ごあいさつ

公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団
理事長

小林

一俊

本財団は、1990 年に株式会社コーセーの創業者小林孝三郎により設立され、以来コスメトロジー（化粧品科学）の確立と発展をめざして研究助成活動を展開
してまいりました。
このたび、小林保清前理事長の後任として、当財団の理事長に就任いたしました。当財団設立の理念を引き継ぎながら、さらに活動を充実させていく所存でございますので、なにとぞ一層のご支援を賜りますようお願い申し上げます。
化粧品科学は、医学、生命科学、化学、心理学、社会学など幅広い学問領域を基盤に成り立っています。これら様々な専門分野の研究者が一堂に集って化粧品分野の研究テーマに取り組むことで、今日のコスメトロジーが体系づけられてきたといえます。
本財団が助成した研究テーマも、化粧品の新素材や物性評価など工学的なテーマから、健康な皮膚、美容のための皮膚科学や安全性の研究、さらには化粧心理や化粧文化といった化粧行為を対象にしたものなど多岐にわたります。
今回の研究報告書は、2019 年度から 2020 年度に助成を受けられた研究者 37
名の研究報告を収載しております。また、昨年秋の第 32 回表彰・贈呈式でご講演いただいた黒田玲子中部大学特任教授・東京大学名誉教授の講演録を掲載しています。
皆様には、この研究報告書 COSMETOLOGY 誌をご高覧いただきまして、本誌をコスメトロジーの更なる発展に向けてご活用いただければ幸いです。
引き続き、本財団は、コスメトロジー分野の独創的で発展性ある研究テーマを積極的に助成してまいります。今後とも皆様の温かいご理解とご協力をお願い申し上げます。
令和 4 年 9 月

目次■ごあいさつ
■記念講演
・第 32 回表彰・贈呈式記念講演「科学の醍醐味─左右性から見る自然界の不思議」････････････････････････････････････････････････ 3
中部大学先端研究センター特任教授、東京大学名誉教授 黒田 玲子■コーセーコスメトロジー奨励賞
・2021年度 コーセーコスメトロジー奨励賞･･･････････････････････････････････････････････････････ 19
名城大学理工学部教授 景山 伯春■コスメトロジー研究助成報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・･カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価･････････････････････････････ 24
澍
東北大学多元物質科学研究所 殷・･環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動･････････････････････ 32
東京大学大学院新領域創成科学研究科物質系専攻 上沼駿太郎
・･皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析･････････････････････････････････････････ 40
島根大学医学部医学科免疫学講座 小谷 仁司
・･強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発･････････････････････････････････････････ 48
北海道大学大学院工学研究院 佐藤 康治
・･楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用･･･････････････････････････････････････････････ 55
地方独立行政法人大阪産業技術研究所 中橋 明子
・･全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測･･･････････････････････････････････････ 62
東北大学大学院薬学研究科 中林 孝和
・･リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム･･･････････････････････････････ 68
国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門 中村 真紀
・･積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発･･･････････････････････････ 73
慶應義塾大学理工学部 福井 有香
・･アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析･･････････････････････････ 78
広島大学大学院医系科学研究科 松浪 勝義
・･ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立･･･ 84
奈良女子大学 矢田 詩歩
・･放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討････････････････････････････ 90
公益財団法人微生物化学研究会微生物化学研究所 和田 俊一
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・･ヒト iPS 細胞由来神経堤細胞による革新的線維芽制御方法の開発･････････････････････････････････ 100
慶應義塾大学眼科学教室 稲垣 絵海・･毛染め・化粧品アレルギー患者の原因検索における好塩基球活性化試験の有用性の検討と染毛剤アレルギー患者における痒疹反応の病態解析････････････････････････････････････････････ 103
東京医科歯科大学大学院皮膚科学分野 宇賀神つかさ
・･ヒトの視覚と嗅覚を制御する新しい抽出分離素材の開発････････････････････････････････････････ 105
東北大学大学院環境科学研究科先端環境創成学専攻
環境創成計画学講座環境分子化学分野 大田 昌樹− II −

・･ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発･･･････････････････････････ 109
清長岡技術科学大学技術科学イノベーション専攻 大沼・･皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発････････････････････････････････････ 117
順天堂大学大学院医学研究科アトピー疾患研究センター 北浦 次郎
・･イオン導入時の微弱電流による皮膚への安全性の厳密な検証と美容効果の検討････････････････････ 122
徳島大学大学院医歯薬学研究部 小暮 健太朗
・･乳酸菌がもつ抗酸化作用の分子基盤解明･･･････････････････････････････････････････････････････ 127
筑波大学医学医療系 小林 麻己人
・･概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析･･････････････････････････････････････････････ 131
秋田大学大学院医学系研究科 齋藤 康太
・･網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞 XVII 型コラーゲン発現制御機構の解析･･･････････････････ 136
渉
北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室 西江・･亜鉛シグナルはどのように表皮バリア機能を制御しているのか？
─ ZIP10 を標的とするバリア機能制御物質の探索─････････････････････････････････････････････ 139
徳島文理大学薬学部病態分子薬理学研究室 深田 俊幸
・･無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立と in vivo 薬効評価系の構築･ ･･････････････････ 142
明治薬科大学微生物学研究室 松本 靖彦
・･X 線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構の解明･･････････････････････････ 147
安田女子大学薬学部薬学科 的場 康幸
・･最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発････････････････････････････ 151
熊本大学大学院生命科学研究部老化・健康長寿学講座 三浦 恭子
・･シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発････････････････････････････････････ 156彰
静岡県立大学大学院薬学研究院生化学講座 南・･先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発･･････････････････････････････････ 164
大阪大学微生物病研究所 村上 良子
・･皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析･･････････････････････････････････ 170
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科分子細胞毒性研究室 矢嶋 伊知朗
・･非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析

─皮膚は色を識別できるのか？─･･････････････････ 176
日本薬科大学薬学部生命科学薬学分野 山本 博之

Ⅲ．精神、文化に関する分野
・･がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証･･････････････････････････････････ 182
聖路加国際大学成人看護・がん看護学臨床准教授 がん看護専門看護師 逢阪 美里
・･サボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析････････････････････････････････････････････ 190
星薬科大学 柴藤 淳子
・･後期高齢者に頻発するスキン - テアの予測方法の考案･･･････････････････････････････････････････ 195
藤田医科大学研究推進本部社会実装看護創成研究センター 臺 美佐子
・･顔の動画像解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法の開発･･････････････････････････ 201明福島大学共生システム理工学類 田中・･統計的顔画像解析によるメイクアップ効果の数理モデル化･･････････････････････････････････････ 206
ウィーン大学心理学部，日本学術振興会，早稲田大学理工学術院総合研究所 中村 航洋
・･木の香りによる作業効率への影響解析･････････････････････････････････････････････････････････ 211
国立研究開発法人森林研究・整備機構森林総合研究所複合材料研究領域 松原 恵理− III −

・･匠の技の定量化 ─ Deep Learning による先駆的顎顔面補綴支援システムの開発･･･････････････････ 217
広島大学大学院医系科学研究科医療システム工学

峯裕一

・･分光イメージング装置を用いた天然歯のグラデーションの数理解析･･････････････････････････････ 221
大阪大学歯学部附属病院 若林 一道
Ⅳ．コスメトロジー研究助成を受けて･･････････････････････････････････････････････････････････････ 228■学術集会支援助成、国際交流助成 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････ 249■付

録

事業報告書 ･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 259
2021 年度

表彰および助成を受けられた方々 ･･･････････････････････････････････････････････････････ 261

役員一覧 ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 264− IV −

●第 32 回表彰・贈呈式記念講演
●

黒田 玲子

第 32 回表彰・贈呈式

記念講演（株式会社コーセー 本社・2021年11月25日）

科学の醍醐味─左右性から見る自然界の不思議
中部大学先端研究センター特任教授、東京大学名誉教授

黒田玲子

くろだ・れいこキラリティ、化学構造の左右性に着目し、自然界に広く現れる左右非対称性を明らかにする研究を進め、この分野での世界的リーダ
ーとして知られている。
1993 年猿橋賞、2009 年文部科学大臣表彰、2013 年にはロレアル - ユネスコ化学賞をはじめ多数の表彰を受賞。国内外の科学技術政策や環境問題への取り組みにも貢献し、永年にわたり政府の審議会や国際科学会議（ICSU）副会長など多くの公職を歴任されています。
世界科学アカデミー TWAS フェロー、スウェーデン王立アカデミー会員、また 2021 年６月にイギリスで開かれた G7 サミットで男女共同参画諮問委員会のメンバーに選ばれるなど、科学と社会との関係づくりや男女共同参画社会の実現に向けて、日本を代表して国際的にご活躍されています。

Ⅰ．はじめに皆さんこんにちは。今日は「科学の醍醐味──左右性か
ら見る自然界の不思議」という題名でお話をさせていただ
きます。ここに変わった絵を描いています（Fig. 1）。中央に巻貝です。私が扱っているヨーロッパモノアラガイ（Lymnaea stagnalis）と、左上がその４細胞期の胚です。
その下にアミノ酸が描いてあって、中央下にあるのがパス
ツールの酒石酸ナトリウムアンモニウム塩の結晶模型です。
また、分光装置があります。これは私が開発した固体状態
でのキラリティも測定できる装置で、2 つ角が出ています
が、光電子増倍管を 2 台搭載しているすごく変わった装置です。特許も取っています。化学の分野では固体状態におけるキラリティの化学を開拓しています。生物の分野ではろな催しが行われました。たとえば、Victoria and Albert

動物の体の左右性決定のメカニズムの解明に挑戦していまMuseum というロンドンのミュージアムは「Curiouser andす。両分野の研究を行っています。今日は、駆け足で左右Curiouser !」──これは『不思議の国のアリス』に出てくる性をめぐる多様なお話をいたします。

言葉なのですが ──という展示を今年いっぱい行っています。残念ながらとても行けません。それから The Lewis

Ⅰ -1．
『鏡の国のアリス』

Carroll Society という協会があって、そこが学会誌を出し

まずは『鏡の国のアリス』
から始めます。高山宏訳からのています。その 35・36 号を合体した 150 周年記念特集号

抜粋です。

がおそらく今週に発刊されると思います。私もひょんなこ「さあキティ、鏡のおうちのことをお話してあげますよ。

とから執筆を依頼され、今日皆さんにお話しする鏡の国のまずね、鏡の向こうにお部屋が見えるでしょう。こちらの化学と生物について書きました。普通は文学関係の論文、客間とまるで同じお部屋だけど、家具がみんなあべこべだ

エッセイがほとんどで、ルイス・キャロルが数学者であっわね。……うちの本そっくりな本もあるけど、字があべこたことから数学関係のものもたまにありますが、どんな本べね。……鏡の国で暮らすのはどうキティ？

になって出版されるのか楽しみにしています。

あっちでミ

鏡の国のミルクってきっとおい

ところで、鏡の国では何が違うのでしょうか？「家具やしくないわよ。……通り抜けて鏡のおうちへ出られるとい文字があべこべみたい、ミルクはきっとおいしくない」といわね。あらあら、本当に鏡がもやみたいになっていくわ。

アリスはいっていましたけれど。それに、私の講演のタ

ルク、もらえるかしら？

次の瞬間アリスは、鏡を通り抜けていて、軽々と鏡のおイトルにある「左右性」って何なのでしょうか？

私の講

演には鏡像と実像、左右非対称、不斉、キラリティなどい部屋に飛び降りていました。
」
さてこの本の原題は『Through the Looking Glass andろいろな言葉が出てきますが、これらは何なのでしょうか。

what Alice found there』というものです。ルイス・キャ

キラリティはマクロなレベルにもミクロなレベルにも、つロルのこの本は 1871 年 12 月 27 日に初版が発刊されましまり分子（素粒子の場合はパリティということになります

た。つまり今年は 150 周年記念なのです。そこで、いろいが）にも現れてきます。でも、皆さんはこんな質問をされ−3−

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

るかもしれません。「右と左の違いなんてどうでもいいのに。なぜ重要なの？」って。今日の聴衆の皆様はレベルが高すぎて、そんなことを訊く人はいらっしゃらないかもしれませんが、
そんな問いに答えるために、「靴と靴下の原理」
なんて変なものをつくってしまいました。あとでご紹介します。

Ⅰ- 2．キラル、キラリティとは？名づけ親は誰？
さ て、 キ ラ リ テ ィ（ キ ラ ル ） と は 何 で し ょ う か？
「KOSE」という文字を鏡に映します。こんな文字になります。KOSÉ 鏡に映してみると ÉSOK。O だけ普通ですけれど、
あとは鏡文字ですね。つまり、鏡に映して変わるものと変
わらないものがあることに気がつきます。キラリティは 3の一帯はケルビン公園と呼ばれています。ですから Lord

次元の世界で定義されることなので、ちょっと 3 次元の世

Kelvin ではなく Lord Thomson となっていたら、絶対温度界に行ってみましょう。
鏡像と実像が別のものをキラル（カは T で書いたかもしれません。

イラル・Chiral）といいます。たとえば手とか足です。右手を鏡に映すと左手です。つまり鏡像と実像はスーパーイ

Ⅰ- 3．水晶にもキラリティがある

ンポーズできない（重ねられない）
別のものです。足も靴も、結晶にもキラリティがあります。1812 年、哲学者のア

そして分子にも、もちろんあります。例えば、ほとんどのラゴが水晶には右水晶と左水晶があるということを、偏光

アミノ酸は鏡に映すと別のものになります。分子のキラル

面の回転方向から見つけました（Fig. 2）。このため、キラな性質を不斉といいます。そして分子の構造の不斉を表す

リティを光学活性といういい方をすることがあります。水のに、
ラテン語の右、左を表す言葉
（Dextro, Levo）（、Rectus,

晶には分子はありません。Si と O 原子からできているのでSinistral）の頭文字をとった D, L あるいは R, S を用います。

すが、その並び方が螺旋状になっていて、右型と左型があ電磁波にもキラルな性質をもつものがありますが、キラルるのです。だいぶん前のことですが、「東大寺のすべて」とな分子との相互作用の結果、電磁波の偏光面が回転する方いう大展覧会が奈良国立博物館でありました。2002 年で向を使って、分子の右型・左型を
（＋）
・
（−）
で表すこともす。これは東大寺の廬舎那仏開眼 1250 周年を記念したもあります。

のでした。これに行ってきましたが、このとき不空羂索観

鏡像と実像が同じものをアキラル（achiral）といいます

ふ くうけんさくかんのん りゅう ぞう

音 立 像が一般公開されていました。この像の合掌する手が、もちろん、この例もたくさんあります。靴下、動物のの間に水晶が入っています。でもこれは後からつけ加えら

外観、分子、電磁波など、こちらのほうが多いと思います。

れたという説もあります。それから観音様の眉間にある白じゃあキラリティ（chirality）の語源は何なのでしょ毫ですね。これが水晶だといわれています。この観音像でうか？

誰が名づけたのでしょうか？

これは古代ギリ一番有名なのは宝冠です。この非破壊分析が行われ、6 割

シャ語の cheir という言葉からきていて、これは手を意が奈良時代につくられた鉛ガラスだったけれど、3 割が弥味します。例えば英語で手相観のことをカイロマンシー

生古墳時代におそらく韓国から輸入された貴重なアルカリ（chiromancy）といいます。では誰が決めたの？

といい

ガラス、残り 1 割が翡翠や水晶、琥珀だったとわかり、大ますと、ウイリアム・トムソンが 1884 年の講演で「鏡像きなニュースとなりました。これを見て私は、この観音様と実像がスーパーインポーズされないものをキラルと言おに使われている水晶は、右水晶かな、左水晶かな、何で調う」と定義しました。さて、J. J. トムソンなら電子の発見

べてくれなかったんだろうと思いました。

者として知っているけれど、ウイリアム・トムソンなんて知らないと思われるかもしれませんが、実は皆さんがよくⅠ- 4．動物の体のキラリティ

知っている人なんです。この人は爵位をもらって「ロード・動物の体にもキラリティがあります。羊の角の巻き方はケルビン」（ケルビン卿）となった人、絶対温度の単位 K

真ん中で左右対称になっています。人の体も左右対称です。

（ケルビン）の由来となった人なのです。グラスゴー大学の

一般に外観はキラルではないのですが、体内構造、内臓器

物理学の教授で、いろいろ優れた業績を上げた人です。グ官はキラルです。心臓は左側にあるし、腸は一方に巻いてラスゴー大学の中に石像があり、周りの花壇にはきれいないる。人でも 1 万人に一人は、内臓逆位の人がいます。体

花が植えられていました。ケルビンという名の由来ですが、内構造の左右性が完全に逆転していれば、何も不都合は起大学の中にケルビン川という小さな川が流れています。こきませんので普通に暮らせます。健康診断のときにお医者−4−

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

さんがびっくりするくらいです。私は内臓のキラリティが外にも現れている巻貝を研究対象にしています。

Ⅰ- 5. 分子の世界のキラリティ
分子の世界にもキラリティがあります。皆さん、DNAには、C と G、A と T の塩基対があることはご存じと思います。塩基対の外側に糖リン酸骨格があるのですが、この糖は D- デオキシリボースで右型です（Fig. 3）。タンパク質はアミノ酸からできているのですが、それをつくっているのは L- アミノ酸、左型だけです。地球上のすべての生物が使う分子のキラリティは共通していて、おそらく 40 億年前に地球上に最初の生物が生まれたときから同じキラリ
ティだっただろうといわれています。このことを「ホモキラルな生命世界」といいます。鏡に映した L 型と D 型の分子があるにもかかわらず、DNA や RNA は D 型のリボースを使っている。タンパク質も D 型と L 型アミノ酸があるにもかかわらず L 型しか使わない。なぜなのか、とても不思議です。生命世界がホモキラルであることが実生活にはとても重要であることを、わたしがつくった「靴と靴下の原理」
でご説明したいと思います。

Ⅰ- 6.「靴と靴下の原理」
熱力学の法則と同じように３つ作ってみました（Fig. 4a）。
原理の 1。靴の左右を履き違えると、すぐにわかるが、靴下ではそのようなことはない。足袋は別ですよ。足袋には右と左の違いがあります。
原理の 2。小さな子どもが大人の靴を履いた場合は、左右を履き違えても差はわからない。
原理の 3。靴下は履いている間は左右の違いのある形をしている。でも、脱ぐと左右の違いのない形になります。
これはダイナミックキラリティなのですね。でも長い間履いていると親指部分が薄くなって穴が開いて、左右の区別ができてしまいます。
私はこんな研究をしているのです。といっても、これだ
けでは皆さんだいたい馬鹿にしますから、ちゃんと科学版をつくってあります。
靴と靴下の原理の科学版第 1（Fig. 4b）。キラルな化合物は、キラルな化合物やキラルな電磁波と相互作用すると、左右の違いを認識する。たとえ一方がキラルでも相互作用する相手がキラルでなければ差は現れない。足と靴・靴下をしている間は、キラルでないものにダイナミックにキラですね。
靴と靴下の原理の科学版第 2。スケールが異なれば、キリティが誘導されることがある。たとえば、DNA にキラ

ラルなもの同士の相互作用でも差は現れない。小さな子ど

ルでない化合物が結合すると、キラリティが誘導されます。

もがお父さんの靴を履いた場合です。これは分子レベルど

そのキラリティを分光法で測定してその化合物が DNA にうしで比較しているのか、電磁波ならどういう波長の電磁どのように結合しているのかを調べる方法を編み出したの波との相互作用を見ているかがポイントとなります。

は私ですが、今日はその話はしません。また、ダイナミッ

靴と靴下の原理の科学版第 3。キラルなものと相互作用

クキラリティを恒久的なキラリティに変換できる可能性が−5−

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022あります。分子の構造変換や動きを止めた結晶中で光反応を行い、キラリティ選択的に新しい結合をつくってみましたが、時間がありましたら後ほど少しお話をします。

Ⅰ- 7．右型、左型で違う味、香り、薬効─靴と靴下の原理 1，2（Fig. 5）
さて、この原理の 1 と２があるので、左右はとっても重要だということになります。L-アミノ酸でタンパクはできていますが、タンパク質以外では D- アミノ酸もあって、なめてみると D- アミノ酸はどらちかというと甘いのです。
でも鏡に映しただけなのに L- アミノ酸は味がなかったり、苦かったりします。これは私たちの味を感じる味蕾がキラルな構造をしているからなのです。鏡の国のミルクの味は、訳本では「おいしくないわよ」となっていますが、おいしいって何なのだろうと考えました。もしカゼインが D- アミノ酸でできていたら消化できないなと思いました。この部分を原著で見ると「Perhaps, Looking-glass milk isn’t goodto drink」で「飲まないほうがいいよ」です。こちらのほうが科学的に正しいなと思います。訳としては「おいしい、おいしくない」のほうが一般向けでいいけれど、ちょっと違うよなと、科学者として余計なことにこだわりました。
香りについても、カルボンという物質はひとつがキャロウェイの種の香りがするのに、その鏡像体はスペアミントの香りがします。もっと深刻なのは薬効とか副作用です。
皆さんはサリドマイド事件をご存じだと思います。つわり止めのために妊娠中のご婦人が摂った結果、手足に奇形のあるお子さんが生まれました。これは S 型だけが奇形を生したのでイギリスへ行って、最初は化学科で分光学、結晶

じ R 型はそうではないということが動物実験から知られて学の分野でキラリティの研究を続けていたのですが、ひょいます。農薬もそうで、右型と左型で効き方がまったく違んなことから生物物理学科に移って DNA と抗がん剤、発うことがあります。ということで、右左の違いがとても重がん物質との相互作用を結晶構造解析法を使って調べるよ

要だということがわかっていただけたかと思います。

うになりました。しかし、そのうち、それだけではつまら

Ⅱ．カイロモルフォロジー研究ないと考えるようになり、土・日に別の研究室へ行って分子生物学の手法を学び、DNA と抗がん剤、発がん物質と私 は カ イ ロ モ ロ フ ォ ロ ジ ー（Chiromorphology）研 究の相互作用の研究に適用しました。日本に帰ってきてからという舌をかみそうな名前の研究をしています。これはしばらくは結晶学と分光学、分子生物学の研究をやってい私がつくった単語で、キラル（カイラル・Chiral）＋形態

たのですが、１個の遺伝子で左右の巻型が決まる巻貝に惚（Morphology）からつくっています。そしてキラリティをれ込んでしまい、ついに、生きた生物を扱う発生生物学分切り口にミクロとマクロのリンクを探る、つまり分子が集野の研究も始めてしまったのです。どれも面白いです。一

まってどうやってマクロな結晶となるのか、あるいは生物貫して、左右性の研究をしています。

の階層構造を経て分子からどうやって究極の生物個体がで絵で描きますと、今私がやっている研究テーマは Fig. 6

きていくのかを調べるのにキラリティを使いたいと思ってのようになります。縦軸は対数スケール、10 の n 乗 m で、います。あるいは生物界と非生物界のリンクも探れたらい

n=2 と書いてあるところが 100 ｍ、鯨くらいですね。私たいなと思っています（Fig. 6）。

ちは 0 の目盛りのところの大きさです。10 のマイナス 10

何で化学と生物の両方とも研究しているのか不思議に思乗 m がオングストローム、10 のマイナス 15 乗 m は素粒子

われるかもしれませんが、私は元々物理化学出身で、金属の世界です。図の左側は生物界です。先ほどお話ししまし錯体のキラリティに関する結晶学と分光学で博士号を取りたように、遺伝子やたんぱく質では左右一方の分子しか使ました。日本では女性研究者はお呼びではなかった時代でわれていません。図には体の左右性構築に関係する遺伝子−6−

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

名が書いてありますが、その中でも nodal と Pitx2 というティの認識、創成、転写、増幅など溶液化学とは異なった

2 つの遺伝子は、私たち脊椎動物の心臓を左におくか、腸新しい化学を展開しました。そして固体状態のキラリティ

をどっちに巻くかを決めていることで知られている重要なを測定するために必要な新しい分光装置も開発してしまい、

遺伝子です。私はそれが巻貝にもあることを見つけていま

それを使って無機・有機化合物、アルツハイマー病やパーす。そして、Lsdial1 という遺伝子が巻型を決定しており、

キンソン病に関連するタンパク質の研究にも展開していき

この遺伝子が nodal, Pitx 遺伝子の発現場所も制御していました。そして「Ⅵ . 生物の世界のカイロモルフォロジー

ることを発見したのですが、そのことについては後でお話研究」では巻貝の巻型を決める 1 個の遺伝子を同定するこをします。細胞から器官ができ、個体ができあがっていく、とができ、現在、そのメカニズムを明らかにしたいと研究

そのプロセスの発端を明らかにしたいと思っています。

しています。これは、化学の話の後にお話いたします。

図の右側は物質世界です。結晶化の例として、酒石酸ア
ンモニウムナトリウム塩をあげています。右と左の分子

Ⅳ．化学の世界のカイロモルフォロジー研究がビーカー内の溶液中で飛び回っています。そして温度

まず化学の話です。皆さんは化学分野の研究者が多いのが 27 ℃以下だと、右型の分子だけが集まって結晶をつくでしょうか？

り、また左型の分子だけが集まってキラルな結晶をつくりノーベル化学賞が触媒による不斉合成に、今年のノーベルます。こういう現象を自然分晶といいますが、パスツール

化学賞も有機不斉触媒に授与されたことからも明らかです。

が初めて見つけました。そして温度が 27 ℃以上では右型

私がやっているのは左右一方を作る不斉合成ではなく、左と左型の分子が同じ数だけ集まったアキラルな結晶ができ

右の混合物を分ける、左右どちらかに変換する、というこます。これはイタリアのスカッチがやった仕事です。もうとです。あるいは左右に関する情報を使って構造を知る、

少しフランスが赤道に近かったら実験室の温度が 27 ℃以

そんな研究をやっています。絵で描くと Fig. 7 のようにな

上で、パスツールがこの発見をしなかったかもしれません。

りますが、今日はとても時間がないので一部だけをごく簡「もう少しクレオパトラの鼻が低かったら」などと同じよう単にお話をします。

な言い回しですが、そうだったかもしれません。

なぜ右左が重要かということは 2001 年のⅣ -1. 溶液からの結晶化でキラリティ識別

Ⅲ．話の流れまず Fig. 7 の左上の、溶液からの結晶化です。Fig. 8 はさて、今日の話の流れです。まず、「Ⅰ . はじめに」で、先ほどお話ししたパスツールの結晶の話なのですが、酒石

キラル、キラリティとは何か、そして靴と靴下の原理の話。

酸の結晶の研究から分子にもキラリティがあるに違いない

これは既にしました。分子レベルで眺めてみると生物世界と洞察したのがパスツールです。Fig. 8 の左上の写真に見はほぼ左右一方に偏っていてホモキラルですが、物質世界えるのがワインを熟成させる醸造の樽です。その底にできはほぼ左右が同数ある（ラセミ）というお話もしました。い

てくる結晶から研究が始まりました。真ん中の図はパスツ

よいよ、化学の世界のわたくしの研究、「Ⅳ . 化学の世界ール博物館にある右と左の結晶の模型です。結構大きいでのカイロモルフォロジー研究」の話です。キラル識別が強す。結晶面の出方（半面像）に左右性があるので、区別がつく現れる固体状態の研究です。溶液ですと分子は溶媒に囲きます。実験室で合成すると右型と左型分子が同じ数だ

まれていてお互いのキラリティを容易に認識しません。でけできてきます。そして 27 ℃以下で結晶化させると自然すから固体での研究をやろうと思いました。そこでキラリ分晶が起き、27 ℃以上だとアキラルなラセミ結晶ができ−7−

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022てくるのです。ワインの醸造では微生物の働きによるので、右型の分子しかできてきません。ワインの醸造タンクの底にできてくる結晶は、27 ℃以下の温度で起きた自然分晶のうち、左側の結晶、赤い丸が詰まったほうの結晶です。
パスツールは結晶の示す右型、左型の違いは、結晶を構成している分子に右型と左型があるからだろうと、洞察したのです。
100 億の 2 乗個の分子が集まって結晶ができてくる。分
子はどうやって隣の分子のキラリティを認識して凝集して結晶を作るのか？

この不思議を理解したいと思ってパス

ツールとスカッチの結晶を作り構造解析したのは実は私です。1848 年からずいぶんたっていました。格子エネルギ
ーの計算もしたのですが、片方は 4 水和物、片方は 1 水和物で簡単ではありませんでした。ひとつわかったのは、キラルではない水分子とアンモニウムイオンが重要な役割を果たしてキラリティ認識をしているということです。
2 級のアルキルアルコールは右型と左型を分けるのがとても難しく、いろいろな人がアルコール分子に修飾をしてみたり温度を上げたりといろいろなことをやっていたのですが、なかなかうまくいきませんでした。私は発想を転換

記念講演（2021年11月25日）よりして右型と左型を同数含むアルコールを溶媒として使ってみました（Fig. 9）。当時、ポスドクだった今井喜胤博士（現

溶液中のジカルボン酸全部が aS か aR に変換されるように

在、近畿大学准教授）がやってくれました。右と左が混じなっています。ですから、収率が 50 ％ではなく 100 ％にったアルコールの中にキラルなジアミンとプロキラルなジなります。こんなことを考えて研究をやっています。

カルボン酸という 2 つの化合物を溶かし、“果報は寝て待て”で、1 日か 2 日待つと結晶が出てきます。その結晶を見Ⅳ - 2．結晶共粉砕でユニークな結晶・分子を作るてみるとジアミンのキラリティにより、左右のほとんど一

それから、Fig. 7 の中央上の図に示した、結晶と結晶を方だけのアルコールがトラップされていました。この場合こするという話です（Fig. 10）。キラルな 1-1’ ビスベータにも、パスツールの酒石酸塩の結晶のように、キラルでな

ナフトールの白いラセミ結晶とアキラルなパラベンゾキノ

い水分子の関与が重要な事が分かりました。結晶を集めてンの黄色い結晶をビーカー内の溶媒に溶かすと赤い結晶がアルコールをとりだすことで、簡単に左右一方のアルコー

できてきます。その結晶構造を決めると（R）-1-1’ビスベー

ルを得ることができます。おまけにちょっと工夫がしてあタナフトールと（R）-1-1’ ビスベータナフトールがベンゾキって、ルシャトリエの法則ですが、ジカルボン酸のキラル

ノンをサンドイッチしている電荷移動錯体ができていましなコンフォメーション（aS と aR）が容易に逆転できるので、た。ほかのところでは（S）と（S）がサンドイッチしている−8−

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

ので、結晶全体としては S と R が同数ありアキラルですが、
ホモカイ（キ）
ラルペアが電荷移動錯体をつくっているのです。ところが乳鉢でこの白い結晶と黄色い結晶をゴリゴリとこすると、驚くことに融解状態を経ずに赤い結晶ができます。そんなことはありえない、嘘だろうといわれて 2 年
間ぐらい論文にならず、また、その間に誰かにパクられる
し、いやな思いをしましたが、今では類似の例がたくさん報告されています。結晶共粉砕では、（R）と（S）のラセミ
ックペアがベンゾキノンをサンドイッチしています。結晶の色はそっくりですが、まったく違う構造です。なぜこのようなことが起きるかというとは、結晶共粉砕の場合には、元の結晶構造の記憶があるからだと思っています。溶液の場合、分子の集合体は一旦溶液中でばらばらになり、そこから自由エネルギーが一番低い結晶ができてくるのですが、固体状態では、元の結晶構造をある程度保ちながら新しい構造をつくるので、元の結晶構造を記憶しているということなのです。そうすると、溶液から赤い結晶ができるのに、固体結晶化だと青色の結晶ができてくるという化合物の組合わせもあります。本当におもしろいです。カメレオン結
晶化と名付けて喜んでいたのですけれど、この話はここで止めておきます。
金属錯体でも同様の面白いことが起きます。水溶液からつくるとどうしても水が配位した錯体分子ができてしまう
し、金属によってはゴリゴリこすっても水分子の配位した錯体分子ができます（Fig. 11）。しかし、さらにこの錯体をこすりながら加熱してやると水分子が飛んでポリマーができます。でも放っておくと空気中の水分を吸ってまたモノマーに戻る。これを 30 回くらい行ったり来たりできました。こんなことができるって面白いです。これらの仕事
は雑誌の表紙にもなったりしました（Fig. 12）。ずいぶん昔の話です。

Ⅳ- 3．結晶中での光反応
さて、Fig. 7 の左下の固体反応です。右型と左型の分子構造が溶液中で簡単に変換できる物質があります（Fig.
13）。光反応が起きると新しい炭素 - 炭素結合ができ、もはや右型、左型間の変換は起きなくなります。溶液で光反応を起こすと、右型にねじれた出発分子からは右型の生成物が、左型にねじれた出発分子からは左型の生成物ができ、れば、一方のキラリティの生成物を得ることができるはず全体としてはラセミ混合物が生じます。一方、固体の中でです。しかしながら、キラルな結晶というのは、なかなか

は分子構造の変換は簡単に起きません。それで、結晶を使できないのです。そこで、キラルな化合物と共結晶をつって反応してみました。結晶状態での反応でも、ラセミ結

くるということをやりました。キラルなホスト化合物の影晶の場合にはどっちみち右型、左型にねじれた出発分子が

響で、分子は一方にねじれた形で結晶化します。これはち同数あるので、それから右型、左型の生成物ができてきまょうど靴下を足に履かせたということになります。足に履す。一方、キラルな結晶には、通常、一方のキラリティのいたところで、親指のところに穴が開くように光を当てる。

出発物質しか含まれていません。今の場合は一方にねじれ

そうすると足から取っても靴下はキラルなものになってした出発物質だけです。そこで、キラルな結晶に光反応をす

まっています。そのような固体化学反応もやっていました。

−9−コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

さらに、固体と溶液とでは反応ルートが違う場合がある
こともみつけました。時間がありませんので今日はこの話はできませんが、溶液では一旦 trans 体ができてから cis 体に変換していくのに対し、結晶中では、重原子があるとス
ピン・オービト・カップリングのために最初から cis 体を生じるルートをとることを見つけています。この仕事は現在広島大学で准教授をやっている関谷亮博士が助手のときにやってくれました。

Ⅴ．分光装置の開発
そして装置開発です（Fig. 7 右下）。フロンティアの研究
は装置の開発からです（Fig. 14）。溶液とは異なる固体状態でのキラリティや固体状態で初めて現れるキラリティの測定をしたい。でも固体状態でのキラリティは市販の装置では正しい測定ができない。そこで、固体 CD 測定装置の開発が必要でした。CD というのはコンパクトディスクではなく、クリスチャン・ディオールでもなく、サーキュラー・ダイクロイズム（Circular Dichroism、円二色性）というキラリティの属性を表す言葉で、これを測定してキラリ
ティの情報を得ることができます。福井大学の神藤洋爾先生、それに、先生の修士の学生さんだった原田拓典君が私のところに博士課程の学生として入ってくれ、その後ポス
ドクとしても一緒に装置開発をやってくれました。日本分
光㈱と一緒に開発しました。固体状態を測定できる市販の装置がなかったら自分たちで作ってしまおう、作ってしま
ったら、この装置を使ってでないとできないような研究を展開しようという意気込みでした。

Ⅴ -1．UCS の測定原理と設計
Fig. 15 の式からわかるように、50kHz のシグナルには、測りたい CD シグナル以外にたくさんの項があります。セル、光電子増倍管とか光弾性変調器（フォトエラスティッ
クモジュレータ（PEM））とか高品質のものをいろいろ選び、装置を調整しても、Fig. 15 の黄色で囲まれた式（1）にしかなりません。
この式にも、CD 以外の、LD（Linear Dichroism）、LB（Linear Birefringence）が含まれています。溶液ではこれ
らは平均されてゼロになるのですが、固体状態ではこれらの巨視的異方性が大きくて CD の 500 倍とか 1000 倍に置をつくって、その測定方法も考案しました。何でも測れなることもあるのです。気をつけなければいけません。試る の で UCS（Universal Chiroptical Spectrophotometer）

料を光に垂直な面で回転させて測定し、θで平均すればいという名をつけました。J800 を改良したので日本分光

いとある著名な研究者が論文に書いたために多くの人が信㈱ は J800KCM と い う 名 を つ け ま し た（KCM = Kuroda

じてしまったのですが、それは正しくありません。式（1）ChiroMorphology）。

上の行にはθがかかっていない項がありますので、回転外観は Fig. 16 のようで、市販品と変わりないように見してスペクトルを平均しても異方性によるシグナルは除えますけれど、右下の回路から明らかなように、いろいろ

去できないのです。私たちはこの式から出発し、Stokes-

工夫がしてあります。50kHz と 100kHz のロックイン増幅

Muller matrix を使って、CD も LD も LB も CB も測れる装器を２つ持っている、アナライザーを抜き入れできる、回− 10 −

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

転しながらスペクトルを測れるなど、いろいろな工夫がしてあります。
サンプルフォルダーも別に特許を取っています。

Ⅴ -2．UCS で測定した固体状態の CD の例
実際のスペクトルをお見せしましょう（Fig. 17）。キラルではないにもかかわらず、偽の強いシグナルが検出されることがありますが（左側、青い背景のスペクトル）、UCSで測定し、演算をしますと右側の黄色い背景のスペクトルとなります。CD 強度がほぼゼロの正しいスペクトルが得られました。
あるいは BSA（Bovine Serum Albumin）はプリオンや狂牛病と同じように膜になると β-sheet に変わるという論文が出ていますが（左側青い背景の図のスペクトル）、これは異方性に起因する偽の信号を測ったためで、私たちの測定の仕方では、溶液状態と同様にきれいな α-helix 構造をしていました（右側の黄色い背景のスペクトル）。そのほか、先ほどお話ししたキラルな結晶中にトラップされたプロキ
ラルな化合物の光反応を追いかけるなど、いろいろなことをやっていますが今日は時間がないので割愛します。
おそらく皆さんが興味をもたれると思うのはアミロイドタンパク Aβ（1-40）ですね（Fig. 18）。溶液では α-helix が
17 ％、β-sheet が 34 ％。β-sheet になるとプラークをつく
りやすくなります。これをキャストフィルムや LB（ラングミュア - ブロジェット）膜にします。膜にすると α -helix
が 4 ％と大幅に減少し、β-sheet が 40 ％になっています。
この Aβ（1- 40）
は、プリカーサー（前駆体）といわれる大きなトランスメンブレイン（膜を貫通する）タンパク質から
β- セクレターゼと γ- セクレターゼによって切り出されてできた、40 個のアミノ酸残基から成るペプチドてす。ところがアルツハイマー病になりやすい家系があって、その家系の人は γ セクレターゼが C 端方向にアミノ酸残基 2 個分ずれたところでプリカーサーを切断します。つまり結果
として 42 個の長さの Aβ（1-42）ができるのです。このペプ
チドを調べてみると、何と溶液状態から α-helix が 3 ％しかない。40 ％がプラークをつくりやすい β-Sheet 構造になっていることが明らかになりました。こんなことも、10年くらい前に発表しました。
もっと最近の話になりますと、スズメバチシルクの膜ですが、見た目は変わらないのですが、膜に水蒸気を 5 秒当てるだけでタンパク質の高次構造が変わってすけれど、どうしてもジェルとか軟らかいものは重力の影

いきます（Fig. 19）。α-helix から coiled coil そして coiled

響を受けるからサンプルを水平に置くほうがよいと考えて、

cross-β -sheet へとあっという間に変わっていくというこ

こんな変わった装置を作りました（Fig. 20）。これが講演とを発見して、これも雑誌の表紙になっています。

の最初に写真でお見せした分光計なのですけれど、２つ光Ⅴ -3．試料を水平に置いて CD 測定できる装置の開発
UCS-2, UCS-3
また、吹っ飛んだ発想をし、水平思考といっているので

電子増倍管があります。サンプルを水平において光を直角に曲げて透過 CD を測定する、もう一つは粉を積分反射球の中に置いて DRCD（拡散反射）CD スペクトルを測ることができます。これも特許を取っています。

− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

この装置を使うと、先ほどのアミロイドですが、ぽたっ

そして、それから、これから話す巻貝の研究分野の試料と液を落としますと（Fig. 21）、出発は溶液です。グラフ

も、いずれ in vitro で我々の CD 分光法などで調べられなの横軸は時間です。液滴が時間の経過とともに乾燥して膜いかなと考えています。

になるのですがその過程を追っています。この赤い縦の線

Ⅵ．生物の世界のカイロモルフォロジー研究
─巻貝の巻型を決める1 個の遺伝子の同定のところまではまだ α-helix 構造ですが、この短い時間で一挙に β-sheet 構造に変わるなんていう面白いことを追跡できるようになりました。

Ⅴ-4. 新概念による CD 装置の開発
不要、異方性信号除去不要

さて、巻貝の研究の話です。巻貝の巻型を決める分子機

─波長スキャン

構を調べたいと思いました。なぜ巻貝なのかというと、とてもユニークな特徴があるからです。でもあまり研究している人がいなくて、どうやって飼育するのか？ DNA やでも、波長をスキャンしている間にどうしても速いダイ

RNA をどうやって抽出するのか、どうやって胚操作をす

ナミックスでは構造変化が起きてしまう。それだったら、るのかなどがわからなくて、本当に苦労しました。ユニー

波長スキャンなしで測れる装置がほしいと思い、かつ、異クな特徴とは、体内構造の左右性が体の外にも現れていて方性 LD、LB を取り除くのがすごく大変なので、それなら左右性の観察が楽なこと；Lymnaea 属にはなぜか、右巻と左最初から LD、LB のシグナルが混入しない観測の仕方がで巻の両方が天然にいること；右対左が 98 対 2 くらいです。雌

きないかと考えました。これも試作機を作り、アメリカの雄同体で、自家受精と他家受精の両方を行いますので遺特許も取りました。マルチチャンネル CD 分光装置の設計

伝学の研究がやりやすいこと；世代交代が短く、3 ヵ月かでは、白色光を偏光板で偏光し、PEM で変調し、試料通ら 4 ヵ月で次世代を産みます。もっと長かったら私は 150

過後、回折格子で分光し、エレクトリックシャッターで円

歳から 200 歳まで生きて研究しなければなりませんでし

偏光のみをとりだし、マイクロチャネルプレートで増幅。

た。また、巻貝の巻型が発生のごく初期に決まるというこ

右巻円偏光と左巻円偏光の CCD イメージの差をとることとです。1894 年に Crampton が 4 細胞期から 8 細胞期になで CD スペクトルを得るというものです。その結果得られる第 3 らせん卵割時に、小割球が右旋すると右巻貝に、左た CD スペクトルは、UCS で測定したスペクトルと大変よ

旋すると左巻貝になることを、異なった右巻種と左巻種のく似ています。ただし、SN 比が悪いです。測定にどれだ貝を観察して報告しています。1923 年に巻型は遅滞遺伝

けの時間がかかったかというと、UCS は 5 分、でもマルし、母貝の 1 個の遺伝子で巻型が決まると報告されました。

チチャンネル法では 7 秒。もっと短くできるだろうと思っ─これは実はワトソン、クリック、ウイルキンスらによるています。現在は当時と比べるともっと良い品質の光ファ

DNA 発見のはるかに前のことで、今の定義の遺伝子ではイバーや CCD があるはずですが、今となっては、資金もありません。しかし、遺伝が大変シンプルであることを示

人手もなくて、開発を進めることができませんし、東大に唆していると思いました。
そこで私は ERATO 研究助成に応募したときに、現代のも海外の特許は高いといわれて切られてしまいました。
化学分野では、今日お話しした以外にも、これから展開遺伝子でも 1 個の遺伝子で決まっているのか？

したいおもしろい現象をいくつか見つけています。固体状

巻型決定遺伝子とは何なのか？

態のキラル分光も現在、岡崎の分子科学研究所やエストニはどのようなメカニズムで決まるのか？

アの大学の先生と共同研究を行っています。

わって目で見える体の左右を決めているの？

− 12 −

そうなら、卵割時の割球の回転方向
遺伝子がどう関ほかの生物

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

種との共通点・相違点はあるのか？

このような疑問に答

えたいと応募しました。最初の 2 つの疑問には答えることができました。残りの３つの疑問もかなりわかってきまし
たが、研究はまだ続いています。プロジェクトを始めたときは、巻貝の飼い方もわからず、熱帯魚屋さんに相談しつ
つ大きな飼育システムまでつくりました。手探りで系統を維持し、コンジェニック系統も作りました。今は研究資金もなく、人もいなくて小さな水槽でしか飼っていませんが、細々ながら大きなテーマに挑戦しています。分子生物学、発生生物学、細胞生物学と幅広く手がけました。

Ⅵ -1．左右対称性の破れ
最初の発見です。すべての発生生物学の教科書には「右巻貝と左巻貝は、初期らせん卵割過程もそれ以降の形態形
成も鏡像対象に進行する」と書かれています（Fig. 22）。と
ころが、それが違っていました。違うところが重要なのだということに気がつきました。動画をお見せします。上段
が左巻貝の胚で第 3 卵割で小割球が左にくるんと回るのがわかるでしょう。右巻貝の胚では右にくるんと回りますね（本報告書では動画は割愛）。これが、Cramptonが観察したことで、多くの教科書に載っている図はそれを描いています。
でも実は丁寧に観察すると（Fig. 23 left）、第３卵割のときに左巻胚のほうは真上に小さな割球がでてきて、それから左に回る。右巻胚のほうは最初かららせん状に細胞の形が変形し（SD）、スピンドルも傾いて（SI）、早い段階でキラリティが決まっているのです。SD（SpiralDeformation）、SI（Spindle Inclination）と名づけました。
じゃあこれが何で引き起こされているのかというと、微小管ができなくても非常に強くキラリティが現れるけれ
ど、アクチンの重合を阻害する薬剤で処理をするとキラリ
ティがなくなることから、アクチンが関係しているのだというヒントをこのときに得ました（Fig. 23 right）。この研究成果は、『Current Biology』の表紙にもなりましたし、『Dispatch』という紹介記事も出ました。
それを見て「exiting
and elegant new study」とコメント書いてくれた人もいま
すし、『Science』誌も紹介記事を書いてくれました。結構
日本の新聞も書いてくれました。これはわたくしの発生生物学の論文としては、ほぼ初めてのものです（Fig. 24）。

Ⅵ -2. メカノジェネティックス ─物理的胚操作で逆巻の貝を作成と割球を押す実験とその後の卵外人工胚培養に見事に成功

第二の発見は「あそこでくるんと回るのが重要なのだかできてくるのでそこから押し始め、右巻胚では早くからキら、手で逆に回してみたらどうなるだろうか、やってみよ

ラリティが決まりだすから早くから押して、細胞接着構造

う」と発想したことから始まりました。私はよく吹っ飛んが固定してしまうまで押し続けました（Fig. 25）。

してくれました。左巻胚ではまず、小割球が中立に真上にだアイデアをいう人間なので、そういいましたら、研究室

脊椎動物の体の左右性構築には共通して nodal、Pitx 遺のみんなが声を上げて笑いました。でも遠藤さんという器伝子が働いていることが知られています。マウスでよく調用なテクニシャンがいて、彼は顕微鏡下でガラス棒でそっべられていて、nodal flow が起きて nodal 遺伝子が発現す− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

るとそちらが左に定義されます。軟体動物の貝にはこれ
らの遺伝子は存在しないと報告されていたのですが、実はあることを見つけ、右巻貝の胚では胚の右側、左巻貝の胚は左側で発現することを突き止めました。図の青くなったところがその遺伝子が発現しているところです。
（巻
貝におけるこの遺伝子の存在はほとんど同時に Grande のグループからも報告されました）。そして、このように物理的に 8 細胞期の割球の位置関係の左右性を逆転させると、nodal, Pitx 遺伝子の発現場所も左右逆転し、その結果、逆巻きの貝が誕生したのです。子どもを産むことができる健康な巻貝でした。遺伝子は操作していないので、当然ながら次の世代は、遺伝子に則った元の巻型に戻ったのです。
この論文はクレームがほとんどなしで『Nature』誌に掲

ムという F10 世代系統をつくり、その 0.1 ％に巻型決定遺載され、『NEWS & VIEWS』に紹介されました。フラン伝子を受け継いでいると必ず SD、SI があって第 3 卵割でス人はエスカルゴが好きなためか、フランスの新聞、『Le

右旋性をして右巻の貝になることをつきとめました。ですmonde』が書いてくれましたし、また「elegant」な研究と書から現代の定義による遺伝子でも、１個の遺伝子座によっいてくれた記事もあり、とても嬉しかったです（Fig. 26）。

て、巻型が決まっていることになります。世界で使われてただ、右と左の両方の巻型が天然にいる種だから物理的いる教科書（2016 年版）が『Current Biology』,『Nature』誌

操作で逆巻にできるのは当たり前じゃないかといわれるかに乗った成果を図入りで結構大きく取り上げてくれ、章のもしれないので、天然に左巻しかいない Physa acuta で同扉にも私の貝の写真が載りました。

様の物理操作実験をやってみたのです。そうしたらこれまで誰も見たことがない右巻の Physa acuta 貝ができたので

Ⅵ - 4．巻型決定遺伝子候補の同定す。そしてその子はまた左巻に戻るということも確認しま

では、この 1 個の遺伝子とは何なのでしょうか？

世界した。巻貝の巻型を決めるプロセスには共通のメカニズム中で 1 世紀近く、この遺伝子を同定すべく、研究が行わがあることを示唆しています。

れてきました。我々も、非常に長い時間をかけましたが、BAC ライブラリーの作製から始め、AFLP マーカーを作り、

Ⅵ - 3．巻型は 1 個の遺伝子座で決まっている

ポジショナルクローニングで領域を狭め、15 個の遺伝子

コンジェニックというのですが、連続戻し交配という手候補に絞りました（Fig. 27a）。その中から、アクチンが関法で、どんどん右巻のゲノムの比率を薄くしていって左巻係していて母性遺伝する遺伝子 5 個を選び、右巻貝と左巻のゲノムに置換していきます。右巻のゲノムの中の巻型決貝で差があるかを塩基配列を決めて調べたのです。その結定遺伝子を受け継いでいるものは右巻の子どもを産みます

果、左巻の貝には、Lsdia1 と名づけた遺伝子の両方の対ので、それを選び、交配を続けていきます。F2, F3, F4…

立遺伝子に１個突然変異が入っていて、その結果すぐ終止と戻し交配を行い、右巻きゲノムの割合を減らしていきま

コドンとなってタンパク質がつくられていないことが明らす。そうして、0.1 ％右巻のゲノムで、99.9 ％左巻のゲノ

かになりました。それ以外の遺伝子には右巻、左巻で差− 14 −

第 32 回表彰・贈呈式記念講演 「科学の醍醐味 ─ 左右性から見る自然界の不思議」

はありませんでした。Fig. 27c を見ると右巻貝では緑（A）
、
緑（A）
、青（C）
、青（C）
、赤（T）の順にピークが並んでいる
のに、左巻貝では、緑
（A）
、緑
（A）
、青
（C）
、赤
（T）
と、青（C）
が 1 個抜けています。これだけで右巻左巻が決まるのでしょうか？ Western blot をやっても確かに LsDia1 タンパク質は左にはないということも確認しました。
Fig. 27b からあきらかなように、Lsdia1 と Lsdia2 の 2つの遺伝子がタンデムに並んでいます。しかもこの 2 つのタンパク質には 89.4 ％も相同性があるのです。LsDia1,
LsDia2 の 2 つのタンパク質があると右巻きに、LsDia2 だ
けですと左巻になるという結果です（Fig. 27d）。
（我々とほぼ同時に同じ遺伝子を候補とした論文が出ましたが、その根拠となっている実験やゲノム配列には残念ながら重大な間違いがあります）。これはまだ、巻型決定遺伝子の候補にすぎません。他にも遺伝子があるかもしれませんし、他の遺伝子と協働して左右が決まっている可能性もあります。

Ⅵ -5. 巻 型 決 定 遺 伝 子 の 同 定 に 成 功 ─ CRISPR/
Cas9 ゲノム編集でそこで、この遺伝子をCRISPR/Cas9 ゲノム編集でノックアウトしたらどうなるかを調べました。Fig. 28 のLsDia1 配列の左に示した黒矢印は天然に入っている点突然変異の位置です。ゲノム編集のターゲットをそこには設定できず、
右巻、左巻の塩基配列で差の大きな真ん中の FH1 のところ（赤矢頭）をターゲットにして右巻貝の胚にノックアウト
実験をやってみました。その結果、遺伝子型に対応した大変クリアな結果になりました（Fig. 29）。両方の対立遺伝
子にフレームシフトミューテーションを起こす変異が入ると右巻のはずの貝が左巻になりました。それ以外の変異では右巻です。第 3 卵割の割球の回転方向も完全に Lsdai1の遺伝子型と対応しますし、Western blot で LsDia1 タン
パク質があるかないかを確認しましたが、これも完全に遺伝子型と対応していることがわかりました。
まとめると LsDia1、LsDia2 両方あると右巻なのに、その中の 1 個、Lsdia1 遺伝子をノックアウトすると代々左巻になります。今は F7 世代まで行っています。それから、受精卵ですでに左右性が決まっていることも突き止めました。
この成果は、うれしいことに、『Development』という学術雑誌の表紙の図に採用され、著者紹介の記事も出まし・LsDia1 が受精卵から左右性を決定している。

た。Fig. 30 には 2004 年に『Current Biology』という雑誌

・90 ％相同性のある LsDia1、LsDia2 両方があると右巻、に我々の論文が掲載された号の表紙も一緒に載せていま

LsDia2 のみになると左巻になることを明らかにしましす。どちらも左巻、右巻貝ですが、『Current Biology』のた。

場合は天然にいる右巻と左巻の貝の写真、それに対して、・世界唯一の系統を樹立・維持し、巻貝のゲノム編集技術『Development』の表紙のほうは、右巻き貝と、右巻貝の１も世界で初めて確立しました。

遺伝子をノックアウトして作った左巻貝のペアの写真です。

しかし、分子レベルでは左右性はいつ、どこで、どのよ

これまでに、

うにして決められているのでしょうか？

− 15 −

多くのことを明コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

らかにしてきましたが、実はまだ出発点に立ったばかりじゃないか、これからじゃないかと思っています。SD、SIの役割は謎です。dia という遺伝子は真核生物すべてがもっている基本遺伝子で、アクチン線維の伸張に関わる遺伝子です。いったい何をやっているのか、現在、その研究を始めています。
脊椎動物の発生初期の左右性決定はほとんどわからないことばかりです。マウスの場合は 7.5 日齢になって nodal
flow が起こり、8.25 日齢になってはじめて nodal 遺伝子が発現してきます。人も１万人に一人くらい内臓逆位の人がいます。私が研究している貝では、１細胞期で左右性が決まっていて、3 時間で左右性が確立し、5.5 時間後の 24 細胞期で細胞運命が決まっており、12 時間後の 49 細胞期でnodal が発現することを明らかにできましたので、この系しく思っています。認知症の研究についても計画中です。

でこそ左右形態形成の謎を解明する研究ができるはずと思ある意味では、やっと出発点に立てた感じです。これかっています。

らやりたいテーマが満載です。

さらに、軟体動物の CRISPR/Cas9 ゲノム編集は意外に難しく、成功したのは今のところ我々だけなのです。左右性決定の謎をさらに追及するとともに、今後は医療分野に

Ⅶ．共同研究者、所属機関、資金提供くだ
さった JSPS に深謝も展開したいと考えています。ヒト住血吸虫症はマラリア共同研究者です。先ほどから、各項目で何人かの中心的の次に重篤な感染症ですが、その制御に貢献したいと思っに実験をしてくれた人の名前と写真をお見せしたのですが、ています。寄生虫がヒトに感染するためには中間宿主内でそれ以外にもたくさんの人が貢献してくれました。JST

変態することが必要ですが、中間宿主は、これまで左右性

ERATO/SORST プロジェクト研究をやらせていただいたの研究対象としてきた巻貝とそれほど遠くない巻貝種なのこと、研究場所となった、東大、理科大と今の中部大学にです。これまでの経験を生かして、感染耐性を理解しよう

も心から感謝します（Fig. 31）。

と考えています。幸い、科研費挑戦的萌芽に採択され、嬉− 16 −

ご清聴ありがとうございました。

2021 年度 コーセーコスメトロジー奨励賞● 奨励賞の趣旨「コーセーコスメトロジー奨励賞」は、2020 年の本財団創立 30 周年にあたり創設された表彰制度で、本財団の研究助成採択者の中から、論文発表を通してコスメトロジー研究の発展に功績があった研究者を表彰するものです。
これにより助成課題の更なる発展を期待するとともに、これをインセンティブとして、コスメトロジー研究の学術論文による成果公表を奨励し、研究成果の社会還元を一層促進することを目的にしています。
そのため本財団は、コスメトロジー研究助成を受けられた研究者から助成課題に関する論文の提出を受けて、論文
実績に基づく選考を行い毎年の最優秀者を表彰してまいります。
● 選考の経過2021 年 4 月、2018 年以降のコスメトロジー研究助成採択者全員に、本表彰の趣意書を送付しました。8 月末日の締切日までに 14 名の研究者から助成課題の研究成果を発表した論文延べ 21 報の提出を受けました。
本表彰受賞者の選考にあたり、提出されたそれぞれの論文について論文実績の客観的指標として被引用件数を調査しました。この調査結果から、最も論文実績が優れた研究者 1 名を選考委員会において表彰候補者として選出し、理事会の承認を得て、本年度の受賞者を決定しました。
● 受賞者
景山 伯春（名城大学理工学部 教授）
・第 29 回コスメトロジー研究助成受賞（ 2018）
・研究課題：天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明

中央：景山 伯春（名城大学理工学部教授））
左：小林 保清（前 理事長）
・右：小林 一俊（現 理事長）

− 19 −

●
Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野
Ⅳ．コスメトロジー研究助成を受けて●カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価
東北大学多元物質科学研究所

殷澍B and N co-doped anatase(BN-Ana), rutile(BN-Rut), and brookite(BN-Bro) TiO2 were successfully synthesized by ahydrothermal assisted nitridation method. The apparent color of as-obtain BN-Ana, BN-Rut and BN-Bro was red, cyan andyellow-green, respectively. The mechanisms of various coloring were concluded as the different band gap configurations andthe formation of covalent B-N bonding. The nitridation time expressed less effect on changing the color. On the contrary,
the nitridation temperature enabled the distinct color changes by altering the brightness. The lower temperature, the fewer
doping concentration, and brighter apparent color, vice versa. Through tuning the brightness, a gradient of yellow-orangered was achieved in the case of BN-Ana, as well the transitions of grey-to-cyan and white-to-green-yellow were achieved in
BN-Rut and BN-Bro, respectively. This research proposed a method for the synthesis of color-full titania pigment without
the addition of other toxic transition metal elements. It was also found that the color titania with various phase composition
possessed different photocatalytic activity. The results indicated that BN-Bro was the most active species, showed almost
the same level photocatalytic activity as Degauss P-25 titania under UV light (λ > 290 nm) or blue-free visible light (λ >500 nm) irradiation, while it shows higher activity under λ > 400 nm irradiation. The photocatalytic durability of BN-Bro
decreased to about 44 % of its original activity after five times cycling test. On the other hand, the photocatalytic activityof BN-Ana and BN-Rut show quite low photocatalytic deNOx activity, indicating that BN-Ana and BN-Rut are potential
candidates for toxic-free pigment or cosmetic applications

１．緒が知られているが、酸化チタン単独組成では、赤や緑等カ

言

ラフルな色を示すことは難しい 2 , 3）。尚、これまでの赤色

遷移金属化合物は多彩な色を示すことで知られている。

無機顔料としては、鉄イオンを利用することが殆どであり、これは遷移金属元素の d 軌道や f 軌道が電子によって完全鮮やかな赤色の実現は困難であった。本研究は、環境に優に満たされていないことに起因し、分裂した d 軌道間の電

しいソルボサーマル反応を利用し、貴金属及びチタン以外

子遷移（d-d 遷移）、局在した軌道間の電子遷移（電荷移動の遷移金属フリーなカラフル酸化チタン無機顔料を合成し、遷移）等に由来すると知られている。しかしながら、遷移紫外線遮蔽や触媒活性評価を行い、化粧品としての機能評

金属元素は，毒性を持つものが多く、医薬用途等制限され価とその応用を検証した。酸化チタンは白色や黄色だけでるケースが多い 1）。一方、酸化チタンは無毒で、高い化学はなく、鉄イオンフリーな赤色無機顔料、並びにグレー、的安定性を有するため、化粧品をはじめ、食品添加剤等に緑色、紫色、黒色等、様々な色を有する無機顔料を酸化チも広く利用されている無機材料である。一般に、遷移金属

タンのみで実現できることを検証した。

イオンのドープにより、白色の酸化チタンを着色させるこ

２．方とは可能であるものの、遷移金属に由来する生体毒性を回法避することが難しいと思われる。通常の酸化チタンは屈本研究では、溶液ベースソルボサーマル反応及びガス雰

折率が高く、優れた隠ぺい力を有し、化学的安定かつ無害

囲気中での処理により、単一アニオン及び複合アニオンド

で、化粧品の重要な原料である。一般に、酸化チタンのバープ酸化チタンの合成を行い、アニオンドープによるバン

ンドギャップ 3 . 0 - 3 . 2 eV であり、白色である。酸化チタ

ドギャップの精密制御を施し、酸化チタンへの様々な着色ンの色制御は塗料等における応用だけではなく、様々な新を実現した。尚、ソルボサーマル反応の反応条件を変化さ

規機能材料としての応用も期待される。窒素アニオンを酸せることにより、3 つの異なる結晶相を有する酸化チタン

化チタンの格子にドーピングすると、酸化チタンのバンドを選択的に合成し、さらなる熱処理雰囲気制御による色のギャップが狭くなり、可視光を吸収し、黄色を呈すること

精密制御の可能性を検証した 4）。代表的な合成プロセスをScheme 1 に示す。アナターゼ（BN-Ana）の場合、200 mMの TiB 2 を 0 . 5 M Na 2 SO 4 を 含 む 0 . 5 M H 2 SO 4 溶 液 中 でCreation of Colorful Titanium Oxide
Inorganic Pigments and Functional
Evaluation as Cosmetic Materials
Shu Yin
Institute of Multidisciplinary Research for
Advanced Materials, Tohoku University

180 ℃、24 時間水熱処理し、50 mL/min アンモニア気流
中で 600 ℃、1 時間窒化処理を行うことで合成した。ルチル（BN-Rut）の場合 80 mL の 0 . 5 M HCl 中で水熱処理し、ブルッカイト（BN-Bro）の場合 2 M 尿素溶液と 3 mL の DL乳酸ナトリウム溶液中で水熱処理し、同じ窒化条件で処理− 24 −

カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価することにより合成した。尚、窒化処理時間及び窒化処〜 700 ℃の範囲で変化する窒化温度は、結晶構造に実質的

理温度による影響も検証した。XRD、DRS、XPS、SEM

な影響を与えないことが分かった。500 〜 700 ℃での窒化等を用い、得られたサンプルの物理化学特性評価を行っでは、ルチル相が単一相として存在するが、ブルッカイト

た。粉体の色彩は 3 次元色空間 CIELAB システムによっ相にはわずかなルチル相が存在する。700 ℃以上では、ブて評価し、光触媒活性は異なる波長（> 510 nm, > 400 nm,

ルッカイトからルチルへの相転移が進行し、27 °付近の回> 290 nm）照射における NOx ガスの連続分解によって評価

折ピーク強度の増加が観察された。
Fig. 2 には、600 ℃の窒化温度で合成された異なる結晶した。

相を有する着色酸化チタンの拡散反射スペクトル、SEM

３．結果と考察と色彩イメージ及びバンドギャップ値を示す。バンド

Fig. 1 は、異なる条件下で水熱処理を行い、得られたアギャップ（Eg）の値は、UV-vis 吸収スペクトルに基づく

ナターゼ、ルチル、ブルッカイト相ベース酸化チタン粉

Tauc-plot 法 5）に よ り 算 出 し た。3 つ の 相 を 有 す る BN-

体をさらに 500 〜 700 ℃のアンモニアガス中で窒化処理しTiO 2 は、いずれも数百ナノのサイズを有し、赤（BN-Ana,

たものの XRD パターンを示す。一次相がアナターゼベー

Eg= 1 . 85 eV）、 シ ア ン（BN-Rut, Eg= 2 . 06 & 2 . 89 eV）、 黄スの場合（BN-Ana）、窒化温度が 600 ℃以下では、若干の緑（BN-Bro, Eg= 2 . 28 eV）色を示し、優れた可視光吸収能

TiB 2 不純物が存在し、600 〜 700 ℃には不純物 TiB 2 は完力を有する。 Fig. 2 に示すように、BN-Ana の光吸収は全に消失した。700 ℃以上では窒化物（TiN）が生成する可全体的に 750 nm あたりまで広がっており、青色光を強く能性が高くなり、単一相を得るため、700 ℃以下での処理

吸収し、見かけ上は赤色に着色した。一方、BN-Rut はは適切と言える。これに対し、ルチル相（BN-Rut）及びブ

200 〜 2000 nm 範囲内では 3 段階の吸収を示す。< 400 nm

ルッカイト相（BN-Bro）は TiB 2 不純物ピークがなく、500（UV 光）での吸収は、TiO 2 固有のバンドギャップに由来し、Scheme 1

Fig. 1

Flowchart for the typical synthesis process of B/N co-doped TiO2.

XRD patterns of ⒜ BNA, ⒝ BNR, ⒞ BNB synthesized with different nitridation temperatures（500-700˚C）− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 2 DRS spectra, SEM images, related color and bandgap values of ⒜ B/N-Ana, ⒝ B/N-Rut,⒞ B/N-Bro synthesized with nitridation temperatures at 600˚C

Fig. 3 The UV-vis spectra of A B/N-Ana, B B/N-Rut and C B/N-Bro samples synthesized by nitridation at 600℃ for ⒜ 30,⒝ 60, and ⒞ 120min., respectively. The inserts are the photographs used to present the apparent color of each sample.

400 - 500 nm の可視光領域では、短波長側の小さな膨らみ

調の微細制御ができることを明らかにした。さらに異なる

2 , 6）

ガス雰囲気制御と熱処理条件の精密制御により、酸化チタ

一方、スペクトルは近赤外（NIR）領域のほぼ全体をカバー

ンの結晶構造を保持しながら、さらなる繊細な色制御でき

し、波長中心が 1000 nm の広いピークは、Ti 3 + 欠陥に由来る可能性が期待される。

は、格子間 N（Nint）状態の電子励起によるものである。

7 , 8）。BN-Bro は BN-Rut と同様な光吸収範

酸化チタンに窒素をドープする場合、新たな N 2 p 準位

囲を有するが、近赤外（NIR）領域に BN-Rut ほどの強い吸を形成することにより、鮮やかな黄色を生み出すことがで収を示さない。

きることが知られ、N 2 p のバンドが O 2 p バンドと混成すると思われる

Fig. 3 には、600 ℃で異なる窒化時間により合成された

せず、独立に存在するとされる 2 , 3 , 9）。異なるアニオン種類

3 つの結晶相を有する着色酸化チタンの拡散反射スペクト
ルと色彩イメージを示す。関連する色空間の結果（L*a*b*
色座標情報）を Table 1 及び Fig. 4 にまとめた。いずれのサンプルも窒化温度 600 ℃では +L* が最大値になり、さらに窒化温度が高くなることにつれ、明るさが減少した。窒化温度の増加に伴い、BNA の +a* 及び +b* が減少し、赤Table 1 Color parameters of samples with different nitridation
times（30, 60 and 120 min）in terms of CIELAB system
GroupsAna.

みと青みが単調に減少した。BNR の -a* が増加、+b* が減
少傾向となり、緑調及び青みが減少した。BNB に関して、窒化温度変化による -a* と +b* の変化がそれほど大きくな

Rut.

い傾向となった。基本的には、窒化時間は結晶相及び色ベースに対する影響が少ないが、光吸収と色彩の度合いに影Bro.

響をもたらし、窒化時間を変化させることにより、粉体色− 26 −

Samples

L*

a*

b*

h˚

C

BNA_30

39.15

10.01

6.29

32

12

BNA_60

39.61

9.01

6.17

34

11

BNA_120 37.36

7.75

4.51

30

9

BNR_30

53.44

-4.12

4.03

316

6

BNR_60

60.52

-3.83

4.54

310

6

BNR_120

47.70

-3.32

2.69

321

4

BNB_30

56.63

-3.28

7.12

295

8

BNB_60

60.41

-2.92

6.61

294

7

BNB_120 54.60

-3.35

6.99

296

8

カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価

Fig. 4The dynamic changes in L* a* b* parameters were darwn as the function of nitridation time

Fig. 5The B 1s XPS spectra of three B-TiO2 before（left）and after（right）nitridation at 600℃に変えることにより、複合イオン共ドープ酸化チタンは赤ドーピングのドーピング状態及び各結晶の構造とエネルギ

色や緑色等をもたらすことが可能である 4）。Fig. 5 に窒化ーバンド構造に依存し、ドーピング量の精密制御により、処理前後のサンプルの B 1 s XPS スペクトルを示す。結合

さらなる詳細な色制御できることが期待される。

10）

エネルギーが 190 eV 付近のピークは、置換型 B（Bsub） に

Fig. 7 に N-TiO 2 と BN-Ana、BN-Rut、BN-Bro 3 つの対応し、192 eV 付近のピークは格子間型 B（Bint）6）に由来相を有する BN-TiO 2 のバンドギャップ構造と粉体のカラする。窒化処理後ピーク強度が逆転し、Bsub/Bint の比率がーイメージを示す。アニオン元素ドーピングは TiO 2 中に大きく変化した。すなわちNの導入により、格子間型B（Bint）

2 種類の原子状態（格子間型（Nint、Bint、）と置換型（Nsub、Bsub）の生成が促進されることが分かった。また、窒化処理後を引き起こし、格子間窒素とホウ素の濃度は、B 及び N エのサンプルの N 1 s スペクトルより、B/N-Ana、B/N-Rut、

ネルギー準位の統合の程度に影響を与え、これが可視光領

3+

B/N-Bro のいずれも Ti の存在（点線）を示唆した（Fig. 6）。

域の吸収の主な原因と考えられる。単一窒素ドープ酸化チTable 2 に は、XPS 測 定 に よ り 同 定 し た 3 種 の BN-

タンは価電子帯の上方 0 . 59 - 0 . 75 eV のところに N 1 s 準位

TiO 2 の表面元素組成を示す。B と N はいずれも格子間型が形成され、粉体は黄色を示す 2 - 3 , 9）。一方 B と N コドープ（int）と置換型（sub）ドープが存在し、アナターゼ相の場合

した酸化チタンの価電子帯の上方に N 1 s 準位のほか、格4 . 4 at. % B と 1 . 31 at. % N が含まれており、ルチル相とブルッカイトの場合、それぞれ、3 . 5 at. % B、1 . 7 at. % N と
1 . 92 at. % B、1 . 43 at. % N を含有し、結晶相によって、ドーピングされた量が変化することが分かった。さらに窒化温度の上昇により、B と N のドーピング量が上昇し、700℃窒化処理では、BNA、BNR、BNB における B と N のドーピング量はそれぞれ 6 . 25、3 . 20、5 . 85 at. % B 及び 2 . 15、
2 . 34、2 . 46 at. % N となった。異なる着色はホウ素と窒素

Table 2 Surface elemental composition of three BN-TiO 2
measured by XPS without Ar+ sputtering treatment
Samples

B at. %

N at. %

Tot.

Bint*

Bsub*

Tot.

Nint

Nsub

4.40

3.71

0.66

1.31

0.37

0.94

BN-Rut

3.51

3.00

0.51

1.70

0.58

1.12

BN-Bro

1.92

1.34

0.58

1.43

0.48

0.95

BN-Ana*int./sub.: intermediate / substitutional doping− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 6 The N1s XPS spectra of ⒜ B/N-Ana, ⒝ B/N-Rut, ⒞ B/N-Bro fitted by Ti4+. The deviations（dash line）mean the existence of Ti3+
Table 3 Color parameters in terms of CIELAB system andcolor images for BNA, BNR and BNB samples synthesized
at various temperatures
Groups Samples*

Ana.

Rut.

Fig. 7 Predicted band gap structures and color images of
N-TiO 2 and three phases of BN -TiO 2（B/N-Ana; B/
N-Rut,; B/N-Bro）

子間 Bint も存在し、N 1 s と格子間型 B 1 s（Bint）が幅広いハ
イブリッド準位が形成され、伝導体下方に置換型 B（Bsub）

Bro.

L*

a*

b*

h˚

C

BNA500 44.77 5.00 9.49

62

11

BNA550 39.73 8.95 7.04

38

11

BNA600 39.61

34

11

9.01

6.17

BNA650 37.39 6.55 4.34

34

8

BNA700 34.28 0.92 0.47

27

1

BNR500 57.98 -2.89 2.41 320

4

BNR550 52.93 -3.66 2.81 322

5

BNR600 60.52 -3.83 4.54 310

6BNR650 40.06 -2.41 0.30 353

2

BNR700 35.69 -1.56 -2.18

54

3

BNB500 62.89 -2.53 5.93 293

6

BNB550 61.50 -3.08 6.78 294

7BNB600 60.41 -2.92 6.61 294

7

BNB650 48.96 -2.55 4.39 300

5BNB700 43.85 -1.88 0.27 352

2

Color
images*Number in the sample name denoted the nitridation temperatures.

が存在する。同時に、アナターゼ、ルチル、ブルッカイト
本来の価電子帯レベルにもわずかな差が存在することが関準位の形成傾向が強い。尚、Bsub は、伝導帯（CB）に近い浅

わり、結果として異なる結晶相を有する酸化チタンに遷移いトラップ状態であり、赤外線吸収を引き起こし、1 , 000 nm

金属フリーなカチオンコドープすることにより、赤や緑等+
近辺、ルチルに多めに存在するTi 3（Fig.
6 ⒝）とBsub の連携

カラフルな酸化チタン粉体を得ることができた。BN-Ana

により、可視光領域で顕著な吸収をもたらす 7 , 8）。しかし及び BN-Bro の N と B 間の相互作用は、広いハイブリッド

ながら、BN-Ana は、Ti 3 + の量が少なく、長波長領域光にエネルギーレベルを形成し、400 〜 750 nm での広範な吸対する吸収が少なく、800 nm を超える波長範囲ではスペ

収をもたらす。

クトルは平坦であり、多量の B（Bsub と Bint 合計 4 . 4 at.％）

尚、Table 2 に 示 す よ う に、BN-Bro の Bint の 量（1 . 34

が存在するため、バレンスバンド（VB）に連続したハイブat.％）は、BN-Ana（3 . 71 at.％）と比較して非常に少なく、リッド準位の存在による吸収波長の明確なシフトをもたら

BN-Bro の吸収端の拡張は限定的になり、400 〜 750 nmしたと考えられる 6）。

の範囲での吸収強度は BN-Ana よりも低くなった。また、

Table 3 には様々な窒化温度で合成された BNA、BNR、

BN-Rut では、N ドープ量は 1 . 70 at.％に達しており、BN-

BNB サンプルの色空間 CIELAB 指数と粉体カラーイメー

Ana 及び BN-Bro（1 . 31 - 1 . 43 at.％）より高く、独立した Nジを示す。BNA シリーズサンプルは黄 - オレンジ - 赤色

− 28 −

カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価

Fig. 8 ⒜ NO photodegradation capacity of various photocatalysts. Degussa P25 was regarded as reference to evaluate thephotocatalytic activity of each BN-TiO2. The columns with orange, green and purple color represent the different degradation
ability under λ>510nm, λ>400nm and λ>290m nm light irradiation, respectively. ⒝ The results of five times cycling
experiments under successive visible light irradiation（λ>400nm）．N is cycling times. The NO conversion ratios were acquiredby solving the average for NO concentration nearby the lowest level.

調が中心となり、窒化温度の上昇により、明るさ（+L*）とった結果、テスト後に触媒活性は約 17 . 9 % に落ち、初期

黄色（+b*）色調が減少傾向となり、赤み色調（+a*）は 500 -活性の約 44 ％が低下した。一方、BN-Ana と BN-Rut の

600 ℃窒化処理時最大値（～ 9）を示した。BNR シリーズサ

光触媒活性は、非常に低い光触媒活性を示し、BN-Ana とンプルは灰色からシアン色調が中心となり、600 ℃窒化処

BN-Rut が無毒顔料及び化粧品用途における潜在的な候補

理時では、明るさ（+L*）と黄色（+b*）が最大となるが、700材料であることを示唆した。

℃窒化処理では、明るさ（+L*）
が減少し、青み（-b*）が急激

Fig. 9 に様々な窒化温度で合成された各種着色酸化チタに増える結果となった。BNB シリーズサンプルは黄緑色

ンの光触媒活性を示す。比較のため Degussa-P 25 酸化チ調が中心であり、窒化温度の上昇により、明るさ（+L*）とタンを参照として用いた。合成したサンプルの触媒活性は黄色（+b*）が減少傾向だが、赤み（+a*）が増加した。通常

窒化温度によって変化することが分かった。λ > 510 nm にの白色酸化チタンは、優れた光触媒活性を有することが知おける触媒活性に関して、BN-Ana シリーズサンプルはられている。しかしながら、顔料や化粧品として利用され全く活性を示さないことに対し、BN-Rut シリーズは僅かる際に、光照射を受け、価電子帯と伝導体にホールと電子

な活性、BN-Bro シリーズは比較的高い活性を示した。尚、が生成され、そのホールの酸化力と電子の還元力に由来す

600 ℃窒化温度で得られたサンプルの光触媒活性は最大値

る光触媒活性は有機物や皮膚の DNA 等に対し化学反応を起こし、ダメージを与えてしまうことが懸念される。
Fig. 8 に合成された各種着色酸化チタンの光触媒活性を示す。比較のため標準サンプルとして Degussa-P 25 酸化チタンも用いて評価した。照射光は各種フィルターを掛けることにより λ > 510 nm、λ > 400 nm、λ> 290 mnm に制御し、それぞれ青色光を含まない可視光、可視光及び紫外線（＋可視光）を見なすことができる。NO 変換率は、初期濃度及び分解後 NO 濃度の平均最低値によって算出された。波長が短くなると、光のエネルギーが強くなり、見かけ上の光触媒活性が高くなる。BN-Bro は Degussa-P 25
酸化チタンと同程度の紫外（> 290 nm）と青色を含まない可視光（λ > 510 nm）励起活性を有するが、λ > 400 nm 可視光
照射下では、32 . 0 % の NOx（1 ppm, 200 mL/cm 3）を連続的に分解でき、P- 25 を超える高い触媒活性を有することが分かった。また、BN-Bro の光触媒耐久性についても検証し、λ> 400 nm 連続可視光照射下で 5 回サイクル実験を行Fig. 9 Light-driven NO decomposition ability of each
prepared sample. The columns are grouped by crystal
phases. Red is for anatase, blue is for rutile and green isfor brookite.

− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022を示した。λ > 400 nm における触媒活性に関して、同様

Shu Yin, Synthesis of colorful nonmetal doped TiO2に 600 ℃窒化温度で得られたサンプルの光触媒活性は最and the achievement of corresponding color gradation

大値を示した。λ > 290 nm の紫外線励起触媒活性は、BN-by crystal-phase engineering, 2020 年度 東北大学環境

Ana シリーズサンプルは触媒活性の変化傾向が変わり、窒

科学討論会 , 仙台 , 2020.10.30.

化温度上昇に伴い、触媒活性が単調に低下した。BN-Rut

3） 殷シユウ、曹ジンヂ、朝倉祐介、長谷川拓哉、PCT/及び BN-Bro シリーズサンプルは、600 ℃窒化温度で得らJP2021/028401（特願 2020-130912），二酸化チタン着

れたサンプルの光触媒活性は最大値を示した。Fig. 8 同様、色粒子及びその製造方法、並びに酸化チタン粒子混合物、

BN-Ana と BN-Rut の各サンプルは、非常に低い光触媒活2021 年 7 月 30 日．

性を示し、顔料としての有効性をうかがえる。

４．総４）Jingdi Cao, Takuya Hasegawa, Yusuke Asakura, Shu
Yin, Synthesis of B and N Co-doped Anatase, Rutile括

and Brookite TiO2 with Diverse Characteristic Optical

酸化チタンは光触媒や白色顔料としての応用が知られてProperties, 日本セラミックス協会 基礎科学部会、第 59いる。これまで、光触媒の機能性を向上及び無機顔料の色

回 セラミックス基礎科学討論会（オンライン）2021.1.7-

付与は、様々な遷移金属元素の添加が利用されている。し1.8, CBS2021-H11

かし、金属イオンドープにより酸素欠陥等を生じ、光触媒

5） Jingdi CAO, Takuya HASEGAWA, Yusuke ASAKURA,

活性向上の妨げになるケースが多く存在すると共に、遷移

Peng SUN, Shuo YANG, Bin LI, Wenbin CAO, and Shu

金属イオンの毒性により、化粧品原料として利用する際にYIN, Synthesis and Color Tuning of Titanium Oxide

は安全性リスクが懸念される。本研究では、酸化チタン以Inorganic Pigment by Phase Control and Mixed-Anion

外の遷移金属を利用することがなく、アニオンドープによ

Co-doping, Adv. Powder Technol., 33, 103576, 2022.

る材料の修飾及び機能性の大幅向上を実現し、様々な色を

6） J i n g d i C A O , T a k u y a H A S E G A W A , Y u s u k e

有するカラフルな酸化チタンを合成できる手法を確立した。

ASAKURA, Akira YAMAKATA, and Shu YIN,

また、異なる相組成による色制御メカニズムを解明し、光Synthesis of Crystal-Phase and Color Tunable

触媒活性の有無を制御・作り分けが可能であり、触媒活性

Mixed Anion Co-Doped Titanium Oxides and theirを抑制することにより、化粧品を含む様々な無機顔料としControllable Photocatalytic Activity, Submitted andての応用が大きく期待される。さらなる色バリエーション

under review.

の拡張及び化粧品としての詳細な適応性評価は今後の課題であるが、複合アニオンによるバンドギャップ制御技術（引用文献）の確立により、多くの他の無機酸化物への適用が期待され、

1） A. Y. Nazarova and N.I. Radishevskaya, Inorganic

コスメトロジーだけではなく、顔料、塗料等を含め、光触pigments based on transition-metal oxometallates for媒等様々な新規機能性創出及びその原理の究明により、学

protective and decorative aluminophosphate-bonded

術的だけではなく、産業界にも大きなインパクトが期待さ

coatings, J. Physics: Conf.Ser., 1459, 012018, 2020.

れ、社会インフラのグリーン化において重要な役割を果た

2） R. Asahi, T. Morikawa, T. Ohwaki, K. Aoki and Y.

しグリーンイノベーションの推進・豊かな生活環境の構築

Taga, Visible-light photocatalysis in nitrogen-dopedに貢献すると期待される。

titanium oxides、Science, 293, 269-271,2001.
3） S.Yin, Y. Aita, M. Komatsu, and T. Sato, Visible-

謝辞Light Induced Photocatalytic Activity of TiO 2-xN y

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス

Prepared by Solvothermal Process in Urea ‒ Alcohol

メトロジー研究財団によりご助成いただきましたことに心より感謝申し上げます。

System. J.Euro.Ceram.Soc., 26, 2735-2742, 2006.
4） J.Cao, T. Hasegawa, Y. Asakura, P. Sun, S. Yang, B.
Li, W. Cao, and S. Yin, Synthesis and Color Tuning of

本研究助成により得られた成果

Titanium Oxide Inorganic Pigment by Phase Control

1） Jingdi Cao, Yusuke Asakura, Takuya Hasegawa, andand Mixed-Anion Co-doping, Adv. Powder Technol.,Shu Yin, Synthesis and Photochemical Performance33, 103576, 2022.

Evaluation of Colorful Three Phases TiO2, 公益社団法

5） J. Tauc, Optical properties and electronic structure人日本セラミックス協会 2020 年年会、東京、2020.3.18-

of amorphous Ge and Si, Mater. Res. Bull., 3, 3 7-4 6,

20,（2Q02）．

1968.

2） Jingdi Cao, Takuya Hasegawa, Yusuke Asakura and6） G. Liu, L.-C. Yin, J. Wang, P. Niu, C. Zhen, Y. Xie,

− 30 −

カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能評価

and H.-M. Cheng, A red anatase TiO2 photocatalyst forsolar energy conversion, Energy Environ. Sci., 5, 96039610, 2012.

Phys. Chem. C, 113, 20543-20552, 2009.
9） S.Yin, Y. Aita, M. Komatsu, J.Wang, Q. Tang, and
T. Sato, Synthesis of Excellent Visible-light Induced

3+7） P.Wang, C. Jia, J. Li, and P. Yang, Ti -doped

TiO2-xNy Photocatalyst by Homogeneous Precipitation-

TiO2 B/anatase spheres prepared using thioglycolic

Solvothermal Process. J.Mater.Chem., 15, 674-682.2005,

acid towards super photocatalysis performance J.

10）E. Finazzi, E., C. Di Valentin, and G. Pacchioni,
Boron-Doped Anatase TiO 2 : Pure and Hybrid DFTAlloys Compd., 780, 660-670, 2019.
8） C. Di Valentin, G. Pacchioni, and A. Selloni, Reduced
and n-Type Doped TiO 2: Nature of Ti

3+Species, J.

− 31 −

Calculations, J. Phys. Chem. C, 113 , 220 - 228 , 2008 .

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動
東京大学大学院新領域創成科学研究科物質系専攻

上沼

駿太郎

We recently reported the formation of a pseudo-polyrotaxane nanosheet (PPRNS), which possesses a self-assembled
nanosheet structure bearing a pseudo-polyrotaxane (PPR) consisting of β-cyclodextrins (β-CDs) and a carboxyl-terminatedpoly(ethylene oxide)75-b-poly(propylene oxide)29-b-poly(ethylene oxide)75 triblock copolymer (EO75PO29EO75-COOH). In
this study, we investigate the ability of PPRNS to load fluorescent probes, the dissolution mechanism of PPRNS into solventby heating, and the adhesion behavior of PPRNS to uneven material surfaces. The fluorescent probes without methyl groups
were not absorbed by PPRNS. These results indicate that PPRNS has a molecular recognition property based on the host−
guest interaction of the functional groups on probe molecules and molecular-sized spaces of PPRNS surfaces, which may bevacant β-CDs and voids between β-CD columns. The dissolution mechanism of PPRNS was investigated from the viewpointof crystallinity, particle morphology, and PPRNS concentration through proton nuclear magnetic resonance spectroscopy,
scanning electron microscopy, and X-ray scattering analysis. The results revealed that the PPRNS dissolved in two steps
during heating. First, β-CDs of the PPRNS de-threaded from the axis and the PPRNS dissolved in the out-of-plane direction
thinned while maintaining the rhombic structure. Upon further heating, both β-CD and the PPR dissolved, collapsing therhombic structure of the PPRNS in the in-plane direction—this occurred upon the melting of the β-CD crystals of the
PPRNS—thereby achieving an amorphous state. Finally, we could achieve observing the adhesion behavior of PPRNS to the
Blu-ray disk substrate (1D bending), polystyrene spherical beads (2D bending), and random rough surface of pork skin. In
the future, we will further elucidate the basic mechanism, investigate molecular loading and sustained-release capabilities,
and discover the potential of this material as DDS material.

１．緒

（a）

言

膜厚が 100 nm 以下で大面積を有する粒子はナノシートと呼ばれる。材料は薄いほど柔軟であり、ナノシートは特に大きな柔軟性を有するため、標的物の凹凸に対してフレキシブルに追従できる。これにより密接に大面積で材料表
面と近距離相互作用することで強力な接着特性を示す。近

（c）

（b）

年、ナノシートに薬剤を担持させることで、高接着性の農薬・生体・化粧品材料への応用を目指した研究が注目されている。しかし従来のナノシート材料は無機物質から成り、
生体安全性が懸念されている。
我々はごく最近、高生体安全性と分解性を同時に有す

Fig. 1PPRNS の形成モデルと構造

る全く新しいナノシート材料である擬ポリロタキサンナ
ノシート（PPRNS）の作成に成功した 1 ‒ 3）。環状オリゴ糖でし、その後 β-CD の直径方向にのみ結晶が成長することある β- シクロデキストリン（CD）と生体適合性の高い poly

で PPRNS が形成される。走査型電子顕微鏡観察（SEM）や（ethylene oxide）7 5 -b-poly（propylene oxide）2 9 -b-poly

原子間力顕微鏡（AFM）測定により詳細な構造が明らかと（ethylene oxide）75（EO 75 PO 29 EO 75；下付き文字はユニッなっている（Fig. 1 b, c）1）。本研究では、生体材料やドラ

ト数）トリブロックコポリマーを室温の水中で混合する

ッグデリバリーシステム（DDS）としての応用を見据えて、だけで PPRNS は自発的に形成される（Fig. 1 a）
。β-CD はPPRNS の低分子担持能力、PPRNS の溶解挙動、およびブロックコポリマー中央の PO 部位のみを選択的に包接

PPRNS の材料表面への接着挙動について明らかにした。

２．方Self-Assembled Nanosheet Composed of
Cyclic Oligosaccharides: Drug loading andrelease properties and adhesion behavior
Shuntaro Uenuma
Graduate School of Frontier Sciences, The
University of Tokyo法2 . 1. PPRNS の作成
重水を溶媒に用いた PPRNS の作成手順を次の通りである。16 mg/mL の β-CD を重水中に加え、加熱することでほぼ完全に溶解させた。この β-CD 重水溶液を室温に戻したあと、4 mg/mL の両末端カルボン酸化 EO 75 PO 29 EO 75− 32 −

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動（EO 75 PO 29 EO 75 -COOH）を溶解させ、数日間静置するこを Si 基板上にドロップキャストし、次に PPRNS 水分散とで PPRNS 重水分散液を作製した。また PPRNS 濃度を

液 30 µL を滴下してポリスチレン球上に PPRNS を載せた。

濃縮した試料を次のように作成した。遠心分離によって

豚皮：PPRNS 水分散液 30 µL を豚皮上に滴下し乾燥させた。

PPRNS を沈殿させ、75 vol% の上澄みを除去することで

３．結PPRNS 濃度を 4 倍に濃縮した。低分子担持と溶解機構解明の実験ではこの PPRNS を用いた。また両末端アミノ

果

3 . 1. PPRNS への低分子担持

4）化 EO 75 PO 29 EO 75（EO 75 PO 29 EO 75 -NH 2）を用いて PPRNS

種々の蛍光分子を PPRNS 重水分散液に添加した後の蛍試料を同様に準備し、材料表面への付着実験ではこの

光顕微鏡観察像を Fig. 2 に示す。輝度が高い粒子は蛍光分

PPRNS を用いた。

子を担持した PPRNS であり、輝度の低い粒子は蛍光分子を排斥していることを示す。これらの結果から、化学構造

2 . 2 . PPRNS への低分子担持実験と定量のわずかな違いによって PPRNS への担持の可否が異なる

PPRNS へ担持させるモデル分子として、蛍光分子であことがわかった。

るローダミン（R）6 G、R 123、R 590、Uranine、RB、R 640

PPRNS に担持された RG と R 590 に対し、担持量の定量

を PPRNS の分散液に加えて蛍光顕微鏡観察を行い、これ解析を行った。その結果、RG と R 590 の担持量は PPRNS

らの色素の H 2 O-PPRNS への担持の可否を調べた。またを構成する CD の mol 量に対してそれぞれ 2 . 7 mol% および

R 6 G と R 590 は重水中の PPRNS に担持されたので、遠心4 . 3 mol % であった。

分離により沈降として回収し、上澄みを紫外可視吸収スペ

PPRNS への蛍光分子の担持において、Fig. 2 中の化学

クトル（UV-vis）測定することで R 6 G と R 590 が PPRNS へ

構造に赤線で示した官能基が重要な役割を果たしていると担持された量を調べた。

考えられる。これらの官能基は立体的に小さく疎水的である。PPRNS の表面には CD の結晶構造に由来する分子サ

2 . 3 . 加熱によるPPRNS の溶解の機構

イズの空孔が存在するため、それらの空孔と官能基が相互

PPRNS の重水分散液は加熱することで溶解する。各温作用したと考えられる（Fig. 3）。蛍光分子はサイズの観点度において PPRNS の重水分散液に対してプロトン核磁気から PPRNS の内部に侵入することは難しいため、低分子共鳴（1 H NMR）測定を行うことで、加熱による PPRNS かは PPRNS の表面のみに付着したと考えられる。それにもらの β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の溶解量の定量を行関わらず有意な量の分子担持を実現できたことは、表面積った。マレイン酸を標準物質として使用し、PPRNS 分散が極めて大きいナノシート形状の恩恵と言える 4）。

液とマレイン酸重水溶液が混合しないように特殊 NMR 管（二重 NMR 管）を用いて測定を行った。内管に少量のマレ

3 . 2 . PPRNS の溶解機構

5）

イン酸標準物質の重水溶液を、外管に 600 µL の PPRNS 重PPRNS は DDS 材料などへの利用が展望されている。薬

水分散液を封入することで両者が混合しないので、分子が物の徐放性を制御するために、PPRNS の溶解機構の理解

互いに干渉することなく 1 H NMR を測定することができは重要である。本研究では、PPRNS が加熱により溶解する。EO 75 PO 29 EO 75 -COOH および β-CD の濃度の算出にある際の機構を 1 H NMR による組成解析や種々の構造解析

たっては、EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の PO 部位のメチル基に手法を用いて調べた。

由来する 1 ppm 付近のピークと、β-CD の 2 つの O 原子が

重 水（D 2 O）を 用 い て 作 成 し た PPRNS 分 散 液 に お い

結合している C 1 H に由来する 5 ‒ 6 ppm のピークの積分値て、PPRNS は加熱により溶解する。PPRNS から溶解しを用いた。

た β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の量を定量するために
1

2 . 4 . PPRNS の材料表面への付着

H NMR 測定を用いた。1 H NMR 測定によって溶解した成分は検出されるが、固体である PPRNS は検出されない 4）。

PPRNS をブルーレイディスク（BD）や半径約 1 . 43 µm の

PPRNS が溶解した場合、1 H NMR スペクトルの β-CD とポリスチレン球、豚皮などの凹凸・曲面を有する材料表面

EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の PO 部位に由来するピークの積分

上に PPRNS を付着させ、SEM 観察または AFM 測定を行

値の増加は、PPRNS からの溶解量を示す。

うことで PPRNS の付着挙動を調べた。PPRNS を各材料表

Fig. 4 a, b は そ れ ぞ れ β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH

面に付着させる方法は次の通りである。BD：BD 表面のを混合した直後の溶液と混合後 1 週間経過した重水溶液

フィルムを粘着性テープで剥がし、ディスク記録層を露出の 1 H NMR スペクトルである。β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -させ PPRNS の付着対象とした。BD を PPRNS 水分散液にCOOH に由来するピークの積分値が時間とともに減少し

2 秒間浸した後、表面を水で 2 秒間ほど洗浄し、乾燥させたことから、PPRNS が形成したことがわかる。次に 23 ˚C でた。ポリスチレン球：ポリスチレン球の水分散液（30 µL）

1 週間形成させた PPRNSを 90 ˚C に加熱し 1 H NMR 測定を− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 2 化学構造が異なる蛍光分子を PPRNS 分散水に添加した後の蛍光顕微鏡観察像

Fig. 3 Schematic illustration of the interaction between the
methyl groups a and c of R6G and the PPRNS surfaces.
Only the movement of groups a and c are constrained.

− 34 −

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動行った（Fig. 4 c）。β-CDのC 1 HプロトンとEO 75 PO 29 EO 75 COOH の CH 3 プロトンのピークの積分値は加熱により増加した。ここで、23 ˚C の形成開始時（t = 0）における溶液のβ-CD の C 1 H と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の CH 3 の積分値をそれぞれ Ii_CD、Ii_axis とし、形成開始から 1 週間後の溶液においてそれぞれ ICD（23 ˚C）、Iaxis（23 ˚C）とする。同様に温度 T におけるそれぞれの積分値を ICD（T）および Iaxis（T）とする。各温度におけるPPRNS中のβ-CDと軸の溶解度（XCD（T）、Xaxis（T））は以下のように示される。
……（1）
……（2）
ここで、Ii_CD-I_CD（23 ˚C）、Ii_axis-I_axis（23 ˚C）は、23 ˚C に
おいて PPRNS を構成する β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOHの量に対応する。またICD（T）-ICD（23˚C）、Iaxis（T）-Iaxis（23˚C）
は、各温度への加熱により PPRNS から溶解した β-CD お
よび EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の量に対応する。Fig. 5 は XCD（T）と Xaxis（T）の温度に対するプロットである。このプロットから、PPRNS の β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH は加熱により溶解し、80 ˚C 以上で XCD（T）と Xaxis（T）はほぼ
100 % に達することがわかる。さらに PPRNS を構成する
β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の量を求めることができ、
1
118 . 8 mg mL-（16. 5 mmol L- 1）のβ-CDと 7 . 0 mg mL-（0. 83mmol L- 1）の EO 75 PO 29 EO 75 -COOH であることがわかった。
PPRNS の XCD（T）と Xaxis（T）の温度に対するプロット
Fig. 4 1H NMR spectra of PPRNS ⒜ immediately after
mixing ㌼-CD and EO75PO29EO75-COOH in D2O, ⒝ 1 week
after its formation, and ⒞ heated to 90℃（Fig. 5）から、23 - 35 ˚C の範囲では β-CD と EO 75 PO 29 EO 75 COOH は溶解しないことがわかる。一方で中温域（35 ‒ 55℃）では、XCD（T）は 17 %、Xaxis（T）は 1 . 2 %（53 ℃）となった。β-CD が EO 75 PO 29 EO 75 -COOH に比べて優先的に溶解しており、PPRNS 中の β-CD が軸から脱包接したことを示唆する。さらに加熱して 55 ˚C 以上になると溶解が急激に加速し、82 ˚C で XCD（T）と Xaxis（T）はほぼ 100 % に達した。この結果から、PPRNS の溶解過程は 3 段階（23 ‒ 35 ˚C、
35 ‒ 55 ˚C、55 ˚C 以上）に分けられることがわかった。
PPRNS の構造変化を解析するために、PPRNS の重水
分 散 液 を 30、50、60、70、95 ˚C に 加 熱 し て 5 分 間 保 持
し、PPRNS を Si 基板上に載せ SEM 観察を行った（Fig. 6）。
PPRNS は 30、50、60 ˚C では単斜晶構造を反映した菱形が観察された。一方で 70 ℃では菱形構造が乱れ、95 ℃では構造体がほとんど観察されなかった。PPRNS の構造変化を定量的に解析するために、各温度の PPRNS について
300 - 400 個の粒子をカウントして平均面積を求め温度に対してプロットした（Fig. 6）。平均面積は 50 ˚C まではほとFig. 5 Plots of X CD（T ）and X axis（T ）of PPRNS D 2 O
dispersion as a function of temperature.

んど変化せず、60 ˚C で平均面積は減少した。これは面内方向の分解が進行したことを示しており、70 ˚C に加熱し− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 6 SEM images of PPRNS prepared at 30, 50, 60, 70, and 95℃ and the average area of PPRNS
as a function of temperature.

⒜⒝Fig. 7 ⒜ WAXS patterns of PPRNS D2O dispersion at different temperatures. ⒝ The relative
peak area of the 020 plane (R 020, the initial value is 1）as a function of temperature.

た PPRNS の平均面積はさらに減少した。95 ˚C では、ほとを温度に対してプロットした（Fig. 7 b）。R 020 は 55 ˚C までんどすべての粒子が溶液中に溶解した。これらの結果は徐々に減少し、55 ˚C 以上では急速に減少した。65 ˚C にな

PPRNS の溶解が温度の上昇に伴って促進したことを示しると R 020 はほとんど消失した。約 55 ˚C を境に R 020 の温度ており、1 H NMR の結果と整合している。

依存性が異なることから、PPRNS の β-CD 結晶の溶解に加熱によるPPRNS の結晶化度の変化をWAXS により測は 2 種類の機構が存在することが示唆された。

定した（Fig. 7a）。30 ˚C において 2 ϑ= 7. 3 °、9 . 8 °、12 . 0 °、小 角 X 線 散 乱（SAXS）測 定 を 用 い て 重 水 中 の PPRNS

14 . 6 °、15 . 3 °、17 . 7 °、19 . 7 °に回折ピークが観察された。

の構造と加熱による構造変化を調べた（Fig. 8）。30 ˚C のこれらのピークはそれぞれ β-CD の単結晶構造の（020）、

PPRNS 重水分散液の SAXS プロファイルにおいて、ナノ（200）、
（112）
、
（040）
、
（310）
、
（240）
、
（241）
面に対応する。

シートの形状因子が観測された。PPRNS において β-CD

そして加熱によりこれらのピーク面積は減少した。これら

結晶層の電子密度が高いため、SAXS プロファイルにはのピーク面積の減少は β-CD 結晶が非晶化または溶解した

β-CD 結晶層に由来する散乱が主に観測される。このことことを示す。PPRNS について、020 面の相対ピーク面積から β-CD 結晶層がナノシート形状をとっていることがわ（R 020、30˚Cにおける 020 面のピーク面積を初期値 1 とする）

かった。さらにフィッティングにより、このナノシートの− 36 −

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動解するという結果と一貫する。PPRNS 重水分散液を 65 ˚C

厚さは約 10 . 5 nm と評価された。
PPRNS 重水分散液を 55 ˚C に加熱したところ、形状因に加熱すると、構造因子に由来するピークが観測された。

子のフリンジ（落ち込み）の位置は high q 側へシフトした。

二次ピークの q 値は一次ピークの q 値の 2 倍であることか

フィッティングにより、PPRNS の β-CD 結晶層の厚さがら、ラメラ構造が形成されたことがわかった。さらに一次

10 . 5 nm から 9 . 0 nm に減少したことがわかった。PPRNS

ピークの位置（q = 0 . 0099 Å- 1）から周期長が 63 nm である

中の β-CD が軸から脱包接することで β-CD 結晶層が薄くことがわかった。この値は EO 75 PO 29 EO 75 -COOH の伸び

1なったと考えられる。この結果は、 H NMR 測定で得ら

きり鎖長である 63 nm と等しいことから、EO 75 PO 29 EO 75 -れた、中温域（35 ‒ 55 ℃）では β-CD のみが PPRNS から溶

COOH が伸びきった状態で積層していることが示唆される。ここで、65 ℃では PPRNS の β-CD 層は非晶質であることが WAXS 測定からわかっている。β-CD 層が非晶化することにより、β-CD が PO 鎖だけでなく EO 鎖の一部も覆い、軸全体に分散した β-CD が軸を引き伸ばしたと考えられる。95 ˚C の PPRNS 重水分散液の SAXS プロファイルでは、ナノシートの形状因子は消失し、low q領域（q = 0.02Å-1以下）の散乱強度が大きく減少した。同時に、q ≈ 0 . 02 Å- 1にブロードなピークが観測され、数十ナノメートルオーダ
ーのミセルが形成されたことが示唆された。実際、同じ濃度の EO 75 PO 29 EO 75 -COOH 溶液について 95 ˚C で SAXS
測定を行ったところ同様の散乱パターンが観測された。
EO 75 PO 29 EO 75 は水中で、PO 鎖の疎水凝集によるミセルを形成することがよく知られている 6）。
加熱による PPRNS の構造変化のまとめを Fig. 9 に示す。23 ˚C から 30 ˚C では、PPRNS の構造変化はほとんど見られない。中温域（35 ‒ 55 ˚C）では、PPRNS 中の β-CD がFig. 8. SAXS patterns of PPRNS D2O dispersion at
different temperatures.

