シリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発
横浜国立大学大学院工学研究院

飯島一智

In this study, epidermal and epidermal-dermal skin models were constructed using silica nano-nonwoven fabrics. Toconstruct the epidermal skin model, epidermal keratinocyte line, HaCaT cells, or primary normal human epidermal keratinocytes (NHEK) were seeded onto silica nano-nonwoven fabrics placed in cell culture inserts and cultured at the air-liquidinterface for two weeks in keratinocyte differentiation medium. In order to construct the epidermal-dermal skin model, fibroblast cell line, NIH3T3 cells, or primary normal human dermal fibroblasts (NHDF) were seeded and cultured for five days insilica nano-nonwoven fabrics prior to seeding of keratinocytes. Constructed models were evaluated by microscopic observation after hematoxylin and eosin staining, trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurement and quantification ofvarious epidermal/dermal-related gene expressions using real-time PCR. The thickness of epidermis of the models constructed with silica nano-nonwoven fabrics was thicker than that constructed in cell culture inserts. The expression of genes suchas hTGM1 and hLOR in epidermal models constructed on silica nano-nonwoven fabrics were much higher than those of cell
culture inserts. This means that silica nano-nonwoven fabrics may mimic the basal lamina structure and increase the functions of keratinocytes. In the construction of epidermal-dermal skin models, similar positive effect of silica nano-nonwoven
fabrics were observed. Finally, the prepared three-dimensional epidermal and epidermal-dermal skin models were evaluatedby a method similar to the OECD TG skin corrosiveness test. The three-dimensional skin models met the evaluation criteriaof the skin corrosiveness test. These results suggested the usefulness of the silica nano-nonwoven fabrics-based three-dimensional skin models.

1.

緒

動し三次元に分布することができ、十分な機械的強度によ言り長期的な細胞培養に伴う収縮を防ぐこともできる。さらEU 圏内における化粧品製品および原料の動物実験の完に高い物質拡散性を有し、三次元培養において問題となる全禁止を受け、我が国の化粧品メーカー各社も動物実験廃内部への栄養、酸素、増殖因子などの十分な供給が可能と止を表明しており、その代替法の開発が進められている。

なる。また、近年、シリカナノ不織布中で培養することで、皮膚刺激性試験としては、OECD テストガイドラインに収線維芽細胞のコラーゲン産生能が顕著に増加することを見載されている代替法としてコラーゲンマトリックスを用い出した 4）。

た人工皮膚三次元モデル 1）などが用いられているが、非常本研究では、シリカナノ不織布を細胞足場として用い、に高価である。今後、発展途上国を含めた世界中で実験動表皮層のみ、あるいは、真皮層と表皮層からなる人工皮膚物を用いない皮膚刺激性試験法を普及させるためには、よ三次元モデルを作製した。作製した人工皮膚三次元モデル

り安価で取り扱いの簡便な三次元皮膚モデルの開発が必要については、従来法である表皮モデルやコラーゲンを用いと考えられる。

た真皮 - 表皮モデルと比較し、シリカナノ不織布が表皮角

我々はシリカナノ不織布を用いた細胞の三次元培養法の開発に取り組んできた化細胞や線維芽細胞に与える影響について解析を行った。

2 - 4）。ゾル - ゲルプロセスを介して２．方電界紡糸により作製されるシリカナノ不織布は高い生体適合性を示すとともに、シリカのもつ高い熱安定性のためオ法

2. 1. 細胞剥離方法の検討

ートクレーブにより滅菌することができる。さらに、シリ皮膚モデルの作製にあたり、まず真皮層を構成する線維カナノ不織布は、細胞外マトリックス（ECM）を形態的に芽細胞の剥離方法の検討を行った。通常のトリプシン模倣することで細胞の高機能化に寄与する。高い空孔率を-EDTA を用いた剥離と感温性培養プレートを用いた剥離有し、細胞は多くの交互連結した孔を通じて不織布中を移について、それぞれの手法で剥離した細胞を播種した際のシリカナノ不織布への侵入能を評価した。両者に有意な差は認めなかったため、以降の実験ではより安価なトリプシ

