ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導
富山大学大学院医学薬学研究部

黒 崎

文 也

Several lines of evidence suggested that Rac/Rop GTPases in Aquilaria microcarpa play roles in jasmonates-induced
activation of sesquiterpene biosynthesis in the plant cells. The expression of farnesyl diphosphate synthase gene of A.
microcarpa was markedly increased even in the absence of methyl jasmonate in the cells over-expressing a calmodulin gene
and a Rac/Rop GTPase gene. These findings suggest that calmodulin and Rac/Rop GTPase proteins should function as a key
mediator in jasmonate-signaling in higher plant cells.

１．緒

今回の研究の材料として用いたのは東南アジア原産のジ言

ンチョウゲ科木本植物である Aquilaria microcarpa で、機Jasmonic acid（JA）及びそのメチルエステル体である

械的傷害や微生物の感染といったストレスにさらされるこ

methyl jasmonate（MJ）は「jasmonate」と称される植物とにより、幹の内部に芳香性セスキテルペンを多く含む樹ホルモンの一種で、植物の成長、発達ならびに乾燥、傷害、脂状の「沈香」を形成する。通常の状態ではマスクされて微生物の感染等の多彩な外的ストレスに対する防御応答にいる Aquilaria 植物のセスキテルペン生合成能を発現させおいて重要な役割を担うメッセンジャー分子である 。まるために様々な試みがなされているが、最近 Okudera 等

た、jasmonate を細胞外から人為的に添加することによっによって MJ 刺激を与えることでセスキテルペン群の生合て、様々な二次代謝産物の生合成が活性化することが良く成が誘導されることが示された。 本研究では、jasmonate知られている 。最近の研究によれば、JA は植物細胞内を引き金とする A. microcarpa のセスキテルペン生合成発に 取 り 込 ま れ た 後 isoleucine と 接 合 体 を 形 成 し、SCF現に関わる細胞内情報伝達機構を解明し、その応用として、

ubiquitin E 3 ligase の構成成分である COI 1 タンパクに認Aquilaria 細胞内に潜在的に存在している二次代謝能を顕識される。 その後、転写抑制因子である JAZ がユビキチ在化させるための方法論を開発することを目的とした。

1）2）

ン化され、次いでプロテアソームによる分解を引き金とし2．実てカスケードに関わる様々な因子の転写が開始されること
3）5）

験が示されている 。しかしながら、その後、どのような機

2 .1 RACE法によるFaPS 並びに Am-racのクローニング

構によって多様な細胞の反応が誘導されるかについては殆A. microcarpa のカルスからRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）

んど知見が無い。我々のグループはこれまでの研究で MJによって total RNA を抽出し、次いで逆転写反応によってをはじめとする外部刺激に呼応した二次代謝産物生合成能

cDNA を合成した。3’-RACE のための cDNA については活性化には Ca カスケードの活性化が必須であり、更に、

GeneRacer Kit（Invitrogen）、 ま た、5’-RACE の た め の

こ れ ら の プ ロ セ ス に は Ca 結 合 タ ン パ ク で あ る

cDNA は 5’/ 3’RACE Kit 2 nd Generation（Roche）をそれcalmodulin（CAM）や monomer 型 GTP 結合タンパクの一ぞれ用いて作製した。データベースを検索して設計したプ種である Rac/Rop GTPase などの機能分子が関与するこライマーを組み合わせて PCR を行い、増幅された DNA 断とを報告している 。また、これらの現象が、植物種や化片を精製した後に pGEM-T Easy Vector（Promega）に組合物種に依存せず幅広く保存されていることに着目して、み込んだ。その後、One Shot Top10 Chemically Competent

情報伝達関連因子の遺伝子を植物に導入・発現させ、細胞Cell（Invitrogen）を形質転換して、目的の遺伝子の存在が内情報伝達機構を人為的に操作することで、二次代謝能を確認できたプラスミドの塩基配列を決定した。

2+2+4）

4）

活性化させうる可能性を提案している 。

2.2
Induction of biosynthetic activity ofsesquiterpene compounds by artificial
modif ication of sig na l-transduct ion
processes of Aquilaria plant cells
Fumiya Kurosaki
G r adu at e S cho o l of Med ic i ne a nd
Pharmaceutical Sciences for Research
University of Toyama

