創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定
京都大学大学院

高

橋

医学研究科

健

造

Injury to the skin tissue elicits a repair response aimed at restoring the epithelial continuity, which is essential to anormal skin barrier function. Epidermal keratinocytes at the wound edge are recruited for the re-epithelialization of
the wound site. However, the mechanism of the re-epithelialization is not easily understood compared with the simple
epithelia. While the migration of keratinocytes occurs in the form of a stratified sheet, the relative contribution andultimate fate of progenitor and differentiating keratinocytes during this vital process remains unclear. In this study,
we use the transgenic technology to induce the wound specific gene recombination. We prepared two kinds of thetransgenes to introduce the injured epidermis specific gene expression at the suprabasal keratinocytes, one for the
wound specific expression of the cre recombinase and the other for the expression of the marker proteins.
We usedthe double transgenic mice to trace the migration of the suprabasal keratinocytes activated at the wound edge. By
this transgenic work we might be able to conclude the long term question, whether the suprabasal keratinocytes could
recover the mitogenic property and migrate into the ulcerative surface or not.

１を有する。表皮組織の創傷治癒過程においては、いずれのはじめに分化段階の細胞がそれぞれどのような役割を担っているの

皮膚はヒトの体の最も外側に位置し、生体内部の臓器をかはわかっていない。すなわちどの層の細胞が潰瘍部に遊保護する重要なバリアーとして働いている。外傷などによ走し、再生し上皮化した新生表皮を構築しうるのはどの細る皮膚の欠損は、きわめてすばやい治癒反応を引き起こす。

胞に由来しているのかなどは、いまだ決定されていない。

この創傷治癒反応は、秒単位で現われる血小板や血管内皮

表皮に代表される重層偏平上皮の創傷治癒機転のモデ細胞の関与する凝固・止血反応にはじまり、真皮線維芽細ルとして、従来より２つのモデルが提唱されている（図１）

胞による創傷部の収縮・肉芽の形成、表皮欠損部への表皮（文献７, ８, 10 - 12）角化細胞の遊走・増殖とこれらによる潰瘍表面の再上皮化皮と同様に、基底細胞の増殖と遊走のみが重要な役割を担から最終的には新生表皮組織の再構築へと続く（文献２, ３, ８,10）。

い、基底層より上に位置する有棘細胞は補助的な役割のみ

外胚葉性の上皮組織であり体表を取り巻く表皮細胞は、を持つか、あるいは積極的な関与がないとする考えである

消化管や肝臓・腎臓などの内胚葉由来の単層上皮より構。１つは重層上皮の再上皮化においても単層上（スライデイング仮説）（図１上）。

成される組織とは異なり、重層化した数層よりなる偏平組

一方、別のモデルであるローリング仮説によると、表皮織により構成する。すなわち皮膚は基底細胞（Basal Cell）

組織においては創傷外縁の有棘細胞が、基底層へと転がりと基底細胞の上層に位置する有棘細胞（Suprabasal Cell）、

落ちキャタピラのように次々と欠損した上皮を覆っていく

顆粒細胞（Granular Cell）さらに最外層をなす角質層の数というものである。この考えによると基底層上層の有棘細ー十数層の細胞より形成され、単層上皮と比較して遙かに複雑な構成成分よりなる（文献３）。
基底細胞が順次上層の細胞へと分化し、充分な保護能力を獲得しつつアポトーシス類似のシステムにより死滅し脱落していくこの過程は角化と呼ばれ、表皮や口腔粘膜、角膜などの重層扁平上皮に特有な分化形態である。各角化段
階の細胞層はそれぞれ固有の機能やそれに伴う細胞生物学
的・生化学的な特徴を有する。このため表皮組織の創傷治
癒過程は、単層上皮組織のものよりもはるかに複雑な段階
Injury specific gene marking to follow the
wound healing process under the injured
epidermis specific gene recombination
Kenzo Takahashi
Department of Dermatology, Kyoto
University Graduate School of Medicine

