新発見の糊代を持ったタンパク質の基礎と応用（タンパク質接着能を有する化粧品素材の開発）
東京工業大学広瀬

生命理工学部茂久Trappins are a family of unique proteins that have recently been identified and shown to have an anchoring
sequence at their N-termini through which they become covalently trapped at the site of action. A typicalexample of the trappin family members is the elastase inhibitor elafin which is composed of two domains: theN-terminal transglutaminase substrate domain or "cementoin" domain that serves as an anchoring sequence andthe C-terminal inhibitor domain having a compact structure stabilized by four disulfide bonds and therefore called"four disulfide core" or "WAP motif". In this study, as summarized below, we characterized the cementoin moiety
which has an important potential application in developing intelligent cosmetic materials and further carried out aseries of basic research on trappins such as molecular evolution of trappins.
Two types of derivatives of the cementoin-like anchoring sequence of trappin-1 were produced andcharacterized. The cementoin-like sequence (cem) was first elongated by tandemly linking its cDNA andexpressing it in E. coli. Using the genetically engineered cem-cem, the anchoring sequence rich in Gln, Lys,and Pro was shown to have a random coil structure and to serve as a good substrate for transglutaminase, acharacteristic very useful for developing the biotechnology of protein cross-linking or protein gluing. As a second
construct, we prepared a fusion protein of cem and green fluorescent protein (GFP). The useful properties of thecomponent proteins are maintained in the fusion protein, namely we succeeded to prepare a fluorescent cementoin
moiety that will be of special interest and importance in protein engineering.
Previous studies showed that trappin genes, especially of the pig, have undergone rapid evolution, producing
trappins with a broad spectrum of action. To understand the evolution of such a rapidly evolving multigene family,
we characterized the trappin genes and found that the intron sequences are homogenized by gene conversion.
Similar mechanisms may also operate in the other genes whose intron sequences are conserved much highly thanthe exon sequences.
In summary, 1) using the newly discovered adhesive protein "cementoin" and its family members, we developed
a powerful method for protein cross-linking. 2) The secondary structure of cementoin was determined using
recombinant cementoin. 3) Fluorescent cementoin was prepared by fusing it with green fluorescent protein. 4)
Evolution of cementoin family genes was clarified.

とが分かった（図１）。すなわちＮ末端側に Lys と

１ 緒 言

Gln に富む繰り返し配列があり，この部分を介し

私たちは最近働き場所に共有結合でとどまるとてトランスグルタミナーゼによって他のタンパクいう風変わりなタンパク質を見つけトラッピン

質に架橋されることが明らかになった。糊代に相１−９）。働き場所にトラップ

当する部分に私たちはその働きにちなんで，セメされるという意味と次に述べるようにトランスグ

ントインと命名した４）。セメントインないしはそ

ルタミナーゼ（Transglutaminase）の基質になるとの誘導体を利用すると，タンパク質の接着技術がいう意味からそう名付けた。cDNA 及び遺伝子を開発できるのみならず，皮膚の保護剤や枝毛防止

クローニングして構造を決定したところ，このタ剤として化粧品の分野でも有用な素材になると考ンパク質のＮ末端に糊代に相当する部分があるこ

えられるので，本研究ではセメントインを遺伝子（Trappin）と命名した

Properties, evolution, andcosmetological aspects of trappinsthat have recently been discovered
as a new protein family and shownto have anchoring sequences
Shigehisa Hirose
Department of Biological Sciences,
Tokyo Institute of Technology

工学的に生産し，その性質を明らかにするとともに，応用の可能性を探った。また基礎の観点から特に興味が持たれるセメントイン部分の由来を明らかにするべく，遺伝子レベルで，詳細な分子進
化学的な解析を行った。

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図１ Structural features of trappins. A) Covalent cross-linking of trappins to otherproteins through the transglutaminase substrate domain. B) Domain structure of thetrappin precursor. C) Mechanism of action of transglutaminase that catalyzes theformation of the isopeptide bond. Glutamine residue (Q) acts as an acyl donor andlysine (K) residue serves as an acceptor. The catalytic sulfhydryl group involved in
the formation of an acylenzyme intermediate is also shown (for review, see Refs.
1 and 2). D) Three dimensional structure of the WAP motif of human trappin 2(SKALP/elafin) determined by x-ray crystallography and NMR spectroscopy. Four
disulfide bonds are indicated by broken lines.

