皮膚における生体リズムの分子機構
神戸大学大学院

医学系研究科脳科学講座分子脳科学分野

岡村均

Most organisms living on earth have an internal clock and thus circadian rhythm represent a basic feature of life. Inmammals, as in other many organisms, cellular circadian core oscillator is thought to be composed of an autoregulatorytranscription-(post)translation-based feedback loop involving a set of clock genes. Although master clock of the bodywas localized in the suprachiasmatic nucleus of the brain, the molecular core clock oscillatory loop is known to exist
in most of the cells in the body including skin. Here we investigated the expression of mPer1 and mPer2 genes in theskin, and found that skin keratinocytes and fibroblasts rhythmically expressed mPer1 and mPer2 genes. Clock signals
were transmitted from the SCN to peripheral tissues through oscillation conducting systems, in which corticosterone
and adrenergic signals may play the important part. Arrived clock signals entrain the cell-clock in the skin, and theintracellular oscillating loop coordinates the timing of the expression of a variety of genes with specific cellular function.

１．緒言

２．実験自転する地球の環境変動に適応するため地球上の生命が２．１ マウス皮膚における時計遺伝子の発現のサーカディアンリズム獲得した基本的な生命原理である。この体内時計を司る、時計遺伝子 mPer1, mPer2 の皮膚における日周変動を、長らく嘱望されていた哺乳類時計遺伝子 clock, mPer1 が、ノーザンブロットにて４時間毎、12 時間明・12 時間暗の我々を含む複数グループにより、1990 年代後半に発見さ明暗条件下で検索した。次に、これらの変化が、光刺激にれたのをきっかけに、哺乳類リズム研究は全く新しい局面よるものか、内因性リズムによるものかを判別するため、を迎え急速に仕事が進んでいる。

恒常暗条件下で検索した。

体内時計（生物時計 biological clock）は 24 時間周期で今回着目するのは、皮膚における時計遺伝子の発現であ以外の皮膚を含む末梢臓器に時計遺伝子がリズミックに発

２．２ マウス皮膚における時計遺伝子の発現のミクロ的解析現することが注目された。今回、この分子メカニズムを解哺乳類 mPer2 遺伝子の産物である mPER2 蛋白質に対明する。この末梢臓器における時計機構の発見により、体する特異的抗血清を用いて、マウス皮膚における時計蛋白

内の 24 時間リズムは、視床下部の視交叉上核を頂点とし、発現のサーカディアンリズムを検索した。

る。時計遺伝子の発見とともに体内時計のある視交叉上核他の神経系や内分泌系を中間とし、末梢臓器を底辺とする階層的時計機構により精妙に制御されていると想定されて２．３

時計遺伝子の転写制御機構いる。従来より、皮膚の代謝・血管・運動・立毛・発汗・時計遺伝子の発振機構で注目されるのは、転写から行動細胞分裂像が日内リズムを呈する事は知られているが、体まで、地球上の生物で共通する法則があることである。そ系的に検索はされていない。今回我々は、正常マウスにおれは、時計遺伝子が転写・翻訳後産生された時計蛋白質

ける時計遺伝子の日内リズムを検索し、皮膚のサーカディが、自分自身の転写制御を抑制するというオートフィー

アンリズムと活動の相関を検索した。

ドバックループによる発振分子機構である。哺乳類では、コア振動体を構成する発振の中心となる振動子は、mPer1と mPer2 の２つの遺伝子である。mPer1、mPer2 の転写によって産生された mPer1 mRNA, mPer2 mRNA から、

Molecular Mechanisms of BiologicalClocks in the Skin
Hitoshi Okamura
Division of Molecular Brain Science,
Department of Brain Sciences, Kobe
University Graduate School of Medicine.

PER1 蛋白質、PER2 蛋白質ができる。これが、細胞質から核の中へ入って CRY 蛋白と結合して、ポジティブ因子の転写を押さえる。これでループが閉じ、転写減少に続く
PER1、PER2 蛋白減少にともなう抑制効果の減少により、mPer1,mPer2 時計遺伝子の転写が再開される１）。mPer1 の５つの E-box（CACGTG, CACGTT）を介する転写制御を、bHLH-PAS 蛋白である CLOCK と BMAL1、CRY1、− 94 −皮膚における生体リズムの分子機構

