ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節
北海道公立大学法人札幌医科大学

白土明子

Some nanomaterials in cosmetic products act as UV-filters for skin. It is known, however, that some types ofnanomaterials can induce skin inflammation. The inflammation is thought to be due to the harmfulness of the nanomaterials
themselves. On the contrary, we considered another hypothesis on the action of nanomaterials in the skin damages. Thatis, nanomaterials would alter gene expression of indigenous bacteria in skin and they would induce inflammation indirectly.
We investigated influence of some nanomaterials on the action of membrane receptors of Escherichia coli, and found levelof two receptors activities were reduced by treatment of two nanomaterials ZnO and TiO 2 . Lack of the receptors in E.
coli altered bacterial virulence to model host Drosophila. These results suggested that some nanomaterials have roles forregulation of bacterial virulence through change the activity of the membrane receptors.

１．緒の実体や制御機構の知見の蓄積が多い。そのため，活性変言化する情報経路がわかると，細菌の性質変化をある程度予近年，ナノマテリアルが利用されている化粧品が増えて測することも可能となる。また，細菌の情報経路は細菌種おり，中でも，日焼け止めやファウンデーションなどの，を超えて共通する種類も多く，各種のモデル細菌系で得ら皮膚に直接に触れる面積の広い種類へ配合される例もある。

れた成果は，他の細菌にも当てはまる可能性が高い。これそのため，ナノマテリアルの毒性評価は化粧品の安全性にらのことから，ナノマテリアルが細菌の情報経路に与える重要な要素とされてきている。

作用を評価した。

近年，毒性が低いとされる細菌が，皮膚や傷に付着した

２．方際に皮膚炎や傷害，強い毒性を与える場合のあることが報告されるようになった。細菌には環境を感知する仕組みが

２．
１．材法

料

あり，環境中の化学物質や宿主内の物質の認識により，遺グラム陰性細菌のうち，遺伝子発現制御機構がもっとも伝子発現を変化させて環境変化に適応して生存生育する。

よく知られている大腸菌の実験株の BW 25113 株を材料と皮膚表面には常在細菌を含め多くの細菌が存在しており，し，また，これを親株とする遺伝子欠損菌株を，国立遺伝ナノマテリアルが細菌の生理状態を変化させることで，皮学研究所ナショナルリソースセンターより入手して用いた。

膚への炎症や傷害の状態に影響を与えている可能性が提唱

大腸菌の環境感知を行う情報経路は二成分制御系と呼ばれ，されているが1 - 3）

，直接の作用はまだ十分に調べられては細胞膜受容体と転写調節因子の 2 種類のタンパク質の組み合わせで構成され，約 50 の因子を持つ（Fig. 1 前が受容体、こなかった。
本研究では，ナノマテリアルによる細菌の遺伝子発現変後が転写調節因子の名前を示す）。それぞれの経路により動と生理的性質の変化，および宿主組織への影響を解析す正に制御される遺伝子を選び，これらの転写プロモーターることとした。細菌の細胞膜には環境物質を認識する膜受配列の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェ容体があり，これが活性化すると特定の転写調節因子の活ラーゼを発現するプラスミドpBR322 を準備し，それぞれを性状態を変化させ，支配下遺伝子群の発現を正または負に保持させた大腸菌株を用意した（Fig. 2）4）。ナノマテリアルと調節する。また，特定の情報経路はストレス応答，輸送体群，して，サンスクリーン剤に利用される MZ- 500（ZnO）およ

呼吸関連，代謝などの，ひとまとまりの働きを発揮する遺伝子群を一括して制御する 4）。特に，遺伝子発現制御系の解析が進んでいる遺伝学モデル細菌では，制御下遺伝子群

Role for nanomaterials of bacterial gene
expression and infectious state of hostorganisms

