小皺形成に関わる
皮膚特異的プロテアーゼ SASPase 活性と加齢との関係
京都大学 物質−細胞統合システム拠点 柊研究室

松 井毅The epidermis layer of the skin is composed of basal, spinous, granular, and cornified cell layers. Skin aspartic protease(SASPase) is expressed primarily in the granular layer of human and mouse stratified epithelia. In a previous report, weused high throughput in situ hybridization screening to identify the mouse homolog of SASPase. We recently reported
that SASPase-deficient hairless adult mice showed characteristic dry-skin like phenotype. In this study, we analyzed therelationship between the mode of activation of SASPase and the aging of skin. In addition, we identified profilaggrin, as oneof endogenous substrates of SASPase. Profilaggrin processing activity by SASPase would be an important hallmark of agingof skin.
Copyright 2011 Wiley. Used with permission from Matsui et al., SASPase regulates stratum corneum hydration throughprofilaggrin-to-filaggrin processing. EMBO Mol. Med. 3:320-333, 2011.

１．緒

トロジーに関する問題は明らかになっていない。そこで、

言本研究課題では、マウスを用いて、SASPase の活性型定

しわのない肌は、若い皮膚の特徴であり、若々しく、美量法の検討と、SASPase の基質が Profilaggrin である事のしい肌を長い間維持する事は、精神や気力の充実に大きな証明と、SASPase による Profilaggrin の切断部位決定を行影響を与える。皮膚は、表皮・真皮・皮下組織の三つの区い、ヒトにおける活性測定法を将来的に行う為の基盤研究画から構成されるが、しわの形成は表皮・真皮の老化が原を行った。

因である事が明らかにされつつある。加齢に伴う、真皮に２．実おけるコラーゲンや弾性繊維等の劣化は大きなしわ（大じ験

水分蒸発量の変化や表皮柔軟性の変化により目尻等に出現

２．１ マウス表皮角質層における前駆体型・活性型
SASPase の検出する小じわが誘導されると考えられている１）。大じわの形無毛マウス（Hos:HR-1、４週齢及び 14 週齢、雌）の全身わ）の形成を促す事が知られている。一方、表皮における成機構は、UV 照射や Fiblin-5 欠損マウス

２）等を用いる事の 表 皮 角 質 層 の テ ー プ ス ト リ ッ ピ ン グ（SCOTCH, 3M,により解析が可能であるが、小じわに関しては、その形成Book tape）を１〜５回、６〜 10 回行った。得られた角質機構は依然として不明な部分が多く、モデルマウスも存在層をそれぞれ５ml の Urea 抽出液（5M urea，2 M thiourea，していなかった。我々は、皮膚特異的であり、表皮顆粒層

PBS，1mM EDTA）を用いて回収し、Amicon-ultra 10kDaに発現するレトロウイルス型アスパラギン酸プロテアーゼを用いて 50 ul に濃縮した。得られた角質層抽出液をブラSASPase（Skin ASpartic Protease）の欠損マウスを作製

ッ ト フ ォ ー ド 法 に よ り 蛋 白 質 を 定 量 し、 ５ug を SDS-３）し、その体側に小じわが形成される事を発見した 。また、

PAGE に供した。その後、抗 SASPase 抗体３）（99-217 aa を

最近、我々は、SASPase 欠損無毛マウスが、小じわのみ認識する抗体）を用いてイムノブロットを行い、前駆体型４）ならず、乾燥肌様表皮を呈する事も明らかにした（図１） 。 （32kDa）・活性型（15kDa）の SASPase を検出した。
このように、SASPase は、角質層水分量の調節に関わるなマウス表皮において、加齢と供に SASPase の活性がど２．２ SASPase 欠損無毛マウスにおける表皮分 化マーカーの発現のように変化するのか、発現量はどのように変化するのか、SASPase 欠損マウスを無毛マウス（Hos : HR-1）と戻し活性型 SASPase の産生量はどのように変化するのか、そ交配する事で作製した SASPase 欠損無毛マウスの皮膚表の比活性はどのように変化するのか、など基本的なコスメ