Development of a versat ile t hree dimensional skin modelusing silica nano-nonwoven fabrics

ン -EDTA を用いた細胞剥離手法を採用することとした。

2. 2. 表皮のみからなる三次元皮膚モデルの作製
表皮のみからなる三次元皮膚モデルは、セルカルチャー

Kazutoshi Iijima
Yokohama National University

インサート内にセットしたシリカナノ不織布上にヒト表皮− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

角化細胞株 HaCaT または正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）測定により評価した。遺伝子発現解析では、各種表皮関連を播種し、市販の角化培地で 14 日間気 - 液界面培養し角遺伝子および真皮関連遺伝子の発現をリアルタイム PCR化させることで作製した（シリカ表皮モデル）。対照として、により定量した。リアルタイム PCR は hGAPDH およびセルカルチャーインサートに直接 HaCaT または NHEK をmGAPDH をコントロールとし、ΔΔCt 法により定量化した。

播種し、シリカ表皮モデル同様に角化培地で 14 日間の気さらに、OECD TG 皮膚腐食性試験 5）に準ずる手法により、- 液界面培養により角化させた（インサート表皮モデル）。

作製した各種三次元皮膚モデルを用いた皮膚腐食性試験を播種細胞数は用いるセルカルチャーインサートのサイズに行った。具体的には、陽性対照の 8 N KOH および 14 . 4 %よるが、例えば 12 ウェルセルカルチャーインサートを用

HCl 処 理 後 の 生 存 率 を 3 -（4 , 5 -Dimethyl- 2 -thiazolyl）いる場合には、播種細胞数は 2 . 5 × 105 cells とした。

- 2 , 5 -diphenyltetrazolium Bromide（MTT）アッセイにより定量化し、陰性対照の水に対する相対値で表した。

2. 3. 表皮と真皮からなる三次元皮膚モデルの作製

３．結

表皮と真皮からなるモデルは、マウス胎児線維芽細胞株

果カ ナ ノ 不 織 布 へ 播 種 し 5 日 間 培 養 し た 後、 上 部 か ら

3. 1. 不死化細胞株を用いた三次元皮膚モデルの作製と評価

HaCaT または NHEK を播種し表皮モデルと同様に角化さ

Fig. 1 に不死化細胞株を用いた皮膚モデルの組織像を示せることで作製した（シリカ真皮・表皮モデル）。対照は、す。シリカ表皮モデルにおいて表皮角化細胞はシリカナノ

NIH 3 T 3 または NHDF を含むコラーゲンゲルを作製し、不織布中には侵入せず、その表面において角化が起こって培養することなくその上部に HaCaT または NHEK を播種いることがわかった。シリカ表皮モデル（Fig. 1 b）の表皮し角化させて作製した（コラーゲン真皮・表皮モデル）。播層の厚みはインサート表皮モデル（Fig. 1 a）と比較してよ

種細胞数は用いるセルカルチャーインサートのサイズにより大きく、扁平重層構造が観察された。一方、シリカ真皮・るが、例えば 12 ウェルセルカルチャーインサートを用い表皮モデル（Fig. 1 c）の表皮層の厚みはコラーゲン真皮・NIH 3 T 3 または正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）をシリ5る場合には、播種細胞数は線維芽細胞が 5 ×10 cells、表表皮モデル（Fig. 1 d）と同程度であった。

5不死化細胞株を用いた三次元皮膚モデルの構築では、表皮角化細胞が 2 . 5 × 10 cells とした。

皮層を構成する表皮角化細胞 HaCaT がヒト由来、真皮層2. 4. 作製した各種三次元皮膚モデルの評価を構成する線維芽細胞 NIH 3 T 3 がマウス由来の細胞株で作製した各種三次元皮膚モデルについては、形態、バリあるため、表皮層と真皮層の遺伝子発現を区別して評価す

