皮膚の生理機能解明を目指した
カルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用
東京大学大学院薬学系研究科

花 岡健 二 郎

The development of sophisticated fluorescence sensor probes has contributed to elucidation of the molecularmechanisms of many complex biological phenomena. In particular, calcium ion (Ca2+) is a pivotal second messenger inside
cells, and fluctuation of intracellular Ca2+ works together with various biomolecules in biological systems. So, we expectthat simultaneous visualization of Ca2+ and other biomolecules, i.e., multicolor imaging, brings us many biological findings.
However, color choices are not sufficient at present, that is, reported long wavelength fluorescence probes for Ca2+ havesome disadvantages. For example, AM ester form of Rhod-2, one of the most widely used red fluorescence probe for Ca2+,
often localizes into mitochondria and monitors mitochondrial Ca2+ concentration change, although cytoplasmic Ca2+ ismuch more important for the research of Ca2+ signaling. Thus, we set out to develop a red fluorescence probe for Ca2+ withexcellent properties including the cytoplasmic distribution to elucidate cytoplasmic Ca2+-related biological phenomena suchas hydraulic pressure stimulation in skin and epithelial wound-healing.
So far, we have developed a novel fluorescein analogue, TokyoMagenta (TM), in which the O atom at the 10 positionof the xanthene chromophore of fluorescein is replaced with a Si atom. The absorption and emission wavelengths of TM
were about 90 nm longer than those of TokyoGreen (a fluorescein derivative). In this study, we introduced chlorine into thefluorophore and developed dichloro TokyoMagenta (DCTM). Then, by utilizing DCTM, we developed a red fluorescenceprobe for Ca2+, CaTM-2, and its activation ratio of the fluorescence intensity reaching 16-fold was practically useful. The
chlorination of the fluorophore was also advantageous, and the pKa value of CaTM-2 was greatly shifted to the acidic region
compared with that of TM, and was sufficiently low (pKa = 5.1) for practical use. For cellular application, we synthesized
CaTM-2 AM, an AM ester form of CaTM-2. CaTM-2 AM diffused into cytosol uniformly in living cells, and showed thechange in its fluorescence intensity by the histamine stimulus, monitoring the change of the cytoplasmic Ca2+ concentration.
As a further demonstration of the usefulness of CaTM-2 AM, we confirmed that it could be applied to rat hippocampal slice
cultures for monitoring activities of neurons. Thus, CaTM-2 and CaTM-2 AM would provide an innovative approach forresearchers to work on many challenges related to Ca2+.

１．緒

組んでおり 1−4）、本研究では皮膚の生理機能の解明を目指言し、新たなカルシウムイオン蛍光プローブの開発を行った。

我々生物を構成する細胞の内側では、タンパク質や金属

近年、皮膚の表面電位は表皮が起こしていること、また、イオンなどの無数の生体分子がその濃度、局在、活性を連

表皮が正常に機能する上でイオンポンプの働きが重要であ続的に変化させ、細胞の機能や恒常性を制御している。つることが分かっている。この表面電位において、カルシウまり、それら分子の協奏によって、個々の細胞は情報伝達

ムイオンは角層の直下に分布し、皮膚の正常な機能の維持を行い、アポトーシスなどの多岐に渡る生体応答を引き起において重要な役割を担っていることが報告されている。

こしている。そのため、細胞内におけるそれら生体分子のこのように、皮膚の生理機構とカルシウムイオンは深く関挙動を継時的に時々刻々と解析することは生物学研究におわっている 5−7）。そこで、培養細胞レベルのみならず、動いて極めて重要であり、これまでに多くの研究が行われて物個体レベルおよび組織レベルでの応用をも視野に入れて、きた。その中でも、蛍光分子や蛍光タンパク質を用いたバ赤色光領域でのカルシウム蛍光プローブの開発を行った。

イオイメージング技術は細胞内における様々な生体分子のこれまでに汎用されている緑色領域（500 nm 程度）より更挙動をリアルタイムに観察する手法として有用であり、今に長い赤色の蛍光波長を有する蛍光プローブを開発するこ日の生命科学研究の進展に大きく貢献している。我々は近とで、より低い自家蛍光および高い組織透過性、マルチカ年、さらに高度な蛍光イメージングを可能とすべく、有機ラーイメージングへの応用が期待され、より詳細にカルシ小分子を基礎とした新たな蛍光団の開発とその応用に取りウムイオンの役割を解明できると期待される。