EO 75 PO 29 EO 75 -COOH から脱包接して溶解し、PPRNS のFig. 9 Schematic illustrations of the structural changes PPRNS in D2O upon heating.

− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

結晶性と菱形構造は維持されているものの薄層化が進行

PPRNS も同様に、凹凸のある材料表面に対して柔軟に折する。55 ˚C 以上では PPRNS の結晶性が低下し、菱形構造

れ曲がり追従し、高い付着性を示すことが期待される。周が大きく崩れ、EO 75 PO 29 EO 75 -COOH と β-CD が溶媒中に期的な凹凸（高さのギャップ = 25 nm、ピッチ = 200 nm）を大きく溶解する。この二段階の分解は、PPRNS における有するブルーレイディスク（BD）基板に付着した PPRNS に

β-CD のトポロジカルな拘束の異方性に基づく。PPRNS の

対して AFM 測定を行った（Fig. 10 a）。また AFM 像中の面外方向の分解は、β-CD が軸から 1 つずつ外れることに線に沿った高さプロファイルを Fig. 10 b に示す。PPRNSより生じるため、より低い温度で起こる。一方で面内方向

は表面の凹凸に追従して一次元的に曲がっていることが確の分解は、β-CD が軸上で積層したカラムナー構造体（約認された。円の関数のフィッティングにより、曲げ半径は10 個の β-CD から成る）間の水素結合を同時に切断する必200 nm であることがわかった。さらに半径 1 . 43 µm のポ

要があり、β-CD が 1 つずつ脱包接するよりも高いエネル

リスチレン球に PPRNS を付着させ SEM 観察を行ったとこ

ギーが必要であるため、より高い温度で生じる。さらに加ろ（Fig. 10 c）、PPRNS は二次元的に屈曲し球に対して密接熱して 65 ˚C になると、PPRNS 中の β-CD 層は非晶化した。

に付着することが明らかになった。最後に PPRNS を豚皮

このとき β-CD は主に PO 鎖上に、一部は EO 鎖上に存在しに付着させ SEM 観察を行ったところ（Fig. 10 d）、PPRNSており、EO 75 PO 29 EO 75 -COOH は引き延ばされたコンフはランダムな凹凸を有する表面にも追従することがわかォメーションをとり、面間隔 63 nm のラメラ構造を形成しった。PPRNS の曲げの駆動力は、乾燥過程での液架橋力た。

とそれに続くファンデルワールス相互作用と考えられる。

3 . 3 . PPRNS の材料表面への付着

PPRNS は溶液中でシート形状を維持できるほどの硬さを7）有しているが、基板表面に付着したときには壊れずに折れ曲がることができる適度な柔軟性を有している。

ナノシート材料は一般に曲げ剛性が小さく柔軟に折れ曲がることができるため、付着性が高いことが知られている。
⒜

⒞

⒝

⒟

Fig. 10 ⒜ AFM image and ⒝ height profile of PPRNS on a BD substrate (1D bending); ⒞ SEM image of
PPRNS on a polystyrene spherical bead（2D bending）with a radius of 1.43 µm; and ⒟ SEM image of
PPRNS on a rough pork skin.

− 38 −

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特性と接着挙動

４．考3） U e n u m a , S . ; M a e d a , R . ; Y o k o y a m a , H . ; I t o ,察

K. Formation of Well-Defined Supramolecular

本研究では当研究室にてごく最近見出された新材料であMicrostructures Consisting of γ-Cyclodextrin andる擬ポリロタキサンナノシート（PPRNS）を用いて、生体

Polyether—Rods, Cubes, Plates, and Nanosheets—

材料やドラッグデリバリーシステム（DDS）への応用を見Guided by Guest Polymer Structure. Polymer. 2 0 1 9,

据えて、PPRNS の低分子化合物担持能、加熱によって液179, 121689.

中へ溶解する機構、凹凸のある材料表面への付着挙動を明

4） Uenuma, S.; Maeda, R.; Yokoyama, H.; Ito, K.

らかにした。今後はさらに詳細な基礎的機構を明らかにす

Molecular Recognition of Fluorescent Probe Molecules

るとともに、分子担持や徐放能を調べて、DDS 材料としwith a Pseudopolyrotaxane Nanosheet. ACS Macroての可能性を見出していきたいと考えている。

Lett. 2021, 10（2），237‒242.
5） Ando, N.; Uenuma, S.; Yokoyama, H.; Ito, K.

謝辞Thermally Induced Disassembly Mechanism of Pseudo-

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス

Polyrotaxane Nanosheets Consisting of β-CD and a

メトロジー研究財団よりご助成いただきましたことに心よ

Poly（Ethylene Oxide）- b -Poly（Propylene Oxide）

り感謝申し上げます。

- b -Poly（Ethylene Oxide）Triblock Copolymer. Polym.
Chem. 2022, 13（4），501‒507.

（引用文献）

6） Alexandridis, P.; Holzwarth, J. F.; Hatton, T. A.

1） Uenuma, S.; Maeda, R.; Yokoyama, H.; Ito, K.

Micellization of Poly（Ethylene Oxide）-Poly（Propylene

Autonomously Isolated Pseudo-Polyrotaxane

Oxide）-Poly（Ethylene Oxide）Triblock Copolymers

Nanosheets Fabricated via Hierarchically Orderedin Aqueous Solutions: Thermodynamics of Copolymer

Supramolecular Self-Assembly. Chem. Commun. 2019,

Association. Macromolecules 1994, 27（9），2414‒2425.
7） Uenuma, S.; Endo, K.; Yamada, N. L.; Yokoyama,

55（29），4158‒4161.
2） Uenuma, S.; Maeda, R.; Yokoyama, H.; Ito, K.

H.; Ito, K. Polymer Brush Formation Assisted byFormation of Isolated Pseudo-Polyrotaxane Nanosheet

the Hierarchical Self-Assembly of Topological

Consisting of α-Cyclodextrin and Poly（Ethylene

Supramolecules. ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13

Glycol）．Macromolecules 2019, 52（10），3881–3887.

（50），60446‒60453.

− 39 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析
島根大学医学部医学科免疫学講座

小谷仁司

Skin aging is one of the important problems in the cosmetics field that is difficult to control or improve. In recent
years, it has become clear that the functional deterioration due to skin aging is due to the SASP factor secreted by aging
cells. Therefore, we decided to search for a plant extract that specifically removes senescent cells in the skin by means ofsenolysis. In this study, we screened the senolytic effect of many plant extracts. Among them, we focused on the ginger
extract and performed a detailed analysis, but unfortunately, we could not clarify the selective activity of senescent cells.
However, it was suggested that the combination of some flavonoids and the anticancer drug dasatinib has a senolytic effect.
In the future, we would like to further search for the remaining plant extracts and contribute to the development of cosmetics
that are useful for improving skin aging.

１．緒

言

皮膚の老化は美容にとって最も目立つとともに、抑制・改善が難しい問題点の 1 つとなっている。加齢による皮膚細胞の老化だけでなく、日々の生活において、肌は日
光により UV 照射され、皮膚の細胞は酸化ストレスを生じ、DNA の損傷をはじめ皮膚細胞の老化が非加齢的にも生じている。また、酸化ストレスによる皮膚の老化だけでなく、皮膚のシミが生成することなどを気にするため、日焼け止めを塗り、日傘をさし、日光を避けるというのが現状における防御策となっている。本研究では、近年注目されてきている老化細胞除去薬（senolytic drug）という概念
を、皮膚の老化改善に適用することにより、新たな皮膚老化改善に有用な天然植物成分を見出すことができるのではないかと考え研究に取り組むことにした。これまでの皮膚

Fig. 1 細胞老化メカニズムと老化細胞除去薬（senolytic drug）
による皮膚老化改善作用

老化抑制などの方法論は、老化を起こす原因となる紫外線照射を防ぐ日焼け止めや、DNA 損傷を起こす酸化ストレ２．方スの抑制を目的に、抗酸化物質などが注目されていた。し法

かし、皮膚の機能低下は老化細胞が産生する老化細胞分泌

本研究では、株化培養細胞のケラチノサイトを用いて、因子（インターロイキン 6：IL- 6 をはじめとする炎症性サ

細胞老化を誘導し、in vitro において老化ケラチノサイト

イトカインなど）に大きく制御されていることから、老化と非老化ケラチノサイトに対する細胞生存率や細胞死誘導

細胞の増加を抑制するのではなく、老化細胞を特異的に取活性を比較することにより老化細胞特異的に細胞死を誘導

り除くという新たな方法論で皮膚機能を健康的に維持する（老化細胞除去）する天然植物成分を探索・機能解析するこことを目指し、老化細胞除去活性を有する天然植物成分のととした。また、これまでの研究で抗癌剤誘導性の細胞老探索を進めることとした。

化を起こすヒト癌細胞株に関しても同様の評価をおこなう
ことにより、老化細胞除去活性を持つ天然植物成分の絞り込みをおこなうこととした。

Search and functional analysis of natural
plant components that improve skin aging
Hitoshi Kotani
Department of Immunology Shimane
University Faculty of Medicine

2 . 1. 使用細胞株
株化されたヒトケラチノサイトである HaCaT 細胞はドイツ連邦共和国ガン研究センターより入手した。比較対象として使用するヒト癌細胞株は肺癌細胞株である A 549 細胞または乳癌細胞株である MDA-MB- 231 細胞を使用し− 40 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析た。HaCaT 細 胞 お よ び MDA-MB- 231 細 胞 は DMEM 培

クロプレートリーダーにより測定した。

地（高グルコース）に 10 % FBS と抗生物質のゲンタマイシ
ンを添加した培地を用いて 37 ℃ 5 %CO 2 存在下での培養をおこなった。A 549 細胞は RPMI 1670 培地に 10 % FBS

2 . 7. 細胞死の評価
解析と抗生物質のゲンタマイシンを添加した培地を用いて 37℃ 5 %CO 2 存在下での培養をおこなった。

Annexin V & PI染色とFACS

細胞死の測定は、APC 蛍光ラベルされた Annexin V と
Propidium Iodide（PI）を回収した細胞に添加し、FACS を用いて測定をおこなった。

2 . 2 . 使用植物エキス
本研究で使用する植物エキスは、生薬約 150 種類のメタ

2 . 8 . 細胞老化の誘導方法

ノール抽出エキスおよび、共同研究者により採取された沖他の研究者により既に HaCaT 細胞での細胞老化誘導が縄・奄美産植物エキスの 80 ％メタノール抽出エキスを利報告されている Bromodeoxyuridine（BrdU）の添加での方用し、100 µg/mL となるように調製して、細胞生存率を指法 1）でおこなうこととした。具体的には、BrdU 45 µM を標として非老化細胞と老化細胞の比較をおこなうことによ含む培地で 7 日間培養をおこなうことで細胞老化を誘導しり老化細胞除去活性をスクリーニングした。

た。比較対象とする癌細胞株の細胞老化誘導に関しては、
我々の研究室で既に確立している DNA ポリメラーゼ阻害

2 . 3 . ウエスタンブロット法剤の１つである aphidicolin 500 nM を含む培地で 5 日間培

細胞を回収し、PBS で洗浄した後に RIPA buffer を添加養をおこなうことで細胞老化を誘導した。これらの細胞老し、氷上で 30 分かけてタンパク抽出をおこなった。タン化が誘導されたことの確認は、老化細胞の指標となる p 21

パク定量をおこない、同タンパク量となるようにポリア

タンパクの発現や SA-β-gal 染色、細胞の肥大化などによクリルアミドゲルを用いて電気泳動をおこなった。その後、り確認をおこなった。

PVDF 膜に転写し、5 % スキムミルク溶液でブロッキング

３．結した後、1 次抗体および 2 次抗体と反応させ、画像解析装
置 Amersham imageQuant 800（Cytiva）によりタンパク発現を測定した。

果

皮膚の老化改善作用を調べるために、in vitro での細胞老化誘導をヒトケラチノサイトである HaCaT 細胞株に対して BrdU を添加し、７日間培養をおこない細胞老化を2 . 4 . Senescence associated beta
galactosidase（SA-β-gal）染色とFACS 解析誘導した。その結果、老化細胞の指標の１つである p 21

SA-β-gal 染色とその測定は、4 % パラホルムアルデヒとが確認された（Fig. 2）。さらに、老化細胞が産生する

ドで固定した細胞に基質である SPiDER-β Gal（同仁化学）

SA-βgal の発現を基質となる SPiDER-βGal を用いて確認を添加した後、フローサイトメーター（FACS）CytoFLEXをおこなったところ、BrdU 45 µM 添加後 7 日の細胞にお（BECKMAN COULTER）
を用いて測定した。

いて SA-β-gal 活性の増化が確認されるとともに、老化細のタンパク発現が BrdU の濃度依存的に増化しているこ胞の特徴である細胞の肥大化が確認された（Fig. 2）。この

2 . 5 . RNA 抽出とrealtime RT-PCR

細胞の肥大化に関しては、顕微鏡での形状観察と FACS に細胞を回収し、Nucleo ZOL（Takara）を用いて RNA 抽
出をおこない、さらに ReverTra Ace qPCR RT Master

よる細胞サイズをあらわす forward scatter（FSC）の増大で確認した。

Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて逆転写を

次に老化細胞除去活性を持つ天然植物エキスのスクリーおこない、作成した cDNA を用いて、realtime RT-PCR

ニングをおこなうにあたり、HaCaT 細胞だけでなく他のを お こ な っ た。Realtime RT-PCR は THUNDERBIRD

老化細胞を同時にスクリーニングして、活性を持つ植物のSYBR qPCR Mix（TOYOBO）を 用 い て Thermal Cycler

絞り込みをおこないやすくするため、ヒト肺癌細胞株であDice TP 900（Takara）により測定し、ΔΔCt 法により各る A 549 細胞を用いて、既に我々の研究室で確立されていmRNA 発現量の解析をおこなった。

る aphidicolin 誘導性細胞老化を利用することとした。このaphidicolin はセファロスポラム・アフィジコラという菌類

2 . 6. 細胞の生存率の測定（CCK- 8）assay

Cell Counting Kit- 8から単離された抗生物質の１つであり、DNA ポリメラーゼ阻害作用を持つ化合物である。A 549 細胞に aphidicolin細胞の生存率の測定は、96 well plate を用いてサンプル

500 nM を添加し、5 日間培養することにより細胞老化誘添加し培養したのち、細胞の入った well に CCK- 8 試薬（同

導をおこなった。A 549 に関しても細胞老化の確認のた

仁化学）を添加し、1 〜 2 時間後に各 well の吸光度をマイめ、SA-β-gal の発現確認と p 21 タンパクの発現確認をお− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 2 BrdU 添加により細胞老化誘導した HaCaT 細胞の解析
A. SA-β-gal 活性・細胞サイズの FACS 解析
B. p21 タンパク発現解析
C. SASP および抗アポトーシスタンパクの mRNA 発現解析

Fig. 3 Aphidicolin 添加により細胞老化誘導した A549 細胞の解析
A. SA-β-gal 活性・細胞サイズの FACS 解析
B. p21 タンパク発現解析
C. SASP および抗アポトーシスタンパクの mRNA 発現解析

こなった（Fig. 3）。さらに、細胞老化を誘導した HaCaT 細factor）2）の mRNA 発現を調べるために RNA 抽出をおこな胞および A 549 細胞に関して、組織の機能低下を起こす原い、realtime RT-PCR 法を用いて mRNA 発現量を非老化因となることが示唆されている老化細胞分泌因子（SASP

細胞と比較した（Fig. 2 , 3）。その結果、HaCaT 細胞におい− 42 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析て老化誘導された細胞でインターロイキン（IL）- 1 β、IL- 6、比較検討をおこなう方法として進めた。ここでは、既に老IL- 8 などの炎症性サイトカインの mRNA 発現が増化して化細胞除去薬として報告のある Bcl- 2 および Bcl-xL 阻害

いるとともに、細胞周期に関わる p 21 や抗アポトーシス剤である ABT- 2633）という化合物をポジティブコントロ

タンパクである Bcl- 2 および Bcl-xL などの mRNA 発現もールとして使用した。使用した植物エキスは生薬メタノー

増化していることが明らかになった。同様に A 549 に関し

ル抽出エキス 150 種類と奄美産植物 80 ％メタノール抽出ても老化細胞で IL- 1 β、IL- 6、p 21 などの mRNA 発現増

エキス 560 種類であり、現在もスクリーニングを完了して化が確認されたが、Bcl- 2 や Bcl-xL の mRNA 発現はほといない沖縄産植物 80 ％メタノール抽出エキスについて継んど変化していなかった。

続的に探索をおこなっている。スクリーニングの結果、生これらの細胞老化誘導した HaCaT 細胞と A 549 細胞を薬抽出エキスではオウバク、カシュウ、カンキョウ、シン

用いて、非老化細胞と比較をおこないながら植物エキス

イ、ウワウルシなどで、HaCaT 細胞の老化細胞での生存100 µg/mL を 48 時間添加した時の細胞の生存率を CCK-

率が低い結果が得られた。（Fig. 4）さらに、A 549 細胞に

8 assay によりスクリーニングをおこなうことで、老化細おいても老化細胞での生存率が低い結果が得られた生薬エ

胞特異的に細胞傷害を示すという老化細胞除去活性を持キスに、カンキョウが見出された。

つ植物エキスを探索することとした。当初の研究計画でこのカンキョウという生薬は食品で知られる生姜をもと

は、HaCaT 細胞に蛍光タンパクを定常発現させ、赤色蛍とした生薬であり、同じ生姜をもととしたショウキョウと光タンパクと緑色蛍光タンパクを発現させた細胞で、非老呼ばれる生薬と区別して使われている。ショウキョウのほ化細胞と老化細胞を色分けし、同じ well 内で植物エキス

うはあまり老化細胞と非老化細胞での生存率に変化はなく、添加をおこない、蛍光タンパクの色の比率で老化細胞を特同じ生姜由来でこのように結果が異なることに興味を持

異的に細胞傷害する活性を持つものを探索する予定として

ち、少し調べることとした。カンキョウは生姜を蒸してかいたが、HaCaT 細胞を入手するのに時間がかかったため、ら乾燥させるという漢方医学的な修治という処理がおこな

CCK- 8 assay という簡便な細胞生存率を測定する方法で、われている生薬であり、蒸さずに乾燥させたものをショウ

Fig. 4 老化誘導細胞と非老化誘導細胞を用いた生薬抽出エキスの老化細胞除去活性スクリーニング結果− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

キョウと呼んでいる。では、この蒸すという処理で何が起られ、さらに、カンキョウに多く含まれる 6 -shogaol でのこっているかについてだが、生姜に多く含まれる gingerol

apoptosis が annexin V の発現割合を見ると、老化細胞のという化合物が、この処理により shogaol という化合物にほうがほんの少し apoptosis の割合が多いが、非老化細胞

化学変化し、shogaol の含有量が増加するというのが知らでも濃度依存的に apoptosis が誘導され、グラフには記載れている。そこで、カンキョウおよびショウキョウの比較されていないが、6 -shogaol の 40 µM ではそのほとんどのと、市販で購入することができる 6 -gingerol と 6 -shogaol

細胞が apoptosis するほどであることが明らかとなった。

を用いて、HaCaT 細胞の非老化細胞と老化細胞に対する

次に、奄美産植物エキスにおけるスクリーニング結果のapoptosis 誘導に関して比較をおこなうこととした（Fig. 5）。

一部を紹介する。奄美産植物エキスは 560 種類ほどあり、

その結果、アポトーシス誘導により活性化する PARP とその中から老化細胞のほうで細胞生存率が低く見られたト

annexinV の発現をウエスタンブロット法と FACS で解析

ベラ、ヒメガマ、アイダクグ、ナチシダ、キツネノマゴをしたところ、スクリーニングの時の結果に反し、非老化グラフで示す（Fig. 6）。これらの植物エキスに関する詳細

細胞でのアポトーシス誘導がカンキョウエキスで強く見な解析をおこなう必要があるが、これらの奄美産植物エキ

Fig. 5 生姜含有成分（6-gingerol および 6-shogaol）の HaCaT 細胞への apoptosis 誘導活性評価
A. 生姜含有成分の化学構造と修治（boil or steam）による化学変化
B. 生姜エキス（カンキョウ・ショウキョウ）とその成分による PARP の活性化のウエスタンブロット解析
C. 生姜含有成分による apoptosis 細胞（Annexin V 陽性細胞）の FACS 解析

Fig. 6 HaCaT 細胞での奄美産植物抽出エキス（100µg/mL）の老化細胞除去活性スクリーニング結果の一部− 44 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析

Fig. 7 HaCaT 細胞でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価

Fig. 8 A549 細胞でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Fig. 9 ヒト乳癌細胞株（MDA-MB-231 細胞）でのフラボノイド + ダサチニブによる老化細胞除去活性評価

スは共同研究者により、採取された植物であり、さらにエ存率が特異的に低下する結果が得られ、その他にもクリシ

キス量を増やして様々な解析をおこなうためには、奄美でンやアピゲニン、ルテオリンやノビレチンなどをダサチニの植物採取をおこなう必要が出てくることから、現在の新ブと組み合わせることで、老化細胞での細胞生存率が低下

型コロナウイルス感染に関わる社会情勢から、植物採取のしている傾向が見られた。しかし、HaCaT 細胞や A 549

ために移動することが難しいことから、詳細な解析は一旦細胞では老化細胞より非老化細胞での細胞生存率が低下す保留とし、残っている沖縄産植物エキスのスクリーニングる傾向が多く見られ、その結果の解析が難しいこととなっを進めていくこととした。

た。

さらに、老化細胞除去活性を持つ天然由来化合物を探索

４．考するために、他の研究者により既に報告 4）がある、フラボ

察

ノイドのクエルセチンと抗癌剤のダサチニブの組み合わせ

本研究では、スクリーニング結果からのヒットエキスとを参考に、様々なフラボノイドとダサチニブの組み合わせ

してカンキョウエキスに注目して、その特徴的な成分の解で老化細胞除去活性を持つものがないか調べることとした。

析などもおこなったが、残念ながら非老化細胞でも細胞傷

ここでは、HaCaT 細胞と A 549 細胞、さらにヒト乳癌細害を示す結果となってしまった。このカンキョウエキスを胞株の MDA-MB- 231 について CCK- 8 assay による細胞

詳細に解析する際には、新たにカンキョウの購入から抽出

生存率を指標として比較をおこなった（Fig. 7 - 9）
。その結までおこなっており、スクリーニング時のカンキョウとロ果、ポジティブコントロールとして利用した ABT- 263 のットが異なるという原因も影響している可能性が考えられ老化細胞に対する特異性が MDA-MB- 231 細胞で特に高る。生姜という素材であることから、幅広いロットの抽出いことが明らかとなった。さらに、HaCaT 細胞は非老化エキスでの検討と成分分画をおこなったものでの評価も今

細胞でも ABT- 263 に濃度依存的な生存率抑制効果があり、後おこなっていくべきであると考える。さらに、今回の老老化細胞特異的な活性を調べるのが難しいことが明らかと化細胞と非老化細胞の比較という方法では多くの問題点もなった。フラボノイドの結果では、MDA-MB- 231 細胞で明らかとなった。老化細胞は細胞周期が止まり増殖しなく

既に報告があるフィセチンとクエルセチンで老化細胞の生なり、細胞も肥大化するが、非老化細胞は細胞増殖が起き− 46 −

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析るということから、薬剤添加から解析までの時間が経つほ

続的に実施し、皮膚の老化改善に役立つ製品として研究成

ど細胞増殖の影響が大きく影響するという同じ細胞数で実果を社会に還元していきたいと考えている。

験を行うとしても、CCK- 8 assay など細胞サイズの異なるものを同じように評価するのは問題ないのかなど、考慮すべき内容はたくさん存在する。これらの点に注意をしなが（引用文献）
1） E. Michishita, N. Matsumura, T. Kurahashi, T.

らさらに研究を進めていく予定である。

５．総

Suzuki, H. Ogino, M. Fujii, D. Ayusawa, Biosci.
Biotechnol. Bio- chem., 66（4），877-879（2002）

括2） Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J.N., Weigand, B.M.,

本研究により、皮膚の老化改善に有効となる天然植物エ

Palmer, A.K., Weivoda, M.M., Inman, C.L., Ogrodnik,

キスを明らかにすることはできなかったが、老化細胞除去

M.B., Hachfeld, C.M., Fraser, D.G., et al. Nat. Med., 2 4,活性を持つ植物エキスの探索がスタートするとともに、問1246-1256. 2018

題点などを明らかにさせながら進めていくことができるよ3） Kota Sato, Soichiro Iwasaki, Hironori Yoshino Int J
Mol Sci. 22（24）:13233. 2021

うになった。まだ、奄美産植物のナチシダのように非常に老化細胞に特異的な植物エキスも残っており、まだスクリ

4） Hidetaka Ota, Ayuto Kodama Sci Rep.1 2（1）:2 4 2 5.

ーニング中の沖縄産植物エキスもあるため、より老化細胞に特異性の高い植物エキスおよびその活性成分の探索を継− 47 −

2022

強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発
北海道大学大学院工学研究院

佐藤康治

Hydroxytyrosol (HT) obtained from olives is an antioxidant with multiple health benefits for human. Because of its low
content in olives, fermentative processes with engineered microorganisms have been developed as alternative sources. We
for the first time succeeded in HT production from glucose with Escherichia coli engineered an artificial pathway employedtyrosine (Tyr) hydroxylase (TyrH), dihydroxyphenylalanine (DOPA) decarboxylase (DDC), and monoamine oxidase (MAO).
In the pathway, central metabolic Tyr is converted into HT as follows: (i) hydroxylation of Tyr by TyrH, (ii) decarboxylationof DOPA by DDC, (iii) oxidation of dopamine by MAO, and (iv) reduction of dihydroxyphenylacetaldehyde by endogenous
alchohol dehydrogenase(s). However, the productivity was quite low. For high HT production, enhanced Tyr-supply in thecells is needed. Here, we established a Tyr-supplying pathway using a bacterial phenylalanine (Phe) hydroxylase together
with a cofactor-recycling system in E. coli and the titers of Tyr reached 2.9 g/L from Phe. Even though the strain was applied
to the HT production, the productivity was still low unexpectedly. We therefore need further improvements to accomplish
practical HT production.

１．緒言ヒドロキシチロソール（HT、図１）は、オリーブなどに含まれる強力な抗酸化物質で、その効果はビタミン C の10 倍ともいわれる。抗酸化作用のほか、抗炎症・抗菌作用、

図 1 オリーブにおける HT 生合成経路

メラニン産生や紫外線による DNA 損傷の抑制効果などが知られ、化粧品やスキンケア用品の有効成分として使用されている 1 , 2）。また、体の外側からだけでなく、美肌やアでなく、近年の世界的な環境意識の高まりから、石油に依ンチエイジング効果が期待されるサプリメントとして、内存する化学原料や有害な金属触媒の使用、さらには高温・側からのケアにも利用されている。さらに抗ウイルス活性

高圧条件下で合成するプロセスは敬遠され、新たな供給ルも知られており、最近は現在パンデミックを引き起こしてートが模索されている。このほかに、オリーブオイル製造

いる新型コロナウイルス感染症（COVID- 19）の感染予防効

時に発生する排水からの精製も検討されてはいるが、効率3）が低く、実用化には至っていない 4）。

果が注目されている 。
我々は HT を食事から摂取している。主な摂取源はバー

2015 年、持続可能な社会を実現するための世界目標（持

ジンオリーブオイルであるが、含有量が低いため十分な健続可能な開発目標、SDGs）が決定された。その達成に向康効果が得られておらず、近年の健康志向の高まりもあり、け、経済活動と環境保全が両立した新しいプロセス開発が

食品添加物やサプリメントとしての利用が拡大している。

要請され、従来の化学工業的製法とは異なり、省エネルギ

現在は、オリーブ果汁や葉エキスの濃縮物が使用されていー・低環境負荷で目的化合物を製造できるバイオテクノる。しかし、含有量の低さ、不純物の混在、個体・栽培エ

ロジーは、その一端を担う重要な技術として注目されていリアによるバラつき、季節性などから、高純度での配合やる。特に微生物や酵素のもつ優れた物質変換能を活用した

通年の安定供給に課題がある。また、HT はオレウロペイ

有用物質生産は、今後、ますます重要な技術になると期待ンの部分構造として生合成されるため（図１）、加水分解しされる。このような背景から、HT を生体触媒である酵素

2）遊離する必要があり、製造工程をより煩雑にする 。高純を用い合成する手法も報告されている 5 ‒ 7）。例えば、メラ度品も販売されているが、化学合成品で非常に高価なだけ

ニン色素合成に関与するチロシナーゼの利用がある 5）。本酵素は酸素を酸化剤としてタンパク質アミノ酸であるチロシン（Tyr）を水酸化し、ジヒドロキシフェニルアラニン

Development of production systems of apowerful antioxidant hydroxytyrosol
Yasuharu SatohDivision of Eng ineering, Hokka ido
University（DOPA）を生成する（図 2 上段）。キノコ由来チロシナーゼ
は Tyr と同じくフェノール構造をもつチロソールも水酸化できるため、HT 合成に利用された（図 2 下段）。しかし、本酵素はジオキシゲナーゼであり、水酸化反応に加えてキノン体への過剰な酸化反応も触媒するため、アスコルビン− 48 −

強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発

図 2 チロシナーゼを利用した HT 合成
上段： Tyr 水酸化反応、下段： HT 合成反応

酸による還元プロセスが必要となる。このほかに、フラビ

ペインの加水分解によって生成される（図 1）。オレウロペン依存性ヒドロキシフェニル酢酸モノオキシゲナーゼやトインはチロソールを部分構造にもつリグストロシドの水酸

ルエンモノオキシゲナーゼを用いたチロソールの HT への化によって生合成されると予想されているが 2）、関与する

変換プロセスも報告されている

6 , 7）。これらの酵素合成法

はいずれも化学合成された原料を用いるため、持続可能な酵素は同定されておらず、新たな経路をデザインすることとした。
我々は Tyr を原料に脱炭酸とそれに続くアミノ基の酸

開発目標 SDGs の達成の観点から改善が求められる。
そこで我々は、再生可能で安定供給が可能なバイオマス

化、生成したアルデヒド基の還元反応を経てチロソールへを原料に、常温・常圧下で物質生産が可能な微生物による変換する植物および微生物由来酵素を用いた人工的な代謝

発酵生産法の開発に着手した。これまでに HT 高生産菌の経路を設計し、合成生物学的アプローチで大腸菌へ実装す

報告はなかったため、HT 生合成経路を実装した遺伝子組ることに成功していた 8）（図 3）。この成果に基づき、Tyr

換え大腸菌による発酵生産について検討した。大腸菌はゲに代えて DOPA を出発化合物とすることで HT が合成可能

ノム情報や遺伝子機能に関する知見などが充実し、さらにになると考え、検証した 9）（図 3）。チロソール合成で採用

プラスミドベクターや遺伝子ライブラリーなどの遺伝子工した植物由来 Tyr 脱炭酸酵素（TDC）は DOPA の脱炭酸反学ツールが豊富、遺伝子導入や破壊が容易など、ほかの宿応も触媒するため HT 合成に利用できる。しかし、Tyr が主微生物よりも非常に扱いやすいという利点があり、物質存在する大腸菌内ではチロソールが副生される。後述のよ生産に広く用いられている。まずは、導入する HT 生合成

うに、Tyr は DOPA 合成の基質でもあり HT 収率の低下を経路を検討した。オリーブから得られる HT は、オレウロ

招く。酵素は多種多様な化合物が混在する生体内で特定の

図 3 構築した HT およびチロソール生合成経路
BH4：テトラヒドロビオプテリン、MH4：テト
ラヒドロモナプテリン、HPAA：ヒドロキシフ
ェニルアセトアルデヒド、DOPA：ジヒドロキ
シフェニルアラニン、DHPAA：ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、HT：ヒドロキシチ
ロソール、PheH：Phe 水 酸化酵 素、TyrH：
Tyr 水 酸 化 酵 素、TDC：Tyr 脱 炭 酸 酵 素、
MAO：モノアミン酸化酵素、ADH：アルコー
ル脱水素酵素、DDC：DOPA 特異的脱炭酸酵素− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

化合物と反応する高い基質特異性をもつため、動物由来のサンプル数は N= 3 とし、データは平均値 ± 標準偏差で記DOPA 特異的脱炭酸酵素（DDC）を用いることで、HT 選択

載した。
HPLC 解析は、GL サイエンス社製 InertSustein C 18 カ

的合成を達成した。
9）

続いて、大腸菌での DOPA 合成を検討した 。DOPA

ラム（15 cm × 2 . 1 mm ID, 3 µm）を連結した島津製作所社

合成活性をもつ酵素として前述のチロシナーゼがあるが、製 HPLC システムで行った。各培養液は 1 N 塩酸水溶液でDOPA は中間体であり、さらに酸化されたドパキノンを5 倍に希釈し、2 µL をインジェクションした。化合物は下還元する必要がある（図 2）。このほかに、動物が神経伝達記の条件で分離し、210 nm の吸収に基づき定量した。移物質ドパミンやアドレナリンの生合成に用いる Tyr 水酸

動相 A：0 . 1 %（v/v）ギ酸水溶液、移動相 B：0 . 1 %（v/v）
ギ化酵素（TyrH）も知られていた。しかし本酵素は動物に特酸含有メタノール、流速：0 . 2 mL/min、カラム温度：35 ℃、

異的な補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（BH 4）をグラジエント条件：5 %, 0 - 2 min、5 ‒ 30 %、2 ‒ 22 min。

要求するため、微生物による物質生産には利用されていな

３．結果と考察かった。このような背景下、我々はマウス由来酵素を大腸するテトラヒドロモナプテリン（MH 4）が補酵素として機3 . 1. HT生産における律速反応の解明とTyr 供給の強化

能することを明らかにした。MH 4 や BH 4 は反応の進行にグルコース（1 . 0 %［w/v］）からの HT 生産量は 12 mg/L

より酸化され消費される。ヒトは BH 4 再生系をもち、生（0 . 08 mM）と低く、また Tyr を 181 mg/L（ 1 mM）添加し体内での Tyr 水酸化反応の進行には、その両方が必須でた培地を用いた場合でも 29 mg/L（0 . 19 mM）と低かった 9）。

ある。そこで BH 4 再生関連酵素も大腸菌で共発現させた後者において Tyr の残存が確認されたことから、Tyr から

結果、DOPA 合成反応が効果的に進行することがわかった。

DOPA への変換率の低さが原因と考えられた。本反応は最終的に、全ての遺伝子を導入した大腸菌でグルコースを

TyrH が担うが、大腸菌内で反応を進行させるには補酵素

原料に HT の発酵生産に成功した（図 3）。これは安価で再MH 4 の供給も欠かせず、TyrH と補酵素再生系の両方の生可能な糖（グルコースなど）を原料に、有害な化合物を使

活性を評価する必要がある。

菌で異種宿主発現させ種々検討したところ、大腸菌に内在用せず、常温・常圧下で製造する持続可能なプロセスであ

微生物の培養試験では、雑菌の混入を避けるため、試験る。しかし、現状の生産性は 12 mg/L（0 . 08 mM）と非常培地を蒸気滅菌や濾過滅菌し使用する。しかし、Tyr の水に低い。そこで本研究では、HT 生産性を改善し、実用生への溶解度は 453 mg/L（2 . 5 mM）と低いため、高濃度 Tyr

産の可能性を検証した。

添加培地の調製に濾過滅菌は不適である。蒸気滅菌は、処２．方理中に Tyr がほかの培地成分と予期せぬ反応を引き起こす法

ため適用できない。ヒトにとって Phe は必須アミノ酸であ2 . 1. プラスミド構築

るが、Tyr は非必須アミノ酸である。これはヒトが Phe 水

ラット由来 PheH 遺伝子、ヒト由来 PCD および DHPR

酸化酵素（PheH）をもち、Phe から Tyr を合成できるから遺伝子は、大腸菌のコドンに最適化した配列で遺伝子合である。本反応を担う PheH も TyrH と同じプテリン依存成し取得した。細菌由来 PheH 遺伝子は、当研究室の保存性芳香族アミノ酸水酸化酵素の一種である。Phe の水への株より調製したゲノム DNA を鋳型とした PCR で増幅した。

溶解度は 26 , 900 mg/L（163 mM）と Tyr のそれと比較して得られた DNA は該当の発現プラスミドへそれぞれクロー

非常に高い。そこで、本酵素を用いた Phe から Tyr 変換経

ニングし、各試験に使用した。

路を構築することで、高濃度での Tyr 供給が可能になるだ
けでなく、MH 4 再生系の効率評価も可能になると考え検

2 . 2 . 生産試験証した。

生産試験には、M 9 Y 培地（0 . 1 %［w/v］酵母エキスを含MH 4 再生には、ヒト由来プテリン - 4 α- カルビノール

む M 9 最少培地。炭素源としてグルコースまたはグリセ

アミン脱水素酵素（PCD）とジヒドロプテリジン還元酵素

ロールを 1 . 0 %（w/v）含む。
）に 5 g/L Phe および 20 mg/L

（DHPR）を用いた。本遺伝子は PCD‒DHPR の順のオペロ

FeSO 4 を添加した培地を使用した。この試験培地 3 mL にンとなるように、中コピーベクターである pSTV 28 の lac

一晩培養した組換え大腸菌培養液を OD（濁度）が 0 . 15 とプロモーター下流にクローニングした（pSTV-BH 4 R、図なるように植菌し、30 ℃、200 rpm で培養した。タンパ

4）。構築したプラスミドで大腸菌を形質転換し、タンパ

ク質発現を誘導するため、培養開始から 3 時間経過後にク質発現を SDS‒PAGE 解析したが、明白なバンドは確認

イソプロピル -β- チオガラクトピラノシドを最終濃度ができなかった（図 5 A）
。そこで、各酵素に対する抗体を用

0 . 5 mM となるように添加した。各時間に培養液をサンプ

いWestern blot解析した結果、図 5 BおよびCに示すように、リングし、菌体濃度は OD 測定、生産物は HPLC 解析した。

可溶性画分に両タンパク質の発現が確認できた。

− 50 −

強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発

図 4 プラスミド pSTV-BH4R のマップ

図 6 プラスミド pQE1a-Rat のマップ

図 5 大腸菌での PCD および DHPR 発現の検証
A：SDS-PAGE 解析、B：抗 PCD 抗体を用いた Western blot 解析、C：抗 DHPR 抗体を用いた Western blot 解析、empty：pSTV28（コントロール）、BH4R：pSTV-BH4R、M：
分子量マーカー、W：菌体破砕物、S：W の可溶性画分、I：W の不溶性画分
Western blot 解析では、活性な酵素が存在する可溶性画分を分析。

次に、PheH との共発現を検討した。PheH は大腸菌で一部の微生物も PheH をもつ 10）。そこで、7 種の細菌かの発現が確認されているラット由来酵素の触媒ドメイン領

ら PheH 遺伝子を取得し、上記と同様の手法で評価した。

域を高コピーベクター pQE 1 a の強力な tac プロモーター

その結果、当研究室で単離した Gulbenkiania 属細菌由来

下にクローニングした（図 6）。この際、宿主自身が産生しPheH（GsPheH、図 7）を発現した株で最も高い変換能が確

た Tyr の混入を避けるため、Tyr 合成に必須な TyrA 遺伝

認され、培養 72 時間で 5 , 236 ± 598 mg/L（28 . 9 ± 3 . 3 mM、子を破壊した大腸菌（Y 0 株）を用いた。その結果、Phe（分図 8）に達した。したがって、以降の検討には GsPheH を

子量 165 . 19）を 5 , 000 mg/L（30 . 3 mM）添加した培地を用用いた。

い試験した結果、培養 48 時間で 79 . 7 ± 5 . 4 mg/L（0 . 44 ±2 つのプラスミドの使用は、2 種の抗生物質への耐性獲0 . 03 mM）の Tyr（分子量 181 . 19）生産が確認されたが、変得やプラスミド DNA 合成による負担（代謝負荷）の増加に

換率は 1 . 6 ％と低かった。DHPR は MH 4 再生時に補酵素より、変換能が低下することが知られている。その影響をNAD（P）H を用いる。その供給には炭素源としてグルコ軽減するため、プラスミド pSTV-BH 4 R（図 4）中の lac プースよりもグリセロールの方が適していることが知られてロモーターと補酵素再生関連遺伝子（PCD と DHPR）を含

おり、グルコースに代えてグリセロールを用い評価した。

む領域を PCR で増幅し、プラスミド pQE 1 a-Gs の NheI サ

その結果、Tyr 生産量は約 2 . 5 倍（197 ± 34 mg/L, 1 . 09 ±イトに挿入した（pQE 1 a-Gs-BH 4 R、図 9）。本プラスミ0 . 19 mM）に向上した。SDS-PAGE 解析で PheH の発現がドで形質転換した Y 0 株の Tyr 生産量は、培養 72 時間で確認できたにも関わらず、変換率は 3 . 6 ％と依然として低5 , 852 ± 471 mg/L（32 . 3 ± 2 . 6 mM）に達した（図 10）。こかったため、ほかの酵素の利用を検討した。

の Tyr 生産量は添加した Phe を超過しているが、大腸菌− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 7 GsPheH 発現プラスミド pQE1a-Gs のマップ

図 9 プラスミド pQE1a-Gs-BH4R のマップ

図 8 pQE1a-Gs と pSTV-BH4R を導入した Y0 株の Tyr 生産
試験■：Phe、□：Tyr、○：OD

図 10 pQE1a-Gs-BH4R を導入した Y0 株の Tyr 生産試験■：Phe、□：Tyr、○：OD

自身が産生した Phe が変換されたことが原因と考えられた。
また、先の 2 つのプラスミドを導入した株（図 8）と比較して、培養 24 時間時点の Tyr 生産量が大きく増加していた。
これはプラスミド数削減によって代謝負荷が軽減し、生産速度が向上したためと考えられた。さらに、Tyr 高生産が確認されたことから、補酵素再生系も効率的に機能することが分かった。
プラスミド pQE 1 a-Gs-BH 4 R は、以前の HT 生産研究で構築した TyrH 発現プラスミド pBbE 1 k- 39）（図 11）と同種の複製開始点（ori）をもつため、大腸菌内で同時に保持させることができない。また HT 生産には、さらに DDCとモノアミン酸化酵素（MAO）遺伝子の導入が必須であり、図 11 プラスミド pBbE1k-3 のマップ

多数のプラスミドの使用による宿主への代謝負荷の増大が懸念された。そこで、Tyr 生産に関与する PheH と補酵素
再生遺伝子は大腸菌ゲノムへ組込むこととした。プラスミ

要求性大腸菌（Y 0 株）の TyrA 遺伝子破壊領域へ導入した

ド pQE 1 a-Gs-BH 4 R から PheH、PCD と DHPR 遺伝子を（Gs 1 株）
。その培養 48 時間の Tyr 生産量を評価したとこ

含む領域（Tyr 生産遺伝子カセット）を PCR で増幅し、Tyr

ろ、45 . 3 ± 1 . 8 mg/L（0 . 25 ± 0 . 01 mM）と非常に低かった− 52 −

強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発

図 12 Tyr 生産遺伝子カセット組込み株とそれらに pQE1a-Gs ま
たは pSTV-BH4R を導入した株の Tyr 生産試験
Gs1 〜 Gs5：Tyr 生産遺伝子カセットを 1 〜 5 個組込んだ株

図 13 プラスミド pBbS1a-3 のマップ

（図 12）。ゲノム組込みでは、大腸菌内で遺伝子は 1 コピ

現するプラスミド pBbE 1 k- 39）（図 11）を用いた。その結果、ーであるのに対し、プラスミド pQE 1 a-Gs-BH 4 R は約 30

期待通り DOPA 生産（1 , 033 ± 12 mg/L；5 . 2 ± 0 . 06 mM）

コピーになる。Tyr 生産量の低下は、遺伝子コピー数の減が確認された。

少が影響していると考えられたため、Tyr 生産遺伝子カ

グラムオーダーでの DOPA 供給が可能であったため、セットを大腸菌ゲノムの FeaB 遺伝子座へ追加で組込んだHT 生産を試みた。以前、我々が HT 生産時に使用したブ（Gs 2 株）
。その結果、Tyr 生産量は約 2 . 8 倍に向上したが、タ由来 DDC 遺伝子と Micrococcus luteus 由来 MAO 遺伝子

依然として低かった（図 12）。そこで、大腸菌ゲノムに組をオペロンとして発現するプラスミド pBbS 1 a- 39）（図 13）込む遺伝子カセット数を 3、4、5 個とさらに増加させた株を上記の pBbE 1 k- 3 を含む Gs 5 株に導入し評価した。そ（Gs 3、Gs 4 および Gs 5 株）を構築し評価した結果、遺伝子の結果、予想に反し、HT だけでなく DOPA も検出されず、

カセット数に比例した Tyr 生産量の増加が確認された（図約 30 mM の Phe が未反応のまま残存していた。このよう12）。しかし、プラスミド発現時（図 10）よりも大きく減少に反応が全く進行しなかった原因として、3 章 1 節で確認した。Phe の Tyr への変換反応は、Phe 水酸化と補酵素再された複数プラスミドの導入による宿主の代謝負荷の増大

生という 2 種の反応が必要なため、どちらかが律速反応にが考えられた。

なっていると予想した。この検証のため、Tyr 生産遺伝子

４．総カセットをゲノムに組込んだ株に、先に構築した GsPheH

括発現プラスミド pQE 1 a-Gs（図 7）または補酵素再生遺伝子

強力な抗酸化活性をもつ HT の化粧品原料としての利用

発現プラスミド pSTV-BH 4 R（図 4）をそれぞれ導入し検価値は非常に高い。近年は COVID- 19 の感染予防効果も証した（図 12）
。その結果、GsPheH 遺伝子の導入では Tyr

注目されており、高純度品を安価に安定供給するルートが生産量は 978 ± 18 mg/L（5 . 4 ± 0 . 10 mM）であったのに対模索されている。我々は、その１つとして組換え大腸菌にし、BH 4 再 生 遺 伝 子 導 入 で は 2 , 862 ± 83 mg/L（15 . 8 ±よる発酵生産法を提案した 9）。本研究では、その生産性向

0 . 46 mM）へと大きく向上した。よって、補酵素再生系が上を目指し、まずは基質となる Tyr 供給の強化に取組み、律速反応と判明した。このように Tyr 生産遺伝子カセット成功した。そこで、Tyr 供給を強化した大腸菌へ以前の研5 個をゲノムに組込んだ Gs 5 株は、補酵素再生遺伝子の導究で構築した HT 生産用プラスミドを導入したが、HT 生

入により物質生産において十分な Tyr 供給が可能であった

産を達成できなかった。この原因として、複数プラスミド

ことから、以降の検討に用いた。

の導入による宿主の代謝負荷の増加が考えられた。今後は代謝負荷の軽減のため、HT 合成に必要な遺伝子全てを大3 . 2 . HT生産の検証

腸菌ゲノムへ組込む必要があると考えている。

高い Tyr 供給が可能になったため、次の反応ステップ
である DOPA 変換について検証した。上述のように補酵謝辞素再生系の律速を回避するためには、その遺伝子の発現強本研究の遂行にあたり、御援助を賜りました公益財団法化が必要であったため、以前の研究で構築したマウス由来人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げま

TyrH 遺伝子と BH 4 再生関連遺伝子をオペロンとして発す。

− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

（引用文献）hydroxytyrosol using tyrosinase as biocatalyst. J.
Agric. Food Chem. 49, 1187‒1193（2001）

1） L. Martínez-Zamora, R. Peñalver, G. Ros, G. Nieto.
Olive tree derivatives and hydroxytyrosol: their

6） P. P. Liebgott, A. Amouric, A. Comte, J. L. Tholozan,

potential effects on human health and its use as

J. Lorquin. Hydroxytyrosol from tyrosol using

functional ingredient in meat. Foods 10, 2611（2021）

hydroxyphenylacetic acid-induced bacterial cultures

2） S . H . O m a r . O l e u r o p e i n i n o l i v e a n d i t s

and evidence of the role of 4-HPA 3-hydroxylase. Res.
Microbiol. 160, 757‒766（2009）pharmacological effects. Sci. Pharm. 78, 133‒154（2010）3） S. Paolacci, M. C. Ergoren, D. De Forni, E. Manara,7） M. Brouk, A. Fishman. Protein engineering of toluene

B. Poddesu, G. Cugia, K. Dhuli, G. Camilleri, G. Tuncel,

monooxygenases for synthesis of hydroxytyrosol. Food

H. Kaya Suer, N. Sultanoglu, M. Sayan, M. Dundar,

Chem. 116, 114-121（2009）

T. Beccari, M. R. Ceccarini, I. S. Gunsel, A. Dautaj,

8） Y. Satoh, K. Tajima, M. Munekata, J. D. Keasling, T.

T. Sanlidag, S. T. Connelly, G. M. Tartaglia, M.

S. Lee. Engineering of a tyrosol-producing pathway,

Bertelli. In vitro and clinical studies on the efficacy

utilizing simple sugar and the central metabolicof α-cyclodextrin and hydroxytyrosol against SARS-

tyrosine. J. Agric. Food Chem. 60, 979‒984（2012）

CoV-2 infection. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2 5,9） Y. Satoh, K. Tajima, M. Munekata, J. D. Keasling,
T. S. Lee. Engineering of L-tyrosine oxidation

81‒89（2021）

in Escherichia coli and microbial production of4） N. Kalogerakis, M. Politi, S. Foteinis, E. Chatzisymeon,hydroxytyrosol. Metab. Eng. 14, 603‒610（2012）

D. Mantzavinos. Recovery of antioxidants from olive
mill wastewaters: a viable solution that promotes their

10）A. Pribat, I. K. Blaby, A. Lara-Nunez, J. F. Gregory

overall sustainable management. J. Environ. Manage.

III, V. de Crecy-Lagard, A. D. Hanson. FolX and FolM

128, 749-758（2013）．

are essential for tetrahydromonapterin synthesis

5） J. C. Espín, C. Soler-Rivas, E. Cantos, F. A. TomásBarberán, H. J. Wichers. Synthesis of the antioxidant− 54 −

in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. J.
Bacteriol. 192 , 475 ‒ 482（2010）

楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用
地方独立行政法人大阪産業技術研究所

中橋明子

It was reported that polymer particles of ellipsoidal and needle shape have high UV-ray scattering effect. In most cases,
polymer particles prepared by emulsion and precipitation polymerization are spherical shapes, which are thermodynamicallystable shapes. To obtain nonspherical polymer particles, complicated methods are necessary. In a few cases, the ratioof several kinds of solvents, monomers, and emulsifiers are precisely controlled to obtain nonspherical particles during
polymerization. On the other hand, nonspherical particles are transformed from spherical particles by complicated processes.
Polyimide (PI) fine particles prepared by precipitation polymerization has already reported. Recently, it has been foundthat the PI particles transform from spherical to ellipsoidal by stirring in a solvent. In this study, the stirring conditions fortransformation from spherical to ellipsoidal were investigated. Furthermore, the thermal stability and optical properties of
the resulting ellipsoidal PI particles were evaluated.
Various kinds of stirring bar were applied, and cylinder-shape stirring bar was most effective to transform PI particles.
Destruction of particles were observed when the dispersion of PI particles stirred with a glass stirring bar in a glass bottle.
Transformed PI particles were not obtained in chloroform, ethylene glycol, and isopropyl alcohol. These results suggested
that PI particles transformed at the clearance between the stirring bar and the vessel. Ellipsoidal PI particles with around
0.6 times the thickness and around 1.3 times the axial length of the original size were obtained by optimizing the stirring
condition.
The shape of ellipsoidal PI particles was retained after heating at 150 °C for 2 h. The dispersion of ellipsoidal PI
particles showed lower UV-Visible transmittance than that of spherical particles. The transmittance of acrylic polymer films
with PI particles dispersed on surface or inside was also measured. Under both conditions, ellipsoidal PI particles showed
lower UV transmittance than that of spherical PI particles.

１．緒

くなり、好ましくない。一方、桂皮酸誘導体やベンゾフェ

言

ノン誘導体などの有機低分子は、UV 吸収剤として用いら

近年、太陽光に含まれる紫外線（UV）が人体に悪影響をれる。これらの有機低分子は、添加量を多くすれば効果が及ぼすことが周知され、紫外線防御の重要性について、認向上するが、保存あるいは使用中の分解、皮膚への刺激に識が高まっている。現在、化粧品は、紫外線防御剤とし加え、毒性などが懸念され、使用量に一定の制限がある。

て、酸化チタンや酸化亜鉛などの無機微粒子および桂皮酸

したがって、従来の紫外線防御剤を日焼け止め料やファン

誘導体やベンゾフェノン誘導体などの有機低分子化合物がデーションに配合する際には、防御剤それぞれの特性を考使用されている。無機微粒子は、紫外線防御剤中、UV 散

慮し、安全性や紫外線遮蔽性の観点から数種類の紫外線防乱剤に分類され、UV を散乱または反射させることにより御剤を組み合わせる必要がある。そのため、無機微粒子や防御剤として機能する。しかし、無機微粒子は屈折率が高有機低分子に替わる新規紫外線防御剤の創出によって、そく、化粧品材料として使用すると白浮きするため、その回れらを含む化粧品設計の幅を大きく拡大させることができ避策として一般的に 100 nm 以下の微細微粒子が用いられると考え、本研究の実施に至った。

る。粒子の微細化に伴い凝集が進行しやすく、水や油など

新たな紫外線防御剤の作製指針として、高分子材料を用に対し、一次粒子の状態での分散が難しくなり、紫外線防いた紫外線防御においては、高分子微粒子の形状を楕円体

御効果は低下する。そのため、微細な無機微粒子を化粧品状または針状にすることで、UV に対し、高い散乱効果が中に分散させ、その分散を長期間に亘って維持するために認められるとの報告がある 1）。一般的に、乳化重合や沈殿は、より多くの界面活性剤が必要となる。その結果、人体重合などにより調製される高分子微粒子は、そのほとんどに対しては、肌荒れや皮膚老化を誘発させる可能性が大きが熱力学的に安定な球状である。そのため、非球状の微粒子を得るには、微粒子を調製する際に特定の条件に精密制御する、あるいは煩雑な変形操作によって球状微粒子から

Ellipsoidal polyimide particles for UV
protective agents
Akiko Nakahashi
Osaka Research Institute of Industrial
Science and Technology

変形させる必要があった 2 - 4）。
当研究所では、これまで、ポリイミド（PI）の球状微粒子の研究開発を行ってきた 5 , 6）。モノマーであるジアミンと酸無水物を用い、溶液中での沈殿重合によって、数十 nm〜数 µm の粒子径を有する単分散球状 PI 微粒子の作製に成− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

功している。PI は高い耐熱性、耐薬品性、および耐候性

酸微粒子をドデカンに分散し、加熱イミド化を行い、球状を有し、電子材料分野や航空宇宙分野などにおいては必須

PI 微粒子を調製した。本研究では平均粒径が約 1 . 4 µm のの重要な材料である。さらに、PI は芳香環を高い割合で

PI 微粒子を調整し、使用した（図 1 ⒜）。

含む有機高分子であることから、400 nm 以下の短波長光の吸収が大きい材料である。また、PI 自体は為害性が低く、

2 . 2 . 楕円体状 PI 微粒子の調製

医療器具としても用いられる材料である。しかし、その高ガラス製サンプル瓶中で、2 . 1 . で得られた球状 PI 微粒

い耐熱性、耐薬品性のために、汎用高分子に比べて加工性

子を種々の溶媒に分散し、フッ素樹脂（PTFE）製撹拌子おが極めて悪い。この加工性を改善するために鋭意検討した

よびマグネティックスターラーを用いて撹拌を行った。１

結果、PI を微粒子状にすることで、配合や成型の際に自週間後、遠心分離によって微粒子を回収し、楕円体状 PI

在に適用することが可能となり、PI の様々な分野への応

微粒子を得た。なお、今回の研究において、この撹拌操作用について、その可能性を大きく広げた。

条件について最適化を行った。具体的には、用いる溶媒の

筆者は、これまでの研究開発において、液中に分散させ種類、量、および撹拌子の形状などを変化させたとき（表た球状 PI 微粒子を撹拌することで、球状微粒子が楕円体1）に得られる粒子形状を確認することで、楕円体状 PI 微状に変形することを見出した。得られた楕円体状 PI 微粒

粒子の形成メカニズムを考察した。

子は、材料由来の高い UV 吸収に加え、そのユニークな形
状から優れた UV 散乱特性が期待できることから、この楕

2 . 3 . PI 微粒子の変形評価

円体状 PI 微粒子の紫外線防御剤への応用について着想し撹拌条件による変形の程度を評価するために、FE-SEMた。また、球状 PI 微粒子が楕円体状に変形するメカニズ

を用いて PI 微粒子の大きさや形状を観察した。観察対象

ムについて、明らかになっておらず、そのメカニズムの解となる球状または楕円体状 PI 微粒子について、少量をア

明が UV 散乱特性の更なる向上に繋がることは確かであり、セトンに分散後、アルミホイル上に分散液を滴下し乾燥さメカニズムの解明についても精力的に行った。

せた。この操作により、粒子同士の重なりが少なくなり、本研究では、まず、球状 PI 微粒子を楕円体状 PI 微粒子

楕円体の広い面が平面方向に配列する。調製したサンプルへ変形させるための条件について詳細に検討した。さらに、について、粒子の長軸および直行する軸の長さをそれぞれ得られた楕円体状 PI 微粒子の耐熱性および光学特性を調X および Y 値としてプロットした。変形操作前後の X、Yべ、紫外線防御剤への応用の可能性について評価した。

プロットの分布を比較することで、球状 PI 微粒子の変形

２．方について評価した。

法

2 . 1. 球状 PI 微粒子の調製
文献 6 を参考に、まず球状 PI 微粒子を調製した。3 , 3’ ,2 . 4 . PI 微粒子の紫外可視透過率（全光線透過率）測定

4 , 4’ - ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物（BTDA）

球状 PI 微粒子および楕円体状 PI 微粒子について紫外可のアセトン溶液、BTDA に対し 80 mol% の 4 , 4’ - ジアミノ

視透過率測定を行い、粒子形状による差異を確認した。な

ジフェニルエーテル（DPE）のアセトン溶液および 20 mol%

お、紫外可視透過率測定には、以下のサンプル①～③を用の 2 , 4 , 6 - トリアミノピリミジン（TAP）のメタノール／ア

いた。

セトン溶液を混合した後、超音波を照射し、球状ポリアミ

サンプル①：PI 微粒子をそれぞれ流動パラフィン中（0 . 01

ック酸微粒子を沈殿物として得た。得られたポリアミックwt%）に加え、超音波照射を行うことで分散液を作製し⒝ 楕円体状 PI 微粒子⒜ 球状 PI 微粒子
図 1 PI 微粒子の SEM 画像− 56 −

楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用た。次に、得られた分散液を 10 mm 角型石英セルに入れ、拡げた後、エアダスターを用いて固定されていない PI

透過率を測定した。

微粒子を除去し、透過率測定試料とした。サンプル②とサンプル②：アクリルポリマーを溶かした酢酸エチル溶液

同様に、積分球を用い、調製した試料について全光線透（固形分濃度 36 %）と PI 微粒子を含むアセトン分散液か過率測定を行った。

らなる混合液を石英板上に塗布し、バーコーターにてポ３．結

リマー層を作製後、乾燥させた。なお、ポリマー層の乾燥後の厚さは 17 µm であった。また、アクリルポリマー

果

3 . 1. 楕円体状 PI 微粒子の調製条件の検討

溶液の重量と混合した PI 微粒子の重量の比からポリマ

サンプル瓶中、球状 PI 微粒子を含むアセトニトリル分

ー層は 1 . 8 wt% の PI 微粒子を含むことがわかった。次に、散液をシリンダー型 PTFE 撹拌子で１週間撹拌すると、楕積分球を用い、作製したポリマー層について全光線透過

円体状 PI 微粒子が得られた（図 1 ⒝）。この撹拌条件で変率測定を行った。

形を評価するため、まず、種々の形状の撹拌子を用いて撹

サンプル③：石英板上でアクリルポリマー溶液を塗布乾燥

拌操作を行い（表 1、run 1 - 4）
、変形程度を比較した。変することで、石英板上に粘着性を有するアクリルポリマ

形操作後、2 . 3 . の方法で SEM 観察用試料を調製し、粒子ーフィルムを作製した。次に、得られたフィルム上にの長軸および直交する軸の計測値を X および Y 値としてプPI 微粒子を載せ、手袋を装着した指で拡げた。十分にロットしたものを図 2 ⒜～⒟に示す。変形操作後のプロッグラフ（a〜e）の X および Y 値と微粒子の X, Y の関係

図 2 撹拌後 SEM 観察で計測した粒子サイズの分布− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

表 1 球状 PI 微粒子分散液の撹拌条件検討

ト分布が球状 PI 微粒子のプロットから右上にずれるほど、

表 2 用いた有機溶媒の比重と粘度

軸が長くなり、すなわち変形が大きいことが認められる。
run 1 〜 4 においては、run 1 の場合が最も変形の程度が大きく、シリンダー型撹拌子を用いた場合に最も効率よく変形することがわかった。そのため、以降の検討ではシリン
ダー型撹拌子を使用した。分散微粒子の濃度が低い場合、
run 1 と同じ撹拌子と容器を用いても変形度が小さいことが認められた（表 1、run 5。図 2 ⒠）。次に、ガラスサンプ
ル瓶中でガラス製撹拌子を用いた変形についての検討を行った。この場合、微粒子が粉々になり、目的とする楕円体状 PI 微粒子が得られなかった。一方、フッ素樹脂（PFA）

えられる。また、IPA や EG のように粘度が高い分散媒を容器中、PTFE 撹拌子を用いて撹拌した場合はほとんど変用いた場合においても、媒体中での微粒子の動きが制限さ

形が起こらなかった。以上の結果から、PI 微粒子の変形

れ、クロロホルムの場合と同様に撹拌子と容器との間に微操作は、撹拌に用いる器具の形状および材質の影響を大き粒子が入り込みにくくなり、変形できなかったと推察されく受けることが明らかになった。そのため、PI 微粒子のる。

変形は撹拌子と容器との間で起こっていると推察された。

種々の条件を検討した結果、run 1 の場合に最も変形が次に、アセトニトリルと異なる分散媒に微粒子を分散大きく、長径が元の 1 . 3 倍程度、側面の厚さが 0 . 6 倍程度させ、変形操作を行った。分散媒として用いた溶媒の比の楕円体状 PI 微粒子が得られた。なお、得られた楕円体

重と粘度を表 2 にまとめた。分散媒にアセトン、ヘキサ

状 PI 微粒子を 150 ℃にて、2 h 熱処理を行っても楕円体状

ン、および水を用いた場合は楕円体状 PI 微粒子が得られを保っていることがわかった。このことは、ヒトの生活環

たが、クロロホルム、イソプロピルアルコール（IPA）やエ

境においては形状変化なく十分に利用できることを示してチレングリコール（EG）を用いた場合、変形がほとんど進いる。

行しなかった。そのため、楕円体状微粒子を調製する上で分散媒の種類も影響を及ぼすことが明らかとなった。表3 . 2 . 楕円体状 PI 微粒子の紫外線防御能の評価

２から、クロロホルムは、今回用いた他の溶媒に比べ比重

変形前の球状 PI 微粒子および最適化条件によって得らが大きく（d：1 . 48）、IPA や EG は他の溶媒に比べ粘度がれた楕円体状 PI 微粒子の紫外可視透過率を測定した。サ

高いことがわかる。これらの溶媒では、球状 PI 微粒子のンプル①（流動パラフィン中に PI 微粒子を分散）について、変形が起こらなかったことから、分散媒の比重および粘度

球状 PI 微粒子分散液の 280 nm における透過率は 65 % 程が PI 微粒子の変形に影響を与える因子の一つになってい度であった。一方、楕円体状 PI 微粒子分散液の透過率はると考えられる。PI の比重は 1 . 5 程度であり、クロロホル

40 % 程度であり、280 - 800 nm の測定領域全体においてムの比重に近いため、他の分散媒中に比べてクロロホルム

は楕円体状 PI 微粒子の方が低い透過率であった（図 3）。次

中では PI 微粒子が沈降しにくい状態といえる。そのため、に、サンプル②の透過率測定を行った（図 4）。この系ではクロロホルムを分散媒とした場合、撹拌子と容器との間に400 nm より長波長の領域では顕著な差は見られなかった微粒子が入り込む確率が下がり変形が進まなかった、と考が、紫外光領域の透過率は楕円体状 PI 微粒子の方が低い− 58 −

楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用

図 3 サンプル①（流動パラフィン中に分散させた PI
微粒子）の紫外可視透過率

図 4 サンプル②（アクリルポリマー中に分散させた PI微粒子）の紫外可視透過率

図 5 測定試料の模式図

図 6 サンプル②の光学顕微鏡像およびそれぞれの模式図現れたと考えられる。

ことがわかった。
サンプル①と②の測定試料の模式図を示す（図 5）。サン

サンプル②について、測定試料をシート表面から観察し

プル①では粒子が液体中で自由に動き、また、透過する粒

た光学顕微鏡像を図６に示す。とくに、球状 PI 微粒子で子分散体の距離が長い（図５⒜）。サンプル①と②では、微は粒子の凝集体が比較的多く観察された（図６⒜）。

粒子の運動性と光路長が異なり、粒子の散乱パターンや反サンプル①および②の結果から、粒子が媒体に分散して射散乱に関与する粒子数の違いが透過率スペクトルの差にいる状態では、楕円体状微粒子の方が球状微粒子よりも低− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 7 光透過の阻害

図 8 サンプル③（アクリルポリマーフィルム上に塗布された PI 微粒子）の紫外可視透過率

図 9 サンプル③の SEM 画像

い紫外線透過率となることが認められた。なお、微粒子

次粒子で分散した状態では粒径が可視光の波長に近く、可分散状態では、PI 微粒子は、⑴幾何光学的な反射と散乱、視光の波長の光透過においては、凝集体と比べると⑵ の⑵ Mie 散乱、および⑶粒子（PI）の光吸収の３つの作用で光Mie 散乱による前方散乱量の影響が大きいためと推察されの透過を妨げると考えられる（図 7）。⑴は粒子径が光の波る。この影響により、楕円体状 PI 微粒子においては可視長に比べ大きい場合に寄与が大きく、遮蔽効果は粒子の断光領域の透過率は大きく減らなかったと考えられる。一方、面積に比例する。⑵は光の波長と同程度の粒子径を有する

紫外光領域波長の光は可視光より波長が短く、⑵ の寄与

場合に寄与が大きく、前方散乱の量が多い。球状 PI 微粒

が小さくなり、紫外光が直線透過できる面積の大きさに応子（図６⒜）
では凝集体が多く存在したが、凝集体は粒径がじた光透過性を示し、楕円体状 PI 微粒子の方がより紫外大きい粒子に相当し、そのため、凝集体は、透過率測定に線透過率が低くなったと推察される。

おける⑴の寄与が大きくなり光の透過を妨げると考えられ

サンプル③のように PI 微粒子をポリマーフィルム上にる。他方、凝集体の形成により、光路に粒子が全く存在し広げた試料の透過率を測定すると、300 - 400 nm では球状ない部分が生じ、光が直線透過できる面積の比率が大きい

PI 微粒子の方が、また、280 nm- 300 nm では楕円体状 PI

構造体となっていることが光学顕微鏡像からも認められ微粒子の方が低い透過率であった（図 8）。塗布後の PI 微粒

る。さらに、楕円体状 PI 微粒子では球状 PI 微粒子の場合子の状態を確認したところ、球状微粒子の方が粒子間の隙よりも媒体中での分散が良く、光が直線透過できる面積の間は多く存在したため、楕円体状粒子の方が塗布後の被覆比率が小さいにもかかわらず、光学顕微鏡像から、楕円体

面積は大きかった（図 9）。加えて、楕円体状 PI 微粒子はポ状 PI 粒子が存在している領域においても完全に可視光をリマーフィルム上にほぼ１層で粒子が積層し、そのほとん

遮断できていない部分が存在することがわかる。これは 1

どがフィルムの平面方向に配列していることがわかった。

− 60 −

楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用

この系については、先述の⑴〜⑶の光透過を妨げる因子の謝

辞中では、⑴ は光透過の面積、⑶ は光透過の面積と PI 微粒

本研究の実施にあたり、助成いただきました公益財団法

子が形成する層の厚さがその作用の大きさを決定すると考人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。

えられる。⑵ の Mie 散乱に関しては、球状と楕円体状 PI

また、本研究の遂行にあたり有益なご助言をいただきまし

微粒子では、微粒子の凝集が同程度であることから、形状

た、神戸大学大学院工学研究科の南秀人教授、鈴木登代子

による差は小さく、⑵ の影響が大きくなる長波長領域で助教に御礼申し上げます。

前方散乱を妨害する⑶ の効果が高い方が透過率は低くなると考えられる。なお、300 - 400 nm の領域では、塗布し本研究助成により得られた成果

た PI 微粒子が形成する層の厚さ（図 5 の厚さ）の影響が大・学会発表

きい球状微粒子において、透過率が低くなったと考察され「非球状ポリイミド微粒子の調製」 日本化学会 第 101
春季年会る。さらに、300 nm 以下の紫外線領域では、⑴が支配的となり、楕円体状微粒子の方が低い紫外線透過率になった「扁平なポリイミド微粒子の調製」 第 70 回高分子学会
年次大会と推察される。
以上、粒子形状が光吸収や光散乱などに与える影響につ「楕円体状ポリイミド微粒子」 第 30 回ポリマー材料フォーラム

いて述べた。とくに、紫外線領域において楕円体状 PI 粒子の方が低い透過率となることがわかった。サンプル②は「非球状ポリイミド微粒子を簡便に調製」 産業技術支援
フェア in KANSAI 2021

肌にオイル分散液を、サンプル③は肌にパウダーを塗った状態に近いと考えられ、本研究によって楕円体状 PI 微粒

・依頼講演

子の方が紫外線防御の効果が高い可能性が明らかになった。

「ポリイミド微粒子の調製とその応用」 2021 年度関西

４．総

接着ワークショップ 第 1 回研究会

括・論文等発表従来、微粒子を楕円体状に変形させるためには、シート「ポリイミド微粒子の調製とその表面修飾」コロイドおよ

中に微粒子を分散、固定し、シートに圧力を印加後にシーび界面化学部会ニュースレター C & I Commun., 45

トを溶解除去し、楕円体状微粒子を回収する、といった煩（3），47 - 49（2020）．

雑な操作に加え、変形条件においては厳密な制御が必要で「簡便な楕円体状ポリイミド微粒子の調製」 令和３年度
大阪技術研テクノレポートあった。本研究を通じて、分散媒中で PI 微粒子を撹拌するだけで、簡便に楕円体状 PI 微粒子が調製可能であることがわかった。とくに、撹拌条件を種々変化させることで、 （引用文献）
調製の際に影響の大きい因子を抽出することに成功した。

1） Japan patent JP5780285B.

今回の結果から、微粒子の変形は分散媒の剪断力によって

2） J.A.Champion, Y. K. Katare, S. Mitragotri. PNAS,

起こるのではなく、微粒子が容器や撹拌子と物理的に接触

104, 11901-11904,（2007）．

し、変形することが推察された。得られた楕円体状 PI 微3） H. Zhang, W. Tuntanatewin, K. Ishikura, D. Sogabe,

粒子は、150 ℃、2 h の環境下でも形状を十分に維持する

K. Sugawara, A. Tokui, A. Nakagawa, Y. Okamura.

ことを確認した。また、紫外可視吸収測定において、光吸収や光散乱などの挙動が粒子形状によって異なることを明ACS Applied Polymer Materials, （8）2 ，3355-3364,（2020）．
4） W. Li, T. Suzuki, H. Minami, Angew. Chem., Int. Ed.,らかにした。

57, 9936-9940,（2018）．

本研究で使用した球状および楕円体状 PI 微粒子は、高5） K. Asao. J. Photopolym. Sci. Technol., 2 7, 1 8 1-1 8 5.

分子材料でありながら、ヒトの生活環境においては変形や（2014）．

溶融することなく容易に用いることができるため、材料と

6） Japan patent JP3478977B.

しての混合もしくは保管時においても雰囲気温度を気にすることなく使用可能である。したがって、高耐熱性 UV 防御剤としての応用展開が期待できる材料であることが明らかになった。

− 61 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測東北大学大学院薬学研究科

中林

孝和

Recently, Raman microscopy has attracted much attention as a label-free technique for observing living cells. We
have focused on intracellular water, an intracellular molecule that cannot be labeled, as a label-free detection by Raman
microscopy. This study investigated water molecules around biomembrane interfaces using Raman microscopy. The states ofwater molecules around biomembranes are proposed to be important for membrane functions; however, the detailed natureof water around membranes is still unknown because of insufficient measurement techniques. In this study, we constructed a
total internal reflection (TIR) Raman microscope that can selectively observe molecules around membrane interfaces. Only
molecules near the interface can be monitored using evanescent light generated under a TIR condition. The microscope
was constructed with an objective lens-type configuration using an inverted confocal microscope and a high NA objective
lens, which enables the measurement of a living cell incubated in a glass-bottomed dish. The absence of spectral distortion
associated with the TIR condition was confirmed by the fluorescence of the nanoparticle. The constructed microscope wasapplied to the observation of water on a self-assembled monolayer fabricated on a cover glass, and the C-H stretchingbands of the monolayer were observed to be enhanced under the TIR condition. We then measured TIR Raman spectra of acultured HeLa cell and the obtained results were discussed based on the previous report on the TIR spectra of water using a
prism-type configuration.

１．緒

密度変化、水分子の O‒H 伸縮振動ラマンバンドの形状解

言析から細胞内温度の測定ができることも提案した。これら

近年、ラマンイメージングを用いた細胞計測が広く行われている。分子の振動をラマンバンドとして直接観測するの研究を通して、「細胞内の水」が細胞を理解する新たなパラメータとなり得ることを示すことができた。

ラマンイメージングは、細胞内にある分子やタンパク質を本研究は、ラマン顕微鏡を用いた O‒H 伸縮振動バンド

蛍光色素や蛍光タンパク質で染色することなく観測できるの測定を界面水 7）に応用し、細胞膜や皮膚界面にある水分特徴を持つ。細胞内にある脂質やタンパク質、または細胞子の選択的計測および水素結合様式の解明を目的とする。

内に導入した分子の細胞内分布や細胞内での反応・代謝にラマン分光法の皮膚計測の応用は古くから行われており、関する情報をラベルフリーで得ることができる

1 ‒ 3）

水のラマンバンドから皮膚の水分量なども求められてい。

我々は，ラマンイメージングによる細胞内ラベルフリー

る。しかし、深さ分解能は 2 µm 程度が限界であり、界面検出として、ラベル化できない細胞内分子、「細胞内の水水と呼ばれる皮膚表面や細胞膜の近傍の水の選択的測定は4 ‒ 6）。水は最も重要な細行うことができなかった。脂質膜近傍の水分子の O‒H 伸

胞内成分であるが、細胞内での水の理解は未だ十分ではな

縮振動バンドについては、和周波発生法（Sum frequency

く、オルガネラ間での水の密度の差も不明であった。我々

generation, SFG）によって測定されているが 8）、SFG では

は、3400 cm‒ 1 付近にある水分子のブロードな O‒H 伸縮振高強度のパルスレーザーを用いるために、細胞膜などの生動バンドのラマンイメージングから、細胞内の水の密度の体膜に適用することが難しい。生体膜界面の水の振動バン

定量が行えることを提案し、核の方が細胞質よりも水の濃ドを観測する適切な分光法がないのが現状である。

分子」に着目した研究を進めている

度が高く、また O‒H 伸縮振動バンドの形状も核、細胞質、そこで本研究では、生細胞や皮膚組織を対象とした全反細胞周囲の水で異なることも示した。水分子の O‒H 伸縮

射ラマン顕微鏡を製作し、膜界面の水測定を行うことを目

振動バンドの形状は、水分子間の水素結合様式を反映して指す。全反射ラマン顕微鏡は、エバネッセント波と呼ばれおり、我々の結果は、細胞内外で水素結合様式が異なる可る微弱光によって、表面近傍のみのラマン散乱光を測定す

能性を示唆している。また、細胞周期に伴う細胞内の水のることができる。そのために、試料の損傷を最小限に抑え、膜近傍の約 100 nm の範囲の水分子や生体分子の挙動を選択的に議論できる 9 , 10）。全反射ラマン顕微鏡は、染色を行

Selective Observation of Water near
Biological Membranes using AttenuatedTotal Reflection Raman Microscopy
Takakazu Nakabayashi
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Tohoku University

わずに分子情報を得ることができ、主成分分析などの統計解析手法と組み合わせることで生体膜界面の分子構造を知る有用な手法になることができる。本研究を通して、全反射ラマン顕微鏡が皮膚や細胞膜近傍の構造を観測する適切な手法であり、コスメトロジーを発展させる汎用な手法と− 62 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測

共焦点光学系を用いて励起光源を回折限界まで絞ったときなり得ることを提案したい。

２．方の照射領域は軸長 1 ‒ 2 µm 程度の円筒となるため、全反射法

照明では回折限界を超えた深さで分子を励起できる。

2 . 1. 全反射

全反射照明とするには、基板と試料の間に相応の屈折率

全反射とは、屈折率が高い媒質から低い媒質へと光を入の差が必要である。顕微鏡においては、屈折率の高いプリ射する際に、入射角が臨界角を超えると光が屈折すること

ズムを利用して光学系を組むプリズム型と、開口数の大きなくすべて反射される現象を指す。この全反射過程においな対物レンズの辺縁部から励起光を導入し、基板と試料のて、界面からはエバネッセント波と呼ばれる光が染み出し、境界面で全反射を起こす対物レンズ型がある。プリズム型

界面近傍の物質と相互作用する。界面からの深さ z におけ

全反射顕微鏡は屈折率の高いプリズムを用い、比較的安価

るエバネッセント波の強度 I（z）
は以下の式で与えられる。

に構築できる。しかし、細胞の測定においては細胞をプリズム上で培養する必要があり、汎用性は低い。そこで本研
究では対物レンズ型を用いた。対物レンズ型は、開口数のd はエバネッセント波の強度が入射光（I 0）に対して 1 /e

高い対物レンズが必要であるが、試料操作が容易でありガとなる深さであり、しみ出し深さといわれる。d の値は入ラスベースディッシュ上で培養した生細胞の測定を行うこ

射光の波長を λ、屈折率が高い媒質の屈折率を n 1，屈折率とができる。対物レンズ型の試料部分を図 2 A に示す。

が低い媒質の屈折率を n 2，入射角を θ として，次式で求め

2 . 2 . 全反射ラマン顕微鏡られる。

製作した装置の概略図を図 2 B に示す。測定配置は通常の倒立顕微鏡と同一であり、ディッシュ上の皮膚組織、培養細胞など、様々な生体試料のラマンイメージングを行う
図 1 に全反射としみ出し深さの模式図を示す。このエバ

ことができる。励起光には現有の 532 nm の cw Nd:YAG

ネッセント波を励起光としてラマンスペクトルを得る手法

レーザーを用い、倒立顕微鏡（OLYMPUS）上で試料が励を全反射ラマン分光法と呼ぶ。励起光を可視光の領域とす起される構成とする。試料からのラマン散乱光は、ポリク

ると，エバネッセント波の染み出し深さは約 100 nm とな

ロメーター（ACTON）によってエネルギー分散され、電子り、100 nm の深さの範囲のみのラマン散乱光が得られる。

冷却 CCD（ANDOR）によって検出される。顕微鏡に XY 自動ステージ（Physik Instrumente）を組み込み、サンプル側
を二次元走査することでイメージング測定も行えるようにした。ガラスベースディッシュ上に水溶液や高分子を入れ、またはディッシュ上に細胞を培養させ、倒立型の配置でラマン測定を行った。対物レンズには、100 倍 , NA 1 . 49 の
油浸対物レンズ（UAPON 100 XOTIRF，OLYMPUS）を用い、入射光に角度をつけて全反射条件での測定を行った。
図 2 B において、Mirror 1 の角度をマイクロメーターによって微調整できるようにし、試料に照射される励起光の角度を変化させられるようにした。この角度を変化させ、

図 1 全反射の模式図

AB

図 2 全反射ラマン顕微鏡の A 試料部分、B 光学系の概略図− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

対物レンズに励起光が垂直に入射すると広視野顕微鏡になり、大きく角度をつけることで全反射条件になる。また広視野顕微鏡の条件で Mirror 2 直後のレンズを外すと共焦点顕微鏡となる。全反射ラマン顕微鏡では、励起レーザー
光の対物レンズ内の光路を精密に制御しなければならず、また広視野や共焦点での測定も行える必要がある。製作したシステムはそれらの要請をすべて満たし、全反射と広視野のスペクトルの比較などを容易に行える。

３．結果

図 3 マイクロメーターの目盛りと入射角度との関係（赤）と回帰直線（青）3 . 1. 励起光の入射角の決定
蛍光色素である Rhodamine 6 G 水溶液をガラスベースデ
ィッシュに加え、Mirror 1 のマイクロメーターの移動メ
モリと励起光の入射角との関係を蛍光から検討した（図 3）。
マイクロメーターのメモリと入射角はほぼ直線関係となる
ことがわかる。細胞の屈折率を 1 . 38 とすると、ガラスと細胞の間の臨界角は 65 . 2 º となる。そのため、細胞を観察するとき、マイクロメーターを 105 以上動かすと全反射条件になる。

3 . 2 . 入射角の変化によるスペクトル歪みの確認
全反射ラマンスペクトルの測定において、比較対象とする広視野や共焦点の測定とは励起光の入射角が大きく異なるため、光軸の違いがスペクトル形の変化として現

図 4 共焦点系と広視野照明、広視野照明からミラーをマイクロメーターのメモリで 85、95、105、115 動かしたときの Qdot
655 の蛍光スペクトル。横軸は上が波長、下がラマンスペクト
ルとした時の波数表示としている。

れる可能性がある。本研究では水の O-H 伸縮振動バンドを検討することから、O-H 伸縮振動バンドと同一の波長域に蛍光を示す蛍光性ナノ粒子（Qdot 655）を用いて、光の照射方法の違いによるスペクトル形の変化を検討した。
Qdot 655 は 655 nm 付近に蛍光の極大波長を持ち、蛍光ス
ペクトルの波長範囲（620 ‒ 680 nm）は 532 nm の光を励起光とした場合の O‒H 伸縮振動バンドの範囲に相当する。
Qdot 655 を Milli-Q に溶解させ、ディッシュ上に導入し、蛍光スペクトルの入射角依存性を測定した。ガラス界面にある粒子からの蛍光がバルク水溶液中の蛍光と異なる可能性を考慮し、共焦点系と広視野照明、複数条件の全反射照
明に加え、全反射直前の条件での測定も行った。図 4 に共図 5 PMMA- 水系のラマンスペクトル
赤：広視野、青：全反射条件

焦点系と広視野照明、広視野照明でミラーを動かしたときの Qdot 655 の蛍光スペクトルを示す。共焦点、広視野照明、
広視野照明でミラーを動かした場合のいずれの蛍光スペク
トルもその形状が一致した。光学系を変えてもスペクトルなどを行った。PMMA（Polymethyl methacrylate）の高分形状が変化しないことがわかった。全反射と共焦点におい子薄膜をカバーガラス上に作成・その上に水滴を載せ、広てスペクトル形状が異なった場合、入射角の違いによるス

視野条件と全反射条件でのラマンスペクトルの比較を行っ

ペクトル形の変化ではなく、全反射による界面付近の選択た（図 5）。3400 cm‒ 1 を中心とするブロードな水の O‒H 伸

測定による効果であると言える。

縮振動と PMMA 膜に由来する 2900 cm‒ 1 の C‒H 伸縮振動
バンドが観測されている。これらの 2 つのバンドの強度比

3 . 3 . 高分子膜の測定が角度によって異なり、全反射条件では水のラマンバン

実験では初めに高分子薄膜を用いて全反射条件の最適化

ドが大きく減少し、薄膜の C‒H 伸縮振動バンドが選択的− 64 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測に観測された。O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒H 伸縮振のラマンスペクトルの励起光角度依存性を図 6 に示す。プ動バンドの強度は、全反射条件では広視野条件の約 1 / 40

リズム型を用いた自己組織化単分子膜上の水の全反射ラマとなり、全反射条件では PMMA 膜を選択的に観測できる

ンスペクトルは報告されており、本システムで得られた結ことがわかった。PMMA 膜と水との界面で全反射が生じ、果との比較を行った。励起光の角度が増加するにつれて、屈折率の値から界面から約 80 nm までを観測していると考O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒­H 伸縮振動バンドの強度えられる。

が増加し、バルクに存在する水由来の情報が減少し、界面由来の情報が相対的に増加している。Mirror 1 のマイ

3 . 4 . 自己組織化単分子膜の測定

クロメーターが 80 のときのラマンスペクトルを基準とし、次に水の全反射ラマンスペクトルの評価として、自己組

差スペクトルとして全反射ラマンスペクトルを評価する

織化単分子膜をカバーガラス上に作成し、角度依存性の測と、O‒H 伸縮振動バンドの一部にあたる 3500 cm‒ 1 付近が定を行った。自己組織化単分子膜は、カバーガラス上にオ僅かに減少した形で差スペクトルが得られた。プリズム型

クタデシルトリメトキシシランを用いて単分子膜を作成しで報告されている結果 10）では、統計解析の手法の一つでた。

ある主成分分析を行うことで第 2 主成分に C‒H 伸縮振動

観測しているラマンスペクトルには，油浸対物レンズにバンドの変化と同じ方向に 3600 cm‒ 1 付近に比較的鋭いピ

用いるオイル（immersion oil）や基板となるガラスからのークが現れていた。今回の結果では、C‒H 伸縮振動バン

微弱発光成分を含み、これらの寄与が入射角度によってドと逆の方向に 3500 cm‒ 1 付近の変化が現れており、報告

異なり、スペクトルの角度依存性の解析を妨害する。特されたスペクトルとは同一の変化ではなかった。この理由に immersion oil と単分子膜の C‒H 伸縮振動バンドが重なは、考察項で検討する。

っている。そこでこれらの寄与を適切に取り除くために、内部標準としてベンゾニトリルを immersion oil に加えた。

3 . 5 . HeLa 細胞の測定

ベンゾニトリルのニトリル基の伸縮振動バンドは、細胞の‒1

人のがん細胞由来の細胞株である HeLa 細胞を用いて細ラマンスペクトルではバンドが現れない約 2300 cm にピ

胞 ‒ 水界面の全反射ラマンスペクトルを測定した。ガラスークを示す。そのために容易にニトリル基の伸縮振動バン

ベースディッシュ上に HeLa 細胞を培養し、蛍光を示さなドを検出することができ、ニトリル基のバンドが消えるよ

い HBSS に培地を置換して全反射ラマンスペクトルを測定

うにベンゾニトリルを含んだ immersion oil のラマンスペ

した。得られた代表的なラマンスペクトルを図 7 に示す。

クトルをバックグラウンドとして引くことで単分子膜のラO‒H 伸縮振動バンドにあたる 3050 ‒ 3800 cm‒ 1 の積分強度

マンスペクトルを得た。

で規格化し、全反射照明と共焦点系の差をとると C‒H 伸

自己組織化単分子膜／水（ハンクス平衡塩溶液（HBSS））

縮振動バンドに負のピークが現れた。しかしこの傾向の再図 6 自己組織化単分子膜のラマンスペクトルの入射角依存性− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 7 HeLa 細胞のラマンスペクトル（赤）共焦点、（青）全反射、（緑）
差スペクトル

現性は低く、測定した全ての細胞で現れてはいない。一方、成分で観測していると考察している。C‒H 伸縮バンドとO‒H 伸縮振動バンド領域の差スペクトルの形状に着目す同じ変化方向に現れた 3600 cm‒ 1 付近の鋭いピークにシラ

ると、高波数側で強度低下、低波数側で強度上昇が観測さノール基の寄与があるとし、自己組織化単分子膜に生じたれ、自己組織化単分子膜と似た差スペクトルが得られた。

ナノサイズの間隙に入った水分子の寄与も大きいとしている。今回のような差スペクトルの場合、数十ナノメートル

４．考の範囲の水分子を観測しており、異なる状態の水分子を観察測しているために、Ota の結果を再現できなかったと考え

自己組織化単分子膜の界面測定において、励起光の角度増加に伴い O‒H 伸縮振動バンドに対する C‒H 伸縮振動バられる。また、自己組織化単分子膜の状態も Ota とは一致していない可能性もある。

ンド強度の上昇が明瞭に観測された。C‒H 伸縮振動バン

プリズム型は変化させる角度範囲が広く、様々な角度でド強度の上昇は、Mirror 1 のマイクロメーターを 100 かの測定が容易に行えるのに対し、対物レンズ型は角度の変ら 105 に動かしたときに大きく増加している。これは 100

化範囲が狭く、主成分分析が行えるほどの角度依存性を測から 105 の間に入射角が臨界角を超えたために、エバネッ

定することが難しい。しかし、界面のみの情報を得るため

セント波で励起されたラマン散乱光だけが観測されたためには主成分分析をはじめとする統計解析手法が必要であるであると考えている。O‒H 伸縮振動バンド領域では、マと考えられ、今後の検討課題である。

イクロメーターを 80 まで動かしたときのスペクトルを基構築した全反射ラマン顕微鏡で HeLa 細胞を測定した結準とし、それぞれのスペクトルとの差をとると 3500 cm‒ 1

果、共焦点系で測定した場合に比べて低波数側の強度上昇

付近に負のピークが見られた。得られた結果は、上述のよが観測された。水の O‒H 伸縮振動バンドは他の振動バン

うに Ota によって報告されたプリズム型の全反射ラマンス

ドに比べて非常にブロードであり、水の多様な水素結合様ペクトルと形状が異なっていた 10）。Ota は主成分分析を用式を反映している。今後、細胞培養を行うディッシュの基

いて全反射ラマンスペクトルを解析し、主成分の第２成分

板依存性などの詳細を検討し、得られたスペクトルが何に‒1

では、C‒H 伸縮バンドと同じ変化方向に 3600 cm 付近の基づいているのかを明らかにする。

鋭いピークが現れている。今回得られた図 7 では、C‒H 伸

５. 総縮バンドと O‒H 伸縮振動バンドの変化の正負は逆であっ括た。再現しない理由として主成分分析と差スペクトルによ全反射ラマン顕微鏡の製作に成功し、装置の特性評価、る解析の違いを上げることができる。Ota は主成分分析で自己組織化単分子膜、HeLa 細胞の全反射ラマンスペクト

得られた結果について、どの程度の厚さの分子を観測してルの測定を行った。界面近傍の分子観測には成功しているいるのか見積もっており、オクタデシルトリメトキシシラ

が、十分には膜界面の水の状態を観測しきれていないと考ンの鎖長に対応する数ナノメートルの範囲の分子種を第 2えている。考察項で記したように、統計解析の手法を組み− 66 −

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測

合わせ、生体膜界面の水を捉える研究を続けていきたい。

5） T. Sugimura, S. Kajimoto, T. Nakabayashi, Label-free
imaging of intracellular temperature by using the O-H（引用文献）

stretching Raman band of water. Angew. Chem. Int.
Ed. 59, 7755‒7760（2020）．

1） C. Krafft, M. Schmitt, I. W. Schie, D. Cialla-May, C.
Matthäus, T. Bocklitz, J. Popp, Label-Free Molecular6） D. Shibata, S. Kajimoto, T. Nakabayashi, Label-free

Imaging of Biological Cells and Tissues by Linear andtracking of intracellular molecular crowding with cell-

Nonlinear Raman Spectroscopic Approaches. Angew.

cycle progression using Raman microscopy. Chem.

Chem. Int. Ed. 56, 4392‒4430（2017）．

Phys. Lett. 779, 138843（2021）．

2） K. Aljakouch, T. Lechtonen, H. K. Yosef, M. K.

7） E. Yamamoto, T. Akimoto, M. Yasui, K. Yasuoka,

Hammoud, W. Alsaidi, C. Kötting, C. Mügge, R.

Origin of subdiffusion of water molecules on cell

Kourist, S. F. El-Mashtoly, K. Gerwert, Raman

membrane surfaces. Sci. Rep. 4, 4720（2014）．

Microspectroscopic Evidence for the Metabolism of a8） J. D. Cyran, E. H. G. Backus, Y. Nagata, M. Bonn,

Tyrosine Kinase Inhibitor, Neratinib, in Cancer Cells.

Structure from Dynamics: Vibrational Dynamics ofAngew. Chem. Int. Ed. 57, 7250‒7254（2018）．

Interfacial Water as a Probe of Aqueous Heterogeneity.
J. Phys. Chem. B 122, 3667‒3679（2018）．

3） H. Takahashi, A. Yanamisawa, S. Kajimoto, T.
Nakabayashi, Observation of the changes in the9） F. Ishizaki, M. Kim, Near-Infrared Attenuated Total

chemical composition of lipid droplets using Raman

Reflection Raman Spectroscopy for Polymer Surface

microscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 22, 21646-21650

Observation. Jpn. J. Appl. Phys. 47, 1621‒1627（2008）．
10）C. Ota, Investigation of the Structure of Water at（2020）．
4） M . T a k e u c h i , S . K a j i m o t o , T . N a k a b a y a s h i ,Hydrophobic and Hydrophilic Interfaces by Angle-

Experimental Evaluation of Density of Water in a

Resolved TIR Raman Spectroscopy. Phys. Chem.

Cell by Raman Microscopy. J. Phys. Chem. Lett. 8,

Chem. Phys. 17 , 26435 ‒ 26442（2015）．

5241‒5245（2017）．

− 67 −

リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム
国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門

中村真紀

Transdermal delivery system of cytokines by calcium phosphate (CaP) nanoparticles would be useful in the cosmetic
and medical fields. In this study, we aimed to fabricate CaP nanoparticles containing a clinically approved cytokine, basic
fibroblast growth factor (FGF-2). First, we used cytochrome C as a model basic protein, which has similar characteristics(isoelectric point and molecular weight) to FGF-2. Negatively charged heparin was co-immobilized within CaP nanoparticles
as a dispersant. The CaP nanoparticles immobilizing both cytochrome C and heparin were fabricated from a reaction solution
containing calcium ions, phosphate ions, carbonate ions, heparin, and cytochrome C. The immobilization efficiencies ofcytochrome C in the CaP nanoparticles with heparin were about three times higher than those in the CaP nanoparticles
without heparin, indicating that heparin improved immobilization efficiencies of cytochrome C within CaP nanoparticles.
This might be due to the interaction between negatively charged heparin and basic protein, cytochrome C. The role ofheparin as a dispersant was also confirmed: the cytochrome C–CaP nanoparticles with heparin were dispersed in water,whereas those without heparin did not. Next, we fabricated CaP nanoparticles immobilizing both FGF-2 and heparin in thesame manner. The resulting nanoparticles slowly released FGF-2 in a culture medium for at least two days. These results
indicate the potential of the resulting nanoparticles as cosmetic and medical materials, which are capable of releasing FGF-2.