図１ これまでに提唱されている重層上皮組織の創傷治癒過程のモデル
創傷近傍の基底層の細胞のみが潰瘍面に直接遊走すると考えるスライディング仮説と、有棘層の細胞も潰瘍面に転がり落ち、上皮化に参加するとする２説が提唱されてきた。

− 90 −

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定胞も表皮の再生に積極的な役割を果たしていることになる層よりも上層の細胞にのみ発現することを確認した。

（図１下）。しばしば創傷治癒過程の皮膚においては、有棘

そこでさらに創傷治癒過程後期あるいは潰瘍局面が再上層の細胞が基底細胞を乗り越え潰瘍面へと落ち込んでいる

皮化された後の再生表皮細胞が基底細胞あるいは有棘細胞

かのような組織像が観察され、このローリング仮説はこののどちらの細胞に由来するのかを決定するために、創傷表ような組織学的所見にはうまく合致する。しかしながら正皮に特異的な遺伝子組み替えシステムを用意した。バクテ

常な皮膚組織においては、有棘層より上層の細胞は基底細リオファージ由来の Cre/LoxP の組み替えシステムを用い胞より分化し分裂能を失った細胞であると考えられている。

創傷表皮に特異的な遺伝子の組み替えを誘導し、導入した

実際、マウスや人の摘出皮膚を短期間 BrdU や放射性サイ

遺伝子自体をマーカーとすることで、潰瘍面に遊走する有ミジンの存在下で標識しても正常な有棘層の細胞はラベル

棘細胞を追跡することを目指した。マーカーとして導入遺されてこない。このようにローリング仮説は、有棘細胞が伝子自身を活用することで、レポーターとなる蛋白質が細創傷などの刺激により、再び増殖・分裂能を回復し基底細胞内で変性され追跡が困難になることなく、治癒過程の後胞の性格を取り戻す脱分化を起こしうるのかという問題に期における細胞の遊走の様子や由来の観察が可能となると直面する。このように、重層上皮の創傷治癒機転を考える

考えた。創傷治癒過程の完了後に新たに再上皮化された表上で、創傷治癒後に再上皮化した新生表皮組織が創傷部近皮細胞がどのレポーターを発現しているのかを観察するこ傍の基底細胞にのみ由来するのか、あるは基底層上層の有とで、新生表皮は表皮基底細胞あるいは基底層上層の有棘棘細胞にも由来するのかは、皮膚の創傷治癒研究における細胞のどちらに由来するのかを観察し、創傷治癒過程にお長年の解決すべき大きな命題である。
今回我々は、近年の遺伝子導入マウスの技術を応用し、創傷治癒にかかわる表皮角化細胞、特に有棘層の細胞にマーキングをすることで、創傷部位近傍の有棘細胞が実際の治癒過程においてどう遊走し、表皮の再生にどのような役割を担っているのかを決定したいと考えた。

２

実験方法

図２

ヒトケラチン 6 遺伝子同位体群の構造
ヒトの染色体上には少なくとも６種以上のケラチン６同位体が存在し、そのいくつかは互いに隣接して存在する。エク
ソンーイントロン構造や大きさなど極めて類似した構造を示す。

創傷表皮に特異的に遺伝子を誘導するために、創傷部近傍の有棘細胞に強く発現することの知られているヒトケラ
チン６遺伝子を利用することから始めた。我々はこれまでにヒトのケラチン６遺伝子には６種以上の同位体が存在し、それぞれ異なった発現調節をなされていることを同定している（図２）。その中より創傷やフォルボールエステル、

表１

レチノイン酸などの刺激により最も強く誘導される同位体であるケラチン６a の発現活性（表１）をトランスジェニ
ックマウスの作製に用いることにした。
今回の研究ではすでに単離し解析を加えてきたヒトのケ
ラチン６a 遺伝子の 5 ' 側非翻訳領域の（約５kbp）をプロ
モーターとして利用した発現ベクターを開発した。まず始めに、この発現ベクターを用いてレポーターとなるガラク
トシダーゼ蛋白質を繋げた遺伝子を構築し、この導入遺伝子を持つトランスジェニックマウスを作成し、（図３上）
このプロモーターの誘導活性を様々な刺激を加えたマウスの表皮組織において検討を加えた。
この導入遺伝子を持つマウスでは実験結果（図４）に示すように創傷表皮にのみ特異的にガラクトシダーゼ遺伝子
を強く発現することが観察された。このマウスを用いて創傷治癒実験を行い、治癒過程を組織学的に追跡することで、創傷治癒過程の早期における有棘細胞の遊走のようすの観察が可能となり、またこのプロモーターが創傷表皮の有棘− 91 −

