〔大学院博士課程（後期）奨学金贈呈者〕

カロテノイドによる薬物代謝酵素シトクロム P450 誘導における分子基盤の形成

大野北海道大学大学院獣医学研究科

緒円

実

博士課程

Ax の薬物代謝への影響を調べるために、Ax の摂取によ言
カロテノイドはさまざまな植物由来食品に広く含まれり CYP および抱合酵素の代謝活性がどのように変化する赤色もしくは黄色色素の総称であり、βカロテンなどるか、ラットを用いて調べた。以下に具体的な方法を示

は体内でビタミン A に変換されることで、さまざまなす。

活性を発揮する。特に、in vivo および in vitro の実験か

8 週齢の Wistar ラット（オス）に Ax 含有ココナツ油ら、多くのカロテノイドが優れた抗酸化作用を示すこと（100mg/kg 体重 / 日）または対照としてココナツ油単がすでに明らかになっている。そのため、カロテノイド独を 3 日間経口投与した。最後の投与から 24 時間後にが動物や人間の健康にとって有用であるとの見方が強安楽殺し、各種臓器を採取した。リアルタイム PCR 法

く、サプリメントや飼料添加物として積極的に用いられを用いて臓器内での CYP1A1、グルタチオン抱合酵素ている。しかし、2 つの大規模なコホート研究により、（GST）、グルクロン酸抱合酵素（UGT）の mRNA 発現βカロテンが喫煙者やアスベスト被曝露者において肺が量を定量した。また、ウェスタンブロッティング法によ1,2)という可能性が示された。さり CYP1A1 および NADPH シトクロム P450 還元酵素

らに、近年になってアスタキサンチン（Ax）などのビ（CPR）タンパク質発現量を測定した。さらに、肝臓酵

タミン A に変換されないカロテノイドが薬物代謝酵素素画分（S9 およびミクロソーム）を調整し、CYP1A1、シトクロム P450（CYP）1A の活性を非常に強く誘導

GST、UGT、CPR 活性をそれぞれ測定した。

んリスクを増大させるするという予期せぬ作用が報告された

3-5)。CYP1A は多2．CYP1A1 転写誘導機構の検討くの発がん前駆物質の活性化を行うことが知られておH4IIE（ラット肝癌由来細胞株）および HepG2（ヒトり、その酵素活性の誘導と肺がんや大腸がんリスクの増肝癌由来細胞）に Ax を曝露し、CYP1A1 の mRNA 発大に関連があるとされている6,7)。しかしながら、カロ現量を測定した。また、ヒト CYP1A1 転写調節領域をテノイドの摂取による薬物代謝の変化やカロテノイドに含むルシフェラーゼレポータープラスミドを導入した

よる CYP の転写誘導機序についての研究は十分ではな

H4IIE および HepG2 を用いて、Ax の転写活性化能を調く、ヒトを含めた動物におけるカロテノイドの CYP にべた。

対する影響は不明である。そこで本研究では、Ax などのカロテノイドが CYP の酵素活性に与える影響につい低いて転写レベルから酵素反応時における影響まで明らかにすることを目的とした。
水溶性

方第Ⅰ相：CYP などによる１酸素付加法

1．ラットにおける Ax 摂取による薬物代謝能の変化

第Ⅱ相：抱合酵素による抱合

一般に、体内に取り込まれた脂溶性物質は 2 段階の反応を経て水溶性が増し、体外へ排出される（図 1）。

高い

1 酸素付加反応が行われる第 I 相においては CYP が主体外へ排出に働き、続く第 II 相においては抱合酵素が水溶性の高い補酵素を添加することで水溶性をさらに増大させる。

図11

脂溶性物質の代謝の概略

大結野

円

実

ラットの肝ミクロソームに埋め込み、Ax 含有肝ミクロ果ソームを作製した。Ax 含有肝ミクロソームの CPR 活性1．ラットにおける Ax 摂取による薬物代謝能の変化を同様に測定したところ、Ax は濃度依存性に CPR 活性

図 2、3 に示すように、対照群と比べて Ax 投与群では GST、UGT の mRNA 発現量とその酵素活性は変化しを抑制した（図 6）。

な か っ た。 一 方、CYP1A1 は mRNA 発 現 量 が 5.5 倍、2．CYP1A1 転写誘導機構の検討

CYP1A1 酵素活性は Ax 投与群で 2.5 倍増加していたが、HepG2（ ＞ 50µM） の 両 方 で CYP1A1mRNA 発 現 量タンパク質発現量から考えると予想したよりも低い活性が 有 意 に 増 加 し た（ 図 7）
。H4IIE に お い て、 典 型 的であった。そこで、CYP の酵素反応における律速因子

CYP1A1 誘導剤であるズダン III による CYP1A1mRNAである CPR（CYP に電子を供給する酵素）のタンパク発現量は曝露 12 時間後に最大となるが、Ax は曝露開質発現量および酵素活性を測定した。すると、CPR タ始から 6 時間後にピークを迎えた（data not shown）。

ンパク質発現量は Ax 投与群で増加していたものの、そまた、HepG2 よりも H4IIE のほうがズダン III によるの酵素活性は有意に減少していることがわかった（図CYP1A1 誘導作用が鋭敏に観察されたが、Ax について5）。さらに、遠心によりさまざまな濃度の Ax を無処置も同様の傾向が観察された。さらに、レポーターアッセ

12

それぞれの特異的基質に対する酵素活性（nmol/min/mg protein)

