ごあいさつ
このたび、当財団として 15 冊目の研究報告書をお届けできることになりました。小林孝三郎が 1990 年にコスメトロジー研究振興財団を設立して以来、多くの優れた研究に対する助成活動等を行ってまいりましたが、人々の豊かで美しい生活を実現するための一助となれば、これ以上嬉しいことはないと考える次第
でございます。
今回の研究報告書では平成 16 〜 17 年度に研究助成を受けられた方の中から22 名の方の研究成果を掲載させていただきました。
コスメトロジーと一番関わりの深い表皮細胞に関する研究を中心に、活性酸素や抗酸化作用など人類の究極の願いでもあるアンチエイジング関係の研究が多い
ことが今回の特長だということができます。また、化粧と心理学分野の融合した研究は従来からも多かったのですが、ＱＯＬ（クオリティ オブ ライフ）や緩和ケアなど医療分野における化粧品の効用など今注目の分野に関わる研究も増えてきています。
安倍首相は所信表明演説の中で、医療や工学、情報技術など社会の成長に貢献する分野のイノベーション創造のために、2025 年までの長期的戦略指針 ｢ イノベーション 25｣ を発表しましたが、医療や薬学の分野とコスメトロジー分野の研究融合はますます進むものと考えられます。
化粧品分野からアプローチした老化研究の成果が医療分野へ応用されるケースも多くなっていますし、再生医療の美容分野への応用、人間の免疫能と化粧療法の関わりなど、コスメトロジーにまつわる研究は人間生活にとってますます重要な役割を持つものになってまいります。
当財団といたしましても、このようなコスメトロジーの進化と発展に今後とも深く関わってまいりたいと考えております。
皆様のますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 19 年 7 月
財団法人

コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

礼次郎

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・シルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価…………………………………… 2

大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻
・酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発

宇

山

浩

……………………………………………………… 7

広島大学大学院生物圏科学研究科
・アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

耕 一…………………………………………… 13

東京医科歯科大学生体材料工学研究所
・脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築

秋 吉

一 成

…………………………… 18

山口大学工学部応用化学工学科
・ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用

船 戸

吉

本

誠

…………………………………………………… 23
同志社大学工学部

野 口・リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討
金沢大学大学院自然科学研究科
・二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果……………… 29

太 田

明 雄

……………………… 36

分子科学研究所・コラーゲンに正しい構造を取らせる、HSP47 誘導剤の発見

範 子

手 老

龍 吾

………………………………………………… 42

熊本大学大学院医学薬学研究部
・皮膚再生を促す non-drug 細胞間脂質類似構造体（リオトロピック液晶）の開発

水

島

徹

……………………… 44

聖マリアンナ医科大学難病治療研究センター DDS 研究室

五十嵐 理 慧Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・ラミニン - 5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化…………………………… 50

京都大学大学院医学研究科皮膚生命科学講座
・表皮細胞におけるエピプラキンの機能・皮膚の光音響学的診断法の開発

宇 谷

厚 志

……………………………………………………………………… 57
大分大学医学部皮膚科 藤 原

作 平……………………………………………………………………………… 64

防衛医科大学校防衛医学研究センター情報システム研究部門
・インターロイキン12 による紫外線防護に関する研究

佐 藤

俊 一

……………………………………………………… 73

長崎大学先導生命科学研究支援センター
・薬用人参の皮膚老化防止作用と育毛作用の分子メカニズム

松 田

尚 樹

………………………………………………… 78

東京医科歯科大学難治疾患研究所

古 川

哲 史

目
・高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ――脂漏性角化症との関連について

次……………… 85

筑波大学人間総合科学研究科 六町皮フ科クリニック 伴 野

・皮膚における弾性繊 維形成とトロポエラスチンの細胞機能 解 析………………………………………… 94

星薬科大学薬学部臨床化学教室
・表皮細胞の増殖・分化・細胞死に影響を与える遺伝子群の機能解析システムの構築
大阪大学医学系研究科社会環境医学
・色素細胞幹細胞の制御による白斑症治療モデルの開発

朋 裕

輪 千

浩 史

…………………… 99

竹 田

潤 二

…………………………………………………… 101

岐阜大学大学院医学系研究科

國 貞

隆 弘

Ⅲ．精神、文化に関する分野
・化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化……………………………………………… 106

仙台大学体育学部健康福祉学科
・口唇裂患者の化粧による外観変化と内面変化について

吉 田 寿美子……………………………………………………… 115

大阪大学大学院歯学研究科顎口腔病因病態制御学講座口腔外科学第一教室
・化粧品の香料がヒト自律神経系に及ぼす生理学的効用の研究

古 郷

幹 彦

……………………………………………… 120

藤田保健衛生大学医学部生理学

河 合・皮膚ボディーイメージ評価尺度 Cutaneous Body Image Scale（CBIS）日本語版の作成
東京女子医科大学附属女性生涯健康センター

房 夫…………… 125

檜 垣

祐 子

■記念講演
平成 18 年度記念講演 『顔と心と体について』 ……………………………………………………………… 131
フェイシャルセラピスト、歯学博士、REIKO KAZKI 主宰■コスメトロジー研究雑感■付

かづきれいこ……………………………………………………………………………………………… 135

録
平成 18 年度事業報告
役員一覧…………………………………………………………………………………………… 149…………………………………………………………………………………………………………… 152

Ⅰ.
Ⅱ.
Ⅲ.

●
素材、物性に関する分野
生体作用、安全性に関する分野
精神、文化に関する分野●

シルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価

大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻

宇山浩

The biological and pharmacological effects of polyphenols have been demonstrated in numerous human, animal
and in vitro studies. The present report describes synthesis and bio-related properties of polyphenol conjugateson poly(amino acid)s such as silk protein and poly(ε-lysine). In this study, chlorogenic acid, caffeic acid, and green
tea catechin were used as polyphenol for the conjugation. At first, silk protein was chemically modified with thepolyphenols by using dehydrating coupling agent, but the introduced ratio of the polyphenols was very low. Next, an
enzymatic conjugation of the polyphenols on poly(ε--lysine) has been examined. The conjugates were successfully
synthesized by the oxidation of the polyphenols using Myceliophthora laccase as catalyst in the presence ofpoly(ε-lysine). The antioxidant activity of the resulting conjugates was evaluated in terms of superoxide anion
scavenging activity. The conjugates greatly scavenged superoxide anions in a concentration dependent manner on
the polyphenol unit level, compared to the monomeric polyphenol. These data imply that the enzymatic conjugation
enormously improved the antioxidant property of the polyphenols. Additionally, the conjugates showed goodinhibitory effects toward disease-related enzymes, xanthine oxidase, collagenase, and hyaluronidase.

１． 緒

ール類の酵素的酸化を伴うカップリング、の二種類の方法

言を検討した。
②に関し、ポリ（ε-リジン）−クロロゲン酸コンジュゲ

緑茶をはじめとする食品に含まれるポリフェノール類は、優れた抗酸化性、抗ガン活性、抗菌性、抗炎症性、抗ウィートの合成を詳しく述べる。大気中、ポリ（ε-リジン）（0.64 g, ５

ルス性などの種々の生理活性を有することが知られており、

mmol monomer unit）を蒸留水 20 ㎖に溶解させ、pH を 7

動脈硬化などの成人病やガン発生を予防する機能性食品基に調整した。ここに２㎖のメタノールに溶解させたクロロ

材として注目されている。一方、天然にはプロアントシア

ゲン酸（0.089g, 0.25mmol）を混合した。ラッカーゼ溶液

ニジンに代表されるポリフェノールオリゴマーが知られて（5μℓ, 5units）を添加することで反応を開始し、24 時間

おり、低分子ポリフェノール類とは異なる特異的な生理活

後、６N HCl 数滴を加え、10% メタノールを含む蒸留水性を示す。動脈硬化抑制作用、胃潰瘍抑制作用、大腸ガン

中で透析することにより精製した（cut-off MW=500）。得

抑制作用、糖尿病合併症抑制作用などが見出されている。
一方、我々は低分子量ポリフェノール類を人工的に高分られた溶液を凍結乾燥し、0.38g のコンジュゲートを得た。
1

H-NMR（DMSO-d6）: δ/ppm ＝ 1.0-2.0（br. CH2CH2CH2

子量化することで、ポリフェノールの機能向上・新機能発

of PL），2.4-2.9（CH2），3.0-3.2（brε-CH2），3.2-3.6（br.

現を検討してきた 1 −８）。本研究ではシルクプロテインをCHOH），
3.6-3.9（α-CH2），
7.5-8.6（br. CH=CH，Ar-H），
8.7-9.1（br.

始めとするタンパク質（ポリアミノ酸）へポリフェノール

Ar-OH）。ポリ（ε-リジン）−カフェ酸コンジュゲート、を導入し、その機能の増幅を調べた。

ポリ（ε-リジン）−緑茶カテキンコンジュゲートは同様に

２．実

合成した。

験

３．結

ポリフェノール類としてはクロロゲン酸（ChA）、カフ果

ェ酸（CA）といったカルボン酸含有のポリフェノールと本研究の前半ではポリフェノールとしてクロロゲン酸と緑茶抽出カテキン（GTC）を用いた。幹ポリマーへのコ

カフェ酸を用いた。これらはコーヒーの独特の褐色、香り、

ンジュゲート化は幹ポリマー側鎖のアミノ基を利用し、①味のもとになるものであり、抗酸化性、抗炎症性、抗アレ

ポリフェノールのカルボン酸間の脱水縮合、②ポリフェノ

ルギー性などの様々な生理活性が知られている。コーヒーは 13 世紀半ば頃からアラビアを中心とするイスラム教のSynthesis of Silk Protein-Polyphenol
Conjugates and Evaluation of Their
Properties
Hiroshi Uyama
Depa rtment of Applied Chemist ry,
Graduate School of Engineering, Osaka
University

国々で愛飲され薬としても用いられたと言われており、後に欧州に伝わり現在では緑茶と並び世界中で広く飲用されている。近年ではコーヒーに肝臓がん予防効果があることなども報告されている。
最初にモデル反応として、合成ポリアミンの一種である
分岐状ポリエチレンイミン（分子量 2 万）とカフェ酸の反−2−

シルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価応を検討した。水中でのペプチド結合形成に一般的に用いクロロゲン酸コンジュゲート（PL-ChA）の UV-vis スペ

られる縮合剤 1- エチル -3-（3- ジメチルアミノプロピル）

クトルを測定したところ、250 〜 450nm にポリリジンがカルボジイミド塩酸塩と縮合助剤 N- ヒドロキシスクシン

ほとんど吸収を示さないのに対し、コンジュゲート化によイミドを用いることで、カフェ酸が効率的に導入された（ポりクロロゲン酸に由来する吸収が見られた。カフェ酸におリエチレンイミンのアミノ基当たり数％の導入）。

いても同様の結果が得られた。ポリ（ε- リジン）へのクロ

スーパーオキシドアニオンは通常の好気性代謝などによロゲン酸とカフェ酸の導入率を元素分析により求めたとこって、生体内で常に生成している。そのひとつにキサンチ

ろ、7.4%（PL-ChA）と 8.1%（ポリ（ε-リジン）−カフェ酸

ンがキサンチンオキシダーゼによって尿酸に変わる反応がコンジュゲート（PL-CA））であった。
得られたコンジュゲートの SOD 様活性を調べた（Fig. 1）。

ある。この過程で酸素が電子受容体として働くことで同時にスーパーオキシドアニオン（SOD）が発生する。そこで、クロロゲン酸、カフェ酸のいずれにおいてもポリペプチ

このキサンチン／キサンチンオキシダーゼ系を用いてスードへのコンジュゲート化により SOD 様活性が大きく向上

パーオキシドアニオンを発生させ、化学発光法で検出するした。また、コンジュゲート化ポリフェノールの DPPH

ことにより生成物のスーパーオキシドアニオン消去能、す（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）ラジカルに対する消去能

なわち SOD 様活性を調べたその結果、カフェ酸に比較しを測定した。DPPH は天然には存在しないが、比較的安定てコンジュゲート化による機能の向上が見られなかった。

なラジカルであり評価が簡便なことから、抗酸化性の指標

次にシルクプロテインを用いて同様の反応を行ったが、カとしてよく用いられる。Table 1 に IC50 値として抗酸化性

フェ酸の導入率が 1％以下であったため、酵素法によるポ機能を示す。これより、DPPH 消去能がコンジュゲート化

リフェノール類のコンジュゲート化に切り替えて、狙いとにより低下することが明らかとなった。

するコンジュゲートの合成を試みた。

キサンチンオキシダーゼによりキサンチンから尿酸が生

クロロゲン酸とカフェ酸といったカルボン酸基含有ポリ

じる反応は、プリン体と呼ばれる共通構造を持つ物質が分フェノールを用いる酵素的コンジュゲート化を検討した。

解される最後の過程である。プリン体は体内の代謝によっ

幹ポリマーとしては、抗菌・静菌作用を有する食品基材て生成したり、またビールや動物性食品に含まれることでであるポリ（ε- リジン）を用いた。Myceliophthora 由来のも知られており、最終産物である尿酸が関節に蓄積するこ

ラッカーゼを触媒に用い、ポリフェノールをポリ（ε- リジとにより痛風などの症状を引き起こす。よってキサンチンン）（PL）にコンジュゲートさせた。ポリ（ε- リジン）−

オキシダーゼの阻害物質はスーパーオキシドアニオンの生

(a)

100
SOD-like activity (%)

SOD-like activity (%)

100
80
60
40
20
0

05

0

100

(b)

80
60
40
20
0

150

05

Concentration (µM)

0
100
150
Concentration (µM)■:ChA, ●:PL- ChA■:ChA, ●:PL- ChA

Fig.1 SOD-like activity of PL-polyphenol conjugates: (a) chlorogenic acid; (b) caffeic acid.

Table1 Antioxidant property and enzyme inhibition activity of PL-polyphenol conjugates

Product

IC50 (μM)
DPPH scavenging

Collagenase inhibition

Hyaluronidase inhibition

Chlorogenic acid
PL-ChA

18.4
>30

145
>150

145
157

Caffeic acid
PL-CA

17.3
>30

145
150

145
230

−3−

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

成を抑制するとともに、尿酸の生成を阻害することによるに阻害活性が見られたが、その活性はモノマーと同程度あ

痛風治療薬としても有用であると考えられる。Fig. 2 に本

るいはそれ以下に留まった。

コンジュゲートのキサンチンオキシダーゼ阻害能を示した。

ヒアルロニダーゼは人間の肌や眼球、鶏のとさかに含まクロロゲン酸、カフェ酸のコンジュゲートは濃度に応じたれる保湿成分であるヒアルロン酸を分解する酵素である。

キサンチンオキシダーゼ阻害を示し、モノマーと同程度で真皮中に存在する酵素ヒアルロニダーゼは活性化して、かあるの阻害活性を示した。

ゆみ・ひりつき・毛細血管の拡張による赤み、むくみなど

マトリックスメタロプロテイナーゼは Zn を活性中心にの炎症を引き起こす。またヒアルロニダーゼは炎症時の血持つ酵素群であり、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロ

管透過性を増加させることにより、アトピー性皮膚炎、ア

メリシンなどからなる。これらは細胞外マトリックスのタ

レルギー性鼻炎やじんましんなどの I 型アレルギー症状にンパク質を分解、再構築する酵素で、その恒常性を保つのも深く関わっており、抗炎症剤、抗アレルギー剤としてヒに重要な役割を果たしているが、その発現や活性のバラン

アルロニダーゼ阻害剤の開発が求められている。本研究でスが崩れると様々な病態が発症する。そのため近年、がん得られたコンジュゲートのヒアルロニダーゼ阻害能についや炎症、関節炎などに対し、マトリックスメタロプロテイて評価を行った（Table １）。その結果、コラゲナーゼ阻

ナーゼをターゲットとした薬剤の開発に注目が集まってい害と同様に顕著な活性の増幅は見出されなかった。

る。同様に、微生物（Clostridium histolyticum）由来の

次に緑茶抽出ポリフェノール（緑茶カテキン）のポリ（εコラゲナーゼについても多くの研究が行われている。この- リジン）へのコンジュゲートを試みた。緑茶に含まれる

微生物コラゲナーゼは基底膜の主成分であるⅣ型コラーゲ

カテキン類は最も豊富に存在しよく研究されている植物ポンを分解する酵素である。コラーゲンは骨、軟骨、皮膚、リフェノールの 1 つである。茶の木は Camellia sinensis

血管などに多く含まれ、体内の全タンパク質の 30% を占というツバキ科に属する植物で、その乾燥葉重量中に 10める。コラーゲンの衰えにより動脈硬化、関節痛、肌あれ、〜 15% のカテキン類が含まれる。中国や日本では古くか

シミ・しわなどの症状が現れる。よって、これらの症状をら健康によいとされ、嗜好品としてだけでなく様々な疾患予防するためのコラゲナーゼ阻害剤の研究が盛んに行われに対する民間療法として緑茶が飲用されてきたが、その薬ており、ポリフェノール類もそのひとつである。そこで本効の多くがこのカテキン類によるものであると考えられる。

研究で得られたコンジュゲートのコラゲナーゼ阻害能につ緑茶カテキンの主成分の構造を Fig. 3 に示す。本研究ではいて評価を行った（Table１）。その結果、コンジュゲート

緑茶カテキンとして三井農林製ポリフェノン 70S を用いた。

100

(a)

80

Inhibition activity (%)

Inhibition activity (%)

100

60
40
20
0

0

100
200
300
Concentration (µM)

(b)

80
60
40
20
0
-20

0

■:ChA, ●:PL- ChA
Fig. 2

HO
OH
O
OH

O

HO
OH

O
HO

HO

OH

OH

OH
OH

O

OH

OH

epicatechin■:ChA, ●:PL- ChA

XO inhibition activity of PL-polyphenol conjugates: (a) chlorogenic acid; (b) caffeic acid.
OH

HO

100
200
300
Concentration (µM)

OH

OH

OH

epigallocatechin gallate
Fig. 3

O

OH

OH
O

OH

O

OH
OH

epigallocatechin

Structure of typical catechin derivatives in green tea

−4−

O

HO

OH

OH

epicatechin gallateシルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価

コンジュゲートの合成はカフェ酸、クロロゲン酸の場合については、緑茶カテキン、ポリ（ε- リジン）−緑茶カと同様にラッカーゼ触媒を用いて行った。得られたポリ（εテキンコンジュゲートともに低濃度で効果的に消去された。

- リジン）−緑茶カテキンコンジュゲート（PL-GTC）に

DPPH についてはコンジュゲート化により緑茶カテキンよおける緑茶カテキンの導入率は 3.4mol% であった。

り抗酸化性が低下したが、ABTS に対しては抗酸化性が抗酸化性評価の尺度として、上述の DPPH 消去能とSOD 様活性以外に、安定カチオンラジカル（2,2’ -Azino-bis向上した。SOD 様活性については、コンジュゲート化による著しい向上が見られた。

（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS）に対するポリ（ε-リジン）−緑茶カテキンコンジュゲートの酵素

消去能を測定した。評価結果を Table2 に示す。比較とし阻害活性について調べたところ、キサンチンオキシダーゼ、て工業的に用いられている抗酸化剤である BHT や Trolox

コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼのいずれに対しても、コンの抗酸化性を示した。DPPH ラジカル、ABTS ラジカル

ジュゲート化により阻害活性が大幅に向上した（Fig.４）。

Table２ Antioxidant activity of PL-GTC conjugate
Radical scavenging activity（IC50 ( μM））

Product

DPPH

ABTS

Superoxide anion

Green tea catechin
PL-GTC conjugate

7.2
16.9

5.2
4.4

55.8
4.6

BHT
Trolox

−
24.8

−
−

>>200
155

100

(a)
Inhibition activity (%)

Inhibition activity (%)

100
80
60
40
20
0

0

100
200
Concentration (µM)■:GTC, ●:PL- GTC

Inhibition activity (%)

100

80
60
40
20
0

300

(b)

0

50
100
Concentration (µM)■:GTC, ●:PL- GTC

(c)

80
60
40
20
0

0

100
200
Concentration (µM)

300■:GTC, ●:PL- GTC
Fig. 4

Enzyme inhibition activity of GTC and PL-GTC conjugate for: (a) xanthine oxidase;(b) collagenase; and (c) hyaluronidase

−5−

150

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

これらの結果から、緑茶カテキンの機能向上にポリペプチ

カフェ酸、緑茶といったポリフェノール類に拡張できるこ

ドへのコンジュゲート化が有効であることがわかった。ことが明らかとなり、得られたポリフェノール含有コンジュの結果はカフェ酸、クロロゲン酸のコンジュゲート化と異ゲートには機能材料としての応用が期待される。

なり、緑茶カテキンに特有の現象である。

４．考（参考文献）

察

１）M. Kurisawa, J. E. Chung, Y. J. Kim, H. Uyama, and

本研究ではカフェ酸、クロロゲン酸、緑茶カテキンとい

S. Kobayashi, Amplification of Antioxidant Activity andったポリフェノール類のタンパク質へのコンジュゲート化

Xanthine Oxidase Inhibition of Catechin by Enzymaticを試みた。ポリフェノールのカルボン酸基を利用したコン

Polymerization, Biomacromolecules, 4, 469-471 (2003).

ジュゲートではモデル系で反応の進行を確認できたが、ア２）M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, and S.

ミノ基（リジン残基）の少ないシルクプロテインでは、十Kobayashi, Enzymatic Synthesis and Antioxidant

分な反応の進行を達成できなかった。また、シルクプロテ

Properties of Poly(rutin), Biomacromolecules, 4,

インは可溶型サンプルの分子量が高くなく（数千程度）、

1394-1399 (2003).

そのことが収率と導入率の低下につながっていると思われ

３）M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, and S.
Kobayashi, Oxidative Coupling of Epigallocatechinる。
一方、酵素法については、
モデルポリマーであるポリ（ε-リ

Gallate Amplifies Antioxidant Activity and Inhibits

ジン）に対するポリフェノールの導入法が確立できた。ラXanthine Oxidase Activity, Chem. Commun., 294-295

ッカーゼの添加により空気酸素を用いた酸化が利用できる(2004).

ために、コンジュゲート体合成の操作は極めて簡便である。

４）Y. J. Kim, J. E. Chung, M. Kurisawa, H. Uyama, and

また、抗酸化性や酵素阻害活性が見出されたことから、実S. Kobayashi, New Tyrosinase Inhibitors, (+)-Catechin-

用的香粧品基材としての可能性が示された。

Aldehyde Polycondensates, Biomacromolecules, 5,474-479 (2004).

活性酸素やフリーラジカルによる酸化傷害は種々の疾病
や発がん、老化と密接に関わっている。酸化ストレスは、

５）Y. J. Kim, J. E. Chung, M. Kurisawa, H. Uyama,

細胞の DNA、細胞膜上のリン酸脂質、蛋白、糖質を傷害

and S. Kobayashi, Superoxide Anion Scavenging and

し、老化や血管傷害、脳障害、がんなどを進行させる。こXanthine Oxidase Inhibition of (+)-Catechin-Aldehyde

うした酸化ストレスから体を防御して体を錆びつくのを防Polycondensates. Amplification of Antioxidant Property

止するために、優れた抗酸化作用を有する食品や医薬品がof (+)-Catechin by Polycondensation with Aldehydes,必要とされる。現在、緑茶カテキンをはじめとするポリフ

Biomacromolecules, 5, 547-552 (2004).

ェノール類は飲料やサプリメントなどの健康食品として用６）Y. J. Kim, H. Uyama, and S. Kobayashi, Inhibition

いられているが、さらに機能を高めることにより疾患を治Effects of (+)-Catechin-Aldehyde Polycondensates

療する製剤などへの積極的な利用が期待される。その観点

on Proteinases Causing Proteolytic Degradation ofから本研究で開発したポリ（ε- リジン）には機能性食品、Extracellular Matrix, Biochem. Biophy. Res. Commun.,

予防薬への用途が想定される。

320, 256-261 (2004).
７）N. Ihara, S. Schmitz, M. Kurisawa, J. E. Chung, H.

５．まとめ

Uyama, and S. Kobayashi, Amplification of Inhibitory

本研究では、主に酵素を触媒に用いたクロロゲン酸、カActivity of Catechin against Disease-Related Enzymes

フェ酸、緑茶カテキンのポリ（ε- リジン）へのコンジュ

by Conjugation on Poly(ε-lysine), Biomacromolecules, 5,ゲート体の合成と機能評価を行った。コンジュゲート化に

1633-1636 (2004).

よりスーパーオキシドアニオン消去能が著しく向上し、キ８）N. Ihara, M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, andサンチンオキシダーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ

S. Kobayashi, Enzymatic Synthesis of a Catechinといった疾患関連酵素に対する阻害能が見出された。これ

Conjugate of Polyhedral Oligomeric Silsesquioxane andらの結果から、我々が先に見出したポリフェノール類の高Evaluation of Antioxidant Property, Appl. Microbiol.

分子量化による生理活性の増幅という手法をクロロゲン酸、Biotechnol., 66, 430-433 (2005).

−6−

酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発

広島大学大学院生物圏科学研究科

船戸耕一

Yeast has been widely and successfully used to produce polypeptides, enzymes, vitamins, and lipid components
of high commercial interest. Here we describe progress using the yeast Saccharomyces cerevisiae as an industrialorganism for production of human-type ceramides. The yeast cells do not synthesize sphingolipids desaturated
at the ∆4-position of the dihydrosphingosine, which are found in many eukaryotic organisms including humans.
Instead, they produce sphingolipids hydroxylated at the C-4 position. Therefore in order to 'humanize' ceramide
biosynthesis in the yeast, it is necessar y to eliminate endogenous yeast ceramide biosynthetic pathway andintroduce a heterologous DES1 gene encoding a sphingolipid ∆4-desaturase. Indeed, the resultant yeast strain wascapable of synthesizing ∆4-desatulated sphingolipids. Furthermore, we observed that the engineered yeast can
produce a human-type ceramide, ceramide NS. Since ceramides play a critical role in maintaining the permeability
barrier function of the skin, the yeast-derived human-type ceramide could be used for clinical applications toimprove the impaired barrier function seen in several skin diseases including atopic dermatitis.

１．緒より、ヒトの皮膚に対して最も安全で高い効果が期待され言るヒト型セラミドを効率的に生産するシステムを開発する

皮膚の最外層には、水分を保持する保湿機能と外部刺激ことを目的とした。

から肌を保護するバリア機能を司る角質層という組織が存

２．実在する。角質層は角質細胞と天然保湿因子、そして細胞間験

約半分を占めるセラミドが、それらの機能に極めて重要な

２.１ hDES1（ヒト由来の DES1）遺伝子発現ベクターと破壊株の作製役割を担っている。例えば、アトピー性皮膚炎や老人性乾ヒト cDNA ライブラリーを鋳型として PCR を行い、得皮症に共通する特徴は保湿能の著しい低下であるが、そのられた PCR 産物の制限酵素サイトを利用して酵母用遺伝

主因は脂質代謝酵素異常によるセラミド量の減少であるこ子発現ベクターにクローニングした。またタンパク質の発とが知られている。またセラミドはバリア機能の増強・美現チェック用として、N 末端に HA および GFP が融合し白作用やメラニンの生成を抑制する作用があることも示唆た hDES1 遺伝子発現ベクターも作製した。酵母破壊株のされている。セラミドは外部から補給することが可能な物

作製は PCR を用いた遺伝子置換法を用いた。YDp プラス

質である。そのため近年では、乾燥敏感肌を伴う皮膚疾患

ミドを鋳型として PCR を行い、標的遺伝子の上流−選択に対する治療薬あるいは化粧品・美容健康食品の素材としマーカー遺伝子−下流が連結した PCR 産物を得た。形質て大変注目されている。実際、化粧品に関しては、セラミ転換を行い、栄養要求性培地で形質転換体を選抜し標的遺ドを配合した多くの製品がすでに市販されている。セラミ伝子の破壊株を得た。

脂質から構成されているが、その中でも特に細胞間脂質のドの原料としては、これまで牛などの動物由来のものが使われていたが、感染症の問題が指摘され、現在では米、小麦、大豆や芋などの植物性セラミドが主流である。しかし、

２ . ２ 放 射 能 標 識 [3H] myo-inositol お よ び [3H]
sphingosine を用いたイノシトール含有スフィンゴ

植物性セラミドはヒトのセラミドと構造が異なる上に生産脂質の解析性が低いことから、それらを克服することが可能な新しい

野 生 株、 各 遺 伝 子 破 壊 株 を SD 培 地 で 25 ℃、 一 晩 振生産技術の開発が強く望まれている。本研究では、酵母の盪培養した後、イノシトールを含まない SD あるいは含セラミドの合成および代謝システムを巧く制御することに有 SD 懸 濁 液 0.5 ㎖（ 菌 体 重 量 50 ㎎ ） を 調 製 し た。 ラ
ベル時の温度で 10 min 間プレインキュベーションした

Genetic engineering for synthesis ofhuman ceramides in yeast

後、[3H] myo-inositol（15µℓ，15µCi）（図 2A）または [3H]

Kouichi Funato

myo-inositol）あるいは 37℃で 3 時間（[3H] sphingosine）

Graduate School of Biosphere Science,
Hiroshima University

sphingosine（8µℓ，4µCi）（図 2B）加え、30℃で２時間（[3H]
インキュベーションした。10mM の非標識 PHS は、最終
濃度が 100µM になるように、プレインキュベーションの前に加えた）（図 2A）。250mM の NaF と 250mM の NaN3

−7−

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

を 20µℓ加え、反応を停止させた後、氷冷した滅菌水で 3℃で 90min 間反応させた後、0.6N 酢酸溶液で中和させた。

度洗浄し、菌体を 66µℓの滅菌水に懸濁させた。懸濁液にブタノール抽出により塩を除去し、得られたブタノール層

グラスビーズを加え、激しく攪拌することにより菌体を破を窒素ガスにより濃縮乾燥させた。脂質を 20µℓのクロロ

砕した。これにクロロホルム、メタノール、懸濁液の比がホルム−メタノール−水（10：10：3）に溶解させ、薄層10：10：3 になるようにクロロホルム、メタノールを加え、クロマトグラフィー（TLC）プレートに全量をスポットし、脂質を抽出した。抽出液の遠心分離を行い、得られた上清

クロロホルム−メタノール− 4.2N NH4OH（9：7：2）でを回収した後、窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。試展開した１）。展開後、放射能標識スフィンゴ脂質をバイオ料を 100µℓのクロロホルム - メタノール−水（10：10：3）

イメージアナライザー（BAS）で解析した。

に溶解し、0.6N NaOH メタノール溶液を 20µℓ加え、30

図１

酵母のスフィンゴ脂質生合成経路（

図２）とヒト型セラミドの産生経路（

出芽酵母におけるヒト型スフィンゴ脂質の合成活性能力−8−）

酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発

２. ３

hDES1 タンパク質の発現解析

２. ５

野生株、N 末端に HA が融合した hDES1（HA-hDES1）

放射能標識 [3H] DHS を用いたセラミドの解析

sur2 遺伝子破壊株および hDES1 遺伝子発現ベクターを遺伝子発現ベクターを形質転換した sur2 破壊株を SD 培

形質転換した株を SD 培地で 25℃、一晩振盪培養した後、地で 25℃、一晩振盪培養した後、ミクロソーム画分を調SD 懸濁液 5 ㎖（0.5OD600units, 0.1 OD600/ ㎖）を調製した。

２）

製した 。ミクロソーム画分を遠心（100,000g×60 min）し、[3H] DHS を 10µℓ（10µCi）加え、25℃で 24 時間培養した。

可溶性画分（S）と膜画分（P）を分離した。SDS-PAGE 後、

250mM の NaF と 250mM の NaN3 を 200µℓ加え、反応を

ニトロセルロース膜に転写し、マウス抗 HA モノクロー

停止させた後、氷冷した滅菌水で 3 度洗浄し、菌体を 66µナル抗体を用いてウエスタン解析した（図３）。

ℓの滅菌水に懸濁させた。上述したように、菌体を破砕、脂質を抽出・濃縮乾燥した後、NaOH 処理、ブタノール抽出、

２. ４ ニンヒドリン試薬を用いたスフィンゴイド塩
基の解析

脂質の濃縮乾燥を行った。脂質を 20µℓのクロロホルム−
メタノール−水（10：10：3）またはクロロホルム−メタ

sur2 遺伝子破壊株および hDES1 遺伝子発現ベクターをノール（10：10）に溶解させ、あらかじめ borate（70mM

形質転換した株を SD 培地で 25℃、一晩振盪培養した後、Na2B4O7. 10H20 メタノール溶液）で 30 min 間処理し乾燥SD 懸濁液 0.5 ㎖（菌体重量 50 ㎎）を調製した。30℃で２させた TLC プレートに全量をスポットし、クロロホルム

時間インキュベーションした後、氷冷した滅菌水で 3 度洗

−メタノール（9：1）で展開した４）。展開後、放射能標識

浄し、菌体を 66µℓの滅菌水に懸濁させた。上述したようセラミドを BAS で解析した（図 5A，5B）。

に、菌体を破砕、脂質を抽出・濃縮乾燥した後、200µℓの3．結果と考察

メタノール− 5N HCl（9：2）混合液を加え、80℃で 1 時
間インキュベーションした。再度、濃縮乾燥させた後、ブジヒドロスフィンゴシン（DHS）生合成以降の反応はタノール抽出、脂質の濃縮乾燥を行った。脂質を 20µℓの高等動物細胞と酵母の間で大きく異なる。宿主として用い

クロロホルム−メタノール−水（10：10：3）に溶解させ、る出芽酵母にはスフィンゴイド ∆4 - デサチュラーゼ遺伝

TLC プレートに全量をスポットし、クロロホルム - メタ

子 DES1 が存在しないことから、スフィンゴシンを骨格

３）ノール− 2.5N NH4OH（40：10：1）で展開した 。TLCにもつヒト型セラミドは合成されない（図１）3, 5 −6）。そ

プレートにニンヒドリン試薬（0.2％ニンヒドリンエタノの代わり sur2 遺伝子がコードする酵素によって DHS のール溶液）を噴霧、100℃で数分間加熱し、スフィンゴイ

C- 4 位が水酸化されフィトスフィンゴシン（PHS）が合成

ド塩基を解析した（図 4）。スタンダードとして、50nmols

される。次いでそれらのスフィンゴイド塩基 DHS と PHS（10mM の 5µℓ）の精製品（S, DHS, PHS）を用いた。

は、それぞれジヒドロセラミドとフィトセラミドに変換さ

図３

出芽酵母における hDES1 タンパク質の発現

図４ hDES1 遺伝子導入によるスフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ
脂質の産生

−9−

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007れる。そのためヒト型セラミドを酵母で合成させるためにそこで、放射能標識 [3H] スフィンゴシンを用いて、外因性は、酵母特有の PHS とフィトセラミドの両方が合成されスフィンゴシンがイノシトール含有スフィンゴ脂質に変換ないように細工をし、DES1 遺伝子を酵母に導入する必要されるかどうか解析を行った。sur2 破壊株に [3H] スフィがあると考えられる。もし酵母のセラミド合成酵素がスフンゴシンを加えると、スフィンゴシン由来の 2 つの特異的ィンゴシンあるいは DES1 タンパク質がジヒドロセラミド

な脂質が検出された（図 2B）。比較的穏やかな NaOH 処

を基質として認識することができるならば、スフィンゴシ

理後に検出されることから、この 2 つの脂質はアミド結合

ンを骨格にもつヒト型セラミドが酵母で合成されるはずでを有するスフィンゴ脂質であり、それらの移動度からそれある。本研究では、酵母の SUR2 遺伝子を破壊した株をぞれ IPC-AS と MIPC-AS（A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖 ,S:

ベースにし、ヒト由来の DES1（hDES1）遺伝子を導入

スフィンゴシン骨格）であると推定された。一方、野生株することによってヒト型セラミドが産生されるかどうかにではそれらの脂質はほとんど検出されない。これは、おそついて解析を行った。

らく野生株で作られる PHS あるいはフィトセラミドとの競合が原因であると考えられる。これらの結果は、細胞内

３.１ 外因性基質によるヒト型スフィンゴ脂質の合成活性
SUR2 遺伝子がコードする酵素 C4- ヒドロキシラーゼは、でスフィンゴシンが合成されれば、スフィンゴシン骨格をもつヒト型セラミドが sur2 破壊株で合成される可能性を

DHS またはジヒドロセラミドの C-4 位に水酸基を導入す示している。また SUR2 遺伝子の破壊がヒト型セラミド

る触媒活性をもつ。従って、その遺伝子破壊株は、C-4 位の合成のための必須な条件であることも示唆している。

が水酸化された PHS 骨格をもつイノシトール含有スフィ

酵母には、C4- ヒドロキシラーゼ SUR2 タンパク質以

ンゴ脂質、イノシトールリン酸セラミド（IPC-NP，IPC-

外に、スフィンゴ脂質の脂肪酸の α 位に特異的に作用す

AP，IPC-BP； N: 脂肪酸鎖，A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖，

る α- ヒドロキシラーゼの存在が知られている。この酵

B : ジヒドロキシ脂肪酸鎖，P: フィトスフィンゴシン骨格）

素をコードする遺伝子は SCS7 であり、この遺伝子の破と マ ン ノ シ ル -IPC（MIPC-NP，MIPC-AP） を 合 成 す る

壊株はスフィンゴ脂質の脂肪酸の α 位に水酸基を導入すことができない（図 2A）。この sur2 破壊株に細胞外からることができない（図１）。上述したように、sur2 破壊株

PHS を供給させると、PHS 骨格をもつ IPC-AP と MIPC-

では PHS を骨格にもつスフィンゴ脂質は合成されないが、AP が合成される。このことは、内因性のスフィンゴイド

SCS7 タンパク質の作用により 2 種類の異なった脂肪酸鎖塩基と同様に、細胞内に取り込まれた外因性スフィンゴイ（N: 脂肪酸鎖、A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖）を有するセラ

ド塩基もセラミドの合成を経てイノシトール含有スフィン

ミド（Cer-NSa, Cer-ASa）とイノシトール含有スフィンゴ

ゴ脂質へ変換されることを示している。

脂質（IPC-NSa, IPC-ASa, MIPC-NSa, MIPC-ASa）が合成

ヒト型スフィンゴイド塩基（スフィンゴシン）をセラミされる（図 2A）
。酵母でヒト型セラミドを効率的に生産ドに変換させる能力が酵母にあるかどうかは不明である。

させるためには、またその後の抽出と精製を容易にさせる

図５ hDES1 遺伝子導入によるセラミド NS の産生と YDC1 破壊及び ISC1 過剰発現の影響

− 10 −

酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発には、基質となるセラミドの種類が少ないほうがより効果したコントロール株では検出されない。また sur2 と scs7

的であると考えられる。そこで、モノヒドロキシ脂肪酸鎖の両方の遺伝子を破壊させた株に hDES1 遺伝子を導入しからなるスフィンゴ脂質（Cer-ASa, IPC-ASa, MIPC-ASa）

たときにのみ観察され、sur2 単独破壊株においては認めが合成されない sur2 scs2 二重破壊株（図 2A）においてられなかった。更に放射能標識 [3H] sphingosine でラベルも、上記と同様の実験を行った。その結果、sur2 単独破した sur2 scs7 二重破壊株において検出されたセラミド分壊でみられたスフィンゴ脂質と移動度の異なる 2 つのスフ子と同じ移動度を示すこと、この脂質の合成がセラミド合

ィンゴ脂質が観察された（図 2B）。SCS7 タンパク質の機成阻害剤である australifungin により阻害されたことから

能とその移動度から推察するに、この 2 つの脂質はそれぞ（data not shown）、Cer-NS であると考えられる。これは、れ IPC-NS と MIPC-NS であると考えられる。以上の結果

hDES1 遺伝子を形質転換した sur2 scs7 二重破壊株で産生は、sur2 破壊株と同様に、細胞内でスフィンゴシンが合されたセラミドの主なものが Cer-NSa と Cer-NS であると成されれば、スフィンゴシン骨格をもつヒト型セラミドがいう LC-MS/MS の解析結果とも一致している（data notsur2 scs2 破壊株で合成される可能性を示している。

shown）。
そこで、この評価系を用いて、アルカリジヒドロセラミ

３. ２

hDES1 タンパク質の発現解析

ダーゼをコードする YDC1 遺伝子（図 1 参照）の破壊お

hDES1 タンパク質が酵母の細胞内で発現されるかどう

よびイノシトールホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパー

かついて調べるため、N 末端に HA が融合した hDES1 遺ゼ C をコードする ISC1 遺伝子（図１参照）の過剰発現の伝子発現ベクターを sur2 破壊株に形質転換し、可溶性画

影響について解析を行った。その結果、sur2 scs7 二重破分と膜画分を調製した後、それらの画分をウエスタン解析

壊株の Cer-NSa を 100％とした場合、二重破壊の Cer-NS

した。その結果、HA 融合 hDES1 タンパク質の殆どは膜は 30%、sur2 scs7 ydc1 三重破壊株で 64%、ISC1 を高発画分に存在し、酵母内で hDES1 タンパク質が膜タンパク現させた sur2 scs7 ydc1 三重破壊株で 309% と順次増加

質として発現していることが確認できた（図３）。また蛍した（図 5B）。以上の結果は、hDES1 遺伝子を sur2 scs7

光顕微鏡により GFP 融合 hDES1 タンパク質の発現も確

二重破壊株に導入することによって、ヒト型セラミドであ認できた（data not shown）。

る Cer-NS が産生されること、および Cer-NS を酵母で効率的に産生させるには YDC1 との三重破壊と ISC1 の高

３. ３ hDES1 遺伝子導入によるヒト型スフィンゴ脂質の産生発現が有効であることを示唆している。

４．総

sur2 破壊株と sur2 scs7 破壊株に hDES1 遺伝子を導入

括することによって、スフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ

本研究では、まず hDES1 遺伝子を sur2 破壊株および脂質が合成されるかどうかについて解析を行った。形質転

sur2 scs7 二重破壊株に形質転換させるとスフィンゴシン

換した株から脂質を抽出、塩酸で処理（スフィンゴ脂質の骨格を有するスフィンゴ脂質が合成されることが示された。

アミド結合を分解）した後、得られた全スフィンゴイド塩

また hDES1 遺伝子を sur2 scs7 二重破壊株に形質転換さ基をニンヒドリン試薬で分析した。その結果、hDES1 遺せることによりヒト型セラミドである Cer-NS が産生され伝子を形質転換した両方の株からスフィンゴシンが検出さること、Cer-NS をより効率的に産生させるには YDC1 とれた（図 4）。コントロールベクターを形質転換した sur2の三重破壊と ISC1 の高発現が有効であることが示唆され破壊株では、スフィンゴシンは検出されない。これらの結た。以上の結果より、出芽酵母を用いてヒト型セラミド

果は、hDES1 を導入した sur2 破壊株および sur2 scs7 破を産生する基盤的システムが構築できたといえる 7）。今後、壊株において、スフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ脂質

この Cer-NS 合成システムをより効果的なシステムに最適が合成されていることを示しており、ヒト型セラミドが産化することにより、実用化可能なシステムの開発が期待さ生されている可能性を強く示唆している。

れる。

次に実際に、ヒト型セラミドが産生されているかどうかについて解析を行った。TLC を用いたセラミド分子種の謝

辞

分離の方法についてはこれまでいくつか報告がある。そ本研究に対してご支援を頂いた財団法人コスメトロジーのなかで Cer-NSa と Cer-NS を分離することが可能な方法

研究振興財団に深く感謝致します。また本研究の遂行にごを用いて、ヒト型セラミドの産生評価を行った。その結尽力頂いた広島大学大学院生物圏科学研究科とサントリー

果、hDES1 遺伝子を形質転換した sur2 scs7 破壊株にお株式会社先進コア技術研究所の共同研究者の皆様に厚く御いて、Cer-NSa とはあきらかに移動度の異なる脂質が検出

礼申し上げます。

された（図 5A）
。この脂質は、ベクターのみを形質転換− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

（参考文献）

2S）-2-hydroxy-1-hydroxymethyl-2-（2-tridecyl-1-１）Zanolari B, Friant S, Funato K, et al. : Sphingoid

cyclopropenyl）ethyl]octanamide（GT11）in primarybase synthesis requirement for endocytosis incultured cerebellar neurons, Molecular Pharmacology,

Saccharomyces cerevisiae, EMBO J., 19, 2824-2833, 2000.

66, 1671-1678, 2004.

２）Funato K, Lombardi R, Vallee B, et al.: Lcb4p is a５）Funato K, Vallee B, Riezman H: Biosynthesis andkey regulator of ceramide synthesis from exogenous

Trafficking of sphingolipids in the yeast Saccharomyces

long chain sphingoid base in Saccharomyces cerevisiae,

cerevisiae, Biochemistry, 41, 15105-15114,2002.
６）Ternes P, Franke S, Zahringer U, et al.: Identification

J. Biol. Chem., 278, 7325-7334, 2003.

and characterization of a sphingolipid ∆4-desaturase３）Haak D, Gabel K, Beeler T, et al.: Hydroxylation offamily, J. Biol. Chem., 277, 25512-25518, 2002.

Saccharomyces cerevisiae ceramides requires Sur2p

７）児玉由紀子、永野秀昭、船戸耕一、形質転換酵母を用and Scs7p, J. Biol. Chem., 272, 29704-29710, 1997.
４）Triola G, Fabrias G, Dragusin M, et al.: Specificityof the dihydroceramide desaturase inhibitor N-［（1R,− 12 −いるセラミドの製造方法、特願 2005-351366

アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

東京医科歯科大学生体材料工学研究所

秋吉

一成

Synopsis: Stimuli-responsive molecular assembly systems have attracted considerable attention in the fieldsof biotechnology and drug delivery systems. Typically, the external stimulus is heat, pH, light or the addition ofmolecules, such as glucose or cyclodextrin. Enzymes are also used to trigger the response of a system. We report
here new enzyme-responsive micellar systems in which an enzymatic reaction controls the amphiphilicity of thesurfactants. The surfactants in our study consist of a short alkyl chain and a maltooligomer as a primer which canbe synthesized enzymatically. In the presence of phosphorylase and α-D-glucose-1-phosphate (G1P), the elongation
reaction of the saccharide chain proceeds from the non-reducing 4-OH terminus of the (α1→4)-glucan chain. Thus,
we first prepared amylose-primer surfactants (C8MP, C12MP, C16MP) where an alkyl group (C8, C12, C16) is linked
to the reduced terminus of maltopentaose (MP, number of glucose units (GU) = 5). The surfactants form micelles inwater, which are dissociated upon the enzymatic elongation reaction of the sugar moiety. The association of amylose
primer surfactants was controlled by changing the amphiphilicity with a chain-elongation reaction triggered by
the addition of phosphorylase. We demonstrate here that by using this property the micelle-to-vesicle transitionof mixed lipid/ primer systems can be controlled, and this presents a new method for the reconstitution of transmembrane protein to liposome.

１．緒よる会合構造の制御、およびそのバイオテクノロジー応用

言について検討した。

生分解性を有するアミロースは水溶液中において螺旋構

２．実造を形成し、その中に疎水性の低分子を包接しえる興味あ験

基 5 つからなるマルトペンタオースをプライマーとして、ホ2. 1 アルキル置換アミロースプライマーの合成とキャラクタリゼーション

スホリラーゼを用いた酵素触媒重合により合成できる [1, 2]。

マルトペンタオースの還元末端を既存の方法によりラクる高分子ホストである。アミロースはまた、グルコース残

この反応は非還元末端から進行することから還元末端の修トン化し、マルトペンタオースラクトンを得た（図１）
。

[3-6]

その後、マルトペンタオースラクトン / エチレングリ

我々はこれまでにポリエチレンオキシド（PEO）修飾

コール溶液にアルキルアミン / エチレングリコール溶液

プライマーを合成し、酵素重合法により両親媒性の PEO-を滴下し、窒素雰囲気化にて 70℃で 6 時間攪拌することで、アミロースブロックコポリマーを合成した。この PEO- ア

ア ル キ ル 鎖 長 が 8、12、16 の C8-MP、C12-MP、C16-MP

ミロースがクロロホルム中にてアミロース部位を内核としを得た。

飾により、様々なアミロース誘導体の合成が可能である。

た会合体を形成し、特異な包接挙動を示すことを明らかと構造解析は 1H-NMR、FT-IR、MS より行った。次に表した [6]。食品やドラッグデリバリー分野ではすでに利用さ

面張力測定により各アルキル置換プライマーの臨界ミセル

れ安全性も高いアミロースの自己組織化制御による機能発濃度（CMC）を決定した。また C12-MP、C16-MP の水溶

現、ナノバイオマテリアル創製はより広範な利用の途が開

液中における会合挙動を多角度光散乱測定（MALS）測定

かれるものと期待される。

により評価した。

本研究ではマルトペンタオースにアルキル鎖（アルキルプ ラ イ マ ー（C8-MP、C12-MP、C16-MP） を 合 成 し、 そ2. 2 アルキル置換プライマーを用いた筋肉ホスホリ
ラーゼによる酵素重合の水中での会合挙動、ホスホリラーゼを用いた酵素重合に合成した各プライマーを用いて筋肉ホスホリラーゼによ

鎖長 =8、12、16）を化学置換した両親媒性アルキル置換

る酵素重合を行った（図２）。
Amylose engineering: Design of nanogel
particles with molecular recognition
Kazunari Akiyoshi
Institute of Biomateria ls andBioengineering, Tokyo Medical and
Dental University

各 プ ラ イ マ ー ま た は マ ル ト ペ ン タ オ ー ス（1.0mM）、
G-1-P（100mM）、AMP（10mM）、筋肉ホスホリラーゼ（0.26μM）となるように pH6.2 の 100mM Bis-Tris buffer に溶解し、40℃にて重合を開始した。所定の時間における反応液を用いて遊離リン酸の定量を行い、重合度を求めた。

− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

2. 3 アルキル置換プライマーの酵素重合による動的構造変化

μm のフィルターを通した後、動的光散乱 (DLS) 測定を行い粒径を評価した。TEM 観察は 0.5% の酢酸ウランにより染色後、100kV で行った。

酵素重合による C12-MP ミセルの崩壊挙動を重合条件下における表面張力変化および重合度より評価した。

３．結果および考察

2. 4 アルキル置換プライマーの酵素重合によるリポ
ソームの再構成

3. 1
1

合成をそれぞれ確認した。

DPPC（1mM）および C12-MP（1mM）を G-1-P（100mM）、合成の結果、それぞれ収率 50％、39％、20％で C8-MP、AMP（10mM）、 筋 肉 ホ ス ホ リ ラ ー ゼ（1.3μM） を 含 む

C12-MP、C16-MP を得た（表１）。

pH6.2 の 100mM Bis-Tris buffer（1mL） に 溶 解 し、40 ℃

両親媒性プライマーは表面張力測定からミセルを形にて重合を開始した。各時間における溶液を採取し、0.80

CH2OH

CH2OH

CH2OH

O

O

O
O

O

OH

OH

OH

OH
OH

3

R

OH

O
OH

OH

OH

70℃, 6h, Ethyleneglycol

O

OH

OH

O

OH
OH

CH2 OH

OH

O

+

NH

3

OPO3 K 2OH

α-glucose-1-phosphate
CH2 OHCH2 OHO

CH2 OHO

OH

Muscle phosphorylase b
AMP

OH
OH

OH

C12-MP primer

40℃, pH6.2

O

n

O

O
OH

アルキル化アミロースプライマーの合成

OH

O-(CH2)11CH3[C12-MP]-(CH2)15CH3[C16-MP]

CH2 OHOH

R: -(CH2)7CH3[C8-MP]OH

3Primer
図１

HN R

O

O

OH

OH

OH

CH2OH

CH2OH

O

CH2 OH

3

Maltopentaoselactone
CH2OH

CH2 OH

O

O
OH

OH

Maltopentaose
H2N

OH

OH
O

OH

O

O

O
OH

(ii) Ion exchange

CH2OH

CH2OH

CH2OH
(i) I 2 , KOH

OH

OH

OH

プライマーの合成とキャラクタリゼーション

H-NMR、MS スペクトルより、アルキルプライマーの

OH

OH

OH

O

OH
OH

OH

NH
O

O

n+ 3

OH

C12-amylose
図２

C12-MP プライマーの酵素重合− 14 −+ n K 2 HPO4

アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

成 し て い る こ と が 示 唆 さ れ、CMC は、 そ れ ぞ れ C8-速された。これは、ミセル表面で基質の濃縮効果によるも

MP=10mM、C12-MP=0.5mM、C16-MP=0.05mM であるこのと思われる。一方、C16-MP では CMC よりも高い濃度とが明らかとなった。静的光散乱測定による求められた会

では重合反応はむしろ抑制された。本酵素反応の律速は、合体の分子量から、C12-MP では会合数が約 68 分子のミミセルから基質プライマーが引き抜かれ、酵素活性点へ取セルを C16-MP では 138 分子からなるミセルをそれぞれ形

り込まれる段階であると考えられる。疎水性が高く最も安成していることが示された。

定なミセルを形成する C16-MP 系では、ミセルへの引き抜きが抑制され結果的に反応が抑制されたものと考えられた。

3. 2

プライマーの酵素重合

プライマーの会合状態により、酵素反応が制御しえること

図３より 1mM の各プライマー存在下にて筋肉ホスホリが明らかになった。

ラーゼを用いた酵素重合では C12-MP において酵素重合がまた、ホスホリラーゼ b は AMP が存在することで活性

マルトペンタオースに比べ、約 4 倍早く進行した。リン定型となり重合を開始することから、AMP 分子応答性のミ1量により求められた重合度の値は H-NMR より計算されセルともいえる。

た重合度とほぼ一致することが確かめられた。また、糖鎖の伸長はマススペクトル（MS）より確認され、分子量分

3. 3

布も狭いことが分かった。

酵素重合によるミセル構造の動的変化

C12-MP ミセル（1mM）系での酵素重合反応の時間変

いずれの系でも CMC より低い濃度、すなわちモノマー化を詳細に観測したところ、重合および表面張力は時間ととして存在する濃度では、重合速度は、アルキル鎖を導入

ともに、初期の早い反応過程とその後ある時間経過後の遅していない未修飾のマルトペンタオース（MP）とほぼ等

い反応の二段階で進行することが明らかになった（図４）。

しかった。一方、C8-MP と C12-MP を CMC よりも高い

これは糖鎖の伸長により親水性が増大し、ミセル臨界濃濃度で重合させた場合には、未修飾 MP よりも反応が加度が増加し、最終的には C12-MP ミセルが崩壊したものと

表１

アルキル置換アミロースプライマーの合成およびキャラクタリゼーション

Abb.

