皮膚に存在する環境センサーTRPVチャネルを介した保湿関連物質の分泌制御機構の解明
愛知学院大学

薬学部

村 木

薬効解析学講座

克 彦

Recent studies demonstrate that TRPV3, TRPV4, and TRPA1 channels could be useful targets in skin health andcosmetology fields because of their highly expressions in human keratinocytes. Here we examined Ca2+ response of HEK293
cells transfected with wild-type TRPV4 (HEK-wTRPV4) and a novel variant of TRPV4 (HEK-vTRPV4) to TRPV4 agonists
to determine molecular targets of these agonists on TRPV4. When 4a-phorbol 12,13-didecanoate, an well-known standard
TRPV4 agonist, was cumulatively applied to HEK-wTRPV4 and HEK-vTRPV4, intracellular Ca2+ concentration wasincreased in both TRPV4 transfectants in a similar manner. In contrast, a novel and potent TRPV4 agonist, GSK, induced asmall Ca2+ response in HEK-vTRPV4, while highly effective on HEK-wTRPV4. Moreover, activation of TRPV4 potentiatedcell-proliferation, hence suggesting that amino acids mutated in vTRPV4 are putative binding sites of GSK and the activationof TRPV4 by its potent agonists may change the barrier function.

１．緒

際に鍵となる刺激薬のチャネル結合部位の同定を試みた。

言

さらに TRPV 4 の活性化が細胞増殖に与える影響に関して正常な皮膚機能の維持において、皮膚の保湿は極めて重も検討した 4）。

要であり、保湿作用を有する機能性香粧品の開発が精力的

また TRPV 4 と同様にヒト表皮角化細胞に高発現するに進められ、実用化されてきた。またアトピー性皮膚炎やTRPA 1 チャネル 5）と炎症刺激の関係や臨床応用薬物の皮膚乾皮症などの治療補助薬としても、皮膚保湿薬は重要

TRPA 1 チャネルに対する効果についても検討したので併な位置を占め、とくに近年、急増するアレルギー性のアトせて報告する 6，7）。

ピー症候群への治療補助薬として、より効果的で作用持続２．実時間の長い保湿薬の開発が求められている。またこうした皮膚疾患では炎症も重なることが多く、炎症と保湿との関２.１

験

細胞培養

連も注目されている。しかしこれまでの保湿薬は、皮膚表ヒト胎児腎由来細胞株（HEK 293 細胞）はヒューマン

面からの水分消失防御が主であり、皮膚での水分、コラーサイエンス研究資源バンクより入手した。ヒト表皮角ゲン、脂質成分の分泌を制御することで保湿を実現した例

化細胞、ヒト滑膜細胞、ヒト脳毛細血管内皮細胞は Cellはほとんどない。

Applications より入手した。HEK 293 細胞及びヒト表皮角Ca 透過性のバニロイド型 TRP カチオンチャネル（TRPV

化 細 胞 は DMEM に 100 U/ml ペ ニ シ リ ン G、100 µg/ml スチャネル）は温度変化や圧力、浸透圧変化を感知する環境セ

トレプトマイシン及び 10 % 非働化 FBS を加えて、5 % CO 21）ンサーであり、皮膚をはじめ全身の組織に分布する 。最近、存在下 37 ℃で培養した。ヒト滑膜細胞 6）およびヒト脳毛TRPV チャネルの一種である TRPV 3 チャネルや TRPV 4細血管内皮細胞 4）については、専用培地で培養した。

チャネルが、皮膚組織に発現し、皮膚の水分透過性を制御していることが明らかとなってきた 2，3）。そこで本研究２. ２発現プラスミド調製

では、ヒト表皮角化細胞における TRPV 3 チャネルおよびHEK 293 細胞に LipofectamineTM 2000（invitrogen）を用

TRPV 4 チャネルを介したコラーゲンや脂質成分などの保い て、pIRES-TRPV 4 WT（ 野 生 型 ヒ ト TRPV 4）お よ び

湿関連物質の分泌機構および水分保湿との関連を明らかに

pIRES-TRPV 4 VT（変異型ヒト TRPV 4）、pIRES-TRPA 1することを目指し、ヒト表皮角化細胞における TRPV チ（TRPA 1）を標準のプロトコールによりトランスフェクシ