２．実験・結果
Development of a red fluorescence probe
for monitoring dynamics of cytoplasmic
calcium ion to elucidate physiologicalmechanism in skinKenjiro Hanaoka
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, The University of Tokyo

2 .1 赤色蛍光を有するフルオレセイン類似蛍光色素
TokyoMagenta 類の開発
蛍光イメージングにおいて、蛍光団を特定の標的分子を検出できるようにセンサー化した化合物、すなわち、蛍光プローブが汎用されており、有機小分子をもととした蛍光− 147 −コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

プローブの蛍光団母核として、「フルオレセイン」というレセイン類似蛍光色素 TokyoMagenta 類について説明さ緑色蛍光色素が特に汎用されている（図 1 a：TokyoGreenせて頂く。

はフルオレセインの誘導体である）。これはフルオレセイ

長波長蛍光を有するフルオレセイン類似色素を、フルオンが、高い水溶性、高い蛍光量子収率、確立した蛍光制御

レセインにおけるキサンテン環の 10 位 O 原子を他の原子機構など蛍光プローブの蛍光団母核として多くの長所を有に置換することにより開発することを試みた。これまでに、しているためである。例えば、生細胞染色に用いられていキサンテン環上の π 共役系近傍に Si –Me 結合が存在する

る Calcein AM や、カルシウムプローブ Fluo- 3、Fluo - 4 な

ことで、キサンテン環上の π* 軌道および、Si –Me 結合のどはフルオレセインを蛍光団母核として用いた蛍光プロー

σ* 軌道とが結合性相互作用を起こし、LUMO が安定化す

ブの代表例であり、実際に、現在多くの生物学研究に応用ることが報告されている 10 , 11）。これをもとに、我々は 10されている 8 , 9）。このようなフルオレセイン骨格を用いて位 Si 置換フルオレセイン類 TokyoMagenta（TM）の設計、開発された蛍光プローブは生物学研究に必要不可欠なもの開発を行った（図 1 a, b）12）。その結果、狙い通りに水溶液となっているが、それらは全て緑色光の波長領域に蛍光波中での TM の吸収波長、蛍光波長が共に、フルオレセイン長を有するため、例えば、汎用される緑色蛍光タンパク誘導体である TokyoGreen（TG）と比較して 90 nm もの大GFP を発現させた細胞や動物に応用することや、他の緑きな長波長化を示した（図 1 c, d）。さらに、分子軌道計算

色蛍光プローブとの共染色を行うことは不可能である。そによって TM、TG の HOMO および LUMO エネルギーレ

こで我々は、フルオレセインの蛍光プローブの蛍光団母核ベルを計算したところ、TG と比較して TM の LUMO エネとしての優れた特性を保持したまま、長波長蛍光を有するルギーレベルは大きく低下しており、この LUMO エネル

新たな蛍光団を開発し、それによってマルチカラーイメーギーレベルの安定化が波長変化の主な要因であると考えてジングなど蛍光イメージングの可能性をさらに大きく広げいる（図 1 e）。

ることを目指している。このような蛍光波長を赤色光や近赤外光の波長領域へと移動させることは、自家蛍光を低く2.2

β-ガラクトシダーゼ活性検出蛍光プローブの開発抑え、かつ、高い組織透過性をも得ることができる。以下

光学特性を精査する中で、TM に特徴的な光学特性を見にこれまでに開発に成功している赤色蛍光団であるフルオ出した。TG および TM には pH 依存的にアニオン型、ニ

図 1 （a, b）TokyoGreen（a）、および TokyoMagenta（b）の分子構造、モル吸光係数（ε）
、蛍光量子収率（Φfl）（ε、Φfl は、共に R = 2-Me 体を用いて測定）。（c, d）2-Me TokyoGreen（緑）、および 2-Me TokyoMagenta（赤）のリン酸ナトリウムバッファー（pH 9）中での吸収（c）、蛍光（d）スペクトル。（e）Gaussian 09 を用いた時間依存密度汎関数法（TDDFT）による分子軌道計算により算出した HOMO および LUMO エネルギーレベル。

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皮膚の生理機能解明を目指したカルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用ュートラル型の平衡が存在し、アニオン型は強蛍光性、ニを選択的にアニオン型での最大吸収波長で励起することで、ュートラル型は弱蛍光性を示す（図 2 a）
。それら構造変化