アルキルアミン 1）(mmol)

エチレングリコール
(mL)

収率
(%)

CMC 2）
(mM)

C8-MP

6.0

18

50

10

C12-MP

6.0

18

39

0.5

C16-MP

6.0

21

20

0.05

C8-MP
C12-MP
C16-MP
マルトペンタオース

987

表面張力 (dyn/cm)

重合度（グルコース単位）

10

6
5
4
3

70

20

60

15

50

10

40

5

30

0

2
1
0

0

30

60

90

120

0

200

300

400

重合時間（分）重合時間（分）図３

100

各プライマーの酵素重合

図４− 15 −

C12-MP の酵素重合による表面張力変化

重合度（グルコース単位）

1）マルトペンタオースの仕込量：1.2mmol2）表面張力測定による

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

いえる。今回行った表面張力測定では 40 分後から 160 分

４．

後に急激な変化が見られたことから、その中間点である

総括100 分後の重合度（DP ＝ 9）あたりからミセルの崩壊が以上のように、糖鎖界面活性剤は、水中、中性 pH とい

始まり、180 分後の重合度（DP ＝ 17）でミセルは完全にう穏和な条件下でホスホリラーゼ酵素による糖鎖伸長反応

崩壊していると考えられた。

により分子の親水性 - 疎水性を変化させ、その集合特性、界面特性を制御しえることが明らかになった。これら界面

3. 4 ミセルーベシクル転移の酵素反応制御 : 新規リ
ポソーム合成法

活性の制御は、材料表面へのコーティング、物質可溶化、エマルション作成はもとより近年のマイクロ計測におけるリン脂質 - 界面活性剤系における酵素応答性ミセルーベ

流れやぬれの制御などにおいて重要であろう。この新規酵

シクル転移についても検討した。リン脂質と C12-MP を混素応答性界面活性剤を持ちうることで、コロイド化学のみ合すると動的光散乱測定より粒径 21.1nm の混合ミセルがならず、タンパク質再生や膜タンパク質再構成などのバイ形成することがわかった。この溶液に酵素処理を行うと、オテクノロジー分野での幅広い応用が期待できる。

時間とともに会合体の粒径が増加し、重合時間が 2 時間を経過すると（重合度 14）比較的サイズの揃った約 100 nm（参考文献）のリポソームが形成した。C12-MP の糖鎖の伸長に伴って、

１）Whelan WJ, Bailey JM, : The action pattern of potato
phosphorylase, Biochem. J. 58, 560-9, 1954.

その親水性が増加して界面活性剤としての性質が失われ、会合体から除去され結果的にリン脂質のみからなるリポソ

２）Ziegast G, Pfannemueller B,: Linear and star-shaped
hybrid polymers.4. Phosphorolyric synthesis with di-ームへと転移したものと考えられる。

functional, oligo-functional and multifunctional primers,

この重合条件における混合ミセルの重合速度は MP の

Carbohydr. Res., 160, 185-204, 1987.

1.5 倍であった。電子顕微鏡観察からもサイズの揃ったリ
ポソーム形成が確認された。これは、リポソーム形成法と

３）Kobayashi K, Kamiya S,:Amylose-carrying styrene
Macromonomer and its homo- and copolymers:

して従来にない新しい手法である。
C12-MP ミセルは、バクテリオロドプシン（BR）を可

Synthesis via enzyme-catalyzed polymerization and

溶化した。この BR を含むミセル溶液に C12-MP- リン脂

complex formation with iodine, Macromolecules 29,

質（DPPC）混合ミセルを加えた。この溶液に対して、グ

8670-8676,1996.

ルコース - １- リン酸および筋肉ホスホリラーゼ存在下酵

４）Loos K, Stadler R,: Synthesis of Amylose-block-

素重合を 2 時間行ったところ、約 150nm のロドプシン再polystyrene rod-coil block copolymers, Macromolecules

構成リポソームが調製しえた。この再構成されたロドプシ

30, 7641-7643, 1997.

ンは、プロトンポンプ活性を有しており、本システムが、

５）Enomoto N, Furukawa S, Ogasawara Y, Akano H,

新規な膜タンパク質再構成リポソーム調製法として有効でKawamura Y, Yashima E, Okamoto Y,: Preparation of

あることが明らかになった。

silica gel-bonded amylose through enzyme-catalyzed

散乱強度 (%)

20
15

C12-MP/DPPC
混合ミセル

DPPCリポソーム

10
5
0

1

10

100

1000

粒径 (nm)
図５

C12-MP/DPPC 混合ミセルの酵素重合によるベシクル転移− 16 −

200 nm
図６ C12-MP/DPPC 混合ミセルの酵素重合により得られた DPPC リポソームの電子顕微鏡像

アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

polymerization and chiral recognition ability of its

recognition site: Induction of a novel binding

phenylcarbamate derivative in HPLC, Anal. Chem., 68,characteristic of amylose by self-assembly of

2798-2804, 1996.

poly(ethylene oxide)-block-amylose in chloroform,

６）Akiyoshi K, Maruichi N, Kohara M, Kitamura

Biomacromolecules, 3, 280-3, 2002.

S,: Amphiphilic block copolymer with a molecular− 17 −

脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による
新規な抗酸化系の構築
山口大学工学部応用化学工学科

吉本誠

The structure and function of phospholipids are modified in the presence of reactive oxygen species（ROS）
such as hydrogen peroxide. An excess amount of the ROS is known to be decomposed enzymatically with catalase.
To our knowledge, little is known on the role of phospholipid molecules in decomposing the ROS in the absenceof the enzyme. In the present work, the decomposition of hydrogen peroxide at the initial concentration of 1.0 mM
was examined at pH 7.4 in the presence of the various molecular assemblies of phospholipids. Phospholipids usedwere various phosphatidylcholines（PC）which were different in the number of carbon atoms in the acyl chains n as
well as the degree of unsaturation. The saturated PCs（n < 10）forming monomers and micelles slightly enhanced
the decomposition of hydrogen peroxide. In marked contrast, the PCs forming liposomes（10 n）significantly
enhanced the decomposition reaction with neither lipid peroxidation nor change in the size of liposomes. Therefore,
the liposomes were suggested to undergo negligible physicochemical modifications in the presence of hydrogen
peroxide. The steady-state fluorescence polarization of the probes incorporated in the liposome membranes wasmeasured to clarify an effect of hydrogen peroxide on the fluidity of liposome membranes. The fluidity of thelipid-water interface in the liposomes was decreased by the presence of hydrogen peroxide. On the other hand,practically no effect of hydrogen peroxide was seen on the fluidity of the hydrophobic region in the membrane.
These results obtained indicated that the liposome-mediated decomposition of hydrogen peroxide proceeded at thelipid-water interface of liposomes. In conclusion, it was revealed that the phospholipid bilayer membranes forming
liposomes functioned as a novel antioxidant system which effectively decomposed hydrogen peroxide.

１．緒

活性酸素による不飽和脂質分子の過酸化反応については豊言

富な知見が蓄積されている。一方、脂質分子が活性酸素の過酸化水素をはじめとする活性酸素種は、生体内におい安定性にどのように影響するのかについては不明な点が多て種々の機能を制御する因子として重要である１）。一方、

い。脂質の共存下における活性酸素の安定性を明らかにす

過剰に生成蓄積した活性酸素は、脂質膜の過酸化を引き起ることは、活性酸素に対する脂質膜の自己防御機能を解明

２）

こして疾病の原因となる 。生体内では過酸化水素は通常して脂質膜を利用した新規な抗酸化系を構築する観点からカタラーゼ等の酵素により効率よく分解除去されている。

重要であると考えられる。
本研究では、種々の疎水鎖長、不飽和度を有するホスフ

一方、脂質膜自体が活性酸素に対して発現すると考えられァチジルコリンを用いてリン脂質モノマー、ミセル溶液及る自己防御的な機能は殆ど知られていない。
著者らは、リポソーム内に封入されたグルコースオキシ

びリポソーム懸濁液を調製し、それらの脂質分子集合体がダーゼによるグルコース酸化反応を、酸素を連続的に供給モデル活性酸素である過酸化水素の分解反応に及ぼす影響

する気泡塔バイオリアクターの条件下で行い、共存するリを検討した。また、脂質分子集合体の化学的安定性、粒子

ポソーム内封入カタラーゼにより生成過酸化水素が効率よ

径及び膜流動性に及ぼす共存過酸化水素の影響を検討して、く分解されることを報告した

３-5）。この酸化反応過程にお脂質分子集合体と過酸化水素の相互作用機構を推定した。

いて、カタラーゼ分子のみならず、リポソームを構成する

２．実

脂質二分子膜自体が過酸化水素の分解を促進していることが示唆された。脂質二分子膜は、タンパク質や水をはじめ

２．１

験

リン脂質

とする種々の生体分子と静電・疎水性相互作用や水素結合

飽和リン脂質として、脂質親水部位（Choline）が同などにより複合体を形成して、脂質膜に結合した分子の構一であるが、疎水鎖を構成する炭素数が異なる種々の造に影響を及ぼすことが報告されている

６，７）。これまでに、

diC nPC（diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine, n=4, 6, 7,
8, 10, 12, 14） を 用 い た。 ま た、 不 飽 和 リ ン 脂 質 と し て、A novel antioxidant system based on lipid
assemblies-mediated decomposition ofreactive oxygen species
Makoto Yoshimoto
Depa r t ment of Appl ied Chem ist r y
and Chemical Engineering, Faculty ofEngineering, Yamaguchi University

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（POPC）
を用いた。

２．２

脂質分子集合体の調製

ナス型フラスコ内で脂質を有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を留去してフラスコ壁面に脂質薄膜を形成させた。凍− 18 −

脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築

結乾燥機を用いて８Pa 以下の減圧下（２h）で有機溶媒をand 0.1g/L 2,6-di-t-butyl-4-methylphenol（BHT） か ら な

ほぼ完全に留去した後、50 mM Tris-HCl/100 mM NaCl

る TBA 試薬 2 mL とを混合した。POPC-TBA 試薬混合液

緩衝液（pH 7.4）で乾燥脂質膜を水和した。この操作によを密閉したガラス製容器に入れ、15 分間沸騰後、水冷した。

り炭素鎖長の短い脂質（n遠心分離（1000 g, 15 分）した後、532 nm の吸光度を測定

8）は、脂質濃度 10 mM において脂質モノマー溶液あるいは脂質ミセル溶液を形成した。

して過酸化脂質生成量の指標とした。

リポソームを形成した脂質懸濁液について、大きな多重層
リポソームを形成させるために、−80℃で凍結及び 35℃で２．７

脂質膜流動性の評価

融解する操作を 7 回繰り返した。さらに、エクストルーダー

脂質二分子膜の親水部位と疎水部位に配向する蛍光プロ

を 用 い て 平 均 細 孔 径 が 400nm、200nm、100 nm、80nm、ーブとして、Trimethylammoniumphenyl）-6-phenyl-1,3,5-

50 nm、30nm のポリカーボネート膜を 11 回通過させて種々

hexatriene iodide（TMA-DPH）と Diphenyl-1,3,5- hexatrieneの粒子径を有する一枚膜リポソームを調製した。脂質濃度（DPH）をそれぞれ用いた。脂質濃度 0.5 mM のリポソー

は酵素法で測定し、調製した脂質分子集合体は−４℃で遮ムと 0.4 µM の DPH あるいは 2.0 µM の TMA-DPH を混合光保存した。

して 24 h 静置後、過酸化水素（10mM）を添加して５h 後の分極率 P を蛍光分光光度計で測定した。1/P 値をリポ

２．
３

リン脂質共存下における過酸化水素の分解

ソーム膜流動性の指標とした。

脂質分子を溶解あるいは懸濁した Tris 緩衝液と過酸化3．

水素水溶液を混合して、脂質と過酸化水素の濃度がそれぞ
れ 1.0 − 40 mM と 1.0 mM の溶液 1.0 − 1.5 mL を調製した。

３．１

結

果

リポソームの過酸化水素分解機能

これをガラス製試験管に入れ、綿栓をして種々の温度に設

Fig. 1 に 25℃において脂質を含有しない Tris 緩衝液（pH定した恒温槽中に静置した。過酸化水素濃度の経時変化を7.4）及び平均直径 100 nm の POPC リポソームを種々の濃

後述の酵素法により 120h 追跡した。

度で懸濁した Tris 緩衝液中の過酸化水素濃度の経時変化を示す。初期過酸化水素濃度は 1.0 mM である。脂質非共

２．
４

過酸化水素濃度の測定

存系では、過酸化水素は 120 h の間 90% 以上が分解せずに過酸化水素濃度は、
西洋ワサビ由来の Peroxidase（HRP）

安定に存在している。これより、過酸化水素分解の要因と触媒下の過酸化水素による o-dianisidine の酸化反応に基なり得る緩衝液中の不純物金属イオン及び試験管壁の影響

３）づき定量した 。反応溶液中の HRP、o-dianisidine 及びコは無視できることがわかる。一方、POPC リポソーム懸濁

ール酸ナトリウムの濃度は、それぞれ５µM、3.3mM 及び系では、過酸化水素の分解反応が促進されている。リポソ

10 mM とした。ここで、コール酸ナトリウムは、リポソームの過酸化水素分解促進効果は、高脂質濃度条件下ほどームを溶解させ、リポソーム内水相の過酸化水素溶液を放顕著である。100µM Fe2+ イオン共存下において過酸化水出させるために添加した。25℃において、460 nm の吸光

素は 25 h で 90％以上が分解した（データ省略）。これは、本定量に影響を及ぼさなかった。

２．
５

脂質懸濁液の濁度測定

リポソーム粒子径及び粒子径分布の指標として、リポソームを懸濁した Tris 緩衝液の濁度を 600nm、25℃における吸光度（OD600）から評価した。初濃度 1.0 mM の過酸
化水素と 120 h 共存させる前後のリポソーム懸濁液（[lipid]=10mM）の濁度を測定した。

２．
６

生成過酸化脂質量の評価

生成過酸化脂質の指標として、過酸化脂質の二次反応生成物を定量することができるチオバルビツール酸

Remmining hydrogen peroxide [%]度を測定して過酸化水素濃度を決定した。共存する脂質は、と 3.75 g/L TBA、150 g/L trichloroacetic acid, 0.25 M HCl

60
10mM
40

25 oC
POPC liposome : 100nm

20

0

25

50

75

40 mM

100

125

Reaction time [h]本測定は、脂質過酸化を受ける可能性がある不飽和脂質
POPC について行った。POPC リポソーム懸濁液 0.5 mL[POPC]=1.0mM80

0（4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidine; TBA）法 8）を用いた。

Tris buffer (no lipid)

100

Fig. １ 初濃度 1.0mM 過酸化水素の分解に及ぼす共存 POPC
リポソームの影響（25℃ , pH 7.4）

− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Fe2+ イオンによりラジカル種が生成して過酸化水素の分解

３．３

種々の脂質分子集合体の過酸化水素分解機能反応が著しく促進されたためである。リポソーム共存によ

脂質分子の会合状態と脂質の炭素鎖の特性が共存する過る過酸化水素分解反応速度は Fe2+ 共存下の分解反応の場

酸化水素の分解反応に及ぼす影響を検討した。脂質濃度を合に比べて小さいことがわかった。

10 mM の一定として、脂質と初濃度 1.0 mM の過酸化水素を 120 h 共存させたときの残存過酸化水素濃度を Fig. ２

３．２ 過酸化水素共存下におけるリポソームの物理
化学的特性の変化に示す。分解反応は pH7.4、 25℃の条件下で行った。脂30− 400nm の平均粒子径を有する POPC リポソームとル溶液（n= 7, 8）９）及びリポソーム懸濁液（n= 10, 12, 14,

過酸化水素を 120 h 共存させた後にリポソーム懸濁液の濁POPC）を形成した。リポソームの平均粒子径は 100 nm度を測定して、過酸化水素共存前のそれぞれの濁度と比較とした。脂質によるリポソームの形成は濁度から判定した。

した。結果を Table 1 に示す。リポソーム懸濁液の濁度はFig. 2 において、脂質モノマーおよび脂質ミセル溶液中で過酸化水素の共存により僅かに増加しているものの、120は、脂質を添加していない Tris 緩衝液系よりも過酸化水

h 静置中に一部のリポソーム間において凝集体が形成する

素の分解がやや促進されている。一方、リポソーム懸濁液

ことを考慮すると、過酸化水素はリポソーム懸濁液の濁度

中では、脂質モノマー、ミセル溶液中に比べて過酸化水素に殆ど影響しないとみなすことができる。すなわち、リポの分解が著しく促進されている。これより、脂質が発現す

ソーム粒子径が共存過酸化水素の分解反応中に殆ど変化しる過酸化水素分解活性は脂質分子の集合状態に依存し、リないことがわかる。また、POPC リポソームと過酸化水素

ポソームが最も高い活性をもつことがわかった。また、リを 120 h 共存させた後に過酸化脂質生成量を TBA 法で評

ポソームを形成する脂質の種類により、リポソームの過酸

価したところ、POPC は過酸化されていなことがわかった。

化水素分解促進効果が異なることがわかる。diC14PC から以上の結果より、リポソームは過酸化水素共存下において形成されるリポソームは最も高い過酸化水素分解促進効果

物理化学的な修飾を受けることなく過酸化水素の分解反応を示している。

質は、炭素鎖長 n により、モノマー溶液（n= 4, 6）、ミセを促進していると考えられる。
Table１
リポソーム平均直径[nm]

リポソーム懸濁液濁度に及ぼす共存過酸化水素の影響
OD600（過酸化水素非共存下）

50
100
200
400

OD600（過酸化水素と120h 共存後）0.22 ± 0.06
0.39 ± 0.05
0.79 ± 0.08
2.13 ± 0.21

0.24 ± 0.07
0.54 ± 0.23
1.05 ± 0.25
2.13 ± 0.09

POPC

25 oC

diC14PC

Liposomes(100 nm)

diC12PC
diC10PC
diC8PC

MicellesdiC7PC
diC6PCMonomers

diC
C4PC
Tris buffer(no lipid)

0

20

40

60

80

100

Remaining hydrogen peroxide [%]Fig. ２ 1.0 mM 過酸化水素の分解に及ぼす種々の脂質分子の会合状態の影響（[lipid] =10 mM, 25℃ , pH 7.4)

− 20 −

脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築

３．４ リポソームの過酸化水素分解活性に及ぼす脂質膜相状態の影響なく、リポソームが触媒的に作用していることが示唆されFig. ３に diC14PC から形成される平均粒子径 100 nm のゼを触媒とすると速やかに分解されることから、リポソー

リポソームを 15−35 ℃で初濃度 1.0 mM 過酸化水素と 120

ムが発現する過酸化水素分解活性は微弱であり、低濃度のる。Fig. １で用いた 1.0 mM の過酸化水素は酵素カタラー

h 共存させたときの残存過酸化水素量を示す。diC14PC 膜

過酸化水素に対する脂質膜の自己防御的な機能として捉えがゲル相から液晶相へ転移する温度 Tm は 23 ℃付近であることができる。脂質分子が過酸化水素の分解反応を効率る。リポソーム非共存系では、各温度において過酸化水素

よく促進するのは、脂質分子がリポソームを形成するときは安定である。リポソーム共存系では、全ての温度においである（Fig. ２）。リポソームの脂質二分子膜は、数万からて過酸化水素の分解が促進されているが、15℃ではリポソ

数十万の脂質分子が高密度かつ秩序的に集合して形成するームの共存効果がやや小さくなる傾向が認められる。これ

安定な会合体であるのに対し、脂質ミセルはミセル間の脂より、液晶相の状態にあるリポソーム膜は共存過酸化水素

質分子の組み換えが容易な不安定な会合体である。すなわの分解促進に有利であることが示唆される。

ち、脂質分子集合体内において分子の配向性と密度が高い
ことが過酸化水素分解活性の発現に寄与すると考えられる。

３．
５リポソームによる過酸化水素分解機構

また、Fig. ３の結果は、diC14PC から形成されるリポソー

リポソームと過酸化水素間の相互作用を効率よく検出す

ムがゲル状態に比べて液晶状態にある場合に高い過酸化水るために、種々のリポソーム（[lipid] = 0.5 mM）を初濃度

素分解促進機能を示すことを示している。相転移温度が室10 mM の過酸化水素と５h 接触させ，H2O2/lipid モル比が温付近である diC14PC リポソームの過酸化水素分解機能に高い条件下で膜流動性を測定した。Fig. ４に異なる粒子径

ついてはさらに詳細な検討が必要である。

の POPC リポソームを用いたときに得られた結果を示す。

過酸化水素の共存による脂質膜親水部位の流動性の低下

いずれのリポソームでも疎水部位の流動性は親水部位に比（Fig. ４）より、過酸化水素分子がリン脂質親水部位と複べて高く、過酸化水素に殆ど影響を受けていない。一方、合体を形成して、脂質分子の回転運動を阻害しているもの

親水部位の流動性は、いずれの場合も過酸化水素の添加にと推測される。すなわち、過酸化水素の分解はリポソームより僅かに減少している。この結果は，過酸化水素分子が外膜 - 液本体及びリポソーム内膜 - リポソーム内水相の各脂質膜の親水部位（リポソーム膜表層）に結合して分解作界面で進行すると推定される。

用を受けることを示唆している。

４．考

リポソーム膜が発現する過酸化水素分解活性を最大限に高めることができれば、リポソームを安定な抗酸化素子と察して活用できると考えられる。例えば、リポソームとカタ

POPC リポソームを過酸化水素と共存させた後に過酸化ラーゼを複合化した過酸化水素分解素子は、気泡塔バイオ

脂質の生成およびリポソーム径の変化が認められなかった

リアクターの条件下において、酸化酵素反応で副生する過（Table １）。したがって、リポソームによる過酸化水素分

酸化水素を効率よく安定に分解除去する機能を発現するこ解反応では、リポソーム自体が物理化学的に変化することとを明らかにしている５）。

Liquid-crystal state
Gel state80Tm= 24oC60[H2O2]initial = 1.0 mM
di14PC liposome

40[Lipid] = 10 mM
Reaction time : 120h

20
0

10

20

30

40

Temperature [℃]Fig. ３ DMPC リポソームの過酸化水素分解機能に及ぼす温度の影響（■：脂質非共存下、□：脂質共存下、[lipid] =10 mM, pH 7.4）

Membrane fluidity, 1/P [−]Remaining H2O2 [%]

100

10

4

(a) Hydrophobic
region

3.5

8

3

6

2.5

4
2

(a) Hydrophilic
region

30

50

80

100

200

400

Diameter of POPC liposomes [nm]

2

30

50

80

100

200

400

Diameter of POPC liposomes [nm]Fig. ４ POPC リポソームの（a）疎水部と （b）親水部の膜流動性の変化（過酸化水素添加前（■），添加後（□））− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

（参考文献）

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diseases and oxidative stress. Biomed. Pharmacotherapy,７）Kuboi, R., Yoshimoto, M., Walde, P. and Luisi,

58, 39-46（2004）
３）Yoshimoto, M., Miyazaki, Y., Sato, M., Fukunaga, K.,

P. L., Refolding of carbonic anhydrase assisted by

Kuboi, R. and Nakao, K., Mechanism for high stability

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
liposomes. Biotechnol. Prog., 13, 828（1997）of liposomal glucose oxidase to inhibitor hydrogen
peroxide produced in prolonged glucose oxidation.

８）Genot, C., Metro, B., Viau, M. and Bouchet, B.,
Characterisation and stability during storage of

Bioconjugate Chem., 15, 1055-1061（2004）

liposomes made of muscle phospholipids. Lebensm.-

４）Yoshimoto, M., Wang, S., Fukunaga, K., Fournier, D.,

Wiss. u.-Technol., 32, 167-174（1999）

Walde, P., Kuboi, R. and Nakao, K. Novel immobilized
liposomal glucose oxidase system using the channel

９）Hauser. H., Short-chain phospholipids as detergents.

protein OmpF and catalase. Biotechnol. Bioeng., 90,− 22 −

Biochim. Biophys. Acta, 1508, 164-181（2000）

ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用

同志社大学工学部（前・東京大学先端科学技術研究センター）

野口範子

Ginger is the rhizome of Zingiber officinale Roscoe, a plant cultivated in tropical and subtropical countries.
Ginger extract contains many kinds of constituents, such as gingerol, shogaol, and gingediol, responsible for thepungent taste of ginger and has been know to possess a variety of pharmaceutical effects. The present study was
conducted to evaluate antioxidant activities of some of ginger constituents and their synthetic derivatives (thirteencompounds) and to find out novel functions of these compounds in cell. All phenolic compounds inhibited lipid
peroxidation of methyl linoleate and low density lipoprotein (LDL). A hydrophilic group at the end of side chain
decreased antioxidant activity in LDL. The compounds with longer side chain showed stronger antioxidant activity.
A global study of gene expression using DNA microarray in endothelial cell exposed to ginger-related compounds
revealed that compounds having α-,β-unsaturated carbonyl, eg. shogaol, strongly induced expression of genes
which were regulated by Keap-1/Nrf2/ARE pathway. The side chain effects on gene expression was not as large as
observed in antioxidant activity. Nrf2-regulated genes encode cytoprotective proteins against oxidative stress, which
may explain a part of pharmaceutical effects of ginger extract.

１．緒Fig. １に示した。これらの化合物は東亜合成株式会社より言供与された。ヒト臍帯静脈内皮細胞 human umbilical vein

ショウガはインドや東南アジア原産の宿根草で、古来よ

endothelial cells（HUVEC）と培養液は Clonetics 社からり漢方の多くの処方に配合されている。ショウガには「生購入した。DNA マイクロアレイ用の GeneChip, Human

姜」と「乾姜」があり、それぞれ薬効に違いがあるとされ、Genome Focus Array は Affymetrics 社から購入した。そ使い分けられている。日本では古くから、調味や薬味としの他の試薬は和光純薬から購入した。

て親しまれているが、日本で用いられている「生姜」は厳
密には「乾生姜」に相当する。本稿ではこれらすべてを含めショウガと総称することとする。

2. 2

抗酸化作用の評価

ショウガ成分の誘導体の脂質酸化に対する抗酸化作用にショウガには解毒や解熱作用があり、頭痛や咳、痰、鼻ついて、リノール酸メチルのアセトニトリル均一溶液中、づまりなど風邪の諸症状を緩和したり、胃痛、腹痛、嘔気

リン脂質のリポソーム膜、そしてリポタンパク質の酸化にを鎮めるなど多岐にわたる効能が知られ、薬理作用につい対して評価をおこなった。低比重リポタンパク質（LDL）

１）て詳細な研究がされている 。さらに、肌の美白作用もあの精製、分析および解析は研究室の常法に従った２）。

るとされコスメトロジーの分野においても非常に興味深い
食材料である。ショウガの成分としては、精油や辛味成分

2. 3

内皮細胞における遺伝子発現の解析が知られている。精油は食品や化粧品の香料としてよく用HUVEC（１×105cells）に対して、エタノールに溶解

いられている。辛味成分としては gingerol 類、shogaol 類

し た カ ル ボ ン 酸 型 シ ョ ウ ガ オ ー ル（[8]-Shogaol-COOH）、がある。本研究は後者の成分である gingerol 類、shogaol[6]-OCH3 -Gingediol そして [6]-OCH3 - Gingerol を終濃度 5µ類とその誘導体の抗酸化作用と血管内皮細胞に対する作用

M になるように添加し、6 時間後に細胞から RNA を回収を明らかにすることを目的としておこなった。

して DNA マイクロアレイに供した３）。

２．実
2. 1

試

験

2. 4

薬

Real-time PCR

ショウガ誘導体によって大きく誘導された遺伝子につい本研究に用いたショウガ成分の誘導体の化学構造式をて、Real-Time PCR を用いて再現性の確認を行った。また、DNA マイクロアレイで検討した化合物以外のショウガ誘Act ivity of Shogaol Derivat ives as
A nt iox ida nt a nd G ene E xpres sion
Regulator
Noriko Noguchi
RCAST, University of Tokyo(Faculty of Engineering, Doshisha
University)

導体について、遺伝子誘導能を調べるために用いた４）。

2. 5

Western blot

ショウガ誘導体を添加 6 時間後の細胞を溶解し、電気泳動をおこなった後、転写因子 Nrf2 に対する抗体（Sant
Cruz 社）を用いて Western blot を行った４）。

− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

2. 6

LDL 受容体欠損マウスへのショウガ成分投与

酸化物質の代表のひとつである α -トコフェロールを対照と[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol、 そ し て 天 然 のした。リノール酸メチルはラジカル開始剤から放出される[8]-Shogaol を２％コレステロール負荷した基本食餌に５％ラジカルにより酸化し、234nm に吸収をもつ酸化生成物

重量で添加し、自発的摂取で４週間与えた。大動脈弁からを与える（Fig. ２, none）。α -トコフェロールはその高い

腹部大動脈までを取り出し、ホルマリン固定後、オイルレ

ラジカル捕捉能によって酸化を効率よく抑制し、α -トコフ

ッド染色を行った。

ェロールが消費されると抗酸化物がないときと同じ酸化速

３．結
3. 1

度にもどる。これに対して、３種類のショウガ成分誘導体

果は酸化を抑制するがその抑制能は小さかった。また、３種リノール酸メチルの酸化に対する抑制作用

間に酸化抑制作用に大きな差は認められなかった。

生姜には [6]-gingerol や [8]-gingerol が多く含まれるが、3. 2

乾燥度の増加や精製の過程で脱水がおこるとそれぞれに対LDL の酸化に対する抑制作用

応する [6]-shogaol や [8]-shogaol が 10：1 で回収されるよ酸化 LDL は動脈硬化の主要な危険因子である。LDL のうになる（Fig. １）。本研究ではこれらの天然ショウガ成

脂溶性ラジカル開始剤による酸化に対する３種ショウガ

分 の 誘 導 体 ３ 種、[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol

成分誘導体の抗酸化作用を調べた。均一溶液での脂質酸

そして [6]-OCH3-Gingerol を合成し、これらのリノール酸

化 と は 異 な り、[6]-OCH3 -Gingediol と [6]-OCH3 -Gingerol

メチルのアセトニトリル均一溶液中におけるラジカル酸化は 強 い 抗 酸 化 作 用 を 示 し た（Fig. 3）。 こ れ に 対 し て、に対する抗酸化作用の評価を行なった。ラジカル捕捉型抗[8]-Shogaol-COOH も酸化を抑制したが、その作用は他の

CH3O

O

OH

HO

-H2O

HO

O

CH3O

[6]-Gingerol

CH3O

O

[6]-Shogaol

OCH3

O

CH3O
HO

HO

[8]-Shogaol[6]-OCH3-Gingerol

CH3O

OH OCH3

O

CH3O

COOH

HO

HO
[6]-OCH3-Gingediol

Fig.1[8]-Shogaol-COOH

Chemical structure of constituents in ginger extract and their synthetic derivatives

3

1

Absorbance 234nm

Absorbance 234nm

2.5
2
1.5
1
0.5

0.8
0.6
0.4
0.2
0

0
05

0

0

100

-0.2

Time,min

50

100

150

200

Time,minFig.2 Antioxidant effect of [8]-Shogaol-COOH, [6]-OCH3Gingerol, and [6]-OCH3-Gingediol on oxidation of methyl
linoleate Increase in absorption at 234 nm in the oxidationof methyl linoleate (15mM) induced by 0.5mM AMVN in
acetonitrile at 37 ℃ .
◆ : control; △ :1µM α-tocopherol; ◇ : 5µM [8]-Shogaol-COOH;● : 5µM [6]-OCH3-Gingerol; □ : 5µM [6]-OCH3-Gingediol

Fig.3 Antioxidant effect of [8]-Shogaol-COOH, [6]-OCH 3Gingerol, and [6]-OCH3-Gingediol on LDL oxidation
Increase in absorption at 234nm in the oxidation of LDL (0.1
mg/ml) induced by 0.4mM AMVN in PBS (pH7.4) at 37 ℃ .
■ :control; ◇ : 5µM [8]-Shogaol-COOH; ● : 5µM [6]-OCH3Gingerol; □ : 5µM [6]-OCH3-Gingediol− 24 −

ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用

２ 種 よ り も 劣 っ て い た。[8]-Shogaol-COOH と [6]-OCH3-

転写因子 Nrf2 によって制御されることが知られている

Gingediol および [6]-OCH3 - Gingerol との化学構造の違いは遺伝子によって占められていた。これらの遺伝子発現に側鎖にある。そこで、Fig. 4A に示すように Gingediol の[6]-OCH3-Gingediol や [6]-OCH3 -Gingerol は全く影響を及ぼ

側鎖に修飾を加えた化合物を合成し、側鎖の化学構造のさなかった。

ちがいが LDL の酸化に対する抑制効果に及ぼす影響を検GeneChip で得られた結果についてその再現性を real

討した。その結果、[6]-OCH3-Gingerol の側鎖末端に -OHtime PCR に よ っ て 確 認 す る と と も に、Fig. 6A に 示 し基をつけると ([6]-OCH3-Gingerol-OH)、抗酸化効果が大きた他の誘導体を用いて比較することにより、遺伝子発現く低下することがわかった（Fig. 4B）。しかし、同じく末を決定する化学構造を求めた。もっとも強く誘導された

端に -OH 基をもつが炭素鎖の長さをのばすと ([8]-OCH3-

hemeoxygenase-1（HO-1）は、[8]-Shogaol-COOH によって誘Gingerol-OH), 抗酸化効果は [6]-OCH3 -Gingerol-OH よりも導されるが [6]-OCH3-Gingerol では誘導されないことが real

優れ、[6]-OCH3 -Gingerol に近づいた。

time PCR に よ る 解 析 に お い て も 確 認 さ れ た（Fig. 6B）。

フェノール性の抗酸化物の抗酸化活性部位は、通常フ[8]-Shogaol-COOH と [6]-OCH3 -Gingediol ま た は [6]-OCH3 -ェノール基（ベンゼン冠の -OH 基）にあるが、ショウガ

Gingerol の化学構造上の違いは、[8]-Shogaol-COOH の側成分誘導体についてこの点を確認するために Phenyl-[8]-鎖にある α, β - 不飽和カルボニルであることに着目し、こShogaol-COOH を合成し、LDL の酸化に対する抑制作用の部分が Keto 型、そして Enol 型の化合物を用いて HO-1

を調べた（Fig. 5A）。Phenyl-[8]-Shogaol-COOH は LDL のの 誘 導 能 を 調 べ た（Fig. 6B）。Keto 型 お よ び Enol 型

酸化をほとんどまったく抑制しなかった（Fig. 5B）。

shogaol はいずれも HO-1 の誘導をおこさなかった。抗酸化能に影響を与えた側鎖末端の修飾基やフェノール基の3. 3 血管内皮細胞の遺伝子発現誘導に及ぼす化学構造

HO-1 誘導能に及ぼす影響について検討をおこなったとこ

ショウガ成分の誘導体の血管内皮細胞の遺伝子発現ろ（Fig. 6C）、[8]-Shogaol-COOH の末端のカルボキシル基に及ぼす影響を網羅的に解析するために、ヒト遺伝子約に換わって、ヒドロキシル基（-OH）をもつ [8]-Shogaol-

一万個に対するプローブを搭載した GeneChip を用いてOH の HO-1 誘導能は [8]-Shogaol-COOH と差はなかったが、[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol そ し て [6]-OCH3-エステル基をもつ [8]-Shogaol-CooEt は HO-1 を誘導する

Gingerol に よ る 遺 伝 子 発 現 誘 導 を 調 べ た（Table １）。

もののその誘導能は [8]-Shogaol-COOH に比べて小さかっ

そ の 結 果、 非 常 に 興 味 深 い こ と に、[8]-Shogaol-COOH

た。抗酸化能がまったくない Phenyl-[8]-Shogaol-COOH はの み が 遺 伝 子 発 現 を 大 き く 誘 導 す る こ と が わ か っ た。

HO-1 誘導能をもつがその作用は [8]-Shogaol-COOH に比較[8]-Shogaol-COOH に よ っ て 誘 導 さ れ る 遺 伝 子 の 上 位 は、して小さかった。また、比較のために天然のショウガ成分

（A）

（B）
OH

1

OCH 3

CH 3 O[6]-OCH 3-Gingediol
OH

OCH 3
OH

CH 3 OHO[6]-OCH 3-Gingediol-OH
OH

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

OCH 3
OH

CH 3 OHO

Absorbance 234nm

HO

0.9

0
0

[8]-OCH 3-Gingediol-OH

50

100

150

Time,minFig.4 Effects of side chain on LDL oxidation(A) Chemical structure of compounds studied.
(B) Increase in absorption at 234 nm in the oxidation of LDL (0.1 mg/ml) induced by 0.4 mM AMVN in PBS (pH7.4)
at 37 ℃ .
■ :control; ■ :5 µM [6]-OCH3-Gingediol; □ : 5µM: [6]-OCH3-Gingediol-OH; X: 5µM [8]-OCH3-Gingediol-OH− 25 −

200

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

である [6]-Shogaol や [8]-Shogaol の HO-1 誘導作用を分析とに注目し、これらのラジカル捕捉型抗酸化物質としてのしたところ、[8]-Shogaol は [8]-Shogaol-COOH とほぼ同等作用について研究を行なった。天然の化合物に加え、化学の誘導を示したが、[6]-Shogaol の誘導能は小さかった。

構造の一部がわずかに異なる種々の誘導体を合成し、その作用を比較検討することにより、抗酸化作用に影響を与え

3. 4 LDL 受容体欠損マウスの動脈硬化巣形成に対するショウガ成分の影響

る分子内構造を特定することができた。
[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol そ し て [6]-OCH3-

今回の投与期間（４週間）ではいずれの化合物も顕著な

Gingerol の３種のショウガ成分誘導体は均一溶液中にお動脈硬化抑制作用を示さなかった。投与期間を延長するな

ける脂質酸化に対してはほとんど同じ抗酸化作用を示した。

ど、実験方法を再検討する必要があると考えられた。

これは均一溶液中では側鎖のちがいによる化合物の動きに４．考差がないためと考えられる。

察

これに対し、LDL の酸化においては側鎖の影響が強くショウガには古くから様々な効能をもつ成分が含まれて現れた。側鎖の末端に親水性の高いカルボキシル基をもいることが知られていたが、その作用メカニズムに関して

つ [8]-Shogaol-COOH は [6]-OCH3-Gingediol や [6]-OCH3-は明らかでない部分も多かった。本研究では、ショウガのGingerol よりも抗酸化作用は劣ることが明らかとなった成分のなかで shogaol や gingerol がフェノール基をもつこが、これは脂質と蛋白質の球状複合体である LDL 内へ

（A）

（B）

1
0.9

O

0.8
COOH

HO

[8]-Shogaol-COOH
O
COOH

Absorbance 234nm

CH 3O

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2

Phenyl-[8]-Shogaol-COOH

0.1
0-0.1 0

50

100

150

Time, min200

Fig.5 Effects of phenol group on LDL oxidation(A) Chemical structure of compounds studied.
(B) Increase in absorption at 234nm in the oxidation of LDL (0.1mg/ml) induced by 0.4 mM AMVN in PBS (pH7.4)
at 37℃．
◆ :control; □ : 5 µM [8]-Shogaol-COOH; ● : 5 µM Phenyl-[8]-Shogaol-COOH

Table1 Gene expression in endothelial cell induced by shogaol derivatives

Gene Namehemeoxygenase 1
tripartite motif-containing 16
sequestosome 1
glutamate-cysteineligase, modifier subunit
solute carrier family7, member 11
solute carrier family 3, member 2

HO-1
TRIM16SQSTM1GCLM
SLC7A11
SLC3A2− 26 −

none

ShogaolCOOH

161
123
61
223
608
229

1959
681
219
753
1635
466

OCH3OCH3Gingediol Gingerol
188
152
73
283
726
256

178
120
75
213
642
254

ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用の侵入、分布が親水性の高いカルボキシルによって妨げ５）長さも重要であることがわかった。炭素数を２つ増やしてられたためと考えられる 。この効果は側鎖中央部がま

炭素鎖を長くした [8]-OCH3-Gingediol-OH は末端に -OH 基

ったく同じで末端のヒドロキシル基の有無のみが異なるがあるにもかかわらず抗酸化効果は [6]-OCH3-Gingediol に[6]-OCH3 -Gingediol と [6]-OCH3 -Gingediol-OH の 比 較 に よ

かなり近づいたことから明らかである。

り明確に示されたといえる（Fig. 4）。LDL の抗酸化作用にフェノール系抗酸化物質の抗酸化活性はラジカルへの影響を与えるのは側鎖末端だけではなく、側鎖の炭素鎖のフェノール基からの電子、水素の供与であると考えられ

（A）
O

O
CH 3O

COOH

COOH

HO

[8]-Shogaol-COOH(Shogaol-COOH)

Phenyl-[8]-Shogaol-COOH(Phenyl-Shogaol)
OH

O

CH 3O

CH 3O

COOH

COOH

HO

HO

Enol

Keto
O

O
CH 3O

CH2OH

CH 3O

COOEt

HO

HO

[8]-Shogaol-OH(Shogaol-OH)[8]-Shogaol-COOEt(Shogaol-COOEt)
O

O

CH 3O

CH 3O

HO

HO

[6]-Shogaol[8]-Shogaol
OH

OCH3

CH O
3

HO

[6]-OCH3-Gingediol

（B）

（C）
50

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

15

*
10

5

0
none
Keto
Shogaol
-COOH

*
40
30
20

*
none

*

Shogaol Shogaol 6-Shogaol-COOH -OH
PhenylShogaol 8-Shogaol-Shogaol -COOEt

Fig.6 Induction of hemeoxygenase-1 (HO-1) by shogaol derivatives in endothelial cell.
(A) Chemical structure of compounds studied.
(B), (C)Relative mRNA levels of HO-1 were measured by real-time PCR. *p<0.01− 27 −**

100

Enol OCH3Gerol*コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

るため ２）、[8]-Shogaol-COOH のベンゼン環の置換基がす5-hydroxy-2,2-dipentyl-4,6-di-tert-butylbenzofuran:

べてメチル基である Phenyl-[8]-Shogaol-COOH は予想どお

Design and evaluation as a novel radical-scavenging

り LDL の酸化を全く抑制しなかった。また、[8]-Shogaol-

antioxidant against lipid peroxidation, Arch. Biochem.

COOH の置換基を２つの -OCH3 に変えた化合物も同様にBiophys., 342, 236-243, 1997.
３）Takabe W, Kanai Y, Chairoungdua A, et al.:

抗酸化作用をもたなかった（data not shown）。
ショウガ成分とその誘導体による内皮細胞の遺伝子発

Lysophosphatidylcholine enhances cytokine production

現誘導能の網羅的解析によって、転写因子の一つであるof endothelial cells via induction of L-type amino acidNrf2 が制御する遺伝子群が数多く誘導されることが示さ

transporter 1 and cell surface antigen 4F2. Arterioscler

れた

Thromb Vasc Biol. 24,1640-1645, 2004.

4，6，7）。さらにある特定の化学構造がこの遺伝子発現を厳密に規定していることが、種々の誘導体の遺伝子発現

４）Warabi E, Wada Y, Kajiwara H, et al.: Effect on

能を比較することにより明らかとなった。その構造はショ

endothelial cell gene expression of shear stress, oxygen

ウガ成分類の側鎖にある α−, β− 不飽和カルボニルであった。

concentration, and low-density lipoprotein as studied

Nrf2 は合成されると、細胞質に存在する蛋白質 Keap-1

by a novel flow cell culture system. Free Radic. Biol.
Med. 37,682-694, 2004.

と結合し、Keap-1 のユビキチン化酵素作用によりユビキ
8, 9）５）Gotoh N, Noguchi N, Tsuchiya J, et al.: Inhibition of

ところが、親電子性の化合物やラジカル性の活性酸素が細oxidation of low density lipoprotein by vitamin E and胞内に増加すると Keap-1 分子内の２つの -SH が酸化され、related compounds. Free Rad. Res., 24, 123-134, 1996.

-S-S- 結合が生じたり、あるいは化合物（X）自体が結合

６）Hosoya T, Maruyama A, Kang M-I, et al.: Differential

して架橋構造をとり（-S-X-S-）、Keap-1 の構造変化がおこ

responses of the Nrf2-Keap1 System to laminar and

るため Nrf2 は Keap-1 から解離する 10）。解離した Nrf2 はoscillatory shear stress in endothelial cells. J. Biol.

核内に移行して遺伝子のプロモーター領域の antioxidant

Chem., 280, 27244-27250, 2005.

チン化されプロテアソームによって速やかに分解される。

response element（ARE）配列に結合し転写活性を促す。

７）Chen X L, Varner S E, Rao A S, et al.: Laminar flow

Table １に示したショウガ成分類によって発現誘導された

induction of antioxidant response element-mediated

遺伝子はすべてそのプロモーター領域に ARE 配列がある

genes in endothelial cells. A novel anti-inflammatory

ことが知られている。これらの遺伝子にコードされる蛋白mechanism. J. Biol. Chem. 278, 703-711, 2003.

質は細胞内を還元状態に保ち、酸化ストレスから細胞を防８）McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, et al.: Keap1-

御する機能をもつ。また、解毒機構の第二相の酵素も同じ

dependent proteasomal degradation of transcription

く Nrf2/ARE 制御下にあることがわかっている。ショウ

factor Nrf2 contributes to the negative regulation of

ガの効能のいくつかは α−, β− 不飽和カルボニル構造によantioxidant response element-driven gene expression.
J. Biol. Chem. 278, 21592-21600, 2003.

るこれらの遺伝子誘導にその作用機序を求めることができ

９）Itoh K, Tong K I, Yamamoto M,: Molecular

ると考えられる。
本研究により、ショウガ成分およびその誘導体の脂質

mechanism activating Nrf2-Keap1 pathway inや LDL の酸化に対する抗酸化作用に影響する化学構造と、

regulation of adaptive response to electrophiles. Free

遺伝子発現に影響する化学構造がそれぞれ明確になった。

Radic. Biol. Med. 36,1208-1213, 2004

また、ショウガ成分の細胞防御に関わる新規機能が明らか

10）Wakabayashi N, Dinkova-Kostova AT, Holtzclaw W
D, et al.: Protection against electrophile and oxidantになった。

stress by induction of the phase 2 response: fate of（引用文献）

cysteines of the Keap1 sensor modified by inducers.

１）油田正樹：現代東洋医学 , 8, 45-50, 1987.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101,2040-2045, 2004.

２）Noguch N, Iwaki Y, Takahashi M, et al.: 2,3-Dihydro-− 28 −

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討
金沢大学大学院自然科学研究科

太田明雄

Incorporation behavior of N-amino acid-type surfactant into phospholipid vesicle membrane has been studied.
It was known that leakage of the vesicle-entrapped probe took place slowly at a very low concentration in the sulfateor sulfonate-type surfactant systems, on the other hand it occurred rapidly at the concentration just below the
CMC in the amino acid-type surfactant systems. These results suggest that the amino acid-type surfactants adsorb
cooperatively on the vesicle surface, and as a result, the surfactant molecules organize to make a kind of channel
which is large enough for the entrapped molecules to pass through easily. In this study, the effect of amino acidresidue on the incorporation into the vesicle membrane was investigated from the both view points of morphology
and interaction. Furthermore the control of the release of entrapped-molecules from vesicles by temperature or pH
was examined.

１．緒

度 CMC よりも低濃度）；２）（その臨界濃度以上で）ベシ

言

クル二分子膜構造を破壊することなしに内包物を放出させこれまでアシル化アミノ酸に代表されるアミノ酸系界面

る；３）内包物の放出速度が大きい；ということである。

活性剤は肌に優しくマイルドな界面活性剤として認知され、これらの事実より、アシルアミノ酸界面活性剤（リポアミ

またその特性を生かした商品も数多く開発されている。まノ酸）はベシクル２分子膜上に協同的に吸着し、内包物のたアミノ酸の種類を選ぶことにより、官能基を系統的に変通り道（チャンネル）を形成しているのではないかと推測化させることができるため、親水部位のサイズや極性、電した。そこで本申請研究では、ａ）リポアミノ酸のリン脂荷といったものが界面活性剤の物理化学的性質に及ぼす影

質ベシクルへの作用様式とその形態観察、ｂ）そのアミノ

響を検討する上でも、都合の良い対象である。更にグリシ酸側鎖の影響を系統的に検討した。さらにこの作用を利用

ンを除くアミノ酸は光学活性体であり、分子不斉といったして、温度や pH による内包薬物の放出制御を試みた。

観点からも非常に興味深い対象である。実際アシルアミノ

２．実

酸塩を扱った研究について、総説として既に多くが紹介さ験れいている 1）− 7）。しかしながら、生体に対して“マイルリン脂質として L-α- ジパルミトイルホスファチジルコ

ドである”とは物理化学的にどのようなことなのか、そのリン（DPPC）を選んだ。ベシクルは Bangham 法にて作メカニズムは詳細には明らかにされていない。そこで我々成した後、ポリカーボネートメンブランを用いたエクスト

はこれまで蓄積してきたアミノ酸系界面活性剤の研究手法

ルージョン法にて、約 100 nm 径を有する均一のユニラメや成果を生かし、上記のメカニズムを脂質膜（リン脂質ベラベシクルとして調製した。内包薬物のモデルとして 5（6）シクル）とアシルアミノ酸界面活性剤（リポアミノ酸）と- カルボキシフルオレセイン（CF）を利用し、濃度消光すの相互作用という観点から明らかにすることを目的としるような濃度（0.1M）にて封入した。CF を封入したベシて実験を進めているが、その中で硫酸エステル系やスル

クル分散液は 100nm にサイジングした後、封入できなか

ホン酸系界面活性剤と、アミノ酸系界面活性剤ではベシク

った CF をゲルろ過にて除去した。薬物放出実験の場合で８）

ルに対する作用が全く異なる事が明らかとなった 。前者

は、DPPC 濃度は 0.05mM に調製し、界面活性剤を添加しの界面活性剤と比較してアミノ酸系界面活性剤のベシクル

た後の CF 蛍光強度の回復度より漏出率を見積もった。アへの作用としての主な特徴は、１）ベシクルへの作用に対

シルアミノ酸界面活性剤として N- ドデカノイル - グリシ

し協同性を有し、ある臨界濃度が存在する（臨界ミセル濃ン（C12-Gly）、-L- アラニン（C12-Ala）、L- ロイシン（C12Leu）、- Ｌ - フェニルアラニン（C12-Phe）およびドデカノ

Investigation on nano-channels madefrom lipo -amino acid surfactants on
phospholipids vesicles
Akio Ohta
Graduate School of Natural Science andTechnology, Kanazawa University

イル -L- セリン（C12-Ser）、-L- アスパラギン（C12-Asn）、-L- グルタミン酸（C12-Glu）の各ナトリウム塩を使用した。
こ れ ら の 界 面 活 性 剤 の 構 造 式 を Schem1 に、 ま た TrisHCl 0.1M（pH ＝ 7.4）緩衝液中における CMC を Table 1にそれぞれ示した。アシルアミノ酸のベシクルへの作用
様式は恒温滴定型カロリメトリー（ITC）と 300kV Cryo-− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

TEM による形態観察を位相差法により非染色の条件下とがわかる。比較としてドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で行った。Cryo-TEM による形態観察では DPPC 濃度はの系を示した。SDS 系では低濃度からすでに漏れが生じ、2mM で固定し、アシルアミノ酸濃度を変化させて実験を

CMC に近づくにつれ徐々に漏れ率が上昇するものの、２行った。また各サンプル調製には、Tris-HCl 0.1M（pH ＝

時間後でもそれほど大きな漏れを引き起こしていないこと

7.4）緩衝液を溶媒として使用した。内包薬物の放出制御がわかる。両者を比較するとそのアシルアミノ酸界面活性の実験では、他に pH ＝ 6.0 と 8.2 の緩衝液も溶媒として剤の作用における協同性が顕著であることがよくわかる。

使用した。これらは Tris-HCl 0.1M（pH ＝ 7.4）緩衝液に、次にアミノ酸の違いについて検討することにする。まず疎それぞれ HCl、NaOH 水溶液を適量加えることで調製した。

水性アミノ酸で比較すると側鎖が嵩高い Leu, Phe ではその漏れ速度が非常に高く、側鎖の小さな Gly と Ala 系で３．結果と考察はその速度が低いことがわかる。特に Phe 系では CMC のFig.１に界面活性剤の添加直後と２時間後の CF 漏出率20％程度の低濃度の溶液においてさえ、ベシクル添加後二を、各 CMC で換算した界面活性剤濃度（C * ＝ C /CMC）

時間以内に内包物を完全に放出させている。一方親水性アに対してプロットしたものである。なお漏出率 L は各点

ミノ酸である Ser、Asn、Glu 系はそれぞれ異なる挙動を

における蛍光強度 I、界面活性剤添加以前の蛍光強度 Ibg、示した。側鎖に水酸基を有する Ser 系は添加直後の漏れ率

ならびに TritonX-100 を添加することで完全にベシクルをは低いものの Leu, Phe 系に似たような挙動を示した。こ

崩壊させた後の蛍光強度 Itriton から以下の式により計算しれに対しアミド基を有する Asn 系は Gly、Ala 系の挙動にている。

似ているが、漏れ率は他の系と比べて小さかった。なお後L（％）＝

I − Ibg
Itriton×r − Ibg

者の系では、CMC 以降の高い濃度領域で漏出率が再度減

× 100

少している。この原因については未解明であるが、現時点

なお r は TritonX-100 を添加することによる希釈率を表では界面活性剤ミセルと DPPC ベシクルとの複合体が形しており、今回のケースでは 1.1 とした。いずれのアシル成されたためではないかと考えている。側鎖にカルボキシ

アミノ酸界面活性剤の場合でも、かなり低い濃度ではベル基を有する Glu 系も同様に、CMC 後に漏れ率の低下をシクルの漏れを殆ど引き起こさないものの、CMC よりも示したが、この系に関しては CF は C12-Glu ミセルに可溶低いある濃度に達すると急激に漏出率が上昇しているこ化されると顕著に消光されることがわかっており、この蛍

O

O
N
H

CO
OONa

C12-GlyN
H
C12-AlaO

ON
H

C12-LeuN
H

C12-Ser

COONa

O

N
H

C12-PheOH

O

C12-Glu

COONa

COONa
O
NH2

O

COONa
C12-Asn

N
H

COONa

COOH
N
H

COONa

Scheme 1 使用したアシルアミノ酸界面活性剤の分子構造

Table 1 各界面活性剤の臨界ミセル濃度（25℃ in 0.1M tris-HCl pH = 7.4）

CMC /
mM

SDS

C12-Gly

C12-Ala

C12-Leu

1.1

3.0

3.0

0.60

C12-PheC12-Ser

C12-Asn

C12-Glu

0.35

4.1

4.8

14.0

− 30 −

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討

光の消光により見かけの漏れ率が減少したものと思われる。

活性剤の微分エンタルピーの結果を Fig. ２に、それぞれ次に DPPC ベシクル懸濁液と界面活性剤水溶液との微Fig. １と同様に CMC で換算された濃度に対して示した。

分希釈熱測定を行った。なお DPPC 濃度は蛍光実験の際DPPC ベシクルが存在しない場合の微分エンタルピーはに使用した量と同じ濃度になるように適量をセルに添加

CMC 近傍で急激に変化し、CMC 前後のエンタルピーのし、各界面活性剤の CMC の 20 倍の濃厚水溶液を滴下した。

差を取ることで、ミセル形成エンタルピーを得ることがでDPPC ベシクル存在下、非存在下での各系における界面

きる ９）。その結果より SDS 系、C12-Phe 系ではミセル形

Fig.1 SDS および各アシルアミノ酸界面活性剤系におけるベシクル内包物の放出挙動。（○）添加直後、（●）添加２時間後(a) SDS, (b) C12-Gly, (c)C12-Ala, (d) C12-Leu, (e) C12-Phe, (f) C12-Ser, (g) C12-Asn, (h) C12-Glu

Fig.2 SDS および各アシルアミノ酸界面活性剤系における界面活性剤の微分エンタルピー （○）界面活性剤のみ、（●）DPPC
ベシクル共存下(a) SDS, (b) C12-Gly, (c) C12-Leu, (d) C12-Phe.

− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

成は発熱的であり、C12-Gly と C12-Leu 系では逆に吸熱的の値は DPPC 分子がベシクル状態からミセル内に移行すであることがわかる。一方 DPPC ベシクルが存在した場合、る際のエンタルピー変化に相当するが、このことは DPPC

このミセル崩壊のプロセスに伴う熱の出入りに加え、ベシの可溶化に伴うエンタルピー変化は界面活性剤の種類にあ

クルへの界面活性剤の作用に伴うエンタルピー変化が加わ

まり依存しないことを示している。実際に得られた回帰曲

ることになる。SDS 系では比較的低濃度から DPPC が存線から DPPC 濃度がゼロの極限値を算出したところ、そ在しない場合の希釈熱のカーブからずれ始め、CMC の 50

れぞれ 36 〜 42 kJ mol −1 付近の値を示した。なお DPPC

％程度の濃度において最大値に達し、その後単調に減少しベシクルは 42 ℃付近でゲル状態から流動性の大きな液晶

た。C12-Gly と C12-Leu 系では CMC の 50％程度の濃度ま状態への転移を示すことが知られているが 10）、その相転ではほぼ一定の値であったが、最初の矢印の点で急激に上移の潜熱が約 36 kJ mol −1 である 11）。可溶化に伴うエンタ

昇し、CMC の 80％程度の濃度において極大値をとりそのルピー変化とほぼ同等であることから、界面活性剤ミセル

後ＣＭＣに達した後 DPPC が存在しない場合の希釈熱の中での DPPC の状態は液晶状態に似通っているといえる。

カーブと同様の挙動を示した。これらの結果は上述した各

しかしながら DPPC 濃度が上昇するにつれ、各界面活性界面活性剤におけるベシクル膜への作用様式を強く支持し剤系における微分エンタルピーの差が拡大している。詳している。つまり SDS 系では低濃度領域から単調に作用しく見てみると、SDS 系では比較的その減少度が小さいのているのに対し、C12-Gly と C12-Leu 系では最初の矢印のに対し、アシルアミノ酸界面活性剤系ではそのエンタルピ

点まではベシクル膜に対してエンタルピー的には殆ど影響

ー値がより急激に減少した。これはミセル中での混和性のを与えていないものの、ある濃度に達すると協同的に作用違いを反映しているものと思われる。つまり DPPC はア

していることになる。また界面活性剤が作用した際の大き

シルアミノ酸界面活性剤ミセル中よりも、SDS ミセル中な吸熱は、主に DPPC ベシクル膜のパッキング状態の緩でより界面活性剤と混和しているものと思われる。この結和を反映したものと思われる。その後は添加された分子は果はこれまで考察してきた DPPC ベシクル内での界面活

膜上のドメイン形成に消費され、界面活性剤モノマー濃度

性剤の混和性の違いと共通している。

が CMC に到達するとミセルが形成され、DPPC 分子はミ

これらの結果をもとに、C12-Gly、C12-Leu と C12-Phe

セル内に可溶化されていくものと思われる。一方 C12-Phe系に対して、幾つかの濃度において、cryo-TEM によるベ系では、非常に希薄な濃度においては DPPC が存在しな

シクルの形態観察を行った。結果はそれぞれ Fig. ４に示い場合の希釈熱のカーブから負の方向にずれており、低濃した。Fig．4a は C12-Gly（C*＝ 0.6）における像であるが、度における吸着が発熱的であることを示している。その後

漏れ挙動や熱測定の結果からは既にベシクルに対して作用他のアシルアミノ酸型界面活性剤と同様に CMC の 50％

し、内包薬物を漏れさせているにもかかわらず、ほぼもと程度の濃度付近から急激に上昇し、CMC 付近で極値をとの粒径を保ったユニラメラベシクル像を得ることができた。

った後減少した。C12-Phe 系での極大のエンタルピーは他一方同じ濃度（C* ＝ 0.6）における C12-Leu 系（Fig．
4d）
、の界面活性剤に比べ非常に大きな値を示した。この結果は

C12-Phe 系（Fig．4f）では、C12-Gly 系と同様に急激な漏先の内包物の漏れ挙動の結果と対応しているように思われれの発生や大きな正のエンタルピー変化を起すという点でる。すなわち C12-Phe はベシクルに対して非常に強く作は似通った挙動であるにも関わらず、その形態が異なって用する結果、内包物の素早い漏れを引き起こしたのではな

いた。C12-Leu 系ではほとんどのベシクルはカプセル形をいかと考えられる。

保っていたが、その輪郭は円形ではなく多角形であった。

次に各界面活性剤ミセルの DPPC 分子の可溶化能を検更に写真にあるような一部にはシートに転移したものが観討するために、先の実験とは逆の滴定測定を行った。具

察できた。なおそのシートへ転移したものの存在比は１％

体的にはセル内の各 CMC の４倍濃度のミセル溶液中に以下であった。C12-Phe 系ではその違いが著しく、球状ベ

DPPC ベシクル懸濁液を滴定し、その際に発生する熱を測

シクルは全く観察されず、全てのベシクルがシートへと転定した。結果を DPPC の微分エンタルピーを DPPC の濃移していた。C12-Leu、C12-Phe 系で見られた内包物の急度に対して Fig.３に示した。各界面活性剤系ともに比較的激な漏れは、ベシクルの形態をカプセル状からシートへと大きな正の値を示し、DPPC 濃度の上昇とともに減少する

転移させることに起因しているものと思われる。またベシような挙動を示した。なおグラフ内に示した実線は、回クルの輪郭が多角形に近いような形が得られたことは、界

帰曲線に分数関数（f（CDPPC）＝ P1 ＋ P2/（P3 ＋ CDPPC）：

面活性剤がベシクルに均一に作用しているのではなく局所

P1，P2，P3 は可変パラメータ）を用いてフィッティング

的に作用していることを裏付けているように思われる 12）。

したものであるが、実験結果をうまく再現できている。まつまり部分的に吸着した結果、DPPC リッチドメインと界

た DPPC 濃度が無限希釈に近づくにつれ、各系の値は同面活性剤が吸着した部分との間に、ある種の界面が形成さじような値に収束していくように見える。この無限希釈でれたためではないかと考えている。次に、C12-Leu、C12-− 32 −

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討

Phe 系において漏れが起こり始める濃度（C*＝ 0.1）にお態転移を引き起こすことで、漏出効率が高くなる C12-Leu

ける画像を検討してみる（Figs. 4c, 4e）。この濃度においと C12-Phe 系に対して、温度と pH の変化による内包物のてはどちらの系ともにシート構造は殆ど確認できなかった

放出挙動を検討した。またこれらの界面活性剤は CMC がが、やはりベシクルの輪郭は多角形であった。これらのこ低く、他の系に比べ添加量を抑えることができることも利とから C12-Leu、C12-Phe 系の場合では、ベシクルへの局点として挙げられる。なお内包物には同様に CF を用いた。

所的な作用は低濃度から既に起こっており、濃度が上昇す

まず両系ともにおいて CMC の４％、ならびに 40％の濃度

るにつれ過度なドメイン形成が、カプセルを崩壊させシーでの結果を Fig. 5 に示した。この結果より、温度を上げる

トへと転移させていることが予想される。最後に Fig. 4b

ことで内包物が放出されやすくなることがわかった。これの C12-Gly（C*＝ 4）における像について触れてみる。画は界面活性剤の作用によるベシクル形態の転移が温度の上像にあるように一部には疎水性アミノ酸系で見られた多角

昇により促進されたためだと思われる。特に CMC の４％形状の輪郭が得られたものの、観察できたベシクルは全てでは、25℃以下の温度においては全く漏れを生じさせていカプセル状であった。漏れ挙動の結果において C12-Gly 系

ないが、35℃まで温度を上昇させることで内包物を速やかを含む幾つかの系では、CMC 後に漏れ率が減少するといに漏出させることができることがわかった。なお C12-Leu、

う特異な挙動を示しているが、TEM 画像からは形態の変C12-Phe 両系とも CMC の 40％濃度においても、DPPC の化など特に変わった様子は見られなかった。

二分子膜の相転移温度は 35℃以上であることを確認して以上の結果より、界面活性剤の作用によりベシクルの形いる。同様に Fig. ６に示したように、pH については低下

Fig.3 各界面活性剤ミセル水溶液中における DPPC の微分エンタル
ピー

Fig.4 各界面活性剤系におけるベシ
クルの形態(a) C12-Gly, C* = 0.6, (b) C12Gly, C* = 4, (c) C12-Leu, C* =0.2, (d) C12-Leu, C* = 0.6, (e)C12-Phe, C* = 0.1, (f) C12-Phe,C* = 0.6 ( 各 bar = 100nm)− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

させることで内包物が放出されやすくなることが分かった。

C12-Leu、C12-Phe 系では、速やかな放出能を有すること

特に pH を７から６へと僅かに下げることで劇的な変化をがわかった。TEM 観察により、これらの系におけるベ

しており、両系とも CMC の 10％程度の濃度においては、シクル膜への作用が局所的であり、かつその性質のため

内包物の放出のオン・オフをほぼ完全に制御することが可

CMC 以下においてベシクル形態の転移を引き起こすこと能である。これらの界面活性剤の見かけの pKa は７前後がわかった。このベシクル形態の転移が内包物の速やかなであることから、界面活性剤のカルボキシル基の解離を抑放出をもたらすことが予想される。更に添加する界面活性えることで、ベシクルへの吸着量が飛躍的に向上し、その剤にこの C12-Leu や C12-Phe を用いることで、僅かな pH

結果内包物の放出を招いたのではないかと考えられる。

や温度の調節により、鋭敏にベシクル内包物の放出を制御

４．結できることがわかった。

言

アシルアミノ酸界面活性剤を用いたベシクル膜内包

謝

辞

物の放出作用を系統的に検討した。これらの界面活性剤

本研究を遂行するにあたり㈶コスメトロジー研究振興

は SDS と比較すると、その作用が協同的であることが特財団の支援をいただきました。ベシクルの熱測定は、北陸

徴としてあげられる。特に側鎖に嵩高い疎水基を有する

先端科学技術大学院大学教授

(a)

100

15℃
25℃
35℃

80

L/%

100

100

(c)

80

80

60

60

60

60

40

40

40

40

20

20

20

20

0
0
0
100
200
300
0
100
200
300
0
100
200
300
0
t / sect / sect / sec
Fig.5 C12-Phe および C12-Leu 希薄溶液系におけるベシクル内包物放出挙動の温度依存性(a) C12-Phe, C* = 0.04, (b) C12-Phe, C* = 0.4, (c) C12-Leu, C* = 0.04, (d) C12-Leu, C* = 0.4.
0

(a)

100
80

100

pH = 6
pH = 7
pH = 8

L/%

60
40
20
0

(b)

100

(c)

80

80

80

60

60

60

40

40

40

20

20

20

40

− 34 −

100
200
t / sec

300

(d)

100

0
0
0
80
120
0
40
80
120
0
40
80
120
0
t / sect / sect / sec
Fig.6 C12-Phe および C12-Leu 希薄溶液系におけるベシクル内包物放出挙動の pH 依存性(a) C12-Phe, C* = 0.1, (b) C12-Phe, C* = 0.4, (c) C12-Leu, C* = 0.2, (d) C12-Leu, C* = 0.4.

0

(d)

100

80

0

L/%

(b)

由井伸彦氏の協力により行

40

80t / sec120

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討いました。また TEM 観察は、分子科学研究所「ナノ支援」

７）宮岸重好，表面，35，85 (1997).

プログラムの援助を受け、生理学研究所教授

８）Yasuhara K. Ohta A.

永山國昭氏

Asakura Y.

Kodama T.

ならびに R.Danev 博士に多大なご協力をいただきました。

Asakawa T. Miyagishi S., Colloid Polymer Science 283, 8,

この場を借りて深謝いたします。

p.987-993 (2005).
９）Ohta A., Murakami R., Takiue T., Ikeda N., Aratono（関連文献）

M., J. Phys Chem. B 104(35), p8592-8597 (2000).

１） 吉 田 良 之 助， 竹 原 将 博， 有 機 合 成 化 学 協 会 誌，33，

ックス II (4) 生体膜のダイナミクス，共立出版 (2000).

671 (1975).
２）吉田良之助，竹原将博，渋江昭夫，薄羽恭謙，油化学，
26，747 (1977).
３）竹原将博，表面，22，459 (1984).

10）八田一郎，村田昌之：シリーズ・ニューバイオフィジ
11）Fa N., Ronkart S., Schank A., Deleu M., GaigneauxA., Goormaghtigh E., Mingeot-Leclercq M. -P., Chem.
Phys. Lipids 144, p108-116 (2006).

４）竹原将博，表面，22，512 (1984).

12）Ickenstein L.M., Arfividsson M.C., Needham D.,

５）竹原将博，油化学，34，964 (1985).

Mayer L.D., Edward K., Biochim. Biophys. Acta 1614,

６）坂本一民，油化学，44，256 (1995).

p1335-138 (2003).

− 35 −

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果
分子科学研究所

手老龍吾

Lipid bilayer membranes on TiO2 substrates were investigated by means of atomic force microscopy（AFM）
and fluorescence microscopy. Lipid bilayer membranes deposited on flat solid surfaces are called "supported planar
bilayers"（SPBs）, and expected to be an effective cell-membrane-mimicking model system in vitro. TiO2 is widelyused in cosmetic products such as sunscreens, face-powders, foundations, etc. I propose that the SPB on TiO2
surfaces can be a good model-system of the cell/cosmetics interface on skins.
Single-stepped rutile-TiO 2 low index surfaces were used in order to clarify the effects of surface atomic,（001）and（110）surfaces
structures and chemical properties of each TiO2 surface. Single-stepped TiO（100）2were prepared by HF aq. immersion and thermal treatment at 700-850°C at O 2 flow. The SPBs were formed byvesicle fusion methods using extruded vesicles through 50-100 nm and sonicated vesicles. Two kinds of saturated
phospholipids, dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC）and dipalmitoylphosphatidylcholine（DPPC）, an
unsaturated phospholipid, dipalmitoleoylphosphatidylcholine（DPoPC）, or their mixture were used for the SPBs on
purpose.
was incubated in the 100-nm-filtered and sonicated DPoPC vesicle
After the single-stepped TiO（100）surface
2
suspension, a defect-less and full-coverage SPB formed. Fluorescence recovery after photobleaching experimentshowed that the SPB retains the fluidity. In the AFM images, the trace of the single steps was recognized on
the DPoPC-SPB on the TiO2（100）. This step-trace was also observed on both gel-phase and liquid-crystal-phasedomains in a phase-separated binary SPB of DPPC and DPoPC. The gel-domains edges along the substrate steps
preferentially appeared. It was also found that the nucleation of the gel-domains occurred on the terrace regions.
These results indicated the atomic structure on the substrates actually affects to the assembly of lipid molecules in
the SPBs.
The DMPC 50-nm-filtered vesicles transformed to planar bilayer on the O2-annealed TiO（100）, but adsorbed
2
as vesicles on the UV-irradiated TiO（100）. Stable hydrogen-bonded water layer formed due to the UV-induced
2hydrophicity on the TiO2 surface. The water layer worked as the barrier for the interaction between the DMPC headgroup and the substrate.

１．緒

言

脂質分子

化粧品には金属酸化物や粘土鉱物などの様々な無機材
料の微粒子が使われており、生体物質 ( 細胞 ) と無機物質

水の層（1-2nm）の界面系として捉えることができる。細胞膜の主成分である脂質分子を固体表面上に平面二重膜として堆積した固体基板“supported planar bilayer（SPB）”（図 1）は細胞膜のモ

図1

デルシステムとして生化学や医療分野で有力視されている。
本来は流動的で壊れやすい脂質二重膜が固体表面に支持さSupported planar bilayer（SPB）の模式図

うな影響を与えるかを明らかにする事を目的とする。

れることにより安定化され、また、走査プローブ顕微鏡や近年では化粧品に用いられる TiO2 は透明度を上げるた

各種分光法などの高空間分解能・高感度の表面科学的実験

めに超微粒子化が進んでいる。ナノメーターサイズの微粒手法を用いて解析を行うことができる点が長所として挙げ子は、粒径や調整方法によって低指数面の組み合わせで形られる。本研究では、白色顔料や UV カット素材として化成される特徴的な構造を取ることが知られている１, ２）。図粧品に広く用いられている TiO2 の表面に堆積した SPB を

2 がルチル型 TiO2 の代表的な低指数表面の構造である。

用いて、無機固体の物理的・化学的特性が脂質膜にどのよ

ルチル型 TiO2 表面は酸化物表面の中ではこれまでに最も多くの研究がなされており、表面原子構造、電子状態、化Effect of Surface Properties and UV
irradiation on the Supported Lipid
Bilayer Membranes on Titanium Dioxide
Surfaces

学反応特性について多くの情報が既に得られている ３, ４）。

Ryugo Tero

性の「何が」「どのように」脂質膜に影響するのかを要素

Institute for Molecular Science

化することができると期待される。また、TiO2 は UV 照

それぞれの低指数面の SPB に対する特性を TiO2 単結晶表面を試料として用いることでモデル化すれば、基板表面物

射による超親水性の発現など、多様な表面機能を示す。本

− 36 −

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果

２．３

a : TiO2（110）

基板表面上への SPB 形成

TiO2 表面への SPB 形成はベシクル展開法６, ７）によって行った。洗浄・焼成した TiO2 表面上にベシクル懸濁液を滴下し、40℃に 30 分間保った後、液相を緩衝溶液で置換して未反応のベシクルを取り除いた。
b : TiO2（110）

２．４

AFM および蛍光顕微鏡観察

AFM 観察は、TiO2 表面形状は大気中、SPB 形成後の試料は緩衝溶液中でそれぞれ行った。前者は通常のタッピ
ングモード、後者は磁気励振モードで行った。
蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の た め に、 あ ら か じ め 色 素 ラ ベ

c : TiO2（110）ル し た リ ン 脂 質（lissamine rhodamine B sulfonyldioleoylphosphatidylethanolamine（Rb-DOPE）, Ex/Em:
550/590 nm）を１% 混ぜてベシクル懸濁液を調製した。
脂質膜の蛍光顕微鏡観察は水銀ランプを備えた落射型顕微

図 2 ルチル型 TiO2 低指数面のバルク終端構造モデル⒜ TiO（110）;⒝ TiO（001）;⒞ TiO（100）。ルチル型
22
2
TiO2 の単位格子は正方晶なので、（001）面と（100）面は等しくない。

鏡を用いて行った。

３．結
３．１

果

TiO2 低指数面の表面構造レポートでは、TiO2 の表面構造および表面状態が SPB の

酸素雰囲気下で焼成した後の TiO2 低指数表面の AFM

形状や性質、ドメイン構造に及ぼす影響を原子間力顕微鏡像を図 3 に示す。TiO（110）（図 3a）,（001）（図 3b）,（100）2（AFM）と蛍光顕微鏡を用いて調べた結果について報告する。 （図 3c）の 3 種類の低指数面を用いて、平坦なテラスとス

２．実
２．
１

テップで形成される表面を再現性よく調製することができ験た。図 3d には TiO（100）面（図3c）のラインプロファ
2リン脂質ベシクル懸濁液の調製

イルのみを示したが、それぞれのステップの高さは単位格

目的に応じて、ゲル - 液晶相転移温度（Tc）の異なる 3
種類のリン脂質を使用した ; dipalmitoylphosphatidylcholine

子１つ分の高さに等しく、シングルステップが形成されていることがわかる。

（DPPC, Tc ＝ 41℃）
, dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC,

TiO（100）面上では、焼成温度を変えることでモフォロ
2

Tc ＝ 24 ℃）, dipalmitoleoylphosphatidylcholine（DPoPC,

ジーの異なるステップ & テラス構造が現れることを見出− 36℃）。ガラスバイアル壁面に広げて真空乾燥させたした。焼成温度 700℃ではシングルステップが形成される

後、リン脂質フィルムを緩衝溶液（KCl 150 mM, MgCl2（図 3c, d）が、焼成温度 800℃ではステップ高さが 2 倍に40 mM, HEPES 5 mM /pH 7.2 KOH）中で撹拌して 0.1 ㎎

なったダブルステップ構造が現れた（図 3e）。テラス幅も/ ㎖のベシクル懸濁液とした。この懸濁液を凍結・解凍 5

およそ 2 倍に広がっているため、面全体での平均の傾きは回、超音波破砕、ポリカーボネート膜（50 nm または 100

変わっていない。焼成温度 850℃の表面では、ステップ高

nm メッシュ）を通すフィルタリング５）、のプロセスによさはシングルステップ相当ながら、いびつなステップ形状って SPB 形成に適した small unilamellar vesicle を調製しを持ち、テラス上に［001］方向に走るストリーク構造が

た

６, ７）

。これらのプロセス（凍結時は除く）は懸濁液をそ観察された（図 3f）。
図 3 に示した TiO2 表面は、いずれの表面も室温の大気

れぞれのリン脂質の Tc 以上に保って行った。

中、緩衝溶液中で安定に存在することを確認した。次に、

２．
２

シングルステップ TiO2 表面の調製

これらの TiO2 表面のうち、TiO（100）表面上へのSPB
2

TiO2 表面の処理は、文献８）のウェット法を一部変更

形成にの結果について述べる。

して用いた。アセトン、メタノール、純水中で超音波洗浄した TiO2 単結晶基板を H2SO4+H2O2（4：1）溶液中で５s 煮

３．２

TiO（100）表面上のSPB
2

沸して有機物を完全に取り除き、10% HF 水溶液中に 10

図 3c に示したシングルステップ TiO（100）表面上にベ2min 浸漬した後、酸素流通下（1.0 L/min）で 700-850℃、シクル展開法によって SPB 形成を行った。100 nm フィル

１h 焼成した。

ターを通してから超音波破砕した DPoPC ベシクル懸濁液
下で TiO（100）を40℃でインキュベーションすることに2− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

a

a

b

b

20 µm

Height
[nm]

1.40

0
0

e

1.00

d
B

0.25 nmA

Distance [µm]2.0fHeight
[nm]

c

0
0

0.20nmDistance [µm]2.0

図 4 シングルステップ TiO（100）表面上に形成した
2
DPoPC-SPB の⒜蛍光顕微鏡像と⒝ AFM 像 (2.0×2.0
μ ㎡）⒜は同じ領域で FRAP を行い、蛍光が回復していく過程を撮影したもの。A, B で示した輝点と明るい領域はそれぞれ吸着ベシクルと 2 層目の二重膜。

光顕微鏡像とステップ高さがシングルステップよりも低く観察されることなどから観察領域全体が脂質膜に覆われていると考えられるが、直接的なデータであるとは言いがたい。そこで、室温で液晶相の DPoPC（(Tc= − 36℃）に室温でゲル相をとる DPPC（Tc=41℃）を 1：1 で混ぜた 2 相系 SPBを形成し、AFM 観察を行った（図 5a）。2 種類の脂質を混ぜることで DPPC の Tc が低下するため、[001]

インキュベーション（40℃）時には全体が液晶の

図 3 HF 処理後に酸素雰囲気下で 1h 焼成した TiO2 単結晶低指数表面の AFM 像⒜ )TiO2（110）, 焼成温度 800℃（(1.0×1.0μ ㎡）; ⒝ TiO（001）,2
850℃（(1.0×1.0μ ㎡）; ⒞ TiO2（100）, 700℃（2.0×2.0μ ㎡）;⒟ ) 図 3c のラインプロファイル ; ⒠ TiO2（100）, 800℃（2.0×2.0
μ ㎡）; ⒡ TiO（100）,
850℃（2.0×2.0μ ㎡）, 挿入図は 400×2
400n㎡。全て大気中、室温で観察。

SPB が形成されるが、室温付近では相分離が起こ
り、DPPC リッチなゲル相ドメインが析出する。液晶からゲルへの相転移に伴いランダムな配向をとっていたリン脂質の炭化水素鎖がオールトランス
配向に変化してパッキングするため、膜厚が増加して、1 分子当たりの占有面積は減少する。そのため、AFM 像の高さの差から、ゲル相と液晶相のドメインを区
よって、ディフェクトの無い SPB が TiO2 表面全体を覆う

別することができる。また、面積の減少にともない SPB

ことを蛍光顕微鏡観察によって確認した（図 4a）。蛍光消に欠陥が形成されて基板表面が露出するため、SPB の厚光回復法（FRAP）によって、形成された SPB が連続的さを評価することができる。ゲル相ドメイン、液晶相ドメで流動性を保っていることが示された。吸着ベシクルと 2インの膜圧はそれぞれ 5.8 nm, 4.3 nm であった（図 5a）。

層目の SPB が存在するため、定量的な拡散係数の算出は

AFM 像の Z 方向のコントラストを強調すると、いずれのできなかった。図 4a の試料をそのまま AFM で観察したドメイン上でも TiO2 基板のステップ構造を認識すること

ものがを図 4b である。表面全体を覆っている脂質膜が、ができたことから（図 5b）、相状態にかかわらず SPB が基板のステップ & テラス構造を反映した階段状の構造を

基板表面の原子レベル構造を反映した形状をとっているこ

とっていることがわかる。

とが確認された。また、ゲル相ドメインの 2 次元的な形状

一般的に液晶相の SPB は流動性が高くて膜に欠陥が出来にくいため、AFM 像からは被覆率 100% の SPB と何もに着目すると、図 5c のように基板ステップ方向に伸びた
エッジ多く観察された。

９）無い表面の見分けがつきにくい 。図 4b においても、蛍− 38 −DPPC と DPoPC の混合比と観察温度を制御すること

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果a
Height
[nm]

10.0

0

gel

0

a

5.8nm

b

gel domains

4.5nm
Distance [µm]2.0liquid crystal

liquid crystal
bare TiO2bc

図 6 ⒜ ダ ブ ル ス テ ッ プ TiO2（100） 表 面 上 に 形 成 し た
DPoPC+DPPC（3：1） の 2 相 混 合 SPB の AFM 像（2.0×2.0μ ㎡）。⒝図 6a の液晶相上に観察されるステップ構造を破線で示した。

ab

step direction

図5⒜ シ ン グ ル ス テ ッ プ TiO（100）
表面上に形成した
2
DPoPC+DPPC（1：1） の 2 相 混 合 SPB の AFM 像（2.0×2.0μ㎡）。⒝ 図 5b の Z 方向のコントラストを強調した像。
⒞ステップ方向に沿ったエッジを持つゲル相ドメインのAFM 像（1.5×1.5μ ㎡）。

で、ゲル / 液晶ドメインの割合を変化させることができる。図 6 はダブルステップの TiO（100）表面（図3e）上2に形成した DPPC：DPoPC = 1：3 の混合 SPB を 30 K/s

図 7 シングルステップ TiO（100）表面上へのベシクル展開
2法による SPB 形成における、基板表面への紫外光照射の効
果。⒜紫外光照射なし。平面膜が形成されている。⒝紫外光照射を行ったTiO2（100）。表面にベシクルが吸着したままで、平面膜形成が進んでいない。

で 25℃から 5℃に冷却し、5℃で観察した AFM 像である。
この冷却条件では DPoPC リッチな液晶相の SPB の中に、ーを通して粒径を約 50 nm にそろえた DMPC- ベシクル懸小さなゲル相ドメインが点在しているのが観察された（図濁液を用いて、紫外光照射の有無により SPB 形成に差が6a）。ゲル相ドメインの大きさがテラス幅と同程度まで小現れるかどうかを確かめた。紫外光照射を行わない TiO2

さくなっており、液晶ドメイン上から基板のステップ構造（100）表面上では図４-６同様 SPB が形成された（図 7a）が認識できるため、ゲル相析出の核生成サイトを調べるこのに対し、あらかじめ紫外光照射した TiO（100）面上で2とができる。図 6b から、ゲル相の析出は平坦なテラス上はベシクルが吸着したままで平面膜の形成が進まなかったで優先的に起きていることが確認された。

（図 7b）。

３．
３

４．考TiO2 表面への UV 照射効果

TiO2 の重要な表面特性として、紫外光照射による超親焼成後の TiO2 表面でシングルステップ現れるという結。基材表面の親水性は微粒子

果は文献８） に倣ったものであるが、加熱を酸素下で行っの分散度などにも関係する要因であり、また、紫外光誘起たことによってステップ形状などに違いが現れている。ま

水性の発現が上げられる

10）

察の表面改質は屋外に長時間滞在した際の基材の材質変化とた、TiO（100）表面が焼成温度によってステップ& テラ
2

しても影響すると考えられる。そこで、ベシクル展開法にス構造を保ちながらも、異なるモフォロジーを持つことはよって脂質を堆積する前の TiO2 表面上に紫外光照射を行

非常に興味深い（図 3c-e）。これらの表面上での SPB の挙った場合の SPB 形成への影響について調べた。

動を詳細に調べることによって、無機材料の表面処理方法

まず、シングルステップ TiO（100）面（図7c）に低圧2
水銀灯（25 W）を用いて大気中で紫外光照射を行い、表面構造に変化が現れないことを確認した。次に、フィルタと生体膜の相互作用について新しい知見が得られると期待できる。
本研究においては TiO（100）表面にベシクル展開法に
2− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

よって比較的容易に SPB 形成をすることができたが、過性を低下させた方が SPB 形成速度が上昇することを報告

去の報告では TiO2 表面上では SPB の形成が進みにくいとした７）。これは、表面水酸基密度が高く最も親水度が高いされてきた 11, 12）。SPB は固液界面に存在する有機分子の自SiO2 表面近傍には、水素結合で表面水酸基と結ばれた安己組織化構造であり、基板表面の形状と化学状態、溶液の定な水の層が存在するためである。この水素結合ネットワ

イオン濃度や pH、脂質の組成と相状態など、非常に多くークがベシクルの基板表面への安定吸着を妨げ、平面膜形のパラメーターを含む複雑な系である。TiO（001）, TiO2
2成のための障壁として働いている。光照射によって表面水（110）表面上での平面二重膜形成にも着手しており、いず酸基密度が増加した TiO2 表面上で SPB 形成が進まなかっ

れも質の良い SPB を作製できそうな感触を得ている。こたことも、同様のメカニズムで説明することができると考れらの実験によって、「表面」の持つパラメーターを要素えている。

化することに近づくと期待している。

５． 総

Supported bilayer においては、脂質分子は基板表面に括直接吸着しているのではなく、図 1 に示したように 1-2

TiO2 単結晶基板上にステップ & テラス構造を調整してnm の水の層を介して基板上に支持されている 13）。この水SPB 形成を行い、その構造を AFM と蛍光顕微鏡によっの層を挟んだ上で、図 4, 5 で観察されたように、厚さ約 5て観察した。SPB は原子ステップ高さの表面構造を反映

nm ある SPB はたった 0.25 nm の表面原子ステップ構造

した形状をとっており、その微細なひずみによって SPBを反映した形状をとっており、基板表面と脂質膜間の距離

内での相分離の際にドメイン構造や核生成サイトの形状・が広範囲にわたってオングストロームオーダーで精密に決位置が影響されることを明らかにした。また、TiO2 表面

まっていることがわかる。また、図 5, 6 の結果は、この脂の光誘起親水性の発現によって脂質膜の吸着構造が大きく質膜の厚さのわずか 5% 程度の小さなひずみが、脂質膜内変化することを見出した。

のドメイン形状やゲル相の核生成などの相分離過程に大きく影響を及ぼしていることを示している。ゲル相ドメイン

謝辞の形状が表面ステップ構造を反映したことから、脂質膜中

本研究は、分子科学研究所・宇理須恒雄教授、名古屋大での 2 次元分子拡散がステップに垂直 / 平行な方向で異方学・宇治原徹助教授との共同研究である。本研究に対して性を持っている可能性がある。表面微細構造を利用した指助成をいただきました財団法人コスメトロジー研究振興財

向性分子輸送や、拡散速度の違いを利用した分子選別など団に深く感謝いたします。

につながると期待できる。ゲル相の核生成がテラス上で選択的に起きた（図 6）のは、ステップ構造によってできた（参考文献）

歪によって分子の分配係数が変化したためであろう。脂質

１）P. M. Oliver, G. W. Watson, E. T. Kelsey, et al.,

膜が歪んだ状態のステップ上にはよりフレキシビリティのAtomistic simulation of the surface structure of the

高い液晶相の DPoPC が優先的に存在するため、結果としTiO2 polymorphs rutile and anatase, J. Mater. Chem. ,て平坦なテラス上の SPB 内での DPPC 濃度が上昇し、過7, 563-568, 1997.

飽和度を越えた時点でゲル相の析出が始まると考えている。

２）T. Ohno, K. Sarukawa, and M. Matsumura, Crystal

しかし、このような立体的効果だけでなく、ステップとテfaces of rutile and anatase TiO2 particles and their

ラスでの原子の化学状態の違いが影響している可能性も残roles in photocatalytic reactions, New J. Chem., 26,

されており、今後 TiO（110）（001）面など表面原子配列や,
21167-1170, 2002.

化学特性の異なる低指数表面を用いての実験で詳細を明ら

３）Y. Iwasawa, Dynamic oxide interfaces by
microscopic techniques at high resolutions, Surf. Sci.,

かにしたい。

404-404, 8-19, 1998.

紫外光照射による超親水性発現のメカニズムについては今でも盛んに研究が行われているが、TiO2 表面において

４）U. Diebold, The surface science of titanium dioxide,
Surf. Sci. Rep., 48, 53-229, 2003.

は水分子が光誘起の解離吸着を起こして準安定的に表面水
10）。ベ５）R. C. MacDonald, R. I. MacDonald, B. P. M. Menco, et

シクルあるいは SPB のリン脂質分子は親水性頭部によっal., Small-volume extrusion apparatus for preparationて水を介して親水基板表面に支持されているため、直観of large, unilamellar vesicles, Biochim. Biophys. Acta,

酸基密度が増加した状態になると報告されている

1061, 297-303, 1991.

的には基板表面親水性の上昇にともないベシクル吸着が強まり SPB 形成速度は上昇しそうに思えるが、図 7 の結

６）R. Tero, M. Takizawa, Y. J. Li, et al., Lipid membrane

果は全くの反対である。筆者は以前、表面親水性を制御しformation by vesicle fusion on silicon dioxide surfaces

た SiO2 表面上への SPB 形成において、ある程度まで親水

modified with alkyl self-assembled monolayer islands,− 40 −

二酸化チタン上に形成した脂質二重膜への表面特性の影響および UV 照射効果

Langmuir, 20, 7526-7531, 2004.

252-259, 2004.

７）R. Tero, H. Watanabe, and T. Urisu, Supported

11）C. A. Keller and B. Kasemo, Surface Specific Kinetics

phospholipid bilayer formation on hydrophilicity-of Lipid Vesicle Adsorption Measured with a Quartz

controlled silicon dioxide surfaces., Phys. Chem. Chem.

Crystal Microbalance, Biophys. J., 75, 1397-1402, 1998.

Phys., 8, 3885-3894, 2006.

12）I. Reviakine, F. F. Rossetti, A. N. Morozov, et al.,８）Y. Yamamoto, K. Nakajima, T. Ohsawa, et al.,Investigating the properties of supported vesicularPreparation of atomically smooth TiO2 single crystal

layers on titanium dioxide by quartz crystal

surfaces and their photochemical property, Jpn. J.

microbalance with dissipation measurements, J. Chem.
Phys., 122, 204711-204711-204718, 2005.

Appl. Phys., 44, L511-L514, 2005.
９）S. Furuikea, J. Hirokawa, S. Yamada, et al., Atomic

13）C. M. Ajo-Franklin, C. Yoshina-Ishii, and S. G. Boxer,force microscopy studies of interaction of the 20S

Probing the Structure of Supported Membranes

proteasome with supported lipid bilayers, Biochim.

and Tethered Oligonucleotides by Fluorescence

Biophys. Acta, 1615, 1-6, 2003.

Interference Contrast Microscopy, Langmuir, 21,10）K. Hashimoto and H. Irie, Photo-induced Hydrophilic

4976-4983, 2005.

Conversion on TiO 2 Surface, Hyomenkagaku, 25,− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

コラーゲンに正しい構造を取らせる、HSP47 誘導剤の発見

熊本大学大学院医学薬学研究部

水島徹

Since HSP make cells resistant to various stressors, HSP-inducers are effective against various diseases, such as
gastric ulcer. Therefore, we here try to establish the screening system for HSP-inducers. We construct plasmid inwhich the luciferase gene is located downstream of the promoter of HSP gene. Cells transfected with this plasmid
showed phenotype of stimulation of luciferase activity upon heat shock, suggesting that this system is useful for
screening of HSP-inducers. We are now starting such screening from natural products.

１

緒いることが明らかにされ、それらの疾患は“蛋白質フォー

言ルディング異常病”と総称されるようになった。代表的な細胞、特に人体を外界から隔てている上皮細胞の傷害（細蛋白質フォールディング異常病は、神経変性疾患、プリオ胞死）は疾患の直接の原因となる。例えば胃を様々なストン病（いわゆる狂牛病）、嚢胞性繊維症などである。ほとレスから守っている胃粘膜細胞の傷害は胃潰瘍を導く。まんど全ての蛋白質フォールディング異常病の根本的な治療

た、気道を保護している気道上皮細胞の傷害は、神経終末法は確立していない。これは蛋白質フォールディング異常の露出により気道過敏症、即ち喘息を起こす。従って、細病の根本的な原因である、蛋白質のフォールディング異常

胞を様々なストレスから守る物質は、疾患治療薬として有の観点からその治療法を開発しようとする研究がほとんど望である。本研究提案は、細胞を保護する蛋白質を誘導す

なされてこなかったためである。HSP は蛋白質が正しいる物質を天然物から選択し、疾患治療薬（抗潰瘍薬、抗喘フォールディングをとるのを積極的に助けている。そこで、

息薬）として開発することを目的としている。このような安全な HSP 誘導薬は、抗潰瘍薬、及び抗喘息薬としてだ

医薬品は現在なく、本研究は独創的である。

けでなく、蛋白質フォールディング異常病の根本的治療法

我々が注目しているのはストレス蛋白質である。細胞はを確立にもつながると期待されている。

ストレスに対し、適切な蛋白質（ストレス蛋白質）を発現２することによって、自らの生存を保っている。そこでストレス蛋白質を人工的に発現させることによって、細胞をス

２．１

実

験

プラスミドの構築

トレスから守ることが出来る。実際我々は胃粘膜細胞にプ ラ ス ミ ド、LSNWT を 入 手 し、 そ れ を HaeIII と

おいて、代表的なストレス蛋白質である熱ショック蛋白質

BamHI で切断し、human HSP47 プロモーター部分を切（HSP）を人工的に誘導することによって、胃粘膜細胞を様々

り出し、それを pGL3-basic Neo Vector plasmid の Bgl II-

なストレス（アルコール、酸、ピロリ菌など）に耐性化出

Sma I 部位に導入した。作成されたプラスミドを、pGL3-

来ること、及びそれによりストレス性胃潰瘍を防御できる

pHSP47 と命名した。

ことを初めて見出した。また最近、気道上皮細胞に HSP
を人工的に誘導することによって、気道上皮細胞を様々な２．２

ストレス（アレルゲン、活性酸素、炎症性細胞傷害因子）

細胞への導入CHO-K1

細 胞 に、pGL3-basic Neo Vector plasmid、に耐性化出来ること、及びそれにより喘息症状を和らげる

pGL3-pHSP47、及び pGL3-pHSP47 をリポフェクトアミン

ことができることを初めて見出した。

（プロメガ社）を用いて導入した。モノセル化後、G418（400一方最近、蛋白質の高次構造（これをフォールディングµg/ ㎖）で選択した。熱ショックによるルシフェラーゼ活（折り畳み）と呼ぶ）の異常が多くの疾患の原因になって性上昇を指標に候補細胞を選択し、さらに同様の条件でモノセル化を２回行った（モノセル化後、同様の方法で候補

Identification of HSP47-inducers

細胞を選択した）。最も誘導効率の高い細胞をストックし、Toru Mizushima

それを起こして、次の項で述べる実験を行った。

Graduate S cho ol of Med ica l a nd
Pharmaceutical Sciences, Kumamoto
University

２．３

ルシフェラーゼアッセイ

24well プレート上で confluent になるまで培養した（HamF12, 10%FCS, 400 µg/ ㎖ G418）。42 度で 1.5 h 熱ショッ

− 42 −

コラーゲンに正しい構造を取らせる、HSP47 誘導剤の発見

クをかけ、その後 37 度で 12 時間培養した。ルシフェラー２）Mima, S., Tsutsumi, S., Ushijima, H., Takeda,

ゼアッセイは、プロメガ社のルシフェラーゼアッセイキッ

M., Fukuda, I., Yokomizo, K., Suzuki, K., Sano,トを用いた。

T., Nakanishi, T., Tomisato, W., Tsuchiya, T. and３

結Mizushima, T. Cancer Res. 65, 1868-1876.（2005）

果３）Tanaka, K., Tomisato, W., Hoshino, T., Ishihara, T.,

熱ショック依存にルシフェラーゼ活性の上昇が顕著に見

Nanba, T., Aburaya, M., Katsu, T., Suzuki, K., Tsutsumi,

られた。この結果は、継代培養を続けても、また一端スト

S. and Mizushima, T. J. Biol. Chem. 280, 31059-31067.

ックし、それをまた起こして使用しても、ほぼ同じ結果が（2005）

得られている。

４）Ushijima, H., Tanaka, K., Takeda, M., Katsu, T.,

４

考Mima, S. and Mizushima, T. Mol. Pharmacol. 68,

察

1156-1161.（2005）

以上の結果から、ルシフェラーゼを用いた、HSP 誘導

５）Tsutsumi, S., Namba, T., Tanaka, K., Ishihara, T.,

薬のスクリーニングシステムを確立することが出来たと考Arai, Y., Aburaya, M., Suzuki, K., Hoshino, T. and

えている。そこで現在このシステムを用いて、様々な生薬

Mizushima, T. Oncogene 25, 1028-1029.（2006）６）Aburaya, M., Tanaka, K., Hoshino, T. Tsutsumi,

成分から、HSP 誘導薬の検索を行っている。

S., Suzuki, K., Makise M., Akagi, R. and Mizushima,（参考文献）（本研究成果は投稿準備中）

T. Heme oxygenase-1 protects gastric mucosal cells

１）Tsutsumi, S., Gotoh, T., Mima, S., Tomisato, W.,against non-steroidal anti-inflammatory drugs. J. Biol.

Hoshino, T., Hwang, H-J., Mori, M., Tsuchiya, T. andChem. in press.（2006）

Mizushima, T. Cell Death Differ. 11, 1009-1016.（2004）− 43 −

皮膚再生を促す non-drug 細胞間脂質類似構造体（リオトロピック液晶）の開発
聖マリアンナ医科大学難病治療研究センター DDS 研究室

五十嵐

理慧

Tissue in body must quickly recognize injury to response to the rapid pace of epidermal growth. In skin, theepidermal cells must also react to danger signals from the surrounding extracellular lipid of the stratum corneum
spaces and immediately participate by initiating the wound repair process. The topical administration of lyotropic
liquid crystal on stratum corneum rapidly broke down the lipid lamella structure which would be recognized as awound without organ-change. This can activate a variety of biological processes. This study set out to determine if
the occur of the phase transition of lipid to neighbour different physicochemical structure can stimulate keratinocyte
cells and what mechanism is responsible for this response. Using small angle x-ray scattering (SAXS) analysis, theresponse to the transient structural change of lipid was detected because it might result the diffusion of oil and/or
water from liquid crystal towards lipid lamella phase. Simultaneously, significant increase of the growth factors andinflammatory cytokines were detected after the administration of liquid crystal. Not only the excess expression ofcytokines but also the extent of TEWL as the barrier marker of skin increased. These observations suggest thatthe structural change of lipid can stimulate to trigger recognition of a slight injury in the wound defence and repair
response as homeostasis. This method actually succeeded the improvement of photo-induced hyperpigmentation
on human face.

１．緒

化剤やイオントフォレシス、マイクロニードル法など）に言

よってより効率良く角質層の透過性を向上させる技術開発

加齢や光老化による顔面の日光性（老人性）色素斑、いが主流である。しかしながら、一方生体は本来自然治癒をわゆるシミやしわ（顔面の陥凹、変形を含む）の改善は、促す能力、ホメオスタシスを備えている。例えば皮膚が創

Quality of Life（QOL）を重要視するこれからの高齢化社傷した際、器質的に変化が生じる、すなわち機械的損傷を会において非常に重要な問題のひとつになると予想される。

伴う場合と、器質的に変化が生じない場合の 2 通りに大き従来から、シミやしわの改善については化粧品業界が中心

く分類される。一般に創傷時は炎症性サイトカインが産生的に商品開発を行い、美白効果がある様々な薬物を発見・し、炎症状態を引き起こす。器質的変化が生じた場合は、開発している。近年では、長期使用しなければ効果が得ら

生体は自然治癒するため様々なサイトカインやケモカイン

れにくい化粧品や医薬部外品では消費者の満足が得られにを細胞に産生させ、細胞の修復や遊走が起こり治癒する方

くくなってきたため、確実に効果が上がる形成外科や皮膚向に向かう。一方、器質的変化が生じない場合の詳細な検科におけるレーザー治療、医師主導で開発された化粧品 (討は今のところなされていない。これは、外観上の変化がドクターズコスメ ) に人気が集まっている。我々の研究室ないために研究として重要視されていないものと予想されでは、皮膚再生に効果の高い薬物であるビタミン A 活性る。しかしながら、物理的概観変化なしに皮膚再生を引き

１，２）を新規ナノテクノ起こすことが出来れば、新たな治療法として有効であるとロジー技術によって Drug Delivery System（DDS）化し考えられる。そこで我々は、ホメオスタシス誘導による皮た外用剤（nanoegg®）を開発した。表皮ターンオーバー

膚再生を目指し、バリアー機能を有する皮膚角質層に着目を加速することでシミの排出を促し、同時に表皮細胞にヒした。角質層の細胞間脂質の一過性の物理的変化が器質的

アルロン酸産生を誘導したことからしわの改善も達成する

変化なしの創傷に相当すると仮定し、新たな皮膚再生誘導

ことが可能となった３，４）。

法として研究を行っている５）。

体（all-trans Retinoic Acid,atRA）

このように、皮膚再生研究は表皮もしくは真皮における細胞の分化・増殖を促す薬物を用い、種々の方法（角質軟細胞間脂質はリオトロピックラメラ液晶構造を形成し、外界からの細菌の侵入や水分の蒸散をコントロールしバリ
アーとしての機能を果たしている。我々は、リオトロピッ

Development of intercellula r lipids（lyotoropic liquid crystal）which can
induce skin regeneration

ク液晶を作製した。本稿では、リオトロピック液晶を皮膚に塗布した際の皮膚再生効果とその機序について報告する。

２．実

Rie Igarashi
I n s t it ut e o f M e d i c a l S c i e n c e , S t .
Marianna University, School of Medicine

２．１

験

リオトロピック液晶の作製

水、極性油、界面活性剤を様々な配合で混合し、相平衡− 44 −

皮膚再生を促す non-drug 細胞間脂質類似構造体（リオトロピック液晶）の開発

図を作成した。リオトロピック液晶領域内で、小角 x 線

表皮基底及び有棘細胞間隙にヒアルロン酸（青く染色され散乱を用い、領域内液晶の構造を同定した。

ている部分）が産生されていた。液晶を皮膚に塗布すると、単回塗布にもかかわらず表皮は肥厚し、その肥厚度の程度

２．
２in vivo 皮膚塗布実験

から最適液晶濃度が存在することが Fig.1 と Fig.2 の結果

2．1 で作製した非イオン界面活性剤、油、水からなるから明らかとなった。この肥厚は、基底細胞の増殖（増殖リオトロピック液晶を、ddY mice（5-week, male）背部 2時に発現する Ki-67 の免疫染色が陽性）と、有棘細胞及び×2 ㎠に 30 ㎎を塗布し、2 日後に皮膚を採取、コロイド

顆粒細胞の分化（cytokeratin 1 の蛍光染色が強く陽性で、鉄染色（ヒアルロン酸を検出するための染色方法で併せてloricrin の発現は wild-type と大きく変わらない）の増強

表皮部位の認知も出来る染色方法）を行った。

のために、顕著な効果が得られたと考えられる５）。

２．
３

３．
２ リオトロピック液晶による皮膚再生メカニズム

皮膚組織染色及び解析

ddY mice（5-week, male）背部に塗布し 2 日後に採取

創傷治癒時に細胞はヒアルロン酸を産生すると言われした皮膚を、ホルマリン固定後、コロイド鉄染色（ヒアルている６）。液晶塗布が創傷治癒と同じ状態を促している

ロン酸を検出するための染色方法で併せて表皮部位の認知ならば、ヒアルロン酸の産生だけでなく、炎症性サイトも出来る染色方法）を行った。

カ イ ン（tumor necrosis factor（TNF）-α や interleukin（IL）1 β など）量も増加しているはずである。Fig. 3 は

３．結果と考察３．
１

keratinocyte の増殖・分化に大きく関わっているサイト

リオトロピック液晶塗布による皮膚再生効果

カ イ ン で あ る heparin-binding epidermal growth factor-

ddY マウスに塗布した結果を Fig.１に示す。

like growth factor（HB-EGF）７）mRNA や Transforming

皮膚再生効果がある場合、表皮細胞のターンオーバーがgrowth factor（TGF）-β 1 ８）mRNA の産生量も測定してい促進されるため表皮の肥厚化（keratinocyte の増殖・分化る。無処置に比べ、HB - EGF や TGF-β1 の産生は 4 倍以の結果）として検出される。Fig. 1 の赤色で染色されてい上であり、炎症性サイトカインである TNF-- α ９） や IL-1β

る上層部分が表皮層に相当する。液晶を形成している各成の産生も高いことがわかる。この結果は、液晶塗布による分にはほとんど表皮肥厚効果はないが、液晶塗布では明

皮膚再生は増殖・分化に関わるサイトカインの産生に大きらかに表皮は肥厚していることがわかる。そこで、次に液く依存していることが理解されるが、同時に炎症性サイト

晶の表皮肥厚に対する濃度依存性について検討した結果をカイン産生も増加していたことから、ホメオスタシスに基Fig. 2 に示す。同様にエマルションローション溶液に配合

づく創傷治癒状態に近いことも予想された。

されている液晶濃度に応じて表皮は肥厚し、30％配合では液晶塗布により皮膚に何が起きているのかを理解する

Fig.1 Histological researches of
topical administration of liquid
crystal. The dorsal areas of ddY
mice（male, 5-week）were used
as in vivo. （a）non-treatment（b）
liquid crystal treatment（c）oil（d）
surfactant− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

700
600
500

0.035

400

TEWL（mg/cm2/min）each mRNA/GAPDH/non-treatment（％）

Fig.2 Dose dependence of liquid crystal. The dorsal areas of ddY mice（male, 5-week）were used as in vivo.（a）liquid
crystal 0%（b） liquid crystal 10%（c）liquid crystal 20%（d）liquid crystal 30%

300
200
100
0

non-treatment HB-EGF

TGF-β1

IL-1β

TNF-α

Fig. 3 Expression of mRNAs of several cytokines HB-EGF,
TGF-β1 for the proliferation and differentiation of
keratinocytes, and IL-1β, TNF-α for the inflammation. The
expression of each cytokines was estimated the level of
non-treatment sample as 100%, respectively. The liquid
crystal 30mg was administered on mice dorsal areas, andthe tissue was taken at 2-day after one time treatment withliquid crystal.

0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0

0

3

6

24

Time after the administation（hr）

Fig. ４ Change of TEWL degree after the topicaladministration of liquid crystal on the mouse dorsal area 2
×2cm2. 50mg of liquid crystal was administered one time（n=5）.

ために、マウスへの液晶塗布後の transdepidermal water

４．総

loss（TEWL）
値を測定した（Fig. 4）
。塗布後６時間まで徐々括にバリアー機能は崩壊し、1 日後にはほぼ戻っていること

液晶に使用されている各成分は塗布と同時に細胞間脂がわかった。崩壊の程度は正常が 0.02mg/ ㎠ /min である質への受動拡散、もしくは細胞間脂質成分の塗布液晶内ことからそれほど大きくはない。バリアー機能崩壊は、バへの拡散が起こり、その結果細胞間脂質構造相転移が引リアー機能を中心的に担う角質層の細胞間脂質変化に基づき起こされたと想定できる。塗布後短時間で細胞間脂質のくものと考えられる。

秩序構造崩壊が誘導されスピノーダル分解による chaotic
structure に変化する。時間経過とともに本来の細胞間脂− 46 −

皮膚再生を促す non-drug 細胞間脂質類似構造体（リオトロピック液晶）の開発

質構造であるラメラ構造は bicontinuous cubic phase への（参考文献）

転移が誘導される。しかしながら、この相転移は一過性で、

１）Klingman, L.H., Duo, C.H., Klingman, A.M., Connect.

塗布後 24 時間でほぼ元の状態に戻ると考えられる。この仮説は TEWL 値変化（Fig. 4）からも理解できる。液晶
構造が皮膚再生能にどのように影響するかを検討するた

Tissue Res., 12 (1984) 139.
２）Klingman, A.M., Grove, G.L., Hirose, R., Leyden, J.J. J.
Am. Acad. Dermatol., 15 (1986) 836.

め、preliminary experiment として液晶の面間隔変化と表

３）Y.Yamaguchi, T.Nagasawa, N.Nakamura,

皮肥厚現象の関係を検証する予定である。液晶の面間隔を

M.Takenaga, M.Mizoguchi, S.Kawai, Y.Mizushima,

示す SAXS 散乱カーブと、マウス切片の HE（hematoxylin

R.Igarashi, J.Controlled Release, 104 (2005) 29

Eogin）染色の関係を検証することで、新たな皮膚再生の

４）Y.Yamaguchi, N.Nakamura, T.Nagasawa,

メカニズムを明らかにし、薬物を使用せずに生体の本来持A.Kitagawa, K.Matsumoto,

つ自然治癒力を促して皮膚再生を実現するといった従来にDie Pharmasie, (2006) 6,117-121

ないまったく新しい概念を構築していきたいと考えている。

M.Mizoguchi, R.Igarashi,

５）Y.Yamaguchi, T.Nagasawa, A.Kitagawa, N.Nakamura,
K.Matsumoto, H.Uchiwa, K.Hirata, R.Igarashi, Die謝辞Pharmasie,(2006) 6,112-116

本研究は、聖マリアンナ医科大学難病治療研究センター

６）Kristen R.Taylor, Janet M. Trowbridge, Jennifer A.

先端医薬開発部門 DDS 研究室の山口葉子氏、長澤輝明氏、Rudisill, Christian C.Termeer, Jan C.Simon, Richard

中村なつみ氏、松本香代氏、平田圭一氏らの研究に基づく

L.Gallo, J.Bio. Chem. 279 (2004) 17079

ものである。ここに記して感謝する。

７）Stoll S.W., Elder J.T., Exp. Dermatol., 7 (1998) 391.
８）Jennings MT, Pietenpol JA. J Neurooncol 36(1998)
123９）Hatano Y. Terashi H, Arakawa S, Katagiri K. J
Invest Dermatol 124 (2005) 786− 47 −

ラミニン - 5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化
京都大学大学院医学研究科皮膚生命科学講座

宇谷厚志

Laminin α3 chain, a functional key subunit of laminin-5, contains a large globular module (G module) at its
C-terminus, which consists of a tandem repeat of five homologous LG modules (LG1~5). Here, we show that a
recombinant α3LG4 and synthetic peptides containing syndecan binding motif within LG4 (A3G756) induced
keratinocytes motility and a MMP-9 expression in keratinocytes. The A3G756-induced cell motility was inhibitedby an MMP-9 inhibitor and a neutralizing antibody of MMP-9, indicating the cell motility was dependent on an
MMP-9 activity. In addition, the A3G756-induced cell migration was also abolished by the presence of p38MAPK
inhibitor, but not by Erk MAPK inhibitor. Neutralizing antibody to integrin α5 as well as β1 could inhibit A3G756induced cell migration. These data showed that syndecan binding with laminin-5 α3LG4 module induced
keratinocyte migration, which was mediated by a set of molecules such as MMP-9, p38MAPK, and integrin α5β1. These results suggest that the interaction between laminin and syndecan may have a significant role inreepithelialization at wound healing.