ヒトケラチン 6a 遺伝子同位体群の発現様式
ケラチン６同位体は極めて類似した遺伝子構造を保持するが、発現活性は同位体間で大きく異なっている。ケラチン
6a 同位体がいずれの部位においても有意に発現している。

図３

導入遺伝子の構造
上段 (K6a-LacZ) がヒトケラチン 6a遺伝子プロモーターの下流にガラクト
シダーゼ遺伝子を有する。この導入遺伝子によりケラチン 6a 遺伝子を用いた発現ベクターの in vivo での転写活性を詳細に検討し、創傷治癒反応の初期における角化細胞の遊走の様子を検討した。中段 (K6a-Cre) はこのヒト
ケラチン 6a 遺伝子の発現ベクターにCre リコンビネースを連結した導入遺伝子である。下段 (CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ) はサイトメガロウイルス
プロモーターにより転写されるレポー
ター遺伝子を表す。第一のレポーター
である緑色蛍光蛋白 (GFP) はその両端に LoxP 配列を有し、その下流には第二のレポーターであるガラクトシ
ダーゼ遺伝子が結合する。

いては有棘層の細胞が実際に分裂能を取り戻しうるのかを決定できる。
このために、次の２種類の導入遺伝子を構築した。１つ目の導入遺伝子は、バクテリオファージ由来の Cre リ
コンビネースを創部表皮の有棘細胞にのみ特異的に誘導するためのもので、上記のヒトケラチン６a 遺伝子由来の5 kbp のプロモーターの下流に Cre リコンビネースを連結させた（図３中）。さらに導入遺伝子をマウスの生体内でマーカーとして使うためのレポーター遺伝子の組み合わせをもう１つの導入遺伝子として用意した。第一のレポーターである緑色蛍光蛋白（GFP）の両端に、Cre リコンビネ
ースによって認識される LoxP 配列を配置しておく（図３下）。この第一レポーターの下流には第二のレポーター遺伝子としてガラクトシダーゼ遺伝子を繋げ、これらは上流に存在するウイルスのプロモーターにより、全ての細胞に発現されように構築した。これらの導入遺伝子を染色体上に導入されたトランスジェニックマウスをそれぞれ作成し、両者をかけ合わせ、両方の導入遺伝子をもつダブルトラン

図４

K6a-LacZ 導入マウスを用いた創傷治癒実験。
創傷やフォルボールエステル，レチノイン酸塗布によりガラクトシダーゼ遺伝子は創傷近傍の有棘層の細胞に強く誘導されるが、内在性のケラチン 6a が恒常的に発現する毛嚢などの表皮付属器には、全く転写活性はない。

スジェニックマウスを創傷治癒実験に用いた。
この実験系において、創傷特異的な発現活性をもつケラ
チン６a のプロモーターに誘導される Cre リコンビネース
は、健常な上皮組織に発現されることはなく、LoxP 配列を認識した組み替えは起こらない。しかし、ひとたびこののなら、再上皮化が完了したのちの新生表皮細胞は依然とダブルトランスジェニックマウスの皮膚に創傷刺激を加えして、第一のレポーターである緑色蛍光蛋白（GFP）のみ

ると、近傍の有棘細胞においてケラチン６a 遺伝子によるを発現している。一方ローリング仮説が予言するように、Cre リコンビネースの発現が誘導され、この働きにより基底層上層の有棘細胞が再上皮化にかかわるのならば、新LoxP 配列を介した第一のレポーター遺伝子の組み替えが生した表皮細胞はすでに Cre リコンビネースによるレポ起こりマウスの染色体より切り離される。その結果、創傷ーター遺伝子の組み替えが起こった後なので、第二のレポ