を担体とするアフィニティーカラムにかけ精製し２ 実 験た。約 20mg の目的産物がマルトース結合タンパ
ク質との融合タンパク質の形で得られた。この精２. １ 遺伝子工学的生産法と精製法
実験手順の概要を図２に示す。まず，Trappin
ないしは Trappin のセメントイン部分をコードす
る cDNA を発現ベクター pMAL− p（New England
Biolabs 社）に組み込み，大腸菌に導入し，マルト
ース結合タンパク質との融合タンパク質の形でペリプラズムに分泌されるようにした。このようにして作製した形質転換大腸菌を４L の規模で４〜５時間 振とう培養したのちに，IPTG で誘導をかけて，目的タンパク質を多量に作らせた。集菌後，Cold osmotic shock をかけて，ペリプラズム中のタンパク質を回収し，これをアミロース・レジン

製標品にファクター Xa（プロテアーゼ）を作用させて，不要なマルトース結合タンパク質部分を切断除去し，ヒドロキシアパタイト・カラムに通すことにより簡便かつ効率よく目的物を得る方法を開発した。最終的な収量は約５mg であった。
２. ２ 接着能の評価
上記のようにして得た Trappin ないしはセメン
トインに触媒量のトランスグルタミナーゼを作用させ，それらが架橋接着されて重合体になる様子を光散乱法及び SDS ポリアクリルアミドゲル電− 19 −

気泳動法によりモニター
した。架橋接着反応の進行は，散乱光の増加ない
しは電気泳動ゲル上の単体に相当するバンドが消失し多量体に相当する高分子量のところに新しくバンドが現れることにより検出できる。
２. ３ その他
遺伝子工学的手法（プラスミドの調製，PCR，

図２ 糊代の役割を たすセメントインの遺伝子工学的生産と精製法の概要。

塩基配列の決定），抗体の作製，免疫化学的組織染色，インサイチュハイ
ブリダイゼーション等は通常の方法に従った。

３ 結果と考察３. １ セメントイン及びその同族分子の生産と性質
タンパク質の接着技術を確立する上で要となる
セメントインを遺伝子工学的に大腸菌に作らせる系を構築し，セメントインの性質を明らかにした。
同様に，本研究を通して新たに発見した同族分子についても，大腸菌を利用した発現系とアフィニ
ティークロマトグラフィーによる精製系を確立した。このようにして得た産物は，予想通り触媒量のトランスグルタミナーゼによって非常に効率よく架橋され，優れたタンパク質接着能力を有する
ことが確かめられた（図３）。
３. ２ セメントインの２次構造
糊代として働くセメントイン領域は，一次構造上は，Lys と Gln に富む繰り返し構造をとっていることが明らかになっているが，より高次の構造については不明である。そこで，大腸菌で生産したセメントインを用いて二次構造の決定をおこなった。立体構造に関する情報は，セメントインの接着能を理解し，応用に役立てるためには極めて重要である。

図３ 蛍光性セメントイン（His6-GFP-Cem）の調製と評価。大
腸菌用の発現ベクターにクラゲの蛍光タンパク質（GFP）とセ
メントイン（Cem）の cDNA を組み込み，産物をインクルー
ジョン・ボディとして回収し，尿素で可溶化後，Ni キレート
カラムにかけて精製した。精製標品を大 の中性緩衝液で希釈
後４℃に５日間放置し，蛍光性とした。低温で徐々に酸化させることにより蛍光を発するクロモフォアが形成されたものと推定される。トランスグルタミナーゼ（TGase）の添加により His6-GFP-Cem は速やかに架橋接着され，SDS- ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって はっきりと識 できるほど高分子化した（レーン２と４）。GFP は，一旦蛍光性になるとクロモフォアは極めて安定で SDS のような界 活性剤の存在下でも蛍光を失わないという利点を有する。

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セメントインを大腸菌でマルトース結合タンパる。

ク質との融合タンパク質として発現させ，セメン
トイン部分のみを切り離し精製した後に，円偏光

３. ４ 蛍光性セメントイン分子の作製

二色性（CD スペクトル）を測定することによって，

セメントインは期待どおり非常に優れたタンパ二次構造である α ヘリックス，β 構造の含量を

ク質の接着剤になることがわかったが，さらにセ求めたところ，予想外に，特徴的な二次構造は持メントイン分子を標識することが出来れば利用価

たず，ランダムコイル構造をとっていることが判

値は格段に上がる。そこで，最近よく利用されて明した。最初は α ヘリックス構造が主ではないいるクラゲ由来の蛍光性タンパク質 GFP（Greenかと予想していたが，よく考えてみると，ランダ

