アロエの美白成分クロモン類の生合成研究

東京大学大学院薬学系研究科

阿 部

郁 朗

Octaketide synthase (OKS) from Aloe arborescens is a plant-specific type III polyketide synthase (PKS) that catalyzes
iterative condensations of eight molecules of malonyl-CoA to produce the C16 aromatic octaketides SEK4 and SEK4b.
On the basis of the crystal structures of OKS, the F66L/N222G double mutant was constructed and shown to produce anunnatural dodecaketide TW95a by sequential condensations of twelve molecules of malonyl-CoA. The C24 naphthophenone
TW95a is a product of the minimal type II PKS, and is structurally related to the C20 decaketide benzophenone SEK15,the product of the OKS N222G point mutant. The C24 dodecaketide naphthophenone TW95a is the first and the longest
polyketide scaffold generated by a structurally simple type III PKS. A homology model predicted that the active-site3
3
cavity volume of the F66L/N222G mutant is increased to 748 Å , from 652 Å of the wild-type OKS. The structure-basedengineering thus greatly expanded the catalytic repertoire of the simple type III PKS to further produce larger and morecomplex polyketide molecules.

１．緒

な酵素機能の制御と分子多様性創出の格好のモデルともい

言える、薬用植物キダチアロエ由来オクタケタイド合成酵素

多彩な生理活性と構造多様性を有する植物ポリフェノーをとりあげ、酵素結晶構造に基づく合理的な部位特異的変

ルは、医薬品原料や健康食品以外にも、美肌、シミ抑制効異の導入により、酵素触媒機能のさらなる拡張と非天然型果など化粧品原料としても重要な天然資源である。特に静新規化合物の創出をめざした 7）。

岡県特産の薬用植物であるアロエに含まれるクロモン類に

２．実

は、抗炎症や抗アレルギー作用に加えて、メラニン色素生験

産の原因となる酵素チロシナーゼの阻害活性やメラノサイ

薬用植物のキダチアロエ（Aloe arborescens）からクロートそのものの増殖抑制によるシミの生成抑制効果などが報ニングに成功した、オクタケタイド合成酵素（OKS）は、告され注目を集めている。筆者は、長年にわたり植物ポリ８分子のマロニル CoA の縮合により芳香族オクタケタイフェノールの生合成と生理活性に関する研究に従事してきドの骨格を構築する新規Ⅲ型ポリケタイド合成酵素（PKS）

1, 2）、最近、アロエよりペンタケタイドクロモン合成である（Fig. 1A, Fig. 2A）4）。これまでに大腸菌において酵素やアロエソン合成酵素など、アロエクロモン類の生合異種発現した組み替え酵素を用いて、OKS の活性中心キ成に関わる数種の酵素遺伝子のクローニングに世界に先駆

ャビティを構成する Gly207 への部位特異的変異の導入にたがけて成功した

3, 4）。これにより、多様な骨格を有し薬用成より、マロニル CoA 縮合数と生成物特異性が決定される分として著名な植物ポリフェノールの生合成に、一連の植ことを明らかにした 4）。また OKS とアミノ酸レベルで 92%物ポリケタイド合成酵素スーパーファミリーが広く関与す相同性を示し、本来５分子のマロニル CoA の縮合反応をることを明らかにし、これまで関連性が考えられなかった触媒する、キダチアロエ由来ペンタケタイドクロモン合成

植物二次代謝産物の生合成に統一的な視点を与えた。また、酵素（PCS）についても、活性中心キャビティを構成するこれら酵素の部位特異的変異実験の結果から、基質及び生アミノ酸残基への点変異 M207G、及び、結晶構造に基づ成物特異性を決定する活性中心アミノ酸残基を同定し、さくトリプル変異 F80A/Y82A/M207G の導入により、マロらに、Ｘ線結晶構造解析及び分子モデリングの結果に基づニル CoA の縮合数をそれぞれ 8 分子、及び、9 分子まで伸く合理的な変異の導入により、これまで困難とされてきた長することに成功している 5, 6）。

酵素触媒機能の拡張にも展望を開きつつある 5, 6）。

そこで本来８分子のマロニル CoA を縮合する OKS につ本研究では、こうした一連の研究成果を踏まえ、人為的いても、PCS の場合と同様に、Ｘ線結晶構造解析、そして、結晶構造に基づく合理的な酵素機能の改変へと研究を展開した 7）。まず、Cys を起点としてポリケタイド鎖が伸張していく際に壁となる Asn222 にランダムミューテーション

