皮膚の老化に伴う エ ラスチン遺伝子発現の動態
多Tropoelastin(65kd)

was反応義塾大学医学部

島新吾

found to be converted to a lower molecular weightfragment(45kd) in the cultured medium in chick smooth muscle cell culture. The conversion was
found to be time-dependent by pulse-chase experiment using cell culture system. Thisconfirmed
by chase experimentin test tube.
These results indicate that theof tropoelastm
was mediatedby a protease present m the cultured medium
In fact the conversion was specifically inhibited by ImM EDTA and not by NEM andPMSF. The processing of tropoelastin is of vital importance for understanding trop0-was

alsoprocessing

elastmmetabolisml 。緒を行った。

言

老化に伴う皮膚の変化のうち5。 nIle干( 老人性弾力線 維症) は老人の日光 曝露 部の皮膚 真受精後20日目の鶏胚動脈より酵素消化決 ( コラ皮 表層に ェ ラスチン 線維が蓄積する状態で，長期の紫外線照射により エ ラスチン 線維 に何らかの 異常が生じるために発生すると考えられている。 現ゲナーゼ，エラスターゼ ) を用いて平滑筋細胞を単離した。以下の実験には初代培養細胞のみを用いた。細胞が confluentｨ 状態になるまで 10%牛胎児血清添加 DulbeCCo'5 口 Od f ed EagL
medium(DMEM) にて培養した。 0 5%牛脂月血清添加DMEM にて 48時間培養し， その最終 6時間をバリン 不含 DMEM 中に ['H) バリン (60Cけ荏 まで， senile elaStoSL 中の エ ラスチン架橋( デスモシン， イソ ヂ スモシン ) 量 が増加していること。

ミエ ラスチン発現量 に変化がないことがすで日mol) で タンパクを標識した。

ェ ラスニン (10OOCツ mmol)/ 皿口 01)

けた エ ラスチン ペプチド がさらにどのよう 低代謝をうけるのか，不明である。 我 みは エ ラスチンの，，口 H コグルコサミン (5OCi(3H) マンノース(3OCM 口 m01) で 標識した。培地中のタンパクはプロテ アーゼインヒビ

分解物が組織中に比較的安定に存 往し ，かっその後架橋形成にも関与し より不安定な エ ラスチン線維を形成するという仮定に基づき，まず エラスター (ImMEDTAPMSF)

中で 30%硫安で沈澱させ， 4〜 15% が adIenbSDS

POlyaCryl ―，NEM，

amidegel electrophosesis(SDS-PAGE)-Sr^r

チン分解物の同走，分解メカニズムについて検討
gene expression

pulSe ― Cka5e の実験では パリンで 標識後 cold バリン (100は M) をし 川え chase した。バリン 以舛では TS コメチオターゼが知られているのみである。また分解をうElastin

え・に知られている。この事実は局所の エ ラスチン 合成 活性には異常は認められず，合成後の エ ラスチ
ンタンパクの修飾，あるいは分解に異常が存 荏 していることを示唆する。 エ ラスチンの分解過程はいまだ不明の点が多く主に白血球由来の

実 験

2eIaSboS S

オートラジオグラフィーを行った。必要のin the aged skin

Shmgo Tajima-59-場

合ヂ ンシトメーターで各タンパクの相対量 を比較生じる可能性が考えられた。タンパクをブロットした。

しエ ラスチン抗体で染色した結果

3 ・結果

コラーゲンの他に分子 量 65kd のトロ ポ エラスチン分子を活発に合成していることを報告した。

エラスチンはすでに 糖鎖を有さないこと， メチオ
ニン 残 基を有さないこと， シスチン 残 基を C 末端(Fig lB ，矢印) にr42残基有することがわかって い・5kd いずれのタンパクも，，マン

ミン，ース，

干でに報告されている。アミノ 酸酊列では2 所の酊 列が spliceout される (F g lB 大文字) ことが報告されているが， いずれの配列の 鎖 長もたかだか62残基であり ( 約 6 2kd)65kdから 45kd への変

グル コサ

換は alternatesplicing の産物による可能性は低いと思われた。したがって 45kdペプチドは 65kd
ト口干エラスチンが合成されてから分解をうけて坐 じた産物であると考えられた。
45kd タンパクが 65k トロポエラスチンの分解産物であることを検討するために PulSe-ChaSe
巳

メチオニンのとりこみが認められず (f 唱 lA;lanelA)

2 田 また シ スチンのとり，・，ト

65kd

mult Pl(Plgalternatesplicing を認めることがす士

スチン由来のぺ プチドであることを各種標識 RIおよび エ ラスチン抗体を用いて検討した。
日米。

可能性が示唆された。― 方 エラスチン 日RNA は；

今回の実験でトロポエラスチンより低分子のタンパク (45kd)を認め， このタンパクがトロポエラる，ずれの ノパク も特異的に検出された。以上の結果 より 45kd タンパクは 65kd タンパクに由来する

すでに 我 みは培養平滑筋細腕が フ イプロ ネ クチン，65kd 45kd いB)l，こみが認められた (Fig.lA;lane4)。このことは45kd ペプチドは C 末端が切断されたものでなくｨ7N 末端から 約 2Okd
川ラグメントが切断されて口1 GGyFGAirefloVPGWFPPoAGVGGLCAG1.GAGLGAGGKPlltPGVSCLGG
5051 LGPLGLQPCAGVGGLGAGLCAFE'tAAFPCAAailAA1.KAAAIIAGAG1.GGiGIM)
fid
101 GIGGLGGVGGVGVPCGLGVPGVVOPGVGAAGKPPKVPCAGlPGAFrCGGk
151 LPGAGIBFPGVGVIPGVPTOTGIKAHGPGBGAFAC1PGLG6FGGMPGVP?U0251