１

緒

能があまりに明確であるために、かえってマトリックス成言

分が細胞を活性化するという面に、関心が低かったと言え

表皮真皮基底膜に接して存在する表皮細胞の「皮膚基底る。それだけに、「基底膜分子が表皮を活性化する」とい細胞層」には、表皮細胞、メラノサイトなどが属する。こうコンセプトは、これから注目を集める分野に成りうると

れらの細胞は、基底膜の細胞外マトリックスに直接結合し考える。

ており、マトリックスからシグナルを受け、分化、増殖、

２

アポトーシス等生物学的活動を調節している。基底膜は表皮幹細胞のいわゆる「ニッチェ」を提供していると考えられる。一般に接着細胞は、その足場を「受容体」で認識し、実験Materials and methods
1 Cell culture

本来の機能を発揮する。皮膚基底膜には、４型コラーゲン、

Human primary keratinocytes were purchased

パーレカンをはじめとするプロテオグリカン、ラミニンなfrom Clonetics and maintained in keratinocyte-SFM

どが存在する。これらが、複雑に相互結合し、細胞へのシsupplemented with EGF and bovine pituitary extracts

グナルを調節していると考えられる。その中で、ラミニン（Invitrogen Life Technologies）． Keratinocytes were

-5 は、特に皮膚科で精力的に研究されている分子の１つでused at the 2nd 〜 5th passage in the experiments.

ある。角化細胞に対して、ラミニン- 5 は、細胞接着、遊走、
分化、アポトーシス等の機能を有し、また癌細胞の転移を2制御する機能もあるなど皮膚科医にとって興味深い分子である。

Recombinant Proteins and Synthetic Peptide
Recombinant α3 LG4-5, LG4 and LG5 modules wereexpressed as a chimera with human IgG Fc portion at

私は、ラミニン -5 の生物学的活性を研究してきており、

the C-terminus and purified as previously described with1, 2）

a minor modification1, 2）. Briefly, recombinant proteins

本研究では、ラミニン - 5 由来細胞接着活性中心を含む合were expressed in 293 T cells by Ca-P transfection

成ペプチドの表皮細胞遊走活性化をマトリックスメタロプ

kit（Invitrogen Life Technologies）．After 24h, cells

ロテイナーゼ産生、MAPK，インテグリンに焦点を当ててwere incubated with CHO medium（Invitrogen

解析する。皮膚基底膜は、単なる「構成成分」としての機Life Technologies）for another 2 days, followed by

近年、ヘパリン依存性細胞接着活性中心を同定した。

purification with protein A-Sepharose（AmershamKeratinocyte migration activated bysynthetic peptide containing syndecanbinding site within laminin- 5 α 3LG 4domainPharmacia Biotech）．

3

Atsushi Utani
Associate professor, Department ofdermatology, Kyoto University Graduate
School of Medicine

Reagents
An anti-human MMP-9 monoclonal antibody（6-6B）

and a MMPs inhibitor（MMP-9/MMP-13 Inhibitor I,
444252）were purchased from Calbiochem.

− 50 −

ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化

FITC-conjugated anti fibronectin antibody（#4470-2504）

5

RT-PCR Analysis of MMP-9

was from Biogenesis. MAPKs inhibitors, SB203580

After 24 h stimulation of recombinant proteins orand PD98059, were from Calbiochem. The MMPs andsynthetic peptides, total RNA was prepared from cells by

MAPKs inhibitor were dissolved in dimithyl sulfoxide

RNAeasy kit（Qiagen GmbH）． cDNA was synthesized（DMSO）．Heparin was from SEIKAGAKU KOGYO andfrom RNA（2.0 μg）with an oligo（dT）primer in a total

cycloheximide from Sigma Chemical Co. The protein

volume of 21 μl by SuperScriptTM First-Strand Synthesis

concentration is calculated by the BCA Protein Assay

System for RT-PCR（Invitrogen Life Technologies）．
cDNA

Kit（Pierce）．Purity of proteins was determined by（1 μl for MMP-9 or 0.1 μl for GAPDH）was subjected

reducing 10% SDS-PAGE and Coomassie Blue staining.

to PCR for amplification. In preliminary experiments,

The following function-blocking monoclonal antibodies

we determined the optimal number of cycles within（mAbs）against integrin subunits were used: P1E6

the linearity of reactions for each PCR product. Theagainst integrin α2; P1B5 against integrin α3; P1D6

cycle number for MMP-9 was 30 cycles and GAPDH

against integrin α5; GoH3 against integrin α6. All of

was 25 cycles. The primers for PCR are: The primers

them were obtained from chemicon, Temecula, CA. Rat

for PCR are: human MMP-9（1715-2129nt, GenbankTM

mAb13 against integrin β1 was a kind gift from Dr. K.

J05070），forward 5'-AAGCTGGACTCGGTCTTTGAG

M. Yamada（National Institute of Dental and Craniofacial

and backward 5'-ACTGCAGGATGTCATAGGTC;

Research, National Institutes of Health, Bethesda, USA）．

human GAPDH (292-885 nt, GenbankTM J04038),
forward 5'-CCCATCACCATCTTCCAG and backward

4

3）

Colloidal Gold Phagokinetic Assay

5'-CCTGCTTCACCACCTTCT. Using these primers,

Cell migration induced by synthetic peptides was

PCR was performed by the Expand High Fidelity PCR

examined by a phagokinetic track assay, as previously

System（Roche Diagnostics）at 94℃ for 4 min followed

described by Albrecht-Buehler. Briefly, cover slips（10by individual cycles at 94℃ for 30 s, 58℃ for 30 s, 72℃ for

mm in diameter）were dipped in 1 % freshly prepared

1 min with an extension step of 7 min at 72℃ at the end

bovine serum albumin（BSA）in distilled water andof the last cycle. The products were separated on 1.5%

then in 100% ethanol and were quickly dried with aagarose gel. The bands were visualized with ethidium

hair dryer. They were placed into 24-well tissue culture

bromide staining.

plates. The BSA-coated cover slip was covered with
0.3 ml of Gold salt solution（0.01% of formaldehyde was

6Gelatin Zymography

mixed in the solution（10% of 14.5mM HAuCl4, 58% of

Keratinocytes（1.2×10 4 cells in 96-well dishes）were

H2O and 32% of 36.5mM Na2CO3）with boiling.) and leftseeded and incubated for 24h. Cells were starved

undisturbed for 1-2 h to let the gold salt particles settle.

for 24h and treated in 50 μl of fresh medium with

Following PBS wash, the cover slips were kept at 4 ℃

reagents. Conditioned media were recovered, andin dMEM. Plates were rinsed once with PBS before use.

lyophilized. The lyophilized samples were dissolved in

Approximately 3,000 cells were plated onto the wells andnonreducing sample buffer（6 % glycerol, 1% SDS, andallowed to adhere the cover slips for 30~60 minutes, the0.004 % bromophenol blue），and incubated in 37℃ water

peptide was added to medium to induce migration. The

bath for 10 min. Samples were loaded on a 10% SDS-

cells were incubated for 12~24 h, washed and fixed inpolyacrylamide gel containing 1 mg/ml gelatin（BioRad

10% formaldehyde in PBS for 10 min. Three randomly

Co.Ltd.）．The gel was run in Tris/glycine buffer for 2h

selected and non-overlapping fields（x40）analyzed under

and then incubated in 2.5 % Triton X-100 solution for 15

dark field optics and photographed with a CCD camera

min twice to remove SDS. To detect gelatinase activity,（Model VB7010, KEYENCE）and by a NIH Image 1.60

the gel was incubated in reaction buffer containing 50

program. The migration was detected as an area without

M Tris-HCl（pH 7.4），0.2M NaCl, 5 mM CaCl2 and 1

golf particle. The migration index（MI）represented themM ZnCl2 overnight at 37 ℃ . The gelatinolytic activity

ratio of the area consumed by cell migration tracks to a

was visualized by staining with 0.1%（w/v）Coomassie

whole area of the field.

Brilliant Blue R-250, 10%（v/v）glacial acetic acid, and30%（v/v）methanol and destaining with 10%（v/v）
acetic acid and 30%（v/v）methanol. Protease activity− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

was detected as translucent area in a Coomassie blue-

taken by Carl Zeiss LSM510 Confocal microscopy.

stained gel. The scanned results of gels were calculated

３by NIH image 1.60. The values except time course
analysis were depicted as the ratio of the conditioned
media only as a control.

結果・考察

３・１ ラミニン - ５α３鎖の LG4 ドメインは、角化細胞遊走を刺激する。
以前、ラミニン α3 鎖 LG4 に細胞接着活性があること 1）、

7

Immunostaing

また同部位が MMP-1 分泌を促すこと２）を証明した。本研

HaCat cells（immortalized keratinocytes）seeded on

究において、その活性部位が細胞遊走を刺激するかどうか

poly-D-lysine coated cover glass were fixed with 4%を判定した。はじめにレコンビナント蛋白で LG45 ドメイ

paraormaldehyde/PBS and followed by incubation with

ンをつくり、培養角化細胞に投与し、その遊走刺激活性を

FITC-conjugated anti fibronectin antibody（Biogenesis）

金コロイド法で判定した（Fig. 1A, B）。細胞が動いた部

at 1：200 for 1 h at room temperature. Photograph was

分の金コロイドを貪食するという性質を利用した方法であFigure1 ラミニン α3LG4 はケラチノサイトの遊走を刺激する
A: Keratinocyte migration stimulated by recombinant laminin α3LG4-5 module. Keratinocytes were incubated on gold particle
coated cover slips without (a) or with (b) 10 µg/ml of the rec-LG4-5 module. After 24 hour stimulation, cells were fixed andrepresentative fields were photographed at x 40 under dark field optics.
B: Quantitation of the Phagokinetic track was calculated by measuring the MIs, using NIH Image 1.60. The data presented aremean +/- S. D. of three independent experiments. *, p<0.05.
C: Dose-dependent manner of cell migration activity stimulated by recombinant LG4 modules. Keratinocytes were stimulated
for 24 h. Quantitation of the Phagokinetic track was calculated as above.

− 52 −

ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化る。この結果 LG4 は、濃度依存性に遊走刺激活性を持つ

5 アミノ酸残基ほど C 末にのばした 19mer の合成ペプチ

ことが明らかになった（Fig. 1C）。

ド A3G756 を新たに作成し、活性を証明した（Fig. 2B）。
これらの実験は α3 鎖 LG4 ドメインのシンデカン結合部位

３・２

活性部位マッピング

は、遊走刺激活性を有するということを示している。

LG4 ドメイン（約 200 アミノ酸残基）のうちの活性部

一般に細胞遊走を引き起こす機構は実に数多くの分子が位のマッピングをおこなった（Fig. 2A）。LG4 ドメインを関与している。そのなかでも、細胞外マトリックスと直接カヴァーする 21 個の合成ペプチド 1）を用いて、遊走刺関係している分子として、受容体のインテグリンと細胞周激活性を金コロイド法で計測した。シンデカン結合部位と辺成分を分解することで遊走を引き起こす MMP（マトリ

して同定した部分（75aR）のみに活性が同定できた。こックスメタロプロテイナーゼ）に注目した。まず MMP かの活性はヘパリン共存により阻害されるので、この活性は

ら解析を始めた。以前 A3G756 が角化細胞の MMP-1 の産

シンデカン依存性であると考えた。水溶性を増すために、生増加を引き起こすことを報告していたため 2）、遊走刺激

Figure 2 合成ペプチドを用いた活性部位マッピング
A: Cell migration was stimulated by the synthetic peptides (192 µg/ml) for 12 hour. The
active peptide, A3G75aR- promoting migration was inhibited by heparin (30 µg/ml)(column 75aR-Hep).
B: Keratinocytes were treated with 30 µg/ml of the scrambled peptide (S4) (a) or theA3G756 (b) for 12 hours on colloidal gold coated cover slips, and photographed at x40.

− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

も逆に活性は減弱した。時間の検討では、ペプチド添加後と代表的 MMP の１つである MMP-9 に注目した。

12 時間でプラトーに達した（Fig. 4AB）。この A3G756 は３・３

A3G756 による MMP-9 産生刺激実験（Fig. 2）より MMP-9 の産生増加を引き起こすので、まず MMP- ２，-9 のタンパク量を、ゼラチンザイモグ

化学阻害剤（MMP-9/MMP-13 chemical inhibitor 444252）

ラフィーを行った（Fig. 3A）。レコンビナント蛋白（rec-ならびに MMP-9 中和抗体を共存させ、金コロイド法実

LG4）、および合成ペプチド（A3G756）で、明らかに濃度験を行った。A3G756 ペプチドによる遊走刺激は中和抗依存性に MMP-9 のみの増加を引き起こした。その増加は、体、MMP-9/-13 に対する阻害剤の共存で完全に阻害できmRNA の増加によるものであり、ヘパリン依存性である

た（Fig. 4C）。この事実は、A3G756 ペプチドは、シンデと共に denovo な蛋白合成を必要とすることが、RT-PCR

カンに結合後、遊走を引き起こす機構には、MMP-9 の活にて判明した（Fig. ３B）。

性が必須であることを示している。

３・４ A3G756 ペプチドによる細胞遊走刺激およびその MMP-9 依存性

３・５

p38MAPK の関与

この A3G756 は、シンデカンに結合後 p38MAPK をリ

A3G756 ペプチドによる細胞遊走刺激をペプチドによるン酸化することにより細胞内へシグナルを伝達することを

遊走刺激活性を金コロイド法で計測した。濃度依存性に遊報告した 2）。そこで、この細胞遊走への MAPK の関与を走を刺激した。ただし 30μg/ ㎖をこえて濃度をこくして検討した（Fig. 4D）。P38MAPK と MEK の阻害剤共存下

Figure 3 ラミニン α3LG4 and A3G756 による MMP-9 の発現増加 .
A: MMP-9 activity induced by the recombinant LG4 modules (left) or the A3G756 (right). Keratinocytes
were incubated for 24 h. MMP-9 in the conditioned medium was analyzed by zymography (Upper). Lower,
pooled results of zymography analysis. S4, scrambled peptide.
B: The A3G756-mediated MMP-9 induction through an increase of mRNA. Keratinocytes were incubatedwith 30 µg /ml of the A3G756 or the S4 peptide in the presence of cycloheximide (CHX) or heparin (Hep).
RT-PCR was performed as described in M&M.

− 54 −

ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化

Figure 4 A3G756 による遊走刺激は MMP-9 と p38MAPK に依存している .
A: Dose-dependent cell migration. keratinocytes were incubated with various amounts of A3G756 for 12 h.
B: Time course of cell migration. Keratinocytes were incubated with 30µg/ml A3G756 (+) or S4 (-) for indicated periods. Data
presented are mean +/- S.D. of three non-overlapped fields from each cover slip.
C: Keratinocytes on gold particle-coated cover slips were incubated with the S4 or the A3G756 peptide (30µg/ml) for 12 h in
the presence of an MMP-9 neutralizing antibody (Ab) (20µg/ml), an MMP-9/-13 chemical inhibitor 444252 (inhibitor), 2mM,
or a mouse IgG as a control antibody (IgG) (20µg/ml).
D: Keratinocytes were incubated with 30µg/ml A3G756 in the presence of PD98053 (20µM) or SB203580 (30µM) for 12 h.
The value of the sample incubated with A3G756 was taken as 100%. Data are mean +/- S. D. of three independent
experiments.

Figure 5 A3G756 による遊走はインテグリン α5β1を介している。
A: Keratinocytes were incubated with A3G756 in the presence of functional blocking antibodies. Mouse IgG for control (IgG),
integrin α2 (P1E6), integrin α3 (P1B5), integrin α5 (P1D6), and integrin α6 (GoH3), and integrin β1 (rat IgG2 antibody
mAb13). Data presented are mean +/- S.D. of three non-overlapped fields from each cover slip.
B: Fibronectin staining using HaCat cell with Carl Zeiss LSM510 Confocal microscopy. Original magnification, X100.

− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

で遊走刺激活性測定を金コロイド法で試みた。P38MAPKれる。そこに MMP-9 が何らかのマトリックス蛋白もしく阻害剤を添加した場合に遊走は著しく低下した。このこは細胞表面分子などをプロセスする経路も加わって、遊走とより、A3G756 の遊走刺激活性には P38MAPK が関与が可能になると考えられる。
以上により A3G756 は、19 アミノ酸と短く合成が容易していると示された。RT-PCR の結果から、P38MAPK は
MMP-9 の mRNA の増加を阻害することが判明した 。こであり、皮膚へ直接作用させる際にも、工夫しやすいと考の結果から p38MAPK は、MMP-9 転写レベルの抑制によえられる。In vitro の実験である程度分子機構が明らかに

り遊走活性を阻害する可能性を示している。

されたと考え、in vivo の動物実験による潰瘍治癒促進効

4）

果の検討を計画している。

３・６

integrin α5β1 の関与

これらの実験よりラミニン- 5α3 鎖 LG4 は、シンデカン（文献）に結合することにより細胞遊走を刺激しその際に増加する

１）Utani A, Nomizu M, Matsuura H, et al. A unique

MMP-9 が細胞遊走に必須であることが判明した。そこで、

sequence of the laminin alpha3 G domain binds

細胞遊走の際に必須といわれているインテグリンについて

to heparin and promotes cell adhesion throughその関与を検討した（Fig. 5A）。インテグリン中和抗体を

syndecan-2 and -4. J Biol Chem 276: 28779-28788, 2001

共存下で遊走刺激活性測定を金コロイド法で試みた。結果

２）Utani A, Momota Y, Endo H, et al. Laminin alpha3

は、インテグリン α5β1 の関与が最も考えられた。抗 α5 中

LG4 module induces matrix metalloproteinase1

和抗体単独で 100％阻害できないので、他の α 鎖の関与も(MMP1) through MAPK signaling. J Biol Chem 278:

少ないながら存在すると考えられる。抗 β1 抗体では完全34483-34490, 2003に抑制できたので、β 鎖に関しては β1 のみであると考え

３）Albrecht-Buehler G. The Phagokinetic Tracks of 3T3
Cells. Cell 1977, 11 (2), 395-404

られる。
培養ケラチノサイトはファイブロネクチンを培養細胞の４）Momota Y, Suzuki N, Kasuya Y, Kobayashi T,

まわりに分泌沈着させている（Fig. 5B）。インテグリン α

Mizoguchi M, Yokoyama F, Nomizu M, Shinkai H,

5β1 のリガンドは、ファイブロネクチンである事実より、

Iwasaki T, Utani A. Laminin ?3 LG4 module induces

A3G756 による遊走活性には細胞自身が分泌しガラス面にkeratinocyte migration: involvement of matrix

沈着させるファイブロネクチンの存在が必要であり、イン

metalloproteinase-9. J Recept Signal Transduct Res.

テグリン α5β1 を介してのシグナルが必須であると考えら

25:1-17, 2005

− 56 −

表皮細胞におけるエピプラキンの機能

大分大学医学部皮膚科

藤原作平

Epiplakin(EPPK), a cytoskeletal linker protein, was originally identified as an autoantigen in serum from apatient with subepidermal blistering disease. To clarify the function of EPPK, we performed slot-blot assays using
fusion proteins that included various wild-type and mutated EPPK domains. At least two of the 4.6 repeats in the B
domains of epiplakin were necessary for the binding of fusion proteins to keratin. The repeated structures of linker
domains were also important for the binding of EPPK to keratin in these assays. Similar but weaker binding tovimentin and desmin was also detected. To confirm these interactions between EPPK and intermediate filaments(IFs), we performed cell- overlay assays with fusion proteins. In HeLa cells, the distribution of fusion proteins in thecytoplasm and their partial colocalization with keratin filaments suggested that the B domains are mainly importantfor interactions with IFs, while linker domains might include multifunctional regions that are involved in binding to
IFs and to molecule(s) other than IFs.

１．緒

これらの繰り返し構造に着目し、中間径フィラメントとの言相互作用を検討した。

エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原と２．実して同定された分子量 552kDa（ヒト）ないし 725kDa（マウス）の分子であるが、表皮細胞内に局在する。構造上の２−１験

Slot-blot Assays

特徴として、他のプラキン分子、例えばデスモプラキン、

まず B ドメイン、Linker ドメインと B+Linker ドメイ

BPAG1、プレクチンのカルボキシ末端に見られる B ドメ

ンのそれぞれに対するプライマーを用いて、ヒト白血球由

イン構造が、ポリペプチド全体にわたりヒトでは 13 個、来の遺伝子断片を鋳型として、PCR 法により各ドメイン

マウスでは 16 個見い出され、特にカルボキシ末端にはほを支配する cDNA を得た（Fig. 1a）。配列を確認した上で、ぼ完全に保存された５（ヒト）−８（マウス）回の繰り返し構PGEX 発現ベクターに組み込み、GST 融合蛋白質を得造が存在している（Fig. 1a） 。 プラキン分子は細胞骨格た。B ドメイン内のリピート数とケラチンとの相互作用を結合蛋白に分類され、その中のデスモプラキンやプレクチ調べるために、B ドメイン中の 4.6 回のリピートのうちの 1ンなどは中間径フィラメントと相互作用することは、すでリピート（1R）、2 リピート（2R）、3 リピート（3R）を含に明らかになっていたが、新たな分子であるエピプラキン

むコンストラクトを作成し、GST 融合蛋白質として発現

１）と中間径フィラメントとの相互作用は不明であった。今回させた（Fig. 1b）。次に Linker ドメイン内の 1 リピート

この相互作用を検討するために、いくつかの融合蛋白質を（L1R）、2 リピート（L2R）、3 リピート（L3R）を含むコン使った Slot-blot Assays と Cell-Overlay Assays による実ストラクトを作成し、GST 融合蛋白質として発現させた験を行った。一般にプラキン分子の B ドメイン構造には、 （Fig. 1c）。これらの GST 融合蛋白質を用いて、Slot-blot
38 アミノ酸モチーフ（plakin repeat domain=PRD）からAssays を行った。メタノール処理後の PVDF 膜上に中間なる 4.6 回の繰り返し構造が存在するが、これはエピプラ

径フィラメントをしみこませた後、ブロッキングをおこな

キンにも存在し、これが機能の単位になっている可能性がい、それぞれの GST 融合蛋白質を加え、一晩インキュベある（Fig. 1b）。さらにエピプラキンでは、B ドメイン構ートした。翌日抗 GST 抗体を加え、２時間インキュベー

造を連結するリンカードメインにも 3 回の繰り返し構造がトした後、二次抗体を加え、さらに１時間インキュベート

存在するが、これはエピプラキンに特異的で、他のプラキ

後、化学発光法で抗原を検出した。中間径フィラメントのン分子には見られない構造である（Fig. 1c）。今回我々は、高次構造が各ドメインとの相互作用にどのような影響を及
ぼすかを調べるために、PVDF 膜上に中間径フィラメン

The function of epiplakin in keratinocytes

トをブロットした後６M のグアニジン塩酸で変性し、GST

Sakuhei Fujiwara, M.D.Ph.D

融合蛋白質との反応性を上記と同様の方法で検討した。

Department of Anatomy, Biology and
Med icine（ Der matolog y）Facu lty of
Medicine, Oita University

２−２

Cell-Overlay Assays

さらに、これらの GST 融合蛋白質と細胞全体との反応性を検討するために、培養 HeLa 細胞、HaCaT 細胞をメ

− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

タノール固定後、GST 融合蛋白質を加えインキュベート

作用が一番強く、次いで GST-B、GST-Linker の順であっ

後に洗浄し、抗 GST 抗体を加え、さらに二次抗体を加えた（Fig. 3）。中間径フィラメントについては、ケラチン、て Cell-Overlay Assays を行った。

ビメンチン、デスミン順で弱くなった（Fig. 3）。ケラチ

３．結
３−１

ンを６M のグアニジン塩酸で変性させた後には、B ドメ

果インとの相互作用がほぼ消失した（Fig. 4）。B ドメインSlot-blot Assays

内のリピート数を変化させた融合蛋白質を用いて Slot-blot

B ド メ イ ン、Linker ド メ イ ン、B+Linker ド メ イ ン のAssays を行なった結果、少なくとも、2 ないし 3 リピ

GST 融合蛋白質が、正しく作成されているか否かを確認

ートで GST-B ドメインとケラチンとの相互作用にほぼ匹するため、作成した融合蛋白質を SDS ポリアクリルアミ

敵したため、GST-B ドメインとケラチンとの相互作用に

ド電気泳動を行ない、クーマシーブルー蛋白染色、抗 B

は少なくとも 2 ないし 3 つのリピートが必要であることがドメイン抗体、抗 Linker ドメイン抗体、抗 GST 抗体との明らかになった（Fig. 5）。HeLa 細胞と HaCaT 細胞から反応性を検討した（Fig. 2 a-d）
。その結果、融合蛋白質は抽出されたケラチンを使って、同様の Slot-blot

それぞれの抗体と反応することが示され、また B ドメイン、を行なった結果、同様の結果が得られた（Fig. 5）。次にLinker ドメインはアミノ酸配列上も正しい融合蛋白質でLinker ドメイン内のリピート数を変化させた融合蛋白質

あることが明らかになった。Slot-blot Assays の結果、Bを用いて Slot-blot

ドメイン、Linker ドメインと B+Linker ドメインの GST

数が増すとともに相互作用が強くなった（Fig. 6）

AssaysAssays を行なった結果、リピートの２））。

融合蛋白質の中、B+Linker ドメインとケラチンとの相互

Figure1 Schematic representation of epiplakin (a) and the repeat structures of the B domain (b) and the linker domain (c).
(a) Numbered boxes indicate B domains that are 46-70% homologous to the B domain in desmoplakin. The double-lined
linker regions and the five corresponding B domains (9-13) are almost identical (1). We performed PCR to generate
GST-B domain (8B), GST-linker domain (L8-9), and GST-B+linker domain (B8+L8-9).
(b) The structure of each B domain includes 4.6 copies of a motif of 38 amino acids, which is referred to as the plakin
repeat domain (PRD). The sequence shown is that of B8. When at least three amino acid residues are identical in the 4.6
copies, they are shown in green, while identical amino acid residues in the first and third or second and fourth copies
are shown in yellow. 1R denotes a GST-fusion protein that contains one copy unit, and 2R and 3R denote fusion
proteins with two and three copies units, respectively.
(c) The structure of the linker domain between B8 and B9, with 2.7 repeats of a sequence of 82 amino acids (1). These
repeats are lined up along the entire linker domain. L1R denotes the GST-fusion protein that included the first one
repeat of the linker domain (repeat 1). L2R and L3R denote GST-fusion proteins that included two linker repeats(repeat1+repeat2) and three linker repeats (repeat1-3), respectively. L3R also included a non-repeated structure (residue
2555-2612).

− 58 −

表皮細胞におけるエピプラキンの機能

Figure 2 The purity of GST-fusion proteins was examinedby SDS-PAGE.
GST-B domain (lane 1), GST-linker domain (lane 2),
GST-B+linker domain (lane 3), and GST (lane 4) wereseparated on an SDS-polyacrylamide gel (12.5%
polyacrylamide) and then stained with Coomassie Brilliant
Blue (a). Proteins were immunostained with polyclonal
antibodies specific for the B domain (b) or with monoclonal
antibodies specific for the linker domain (c) or withpolyclonal antibodies specific for GST (d). Molecularmarkers were included on the left side of a and b.

Figure 3 Keratin interacted most strongly with GST-B+linker
domain, less strongly with GST-B and least strongly with
GST-linker domain.
In slot-blot assays, the indicated protein or BSA (as acontrol) was immobilized on membranes and then themembranes were incubated with the indicated fusion
protein (GST-B, 1.0 µg/ml; GST-linker, 1.3 µg/ml; GSTB+linker, 1.6 µg/ml; these concentrations are equal on amolar basis.) or with GST (as a control) and probed with
GST-specific rabbit polyclonal antibodies and HRPconjugated goat antibodies against rabbit IgG. The
immunoreactive proteins on membranes were visualized bychemiluminescence and exposure to x-ray film. The protein
loading was monitored with Coomassie Brilliant Blue
staining (CBB) or reaction using anti-keratin (right upper
panel) or anti-vimentin (right lower panel) antibodies andHRP-conjugated goat antibodies against mouse IgG. The
immunoreactive proteins on membranes were visualized
described above.
Keratin interacted most strongly with GST-B+linker
domain and it reacted less strongly with GST-B and GSTlinker domain, in that order. Although vimentin and desmin
also bound to GST-B+linker, GST-B, and GST-linker
domain, in a descending order of avidity, the binding was
weaker than that to keratin.

− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Figure 4 Denatured keratin decreased binding with GST-B
domain.
In slot-blot assays, keratin was immobilized on a PVDFmembranes and the membranes were denatured with (lane
2 and 4) or without (lane 1 and 3) 6M guanidinium chloride
and two pieces of membranes (lane 1 and 2) wereincubated with GST-B, 1.0 μg/ml and probed with GSTspecific rabbit polyclonal antibodies. The proteins werevisualized as described in the legend to Fig. 3. The protein
loading was monitored by reaction using anti-keratin
antibodies, HRP-conjugated goat antibodies against mouse
IgG and a chemiluminescent reagent (lane 3 and 4). After
denaturing keratin, the binding ability of the GST-B fusion
protein decreased.

Figure 5
Repeated structures of B domain areimportant for binding to keratin.
For slot-blot assays, keratin, IF fractions extracted
from HeLa cells and HaCaT cells, and BSA (as acontrol), were immobilized on a PVDF membrane.
Each membrane was incubated with 1.0 µg/ml of
GST-fusion proteins that included one, two and threecopies of PRD (1R-3R as shown in Fig.1), GST-B
domain and GST (as a control). The proteins werevisualized as described in the legend to Fig. 3. The
protein loading was monitored by with Coomassie
Brilliant Blue staining (CBB)
2R and almost 3R in the B domain were necessary
for binding to keratin, or to IFs extracted from HeLa
or HaCaT cells.

Figure 6 Repeated structures of the linker domain are also
important for the binding to keratin.
Immobilized keratin or BSA (as a control) on a PVDF
membrane was incubated with 3.0 µg/ml of fusion proteins(L1R, L2R, L3R and GST-linker) and GST (as a control), as
shown schematically in Fig. 1. The proteins were visualized
as described in the legend to Fig. 3. The protein loading
was monitored by with Coomassie Brilliant Blue staining(CBB). L3R that included three linker repeats bound to
keratin almost as strongly as the entire linker domain, while
L2R and L1R to keratin bound less strongly in that order.

− 60 −

表皮細胞におけるエピプラキンの機能

３−２

Cell-Overlay Assays

径線維の棒状ドメインと結合するとしたモデルが提唱されHeLa 細胞を用いた Cell-Overlay Assays の結果、GST-Bているが 6）、ケラチンとの相互作用をする上で、B ドメ

ドメインは、核周囲に顆粒状に分布し、一部にケラチンとイン内の少なくとも 3 リピートが、GST-B にほぼ匹敵しの局在が認められた（Fig. 7, B- C）。GST-Linker ドメイン

た我々のデータは、このモデルを支持している。しかし、は、細胞内に点状に分布し、ケラチンとの局在は見られ

彼らはデスモプラキンの Linker ドメインは、ビメンチンず（Fig. 7, E -F）、GST-B ＋ Linker ド メ イ ン は、GST-Bとの結合に大きく寄与しないとしており、今後おそらく球と GST-Linker ドメインの中間的分布すなわち一部顆粒状、状であるエピプラキンの Linker ドメインの結晶解析を進

一部点状の分布がみられた（Fig. 7, H-I）
。このことから、める必要があろう。B+Linker ドメインはケラチンと最も

GST-Linker ドメインは、ケラチン以外の他の分子とも相強く相互作用し、ビメンチン、デスミンの順に弱くなる現互作用することが示唆された。HaCaT 細胞における結果

象は、デスモプラキンと中間径フィラメントとの相互作用

も HeLa 細胞と同様の結果が得られた。

に類似している。プレクチンの B と一部の Linker ドメイ

４．考

ンは、ケラチン（5/14）よりむしろビメンチンとの相互作察用が強い。エピプラキン、デスモプラキン、プレクチンのSlot-blot Assays および Cell-Overlay Assays の結果、エピ

B ドメイン間のホモロジーは互いに 70％でほぼ等しいが、プラキンの B ドメインは、ビメンチンよりもケラチンとエピプラキンとデスモプラキン、あるいはエピプラキンと強く結合することが明らかになった。加えて Linker ドメ

プレクチンの Linker ドメイン間のホモロジーは、デスモ

インもケラチンと結合することが明らかになった。後者

プラキンとプレクチンの Linker ドメイン間のホモロジー

は、B+Linker ドメインとケラチンとの相互作用が B ドメ

よりも低い。したがってエピプラキンの B+Linker ドメイ

インとケラチンとの相互作用よりも強かったことを、よくンが中間径フィラメントと相互作用するにあたっては、高説明しうる。しかしこれらの結果は、B ドメインがケラチ

次構造が重要と考えられる。

ン 5/14 よりビメンチンと強く結合し、Linker ドメインが、は B ドメインがケラチンと相互作用する形式については、

ケラチン 5/14 やビメンチンと反応しないとした Jang ら

エピプラキンが、数本のケラチンを束ねると我々は想定しの結果と異なっている 3）。この違いは、我々がヒト表皮ており、今後この仮説を検証していきたい。

B+Linker ドメインあるいのケラチン（おそらくケラチン 5/14 以外にケラチン 1/10

一方エピプラキンのノックアウトマウスを使った実験でも含む）を使用したことや、Linker ドメイン融合蛋白質

は、野生型マウスに比し創傷治癒が速くなる傾向が認めらの結合能の不安定性によると考えられる。新規に調整しれた 7）。現時点では、エピプラキンノックアウトマウス

た Linker ドメイン融合蛋白質は、ケラチンと再現性良くでは、ケラチン 6 の発現が低下し、それに伴ってデスモゾ結合した。Linker ドメインが、繰り返し配列をとること

ームの構造が変化し、表皮細胞の移動が速くなるのではな

は、エピプラキンの特徴であり、繰り返し構造が増すごといかと考えているが、今後エピプラキンノックアウトマウに、ケラチンへの結合能が増したことは大変興味深い。デスでは、野生型マウスと比較してデスモゾームやケラチン

スモプラキン、BPAG1、プレクチン、エンボプラキンやの配行などにどのような違いを生じているのか、電子顕微

ぺリプラキンなどの他のプラキン分子の L サブドメイン

鏡レベルで詳しく検討する余地がある。また創傷治癒過程と呼ばれる Linker ドメイン（ぺリプラキン以外は C ドメ

で発現するケラチン 6、17、18 とエピプラキンとの相互作

インのアミノ末端側、ぺリプラキンには C ドメインがなく、用についても検討する必要があると考えられる。

棒状ドメインのカルボキシ末端側）が、ケラチンやビメ

５．総

ンチンと結合することが知られているが 4）、その部分と

括共通の配列は、エピプラキンの Linker ドメインには見ら

エピプラキンは、自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原れなかった。また Fontao らが、デスモプラキンの Linker

として同定された表皮内蛋白質であるが、その B ドメイ

ドメインが、単層上皮のケラチン 8/18 やビメンチンと反ン、Linker ドメイン共に中間径フィラメントと相互作用応するが、ケラチン 5/14 と結合しないことを報告していし、GST 融合蛋白質の中では、B+Linker ドメイン、次いる 5)。エピプラキンでは、今後ケラチン 8/18 やケラチン

で GST-B、GST-Linker の順で相互作用が弱くなった。中6/16 または 6/17 と結合するか否か、そしてそれが B ドメ

間径フィラメントに関しては、ケラチン、ビメンチン、デイン、Linker ドメインのいずれと結合するかを検討する

スミンの順に弱くなった。B ドメイン、Linker ドメイン

必要があろう。最近のデスモプラキンの B ドメインの結共に、その繰り返しのリピート数が増すに連れて中間径フ晶解析から、4.6 回の繰り返し構造のうち 1-2 回と 3-4 回のィラメントとの相互作用が強くなった。

繰り返し構造の間に溝が形成され、それがおそらく、中間− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Figure 7 GST-B bound to the cytoplasm partially along keratin filaments, although GST-linker and GST-B+linker
distributed mainly in dots in the cytoplasm in HeLa cells.
HeLa cells were fixed with 100% methanol and then were incubated with fusion proteins in 1% BSA/PBS.
After washing with PBS, cells were incubated with a mixture of anti-pan-keratin monoclonal antibody C11 andanti-GST rabbit polyclonal antibodies, and then washed with PBS. Cells were subsequently incubated with FITCand Rodamine-conjugated secondary antibodies directed against mouse or rabbit IgG.
GST-B(red)localized around the nucleus in the cytoplasm partially along keratin filaments (green) in HeLa
cells(B). Both GST-linker and GST-B+linker distributed mainly in dots in the cytoplasm(E,H) and did not
colocalized with keratin filaments, which indicated that linker domains interacts with other component(s) otherthan IFs. Bars=20µm− 62 −

表皮細胞におけるエピプラキンの機能（References）

115: 5027-5037,2002.

１）Fujiwara S, Takeo N, Otani Y, et al: Epiplakin,５）Fontao L, Favre B, Riou S, et al: Interaction of

a novel member of the plakin family originallythe bullous pemphigoid antigen 1 （BP230） andidentified as a

450-kDa human epidermal autoantigen:desmoplakin with intermediate filaments is mediated

Structure and tissue localization,J Biol Chem,276:

by distinct sequences within their COOH terminus,

13340-13347,2001.

Mol Biol Cell,14:1978-1992,2003.

２）Wang W, Sumiyoshi H, Yoshioka H, et al：６）Choi HJ, Park-Snyder S, Pascoe LT et al: Structures

Interactions between epiplakin and intermediateof two intermediate filament-binding fragments offilaments. J Dermatol, 33, 518-527, 2006.

desmoplakin reveal a unique repeat motif structure,３）Jang SI, Kalinin A, Takahashi K, et al:

Nat Struct Biol, 9: 612-620,2002.

Characterization of human epiplakin: RNAi-mediated７）Goto M, Sumiyoshi H, Sakai T, et al: Elimination of

epiplakin depletion leads to the disruption of keratin

epiplakin by gene targeting results in acceleration ofand vimentin IF networks, J Cell Sci, 118: 781-793,2005.

keratinocyte migration in mice. Mol Cell Biol, 26（2）,４）Karashima T, Watt FW: Interaction of periplakin548-558, 2006.

and envoplakin with intermediate filaments, J Cell Sci,

− 63 −

皮膚の光音響学的診断法の開発

防衛医科大学校防衛医学研究センター情報システム研究部門

佐藤俊一

Chromophores in skin tissue, such as melanin and hemoglobin, can be excited by irradiation with short pulsed
light, by which adiabatic expansion occurs in the chromophores and as a result, photoacoustic waves are emitted in
the tissue. By detecting the photoacoustic waves on the skin surface, we can obtain information on the distributionsof chromophores in the skin, which is an important factor for determining cosmetic characteristics of the skin. The
objective of this study was to develop a new modality for skin diagnosis, based on the photoacoustic technique. To
investigate the validity of this technique, we performed multiwavelength measurements of photoacoustic signals
induced in rat skins and human skins under the various experimental conditions. We used a transducer which
consisted of an annular P(VdF/TrFE) (vinylydene fluoride trifluoroethylene copolymer) film and a quartz fiber; thefilm and fiber were coaxially arranged. Output pulses from an OPO (optical parametric oscillator) were coupled
to the fiber and transmitted pulses irradiated skins. Photoacoustic signals induced were recorded in a high-speed
digital oscilloscope. For human forearm skins, photoacoustic signal peaks appeared in the depth range of 0.1 - 0.2
mm, which were thought to be originated from melanin in the epidermis. The signal amplitude for the forearmoutside skin was higher than that for the inside skin, indicating the higher melanin content in the outside skin
due to exposure to larger amount of sunlight. For human palm skin, no clear signal originating from melanin wasobserved, while signal peaks which were thought to be originated from hemoglobin were observed in the threedepth ranges: 0.3 - 0.4 mm, 0.75 - 0.8 mm, and 1.1 - 1.2 mm. Theses results suggest the validity of this method for
depth-resolved skin diagnosis.

１．緒

歴史的にみると，光音響効果は 1880 年 Bell により報告

言され１），その後一般科学技術分野，産業分野において様々

コスメトロジー分野において，皮膚の色調や組織の吸収・な応用技術が創出されてきた。しかし，生体・医学分野に散乱係数などの光学特性を評価する技術は非常に重要であおいて研究が盛んになってきたのは 2000 年代に入ってのる。皮膚の色については，近年，マルチスペクトルイメーことである。ここ１〜２年の技術的進展は著しく，診断のジング技術の進歩により客観的評価技術が確立しつつある

対象は全身のほぼ全ての組織と言ってよいが，皮膚科学分が，これにより色を決定する各種色素（メラニン，ヘモグ

野の応用は特に重要な位置づけにある。

ロビンなど）の深さ方向分布に関する定量的情報を得るこ

２．原とはできない。そこで本研究は，光音響学的アプローチに理

簡単のため，図１に示すような深さ z ＝ z0 に吸収係数

より，皮膚組織中（一部皮下組織を含む）の色素の深さ方
向分布をリアルタイムで計測する新しい診断技術を確立す

μa の層が存在する半無限透明媒質（散乱係数 μs ＝ 0）のることを目的とした。

表面に，時刻 t ＝ 0 でパルス幅 τp ，フルエンス F0 のビー

光音響学的診断法（以下，単に光音響法と呼ぶ）の原理

ム径の大きいレーザー光を照射することを考える。レーザについては次項で述べるが，簡単には，組織に光を照射し，ー光は吸収層で吸収されて熱に変換されるが，応力の閉じ吸収体（chromophore）が発生する音響波を検出する診断

込め条件（τp ≪１/μavs，vs は音速）が満たされると，熱法である。光診断と超音波診断の両方の特徴を併せ持ち，弾性過程により次式で示される圧力波が効率的に放出され，検出対象が音波であるために，光診断の最大の問題である

これを光音響波と呼ぶ。
p (z) ＝ ( ßvs²/cp) μaF0 exp (‑μaz)

散乱による信号の減衰の影響を直接的には受けない。この（1）

ため，比較的深い組織を高い空間分解能で観測することがここで β は体積膨張率，c p は定圧比熱，ß v s²/c p ＝ Γ はでき，ヒトの皮膚や皮下組織の診断に十分な能力を有する。

Grüneisen 係数と呼ばれる無次元数で，光から熱弾性波への変換効率を表す。上記の応力閉じ込め条件は，多くの生Development of photoacoust ic skindiagnostics
Shunichi Sato
Division of Biomedica l Information
Sciences, National Defense Medical
College Research Institute

体応用において，ナノ秒オーダー（10 − 9 − 10 −8s）のパル
ス光を使用することで満たされる。
（1）式で示される圧力波（光音響波）は二分され，それぞれ媒質の表面方向と裏面方向に伝搬する。前者を媒質表面（z ＝ 0）に配置した検出器（図の transducer #1）で検出すると，その振幅ないし指数関数的スロープより µa− 64 −

皮膚の光音響学的診断法の開発に関する情報を，また伝搬時間と音速 vs の積より吸収層

基礎データの収集を行った。次に，これに基づいてヒト皮の深さ z0 を知ることができる（後方または反射型検出方

膚の光音響信号の取得を試み，本診断法の有用性について式）。検出器を媒質裏面に配置する形式（図の transducer

検討を行った。

#2）でも同様の計測が可能であるが（前方または透過型

３．実

検出方式）
，皮膚を対象とする場合は反射型検出方式が用験いられる。複数の吸収層がある場合も，観測した光音響波

光音響波計測においては，照射光の波長とパルスエネ

を各層で発生する光音響波の合成と考えればよく，この方ルギーが重要なパラメータとなる。光音響波は光が組織中法により，吸収体の深さ方向分布計測（depth profiling）の chromophore に吸収され，断熱的に膨張することによが可能となる。検出器を走査すれば吸収体の二次元断層情り発生するため（熱弾性過程），観測したい吸収体の吸収報を得ることができ，これを光音響トモグラフィー（PAT

スペクトルに合った波長の光を照射する必要がある。皮膚: photoacoustic tomography）などと呼ぶ。

の代表的な吸収体であるメラニン２, ３）とヘモグロビン４– ６）

本研究では，皮膚の光音響診断を行うための実験系を構の吸収スペクトルを図 2 にまとめた。メラニンの吸収係数

築し，まず動物（ラット）の皮膚を対象とした実験によりは波長が短くなるに従い単調に増大するのに対し，ヘモグ

図１

図２

光音響法の原理図

メラニン，ヘモグロビンの吸収スペクトル（文献２−６のデータより作成）− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

ロビン，特に酸素化ヘモグロビンは複雑な吸収スペクトル実験に用いた検出器と装置の構成を図３に示す。光音響を示し，わずか数 nm 程度の波長の違いが光音響波の発生波の検出に用いた圧電素子は外径 5.5 mm，内径 1.5 mm，に大きな影響を与えうる。逆にこの点を利用して，皮膚組

厚さ 30µm のリング形 P（VdF/TrFE）（フッ化ビニリデ

織中のヘモダイナミックスを評価することも可能である。

ン／三フッ化エチレン共重合体）フィルム（東レ製）で，また適切な波長を選定しても，光エネルギーが不十分であ

周波数帯域（-６dB 帯域）は 13.6 − 39.2MHz である。こると検出に充分な信号を得られない。一般に光は，生体組の素子の中心部に光音響波の励起光を伝送するための石英

織中で吸収と散乱を受けて大きく減衰するため，特に深部

光ファイバー（コア径 600 µm）を配置した。これら素子の吸収体を観測するためには高いエネルギーが必要となる。

とファイバー出射端の下面には，皮膚からの反射光を減弱

ただし，エネルギーを高くしすぎると皮膚損傷を招くおそさせるため，厚さ６mm の PMMA（ポリメチルメタクリ

れがあるため，一定の制限を受ける。以上の観点より，本レート）のスペーサを設けた。ファイバー出射光はこのス

研究ではまずラット皮膚を対象に，照射光パラメータが光ペーサを透過して皮膚に照射され，発生した光音響波もこ

音響信号にどのような影響を与えるかについて調べた。

のスペーサを伝搬して素子に到達する。光音響波励起用の

図３

図４

実験装置の構成（左）と検出器の構造（右）ラット背部皮膚の組織画像（HE 染色）。スケールバー 500μm− 66 −

皮膚の光音響学的診断法の開発

光源には出力波長可変の光パラメトリック発振器（OPO：

条件において，照射パルス光エネルギーを最大 500 µJ ま

optical parametric oscillator）を用いた。OPO の出力光はで変化させて光音響信号を取得した。図７に波長 532 nm

可変アッテネータを介して前記ファイバーに導入した。圧の場合（酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの電素子の出力信号（電圧信号）は同軸ケーブルを介してほぼ等吸収点）の信号波形を示す。ここで，時間波形を音

FET（電界効果トランジスタ）増幅器で増幅後，デジタ

速 1500 m/s を用いて深度分布に変換した。信号は照射エ

ルオシロスコープで記録した。

ネルギーが大きくなるに従い増大し，深さ約 0.1mm 付近，

ラットを用いた実験は，Wistar 系ラットオス，体重約0.7 mm 付近，1.3 mm 付近の三箇所に顕著なピークが認め400ｇの背部および腹部の皮膚を計測対象とした。図４にられる。組織画像（図４）より，これらの深度はそれぞれ，

背部皮膚の組織画像を示す。表皮および真皮の厚さはそれ

表皮深部ないし真皮最上部，真皮深部，皮下組織（筋層）

ぞれ 70 − 80µm，約１mm であった。全身麻酔下（ペンに相当することがわかる。

トバルビタール 50 mg/kg）で皮膚を剃毛，除毛し，約１

図８に各波長における最大ピーク信号（振幅）の照射

時間経過後に計測を行った。計測の状況を図５に示す。ヒ

パルスエネルギー依存性を示す。（1）式より，発生する光ト皮膚の計測は，著者（47 歳，男性）の前腕皮膚（内側，

音響波の圧力は吸収エネルギーすなわち照射光エネルギー外側）と手掌部を対象に行った。計測部位の写真を図 6 にに比例するが，同図は 450µJ 付近までその関係が成立し示す。全ての計測において，検出器は超音波ゼリーを塗布ていることを示している。また信号の大きさは，波長 600

して皮膚に接触させた。

nm<560 nm<532 nm の順に大きくなっており，これは酸素化ヘモグロビンの吸収係数の順に対応している（図２）。

４．結果および考察
４．
１

これより，これらの波長における計測においては，上記各ラット皮膚の光音響波計測

深度領域における酸素化ヘモグロビンが主な吸収体としてラット背部皮膚を対象に，波長 532，560，600 nm の３図５ラット皮膚の光音響波計測状況

図７

図６

働いていることが推察される。ただし 600 nm においては，

ヒト皮膚の光音響波計測部位。 手掌部および前腕内側（左），前腕外側（右）照射光パルスエネルギーを変化させた場合のラット背部皮膚の光音響信号波形。波長 532nm− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

脱酸素化ヘモグロビンの吸収係数が酸素化ヘモグロビンのとなっていることを示唆するデータである。一方，第三の吸収係数より 4 倍以上高いことから，他の波長と比較して， （皮下組織の）信号ピークのスペクトルは，長波長側で低脱酸素化ヘモグロビンの寄与が大きくなっていると考えら下がみられないことが特徴的である。これは，長波長の光れる。

の組織内減衰が小さく，比較的大きな光エネルギーが皮下

図９に波長 500 − 665 nm の帯域における，上記の三つ組織に到達していることによると考えられる。

のピーク信号の波長依存性（光音響スペクトル）を示す。

以上は全て同一ラットの同一部位（背部）のデータであ第二の（真皮深部の）信号ピークのスペクトルは明確な双るが，図 10 に二匹のラットのそれぞれ背部と腹部を対象

峰性を示し，酸素化ヘモグロビンの吸収スペクトルと同様に計測した光音響信号の比較を示す。これより，背部およの傾向を示している。これに対し，第一の（表皮から真皮

び腹部同士の信号の個体差は大きくないが，背部と腹部の最上部の）信号ピークのスペクトルは 500 nm において最信号には大きな違いがあることがわかる。すなわち腹部皮大となっており，ヘモグロビンの吸収スペクトルと大きく膚の信号には，背部皮膚の表層付近に観測された顕著なピ

異なっている。これは表皮中のメラニン等が主要な吸収体

ークがみられない。用いたラットにおいては，背部皮膚表

図８ 波長 532nm，560nm，600nm におけるラット背部皮膚の最大光
音響信号の照射光エネルギー依存性

図 10 ラット背部皮膚の光音響信号の波長依存性（光音響スペクトル）。
第１ピーク（上段），第２ピーク（中段），第３ピーク（下段）− 68 −

図９ ラット２匹のそれぞれの背部皮膚，腹部皮膚の光音響信号波形。照射光波長 532nm，パルスエ
ネルギー 300µJ

皮膚の光音響学的診断法の開発

面に淡褐色の色素沈着が認められたのに対し，腹部ではこ者の部位において，メラニン濃度が高くなっていることをれがなかった。この色素沈着は，剃毛，除毛の過程で目視示している。また手掌部はメラニン濃度が低いことが知ら

上は消失したが，背部皮膚においては残留色素成分に起因れているが，同部位の信号ピーク（深度 0.1 − 0.2 mm，波する光音響信号がピークとして表れたものと考えられる。

長 532 nm）は 0.02V 以下と低い値を示している。このよ

この結果は，本光音響診断法の感度の高さを示すものであうに，光音響信号ピークとメラニン量の間には明確な相関る。

が認められた。
前腕内側および外側の深度 0.2 −0.4 mm 付近の信号ピー

４．
２

ヒト皮膚の光音響波計測

クは，メラニンと真皮上部のヘモグロビンの両方に由来し

著者（47 歳，男性）の前腕皮膚（内側，外側）と手掌ていると考えられる。今回取得したデータから両因子の寄部の直線２cm 区間において，検出器を２mm 間隔で走査与率を見積もることは困難であるが，同一点，同一深度のして光音響波の計測を行った（図６）。パルスエネルギー

信号の振幅の波長依存性を詳しく調べることにより，あるは 200µJ で一定，測定波長は 532 nm（酸素化・脱酸素化ヘ程度の定量化は可能であると考えられる。一方，手掌部のモグロビン等吸収点），556 nm（脱酸素化ヘモグロビンに0.2mm より深い領域の信号は，酸素化・脱酸素化何れかよる吸収が優勢），576 nm（酸素化ヘモグロビンによる吸のヘモグロビンに由来すると考えられる。532 nm（等吸収が優勢），600nm（脱酸素化ヘモグロビンによる吸収が収点），556nm（脱酸素化ヘモグロビン優勢），576 nm（酸支配的）の 4 波長とした。前述したようにメラニンの吸収

素化ヘモグロビン優勢）の各波長の波形によると，深さ係数は波長が短くなるに従って大きくなることから，上記

0.3 − 0.4 mm 付近，0.75 − 0.8 mm 付近，1.1 − 1.2 mm 付

4 波長の中では 532 nm において最大になると考えられる。

近に信号ピークが認められ，これら深度領域に血液層が存

図 11，12，13 にそれぞれ前腕皮膚内側，同外側および在していることを示している。脱酸素化ヘモグロビンによ

手掌部の各波長における 10 計測点の光音響波形を示す。

る吸収が支配的な 600 nm の信号において顕著な信号ピー

各波形において，深さ 0.1 − 0.2mm 付近にある信号ピー

クが認められないことから，上記の各信号ピークは酸素化

クは，表皮中のメラニンに由来すると考えられる。いま同ヘモグロビンによる吸収の寄与率が大きいと考えられる。

深度領域にある波長 532 nm の信号ピークに着目すると，

600 nm の信号においては，深さ 1.3 − 1.4 mm 付近に小さ

前腕内側で 0.04 − 0.1V であるのに対し，前腕外側で 0.06

な信号ピークが認められ，この深度領域において脱酸素化− 0.15V と高くなっている。これは紫外線暴露量が多い後ヘモグロビンの濃度が高くなっている可能性を示唆してい図 11

各波長におけるヒト前腕内側皮膚 10 点の光音響信号波形。パルスエネルギー 200µJ− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

図 12

各波長におけるヒト前腕外側皮膚 10 点の光音響信号波形。パルスエネルギー 200µJ

図 13

各波長におけるヒト手掌部皮膚 10 点の光音響信号波形。パルスエネルギー 200µJ− 70 −

皮膚の光音響学的診断法の開発

り，黒色メラニンと黄色メラニンの分布を診断できる可能る。
図 11，12，13 の各点のデータより信号の二次元分布を性もある。

求めた結果（光音響トモグラム）を図 14 に示す。上述し５．総た傾向を視覚的に捉えることができる。

括

今回の実験は，波長毎に三部位の計測を行ったこと

光音響法が皮膚組織中のメラニン，ヘモグロビンなどのから，同一部位の各波長のデータ取得時間には数 10 分

深さ分布を診断するのに有効であることがわかった。本方の時間差がある。この間の信号の時間変動が無視できれ

法は無侵襲かつリアルタイムの皮膚診断が可能であり，皮ば，各波長の信号の比を取り，例えば，556nm/532 nm，

膚診断用ツールとして有望である。今後，装置の小型・軽576 nm/532 nm が一定値以上の領域を，それぞれ静脈と動量化および上述した高機能化に取り組み，コスメトロジー

脈として表示することも可能であろう。また波長を高速で分野での実用化を目指したい。

走査してメラニンの光音響信号スペクトルを得ることによ図 14 各波長における手掌部，前腕内側，前腕外側の光音響トモグラム。カラーバーにおいて，青色から赤色に行くに従い光音響信号（振幅）が大きくなる。パルスエネルギー 200µJ− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

（参考文献）

Acta., 538, 164-170, 1987. ４）１）Bell AG, :The production and reproduction of soundmeasurement of blood oxygenation by implantable

Schmitt JM, :Opticaltelemetry, Technical Report G558-15, Stanford.

by light, Am. J. Sci., 20, 305, 1880.
２）Sarna T and Sealy RC, :Photoinduced oxygen５）Moaveni MK, :A multiple scattering field theory

consumption in melanin systems. Action spectra andapplied to whole blood, Ph.D. dissertation, Dept. ofquantum yields foreumelanin and synthetic melanin,

Electrical Engineering, University of Washington, 1970.
６）Takatani S and Graham MD, :Theoretical analysis of

Photochem. Photobiol., 39, 69-74, 1984.
３）Crippa RP, Cristofoletti V, and Romeo N, :A bandmodel for melanin deduced from optical absorption
and photoconductivity experiments, Biochim. Biophys.