E ng i n e e r e d b i o s y nt h e s i s o f A l o echromones
Ikuro AbeThe University of Tokyo Graduate Schoolof Pharmaceutical Sciencesを導入した結果、Gly 置換体でマロニル CoA 縮合数が 10分子まで拡大して、非天然型デカケタイド・ベンゾフェノン化合物 SEK15 を単一生成物として与えることを見出した（Fig. 1B, Fig. 2B）。また、X 線結晶構造解析の結果、− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

変異の導入によって CAV が実際に拡大することも確認し炭素数 24 からなる非天然型ナフトフェノン TW95a は、単た。このように、合理的な部位特異的変異導入により酵素純な構造をもつⅢ型 PKS が生産するポリケタイドの中で、機能が拡大し最大で 10 分子のマロニル CoA の縮合が可能

炭素鎖長が最大であり、しかも興味深いことに、上述した7）となった 。そこで今回、更なるポリケタイド鎖長の増大

非天然型デカケタイド・ベンゾフェノン化合物 SEK15 とによる新規ポリケタイドの創出を目的として X 線結晶構構造類似性を示す。また、酵素反応のキネティクスを比較造に基づく部位特異的変異導入を行った。即ち、Asn222

した場合、野生型酵素と比較して顕著な活性の低下は認め近傍に位置する F66 残基にも同時に変異を導入した F66L/

られなかった 7）。一方、二重変異酵素 F66L/N222G につい

N222G 二重変異酵素を設計した。大腸菌において異種発て、結晶構造に基づくホモロジーモデルを構築したところ、現、精製した組み替え酵素を用いて、この部位特異的変異活性中心キャビティの大きさが、野生型酵素の 652 Å3 かの導入が酵素活性に与える影響を精査した 7）。

ら、748 Å3 に拡大していることが予想された（Fig. 3）7）。

３．結

以上、筆者らは、この特異な酵素の立体構造を基盤とし果て、酵素活性中心構造を解明し、さらに結晶構造に基づく本来８分子のマロニル CoA の縮合により芳香族オクタ合理的な部位特異的変異の導入により、C2 単位縮合数のケタイドの骨格を構築する新規Ⅲ型 PKS である。本来８拡大、非天然型炭素 - 炭素結合の形成、芳香環縮合系の構分子のマロニル CoA を縮合するキダチアロエ由来 OKS に築など、これまで困難とされてきた酵素触媒機能の操作について、Ｘ線結晶構造解析に基づく合理的な酵素機能の改も展望を開いた。即ち、本研究により、ポリケタイド鎖長変へと研究を展開した。その結果、Cys を起点としてポリ及び生成物特異性を決定する活性中心アミノ酸残基を明らケタイド鎖が伸張していく際にキャビティの壁となるかにし、活性中心キャビティの大きさと形状に応じて、マPhe66 と Asn222 に同時に変異を導入した二重変異酵素

ロニル CoA 縮合数の人為的な制御が可能であることを示

F66L/N222G が、マロニル CoA 縮合数を 12 分子まで拡大した。一連の生理活性二次代謝産物の基本骨格構築においして、非天然型ドデカデカケタイド・ナフトフェノンTW95aて決定的な役割を演ずるⅢ型 PKS の酵素触媒機能の人為7）を高収率で生成することを見出した（Fig. 1C, Fig. 2C） 。

的な制御にむけて大きな前進といえる。今後の課題として、

Figure 1 Proposed mechanism for the formation of (A) SEK4 and SEK4b by thewild-type OKS, (B) SEK 15 by the N222G mutant OKS, and (C) TW95a by theF66L/N222G mutant OKS.

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アロエの美白成分クロモン類の生合成研究

Figure 2 HPLC elution profiles of the enzyme reaction products of (A) the wild-typeOKS, (B) the N222G mutant OKS, and (C) the F66L/N222G mutant OKS.