皮に対して Urea 抽出液（５ml）を用いて表皮抽出液を調プロテアーゼである事が明らかになってきているが、正常製し、様々な表皮分化マーカー（Keratin14，Keratin1，Involucrin，Loricrin）に対する抗体（COVANCE 社）を用
Activity of SASPase in Stratum Corneum
and Aging of Skin
Takeshi Matsui
Hiiragi Laboratory Institute for Integrated
Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto
Universityいたイムノブロットを行った。また、Profilaggrin の分解パターンを解析する為に、２．１の方法を用いて、テープストリップ 10 回分からの抽出液に対して抗 Filaggrin 抗体（COVANCE 社）を用いたイムノブロットを行った。

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図１ レトロウイルス型アスパラギン酸プロテアーゼ SASPase（a）ヒト及びマウス SASPase の構造
ヒト及びマウス SASPase は、N 末端側に膜貫通ドメインを持つがその役割は不明である。（黒エリア）また C 末端側にプロテアーゼ活性ドメインを持つが，ヒト・マウス顆粒層において、ヒトでは 28kDa 型（hSASP28）、マウスでは 32kDa 型（mSASP32）として細胞質に局在していると考えられる。マウスでは、
mSASP32 は 91 − 339aa として存在しており、それらはホモダイマーを形成し、自己分解により活性化し、プロテアーゼドメイン（Protease）のみを産生する。
（ヒトでは 14kDa；hSASP14、マウスでは 15kDa；
mSASP15）（b）抗 SASPase 抗体による成体無毛マウス皮膚表皮凍結切片に対する免疫蛍光染色像 SASPase は表皮顆粒層の最上層に発現する。点線；表皮と真皮の境界（c）SASPase 欠損無毛マウスは、小じわと乾燥肌様表皮を呈する。
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２．３ SASPase の内在性基質としての Profilaggrin リンカー配列の in vitro 切断実験

分解されずに蓄積し、このような表現系を呈する事が推測

２．２ で 得 ら れ た 結 果 よ り、 ダ イ マ ー・ ト リ マ ー のの基質配列の切断活性を解析する事により SASPase の活Profilaggrin が SASPase 欠損無毛マウスに蓄積していた事性を測定すれば、皮膚老化との関連性を検討できる可能性から、Profilaggrin リンカー配列が SASPase の基質であるがある。そこで、SASPase 欠損無毛マウスの表皮抽出液可能性が考えられた。そこで、Maltose-binding protein とに対して、様々な表皮分化マーカー（Keratin 14，Keratin

リンカー配列とヒトFilaggrin の融合蛋白質（MBP-hFilaggrin）

1，Involucrin，Loricrin）の免疫蛍光染色とイムノブロッを大腸菌にて発現させ、Maltose resin にて精製を行った。

４）
トを行った（図３）。SASPase 欠損無毛マウスにおいては、リコンビナントヒト SASPase は GST 融合蛋白質としてこれらの表皮分化マーカーには異常は認められなかった。

GST-SASP28（28 Da 型）を大腸菌にて、発現・精製を行い、しかし、３．１のような角質層抽出液に対するイムノブロッ

5mg/ml の濃度の GST-SASP28 を 50 mM phosphate buffer

ト法によって、バリア蛋白質 Filaggrin の分解パターンが異常（pH 6.0），700 mM NaCl, １mM EDTA, protease inhibitorになり、異常蓄積している事が明らかになった（図４）４）。

cocktail（Nakarai Tesque）において自己分解反応を 37℃，またイムノブロットのパターンから、SASPase の 基 質 は60 分 間 行 っ た。 次 に、1 ml の 5 mM phosphate buffer

Profilaggrin のリンカー配列である事が予測された。そこ（pH6.0），70 mM NaClにより希釈した後、200 ml のGlutathione

で、 リ コ ン ビ ナ ン ト Profilaggrin の リ ン カ ー 配 列 をSepharose 4B ビーズに対して二回素通りさせる事により、SASPase が 切 断 す る か ど う か を 検 討 し た。 マ ウ ス

