生理活性ペプチド生産のためのダイズ種子の熱ストレス応答機構の解明
藤原圭吾林泰則山伸之

京都大学大学院農学研究科

小修士課程

京都大学農学部丸

京都大学大学院農学研究科

緒准教授

実験方法

言
21 世紀の食糧問題の一つとして、生活習慣病に代表１. ダイズ種子の湯浴処理によるサンプル調製される食源性疾患の増大が挙げられる。この問題に対処

アルミホイルで遮光したファルコンチューブにダイするには、生活習慣の改善とともに生活習慣病改善効果

ズ種子 (5g；品種エンレイ、ペキン、タマホマレ、IOM)のある生理活性物質を積極的に摂取することが必要であと buffer(0.05M リン酸緩衝液、pH8.0、0.2M NaCl) をると考えられる。哺乳類由来のペプチドにおいてそのよ加えて密封した後、各温度条件 (10℃、25℃、50℃ )うな生理機能性をもつペプチドは見つかってきているにおいてウォーターバスで一定時間 (1 〜 16 時間 ) 振が、それを生産する手段として植物を利用することが着とうした。湯浴処理後、チューブから buffer と種子を目されている。動物や動物の培養細胞を用いて生産する分けて解析に用いた。すぐに解析に用いない場合には、場合に比べて、病原体混入の危険性が極めて低い、そしbuffer を別のチューブに移し液体窒素で凍結後ディープて生産コストが低いという２つの大きな利点があることフリーザーにて保存した。buffer を回収した後、種子はが主要な要因となっている。種子は、植物の器官の中でチューブ内に入れたまま蒸留水で 2 回洗浄した後に液最もタンパク質含量が多い。また、乾燥状態においても、体窒素で凍結しディープフリーザーにて保存した。

タンパク質を安定に保持することができるので、貯蔵や２．湯浴処理後溶液の分析輸送にコストがかからないため、植物でタンパク質やペ湯浴処理中、1、2、4、6、8、12、16 時間経過時にチュープチドを生産するための理想的な植物組織である。すでブ か ら buffer を 100 μl 採 取 し 遠 心 し た (15000rpm、に我々はダイズおよびイネ種子に生活習慣病改善効果の4℃、5 分 )。遠心後上清についてタンパク質定量用キッあるペプチドを種子タンパク質をキャリアーとして種子ト ( 和光純薬工業製 ) を用いてタンパク質濃度を定量しに蓄積させることに成功している。このような種子からた。さらに SDS-PAGE により buffer 中のタンパク質を簡便にペプチドやタンパク質を抽出および精製すること解析した。

が出来れば、より安価に生活習慣病改善効果をもつペプ

３．湯浴処理後種子中タンパク質の分析チドを生産することが可能となる。

湯浴処理後に凍結保存しておいた種子をミルで破砕しダイズなどの豆類種子に含まれる Bg7S( 塩基性 7S グ

細かい粉末にしてからヘキサンとアセトンを用いて脱脂ロブリン ) は、50 〜 60°C の湯浴に乾燥種子を浸漬すした。脱脂ダイズ粉末 (30mg) を 1.5ml チューブに入れ、ると、新たに合成され、湯浴中に放出される1,2)。しかSDS を含む buffer(500μl）を加え抽出した。遠心したも Bg7S が放出されるタンパク質の主要成分となってい後 (15000rpm、4℃、5 分 )、得られた上清のタンパクる。したがって、Bg7S が湯浴処理により種子外へ放出質濃度を定量した後、SDS-PAGE による分離を行った。

される機構を解明して、制御することができれば、生活さらに、抗 Bg ７S 血清を使用したウエスタンブロット

習慣病改善効果のあるペプチドを蓄積した種子から、そを行った。

れらを簡便に精製することが可能になる。そこで、本

４．乾燥種子及び湯浴処理後種子の透過型電子顕微鏡観察

研究では Bg7S の湯浴処理に対する分子応答機構を解明

ダイズ種子 ( タマホマレ乾燥種子、タマホマレ湯浴処し、種子外へのタンパク質放出機構を、植物種子におけ

理後種子 ) を 0.5 〜 1.0mm の立方体となるようにメスる生活習慣病改善効果をもつペプチド生産に利用するこで切り出した。切り出したサンプルを 2ml チューブにとを目的として行う。