１．緒

ノ粒子の DDS 応用の可能性について検討してきた 1 , 2）。

言本研究では、サイトカインを真皮層まで送りこむことの皮膚内へ有効成分を浸透させる経皮薬物送達システム

できる経皮 DDS 構築に向けて、リン酸カルシウムとサイ（DDS）は、低侵襲であることから、美容ならびに医療のトカインの複合ナノ粒子の合成を試みた。著者らのリン酸分野で注目されている。線維芽細胞増殖因子（FGF）等のカルシウムナノ粒子合成技術を発展させ、粒子構造や表面

サイトカイン（細胞から分泌され、細胞間の情報伝達等に特性を制御することで、DDS に適した分散性ナノ粒子の関与するタンパク質）は、細胞増殖促進作用等を有するこ設計を目指した。サイトカインとしては、褥瘡（床ずれ）・とから、化粧品や医薬品の成分としても有用である。しか皮膚潰瘍治療剤等として臨床応用されている FGF- 2 を選し、親水性のサイトカインの場合、細胞が密に並び強固な択した。また、粒子の分散性向上を期待して、負電荷を有バリア機能を持つ皮膚表面の疎水性の角層を透過するのはし、血液凝固阻止剤として臨床応用されているヘパリンの容易ではない。皮膚を透過することのできるナノ粒子等の共担持を試みた 3）。まず、FGF- 2 のモデルタンパク質と

キャリア
（運搬体）
にサイトカインを複合化できれば、サイ

してシトクロム c（FGF- 2 と類似した等電点・分子量を有トカインを真皮層まで送りこむことができると期待される。

し、安価で取り扱いや分析が容易）を用いた予備的な条件

リン酸カルシウムは、歯や骨の主要無機成分であり、フ検討を行い、続いて FGF- 2 を用いた検討を行った。さらに、

ァンデーション等のコスメトロジー素材としても使用され得られたナノ粒子からの FGF- 2 放出挙動について、予備ている。優れた生体親和性と生体吸収性（例外もあり）を示的な評価を行った。

し、汎用的な無機塩と水のみで合成できることから、安価

２．方で安全性に優れる DDS 用のキャリアとして注目されてい法する DDS について研究を進め、様々な機能性物質（DNA、

2 . 1. シトクロム c 担持リン酸カルシウムナノ粒子の合成

磁性酸化鉄ナノ粒子、銀ナノ粒子等）を複合化したリン酸

塩化カルシウム溶液（500 mM）、リン酸水素二カリウム

カルシウムナノ粒子の液相合成技術を開発し、得られたナ溶液（500 mM）、生理食塩水（0 . 9 w/v%）は、無菌性・エンる。著者らはこれまで、リン酸カルシウムをキャリアとドトキシンフリーといった安全性の担保されている医療用
注射液を用いた。炭酸ナトリウム、ヘパリンナトリウムTransdermal delivery system of cytokines
by calcium phosphate nanoparticles

は一般用試薬を用い、それぞれ、超純水、生理食塩水に溶

Maki Nakamura

パリンナトリウム溶液：5 mg/mL）。まず、塩化カルシウ

Nanomaterials Research Institute, National
Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology (AIST)解させた溶液を用いた（炭酸ナトリウム溶液：500 mM、ヘ
ム溶液、ヘパリンナトリウム溶液、生理食塩水を混合した
A 液（カルシウムイオン濃度：80 mM、ヘパリン濃度：0、− 68 −

リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム

1 . 0、2 . 0、2 . 5、3 . 0 mg/mL）、ならびに、リン酸二カリウ料を得た。振とう時間は 0 時間あるいは 24 時間とした。

ム溶液、炭酸ナトリウム溶液、生理食塩水を混合した B 液

振とう時間 0 時間では、ヘパリンの有無にかかわらず、（リン酸イオン濃度：80 mM、炭酸イオン濃度：80 mM）を一次粒子径 50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得ら調製した。また、シトクロム c を生理食塩水に溶解させた

れた（図 1 上）。EDX スペクトルでは、いずれの試料にも溶液を C 液とした（シトクロム c 濃度：2 mg/mL）。15 mL

カルシウム（Ca）、リン（P）、酸素（O）の大きなピークが検チ ュ ー ブ に、B 液 1 mL、C 液 1 mL、A 液 2 mL の 順 に 加

出され、ヘパリンを添加して得られた試料では、ヘパリ

え、1 分間ボルテックスで撹拌した後、振とう機（25 ℃、ン特有の元素である硫黄（S）の小さなピークも検出された

150 rpm）で 0、1、3、6、24、48、75 時間反応させた。振（図 2）。これにより、ヘパリンがこれらの粒子中に担持さとう後（振とう時間 0 時間では振とうせずに撹拌後すぐ）、れたことを確認できた。炭素（C）の小さなピークの一部は、遠心操作により析出物を回収した。また、遠心後の上澄み担持されたヘパリンやシトクロム c に由来するものと考えを希釈し（上澄み希釈液）、シトクロム c の担持量算出に用られる。シトクロム c 担持率は、ヘパリンを添加して得らいた（詳細は 2 . 3 .）。

れた試料で 37 %、添加せずに得られた試料で 13 % と、ヘ
パリン添加により大きく増加した（図 3）。負電荷を有する2 . 2 . FGF- 2 担持リン酸カルシウムナノ粒子の合成

ヘパリンと、塩基性タンパク質であるシトクロム c の静電A 液ならびに B 液は、2 . 1 . と同様に調製した。FGF- 2的相互作用により、シトクロム c がヘパリンと共に粒子にを遺伝子組み換えしたトラフェルミン製剤（褥瘡・皮膚潰瘍治療剤）を生理食塩水に溶解させた溶液を C 液とした
（FGF- 2 濃度：0、10、20、50、100 µg/mL）。反応の際にタ
ンパク質低吸着性の 15 mL チューブを用いた以外は、2 . 1 .
と同様の手順で反応を行い、析出物を回収した。

2 . 3 . 構造・組成評価得られた試料をシリコン基板上で乾燥させ、走査電子顕微鏡（SEM）観察ならびにエネルギー分散型 X 線分光法
（EDX）による元素分析を行った。SEM 観察においては、試料に金蒸着を行った。シトクロム c 担持粒子では、紫外可視分光光度計により上澄み希釈液の吸光度（409 nm）を測定し、検量線を用いて上澄みに含まれるシトクロム c 量を算出、反応液中のシトクロム c 量（2 mg）との差分を担持量として算出した。担持率は、（粒子に担持されたシトク

図 1 得られた試料の SEM 像

ロム c 量）／（反応液中のシトクロム c 量：2 mg）× 100（%）
として算出した。また、得られた試料を超純水に懸濁させ、粒子径分布およびゼータ電位を、動的光散乱法（DLS）および電気泳動光散乱法（ELS）により調べた。

2 . 4 . FGF- 2 の放出挙動評価
2 . 2 . で得られた試料を細胞培養用の培地に懸濁し、懸濁後すぐ（0 時間）ならびに 37 ℃で 24、48 時間静置後に培 地 中 に 放 出 さ れ た FGF- 2 の 濃 度 を ELISA（EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay）
で測定した。

３．結果

3 . 1. シトクロム c 担持リン酸カルシウムナノ粒子
3. 1. 1. ヘパリンの有無の影響
ヘパリンの有無がシトクロム c の担持率や粒子分散性に与える影響を検討するため、A 液のヘパリン濃度を 2 . 5
mg/mL（Hep（+））あるいは 0 mg/mL（Hep（−））として試

図 2 得られた試料の EDX スペクトル（シリコン（Si）
は基板由来）− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 3 得られた試料のシトクロム c 担持率
図 4 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料の SEM 像
表 1 得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位

担持されやすい状態となり、より多くのシトクロム c が担持されたと考えられた。DLS 測定によると、ヘパリンを添加して得られた試料の平均粒子径は 140 nm 程度であったが、添加せずに得られた試料は水中で沈降しやすく、信頼できる粒子径は得られなかった（表 1）。また、ヘパリンを添加して得られた試料のゼータ電位は ‒ 15 mV であり、

図 5 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料のシトクロム c 担
持率

添加せずに得られた試料の + 6 mV よりも絶対値が大きくなった（表 1）
。ヘパリンを添加して得られた試料では、粒た試料の + 6 mV よりも絶対値が大きくなった（表 1）。振と子間の静電的反発が粒子の分散性に寄与したと考えられた。

う時間 0 時間で得られた試料と同様、ヘパリンを添加して振とう時間 24 時間では、ヘパリンの有無にかかわらず得られた試料では、粒子間の静電的反発が粒子の分散性に

不定形の粒子が得られた（図 1 下）
。EDX スペクトルでは、寄与したと考えられた。

振とう時間 0 時間と同様に、カルシウム（Ca）、リン（P）、

以上より、ヘパリンは、シトクロム c の担持率向上なら酸素（O）の大きなピークが検出され、ヘパリンを添加しびに生成粒子の分散性向上に大きく寄与することが示されて得られた試料では硫黄（S）の小さなピークも検出された

た。

（図 2）。ヘパリンを添加して得られた試料における S/Ca

3. 1. 2. ヘパリン濃度の影響

元素比（EDX ピークにより算出）は、振とう時間 0 時間（S/

ヘパリンの濃度がシトクロム c の担持率や粒子分散性

Ca= 0 . 068）よりも振とう時間 24 時間（S/Ca= 0 . 116）で大に与える影響を検討するため、A 液のヘパリン濃度を 1 . 0、

きくなり、より多くのヘパリンが担持されたと考えられた。

2 . 0、2 . 5、3 . 0 mg/mL（Hep 1 . 0、2 . 0、2 . 5、3 . 0）と 変 化

シトクロム c 担持率は、ヘパリンを添加して得られた試料

させて試料を得た。振とう時間は 0 時間とした。

で 76 %、添加せずに得られた試料で 23 % と、ヘパリン添SEM 観察によると、ヘパリン濃度にかかわらず、一次加により大きく増加し、さらに振とう時間 0 時間よりも増

粒子径 50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得られた

加した（図 3）。DLS 測定によると、ヘパリンを添加して得（図 4）。シトクロム c 担持率は、ヘパリン濃度が増加する

られた試料の平均粒子径は 160 nm 程度であったが、添加につれてわずかに増加した（図 5）。DLS 測定によると、得せずに得られた試料は水中で沈降しやすく、信頼できる粒られた試料の平均粒子径は 130 ～ 180 nm 程度、ゼータ電子径は得られなかった（表 1）。ヘパリンを添加して得られ位は - 17 ～ - 16 mV 程度であり（表 2）、ヘパリン濃度によた試料のゼータ電位は − 2 2 mV であり、添加せずに得られり大きな違いは見られなかった。

− 70 −

リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム

表 2 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位

以上より、今回変化させたヘパリン濃度の範囲内では、
ヘパリン濃度はシトクロム c の担持率や粒子分散性に大きな影響を与えないことが示された。
3. 1. 3. 振とう時間の影響

図 6 振とう時間を変化させて得られた試料の SEM 像

振とう時間がシトクロム c の担持率に与える影響を検討するため、振とう時間を 0、1、3、6、24、48、75 時間と変化させて試料を得た。A 液のヘパリン濃度は 2 . 5 mg/
mL とした。
振とう時間 1、3、6 時間で得られた試料の SEM 観察によると、振とう時間 0 時間（図 1 左上）と同様、一次粒子径
50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得られた（図 6）。
すなわち、振とう時間 6 時間から 24 時間（図 1 左下）にかけて不定形に形状が変化すると考えられた。この形状変化の理由の 1 つとして、長時間の反応によるリン酸カルシウ
ムの結晶構造の変化が推測されることから、今後結晶構造解析を行う予定である。なお、シトクロム c 担持率は、0
時間から 24 時間では振とう時間が増加するにつれて増加したが、24 時間以降はほぼ同じであった（図 7）。
以上より、振とう時間が 24 時間あれば、シトクロム cを充分に担持できることが示された。

図 7 振とう時間を変化させて得られた試料のシトクロム c 担
持率表 3 FGF-2 濃度を変化させて得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位

3 . 2 . FGF- 2 担持リン酸カルシウムナノ粒子
3. 2. 1. FGF-2濃度の影響
3 . 1 . のシトクロム c に代えて、FGF- 2 の担持を試みた。
その際、C 液の FGF- 2 濃度を 0、10、20、50、100 µg/mLと変化させて試料を得た。A 液のヘパリン濃度は 2 . 5 mg/
mL、振とう時間は 0 時間あるいは 24 時間とした。
FGF- 2 濃度 100 µg/mL で得られた試料では、振とう時間にかかわらず、水中で沈降しやすく、DLS 測定において信頼できる粒子径は得られなかった。FGF- 2 濃度 0 ～50 µg/mL で得られた試料では、振とう時間 0 時間で平均
粒子径 140 ～ 220 nm 程度、振とう時間 24 時間で平均粒子
径 150 ～ 240 nm 程度となった（表 3）。ゼータ電位は、振る添加物（エデト酸ナトリウム水和物等）の影響が考えられ

とう時間 0 時間で - 18 ～− 15 mV 程度、振とう時間 24 時

る。添加物を含まない FGF- 2 を用いた検討は今後の課題

間で - 24 ～− 17 mV 程度となり、FGF- 2 濃度の低い方がとしたい。

ゼータ電位の絶対値が大きくなる傾向にあった。

3. 2. 2. FGF-2の放出挙動

FGF- 2 濃度 100 µg/mL で得られた試料が沈降しやすか

C 液中の FGF- 2 濃度 10、20、50 µg/mL で得られた試料った理由として、FGF- 2 原料として用いた製剤に含まれについて、培地中での FGF- 2 放出挙動を評価した。振と− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

う時間 0 時間で得られた試料では、粒子を懸濁させた直後の培地中に、14 ng/mL（C 液中 FGF- 2 濃度 = 10 µg/mL）から 70 ng/mL（C 液中 FGF- 2 濃度 = 50 µg/mL）の FGF- 2 が検出された。しかし、いずれの試料でも、24、48 時間後にはほとんど FGF- 2 が検出されなくなった（図 8 左）。これは、培地中に放出された FGF- 2 が構造変化を起こしたことによると考えられる（培地中で FGF- 2 が構造変化し、
ELISA で検出される濃度が急減することが知られている）。
従って、振とう時間 0 時間で得られた試料では、FGF- 2
が粒子より速やかに放出されたものの、持続的な FGF- 2
放出はなかったと考えられた。一方、振とう時間 24 時間

図 8 FGF-2 濃度を変化させて得られた試料の FGF-2 放出挙動で得られた試料では、24、48 時間後であっても FGF- 2 が放出初期と同程度の濃度で検出されたことから（図 8 右）、FGF- 2 の放出が、24、48 時間後でも継続していたと考え謝辞られた。後者の試料では、長時間の反応によって、表面だ

本研究は、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財

けでなく内部にも FGF- 2 の担持されたリン酸カルシウム団の助成を受けて行われたものである。研究の実施に当たナノ粒子が生成したと推定される。

っては、産業技術総合研究所の大矢根綾子博士、分領和歌

以上より、振とう時間によって FGF- 2 の放出挙動が大きく変化すること、ならびに、振とう時間 24 時間で得ら

子氏、黒岩輝代子氏、荒木裕子氏をはじめ、関係各位にご指導・ご協力を頂いた。

れた試料では FGF- 2 を少なくとも 48 時間にわたって徐放（引用文献）

できることが示された。

４．総

1） 中村 真紀 , 大矢根 綾子 ,「機能性リン酸カルシウムナ

括

ノ粒子の液相合成とバイオメディカル応用」, セラミッ
クス , 55, 189‒192（2020）．

著者らのリン酸カルシウムナノ粒子合成技術をもとに、塩基性タンパク質であるシトクロム c（FGF- 2 のモデルタ

2） 中村 真紀 , 大矢根 綾子 ,「遺伝子や造影剤を細胞へ送ンパク質として条件検討に使用）
ならびに FGF- 2 を担持し達するリン酸カルシウムナノ粒子の簡便・迅速な作製技術の開発」，NEW GLASS, 36, 22‒24（2021）．

た分散性リン酸カルシウムナノ粒子を合成した。ヘパリンの共担持が、タンパク質の担持率向上（本研究ではシトク

3） M. Nakamura, A. Oyane, K. Kuroiwa, Y. Shimizu,

ロム c でのみ確認）や粒子分散性向上に大きく寄与するこA. Pyatenko, M. Misawa, T. Numano, H. Kosuge,とが明らかとなった。得られたナノ粒子は、FGF- 2 を持“Facile one-pot fabrication of calcium phosphate-

続的に放出できることから、美容や医療の分野への応用がbased composite nanoparticles as delivery and MRI

期待される。今後の課題としては、皮膚の透過に適したナ

contrast agents for macrophages” , Colloids Surf. B

ノ粒子構造の最適化等が挙げられる。

Biointerfaces, 162, 135‒145（2018）．

− 72 −

積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発
慶應義塾大学理工学部

福井有香

In this research, we carried out internal and surface modifications of liposomes to prepare nanosized capsules withvarious functional properties including improved incorporation of active agents and controlled release of cargo in response
to external stimuli. For internal modification of liposomes, anionic polymers were generated within liposomes by living
radical polymerization. The obtained nanocapsules showed good absorption and retention of chemical substances dependingon the binding ability to the incorporated polymers, and the absorption capacity could be controlled by the length anddissolved state of the polymer chains. In addition, surface modification of liposomes was carried out by the layer-by-layer
deposition of enzymes and polysaccharides to prepare capsule walls with enzymatic degradability. First, lysozyme (Lyso)and phosphorylated chitosan (PCHI), which is cleavable by Lyso, were deposited over the liposome. Then, hyaluronic acid
(HA) was deposited as an outermost layer. The degradation of the inner layer consisting of PCHI allowed the release of theoutermost layer consisting of HA. Also, degradation of the PCHI layer led to the exposure of the lipid membrane, whichfacilitated the release of cargo from the inner cavity of the liposome. We expect that polymer-deposited nanocapsules would
open up application potential as a carrier for delivery of active agents to the targeted skin region.

１．緒

よって、カプセルの表面状態を段階的に変化できることを言報告している 3）。この研究から、カプセル層の環境に応答

ナノサイズのカプセルは、組織への浸透性に加えて、カした再構築によって、物質放出の促進や目的部位に対するプセル層と内部のキャビティへの物質の保持能を有してお

アフィニティの表面提示といった新しい機能発現の可能性

り、細胞、組織、皮膚、頭皮、毛髪などをターゲットとしが示された。
本研究では、リポソームとポリマーの複合ナノカプセル

たキャリア素材として注目されている。中でも、リン脂質分子からなる閉鎖小胞（リポソーム）は、生体安全性に優れ、 （リポナノカプセル）の化粧品用キャリア素材への応用展開
中空部（水相）には水溶性の物質と脂質膜部には脂溶性の物に向けて、リポナノカプセルの①表面と②内部の改質によ質を同時に封入可能で、医薬品、化粧品および食品用のカる機能開拓に挑戦した。図 1 に示すように、まず、①リポ

プセル素材として応用研究が行われている。これまでに申ソーム表面にバイオポリマーとその分解酵素を積層化する請者らは、リポソーム表面に天然物質（ポリマーおよびミ

ことで、皮膚近傍の環境に応答して、積層膜の分解・剥離ネラル）を積層（layer-by-layer, LbL）することで、全てバを起こすことによって、リポソーム内部とカプセル層からイオ由来素材からなるカプセル素材（リポナノカプセル）のの有効成分の放出について検討を行った。さらに、②リポ開発を行ってきた 1 , 2）。この方法は、ポリマーの種類や吸ソームの内部にポリマーを複合化することで、ポリマーと着の量・形態・分布の調節から、吸着層の厚み、組成など、のアフィニティを利用した有効成分の保持能の付与を行っナノスケールにおける積層構造の精密なデザインが可能でた。

あり、膜安定性、分散安定性、物質保持能、標的指向性な

２．方

どの機能を組み込むこと（機能プログラミング）も可能である。また、この積層構造に着目した機能設計として、カプ

法

2 . 1. リポソーム表面への積層膜の構築膜の構築

セル層の分解・剥離による担持物質の放出、表面性状の変アニオン性リン脂質であるDilauroyl phosphatidylacid（DLPA）

化、および内包物の放出について検討を始めている。実際と 中 性 リ ン 脂 質 で あ る Dimyristoyl phosphatidylcholineに、カプセル層にバイオポリマーとその分解酵素を組み合（DMPC）を用いて、単純水和法とエクストルージョン法

わせることで、酵素によるバイオポリマーの分解と剥離に（pore size: 100nm）
により、アニオン性のリポソーム（Lipo）を作製した。カチオン性多糖であるキトサン（MW: 8 . 2 ×
104 Da, pKa= 6 . 5）にリン酸基を導入するために、メタン

P repa rat ion of Poly mer- depo sited
Nanocapsules for Cosmetic Delivery
SystemYuuka Fukui
Faculty of Science and Technology,
Keio University

スルホン酸存在下で五酸化二リンを反応させてリン酸化
キトサン（PCHI）を合成した。次に、PCHI がカチオン性を示す pH 3 . 0 において、アニオン性リポソーム（Lipo）の表面に PCHI の吸着を行った（Lipo-PCHI）。PCHI の吸着量は、アミノ基の定量法であるフルオレスカミン法を用いて測定した。

− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 1 リポソームの表面と内部へのポリマー複合化によるリポナノカプセルの作製とコ
スメティックデリバリーシステムへの応用

pH 7 . 4 において、
Lipo-PCHI の表面にLyso（pI: 11 . 10 ~ 11 . 35）

2 . 3 . リポソーム内部へのポリマー複合化と物質保持機能の付与の吸着を行った（Lipo-PCHI-Lyso）。Lyso の吸着量は蛍光2 . 1 . 項と同様の方法でアニオン性のリポソーム（Lipo）

ラベル化した Lyso によって定量した。さらに、この表面を作製した。次に、リポソーム内部に光リビング開始が正電荷を示す条件において、アニオン性のヒアルロン酸剤であるイニファーターとアニオン性モノマーである（HA）の吸着を行った（Lipo-PCHI-Lyso-HA）。得られたカ2 -acrylamido- 2 -methyl-sulfonic acid（AMPS） を 封 入

プセルについて、動的光散乱法による水中粒径測定、電気し（AMPS-in-Lipo）、UV 照射（高圧水銀灯）による光リ

次に、PCHI の分解酵素としてリゾチーム（Lyso）を選択し、泳動光散乱法によるゼータ電位測定、さらに透過型電子顕

ビングラジカル重合を行った。得られた AMPS ポリマー

微鏡（TEM）
による形状観察を行った。

（PAMPS）内封リポソーム（PAMPS-in-Lipo）について、水中粒径測定、ゼータ電位測定、および TEM による形状

2 . 2 . 積層膜の分解・剥離に伴う物性の変化と内包物質の放出観察を行った。次に、内部の PAMPS を利用した物質のLyso による PCHI の酵素分解性を評価するため、Lipo-

討 す る た め に、PAMPS-in-Lipo 分 散 液 に カ チ オ ン 性 物

PCHI-LysoとLipo-PCHI-Lyso-HAを種々のpH条件下（pH5.0,質（Rhodamine 6 G（Rho 6 G）、Acridine Orange（AO）） と吸収と保持について検討を行った。まず、吸収挙動を検6 . 2 , 7 . 4）において、37 ℃で 24 時間インキュベートした。

ア ニ オ ン 性 物 質（Hydroxypyrene- 3 , 6 , 8 -trisulfonic acid

その後、分解によって生じた PCHI 断片を回収し、フェリシ（HPTS））を加え、種々の条件でインキュベーションを行

アン化カリウムを用いて PCHI の還元末端を検出した。また、った。遠心分離によって PAMPS-in-Lipo を回収した後、酵素分解後にLipo-PCHI-Lyso-HAの分散液を透析すること

界面活性剤を加えて PAMPS-in-Lipo を崩壊させて、封入で、剥離した HA を回収し、ゲル浸透クロマトグラフィ法された各蛍光物質の定量を行った。

（GPC）
によって分子量の測定を行った。次に、酵素分解前

３．結後の膜物性評価として、1 , 6 -diphenyl- 1 , 3 , 5 -hexatriene（DPH）を用いて、蛍光偏光解消測定により脂質膜の流動

果3 . 1. リポソーム表面への積層膜の構築性を評価した。次に、アニオン性の蛍光物質の HPTS を封作製した PCHI は両性（pI= 5 . 0）であり、低 pH で正電荷、入した Lipo を作製し、その表面に PCHI、Lyso および HA

高 pH で負電荷を帯びる。そこで、アニオン性の Lipo（粒径：を積層化した後、種々の条件下で酵素分解を行い、放出さ

90 ± 31 nm）に対して、PCHI が正電荷を帯びる pH 条件におれた HPTS の蛍光強度測定より、放出量を算出した。

いて吸着を行ったところ、仕込みの PCHI 濃度に応じて、吸着量が増大した（Lipo-PCHI）。飽和吸着となるように作製した Lipo-PCHI の粒径は、90 ± 31 nm から 141 ± 30 nm と大− 74 −

積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発で 24 時間静置したところ、Lyso の至適 pH（pH 5 . 0 - 6 . 0）付近においてともに PCHI の分解が促進された。Lipo-PCHILyso については、ゼータ電位（pH 6 . 2）が + 4 . 5 ± 4 mV から- 45 ± 2 mV と正から負に反転した。これは、表面から PCHI
断片が剥離して、脂質膜が露出したことによると考えられた。次に、Lipo-PCHI-Lyso-HA については、酵素分解によって HA 断片が剥離し、低分子量化していることが確認された。HA は分子内に、Lyso の基質である N- アセチルグ
ルコサミン残基を有しているため、Lyso によって分子が図 2 異なる pH 条件下における各種ナノカプセルのゼータ電位

切断される。これらの結果から、酵素分解によってカプセル層に担持した物質の放出が可能であることを見出した。
次に、3 . 1 . 項で作製したナノカプセルの酵素分解に伴きくなった。また、ゼータ電位は pH とともに正から負へう膜物性評価を行った。脂質膜の流動性による影響につと変化し、両性を示すことがわかった（図 2、緑色）。そこで、いて、蛍光プローブである DPH を用いて、蛍光偏光解消

Lipo-PCHI が負電荷を帯びる条件（pH 7 . 4）において、Lyso

測定により検討した。DPH は長い棒状の分子であるため、の吸着を行ったところ、Lyso の仕込み濃度に応じて吸着

脂質分子の分子軸に沿って配向する。脂質の運動が束縛さ量が増加することがわかった（Lipo-PCHI-Lyso）。カプセ

れている場合は、DPH の蛍光偏光（蛍光異方性）は保たれ、

2

ル表面の 100 nm 当たりに 1 . 4 個の Lyso が吸着した Lipo-

脂質の運動性が上がると蛍光偏光は素早く解消される。各

PCHI-Lyso において、粒径は 169 ± 32 nm となり、等電点

種ナノカプセルに DPH を加えて、蛍光偏光解消を測定しはLipo-PCHIよりも高pH側にシフトすることがわかった（図たところ、リポソームでは、昇温すると 35 - 45 ºC で蛍光２、黄色）。次に、Lipo-PCHI-Lyso が正電荷を示し、Lyso

異方性の急激な減少が見られた（図 3）。これは、この温度の至適 pH より低い pH 2 . 0 において、アニオン性の HA の領域で脂質膜のゲルから液晶への転移が起こり、膜内の吸着を行ったところ、粒径は 124 ± 62 nm となり、ゼータ

DPH の運動性が上がったことによると考えられる。一方、電位は負に反転した（Lipo-PCHI-Lyso-HA）。また、得ら

Lipo-PCHI-Lyso（酵素分解前）と Lipo-PCHI-Lyso-HA（酵素れた Lipo-PCHI-Lyso-HA は、いずれの pH 環境においても分解前）については、広い温度領域において蛍光異方性は

HA 由来の負電荷を呈するようになった（図２、赤色）。こ

高い値となり、リポソームと比較して膜流動性が低い状態

れより、表面が HA で覆われたことが示された。TEM 観となっていることがわかった。これは、脂質膜表面へポリ

察より、作製したナノカプセルはリポソーム由来の球形でマーが吸着することで、脂質膜の流動性が低下したことに中空構造を維持していた。

よると考えられる。さらに、Lipo-PCHI-Lyso と Lipo-PCHILyso-HA について、Lyso の至適条件（pH 6 . 2 , 37 ℃）近傍

3 . 2 . 積層膜の分解・剥離に伴う物性の変化と内包物において 24 時間インキュベートを行ったところ、脂質膜質の放出のゲル－液晶相転移が明確に観察されるようになり、蛍光

次に、酵素によるカプセル層の分解を確認するため、異方性が低下した。このことから、カプセル層の酵素分解

Lipo-PCHI-Lyso と Lipo-PCHI-Lyso-HA を種々の pH 条件下

によって膜流動性が増大することが示された。

図 3 蛍光偏光解消測定による各種ナノカプセルの膜流動性の評価− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 4 異なる pH 条件下における Lipo-PCHI からの HPTS 放出挙動

図 5 異なる pH 条件下における Lipo-PCHI-Lyso からの HPTS 放出
挙動

次に、カプセル層の酵素分解に伴う物質の放出について検討を行った。Lipo に蛍光物質である HPTS の封入を行った後、カプセル層の構築を行った。Lipo の場合には素早い放出が見られ、24 時間後には放出率が 60 % に達した。
一方、Lipo-PCHI では pH によらず放出は 5 % 以下に抑制された（図 4）。上述したように、リポソーム表面にポリマーを被覆することで、脂質膜の流動性が低下するため（図 3）、
内封物質の物質透過性が低下したことによると推察している。Lipo-PCHI-Lyso については、Lyso の至適条件（pH 5 . 0 6 . 0）近傍において放出の促進が見られ、pH 6 . 2 では、24時間後に 10 %、48 % 時間後に約 50 % の放出が観察された（図 5）。同様に、Lipo-PCHI-Lyso-HA についても、放出の促進が見られた。酵素分解による PCHI と HA の分解と剥離

図 6 各種ナノカプセルの Rho6G 封入量に伴って脂質膜の流動性が増大し（図 3）、カプセル層の物
質透過性が増大したことによると考えられる。

3 . 3 . リポソーム内部へのポリマー複合化と物質保持
4）
機能の付与
次に、リポソーム内部においてリビングラジカル重合によってポリマーを生成し、このポリマーとのアフィニティを利用した物質のカプセル内への封入を行った。リビング
ラジカル重合は、開始点（開始剤）の数と重合時間により、

図 7 Rho6G 封入ナノカプセル
を遠心濃縮した後の写真

ポリマーの数、鎖長および化学組成を精密に制御することが可能である。1 H NMR 測定より PAMPS の生成が確認でき、重合時間が 300 分の場合の分子量は 36 , 000 g/molと算出された。また、重合前後においてカプセルの粒径

ポソームと重合する前のリポソーム（AMPS-in-Lipo）と比は 84 ± 26 nm から 84 ± 29 nm、ζ- 電位は ‒ 46 ± 6 mV から

較して、PAMPS-in-Lipo への吸収量は高い値となった（図‒ 42 ± 4 mV となり、TEM 観察から球形で中空構造を維持

6）。また、重合時間（ポリマー鎖長）を 150 分から 380 分

したままであることが確認された。

にすることで吸収量が増加することもわかった。AMPS-

作 製 し た PAMPS-in-Lipo へ の ア ニ オ ン 性 の HPTS の

in-Lipo に比べて PAMPS-in-Lipo の方が濃く染まること吸収については、未処理のリポソームよりも PAMPS-in-が観察できた（図 7）。また、図 6 より、PAMPS-in-Lipo（重Lipo の方が低い値となった。これは、内部の PAMPS によ合時間：380 min）内部の Rho 6 G 濃度は、外水相の約 70 倍

る静電反発によって HPTS の吸収が抑制されたと考えていとなり、内部のポリマーによって物質を高濃度に封入できる。一方、カチオン性物質の吸収については、未処理のリることがわかった。

− 76 −

積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発

４．総ィックデリバリーシステムの開発が期待できる。

括

本研究では、リポソームの表層と内部にポリマーを複合謝

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コーセー

化することで、カプセル層の分解と剥離による表面性状の変化と物質の放出を可能とする機能性ナノカプセルの創製、

辞

コスメトロジー研究財団に深く御礼申し上げます。

さらに内部への有効成分の濃縮を行った。すなわち、リポ
ソーム表面にバイオポリマーとその分解酵素を積層化することで、皮膚表面の弱酸性環境に応答して、封入物質の放（引用文献）
1） Fujimoto, K., Toyoda, T., Fukui, Y., Macromolecules,

出とカプセル層からの有効成分（HA）の放出を調節するこ40, 5122-5128（2007）．

とが可能となった。また、粒径約 100 nm のリポソーム内

2） Fukui, Y., Fujimoto, K., Langmuir, 25, 10020-10025

部において、アニオン性ポリマーを複合化することで、外（2009）．

水相に添加したカチオン性の化合物を内部に濃縮可能であ

3） Fukui, Y., Otsuka, H., Fujimoto, K., Polymer Journal,

ることを見出した。以上のように、リポソームと複合化す
るポリマーの種類と組み合わせを選択することで、目的・

51, 1223-1230（2019）．
4） Fukui, Y., Fukui, A., Fujimoto, K., Polymer Journal,

用途に応じたカプセル素材の構築が可能であり、皮膚内の目的部位に有効成分を効果的にデリバリー可能なコスメテ− 77 −

published online.

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析
広島大学大学院医系科学研究科

松浪勝義

Propionibacterium acnes is a Gram-positive anaerobic rod-shaped bacteria found on the skin and in the intestinal tract. It
is widely known as the causative agent of acne vulgaris, but has recently attracted attention for its involvement in pustulosis,
prostatitis, hyperostosis, synovitis, sarcoidosis (granuloma), and implant-related infections. Therefore, it is an important
issue to clarify what mechanisms influence pathogenesis. In this study, we investigated the cytotoxicity of culture extracts
obtained under various culture conditions together with Staphylococcus aureus against human skin-derived fibroblast cellline KMST-6. The results showed that the cytotoxicity of the culture extracts varied depending on the culture medium.
For example, S. aureus was active in LB and MH media, but not in GAM and BHI media, which suggests that the culture
conditions, including the culture medium, are important in the study of metabolites. As no significant differences wereobserved in TLC and LC-MS analyses, it is possible that the compounds that are primarily responsible for the activity aretrace amount that is difficult to isolate and purify, or that the difference in activity is not dependent on a specific compoundbut on the overall activity of various compounds such as lipids that have weak activity. However, as observed in the coculture in LB medium, the activity was stronger in the co-culture than in the monoculture, this observation may provide aninteresting feature for future research on the interaction of these indigenous skin bacteria.

１．緒

養条件の変更や他の微生物との共培養法などで休眠遺伝子

言の活性化 4）を行うなど詳細に代謝産物を検討することが必

ヒトの皮膚表面には皮膚常在菌と呼ばれる細菌や酵母要である。

が存在し均衡状態を保っている。皮膚常在菌は肌を弱酸

以上の観点から、美容などのコスメトロジー領域におい性に保ち、病原菌の侵入に対しバリア機能の役割を果て重要な疾患であるニキビに注目し、その原因菌であるア

たす一方、バランスが崩れ、ある種の菌が多量に増殖すクネ桿菌（P. acnes）や黄色ブドウ球菌（S. aureus）について

ると種々の皮膚炎症を引き起こす。代表的な皮膚常在種々の条件で培養（単独および共培養）を行い、皮膚細胞に菌 は 表 皮 ブ ド ウ 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、 ア

対する細胞毒性を評価することとした。

ク ネ 桿 菌（Propionibacterium acnes）、黄色ブドウ球菌

２．方（Staphylococcus aureus）である 1 , 2）。表皮ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌の増殖を防ぐ抗菌ペプチドや皮膚のバリア機

法2 . 1. 微生物株および培養について能を高めるグリセロールを産生することが知られている。一使用菌株アクネ菌 Propionibacterium acnes（GTC 00154、方、黄色ブドウ球菌は皮膚炎や創傷部位の化膿を引き起こ

嫌気性グラム陽性桿菌）は岐阜大学の微生物コレクション

し、アクネ菌はニキビの誘発に関係が深い。しかし、代謝から分与いただいた。アクネ菌（P. acnes）は嫌気性細菌の産物としてはこれまでに histamine, tryptamine, propionic

ため角型ジャー・ケンキシステム（三菱ガス化学 , A- 41）

acidなどの短鎖脂肪酸などが報告されているが

2 , 3）、いずれあるいはパウチ袋（三菱ガス化学 , A- 94）に入れ、アネロ

も HPLC によるあらかじめ想定した標品との比較によるも

パック・ケンキ（三菱ガス化学 , 脱酸素剤 A- 04）による嫌ので化学的研究は十分ではない。一方、放線菌などのゲノ気培養を行った。黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus

ム配列研究の結果、単一の培養条件では一部の２次代謝産（JCM 20624、理研微生物材料開発室（RIKEN BRC）
）は生遺伝子しか活性化しておらず眠っている遺伝子（cryptic

好気性のため前培養は通常の好気条件下（35 ℃, 150 rpm）

genes）から本来さらに多様な２次代謝産物を産生する能で培養を行った。共培養の場合は、それぞれの菌株を上力があることが報告されている。そのため、培地などの培記条件にて前培養後に混合し、嫌気培養条件で培養した。
使用培地は、嫌気性細菌用培地（GAM：Gifu Anaerobic
Medium）や一般的な細菌類の培養に用いられる Luria-

Chem ica l a na lysis of seconda r ymetabolites of Propionibacterium acnes
Katsuyoshi Matsunami
D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o g n o s y,
Graduate School of Biomedical and
Health Sciences, Hiroshima University

Bertani Broth Medium（LB）培地、Mueller Hinton Broth（MH）培地、Brain Heart Infusion（BHI）培地をベースに人工皮脂としてヒト皮脂の代わりに入手しやすい馬油（井藤漢方製薬 , 純馬油）を 0 . 5 w/v% 添加し培養した。LB 培地
を用いたアクネ菌と黄色ブドウ球菌の共培養については 1− 78 −

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析

週間にわたって毎日一部を回収、抽出、乾固して被験物質とし、以下に示す方法でヒト皮膚由来線維芽細胞 KMST 6

2 . 3 . ヒト皮膚由来線維芽細胞株に対する細胞毒性評
価に対する細胞毒性を MTT 法により評価した。

抽出物添加条件での培養および吸光度測定には平底 96well

抽出は培養液と等量の酢酸エチルを加え、十分に攪拌、

plate（Nunc microwell 167008 , Thermo Fisher Scientific）

静置の後、上層を酢酸エチル可溶画分として回収した。まを使用した。
ヒト皮膚由来線維芽細胞株 KMST- 6（RCB1955、た、エマルジョンを形成した培養物についてはスクリュー

Riken BRC 細 胞 材 料 開 発 室 ）は 培 地 と し て Dulbeccoʼs

キャップ付き試験管に入れ、遠心操作（2000 rpm）によりModified Eagleʼs Medium（DMEM、D 5796、SIGMA）に十分に分離させた上で上層を回収し、減圧下で溶媒を除去

非 働 化 済 み 牛 胎 児 血 清 10 %、Amphotericin B（SIGMAすることで抽出物を得た。

A 9528）、Kanamycin sulfate（WAKO 119 - 00703）をそれまた、大量培養については、1 L の三角フラスコ２本にぞれ、5 . 6 µg/mL、100 µg/mL になるよう加えたものを使それぞれ 500 mL の培地を調製し、オートクレーブにより用した。5 % CO 2、37 ℃、湿度 95 % の条件下で培養を行い、滅菌した培地を用いて行った。まず、平板培養から得たコ

0 . 05 % Trypsin-EDTA 溶液により細胞をはがし、得られロニーを、試験管培地（2 mL）に摂取し前培養（増殖に差がた細胞懸濁液を継代およびアッセイに使用した。培養抽あるため S. aureus は好気下で 1 日、P. acnes は嫌気下で出物は DMSO に溶解し、培地を加えることで終濃度 500、

5 日、35 ℃）を行った。そのうち 1 mL を 100 mL フラスコ

200、100 µg/mL の濃度に調整した。各 well には 5 × 103（培地 20 mL）に接種し同様の条件で中間培養を行い、最後個の細胞を播種し、化合物を添加後 72 hr 培養を行った。

にこの中間培養物 10 mL を摂取することで、上記 1 L のフ

終濃度 1 % の DMSO 溶液のみで培養した well を比較対象

ラスコを用いて大量培養を行った。抽出は等量の酢酸エチとして、抽出物の有無による細胞増殖率の変化を吸光度測ルを加え、分液ロートでよく攪拌、混合したのち、静置し、定により評価した。具体的には、72 hr の培養の後、上清

必要に応じて遠心操作（2000 rpm）により上層を酢酸エチを吸引除去し、MTT（0 . 5 mg/mL）を含む培地を 100 µL 加

ル可溶画分として回収した。さらに、エバポレーターで濃え、さらに 1 . 5 hr 培養を行った。その後培地を吸引し、生縮を行い、残存した水分をオイルポンプで除去することで成した MTT formazan を DMSO 100 µL を加えることで溶抽出物を得た。

解し、マイクロプレートリーダーにより 540 nm の吸光度を測定した。また、細胞の形態変化を調べるため、通常の2 . 2 . HPLC 分析および分離精製について

明視野観察に加えて、細胞の染色像として MTT を添加・少量培養抽出物はメタノールに溶解あるいは懸濁し、培養したものについても写真撮影を行った。

Sep-pack C 18 カートリッジ（Waters）に通液したものをサンプルとした。HPLC の使用カラムは Inertsil ODS- 3

増殖抑制率は下記の式を用いて算出し、細胞毒性を評価した。

（6 . 5 mm × 250 mm、GL サイエンス）で分離を行った。得

増殖抑制率（%）

られた化合物の同定は Bruker Avance III 500 核磁気共鳴=［1 ‒（Asample ‒Ablank）/（Acontrol‒Ablank）
］
× 100

装置
（Bruker）（共鳴周波数 1 H NMR : 500 MHz、13 C NMR

Asample：サンプルを添加して培養した場合の吸光度: 125 MHz）を使用し、溶媒中の D シグナルを internal lock

Ablank ：Plate や培地に由来する吸光度

signal とした。ケミカルシフト値の表示は調製に用いた重Acontrol：DMSO を添加して培養した場合の吸光度

水素化溶媒の残存軽水素シグナルの δ 値（ppm）で補正した。

３．結

また、ハイブリッド型質量分析システム LTQ Orbitrap
X（Thermo Fisher Scientific）を使用し質量分析を行った。

果

3 . 1. KMST- 6 に対する増殖阻害活性の経時変化

また、活性の見られた抽出物との代謝物の差異を見るため

まず、一般的な細菌用培地である LB 培地を用い、P.

LC-ESI-MS による分析を行った。使用カラムは上記と同acnes と S. aureus の共培養条件下で、培養日数による活様に Inertsil ODS- 3（6 . 5 mm × 250 mm、GL サイエンス）

性の変化について検討を行った。前培養で十分増殖したを用い、移動相 A（0 . 1 % ギ酸 -H 2 O）
、移動相 B（0 . 1 % ギ

それぞれの培養液を混合し（Day 1）、35 ℃の嫌気培養下で酸 - アセトニトリル）、
流速 0 . 5 mL/min、
0 - 10 min（A : 90 %,Day 7 まで培養を継続した。培養期間中、一日ごとに培養

B : 1 0 %）、1 0 - 1 2 0 min（A : 9 0 %, B : 1 0 % か

ら A : 0 %,液の一部を回収し、酢酸エチルを加えて混合し、静置してB : 100 %、グラジエント溶出）、イオン化 : ESI、positive

得られた上層を酢酸エチル可溶画分として回収した。減モ ー ド、Spray voltage : 5 kV、Sheath gas flow rate : 60、圧下で有機溶媒を留去し、得られた培養粗抽出物のヒト

Aux gas flow rate: 20 で分析を行った。

KMST- 6 細胞に対する細胞増殖抑制率を MTT 法により求めた（図 1）
。その結果、培養開始の初期（Day 1 - 2）にはそれほど活性は見られないが、培養 4 日目あたりで十分な− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

インにデンプンを加えた Mueller-Hinton broth（MH 培地）、
嫌気性細菌用培地の Gifu Anaerobic Medium（GAM 培地）など組成が大きく異なるものを用い、単独培養および共培養を行い、KMST- 6 に対する細胞毒性評価を行った（図 2）。
それぞれの菌株の至適条件を考慮し、P. acnes 単独（PA）
および P. acnes と S. aureus の混合培養（PA+SA）は嫌気培
養、S. aureus（SA）は前培養のみ好気下で行った。培養は上述の結果をもとに７日間、35 ℃で行った。
LB 培地では図 1 同様に共培養で活性が見られ、500 µg/
図 1 ヒト皮膚由来線維芽細胞 KMST-6 に対する増殖阻害活性P. acnes と S. aureus との共培養代謝産物の経時変化（35℃、
嫌気培養）。抽出物濃度：500µg/mL, LB（Luria-Bertani）培地

mL の濃度で阻害率 46 . 5 ± 7 . 6 % の増殖阻害活性を示したが、S. aureus 単独でも 34 . 8 ± 3 . 3 % の活性が見られることから主に S. aureus に由来する代謝産物であると考えられ た（ 図 2、3）。 一 方、MH 培 地 で は S. aureus で 95 . 0 ±0 . 01 % の阻害活性が見られたが、200 µg/mL では活性は活性が見られるようになり、その後はほとんど活性の変見られなかった。一方、共培養条件（PA+SA）では活性化はなかったことから、培養は 4 - 7 日で行えば十分に活が見られなかったことから、S. aureus 単独による条件が性が見いだされることが示された。そこで、今後の実験重要であると考えられた。逆に、嫌気培養用培地である

では 7 日間の培養期間で活性を評価することとした。一方、

GAM 培地では P. acnes 単独培養のみ活性が見いだされた

500 µg/mL の濃度では活性が見られたが、200 µg/mL 以（抑制率 82 . 1 ± 11 . 9 %）。共培養では細胞毒性を示さなか下では活性は見いだされなかったことから、それほど強いったことから S. aureus の共存により P. acnes による２次毒性ではなく、さらに、培地の変更や単独培養についても代謝に変化が起こったか、S. aureus による毒性成分の代併せて検討を行うこととした。

謝が起こった可能性がある。この GAM 培地での P. acnes
単独培養では 200 µg/mL で 17 . 3 ± 1 . 0 % の細胞毒性が示さ

3 . 2 . 種々の培地条件における単独および共培養による活性の変化れたが 100 µg/mL では毒性は見られなかった（図 2）。また、培養条件の違いにより代謝産物が変化することが知られも細胞形態の変化は見られ、同様の形態変化は GAM（SA,

増殖率には影響しなかったが、BHI 培地（SA, PA+SA）でていることから 、LB 培地に加え、動物脳と心臓組織由

PA+SA）, LB（PA, SA, PA+SA）, MH（PA, PA+SA）の場

来の Brain Heart Infusion broth（BHI 培地）や牛肉、カゼ合でも観察されたことから、何らかの影響を及ぼしている

5）

図 2 各種培地における単独培養および共培養代謝産物の KMST-6 に対する増殖阻害活性PA : P. acnes, SA : S. aureus, PA+SA : 混 合 培 養 , LB : Luria-Bertani medium, MH :Mueller–Hinton medium, BHI : Brain Heart Infusion medium, GAM : Gifu Anaerobic
Medium, 35℃ , 抽出物濃度 : 500µg/mL, n=3− 80 −

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析

図 3 各種培地における単独培養および共培養代謝産物の KMST-6 に対する影響
PA : P. acnes, SA : S. aureus, PA+SA : 混 合 培 養 , LB : Luria-Bertani medium, MH : Mueller‒Hinton
medium, BHI : Brain Heart Infusion medium, GAM : Gifu Anaerobic Medium, 35 ℃ , 抽 出 物 濃 度：
500µg/mL, DMSO : 通常の明視野観察像と MTT 発色後 , X2 : PA+SA に見られる形態変化（通常明視野 ,X ２倍に拡大 , 同様の形態変化は BHI 培地（SA, PA+SA）, GAM（SA, PA+SA）, LB（PA, SA, PA+SA）,
MH（PA, PA+SA）にも観察される。

ことが示唆された（図 3）。以上の結果から、最も強い細胞る HPLC クロマトグラムの比較により、活性に関わる成分

毒性の見られた MH 培地による S. aureus の単独培養、おが見い出せないか検討することとした。培養抽出物をメタ

よび GAM 培地による P. acnes の単独培養に注目し、代謝

ノールに溶解あるいは懸濁し、Sep-pack C 18 カートリッ

物について検討を行うこととした。

ジに通液することでメタノール溶出液を得た。0 . 1 % のギ酸存在下、10 % アセトニトリルから 100 % アセトニトリル

3 . 3 . 培養抽出物に含まれる代謝産物の解析

まで溶出強度を変化させてグラジエント溶出を行った。ク

次に細胞毒性の見られた MH 培地による S. aureus 培養

ロマトグラムは LC-ESI-MS による TIC（Total Ion Count）

抽出物（MH-SA）、および GAM 培地による P. acnes 培養

でプロットしクロマトグラムプロファイルを比較したも抽出物（GAM-PA）について含有化学成分の化学的解析をのを図 4 に示す。溶出時間 43 . 6、46 . 9、100 . 5、115 . 6 min

行うこととした。まず、MH 培地による S. aureus の大量などの主要な成分は毒性の見られた GAM-PA および毒性

培養の後、得られた抽出物についてシリカゲル TLC 分析の見られなかった GAM-SA で共通に存在することから細（CHCl 3 : MeOH= 20 : 1 および 7 : 1 で展開後、0 . 5 % 硫酸／

胞毒性に関与するとは考えにくい。その他、マイナー成分

加熱発色）を行い、確認されたスポットについて高分解についても顕著な差異を見出すことは難しく、前処理条件

能 TLC（HPTLC）を用いて薄層分取を行った。次に得らや分析条件を検討する余地はあるものの、毒性に関係する

13

れた成分について H および C NMR、MS の測定を行い成分は検出されない程度の微量であることが示唆され、同

化合物の同定を試みたところジグリセリドの混合物であ定は困難であると予想される結果となった（図 4）。なお、ると推定された。さらに HPLC などで分離を試みる必要

MH 培地を用いた S. aureus の毒性成分についても同様にがあるが、培地の添加物として馬油を用いていることか

LC-MS 分析を行ったが、差異を見出すことは困難であった。

1

ら、S. aureus に由来するものかについても含めて今後詳４．考細に検討する必要がある。一方、上述の 3 . 2 . の結果（図 2）

察から、MH 培地による P. acnes 培養抽出物（MH-PA）、おPropionibacterium acnes（ゲノム解析によりCutibacterium

よび、GAM 培地による S. aureus 培養抽出物（GAM-SA）

acnesに変更 6））はグラム陽性嫌気性桿菌で、皮膚や腸管なに毒性が見られなかったことから、グラジエント溶出によどに存在するヒトの常在菌の一つである。ニキビ（尋常性− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 4 S. aureus（GAM-SA）および P. acnes（GAM-PA）
培養代謝産物の LC-ESI-MS クロマトグラム
GAM 培地 , 嫌気培養 , 35℃ , 10% アセトニトリルから 100% アセトニトリルでグラジエント溶出。縦軸は Total ion count の相対値を示す。横軸は溶出時間。

痤瘡）の原因菌として広く知られるが、近年、前立腺がん

よび量の差に起因する可能性がある。実際、細胞毒性が見の原因にもなる前立腺炎、滑膜炎、膿疱症、骨化過剰症、られた濃度は 500 µg/mL と比較的高い濃度であり、また、骨炎症候群、サルコイドーシス（肉芽腫）、坐骨神経痛、イ

TLC 分析および LC-MS 分析で目立った差異が見られなか

7）

ンプラント関連感染症に関与するとして注目されている 。

ったことから、活性を中心的に担う成分は単離・精製が難

そのため、どのような機構が発症に影響するかを明らかしい微量成分であるか、または、特定成分に依るのではなにすることは重要な課題となっている。本研究では、同じ

く、弱い活性をもつ脂質などの種々の成分の活性が総合的く皮膚常在菌の一つである黄色ブドウ球菌 Staphylococcusに差異となって現れた可能性がある。今後のより網羅的な

aureus と合わせて種々の培養条件で得られる培養抽出物

メタボローム解析手法などにより詳細が明らかになることについてヒト皮膚由来線維芽細胞株 KMST- 6 に対する細を期待する。

胞傷害、LC-ESI-MS による含有代謝物の基礎的解析を行

５. 総

った。

括

その結果、種々の培地にて培養産物を得たところ、培地

皮膚の表面にはアクネ菌や黄色ブドウ球菌が常在し、皮によって細胞毒性が変化することが示された。例えば、S.

脂などを代謝することで様々な代謝物を産生している。ヒaureus については LB や MH 培地では活性が見られるもの

ト皮膚由来細胞に対する細胞毒性は、これらの微生物の皮の、GAM や BHI 培地では活性が見られなかった。一方、膚に対する炎症などに関係すると考えられ、活性化合物をP. acnes については GAM 培地で活性が見られたものの、明らかにすることは皮膚科学、コスメトロジー研究にとっ他の 3 種の培地では活性が見られなかったことから代謝産て重要であり、創薬標的の発見も期待できると期待される。

物の研究にあたっては培地を含めた培養条件の検討が重要

今回の結果から、抗生物質産生菌に見られるような特定物であることを示している。しかし、GAM 培地の組成には質の産生は見られないか、あるいは微量なため活性本体をLB 培地にも含まれるペプトン類や BHI や MH 培地に含ま明らかにすることが困難な可能性が示唆された。しかし、れるような動物組織由来の抽出物も含まれるなど炭素源やLB 培地での共培養で見られたように単独培養よりも共培

窒素源は他の培地と類似しているともとれる。大きな違い

養の方が活性が強く見られた結果も得ており、これら皮膚としてはシステインやチオグリコール酸などの還元性の成

常在菌の相互作用について今後の研究に興味がもたれる結分が含まれることから、嫌気的環境が細胞毒性成分の生成果となった。

には重要である可能性がある。今回は活性本体の同定には至らなかったが、過去の論文ではグリセロリン脂質やホス（引用文献）

ファチジルイノシトールが、また、同属の P. propionicum

1） Alexandra P, Peter L, Propionibacterium acnes:

からは糖脂質が報告されている 。これら脂質類は一般の

infection beyond the skin, Expert Rev Anti Infect8）

細菌にも見られる膜成分であるが、培養動物細胞の細胞膜

Ther, 9（12）:1149-56,（2011）．doi: 10.1586/eri.11.137.

に影響することから細胞毒性成分として同定されることも

2） Allaker RP, Greenman J, Osborne RH, The production

多い。そのため、今回の研究で見出された培養条件の違い

of inflammatory compounds by Propionibacterium acnesによる細胞毒性活性の発現の差異は含有脂質成分の種類おand other skin organisms, Br J Dermatol, 117: 175-183− 82 −

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析（1987）．doi.org/10.1111/j.1365-2133.1987.tb04114.x

proposed novel genera Acidipropionibacterium gen. nov.,

3） Tax G, Urbán E, Palotás Z, Puskás R, Kónya Z, Bíró

Cutibacterium gen. nov. and Pseudopropionibacterium

T, Kemény L, Szabó K, Propionic acid produced bygen. nov., Int J Syst Evol Microbiol, 6 6（1 1）:4 4 2 2-4 4 3 2

Propionibacterium acnes strains contributes to their（2016）．doi: 10.1099/ijsem.0.001367.

pathogenicity. Acta Derm Venereol, 96: 43–49（2016）．

7） Aubin GG, Portillo ME, Trampuz A, Corvec S,4） Abdelmohsen UR, Grkovic T, Balasubramanian

Propionibacterium acnes, an emerging pathogen:

S, Kamel MS, Quinn RJ, Hentschel U, Elicitation of

from acne to implant-infections, from phylotype tosecondary metabolism in actinomycetes, Biotech Adv,

resistance, Med Mal Infect, 4 4（6）:2 4 1-5 0（2 0 1 4）．doi:．
33: 798-811（2015）

10.1016/j.medmal.2014.02.004.

5） Pan R, Bai X, Chen J, Zhang H, Wang H, Exploring

8） Mariola P, Otto H, Buko L, Halina M, Andrzej G,

Structural Diversity of Microbe Secondary Metabolites

Novel bacterial polar lipids containing ether-linked

Using OSMAC Strategy: A Literature Review, Front

alkyl chains, the structures and biological properties

Microbiol, 10 : 294（2019）．doi: 10.3389/fmicb.2019.00294.

of the four major glycolipids from Propionibacterium6） Christian FPS, Mogens K, The natural history of

propionicum PCM 2431（ATCC 14157T），J Biol Chem,

cutaneous propionibacteria, and reclassification of selected278（6）:3948-56（2003）．doi: 10.1074/jbc.M206013200.

species within the genus Propionibacterium to the− 83 −

ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた
泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立
奈良女子大学矢田

詩歩

Small-angle neutron scattering, which has not been extensively utilized for foam characterization, can provide
important insights into the microstructure of surfactant-stabilized foam. Small-angle neutron scattering in combination
with several other techniques was herein employed to determine the microstructure of foams stabilized by homogeneous
polyoxypropylene-polyoxyethylene alkyl ether type nonionic surfactants (C12EO8POy, y = 1, 2, 3), alkoxy-group-modified
homogeneous polyoxyethylene alkyl ether nonionic surfactants (C 12EO xOR, R = OCH 3, OC 2H 5) and homogeneous
polyoxyethylene alkyl ether sulfate sodium salt anionic surfactants (C12EOxSO4Na, x = 2, 4, 6, 8).

１．緒

われてきたが，時々刻々と変化する泡のミクロ構造につい言て定量的に調べた研究はほとんどないのが現状である。そポリオキシエチレン（EO）鎖を親水基に有する EO 系非こで著者は，アミノ酸系界面活性剤が形成する泡沫の構造

イオン界面活性剤は，他の種類の界面活性剤に比べて，産を，中性子小角散乱（SANS）を中心に用いて調べ，泡膜中

業分野での生産や消費などの面で最も需要がある。近年著のミセルの存在状態や，泡膜の厚み，総量，泡沫中の界面者は，既存の EO 系非イオン界面活性剤に対してさらなる活性剤の体積分率の時間に依存した情報が定量的に得られ性能の向上や高機能性の発現を目指して，新しい構造の末ることを明らかにした 3）。

端基修飾型単一鎖長 EO 系非イオン界面活性剤を開発した。

本研究では，末端基修飾型単一鎖長 EO 系非イオン界面

これまでに EO 系界面活性剤の EO 鎖の末端にポリオキシ

活性剤（Figure 1）が形成する泡沫の構造や特性を，SANS

プロピレン（PO）鎖やアルコキシ基を修飾した単一鎖長 EOや溶液安定性評価，界面粘弾性，粘度，ラメラ長，動的表系非イオン界面活性剤（C 12 EO 8 POy，y= 1 , 2 , 3 , C 12 EO 8 R，面張力などの測定を組み合わせることで，詳細に検討しR = OCH（OMe），OC 2 H（OEt），Figure 1）を新規に合35た。また，EO 系非イオン界面活性剤の EO 鎖の末端に硫成し，これらの末端基修飾型 EO 系界面活性剤が既存の酸エステル基を修飾した単一鎖長ポリオキシエチレンアル

EO 系界面活性剤に比べて，優れた表面張力低下能やミセ

キルエーテル硫酸ナトリウム（C 12 EOxSO 4 Na，x = 2 , 4 , 6 ,ル形成能を有し，高濃度の水溶液においてヘキサゴナル液

8 および C 14 EO 8 SO 4 Na，Figure 2）についても新規に合成晶の形成を制御できることを明らかにした

1 - 2）

し，同様の測定を用いて泡沫特性を検討し，泡沫特性に及。

また，界面活性剤が形成する泡沫は，日々の生活や工業
プロセスにおいてさまざまなアプリケーションとして使用

ぼす EO 鎖の末端基構造や EO 鎖長，アルキル鎖長の影響について調べた。

されている。このような泡沫に対してさまざまな評価が行

Figure 1 Structure of C12EO8POy（y=1, 2, 3）and C12EO8R（R= OCH3（OMe），OC2H5（OEt））

Establishment of innovative evaluation
for microstructural characterization offoam formed by polyoxyethylene typenonionic surfactant
Shiho Yada
Figure 2 Structure of C12EOxSO4Na（x=2, 4, 6, 8）

Nara Woman’ s University− 84 −

ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立

２．方
2 . 1. 合5 分毎）行った。

法

2. 2. 2. 動的表面張力

成

動的表面張力は，Krüss BP 2 bubble pressure tensiometerポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン（PO）鎖 を 修 飾 し た 単 一 鎖 長
PO-EO 系非イオン界面活性剤は，まずオクタオキシエチ（Hamburg, Germany）を用いて測定した。
2. 2. 3. 粘度

レンドデシルエーテルに塩化 p- トルエンスルホニル，次各種界面活性剤水溶液の粘度は，コーンプレート型粘度

いでポリプリピレングリコール（POx，x= 1，2，3）を作

計 LVDV 2 T Viscometer（BROOK FIELD）を用いて測定

1用させることで得た（Scheme 1）。構造は H NMR，ESI-した。コーンは CP- 40 を用いて回転数 0 . 1 ～ 20 rpm で 30

MS，元素分析により確認した。末端基修飾型 EO 系界面活

秒毎に回転数を上げながら 25 ℃で測定を行った。

性剤 C 12 EO 8 PO 1，C 12 EO 8 PO 2，C 12 EO 8 PO 3 はそれぞれ収2. 2. 4. 界面粘弾性
気／液界面における界面粘弾性は，界面粘弾性装置

率 12，16，13 % で得た。
アルコキシ基を修飾した単一鎖長アルコキシ -EO 系非TECLIS Tracker（Civrieux-d’Azergues, France）
を用いてイオン界面活性剤は，まずヘキサオキシエチレンドデシル

行った。振動面積は初期面積の 20 %，周波数は 0 . 1 Hz とエーテルに塩化 p- トルエンスルホニル，次いでエチレンした。測定は 5 回行い，平均値と標準偏差を求めた。

グリコールモノメチルエーテルまたはエチレングリコール

2. 2. 5. ラメラ長

1

モノエチルエーテルを作用させることで得た。構造は H

ラメラ長の測定は，Kruss K 100 C を用いて行った。伸

NMR，ESI-MS，元素分析により確認した。末端基修飾型

び速さは 6 . 0 mm min‒ 1 とした。測定は 3 回行い，平均値

EO 系界面活性剤 C 12 EO 8 OMe，C 12 EO 8 OEt はそれぞれ収と標準偏差を求めた。

率 15，26 % であった。

2. 2. 6. 中性子小角散乱
泡 沫 の 中 性 子 小 角 散 乱 は，J-PARC の ビ ー ム ラ イ ン

2 . 2 . 泡沫の構造および安定性評価

BL 15 に設置された中性子小角散乱装置 TAIKAN を用い

２. 2. 1 溶液安定性評価て，泡沫の中性子小角散乱の測定を行った。測定に用いた

泡沫の安定性は，溶液安定性評価装置 Turbiscan Tower

試料セルのイメージを Figure 3 に示す。試料セルに界面（Formulaction, Toulouse, France）を用いて行った。各種活性剤の D 2 O 溶液 10 , 50 mmol dm‒ 3 , 25 mL を注ぎ，電動界面活性剤水溶液 10 , 50 , 100 mmol dm‒ 3 , 1 . 5 mL を円筒

エアポンプで一定流速の空気をガラスフィルターから流し

形セル（直径 12 mm，高さ 140 mm）に入れ，エアポンプて起泡させた。試料セルが泡沫で満たされたことを確認しによりセルの底から 6 cm の高さまで起泡させた後，波長た後，エアポンプを止め，高さ 25 cm のところに中性子を

850 nm の光を照射し，セルの各高さ（40 µm 毎）における

30 分間照射して SANS の測定を行った。データは 30 秒毎

透過率と後方散乱率（散乱角 135 °）を一定時間毎に測定しに処理した。

た。測定は 2 時間（最初の 1 時間は 2 分毎，次の 1 時間はScheme 1 Synthesis of C12EO8POy（y = 1, 2, 3）and C12EO8R（R =OCH3, OC2H5）

Scheme 2 Synthesis of C12EOxSO4Na（x = 2, 4, 6, 8）and C14EO8SO4Na− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

3. 1. 2 動的表面張力
気／液界面への吸着ダイナミクスを調べるために，動的表面張力の測定を行った。末端基修飾型 EO 系界面活性 剤 C 12 EO 8，C 12 EO 8 PO 1，C 12 EO 8 PO 2，C 12 EO 8 PO 3 の臨界ミセル濃度（CMC）における動的表面張力と表面寿命の関係を Figure 5 に示す。ここで，C 12 EO 8，C 12 EO 8 PO 1，
C 12 EO 8 PO 2，C 12 EO 8 PO 3 の CMC は そ れ ぞ れ 0 . 102，0 . 0321，0 . 0397，0 . 0480 mmol dm‒ 3 である 1）。C 12 EO 8 は末端基を修飾した C 12 EO 8 POy に比べて，短い表面寿命で表面張力が低下することがわかった。これより，C 12 EO 8
は C 12 EO 8 PO 3 に比べて気／液界面に速く吸着することがわかった。動的表面張力と起泡力の間には相関があるこ
Figure 3 Schematic illustration of the sample cell used for
SANS measurementsとが知られており 4），C 12 EO 8 の起泡力は C 12 EO 8 PO 3 よりも高いことが考えられる。今後，動的フォームアナライ
ザや改良 Ross-Miles 法を用いて起泡力を評価する。また，

３．結C 12 EO 8 OMe および C 12 EO 8 OE の動的表面張力についても

果

今後同様に測定する予定である。

3 . 1. 非イオン界面活性剤の泡沫の構造および安定性
評価
3. 1. 1. 溶液安定性評価
末端基修飾型 EO 系界面活性剤の泡沫安定性を調べるた
めに，溶液安定性評価装置タービスキャンによる透過光の測定を行った。末端基修飾型単一鎖長 EO 系界面活性剤
水溶液（10 , 50 , 100 mmol dm‒ 3）が形成する泡沫の割合と時間の関係を Figure 4 に示す。ここで，泡沫の割合は起泡直後の泡沫の高さに対する時間 t 分後の泡沫の高さを示す。
50 mmol dm‒ 3 の水溶液における泡沫安定性は，C 12 EO 8，
C 1 2 EO 8 OEt，C 1 2 EO 8 PO 1，C 1 2 EO 8 PO 2，C 1 2 EO 8 PO 3，
C 12 EO 8 OEt の順で低下した。いずれの濃度においてもC 12 EO 8 OEt が最も低い泡沫安定性を示した。これより，
EO 鎖の末端に PO 鎖やアルコキシ基の疎水性の末端基を導入することで泡沫安定性が低下することがわかった。

Figure 5 Dynamic surface tension of C12EO 8 , C12EO 8 PO1,C12EO8PO2 and C12EO8PO3 at CMC

Figure 4 Relationship between ratio of foam height and time for C12EO8, C12EO8OMe, C12EO8OEt, C12EO8PO1, C12EO8PO2 andC12EO8PO3⒜ 10mmol dm‒3, ⒝ 50mmol dm‒3, ⒞ 100mmol dm‒3

− 86 −

ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立

Figure 6 Variation in viscosity with shear rate for nonionic surfactant solution at（●）10mmol dm‒3（, ●）50mmol dm‒3 and（●）‒3
100mmol dm⒜ C12EO8, ⒝ C12EO8OMe, ⒞ C12EO8OEt, ⒟ C12EO8PO2, and ⒠ C12EO8PO3

3. 1. 3 粘度

泡沫安定性に及ぼす泡膜内の溶液の粘度の影響を調べるために，界面活性剤水溶液の粘度を調べた。末端基修飾型
EO 系 界 面 活 性 剤 C 12 EO 8，C 12 EO 8 OMe，C 12 EO 8 OEt 水溶液（10，50，100 mmol dm‒ 3）の粘度とずり速度の関係を
Figure 6 に示す。10 mmol dm‒ 3 において，いずれも粘度は水とほぼ同じ値を示し，ニュートン流動であった。これより，いずれの界面活性剤も数ナノメートルサイズの小さなミセルを形成していることが考えられる。濃度が増加す
ると，いずれの界面活性剤も粘度は増加したが，ニュートン流動のままであった。これより，濃度の増加に伴い水溶液中に存在するミセルの数は増加するものの，会合体の構造は大きく変化しないことが考えられる。100 mmol dm‒ 3において，C 12 EO 8 PO 3 の粘度は他に比べてわずかに高い値を示した。今後，動的光散乱や X 線小角散乱などの測定

Figure 7 Variation in lamella with concentration for nonionicsurfactantsにより会合体の構造を詳細に明らかにする予定である。
3. 1. 4. ラメラ長

た。

界面活性剤水溶液のラメラ長について検討した。Figure

3. 1. 5. 界面粘弾性

7 にラメラ長と濃度の関係を示す。末端基修飾型 EO 系界‒3

各種界面活性剤水溶液の気／液界面における界面粘弾性

面活性剤の 0 . 1 〜 100 mmol dm の水溶液におけるラメラ（E）と界面活性剤の濃度の関係を CMC とともに Figure 8

長は，いずれも 4 . 7 〜 5 . 0 mm であり，EO 鎖の末端基構に示す。いずれも界面活性剤の濃度の増加に伴い E は増造と濃度に依存しないことがわかった。これより，ラメラ

加し，ある濃度を境に急激に減少した。E が極大となる界

長と泡沫安定性との間に相関は認められないことがわかっ

面活性剤の濃度は，いずれの系も CMC よりも低くなった。

− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Figure 8 Effect of concentration on the viscoelastic modulus
E for nonionic surfactants（●）C12EO（●）
C12EO8OMe,（●）
8,
C12EO8OEt, and（●）C12EO8PO1
Dotted lines correspond to the CMC determined fromsurface tension measurement

Figure 9 SANS profiles of C12SO 4 Na‒stabilized foams in
D2O at 10 mmol dm‒3 acquired at a height of 250 mm fromthe cell bottom● : 0–30, ● : 300–350, ● : 600–650, ● : 900–950, ●: 1200–1250, ● : 1500–1530, ● : 1800–1830 sec

界面活性剤の濃度が非常に低い場合，気泡を変形させる以

この振動は泡沫の気／液界面の反射率に由来する 12 -13）。振前の界面活性剤の吸着量が少ないため，気泡を変形させて動周期Δq を用いると，泡の膜厚 T を T = 2 π/Δ q の関係かも大きな表面張力の勾配を得ることができず，E は小さく

ら求めることができる 12 - 13）。Figure 9 において，振動周なったと考えられる。CMC より高い濃度の場合，界面が期Δq は時間の経過に伴い増加した。これより，時間の経飽和吸着した状態から気泡を変形させるため，表面張力の過に伴い泡の膜厚が減少していることが考えられる。これ

勾配は一時的に大きくなるが，新たな界面にバルクからのは時間の経過に伴い重力による排水が進行するためと考え

界面活性剤がすばやく吸着するため，表面張力の勾配は消られる。また，散乱強度は時間の経過に伴いわずかに減少

失し，E は小さくなったと考えられる。これは，その他のした。これより，泡膜の数が時間の経過に伴い減少していさまざまな界面活性剤を用いた実験でも同様の挙動が得らることが考えられる 14）。

れており 5 - 9），この現象は，Van den tempel と Lucassen
10）

アニオン界面活性剤の EO 鎖長が 2，4，6，8 と増加すると，と一致した。また，泡振動の数は減少した。また EO 鎖長が長くなると，散乱強沫安定性の高い界面活性剤において，界面粘弾性が高くな

度は時間の経過に伴い大幅に減少した。これより，EO 鎖り，泡沫安定性と界面粘弾性との間に相関がみられた。

長の増加に伴い泡沫安定性が低下することが考えられる。

によって提案された理論モデル

EO 系界面活性剤の EO 鎖の末端に PO 鎖やアルコキシ基

これは目視観察の結果とも一致した。今後，SANS プロフを導入することで，泡沫安定性が低下することがわかった。

ァイルの詳細な解析を行い，泡の膜厚や比表面積などを算

今後，泡沫のナノ構造を明らかにするために SANS の測定

出する予定である。

を行う予定である。

４．考3 . 2 . アニオン界面活性剤の測定

察

本研究では，末端基修飾型単一鎖長 EO 系非イオン界面

3. 2. 1. 中性子小角散乱

活性剤が形成する泡沫の構造や特性を，SANS や溶液安定

C 12 EOxSO 4 Na（x = 0 , 2 , 4 , 6 , 8） お よ び C 12 EO（10,8‒3

性評価，界面粘弾性，粘度，ラメラ長，動的表面張力など

50 mmol dm 重水溶液）が形成する泡沫の SANS 測定をの測定を組み合わせることで，詳細に検討した。また，EO行った。C 12 SO 4 Na の 10 mmol dm‒ 3 重水溶液が形成する系非イオン界面活性剤のEO 鎖の末端に硫酸エステル基を修

泡沫の SANS プロファイルを Figure 9 に示す。散乱ベク

飾した単一鎖長ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナト‒1トルq= 0 . 2 ～ 1 . 0 nm において，散乱プロファイルはおよそリウムについても新規に合成し，同様の測定を用いて泡沫特q‒ 4 に従った。いずれの時間においてもq= 0 . 2 ～ 1 . 0 nm‒1 に性を検討し，泡沫特性に及ぼすEO 鎖の末端基構造やEO 鎖

おいて、３つの振動が確認された。泡沫の SANS の結果は，

長，アルキル鎖長の影響について調べた。本研究から得ら

11）

泡膜の反射と泡膜内部の溶液の散乱の重ね合わせであり ，れた情報は，洗浄や食品，化粧品などの産業分野において− 88 −

ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立重要である。今後もさまざまな分子構造の界面活性剤を用い

and its relation to foam stability in solutions of sodium

た泡沫の構造解析に関する研究が進み，泡沫特性に及ぼす

decyl sulfate. Colloids and Surfaces A: Physicochemical

界面活性剤の分子構造の影響について体系的な理解が深まand Engineering Aspects 2017, 532, 472-475.
7） Yan, F.; Zhang, L.; Zhao, R.-H.; Huang, H.-Y.; Dong,

ることを願いたい。

L.-F.; Zhang, L.; Zhao, S.; Yu, J.-Y., Surface dilational謝辞rheological and foam properties of aromatic side

本研究は，奈良女子大学研究院自然科学系化学領域 吉chained N-acyltaurate amphiphiles. Colloids and

村倫一教授の協力のもと行われました。心より感謝申し上Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects
2012, 396, 317-327.

げます。
本研究の遂行にあたり，多大なるご支援をいただきまし8） Lai, L.; Mei, P.; Wu, X.-M.; Cheng, L.; Ren, Z.-H.; Liu,

た公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より

Y., Interfacial Dynamic Properties and Dilational

感謝申し上げます。

Rheology of Sulfonate Gemini Surfactant and its
Mixtures with Quaternary Ammonium Bromides at（引用文献）

the Air–Water Interface. Journal of Surfactants andDetergents 2017, 20（3），565-576.

1） Yada, S.; Suzuki, T.; Hashimoto, S.; Yoshimura,T. , Adsor pt ion a nd Agg regat ion P roper t ies of9） Zhu, Y.; Xu, G.; Xin, X.; Zhang, H.; Shi, X., Surface

Homogeneous Polyoxypropylene–Polyoxyethylene Alkyl

Tension and Dilational Viscoelasticity of Water in the

Ether Type Nonionic Surfactants. Langmuir 2017, 33

Presence of Surfactants Tyloxapol and Triton X-100 with（15）, 3794-3801.

Cetyl Trimethylammonium Bromide at 25 ℃ . Journal of2） Yada, S.; Suzuki, T.; Hashimoto, S.; Yoshimura, T.,

Chemical & Engineering Data 2009, 54（3）, 989-995.

Adsorption dynamics of homogeneous polyoxypropylene-10）Luca s sen , J. ; Va n Den Tempel , M . , D y na m ic

polyoxyethylene alkyl ether nonionic surfactants at themeasurements of dilational properties of a liquid interface.
Chemical Engineering Science 1972 , 27（6）, 1283 -1291 .

air/water interface. Journal of Molecular Liquids 2 018,

11）Micheau, C.; Bauduin, P.; Diat, O.; Faure, S., Specific

255, 208-214.

Salt and pH Effects on Foam Film of a pH Sensitive3） Yada, S.; Shimosegawa, H.; Fujita, H.; Yamada,

Surfactant. Langmuir 2013 , 29（27）, 8472 - 8481 .

M . ; Matsue, Y. ; Yoshimura , T. , Microstructura lCharacterization of Foam Formed by a Hydroxy Group-

12 . Schmidt, I.; Novales, B.; Boué, F.; Axelos, M. A. V.,

Containing Amino Acid Surfactant Using Small-Angle

Foaming properties of protein/pectin electrostatic

Neutron Scattering. Langmuir 2020, 36（27）, 7808-7813.

complexes and foam structure at nanoscale. Journal of

4） Pandey, S.; Bagwe, R. P.; Shah, D. O., Effect ofColloid and Interface Science 2010 , 345（2）, 316 - 324 .

counterions on surface and foaming properties of13）Axelos, M. A. V.; Boué, F., Foams As Viewed bydodecyl sulfate. Journal of Colloid and Interface Science

Small-Angle Neutron Scattering. Langmuir 2 0 0 3 , 1 9，160-166.
2003, 267（1）（17）, 6598 - 6604 .

5） Sun, H.-Q.; Zhang, L.; Li, Z.-Q.; Song, X.-W.; Cao, X.-

14）Ropers, M. H.; Novales, B.; Boué, F.; Axelos, M. A.

L.; Zhang, L.; Zhao, S.; Yu, J.-Y., Effect of alkyl chain

V., Polysaccharide/Surfactant Complexes at the Air

length on the surface dilational rheological and foam

− Water Interface − Effect of the Charge Density on

properties of N-acyltaurate amphiphiles. Colloid andInterfacial and Foaming Behaviors. Langmuir 2008 , 24

Polymer Science 2012, 290（1），31-40.

（22）, 12849 - 12857 .

6） Hofmann, M. J.; Motschmann, H., Surface rheology− 89 −

放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討
公益財団法人微生物化学研究会微生物化学研究所

和田俊一

Nonreducing disaccharide trehalose is used as a stabilizer and humectant in various products including cosmetics andskincare products. However, its use has some problems. Trehalose is hydrolyzed by trehalase, a widely expressed enzyme inmultiple organisms including microbes on the skin and environment. When trehalose is hydrolyzed, two glucose molecules
are released, and it can be a nutrient of the microbes and promote their growth. It may disturb the microbial flora on the skinand may be a cause of the deterioration and putrefaction of products containing it. The released glucose can glycate proteins
and lipids in the skin cells and accelerate the aging of the skin. New trehalose analogs that have adequate moisture retention
and protective activities and cannot be hydrolyzed and digested by trehalase and microbes are expected. More than 40
trehalose analogs were prepared including microbial metabolites and synthetic compounds. Among them, a mass-producible
metabolite of an actinomycete 4-trehalosamine and its derivative detergent compounds IMCTA-Cns (n=8-15) were selected
to be analyzed their properties in this study. Compared with trehalose, 4-trehalosamine exhibited better or comparable
protective activities on a starch, proteins, and microbial cells. 4-Trehalosamine also exhibited a high buffer capacity aroundthe neutral pH. 4-Trehalosamine was biologically stable that was not assimilated by microbes and not hydrolyzed bymammalian trehalases. While IMCTA-Cn detergents could be effectively used in membrane protein extraction without the
denaturing activity, long-chain detergents IMCTA-C13 – IMCTA-C15 showed 1000–3000-fold stronger autophagy-inducing
activity in cultured cells than trehalose and are expected to become a drug lead and research reagent. These results indicatethat 4-trehalosamine and the derivative detergents are potential trehalose substitute for various purposes. They can be usefulingredient of cosmetics and skincare products.

１．緒

乾燥肌や皮膚炎の緩和、創傷被覆、あるいは皮膚再生能の言向上などの効果が期待でき、化粧品や保湿クリームに広くTrehalose は glucose 二 分 子 が 1 , 1 結 合 し た 二 糖 で あ利用されている。

る。Glucose の還元末端同士が結合により相殺されていしかしながら、trehalose は多くの微生物にも発現の見るため非還元性となる。還元糖は反応性の高いアルデヒられる trehalase により分解され、微生物の栄養源となりドやケトンを有するため、タンパク質や脂質など多種の得るため、スキンケア製品への利用においては皮膚常在微分子に結合し構造や活性に悪影響を及ぼすが、非還元糖生物叢への悪影響や、保管時の製品腐敗、劣化に注意が必である trehalose はそうした反応性が低く、分子量が小さ要となる。また、分解産物である glucose は皮膚組織の糖い安定な親水性ユニットの一種として考えることができ化を促し、老化の原因ともなり得る。このため、保湿、保る。保湿作用や水分子代替能の強さによるものと思われる護作用などの期待される機能を維持しつつ分解されにくいが、trehalose はタンパク質、多糖、細胞、組織などの保護、

新たな trehalose 類縁体化合物の開発が期待される。

品質維持機能に優れている。多くの動植物や微生物が保有

我 々 は こ れ ま で に 放 線 菌 よ り 新 規 trehalose 類 縁 体し、乾燥条件下での保護物質、浸透圧調節物質、あるいはlentztrehalose A, B, C を 発 見 し、 こ れ ら が trehalase や貯蔵糖などとして利用されている。ヒトは trehalose を産各種微生物に分解されず安定であることを明らかとして生しないが、特異的分解酵素 trehalase を小腸や腎臓など

きた 1 - 3）。さらに、他の難分解性類縁体の探索、合成もで発現させており、食事から摂取した trehalose は分解し行い、現在は 40 種余りを保有している。これらの類縁て glucose にし、エネルギー源とすることができる。また、体の化粧品を含めた様々な製品への利用を目指して、保trehalose は、保湿、保護作用をもとに、現在、様々な製

湿、保護作用や生産条件などに関する検討を行うこととし品の添加物として利用されている。スキンケア分野でも、た。特に、工業スケールでの大量生産が可能と見込まれた
4 -trehalosamine とその誘導体化合物 IMCTA-C 14 についCharacterization and application ofe n z y me - st able t re h a lo s e a n a log sderived from actinomycetes
Shun-ichi Wada
The Microbial Chemistry Research
Fou ndat ion I nst it ute of M icrobia lChemistryて（図 1）4）、本研究での主な検討対象とすることとした。

２．方法

2 . 1. 4 -Trehalosamine 増産法の検討
微 生 物 化 学 研 究 所 で 保 有 す る 放 線 菌 の う ち、 生 産菌 候 補 と 考 え ら れ た 約 50 株 を 培 養 し、 そ の 抽 出 物 を− 90 −

放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討

2 . 6 . 4 -Trehalosamine の哺乳類 trehalase に対する分解耐性
4 -Trehalosamine や lentztrehalose A な ど の trehalose
類縁体化合物をブタ腎臓由来 trehalase やヒト trehalase 発
現細胞抽出液により反応させ、分解の有無を調べた。

2 . 7. IMCTA-Cn 化合物の界面活性剤としての評価
4 -Trehalosamine に脂肪属アルデヒドを結合させ還元
し、界面活性剤化合物群 IMCTA-Cn（n = 8 - 15）を合成した。
各化合物の臨界ミセル化濃度は測定キットにより評価した。ミセルサイズは動的光散乱法により測定した。HLB
図 1 4-Trehalosamine と IMCTA-C14

値はグリフィン法により計算した。また、ヒト培養細胞

薄層クロマトグラフィーおよび LC-MS により分析し、タンパク質可溶化能を評価するとともに、抽出タンパク質

4 -trehalosamine の高生産株を選抜した。また、基本液体のフォスファターゼ活性を調べ、タンパク質変性能の有無

培地の成分組成を調整し、高生産条件について検討を行っについても評価を加えた。

OVK 18 からのタンパク質抽出量を調べ、各化合物によるた。

2 . 2 . 4 -Trehalosamine のでんぷん老化抑制作用の検討

2 . 8 . 4 -Trehalosamine および IMCTA-C14 によるオートファジー誘導能の評価
ヒト培養細胞 OVK 18 や Mewo などを 4 -trehalosamine

β- アミラーゼを用いた酵素法と動的粘弾性測定法によや IMCTA-C 14 を含む各種の trehalose 類縁体により処理

り、4 -trehalosamine によるコーンスターチゲル老化抑制

し、オートファジー関連タンパク質の発現、修飾、および作用について検討した。

局在についてウェスタンブロッティングや免疫染色により調べた。

2 . 3 . 4 -Trehalosamine のタンパク質および微生物の乾燥保護作用の検討
ウシalkaline phosphatase（CIP）、酵母alcohol dehydrogenase

３．結果

3 . 1. 4 -Trehalosamine 増産法の検討（ADH）、およびウシ collagen Type I を 4-trehalosamine や予備実験において 4 -trehalosamine の生産菌株候補としtrehalose など各種の糖を加えた条件で凍結乾燥した。凍結て考えられた約 50 株のうち、4 -trehalosamine の生産が確

乾燥後、元の量の水を加え、酵素 2 種については活性を測認されたのは 3 株であった。このうち、生産量が最も多か定し、collagen Type I については Sirius red の取り込みにった Streptomyces sp. MK 186 -mF 5 株を以降の実験に使よる立体構造の維持を評価した。微生物については、大腸用することとした。初期の培地での生産量は液体培養物中菌および酵母に対してタンパク質同様凍結乾燥実験を行っで 0 . 5 g/L 程度（未精製物の含有量として）であった。培地

た。凍結乾燥物を再懸濁して寒天プレート上にまき、生え成分を調整した結果、最適な培地、培養条件下では 5 . 48

たコロニー数を測定して各糖による微生物の乾燥保護効果

g/L まで生産量が上昇した（図 2）。ファーメンターによるを評価した。

大量培養物からの精製を試みた結果、純度 97 % 以上、1 水
和物と考えられる精製物が 540 g 得られた。

2 . 4 . 4 -Trehalosamine の pH 緩衝作用の評価
NaOH を滴定し、pH 緩衝能を評価した。

3 . 2 . 4 -Trehalosamine のでんぷん老化抑制作用の検討

2 . 5 . 4 -Trehalosamine の微生物による分解、資な機能として知られるものである。これにより、現在

10 mM 4 -trehalosamine 水溶液に 1 M HCl あるいは 1 M

で ん ぷ ん の 老 化（ 硬 化 ）抑 制 は、trehalose の 代 表 的化性の評価

trehalose は多くのでんぷん加工食品に添加利用されていグラム陽性菌、陰性菌、抗酸菌、および真菌を含む 12

る。4 -Trehalosamine について、でんぷんの老化抑制作用

種類の微生物の最低栄養培養液中に glucose、trehalose、を調べ、trehalose による作用との比較を試みた。２つの4 -trehalosamine などを加え、菌の増殖を測定し、各糖に系により 96 時間低温保存後のコーンスターチゲルの老化

対する資化性の有無を評価した。

度の比較を行ったところ、4 -trehalosamine を加えて調製− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

増加傾向を見せた。

3 . 3 . 4 -Trehalosamine のタンパク質および微生物の乾燥保護作用の検討
Trehalose の機能としてよく知られたものの一つが、タンパク質の乾燥からの保護作用である。凍結乾燥時に
図 2 4-Trehalosamine 増産
法の検討
元の培地
（1）の成分量を１つずつ変え（2-8）、生産量が増加する条件を組み合わせた（9, 10）。上は薄層クロマ
トグラフィーによる検出結果、 下 は LC-MS に よ る
4-trehalosamine の測定結果を示す。

4 -trehalosamine を加えた場合、CIP と ADH では、他の糖を加えた場合にくらべて活性の保護作用が高く見られた（図 4）。一方、collagen Type I では、4 -trehalosamine
添加による立体構造の維持効果は見られなかった。また、細胞、組織の乾燥からの保護作用を評価していくための前段階の実験として、微生物の乾燥からの保護作用について検討した。微生物では、大腸菌、パン酵母ともに4 -trehalosamine を加えた場合では、他の糖を加えた場合にくらべて若干、菌の生存率が上昇することが確認されたしたゲルは trehalose、sucrose、あるいは glycerol を加え（図 5）。

たものにくらべて有意に老化の進行が遅くなることが確認された（図 3）。酵素法（EA）では、4 -trehalosamine を加え

3 . 4 . 4 -Trehalosamine の pH 緩衝作用の評価

た場合、老化が抑制され、酵素の反応性が高く維持される

Tris との部分構造の類似性から、4 -trehalosamine の pHことが確認された。一方、直接的なゲルの硬さや粘度を評

緩衝能について検討を行った。4 -Trehalosamine には Tris、

価する動的粘弾性測定法（DV）では、他の糖を加えたゲル

MES、あるいは HEPES といった代表的な緩衝物質と同程では一つの指標である Tan δ 値が硬化を示す減少傾向を見度に強力な pH 緩衝作用があることが明らかとなった。緩せたのに対し、4 -trehalosamine を加えたものでは若干の衝 pH 範囲は Tris より 1 . 0 ほど低く、pH 7 . 0 付近で最も強

図 3 4-Trehalosamine のでんぷん
老化抑制作用の検討
15% コーンスターチゲル作製時に
1 0 % t r e h a l o s e（ T R H ）、
4-trehalosamine（4TA）、sucrose（SCR）、glycerol（GOL）を加え、24、48、および 96 時間後の老化度を酵素法（EA）と動的粘弾性法（DV）により測定した。

図 4 4-Trehalosamine のタンパク質の乾燥保護作用の検討
CIP、ADH、Collagen Type I の水
溶 液 を、tre halose（T R H）、
4-trehalosamine（4TA）、maltose（MLT）、sucrose（SCR）、あるいは glycerol（GOL）を混ぜて凍結乾燥したのち、元の量の水を加え、酵素活性と立体構造の維持について検討を行った。

− 92 −

放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討

図 5 4-Trehalosamine の微生物の乾燥保護
作用の検討
大腸菌
（左）とパン酵母（右）の水懸濁液中にtrehalose（TRH）、4-trehalosamine（4TA）、
maltose（MLT）、sucrose（SCR）、 および
glycerol（GOL）を加え凍結乾燥（（FD）した
のち、元の量の水を加え、1/10 の希釈系
列で作製した懸濁液を寒天プレート上にまいた。NF は冷凍していない元の微生物懸濁液、FT は凍結後そのまま解凍した懸濁液。Viability は、糖を加えずに凍結乾燥した場合のコロニー数を１としたときの、それぞれのコロニー数を示す。

図 6 4-Trehalosamine の pH 緩衝作用の評
価
4-Trehalosamine（4TA）、trehalose（TRH）、
Tris、MES, お よ び HEPES の 10 mM 水溶液に 1 M HCl または 1 M NaOH を滴定
し、pH の変化を調べた。

力な緩衝能を発揮した（図 6）。

3 . 5 . 4 -Trehalosamine の微生物による資化性の評価

のみ分解産物の glucose の産生が見られ、4 -trehalosamine

4 -Trehalosamine が微生物に分解され栄養源となりうと 他 の trehalose 類 縁 体 で は glucose の 産 生 は 見 ら れ な

るのか調べることとした。12 種類の各種微生物それぞれかった。また、ヒト trehalase 発現細胞抽出液を用いたに対し、炭素源の不足した最低栄養培地を用意し培養を行実 験（ 図 8 B）で は、 抽 出 液 反 応 後 の trehalose 類 縁 体 化った（図 7 bar 1）。いずれの場合も glucose の添加（bar 2）に合物の残存量を測定したが、やはり trehalose のみが分より菌の増殖率の上昇が見られる培地とした。Glucose の解され、他の類縁体は分解されないことが確認された。

代わりに trehalose を添加した場合（bar 3）でも、6 種類ほ

4 -Trehalosamine は哺乳類 trehalase に分解されないこと

どの菌では増殖率の上昇が確認された。4 -Trehalosamineが示された。

を添加した場合（bar 4）ではどの菌でも増殖率の上昇は見られず、微生物の栄養源とはならないことが示された。

3 . 7. IMCTA-Cn 化合物の界面活性剤としての評価

3 . 6 . 4 -Trehalosamine の哺乳類 trehalase に対する分解耐性

IMCTA-Cn（n= 8 - 15）について、界面活性剤としての性

ブタtrehalase（ 図 8 A）を反応させた場合では、trehalose（DDM）の同じ長さの脂肪鎖をもつものでの比較では、

4 -Trehalosamine を 原 料 と し て 合 成 し た 化 合 物
質 を 調 べ た。IMCTA-C 12 と n-dodecyl-β-D-maltoside− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 7 4-Trehalosamine の微生物による資化性の評
価
12 種類の微生物それぞれの最低栄養培地（bar 1）に、glu c ose（b a r 2）、tre h alose（b a r 3）、
4-trehalosamine（bar 4）、 お よ び そ の 他 のtrehalose 類縁体（bars 5-7）を加え、各菌の増殖を測定した。

図 8 4-Trehalosamine の哺乳類 trehalase に対する分解耐性
A. ブタ腎臓由来 trehalase を trehalose（TRH）、4-trehalosamine（4TA）、およびその他の trehalose 類縁体化合物に反応させ、分解産物である glucose の放出量を測定した。右は 4TA とその他の類縁体のプロットの重なりを拡大したもの。
B. ヒト培養細胞 KP4 でヒト trehalase を発現させ、その抽出液による trehalose 類縁体の分解について調べた。KP4-TREH10 はtrehalase 安定発現株。グラフ中、白印は親株 KP4 抽出液で trehalose 類縁体を反応させたもの。黒印は KP4-TREH10 抽出液
で反応させたもの。

ズが大きかった（図 9 A）
。培養細胞からのタンパク質抽出、

3 . 8 . 4 -Trehalosamine および IMCTA-C14 によるオートファジー誘導能の評価

可溶化効率について調べた結果、IMCTA-C 11 ‒C 14 は効

Trehalose 類 の 生 理 機 能 と し て、50 - 100 mM 程 度 の率が高く、特に IMCTA-C 13 では SDS と同等に高い効率

高濃度で用いた場合に細胞にオートファジーを誘導すを示した（図 9 B）。抽出液中の EGFR、TRPV 6、あるいはる こ と が 知 ら れ て い る。4 -Trehalosamine と IMCTA-

Na+/K+-ATPase の存在量を確認した結果、これらの化合

Cn 化合物のオートファジー誘導能の有無について調べ

物では膜タンパク質の抽出も効率よくできていることが明た。4 -Trehalosamine による処理では、trehalose より強らかとなった（図 9 C）
。一方、抽出液のフォスファターゼ

いオートファジーマーカー LC3-IIの発現が確認された（図

活性を調べたところ、SDS で抽出したものでは、フォスフ

10 A）。IMCTA-Cn 類はさらに強いオートファジー誘導能

ァターゼが変性し活性が低下していたが、IMCTA-Cn でを示した。IMCTA-C 13 ‒C 15 では、trehalose の 1 / 3000 -はフォスファターゼ活性が維持されており、これらがタン

1 / 1000 ほどの濃度で、Trehalose よりも強くオートファ

パク質変性作用を示さない界面活性剤であることが確認さ

ジーマーカーの発現が確認された。4 -Trehalosamine やれた（図 9 D）。

IMCTA-Cn に よ る 処 理 時、rapamycin の 場 合 と 異 な り

IMCTA-C 12 の方が臨界ミセル濃度が高く、ミセルサイ

p 70 S 6 K の脱リン酸化が確認されていなかった（図 10 B）− 94 −

放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討

図 9 IMCTA-Cn 化合物の界面活性剤としての評価
A. IMCTA-Cn（n = 8-15）化合物の臨界
ミセル 濃 度、 ミセル サイズ、 および
HLB 値を示す。
B. IMCTA-Cn（C8‒C15）と各種界面活性 剤を右に示す濃 度で使 用した際のOVK18 細胞抽出液中のタンパク質濃度を BCA 法により測定した。
C. B の抽出液の一部をウェスタンブロッ
ティングにより分析し、各化合物による膜タンパク質の抽出、可溶化効率を確認した。
D. 各化合物抽出液のフォスファターゼ活性を測定し、タンパク質変性能を検討した。

こ と か ら、 こ れ ら も trehalose と 同 様、mTOR 非 依 存 的るものと考えられる。現在その酵素については未同定であるにオートファジーを誘導するものと考えられた。また、が、将来的にはその応用により、でんぷんからの trehalose

4 -Trehalosamine と IMCTA-C 14 は trehalose 同様、細胞の生産と同様、安価な材料物質を数種の酵素で処理すること

内の凝集性ペプチドを減少させ（図 10 C）、オートファジ

で大量生産することができる可能性があり期待される。
4 -Trehalosamineには collagen type Iの乾燥からの保護

ー関連転写因子 TFEB の核移行を促進させた（図 10 D）。

４．考作用はほんとど見られなかったが、でんぷんの老化抑制作用

察に関してはtrehalose や他の糖類に比べて有意に強く見られ、本研究は我々が長期的に行っている難分解性 trehalose 類

また、CIP やADHといった酵素や、大腸菌や酵母などの微縁体化合物の実用化に向けた検討の一環として行われたもの

生物の乾燥からの保護作用も他の糖より強いか、あるいは同である。本研究期間においては 4 -trehalosamine の産業的程度に確認された。哺乳類の細胞や組織に対する保護効果

大量生産が期待される結果が得られたため、これを中心にに関しては、まだ予備実験段階であるが、マウス皮膚の再利用法の検討を行うこととした。

生や創傷治癒作用についても、少なくともtrehaloseと同程度

4 -Trehalosamine については本研究での検討により、現の効果が認められている。本研究において 4 -trehalosamine

段階で実験室レベルの設備と 1 か月ほどの作業により、500 g

は強い pH 緩衝能を示し、微 生物に資化されず、trehalase

以上生産することが可能となった。今後は変異原物質を用に分解されない、といった trehaloseには無い特長が幾つかいた生産菌育種や新たな培地、培養条件の検討により、更確認された。Trehalose は保湿保護物質として優れた特性をなる増産にも期 待 することが できる。 また、trehalose や有し、現在多くの製品に使用されているが、その一方で、一

各種アミノグリコシド化合物の生合成機構を考慮すると、般的に流通している類縁体化合物が存在しないため、製品

4 -trehalosamineは数種類程度の酵素により生合成されてい開発段階において性能を比較し、より良いものを選択すると− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 10 4-Trehalosamine および IMCTA-Cn
によるオートファジー誘導能の評価
A. Trehalose 類縁体処理細胞内でのオートファジーマーカータンパク質 LC3-II の発現
上 昇について調べた。LT-1、-2、-7 は、
別 のトレハ ロ ース 類 縁 体。TRH-Cn はtrehalose の 6 位に脂肪酸が結合したエステル。
B. mTOR の基質である p70S6K のリン酸化状態を調べ、4-trehalosamine と IMCTACn によるオートファジー誘導が mTOR 依
存的なものであるのかどうか調べた。RM
は mTOR 阻害剤 rapamycin。
C. Trehalose 類で処理した際の、凝集性ペプチド Q74 と SynA53T の細胞内での存在量を調べた。低浸透圧液を使用し、凝集物画分（Agg）と可溶物画分（Sol）に分けて評価を行った。
D. Trehalose 類で処理した際のオートファジ
ー関連転写因子 TFEB の発現量と核移行についてウェスタンブロットと免疫染色により調べた。

いうことができない。化粧品、スキンケア製品開発において、

trehaloseは、その後 25 年ほどで年間 4 - 5 万トン生産される

4 -trehalosamine には、まずは trehaloseとの比較対象としようになり、現在では食品以外にも多くの製品に添加、使用て使用されることから期待したい。

されるようになった。我々が日々消費する様々な製品の原材

Trehalose 類縁体化合物の一般的な流通が進まない理由

料欄を見るとき、単一の糖または糖アルコールとして最も頻繁の一つとして、誘導体化合物の安価な大量生産が困難であるに含有が確認できるものの一つが trehaloseである。それ以点が挙げられる。分子内に 8 個含まれる水酸基のうち、特前も酵母から抽出された少量のものが一部の化粧品や研究

定のものを修飾、構造変換することは産業レベルでは困難で試薬などに使用されていたようではあるが、生産、利用規模ある。4 -Trehalosamineに関しては、4 位に限定されるものの、は革命的な変化を見せてきた。林原によるtrehaloseのこれま水酸基とは反応性の異なるアミノ基を利用することで容易にでの生産、販売展開の軌跡は、「人類が利用可能な新たな糖」

多数の誘導体化合物を合成することが可能である。本研究が一つ発見されるということが産業史上いかに重大な意義をでは、当初、構造生物学分野での膜タンパク質研究への利もつのかを示す特筆すべき事例であるものと言える。

用を考えて、4 -trehalosamine 誘導体であるIMCTA-Cn 化

4 -Trehalosamine は産業的な大量生産が可能であるもの

合物を合成した。IMCTA-C 13 を中心とした脂肪鎖が長めと考えられ、trehaloseより優れた幾つかの性質を示すため、のものについてはタンパク質可溶化作用が強く認められる一

正に「人類が利用可能な新たな糖」の一つとなり得るものと期方で、変性作用は示さないマイルドな界面活性剤であること待される。近い将来我々の生活に深く浸透していくものになが確認された。化粧品分野では乳化剤としての利用が期待さる可能性がある。

れる。また、強いオートファジー誘導能が確認されたことから、

また 4 -trehalosamineは合成原料としての有用性にも期待

実用化には更なる慎重な検討が必要であるが、皮膚組織のが集まる。本研究で開発された IMCTA-Cn 化合物の一部は新陳代謝を促進するような効果が得られることも期待される。

乳化剤や洗剤としての利用以外に、trehaloseタイプの強力な

５．総

オートファジー誘導剤として神経変性疾患や肝疾患の治療薬

括あるいはリード化合物としての開発、利用も期待される。また、1990 年代半ばに日本の製糖企業株式会社林原によって、現在はまだ着手していないが、4 -trehalosamineを規則的にでんぷんの酵素処理による安価な大量生産法が開発された結合させた、保湿、保護効果を有した樹脂、繊維、接着剤− 96 −

放線菌由来難分解性 trehalose 類縁体化合物の物性評価と利用法の検討（引用文献）などの高分子物質の開発にも今後興味がもたれる。

1） Wada S et a l . Stability a nd bioava ilability of謝辞

lentztrehaloses A, B, and C as replacements for

本研究を進めるにあたり、多大なご支援をいただきましtrehalose. J. Agric. Food Chem. 64, 7121-7126.（2016）

た公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より

2） Wada S et al. Novel autophagy inducers lentztrehaloses

感謝申し上げます。

A, B and C. J. Antibiot. 68, 521-529.（2015）

本研究は、有村帆波美氏、吉田温子氏、永吉美穂氏、松3） Wada S et al. Structure and biological properties of

波さくら氏、柳澤諒氏、五十嵐雅之博士、大庭俊一氏、澤lentztrehalose: a novel trehalose analog. J. Antibiot. 67,

竜一博士、久保田由美子氏、大石智一博士、原川晃子氏、

319-322.（2014）

清水孝雄博士をはじめ、微生物化学研究所の多くの方々の

4） Wada S et al. Rediscovery of 4-trehalosamine as a

ご協力により進めてまいりました。厚く感謝申し上げます。

biologically stable, mass-producible, and chemicallymodifiable trehalose analog. Adv Biol (Weinh). https://doi.org/10.1002/adbi.202101309（2022）− 97 −

ヒト iPS 細胞由来神経堤細胞による革新的線維芽制御方法の開発
慶應義塾大学眼科学教室

稲垣

絵海With the advent of an aging society, the importance of prevention and treatment of various chronic diseases has been
pointed out. Inflammation and fibrosis control are considered to be important as the underlying pathology common to chronic diseases. We focused on the wound healing mechanism during the embryonic period and investigated neural crest cells(NC) that have the ability to migrate during the embryonic period. In this study, we focused on neural crest cells derived
from iPSCs to overcome disease phenotypes, and found that they secrete a secretome that acts in an inhibitory manner
against inflammation and is useful in disease models. Since neural crest cells derived from living organisms have a relatively
limited capacity, induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived neural crest cells may be advantageous for cell therapy andmay enhance regenerative functions. However, there are some barriers to clinical application, such as standardization of
production methods, product quality control and standardization, and in vivo viability, when considering extrapolation as aregenerative medicine product, but the potential as a new cell source with interesting possibilities is promising.

1．緒

言

2. 方

法

世界的な高齢化社会を迎え、基礎研究分野でも加齢に伴我々は既報に準じた神経堤細胞の誘導法を改善し、現在

う疾病の克服に向けた新たな時代が到来している。人間のでは 90 % 以上の誘導効率を担保する誘導系を確立した 15 , 16）。

老化や加齢に伴う疾病のメカニズムや治療法の解明という誘導した iPS 由来誘導細胞において神経堤細胞マーカーの問題は、差し迫った高齢化社会を反映し、新たな局面を迎

遺伝子発現解析については DNA マイクロアレイを用いてえている。老化の詳細なメカニズムは依然として不明な点検証した。分泌している液性因子に関してはサイトカインがあり、複数の調節機構の関与が報告されている

1 - 3）

アレイを用いて上清成分の定量化および解析を実施した。

。このなかで臓器線維化は慢性炎症に伴い生じ、主要臓器では3. 結致死を招く病態である。皮膚や角膜は強く損傷すると瘢痕

果を残して治癒し、決して元の状態には再生されない。しか施行した遺伝子解析においては誘導の過程においてし、胎生期のある時期までは、たとえどのような深い傷を

NGFR, SNAI, SOX 9 , SOX 10 , TFAP 2 A などの神経堤マ追っても瘢痕を全く形成することなく完全に元の状態に再ーカーの発現上昇を確認した。ウェスタンブロッテイング

生され、この機構は胎仔創傷治癒機構（scarless woundにて検証した蛋白定量においても NGFR, SOX 9 らの発現

healing）といわれる

4 - 7）。我々は、これまでの知見で生来を確認した。また DNA マイクロアレイの解析において誘における神経堤由来の細胞の局在について検討を実施、移導細胞が神経堤マーカーの発現が高いことを確認した。ま

8 , 9）。2006 年とた同細胞の培養液上清を用いて志向したサイトカインアレ

2007 年に、高橋らはマウスとヒトの体性線維芽細胞からイの結果より複数の候補因子群を抽出した。さらに実際の10 , 11）

生体における創傷治癒機構を解明するため、げっ歯類にお以来 iPS 細胞を用いた組織分化のメカニズムやヒト疾患のける眼疾患モデルを用いこれらの候補因子の有効性につい

病態生理を解明する病態解析の試験管モデルとしての有用て検討を行った。結果として単一因子としては優位な瘢痕性と共に細胞置換療法としての移植治療が着目され病態解抑制を認めることはできなかったが、培養上清の添加によ明や新規治療法開発が実施されている 12 - 14）。本研究ではって効果を認めたことから培養上清中に分泌される複数の

iPS 由来誘導神経堤細胞の移植細胞源としての特性を明ら因子が作用していることが示唆された。

植細胞源としての有用性を実証してきた

人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する技術を報告した。

かにする目的で実施を行った。

4. 考

察

我々の解析により今回 iPS 細胞由来誘導神経堤細胞からDevelopment of an Innovative Method
for Modulating Fibrosis by Human iPS
Cell-Derived Neural Crest Cells
Emi Inagaki
Keio University, School of Medicine,
Department of Ophthalmology分泌される液性因子による新しい瘢痕抑制効果を見出した。
想定される奏功機序に寄与した液性因子が線維芽細胞に作用し細胞外基質や蛋白分解酵素の発現の修飾をする予備知
見を得ており、神経堤の形質を有する本誘導細胞が炎症に関して収束的な役割に寄与することを推察している。

− 100 −

ヒト iPS 細胞由来神経堤細胞による革新的線維芽制御方法の開発（3）: p. 237-47.

5 . 結論・まとめ

7） Pratsinis, H., E. Mavrogonatou, and D. Kletsas,

神経堤（neural crest: NC）細胞は胎生期から成体にかけ

Scarless wound healing: From development toて軟骨や骨、皮膚など結合織をはじめとして驚異的に様々

senescence. Adv Drug Deliv Rev, 2019. 146: p. 325-343.

な種類の細胞系譜への可能性を秘めかつ、成体になっても

8） Yoshida, S., et al., Isolation of multipotent neural

持続する自己複製能力を有する細胞である 17 - 19）。近年同crest-derived stem cells from the adult mouse cornea.

細胞を細胞治療用に探索する試みも報告されつつある

20 , 21）。

Stem Cells, 2006. 24（12）: p. 2714-22.

同細胞を用いて治療の標的としては神経堤から分化するよ9） Inagaki, E., et al., Skin-Derived Precursors as a

うな組織における組織構築に関する貢献を期待する場合、Source of Progenitors for Corneal Endothelial

もう一つは疾患特異的な修復を期待する場合である。今回Regeneration. Stem Cells Transl Med, 2 0 1 7. 6（3）: p.

標的とした角膜実質は神経堤由来の誘導組織と報告されて788-798.

いるが、我々もヒト NC 由来の多能性前駆細胞をヒト成体

10）Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction ofから単離した場合に、年齢依存的な変化を呈しており自己

pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult

複製能力と多能性に関しては制限されていることなどを報

fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126（4）: p.

告している

22）

。よって移植細胞として用いる場合にはよ663-76.

り幼若な iPS 細胞あるいは ES 細胞のような細胞源が適切

11）Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem

とも考えられる。本研究では主に組織修復における有用性

cells from adult human fibroblasts by defined factors.

を検証したが、ヒルシュスプリング病など神経堤由来細胞

Cell, 2007. 131（5）: p. 861-72.

の発生異常関連疾患においても寄与することが期待できう

12）Liu, G.H., Z. Ding, and J.C. Izpisua Belmonte, iPSC

る。再生医療においては長期的な安定性を厳密に管理する

technology to study human aging and aging-related

ことが重要であると考えられる。たとえば規格化などの点

disorders. Curr Opin Cell Biol, 2012. 24（6）: p. 765-74.

においては代表的な神経堤細胞表面抗原である p 75 を使

13）Okano, H. and S. Yamanaka, iPS cell technologies:

用することが推定されるが、複数の適切な表面抗原の選定

significance and applications to CNS regeneration andが必要である。iPS 由来誘導細胞を用いた新しい細胞治療

disease. Mol Brain, 2014. 7: p. 22.

を構築するには、有効性評価の確立、細胞の安全性、毒性評価、投与方法の最適化を踏まえる必要がある

23 , 24）。も14）Okano, H. and D. Sipp, New trends in cellular therapy.
Development, 2020. 147（18）．

し同等の効果を有する場合に液性因子のみを投与するよう

15）Lee, G., et al., Isolation and directed differentiation of

な試みも充分に考えうる。本領域においてはモデル動物で

neural crest stem cells derived from human embryonicの検討と iPS 由来誘導細胞において互いに補完して研究を

stem cells. Nat Biotechnol, 2007. 25（12）: p. 1468-75.

進めていくことが有用であると考えられる。今後も当該領

16）Chambers, S.M., et al., Dual-SMAD Inhibition/WNT
Activation-Based Methods to Induce Neural Crest and

域において進歩がなされることを期待する。

Derivatives from Human Pluripotent Stem Cells.
（文献）

Methods Mol Biol, 2016. 1307: p. 329-43.

