2018/6/17

武田セミナー2018年6月16日

遺伝子組換えとゲノム編集
ゲノム編集とは濡木 理
東京大学大学院理学系研究科

遺伝子↓タンパク質・RNA
↓

生化学

立体構造
↓
メカニズム

分子生物学
構造生物学
構造生命科学↓生命現象1

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ペプチド結合αヘリックス2

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平行、逆平行βシート

Mg2+チャネル MgtE
CBS domain

CBS domain
N domain

N domainintracellular

C-N domain

Plug helix

Plug helices
TM domain

extracellularN+

Plasmamembrane

Mg2+

Hattori, et al., Nature (2007)3

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時代は今、CRISPR
Googleにおける検索トレンドの時系列的推移(全世界)「この技術は私たちのiPSも足下にも及ばないようなiPS可能性のある技術」
山中伸弥博士@2015.8
クローズアップ現代

iPSにノーベル賞
2012.10

iPS

Sep-06
Jan-07
May-07Sep-07
Jan-08May-08
Sep-08Jan-09
May-09Sep-09Jan-10May-10
Sep-10Jan-11
May-11
Sep-11
Jan-12
May-12
Sep-12
Jan-13May-13
Sep-13Jan-14May-14
Sep-14

Sep-05Jan-06
May-06

RNAi
RNAiにノーベル賞
2006.10CRISPR

Jan-15May-15
Sep-15Jan-16May-16
Sep-16
Jan-17

RNAi

Jan-04
May-04
Sep-04Jan-05
May-05

100
90
80
70
60
50
4030
20
100

Googleにおける検索の国別分布(2005-2015年のピーク時)

RNAi

iPS

Source : Google Trendsを元にEdiGENEにて作成

CRISPR

7

ついに島耕作にもゲノム編集登場

Source : モーニング 2017.2.16号

842018/6/17

2017年10月12日放映 テレビ朝日「羽鳥慎一のモーニングショー」より（Youtube 濡木で検索してください）

レトロウイルスを用いた従来の遺伝子組換え治療

とにかく遺伝子をゲノムのどこでもいいから組み換えてしまうことが危険52018/6/17

X-SCID：造血幹細胞の遺伝子組換え治療による発がん• 造血幹細胞の遺伝子治療によって骨髄移植並か、それ以上の効果が得られるが、治療を受けた92人中11人に白血病が発症、1人が死亡した。
• 原因は、治療に用いたレトロウイルスがゲノムのあちこちに入り込むことによる突然変異発がんが考えられている。

従来の遺伝子組換え

ゲノム編集による遺伝子矯正62018/6/17

ゲノム72018/6/17

Genome editing
相同組換えを用いたゲノム編集

人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集

マウス、酵母などさまざまな生物種

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Engineered nuclease
ZFN (zinc finger nuclease)Cas9-sgRNA

1 ZF -> 3塩基

Cas9
TALEN (TAL effector nuclease)

標的DNA

1 TALE -> 1塩基sgRNA(single guide RNA)• タンパク質モジュールがDNAを認識• ガイドRNAがDNAを認識• アミノ酸置換 -> 標的配列の変更• RNA配列の変更 -> 標的配列の変更• 標的配列の変更が非常に煩雑• 標的配列の変更が迅速・簡便ターゲット毎に切断酵素を設計しなければならない前世代の技術に対して、
CRISPRはガイドRNAの設計だけでゲノムのカット&ペーストができるスピードとスループットに優れた最新のゲノム編集技術

ガイドRNAZFN/TAL

毎回専用のハサミを作成する

ハサミは共通Cas9

RNAで目印をつけるだけ
18

Nature Reviews Genetics 16, 501–516 (2015)92018/6/17

CRISPR-Cas9 system

Cas9 is a putative nuclease
Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)11368?

?

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Cas9 is an dual RNA-guided DNA nuclease

Jinek et al. Science2012

Cas9 is an dual RNA-guided DNA nuclease
RuvC
Non-target
DNA strand
HNH

TargetDNA strand

TargetRepeat5’GuidePAM

crRNA
3’ (CRISPR RNA)

5’Anti-repeat

tracrRNA(trans-activating RNA)3’(protospacer adjacent motif)
Jinek et al. Science
2012

11

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Cas9 can work with a sgRNA
RuvC
Non-target
DNA strand
HNH

TargetDNA strand

TargetRepeatsgRNA

5’GuideAnti-repeat

PAM(single-guide RNA)3’
(protospacer adjacent motif)
Jinek et al. Science
2012

Genome editing by Cas9Cong et al. Science201312

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Genome editing by Cas9

Charpentier & Doudna Nature N&V2013• Introduction of Cas9 and 5sgRNAs into mouse ES cells
enabled simultaneous knockout of 5 genes.
• Two gene knocked-out
mouse was generated byCas9.

Wang et al. Cell 201313

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Double strand break in genome causes non-homologous
end joining (NHEJ) or homologous recombination (HDR)

ゲノム編集は決まった位置に切れ目を入れるだけ、あとは細胞が自然の摂理で修復する過程を遺伝子矯正に利用するのみ

NHEJ

HDR

RepairCRISPRはゲノム上の狙った部位をピンポイントで切断し、書き換えられるゲノム編集技術

Cas9(切断酵素)
ゲノムDNA

置換配列
ターゲット切断部位

ガイドRNA

切りたい場所の遺伝子配列に合わせて設計

修復酵素2814

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CRISPR(ゲノム編集)は遺伝子治療法開発にブレークスルーをもたらす強力な技術•

体外に細胞を取り出して編集する方法と体内で編集する方法がある

体外および体内でのゲノム編集医療
体外
自己細胞採取ゲノム編集•

短時間かつ効率のよい設計と導入が可能になる•痕跡のないクリーンな方法によって遺伝子を修復できる•

自己の細胞を編集するので探すのが大変な移植ドナーが不要

正常化した
自己細胞の注射
体内

全身投与

局所投与

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Question
How does Cas9–sgRNArecognize and cleave DNAtargets?

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