刺激を受けた有棘細胞では第二のレポーターであるガラクーターであるガラクトシダーゼ遺伝子が基底細胞から有棘

トシダーゼ遺伝子の発現が誘導されると考えた。

層の細胞まで全ての表皮細胞層で新生表皮において観察さもし創傷部位への遊走に基底細胞のみがかかわっているれるはずである。

− 92 −

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定

３

結

遺伝子組み替え作用を有する Cre リコンビネースを上で果検討したケラチン 6 a の発現ベクターを用いて誘導する。

図３に示した３種類の導入遺伝子を染色体上に組み込ま

創傷特異的な発現活性をもつケラチン６a のプロモータ

れたトランスジェニックマウスをそれぞれ数系統ずつ作製

ーに誘導される Cre リコンビネースは、健常な上皮組織した。その中で発現活性の強く子孫への導入遺伝子の伝搬に発現されることはなく、第二の導入遺伝子に存在するの良好な２−３系のマウスに代表させ以下の実験に用いた。

LoxP 配列を認識した遺伝子の組み替えは起こらない。そまずは今回の実験系の基礎となるケラチン６a 遺伝子をのため健常な表皮組織においては、基底細胞から有棘層、用いた発現ベクターの転写活性を詳細に検討するために、

顆粒層のすべての細胞に上流に位置するレポーターである

ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター（図３上）とした導緑色蛍光蛋白（GFP）の発現のみが観察される。しかし、入遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いて創傷治

ひとたびこのダブルトランスジェニックマウスの皮膚に切癒実験を行った。

開を加えると、その近傍の有棘細胞においてケラチン６遺ヒトのケラチン６蛋白質はケラチン６a 同位体蛋白を含伝子による Cre リコンビネースの発現が誘導され、このめ、健常な皮膚においては、毛嚢や脂腺などの付属器の恒働きにより LoxP 配列を介した第一のレポーター遺伝子の常的に発現しているが、表皮角化細胞には基底層から有棘遺伝子の組み替えが生じ、マウスの染色体より切り離され層、顆粒層のいかなる細胞にも発現していない。しかし創る。その結果、創傷刺激を受けた有棘細胞では第二のレポ

傷やフォルボールエステルなどによるの刺激を表皮に加えーターであるガラクトシダーゼ遺伝子の発現が誘導される

るとケラチン６の蛋白質は急速にそして大量に基底層よりと考えた。もし創傷部位への遊走に基底細胞のみがかかわ

も上層の有棘層・顆粒層の細胞に誘導される（図４）。

っているのなら、再上皮化が完了したのちの新生表皮細ヒトケラチン６a 遺伝子の 5 kbp の非翻訳領域をプロモ胞は依然として、第一のレポーターである緑色蛍光蛋白

ーターとして利用することにより、ガラクトシダーゼ遺伝（GFP）のみを発現している。一方ローリング仮説が予言

子は創傷刺激やフォルボールエステル、レチノイン酸によするように、基底層上層の有棘細胞が再上皮化にかかわるる刺激をうけた表皮や舌、口腔粘膜などの扁平上皮組織ののならば、新生した表皮細胞はすでに Cre リコンビネー

基底層より上層の有棘細胞に強く発現誘導されたが、本来スによるレポーター遺伝子の組み替えが起こった後なので、ケラチン６が恒常的に発現している毛嚢などの皮膚の付属

第二のレポーターであるガラクトシダーゼ遺伝子が基底細器での転写活性は全く失活していた（図４）。このマウス

胞から有棘層の細胞まで全ての表皮細胞層で新生表皮におでは、創傷をうけた表皮などの重層扁平上皮においてのみ

いて観察されるはずである。

ガラクトシダーゼ遺伝子が誘導されるが、その他の健常なまずは、今回開発した発現ベクターを用いた Cre/LoxP

表皮や他の上皮組織においては、発生、成長の段階をとおの遺伝子組み替えシステムが、表皮角化細胞において有効して導入遺伝子は発現されない。また創傷部においても基に働くことを示すために培養表皮細胞株（DJM- 1）の形

