならびに UVS 症候群の病態に関する研究−社）にて 45 分間反応させた。DAB・H 202 にて発色、He-pornent 抗体５）ならびに抗 HB- ８抗体陽性６）、４）電顕的matoxylin で核染色を行い脱水封入した。対照試験にはに弾性線維構造を示す部分があること、また酸オルセイン

monoclonal

染色陽性であることなどから本物質が弾性線維由来である

anti-AGE antiboidy を AGE-BSA で吸収して用いる吸収試験を行った。

ことが示唆され、elastotic material とも呼ばれている。そ電顕観察： 通常電顕用は Karnovsky 液で前固定、PBの産生機序として、既存の弾線維の変性あるいは紫外線の洗浄後２％オスミウム酸で固定した。エタノール系列で脱影響で変化した線維芽細胞が異常な弾性線維前駆物質分泌水、Epon 812 で包埋した。薄切後クエン酸鉛と酢酸ウラにより、異常な弾性線維形成などの説７）がある。また elas-ニウムで二重染色および一部の切片についてはタンニン酸

totic material がその の増加が顕著なのは、lysozyme によ染色を行った。免疫電顕用には post-embedding 法を用いる elastase の分解抑制がおこるとの説８）もある。いずれにた。LR White resin 包埋後超薄切片を、金コロイド法で、せよ elastotic material 形成の機序は全く不明である。

抗 CML 抗体を 15 nm, 抗エラスチン抗体には６nm で標識

３. ２ 日光弾性線維症とメイライード反応後期生成物した。
動物実験：ヘアレスマウス（Hos:Hr- 1 , 雄、試験開始時（AGE）７週齢）を用いた。紫外線照射はタイマーを用いて 8：00

３. ２. １〜 20 時の間、15 週、30 週および 45 週毎日照射した。紫cation

メイラード反応後期生成物（advanced glyendproducts, AGE）について９）外線強度は紫外線照度計（UVR 305 / 365 D Ⅱ, TOPCON 製）

多くの蛋白質が生体内で非酵素学的修飾、メイラードで一ヶ月ごとに補正した。肉眼的観察、病理組織学的およ（Maillard）反応を受ける。この反応は古く 1912 年 Mail-

び免疫組織学的検討を行った。

lard 10）が、アミノ酸と還元糖を加熱すると黄褐色色素が生成されることを発見したことから始まる。蛋白質のアミノ３．結果と考察
３. １

背酸と還元糖のカルボニル基とが反応し、シッフ塩基、さら景にアマドリ転位生成物を形成する前期反応と、これらの紫外線は長波長（320−400 nm）、中波長（290−320 nm）

前期反応生成物がさらに酸化、脱水、縮合、環状化などのおよび短波長に区分されている。それぞれ UVA、UVB そ反応を経由して、メイラード反応後期生成物（advancedして UVC と略記される。UVC はオゾン層が破壊されなglycation end-products，AGE）にいたる後期反応がある。

ければ地上に届くことはない。一方、UVA はその地表へ

すなわち、AGE は蛋白の非酵素的糖付加反応によって不の到達量は UVB の 10 倍以上である。幸い UVA の光生

可逆的に生成された構造の総称である。現在迄に明らかに物学的効果は UVB の 1 / 1000 とみなされている。つまりされてきた AGE 構造体は、CML（カルボキシメチルリジUVA は安全な紫外線と思われて来たのである。小麦色にン）、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、X 1、ピロピ

焼けた肌が健康のシンボルとされていたのである。いわゆ

リジンなどである。当初、本反応は食品化学領域で重視さる「日焼けサロン」はその一つの現象である。しかし、最れてきた。しかし、1960 年代に入りアマドリ転 生成物と近 UVA の皮膚への影響が注目され始めている。一つはしてのヘモグロビン A 1 c が血糖コントロールの指標としUVB との相乗的に作用し、それは日光発がんと関係するて応用されるようになり、生体でのメイラード反応が注目こと。もう一方で UVA が真皮深く到達するために、線維されるようになった。すなわち、老化あるいは粥状動脈硬芽細胞にまでその影響をおよぼし、光老化のフリーラジカ化症、糖尿病などとの関連が知られて来た。特に CMLル説からも、その影響を無視できないことである。さらに形成において、酸化がが重要な意義を有することが明かと高齢社会の今日、日光老化による発がんと皮膚の老化が社なるにつれ、CML が glycoxidation products（GOP）と会生活において、その QOL を著しく低下させていることして提唱され、生体蛋白質の糖化および酸化を反映する指が認識されねばならない。

