解糖系の抑制による放射線耐性の克服

志（現緒言村勉

東北大学加齢医学研究所 助教
国立保健医療科学院生活環境研究部衛生環境管理研究分野）ことが考えられる。

日本人における死因の第 1 位はがんである。がん征本研究では、解糖系が放射線耐性に関わるかどうかを圧の研究推進が行われているが、いまだにがんに対する解析した。さらに、グルコース拮抗阻害剤 2- デオキシ決定打となる治療法は確立されていない。がんの 3 大グルコース（2-DG）でグルコースの取り込みを抑制し、治療法の１つである放射線治療は、放射線による細胞傷獲得放射線耐性の克服が可能であるかどうかを検討し害性を利用してがんを制御する局所療法であり、組織のた。以上の解析から、がん細胞のエネルギー代謝経路を機能温存性に優れている。しかし、がん細胞は容易に放標的とした、より有効な放射線治療法の開発に取り組ん

射線に耐性を獲得するため、放射線治療によるがんの根だ。

絶には、がんの放射線耐性の克服が必要とされる。我々
実験方法

は、ヒト肝がん細胞株 HepG2 とヒト子宮頚がん細胞株1. 分割照射による獲得放射線耐性細胞の樹立

HeLa に 0.5Gy のＸ線を 1 日 2 回、31 日間分割照射することで、がん細胞が放射線耐性を獲得することを明ら

ヒト肝がん細胞株 HepG2 とヒト子宮頚がん細胞株かにした。さらに、放射線照射後の影響について解析し、HeLa に 0.5Gy の X 線を 12 時間毎に 31 日間分割照射

分割照射を止めて１月以上培養した細胞においても、獲し、31fractionated radiation（FR）細 胞 を 作 製 し た。

得放射線耐性形質は維持されることを明らかにした 。

31FR 細胞をさらに照射を休止して 31 日間以上培養し、これまでの我々の解析から、長期分割照射によって、31FR-31non-radiation（NR） 細 胞 を 作 成 し た。X 線細胞の生存シグナル AKT シグナル経路が恒常的に活性照射は X 線照射装置（X 線血液照射装置 MBR-1520R、化し、これが獲得放射線耐性の原因であることを明らか

日 立 メ デ ィ コ 社 ） を 用 い て 150kV、20mA の X 線 をにした

0.5mmCu と 0.1mmAl のフィルターを用いて、1Gy/ 分１）。AKT は細胞増殖、細胞死の抑制ととも

１, ２, ３）の線量率で細胞に照射した。にグルコースの代謝を制御する。AKT はグルコースト
ランスポーター GLUT1 と GLUT4 の細胞膜への局在を2. 乳酸、ピルビン酸、ATPの測定制御し、グルコースの細胞内への取り込みを促進する。
このため、AKT 経路が活性化している獲得放射線耐性

乳酸、ピルピン酸，ATP 量は Biovision 社のキット

細胞では親株細胞と比較して解糖系が亢進していることを用いて、比色法により検出した。
マイクロプレートリーが予想される。細胞は嫌気条件下では解糖系を用いて、ダーで吸光度を測定し、濃度を定量した。5Gy の X 線

エネルギーを産生する。しかし、がん細胞では酸素存在を照射 24 時間に、親株細胞と獲得放射線細胞それぞれ下においてもミトコンドリアの機能不全が原因となり、について培養上清を回収した。AKT 阻害剤と放射線の嫌気的解糖系でエネルギーを産生する Warburg 効果が併用については、AKT 阻害剤で 24 時間処理後、阻害剤知られている。嫌気的解糖系の代謝産物、ピルビン酸やを PBS（−）で洗浄した後、放射線照射して 24 時間後

