天然を超える抗酸化＆抗菌活性の発現をめざした
ポリフェノール模倣高分子の精密重合東京大学大学院工学系研究科マテリアル工学専攻

江島広貴

Polyphenols are plant-derived chemicals with more than or equal to two phenolic hydroxy groups by the Quideau
definition. These molecules usually have both catechol and gallol groups in their chemical structures, that play key roles intheir antioxidant and antibacterial activities. Inspired by this, I synthesized gallol-functionalized polymers via controlled
radical polymerization for the first time. The reversible addition–fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization of
3 , 4 , 5 -trimethoxystyrene was carried out using cyanomethyl dodecyl trithiocarbonate as the chain transfer agent. Thismethod produces well-defined polymers with a wide range of molecular weight (from 5 . 4 to 53 . 4 kg mol – 1 ) and low
polydispersity index (Mw/Mn < 1 . 3 ). Subsequent demethylation of poly( 3 , 4 , 5 -trimethoxystyrene) yields poly( 3 , 4 , 5 trihydroxystyrene) (polyvinylgallol, PVGal). These newly synthesized polymers exhibit greater antioxidant activities thanwidely used catechol-functionalized polymers based on the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH), 2,2’-azinobis(3ethylbenzothiazoline- 6 -sulfonic acid) (ABTS), and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) methods. Given this highantioxidant property, the effective use of gallol-functionalized polymers in biomaterials is expected.

1. 緒

クであるフェノール性官能基（ガロール基）に着目し、これ言を側鎖に持つ新規ポリマー、ポリビニルガロール（PVGal）

持続型社会への転換要請から、バイオマス由来の素材ををリビングラジカル重合によって合成した（Fig. 1b）。こ用いた機能性材料開発が求められている。ポリフェノール

れまで、有機低分子化合物として用いられてきた ‘ポリ’ フは植物の葉、茎、樹皮、果皮、種子などに多く含まれていェノールをポリマー化することによって、優れた加工性、るバイオマス由来の化合物である。Quideau の定義

1）

では、

多価効果、隣接効果、分子量効果などが期待でき、天然のポリフェノールとは分子内に 2 つ以上のフェノール性ヒド

ポリフェノールより優れた抗酸化 or 抗菌素材開発が可能

ロキシ基を持つ植物成分の総称である。抗酸化作用、抗炎になるものと期待される。

症性、抗菌作用といった優れた生理活性を持つものが多く、人類はその長い歴史の上で、伝統的にポリフェノールを活

2. 方

法

く、革なめし工程におけるタンニン、ワインにおけるタン

2. 1. Wittig 反応による 3,4,5-トリメトキシスチレン（TMS）の合成

パク質系澱下げ剤、漆（ポリフェノールの一種）
塗りやお歯

窒素雰囲気下でメチルトリフェニルホスホニウムブ

黒における利用など、枚挙にいとまがない。ポリフェノー

ロミド（26.2g，74.9 mmol）を無水 THF（180 mL）に懸濁

ルの抗菌作用は抗生物質と比べると弱いものの、環境と生し、− 78 ℃に冷却して n- ブチルリチウム（1.6 M ヘキサン

体に優しい抗菌物質として近年再び注目を集めている。ま溶液を 47 mL，75.2 mmol）を加えた。反応混合物を室温た、没食子酸プロピル（ポリフェノールの一種）
は化粧品にまで昇温させた後、3,4,5 - トリメトキシベンズアルデヒド

抗酸化物質として既に配合されている。ところで、有機化（TMB，11.0g，55.3mmol）を加え、一晩攪拌した。反応溶学で用いられる ‘ポリ’ は 2 コ以上をさすため、フェノール

液を 100 mL の蒸留水に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出し性水酸基を 2 コ以上分子内に持てば ‘ポリ’ フェノールであた。硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧留去る。一方、高分子科学で用いられる‘ポリ’は通常 10 コ以上した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサ

