細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージング
東京大学大学院農学生命科学研究科

佐々木

栄太

Oxidative stress due to cell damage or aging results in lipid peroxidation, which produces various lipid radicals and α,β-unsaturated aldehydes. The highly reactive aldehyde species readily modify specific or unspecific protein sites and maybe
involved in many diseases such as atherosclerosis and cancer. Although many analytical methods have been developed forlipid peroxidation, imaging of the aldehydes in living cells is still challenging due to lack of appropriate chemical probes.
Here, I designed, synthesized an investigated two aryl azide-based fluorescence probes to detect acrolein, the shortest α,β-unsaturated aldehydes with a three carbon unit, and an alkoxyamine-based probe targeting the reactive aldehydes. Oneof the aryl azide-based probes with a 7-nitrobenzoxadiazole scaffold yielded the corresponding formyl triazole productupon reaction with acrolein. The reaction product showed substantially red-shifted absorbance compared to the unreacted
probe, however, instability of the azide group in the probes may limit their use for the imaging of acrolein in living cells.
The other probe containing a rhodamine scaffold with an alkoxyamine substituent showed pH-dependent absorbance andfluorescence spectra, which are characteristic for many rhodamine derivatives due to the open and closed spirocyclic forms inequilibrium. When it was mixed with α, β-unsaturated aldehydes at pH 7, significant increase of absorbance and fluorescence
was observed likely because the open form was stabilized for the reaction product. Thus, the probe was applied to HeLa
cells. Confocal microscopy images showed fluorescence increase in some cellular compartments. Co-labeling the cellswith a lysosome-targeted dye revealed that the probe turned to fluorescence in lysosome, where the local pH is known to be
4.5-5.0. Accumulation of the probe in lysosome may hamper the desired imaging of the reactive aldehyde species. Further
investigation is in progress to determine where the probe distributes in the cells and if it can detect endogenous aldehydes
under oxidative stress.

１．緒

ノ酸残基を化学修飾しうることがわかってきて注目を集め言ている。それによって生成するさまざまなタンパク質修飾

生体組織の酸化還元状態は、酸化物質と還元物質の巧みなバランスによって適切な状態に保たれている。しかし、体の詳細な働きは未だ明らかとなっていないが、疾病や老化に関わる新たな危険因子の可能性がある 1）。

癌や生活習慣病をはじめとする疾患や、加齢などによって本研究では、細胞内に生成する脂質過酸化物を高感度・酸化ストレスが亢進すると、生体内で日常的に発生してい高時空間分解能で検出する方法の開発を目指し、生理的条る反応性の高い活性酸素種が、DNA、タンパク質、脂質件下これらの分子種と反応して蛍光性を獲得する機能性小といった主要な生体構成分子を酸化し、細胞障害を引き起分子プローブを創成することを目的とした。具体的には、
1）

こす。したがって、これらの活性酸素種、またはそれによ

近年アクロレインとの反応性が報告されたアリルアジド基って酸化的な修飾を受けた生体分子を感度良く検出するこを反応部位として含む蛍光プローブ、2）さまざまな炭素鎖とができれば、細胞の健康状態や老化の度合いを判定する長を有するアルデヒド基をターゲットとしたアルコキシア

上で有効である。

ミノ基を反応部位とする蛍光プローブの開発を行った。目

リン脂質やコレステロールエステルなどの生体膜を構成的とする脂質過酸化物感受性蛍光プローブによって、さまする多価不飽和脂肪酸は、特に活性酸素による酸化修飾をざまな酸化ストレス条件下での生細胞イメージングデータ

受けやすい性質をもつ。したがって、これらの脂質が酸化を蓄積することができれば、疾病や老化による細胞障害の的に分解して生じる不飽和アルデヒド化合物（加齢臭の原診断や、新たな病態または加齢メカニズムの解明につなが因として知られる 2 - ノネナールや毒性の高いアクロレイると期待できる。