底層の細胞はガラクトシダーゼ遺伝子の発現は見られない。

質転換に用い、これらの２つの導入遺伝子を in vitro の系

これらの結果より 5 kbp のケラチン６a 遺伝子プロモータ

で強制発現させた。GFP とガラクトシダーゼ遺伝子の連ーは創傷表皮の有棘層のマーキングに大変有用な発現ベク

結したレポーター遺伝子のみの形質転換では、第一のレポターとなることが証明された。実際、創傷治癒過程の早期ーターである GFP の発現のみ観察され、ガラクトシダー

において、創部近傍の表皮角化細胞が潰瘍部へと遊走する

ゼ遺伝子の発現は全く認められなかった。しかし Cre リ

様子が観察された（図４）。しかしながらこの組織像よりコンビネースの遺伝子と共発現させた際には GFP の発現

直接に有棘層の細胞が潰瘍表面を覆い再上皮化した皮膚をは消失しガラクトシダーゼ遺伝子の発現が確認された（図構成しているとは決定できない。有棘層の細胞同様基底層５）。これらの事実は、少なくとも培養表皮細胞においての細胞も潰瘍面へと遊走し、その後の分化過程により基底はこの遺伝子組み替えシステムが働いていることを証明す

層上層へと角化した細胞がガラクトシダーゼ遺伝子を発現るものである。

するに至ったとも考えられるためである。また再上皮化がこれら２種類の導入遺伝子（図３中、下）をもつ遺伝子終了した後の再生表皮においては一旦発現したガラクトシ

導入マウスを作成し、それぞれについて５- １０系統のマダーゼ蛋白は遺伝子の発現がなくなり、蛋白の分解によりウスのラインを獲得した。この中より発現の強く子孫へと観察されなくなる。

導入遺伝子を伝搬する効率の高い系統を選び、これらを掛

そこで我々はこの発現ベクターのアイデアを進め創傷部

け合わせることで創傷治癒後期の表皮角化細胞の遊走の様位に誘導されるガラクトシダーゼ蛋白ではなくて、遺伝子子を観察した。耳にパンチにより付けた創傷後の組織をそのものを追跡マーカーとして用いる導入遺伝子のシステ

４８時間後に X-Gal 染色したところ、Cre と LoxP の両者ムを構築した。上の実験方法にあげたように部位特異的なの導入遺伝子を持つダブルトランスジェニックマウスも創− 93 −

傷周囲にガラクトシダーゼ遺伝子を誘導しているのが観察

ー遺伝子の発現を検討した。体幹表皮を用いたこの創傷治された（図６）。そこで、マウスの尾に細長い創傷を作り、癒実験においても、創傷初期においては第二のレポーター

経時的に再生上皮におけるガラクトシダーゼ遺伝子の発現であるガラクトシダーゼ遺伝子の発現が観察されたが、治を追跡した。マウスの尾は下床直下に尾骨があり、創傷治

癒反応の終了した後の再上皮化した表皮においては、ガラ

癒過程に真皮の創傷収縮が関与する率が少なく、上皮の遊クトシダーゼ遺伝子を発現する細胞は僅かにしか観察され走・再生が大きな役割を示すために用いた。

ない（図８）。

創傷治癒が完了し再上皮化の終了した後の尾皮膚の新生

しかしながら、この事実が直ちに有棘層の細胞が創傷治

上皮においてはガラクトシダーゼ遺伝子は僅かの孤立的な癒に貢献していないことの証明であるとは断定できない。

細胞においての発現しか観察されなかった（図７）。

このマウスの創傷部の表皮の病理像を蛍光抗体法により観さらに体幹部の皮膚に直径２−３cm 程の皮膚全層の切察したところ、創傷表皮における Cre リコンビネースの除を加え、経時的な生検によりさまざまな段階でのマーカ発現は、比較的高いレベルの有棘層あるいは顆粒層に相当する細胞にのみ限られ、基底層の近傍の細胞には発現誘導されていない。このため Cre リコンビネースによって引き起こされる遺伝子組み替えは、さらに遅れ最終的なガラ
クトシダーゼ遺伝子の発現は顆粒層から角層に近い層に限局するものとして観察された（図９）。そこでヒトケラチ