をさし、‘ポリ’フェノールはいわゆる‘ポリ’マーではない。

ン / 酢酸エチル =4/1）で精製し、目的物を得た（収率 64%）。

用してきた。例えば、薬や食品添加物としての例は数多

本研究ではポリフェノールの化学構造（Fig. 1a）から着想を得て、そのシンプルかつ普遍的なビルディングブロッ

1

H NMR（4 0 0 MHz，CDCl3）：（δ，ppm）6.7（2H，s，Ar-

H），6.7–6.6（1H，m，CH=CH2），5.7–5.1（2H，m，CH2=CH），
3.9（6H，s，OCH3），3.8（3H，s，OCH3）．13C NMR（400 MHz,CDCl3）：（δ，ppm）152.7，135.5，104.4，60.7，55.8，31.9．

Controlled Radical Polymerization of
Polyphenol-Inspired Polymers with HighAntioxidant and Antibacterial Properties
Hirotaka Ejima
Department of Materials Engineering,
The University of Tokyo2. 2. RAFT 重合 によるポリトリメトキシスチレン（PTMS）の合成
シ ュ レ ン ク 管 に TMS（2 g，10.3 mmol）、cyanomethyl
dodecyl trithiocarbonate（CDTTC）、 重 合 開 始 剤−4−天然を超える抗酸化＆抗菌活性の発現をめざしたポリフェノール模倣高分子の精密重合

Fig. 1 Polyphenols and polyphenol-inspired polymers.
(a) Chemical structures of gallic acid found in strawberry, myricetin in apple,
epigallocatechin in tea leaf, lignin in wood.
(b) Synthetic route for the preparation of poly(3,4,5-trihydroxystyrene), PVGal.

azobisisobutyronitrile（AIBN）、THF（4mL）を入れ、凍結脱気を 3 回繰り返した後、窒素を充填した。オイルバ
ス中で 60 ℃に加熱することで RAFT 重合を開始した。この時のモノマー TMS に対する CDTTC と AIBN のモル比（［TMS］：［CDTTC］：［AIBN］）を変えることで、様々な分子量の PTMS を合成した。重合後、反応溶液を 0 ℃に冷却した。THF（10 mL）を添加することでポリマーをよく溶解させ、これをヘキサンで再沈殿することで PTMSを得た（収率 90%、Fig. 2）。1H NMR（400MHz, CDCl3）：（δ，ppm）6.3–5.5（Ar-H），4.0–3.4（OCH3），3.3–3.1（CH2-S），
2.4–2.2（CH2-CN），1.2-0.7（C1 0H2 0-CH 3），2.1–1.0（CH（Ar）-CH2）．1 3C NMR（4 0 0 MHz, CDCl 3）：（δ, ppm）1 5 2.7，
135.5，104.4，60.7，55.8，41.2，31.7，29.7，22.9，14.4．
Fig. 2 1H NMR spectra of (a) PTMS and (b) PVGal.

2. 3. ポリビニルガロール（PVGal）の合成
100 mL ナス型フラスコ中で PTMS（0.96g，5mmol）を法（DPPH アッセイ）、2,2’ -azinobis（3-ethylbenzothiazoline-

ジクロロメタン 20mL に溶かし、15 分間窒素でパージした。

6-sulfonic acid）カチオンラジカル消去活性法（ABTS アッ

溶液を 0 ℃まで冷却し、10 分間攪拌した後、三臭化ホウセイ）、oxygen radical absorbance capacity 法（ORAC ア

素（1 M，15 mL，15mmol）を 10 分間かけて滴下した。30ッセイ）の 3 種の方法を併用して評価した。

分後に反応溶液を室温まで昇温し、一晩攪拌した。1% 塩

2. 4. 1. DPPH アッセイ

酸水溶液を加え、生じた沈殿を濾過によって回収した。こ36 mg の DPPH を 100 mL のメタノールに溶かしてスト

れをメタノールに溶かして濾過した。瀘液をエバポレータ

ック溶液とした。このストック溶液と抗酸化物質のメタノーによって濃縮し、THF に再び溶解した。これをヘキサール溶液を適切な量希釈し混ぜることで、DPPH の終濃度