ア機能および遺伝子発現に基づいて評価を行った。形態観ることができる。遺伝子発現解析の結果の概要を Fig. 2 に察のための試料はパラフィン包埋ブロックをミクロトームまとめた。シリカ表皮モデルでは、インサート表皮モデルにより薄切後、ヘマトキシリン - エオジン（HE）染色を行と比較して hTGM 1 , hLOR, hIVL, hFLG, hZNF 750 の有うことで作製した。バリア機能は経上皮電気抵抗（TEER）意な発現上昇がみられた。さらに NIH 3 T 3 細胞を播種したシリカ真皮・表皮モデルでは、コラーゲン真皮・表皮モデルと比較して、hTGM 1 , hTGM 2 , mCol 4 の発現が有意に高かった。

Fig. 1 Hematoxylin and eosin staining of skin model
constructed with immortalized cell lines− 68 −

Fig. 2 Summary of gene expression in skin models
constructed with immortalized cell linesシリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発

3. 2. 初代培養細胞株を用いた皮膚モデルの作製
次に、より生体に近い初代ヒト細胞を用いて各種皮膚モデルを作製した。各種モデルについて MTT アッセイにより細胞活性を評価した。結果、シリカ表皮モデルはインサート表皮モデルよりも、シリカ真皮・表皮モデルはコラーゲン真皮・表皮モデルよりも高い活性を示した。
遺伝子発現解析の結果の概要を Fig. 3 にまとめた。シリカ表皮モデルではインサート表皮モデルと比較して
hTGM 2 の発現上昇がみられた。また、シリカ真皮・表皮
モ デ ル で は、 シ リ カ 表 皮 モ デ ル と 比 較 し て hTGM 1 ,Fig. 3 Summary of gene expression in skin models
constructed with human primary cells

hTGM2, hZNF750 が高発現であった。さらにシリカ真皮・表皮モデルは、コラーゲン真皮・表皮モデルと比較して
hTGM 2 , hCOL 1 , hCOL 3 , hCOL 4 の発現が上昇した。

3. 3. 皮膚モデルとしての利用可能性の評価
作製した各種三次元皮膚モデルについて、OECD TG 皮
膚腐食性試験 5）に準ずる手法により評価を行った。シリカ
表皮モデルにおいて皮膚腐食性の評価基準である、陽性対照物質添加後 3 min における生存率 50 ％以下、または添加後 60 min における生存率 15 ％以下のいずれかを満たしていた（Fig. 4）。

４．考察

シリカナノ不織布を細胞足場として用い、不死化細胞株
または初代培養細胞より表皮のみからなる皮膚三次元モデ
ル（シリカ表皮モデル）
および、真皮と表皮からなる皮膚三Fig. 4 MTT assay of primary cell skin models conductedaccording to protocol of skin corrosion test次元モデル（シリカ真皮・表皮モデル）を作製した。
シリカ表皮モデルは扁平重層構造を有しており、表皮層に、過去の我々の報告 4）と同様にシリカナノ不織布中におの厚みは、セルカルチャーインサート内で作製される従来ける三次元培養が線維芽細胞の機能を高めたと考えられる。の表皮モデルと比較して 2 倍程度の厚みを有していた。イ

次に、より生体に近い初代ヒト細胞を用いて各種皮膚モンサート表皮モデルと比較してシリカ表皮モデルにおいてデルを作製した。MTT アッセイにおいてシリカ表皮モデ発現が亢進していた遺伝子群について詳細に調べると、

ルはインサート表皮モデルよりも、シリカ真皮・表皮モデ

hTGM 1 および hLOR は角化マーカーであり、hIVL およルはコラーゲン真皮・表皮モデルよりも高い活性を示した。

び hFLG はバリア機能に関連するタンパク質をコードし、シリカナノ不織布を用いて作製した両方の三次元皮膚モデ

hZNF 750 はマーカー細胞増殖・接着マーカーである。こルでは細胞数が多く、播種後の増殖能が高い可能性が示唆

れより表皮層の厚みの増加は、表皮角化細胞の高機能化（表された。

皮の角化、バリア機能上昇や細胞増殖の促進）によるもの

遺伝子発現解析の結果、シリカ表皮モデルではインサーと推測された。シリカナノ不織布の剛性の高い繊維構造がト表皮モデルと比較して hTGM 2 の有意な発現上昇が確

形態的に基底膜構造を模倣することで、その上部に播種さ認された。TGM 2 は表皮の基底層付近の細胞において高れた表皮角化細胞の機能が亢進された可能性が考えられる。

