【研究報告】（自然科学部門）

制御性 B 細胞を誘導する食品因子による炎症抑制効果

戸塚

東京大学大学院農学生命科学研究科
緒言

かかわるものと考えられており、護准教授で誘導されたアレルギー疾患や自己免疫疾患など、免疫機能の異Breg は動物実験モデルにおいてアレルギーや自己免疫常を原因とする疾患の増加は我が国においても大きな問疾患の発症予防効果を示すことも報告されている 3, 4）。

題となっている。一方、軽度の炎症が持続的に進行する

また、脂肪組織中には IL-10 を産生する Breg が多数存反応である慢性炎症が、生活習慣病、がん、神経変性疾在しており、これが脂肪組織における炎症反応を抑制す患などの発症基盤となっていることが近年明らかにされることでメタボリックシンドローム発症の抑制に寄与しつつある。炎症・免疫応答の制御には、免疫系の司令塔ていることが報告されている5）。やせたマウスと比較しとも呼ばれる T 細胞とその活性化を制御する樹状細胞て肥満したマウスでは脂肪組織における Breg の数が減が重要な役割を果たしている。我々は、食品による炎少しており、この現象はヒトにおいても確認されてい症・免疫反応の制御を目的として、免疫応答を抑制するる。

機能をもつ制御性 T 細胞（Treg）の分化誘導を促進す
る活性をもつ植物由来食品成分を

我々は、これまでに Breg 誘導活性を有する食品因子

CD4 T 細胞の検索を行い、フラボノイドである Kaempferol および分化誘導系を用いて検索した結果、柑橘類に多く含まれTamarixetin が Breg 誘導活性をもつことを明らかにしるフラボノイドであるナリンゲニンにその活性があるこて い る。 本 研 究 で は、Kaempferol お よ び Tamarixetin＋1）に類似した構造をもつフラボノイドの Breg 誘導活性をとを明らかにした 。
T 細胞とならぶ、もう一つのリンパ球である B 細胞比較検討することで、それらの構造と Breg 誘導効果のは、侵入した病原体に対する最終的な攻撃の武器となる関連性を検討した。また、Kaempferol を実際に経口投抗体を生産することがその主要な働きである。ところ

与した際の Breg 誘導効果および抗炎症作用を検討した。

が、近年の研究により B 細胞の一部は主に抑制性サイトカインであるインターロイキン 10（IL-10）を産生する

結ことにより、過剰な免疫応答を負に制御する機能をもつ

1.

果
Breg 分化誘導・活性化に影響を与える食品成分の検索

制御性 B 細胞（Breg）として働くことが明らかにされ2）てきた 。Breg は直接 Th1、Th2 などのエフェクター T

Kaempferol、Tamarixetin およびそれに類似した構造細胞の活性化を抑制する、あるいは Treg の分化誘導にをもつフラボノイドの Breg 誘導効果を検討した。すな

図1

本研究で用いたフラボノイドの構造
1

戸

図2

塚

護

フラボノイドの制御性 B 細胞誘導活性

C57BL/6 マウス脾臓から調製した B 細胞を、LPS（10 μg/ml）の存在下、各フラボノイド（1.25〜10 μM）を添加して 48 時間培養し、培養上清中の IL-10 量を ELISA 法で測定した。それぞれデータは平均値±標準誤差（ ＝3）で示した。異符号間で有意差（ ＜0.05、Tukey 法）があることを示す。

わち C57BL/6 マウス脾臓から磁気ビーズ法（MACS 法）
を 用 い て B 細 胞（B220＋ 細 胞） を 調 製 し、 リ ポ 多 糖（LPS、10 μg/ml）の存在下、6 種類のフラボノール類および 5 種類のフラボン類（図 1）のうち、いずれかを 1.25〜10 μM の濃度で添加し、48 時間培養した。その培養上清中に含まれる IL-10 量を酵素免疫測定法（ELISA）により測定した。また、フローサイトメトリーにより細胞の生存率、生細胞中の IL-10 産生細胞の割合を解析した。
そ の 結 果、 フ ラ ボ ノ ー ル 類 の Kaempferol、Tamarixetin、Galangin およびフラボン類の Chrysin では、1.25〜2.5 μM 以上で有意な IL-10 産生の増加が認め

図3られ、濃度依存的な増加が観察された（図 2）。フラボフラボノイドの B 細胞に対する細胞毒性

C57BL/6 マウス脾臓から調製した B 細胞を、LPS（10 μg/ml）の存在下、各フラボノイド（10 μM）を添加して 48 時間培養した後、フローサイトメトリーにより生細胞と死細胞の比率を解析した。データは細胞生存率（％）で示した。