RT-PCR による発現解析

Murashige-Skoog（MS）寒天培地上に A. microcarpa のカルス（100 mg）をとり、yeast extract（Difco、１mg/mL）、2+MJ（和光純薬、100 μM）、Ca -ionophore A 23187（和光純薬、10 μM）の溶液（100 μL）を滴下することで刺激を加え、25℃、暗所でインキュベートした。外部刺激を与えた後、経時的にカルスを回収し、前述の方法で total RNA を調製− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014した。 得られた RNA を逆転写し、次いで、目的遺伝子の凍 結 融 解 法 に よ っ て Agrobacterium tumefaciens 4404

翻訳領域及び 3’側非翻訳領域に対応するプライマーで PCR（Invitrogen）に導入した。

を行い、生成物を電気泳動で分析して発現量を解析した。

植 物 へ の 遺 伝 子 導 入 に あ た っ て は 形 質 転 換 し た A.

コントロールには total RNA あるいは恒常的に発現するこtumefaciens 菌液にカルスを３分間浸漬し、次いで菌液をとが確認されている Am-cam 2 を用いた。

濾紙に吸収させた後、2 , 4 - dichlorophenoxyacetic acid ３6μM、N -benzyladenine ３μM を 含 む MS 寒 天 培 地 上に 静

2. 3 阻害剤存在下での MJ 刺激に対する Am-FaPS1の発現解析
プロテアソーム阻害剤である MG- 132（Calbiochem、10置 し た。 こ れ ら を 25 ℃、 暗 所 で ３ 日 間 共 培 養 し た 後、cefotaxime（和光純薬、500 μg/mL）、kanamycin（和光純薬、50 μg/mL）、2 , 4 -dichlorophenoxyacetic acid
6３μM、or 2 . 5 μM）、rac 阻 害 剤 で あ る NSC 23766（Calbiochem、N -benzyladenine ３μM を含む MS 培地上に 25℃暗所で４100 or 25 μM）、Ca チ ャ ネ ル 阻 害 剤 で あ る verapamil

日 間 静 置 す る こ と で 殺 菌 を 行 っ た。GFP、Am-cam 1、hydrochloride（Sigma、100 or 25μM）、また、CAM阻害剤でAm-rac 2、CArac 2、DNrac 2 を組み込んだ A. microcarpa

あるN（6 - aminohexyl）-5 - chloro-1-naphthalenesulfonamideのカルス（100 mg）から前述の手法で total RNA を抽出し、（W- 7、BIOML. Res. Lab.、100 or 25 μM）をそれぞれ含ん逆転写によって cDNA を得て PCR を行い、生成物の電気だ2,4-dichlorophenoxyacetic acid、３μM、N -benzyladenine

泳動によって発現量を解析した。定量的評価にあたっては、

３μM 入りの MS 寒天培地を作製し、その上にA. microcarpa

Image J を用いてバンドの濃度を数値化し相対値として表のカルスを静置して、25℃、暗所で４日間プレインキュベした。

2+6ーションを行った。次いで MJ（100 μM）100 μL を滴下し3．結６時間インキュベーションを行い、total RNA の逆転写によって得た cDNA を鋳型として PCR を行った。また、コン3.１

トロールには Am-cam 2 を用いた。

3.1.1

果FaPS のクローニングと諸性質の解析
FaPS のクローニング

A. microcarpa のセスキテルペン生合成活性を評価する

2. ４

Am-rac2 への変異の導入にあたり、まず前駆物質であるファルネシル二リン酸生合

Am-rac 2（GenBank accession no. JF 922915）を用いて、成酵素、FaPS、をコードする遺伝子を単離することを試み

植物に恒常的活性型、恒常的不活性型の Am-rac 2 タンパた。これまでに報告されている FaPS 遺伝子配列中でよくクを発現させるために Am-rac 2 の ORF に 1 塩基置換を行保存されている領域からプライマーを設計し、RACE 法にった。

よりクローニングを行った。縮重プライマーにより、まず

2.4.1

恒常的活性型 Am-rac 2 の作製

コア構造を得た後に 3’側および 5’側の配列をそれぞれ決Am-rac 2 の GTP の加水分解を担う領域にある G 15 を V定した。得られた配列をデータベースに報告されている配に置換するためのプライマーを設計し、Quick Change Ⅱ列と比較検討してところ、既知の FaPS 遺伝子配列と高いSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を 用 い て プ相同性を示し、新規の FaPS 遺伝子であることを確認した。

ロトコールに従い反応を行った。得られた恒常的活性型

Am-FaPS 1 と 名 付 け た 遺 伝 子（GenBank accession no.