ンなど）は酸化ストレスの良いマーカーとなりうる。近年、

２．方

これらの高反応性脂質過酸化物が、タンパク質の特定アミ法

２．
１．プローブの合成
アリルアジド基を反応部位として含む蛍光プローブ 1 お
Bioimaging of lipid peroxidation inducedby cell damage or aging
Eita Sasaki
Graduate School of Agricultural andLife Sciences, The University of Tokyo

よび 2（図 1 A）は、4 - クロロ - 7 - ニトロベンゾフラザン
および IR- 780 ヨウ化物をアセトンまたはメタノールに溶解し、アジ化ナトリウムを加えることで合成した。アル
コキシアミノ基を反応部位とする蛍光プローブ 3（図 1 B）
は、ローダミン B をベンジルアルコール誘導体（4）、ベン− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ジルブロマイド誘導体へと変換した後に 2）、N,N- ジメチ

octenal, trans- 2 -nonenal, trans- 2 -decenal）とリン酸緩衝

ルホルムアミド（DMF）中に溶解し、ジアザビシクロウン

液（pH 7）中またはメタノール中で反応させ、波長 560 nm

デセン存在下 N-Boc- ヒドロキシルアミンと反応させ、酸の吸光度をプレートリーダー（ARVO X 3 , PerkinElmer）

による Boc 基の脱保護を行うことによって合成した。それによって測定し、それぞれの溶液を HPLC および質量分析

ぞれのプローブまたはその中間体は、シリカゲルクロマト

装置によって解析した。

グラフィーまたは逆相カラム（C 18）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（JASCO）によって精製した。ま２．３．プローブ 3 のリン酸緩衝液中での光学特性た、得られた化合物の構造は、NMR（JNM-ECA 500 II,

プローブ 3 のジメチルスルホキシド（DMSO）溶液をさまJEOL）および質量分析（JMS-T 100 LC, JEOL）によって同

ざまな pH に調製した 0 . 1 M のリン酸緩衝液（pH 3−11）に定した。

終濃度が 10 µM（1 % DMSO）となるように溶解し、分光
光度計、蛍光光度計を用いてその吸収・蛍光スペクトルを

２．２．プローブとアクロレインやその他のα,β- 不飽
和アルデヒドとの反応
プローブ 1 をテトラヒドロフラン（THF）中でアクロレ分析した。また、対象実験として、ローダミン B とそのベ
ンジルアルコール誘導体（4）の光学特性についても同様に分析した。

インと混合した後、HPLC を用いてその反応物を分析、分光学特性は、分光光度計（U- 3900 , Hitachi）、蛍光光度計

２．４．プローブ 3 による培養細胞（HeLa 細胞）のイメ
ージング（F- 7100 , Hitachi）を用いて分析した。プローブ 2 は、メ

直 径 35 mm の ガ ラ ス ボ ト ム シ ャ ー レ（CELLview,

タノール、DMF、クロロホルム、ジクロロメタン、アセGreiner Bio-One）上に培養した HeLa 細胞をカルシウムとトン、酢酸エチル、アセトニトリル中でアクロレインと混

マグネシウムを含むリン酸緩衝食塩水（PBS（+））で洗浄合し、またはプローブのみで、その吸収スペクトル、蛍光後、1 mL の PBS（+）を加えた。プローブ 3 の DMSO 溶

スペクトルを継時的に測定した。プローブ 3 は、リン酸緩液を 1 mL の PBS（+）と混合し、これを共焦点レーザー

衝液（pH 7 または 8）中でアクロレインを加えた時の吸収ス

顕微鏡（FV 1200 , Olympus）下、シャーレに加え、経時的

ペクトル、蛍光スペクトルを継時的に測定した。さらに、な蛍光観察を行った（プローブ 3 の終濃度 100 nM, DMSO

プローブ 3 をさまざまな炭素鎖長をもつ α, β- 不飽和アルの終濃度 0 . 1 %）
。また、市販のリソソーム染色蛍光試薬

デ ヒ ド 分 子（C 3 - C 10 : acroleine, crotonaldehyde, trans-（LysoTracker Green DND- 26 , ThermoFisher Scientific）

