小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明
山形大学大学院医学系研究科生化学・分子生物学

藤井順逸

Vitamin C (ascorbic acid; AsA) is an essential nutritional factor and required for collagen production as well as
antioxidation in human. We have analyzed genetically modified mice regarding Akr1a, which catalyzes a step in the AsA
biosynthesis, and the embryonic fibroblasts derived from the mice (MEFs). The body weight of the knockout (KO) mice
was the same as the wild-type (WT) mice up to ~20 weeks. The KO mice started dying around 10 weeks of age and all
had died within one year under the AsA-deficient diet. However, supplementation of AsA contributed to maintaining bodyweight and extended the life-span of the KO mice. We then used MEFs from WT and human Akr1a-transgenic (Tg) mice
to investigate the potential roles of Akr1a under culture conditions. Tg MEFs showed higher acrolein-reducing activities
than WT MEFs and were more resistant to cytotoxicity. While the administration of ascorbic acid to the cells increased theintracellular levels of ascorbic acid, it had no effect on the resistance to acrolein. Thus, one of the principle roles of Akr1a inprimates is the reductive detoxification of aldehydes, notably acrolein, and protection from its detrimental effects. We also
examined the impact of a deficiency of Akr1a on fibrotic damage caused by unilateral ureteric obstruction in the mice. Even
though Akrla-deficient mice could produce only about 10% of the AsA produced by WT mice, no difference was observed incollagen I synthesis under pathological conditions. The data implied either a low demand for AsA or the presence of anotherelectron donor for collagen I production in the mouse kidney. Application of the genetically modified mice would give us anadvantage in elucidation of in vivo-roles of AsA such as collagen synthesis and anti-oxidation.

１．緒も Prolyl 4-hydorxylase によるプロリンのヒドロキシル化

言反応では、AsA が電子供与体となってコラーゲン形成に関皮膚は、外気や光その他の有害な外的環境に常にさらさわると考えられている。そのため AsA が不足するとコラれているため、様々な影響を受けている。皮膚の創傷によーゲンなどの形成が障害され、壊血病や骨形成異常を来す。

り、護られていた内部組織に障害が及び感染などの危険が霊長類は進化の過程で AsA 合成の最終段階を触媒する増すため、すみやかな治癒が進行する（図 1）。創傷治癒はGulo 遺伝子に変異を生じたため、ヒトはその合成能を欠複雑な過程を経るが、その際にコラーゲンなどをはじめとくが、げっ歯類をはじめとする多くの実験動物はグルコーする細胞外基質タンパク質が大量に合成され、創傷部位のスやグリコーゲンを出発材料として AsA を合成できる。

保護とその後のリモデリングなどに働く。

Aldehyde Reductase（遺伝子名 ; Akr1a）はアスコルビン

コラーゲンは身体で最も多いタンパク質であり、その保酸合成反応のうち Gulo とは異なる段階を触媒し、その遺水性や弾力性によって皮膚を若く健康に保つ作用に加え、伝子欠損（Akr1a-KO）によりアスコルビン酸合成能が 10%多様な生理機能を担っている。例えば心臓や肝臓などの臓程度にまで低下する （図３）。マウスは遺伝子改変技術

器は虚血などによって細胞死が起り失われると、筋線維芽が確立しているため病態モデル動物として頻用されるが、細胞が増殖してコラーゲンをはじめとする基質タンパク質AsA 欠乏の病態を示さないことから、AsA に関する生理を大量に分泌し、その間隙を埋める（図 2）。このような臓機能の解明を目的とする研究材料には適さない。

1）

器の線維化が緊急対応として機能し、その間に本来の細胞一般に分泌タンパク質は、粗面小胞体で合成された後に数が回復すれば臓器機能が維持されるが、線維化が進行す小胞体内でシステイン -SH 基が酸化されてジスルフィド結ると臓器不全に陥る。こうした細胞外基質の形成は、細胞合を形成することで、機能を発揮できる立体構造をとる（図によるタンパク質の合成と分泌反応とも密接に関係する。

4）。PRDX4 は ERO1 とともに新生タンパク質のシステイ

ビタミン C（アスコルビン酸 ; AsA）はその抗酸化能に加ン-SH 基を酸化してジスルフィド結合を導入し、タンパクえて、いくつかの酵素系で電子供与体として作用する。中で質の酸化的折畳みを行う 。ERO1 欠損マウスと我々が樹2）3）立した PRDX4 欠損マウス を交配して得た ERO1;;PRDX4
Elucidation of malfunction of collagensynthesis caused by defected oxidativeprotein folding in endoplasmic reticulum
Junichi Fujii
Yamagata University, Graduate Schoolof Medical Sciences, Department ofBiochemistry and Molecular Biology