1） Harman, D., The aging process. Proc Natl Acad Sci U17）dʼAquino, R., et al., Human neural crest-derived
postnatal cells exhibit remarkable embryonic attributes

S A, 1981. 78（11）: p. 7124-8.
2） Haigis, M.C. and B.A. Yankner, The aging stresseither in vitro or in vivo. Eur Cell Mater, 2011. 21: p.
304-16.

response. Mol Cell, 2010. 40（2）: p. 333-44.
3） López-Otín, C., et al., The Hallmarks of Aging. Cell,

18）Achilleos, A. and P.A. Trainor, Neural crest stem
cells: discovery, properties and potential for therapy.

2013. 153（6）: p. 1194-1217.
4） Larson, B.J., M.T. Longaker, and H.P. Lorenz, Scarlessfetal wound healing: a basic science review. Plast

Cell Res, 2012. 22（2）: p. 288-304.
19）Griswold, S.L. and P.Y. Lwigale, Analysis of neuralcrest migration and differentiation by cross-species

Reconstr Surg, 2010. 126（4）: p. 1172-1180.
5） Schwartzfarb, E. and R.S. Kirsner, Understanding
scarring: scarless fetal wound healing as a model. Jtransplantation. J Vis Exp, 2012（60）．
20）Li, L.K., et al., Intramuscular delivery of neural crest
stem cell spheroids enhances neuromuscular regeneration

Invest Dermatol, 2012. 132（2）: p. 260.
6） Lo, D.D., et al., Scarless fetal skin wound healing
update. Birth Defects Res C Embryo Today, 2012. 96

after denervation injury. Stem Cell Res Ther, 2022. 13（1）: p. 205.

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

21）Brizi, V., et al., Human iPSC-derived neural crest23）Blau, H.M. and G.Q. Daley, Stem Cells in thestem cells can produce EPO and induce erythropoiesis

Treatment of Disease. N Engl J Med, 201.9. 380（18）: p.

in anemic mice. Stem Cell Res, 2021. 55: p. 102476.

1748-1760.

22）Hatou, S., et al., Functional corneal endothelium24）M a d l , C . M . , S . C . H e i l s h o r n , a n d H . M . B l a u ,derived from corneal stroma stem cells of neural crest

Bioengineering strategies to accelerate stem cellorigin by retinoic acid and Wnt/beta-catenin signaling.

therapeutics. Nature, 2018. 557（7705）: p. 335-342.

Stem Cells Dev, 2013. 22（5）: p. 828-39.

− 102 −

毛染め・化粧品アレルギー患者の原因検索における好塩基球活性化試験の有用性の検討と染毛剤アレルギー患者における痒疹反応の病態解析
東京医科歯科大学大学院皮膚科学分野

宇賀神

つかさ

The incidence of hair dye and cosmetics allergy have increased considerably among young people. Contact
hypersensitivity commonly occurs with hair dye exposure, manifesting as urticaria or eczematous eruptions in localised
exposed areas. However, in some cases, prurigo can be diffusely occurred. Neither the histopathology nor molecularmechanisms of hair dye-induced prurigo have been elucidated.
Basophil activation test (BAT) is a safe, ex vivo assay to confirm allergy diagnosis. In this study, we first examined theutility of BAT for diagnosing hair dye allergy by analyzing the results of BAT performed in four cases (two cases, contact
eczema; one case, contact urticaria; one case, prurigo) that have positive patch test reactions to p-phenylenediamine (PPD).
Basophils isolated from two cases (one case, contact eczema; one case, contact urticaria) were non-responder. Responder
basophils from two residual cases (one case, contact eczema; one case, prurigo) did not respond to PPD. Therefore, in casesof delayed-type reaction against PPD including prurigo, PPD and PPD specific IgE-induced basophil activation might not
be involved. However, the utility of BAT in diagnosis of immediate-type PPD allergy such as contact urticaria could not be
elucidated in this study.
We further showed the histological features of hair dye-induced prurigo, including the characteristics of an immune
cell infiltrate. The histopathology exhibited hyperkeratosis, acanthosis, and subcorneal collection of neutrophils.
Immunohistochemical staining revealed moderate basophil infiltration in subcorneal microabscesses with infiltration of
CD4+ cells, IL-17+ cells, and Foxp3+ cells beneath microabscesses and perivascular area in upper dermis. Together,whereas basophil activation was not observed following exposure to PPD, basophil was infiltrated in central portion of thelesions. Further studies are necessary to reveal the role of basophils in hair dye-induced prurigo.

１．緒こで、本研究ではさらに、染毛剤アレルギーによる痒疹反言

応における好塩基球や種々の免疫細胞の関与を病理組織学

近年、毛染めや化粧品の使用に伴うスキントラブルは、的に解析した。

若年層での広がりを見せており、患者数は増加している。

２．方

化粧品の使用に伴うスキントラブルは、接触皮膚炎や接触法

一方、染毛剤は接触皮膚炎や接触蕁麻疹に加え、アナフ

2 . 1. 染毛剤アレルギーにおける好塩基球活性化試験の有用性ィラキシーショック、痒疹など、全身性に多彩な臨床症状

東京医科歯科大学皮膚科を受診し、染毛剤アレルギーを呈することが知られるが、その病態の詳細は不明である。

が疑われ、精査を施行した症例を対象に検討した。症例

アレルギー精査においては、遅延型アレルギーであればパは、臨床症状より病型分類した。染毛剤とジャパニーズス

ッチテスト、即時型アレルギーであればプリックテストやタンダードシリーズの p-phenylenediamine（PPD）を用い

オープンテストが施行されるが、後者は、アナフィラキシ

たパッチテストあるいはオープンテストの結果を検討した。

ーなどの重篤な症状が誘発されるリスクがあり、安全性に

BAT は PPD の希釈系列の付加による末梢血好塩基球の活は十分な配慮が必要である。好塩基球活性化試験は、安全性化（CD 203 c）の有無をフローサイトメトリーにて解析しな ex vivo の検査であり、アレルギー診断に有用であるこた結果を検討した。さらに、臨床症状と精査結果を比較検とが知られている。本研究では毛染めアレルギーにおける討することで、染毛剤アレルギーにおける BAT の有用性

好塩基球活性化試験の有用性を検討した。また、当科の先について検討した。

蕁麻疹など接触部に留まるアレルギー反応が主体である。

行研究では、一般的な慢性痒疹の病態には、IgE 抗体や好塩基球が深く関与することが明らかになっている 1 - 2）。そAnalysis on the utility of basophil
activation test in the diagnosis of hairdye and cosmetics allergy and themechanism of prurigo reaction causedby hair dye
Tsukasa Ugajin
Department of Dermatology, Tokyo
Medical and Dental University

2 . 2 . 染毛剤アレルギーによる痒疹の病態解析
診断のために採取した染毛剤アレルギーによる痒疹の病
理組織標本を用いて、好塩基球の他、各種免疫細胞の浸潤を病理組織学的に評価した。好中球や好酸球はヘマトキシ
リンエオジン（HE）染色で、肥満細胞はアルーシャンブル
ー染色で検出した。好塩基球は、顆粒特異的抗体を用いて、リンパ球は CD 4・CD 8・Forkhead boxprotein P 3（FoxP 3）抗体を用いて、interleukin（IL）-17 産生細胞は抗 IL- 17 抗

− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 1 左：染毛剤のよる痒疹反応 HE
染色、右：同 好塩基球特異的抗体
による免疫染色（200 倍）Scale bar, 50µm 文献 5）より引用し、改編

当研究室で樹立した染毛剤アレルギーのモデルマウスは 3）、

体を用いて免疫組織染色で検出した。

３．結

3 日間連日抗原感作した後、抗原をチャレンジするという果ものであるが、IgE 上昇を伴う STAT 6 依存性の 2 型免疫染毛剤アレルギーが疑われ、当科で精査を施行した症例応答が誘導される。近年、別の手法を用いたモデルマウス

12 症例（男性 2 例、女性 10 例）について検討した。12 症において、IL- 17 産生細胞や制御性 T 細胞がリンパ節にお例の内、4 例は、PPD あるいは染毛剤のパッチテスト陽性

いて誘導されることが報告された 4）。染毛剤アレルギーにだった。4 例の臨床症状は、2 例が接触皮膚炎、1 例が接おける痒疹は、後者のモデルに類似すると考えられ、これ

触蕁麻疹、1 例が痒疹だった。PPD を用いた BAT では、2を論文報告した 5）。

例（接触皮膚炎と接触蕁麻疹が各 1 例）
は anti-IgE 抗体によ本研究の成果より、染毛剤アレルギーによる痒疹反応でる陽性コントロールでも好塩基球における CD 203 c の発現は PPD の曝露による好塩基球活性化は確認できなかった変動が見られず non-responder であったと考えられた。残が、痒疹病変の中心部には好塩基球の浸潤を認めていた。

り 2 例（接触皮膚炎と痒疹が各 1 例）は responder であった

今後、染毛剤アレルギーによる痒疹反応における好塩基球

が、PPD の付加で好塩基球における CD 203 c の発現に変機能を解明していくためには、さらなる解析が求められる。

動は見られなかった。

５．総染毛剤アレルギーによる痒疹の病態解析として、病変部より採取した病理組織標本を用いて、免疫組織学的な解析

括

結論、まとめを考察に含める。

を行った。表皮の肥厚、表皮内には好中球と比較的多くの
好塩基球の浸潤が見られた（図 1）。一方、肥満細胞の増殖は確認できなかった。リンパ球は、CD 4 陽性細胞が大半を占め、IL- 17 陽性、FoxP 3 陽性細胞を混じていた。

４．考（引用文献）
1） Ugajin T, Yokozeki H. Efficacy of anti-immunoglobulin
E therapy in patients with prurigo: a pilot study. J
Cutan Immunol Allergy 2019, DOI: 10.1002/cia2.12061

察2） Inui K, Ugajin T, Namiki T, Yokozeki H. Chronic

PPD に対するパッチテストが陽性反応を示した 4 症例の内、responder の好塩基球を有する 2 症例は接触皮膚炎とprurigo: A retrospective study of 1 6 8 cases. J
Dermatol. 47:283-9, 2020

痒疹型の患者であったが、この 2 症例において PPD による

3） Yokozeki H, Wu MH, Sumi K et al. Th2 cytokines,

BAT は共に陰性の結果であった。少なくとも痒疹型を含

IgE and mast cells play a crucial role in the

む遅延型の PPD アレルギーの患者においては、PPD の曝

induction of para-phenylenediamine-induced contact

露による好塩基球の活性化は見られないこと、PPD/ 特異

hypersensitivity in mice. Clin Exp Immunol 132: 385-

的 IgE 抗体の反応が関与しない可能性が考えられた。PPD

92, 2003

による即時型アレルギー（接触蕁麻疹）の１症例において

4） Rubin IMC, Dabelsteen S, Nielsen MM et al.

も、BAT が検討されたが、non responder の好塩基球を有Repeated exposure to hair dye induces regulatory T

しており、診断における BAT の有用性については明らか

cells in mice. Br J Dermatol 163: 992-8, 2010にならなかった。今後さらなる症例の蓄積が必要である。

5） Ugajin T, Namiki T, Yokozeki H. A case of prurigo

染毛剤アレルギーによる痒疹の病理組織では、病変部

caused by hair dye containing p-Phenylenediamine:の中心部である表皮において、好中球の他、多くの好塩

Histopathological finding. Eur J Dermatol 3 1:1 0 3-4,

基球浸潤が認められた。また、その周囲や真皮上層には、

2021

IL- 17 産生細胞・制御性 T 細胞の浸潤が見られた。過去に− 104 −

ヒトの視覚と嗅覚を制御する新しい抽出分離素材の開発
東北大学大学院環境科学研究科先端環境創成学専攻環境創成計画学講座環境分子化学分野

大田

昌樹

Measurements of vapor-liquid distribution coefficients (K-values) of compounds contained in hops-extract ethanol
solution in high pressure CO2 system were carried out at temperatures of 313–373 K and pressures of 5–14 MPa with acontinuous flow apparatus for fractionation of hops-extract by using supercritical counter-current extraction process. Using
available experimental data for 105 K-values, a correlation equation for the vapor-liquid distribution coefficient of solutes
was constructed based on entropy-based solubility parameter (eSP) and dimensionless temperature. The dimensionless
distribution equation that takes into account the eSP concept, originally developed in the previous work (Ota et al., 2017),
was also applied to the available experimental data, and four universal constants were re-determined. From the establishedcalculation methods, the K-values of solutes could be applied to the counter-current extraction systems with supercritical
CO2.

１．緒

これまで著者らは，超臨界二酸化炭素抽出に精留機構を組言み合わせた半回分プロセスにより天然由来成分の分画を検従来一緒くたに抽出されてきた天然・合成化合物を分離討してきたが，本法は半回分式ゆえに固体原料の仕込み直する技術には，時代に左右されない一定の需要があるもの

しに手間がかかるという課題があった．そこで，常温常圧と考える．例えば，最近，飲料関連の市場を賑わせているにて産業上汎用される液体原料を溶媒と連続的に向流接触

一見透明な水に見えるが，オレンジジュースの味や香りがさせる抽出法（向流接触抽出法）を例に，高圧系への拡張をする飲料等は正にその例といえよう．これは，従来のオレ目指した研究を展開し，まず高圧フラッシュ平衡測定を可ンジジュースがもつ特有の β クリプトキサンチン等のカロ能とする気液平衡比測定装置を開発した．二酸化炭素 ‒ エ

テノイド色素を除いた飲料と言い換えることができ，これタノール ‒ホップエキス系に本装置を応用した結果，主要７溶までの世間の常識の範疇を超えた応用事例であろう．著者

質についての基礎データを蓄積するとともに溶解度パラメ

は，こうータに基づく気液平衡比の推算式を報告している 1）．このした応用事例に正に適用可能であり，将来的には，医薬食基礎データに基づき，超臨界二酸化炭素を用いたホップエ

品・飲料の他，
化粧品や化成品への応用も視野に入れている．

タノールエキスの向流接触抽出実験を実施した結果，高温，

今回の実験対象としたのは，ホップ（Humulus lupulus）で高圧かつ抽剤／原溶媒比（S/F 比）が大きいほど香気成分とある．ホップは，麦芽，水，酵母と並ぶビールの重要な原

レジン成分の分離効率が高いことがわかった 2）．このこと料であり，多くの香気成分や精油，樹脂成分や色素を含んは，一般的な二酸化炭素 - エタノール – 精油系の気液平衡

でいる（Canbas et al., 2001）．ビールの製造において，ホ比データの傾向とも一致した 3）．

らがオリジナル開発した亜臨界溶媒分離技術

1 - 5）

ップは少量の添加により飲料の味および香りを調整できる

しかしながら，これまでの既往の研究では，実験のだけでなく，ビールに対する清澄作用や殺菌作用を示す．

温 度 お よ び 圧 力 条 件 が そ れ ぞ れ 323 - 343 K お よ び 圧 力

一般に，ホップは抽出分離操作により目的成分が濃縮され

8 - 10 MPa と狭く 1），得られた気液平衡比データ数も計 7たホップエキスの状態で利用される．最近では，このよう溶質で 35 データと限られていた．そこで本研究では，さな天然材料中の含有成分抽出・分画手法として，抽出物にらなるデータの拡充のため実験条件範囲の拡大を目的とし，有害な溶媒が残留する恐れがなく，抽出時に成分の酸化劣CO 2 -ethanol 共溶媒系におけるホップエキス含有成分の気化を防ぐことができる等の利点を有する超臨界・亜臨界流

液平衡比の測定を，温度および圧力条件をそれぞれ 313 -体抽出が注目されている．

373 K および 5 - 14 MPa として実施した．さらに，得られた気液平衡比の傾向を定量的に表現する相関式を提案し，著者らが以前に開発した溶解度パラメータに基づく推算式 1）

Development of new extract-materials
from separation of natural products
including pigments and flavors
Masaki Ota
Graduate School of Environmenta lStudies, Tohoku Universityと比較した．これらの検討より，従来一緒くたに抽出されてきた成分の効率的な分離を実現するための温度・圧力条
件による気液平衡比の予測法を構築することを目的とした．
なお，この報告書は，投稿論文として寄稿した化学工学論
文集の内容 4 - 5）からの抜粋であることをご了承いただきた− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

実験条件は温度 313 - 373 K，圧力 5 - 14 MPa とした．な

い．

２．方

お，気液共存領域での操作とするため温度によって圧力範法

囲は異なる．また，Feed モル組成は溶質 -free の値で，抽2 . 1. 実験資料

剤 : 原溶媒として，二酸化炭素 : エタノールの物質量流量を

溶媒には CO（大陽日酸株
式会社，純度 99 . 5 %）および2
ethanol（富士フィルム和光純薬工業株式会社，純度 99 . 5 %）80 : 20 とし，かつ合計を 0 . 075 mol/min となるように設定した．

を使用した．溶質となるホップ試料には BarthHaas 社製のホ

3．結

ップエキス
（品種：Perle）
を使用した．

果

ホップ含有 7 成分の高圧 CO 2 -ethanol 共溶媒系における

2 . 2 . 実験装置・方法

気液平衡比測定結果のうち，1 例として温度 353 K，圧力

気液平衡比の流通式測定装置は，以前報告したものと
6）

5 - 12 MPa および温度 333 - 373 K，圧力 10 MPa における同一のものを使用した ．本装置は，供給部，平衡到達

Ksolute 測定結果を Fig. 1 a および 1 b にそれぞれ示す．Fig.

部，組成分析部から構成され，設計最高温度，最高圧力は

1 a より，Ksolute の圧力依存性は香気成分とレジン成分で異373 K，25 MPa である．

なる挙動を示した．すなわち，香気成分では圧力ととも供給部では，ホップエキス濃度 0 . 5 wt% となるように調に Ksolute が単調に増加する一方，レジン成分では 6 MPa 付製された ethanol 溶液が HPLC ポンプ（日本分光㈱製，PU-

近で Ksolute が極小となった．これらは Fig. 2 に示す溶媒の2085）により装置内に供給される一方，CO 2 は冷却機能がK 値（KCO 2 および Kethanol）から説明できるものと考える．つ

搭載された HPLC ポンプ（日本分光㈱製，PU- 2080 -CO 2）

まり，香気成分はレジン成分よりも低極性で揮発性が高い

により装置内に供給される．平衡到達部では予熱コイル，

ため，Fig. 2 の KCO 2 に見られるような単調な圧力依存性

ミキサー，気液分離セルが空気恒温槽内に設置され，系内を示したが，レジン成分は高極性で難揮発性物質であるこの温度が所定温度に制御される．圧力が作動時間間隔を調とから，極性成分であるエタノールの分配（Kethanol），すな

整した連動式背圧弁によりコントロールされるとともに，気液界面の位置が一定に保持される．気相および液相のサンプルは，それぞれアセトン - ドライアイスからなる冷却トラップを用いて採取される．
CO 2 流量は気相側では乾式ガス流量計，液相側では湿式ガス流量計により定量し，ethanol 溶液は秤量により定量した．なお，ethanol 溶液中の着目溶質はホップエキ
ス含有成分のうち，含有組成の大きい 7 成分（myrcene,caryophyllene, humulene, cohumulone, humulone,colupulone，lupulone）とした．各名称の略称を Table 1 に示す．略称の頭文字 F，R はそれぞれ Flavor（香気）成分，
Resin（レジン）成分とした．このうち，myrceneについては以前測定した CO 2 -ethanol-myrcene 系気液平衡の文献値 3）
より Ksolute（= ysolute/xsolute）を算出した．myrcene 以外の 6 成分については GC-FID および HPLC-UV による本研究での測定結果から溶質気液平衡比 Ksolute を算出した．
Table 1 Name and abbreviation for the targeted compounds

Fig. 1 Experimental results of Ksolute in CO2（1）-ethanol（2）systems（（a）Pressure dependence at 353 K and（b）
Temperature dependence at 10 MPa）

− 106 −

ヒトの視覚と嗅覚を制御する新しい抽出分離素材の開発

eSP 値は Maxwell の関係を利用して Eq. ⑴で定義され，本研究では Eqs. ⑵ - ⑻に示す Peng-Robinson（PR-EoS）状態
方程式中の圧力を体積一定のもと温度で偏微分することで算出した．なお，PR-EoS における CO 2 およびエタノー
ルの臨界定数，偏心因子，2 成分間相互作用パラメータ kij
および lij は以前に報告した文献値 6）の値をそのまま用いた．
また，溶質は希薄なので CO 2 - ethanol 2 成分系気液平衡関係には影響を与えないものとして計算を行った .
構築した気液平衡比の相関式を Eq. ⑼に示す．式中の変数としては気液両相における溶質 free の溶媒についてのFig. 2 Pressure dependence of KCO2 and Kethanol measured at
353 K. Circle and triangle symbols show CO2 and ethanol,
respectively.

eSP 値比の他，無次元温度（T/T 0）を用いた．なお，式中の基準温度 T 0 は 298 . 15 K とした．また，式中の Ai および Bi はフィッティングパラメータであり各成分に対して実験値との相関により決定した．

わち高圧ほど気相中のエタノール組成が増大する影響を受けたものと考えた．

決定したパラメータを Table 2，Ksolute の相関結果を Fig.
3 および Fig. 4 にそれぞれ示す．図より，Ksolute は Eq. ⑼に

次に，Fig. 1 b より，Ksolute の温度依存性は，香気成分おより良好に表現できており，任意の条件において 2 成分系

よびレジン成分ともに 353 K で極小を示した．これは温度共溶媒の eSP 値から Ksolute の算出が可能となった．これに上昇に伴う気相密度の低下と，溶質成分の昇華圧の増加がより，先の 7 個のホップエキス含有成分における全実験デ拮抗した結果と考える．この結果から，後述する本系におータを相対平均偏差 45 . 2 % で相関することができた．たけるホップエキス含有成分の Ksolute の相関式化に際しては，気相密度などの諸物性の他，ethanol の気液分配による影響などを考慮する必要があるものと考える．

4．考

………⑴
………⑵

察

実測した Ksolute を任意の条件で予測するためには，Ksoluteと操作条件との定量的な相関式が必要となる．特に，将来的な向流接触抽出モデルへの応用に向けては，より高い精度での気液平衡比の相関が必要である．この相関式の構築にあたり，Fig. 1 および 2 より，香気成分では KCO 2，レジン成分では Kethanol の影響が顕著であったので，これらの影響を相関式に反映させることが必要と考えた．そのためには，溶媒特性のうち極性の影響の定量化が必要と考え，
Hildebrand 溶解度パラメータに対して，高温高圧混合系に拡張した eSP（δS）値 7）に着目して Ksolute の整理を行った．

………⑶
………⑷
………⑸
………⑹
………⑺
………⑻
………⑼

………⑽

………⑾

………⑿

− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

はそれぞれ気相，液相および溶質の eSP 値を示す．なお，

Table 2 The obtained constants in Eq. ⑼

Eq. ⑽ および Eq. ⑾ 中の分母は液相組成，分子は気相組
成をそれぞれ示し，各組成は溶質の eSP 値を基準にガウス分布により表現されている．このうち，Eq. ⑽では，溶質の eSP 値が気相と液相に挟まれる場合（δS,V<δS,Solute<δS,L），
Eq. ⑾ では，溶質の eSP 値が気相と液相の各値よりもそれぞれ大きい場合（δS,V<δS,L<δS,Solute）を示している．なお，式中に存在する 4 つのパラメータ（σy, σx, A, B）は気液平衡比の実験データに合わせてそれぞれ決定する必要があるが，今回最小自乗法によりそれぞれ（582 . 8 , 522 . 6 , 13 . 9 ,- 11 . 4）と再決定することができ，このとき実験値と計算
値における相対平均偏差は 149 . 9 % となった．これは，既報（Ota et al., 2017）の推奨値（308 . 1 , 167 . 7 , 16 . 6 , - 7 . 10）を本実験データに適用したときの相対平均偏差 356 . 8 % を大幅に下回る数値であった．得られた実験値と計算値の比
較結果を Fig. 3 に示す．
これらの結果をまとめると，推算式において再決定したパラメータを用いた偏差（149 . 9 %）は，先の相関式での値（45 . 2 %）に比べて大きかったが，前者の推算式では一度パラメータを決めてしまえばこれらを定数として取り扱うことができる点がメリットとなる．すなわち，未知物質を想Fig. 3 Ksolute correlated by Eq. ⑼ or Eqs. ⑽ - ⑿定した場合に，その物質の eSP 値さえわかれば，気相と液相の eSP 値を実験条件として入力することができ，結果として Eqs. ⑽ - ⑿の推算式より気液平衡比を計算できること
になる．

5. 総

括

本研究にて構築した相関式では本研究で対象とした成分においては高精度な予測が可能となることがわかった．その一方で，モデルパラメータとして定数を見直した推算式
では，溶質の eSP 値さえわかれば，気相および液相の eSP
値と照合させて気液平衡比を定量的に把握できるようになることがわかった．

（引用文献）
1） M. Ota et al., Fluid Phase Equilibria, 434, 44-48, 2017.
Fig. 4 Experimental Ksolute correlated by Eq. ⑼2） Y. Hoshino et al., The Journal of Supercritical Fluids,
136, 37-43, 2018

だし，この相関式は高精度の計算が可能となるが，各溶質につきフィッティングパラメータを 2 つ含む表現となって

3） Y. Obonai et al., Kagaku Kogaku Ronbunshu, 45（6）,238-243, 20194） Y. Hoshino et al., Kagaku Kogaku Ronbunshu, 47
（2）,

いる．
その一方で，以前に構築した CO 2 -ethanol 共溶媒系に1）おけるホップエキス含有 7 成分の気液平衡比の推算式 は，各溶質に依存するフィッティグパラメータがないことが特徴である．そこで本研究で測定した計 105 の実験データに17-22, 2021
5） Y. Ueno et al., Kagaku Kogaku Ronbunshu, 4 7（2）,23-27, 2021
6） Y. Maeta et al., Fluid Phase Equilibria, 405, 96-100,
2015

Eqs. ⑽ - ⑿に示す推算式を適用してみた．
こ こ で，Eq. ⑽ お よ び Eq. ⑾ 中 の δS,V, δS,L お よ び δS,Solute7） M. Ota et al., Fluid Phase Equilibria, 425, 65-71, 2016

− 108 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発
長岡技術科学大学技術科学イノベーション専攻

大沼清

Safety is one of the most fundamental criteria that cosmetics must fulfill. People, who may become pregnant, areconcerned about the safety of themselves and the fetus. Recently, human pluripotent stem cells have gained attention fordeveloping in vitro tests of teratogenicity and malformation because using animals for testing cosmetics is prohibited now.
However, the effect of toxicity on the whole body (teratogenicity) is not easy to assess because it is difficult to form amacroscopic spatial pattern from human pluripotent stem cells (hPSCs). The cause of the difficulty is that the movement ofmorphogens, which are responsible for the cell-cell interaction and cell differentiation, cannot be controlled by a standard
culture dish. We previously applied unidirectional-microfluidics to control the advection-diffusion of the morphogen andsucceeded in making a macroscopic pattern where the upstream cells differentiated but downstream cells did not. However,
the mechanism is not well understood.
We made an "in vitro organizer formation hypothesis" and tested it. In vivo, the organizer secretes inhibitors of
mesoderm induction signal, which form a concentration gradient of signal, resulting in a macroscopic differentiation pattern.
To test the hypothesis, we measured the signaling inhibitors in the supernatant of the cultured hPSCs. We found that thecells secrete a BMP inhibitor, Noggin, secreted from the organizer. However, the concentration of secreted Noggin is too
low to inhibit BMP action. Thus, we assumed that diffusion on the cell surface is slow because proteoglycans such as
heparan sulfate bind Noggin and BMP. Based on this assumption, experimental results could be explained by the reaction
advection-diffusion model, supporting our hypothesis. Moreover, using a potent teratogen, thalidomide, we found that many
genes, including cardiomyocyte marker ACTC1, were up- and down-regulated, suggesting these genes could be used as
teratogenicity markers.
Our findings may use to develop in vitro tools that help the safety test of cosmetics.

１．緒

近年、マイクロ加工技術によりヒト PS 細胞を制御し、言

全身のパターン形成を模倣する研究が試みられている 2）。

安全性は、化粧品の満たすべき基本条件である。特に、我々もこれまで、ヒト iPS 細胞を無血清培養やマイクロ流妊娠の可能性のある女性にとっては、自身はもちろんのこ路で制御する手法を研究してきた 3 - 5）。そして、一方向性のと、胎児への影響も気になる。したがって、妊娠の可能性

マイクロ流路を用いて、分化途中のヒト iPS 細胞からの分のある女性にも安心して使用してもらうためには、成人に泌タンパクの移動拡散を一方向化し、ヒト iPS 細胞から巨対してだけでなく胎児や胚に対しても、材料となる成分の視的な空間パターンをもって分化させることに成功した 5）。

毒性（催奇形性）
テストが必要となる。ところが近年、動物そして以上の実験から我々は、以下の「in vitro オーガナイ

愛護の点から化粧品の動物実験は禁止されている。そこで、

ザー形成仮説」を考えている（図１）。この仮説ではまず、胎児の体になる部分（胚盤葉上層）に近い性質をもつヒト

上流から BMP を流すと、上流のヒト iPS 細胞が中胚葉にの胚性幹細胞や人工多能性幹（induced pluripotent stem:

分 化 す る。 次 に、 中 胚 葉 の 細 胞 が BMP 阻 害 剤 で あ るiPS）細胞などの多能性幹（pluripotent stem: PS）細胞を用いて胚を模倣し、催奇形性のテストをする方法が注目されている 1）。ところが、ヒト PS 細胞は、空間的な巨視的パターンができにくいという欠点がある。つまり、全身のパターン形成への影響がわからない。その原因は、通常の培養皿を用いては、細胞間の相互作用を担う分泌タンパクなどの移動拡散の制御ができない点にある。
Development of in vitro teratogenicity
test method by imitating macroscopic
pattern of the human embryo
Kiyoshi Ohnuma
Department of Science of Technology
I nnovation , Nagaoka University ofTechnology

図 1 「in vitro オーガナイザー形成仮説」
概念図
細胞が中胚葉分化シグナルの阻害タンパク質を分泌することで、生体内では背腹・頭尾の軸が決定するように、マイクロ流路内でも巨視的パターンが出現する。
この現象を利用することで、マイクロ流路内で胚を模倣する“Embryo-on-a-chip”を構築することが可能となる。

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Noggin、Chordin などの BMP 阻害剤を放出し、オーガナ
イザーとしての役割を担う。最後に、上流より分泌された阻害剤が、下流のヒト iPS 細胞の分化を抑制する。つまり、生体内におけるオーガナイザーによる体軸形成と同様の現象が起きていると考えている。
本研究の目的は、大きく分けて 2 つある。１つ目は、仮説の検証である。細胞からの分泌物の実測と、シミュレー
ションとを行い、「in vitro オーガナイザー形成仮説」を検証する。2 つ目は催奇形性テストの実証である。心筋分化

こ こ で、t は 時 間、DN、DB、 お よ び DBN は そ れ ぞ れ、

実験と、サリドマイド添加を行い、催奇形性の試験に応用

Noggin、BMP 4、および BMP 4 -Noggin 複合体の拡散係可能なことを実証する。

数であり、q は一方向の灌流マイクロチャンバーを使用し２．方たときの流速である。

法

細胞の分化は、細胞表面のBMP4 が曝露された積算値［総2 . 1. 細胞培養

曝露 BMP］（h ng/mL）が閾値を超えた時点で起こると仮定
6）

ヒト iPSC の培養 hPSC 細胞株 201 B 7 は、理研 BRC セ

した。［総曝露 BMP］は、最初（t = 0 s）でゼロとし、BMP 4

ルバンク（HPS 0063、つくば）から、文部科学省のナショ

濃度（ng/m）の時間（h）で積分していき、閾値として定め

ナルバイオリソースプロジェクトを通じて入手した。細胞た 100 h ng/mL BMP 4 を超えたときに、細胞の分化マー

は、Y- 27632（ロック阻害剤、最終濃度 5 µM、036 - 24023、

カータンパク質の発現が変化すると仮定した。培養上清2

フジフィルム和光純薬株式会社）および 2 . 5 µg/cm ラミ

中の Noggin 濃度は、培地の下限（細胞表面の拡散の抑制

ニン断片（iMatrix- 511 - シルク、タカラバイオ株式会社）

構造の上部、y = ymin）から上限（培地表面、y= ymax）の間のを含む維持培地（StemFit AK 02 N、味の素、東京）を用い、Noggin の空間平均した濃度（［N（ymin < y < ymax ）］）として製造元のプロトコルに従って培養した。

計算した。x と y は、それぞれ培養容器の水平方向と垂直方向である 7 , 8）。

2 . 2 . 培養上清のEnzyme-Linked Immunosorbent
Assay（ELISA）

2 . 5 . サリドマイドの添加回収した培養上清（120 µL）は凍結保存した。解凍した培

未 分 化 の hiPSC を 単 一 細 胞 に 分 離 し て 播 種 し た。 未

養上清を、1000 × g で 2 分間遠心分離し、Noggin 測定用の

分化 hiPSC の場合、播種の 1 日後からサリドマイドを添

ELISA キ ッ ト（SEC 130 Hu、Cloud Clone Corp.、 ヒ ュ ー

加し、4 日目に回収した。中胚葉条件では、播種 1 日後

ストン、米国）を製造元のプロトコルに従い測定した。吸に 培 地 を 50 ng/mL ア ク チ ビ ン、3 µM CHIR 99021（R ＆

光度の測定には、マイクロプレートリーダー（モデル 680、

D Systems）、および Y- 27632 を含む hESF 6 培地に交換

Bio-Rad、カリフォルニア）を用いて 450 nm で測定した 7）。

し た（ 図 2 A）。1 日 目 に CHIR 99021 を 除 去 し、3 日 目 に
Y- 27632 を除去し、0 日目に 0 . 1 ％ジメチルスルホキシド

2 . 3 . 免疫染色

（DMSO）で調製したサリドマイドで細胞を処理した。5 日

細胞を 4 ％パラホルムアルデヒド（163 ‒ 20145、和光）で目に細胞を回収した 9）。

固定し、透過処理し、0 . 2 ％ TritonX とおよび 1 ％ウシ血
清アルブミン（BSA）（019 ‒ 27051、和光、大阪、日本）入2 . 6 . RT-qPCR アレイ分析

りのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でブロックした。続いて、採取した細胞から RNA を抽出し、cDNA を合成した細胞をブロッキングバッファーで一次および二次抗体を薄後、RT 2 SYBRGreen ROX qPCR Mastermix（3 3 0 4 0 4、

めてから反応させた（補足表 TS 2）。細胞は、蛍光顕微鏡

Qiagen）の混合物を RT 2 Profiler PCR アレイヒト人工多能（BZ- 8100、キーエンス、大阪）を用いて撮影した。

性幹細胞（PAHS- 092 ZE- 4、Qiagen）に添加し、7900 HT
FastReal-TimePCR（Applied Biosystems、CA、USA）で

2 . 4 . シミュレーション解析した。45 個の hiPSC 遺伝子、16 個の ESC 遺伝子、4

BMP 4 と Noggin は 1 対 1 で反応（BMP+Noggin ⇔ BMP-個の内胚葉遺伝子、6 個の中胚葉遺伝子、9 個の外胚葉（神Noggin）す る こ と で、BMP 4 の 不 活 性 型 で あ る BMP 4 -経幹細胞を含む）遺伝子などを含む 84 個の遺伝子を標的とNoggin 複合体（BMP 4 -Noggin）を生成しつつ、移流拡散

した 9）。

する。BMP、
Noggin、BMP 4 -Noggin の濃度をそれぞれ［B］、［N］、［BN］
で表すと、以下の式となる。

− 110 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

3．結ような結果が得られているが、それでも 14 倍の差がある。

果

BMP 4 と Noggin は 1 対 1 で反応して BMP 4 が不活性化状

3 . 1. 細胞からの分泌物の実測態になる（BMP 4 -Noggin）場合、この Noggin の放出量はBMP 4 の添加により分化誘導した細胞の培養上清に分非常に低く、BMP 4 による分化を抑えることは難しいと泌される Noggin を ELISA を用いて定量した。Noggin を予想される。実際、シミュレーションしてみても、やはり含まない無血清・フィーダーフリー条件下で、BMP 4 添加・分化を抑えるためには、Noggin の放出量が数十倍足りな

42

無添加の状態で、低細胞密度播種条件（1 × 10 cells/cm ）いことが明らかとなった 7）。したがって、われわれが以前と高細胞密度播種条件（5 × 104 cells/cm 2）で hPSC を培養し、に報告したような高細胞密度での分化の抑制や一方向性の1 日ごとに培養上清を回収して測定し、3 日目に免疫染色

マイクロ流路による下流の分化の抑制などの実験結果は 5）、して細胞状態を確認した。BMP 4 は低細胞密度播種条件

単純な BMP と Noggin の単純な反応・拡散を仮定しては説で細胞分化を誘導したが（SSEA- 1 陽性）、高細胞密度播種

明がつかない。

条件で未分化（SOX 2 陽性）のままであった（図 2 AB）。この結果は、細胞が分化阻害剤を分泌しており、高細胞密度ではその分化阻害剤が細胞分化を抑えるのに十分な濃度に5）達したことを示唆している 。

3 . 2 . 静置培養における拡散障壁の影響
分化抑制現象を説明するのに必要な Noggin の分泌量が足りない問題に対処するため、細胞表面で拡散が遅くな

そこで、高細胞密度播種条件のときに上清中へと分泌さる現象に着目した。細胞の表面は、ヘパラン硫酸を含むれた Noggin を ELISA 測定した結果、Noggin の平均濃度

様々な糖タンパク質が密集しており、BMP や Noggin をは BMP 4 の有無にかかわらず 6 つの条件すべての平均値

含む多くのシグナル伝達分子はこれらに結合する 10）。こは 0 . 69 ng/mL であることがわかった（図 2 C）
。6 つの条件の Noggin と HSPB の結合は生理的塩濃度では非常に強いの平均値の間に有意差はなかった（P= 0 . 54 〜 0 . 99、スチが、少しずつ乖離・結合を繰り返すことで、結果として

ューデント t 検定）。したがって、BMP 4 の有無に関係なく、

Noggin がゆっくりと拡散する 11）。ヘパリンを修飾したビ細胞は常に約 0 . 69 ng/mL の Noggin を分泌していたことーズ表面で Noggin の拡散係数は、水中と比較して 1 / 400を示唆している。

（0 . 2 µm/s 2）に低下することが報告されている 11）。更に、

この Noggin の濃度は、予想を大きく下回るものであっ

ヒト PS 細胞の円形コロニーを用いてやはり Noggin によるた。 添 加 し た BMP 4 は 50 ng/mL に 対 し て、0 . 69 ng/mL

分化抑制効果を調べているグループも、現象を説明するたの Noggin しか検出されていないため、濃度差が 70 倍もあめには拡散速度を水中の 1 / 10 に減らすと良いとの報告をる。以前の実験では、BMP 4 の濃度が 10 ng/mL でも同じしている 12）。そこで我々は、「HSPG などの細胞表面の高図 2 上清中の Noggin の ELISA（A）実験の概略図。BMP4 添加（黒）、無添加（白）の条件で、1、2、3 日目に ELISA 用に上清を回収した。
（B）BMP4 添加（左）、無添加（右）で 3日培養した細胞の免疫染色。
：未分化マーカの SOX2（緑）。中胚葉マーカの Brachyury（赤）。各マーカの DAPI（青）。
（C）ELISA の結果。縦軸は上清中の Noggin 濃度。異なる継代の異なる細胞培養から上清を収集した。
（平均± S.E.、n=4）。水平の点線は、全データの平均（0.69ng/
mL）を示している。

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

分子が拡散の抑制構造として働くことで、細胞から分泌さた実験でも検証してみた。私たちは、ヒト PS 細胞をタンれた Noggin は細胞表面付近長く・高濃度でとどまるため、パク質が一方向に輸送される一方向灌流培養チャンバー内

BMP 4 による細胞分化を抑制するとともに培養上清中のでBMP4 とともに培養した結果、上流の数ミリメートル以内

Noggin 濃度が低くなる（図 3 A）」との作業仮説を新たに立の細胞が分化し、下流の分化が阻害することを示した 5）。こてた。

の結果を、拡散の抑制構造を含む反応・移流拡散の仮説でこの仮説を検証するために、2 つの仮定を新たに加え説明できるかを計算した（図 4 AB）。静培養の計算で使用てシミュレーションをした。一つ目の仮定は、Noggin、した 2 つの仮定に加えて、HSPG 内での Noggin の流速もBMP 4、および Noggin-BMP 4 複合体の拡散係数が細胞水の 1 / 400 に減少するという仮定を新たに追加した。こ

表 面 で 1 / 400 に な る と し た。2 つ 目 の 仮 定 は、 前 培 養の仮定については文献がなかったため、拡散と同様減少す（Day- 1）では BMP 4 を含まない培地で細胞を培養したたるとした（ペクレ数が一定）。細胞からの Noggin 分泌速度

め、分化開始時（Day 0）においては、拡散の抑制構造内は、静置培養の結果から 2 × 10 - 4 から 2 × 10 - 3 amol/cell/sには Noggin のみが存在して BMP 4 は存在してないとしとした。

た。この新しい 2 つの仮定を追加して計算をした。横軸

その結果、拡散の抑制構造がない場合は、2 × 10 - 4 amol/

は細胞表面が BMP 4 が曝露された積算値（［総曝露 BMP］

cell/s の Noggin 分泌速度のときはすべての領域が分化した= 100 h ng/mL 以上で細胞が分化する）、縦軸はバリアよりが、5 × 10 - 4、1 × 10 - 3、2 × 10 - 3 amol/cell/s の Noggin 分 泌

上の培地内における Noggin の濃度の平均値（［N（barrier

速度のときは上流の細胞の約 5、2、1 mm が分化した（図thickness<y<ymax）］= 0 . 69 が ELISA 結果）として、計算

4 CD）ため、広範囲の Noggin 分泌速度で実験結果が定性

結果をプロットした（図 3 B）
。未分化・分化の閾値の垂直的に再現できることを示唆している。それに対して、拡散の線（総露出 BMP 4 = 100 h ng/mL）との交点は、バリアがな

抑制構造が 20 µm、40 µm、160 µmと厚くなるにしたがって、いときは約 70 ng/mL だったが、バリアが高くなるに従いNoggin 分泌速度が少し変化するだけで、分化する部分の長低下して、160 µm バリアにおいては ELISA 結果（0 . 69 ng/

さが大きく変化するとともに上流の狭い範囲内に限定されたmL）とほぼ同じ値となった（図 3 B）
。したがって仮説通り、 （図 4 CD）。ヒト胚の大きさが数百µmであり、その中に様々細胞表面の HSPG などにより拡散が制限されれば、分泌さな細胞が分化・配置されることを考えると、この急激な変化

れた Noggin により BMP 4 による分化を抑制できる可能性

はむしろ生体内に近い変化を示していることとなる。

が示唆された。

3 . 3 . 灌流培養における、細胞表面の拡散抑制の効果
前節で仮説を、一方向灌流マイクロチャンバーを使用し3 . 4 . サリドマイドを用いた、心筋分化への影響
サリドマイドは優れた鎮静剤として販売されたが、催奇形性が高いため、1960 年代に使用が中止された 13）。最近、ヒ

図 3 拡散バリアを備えた静的培養のシミュレーション（A）ヘパラン硫酸などのバリア構造の概念図。細胞表面はヘパラン硫酸により覆われており、Noggin、BMP4、および NogginBMP4 の拡散定数は、へパラン硫酸の中では 1/400 に設定した。
（B）縦軸はヘパラン硫酸などのバリア構造の上にある培地内の平均
Noggin 濃度で、水平の点線は ELISA での測定値（0.69ng/mL）を表す。横軸は細胞が 10ng/ mL の BMP4 に 72 時間曝露された積
算値で、垂直の点線は、細胞分化の閾値を示しており、その右側では細胞が分化する。ヘパラン硫酸などの厚さは、0、40、80、160、320µm とした。

− 112 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

図４ 拡散の抑制を使用した一方向灌流培養のシミュレーション（A）HSPG を使用したバリア構造のスキーム。
（B）灌流培養のシミュレーションの概略図。 下部に配置された細胞（y = 0）は培地で覆われている（y> 0）。 媒体は x=0 で流入し、x 方向に流入する。各正方形は 20µm × 20µm。影付きの領域は、拡散と流れが 1/400であった拡散の抑制領域を示している。
（C）上流からの分化した細胞の面積が示されている。縦軸は拡散の抑制の厚さ 0（未適用）、
20、40、160µm。 横軸は分化した細胞の面積。
（D）t=72 時間での総曝露 BMP4。 縦軸は総露出 BMP4。横軸は上流からの距離。

トのサリドマイドの催奇形性をテストするために、多くのグループがヒト PS 細胞を使用している

14）。我々も以前、

FABP 7 発現を強力に阻害することを示唆している。更に、中胚葉分化条件で大きく（4 倍以上）変化した遺伝子として、サリドマイドが未分化のヒト PS 細胞と中胚葉（心筋への分上方制御されたのは EMX 2（empty spiracles homolog 2化の前段階）のアポトーシスを増加させることを示しましをエンコードする。脳の神経分化と細胞増殖、および四肢た 15 , 16）。今回は、RT-qPCR アレイを使用して、ヒト PS 細の形成に関連する）のみだったが、下方制御された遺伝子

胞の多能性幹細胞マーカーと初期分化マーカーを含む 84

は ACTC 1（心筋のアルファアクチン）、FOXD 3（forkhead個の遺伝子の発現を調べ、どの遺伝子発現を目安に催奇形box protein D 3 , ヒト PS 細胞マーカーの一つである転写性を調べると良いかを検討した。

因子）、FGF 4（線維芽細胞成長因子 4、肢芽の発達を含む

その結果、未分化維持条件で大きく（4 倍以上）変化した

発達に関連、ヒト PS 細胞マーカーの一つ）、CDH 1（未分遺伝子として、上方制御されたのは LEFTY 2（初期発生化ヒト PS 細胞の細胞間接着を担う E- カドヘリン発現の関に重要な TGF-β の抑制タンパク質）と SOX 17（初期の内連）、FOXA 2（初期の内胚葉分化マーカ）であった。以上

胚葉分化マーカー）の２つであり（図 5 A）
、下方制御されより、心筋関連の遺伝子で ACTC 1 が大きく下方制御されたのは FABP 7（脂肪酸結合タンパク質ファミリーのメンることが明らかとなった。

バーで、主に脳で発現し、レチノイン酸シグナルに関係し、4．考神経発達に関与する）だった 17 , 18）（図 5 B）。驚いたことに、

察

FABP 7 はサリドマイドによって強く（平均で約 300 倍）

今回の研究開発では、2 つの目標を定めていた。１つ目

下方制御されており、サリドマイドが未分化 hiPSC でのの目標は、細胞からの分泌物の実測と、シミュレーショ

− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 5 サイドマイドによる未分化・分化マーカーの変化
未分化なヒト iPS 細胞（AB）と中胚葉分化した細胞（CD）において、上方制御された遺伝子（BC）および下方制御された遺伝子（BD）。

ンとを行い、「in vitro オーガナイザー形成仮説」を検証すを支持しているといえる。

ることであった。ELISA により分泌物を測定したところ、2 つ目の目標は、催奇形性テストであった。強い催奇形

BMP 4 抑制シグナルとし最も有力な Noggin が検出され性をもつサリドマイドを心筋分化初期（中胚葉分化）に添加た。しかしその濃度は BMP 4 の添加に関係なく 0 . 69 ng/

することで、催奇形性の試験に使えるような大きく発現がmL であり、予想より数十倍低い濃度だった。そこで、細変化する遺伝子を探索した。その結果、心筋分化に関する

胞表面に拡散が遅い層（HSPG などによる結合）があるとの遺伝子として、ACTC 1 が大きく下方制御されることが明仮説の下でシミュレーションした結果、実験結果を説明でらかとなった。今回の報告書には掲載しなかったが、ヒトきることが明らかとなった。BMP 4 阻害分子に関しては、

iPS 細胞から心筋分化をしたところ BMP 4 分化と似た現象

Noggin 以外にも分泌している可能性があるため、それらが観察されている 19 , 20）。心筋の分化には、Wnt シグナルの測定が必要となる。また、HSPG などの細胞表面の拡散の活性化とそれに続く抑制が必要であるが、私たちは細胞が遅い層に関しては、実際にどれだけの厚みがあるかの測が Wnt シグナルの阻害タンパク（DKK 1 , DKK 4 , CER 1）を定とともに、その中でのシグナル分子の拡散係数や移動速分泌していることと、それが心筋分化を促進していること度が必要となる。これらの限界はあるために定量的な結果を明らかにした。今後は、上述のマイクロ流路において心とはいえないが、定性的には胚発生過程において中胚葉分筋分化をし、その過程で ACTC 1 などの発現を指標にすれ化に続いて中胚葉分化シグナルの阻害剤が分泌されるオー

ば、分化初期における催奇形性を調べる良い系となること

ガナイザーが形成されることと同様のことが培養皿内で起が予想される。

こっていること、つまり「in vitro オーガナイザー形成仮説」− 114 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

５ 総括

本研究では、マイクロ流路とヒト iPS 細胞を利用して胚を模倣して催奇形性のテストをする方法の研究・開発をした。そして、マイクロ流路ないのヒト iPS 細胞のふるまいが「in vitro オーガナイザー形成仮説」で説明できること、
つまり、胚発生における体軸形成と同様の現象が起きていることを明らかにした。また、強い催奇形性をもつサリド
マイドを添加したときに、様々な遺伝子が変化することを明らかにした。胚の状態を模倣し、催奇形性をテストで

図 6 本研究の最終目標
ヒト iPS 細胞由来の各種細胞とマイクロ流路を組み合わせ、催奇形性試験を行うシステムを開発することで、すべての人に安心・安全なコスメトロジーの発展に貢献する。

きるシステム “Embryo-on-a-chip” の実現に一歩近づけた。
本研究を継続し「すべての人に安全・安心なコスメトロジ

mediated by BMP4 and its inhibitor noggin secretedー」の実現の一助としたい（図 6）。

from cells. Biochemical Engineering Journal 1 7 6,108159,（2021）．

（引用文献）

9） Shimizu, M. et al. Thalidomide affects limb formation

1） Genschow, E . et al. The ECVAM internationaland multiple myeloma related genes in humanvalidation study on in vitro embryotoxicity tests: results

induced pluripotent stem cells and their mesodermof the definitive phase and evaluation of prediction

differentiation. Biochemistry and biophysics reports 2 6,models. ATLA-NOTTINGHAM- 30, 151-176（2002）．

100978,（2021）．

2） Shahbazi, M. N., Siggia, E. D. & Zernicka-Goetz, M.

10）Häcker, U., Nybakken, K. & Perrimon, N. HeparanSelf-organization of stem cells into embryos: A windowsulphate proteoglycans: the sweet side of development.

on early mammalian development. Science 3 6 4, 9 4 8-

Nature reviews Molecular cell biology 6, 530-541（2005）．
11）Nesterenko, A. M. et al. Affinity of the heparin951（2019）．
3） Yoshimitsu, R. et al. Microfluidic perfusion culture

binding motif of Noggin 1 to heparan sulfate and itsof human induced pluripotent stem cells undervisualization in the embryonic tissues. Biochemical

fully defined culture conditions. Biotechnology andand biophysical research communications 468 , 331 - 336

Bioengineering 111, 937-947,（2014）．

（2015）．

4） Kondo, Y. et al. Compartmentalized microfluidic12）Etoc, F. et al. A Balance between Secreted

perfusion system to culture human induced pluripotent

Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-

stem cell aggregates. J Biosci Bioeng 1 2 4, 2 3 4-2 4 1,

Organization. Developmental Cell 39 , 302 - 315（2016）．
13）Melchert, M. & List, A. The thalidomide saga. Int J（2017）．
5） Tashiro, S. et al. High cell density suppresses BMP4-

Biochem Cell Biol 39 , 1489 - 1499（2007）,．

induced differentiation of human pluripotent stem14）Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S. & Yu, H. A method forcells to produce macroscopic spatial patterning in ahuman teratogen detection by geometrically confined

unidirectional perfusion culture chamber. Journal ofcell differentiation and migration. Sci Rep 5 , 1 0 0 3 8 ,Bioscience and Bioengineering 126, 379-388（2018）．

（2015）．

6） Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem15）Tachikawa, S., Nishimura, T., Nakauchi, H. &cells from adult human fibroblasts by defined factors.

Ohnuma, K. Thalidomide induces apoptosis in

Cell 131, 861-872,（2007）．

undifferentiated human induced pluripotent stem cells.

7） Nakatani, E., Okajima, R. & Ohnuma, K. Slow

In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 53,
841 - 851（2017）,．

diffusion on the monolayer culture enhances auto/
paracrine effects of Noggin in differentiation of human16）T a c h i k a w a , S . , S h i m i z u , M . , M a r u y a m a , K .

iPS cells induced by BMP. Biochemistry and biophysics& Ohnuma, K. Thalidomide induces apoptosis

reports 29, 101195,（2022）．

during early mesodermal differentiation of human8） Nakatani, E., Yamazaki, W., Sugiura, S., Kanamori,

induced pluripotent stem cells. In Vitro Cellular &T. & Ohnuma, K. Modeling of differentiation pattern

Developmental Biology-Animal 54 , 231 – 240（2018）．

formation in human induced pluripotent stem cells17）Storch, J. & Thumser, A. E. Tissue-specific functions− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

in the fatty acid-binding protein family. Journal ofdensity of human-induced pluripotent stem cells. In

Biological Chemistry 285 , 32679 - 32683（2010）．

Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 5 4 ,
513 - 522（2018）．

18）Sharifi, K. et al. FABP 7 expression in normal andstab-injured brain cortex and its role in astrocyte20）Le, M. N. T., Takahi, M. & Ohnuma, K. Auto/proliferation. Histochemistry and cell biology 136 , 501

paracrine factors and early Wnt inhibition promote（2011）．

cardiomyocyte differentiation from human induced19）Le, M. N. T., Takahi, M., Maruyama, K., Kurisaki, A.

pluripotent stem cells at initial low cell density.

& Ohnuma, K. Cardiac differentiation at an initial low

Scientific Reports 11 , 21426（2021）,．

− 116 −

皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発
順天堂大学大学院医学研究科アトピー疾患研究センター

北浦次郎

Recently, it was reported that many cationic drugs (e.g., antibiotics) directly activate connective tissue mast cells, whichleads to drug-induced pseudo-allergy via Mas-related G-protein coupled receptor X2 (MRGPRX2) in humans and Mrgprb2
in mice. On the other hand, a variety of cationic peptides/proteins (e.g., host defense peptides and neuropeptides) havebeen identified as endogenous ligands of MRGPRX2/Mrgprb2. Of these, many show a significantly lower EC50 against
MRGPRX2 than against Mrgprb2. Accordingly, we hypothesize that unknown cationic molecules contained in cosmetics
or foreign matters which can come into contact with skin could activate connective tissue mast cells via MRGPRX2,
resulting in skin pseudo-allergy. The objective of the current study is to develop a screening method for the identification ofmolecules that can induce pseudo-allergy in skin. For this end, we used newly-bred MRGPRX2 knock-in (MRGPRX2-KI)
and Mrgprb2 knock-out (Mrgprb2-KO) mice as well as wild-type (WT) mice. We found that peritoneal mast cells from WTand MRGPEX2-KI mice, but not from Mrgprb2-KO mice, degranulated in response to stimulation with compound 48/80,
a known MRGPRX2/Mrgprb2 ligand, although MRGPEX2-KI mast cells more strongly activated than WT mast cells. In
addition, WT and MRGPEX2-KI mice, but not Mrgprb2-KO mice, exhibited skin pseudo-allergic reactions in response to
intradermal injection of compound 48/80. Moreover, skin pseudo-allergic reactions were stronger in MRGPRX2-KI micethan in WT mice. Thus, we were able to develop both in vitro and in vivo methods to identify MRGPRX2 ligands, which
will help uncover the molecular mechanisms underlying skin pseudo-allergy and test the safety of cosmetics and therapeutic
drugs.

１．緒性を向上させることである。

言

Mrgprb2 ノックア ウト（Mrgprb2-KO）マ ウスの 解 析 は非常に多くのカチオン性薬剤（抗菌薬など）が皮膚の結

MRGPRX 2 の 機 能 を 想 定 す る の に 役 立 つ が、 ヒ ト

合組織型マスト細胞を直接活性化（脱顆粒）させて皮膚のMRGPRX 2 の生体内機能を解明するには不十分である。

炎症やかゆみを誘導することが知られている。これが偽

ま た、MRGPRX 2 と Mrgprb 2 に 共 通 す る 既 知 リ ガ ン ドアレルギーと呼ばれるのは、その症状が IgE と抗原によるに対する MRGPRX 2 の EC 50 は Mrgprb 2 と比較して低い

マスト細胞の活性化（脱顆粒）に依存する即時型アレルギ

ことから、MRGPRX 2 はヒトの皮膚で多くのリガンドをーの症状と類似するためである。最近、マウスの結合組

鋭敏に認識してより重要な役割を担うと考えられた。そ織型マスト細胞に発現する G タンパク共役型受容体 Mas-

こで、申請者は、世界に先駆けて MRGPRX 2 ノックイン

related G protein-coupled receptor b 2（Mrgprb 2）（ヒト（MRGPRX 2 -KI）マウス（Mrgprb 2 の代わりに MRGPRX 2

では MRGPRX 2）がカチオン性薬剤により活性化して偽を発現するマウス）を作製した。本研究では、野生型
（WT）
、

1）

アレルギーを引き起こすことが判明した 。また、ヒト

Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスから結合組織型マMRGPRX 2（マウス Mrgprb 2）は多くの内因性リガンド（カスト細胞を分離・誘導して、マスト細胞の脱顆粒を指標

チオン性の抗菌ペプチドや神経ペプチドなど）を有することして MRGPRX 2 リガンドを in vitro でスクリーニング

とも明らかになった 2 - 7）。これらの結果は、皮膚に塗布さする系の確立を目指した。さらに、WT、Mrgprb 2 -KO、れる化粧品や皮膚に付着する動植物成分の中にも偽アレル

MRGPRX 2 -KI マウスの耳介における偽アレルギー反応を

ギーを誘導する分子が存在する可能性を示唆した。

指標として MRGPRX 2 リガンドを in vivo でスクリーニン

研究の目的は、ヒト MRGPRX 2 に着目して偽アレルギ

グする系の確立を目指した。多くの医薬品・化粧品の成分

ーを誘導する分子を in vitro 及び in vivo でスクリーニングや皮膚に付着する動植物成分をスクリーニングすることする系を確立して、皮膚に塗布する医薬品・化粧品の安全

により、偽アレルギーを誘導する分子の同定が可能になる。
また、動植物成分の中から MRGPRX 2 リガンドが同定さDevelopment of a screening method forthe identification of molecules that can
induce pseudo-allergy in skin
Jiro Kitaura
Atopy (A l lerg y) Resea rch C enter,
Juntendo University Graduate School of
Medicine

れれば、皮膚における炎症やかゆみの新規病態機序の解明につながる。最終的な目標は、in vitro 及び in vivo のスクリーニング系を利用して MRGPRX 2 リガンドを同定して、皮膚における偽アレルギーの予防法を開発することである。

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

２．方

漏出量を定量化した（通常の受動的皮膚アナフィラキシー

法

反応の評価法と同様）8）。色素漏出量は、マスト細胞の脱2 . 1. マウスから腹腔マスト細胞や骨髄由来マスト細胞の誘導顆粒により上昇する血管透過性と比例するので、偽アレル
ギーの程度を評価できる。

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウス の 腹 腔 を

3．結PBS で 洗 浄 し て 採 取 し た 腹 腔 細 胞 を IL- 3（10 ng/mL）と SCF（100 ng/mL）の 存 在 下 で 10 日 間 培 養 し た。flow
cytometry に よ り、 細 胞 の 90 ％ 以 上 が FcεRIα 陽 性・果

3 . 1. MRGPRX 2 リガンドをin vitroでスクリーニ
ングする系の確立

c-Kit 陽性の腹腔マスト細胞であることを確認した。WT、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスから誘導しMrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスの脛骨から採取した腹腔マスト細胞表面における FcεRIα や c-Kit の発現レベ

た骨髄細胞を IL- 3（10 ng/mL）の存在下で 5 週間培養した。

ルに有意な差はなかった（図 1）。抗 MRGPRX 2 抗体によflow cytometry により、細胞の 95 % 以上が FcεRIα 陽性・る細胞表面染色により、MRGPRX 2 -KI マウス由来腹腔マ

c-Kit 陽性の骨髄由来マスト細胞（bone marrow-derived

スト細胞表面に MRGPRX 2 の発現が確認された。IgE と

8）mast cell: BMMC）
であることを確認した 。

抗原で刺激したときの腹腔マスト細胞の脱顆粒率に有意な差は認められなかった。他方、compound 48 / 80（既知の2 . 2 . マスト細胞の脱顆粒率のin vitro測定法

MRGPRX 2 /Mrgprb 2 リガンド）で腹腔マスト細胞を刺激

既知の Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リガンドを含む種々の分すると、WT 及び MRGPRX 2 -KI 腹腔マスト細胞は濃度依子（ 薬 剤 な ど ）で、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI

存的に脱顆粒した。しかし、Mrgprb 2 -KO 腹腔マスト細マウス由来の腹腔マスト細胞あるいは BMMC を刺激した。

胞の脱顆粒は認められなかった。また、WT 腹腔マスト細また、上記のマスト細胞を anti-TNP IgE（0 . 5 µg/mL）で胞と比較して、MRGPRX 2 -KI 腹腔マスト細胞は同じ濃度

感作（24 h）した後、TNP-HSA（10 ng/mL）で刺激した。刺の compound 48 / 80 に対してより強く脱顆粒した（図 2）。

激 1 時間後のマスト細胞の脱顆粒率を β-hexosaminidase

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス か ら 誘

assay（細胞内から細胞外に放出された β-hexosaminidase

導 し た BMMC 表 面 に お け る FcεRIα や c-Kit の 発 現 レ ベの割合を解析する）や flow cytometry（マスト細胞表面にルに有意な差はなかった。抗 MRGPRX 2 抗体による細CD63 を発現する細胞の割合を解析する）
により測定した 8）。

胞 表 面 染 色 に よ り、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス 由 来 BMMCに MRGPRX 2 の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た。 つ ま り、

2 . 3 . 皮膚における偽アレルギーのin vivo評価法

MRGPRX 2 は結合組織型マスト細胞表面に発現するが、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウスの耳介に既未熟な粘膜型マスト細胞（BMMC）表面に発現しないこと

知の Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リガンドを含む種々の分子（薬が確認された。IgE と抗原で刺激したときの BMMC の脱剤など）を皮下注射し、その直後に、色素（エバンスブルー）

顆粒率に有意な差は認められなかった。また、compoundを静脈注射した。1 時間後に採取した耳介に含まれる色素

48 / 80 でこれらの BMMC を刺激しても脱顆粒しないこと

図１ WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウス由来腹腔マスト細胞における FcεRIα と c-Kit の（細胞表面）発現レベル− 118 −

皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発

図 2 WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウス由来腹腔
マスト 細 胞 の compound 48/80 に 対 する 脱 顆 粒 率（β-hexosaminidase assay）

が確認された。
こ の よ う に、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI
マウスから誘導した腹腔マスト細胞の脱顆粒を指標に、

図 3 WT、Mrgprb2-KO、MRGPRX2-KI マウスの耳介にcompound 48/80 を皮下投与したときの偽アレルギー反応

MRGPRX 2 リガンドを同定するための in vitro スクリーニ
ング法が確立された。Mrgprb 2 リガンドとして作用しな
いが MRGPRX 2 リガンドとして作用する分子、Mrgprb 2

4．考

リガンドとしての作用は弱いが MRGPRX 2 リガンドとしての作用が強い分子を in vitro で同定することが可能になった。

察

マウスやヒトのマスト細胞（株）の解析、Mrgprb 2 や
MRGPRX 2 を一過性に過剰発現させた細胞の解析などから、（compound 48 / 80 を含む）多くの共通リガンドに対す

3 . 2 . MRGPRX 2 リガンドをin vivoでスクリーニ

る MRGPRX 2 の EC 50 は Mrgprb 2 より低いことが報告さ

ングする系の確立れた。今回、WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マウス

WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス の 成 長・由来の腹腔マスト細胞を利用する in vitro スクリーニング

発達に差は認められなかった。また、定常状態におけ法により、同じ条件下で容易に Mrgprb 2 /MRGPRX 2 リる（マスト細胞を含む）血球系細胞の組織分布や数に有意ガンドの同定及びリガンドとしての強さの評価が可能になな差は認められなかった。次に、WT、Mrgprb 2 -KO、った。腹腔マスト細胞における脱顆粒の強さが、MRGPRX 2 -KI マウスの耳介に compound 48 / 80 を皮下① MRGPRX 2 -KI ≒ WT＞Mrgprb 2 -KO

注射した直後に色素を静脈注射し、1 時間後の耳介にお② MRGPRX 2 -KI ＞WT＞Mrgprb 2 -KO

ける色素漏出量を定量化した。その結果、WT マウスの

③ MRGPRX 2 -KI＞ WT≒Mrgprb 2 -KO

耳介で認められた色素漏出は Mrgprb 2 -KO マウスでほの場合などが想定される。いずれも MRGPRX 2 リガンド

とんど認められなかった。また、WT マウスと比較してであるが、③の場合はヒトでのみ重要な作用を有すると考MRGPRX 2 -KI マウスの耳介における色素漏出量は多かえられる。また、腹腔マスト細胞の脱顆粒を誘導しないが、った（図３）。これらの結果は、compound 48 / 80 による

BMMC の脱顆粒を誘導する場合、その分子は Mrgprb 2 /（耳介の）組織型マスト細胞の脱顆粒による偽アレルギー反MRGPRX 2 とは異なる受容体（粘膜型マスト細胞に発現す

応が Mrgprb 2 /MRGPRX 2 依存的であること、生体内でる）のリガンドとしてマスト細胞を脱顆粒させると想定さ

MRGPRX 2 は Mrgprb 2 より鋭敏に compound 48 / 80 を認れる。Mrgprb 2 や MRGPRX 2 の発現とは無関係に腹腔マ識して偽アレルギーを誘導することが示された。このようスト細胞が脱顆粒する場合、その分子は（結合組織型マスに、MRGPRX 2 リガンドとして作用する分子を in vivo でト細胞に発現する）Mrgprb 2 /MRGPRX 2 とは異なる受容同定することが可能になった。

体のリガンドとして作用すると想定される。

− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

さらに、MRGPRX 2 リガンドの in vivo スクリーニング法の確立により、上記の in vitro スクリーニング法で同定されたリガンド分子が生体内で MRGPRX 2 依存的な偽アレルギーを誘導するか否かを評価することが可能になった。
偽アレルギーの強さが MRGPRX 2 -KI ＞ WT≒Mrgprb 2 KO の場合、その分子はヒトでのみ MRGPRX 2 依存的な偽アレルギーを誘導する可能性が高い。他方、MRGPRX 2 KI 腹 腔 マ ス ト 細 胞 を 脱 顆 粒 さ せ な い 分 子 が in vivo で
MRGPRX 2 依存的に偽アレルギーを誘導する場合、この

図 4 MRGPRX2 リガンドの in vitro スクリーニング法

分子は皮膚でマスト細胞以外の細胞に作用して、そこで放出される内因性 MRGPRX 2 リガンドが組織型マスト細胞に作用して脱顆粒を引き起こすと考えられる。実際、ダニに含まれるプロテアーゼが神経細胞に作用し、活性化した神経細胞の放出するサブスタンス P が組織型マスト細胞を脱顆粒させて、皮膚炎症を増悪させることが報告されている 9）。また、MRGPRX 2 リガンドの in vitro 及び in vivo
スクリーニング系において、サブスタンス P は compound48 / 80 と ほ ぼ 同 じ よ う な 傾 向（MRGPRX 2 -KI ＞ WT ＞
Mrgprb 2 -KO）を示すことが確認されている。いずれにせよ、本研究で確立した、MRGPRX 2 リガンドの in vitro 及び in vivo スクリーニング法を活用して、偽アレルギーを誘導する分子の同定及び偽アレルギーの分子機序の解明が期待される（図４、５）。

５．総

図 5 MRGPRX2 リガンドの in vivo スクリーニング法

括WT、Mrgprb 2 -KO、MRGPRX 2 -KI マ ウ ス 由 来 のAli H. Small-Molecule Host-Defense Peptide Mimetic

腹 腔 マスト細 胞の脱 顆 粒を指 標とする MRGPRX 2 リガ

Antibacterial and Antifungal Agents Activate Human

ンドの in vitro スクリーニング法とWT、Mrgprb 2 -KO、and Mouse Mast Cells via Mas-Related GPCRs. Cells. 8,

MRGPRX 2 -KI マウスの 偽アレルギー反 応を指 標とする

311（2019）．

MRGPRX 2 リガンドの in vivoスクリーニング法が開発され

4） Roy S, Chompunud Na Ayudhya C, Thapaliya M,

た。現在、様々な生体内外分子をスクリーニングしており、Deepak V, Ali H. Multifaceted MRGPRX2: New insight

今後、皮膚の偽アレルギーの全貌を明らかにする予定である。

into the role of mast cells in health and disease. J

主に皮膚に塗布される化粧品は美容に貢献し健康的な生

Allergy Clin Immunol. 148, 293-308（2021）．

活に不可欠な存在であるがゆえに、偽アレルギーを誘導す

5） Kühn H, Kolkhir P, Babina M, Düll M, Frischbutter

る成分の混入を避けることは不可欠である。従って、本研

S, Fok JS, Jiao Q, Metz M, Scheffel J, Wolf K, Kremer

究の成果がコスメトロジーの進歩・発展に貢献することがAE, Maurer M. Mas-related G protein-coupled receptor

期待される。

X2 and its activators in dermatologic allergies. J
Allergy Clin Immunol. 147, 456-469（2021）．

（引用文献）

6） McNeil BD. MRGPRX2 and Adverse Drug Reactions.

1） McNeil BD, Pundir P, Meeker S, Han L, Undem BJ,

Front Immunol. 12, 676354（2021）．

Kulka M, Dong X. Identification of a mast-cell-specific7） Subramanian H, Gupta K, Ali H. Roles of Mas-related

receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.

G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediatedNature. 2015 519, 237-241（2015）．

host defense, pseudoallergic drug reactions, and

2） Bader M, Alenina N, Andrade-Navarro MA, Santos
RA. Pharmacol Rev. MAS and its related G protein-chronic inflammatory diseases. J Allergy Clin Immunol.
138, 700-710（2016）．
8） Takamori A, Izawa K, Kaitani A, Ando T, Okamoto

coupled receptors, Mrgprs. 66, 1080-105（2014）．
3） Alkanfari I, Freeman KB, Roy S, Jahan T, Scott RW,

Y, Maehara A, Tanabe A, Nagamine M, Yamada H,− 120 −

皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法開発

Uchida S, Uchida K, Isobe M, Hatayama T, Watanabe

9） Serhan N, Basso L, Sibilano R, Petitfils C, Meixiong

D, Ando T, Ide T, Matsuzawa M, Maeda K, Nakano

J, Bonnart C, Reber LL, Marichal T, Starkl P, Cenac N,

N, Tamura N, Ikeda K, Ebihara N, Shimizu T, Ogawa

Dong X, Tsai M, Galli SJ, Gaudenzio N.

H, Okumura K, Kitaura J. Identification of inhibitory

mites activate nociceptor-mast cell clusters to drive

House dust

mechanisms in pseudo-allergy involving Mrgprb2/

type 2 skin inflammation. Nat Immunol. 20, 1435-1443

MRGPRX2-mediated mast cell activation. J Allergy（2019）．

Clin Immunol. 143, 1231-1235（2019）．

− 121 −

イオン導入時の微弱電流による皮膚への安全性の厳密な検証と美容効果の検討
徳島大学大学院医歯薬学研究部

小暮

健太朗

Iontophoresis is a non-invasive transdermal drug delivery technology using weak electric current. Although
iontophoresis is widely used in beauty field, its safety has not been investigated. Based on the previous our research, it waspredicted that iontophoresis will induce some negative effects such as inflammation via activation cell signaling. In thisstudy, we tried to study the effect of weak electric current at iontophoresis on the safety and functionality of each skin undercathode and anode. Morphological damage was not observed in the skin after iontophoresis. The amounts of mRNAs relating
inflammation, tumor necrosis factor-α and interleukin (IL) -6 and anti-inflammatory cytokine IL-10 and transforming growth
factor (TGF)-β. The amounts of these mRNAs were not affected by iontophoresis under normal conditions (0.34 mA/cm2).
However, iontophoresis under more intense conditions (1.0 mA / cm2) showed an increasing trend of IL-6 and IL-10 mRNA.
The skin functional components collagen and ceramide were increased by iontophoresis under normal conditions. Fromthese results, it was suggested that iontophoresis under normal conditions does not induce any inflammation in the skintissue. In conclusion, iontophoresis is a safety and useful technology for transdermal drug delivery and skin beauty.

１．緒が重要である。WEB などでイオン導入に関する記事を目言にするが、その多くは「ビタミン C などの美容成分を皮内

イオントフォレシスは、微弱な電流（0 . 3 ～ 0 . 5 mA/cm ）に導入できる」という点のみに触れたものであり、イオンを用いて皮膚内にイオン性の物質を送達する技術として古導入（微弱電流処理）が皮膚に対して及ぼす影響に関するもくから知られている。美容領域においては、「イオン導入」のは皆無である。すなわち、薬学的観点および香粧品開発という呼称で認知されており、様々なデバイスが開発され、の観点においては、イオン導入の皮膚に及ぼす影響につい

美容整形外科などで用いられている。イオントフォレシスては、ほとんど手付かずであった。

2

に関する研究は、従来抗炎症剤などの低分子薬物を対象と

我々は、これまでイオントフォレシス（イオン導入）によしたものが盛んに行われてきた。それらの研究では、動物

る siRNA や抗体などの高分子薬物の皮内送達研究に取り

皮膚切片および市販のヒト皮膚切片をフランツ型セルに装組んできた 1 - 5）。研究開始当初は、切り取った（死んだ）皮

着し、上層に添加した薬物が皮膚を透過して下層に移行す膚を用いて、抗炎症剤などの低分子薬物の皮膚透過についる量を定量することで皮膚透過性を評価する研究が主であて検討を行っていた。ところが、皮内での徐放効果を期待った。加えて、現在多くの化粧品企業において、動物個体して、主たる研究者の専門テーマであったナノ粒子（リポを用いた研究が実施できない状況にある。そのため、それソーム）とイオントフォレシスとの組み合わせの検討過程

らの研究には「死んだ皮膚」
が多く用いられている。イオンにおいて、動物個体（活きた皮膚）を用いた時に、それまでトフォレシス研究において、皮膚の物理的損傷に関する検不可能だと考えられていたナノ粒子が、イオントフォレシ

討は容易であるが、死んだ皮膚を用いるため生理的な影響、スによって皮内送達可能であることを発見した 2 , 4 , 5）。従来、

特に炎症性サイトカイン産生やシグナル伝達系タンパク質

イオントフォレシスによる皮内薬物送達メカニズムは、電の活性化などを観察することはできない。ヒトの皮膚でモ

極と荷電性薬物との電気的反発とイオンの動きに伴う水のニターを行う場合も、皮膚表面の発赤くらいしか評価する

流れ（電気浸透流）であると考えられていた。しかし、主たことはできない。しかしながら、イオントフォレシス（イる研究者らによる検討の結果、微弱電流によって細胞内オン導入）における微弱電流の皮膚への影響を検討するた

Ca 2 + 濃度が上昇することで、皮膚組織細胞のシグナル伝

めには、「活きた皮膚」
を用いることが必須であり、特に皮達系が活性化され、細胞間隙が開裂することにより、高分膚組織生理への影響については個体レベルで評価すること

子などが皮内に浸透できるようになることを発見した 6）。
すなわち、微弱電流による皮膚組織の生理機能変化が、イオン導入（イオントフォレシス）による高分子の皮内浸透メ

Verification of skin safety and examinationof cosmetolog ica l ef fects by wea kelectric current of iontophoresis
Kentaro Kogure
Graduate School of Biomedical Sciences,
Tokushima University

カニズムであることを明らかにしている。さらに我々は、培養細胞を用いた検討によって、微弱電流刺激は、皮膚組織細胞間隙を開裂させるだけでなく、ユニークな細胞取り込み機構（エンドサイトーシス）を誘起し、細胞外の物質を細胞内に取り込ませるとともに、細胞質に漏出させること− 122 −

イオン導入時の微弱電流による皮膚への安全性の厳密な検証と美容効果の検討も発見している 7 - 10）。これらの知見から、イオントフォレシ

を顕微鏡で観察することで、皮膚の組織学的変化を評価し

ス（イオン導入）における微弱電流処理は、皮膚組織・細胞た。皮膚の採取は、微弱電流処理後 3 時間および 24 時間

におけるシグナル伝達経路を活性化し、組織レベルだけで後とし、それぞれ回収した皮膚について HE 染色後、組織なく細胞レベルでの生理機能を変化させることで、高分子切片観察を行った。

などの皮内薬物送達が可能になっていることが示唆されてグナル伝達以外にも、微弱電流は様々なシグナル伝達、特2 . 2 . 微弱電流処理した皮膚における炎症性サイト
カイン mRNA 量の検討に安全性に関与する炎症関連シグナルを活性化するのではWister ラットの毛を刈った背部皮膚上にヒト心電図用ないかと考えた。この仮説に基づき、主たる研究者の小暮

Ag/AgCl 電極を設置し、微弱電流処理（0 . 34 mA/cm 2、1は、2018 年度に貴財団に採択いただき、動物皮膚に対す時間）を行った。微弱電流処理後、陽極および陰極貼付部

るイオン導入（微弱電流処理）によって、炎症性サイトカイ

分の皮膚をそれぞれ回収し、キットを用いて RNA を抽出

ン産生や皮膚組織変化など負の影響は誘導されないこと、した後、Real-time PCR 法によって炎症性サイトカインなつまりイオン導入は安全性の高い薬物送達技術である可能ど（腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン（IL）- 6）お性を見出した。予定研究期間終了後も、微弱電流処理によよび抗炎症性サイトカイン（IL- 10、腫瘍成長因子（TGF）

る安全性評価を継続したところ、用いる電極の陽極と陰極-β）の mRNA 量を定量解析した。皮膚の採取は、微弱電流において炎症性サイトカインなどの発現が異なる傾向を見

処理後 3 時間および 24 時間後とし、回収した RNA につ出した（論文投稿準備中）。このことは、科学的に理にかな

いて解析を行った。さらに、電流強度を増大させた条件っており、陽・陰電極の下で起こる事象を個別に評価する（1 . 0 mA/cm 2、1 時間）において処理したラット皮膚につ必要性を示唆している。そのため、「安全だ」と断言するたいて、上記と同様に陽極および陰極貼付部分の皮膚を回収

めには、より厳密な評価が必要であると考えた。そこで本し、処理後 3 時間と 24 時間後における炎症性サイトカイ

研究では、美容領域などで汎用されているイオン導入（微弱

ンなど（IL- 6、IL- 10、TNF-α、TGF-β）の mRNA 発現を

電流による皮膚処理）において、陽・陰電極貼付下の皮膚でReal-time PCR 法によって定量解析した。

いる。これらのことから我々は、薬物送達に繋がる細胞シ

個別に起こっている事象を正確に捉え、安全性を厳密に検年度にイオン導入（微弱電流処理）による動物皮膚（特に表皮2 . 3 . 微弱電流処理した皮膚におけるコラーゲン量変化の検討領域）中のセラミド量の増加を世界で初めて見出している 10）。

Wister ラットの毛を刈った背部皮膚上にヒト心電図用

また、これまでの安全性評価過程において、皮内コラーゲン

Ag/AgCl 電極を設置し、微弱電流処理（0 . 34 mA/cm 2、1が微弱電流処理によって増える可能性も見出している（論文準時間）を行った。微弱電流処理後、陽極および陰極貼付部備中）。これらの結果は、これまで局所麻酔剤やビタミンC な分の皮膚をそれぞれ回収し、OCT コンパウンド中で凍結

どの物質の皮内送達技術として捉えられてきたイオン導入（イオ固化させたものをクライオスタットにより凍結切片とした。

ントフォレシス）が、それ単独で皮膚の保湿改善や弾性向上を得られた切片に対して、ピクロシリウスレッド溶液を添加誘導可能な美容技術となる可能性を示唆している。本研究でし、60 分間室温でインキュベートした。その後、酢酸おは、微弱電流処理時の安全性の厳密な評価と同時に、皮膚よびエタノールで洗浄し、キシレンに 15 分間、3 回浸す

機能性に関与する皮内コラーゲンおよびセラミド産生誘導をことで透徹処理を行った。キシレンが乾く前に疎水性マウ

定量的に評価することで、イオン導入（微弱電流処理）が安全性

ント剤をマウントし、カバーガラスで封入した。マウントの高い美容技術となり得ることを証明したいと考えた。

剤乾燥後、倒立型顕微鏡を用いて観察を行った。得られた証したいと考えた。さらに、主たる研究者の小暮は、2019２．方

画像について、画像解析ソフトを用いてコラーゲンに相当

法する赤色部分を数値化した。また、コラーゲンの主成分で

2 . 1 . 微弱電流処理した皮膚の組織学的変化の検討

あるヒドロキシプロリン量を評価するために、イオントフ

Wister ラットの背部皮膚の毛を刈り、露出した皮膚上ォレシス処理をしたラット背部から皮膚を回収し、ヒドロに PBS を浸漬させた脱脂綿を貼付し、その上にヒト心電キシプロリン染色アッセイキットを用いて、皮内のヒドロ

図用の Ag/AgCl 電極を設置して、過去の検討で用いてキシプロリン量を定量した。検量線を用いて吸光度からヒ2きた通電条件（0 . 34 mA/cm 、1 時間）により微弱電流処

ドロキシプロリン濃度を測定した。

理を行った。微弱電流処理を施した部分の皮膚を回収し、タットにより凍結切片とした。得られた切片をヘマトキシ

2 . 4 . 微弱電流処理した皮膚におけるセラミドの定量と分子種同定の検討

リン・エオシン（HE）によって染色し、染色後の皮膚切片

Wister ラットの毛を刈った背部皮膚上にヒト心電図用

OCT コンパウンド中で凍結固化させたものをクライオス− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Ag/AgCl 電極を設置し、微弱電流処理（0 . 34 mA/cm 2、1

れることが知られているが、今回示したように微弱電流処

時間）を行った。微弱電流処理後、陽極および陰極貼付部

理後の皮膚においては、肥厚化は確認されなかった。

分の皮膚をそれぞれ回収し、OCT コンパウンド中で凍結た。得られた切片に対して、1 次抗体として抗セラミド抗3 . 2 . 微弱電流処理した皮膚における炎症性サイト
カイン mRNA 量の検討

体を用い、2 次抗体として蛍光色素結合抗 IgG 抗体を用い微弱電流処理後の陽極貼付下および陰極貼付下の皮膚をて、免疫染色を行った。免疫染色後、共焦点レーザー顕微

それぞれ回収し、RNA を抽出した後、Real-time PCR 法

鏡により切片中の蛍光を観察した。得られた画像について、によって炎症性サイトカインなどの炎症関連因子（TNF-α、

画像解析ソフトを用いてセラミドに相当する蛍光量を数

IL- 6）および抗炎症性サイトカイン（IL- 10、TGF-β）の値化した。また、培養細胞を微弱電流処理（0 . 34 mA/cm 2、mRNA 量 を 定 量 解 析 し た。 微 弱 電 流 処 理 3 時 間 後 に お

15 分間）した後、回収した細胞について LC-MS/MS によける陽極貼付下および陰極貼付下の各皮膚組織中の各因る質量分析解析を行い、微弱電流によって増加したセラミ子 mRNA を比較すると、ばらつきがあるものの、IL- 6、ドの分子種の同定を試みた。

TNF-α および TGF-β については、陽極および陰極に関わ固化させたものをクライオスタットにより凍結切片とし

3．結らず目立った変動は認められなかった。しかし、IL- 10 に果

ついては、陽極貼付下皮膚では、変動は見られなかったが、

3 . 1 . 微弱電流処理した皮膚の組織学的変化の検討

陰極貼付下の皮膚において、統計的に有意ではないが、増微弱電流処理後、陽極および陰極貼付部分から回収した加する傾向が認められた。さらに、微弱電流処理 24 時間

皮膚について、HE 染色を行い顕微鏡観察したところ、写後における陽極貼付下および陰極貼付下の皮膚における各真で示すように、まず微弱電流処理 3 時間後の皮膚切片は、

因子 mRNA について定量した結果、IL- 6、TNF-α および

陽極貼付および陰極貼付下の皮膚ともに未処理皮膚と同じ

TGF-β については、3 時間と同様に陽極および陰極に関わであり、微弱電流処理による皮膚組織への目立った影響はらず目立った変動は認められなかった。IL- 10 については、確認されなかった（図 1 A）
。さらに、微弱電流処理 24 時

3 時間とは逆に、陰極貼付下皮膚では、変動は見られなか間後の皮膚についても同様に HE 染色した組織切片観察をったが、陽極貼付下の皮膚において、統計的に有意ではな行ったが、24 時間後においても陽極貼付下および陰極貼

いが、増加する傾向が認められた。加えて、通常のイオン

付下の皮膚の組織像は未処理皮膚と同じであり、微弱電流

導入条件よりも強力な条件（1 . 0 mA/cm 2）で１時間処理し処理による皮膚組織への影響は陽極・陰極いずれにおいてた場合についても検討を行った。その結果、微弱電流処理も認められなかった（図 1 B）。炎症皮膚病態（アトピー性皮

3 時間後においては、IL- 6 が陽極貼付下および陰極貼付

膚炎や乾癬、紫外線障害など）では、表皮肥厚化が誘起さ下の両方の皮膚において増加傾向を示した。その他の IL10、TNF-α および TGF-β についても IL- 6 ほどではないが、増加の傾向を示した。ところが 24 時間後には、陰極貼付
下の皮膚において、ばらつきが大きいものの、IL- 10 が大きく増加していた。

3 . 3 . 微弱電流処理した皮膚におけるコラーゲン量
変化の検討

微弱電流処理後の陽極貼付下および陰極貼付下の皮膚をそれぞれ回収し、組織切片についてピクロシリウスレッド
染色を行い、組織切片染色画像の画像解析からコラーゲン量を定量したところ、３時間後の陰極貼付下皮膚におけるコラーゲン量が未処理皮膚よりもわずかではあるが増加している結果が得られた。さらに、24 時間後の陽極貼付下および陰極貼付下皮膚中のコラーゲン量を評価したところ、
3 時間時点ほどではないが陰極貼付下皮膚において増加する傾向が認められた。さらに、コラーゲンの成分として知られるヒドロキシプロリンについて、陽極貼付下および陰図１ 微弱電流処理下皮膚の組織学的変化
白バーは 100µm を示す。

極貼付下皮膚中の定量を行ったところ、ピクロシリウスレ
ッド染色の結果とは異なり、3 時間後の陽極貼付下皮膚に− 124 −

イオン導入時の微弱電流による皮膚への安全性の厳密な検証と美容効果の検討

おいて増加していることが確認された。しかし、24 時間

よりも強力な電流で微弱電流処理を行う場合、特に陰極貼後には、陰極貼付下の皮膚において、有意ではないがヒド

付下の皮膚に炎症などを誘起する可能性を示している。皮

ロキシプロリンの増加傾向が認められたが、陽極貼付下の内への物質浸透は、電流強度に依存すると考えられるが、皮膚では大きな変化は認められなかった。

物質浸透を促進するために電流強度を上げることは、皮膚障害を誘起する危険性があることが明らかとなった。興味3 . 4 . 微弱電流処理した皮膚における炎症性サイト
カイン mRNA 量の検討
微弱電流処理後の陽極貼付下および陰極貼付下の皮膚を深い点は、電極の違いによって、誘起される影響が異なることであり、今回の検討によってはじめて明らかになったことである。

それぞれ回収し、組織切片について抗セラミド抗体を用い今回、微弱電流処理による皮膚の機能性への影響を検討て、組織中セラミド量の変化を評価した。その結果、陽極するため、弾力性など皮膚の構造維持に重要なコラーゲン

貼付下の皮膚においては、微弱電流処理直後からセラミド量の変化を評価した。その結果、微弱電流処理後の陰極貼量が増加する傾向が認められた。一方、陰極貼付下の皮膚

付下の皮膚において、コラーゲン量がわずかに増加していにおいては、３時間後にセラミド量の増加傾向が見られ、た。また、コラーゲン成分であるヒドロキシプロリン量が12 時間後および 24 時間後には有意なセラミド量の増加が陽極貼付下の皮膚において増加していた。いずれもバラつ確認された。陰極貼付下の皮膚におけるセラミド量は、最きもあり、より詳細な検討が必要ではあるが、コラーゲン

大で 2 倍弱にまで増大した。培養細胞を用いて、微弱電流

量やヒドロキシプロリン量が減少するのではなく増加して処理により増大するセラミドの分子種を質量分析手法によいたことから、イオントフォレシスにおける微弱電流処理って解析したところ、炭素数 16 のセラミドが有意に増大

によって皮膚の機能性が負の影響を受けることなく、改善することが明らかとなった。

される可能性が示された。

4．考

また、微弱電流処理後の皮膚における組織中セラミド量

察の変化を評価した結果、セラミド量が増加することが確認

本研究では、イオン導入実施（微弱電流処理）時における、された。特に、陰極貼付下の皮膚においては、セラミド量は、皮膚への影響を厳密に評価するため、陽極貼付下および陰

最大で２倍弱にまで増大することが明らかとなった。セラ

極貼付下の皮膚に分けて、それぞれの皮膚における組織学

ミドは、肌の保湿に重要な役割を果たすことから、イオン的変化、炎症性サイトカインなどの発現、コラーゲンおよ導入時の微弱電流処理によって、皮膚中のセラミド量が大びセラミドの産生について詳細な検討を行った。まず、微きく増大することで、肌の保湿機能が向上する可能性が示

弱電流処理した皮膚の組織学的変化の検討を行った結果、された。さらに、培養細胞を用いた検討から、微弱電流処

微弱電流処理 3 時間後および 24 時間後において、陽極貼理によって増大するセラミドの分子種が、炭素数 16 のセ付下および陰極貼付下の皮膚における組織損傷などは認め

ラミド分子であることが明らかとなり、ある決まった分子

られず、また炎症発生時に生じる表皮の肥厚化も全く認め種の生成が微弱電流処理によって誘導される可能性が示唆られなかった。これらのことから、微弱電流処理は、皮膚された。
以上をまとめると、イオン導入時の微弱電流処理は、通への組織学的変化を誘導しないことが確認された。
さらに、炎症性サイトカインなどの炎症関連因子（TNF-α、常の条件（0 . 3 - 0 . 5 mA/cm 2）であれば、懸念された炎症性IL- 6）および抗炎症性サイトカイン（IL- 10、TGF-β）のサイトカインなどの発現を誘導する可能性は極めて低いこ

mRNA 量を定量解析した結果、これらの遺伝子発現にはとが確認された。しかし、皮内への物質送達の効率を向上

大きな変動は認められなかったことから、通常のイオン導させるために電流値を増大させると、炎症性サイトカイン

2

入条件（0 . 3 - 0 . 5 mA/cm ）では、１時間に及ぶ処理であっの誘導を引き起こす危険性があることも明らかとなった。

ても、炎症性サイトカイン（IL- 6、TNF-α）発現誘導は見また、皮膚の機能性を担うコラーゲンが微弱電流処理によられず、大きな負の影響は示さないことが示唆された。さって増大する可能性が示された。さらに、皮膚の保湿成分

らに、抗炎症性サイトカイン IL- 10 の発現が、時間によっであるセラミドが微弱電流処理後の皮膚において増加するて陰極と陽極の違いはあったが、増加傾向を示したことかことを見出した。すなわち、微弱電流処理によって、皮膚

ら、微弱電流処理は炎症を抑える方向で作用する可能性がの機能性（弾力性と保湿性）が改善される可能性が見出され推察された。さらに通常のイオン導入条件よりも強力な条た。今後さらなる検討により、薬物送達技術であったイオ2件（1 . 0 mA/cm ）で１時間処理した場合、微弱電流処理 3

ントフォレシスが、安全で理想的な肌の美容技術となるこ

時間後においては、各遺伝子発現が増加傾向を示し、さらとが期待される。

に 24 時間後には、陰極貼付下の皮膚において、IL- 10 が大きく増加していた。このことは、通常のイオン導入条件− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

謝辞6） Hama S, Kimura Y, Mikami A, Shiota K, Toyoda

本研究の遂行にご支援をいただきました公益財団法人コM, Tamura A, Nagasaki Y, Kanamura K, Kajimoto K,ーセーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げます。

Kogure K. Electric stimulus opens intercellular spaces
in skin. J. Biol. Chem. 289, 2450-2456（2014）．

（引用文献）

7） Hasan M, Nishimoto A, Ohgita T, Hama S, Kashida1） Kigasawa K, Kajimoto K, Hama S, Saito A, Kanamura

H, Asanuma H, Kogure K. Faint electric treatment-

K, Kogure K. Noninvasive delivery of siRNA into the

induced rapid and efficient delivery of extraneous

epidermis by iontophoresis using an atopic dermatitis-hydrophilic molecules into the cytoplasm. J. Control.
Release 228, 20-25（2016）．

like model rat. Int. J. Pharm. 383,157-160（2010）．
2） Kajimoto K, Yamamoto M, Watanabe M, Kigasawa

8） Hasan M, Tarashima N, Fujikawa K, Ohgita T, Hama

K, Kanamura K, Harashima H, Kogure K. Noninvasive

S, Tanaka T, Saito H, Minakawa N, Kogure K. The

and persistent transfollicular drug delivery system

novel functional nucleic acid iRed effectively regulates

using a combination of liposomes and iontophoresis.

target genes following cytoplasmic delivery by faintInt. J. Pharm. 403, 57-65（2011）．

electric treatment. Sci. Technol. Adv. Mater. 17, 554-

3） Kigasawa K, Kajimoto K, Nakamura T, Hama S,

562（2016）．

Kanamura K, Harashima H, Kogure K. Noninvasive9） Hasan M, Hama S, Kogure K. Low electric treatment

and efficient transdermal delivery of CpG-

activates Rho GTPase via heat shock protein 9 0 andoligodeoxynucleotide for cancer immunotherapy. J.

protein kinase c for intracellular delivery of siRNA.
Sci. Rep. 9, 4114（2019）．

Control. Release 150, 256-265（2011）．
4） H a s a n M , K h a t u n A , F u k u t a T , K o g u r e K .

10）Torao T, Mimura M, Oshima Y, Fujikawa K, Hasan

Noninvasive transdermal delivery of liposomes by

M, Shimokawa T, Yamazaki N, Ando H, Ishida T,

weak electric current. Adv. Drug Deliv. Rev. 154-155,

Fukuta T, Tanaka T, Kogure K. Characteristics of

227-235（2020）．

unique endocytosis induced by weak current for5） Hasan M, Khatun A, Kogure K. Iontophoresis of
Biological Macromolecular Drugs. Pharmaceutics 1 4,cytoplasmic drug delivery. Int. J. Pharm. 576 , 119010（2020）．

525（2022）．

− 126 −

乳酸菌がもつ抗酸化作用の分子基盤解明
筑波大学医学医療系

小林麻己人

Heat-treated cells of Lactococcus lactis strain H61 have been reported to exhibit anti-aging effects on human skin andbeing considered for application in cosmetics. However, the mechanism of the effects is not clear. I have been studying theantioxidant effects of various dietary phytochemicals using zebrafish as a model animal. In this study, I tried to evaluate
the antioxidant effect of Lactococcus lactis strain H61 by utilizing zebrafish. As a result, I found that strain H61 exerts its
antioxidant effect in zebrafish larvae, in which the relationship between biological effects and genetic mutations is easy toanalyze. Using this system, the antioxidant effect of strain H61 was shown to be not mediated by the Nrf2 pathway, whichis the master mechanism of cellular antioxidant response. Furthermore, we generated zebrafish mutants that disrupted key
genes in the mitochondrial biosynthesis pathway or the innate immune response pathway, paving the way to identify thisunknown mechanism.

１．緒

外の抗酸化経路を活性化する化粧品の開発が期待される。

言

乳酸菌は腸内細菌叢を調整するプロバイオティクスとし

65 歳以上の高齢者人口が 1 / 3 を占めるようになり、本て注目を集めてきたが、最近では菌体成分そのものがもつ

邦はいよいよ超高齢化社会を迎えようとしている。その中バイオジェニックスとしての機能にも注目が集まっている。

で、抗酸化活性をもつ食品やサプリメントが生活習慣病の

実際、乳酸菌成分入りの化粧品も市販され始めている。本予防に有効と注目され、中でも Nrf 2 経路というストレス

研究課題で研究対象となっている乳酸菌 H 61 株もその一防御システムを活性化する食品成分の研究が国内外で進んつである 3）。乳酸菌成分の効果の一端は皮膚細胞に対するでいる 1 , 2）。ところが最近、Nrf 2 経路はがん増進にも働く

抗酸化作用と考えられているが、その分子メカニズムに関ことが報告され、安全性が危惧されるようにもなってきた。

してはほとんどわかっていない。

また、Nrf 2 経路は年齢を重ねるにつれ、活性化力が減弱研究代表者は、Nrf 2 経路を介する抗酸化活性の研究をするという報告もされている。これらのことは、健常人、

ゼブラフィッシュというモデル動物を用いて長年行って特に健常な高齢者にとって、Nrf 2 経路以外の抗酸化経路

きた 4 - 6）。この過程で、様々な食品成分が Nrf 2 を活性化

を活性化する食品やサプリメントの摂取の方が望ましいこし、動物個体内で抗酸化活性を発揮させることを見出しとを示唆するが、そのような経路はまだ見つかっていない。

てきた 7 - 9）。一方、農研機構の木元広実博士は乳酸菌研究

化粧品に関しても抗酸化成分を含有する商品のニーズがの第一人者で、多くの菌株を保持・解析すると同時に、機高まっており、実際、ビタミン C や E 等の抗酸化物質を含能性の高い菌株に関しては特許を取得し、動物試験・ヒト有する商品が多く市販されている。ただし、これらは酸化介入試験を行い、女性の肌健康への効用を実証した上で、ストレスを直接消去する抗酸化成分であり、安定性が低い

H 61 株含有ヨーグルトの商品化に導いている 10）。加えて上、量的に多く必要とされる。一方、Nrf 2 経路等を活性最近では、ヒト表皮角化細胞への直接添加で UV ダメージ化して、細胞内部の抗酸化物質や抗酸化タンパク質を誘導からの保護効果を示し、化粧品成分への応用の可能性も示

する間接型の抗酸化成分は、持続性が高く、少量でも効果している 11）。本課題研究では木元博士に乳酸菌 H 61 株をがあることが期待される。Nrf 2 経路の活性化が UV からご提供いただき、その抗酸化作用の実体同定を目的にゼブ肌を守ることは示されており、既に Nrf 2 経路を活性化す

ラフィッシュを用いた解析を試みた。

る植物成分を配合した化粧品も市販され始めている。ただ

２．方し、前述の通り、Nrf 2 経路にも問題があり、Nrf 2 経路以法

2 . 1. ゼブラフィッシュに対する乳酸菌の抗酸化作用の解析
Elucidation of the molecular basis ofa nt iox id a nt ef fe ct s of l a ct ic ac id
bacteria
Makoto Kobayashi
Faculty of Medicine, University ofTsukuba

抗酸化作用の測定は遠藤らの方法 9）に従い、受精後 3 . 5日のゼブラフィッシュ稚魚 24 匹に対し、乳酸菌溶液を 12
時間前処理後、洗浄し、新たに酸化ストレス剤として過酸
化水素溶液を 48 時間処理し、12 時間ごとの生存率を計測した。ゼブラフィッシュ系統には野生型 AB 系統と Nrf 2− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

系統 7）を用いた。乳酸菌は農研機構・

り、致死率が 25 % 程度に下がった。この結果は、H 61 株

木元博士からご供与いただいた H 61 株と G 50 株の加熱処の前処理がゼブラフィッシュ体内の抗酸化力を高めること

理菌体の凍結乾燥品を用いた。

を示唆する。一方、G 50 株ではこの効果が観察されなか変異型 nfe 2 l 2 a

fh 318ったことから、H 61 株特異的な作用であることが示された。

2 . 2 . CRISPR-Cas 9 によるゲノム編集った。標的配列に相補的な crRNA、Cas 9 との結合に必要

3 . 2 . Nrf 2 変異型ゼブラフィッシュ系統を用いた解析な tracrRNA、Cas 9 タンパク質の 3 者を 1 細胞期のゼブラ

直接的抗酸化剤であるビタミン C や E ではこうした効果

フィッシュ胚に注入した。注入胚を成魚まで育成し、PCRは観察されないことから、H 61 株の抗酸化作用はゼブラ及び DNA シークエンスを用いたジェノタイピングで目的

フィッシュ体内の抗酸化経路を活性化する間接的作用と推の遺伝子破壊に成功した F 0 世代を選び出し、野生型成魚測された。細胞や動物の抗酸化力を間接的に高めるしくとの交配で F 1 世代を作出した。

みとして Nrf 2 経路が知られている。そこで H 61 株の抗酸

CRISPR-Cas 9 によるゲノム編集は小谷らの方法 12）で行化作用が Nrf 2 経路の活性化を介するものかを Nrf 2 変異型

2 . 3 . 遺伝子発現解析

系統（nfe 2 l 2 a

fh 318）で検証した（図 2）。nfe 2 l 2 a

fh 318

ホモ変乳酸菌等を処理したゼブラフィッシュ稚魚における遺伝子異型稚魚を用いて H 61 株の抗酸化作用を解析したところ、発現変動をqPCR 及び RNA-seqにより行った。いずれも乳Nrf 2 ホモ変異型稚魚においても H 61 株の前処理がコント酸菌等を処理した稚魚の抽出 total RNAを用いた。qPCR

ロールに比べて有意に生存率を向上させた。この結果は、は、total RNAを鋳型として合成した cDNAを用いて SYBR

H 61 株の抗酸化作用が Nrf 2 経路の活性化を介さないもの

Green 法で行った。RNA-seq はつくば i-Laboratory で実である可能性を示唆した。

施した。一次解 析データをもとに、野生型と Nrf 2 変異型
稚魚の両方で無処理のコントロールよりも 1 . 5 倍以上の発現上昇が見られた遺伝子に着目した。これらをヒト遺伝子名に変換し、DAVID によるパスウェイ解析を行った。

3．結

3 . 3 . H 61 株処理による遺伝子発現変動
H 61 株の抗酸化作用がどのような生体経路を介するかを調べるために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子群を RNA-seq 法で探索した。浮かび上がった遺伝子群を果用いてパスウェイ解析を行ったところ、ミトコンドリアタ

3 . 1. ゼブラフィッシュに対する乳酸菌の抗酸化作用

ンパク質をコードする遺伝子群の多くが発現亢進していた。

野生型 4 日稚魚に対し過酸化水素処理をしたところ、24

検証のために、いくつかのミトコンドリアタンパク質遺伝

時間後には 75 % 以上が致死となった（図 1）。この条件下で子に対して qPCR 解析を行ったところ、弱いながらも H 61

乳酸菌 H 61 株を 12 時間前処理すると有意に生存率が上が株により発現誘導される傾向があることがわかり（図 3）、

図 1 乳酸菌株の抗酸化作用
野生型 3.5日稚魚にH61株またはG50 株の125µg/ml 溶液を
12 時間前処理した後、2.8mM 過酸化水素溶液を曝露させ 12
時間ごとに生存率を測定した。* p < 0.05。

図 2 Nrf2 変異型稚魚に対する H61 株の抗酸化作用
nfe2l2afh318 ホモ変異型 3.5 日稚魚に H61 株を 12 時間前処理
した後、2.2mM 過酸化水素溶液を曝露させ 12 時間ごとに生存率を測定した。* p < 0.05。

− 128 −

乳酸菌がもつ抗酸化作用の分子基盤解明

ミトコンドリア生合成が亢進している可能性を示唆された。

製を CRISPR-Cas 9 を用いて試みた。その結果、Myd 88
破壊系統の作製にも成功した。

3 . 4 . 遺伝子破壊ゼブラフィッシュ系統の作製

4．考H 61 株によるミトコンドリア生合成亢進が抗酸化作用

察に関与する可能性が浮かび上がったので、ミトコンドリア

本研究により、乳酸菌 H 61 株がゼブラフィッシュの抗生合成経路が異常な時に、H 61 株の抗酸化作用がどうな酸化作用を高めることを明らかにできた。このことは、よるかを検証することにした。そのために、まずミトコンド

り高抗酸化力のある乳酸菌探索にゼブラフィッシュが有用

リア生合成に関わる転写因子 Sirt 1 及び PGC- 1 α の遺伝子であることを示すとともに、遺伝子破壊系統の活用により破壊ゼブラフィッシュを CRISPR-Cas 9 を用いて作製した。

作用メカニズムを遺伝学的に解明できる可能性が示唆されいずれもゲノム編集に成功したが、Sirt 1 破壊系統に関した。実際、Nrf 2 変異型系統を用いた解析の結果、H 61 株ては F 1 世代まで系統化できた。この sirt 1

系統は 7 bpの抗酸化作用は Nrf 2 経路以外の生体経路を介すると推測の塩基欠失が導入されたフレームシフト変異系統であり、された。Nrf 2 経路とがん増進の関係が危惧されているたその産物は酵素活性ドメインを失うと予想される（図 4）。

め、H 61 株が Nrf 2 以外の経路を介して抗酸化作用を発揮

it 326

3）

H 61 株には免疫賦活作用があることも知られており 、その作用は自然免疫応答機構を介すると予想されている。

することは、化粧品の開発応用を考える上で朗報となりうる。

H 61 株による抗酸化作用にも自然免疫応答が必要である

次に H 61 株の抗酸化作用を介する生体経路を明らかに可能性もあり、その検証のために自然免疫応答が減弱したするために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子群をゼブラフィッシュを用いた解析を試みることにした。乳酸RNA-seq 解析で探索し、ミトコンドリア生合成が関与

菌による自然免疫応答は Toll 様受容体 -Myd 88 経路を介する可能性を見いだした。その検証のために Sirt 1 及びするので、Myd 88 を破壊したゼブラフィッシュ系統の作

PGC- 1 α 遺伝子を破壊したゼブラフィッシュ系統を作製し

図 3 ミトコンドリア関連遺伝子の発現誘導
H61 株を 12 時間前処理した野生型 4 日稚魚を用いてmrps24、mrpl53、ndufs8b
遺伝子の発現解析を qPCR により行い、無処理稚魚を 1 とした時の相対発現量を解析した。* p < 0.05。

図 4 Sirt1 破壊系統の作製
it326
CRISPR-Cas9 により Sirt1 遺伝子領域に 7bp 欠損のフレームシフト変異を導入した（sirt1 ）。
生じるタンパク質は脱アセチル化ドメインを含む C 末 3/4 が欠失していると予想される。

− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

た。ただ、抗酸化作用の解析までには至らず、今後の課題

5） M. Kobayashi et al.: The antioxidant defense system

として残った。一方、H 61 株が自然免疫応答遺伝子群をKeap1-Nrf2 comprises a multiple sensing mechanism

弱いながらも誘導することが RNA-seq 解析によりわかっ

for responding to a wide range of chemical compounds.