標となることが示唆されて来た。CMLs はその産生過程で、我々はこのような観点から、日光老化、なかんずくそのもっとも顕著な病理学的変化である「日光弾性線維症」の活性酸素が産生され、それが生体分子を損傷し、またさらに AGE 形成を促進したりするのである。

について検討している。
３. ２. ２

さて、日光弾性線維症は病理組織学的に真皮網状層に好塩基性に染まる彎曲・ちじれ・膨化した線維として観察さ日光弾性線維症における AGE 局在光顕・免疫組織学的レベルでの局在：我々は堀内らが作れる。高度になるとそれは一塊となり、無均質な塊状物質成したポリクローナルおよびモノクローナル抗 AGE 抗体として観察される。この断列した線維あるいは塊は、１）（６D 12、CML をエピトープ）を用いて、日光弾性線維症

光顕的に弾性線維染色陽性、２）
抗エラスチン抗体陽性、３）病変部に AGE が局在することを免疫組織学的に確認した。

弾性線維周囲 micro-fibril を認識する抗 amyloid P com-

そして、抗エラスチン抗体局在部とその沈着がほぼ一致す− 53 −

ることを共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。すなわち９た 13 検における群間比較でも、露光部に優 に CML レベ歳から 100 歳までの 51 人からの露光部あるいは非露光部ルは高いことが判明した。

皮膚５７検体を材料として検討を行った。HE 染色で明ら

免疫電顕レベルでの局在：通常日光老化部の真皮に観察

かに日光弾性線維症の所見を認めた 28 検体は 53 歳以上でされる高電子密度部の増加した弾性線維においては、エラあったが、それらはいずれも凍結切片で免疫組織学的に、スチンをを示す６nm 金粒子は弾性線維低電子密度の部に病変部に一致して CML 陽性であった（図１）。28 歳から限局する傾向がみられた（図２）。一方、CML の局在を示

42 歳の５検体においては、HE 染色にて明らかな日光弾性す 15 nm 金粒子は高電子密度部に存在した。なお同一症

線維症所見は見られなかったが、免疫組織学的に僅かに線例の非露光部弾性線維には、高電子密度部がほとんど観察状に CML 陽性が認められた。10 代４検体では完全に陰性されず、CML の局在も認められなかった。

であった。非露光部 20 検体は年齢に関わらず HE 染色でなお、電顕的にも明確に弾性線維と断定できない amor-陰性であった。免疫組織学的には２例で僅かな陽性を呈しphous material には、CML がエラスチンと混在して認めた。さらに皮膚組織内における CML の存在を確認するたられた。一方、コラーゲン線維には明らかな CML の局在めに、薄切した凍結組織をエラスターゼで消化後、エラスは確認できなかった。

ターゼ可溶性分画を CML を用いた ELISA 法で測定した。

以上の結 から日光老化皮膚に認められる日光弾性線維

71 歳から 91 歳の５例の、それぞれの露光部および非露光症病変部の elastotic material は弾性線維が CML の修飾を部皮膚での比較では全例露光部の値が非露光部より高値を受けていること、日光により変化した弾性線維の高電子密示した。また露光部あるいは非露光部の一方から採取され度部の発現には CML が関与していることが明らかにされたと考えている。
マウスにおける日光老化と AGE: UVA,UVB およびUVA+UVB 照射をそれぞれ５匹ずつ行った。UVA+UVB群が肉眼的に顕著なしわ、皮膚肥厚がみられ、日光老化の所見を呈したが、それでもヒトにみられる日光弾性線維症は確認できなかった。また免疫組織学的にも AGE の局在は確認できなかった。