ンで再沈殿し、瀘過で回収することで目的物を得た（収率が 91μM、抗酸化物の終濃度が 250，100，50，25，10，5，

160%）。 H NMR（400MHz，DMSO-d6）：（δ，ppm）9.1–

2.5，1，0.5，0.25 mM となるように溶液を調製した。その8.0（OH），6.2 –5.4（Ar-H），2.2–0.8（CH（Ar）-CH2）．13C

後すぐに、515 nm における吸光度を 0.2 秒ごとに 12 分にNMR（400 MHz，CD3OD）：144.8，131.1，106.7，67.9，

わたって測定した。抗酸化能は以下の式より計算した。

40.3，31.7，25.2，22.3，13.3．

Radical scavenging effect（%）=［（Control Abs.）– Sample Abs. / Control Abs.］× 100

2. 4. 抗酸化能の測定

2. 4. 2. ABTS アッセイ

抗酸化能は2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylラジカル消去活性−5−ABTS と硫酸カリウムの混合水溶液（終濃度はそれぞコスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

れ 7.0, 2.5 mM）を 20 時間暗所で静置した。これを λ=734

分子量を求める際はポリスチレンを標準物質として作成しnm における吸光度が約 1.0 になるように希釈し、所定のた検量線を使用した。絶対分子量を求める際に必要な屈折濃度の抗酸化物質と混ぜ、吸光度の退色を追跡した。抗率濃度増分（dn/dc）は 0.104 mL g-1 であった。

酸 化 能 は 以 下 の 式 に よ り 標 準 物 質 6-hydroxy-2,5,7,8-

3. 結果と考察

tetramethylchroman-2-carboxylic acid（Trolox）換 算 値（Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC）として計RAFT 重合（可逆的付加開裂連鎖移動重合）の際に使用算した。ただし、A12 は 12 分後の λ=734 nm における吸光

する連鎖移動剤（CTA）は、分子量の制御に重要である。

度を表す。

CTA は成長ポリマー鎖からラジカルを受け取り、ポリマ
ーの伸長を止めるが、ラジカルを受け取った CTA はモノ

TEAC =［A12 − A0］antioxidant /［A12 − A0］
trolox2. 4. 3. ORAC アッセイ

マーを攻撃して再び重合を開始させる。この平衡反応の存

フルオレセインのリン酸緩衝溶液（70nM，pH7.4）と在によりラジカル活性種の濃度が反応溶液中で低く抑え

抗酸化ポリマー（モノマー単位の濃度で 10 μM）のメタられるため停止反応などの副反応が起こりにくい。そのた

ノール溶液（0.3 mL）を石英セル中で混合した。次に、2,2’

め RAFT 重合では通常のラジカル重合と比べて分子量分-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride（AAPH）

布の狭いポリマーを合成することができる。しかしながら、のリン酸緩衝溶液（18mM，pH 7.4）を添加し、蛍光強度用いるモノマー種によって適する CTA と適さない CTA が（Ex：468 nm，Em：520nm）を 60 分にわたって 2 秒ごと存在するため、最適な CTA を探索する必要がある。

に測定した。蛍光強度を時間に対してプロットし、その曲本研究では、まず 4 種類の CTA、2 （- dodecylthiocarbono

線の下部の面積（Area Under the Curve, AUC）を計算しthioylthio）-2-methylpropionic acid（DDMAT）、た。対照実験として、メタノールのみを加えた（サンプルcyanomethyl dodecyl trithiocarbonate （CDTTC）、

濃度 0μM）ものと Trolox のメタノール溶液（濃度：1，3，5，2-cyano-2-propyl dodecyl trithiocarbonate（CPDTTC）、

7 μM）を加えたものでも測定して AUC を求め、検量線を4-cyano-4-［（dodecylsulfanyl-thiocarbonyl）sulfanyl］

作成した。この検量線を用いることで、抗酸化能は TEAC

pentanoic acid（CDSPA） を用いて、RAFT 重合 条 件 の値として算出した。

最適化を行った。
［TMS］：［CTA］=30：1 の条件で（標的
重合度 30）重合したところ、得られたポリマーの重合度は

2. 5. 測定機器
1

DDMAT，CDTTC，CPDTTC，CDSPAの場 合、 それぞ

13

H-， C-NMR 測定は、日本電子社製の NMR 分光測定

れ 16，29，18，18 であった。また多分散度（Mw/Mn）は 1.4，装置（JNM–AL400）を用いた。紫外可視分光光度計は日1.2，1.2，1.6 であった。CTAを用いないフリーラジカル重立社製の U-3010 を使用した。フーリエ変換赤外分光装置

