紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用
放射線医学総合研究所

小

澤

俊

彦、竹

下

啓

蔵

There have been little reports about direct evidence of generation of free radicals including oxygen radicals duringexposure to ultraviolet (UV) light, although free radicals may be involved in various injuries caused by UV light. In thisstudy, generation mechanism of oxygen radicals during photodynamic reaction was examined precisely with in vitro spin
trapping technique, and then induction of radical reaction in skin of living mouse was examined under UV light by using
in vivo electron spin resonance (ESR) spectroscopy. ESR signal of hydroxyl radical (・OH) adduct of spin trapping agent,
DMPO, formed during uroporphyrin photosensitization increased in the presence of NADPH. This increase was suppressedby addition of scavengers of ・OH and singlet oxygen (1O2), and enhanced in deutrated solvent. The appearance of 1O2, as
determined by the oxidation of TEMPD, was delayed with an increase in the concentration of NADPH, while the productionof ・OH was upregulated. Addition of H2O2 did not increase the signal. These results suggest that the ・OH was produced
1O2-dependently, and that its production involves neither superoxide anion radical nor H2O2. An aqueous solution of
carbamoyl-PROXYL was injected intravenously as a redox probe to an anesthetized mouse, and ESR spectrum of the probe
was measured at the dorsal region of hair-removed ddY mice and hairless mice using an L-band ESR spectrometer with asurface-coil-type resonator. The rate of signal decay increased during irradiation of UV light. The increase was statisticallysignificant. The increase of signal decay rate was suppressed by pre-administration of spin trapping agent, PBN, while PBN
did not change the decay rate of non-irradiated mouse. These observations suggest that the estimation of radical generation
under UV-irradiation may be possible by using in vivo ESR spectroscopy with a nitroxyl redox probe./

１．緒ルが関わっていることが十分考えられる。

言

最近、UVA 照射によりウミホタル・ルシフェリンアナ

400 nm）と UVB（280 - 320 nm）で、これらの過剰の曝露はログ（CLA）を塗布したマウス皮膚で発光が起こることが報告された８）。CLA はスーパーオキシドラジカル（O 2・-）

皮膚に日焼け、炎症、老化、免疫抑制、発がんなどを起こ

や一重項酸素（1 O 2）に特異的に反応すると考えられていす。最近の研究では、これら障害の一因として生体構成成ることから、これは活性酸素生成を比較的特異的に、しか分（核酸、脂質、タンパク質）の酸化や、ある種の遺伝子も非侵襲的に検出した最初の報告である。しかし、この場発現の促進による細胞内シグナル伝達の変化が関係してい合発光は紫外線照射をやめた直後から増加し始め、照射中

ることがわかってきている 1 - ４）。さらに、紫外線照射によに生きた動物皮膚でどのような活性酸素あるいはラジカル

る生体構成成分の酸化が活性酸素消去剤により抑制されるが生成されているかは不明である。

太陽光に含まれ地上にまで達する紫外線は UVA（320 -ことや生体内抗酸化物質の量が変動すること、培養細胞系

本研究では、まずウロポルフィリン光増感反応によるや切除皮膚の紫外線照射でスピントラップ -ESR 法により酸素ラジカルが確認されたことなどから、紫外線照射によO 2 発生系を利用して 1 O 2 が NADPH 等の存在で強力な酸素ラジカルである ･ OH に変換されることを in vitro でり活性酸素やフリーラジカルが生成することが示唆されて示した。さらに、生体内ラジカル反応の無侵襲測定が可能。また、電離放射線についても皮膚がんなどをな生体計測 ESR（電子スピン共鳴）と試料表面のラジカいる

1 , 2 , 5 - 7）1発生させ、また、in vitro の実験では水の電離分解によりヒドロキシルラジカル（･OH）などの活性酸素を生じさせル検出に最適なサーフェイスコイル型検出器を組み合わせ、ることが古くから知られている。活性酸素・フリーラジカ

ル反応を解析した。

生きた動物皮膚において紫外線等により惹起されるラジカ

ルは遺伝子の損傷や転写調節に関与することが培養細胞を２．実用いた実験等で示唆されていることから、紫外線・電離放射線による細胞内シグナル伝達に活性酸素・フリーラジカ

In vitro の光増感反応における活性酸素の測定

酸素ラジカルの生成は 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide

Non-invasive measurement of radical
reactions in skin induced by UV and ionizing
radiation and its application to evaluation ofantioxidants for protection of skin injury.