二重欠損マウスは、タンパク質の酸化的折畳みが正常に進行しないことが原因となって AsA が消費され、その結4）

果コラーゲン形成障害が起って壊血病になる 。一方、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の際に起こる線維化は、
5）

PRDX4 欠損により増悪し過剰発現により改善される 。
このように、コラーゲンについては、小胞体における酸化− 98 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

図1

皮膚の創傷治癒過程とコラーゲンをはじめとする基質タンパク質の役割 11）

図 2 臓器線維化の過程で筋線維芽細胞が分化・増殖し、コラーゲンなどの基質タンパク質を生成する

図3

グルコース・グリコーゲンからの血糖供給と AsA の合成経路− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 4 コラーゲンの生成には小胞体におけるタンパク質の酸化的折畳みとプロリンのヒドロキシル化が必要

的折畳みに加えて、プロリンがヒドロキシル化された後にした Akr1a-KO マウス（9−10 週齢）群を用いて一側尿管分泌され、細胞外基質としての機能を発揮するようになる。

結紮モデルを作製し、5 日目に腎臓を摘出して腎線維化

本研究では、主に Akr1a 欠損マウスを用いて、コラーに伴うコラーゲン形成と腎障害に及ぼす効果について検ゲンの合成と機能発現における AsA の役割について解明

討 し た。 腎 臓 組 織 切 片 を Elastica-Masson 染 色 し て、 線するとともに、AsA 合成以外の Akr1a の役割について検維 化 の 程 度 を 評 価 し た。 ま た、 核 酸 の 酸 化 体 で あ る討した。

8-hydorxylguanine（8OH-dG）の抗体を用いた免疫染色を２．実行い、酸化ストレスの病態への関与について検討した。さ験らに、線維化に関わる筋線維芽細胞のマーカータンパク質

2. 1. Akr1a KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用である a-smooth muscle actin（aSMA）、主要な基質タン野生型（WT）
・Akr1a- 欠損（Akr1a-KO）
・ヒト Akr1a ト

パク質、オートファジー関連タンパク質、ミトコンドリアランスジェニック（hAkr1a- Tg）マウスを AsA 欠乏餌で電子伝達複合体（Ⅰ～Ⅴ）ならびにシトクローム- c の発現飼育し、AsA 欠乏がマウスの生存に与える影響を調べた。

について、イムノブロット解析を行った。

パク質であるコラーゲンⅠ、抗酸化酵素、小胞体関連タン

また Akr1a-KO マウスに AsA 含有水（1.5 g/L）を与えるこ

３．結とで AsA 欠乏症状への効果を調べ、肝臓・腎臓ならびに果3. 1. Akr1a-KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用

血漿中の AsA を測定した。

2. 2. マウス胚性線維芽細胞（MEF）を用いた解析

Akr1a-KO 雌マウスについては、出生率の著しい低下がWT・Akr1a-KO・hAkr1a-Tg の妊娠雌マウスの胎仔か認められ、産まれた仔についてもその多くが出生後すぐにら MEF を単離し、SV40 large T 抗原を用いて不死化させ死亡した。また、生き残ったマウスも、通常餌での飼育では、て、それぞれの遺伝子型の MEF を樹立した。その MEF1 年以内にすべて死亡した。そこで AsA（1.5g/L）を飲水を用いて、AsA 含有量の測定と AsA の合成中間体であるに加えて投与したところ出生率が著しく改善し、死亡する

D-glucuronate の還元活性を測定し、さらに各種アルデヒこともほとんどなくなった（図５）。

ド化合物に対する感受性を調べて、MEF における Akr1a

Akr1a-KO 雌マウスにペントバルビタール麻酔を施すとの役割について検討した。特に脂質過酸化の最終産物や環覚醒が遅れたが、AsA を投与することで改善された。こ境毒素として知られるアクロレインの解毒作用に焦点を当の時ペントバルビタールの代謝を行う肝臓の P450 系はてて検討した。