Am-rac 2 を CArac 2 とした。

HM 067872）は全長 1310 塩基であり、342 アミノ酸をコー2.4.2

ドしていた。

恒常的不活性型 Am-rac 2 の作製

Am-rac 2 の GDP/GTP 結合領域である D 121 を A に置換

3.1.2

アミノ酸配列の特徴と比較するためのプライマーを設計し、CArac 2 と同様の手法でAm-FaPS 1 と他の植物の FaPS のコードするアミノ酸配恒常的不活性型Am-rac2を得て、これを DNrac 2 とした。

列を比較したところ、いずれの対象に対しても高い相同性を示し、FaPS として機能するために必要とされている鎖2.52+形質転換植物体の作成

長決定領域や活性部位覆部領域、Mg 結合部位も確認さ

A. microcarpa より単離した CAM 遺伝子 Am-cam 1、並れた。アミノ酸配列の系統樹解析ではいずれの FaPS も高びに、Am-rac 2、CArac 2、DNrac 2 を発現させた形質転い相同性を示し、Am-FaPS 1 は特にトウダイグサ科のタカ換植物を作るにあたり、CMV 35 S プロモーター支配下にトウダイ（E. pekinensis）と最も高い相同性を示した（Fig. 1）。

そ れ ぞ れ の 目 的 遺 伝 子 を 配 置 し た pBI-OX-GW（GFP

3.1.3

RT-PCR による発現解析

selective）（Inplanta Innovations）を構築した。コントロ

外部刺激に対する Am-FaPS 1 の発現応答についての知ールとしては GFP のみを発現するものを用いた。エント見を得るために、A. microcarpa のカルスを様々な試薬でリーベクター内の ORF 部分を LR clonase（Invitrogen）を処理し、発現変化を RT-PCR を用いて経時的に観察した。

用いて pBI-OX-GW に組み入れ、これを、37℃、５分間の本実験で用いた試薬の中で MJ がもっとも顕著な転写活性− 16 −

ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導の活性化を誘導し、処理後 3 時間から発現の上昇が観察さ

Scoparia dulcis のジテルペン化合物の生合成をモデルとしれ高いレベルに維持されていた（Fig. 2）。Yeast extractて、MJ 添加による植物二次代謝能活性化の細胞内情報伝は植物の防御応答に関連する二次代謝産物の生合成を誘導

達機構についての提案を行なっている。しかしながら、することが知られているが、処理後 3 時間から MJ と同様MJ による S. dulcis のジテルペン生合成活性化は、いわば2+に転写活性の上昇が観察された。 Ca -ionophore A 23187「既存の生合成活性の上昇」というべきものであるが、本処理では転写活性の上昇は見られたものの、処理後６時間研究の対象とした A. microcarpa のセスキテルペン生合成をピークとして 24 時間には処理前と同程度にまで減少しの誘導は「高等植物が潜在的に保有している二次代謝活性た 。の顕在化」であり、S. dulcis の場合とは区別すべきものと6）考えられる。この「潜在的生合成能の顕在化」においても、

3 . 2 MJ 誘導性 Am-FaPS 1の発現に及ぼす様々な情報伝達阻害剤の効果

我々が既に提案した機構と類似する細胞内イベントが関与するか否かを検討するために、様々な情報伝達関連因子阻

今回のこれまでの実験で、MJ が A. microcarpa におけ害剤の存在下で A. microcarpa のカルスに MJ 外部刺激をる Am-FaPS 1 の発現を顕著に活性化させることが明らか与え、Am-FaPS 1 の発現変化を RT-PCR によって観察しとなった。我々のグループはゴマノハグサ科植物であるた（Fig. 3）。その結果、Rac/Rop GTPase、Ca - チャンネ

Fig. 1 FaPS アミノ酸配列の系統樹による比較。カッコ内は GenBankaccession number を示す。

Fig. 2 RT-PCR に よ る Am-FaPS1 の 発 現 解 析。MJ、yeast extract、
Ca2+-ionophore 処理による発現量の変化。Control は H2O による処理。

− 17 −2+

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ル、CAM、ユビキチン - プロテアソームの阻害剤で処理を

Am-rac 1 及 び 2 が コ ー ド す る タ ン パ ク と 他 の 植 物 の行なったいずれの場合においても、これらの試薬の濃度にRac/Rop G タンパクのアミノ配列を比較したところ、ほ依存して、MJ 添加による Am-FaPS 1 発現が阻害されるこ