合では、得られたポリマーの重合度は 80 でMw/Mn は 2.3 では Thermo Scientific 社 製 の Nicolet iS10 FT-IR に Smartあった。最も標的重合度に近く、分子量分布も狭いポリマー

iTR attenuated total reflectance apparatus を装着したもが得られた CDTTCを CTAとして用いることに決定した。

のを用いた。数平均分子量（Mn）、重量平均分子量（Mw）は次に CTA と重合開始剤の比を［CDTTC］：［AIBN］=1：

絶対分子量測定マルチ検出器システム（示唆屈折計検出器，

1 に固定し、モノマーと CTA の比を［TMS］：［CDTTC］

粘度検出器，光散乱検出器）を備えた東ソー社製の GPC=20：1，30：1，50：1，100：1，200：1，300：1 で 重 合（HLC-8320）に TSKgel GMHHR-M カラムを装着したもの

し た と こ ろ、26，35，53，115，185，276 量 体 の PTMS

を用いて求めた。クロロホルムの流速は 1mL min‒1、相対が得られた（Fig. 3）。すなわち Mn にすると 5 – 50 kg mol-1

Fig. 3 (a) Plots of molecular weight (Mn) and polydispersity (M w/Mn) against RAFT polymerization time.
(b) GPC traces of PTMS with various molecular weight.

−6−

天然を超える抗酸化＆抗菌活性の発現をめざしたポリフェノール模倣高分子の精密重合

Fig. 4 Reaction of the DPPH radical and a phenolic molecule.

Fig. 5 (a) Decoloration of the DPPH radicals in methanol reacting with polyphenolinspired polymers. (b) The antioxidant activity of polyphenol-inspired polymers andthe corresponding monomers after 2 min with the tested antioxidant in thepresence of DPPH.

の範囲で分子量を良好に調節できた。どの分子量の PTMS
も Mw/Mn は < 1.3 であり、分子量が揃ったポリマーが得られた。最後に、PTMS のメトキシ基を三臭化ホウ素によって脱保護することで PVGal を得た。脱保護反応の進行は
1

H NMR，13C NMR，FT-IR によって、メトキシ基ピークの消失およびヒドロキシ基ピークの出現から確認した。
DPPH は 安 定 な ラ ジ カ ル を 持 ち、 紫 色 を 呈 色 す る。
DPPH ラジカルが Fig. 4 のような反応を経て抗酸化物質によって消去されると、色が黄色に変化するため、比色分
析によって抗酸化活性を評価することができる 2）。フェノール性水酸基をそれぞれ１つ、２つ、３つ持つ、PVPh、Fig. 6 DPPH decoloration kinetics for the tested antioxidant
polymers.

PVCat、PVGal の抗酸化活性を Fig. 5 に示した。フェノール性水酸基の数が多くなるほど高い抗酸化活性を示しでは退色はほとんどみられなかった。使用したポリマーのた。PVGal は PVPh と比べると 60 倍以上、PVCat と比べ重合度は約 110 量体で揃えてあるため、溶液中での拡散速ても 2 倍程度の高い抗酸化活性を示した。この際、用いた度に大きな差はない。そのため PVGal の高い DPPH ラジ

フェノール性ポリマーの重合度は約 100 に揃えてある。低カル消去活性はその化学構造に由来すると考えられる。
ガロール基の 3 つのヒドロキシ基の酸化還元電位は 1.16，分子のピロガロールとピロカテコールは、ポリマーである
PVGal と PVCat よりも同じ重量濃度で比べると高い抗酸

1.40，1.92 V（vs. Ag/AgCl）である。一方で、カテコール化活性を示したが、モル濃度で比べるとポリマーの方が高基の 2 つのヒドロキシ基の還元電位は 1.18，1.35V（vs.