ャネル遺伝子発現の検討や TRPV 4 チャネル刺激薬開発のョンし、24 時間から 48 時間以内に実験に供した。

S ecret ion of sk in moisture -related
substances mediated by environmental
sensor TRPV channels in keratinocyte
Katsuhiko Muraki
Laboratory of Cellular Pharmacology,
S cho ol of Pha r macy, A ich i - Ga ku in
University

２. ３

細胞内 Ca 濃度測定2+

細胞内カルシウム濃度（［Ca ］i）測定には、蛍光指示薬8）として fura- 2 acetoxymethyl ester（fura- 2 AM）を用いた 。
細胞内色素を 340 nm 及び 380 nm の励起光で励起し、放出された 510 nm の各々の蛍光を高感度カメラで取得した後、その蛍光強度比を算出した。細胞内 Ca 濃度測定実験では− 114 −皮膚に存在する環境センサー TRPV チャネルを介した保湿関連物質の分泌制御機構の解明

以 下 の 細 胞 外 液 を 使 用 し た（mM）。 正 常 HEPES 溶 液

異部位は GSK の作用に極めて重要なアミノ酸部位と推定（mM）：NaCl 137，KCl 5 . 9，CaCl 2 . 2，MgCl 1 . 2，される（論文準備中）。

22

glucose 14，HEPES 10（pH 7 . 4 with NaOH）。実験はすべて室温（25 ± 1℃）で行った。

３. ３

TRPV4 チャネルの活性化による細胞増殖作用

２. ４

分透過性を制御していることが報告されている 2，3）。そこ

最近、TRPV 4 チャネルが皮膚組織に発現し、皮膚の水RNA 抽出と逆転写酵素反応

AGPC 法によりヒト表皮角化細胞から total RNA を抽で皮膚と同じく物質の透過性制御に重要な役割を果たすヒ出し（0 . 2 µg/µl に調製）
、標準のプロトコール（Applied

ト脳毛細血管内皮細胞を用いて、TRPV 4 チャネル活性がBiosystems 社）により逆転写反応を行った。PCR 法によ細胞増殖に与える影響について検討した。BrdU の DNAる遺伝子の増幅には文献中のプライマー（human）を使用への取り込みを指標に DNA 合成を検討したところ、対7）照に比べ 0 . 3 µM および 1 µM 4 aPDD 処理で、それぞれ約した 。

30％および約 40％ DNA 合成が促進した（表１4））
。また

２. ５

DNA合成反応の定量

4 aPDD 処理で細胞数も有意に増加した 4）。TRPV 4 チャネ

5 -bromo- 2’-deoxyuridine（BrdU）の DNA への取り込み
4）

皮細胞の細胞間接着を増強する可能性がある。

を標準プロトコールにより測定した 。

３．結３.１
現ルの活性化は、細胞増殖を促すことで、ヒト脳毛細血管内

果

３. ４

ヒト表皮角化細胞における TRPV チャネルの発炎症刺激による TRPA1 チャネルの発現増加

炎症反応においてサイトカイン類は中心的な役割を担う。
皮膚組織の炎症時にもインターロイキン Ib（IL- 1 b）や腫ヒト表皮角化細胞における TRPV チャネルの遺伝子発瘍壊死因子 a（TNF-a）などが炎症反応のメディエーター現を検討したところ、報告されているように TRPV 4 チとして関与することが知られている。そこで IL 1 や TNF-a

ャネルが高発現していた。またカプサイシン感受性のなどの炎症性サイトカイン刺激を受けたとき、TRPV 4 チTRPV 1 チャネルも高発現していた。一方、発現が報告さャネルや TRPA 1 チャネルの発現が変化するか検討した。

れている TRPV 3 チャネルについては、その発現レベルはその結果、ヒト滑膜細胞を IL 1 a や TNF-a で 24 時間刺激低かった（図示せず。中間報告図１で発表済み）。