− 72 −

diffuse reflectance from a two-layer tissue model, IEEE
Trans. Biomed. Eng., BME-26, 656-664, 1987.

インターロイキン 12 による紫外線防護に関する研究

長崎大学先導生命科学研究支援センター

松田尚樹

Interleukin-12(IL-12), one of the cytokines produced in UV-irradiated human skin, has been reported to prevent
UV-induced immunosuppression through the mechanisms involving enhancement of DNA repair. This fact let us
to speculate on the potential use of IL-12 for biological protection against harmful solar UV radiation. We examined
effects of exogenously-added IL-12 on UV-irradiated human epidermal keratinocytes, the expression of IL-12
in those cells, and UV-induced intracellular signaling molecules responsible for IL-12 production. The removalof cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) from the genomic DNA in cells irradiated with 100J/m2 of UV-B (80µW/cm2) was accelerated by the presence of human recombinant IL-12 at doses of 50 or 100ng/ml. Treatmentof the irradiated cells with IL-12 also resulted in elevated survival level following UV-B irradiation. When cells
were irradiated with 200J/m2 of UV-B, IL-12 concentration in conditioned medium for 24h post-irradiation wasapproximately 12pg/ml, which was 10 fold higher than that in unirradiated control. Expression for IL-12A(p35)mRNA was also increased to 2.4 fold over the control level in 16h following exposure. Both the IL-12 secretion andIL-12 mRNA expression were inhibited by a JNK inhibitor and by an antioxidant. These results suggested that UVinduced oxidative stress in the cells triggers activation of intracellular signaling, including a JNK pathway. Although
the downstream signaling is to be determined, activated JNK would lead to secretion of IL-12 through upregulationof IL-12 mRNA expression. IL-12 then enhances elimination of CPD from damaged DNA. Thus, UV-induced
signaling pathways toward production of IL-12 are possibly a positive autocrine regulation of DNA repair system. To
potentate this mechanism may lead to a new approach toward biological protection against solar UV light.

１．緒

photolyase の適用が既に試みられているが、健常者が日常言の生活で使用し得る生物学的防護法は未だ確立していない。

オゾン層破壊による太陽紫外線（以下 UV）被ばく量増

サイトカインの一種であるインターロイキン 12（IL-12）

加に伴う人体影響が危惧されている。UV の悪影響を低減

は、免疫担当細胞により産生され、免疫ネットワークをするための UV 防護として、衣服、帽子、眼鏡等の着用制御する液性因子としてクローニングされたものである。

や、サンスクリーン剤の塗布による物理的あるいは化学的

その後、皮膚構成細胞も IL-12 を産生し、UV がこれを誘な方法が用いられ、これらの方法はいずれも有効であるが、導すること 1，2）、また IL-12 が UV による皮膚免疫抑制に

生体の UV 防御反応を促進するものではない。そのため、対して拮抗的に働くこと３） が報告されてきたが、この機

UV を浴びた後に適用しても有効な生物学的 UV 防護法が構の一つとし - て、IL-12 による DNA 損傷の除去修復促

望まれている。

進の可能性が示されている４）。このことは、IL-12 が免疫

UV 被ばく後の表皮には DNA 損傷が生じており、その系に対して働くのみならず、UV を浴びた後の組織防護

大部分は修復されるが、修復されない損傷や誤った修復に働く可能性を示す。一方、UV 照射された細胞内では、を受けた損傷が、細胞死または突然変異を引き起こし、ひDNA 損傷に起因する、あるいは起因しないシグナル分子

いては、短期的には重篤な日光皮膚炎、長期的には発が群が活性化し、細胞の増殖、アポトーシス、また分化機能

んを誘導する。したがって、生物学的 UV 防護のアプロ

といった多様な細胞機能の発現に関わっているが５―７）、そーチの一つとして、DNA 損傷の修復を促進する因子をの IL-12 誘導との関連性については知られていない。

適用することが考えられる。事実、DNA 損傷の修復に

本研究では、UV による組織の損傷を低減し、組織の再必要な遺伝子の機能を欠損した XP（色素性乾皮症）患生を促す新たな UV 防護因子としての IL-12 の可能性を探者の臨床においては、DNA 損傷の除去修復の際に必須ることを目的とし、培養ヒト表皮角化細胞を用いて、中波の UV-endonuclease V や、 損 傷 の 光 回 復 を 可 能 と す る

長 UV（UV-B）照射後の DNA 損傷修復と細胞死に対する exogenous に与えられた IL-12 の作用、および UV-B

Biological protection from ultraviolet
radiation by interleukin-12
Naoki Matsuda

照射による endogenous な IL-12 産生誘導と、それに関わる UV-B 誘導細胞内シグナル分子群について検討した。

２．材料と方法

Center for Frontier Life Sciences,
Nagasaki University

細 胞 に は 初 代 培 養 正 常 ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞（normal
human epidermal keratinocytes: NHEK）、またはヒト表− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

皮角化細胞由来樹立株（HaCaT）を用い、培養液にはそ

そこで、あらかじめ細胞を IL-12（ヒト・リコンビナ

れぞれ EpiLife-KG2（Kurabo）または DMEM/10％ FBS

ント体、Sigma）で１時間培養した後に UV-B を照射し、を用いた。なお NHEK は継代数１- ３の細胞を実験に供

さ ら に IL-12 存 在 下 で 培 養 を 続 け、CPD 及 び 6-4PP 量した。UV-B 照射には、CO2 インキュベータ内に設置したを測定したところ、10ng/ ㎖および 50ng/ ㎖の IL-12 にUVB ランプ（UVP F8T5 8W、波長ピーク 302nm、線量率

よって照射６時間後における CPD 量が有意に減少して80µW/ ㎠）を用いた。

いた（Fig. ２）。しかし照射 24 時間後では IL-12 の作用

照 射 後 の 細 胞 よ り DNA を 単 離 し、UVB に よ る 主 要は見られなかった。また、データには示さないが、IL-12

な DNA 損傷であるシクロブタン型ピリミジンダイマー

は 6-4PP の量には影響を与えなかった。さらに、UV-B（CPD）及び 6-4 光産物（6-4PP）を、
抗 CPD 抗体（TDM-2）

照射後の細胞の生存率は、IL-12 の存在により上昇したまたは抗 6-4PP 抗体（64 M-2）を用いて ELISA 法によ（Fig. ３）。以上を合わせると、exogenous に加えられたり測定した。また UVB 照射後の細胞生存率をコロニー

IL-12 は、CPD の修復のうち特に初期過程を促進し、そ形 成 法 に よ り 求 め た。 一 方、 照 射 後 の 細 胞 に よ る IL-の結果、UV-B による細胞死を防ぐことが考えられる。

12A（p35）mRNA の発現は等長プライマー伸長法（IPE

次に、UV-B による IL-12 の産生誘導について検討し法、TrimGen）により、また培養液中に分泌された IL-12

たところ、NHEK 細胞では、200J/ ㎡の UV-B 照射 16 時（p70）量は ELISA（Endogen）により定量した。細胞内間後における IL-12 mRNA の顕著な発現（非照射に対シグナル分子としてはすでに UV-B に応答することを報告

して約 2.4 倍、Fig.４）と、24 時間後における培養液へのしている MAP kinase 群である ERK1/2、JNK1/2、およIL-12 の分泌の線量依存的な増加（200J/ ㎡では約 12pg/

び p38 に着目し、それぞれのシグナル伝達系の阻害剤でml、Fig. ５）が認められた。興味深いことに、HaCaT ではある PD98059（MEK inhibitor, 100µM）、
SP600125（JNK1/2

このような UV-B による IL-12 の誘導は見られなかった

inhibitor, 20µM）、および SB203580（p38 inhibitor, 25µM、 （data not shown）。
以 上 Calbiochem） に よ る IL-12 発 現 量 の 変 化 を 調 べ た。

この UV-B 誘導 IL-12 産生に関わる細胞内シグナル伝

シグナル分子のリン酸化は western blot により検出した。

達経路を推定するために、UV-B で活性化することが確かめられている MAP kinase 群の阻害剤の存在下で UV-B を

３．結果照射し培養を続けたところ、IL-12 分泌（照射 24 時間後、

100J/ ㎡の UV-B を照射された HaCaT における CPD 及

Fig. ６）および IL-12 mRNA 発現（照射 16 時間後、Fig.７）

び 6-4PP 量の経時変化を Fig. １に示す。CPD 量は照射後のいずれもが、JNK1/2 の特異的阻害剤である SP600125

8 時間で半減し、24 時間後にも約 20% が残存したのに対により非照射のレベルまで抑制された。また、抗酸化剤

して、6-4PP は照射後 2 時間で急激に減少し、16 時間後

で あ る N-acetyl-cysteine（NAC） は SP600125 と 同 様 ににはほぼ未照射のレベル（OD=0）に達した。すなわち、

IL-12 産生を抑制するとともに、UV-B による JNK1/2 の

CPD はゆっくりと、6-4PP は早く修復されることが示さ

リン酸化を阻害していた（Fig. ８）。

れた。

Fig.1

Repair kinetics of CPD (left) and 6-4PP (right) of HaCaT cells following exposure to UV-B (100J/ ㎡ ).

− 74 −

インターロイキン 12 による紫外線防護に関する研究

Fig.2 Effect of exogenously-added IL-12 on removal of CPD in HaCaT
cells in 6 h or 24h following exposure to UV-B (100J/㎡ ).

Fig.4 mRNA expression for IL-12 (p35) in normal humanepidermal keratinocytes in 16h or 24h following exposure
to UV-B (100J/㎡ or 200J/㎡ ).

Fig.3 Clonogenic cell survival of HaCaT cells in
the presence or absence of IL-12 following
irradiation with UV-B at various doses.

Fig.5 Secretion of IL-12(p70) by normal human epidermal
keratinocytes in 24h following exposure to increasing
doses of UV-B.

− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Fig.6 Inhibition of IL-12 secretion by various MAPK inhibitors and an antioxidant in 24hfollowing irradiation with 200J/㎡ of UV-B. PD:PD98059 (MEK inhibitor, 100µM），
SP:SP600125（JNK1/2 inhibitor, 20µM）,SB:SB203580（25µM），NAC:N-acetyl
cysteine (antioxidant, 1mM).

Fig.7 Inhibition of IL-12A mRNA expression by various MAPK inhibitors and by anantioxidant in 16 h following irradiation with 200J/㎡ of UV-B.

Fig.8 Phosphorylation of JNK and its inhibition by NAC in 24h following irradiation with
400J/㎡ of UV-B.

− 76 −

インターロイキン 12 による紫外線防護に関する研究

４．考（参考文献）

察１）Kondo S, Jimbow K:Dose-dependent induction of

UV-B はヒト表皮角化細胞による IL-12 の産生を誘導しIL-12 but not IL-10 from human keratinocytes after

たこと、一方、exogenous に加えた IL-12 が CPD の修復

exposure to ultraviolet light A. J Cell Physiol 177,を促進し UV-B による細胞死を抑制したことは、UV-B に493-498, 1998.

より放出誘導された IL-12 が DNA 損傷の修復を促進する

２）Werth VP, Bashir MM, Zhang W:IL-12 completelyという、一種の autocrine な upregulation 機構の存在を示

blocks ultraviolet-induced secretion of tumor

唆する。しかし、exogenous に加えられた IL-12 の有効

necrosis factorαfrom cultured skin fibroblasts and

濃度域（ng）は、培養液中に検出された IL-12 濃度（pg）

keratinocytes. J Invest Dermatol 120, 116-122, 2003.

よりも高く、また IL-12 は CPD の修復のうち特に照射 6３）Schwarz A, Grabbe S, Aragane Y et al.:

時間以内の初期過程を促進したが、培養液中への IL-12 のInterleukin-12 prevents UVB-induced local分泌が確認されたのは照射 24 時間を経た後であった。そimmunosuppression and overcomes UBN-inducedのため、この autocrine な regulation が生理的に生じていtolerance. J Invest Dermatol 106, 1187-1191, 1996.

るかという点について、IL-12 をノックダウン、もしくは４）Schwarz A, Staender S, Berneburg M et al.: Interleukin-12
suppresses ultraviolet radiation-induced apoptosis by

強制発現させた細胞系での確認が必要である。
UV による IL-12 の誘導には細胞種波長依存性があり、

inducing DNA repair. Nat Cell Biol 4, 26-31, 2001.

HaCaT で は UV-B に よ る IL-12 の 誘 導 は 見 ら れ な か っ５）Matsuda N, Horikawa M, Wang LH et al.: Differential

た（data not shown）。HaCaT に は 樹 立 化 に 伴 い p53 等

activation of ERK 1/2 and JNK in normal humanの遺伝子に変異が生じていることが知られており 、正fibroblast-like cells in response to UVC under different

常な細胞とは異なる UV-B 応答性が関与しているのか

oxygen tensions. Photochem Photobiol 72, 334-339, 2000.

もしれない。また波長依存性も存在し、IL-12 誘導能は

６）Yanase H, Ando H, Horikawa M et al.: Possible

UV-A が UV-B よ り も 高 い。 さ ら に UV-B 照 射 に よ る

involvement of ERK 1/2 in UVA-induced

immunosuppression は UV-A の共照射により抑制される

melanogenesis in cultured human epidermal

ことも報告されている 9）。以上を合わせ考えると、太陽

melanocytes. Pigment Cell Res, 14, 103-109, 2001.

8）

光紫外線の大部分を占める UV-A が、日常生活における

７）Horikawa-Miura M, Matsuda N, Yoshida M et al.:The higher lethality of UVB radiation to cultured

UV-B 防御的な働きをしている可能性もあろう。
UV を受けた表皮細胞の IL-12 の産生機構については

human cells is associated with the specific activation of

明らかではなかったが、今回の結果は、UV-B により産a DNA damage-independent signaling pathway. Radiat

生された活性酸素種が JNK1/2 経路を活性化し、その下Res, in press.

流で IL-12 遺伝子発現が制御されていることを示唆する。

８）Lehman TA, Modali R, Boukamp P et al.: p53

JNK による IL-12 産生制御に関する同様の報告は、マクmutations in human immortalized epithelial cell lines.

ロファージにおける LPS 誘導 IL-12 産生系においても見Carcinogenesis 4, 833-839, 1993.

。UV を照射され細胞内で活性化するシグナル伝

９）Reeve VE, Domanski D, Slater M: Radiation

達経路のうち、JNK1/2 経路は一般にアポトーシスに関連

sources providing increased UVA/UVB ratios induce

すると考えられてきた 5）。今回の結果と合わせ考えると、

photoprotection dependent on the UVA dose in

JNK1/2 経路はアポトーシスによる損傷細胞の排除のみな

hairless mice. Photochem Photobiol 82, 406-411, 2006.

らず、IL-12 産生を介した DNA 損傷修復によっても UV10）Utsugi M, Dobashi K, Ishizuka T et al.: c-Jun N-terminal

られる

10）

kinase negatively regulates lipopolysaccharide-induced

防御的に働いているのかもしれない。
本研究では、ヒト表皮角化細胞における UV-B 照射→IL-12 production in human macrophages: Role of

活性酸素種→ JNK1/2 → IL-12 → CPD 修復→細胞生存のmitogen-activated protein kinase in glutathione redox

一連の autocrine regulation の機構の存在を示した。今後、

regulation of IL-12 production. J Immunol 171, 628-635,

生物学的な紫外線防護法開発へのアプローチの一つとして、

2003.

この機構に変化を及ぼす薬物、因子、素材等の投与によるIL-12 産生の間接的活性化が考えられよう。

− 77 −

薬用人参の皮膚老化防止作用と育毛作用の分子メカニズム

東京医科歯科大学難治疾患研究所

古川哲史

The earliest evidence of humans’ use of herb for healing dates back to the Neanderthal period. In the late 20th
century, with concerns over the iatrogenic effects of conventional medicine and desire for more self-reliance, interestin natural health increased and use of herbal medicines again became popular. Among >20,000 herbal products thatare currently on the market, ginseng root is one of the most popular herbs. The name “ginseng” originates in the“panacea (cure-all )”, and it exhibits varieties of actions, including modulation of immune responses, antineoplastic
effects, and cardio-protection. In addition, recent data show that ginseng has beneficial effects on skin-care and hair
growth, and ginseng is widely used as a cosmetology medicine in Eastern Asia.
Steroid saponin “ginsenoside” is the major constituent of ginseng: more than 30 ginsenosides are included inginseng. In this study, we examined effects of ginsenoside Re which exerts the strongest bioactivities. Ginsenoside
Re exhibits estrogenic actions in a dose-dependent manner. Estrogen exhibits its actions by transactivation ofvarious genes, referred as a classical genomic pathway and by membrane-delimited signaling referred as a nongenomic pathway. Ginsenoside Re produces nitric oxide via the non-genomic pathway of estrogen receptor without
activation of genomic pathway. This is because ginsenoside Re has a bulky side-chain which interferes with theco-activator recruitment. Thus, ginsenoside Re is considered as non-genomic pathway specific ligand of estrogen
receptor. Since estrogen is known to increase collagen content in the skin and proliferate hair follicle cells, the roleof estrogenic actions of ginsenoside Re in skin-care and hair growth should be examined in the future study.

１．緒用があることも報告されている 7, 8）。そこで、本申請では

言

薬用人参成分の性ホルモン作用の分子メカニズムを検討しハーブの医療に対する使用の歴史はネアンデルタール人
までさかのぼる

た９）。

1, ２）

。20 世紀に入ってから近代医薬品の副２．実験と考察

作用に対する危惧や個人の健康に対する意識の高まりから、されているハーブ医薬品・ハーブサプリメントは 2 万種類

2・1 薬用人参の主成分 ginsenoside のエストロゲン様作用以上あるが、その中で薬用人参 Panax ginseng は最も人

申請者は性ホルモンであるテストステロン・エストロ

ハーブ薬品の使用頻度が再び増加傾向を示している。市販

３）

気のあるハーブ医薬品の一つである 。Panax はラテン語

ゲンが性ホルモン受容体を介する作用で、心筋のカリウの panacea（=cure-all）に由来し万能薬として使用されてムチャネルを活性化することを報告している 10-12）。そこ

おり、免疫活性化作用・抗腫瘍作用・強心作用など様々なで薬用人参の主成分 steroid saponin（=ginsenoside）の性作用を有する。最近スキンケア・育毛に効果があることがホルモン様作用の強さを、本アッセイ系を用いて検討し注目されており、東アジアを中心として広く使用されていた。薬用人参には 30 種類以上の ginsenoside の存在が知るが、そのメカニズムは充分解明されていない。

られている。現在市販されている ginsenoside は Rb1, Rc,

薬用人参の主成分は steroid saponin の ginsenoside であ

Rd, Re, Rg1 の 5 種類であり、これらに関して検討した。

り、現在では 30 種類以上の ginsenoside が含まれると考Ginsenoside は 3 位と 21 位に糖鎖のついた panaxadiol とえられている4, 5）。薬用人参は閉経期に伴う様々な症状に有効であることが知られており、中国では更年期障害の治6）療薬として処方されている 。乳がん由来細胞株 MCF-7

6 位と 21 位に糖鎖のついた panaxatriol に分類されるが、ginsenoside Rb1. Rc, Rd は panaxadiol に、ginsenoside
Re, Rg1 は panaxatriol に分類される（図１Ａ）4, 5）。

を用いた転写アッセイ実験では、人参にエストロゲン様作

これらの ginsenoside の心筋カリウムチャネル活性化の 濃 度 — 反 応 曲 線 を 取 っ て み る と 図 1B の よ う に な り、Molecular mechanism for protection
against skin aging and hair growth by
Panaex ginseng
Tetsushi Furukawa
Tokyo Medical and Dental University,
Medical research Instituteginsenoside Re が最も作用が強く、ginsenoside Rd はほと ん ど 活 性 化 作 用 を 示 さ ず、ginsenoside Rb1, Rc, Rg1
はこれらの中間の作用を示した。そこで以下の検討はginsenoside Re のみを用いて行った。

− 78 −

薬用人参の皮膚老化防止作用と育毛作用の分子メカニズム

2・2 Ginsenoside Re の性ホルモン受容体への結合
アッセイ

る性ホルモン受容体に結合し、ホルモン−受容体複合体がGinsenoside Re の性ホルモン受容体であるアンドロゲン

し転写調節を行うゲノム作用であり、これは転写−翻訳の受容体（AR）
・エストロゲン受容体（ER）
・プロゲステロ過程を経ることから数時間〜数日の時間経過で起こる反応

ン受容体（PR）への結合アッセイを competitive bindingである（図３）13）。ところが近年、数秒〜数分のゲノム作

assay を用いて行った。ジヒドロテストステロン（DHT）

用では説明できない早い経過で起こる反応が性ホルモンにの AR への結合の IC50、エストラジオール（E2）の ER へ

はあることが判明し、非ゲノム作用と呼ばれ特に末梢組織の結合の IC50、プロゲステロン（P4）の PR への結合のにおける重要性が注目を集めている 14, 15）。非ゲノム作用

IC50 は、それぞれ 2.8 nM、33.8 nM、50.0 nM であった（図２）。

は細胞膜に局在した反応であり、チロシンキナーゼ c-Src,

Ginsenoside Re も AR, ER, PR に対して濃度依存的に結合

脂質キナーゼである PI3-kinase、Ser/Thr キナーゼである

し、その IC50 はそれぞれ 59.0 µM、80.6 µM、80.6 µM と比Akt、内皮型一酸化窒素合成酵素 eNOS を介して一酸化窒

較的高濃度であった（図２）。

素 NO を産生する経路が良く知られている（図３）14, 16）。

核内へ移行し、性ホルモン応答領域を有する遺伝子に結合

まず最初に、ginsenoside Re の性ホルモンゲノム作用

２・３

Ginsenoside Re のゲノム作用の有無を検討した。アンドロゲンのゲノム作用は前立性ホルモンの古典的作用は、脂溶性の性ステロイドホル

腺ガン由来の細胞株 LNCaP の増殖で 17）、エストロゲン

モンが脂質２重層からなる細胞膜を透過し、細胞質内にあのゲノム作用な MCF7 細胞の増殖で検討されている 18）。

図１ 種々の ginsenoside とエストロゲン様作用の強さ．
A. Panaxadiol と panaxatriol の化学構造．Panaxadiol は 3 位と 21 位にインセットにある糖鎖が付き、panaxatriol は 6
位と 21 位に糖鎖が付く。
B. 心筋カリウムチャネル活性化を用いてアッセイした ginsenoside のエストロゲン様作用。Re が最も作用が強く、Rdは作用が無く、Rb1, Rc, Rg1 はこれらの中間の強さを示す。

図２ Ginsenoside Re の性ホルモン受容体への結合．
AR（パネルＡ）・ER（パネルＢ）・PR（パネルＣ）に対するそれぞれのリガンドと ginsenoside Re の結合．

− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

そこでこれらの細胞の増殖に対する作用を検討すると、

activation factor-1（AF-1）, DNA-binding domain（DBD）

ginsenoside Re はいずれも増殖作用を示さず、逆に DHT, ligand-binding domain（LBD）, activation factor-2（AF-2）

および E2 による増殖作用に対して抑制的に働いた（図４）。

の 4 つのドメイン構造を有している 20）。ゲノム経路では性ホルモンが LBD に結合するとヘリックス 12 が構造変

2・4Ginsenoside Re の非ゲノム作用化を起こすことによりコアクチベーターの結合ポケット

次に ginsenoside Re の性ホルモン非ゲノム作用の有無が生じ、コアクチベーターをリクルートする 21, 22）。一方を検討した。非ゲノム作用は Akt のリン酸化抗体を用い非ゲノム経路では LBD に性ホルモンが結合すると、AR・た Western blot 解析により Akt のリン酸化により検討し

PR ではプロリンリッチ領域の構造変化が起こり c-Src のた19）。図 5A に示すように、ginsenoside Re は濃度依存

SH-3 ドメインに結合し、ER ではリン酸化チロシン周辺の性に Akt をリン酸化した。Ginsenoside のリン酸化は AR

構造変化が起こり c-Src の SH-2 ドメインに結合し、c-Srcの 阻 害 薬 nilutamide、ER の 阻 害 薬 ICI182,780、PR の 阻の 活 性 化 を も た ら す 16）。 そ こ で、ginsenoside Re に よ

害薬 mifepristone により部分的に阻害され、nilutamide,

るコアクチベーターのリクルートの検討を、fluorescent

ICI182,780, mifepristone の同時投与によりほぼ完全に阻害

resonance energy transfer（FRET）を用いた検討によりされ（図 5B）、ginsenoside Re は AR, ER, PR それぞれの行った。コアクチベーターは L-X-X-L-L（L はロイシン、

非ゲノム経路を活性化することが示唆される。また c-Src

X はあらゆるアミノ酸）からなるモチーフが性ホルモン受の 阻 害 薬 PP2、PI3-kinase の 阻 害 薬 wortmanin、Akt の

容体コアクチベーター結合ポケットに結合する。そこで、阻害薬 SH-6 により阻害されたことから（図 5B）、
心筋カリ

東京大学大学院理学系研究科化学専攻梅澤研究室で開発さウムチャネル活性化で明らかにした、性ホルモン受容体−

れた CFP-LBD-（L-X-X-L-L）モチーフ -YFP からなる蛍

c-Src − PI3-kinase − Akt − eNOS の経路で NO を産生す

光プローブ、AR-SCCoR, ER-SCCoR, PR-SCCoR、を活用

ることが ginsenoside Re の主な作用経路であることが示した 23-25）。CFP は 440nm の光で励起され、480nm の蛍光唆された 12）。

を発し、YFP は 480 nm の光で励起され 535nm の光を発する。そこで、この蛍光プローブに 440 nm の光を当てる

2・5

コアクチベーターのリクルートに対する作用と、通常は CFP だけが励起され 480 nm の光を発生するが、以上から、ginsenoside Re は性ホルモンのゲノム経路

リガンドが結合しコアクチベーターが LBD に結合すると、は活性化せず、非ゲノム経路のみを特異的に活性化する

CFP から発生した 480 nm の光で YFP が励起され 535 nm

ことが判明した。性ホルモン受容体はアミノ末端からの光を発生する。これによりコアクチベーターのリクルー

図３ 性ホルモンのゲノム作用と非ゲノム作用．
ゲノム作用では、性ホルモンが受容体に結合し、ホルモン−受容体複合体が、コアクチベーターをリクルートし、ホル
モン応答領域を有する遺伝子に結合し転写を制御する．一方、非ゲノム作用は膜局在の受容体に結合し、c-Src を介して
MAP-kinase 経路あるいは NO 合成酵素（eNOS）を活性化する．

− 80 −

薬用人参の皮膚老化防止作用と育毛作用の分子メカニズム

トの有無を検討できる。図６にあるように、ginsenosideginsenoside がケラチノサイトにおいて紫外線によるアポRe は AR-SCCoR, ER-SCCoR, PR-SCCoR とも FRET シグ

トーシスから保護すること 27）、皮膚損傷の修復を促進す

ナルを発せず、性ホルモン受容体には結合するがコアクチ

ること 28）などが知られている。また、薬用人参がマウス

ベーターのリクルートが出来ないためにゲノム作用は示さの毛根細胞の増殖を誘導すること 29）、放射線による毛根細なかったものと考えられる。DHT, E2, P4 でもたらされる胞のアポトーシスを抑制すること 8 などが報告されている。

FRET シグナルに対しては ginsenoside Re は逆に抑制す

エストロゲンも皮膚や毛髪に対して重要な働きをすることることから、これらの阻害薬として作用することが判明しは古くから知られている。エストロゲンは皮膚のコラーゲた。

ン含量を増加させること、紫外線傷害に対して保護的に働

３．考く30）。また、産後脱毛症が知られており、妊娠中は成長期

察にある毛根細胞の割合が増え、出産後は休止期にある毛根薬用人参あるいはその主成分 ginsenoside は、多くの細胞の割合が増えることが知られている 31）。以上のような

スキンケア製品・育毛製品として市販されているが、そ

薬用人参とエストロゲン作用の類似性は、ginsenoside Reの作用メカニズムは充分解明されていない。文献的にに見られるエストロゲン様作用で説明される可能性がある。

は、薬用人参が１型コラーゲンの合成を誘導すること

26）、

今回の検討では、ginsenoside Re は性ホルモン受容体の

図４ Ginsenoside Re のゲノム作用．
性ホルモン受容体（AR・ER）のゲノム作用を、アンドロゲン感受性細胞 LNCaP とエストロゲン感受性細胞 MCF-7 の増殖に対する作用で検討．Ginsenoside Re はこれらの細胞の増殖促進せず、DHT・E2 による増殖に対して阻害した．

図５ Ginsnoside Re の非ゲノム作用．
性ホルモンの非ゲノム作用を、Akt のリン酸化で検討した．
Ａ．Ginsenoside は Akt のリン酸化を濃度依存性に増強した．
Ｂ．ICI182,780・nilutamide・mifepristone は Akt のリン酸化を部分的に抑制し、これら 3 阻害薬の同時投与はほぼ完全に抑制した．また、PP2・wortmanin・SH-6 も Akt のリン酸化をほぼ完全に抑制した．

− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

ゲノム経路は活性化せず、非ゲノム経路を選択的に活性化

謝

9）

辞

した 。これは ginsenoside Re は性ホルモン受容体に結本研究を遂行するに当たり、ご支援を頂きました（財）合することはできるが、コアクチベーターをリクルートでコスメトロジー研究振興財団及び共同研究者に深く感謝いきないためと考えられた。エストロゲン受容体のアンタゴたします。

ニストは長い側鎖を有しており、LBD に結合しても側鎖がヘリックス 12 の移動を妨げるため、コアクチベーター（文

結合ポケットを形成できないためリガンドの作用を阻害す

１）Winslow LC, Kroll DJ. Herbs as medicines. Archると考えられる。Ginsenoside Re も長い側鎖を有しており、献）Internal Med. 1998;158:2192-2199.

ドッキング実験でも ER の LBD に対する ginsenoside Re

２）Goldman P. Herbal medicines today and the roots ofの結合はヘリックス 12 の移動を妨げることが示唆されてmodern pharmacology. Ann Internal Med. 2001;135:594-

おり、ginsenoside Re が E2 による MCF-7 細胞の増殖を600.

抑制し、ER-SCCoR において E2 による FRET シグナルを

３）Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology:

抑制し、アンタゴニストとして作用することと良く一致す

multiple constituents and multiple actions. Biochem

る。今回の検討では ginsenoside Re の性ホルモン非ゲノ

Pharmacol. 1999;58:1685-1693.

ム作用が、スキンケア・育毛の作用することを示す直接の４）Kaku T, Miyata T, Uruno T, Sako I, Kinoshita

証拠は得られておらず今後の課題と考えられる。

A. Chemico-pharmacological studies on saponins of

図６ コアクチベーターリクルートアッセイ．
性ホルモン受容体のコアクチベーターリクルートを、FRET プローブ（AR-SCCoR・ER-SCCoR・PR-SCCoR）を用いて行った．
Ａ．Ginsenoside Re は AR・ER・PR いずれにおいてもコアクチベーターのリクルートを誘導しなかった。
Ｂ．E2 は ER のコアクチベーターリクルートを誘導し、ginsenoside Re はこの作用を抑制した。
Ｃ．実際の実験例。E2 により FRET シグナルが誘導されており、E2 と ginsenoside Re の同時投与では E2 による
FRET シグナル誘導が抑制されている．
Ｄ．複数例での統計的解析。Ginsenoside Re は AR・ER・PR のコアクチベーターリクルートを誘導せず、DHT・E2・P4 によるコアクチベーター誘導を抑制した。

− 82 −

薬用人参の皮膚老化防止作用と育毛作用の分子メカニズム

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コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

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− 84 −

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高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ――脂漏性角化症との関連について
筑波大学人間総合科学研究科

伴野

六町皮フ科クリニック

朋裕

Seborrheic keratoses (SK) are verrucous dark-brown nodules or elevated macules, which develop on theface and the body mainly in elderly patients. They are often multiple in seborrheic areas and show epidermal
proliferation with hyperkeratosis. Lipophilic yeasts of the genus Malassezia are members of the normal humancutaneous microflora and are also associated with several skin diseases including atopic dermatitis and seborrheic
dermatitis. We investigated the roles of genus Malassezia in SK by microflora analysis using nested PCR. Malassezia
obtusa and Malassezia slooffiae were preferentially detected in SK group. Aging and a lack of face cleansing areimportant factors in the detection rate for both species. DNA microarray analysis in normal human keratinocytes
incubated with Malassezia slooffiae for 24 hours revealed transcriptional changes toward epidermal proliferation,
keratinization, and up-regulation of lipid metabolism, which provide beneficial environments for the growth ofMalassezia spp.

１．緒

では検出率にかなりのばらつきがみられる。一方、最近、

言

杉田らによって開発されたマラセチアの rRNA 遺伝子解高齢化社会となり高齢者の美容に対する関心が高まって析による菌種同定は発育条件によらず菌相解析が可能な有いるなか、中年以降に顔面に多発する脂漏性角化症（老人意義な方法であり１）、本研究では主にこの方法を用いた。

性いぼ）は多くの人々を悩ませている。脂漏性角化症の発次に、マラセチアによってヒトの表皮細胞がどのように生には古くから紫外線の影響が言われているが、脂漏性角遺伝子発現を変化させるのか調べる目的で、DNA マイク化症は非露光部にも多発することから紫外線以外の因子もロアレイを用いてマラセチアと共培養したケラチノサイト

その発生に関与していると思われる。脂漏性角化症は黒褐の転写プロファイリングを行った。

色のいぼ状外観のため老人様顔貌の象徴ともなっているが、２．実験方法

脂漏性角化症を予防ないし治療したいと希望する高齢者は少なくない。したがって、脂漏性角化症の発生機序を明らかにすることは高齢化社会において無視できない課題であ
る。

２- １

対象と観察

顔面片側に径５㎜以上の脂漏性角化症が６個以上多発する 60 歳以上の男女のうち同意を得た方を対象とした。対最近、マラセチア（Malassezia）族がアトピー性皮膚炎

照として 60 歳以上であるが顔面に脂漏性角化症が少ないや脂漏性皮膚炎の増悪因子であることが明らかとなってき方に協力いただいた。被験者には日光暴露の有無、入浴やた１）。脂漏部位に好んで常在するマラセチア族が表皮ケラ

洗顔の頻度と方法、石鹸使用の有無などについて問診する

チノサイトに対して様々なサイトカインの分泌を誘導しとともに、写真撮影とダーマスコープによる観察を行い、皮膚炎を惹起する病態が推測されている

２, ３）。本研究では、高齢者の顔面におけるマラセチア族のフローラをタイピン

顔面以外の脂漏部位（頭皮、腋窩、臍周囲など）についても観察した。

グ（菌相解析）するとともに、特に脂漏部位において老人性色素斑が隆起しやすく脂漏性角化症が多発することに着

２- ２

マラセチアの菌相解析

目し、老人の顔面にみられる脂漏性角化症とマラセチア族

被験者の顔面頬部生え際付近からオプサイト ®( 医療の関連を調べた。マラセチア族の菌相解析は培養法が主流

用滅菌シール）貼付により皮膚表層の常在真菌を採取しであったが、マラセチア族は培養が困難でありフローラのて DNA を抽出した。現在まで知られている 11 種のマラ解析にあたっては培地など発育条件の違いのために培養法

セチアのうち動物のみに検出される M. pachydermatitisと M. nana を除く９種のマラセチアについて、rRNA 遺Malassezia microflora on the senile faceassociated with seborrheic keratoses

伝 子 の IGS（intergenic spacer） あ る い は ITS（internal

Tomohiro Banno

異的なプライマー（表１）を用いて nested PCR を行った。

Tsukuba University Graduate Schoolof Comprehensive Human Sciences,
Rokucho Skin Clinic

transcribed spacer）領域に設計した各種マラセチアに特菌株分離のためにはクロモアガーマラセチア / カンジダ生培地 ®( 関東化学）による培養と PCR による菌種同定を併用した。

− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

２- ３ 培養ヒト正常ケラチノサイトにおける転写プ
ロファイリングてデータを抽出、比較した。統計学的に有意な発現変化を示す遺伝子を選択し、分子機能により分類してプロファイ
リングした。

ヒト正常ケラチノサイトを Keratinocyte growth medium（KGM）で第３パッセージまで培養し keratinocyte basal

３．結

medium（KBM）に培地を交換した。マラセチアの菌相３- １解析により脂漏性角化症と関連がありそうな特定のマラセ

果

脂漏性角化症の観察

チア族を同定し、ケラチノサイトと共培養したものを実験症 例 群 17 名（ 平 均 年 齢 76.6±8.5）、 健 常 群 17 名（ 平群としてＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。本研究

均年齢 70.1±7.4）について調査した。長期日光暴露を受の中間報告で示したように培養ケラチノサイトは細胞密度けていた例では老人性色素斑が多発する傾向があった。こ依存性に遺伝子発現を大きく変化させる。このような培養のような症例ではしばしば老人性色素斑から脂漏性角化症にともなう遺伝子発現変化を除外するため実験群と同時進への移行像を見ることがあり、脂漏性角化症は扁平隆起性

行でケラチノサイトを単独培養したものを対照群とした。

のものが多い（図 1a）。老人性色素斑は顔面のどこにでもマラセチア感染から 24 時間後に RNA を抽出し、mRNA

生じるようであるが、脂漏性角化症は毛髪生え際付近の頬選択、cDNA 変換、cRNA 合成を経て等量の標識 RNA を部、眉毛付近、鼻のわき、外耳道など脂漏部位優位に分布

Affymetrix 社 GeneChip にハイブリダイゼーションした。

する傾向がある（図 1b）。老人性色素斑と脂漏性角化症のマラセチア感染の他は実験群と対照群ですべての条件を統区別が必ずしも容易でないものもあるが、拡大写真やダー一した。シグナルは標準化し、Data Mining Tool を用い

モスコープで確認すると脂漏性角化症は顆粒状ないし乳頭

表1

nested PCRに用いた各種 Malassezia 特異的プライマー

Species andSequence (5' → 3')

Annealing temp.（℃）

1st PCR for six Malassezia species (a)Forward
ReverseATCCTTTGCAGACGACTTGATGCTTAACTTCGGAGATCGG

55

1st PCR for three Malassezia species (b)Forward
ReverseACCTGCAGAAGGATCATTAGTGATCCTCCGCTTATTGATATG

56

M. dematis

Forward
ReverseCGCACCTTGCGCTCCATGGT
AGCCTGGTTTCCCAGGCAGCGG

58

M. furfur

Forward
ReverseTGTGTACCATAGGCACCCACCACGGTGATAAAGGGATGCA

58

M. globosa

Forward
ReverseTCGAGTGCATACCACACTCGAGTACGGTGCTTTCACGGTTCT

57

M. japonica

Forward
ReverseCGTATGTGGATCTTATCCTATTGACTAGTGTCGTAGGCACGGTA

44

M. obtusa

Forward
ReverseCATGGTCCATCTCCCACACAAGAGAGTGCGTGGCGCATGGT

60

M. restricta

Forward
ReverseCGACCTAGTCGACTACATCCTACT
TTCGGAGATACAAGCCTCCAT

55

M. slooffiae

Forward
ReverseACGCACGCTAACACAACGTG
TGTGCGATTCGAAGCGCACA

60

M. sympodialis

Forward
ReverseCGCACCTTGCGCTCCATGGTGGTACAATCCCCAGGCAGCAA

58

M. yamatoensis

Forward
ReverseCGATCAAACTTCTCTGTGTCCAG
TGTGTGGGAGGTAGAAGAGGCA

59

2nd PCR for each Malassezia species(a) M. furfur, M. globosa, M. japonica, M. obtusa, M. restricta, M.yamatoensisyamatoensis(b) M. dermatis, M.slooffiae, M.sympodialis− 86 −

高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ――脂漏性角化症との関連について

腫状に隆起しており、表面に鱗屑が付着して角化性である族との関連を想起させる。図 2e の症例は入浴の際にほとことがわかる（図 1c, d）。顔面以外について観察すると、

んど石鹸を用いないという方であるが、臍と臍周囲に脂漏

非露光部である腹部の溝に脂漏性角化症が多発する例（図性角化症が多発していた。特に臍の脂漏性角化症は油粕の2a）や代表的な脂漏部位である頭皮に脂漏性角化症が多発ような厚い鱗屑があかつき状に付着しており、ここからもする症例（図 2b）があった。腋窩付近の側胸部に脂漏性多種のマラセチアが検出された。

角化症と癜風様の紅褐色斑が共存する場合もあり（図 2c）、
この紅褐色斑を擦過すると多量の鱗屑が得られ、KOH 検

３- ２

マラセチア族の菌相解析

鏡で菌糸（後にマラセチアと同定）を確認できた（図 2d）。

マラセチアの rRNA 遺伝子について nested PCR により

図 2a 〜 c の症例はいずれも多汗ないしあぶら症と自覚し菌種同定し（図 3a）、クロモアガーマラセチア / カンジダており、脂漏性角化症の発生と汗や脂質を好むマラセチア

生培地 ®を用いた培養で各マラセチアを分離した（図 3b）。

図 1 顔面に生じた脂漏性角化症の観察
a: 長期日光暴露者に生じた脂漏性角化症 ｂ : 脂漏部位である生え際と外耳道に脂漏性角化症が多発する例 c: 脂漏性角化症の拡大像 d: ダーモスコープによる脂漏性角化症の観察

図 2 顔面以外に生じた脂漏性角化症の観察
a: 腹部の皺溝に多発する脂漏性角化症 b: 被髪頭部に多発する脂漏性角化症
c: 腋窩付近に多発する脂漏性角化症と癜風様紅褐色斑 d:
KOH 検鏡で菌糸を確認
e: 臍と臍周囲に多発する脂漏性角化症（入浴の際にほとんど石鹸を用いない例）

図 3 マラセチアフローラの菌相解析
a: PCR によるマラセチアの菌相解析 b: クロモアガーマラ
セチア / カンジダ生培地 ®を用いたマラセチアの分離培養− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

被験者のプロフィールと菌相解析の結果を表２に示す。顔養し、DNA マイクロアレイを用いて遺伝子発現をプロ面に脂漏性角化症が少ない健常群の高齢者でも複数のマ

ファイリングした。M. slooffiae 感染ケラチノサイトは細ラセチア族がフローラを形成していた。特に M. globosa、

胞周期関連遺伝子や DNA 合成に関わる遺伝子の発現を

M. sympodialis、M. dermatis は両群を通じて検出率が高一斉に増加させた。一方、細胞周期抑制性分子の発現はかった（表３）。一方、M. obtusa と M. slooffiae は症例群低下した（表４）。どちらの変化もケラチノサイトを増殖と健常群における検出率の差が顕著であった（M. obtusa、性にするものと思われる。ケラチノサイトの分化関連遺M. slooffiae とも症例群における検出率が 65％で健常群の伝子群は発現増強した（表５）。角化に関する代表的な分

3.6 倍）。年齢が高齢であるほど多種のマラセチアが検出さ化マーカーである transglutaminase 1, involucrin, loricrin,れる傾向があり、女性よりも男性に、外来患者より入院患

filaggrin は 2 倍以上の増加であったが、small proline-rich

者に多種のマラセチアが検出された。また、洗顔頻度の少protein, S100A protein, 分化関連蛋白分解酵素である各ない者、石鹸を使用しない者にマラセチアが多く検出され種 kallikrein は比較的軽度の上昇を示した。分化型ケラる傾向があった。

チンである keratin 1,10 の増加と、角化開始前の表皮基底層で主に発現する keratin 15 の減少もマラセチアと共

３- ３ DNAマイクロアレイを用いた転写プロファイリング

培養したケラチノサイトが分化傾向を示すことを意味す

M. slooffiae とヒト正常ケラチノサイトを 24 時間共培る。また、主に基底層のケラチノサイトが産生するコラー

表2

被験者のプロフィールとマラセチア菌相解析結果

No.

年齢 性

区分

洗顔

石鹸

SL

SK

G Sy D

R

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
12
13
14
15
16
17

70
73
65
75
81
76
72
71
84
79
69
75
93
86
91
63
79

M
M
M
M
F
M
M
M
M
F
M
F
M
F
M
F
M

外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
入院
入院
入院
入院
入院
入院

毎日
稀
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
稀
毎日
毎日
毎日
2/週
2/週
2/週
2/週
2/週
2/週

不使用
不使用
使用
不使用
不使用
使用
使用
不使用
使用
不使用
不使用
不使用
不使用
不使用
不使用
不使用
不使用

多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
少
少
多
多
多
多
多

多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多
多

●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●

●

18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

66
65
65
62
63
73
74
68
66
72
62
64
76
68
83
77
87

F
M
M
M
F
F
F
F
F
M
M
F
M
M
M
F
F

外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
外来
入院
入院
入院

毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
毎日
2/週
2/週
2/週

使用
使用
使用
使用
使用
不使用
使用
使用
使用
不使用
使用
使用
不使用
使用
不使用
不使用
不使用

少
少
少
少
少
少
多
多
少
少
少
少
少
少
少
少
少

少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少
少

●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●

● ●
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● ●
●
● ●
● ●
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●
● ●
● ●
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● ●
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● ●

●
●
●
●
●

Y

F

J

O

Sl

●
●

●
● ●

●
●
●
● ● ●
●
●

●
●

● ●
●
●

●

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● ●
● ●
● ●
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● ●
● ● ●
● ●
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● ●
●
●
●
● ● ●
● ● ●
●
●
●
●
●
● ●
●
● ●
● ●
●
●
● ●
●

備考
日光
SD

日光

SD

日光

SD

SL：Senile Lentigo（老人性色素斑），SK：Seborrheric Keratosis（脂漏性角化症），
SD：Seborrheric dermatitis（脂漏性皮膚炎）
日光：長期日光暴露歴あり
Ｇ：M. globasa, Sy：M. sympodialis, D：M. dermatis, R：M. restricta, Y：M. yamatoensis, F：M. furfur,
Ｊ：M. Japonica，O：M. obtusa, SI：M. slooffiae● : 検出− 88 −

高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ

表３――脂漏性角化症との関連について

脂漏性角化症群と健常群における各種Malassezia族の検出率
SpeciesM. dermatis
M. furfur
M. globosa
M. japonica
M. obtusa
M. restricta
M. slooffiae
M. sympodialis
M. yamatoensis

Detection (%)
SK
HS
82
35
100
12
65
47
65
94
18

71
18
100
12
18
41
18
71
12

SK：脂漏性角化症群（症例群）
HS：健常群

表4

細胞周期関連分子の遺伝子発現変化

SymbolGene

SignalS.L.R. Change Function

CCNA1
CCNA2
CCNB1
CCNB2
CDC2
CDC20
CDC25B
CDC2L1CDKN3CENPADEEPEST
G0S2
GTSE1
KIAA0165
KIF13B
MAD2L1MPHOSPH6
KATNB1
PLK
BUB1
BUB1B
AMPD3
DNASE1L3
RRM2
UP
H1F0
H2AFL
H2AFO
H2BFQ
CDKN2BGAS1
GAS6
GADD45B
RAB27B
RAB9
SSPN
NDRG1
NDRG2
NOTCH2
NOTCH3cyclin A1
cyclin A2
cyclin B1
cyclin B2cell division cycle 2
CDC20
541
cell division cycle 25B
cell division cycle 2-like 1
cyclin-dependent kinase inhibitor 3
centromere protein A
mitotic spindle coiled-coil related protein
putative lymphocyte G0/G1 switch geneG-2 and S-phase expressed 1
extra spindle poles
kinesin family member 13B
MAD2 like 1
M-phase phosphoprotein 6katanin p80 subunit B 1
polo (Drosophia)-like kinase
BUB1
BUB1B
adenosine monophosphate deaminase 3
deoxyribonuclease I-like 3
ribonucleotide reductase M2 polypeptide
uridine phosphorylase
H1 histone family, member 0
H2A histone family, member L
H2A histone family, member O
H2B histone family, member Q
cyclin-dependent kinase inhibitor 2B
growth arrest-specific 1
growth arrest-specific 6
growth arrest and DNA-damage-inducible
RAB27B, member RAS oncogene family
RAB9, member RAS oncogene family
sarcospan (Kras oncogene-associated)
N-myc downstream regulated
N-myc downstream-regulated gene 2
Notch (Drosophila) homolog 2
Notch (Drosophila) homolog 3

136
202
1305
697
788

0.8
0.6
0.7
0.6
0.5
0.5
0.7
0.5
0.5
0.5
0.6
1.2
0.5
0.6
1
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.7
0.8
0.6
0.8
0.5
0.7
0.6
0.5
-0.5
-0.5
-0.5
-0.6
1.1
0.6
0.7
0.7
0.9
0.5
0.7

S. L. R : Signal Log Ratio, Log（Log2）比− 89 −

412
461
393
349
176
365
62
136
58
604
1218
663
177
257
275
392
115
911
226
811
138
2580
343
253
228
796
317
72
867
80
3093
233
332
319

Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Dn
Dn
Dn
Dn
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up

Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
Cell cycle
DNA synthesis
DNA synthesis
DNA synthesis
DNA synthesis
HistoneHistoneHistoneHistoneCell cycle inhibitor
Cell cycle inhibitor
Cell cycle inhibitor
Cell cycle inhibitor
Ras pathway
Ras pathway
Ras pathway
Myc pathway
Myc pathway
Notch pathway
Notch pathwayコスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

表５

ケラチノサイト分化関連分子の遺伝子発現変化

SymbolGene

SignalS.L.R.

Change

TGM1
IVL
LOR
FLG
KLK7
KLK8
KLK10
KLK11
CDSN
ANXA9
ARS
SPRK
S100A4
S100A7
S100A8S100A9
SCEL
KRT1
KRT10
KRT15
COL4A1
COL4A2
COL5A1
COL5A2
P4HA2
PLOD2
CSPG4
EFEMP1
MATN2
SDC2
DSC1
DSG1
ALOX12B
ALOX15B
PTGS2
PLA2G4AUGCG
AKR1C1
AKR1C3
HSD17B2
SULT2B1
GCH1
PPT2

transglutaminase 1
involucrin
loricrinfilaggrin
kallikrein 7
kallikrein 8
kallikrein 10
kallikrein 11
corneodesmosin
annexin A9
ARS component B
Small proline-rich protein SPRK
S100 calcium-binding protein A4
S100 calcium-binding protein A7
S100 calcium-binding protein A8
S100 calcium-binding protein A9
sciellin
keratin 1
keratin 10
keratin 15
collagen, type IV, alpha 1
collagen, type IV, alpha 2collagen, type V, alpha 1
collagen, type V, alpha 2
procollagen-proline
procollagen-lysine
chondroitin sulfate proteoglycan 4
EFEMP1matrilin 2
syndecan 2
desmocollin 1
desmoglein 1
arachidonate 12-lipoxygenasearachidonate 15-lipoxygenase
prostaglandin-endoperoxide synthase 2
phospholipase A2, group IVA
UDP-glucose ceramide glucosyltransferase
aldo-keto reductase family 1C1
aldo-keto reductase family 1C3hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2
sulfotransferase family
GTP cyclohydrolase 1
palmitoyl-protein thioesterase 2

214
622
153
497
732
664
3174
488
355
56
161
10986
278
564
12728
6634
186
3338
4898
823
862
1517
305
418
1925
391
62
819
312
52
2101
2185
170
178
474
520
872
3144
758
105
361
354
129

1.2
1.3
2.2
2.9
0.9
0.6
1
1
2
1.9
1.7
0.5
0.6
4.6
0.7
1.8
0.7
1.2
0.6
-0.5
-0.8
-0.5
-0.6
-0.5
-0.5
-0.5
-0.5
-0.5
-0.7
-0.5
0.8
0.6
1.7
1.7
0.5
0.5
0.7
0.6
1.3
2
1.1
0.5
0.7

Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up

− 90 −

Function
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
Cornification
keratinkeratinkeratin
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
ECM
Desmosomal
Desmosomal
Prostaglandin pathway
Prostaglandin pathway
Prostaglandin pathway
Prostaglandin pathway
Lipid metabolism
Lipid metabolism
Lipid metabolism
Lipid metabolism
Lipid metabolism
Lipid metabolism
Lipid metabolism

高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ――脂漏性角化症との関連についてゲンなどの細胞外マトリックスの遺伝子発現はいっせい

M. slooffiae ないし M. obtusa が検出される率が高く、そに低下した。このこともケラチノサイトが basaltype からの要因を検討していくうちにこのふたつの菌種については、

supurabasal type にシフトしていることを示唆する。脂質

年齢、洗顔の頻度、石鹸使用の有無が特に重要な因子であ代謝に関する遺伝子群は発現増強した（表５）。特に角化ることも示唆された。つまり顔面に両菌種が検出されるのにともなう細胞間脂質の産生に関連した分子の発現増加がはほとんどが 70 歳以上であり、洗顔の頻度が低く、洗顔特徴的である。各種ケモカインや炎症性サイトカインであの際に石鹸を用いない場合が多い。すでに報告されている

る interleukin1 や TNFα、マラセチアの菌相解析では主に若年から中年を対象にしておよび interferon 関連遺伝子の発現は増加した（表６）。

おり、実験系が異なるので本研究結果と一概に比較できな

一方、ケラチノサイトの増殖抑制作用を有する TGFβ のいが、高齢者の方がより多種類のマラセチアが検出される発現は低下した。

印象がある。本研究の被験者においても年齢が高いほど

４．考

多種のマラセチアがフローラを形成する傾向があった。特察に 91 歳の男性入院患者では、検索した全９種のマラセチ

脂漏性角化症が多発している高齢者からは M. slooffiae

アのうち８種が検出された。高齢になるにつれ顔面の脂腺と M. obtusa が検出されることが多く、疾患との関連が示の活動が活発になることも一因かもしれない。このように唆された。しかし、対照群にあっても入院患者の場合は

年齢は顔面におけるマラセチアのフローラにおいて重要な

表6

サイトカイン関連分子の遺伝子発現変化

SymbolGene

SignalS.L.R.