た。そこで自然免疫の関与を検証するために Myd 88 破壊

Mol. Cell. Biol. 29: 493-502（2009）．

系統も作製したが、こちらの解析も今後の課題である。今6） K. Mukaigasa et al.: Nrf2 activation attenuates

回の RNA-seq 解析ではミトコンドリア生合成以外の経路

genetic endoplasmic reticulum stress induced by

は浮かび上がらなかった。技術的な問題である可能性もあa mutation in the phosphomannomutase 2 gene in

り、別手段としてマイクロアレイ解析も現在行っている。

zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115: 2758-2763

H 61 株の作用が遺伝子発現変動を伴わない可能性もあ（2018）．

る。その場合は遺伝子発現解析を基盤とした戦略では作用

7） K. Mukaigasa et al.: Genetic evidence of an evolutionarily

機構に迫ることができない。そこで現在、乳酸菌側からconserved role for Nrf2 in the protection against

迫る戦略も開始している。具体的には H 61 株を成分分離

oxidative stress. Mol. Cell. Biol. 32: 4455-4461（2012）．

し、どの成分に抗酸化作用があるか絞り込むアプローチと、

8） Y. Fuse et al.: Nrf2-dependent protection against

H 61 株の変異株を作製・解析し、どのような乳酸菌遺伝

acute sodium arsenite toxicity in zebrafish. Toxicol.

子が抗酸化作用に関与するかを探索するアプローチである。

Appl. Pharmacol. 305: 136-142（2016）．
9） Y. Endo et al.: Evaluation of antioxidant activity of

まだ開始したばかりで今後の結果が待たれる。

spice-derived phytochemicals using zebrafish. Int. J.

（引用文献）

Mol. Sci. 21: 1109（2020）．

1） M. Kobayashi & M. Yamamoto: Molecular mechanisms

10）H. Kimoto-Nira et al.: Effects of ingesting milk

activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant genefermented by Lactococcus lactis H 6 1 on skin healthregulation. Antioxid. Redox Signal. 7: 385-394（2005）．

in young women: a randomized double-blind study. J.

2） M. Kobayashi & M. Yamamoto: Nrf2-Keap1 regulation

Dairy Sci. 97 : 5898 - 5903（2014）．

of cellular defense mechanisms against electrophiles11）H. Kimoto-Nira et al.: Towards application of waterand reactive oxygen species. Adv. Enzyme. Reg. 4 6:

extract from heat-killed Lactococcus lactis H 6 1 as a113-140（2006）．

cosmetic ingredient. Lett. Appl. Microbiol. 68 : 530 - 536

3） H. Kimoto-Nira: New lactic acid bacteria for skinhealth via oral intake of heat-killed or live cells. Anim.

（2019）．
12）H . K o t a n i e t a l . : E f f i c i e n t m u l t i p l e g e n o m emodifications induced by the crRNAs, tracrRNA andSci. J. 89: 835-842（2018）．
4） M. Kobayashi et al.: Identification of the interactive
interface and phylogenic conservation of the Nrf2-

Cas 9 protein complex in zebrafish. PLoS One 1 0 :e 0128319（2015）．

Keap1 system. Genes Cells 7: 807-820（2002）．

− 130 −

概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析
秋田大学大学院医学系研究科

齋藤康太

Proteins synthesized within the ER is exported via COPII-coated vesicles to the Golgi for secretion. We have found thatTANGO1 is not only collagen cargo receptor at ER exit sites but it organizes the formation of ER exit site via interactingwith Sec16. In this analysis, we have found that TANGO1 is phosphorylated by casein kinase 1 and dephosphorylated by
PP1 in a cell-cycle dependent manner and the phosphorylation regulates the organization of ER exit sites. CK1 activity is
involved in the regulation of circadian rhythm, so that our analysis would lead to the future investigation on the regulation ofcollagen secretion with circadian rhythm.

１．緒

明らかにした 4）。また、cTAGE 5 に低分子量 G タンパク言

質 Sar 1 の活性化因子である Sec 12 が結合することで、ER受容体の脱感作をはじめ、シグナルによるエンドサイト

exit site における Sar 1 の効率的な活性化を介し、ER exit

ーシス経路の制御については盛んに研究が行われている。

site からのコラーゲンの分泌を担っていることを見出し

一方で全タンパク質の約 3 割が関与する小胞体からの分泌た（図 2）5 - 7）。続いて脊椎動物において TANGO 1 に長鎖に関しては、シグナルによる制御機構はほとんどわかっていない（図 1）
。分泌は、細胞内で合成されたタンパク質が細胞外や細胞表面に出るまでの一連の過程である。インス
リンなどのペプチドホルモンや、コラーゲンをはじめとする細胞外マトリックスなど、生体内の多くの因子は分泌されて機能する。これらのタンパク質は、小胞体内で合成された後、ゴルジ体へ輸送され、トランスゴルジ網を経由して最終的に細胞膜表面へ到達する（図 1）。
これまでわれわれは、分泌経路の初期段階である小胞体 - ゴルジ体間のタンパク質輸送に着目してきた。小胞体からゴルジ体へ分泌タンパク質を輸送する COPII 小胞は、小胞体上の特殊な領域である “ER exit site” で形成される。
ER exit site には COPII 小胞の被覆因子である Sec 23 / 24
複合体、Sec 13 / 31 複合体が Sec 16 依存的に集積してい図 1 細胞内分泌経路る 1）。われわれはこれまで、高等真核生物の ER exit siteに局在する新規因子 Transport and Golgi organization 1（TANGO 1）の機能解析を行ってきた。TANGO 1 はショ
ウジョウバエ由来の S 2 細胞を用いた分泌スクリーニン
グによって単離された膜貫通型タンパク質である 2）。われわれは TANGO 1 が ER exit site において、コラーゲンの積荷受容体として機能することを見出した 3）。さらに
TANGO 1 が cTAGE 5 と共受容体として機能することをMecha n isms of col lagen secret ion
regulated by circadian rhythm
Kota Saito
Akita University, Graduate School of
Medicine

図 2 cTAGE5/TANGO1/Sec12 複合体によるⅦ型コラーゲン
分泌モデル− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

（TANGO 1 L）と短鎖（TANGO 1 S）の 2 つのアイソフォー
ムが存在することを明らかにし、両者が Sec 16 と結合することで、協調して ER exit site の場を決定するオーガナ

2 . 4 . 細胞周期の同調
細胞周期の同調は、ダブルチミジン法あるいはノコダゾール法を適宜用いた。

イザーとしての役割を有することを明らかにしてきた 8 , 9）。

3．結

また ER exit site を超解像顕微鏡により観察することにより、ER exit site の構成因子がドメインを形成して存在することを明らかにした 10）。

果3 . 1. TANGO1 の PPS 領域におけるリン酸化修飾
は TANGO1とSec16 の結合親和性を減弱させ、ER exit site を崩壊させる

最近われわれは CK 1 δ, ε による TANGO 1 のリン酸化によって、ER exit site が崩壊することを見出した。CK 1 δ,TANGO1 の各アミノ酸残基におけるタンパク質修飾についε は概日リズムの制御に関与し、CK 1 δ, ε を阻害したマウて、PhosphositePlusを用いて調べた結果、TANGO 1 の細スでは概日リズムが障害されることが明らかになっている。

胞質側領域の一部にリン酸化報告が多数存在する残基を見以上のことは、TANGO 1 によるコラーゲン分泌が CK 1 δ,

出した。この領域（TANGO 1 L: 1651 - 1750 , TANGO 1 S:ε によって制御されている可能性を強く示唆している。事529-628 aa.）をphosphorylation predicted sequences（PPS）

実、最近コラーゲンの分泌が概日リズムによって制御されと命名し、種間保存性を調べた結果、PPS 領域内の配列はている可能性が見出されつつあるが、分子メカニズムの全

他の領域に比較して種間保存性が高いことが明らかになっ貌は未解明であった。

た。また PPS は Sec 16 と TANGO 1 の相互作用領域である

２．方

SIR（Sec 16 Interaction Region）の近傍に存在した。

法

次に、TANGO 1 S の PPS 内にリン酸化候補残基をアラ

2 . 1. 免疫染色

ニンに置換した非リン酸化変異体（SA 変異体）および、グ

冷メタノール固定した細胞を 5% BSA/PBS/0 . 1% Triton

ルタミン酸に置換したリン酸化模倣変異体（SE 変異体）

X- 100 にてブロッキング後、一次抗体および Alexa Fluorを作出し、Sec 16 との結合について検討した。その結果、標識した二次抗体によって染色した。核染色には DAPI を

SE 変異体においては、野生型 TANGO 1 S に比べ Sec 16 と用いた。観察は共焦点顕微鏡 LSM 700（Zeiss）によって行の結合が減弱していた一方で、SA 変異体は野生型よりもった。

結合が増強していた。したがって TANGO 1 の PPS 領域がリン酸化されることで Sec 16 と TANGO 1 の結合親和性が2 . 2 . in vitro キナーゼアッセイ

減弱することが明らかになった。

GST-TANGO1 PRDリコンビナントタンパク質に CK 1 δ（1 -次 に、 内 在 の TANGO 1 L お よ び TANGO 1 S を 発 現 抑

351 aa.）を 添 加 し、20 mM Tris-HCl（pH 7 . 4）、150 mM

制 し た 細 胞 に、TANGO 1 S 各 変 異 体 を そ れ ぞ れ 発 現 さNaCl、0 . 1 % Triton X- 100、2 mM MgCl 2、25 mM［γ- 32 P］

せ ER exit site の形成能を評価した。TANGO 1 L および

ATP 水溶液中で 30 ℃、1 時間反応させた。リン酸化反応

TANGO 1 S を発現抑制した細胞においては、以前報告しは Laemmli Sample buffer と混合し加熱することで停止さたように Sec 16 と Sec 31 が一部乖離して存在するが、野せた。SDS-PAGE 後、オートラジオグラフィーにてリン

生型 TANGO 1 S や SA 変異体を発現した細胞においては酸化を検出した。

Sec 16 , Sec 31 の共局在が回復した。一方で SE 変異体を発現した細胞においては、Sec 16 と Sec 31 は一部乖離した

2 . 3 . 免疫沈降実験およびウエスタンブロット

ままとなった。また、SE 変異体を発現する細胞では小胞

293 T 細胞へのトランスフェクションは PEI を用いた。

体からの VSVG の輸送が遅延していた。以上の結果から、

2 0 mM Tris-HCl（pH 7 . 4）
、1 0 0 mM NaCl、1 mM EDTA、TANGO 1 の PPS 領域がリン酸化されることで、Sec 16 と1 % TritonX- 100 およびプロテアーゼ阻害剤によって破砕の結合親和性が減弱し、ER exit site の崩壊と分泌の阻害

した細胞を 15 , 000 rpm、15 min 遠心した上清を細胞抽出が生じることを示唆している。

液とし、抗 FLAG 抗体による免疫沈降した。TBS/ 0 . 1 %TritonX- 100 で 5 回洗浄後、0 . 2 mg/ml FLAG ペプチドに

3 . 2 . CK1δ は TANGO1 を直 接リン 酸化し、ER

よって溶出した。サンプルは Laemmli Sample buffer と混

exit site を崩壊させる

合し、5 分間煮沸後、SDS-PAGE し、PVDF 膜に転写後、次に、TANGO 1 の PPS 領域をリン酸化するキナーゼを各抗体によってウエスタンブロットを行った。二次抗体は探索した。先行知見として CK 1 δ が小胞体 - ゴルジ体間のHRP 標識されているものを用い、ルミノール・ペルオキ

タンパク質輸送に関与することが明らかになっていたため、シド基質を用い LAS 4000 mini（cytiva）
によって検出した。

CK 1 δ が TANGO 1 を直接リン酸化するかを γ 32 P-ATP を用いた in vitro の評価系で検証した。TANGO 1 は PPS 領− 132 −

概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析として調製し、CK 1 δ は自己リン酸化による活性減弱を防

3 . 4. 細胞分裂期におけるTANGO1 のリン酸化亢進によって ER exit site は崩壊する

ぐため、触媒ドメイン部分のリコンビナントを調製して用細胞分裂期において、分泌の停止に伴って ER exit site

いた。結果、
TANGO 1 は CK 1 δ 存在下でリン酸化されたが、も崩壊し、Sec 16 と Sec 31 は分裂前期から後期にかけて域を含む C 末端 257 アミノ酸領域部分をリコンビナント

32

TANGO 1 の SA 変異を含むリコンビナントにおいて P は局在が乖離することが報告されている。しかし、この一ほとんど検出されなかった。以上の結果より、CK 1 δ によ

時的な ER exit site 崩壊の分子メカニズムは不明だった。

って TANGO 1 の PPS 領域が直接リン酸化されることが明Sec 16 と Sec 31 の乖離は TANGO 1 のリン酸化模倣変異体

らかになった。

発現時や、CK 1 δ の過剰発現時、PP 1 の活性抑制時においさらに、CK 1 δ が ER exit site の構成や形態に与える影ても観察されたこと、PP 1 は細胞分裂期に一時的に活性低響を評価した。CK 1 δ を過剰発現させた細胞では Sec 16 と下することから、我々は細胞分裂期において TANGO 1

Sec 31 は乖離し、TANGO 1 S の SE 変異体を発現させた際の PPS 領域におけるリン酸化が亢進し、Sec 16 との結合がと同様の表現型が観察された。一方、キナーゼ活性を有さ外れることが ER exit site の崩壊の契機となる仮説を考え、ない CK 1 δ K 38 R 変異体を発現させた細胞では、ER exit

その検証を行った。まず、間期と分裂期それぞれにおけるsite の乖離は認められなかった。また、CK 1 δ の阻害剤で

TANGO 1 S のリン酸化量を phos-tag により定量した。そある IC 261 を添加した細胞および CK 1 δ および CK 1 ε をノの結果、nocodazole で細胞分裂期に同調させた培養細胞にックダウンした細胞において、ER exit site は肥大化しておいて野生型 TANGO 1 S のリン酸化量は増加していたが、いた（図３）。以上の結果より、CK 1 δ がキナーゼ活性によ

一方で TANGO 1 S SA 変異体は細胞分裂期においてもリ

り ER exit site の形態に影響を与え得ることが明らかにな

ン酸化量が変化しなかった。したがって、細胞分裂期にはった。

TANGO 1 の PPS 領域においてリン酸化が亢進することが明らかになった。

3 . 3 . TANGO1 は PP1 によって脱リン酸化される

さ ら に、 野 生 型 TANGO 1 S あ る い は TANGO 1 S SA

H 61 株の抗酸化作用がどのような生体経路を介するか変異体を発現する安定発現株での細胞分裂期におけるを調べるために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子

ER exit site の 様 子 を 観 察 し た。 野 生 型 TANGO 1 S を

群を RNA-seq 法で探索した。浮かび上がった遺伝子群を発現する細胞では、親株の HeLa 細胞と同様に、分裂中用いてパスウェイ解析を行ったところ、ミトコンドリアタ

期において Sec 16 /Sec 31 の局在が乖離していた。一方、ンパク質をコードする遺伝子群の多くが発現亢進していた。

TANGO 1 S SA 変異体を発現する細胞では、分裂中期にお検証のために、いくつかのミトコンドリアタンパク質遺伝

いても Sec 16 と Sec 31 が共局在する点が多数認められた。

子に対して qPCR 解析を行ったところ、弱いながらも H 61

この結果は、細胞分裂期における ER exit site の崩壊には株により発現誘導される傾向があることがわかり（図 3）、

TANGO 1 の PPS 領域におけるリン酸化が必要であること

ミトコンドリア生合成が亢進している可能性を示唆された。

を意味している。

図 3 CK1δ/ε のノックダウンにより ER exit site が肥大化する− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

ε は細胞分裂中期における ER exit site の崩壊に重要である
図 4 CK1δ，
CK1δ および CK1ε をノックダウンした細胞をダブルチミジン法により同調させた後、細胞分裂期の細胞を免疫染色した（スケールバー：10µm）。箱ひげ図は Sec16/Sec31 の細胞ごとの共局在率を示す。

さ ら に、 細 胞 分 裂 期 に お け る ER exit site の 崩 壊 にズムに応じた TANGO 1 のリン酸化状態等を検証していく

CK 1 δ が関与する可能性を検討するため、CK 1 δ/ε を発ことにより、今後、さらに ER exit site のシグナルによる現抑制した細胞での ER exit site を観察した。その結果、形成制御機構を明らかにすることができると考える。

TANGO 1 S SA 変異体安定発現株と同様、CK 1 δ/ε を発現抑制した細胞においては Sec 16 と Sec 31 が共局在する点（引用文献）が認められた（図 4）。以上の結果から、細胞分裂期におけ

1） Saito, K.* and Katada, T. Mechanisms for exporting

る ER exit site の崩壊は CK 1 δ による TANGO 1 PPS 領域

large-sized cargoes from the endoplasmic reticulum.

のリン酸化によって生じる可能性が強く示唆された。

Cell. Mol. Life Sci. 72（19），3709-20.（2015）

4．考2） Bard, F., Casano, L., Mallabiabarrena, A., Wallace, E.,察

Saito, K., Kitayama, H., Guizzunti, G., Hu, Y., Wendler, F.,

本 研 究 に よ り、TANGO 1 の PPS 領 域 を CK 1 δ が リ ン

Dasgupta, R., Perrimon, N. and Malhotra, V. Functional

酸化し、PP 1 が脱リン酸化することが明らかになった。

genomics reveals genes involved in protein secretion

CK 1 δ の活性は細胞周期を通じて一定であるが、PP 1 のand Golgi organization. Nature, 439, 604-7.（2006）

活性は細胞分裂期に Cdk 1 -CyclinB 1 複合体によってリ

3） Saito, K., Chen, M., Bard, F., Chen, S., Zhou, H.,

ン酸化されることで減弱する。したがって間期においてWoodley, D., Polischuk, R., Schekman, R. and Malhotra,

TANGO 1 の リ ン 酸 化 状 態 は、CK 1 δ に よ る リ ン 酸 化 と

V. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic

PP 1 による脱リン酸化の平衡状態にあるが、細胞分裂期においては PP 1 の脱リン酸化活性のみが低下するために、
TANGO 1 のリン酸化が亢進すると考えられる 11 , 12）。

reticulum exit sites. Cell, 136, 891-902.（2009）4） Saito, K., Yamashiro, K., Ichikawa, Y., Erlmann, P.,
Kontani, K., Malhotra, V. and Katada, T. cTAGE5

また ER exit site は細胞外環境や概日リズムに応じてそ

mediates collagen secretion through interaction withの数や大きさを変化させ、分泌を調節することが報告され

TANGO1 at endoplasmic reticulum exit sites. Mol.

ている。TANGO 1 と Sec 16 の結合は ER exit site の形成

Biol. Cell, 22, 2301-8.（2011）

起点となることから、細胞分裂期以外の ER exit site の適

5） Saito, K.*, Yamashiro, K., Shimazu, N., Tanabe, T.,

応メカニズムにおいても今回得た知見と同様の制御機構がKontani, K. and Katada, T. Concentration of Sec1 2 at

関与する可能性が考えられる。特に CK 1 δ, ε は概日リズム

ER exit sites via interaction with cTAGE5 is requiredの制御に関与し、CK 1 δ, ε を阻害したマウスでは概日リズ

for collagen export. J. Cell. Biol., 206（6）, 751-62.（2014）

ムが障害されることが明らかになっている。よって概日リ

6） Tanabe, T., Maeda, M., Saito, K.*, and Katada, T.

− 134 −

概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析

図 5 細胞分裂期における ER exit site の形成と崩壊の分子メカニズム

Dual function of cTAGE5 in collagen export from the10）Maeda, M., Kurokawa, K., Katada, T., Nakano, A. andendoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell, 27, 2008-13（2016）

Saito, K.* COPII proteins exhibit distinct subdomains

7） Saito, K.*, Maeda, M. and Katada, T. Regulation ofwithin each ER exit site for executing their functions.

the Sar1 GTPase Cycle Is Necessary for Large Cargo
Secretion from the Endoplasmic Reticulum. Front. Cell
Dev. Biol. 5, 75（2017）

Sci. Rep., 9 , 7346（2019）11）Maeda M., Komatsu Y. and Saito K. “Mitotic ER
exit site dynamics: Insights into blockade of secretion

8） Maeda, M., Saito, K.*, and Katada, T. Distinct

from the ER during mitosis.” Mol. Cell. Oncol., 7（6）,isoform-specific complexes of TANGO1 cooperatively
facilitate collagen secretion from the endoplasmic
reticulum. Mol. Biol. Cell, 27, 2688-96（2016）

1832420（2020）
12）Maeda M., Komatsu, Y. and Saito, K. Mitotic ER
Exit Site Disassembly and Reassembly Are Regulated

9） Maeda, M., Katada, T. and Saito, K.* TANGO1

by the Phosphorylation Status of TANGO 1 . Dev. Cell,

recruits Sec1 6 to coordinately organize ER exit sites
for efficient secretion.J. Cell Biol., 216（6）, 1731-43（2017）− 135 −

55 , 237 - 250 , 1731 - 43（2020）

網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞
ⅩVII 型コラーゲン発現制御機構の解析
北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室

西江渉

Collagen XVII (COL17) is one of the major components forming hemidesmosomes in basal keratinocytes, whichfunctions adhesion between the epidermis and the dermis. Loss of function of COL17 due to gene mutations coding
COL17A1 or autoimmunity to COL17 both read to blistering diseases including epidermolysis bullosa and bullous
pemphigoid. In addition, COL17 is known to play important roles for keeping stemness in keratinocytes. Therefore,
identification of genes regulating COL17 expression must be helpful for developing new therapies for blistering diseases
and elucidating regulation mechanisms of keratinocyte stemness. In this study, we tried to identify key genes upregulating
COL17 expression by CRISPR/Cas9-mediated genome-wide screening. First, as a positive control study, collagen VII(COL7) promoter was introduced upstream of the destabilized GFP (dscGFP) gene in HaCaT immortalized keratinocytes.
This method was able to visualize COL7-related GFP expression in HaCaT keratinocytes. However, COL17 gene expression
was not high enough for performing FACS-sorting when COL17 promoter was introduced upstream of the dscGFP gene in
HaCaT keratinocytes. Therefore, we are analyzing HaCaT keratinocytes in which COL17 promoter was introduced upstreamof the hygromycin resistant gene.

１．緒

胞集団を作製し、COL 17 プロモーター活性が増加した細言

胞集団を解析しノックアウトされた遺伝子を同定する手法

皮膚の表皮基底細胞ヘミデスモゾーム構成分子のひとつを計画した。最初に、lentiCas 9-Blast ベクター（Addgene、である XVII 型コラーゲン（COL 17）は、表皮真皮間接合にBlasticidin 耐性）を 293 TN 細胞へ遺伝子導入し作成したレ

重要な生理機能を担っている。先天的な遺伝子変異に伴うンチウイルス粒子を不死化表皮角化細胞である HaCaT 細

COL 17 の機能障害によって容易に水疱を生じる接合部型胞へ感染させ、Cas 9 タンパク安定発現 HaCaT 細胞株を作

表皮水疱症を発症し、COL 17 に対する後天的な自己免疫成する。次に、COL17 プロモーター領域（− 1251 to +379）

反応が生じると水疱性類天疱瘡を発症する。また COL 17をクローニング後 pGreenFire lenti-reporter ベクター（SBI、は、色素幹細胞の維持や皮膚の老化にも関与する分子であpuromycin 耐性）へ導入し、COL17 遺伝子プロモーター下り、皮膚における COL 17 発現量を制御し増加できると水で destabilized GFP（dscGFP）と Luciferase を 発 現 す る ベ疱性皮膚疾患だけでなく皮膚の抗老化など様々な応用がクターを作成する。その際、VII 型コラーゲン（COL7）遺期待できる。さらに COL 17 は皮膚表皮細胞の幹細胞マー

伝子プロモーター領域（− 1351 to + 145）も同様にクローニ

カーのひとつであるため、COL 17 発現量の増加は表皮幹

ングし、陽性コントロールとして作成した（図 1、A）
。さ

細胞の効率的な培養法確立へ発展する可能性も予想されらに中間報告の結果を踏まえ、ヒグロマイシン耐性遺伝

る。遺伝子の発現量はプロモーター活性に依存するため、子（HygR）を同様に COL 17 プロモーター下に導入したコ

COL 17 プロモーター活性の制御分子の同定は様々な応用

ンストラクトも作成した。網羅的ゲノム編集で用いる約性と発展性が期待できる。そこで、COL 17 発現を亢進す

20 ,000 種の遺伝子を標的とする gRNA 発現コンストラク

る分子を、ゲノム編集を応用した網羅的スクリーニング法 1）

トは、レンチウイルスで導入後 puromycin によるセレクで同定する研究を計画した。

ションが必要なため 1）、作成した COL 17 あるいは COL7

２．実

発現レポーターコンストラクトと Cas9 タンパクを同時験発現する HaCaT 細胞へ、puromycin を標的とする gRNA

網羅的ゲノム編集によって 1 細胞あたり 1 遺伝子（合計（5’-ATCCGGACCGCCACATCGAG- 3’）を 遺 伝 子 導 入 し

約 20 ,000 遺伝子）を網羅的にノックアウトした表皮角化細puromycin 感受性株を得る。最後に、ノックアウト gRNA
ライブラリー（GeCKO v2 , Addgene）を低濃度（MOI= 0.2〜 0 .4）のレンチウイルスで感染させ、puromycin でセレク

Reg ulation mecha nism of collagen
XVII: elucidation by CRISPR/Cas 9 mediated genome-wide screening
Wataru Nishie
Department of Dermatology, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

ション後 GFP 蛍光が増強した細胞群を FACS ソーティング
する。HygR を COL 17 プロモーター下に導入したコンス
トラクト導入細胞では、FACS ソーティングではなくヒグ
ロマイシンを培地へ添加し耐性株をセレクション可能である。COL 17 プロモーター活性が上がった細胞群から抽出し− 136 −

網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞 XVII 型コラーゲン発現制御機構の解析

3．結果

コントロールとして COL 7 レポーターコンストラクトを
レンチウイルスで導入した Cas 9 発現 HaCaT 細胞では、コロニーの辺縁に dscGFP 発現が増強した細胞群が確認された（図 1、B）。一方、COL 17 レポーターコンストラクトを導入した Cas 9 発現 HaCaT 細胞では、予想に反し明瞭な
GFP 蛍光を発する細胞は認めなかった。作成した COL 17
レポーターコンストラクトを 293 細胞へ一過性にトランス
フェクションしたところ GFP 蛍光を確認したため、可視下で確認可能な発現量ではない可能性を考えた。FACS ソー
ティングでの細胞分離が困難と判断し、抗生剤でのセレクションを考えた。そこで COL 17 プロモーター下に HygRを発現する系を新たに作成し（図 2、A）lentiCas 9 -Blast 発
現 HaCaT 細胞へレンチウイルスで導入したところ、比較的高濃度のヒグロマイシン下でも耐性となるクローンを複Fig. 1 GFP 蛍光下で COL17 および COL7 プロモーター活性を可視化するコンストラクト（A）。COL7 プロモーター活性を可視化した HaCaT 細胞。細胞辺縁で発現量が増加している（B）。

数認め薬剤でのセレクションが可能と判断した（図 2、B）。

4．考察

今回クローニングした COL 17 プロモーター領域は、
HaCaT 細胞では GFP 蛍光を目視できない程度の低レベル
た DNA をテンプレートに用い、導入された GeCKO v 2 のであると予想された。そこで薬剤耐性遺伝子（ヒグロマイ

gRNA 配列領域を PCR 法で増幅後、次世代シークエンサー

シン耐性遺伝子）を用い、COL 17 プロモーター活性が増強（Miseq）
でアンプリコンシーケンスを行う。シーケンスデー

した細胞を採取する新たな手法を検討したところ、複数の2）

タ（FASTQファイル）をMAGeCKFlute で解析し、COL17

薬剤耐性クローンの樹立に成功した。薬剤耐性遺伝子を用あるいは COL7 発現増強に関与する遺伝子を同定する。

いるとセレクション濃度を最適化が容易なため、COL 17

Fig. 2 COL17 プロモーター下でヒグロマイシン耐性遺伝子（HygR）を発現するコンストラクト（A）。ヒグロマイシン耐性クローンを複数確認した（No.6, 10, 12、B）。

− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

プロモーター活性が上がった細胞群を FACS ソーティング

量を蛍光で確認できるため非常に有用と思われる。既により簡便に分離できることが期待できる。本研究期間内でCas 9 タンパクを発現しているため、標的となる遺伝子のは細胞群の採取まで至らなかったが、今後機会があれば実gRNA を導入するだけで網羅的ゲノム編集が可能である。

験を継続したいと考えている。一方、COL 7 レポーターコ

予想に反して COL 17 プロモーター活性は GFP 蛍光を可視ンストラクトを導入した HaCaT 細胞ではコロニー辺縁の化可能なほど十分ではなかったが、抗生物質耐性遺伝子を細胞群で発現が増強していた（図１、B）。本所見は COL 7

発現することは可能であった。今後、ヒグロマイシン濃度

遺伝子発現が TGF-β で制御されるという過去の報告に矛を最適化した後に COL 17 発現を制御する新規遺伝子が同3）

盾せず 、培養下で COL 7 の発現量を間接的に可視化可能

定されることを期待している。

な画期的な実験系である。今後、細胞の遊走や創傷治癒における COL 7 の機能解析など、様々な研究に応用されることが期待される。

（引用文献）
1） Joung J, et al. Nat Protoc 12: 828-863, 2017.
2） Wang B, et al. Nat Protoc 14: 756-780, 2019.

５．まとめ

3） Akasaka E, et al. J Invest Dermatol 141: 1450-1460,

今回作成した遺伝子改変 HaCaT 細胞は、遺伝子の発現

2021.

− 138 −

亜鉛シグナルはどのように表皮バリア機能を制御しているのか？
−ZIP10 を標的とするバリア機能制御物質の探索−
徳島文理大学薬学部病態分子薬理学研究室

深田俊幸

Zinc is an essential trance element for life, and zinc deficiency causes numbers of symptoms including dermal
inflammation and immune deficiency, so that zinc homeostasis must be tightly fine-tuned via zinc transporters, however, theinvestigations for the involvement of zinc transporters in skin and immunological homeostasis have not been conducted indetail so far.
Previously, we have demonstrated that zinc transporter SLC39A10/ZIP10 plays important roles in early B cell
development and B cell-mediated immune responses. Further, we have found that ZIP10 is highly expressed in the hairfollicles, which is required for skin and hair follicles formation, however, there is limited information on ZIP10-expressing
cells about their physiological roles, their fate determining, and the molecular events controlled by zinc transporter ZIP10.
To clarify the physiological functions of ZIP10 and the profiles of ZIP10 expressing cells in vivo, we have generated
Zip10-IRES-GFP knock-in (Zip10-GFP-KI) mouse, which was further crossed with Rosa26 Tomato-KI mouse to generate
Zip10-GFP/Tomato-KI mouse. The GFP expression was detected in the hematopoietic stem cell and ZIP10-expressing pre-/pro-B cell populations in the bone marrow cells from the Zip10-GFP-KI mice. Tomato expression was also detected in partof the ZIP10-expressing pre-/pro-B cell populations, indicating that Tomato expressing pre-/pro-B cells were derived from
ZIP10-expressing progenitor cells. In skin of the mice, GFP and Tomato were detected around the lower and upper bulge
regions, respectively. The hair follicle stem cell populations also contained GFP and GFP/Tomato expressing cells.
These findings indicated that both Zip10-GFP-KI and Zip10-GFP/Tomato-KI mice are valuable tools to investigate
the functions of ZIP10 and the fate of the ZIP10-expressing cells in vitro and in vivo, which will bring us numbers ofopportunities for better understanding of the dermatology and the cosmetology in the future.

１．緒ZIP 10 を発現することを見出したので、以下にその内容を

言

報告する。

亜鉛は生命の維持に不可欠な微量金属であり、細胞内外

２．方における亜鉛の恒常性は亜鉛トランスポーターが担ってい法

シウムイオンのようにシグナル因子（＝亜鉛シグナル）とし

2 . 1. Zip10 -GFP-KIマウスとZip10 -GFP/TomatoKIマウスの作成て細胞機能を制御する 1）。代表研究者は、亜鉛トランスポ

ZIP10 発現細胞の特徴を解析するために、EGFP-IRES-

ーター ZIP 10 の亜鉛シグナルが表皮バリア機能に必要でCreERT2 遺伝子カセットを Zip 10 プロモーター下流に挿あることを見出し、ZIP 10 が皮膚領域における重要な研究

入（knock-in: KI）したZip 10-GFP-KIマウスを作成した（図対象であることを示した 2）。一方、ZIP 10 の亜鉛シグナル

1 :未発表）。

る。亜鉛トランスポーターが輸送する亜鉛イオンは、カルが表皮バリア機能をどのように制御しているのか、その詳

ZIP 10 発現細胞の子孫細胞を可視化するために、Zip10GFP-KI マ ウ ス と Rosa26 領 域 に loxp 配 列 で 挟 ま れ た

細な分子機序はまだ解明されていない。
本研究は、「ZIP 10 の亜鉛シグナルは、表皮バリア機
能にどのような役割を演じているのか」について解明し、Tomato 遺伝子を挿入した Tomato-KI マウスを交配してZip10-GFP/Tomato-KIマウスを作成した。

ZIP 10 を標的とする表皮バリア機能に有用な新しい素材

Zip 10-GFP/Tomato-KI マウスの ZIP10 発現細胞は、タを探索することを目標に設定した。ZIP 10 は血球系細胞

モキシフェン依存的に活性化される CreERT 2 が発現するにも発現すること 3 , 4）、表皮バリア機能には血球系細胞のため、当該マウスをタモキシフェンで処理すると、ZIP 10関与も示されていることから、造血幹細胞も研究対象に加発現細胞はTomato を発現して赤色発光し、ZIP10 発現が消えて解析した。現時点で、毛包幹細胞および造血幹細胞が失した後も Tomato を発現する。したがって、Zip10-GFP/

How does zinc signaling control theskin barrier functions?
Toshiyuki Fukada
Molecular and Cellular Physiology,
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Tokushima Bunri University− 139 −

図 1 Zip10-GFP-IRES-CreERT2-KI（Zip10GFP-KI）マウスのゲノムマップ

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Tomato-KI マウスを用いることにより、ZIP10 を発現する確認した（図 5 : 未発表）
。さらに、タモキシフェン処理した細胞とその子孫細胞を可視化することができる。

Zip 10 -GFP/Tomato-KI マウスの B 前駆細胞には、GFP 陽性細胞と GFP/Tomato 共陽性細胞が存在することを確認し

2 . 2 . 毛包に関する解析た（図 6 : 未発表）。

Zip 10-GFP-KI マウスの背部皮膚試料を蛍光顕微鏡で観これらの結果は、造血幹細胞群またはその亜集団に察し、毛包における GFP の発現を精査した。ZIP 10 発現細ZIP 10 発現細胞が存在すること、B 前駆細胞が ZIP 10 を発胞の子孫細胞を可視化するために、Zip10 -GFP-KI マウス

現することを示すとともに、B 前駆細胞が ZIP 10 を発現しと Tomato-KI マウスを交配した Zip10 -GFP/Tomato-KI マていた細胞から分化した可能性を示唆するものと考える。

ウスにタモキシフェンを腹腔内投与し、皮膚の毛包幹細胞
における GFPと Tomatoの発現をFACS で解析した。

2 . 3 . 血球系細胞に関する解析
Zip10-GFP-KI マウスの骨髄由来細胞を用いて、造血幹細胞および B 前駆細胞画分における GFP の発現を FACS で
解析した。

3．結

果

3 . 1. 毛包に関する解析
Zip 10 -GFP-KI マ ウ ス の 皮 膚 毛 包 に、GFP の 発 現 を確認した（図 2 : 未発表）
。さらに、タモキシフェン処理した Zip 10 -GFP/Tomato-KI マウスの毛包および上部バルジ領域に Tomato の発色を確認した（図 3 : 未発表）
。加えて、FACS による毛包幹細胞分画の解析により、GFP お

図 4 タモキシフェン処理した Zip10-GFP-KI マウスの毛包幹細胞（HFSCs）
における GFP と Tomato の検出

よび Tomato の発現を確認した（図 4 : 未発表）
。すなわち、
ZIP 10 発現細胞および ZIP 10 発現細胞の子孫細胞が、毛包幹細胞分画に存在することが示唆された。

3 . 2 . 血球系細胞に関する解析
Zip 10 -GFP-KI マウスの造血幹細胞に、GFP の発現を

図 5 Zip10-GFP-KI マウスの造血幹細胞における GFP の検出

図 2 Zip10-GFP-KI マウスの皮膚組織における毛包周囲の GFP の検出

図 3 タモキシフェン処理した Zip10-GFP/Tomato-KI
マウスの毛包周囲組織における GFP とTomato の検出

図 6 Zip10-GFP/Tomato-KI マウスにおける（a）B 前駆細胞（preB/proB 分画）と（b）GFP/Tomato 共陽性細胞の検出− 140 −

亜鉛シグナルはどのように表皮バリア機能を制御しているのか？ーZIP10 を標的とするバリア機能制御物質の探索ー

4．考な皮膚の形成と維持を科学するコスメトロジーの発展に貢察献したいと考えている。

毛包幹細胞分画に ZIP 10 発現細胞の子孫細胞が存在することから、ZIP 10 が毛包幹細胞の分化や維持に関与する可能性が示された。一方、ZIP 10 が造血幹細胞に発現する謝辞コロナ禍の影響を多大に受けた研究期間でありましたが、ことから、ZIP 10 が造血幹細胞の細胞増殖や維持等に関与

貴財団のご援助により、本研究を大きく進展させることがすることが示唆された。

できました。得られた研究成果を基盤にして、本研究をさ今後は、毛包幹細胞や造血幹細胞における ZIP 10 の役
割を解明するために、Zip 10 -GFP/Tomato-KI マウスからに発展させるべく邁進する所存です。貴財団の御高配に心よりお礼申し上げます。

ら ZIP 10 を発現する毛包幹細胞および造血幹細胞を GFPと Tomato を指標にしてソーティングし、RNA-sequence
や singe cell analysis によって遺伝子発現様式を精査して、これらの細胞の特徴を解析する。さらに、ZIP 10 の亜鉛シ
グナルを制御する化合物を探索して、毛包と表皮の形成に係る創薬研究のための実験を実施する。

５．総（引用文献）
1） Fukada T. and Kambe T. Zinc Signaling（editor）,
Springer Nature Singapore Pte Ltd.2019
2） Bin BH, et al. Requirement of zinc transporter ZIP10
for epidermal development: Implication of the ZIP1 0–
p6 3 axis in epithelial homeostasis. Proc. Natl. Acad.

括

Sci. USA 114: 12243-12248, 2017

我々が開発したZIP10 発現細胞とその子孫細胞を可視化

3） Miyai T, et al. Zinc transporter SLC3 9A1 0/ZIP1 0

することができる Zip 10 -GFP-KI マウスと Zip 10 -GFP/

facilitates antiapoptotic signaling during early B-cell

Tomato-KI マウスは、「亜鉛トランスポーター ZIP 10 の亜development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 11780-

鉛シグナルは、表皮バリア機能にどのような役割を演じて85, 2014

いるのか」を究明する上で極めて有用なツールであり、本

4） Hojyo S, et al. Zinc transporter SLC3 9A1 0/ZIP1 0

研究ではこれらのマウスに由来する細胞の解析を進めるこ

controls humoral immunity by modulating B cellとにより、ZIP 10 を発現する毛包幹細胞等の特徴と役割の

receptor signal strength. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

解析を実施した。

111: 11786-11791, 2014

本研究期間には、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では5）5） K.Nakajima, et al. Possible involvement of zinc

ZIP 10 の発現が減少していること 、亜鉛シグナルは表皮transporter ZIP1 0 in atopic dermatitis. J.Dermatol.

におけるエピジェネティックな遺伝子発現の制御に関与

47:e51-e53, 20206）

することを見出している 。今後の研究において、Zip 10 -6） Lee MG, et al. Implication of the zinc-epigenetic axis

GFP-KI マウスと Zip 10 -GFP/Tomato-KI マウスを様々

in epidermal homeostasis J.Dermatol. Sci. 98: 203‒206,

な実験に適用することにより、亜鉛トランスポーター

2020

ZIP 10 が関わる皮膚科学の理解と、亜鉛が関与する健康的− 141 −

無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立とin vivo 薬効評価系の構築
明治薬科大学微生物学研究室

松本靖彦

Cutibacterium acnes is a causative agent of inflammatory skin diseases such as acne vulgaris. In this study, weestablished a silkworm infection model to evaluate the host toxicity caused by C. acnes, and the efficacy of antibacterial
drugs. Silkworms infected with C. acnes died when reared at 37˚C. The dose of injected bacterial cells required to kill
half of the silkworms (LD50) was determined under rearing conditions at 37˚C. The viable cell number of C. acnes wasincreased in the hemolymph and fat body of the infected silkworms. The survival time of silkworms injected with C. acnes
was prolonged by the injection of antibacterial drugs such as tetracycline and clindamycin. Acute melanization, an innate
immune response of silkworm, was induced by infection of C. acnes, but not by that of Staphylococcus aureus that causesa skin disease such as atopic dermatitis. Co-infection of C. acnes and S. aureus on the skin surface of silkworms led to skinmelanization. These findings suggest that the silkworm C. acnes infection model can be used to evaluate host toxicity andinnate immune response caused by C. acnes.

１．緒

難な化粧品開発において重要な代替動物になると考えられ言る。一般にカイコなどの無脊椎動物は、哺乳動物と比べて、皮膚は多数の細菌から構成される細菌叢によって健常な1 動物を飼育するためのコストが低い

皮膚バリア機構を維持している。しかし、バランスを保っ

2 狭いスペースで大量の個体が飼育可能ている皮膚細菌叢が何らかの原因によって崩壊することで3 脊椎動物に比べ殺傷に対する倫理的問題が少ない

尋常性ざ瘡やアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患が発

4 個体サイズが小さく、実験に必要なサンプル量が少ない症 す る。Cutibacterium acnes（Propionibacterium acnes）
が尋常性ざ瘡の起因菌であると考えられており、これまでなどの利点が挙げられる。また、化合物のカイコへの毒性にマウスを用いた尋常性ざ瘡の実験モデルが確立されていや抗生物質の治療効果は、マウスやラットなどの哺乳動物

1）る 。このような動物を用いた化合物の評価系は化粧品やと類似している 3 , 4）。よって、カイコは、化合物の薬効や医薬品の開発に重要である。

毒性に関する研究を行う上で有用な実験動物である 5）。し哺乳動物を使った動物実験の場合、国際指針である 3 Rs
（Reduction, Refinement, Replacement）を遵守して研究を
2）

かし、これまでにカイコを用いた炎症性皮膚疾患モデルは確立されていない。

遂行しなければならない 。すなわち、多数の哺乳動物をカイコにおける自然免疫機構の一つに体液のメラニン化用いて実験を行うことは動物愛護などの倫理的側面から困反応がある。メラニン化は、細菌や真菌などの外来の異物難になってきており、有効な化合物の探索研究などの基礎が体内に侵入すると体液内でメラニンを生成させて、侵入研究を行う上で生じる倫理的な問題が今後はもっと深刻にした異物を凝集させる反応である。このカイコにおける体なると予想される。

液のメラニン化と Toll 経路を介した免疫応答は同じシグナ

我々は、これらの問題点を克服する方法の一つとして、無脊椎動物であるカイコの利用を提案している。無ル伝達経路を介する 6）。よって、カイコにおけるメラニン
化反応は、自然免疫誘導の指標となり得る。

脊椎動物であるカイコを用いることは、Replacement の中本研究で我々は、カイコを用いて C. acnes に対する治療で記載されている下等生物を用いた代替実験手法の確立

薬の薬効を評価できるカイコ感染モデルを確立した。また、（Relative Replacement）のコンセプトと合致している。よ

カイコの体液のメラニン化を指標とした C. acnes の免疫活って、カイコは哺乳動物を用いた基礎研究を行うことが困

性化の評価系を構築した。さらに、C. acnes と黄色ブドウ球菌の共感染によるカイコの皮膚のメラニン化が誘導される感染実験系を確立した。

Development of an in vivo drug efficacy
evaluation system and a skin infection
model using an invertebrate
Yasuhiko Matsumoto
Meiji Pharmaceutical University

２．方法

2 . 1. 菌の培養本研究で我々は、C. acnes ATCC6919 株、及び黄色ブドウ球菌Newman株を使用した。C. acnes ATCC6919 株の培− 142 −

無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立と in vivo 薬効評価系の構築

養では、菌を GAM 寒天培地に塗布し、嫌気条件、37 ˚C に色ブドウ球菌の生菌をオリーブオイルで懸濁して、ガーゼ

おいて 3 日培養した。黄色ブドウ球菌 Newman 株の培養でに染み込ませて消毒した部位に貼付した。カイコを 37˚C では、菌を TSB 寒天培地に塗布し、好気条件、37˚C で 1 日培

飼育し、24 時間後にガーゼを剥がしてカイコの背面の写真

養した。

を撮った。

3．結

2 . 2 . カイコ感染実験
カイコの卵は、愛媛蚕種から購入して、消毒後に 25 ˚C で

果3 . 1. カイコ感染モデルの開発孵化させた。カイコは、Silkmate 2S という抗生物質を含変温動物であるカイコは、飼育温度を変えることでカイむ人工餌を与えられた。5 齢のカイコを実験に用いた。5コの体温を調節でき、病原微生物ごとにカイコに対する齢のカイコに人工餌である Silkmate 2 S を 1 日給餌させた。

病原性に至適な飼育温度が異なる 7）。C. acnes は皮膚上でGAM 寒天培地上で生育した C. acnes を生理食塩水で懸濁しはおよそ 32 ˚C で生存し、ヒトの体内では 37 ˚C で生存する。

た。C. acnes の懸濁液 50µL を 1mL ツベルクリンシリンジ

そこで我々は、C. acnes がカイコに対して病原性を示す飼を用いてカイコに接種した。C. acnes を接種したカイコを育温度を検討した。C. acnes のカイコへの接種後 37 ˚C での27 ˚C、もしくは 37 ˚C で飼育し、カイコの生存数、もしくは飼育では、カイコに C. acnes を接種して 40 時間後に全て体液中の C. acnesの生菌数を測定した。

のカイコが死亡し、32 ˚C での飼育条件より早くカイコが死亡した（図 1 A、B）
。37 ˚C での飼育条件における C. acnes

2 . 3 . カイコの体液のメラニン化試験のカイコを半数を死亡させるために必要な接種菌量である

人工餌を一晩摂食した 5 齢のカイコに C. acnes や黄色ブ

LD 50 値は、1 - 4 × 108 細胞であった（図 1 C）
。これらの結果

ドウ球菌の菌液を注射後にカイコの体液を回収した。96 ウ

から、37 ˚C 飼育条件の方が、C. acnes の接種によりカイコェルマイクロプレートにカイコの体液を 50µL と生理食塩が死亡しやすく、その条件で定量的な病原性の評価に利用

TM

水を 50µL を添加した。BaioRad の iMark

マイクロプレーできるLD 50 値が算出できることが示唆された。次に我々は、
C. acnes の接種によるカイコの死が、カイコの体内での菌トリーダーを用いて 490nm の吸光度
（A 490）を測定した。

数の増加による感染であるか検討した。C. acnes をカイコ

2 . 4 . カイコの表皮感染によるメラニン化に接種して 1 時間後より 24 時間後の方がカイコの体液中、人工餌を一晩摂食した 5 齢のカイコの背面の体表を 70 %及びカイコの脂肪組織である脂肪体での C. acnes の生菌数

エタノールで清拭し、30 分間室温に置いた。C. acnes と黄が多かった（図 2）。また、C. acnes のオートクレーブ処理

図 1 C. acnes によるカイコの感染死
カイコに C. acnes を接 種 後 に 32˚C（A）、
及び 37˚C（B）で飼育し、それぞれの条件におけるカイコの⽣存率を経時的に測定した。
（C）
カイコ感染実験における C. acnes の⽤量依存性試験。独⽴した 3 回の実験結果を⽰した。

− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

菌体ではカイコが死亡しなかった（図 3）。これらの結果かカイコに抗菌薬であるテトラサイクリンやクリンダマイシ

ら、カイコに対する C. acnes の病原性が細胞壁などの菌体ンを投与すると、カイコの生存時間が延長した（図 4）。こ成分によるショック死ではなく、生菌であることが必要なの結果から、C. acnes のカイコ感染モデルを用いて in vivo感染であることが示唆された。

での抗菌薬の薬効評価が行えることが示唆された。

3 . 2 . カイコ感染モデルを用いた抗菌薬の評価

3 . 3 . C. acnes によるカイコの体液のメラニン化

次に我々は、C. acnes によるカイコに対する病原性に対

C. acnes によるカイコの体液のメラニン化を免疫誘導能

して抗菌薬が効果を示すか検討した。C. acnes を接種したの指標として評価できる条件の検討を試みた。C. acnes の

図 2 カイコの体液、及び脂肪体における C. acnes の増殖（A）コ感染実験のスケジュールを⽰した。カイコに C. acnes を接種して 1 時間後、及び 24 時間後に体液（B）、及び脂肪体（C）を採取し、C. acnes の⽣菌数を測定した。

図 3 熱処理による C. acnes のカイコに対する毒性の消失（A）
カイコに C. acnes の⽣菌、及び⾼圧蒸気滅菌した C. acnesを接種してカイコの⽣存率を経時的に測定した。
（B）C. acnesの菌体サンプルを接種して 48 時間後のカイコを⽰す。

図 4 抗菌薬の投与による C. acnes が感染したカイコの延命効果
カイコに C. acnes を接種後、すぐにテトラサイクリン（A）、及びクリンダマイシン（B）を接種し、⽣存率を経時的に測定した。

− 144 −

無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立と in vivo 薬効評価系の構築

カイコへの接種後に 37 ˚C の飼育条件で 3 時間以内にカイ皮膚でのメラニン化が誘導された（図 7）。これらの結果は、

コの体液の黒色化が確認された（図 5）。次に C. acnes 以外

C. acnes によるカイコの皮膚上でのメラニン化の誘導に黄のグラム陽性細菌と免疫誘導能を比較するために、表皮に色ブドウ球菌が補助的な役割を演じる可能性を示唆してい存在してアトピー性皮膚炎の増悪化に関わる黄色ブドウ球る。

菌を用いて検討した。C. acnes を接種した方が黄色ブドウ4．考

球菌よりカイコの体液のメラニン化が亢進していた（図 6）。
以上の結果は、C. acnes が黄色ブドウ球菌よりカイコの免疫を強く誘導する活性があることを示唆している。

察

本研究で我々は、C. acnes の宿主障害性を評価するための実験条件を見出し、C. acnes のカイコ感染モデルを用いた抗菌薬の薬効評価系を確立することができた。また、カ3 . 4 . C. acnesと黄色ブドウ球菌の共感染によるカイコの皮膚のメラニン化

イコの免疫応答であるメラニン化の亢進を指標に C. acnes

C. acnes の菌体をカイコの皮膚に塗布することでカイコ

C. acnes と黄色ブドウ球菌の共感染により、カイコの皮膚の皮膚でのメラニン化が起こるか検討した。C. acnes や黄にメラニン化が起こる条件を見出した。我々は、C. acnesの過剰免疫応答を評価できることが示唆された。さらに、

色ブドウ球菌の単独感染ではカイコの皮膚上のメラニン化の誘導は起こらなかった（図 7）。一方、C. acnes と黄色ブドウ球菌をカイコの皮膚上で共感染させることでカイコの図 5 C. acnes によるカイコの体液のメラニン化
カイコに C. acnes を接種し、カイコの体液を経時的に採取し、490 nm の吸光度を測定した。

図 6 カイコの体液のメラニン化の誘導における細菌間の⽐較
カイコに C. acnes、及び⻩⾊ブドウ球菌（S. aureus）を接種して 3 時間後にカイコの体液を採取し、490nm の吸光度を測定した。

図 7 C. acnes と⻩⾊ブドウ球菌の共感染によるカイコの体表のメラニン化
C. acnes、及び⻩⾊ブドウ球菌（S. aureus）をオリーブオイルで懸濁してガーゼに染み込ませてカイコの体表に貼付した。感染させて24 時間後のカイコの体表を⽰す。

− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022のカイコ感染モデルを用いた抗菌薬の評価やカイコのメラて採用することは次世代の化粧品開発の基盤的技術としてニン化を基軸とした皮膚感染モデルの確立ができたと考え重要性は高いと考えられる。

ている。
カイコに病原性微生物を接種させた時に菌体成分による
8）

謝

辞

ショック死が起こることがある 。歯周病菌をカイコに接本研究の遂行にあたり、ご支援いただきました公益財団

種するとカイコは死亡するが、その熱処理死菌でもカイコ

法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げ

は死亡する 8）。このショック死の条件だと抗生物質で治療

ます。

8）

することはできない 。本研究での C. acnes のカイコ感染モデルでは、熱処理死菌の投与ではカイコが死なず、また本研究助成により得られた成果

抗菌薬で治療ができることから、カイコの体内で C. acnes

Matsumoto Y, et al, Evaluation of Antibacterial Drugsが増殖することがその病原性に重要であることが考えられUsing Silkworms Infected by Cutibacterium acnes.

る。

Insects, 12 : 619（2021）

尋常性ざ瘡は C. acnes による過剰免疫応答による疾患である。哺乳動物細胞において、この C. acnes の菌体成分に（引用文献）

よる過剰免疫応答には Toll like Receptor が関与している。

1） Kolar SL, et al., Propionibacterium acnes-induced

カイコのメラニン化反応も菌体成分を認識して Toll 経路のimmunopathology correlates with health and disease

活性化と並行して起こる免疫応答である 6）。よって、我々

association. JCI Insight, 4:e124687（2019）

はカイコのメラニン化反応を定量することで C. acnes の免

2） Weihe WH. Use and misuse of an imprecise concept:

疫誘導活性を評価できるのではないかと考えている。さらalternative methods in animal experiments. Lab Anim.,に、C. acnes と黄色ブドウ球菌をカイコの皮膚上で共感染

19:19-26（1985）

させることでカイコの皮膚でのメラニン化が誘導された。

3） Usui K, et al, Acute oral toxicity test of chemical

黄色ブドウ球菌は、溶血毒素やプロテアーゼなどの表皮細compounds in silkworms. Drug Discov Ther., 10:57-61

胞を障害するタンパク質を放出する。黄色ブドウ球菌が表（2016）

皮細胞を障害した後に C. acnes のメラニン化の誘導物質が4） Paudel A, et al, Pharmacokinetic parameters explain

真皮に届き、メラニン化を誘導した可能性があると考えて

the therapeutic activity of antimicrobial agents in aいる。

silkworm infection model. Sci Rep., 8:1578（2018）

本研究では、カイコで炎症性皮膚疾患を引き起こす C.

5） Matsumoto Y. Facilitating Drug Discovery in Humanacnes の宿主障害性や免疫誘導活性の評価ができる可能性

Disease Models Using Insects. Biol Pharm Bull.,が示された。今後は抗菌薬や化粧品の候補となる化合物の

43:216-220（2020）
6） Geng T, et al, Lineage-specific gene evolution of

薬効評価が行えるかが課題となるだろう。

５．総

innate immunity in Bombyx mori to adapt to challenge括by pathogens, especially entomopathogenic fungi. Dev

本研究で我々は、C. acnes の体液内への摂取によりカイComp Immunol., 123:104171（2021）

コが死亡すること、並びにそのカイコ感染モデルを用いて

7） Matsumoto Y, and Sekimizu K, Silkworm as an

抗菌薬の薬効評価が行えることを見出した。我々の知見は、

experimental animal for research on fungal infections.

カイコ感染モデルが C. acnes の感染における病原性や抗菌

Microbiol Immunol., 12:619（2019）

薬の薬効評価に有用であることを示唆している。カイコを

8） Ishii K, et al, Porphyromonas gingivalis peptidoglycans用いた実験は哺乳動物を用いた実験より倫理的な問題を回induce excessive activation of the innate immune

避する上で有用であると考えられる。今後さらに厳しくな

system in silkworm larvae. J Biol Chem., 285:33338-47

る動物実験の制限に対応する上で、カイコを実験動物とし（2010）− 146 −

X 線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構の解明
安田女子大学薬学部薬学科

的場康幸

Tyrosinase (Ty) and catechol oxidase (CO) are members of type-3 copper enzymes. While Ty catalyzes both phenolase
and catecholase reactions, CO catalyzes only the latter reaction. In the present study, Ty was found to catalyze thecatecholase reaction, but hardly the phenolase reaction in the presence of the metallochaperon called “caddie protein (Cad)”.
The ability of the substrates to dissociate the motif shielding the active-site pocket seems to contribute critically to thesubstrate specificity of Ty. In addition, a mutation at the N191 residue, which forms a hydrogen bond with a water molecule
near the active center, decreased the inherent ratio of phenolase versus catecholase activity. Unlike the wild-type complex,
reaction intermediates were not observed when the catalytic reaction toward the Y98 residue of Cad was progressed in
the crystalline state. The increased basicity of the water molecule may be necessary to inhibit the proton transfer from theconjugate acid to a hydroxide ion bridging the two copper ions. The deprotonation of the substrate hydroxyl by the bridging
hydroxide seems to be significant for the efficient catalytic cycle of the phenolase reaction.

１．緒の銅イオンが酸化されているものの、分子状酸素とは結合言していない構造を指す。Ty のフェノラーゼ活性はオキシ

メラニン色素生成に関わる酵素としてチロシナーゼ型酵素によって触媒されるが、カテコラーゼ活性はオキシ（Ty）が知られている。本酵素は、アミノ酸の一種である型でもメト型でも触媒される。オキシ型酵素がフェノラー

チロシンをメラニン前駆物質であるドーパキノンへと変換

ゼ活性を触媒すると、デオキシ型に変換され、次の触媒サする反応を触媒する。この反応は皮膚や毛髪のメラニン色

イクルに向かう。一方、オキシ型酵素がカテコラーゼ活性素合成に関わっており、皮膚で過剰にメラニンが生成するを触媒するとメト型に変換され、メト型酵素がカテコラーとシミやソバカスの原因となる。このため、Ty 活性を阻

ゼ活性を触媒すると、デオキシ型に変換される。このため、害すれば、メラニン色素の生成を抑制できる。Ty は、そTy と CO の酵素学的違いとは、オキシ型酵素がフェノラの活性中心に 2 個の銅イオンを含むⅢ型銅結合酵素であーゼ活性を持つかどうかという点に集約できる。

り、ヒトから細菌に至るまで広く分布している。また、本研究対象としている放線菌由来 Ty は、特異的な銅輸送酵素の活性中心部位を含む約 250 アミノ酸からなる領域は、タンパク質（Cad）との複合体として産生される。この複合生物種を超えてアミノ酸配列上での相同性が認められる。

体に銅イオンを添加すると、Ty の活性中心に銅イオンがTy は、チロシンやチラミンをはじめとするフェノール基

取り込まれ、Ty は活性型に変化する。その一方で、Cad質、および、ドーパやドーパミンをはじめとするカテコー

は複合体から解離し、解離した Cad は重合して凝集体をル基質に作用し、両者をオルトキノンに変換する。それぞ形成する。Ty・Cad 複合体の結晶構造（図 1）においては、れの酵素活性をフェノラーゼおよびカテコラーゼ活性という。一方、Ty と同じⅢ型銅結合酵素であるカテコールオ
キシダーゼ（CO）は、フェノールを基質とすることができず、カテコラーゼ活性のみ有する。
Ⅲ型銅結合酵素の活性中心は、デオキシ型、オキシ型、
メト型という 3 つの構造をとる。デオキシ型では活性中心にある 2 つの銅イオンが還元されており、分子状酸素と結合してオキシ型を生じる。メト型は、活性中心にある 2 つElucidation of maturation and catalytic
mechanisms of tyrosinase based on the
crystal structure
Yasuyuki Matoba
Faculty of Pharmacy, Yasuda Womenʼs
University− 147 −

図 1 Ty・Cad 複合体の結晶構造
Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Cad の Y 98 残基が、Ty の活性中心にフタをするように位置している 1）。筆者は、Cad の Y 98 残基が Ty の触媒作用により、ドーパキノンへと変換されることを発見した 2）。
また、Y 98 残基に対する酸化反応を時間分割 X 線結晶構
造解析で観察することにより、触媒機構を予測することに成功した 3）。一方、海外グループの研究により、活性中心近傍に存在するシールドモチーフや水分子が Ty のフェノラーゼ活性に重要であると指摘されている 4）。
本研究では、放線菌由来 Ty を研究対象とし、その成熟化機構と反応機構を構造学的に明らかにすることを試みる。
得られた知見は、より高等な生物の持つ Ty においても共

図 2 Ty・Cad 複合体における Ty の活性中心の構造
Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

通していることが予想され、ヒトの Ty を対象にした効果的な阻害剤開発に役立つと考えられる。

２．方

法

3．結

本研究では、活性中心近傍に存在する水分子 Wat4 に着果目した（図 2）。放線菌 Ty において、この水分子は E 182 と

Cad と 結 合 し て い な い 野 生 型 Ty は 調 製 で き た が、N 191 残基の側鎖と水素結合している。各種Ⅲ型銅結合酵素

N 191 G 変異型 Ty は調製できなかった。そこで、Cad と複のアミノ酸配列を比較すると、放線菌 Ty の E 182 に対応す合体を形成している野生型もしくは N 191 G 変異型 Ty に、る残基はグルタミン酸であり、高度に保存されている。一方、

0 . 1 mM CuSO 4 と 1 mM NH 2 OH を添加し、30 ℃で 5 分間

N 191 に対応する残基は、Ty では保存されている場合が多放置することで、Ty を活性化した。その後、種々の濃度

いが、CO ではグリシンになっている場合が多い。そこでの基質を加え、470 nm の吸光度の増加を経時的に測定した。

N191 残基をグリシンに置換した N 191G 変異体を作成した。

なお、フェノール基質としてチラミン、カテコール基質とこの変異体の酵素活性を調査するとともに、その X 線結晶

してドーパミンを用いた。得られたカイネティクスパラメ

構造解析を実施した。なお、本研究で使用した NH 2 OH は、ーターを表 1 に示す。

酵素に結合した銅イオンを還元する作用を持つため、分子

野生型複合体および N 191 G 変異型複合体の結晶を作成

状酸素存在下で NH 2 OH を加えると、オキシ型酵素を生じし、1 mM CuSO 4 と 10 mM NH 2 OH を含む溶液中で 24 時させることができる。

間ソーキングした後に回折強度を測定し、その結晶構造を決定した。その結果、両複合体で Y 98 残基に対する反応が

表 1 Ty のカイネティクスパラメーター− 148 −

X 線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構の解明

図 3 Ty・Cad 複合体における Y98、CuA および CuB の電子密度（A）は野生型、（B）は N191G 変異型のものを示している。Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

進行していることが観察された（図 3）。しかしながら、野と近づく。一方、デオキシ 2 型においては、CuA は元の位生型複合体では、Cu（II）結合型ドーパセミキノンを含む中置に戻る。ただし、触媒サイクルで酸素分子と結合する間体と、架橋部位に水酸化物イオンを持つデオキシ中間体

デオキシ型では 2 つの銅イオン間の架橋分子が水であるの（デオキシ 2 型）の存在が示唆されたが、N 191 G 変異型複合に対し、デオキシ 2 型では水酸化物イオンであり、CuA と体ではこれらの中間体が見いだされなかった。

CuB の間の距離が短くなる。

4．考

Ty のモデル錯体を利用した研究から、Ty のフェノラー察

ゼ活性は、基質のフェノール性水酸基が脱プロトン化してCad と結合していない野生型 Ty を用いたときと比べ、いるときに効率よく触媒されることが示されている 5）。今Cad が存在すると Ty のカテコラーゼ活性およびフェノラ

回、フェノラーゼ活性が低い N 191 G 変異体では、Cu（II）ーゼ活性は減少した（表 1）。ただし、フェノラーゼ活性の結合型ドーパセミキノンとデオキシ 2 型中間体が見られな減少の方が顕著である。一方、ドーパミンを共存させると、かった。このことは、Ty のフェノラーゼ活性が効率よく

Cad 存在下における野生型 Ty のフェノラーゼ活性が増加

回転するためには、架橋位置に水酸化物イオンが存在するした。Cad は Ty に銅を輸送するだけでなく、活性中心をデオキシ 2 型中間体の生成が必要であり、この中間体の水シールドする役割を持つと考えられる。すなわち、本実験

酸化物イオンが、次のフェノール基質を脱プロトン化する

結果は、フェノールに比べカテコールの方が、活性中心近のではないかと示唆される。野生型 Ty において、Wat 4

傍にあるシールド部分を引きはがす能力が高いことを示唆

は E 182 と N 191 残基と相互作用し安定化されるとともに、している。またこのことは、Ty の成熟化の最終段階にお塩基性が高くなっている。また、フェノラーゼ活性の触媒

いて、カテコール基質が基質結合ポケットに侵入し、シーサイクルで水素イオンが生じる。これらのことを合わせルド部分を取り除く作用を持つこと、および、シールド部て考えると、野生型では Wat 4 の部位で酵素反応中に生じ分の存在が酵素の見かけ上の基質特異性に影響を及ぼすこた水素イオンが保持され、架橋部位が水分子に変換されるとを示している。一方、N 191 G 変異型 Ty はカテコラーゼのを妨げていると推測される。一方、N 191 G 変異体では活性を有していたものの、ドーパミン添加の有無に関わら

Wat 4 の位置で水素イオンを保持できず、デオキシ 2 型がず、フェノラーゼ活性が極めて低かった。このことは、シ

速やかに消失し、効率的な触媒サイクルを維持できないのールド部分だけでなく、活性中心近傍における水分子の安ではないかと考えられる。

定性・塩基性も、基質特異性に影響を及ぼしていることを

５．総

示唆する。

括

筆者らが行った Cad の Y 98 残基に対する時間分割 X 線

本研究を通じて、カテコール化合物が Ty の成熟化を促

結晶構造解析 3）から、Ty のフェノラーゼ活性においては、進していること、および、活性中心近傍の水分子の安定性・オキシ型酵素による酸素添加反応後に Cu（II）結合型ドー

塩基性により、Ty のフェノラーゼ活性が制御されている

パセミキノンが生じる。その後、電子移動を伴って、デオことが明らかとなった 6）。これらの知見は美白用化粧品のキシ 2 型とドーパキノンへと変換されることが示唆された。

開発に役立つものと考えられる。

Cu（II）結合型ドーパセミキノンの生成時には、2 つの銅イオンのうち CuA が大きく位置を変え、基質の水酸基の方へ− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

（引用文献）

e3000077, 2018.

1） Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu

4） Pretzler, M, Rompel, A. What causes the different

H, Sugiyama M. Crystallographic evidence that thefunctionality in type-III-copper enzymes? A state ofdinuclear copper center of tyrosinase is flexible during

the art perspective. Inorg. Chim. Acta 481, 25‒31, 2018.
5） Itoh S, Kumei H, Taki M, Nagatomo S, Kitagawa T,

catalysis. J. Biol. Chem. 281, 8981‒8990, 2006.
2） Matoba Y, Kihara S, Muraki Y, Bando N, Yoshitsu

Fukuzumi S. Oxygenation of phenols to catechols by aH, Kuroda T, Sakaguchi M, Kayama K, Tai H, Hirota

μ-η :η dicopper（II）complex: mechanistic insight into

S, Ogura T, Sugiyama M. Activation mechanism of

the phenolase activity of tyrosinase. J. Am. Chem. Soc.

the Streptomyces tyrosinase assisted by the caddie

22123, 6708‒6709, 2001.
6） Matoba Y, Oda K, Muraki Y, Masuda T. The basicity

protein. Biochemistry 56, 5593‒5603, 2017.
3） Matoba Y, Kihara S, Bando N, Yoshitsu H, Sakaguchiof an active-site water molecule discriminates between

M, Kayama K, Yanagisawa S, Ogura T, Sugiyama M.

tyrosinase and catechol oxidase activity. Int. J. Biol.

Catalytic mechanism of the tyrosinase reaction toward

Macromol. 183, 1861-1870, 2021.

the Tyr98 residue in the caddie protein. PLoS Biol. 16,− 150 −

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発
熊本大学大学院生命科学研究部老化・健康長寿学講座

三浦恭子

The naked mole-rat (NMR) is an African rodent that forms a eusocial colony in subterranean environments. The NMR
shows an extraordinary longevity with a maximum lifespan of more than 37 years, although its body mass is similar to thatof the laboratory mouse. The NMR also displays delayed aging phenotype and cancer resistance. Cellular senescence plays
an important role in the aging and carcinogenesis processes, suggesting that NMRs may have species-specific mechanisms toprevent the accumulation of senescent cells. Here we show that upon induction of cellular senescence, NMR fibroblasts progressively activate cell death including apoptosis through activation of the INK4a-Retinoblastoma protein (RB) pathway ina mechanism we termed “ INK4a-RB cell death”. We show that INK4a-RB cell death is independent of p53 activity and notobserved in mouse fibroblasts. NMR fibroblasts uniquely accumulate serotonin and are inherently vulnerable to hydrogen
peroxide (H2O2). Upon activation of the INK4a-RB pathway, NMR fibroblasts increase monoamine oxidases (MAOs) levels,
which oxidize monoamine including serotonin and produce H2O2, resulting in increased oxidative damage and activation ofcell death. The INK4a-RB cell death may potentially contribute to the suppression of senescent cell accumulation in NMRs.
Our findings provide novel insights into the mechanisms of delayed aging and cancer resistance in NMRs.

1．緒言

本研究は、最長寿かつ老化耐性を持つ齧歯類、ハダカデ
バネズミ（Naked mole-rat; NMR、図 1）における皮膚線維芽細胞の老化抑制機構の解明を目指すものである。この機構を解明することで、将来的に新規の皮膚老化予防薬の開発に繋がりうると考えられる。

図1

ハダカデバネズミは、哺乳類では極めて珍しい、昆虫の最長寿齧歯類ハダカデバネズミ

アリやハチに類似した「真社会性」と呼ばれる分業制の社会

老化耐性の特徴を持つ 2 , 3）。また、今まで自然発生腫瘍が数を形成し、エチオピア・ケニア・ソマリアのサバンナの地

例しか確認されたことがない、顕著ながん化耐性を示す 4）。

下に、トンネル状の巣を形成して集団で生息している。こ皮膚において、コラーゲン等の細胞外基質を産生する線の地下トンネルは、場所によっては酸素濃度が約 7 % とな

維芽細胞は、加齢に伴い DNA 損傷等の様々なストレスにるため、ハダカデバネズミは低酸素環境に適応しており、より、細胞老化と呼ばれる不可逆的な分裂停止を引き起こ

酸素消費量はマウスの 3 分の 2 程度と低く、ヘモグロビン

すことが知られている。細胞老化は異常な細胞がそれ以上の酸素親和性が高い。さらに最近、ハダカデバネズミ個体

分裂することを防ぐ機構であり、がん抑制機構として働くは無酸素状態に顕著な耐性があり、フルクトースを直接用ことが知られている。さらに発生過程においても細胞老化

1）いる解糖系代謝が関係することが報告されている 。ハダが形態形成に寄与すること 5）、損傷治癒過程においても老カデバネズミはマウスと同程度の大きさながら、最大寿命化細胞の出す PDGF-AA（platelet-derived growth factor

が 37 年（この 37 歳のハダカデバネズミは現在も生存）と報AA）が筋線維芽細胞への分化を引き起こすことで治癒を告されている異例の長寿動物である。驚くべきことに、ハ早めることが報告されている 6）。しかし一方で、長期にわた

ダカデバネズミでは加齢に伴う死亡率の上昇が認められなり老化細胞が組織中に存在すると、老化細胞は炎症性サイいことが報告されており、さらに生存期間の約８割の間は、トカインや活性酸素（ROS）等を分泌するSASP（ senescence-

皮膚を含む各種組織・臓器の老化や機能低下が起こらない

associated secretory phenotype）と呼ばれる現象を引き起こし、これにより周辺細胞に悪影響を及ぼす。Baker らはDevelopment of a new met hod toprevent skin aging using the longestlived and aging-resistant rodent
Kyoko Miura
Kumamoto University, Faculty of Life
Sciences, Department of Aging andLongevity Research

細胞老化マーカーでサイクリン依存性キナーゼインヒビターの１種である Ink 4 a のプロモーター下流に、薬剤投与でアポトーシスを引き起こす遺伝子を連結したトランスジェ
ニックマウスを作製した。このマウスを用いて、老化細胞をアポトーシスで排除することにより、個体の老化が減弱することを報告し、老化細胞の蓄積と個体老化に直接的な− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

関係があることを示した 7 , 8）。このように、老化細胞の増地に交換し、さらに 24 時間培養した。その後、細胞を洗加が組織の老化・機能低下やがん化に大きな役割を果たす

浄し、新鮮な培地で 21 日間、2 日ごとに培地交換をしなことが明らかとなってきた。

がら培養を行い、細胞老化を誘導した。

では、老化耐性を持つハダカデバネズミの細胞老化はどうなっているのだろうか。これまでに、ハダカデバネズミの線維芽細胞はがん遺伝子の導入、放射線照射により細胞
9）2. 3. 皮膚線維芽細胞への遺伝子導入
マウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞にレンチウイ

老化を起こすことが報告されている 。一方、ハダカデバ

ルスベクターを用いて遺伝子導入を行った。目的遺伝子発

ネズミの脳において加齢に伴う INK 4 a の発現上昇が起こ

現ベクターおよびウイルスパッケージングベクター２種を、りにくいことが示されている

10）。これらの結果から我々は、

HEK293 細胞にPEI MAX transfection regent（Polysciences）

ハダカデバネズミには老化細胞が蓄積されにくいメカニズ

を用いてトランスフェクションした。9 時間後に培地交換ムがあるのではないかと考えた。

を行い、その後 24 時間培養した培養上清を 0 . 45 µm シリ

これまでに我々は、老化耐性ハダカデバネズミの皮膚線

ンジフィルター（ザルトリウス）で濾過し、ウイルス含有

維芽細胞において、細胞老化誘導によりハダカデバネズミ

conditioned medium とした。この conditioned medium を特異的細胞死が生じることを見出した。この現象はヒトや培養培地で 2 倍希釈し、線維芽細胞へのウイルス感染に使

マウスでは全く認められない。ハダカデバネズミでは種特用した。

異的な本現象により老化細胞が除去されることで、皮膚の老化が抑制されていると考えられる。しかしこのハダカデ

2. 4. ウェスタンブロッティング

バネズミ特異的な細胞死の誘導機構はいまだ不明であり、細胞を PBS で洗浄し、2 ×サンプルバッファー（125 mM

解明することで、全く新規の皮膚老化予防薬の開発に繋がTris-HCl, pH 6 . 8 , 4 % SDS, 10 % sucrose）で溶解し、5 分

りうる。そこで本研究では、ハダカデバネズミ特異的細胞間煮沸した。BCA Protein Assay Kit（TaKaRa）を用いて死のメカニズム・誘導遺伝子を解明することを目的とし、タンパク質濃度を測定したのち、10 µg のタンパク質を用研究を行った。また研究成果は現在論文投稿中である。

い て SDS-PAGE を 行 い、Trans-Blot Turbo Transfer

2. 方System（Bio-Rad）を用いて PVDF メンブレンにトランス法ファーした。以下に示した一次抗体にて 4 ℃で over night

2. 1. 実験動物

反応させ、TBST で洗浄したのち、二次抗体を反応させた。

1 - 2 歳の成体ハダカデバネズミは熊本大学で維持し、6ECL Western Blotting Detection System または ECL Prime

週齢の成体 C 57 BL/ 6 N マウスは日本クレアから購入した。

Western Blotting Detection Reagent（Amersham）で可視

この研究は、熊本大学動物実験委員会によって承認された化した。シグナル検出には LAS- 4000 mini イメージングシ

プロトコールに従って実施した。

ステム（FUJIFILM）を、データ解析には Multi Gauge V 3 . 0

2. 2. 皮膚線維芽細胞の樹立および細胞老化誘導（CST; 9309; 1:1000 for NMR, CST; 9313; 1:1000 for mouse）、

ソフトウェア（FUJIFILM）を使用した。一次抗体には、RB
1 - 2 歳の成体ハダカデバネズミおよび 6 週齢の成体

pRB（CST; 8 5 1 6 ; 1 : 1 0 0 0）
、MAO-A（abcam; ab 1 2 6 7 5 1 ;C 57 BL/ 6 N マウスの背部皮膚を採取し、初代皮膚線維芽1 : 1 0 0 0）、MAO-B（Novus Biologicals; NBP 1 - 8 7 4 9 3 ;細胞を分離した。組織は、1 ％ペニシリン／ストレプトマ

1 : 1000）および β-Actin（CST; 4970 ; 1 : 2000）を使用した。

イシン（富士フイルム和光）およびアンフォテリシン B（富二次抗体は、HRP 標識抗ウサギ（CST; 7074 ; 1 : 1000）また士フイルム和光）を含む氷冷した PBS（ナカライテスク）では抗マウス（CST; 7076 ; 1 : 1000）IgG 抗体を使用した。

洗浄後、細断した。組織片を 15％ウシ胎児血清
（FBS）
（NMR
線維芽細胞用）または 10 ％ FBS（マウス線維芽細胞用）を

2. 5. RNA-sequencingとMetabolome analysis

含む DMEM 培地に懸濁し、ゼラチンコートした 10 cm 細細胞老化誘導時にハダカデバネズミ特異的に発現変動す

胞培養皿（IWAKI）に播種、32 ℃、5 ％ CO 2、5 ％ O 2 条件

る候補遺伝子群を抽出するために、ハダカデバネズミおよで培養した。遊走してきた線維芽細胞を回収し、初代線維びマウス皮膚線維芽細胞に細胞老化誘導（INK 4 a を過剰発芽細胞として使用した。線維芽細胞は 5 回継代以内で使用現）を行った後 TRIzol reagent（Invitrogen）に溶解した。

し、培地は 2 日おきに交換した。

RNA 抽出後ライブラリーを調製、Novaseq 6000 にて RNA-

サブコンフルエントになったマウスおよびハダカデバネ

sequencing を実 施（Novogene Bioinformatics Institute）し、ズミ線維芽細胞に、DNA 傷害剤であるドキソルビシン

変動遺伝子について種間比較を行った。また、一般的に老（DXR；富士フイルム和光）を 100 nM の濃度で含む培地を化細胞では代謝状態が大きく変動するが、老化ハダカデバ

添加した。24 時間後、培地を新しく調製した DXR 含有培

ネズミ細胞における代謝状態を解析するために、ハダカデ− 152 −

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発

バネズミおよびマウス皮膚線維芽細胞に細胞老化誘導し、液体窒素で凍結後氷冷メタノールで回収し、メタボローム
解析を行った。

3. 2. INK4aの発現上昇はハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こす
INK 4 a の発現上昇がハダカデバネズミ線維芽細胞に細3. 結胞死を引き起こすのかを調べるために、レンチウイルスベ

果

クターを用いてマウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞

3. 1. 細胞老化誘導時のハダカデバネズミ細胞の挙動に INK 4 a を過剰発現した。DXR 老化誘導時と同様にマウ

マウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞に低濃度

スおよびハダカデバネズミ細胞で、SA-β-Gal 陽性細胞の（100 nM）のドキソルビシン（DXR）を添加し、細胞老化を増加、BrdU 取り込みの低下が認められた。INK 4 a はサイ

誘導してその後の挙動を経時的に 3 日おき、21 日まで解クリン依存性キナーゼである CDK 4 / 6 を阻害することに析した。その結果、ハダカデバネズミ、マウスともに細胞より、RB の脱リン酸化（活性化）を起こし、細胞周期停止

老化マーカーである SA-β-Gal 陽性細胞の増加、細胞増殖を引き起こす。ウェスタンブロッティングにより解析を行の停止を示す BrdU 取り込みの低下、細胞老化マーカー遺ったところ、マウスおよびハダカデバネズミ細胞で RB の伝子である INK 4 a および p 21 の発現上昇が認められた。

脱リン酸化が見られた。このように両種の細胞で細胞老化

興味深いことに、マウスでは細胞死の上昇は見られないのの特徴を示す一方、ハダカデバネズミ細胞のみで細胞死がに対し、ハダカデバネズミでは DXR 処理後 12 日目以降に上昇した（図 3）。これらの結果から、INK 4 a の発現上昇が細胞死が有意に上昇した（図 2 A, B）。また、細胞死の上昇

ハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こすことがと INK 4 a の発現上昇が同時期に起こっていた。さらにハ

明らかとなった。

ダカデバネズミ線維芽細胞でINK 4 aをノックダウンすると、DXR処理して 21 日後の細胞死が有意に減少した。これらの結果から、ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK 4 a の発現上
昇が細胞死の増加に寄与していると考えられた。

3. 3. ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK4aの発現上昇はp53とは無関係にRBを介して細胞死を引き起こす一般的に細胞へのダメージが大きい場合は細胞死が、小図2

図3

細胞老化誘導時のハダカデバネズミ細胞の挙動

INK 4 aの発現上昇はハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こす− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

さい場合は細胞老化が引き起こされ 11）、図 4 A に示すように、

ハダカデバネズミおよびマウス皮膚線維芽細胞に INK 4 a

がん抑制遺伝子であるp 53 はアポトーシスの誘導に大きく寄過剰発現による細胞老化誘導を行い、mRNA-seq を実施与している。本研究で見られたハダカデバネズミ特異的細胞した。ハダカデバネズミの老化細胞で発現上昇していた遺死が p 53 に依存するのかを調べるために、ウイルス由来の伝子群について gene ontology（GO）解析を行ったところ、

SV 40 Large T antigen（LT）タンパクとその変異体を使用

老化および細胞死を反映していると考えられる GO term；

した。野生型 LT は p 53 とRB の両方を阻害し、その変異体“SASP” や“aging”、“positive regulation of cell death” ととLTΔ 434 ‒ 444（LTΔ）
は RB のみを、LTK 1 変異体（LTK 1）

もに、“hydrogen peroxide metabolic process” に関わる遺は p 53 のみを阻害する。これらとINK 4 aをハダカデバネズミ

伝子群が濃縮されていた（図 5）。ハダカデバネズミはこれま

線維芽細胞に過剰発現させ、細胞死を解析した。その結果、

でに hydrogen peroxide（H 2 O 2）に対して顕著な脆弱性 12）

LTとLTΔ は顕著に細胞死を抑制し、LTK 1 は細胞死を抑を持つことが報告されている。我々はハダカデバネズミ線

制しなかった（図 4 B）。また、DXR 処理ハダカデバネズミ細維芽細胞がマウス線維芽細胞と比べて、これまでの報告通胞においても同様の結果が得られた。これらの結果から、り、顕著に H 2 O 2 に対して脆弱であることを見出した。こハダカデバネズミの細 胞 老 化 誘 導 時の細 胞 死は p 5 3 非 依のことから、我々はハダカデバネズミの INK 4 a-RB cell

存的、RB 依存的に起こっていることが明らかとなった。そdeath には、酸化ストレスの亢進が関与しているのではな

こで我々はこの細胞死をINK 4 a-RB cell deathと命名した。

いかと考えられた。実際、INK 4 a-RB cell death を起こして い る ハ ダ カ デ バ ネ ズ ミ 細 胞 に お い て、2 ', 7 '- dihydro3. 4. ハダカデバネズミ線維芽細胞において、固有のH2O2への脆弱性がINK4a-RB cell deathに寄与している
INK 4 a-RB cell death のメカニズムを解析するために、

図4

dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA）を用いて活性酸
素種（ROS）が増加しているかを解析したところ、ROS レ
ベルの上昇が認められた。

ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK 4 aの発現上昇はp 53とは無関係にRBを介して細胞死を引き起こす

図5

INK 4 a過剰発現ハダカデバネズミ線維芽細胞のgene ontology（GO）解析− 154 −

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発

次にメタボローム解析を行ったところ、興味深いことに、老化していないハダカデバネズミ線維芽細胞では種特異的

phenotype” を持っており、今後研究を進めることで、真に安全な“senolytic drug”の開発に寄与する可能性がある。

に serotonin が顕著に蓄積しており、老化したハダカデバ
ネズミ細胞ではその代謝産物である5-hydroxyindoleacetic（引用文献）

acid（5 -HIAA）が 有 意 に 増 加 し て い た。Serotonin か ら

1） Park, T. J. et al. Fructose-driven glycolysis supports

5 -HIAA への代謝経路は大量の H 2 O 2 を産生することが知anoxia resistance in the naked mole-rat. Science 3 5 6,られており、
その代謝経路には monoamine oxidase（MAO）

307‒311（2017）．

が寄与している。上述の mRNA-sequencing の結果におい

2） Edrey, Y. H., Hanes, M., Pinto, M., Mele, J. &ても“hydrogen peroxide metabolic process” には MAO-B

Buffenstein, R. Successful aging and sustained goodが含まれていた。さらに INK 4 a を過剰発現させたハダカ

health in the naked mole rat: A long-lived mammalian

デバネズミ線維芽細胞では MAO-A および MAO-B タンパ

model for biogerontology and biomedical research.

クの発現が上昇していた。これらの結果から、ハダカデバ

ILAR J. 52, 41‒53（2011）．

ネズミの INK 4 a-RB cell death には MAO による H 2 O 2 の3） Ruby, J. G., Smith, M. & Buffenstein, R. Naked mole-

産生が寄与している可能性が考えられた。H 2 O 2 を含む

rat mortality rates defy gompertzian laws by not

ROS の 増 加 が ハ ダ カ デ バ ネ ズ ミ 細 胞 に INK 4 a-RB cellincreasing with age. Elife 7, 1‒18（2018）．

death を引き起こしているのかを明らかにするために、

4） Buffenstein, R. Negligible senescence in the longest

INK 4 a-RB cell death を誘導したハダカデバネズミ細胞に

living rodent, the naked mole-rat: insights from a

抗酸化剤である NAC、Trolox、Tempol を投与した。そのsuccessfully aging species. J. Comp. Physiol. B. 1 7 8,

結果、INK 4 a-RB cell death は有意に減弱した。これらの439 ‒ 45（2008）．

ことから、ハダカデバネズミ細胞が持つ生来の H 2 O 2 への

5） Storer, M. et al. Senescence is a developmental

脆弱性と、細胞老化時に H 2 O 2 を大量に産生するような代

mechanism that contributes to embryonic growth and

謝状態への変化によって、INK 4 a-RB cell death が起きて

patterning. Cell 155, 1119（2013）．
6） Demaria, M. et al. An essential role for senescentいると考えられた。

cells in optimal wound healing through secretion of

4 . 考察とまとめ

PDGF-AA. Dev. Cell 31, 722‒733（2014）．

酸化ストレス仮説は個体老化のメカニズムの１つとして

7） Baker, D. J. et al. Clearance of p1 6Ink4a-positive

よく知られている。酸化ストレス仮説とは、ROS による

senescent cells delays ageing-associated disorders.

酸化的ダメージが加齢とともに蓄積し、それに起因する細Nature 479, 232‒236（2011）．

胞障害が個体の機能低下をもたらすという考え方である。

8） Baker, D. J. et al. Naturally occurring p1 6Ink4a-

ハダカデバネズミは老化耐性動物であることから、酸化ス

positive cells shorten healthy lifespan. Nature 5 3 0,

トレス仮説に基づいた検証が積極的に行われてきたが、184‒189（2016）．

ROS に対して抵抗性を持っているとする報告や ROS に対

9） Zhao, Y. et al. Naked mole rats can undergo

する防御機構の低さを示す報告といった相反する結果が報

developmental, oncogene-induced and DNA damage-

告されており、これまで一定の見解は得られていない。本

induced cellular senescence. Proc. Natl. Acad. Sci. 115,

研究は、ハダカデバネズミ線維芽細胞において INK 4 a-

1801‒1806（2018）．

RB 経路が活性化し、H 2 O 2 産生代謝経路が活性化するこ

10）Lee, B. P., Smith, M., Buffenstein, R. & Harries, L. W.

とと、ハダカデバネズミ線維芽細胞が生来持つ ROS の１

Negligible senescence in naked mole rats may be a

種である H 2 O 2 に対する脆弱性が協調して INK 4 a-RB cellconsequence of well-maintained splicing regulation.

deathを引き起こしていることを明らかにした。この機構により、

GeroScience 42, 633‒651（2020）．

ハダカデバネズミにおいて老化細胞が除去され、皮膚をはじめとする個体の老化耐性に寄与しているのではないかと考えられる。

11）Childs, B. G. et al. Senescence and apoptosis: duelingor complementary cell fates? EMBO Rep. 15, 1‒15（2014）．

本研究は、ハダカデバネズミにおけるH 2 O 2 に対する脆弱性と

12）Salmon, A. B., Akha, A. A. S., Buffenstein, R. &老化耐性を結びつけた初めての報告である。近年、老化防止

Miller, R. A. Fibroblasts from naked mole-rats are

薬として老化細胞を除去する“senolytic drug” の開発が進んでresistant to multiple forms of cell injury, but sensitive

いるが、老化細胞は個体にとって有益な側面も持っており、老to peroxide, ultraviolet light, and endoplasmic化細胞の除去が本当に安全なのかは議論の余地がある。ハダ

reticulum stress. Journals Gerontol. Ser. A Biol. Sci.

カデバネズミは進化の過程で獲得した “naturally senolytic

Med. Sci. 63, 232‒241（2008）．

− 155 −

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発
静岡県立大学大学院薬学研究院生化学講座

南彰Sialidase is a hydrolase that cleaves a sialic acid residue from sialoglycoconjugate. We have previously developed afluorescent probe (BTP-Neu5Ac) that allows highly sensitive visualization of the enzymatic activity of sialidase on tissue.
Staining of the rat skin using BTP-Neu5Ac revealed intense sialidase activity in the lower layers of the dermis. However,
the role of sialidase in the skin is not well understood. In the present study, we investigated the role of sialidase in the skinand developed the transdermal delivery technology of sialidase. We first examined changes in sialidase activity with aging
and found that sialidase activity increased with growth and decreased with aging. Next, to investigate the role of sialidase,
we delivered the sialidase to the dermis and studied its effect on elastin which gives skin elasticity. The barrier function of
the skin is high and cannot allow substances with a molecular weight of 500 or more to pass through. Therefore, we usedcholine and geranate (CAGE), one of the ionic liquids, to deliver sialidase transdermally. CAGE can provide the sialidase
subcutaneously while maintaining the enzymatic activity. The elastin level in the dermis was increased by applying sialidasefrom Arthrobacter ureafaciens with CAGE on the skin for five days in rats and senescence-accelerated mice prone 1 and 8.
Sialidase activity in the dermis was considered to be mainly due to Neu2 based on the expression level of sialidase isozyme
mRNA. Transdermal administration of Neu2 with CAGE also increased the level of elastin in the dermis. Therefore, Neu2
would be involved in elastic fiber assembly. The reduction of elastin in the skin causes various skin diseases as well as wrinkles and sagging with aging. Thus, transdermal administration of sialidase is expected to be helpful for the improvement of
wrinkles and skin disorders due to the loss of elastic fibers.

