コウジ酸、コウジ酸エステル及びメラトニンの皮膚透過と皮膚生理活性に及ぼす影響
近畿大学

小木曽

薬学部

太

郎

This study was designed to compare the in vitro skin penetration, skin distribution and physiologicalactivities of kojic acid laurate (ester) with those of kojic acid. Kojic acid penetrated across the rat skinmuch faster than the ester, but the amount of ester distributed in the epidermis was relatively muchcompared with that of kojic acid. The ester inhibited tyrosinase activity to the same extent as kojic acid did.
Enhancers enhanced the penetration of kojic acid much more than that of ester. In addition, the penetrationof melatonin through rat and human skins and the effect of melatonin on lipid peroxidation and UVB-induced
erythema were estimated. Melatonin facilely penetrated across both skins. Melatonin, in concentrations of 5
and 10 mM, significantly reduced lipid peroxidation and enhanced the photoprotective effect.

的な睡眠を導入する化合物として注目を集めてい１ 緒 言るが、メラトニンはまた免疫力を回復する７）、フ美白（化粧料）は女性の美しさへの願望を満たす

リーラジカル消去作用を示し細胞の老化を抑える、著しい抗酸化作用を有すること 10）も報告さ

テーマの一つである。種々の化合物が美白剤とし８、９）

胎盤エキス３）、て開発されてきた。
ビタミン C 類１、２）、れている。皮膚に関しても、UVB 照射で惹起されコウジ酸４）、アルブチン５）、などが市場に登場した。

た紅斑を抑制することが知られている 11）。メラト

コウジ酸は、3,4− dihydroxyphenylalanine（DOPA）

ニンの皮膚生理機能に対する影響と、その皮膚透と dopaquinone を経てチロシンからメラニンの生過について知るため、メラトニンの抗酸化作用、成を触媒するチロシナーゼを阻害することが知ら

UVB 照射ラット皮膚での紅斑の抑制及びラット、れている。コウジ酸がチロシナーゼ阻害効果

４、６）

ヒト皮膚での透過性を調べた。

を発現するには、コウジ酸がメラニン生成部位である表皮基底層に長時間滞留することが必要である。皮膚内滞留性の増加を図るため、コウジ酸のエステル化を行った。そのチロシナーゼ阻害作用

Fig.1 Structures of kojic acid and kojic acid esterと、皮膚透過及び皮膚内分配性について、コウジ酸と比較評価した。一方、メラトニンは松果体に２ 実 験

おいてセロトニンから２段階の酵素反応を経て合成されるホルモンである。セロトニン量が昼間は２. １ コウジ酸のラウリン酸エステルの合成

多く夜間減少するのに対し、メラトニンは夜間にコウジ酸３g（21.11mmol）をピリジン 50mL には日中の 50 〜 100 倍になる。メラトニンは生理

溶解後氷冷下にラウリン酸クロリド 5.37mL を滴Skin penetration of kojic acid, its esterand melatonin, and effect of them on
physiological activities of skinTaro Ogiso
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kinki University, Kowakae 3-4-1,
Higashi-Osaka, Osaka 577-8502, Japan下した。24h 反応後、反応液中のピリジンを減圧留去した。残渣をエーテル 100mL に溶解した後、吸引ろ過した。エーテル層を 5％ HCl 10mL で３回洗浄後エーテル層を MgSO ４で乾燥、ろ過した。エーテルを留去後残渣をクロロホルムに溶解させ、シリカゲルカラムに負荷した。展開溶媒に− 53 −

はクロロホルム：エタノール（50：１）を用いた。

た。メラトニンの透過実験ではゲル軟膏 0.1g を過液を減圧留去した。得られた化合物をベンゼン：

0.785cm 2 に適用し、リザーバー液に 0.5mM のヘキサン（２：３）で再結晶させた。エステル体

Na ２S ２O ５を加えた。

の収率は 1.52g（22.2％）であった。本品の生成は
IR, 1 H− NMR, 13 C− NMR で確認した。

２. ４ 皮膚内分配量の測定

２. ２ ゲル軟膏の調製用６h と 24h 後に皮膚をフランツセルより取り外In vitro 吸収実験と同様に行った。ゲル軟膏適Hiviswako 104 を水で膨潤させ、これにジイソ

