女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムのin vitro 解析系の構築
東京工科大学応用生物学部

岩渕徳郎

Development of in vitro evaluation system for telogen-anagen transition was attempt. The respiration activity of mixed
monolayer-culture of human dermal papilla cells (hDP) and human outer root sheath cells was significantly increased in
10 days, however, that of sphere-formed hDP and human outer root sheath cells was significantly decreased. The results on
respiration activity of sphere indicated that characteristics of the sphere-formed hDP was similar to the hair bulb in telogen
phase. Gene expression profile of hair cycle regulating-factors in sphere suggested that the profile of sphere-formed hDP wassimilar to hDP in telogen phase. When cyclosporin A which is a powerful hair growth inducer was added to sphere-formed
hDP, gene expression profile for hair cycle regulating-factors was similar to hDP in anagen phase. The results suggested thatsphere-formed hDP might be used as an in vitro system to evaluate for new hair induction. This system would be useful for
screening of hair regrowth reagent for female hair loss.

1. 緒

本研究は女性の薄毛で重要な課題である発毛を解析可能言な in vitro 評価系を構築することを目的とした。そのため、ヒ男性だけでなく、女性でも薄毛は大きな毛髪悩みである。
男性の薄毛は毛髪径の減少の影響が大きいが、女性の薄毛ト毛包由来の細胞および関連細胞を用いてスフェアを形成させ、その特性を解析した。

は毛髪密度の低下の影響が大きい 1 , 2）。これは、女性では発2. 方毛が重要であることを示唆している。これまで男性の薄毛研究の結果、「太く、長く」を訴求する薬剤が探索されてきたが、法2 . 1. 細胞、培地、細胞培養

3）

女性の薄毛の研究例は少ない 。

細胞は、間葉系細胞としてヒト女性毛包由来の毛乳頭細ヒトの毛髪には毛が成長する成長期、毛が成長しない休止胞（hDP- 49 F）を使用した。上皮系細胞としてヒト女性毛包期、成長期から休止期へ移行する退行期の 3 つの期があり、由来の外毛根鞘細胞（hORS- 40 F）または正常ヒト角化細胞

生涯を通して成長期、退行期、休止期を繰り返す。これを毛（hKC）を使用した。

周期と言う4 - 6）。発毛とは毛周期の休止期から成長期への移培地は、間葉系細胞用の基礎培地として DMEM（Life行であり、新たな毛球部の形成が上皮系細胞- 間葉系細胞間Technologies） を 使 用 し、 栄 養 培 地 と し て 10 % FBS-の相互作用によって起こる現象である 7）。発毛評価法は現時DMEM を使用した。上皮系細胞用の基礎培地として、点ではマウスの in vivo 発毛試験のみが実用化されているが、Life Technologies 社 指 定 の サ プ リ メ ン ト を 添 加 し な い

動物実験廃止の流れにそぐわず、ヒト頭髪とマウス体毛の差

Keratinocyte-SFM（K-SFM；Life Technologies）を、栄異の説明も難しい。

養培地としてサプリメントを添加した K-SFM を使用した。

報告者らのこれまでの研究により、2 種の毛包由来細胞全ての培地には抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B）を添加した。

（毛乳頭細胞［hDP］と外毛根鞘細胞［hORS］）
を用いて、

細 胞 の 3 次 元 培 養 法として、 非 接 着 性 丸 底プレート① 3 次元培養（スフェア形成）を行うと毛包様構造を形成（PrimeSurface 96 U プレート、以下 PS- 96 U プレート；住すること② hORS が hDP を取囲むように配置すること

友ベークライト）を使用し、本プレートの各ウェルに細胞を③既知発毛薬剤で hORS のみが増殖刺激を受けること

2000 播種した。細胞播種後、37 ℃ - 5 % CO 2 で培養し、が確認されている。これらより、ヒト毛髪細胞の 3 次元培スフェアを形成させた。対照実験として、通常の細胞培養用養で発毛様のイベントを解析できる可能性が示唆された。

プレートで単層培養を同条件で行った。

2 . 2 . 遺伝子発現解析
Development of in vitro evaluation system
for telogen-anagen transition in female
hair cycle
Tokuro Iwabuchi
Faculty of Bioscience and Biotechnology,
Tokyo University of Technology

遺伝子発現の解析は、形成させたスフェアおよび単層培養細胞から、ISOGEN（日本ジーン）で mRNA を調製した後、SuperScript Ⅲ（Invitrogen）を用いて、cDNA を調製した。
調製した cDNA を鋳型に real time PCR で被検遺伝子の発現量を単層培養と 3 次元培養の場合とで比較した。