CRY2 を用いて検索し、DBP 結合部位（D-box: RTTAY-

約 24 時間の時計遺伝子の振動が認められるという事実を発GTAAY (R: purine 、Y: pyrimidine)）の PAR 蛋白質群

見した３）。このリズムは１）、mPer1 mRNA, mPer2 mRNA（HLF, TEF, DBP）と転写抑制因子である E4BP4 との結と PER1 蛋白質、PER2 蛋白質の発現差異が４−８時間あ-/-/ること２）、Cr y1 Cr y2 のダブルノックアウトマウスがリ合解析を行った。

ズム消失すること、Cry1 が短周期を示すこと、Cry2-/--/-が２．４ 時計遺伝子の転写制御と時計蛋白質 PER2 の細胞内での時間的・空間的位置変化長周期を示すことなど、行動リズムと全く同じ変異を示し時計遺伝子の単純なフィードバックループにさらに、蛋で、末梢臓器の時計も視交叉上核と同じ完全なサーカディ

白質レベルの修飾が加わり、24 時間リズムができると考た。行動リズムの性質は視交叉上核で完全に決定されるのアン時計があるといえる。

えられる。まず初めは、リン酸化による分解制御である。

次に、この末梢時計が自律的なリズムを持つかどうか決

まず、できた PER1, PER2 蛋白質モノマーは、細胞質中に定するため、視交叉上核を電気凝固の方法で破壊した後の、存在する caseine kinase Iε（CKIε）によりリン酸化され末梢臓器の末梢時計の時計遺伝子の発現リズムを経時的に

２）

免疫組織化学とノーザンブロットにて検索した。

、リン酸化された PER1, PER2 は分解される。時計蛋白質 PER1, PER2 の分解に、ユビキチン・プロテアソームが３．結関与しているかどうかを検索した。

２．５ 視交叉上核の中枢時計が末梢臓器の末梢時計に与える影響

果

３．１ マウス皮膚における時計遺伝子の発現のサーカディアンリズム
時計遺伝子 mPer1, mPer2 の皮膚における日周変動を、視交叉上核では mPer1, mPer2 を中心とする分子時計がノーザンブロットにて４時間毎、12 時間明・12 時間暗の昼をピークとする発現振動を起こし、これが全身のリズム明暗条件下で検索すると、著明な昼夜差が認められた。次を引き起こすと考えられている（図１）。 1998 年 Schiblerに、これらの変化が、光刺激によるものか、内因性リズムのグループは rat1 線維芽細胞系に血清刺激を加えると、によるものかを判別するため、恒常暗条件下で検索しても、

図１

哺乳類における時計のコア・ループ
時計遺伝子群の E-box に CLOCK/BMAL1 のヘテロ二量体が結合し、mPer1, mPer2 転写を促進する。
mPER1, mPER2 はカゼインキナーゼ Iε (CKIε) によるリン酸化を受けた後分解されるため、蓄積するのに時間がかかる。核・細胞質にはシャトリング機構があり、これも PER2 の核内移行に時間をかからせる原因である。核内では、PER2, CRY1, CRY2 抑制性の複合体が CLOCK/BMAL1 による転写の活性化を解除し、自分自身（時計遺伝子群）の転写を抑制することによりループが取れる。この繰り返しが約 24 時間の周期を作り出す。

− 95 −

著明な昼夜差が認められた（図２）。この結果は、皮膚にも内因性リズムが存在すること、時計のコア・ループによる発振が行われていることを示唆する。

３．２ マウス皮膚における時計遺伝子の発現のミクロ的解析
哺乳類時計遺伝子の中でリズム発振に最も重要な遺伝子

図２

皮膚の mPer2 mRNA 発現の昼夜差
恒常暗条件で、CT4（体内時計の朝）、CT12（体内時計の夕刻）、CT16（体内時計の夜半）の時期での皮膚 mPer2
mRNA のノーザンブロットによる検出。と目される mPer2 遺伝子の産物である mPER2 蛋白質に対する特異的抗血清を用いて、皮膚におけるサーカディアンリズムを検索した。ケラチノサイトに時計遺伝子が体内時計の夜の時間に強く発現していることを見出した。これは、上記のノーザンブロットの結果とよく一致して、転写証明した５）。この NLS-NES によるシャトリング機構によの増大は、時計蛋白の増大を引き起こすことを示している。

り PER1, PER2 蛋白質の核内濃度は調節される。
この核—細胞質間の平衡状態を打ち破るのが、核蛋白３．
３

時計遺伝子の転写制御機構

CRY1, CRY2 である。CRY1,CRY2 の核内出現は厳密に時

mPer1, mPer2 の 転 写 は、bHLH-PAS 蛋 白 で あ る間によりコントロールされているが、これが核内に多量にCLOCK と BMAL1 のヘテロダイマーが mPer1, mPer2 のなると、PER2 と結合し、安定な PER2-CRY1 及び PER2-