活性型ヒト SASPase（14kDa；hSASP14）を精製した。精Profilaggrin のリンカー配列を大腸菌内で発現させようと製 し た hSASP14（419pmol）を 3.6mM の MBP-hFilaggrin

したが、充分に発現させる事ができなかった。そこで、ヒと 100 ml の 50 mM phosphate buffer（pH6.0），0.7M NaCl，ト Profilaggrin の リ ン カ ー 配 列 と モ ノ マ ー Filaggrin を1mM EDTA，protease inhibitor cocktail 中において 37℃，MBP との融合蛋白質として大腸菌内で発現・精製し、リ60 分反応させ 50 ul の３×SDS sample buffer にて停止させ、コンビナントヒト活性型 SASPase（hSASP14）とともに、10ul を SDS-PAGE に供し、それぞれ切断された断片を N

その至適 pH である弱酸性条件で、反応させたところ、分末端アミノ酸シーケンス解析を行い、切断点を決定した。

解産物（バンド）が出現した。それぞれのバンドを N 末端される。すなわち、SASPase の内在性の基質を探索し、そアミノ酸シーケンスにより解析し、ヒト SASPase による３．結果と考察

ヒト Profilaggrin リンカー配列の切断点を決定した。その

３．１ マウス表皮角質層における前駆体型・活性型
SASPase 検出法の確立

結 果、hSASP14 は MBP-hFilaggrin の リ ン カ ー 配 列 の“GSFLY” と“QVSTH” との間を切断する事が明らかと雌の 4 週齢と 14 週齢の無毛マウス表皮角質層抽出液に対する抗 SASPase 抗体を用いたイムノブロット解析により、角層において、SASPase の前駆体型（mSASP32）・活性型（mSASP15）の両型が存在する事が明らかとなった（図２）。
また mSASP32 と mSASP15 のバンド強度から両者の比率は、活性型（角質層の表層（１〜 5 回のテープストリップ）の方が、多く存在している事が明らかとなった。4 週齢と１4 週齢の間に大きなパターンの違いは認められなかったが、老齢個体においては、発現量の個体毎のばらつきが大きく、定量性の低い Immunoblotting を用いた活性の定量は、困難であると考えられた。一方で、SASPase は角質層上層程、高い活性を示す可能性があり、SASPase の基質切断活性を測定する事で、簡便な活性測定法が検出されると考えられた（図２）。

３．
２SASPase の内在性基質の同定

そこで、SASPase の内在性基質を決定する事を試みた。
我々は、乾燥肌様表皮を示す SASPase 欠損無毛マウスは小じわ形成とともに、乾燥肌様表皮を呈する事を発見していた。このマウスにおいては、SASPase の内在性基質が

図２ 抗 SASPase 抗体を用いたマウス角層抽出液に対するイムノブロット
４週齢、14 週齢の雌のヘアレスマウスの背中からの１〜５回及び６〜 10 回のテープストリッピング（1 〜 5，6 〜10）の抽出液（５mg）を SDS-PAGE に供し、抗 SASPase抗体を用いてイムノブロットを行った。角層上層においては、前駆体型（32kDA；mSASP32；矢頭）よりも活性型（15kDa：mSASP15；矢印）の方が多く存在している。

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図３ SASPase 欠損無毛マウスにおける表皮分化マーカーの発現（A）SASP＋/− 及 び SASP−/− 無毛マウスの背皮膚の凍結切片に対す る 抗 keratin 14，keratin 1，Involucrin，Loricrin 抗 体 に よ る、
免 疫 染 色 像。 こ れ ら の 表 皮 分 化
マ ー カ ー は SASP−/− 無 毛 マ ウスでは、正常な発現部位を示していた。Scale bar：10μm 点線：表皮と真皮の境界（B）SASP＋/＋，SASP＋/− 及 び
SASP−/−無毛マウスの表皮抽出液に対する抗 keratin 14，keratin
1，Involucrin，Loricrin 抗体による、イムノブロット。これらの表皮分化
マ ー カ ー は SASP−/− 無 毛 マ ウ
スでは正常な発現量を示していた。
Reproduced and modified withpermission from John Wiley andSons (Matsui et al., EMBO Mol.
Med. 3:320-333, 2011).