1．緒言

シアリダーゼは、糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖構造からシアル酸を脱離する加水分解酵素である。研究代表らはこれまでに、組織においてシアリダーゼの酵素活性をイ
メージングすることができる蛍光プローブ
Benzothiazolylphenol-based sialic acid derivative type 3（BTP 3 -Neu 5 Ac）を開発した（図 1）1 - 3）。BTP 3 -Neu 5 Acは抗体を利用してタンパク質を検出する免疫組織染色とは

図1

異 な り、 酵 素 活 性 を 検 出 で き る 利 点 が あ る。BTP 3 -BTP 3 -Neu 5 Acの染色原理

Neu 5 Ac は無蛍光で水に可溶性であるが、シアリダーゼによ る 加 水 分 解 を 受 け る と BTP 3 を 遊 離 す る。BTP 3 はる海馬においては、主要な興奮性神経線維である苔状線維

150 nm 程度の大きなストークスシフトをもつ強い緑色蛍の神経終末が強く染色される。このような脳におけるシア

光物質であり、水に不溶であるため組織に沈着することでリダーゼ活性の分布情報を利用して、シアリダーゼが認知

染 色 さ れ る。 染 色 方 法 は 比 較 的 簡 便 で あ り、BTP 3 -機能に不可欠であることが見いだされている 4 - 6）。また、

Neu 5 Ac（10 - 1 , 000 µM）を含む緩衝液中で 30 分程度イン

BTP 3 -Neu 5 Ac でマウス膵臓を染色したところ、インス

キュベートした後、組織や切片を緩衝液で洗浄することでリンを分泌する膵臓のランゲルハンス島に比較的強いシア完了する。

リダーゼ活性があることが分かった。このイメージング情BTP 3 -Neu 5 Ac でラット脳を染色すると、脳梁や内包報を利用して、シアリダーゼがインスリンの分泌に関与すといった白質領域が強く染色される。また、記憶領域であることや、シアリダーゼ阻害剤 2 , 3 -dehydro- 2 -deoxy-Nacetylneuraminic acid（DANA）がインスリン分泌を促進

Role of s i a l id a s e i n t he s k i n a ndtransdermal delivery technology ofsialidase
Akira Minami
Department of Biochemistry, School of
Pharmaceutical Sciences, University of
Shizuoka

することが見出された 7）。DANA は低血糖時にはインス
リン分泌に影響しないことから、低血糖の副作用を回避することができる糖尿病の治療薬として実用化できると期待されている。これまでに大腸癌は強いシアリダーゼ活性を持つことが報告されている。そこで BTP 3 -Neu 5 Ac でヒトの大腸癌を染色したところ、大腸癌を高感度で検出され− 156 −

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発た 2）。現在、内視鏡で腸癌と思われる部位に吹きかけることによって、癌細胞を取り残すことなく除くことができる技術の開発を目指している。最近では、BTP 3 -Neu 5 Acがインフルエンザウイルスに感染した細胞の検出や薬剤耐性株の検出に活用することができることが分かった 8）。
様々な組織を BTP 3 -Neu 5 Ac で染色する過程で、皮膚の真皮に強いシアリダーゼ活性があることを見出した。皮膚は、コラーゲンやヒアルロン酸、エラスチンなどの細胞

図2

皮膚の老化に伴うエラスチン量の減少

図3

哺乳動物のシアリダーゼアイソザイム

外マトリックス成分で構成される。細胞外マトリックスの最も巨大な構造はエラスチンで、皮膚、肺、動脈などの組織に豊富に存在している。長期間の日光曝露により損傷を受けた皮膚では、エラスチン含有物質が真皮に蓄積し、最終的に弾力性の欠如に至る（光老化）。逆に、太陽光から保護された皮膚では、エラスチン線維は加齢とともに減少し、シワやたるみ、皮膚障害の原因となる（図 2）。エラスチンのターンオーバーには長い時間がかかるため、失ったエラ
スチンを再生することは難しい。
哺乳類のシアリダーゼには Neu 1、Neu 2、Neu 3、Neu 4の 4 つのアイソザイムが存在する（図 3）。これらの 4 つのアイソザイムは、発現する組織や細胞内局在、基質特異性、至適 pH が異なる。主にリソソームに局在するシアリダー
ゼアイソザイム Neu 1 は、細胞表面においてエラスチン結

図4

経皮酵素送達基剤CAGE

合タンパク質（EBP）と複合体を形成することが報告されている。Neu 1 によるミクロフィブリルからのシアル酸の遊皮下脂肪を含む腹側部組織を採取し、Tissue-Tek OCT コ

離は、エラスチン集合を促進する。このことから、真皮にンパウンド（サクラファインテックジャパン）で包埋した。

検出されるシアリダーゼ活性は、エラスチン産生に関与す

凍結後、100 - 300 µm 厚の切片を作製した。1 mM BTP 3 -ると考えられる。真皮におけるシアリダーゼの機能を解明

Neu 5 Ac（27 ℃）で染色した後、PBS で洗浄し、蛍光顕微する過程で、皮膚におけるシアリダーゼ活性が加齢ととも鏡（ex/em: BP 330 - 385 /BA 510 IF、 ま た は BP 340 - 380 /に著しく低下することが明らかとなった。真皮にシアリダ

BA 500 - 550）で蛍光を観察した。カメラの検出感度は染色ーゼを送達することで、加齢に伴うエラスチンの減少を回していない皮膚切片のバックグラウンド蛍光を検出しない

復させることができると考えられる。

レベルに設定した。写真を撮った後、スライスを 4 % パラ

本研究では初めに、皮膚におけるシアリダーゼ活性の分布と加齢によるシアリダーゼ活性の変化について検討した。

ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。

また、シアリダーゼの経皮送達がエラスチン産生に及ぼす影響について検討した。経皮投与では角質層が皮膚のバリ
アーとなり、一般的に分子量 500 以上の物質を透過するこ

2. 2. シアリダーゼ活性の測定
ラット皮膚のホモジネートを 96 ウェルプレートに移し、とができない。効果的かつ非侵襲的な経皮吸収のためには、

10 µM 4 MU-Neu 5 Ac を含む PBS 中で 27 ℃、60 分間イン

最適な経皮輸送基剤の選択が必要となる。イオン液体は、キ ュ ベ ー ト し た。 炭 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液（500 mM、陽イオンと陰イオンからなる低融点溶融塩として知られてpH 10 . 7）を加えた後、マイクロプレートリーダー（ex/em,

いる。イオン液体のうち Choline and geranate（CAGE）は355 nm/ 460 nm）を用いて遊離した 4 MU の蛍光強度を測

低分子化合物からペプチドやタンパク質などの高分子化合定した。

物まで様々な種類の薬剤を効率的に経皮投与できる（図 4）。

2. 3. CAGE中のシアリダーゼの安定性評価

ここでは、経皮送達基剤として CAGE を利用した。

2. 方

Arthrobacter ureafaciens 由来シアリダーゼ（AUSA）を法

10 mU/mL で CAGE または PBS に溶解し、27 ℃で 28 日間

2. 1. シアリダーゼ活性のイメージング静置した。その後、4 MU-Neu 5 Ac でシアリダーゼの酵素

Wistar 系雄性ラット（12 週齢、日本 SLC）
から皮膚、筋肉、活性を測定した。

− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Neu 4 : 5’ -TCTGGAGTGCCAACTGGC- 3’ と 5’ -AAGGAA

2. 4. シアリダーゼの経皮投与

GTGCCTTCATCAGCAC- 3’

ラットやSAMP1、SAMP8 の腹側部の皮膚を剃毛した後、CAGE に溶解したシアリダーゼ AUSA（1U/mL）を 1 日 2 回、5 日間にわたって塗布した。真皮組織を採取し、ホモジナイ
ズした。ホモジネート中のシアリダーゼ活性は、4MU-

エラスチン : 5’ -GCTTAGAGTCTCAACAGGTGC- 3’ と 5’
-CGGAACCTTGGCCTTGACTC- 3’
GAPDH: 5’ -TGAACGATTTGGCCGTATCGG- 3’と 5’-TC
AATGAAGGTCGTTGATGG- 3’

Neu5Ac（40µM）を用いて測定した。真皮から抽出したエラ
スチン含有量は、定量色素 5, 10, 15, 20 -tetraphenyl-21 ,23 -porphine tetra-sulfonate（Fastin Elastin Assay Kit）を利用して測定した。

2. 8. Neu2の経皮投与
先に樹立したラット Neu 2 を安定に発現する C 6 ラット
グリオーマ細胞から分泌された Neu 2 を、限外ろ過フィル
ター（Amicon Ultra）を用いて回収した。4 MU-Neu 5 Ac

2. 5. 免疫組織化学染色

でNeu2 のシアリダーゼ活性を測定した。Neu2（21.3nmol/

真皮の伸展切片を 4 ％パラホルムアルデヒドで固定した

min/mL）と CAGE を 3：7 の割合で混合した。剃毛後、後、2 ％ヤギ血清でブロッキングした。エラスチンの染色

Neu 2 と CAGE の混合物 60 µL をラット（12 週齢）の側腹部

では、切片をウサギ抗エラスチンポリクローナルIgG（Bioss

皮 膚 に 塗 布 し た。 ま た は、Neu 2 を 18 µL 塗 布 し た 後、Antibodies）および FITC 標識ヤギ抗ウサギ IgG（Jackson

CAGE を 42 µL 塗布した。塗布は 1 日 2 回、5 日間行った。

ImmunoResearch Laboratories）に よ り 染 色 し た。Neu 2

真皮に含まれるエラスチンは、２. 4 . と同様の方法で定量の染色では、切片をウサギ抗 Neu 2 ポリクローナル IgGした。

（Rockland, Gilbertsville, PA）および HiLyte Fluor 555 標
識ヤギ抗ラビット IgG（Anaspec, Fremont, CA）で染色し2. 9. 統計解析た。また、DAPI（1 g/mL）で対比染色を行い、蛍光顕微鏡

統計解析は、Bonferroni の多重比較検定を伴う一元配置

BZ-X 710 で観察した。蛍光のバックグラウンドレベルは、

分散分析、および t 検定を利用した。2 群間の分散が異な二次抗体のみで染色した切片を利用して決定した。すべてる場合は、Welch の補正を加えた t 検定を利用した。

のイメージングは少なくとも 2 回実施し、再現性を確認し

3. 結

た。

果

3. 1. 皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の加齢に伴う変化

2. 6. エラスチンの自家蛍光の観察
真皮切片を 4 ％パラフォルムアルデヒドで固定した後、皮膚におけるシアリダーゼ活性の分布を調べるために、

蛍 光 顕 微 鏡（BZ-X 810、ex/em: BP 450 - 490 /BA 500 -12 週齢のラット腹側部を 100 µM BTP 3 -Neu 5 Ac で染色550）で自家蛍光を観察した。

した。ヘマトキシリン・エオジン染色で確認された真皮下層や筋肉に強いシアリダーゼ活性は検出された（図 5 A）。

2. 7. リアルタイムRT-PCR

また、皮膚におけるシアリダーゼ活性の加齢による変化を

TRIzol 試薬（Life Technologies）を用いて、ラットの腹調べたところ、胎生 19 日から 12 週齢にかけて上昇した。

側部の皮膚や脂肪などの組織から mRNA を抽出した後、21 ヶ月齢以上のラット皮膚におけるシアリダーゼ活性は、

サーマルサイクラーシステム（Thermal Cycler Dice Real-

12 週齢のラット皮膚における活性と比較して著しく減弱

Time System Lite, タ カ ラ バ イ オ ）と One-Step SYBRした（図 5 B）。

PrimeScript PLUS RT-PCR キ ッ ト（Perfect Real Time,ア ル デ ヒ ド - 3 - リ ン 酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ（GAPDH）の3. 2. シアリダーゼの経皮送達による皮膚エラスチン
量の増加

mRNA を内部標準として利用した。以下に使用したプラ

次に、シアリダーゼの経皮投与がエラスチン量に及ぼす

タカラバイオ）を利用して mRNA を定量した。グリセル

イマーの配列を示す。

影響について検討した。初めに、経皮輸送基剤 CAGE に

Neu 1 : 5’ -CCCATCCCGAGTACCGAGT- 3’と 5’-CCCGGC

よって酵素活性が変化しないことを確認した（図 6 A）
。次に、経皮輸送基剤 CAGE を使用してシアリダーゼ（AUSA）

CACAACTGGAC- 3’
Neu 2 : 5’ -GAGCCACCAACCATGTCAAG - 3’ と 5’ -AAG
Neu 3 : 5’ -CGGAGCTGTGAGCTGAG- 3’と5’-CCTGCTGG
AACAGTGCTG- 3’

を 1 日 2 回、5 日間皮膚に塗布すると、ラット皮膚におけるシアリダーゼ活性が増加した（図 6 B）
。また、ラット皮

GGACATGATTCATGGAG- 3’

膚に含まれるトロポエラスチンを含むエラスチンの総量を測定したところ、エラスチン量が増加した（図 6 C）。

− 158 −

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発

図5 ラット皮膚におけるシアリダーゼ活性の分布と加齢に伴う変化（A）BTP 3 -Neu 5 Acによるラット皮膚のイメージング、（B）老化に伴う皮膚シアリダーゼ活性の減弱

図6 シアリダーゼの経皮送達によるエラスチンの増加（A）CAGEがシアリダーゼ活性に及ぼす影響、（B, C）シアリダーゼの経皮送達後における真皮のシアリダーゼ活性（B）およびエラスチン量（C）の増加BTP 3 -Neu 5 Ac によるシアリダーゼ活性のイメージン

スと免疫不全が特徴である。SAMP 1 系統は、12 - 18 ヶ月

グにおいても同様に、AUSA を経皮投与すると真皮に強齢でエラスチンと表皮の厚みが増加し、明らかなエラスト

いシアリダーゼ活性が観察された（図 7 A）
。また、伸展切ーシスに発展し、その特徴はヒトの光老化と類似している。

片の免疫組織染色およびエラスチン自家蛍光の観察においSAMP 8 系統は、アルツハイマー病様の神経変性と認知障て、AUSA 投与後の真皮にエラスチンの高い発現が認め

害および概日リズム障害を特徴とする。SAMP 8 マウスはられた
（図 7 B および C）。

野生型マウスの老化と比較的類似した老化症状を示す。
本研究では、SAMP 1 および SAMP 8 を用いて、エラス

3. 3. シアリダーゼの経皮送達による老化促進マウスの皮膚エラスチン量の増加

チン量に及ぼす AUSA の影響を検討した。AUSA を含む

老化促進モデルマウス（SAM）は、寿命が短く、老化症

および SAMP 8 でエラスチン量が有意に増加した（図 8 A状の早期出現と急速な進行を特徴とするマウスであり、CAGE を 1 日 2 回、5 日間経皮投与したところ、SAMP 1
および B）。

AKR/J 系統の近親交配により、これまでに 9 系統の老化促進マウス（SAMP）と 3 系統の老化抵抗性マウス（SAMR）が確立されている。SAMP 1 系統は、老化アミロイドーシ

3. 4. 皮膚におけるシアリダーゼアイソザイムの発現
真皮における強いシアリダーゼ活性が哺乳動物シアリダ− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図7 シアリダーゼの経皮送達によるエラスチンの増加（A-C）シアリダーゼの経皮送達後における真皮のシアリダーゼ活性（A）、およびエラスチン量（B: 免疫組織染色;
C: 自家蛍光観察）の増加

図8 シアリダーゼの経皮送達による老化促進モデルマウスの真皮におけるエラスチンの増加（A）SAMP 1 （B）SAMP 8− 160 −

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発

ーゼの 4 つのアイソザイムの内、どのアイソザイムに起因法でも皮膚のエラスチンレベルが上昇することが見出ださするのかを明らかにする目的で、ラットの皮下組織におけれた（図 10 B）。また、皮膚のエラスチン mRNA レベルは、るシアリダーゼアイソザイムの発現を比較した。Neu 2

Neu 2 を適用しても有意な影響を受けなかった（図 10 C）。

mRNA の発現量は、脂肪組織よりも真皮や筋肉などの組4．考織で顕著に高かった（図 9 A-D）
。一方、Neu 1、Neu 3、Neu 4 の発現量は、真皮と筋肉を含む組織よりも脂肪組織で高かった。

察

本研究では、皮膚におけるシアリダーゼの酵素活性の分布や発現するアイソザイム、加齢に伴う発現量の変化など、
シアリダーゼに関する基礎的知見を得た。ラット側腹部の3. 5. Neu2の経皮投与による皮膚エラスチンの増加

組織を pH 7 . 3 の BTP 3 -Neu 5 Ac で染色すると、脂肪組織

腹側部における免疫組織染色において、Neu 2 は皮下脂と比較して真皮と筋肉に強いシアリダーゼ活性が検出され肪に比べ真皮と筋肉に多く発現していた（図 10 A）。Neu 2た。BTP 3 -Neu 5 Ac は pH 7 . 3 ではシアリダーゼアイソザ

がエラスチン産生に及ぼす影響は不明であることから、イムの Neu 2 と Neu 4 によって優先的に加水分解され、C 6 ラットグリオーマ細胞で作製したラット Neu 2 を用い

Neu 1 と Neu 3 によって弱く加水分解される 6）。従って、て、Neu 2 が皮膚のエラスチン量に及ぼす影響を検討した。

pH 7 . 3 の真皮と筋肉における強いシアリダーゼ活性は、

Neu 2 の経皮投与においては、Neu 2 を含む CAGE をラッNeu 2 によるものと推定された。また、pH 4 . 6 におけるシト皮膚に塗布する方法、または、Neu 2 を先に皮膚に塗布

アリダーゼ活性の分布は、pH 7 . 3 における分布と大きなし、 そ の 後 CAGE を 塗 布 す る 方 法 の 2 通 り で 試 し た。

違 い は な か っ た。pH 4 . 6 で は、BTP 3 -Neu 5 Ac は Neu 1

Neu 2 の塗布を 1 日 2 回、5 日間行った結果、どちらの方と Neu 3 によって効率よく加水分解されるが、Neu 2 と

図9

皮膚におけるシアリダーゼアイソザイムの発現比較

図10 Neu 2の経皮投与による皮膚エラスチンの増加（A）皮膚におけるNeu 2の発現分布（B, C）Neu 2の経皮投与がエラスチン（B）やエラスチンｍRNA（C）の発現に及ぼす影響− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Neu 4 によっても分解される 6）。pH 4 . 6 でも皮膚における

5．総シアリダーゼ活性のイメージングには主に Neu 2 が寄与していると思われる。

括

皮膚の真皮には Neu 2 に起因する強いシアリダーゼ活性

皮膚の老化は、真皮のコラーゲン、エラスチン、グリコがあり、加齢とともに活性が低下することが示された。まサミノグリカンなどの質的・量的な変化に起因している。

た、経皮輸送基剤 CAGE は、シアリダーゼの酵素活性を

皮膚エラスチンの減少によって、皮膚の弾力性が失われる。

維持したまま経皮投与できる有用性が確認された。CAGE

本研究では、4 MU-Neu 5 Ac を用いて pH 7 . 3 で測定したはシアリダーゼだけでなく、様々な酵素の経皮投与に有用

シアリダーゼ活性が老化によって低下することを明らかにであると考えられる。さらに、CAGE を用いたシアリダー

した。シアリダーゼはエラスチン集合を促進することから、

ゼの経皮投与により、皮膚エラスチンが増加することを明

加齢に伴うエラスチンの減少は、シアリダーゼ活性の低下

らかにした。シアリダーゼの経皮投与は、エラスチンの減と関係している可能性がある。

少によるシワや皮膚障害の改善に有用であると期待される。

CAGE を用いてシアリダーゼを経皮投与したところ、真皮におけるシアリダーゼ活性は経皮投与後に増加した。

（本研究により得られた成果）

CAGE が酵素活性を維持したまま酵素を経皮投与できるこ・Akira Minami, Yuka Fujita, Jun Goto, Ayano Iuchi,とを示唆している。今回、シアリダーゼの経皮投与によっ

Kosei Fujita, Yasuyo Mikami, Mako Shiratori, Amiて、皮膚のエラスチン量を増加させることが見いだされた。

Ishii, Samir Mitragotri, Yasunori Iwao, Hiroaki

Neu 1 はエラスチンの集合を促進するだけでなく、エラス

Kanazawa, Yuuki Kurebayashi, Tadanobu Takahashi,

チン由来ペプチドの分解調節に関与することが報告されてTadamune Otsubo, Kiyoshi Ikeda, Takashi Suzuki:

いる。シアリダーゼの経皮投与によりエラスチン量が増加

Enhancement of elastin expression by transdermal

したことから、外因性のシアリダーゼはエラスチンの分解

administration of sialidase isozyme Neu2. Sci. Rep., 11,

促進ではなく、エラスチン集合の促進に主に寄与すると考3302（2021）．

えられる。
バクテリア由来のシアリダーゼのみならず、Neu 2 を経

（引用文献）

皮投与することによっても皮膚のエラスチン量が増加した。

1） Minami A, Kurebayashi Y, Takahashi T, Otsubo T,

エラスチン産生には Neu 1 だけでなく Neu 2 も関与していIkeda K, Suzuki T: The Function of Sialidase Revealed

ると考えられる。皮膚中のエラスチン mRNA 量は Neu 2

by Sialidase Activity Imaging Probe. Int. J. Mol. Sci.,

塗布による有意な影響は見られなかった。従って、シアリ．
22,（2021）

ダーゼによるエラスチンの増加は、ミクロフィブリルから

2） Minami A, Otsubo T, Ieno D, Ikeda K, Kanazawa H,のシアル酸脱離によるエラスチンの集合の促進によると考Shimizu K, Ohata K, Yokochi T, Horii Y, Fukumoto H,

え ら れ る。Neu 1 は リ ソ ゾ ー ム 酵 素 で あ り、 至 適 pH は

Taguchi R, Takahashi T, Oku N, Suzuki T:

4 . 4 - 4 . 6 である。Neu 2 は糖タンパク質、オリゴ糖、ガンVisualization of sialidase activity in Mammalian tissues

グリオシドを加水分解し、至適 pH は 6 . 0 - 6 . 5 である。

and cancer detection with a novel fluorescent sialidase

Neu 2 は細胞外の中性 pH で作用するので、Neu 2 を経皮投

substrate. PLoS One, 9, e81941（2014）．

与すると細胞外空間のミクロフィブリルからシアル酸が効

3） Minami A, Shimizu H, Meguro Y, Shibata N,

率的に遊離すると思われる。Neu 2 を経皮投与した皮膚にKanazawa H, Ikeda K, Suzuki T: Imaging of sialidase

おいて、光老化皮膚に見られるような重度の皮膚エラスト

activity in rat brain sections by a highly sensitive

ーシスは観察されなかった。しかし、シアリダーゼが皮膚fluorescent histochemical method. Neuroimage, 58, 34-

エラストーシスを誘導しないことを厳密に確認するために40（2011）．

は、より詳細に検討する必要がある。

4） Minami A, Ishii A, Shimba S, Kano T, Fujioka E, Sai

エラスチンは、皮膚の老化に伴って減少する。加齢のほS, Oshio N, Ishibashi S, Takahashi T, Kurebayashi Y,か、 皮 膚 弛 緩 症 や 弾 性 線 維 性 仮 性 黄 色 腫、Williams-

Kanazawa H, Yuki N, Otsubo T, Ikeda K, Suzuki T:

Beuren 症候群、肥満による皮膚障害などによって、皮膚

Down-regulation of glutamate release from

環境が悪化するとエラスチンが減少することが明らかにさ

hippocampal neurons by sialidase. J. Biochem., 1 6 3,れている。皮下脂肪組織の増加は、真皮エラスチンの分解

273-280（2018）．

を促進させる。エラスチンのターンオーバーには長い時間

5） Minami A, Meguro Y, Ishibashi S, Ishii A, Shiratoriを要するが、シアリダーゼの経皮投与によりエラスチンを

M, Sai S, Horii Y, Shimizu H, Fukumoto H, Shinba S,

回復させることで皮膚環境が改善されると考えられる。

Taguchi R, Takahashi T, Otsubo T, Ikeda K, Suzuki T:− 162 −

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発

Rapid regulation of sialidase activity in response to

Mikami Y, Sekita R, Kurebayashi Y, Takahashi T,

neural activity and sialic acid removal during memory

Miyagi T, Ishikawa T, Suzuki T: The sialidase inhibitor

processing in rat hippocampus. J. Biol. Chem., 2 9 2,

2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid is a5645-5654（2017）．

glucose-dependent potentiator of insulin secretion. Sci.

6） Minami A, Saito M, Mamada S, Ieno D, Hikita T,

Rep., 10, 5198（2020）．

Takahashi T, Otsubo T, Ikeda K, Suzuki T: Role of8） Kurebayashi Y, Takahashi T, Miura T, Otsubo T,

sialidase in long-term potentiation at mossy fiber-CA3

Minami A, Fujita Y, Sakakibara K, Tanabe M, Iuchi A,

Synapses and hippocampus-dependent spatial memory.

Ota R, Ikeda K, Suzuki T: Fluorogenic probes for

PLoS One, 11, e0165257（2016）．

accurate in situ imaging of viral and mammalian7） Minami A, Fujita Y, Shimba S, Shiratori M, Kaneko

sialidases. ACS Chem. Biol., 14, 1195-1204（2019）．

YK, Sawatani T, Otsubo T, Ikeda K, Kanazawa H,− 163 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発
大阪大学微生物病研究所

村上良子

Inherited GPI deficiency (IGD) is caused by the mutations of the genes involved in the GPI biosynthesis. There are atleast 150 kinds of GPI anchored protein in the mammalian cell, and they play various important roles, such as neurologicaldevelopment. IGD patients are often suffered from developmental delay and interactable seizures and in severe cases, someof them have ichthyosis. In the skin specific Piga KO mice, secretion of glucosylceramide (GlcCer), packed into the lamellar
bodies of keratinocytes was impaired, leading to disruption of skin barrier function, which caused the early neonatal death.
PIGA is the catalytic component of the GPI-N-acetylglucosaminyltransferase, the first step enzyme of GPI biosynthesis. Thisphenotype is similar to ABCA12 KO mouse model, in which GlcCer could not be packed into the lamellar body, leading to
the defect in secretion of GlcCer. To elucidate the mechanism of the defect in the secretion of GlcCer in the Piga KO model,
we made the PIGA knockout and its PIGA rescued HaCaT cell, a human keratinocyte cell line. We also made the ABCA12
KO cell to compare the phenotypes. Anti-GlcCer antibody could not show the clear localization in the either cell, howeveranti-ceramide antibody showed difference in the localization of ceramide between in Piga KO and its rescued cells and moreclearly in ABCA12 KO cells. According to these evidences, we will further investigate the pathogenic mechanism of ichthyosis in PIGA deficiency and develop its treatment using synthesized GlcNAcPI, the first step product.

1．緒

皮膚における GPI アンカーの役割を調べるために、K 5 -言

Cre マウスと Pigafloxed マウスを交配することにより表皮哺乳細胞では GPI（glycosylphosphatidylinositol）という特異的な Piga ノックアウト（KO）マウスを作製した。完全糖脂質で細胞膜につながれている GPI アンカー型タンパク欠損となるオスのマウスは乾燥した皺の多い皮膚を呈し、質（GPI-AP）が約 150 種知られており、酵素や受容体、接生後数日で死亡した。表皮のバリア機能の消失によって水

着因子、補体制御因子など受精、個体発生、神経発達、免分保持能が低下し、角質細胞の水和が阻害されて古い角質疫機能などにおいて重要な働きをしている。GPI-AP は小層がはがれないため、角質が著しく肥厚していた 4）。その胞体（ER）でタンパク質部分と GPI が別々に合成され、完後の解析により角質細胞内に形成される層板顆粒

成した GPI が GPI 付加シグナルを持つ前駆タンパク質のカ（lamellar body）の異常や分泌される lamellar body の消失

ルボキシル末端に付加される。その後も小胞体とゴルジ体など GPI-AP が、表皮の正常な分化に必須であることが明で修飾を受け、細胞膜のコレステロールに富む領域に運ば

ら か に な っ た 5）。 こ の 症 状 は、 重 篤 な 皮 膚 疾 患 で あ るれる。このような GPI-AP の生合成と修飾に 30 個の遺伝

Harlequin-type ichthyosis の病態に極めて類似している。

1）子が関与している 。先天性 GPI 欠損症（IGD）は近年見つ

この疾患は脂質のlamellar bodyへの輸送に関わるABCA12

かった潜性遺伝性疾患で、これらの遺伝子に変異がおこり（ATP Binding Cassette Subfamily A Member）12）遺伝子の重要な機能を担う種々の GPI アンカー型タンパク質（GPI-

変異によっておこることが知られている 6）。角質層の直下AP）の細胞膜上の発現低下や構造異常により、精神運動発に あ る 顆 粒 層 に 存 在 す る lamellar body は、TGN（trans

達の遅れ、てんかん、多臓器奇形などを来す

2 , 3）。現在まGolgi network）に由来するとされているが、その内部にグでに海外で約 400 例、国内で約 50 例の報告がある。厚労ルコシルセラミド（GlcCer）やスフィンゴミエリンを取り

省難治性疾患の研究班により診療ガイドラインを作成し、込み、角層と顆粒層の界面に放出する。放出されたグルコ

2017 年より指定難病に認定され、2018 年より小児慢性特シルセラミド、スフィンゴミエリンは，酸性型の β- グル

定疾病となっている。

コセレブロシダーゼとスフィンゴミエリナーゼによりそれ

本研究では重症例でしばしば見られる魚鱗癬様の皮膚病

ぞれ加水分解を受け、セラミドに変換される。生成したセ3）

ラミドは脂肪酸やコレステロールとラメラ構造体を作り、変 の病態解析と治療法の開発を目的とした。以前我々は、表皮透過バリアを形成する 7）。これらの脂質の合成と分泌過程に GPI-AP が何らかの形で関わっていると考えられ、表皮における GPI-AP の機能の解明が、両疾患の病態解明
Patholog ica l a na lysis of ichthyosis
associate with Inherited GPI deficiencyにつながる可能性がある。

Yoshiko Murakami
Research Institute for Microbial Diseases− 164 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発

2. 方

2. 2.

法

まずヒト表皮角化細胞株である HaCaT 細胞を使って in

2. 1.

vitro の実験系を樹立した。Cas 9 と guideRNA を発現する

PIGA は GPI 生合成の最初のステップに関係する X 染色

ベクター（px 330 Addgene # 42230）に PIGA 遺伝子のター

体上の遺伝子で、その変異により機能が低下すると、すべゲット配列（ACACTCTCTCGGGTTAGCCC）を挿入したての GPI-AP の細胞表面における発現が低下する 1）。ドイ

プ ラ ス ミ ド を リ ポ フ ェ ク シ ョ ン（lipofectamine 2000 ,ツ の グ ル ー プ と の 共 同 研 究 に よ り PIGA の 産 物 で あ る

Thermo Fisher Scientific）により HaCaT 細胞に導入してGlcNAcPI を合成した（図 1 A）
。PIGA 欠損の HEK 293 細PIGA をノックアウトし、PIGA KO クローン # 11 , 12 を胞を無血清培地に 2 µM の GlcNAcPI を加えた培養液で 24樹立した。フローサイトメトリー解析により、野生株の細時間培養し、フローサイトメトリーにより GPI-AP の発現

胞表面に発現する GPI-AP が KO 細胞で欠損していることの回復を解析した。GlcNAcPI は効率よく次のステップのを確認した。さらに KO 細胞に PIGA cDNA をレトロウイ

PIGL の基質として使われ GPI-AP である CD 59 と DAF のルスベクター（pLIB-hyg-FLAG-PIGA）を使って導入し発現が正常の 60 ％まで回復した（図 1 B）8）。フローサイト

た後、ハイグロマイシン 200 µg/ml を含む選択培地で培養

メ ト リ ー 解 析 に は mouse anti-human CD 59（5 H 8），

してレスキュー細胞を作製し、正常コントロールとした（図-DAF（IA 10 , Biolegend）と 2 次抗体として Phycoerythrin2）。次に GlcNAcPI の効果を確認するために、2 . 1 . と同conjugated anti-mouse IgG を使用した。

様の方法で培養液中に加えて細胞膜上の GPI-AP の回復を

図1 A

合成GlcNAcPI（18 : 0 , 18 : 1）の構造

図1B PIGAKOのHEK 293細胞を無血清培地に2 µMのGlcNAcPIを加えた培養液で24時
間培養後フローサイトメトリーによりGPI-AP（CD 59 , DAF）の発現の回復を解析した。

図2

PIGA KOとPIGAをレスキューしたHaCaT細胞のフローサイトメトリー解析− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し た（ 図 3）
。FLAERdonkey anti-rabbit IgG（Jackson），Alexa 488 conjugated（fluorescent-labeled inactive toxin aerolysin,goat anti-mouse IgG（Biolegend）を使って、その局在の違

CEDARLANE）は GPI-AP に 結 合 す る 毒 素 の 変 異 体 にいを顕微鏡で観察した（KEYENCE BZ-X 800）
。メタノー

Alexa 488 の蛍光ラベルを付加したプローブで、GPI-APルあるいはパラホルムアルデヒド（PFA）で固定した細胞の 発 現 量 を 示 す。CD 109 の 発 現 は mouse anti-CD 109

は Anti-GlcCer, -Cer による免疫染色に適さないことがわ（Biolegend）
を使用して解析した。

か っ た の で、 既 報 の 手 法 を 踏 襲 し て 無 固 定 で 0 . 1 %TritonX 100 , 1 % donkey serum in PBS で処理して 1 次抗

2. 3.

体、2 次抗体で 2 段階で染色し、4 % PFA で後固定して観細胞内 GlcCer の蓄積を比較観察するため HaCaT 細胞の察した。

ABCA 12 遺伝子のKO 細胞クローンを 2 . 2 . と同様の方法で３．結作 製した。ターゲットサイトは 2 箇 所 設 計し（5’ -CAAAGGATTCG GGGCAATAT, 5’ -AAACAGAAAAG T C G T

果

3. 1.

CAAGC）、KO 細胞クローンを樹立したのちに、ゲノムの配列

PIGA欠損のHEK293 細胞の培養液に合成したGlcNAcPI

を読んで完全なKO 細胞であると確認できた細胞クローンを 2 µM 加えたところ図 1 B のように GPI-AP である CD 59 ,# 27 , 30 を ABCA 12 KO 細胞として使用している。

DAF が、ともに正常の 60 % まで発現量が回復した。これ

2. 4.

（11）: 2297 - 2306）。

に関連する結果は報告した（ACS Chem Biol. 2021 19 ; 16
この３種類の細胞（PIGA KO + PIGA rescued, PIGA
KO + empty vector, ABCA 12 KO ）における GlcCer の局

3. 2.

在を確認するために、角化細胞に分化させる条件を検討しHaCaT 細胞膜上に発現する GPI-AP が PIGA KO クロー

た。HaCaT 細胞は高 Ca の濃度で角化細胞に分化すること

ンでは完全にその発現が消失し、さらに PIGA cDNA を9）が知られている 。異なる Ca 濃度で細胞を培養して形態導入することによって発現が完全に回復していることを示を観察した結果、角化細胞に分化させる高 Ca の条件を

す
（図 2）
。

2 . 8 mM とし、分化しない低 Ca の条件を 0 . 03 mM とした。

さらに 3 . 1 . と同様に合成基質 GlcNAcPI 3 µM の添加に低 Ca の条件は Ca 添加のない DMEM 培地に透析した FCS

より、GPI-AP である CD 59 と DAF の発現が正常の 10 ％を 10 % 加えたものに CaCl 2 を加えて final 0 . 03 mM とした。

程度まで回復することがわかった。回復の効率は HEK 293細胞に比べて低かったが、ピークとなる時間は 24 時間と2. 5.

同じであったことから、取り込みの効率、あるいは小胞体

これらの３種の細胞を、poly-L-Lysine をコートしたカ
バーグラス上で培養し、高 Ca の条件で角化細胞に分化さでの利用の効率が HEK 293 細胞に比べて低いと考えられ
る
（図 3）
。

せた上で、rabbit anti-GlcCer（RAS_ 0011 , Glycobiotech）
mouse anti-ceramide（-Cer）（C 8 1 0 4 , Sigma），rabbit
anti-keratin1（Biolegend），2 次抗体としてFITC conjugated

3. 3.
ABCA 12 KO の作製と完全なノックアウト細胞である

図 3 PIGAKO HaCaT 細胞を無血清培地に 3µM の GlcNAcPIを加えた培養液で 24 時間培養し、フローサ
イトメトリーによりGPI-AP（CD59, DAF）の発現を解析した。

− 166 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発

ABCA 12 KO については既報のデータの再現性は得られことをゲノム配列の解析により確認した（図 4）。

ず、PIGA KO とレスキュー細胞の間にも局在のパターン

3. 4.

に差は見られなかった。一方セラミドの分布については、

文献によると正常の角質細胞では GlcCer の分布が細胞

PIGA レスキュー細胞では一部細かい繊維状の染色が目立質全体に分布しているのに対し、ABCA 12 遺伝子に変異

つ細胞はあるが、主に細胞膜と細胞質に dot 状に分布してをもつ Harlequin-type ichthyosis の患者の角質細胞ではいるのに対し、PIGA KO 細胞（# 11 , 12）では繊維状の染

GlcCer が lamellar body に運ばれずに核の周囲の塊として色パターンの細胞の割合が増加しており、ABCA 12 KO

存在し、分布に異常をきたしている。

（# 27 , 30）ではほぼすべての細胞が網目状に伸びた荒い繊作製した ABCA 12 KO 細胞の GlcCer とセラミドの分布

維 状 の 染 色 パ タ ー ン を 示 し て い た。PIGA KO 細 胞 にを positive control として３種類の細胞の免疫染色のパタ

GlcNAcPI 3 µM を添加するも、明瞭な変化はみられなかーンを比較した。GlcCer は図 5 A のように染色が弱く、った（data not shown）。

図4

ABCA 12 KO細胞のゲノムのターゲットサイトの解析

図5 A PIGAKO 細胞（# 11）、そのレスキュー細胞、ABCA12 KO細胞（# 27）を高Caの条件で分化させてanti- GlcCer 抗体でGlcCerの局在を確認した。他のクローンも同様であった。

図5 B PIGAKO 細胞（# 11）とそのレスキュー細胞、ABCA12 KO細胞（# 27）を高Caの条件で分化させてanti- Cer antibodyでCerの局在を確認した。他のクローンも同様であった。

− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

いは GPI 中間体と GlcCer の ER からゴルジ体への輸送が連4 . 考察および総括動している可能性を示唆している 13）。

セラミドは小胞体で合成され、多くは小胞輸送によりゴ

今後は HaCAT 細胞におけるセラミドの分布の違いを、ルジ体に運ばれ、細胞質側で GlcCer に合成されて細胞膜

オルガネラマーカーを加えて解析し GPI 欠損による病態をの ラ フ ト に 運 ば れ る。 一 部 の セ ラ ミ ド は Ceramide解明する。角化細胞は基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角Transport protein（CERT）により小胞体膜から引き抜か質細胞と分化していくが、lamellar body を分泌するのはれてゴルジ体に運ばれ、内腔にフリップしたのちにスフィ顆粒細胞である。HaCaT 細胞はヒト角化細胞株で、有棘ンゴミエリンに合成されて、同様に細胞膜のラフトに運ば細胞、顆粒細胞、角質細胞のいずれにも分化できるとされ

10）。lamellar body は TGN 由来の小胞であるとされてている。それぞれの分化マーカーが知られているので顆粒

いるが、その内部に GlcCer やスフィンゴミエリンを蓄積

細胞に分化させた上で、GlcCer やセラミド、ABCA 12 のしており角層に分泌されたのちに酵素により再びセラミド

分布を観察するとともに、western blot によりそれらの量と な っ て 皮 膚 の バ リ ア 機 能 を 発 揮 す る。ABCA 12 はを比較する。また電子顕微鏡により lamellar body の形態

lamellar body の膜上にあって GlcCer のトランスポーター、を３者で比較する。NBD ラベルのセラミドをこれらの細あるいは GlcCer をゴルジ体膜の細胞質側から内腔側に移胞に投与し、その局在や運搬、GlcCer への変換を確認する。

れる

11）

、実証されておらず、そHaCaT 細胞は３次元培養できるので、マウスのフェノタの 作 用 部 位 は 明 ら か で な い。ABCA 12 が 欠 損 す る とイ プ が 再 現 で き る か を 確 認 す る。 今 回 は in vitro で のlamellar body に GlcCer が積み込まれず、その結果角層のGlcNAcPI の投与による効果が見えなかったので、マウスセラミドが欠損し皮膚のバリア機能が障害される。本プロの実験までは進めなかったが、上記により病態解析が進めジェクトではヒトの皮膚の角質細胞から樹立された細胞株

ば、効果判定の指標がよりはっきりするので、それをもと

HaCaT 細胞をモデル細胞として使用して前述のように３に GlcNAcPI の投与による治療を試みる。

す働きがあるとされているが種の細胞株を樹立し、主に GlcCer とセラミドの局在を観察することでそのフェノタイプを解析した。GlcCer の局

謝辞在に関しては、抗体に問題があり解析が困難であった。既本研究を遂行するにあたり、御援助を賜りました公益財報によると ABCA 12 変異角質細胞では GlcCer は細胞の核

団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝を申し

周囲に局在するとされている 6）。蛍光標識したセラミドを上げます。

外から加えると、核周囲に集結することが報告されているが、その分布は CERT の分布に一致する 12）。すなわち核（引用文献）

周囲の集積はゴルジ体での蓄積の可能性が高い。TGN か1） Kinoshita, T. Biosynthesis and biology of mammalian

ら生じる小胞、Lamellar body に GlcCer が積みこまれない

GPI-anchored proteins. Open Biol 1 0, 1 9 0 2 9 0, doi: 1 0.

せいであると考えられる。一方で荒い繊維状の染色パター

1098/rsob. 190290（2020）．

ンを示した ceramide の局在は、ER の可能性が考えられる

2） Kuki, I., Yukitoshi Takahashi, Shin Okazaki, Hisashi

が ER マーカーの局在と比較する必要がある。GlcCer の輸

Kawawaki, Eiji Ehara, Norimitsu Inoue, Taroh

送障害のためにその前のステップのセラミドの輸送も障害

Kinoshita and Yoshiko Murakami Case report on

されている可能性がある。角層に含まれる 7 種のセラミド

vitamin B6 responsive epilepsy due to inherited GPI

は６種のグルコシルセラミドとアシルグルコシルセラミド

deficiency. Neurology 81, 1467-1469., doi: DOI: 10. 1212/（Epidermoside）から産生されるが、スフィンゴミエリン

WNL. 0b013e3182a8411a（2013）．

からは 2 種のセラミドの産生にとどまる。グルコセレブロ

3） Tanigawa, J., Mimatsu, H., Mizuno, S., Okamoto, N.,

シダーゼの異常によるゴーシェ病においてはグルコシルセ

Fukushi, D., Tominaga, K., Kidokoro, H., Muramatsu,

ラミドからセラミドを産生できず皮膚透化バリアの形成不Y., Nishi, E., Nakamura, S., Motooka, D., Nomura, N.,

全を起こす。一方スフィンゴミエリナーゼの異常によるニHayasaka, K., Niihori, T., Aoki, Y., Nabatame, S.,ーマン・ピック病においては皮膚症状は報告されていない。

Hayakawa, M., Natsume, J., Ozono, K., Kinoshita, T.,

すなわちグルコシルセラミド由来のセラミドがバリア形成

Wakamatsu, N. & Murakami, Y. Phenotype-genotype

7）に重要であることがわかる 。GlcCer から産生される角層

correlations of PIGO deficiency with variableのセラミドのアミド基に付加されている脂肪酸は多くがphenotypes from infantile lethality to mild learning

C 22 から C 26 の長鎖脂肪酸である 7）。GPI 生合成の初期

difficulties. Hum Mutat 38, 805-815, doi: 10. 1002/humu.

の遺伝子の欠損細胞で長鎖脂肪酸を含む GlcCer が減少し23219（2017）．

ているというリピドミクスのデータがあり、GPI-AP ある

4） Tarutani, M., Itami, S., Okabe, M., Ikawa, M., Tezuka,− 168 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発

T., Yoshikawa, K., Kinoshita, T. & Takeda, J. Tissue

inositol Oligosaccharides. ACS Chem Biol 1 6, 2 2 9 7-

specific knock-out of the mouse Pig-a gene reveals

2306, doi: 10. 1021/acschembio. 1c00465（2021）．

important roles for GPI-anchored proteins in skin9） Wilson, V. G. Growth and differentiation of HaCaT

development. Proc Natl Acad Sci USA 94, 7400-7405

keratinocytes. Methods Mol Biol 1 1 9 5, 3 3-4 1, doi: 1 0.
1007/7651_2013_42（2014）．

（1997）．
5） Hara-Chikuma, M., Takeda, J., Tarutani, M., Uchida,10）Ishibashi, Y., Kohyama-Koganeya, A. & Hirabayashi,Y., Holleran, W. M., Endo, Y., Elias, P. M. & Inoue, S.

Y. New insights on glucosylated lipids: metabolism andEpidermal-specific defect of GPI anchor in Pig-a nullfunctions. Biochim Biophys Acta 1831, 1475-1485, doi:

mice results in Harlequin ichthyosis-like features. J
Invest Dermatol 1 2 3, 4 6 4-4 6 9, doi: 1 0. 1 1 1 1/j. 0 0 2 2-

10. 1016/j. bbalip. 2013. 06. 001（2013）．
11）Mitsutake, S., Suzuki, C., Akiyama, M., Tsuji, K.,
Yanagi, T., Shimizu, H. & Igarashi, Y. ABCA1 2

202X. 2004. 23227. x（2004）．
6） Yanagi, T., Akiyama, M., Nishihara, H., Sakai, K.,dysfunction causes a disorder in glucosylceramide

Nishie, W., Tanaka, S. & Shimizu, H. Harlequinaccumulation during keratinocyte differentiation. J

ichthyosis model mouse reveals alveolar collapse andDermatol Sci 60, 128-129, doi: 10. 1016/j. jdermsci. 2010.

severe fetal skin barrier defects. Hum Mol Genet 1 7,

08. 012（2010）．
12）Charruyer, A., Bell, S. M., Kawano, M., Douangpanya, S., Yen, T.

3075-3083, doi: 10. 1093/hmg/ddn204（2008）．
7） Hamanaka, S., Hara, M., Nishio, H., Otsuka, F., Suzuki,Y., Macher, B. A., Kumagai, K., Hanada, K., Holleran, W. M. &A. & Uchida, Y. Human epidermal glucosylceramides

Uchida, Y. Decreased ceramide transport protein（CERT）

are major precursors of stratum corneum ceramides. J

function alters sphingomyelin production following UVB

Invest Dermatol 119, 416-423, doi: 10. 1046/j. 1523-1747.

irradiation. J Biol Chem 283, 16682-16692, doi: 10. 1074/jbc.

2002.01836. x（2002）．

M800799200（2008）．

8） Guerrero, P. A., Murakami, Y., Malik, A., Seeberger,

13） Loizides-Mangold, U., David, F. P., Nesatyy, V. J., Kinoshita, T. &P. H., Kinoshita, T. & Varon Silva, D. Rescue of

Riezman, H. Glycosylphosphatidylinositol anchors regulate

Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Protein

glycosphingolipid levels. J Lipid Res 53, 1522-1534, doi: 10. 1194/

Biosynthesis Using Synthetic Glycosylphosphatidyl

jlr. M025692（2012）．

− 169 −

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科分子細胞毒性研究室

矢嶋

伊知朗

Skin is exposed to various environmental factors and various stresses in addition to natural aging, which in turn causes
various types of damage to the skin. Ultraviolet rays are one of the environmental factors well known to cause skin damage,and are known to induce skin keratinization and melanin pigmentation, resulting in adverse effects such as wrinkles, spots,
and freckles. It is also known that various heavy metals contained in drinking water and food can adversely affect the skin.
In particular, arsenic is contained in large amounts in marine products (especially hijiki) that Japanese people consume ona daily basis, and many cases of chronic exposure of arsenic inducing skin keratinization and melanin pigmentation havebeen reported in the whole world. The purpose of this study was to ‘clarify the expression pattern of miRNAs related to skinkeratinization and melanin pigmentation in body hair and the relationship between UV irradiation and arsenic-induced skinkeratinization and melanin deposition’. We focused on 11 miRNAs and analyzed their expression patterns in mouse bodyhair and cultured cell lines derived from skin tissues. In body hairs, miRNAs showed characteristic expression patterns in
response to UV and arsenic exposure, and common expression patterns were also observed. In the cell culture experiments, ahuman skin keratinocyte cell line (HaCaT) and a melanocyte-based cultured cell line (B10F10) were used to analyze miRNA
expression patterns. Keratinocyte-specific or melanocyte-specific expression patterns were identified, as well as miRNAs
which expression was significantly altered by combined exposure to UV light and arsenic. These results suggest that analysisof miRNA expression patterns using body hair may contribute to the prevention and therapy of skin diseases caused by UV
and arsenic exposure.

1．緒

るものの、同じしわ・シミ・ソバカスであっても、環境因言子によってその発症機構には大きな違いが存在し、発症原

皮膚は様々な環境因子に曝され、加齢などの自然老化に加えた様々なストレスを受け、それにより皮膚は様々なダメージを受けている。例えば紫外線は誰もが知る皮膚ダメ

因とその機構をあらかじめ知っておくことが、より良い予防や治療には必要不可欠である。
近年、リボ核酸（RNA）の一種で極めてサイズの小さい、ージを引き起こす環境因子の一つであり、皮膚角化やメラマイクロ RNA（microRNA, miRNA）が体内で数千種類発

ニン沈着を誘導し、しわ・シミ・ソバカスなどの悪影響を現しており、様々な疾患の発症や抑制に作用していること引き起こすことが知られている。我々もこれまでの研究にが明らかにされている、様々な miRNA の組み合わせで検おいて、紫外線照射が皮膚ダメージ、特に DNA 損傷を誘出することにより、多種の疾患を診断、或いは予知するこ1）発することをヒト及びマウスのレベルで実証している 。

とが可能となっている。また、毛髪中（非侵襲的に採取可能）

また、飲用水や食品に含まれる様々な重金属が体内からに含まれる miRNA の量と種類のパターンが、様々な皮膚

皮膚に悪影響を及ぼすことも知られている。特にヒ素は、疾患の診断に利用可能であることが近年報告されている。

例えば日本人が日常的に摂取する海産物（特にヒジキ）に多

我々はこれまでの実験マウスを用いた予備的検討から、量に含まれており、海外ではヒ素の慢性的な摂取が皮膚角

紫外線曝露・ヒ素曝露によって体毛中の miRNA 発現（正化やメラニン沈着を誘発するケースが多数報告されている。

確には「含有量」だが、ここでは「発現量」に統一する）パタ

我々の研究でも、ヒ素曝露と皮膚疾患、皮膚メラニン沈着ーンに変化が生じ、特に皮膚角化やメラニン沈着に関与すの関連性をヒトレベルで明らかにし、さらにマウスモデル

る miRNA が大きく変化していることを発見した（図 1 参の樹立にも成功している 2 , 3）。

照）。

これまでの様々な研究により、環境因子による皮膚のし我々は、他研究者による研究や、我々自身の予備的検討

わ・シミ・ソバカスなどの発症機構が明らかにされつつあ

結果から、非侵襲的に毛髪を採取（毛根は含まない）しAnalysis of the relationship between skinkeratinization and melanin pigmentationand microRNA levels in hair

miRNA 発現パターンを明らかにすることで、皮膚に現れている（或いはこれから現れるであろう）しわ・シミ・ソバ
カスの発症原因やその発症機構をオーダーメイドで明らか

Ichiro Yajimaにすることが可能となり、様々な予防法や治療法を提供可

Molecular and Cellular Toxicology, Departmentof Bioscience and Engineering, College ofSystems Engineering and Science, Shibaura
Institute of Technology

能になるのではないかと着想した。この将来的なゴールを見 据 え、 本 研 究 で は、 皮 膚 角 化 や メ ラ ニ ン 沈 着 関 連
miRNA の体毛での発現パターンと紫外線照射及びヒ素誘− 170 −

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

図1 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの体毛中miRNAの紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化（QPCRによる解析）。同じmiRNAでも、環境因子によって体毛中レベルの変化は異なっている。

発性皮膚角化及びメラニン沈着の関連性を明らかにするこ

1 N NaOH/ 10 % DMSO を加え、軽くボルテックスをおことを目的とした。

なった後、80 ℃で 2 時間処理を行う。2 時間後、96 well

2. 方plate に各チューブから 100 µl ずつ分注し、405 nm で吸光法

度を測定、メラニン産生量を算出する。細胞生存率データ

2. 1. マウス体毛からのmiRNA精製による補正を行うことで、細胞あたりのメラニン量を計算

マウス背側体毛を剪毛し、エタノールにて洗浄・乾燥後する。

1 . 5 ml tube に 移 し、 凍 結 保 存 し た。miRNA の 精 製 はHigh Pure miRNA Isolation Kit（Roche）
及びTRIzol RNA

2. 4. cDNA合成とQPCR

Isolation Reagents（Thermo Fisher）を使用し、プロトコ

細 胞 か ら の miRNA を 含 む total RNA の 精 製 は Highールに沿って精製を行った。精製した miRNA は−80 ºC に

Pure miRNA Isolation Kit（Roche）を 用 い て 行 っ た。

て保存した。

miRNA の cDNA 及 び QPCR は Mir-X ™ miRNA qRTPCR TB Green® Kit（TaKaRa）を使用した。

2. 2. 培養細胞と培養方法

３. 結細胞はヒト正常皮膚角化細胞株（HaCaT）、マウスメラノ ー マ 細 胞 株（B 10 F 10）を 用 い た。HaCaT の 培 養 液 は果

3. 1. 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの毛髪中発

DMEM+ 10 % FBS、
B 16 は RPMI- 1640 + 10 % FBS で 37 ℃、現量の測定

CO 2 5 % の環境下で培養を行った。曝露試験においては我々の予備的検討結果より、皮膚角化とメラニン沈着両

6 -well plate または 24 -well plate に細胞を規定量播種し、方に関与する miRNA（miR-a, -b, -c が紫外線及びヒ素曝24 時間後に 1 % FBS 入り培養液に置換した。その 24 時間

露によって体毛中のパターンに変化が起きることが明らか

後 よ り 曝 露 を 開 始 し た。 ヒ 素 曝 露 に つ い て は 100 mMとなっている（図 1 参照）が、まだ未解析の同様の機能を有

stock 溶液を作成、培養液にて希釈して曝露を行った。紫する他の miRNA（miR-d, -e, -f など）の解析を行った。マ

外線曝露では、細胞を PBS で洗浄後、PBS を 2 ml/well 加え、ウスに対し、脱毛部への紫外線照射またはヒ素飲水投与を

2

2

紫外線照射（UVB（365 nm）15 mJ/cm または 20 mJ/cm ）6 ヶ月間実施し、回収した体毛（毛根は含まないため抜毛を行った。紫外線照射後、PBS をアスピレーターで吸収し、ではなく剪毛。非侵襲的）を用いて、QPCR によって目的

1 % FBS 入り培養液に置換した。その後 37 ℃、CO 2 5 %のmiRNA量及びパターンをQPCR法にて解析を行った（図の環境下で 24 時間培養を行った。

2 - 1 , 2 - 2）
。miR-d は紫外線曝露及びヒ素曝露によって有意に減少し、濃度依存的な傾向が観察された。miR-e は紫

2. 3. 細胞生存率測定とメラニン量測定

外線曝露及びヒ素曝露によって有意に減少し、濃度依存的

細胞生存率測定は Cell Counting Kit- 8（DOJINDO）を用な傾向が観察された。miR-f は紫外線曝露では有意に減少いて行った。メラニン量測定は以下の通り。曝露試験を行し、ヒ素曝露によって有意に上昇した。miR-g は紫外線曝った細胞を PBS で２回洗浄し PBS を吸引後 PBS を 500 µl

露によって非常に強く発現量の上昇が観察されたが、ヒ素ずつ加え、スクレイパーで細胞を 1 . 5 ml tube に回収する。

曝露では変化は認められなかった。miR-h は紫外線曝露で2000 g, 1 min の条件で遠心を行い、上清を捨て 500 µl のは紫外線強度依存的に有意に減少したが、ヒ素曝露では濃− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 2-1 皮 膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-d, -e, -f,-g）の体毛中 miRNA の紫外線曝露（UVB）
及びヒ素曝露（As）
による変化。

図 2-2 皮 膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-d, -e, -f,-g）の体毛中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）
による変化。

度に関係なく、強い発現低下が観察された。miR-i では紫変化が観察された miR-a, b, c, d, e, f, h, k の８種類を対象

外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量の有意な変化は認められとした。miR-a は紫外線、ヒ素曝露ともに発現量が有意になかった。miR-j は紫外線曝露による発現変化は認められ低下し、複合曝露でも同程度の低下が観察された。miR-b

なかったが、ヒ素曝露では有意な濃度依存的発現上昇が観は紫外線曝露によって発現量が有意に低下し、ヒ素曝露で察された。miR-k は紫外線曝露による濃度依存的発現上昇は有意な変化は観察されなかった。複合曝露では有意な低が観察され、ヒ素曝露では濃度に関係なく、強い発現低下下が見られた。miR-c では、紫外線曝露、ヒ素曝露、複合が観察された。

曝露ともに有意な変化は観察されなかった。miR-d では、
紫外線曝露によって有意な発現低下が観察され、ヒ素曝露

3. 2. 培養細胞株における紫外線曝露及びヒ素曝露にでは低レベルではあるが、有意な発現上昇が観察された。

よるmiRNA発現パターン解析

複合曝露では発現量に有意な減少が観察された。miR-e はin vivo 実験より同定された体毛中の miRNA がどのよう

紫外線曝露及びヒ素曝露でともにわずかな発現上昇が観察な機構で発現制御されているのかを、培養細胞を用いて解され、複合曝露では極めて強い発現の上昇が観察された。

析をおこなった。紫外線曝露やヒ素曝露による皮膚疾患は

miR-f は、紫外線曝露では発現が強く抑制され、ヒ素曝露

皮膚角化細胞及びメラノサイトでの発症が大きく、本研究では変化は観察されなかった。複合曝露では発現が強く抑ではそれらの影響を細胞レベルで解明するために、ヒト皮制された。miR-h では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量

膚角化細胞株（HaCaT）及びマウス B 16 F 10 メラノーマ細の有意な低下が観察され、複合曝露では最も強く発現が抑胞株に対して紫外線及びヒ素を個別及び複合曝露し、制された。miR-k では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量

miRNA の発現パターンを解析した（図 3 , 4）
。まず、メラの有意な低下が観察され、複合曝露では最も強く発現が抑ノサイトへの影響を調査するためにメラノサイトのモデル制された。

細胞として多用されている B 16 F 10 細胞株を用いた発現

次に、皮膚角化細胞への影響を調査するために、角化細パターン解析を行った（図 3 - 1 , 3 - 2）
。なお、本実験では胞モデルである HaCaT 細胞を用いた発現パターン解析を

3 . 1 . で調査した miRNA のうち、発現パターンに大きな行った（図 4 - 1 , 4 - 2）。miR-a では、紫外線曝露、ヒ素曝露、− 172 −

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

図 3 - 1 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-a, -b, -c-d）の B 16 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 3 - 2 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-e, -f, -h,-k）の B 16 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 4 - 1 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-a, -b, -c-d）の HaCaT 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝
露（As）による変化。

図 4 - 2 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-e, -f, -h,-k）の HaCaT 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

複合曝露ともに同レベルで有意な発現低下が観察された。

4. 考

miR-b では紫外線曝露、ヒ素曝露、複合曝露ともに有意な変化は観察されなかった。miR-c では紫外線曝露、ヒ素曝
露ともに有意な発現上昇が観察され、複合曝露ではより強察

4. 1. 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの体毛中miRNAの紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）

い発現上昇が観察された。miR-d では、紫外線曝露では強による変化

い発現低下が観察され、ヒ素曝露ではわずかな発現上昇が本研究では、皮膚角化やメラニン沈着関連 miRNA の体観察された。複合曝露では強い発現低下が観察された。

毛での発現パターンと紫外線照射及びヒ素誘発性皮膚角化

miR-e では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに僅かな発現上昇が及びメラニン沈着の関連性を明らかにすることを目的とし観察され、複合曝露では非常に高いレベルでの発現上昇がて、曝露実験によるマウス体毛内の miRNA の定量を行っ観察された。miR-f では紫外線曝露では有意に発現量が低た。miRNA の種類によって紫外線曝露とヒ素曝露が同じ

下し、ヒ素曝露では有意に上昇した。複合曝露では有意な発現パターンを示す場合もあれば、逆のパターン（片方が発現変化は観察されなかった。miR-k では紫外線曝露、ヒ発現上昇し、もう片方が発現低下）もあり、非常に多様な

素曝露、複合曝露ともに発現量の有意な低下が観察された。

発現制御機構を持つことが考えられる。miR-e は今回の候

その中でも、複合曝露が最も発現量の低下が観察された。

補 miRNA の中で唯一紫外線曝露でもヒ素曝露でも発現量− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022が上昇し、かつ濃度依存性を示していることから、miR-e

サイトを起点とする疾患発症に関与していると考えられる。

は紫外線曝露とヒ素曝露による疾患の発症メカニズムに共miR-d, -f は B 16 F 10 細胞における miR-b, -d, f と類似し通して関与している可能性を示唆している。一方で、たパターン、すなわち紫外線曝露による発現の減少に大きmiR-a, -d, -h, -k は紫外線曝露でもヒ素曝露でも発現量がく寄与していることから、特に miR-d, -f はメラノサイト

有意に減少しており、紫外線曝露とヒ素曝露による疾患のと角化細胞の紫外線曝露に対する応答に共通して機能して発症に共通するメカニズムではこれら miRNA の発現を減いることを強く示唆している。

少させること、つまりはターゲット遺伝子の発現を阻害す
ることが重要な役割を果たすと考えられる。miR-b, -g は

4. 3. in vivo研究とin vitro研究の相違について

紫外線曝露でその発現量をそれぞれ低下、上昇させるが、体毛は角化細胞からのケラチン産生とメラノサイトからヒ素曝露での変化は観察されなかったことから、これらののメラニン産生により構成されていることから、体毛でのmiRNA は紫外線曝露関連疾患にのみ関与していることがmiRNA の量的パターンと角化細胞及びメラノサイトでの示唆される。一方、miR-c, j ははヒ素曝露でその発現量をパターンには類似性が存在すると考えられる。本研究では、それぞれ上昇、低下させるが、紫外線曝露での変化は観察

このような類似性についても検討した。miR-a は体毛、メされなかったことから、これらの miRNA はヒ素曝露関連

ラノサイト、角化細胞のいずれでも紫外線曝露、ヒ素曝露

疾患にのみ関与していることが示唆される。

で発現低下が観察され、miR-e, -k は体毛、メラノサイト、角化細胞のいずれでも紫外線曝露、ヒ素曝露で発現上昇が4. 2. 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNAの培養細胞中 miRNA の紫外 線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化

観察されており、miR-a, -e, -k を体毛で検出、解析する

皮膚及び体毛などを対象とした実験は個体への影響を解毛とメラノサイトでの発現パターンが類似していることか析するためには有用だが、細胞種ごとの解析には不適であら、体毛での検出によりメラノサイトでの現象のみを検出る。そのため我々は紫外線曝露やヒ素曝露による皮膚疾患するマーカーとして有効であると考えられる。

ことは皮膚での各細胞の現象を検出することとなり、関連疾患マーカーとして有望であると考えられる。miR-b は体で影響を受けやすい細胞である角化細胞とメラノサイト系
譜細胞株を用いた細胞種特異的な発現パターン解析を行っ4. 4. 複合曝露とmiRNA発現パターンについてた。メラノサイト系譜である B 16 F 10 細胞では曝露の種

本研究では、培養細胞実験において紫外線曝露とヒ素曝

類や複合曝露による大きな変化が観察された。miR-a, -h,

露の複合曝露実験も実施した。ヒ素曝露は主に経口摂取よ-k では紫外線曝露、ヒ素曝露、複合曝露ともに発現量のり皮膚に蓄積し、紫外線曝露は屋外活動により日常的に引有意な低下が観察され特に miR-k は各単独暴露の影響がき起こされることから、ヒ素曝露地域では自ずと複合曝露加算されて複合曝露に対する影響となって現れたと考えらが誘発されることになる。今回解析した miRNA のうちれた。これらの miRNA は紫外線曝露、複合曝露関連疾患

miR-e はメラノサイトでも角化細胞でも、単独曝露によるに共通し、メラノサイトを通じて関与している可能性が示効果よりも複合曝露による効果が非常に強く、両曝露に関唆された。miR-b, -d, -f は紫外線曝露では共通して発現量連する疾患に共通するメカニズムに深く関与していることが大きく減少している一方、ヒ素曝露では変化しないあるを示唆している。また、複合曝露が特定の miRNA の発現

いはわずかに発現上昇しているのみであることから、これを相乗的に変化させることを示しており、miRNA の解析

らの miRNA はメラノサイトでは紫外線曝露に対してのみにおいても複合曝露を念頭に置いた新たな解析手法が必要

応答、機能している可能性が示唆される。miR-e は紫外線であることを示唆している。

曝露、ヒ素曝露ともに発現が僅かに上昇している程度だが、複合曝露ではその発現量が大きく増大している。これらの4. 5. まとめ結果は、miR-e が特に複合曝露によって発現誘導されるこ今回用いた 11 種類の miRNA に対する解析では、4 種類と、複合曝露による疾患発症に特に関与している可能性をの疾患マーカーとしての有望な候補が見いだされた。本研示唆している。

究では 11 種類であったが、他にも皮膚疾患に関連すると

角化細胞系譜である HaCaT 細胞でもまた、細胞系譜特考えられる miRNA は多数存在しており、これらの候補を異的な発現パターンが観察された。miR-a, -h は紫外線曝網羅的に検証することでより多くの疾患マーカーの同定が露、ヒ素曝露、複合曝露ともに同程度のレベルで発現がそ可能となると期待できる。本研究で同定された miRNA はれぞれ減少、上昇していた。miR-b は変化が認められなか直接疾患発症に機能的に関与している可能性もあり、ったことから、B 16 F 10 細胞での紫外線曝露特異的発現変

miRNA や mimic RNA を使用した研究を今後実施するこ化という結果とともに考えると、紫外線曝露によるメラノとで、機能との直接的な関わりを証明できると期待できる。

− 174 −

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

将来的には本研究と今後の応用的研究が皮膚疾患の余地・

Hossain, Nobutaka Ohgami, Masashi Kato. Arsenic-

予防に大きく寄与することを期待している。

mediated hyperpigmentation in skin via NF-kappa B/
endothelin-1 signaling in an originally developed（引用文献）

hairless mouse model. Arch Toxicol. 9 1: 3 5 0 7-3 5 1 6.

1） Masashi Kato, Machiko Iida, Yuji Goto, Takaaki

2017.

Kondo, Ichiro YajimaKato M. and Yajima I. Sunlight3） Ichiro Yajima, Mayuko Y Kumasaka, Shoko Ohnuma,

exposure-mediated DNA damage in young adults.

Nobutaka Ohgami, Hisao Naito, Hossain U Shekhar,

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2 0: 1 6 2 2-1 6 2 8.

Yasuhiro Omata, Masashi Kato. Arsenite-Mediated2011.

Promotion of Anchorage-Independent Growth of2） Ichiro Yajima, Mayuko Y Kumasaka, Machiko Iida,
Reina Oshino, Hiroko Tanihata, Aeorangajeb Al

HaCaT Cells through Placental Growth Factor. J
Invest Dermatol, 135: 1147-1156. 2015.

− 175 −

非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析
─皮膚は色を識別できるのか？─
日本薬科大学薬学部生命科学薬学分野

山本博之

The skin is the most external part of the body and is strongly influenced by light. Previous study, the effects of light on
the skin have been evaluated mainly in terms of the biological effects of UV light, which has high energy, but the mechanisms of skin tissue response to visible light are still unclear. In this study, we investigated the light response of skin, anon-visual tissue, focusing on photoreceptors. Photoreceptor expression in skin tissue and skin keratinocytes was evaluatedby RT-PCR, and multiple opsin receptor mRNA expressions were found in rat skin tissue and FRSK cells. The expressionof enzymes related to the visual cycle, which is involved in the maintenance of photoreceptor activity, was also examinedby RT-PCR. The results showed that all enzymes involved in the visual cycle were expressed in rat skin tissue. Retinal metabolites in FRSK cells after light exposure were detected by HPLC. The results showed that 11cis-retinal was converted to
all trans-retinal by exposure to light. These results indicates that photoreceptors expressed on keratinocytes are modulated intheir activity by exposure to light.

1．緒

プシンタンパク質に 11-cis レチナールが結合しているこ言とが重要である。オプシンタンパク質に結合する 11 -cis

皮膚は最も外側に位置する組織であり、外界から様々な

レチナールは光線の曝露によって all trans- レチナールに物理的刺激を受けている。それらの刺激の中でも光は生活変換された後、オプシンタンパク質から解離される。そのする上で避けることができないものである。生体に対するため、11 -cis レチナールを失ったオプシンタンパク質は失光の影響は、エネルギーの大きな紫外線の影響を中心に評活する。眼では解離した all trans - レチナールが再び 11 -価がされてきた。紫外線は組織において活性酸素種の増加

cis レチナールとなりオプシンタンパク質に結合する経路

や DNA 障害などを介して、色素沈着や細胞外マトリック（図 1 視サイクル）が存在し、オプシンタンパク質が活性

スの分解、炎症の惹起などを引き起こす 1）。紫外線によりを持続できる環境が整っている 3）。そこで本研究では、光引き起こされるこれらの応答は、シミやしわといった皮膚線の曝露による皮膚の活性化機構についてオプシンタンパの老化現象と類似していることから光老化と呼ばれる。一ク質に着目し、初めに皮膚に発現するオプシン類の探索を方、紫外線よりも長波長の可視光線は皮膚の美容領域で利用されており、皮膚に存在する細胞は表 1 のように、浴びる光の波長によりペプチドやプロテアーゼの産生、セラミ表1波長による皮膚由来細胞の応答の違い

ド合成、メラニン産生などの細胞応答が起こることが報告されている。このような光線の曝露から細胞応答が起きる
反応には、光線の刺激が化学シグナルに変換されて細胞応答が起こると考えられるが、皮膚における光応答の仕組みは不明な点が多い。皮膚が光を認識する機構として、光受容体として機能するオプシンタンパク質の研究が進められている 2）。オプシンタンパク質は G タンパク質共役型受容体に分類され、サブタイプの違いによって認識する波長が異なる。眼の網膜では、青、緑、赤の波長を受容するオプ
シンタンパク質が網膜の錐体細胞に発現しており外界からの光の色の違いを識別している。また、その活性には、オ

Activation mechanism of photoreceptors
expressed in skin tissue
Hiroyuki Yamamoto
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Nihon
Pharmaceutical University− 176 −

図1

視サイクル

非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析

─皮膚は色を識別できるのか？─

行った。また、皮膚に発現するオプシンが光を受けて活性出した。抽出液は遠心分離後、上清を回収してウエスタンを維持するために必要な視サイクルが皮膚においても存在

ブロットの試料とした。ウエスタンブロットは、12 ％ ア

しているのかを検証した。さらに、皮膚に発現するオプシ

クリルアミドゲルにて試料を電気泳動し、ニトロセルロー

ンタンパク質が光を受けて活性を調整しているのかをレチス膜に転写した。転写したニトロセルロース膜は、スキム

ナール代謝産物を検出することで評価した。

ミ ル ク で ブ ロ ッ キ ン グ 後、 抗 RPE 65 抗 体（3 , 000 倍、

2. 方

GeneTex 社）、2 次抗体として HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体

法（10 , 000 倍、SeraCare 社）で反応させたのち、RPE 65 タン

2. 1. 実験動物と培養細胞

パク質をイムノスターゼータ（和光純薬）で検出した。

実験には、Sprague-Dawley ラット（SDR）および弘前小眼球ラット（Hirosaki Small Eye Rat； HiSER）を用いた。

2. 4. レチナール代謝産物の検出
10 cm シャーレに 1 × 107 細胞となるように播種した。

HiSER ラットは、SDR より自然突然変異により発生したラットであり、常染色体劣性遺伝性かつ進行性の水晶体の24 時間培養後、細胞を 350 nm- 850 nm の波長を含む LED

白濁や退縮、網膜の剥離などの異常を示すラットである 4）。

光で 15 分間、曝露した。曝露後、10 分および 30 分の細ラットの飼育は、室温 23 ± 1 ℃、湿度 50 ％、明暗を 12 時

胞からレチナール代謝産物およびレチノール代謝産物を抽間サイクルに維持された飼育室にて、摂餌・飲水は自由に出した。また、LED 光で曝露していないものを非照射細摂取できる環境で飼育した。本実験は日本薬科大学動物実胞として用いた。レチナール代謝産物は、ホルムアルデヒ

験倫理委員会によって承認を受けて実施した。

ド法 5）、レチノール代謝産物はヘキサン 6）により抽出した。

また、実験に用いたラット胎児角化細胞（FRSK）は、

すなわち、レチナール代謝産物は、PBS で洗浄後、6 M ホ

JCRB 細胞バンク（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄ルムアルデヒドで固定した後、レチナール代謝産物をジク

養研究所）より分譲されたものを用いた。FRSK 細胞は、

ロロメタン /n- ヘキサンで分配抽出した。抽出物は遠心エ

10 ％ FCS を 添 加 し た ダ ル ベ ッ コ 改 変 イ ー グ ル 培 地

バポレーターにて乾固させた。また、レチノール代謝産物（DMEM）で、CO 2 インキュベーターを用いて 5 ％ CO 2、は、PBS で洗浄後、エタノールで除タンパク質した後、ジ

37 ℃の条件で培養した。

クロロメタン /n- ヘキサン溶液によりレチノールを抽出した。抽出物は遠心エバポレーターにて乾固させた。抽出し2. 2. ラット胎児角化細胞に発現する光受容体および視サイクル関連酵素mRNA発現の検討
7たレチナール代謝産物とレチノール代謝産物はメタノール／ リ ン 酸 緩 衝 液 で 溶 解 後、 逆 相 カ ラ ム（ コ ス モ シ ー ル

FRSK 細胞を 10 cm シャーレに 1 × 10 細胞となるように

Cholester カラム、ナカライテスク）を用いた高速液体クロ播種した。24 時間後、培地を除去した後、RNA 抽出用試

マトグラフィーにより分離し、溶出時間からレチノールお薬 Isogen を用いて total RNA を抽出した。抽出した total

よびレチナール代謝産物の分子型を評価した。

RNA は、逆転写酵素（ReverTra Ace、東洋紡）を用いて

3. 結

cDNA を合成した。また、SDR および HiSER より背部皮膚と眼組織を採取し、FRSK 細胞と同様に cDNA を調製した。調製した cDNA を用いて、光受容体および視サイク
ル関連酵素遺伝子の発現を PCR 法により検討した。光受果

3. 1. 角化細胞および皮膚組織に発現する光受容体の探索
皮膚組織に発現する光受容体の探索を行った。その結果、容体は、OPN 1 -SW、OPN 1 -MW/LW、OPN 2、OPN 3、

ラット背部の皮膚組織には OPN 1 -SW、OPN 3、OPN 4 お

OPN 4 および OPN 5 mRNA の発現を PCR 法により検討しよび OPN 5 mRNA の発現が認められた（図 2 -A）。ラット

た。また、視サイクル関連酵素はレチノールデヒドロゲナの皮膚に発現する光受容体の波長と活性の関連を図 2 -Bーゼ（RDH）8、RDH 12、RDH 11、レシチン - レチノールに示す。このことから、皮膚組織には UV-A に相当する

アシルトランスフェラーゼ（LRAT）およびレチノイドイソ

380 nm 付近から緑色の 550 nm 付近の波長に応答する光受

メロヒドロラーゼ（RPE）65 mRNA の発現を PCR 法により容体が発現することが示された。紫外線や青色光などの短評価した。

波長の光は組織への透過力が弱く表皮や真皮にまでしか到達しない。そこで、皮膚で最も外部に位置する表皮の主な

2. 3. ラット胎児角化細胞に発現するRPE65タンパ細胞である角化細胞に与える影響が大きいと考え、角化細ク質の検出

胞に発現する光受容体を RT-PCR 法にて解析した。そのFRSK 細胞を 10 cm シャーレに 1 × 107 細胞となるように

結果、FRSK細胞にはOPN1-SW、OPN2、OPN3 およびOPN 5播種した。24 時間後、培地を除去した後、PBS で細胞をmRNA の発現が認められた（図 2 -A）。FRSK 細胞に発現

洗浄後、RIPA 緩衝液で細胞を可溶化してタンパク質を抽する光受容体と活性化される波長の関係から、皮膚組織と− 177 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図2

ラット皮膚および皮膚角化細胞における光受容体遺伝子の発現検討

A： RT-PCR法によるラット皮膚およびラット角化細胞に発現する光受容体mRNAの検討
B： 皮膚組織および角化細胞に発現する光受容体と応答する波長の関係

図3

ラット皮膚および皮膚角化細胞での視サイクル関連酵素の発現検討

A： RT-PCR法によるラット皮膚および眼組織に発現する視サイクル関連酵素発現の検討
B： 皮膚に発現する視サイクル関連酵素発現の系統の違いに関する検討
C： ウエスタンブロットによるRPE 65タンパク質発現の検討

同様に FRSK 細胞は 380 nm から 550 nm 付近の光線を認識

trans - レチナールが all trans - レチノール、11 cis- レチナする光受容体が発現していることが示唆された（図 2 -B）。

ールを介して 11 cis - レチノールに変換されるのに必要なすべての酵素が発現していることを示している。また、視サ

3. 2. 皮膚組織に発現する視サイクル関連酵素の探索

イクルに関わる酵素の発現が週齢やラットの系統により違

ラットの皮膚組織や表皮角化細胞に複数の光受容体が発いがあるのかについても検討を行った（図 3 -B）。その結果、現していることが示唆された。そこで、光受容体が活性を

SDR および HiSER ラットのいずれの系統においても、視サ維持するために必要な視サイクルに関わる酵素が皮膚組織

イクルに関わる酵素の発現が認められた。また、酵素の発に発現しているかを確認するために、RT-PCR 法にて検現は 1 週齢から 4 週齢にかけて大きな変化は認められなか討した。その結果、図 3 -A に示すように眼組織と同等にった。さらに、all trans - レチノールを 11 cis - レチナール

皮膚組織においても視サイクルに関わる RDH 8、RDH 12、に変換する RPE 65 タンパク質の発現をウエスタンブロット

RDH 11、LRAT および RPE 65 mRNA の発現が認められた。

法にて検出した。その結果、ラット皮膚においても眼組織

こ の 結 果 は 光 の 曝 露 に よ り 光 受 容 体 か ら 遊 離 し た allと同様に RPE 65 が発現していることが示された（図 3 -C）。

− 178 −

非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析

図4

─皮膚は色を識別できるのか？─

光線曝露後の角化細胞内のレチノールおよびレチナール代謝産物の検出

A： 標準物質の溶出位置、B： 光線非曝露細胞、C： 光線曝露10分後、D： 光線曝露30分後

3. 3. 角化細胞における光線曝露後のレチナール代謝
ラットの皮膚組織や表皮角化細胞に光受容体が発現してな る と、all trans- レ チ ナ ー ル の ピ ー ク は 減 少 し、alltrans- レチノールの割合が大きくなった（図 4 -D）。

おり、その活性の維持に関わる視サイクルが存在している

４. 考ことが示唆された。そこで、FRSK 細胞が光線の曝露を受察けたときに、細胞に発現する光受容体が活性化されている

以上より皮膚組織においても眼と同様に光受容体であるのか、また、光受容体の活性を維持するためにレチノール

オプシンタンパク質の発現が認められ、可視光線を感受す

およびレチナール関連分子が代謝を受けているのかを明らることが示唆された。皮膚組織に発現する光受容体の応答

かにすることを目的に光線曝露後のレチナール代謝産物の波長をまとめると皮膚は紫外光から緑色光にわたり、広い

経時変化を解析した。図 4 -A に視サイクルで生成される範囲の波長で光を受容することが可能であると考えられた。

レチナールおよびレチノール代謝産物の標準物質のクロマ

これまでに、角化細胞や毛乳頭細胞において青色光によりト グ ラ ム を 示 す。 本 実 験 条 件 で は 11 cis -レ チ ナ ー ル、活性化される OPN 3 の発現が報告されており、角化細胞

11 cis - レチノール、all trans-レチナールおよび all trans-

では分化を抑制することにより表皮を厚くすることで皮膚レ チ ノ ー ル は そ れ ぞ れ、9 . 1 分、8 . 1 分、11 . 0 分 お よ びの保護作用を亢進すること 7）や毛乳頭細胞では毛髪の成長

10 . 0 分付近に溶出された。LED 光で細胞を曝露する前に速度を促進すること 8）が報告されている。紫外光や青色光

は、11 cis - レチナールの存在割合が大きく、11 cis - レチノ

は短波長の光線に分類され、皮膚の透過性は小さく、組織ール、all trans -レチナールおよび all trans- レチノールはに与える影響が大きい波長である。そのため、これらの応検出されるものの存在割合は小さかった（図 4 -B）。次に、答は光線曝露からの生体の防御応答と考えられた。一方、LED 光線曝露 10 分後では、11 cis-レチナールはほとんど

赤色光の長波長を認識する光受容体は検出されておらず、検出されなくなり、all trans-レチナールの存在割合が最オプシンタンパク質以外に光を認識する仕組みの存在が予も高くなった（図 4 -C）。さらに、LED 光線曝露後 30 分に想された。

− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

皮膚組織においてオプシンタンパク質の活性維持に必要

2017, 39, 1-5.

な酵素の発現も認められ、皮膚に発現するオプシンタンパ

2） Suh S, Choi EH, Atanaskova Mesinkovska N. The

ク質が機能していることが強く示唆された。また、皮膚角

expression of opsins in the human skin and its化細胞に光線を曝露すると一過性に all trans-レチナール

implications for photobiomodulation: A Systematicが増加し、その後 all trans-レチノールの増加が見られた

Review. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2020,

ことから、皮膚角化細胞においても視サイクルと同様の代

36, 329-338.

謝が行われていることが示された。さらに、光線の曝露に

3） Choi EH, Daruwalla A, Suh S, Leinonen H, Palczewski

よって all trans -レチナールが増加したことは、皮膚角化

K. Retinoids in the visual cycle: role of the retinal G細胞に発現するオプシン受容体が曝露された光線に応答しprotein-coupled receptor. J Lipid Res. 2021, 62, 100040.

ていることを示している。本研究では、350 から 850 nm

4） Yamada T, Nanashima N, Shimizu T, Nakazawa Y,の波長を示す LED 光を用いているため、いずれの波長がNakazawa M, Tsuchida S. Establishment of a recessive

オプシン受容体の活性調節に関わっているかまでは明らか

mutant small-eye rat with lens involution and retinalにできていない。今後は、単一波長の LED 光で曝露した

detachment associated with partial deletion and時のレチナール代謝産物を検出することにより、細胞が認

rearrangement of the Cryba1 gene. Biochem J. 2 0 1 5,

識する波長の同定に取り組む予定である。

471（2）, 293-305.

5. 総

5） Suzuki T, Fujita Y, Noda Y, Miyata S. A simple

括

procedure for the extraction of the native chromophore

近年は、光を利用した病気の治療や美容分野での応用が進んでいる。これらの治療には、局所に高いエネルギーをof visual pigments: the formaldehyde method. Vision
Res. 1986, 26（3），425-9.

照射できる紫外光や生体の深部まで到達可能な近赤外光が6） Kane MA, Folias AE, Napoli JL. HPLC/UV quantitation

利用されているが、その作用発現の機序は不明な点が多く

of retinal, retinol, and retinyl esters in serum and残っている。本研究を進めることにより、効果的で安全な

tissues. Anal Biochem. 2008, 378（1）, 71-9.
7） Buscone S, Mardaryev AN, Raafs B, Bikker JW,

光の利用を可能にできるものと考えている。

Sticht C, Gretz N, Farjo N, Uzunbajakava NE,
謝辞Botchkareva NV. A new path in defining light

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス

parameters for hair growth: Discovery and modulation

メトロジー研究財団のご支援をいただきましたことに心よof photoreceptors in human hair follicle. Lasers Surg

り感謝申し上げます。また、ここで報告した研究は、当研

Med. 2017, 49（7）, 705-718.

究室のメンバーの協力による成果です。メンバー各位に御8） Castellano-Pellicena I, Uzunbajakava NE, Mignon C,
Raafs B, Botchkarev VA, Thornton MJ. Does blue light

礼申し上げます。

restore human epidermal barrier function via（引用文献）

activation of Opsin during cutaneous wound healing?

1） Moriwaki S. Light-emitting diodes as a new medical

Lasers Surg Med. 2019, 51（4）, 370-382.

tool in aesthetic dermatology. Photomed. Photobiol.

− 180 −

がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証
聖路加国際大学成人看護・がん看護学臨床准教授

逢阪

がん看護専門看護師

美里

We conducted 1) a prospective observational study of finger nail findings, skin around nails and quality of life in breast
cancer patients undergoing pre- and postoperative adjuvant chemotherapy, and 2) an online nail care intervention study toevaluate the impact of the study.
A prospective observational study showed that peri- and peri-nail skin symptoms appeared before the start of cancer
drug therapy, increased during treatment, and gradually improved after treatment, and that the course of nail symptoms differed according to regimen schedule. The present data could not fully explain the relationship between nail symptoms andquality of life, so further accumulation and validation of data is necessary.
In the online nail care intervention study, there was not an increase the Quality of Life score at each time point after theintervention compared to the pre-intervention time point, and the study participants' impressions indicated that they enjoyedperforming nail care, felt more positive about treatment, gained self-care, and gained more consideration for their surroundings The results of the study showed that the Future studies of the effects of this study in patients of different ages and undergoing different treatment regimens will help to support cancer patients in clinical practice.

1．緒く、そのことにより患者の爪の整容が制限されていると考言える。

がん薬物療法による爪および爪周囲組織への副作用の機2. 目

序は明らかにされていないが、薬物投与による直接的な爪的

母や爪床上皮への細胞毒性や、タキサン系薬剤による血管本研究では、乳がんで化学療法を受ける女性を対象に術新生抑制作用や神経原性炎症などが起こることで爪および後化学療法中に、爪の変化と Quality of Life がどのように爪周囲の変化が起こると推測されている 1）。手の爪は指先変化し影響しているか調査する。またオンラインネイルケに位置することで、自分自身または周囲の人の目につきやアにより Quality of Life にどのような効果をもたらすのかすい存在である。がん薬物療法中に爪の副作用が起こるこ検証する。

とで患者は指先での作業に支障が生じ、見た目の変化によ

3 . 研究の意義り、患者にとって落ち込みなどの心理的苦痛だけでなく、外出を控えるといった社会生活への影響ももたらす副作用である。

日本におけるがん対策の中でがんサバイバーの支援の充実が掲げられているが、コロナ禍において、がん患者の治

しかしながら爪に起こる副作用は、重症化したとしても療環境、支援方法は大きく変化した。過去には体験者同士

生命をおびやかすことにつながりにくいことから、これまが同じ場所に集う対面での交流会が多く開催されていたが、で調査研究が十分になされず医療的なサポートの確立がな

同じ悩みを分かち合い治療の副作用への対処方法を意見交されなかった。外見変化に対する効果的なケアの方法論に換する場が減っている。このような中、不安や孤独を感じ

ついての根拠の乏しさも指摘されており、とくに爪の変化る患者が増えていることが推測され、現状に応じたがん薬に対し安全な整容方法は確立されていない。日本において物療法中のアピアランス支援を工夫する必要があると感じ

外見ケアに関する手引きが作成されたが、がん薬物療法中ている。

の爪の変色や変形に対するケアや整容方法に関する根拠は本研究では、がん薬物治療に関わる乳腺外科医、腫瘍内十分でない。つまり爪のケアに関しては整容を行うことの科医、診療科看護師、また治療中の爪や皮膚の副作用に対安全性、留意点を説明するための十分なエビデンスが乏し応されている皮膚科医と共同し実施することで、より専門的な知識にもとづく爪の変化の情報収集や、爪の変化への

Research of nail care during cancer
chemotherapy

対処の提案につながると考える。
また乳がん補助化学療法中の爪症状の前向き調査により、

Misato Osaka

治療開始後の爪症状に関する経時的変化に関する知見を得

RN, MSN, Certified Nurse Specialist in
Oncology, Clinical Associate Professor,
Oncology Nursing, St. Lukeʼs International
University

ることができる。またオンラインネイルケアの介入による爪症状、Quality of Life への影響を明かにすることで、具体的な対処やケアの提供につながると考えられる。

− 182 −

がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証を調査した。オンラインネイルケアプログラムは、（1）看4 . 研究方法

護師による治療中の爪の変化およびセルフケア方法に関す

本研究は乳がんで術前・術後の補助化学療法を受ける患る情報提供、（2）ネイリストによる手の爪のネイルケア方者を対象に、①爪周囲の皮膚および爪症状と Quality of

法のレクチャー、（3）患者が自身でネイルケアを実施する、Life に関する観察研究、②オンラインネイルケア介入研究

30 分程度の内容とした。オンラインネイルケアプログラ

による効果の検証。

ムの内容は、研究者と共同研究者が開発したものをがん薬
物療法中の患者のケアの経験を有する看護師を対象にパイ

５. 研究デザイン

ロットプログラムを実施し、内容を精査した。がん化学療５. 1. 乳がん補助化学療法中の爪症状とQuality of
Lifeの前向き観察研究

法患者に対するネイルケアの経験を有するネイリストによ乳がん術前後補助化学療法を受ける患者を対象に前向きた爪および周囲の皮膚の保湿方法、水性ネイルを用いたネ観察研究を実施した。観察研究は治療開始前（T 1）、治療るレクチャーでは、手の爪の整え方、ネイルオイルを用いイルカラーを実施した（図 1）。

中 3 週間ごと（T 2 - 8）
、治療後 1、3、6（T 9 - 11）か月後のオンラインネイルケアの実施は、対象者のプライバシー

計 11 回の時点で、両手爪症状の観察を実施し、爪の症状が確保できる個別スペースにおいて、パクリタキセル投与についての悩み、Quality of Life に関するアンケート調査

2、5、8、11 回目投与時の計 4 回とした。プログラム実施を行った。

当日は、開始前に研究担当者が体調、爪および周囲皮膚の各時点で両手指に写真を撮影し、これを共同研究者の皮膚科医が爪変化の判定シートを用い爪症状を得点化し、同感染などの有無を確認し、プログラムが実施可能かどうか判断した。

時に手の皮膚乾燥、指関節の色素沈着を「あり」「なし」で介入前、介入中、介入後に手の爪症状、Quality of Life評価した。爪症状の判定シートは、爪母・爪床を 4 分割し、に関する質問紙調査を行い、前後の変化について検討した。

爪母を点状陥凹、爪塑造、爪甲白濁、爪半月の紅色点の有爪の症状の観察、爪の症状の悩み、Quality of Life に関す

無、爪床を爪甲剥離、線状出血、油滴状爪、爪甲下角質増る質問紙調査は、前述「①爪の変化と Quality of Life 観察

殖の有無を確認し、０（なし）または 1（あり）で評価し、爪研究」と同様の質問紙を用い測定し、観察研究の結果と比母（0 - 4 点）爪床（0 - 4 点）これを合わせた爪症状得点（0 - 8

較した。
またオンラインネイルケアプログラム実施後は、研究担点）とした。
Quality of LifeはThe Functional Assessment of Cancer
Therapy scale（以下 FACT）Breast および FACT-Taxane

当者が作成したインタビューガイドに沿ってプログラムを受けた感想を聞き取り、質的に解析した。

を使用した。質問項目は身体面（PWB）社会面（SWB）心理面（SWB）活 動 面（FWB）の 計 20 項 目、 乳 が ん 特 異 面

倫理的配慮（Breast）9 項目、タキサン系毒性特異面（Tx）16 項目のサ研究対象者には研究の目的、内容および方法、研究参加

ブスケールで構成されており、点数が高いほど QOL が高の自由意思による参加の保証について書面を用い説明した。

いことを示す。サブスケール点数は身体面 0 - 28 点、社会研究で得られたデータは匿名化し個人が特定されないよう

面 0 - 28 点、心理面 0 - 24 点、活動面 0 - 28 点、乳がん特保管した。本研究は聖路加国際大学研究倫理審査委員会の異面 0 - 40 点、タキサン系毒性特異面 0 - 64 点であり各時点での平均点を比較した。
本研究のデータは、がん薬物療法を受ける患者の介入前後の前向き観察研究であり、対象者 1 名につき最大 11 回の繰り返しデータがある。観察の過程において、対象者のQuality of Life 得点はがん薬物療法の副作用や生活状況の変化などに影響され、個人差があることが想定された。そのため治療開始前の Quality of Life が各時点でどのように変化するか、線形近混合モデルを用い検討した。

5. 2. オンラインネイルケア介入研究
乳がん術前術後補助化学療法として週に 1 回のパクリタ
キセルを受ける患者を対象に、オンラインネイルケアプロ
グラムを 4 回実施し介入前後に Quality of Life、爪の症状− 183 −

図1

オンラインネイルケアプログラム

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

中は 27 名、術後化学療法中は 37 名で、アントラサイクリ

承認を得て実施した。

ン系薬剤を含む治療後にタキサン系薬剤を含む治療を受け

6 . 研究結果た患者は 49 名、タキサン系薬剤を含む治療後にアントラ

6. 1. 爪の症状、Quality of Lifeに関する前向き観察研究

サイクリン系薬剤を含む治療を受け対象者は 15 名であっ

6 .1 1. 対象者の概要

6 . 1. 2 . 手の皮膚、爪症状の経時的変化

た
（表 1）
。

対象者は 64 名で平均年齢 47 . 9 歳、年代で多かったのは治療開始後、皮膚乾燥および関節部位の色素沈着は次第

40 歳代 28 名であった。既婚者は 42 名、独身者は 10 名で、に増え、皮膚乾燥は 6 時点目、関節部位の色素沈着は 7 時

同居者は夫が 55 名、子供が 27 名だった。就業状況はフル点目をピークにその後次第に低下していた。爪症状は治療

タイム 23 名、パートタイム 9 名であった。術前化学療法

後次第に上昇し 7 時点目をピークにその後次第に低下して

表1

対象者の概要

対象者

年代

婚姻状況

仕事状況

同居家族
治療状況

アントラ
先行
治療
レジメン
タキサン
先行
A: アドリアマイシン
F: ５FU

30歳代
40歳代
50歳代
60歳代
70歳代
既婚
独身
離婚
死別
同居パートナーあり
フルタイム
パートタイム主婦
無職・その他
夫
子供
なし
術前化学療法
術後化学療法ACのみ（タキサン系投与なし）
ACよりドセタキセル
ACよりパクリタキセル
ddACよりパクリタキセル
ECよりドセタキセル
FECよりパクリタキセル
ドセタキセルよりAC
パクリタキセルのみ
パクリタキセルよりAC
パクリタキセルよりEC
E: エピルビシン

人数
12
28
15
5
4
42
10
10
1
1
30
13
16
5
38
31
8
27
37
1
22
21
3
1
1
2
1
8
4

図2

図3

C: シクロホスファシド

図4

爪症状の推移− 184 −

皮膚乾燥の推移

関節部位色素沈着の推移

がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証

図5

観察時点の爪写真いた（図 2 - 5）。
6 . 1. 3 . レジメンスケジュールによる手の皮膚、爪症状の経時的変化
レジメンスケジュールにより手の皮膚症状、爪症状の推移は異なっていた。
皮膚乾燥は、アントラサイクリン系薬剤を含む治療先行グループは、開始後上昇し 6、7 時点目におおよそ 70 ％とピークとなりその後 11 時点目に低下していた。タキサン
系薬剤を含む治療先行グループは、開始時 5 . 2 ％でその後

図6

ゆるやかに上昇し 6 時点目に 19 ％とピークとなりその後レジメンスケジュールごとの皮膚乾燥の推移

低下していた（図 6）。
関節部位の色素沈着は、アントラサイクリン系薬剤を含む治療先行グループは、開始時 0 ％が 2 時点目 41 . 4 ％と上昇し 7 時点目にピークとなりその後 11 時点目に 8 . 5 ％に低下していた。タキサン系薬剤を含む治療先行グループ
は、開始時ゆるやかに上昇し 8 時点目にピークとなりその後低下していた（図 7）。
爪症状は、アントラサイクリン系薬剤を含む治療先行グループは、皮膚症状と同じく 2 時点目より上昇し 7 時点目にピークをむかえその後低下しており、タキサン系薬剤を含む治療先行グループは、開始時ゆるやかに上昇し 9 時点

図7

レジメンスケジュールごとの関節部位色素沈着の推移

目にピークをむかえとなりその後低下していたが 11 時点
目も開始時より高かった（図 8）。
6 . 1. 4 . 爪症状とQuality of Life の関連
Quality of Life の得点である FACT の各サブスケール得
点が、時点、レジメンスケジュールに影響されるか検定した。皮膚乾燥が強い者では QOL サブスケールの社会面，活動面，乳がん特異面の得点が有意に低かった。
爪症状得点が高い者では，QOL サブスケールの身体面、乳がん特異面、QOL トータル、タキサントータル、乳がんトータルが有意に低かった
（表 2）
。

図8

レジメンスケジュールごとの爪症状得点の推移

6. 2. オンラインネイルケア介入研究
6 . 2 . 1. 対象者の概要

は 10 名で、術後化学療法中の対象者のうち 4 名はパクリ

対象者はパクリタキセル投与を受ける 23 名で、30 歳代

タキセル治療の前にアントラサイクリン系薬剤を含む治療

2 名、40 歳代 9 名、50 歳代 8 名、60 歳代 4 名だった。術レジメンの治療を受けていた。前述観察研究対象者と比較

前化学療法中の対象者は 12 名、術後化学療法中の対象者

し年齢構成はほぼ同じだったが、アントラサイクリン系薬− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

表2
身体面爪症状とQOLの関連

社会面

精神面

活動面

乳がん特異面

推定値

P値

推定値

P値

推定値

P値

推定値

P値

推定値

皮膚乾燥

−0 . 88453

0 . 134−0 . 70761

0 . 045−0 . 63129

0 . 073−0 . 87188

0 . 039−1 . 59526

爪症状得点−0 . 30752

0 . 011−0 . 01145

0 . 885−0 . 10562

0 . 177−0 . 13377

0 . 157−1 . 12141

タキサントータル

乳がんトータル

推定値

タキサン特異面
P値

推定値

QOLトータル
P値

推定値

P値

推定値

P値

皮膚乾燥

0 . 278141

0 . 516−1 . 57665

0 . 358

0 . 278141

0 . 516−1 . 82737

0 . 455

爪症状得点−0 . 79677

0 . 409−0 . 85627

0 . 015−1 . 11529

0 . 01−1 . 12141

0 . 025

P値
0 . 0250 . 025

調査時点，各QOL得点のベースライン得点で制御した一般線形制御モデルによる推定値

表3

オンラインネイルケア介入 対象者の概要
対象者

年代

婚姻状況

仕事状況
同居家族
治療状況
事前治療レジメン

30歳代
40歳代
50歳代
60歳代
70歳代
既婚
離婚
死別
独身
フルタイム
パートタイム
主婦
夫
子供
術後補助化学療法
術前補助化学療法
アントラ系薬剤
なし

人数
2
9
8
4
0
18
1
1
3
12
7
4
17
13
10
13
4
19

図9 オンラインネイルケア介入前後の皮膚乾燥 関節部位の色素沈着剤を含む治療先行グループの割合は少なかった（表 3）。

図10

6 . 2 . 2 . 手の皮膚爪の症状の経時的変化

オンラインネイルケア介入前後の爪症状

オンラインネイルケアを受けた参加者の、介入前後の爪周囲の皮膚乾燥、関節部位の色素沈着の有無、爪症状の得点を比較した。皮膚の乾燥および関節部位の色素沈着が認められる数は増え、平均点は介入前に比べ介入後次第に上昇していた（図 9 - 11）。
6 . 2 . 3 . オンラインネイルケアとQuality of Life の変化の関連観察研究対象者とオンラインネイル介入研究対象者のQuality of Life 得点を比較するため、観察群のうちパクリ
タキセル治療先行をうけた対象 13 名と、オンラインネイ

図11

オンラインネイルケア3回目参加者の介入前後の爪写真

ルケア介入対象者 16 名を抽出し、各 QOL 得点のベースラ
イン得点で制御した一般線形混合モデルによる推定値で比聞き取り、その内容をカテゴリー化し４つのカテゴリーが較した。オンラインネイルケア介入群のサブスケールで有抽出された。カテゴリー「前向きさの獲得」は、「毎週治療

意な上昇はなかった（図 12）。

に来ていますが、ネイルの日は「今日はネイルの日だな」

6 . 2 . 4 . オンラインネイルケアを受けた対象者の感想って少し楽しみになります」「ピカピカになって気分があオンラインネイルケアを受けた対象者に介入後の感想をがりました」とネイルケアを受けることの楽しさを実感し− 186 −

がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証

図12

オンラインネイルケア介入前後のQuality of Life得点

楽しみにしているという感想があった。カテゴリー「治療事中にもオイルを塗ったりするようになりました。
」と日常中の不安感の軽減」
では「夢中になってネイルをしていまし

生活の中でネイルケアを行う機会ができたとう感想があった。こんなに夢中になる時間は最近なかったのでとてもよ

た
（表 4）
。

かった」という感想があり、オンラインネイルケアの時間

7. 考は自身でネイルケアを行うことに夢中になり治療のことか

察ら解放されたという内容だった。カテゴリー「周囲の心配

本研究の観察研究の対象者は、乳がん術前後の補助化学の解消」では、オンラインネイルケアを受け実際にネイル療法を受ける女性であり、研究で測定した QOL 得点は治カラーを行う生活において「子供が私の見た目がかわるこ

療による副作用、治療を受けることによる生活の変化が大とをなんとなく気にしているので、私もどんなふうにすれ

きく影響されたものを反映していると考えている。また研ばきれいに普通どおりになるかなって考えてるときで、対究の目的とした爪の症状が QOL との関連を検討するため

処方法をきけてよかった。
」と爪の変化をカバーするというに十分な対象者数とはいいきれず、研究の限界と考える。

対処方法で周囲の人へ配慮できることの獲得につながって象者は介入後実際にオンラインネイルケア後ネイルケアが7. 1. 乳がん補助薬物療法中の爪とQulity of Life前向き観察研究に関する考察

習慣になったと話しており、「前回教えてもらったので仕

治療開始前と比較し治療中治療後の時間経過において、いた。カテゴリー「爪のセルフケア方法の獲得」では、対− 187 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

表4
カテゴリーテーマ

オンラインネイルケア感想

サブカテゴリー感

想・毎週治療に来ていますが、ネイルの日は「今日はネイルの日だな」って少し楽しみになります。
・ピカピカになって気分があがりました。

前向きさの獲得

気持ちが明るくなった

治療中の不安感の軽減

夢中になって治療のこと ・夢中になってネイルをしていました。こんなに夢中になる時間は最近なかったから解放されたのでとてもよかった。

周囲の人への配慮の獲
家族の心配を解消できた
得・子供が私の見た目がかわることをなんとなく気にしているので私もどんなふうにすればきれいに普通どおりになるかなって考えてるときで対処方法をきけてよかった。

爪のセルフケア方法の オンラインネイルケア後ネ・前回教えてもらったので仕事中にもオイルを塗ったりするようになりました。
獲得
イルケアが習慣になった爪母および爪床の症状の得点は増加し、治療後次第に低下

治療中に起こる変化について情報提供を行うことが提案さし、治療後 6 か月（T 11）にほぼ治療開始前の得点に回復しれている 8）。本観察研究において、使用している薬剤や、ていた。正常な手の爪は 1 か月あたり 3 ㎜程度成長し 4 - 6

治療後の時期において爪症状が変化していることが明らか

か月で新しい爪に置き換わるとされており、本観察研究にとなったため、治療や時期など具体的な情報提供に活用でおいても対象者の多くは治療期間中にダメージが起きたときると考える。

しても 6 か月程度で正常に戻ることが示唆された。
レジメンスケジュールによる比較では、アントラサイク

7. 2 オンラインネイルケア介入研究に関する考察

リン系薬剤を含む治療先行グループがタキサン系薬剤を含皮膚乾燥、関節部位の色素沈着、爪症状はオンラインネ

む治療先行グループより皮膚乾燥、関節部位の色素沈着、イルケア介入前より介入後の時点で上昇していたが、観察

爪症状すべてにおいて治療開始後すぐに急激な上昇がみら群でも同様の変化が認められたため、介入によって得点がれた。

上昇したのではなく治療を開始したことによる皮膚およびがん薬物療法による爪および爪周囲組織への副作用の機

爪の変化であると考えられる。

序は明らかになっていないが、薬物投与による爪母の直接観察群とオンラインネイルケア介入群のパクリタキセル

的な爪母や爪床上皮への細胞毒性や、タキサン系薬剤ではを先行投与したグループ同士の Quality of Life の得点比較

薬剤による血管新生抑制作用や神経原性炎症などが起こるでは、有意な違いはなかった。しかしオンラインネイルケ

ことで爪および爪周囲の変化が起こると推測されている 1 , 2）。

ア介入後の参加者の感想から、オンラインネイルケアを受

がん薬物投与により、爪甲下角質増加やネイルマトリック

けたことで楽しさを感じ、前向きさを獲得や不安感の軽減

スの障害によりビュー線の発生、爪母細胞のメラノサイトを得られたことが明らかとなった。

の活性化や光過敏による爪甲の線状の色素沈着、爪甲下出

参加者は 40 ～ 50 歳代が多く、子育てや就労しながら治血などが考えられている。またがん薬物療法のサイクル数

療を継続していた。このような社会生活を送る中、爪の外が多くなることで爪の症状が増加することが報告されてい見変化は自身だけでなく家族や周囲から見られることで、

3 - 7）。アントラサイクリン系薬剤を含む治療レジメンは治療の副作用を周囲に知られることを気がかりに感じる機

多剤併用治療であり吐き気や嘔吐などの消化器症状のほか会も多いと推測される。がん治療を受ける中で、治療や副脱毛が起こる頻度も高い。おそらく皮膚細胞や爪母細胞が作用に対する不安や見通しが立てられない状況の中でオン強く傷害されることで、手の皮膚乾燥や爪症状の頻度も高ラインネイルケアをうけることにより、爪の変化という副いい結果となったと考えられる。

作用への対処を実践することで安堵感になっていたのではる観察研究では皮膚乾燥や爪症状は、Quality of Life の心ないかと考える。またネイリストとの対話や自分のネイル

理面、精神面との関連が示唆されたが、前述のようにがんケアを行う行為に集中し不安感からの解消した感想も得ら

薬物療法を受ける中での様々な副作用や生活の変化が得点

れ、治療に対し前向きに取り組む気持ちにつながっていたに反映されたと推測され、手の皮膚や爪症状が Quality ofと考える。

Life に直接的に影響するかどうか説明は難しい。今後の手介入研究参加者からの感想には「普段からネイルケアをに皮膚や爪症状による見た目の変化がどのように患者の悩行うようになった」とあり、日常でのセルフケアの実践に

みや生活上の困りごとに影響しているのか、さらに調査をつながっていた。介入内容では看護師からの爪の変化につ継続して明らかにしたい。

いての情報提供とネイリストからのケア方法の詳細な内容

がん薬物療法による爪に起こる副作用に関して、事前にが含まれており、参加者のセルフケアへの動機付けとなり− 188 −

がん薬物療法に伴う爪の変化に対するアピアランスケアの検証

継続につながっていたと考える。本介入研究は短期間の効

5） Almagro M, et al. Nail alterations secondary to

果のみの検証であったがケアを継続することでの効果の検

pactitaxel [corrected] therapy. Eur J Dermatol. 2 0 0 0

証も必要と考える

Mar; 10（2）: 146-7
6） A M Minisini 1, et al. Taxane-induced nail changes:

共同研究機関incidence, clinical presentation and outcome Ann Oncol.
2003 Feb; 14（2）: 333-7.

ikus 医療美容ケア研究会

7） Dorte Winther et al. Nail changes due to docetaxel--a（引用文献）

neglected side effect and nuisance for the patient.
Support Care Cancer. 2007 Oct; 15（10）: 1191-7.

1） 東 禹彦 爪 第 2 版 基礎から臨床まで 2016 金原出版
2） Ralph Peter Braun et al. Diagnosis and management

8） Baker J, et al. Docetaxel-related side effects and theirof nail pigmentations J Am Acad Dermatol. 2007 May;

management. Eur J Oncol Nurs. 2009 Feb; 13（1）: 49-56（5）: 835-47.

59.

3） Peter Gilbar, Alice Hain, Veta-Marie Peereboom. Nail
toxicity induced by cancer chemotherapyJ Oncol（参考文献）

Pharm Pract. 2009 Sep; 15（3）: 143-55.

9） Nozawa K. Shimizu C. et al. Quantitative assessment4） Hong J, Park SH, et al. Nail toxicity after treatmentof appearance changes and related distress incancerwith docetaxel: a prospective analysis in patients withpatients. Psycho oncology. 2013 Sep; 22（9）: 2140-7.

advanced non-small cell lung cancer. Jpn J Clin Oncol.

10）野澤桂子、藤間勝子編、臨床で活かすがん患者のアピ2007 Jun; 37（6）: 424-8.

アランスケア 南山堂 2017

− 189 −

サボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析
星薬科大学

柴藤

淳子

In recent years, the population of people with thinning hair has been increasing due to a variety of reasons, including
stress from work, relationships, diet, etc. Since hair greatly influences one's appearance and age, interest in hair growth in thehair care market is growing among both men and women. Since the psychological impact of thinning hair is particularly serious, the development of an effective hair-growth product will contribute to the maintenance and improvement of consumers'
mental and physical health, and thus an epoch-making hair-growth product is expected to be developed. However, in reality
there are few products that provide sufficient hair-growth effects and for which the scientific basis for the hair-growth effects
has been clarified. Moreover, the problematic side effects caused by chemical substances in ‘hair growth products’ remains aserious issue that cannot be ignored.
We have been paying attention and researching since long on the hair-growing effects of cactus cell extracts obtained
through low-temperature vacuum extraction. Compared to the conventional steam distillation method, the cell extract obtained by low-temperature vacuum extraction is 100% plant-derived, and we believe that it can contribute to the provision ofmaterials for hair-growth agents with high safety. Since ancient times, Japanese women have valued the beauty of their hair.
Since beautiful hair has always been a longing of women, we hope to develop hair growth products that also care for beautiful hair by clarifying the mechanism of action of cactus cell extract on hair growth and the ingredients involved in nurturing
beautiful hair.