し、皮膚表面の軟膏を拭き取った。適用部位の皮

プロパノールアミンの水溶液を加え中和した。コ

膚を切り取った。表皮の調製には、アルミ箔で包ウジ酸またはエステルはプロピレングリコールに

み 60℃で２分間加熱後ミクロスパーテルで真皮を溶解した。処方３と４の場合は d− limonene をさ取り除いた。コウジ酸軟膏の場合は４mL の 70％

らに溶解した。処方５と６では OTG を水に溶解

メタノール中で、エステル軟膏の場合は、70％ア

して基剤に加えた。残りのゲンタマイシン、水をセトニトリル中でヒスコトロンホモジナイザーを加えた。処方７と８も同様に調製した。

用い２分間ホモジナイズした。遠心分離後上清中のコウジ酸とそのエステルを定量した。メラトニ

２. ３ 皮膚の調製と in vitro 皮吸収実験

ンの皮膚内分配量は 0.1M 過塩素酸（４mL）中でヘアレスラットまたは Wistar ラット皮膚を実験前日に除毛した。次の日腹部皮膚（3×3cm）をホモジナイズ後、遠心分離して得られた上清を使用した。

切除し、下部の脂肪組織等を取り除き、0.85％
NaCl− 10mM リン酸緩衝液（pH 7.4、ゲンタマイ

２. ５ 定 量

シン液を 1/100 容含有）で湿らせたろ紙上にのせコウジ酸定量の内部標準物質（i.s.）はヒドロキノ

５℃で 12h 水和させた。水和した皮膚をフランン、コウジ酸エステルの i.s. にはアントラセンを用

ツ拡散セル（透過面積 2.01/cm 、リザーバー容いた。HPLC のカラムは Inertsil ODS を用い、測積 10.5mL）に装着した。皮膚上にゲル軟膏 0.25g

定条件は検出波長 223nm、温度 20℃、移動相は、を均一に塗布した。アルミ箔で被い、37℃でイン

コウジ酸の測定にはアセトニトリル：水：リン酸

キュベートした。レシバー液を経時的に採取し（２：97：１、v/v）、エステルではアセトニトリ

た。ヒト皮膚については水和せずに同様に実験しル：水（30：70、v/v）を用いた。メラトニンの定

2Table 1 Composition of kojic acid, kojic acid ester, and melatonin gel ointments− 54 −

コウジ酸、コウジ酸エステル及びメラトニンの皮膚透過と皮膚生理活性に及ぼす影響

量には、Inertsil ODS C18 カラム、波長 278nm、２.10 データの解析

移動相は 50mM 酢酸ナトリウム− 100mM 酢酸−
0.1mM EDTA：アセトニトリル（80：20、v/v）、

In vitro 透過パラメータは次式を用いて計算した。

i.s. は 5− metheoxyindole− 3− acetic acid を用いた。

２

δ
D ＝６
τ

Js ＝ D K mCs ＝ K p Cs

２. ６ チロシナーゼ活性の測定δ

マッシュルームチロシナーゼ 50U、基質としD は皮膚内の拡散定数、J s は透過速度、K m はて 0.05％ L− DOPA を用い、37℃で 20 分反応後、皮膚／軟膏分配係数、K p は透過係数である。有意

475nm で吸光度を測定した。

差検定は Student t− test により行った。

３ 結果と考察２. ７ 脂質過酸化の測定
ヘアレスラット肝の 9000xg 上清画分または３. １ コウジ酸とそのエステル

皮膚ホモジネートの 9000xg 上清画分 1.0mL に

３. １. １ In vitro 皮膚透過300mM 硫酸第１鉄 0.1mL、20mM Tris− HCl 緩

ゲル軟膏適用時のコウジ酸のヘアレスラット皮

衝液（pH7.4）またはメラトニン液 0.4mL を加膚透過を Fig.2A に示した。コウジ酸の透過速度

え、37℃で 60 分インキュベートした後、0.5mL（J s）と透過係数（K p）は、エステル適用時のそれの 25％トリクロル酢酸を加え遠心分離した。上清より３〜４倍大きかった（Table ２）。なお、コウ