すると、TRPA 1 チャネルの遺伝子発現は数百倍増加した 6）。
また炎症時には発現増加した TRPA 1 チャネルが自律的に

３. ２ 野生型 TRPV4 チャネルおよび変異型 TRPV4
チャネルに対する TRPV4 チャネル刺激薬の効果活性化され、炎症刺激で増加した IL- 6 や IL- 8 の産生を抑制していることが明らかとなった 6）。

次にヒト表皮角化細胞に高発現する TRPV 4 チャネルの新規刺激薬の開発を目指し、既存の TRPV 4 チャネル刺激３. ５

臨床応用薬物によるTRPA1チャネルの活性化薬のチャネル作用部位の同定を試みた。野生型および変皮膚組織を構成する細胞に TRPV 4 チャネルや TRPA 1

異型 TRPV 4 チャネル遺伝子を HEK 293 細胞に強制発現チャネルが高発現していることから、臨床応用されている

し、細胞内 Ca 濃度測定法により TRPV 4 チャネルの活性薬物がこれらのイオンチャネルを活性化することで薬効変化を検討した。TRPV 4 チャネル刺激薬 4 a-phorbol 12，あるいは副作用を引き起こしている可能性がある。リウ

13 -didecanoate（4 aPDD）を 0 . 03 µM か ら 3 µM ま で 野 生

マチの治療薬として臨床応用されているオーラノフィン型および変異型 TRPV 4 チャネルを発現させた HEK 293（AUR）は 0 . 1 ～ 5％の患者で皮膚掻痒感や発疹を引き起細胞に投与したところ、濃度依存的な細胞内 Ca 濃度の上こすことが知られている。そこで TRPV 4 および TRPA 1昇が観察され、その 50％有効濃度は野生型および変異型チャネルに対する AUR の作用について検討した。その結TRPV 4 チャネルとも約 0 . 3 µM 程度であった（図示せず。
中間報告図２で発表済み）。このことから 4 aPDD は野生型および変異型 TRPV 4 チャネルに同等に作用すると考えられる。
一方、強力な TRPV 4 刺激薬の GSK を 3 nM 投与したと

表 １ ヒ ト 脳 毛 細 血 管 内 皮 細 胞 に お け る TRPV 刺 激 薬（4aPDD）誘発の細胞増殖促進作用細胞増殖作用を BrdU の DNA への取り込みとして評価した。対照（薬物非投与群）を 100 として、薬物投与群の変化を％表示した。

ころ、野生型 TRPV 4 チャネル発現細胞では大きな細胞内Ca 濃度の上昇が観察されたが、変異型 TRPV 4 チャネル発現細胞では、その細胞内 Ca 濃度上昇効果は小さかった（図示せず。中間報告図３，４で発表済み）。このことから、変− 115 −対照

1000 . 3 mm 4 aPDD

127 ± 41 mm 4 aPDD

140 ± 6コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

ャネルがその標的となっている可能性もあり、副作用発現率の高い薬剤については、こうしたチャネルへの作用を早急に検討すべきである。
謝

辞
本研究はおもに愛知学院大学 薬学部 薬効解析学講座 波多野紀行博士、鈴木裕可博士との共同研究として実施したものである。支援を頂きましたコスメトロジー研究振興財団に深謝致します。
図１ HEK-TRPA1 細胞における AUR 誘発の細胞内 Ca2+ 濃度上昇効果
細胞内 Ca2+ 濃度（Ca2+i（F340/F380））を測定下、AURを 0.1mM から 10mM まで段階的に投与した。代表的な変化を示す。

（引用文献）
１）M.J. Gunthorpe, C.D. Benham, A. Randall, J.B. : Davis,
The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor familyof ion channels, Trends Pharmacol.Sci., 23 , 183 -191 , 2002 .
２）M. Denda, T. Sokabe, T. Fukumi-Tominaga, M.

果、図１に示すように TRPA 1 チャネル発現細胞（HEK-Tominaga, : Effects of skin surface temperature on

TRPA 1）に AUR を投与したところ、TRPA 1 チャネルの活

epidermal permeability barrier homeostasis, J.Invest.