− 90 −

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築

発毛薬剤である cyclosporin A（CsA）に対する応答性に洗浄後、2 次抗体反応を行い、DAPI を含有したマウント対する培養方法の比較は、3 次元培養および単層培養した剤を添加し、蛍光顕微鏡で観察した。毛乳頭細胞検出用

hDP に CsA（終濃度 50 ng/ml）を添加し、37 ℃ - 5 % CO 2には間葉系細胞マーカーとして Vimentin［Anti-Vimentin

で培養後、遺伝子発現を real time PCR で比較した。

（D 21 H 3；CST ジャパン）］を、上皮系細胞検出用には上皮系細胞マーカーとして Pancytokeratin［Cytokeratin Pan

2 . 3 . 細胞増殖測定

Monoclonal Antibody（PAN-CK; Life Technologies）］を細胞の増殖性は細胞の呼吸活性を指標に、AlamarBlue選定した。

（BioRad）を用いて測定した。単層培養は 96 well プレート

3. 結で、3 次元培養（スフェア形成）は PS- 96 U プレートで行った。いずれのプレートとも、1 種の細胞を培養する時は 1well あたり 3000 細胞を、2 種の細胞を培養する時は 1 well

果3 . 1. 毛包由来細胞の単層培養とスフェアでの呼吸活性の違い

あたり両細胞とも 2000 細胞（計 4000 細胞）を播種した。培hDP 単独での単層培養とスフェアにした場合の経時で養後、1 well の培地量の 1 / 100 量の AlamarBlue を添加しの呼吸活性変化を図 1 に示した。単層培養では、経時的に4 時間 37 ℃ - 5 % CO 2 インキュベーターで静置したのち測有意に呼吸活性は増加したのに対し、スフェアでは細胞播定した（Ex. 560 nm, Em. 590 nm）。スフェアの呼吸活性測

種後 6 日では変化はなく、10 日目に有意に減少を示した。
混合培養（hDP+hORS）での単層培養とスフェアにした定時は、96 well プレートに全量移して測定した。

場合の経時での呼吸活性変化を図 2 に示した。単層培養で2 . 4 . 細胞染色

は、経時的に有意に呼吸活性は増加したのに対し、スフェ

O. C. T Compound でスフェアを凍結固定後、ミクロト

アでは細胞播種後 6 日以降有意に減少を示した。

ームでスフェア切片を作成し、スライドグラスに固定し切片を固定し、TritonX- 100 処理を行い、3 % BSA-PBS

3 . 2 . 毛乳頭細胞と上皮系細胞から形成したスフェアの内部構造（-）に 60 分間浸漬し、1 次抗体反応を行った。PBS（-）で前項の検討から、hDP 単独および hDP+hORS 混合のスた。さらに、4 % パラホルムアルデヒド（PFA）でスフェア

図1

単層培養とスフェアでの呼吸活性比較（毛乳頭単独培養）

図2

単層培養とスフェアでの呼吸活性比較（混合培養）− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

フェアはいずれも、呼吸活性が低下し、休止期状態の毛再度平板上で培養し細胞の生存性を観察した。図 4 に平板球部と似ている状態であることがわかった。次に、混合に静置後 1 日の hDP スフェア（左）を、静置後 10 日の hDP

スフェアを作成した時のスフェアの構造を解析した。本スフェア（右）を示した。hDP スフェアから明らかに hDP

実験では上皮系細胞として、hORS に代えて hKC を使用がアウトグロースしており、インタクトな毛乳頭を単離しした。hDP を特異的に認識する抗 Vimentin 抗体を、hKCて培養した時と同様の様子を示した。結果から、スフェアを特異的に認識する抗 Pancytokeratin 抗体を使用し、抗化した hDP は生存しており、単に呼吸活性が低下しただ

Vimentin 抗 体 を 検 出 す る 2 次 抗 体 に は FITC が、 抗けの状態であることが確認された。

Pancytokeratin 抗体を検出する 2 次抗体には Alexa Fluor
594 が 蛍 光 物 質 と し て 結 合 し て い る。 な お、 細 胞 核 はDAPI で蛍光染色した。

3 . 4 . 毛乳頭細胞単独の単層培養とスフェアでの毛周期関連遺伝子の発現特性

hDP+hORS 混合スフェアの切片の染色像を図 3 に示し

hDP のスフェアと単層培養細胞を作成し、休止期維持た。中心部が緑色（FITC）を示したことから、hDP が中因子（BMP- 4）8）、成長期維持因子（FGF 7、アルカリ性心部に凝集し、それを取り囲むように外側に赤色（Alexa