1.5mL に 0.67％チオバルビツール酸 1.5mL を加ジ酸エステル適用時リザーバー液中にエステルはえ 100℃で 10 分加熱、冷後 535nm で吸光度を測検出されず、全てがコウジ酸に加水分解されてい定した。

た。lag time（τ）もコウジ酸は 1/2 であった。コ
ウジ酸エステル適用時のコウジ酸の J s が小さい理

２. ８ 皮膚一次刺激性試験

由は、脂溶性のエステルが角質層を透過後、親水

前日に除毛した白色系雄性家兔（体重、2kg）脊部に処方１〜６のゲル軟膏 0.2g/3.14cm を適用
2性の生きた表皮を透過できにくいためと考えられる。
吸収促進剤の d− limonene と OTG を配合するこ後、粘着テープで固定した。24h 後皮膚の反応を一次刺激性試験法に準じ判定した。

とにより、コウジ酸の透過は促進され Js は Rp. １

13）のそれぞれ５倍と 10 倍に増加した。一方、コウ２. ９ 紅斑抑制作用の測定

ジ酸エステルの場合も透過は増大したが、促進の

雄 性 ヘ ア レ ス ラ ッ ト（10 週 令、 体 重 200 〜

程度はコウジ酸の場合より小さく、３倍と 3.5 倍210g）の脊部皮膚を除毛した。UVB はラットの脊の増加であった。これらのことから、コウジ酸は部より 45cm の距離（0.298mW/cm ）から 30 分間

ラット皮膚を比較的容易に透過するが、エステル照射した。この照射を週３日間、計６回行った。

の透過性は低いと判断される。またこのエステル

メラトニン処理群は 0.2％メラトニン軟膏（0.75g/

結合は生きた表皮と真皮及びリザーバー液（真皮６cm ）を UVB 照射後 24h 塗布した。酢酸レチノから遊離した酵素が存在）中で加水分解されるとール処理群は 0.2％酢酸レチノール軟膏を同様に考えられる。

22塗布した。最終処理後、皮膚の紅斑を判定基準０（紅斑を認めない）、１（微弱あるいは境界不明瞭

３. １. ２ 皮膚内分配な紅斑）、２（中等度の境界明瞭な紅斑）、３（強度

各ゲル軟膏適用 6h と 24h 後に、全皮膚（FS）の境界明瞭な紅斑）に従い判定した。

及び表皮（EP）中のコウジ酸とエステル量を測定− 55 −

Fig.2 Penetration profiles of kojic acid through hairless rat skin
Each value represents the mean ± S.D.（n=3-4）. A 0.25g/2.01cm 2 of gel oinment was applied.
Table 2 In vitro percutaneous penetration parameters of kojic acid ant its ester through rat skinFig. 3 Comparoson of amount remaining in stratum corneum with that in full-thickness of skin
Application ; Kojic acid ointment（n=4-6）. FS, Full-thickness skin ; epidermis.

Fig. 4 Comparison of amount remaining in stratum corneum with that in full-thickness of skin
Application : Kojic acid ester ointment（n=3-4）.

した結果を Fig. ３と４に示した。全皮膚中のコウ

この傾向が顕著であった。これは、促進剤が皮膚

ジ酸量は、表皮中より多かったが、Rp. ５（OTG

透過を高めるため、24h 後には透過が殆ど終了し配合）を除いて、60％以上が表皮中に存在した。

皮膚内量が少なくなるためと考えられる。OTG を

Rp. １の場合は 24h 後にも皮膚内量は増加してい配合すると真皮内（FS 量− EP 量＝真皮内量）にたが、促進剤を加えた Rp. ３と５では 24h 後の皮多くなる理由は、既に報告したように 14）、OTG