（DMPO）を用いたスピントラップ法による DMPO 付加体

Toshihiko Ozawa, Keizo Takeshita

により調べた。ウロポルフィリン（UP）と DMPO あるい＊

National Institute of Radiological Sciences
＊

２. １

験

の生成により、また 1 O2 の生成は TEMPD の酸化による
2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidone-N-oxyl（TEMPON）の生成
は TEMPD を含み 20mM リン酸緩衝液（pH7.4）で調製した試料溶液を ESR 測定用の石英製フラットセルに入れ、室− 56 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用

温で可視光線を照射し、X- バンド ESR（JEOL JES RE-1X）

ミ箔で覆った後、マウスの上方からラジカルリサーチ社製で測定した。過酸化水素（H2 O2）は Frew らの方法

でRUVF- 203 S 型紫外線照射装置に 290 nm カットフィルター測定した。この方法では H2 O2 は 4-aminoantipyrine およびを装着して行った。この装置は光源に水銀キセノンランプ

phenol と反応し、505nm に吸収極大をもつ quinoneimine

を用いており、365 nm、410 nm 及び 435 nm にピークを持つ。

９）chlomogen を生成する。いずれも、可視光源として反射板

３．結と集光レンズを装備したタングステンランプを用いた。光
照射はスピントラップ法では 0.7W/m 2 で、H2 O2 の定量に

３. １

O2 依存的酸素ラジカルの生成

1

3．1．1

は 10W/cm で行った（SL021/FQI 検出器を装着した IL
2

1400A 光量計（International Light, Inc.）による計測）。

果

NADPH 存在下の ･OH の生成

UP を NADPH と DMPO の存在下光照射したところ、4 本線のESR スペクトルが観測された（図 1A）。このスペクトルはピ

２. ２

紫外線照射によるラジカル生成の in vivo 検出

除毛した ddY 系マウス（雄性 , ４週齢）あるいはヘアーク比（1:2:2:1）と超微細分裂定数（a N=a H=1.49mT）から、DMPO の ･OH 付加体（DMPO-OH）のスペクトルと同レスマウス（雄 , ５週齢）をペントバルビタールナトリウ

定された。このスペクトルのシグナル強度は NADPH を省ムで麻酔し、ESR マグネットの間にうつ伏せに固定した。

いたときには小さく（図 1B）、また暗所に同じ時間おいたと尾静脈より 3 -carbamoyl- 2 , 2 , 5 , 5 -tetramethyl-pyrrolidine-N-

きにはシグナルが検出されなかった。この反応系にエタノー

oxyl（carbamoyl-PROXYL）水溶液（280 mM、60 µL）をルあるいはぎ酸ナトリウムを存在させたところ、DMPO-OHのシグナルは小さくなり、代わりに DMPO の ･CH（OH）

投与し、直ちにサーフェイスコイル型共振器を背部皮膚に当てて ESR を測定した。ESR 測定装置は、直径 5 mm

CH3 付 加体（aN=1.59 mT, aH=2.29 mT）あ るいは ･CO 2 −付の電子同調サーフェイスコイル型共振器 10、11） 並びに磁場加体（aN=1.57 mT, aH=1.87 mT）に由来する 6 本線シグナ

変調コイルを日本電子製 L- バンド ESR 測定装置に接続しルが観測された。エタノール、ぎ酸ナトリウム、あるいはて用いた。紫外線照射はマウスの照射部以外の部位をアル

dimethylsulfoxide（DMSO）を添加した場合には DMPO-OHのシグナルが３− 30% に減少した（図１、表１）。これらの・ことから検出されたDMPO-OH の 70% 以上は O2 の DMPO