乳酸は抗酸化作用を持つため、放射線が水分子に作用しの培養上清を回収し、解析した。細胞数を計測し、1×て発生する活性酸素を補足し、放射線の間接効果を軽減

106 細胞当たりの乳酸、ピルピン酸，ATP 濃度で示した。

することが予想される。つまり、解糖系の代謝産物が放射線防護に働き、がん細胞の放射線耐性機構に関与する
1

志村勉が形成されるまで細胞を培養した。細胞を 70% エタノー

3. Reactive oxygen species (ROS)の検出
細胞を 10μM の 2,7-dichlorodihydroﬂurescein diacetate

ルで固定した後、ギムザ染色液で、染色した。実体顕微（DCFDA）で 37℃、30 分間染色した。細胞をトリプシンで鏡下で 50 個以上の細胞から形成されるコロニーを計測剥がした後、スライドグラスにのせ、カバーガラスをし、蛍した。細胞の生存率は非照射細胞群のコロニー数を１と光顕微鏡（Biozero, キーエンス社）で観察した。細胞の蛍して求めた。

光像は 20 倍の対物レンズを用いて、CCD カメラで撮影した。
6. アネキシンⅤ-PI染色4. γ-H2AXのウエスタンブロッティング法

アネキシン V 染色はバイオビジョン社 アネキシンⅤ

細胞溶解液［0.5% Triton X-100（v/v）, 2mM PMSF,-FITC 染色キットを用いて、キットのプロトコールに0.02%（w/v）NaN3, 1% Phosphatase Inhibitor Cocktail,従って染色した。フローサイトメーター（Cytomics FC

1% Protease Inhibitor Cocktailin PBS（-）］で細胞を500）を用いてアネキシン V 陽性細胞を定量した。

溶解し、遠心によりクロマチン分画を回収した。0.2N
結HCL を加え、一晩 4℃でヒストンタンパク質を抽出し果1. 獲得放射線耐性細胞31FR-31NR 細胞における乳た。Bradford 法でタンパク質を定量し、15μg の試料を、酸、ピルビン酸の蓄積

15％ SDS- ポリアクリルアミドゲルで , 定電流 25mA、1時間の電気泳動により分離した。PVDF メンブレンへの獲得放射線耐性細胞 31FR-31NR 細胞では、AKT 経転写は定電圧 50V、1 時間で行った。メンブレンを 5%路の活性化により解糖系が亢進されているかどうかを、Blocking Reagent でブロッキング解糖系の代謝産物であるピルビン酸と乳酸の量を測定した 後、１次 抗 体 anti-β-actin、anti-phospho-Histone

し、解析した（図 1）。非照射コントロール HepG2 細胞

H2A.X-ser139、2 次 抗 体 HRP-conjugated goat anti-（0FR 細胞）と比較して、HepG2 31FR-31NR 細胞では、mouse IgG、HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG で反乳酸およびピルビン酸が蓄積していることを明らかにし応させ、Chemi-Lumi one（ナカライテスク社）で発色させ、た（図１）。さらに、5Gy の X 線を照射し、放射線照射

LAS-4000 mini（フジフィルム社）を用い、蛍光シグナル

24 時間後の乳酸、ピルビン酸量を測定した。放射線照射を CCD カメラで撮影した。

後においても、0FR 細胞に比べ、獲得放射線耐性細胞のTM

PhosphoBLOCKER乳酸、ピルビン酸の量は多いことを明らかにした。獲得
5. コロニーアッセイ法

耐性細胞における乳酸、ピルビン酸の蓄積は、AKT の活

放射線照射の 3 時間前に 5μ Ｍの 2-DG を培養液に加性化による解糖系の亢進が原因であるかどうかを、AKTえた。放射線照射後、細胞数を計測し、1000 個の細胞阻害剤（API-2）を用いて解析した。我々は、20μM のを 60mm シャーレにまいた。7 日から 10 日間、コロニー