膚内量は減少する傾向がみられた。特に Rp. ５でが角質層の細胞間結合を離反させ、そのバリア機− 56 −

コウジ酸、コウジ酸エステル及びメラトニンの皮膚透過と皮膚生理活性に及ぼす影響

能を殆ど消失させるので、プロピレングリコール

４倍高い値となった。したがって基底層でのメラに溶解したコウジ酸が容易に真皮に移行したため

トニン生成の抑制には、表皮内分配性の高いコウと思われる。

ジ酸エステルがコウジ酸より有効であると判断さエステル配合ゲル軟膏の Rp. ２、４と６を適用れる。

した場合、24h 後に表皮及び全皮膚中にエステルがかなり残存していた。d− limonene を配合した

３. １. ３ チロシナーゼ活性の阻害

Rp. ４では６h 後に多量のエステルが全皮膚内に検

コウジ酸のエステル化によりチロシナーゼ活性出された（Fig. ４）。脂溶性のエステルの角質層透が変化するか否かを検討した。その結果を Table

過が促進された結果、生きた表皮と真皮内に多く３に示したが、エステル体自身にもチロシナーゼ

残留しているためと考えられる。

活性阻害作用が認められた。また、その阻害作用

Rp. ２ゲル軟膏適用時の表皮内エステル（コウはコウジ酸のそれに匹敵する強い阻害であった。

ジ酸量に換算）とコウジ酸の合計量は 6h 後でなお、このエステルは非水溶性であるため、濃度

7.9µg/cm 、24h 後で 15.4µg/cm であった。この高い場合には阻害活性が測定できなかった。この量はコウジ酸のゲル軟膏（Rp. １）適用時の値、の結果、表皮基底層に達したエステルはその型で16.6 と 22.5µg/cm と比較して少ないが、皮膚のメラニン色素の生成を阻害できると考えられる。

透過量量を考慮すると、エステル処方の皮膚内分

また経時的に加水分解されるので生成したコウジ

配量は相対的に高くなった。事実 24h 後の［表皮酸と相まって阻害作用を発現すると判断される。

2

2

2

分配量／ 24h での透過量］の比を求めると Rp. １
で 0.137、Rp. ２で 0.282 となり、エステル処方が

３. １. ４ 皮膚一次刺激性

２倍以上高い値を示した。促進剤配合の Rp. ４とエステル体の刺激性をコウジ酸と比較した。

６についても同様、この比はエステル処方が２〜

Table ４に示すように、Rp. １と Rp. ２（エステルTable 3 Tyrosinase inhibitory activity of kojic acid and its ester

Table 4 Evaluation of skin reaction by kojic acid and kojic acid ester gel ointments− 57 −

配合）ゲル軟膏適用では明瞭な紅斑は認められな合（Rp. ８）は J s と Kp を３倍に増大した（Table ５）。

かったが、微弱な紅斑が観察された。しかし両者

メラトニンの容易な皮膚透過は、その高い脂溶性の間に明確な差異は認められなかった。この結果と低分子量のため、角質層の細胞間脂質を容易にはエステルもコウジ酸と同じく若干の刺激作用を浸透できることによると考えられる。

有することを示唆する。なお、d− limonene を配合
すると刺激性は僅かに増加した。

ヒト皮膚の透過を Fig. 5B に示した。メラトニ
ンはまたヒト皮膚を透過できるが、透過速度はラットに比較して若干小さく、Rp. ７ではラットの３. ２ メラトニン

1/2 であった。しかし lag time はラットより５倍

３. ２. １ In vitro 皮膚透過

大きかった。一方 d− limonene を配合すると透過

メラトニンの皮膚透過を Wistar ラットとヒト速度は減少した。この理由は d− limonene に溶解

皮膚について測定した。ラット皮膚の透過を Fig.

したメラトニンの多くが親水性の生きた表皮を透5A に示した。メラトニンはラット皮膚を促進剤

過しにくいためと思われる。

なしでもかなり容易に透過した。d− limonene の配３. ２. ２ 皮膚内分配

Fig. 5 Penetration profiles of melatonin through Wistar rat（A）and human skins（B）
Each value represents the mean±S.D.（n= 3 - 4）
. A 0 . 1 g/ 0 . 785 cm 2 of gel ointment was applied.