付加体の分解などによるものではなく、遊離の ･OH と DMPOとの反応によるものであることが示唆される。
3．1．2 ･OH の生成における 1O2 依存性

NADPH 存 在 下 の DMPO-OH の シ グ ナ ル は 1 O 2
消 去 剤 で あ る ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム、L- ヒ ス チ ジ ン、
1 , 4 -diazabicyclo[ 2 . 2 . 2 ]octane（DABCO）の添加で完全に消失した（表１）。アジ化ナトリウムを添加した場合には、･ OH とアジ化ナトリウムとの反応で生じる ･ N 3 の DMPO
付加体のシグナルはほとんど検出されなかった（図 1 E）。
1

O 2 の寿命は溶媒を重水素化することで延長されることが

表１ NADPH 存在下 UP 光増感反応で生成する DMPO-OHに及ぼす活性酸素消去剤の影響

図 1 UP 光増感反応で生成した DMPO 付加体の ESR スペクトル(A) UP+NADPH+DMPO 2 分間照射 , (B) UP+DMPO 2 分
間照射 , (C) UP+NADPH+DMPO+ エタノール 2 分間照射 ,(D) UP+NADPH+DMPO+ ぎ酸ナトリウム 2 分間照射 , (E)
UP+NADPH+DMPO+ アジ化ナトリウム 2 分間照射 , ( ○ )DMPOの ･OH付加体, (△) DMPOの ･CH(OH)CH3 付加体 , (◇)
DMPO の ･CO2− 付加体 .

− 57 −

知られているため、･ OH の生成における 1 O 2 の関与を確認するために、反応溶媒を重水素化して同様に DMPO-OH の生成を調べた。97 % の水を重水に置き換えると DMPO-OHの生成速度と生成量が共に増加した（図２）。これらのこと
1･
は、 O 2 が OH の生成中間体であることを強く示唆する。

･OH の生成と 1 O 2 の関係を調べるために、･OH と 1 O 2 を別々に測定し重ね描きした（図３）。NADPH の存在しない
ときには TEMPON のシグナルが時間と共に増加した。このシグナルは 1 O 2 の消去剤であるアジ化ナトリウムや Lヒスチジンの存在で減少したが、･ OH 消去剤、カタラー
ゼ、およびスーパーオキシド・ジスムターゼ（SOD）の存
在はシグナル強度に影響しなかった（表２）。このことはTEMPD から TEMPON への酸化はこの条件下では 1 O 2 に特異的であることを示している。この系に NADPH を存在させると TEMPON のシグナルの出現にラグタイムが生じた。このラグタイムは NADPH の濃度が増加するに従い

図2

重水素化溶媒中での DMPO-OH の増加
UP+NADPH+DMPO を H2O ( ○ ) あるいは 97 % D2O -3%H2O ( ● ) 中で調製し、光照射した。

表 2 NADPH 非存在下 UP の光増感反応で生成する TEMPON に及
ぼす活性酸素阻害剤の影響

図 3 UP 光増感反応での DMPO-OH および TEMPON 生
成における NADPH の効
UP+DMPO に NADPH を (A) 0M, (B) 7M, (C) 33 M,
and (D) 167M を添加して光照射した。

− 58 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用延長された。一方、DMPO-OH の生成速度は NADPH のの生成における H 2 O 2 の役割を確認するために、UP およ

濃度が増加するに従い増加した。このことは、NADPH 依
存的に 1 O 2 が ･ OH に変換されることを意味する。このとOH の生成を調べた。図４に示すように DMPO-OH のび UP-NADPH 系に 0 . 63 mM の H 2 O 2 を添加し DMPO-は、 O 2 と NADPH との反応が O 2 と TEMPD との反応

生成は H 2 O 2 の存在下でも増加しなかった。このことは、
H 2 O 2 から ･ OH への変換はたとえ H 2 O 2 が生成されてもこに比べてはるかに速いためと推測される。