Fluorescent Protein）との融合タンパク質として発ムコイルの方がより効率よくタンパク質を架橋す

現させることを試みた。GFP の N 末端と C 末端るのに適した構造といえそうである。

にセメントインを結合させた融合タンパク質をデザインし，それぞれの N 末端に精製のためのヒス

３. ３ 局在部位の同定

チジン・タグを付けて大腸菌で発現させた。いず

精製標品に対する抗体も作製し，ウエスタン分

れも不溶性のインクルージョンボディとして回収

析や免疫組織化学やラジオイムノアッセイの開発されたが，N 末端にセメントインを結合させたもに応用した。その結果，セメントイン及びセメンのでは，Renaturation 後も GFP の蛍光は戻らなか

トイン様接着分子は生体中では細胞外マトリック

ったので，C 末端にくつけた His6− GFP- セメント

スタンパク質に架橋されて存在すること，気管やインについて詳細に検討することにした。
His6− GFP- セメントインをインクルージョンボ

腸の上皮細胞に多く発現しており，血中にも存在
４，６）。組織分布に関しディとして回収し，6M 尿素で可溶化後，金属キては，RNase プロテクションアッセイによってもレートカラムで精製した。精製標品を希釈法によ

気管や腸に多いことを確かめた。さらにヒトのあって Renaturation し，低温に放置することによりる種の病態（Psoriasis，乾癬）では，セメントイン

蛍光を発するようにした。希釈時に，0.1％のポリが異常に発現し，皮膚等の結合組織の病気になる

エチレングリコール（MW6000）を共存させるとすることが明らかになった５）ことが判明した 。以上の結果は，本研究対象でRenaturation の効率が良くなることも見い出した。

ある接着因子が基礎及び応用の両面において，極蛍光性とすることに成功した His6− GFP- セメ

めて重要な因子であることをよく物語っている。

ントインにトランスグルタミナーゼを作用させる

私たちが最初に見つけた Trappin（Trappin−１）と，His6− GFP- セメントインは容易に重合し高分は，上述のように血中にも多量に存在するが，そ子化した。すなわち His6− GFP- セメントインは，

れがどこから来るのか不明であった。そこで，こ当初のもくろみどおり，蛍光性のタンパク質接着の問題を解く手がかりを得るために，インサイチ剤として機能することが確かめられた（図３）。最ュ ハイブリダイゼーションにより Trappin−１の近では改良型 GFP として色調の異なるものも開局在部位を決定した。ブタの小腸切片を用いて，発されており，私たちのセメントインと組み合わTrappin−１ mRNA の局在を調べたところ，陰窩

せれば魅力的な化粧品素材の一つになるものと期

底部の内分泌細胞（enteroendocrine cells）がきれ

待されよう。

７）

いに染色された 。エンテロエンドクリン細胞は，種々の腸管ペプチドを合成・分泌しており，ここ３. ５ セメントイン遺伝子ファミリーの出来方

で Trappin−１が合成されている事実は，腸の陰窩と進化が血中の Trappin−１源であることを強く示唆すセメントイン領域すなわち糊代を持った興味深− 21 −

い一群のタンパク質が存在することを見つけ，そREST 遺伝子と Trappin の活性部位をコードしてれらの性質と応用の可能性について検討してきいる WAP モチーフの先祖遺伝子がエクソン・シ

た。これらのタンパク質は皮膚等の上皮組織を守ャッフリングすることによって出来たものと推定るという極めて重要な役割を担っていることからされる。

皮膚科学との関連においてもより詳細な生化学

トラッピン・ファミリーの進化系統樹を図５に的・分子生物学的な研究を進めなければならない示す。トラッピン・ファミリーのメンバーの数がが，もう一つ明らかにしなければならない根本的動物種によって大きく異なるのも特徴であるが，問題がある。すなわち進化の過程でどのようにしブタにおいてその傾向が特に強いので，ブタの近てこのように風変わりな構造を持つタンパク質が縁種（イボイノシシ，ペッカリー，カバ）で詳細な登場したかという根源的問題にも答えなければな

解析を試みつつある（図６）11）。この過程で，イボらない。この問題解決の糸口を見つけるために，イノシシのトラッピン遺伝子を解析した際に，以DNA データベースの検索をおこない，遺伝子構下に述べるように，予想外の大発見をした。