1．緒

言

2. 方

近年、仕事や人間関係などのストレスによる薄毛人口が法

2. 1. マウス育毛評価実験

増加している。毛髪は見た目年齢を大きく左右するためヘ

実験には青王丸（Notocactus ottonis）から低温真空抽出

アケア市場における育毛関連の関心は男女問わず高まって法（Yoshimi Medical Farm Co., Ltd.）により得られたセルいる。特に薄毛が及ぼす精神面への影響は深刻で、効果のエキストラクト（N-CE）を用いた。C 57 BL/ 6 J 雄マウスは、ある育毛剤が開発されれば消費者の心身の健康維持・増進

22 ± 2 ℃、6：00 - 18：00、12 時間 / 12 時間の明 / 暗サイにも貢献することから画期的な育毛剤が期待されている。

クルで自由摂取により飼育された。ミノキシジル（MXD）

しかしながら十分な育毛効果が得られ、さらに育毛作用のは脱毛症の治療に使用され、多くの毛髪研究でポジティブ

科学的根拠が明らかにされている製品は少なく、化学物質

コントロールとして使用されていることから比較として用による副作用などの問題も無視できない課題である。

いた。プロピレングリコール：エタノール：水（5 : 3 : 2）を

我々は以前より低温真空抽出法で得られたサボテンセル

Vehicle 対照群（VC）とし、予備実験を行ったところ N-CE

エキストラクトの育毛効果に注目してきた。従来の水蒸気

10 % 濃 度 で 良 好 な 育 毛 促 進 が 確 認 さ れ た。 よ っ て

蒸留法と比べ溶剤を使用しないので低温真空抽出法で得ら

C 57 BL/ 6 J マウスを N-CE 10 %、MXD 3 %、VC の 3 つのれるセルエキストラクトは 100 % 植物由来であり、安全性

グループ（6 匹 / グループ）に分け、雄マウスの背部の毛をの高い育毛剤の素材提供に貢献できると考えている。古来

剃って 1 週間後に再度毛を剃ることで毛周期を合わせ、調より日本の女性たちは髪の美しさを大切にしてきた。美し整試料 200 µL を毎日背部に塗布し観察および写真撮影を

い髪はいつの時代も憧れであることから、サボテンセルエ行った。写真画像は ImageJ ソフトウェアを使用し画像解

キストラクトの育毛作用メカニズムや美髪に関与する成分析した。マウスの剃毛領域に対する育毛領域の割合を算出を明確にすることで、美髪ケアも兼ねた育毛商品の開発をし育毛率（%）を測定した。

目指せればと考えている。

2. 2. マウス毛包観察
C 57 BL/ 6 J 雄マウスの背部全層皮膚組織を 4 ％パラホル
Hair Growth Activity and Ingredient
Analysis of Cactus Cell Extract
Junko Shibato
School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Hoshi University

ムアルデヒド溶液で固定し、PBS に置換した。パラフィンに包埋するために脱水しキシレン浸透させた。5 µm のパ
ラフィン切片をヘマトキシリン／エオシン染色処理後、脱水のち透徹しカバーガラスで封入した。切片画像は、
BZ-X 710 明視野システム（Keyence）によって×20 倍率で− 190 −

サボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析

写真撮影し、画像は ImageJ ソフトウェアを使用し解析しソフトウェア、Perseus および R プログラム）でタンパクた。切片写真の真皮と皮下組織における毛包総数と皮下組質同定ならびに相対定量数値化を行った。その後 VC と比織のみにおける毛包数を測定し、平均毛包数を算出した。

較して発現変動したタンパク質（アップレギュレーション：
Up（ ≧ 2 . 0 -fold）、 ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー シ ョ ン：Down（ ≦2. 3. 育毛成分のスクリーニング分析

0 . 5 -fold））をリスト化した。

N-CE の育毛成分のスクリーニング法としてメタボロー
ム解析法を採用した。N-CE をエバポレーターで 400 倍に

2. 6. カテゴリー解析

濃縮し、80µLの試料に対し内部標準物質の濃度が 1 , 000 µM

リスト化した遺伝子およびタンパク質の生物学的機能カとなるように調製した 20 µL の水溶液を加えて撹拌し、限テゴリー（エンリッチメント）解析はDatabase for Annotation,

外ろ過処理を行った。サンプルは CE-TOFMS（Agilent

Visualization and Integrated Discovery（DAVID）v 6 . 8 をTechnologies）、による測定に供した。検出されたピーク用いて行った。

は HMT 代謝物質ライブラリおよび Known-Unknown ラ

3. 結

イブラリに登録された全物質との照合検索を行った。

果

3. 1. マウス実験におけるN-CEの育毛効果

2. 4. マイクロアレイ解析

マウスを用いた育毛実験の調整試料塗布後 14 および 27

マウス育毛評価実験において調整試料塗布後 1 週間ごと

日後の育毛領域の割合を Fig. 1 に示した。14 日後では 3 %に 3 週間目までのマウス背部全層皮膚組織をサンプリング

MXD と比較して 10 % N-CE の育毛率はやや低かったが、し−80 ℃で保存した。組織から RNA を抽出し、マイクロ

27 日後では 3 % MXD と同程度の高い育毛促進効果が確認

アレイ解析は Whole Mouse Genome オリゴ DNA マイクロできた（Fig. 1）。さらにマウス背部全層皮膚組織の毛包総

アレイキット 4 x 44 K（Agilent）を用い Dye-swap 法により数は 3 % MXD より増加傾向にあることが確認できた（Fig.

VC と比較して発現変動した遺伝子（アップレギュレーシ

2）。

ョン：Up（≧ 1 . 5 -fold）、ダウンレギュレーション：Down

3. 2. N-CEの育毛成分分析（≦ 0 . 75 -fold））
をリスト化した。

N-CE に含まれる育毛成分のメタボローム解析によるス

2. 5. プロテオーム解析

クリーニング分析の結果から、育毛剤やシャンプーなどの−80 ℃で保存したマウス皮膚組織からタンパク質を抽

ヘアケア製品に使用されている物質が検出された（Table

出し、トリプシン消化処理をした。消化サンプルを TMT1）。育毛剤関連ではアデノシン、アゼライン酸、ジベレ

標識し、HLB OASIS カラムで脱塩後、POROS 20 R 2 逆

リン酸、プロスタグランジン E 2 の他にリボフラビン、ニ

相レジンを使用して 5 - 100 % ACN Buffer（pH 10）で 12 分

コチン酸、パントテン酸、ピリドキサール、ピリドキサミ

画 を 溶 出 し た。Q-Exactive MS 分 析 は UHPLC Dionex

ン、ピリドキシンなどビタミン B 群がスクリーニングされUltiMate® 3000（Thermo Fisher Scientific）を使用した逆た（Table 1）。

相クロマトグラフィーで分離し、データベース（MaxQuantFig. 1

マウスによる育毛実験

Fig. 2− 191 −

マウス背部皮膚組織の毛包数測定実験

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Table 1

色に関与 11 , 12））が同定された。発現減少タンパク質のカテ

N-CEに含まれる育毛関連代謝化合物

ゴリーはケラチン、鉄結合、アクチン結合があった。

3. 4. 生物学的機能エンリッチメント解析
DAVID ツールにより得られた生物機能解析（Functional
Category Term）の結果は有意（p 値≦ 0 . 05）であり、さらに例えば “Signal” や “Activator” というような分類される遺伝子数が膨大になるような Term は省いて Table 2 , 3に示した。MXD による発現増加遺伝子（3 % MXD UP：
Microarray）カテゴリーのトップはケラチンで、角質化、メラニン生合成など毛髪に関与するものが含まれていた。
発現減少遺伝子（3 % MXD Down : Microarray）では筋タ
ンパク、ミオシン、筋小胞体など筋収縮に関与するものが多かった。この結果はタンパク質の場合でもほぼ同じことが確認できた（Table 2）。

3. 3. 育毛関連因子の同定

一 方 N-CE に よ る 発 現 増 加 遺 伝 子（10 % N-CE UP：

マイクロアレイ・プロテオーム解析から得られた発現変Microarray）カテゴリーは免疫、サイトカイン、炎症、ゴ

動遺伝子およびタンパク質データの上位 20 を調査した結ルジ体、シトルリン化、ホメオボックスなどがあり、発現果、幾つかの育毛関連因子が同定された。

減少遺伝子（10 % N-CE Down : Microarray）カテゴリーに

3 . 3 . 1. 3 % MXD マイクロアレイ解析

はケラチン、メラニン生合成、筋タンパクなどが含まれて発現増加遺伝子群の多くがサイトカイン、ケラチン、細いた。またタンパク質の場合は発現増加および発現減少の

胞接着、細胞増殖のカテゴリーに分類されるものだった。

いずれにおいてもケラチン、筋タンパクが多く含まれてい1）

育毛関連では Lef 1（毛乳頭細胞マーカー ）、Dsg 4（毛包ることが確認できた（Table 3）。

ケラチノサイト細胞接着の重要なメディエーター 2））の発

4. 考

現増加が確認された。発現減少遺伝子群では筋収縮、鉄恒
常性・細胞増殖に分類されるものが多く、その他にオート察

MXD では遺伝子およびタンパク質共にケラチン、メラ

ファゴソーム、凝固に関連する遺伝子もあった。

ニンなど毛髪関連が発現増加を示し、筋収縮関連の発現減3 . 3 . 2 . 3 % MXD プロテオーム解析

少が確認された。これは MXD の育毛作用メカニズムとさ塗布から 1 週間目においてはサイトカイン、好中球、ケれている血管平滑筋弛緩（血管拡張）→血流改善→育毛促進

ラチン、血液凝固・フィブリン血餅形成のタンパク質発現が実際に生じた結果によるものと考えられた。しかしなが増加が多く見られたが、２および３週間目ではケラチン関

ら N-CE では MXD とは異なるカテゴリーが多く確認でき連が大多数になっていた。育毛関連では Tchhl 1（ケラチノ

た。成分分析の結果、N-CE には育毛に関与する物質が多サイト増殖、毛髪形成

3 , 4）

5））、Tchh（毛幹形成 ）、Padi 3、

Padi 1（PADI 1 / 3 を介した TCHH のシトルリン化による数含まれていたことからも、MXD とは異なる育毛作用機序の存在が示唆された。

毛幹分化 6））、Padi 4（毛髪幹細胞再生と増殖の調整 6））の発育毛効果のある成分から検討すると、アデノシンの関与

現増加が確認された。発現減少タンパク質においてはいずが考えられた。アデノシンはアデノシン A 2 A 受容体を介れも筋収縮関連が殆どであった。

した血小板内 Cyclic AMP 濃度の上昇による血小板凝集抑3 . 3 . 3 . 10 % N-CE制、血管平滑筋弛緩、血管新生、成長因子促進などが育毛

マイクロアレイ解析

発現増加遺伝子のカテゴリーは、血管新生、オートファ作用とされており資生堂から育毛剤“アデノゲン” が販売さ

ジー、成長・分化、筋収縮、細胞接着が多く、育毛関連はれている。今回の結果では N-CE による凝固関連の減少、

FGF 2（毛包の成長・発達 ）、PAX 6（メラニン形成 ）が血管新生や成長因子の増加は確認されたが、MXD のよう確認された。発現減少遺伝子はサイトカイン、メラノサイ

な明確な筋収縮関連の減少は確認できなかった。この結果

ト、凝固、鉄恒常性などが多かった。

はアデノシンには血管拡張作用があるが、同時に血管収縮

3 . 3 . 4 . 10 % N-CE作用もあることに起因している可能性が示唆された 13）。

7）

8）

プロテオーム解析

発現増加タンパク質のカテゴリーはエンドサイトーシス、
オートファジー、筋収縮があり、育毛関連では Ldb 1（毛9）包幹細胞の維持 ）、Kctd 1（皮膚や髪の発達

10）

）
、
Myo 5 a（毛次に考えられるのはオートファジーの関与であった。最近ではオートファジー活性化による発毛促進の報告は多数されている。オートファジーを誘発することによって毛包− 192 −

サボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析

Table 2

3％ NXDによる発現変動遺伝子およびタンパク質のカテゴリー解析

Table 3

10％ N-CEによる発現変動遺伝子およびタンパク質のカテゴリー解析− 193 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

サイクルの成長期への誘導や成長期の延長をもたらすとさ

Formation Cause Uncombable Hair Syndrome. Am Jれている。さらにオートファジー阻害剤である抗マラリア

Hum Genet. Dec 1; 99（6）: 1292-1304.（2016）剤クロロキンが髪色の変化や脱毛などを誘発する可能性があることも示されている

14）。N-CE によるオートファジー

やオートファゴソーム関与因子の発現変動が多く確認されたことから、N-CE はオートファジー誘発による育毛作用

Regeneration and Alopecia. Front Cell Dev Biol. Dec
13; 9: 789676.（2021）
7） Kyung-A Hwang et al., Adenosine stimulates growthof dermal papilla and lengthens the anagen phase byを有している可能性も高いと思われた。

5. 総

6） Kim Vikhe Patil et al., A Hairy Cituation – PADIs in

increasing the cysteine level via fibroblast growth括factors 2 and 7 in an organ culture of mouse vibrissae

今回のマイクロアレイ解析とプロテオーム解析から

hair follicles. Int J Mol Med. Feb; 29（2）:195-201.（2012）

N-CE による育毛作用は MXD の作用機序とは異なる可能

8） Raviv S, et al., PAX6 regulates melanogenesis in the

性が確認できた。今後は膨大なデータを基にさらなる生物

retinal pigmented epithelium through feed-forward

学的な機能の解釈やパスウェイ解析を行うことで N-CE にregulatory interactions with MITF. PLoS Genet. May

よる育毛作用や美髪効果などについて明らかにしていくと

29; 10（5）（2014）

ともに、N-CE と MXD の併用によるより効果的な育毛条

9） Xiaoman Xu et al., Co-factors of LIM domains（Clims/

件の検討を進めることで臨床試験移行に貢献できればと考

Ldb/Nli） regulate corneal homeostasis andえている。

maintenance of hair follicle stem cells. Dev Biol. Dec
15;312（2）: 484-500.（2007）（引用文献）

10）Xiaoling Chen et al., The phenotypic characteristics

1） Yi Zhang et al., Lef1 contributes to the differentiationof bulge stem cells by nuclear translocation and crosstalk with the Notch signaling pathway, Int J Med Sci.

of patients with athelia and tooth agenesis. Ann Transl
Med. Oct; 9（20）: 1583.（2021）
11）Christen M et al., MYO5A Frameshift Variant in a
Miniature Dachshund with Coat Color Dilution and

Apr 17; 10（6）: 738-46（2013）
2） Kljuic A, et al. Desmoglein 4 in hair follicle

Neurological Defects Resembling Human Griscelli

differentiation and epidermal adhesion: evidence from

Syndrome Type 1. Genes（Basel）. Sep 23 ; 12（10）: 1 4 7 9.

inherited hypotrichosis and acquired pemphigus（2021）

vulgaris. Cell. Apr 18; 113（2）: 249-60（2003）

12）Hui Zhang et al., Novel mutations in the Myo5a gene3） Teruhiko Makino et al., Trichohyalin-like 1 protein
plays a crucial role in proliferation and anti-apoptosis
of normal human keratinocytes and squamous cellcause a dilute coat color phenotype in mice. FASEB J.
Apr;35（4）: e21261.（2021）
13）Joana Beatriz Sousa and Carmen Diniz, The
Adenosinergic System as a Therapeutic Target in the

carcinoma cells. Cell Death Discov; 6: 109.（2020）
4） Wu Z et al., Identification of trichohyalin-like 1, an
s1 0 0 fused-type protein selectively expressed in hair

Vasculature: New Ligands and Challenges. Molecules.
May 6; 22（5）: 752.（2017）

follicles. J Invest Dermatol. Aug; 131（8）: 1761-3.（2011）14）Min Chai et al., Stimulation of Hair Growth by Small

5） F Buket Ü Basmanav et al., Mutations in Three

Molecules that Activate Autophagy. Cell Rep. Jun 18;

Genes Encoding Proteins Involved in Hair Shaft

27（12）: 3413-3421. e3.（2019）− 194 −

後期高齢者に頻発するスキン- テアの予測方法の考案
藤田医科大学研究推進本部社会実装看護創成研究センター

臺美佐子

Aim: Because painful skin tears frequently occur in older patients, the prevention of skin tears is fundamental to improvetheir quality of life. However, a risk assessment tool for skin tears has not been established yet in Japan. Therefore, we aimed
to propose a risk scoring tool for skin tears in Japanese older adult.
Methods: We conducted a prospective cohort study with 6-month follow-up in two long-term care hospitals in Japan. A totalof 257 inpatients were recruited. Patient and skin characteristics were collected at baseline, and the occurrence of forearmskin tears were examined during follow-up. To develop a risk scoring tool, we identified risk factors, and converted theircoefficients estimated in the multiple logistic regression analysis into simplified scores. The predictive accuracy of the total
score was evaluated.
Results: Of 244 participants, 29 developed forearm skin tears during the follow-up period, a cumulative incidence of 13.5%.
Senile purpura, pseudoscar, contracture, and dry skin were identified as risk factors for skin tears. Their weighted scores
were 6, 4, 5, and 6, respectively. The area under the receiver operating characteristic curve of the total score was 0.806. At a
cut-off score of 12, the sensitivity was 0.86, and the specificity was 0.67.
Conclusion: Our forearm skin tear risk scoring tool showed high accuracy, whereas specificity was low. This tool can contribute to prevent forearm skin tears in Japanese older adults.

1．緒

分析における曲線下面積（AUC）
が 0.854 と、高い診断精度を言示していた。しかし、この予測モデルは、前述のように欧スキン - テアは、主に高齢者の四肢に生じる、摩擦や剪
1）

米と日本では異なるため、日本人集団への適用には疑問が断による部分的または全面的な創傷と定義される 。疼痛

ある。そこで、我々は、日本人集団におけるスキン - テアと外観の審美性が損なわれることが高齢者に大きな苦痛をの予測には、別のモデルが必要であると考えた。

与えることから、スキン - テア予防は高齢者の生活の質（QOL）向上のために重要である

2 , 3）。近年、日本人高齢者

本研究では、対象者の前腕部のみに着目した。これは、我々の以前の研究 5）において、日本人高齢者のスキン - テ

におけるスキン - テアの危険因子が明らかになったが 5 , 6）、

アの半数（56 . 4 ％）は前腕部に発生していたからである。ス

予測妥当性のあるリスク評価ツールはまだ確立されていな

キン - テアの関連因子は、解剖学的部位によって異なる可い。そこで、本研究では、日本人高齢者を対象とした新た能性がある。したがって、危険因子を特定するためには、なスキン - テアの予測モデルを開発した。

特定の部位に着目することが有効な方策であると考えられこれまでの研究ではオーストラリア、カナダ、デンマーる。

クでは、スキン - テアの有病率は 11 . 4 ～ 22 ％で 7 - 10）、転本研究の目的は、日本人高齢者の前腕部におけるスキン

倒歴、スキン - テアの既往、日常生活自立度、紫斑、血腫、- テアの発生に関連する因子を特定し、日本人に適応した線維化がスキン - テアと関連していた

11 - 13）。一方、日本でスキン - テア予測モデルを提案することとした。

は、有病率は 3 . 9 ％と欧米諸国より低く、危険因子はスキ

2. 方ン - テアの既往とブレーデンスケールのみであった 4）。こ法のような日本と欧米諸国との相違は、民族、環境、医療状

研究デザイン：前向きコホート研究（6 カ月間）

況などの条件の違いが影響を与えていることを示唆してい対象者：長期療養型医療施設 2 施設に入院・入居する高齢る。

者（65 歳以上）の前腕の内側・外側を観察対象部位としRaynerらは、これまでの研究をもとに、スキン-テア予測
14）

モデルを提案し 、ROC（receiver-operating characteristic）
Risk scoring tool for forearm skin tears
in Japanese older adults: A prospective
cohort study

た。除外基準として、炎症性皮膚疾患（アトピー性皮膚炎、乾癬など）を有する者とした。
調査項目：初回時に、基本情報ならびにスキン - テア発生
要因と考えられる指標を診療録及び視診と触診により得る。具体的には、性別、年齢、病歴、日常生活自立度、Misako Dai

転倒歴、拘縮状況、日光曝露に関わる職歴、服薬、喫煙

Research Center for Implementation
Nursing Science Initiative, Research
Promotion Headquarters, Fujita Health
University

歴、スキン - テア既往歴、皮膚の特徴（皮膚の色調・色
素沈着・紫斑・瘢痕・乾燥・皺・たるみ・硬さ）とし、追跡は、2 週間後、1 ヶ月後、2 ヶ月後、3 ヶ月後、4 ヶ− 195 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

月後、5 ヶ月後、6 ヶ月後に、スキン - テアの発生有無をスキン - テア評価に精通した、皮膚・排泄ケア認定看護師資格を有する看護学研究者にて判定した。

3. 3. 対象者の基本的特徴
Table 2 にベースラインの基本特徴を示した。スキン テア発生群は、非発生群と比較し年齢、拘縮の頻度は有意

分析：6 ヶ月間の累積皮膚スキン - テア発生率（%）は、追跡期間中にスキン - テアが発生した参加者数をベースラ
インでの参加者総数で除算し算出した。

に高く（p= 0 . 032 , 0 . 015）
、認知症の頻度は有意に低かった（p = 0 . 042）。
Table 3 にベースライン時の対象者の皮膚特性を示す。

連続変数は平均標準偏差（SD）で示し、t 検定で解析した。カテゴリー変数は頻度（%）で示し、個人と皮膚の特紫斑と瘢痕の頻度は有意に高く（p < 0 . 001、p = 0 . 004）、
皮膚の乾燥は、割合の高い傾向があった（p = 0 . 052）。

徴に関する記述統計ではカイ二乗検定または Fisher の
正確確率検定で解析した。p 値が 0 . 05 未満の場合は有3. 4. スキン-テアモデルの予測意とした。また、スキン - テアの危険因子候補を同定す

スキン - テアのリスクファクターを特定するためのロジ

るため、単変量ロジスティック回帰分析を行った。多重スティック回帰分析を示す（Table 4）。紫斑、拘縮、瘢痕

共線性を考慮した結果、単変量解析で p 値が 0 . 6 未満との有無は有意に関連し（p= 0 . 002、0 . 023、0 . 027）
、年齢調

なった変数と年齢を多変量ロジスティックモデルに組み整後の皮膚の乾燥はスキン - テアと関連する傾向があった入れた。スキン - テアの発生率との関連の強さは、オッ（p= 0 . 051）。

ズ比（OR）及び 95 ％信頼区間（CI）で表した。多変量回帰

予測モデルを作成するために、リスクファクターを回帰分析で有意な関連を示した危険因子は、先行研究 18）に係数に基づいて紫斑 6、皮膚の乾燥 6、拘縮 6 と重み付け

従って回帰係数をもとに重み付けを行った。重み付けしした。合計スコアの ROC 解析では、AUC は 0 . 806 であった危険因子の合計スコアの予測精度を ROC 解析によりた（Fig. 2）。カットオフスコアを 12 点以上とした場合、感評価した。カットオフスコアの決定後、感度、特異度、度は 0 . 86、特異度は 0 . 67、陽性的中率は 0 . 26、陰性的中

positive predictive value（PPV）及び negative predictive

率は 0 . 97 であった（Table 5）。

value（NPV）を算 出した。 解 析に Stata/SE version 14 . 2（StataCorp LLC, College Station, Texas）
を使用した。
倫理的配慮：東京大学医学部倫理審査委員会の承認を得て（＃ 12067 - 1）
、倫理規定に準じて実施した。

3. 結

果

3. 1. 対象者
257 名の入院患者のうち、除外基準に合致した者を除き、244 名が分析対象者となった。

3. 2. スキンテア発生率244 名のうち、6 ヶ月間の追跡期間中に前腕部に皮膚断裂が発生したのは 29 名で、累積発生率は 13 . 5 ％（Fig. 1）、
STARによるスキン-テア分類は 1aが最多であった（Table1）。

Table 1

Fig. 1 Kaplan-Mejer curve for forearm skin tear incidence ina sample of Japanese older adults

Skin Tear Audit Research（STAR）classification− 196 −

後期高齢者に頻発するスキン - テアの予測方法の考案

Table 2

Participant characteristics at baseline− 197 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Table 3Skin characteristics of participants at baseline

Table 4

Table 5

Logistic regression analysys result

Prediction of skin tear occurrence by the total score of risk factors

Fig. 2 Reciever oprerating characteristics curve for the forearm skintear prediction model in a sample of Japanese older adults− 198 −

後期高齢者に頻発するスキン - テアの予測方法の考案

4. 考

された。その結果、前腕部皮膚断裂の予測モデルは高い精察度を示したが、特異度と陽性適中率は低かった。今後、多本研究では、日本人高齢者において、紫斑、拘縮、瘢痕、乾燥が前腕部スキン - テアのリスクファクターであること

部位・多施設での調査により予測モデルの改善が期待される。

を明らかにした。さらに、予測モデルを提案し、その感度、（引用文献）

特異度、PPV、NPV はそれぞれ 0 . 86、0 . 67、0 . 26、0 . 97

1） LeBlanc K, Baranoski S. Skin tear: State of theであった。
先行研究で、我々は長期療養型病院の日本人高齢入院患
4）

science: Consensus statements for the prevention,

者 410 名を対象に、スキン - テアの発生率を調査した 。

prediction, assessment, and treatment of skin tears.

3 ヶ月間の累積罹患率は 3 . 8 ％であり、STAR 分類の大分

Adv Skin Wound Care. 2011; 24（9 suppl）: 2-15類は 1b（57.1 ％）であった。本研究は、前報と比較して追跡

2） Payne RL, Martin ML. The epidemiology and

期間が長いにもかかわらず、6 ヶ月累積発症率が 13.5％と高management of skin tears in older adults. Ostomy

く、STAR分類も 1aが 34.5％、2aが 17.2％と大きく異なっ

Wound Manage 1990 ; 26: 26-37

た。STAR分類の大分類が 1b（淡色、くすみ、黒ずみ）から

3） Malone ML, Rozario N, Gavinski M, Goodwin J. The

1a（正常皮膚色）に変化したことは、スキン - テアの重症度

epidemiology of skin tear in the institutionalized
elderly. J Am Geriatr Soc. 1991; 39（6）: 591-595が低下したことを示し、累積罹患率の上昇は、医療従事者のスキン - テアに対する認識の向上を反映していると考え

4） Sanada H, Nakagami G, Koyano Y, Iizaka S, Sugama
J. Incidence of skin tears in the extremities amongられる。
日本人の高齢者では前腕のスキン - テアが半数以上を占

elderly patients at a long-term medical facility in

めていること 4）、解剖学的部位によって関連因子が異なる

Japan: A prospective cohort study. Geriatr Gerontol

可能性があることから

13）、本研究では前腕のみに注目した。

Int. 2015;15（8）: 1058-1063

本研究では、紫斑、拘縮、瘢痕、皮膚の乾燥の 4 つの前腕

5） Koyano Y, Nakagami G, Iizaka S, Minematsu T,部スキン - テアのリスクファクターを特定でき、前腕部へ

Noguchi H, Tamai N, Yamamoto Y, Kitamura A,の予測指標として使用が期待される。

Tabata K, Abe M, Murayama R, Sugama J, Sanada H.
Exploring the prevalence of skin tears and skin

紫斑は、Bateman の紫斑病や光線性紫斑病としても知られ、四肢の光線性皮膚に生じる紫色の斑点や病変である

19 - 21）properties related to skin tears in elderly patients at a

老人性紫斑病は、血管の減少、真皮の菲薄化を伴う

22 , 23）

long-term medical facility in Japan. Int Wound J.

。
。

偽瘢痕は、白色の、星状または線状の瘢痕様皮膚病変であ24 , 25）

る。これらは、高齢者の皮膚にしばしば観察され、高2016;13（2）: 189-197
6. Koyano Y, Nakagami G, Iizaka S, Sugama J, Sanada H.

。したがって、Skin property can predict the development of skin

この 2 つの皮膚特性が、いくつかの研究においてスキン -tears among elderly patients: A prospective cohort

テアのリスクファクターとして同定されたことは妥当であ

study. Int Wound J. 2017;14（4）: 691-697

齢者の皮膚の脆弱性に関連している

21 , 26）。一方、オーストラリアで報告されてきた線維

7） Carville K, Smith JA. Report on the effectiveness ofは地域特異的であると考えられる。これは、紫外

comprehensive wound assessment and documentationる11 - 13 , 27）

化

13 , 15）

線曝露により真皮に線維が大量に蓄積する現象である 28）。

in the community. Prim Intent. 2004; 12 : 41-48

これらの結果は、異なる環境条件がスキン - テアに影響す

8） Leblanc K, Christensen D, Cook J, Culhane B, Gutierrez

るため、地域別の予測モデルの必要性を示唆するものであO. Prevalence of skin tears in a long-term care facility. J

った。

Wound Ostomy Continece Nurs. 2013; 40（6）: 580-584

本研究の限界は、限定的な部位の観察、症例数、2 施設

9） Woo K, LeBlanc K. Prevalence of skin tears amongに限られたことである。本研究の結果を標準化するには、

frail older adults living in Canadian long-term carefacilities. Int J Palliat Nurs. 2018; 24（6）: 288-294

複数の施設や環境での大規模な研究が必要である。

5. 結

10）Bermark S, Wahlers B, Gerber AL, Philipsen PA,

論

Skiveren J. Prevalence of skin tears in the extremities

我々は、日本の高齢者人口に適応した新しい前腕スキン- テア発生予測モデルを開発するために、2 つの長期療養in inpatients at a hospital in Denmark. Int Wound J.
2018; 15（2）: 212-217

型病院において前向きコホート研究を実施した。その結果、

11）Lewin GF, Newall N, Alan JJ, Carville KJ, Santamaria

紫斑、偽瘢痕、拘縮、皮膚の乾燥の 4 つの危険因子が同定

NM, Roberts PA. Identification of risk factors− 199 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

associated with the development of skin tears in
hospitalised older persons: a case-control study. Int20）M e n d i t t o V , B o r r e l l i L . B a t e m a n ’ s d i s e a s e .
Pahologica. 1994; 86（6）: 645 - 64821）Karadag AS, Parish LC, Lambert WC. Senile purpura

Wound J. 2016;13（6）: 1246-1251
12）Newall N, Lewin GF, Bulsara MK, Carville KJ, Leslie
GD, Roberts PA. The development and testing of askin tear risk assessment tool. Int Wound J. 2017; 14（1）

as a stage of dermatoporosis. Skinmed. 2017; 15（2）:9192
22）McKnight B, Seidel R, Moy R. Topical humanepidermal growth factor in the treatment of senile: 97-10313）Rayner R, Carville K, Leslie G, Dhaliwal SS. A risk
model for the prediction of skin tears in aged care
residents: A prospective cohort study. Int Wound J.

purpura and the prevention of dermatoporosis. J Drugs
Dermatol. 2015; 14（10）: 1147-1150
23）Borroni RG, Grassi S, Concardi M, Agozzino M,
Caspani C, Giordano C, Vignini M, Arbustini E.

2019; 16（1）: 52-63
14）Rayner R, Carville K, Leslie G, Dhaliwal SS. Models

Involvement of dermal vascular basement membrane

for predicting skin tears: A comparison. Int Wound J.

in senile purpura: Quantitative immunohistochemical

2020; 17（3）: 823-830

study. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2016; 30（10）:15）Rayner RL, Carville KJ, Leslie GD, Dhaliwal SS.

e63-e65

Clinical purpura and elastosis and their correlation24）Kobayashi K, Tanaka M, Ito H, Harada T, Aiba M.

with skin tears in an aged population. Arch DermatolDermoscopic features of stellate spontaneousRes. 2019; 311（3）: 231-247

pseudoscars in five Japanese men. Br J Dermatol. 2008;16）Bergstrom N, Braden BJ, Laguzza A, Holman V. The
Braden Scale for Predicting Pressure Sore Risk. Nurs

159（2）: 479 - 48025）Kaya G, Saurat JH. Dermatoporosis: A chronic cutaneous
insufficiency/fragility syndrome. Clinicopahological features,Res. 1987; 36（4）: 205-1017）Carville K, Lewin G. STAR: A consensus for skinmechanisms, prevention and potential treatments.
Dermatology. 2007; 215（4）:284-294

tear classification. Prim Intent. 2007; 15: 18-29
18）Sanada H, Iizaka S, Matsui Y, Furue M, Tachibana

26）Menzinger S, Saurat JH, Kaya G. Morphological

T, Nakayama T, Sugama J, Furuta K, Tachi M,

Analysis of Dermatoporosis by in vivo ReflectanceTokunaga K, Miyachi Y, Scientific Education

Confocal Microscopy and Ultrasonography.

Committee of the Japanese Society of Pressure Ulcers.

Dermatopathology. 2020; 6（4）: 279-287

Clinical wound assessment using DESIGN-R total score
can predict pressure ulcer healing: pooled analysis
from two multicenter cohort studies. Wound Repair

27）Wick JY, Zanni GR. Skin tears: Prevention andtreatment. Consult Pharm. 2008; 23（7）: 508-510
28）Uitto J. The role of elastin and collagen in cutaneous
aging: Intrinsic aging versus photoexposure. J Drugs

Regen. 2011; 19（5）: 559-567
19）Bateman T. A practical synopsis of cutaneous

Dermatol. 2008;7（2 suppl）: s12-s16

diseases, 3rd edn. London, Longmans, 1813

− 200 −

顔の動画像解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法の開発
福島大学共生システム理工学類

田中明

In recent years, video plethysmography (vPPG) which is pulse wave derived from the skin video image has attracted
attention as a non-contact heart rate measurement technique. vPPG may be used to evaluate not only heart rate but also local
hemodynamics by simultaneously obtaining vPPG from multiple regions. In this study, a two-dimensional evaluation of facial subcutaneous hemodynamics was performed by means of the features of vPPG. The facial video and ear PPG were measured before and after facial massage in experiments. The facial video was divided into small grid regions of interest (ROI),
and vPPGs were extracted at each ROI using repetitive periodic component analysis (r-PiCA). PiCA is a technique to extract
the most periodic components from a set of multichannel recordings. The three features which were crest time, the time toreach 50% of the pulse wave area and lag of vPPG from PPG were calculated from vPPG of each ROI. The feature values
wave changed significantly with facial massage. The results indicate the possibility to evaluate of subcutaneous hemodynamics aspects of face using vPPG.

1．緒

評価対象の肌表面内を細かく分割してそれらの部分で脈波

言を抽出する必要があるが、抽出が比較的容易な顔であって近年、通常のカラーカメラで撮影された顔などの人の肌も、内部散乱光の状態は部位によって異なり、信号の SNの映像から、皮膚の色の変化を解析することによって脈波比も場所によって大きく異なる。さらに、脈波の抽出精度

成分（映像脈波 ; Video Plethysmography（vPPG））が抽出

は、照明、カメラの性能や体動などの影響を大きく受ける可能であり、そこから心拍数や脈波伝播時間などの生理指ことなど、血行動態を解析するためには、脈波の形を維持標を得る手法が提案され、様々な応用が期待されている。

した安定的な抽出法の開発が必要である。

これは、皮下の光の吸収量の特性を利用したものであり、本研究では、周期成分分析（PiCA）を応用した、vPPG 抽

特に RGB 成分のうち、ヘモグロビンによる吸収量の多い

出方法を顔の映像に適用し、得られた vPPG の特徴量を利緑成分（G）は皮下の血液容積の変化の影響を強く受けて変用した顔表面の皮下の血行動態解析を目的とした。

化するため、緑成分の時間変化に対して簡単な帯域通過フ

2. 方

ィルタを適用するだけで平均心拍数などの情報を得ること

法

2. 1. 周期成分分析を利用した脈波抽出が可能である 1）。
vPPG はその計測の原理から、臨床や健康分野で利用さ上述したように、RGB 信号で記録された肌の映像にはれている接触式の容積脈波に近い情報を含んでいることが脈波成分が含まれており、それを抽出することによって容期待できることから、もし映像脈波が精度よく得られれば、積脈波に近い情報を得られる可能性がある。それはあたか

脈波から得られる様々な生理指標が非接触で得られ、血行も無数の脈波センサを皮膚表面に設置していることに相当

動態の評価に利用できる可能性がある。また、vPPG の利

し、異なる部位の脈波を同時に得られることで、脈波の伝点は、非接触計測が可能なだけでなく、映像に写っている

播特性や部位の違いを積極的に活用した新たな血行動態解複数の部位の脈波を同時に得られることであり、心拍数だ

析の可能性もある。

けでなく、複数の関心領域（ROI）間の脈波の伝播特性や脈しかし、vPPG はその撮影環境や部位、さらには体動な波形状の部位による違いといった血行動態に関する新たなどのアーチファクトの影響を大きく受けるため、ノイズ除情報が抽出できる可能性もある。

去などの信号処理は不可欠であるが、狭帯域の帯域通過フ

しかし、肌の皮下の血行動態を面で評価するためには、

ィルタなどのように過度なフィルタ操作は波形を歪ませてしまい、脈の立ち上がり点の位置や波形そのものに含まれExtraction of multipoint pulse wave
a nd eva luat ion of subcut a neous
hemodynamics by analysis of facial
videosAkira Tanaka
Faculty of Symbiotic Systems Science,
Fukushima University

る有用な情報が失われてしまう可能性がある。したがって、
脈波解析に利用できる精度で vPPG を得るためには、脈波の高調波成分をできる限り維持して抽出する必要がある。
帯域通過フィルタ以外の脈波抽出法として、これまでに、
クロミナンスに着目し RGB 信号に対する線形変換を用いるもの 2）、RGB 信号に対して独立成分分析を適用して脈波− 201 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

成分を抽出する方法 3）などが報告されている。
本研究では、周期成分分析を利用した方法を用いてvPPG を抽出する。周期成分分析（PiCA）とは、既知の位相情報を基に、同時に記録された多チャンネルの信号に対して適当な変換行列を適用させることによって、既知あるいは想定される周期に近い周期成分を多く含む信号から順に分離する手法である 4）。Reza らは PiCA を用いて妊婦から得た複数チャンネルの心電図波形から母体と胎児の双方の心電図波形を分離できること、ICA（JADE 法）における一般的な問題である分離信号の順序の不定性を回避できることを報告している 5）。
周期成分分析は疑似周期信号に対して適用可能ではあるが、あらかじ位相情報、すなわち拍毎の心周期の情報が必要である。そこで本研究では、初めに仮の心周期を算出し、

図1

PiCA による脈波抽出と心周期情報の更新を繰り返し実行

繰り返しPiCAによる映像脈波抽出手順

することによって最終的に vPPG を得る、繰り返し周期成
分分析（r - PiCA）
を用いて抽出する 5）。
本手法の手順を図 1 に示す。まず、関心領域（ROI）の平均 RGB 信号について、G 信号のパワースペクトルから推定される平均心拍数を中心周波数とする帯域通過フィルタによって脈波信号を抽出し、心周期を拍毎に求め、それを仮の心周期とする。次に、ROI を複数の領域（subROI）に分割し、それぞれの subROI における RGB 信号で観測信号
ベクトルを構成する。したがって信号のチャンネル数は
subROI の数× 3 となる。初めに求めた仮の心周期を利用

図2

して PiCA を行い、得られた変換信号の中から心周期の成基線を除した映像脈波と特徴量分を最も多く含む系列を選択し、それを vPPG とする。得time）。

られた脈波を基に再計算された心周期情報を用いて再び（2）脈波面積が半分になる時間（TG）

PiCA によって脈波を更新する。これを心周期のばらつき

図 2 に示す脈波において、立ち上がりから脈波の積分値がある程度収束するまで繰り返して最終的な vPPG を算出

が一拍の脈波面積の半分に達するまでの時間。

する。

（3）耳朶の脈波との伝播時間差（ΔT）
耳朶に取り付けた接触式の光電容積脈波（PPG）と vPPG

2. 2. 顔の映像脈波による皮下の血行動態の評価方法との相互相関関数から算出される映像脈波の遅れ時間。

顔表面の血行動態を評価するために、まず、顔の映像を格子状に分割し、その中の肌の部位を関心領域（ROI）とし、各 ROI の RGB 信 号 に つ い て 繰 り 返 し PiCA を 使 用 し て
vPPG を抽出する。

2. 3. 顔のマッサージを利用した検証実験
実験対象は 21 歳から 22 歳までの健常者 10 名（男性 4 名、
女性 6 名、平均年齢 21 . 6 ± 0 . 5 歳）であり、それぞれに左得られた脈波は輝度情報に含まれる脈動成分から抽出さ頬をマッサージする試行と右頬をマッサージする試行の 2れるため、その振幅は照明、肌の吸光特性、肌の表面反射種類の実験を実施した。実験の概要を図 3 に示す。被験者

やカメラの感度などの影響を受ける。したがって、vPPG

は椅子に座り、顔を顎台に乗せて安静にしてもらい、12の波高値の情報を用いて血行動態を評価する場合には注意

秒を 1 セットとして計測を行った。計測量は、マッサージが必要である。本研究では脈波の形状における時間情報に側の耳朶容積脈波（PPG）および顔映像であり、PPG はサン着目する。すなわち、図 2 に示す vPPG の各拍の脈の立ち

プリング周波数 1 kHz で記録した。顔映像はカラーカメラ

上がり点を結んだ基線を除去した波形について、以下の３を用いて、フレームレート 100 fps で撮影した。

つの特徴量を算出する。

まず、実験当日の体調確認のため上腕で血圧を計測し、（1）立ち上がり時間（TC）

センサを装着した後、マッサージ前の安静状態を計測した。

脈波の立ち上がりから最初の極大点までの時間（crest

その後、図 4 に示すように、片側の頬のみをマッサージロ− 202 −

顔の動画像解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法の開発

図3

図4 マッサージ位置と特徴量の左右比較をしたROI の位置

実験の概要

ーラで、口元から目の下の位置を上下に 2 分間マッサージ

図 6（a）～（c）は各特徴量の頬の部分の平均値の左右差を行った。マッサージは強さ（押圧）を任意とし、一往復当（マッサージしていない方を基準とした差）の変化を示した

たりおよそ 2 秒で行うよう指示した。マッサージ後、再びものである。マッサージ終了直後から時間の経過とともに顎台に顔を乗せてもらい、マッサージ終了後 1 分から 1 分

減少傾向を示しており、マッサージ直後よりも数分後のほおきに５回の計測を行った。さらに、異なる日に反対側のうがマッサージ前に比べて優位に値が減少している。これ

頬をマッサージする同様の実験を行った。

は、マッサージが皮下の血行動態を変化させたこと、血行得られた映像の格子状の各 ROI で上述の特徴量を算出

動態がマッサージ終了後も変化し続けていることを示してし、各セット（12 秒間）の平均値を求めた。また、マッサいる。しかし、本実験結果からは、この変化がどの程度継ージの効果を明確にするために、図 4 に示すように、左右続するかは不明であった。

の目の下方に約 3 cm × 3 cm の ROI を設け、特徴量の平均4. 考値を算出し、マッサージをした側からしていない側の値を減じた左右差を計算し、この値のマッサージ前からの変化量を評価した。

察

図 5 の結果は、顔の皮下の局所的な血行動態が捉えられていることを示しており、マッサージ前の安静状態であっ3. 結ても特徴量は局所的に異なる値になっており、もともとの果

皮下の血流の偏りなどを捉えられる可能性がある。マッサ

図 5 はある被験者のマッサージ前後の TC、TG およびージの効果では、マッサージローラの押圧などの違いと思ΔT の顔表面の分布を示したものである。マッサージ前のわれる変化も現れており、適切なマッサージとその効果の結果では、TC、TG および ΔT は両頬のあたりで値が低く、評価が行える可能性がある。

額で大きな値になっており、脈が各 ROI に至るまでの血図 5 および図 6 の結果から、マッサージによって、TC、

管インピーダンスおよび脈波伝播時間が反映されている。

TG および ΔT の減少が生じた。一般にマッサージの効果と特に ΔT は心臓からの距離にも依存するため、額で高値として血行が良くなることが挙げられるが、脈の伝播特性をなっていると考えられる。また、本被験者では、マッサー

RC 回路による集中定数型の電気回路モデル（ローパスフィ

ジ前であってもすでに左右差や局所的な指標の違いが見てルタ）で表現できると仮定すると、本結果が、末梢組織に取れることから、各 ROI の支配血管の特性や組織の血管至る血管抵抗が減少し、立ち上がり時間の減少（時定数の床の特性の違いが現れていると考えられる。

減少）とカットオフ周波数の増加によって生じたと考える

マッサージ後はそれぞれの特徴量がマッサージ側で減少ことと矛盾しない。

しており、特にあご付近で減少量が大きい結果となった。

一方、本研究で採用した特徴量は、末梢の血行動態だけ

これは、あご付近でマッサージローラの押圧が最も高くな

でなく、心機能や血圧などの影響も受けることから、顔内っていること、骨と顔表面との間の組織の厚みなどの影響の相対的な違いは末梢の血行動態の違いとして評価できるであると考えられる。また、マッサージ後数分経っても変が、特徴量の絶対値から組織の血行動態を表することは困

化は元に戻らない、あるいはさらに変化が大きくなる傾向難である。今後、脈波の 2 階微分値である加速度脈波解析が見てとれる。

による反射波の解析の応用や、姿勢変化などなんらかの刺− 203 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図5

顔の映像脈波から算出された特徴量のマッサージ前後の変化

図6

頬の特徴量の左右差の経時的変化（ (a) TC, (b) TG, (c) ΔT）

激あるいは負荷に対する応答で評価するなどの工夫が必要

ジ前であっても顔の部位によって指標に特徴的な違いがあである。

り、血管の支配や特性の違いも評価できる可能性も示され5. 総

た。しかし、脈波形状は末梢血管特性だけでなく、心機能、括組織までの血管性状および血圧なども影響すると考えられ

本研究では、顔を対象とした映像脈波 vPPG による 2 次
元的な皮下の血行動態解析を目的とし、顔のマッサージにるため、今後、値の相対的な評価だけでなく、脈の伝播の物理モデルを考慮した解析が必要である。

よる血行動態の変化を、顔を細かい ROI に分割し、r-PiCA
を用いて抽出した vPPG の脈波波形から皮下の血行動態を（引用文献）

評価した。評価指標として、vPPG の立ち上がり時間、脈

1） M. Yoshizawa, N. Sugita, et al.: Blood perfusion

波面積の 50 ％となる時刻、耳朶の容積脈波との脈波伝播

display based on video pulse wave, Proc. 38th Annual

時間差を用いて評価したところ、マッサージによって各特Conference of IEEE Engineering in Medicine Biology

徴量が有意に減少し、vPPG 解析によって皮下の血管抵抗

Society 2016, 4763-4767（2016）．

の変化を評価できる可能性が示唆された。また、マッサー

2） G. de Haan and V. Jeanne: Robust Pulse Rate From− 204 −

顔の動画像解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法の開発

Chrominance-Based rPPG, IEEE Transactions on4） S. Reza, et al.: Multichannel Electrocardiogram

Biomedical Engineering, 60（10），2878-2886（2013）．

Decomposition Using Periodic Component Analysis,3） M. Poh, et al.: Non-contact, automated cardiac pulse

IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 55（8），measurements using video imaging and blind source
separation, Optics Express, 18（10），10762-10774（2010）．

1935-1940（2008）．
5） A. Tanaka, M. Kumagai and M. Yoshizawa: Non-

4） L. K. Saul and J. B. Allen: Periodic component

contact Assessment of Peripheral Hemodynamics byanalysis: An eigenvaluemethod for representing

Using Video Plethysmography, Proc. IEEE 8th Global

periodic structure in speech, Proc. Advances in Neural

Conference on Consumer Electronics（GCCE），1 3 1-

Information Processing Systems 13（NIPS 2000），807-

133（2019）．

813（2000）．

− 205 −

統計的顔画像解析によるメイクアップ効果の数理モデル化
ウィーン大学心理学部，日本学術振興会，早稲田大学理工学術院総合研究所

中村航洋

Millions of people wear cosmetic makeup every day to make their faces look more attractive, feminine, and healthier.
Accumulated evidence from research indicates that several cosmetic practices accentuate perceived femininity and attractiveness. However, the quantitative link between facial appearance modification through cosmetic makeup and perceived
facial impressions remains unclear. This study aimed to build a mathematical model of Japanese women’s everyday facial
makeup using a statistical image quantification technique (Study 1). In addition, it sought to identify psychological factors
underlying the cosmetic effect on facial attractiveness (Study 2). In Study 1, 16 Japanese women’s faces were photographed
before and after applying facial makeup. The facial images were analyzed using principal component analysis to quantify
the change in the facial surface associated with the cosmetics. The statistical image quantification enabled visualization of
facial appearance linked to makeup. It revealed that cosmetics exaggerated the luminance contrasts between facial parts (i.e.,eyes, eyebrows, and lips) and surrounding facial areas. The validation test confirmed that perceived attractiveness, health,and naturalness were curvilinearly changed due to the facial makeup exaggeration. Study 2 demonstrated a sex differencein the luminance contrast of facial parts (53 women and 54 men), suggesting these traits are sexually dimorphic. The results
indicated that widely used cosmetic makeup among Japanese women accentuates facial features that signal femininity andyouthfulness by heightening the luminance contrasts of facial parts.

1．緒あると考えられている。生物学的な女性と男性の顔を比較

言すると，女性の顔の方が明るいトーンの肌を持つため，目メイクアップは健康的な美しさや個性を魅力的に演出すや唇などの顔パーツとその周辺の肌色に大きなコントラスる方法として，人々の間で広く用いられている。化粧によトが生じる 7）。したがって，多くの女性に共通するメイク

る顔の印象の演出には，個性や社会的地位，思想などの社

アップは，女性の顔が持つ女性的な特徴を強調することで，

会的表示機能と，普遍的に顔印象を美化する機能の両方が魅力印象を高める効果を持つのではないかと考えられてい1）あると考えられている 。化粧がつくりだす印象の美化効

る 2 , 7）。

果には，幾何学的錯視効果によって顔形状の知覚に作用す

このように，メイクアップによる顔の局所的な表面特徴

るものもあるが，肌表面の明るさや色の空間的分布，コンの変化から，顔印象の演出効果が生み出されていることはトラストに作用して，印象を演出するものもある 2 - 4）。化粧ある程度明らかになっているが，女性が日常的に行うメイ品を用いたメイクアップにより顔の印象が変容することはクアップが顔全体の顔表面特徴をどのように変化させ，そ日常の実践と経験知としてはよく知られており，アイメイ

れが見た目の印象にどのように影響しているのかを定量的

クやベースメイクには，顔の魅力印象を高める効果があるに示した研究はこれまでにほとんど存在しない。メイクア

5）ップの視覚効果を科学的手法で解析することは，さまざまことが報告されている 。
化粧による顔印象の演出効果については，これまで女性なメイクアップ方法の背後で共通する心理的な効果を明らの顔を対象とした実証研究が複数行われており，目元や口かにし，個性を魅力的に演出するメイクアップを考案する

元にメイクアップを施すことで，若さや女性らしさの印象ことにも繋がる 6）。

が強調され，魅力印象が高まると考えられている 1 , 6）。特に，そこで本研究では，日本人が日常的に行っているメイク

多くの人が用いるメイクアップ方法には，目元，口元とそアップの視覚効果を統計的顔画像解析によって定量化し，の周辺の肌色のコントラストを強調するように作用するもメイクアップが見た目の印象に及ぼす影響とその背景要因のが多い。目，唇とその周辺の肌色のコントラストには，を明らかにすることを目的とした。まず，研究 1 では，日

生物学的な女性と男性の間で性差があり，性的二型特徴で本人女性が自らの顔に施したメイクアップによって変容す
る肌表面特徴を統計的顔画像解析によって特定し，その特Modelling facial makeup by statisticalimage analysis

徴を定量的に操作した際に，見た目の顔印象がどのように変化するかを心理学実験によって検証した。研究 2 では，Koyo Nakamura

目，眉，唇の 3 箇所の顔パーツとその周辺のコントラスト

Faculty of Psychology, University of
Vienna. Japan Society for the Promotionof Science. Faculty of Science andEngineering, Waseda Universityの変化を画像解析によって測定し，日本人女性のメイクア
ップに，性的二型特徴を誇張するような視覚効果が存在するかを検証した。

− 206 −

統計的顔画像解析によるメイクアップ効果の数理モデル化

図1

統計的顔画像解析に基づくメイクアップの視覚効果の可視化（SD値が大きいほど，メイクアップによる肌表面特徴の変化が強調される）

2 . 研究 1：統計的顔画像解析による日本人女性のメイクアップ効果の定量化
2. 1. 方法日本人女子大学生 16 名（平均年齢 20 . 43 , SD = 1 . 22）に協力を依頼し，メイクを施していない状態と各自が自分を最も魅力的に見せるメイクアップを施した状態で，顔画像の撮影を行った。顔画像の撮影は，一眼レフカメラ（Nikon
D 850）を用いて，照明光を厳密に統制した環境で行われた。
撮影された顔画像には色補正を施し，顔面形状を正規化した後，主成分分析により顔の表面特徴量を表す固有空間を算出した。この表面特徴の固有空間には，肌表面特徴の個
人差やメイク前後での肌表面の変化も含まれており，本研
究では，メイク前後における肌表面の変化に関わる特徴量をさまざまな重み付けで強調することで，メイクアップによる肌表面特徴の変化を可視化した 8）。本研究では，メイクアップによる表面特徴変化を強調する変換を 16 名の各
顔画像に適用し，顔画像を再構成した。その際，標準偏差（SD）を単位として強調度を定義した。図 1 は平均顔に対

図2

メイクアップの強調度と顔印象評価

点は評定平均値，曲線は階層ベイズ回帰分析における事後予測
平均値，誤差範囲は95 %信用区間を示す。

してメイクアップの視覚効果を強調した画像を示している。
メイクアップの視覚効果の強調度が見た目の顔印象に及さらに，メイクアップの視覚効果を段階的に強調すると，ぼす影響を検討するため，日本人大学生 24 名（平均年齢

魅力，見た目の健康さ，見た目の自然さの印象が曲線的に20 . 45 歳 , SD = 2 . 30 , うち男性 12 名）に，5 段階（−5 . 0 vs.

高まっていくことも明らかになった（図 2）。これら 3 つの− 2 . 5 vs. 0 vs. + 2 . 5 vs. + 5 . 0 SD）に強調された 16 名の顔

印象の間では，印象が最大に到達する強調度が異なってお画像を提示し，魅力，見た目の健康さ，見た目の自然さのり，自然さの印象よりも魅力や見た目の健康さの印象にお3 項目について 9 件法で評価することを求めた。

いて印象が最大化する強調度が高いことが確認された。このことは，演出したい見た目の印象の内容によって，最適

2. 2. 結果と考察

なメイクアップの強度が異なることを示唆している。

統計的顔画像解析の結果，メイクアップにより，目と眉

メイクアップによる視覚効果をモデル化し可視化すると，の明暗コントラストが強調され，頬部と唇の赤みが強調さ日本人女性が日常的に行うメイクアップは，顔全体の色のれることが明らかになった。ヨーロッパ文化圏の人々を対分布と局所的なコントラストの両方を変化させていること象とした研究からは，目と唇とその周囲のコントラストをが分かる。顔の上部においては，アイシャドーやアイライ

強調し

2 , 7）

4），唇の赤みを強調することで ，女性らしさやナー，マスカラなどを用いたアイメイクにより，目元とそ魅力の印象を高める効果があることが報告されていたが，の周囲の明暗コントラストが強調されていることが窺える。

日本人女性が行うメイクアップにおいても同様の視覚効果

加えて，アイブロウによる眉のコントラストも強調されてが認められることが分かった（図 1）。

いることが分かる。顔の下部では，リップに鮮やかな赤み− 207 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

を添えることで，口元とその周囲のコントラストが強調される効果が生み出されているように見える。したがって，
日本人のメイクアップによる視覚効果には，目，眉，唇とその周辺のコントラストの強調が顕著に認められると言えるだろう。
目元と口元のコントラストを強調することで，女性らしい印象を強調し，顔印象の美化効果を期待できることは既に触れた 2 , 7）。生物学的な女性と男性の肌色を比較すると，女性の肌のトーンは男性よりも平均的に明るいが，目や唇の色そのものの性差は比較的小さいため，女性の顔においては，目とその周辺，唇とその周辺で明るさに大きなコン
トラストが生じる。したがって，コントラストが強調された目元や口元は，誇張された女性らしさとして知覚され，それが魅力印象を高めていると考えられている 7）。しかしながら，眉のコントラストについては，男性の方が濃い眉
図3を持つため，その周囲の肌色と大きなコントラストが生じ

目、眉、唇とその周囲のコントラスト（赤：顔パーツ内の領域、青：周辺の領域）

9）ることが知られている 。したがって，日本人女性のメイ
クアップにおいて，眉のコントラストが強調されている点については，むしろ男性らしい特徴が強調されているよう

各顔パーツの周辺領域として定義し，その領域内の L* のに見える。眉のコントラストは性的二型特徴である一方で，平均値を取得した（図 3）。各パーツとその周辺のコントラ

加齢によって変化する特徴であることも知られている。実ストは，（周辺の L* −パーツの L*）／（周辺の L* + パーツ

際に，加齢に伴って眉は薄くなるため，眉コントラストはの L*）によって算出した。コントラストは−1 から + 1 の値9）低くなっていく 。したがって，眉のコントラストは年齢を取り，正の値は周辺領域がパーツ内部よりも高い輝度をの手がかりであり，コントラストの高い眉は若々しい印象持つことを示す。
ここでは，生物学的な女性と男性の顔パーツのコントラを与えると予測される。
研究 2 では，日本人の目，眉，唇の 3 箇所のコントラス

ストを比較するために，メイクアップを施していない状態

トの性差を測定し，メイクアップによって女性らしい顔特でのコントラストの計測を行った。さらに，メイクアップ

徴が強調されているという仮説

2 , 7）

について検証することために，女性のメイク前とメイク後の顔コントラストの比を目的とした。

3 . 研究 2：目，眉，唇領域のコントラストの性差とメイクアップによるコントラストの変化
3. 1. 方によってコントラストがどのように変化するかを検討する

法較を行った。

3. 2. 結果と考察
目，眉，唇の 3 つの顔パーツとその周辺のコントラスト

日本人大学生を対象に，女性 53 名（平均年齢 20 . 94 歳 ,の性差を検討した結果，女性の顔は，目と唇領域においてSD = 1 . 63），男性 54 名（平均年齢 21 . 13 歳 , SD = 2 . 41）に

男性の顔よりもコントラストが高いことが示された（図 4）。

顔画像の撮影協力を依頼した。参加者は，顔にメイクアッその一方で，男性の顔においては眉が濃く，それによってプを施していない状態で撮影に協力し，女性参加者のうち

眉領域におけるコントラストが高いことが確認された。し49 名は各自が自分を最も魅力的に見せるメイクアップをたがって，日本人大学生の顔においては，目と唇領域にお施した状態での撮影にも協力した。顔画像の撮影は，一眼けるコントラストの高さが女性の顔の典型的特徴であり，レフカメラ（Nikon D 850）を用いて，照明光を厳密に統制

眉領域のコントラストの高さが男性の顔の典型的特徴であした環境で行われた。撮影された顔画像には色補正を施し，ると言えるだろう。

顔面形状を正規化することで，表面特徴を直接比較するこ

次に，メイクアップによる女性の顔パーツのコントラス
トの変化を分析した結果，メイクアップによる目領域の顕とができるように前処理を施した。
顔パーツとその周辺領域のコントラストを計測するため著な変化は認められなかったものの，眉と唇領域においてに，顔画像の RGB 値を CIE L*a*b* に変換し，両目，両眉，

顕著なコントラストの増大が確認された（図 5）。このコン

唇の領域内の L*（ 輝度）の平均値を算出した。さらに，両トラストの増大は，アイブロウとリップカラーによりそれ目の 2 倍，両眉の 1 . 5 倍，唇の 1 . 5 倍のサイズのエリアを，ぞれのパーツが周辺領域よりも暗くなったために生じたと− 208 −

統計的顔画像解析によるメイクアップ効果の数理モデル化

図4

顔パーツとその周辺のコントラストの性差

図5 メイク前後での顔パーツとその周辺のコントラストの変化

点はベイズ回帰分析における事後予測平均値，誤差範囲は95 %信用区間を示す。

点はベイズ回帰分析における事後予測平均値，誤差範囲は95 %信用区間を示す。

推察される。唇領域の化粧によるコントラストの増大は，状のシンメトリー性や性的二型特徴）を高める目的で行わ

女性の顔に典型的な特徴が誇張されたものであり，化粧はれるわけではない。多様な美のあり方を受け入れる新しい女性の顔が本来的に持つ特徴を誇張することで，魅力の印文化に移行しつつある現代社会では，個性の視覚表現とし象を演出しているという仮説を支持するものであるようにての化粧や社会的表示機能としての化粧の役割がより大き7）見える 。その一方で，眉領域の化粧においてもコントラくなっていく可能性がある。本研究の成果は，多様な印象

ストの増大が認められ，一見すると男性に典型的な特徴をを演出するメイクアップの科学的理解に寄与するのみなら誇張したものであるように見えるが，周辺の肌とのコント

ず，画像解析に基づくメイクアップ・シミュレーション技

ラストの高い眉は若々しい印象を与えるため，日本人大学術の開発や個性的な美を表現するためのメイク手法の提案

生に共通する眉メイクは，アンチエイジング効果によってなど，応用的価値の創出にも繋がると考えている。今後は印象を演出している可能性がある。

これまでの研究を継続し発展させると同時に，画像解析的アプローチを男性のスキンケアやメイクアップの研究に応4．総合考察用し，見た目の肌質や印象に悩みを感じる人へのケアと支本研究では，統計的顔画像解析により，日本人が魅力を援を目指した研究にも取り組みたい。

演出する目的で行うメイクアップに共通した特徴を可視化することができた。特に，目，眉，唇とその周囲で強調さ（引用文献）

れた明暗コントラスト，口元に添えられた鮮やかな赤みが

1） R. Russell, Why cosmetics work, in The Science of

顕著であり，化粧品の使用によって女性の顔に本来備わるSocial Vision, R. B. Adams, N. Ambady, K. Nakayama,

女性らしい特徴や若々しさの手がかりが誇張されているこ

S. Shimojo, Oxford University Press, 186-203, 2011.

6）とが示唆された 。さらに，統計的顔画像解析によってメ

2） R. Russell, Sex, beauty, and the relative luminance of

イクアップの視覚効果を定量化したことで，メイクアップ

facial features, Perception, 32（9），1093-1107, 2003.

の強調度を段階的に操作し，見た目の印象との数量関係を

3） A. L. Jones, R. Russell, and R. Ward, Cosmetics alter

明らかにすることができた。さらに，日本人の目，眉，唇biologically-based factors of beauty: Evidence fromとその周囲の肌のコントラストには性差が存在し，女性のfacial contrast, Evol. Psychol., 13（1），210-229, 2015.

メイクアップは，女性らしい顔特徴を強調しているという

4） I. D. Stephen and A. M. McKeeganh, Lip colour

仮説を裏付ける知見を得ることができた 7）。これらの結果

affects perceived sex typicality and attractiveness ofから，日本人女性が魅力を演出する目的で行うメイクアッhuman faces, Perception, 39（8），1104-1110, 2010.

プには，顔パーツのコントラストを高めることで，女性ら

5） R. Mulhern, G. Fieldman, T. Hussey, J. L. Lévêque,しさと若々しさを同時に強調する効果があることが示唆さ

and P. Pineau, Do cosmetics enhance female Caucasian

れた。

facial attractiveness?, Int. J. Cosmet. Sci., 25（4），199-

本研究では，集団に共通したメイクアップの一般的傾向

205, 2003.

を特定することを目的としていたが，化粧によってどのよ

6） 中村航洋・小林麻衣子・渡邊克巳 , 進化心理学の視点

うに顔を装うか，そこには大きな多様性があると考えられか ら 見 た 化 粧 の 視 覚 効 果 , FRAGRANCE JOURNAL

る。化粧は，必ずしも顔への生物学的選好（例えば，顔形

2020/4 月号【特集】化粧がもたらす心身機能への効果 ,− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

The relative contributions of shape and reflectance to30–37, 2020.
7） R. Russell, A sex difference in facial contrast and its
exaggeration by cosmetics, Perception, 3 8（8），1 2 1 1-

attractiveness judgements, R. Soc. Open Sci., 6（5），182189, 2019.
9） A. Porcheron, E. Mauger, and R. Russell, Aspects of1219, 2009.
8） K. Nakamura and K. Watanabe, Data-driven
mathematical model of East-Asian facial attractiveness:

facial contrast decrease with age and are cues for age
perception, PLoS ONE, 8（3），e57985, 2013.

− 210 −

木の香りによる作業効率への影響解析
国立研究開発法人森林研究・整備機構 森林総合研究所複合材料研究領域

松原恵理

Several studies have reported that wood odor has a relaxing effect on humans. This study aims to examine the effects
of wood odor on workers’ relaxation and the ability to maintain moderate concentration in an office space. Therefore, theeffects of wood odor on the performance of multiple tasks and physiological and psychological aspects during work were
investigated. Two commercially available essential oils made from cypress were selected as experimental materials. The experimental subjects were 20 university students, who completed five simulated tasks in the experiment. Autonomic nervous
activity and salivary oxytocin levels of the subjects were used as physiological indices, and the stress response scale and a
subjective questionnaire were used as psychological indices. A gas chromatograph-mass spectrometer was also used to qualitatively and quantitatively analyze the volatiles. The results showed that α-pinene and 1,8-cineole were the main compounds
in the experimental room. On comparing the rooms with essential oils to the control room, the number of correct responses
increased and the error rate decreased. The participants were more relaxed during the tasks performed in the essential oilroom according to the results of the physiological indice analysis. These results suggest that wood odor can help people relax
and improve work efficiency and can be used in offices.

1．緒

つながる可能性があると考えた。

言

一般的なオフィスでは、データ入力などの実務的な作業

業種を問わず、長時間労働は働く人の心身に大きな影響

から商品開発のような創造性が必要とされる作業など、を与えることが報告されており 1）、労働時間を減らすこと

様々な業務内容がある。単調な計算作業時における樹木のが必要とされている。さらに、2019 年 4 月に「働き方改革」

香りの効果についてはこれまでに報告はあるが、創造的な関連法の一部が施行されて就業スタイルの多様性が増えて作業時での調査はほとんど報告されていない。そこで本研

いくとともに、労働生産性の向上に対する関心はより高ま

究では、複数の模擬作業課題を設定して作業成績を検討すってきたと言える。

るとともに、作業従事時の人の生理心理面への影響を解析

労働生産性の向上に対して、作業工程を見直して無駄を省き、通信インフラの整備や人工知能の活用などの技術的し、樹木の香りの有用性について検討することを目的とした。

な投資も重要とされる一方で、個人の能力を引き出して集

2. 方

中力の持続を促し、時間あたりの労働生産性を向上させる
取り組みも有効とされている。例えば、集中力の持続が必
要な会議室への香り導入などを始めている企業があり、様々な効果を持つ植物由来の香り

2 - 5）の活用に注目が集ま法

2. 1. 供試材料および供試方法
市販の精油を 2 種類（試料 1、2）選定して実験に供した。
精油の主原料はいずれもヒノキ科樹木であり、そのほかの原料として試料 1 にはマツ科樹木、試料 2 にはマツ科やクっている。
これまで私たちは、樹木の香り成分が作業ストレスの緩

スノキ科樹木などが含まれている。精油は、ディフューザ

和に有用であることを明らかにしてきた 6 , 7）。古来より生の取扱説明書に従い、適宜、希釈液にて調整して実験室内

活の様々な場面で木を使い、木に親しんできた文化が根付に噴霧した。対照は、希釈液のみを供試した。

いている日本人は、樹木の香りに対して落ち着きや安心などを感じやすいことが知られている。このことから、オフ

2. 2. 香りの成分分析

ィス空間に樹木の香りを漂わせることで、働く人がリラッ

ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて、精油に含まれクスして適度に集中力を維持でき、労働生産性の向上にもる成分と組成比を明らかにした。次に、実験室内に噴霧した香りについて、携帯型空気吸引ポンプと捕集管を用いてアクティブサンプリング法により捕集し、ガスクロマトグ

Analysis of the effects of wood odor on
work efficiency
Eri Matsubara
Department of Wood-Based Materials,
Forestry and Forest Products ResearchInstitute

ラフ質量分析計を用いて定量分析を実施した。成分捕集の様子を図 1 に示す。

2. 3. 実験対象者および実験スケジュール
本研究は、国立研究開発法人森林研究・整備機構森林総− 211 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

でないこと。また、実験前に嗅覚感度を判定する試験を実施し嗅覚に異常がないことを確認した。
実験は、研究所内の耐震・快適性工学実験棟（RC 造）2階の一室にて、一度に 2 名ないし 3 名一組を対象に実施した。実験の様子の例を図 2、および実験スケジュールを図3 に示す。ちなみに、図 2 の写真は実験とは別日に撮ったものであり、新型コロナウィルス感染症拡大防止のためにマスクを着用したままであったが、本実験実施時には実験
中のみマスクを外していただいた。さらに、当該感染症拡大防止策の一環として実験中は実験室の窓とドアを少し開けた状態にした。
実験スケジュールの概要を以下に示す。まず初めに、実図1

験前室にて実験対象者に心拍センサを取り付けた。その後、

成分捕集の様子

実験対象者を実験室に入室させ、作業前のだ液を採取して合研究所倫理審査委員会の審査・承認を得て実施した。実

心理反応尺度に記入させた。続いて、椅子に座ったまま安験を始める前に、実験対象者に対して実験の目的や手順な静状態で試験開始の音声がスピーカーから流れるのを待たどに関する説明を十分に行い、実験参加に対する同意を得せた。実験開始後、実験対象者にはスピーカーの音声に従た。

い計 5 つの作業課題を順に実施させ、全ての課題が終了し実験対象者は、女子大学・大学院生 20 名（平均年齢：

た後には、直ちにだ液を採取し心理反応尺度および主観調

22 . 0 ± 1 . 3 歳）であった。実験対象者に対しては事前に心査票に記入させ、その後、適宜、退室させた。本研究では、身の健康に問題がないこと、薬を服用しておらず、喫煙者

計 3 回の実験を同一日に実施した。実験対象者には午前 9

図2

図3

実験風景

実験スケジュール

− 212 −

木の香りによる作業効率への影響解析

時半頃に集合させ、各実験の間で 2 時間ずつの休憩時間を置分散分析および Bonferroni の多重比較、ストレス反応尺

挟みながら実験を実施し、おおよそ 17 時半に全実験を終

度は Wilcoxon の符号付き順位検定、香りの印象や強さ、了した。

快 - 不 快 度、 主 観 的 な 疲 労 感 や 眠 さ の 評 価 は Kruskal-

実験に使用した試料は、精油 2 種類および対照（香り無）Wallis の 検 定 に よ り 検 討 し た。 統 計 解 析 ソ フ ト は IBMであり、いずれも実験を開始する直前に噴霧を開始し、実SPSS Statistics ver. 27 を用い、すべての検定の有意水準

験対象者が退室するまで継続した。また、試料の供試順はは危険率 5 ％以下とし、10 ％以下を有意傾向とした。

ランダム化し、実験対象者には 3 つの試料条件すべてに参

3. 結

加させた。

果

3. 1. 香りの定性・定量分析の結果

2. 4. 作業課題および作業成績の算出

2 種類の精油の定性分析の結果として、ライブラリとの

8 - 11）

を参考にして、計 5 つの模擬作業課題を作

類似度 90 ％以上の化合物名および含有割合を表 1 に示す成した。本研究では、加算テスト（課題 1）と d 2 テスト（課（Tr は含有割合 0 . 05 ％以下）
。試料 1 の主成分は α- ピネン

題 2）を単純業務の模擬課題とし、RAT（Remote Associates

であり、そのほかにリモネンや 1 , 8 - シネオールが比較的

Task）
課題
（課題 3）とアナグラム課題（課題 4）、マインドマ多く含まれていた。試料 2 は α -ピネンと 1 , 8 - シネオール

ップ（課題 5）を創造性が必要な業務の模擬課題とした。図が主成分であり、リナロールも比較的多く含まれていた。

先行研究

4 に各課題の例を示す。いずれも同程度の難易度に揃えた

さらに実験室内に噴霧した香りの定性・定量分析の結果、課題用紙を 3 パターン準備して 3 回の実験に供した。各課

試料 1 の成分として α-ピネンやカンフェン、リモネン、

題の回答時間については、課題 1、2、4 は 5 分間、課題 3

1 , 8 -シネオール、p-シメンなどが検出され、試料 2 の成は 10 分間、課題 5 は 15 分間と設定した。各作業の成績に分として α -ピネンやカンフェン、リモネン、1 , 8 -シネオ

ついては、課題 1、3、4 は正答数、課題 2 は達成率とミスール、p-シメン、リナロールなどが検出された。香りの総率、課題 5 は回答数を算出した。

量は試料 1、2 ともに約 500 μg/m 3 であったが、試料 1 と2 で異なる点として試料 1 は α -ピネンが約 3 割を占め、試2. 5. 生理心理学的な指標

料 2 は α -ピネンと 1 , 8 - シネオールがいずれも約 3 割を占

生理学的な指標には、自律神経活動（交感神経、副交感

めていたことが分かった。

神経）量およびだ液中のオキシトシン量を用いた。自律神
経活動量については心拍センサを用いて連続データを採取

3. 2. 作業成績の分析結果し、実験開始前の安静時と実験開始後から終了までの時間

単純業務の模擬課題とした課題 1 および 2 の作業成績に帯に分けて解析した。オキシトシン量は実験開始前と終了

ついて図 5 a に示す。いずれの課題も、実験条件間での統時に採取しただ液を、ELISA キットを用いて分析した。

計的な有意差はないが、精油を噴霧した室内では対照より

また、心理学的な指標については、ストレス反応尺度

も正答数が増加、達成率が向上し、ミス率が低下すること（SRS- 18）および主観調査表（香りの印象や香りの強さ、快- 不快度、自覚的な疲労感や眠気の程度に関する質問項目
表1を含む）
を用いて調査した。

2. 6. 統計的な解析
統計学的には、作業課題および生理学的な指標は一元配

図4

作業課題の例− 213 −

精油成分および含有割合（％）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022が分かった。また、創造性が必要な業務の模擬課題とした

た。また、だ液中に含まれるオキシトシン量については、

課題 3、4、5 の作業成績について図 5 b に示す。課題 4 の作業後と作業前の値の差を取り変化量を算出した。その結アナグラムでは試料 1 のみ対照よりも正答数が少なかった果、実験条件間での統計的な有意差はなかったが、精油をが、そのほかの課題においては単純な業務課題と同様に、噴霧した室内では対照よりも変化量が小さく、対照条件で精油を噴霧した室内では対照よりも正答数や回答数が増加

最もオキシトシン分泌が促進していたことが分かった。
心理学的な指標について、実験前後の心理的なストレスすることが分かった。

反応の結果を図 7 に示す。精油を噴霧した室内では、統計

3. 3. 生理心理学的な指標の解析結果的に有意または有意傾向ではあるが、抑うつ・不安や無気

生理学的な指標として、作業中の自律神経活動（交感神

力の得点が低下することが分かった。香りの印象に関して経、副交感神経）の量を安静時と比較して、変化量を算出

は、“好きな－嫌いな”、“気分が安らぐ－気分が高まる”、“平した（図 6）。精油を噴霧した室内では対照よりも交感神経

凡な－個性的な”、“落ち着く－落ち着かない” の評価にお活動が低下し、副交感神経活動が増加することが分かった。

いて実験条件間の有意な差があることが分かった。また、

なかでも、有意傾向ではあるが、副交感神経活動について

香りの強さおよび快 - 不快度については、対照が「無臭～は実験条件間で差があり、特に試料 1 条件では対照と比較、試料
やっと感知できる、快でも不快でもない～やや快」して作業中の副交感神経活動が優位であったことが分かっ

１および２は「弱い～楽に感知できる、やや快～快」
であり、

図6

図5 a

単純課題の成績

図5 b

創造性課題の成績

作業中の自律神経系活動量− 214 −

木の香りによる作業効率への影響解析

図7

実験前後の心理的ストレス反応

精油を噴霧した室内では対照よりも実験後の疲労感が低く、や主観的な眠気の低下が見られた。先行研究において、ヒ眠気も生じにくかったことも分かった。

ノキ材部の香りは嗅ぎ始めてすぐに脳の活動を鎮静化させ、

4. 考

主観的にも好まれること、さらに、単調な計算作業を実施

察している間もリラックスしていたことを報告している 14 , 15）。

職場の労働生産性の向上に対する関心が高まる中で、気また、ヒノキ材部の香りに含まれる α- ピネンやリモネン

持ちを落ち着かせたり集中力を高めたりする効果のある植は本研究で用いた試料の香りにも含まれる成分であり、α-物由来の香りに対しても注目が集まっている。そこで本研

ピネンやリモネン、リナロールなどによる人の心や身体へ

究では、日本人が古来より慣れ親しんできた木を主原料との機能性がたくさん報告されている 5 , 16 , 17）。これらのことした香りを用いた空間において、実務的な単純業務とよりから、本研究結果は先行研究ともよく一致すると考えられ創造性が必要な業務を模した作業を行わせ、その成績や生た。

理心理的な面への影響について分析し有用性を検討した。

5. 総

作業成績の分析結果、統計的な有意差は得られなかった括が、樹木由来の香りが作業空間にあることで、多くの課題

アロマテラピーは、植物から抽出した精油で身体と心ので成績が良くなることが示唆された。特に、本研究で用い機能回復を促し、健康や美容面に役立てていく自然療法とた試料 2 については単純な業務から創造的で複雑な思考を言われる。今回の検討からは、樹木の香りが人の心や身体必要とする業務の遂行時においても、十分に活用可能性がの状態をより良くすることで、結果として仕事効率の向上

高いことが推察された。香り成分の分析より、試料 2 はにつながる可能性が推察された。本研究の成果は今後、様々

α- ピネンと 1 , 8 - シネオールが多く含まれることが分かっな形での応用が可能であると考えられるが、例えば、ハンている。先行研究から、1 , 8 - シネオールが前頭葉の活動

ドクリームなどへ添加し、仕事の場で使うことでどのようを増加させること、また、1 , 8 - シネオールを含む植物のな影響があるのか、実際のオフィス空間で働く方々を対象

香りが作業成績の向上に効果的であること 4 , 12 , 13）が報告さとした継続研究へとつなげていきたい。化粧品と森林資源れており、本研究結果はそれらの先行研究と同様であったを結び付けて従来の製品に新たな価値を付与することで、と考えられた。

コスメトロジー研究および森林資源の利用に少しでも貢献

生理的な指標を解析した結果、精油を噴霧した室内ではしていくことができれば大変幸いである。

交感神経活動の低下と副交感神経活動の増加が見られた。
一般的に、交感神経活動は緊張状態のとき、副交感神経活謝

辞動はリラックス状態のときに優位になることが知られてい本研究の実験に参加してくださった実験対象者の皆様にる。本結果から、実験対象者は香りを嗅ぐことでリラック

心より感謝申し上げます。また本研究を遂行するにあたり、スして作業に従事できたことが推察された。また、心理学

公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団のご支援を的には、作業後に抑うつや不安、無気力感の低下、疲労感賜りましたことに深く御礼申し上げます。

− 215 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

（引用文献）

業テストと嗅覚閾値 . 日本建築学会近畿支部研究報告集 ,1） 独立行政法人 労働政策研究・研修機構 . 第３回日本人

58, 257-260（2018）の就業実態に関する総合調査（2018 年度調査）．
（2020）

10）市村賢士郎 , 河村悠太 , 高橋雄介 , 楠見孝 . ラーニング

2） Moss M, Cook J, Wesnes K, Duckett P. Aromas of

コモンズの環境要因と創造性課題の成績との関連 . 日本

rosemary and lavender essential oils differentially

教育工学会論文誌 , 42（1），55-64（2018）

affect cognition and mood in healthy adults. Int J

11）北田華世 , 有光興記 . グレープフルーツとベルガモッ

Neurosci, doi.org/10.1080/00207450390161903（2003）

トの香りがアナグラム課題に対する心理生理学的ストレ

3） Heuberger E. Ilmberger J, The Influence of Essential

ス反応に及ぼす影響 , 関西学院大学心理科学研究 , 45,

Oils on Human Vigilance. Nat Prod Commun, 5（9），83-89（2019）12）Amobrosch S, Duliban C, Heger H, Moser E, laistler

1441-1446（2010）
4） Matsubara E, Fukagawa M, Okamoto T, Fukuda A,

E, Windischberger C, Heuberger E. Effects ofHayashi C, Ohnuki K, Shimizu K, Kondo R. Volatiles

1,8-Cineole and （-）-Linalool on Functional Brainemitted from the leaves of Laurus nobilis L. improve

Activation in a Working Memory Task. Flavour Fragvigilance performance in visual discrimination task.

J. 33（3）doi: 10.1002/ffj. 3436（2018）13）Moss M, Oliver L. Plasma 1,8-cineole correlates with

Biomed Res（Tokyo），32（1），19-28（2011）5） 鈴木桂輔，五藤光，田中尚 . ドライバへの α- ピネン供

cognitive performance following exposure to rosemary

給による心理的ストレスの低減効果 . 自動車技術会論文

essential oil aroma. Ther Adv Psychopharmacol, doi:集，40（1），193 -198（2009）10.1177/2045125312436573（2012）

6） Matsubara E, Tsunetsugu Y, Ohira T, Sugiyama M.

14）松原恵理 . 木材精油の香気成分組成分析と脳血流量変Essential oil of Japanese cedar（Cryptomeria japonica）

動 へ の 影 響 解 析 . 日 本 味 と 匂 学 会 誌 第 52 回 大 会

wood increases salivary dehydroepiandrosterone

Proceeding 集 , S105-S106（2019）sulfate levels after monotonous work. Int J Environ15）Matsubara E, Matsui N, Ohira T. Evaluation of the

Res Public Health, 1 4（1）， 9 7, doi:1 0.3 3 9 0/ijerph

psychophysiological effects of the Cupressaceae family

14010097（2017）

wood odor. Wood Sci Technol, 54, 269-286（2020）

7） Matsubara E and Ohira T. Inhalation of Japanese16）Kuroda K, Inoue N, Ito Y, Kubota K, Sugimoto A,

cedar （Cryptomeria japonica） wood odor causes

Kakuda T, Fushiki T. Sedative effects of the jasmine

psychological relaxation after monotonous work amongtea odor and（R）（- -）-linalool, one of the major odor

female participants. Biomed Res（Tokyo），39（5），241-

compounds, on autonomic nerve activity and mood249（2018）

states. Eur J Appl Physiol, 95, 107-114（2005）8） 市原真希 , 張本和芳 , 伊香賀俊治 , 佐藤啓明 , 割田智裕 .

17）Hoenen M, Müller K, Pause B M, Lübke K T. Fancy

照明計画と知的生産性に関する研究 . 大成建設技術セン

citrus, feel good: positive judgment of citrus odor, but

ター報 , 43, 54-1-8（2010）

not the odor itself, is associated with elevated mood9） 吉本梨紗 山中俊夫 , 竹村明久 . 臭気質が在室者の主観評価・知的生産性に及ぼす影響（その 1）複数の知的作

during experiences helplessness. Front Psychol,
doi:10.3389/fpsyg.2016.00074（2016）− 216 −

匠の技の定量化 ─ Deep Learning による
先駆的顎顔面補綴支援システムの開発
広島大学大学院医系科学研究科医療システム工学

峯裕一

Maxillofacial prosthetic rehabilitation replaces missing structures to recover the function and aesthetics relating to facial
defects or injuries. Deep learning is rapidly expanding with respect to applications in medical fields. In this study, we apply
the artificial neural network (ANN)-based deep learning approach to coloration support for fabricating maxillofacial prostheses. We prepared 52 silicone elastomer specimens of varying colors and measured the CIE 1976 L* a* b* color space information using a spectrophotometer and an application for mobile device. We constructed the deep ANN using Python and implemented it using the Keras with TensorFlow as the backend. The deep ANN architecture consisted of three input variables,
two hidden layers with 1000 nodes, and four output variables. The output of these algorithms indicated the compounding
amount of four pigments. According to the algorithms’ pigment compounding predictions, we prepared the specimens forvalidation analysis and measured the CIE 1976 L* a* b* values. We determined the color differences between the real skincolor of ten research participants and that of the silicone elastomer specimens fabricated based on the algorithm predictions
using the CIEDE00 ΔE00 color system. The color differences (ΔE00 value) between the real skin color and silicone elastomer
validation specimens were 3.45±0.87 (the algorithm trained using values of specimens measured with a spectrophotometer)and 8.93±3.65 (the algorithm trained using values of specimens measured with an application for mobile device), whichindicates that the deep ANN approach produced superior results with respect to the ΔE00 value. These results suggest that applying deep ANN is a promising technique for the coloration of maxillofacial prostheses.

1．緒

シリコーン樹脂用の顔料を混ぜ合わせ、試行錯誤を重ね最言

終的な配合量を決定する。

顎顔面領域の欠損は、外傷や悪性腫瘍に対する切除手術

少子高齢化社会を迎えた本邦では、労働力の不足やワーなどにより生じる。症例によっては、咀嚼・嚥下・発音な

クライフバランスへの対応など喫緊の課題に直面している。

どの機能性のみならず、審美性に大きな障害をきたす場合

このような状況の中で、人工知能があらゆる分野の業務のが多い。また、外出を控えるようになるなど精神心理的苦

効率化に寄与することが期待されている。特に医療は、国痛を惹起し、著しい QOL の低下を招く。エピテーゼは、

民の健康福祉の増進はもとより、社会保障費用の増加を抑このような人体の一部に欠損が生じた症例に対し、補綴物

制し社会保障制度の持続可能性を担保する観点でも、患者を用いて形態的・審美的・心理的なリハビリテーションをと医療従事者の双方をサポートする人工知能の技術導入が1）行う治療法の一つである 。本邦はもちろんのこと、発展期待されている分野である。米国においては糖尿病網膜症

途上国などのリソースの限られた国々においてもその需要の画像診断などが、日本においては大腸がんの前がん病変は高く 2）、技術者の養成が期待されている。一般的には医である腫瘍性ポリープの画像診断などが、それぞれ医療機

療用シリコーン樹脂を用いて製作されるが、患者の欠損部器として規制当局から認可されている 6 , 7）。人工知能の一を正確に再現するには熟練を要する 3）。これらを解決する手法である機械学習は、「データから規則性や判断基準をために、3 D スキャナや 3 D プリンタといったデジタル技

学習し、それに基づき未知のものを予測、判断する技術」8）術の応用が試みられており、その有用性に関する知見が蓄とされており、客観的には伝え難い技術を定量することを積されつつある4 , 5）。しかしながら、これらにより効率化可能とする。

が期待できるのはエピテーゼの形状設計および製作工程のそこで本研究課題では、いわゆる「匠の技」に依存してい一部であり、エピテーゼ治療の成功に大きな影響を与える

たエピテーゼの製作に対し、人工知能の分析技術である機着色に関しては製作者の技術に依るところが大きい。エピ

械学習の中でも、Deep Learning と呼ばれる研究手法を応テーゼの着色は一般的に、患者の肌の色を再現するために用することで、一般的な歯科技工士やエピテーゼ製作技術者であれば均質なエピテーゼ製作が可能となる手法を構築

Development of innovative support
system for maxillofacial prosthesis
using deep learning
Yuichi Mine
Department of Medical System Engineering,
Graduate School of Biomedical and Health
Sciences, Hiroshima University

することを最終目的とする。

２．方法

２. 1. シリコーン試料の作製
医療用シリコーンとしてジーシーシルフィ（株式会社ジーシー、東京）を、顔料として Functional IntrinsicⅡ（FactorII− 217 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

lnc.、米国）の White、Monastral Red、Yellow および Blue

験では、Intel Core i 7 - 9750 H 2 . 60 GHz CPU（Intel、米国）、を用いた。以下、顔料は白、赤、黄、青と表記する。

16 . 0 GB RAM および NVIDIA GeForce RTX 2070 MAX-Q

9）

8 . 0 GB GPU（NVIDIA、米国）を搭載した PC を使用し実施

Kiat-Amnuay らの報告 を参考に、シリコーン試料を作製した。ジーシーシルフィのシリコーンベース 50 g、キした。

ャタリスト 5 g および Functional Intrinsic II の白、赤、黄および青を、電子天秤（UniBloc；株式会社島津製作所、京2. 4. 人工知能アルゴリズム有用性の検証

都）を用いて秤量し混合した。顔料は、異なる分量（白、本研究は、広島大学疫学研究倫理審査委員会の承認のも

1 . 17 - 1 . 23 g； 赤、0 . 07 - 0 . 13 g； 黄、0 . 14 - 0 . 18 g； 青、と実施した（承認番号：E- 1597）。構築した人工知能アル0 . 03 - 0 . 07 g）を組み合わせ、合計 1 . 5 g になるよう秤量し

ゴリズムの有用性を検証するために、計 10 名の研究協力混合した。これらを真空攪拌器（モリタ東京製作所、埼玉）者の皮膚（第一および第二中手骨間）の L*、a* および b* のにより真空下で練和し、縦 3 cm ×横 4 . 5 cm ×高さ 0 . 7 cm

値を、分光色差計を使用し取得した。トレーニングデータのプラスチック容器に流し込み、室温で 24 時間放置する

セット（色差計）で学習した人工知能アルゴリズムの評価のことで硬化させた。本研究では白、赤、黄および青の顔料ために 5 名、トレーニングデータセット（App）で学習させの配合量を変えることにより、52 通りのシリコーン試料たアルゴリズムの評価のために 5 名の L*、a* および b* のを作製した。

値を取得した。学習済人工知能アルゴリズムは、取得した研究協力者の L*、a* および b* の値を入力することにより、

2. 2. トレーニングデータセットの構築

対象者の皮膚色を再現するための白、赤、黄および青の顔

アルゴリズム学習のためのトレーニングデータセットの構築を目的として、シリコーン試料の色を、CIE 1976 L*

料配合量が出力される。
2 . 4 . 1. 検証用シリコーンの作製

a* b* 色空間 10）により定量化した。測定には分光色差計

学習済人工知能アルゴリズムが予測した、研究協力者の（NF 333；日本電色工業株式会社、東京）とモバイルデバ

皮膚色を再現するための白、赤、黄および青の顔料配合量

イス向けの色差計アプリケーションである ColorMeterをもとに、（2 . 1 .）の方法で、検証用シリコーンを作製した。

RGB Colorimeter（White Marten GmbH、ドイツ）を使用

これらを（2 . 2 .）の方法で、分光色差計を使用して、それぞ

し、それぞれ L*、a* および b* の値を取得した。得られた

れ L*、a* および b* の値を取得した。

L*、a* および b* の値と対応するシリコーン試料作製のため

2 . 4 . 2 . 色差の算出に使用した顔料の配合量を対応させた値を、トレーニング

人工知能アルゴリズムの有用性を検証するために、作製

データセットとした。分光色差計とアプリケーションで取した検証用シリコーンと研究協力者の皮膚から得られた

得した値を使用してデータセットを以下、トレーニングデ

L*、a* お よ び b* の 値 を 使 用 し、 以 下 の 式 を 用 い て 色 差ータセット（色差計）およびトレーニングデータセット

ΔE 00 を算出した 11 , 12）。

（App）と表記する。

2. 3. 人工知能アルゴリズムの構築

ここで、変数 ΔL’、ΔC’、ΔH’は、それぞれ 2 つの物体間

人工知能アルゴリズムとして、Deep Artificial Neuralの明度、彩度、色相の差を表す。変数 kL、kC、kH は実験

Network（Deep ANN）を構築した。ANN は生体の神経系

条件に応じて調整される係数である。これらの係数は 1 にのネットワークを模したモデルであり、階層型 ANN は入設定した。SL、SC、SH はそれぞれ、明度、彩度、色相に力層、出力層とそれら層の間にある隠れ層と呼ばれる 1 層

対する重み付け関数である。RT は彩度差と色相差の相互以上の中間層で構成される。構築には Python を使用し、作用に依存する重み付け関数である。

ニ ュ ー ラ ル ネ ッ ト ワ ー ク ラ イ ブ ラ リ と し て Keras を、
TensorFlow をバックエンドとし使用した。構築した Deep

2. 5. 統計解析

ANN は、入力層が L*、a* および b* の値を入力する 3 ユニ

統計解析は IBM SPSS Statistics version 21 . 0 software

ット、出力層が白、赤、黄および青の顔料配合量を出力す（日本 IBM 株式会社、東京）を用いて、Mann-Whitney U

る 4 ユニットとし、隠れ層は 1000 ユニットを 2 層とした。

検定により 2 値群の比較を行った。

また、オプティマイザーは Stochastic gradient descent を3. 結採用した。これらに、トレーニングデータセット
（色差計）

果

ック数 1 , 000 にて学習させ、患者の皮膚色を再現するため

3. 1. 異なるデバイスによるトレーニングデータセットの取得値の差異の顔料の配合量を決定するアルゴリズムを構築した。本実

分光色差計とモバイルデバイス向けアプリケーションでおよびトレーニングデータセット（App）を使用して、エポ− 218 −

匠の技の定量化 ─ Deep Learning による先駆的顎顔面補綴支援システムの開発影響を与えることが明らかとなった。トレーニングデータ

取得した L*、a* および b* 値の比較を図 1 に示す。
分光色差計とモバイルデバイス向けアプリケーションで

セットの取得に分光色差計を用いた場合、作製した検証シ

a* および b* 値を取得した結果、いずれも分光色差計によリコーンと研究協力者の皮膚の平均色差は 3 . 45 ± 0 . 87 でる取得値が低く、モバイルアプリケーションで取得した値あったのに対し、モバイルデバイス向けアプリケーションが高い傾向を示した。一方、L* 値は同程度もしくは分光を使用した場合の作製した検証シリコーンと研究協力者の色差計による取得値が高い傾向を示した。

皮膚の平均色差は 8 . 93 ± 3 . 65 であり高い値を示した。
近年、途上国においても、癌の発症率の増加や事故によ3. 2. 検証用シリコーンと研究協力者の皮膚との色差

る外傷によりエピテーゼ治療のニーズが増加している。し予測された顔料配合量をもとに検証用シリコーンを作製し、研究協力者の皮膚との色差 ΔE 00 を算出した（表 1）。

かしながらリソースの限られた国々においては、使用できる材料の不足やエピテーゼの製作者・教育者の不在から満トレーニングデータセットの取得に分光色差計を用いた足な治療を受けることはできておらず、このようなリソー

場合、作製した検証シリコーンと研究協力者の皮膚の平均

スの限られた国においてもエピテーゼの提供や技術者の養色差は 3 . 45 ± 0 . 87 であり、良好な値を示した。一方、ト成が期待される。

レーニングデータセットの取得にモバイルデバイス向けア

現在、スマートフォンをはじめとしたデジタルデバイス

プリケーションを使用した場合の作製した検証シリコーン

は、その普及率と相まって医療用途での応用が検討されてと研究協力者の皮膚の平均色差は 8 . 93 ± 3 . 65 であり、分いる。特に、途上国においてもスマートフォンの普及は目

光色差計を用いた場合と比較して有意に高い値を示した。

覚ましく 14）、電子マネー決済などを目的としインフラと

4. 考

して普及しており、医療応用の期待も大きい。

察

本研究では、アルゴリズム学習のデータセットを取得す

一般的に機械学習の精度はトレーニングデータとアルゴるために分光色差計とモバイルデバイス向けアプリケーシ

リズムに強く依存するとされ、どのような手法を用いるか

ョンを用いた。分光色差計は、高精度に CIE 1976 L* a* b*

13）。本研究では Deep ANN を採

色空間を含む各種表色系の測定が可能であること、また、用し、一定の条件において皮膚色再現のために良好な結果

常に同条件の測定が可能であるなど、優れた性能を示すとが得られた。また、Deep ANN はネットワーク構造やハ考えられる。一方、モバイルデバイス向けアプリケーショ

イパーパラメーターを最適化することでさらなる精度の向ンに関する文献的考察はほとんどなされていないのが現状上が期待できる。

である。本研究では分光色差計を用いて取得したトレーニ

は試行錯誤が求められる

一方、トレーニングデータセットの取得に用いたデバイ

ングデータセットを利用して学習したアルゴリズムにおいスの違いが、検証用シリコーンと皮膚色との色差に大きくて、良好に皮膚色を再現することができたものの、分光色図1

分光色差計とモバイルアプリケーションで取得したL*、a*およびb*値

表1
取得デバイス

検証用シリコーンと研究協力者の皮膚との平均色差
平均色差

E 00（±標準偏差）

最小値

P値*
0 . 016

色差計

3 . 45±0 . 87

4 . 922 . 75App

8 . 93±3 . 65

13 . 61

4 . 21* Mann–Whitney U検定

色差計；分光色差計、App；モバイルデバイス向けアプリケーション− 219 −

E 00

最大値

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

差計は一般的な医療機関に普及しているとは言い難く、患based medical devices in the USA and Europe（2015-者の皮膚色の取得に使用するには一定の障壁が存在すると20）: a comparative analysis. Lancet Digit Health. 2021;

考えられる。分光色差計と比較して皮膚色の再現性に劣る

3: e195-e203.

ものの、スマートフォンやタブレットなどのモバイルデバ

7） Aisu N, Miyake M, Takeshita K, Akiyama M,

イス向けの色差計アプリケーションを使用した計測補正法

Kawasaki R, Kashiwagi K, et al. Regulatory-approvedを検討することにより、低廉で精度の高い顎顔面補綴支援

deep learning/machine learning-based medical devices

システムの構築が可能になると考える。

in Japan as of 2020: A systematic review. PLOS Digit
Health. 2022; 1: e0000001.

（引用文献）

8） 総務省 ICT スキル総合習得教材 3 - 5 : 人工知能と機械

1） Dings JPJ, Merkx MAW, de Clonie Maclennan-

学習 .

Naphausen MTP, van de Pol P, Maal TJJ, Meijer GJ.

9） Kiat-Amnuay S, Lemon JC, Powers JM. Effect ofMaxillofacial prosthetic rehabilitation: A survey on theopacifiers on color stability of pigmented maxillofacial

quality of life. J Prosthet Dent. 2018; 120: 780-786.

silicone A-2 1 8 6 subjected to artificial aging. J

2） Tetteh S, Bibb RJ, Martin SJ. Maxillofacial prostheses
challenges in resource constrained regions. Disabil

Prosthodont. 2002; 11: 109-116.
10）International Commission on Illumination. ISO 116644:2 0 0 8（E）/CIE S 0 1 4-4/E:2 0 0 7: joint ISO/CIE

Rehabil. 2019; 41（3）: 348-356.
3） M o h a m m e d M I , C a d d B , P e a r t G , G i b s o n I .
Augmented patient-specific facial prosthesis production

standard: colourimetry — part 4: CIE 1976 l*a*b* colour
space. 1976.

using medical imaging modelling and 3D printing11）Luo MR, Cui G, Rigg B. The development of the CIE

technologies for improved patient outcomes. Virtual2000 colour-difference formula: CIEDE2000. Color Res

Phys Prototyp. 2018; 13: 164-176.

Appl. 2001; 26: 340-50.

4） Unkovskiy A, Spintzyk S, Brom J, Huettig F, Keutel12）Sharma G, Wu W, Dalal EN. The CIEDE2000 colour-

C. Direct 3D printing of silicone facial prostheses: A

difference formula: implementation notes,

preliminary experience in digital workflow. J Prosthet

supplementary test data, and mathematical

Dent. 2018; 120: 303-308.

observations. Color Res Appl. 2005; 30: 21‒30.

5） Jazayeri HE, Kang S, Masri RM, et al. Advancements

13）Waring J, Lindvall C, Umeton R. Automated machinein craniofacial prosthesis fabrication: A narrative

learning: Review of the state-of-the-art andreview of holistic treatment. J Adv Prosthodont. 2018;

opportunities for healthcare. Artif Intell Med. 2020; 104:

10: 430-439.

101822.

6） Muehlematter UJ, Daniore P, Vokinger KN.

14）Newzoo Global Mobile Market Report 2021.

Approval of artificial intelligence and machine learning-− 220 −

分光イメージング装置を用いた天然歯のグラデーションの数理解析
大阪大学歯学部附属病院

若林

一道

Recently, dental CAD/CAM materials with gradation have been developed and are expected to be used in the aesthetic
zone. In clinical practice, it is essential for dental prothesis to match the transparency and color tone of natural teeth in orderto achieve good aesthetics. However, there have been no studies that have mathematically evaluated the change in color tone
(gradation) of the entire crown of a natural tooth. The aim of this study is to analyze the gradation of natural teeth of L*a*b*
values by functionalization. The maxillary right central incisor of 35 adults without a history of dental treatment, caries, andstaining were selected as experimental subjects. The L*a*b* values of 30 points from the cervical to the incisal region were
calculated using a spectral imaging device, and linear, quadratic, cubic, exponential, and logarithmic functions were approximated for each L*, a*, and b* value. About L* and b* values, the cubic function was the best fit for all subjects. About a*value, the cubic function was the best fit for 29 subjects and the exponential function was the best fit for 6 subjects. In thisresearch, the gradation from the cervical to the incisor region of the maxillary central incisor was mathematically analyzed.
The results of this study were considered to be useful for the evaluation of the gradation of natural teeth and for the development of new dental CAD/CAM materials with a gradation similar to that of natural teeth.