Akiko Shiratsuchi
Fig. 1

Sapporo Medical University− 94 −

ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節

在で活性化程度の高い二成分制御系を調べた。そのために，それぞれの受容体経路で活性化することの知られる遺伝子の転写プロモーター制御下に蛍光タンパク質を発現するプラスミドを構築し，これを大腸菌に保持させたライブラリーを準備した。それぞれのプラスミド保持菌株をモデル宿主ショウジョウバエの体腹に注入し，蛍光強度を画像解析した。その結果，ストレス応答性遺伝子を制御する EnvZ-OmpR と CpxA-CpxR, 代謝に関連する PhoBYuhU/YpdA, 呼吸に関連する EnvS-EvgA と PhoQ-PhoPを含む数種類の経路がが高い活性を示した。このうち，細Fig. 2菌の毒性や免疫耐性を念頭におき，ストレス応答に関連すび TiO 2 を用いた。 宿 主との接 触を模 倣するために，宿 主る２種類の経路に着目した。EnvZ-OmpR, CpxA-CpxR血液および血清を用いた。また，個体レベルの実験では，ヒのそれぞれで正に制御される遺伝子を選びその転写プロモトと同じ自然 免 疫 機 構を持つキイロショウジョウバエの野 生ーター活性を調べると，宿主の血液成分により活性化する

5 , 6）ことがわかった（未発表データ）。つづいて，受容体が体液型として Oregon R 系統（Kyorin Flyより供与）を用いた。

により活性化していることを，リン酸化を指標として調べ

２．
２．遺伝子転写プロモーター活性の測定た。そのために，当該受容体を FLAG との融合タンパク

大腸菌株は LB 液体培地で培養し，ここに様々な濃度の質として発現させる大腸菌株を準備し，ここに体液を作用ナノマテリアルを加えた試料も作成する。培養時間経過にさせたのち，抽出液を調製して Phos-tag-SDS-PAGE によ伴う 600 nm の吸光度を測定して，細菌増殖に影響のないり分離し，抗 FLAG 抗体を用いたウエスタンブロットを濃度を設定した。定常期まで培養した大腸菌は，バッファ行った。Phos-tag はリン酸基を捕獲して SDS-PAGE によーで一度すすいでから，測定用の新たなバッファーに懸濁る易動度を小さくする。大腸菌抽出液からは二本のバンドした一定濃度になるよう希釈してからマルチウエブプレーが得られ，易動度の大きいシグナルを非リン酸化体，小さトに分注し，ここに試料群を加えて共培養した。つづいて，いシグナルをリン酸化体として評価した。体液が存在する

GFP の蛍光強度，もしくは，ルシフェラーゼの酵素活性を，と，易動度の小さいシグナルの割合が大きくなったことか

プレートリーダーを用いて測定した。それぞれをレポータ

ら，EnvZ のリン酸化体の割合が増え，活性化程度が亢進4）ーとして，測定値を転写プロモーター活性の指標とした 。

したと判断した（Fig. 3）。この結果は，体液から血球成分一方，細菌のそれぞれの受容体経路の下流には，当該経路を除いた液性成分だけでも，さらにこれを 100 ˚C で 5 分間でのみ，かつ正の制御を受ける遺伝子群が存在する。その処理した成分でもこの性質が保持された（Fig. 4）。これらような遺伝子と内部コントロールとして DNA ポリメラー
ゼアルファサブユニットの mRNA レベルを解析して，受容体活性化の mRNA レベルでの指標とした 6）。

２．
３．モデル宿主を用いた in vivo 感染系での毒性解析
キイロショウジョウバエ成虫オスを炭酸ガスで麻酔し，ハエの腹に窒素ガス制御性マイクロインジェクターに接続したキャピラリーを用いて，バッファーに懸濁した一定数の大腸菌，もしくはバッファーのみを注入した。覚醒後のハエは，餌を入れたバイアルに移し，29 ℃で飼育した。
飼育時間に伴う生存率を調べて毒性の指標とした 7 , 8）。また，ハエを PBS 中でホモジナイズして粗抽出液を調製し，LB 寒天培地に塗布して得られたコロニーを計測して，コロニー形成菌数を生菌の指標とした 6）。