い抗酸化活性を示した。

Ag/AgCl）である 3）。1 つ目の酸化還元電位はガロールのFig. 6 に DPPH の紫色（Abs. = 515 nm）の退色過程を時方が若干低いため、酸化されやすい。すなわち抗酸化活性間に対してプロットしたものを示す。DPPH ラジカルのは高い。それに加えて、ガロール基は Fig. 7 に示すように、消去速度は PVGal>PVCat>PVPh という順番であり、Fig.

発生したラジカルは隣接する 2 つのヒドロキシ基と水素結

5b の抗酸化活性と同様の順番であった。PVGal は約 2 分

合して、カテコール基の場合よりもさらに安定化される。

で DPPH をほぼ全て退色させたが、PVCat は 10 分以上をこの効果は密度汎関数理論（DFT）による計算から、ガロ要した。また測定した 12 分という時間内において PVPh

ール基では 50 kJ mol-1、カテコール基では 33 kJ mol-1 と−7−

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

4. 総

括

市販の化合物である TMB からポリフェノール模倣高分
Fig. 7 Stabilization of phenoxy radicals via hydrogenbondings in gallol and catechol groups.

子 PVGal を合成する 4 ステップの合成ルートを確立した。
さらにリビングラジカル重合の一種である RAFT 重合の条件を最適化し、分子量を制御した PVGal を得ることがTable 1 Trolox equivalent antioxidant capacity ( TEAC)
values of the antioxidants calculated from the ABTS and
ORAC assays.
Antioxidant

ABTS

ORAC

Trolox1.0

1.0

PVPh1150.4

0.1

PVCat111

0.9

0.8

PVGal115

1.4

1.5

できた。今回合成した新規ポリマーである PVGal は他のフェノール性高分子と比べて特に高い抗酸化活性を示した。
謝

辞本研究の遂行にあたり、公益財団法人コスメトロジー研

究振興財団によりご援助いただきましたことに深謝いたします。
（総括引用文献）見積もられる。これにより、ガロール基を側鎖に多くもつ

1） Quideau S, Deffieux D, Douat-Casassus C, Pouysegu
L : Plant polyphenols: Chemical properties, biological

PVGal は高い抗酸化活性を示したと考えられる。

activities, and synthesis, Angew. Chem. Int. Ed., 5 0,

続いて、ABTS アッセイと ORAC アッセイから求めた

586–621, 2011.

TEAC 値を Table 1 に示す。TEAC 値とは、抗酸化物質の標準である Trolox の抗酸化能を 1 として、それに対し

2） Piras A M, Dessy A, Dinucci D, Chiellini F :て相対的に抗酸化能がどのくらいかを表した換算値であ2-Methoxy aniline grafted poly(maleic anhydride-alt-

り、値が大きい方が、抗酸化能が高い。ABTS/ORAC ア

butyl vinyl ether) hemiester: A new biocompatible

ッセイともほぼ同様の結果を与えた。PVGal の TEAC 値

polymeric free radical scavenger, Macromolecules, 4 4,は約 1.5 となり、Trolox よりも大きな値となった。一方で848−856, 2011.

天然のポリフェノールであるエピガロカテキンガレート

3） Carter M K: Correlation of electronic transitions and（EGCG）の TEAC 値を ABTS アッセイで求めたところ 4.2

redox potentials measured for pyrocatechol, resorcinol,

であり、PVGal はその値に及ばなかった。しかしながら、hydroquinone, pyrogallol, and gallic acid with results

分子量の違いを考慮にいれた IC50 値では EGCG の 3.5μM4）of semi-empirical molecular orbital computations–A

に対し、PVGal は 0.3μM と一桁低い値を示した。IC50 値はuseful interpretation tool, J. Mol. Str., 831, 26−36, 2007.

酸化を 50% 阻害する濃度であるから、その値は小さい方

4） Snijman P W, Joubert E, Ferreira D, Li X C, Ding Y,が少ない濃度で酸化を阻害できることを示しており、抗酸Green IR, Gelderblom W C : Antioxidant activity of the

化活性が高い。

dihydrochalcones aspalathin and nothofagin and theircorresponding flavones in relation to other rooibos(aspalathus linearis) flavonoids, epigallocatechin gallate,
and trolox, J. Agric. Food Chem., 57, 6678–6684, 2009.

−8−