培養細胞に Ax を曝露したところ、H4IIE（＞ 10µM）、

コントロールAx

108642

CYP1A1GST

UGT

350

コントロール250200150100500GST 酵素活性

図31086420120100806040200

図4コントロールUGT 酵素活性

GST および UGT 抱合酵素の代謝活性

Ax

CYP1A 酵素活性（pmol/min/mg protein)

58kDa
45kDa

コントロール
Ax300

CYP1A1、GST、UGT の mRNA 発現量コントロールAx

CYP1A のタンパク質発現量および酵素活性Ax
CPR 酵素活性（nmol/min/units of protein)

図2

Relative protein expression

0

Relative protein expression

Relative mRNA expression/GAPDH

タンパク質発現量が 8.5 倍に増加していた
（図 4）
。また、

2.01.51.00.50

図50.030.020.010コントロール

CPR のタンパク質発現量および代謝活性2Axカロテノイドによる薬物代謝酵素シトクロム P450 誘導における分子基盤の形成

イの結果より、Ax がヒト CYP1A1 転写調節領域を活性に増加させる。Ax が CYP1A1 の転写誘導能を有するこ化する可能性が示唆された（data not shown）。とは細胞実験においても明らかにされた。ヒトでは Axの摂取により CYP1A 活性は変化しないと考えられてい考たが、ヒト肝癌由来細胞である HepG2 でも Ax により

察
ラットでの投与実験から、CYP1A 酵素活性は Ax にCYP1A1mRNA が有意に増加したため、高濃度の Ax がよって 2 つの異なる影響を受けることが明らかになっヒトの薬物代謝能に影響を与える可能性が示唆された。

た。第一に、Ax は CPR 活性を抑制、つまり CYP へのCYP1A1 の一般的な誘導剤は転写調節因子アリルハイド

電子供給を減少させることで CYP 酵素活性を間接的にロカーボン受容体（AhR）のリガンドであり、リガンド抑制する。CPR 活性の抑制は、タンパク質の発現量の結合 AhR が細胞質から核内へ移行し、外来異物反応領減少ではなく、Ax のもつ物理的作用であると考えられ域（CACGC）を活性化して下流の遺伝子の転写が開始る。なぜならば、Ax 投与群の肝臓で CPR タンパク質発することが知られている。AhR のリガンドはダイオキ現量はむしろ増加していたことに加え、in vitro 実験系

シン類をはじめ、疎水性で平面的な多環構造を持つ。しで、Ax は濃度依存性に CPR 活性を抑制したからである。

かしながら、カロテノイドはそれらとはかけ離れた構造

Ax は脂溶性が高く、細胞内においては脂質で構成されたをしており、AhR とは結合できないことが予想される。

8)膜系、特にミクロソームに局在すると報告されている 。

実際に、Ax と同様に CYP1A 酵素活性を誘導するカロテ

これらのことから、Ax 投与後のラット肝臓の細胞に取ノイドである、カンタキサンチンはダイオキシン結合部

り込まれた Ax がミクロソーム膜上において CPR から位には作用しないことがすでに報告されている 9)。

CYP への電子伝達を阻害し、CYP1A 酵素活性を抑制し本研究は初めて Ax による CYP1A1 誘導を培養細胞実たと考えられる。

験において再現することに成功したものである。それによって、細胞内シグナルカスケードへカロテノイドが与パク質発現量を増加させることでその酵素活性を量的える影響について詳細に検討することが可能となった。

Relative activity(% )第二に、Ax は CYP1A1mRNA の転写を誘導し、タン120

今後は Ax が標的とする転写調節配列や転写調節因子を100明らかにしていく予定である。

80

要60

Ax は CYP1A1 の転写を増加させ、その酵素活性を40誘導する。しかし、肝臓ミクロソームに取り込まれた20

Ax は CPR 活性を阻害し、CYP への電子供給量を減少

0110させることで CYP 活性を阻害するという 2 重の作用が

100
1000
Ax (nM in reaction)あることがわかった。また、細胞実験から Ax による

図 6 in vitro 実験系における CPR 活性
H4IIE

2515310251000MMμμ01

図7細胞における CYP1A1mRNA 誘導
3Mn001001μn0011MMn0M41HepG25200

CYP1A1 mRNA 発現量 /GAPDH

約1μM01μM05μM001μM

大野円

CYP1A1 の転写誘導が CYP1A1 上流に位置する転写調

実文献

1) Albanes D. et al. J. Natl. Cancer Inst . 88, 1513-1515. 1996

節領域の活性化による可能性が示された。

2) Omenn G.S. et al. J. Natl. Cancer Inst . 88, 1550-1559. 1996

謝3) Wolz E. et al. Drug. Metab. Dispos . 27, 456-462. 1999

辞4) Jewell C., O'Brien, N.M. Br. J. Nutr . 81, 235-242. 1999

本研究を行うにあたり、財団法人三島海雲記念財団か5) Gradelet S. et al. Xenobiotica 26, 49-63. 1996

ら助成を賜りましたことに深く御礼申し上げます。

6) McLemore T.L. et al. J. Natl. Cancer Inst . 82, 1333-1339. 1990
7) Sivaraman L. et al. 1994. Cancer Res . 54, 3692-3695. 1994
8) Petri D., Lundebye A.K. Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol .
145, 202-209. 2007
9) Gradelet S et al. Biochem Pharmacol . 54, 307-15. 1997

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