３．結果

３．
１．宿主遭遇時の大腸菌膜受容体経路活性の変化
ナノマテリアルの作用を知る前提として，宿主体液の存− 95 −Fig. 3

コスメトロジー研究報告 Vol.28, 2020

Fig. 4のことから，体液中の加熱に耐性の液性成分の中に，二成分制御系の膜受容体 EnvZ を活性化する因子が存在するとFig. 5

考えられた。CpxA-CpxR に関しても同様の解析が進行し親菌株 BW 25113 株と比較して，多くのハエを殺すとわかている。

った（Fig. 5）。一方，cpxA-cpxR 遺伝子欠損菌株は親菌株

３．２．大腸菌の生存増殖に影響しないナノマテリアル
処置条件の設定

BW 25113 株と比較して，ハエの生存率が低い傾向があり，LB 液体培地に様々な濃度のナノマテリアル ZnO またはかった（未発表）。これらのことより，EnvZ-OmpR は宿主TiO 2 を添加し，大腸菌 BW 25113 株を 37 ℃で空気中でしへの毒性に抑制的に働き，CpxA-CpxR は宿主の免疫へ抵んとう培養し，時間経過に伴う 600 nm における吸光度を抗に働くと考えられた。今回解析に用いたナノマテリアル定常期に達するまで測定した。その結果，試料の吸光度はにより活性変動する受容体経路の中に，宿主への毒性を調培養時間の経過に伴って増加し，5％（w/v）
以内の濃度では，節するものが見出された。

また，マクロファージにより早く貪食殺菌されることがわ

両者ともにコントロールとした PBS との違いはなかった。

４．考察および総括

また，大腸菌に ZnO または TiO 2 を添加して暴露させ，LB寒天培地でのコロニー形成菌数を調べると薬剤なしとの顕大腸菌は体液成分を感知して情報経路の活性を変化させ著な違いはなかった。これより，ZnO および TiO 2 は，5て遺伝子発現パターンを変えることが示され，宿主への毒％（w/v）で大腸菌の生存増殖を阻害しないと判断し，今後性や免疫感受性を変化させる。そして，ZnO および TiO 2 は，の実験ではこの濃度を用いて解析を行った。

これらの経路の働きを変化させる作用を有することが判明した。皮膚表面には多くの常在細菌を含む細菌が付着して３．３．ナノマテリアルによる大腸菌情報経路活性への作用おり，サンスクリーン剤に含まれるナノマテリアルは，細ここまでに得られた知見を元に，大腸菌液に ZnO およる作用を持ち，これが細菌の性質を変化させる可能性があび TiO 2 を添加して EnvZ-OmpR 経路への働きを調べた。

る。今後は，例えば，宿主への傷害に関連する細菌遺伝子宿主導入時の当該経路下流遺伝子の転写プロモーターの活の働きを抑える作用など，これまでに見出されたこなかっ性は，ナノマテリアルの存在により抑制傾向を示し，コた，ナノマテリアルの働きが見出される可能性がある。

菌の情報経路の活性変化を通じて，遺伝子発現を変化させントロール群と比較して TiO 2 添加群では 91 ％，ZnO では72 ％であり（n= 3，有意差あり）その働きは ZnO の方が大（引用文献）きかった。このことから，ナノマテリアルは EnvZ-OmpR1） Kinoshita, R., et al. Yakugaku Zassi, 132, 319-324（2012）

経路を抑制し，この経路による細菌遺伝子発現の変化を通2） Lee, N-Y., et al. Front. Pharmacol., 10, 1153（2019）

じ宿主への作用を変化させる可能性がある。

3） Yallet-Regi, M., et al. Int. J. Mol. Sci., 20, 3806（2019）4） Pukklay, P., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.

３．
４．大腸菌膜受容体経路の宿主毒性への作用

438, 306-311（2013）

次に，宿主体液で活性化する EnvZ-OmpR および CpxA-5） Nainu, F., et al. Journal of Center of MedicalCpxR の宿主感染時の働きを調べるために，キイロショウ

Education, Sappro Medical University 10, 21-32（2019）

ジョウバエ Oregon R 系統の成虫オスの腹に envZ-ompR6） Hashimoto, Y., et al. J. Immunol., 183, 7451-7450（2009）

遺伝子，cpxA-cpxR 遺伝子のそれぞれを欠損した大腸菌

7） Shiratsuchi, A., et al. J. Immunol., 192, 666-675（2014）

株を注入した。その結果，envZ-ompR 遺伝子欠損菌株は

8） Shiratsuchi, A., et al. J. Immunol., 197, 1298-1307（2016）− 96 −