AsA 欠乏の影響を受けておらず、神経系への作用が関係6）する可能性がある 。

2. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

マウスの肝臓・腎臓ならびに血漿中の AsA 含有量を測

WT マウス、Akr1a-KO マウス、ならびに AsA を投与定したところ、Akr1a-KO マウスでは AsA 含有量は血漿中− 100 −小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

図5

Akr1a 欠損マウスは AsA 欠乏により早期に死亡し AsA 摂取により改善する

図6

Akr1a-Tg マウスの線維芽細胞はアクロレインに対して耐性を示す 7）

で数 % にまで低下し、肝臓および腎臓でも約 1 割程度まで極めて低く遺伝子型による違いが認められないことから、低下していた。Akr1a-KO マウスに AsA を投与することMEF は AsA をほとんど合成していないことが分かった。

で AsA 含有量が回復し、Akr1a 欠損による影響は救済さ

AsA 合成過程で Akr1a の基質となる D-glucuronate の添加れた。しかし、AsA 水を給水し成獣にまで達した Akr1a-により AsA 合成量はわずかに増加したが、その量は肝臓KO マウスについて AsA の投与を中止してもその後に死亡などに比べて極めて僅かであった。一方、培地に AsA を率が高くなることはなかった。

添加した場合には、いずれの細胞でも AsA の顕著な増加が認められ、取り込み量には違いは見られなかった。

3. 2. マウス線維芽細胞（MEF）を用いた解析

Akr1a の基質特異性は低く、様々なアルデヒド化合物をWT・Akr1a-KO・hAkr1a-Tg の 各 マ ウ ス か ら MEF を還元することで広く解毒反応に関わると考えられている。

単離して形態を観察したが、大きな違いを認めなかった。

そこで各種アルデヒド化合物を MEF に添加してその細胞AsA を含まない通常培地で不死化させた MEF を培養した

毒性について調べたところ、hAkr1a-Tg MEF では脂質過ところ、遺伝子型に関係なく正常に増殖した。それぞれの酸化によって生じるアクロレインの細胞毒性に対する耐細胞抽出液を用いて NADPH 依存性の D-glucuronate 還元性が増していた（図 6）。AsA を添加し細胞内の AsA 含有活性を測定したところ、WT と Akr1a-KO MEF の活性に量を増加させた細胞でもこの傾向は変わらなかったことか比べて hAkr1a-Tg MEF は高い活性を示した。

ら、アクロレインに対する耐性の獲得には AsA ではなく、この結果は、Akr1a が D-glucuronate 還元に関わっていることを示している。しかし AsA 含有量はどの細胞でもAkr1a によるアルデヒド還元活性が関わっていることが分7）かった 。

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

3. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

KO マウスでは顔面皮膚に炎症が自然発症し、それは抗酸

9 −10 週齢では、Akr1a-KO と WT マウスの腎臓の機能化剤の N- アセチルシステインにより著しく遅延されるなに違いは認められなかった。そこで一側尿管結紮モデル

ど、抗酸化物質投与の有効性を明らかにした 。創傷治癒（UUO）を作製して 5 日後に摘出した腎臓の組織学的検討

モデルでは SOD1 欠損により治癒速度が遅延し，加齢のを行なったところ、炎症細胞の浸潤と線維化が認められた

進んだマウスでは顕著になる。その機構を解明するためが、遺伝子型による顕著な違いはなかった。発現タンパに、初代培養 MEF による検討を行ったところ，通常培養

ク質の解析では、筋線維芽細胞への分化を誘導する線維（20% 酸素）下では SOD1-KO MEF は死ぬが、体内の酸素化促進因子である TGFb の発現が亢進していた（図 7）。ま（1 − 2 %）では増殖が停止した。こうした細胞分裂異常にた aSMA、コラーゲンⅠ、PRDX4 の発現についても亢進細胞周期関連タンパク質の酸化傷害が関わると考えられるが認められた。その一方で、抗酸化酵素の発現については、

10）。このように、in vivo と in vitro では細胞の性質に大きSOD1 と CAT がわずかに低下したのに対して、ミトコンな違いが認められた。こうした結果を踏まえ、コラーゲンドリアに局在する SOD2 と GPX1 については顕著な低下がの形成に密接に関わり、抗酸化力を有する AsA の役割を認められた。尿管結紮による腎障害に小胞体ストレスが関明らかにするために本研究を行った。