プロモーターの E-box にポジティブ因子として結合してCRY2 複合体を形成し、これがポジティブ因子に結合して促進される（図１）。また mPer1 プロモーターには、転写引き剥がし、Per1, Per2 の転写を阻害する。これで時計発促進因子である PAR 蛋白質群（HLF, TEF, DBP）と転写振のフィードバックループが閉じると考えられる。この抑制因子である E4BP4 があり、D-box での競合制御が重PER2, CRY1, CRY2 による抑制を解除するのが、ユビキチ要である。PAR 蛋白質は昼間に発現し転写を促進するが、ン・プロテアゾームによる分解である。この抑制因子の分４）

E4BP4 は夜に発現し、転写を抑制した 。

解により、転写は再開される。

３．４ 時計遺伝子の転写制御と時計蛋白質 PER2 の細胞内での時間的・空間的位置変化

３．５ 視交叉上核の中枢時計が末梢臓器の末梢時計に与える影響

PER1, PER2 の 蛋 白 質 分 解 は、MG132 で 抑 制 さ れ、全身のマスター時計は脳の視交叉上核にある。最近我々

MG132 で処理した PER2 はユビキチン化されていた。従は、Per1 プロモーター・ルシフェラーゼ（mPer1-luc）をって、PER2 分解にはユビキチン・プロテアソームが関与導入したトランスジェニックマウスを開発し、細胞組織レ５）していると想定される 。従って、転写のはじめの段階でベルで mPer1 の転写発現を可視化することで長時間リア

は、RNA はできても、蛋白質は次々に分解されて、いっルタイムで観察することに成功した７、８）。この mPer1-luc

こうに貯まらないという状態が続く（図３）。ところが、から取った視交叉上核のスライス培養系を極微弱光検出冷

mPer1, mPer2 の転写は刻々と増大し、PER1, PER2 蛋白

却 CCD カメラにて観察することにより、細胞一個一個の質もたくさんできてくると、CKIε は一日中一定であるのリズムを観察することが可能となった８）。この結果、驚くで、蛋白質をリン酸化し分解しきれない状態となる。リン

べきことに、視交叉上核の一つ一つは独立した細胞時計で酸化が時計ループの周期を決定する重要な過程であるこあり、各々のリズム位相は微妙に違い、最大では 10 時間とはヒトでも示されている。最近米国の家系調査により、ものピーク位相の格差が存在する。お互いの細胞時計は連PER2 のリン酸化の障害を示す家系が、体内時計の周期が絡しており、全体は絶妙なハーモニーを奏でて視交叉上核短いことで、時計遺伝子の転写フィードバックループの存の強力な振動を生み出すことが明らかとなった。このよう

６）

在とリン酸化反応の重要性が劇的に証明された 。

な検出システムは、細胞内の遺伝子振動がいかにしてトー分解されなかった PER1 と PER2 は、PER3 等とダイマタルとしての脳・生体機能である行動にまで至るかを解析ー形成し、自身の NLS（nuclear localization signal）を利する有力な実験系として、今後末梢組織のサーカディアン用して、核内に移行する。ここで、第二の抑制遅延機構がリズムの研究に広く用いられて行くであろう。

存在する。それは、PER2 蛋白内の NES（nuclear export

末梢組織では、血管平滑筋の時計遺伝子が非常に大きいsequence）による制御であり、核内から細胞外に PER2振幅を持って振動すること９）、線維芽細胞でもペプチド刺蛋白は排出される。このシャトリングは mPER2（1-916）

激により時計遺伝子の 24 時間周期のリズムが数周期惹起

GFP を発現する NIH3T3 細胞と Hela 細胞の細胞融合系でされた 10）。従来リズム発振機能が全く無いとされてきた− 96 −

皮膚における生体リズムの分子機構

図３

哺乳類におけるコア・ループを構成する時計蛋白質の分解
コアループの抑制機構を司る PER1, PER2, CRY1, CRY2 はユビキチン化されプロテアソームにより分解され、再びフリーとなった CLOCK/BMAL1 が E-box に再結合し、転写が再開する。

肝臓や胃腸などの末梢臓器にも、食餌に同調する、基本的
11）細胞時計として働き、さまざまな細胞内プロセスに時刻シ。では、視交叉上核とグナルを伝達する。時計シグナルにより転写レベルで制同様、末梢臓器の時計は自律発振能を持っているのであろ