の反応系では起こりにくいことを示している。またその結き TEMPON のシグナルの出現にラグタイムが見られるの
1

3．1．3
1

1

果は同時に、DMPO-OH の生成を SOD が増加させ、DFO

O2 依存的 ･OH の生成経路が減少させたのは ･OH 生成が H 2 O 2 の鉄触媒反応に由来

1O 2 は NAD(P)H により一電子還元あるいは二電子還元

されてそれぞれ O 2 ･- 12、13）、H 2 O 2 へ変換されること 14） がすでに報告されている。O 2 ･- や H 2 O 2 は金属触媒下 ･ OHしたためではなく、SOD および DFO の別の反応によるものであることを示唆する。SOD は Cu 触媒 ･ OH 生成反応を起こし 15）、DFO は ･ OH を消去することが報告されてを生成することがわかっている。NADPH 存在下の UP 光増感反応で検出された ･ OH が O 2 ･- や H 2 O 2 を経由してでいる 16）。

きたものか否かを調べるため、DMPO-OH の生成に及ぼ

３. ２

In vivo におけるラジカル反応の検出

す desferrioxamine（DFO）、SOD およびカタラーゼの影

3．2．1

サーフェイスコイル型共振器で測定された響を調べた（表１）。その結果 DFO およびカタラーゼはESR シグナル

DMPO-OH の生成を減少させなかった。SOD は DMPO-

Carbamoyl-PROXYL をヘアレスマウスに静脈内投与

OH の生成をわずかに増加させたが、ここにカタラーゼをした後、背部にてサーフェイスコイルを用いて ESR を存在させても増加は抑えられなかった。このことは SOD

測定すると、ほぼ等強度の３本線シグナルが観測されにより DMPO-OH の量がわずかに増加した結果が SOD
による O 2 ･- の不均化により H 2 O 2 の生成が増加したた

た。そのシグナルの時間変化を図 5 A に示す。シグナルはめではないことを示している。カタラーゼは存在濃度をた。一度剥離したマウスの皮膚を再びもとの場所へ戻し、21000 U/mL まで増加させても影響無かったが、DFO はその上にサーフェイスコイルを当てて、静脈内投与した

0 . 7 mM まで濃度を増加させると DMPO-OH のシグナルがcarbamoyl-PROXYL の ESR を測定すると、シグナル強度減少した。

は未処理のマウスの場合の約 2 / 3 となった。このことか

carbamoyl-PROXYL 投与２- ３分後まで増加した後減少し反応経路をさらに明らかにするために NADPH 存在下ら皮膚表面でサーフェイスコイル型共振器によって検出さUP の光増感反応で生成する H 2 O 2 を定量した。その結果れたシグナルのうち約 1 / 3 は皮膚に存在する carbamoyl-

約 50 µM の H 2 O 2 が生成された。カタラーゼおよびアジ化ナトリウムは完全に H 2 O 2 生成を抑えたが、SOD は影響なかった。DFO は H 2 O 2 の生成を少し増加させた。･ OH

図 4 UP 光増感反応による DMPO-OH 形成に及ぼす H2O2 添加の影響
UP+DMPO ( △ ), UP+DMPO+H2O2 (0.63 mM) ( ▲ ),UP+NADPH+DMPO ( ○ ) ,UP+NADPH+H2O2 (0.63mM)+DMPO ( ● )図 5 サーフェイスコイル型共振器により皮膚表 で測定された carbamoyl-PROXYL の ESR シグナル強度の時間推移と紫外線照射の影響
A. ヘアレスマウスに carbamoyl-PROXYL を尾静脈内投与し、背部においてサーフェイスコイル型共振器を装着した Lバンド ESR でシグナルの消長を追跡した。
B. Carbamoyl-PROXYL 投与 5 分後から紫外線を照射しながら測定した。

− 59 −PROXYL に由来するものと推定される。
3．2．2

表 3 ESR シグナル消失速度（/min）に及ぼす UV 照射の影響

シグナルの消長に及ぼす紫外線照射の影響

図 5 B は carbamoyl-PROXYL の投与５分後から紫外線を照射しながら測定したときのシグナル強度の時間推移を示す。明らかに照射してからのシグナルの消失が照射しない場合（図 5 A）に比べて増加した。剥離した皮膚を再び元の場所に戻したマウスを用いて同様の実験を行ったとこ
ろ、紫外線照射によるシグナル消失速度の増加は見られなかった。このことは、紫外線によるシグナル消失速度の増加は皮膚に存在するプローブの消失によることを示唆する。
シグナル消失速度を１次反応速度定数として求め、紫外線照射の有無で比較した結果を表３に示す。この実験はヘアレスマウス並びに除毛した ddY 系マウスを用いて行ったが、いずれの場合にもシグナル消失速度の増加は統計的に有意であった。
3．2．3
ラ