9）

与する可能性が示唆されているが、Bip や PDI の発現量は討でも顕著な増加は認められず、オートファジーの関与を4. 1. Akr1a KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用示す結果は得られなかった。以上、いずれの検討でも遺伝Akr1a-KO マウスに AsA を投与することで出生率が著し子型による違いはなく、AsA 欠乏の影響を認めなかった。

く回復し、生存率も著しく改善したことから、Akr1a-KO

尿管結紮 5 日後の腎臓について、ミトコンドリア電子伝マウスに見られた表現型の多くは Akr1a 欠損による AsA

達複合体 I ～ V およびシトクローム- c の発現量について調合成能の低下を反映しているものと考えられた 。 AsAべたところ、尿管結紮により著しく低下していた。そこでなどの水溶性ビタミンについては、腎臓から尿中に排泄さ腎線維化にミトコンドリア障害がどのように関わるかを明れるため、過剰症とはならないことが知られており、今回らかにするために、尿管結紮後の異なる時点でこうしたタの検討でも血漿中の AsA は数日で消失した。AsA-KO 雌ンパク質の発現について評価した。その結果、ミトコンドマウスでは出生率が著しく低下することから、胚発生過程

リア電子伝達複合体Ⅰ～Ⅴやシトクローム- c の発現低下がでの重要性が確認された。それが胎児に対する効果なのか、aSMA やコラーゲンⅠの発現に先行して起っていることそれとも母胎に作用して妊娠の維持に必要なのかといったが分った 。

点については引き続き検討を行っている。

僅かに変動しただけであった。また、LC3 抗体を用いた検8）

４．考察8）

4. 2. マウス線維芽細胞（MEF）を用いた解析

当教室は平成 16 年度に本財団より「SOD1 ノックアウト

hAkr1a-Tg マ ウ ス の MEF で は Akr1a を 過 剰 発 現 し てマウスに発症する皮膚炎への活性酸素の関与の解明」の課

いても AsA の含有量に変化がなかったことは、AsA 合成

題で第 14 回研究助成を受けた。その成果として、SOD1-に関わる他の遺伝子の発現が十分でないことを示してお図7

Akr1a-KO による AsA 欠乏は線維化に伴うコラーゲン形成に大きな影響を与えない 8）− 102 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

り、体内での AsA 合成は肝臓などの限られた臓器で行わしてもコラーゲン量に影響を与えないことから、他の分子れるとするこれまでの知見に一致する。肝臓は様々な有害からの電子供与の可能性が示唆された。コラーゲンの形化合物の解毒に働く臓器であり、Akr1a が肝臓で特に高い成には、小胞体の中での酸化的折畳みも関係することから、発現を示すことから、AsA 合成の他にアルデヒド化合物

今後は PRDX4-KO との二重欠損マウスについても併せての解毒に働くと考えられている。実際に MEF を用いた検解析することで、コラーゲン形成に関わる因子の相互作用討では、hAkr1a-Tg MEF がアルデヒドの中でも毒性が高についての解明を目指したい。

いアクロレインに対する耐性を示し、高い解毒作用を有す
7）ることが示唆された 。hAkr1a-Tg MEF では、アクロレ謝

辞インを基質として NADPH による還元活性が高いこともこ本研究を遂行するに当たり、Akr1a-KO ならびに hAkr1a-の結果と一致する。MEF に AsA を添加して取り込ませてTg マウスを提供くださいました宮田哲博士と、研究を助おいてもアクロレインに対する感受性が変わらないことか成してくださいましたコスメトロジー研究振興財団に心から、AsA はこの解毒作用には寄与しないことが分かった。

ら感謝申し上げます。

このことは、hAkr1a-Tg MEF のアクロレイン耐性にはAkr1a による NADPH 依存性還元活性が直接関係すること（引用文献）を示す。

１）Takahashi M, Miyata S, Fujii J, Inai Y, Ueyama S,Araki M, Soga T, Fujinawa R, Nishitani C, Ariki S,

4. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

Shimizu T, Abe T, Ihara Y, Nishikimi M, Kozutsumi Y,

コラーゲンは身体を構成するタンパク質として最も多く、Taniguchi N, and Kuroki Y. In vivo role of aldehyde

皮膚の保湿性や弾力性の保持など、抗老化にとっても重要

reductase. Bichim Biophys Acta, 1820:1787-1796 (2012)である。AsA はコラーゲンの生成に必要であり，不足す２）Fujii J, Ikeda Y, Kurahashi T, Homma T. Physiological