酵素反応前後での大きな蛍光強度上昇を実現した（図 3 c）。に伴う最大吸収波長の変化は、TG では 53 nm であるのにこのように励起波長を適切に選択することでアニオン型の対し、TM では 111 nm と非常に大きな値を示した（図 2 b）。

プローブ分子を選択的に励起することができたのは、アニこの実験結果から、キサンテン環の酸素原子上の構造変化

オン型とニュートラル型の 111 nm もの非常に大きな吸収をスイッチとすることで、高い S/N を示す蛍光プローブ波長の変化に因るものである。さらに、2 -Me TM b gal をの開発が可能であると考えた。つまり、ニュートラル型とHEK 293 b - ガラクトシダーゼ高発現細胞（lacZ+）およびキサンテン環上の酸素原子がアルキル化された化合物とが非発現細胞（lacZ−）にロードしたところ、高発現細胞か類似の光学特性を示すと推測し、例えば、アルキル化されらのみ強い蛍光が観察された（図 3 d, e）。これまでに TG

た TM 誘導体が標的分子とする特定の酵素などにより脱アを母核とした b - ガラクトシダーゼプローブも報告されてルキル化を受けることでアニオン型の TM が生成し、そのいるが、これはベンゼン環部位の酸化電位を厳密に制御し際、アニオン型のプローブ分子のみが励起されるよう励起光誘起電子移動によって蛍光強度の大きな変化を実現して波長を適切に選択することで、大きな蛍光強度上昇が実現

いる 13）。そのため、TG を用いたプローブではベンゼン環できると考えた。実際に、この蛍光プローブの分子設計戦部位の分子構造が大きく制限されている。一方で TM を用略が可能であるか検証するため、我々は β-ガラクトシダー

いた波長変化型プローブでは、ベンゼン環部位の酸化電位ゼの基質となる蛍光プローブ、2 -Me TM b gal の設計、開の厳密な制御が不必要であり、水溶性官能基や細胞内局在発を行った（図 3 a）
。2 -Me TM b gal の吸収スペクトルは制御構造などをベンゼン環部位へと付与できるため、様々2 -Me TM のニュートラル型のスペクトルと類似しており、な目的に応じた自由度の高い分子設計が可能であり、よりb- ガラクトシダーゼとの酵素反応により吸収波長は大き個々の研究目的に適合した蛍光プローブの開発が可能であなレッドシフトを示した（図 3 b）
。さらに、プローブ分子ると考えている。

図 2 （a）TG、TM の pH 依存的な平衡。（b）TG、TM の酸性および、塩基性水溶液中での吸収スペクトル。

図 3 （a）2-Me TM βgal の分子構造および、β-ガラクトシダーゼとの反応。
（b, c）2-Me TM βgal の β-ガラクトシダーゼとの反応前後での吸収（b）および、蛍光（c）（励起波長は 582 nm）スペクトル。
（d, e）2-Me TM βgal を HEK293 細胞の β-ガラクトシダーゼ高発現株 lacZ+（d）および、非発現株 lacZ–（e）にロードし、共焦点顕微鏡にて撮影した透過光像および、蛍光像。
励起波長、検出波長はそれぞれ 580 nm、600ー620 nm。

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コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

2 . 3 細胞質におけるCa 2 + をモニターする蛍光プローブの開発 14）（1,2-bis（o-aminophenoxy）ethane-N,N,N',N '-tetraacetic acid）

カルシウムイオン（Ca 2 +）は生体の重要なセカンドメッ団に塩素原子を導入することで CaTM-1 の Ca 2 + 濃度依存センジャーとして多くの生命現象に関与し、特に細胞内的な蛍光強度変化を改善したプローブ CaTM- 2 を開発した

構造と TM を用いた Ca 2 + プローブ CaTM-1、さらに蛍光2+Ca 濃度変動は様々な生体応答を惹起している。そのため、 （図４）。塩素原子導入により蛍光強度変化が改善した理由
細胞内 Ca 2 + 濃度変動の可視化は、蛍光イメージングの分は、塩素原子が蛍光団の HOMO エネルギーレベルを低下野において最も注目されている研究領域の一つとなっていさせ、Ca 2 + 非存在下において光誘起電子移動による蛍光る。現在、緑色蛍光を有する Fluo-3 や Fluo- 4 などの Ca 2 +の 消 光 効 率 が 高 ま っ た た め と 考 え て い る。 さ ら に、蛍光プローブが広く用いられているが、長波長を有する