フォスファターゼ［ALP］）9 , 10）、退行期誘導因子（TGF-β 2、Fluor 594）を示したことから hKC が配置していることがFGF 5）11 , 12）の発現を real time PCR で評価した（図 5）。単確認された。実際の毛球部では、中心に毛乳頭細胞があり、層培養からスフェアに変化することで、①休止期維持因子毛乳頭と隣接するように局在する。このことから毛球部のBMP- 4 の発現は有意に亢進、②成長期維持因子 FGF 7 と細胞局在と類似した、スフェアであると考察した。本実験

ALP は有意に低下、③退行期誘導因子 TGF-β 2 と FGF 5は実際の毛球部を再現することが重要であるので、評価には有意に低下した。これらの結果は、① BMP- 4 の発現亢用いることができる可能性を示した。

進はスフェアになることによって休止期に近い状態、②FGF- 7 と ALP の発現低下はスフェアが成長期初期から中3 . 3 . スフェア化した hDP の生存性期以外の時期に似ている、③ TGF-β 2 と FGF 5 の発現低hDPをスフェア化すると呼吸活性が低下することが 3 . 1 .の下は成長期後期から退行期以外の時期に似ていることを示検討で明らかとなった。これは、細胞が生存していない可唆していた。以上より、スフェア化 hDP は成長期初期か能性を疑わせた。そこで、スフェア形成後 10 日経過し十ら退行期以外の期、つまり休止期であることを示唆してい分に呼吸活性が低下してスフェア化した hDP を取り出し、た。

図3

図4

スフェア内の間葉系細胞（hDP）と上皮系細胞（hKC）の局在

静置 1 日の hDP スフェア
（左）、および静置 10 日の hDP スフェア

− 92 −

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築

3 . 5 . 毛乳頭細胞単独のスフェアに CsAを添加した
時の毛周期関連遺伝子の発現特性（ALP、血管内皮細胞増殖因子［VEGF］）14）、退行期誘導

スフェア化した hDP に発毛薬剤 CsA 13） を添加（50 ng/た（図 6）。スフェア化した hDP に CsA を添加（50 ng/ml）ml）の有無での休止期維持因子（BMP- 4）、成長期維持因子

することで、①休止期維持因子である BMP- 4 の発現は有図5

図6因子（TGF-β 2、FGF 5）の発現を real time PCR で評価し単層培養とスフェアした hDP での各種毛周期関連遺伝子の発現比較

スフェア化 hDP に CsA を添加した時の各種毛周期関連遺伝子の発現比較− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

意に低下、②成長期維持因子である ALP と VEGF は有意（引用文献）に亢進、③退行期誘導因子である TGF-β 2 と FGF 5 は有1） Ishino A, Takahashi T, Suzuki J, Nakazawa Y,

意に低下した。これらの結果は、① BMP- 4 の発現低下は

Iwabuchi T, Tajima M. Contribution of hair density

CsA 添加によって成長期極初期に近い状態になることを、

and hair diameter to the appearance and progression② ALP と VEGF の発現更新は CsA 添加によって成長期極of androgenetic alopecia in Japanese men. Br. J.

初期に近い状態になることを、③ TGF-β 2 と FGF 5 の発Dermatol. 171: 1052-1059.（2014）

現低下は成長期後期から退行期以外の時期に似ていること

2） Tajima M, Hamada C, Arai T, Miyazawa M, Shibataを示唆していた。以上より、スフェア化した hDP に発毛

R, Ishino A. Characteristic features of Japanese

薬剤 CsA を添加すると、成長期初期に類似した遺伝子発women's hair with aging and with progressing hair

現特性を示すことが明らかとなった。

loss. J. Dermatol. Sci. 2007: 45: 93-103.（2007）

4. 考

3） Birch MP, Messenger JF, Messenger AG. Hair

察density, hair diameter and the prevalence of female

女性由来の毛乳頭細胞を用い、3 次元培養（スフェア化）

pattern hair loss. Br. J. Dermatol. 144: 297-304.（2001）

を行うことによって in vitro 発毛評価系の構築を試みた。

4） Courtois M, Loussouarn G, Hourseau C, Grollier

毛乳頭細胞を単独および上皮系細胞と混合でスフェア化す

JF. Hair cycle and alopecia. Skin Pharmacol. 7: 84-89.