2-pentanal, trans-2-hexenal, trans-2-heptenal, trans-2-による細胞染色は、販売元の取扱い説明書の指示に従っ取した。プローブ 1 およびそのアクロレインとの反応物の図１（A）アジド基を反応部位とする蛍光プローブ1, 2 の構造式（B）アルコキシアミノ基を反応部位とする蛍光プローブ3の構造式− 78 −

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージングて行った。具体的には、HeLa 細胞の培養液に試薬を終濃

タン、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリルなど、多く

度 75 nM で加え、37 ℃で 30 分インキュベートした後に、の溶媒下で化合物 2 のスペクトルに継時的な変化（吸収極PBS（+）
で洗浄した。

大波長 774 nm の減少と吸収極大波長 642 nm の増大）を観３．結測した。しかしながら、当スペクトル変化はアクロレイン

果

無添加でも引き起こされ、光の照射によって加速された。

３．
１．プローブ 1

質量分析などの測定の結果、プローブ 2 とアクロレインとフェニルアジドをニトロベンゾオキサゾール骨格へ導入の期待された反応物は検出されず、プローブ 1 と同様にそしたプローブ 1 を THF 中アクロレインと混合すると、プのアジド基がアミノ基へと変換されていることが確認され

ローブ 1 のホルミルトリアゾール誘導体であると推定された。

る生成物が HPLC および質量分析によって検出された。これを分取精製し、プローブ 1 およびアクロレインとの反応

３．３．プローブ 3

物の吸収スペクトルを測定したところ、アクロレインとのアルコキシアミノ基を有するローダミン B 誘導体である反応によって吸収極大波長が 385 nm から 465 nm へと大きプローブ 3 をさまざまなpHに調製したリン酸緩衝液（pH 3

く長波長側へシフトしていた（図 2 A）
。そこで、459 nm の− 11）に加え、光学特性を分析したところ、pH 依存的な励起波長を用いて蛍光スペクトルを測定したところ、アク吸収スペクトル、蛍光スペクトルの変化が観察された（図ロレインと反応することによって、蛍光極大波長 536 nm

3 A, B）。すなわち、溶液を酸性から塩基性にすることで、の蛍光を発することを観測した（図 2 B）
。以上の結果より、吸光度（吸収極大波長 560 nm）は減少し、それに合わせて

波長 459 nm 付近の光で励起することによって、ホルミル

580 nm 付近の蛍光強度も減少した。吸収極大波長の吸光

トリアゾール体のみが蛍光を発するようなアクロレイン検度を pH に対してプロットしたところ、吸光度の最大値の出条件を設定可能であることがわかった（図 2 B）。

50 % を与える pH（pKcycl）3）は 6 . 2 付近であると見積も次に、プローブ 1 の光安定性を検討するため、1 を水、られた。対象実験として、ローダミン B とプローブ 3 の合

メタノール、または THF に溶解し、室内灯下で吸収スペ成中間体であるローダミン B のベンジルアルコール誘導

クトルを測定したところ、時間依存的なスペクトルの変化

体（4）についても同様の測定を行った。ローダミン B の吸（吸収極大波長〜385 nm の減少と吸収極大波長〜 455 nm

収スペクトルは pH 3−11 の範囲でほとんど変化しなかっの増大）が観測された。質量分析の結果、その原因はプロた。4 の吸光度はプローブ 3 と同様に酸性から塩基性にすーブ 1 のアジド基がアミノ基へと変換されたことに由来することで減少し、そのpKcyclは 8.3 付近と見積もられた（図ると推察された。