1．緒

分光イメージングとは波長毎にデータを捉えることのでき言る液晶チューナブルフィルターと画素毎にデータを捉える

近年、グラデーションを付与した CAD/CAM 用材料がことのできる CCD センサーにより、画像としてデータを開発され、広く臨床で用いられるようになった（図 1）。歯採取し、各波長における画像内のそれぞれの位置に対応し科臨床において、天然歯と近似した色調を有する歯冠補綴

た分光情報を解析可能にする技術である（図 2）。分光イメ装置を装着するためには、歯冠補綴装置と天然歯の色調がージング技術は、非接触のまま精密に解析可能な特徴を生一致することが必要不可欠である 1）。これまで、天然歯やかし、歴史的遺跡の分析や、医科での検査、インク色の分

歯冠補綴装置の色調に関する研究では、特定の部位を計測

析など様々な分野で応用されている 6 - 8）。分光イメージン

して比較した研究報告が多く 2 - 5）、歯頸部から切縁部にかグ装置を用い、各ピクセルの分光情報を計測することで、けた、歯冠全体の色調の変化（グラデーション）
を連続的に選択領域における CIELab 均等空間の L*a*b* 値、および、評価した研究は認められない。天然歯の色調と一致した歯色を構成する３刺激値である XYZ 値を算出し、分布をグ

冠補綴装置を作製するためには、天然歯の歯冠全体の色調

ラフで表示したり、分光反射率を表示したりすることが可を分析し、どのようにグラデーションが認められるかを客能となる。そのため、本装置は天然歯の歯頸部から切縁部観的に解析することが必要である。

にかけてのグラデーションを評価するのに有効であると考

歯冠の部位の違いによる色調変化を連続的に評価するたえられる。

めには、歯冠全体の色調を正確に分析する必要がある。し

本研究では、分光イメージング装置を用いて、天然歯のかし、これまで、多くの研究で用いられてきた分光測色計

測色を行い、歯頸部から切縁部にかけての色調の変化（グや歯科用測色計は、測色の際に測色器を接触させる必要がラデーション）を比較することで、より審美性の高い歯科あり、加えて、特定の領域内においてのみの測色を行うた用材料開発への示唆を得ることを目的とし、天然歯の測色

め、立体物に対して正確に位置を規定して測色を行うことを行った。そして、グラデーションの程度を定量的に評価や、連続的な色の変化を観察することは不可能であった。

するため、色調の変化を数式にあてはめ、数理的解析を行

そこで、本研究では天然歯の連続的な色調を、正確に分った。

析するため、分光イメージングを用いた測色器に着目した。

2. 方

法

2. 1. 天然歯の測色
計測対象者として、上顎右側中切歯に歯科治療歴やカリ

Mathematical analysis of gradation ofnatural teeth using a spectral imaging
deviceエス、着色を有しない健康な成人男女 35 名（男性 12 人、Kazumichi Wakabayashi

者の上顎歯列をシリコーンゴム印象材（ジルデフィット、Osaka University Dental Hospital

松風、京都）で印象採得したのち、石膏模型を作製した。

女性 23 人、平均年齢 24 . 7 ± 2 . 1 歳）を選択した。計測対象− 221 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図１

グラデーションが付与された歯科用CAD/CAM材料（図はメーカーの公式HPより引用）

図3 計測対象者の上顎をシリコーンゴム印象材で印象採得し、超硬石膏で石膏模型を作製した。作製した石膏模型で測定時に用いるマウスガードを
作製した。

図2

分光イメージング装置（模式図）

作製した石膏模型を用いて、測定時に用いる上顎右側中切歯の唇側面のみ切り取った、厚さ 2 . 0 mm の白色および黒
色のマウスガード（Erkoflex ピュアホワイトおよびディー
プブラック、ERKODENT、オーストラリア）
を作製した（図3）。白色および黒色マウスガードを装着後、視覚実験用
顎台に額および下顎を固定し、ソフト開口器（OptraGate、
Ivoclar Vivadent、東京）で口唇を排除した状態で、分光イメージング装置（株式会社オフィス・カラーサイエンス、
神奈川）を用いて測色を行った。測色の際には、測色計と天然歯の歯冠唇側面が平行となるように計測対象者の顔を

図4

測色時の様子

固定し、カメラと対象歯の距離は 17 . 5 mm となるように配置した。照明は人工太陽照明灯（SOLAX-iO、セリック
株式会社、東京）
を 2 台用い、照射角度は 30 度とした
（図 4）。
分光イメージング装置を用いて歯冠全体の分光情報を採取後、測定したデータを専用解析ソフト（Image View、株式会社オフィス・カラーサイエンス、神奈川）を用いて L* a*b* 値を取得した（図 5）。
なお、本研究は大阪大学大学院歯学研究科倫理委員会の− 222 −

図5

測定範囲

分光イメージング装置を用いた天然歯のグラデーションの数理解析

分布を図 7 に示す。L* 値に関して、全ての計測対象者で＋承認下で実施した（承認番号 : H 30 -E 6）。

値（max：80 . 37、min：45 . 58）であった。その値は歯頸部2. 2. グラデーションの数理的評価

から切縁部に向けて増加した後、減少した。a* 値に関して、

分光イメージング装置で測色し得られたデータから、歯31 名の計測対象者では、歯頸部から切縁部にかけて減少

頸部から切縁部にかけた 30 点の L* a* b* 値を算出した。そし続け、4 名の計測対象者で、切縁部で増加しているのがして、算出した 30 点の L* 値、a* 値、b* 値をグラフ上にプ認められた（max：12 . 51、min：- 4 . 74）。b* 値に関して、

2

ロットし、一次関数（y＝ax+b）、二次関数（y＝ax +bx+c）、
3

2

bx

31 名の計測対象者では、歯頸部から切縁部にかけて減少三次関数（y ＝ ax +bx +cx+d）、指数関数（y ＝ ae ）、対し続け、4 名の計測対象者で、切縁部で値が増加している数関数（y ＝ a+b･log（1 +M-x））の近似曲線を取り、残差平のが認められた（max：31 . 42、min：- 0 . 45）。加えて、全方和を用い、どの関数が最も適合しているか分析を行った

測定点 1050 点中 999 点で、a* 値、b* 値ともに＋値であり、

（図 6）
。

計測対象者 17 名で、計測対象者ごとに異なっているが、測定点の最多 5 点、最少 1 点において、a* 値が - 値、b* 値＋値であった。また、全計測対象者中 1 名において、2 点

3. 結

で a* 値が - 値、b* 値が - 値であった。

果

回帰分析において、全計測対象者のうち、一次関数、二解析により得られた L* 値、a* 値、および b* 値のデータ

次関数、三次関数、指数関数、対数関数の中で、残差平方和が最も小さかった関数と人数を図 8 および表 1 に示す。
L* 値、b* 値では、三次関数での残差平方和が全計測対象者で最も少なかった。a* 値では、残差平方和が最も小さかった関数の計測対象者数は、三次関数が 29 名で、指数関数が 6 名であった。三次関数が最も適合していた計測対象者 29 名中 18 名は、全計測点で、a* 値、b* 値ともに＋であった。残りの 11 名は、計測対象者ごとに異なるが、最多
5 点、最少 1 点で、a* 値 -、b* 値＋で、その他は a* 値＋、
b* 値＋であった。指数関数が最も適合していた計測対象者
6 名中、5 名においては、計測対象者ごとに異なるが、最多 5 点、最少 2 点が、a* 値 -、b* 値＋で、その他は a ＊値＋、
b* 値＋であった。残りの 1 名は、4 点が a* 値 -、b* 値＋、2
点が a* 値 -、b* 値 -、その他は a* 値＋、b* 値＋であった（図

図6

9）
。

残差平方和の算出方法

図7

データ分布

− 223 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図8

全計測対象者のL*値、a*値、およびb*値に関数を当てはめた結果
表1

残差平方和が最も小さかった関数の計測対象者数

18名

5名

L*値：三次関数
a*値：三次関数、全て＋
b*値：三次関数、全て＋

L*値：三次関数
a*値：指数関数 数点でー 、		
その他は全て＋
b*値：三次関数、全て＋

11名

1名

L*値：三次関数
a*値：三次関数、数点でー、
		
その他は全て＋
b*値：三次関数、全て＋

L*値：三次関数
a*値：指数関数
b*値：三次関数

図9

実際の写真

− 224 −

a*値＋、b*値＋
a*値ー、b*値ー
a*値ー、b*値＋

2点
2点
4点

分光イメージング装置を用いた天然歯のグラデーションの数理解析

4. 考

天然歯における色調変化の評価や、天然歯に近似したグラ察

デーションを有する CAD/CAM 用ブロック、ディスクの実験１．分光イメージング装置を用いたグラデーション
評価の有用性の検討
O’ Brien ら 4）や Hasegawa ら 5）は天然歯の歯頸部から切開発に有用であるものと考えられた。
謝

辞

縁部にかけての部位間の色差を報告している。これらは特本研究の遂行にご助力賜りました大阪大学大学院歯学研

定の領域を測色し比較したものであり、歯冠の連続的な色究科クラウンブリッジ補綴学分野 並河雅也君、株式会社の変化を捉えたものではない。そこで、本研究では試料全

オフィス・カラーサイエンス 大住雅之様、ならびに、ご体の分光情報を採取することで、連続的な色調評価が可能

支援いただきました公益財団法人コーセーコスメトロジー

な分光イメージング技術に着目した。これまで、分光イメ研究財団に、厚く御礼申し上げます。

ージングを用いた歯の色調に関する研究は認められないた
め、分光イメージング装置のみで観察することのできる色（引用文献）の連続的な変化を測色し、数式を用いて天然歯のグラデー

1） Baldissara P, Wandscher VF, Marchionatti AME,

ションの数理解析を行った。

Parisi C, Manaco C, Ciocca L. Translucency of IPS

天然歯に近似した歯冠補綴装置を作製するためには、口腔内における天然歯の歯頸部から切縁部にかけた色調変化

e.max and cubic zirconia monolithic crowns. J Prosthet
Dent., 120: 269-275（2018）

を分析する必要がある。Wang ら 9）はオールセラミックク

2） Ueda K, Guth JF, Erdelt K, Stimmelmayr M, Kappert

ラウンでは人工歯肉の有無により歯頸部付近の色調が異な

H, Beuer F. Light transmittance by multi-coloredり、歯頸部付近では明度と黄味が減少し、赤味が増加する

zirconia material. Dent Mater., 34: 310-314（2015）と報告している。明度を示す L* 値の歯頸部から切縁部に

3） Kolakarnprasert N, Kaizer MR, Kim DK, Zhang Y.

かけた変化は、歯頸部から切縁部に向けて三次関数的に増New multi-layered zirconias: Composition, microstructure

加した後、減少していた。天然歯において、歯頸部から切and translucency. Dent Mater., 35: 797-806（2019）

縁部にかけた L* 値の変化は、歯冠断面における唇側面形

4） O’ Brien WJ, Hemmendinger H, Boenke KM, Linger

態と相似しており、L* 値は歯冠唇側面形状の影響を受け

JB, Groh CL. Color distribution of three regions ofる可能性があると考えられた。これは、歯冠が有する曲面

extracted human teeth. Dent Mater., 13: 179-185（1997）

により、計測器と各計測点の距離や、角度に差が生じ、光5） Hasegawa A, Motonomi A, Ikeda I, Kawaguchi S.
Color of natural tooth crown in Japanese people. Colorの反射が異なることによる可能性が考えられる。
色相を示す a* 値、b* 値おいては、a* 値は、切縁部にかけ

Research and Application, 25: 43-48（2000）て三次関数的、指数関数的に減少し、b* 値は、三次関数的6） 田口智子 , 大住雅之 , 桐野文良 . 光学的手法および表面に減少した。a* 値は＋の値が赤色、- の値が緑色、b* 値は微細構造解析による江戸時代銀貨の色彩の検討 . 日本色＋の値が黄色、- の値が青色を示すことから、歯頸部から

彩学会誌 , 38: 394-403（2014）

切縁部にかけて赤味や黄味が薄くなっていく。これは、天然歯に関する歯肉色の影響を定量的に考察した研究はこれ

7） Lu G, Fei B. Medical hyperspectral Imaging: a review. J
Biomed Opt., 19: 10901（2014）までにないが、口腔内の色調に歯肉色が関与している可能8） Chlebda DK, Rogulska A, Lojewski T. Assessment of

性があることに加え、エナメル質、象牙質のベースとなる

hyperspectral imaging system for colour measurement.

色調と比率や形態が複合的に関与し変化している可能性がSpectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc., 185: 55-62（2017）

考えられた。

5. 総

9） Wang J, Lin J, Seliger A, Gil M, da Silva JD,

括Ishikawa-Nagai S. Color effects of gingiva on cervical

本研究により、上顎中切歯の歯頸部から切縁部にかけた色調変化を数理的に解析することができた。本研究結果は、regions of all-ceramic crowns. J Esthet Restor Dent.,
25: 254-262（2013）− 225 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて殷澍

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

いて力を入れて研究を進めております。化粧品素材に関すに採択していただき、財団並びに関係者の方々に深く感謝る様々なニーズにも応えるため、多彩な工学的手法を駆使

申し上げます。

し、化学・物理・工学・結晶学の知識を集約・活用するこ

約 10 年ころ前、貴財団より 1 回目の研究助成を受け、とにより、化粧品の安全性と環境負荷を意識した機能性素

酸化セリウム板状粒子の合成とその機能性評価に関する研材の開発にもフォーカスしております。今回は複合アニオ

究を行いました。今回は 2 回目の研究助成となり、採択いンというコンセプトの下で、遷移金属フリーな酸化チタン

ただいた研究課題は前回同様に素材・物性に関する分野での創製に成功しておりまして、同手法を活用し、様々な他あり、白色顔料や紫外線遮蔽剤など化粧品としても広く利の無機材料や顔料の着色にも適用する可能性を検証し、用される酸化チタンの着色に関する研究でした。顔料の着様々な機能性素材開発に取り組んでいきたいと思います。

色は通常遷移金属イオンの添加により、簡単に実現できる

最後に、本研究を遂行するにあたり、共同研究を行っていケースがありますが、化粧品素材として利用される際に、る研究室スタッフや学生に感謝すると共に、今回のご支援

素材の安全性評価・リスクの規制と管理が厳しく求められを賜りましたことを改めて御礼申し上げ、貴財団のますまております。私どもの研究室では環境にやさしいクリーン

すのご発展を心より祈念いたします。
（東北大学多元物質科学研究所）

なプロセスを用い、様々な無機材料の形態制御や新規環境応答機能の開発を行っており、特に材料の光応答機能につ2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
上沼駿太郎

この度はコスメトロジー研究助成に採択いただきありが続けさせていただいております。発見から 3 年が経過して、とうございました。博士学生の身分で採択いただき、その基礎的知見が徐々に集まってきております。私はコスメト

後同研究室にてポスドク、助教と身分が変わっていく中でロジーの専門外で浅学ではありますが、環状オリゴ糖から自分が安定して使用できる研究費がほとんどありませんで成るナノシートの研究の進行とともに、この材料のコスメしたので、貴重な研究費として使用させていただきました。

トロジーとの相性の良さをますます実感しております。
“ナノシートはその薄さから、材料表面に対して高い付

重ねて御礼申し上げます。
当該研究課題の中心材料である環状オリゴ糖（シクロデ着性を示すはず”。この期待だけを根拠に 2019 年に課題申

キストリン）から成るナノシート（擬ポリロタキサンナノシ

請させていただき、そして採択いただきました。当時（今ート）は、私が博士一年生の時に発見した材料です。当時

もですが）黎明期で、応用については実験的証拠がほとんの研究テーマは当研究室にて盛んに行われているポリロタ

どなかったにも関わらず今回のように研究をご支援いただ

キサン（わっか状分子にひも状分子が貫通したネックレス

けたことは、実験の進行だけでなく、大変心の励みになり状構造を有する超分子）を用いた力学材料の強靭化機構にました。今後も基礎・応用の両面から研究を続けて精進し関する研究であり、ナノシートとは全くの別物でした。当てまいりたいと考えております。最後に、このような貴重研究室ではこれまでナノシートに関する研究は行われておな機会をいただけましたこと、深く御礼申し上げます。

りませんでしたが、環状オリゴ糖がナノシートを形成するということが 2019 年に見出されて以降、幸いにも研究を− 228 −

（東京大学大学院新領域創成科学研究科物質系専攻）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
小谷

仁司

私は天然物の機能性成分の研究や免疫学を専門とした研生活を楽しんで生活することができるのではないかと考え究をこれまでおこなってきました。しかし、これらの研究ています。植物成分の機能性を研究する上で、大学でおこ分野がコスメトロジー研究に密接に関連しており、新たななうことができる内容は、培養細胞を使った研究や実験動

化粧品やスキンケアのための製品開発に繋がるような研究物を用いた研究です。しかし近年、食品や化粧品関連の企であることを、これまであまり考える機会がありませんで業では、実験動物を用いた製品開発研究をおこなわないとした。過去に採択された友人の勧めで自身の研究内容とコいう傾向があり、大学の研究者も動物実験を代替えするよ

スメトロジーへの発展に繋がるような研究テーマを考え、うな in vitro での実験を優先するように進められてきてお応募したところ、幸運にも採択していただき、皮膚の老化

ります。そのような点からも、これからの研究の進め方を

改善をテーマとした研究を実施することになりました。こ

考え直すよい機会にもなったと思います。今回助成いただの皮膚の老化というのは、美容などにおいても多くの女性いた研究テーマはまだ完了したわけではなく、これからもが気になるテーマであるだけでなく、男性にとっても年齢

私のコスメトロジー研究の入口として今後も引き続き発展とともに変化する皮膚の質感は、無意識のうちにでも気付させていき、研究成果を社会に還元することができるよう

くような変化です。これらを改善することが可能となれば、にしていきたいと考えています。
（島根大学医学部医学科免疫学講座）

人々の活力が湧き、高齢になっても活き活きと働き、社会2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて佐藤康治

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成しても利用されています。また、その抗ウイルス活性から、に採択していただき、誠にありがとうございました。関係

最近では新型コロナウイルス感染症の感染予防効果も報告

者の皆様には厚く御礼申し上げます。

され注目されています。現在は、HT を比較的高濃度で含2019 年 11 月に開催されました第 30 回表彰・贈呈式では、有するオリーブ果汁や葉エキスの濃縮物が市販されていま

今では夢のような対面での講演会や受賞者間の交流を図るす。しかし、含有量の低さ、不純物の混在、個体・栽培エ

懇親会があり、大変有意義な時間を過ごすことができましリアによるバラつき、季節性などから、高純度品の安定供た。年が明け、本格的に研究を開始した矢先、現在も収束給に課題があり、我々は新たな供給ルートとして発酵生産の兆しが見えない新型コロナウイルス感染症のパンデミッ法を提案しました。残念ながら現時点での HT 生産性は低クが発生し、私たちはこれまでとは異なるライフスタイル

く、実用化のレベルには至っておりません。HT はコスメへの移行を余儀なくされました。この未曾有の事態に、大トロジー分野の発展だけでなく、新型コロナウイルス感染学では手探り状態で学生の感染防止や講義のオンライン化症のパンデミックの終焉を加速させる化合物として期待さなどの対応が求められ、それに追われる日が続いておりまれますので、実用生産の早急な実現を目指し、今後も尽力す。

してまいります。

今回助成いただいた研究テーマは、強力な抗酸化物質ヒ最後になりましたが、今回のご支援を賜りましたことにドロキシチロソール（HT）の発酵生産法の開発です。HT

改めて御礼申し上げますと共に、貴財団のますますのご発

は化粧品やスキンケア用品の有効成分としてだけでなく、展を心より祈念いたしております。

美肌やアンチエイジング効果が期待されるサプリメントと− 229 −

（北海道大学大学院工学研究院）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて中橋

この度はコスメトロジー研究助成にご採択いただき、誠明子

学物性の差異を示すことができました。

にありがとうございました。本提案については、育休中にこれまで、私は高分子の合成や応用、高分子微粒子の研構想を練り、育休明けに申請し、ご採択いただきました結究開発などに携わってきましたが、コスメトロジー分野に

果、スムーズに研究活動に復帰でき、当該研究を着実に進関しましては、興味はあったものの、携わる機会はございめることができました。

ませんでした。今回の助成により、私自身にとっても、微本研究テーマで用いた「ポリイミド」は、機能材料とし粒子の応用、分散および紫外線防御剤の設計や評価など、て電子部品や航空宇宙用途では多く利用されていますが、異分野の知見を学ばせていただくきっかけとなり、研究のコスメトロジー分野への応用については全く検討されてき幅を大きく広げることができたと感じています。今後も多ませんでした。本研究では、私自身のこれまでのポリイミ

角的な視点を持ち精力的に研究を展開し、微力ではござい

ド微粒子に関する研究成果に、ポリイミドならではの UV

ますがコスメトロジー分野の発展に貢献できるように努め吸収能を組み合わせることで、コスメトロジー分野におけたいと思います。

るポリイミド微粒子の新たな展開を目指しました。とくに、最後になりましたが、本研究でのご支援をいただきまし

楕円体状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への可能性を探た貴研究財団と関係者各位に改めて深謝いたしますとともった結果、多くの興味深い結果を得ることができました。

に、貴研究財団のますますのご発展をお祈り申し上げます。

球状ポリイミド微粒子から楕円体状ポリイミド微粒子への（地方独立行政法人大阪産業技術研究所）

変形過程を明らかにし、球状微粒子と楕円体状微粒子の光2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて中林

孝和

このたびは、私達の「全反射ラマン顕微鏡を用いた生体も、高分子界面の水が重要であることが提案されています。

膜近傍の水の選択的観測」の研究課題をコーセーコスメト

しかし、特に分光学的な側面から観測する適切な手法がな

ロジー研究財団の研究助成に採択していただき、誠にあり

く、その詳細は不明でした。そこで本研究では界面選択的がとうございました。私達は、分子の振動をラマンバンドな分光手法である全反射ラマン顕微鏡を製作し、実際に生として直接観測するラマンイメージングの特徴を活かして、細胞への適用を行いました。顕微鏡の立ち上げには成功し色素などで染色できない究極の細胞内分子「細胞内の水」のましたが、界面のみを精度高く測定するためには、更なる研究を行っています。ラマンイメージングを用いることで改良が必要です。本助成にて研究の土台となる部分を立ち

生細胞内にある水の定量や水素結合に関する情報を直接得上げることができましたので、引き続き取り組んでいきまることができ、核や細胞質での水の密度を精度高く測定すす。本当に有難うございました。皮膚組織や細胞内、膜界ることに成功しています。細胞周期に伴う水の密度変化な面にある水の理解は、コスメトロジー、そして生命科学のども示し、「細胞内の水」
が細胞を理解するパラメーターに発展に必要不可欠です。全反射ラマン顕微鏡が皮膚や細胞なりえることを提案しています。次のステップは膜界面の膜近傍の界面水を観測する適切な手法となり、コスメトロ

水であると考え、本研究を提案するに至りました。膜やタジーを発展させる汎用な手法となり得ることを目指し、こンパク質界面の水（界面水）
は、束縛水、中間水と分けられれからも研究を進めていきます。

るなど機能発現に重要であることが提案され、多くの研究が行われています。生体親和性高分子の物性理解において− 230 −

（東北大学大学院薬学研究科）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて中村真紀

この度はコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成にトカインである線維芽細胞増殖因子を内包した分散性リン

採択していただき、2 年間の研究をサポートしていただい酸カルシウムナノ粒子の合成技術開発に取り組むこととなたことに、心より感謝申し上げます。現職に就いてから、り、リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮

私は、機能性リン酸カルシウムナノ材料の合成技術開発と送達システムの構築という最終目標に向けて第一歩を踏みバイオメディカル応用をテーマとして研究を進めており、出すことができました。本研究で得られた知見をもとに、主に医療や歯科の分野で役立つ材料の創製を目指してきま

今後も研究を継続したいと思います。最後になりますが、した。一方で、生体親和性や安全性に優れるリン酸カルシ

本研究にご支援いただいたことに重ねて感謝申し上げるとウムは、ファンデーションなどのコスメトロジー素材としともに、コーセーコスメトロジー研究財団のますますのごても使用されているため、美容分野への展開を見据えた材発展をお祈り申し上げます。

料開発も興味深いのではと考え、今回の研究提案に至りま（国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門）した。本研究期間では、主に、美容効果も期待されるサイ2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて福井

有香

私の専門は高分子コロイドであり、自然に触発されたも研究助成を賜ることで、リポソームの表層だけでなく、内のづくりの観点から、高分子微粒子とカプセルのデザイン、部の微小空間も改質の場と捉えることで、ナノカプセルの創製および機能化に取り組んでいます。その中でも、天然デザイン性の幅をさらに拡げることができ、肌や毛髪の目由来の脂質二分子膜（リポソーム）に高分子を複合化したナ的部位に有効成分を効果的に送達するコスメティックデリ

ノカプセル（リポナノカプセル）の研究は、卒業研究から

バリーシステムへの応用に向けた道筋を見出すことができ

10 年以上続けているテーマであり、指導教授による「リポました。コロナ禍で日々の研究が儘ならない中、こうしてソームの表面に化粧を施して顔を変える」という言葉から研究助成を受けられたことは大変励みになり、オンライン

始まりました。高分子薄膜作製技術（layer-by-layer 法）をを駆使して、学生たちと話し合いながら地道に着実に研究駆使して、リポソームの表面に高分子を交互に積層化するを進めることができたことを心より感謝申し上げます。今ことで、目的・用途に応じて顔を自在に変えることが可能

後は、作製したナノカプセルに有効成分を担持して、皮膚であり、分散安定性、標的指向性などの機能付与を行って深部への送達を可能にすることで、肌本来の機能に働きかきました。また、高分子層を重ねてカプセル層を形成する

け、内側に秘められた本来の美と個性を創出できるようなため、各層に様々な物質を配合可能であり、リポソームにコスメトロジー研究の発展に寄与していきたいと考えていはない多機能性（機械的強度、
環境応答性、
物質保持放出能）ます。

を具備させることが可能となりました。この度、貴財団の− 231 −

（慶應義塾大学理工学部）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて松浪

この度は貴財団の研究助成に採択いただき深く感謝申し

勝義

日々楽しみながら研究をしています。私たちの研究分野である天然物化学は数ある薬学系研究分野の中でも比較的に上げます。
薬学部で教育、研究に携わる過程で、多くの学生、大学歴史のある学問分野です。生薬や漢方といった古代より院生が医薬品だけでなく化粧品領域に興味を持っているこ

人々の健康を支えてきた植物に魅力を感じ、当研究室の門とに気づきます。人々が豊かな人生を歩むために必要なこをくぐった学生たちに少しでも良い研究経験を積ませるこ

れらの研究分野は今も昔も変わらず引き続き魅力ある分野とは、我々、教員の使命でもあり、また、大きなやりがいです。

でもあります。しかし、大学の研究費はそれほど多くなく、

当研究室では、植物や微生物の 2 次代謝産物を対象に種々

また、種々の事務的作業に追われる毎日の中、今回の助成の生物活性成分の探索研究を行っています。がん、炎症、

金は学生の教育および研究に非常に大きな助けとなりまし

感染症などの活性評価のほか、チロシナーゼ阻害活性や培た。加えて、本研究を進める過程でご協力をいただきまし

養細胞およびゼブラフィッシュを用いたメラニン産生阻害

た共同研究者の方々にもこの場をお借りして深くお礼申し

活性の評価など多面的に研究を行っています。in vitro の上げます。最後に、もう一度、この度、ご支援いただいた

活性評価や活性成分の単離、精製、スペクトルデータの解

公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心よりお析による化学構造の解明など種々の技術、経験を駆使して礼申し上げます。今後の貴財団のますますの発展を祈念い

少しでも多くの貢献をこの分野にできるよう学生ともどもたします。

（広島大学大学院医系科学研究科生薬学）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて矢田

詩歩

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

種界面活性剤を新規に合成し、これらの界面活性剤が形成に採択していただき、誠にありがとうございました。

する泡沫の構造や安定性をさまざまな手法を用いて詳細に2019 年 4 月より奈良女子大学研究院自然科学系化学領域調べました。結果として、さまざまな分子構造の界面活性の助教として採用されてまもない時期に、今回の 2 年間に剤の泡沫の構造と安定性の関係を理解することができましわたる助成をいただき研究を進めることができました。

た。本研究で得られた基礎研究の成果は、洗浄や食品、化

今回採択された研究課題は、「ポリオキシエチレン系非粧品などの産業分野において重要であり、得られた知見を

イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的

さらに発展させ、コスメトロジーの発展に貢献できればと評価技術の確立」です。私は学生時代からこれまで、ポリ思います。今後も継続して研究を行うことで、泡沫特性にオキシエチレン（EO）系非イオン界面活性剤を中心とした及ぼす界面活性剤の分子構造の影響について体系的な理解

新規界面活性剤の合成と水溶液物性の評価に取り組んできを深めていきたいと思います。

ました。また最近では、界面活性剤が形成する泡沫の構造

末筆ながら、本研究にご支援いただいたことに重ねて感や安定性を、前例の乏しい中性子小角散乱などのさまざま

謝を申し上げるとともに、コーセーコスメトロジー研究財

な測定を用いて調べてきました。今回の研究課題では、団の今後のますますの発展をお祈り申し上げます。

EO 系非イオン界面活性剤の EO 鎖の末端にポリオキシプ
ロピレン鎖やアルコキシ基、硫酸エステル基を修飾した各− 232 −

（奈良女子大学研究院自然科学系化学領域）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

微生物由来有用低分子化合物の利用について
和田俊一

この度は、貴財団の研究助成に採択していただきましてである lentztrehalose 類を発見しました。元々は別の化合

誠にありがとうございました。おかげ様で 2 年間、研究予物を精製していた際の夾雑物として得たものでしたが、新算に関する不安もなく、大変名誉に感じながら研究を進め規物質であり比較的豊富に得られたため、これらを何らかることができました。私が所属しております微生物化学研の 形 で 実 用 化 に つ な げ よ う と 検 討 を 始 め ま し た。

究所は、カナマイシンの発見者である梅沢浜夫先生によりTrehalose は保湿、保護剤として化粧品に利用されており

約 60 年前に設立されました。それ以降、放線菌を中心とますので、lentztrehalose 類も、一つの方向として化粧品した微生物から抗菌、抗腫瘍抗生物質や免疫抑制剤など、の成分として開発できればと考えておりました。当研究所

主に医薬品としての開発を目指して有用低分子化合物の探ではこれまでに経験のない分野への挑戦となりましたが、索や利用法に関する研究を行ってきました。しかしながら

今回、助成をいただいたことでこの研究を進めることがで

近年は、発見可能な化合物は既にほとんど発見され尽くしき、近い将来の実用化が期待できそうな類縁体化合物を開てしまったかのようで、新たな有用化合物の発見が困難と発することができました。また、細胞、組織を保護する新なっています。そのため、有用化合物の探索源や探索方法

たな成分の探索を今後も積極的に行っていこうという意欲などについて、これまでにない新たな工夫が求められていがわいております。どうもありがとうございました。貴財ます。また、得られた化合物を無駄にしないために、その団の今後ますますのご発展を祈念しております。
（公益財団法人微生物化学研究会 微生物化学研究所）

使い方についても様々な角度から検討する必要があります。
こうした状況のなかで、私たちは trehalose 類縁体化合物

2019 年度

研究助成

研究助成を受けて稲垣

向春の候、貴職におかれましてはますます御健勝のこと

絵海

思えば本当にかけがえのないひと時を過ごさせていただきましたこと厚く御礼申し上げます。助成金は申請した研究とお喜び申し上げます。
皆様今もなお新型コロナウイルスの対策で、大変な時期を過ごされているものとご拝察いたします。この感染の拡を遂行するために使用させていただきましたが、まだ未熟な研究者として大きな一助となりました。

大が一日も早く終息に向かうことを祈るばかりです。この研究の個々の事項についてより精査された結果の報告、

度私共の研究グループに研究助成をいただきまして誠に有論文化へと実施が出来るように分析・執筆活動を進めて参難うございました。大学院を卒業し、個人研究を開始した

ります。本研究の結果が、コスメトロジーのための基礎的ところで、このような研究の機会をいただきましたこと、研究の一助となれれば幸いに存じます。今後も研究領域で深く感謝しております。公益財団法人コーセーコスメトロの学会発表や討議において忌憚のないご意見・ご批評をいジー研究財団の研究助成は採択いただいてまもなく、授賞

ただきながら、今後の研究に生かしたいと考えております。

式と交流会があり、採択者の中で様々な意見交換ができま

この度は誠に有難うございました。

した。また付与くださいましたコーセー社の方々とも実際の化粧品開発についての知見をご教授いただくなど、いま− 233 −

（慶應義塾大学医学部眼科学教室）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
宇賀神

つかさ

この度は、コスメトロジー研究助成をいただき、誠にあは、診断法の確立や病態の解明が望まれる分野であると考りがとうございました。東京医科歯科大学の皮膚科の宇賀

えておりました。そこで私は、助成をうけて、染毛剤アレ

神と申します。私共、皮膚科医は、アレルギーの原因精査

ルギーのより安全で簡便な検査の確立と、特に診断が困難を担当させていただくことの多い診療科になります。助成

な痒疹型染毛剤アレルギーに関して、病理組織学的に病態いただいた研究は「毛染め・化粧品アレルギー」に関するの解明を目指し、研究してまいりました。お蔭様で、染毛

もので、日々の診療の中で着想を得たものになります。染剤アレルギーの病態の断片を明らかにできたのではないか

毛剤や化粧品のアレルギーは、近年、発症年齢が低年齢化と考えております。この経験を励みに今後もコスメトロジ

し、発症頻度も増加し、問題視されておりますが、特に染ー領域を含めたアレルギー診療に尽力してまいりたいと存

毛剤アレルギーは、多様な臨床像を呈することから、医療じます。今後ともご指導ご鞭撻のほどをよろしくお願い申者が疑わず、よって診断に至らず、見逃されているケース

し上げます。

（東京医科歯科大学皮膚科）

も少なからず存在しています。よって、染毛剤アレルギー2020 年度

研究助成

公益社団法人コーセーコスメトロジー研究財団研究助成を受けて大田

この度は，多大なる研究助成を賜り，誠にありがとうご
ざいました．私共が開発した「亜臨界溶媒分離技術」の化粧昌樹

時間を研究に投資してきた事実を正当化するに余りあるものでした．

品分野への応用をこれから新展開していくにあたり，正になお，この研究は，本学 八田四郎次名誉教授より続くきっかけとなる研究期間となりました．振り返れば，民間

化学工学という学問領域において、特に熱力学の研究分野

財団の研究助成においてそう多くはないまとまった金額のを応用しています．斎藤正三郎名誉教授のもと，新井邦夫

研究助成に，採択直後，この上ない喜びを抱いたことを思名誉教授，今野幹男名誉教授，阿尻雅文教授，猪股宏教授，

い返します．この助成は，主に貴財団への寄附金から成り

スミス・リチャード教授，佐藤善之特任教授，渡邉賢教授

立っていることに深く感謝を申し上げます．

などの背中を見て進むことができたことに深く感謝を申し

今回，与えられた研究期間において，従来一緒くたに抽上げます．薬学部の大泉康名誉教授、山國徹特任教授など出されてきた成分を，化学物質の物理化学的特性（沸点やのご支援も受けることができました．ここに感謝を申し上

極性，溶解度パラメータなど）に応じて分離する手法へとげます．学生諸氏の活躍にも大いに助けられました．精緻展開することができました．特に，香気成分とレジン成分

な実験データは，日本分光株式会社の実験装置があってこの分離に着眼いたしましたが，二酸化炭素－エタノール－

そと深く感謝しています．研究資金は，当該研究助成のほ水共溶媒系において分離の選択性が向上することを確認いか，文部科学省・日本学術振興会科学研究費補助金よりいたしました．また，理論化の過程においても独自の 2 つのただくことができました．

モデルを比較して，「精度の良い相関法」と「未知物質への対応に寄与する推算法」の使い分けの可能性を示すことが最後に苦しい状況でもいつも支えてくれた家族に感謝し，筆をおくことにいたします．

できました．これらの研究成果は，人生において約 1/3 の− 234 −

（東北大学大学院環境科学研究科）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

すべての人に安心・安全なコスメトロジーをめざして
大沼清

この度は公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団

流路を用いて、胚の状態を模倣して催奇形性をテストできの研究助成事業にご採択いただきまして、心より感謝申しるシステム “Embryo-on-a-chip” の開発です。本助成のお上げます。採択頂いたのが 2019 年秋で、そのすぐ後にかげで、これまで構築したシステム内部でのメカニズムの

COVID-19 が始まり、思うように研究が進められない日々

解析と、催奇形性薬（サリドマイド）を用いたテスト法の開が長く続きました。しかし、本研究助成に採択いただいて発において成果を上げられ、論文 4 報を公表することがでいたことで、
私の研究を応援して下さっているとの安心感・きました。大変に感謝しております。本助成期間は終了い

責任感とともに、前に進む原動力を与えていただけ、研究たしましたが、本課題はまだ道半ばです。化粧品の安全性・を継続することができました。重ねて御礼申し上げます。

有効性を安価・簡便・迅速に調べることができるようにな

本研究は、「すべての人に安全・安心なコスメトロジー」

る技術の開発を通じ、コスメトロジー研究への貢献ができということを目指して推進しております。安全性は、化粧

るよう、一層精進してまいります。

品の満たすべき基本条件です。特に、妊娠の可能性のある本研究を遂行するにあたり、共同研究を行っていただい方にとっては、自身はもちろんのこと、胎児への影響も気た先生方や、研究室の学生さんに深く感謝申し上げます。

になります。ところが近年、動物愛護の観点から化粧品のまた、本課題の選考・支援に携わっていただいた関係者の動物実験は禁止されており、代替となる安全性テスト技術

皆様に重ねて感謝を申し上げると共に、公益財団法人コーの確立が急務となっております。我々の最終目標は、胎児セーコスメトロジー研究財団のますますのご発展をお祈りの体になる部分に近い性質を持つヒト iPS 細胞とマイクロ申し上げます。

（長岡技術科学大学）

2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて北浦

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

次郎

ドをスクリーニングする方法を確立することができました。
特に、in vivo で MRGPRX2 リガンドとしての作用を評価に採択していただき、心より感謝申し上げます。
私は長年、マスト細胞の活性化によるアレルギーの制御できる系は、ヒトにおける偽アレルギーの病態機序解明に機構の解析を行ってきました。その過程で、多くのカチオ

も大きく役立つと考えられます。主に皮膚に塗布される化

ン性分子が G タンパク共役型受容体のマウス Mrgprb2（ヒ粧品は美容に貢献し健康的な生活に不可欠な存在であるがトでは MRGPRX2）に結合して結合組織型マスト細胞を活ゆえに、偽アレルギーを誘導する成分の混入を避けること

性化
（脱顆粒）
させ、偽アレルギーを誘導することに着目しは重要であり、本研究成果がコスメトロジーの発展につなました。皮膚に塗布される化粧品や皮膚に付着する動植物がることを期待します。

成分の中にも偽アレルギーを誘導する分子が数多く存在す

萌芽的な本研究を支えていただいた、コーセーコスメト

ると考え、皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリー

ロジー研究財団からの研究支援に対して、重ねて御礼申し

ニング法の開発を目指しました。目的を達成するために、上げます。多くの研究者を支援するコーセーコスメトロジ

野生型マウス、Mrgprb2 ノックアウトマウスとともに、ー研究財団のますますのご発展を祈念致します。

新規に作製した MRGPRX2 ノックインマウスを利用しま（順天堂大学大学院医学研究科アトピー疾患研究センター）した。最終的に、in vitro 及び in vivo で MRGPRX2 リガン− 235 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて小暮健太朗

この度は、コーセーコスメトロジー研究助成に採択してロジー研究財団には、我々の研究に注目していただき、ごいただき、誠に感謝申し上げます。私は、2005 年よりイ支援をいただきましたことは、とてもありがたいことであオントフォレシスによる高分子物質の皮内送達に関する研り、本研究助成のおかげにより、イオントフォレシスの安究に取り組んでまいりました。従来、イオントフォレシス

全性を検証することができるとともに、コラーゲンやセラによる皮内送達に高分子物質、特に DNA などの親水性高ミドなどの皮膚の機能性に関する物質に対してイオントフ

分子は適用できないと考えられてきましたが、siRNA な

ォレシスが良い影響を及ぼすことも見出すことができまし

どの核酸医薬やリポソームなどのナノ粒子がイオントフォ

た。今後も、コスメトロジー研究を引き続き推進することレシスによって皮内に送達できることを見出し、様々な物

で、本研究領域のさらなる発展に貢献できればと考えてお質に展開してきました。そのため我々は、皮膚内への物質ります。最後になりましたが、本研究にご支援いただきま

送達ばかりに着目して研究を行ってきたのですが、安全性した公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団と関係に関する検討が不十分である点が常に気になっておりまし

者の皆様に改めて感謝申し上げるとともに、ますますのごた。ただ、安全性の検討だけでは、科研費や他の研究助成

発展をお祈り申し上げます。
（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

金を得ることは困難であるため、なかなか取り組むことができませんでした。このような状況下、コーセーコスメト

2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
小林麻己人

この度はコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成にそれであれば、乳酸菌とゼブラフィッシュという意外な採択していただき、本当にありがとうございました。本課

組み合わせにより、思いもしない発見ができるかもと思い

題研究は、私が所属する筑波大学と同じつくば市内にある

つきました。しかし思いついても、死菌はあっても先立つ

農研機構の木元博士とたまたま知り合う機会があり、意気資金がない。そうした中、貴研究財団が私のこの突飛なア

投合して開始したものです。私は長年ゼブラフィッシュ遺イディアにご賛同いただき、研究助成の対象課題に採択し伝学を用いた研究をしており、木元博士は乳酸菌研究者のていただきました。本当にありがたく思います。残念なが第一人者の一人。当初、乳酸菌とゼブラフィッシュというら、作用メカニズム解明を期間内に達成することはできま組み合わせは、ヒトと魚類では細菌叢も違うし、そもそもせんでしたが、そのための準備は十分にさせていただきま

温度環境が全く違うということで、共同研究をすることはした。この成果を活かして、ぜひ画期的な発見ができれば全く考えもしませんでした。ところが話をよくよく伺ったと思っています。化粧品の開発応用につながりそうな成果

ところ、乳酸菌のアンチエージング効果は、生菌である必を出し、本研究助成に再度採択していただけるよう頑張り

要はなく、むしろ死菌の方が安定した効果を発揮すること、たいと思っています。その際はどうぞよろしくお願いいた

商品化されているものは死菌の方が多いこと、死菌であれします。

ば化粧品への応用もできること、など意外なことばかり。
自分と一見関係なさそうに見える分野の話も、食わず嫌い

最後に、コーセーコスメトロジー研究財団のますますのご発展を祈念いたします。

にならずに聞いてみるものだと思いました。

− 236 −

（筑波大学医学医療系）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて齋藤康太

この度は第 30 回（2019 年度）のコーセーコスメトロジー

泌のみならず、ER exit site そのものの形成にも関与して研究財団の研究助成に採択していただき大変ありがとうごいることがわかってまいりました。さらに今回の助成を得

ざいました。2018 年の 2 月より秋田大学大学院医学系研て、細胞分裂期の ER exit site の形態形成制御が TANGO1

究科の情報制御学・実験治療学講座（旧薬理学講座）に着任のリン酸化修飾の変化によって担われていることが明らかし、研究室を新たに主宰するタイミングで本助成をいただになってきました。今回見出したリン酸化修飾は概日リズ

くことができ、研究室のセットアップに必要なさまざまな

ムによっても制御される可能性があることから、今後も本機器および試薬の購入に大変有意義に研究費を使用させて助成の研究は継続して続けていきたいと考えております。

いただきました。

最後になりましたが、本研究をご支援いただきましたコー

われわれは、これまで小胞体からの分泌小胞出芽部位である ER exit site からのコラーゲン分泌機構を主に解析のセーコスメトロジー研究財団に改めて感謝致します。また
貴財団のますますのご発展をお祈り申し上げます。
（秋田大学大学院医学系研究科）

対象としてまいりました。最近、コラーゲンの積荷受容体として我々が同定していた因子 TANGO1 がコラーゲン分

2019 年度

研究助成

研究生活最後のプロジェクトにご助成くださり有り難うございました
西江渉

この度は、助成してくださり誠に有難うございました。

活動を継続できなくなってしまうことは残念ですが、これ

本研究は、私が准教授として最も精力的に活動していた時まで得られた経験や知識を多少なりとも活かし、臨床の場に、大学院生の時から長年興味を持ち着目してきた XVII

で患者さんへ貢献していきたいと考えております。また、型コラーゲンの発現制御機構の解明を目指す計画を立てた

本研究では大学院生や医学部の学生さんにも手伝っていたも の で す。 当 時 は 先 駆 的 な 手 法 で あ っ た CRISPR

だきました。この場をお借りして感謝申し上げます。近い

screening を解明するという壮大な内容です。ご助成いた

将来、彼ら彼女らが、臨床に直結する新知見を解明していだくこととなり、毎日休みの時も研究のことばかり考え楽くことを期待しています。

しく過ごしておりましたが、研究期間中に異動となり、その後は招聘教官として細々と遂行してきました。今後研究− 237 −

（北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成によって実現した「亜鉛皮膚科学」への挑戦
深田俊幸

コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成のご支援の発現する毛包幹細胞等の特徴と役割の解明に極めて有用なもとで、私達の研究を実施できましたことに心より感謝申研究ツールとして、今後の研究の発展に大きく貢献するこし上げます。本誌面をお借りしまして、貴財団関係者ならとと確信します。
本研究期間に、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では ZIP10

びに審査員の皆様に深くお礼申し上げます。
亜鉛が健康的な皮膚の維持に大切であることは半世紀以の発現が減少していること、亜鉛は表皮におけるエピジェ

上も前に知られていましたが、なぜ亜鉛が皮膚の維持に必

ネティックな遺伝子発現の制御に関与することを報告しま

要なのか、明確な回答はありませんでした。今から 10 年した。今後、Zip10-GFP-KI マウスと Zip10-GFP/Tomato-

ほど前に亜鉛トランスポーター ZIP10 が毛包に発現してKI マウスを様々な実験に適用することにより、健康的ないることを偶然発見し、その美しい発現像から ZIP10 の皮皮膚の形成と維持を科学する『亜鉛皮膚科学』の発展に貢献

膚科学に魅了されて、現在に至っております。ZIP10 の欠

したいと考えております。

損が皮膚バリア機能の損傷を引き起こすことを見出し、最後に、当研究を大きく進展する機会を頂きましたコー「ZIP10 は、皮膚バリア機能にどのような役割を演じていセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げますととるのか」の命題を解明することを目標として、貴財団のごもに、貴財団のますますのご発展を心より祈念申し上げま支援のもとで ZIP10 発現細胞とその子孫細胞を可視化するす。

ことができるZip10-GFP-KIマウスとZip10-GFP/Tomato-（徳島文理大学薬学部先端医療薬学コース病態分子薬理学

KI マウスを開発しました。これらのマウスは、ZIP10 を研究室）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて松本

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

靖彦一つであるメラニン化反応を指標として、C. acnes の免疫誘導の評価ができることを見出しました。また、C. acnesに採択していただき、誠にありがとうございました。
これまでに私は、カイコを実験動物として用いた感染症と黄色ブドウ球菌の共感染によるカイコの皮膚上でのメラ研究を展開する中で、主に薬剤耐性や全身感染症が問題とニン化の誘導が起こりました。これらの結果から、C.

なる黄色ブドウ球菌を研究しておりました。一方、黄色ブ

acnes によるカイコを用いた皮膚における過剰免疫応答をドウ球菌は炎症性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎の増悪評価できる実験系が構築できたと判断しました。今後は、化に関わることも知られております。また、尋常性ざ瘡の本研究で開発したカイコを用いた評価系により、C. acnes

原因となる Cutibacterium acnes や水虫の原因となる真菌の免疫誘導機構の解明や阻害剤のスクリーニングを行いたを研究する機会がありました。さらに、動物愛護の問題か

いと思っております。本研究成果をコスメトロジー研究に

ら、化粧品などの開発に哺乳動物を用いて研究することが貢献できるように研究を展開いたします。

難しい旨のお話を聞きました。これらのことから私は、カ

本研究を遂行するにあたり様々なご助言をいただきましイコを用いた皮膚感染症モデルの確立が今後のコスメトロ

た共同研究者の方々に深く感謝いたします。また、ご支援

ジー研究に貢献するのではないかと考えました。

いただいたコーセーコスメトロジー研究財団および関係者

本研究では、C. acnes のカイコ感染モデルを確立し、抗の皆様に心より御礼申し上げます。

菌薬であるテトラサイクリンやクリンダマイシンの薬効評価が行えることを示しました。さらに、昆虫の免疫応答の− 238 −

（明治薬科大学微生物学研究室）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

チロシナーゼの反応機構解明を目指して
的場

康幸

チロシナーゼは、シミやソバカスなどの皮膚疾患の原因

ただし、この意見はなかなか世間には認められず、他の研

酵素のひとつであり、美白用化粧品開発のためのターゲッ

究者を納得させるには、X 線結晶構造解析だけではなく分ト酵素です。実際に、市販されている美白用化粧品にはチ

光学的なアプローチも必要と方針を変えました。今は亡きロシナーゼ阻害作用を謳うものが多くあります。チロシナ

小倉尚志先生（当時兵庫県立大学に所属）には、分光学的デーゼは創薬の観点から非常に興味深い酵素ですが、その三ータを得るのにご協力いただきました。謹んでお礼申し上

次元構造については、2006 年に発表した筆者らの報告がげます。

最初のものでした。これを契機として、構造に基づくチロ

なお、分光学的データもそろい論文投稿をしようとしてシナーゼ阻害剤のドラッグデザインが可能になったものといたところ、日本の別の研究グループが同じような研究成

思います。

果を持っていることを偶然知りました。その後は、急いで

ただし、チロシナーゼにはもうひとつの重要なテーマが2 報の論文を仕上げ、何とかそのグループに先んじて論文残されていました。それは反応機構についてです。筆者らを出すことができました。今回の研究結果は、そこで予測の結晶構造では、チロシナーゼの活性中心近傍に別のタンした反応機構を補強するものになります。今後は、我々のパク質のチロシン残基が存在しており、反応機構の解明に出したデータに基づいた阻害剤が開発されることを望みま役立つのではないかと考えていました。いろいろな試行錯す。

誤を経て、このチロシン残基が酵素反応を受けるらしいこ

最後に、本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りまとがわかるとともに、触媒サイクルで銅イオンが大きく動した公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深くくのではないかという新しい知見を得ることができました。

感謝申し上げます。

（安田女子大学薬学部薬学科）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受けて三浦

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団コスメトロ
ジー研究助成にて私どもの研究をご支援頂きましたこと、恭子

おかげで、本研究を進め成果を出すことができました。
本研究では、デバ線維芽細胞において、老化細胞で細胞死が活性化することを見出し、解析を実施しました。結果

大変光栄であり、心からお礼申し上げます。
本研究では、最長寿かつ老化耐性を持つ齧歯類、ハダカとして、細胞老化に重要な INK4a-RB 経路が活性化すると、デバネズミ（デバ、Naked mole-rat）における皮膚線維芽

H2O2 を産生するセロトニン代謝経路が活性化し、デバ線細胞の老化抑制機構の解明を目指して、研究を行いました。

維芽細胞が生来持つ ROS の１種である H2O2 に対する脆弱

デバはマウスと同程度の大きさながら、報告されている性が、協調して老化細胞死を引き起こしていることを明ら

最大寿命が 37 年以上の、異例の長寿動物です。また、皮かにすることができました（河村、三浦ら、論文投稿中）。

膚を含む各種組織・臓器が老化耐性の特徴をもち、顕著な以上の結果から、デバは進化の過程で、内在的な老化細胞

がん化耐性を示します。これらの特徴から、デバは、新た除去能力、すなわち “naturally senolytic phenotype” を獲な皮膚の老化予防方法の開発のための動物として、有用と得していると考えられます。これまでご支援頂きましたこ

考えられます。

とを励みに、今後、デバ研究を推進することで、真に安全

一方で、デバは長寿動物であるがゆえに繁殖が難しく、な “senolytic drug”、また老化を防止可能な化粧品の開発

さらに非モデル動物であるため解析手法も一からの立ち上に貢献できるように、日々たゆまず努力していく所存です。

げが必要なことが多く、高額の飼育費・研究費を必要とし

この度は誠にありがとうございました。

ます。苦しい状況の中、貴財団からご支援いただきました− 239 −

（熊本大学大学院生命科学研究部）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受けて
南彰

この度はコスメトロジー研究助成にご採択頂きまして誠にあり

今回、皮膚のシアリダーゼ活性を検出したところ、真皮の下がとうございました。私は糖鎖と認知機能を中心に研究を展開

層に強いシアリダーゼ活性があることがわかりました。シアリダー

しています。これまで、脳において糖分解酵素シアリダーゼのゼの酵素活性分布として大変興味深い知見ではあるものの、当機能を解析するために BTP3-Neu5Ac を開発しました。BTP3-

時は皮膚におけるシアリダーゼの働きを明らかにするための研究

Neu5Ac は組織においてシアリダーゼの酵素活性をイメージン

予算が不足していました。そのような背景の中で本助成金にごグすることができます。脳におけるシアリダーゼ活性のイメージ

採択頂き、皮膚におけるシアリダーゼの機能解明を遂行すること

ングを利用して、シアリダーゼが認知機能に不可欠であることができました。現在シアリダーゼを活用したスキンケア製品の開を見出しています。このイメージングプローブを脳以外にも活発へと展開しています。このような機会を与えていただきました

用して、シアリダーゼの様々な生理機能が明らかになりつつあ

コーセーコスメトロジー研究財団の皆様に、心より感謝申し上げります。例えば、インスリンを分泌する膵臓のランゲルハンス

ます。また、助成金の贈呈式において、学生の頃よりお世話に島に比較的強いシアリダーゼ活性があることがわかりました。

なっている廣部先生や奥先生、山本先生と再会できたこともとてこのイメージング情報を利用して糖尿病の治療薬を開発しましも嬉しく、良い思い出となりました。現在はコロナ禍にあって厳した。また、大 腸 癌は強いシアリダーゼ活 性を持 つことから、

い状況にありますが、研究費に加えて、今後も引き続き研究交

BTP3-Neu5Ac によってヒトの大腸癌を高感度で検出するこ流の場をご提供いただければ幸いです。末筆ながら、コーとができます。最近では、BTP3-Neu5Ac がインフルエンザ

セーコスメトロジー研究財団の今後ますますのご発展を祈念

ウイルスの検出に活用することができることがわかっています。

いたします。（静岡県立大学大学院薬学研究院生化学講座）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受けて村上良子

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

PNH は全く異なる疾患です。私たちは GPI の基礎研究とに採択していただき、厚く御礼申し上げます。先天性グル

並行して IGD 患者のフローサイトメトリーによるスクリ

コシルホスファチジルイノシトール（GPI）欠損症（IGD）はーニングや遺伝子解析を進めて患者情報を集積してきまし2006 年に初めて私たちが報告した疾患で、てんかんや知た。その中で重症例にしばしば魚鱗癬様の皮膚症状が見ら能障害などの神経症状を主症状とする潜性遺伝性疾患です。

れることがわかってきました。これは以前に報告した皮膚細胞表面には GPI という糖脂質で細胞膜にアンカーされて特異的に Piga を欠損させたマウスモデルのフェノタイプ

いる GPI アンカー型タンパク質（GPI-AP）というタンパクに合致する症状で、論文ではマウスの皮膚について詳細な質の１群が約 150 種発現しており、酵素、受容体、補体制

解析結果が示されています。今回 ABCA12 遺伝子の変異

御因子などとして重要な働きをしています。この GPI-APによって起こる道化師様魚鱗癬との類似性をもとに角化細の生合成過程には 30 個の遺伝子が関与しており、これら胞株を使ってノックアウト細胞を作製し、まず細胞レベルの遺伝子の変異により様々な GPI-AP の発現低下や構造異でそのメカニズムを解明することにしました。残念ながら

常が起こり、それに伴って種々の症状を来します。古くか

予想外に時間がかかってしまい、やっと最初の緒にたどりら研究されている発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）は着いたところですが、今後これをもとにさらに研究を進め

後天性の血液疾患で造血幹細胞における PIGA 遺伝子の体ていきます。肌の潤いやバリア機能に必須のセラミドの分細胞突然変異によって発症し、GPI-AP である補体制御因泌過程に関わる GPI-AP を是非とも明らかにしたいと考え子が欠損するので、補体の異常な活性化によって溶血発作ています。

を 起 こ し ま す。 す な わ ち GPI 欠 損 症 と い っ て も IGD と− 240 −

（大阪大学微生物病研究所）

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受けて矢嶋

伊知朗

この度は「皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA

ロの状態で分析が可能となるため、特にコスメトロジー分量の関連性解析」という研究課題としてコスメトロジー研

野では非常に有望なツールになりうると考えられます。本究助成に採択いただき、財団ならびに関係者の皆様方に深研究では体毛における miRNA の量的変化と、皮膚に影響く感謝申し上げます。私は大学４年生の時代から皮膚科学を与える代表的な環境因子である紫外線と重金属（ヒ素）のの研究を一貫して行ってきました。その中で感じているこ

関連性を in vivo だけでなく、in vitro 研究の手法を用いてとは、「コスメトロジーという研究分野は単なる化粧品科

解析を行いました。この両面での研究が、miRNA の非常学という分野を超えて、人々の QOL や場合によっては加にユニークな発現パターンを発見するきっかけとなりまし

齢や寿命にも影響を与える極めて需要な研究分野である」

た。今回の研究では体毛中の miRNA を定量・分析するこということです。今回採択いただいた研究も、シミやしわとで、皮膚のシミやしわ、皮膚角化やメラニン沈着などのといったコスメトロジー分野の研究とがんを含む皮膚疾患

コスメトロジー分野で最も重要な皮膚の現象を、皮膚そのという医学的分野をつなぐ需要な研究内容であると考えてものを調べる必要なく、予知・分析できる可能性を強く示います。本研究では microRNA（miRNA）を用いた研究で唆しています。近い将来、この分析手法は間違いなくコスすが、その研究の発展は主に医学分野で進んでおり、コス

メトロジー分野でも発展していくであろう技術であり、本メトロジー分野ではまだまだこれから大きく発展する素地

助成金によって達成された今回の成果が新たなコスメトロが残されています。特に体毛を用いた分析はあくまでも毛ジー研究の発展に少しでも寄与できれば望外の喜びと思っのシャフト部分を利用するため抜毛の必要がなく、被験者ています。 （芝浦工業大学システム理工学部生命科学科）（ユーザー）
に対する肉体的・精神的ストレスを限りなくゼ2019 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受けて山本

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団より多大な

博之

要なレチナールの代謝経路が皮膚にも存在していることを見出すことができました。これらの成果は、皮膚がどのよるご支援をいただき、心から御礼申し上げます。
皮膚は外界と接する最も大きな組織であり、常に様々なうに光を認識して生体応答が行われているのかを明らかに刺激を受けています。光は、生きていくうえで避けることする大きな手がかりになると思っています。一方で眼では、ができず、毎日、光を浴びて生活をしています。生体にお1 細胞に 1 つの波長を認識する光受容体が発現しているのける光線の感受は、眼の網膜でよく研究がされております。

に対し、皮膚の細胞では 1 つの細胞に複数の光受容体の発眼では、ロドプシンをはじめとする光受容体が色（光の波現が見られます。このことは、皮膚における色の区別は、

長）を識別し、様々な色を認識しています。一方で、古く眼よりも複雑な仕組みであることを意味しており、この謎から光を浴びることで皮膚の状態が変わることが知られてを解き明かすことで、光により調節を受ける皮膚の恒常性いました。しかしながら、その仕組みについてはほとんどの新しい仕組みを明らかにしたいと思っています。

分かっていませんでした。今回助成していただいた研究は、最後になりましたが、重ねまして、ご援助をいただいた

皮膚において光が生体シグナルに変換される仕組みを明らことに感謝申し上げるとともにコーセーコスメトロジー研

かにすることを目的に行ってきました。本研究の成果から、

究財団のますますのご発展をお祈り申し上げます。

皮膚に存在する細胞にも、眼の網膜と同様に光受容体の発現が発現していることや光受容体が活性を維持するのに重− 241 −

（日本薬科大学）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2018 年度

研究助成

コスメトロジー助成を受け
逢坂

美里

このたびは貴財団の研究助成に採択いただきまして、心よ

らったりする方も多く、爪の変化に対するケアを考えたいとり深く感謝申し上げます。当初の研究手順において、対面で今回の研究にとりくむことにしました。オンラインネイルケ

ネイリストによりネイルケアを実施することを予定しており

ア介入研究に参加された方からは、気分転換になった、外見ましたが、新型コロナウイルス感染症の流行により対面でのが綺麗になり前向きになったという感想もあり、がん薬物療施術がかなわず、オンラインでネイルケアを行う内容に変更

法による副作用を体験しながらも、そのひとらしく生活する

いたしました。まさか新型コロナウイルスの蔓延により、計ことにつながる支援の一歩になったかと思います。これから画内容の修正を迫られることになるとは予想しておりません

も患者さんが治療中も自分らしい爪のケア、装いを支える医でしたが、貴財団のご理解のもと、研究計画を見直し無事に療やサポートに貢献していきたいと思います。
本研究に共同し、ご協力いただいた参加者の皆様、ikus.医研究終了を迎えることができました。
現在多くのがん患者さんは、仕事や生活を送りながらがん

療美容研究会の皆様、研究期間中、思慮深く専門的に継続的

薬物療法を受けておられます。治療により脱毛や皮膚や爪のご支援をいただきました聖路加国際病院皮膚科新井達先生

色素沈着など外見の変化が起こり、爪は体の中では小さな部

善家由香理先生、ブレストセンター山内英子、腫瘍内科山内位ですが、患者さんはご自分の爪の変化に落ち込み、周囲に照夫、聖路加国際大学大学院看護学研究科米倉祐貴先生に心も目につきやすいことから、人前で手を差し出すことをためから深く感謝申し上げます。
（聖路加国際大学大学院看護学）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けてて
柴藤淳子

このたびはコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

ベルにおける遺伝子発現等の実験を進めていました。今回に採択いただきまして誠に有難うございます。私の研究室の助成金のおかげで、費用的に困難であったメタボローム

では低温真空抽出法という新しい技術を用いて得られた植解析による育毛成分のスクリーニング分析や、マウスを用

物や果物のセルエキストラクトに抗酸化能や抗炎症作用ないたオミックス解析まで進めることができました。得られどの酵素活性が高く保持されていることを見出してきましたデータが膨大であることからさらなる解析が必要ですが、た。この低温真空抽出技術は規格外として廃棄されている育毛に関与する因子をいくつか見出すことができました。

植物や果物も有効に利用できることから、日本独自の自然

今後この研究のデータを活かすことで臨床研究まで進めら

素材を用いたサステナブル化粧品開発にも貢献できるのでれるように努めてまいります。
最後になりましたが、このような機会をくださったコーはないかと考えております。
採択頂きましたサボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析は、地域特有の農産物の機能性を明らかにし有セーコスメトロジー研究財団と関係者の皆様に重ねて感謝
申し上げます。

効活用するための研究として、これまでは主に培養細胞レ− 242 −

（星薬科大学）コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて臺美佐子

この度は、コスメトロジー研究助成にて「後期高齢者に本研究支援は、この日本での臨床課題を解決すべく、教頻発するスキン - テアの予測方法の考案」にご支援くださ

員 6 名、大学院生 8 名、そして高齢者施設の看護師から成り、誠にありがとうございました。私は、これまで皮膚のるチームでの臨床調査、解析、公表を行う基盤を支えてく

健康に着目し、看護学の視点から研究を行ってまいりましださいました。臨床調査は約 1 年間にわたり毎月前向き調た。皮膚の健やかさ、審美性は、人々の自尊心を維持し、査を行い、貴重な臨床データを得ることができました。そ生きること、暮らすことを支える基本的な要素であると感の成果は、日本人高齢者に特有なリスクファクターから、じます。そうした中、ある施設で、高齢者の腕や足に突然予測スコアリング方法作成に繋がり、日本創傷オストミー

生じた創傷を見て、高齢者ご自身、ご家族、看護や介護に失禁管理学会での英語セッション口演発表、Journal of

携わるスタッフが、驚き、悲しむ姿を知りました。これは、Tissue Viability での論文掲載にまで至りました。今後は

スキン - テアと呼ばれる皮膚裂傷で、患部の疼痛、皮膚外

ハイリスク者に特化したスキンケア等によりスキン - テア

観の痛々しさに加え、虐待を疑われるケースもあり、まさ

発生数の減少が期待できます。

に身体・心理・社会的影響を及ぼす問題でした。しかしな

高齢者の皮膚の健やかさ、審美性を大切にしたいというがら、スキン - テアの国外の知見は、日本人の皮膚の特徴

本研究チームの看護学からの視点に、ご賛同・ご支援くだには合致せず、依然として解決策が見いだされない状況でさいましたこと、心より御礼申し上げます。

した。

（藤田医科大学研究推進本部 社会実装看護創成研究センター）

2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて田中

明

このたびはコスメトロジー研究助成に採択していただきえられる可能性を確認しています。本研究期間において、まして、心より感謝申し上げます。申請課題は顔の動画像

新型コロナウイルス感染症のまん延が収束せず、人を対象

解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法の開とした実験の実施が極めて困難であったことが少し残念で発です。映像脈波とは、カラーカメラで撮影された動画にしたが、今後も、パックやクリームなどの血行への効果も含まれる肌色のわずかな変化から脈動成分を抽出して得ら評価可能かについて検討をしていきたいと考えています。

れる脈波です。もし映像脈波が接触式センサで得られる容

一方で、映像脈波は、テレビ、ビデオ、携帯動画そしてオ

積脈波と同等の脈波として計測できると、それはあたかもンラインミーティング中の画面からも平均心拍数がわかる

無数の脈波センサを皮膚表面に設置していることに相当し、くらいには抽出可能ですが、その精度は計測環境や条件に異なる部位の脈波を同時に得られることで、脈波の伝播特

大きく影響を受けることから、映像の撮影方法や信号処理

性や部位の違いを積極的に活用した新たな血行動態解析の方法についてさらなる改良を行う予定です。
最後に、本研究をご支援いただいたことに改めて深く御可能性があります。
本研究では顔を対象として、映像脈波を利用して皮下の血行動態を評価することを試みたものです。評価実験では礼申し上げるとともに、コーセーコスメトロジー研究財団のますますのご発展を祈念申し上げます。

マッサージによる血行動態の変化が現れるかに着目しましたが、他にもうっ血や温熱によって生じる血行の変化が捉− 243 −

（福島大学共生システム理工学類）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて中村

航洋

この度は，コスメトロジー研究助成にご採択いただき，

知や日常知として実践されてきたメイクアップを科学の視誠に有難うございました。私は認知心理学を専門とする研点から捉え直してみることで，個性美を演出するメイクア

究者で，人が顔から様々な情報を読み取る仕組みについて

ップ手法の提案や見た目の肌質や印象に悩みを感じる人々の研究に取り組んできました。顔はその人物のアイデンテへのケアと支援など，応用的価値の創出に繋がる新たな研ィティを表現する固有性をもちながらも，表情や装いによ究課題を発見することでもできました。

って異なる印象が立ち現れてくるほど，変化に富んだもの

研究を助成いただいた期間には，世の中で様々な価値観でもあります。とりわけ，化粧品によって姿を美しく演出の変化の波が到来しました。新型コロナウイルスの感染拡する装いは，古代から現代に至るまで人々の心を惹きつけ大により人々のコミュニケーションのあり方が変わり，てきたと言えるでしょう。人はどのように自らの個性を美SNSやマスメディアの発信を通じて人々の容姿に対する眼

しく装うのか。そこにはどのような法則性が働いているの差しが以前とは大きく変容してきたように思います。美のか。こうした疑問に顔の研究者として真正面から取り組ん

ニューノーマルが個性の美しさを包摂していく時代においでみたいという思いから，2019 年に研究助成に応募させては，人々が装うことの意義や価値を再定義するような新ていただきました。

たな研究が必要になると感じています。本研究助成にきっ

コスメトロジーについては深い知識を持ち合わせていなかけを頂いた研究を今後もさらに継続し，コスメトロジーい状態からのスタートとなりましたが，本研究に協力して分野の発展に貢献したいと考えております。当初の予定を下さった方々が，化粧によって様々な装いを施す様子を統一部変更しながら研究を遂行することとなりましたが，そ計的画像解析とモデル化によって詳細に研究していくうちの都度手厚くご支援くださいました，貴財団の皆様に心よに，人々の化粧に共通した法則性とその背後にある視覚効り感謝申し上げます。

（ウィーン大学心理学部）

果について理解する緒が見えてきたように思います。経験2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて松原

恵理

このたびは、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究できましたことを大変ありがたく感じております。本研究

財団の研究助成に採択いただきましたこと、心より御礼申は私にとって大きな転機でありました。今後は、本研究でし上げます。私はここ 10 数年、植物の香りが人の心や身得られました成果を関係の企業様との共同研究などを進め体に与える影響について興味を持って研究を進めてきましていくなかで何らかの形にしたいと考えております。また、た。香気成分の定性・定量分析とともにヒトの心身の応答

微力ながらもコスメトロジー研究の一助となれば大変幸いを解析していきながら、香りという目には見えないもののです。最後になりましたが、貴財団のますますのご発展を機能性について少しずつ明らかにしてこられたように思いお祈り申し上げます。この度は誠にありがとうございまします。わずかながら基礎的な研究データを蓄積していく中た。

で、どのようにしたら社会に還元できるかを考えていたと（国立研究開発法人森林研究・整備機構 森林総合研究所

きに本研究助成に採択いただき、新たな研究にチャレンジ

複合材料研究領域）− 244 −

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて峯

この度のコーセーコスメトロジー研究財団研究助成によ

裕一とは重要な課題となります。エピテーゼ治療においては、人工物であるエピテーゼと患者の肌の境に化粧を施すこと

る支援に心より感謝申し上げます。
助成いただいた課題は、エピテーゼと呼ばれる、顎顔面領域の欠損に対するリハビリテーションに関する研究となもあり、エピテーゼに関する研究はコスメトロジー研究の発展に寄与できるものと考えています。

ります。エピテーゼは、一般的には医療用シリコーン樹脂

研究に助成いただいた期間中は COVID-19 の流行化とを用いて製作しますが、患者の欠損部を正確に再現するにいうこともあり、他のコスメトロジー研究者とディスカッは熟練を要します。特にシリコーンの着色は、自然な装着ションする機会が少なかったことを非常に残念に思います。

感を得る上でも非常に重要です。本研究では、このエピテ

本研究成果はオンライン学会ではありましたが、日本歯科ーゼの製作過程に人工知能を応用し、熟練の技を定量化す技工学会で発表し、ポスター発表優秀賞を受賞することもる手法の構築を目指すものです。また近年は、途上国におできました。コーセーコスメトロジー研究財団の関係者のいても癌の発症率の増加や事故による外傷により、エピテ

皆様には重ねて感謝申し上げると共に、貴研究財団のますーゼ治療のニーズが増加しています。このような観点からますのご発展を心よりお祈り申し上げます。
（広島大学大学院医系科学研究科医療システム工学）

も、エピテーゼの質を担保することができるようになるこ

2020 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて若林

この度はコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に一道

ため、歯の色を定量的に分析、評価することが重要ですが、
これまで、多くの研究で用いられてきた測色計は、連続的採択していただき、誠にありがとうございました。
｢ 初頭効果 ｣ という言葉がありますが、人の印象というな色の変化を観察することが不可能でした。そこで、本研

ものは、会ってから最初の 0.6 秒から６秒で決まり、そし

究では天然歯の連続的な色調を、正確に分析するため、分てその時の印象は消えることはないといわれています。ま光イメージングを用いた測色器に着目しました。本計測装

た、「明眸皓歯」という言葉もあります。これは瞳が澄んで置を用いることで、天然歯の連続的な色調を計測すること

（明眸）
歯が白い
（皓歯）
という意味で、唐（現在の中国）の玄ができ、それにより、色調の変化を数式に置き換え評価す

宗皇帝の寵愛を得て、皇后となった楊貴妃のことを指し、ることが可能となりました。本結果は、天然歯における色これが転じて美人を表す言葉として使われています。私た調変化の評価や、天然歯に近似したグラデーションを有す

ち審美歯科医療に携わるものにとって、患者さんに美しいる新たな歯科用材料の開発にきわめて有用であり、今後、歯を提供し、すばらしい笑顔を引き出すことは極めて大切

世界に対し、日本が本領域におけるイニシアティブを握るなことであり、また、やりがいのある仕事であると思ってための一助となるものと期待しています。
今回ご支援いただいた研究を、今後もさらに発展させ、います。
現在、一般歯科臨床では、様々な審美歯科材料が用いらさらに良い研究成果を出せるように精一杯努力したいと思れ、そして、日々新しい材料が開発されています。しかし、います。繰り返しになりますが、ご支援いただいたコーセ

歯科治療における歯の色については、歯科医師や歯科技工

ーコスメトロジー研究財団および関係者の皆様に心より御士の経験や主観に頼るところが大きいのが現状です。その礼申し上げます。

− 245 −

（大阪大学歯学部附属病院）

国際交流助成2020 年度

国際交流助成第 30 回 日本人間工学会 システム大会を終えて
衛藤

憲人

Ergonomics の大家，E. Grandjean 教授の名著タイトル

告，次いで執刀医用のイスのスライド式背当て開発の評価，でもある「“Fitting the Task to the Man”（タスクを人間

眼科手術で用いるペダルの人間工学についての実践的内容に適合させる）」は，重要な人間工学の役割である．変わりが紹介された．第二部では，患者の体位交換へのハイブリゆくタスクへの社会的要求に対して，人間工学を含める戦

ッドデバイスの応用，手術訓練のための Augmentation，

略は，まだまだ改善する余地が多分に存在する．この課題

静脈注射の訓練のための Augmented Reality（AR）の応用

に対し，国際交流助成を活用し，ヨーロッパ屈指の工科大といった医療・コスメトロジーに関わる訓練・手技支援にであるスイス連邦工科大学チューリッヒ校（ETH, Zurich）

つ い て の 発 表・ 討 議 が 行 わ れ た． 加 え て 総 括 と し て，の人間工学部門長である Marino Menozzi 先生を招聘し，Menozzi 先生から，これからの実験研究・コスメトロジー

最新知見についてご教授いただく機会を計画した．同氏はに関する新技術についての解説が行われた．

E. Grandjean 教授の最後の院生であり，人間工学分野の世新型コロナウィルス感染拡大により，Menozzi 先生をは界的第一人者である．さらに Menozzi 先生を座長に，これじめ多くのシンポジストはオンライン発表となったが，会からの人間工学と医療・コスメトロジーの関わりについて

場・オンライン合わせて，のべ 100 名を超える参加者が集深い討議を行う国際シンポジウムを計画した．前後二部構い，極めて盛況な基調講演・国際シンポジウムとなった．

成の同シンポジウムには，学術・医療・産業，各界を代表

今回の国際交流は，E. Grandjean 教授の業績を称えると同する国内・国外の研究者を招聘し，医療・コスメトロジー

時に，若手研究者・学生が最新人間工学に触れることのでの実践に関わる計 6 つの報告を発表していただいた．具体

きる場として成功裏に終了したと考える．

的に第一部では，眼科手術用器具の術中の操作に関して手指の圧力について 8 人の手術医が実験に参加した結果の報− 249 −

（東海大学工学部医工学科）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2020 年度

国際交流助成コスメトロジー国際交流助成を受けて
雁金

詩子

国際交流助成に採択いただき、ありがとうございます。

の接着分子が減少する稀な難治性疾患で、軽微な刺激で皮COVID-19 パンデミックにより開始延期を余儀なくされ膚に損傷をきたします。痒みは QOL を低下させる主要因

たにも関わらず、多大なご配慮により充実した国際交流がであるとともに、掻く行為により皮膚障害を悪化させます。

叶いました。

いまだ効果的な治療法がなく、我々は新規治療薬 NK1RA

私は皮膚科専門医として、身体的・精神的・審美的に患の効果を解析しました。治療薬群のうち約 3 割が、プラセ者様の Quality of Life（QOL）を損ねる皮膚疾患に対して、ボ群に比較して 1 カ月以内に掻痒を減少させたことがわか患者様の状況に応じた治療を心がけてまいりました。しかりました。本試験結果は、論文発表ならびに研究皮膚科学

し、いまだ十分な治療手段がない病気が数多く残されてお会学術大会（2022 年 5 月米国）での発表を予定しています。

り、臨床研究によって新たな治療や診断方法を生み出す必

また、サブプロジェクトとして、人工知能を用いた皮膚科

要性を感じていました。臨床研究の実施と解析には、十分

画像診断の解析を補助し、論文が Nature communications

な知識、経験および多職種連携が求められます。私は今回、に掲載予定です。

米国屈指の研究が進められているスタンフォード大学皮膚1 年間の活動後は、日本の皮膚科学・コスメトロジー分科において、臨床研究の実施と解析を学ぶ機会に恵まれま野において今回の経験を生かしてまいります。今後とも貴した。

財団における調査研究が発展されますことを祈念するとと主要プロジェクトとして「ランダム化第 2 相試験：遺伝性表

もに、本助成に心より感謝申し上げます。

皮水疱症の掻痒に対するNeurokinin 1 Receptor Antagonist（NK1RA）」の結果を解析しました。本疾患は、表皮～真皮− 250 −

（慶應義塾大学医学部）

学術集会支援助成2020 年度

学術集会支援助成コロナ禍の天然薬物の開発と応用シンポジウムを終えて脇本敏幸

日本薬学会生薬天然物部会の主催シンポジウムとして物活性海洋天然物の単離・構造決定」という表題で特異な「第 23 回天然薬物の開発と応用シンポジウム」を令和 3 年

構造を有する海洋天然物の探索や構造決定の詳細について

10 月 16 日、17 日の両日にわたり北海道大学薬学部臨床薬

ご講演いただきました。また、令和２年度と令和３年度の学講義室およびオンライン配信のハイブリッド形式によっ

２年分の生薬天然物部会奨励研究受賞講演を実施し、生薬・て開催しました。本シンポジウムは、薬用植物、微生物・天然物分野の新進気鋭の若手研究者８名にご講演いただき

海洋生物から見出された医薬シーズとしての生物活性物質

ました。さらに企画シンポジウムにて、北海道大学におけからの創薬を目指して、隔年ごとに開催されてまいりましる天然薬物研究分野の第一線の研究者 4 名をお招きしました伝統あるシンポジウムです。

た。

令和に入り初めての天然薬物の開発と応用シンポジウム

また一般演題では口頭発表 13 題、ショートプレゼンテ

は令和２年（2020 年）秋の開催を予定しておりましたが、ーション 18 題の申込があり、その中には天然素材からの2020 年初頭から発生した新型コロナウイルス感染症の世

抗炎症や抗アレルギー活性物質の探索やその作用機序解析

界的な感染拡大に伴い、従来の対面形式のシンポジウムのなど、化粧品分野に関連する演題も複数ございました。発

開催は困難になりました。そのため本シンポジウムは１年

表演題の中から優秀発表賞として 7 演題を表彰いたしまし

越しの令和３年 10 月にハイブリッド形式で開催する運びた。全体の参加者は 100 名を超え、そのうち 40 名程度のになりました。

参加者が対面で会場にお越し下さいました。まさにハイブ

本シンポジウムでは特別講演として、東京大学大学院薬リッド形式が功を奏した形となり、無事にシンポジウムを学系研究科の阿部郁朗先生に「天然物生合成マシナリーの開催することができました。貴財団より賜りましたこの度

合理的再構築による次世代天然物創薬」という表題で生合の多大なるご支援に厚く御礼申し上げます。

成研究に基づく新規天然医薬品資源の探索研究を、また東京大学大学院農学生命科学研究科の松永茂樹先生から「生− 251 −

（北海道大学大学院薬学研究院）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2020 年度

学術集会支援助成

第 6 回国際細胞老化研究会（ICSA）学術会議を終えて原

英二

国際細胞老化研究会（ICSA）は、加齢に伴う生体機能のが多数あり、様々な角度から老化研究を行う気鋭の研究者

低下や加齢性疾患発症のメカニズムを細胞レベルで解明すが集うことにより、皮膚老化のメカニズム解明のみならずることを通して健康長寿社会の実現に貢献することを目指

コスメトロジーの内面の老化に及ぼす影響などについてもした国際コンソーシアムです。2015 年に設立以来、毎年議論を深められ、結果として今後の研究の方向性や国際共

１回、関連分野で世界をリードする研究者が一堂に会して同研究の体制強化に貢献できたのではないかと自負してお最新の研究成果を発表し、議論し合う学術会議を開催してります。

きました。第 6 回目は日本で開催したいとの要望が強く、また、ハイブリッド形式で開催したことにより 400 名を

大阪大学の原教授が ICSA 会長より依頼を受け、2020 年超える予想以上の参加登録者に恵まれ、このような学術会

11 月に大阪市にて開催予定でしたが、新型コロナウィル

議を最も高齢化が進む日本がリーダーシップをとり世界へ

ス感染症拡大の収束の兆しが見えず、2021 年 12 月に再延発信するという重要な役割を担って開催できたことは意義

期後、学術会議の開催形式を、オンラインと対面式による深く、日本のみならず先進諸国が直面する加齢性疾患の対ハイブリッド形式にて開催いたしました。

策などが議論され、実り多い学術会議となったことは喜ば

第 6 回国際細胞老化研究会（ICSA）学術会議では、細胞老化の関連分野で世界トップレベルの実績を有する研究者

しい限りです。今後もさらなる老化研究の発展により国際社会に貢献していきたいと考える次第です。

の方々に招待演者としてご講演いただき、それぞれの研究

最後に、本学術会議を開催するにあたりご援助いただいの現状のみならず、問題点や将来展望などについても議論たコーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げますることが叶いました。招待演者である東京医科歯科大学

す。

の西村栄美教授をはじめ、皮膚老化研究の第一人者の参加− 252 −

（大阪大学微生物病研究所）

学術集会支援助成

2021 年度

学術集会支援助成第 30 回日本色素細胞学会学術大会の開催を終えて福田 光則

日本色素細胞学会（JSPCR: Japanese Society for Pigment

スの感染拡大状況が芳しくないことから、初めてのオンラ

Cell Research）は、全米色素細胞学会（PAPCR）、欧州色素

イン開催となりました。直前まで現地開催を模索してのオ細胞学会（ESPCR）、アジア色素細胞学会（ASPCR）と共にンライン開催ではありましたが、例年通り、大学などの基

国際色素細胞学会連合（IFPCS）を支える主要学会の 1 つで、礎の研究機関、病院の皮膚科、並びに化粧品メーカーなど

色素細胞の研究の発展と会員相互の交流、及び国際的な連の産業界などから様々なバックグラウンドを持つ多様な研携の推進を目指しています。令和 2 年度には国際色素細胞究者が参加しました（参加人数 106 名［内、外国人研究者 3

学会学術大会（IPCC2020）を日本色素細胞学会主催で山形名］）。学術大会では、「メラニン、メラノソームの形成・にて開催（誌上開催）し、令和 3 年度には日本色素細胞学会

輸送・分解、メラノーマ、白斑、肌色制御、白髪予防、毛から国際色素細胞学会連合の会長が選出され、日本色素細髪再生への応用」などをキーワードとした幅広いシンポジ胞学会の活動が世界的にも広く認知されています。日本色

ウムや一般演題を開催し、活発な議論と情報交換が行われ、素細胞学会の主要な活動のひとつが年次学術大会で、色素

コスメトロジーの発展にも貢献できるような実り多い有意細胞に関する基礎・臨床・応用研究の進歩をはかるため、義な学術大会となりました。

分野や立場の垣根を超えて情報交換を行う場となっていま最後になりますが、本学術大会の開催にサポートいただす。令和 3 年度は、第 30 回の学術大会を 10月23日㈯ 〜 24

きました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団の日㈰ の日程で、仙台（東北大学片平キャンパス・さくらホ

学術集会支援助成金に感謝申し上げます。

ール）にて開催を予定していましたが、新型コロナウイル− 253 −

（東北大学大学院生命科学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2021 年度

学術集会支援助成第 65 回日本薬学会関東支部大会を終えて伊藤晃成

このたび、コーセーコスメトロジー研究財団の学術集会した。

支援助成を受け、令和 3 年 9 月11 日 ㈯、千葉市の千葉大学

日本薬学会は有機化学、物理化学、生物化学、薬理学、薬学部 120 周年記念講堂を大会実施本部とし、完全オンラ

製剤学、医療薬学といった基礎〜応用まで広い分野の研究

インにて第 65 回日本薬学会関東支部大会を開催させていた者で構成されており、今回もこれら全分野から発表がありだきました。

ました。多くが医薬品に関連する発表の中、中には天然物

本支部大会は、日本薬学会の地方支部の中でも最大の規の有効成分同定や効率的な合成法開発に関する研究、さら模を誇る関東支部が毎年開催しているものです。薬学部のには化学物質一般の毒性評価に関する研究、化粧品への応

学部学生や薬局、病院の薬剤師等の参加にも配慮し、講義、用を意図した皮膚でのドラッグデリバリーシステムの研究

実習、業務等の影響の少ない土曜開催を原則として続けてなど、香粧品と直接的に関連する発表もありました。香粧

きた伝統ある大会で、今回で 65 回目の開催となります。

品には天然物やその誘導体、または天然物関連の化学構造

関東近郊の薬学部を持つ大学が幹事校を努め、千葉大学はをもつ合成化合物などが含まれることから、医薬品の研究

約 20 年ぶりに担当させていただきました。コロナ禍で完と手法的に重なる部分も多く存在します。香粧品を含む化

全オンラインとなりましたが、最終的に 655 名と非常に多学物質一般に対して薬学的視点から議論を深めることがでくの方々にご参加いただきました。朝 9 時からの一般口頭

きた本大会は、参加者全員にとって大変有意義であったと

発表では、10 個の Zoom 会場を使い 179 演題の一般口頭発

考えます。

表が、午後は 7 個の Zoom 会場を使い 32 演題のシンポジ

最後にご支援を賜ったコーセーコスメトロジー研究財団

ウム発表が行われ、夕方には 173 演題の一般ポスター発表にあらためて感謝申し上げます。

討論が行われました。これら全てを 1 日でこなす非常にタ（千葉大学大学院薬学研究院生物薬剤学／第 65 回日本薬学

イトなスケジュールでしたが、皆さん手慣れた様子でオン会関東支部大会実行委員会委員長）

ライン会場を行き来し、終始活発な討論が交わされていま− 254 −

学術集会支援助成

2021 年度

学術集会支援助成日本ビタミン学会第 73 回大会を終えて石神昭人

この度、2021 年 6 月 19 日から 2 日間を日本ビタミン学会に新型コロナウイルス感染症による感染者数が激減し、東第 73 回大会 Part 1 として一般演題のオンデマンド開催、京でも緊急事態宣言が解除されていたことから、ほとんど

そして 2021 年 11 月 20 日から 2 日間を日本ビタミン学会第の演者の先生方には現地会場にてご講演いただくことがで

73 回大会 Part 2 として東京、芝浦工業大学芝浦校舎にてきました。また、大会参加者の皆様には、オンライン視聴

現地開催とオンライン視聴形式で開催しました。現地開催

形式の併用により、どこにいても講演が視聴可能となり、に際しては、最大限の感染対策をとり、会期終了後に参加

大会にご参加いただけました。

者の方から新型コロナウイルス感染症の発症情報はなく、本大会のシンポジウムでは、「ビタミンを中心としたケ予想を超える多くの方々にご参加いただき、盛会裡に終了

ミカルバイオロジー研究」、「エピジェネティクスから考えすることができました。

るビタミン・バイオファクターの未来」、「ビタミンと脳神本大会は、当初 2021 年 6 月 19 日から 2 日間の日程で、基経機能」、「ビタミン誘導体による人工触媒系の開発および調講演１件、特別講演 3 件、教育講演 3 件、受賞講演 4 件、医療応用研究の最前線」、「企業シンポジウム」の 5 件を企シンポジウム 5 件、一般発表演題 88 件を芝浦工業大学芝浦画しました。化粧品には、各種ビタミンを含む商品が多く校舎にて現地開催すべく準備を進めておりました。しかし、販売されており、その効能・効果が期待されています。一

新型コロナウイルス感染症による第 4 波と重なってしまい、方、いまだ明らかになっていない各種ビタミンの知られざ直前に現地開催を断念せざるを得ない状況になってしまいる効果も予想されることから、化粧品の製造や販売を行う

ました。そのため、急遽、一般演題のみをオンデマンド配

会社の皆様にも多く、大会にご参加いただきました。本大

信による開催に変更させていただきました。一方、大会参会の発表内容が今後の化粧品開発に役立つことを期待して加者や演者、そして学会、大会組織委員からの強い要望もおります。

あり、新型コロナウイルス感染症の状況はまったく先の予末筆となりましたが、本学術集会の開催にあたりご助成

想もつきませんでしたが、11 月 20 日から 2 日間の日程でいただきました、コーセーコスメトロジー研究財団に深く

基調講演、特別講演、教育講演、受賞講演、シンポジウム

御礼申し上げます。貴財団のますますのご発展を心より祈を Part 2 として開催することが決まりました。幸いにも、念しております。

ご講演なさる演者の先生方には全員にご快諾いただき、（東京都健康長寿医療センター研究所 研究部長／日本ビタPart 2 を現地開催とオンライン視聴形式で開催することがミン学会第 73 回大会大会委員長）

できました。さらに、幸いにも、11 月は日本では全国的− 255 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

2021 年度

学術集会支援助成第 28 回日本歯科色彩学会学術大会を終えて
金子潤

2021 年 6 月 26 ～ 27 日の 2 日間にわたり、第 28 回日本歯歯科医療が支える口元の色彩美』とし、歯科医師・歯科衛科色彩学会学術大会を公益財団法人コーセーコスメトロジ

生士・歯科技工士がワンチームで患者さんの口元の審美性ー研究財団の学術集会支援助成を受けて開催いたしました。

を構築・維持するための議論の場を提供しました。特別講

本来であれば現地集合型の対面形式で行いたいところでし演では、明海大学歯学部クラウンブリッジ補綴学分野の三たが、COVID-19 感染拡大の影響により、Zoom を利用し浦賞子先生に「審美補綴装置の色調再現性を高めるために」た Web 開催（ライブ配信）で実施することといたしました。

と題してご講演をいただき、基礎的研究の整理から豊富な無事に学術大会が終了できましたことを、関係各位に感謝

臨床例を含めて詳細に解説していただきました。エビデン

申し上げる次第です。

スに裏付けられた臨床がいかに重要かを再認識させられる

日本歯科色彩学会は、歯科審美を構成する 3 要素、すな

ご講演でした。また、恒例の講習会は 3 演題を準備し、カ

わち「形態美」
「機能美」
「色彩美」
のうち、
「色彩美」
を深く

ラーランド・Lab の元呑昭夫先生、株式会社トクヤマデン

探求し歯科臨床に応用することを目的に活動を行っており

タルの関野雅人先生、株式会社インテグラルの永岡庸平先ます。歯科色彩学は歯学教育の中で詳しく学ぶ機会も少な

生にそれぞれのお立場から歯科色彩学に関連するトピック

く、各個人が歯学部卒業後の臨床経験などに頼って歯科診スをご紹介いただきました。会員口演発表においても、参療を行っているのが現状です。しかし、どんなに「機能」的加者の活発な討論の場を提供できたのではないかと思って

で自然な
「形態」
を有する修復物や補綴装置でも、やはり最おります。

終的な「色彩」
がマッチしていなければ、確実に不満の残る

今回の学術大会で参加者の皆さんと共有できた多くの知結果となることを臨床上しばしば経験します。また、昨今識や技術を今後の歯科臨床に活かしていくとともに、学会の歯科審美に対する社会的ニーズの高まりから、今後ます開催に対してご支援賜った公益財団法人コーセーコスメト

ます歯科色彩学の重要性が認識されていくと予想していま

ロジー研究財団に深く感謝申し上げる次第です。

す。

（明海大学保健医療学部口腔保健学科／第 28 回日本歯科色第 28 回を数える本学術大会では、大会テーマを『チーム

彩学会学術大会大会長）− 256 −

●
事業報告書
2021 年度

表彰および助成を受けられた方々
役員●

事業報告書

事業報告書（自 2021 年 4 月 1 日

至 2022 年 3 月 31 日）《研究助成関連》［コスメトロジー研究助成］
2021
5 10
公募開始

全国 655 の大学、病院、研究機関等へ公募要領を送付し、関連学
術雑誌 3 誌及び 9 関連機関 HP と当財団 HP に公募要領を掲載

7

9

公募締切り

応募総数133件、各分科会毎に選考委員による個別審査（7/16 ～
8/20）

9

14

選考委員会第一分科会（書面） 第 1 分野の書類選考通過 10 課題の承認

9

14

選考委員会第二分科会（書面） 第 2 分野の書類選考通過 17 課題の承認

9

15

選考委員会第三分科会（書面） 第 3 分野の書類選考通過 5 課題の承認

9

28

選考委員会

10

8

臨時理事会（書面）

選考委員長による 2021 年度コスメトロジー研究助成採択候補 32
課題の承認
選考委員会から 2021 年度コスメトロジー研究助成候補課題の答申を受け採択者を決定

2022

11

25

第32回表彰・贈呈式

研究助成採択 32 課題の代表者に対し、助成金贈呈書を授与

12

10

助成金交付

研究助成金を交付

2

14

選考委員への確認・報告（書 2022 年度研究助成公募要領他

総額 5,500 万円

面）［大学講座研究助成］
2021

12

10

助成金交付

2020 年度採択 3 件に 2 年目の助成金交付

総額 8,000 万円

臨時理事会（書面）

選考委員会で承認を得た学術集会支援助成 4 件について採択決定［学術集会支援助成］
2021

10

8

《表彰事業》［コーセーコスメトロジー奨励賞］
2021

4

9

趣意書発送

2018年度以降のコスメトロジー研究助成採択者115名に趣意書を
発送

8

31

受付終了

提出論文21報の被引用件数を調査

9

28

選考委員会

論文実績が優れた研究者を表彰候補者として選出

108

臨時理事会（書面）

選考委員会から提案された候補者を受賞者に決定

1125

第32回表彰・贈呈式

受賞者1名に対し、表彰状と副賞200万円を贈呈

第32回表彰・贈呈式

会場とオンライン同時配信によるハイブリッド形式で実施《表彰・贈呈式》
2021

11

25

記念講演

黒田玲子 中部大学特任教授・東京大学名誉教授

講演題目：「科学の醍醐味－左右性から見る自然界の不思議」
講演終了後、同会場において感染予防対策をとりながら「懇談会」
開催− 259 −

コスメトロジー研究報告Vol. 30, 2022

《理事会関連》
2021

5

28

第一回通常理事会（書面） 2020年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）を承認する件
選考委員の選任に関する件
株主としての議決権行使について

108

臨時理事会（書面）

2021年度コスメトロジー研究助成者等を承認する件
2021年度コーセーコスメトロジー奨励賞受賞者を承認する件

1125

第二回通常理事会

2021年度収支予算書の一部変更を承認する件
2022年度事業計画及び予算案を承認する件
株主としての議決権行使について理事長、副理事長及び専務理事の職務執行状況の報告《評議員会関連》
2021

6

18

定時評議員会（書面）2020年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）を承認する件

123

評議員への報告（書面）

第二回通常理事会議事等の報告

51

中間報告書発行

研究業績中間報告集

91

完了報告書発行

コスメトロジー研究報告

役員及び評議員の報酬等並びに費用に関する規程を一部改定する件《その他》
1）報告書発行
20212）行政届出関連
2021

6

22

内閣府

令和 2 年度事業報告書等の提出

2022

2

9

内閣府

令和 4 年度事業計画書等の提出

3）情報公開（当財団HP等）
2021

2022

2

19

2021年度 事業計画等の掲載

4

5

2021年度 コスメトロジー研究助成公募要領の掲載

510

2021年度 コスメトロジー研究助成公募開始

625

事業報告等の掲載

7

9

2021年度 コスメトロジー研究助成公募終了

91

コスメトロジー研究報告 Vol. 29 の発行及び掲載

1130

2021年度 表彰および研究助成受賞者の掲載

12

1

2021年度 予算書の一部修正

2

10

2022年度 事業計画等の掲載− 260 −

第30号
Vol.29（2021）、CD版を作成

事業報告書2021年度

表彰および助成を受けられた方々

1）コーセーコスメトロジー奨励賞受賞者
氏

名

景山 伯春

所

属

名城大学理工学部

職位

研究課題

教授

2018年度コスメトロジー研究助成採択
天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基
盤開発と機能解明

職位

研究課題2）コスメトロジー研究助成（32名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（10 名）
氏

名

所

属

植田 圭祐

千葉大学大学院薬学研究院

助教

NMR及びCryo-TEM併用によるエマルション中の化粧品原料の分散・溶解状態の定量的評価基盤の確立

内田 紀之

東京農工大学工学部

特任助教

フォトニックウォーターコスメティクス：ほとんど水からなる色
材化粧品

大山 陽介

広島大学大学院先進理工系
科学研究科

教授

製品中の微量水分をピンポイントで検出・可視化する蛍光性水センサー材料の創製

門田 和紀

大阪医科薬科大学薬学部

准教授

多孔性金属錯体による化粧品成分の経皮DDS製剤の開発

桑折 道済

千葉大学大学院工学研究院准教授

メラニン系構造色を基盤とする化粧品開発に向けた技術基盤構築田中 祐圭

東京工業大学物質理工学院
応用化学系

助教

ペプチドマトリックスを用いた化粧品香料の超高感度センシング

徳留 嘉寛

佐賀大学リージョナル・イノベー
ヒアルロン酸・コラーゲンのナノ粒子化による新規皮膚浸透促進
ションセンター
特任教授
技術の開発とそのメカニズムの解明
化粧品科学共同研究講座

真島 剛史

奈良先端科学技術大学院大学
物質創成科学領域

助教

多量体タンパク質のサブユニット間相互作用を利用した新規機能性ハイドロゲルの構築と薬剤徐放システムへの活用

水野 稔久

名古屋工業大学大学院工学専攻
生命・応用化学系プログラム

准教授

化粧品基材に利用可能なペプチド界面活性剤のバクテリア合成系
構築

八波 利恵

東京工業大学生命理工学院准教授

新規枝作り酵素による高保湿剤としての多分岐グルカンの合成と構造・物性解析

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（17 名）
氏

名

所

属

職位

研究課題

阿部 結奈

東北大学工学部・工学研究科

助教

表皮電位を指標とした皮膚バリア光治療法の時空間的評価

石田 竜弘

徳島大学大学院医歯薬学研究部
（薬学系）

教授

ポリエチレングリコール(PEG)含有化粧品によって誘導された抗
PEG抗体によるCOVID-19-mRNAワクチン投与時のアナフィラ
キシー反応誘導現象の検証

今西 規

東海大学医学部基礎医学系
分子生命科学教授

皮膚細胞ゲノムのメチル化測定による加齢マーカーの開発

岩田 浩明

北海道大学病院講師

タイトジャンクションが角層形成に及ぼす影響の解明

臼井 健二

甲南大学
フロンティアサイエンス学部

准教授

ペプチドビーズを用いた反応速度論による迅速・詳細なアレルギ
ー感作試験法の開発

大野 祐介

北海道大学大学院薬学研究院

助教

ヒト特有の表皮セラミド合成経路および生理機能の解明− 261 −

コスメトロジー研究報告Vol. 30, 2022

氏

名

所

属

職位

研究課題

押海 裕之

熊本大学大学院生命科学研究部

教授

自然免疫による炎症制御と新たな抗炎症性化合物の探索

佐々木 淳一大阪大学大学院歯学研究科

講師

グリコサミノグリカンが脈管形成機構に及ぼす影響の解明

笹沼 博之

公益財団法人東京都医学
総合研究所

副参事
研究員

紫外線による細胞老化と光老化を繋ぐ分子基盤の解明

菅波 孝祥

名古屋大学環境医学研究所教授

加齢による皮下脂肪萎縮の分子基盤の解明

鈴木 亮

金沢大学医薬保健研究域薬学系教授

新規アレルギー反応制御分子Ly6Gによる皮膚ホメオスタシス維
持機構の解明竹馬 俊介

慶應義塾大学医学部微生物学
免疫学教室

准教授

皮膚反応性T細胞のステムネスを標的とした、乾癬治療法の研究

冨永 光俊

順天堂大学大学院医学研究科環境医学研究所／
順天堂かゆみ研究センター

先任
准教授

触覚を痒覚に変換するアロネーシス・パスウェイの分子神経基盤の解明と治療法の開発

長野 一也

和歌山県立医科大学薬学部教授

経皮曝露されたナノ粒子の存在様式変化の理解と毒性発現を適切に解析・予測するための試験法の提案

福本 毅

神戸大学医学部附属病院

助教

iPS細胞を用いた色素細胞の老化機序の解明

本田 哲也

浜松医科大学皮膚科学講座

教授

角質層バリア形成および金属アレルギー発症におけるスプラバシ
ンの機能解明前川 大志

慶應義塾大学薬学部薬学研究科

専任講師

皮膚角化細胞の老化を防ぐ脂質分子種の網羅的探索とその分子機
構

職位

研究課題

第３分野：精神、文化に関する分野（5 名）
氏

名

所

属

川崎 洋

理化学研究所生命医科学
研究センター免疫器官形成チーム

上級
研究員

生活行動および心の健康が皮膚の性状・バリアに与える影響の解
析研究

茂地 智子

九州大学病院臨床教育研修センター
きらめきプロジェクト（消化器・総合外科）

特任助教

化学療法中の乳がん患者へのメイクアップ指導によるQOL向上
の検討

堀 龍介

藤田医科大学医学部
耳鼻咽喉科・頭頸部外科

准教授

三次元顔認証スマホアプリによる表情筋トレーニングの客観的指標の導入と末梢性顔面神経麻痺後遺症予防リハビリへの応用

前川 素子

東北大学大学院医学系研究科

講師

毛根細胞を用いた統合失調症発症予測因子の探索

丸山 千秋

公益財団法人東京都医学総合研究所 プロジェクト
サブプレートニューロンから紐解く美意識の起源
リーダー
脳神経回路形成プロジェクト

3）大学講座研究助成（2020年度採択2年目）
氏

名

所

属

職位

研究課題

天谷 雅行

慶應義塾大学医学部皮膚科

教授

表皮角層形成機序の解明と角層機能制御によるアレルギー疾患予
防法の開発

椛島 健治

京都大学大学院医学研究科
皮膚科学

教授

アトピー性皮膚炎の発症機序の時空間的理解とアレルギー克服を目指した研究月田 早智子帝京大学先端総合研究機構

特任教授

上皮バリアの分子細胞生物学的研究を基盤とした皮膚疾患の病態解明と治療予防法の開拓− 262 −

事業報告書4）国際交流助成

2021年度の応募、採択なし

5）学術集会支援助成（4件）
実施責任者

所

属

学術集会

福田 光則

東北大学大学院生命科学研究科

伊藤 晃成

千葉大学大学院薬学研究院

第65回日本薬学会関東支部大会（2021年9月11日）

石神 昭人

東京都健康長寿医療センター研究所

日本ビタミン学会第73回大会（2021年6月11 ～ 7月30日Part1、11月20 ～ 21日Part2）

金子潤

明海大学保健医療学部

第30回日本色素細胞学会学術大会（2021年10月23 ～ 24日）

第28回日本歯科色彩学会総会・学術大会（2021年6月26 ～ 27日）

− 263 −

コスメトロジー研究報告Vol. 30, 2022

役

員
2022 年 7 月現在

理事長

小林

一俊

株式会社コーセー 代表取締役社長

専務理事

亀山

浩一

（常勤）

理

事

岩橋

槇夫

北里大学 名誉教授

理

事

関根

茂

理

事

長野

哲雄

東京大学 名誉教授

理

事

二木

鋭雄

東京大学 名誉教授

理

事

西川

武二

慶應義塾大学 名誉教授

理

事

野呂

影勇

早稲田大学 名誉教授

理

事

宮地

良樹

京都大学 名誉教授・静岡社会健康医学大学院大学 学長

監

事

小林

久美

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

元 株式会社コーセー 常務取締役

評議員

伊藤

正俊

東邦大学 名誉教授

評議員

奥

直人

静岡県立大学 名誉教授・帝京大学薬学部長

評議員

齊藤

勲

評議員

齋藤

美穂

評議員

仙名

保

評議員

中村

陽子

元 厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官

評議員

西岡

清

東京医科歯科大学 名誉教授・兵庫医科大学 理事

評議員

宮㟢

榮三

日光ケミカルズ株式会社 代表取締役名誉会長

元 厚生省大臣官房審議官
早稲田大学 名誉教授・常任理事
慶應義塾大学 名誉教授

東京工業大学 名誉教授

− 264 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒 103— 0028

東京都中央区八重洲一丁目 5 番 17 号
八重洲香川ビルディング 4 階
電話 03（6860）2190

コスメトロジー研究報告

Vol. 30／2022

非売品

2022年 9月 1日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

亀山 浩一
公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒103−0028 東京都中央区八重洲一丁目５番 17 号
電話 03（6860）2190
エイエム企画〒362−0034 埼玉県上尾市愛宕一丁目２番７号
電話 048（778）7943
株式会社サンセー

表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2022

商品デザイン部デザイン室
不許複製

禁無断転載