酵素反応基質やポリケタイド鎖長の制御に加えて、閉環・リーで炭素鎖伸長反応が進行する）。従って、こうした性芳香環形成反応機構の解明と人為的な制御にも挑戦してい質を利用して、一連の人工基質を作用させることにより、きたい。進化分子工学などの手法を取り入れた変異酵素の効率的な化合物ライブラリーの構築が可能になる。一方、触媒活性の最適化や、遺伝子導入による新機能賦与生物の炭素、水素、酸素原子で構成される、単純なカルボニルの作出など、非天然型新規化合物の生産効率の向上と実用に化学を触媒するⅢ型 PKS に、さらに窒素などヘテロ原子供する有用物質生産系の構築についても検討を加えたい。

を導入した人工基質を作用させれば、窒素原子の塩基性を４．考利 用 し た 新 た な 炭 素 - 炭 素 結 合 の 形 成 も 可 能 に な る。

察

Robinson のトロピノン合成や Heathcock のユズリハアル植物 PKS 酵素が示す最大の特徴の一つに、その広範なカロイドの化学合成にみられるように、ポリケトメチレン基質特異性と触媒ポテンシャルが挙げられる。Ⅲ型 PKS

鎖からシッフ塩基の形成を介した分子内環化反応が連続的の反応は、立体化学が厳密に制御された精巧な酵素システに進行して、複雑なアルカロイドの骨格を一挙に効率的にムとは言い難く、むしろ単純なアシル基転移の繰り返しに構築することができれば、Ⅲ型 PKS の酵素触媒機能の可よる「炭素鎖伸長マシン」と捉えるのが適当かもしれない能性をさらに大きく拡張することになる。

（Cys-His-Asn からなる活性中心触媒残基は、全てのⅢ型

上述したように、Ⅲ型 PKS は人為的な酵素機能の制御PKS において例外なく保存されており、同一のケミストと分子多様性創出の格好のモデルと言える。X 線結晶構造− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Figure 3 Surface and schematic representations of the active-site architectures of the wild-type andmutant OKSs. Crystal structure of (A) the wild-type OKS, and (B) the N222G mutant OKS, andhomology model of (C) the F66L/N222G mutant OKS. The substrate entrances are indicated witharrows. The bottoms of the active-site are indicated by purple surfaces. The Cys-His-Asn catalytic
triads are shown as yellow stick models. The mutated residues Asn222 (Gly222) and Phe66(Leu66) are highlighted as blue and purple stick models, respectively.

解析に基づく合理的な変異の導入により、C2 単位縮合数２）Abe I., :Engineered biosynthesis of plant polyketides:の拡大、非天然型炭素 - 炭素結合や炭素 - 窒素結合の形成、

structure-based and precursor-directed approach, Top.

また、芳香環縮合系の構築など、これまで困難とされてきCurr. Chem., 297, 45-66, 2010.

た酵素触媒機能の操作にも展望を開きつつあるが、今後は３）Abe I, Utsumi Y, Oguro S, et al., :A plant type

ポリケタイド鎖長をどこまで伸ばせるか、また、閉環反応

III polyketide synthase that produces pentaketideの様式をいかに制御するかといった点が課題になる。結晶

chromone, J. Am. Chem. Soc., 127, 1362-1363, 2005.

構造解析に基づけば、少なくともマロニル CoA16 分子程４）Abe I, Oguro S, Utsumi Y, et al., :Engineered度の縮合は可能であるものと予想される。一方、閉環・芳

biosynthesis of plant polyketides: chain length control

香環形成反応の制御に関しては、今回 OKS 二重変異酵素

in an octaketide-producing plant type III polyketide

が、ナフトフェノン骨格の合成能を新たに獲得した結果がsynthase, J. Am. Chem. Soc., 127, 12709-12716, 2005.

ヒントになる。アンスロンやアンスラキノン骨格の形成など、

５）Morita H, Kondo S, Oguro S, et al., :Structural insight

Ⅲ型 PKS 酵素触媒機能のさらなる拡張と、新規触媒活性

into chain-length control and product specificity ofを有するスーパー生体触媒の創出に引き続き挑戦したい。

pentaketide chromone synthase from Aloe arborescens,Chem. Biol., 14, 359-369, 2007.

謝辞６）Abe I, Morita H, Oguro S, et al., :Structure-basedengineering of a plant type III polyketide synthase:

本研究を遂行するにあたり、ご支援をいただきましたコ

formation of an unnatural nonaketide naphthopyron, J.

スメトロジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます。

Am. Chem. Soc. 129, 5976-5980, 2007.
（参考文献）

７）W a n i b u c h i K , M o r i t a H , N o g u c h i H , A b e I ,１）Abe I, Morita H, :Structure and function of the:Enzymatic formation of an aromatic dodecaketide bychalcone synthase superfamily of plant type III

engineered plant polyketide synthase, Bioorg. Med.

polyketide synthases, Nat. Prod. Rep., 27, 809-838, 2010.

Chem. Lett., 21, 2083-2086, 2011.

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