ると呼吸活性が低下し、休止期毛包と類似した状態となっ（1994）

た。さらに、混合でのスフェアは実際の毛球部と同様に毛5） Silver AF, Chase HB. DNA synthesis in the adult

乳頭細胞が中心部に凝集し、その周囲を上皮系細胞が取りhair germ during dormancy（telogen）and activation（early anagen）. Dev. Biol. 21: 440-451.（1971）

囲む構造を呈した。
ヒトの毛乳頭細胞を単離し、初代培養を行うと細胞が集6） Tezuka M, Ito M, Ito K, Tazawa T, Sato Y. Investigation

塊を形成し盛り上がってくる現象が観察される。また、こof germinative cells in generating and renewed anagenの盛り上がり部には ALP が強く発現していることが知ら

hair apparatus in mice using anti-bromodeoxyuridine

れている。毛乳頭細胞は凝集化すると形質が変化する性質

monoclonal antibody. J. Dermatol. Sci. 2: 4 3 4-4 4 3.

があることが予想される。本検討において、3 次元培養に（1991）

よって細胞集塊（スフェア）を人為的に形成させることによ

7） Mohammadi P, Youssef KK, Abbasalizadeh S,って何らかの変化を生じさせたことが考えられた。これら

Baharvand H, Aghdami N. Human hair reconstruction:のことから、形態的には毛乳頭細胞のスフェアを用いて inclose, but yet so far. Stem Cells Dev. 2 5: 1 7 6 7-1 7 7 9.

vitro での発毛評価系を構築できる可能性が出てきた。

（2016）

スフェア化した毛乳頭細胞における毛周期関連遺伝子の8） Zhang J, He XC, Tong WG, Johnson T, Wiedemann

発現特性を検討した結果、休止期に類似した遺伝子発現特LM, Mishina Y, Feng JQ, Li L. Bone morphogenetic性を示していることが確認された。さらに、発毛薬剤 CsA

protein signaling inhibits hair follicle anagen induction

によって、遺伝子発現特性が成長期の極初期に類似した状

by restricting epithelial stem/progenitor cell activation態に変化することが確認された。毛乳頭細胞のスフェア化

and expansion. Stem Cells. 24: 2826-2839.（2006）

によってなぜこのような反応が起こるのか詳細は不明だが、

9） Danilenko DM, Ring BD, Yanagihara D, Benson

細胞接着が毛周期関連遺伝子の発現に関与している可能性

W, Wiemann B, Starnes CO, Pierce GF. Keratinocyteが考えられる。細胞接着を強くし過ぎないように働くコン

growth factor is an important endogenous mediator of

ドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種であるバーシカン

hair follicle growth, development, and differentiation.

が、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持に関与している例があNormalization of the nu/nu follicular differentiationる

defect and amelioration of chemotherapy-induced15）。何らかの毛乳頭細胞間の接着機構が単層培養の毛alopecia. Am. J. Pathol. 147: 145-154.（1995）

乳頭細胞とスフェア化した毛乳頭細胞の特性の違いとなっ10）Hamada K, Suzuki K. Evaluation of biochemicalて現れていると思われた。

indices as a hair cycle marker in C 3 H mice. Exp.

形態学的特性、スフェア化による毛周期関連遺伝子の発Anim. 45 : 251 - 256 .（1996）

現特性変化、発毛薬剤による毛周期関連遺伝子の発現特性変化の結果から、スフェア化した毛乳頭細胞はヒトでの発11）Soma T, Tsuji Y, Hibino T. Involvement of transforming

毛を in vitro で評価できる実験系と成り得る可能性が強く

growth factor-beta 2 in catagen induction during the示唆された。

human hair cycle. J. Invest. Dermatol. 1 1 8 : 9 9 3 - 9 9 7 .
（2002）− 94 −

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growth. J. Dermatol. Sci. 9 : 64 - 69（1995）

12）Hébert JM, Rosenquist T, Götz J, Martin GR. FGF 5
as a regulator of the hair growth cycle: evidence from

14）Yano K, Brown LF, Detmar M. Control of hair growthtargeted and spontaneous mutations. Cell. 7 8 : 1 0 1 7 -and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis. J.

1025 .（1994）

Clin. Invest. 107 : 409 - 417 .（2001）

13）Iwabuchi T, Maruyama T, Sei Y, Adachi K. Effect of15）Kishimoto J, Ehama R, Wu L, Jiang S, Jiang N,

immunosuppressive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase

Burgeson RE. Selective activation of the versican（PPIase）inhibitors, cyclosporin A, FK 506 , ascomycin

promoter by epithelial-mesenchymal interactions

and rapamycin, on hair growth initiation in mouse:

during hair follicle development. Proc. Natl. Acad. Sci.

immunosuppression is not required for new hairU. S. A. 96 : 7336 - 7341 .（1999）− 95 −