御されている遺伝子を被時計制御遺伝子 clock controlledうか？最近、リズム異常の線維芽細胞を正常の個体に移植genes（ccg）と総称しているが、この ccg が想定されてしてこの線維芽細胞の時計遺伝子発現を検索すると、正常いるよりもはるかに多く、少なくとも数百の遺伝子にのぼな時計発振機構が備わっているのリズムを示すことがわかった

12）。これは、末梢臓器のることは、最近のジーンチップ解析から明らかとなった

時計は自律振動能が弱く、中枢時計の支配下にあることを13）示している。今回、視交叉上核を破壊したマウスでは、末ムを引き起こす最初の機序は、やはり BMAL/CLOCK の梢臓器のリズムは消失していた。

E-box への結合だと考えられている。

４．考。このコア・ループのシグナルが、これら遺伝子のリズ

CLOCK/BMAL1 ヘテロダイマーは vasopressin、dbp

察など多くの遺伝子が持つプロモーターの部位にある E-box

皮膚における発汗、皮膚血流、表皮細胞分裂など、さまに結合し、転写を増大させる。また、先ほど述べた、転ざまな皮膚組織で起こる現象に概日リズムがあることがわ

写促進因子である PAR 蛋白質群（HLF, TEF, DBP）とかっているが、その詳細は未だ検索されていない。前記し転写抑制因子である E4BP4 との DBP-bs での競合制御もたように、この数年間で生体リズムの分子機構が次々に解重要である。PAR 蛋白質は昼間に発現し転写を促進する

明されつつあり、時計遺伝子の発振シグナルが、コレステが、E4BP4 は夜に発現し、転写を抑制する４）。これにより、ロール合成酵素、アルブミン産生、各種ミトコンドリア酵アルブミン、cholesterol 7α hydroxylase、ドーパ脱炭酸素など生体機能のベーシックな遺伝子の転写をコントロー酵素などの遺伝子が転写制御されると考えられる。夜に発ルすることが知られている。

現する多くの遺伝子は抑制性の転写因子 RevErbα によっ皮膚組織は、ケラチノサイトを中心とした表皮、線維芽て引き起こされる。

細胞が主たる真皮、血管・神経の豊富な疎な結合組織であ多細胞生物において、非常に分化した多種類の細胞に時る皮下組織よりなる。今回の検索で皮膚組織もサーカディ計機能が存在することは、その細胞に特殊化した機能にリアン振動体を持つことがわかった。細胞内のコア振動体はズムがあることが想定される。ケラチノサイトでにおいて− 97 −

も各種酵素の発現の日内リズムはあるであろう。エネルギ

５） Yagita K, Tamanini F, Yasuda M et al.: Nucleocyto-ー代謝、膜蛋白の機能、さらに細胞周期のコントロールな

plasmic shuttling and mCRY dependent inhibition of

ど多くの必須の細胞機能に時計シグナルは利用されている

ubiquitination of the mPER2 clock protein. EMBO J.,と考えられる。

21, 1301-1314, 2002.

皮膚の細胞種のうち、どれがもっとも時計遺伝子の発振

６） Toh KL, Jones CR, He Y, et al.,: An hPer2 phosphor-がなされているのかは、非常に重要な問題である。この解

ylation site mutation in familial advanced sleep phase

明により、皮膚の粘性、湿潤など、時間特異的な化粧品のsyndrome. Science, 291, 1040-1043, 2001.

開発が可能になるかもしれない。また、細胞増殖の時期や

７） Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, et al.,: Visualization

その制御因子がわかれば、紫外線などによる皮膚の障害に

of mPer1 transcription in vitro by luciferase mediated「時間特異的に」防護できる新しい方法が可能になるのか

bioluminescence: NMDA induces a rapid phase-shift ofもしれない。リズム遺伝子が高いときは効率的な代謝変動

mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol., 11, 1524-1527,
2001.になり、リズム遺伝子が低いときは非効率となる。したがって、時計遺伝子の転写変動が滞ると、代謝が低下し、細８） Yamaguchi S, Isejima H, Matsuo T, et al.,: Synchro-胞ダメージが増大する。従って、ストレスなどによるリズ

nization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucle-

ムの乱れが、代謝の滞りを引き起こし、細胞障害を急速に

us. Science, 302, 1408-1412, 2003.

増大する可能性が高い。これを防止する化粧品の開発が可

９） Nonaka, H., Emoto N., Ikeda K., et al.,: Angiotensin
II induces circadian gene expression of clock genes in

能かもしれない。

cultured vascular smooth muscle cells. Circulation, 104,

（文献）

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− 98 −