AKAAAltYGAGVLPCAGGIPtVGGVVPGVGVVPGAGVGGi'A*AAAA*ﾈ!AAA 3Rn351

AAAKAARYGAGVPGVGVPGVGlGGVPGV1-CVToVfGVPGVPGVPGVl'CVPCTPGTClTCTCTfG(irPGﾈﾈ CTPGTCTPCTCTPG

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Flg 2<OU

PCVPGVPGVVFGVGVGGPAAAAAAKAAAKAAAPGAGKVPGVliH'GAVi'2), 24(lane3), 48(lane4)S^chaseLfco，'.(HiBほ Aの 実験を行った (Fig 2) 。この結果 chase の時間経過ととも f@45kdの (65kd タンパクに対する割合が増如していくことが示され 45kdが'65kdの分解により生じる可能性が考えられた。以上の結果 をさらに証明するた 66f@65kdタンパクを DEAE セルロースカラ ムを用いて partlally に精製し，同様の実験を行った。その結果 chase ｨ 時間とともに45kd の665kdに対する割合が増加していくこと

fi7-ifl・

各種 R@にて標識した培地中のタンパクのSDSpAGE
後 オートラジオグラフィー
FH] ダルコサミン (l8ne l)[ H] マンノース(l8n02)[LS] メチオニン(l8ne3)[3sS] シ スチン(lane のにより標識した。
韮標識塔地をトロポエラスチンモノクロー
ナル抗体にて染色L8ne 日
CDNA より推定される二口トリエラスチンの全 アミノ 酸 配列 ( 太線 は引 め rn8te
5p@旧 ng をうける配列。矢印はC 末端に存荏する シ スチン残基)。

，・lBｨ 結果を デノシ"
トメーターで定量した。

H' li(;<( ･ (;liUtGr.VCLHpulSe ― Ch8se 実験。培養平滑窃細胞を['H]バリン で6時間標識し 0(@8n6 l)
l2(l8n8，，。

が判明した (Fig 田、。

45kd が分解過程で生じるのに焙 地中に存 往するプロテ アーゼ が関与している

60 -

皮卜 の老化に伴うエ ラスチン 近 伝子 発窺の 劫態アーゼ によると考えられた。

A)

4 ・考察

今回の実験結果 より エ ラスチン分子は 65kdから 45kdへと低分子化をおこし，この分解は 比較的すみやかに培地中で生じる。回分解は 甜random に生じる (D ではなく， おそらく N 末端

ｨから約2Okdの 7 ラ グメントが切断される。 (3)45Flg.3kd の分解物 は比較的安定に存在している。の この分解はおそらく培地中に存 往 する金属プロテ

partl l@y pur@f 卜 d tropo 川 85t@n を平滑 筋細胞培地に加え・O(Lnel)
6(lan62) ，は(lane3) 24(l8ne4) 時間ch8se した。 B はA 結果を チ ンシトメータで定呈した。

アーゼにより生じることが示唆された。現在エラ日，

ｨ

スチンを分解する酵素として エ ラスターゼがよく，

矧 られている。この酵素は数種類のプロテ65kd と 445kdの割合を検討した (Fig 4)

ず，る 。代表的な PMN エ ラスターゼはセリンプロテアーゼに属し エ ラスチン以外に 皿型 コラーゲン を応・その結果 NEM，APMSF。

では分解は抑制されImM 拝往下においてのみ抑制されEDTA分解するなどの 点 より本実験で示唆されたプロテ

た。このことは分解に関与する酵素は金属プロテA)

アーゼ とは性状が異なると考えられる。マク口ファージエラスターゼは分泌型の金属プロテ アーB)

ゼ であるが " ，本実験にマクロファー ジ が混入し0I

ア ーゼの集合体であり，膵臓由来， 多 形骸 (PMN) 白血球由来，マクロファージ由来のものが 矧 られてい可能性を検討するために培地を試験管内で各種 プ
口 テア ーゼインヒビ ター 存往下で incubate してている可能性は低い。したがって本実験の金属プ

口 テア ーゼ は平滑筋細胞により分泌されるものと考えられた。

本実験で最も興味深い点は 45kdタンパクが安定であり， tntact なエ ラスチンが形 威 されるにあたり 45kd同士あるいは 65kd と 445kd
タンパク

NEMAPMSF同士が架橋を形成する可能性がある点である。 今後不溶性エラスチンが沈着する細胞 画 分について

EDTA

Fig.4A['H]ーゼバリン
存荘下で試験管内で反応させた結標識した培地を各種プロテ栗ア

45kdタンパクの代謝という点から検討する予定

での オートラジオグラフィー，l8ne l ; 培地中のタンパク。 l8ne 2 ; 無添 如 で反応。
l8ne3 4 ; N三 M各セ0.5 l 山 M存往下で反lane5,6;ApMSF@8ne78;EDA 各各な@@@@70.l
0 l lmM@ M存
文 献，，在下。
。

左下。

である。

Bは A，丁・，，干l ) Bandaｨ 結果を チンシトメータで定呈した。

-61，

M J andWerb・・589-605(1981).

-，

2 : BioChem・・J t93・，