API-2 を 24 時間処理し、HepG2 細胞で AKT が不活性

HepG26nmol/1×10 cells

100Lactate

8Pyruvate680
6044022000FR

031FR-31NR

Non-irradiation

5Gy

API-20FR31FR-31NR

API-2+5Gy

図 1 獲得放射線耐性細胞 31FR-31NR 細胞における乳酸、ピルビン酸の蓄積
X 線、AKT 阻害剤、または X 線と AKT 阻害剤を処理 24 時間後に培養上清の乳酸、ピルビン酸量を比色法により定量した。

2解糖系の抑制による放射線耐性の克服化されることを報告した１, ４）。API-2 処理により、獲得とは反し、0FR 細胞と 31FR-31NR 細胞では、ATP 量

放射線耐性細胞の乳酸量、ピルビン酸量は著しく低下すの差は観察されなかった。一方、5Gy の放射線照射後ることから、獲得放射線耐性細胞の AKT 経路が乳酸、では、獲得放射線耐性細胞においてのみ ATP 量は増加

ピルビン酸の蓄積に関与することを明らかにした。

することを明らかにした。この獲得放射線耐性細胞における放射線照射後の ATP 産生は、AKT 阻害剤で抑制さ

2. 獲得放射線耐性細胞におけるROSの解析れることから、AKT 経路が糖代謝を制御し、ATP の産生に関与することを明らかにした（図 3）。

獲得放射線耐性細胞におけるピルビン酸、乳酸の蓄積が、放射線によるフリーラジカル（ROS）の誘導を抑ATP制するのかどうかを検討した。還元型 DCFDA が酸化15され蛍光を有することを利用し、ROS による DCFDA
nmol/1×10 cellsの酸化を蛍光染色により検出した（図 2）。非照射のコ6ントロール 0FR 細胞では、ほとんどの細胞で染色は観察されなかった。一方、5Gy の X 線照射 3 時間後、HepG2 細胞と HeLa 細胞では DCFDA の蛍光が観察され、放射線により ROS が誘導されることを明らかにした。獲得放射線耐性細胞では、分割照射を休止して１月1050以上経過しているにも関わらず、多くの細胞で DCFDA0FR
Non-irradiationの染色が観察され、ピルビン酸、乳酸とともに ROS が蓄積していることを明らかにした。5Gy の放射線照射

31FR-31NR
5Gy

API-2

API-2+5Gy

図 3 獲得放射線耐性細胞における ATP 産生

後では、獲得放射線耐性細胞に DCFDA 陽性細胞の増X 線、AKT 阻害剤、または X 線と AKT 阻害剤を処理 24 時間
後に培養上清の乳酸、ピルビン酸量を比色法により定量した。

加は観察されなかった。
以上の結果から、獲得放射線耐性細胞では、照射前に4. 代謝制御による放射線耐性の克服

ROS は観察されるものの、放射線による新たな ROS は誘導されないことを明らかにした。

我々は解糖系の抑制により獲得放射線耐性の克服が可能かどうかを解析するために、グルコースの拮抗阻害剤

3. 獲得放射線耐性細胞におけるATP産生

2-DG でグルコースの取り込みを抑制し、検討した。放獲得放射線耐性細胞では解糖系が亢進しているため、射線により誘導される DNA 損傷の修復能を、DNA2 重ATP の産生量が多いことが予想された。しかし、予想差切断の指標であるγ-H2AX を用いて定量し、検討し

HepG2
Non-irradiated

HeLa
5 Gy

Non-irradiated

5 Gy

0FR

31FR-31NR

図 2 獲得放射線耐性細胞における ROS の解析
DCFDA 染色により ROS を検出し、蛍光顕微鏡で細胞の蛍光像を撮影した。コントロールの０FR 細胞では、放射線による ROS の誘導を観察した。
31FR-31NR 獲得放射線耐性細胞では、5 Gy の放射線照射の前に、ROS を持つ細胞が観察され、放射線による新たな ROS の誘導は観察されなかった。