性化による濃度依存的な細胞内 Ca 濃度の増加が観察されDermatol., 127 , 654 - 659 , 2007 .

た 。AUR の血中濃度は約 20 µM と報告されていることか

３）S. Mandadi, T. Sokabe, K. Shibasaki, K. Katanosaka,ら、皮膚組織に存在する TRPA 1 チャネルが AUR により

A. Mizuno, A. Moqrich, A. Patapoutian, T. Fukumi-

活性化され、掻痒感を引き起こしている可能性が示唆されTominaga, K. Mizumura, M. Tominaga, : TRPV 3 in

7）7）た。一方、AUR は TRPV 4 チャネルには無効であった 。

４．考

keratinocytes transmits temperature information tosensory neurons via ATP, Pflugers Archiv: E.J.Physiol.,

察458 , 1093 - 1102 , 2009 .

皮膚組織に発現する TRPV 3 チャネルや TRPV 4 チャネ

４）N. Hatano, H. Suzuki, Y. Itoh, K. Muraki, TRPV 4ルは、皮膚の水分透過性の制御に関わることが報告されてpartially participates in proliferation of human brainいる2，3）。皮膚の保湿は正常な皮膚機能の維持に極めて重capillary endothelial cells, Life Sci., 92 , 317 - 324 , 2013 .

要であることから、TRPV 3 チャネルや TRPV4チャネルを標

５）R. Atoyan, D. Shander, N.V. Botchkareva, Non-的とした新規の保湿薬や皮膚機能改善薬の開発が進むとneuronal expression of transient receptor potential

考えられる。本研究で報告した変異型 TRPV 4 チャネルは、

type A 1 (TRPA 1 ) in human skin, J.Invest.Dermatol.,

現在知られている最強の TRPV 4 活性薬 GSK の作用部位

129 , 2312 - 2315 , 2009 .

が変異したことで、GSK に低感受性となったと考えられ、

６）N. Hatano, Y. Itoh, H. Suzuki, Y. Muraki, H. Hayashi,

今後、このアミノ酸を標的とするさらに高い活性と特異性

K. Onozaki, I.C. Wood, D.J. Beech, K. Muraki, Hypoxia-をもつ TRPV 4 チャネル活性薬が開発できると期待される。

inducible Factor- 1 alpha (HIF 1 alpha) Switches on

また TRPV 4 チャネルの活性化は細胞増殖を促進した。

Transient Receptor Potential Ankyrin Repeat 1

細胞増殖の亢進は細胞間隙の減少、すなわち細胞間隙を介(TRPA 1 ) Gene Expression via a Hypoxia Response

する物質透過を減少させる可能性がある。ヒト毛細血管内Element-like Motif to Modulate Cytokine Release,

皮細胞で観察されたこの現象が、皮膚組織でも観察される

J.Biol.Chem., 287 , 31962 - 31972 , 2012 .
７）N. Hatano, H. Suzuki, Y. Muraki, K. Muraki,

か、今後検討する必要がある。
一方、炎症刺激により TRPA 1 チャネルの発現が劇的に

Stimulation of human TRPA 1 channels by clinical増加した。TRP チャネルの発現変化と炎症反応がリンク

concentrations of the anti-rheumatic drug, auranofin,することを明確に示した結果であり、今後、さらにこの病

Am.J.Physiol., Cell Physiol., 304 , C 354 -C 361 , 2013 .

態生理学的意義を解明する必要がある。一方、臨床応用さ８）Y. Itoh, N. Hatano, H. Hayashi, K. Onozaki, K.

れているオーラノフィンがその適用濃度範囲内で、強力にMiyazawa, K. Muraki, An environmental sensor,

TRPA 1 チャネルを活性化することを見出した。多くの薬

TRPV 4 is a novel regulator of intracellular Ca 2 + in剤でその副作用として、掻痒感や発疹の発生が報告されて

human synoviocytes, Am.J.Physiol., Cell Physiol., 297 ,いる。皮膚組織に発現した TRPV 4 チャネルや TRPA 1 チC 1082 - 1090 , 2009 .

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