3 C）。以上の結果により、プローブ 3 は中性のpH 7 付近
（あるいはそれ以上の pH）では、吸光度、蛍光強度ともに低く

３．
２．プローブ 2

抑えられており、酸性条件下ではそれらが上昇するというフェニルアジドをトリカルボシアニン骨格へ導入したプ

ことがわかった。

ローブ 2 をメタノールに溶解し、アクロレインを加えたが、次にプローブ 3 を pH 7 または 8 に調製したリン酸緩衝

その光学特性に大きな変化は観察されなかった。そこで、液に溶解し、アクロレインを加えると、いずれの場合でプローブ 2 とアクロレインとの反応をさまざまな溶媒を用も吸光度と蛍光強度の経時的な上昇が観察された（図 3 D）。

いて検討したところ、DMF、クロロホルム、ジクロロメ

さらに、プローブ 3 をさまざまな炭素鎖長をもつ α, β - 不

図2 （A）プローブ1およびアクロレイン反応生成物の吸収スペクトル（B）プローブ１およびアクロレイン反応生成物の蛍光スペクトル（励起波長: 459 nm）− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 3（A）
プローブ 3（10μM) の 0.1 M リン酸緩衝液（pH 3 − 11）中の吸収スペクトル（B）
プローブ 3（10μM）の 0.1M リン酸緩衝液（p H 3 − 11）中の蛍光スペクトル（励起波長 : 520 nm）（C）プローブ 3、ローダミン
B のベンジルアルコール誘導体（4）、ローダミン B の 0.1M リン酸緩衝液中の pH 依存的な吸光度（560 nm）
変化（D）0.1M リン酸緩衝液（pH 7 または８）に溶解したプローブ 3（10μM）にアクロレイン（1mM）を加えた時の吸光度（560 nm）の時間変化

飽和アルデヒド分子（C 3−C 10）とリン酸緩衝液（pH 7）ま４．考察とまとめたはメタノール中で反応させたところ、いずれの条件下でも吸光度の上昇が観察された。さらに、それぞれの反応溶

生理的条件下での脂質過酸化物のバイオイメージングを

液を質量分析に供することで、対応するオキシム体へと変可能とする蛍光プローブの基本設計としては、ⅰ α, β- 不換されていることを確認した。

飽和アルデヒド構造をもつ脂質過酸化物と特異的かつ効率

最後にプローブ 3 を共焦点レーザー顕微鏡下、HeLa 細的に反応する「反応部位」、ⅱ 細胞毒性の少ない可視光か胞に加えると、経時的な細胞内蛍光強度の上昇を観察した

ら近赤外光を吸収して蛍光を発する「蛍光部位」、ⅲ 標的（図 4 A）。細胞内の蛍光分布の様子から、プローブ 3 がリ物質と反応することで蛍光強度が増強するようなメカニズ

ソソームに局在している可能性が推測されたため、市販のム、の 3 点を満たすことが理想である。標的とする α, β -リソソーム染色試薬（LysoTracker Green DND- 26）で予

不飽和アルデヒド構造を有する分子種の中で、もっとも短め染色した HeLa 細胞にプローブ 3 を加えたところ、リソ

い炭素鎖（C 3）をもつ分子は、アクロレインである。アクソーム染色試薬で染色していない場合と比較して、細胞ロレインの従来の検出・定量法としては、フェニルヒドラ

内でのプローブ 3 の蛍光強度の上昇の仕方が大幅に遅延しジンとの反応で誘導体化した後に、高速液体クロマトグラ

たが、その蛍光分布には良い重なりが観察された（図 4 B）。

フィーで検出する方法がよく知られている他、アニリンまリソソーム内は pH 4 . 5−5 程度の酸性条件であるために、たはフェニレンジアミンを反応基とする蛍光プローブがプローブ 3 はリソソームに局在することで、その蛍光強度報告されている 4 , 5）。しかし、これらの蛍光プローブを用が上昇したと推察される。