Change

CCL27
CXCL1
CXCL2
CXCL10CXCL11
IL8
IL1A
IL1B
TNF
CSF2
DEFB1
EFNA3
EREG
ST16
IL1R2
IL1RN
IFNGR1
CTGF
NRG1
EGF
IGFBP3
IGFBP4TGFB2LGALS9NESP55
SPARC
IL7R
OAS1
OASL
IFI30
IFIT4

CTACK/ILC
GRO α oncogene
GRO β oncogene
IP-10
I-TAC
interleukin 8，CXCL8interleukin 1, alphainterleukin 1, beta
tumor necrosis factor
colony stimulating factor 2
defensin beta 1
ephrin-A3
epiregulin
suppression of tumorigenicity 16
interleukin 1 receptor, type IIinterleukin 1 receptor antagonist
interferon gamma receptor 1
connective tissue growth factor
neuregulin 1
epidermal growth factor
insulin-like growth factor binding protein 3
insulin-like growth factor-binding protein 4transforming growth factor, beta 2lectin, galactoside-binding, soluble 9
neuroendocrine secretory protein 55
secreted protein, acidic, cysteine-richinterleukin 7 receptor
2',5'-oligoadenylate synthetase 12'-5'oligoadenylate synthetase-likeinterferon, gamma-inducible protein 30
interferon-induced protein

79
739
90
485
86
287
2603
1250
95
138
536
120
134
218
318
2390
1925
770
170
65
245
206
92
58
97
776
123
368
73
559
233

1.6
0.9
1.1
1.2
1.3
1
1.3
2.7
1.2
0.5
1.5
0.6
1.6
1.2
1.6
1.3
0.5
-1.2
-0.6
-1.1
-0.6
-0.5
-0.6
-0.6
-0.8
-0.5
-1
0.6
0.5
0.6
0.9

Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Up
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Dn
Up
Up
Up
Up

S. L. R : Signal Log Ratio, Log（Log2）比− 91 −

Function
Secreted, Chemokine
Secreted, Chemokine
Secreted, Chemokine
Secreted, Chemokine
Secreted, Chemokine
Secreted, Chemokine
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Receptor
Receptor
Receptor
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Secreted
Receptor
Interferon regulatedInterferon regulatedInterferon-regulatedInterferon-regulatedコスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

因子と思われるが、高齢であるほど洗顔の頻度が減って石チノサイトが角化を伴う腫瘍性増殖を示していくことがあ鹸を用いなくなる傾向があり、顔面がより脂漏性となりやるかもしれない。つまり洗浄不足により M. slooffiae がフすいだろう。このような年齢に伴う生活様式の変化も大き

ローラの優位菌種となり、その状態が数ヶ月から数年にわな要因と考えられる。今回調査対象にした入院施設は慢性たって持続すれば脂漏性角化症の発生に結びつく可能性が疾患や認知症を有する高齢者をケアする施設であり、清潔ある。実際、長期間入浴しないことで生じるあかつき病で維持のために入浴ではなく週に２回の清拭が行われていは表皮が肥厚し脂漏性の厚い痂皮が付着するが、あかつき

た。顔面の清拭には石鹸を使用しないとのことである。高病の肥厚した角層からは M. slooffiae が検出される６）。ケ

齢者が顔面清潔保持に無頓着になる傾向は女性よりも男性

モカインや炎症性サイトカインの発現誘導は比較的軽度でに顕著であるが、認知症を有する場合は男女を問わず清潔あったが、このことはマラセチアが皮膚に恒常的にフロー保持は介護者に大きく依存するようになる。今回、入院患

ラを形成していく上で都合がよいだろう。あまりに強い炎者から多種のマラセチアが検出されたのはそのような背景症が起これば、棲家である組織が壊死してしまうか炎症にがあるのかもしれない。本研究で脂漏性角化症との関連が

よって微生物が短期間のうちに排除されてしまう可能性疑われた M. slooffiae と M. obtusa についても高齢化にとが高くなるからである。炎症性サイトカインである IL-1,

もなう脂腺の活動亢進や石鹸を用いた洗浄の欠如により増TNFα, IFNγ は免疫応答の惹起のみならずケラチノサイト

加してくるものと考えられる。これら２菌種はおそらく脂において多様な遺伝子変化を生じさせる７, ８）。IL-1 は増殖

質要求性が他のマラセチア菌種より高いのであろう。本研

性のサイトカインであり、ケラチノサイトの増殖にも関与

究ではまだ充分に検討していないが、中年ないし若年者にするだろう。一方、TNFα は炎症惹起とともにケラチノ

おいても何らかの理由で長期間入浴ができない場合や、入サイトの置かれた状況に応じて分化ないし細胞死のための浴しても石鹸を全く使用しない場合は、これら２菌種が通遺伝子発現を準備する８, ９）。M. slooffiae に感染したケラチ

常より高頻度で検出されるようである。また、脂漏部位のノサイトは細胞間脂質に関連する脂質代謝分子の発現を亢

うち石鹸洗浄する機会の少ない外耳道からはしばしば M.

進させた。ケラチノサイトは角化に伴いオドラント小体由

slooffiae が検出される。

来の細胞間脂質を分泌して結果的に角層間に高密度の脂質

本研究で採用した nested PCR を用いた菌相解析はあくを含ませる。したがって、脂質要求性の高いマラセチア族

までも定性的なものであり、菌量を反映するものではない。

にとっては、脂質を豊富に含む角層は格好の棲家となろう。

そこで M. slooffiae と M. obtusa が検出された症例のうち

M. slooffiae はケラチノサイトの遺伝子発現変化を介して２例についてクロモアガーマラセチア培地上のコロニーを表皮増殖、角化、脂質代謝のすべてを亢進させることで自それぞれ任意に 10 個選択して PCR 法にて菌種の同定したらの成育環境を有利に導いているのかもしれない。

ところ、約８割が M. slooffiae であり、計 20 個のコロニ

本研究では脂漏性角化症と M. slooffiae および M. obtusa

ーのなかには M. obtusa はひとつもなかった。このことはの関連が示唆されたが、これら 2 菌種の出現には年齢、性M. obtusa より M. slooffiae が定量的に圧倒的に多いこと

別、洗顔頻度と方法、入院外来の区分など多数の因子が関を意味する。以上の結果から、DNA マイクロアレイによ係しており、マラセチアの存在が必ずしも脂漏性角化症のる解析には M. slooffiae を選択した。DNA マイクロアレ発生に直接結びつくものではないのかもしれない。脂漏イによる転写プロファイリングの結果は、M. slooffiae と性角化症のように脂漏性の厚い角質を有する状態では M.

共培養したケラチノサイトが増殖と分化の両方に向かうこ

slooffiae および M. obtusa が生育しやすいということもあとを示唆している。正常の表皮においては基底層のケラチるだろう。つまり二次的に両菌が脂漏性角化症に生着した

ノサイトは増殖性であるが、有棘層から顆粒層へかけてケ可能性もある。微生物が病原菌であることを証明するには

ラチノサイトが増殖を停止し分化を開始するとともに遺伝「コッホの原則」を満たさなければならない。もっと症例

子発現も大きく変化する４, ５）。したがって、増殖と分化は数を増やして多変量解析を行うとともに、人工表皮や実験

表皮内の各層に特異的な個別の現象であるが、乾癬に代表動物などへの接種実験も行って菌と脂漏性角化症の因果関される炎症性角化症の表皮や今回調査対象にした脂漏性係を確かめる必要がある。また、菌種の同定だけでなくリ角化症では増殖と分化がともに亢進していることが知られアルタイム PCR などによる定量的解析も必要である。最ている。ただし、今回得られた発現変化は M. slooffiae と近、杉田らはアトピー性皮膚炎におけるマラセチア菌相の

ケラチノサイトを共培養してから 24 時間後のものであり、詳細な遺伝子解析を行い、同一菌種でも遺伝子形の違いに

実際に M. slooffiae に感染した表皮が長期的にどのようなより病原性を示す場合があるという機序を提唱している変化を示すのかは不明である。また、増殖関連や角化関連

10）分子の発現変化は比較的軽度であった。しかし、軽微な変かもしれない。今回は主に露光部である顔面についてマラ化であってもそれが長期にわたって持続した場合はケラ

セチア族の菌相解析を行ったが、紫外線の影響を除外する。本研究においても同様の遺伝子形に関する解析が必要− 92 −

高齢者顔面における常在真菌マラセチアのフローラ――脂漏性角化症との関連についてためには非露光部における解析も必要と思われる。腋窩な

profiling of epidermal differentiation. Physiol Genomics.

どの非露光部に脂漏性角化症が多発する症例をしばしば経

27 (1) : 65-78, 2006

験するのでそのような症例にも同様の解析を行っていきた

５）Gazel A, Banno T, Walsh R, et al. Inhibition of JNK
promotes differentiation of epidermal keratinocytes. J

い。

Biol Chem. 281 (29) : 20530-41, 2006

謝辞６）Tajima M, Amaya M, Sugita T,et al. Molecular

PCR 法によるマラセチア菌相解析について技術的な指導をしていただいた明治薬科大学微生物学教室の杉田隆博
士に深謝いたします。共同研究者である筑波大学人間総合

analysis of Malassezia species isolated from three casesof Akatsuki disease (pomade crust)

Nippon Ishinkin

Gakkai Zasshi. 46 (3) : 193-6, 2005

科学研究科の佐藤寛子氏と本研究に対して終始ご支援いた７）Banno T, Adachi M, Mukkamala L, et al. Unique

だいたコスメトロジー研究振興財団に感謝いたします。

keratinocyte-specific effects of interferon-gammathat protect skin from viruses, identified using（参考文献）

transcriptional profiling.

Antivir Ther. 8 : 541-54, 2003

１）Sugita T, Suto H, Unno T, e｢ al. Molecular analysis of８）Banno T, Gazel A, Blumenberg M. Effects ofMalassezia microflora on the skin of atopic dermatitis

tumor necrosis factor-alpha (TNF alpha) in epidermal

patients and healthy subjects.

keratinocytes revealed using global transcriptional

J Clin Microbiol. 39 (10)profiling.

: 3486-90, 2001

J Biol Chem. 279 (31) : 32633-42, 2004

２）Watanabe S, Kano R, Sato H, et al. The effects of９）Banno T, Gazel A, Blumenberg M. Pathway-specific

Malassezia yeasts on cytokine production by humanprofiling identifies the NF-kappa B-dependent tumor

keratinocytes.

necrosis factor alpha-regulated genes in epidermal

J Invest Dermatol. 116 (5) : 769-73, 2001

３）Ishibashi Y, Sugita T, Nishikawa A. Cytokine
secretion profile of human keratinocytes exposed toMalassezia yeasts.

FEMS Immunol Med Microbiol. 48

keratinocytes.

J Biol Chem. 280 (19) : 18973-80, 2005

10）Sugita T, Tajima M, Amaya M, et al. Genotype
analysis of Malassezia restricta as the major cutaneous
flora in patients with atopic dermatitis and healthy(3) : 400-9, 2006
４）Radoja N, Gazel A, Banno T, et al. Transcriptional

subjects.

− 93 −

Microbiol Immunol. 48 (10) : 755-9. 2004

皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析

星薬科大学薬学部臨床化学教室

輪千浩史

Elastin（ELN）is an insoluble extracellular matrix protein and the core protein of the elastic fibers that provide
elasticity to elastic tissues such as arterial, lungs, skin and ligaments. It is secreted from cells as a soluble protein of
approximately 70-kDa referred to the extracellular space as tropoelastin.
The purpose of this study was to investigate the elastic fiber assembly in human skin fibroblast cells on twoor three-dimensional culture. We demonstrated elastic fiber assembly on the neonatal normal human dermal
fibroblast cells（NHDF-Neo）or the adult normal human dermal fibroblast cells（NHDF-Ad）Immunofluorescencestaining showed that NHDF-Ad is difficult to make elastic fiber in contrast to NHDF-Neo in two-dimensional culture
resulting from the activity of tropoelastin degradation is high. Furthermore, the formation of cross-linking aminoacid in NHDF-neo significantly increased by the addition of recombinant human tropoelastin（HTE）. On the other
hand, it was not able to observe the elastic fiber assembly on NHDF-Neo in three-dimensional culture. In addition, it
revealed the gel greater contraction in the presence of HTE.
Taken together, these observations contributed to the clarification of mechanisms of elastic fiber assembly on
the dermal fibroblast cells in two- or three-dimensional culture.

１．緒は、ほとんど報告されていない。近年、網膜上皮色素細胞

言（Pigmented Epithelial cells: PE 細胞）がエラスチンを産

皮膚は表皮・真皮・皮下組織から構成されている。真皮

生せずマイクロフィブリルやリジルオキシダーゼを産生しは、厚い層で毛細血管、皮脂腺、汗腺など大切な付属器官ている細胞にエラスチン遺伝子を導入の導入や組換えトロがあるが、組織の大部分は膠原繊維（コラーゲン）や弾性

ポエラスチンの添加により、エラスチン線維を免疫蛍光染

繊維、その他の細胞外マトリックスで構成されている。膠色で確認すると共に、エラスチン線維固有の架橋アミノ酸

原繊維や弾性繊維は真皮の中に分散している繊維芽細胞かであるデスモシンの形成もアミノ酸分析により明らかとなら作られ、肌の張りと弾力のもとであるばかりでなく、皮った 1-3）。そこで、本研究では、組換えトロポエラスチン

膚の運動にも大きく関わっている。特に、エラスチンは皮を皮膚繊維芽細胞に処理し、2 次元培養におけるエラスチ

膚、血管、肺などの組織や臓器に存在し、弾性力の源としン繊維形成に対する加齢の影響と 3 次元培養におけるトロて重要な機能を果たしている。皮膚は身体の表面を被ってポエラスチンの役割について検討した。

おり、常に外的刺激にさらされている。したがって、老化

２．実に伴い皮膚にたるみやしわが増加する。このような加齢による皮膚の変化が見られる時は弾性繊維の変化が著しいと２･ １考えられている。

験

抗体と試薬抗体に関しては anti fibrillin-1 polyclonal antibody, anti

エラスチンは、前駆体である可溶性トロポエラスチン

His-G monoclonal antibody は Invitrogen（Carlsbad,として細胞外に分泌された後、トロポエラスチン分子の自USA）から、anti tropoelastin monoclonal antibody（MAB2503）

己集合、フィブリリン−１やフィブリン−５と呼ばれる糖は Chemicon International, Inc.（Temecula, USA）から、Alexa

タンパク質との分子間相互作用、銅を補酵素とする Lysyl

Fluor 546 goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 goat anti-oxidase による分子内または分子間架橋形成の過程を経て

mouse IgG は Molecular Probes（Eugene, USA）から HRP

不溶性のエラスチン繊維になると考えられている。トロポ

conjugated anti mouse IgG antibody は Amersham

エラスチン遺伝子発現については様々な研究が報告されて（Buckinghamshire, UK）から購入した。試薬に関しては、コ

いるが、エラスチン繊維形成における加齢の影響について

ラーゲンゲル培養キットは新田ゼラチンより、Human TGF-β1
は和光純薬より、Protease inhibitor cocktail tablets は Roche

Analysis of elastic fiber formation andthe cell functions of tropoelastin on theskin.
Hiroshi Wachi
Department of Clinical Chemistry, Hoshi
University School of Pharmacy andPharmaceutical Sciences.

Diagnostics K. K.（Japan）より購入した。

２･ ２

細胞培養

正常ヒト新生児皮膚細胞（NHDF-Neo）および正常ヒト成人皮膚細胞（NHDF-Ad）はタカラバイオより購入した。2 次元培養は、NHDF-Neo および NHDF-Ad を FBS− 94 −

皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析（Biowest）、L-glutamine、Penicillin-Streptomycin、MEM

２･ ７

Non-Essential Amino Acids、Sodium pyruvate（Gibco）
を含む 10% FBS-DMEM 培地で培養した。3 次元培養は、エラスチカ・ワンギーソン染色

３次元培養したゲルをマイルドホルムで固定後、パラフィン置換し切片を作製した。

NHDF-Neo を コ ラ ー ゲ ン ゲ ル に 包 埋 し、10% dialyzed-

脱パラフィン後、ヘマトキシリン液と塩化鉄液、ヨウ化

FBS DMEM で培養した。また、N 末端に 6×His が付加

カリウム液、滅菌精製水を 20：3：8：5 で混合した溶液をした大腸菌組換えヒトトロポエラスチン（HTE）は前報

切片に添加した。滅菌精製水で洗い塩化鉄液と滅菌精製水

1）にしたがって作製したものを用いた 。

を 3：37 の割合で混合した溶液を切片に添加し分別し、ワンギーソン液を添加後、脱水し乾燥して封入した。

２･ ３

蛍光免疫染色３．結

4% Paraformaldehyde で固定した後、Block Ace
（Roche）

果

抗体（モノクローナル抗体）、
または抗エラスチン抗体（ポ３･ １ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン繊維形成

リクローナル抗体）、V5-tag に対する V5 抗体（モノクロ

NEDF-Neo お よ び NHDF-Ad の HTE の 未 添 加、 添

ーナル抗体）、および Fibrillin-1 に対する抗 Fibrillin-1 抗

加 に よ る エ ラ ス チ ン 繊 維 形 成 を、 抗 Elastin 抗 体 と 抗体（ポリクローナル）で処理し、Alexa Fluor 546 goat

Fibrillin-1 抗体を用いて蛍光免疫染色で確認した。HTE

anti-rabbit IgG と Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG

未添加の場合、NHDF-Neo ではエラスチン繊維を確認すで処理し、蛍光位相差顕微鏡にて観察した。

ることができたが、NHDF-Ad ではエラスチン繊維をほとでブロッキングした細胞に、エラスチンに対する MAB2503

んど確認することができなかった。しかし、NHDF-Ad に２･ ４ RNA 抽出と reverse transcriptase-polymerase
chain reaction（RT-PCR）

HTE を添加することでエラスチン繊維の確認できた（図１）。また、NHDF-Neo において HTE を添加することで、

４）

全 RNA は AGPC 法 で 抽 出 し た 。RT-PCR は、 １µg/10µℓ の全 RNA に 10 mM dNTP、Oligo dT をそれぞれ

A

NHDF-NeoNHDF-Ad

NHDF-NeoNHDF-Ad１µℓ ずつ加えたものを 65℃で５分間 熱変性後、氷上で５分間冷却した。その後、これに 5×1st Strand buffer 4µℓ、

Elastin

100 mM DTT 2µℓ、RNase Inhibitor 1µℓ を加えた。２分
間 37℃でプレインキュベートし、Reverse Transcriptase（M-MLV）を 1µℓ 加えて cDNA を合成し、各遺伝子に特異的なプライマーを用いて遺伝子を増幅した。

２･ ５

ウェスタンブロッティング

Fibrillin-1

培 養 上 清 を 30% 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム で 塩 析 し た 後、
Laemmli sample buffer（1% SDS、5% glycerol、0.01%
BPB、0.1 M DTT 含有 0.01M Tris-HCl pH7.4）を加えて溶解したものをサンプルとした。サンプルを 7.5% ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。ニトロセルロース膜

Bに転写した後、５% スキムミルク含有の T-TBS（50mM
Tris-HCl、pH 8.0、0.9% NaCl、0.05% Tween 20） で 処

Elastin理 し た。 次 に、 抗 His-G 抗 体 で 処 理 し、ECLTM キ ッ ト（Amersham, Buckinghamshire, UK）で検出した。

２･ ６

架橋アミノ酸定量

培養細胞を剥離した後、6N 塩酸で 110℃、18 時間加水
Fibrillin-1分解した。加水分解物を乾燥後、精製水に溶解し架橋アミノ酸測定試料とした。この資料中の架橋アミノ酸量は、テ
キサス大学 Starcher 博士に依頼し、前方に従ってラジオ
イムノアッセイ５）によって測定した。

図１ NHDF-NeoとNHDF-AdにおけるHTE未添加（A）、添加（B）
によるエラスチンおよびフィブリリン１の蛍光免疫染色− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

内因性と外因性のエラスチン繊維が確認でき、エラスチン

した HTE が、培養上背中でどの程度分解されるかを検討

繊維の指標である架橋アミノ酸の有意な増加も認められた。

するため、HTE 添加後、経時的に培養上清を回収し、添尚、エラスチンの足場タンパク質の一つであるフィブリリ

加した HTE のみを検出するため、抗 His-G 抗体を用いてン -1 繊維に大きな変化は認められなかった。
（図２）。

ウェスタンブロット法にて解析した。NHDF-Neo では培
養時間による分解はみられませんでしたが、NHDF-Ad で３･ ２ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン繊維形成関連タンパク質の遺伝子
発現は HTE 添加後 48 時間で☆トロポエラスチンの顕著な低下が認められた。そして、この低下はプロテアーゼ阻害剤の存在下で認められなかった（図４）。

加齢によるエラスチン繊維形成能が低下する原因を検討するため、NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン関連タンパク質の遺伝子発現を RT-PCR

３･ ４ NHDF-Neo の 3 次元培養におけるエラスチン
繊維形成法にて確認した。エラスチン繊維の足場タンパク質として３次元培養における皮膚繊維芽細胞のエラスチン繊維

重要なフィブリリン−１やフィブリン−５、架橋形成に重形成について、２次元培養でエラスチン繊維形成できる

要なリジルオキシダーゼと各遺伝子発現に大きな変化は見

NHDF-Neo を用いて検討した。２次元培養と同様に３次られなかった（図３）。

元培養の NHDF-Neo に HTE を添加後、切片をエラスチカ・
ワンギーソン染色した。その結果、HTE（20µg/㎖）およ３･ ３ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養における添加 HTE の分解活性び TGF-β（10ng/㎖）の添加に関わらず、エラスチン繊維は確認できなかった（図５）。

次に、NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養添加

図２ NHDF-Neo の HTE 添加における架橋アミノ酸、Mean±S.E.
（n=3）、* P<0.05、** P<0.01 （vs. non-treatment, Student’st-test）

図３ NHDF-Neo と NHDF-Ad におけるエラスチン
関連遺伝子発現図４ NHDF-Neo （A）と NHDF-Ad （B）におけるトロポエラ
スチンの分解PI: プロテアーゼインヒビター− 96 −

皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析

３･ ５ NHDF-Neo の３次元培養におけるエラスチン
関連タンパク質の遺伝子発現

４．考察

３次元培養でのエラスチン繊維形成が確認できない原因

弾性繊維は、皮膚や肺、動脈、靭帯などの軟部組織にを検討するため、２次元培養と３次元培養におけるエラス

おいて、弾性の保持に大きく寄与しており、この組織のチン関連タンパク質の mRNA 発現について比較した。そ破綻は、様々な障害や病変を引き起こすことが知られていの結果、３次元培養は、２次元培養と比較して各 mRNAる。弾性繊維は、複数の成分が集合、結合している“機能発現の低下が認められた（図６）。

複合体”であり、その“コア”となる成分のエラスチンと
エラスチンとのネットワークを形成する微細繊維（マイク３･ ６ NHDF-Neo の３次元培養におけるトロポエラ
スチンの細胞活性作用

ロフィブリル繊維 ; フィブリリンや microfibril-associated

さらに、３次元培養の NHDF-Neo に対するトロポエラ

いる。近年、エラスチンノックアウトマウスにおいて大動

スチンの役割を検討するため、コラーゲンゲル収縮を指標

脈では内皮傷害が引き起こされることなく内膜肥厚が起ことした細胞活性を測定した。コラーゲンゲルの中に HTEり、生まれて間もなく死亡することが報告された６）。このが存在することでゲルの収縮が増強することが認められたことより、エラスチンが生命の維持にとって必須のタンパ（図７）。

ク質であることが証明された。また先天性のエラスチン遺

図５

glycoprotein、フィブリンなどから成る）から構成されて3 次元培養のエラスチカ・ワンギーソン染色

図７ コラーゲンゲル収縮における HTE の影響。
A：写真観察 B：収縮したゲルの直径

図６ NHDF-Neo の 2 次元培養と 3 次元培養におけるエラスチン関連遺伝子発現− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

伝子異常疾患として大動脈弁上狭窄症（SVAS）７）や皮膚でなく、HTE の生体応用とより生体に近いエラスチン繊

弛緩症（Cutis laxa） が知られており、SVAS ではエラス

維を含む３次元皮膚モデルの確立に大きく寄与するものとチン繊維の断片化を伴う動脈平滑筋細胞の異常増殖により

考える。

８）

冠動脈の狭窄が起こり、さらに Cutis laxa でもエラスチン
繊維の断片化が原因となり皮膚の過伸展が引き起こされる（引用文献）

ことが報告されている。これらの報告からエラスチン繊維

１）Wachi, H., Sato, F., Murata, H., Nakazawa, J.,形成不全が血管や皮膚における疾患の重要な病因を担ってStarcher, B. C. and Seyama, Y. (2005) Development of aいると思われる。

new in vitro model of elastic fiber assembly in human

筆者らは、２次元培養において、内因性のトロポエラス

pigmented epithelial cells, Clin Biochem, 38, 643-653.

チンを発現していないヒト網膜色素上皮由来細胞に、外因

２）Kozel, B. A., Wachi, H., Davis, E. C. and Mecham, R.

性のトロポエラスチンを添加しエラスチン繊維を再構築す

P. (2003) Domains in tropoelastin that mediate elastin

る新たなエラスチン繊維構築モデルを確立した。本研究にdeposition in vitro and in vivo, J Biol Chem, 278,

お い て も、HTE を NHDF-Neo お よ び NHDF-Ad に 添 加

18491-18498.

することで、成熟エラスチンの指標である架橋アミノ酸の３）Robb, B. W., Wachi, H., Schaub, T., Mecham, R. P.

増加からもエラスチン繊維の再構築が確認できた。しかし

and Davis, E. C. (1999) Characterization of an in vitro

ながら、NHDF-Ad におけるエラスチン繊維構築量は著しmodel of elastic fiber assembly, Mol Biol Cell, 10,

く、この要因として、加齢に伴いトロポエラスチン分解酵

3595-3605.

素の関与が示唆された。皮膚繊維芽細胞をコラーゲンゲル

４）Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Single-

内培養したものは真皮モデルとして用いられているが、そstep method of RNA isolation by acid guanidinium

こにエラスチン繊維は存在していないため、より生体に近thiocyanate- phenol-chloroform extraction, Anal

い状態でのエラスチンに関する検討が困難となっている。

Biochem, 162, 156-159.

そこで、2 次元培養でエラスチン繊維形成することができ

５）Starcher, B. C. and Mecham, R. P. (1981) Desmosine

た NHDF-neo を用いて 3 次元培養でのエラスチン繊維形

radioimmunoassay as a means of studying

成を検討した。しかしながら、HTE の添加および未添加

elastogenesis in cell culture, Connect Tissue Res, 8,に関わらず、エラスチン繊維を確認することが出来なかっ255-258.

た。この要因として、3 次元培養では Elastin 関連タンパ６）Li, D. Y., Brooke, B., Davis, E. C., Mecham, R. P.,

ク質の mRNA 発現の低下によりタンパク質量が減少し、Sorensen, L. K., Boak, B. B., Eichwald, E. and Keating,足場タンパク質の成熟が不十分であった可能性が示唆され

M. T. (1998) Elastin is an essential determinant of

た。一方、NHDF-neo の細胞活性に対する HTE の影響を、

arterial morphogenesis, Nature, 393, 276-280.

3 次元培養ゲル収縮を指標として検討した結果、ゲル内に７）Urban, Z., Zhang, J., Davis, E. C., Maeda, G. K.,

HTE を加えることによりゲル収縮は増強された。このこ

Kumar, A., Stalker, H., Belmont, J. W., Boyd, C. D. andとから、HTE は細胞活性作用を有し、コラーゲンゲル内Wallace, M. R. (2001) Supravalvular aortic stenosis:に存在することで、より生体に近い状態となる可能性が示

genetic and molecular dissection of a complex mutation

唆された。

in the elastin gene, Hum Genet, 109, 512-520.

以上のことから、足場タンパク質の改良と HTE の分解

８）de Schepper, S., Loeys, B., de Paepe, A., Lambert, J.

を抑制することで、ヒト皮膚への HTE の処理が、機能的and Naeyaert, J. M. (2003) Cutis laxa of the autosomal

なエラスチン繊維の再構築を導く可能性が示唆された。本recessive type in a consanguineous family, Eur J

研究は、加齢に伴う皮膚のエラスチン繊維形成の解明だけ

Dermatol, 13, 529-533.

− 98 −

表皮細胞の増殖・分化・細胞死に影響を与える遺伝子群の機能解析システムの構築
大阪大学医学系研究科社会環境医学竹田潤二

Somatic cells from patients with Bloom (Blm) syndrome show an increased rate of homologous recombinationand therefore, results in generation of bi-allelic mutation from mono-allelic mutation. We have used a tetracyclineregulated Blm allele (Blmtet) to introduce bi-allelic mutations in ES cells (5). Phenotype-based genetics is now
achievable and raises new possibilities for identifying novel gene functions.
Although we would like to apply this system in mice or their somatic cells, addition of doxycyline (dox), an
analogue of tetracycline, to Blmtet mice did not result in sufficient reduction of Blm expression because of leaky Blm
expression in vivo. This leaky expression has been markedly reduced in vitro by using a tetracycline-controlled
trans-silencer. A new tetracycline cassette containing the trans-silencer gene was constructed and inserted into
the Blm gene to generate a new Blm allele (Blmtet-new) in ES cells. We tested the dox-dependent regulation of Blm
expression and possible introduction of bi-allelic mutations in mice or their somatic cells derived from the ES cellline bearing Blmtet-new and found that sister chromatid exchange (SCE), a hallmark of Bloom gene deficiency, wasmarkedly increased in lymphocytes derived from mice bearing Blmtet-new alleles, suggesting that efficient bi-allelicmutations have been introduced in mice.
We reported that Sleepng Beauty transposon (SB) jumps efficiently in mouse genome (1) and SB-mediatedmutagenesis is possible (3). Moreover, we have been recently repor ted potential of SB for comprehensive
mutagenesis (6). Since the SB transposon system has a unique feature that can introduce various mutations insomatic tissues, this allows us to search for many novel gene functions in a single mouse.
Combination of the two systems described above opens a new research field for “somatic cell genetic biology”.
In this system, SB-mediated transpositions cause many mono-allelic gene disruptions in somatic cells followed by
the introduction of bi-allelic mutations from them.

１．緒

一方、両アレル変異に関しては、ブルーム遺伝子を利用する。

言

ブルーム遺伝子が欠損したブルーム症候群と呼ばれる患表皮は直接外界に接している組織であり、外界からの刺者では高頻度に癌が発症する。患者由来の細胞を観察する

２）

激から生体を防御している 。表皮細胞一つ一つを解析でと、高頻度に相同組み換えが起こり片アレル変異から両アきれば皮膚疾患の病態解明に多大な効果を及ぼすことが期

レル変異に移行しやすく、このことが癌発症に密接に関連待される。

していると考えられる。

そのために我々は、二つの手法を組合わせて個体の表皮遺伝子の機能を個体で解析するときには、遺伝子が欠損細胞などの体細胞での遺伝子機能を効率良く解析するためしているアレルをホモにする必要がある。通常それは、ヘの手法を開発しようとしている。

テロマウス同士を交配することにより達成される。我々は、一つ目はランダムに変異を効率良く導入する手法であり、ブルーム遺伝子を欠損させることにより交配をしなくても二つ目は、導入された変異をもう片方のアレルにも導入し遺伝子の機能を解析できる手法を開発しようとしている。

（両アレル変異導入）、遺伝子機能解析に供するというもの

ES 細胞を利用してその原理が正しいことを証明できた５）。

である。

上記で述べた二つの手法を組み合わせ、マウス個体の体細ランダム変異導入は、我々が世界に先駆けてマウス個体

胞で遺伝子の機能を効率良く解析しようとするものである。

で効率良く動き回ることを報告した SB トランスポゾンシ

２．実

ステムを用いる１）。トランスポゾンシステムは生殖細胞だけでなく、体細胞でも効率良く動き回ることが知られている。

験２- １ マウストランスポゾンが表皮細胞でも効率良く動き回るかどうかの検討
我々はこれまでに生殖細胞系列で SB トランスポゾンがG ener at ion of a novel sy st em forfunctional analysis of genes involved in
growth, differentiation, and cell death inepidermal cells

効率良く動き回り、内在性遺伝子を破壊できることを報告

Junji Takeda

トランスジェニックマウスを作製した。このマウスとトラ

Department of Social and Environmental
Medicine, Osaka University Graduate
School of Medicine

してきた。そこで体細胞である表皮細胞でも効率良く遺伝
子移動を可能にするために Keratin-5 トランスポーゼース
ンスポゾン保有マウスを交配したダブルトランスジェニッ
クマウスを作製し、表皮細胞でその移動効率を測定した。

− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 20072005 年、アメリカの二つのグループが SB トランスポを作製し、その後ホモマウスを作製した。そのホモマウス

ゾンを体細胞で移動させ癌遺伝子の同定に成功したことがからリンパ球を取り出し、組み換え頻度が上昇しているか

Nature 誌に報告された。その際、体細胞（表皮だけでなどうかを姉妹染色体間の組み換えで測定したところ、顕著

く体細胞全体）での移動効率を高めるために、トランスポに頻度が上昇していることが観察された７）。

ーゼース遺伝子を Rosa-26 遺伝子座にノックインしたマ

４．結語および今後の展開ウスが作製されていた。我々も同様のマウスを独自に作製したのでそのマウスを用いて表皮細胞で移動効率が高まっているかテストした。

二つのシステムを融合して表皮細胞で遺伝子の機能を解析するものであるが、それぞれのシステムは完成に近づきつつあると考えられる４）８）。それらが融合できた時にこれ

２- ２ ブルーム遺伝子欠損による表皮細胞における両アレル変異導入効率の検討

までにない新しいシステムが誕生し、今後新規遺伝子群が多数同定されることが期待される。

我々は、これまで ES 細胞においてブルーム遺伝子を条
件付き（テトラサイクリン類似体を添加した時だけで遺伝（参考文献）

子がオフになるいわゆる tet システム）で破壊することに１）Horie, K., A. Kuroiwa, M. Ikawa, ほか 4 名：Efficientより両アレル変異導入が可能であることを示してきた。そchromosomal transposition of a Tc1/mariner-like

こでその ES 細胞からマウスを樹立し、体細胞を取り出し

transposon Sleeping Beauty in mice. Proc. Natl. Acad.

ES 細胞と同様両アレル変異導入が可能か検討した。

Sci. USA 98: 9191-9196, 2001
２）Takagi, S., H. Tojo, S. Tomita, ほか 9 名：Alteration

３．結果および考察of the 4-sphingenine scaffolds of ceramides in

３- １ マウストランスポゾンの表皮細胞での移動効率

keratinocyte-specific Arnt deficient mice affects skin

実際の移動効率は、遺伝子の挿入で検討しなければいbarrier function. J. Clin. Invest. 112（9）: 1372-1382.

けないが、マウストランスポゾンはランダムに移動する

2003

ので挿入効率を測定するのは困難である。そこで挿入す３）Horie, K., K.Yusa, K.Yae, ほか 10 名：Characterization

る前のトランスポソン切断効率で移動効率を類推した。他

of Sleeping Beauty transposition and its applicationの実験でトランスポゾンが切断されたもののうち、半分

to genetic screening in mice. Mol.Cell.Biol.23(24):は実際に遺伝子挿入が起きていることが証明されている。

9189-9207, 2003

Keratin-5 トランスポーゼーストランスジェニックマウスと

４）Yusa, K., J. Takeda, and K. Horie ; Enhancement of

トランスポゾン保有マウスを交配したダブルトランスジェ

Sleeping Beauty Transposition by CpG Methylation:

ニックの表皮細胞での移動は 10 〜 100 個の細胞に一個ぐ

Possible Role of Heterochromatin Formation, Mol.

らいの頻度で起こっていることが想像された。この頻度は、Cell. Biol., 24; 4004-4018, 2004

表皮での遺伝子機能解析が可能であることが考えられる。

５）Yusa, K., K. Horie, G. Kondoh, ほか 4 名：Genome-wide
phenotype analysis in ES cells by regulated disruption

３- ２

表皮細胞における両アレル変異導入効率of the Bloom's syndrome gene. Nature 429, 896-899,

表皮細胞を培養することが簡単ではないためモデル系と2004

して初期線維芽細胞での両アレル変異導入効率を検討した。

６）Keng, V.W., K. Yae, T. Hayakawa, ほか 10 名：Region-

ブルーム遺伝子欠損は、両アレル変異導入だけではなくて

specific saturated germ-line mutagenesis in mice using

姉妹染色体間の組み換え頻度も同時に上昇するので我々は

the Sleeping Beauty transposon system. Nat. Methods.

実際には初期線維芽細胞での姉妹染色体間の組み換え頻度

2 ; 763-769, 2005

で両アレル変異導入効率を検討した。しかし、ES 細胞で

７）Hayakawa T, Yusa K, Kouno M, ほか 2 名：Bloom’s

みられた組み換え頻度の上昇は見られなかった。その原因

syndrome gene-deficient phenotype in mouse primaryがブルーム遺伝子の Leaky な発現によるものだと考えら

cells induced by a modified tetracycline-controlled

れたので、それを押さえるために tet システムのサプレッ

trans-silencer. Gene,. 369; 80-89, 2006

サーを新たにシステムに加えてテストしたところ姉妹染色８）Ikeda R., C Kokubu, K Yusa, ほか 3 名：Sleeping Beauty

体間の組み換え頻度の上昇がみられた。

transposase has an affinity for heterochromatin

そこで、サプレッサーを組み込んだコンストラクトを新

conformation, Mol. Cell. Biol., 27 : 1665-1676, 2007

たに作製し、ES 細胞にノックインし、それ由来のマウス− 100 −

色素細胞幹細胞の制御による白斑症治療モデルの開発

岐阜大学大学院医学系研究科

國貞隆弘

Piebaldism is an autosomal dominant genetic pigmentary disorder, characterized by congenital white hair andpatches located on the forehead, anterior trunk, and extremities. Most piebald patients have a mutation of the Kit
gene, which encodes a tyrosine kinase receptor involved in pigment cell development. The white hair and patchesof such patients are already completely formed at birth and do not usually expand thereafter. This stability ofpigmented spots also applies to KitW and KitlSl mutant mice. However, 2 novel cases of piebaldism were reported in
2001, in which both mother and daughter having a novel Val620Ala mutation in their Kit gene showed progressive
depigmentation. To prepare an animal model of this mutation to explore undefined functions of KIT signaling for
maintaining pigmented melanocytes in the skin or more specifically the integrity of the melanocyte stem cell systemin the postnatal skin, we produced transgenic mice expressing Val620Ala Kit. These mice well mimicked the whitespotting pattern of patients; however, no change in this pattern was observed after birth, even after increasing thetransgene expression by various means. Here, we report the unexpectedly extremely stable maintenance of themelanocyte stem cell system under stringent conditions for KIT signaling.

１．緒のメカニズムで白斑を生じる分子として、先述の SLF や言

ET3 EDNR3 MITF PAX3、などが知られている４，５）。

色素細胞は発生初期に神経管から離脱した多分化能をも

皮 膚 の 色 素 異 常 は 多 彩 な 臨 床 症 状 を 示 し、Theつ幹細胞である神経堤細胞に由来する。神経堤細胞はマウ

Pigmentary System ６） によると実に 141 種の病名が報告

スでは 9.5 日胚で移動を開始し、13.5 日までには体の様々されている。分類の大まかな基準は、先天的か後天的か、な部分へ移動し、その場所で色素細胞を含め、神経、内分

色素過剰か色素過小か、表皮性か真皮性か、あるいは発生

泌、結合組織、骨組織など様々な細胞・組織へと分化する。

段階で生じるか成長してから生じるかであり、臨床例とし色素細胞へと運命決定された細胞は色素細胞幹細胞（色素て最も多い白斑症（vitiligo）は自己抗体の形成などによる芽細胞）として表皮の近傍の真皮中を移動し、表皮に一斉

後天的な原因で色素細胞が失われ白斑が形成されると考えに移動後毛包の形成と共に一部はその中に進入する。毛包られている。例えば、mi vit というマウスの突然変異は、先で（ヒトでは毛包以外の表皮中にも）生涯色素細胞は維持

天的な白斑（後天的なものと区別して piebaldism あるい

され、UV などの外部刺激に反応してその密度が増減する

は Waardenburg 症候群として記載される）を持つ。mivit

こと、毛周期に同調して増殖・分化を繰り返すことから、

では加齢と共に色素が減少することからヒトの vitiligo の幹細胞システムとして皮膚（ケラチノサイト）の再生と関モデルと考えられてきたが、原因遺伝子が Waardenburg

１- ３）

連しながら再生し続けると考えられる症候群の原因遺伝子と同じ転写調節因子 MITF であるこ。

例えば、White Spotting（W）マウスでは受容体型チロと、ヒト vitiligo に MITF 遺伝子の変異が見つかっていな

シンキナーゼ遺伝子 Kit の突然変異により、それを発現す

いこと、などから典型的な白斑症のモデルとは考えられてる色素細胞幹細胞は体内環境から十分なシグナル（ここでいない。いずれにしても、動物モデルを通して色素異常症

はリガンドとして Kit に結合する SLF）を得られなくなり、の研究を進めることは、病態の分子的な本質を明らかにす

移動能力が低下する。その結果、神経管から遠位にある腹る上で必要不可欠である。

部、額、臀部、四肢の先端を中心に色素細胞幹細胞が到達

我々は、Richard, 深井らにより 2001 年に報告されたヒ

せず、その部分は色素細胞の存在しない白斑になる。同様

ト piebaldism（まだら症）の臨床報告７） に注目した。その患者母娘は c-kit に変異を持ちまだら症と診断されたが、E st abl ish ment of a n i ma l models forpiebaldism by the regulation ofmelanocyte stem cells
Takahiro Kunisada
Depar t ment of T issue and Organ
Development, Gifu University Graduate
School of Medicine

娘には生後白斑の拡大が観察された。白斑形成は、表皮の色素細胞幹細胞の発生・維持ができず色素細胞が消失する、
いわば幹細胞システムの破綻として統一的に扱うことができる。白斑形成という表現型を持つ毛色の突然変異体の解析により幹細胞の増殖・分化・自己複製を制御する因子（遺伝子）のほとんどが明らかにされている。そのような遺伝− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Tg-3

Tg-2

Tg-1

Tg-4

図１

子のひとつとしてマウスやヒトを含むいくつかの哺乳動物

ランスジェニックマウスを作成した（mt-kitV620ATg マウ

で受容体型チロシンキナーゼ c-kit の様々な変異が知られス）。メタロチオネインプロモーターは色素細胞を含む様々ている。c-kit 変異マウスを含む白斑を持つマウス変異体

な組織や細胞で発現を誘導するが、全く c-Kit を発現しなでは白斑パターンが生後に変化する現象は報告されていな

い W マウスですら必ずしも致死的でないことから、ドミナ

い。体表の一部に色素細胞が存在しない領域は、分子的な

ントネガティブに機能すると予想される Val620Ala 変異

原因が何であれ発生中の色素細胞の異常によって生じたもを広範囲の細胞に発現させても個体の生存に影響することのであり、いずれも生後には白斑のパターンは決まっておはないと考えた。これらの操作を含む実験の詳細は文献８）

り、成長に比例してそのサイズは拡大するがパターンは変に詳述した。

化しないとされている。

３．結

ところが、この論文で報告された c-kit 変異（Val620Ala）
では、一旦形成された娘の白斑領域が加齢に伴って拡大し

３．１

果Tg マウスの表現型たことが報告されている。生後表皮の成長とは無関係に色7 個の独立した mt-kitV620ATg マウスが得られ、4 個体

素細胞が減少するということは一端毛包に定着した色素細の白斑が遺伝することが確かめられ、下図１のように胞幹細胞が失われることを意味し、発生時に形成された白Tg-1,2,3,4 とした。この中から、比較的白斑の面積が少な

斑部が安定して維持され、一端発生過程で形成された色素

い Tg-1 と、白斑が最も大きい Tg-4 を株として維持した。

細胞の分布のパターンは生涯変わらないという従来のまだ白斑のサイズやパターンに個体差はあるものの、Tg-1 とら症に対する認識を覆すものである。この表現型が再現で

Tg-4 が外見で区別できないほどではなく、世代を重ねてきれば、受容体型チロシンキナーゼのシグナル異常によっも安定に維持された。トランスジーンの発現量を皮膚で比て生後に進行する白斑症（vitiligo）が生じることを証明

較すると Tg-4 の方が圧倒的に多く、ドミナントネガティ

できるだけでなく、表皮における色素細胞幹細胞の維持機

ブ c-kit 遺伝子の発現量と白斑の面積が比例していること

構の解明に直接つながると考えた。

になり、白斑形成がトランスジーンに起因することが示さ

本申請では報告されたまだら症と同一の点突然変異を導入した c-Kit 遺伝子をメタロチオネイン遺伝子の転写調節れた。つまり、この変異はヒトと同じくマウスにもまだら症を誘発することが確認された。

領域の下流に接続して色素細胞で強制発現させたトランス
ジェニックマウス（Tg マウス）を作成し、この大変希な

mt-kitV620ATg マウスでの加齢に伴う白斑の変化

まだら症の表現型の再現を試みた８）。

２．実

３．２

これらの Tg マウスにおいて白斑の拡大が認められるか、験

長期にわたって観察した。最も大きな白斑を持つ Tg-4 で

ヒトまだら症の c-kit Val620 Ala 変異はこの受容体の細も、生後の白斑の大きさや形状は、成長による表皮の拡

胞内チロシンキナーゼ部位の数百アミノ酸にわたってヒ大以外は認められなかった（図２）。Tg-1 の小さな白斑

トとマウスでほぼ完全に保存されている領域で起こっておも、拡大も縮小もしなかった。多数の mt-kitV620ATg マウ

り、マウス c-kit 遺伝子に同様の変異を導入することで再スについて観察を行ったが、いずれも同様であった。従っ

現可能と考えられた。ミスマッチ PCR プライマーを用いて、通常の飼育状態においては、c-kit のＶ６２０Ａ変異は、て Val620Ala 変異を導入したマウス c-kitcDNA を作成し、発生を反映した白斑形成はヒトの症例と同じく生じるもの

これをメタロチオネイン I 遺伝子の転写プロモーター領域の、生後の白斑の拡大は起こらないと考えられる。

と接続した DNA コンストラクト作成し、これを用いてト− 102 −

色素細胞幹細胞の制御による白斑症治療モデルの開発

Tg-1

やや白斑が小さい（黒毛のストライプが太い）こと以外毛Tg-4

色のパターンは Tg-4 と変わらないが、実際に毛を剃って8d

みると表皮にメラノサイトが存在し、色素が沈着しているのがわかる。このマウスを剃毛後も飼育を続け再び剃毛したところ、表皮の白斑のパターンは変化していなかった。
このようなダブルトランスジェニックマウスを Tg-1 でも作製したが同様の結果であった。さらに、これらのダブル

5w

トランスジェニックマウスに ZnS04 を飲ませても、パターンが変化することはなかった。従って、ヒトと同様に毛包以外の表皮に色素細胞が常在する状態でも、mt-kitV620A

14w

によって生後に白斑が拡大することは無いことがわかった。

４．考察

以上、ヒト kitV620A 変異の生後の白斑の拡大を再現すべ
20w

く行った様々な試みは現在のところ全て失敗した。マウスの多くの piebaldism 変異体で一旦発生過程で生じた白斑の生後の拡大は報告されておらず、我々がそれらのマウス

図２を飼育した経験でもそのようなことは観察されなかった。

３．３ トランスジーンの発現量の増加による白斑の変化

もちろん、ヒトでもこのような報告は一例のみである。従mt-kitV620A の発現を担うメタロチオネインプロモーターの別の遺伝的な要因、あるいは環境因子が付加することには重金属の添加により活性が増大する。実際に、Tg-1 やよって白斑の拡大が生じたと考えるのが妥当と思われる。

って、ヒトでの症例報告では、mt-kitV620A に加えて何らか

Tg-4 においても ZnSO4 を飲用させることで数倍の転写亢

このように、ヒトの症例を再現する試みは成功しなかっ進が認められた。このようにして mt-kitV620A の発現を高めたが、本研究の過程で色素細胞の増殖・分化・維持に関した Tg マウスも、たとえ生後直ちに ZnSO4 の飲用を開始ていくつかの点が明らかになった。まず、色素細胞の発生し長期観察しても、生後の白斑の拡大は観察されなかった。

異常により生じた piebaldism の白斑の安定性である。発Tg-1 のホモ個体では、mt-kit V620A の発現量が 2 倍にな

生過程での白斑のサイズあるいは形態には c-Kit シグナルると考えられ、実際その白斑は Tg-4 よりも大きくほとんが影響を及ぼすことは、今回作製した mt-kitV620ATg マウ

ど白色の固体も見られたが、そこにわずかに残った黒毛もスを見ても明らかであり、実際 SLFTg/+；mt-kitTg-1/+

生涯消失することはなかった。

ダブルトランスジェニックには図４のように Tg-1 では決して観察されない腹部の白斑が極端に小さなものがしば３．４

ヒトに類似した色素細胞分布を示す SLF-Tg
マウスにおける mt-kitV620A トランスジーンの効果しば生じたが、c-Kit のリガンドである SLF の強制発現により、mt-kitV620A の活性が上昇したため、色素細胞がよりマウスでは、生後速やかに毛包以外の色素細胞が失われ野生型に近い分布を示すようになったと考えられる。ただるので、ヒトの色素細胞の動態を調べるモデルとしては限し、この場合ですら生後の白斑の変化は見られなかった。

界がある。ヒトでいう白斑の拡大とは、主に毛包以外の表

マウスの場合、SLF の発現は生後においては毛包に限局

皮に存在する色素細胞が消失をされるが、SLFTg では表皮全指すからである。この点を克服

SLFTg/+;mt-KIT Tg-4/+体に発現し続けるので、我々するため、我々が以前開発したは白斑の周囲の色素細胞が活性

毛包以外の表皮にも生涯色素細化され、幹細胞を含めた色素細胞が維持されるヒト型の表皮を胞が存在しない白斑に進入する持つモデルマウス（hk14-SCFTg

ことは大変考えやすいと予想し

９）

V620A

Tg マ

たが、実際には半年後でも白斑

ウスとを交配し、白斑の状態をのサイズや形状は変化しなかっ調べた。図３に示したように、た。もともと、c-Kit や ET3 な

マ ウ ス ） と mt-kit

SLFTg/+;mt-KIT Tg-1/+

例 え ば SLFTg/+;Tg-4/+ ダ ブ

4w

どのシグナルの不足により生じ

5w

ルトランスジェニックマウスは

図３た piebaidism の 白 斑 が 生 後 も

図４− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

変化しないのは十分予想されることであるが、いくらそれ作製には至らなかったが、たとえば ET3 など他のシグナを強制発現させたリガンドで活性化し、シグナルの不足分

ルも同時に操作することで、様々な白斑症のマウスを作出を補っても（実際に発生過程ではほとんど腹部の白斑が消したい。

失するという著しい効果として現れているのだが）、生後の白斑のパターンは一切変化しない。シグナルの不足に対（引用文献）

しても、過剰に対しても、一旦形成された胎児期の白斑の１）Hall, B.K.（1999）The Neural Crest In Development
and Evolution. New York: Springer.

パターンは強固に維持される。
神経堤由来の色素細胞は発生中皮膚の広範囲を移動し、

２）Le Douarin, N. M., and Kalcheim, C.（1999）The

それには c-Kit が必要であることが実験的に確実に示され

Neural Crest. Cambridge, UK: Cambridge Universityている。生後も、毛包のバルジに存在する色素細胞幹細胞

Press.

が毛周期に対応して毛球部へ移動することは確認されてお３）Nishimura E K, Jordan S A, Oshima H, Yoshida H,

り 、今回確認されたことを言い換えると、生後の色素細Osawa M, Moriyama M, Jackson I J, Barrandon Y,

胞は個々の生存シグナルの増大や減少には反応せず、毛包Miyachi Y, Nishikawa S, : Dominant role of the nicheから毛包へ移動することはない、ということになる。生後

in melanocyte stem-cell fate determination. Nature 416,の色素細胞は、毛包でも表皮でもこれほど移動に対して抵854-860, 2002.

３）

抗することは、多くの脊椎動物が体表の配色を種や個体の４）Bennett DC, Lamoreux ML, : The color loci of mice -識別に使っていることを考えると進化的な合理性があると

a genetic century, Pigment Cell Res., 16, 333-344, 2003.

も考えられる。発生中の色素細胞と、生後のメラノサイト

５）Steingrimsson E, Copeland NG, Jenkins NA, : Mouseのどのような違いによってこのような移動性の差異がもた

Coat Color Mutations: From Fancy Mice to Functional

らされるかを明らかにすることは、piebaldism 以外の白Genomics, Dev. Dyn. 235, 2401-2411, 2006

斑症の発症機構にも参考になると思われる。色素細胞でな

６）The Pigmentary System, J.J. Nordlund, R.E. Boissy,

く、表皮の側に原因があることも考えられる。我々は十分

V.J. Hearing, R.A.King, and J-P Ortonne, eds（New

な検討をしていないが、UV 照射や発癌剤の投与で表皮がYork, NY: Oxford University Press）, pp. 475-487.

一気に黒化する現象の動態を詳しく調べることも必要かも

７）Richards KA, Fukai K, Oiso N, Paller AS, : A novelしれない。色素細胞の幹細胞が刺激に対して柔軟に反応しKIT mutation results in piebaldism with progressive

ないことが、白斑が自然治癒しない大きな原因と考えられdepigmentation. J Am Acad Dermatol 44: 288-292, 2001８）Tosaki H, Kunisada T, Motohashi T, Aoki H,

るからである。
白斑症あるいは白髪などを含め、色素細胞の発生異常と

Yoshida H, Kitajima H, : Mice transgenic for KitV620A:

いう観点から症状の分子機構を調べ、治療あるいは予防を

recapitulation of piebaldism, but not progressive

行おうという試みは最近国内外で盛んである。ただ、実用

depigmentation, seen in humans with this mutation. J.

化という観点では、海外メーカーによるチロシナーゼ遺伝

Invest. Dermatol. 126, 1111-1118, 2006.

子に対するアンチセンス DNA を用いた美容液等新しいメ

９）Kunisada T, Yoshida H, Yamazaki H, Miyamoto,

ラニンコントロール法の実用化は国内外で活発であるが、A, Hemmi H, Nishimura E, Shultz LD, Nishikawa

色素細胞幹細胞の動態を制御する効果の高い製品は存在し

S-I, Hayashi S-I, :ない。その原因は、モデル動物を通した白斑あるいは白髪

factor in the basal layer of epidermis promotesの発生機構の研究が不十分で色素細胞の消失に関する分子

survival, proliferation, differentiation and migration of

機構の解明が不十分であることにある。本研究では、最終melanocyte precursors. Development 125, 2915-2923,

的に当初目指していた vitiligo タイプの白斑症のモデルの1988.