とんどの対象に対して非常に高い相同性を示し、また G タとが明らかとなった 。

ンパクとして機能するために必須とされている４つの7）

GTP 結合部位やエフェクター結合領域も確認された。一3 . 3 Am-rac のクローニングと諸性質の解析

般に small GTPase は、原形質膜への移行・局在のための3.3.1

プレニル化を受けるコンセンサス配列である C-X-X-L を C

Am-rac のクローニング

MJ 刺激に応答した植物細胞の二次代謝物産生に到るシ末端に持つとされている。Am-rac 翻訳産物のアミノ酸配グナル伝達経路の中で Rac/Rop 型 GTPase が重要な因子と列を見ると、Am-rac 2 にはプレニル基との結合のためのして機能している可能性が示唆されたことから、情報伝達コンセンサスなモチーフが含まれているのに対し、Am-にこれをコードする遺伝子を A. microcarpa より単離する

rac 1 にはこれが含まれていないことが明らかとなった。

ことを試みた。縮重プライマーによってコア構造を得た後したがって Am-rac 1 がコードするタンパクは、他の Rac/に、3’側および 5’側の配列をそれぞれ決定して２つのクRop GTPase とは異なる活性化機構をもつ可能性が示唆さローンを単離した。 Am-rac 1 と名づけた遺伝子（GenBankれた。

accession no. JF 922914）は全長 1235 塩基であり 210 アミノ

3.3.3

RT-PCR による発現解析

A 23187、yeast extract、MJ で A. microcarpa を刺激し酸をコードし、Am-rac 2（GenBank accession no. JF 922915）
は全長 1124 塩基であり 198 アミノ酸をコードしていた。

た際の Am-rac 遺伝子の発現活性を RT-PCR で確認したと

3.3.2

ころ、A 23187 では発現に変化がなく、yeast extract の添

アミノ酸配列の特徴と比較

Fig. 3 MJ 誘導性 Am-FaPS1 発現に対する様々な阻害剤の添加効果。NSC 23766(rac 阻害剤 )、verapamil (Ca2+ チャネル阻害剤 )、W-7 (CAM 阻害剤 )、MG-132 ( プロテアソーム阻害剤 ) の存在下で MJ 刺激を与えた際の Am-FaPS1 の発現変化。

Fig. 4 RT-PCR による Am-rac1、Am-rac2 の発現解析。 MJ、yeast extract、Ca2+-ionophore 処理による発現量の変化。Control は H2O による処理。

− 18 −

ジンチョウゲ科植物の細胞内情報伝達系の改変によるフレグランス構成成分生合成活性の誘導加においては３時間にわたって発現が緩やかに上昇した。

４．考

また、MJ 処理の場合は、30 − 60 分で発現レベルが最大となり、その後低下することが確認された（Fig. 4）。

察沈香の基源植物の一つである A. microcarpa のセスキテルペン生合成に寄与する FaPS をコードした遺伝子 Am-3 . 4 組換え A. microcarpa におけるAm-FaPS 1の発現解析

FaPS 1 をクローニングし、外部刺激に対する発現応答を次に、MJ 応答性 CAM 遺伝子である Am-cam 1、同じくとにより Am-FaPS 1 の強い転写活性の誘導・上昇が見ら

MJ 応 答 性 Rac/Rop GTPase 遺 伝 子 で あ る Am-rac 2 を A.

れ、セスキテルペン生合成の活性化が強く示唆された（Fig.

microcarpa で過剰発現させることにより、Am-FaPS 1 の2）。また、植物の防御応答に関わる二次代謝産物の生合成発現レベルを高く維持できる可能性を検討した。また、を誘導することが知られている yeast extract で処理した

Rac/Rop GTPase は 1 アミノ酸を置換することにより恒常場合も同様に Am-FaPS 1 の発現が顕著に上昇することが活 性 型（CA）、 及 び、 恒 常 不 活 性 型（DN）の Rac/Rop