３. ３

今後の展望

前述したように AGE, なかんずく CML の生成には酸化過程は活性酸素産生をともなうことが明らかになって来た。
このことは日光老化が紫外線誘発の酸化ストレスと深く関

図１ 日光弾性線維症： A）HE；真皮に好塩基性に染色される塊状の物質（←）が認められる、 B）抗 elastin 抗体での免疫染色；日光弾性線維症部に一致して陽性、 C）抗 CML抗体での免疫染色；日光弾性線維症部に一致して陽性

図２ 日光弾性線維症；二重免疫染色電顕像：弾性線維の高電子密度部に一致して 15nm の金粒子（←）が存在し、CMLの局在を示す。また６nm 金粒（ ）は低電子密度部に認められるエラスチンの局在を示す（Bar：100nm）− 54 −

日光老化について−とくに日光弾性線維症の発症機構ならびに UVS 症候群の病態に関する研究−

ence of a common structure, J. Biol. Chem., 266 , 7329 -

わっていることの傍証にもなる。この点で我々の研究は日7332 , 1991 .

光老化のきわめて重要なポイントを捉えている可能性が強
今後、他の AGE, たとえばペントシジンなどについても

４）I k e d a K , H i g a s h i T , S a n o H , e t a l . :εN -(carboxymethyl)lysine protein adduct is a major

検討を予定しているが、我々は光顕レベルではやはり日光

immunological epitope in proteins modified with ad-

弾性線維症部にその局在していることを確認している。なvanced glycation end products of the Maillard reaction,

お、我々の観察ではコラーゲ線維には CML は確認されなBiochemistry, 35 , 8075 - 8083 , 1996 .

い。

かった。その理由が判明すると、さらに日光老化の解明が５）Mera SL, Lovell CR, Jones RR, et al. : Elastic fibers in

進むと考えている。またマウスでの実験で日光弾性線維症

normal and sun-damaged skin; an immunohistochemi-が発症しにくいことの原因を解明することも、動物側の因

cal study, Br. J. Dermatol, 117 , 21 - 27 , 1987 .

子のみならず、日光弾性線維症の発症に紫外線のみならず、

６）Matsuta M, Izaki S, Ide C, et al. : Light and electron

他の日光成分の影響も含めて検討されねばならないと考え

microscopic immunohistochemistry of solar elastosis; aている。

study with cutis rhomboidalis nuchae, J. Dermatol, 14 ,364 - 374 , 1987 .
７）Bouissou H, Pieraggi MT, Julian M, et al. : The elas-（文tic tissue of the skin, a comparison of spontaneous献）and actinic (solar) aging, Int. J. Dermatol, 27 , 327 - 335 ,１）Mizutari K, Ono T, Ikeda K, et al. : Photo-enhanced

1988 .

modification of human skin elastin in actinic elastosis
εby N -(carboxymethyl)lysine, one of the glycoxidation

８）Albrecht S, From L, Kahn HJ, : Lysozyme in abnor-products of the Maillard reaction, J. Invest. Dermatol.,mal dermal elastic fibers of cutaneous aging, solar elas-

108 , 797 - 802 , 1997 .

tosis and pseudoxanthoma elasticum, J. Cutan. Pathol,
18 , 75 - 80 , 1991 .

s２）Itoh T, Fujiwara Y, Ono T, et al. : UV syndrome, a
new general category of photosensitive disorder with９）Horiuch S, : Advanced glycation end products

defective DNA repair. Is distinct from xeroderma pig-(AGE)-modified proteins and their potential relevancementosum variant and rodent complementation groupto artherosclerosis, Trends Cardiovasc. Med, 8 , 163 ,1996 .

1 , Am. J. Hum. Genet., 56 , 1267 - 1276 , 1995 .
３）Horiuchi S, Araki N, Morino Y, : Immunochemical

10）Maillard LC, : Action des acides amines sur les su-approach to characterize advanced glycation end prod-cres ; formation des melanoidines par voie methodique,ucts of the Maillard reaction ; evidence for the pres-CR. Acad. Sci. (Paris), 154 , 66 - 68 , 1912 .

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