図５

培養表皮角化細胞での導入遺伝子の発現活性
CMV-LoxP-GFP-LoxP-LacZ 遺伝子単独では、GFP 蛋白のみが発現するが、K6a-Cre と CMV-LoxP-GFP-LoxP-LacZ の共導入においては、GFP 蛋白は切り出され発現が消失する
が、LacZ が誘導されている。

図７

マウス尾部での創傷治癒実験
創傷治癒面近傍の細胞のみ青く染色され、再生された表皮（２５d）においては、染色性は消失している。

図６

マウスの耳の創縁
イアーパンチ後のマウスの耳を X-Gal で染色し、導入遺伝子の転写活性を検討した。K6a-Cre と CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ のダブルトランスジェニックマウスと K6a-LacZ
マウスとも創傷局面に青く染色される。

図８− 94 −

マウスの体幹での創傷治癒実験
治癒過程の遊走面では青く染色されるが、再生表皮組織はLacZ 蛋白の発現は見られない。

創傷を負った表皮組織に特異的な遺伝子の組み替えを用いた、創傷治癒過程の追跡と表皮再生メカニズムの決定

ン 6 a 遺伝子により転写される Cre リコンビネースの活性コンビネースをあらかじめ有棘層へと誘導しておいて切開を強く基底層直上付近まで誘導されるように、トランスジを加える治癒実験を行った。創傷治癒過程の早期においてェニックマウスをかけ合わせ、Cre リコンビネース導入遺は上記の実験同様に潰瘍面や遊走する細胞にガラクトシダ

伝子のコピー数を増加させたマウスを創傷治癒実験に用いーゼ遺伝子の発現が観察される。さらに健常な尾部表皮全た。さらにこのマウス尾部に創傷を加える前処理としてフ体にもガラクトシダーゼ遺伝子が発現するがこれは全処理ォルボールエステル（PMA) を尾部に連日塗布し、Cre リのフォルボールエステル塗布により創傷刺激を加える前よりガラクトシダーゼ遺伝が誘導されていたことを示す（図10 上）。治癒過程後期の尾部においても、潰瘍面へと遊走していく角化細胞にはガラクトシダーゼ遺伝子の発現が観察されるが、その遊走面と健常表皮の間の再上皮化の完成
した再生表皮においてはガラクトシダーゼ遺伝子の発現は見られない。なおこのころには健常表皮のガラクトシダー
ゼ遺伝子の発現は消失している（図 10 下）
。

４

結

語

これまで上記の導入遺伝子を持つマウスの尾部や体幹の皮膚に大きめの切開を加え、さまざまな段階でのマーカー
図９

マウス創傷表皮の免疫染色像
創傷表皮において Cre 蛋白は有棘層上層から顆粒層にかけて発現しているが、LacZ 蛋白はさらに表層の角化層に近い細胞にのみ発現している。

遺伝子の発現を検討してきた。創傷初期から早期においては第二のレポーターであるガラクトシダーゼ遺伝子の発現は潰瘍へ遊走する細胞に発現する様子が観察されたが、治癒反応の終了した後の再上皮化した表皮細胞においてはガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現する細胞は僅かにであった。
この結果は創傷の前処理としてフォルボールエステルによる誘導を試みたマウスにおいても同様であった。
これらの事実を考えると重層上皮においても、ローリング仮説の予想するような有棘層の細胞が再び基底層の細胞へと脱分化し、再生・分裂能を回復するとする考えは証明され得なかった。今後は、単層上皮同様に、表皮組織においてもスライディング仮説が予測するように基底層のみが創傷治癒に重要であるのか、あるいはこの実験系では充分に検証できない欠点があるのかを検討していきたい。
謝辞
この研究のためご支援いただきましたコスメトロジー研

究財団に心より感謝いたします。
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で染色した。左の２ヶが、K6a-Cre と CMV-LoxP-GFPLoxP-LacZ のダブルトランスジェニックマウスで、右の尾がK6a-LacZ マウスのものである。傷面へむかう遊走表皮細胞は青く染色されるが、再生表皮は青く染まらない。

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