造の類似性等を比較検討したところ，セメントイ

Trappin 遺伝子は３個のエクソンと２個のインン領域は REST 遺伝子の一部から派生し（図４），トロンから成る（図６A）。エクソン１は５' 非翻

その後繰り返し単位の複雑な重複や除去等を経訳領域と分泌シグナル（pre-sequence）をコードて，今日の姿になったことが明らかになった（図し，エクソン２はセメントイン領域とそれに続

４）11）。上述の Trappin 分子の遺伝子は，従って，

く WAP モチーフをコードし，エクソン３は５' 非

図４ トラッピン（Trappin）遺伝子の由来。トラッピン遺伝子は，REST 遺伝子と SLPI 遺伝子を起源とすることが明らかになった。REST は Rapidly Evolving Seminal vesicle Transcribed の略で，精嚢で多 に作られている一群のタンパク質の総称であるが，セメントインのようにトランスグルタミナーゼの良い基質となり，架橋接着される。REST 遺伝子産物は，Seminal Vesicle secretory Protein ないしは Seminal Vesicle clotting Protein（SVP）あるいは Semenogelin（SEMG）と呼ばれる。SLPI は，Secretory Leukocyte Proteinase Inhibitor の略で，Antileukoproteinase（ALP）とも呼ばれる。SLPI に特徴的なことは，プロテアーゼインヒビター・ドメイン（WAP
モチーフ）を２個持つことである。第２の WAP モチーフをコードするエクソン（exon ３）が REST 遺伝子の後半と一緒になって，トラッピン遺伝子が出来たと考えられる。

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翻訳領域をコードする。すべてのトラッピン遺伝

子の場合イントロンの保存率が 98％と異常に高子において，エクソン２の変異率が周りのイントい（エクソンは 70％程度）のはなぜかがここ数年ロンに比べて極めて高く，これまでの分子生物学

大問題となっていたわけである９）。私たちはイボの常識では説明できない事実として注目を浴びてイノシシのトラッピン遺伝子を解析中に，この問いる。一般的には機能的制約のないイントロンのいに対する解答を得た。すなわち，ジーン・コン

方が変異しやすいと考えられ，実際にほとんどのバージョンによってイントロンの配列が一定にな遺伝子ではそうなっているので，トラッピン遺伝

るように置換されていることをジーン・コンバー

図５ トラッピン・ファミリーとその関連遺伝子の分子進化系統樹。

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図６ 偶蹄目におけるトラッピン遺伝子の種類と構造。これまでの解析で，ブタで５種類，イボイ
ノシシで２種類，ペッカリー，カバ，ヒトでそれぞれ１種類，合計 10 種類のトラッピン分子の構造が明らかになった。接着部分のバラエティーの豊富さは応用の観点から注目される。A, トラッ
ピンの代表ブタ・エラフィン（Trappin- ２）とその遺伝子構造。B, その他のトラッピン遺伝子ファ
ミリーの構造ジョンの中間体を捕まえることにより明らかにし４ 総 括た（図７）12）。このジーン・コンバージョンの生物学的意義は現在のところ不明であるが，イントロ

糊代に相当するセメントイン領域を有する一ンが保存されるメカニズムが明らかになったこと

群の内在性のタンパク質を発見し，トラッピン

で，今後この分野の大きな進展が期待できよう。

（Trappin）と総称することを提唱した。働き場所

基礎的には画期的な成果である。

にトラップされて機能を発揮しているからであ− 24 −

新発見の糊代を持ったタンパク質の基礎と応用（タンパク質接着能を有する化粧品素材の開発）

図７ トラッピン遺伝子のイントロンの保存機構。左の系統樹は，偶蹄目においてトラッピン遺伝子がどのように分子進化をし，出来てきたかを示す ; トラッピン遺伝子の数，塩基配列の類似性，及び PRE- １の有無に基づいて推定したものである。PRE- １は Pig Repetitive Element の略で，散在性反復配列（Short Interspersed Repetitive Element, SINE）の一種である。
SINE の有無は分子進化の時標として重宝されている。カバのトラッピン遺伝子には PRE- １（SINE）は無く，PRE- １の挿入はカバとイノシシ上科の分岐後に起こったと推定される。A と B には，見かけ上エクソン２の配列のみが変化し，イントロンの配列が保存されるメカニズムが２つ示されている。A は何らかの機構でエクソン２に変異が集中的に起こるとするもので，
現在信じられている進化の中立説では説明しにくい。B は，
変異はイントロンにもエクソンにもまんべんなく起こるが，途中で相同組換えによるジーン・コンバージョン（Gene Conversion）によってイントロンの配列が置換されるために見かけ上イントロンが変化しないように見える。B の可能性を強く示唆する結 がイボイノシシの解析から得られた。