− 104 −

Transgene expression of steel

化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化

仙台大学体育学部健康福祉学科＊，東北大学大学院教育学研究科臨床心理学分野＊＊＊＊＊＊

吉田 寿美子 ，荒川冴子 ，中幡美絵 ，土屋

石津 憲一郎＊＊，安保慶子 ，作山 美智子＊，

英勇＊＊，上埜

高志＊＊

Cosmetic therapy was believed to improve the quality of life (QOL) in women including senile dementia patients.
However, the mechanisms of cosmetic therapy are not clear. In this study, we examined the psychosomatic effects
induced by the cosmetic therapy in senile dementia or healthy elderly women. T h i r t e e n s e n i l e d e m e n t i awomen (mean MMSE: 20.3, mean age: 84.2) received cosmetic therapies conducted by 2 college student volunteers
every week for 3 months (total 12 sessions). Twenty-six healthy elderly women (mean MMSE: 26.6, mean age:70.1) took cosmetic learning class to master self-cosmetic behavior, every week for 1.5 months (total 5 sessions) On
every week, senile dementia or healthy elderly women were evaluated on their physical and psychological status
for the short-term effects (STE) of cosmetic therapy. We also evaluated the status of senile dementia women andthe volunteers (mean age: 22, women) or healthy elderly women before and after the series of cosmetic therapy to
examine its long-term effects (LTE).
For the senile dementia women, 1) the moods assessed by face scale were significantly improved; diastolic bloodpressures, pulse rates, double products and the temperatures of cheeks significantly decreased; the temperature ofpalm significantly increased as STE, 2) depressive moods and anxiety significantly decreased; feeling of well-being
showed tendency in increased only in high public self-consciousness persons. On the contrary, cosmetic therapy
showed no clear effects in volunteer women.
For the healthy elderly women, 1) the moods assessed by face scale or NRS were significantly improved; bloodpressures (both of diastolic and systolic), pulse rates significantly decreased; the temperature of palm, forehead andcheeks significantly increased as STE, 2) the moods significantly improved; felling of well-being showed significantly
increased; increasing of feeling of well-being was not influenced by character, employment or commencing time ofskin-care behavior.
Our study showed cosmetic therapy activated parasympathetic system and improve the mood in both senile
dementia and healthy elderly women. The effects in healthy elderly women (self-cosmetic behavior) exceeded thatin senile dementia women because LTE were not influenced by character.
Cosmetic therapy seems to activate bodies and spirits of both senile dementia and healthy elderly women as
STE, although LTE is limited in senile dementia women.

１．緒宇山，阿部によると「化粧療法」とは「化粧を用いた治療

言法であり，化粧が心理学的な過程を介して心理・生理的な「化粧」に関する心理学的研究は 20 世紀の半ばにその兆

治療効果をもたらすことを期待して行われるものである」

しが現れ，後半に目覚しい発展を遂げた．化粧に種々の心という定義を提案している．

理作用があることを示し，化粧に注目を集めたのは 1985

海 外 で は ア メ リ カ 合 衆 国 に お い て“Look Good...Feel

年に Graham らが化粧の臨床的効用についての書籍を発

Better”という化粧の無料支援プログラムが展開されてい行したことから始まり，「化粧療法」という新たな領域をる．この活動はがん患者などの容貌，容姿に配慮すること生むに至った（阿部，2001）．日本では近年，「化粧療法」

によって症状を改善することを目的として全米化粧品工業

は代替療法の一つとして老人保健施設やデイサービス等の界，アメリカ癌学会，全米コスメトロジー協会の 3 者が共福祉の現場や病院などの医療の現場で取り入れられ始めた．

催して行っており，医療の現場において癌患者のリハビリテーションの一環として定着し，高い評価を得ている（高Spiritual activation induced by cosmetic
therapy in senile dementia women andnursing volunteers
Sumiko Yoshida*, Saeko Arakawa, Mie
Na ka hata , Keiko Tuchiya , M ichiko
Sakuyama , Kenichiro Ishizu, Hideo
Anbo, Takashi Ueno*

Department of Hea lth and Welfare
science, Faculty of Physical Education,
Sendai College
Division of Clinical Psychology, Graduate
School of Education, Tohoku University

橋，2003）．
以上のように福祉，医療及び社会心理学的に「化粧療法」
に関する関心は高まっている．
そこで，我々はこれまでの先行研究を踏まえ，化粧療法
は高齢者の不安や抑うつを減少させて，生きる意欲といった精神的活性化をもたらし，高齢者の生理的状況を改善すると仮定した．さらに，高齢者への化粧療法を施す介護ボランティアにも達成感を与え，介護ボランティアの心理にも良い影響を与えると想定した．本研究では，認知症高齢− 106 −

化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化

女性に対しては介護ボランティアが化粧療法を行い，健康った．

高齢女性に対しては「化粧教室」を開催して化粧を自ら行・研究方法えるように指導した．これらの結果から，化粧は高齢者の同意の得られた協力者に化粧教室全プログラム開始前に精神的活性化をもたらすか，介護ボランティアが高齢者にTable ２- １に示した各尺度と検査を実施した．本研究で化粧を施すことで達成感を得られるかの 2 点を心身への影

は「化粧教室」として週 1 回 1 セッション 1.5 時間，下記

響を検討することで明らかにすることを目的としている．

の内容のプログラムを実施した．

２．実
２. １
・対

験

認知症高齢者を対象とした研究
象

仙台大学近郊の老健施設入居者のうち本研究に同意でき，

第１回

スキンケア・洗顔・顔のマッサージ・下地

第２回

ファンデーション・影・フェイスパウダー

第３回

眉・アイシャドー・アイライン

第４回

マスカラ・チーク・リップ

第５回

復習

同 意 能 力 が あ る 判 断 さ れ る MMSE（Mini-Mental State「化粧教室」ではセッションごとにデモンストレーショ

Examination）が 15 点以上の高齢女性（計 13 名）に研究ンを行い ，協力者にはそのセッションごとの資料を配布

協力を依頼した．MMSE の平均得点は 20.3±3.6 点，平し，個別指導を行った．化粧教室は 5 回のセッションを一

均年齢は 84.2±5.9 歳であった．仙台大学に通学するボラ

つのプログラムとし，最終的には一人で化粧できることをンティア学生（計２名，平均年齢 22 歳）が上記認知症高目標に指導を行った．協力者が多かったため，26 名を前齢者に化粧を実施した．

半と後半の２グループに分け，平成 17 年 11 月 30 日〜平・研究方法

成 18 年３月８日までの約３ヶ月間実施した．協力者に対同意の得られた協力者に化粧療法全プログラム開始前にして毎回のセッション前後に以下の Table ２- ２に示した尺度と検査を実施し，化粧教室プログラム終了後，Table

Table １- １に示した尺度と検査を実施した．
本研究では「化粧療法」として下記のメイクプログラム

２- ３に示した尺度と検査を実施した．最後に，化粧教室の感想と普段の生活の変化の２点を共通の質問項目とし，を実施した（１セッション約 30 分）．
①顔のマッサージ

その他はフリートークを重視した半構造的インタビューを②ファンデーション→白粉

実施した．

③眉墨→アイメイク

２．２

④口紅
⑤チーク

統計

統計は統計ソフト SPSS（Windows, version 11.5J）を用⑥全体のバランス

い，Wilcoxon の符号付順位和検定で比較し，p<.05 を有⑦「きれいになりましたね」と評価する．

意とした．

希望に応じて化粧のアドバイスを行う．
協力者に対して「化粧療法」を週１回，約３ヶ月間（平

２．４

倫理的配慮

成 16 年 11 月８日〜平成 17 年２月 28 日，全 12 セッショ

この研究は仙台大学倫理委員会の了承の下，研究協力者

ン）実施した．毎回のセッションの前後に Table １- ２にに研究の趣旨を口頭と文書にて十分説明し，文書による同示した尺度と検査を実施した．化粧療法全プログラム終了

意を得て行った．データは全て数値化し，個人を特定でき後，再び Table １- １に示した尺度と検査を実施した．

ないように配慮した．

化粧をする介護ボランティアに対しては化粧療法全プロ

３．結グラム開始前及び終了後に Table １- ３に示した尺度を実施した．また、化粧療法プルグラム終了後にはインタビュ

３．１

ーにより高齢者に化粧療法を施術した感想を聴取した．

・毎回のセッション前後の比較

果

認知症高齢女性を対象とした研究

Face Scale は低下（p<.01, Fig. １），拡張期血圧，脈拍

２．
２
・対

健康高齢者を対象とした研究数は低下する人が有意に多かった（p<.01, p<.01; Fig. ２，

象

Fig. ３）．表面温度は頬部が低下，手掌部は上昇する人が本学近郊の A 町の広報誌で公募し，65 歳〜 75 歳の高有意に多かった（各 p<.05, Fig. ４）．収縮期血圧 × 脈拍数

齢女性を募った．研究説明会を実施し，本研究に同意するで計算されるダブルプロダクトは低下する人が有意に多か者を協力者とした．協力者は MMSE の得点がいずれも 22った（p<.01, Fig. ５）．収縮期血圧，前額部の表面温度に点以上であり，認知症の症状はなく自ら化粧ができる者で有意な変化はなかった

あった．なお，平均年齢は 70.1±2.9 歳（計 26 名）であ．

− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

・化粧プログラム前後の比較

常範囲内であった．その他の血液検査項目には変化がなか３ヶ月間のプログラム前後に心理的・生理的尺度に有意な変化は認められなかった．公的自意識尺度の平均得点を基準として，協力者を高群と低群に分類したところ（高群５人・低群６人），高群では，GDI（抑うつ）
，STAI

った．
・介護ボランティアへの影響
３ヶ月の化粧療法プログラム前後の心理的尺度に有意な変化はなったが，以下のような感想が得られた．

（特性不安）が減少する人が有意に多く（それぞれ p<.05,

・「自分が化粧をしてあげることで，高齢者が明るくな

Fig. ６），PGC モラール尺度（幸福感）が高まる人が増加って自分たちが元気をもらったような気がする．
」

傾向であった（p<.10, Fig. ６）．血液検査では随意血糖値・「化粧をする前は，あまり会話がなかったのに，化粧が上昇する人が増加傾向（p<.10）にあり，白血球数が増が終わるとよく話をしてくれるようになって，うれし加する人が有意に多かった（p<.01）が，いずれの値も正かった．」

Table １ 認知症高齢者を対象とした研究で実施した尺度・検査項目

Table ２
項目

GDS 短縮版（高齢者の抑うつ），新版 STAI（不安），PGC モラール尺度（主観的幸福感），Face Scale（気分）,１ 自意識尺度（公的自意識）
血圧（収縮期・拡張期），脈拍数
血液検査（血液一般，生化学検査，免疫機能検査）

Face Scale，NRS， 新 版 STAI（ 特 性 不 安 ），PGC モ
ラール尺度（主観的幸福感），自意識尺度（公的自意識），WHO- ５（こころの健康度），SF- ８（QOL，スタンダー
１ド版），NEO-FFI（性格特性，成人用）, ピッツバーグ睡眠調査，生活暦，化粧に関するアンケート，血圧（収縮期・拡張期），脈拍数

Face Scale（気分），表面温度（前額部，左右頬部，左右手掌部）
２
血圧（収縮期・拡張期），脈拍数，ダブルプロダクト（心付加係数）
孫・祖父母関係評価尺度 ( 孫版），自尊感情尺度，
３ 生き甲斐感スケール，新版 STAI（不安特性），SDS（成人の抑うつ）（注釈）
・GDS 短縮版（Geriatric Depression Scale shorted version; Sheikh
and Yesavage, 1986）：老年者のうつ病のための尺度
・新版 STAI（State-Trait Anxiety Inventory-Form JYZ; 肥田野ほか，
2000）：不安に関する尺度
・PGC モ ラ ー ル 尺 度 改 訂 版（The Philadelphia Geriatric Center
Morale Scale; Lawton, 1975）：主観的幸福感を測定する尺度
・Face Scale（Lorish and Maisiaku, 1986）：1 から 20 までの一連の表情変化のイラストから自分の気分に近いものを選択する気分に関する尺度・公的自意識尺度：自意識尺度 日本語版（菅原，1984）の公的自意識に関する 11 項目を用いた．
・孫・祖父母関係評価尺度（孫版）（田畑ほか，1996）：敬老精神の尺度
・自尊感情尺度（山本ほか，1982）：自分をポジティブに捉えることができる感情の尺度
・生き甲斐感スケール（近藤・鎌田 , 1998）
・日本語版 SDS：抑うつ性を評価する自己評定尺度（福田・小林，
1983）

２

健康高齢者を対象とした研究で実施した尺度・検査

Face Scale（気分），NRS（気分），血圧（収縮期・拡張期），
脈拍数，表面温度（前額部，両頬部，両掌部）

Face Scale（気分），NRS（気分），新版 STAI（特性不安），PGC モラール尺度（主観的幸福感），自意識尺度（公的自意識），WHO- ５（こころの健康度），SF- ８（QOL，
３ スタンダード版），NEO-FFI（性格特性，成人用），ピッツバーグ睡眠調査，化粧教室に対する総合評価表，イン
タビュー，化粧に関するアンケート，血圧（収縮期・拡張期），脈拍数（注釈）
・NRS（Numerical Rating scale：数値的評価スケール）：100 点を最大とした場合，自分の現在の気分は何点かを回答させる．数値が高いほど気分が良いことを表す．
・WHO-5 精 神 的 健 康 状 態 表（1998 年 度 版 ）（WHO-Five WellBeing Index; Awata, S, et al, 2006）：5 つの回答の数字を合計して計算する．祖点の範囲は 0 〜 25 点で，0 点は QOL（Quality ofLife）が最も不良であることを示しており，25 点は QOL が最も良好であることを示している．
・SF-8 日 本 語 版（The MOS 8-Item Short-Form Health Survey
Japanese Version; Fukuhara S and Suzukamo Y, 2004）：PF（身体機能），RP（日常役割機能 - 身体 -），BP（体の痛み），GH（全体的健康感），VT（活力），SF（社会生活機能），RE（日常役割機
能 - 精神 -），MH（心の健康）の８つの健康状態を示す得点を数値化する調査票．一定の測定基準によってスコアリングし，得点を決定する．各項目の得点を重み付けして加算し，定数を加え，公式に当てはめると PCS（身体的サマリースコア），MCS（精神的サマリースコア）を求めることができる．
・日本版 NEO-FFI（NEO Five Factor Inventory Japanese Version;
下仲ら，2002）：合計 60 項目から成っている．大学生用と，成人用の 2 種類がある．神経症傾向，外向性，開放性，調和性，誠実性の人格の５つの次元における個人の特性を明らかにする．
・ピッツバーグ睡眠調査（Pittsburgh sleep quality index ; PSQI）：
睡眠とその質を評価する自記式質問票．18 の質問項目から成り，
睡眠の質，睡眠時間，入眠時間，睡眠効率，睡眠困難，眠剤使用，
日中の眠気などによる日常生活への支障といった７つの要素から構成されている．得点が高いほど睡眠が障害されていると判定する．

− 108 −

化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化

Fig.1

セッション前後のFace Scaleの変化

Fig.３

Fig.５

Fig.２

セッション前後の血圧の変化

セッション前後の脈拍数の変化

Fig.４

セッション前後の表面温度の変化

セッション前後のダブルプロダクトの変化

Fig.６

化粧療法プログラム前後の心理特性変化
公的自意識高群（n＝５）＊実線はｐ＜.01，ｐ＜.05またはｐ＜.10，破線は有意差がないことを示す．

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007３．
２

健康高齢女性を対象とした研究

は，Face Scale の得点が低下する人（p<.01），NRS，モ・毎回のセッション前後の比較

ラール尺度の得点，化粧品目が上昇する人が有意に多Face Scale は低下する人が有意に多く（p<.00），NRS

かった（p<.04, p<.03, p<.05）．就労経験の無い者もモラは上昇する人が有意に多かった（p<.00）．血圧（収縮期・ール尺度，ピッツバーグの睡眠調査，VT，MCS の得拡張期）が低下する人が有意に多く（p<.01，p<.00），表点，化粧品目数が上昇する人は増加傾向であった（p<.06,

面温度（前額部・頬部・手掌部）は上昇する人が有意に多p<.07, p<.08, p<.05, p<.06）．化粧（スキンケア）の開かった（p<.00, p<.00, p<.00）．

始時期を 2 つのグループに分け（25 歳以降の群９人・・「化粧教室」プログラム前後の比較

25 歳以前の群 13 人），比較検討した．25 歳以降の者は全般的な変化：Face Scale の得点が低下する人が有意にFace Scale が 低 下 す る 人，WHO- ５， モ ラ ー ル 尺 度，

多く（p<.00），モラール尺度の得点が上昇する人が有意VT，MCS の得点，化粧品目が上昇する人が有意に多く，に多かった（p<.00）．NRS，WHO- ５の得点が上昇する

ピッツバーグ睡眠調査の得点が上昇する人が増加傾向で人が増加傾向であった（p<.06, p<.07）．その他の項目にあった（p<.02, p<.01, p<.04, p<.03, p<.04, p<.04, p<.06;

ついては変化が見られなかった．生理的尺度の全ての変Fig. ８）．25 歳以前の者はモラール尺度の得点が上昇す数に有意な結果は認められなかった．化粧に関する調査る人が有意に多く（p<.04），Face Scale，STAI の得点がにおける各質問項目（スキンケア，ファンデーション，

低下する人が増加傾向であった（p<.07, p<.06）．化粧品

口紅，アイシャドー）についてはスキンケアのみ得点が目が上昇する人が増加傾向であった（p<.09）．

上昇する人が増加傾向であり（p<.07, Fig. 7）．その他の・総合評価アンケートやインタビューの結果

項目については変化が見られなかった．

アンケート結果：化粧教室に参加しての評価を 4 段階の性格特性の影響：NEO-FFI を用いて，日本人の平均値を選択式アンケートで回答を得た（21 名）．21 人中 21 人

基準として神経症傾向，外向性，開放性，調和性，誠実が良かったと回答した（100％）．その理由について 7 項性の高群と低群に分類して比較したところ，性格傾向に目から選択式の複数回答可で回答を得た．結果は Table

関係なくモラール尺度の得点が高まる人が増加傾向また３に示した．21 人中 20 人が化粧を教えてもらった事がは有意に多かった（p<0.4, p<.07）．公的自意識について良かった理由であると回答した（95.2％）．次いでスタはグループ平均点（36.7）が一般の平均点（56.4）より

ッフと話ができた事と回答した人が 11 人（52.4％）でも低かった為，解析しなかった．

あった．再度化粧教室が行われた際の参加意思について

就労経験の有無や化粧習慣の開始時期の影響：就労経験の４段階の選択式アンケートで回答を得た．ぜひ参加した有無で 2 つのグループに分け（仕事をしていた 10 人・

いと回答した人が 15 人（71.0％），どちらかといえば参していなかった人 12 人）比較したところ，就労経験者

加したいと回答した人が５人（24.0％）であった．再度

Fig. ７ 「化粧教室」プログラム前後のスキンケア（頻度）の変化（ｎ =23）

Fig. ８

化粧習慣が 25 歳以降の人の「化粧教室プログラム」前後の変化（各々；n=12, 13, 13, 9, 9, 13, 9）＊実線は p<.01, p<.05 または p<.10，破線は有意差がないことを示す．

− 110 −

化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化

化粧教室が開催された際に参加したいと考えている人が・化粧療法の長期的効果

95% であることが分かった．どちらかといえば参加し心理的効果：高齢者の化粧療法における長期的効果として，幸福感の高まり，抑うつや不安傾向の改善がみられたくないと回答した人は１人（5.0％）であった．
インタビュー結果：主な内容を６つのカテゴリーに分けてた．これは，化粧には自信と満足感・幸福感を高める効

Table ４に示す．
「化粧の仕方を覚えて良かった，楽し果があり，感情状態を適度の緊張感を帯びた快適な方向かった」，「化粧をする機会が増えた，化粧の話をするよへ向かわせるという報告（余語ら，1990）を支持するもうになった」，「嬉しい，やっぱり女」，「肌にハリ・ツヤがでた」，「褒められた，友達に教えた」という感想や多かった．
「頭の働きが良くなった」「食事にも気を配るようになった」など化粧とは直接関連しない感想も認めら

Table ４
カテゴリー

４．
１

察

認知症高齢女性を対象とした研究

・化粧療法の短期的効果

内

容

人数

化粧の仕方を覚えて良かった

11

楽しかった

10

マッサージの指導が良かった
化粧教室の感
教えてもらえて良かった
想
生活の楽しみだった

9

れた。

４．考

インタビュー結果

心理的効果：高齢者の化粧療法における短期的効果として，

7
6

会話が楽しかった

4

その他

11

化粧する機会が増えた

10

化粧の話をするようになった9

外出するのが面倒でなくなった

8

化粧品を買いに行った6

るものである．１回の化粧療法でも充分に「気分の改善」

家族が協力的になり，自分の時間を作るようになった

5

効果を発揮すると考えられる．

鏡を見るのが楽しみ

5

化粧をしている人を見るようになった4

生活のリズムができた

4

洋服もコーディネイトしたくなった4

テキストで（化粧の）勉強をしている

3

頭の働きが良くなった（考えるようになった）

3

友達ができた

3

その他

7

うれしい

9

やっぱり女

5

気持ちが明るくなった

4

幸せ

4

（化粧すると）気分が良い

3

Face Scale でみられる気分の改善が認められた．これは，化粧を施すことにより被験者の感情表出が豊かになるという報告（岩男・松井，1984），化粧のマッサージによる皮膚接触行為が快感情を生起するという報告（畑山ほか , 1987；浄土ほか , 1987：山田ほか，1987）を支持す

生理的効果：高齢者の化粧療法における生理的効果として，生活の変化

拡張期血圧の低下，脈拍数の低下，手掌部の表面温度の上昇やダブルプロダクトの低下が認められた．これは化
粧療法には，短期的効果として副交感神経を優位にする効果があることを示すものである．この効果の一部はマッサージ固有の効果（阿部，1990，1993）に由来するものと考えられる．尚、頬部の表面温度が有意に低下したが，この要因は不明である。
以上から、化粧療法は，心身両面のリラクゼーション効
果を示すと考えられる．これらの効果は足部の押圧刺激による自立神経系の変化についての調査（許ほか，2004）や音楽療法によるリラックス効果の報告（田川ほか，2003）

心理的変化と同様の結果であることから，化粧療法は指圧や音楽療法と同様な代替医療となる可能性もあると考えられる．
Table ３

3

その他

18

肌にはりがでた・つやがでた

10

顔・肌の変化 きれいになった

化粧教室の評価の理由

化粧を教えてもらった事

自信がついた人数（人） 割合（％）
20
95.2

スタッフと話ができた事

11

52.4

化粧をした事6

28.6

他の化粧教室参加者と話ができた事

4

19.0

温泉に入れた事

4

19.0

外出するきっかけになった事

3

その他

0

顔の表情がにこやかになった
周 囲 と の コ 褒められた
ミュニケー
ションの変化 友達に教えた

4
1
7
6

今後も継続したい15

また化粧教室に参加したい・開催して
欲しい

9

14.3

きれいになりたい4

0.0

今後が楽しみ2

今後の期待− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007のである．これらの報告ではどのような高齢者に心理的認められた．スキンケア以外の「飾る」ことを目的とす効果があるのか不明であったが，今回我々は認知症高齢る化粧項目には有意な変化は認められなかった．大別す者では他人の目を気にする傾向の強い高齢者（公的自意

ると化粧には「飾る」化粧と「慈しむ」化粧がある（阿部，識高群）にのみ認められることを初めて明らかにした．

2002）が，「慈しむ」化粧は自分で実行しやすく、イン

これは，公的自意識の低い女性より公的自意識の高い女

タビュー結果のように「肌にハリがでた・つやがでた」

性の方が，化粧をつけた場面の魅力度が高いという報告と自覚することができて満足感を得られる事からスキン（Miller and Cox, 1982）を支持するものである．

ケアの頻度が高くなったものと考えられる．インタビュ

生理的効果：生化学的検査の結果として，随意血糖値の上ーから「化粧をする機会が増えた」「化粧をしている人

昇，白血球数の増加がみられたが，いずれの値も正常範を見ることが増えた」との感想も聞かれ、化粧行為全般

囲であり特別な意味は無いと考えられる．また，長期的に関して関心が高くなったことが伺える．

効果には短期効果で認められたような副交感神経系を優性格特性の影響：ほぼ性格の特性に関係することなく主観的幸福感の上昇効果があると考えられた．結果では述べ位にする効果は無かった．
介護ボランティアへの影響：データ数が少なく，統計的ななかったが，外向性低群，開放性低群，誠実性低群には処理は出来なかった．インタビューからは認知症高齢者

更に気分の改善効果や精神的 QOL の改善や化粧品目のに化粧を施すことで介護ボランティアに「嬉しい」，「や増加などより多くの変化が認められた．化粧に関してこ

りがいがある」といった満足感や達成感が生じているこ

れらの性格傾向を持つ女性には共通した特性がある可能とが分かる．認知症を介護する現場では介護者の燃えつ性が伺えた．いずれにせよ、認知症高齢女性を対象としきが問題となってきている（谷口・吉田，2000）．このた研究では公的自意識の高い人のみに効果があったこと

燃え尽きに対しては適切な対処法が医療現場では重要でを考えると，能動的化粧は高齢女性誰にでも効果を及ぼあるとされている（片桐ほか，
1999）．以上をふまえると，す点で優れていると考えられる．

化粧療法は介護職に就く人の燃え尽き防止の対処法とし就労経験の有無や化粧習慣の開始時期の影響：就労経験の無い者も，心の健康度が有意に上昇し，有意な差は見らて寄与できる可能性があると考えられた．

れなかったものの，主観的幸福感は上昇する人が増加傾４．
２

健康高齢女性を対象とした研究向であったことから就労経験に関係なく主観的な幸福感が上昇する事が示唆される．化粧習慣の獲得が 25 歳以

・「化粧教室」の短期的効果
Face Scale，NRS の有意な変化に認められるように気前の者も主観的幸福感が上昇する人が有意に多く，気分分の改善，収縮期・拡張期血圧の有意な低下・表面温度のが改善する人が増加傾向であった．以上から，化粧習慣有意な上昇で認められるように副交感神経を優位にする事の獲得の時期に関係なく主観的な幸福感が高まる事が分が分かった．これらの変化は認知症高齢女性を対象とした

かった．しかし，化粧習慣の獲得が遅い人の方が多くの研究より明らかであった．これは対象となった人数の相違

心理的項目が改善された原因は不明であり更なる検討が及び年齢差に基づくものと考えられた．

必要である．
総合評価アンケート及びインタビュー：化粧教室に参加

・「化粧教室」の長期的効果
心理的効果：Face Scale，NRS，WHO-5，モラール尺度

して全員が良かったと回答し，再度化粧教室が開催されの得点が改善され，気分の改善と心の健康度や幸福感がた際に参加したいと考えている人が 95％であることが上昇することが認められた．気分が改善して、幸福感が分かった．あるプログラムを開催しこれ程の好評を得る

高まったことから心の健康度も高まったものと考えられことは殆どないことから，その要因が注目されたが，化る．これらの変化は認知症高齢女性を対象とした研究よ粧行為を通じた他者とのコミュニケーションが化粧行為りも明らかであった．認知症高齢女性との相違は，対象そのものを上回っていたことが分かった．化粧療法の効となった人数の相違・年齢差・対象の特性（認知症と健果は報告者によって差異がある（浜ら，1990；宇野ら，

康高齢者）の違いに基づくものと考えられた．

1997；伊波ら，2002；柳ら）が，その要因の１つに対象

生理的効果：有意な変化が認められなかった．これは認知者とのコミュニケーションの差違いが考えられた．イン症高齢女性を対象とした研究の結果と同様であった．しタビューでは化粧，化粧教室に対して肯定的な感想が多かし，就労経験の無い群及び化粧習慣の開始時期が 25

く聞かれ，これらの内容は化粧教室の心理的効果を補完

歳以上の群ではピッツバーグ睡眠調査の得点の上昇するするものが殆どであった．「孫に化粧を教えた」「夫や娘人が増加傾向であったが，調査を完成できた人が少ないや嫁にほめられた」「頭の働きが良くなった」「食事にもため考察は困難と考えられた．

気を配るようになった」等の感想も聞かれ，化粧教室が化粧習慣への効果：スキンケアの頻度が高くなったことが単に「化粧」だけではなく生活全体にも影響を及ぼして− 112 −

化粧療法による被介護者と介護ボランティアの精神的活性化いることが伺えた．自宅での夫娘，嫁，孫との化粧を介した会話の増加は化粧を通じて多世代との交流のきっか

1983.
11）岩男寿美子・松井豊：化粧の心理的効用（Ⅲ）—化粧けとなる可能性がある．

後の心理的変化．日本社会心理学会第 2 回大会発表論文

以上のように化粧教室の長期効果として，気分の改善，

集 : 128-129, 1984.

主観的幸福感など精神的状態を良好にする可能性を示した．

12）伊波和恵：高齢者と「化粧療法」研究に関する考察おインタビューからは「化粧教室」が生活全体にも影響を及よび展望．Fragrance journal 27(9)：52-58，1999．
13）片桐敦子・斉藤功・真島一郎 他：【医療現場におけるぼしている可能性が伺えた．

５．総

医療従事者のストレス】医療従事のストレスとその関連括事項．ストレス科学 14: 39-43, 1999.

化粧は短期的には心身のリラックス効果を，長期的には精神的な健康状態を良好にする効果があることを示した．
これらの結果は化粧が高齢者の精神的活性化に寄与できる

14）近藤勉・鎌田次郎：現代大学生の生きがい感とスケール作成．健康心理学研究 11: 73-82, 1998.
15）許鳳浩・上馬場和夫・田川美貴

他：足部の押圧刺可能性を示している．これらの効果は自ら化粧をする能動

激 に よ る 循 環・ 呼 吸・ 自 律 神 経 系 の 変 化． 東 方 医 学

的な化粧の方が優れていた．一方，化粧療法を行う介護ボ19(420): 1-12, 2004.

ランティアも満足感や達成感を示したが，統計的な検討は16）Lawton MP: The Philadelphia Geriatric Center
Morale Scale: A revisions, J. of Gerontology 30 (1):

できなかった．

85-89, 1975.
（参考文献）

17）Lorish CD and Maisiaku R: The face Scale: brief,

１）阿部恒之：エステティックの心理学的効果および東洋医学の関連について．Fragrance Journal Special Issue

noerbal method for assessing patient mood. Arthritis
Rheum 29: 906-909, 1986.
18）Miller LC and Cox CI: For appearances' sake. Public

10: 19-26, 1990.
２）阿部恒之 : リラクセイション法としての化粧．現代エ

self-consciousness and makeup use. `Personality andSocial Psychology Bulletin 8: 748-751, 1982.

スプリ 311: 123-132, 1993.
３）阿部恒之：スキンケアへの期待の返還と心理学的効果—容貌の演出・肌の健康・リラクゼーション（編）シリーズ：21 世紀の社会心理学９

大坊郁夫

化粧行動の社

19）Sheikh JI and Yesavage JA: GDS: Resent evidence
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本語版作成の試み．心理学研究 55: 84‐188, 1984.
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Yamashita M, Ohara A, Hinokio Y, Matsuoka H and果に関する研究Ⅱ：⑵ EEG の結果．日本心理学会第 51
回大会論文集 : 399, 1987.

Oka Y: Reliability and validity of the World Health22）下 中 順 子・ 中 里 克 治・ 権 藤 郷 之・ 高 山 緑： 日 本 版

Organization-Five Well-Being Index in the context of

NEO-PI-R,NEO-FFI 使用マニュアル．東京心理株式会

detecting depression in diabetic patients. Psychiatry６）Fukuhara S and Suzukamo Y: Manual of the SF-8
Japanese version：Institute for Health Outcomes &７）浜治世・日比野英子・藤田祐子：化粧による情動活性化の試み．日本心理学会第 54 回大会論文集：p714，

治・星野和美・佐藤朗子

他：青年期における孫・祖父母関係評価尺度の作成．心理学研究 67 ⑸ : 375-381,
1996.
24）田川

Process Evaluation Research，Kyoto，2004．

泰・井口茂・中野裕之他：音楽療法とメラ

トニンの併用による循環動態と皮膚温度の解析

有効かつ十分なリラックス効果と求めて．長崎大学医学部保健学科紀要 16 ⑵ : 55-58, 2003.

1990．
８）畑山俊喜・丸山欣哉・平田社：東京，2002．
23）田畑and Clinical Neurosciences 61: 111-118, 2007.

忠：美粧行為の心理 , 的効果に関する研究Ⅱ：⑴問題・方法および行動観察．日25）高橋

都：がん患者への「化粧」支援プログラムの日本への適用可能性に関する研究．コスメトロジー研究報
告 , 2003.

本心理学会第 51 回大会発表論文集 : 398, 1987.
９）肥田野直・福原眞知子・岩脇三良 他：新版 STAI マ

26）谷口幸一・吉田靖基：【チーム医療におけるストレスとそのコントロール】老人福祉施設職員の介護ストレス

ニュアル．実務教育出版：東京 , 2000.
10）福田一彦・小林重雄：SDS 使用手引．三京房：京都 ,に関する研究．ストレス科学 15: 82-88, 2000.

− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 200727）山田嘉明・浄土英一・畑山俊喜：美粧行為の心理的効果に関する研究Ⅱ：⑶質問紙と作業検査の結果とまとめ．

諸側面の構造．教育心理学研究 , 30: 64-68, 1982.
30）柳美紀・谷口加代・浜野亜由美・大久保まさ子：老人

日本心理学会第 51 回大会発表論文集 : 400, 1987.
28）宇野賀津子・河合すみれ・大西尚之・谷都美子・西幹栄美・吉本美和・沢田学・青地脩・岸田綱太郎：老年者に対する化粧療法の効果．メンタルヘルス岡本記念財団
研究助成報告集：9：21-24，1997．

29）山本真理子・松井豊・山成由紀子：認知された自己の保健施設での化粧療法の試み．日本リハビリテーション
看護学術大会収録，14：73-75，2002．
31）余語真夫・津田兼六・浜治世 他：女性の精神的健康に与える化粧の効用．健康心理学研究 3: 28-32, 1990.

− 114 −

口唇裂患者の化粧による外観変化と内面変化について

大阪大学大学院歯学研究科顎口腔病因病態制御学講座口腔外科学第一教室

古郷幹彦

As a final treatment, we used a make-up for cleft lip patients. In this study, we analyze the effect on the mental
stress of cleft lip patients. Professional make-up treatment was performed on the patients face. The five types ofstress（recognition, body, life, social, total）were evaluated before make-up and after. The surgical lines on the upper
lip were almost diminished with the professional make-up. Higher stress was recognized before make-up treatment.
Each type of stress was reduced with make-up treatment.

１．緒いものがあり、皮膚表面の瘢痕を肉眼的に不明瞭にするこ

言とを可能にした。少なくとも化粧をすれば口唇の瘢痕は見大阪大学歯学部附属病院第一口腔外科で初診した 1977

えなくすることができる。このことが患者の精神的ストレ

年から 2002 年までの 25 年間の口唇裂患者は 1681 人である。

スを改善できる可能性は十分にあると考える。そこで本研

いわゆる口唇口蓋裂患者の 75％であった。うち口蓋裂を合

究は化粧を用いることにより患者の口唇裂瘢痕を消失させ併するものは約 70％であった。口唇口蓋裂は我が国においることが患者の内面に与える効果について検討した。

１）ては約 600 人に 1 人の割合で発生する疾患であり 、先天

２．方異常の中でもその発生数は多いとされる。古くは口唇裂患法者は手術痕跡が瘢痕として目立ち、さらに口蓋裂を合併し大阪大学歯学部附属病院第一口腔外科で総合治療を受けていれば著しい上顎の発育不全も審美性に障害を与えた。

た口唇口蓋裂患者のうち口唇裂を有する 22 名に対し、化そこで口唇裂初回手術においてはミラード法・テニソン法

粧の指導を行った。患者の内訳は 10 歳代 6 人、20 歳代 12をベースにしながら様々な改良が加えられてきた。さらに人、30 歳代 3 人であった。

顎裂部への二次的骨移植術、顎変形の著しい症例には顎骨

大阪大学歯学部附属病院の約 20 年前の口唇口蓋裂治療

骨きり術、その他、口蓋裂の手術法の改良など顎の形態ののスケジュールは著しい改善も行われてきた。ことに顎骨への手術的アプロ

初回口唇形成術

3 ヶ月

ーチ法も仮骨延長術などで画期的に進歩したことなどから、

初回口蓋形成術1 歳 2 ヶ月から 1 歳 6 ヶ月

顔面形態という点ではかなり改善した。このような近年の（言語治療：顎口腔機能治療部にて良好と判断されるまで）医歯学の発達により口唇口蓋裂患者の治療に関しては形態（歯列矯正治療：永久歯萌出以後）

的にはかなり審美的改善ができるようになった。また縫合

顎裂部二次骨移植術

10 歳から 13 歳

法についても新たな吸収性縫合糸の開発などによって瘢痕

口唇外鼻二次修正術

16 歳から 18 歳

が著しく目立つこともなくなってきた。しかしながら手術
瘢痕を完全に消失させるところまでは至っておらず、微細であった。
全員が口唇外鼻二次修正術まで修了していた。

にしろ残存することはやむをえない。患者はこの点について精神的苦痛を大小の違いがあるが感じていることは事実内面審査である。先天異常を顔面に持つことは社会生活上、本人に内面審査は大阪大学歯学部附属病院で患者に直接承諾を精神的ストレスをかけることはしばしばと思われる。この得たものである。熊本大学式ストレス尺度を用い、別紙ア

ような事態をいかに把握するかは医療を行う上で重要なポンケート調査を指導直前と指導直後に行った。患者個人がイントともいえる。一方近年の化粧の技術の発達は目覚し

直接質問シートに記入する方式で行った。
患者ストレスを認知的ストレス、身体的ストレス、社会The effect of makeup on psychologicalstatus of cleft lip patients.

的ストレス、生活的ストレス、総合的自己評的ストレスに

Mikihiko Kogo

下のごとく設定した。

First Department of Oral and Maxillofacial
Surgery, Osaka University Graduate
School of Dentistry

分け、それぞれの項目を無秩序に並ぶように質問項目を以それぞれのストレスについて化粧指導前と指導後で比較し内面における化粧の効果について検討した。
評価は勝俣瑛史氏・篠原弘章氏による熊本大学式ストレ− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

質問シート
あ非
て常
はに
ま
る

あか
てな
はり
ま
る

あ少
てし
は
ま
る

あま
てっ
はた
まく
る

01．美しい花をみても、美しいと感じられない

4

3

2

1

02．自分のスタイル（体型）や容貌のことがとても気になる

4

3

2

1

03．人に自分の心（気持ち）を開くことができない

4

3

2

1

04．何かに挑戦したり、何かをやろうとする意欲がわかず、「何もしたくない」と思う

4

3

2

1

05．自分は「人から愛されていない」と思う

4

3

2

1

06．自分の考えや気持ちを十分に言葉で言う（表現する）ことができない

4

3

2

1

07．胃や心臓などの内臓器官の調子が悪いと感じる

4

3

2

1

08．人前で、もっとうまくしゃべれたらなあと思う

4

3

2

1

09．何かしようとしても、いざとなると実行することができない

4

3

2

1

10．自分は誰からも愛されていない気がする

4

3

2

1

11．物事を判断したり、自分の考えを決めることができない

4

3

2

1

12．性的問題（月経、マスターベーション、性器の問題など）とても気になる

4

3

2

1

13．人に親しみを感じられない

4

3

2

1

14．何かをしようとしても、すぐいやになり続けられない気がする

4

3

2

1

15．自分は「人から必要とされていない」と思う

4

3

2

1

16．何かしようとしても気が散って、集中することができない気がする

4

3

2

1

17．歩いて買い物に出かけたり、散歩したり、スポーツをしたりなど、体を動かす気持ちになれない

4

3

2

1

18．人を信じられないと思う

4

3

2

1

19．やるべき事があるのに、なまけてしまう気になる

4

3

2

1

20．自分のことを「人にわかってもらえない」と思う

4

3

2

1

21．何か考えると、いろいろな考えが浮かばない

4

3

2

1

22．頭痛、腹痛、発熱、吐き気、体のだるさ、肩こりがあり、つらい

4

3

2

1

23．人と一緒に何かするのは苦痛（いや）だと思う

4

3

2

1

24．朝、起きなければならない時間になっても起きられない気がする

4

3

2

1

25．「自分はだめな人間だ」と思う

4

3

2

1

26．何か覚えようとしても、なかなか覚えられないと思う

4

3

2

1

27．心配事があって、よく眠れない気がする

4

3

2

1

28．何かするとしても、人と一緒にしたくないと思う

4

3

2

1

29．いろいろなことががまんできない

4

3

2

1

30．自分に自信が持てない

4

3

2

1

31．今のままの成績や評価ではだめだと思う

4

3

2

1

32．表情や動作が固いと人から言われる

4

3

2

1

33．人と話したくないと思う

4

3

2

1

34．病気以外の理由で、学校（会社・習い事など）休みたい

4

3

2

1

35．楽しい事がほとんどないと思う

4

3

2

1

− 116 −

口唇裂患者の化粧による外観変化と内面変化について

ス尺度（インターネット公開）

表1２）に沿って行った （表１）
。そ

問題番号

れぞれのストレスについて化粧

スコアー

認知的
ストレス

指導前と指導後で比較し内面における化粧の効果について検討

01
06
11
16
21
26
31

した。認知的ストレス、身体的ストレス、社会的ストレス、生活的ストレス、総合的ストレスについて各々メイク前後での変化を統計学的に検定した。検定

合計
得点

は paired-t test（パラメトリッ
ク検定で対応のある t 検定）を

4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3

2
2
2
2
2
2
2

身体的
ストレス
1
1
1
1
1
1
1

02
07
12
17
22
27
32

4 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 1

合計
得点

社会的
ストレス
03
08
13
18
23
28
33

4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3

2
2
2
2
2
2
2

生活的
ストレス
1
1
1
1
1
1
1

合計
得点

04
09
14
19
24
29
34

4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3
4 3

総合的自己知的
ストレス
05
10
15
20
25
30
35

2 1
2 1
2 1
2 1
2 1
2 1
2 1

合計
得点

4 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 14 3 2 1

合計
得点

用 い 危 険 率 は 5% に 設 定 し た（両側検定）。

３．結果

認知的ストレスについて、メイク前には対象者の平均

0.92

が 12.36 であったのに対してメイク後には 11.27 と減少し、0.9

統計学的検定の結果 p=0.009（<0.05）で統計学的有意に認知的ストレスはメイク後減少した。
次に身体的ストレスについて、メイク前には 12.22、メ
イク後には 10.32 と減少し、統計学的検定の結果 p=0.001（<0.05）で、統計学的有意差を認めた。
社会的ストレスについて、メイク前には 11.82、メイク
後には 10.27 と減少し、統計学的検定の結果 p=0.01（<0.05）
で、統計学的有意差を認めた。
生活的ストレスについて、メイク前には 12.05、メイク
後には 10.27 と減少し、統計学的検定の結果 p=0.005（<0.05）
で、統計学的有意差を認めた。
総合的ストレスについて、メイク前には 11.81、メイク

ストレス変化率

0.88
0.86
0.84
0.82
0.8

認知

身体

社会

生活

総合

図１：化粧による各ストレスの変化率
化粧後、身体的ストレスが最も減少し、生活的ストレス、総合的ストレス、社会的ストレス、認知的ストレスの順に減少した（化粧前の各ストレスを 1.0 とする）。

後には 10.09 と減少し、統計学的検定の結果 p=0.001（<0.05）
で、統計学的有意差を認めた。
すなわち統計学的検定の結果全ての項目で統計学的有意にメイク後ストレス値が減少した。平均値の差を見ると、リハビリメイクによって、認知的ストレスで 1.09、身体的ストレスでは 1.90、社会的ストレスでは 1.55、生活的スト
レスでは 1.78、総合的には 1.72 ポイントのストレス軽減を認めた。これを化粧前のそれぞれのストレスを 1.0 としてその変化率で示すと図１のようになる。変化率では身体ストレスが 84.3％と最も縮小し、生活ストレス、総合的ス
トレス、社会的ストレス、認知的ストレスの順に縮小した。
最も変化の少なかった認知的ストレスで 91.5％であった。
化粧後の年代別ストレスの平均値を図２に示す。化粧後のストレス残留は 20 歳代が最も高く 11 前後で、10 歳代、
30 歳代の順に少なくなった。30 歳代で 9 前後であった。

年代別ストレス平均値

12
10
8
6
4
2
0

10歳代

20歳代

30歳代

図２：化粧後の年代別ストレス平均値
化粧後、20 歳代がストレスが他と比べてわずかではあるが最も高く、10 歳代、30 歳代の順であった。

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

４．考

えられる。この場合、その間に別の因子が介在しやすくな察ることも考えねばならない。したがって研究を複雑なもの

口唇口蓋裂の中でも口唇裂を有する患者は顔面にわずかにしてしまう可能性が考えられる。本研究では間に介在すでも治療の痕跡を残すことから自分自身の口唇の状態に神る他の因子を可及的に排除することが研究の端緒としては

経質になっていることが少なくない。このことが患者をス必要であった。

トレスという形で精神的に圧迫していることは十分に考え

口唇裂という疾患は先天異常であることから癌などとはられる。この点は口唇裂を有しない口蓋裂単独患者とは大違い、形態的には問題なくなっても患者は疾患の治癒といきく違うものと推定される。

うことを認識できないことが多い。口唇裂という疾患を一

顎発育をコントロールでき、咬合の確立が成功した患者

生身に持っていると考えることが多い。そのことが日常のは口唇の瘢痕を除けば数メートルはなれれば形態は殆ど正

多くの面にストレスとなって現れる。しかし化粧という手常に近い。今回の研究でそこに専門のメークを施すと口唇技で少しでも確実にストレスが軽減することが本研究によ裂の痕跡が全くと言ってよいくらい素人的な目では正常とって明らかになった。すなわち傷が見えることのストレス

判別がつかなくなった。少なくとも化粧をしている間は口が化粧で軽減したと考えるのが適当であろう。

唇裂をもたない健常人と同じ外見と言ってよい。化粧によ

化粧後の年代別ストレスは 20 歳代が最も高く、10 歳代、って我々医療側も口唇裂の術後瘢痕がいかに人として意味

30 歳代の順であった。これは 30 歳代が最も化粧への理解のないものであるか本人に見せることができることに気づがあるためかもしれないが今後の検討課題となった。10いた。しかしそれでもなお患者本人のストレスは全項目で歳代の女性は化粧を始めたばかりか、これから始めるとこ

いまだ平均約 10 であったことは特筆に価する。

ろであり純粋さをもって協力してくれたのに対し、20 歳

ストレスを研究する際に、人のストレスの程度を計測す

代の女性は自己の方法との葛藤があったかもしれないが、ることは非常に難しい。客観的に評価を行うことは今後のそれぞれの年代の女性による対応の違いは特筆すべきであ

患者の検討を行ううえで非常に重要である。日常のストレろう。

スを熊本大学方式は認知的ストレス、身体的ストレス、社

現在までの治療技術の進歩により機能的にも形態的にも会的ストレス、生活的ストレス、総合的自己評的ストレ

著しく改善できるようになった。しかしながら患者の心にスに分類している。本研究結果では認知的ストレス、身体踏み込むことはまだできていないように感じている。患者

的ストレス、社会的ストレス、生活的ストレス、総合的自が口唇にあまり気を使うあまり、眉や頬などの所への日頃

己評的ストレスのすべての項目で化粧前は平均が 12 前後の配慮が健常人と比べて少なくなっている症例も多く認めであり、化粧後では全ての項目で平均が 10 前後であった。

られた。また外観においても今まで眼周辺に視点をおくこ

また全ての項目で有意差をもってストレスが軽減された。

とがいかに顔貌に変化を及ぼすかを認識できなかった患者

このことは化粧が単に口唇の傷を見えにくくするというだもいた。現在化粧も進歩し 10 代後半から 20 代の女性ならけではなく、患者の持つストレスの減少に役立つことを示ば今は常識となりつつある眉や頬の化粧に視点が行っていしている。数値的には 1 以上 2 以下の差であった。変化率なかった。このことから患者の口唇への執着がいかに強いで言うと身体ストレスが最も影響を受け 84％、認知ストかも伺える。すなわち、心の顔の視点を口唇から離すこと、レスが最も変化が少なく 92％であった。これを僅差と考さらに外観のポイントを口唇から離すことを化粧は可能にえるか否かは様々な意見があると思う。しかし、2 つのアした。このことがストレスの解消へとつながったことも考

ンケートの時間差がおよそ 1 時間以内である。すなわち変えられる。本研究により化粧は口唇だけでなく眼瞼周辺や化のしにくい短時間内の差であることから化粧はある一定

眉、頬など患者自身の美しさを認識させる有効な手段であの効果を患者の内面にもたらすと結論付けることができるることに患者だけでなく医療を行う我々に気づかせる有効と考える。また認知的ストレス、身体的ストレス、社会的な手段であることを認識できた。また今後男性の化粧につストレス、生活的ストレス、総合的自己評的ストレス全て

いても検討を行うことが必要と考えた。

で有意差があったことは見方をかえれば口唇裂という事実

５．総は認知的ストレス、身体的ストレス、社会的ストレス、生活的ストレス、総合的自己評的ストレスという全てのスト括

口唇口蓋裂治療の最終段階で化粧を行うことによる精神レスに影響していることを示すものである。今後の治療に面の効果について検討し以下の結果を得た。

おいてはこれら患者のストレスに対する配慮が重要となる。

１．口唇口蓋裂の医療的治療後でも全体的にストレスが高短時間内に同じ質問をすることは質問と答えの記憶もあいことが示された。

り通常結果は変化しにくい。月あるいは週を隔てればゆっ２．化粧により認知・身体・社会・生活・総合の各ストレくりとした心の変化から明確な差となって現れることも考スが 84％から 91％程度に有意に減少することが明ら− 118 −

口唇裂患者の化粧による外観変化と内面変化について

フの皆様、大阪大学歯学部附属病院第一口腔外科の教室員かとなった。
３．口唇口蓋裂患者に対する化粧は患者の精神面で非常にの皆様のご協力に深く感謝いたします。

有効であることが示された。
（参考文献）謝辞１）足立忠文、古郷幹彦、岡田

本件を遂行するに当り、REIKO KAZUKI 事務所のかづきれいこ氏、大阪大学歯学部附属病院第一口腔外科口唇口蓋裂専門外来担当の先生方、同看護部長西尾善子氏、同副看護部長

池

美穂氏に多大なるご協力を頂いたことに御礼申し上げるとともに、REIKO KAZUKI 事務所のスタッ

元、ほか 6 名：大阪近郊

における唇裂口蓋裂の発生について。大阪大学歯学雑誌、
41：240 − 247，1996．
２）篠原弘章・勝俣暎史 ： 熊大式コンピタンス尺度の開発と妥当性 (1): 小学生の「感情・態度」および「希望」との関係．熊本大学教育学部紀要，49, 93-108、2000．

− 119 −

化粧品の香料がヒト自律神経系に及ぼす生理学的効用の研究

藤田保健衛生大学医学部生理学

河合房夫

In the present experiment, effects of smelling cineole, an odorant, on the human autonomic nervous systemwere investigated by using a physiological engineering method such as the power spectrum analysis of humanheart rate variability (HRV). When subjects smelled cineole, subject's heart rate subsequently decreased, andslightly tended to be larger than the heart rate of the control condition. However, this difference was not statisticallysignificant. In addition, the smell of cineole changed neither the sympathetic nerve index nor the parasympathetic
ner ve index clearly. Therefore, those results may suggest that only smelling cineole does not markedly affecthuman autonomic nerve system.