発現することが知られている。さらにシリカ真皮・表皮モ一方、シリカ真皮・表皮モデルの表皮層の厚みはコラー

デルでは、コラーゲンモデルと比較して hTGM 2 , hCOL 1 ,ゲン真皮・表皮モデルと同程度であったが、表皮角化細胞

hCOL 3 , hCOL 4 の発現が有意に上昇した。これらの結果の角化に関わる hTGM 1、表皮の基底層付近の細胞においは、初代培養細胞を用いた場合にも、不死化細胞の結果同て高発現する hTGM 2 および真皮の基底膜付近の細胞にお様に表皮細胞の高機能化がもたらされることを表している。

いて高発現する mCol 4 の発現が有意に高かった。シリカ

興味深いことに、シリカ真皮・表皮モデルではシリカ表皮表皮モデルと同様にシリカナノ不織布の剛性の高い繊維構モデルと比較して hTGM 1 , hTGM 2 , hZNF 750 の有意な造が基底膜を模倣することで表皮の角化を促進するととも発現上昇が確認され、線維芽細胞との共培養による影響が− 69 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

不死化細胞株を用いた時と比較してより顕著にみられた。

く、安価で安定的に供給可能である。今後、皮膚腐食性試

これはおそらく、初代培養細胞においては線維芽細胞が分験における被験物質の種類を拡大して検証を行うことで、泌し表皮角化細胞に影響を与える因子の分泌量が多い、あシリカナノ不織布を用いた新規皮膚モデルの有効性を明ら

るいは表皮角化細胞のこれらの因子への感受性が高い、たかにする予定である。

めと考えられる。
最後に、作製した各種三次元皮膚モデルについて、
5）（引用文献）

OECD TG 皮膚腐食性試験 に準ずる手法により評価を行

1） OECD TG439

った。作製した各種三次元皮膚モデルは、皮膚腐食性試験

2） Iijima K, Ishikawa S, Sasaki K, Hashizume M,Kawabe M, Otsuka H, Osteogenic differentiation ofの評価基準を満たしていた。
三次元皮膚モデルのバリア機能を評価するために実施しbone marrow-derived mesenchymal stem cells in

た TEER 測定では、シリカナノ不織布とセルカルチャー

electrospun silica nonwoven fabrics, ACS Omega, 3,10180-10187（2018）．

インサートとの間に生じる空隙の影響のため、極端に低い値を示し、正確な評価を行うことができなかった。今後、

3） Ishikawa S, Iijima K, Sasaki K, Hashizume M,作製した三次元皮膚モデルを固定するなどの対策を講じた

Kawabe M, Otsuka H, Cartilage differentiation of bone

うえで、物質透過性とともに評価を行う予定である。

marrow-derived mesenchymal stem cells in three-５．総

dimensional silica nonwoven fabrics, Appl. Sci., 8, 1398

括（2018）．

シリカナノ不織布を細胞足場として用い、表皮層のみ、4） Ishikawa S, Iijima K, Matsukuma D, Iijima M, Osawa

または真皮層と表皮層からなる皮膚三次元モデルの作製に

S, Otsuka H, Silica-based nonwoven fiber fabricated by成功した。シリカナノ不織布は表皮角化細胞や線維芽細胞

electrospinning to promote fibroblast functions, Bull.の機能を高め、優れた皮膚三次元モデルの構築を可能にす

Chem. Soc. Jpn., 93, 477-481（2020）．

ることが示された。さらに、化学合成されるシリカナノ不5） OECD TG431

織布は動物由来のコラーゲンのような供給リスクなどもな− 70 −