3

志A‒2‒DG勉BHeLa
0FR
‒

0.5

331FR-31NR
610‒

0.5

3610g‒H2AXActin

0.1+2‒DG
Time after
5 Gy（hr）

1Survival rate（％）

Time after
5 Gy（hr）

村HeLa

0FR
‒

0.5

3610031FR-31NR‒

0.5

3610g‒H2AXC

23

Dose of X-ray（Gy）

450FR

0FR+2‒DG

31FR-31NR

31FR‒31NR+2‒DG

50
Apoptotic cells（％）

Actin

14030
20
1000FR
Non-irradiation

31FR-31NR
5Gy

2-DG

2‒DG+5Gy

図 4 2 − DG による DNA 修復の阻害と放 h 鎖線耐性の抑制（A）γ-H2AX による DNA 損傷の検出。2-DG は放射線照射の 30 分前に添加した ( 下図）。
（B）0FR 細胞、31FR-31NR 細胞の生存曲線。（C）アネキシン V-PI 染色によるアポトーシスの解析た（ 図 4）。HeLa 細 胞 で は、5Gy の X 線 照 射 30 分 後較して放射線に耐性を示した。この獲得放射線耐性はにγ-H2AX のシグナルが観察され、放射線で DNA 損傷2-DG と放射線の併用により消失した。さらに、アネキが誘導されることを明らかにした。γ-H2AX のシグナ

シン V 染色でアポトーシスの解析を行った。HeLa 細胞

ルは時間経過とともに減少し、照射 10 時間後には消失

では、ヒトパピローマウイルスの感染による p53 が不することから、DNA 損傷は修復されることを明らかに活性化され、p53 依存性のアポトーシスが起きないことし た。 一 方、31FR-31NR 細 胞 で は、5Gy の X 線 照 射が知られている。このような細胞では、放射線により分

30 分後で、0FR 細胞と比較してγ-H2AX のシグナルが裂死が誘導される１）。放射線によるアポトーシス抵抗性

弱く、ほとんどの DNA 損傷は放射線照射後、短時間にの細胞においても、2-DG と放射線の併用により、アポ修復されることを明らかにした。以上の結果から、親株トーシスが誘導されることを明らかにした。

細胞と比較して 31FR-31NR 細胞の修復能は高く、効率以上の結果から、2-DG によるグルコースの取り込みの良い DNA 修復が放射線耐性に関わることが考えられの阻害は、DNA 修復を阻害し、細胞死を誘導し、獲得る。

放射線耐性の抑制に有効であることを明らかにした。

2-DG の添加による DNA 修復への影響を解析した。
2-DG 処 理 で は、 放 射 線 照 射 後 10 時 間 後 に お い て も考察

31FR-31NR 細胞のγ-H2AX のシグナルが観察された。

1. AKT経路の活性化による解糖系の亢進

この結果から、2-DG によるグルコースの細胞内への取これまでのわれわれの解析から、長期分割照射したり込みの抑制は、31FR-31NR 細胞の DNA 修復を阻害細胞では、恒常的に AKT 経路が活性化することで放射することを明らかにした。

線耐性を獲得することを明らかにした１, ３, ４）。ヌードマ

2-DG の放射線増感効果について、コロニーアッセイ

ウスに作成したヒト腫瘍移植片を用いた動物実験によっ法を用いて解析した。31FR-31NR 細胞は親株細胞と比て、AKT 阻害剤と放射線の併用により、生体内におい4解糖系の抑制による放射線耐性の克服