ン類の Apigenin は、1.25 μM で有意な増加が認められたが、濃度の増加には反応しなかった。これら 5 つのフラボノイドは 10 μM の添加でも細胞生存率に影響は与えな量が低下した。この両者は 10 μM 添加時に細胞生存率のかった（図 3）。
Quercetin と Morin は IL-10 産生にも、細胞生存率に著しい低下が観察され、強い細胞毒性を示すことが明らも ほ と ん ど 影 響 を 与 え な か っ た。 ま た、Fisetin、かとなった。さらに、2.5〜5 μM 添加時には、生細胞中Diosmetin は微弱ながら IL-10 産生の増加が観察され、の IL-10 産生細胞の割合が増加していることも示された

10 μM 添加時に細胞生存率の低下が認められた。

（図 4）。したがって、これらは Breg 誘導効果と B 細胞に対する細胞毒性とを併せ持つことが示された。

Baicalein は 5 μM で IL-10 産 生 増 加 が 認 め ら れ た が、10 μM では著しく低下した。Luteolin は 1.25 μM で増加が認められたが、それ以上の濃度では濃度依存的に産生2

制御性 B 細胞を誘導する食品因子による炎症抑制効果

図4

細胞毒性のあるフラボノイドの制御性 B 細胞誘導活性

C57BL/6 マウス脾臓から調製した B 細胞を、LPS（10 μg/ml）の存在下、各フラボノイド（2.5 および 5 μM）を添加して 48 時間培養し、フローサイトメトリーにより（A）生細胞と死細胞を分けた後、（B）生細胞中の IL-10 産生細胞の割合を調べた。

2.

Kaempferol のマウス生体内における Breg 誘導効果
および抗炎症効果
Kaempferol を経口投与したマウス生体内での Breg 誘導活性を検討した。すなわち、Kaempferol を C57BL/6
マウスに経口ゾンデを用いて 1 日当たり 10 mg/Kg 体重で 14 日間経口投与した後、脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞を調製し、IL-10 の細胞内サイトカイン染色により B 細胞中の IL-10 産生細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した。その結果、Kaempferol を経口投与したマウスでは、脾臓および腸間膜リンパ節の両方において、IL-10 産生 Breg の存在比率が上昇しているこ
図5とが明らかとなり（図 5）、経口投与した Kaempferol が生体内においても Breg 誘導活性を示すことが明らかとKaempferol の経口投与による生体内での制御性 B 細胞の誘導

C57BL/6 マウスに経口ゾンデを用いて、Kaempferol を 10 mg/kg 体重／日、14 日間経口投与した後、（A）脾臓細胞および（B）腸間膜リンパ節細胞を調製した（ ＝10）。IL-10 の細胞内サイトカイン染色を行い、フローサイトメトリーにより B 細胞中のIL-10 産生細胞の割合を解析した。

なった。
炎症性腸疾患のモデルとして、デキストラン硫酸ナ
ト リ ウ ム（DSS） 誘 導 性 大 腸 炎 モ デ ル を 用 い、Kaempferol を経口投与した際の抗炎症効果を検討した。
す な わ ち、Kaempferol を 上 記 と 同 様 の 方 法 で 22 日 間た（図 6）。さらに、DSS 投与終了時に解剖し、大腸のC57BL/6 マウスに強制経口投与し、最後の 8 日間に 3％長さ、大腸組織中のミエロペルオキシダーゼ（MPO）

DSS を含む飲料水を自由摂取させることにより腸炎を誘活性および IL-6 量を測定したところ、Kaempferol 投与発した。体重変化、糞便の状態を観察し、その症状を病群では、大腸炎症状の指標となる大腸長の短縮が有意に態スコア（DAI score）として表した。DSS 投与開始の抑制され、大腸組織中の炎症状態を示す MPO 活性およ

2 日後から症状が認められたが、Kaempferol 投与群ではび IL-6 量も有意に低値を示した。これらの結果から、PBS 投与群と比較して病態スコアが有意に低い値を示し

Kaempferol の経口投与は DSS 誘導性大腸炎の症状を緩3

戸

塚

護

ボノイドについて、AhR アゴニストおよびアンタゴニスト活性を検討することにより、Breg 誘導におけるAhR の役割についてより深い理解が得られるものと考えられる。
Kaempferol の経口投与により DSS 誘導性大腸炎の症状悪化が抑制されることが示された。Kaempferol の経口投与が Breg を増加させたことを考えると、少なくともここで示された抗炎症効果の一部は Breg 誘導を介したものであろうと考えられる。Breg 誘導活性をもつ食品因子による炎症・免疫反応の抑制を介した疾病予防効
果については、今後さらなる検討が必要である。
アレルギーや炎症反応は非常に多くの免疫細胞の働きで制御されており、食品成分による制御の標的となる反応は数多くある。医薬においても、リウマチなどの免図6