る。さらにプロテアーゼ等をトラップして不活性謝 辞化するという意味も込められている。この興味深

本研究は以下の方々の献身的な努力に負うとこいタンパク質トラッピンは皮膚を守ることにも大ろ大である : Magdy A. Ghoneim（NEDO 研究員 ;いに貢献しており，化粧品学の観点からも興味深

現 , カイロ大学助教授），古川 真（博士課程大学

い研究対象である。本研究では，基礎及び応用の院生 ; 現 , 有人宇宙システム株式会社），古谷 裕

両面から解析を進め，以下の成果を得た。

（修士課程大学院生 ; 現 , 総合研究大学院生），加藤１）内在性の架橋接着因子であるセメントイン

明（博士課程大学院生 ; 現 , 理化学研究所特 研とその同族分子を利用して効率の良いタンパ究員），鈴木陽子（東京工業大学生命理工学部教務

ク質の接着法を開発した。

職員）。

２）セメントインを遺伝子工学的に量産し，そ
文 献の２次構造を推定した。
３）蛍光性のセメントインを調製し，セメント

１）広瀬茂久 , Ghoneim MA: 糊代をもったタンパ

インの付加価値を高めた。

ク質：タンパク質の局在化機構に新たな視点；

４）セメントイン遺伝子の出来方と進化を分子タンパク質の接着技術への応用にも期待。化学レベルで明らかにした。私たちが世に送り出と生物 34, 632-633, 1996.

したトラッピンが皮膚科学・化粧品学の分野

２）Schalkwijk J, Wiedow O, Hirose S: The trappinで有名になり，愛用されることを願ってやまgene family: proteins defined by an N-terminal

ない。

transglutaminase substrate domain and a
C-terminal four-disulfide core motif. J Invest− 25 −

Dermatol, in press (1998).

immunohistochemistry. J Biol Chem, 271, 29517-

３）Saheki T, Ito F, Hagiwara H, Saito Y, et al.:29520, 1996.

Primary structure of the human elafin precursor８）Hirose S, Furukawa M, Tamechika I, et al.:preproelafin deduced from the nucleotide

Discovery of a new type of proteinase inhibitor

sequence of its gene and the presence of uniquefamily whose members have an anchoring

repetitive sequences in the prosegment. Biochem

sequence. In: Bond J, Suzuki K (eds): Intracellular

Biophys Res Commun 185, 240-245, 1992.

Protein Catabolism. Plenum, New York, 1996, 43-４）Nara K, Ito S, Ito T, et al.: Elastase inhibitor

49.

elafin is a new type of proteinase inhibitor which

９）Tamechika I, Itakura M, Saruta Y, et al.:has a transglutaminase-mediated anchoring

Accelerated evolution in the inhibitor domains ofsequence termed "cementoin". J Biochem, 115,

porcine elafin family members. J Biol Chem, 271,563-567, 1994.

7012-7018, 1996.

５）Nonomura K, Yamanishi K, Yasuno H, et al.:10）Ghoneim MA, Hirose S: Fluorescent protein

Up-regulation of elafin/SKALP gene expression

glues: preparation, properties, and applicationin psoriatic epidermis. J Invest Dermatol, 103, 88-

for protein cross-linking of cementoin moieties of91, 1994.

trappins fused to green fluorescent protein. (in６）Kuroki J, Hosoya T, Itakura M, et al.: Cloning,

preparation)

characterization, and tissue distribution of11）Furutani Y, Kato A, Yasue H, Hirose S:

porcine SPAI, a protein with a transglutaminase

Evolution in Suidae of the trappin multigene

substrate domain and the WAP motif. J Biolfamily with unusually conserved intron

Chem, 270, 22428-22433, 1995.

sequences. (in preparation)７）Furukawa M, Suzuki Y, Ghoneim MA, et al.:12）Kato A, Furutani Y, Yasue H, Hirose S:

Cryptic origin of SPAI, a plasma protein with

Mechanisms of evolution of the trappin genea transglutaminase substrate domain and thefamily and unusual conservation of their intron

WAP motif, revealed by in situ hybridization andsequences. (in preparation)− 26 −