ると壊血病や骨形成異常を来す

11）。一方で、Gulo 欠損により AsA 合成能を欠くマウスを用いた検討では、骨の発and Pathological Views of Prdx4. Free Radic Biol Med,in press (2015)

育不全を来たし 20 週齢頃から死にはじめるが、皮膚のコ

３）Iuchi Y, Okada F, Tsunoda S, Kibe N, Shirasawa N,

ラーゲンは正常に形成されるといった、これまでの認識を

Ikawa M, Okabe M, Ikeda Y, and Fujii J. Peroxiredoxin

覆す結果が報告されている。このように AsA の作用に関

4 knockout results in elevated spermatogenic cell

する分子機構については、従来の理解とは異なる現象も報

death via oxidative stress. Biochem J, 419:149-58 (2009)
４）Zito E, Hansen HG, Yeo GSH, Fujii J, and Ron D.

告されている。
Akr1a-KO マウスにおいては、野生型マウスの 10% 程度

Endoplasmic reticulum thiol oxidase deficiency leads

しか AsA を合成することができないにもかかわらず、WT

to ascorbic acid depletion and noncanonical scurvy in

マウスと比較して、尿管結紮によって生じるコラーゲンⅠ
8）

mice. Mol Cell, 48:39-51 (2012)の合成量に差を認めなかった 。この結果より、マウスの５）Nabeshima A, Yamada S, Guo X, Tanimoto A, Wang

腎障害時におけるコラーゲンⅠ合成には微量の AsA しかKY, Shimajiri S, Kimura S, Tasaki T, Noguchi H,必要としない、もしくは、プロリルヒドロキシラーゼへのKitada S, Watanabe T, Fujii J, Kohno K, and Sasaguri

別の電子供給体が存在する、可能性が示唆された。ヒト由Y. Peroxiredoxin 4 Protects Against Nonalcoholic

来の細胞を培養する際の培地には AsA は含まれていない

Steatohepatitis and Type 2 Diabetes in a Nongenetic

場合がほとんどであるが、こうした細胞でもコラーゲンのMouse Model. Antioxid Redox Signal, 1 9:1 9 8 3-1 9 9 8形成が起こることから、後者の可能性が高いと考えられる。

(2013)

プロリルヒドロキシラーゼへの電子の供給に働くレドック

６）Ito J, Otsuki N, Zhang X, Konno K, Kurahashi T,

ス分子としては、細胞内含有量の多いグルタチオンが有力

Takahashi M, Yamato M, Matsuoka Y, Yamada K,

な候補であるため、MEF などを用いた検討により明らか

Miyata S, and Fujii J. Ascorbic acid reverses theにしたい。

prolonged anesthetic action of pentobarbital in Akr1a-５．総knockout mice. Life Sciences, 98:1-8 (2014)

括７）Kurahashi T, Kwon M, Homma T, Saito Y, Lee

AsA 合成障害のある Akrla-KO マウスを用いて、コラー

J, Takahashi T, Yamada K, Miyata S, and Fujii J.

ゲン合成における AsA の関与について、培養細胞系とマReductive detoxification of acrolein as a potential

ウスを用いて検討を行った。AsA はコラーゲン形成の過role for aldehyde reductase (AKR1A) in mammals.

程でプロリンヒドロキシル化に必要とされているが、欠損

Biochem Biophys Res Commun, 452:136-141 (2014)− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015８）Nishida H, Kurahashi T, Saito Y, Otsuki N, Kwon M,Ohtake H, Yamakawa M, Yamada K, Miyata S, Tomita

wound healing in SOD1-deficient mice. Mol Cell
Biochem, 341:181-194 (2010)

Y, and Fujii J. Kidney fibrosis is independent of the10）Tsunoda S, Kibe N, Kurahashi T, and Fujii J.

amount of ascorbic acid in mice with unilateral ureteral

Differential responses of SOD1-deficient mouseobstruction. Free Radic Res, 48:1115-1124 (2014)

embryonic fibroblasts to oxygen concentrations. Arch９）Iuchi Y, Roy D, Okada F, Kibe N, Tsunoda S, Suzuki

Biochem Biophys 537:5-11 (2013)

S, Takahashi M, Yokoyama H, Yoshitake J, Kondo S,11）Kurahashi T, and Fujii J. Roles of antioxidativeand Fujii J. Spontaneous skin damage and delayedenzymes in wound healing. J Dev Biol, 3 : 57-70 (2015)− 104 −