Kaempferol の経口投与による DSS 誘導大腸炎の症状緩和効果

疫・炎症性疾患の治療には、標的の異なる薬剤を同時に処方する多剤併用療法の有効性が明らかにされてきていC57BL/6 マウスに経口ゾンデを用いて、Kaempferol を 10 mg/kg 体重／日、14 日間経口投与した後、3％DSS を含む飲料水を8 日間自由摂取させた（ ＝5）。14 日間 PBS を投与した後 DSSを投与した群、DSS を投与しない群を対照群として設けた。最後の 8 日間に体重を測定し、糞便の状態（固さ、血便）を観察し、その結果を病態スコアとして示した（A）。最終日にマウスを解剖し、（B）大腸長を測定するとともに、大腸組織中の（C）ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性および（D）IL-6量を測定した。データは平均値±標準偏差で示した。

る。一般に機能性食品成分は医薬品と比較すると、効果の点で活性が弱いものが多いことは否めない。しかしながら、本研究で明らかにした Breg 誘導活性をもつものや、T 細胞やマスト細胞に作用する成分など、異なる標的細胞、標的反応に効果を示す複数の機能性食品成分が同時に働くことで、それぞれの効果は小さくても、総合的にみると高い効果が得られるという可能性が期待される。これはまさに、食による疾病予防における現代の和させることが示された。

「食べ合わせ」の効果を示すものであろう。本研究は、考察新たな標的細胞に対して作用し炎症抑制効果をもつものを見出そうとする研究であり、有効な「食べ合わせ」を本研究で検討した 11 種類のフラボノイドの中でも実現する可能性を広げるものであると考えている。

Kaempferol、Tamarixetin は 高 い IL-10 産 生 を 示 し、Breg 誘導活性が高いことが示された。11 種類のフラボ

要ノイドは、（1）IL-10 産生を誘導し細胞毒性をもたない

約

も の（Kaempferol、Tamarixetin、Galangin、Chrysin、アレルギーなどの免疫機能の異常や、生活習慣病なApigenin）、（2）IL-10 産生誘導活性と細胞毒性をもつもどの発症基盤となる慢性炎症を抑制する機能をもつ食品の（Fisetin、Diosmetin、Baicalein、Luteolin）、（3）成分を探索することを目的として、炎症・免疫反応に抑IL-10 産生・細胞生存率に影響を与えないもの（Morin、制的に作用する制御性 B 細胞（Breg）に着目した。本

Quercetin）、に分類することができた。細胞毒性の強い研究ではフラボノイドの Breg 誘導活性および生体内でものはフラボン類に多かったが、フラボノール類とフラの抗炎症効果について検討した。

ボン類で明確に Breg 誘導活性の有無が分かれるわけで

こ れ ま で に Breg 誘 導 活 性 を 見 出 し て い るはなく、官能基の位置でも明確な構造活性相関は認めら

Kaempferol、Tamarixetin とこれらに類似した構造をもれなかった。

つ 4 種類のフラボノール類および 5 種類のフラボン類のBreg 誘導活性を、マウス脾臓 B 細胞の植物化学物質によるリンパ球の機能分化には、芳香培養系で族炭化水素受容体（AhR）が関与する例が知られていの IL-10 産 生 を 指 標 と し て 検 討 し た と こ ろ、 新 た にる 1, 6）。Breg 誘導においても AhR アンタゴニスト活性

Galangin、Chrysin、Apigenin が活性を有することが明の関与を示す結果が得られている。本研究で用いたフラらかとなった。Baicalein、Luteolin にも Breg 誘導活性4

制御性 B 細胞を誘導する食品因子による炎症抑制効果

謝が認められたが、同時に強い細胞毒性を示すことも明ら辞かとなった。これらの分子の構造と Breg 誘導活性には本研究を遂行するに当たり、助成を賜りました公益

明確な構造活性相関は認められなかった。Kaempferol

財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

をマウスに経口投与したところ、脾臓および腸間膜リン
文パ節において IL-10 産生 Breg の存在比率が上昇し、生体内での Breg 誘導活性が示された。また、Kaempferol

献1） H. K. Wang, et al.:
, 60, 2171–2178,2012.
2） F. E. Lund, T. D. Randall:, 10, 236–247, 2010.
3） S. Amu, et al.:, 125, 1114–1124, 2010.
4） C. Mauri, et al.:
, 6, 636–643, 2010.
5） S. Nishimura, et al.
, 18, 759–766, 2013.
6） Y. Li, et al.:, 147, 629–640, 2011.の経口投与はマウス DSS 誘導性大腸炎モデルにおいて炎症抑制効果を示した。Kaempferol は、生体内で Bregを誘導することを介して抗炎症作用を示すことが示唆された。

5