紫外線照射によるシグナル消失速度の増加とジカル反応の惹起

紫外線照射による carbamoyl-PROXYL のシグナル消失
速度の増加とラジカル反応惹起との関係を調べるためにス
ピントラップ剤 N-t-butyl-α-phenylnitrone（PBN）の投与
効果を調べた。図６に示す様に紫外線照射によるシグナ
ル消失速度の増加は PBN の投与により見られなくなった。
一方、紫外線照射しない場合には PBN はシグナル消失速

図 6 紫外線照射による ESR シグナル消失速度の増加に及ぼす PBN の影響
PBN は照射 35 分前に腹腔内投与した。

度に影響しなかった。このことから紫外線照射下では何ら(i) 反応系に H 2 O 2 を添加しても DMPO-OH の生成量の増かのフリーラジカルが生じ、それが carbamoyl-PROXYL

加は見られなかったこと、(ii) カタラーゼ、DFO はいずれのシグナル消失を促進した可能性が考えられる。

も NADPH 存在下の UP 光増感反応における DMPO-OH

４．考の生成に影響しなかったことから経路 ( 1 ) によるのではな

察

In vitro の光増感反応で得られた結果は、NADPH 存在
下で 1 O 2 を介して ･OH が生成することを示している。1 O 2
依存的 DMPO-OH の生成は様々な系で報告されており、次の経路が推定されている。

O2

1

O2

1

e-

[DMPO- O2 ]
1

H+

O2

1

-SH

-SOOH

17）

DMPO-OH (2)こで得られた結果はこれまでに報告されている経路とは異なる経路で ･OH が生成している可能性を示唆している。
NADPH はシステインと同様に生体内で絶えず turn over

DMPO
-SO• + •OH
DMPO-OH (3)NADPH の存在下で 1 O 2 依存的に O 2 ･- や H 2 O 2 の生成が起こることが報告されているも除去されよう。Buettner 18）はシステイン存在下ヘマト
ポルフィリン誘導体の光増感反応で ･ OH が生成すること

反応で同様な反応が起きているか否かは不明であるが、こDMPO-OH + •OH
DMPOたことから経路 ( 2 ) により DMPO-OH が生成された可能性を見いだし、-SH と 1 O 2 との反応による -SOOH がホモリ
ティカルに解裂して ･ OH が生成したと推定した。今回のeMetals •
DMPO
H2O2
O2•OH
DMPO-OH (1)DMPO

いことが明らかである。また、70 % 以上の DMPO-OH のシグナルがエタノールなどの ･ OH 消去剤の存在で失われされている物質である。本研究で得られた結果は皮膚で1O 2 が生成すれば ･ OH の様な傷害性の強い酸素ラジカルに即座に変換される可能性を示唆するものである。
一方、紫外線で生じるラジカル反応の in vivo 測定では、。NADPH 存在下の UP

12 - 14）

光増感反応では H 2 O 2 が生成することが確認されたため、もし遷移金属がこの反応系に存在すれば ･ OH が生成する

紫外線照射下で惹起されるラジカル反応を in vivo でモニ可能性が考えられる。しかし、本研究で見られた現象は、

ESR シグナル消失速度の増加が如何なる活性酸素あるいタリングできる可能性を示した。Carbamoyl-PROXYL の− 60 −

紫外線ならびに放射線により皮膚で惹起されるラジカル反応の無侵襲測定と皮膚障害予防を目的とした抗酸化剤評価への応用

はフリーラジカルの生成によるものかは、今後様々なラジ

determination of hydrogen peroxide and organic

カル消去剤を用いてそのシグナル消失への影響を調べるこhydroperoxides at low concentration in aqueousとにより明確になるものと思われる。また、更にこのラジ

solution, Anal. Chim. Acta, 155 , 139 - 150 , 1983 .