図４ SASPase 欠損無毛マウスにおける Filaggrin の発現（A, B）SASP＋/−及び SASP−/−
無毛マウスの背皮膚の凍結切片に対する抗 Filaggrin 抗体による免疫染色。
（核は Bisbenzimide により 染 色 し た。
）Filaggrin（ 核 の 上部 の シ グ ナ ル ） は SASP−/− 無毛 マ ウ ス で は、 角 質 層 下 層 部 分（Lower SC）に濃縮していることが 明 ら か と な っ た。Scale bar：10μm、点線：表皮と真皮の境界（C）無毛マウスの表皮のテープスト
リップ抽出液に対するクマシー染色と抗 Filaggrin 抗体による、イムノブロット。Filaggrin は、SASP＋/＋では Profilaggrin から段階的にリンカーが切断され、トリマー、ダイマー、モノマーへと分解されていくパターンが検出されているが、SASP−/−無毛マウスではトリマー、ダイマーからスメアーになるパターンが検出された。この事は、SASP−/−マウスにおける角 質 層 下 層 に お け る 蓄 積 は、Profilaggrin の 分 解 異 常 に よ る トリマー、ダイマーの蓄積が原因と考えられた。
Reproduced and modified withpermission from John Wiley andSons (Matsui et al., EMBO Mol.
Med. 3:320-333, 2011).

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なり、ヒトProfilaggrinのリンカー配列を特異的に SASPase がる可能性がある。また、Filaggrin はアトピー性皮膚炎発切断する事が明らかとなった。切断点の N 末端側配列は既症の最大の疾患素因とされている事 7）から、この活性検出に報告されているヒト精製 Filaggrin の質量分析解析にお法によって角質層バリアー構築と SASPase 活性との関連いて、ピログルタミン酸化されていた Q に相当する事か性にも手がかりを与えると考えられる。その結果と３．１

ら、本来の Profilaggrin の切断部位であると考えられる（図に示したような hSASP14/hSASP28 の存在比を統合する

５）５，６）。

事により、皮膚の老化・小じわ形成・乾燥肌といったコス以上のような SASPase に対する新規基質 Profilaggrin の同定によって、その切断部位の基質 peptide を設計する事メトロジーに重要な現象の定量的指標を構築できる可能性が本研究により示された。

により、検出感度の高い SASPase 活性検出法を構築でき

図５ リコンビナント活性型ヒト SASPase（hSASP14）は Profilaggrin のリンカー配列を in vitro で切断する。
（A）GST-SASP28 からの自己分解活性による hSASP14 の産生と精製精製した GST-SASP28（矢印）を 700mM NaCl 存在下で、０分、60 分間、pH6.0 の条件下でインキュベートした。
GST-SASP28 は自己分解反応を行い、hSASP14 を産生した（矢頭）。切断された GST 融合蛋白質は、グルタチオンビーズにより除かれ、hSASP14 が精製された。ダイマーの hSASP14 のバンドもわずかながら検出されている（＊）（B）hSASP14 による Profilaggrin リンカー配列の切断精製した MBP-hFilaggrin（C 末が truncate された産物も含む：MBP-hFilaggrin-DC）を hSASP14 存在下・非存在下で 700mM Nacl，pH6.0 の条件下で 60 分間インキュベートした。その結果 MBP と hFilaggrin との間のリンカー配列が切断され、MBP（42kDa），hFilaggrin（37kDa），hFilaggrin-DC（23kDa）が産生されている事が、各バンドの N 末端アミノ酸配列解析により明らかになった。
（C）（B）の実験における切断様式の模式図（D）ヒト SASPase によるヒト Profilaggrin リンカー配列の切断の模式図
ホモダイマーを形成した hSASP 14 は Profilaggrin リンカーの GSFLY-QVSTH の間を切断する事が明らかとなった。
Reproduced and modified with permission from John Wiley and Sons (Matsui et al., EMBO Mol.Med. 3:320-333,2011)− 60 −

小皺形成に関わる皮膚特異的プロテアーゼ SASPase 活性と加齢との関係（引用文献）

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