Table 5 In vitro percutaneous penetration parameters of melatonin through rat and human skins− 58 −

コウジ酸、コウジ酸エステル及びメラトニンの皮膚透過と皮膚生理活性に及ぼす影響

メラトニンの皮膚内分配量の測定は、ラット皮

9000xg 上清画分についてメラトニンの防止作用を膚のみで行い、ゲル軟膏適用後２と５h で測定し測定した。その結果を Table ６に示した。メラト

た。メラトニンは両時間とも表皮に大部分検出さニンは反応系濃度５及び 10mM で 70％以上の過れた。おそらく角質層またはその下部の顆粒層、酸化防止作用を示した。この作用はすでに報告さ有棘層、基底層などに分布していると思われるれているメラトニンの lipid peroxidation の抑制と（Fig. ６）。d− Limonene を配合すると（Rp. ８）皮一致する 15）。皮膚については明確な結果が得られ

膚内分配量は２倍近くに増加した。その増加の大なかったが、皮膚でもメラトニンは脂質過酸化を部分は表皮内分配量の増加であった。この増加は防止して、free radical による損傷から皮膚の細胞

Fig. ４に示すような皮膚透過の増大に関連していを保護すると考えられる。

ると思われる。なお、メラトニンは皮膚ホモジネ
ート中で全く加水分解されなかったので、皮膚内３. ２. ４ 紅斑抑制作用

で安定であると考えられる。

UVB 照射による紅斑に対するメラトニンの抑制作用を酢酸レチノールのそれと比較した。UVB 照

３. ２. ３ 脂質過酸化の防止

射により紅斑（スコア 1.33±0.58）が認められた

Wistar ラット皮膚について脂質過酸化を測定しが、メラトニンゲル軟膏の適用により紅斑は消失

たが、皮膚の脂質含量が少ないため、過酸化物はした（スコア０）。この効果は酢酸レチノールのそ検出できなかった。そのため、肝 homogenate のれに（スコア 0.33±0.58）に匹敵した。この実験
では、ラットの例数が少なかった（n ＝３）ので、多数のラットを用いて再確認する必要はあるが、メラトニンは紅斑を抑制できると判断される。

４ 総 括
コウジ酸エステルの皮膚透過、皮膚内分配性及びチロシナーゼ阻害作用などをコウジ酸と比較した。コウジ酸のラット皮膚透過速度はエステル適用時よりも３倍大きかったが、適用６及び 24h 後
Fig. 6 Amount of melatonin remaining in rat skin
Each bar represents the mean±S.D.（n=4）.
a）p<0.05 compared with Rp.7.

の皮膚内分配量はエステル軟膏が相対的に増加
し、［表皮内分配量／透過量］の比はエステル軟膏
が２倍以上高くなった。コウジ酸エステル自体にTable 6 Protecting effect of melatonin on lipid peroxidation

チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。これらのことから、コウジ酸エステル
は皮膚透過が少なく、表皮内に比較的多く滞留するので、基底層でのメラニン色素の生成抑制に有用であると考えられる。吸収促進剤
はコウジ酸及びエステル（皮膚透過時コウジ酸に加水分− 59 −

解される）両者の透過を高めたが、コウジ酸に対８）Reiter R. J., Tan D. X., Poeggeler B., Menendez-

する透過促進が大きかった。

Pelaez A.: Melatonin as a free radical scavenger:

メラトニンはラット及びヒト皮膚を比較的容易

Implications for aging and age-related diseases,に透過した。d− Limonene を配合するとラット皮Ann. N. Y. Acad. Sci., 719, 1-12, 1993.

膚の透過は上昇したが、ヒト皮膚ではむしろ減少

９）Reiter R. J., Regina C., Carneiro C., Oh C.-S.:

した。メラトニンは脂質過酸化を５mM 以上の濃Melatonin in relation to cellular antioxidative度で強く防止した。また、UVB 照射による紅斑をdefence mechanism, Horm. Metab. Res., 29, 363-

抑制し、その効果は酢酸レチノールのそれに匹敵

372, 1997.

した。

10）Poeggeler B., Reiter R. J., Tan D. X., Chen
L. D., Manchester L. C.: Melatonin, hydroxyl

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