カル反応のモニタリング系が確立されれば、抗酸化剤ある

10）Hirata H, Walczak T, Swartz HM, : Electronically

いはサンスクリーン剤のラジカル反応の抑制に基づく intunable surface-coil-type resonator for L-band EPR

vivo における評価法として有用となるものと思われる。

spectroscopy, J. Magn. Reson.., 142 , 159 - 167 , 2000 .
11）高城徳子 , 竹下啓蔵 , 平田

拓 ほか 2 名 , : ポルフィ

（引用文献）リン症モデルマウスの光照射により皮膚で生じるラジ１）Fuchs J, : Potentials and limitations of the natural

カル反応の in vivo ESR 解析 , 磁気共鳴と医学 , 10 , 135 -antioxidants RRR-alpha-tocopherol, L-ascorbic acidand beta-carotene in cutaneous photoprotection, Free

138 , 1999 .
12）Peters G, Rodgers MAJ, : Single-electron transfer

Radic. Biol. Med., 25 , 848 - 873 , 1998 .

from NADH analogues to singlet oxygen, Biochim.

２）Ryter SW, Tyrrell RM, : Singlet molecular oxygen( O 2 ): a possible effector of eukaryotic gene expression,
1

Biophys. Acta, 637 , 43 - 52 , 1981 .
13）Inoue K, Matsuda T, Saito I, : A convenient method

Free Radic. Bio. Med., 24 , 1520 - 1534 , 1998 .

for detecting the superoxide ion from singlet oxygen３）Hattori Y, Nishigori C, Tanaka T, et al., : 8 -hydroxy-reactions of biological systems. Superoxide formation

2 '-deoxyguanosine is increased in epidermal cells of

from hydrogenated nicotinamide adenine dinucleotide

hairless mice after chronic ultraviolet B exposure, J.

and 5 -hydroxytryptophan, J. Photochem., 25 , 511 - 518 ,Invest. Dermatol., 107 , 733 - 737 , 1997 .

1984 .

４）Saliou C, Kitazawa M, McLaughlin L, et al., :14）Bodanes RS, Chan PC, : Singlet oxygen as a mediator

Antioxidants modulate acute solar ultraviolet

in the hematoporphyrin-catalyzed photooxidation ofradiation-induced NF-kappa-B activation in a human

NADPH to NADP+ in deuterium oxide, J. Biol. Chem.,
10 , 8554 - 8560 , 1977 .

keratinocyte cell line, Free Radic. Biol. Med., 26 , 174 -15）Yim MB, Chock PB, Stadtman ER, : Copper, zinc

183 , 1999 .
５）Connor MJ, Wheeler LA, : Depletion of cutaneous

superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical

glutathione by ultraviolet radiation, Photochem.

production from hydrogen peroxide, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87 , 5006 - 5010 , 1983 .

Photobiol., 46 , 239 - 245 , 1987 .
６）Taira J, Mimura K, Yoneya T, et al., : Hydroxyl16）Halliwell B, : Protection against tissue damage inradical formation by UV-irradiated epidermal cells, J.

vivo by desferrioxamine; what is its mechanism ofaction?., Free Rad. Bio. Med., 7 , 645 - 651 , 1983 .

Biochem. 111 , 693 - 695 , 1992 .
７）Masaki H, Atsumi T, Sakurai H, : Detection of17）Feix JB, Kalyanaraman B, : Production of singlet

hydrogen peroxide and hydroxyl radicals in murine

oxygen-derived hydroxyl radical adducts during

skin fibroblasts under UVB irradiation, Biochem.

merocyanine- 540 -mediated photosensitization: Analysis

Biophys. Res. Commun., 206 , 474 - 479 , 1995 .

by ESR-spin trapping and HPLC with electrochemical８）Yasui H, Sakurai H, : Chemiluminescent detection

detection, Arch. Biochem. Biophys., 291 , 43 - 51 , 1997 .

and imaging of reactive oxygen species in live18）Buettner GR, : Thiyl free radical production withmouse skin exposed to UVA, Biochem. Biophys. Res.

hematoporphyrin derivative, cysteine and light: a spin-Commun., 269 , 131 - 136 , 2000 .

trapping study, FEBS Lett., 177 , 295 - 299 , 1985 .

９）Frew JE, Jones P, Scholes G, : Spectrophotometric− 61 −