明らかとなった。MJ のシグナル伝達に関わっている因子

GTPase を作製することが可能であるとされているが、今について更なる知見を得るために、以前の研究で関与が示回の実験では CA 型と DN 型 の Rac/Rop GTPase の導入に唆された様々な情報伝達関連因子の阻害剤を用いて、MJよる効果についても検討した（Fig. 5 ）。その結果、Am-刺激に対する Am-FaPS 1 の発現量の変化を観察した。そcam 1 を導入した組換え体では MJ 非存在下においてもの結果、ユビキチン - プロテアソーム、Rac/Rop GTPase、Am-FaPS 1 転写活性の顕著な上昇が見られ、CAM 遺伝子Ca - チャンネル、CAM の阻害剤を用いたいずれの実験系とその翻訳産物が MJ 刺激によるセスキテルペン生合成誘においても Am-FaPS 1 の発現量は control と比べて用量依導のシグナル伝達のなかで大きく寄与していることが示唆存的に減少していた（Fig. 3 ）。これらのことから、MJ のされた。また、Am-rac 2 を過剰発現させた組換え体では細胞内シグナル伝達には上記の諸因子が関与しており、control と比べて Am-FaPS 1 の転写活性の上昇は見られた

Am-FaPS 1 の転写活性の活性化にはユビキチン−プロテ

ものの、CAM の組換え体ほど顕著な活性化は観察されなアソームと Rac/Rop GTPase が関与する Ca の細胞内流かった。更に、CArac 2 を導入した組換え体においても、入、更には CAM の活性化が不可欠であることが示唆され変異を導入していない Am-rac 2 と比較して大きな差は認めた。

RT-PCR によって検討した。その結果、MJ で刺激するこ2+2+られなかった。また、DNrac 2 組換え体では Am-FaPS 1 転7）

写活性がやや抑制されることが見出された 。

植物二次代謝能の誘導あるいは活性化におけるこれらの因子を物質生産に応用することを目的として、Am-cam 1

Fig. 5 4 つの組換え体につき、それぞれ Am-FaPS1 の発現量の平均値と標準偏差を求め、MJ (+) を 1.0 とした相対値で表した。

− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

遺伝子、Am-rac 2 遺伝子、CArac 2、DNrac 2 遺伝子を A.

３）Creelman RA, Mullet ME,: Biosynthesis and action

microcarpa のカルスに組み込み、Am-FaPS 1 の発現の変of jasmonates in plants, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant

化 を RT-PCR に よ り 解 析 し た（Fig. 5）。 そ の 結 果、Am-Mol. Biol., 48 , 355 - 381 , 1997 .

FaPS 1 の 発 現 量 は Am-cam 1 を 導 入・ 過 剰 発 現 さ せ た４）Asano K, Lee JB, Yamamura Y, Kurosaki F,:

mutant で最も大きくなり、MJ 刺激を与えた場合と同等あEnhanced accumulation of atropine in Atropa

るいはそれ以上の転写活性の上昇が認められた。一方、

belladonna transformed by Rac GTPase gene isolated

Am-rac 2、CArac 2 の mutants では MJ（−）と比べて発現from Scoparia dulcis, Transgenic Res., DOI. 10 . 1007 /量は上昇しているものの MJ（+）や CAM 遺伝子を導入しs 11248 - 013 - 9733 - 4 .

たものほどではないことが認められた。これより、MJ に

５）Okudera Y, Ito M,: Production of agarwood fragrantよるシグナル伝達経路には Rac/Rop GTPase 関与の機構

constituents in Aquilaria calli and suspension cultures,以外にも複数の経路が存在し、これら別の転写制御機構とPlant Biotechnol., 26 , 307 - 315 , 2009 .

Rac/Rop GTPase 系とが複雑に相互作用して Am-rac 導入

６）Kenmotsu Y, Ogita S, Katoh Y, Yamamura Y, Takao

変異体での Am-FaPS 1 の発現に影響を与えた可能性が考Y, Tatsuo Y, Fujino H, Kadota S, Kurosaki F,: Methyl

えられる。

jasmonate-induced enhancement of expression activityof Am-FaPS- 1 , a putative farnesyl diphosphate（引用文献）

synthase gene from Aquilaria microcarpa, J. Nat. Med.,

１）Shan X, Yan J, Xie D,:Comparison of phytohormone

65 , 194 - 197 , 2011 .

signaling mechanisms, Curr. Opin. Plant Biol., 15 , 84 -７）Kenmotsu Y, Asano K, Yamamura Y, Kurosaki F,:
Cloning and expression of putative Rac/Rop GTPase

91 , 2012 .
２）Gundlach H, Muller MJ, Kutchan TM, Zenk MH,:genes, Am-rac 1 and Am-rac 2 , involved in methyl

Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-inducedjasmonate-induced transcriptional activation of farnesyl

plant cell cultures, Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 89 , 2389 -diphosphate synthase in cell cultures of Aquilaria

2393 , 1992 .

microcarpa, Plant Mol. Biol. Rep., 31 , 539 - 546 , 2013 .

− 20 −