いた検出には、強酸あるいは有機溶媒存在下 80−100 ℃の− 80 −

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージング

図４ （A）プローブ 3（終濃度 100 nM）を HeLa 細胞に添加した直後（5 秒）、1 分後、4 分後の微分緩衝像（DIC）および蛍光像（559 nm レーザー励起）（B）HeLa 細胞を LysoTracker Green とプローブ 3 で共染色した後の蛍光像（左から 488 nm レーザー励起、559 nm レーザー励起、それらの重ね合わせ）

加熱が必要なため、生細胞へ直接応用することは非現実的プローブ 1 はアクロレインと反応することで、吸収スペであった。ところが近年、アクロレインが生理的条件下ア

クトルが約 80 nm 長波長シフトした蛍光性のホルミルトリ

リルアジドと反応することが新たに見出され、これを利用

アゾール体を生成することが確認できた一方、プローブ 2した生細胞内でのアクロレインの蛍光観察が報告された 6）。

については、アクロレインとの反応生成物を検出すること

そこで本研究では、上記反応によって、アジド基がホルミができなかった。現在のところ、アリルアジド基を反応部

ルトリアゾールへと変換されることに着目し、その反応前位とするプローブの設計とその細胞応用には 2 点の問題点

後での電子状態の変化が、吸収・蛍光スペクトルの変化にが挙げられる。1 点目は、そのアクロレインとの反応性が連動するようなプローブを創出することが可能であると考不十分である点である。詳細は省略するが、さまざまなフえ、アクロレインとの「反応部位」であるフェニルアジドと、ェニルアジド置換体を用いて、アジド基とアクロレインの生細胞に応用可能な「蛍光部位」であるニトロベンゾオキサ

反応性を検討したところ、電子供与基、電子吸引基のいずゾールまたはシアニン色素を結合した分子（1 , 2）を設計し、れの置換基においても反応性の向上が見られなかった。しアクロレインとの反応前後での吸収・蛍光スペクトルの変たがって、アクロレインを高感度で検出できるプローブを化を測定した。

設計するためには、さらなる検討が必要である。2 点目は、

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プローブ 1、2 のアジド基が、溶媒、光、熱などの影響を応速度は、pH 7 において pH 8 よりも速いことが観察され受け、特定の条件下において容易にアミノ基へと変換された。一般的に、アルコシキアミンとアルデヒドからオキシ

うるという点である。同様の反応はこれまでにも報告されムが生成する反応速度は、pH 4 . 5 付近で最も速くなるこており、光によってアジド基から窒素が放出され、反応性とが知られている 9）。最後にプローブ 3 を HeLa 細胞に応の高いニトレン中間体が生じると考えられており、これを用し、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。ロ

利用した生体分子の光親和性標識法への応用も示唆されてーダミン B は細胞内のミトコンドリアに局在することがよいる

7 , 8）。プローブ 1 においては、アクロレイン反応体（ホく知られている色素だが、共染色の結果、プローブ 3 は極ルミルトリアゾール体）とアミン誘導体の吸収スペクトル

めて効率良くリソソームを染めることが観察された。しかが類似しているため、アクロレイン選択的なイメージング

し、pH が 4 . 5−5 程度であることが知られているリソソー

プローブとしての利用を妨げる要因になりうる。したがっム内では、プローブ 3 はほぼ全てが開環構造（3 open）を形成て、アジド基を用いたアクロレイン検出蛍光プローブをよしていると考えられるため、当初計画していたようなアルり実用化に近づけるためには、アジド基の安定性について