入れ固定液 (3%パラホルムアルデヒド、0.1％グルタル1丸山伸之

アルデヒド、0.1M NaPi pH7.2) で洗浄した後、新しい結果及び考察固定液を 2ml 加えた。チューブを氷上に挿し、15 分×１．湯浴処理溶液中タンパク質濃度の経時変化

6 回 vacuum infiltration した。固定液を新しいものに換

湯浴処理における溶液中のタンパク濃度の経時的変化

えて 4℃で 5 時間静置した。Buffer(0.1M NaPi、pH7.2)を分析した。4 品種すべてにおいて、湯浴処理温度が高で 2 回 洗 浄 後 新 し い buffer を 2ml 加 え た。30 分 後

いほど溶液のタンパク質濃度が高かった。品種間では、buffer を新しいものに交換し、これを 3 回繰り返して10°C、25°C、50°C のいずれの条件においてもタマホから 4℃で一晩静置した。

マレのタンパク質濃度が最も高く、ペキンが最も低かっ

固定したサンプルを 60%エタノールで 2 回洗浄したた。特に 50℃においては、タマホマレのタンパク質放後、60%エタノールを 2ml 加えて 30 分静置した。エタ出量は他品種に比べて非常に高かった。なおエンレイとノール濃度を 10%ずつ上げて (60%〜 90％ ) 、同様のIOM に関しては、10℃と 25℃においては IOM の方が操作を繰り返した。なお 80%のみ氷上で行い、それ以タンパク質を多く放出しているが、50℃では 16 時間経外は常温静置した。99.5％エタノールで 1 時間静置を過時でエンレイの方が多く放出していた。

3 回繰り返した後、LR white 樹脂：99.5%エタノール＝２．湯浴処理後溶液中タンパク質の分析

1：2、2：1 混合溶液でそれぞれ 6 時間から半日ほど静湯浴処理 16 時間後の溶液に含まれるタンパク質を置した。LR white 樹脂に交換し 2 日間静置し、サンプ

SDS-PAGE に供した ( 図 1)。Bg7S はダイズ種子総タン

ルをビームカプセルに移し、紫外線照射器で重合させた。

パク質の約 3％を占めており、等電点が 9.05 〜 9.26 の重合したサンプルをトリミングし、薄切りしやすくしタンパク質で、α鎖 (27kDa) とβ鎖 (16kDa) のふたつのた後ウルトラミクロトームで 70 nm ほどの薄さの切片サブユニットから構成される 。バンドの位置から、ペに切った。切片はホルムバール膜を貼り付けたグリッド

キン以外の 3 品種においては Bg7S を種子の外に放出しにのせ、抗 Bg7S 血清 (2500 倍希釈 )、15 nm 金粒子標ている。また、10℃や 25℃においてペキン以外の 3 品

識ゴート由来抗ウサギ二次抗体 (25 倍希釈 ) で免疫標識種では Bg7S 以外にも比較的高分子量のタンパク質が存した。酢酸ウラニルと硝酸鉛で電子染色した後、透過型在するが、これらはその分子量から種子貯蔵タンパク質

電子顕微鏡で細胞内構造や Bg7S の細胞内局在の観察をの 7S グロブリンと 11S グロブリンだと推測される。一行った。

方、ペキンにおいては Bg7S に対応するバンドははっき3)MW(kDa)976642302014図1

湯浴処理後溶液の SDS-PAGE

Bg, 精製 Bg7S; Peking, ペキン ; Tam, タマホマレ ; Enrei, エンレイ .
2生理活性ペプチド生産のためのダイズ種子の熱ストレス応答機構の解明

りとは確認できなかった。

けでなく、10℃や 25℃で湯浴処理したサンプルにおい３．湯浴処理後種子中タンパク質の分析ても乾燥種子と比べて Bg7S の蓄積量が多いことから、熱以外のストレスでも Bg7S の発現が誘導されているこ