CaTM- 2 の細胞膜透過性体 CaTM- 2 AM を合成し、これをCa 2 + プローブは限定的な応用に留まっている。例えば、用いることで HeLa 細胞におけるヒスタミン刺激による細2+赤色蛍光を有する Ca プローブで最も有名な Rhod- 2 は、胞質 Ca 2 + 濃度変動の可視化に成功した（図 5 a−c）。一方、そのカチオン性のためミトコンドリアに局在しやすい特性

Rhod- 2 AM は同様の実験を行った結果、ミトコンドリアがあり、主にミトコンドリアにおける Ca 2 + イメージングににおける Ca 2 + 濃度変動を可視化した（図 5 d−f）。また、用いられているが、細胞質における Ca 2 + の挙動解析には適CaTM- 2 AM の生物学研究における更なる有用性を示すた

2+していない。一方で、細胞質における Ca はセカンドメめ、ラット脳スライス切片へと応用した結果、神経細胞のッセンジャーとして多くのタンパク質に作用し、その濃度活動を発火に伴った細胞質 Ca 2 + 濃度変動として捉えるこ変動が様々な生体応答を引き起こすため、その可視化は非とに成功した（図６）。このように、皮膚の生理機能の解常に重要である。そこで本研究において、TM を用いて幅明研究を含めた生命科学研究に有用な Ca 2 + 蛍光プローブ

広い応用が可能な細胞質 Ca 2 + をモニターできる蛍光プロの開発に成功した。

ーブの開発を行った。Ca2+ 選択性の高いキレーター、BAPTA

図 4 （a）新規赤色カルシウムプローブ CaTM-1 および CaTM-2 の分子構造と、Ca2+ が配位することによる蛍光強度変化の模式図。
（b, c）CaTM-1（b）および CaTM-2（c）の Ca2+ 依存的な蛍光スペクトル変化。励起波長は 550 nm。

図 5 （a–c）CaTM-2 AM を HeLa 細胞にロードし、ヒスタミン刺激を行った時の蛍光像（a, b）および、蛍光強度の時間変化（c）。
（d–f）Rhod-2 AM を用いて（a–c) と同じ実験を行った結果。

図 6 CaTM-2 AM を用いたラット脳スライス切片における神経細胞の自然発火の可視化。（a–c）CaTM-2（a）、細胞体を同定するために用いた Acridine orange の蛍光像（b）および、重ね合わせた蛍光像（c）。
（d）CaTM-2 の蛍光強度変化。

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皮膚の生理機能解明を目指したカルシウムイオン蛍光プローブの開発とその応用

Calcium ion propagation in cultured keratinocytes and３．考察・総括

other cells in skin in response to hydraulic pressure

複数の蛍光プローブを同時に用いるマルチカラーイメー

stimulation, J. Cell. Physiol., 224 , 229 - 233 , 2010 .

ジングは、複数の生体分子の同時解析や、細胞種、細胞内６）Leiper LJ, Walczysko P, Kucerova R, Ou J, Shanley

小器官など同定した上でのイメージングなどに有用とされ

LJ, Lawson D, Forrester JV, McCaig CD, Zhao M,

る。同時に赤色領域の光は、低い自家蛍光および、高い生

Collinson JM: The roles of calcium signaling and

体組織の透過性など生体組織での蛍光イメージングに適し

ERK 1 / 2 phosphorylation in a Pax 6 +/− mouse modelている。また、蛍光プローブの蛍光団母核として汎用されof epithelial wound-healing delay, BMC Biology, 4 , 27 ,ているフルオレセインを、その分子構造の多くを保存した

2006 .

まま長波長化した新規赤色蛍光団 TokyoMagenta は、今７）Denda M, Denda S: Air-exposed keratinocytes

後、マルチカラーイメージングの可能性を大きく広げるこ

exhibited intracellular calcium oscillation, Skin Res.とが期待される。これまでに、b- ガラクトシダーゼプロー

Technol., 13 , 195 - 201 , 2007 .

ブ 12）および、カルシウムプローブ 14）の開発に成功してい８）K a o J P Y , H a r o o t u n i a n A T , T s i e n R Y :るが、これらの蛍光制御原理を用いることで、フルオレセ

Photochemically generated cytosolic calcium pulses

インを母核とした他の緑色蛍光プローブも赤色領域にて再and their detection by fluo- 3 , J. Biol. Chem., 264 , 8179 –

現できると考えている。今後、開発した赤色カルシウム蛍光プローブによって、皮膚の生理機構の解明が進展することを期待している。

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