デヒド分子との反応による蛍光強度の増強を期待することさらなる検討と改良が必要である。

は難しい。一方で、プローブ 3 の細胞内分布は明確にはわ

そこで次に、アリルアジドとは異なる「反応部位」によっかっておらず、細胞質やその他の細胞小器官などの中性環て、脂質過酸化反応で生じるさまざまな炭素鎖長を有する

境下にも分布する場合は、酸化ストレス由来のアルデヒド

アルデヒド基を標的とした蛍光プローブの設計を試みた。

分子と反応することで蛍光強度が増強することが期待できアルデヒド基に対する「反応部位」
としては、アルコキシア

る。逆に、プローブ 3 がリソソームに局在している場合は、

ミンとヒドラジンがよく知られており、それぞれ対応する

上述したようにオキシム形成に適した pH であるため、酸

9）オキシムとヒドラゾンを生成する 。これらの「反応部位」

化ストレスを加えた後の細胞溶解液を質量分析することで、を利用したアルデヒド検出試薬は数多く報告されているが、リソソーム選択的な脂質過酸化物の同定が可能になるかも

生細胞の脂質過酸化反応に由来するアルデヒドをイメージしれない。これらの実験については、今後の課題である。

10）。そこで、アルコキシアミノ

以上、本研究課題では、生細胞に応用可能な脂質過酸化

基を「反応部位」とし、細胞イメージングに汎用される蛍光物感受性蛍光プローブの開発を目的とした研究を行った。

色素であるローダミンを「蛍光部位」とする分子（3）を新た本研究で得られた知見をさらに発展させ、生細胞内に生成に設計した。一般的に、ローダミン分子内のキサンテン骨する脂質過酸化物をイメージングすることができれば、さま

格 9 位への求核攻撃は、分子内共役系の切断に伴う吸光ス

ざまな酸化ストレスに伴う肌機能の低下を直接または間接ペクトルの変化及び蛍光の消失をもたらすことが知られて的に推測することが可能になると期待されるとともに、疾いる。アルコキシアミノ基の求核性は溶液中の pH によっ

患や老化の新たなメカニズムの解明にも役立つはずである。

ングした例はほとんどないて大きく影響を受けるが、これまでに報告されているさま
ざまなローダミン系の蛍光プローブの蛍光特性から 3）、3は中性条件下においては、スピロ環化合物（3 closed）として（引用文献）
1） Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R. & Aye, Y.
Chem. Rev. 118, 8798-8888（2018）．

ほぼ無蛍光となることを推測した。平衡状態として一部存在するフリーのアルコキシアミン（3 open）が標的とするアル

2） Luo A. L., Gong, Y. J., Zhang, J., Zhang, C. C., Zhang, X.

デヒド分子と反応してオキシムを形成すると、上記の分子

B. & Tan, W. Talanta, 117, 326-332（2013）．

内環化反応が抑制されるために、蛍光が増強することを期

3） Uno, S. et al. Nat. Chem., 6, 681-689（2014）．

待した。

4） Togashi, M. et al. Org. Lett., 12, 1704-1707（2010）．

実際に、プローブ 3 をさまざまな pH に調製したリン酸

5） Imazato, T. et al. Biomed. Chrom., 2 9, 1 3 0 4-1 3 0 8

緩衝液中に溶解し、吸収・蛍光スペクトルを測定したとこ（2015）．

ろ、予想通り中性・塩基性条件下では吸光度、蛍光強度と6） Pradipta, A. R. et al. ACS Sensors 1, 623-632（2016）．

もに低く抑えられていることが確認できた。また、pH 57） Lord, S. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 9204-9205（2008）．

以下の酸性条件下では吸光度、蛍光強度がほぼ一様に高く

8） Lord, S. J. et al. J. Phys. Chem. B 114, 14157-14167

なることが観察された。したがって、プローブ 3 は pH 7、（2010）．

8 の条件下では、その大部分がスピロ環化合物（3 closed）と9） Kölmel, D. K. & Kook, E. T. Chem. Rev. 1 1 7, 1 0 3 5 810376（2017）．

して存在していることが推測された。ここにアクロレインなどの α, β - 不飽和アルデヒド分子を加えると、期待通り

10）Suchy, M., Lazurko, C., Kirby, A., Dang, T., Liu, G. &アルデヒド分子と反応したオキシム体（開環構造）の形成に

Shuhendler, A. J. Org. Biomol. Chem., 1 7 , 1 8 4 3 - 1 8 5 3

伴う吸光度・蛍光強度の増強が確認できた。また、その反（2019）．

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