Growth Factor

DNA damage

PI3K

DNA‒PK
AKT細胞増殖
Cyclin D1
P27, P21

細胞の生存
Bad, Bax
MDM2, NFkB

グルコースの代謝GLUT4PFKFB2

血管新生
VEGF

再増殖

細胞死の抑制ROSの除去間接効果の軽減

再酸素化

図 5 放射線耐性に関わる AKT 経路て放射線耐性の克服が可能であることを明らかにした２）。

3. 2-DGによる放射線耐性の抑制

AKT は様々な分子を制御しており、細胞増殖、細胞の生我々はグルコースの取り込みの抑制により解糖系を制存、グルコースの代謝、血管新生等に関わっていること御し、放射線耐性の克服が可能であるかどうかを検討しが知られている（図５）。グルコースの代謝に関しては、た。2-DG はグルコースへキソキナーゼと結合してグルAKT はグルコーストランスポーター GLUT1 と GLUT4コースの細胞内への取り込みを抑制する。２-DG 処理の細胞膜への局在を制御し、グルコースの取り込みを促により、獲得放射線耐性の高い DNA 修復能は阻害され、進する。AKT 経路が活性化している獲得放射線細胞でアポトーシスが誘導されることを明らかにした。獲得放はピルビン酸、乳酸が蓄積し、AKT 阻害剤によって抑制

射線耐性細胞では放射線照射後に ATP が産生され、こされることから、獲得放射線耐性細胞では解糖系が亢進の ATP は DNA 修復に用いられると考えられる。このしていることを明らかにした。

ため、2-DG による解糖系の抑制により ATP は枯渇し、DNA 修復が阻害されることが考えられる。また、2-DG

2. 獲得放射線耐性細胞における放射線誘発ROSの抑制は獲得放射線耐性細胞にアポトーシスを誘導し、獲得放射線耐性の克服に有効であることを明らかにした。

放射線による細胞傷害は、放射線が直接 DNA 鎖を切断する直接作用と、放射線が水分子に作用してラジカ以上、本研究により、細胞のエネルギー代謝が放射線ルを発生し、ラジカルを介して DNA を切断する間接作の感受性に影響を与えることを明らかにした。糖代謝に用が知られている。放射線による DNA 損傷が引き金と関わる分子を標的に放射線耐性細胞における放射線の増なって、アポトーシス等の細胞死が誘導される。解糖感効果が期待され、今後、新たな標的分子の探索に取り系の代謝産物ピルビン酸、乳酸は抗酸化作用を持つた組みたい。

め、ROS を捕捉し、放射線の防護効果が期待される。
要

我々は放射線による ROS の誘導を DCDA 染色により約検討した。HepG2 と HeLa 細胞では、放射線照射後に我々は長期分割照射により、放射線耐性を獲得した獲DCFDA 陽性の細胞が観察され、放射線によって ROS得放射線耐性細胞では、AKT の活性化により、解糖系が誘導されることを明らかにした。一方、獲得放射線細が亢進していることを明らかにした。獲得放射線耐性で胞では、放射線による ROS の誘導は観察されなかった。

は放射線で誘導される ROS の発生が抑制されることか

獲得放射線耐性細胞では照射前に ROS が蓄積しているら、解糖系の代謝産物ピルビン酸、乳酸の抗酸化作用がことから、ROS の排除機構である抗酸化酵素等の ROS放射線の防護効果を持つことが考えられる。2-DG よるに対するストレス応答が活性化していることが考えられグルコースの細胞内への取り込みの抑制は DNA 修復をる。獲得放射線耐性細胞では、ピルビン酸、乳酸による阻害し、放射線増感効果を持つことを明らかにした。

抗酸化作用とともに、蓄積した ROS に対するストレス以上の結果から、放射線治療によるがんの根絶には、応答により、新たな放射線による ROS の発生を抑制し、がん細胞のエネルギー代謝の抑制が有効であることを明

放射線に耐性を獲得することが考えられる。

らかにした。
5志謝

村

辞本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記

念財団より研究助成を受け賜わりましたことを深く感謝申し上げます。
参考文献
1）T. Shimura, et al.: Oncogene, 29, 4826-4837, 2010.
2）T. Shimura, et al.: International Journal of Radiation
Oncology Biology Physics, 80, 540-548, 2011.
3）T. Shimura. : J. Radiat. Res.（Tokyo）, 52, 539-544,2011.
4）T. Shimura, et al.: Oncogenesis, doi:10.1038/oncsis,
2012.

6

勉