湯 浴 処 理 後 (16 時 間 ) の 種 子 中 タ ン パ ク 質 を SDSPAGE に供した ( 図 2)。種子タンパク質の構成が品種間とが推測される。

で差が見られた。しかし、乾燥種子と湯浴処理後の種子

４．透過型電子顕微鏡による種子内部構造の観察の違いや同一品種内での湯浴処理温度の違いによる種子

タマホマレの乾燥種子及び湯浴処理後種子の細胞内構内におけるタンパク質の変化は確認できなかった。また造の電子顕微鏡観察を行った。乾燥種子 ( 図 4 左 ) と比4 品種すべてにおいて、乾燥種子と湯浴処理種子ともに較して湯浴処理 50℃の種子 ( 図 4 中 ) では、液胞などBg7S に対応するバンドは SDS-PAGE では明確には確認が融合し大きくなっている様子などがみられた。湯浴処できなかったが、ウエスタンブロットでは、すべてのサ

理 10℃の種子 ( 図 4 右 ) では 50℃の種子と異なり、細ンプルにおいて Bg7S が存在することが確認できた ( 図胞内区画の大きな変化は観察されなかったが、細胞間隙3)。また、乾燥種子より湯浴処理後の種子の方が Bg7Sに電子密度の濃い領域が形成されているのが観察されの種子中における蓄積量が多いことがわかる。50℃だ

た。このような細胞間隙は 50℃の種子においてもわず図2

図3

湯浴処理後種子中タンパク質の SDS-PAGE

湯浴処理後種子中タンパク質の抗 Bg7S 抗体によるウエスタンブロット

Bg, 精製 Bg7S; P-C, ペキン乾燥種子 ; P-10, ペキン湯浴処理 10℃ ; P-25, ペキン湯浴処
理 25℃ ; P-50, ペキン湯浴処理 50℃ ; T, タマホマレ ; E, エンレイ ; I, IOM.
3

丸

山伸之

図4

透過型電子顕微鏡により撮影したタマホマレ種子内部構造

図5

Bg7S の細胞内局在の観察

ICS, 細胞間隙 ; CW, 細胞壁かながら観察された。

ることが示唆された。また、50℃で処理すると細胞内５．Bg7S の細胞内局在の観察

区画の構造が大きく変化しており、Bg7S の放出量も多抗 Bg7S 血清により処理した切片の電子顕微鏡観察をくなるが、同時に細胞内構造が損なわれていくと考えら行った。Bg7S は主に細胞壁の中層に局在していることれた。今後、さらに種子外への Bg7S の放出量の多い品

4)が報告されているが 、本研究においても乾燥種子で種を見出すとともに、細胞内構造が損なわれない条件で、Bg7S が細胞壁に多く存在しているのが観察された ( 図長時間 Bg7S を種子外に放出させることにより、より効

5 左 矢印 )。湯浴処理 50°C の種子では Bg7S は細胞壁率の良い生理活性ペプチドの生産が可能になると考えらにはほとんどみられず、細胞内にまばらに存在していたれる。

( 図 5 中 )。一方、10°C で処理した種子では、細胞壁や細胞内に Bg7S はほとんどみられずに、細胞間隙にみ謝

辞本研究に対し助成を頂きました財団法人三島海雲記念られた電子密度の濃い領域にのみ局在しているのが観察された ( 図 5 右 )。

財団ならびに関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。

要文約献1) F. Yamauchi, et al, : Agric. Biol. Chem . 48, 645-650, 1984.

4 品種のダイズ種子を用いて湯浴処理を行ったが、品

2) H. Kagawa, et al, : FEBS Lett . 226, 145-149, 1987.

種により Bg7S の放出量に大きな違いが見られた。細胞3) Y. Watanabe, et al, : Eur. J. Biochem . 224, 167-172, 1994.

内構造を電子顕微鏡により詳細に解析することにより

4) NK. Nishizawa, et al., : Plant Cell Physiol . 35, 1079-1085, 1994.

Bg7S が細胞間隙に分泌された後、種子外に放出してい4