１．緒

よって媒介されると考えられている 19）。心臓に自律神経

言遮断薬を投与すると心拍のゆらぎが消失し、メトロノーム

化粧品には、様々な香料が利用されている。近年、香りのような規則正しいリズムを刻むことが知られている 19）。

が人に及ぼす影響が注目され始め、急速にその研究が進ん

このような心周期のゆらぎは、洞結節（心拍リズムを決めでいる。特に、アロマセラピーはマスコミなどの影響もある場所）を支配する自律神経活動のゆらぎに由来しており、り、多くの人が知る治療法となりつつある。このアロマセ

心拍変動と呼ばれる。心拍数は、交感神経と副交感神経（迷

ラピーには、香りによって気分をリラックスさせ、ホルモン走神経）によって拮抗的に支配されている。これら両神経の分泌を調整する効果などがあると考えられている。ハー

活動のバランスは心拍数に反映され、そのゆらぎである心ブ系精油の主成分である 1,8-cineole（シネオール）には、気管拍変動はそのバランスの揺らぎを反映する 19）。したがって、平滑筋弛緩作用、呼吸器系・消化器系分泌腺刺激作用 １）、

心拍変動には心拍数からは得られない純粋な心臓副交感神

血糖低下作用 １, ２）など様々な効果があると言われている。

経（迷走神経）性心拍数機能調節機構に関する情報が存在

しかし、その効果が、実験的に裏付けられているのは交感する 19）。

神経活動の変化によると考えられる気管平滑筋弛緩作用３）cineole の作用の中には自律神経活動に着目すると相反するものがあるため、本研究では、cineole が実際にヒトだけである。
cineole などの匂い物質は、嗅上皮に存在する嗅細胞と呼ばれる神経細胞により受容されるにどのような効果を与えるかを、心電図から解析した。具

4-15）。嗅細胞には繊毛があり、この部位に匂い分子と結合する受容体が存在する。
匂い分子は、受容体に結合することにより受容器電位を発生させる。匂い分子により発生した脱分極性受容器電位は、嗅細胞の樹状突起を介して細胞体へと伝わり、細胞体ある

精 油

投
与
方
法

気 体

いは軸索において活動電位が発生する。嗅細胞細胞体の原

体外

吸 入

体内

鼻 腔

形質膜には、膜電位依存性の Na+ チャネル、Ca2+ チャネル、及び K ＋チャネルなどが存在し、活動電位の発生に寄与する

16-18）。発生した活動電位が軸索を介して嗅球へと伝達されることにより、匂いの情報が脳へと伝わり処理される（図 1）。

作
用
経
路

嗅細胞
嗅 球

生理的な心拍周期（心周期）のゆらぎは、自律神経に

大脳辺縁系
大 脳

A research on physiological effectsof odorants in cosmetics on humanautonomic nervous system

感情

Fusao Kawai

記憶

Department of Physiology, School of
Medicine, Fujita Health University

自律神経系
免疫系

下垂体
ホルモン系

行動

図１

− 120 −

視床下部

精油（匂い物質）を吸入した時の生理学的作用

化粧品の香料がヒト自律神経系に及ぼす生理学的効用の研究

体的には、心拍変動パワースペクトル解析法等の生理工

下し、被験者から約 50 ㎝の位置に呈示した。本実験では、学的手法を用い、cineole の香りによる交感神経系及び副心電図測定 260 秒と休憩 60 秒を 1 セットとして、cineole

交感神経（迷走神経）系への影響を解析した。また、香呈示前に 2 セット、呈示中に 2 セット、呈示後に 3 セット

りの種類によっては、覚醒感やリラックス感などを起こさの計 7 セットの測定を行った。また、コントロールとしてせるようなものもあり、空調を利用して香りを職場に取り無臭状態で 7 セット測定した。なお測定中、被験者には入れることにより、疲労感が減少し、会議の効率の上昇やパソコンを用いて簡単な暗算（ソフトフェア名：100 ます

VDT（video display-terminal）作業での作業能率を高め

たー，Vector フリーソフト）を行ってもらった（図 3）。

たという報告もある

20-22）。そこで、本研究では、心電図測

定中に暗算課題を課し、その結果から cineole の香りによ

15 人分の心電図（単極胸部誘導 V5）を測定した。
自律神経活動の測定には、胸部誘導法により測定した心る作業能率の変化についても解析した。

２．実

それぞれの状態において、健康な 21 〜 23 歳の女性延べ電図の R 波（図 4A）ピーク毎の間隔（R-R 間隔、図 4B）

験の解析により自律神経活動を測定できる心拍変動パワー

匂い物質として 1,8-cineole を用いた。cineole は、オキスペクトル解析法を用いた 19, 25）。心電図の測定、及び R-R

サイドという化学物質に分類される。オキサイドは酸素基間隔抽出には、パラマテック㈱製の心電計 EP-202（改良が２つの炭素基にはさまれた形になっており、特徴的なリ品）、及びソフトウェア R-R 間隔収集システム（特注品）

１）

ングを形成している 。cineole は、ハーブ系精油の主成を用いた。

分でユーカリ・グロブルス（75％）
、ニアウリ・シネオー

R-R 間隔収集システムで R-R 間隔を検出した後、高速ル（50％）、ローズマリー・ベルベノン（50％）などに多フーリエ変換（FFT）し、心拍変動パワースペクトルを

23）。また、構造異性体が存在し、今回用いた解析した。パワースペクトルの低周波数成分（Lo : 0.04 〜

1,8-cineole（図 2A）はハーブ類に、1,4-cineole（図 2B）は0.15 Hz）、高周波数成分（Hi : 0.15 〜 0.4 Hz）、Total（Loく含まれる柑橘類に含まれる24）

成分と Hi 成分の和：自律神経全体の活動の目安となる）。

1,8-cineole をシャーレに 100 µℓ（不快に感じない量）滴
A

B

CH3

の各スペクトル積分値と心拍数の時間変化を解析した。

CH3

O

O

H3C

CH3

H3C

CH3

図２ 1,8-cineole 及び 1,4-cineole の構造式
A：1,8-cineole
B：1,4-cineole
本研究では 1,8-cineole（A）を用いた。

図３ 暗算課題に用いたソフトウェア（ソフト名：100 ます
たー，vector フリーソフト）

図４ コントロール（無臭状態）の心電図及び R-R 感覚の変化
A：コントロールの心電図
B：R-R 間隔の時間変化− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

本実験では、Lo/Hi を交感神経活動指標、Hi/Total を副言”で記述したように、心周期にはこのような心拍変動と交感神経活動指標として用い、これらの指標の変化から呼ばれるゆらぎが見られ、これは洞結節（心拍リズムを決

cineole が自律神経に与える影響を解析した。

める場所）を支配する自律神経活動のゆらぎに由来していなお、FFT 及び t- 検定の解析には、ソフトウェア Origin7（OriginLab Co.）を、FFT 時の窓関数には、Hanning 窓を用いた 26）。

る 19）。
図 5 は、無臭状態（コントロール状態すなわち標準状態）のおける交感神経と副交感神経（迷走神経）の心拍数調

３．結節機能におけるパワースペクトルである。心拍変動パワー

果スペクトルには、低周波数成分（LF, 0.04 〜 0.15 Hz）と、

まず、コントロール実験として無臭状態で心電図を測定した（図 4A）。心電図には、P 波、Q 波、R 波、S 波、T 波、及び U 波と呼ばれる成分が存在する 25）。これらの波形成

高周波数成分（HF, 0.15 Hz 以上）の２つの成分が存在す
る 19）。
次に、cineole の香りが心拍数に及ぼす影響を測定した。図 6 中の 3，4 セット目において cineole の香りを分のうち、R 波同士の間の時間間隔は R-R 間隔と呼ばれ、 （図 6）
図 4A の矢印の間が 1 回の拍動の R-R 間隔に相当する 25）。

呈示した。四角印（コントロール状態）及び丸印（cineole

図 4B は、無臭状態の R-R 間隔の時間的変化を示す。“緒呈示状態）は、健康な 21 〜 23 歳の女性延べ 15 人の平均値である。図 6 では、cineole の香りによる心拍数変化を解析するため、cineole 呈示直前（第 2 セット目）の心拍数の平均値を 0 にシフトした。すなわち、図 6 の縦軸は 2
セット目を基準とした各セットにおける心拍数の変化を表す。cineole 呈示状態の方が全体的に心拍数が高い結果と

図５ 交感神経と副交感神経（迷走神経）の心拍数調節機能におけるパワースペクトルの差異
LF（0.04 〜 0.15Hz），HF（0.15Hz 以上）は、それぞれ低周波成分、高周波成分を表す。

図６ cineole の香りが心拍数に及ぼす影響
四角印はコントロール状態、丸印は cineole 呈示状態の平均値。各縦棒は標準誤差を示す。cineole の香りによる心拍数変化を調べるため、cineole 呈示直前（第２セット目）の心拍数の平均値を０にシフトした。すなわち、縦軸は２セット目を基準とした各セットにおける心拍数の変化を表す。

図７ cineole の香りが交感神経指標及び副交感神経指標に及ぼす影響
A：交感神経指標，B：副交感神経指標。四角印はコントロー
ル状態、丸印は cineole 呈示状態の平均値。各縦棒は標準誤差を示す。

− 122 −

化粧品の香料がヒト自律神経系に及ぼす生理学的効用の研究なった。また、両状態とも経時的に低下したが、cineole

４．考

呈示状態の方が、その低下率は小さくなる傾向にあった。

察

この変化が有意であるかを調べるため、0.05 レベルにおいcineole の香りは自律神経（交感神経指標・副交感神経て t- 検定を行った。その結果、4 セット目では p = 0.07 で指標）にはほとんど著明な変化を引き起こさなかった。し有意差に近い値を示した（1 セット目より、p = 0.33，0.46，

かしながら、cineole 呈示中は心拍数の低下率が小さくな

0.12，0.07，0.22，0.21，0.11）。

っており、また、心拍数増加では交感神経活動亢進が、心次に、cineole の香りが交感神経指標（図 7A）及び副交

拍数減少では副交感神経活動亢進が関与することから、感神経指標（図 8B）に及ぼす影響を解析した。図 7 では、

cineole 呈示で交感神経が活性化する傾向にある事が推測

図 6 の心拍数解析時と同様に、cineole の香りの効果を調される。さらに、パソコン上での暗算課題において第 6 セ

べるため、香りを呈示する直前（2 セット目）の各指標のット目に有意差が見られた事から、cineole の香りにより、平均値を 1.0 にシフトした。交感神経指標（図 7A）にお作業能率が向上したものと考えられる。

いては、1，3，6，7 セット目では、cineole 呈示状態の方

心拍数変化において、第 3 セット目に比べ 4 セット目のが平均値は高かった。しかし、t- 検定の結果、0.05 レベル

方がより強く効果が現れていた事から、cineole の呈示時において有意差は見られなかった（1 セット目より、p =間を長くすることや、その濃度を高くすることにより、自0.80，−，0.39，0.39，0.99，0.40，0.33）。副交感神経指標

律神経（交感神経指標・副交感神経指標）にも明確な変化（図 7B）においては、4 セット目と 5 セット目で、コントが現れる可能性があると考える。

ロール状態に比べて cineole 呈示状態の方が平均値は高く、大きな差が見られた。しかしながら t- 検定の結果、0.05
レベルにおいて有意差は見られなかった（1 セット目より、
p = 0.68，−，0.84，0.15，0.18，0.70，0.72）。

謝

辞本研究に対して研究助成を賜った財団法人 コスメトロ
ジー研究振興財団に厚く感謝致します。心電計の改良おさらに、暗算課題の正答率の変化から cineole の香り

よび R-R 間隔の検出ソフトウェアを快くご提供頂いたパが作業能率に及ぼす影響について検討した（図 8）。なお、

ラマテック㈱開発部 佐伯俊英氏に謝意を表します。また、暗算課題の問題数は、被験者それぞれにおいて 1 セットの実験に協力して頂いた藤田保健衛生大学 衛生学部 大日方

問題数を測定前に予め設定した（平均：1 セット 172 問）。

千恵さん、岡田絵美さんに感謝します。

したがって、セット毎で問題数が異なるということはない。第 1 〜 6 セット目では cineole 呈示状態の方が正答率（引用文献）

は高い結果となった。この差が有意であるかを調べるため、

１）川端一永，鮫島浩二，小野村健太郎，“医療従事者の0.05 レベルにおいて t- 検定を行った。その結果、6 セット

ためのアロマセラピーハンドブック”，メディカ出版，

目では、p = 0.05 で有意差が見られた（1 セット目より、p

大阪 , 1999. 32-33= 0.46，0.37，0.84，0.93，0.66，0.05，0.79）。

２）Holmes P : The Energetic of Western Herbs. Vol.1.
Artemis, Boulder, USA, 1989.
３）Coelho-de-Souza LN, Leal-Cardoso JH, de Abreu
Matos FJ, Lahlou S, Magalhaes PJ,“Relaxant effects ofthe essential oil of Eucalyptus tereticornis and its main
constituent 1,8-cineole on guinea-pig tracheal smoothmuscle.”, Planta Med, 71(12):1173-1175, 2005.
４）Kawai, F., Kurahashi, T. and Kaneko, A.,“T-type
Ca2+ channel lowers the threshold of spike generationin the newt olfactory receptor cell”，Journal of General
Physiology, 108: 525-535, 1996.
５）K a w a i , F . , K u r a h a s h i , T . a n d K a n e k o , A . ,“Nonselective suppression of voltage-gated currents byodorants in the newt olfactory receptor cells”，Journalof General Physiology, 109: 265-272, 1997.

図８ cineole の香りが作業能率（暗算課題）に及ぼす影響
四角印はコントロール状態、丸印は cineole 呈示状態の平均値。各縦棒は標準誤差を示す。

６）Kawai, F., Kurahashi, T. and Kaneko, A.,“Adrenalineenhances odorant contrast by modulating signal
encoding in olfactory receptor cells”， Nature− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

E.-I. “Linalool suppresses voltage-gated currents

Neuroscience, 2: 133-138, 1999.
７）Kawai, F., “Simulation analysis of effects ofadrenaline on spike generation in olfactory receptor

in sensory neurons and cerebellar Purkinje cells”，
Journal of Neural Transmission, 112: 193-203, 2005.
16）河 合 房 夫， 倉 橋 隆 ,“ 嗅 覚 器 ”，生 体 の 科 学 , 47(5),cells”，Chemical Senses, 24: 701-704, 1999.
８）Kawai, F., “Odorants suppress T- and L-type

482-485, 1996.

Ca2+ currents in olfactory receptor cells by shifting17）Narusuye, K., Kawai, F., and Miyachi, E.,“Spiketheir inactivation curves to a negative voltage”，

encoding of olfactory receptor cells". Neuroscience

Neuroscience Research, 35: 253-263, 1999.

Research, 406: 407-413, 2003.

９）Kawai, F. and Miyachi, E., “Odorants suppress
voltage-gated currents in retinal horizontal cells in18）河合房夫 ,“ハーブの香りを用いた臨床治療の神経生理学的研究”，Aroma Research, 22, 122-129, 200519）早野潤一郎 ,“心拍変動による自律神経機能解析”，循

goldfish”，Neuroscience Letters, 281: 151-154, 2000.
10）Kawai, F. and Miyachi, E.,“Direct suppression by

環器疾患と自律神経機能 , 71-109, 2001.

odorants of cyclic nucleotide-gated currents in the20）関根幸恵，寺門正顕，山岡淳，ケミリー園子，“女性newt photoreceptors”，Brain Research, 876: 180-184,の月経周期と香り—音の長短の弁別課題作業に及ぼす影

2000.

響—”，アロマサイエンス シリーズ 21 ⑦ 香りの機能性11）Kawai, F. and Miyachi, E.,“Modulation by cGMP ofと効用 ，13-14，2001.

the voltage-gated currents in newt olfactory receptor

21）岩橋基行：労働の科学，47（7），364（1992）

cells”，Neuroscience Research, 39: 327-337, 2001.

22）岩橋基行：aromatopia，15，35（1996）

12）Kawai, F. and Miyachi, E.,“Enhancement by T-type23）川端一永，鮫島浩二，小野村健太郎，“医療従事者

Ca2+ currents of odor sensitivity in olfactory receptorのためのアロマセラピーハンドブック”，173,150,196 ，cells”，Journal of Neuroscience, 21: RC144 (1-5), 2001.

1999.

+

13）Kawai, F.“Ca2+-activated K currents regulate odor
adaptation by modulating

spike encoding of olfactory

receptor cells”，Biophysical Journal, 82: 2005-2015, 2002.
14）Ohkuma, M., Kawai, F., and Miyachi, E.-I.“Direct
suppression by odorants ofionotropic glutamate

receptors in newt retinal neurons”，Journal of Neural
Transmission, 109: 1365-1371, 2002.

24）川井悟，“カンキツ類精油成分のがん抑制効果”，アロ

マサイエンス シリーズ 21 ⑦香りの機能性と効用 ，286，
2003.
25）熊田衛 , 瀬山一正“心電図”，標準生理学 499-509,
2000.
26）臼井支朗“生体信号のスペクトル推定”，生体信号処理の基礎 107-126, 1985.

15）Narusuye, K., Kawai, F., Matsuzaki, K., and Miyachi,− 124 −

皮膚ボディーイメージ評価尺度
Cutaneous Body Image Scale（CBIS）日本語版の作成
東京女子医科大学附属女性生涯健康センター

檜垣祐子

Cutaneous body image is defined as the individuals' mental perception of the appearance of their skin, hair, andnails. The concept of cutaneous body image is an important psychodermatological element both in skin diseases
that can affect the patients' appearance and in body dysmorphic disorders. To measure individuals' cutaneous body
image, practical and accurate instrument is necessary. In this study, we translated into Japanese, Cataneous Body
Image scale, 7-item instrument originally created by Gupta et al. using forward- and back-translation method. Sixbilingual persons whose primary language was Japanese translated the instrument into Japanese and produced aunique translation by consensus. Two bilingual persons whose primary language was English carried out backtranslations of the first Japanese version. The original Canadian author of the instrument reviewed both of the firstback-translations. Four doubtful items required a second back-translation to reach satisfactory agreement with theoriginal instrument. The Japanese version was pre-tested in a pilot group composed of Japanese adults with andwithout skin diseases and revealed to be comprehensive and have no problematic item for adaptation to Japaneseculture. In conclusion, we have developed a semantically equivalent translation of Cutaneous Body Image scale
into Japanese. The instrument seemed to be practical and useful to measure cutaneous body image of Japanesedermatological patients, though further evaluation of the measurement property is necessary.

１

緒

ボディーイメージの評価には、妥当性が評価された自言

記式尺度を用いて、その回答を解析するのが一般的であ皮膚は心理状態の影響を受けて変化し、羞恥で顔が赤くり、欧米ではいくつかの評価尺度が考案されている。皮なる、恐怖のために蒼白になるなど、情動を表現する器官

膚に関係する尺度としては、Multidimentional Body-Selfである。また同時に他人の眼に触れることから、コミュニ

Relations Questionaire

ケーションに影響を与え、反対に何らかのアピールの心理患者を対象として考案されてはいるが、皮膚疾患患者やが皮膚を場として表現されることがある。すなわち皮膚は、

一般人には適合しにくい上、煩雑で回答者の負担が大き

対人的、社会的コミュニケーションの媒体として重要な役い。このような背景から、Gupta らが 2004 年に皮膚のボ２）などが、主として形成外科手術割を果たし、皮膚の外見に関わる問題は周囲との人間関係

ディーイメージの評価尺度 Cutaneous body Image Scaleにさまざまな影響を及ぼしている。

（CBIS）を考案し、一般人を対象に計量心理学的検討を行
３）

自分自身の体や外見についての内部からの見方をボディい、その妥当性を確認した 。CBIS（図１）は皮膚全体、ーイメージという。ボディーイメージは誰にでもある身近

顔の皮膚、毛髪、爪の外見についての 7 項目の質問からなな自己の感覚で、一定のものではなく、個人個人で、またり、回答者は項目ごとに０：全くあてはまらない、から、９：個人の中でも様々な要因によって変動する。誰でも自分の非常に良くあてはまる、までの 10 段階の数字を選択する。

顔を直接見ることが出来ないように、自分自身の体は他の項目数が少なく比較的簡便な尺度で、回答者の負担が軽い。

人の体のように見ることが出来ないため、ボディーイメー

我が国では対象者のボディーイメージを適確に評価する、

ジの形成には自分自身の知覚に加えて、感情や思考が影響

実用的かつ国際的に通用する尺度はこれまで全く開発されする。さらにボディーイメージは対人関係や社会生活と関ていない。そこで今回はこの CBIS について、原作者の許連し、相互に影響しあう。従ってボディーイメージはかな

可を得て、言葉の同義性が保たれた日本語版を作成し、皮り多面的な要素からなる複雑な概念といえる 。

膚疾患患者や一般人のボディーイメージについて検討した。

１）

このボディーイメージの形成に皮膚は重要な役割を果たす。

1. I like the overall appearance of my skin
2. I like my complexion or overall color of my skin
3. I like the appearance of the skin of my face
4. I like the complexion or the overall color of the skin of
my face
5. I am very satisfied with my hair
6. I am satisfied with the appearance of my fingernails
7. I am satisfied with the appearance of my toenails

The Japanese version of Cutaneous
Body Image Scale
Yuko Higaki
Institute of Women’s Health, Tokyo
Women’s Medical University

図１− 125 −

３）
Cutaneous Body Image Scale（Gupta）の各項目

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

このような英語版の尺度を翻訳するには、文化的背景の違いなどが問題になる可能性があるものの、新たに日本語版ボディーイメージ評価尺度を作成する場合に比べて、時間、労力、費用が軽減できる利点がある。しかも国際的に通用しうる標準化された尺度が作成できるため、海外のデータともそのまま比較検討することが可能となる。

２
２・１

方

法

CBIS 日本語版への翻訳

CBIS 日本語版への翻訳は forward-back translation 法により行う（図２）。なお日本語版作成に関し、すでに2005 年 2 月に原作者である Gupta 氏の許可を得ている。
順翻訳は日本語を母国語とする医療関係者、非医療関係者計 6 名が、各々英語版から日本語版への翻訳を行う。６
つの日本語版を作成したのち、討議のうえ１つの順翻訳版

順
翻
訳

逆
翻
訳

原
作
者
の
評
価

翻 に翻
訳 ま訳
者 とを
６ め１
名 るつ

翻
訳
者
２
名

承原
を作
得者
るの
了

訳原
権作
を者
取よ
得り
翻

テパ
スイ
トロ
ッ
ト
改必
定要
に
応
じ

の計
た量
め心
の理
検学
討的
評
価

暫
定
版
完
成

図２ Cutaneous Body Image Scale（CBIS）日本語版作成手順

なお本研究は東京女子医科大学倫理委員会で承認を受けたものである（受付番号：964）。
患者の付添い人など皮膚疾患のない、一般人についても調査する。

にまとめる。次に英語を母国語とする逆翻訳者２名により、それぞれ逆翻訳を作成し、２つの逆翻訳について、英語版

２・３・２との言葉の同義性を原作者に照合する。問題のある箇所にGupta の原作についての計量心理学的検討

ついては、順翻訳、逆翻訳を繰り返し、言葉の同義性が保

方法
３）

にのっと

って行う。
信頼性（reliability）については、対象者に Cutaneous

たれた CBIS 日本語版（暫定版）を作成する。

Body Image Scale（CBIS）を施行し、Cronbach α（internal

２・２

Feasibility study

consistency）を計算する。

作成した日本語版（暫定版）について、一般人、皮膚疾

構造妥当性（construct validity）については得られた患患者各々５名に回答してもらい、不明確な表現や文化的

CBIS スコア（７項目の平均得点、低いほどボディーイメに問題のある項目があれば、再度順翻訳、逆翻訳を繰り返ージはネガティブ）につき、以下の仮説を検証する。
①年齢と逆相関し、問題点を修正する。

②男性＞女性

③結婚、教育の違いによる差がない。

２・３

計量心理学的検討

統計解析には SPSS11.5J を用いる。

得られた日本語版（暫定版）について、一般人および皮３

膚疾患患者を対象として、計量心理学的検討を行い、尺度３・１の妥当性を確認する。

結果

CBIS 日本語版への翻訳

言葉の同義性に関して問題になった部分は表１に示し２・３・１

た。項目１は順翻訳の外見「全体」という言葉が、逆翻訳

対象

東京女子医科大学附属女性生涯健康センターまたは東京者 A の１回目の逆翻訳で反映されなかったため、その点

女子医科大学皮膚科外来を受診した皮膚疾患患者を対象とを修正し、２回目の逆翻訳では general という語を加えて、する。調査にあたっては、回答者にプライバシーが侵害さ

原作者の了承を得た。項目 2、4 も同様であった。

れたり、患者が受ける今後の治療に不利益が生じたりする

項目５は大変満足の大変という言葉が逆翻訳者 A の１

ことは一切ないことを説明の上、承諾を得ることとする。

回目の逆翻訳で反映されず、２回目に very を加えて、こ

表1

CBISの原作および言葉の同義性が問題となった逆翻訳

原作

逆翻訳(第１回）

1

I like the overall appearance of my skin.

2

I like my complexion or overall color of my skin.

4

I like the complexion or the overall color of the skin of my face.

5

I am very satisfied with my hair.

同義性の評価*I like the appearance of my skin.
I like the overall appearance of my skin.
I like the color or complexion of my skin.
I like the overall color, or complexion, of my skin.
I like the color or complexion of my facial skin.
I like the overall color, or complexion, of the skin on my face.
I am satisfied with my hair.
I am very satisfied with my hair.

*同義性の評価:a,問題なし; b,問題あり− 126 −

b
a
b
a
b
a
b
a

皮膚ボディーイメージ評価尺度 Cutaneous Body Image Scale（CBIS）日本語版の作成

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

徴となる病態で身体醜形障害がこれに相当する。身体醜形

皮膚の外見全体が気にいっている
皮膚の色全体または色つやが気にいっている
顔の皮膚の外見が気に入っている
顔の皮膚の色全体または色つやが気にいっている
自分の髪に大変満足している
手の爪の外見に満足している
足の爪の外見に満足している

図３

障害は、米国では軽度のものも含めれば形成外科、美容外科、皮膚科受診者の６− 15％に達するともいわれており、これらの患者のボディーイメージを評価し、そのゆがみを把握しておくことは日常診療上、また治療上有益と思われる。
しかしながら、これまで外見の変化を伴う皮膚疾患におCBIS日本語版（暫定版）の各項目

けるボディーイメージの検討はほとんどなく、わずかに乾c Yuko Higaki 2007 禁無断転載

癬について、患者が否定的なボディーイメージを抱えていることが、QOL の評価尺度を用いた研究として報告されれも原作者の了承を得た。
これらの作業を経て、CBIS 日本語版（暫定版）（図３）を作成した。

４）ているに過ぎない 。この理由のひとつには、ボディーイ
メージの概念そのものが複雑であるために、皮膚のボディーイメージを簡便かつ適切に評価する尺度がなかったこと

３・２

Feasibility studyが上げられる。

作成した日本語版（暫定版）について、一般人、皮膚疾

今回著者らは、言葉の同義性を保たれた日本語版 CBIS

患患者各々５名の回答から回答の指示文中の「外見」がわを作成した。英語版の尺度を文化的背景の異なる日本語

かりにくいとのことで、「外見（見た目）」と修正した。質に翻訳する場合、いろいろな困難が付きまとう。翻訳に問項目自体の表現には問題はなかった。

関するガイドラインは主に英語から他のヨーロッパの言語への翻訳を対象にしているため、尺度の中に仮に日本

３・３

CBIS 日本語版の計量心理学的検討の文化になじまない項目があれば変更や削除を余儀なく

現在まで、皮膚疾患患者および一般人各々 150 人以上かされる可能性があるからである。幸いにして今回の翻訳作ら回答を得ており、解析作業中である。このうちすでに解業では大きな困難はなく、言葉の同義性を保った日本語版

析した患者群 50 人に限定した結果を以下に述べる。

CBIS を作成することができた。作成した日本語版 CBIS50 人の年齢は 16 歳から 75 歳、平均 40 歳で、性別は女

は feasibility

study、現在も進行中の計量心理学的検討

性 37 人、 男 性 13 人 で あ っ た。 婚 姻 状 況 は、 未 婚 24 人、を通し、文化への適合性について特に問題は生じていない。

既婚 21 人、その他５人であった。最終学歴については、

CBIS 日本語版の妥当性が十分確認された場合、その活

便宜的に 30 歳以上（31 人）に限定し、大学 18 人、それ用法としては、まず外見の変化を伴う皮膚疾患について、以外（中学、高校、専門学校）13 人で比較した。

患者のボディーイメージへの影響を把握し、その改善をめ

α 係数は 0.84 と高い信頼性が示唆された。

ざした治療を選択するための手段のひとつとなると思われ

CBIS ス コ ア は 全 体 で 3.33、 女 性 は 3.03、 男 性 は 4.16 と、る。また治療アウトカムの指標の１つとしてボディーイメ

女性の方が低かった（ｐ＜ 0.05）。CBIS スコアと年齢とのージの評価を行う際に用いることができる。さらにボディ

間には統計学的に有意な相関は見られなかった。婚姻状況

ーイメージの障害が中心的な問題となる身体醜形障害では、と CBIS スコアとの関連は、未婚者が 3.23、既婚者が 3.41

その症状の評価、治療の指標として CBIS を用いうると思で両者間に統計学的な有意差はなかった。最終学歴についわれる。また CBIS は広く一般人も対象となるため、化粧ては大学卒 3.63、それ以外 3.98 で、両者間に統計学的ななどの心理的効果の評価にも利用できるのではないかと予有意差はなかった。

想される。

Chronbach４

考このように CBIS は皮膚のボディーイメージをめぐるさ察

まざまな課題に広く用いることができ、その有用性が高い

皮膚に関するボディーイメージは「自分自身の皮膚、毛髪、爪の外見についての内部からの見方」である。実際にことが予想され、皮膚のボディーイメージ研究に大きく役立つものと考えている。

ボディーイメージが問題になるのは、大きく分けて、２つの場合が考えられる。第一には多くの皮膚疾患や外傷、熱（引用文献）

傷など実際に外見の変化を伴う場合、患者は否定的なボデ

１）加茂登志子、醜形恐怖とリハビリメイク、かづきれいこ、ィーイメージを持ちやすく、その改善は治療のアウトカム

田上順次編：デンタル・メディカルスタッフのためのリの一つとして重要である。第二には自分の外見に嫌悪感やハビリメイク入門、第 1 版、医歯薬出版、東京、2004、

不満を持っているが、他者から見ればそれに相当する問題

93-98 頁が無い場合がある。これはボディーイメージのゆがみが特２）Cash TF.:MBSRQ− 127 −

Users’
Manual. 3rd rev. Available

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

４）De Korte J, Sprangers MAG, Mombers FMC,

at:www.body-image.com
３）Gupta MA, Gupta AK, Johnson AM.: Cutaneous body

et al.:Quality of life in patients with psoriasis: A

image: Empirical validation of a dermatology construct,systematic literature review, J Invest Dermatol Sympo

J Invest Dermatol., 2004; 123: 405-406

Proc 2004; 9: 140-147− 128 −

●
平成18年度記念講演●

かづきれいこ㈶コスメトロジー研究振興財団
第 17 回表彰・贈呈式記念講演

顔と心と体について
フェイシャルセラピスト、歯学博士
REIKO KAZKI 主宰

かづき

れいこ
場所：日本薬学会

長井記念館ホール

日時：平成 18 年 11 月 16 日

リハビリメイク®とは自身の外観を受容できないため社会生活に支障をきたしている人が、現状を受け入れ、
元気に社会復帰するのを支援するためのメイクアップである 1）。講演は以下の構成でリハビリメイクの社会的役
割とその有用性について、示唆的な講演をいただいた。デモストレーションでは会場から希望者を募り、リハビ
リメイクの効果を非常にわかりやすく実演していただいた。
【講演概要】
1．リハビリメイクについて
2．症例紹介
3．聴講者をモデルにしたデモストレーション
4．結語［㈶コスメトロジー研究振興財団事務局記］
参考文献
1）日本香粧品学会誌，Vol.29，No.4，pp.335-339（2005）

Kazki Reiko
Facial Therapist
Doctor of Medical Dentistry
Superintendence of REIKO KAZKI− 131 −

コスメトロジー研究雑感

平成 16 年度

研究助成

高分子新素材開発とコスメトロジー
宇山浩

私はこれまで高分子新素材の合成と応用を中心に研究

私の研究室では天然素材を基盤とする高分子新材料のしてきた。学生時代に研究した高分子界面活性剤の技術が開発が主たる研究内容である。その中で、ヒアルロン酸、

応用されて、香粧品材料が実用化されるなど、コスメトロ

γ −ポリグルタミン酸といったバイオポリマーの修飾やジーに関連する材料を一貫して開発してきた。世間から見加工、カテキン、ビタミン C といった低分子機能物質のたコスメトロジーという学問分野に対する偏見は持って誘導体化を検討している。抗酸化力を増幅したポリフェノいなかったが、学問分野としての重要性、すなわち、材料

ール誘導体や多機能バイオポリマーゲル、バイオナノファ

設計・開発、皮膚医学などの融合的な異分野研究という認イバーなどを開発している。今までは、何となく、抗酸化識は無かった。当初は材料合成に留まり、機能評価まで自性が強いと化粧品に使えるのでは？

分で踏み込んで考えることをしなかったことが一因であえで香粧品素材を見ていたが、コスメトロジーや皮膚医学る。しかし、産学連携研究を積極的に行うようになり、企をわずかながらでも知ることで、どのようにすれば、皮膚業の研究者と直に交流することが多くなり、更に、昨年にでその機能を発現させることができるのか？

は化粧品メーカーの研究所を見学させて頂く機会を得て、開発した素材の使途を生医学の観点から考えるようにな

コスメトロジーに対する考えが一変した。皮膚における諸った。コスメトロジーの入り口に足ったにすぎないが、自現象の科学的解明とそれに基づく化粧品素材の分子設計分の専門とする天然素材を基盤とする高分子材料開発のを知り、自分でも香粧品素材の開発を行ってみたいと考え技術を香粧品素材に積極的に結び付けていければ、と考えるようになった。

ている。

という浅はかな考と自分で（大阪大学大学院工学研究科）

平成 16 年度

研究助成

セラミド入りボディーローション
船戸耕一

化粧品には全く縁がないと思っていた私だが、ここ数年

湿能の著しい低下であり、その主因は脂質代謝酵素異常に乾燥によるアトピー性皮膚炎に悩まされ、ボディーローシ

よるセラミド量の減少であることわかっている。セラミド

ョンのお世話になっている。暑い風呂を好み、くせで身体は外部から補給することが可能な物質であり、乾燥敏感肌をごしごし洗ってしまい、肌のお手入れなしとくれば、皮を伴う皮膚疾患に対する治療薬あるいは化粧品の素材と膚の乾燥もひどくなる一方でとにかくかゆくなる。かけばして大変注目されている。確かに私の身体にもセラミド入皮膚は赤くはれ、湿疹がさらに広がるという悪循環を繰りりボディーローションは効いているようだ。毎日のお手入返し、見かねた妻からセラミド入りボディーローションをれが大切という妻の言葉である。

手渡された。ひどくなってから強い薬に頼るより、日ごろ

さて、私の研究は、ヒトの皮膚に対して最も安全で高いから予防をせよということらしい。今や薬局には乾燥過敏効果が期待されるヒト型セラミドを効率的に生産するシ肌のためのローションが多く並び、そのなかから選んできステムを開発することを目標としている。まさに自分のたたらしい。妻はこういうものを買うのが好きで、自分でもめに始めたような研究であるが、まったくの偶然である。

あれこれ試しているようだ。

本研究の成果が私のみならず多くの人々のお役に立てれアトピー性皮膚炎や老人性乾皮症に共通する特徴は保ば幸いである。

− 135 −

（広島大学大学院生物圏科学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーと多糖ナノゲル
秋吉

一成

ドラッグデリバリーシステム（DDS）研究に関わるよ化学などの、比較的低分子の化学を研究していた。それまうになって、20 年近く経った。その中で、多糖からなるでに扱っていた分子に比べて、天然由来多糖は、分子量もナノサイズのゲルを開発し、ナノキャリアとしての有用性揃っておらず、分岐構造などもあり非常に複雑な高分子でを明らかにしてきた。特に、一昨年、ナノゲルを抗原タンある。化学修飾するとどんな溶媒にも溶けなくなる等、非パク質のキャリアとして用いた癌免疫療法に関する臨床応

常に扱いにくい物質であった。特に、水溶性の多糖に疎水用が始まった。たとえひとりの患者さんでも、我々の開発性基を導入した疎水化多糖の合成には苦労した。

した DDS によって病気の苦しみから解放できるならば望あきらめずにこつこつ研究をやっていると神様も微笑ん

外の幸せである。しかし、認可も含めて幅広い実用化に向でくれるようで、研究をはじめて３年くらい経ったころ、

けては、まだまだ時間がかかるのが実情である。

疎水化多糖が水中で集合してサイズの揃ったナノサイズの一方、そのナノゲルは、化粧品の素材としても優れてお

ゲル微粒子を形成することを見いだした。タンパク質を取り、４〜５年前から化粧液やヘヤトリートメントの中に添り込んで安定化し、タンパク質のフォールディングを補助加されて市販品として売られている。DDS 応用に先駆けするシャペロン機能が明らかになるなど、興味ある現象がて実用化したことになる。コスメトロジーの分野では、多見つかった。多糖は手なずけるまで苦労するが、その過程

糖は比較的よく使われる素材であろう。ナノゲル化技術にで種々の興味ある特性を示してくれる。コスメトロジー分より多糖の機能をさらに引き出すことに成功した。現在、

野での多糖ナノゲルの様々な応用を期待したい。最後にな

様々な機能を持ったナノゲルを開発している。素材としりましたが、本研究助成を頂いたコスメトロジー研究振興ては、特に天然由来多糖に注目している。多糖を扱い始め財団に心から感謝致します。
（東京医科歯科大学生体材料工学研究所）

たのは DDS 研究をはじめた時と同時期で 20 年前になる。
それ以前、私は両親媒性分子の自己組織化研究や有機金属

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーとリポソーム
吉本誠

リン脂質二分子膜ベシクル（リポソーム）は生体膜と同究課題では、酵素が存在しない条件下においてリポソーム様の基本構造を有する。リポソームは種々の物質を内水相が活性酸素である過酸化水素の分解反応を促進することをあるいは二分子膜中に保持することができる。したがって、示した。リポソームの過酸化水素分解促進機能は微弱ではリポソームは薬物担体や化粧品の開発において生体分子やあるが、リポソームが生体機能の維持に必要な種々の機能効能のある化合物を保護しながら目的の部位に送達するたを潜在的に有する可能性を示すものと考えている。このよめの“小さな入れ物”として有用と考えられている。リポ

うな観点から、リポソームは化粧品材料の開発において単ソームの主要な機能は上述の物質保持機能と脂質膜の選択なる入れ物の役割のみならず多様な機能を発現している可的物質透過性に起因している。両親媒性の脂質分子が自己能性がある。リポソームの活性酸素分解機能は現時点では集合することにより生まれるこれらの機能は、生命体が誕酵素に比べると非常に微弱であるが、リポソーム膜中にお生する極初期過程において重要な役割を担ったと考えられける脂質分子密度や脂質組成を改変することにより、実用ている。活性酸素は生命の進化の過程で重要な役割を担っ的に価値のあるレベルまでリポソーム活性が向上すると考たと考えられるが、脂質膜自体が活性酸素に対してどのよえられる。今後は、リポソーム自体が発現する酵素類似機

うに振舞うかについてはあまり知られていない。このたび能を活用した高い抗酸化機能を有する化粧品などの開発が財団法人コスメトロジー研究振興財団より助成を頂いた研期待される。

− 136 −

（山口大学工学部応用化学工学科）

コスメトロジー研究雑感

平成 16 年度

研究助成

血管からコスメトロジーを考える野口範子

ショウガ成分の抗酸化作用に関する研究を始めるにあた

うことに決めた（実は血管細胞の遺伝子発現データベース

り、あらためて従来より知られているショウガの効能につをもっていたから）。「健康な血管がつくる美しいお肌」をいて文献をあたってみた。解毒、解熱、その他風邪の諸症

自分あてのキャッチフレーズにして熱心にショウガのコス状の緩和など、私の知識内におさまるものに加えて美白、

メトロジー研究を遂行することができた。そしてショウガ

美肌とあった。やはり私も女性である。こういう言葉には

成分は、そんな私の期待を上回る優れた作用を、血管内皮弱い。それならばと、コスメトロジーの観点からショウガ細胞の遺伝子発現誘導を介して示すことが、研究を通して成分について研究をすすめることとした。当初はショウガ

わかってきた。それ以来、香り付けや臭みとりに入れたシ成分の抗酸化作用の評価だけを予定していたのだが、“美ョウガも食べるようになり、お寿司のガリは残した人の分

白、美肌”でショウガへの期待感を大きく膨らませてしまも食べるという執心ぶりをみせている。その効果ですか？

ったので、それだけでは飽き足らず、ショウガの遺伝子発

私は科学者でもあるので、被験者数が１で結論を出すなど現作用を調べることにした。コスメトロジーの研究であれということはしないのである。
（東京大学先端科学技術研究センター）ば、用いる細胞は皮膚を構成する細胞かとも考えたが、「美
しさは内面から」という言葉を思い出し、血管の細胞を使

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
太田

私は主に界面活性剤を含む両親媒性物質の溶液物性や会合挙動について研究しておりますが、研究対象を対外的に、明雄

更には乳化・分散といった製品製造に必要な技術にも界面化学が深く関わっております。

特に研究室に配属が予定されている学部の３年生などに説ところで素人の意見ですが、コスメトロジー製品自体は明する場合に、化粧品やコスメトロジーといった用語を多

既に完成の域に達しているように思われる一方で、連日の用しております。実際にはコスメトロジーの観点から研究

ように新しい商品や参入メーカーが現れ、新聞雑誌をはじしていることは（少なくとも今回の助成を頂くまでは）あめ最近はテレビショッピング、インターネットのバナー広まりなかったのですが、このようなキーワードを交えるこ告など多くのメディアから発信されております。このこととで、学生の興味をぐっと惹きつけることができるのです。

からも人の美に対する欲求に上限がないことを実感させら

ここで改めて界面活性物質や界面化学をコスメトロジーのれます。そこにニーズが存在する限り、コスメトロジー分

観点から考えてみますと、両者は切っても切れない関係で野に対して少しでも新技術や新製品の種になるような研究あることが思い知らされます。コスメトロジーは主に皮膚成果を発信していけるよう努力していきたいと思っておりを対象にしておりますが、その皮膚自身そのもの外界と生ます。最後になりますが、この度コスメトロジー研究振興

体とを仕切る境界（界面）であります。また皮膚の構成物

財団より助成をいただくことができ、大変光栄に思います

質はまぎれもなく界面活性物質です。またコスメトロジーと同時に深く御礼申し上げます。

製品の作用として必要な、保湿・洗浄といった作用機構、− 137 −

（金沢大学大学院自然科学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

平成 17 年度

研究助成

コスメトロジー研究によせて手老龍吾

本助成金に応募するとき、私は「コスメティック」とい基板上でいかにして細胞膜内で起きる複雑な反応を再現すう言葉から「化粧品」という製品そのものだけを連想して、

るか、というのは研究分野内での重要なテーマの１つにな含まれる成分と機能のことばかりを考えていました。採用

っています。ところが、「コスメトロジー」という立場かされた方々の研究が、医薬・生物学はもちろん、心理学やら考えると、無機固体表面が系を構築する重要な要因の１

文化論にまで広大な範囲におよんでいるのを見て新鮮な驚

つに様変わりします。無機微粒子 / 細胞膜界面のモデルときを感じるとともに、自分の視野の狭さを恥じ入るばかりして、微粒子を高分散させるための界面活性剤として、脂でした。これでは自動車を作るのにエンジンとタイヤを組質膜と固体表面の相互作用を知ることで貢献できることがみ立てることばかり考えて、乗る人を無視しているのと同

いろいろありそうです。また、脂質膜をのせる固体基板とじ。それでも採用していただいたけたのは、財団の選考委してはマイカ、シリカ、チタニアなど、化粧品基材として員の先生方の懐の広さと、「乗る人」として妻からのアドも使われている素材が用いられている点も共通しています。

バイスのおかげだと思っています。

これは「生化学的に不活性な材料」という必要条件を考え私の研究では、固体基板上に形成した脂質二重膜に表面れば当然のことなのかもしれませんが。この新しい視点を科学的にアプローチしようと試みています。人工脂質二重得ることができたことは、今後の私の研究にとっていただ

膜を細胞膜のモデルとして使うことは昔から行われていまいた予算以上に貴重な財産になると確信しています。本研

すが、多くの場合、無機物は変性を引き起こすマイナス要究案を採択していただいたコスメトロジー研究振興財団に因として捉えられてきました。この課題を克服して、固体心から感謝申し上げます。

（分子科学研究所）

平成 17 年度

研究助成

胃粘膜と皮膚との類似性
水島

徹

胃私はこれまで消化管粘膜、特に胃粘膜の研究をして参の変化が、肌荒れやしみなどの原因になっていると考えらりました。ご存知の様に胃粘膜は様々なストレスに曝されれています。そこで私は、胃粘膜の研究で明らかになったています。アルコール（お酒）、熱、細菌（ピロリ菌）、経事を皮膚の研究に応用する事によって全く新しい皮膚の口投与された毒性のある薬物（非ステロイド系抗炎症薬

研究、すなわちコスメトロジー研究が出来るのでないかとなど）に胃粘膜は曝され、これら胃粘膜ストレスによる細考えています。本研究も、胃粘膜を様々なストレスから守胞死、及びそれに伴う炎症誘発が胃潰瘍などの様々な疾患

る熱ショックタンパク質（HSP）の誘導剤が様々なストレの原因となっています。一方、胃粘膜細胞は大変代謝回転

スから皮膚を守り化粧品としても有用ではないかというの早い細胞で、一週間でほぼ入れ替わると考えられていま考え方から行われています。今後も、これまで胃粘膜研究す。この代謝回転の変化も、胃癌や胃潰瘍の原因になるとで得た経験を生かしながら、新しいコスメトロジーに対す言われています。この様な胃粘膜、及び胃粘膜関連疾患のる研究を行っていきたいと考えておりますので、よろしく

性質は皮膚細胞のそれとよく似ています。皮膚も外界と接お願い申し上げます。最後に、本助成金を賜りましたことしているため熱、乾燥、毒物など様々なストレスに曝されを深く感謝申し上げます。

ています。また、皮膚細胞も代謝回転している事が知られています。そしてストレスによる皮膚細胞傷害や代謝回転− 138 −

（熊本大学大学院医学薬学研究部）

コスメトロジー研究雑感

平成 17 年度

研究助成

本研究のコスメトロジーに及ぼす影響五十嵐理慧

従来の化粧品や医薬部外品は、皮膚に効果効能のある薬

然効果を期待している。また、最近は IT 革命によって情物を配合して製造している。年齢を重ねるとともに皮膚の報を簡単・迅速に入手することができるために、消費者も細胞の活性化は低下し、顔面にはメラニン色素の沈着やコ化粧品に関する科学的知識を豊富に持っている。このようラーゲンの減少・破壊によるしわの形成が顕著となってくな背景から、今後は効果を伴わないイメージだけの化粧品る。幼少期もしくは若年期には、たとえ怪我をしても自然の開発には限界があるだろう。本来化粧品とは、どのように直す力すなわち自然治癒能が高いため、紫外線暴露下でなものであるべきなのだろうか。薬物を使って特異的に作も沈着もしわの形成もほとんど見られない。薬物による強用を期待するよりも、むしろ本来装備されている生きるた

制的細胞活性や、予防ではなく、本来備わっている自然治めの機能である自然治癒能を高め、細胞を活性化し、自ら癒のメカニズムを呼び覚ますような化粧品の開発が、我々皮膚を再生させる力を付けさせる化粧品が必要ではないだの研究テーマである。今回の研究で皮膚に液晶を塗布する

ろうか。加齢とともに細胞は元気を失っていくが、外的刺と、皮膚のホメオスタシスが誘発され、皮膚再生作用が惹激などによりまだまだ機能を発揮できるはずである。今後起されることを実証することができた。薬物を使用するこは、キャッチコピーだけではなく、本当に本質を伴った化となく、皮膚再生が促される現象を発見し、今後は本研究

粧品、いや医薬と化粧品が融合したような cosmedics な成果を元に新しい化粧品開発を進めたいと考えている。

分野の構築が必要になると考えている。

化粧品は薬理効果を明示してはいけないが、消費者は当（聖マリアンナ医科大学難病治療研究センター DDS 研究室）

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーの観点から見た本研究
宇谷厚志

マトリックスと美容といえば最近は、ヒアルロン酸、グ

私も、大学院のころよりマトリックス研究をはじめ、年

リコスアミノグリカン、数年前は、コラーゲンという具合

月の経つのは早いものですでに 20 年を超え、この間に私に２つの関連づけが、なにやら一大ブームといった感さえの真皮マトリックスも老化し、たるんできた。私はもっぱある。皮膚の「肌理、皺、張り」といった老化事象がまさら真皮コラーゲン、基底膜のラミニンの研究をおこなってしく「皮膚細胞外マトリックス」の老化、変性による現象

きたが、また皮膚科医として創傷治癒との関連でマトリッであることからこのような流行を生んだのではないかと推クスに関心を持ってきた。幸いなことにとうとう本研究に測する。私個人の考えでは外用、または食物として摂取すあるように角化細胞へ作用し、様々な生理活性を引き起こることがどれほどの効果を皮膚に与えてくれるかは、まだすアミノ酸配列をラミニン５の中に見出した。これを合成

確実ではないと考えている。しかし足りなくなったら外かペプチドで作成し研究を行っている。合成ペプチドを使えら補うというシンプルな発想に基づいて細胞外マトリック

ば老化した皮膚でも表皮基底細胞活性化を起こし、皮膚をスを真皮に注入したり、レチノール酸外用で膠原線維をふ

生き生きと若返りさせ得るのではと考え、いよいよ「若返やしたりして、肌を若返らせる手法は美容皮膚科ではルー

りのクリーム発売」の実現かと 2007 年の初夢をみている

ティンで施行されている。現在、マトリックスはその量をところである。
（京都大学大学院医学研究科皮膚生命科学講座）増やす方向でコスメティックに深く取り込まれている。

− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーの観点から見た本研究藤原作平

現時点ではコスメトロジーとは関連性の大変薄い私のえば表皮や角層の厚さなどは何によって規定されているの基礎研究（表皮細胞におけるエピプラキンの機能）に対か？といった問題についてはまだ研究されておりません。

して助成をいただき、コスメトロジー研究振興財団の皆第一シグナルは真皮側に存在し（Yamaguchi ら，J Cell

様に、厚く御礼申し上げます。エピプラキンは表皮下水

Biol, 275-,2004）、それが表皮に伝わるのかもしれませんが、疱症患者の血清が認識する自己抗原として同定された分

さらにそれがケラチンの種類を規定したり、ひいてはエピ子ですが、表皮細胞内に局在しており、その病的意義はプラキンを含む中間径フィラメント結合蛋白質を規定した

まだ解明されておりません。またそのノックアウトマウ

りしている可能性があります。エピプラキンのカルボキシ

スも、現時点で明らかな表現型の異常は見つかっておら末端の 5 回の規則的繰り返し構造が順に切断されている証

ず、創傷時の表皮細胞移動が野生型より速いという現象

拠があり、それが表皮細胞の空間的、時間的差異を表現ししか捉えられておりません。しかし何らかの疾患あるいているのではないかと考えています。もしこれが事実であは病態に必ず関与していると信じ、現在研究を進めていまるならば、エピプラキンは表皮細胞の分裂・老化や部位特す。真皮の体の部位による違いについては、いくつかの論

異的なマーカーとなりうると考えられます。これはまだ仮文で報告されていますが（たとえば Yamaguchi ら，Arch説の段階ですが、いつか近い将来この仮説を検証してみた

Dermatol,621-628,2001）、表皮の体の部位による違い、例

いと思っています。

（大分大学医学部皮膚科）

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーとフォトニクス
佐藤俊一

毎年 1 月下旬，米国のシリコンバレー（San Jose, CA）

ングや多光子マイクロスコピーであるが，さまざまな新技においてフォトニクス（光学）の生体応用に関する世術も注目されている。その一つである光音響診断法は，高界 最 大 の 国 際 シ ン ポ ジ ウ ム，BiOS（Biomedical Optics

コントラストで深さ分解計測ができることから，皮膚中のSymposium）が開催される。とにかく巨大なシンポジウム

メラニン，ヘモグロビン等の診断にピッタリである。しかで，基礎から臨床，診断と治療，先端技術を網羅し，今し研究の方向（少なくともこのシンポジウムにおける）は，

年は論文数が 1,300 を越えた。常時 10 〜 20 のセッション

微細なイメージングや病気の診断を向いており，コスメト（Conference）が進行しているため，聞きたい発表をフォ

ロジーの観点より取り組んでいる例はほとんど見ない。特ローするために広い会場を駆け回ることになる。この中で許検索をすると関係企業からの出願も見られることから，

皮膚科，皮膚科学関係の発表は大変多い。そもそも皮膚はその観点での研究も行われているのであろうが…。いずれ

最も「光」を受けやすく，また人目につきやすい組織。人にしても，今回貴重な助成をいただき，本技術の有用性を

目は「光」を介しているのであるから，フォトニクスの会

確認できたのは大変有意義であった。コスメトロジー界に議で皮膚の話が多いのも当然である。皮膚科・形成外科専おける新ツールとして表舞台に立つ資質十分であると確信

門の Conference も勿論あるが，各種診断・イメージングした。

技術の Conference においても，皮膚を対象とした研究発（防衛医科大学校表は多い。ここ数年目立つのはマルチスペクトルイメージ− 140 −

防衛医学研究センター情報システム研究部門）

コスメトロジー研究雑感

平成 16 年度

研究助成

紫外線教育とコスメトロジー
松田尚樹

大学の地域貢献が必要とされる昨今、放射線施設で放射の細胞応答の流れの中で、紫外線を浴びてしまった後の健線安全管理を行なう傍ら紫外線の研究を進めている立場

康影響を低減するには、どこをどう変化させれば良いの上、出前授業など学外での放射線教育と紫外線教育に関わか、を問うていることにもなる。今回、助成していただいることが多い。正しい知識に基づいて健康影響とその防御た研究では、一つの突破口としてサイトカインを介したを理解していただきたいという目的は、課題が何であれ同

autocrine な DNA 損傷修復促進系に着目してみた。質問

じであるが、ともすれば安全神話確立のための恣意的な教をしてくれた彼らに、胸を張って答えられるだけのまで結育になりやすい放射線教育と異なり、健康影響の日常性と果には至っていないが、サイトカインなど液性因子の産生実感を伴う紫外線教育は聞く側との一体感が生まれやすの調節は生薬や天然物素材のお得意とするところであり、い。これは、対象が小学校の生徒、保護者から、大学生、

コスメトロジーとの相性は良いといっていい。

大学院生にいたるまで同様である。そこで、いくつかの根

さて、いくつかの教育では、受講者のリスク認知度の調

本的な質問に出会うことがある。
「紫外線の防御法はわか査を行なうようにしている。受講後の「紫外線ケアせずにりました、でも浴びてしまったら、もう、どうしようもな

真夏に屋外運動をする」のリスク認知度は、「原子力発電いのですか？

所の近隣で生活する」とほぼ同程度で、「アメリカ産牛肉

浴びてしまったあとにも効くような、何かを食べる」、「シンドラー社製エレベーターに乗る」などよ

いい薬や化粧品はないのですか？」
紫外線を受けた細胞では DNA 損傷が生じ、活性酸素種

りはるかに高くなる。紫外線教育と、紫外線から健康を守が発生し、あるものは修復し、あるものは除去され、そしるコスメトロジーの社会的重要性は、これほどまでにも高てシグナル分子が伝達され遺伝子発現が変化し、最終的いと感じている。
（長崎大学先導生命科学研究支援センター）に細胞の運命が決定する。彼らの素朴な疑問は、この一連

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
古川哲史

本研究助成では薬用人参の美容・育毛に対する影響のが捜し求めた様子が伺える。これらとともに、生薬の中に検討を行った。薬用人参を研究対象としたのは全くの偶

は長寿の薬・若返りの薬と言われるものも多く知られてお然であり、教授として着任した研究室に留学していた中り、今回研究対象とした薬用人参はその代表選手のようで

国人大学院生が研究しており、残り２年間指導をしなくてある。昔から若くありたいというのは万人の強い願望であはならなかったためである。中国からの大学院生がその有ったことが推測されるが、“アンチエージング”というし効性を熱く説明してくれるのであるが、最初は疑心暗鬼でゃれた呼び方で最近とみに注目が高まっている。最近医学指導に取り掛かった。結果として、薬用人参の主成分であの世界でも evidence based medicine が注目されており、る ginsenoside が植物エストロゲン作用を有することを明

以前は薬の作用メカニズムから有効であろうと予想してらかにすることが出来た。生薬のことを勉強していくうち治療が行われてきたが、きちんと大規模試験を行って有効に、極めて奥の深いものであることが分かってきた。生薬性が確認されたものを選択しようという至極あたりまえはネアンデルタール人の頃から使われており、主に麻酔・のアプローチが再認識されている。その点、生薬は有効で喘息・狭心症に有効な生薬が多く知られている。これは、あるというエビデンスが長年多くの人々により証明され昔狩に出て怪我をした時、これを治療する時に麻酔作用をてもののみが生き延びてきているので、そのメカニズムを有するものが必要であったこと、病気の中でも喘息・狭心追求することから“アンチエージング”に対するヒントが症が人々に特にひどい苦痛を与えていたことを意味して得られることが期待される。

おり、必然性にかられてこれらに有効な植物を古代の人々− 141 −

（東京医科歯科大学難治疾患研究所）

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

平成 16 年度

研究助成

皮膚常在酵母とコスメトロジー
伴野朋裕

ある種の酵母からは優秀な美白成分や保湿成分が得らとともに角化と脂質代謝も亢進させれば細胞間脂質に富れるが、皮膚常在酵母のひとつであるマラセチアは今までんだ厚い角層ができるので好脂性であるマラセチアの生悪役と見なされてきた。古くは癜風の病原微生物として、存には有利となるであろう。同時に、その変化が過剰でな

最近ではアトピー性皮膚炎や脂漏性皮膚炎の増悪因子とければ適度に潤いがあって丈夫な表皮となり、皮膚にとっしての認識が定着しつつある。本研究においても、あまりてもメリットかもしれない。腸内の微生物フローラはビタ

洗顔をしない高齢者の顔面から多種多様なマラセチアがミンの代謝吸収や病原菌の増殖阻止に重要な働きをして検出され、一部のマラセチアにおいては老人性いぼ（脂漏いる。皮膚のフローラにも何か重要な役割があるはずであ性角化症）との関連も示唆された。しかし、マラセチアはる。頻回かつ強力に洗顔をする現代人は、人類の歴史のな

本当に人肌にとって悪なのだろうか。私にはマラセチアとかにあっては特殊な存在だろう。長年、適度に汚れた人肌

ケラチノサイトが共存しているように思えてならない。確に慣れ親しんできたマラセチア族にとっては、宿主の急激かに増え過ぎれば問題であろうが、本来マラセチアは、大な生活習慣の変化が巨大な天変地異であるに違いない。年

好きな脂質たっぷりの毛穴の中でひっそりと棲息し強い齢、性別、生活習慣の違いなどでダイナミックに変化する

炎症を惹起することはない。実際、マラセチアと共培養しマラセチア族のフローラが人類の皮膚にとってどのようたケラチノサイトのサイトカイン発現誘導は比較的弱かな意味をもつのか、コスメトロジーにとっても興味深いテった。彼らは、激しい争いを好まず、安全で暖かい洞窟のーマだと思う。

なかで三食昼寝つきでのんびり暮らしているような生き（筑波大学人間総合科学研究科皮膚病態制御分野、
六町皮フ科クリニック）

物なのかもしれない。今回の転写プロファイリングの結果が示すように、マラセチアによってケラチノサイトが増殖

平成 16 年度

研究助成

コスメトロジーの観点から見た本研究の展開
輪千浩史

皮膚は加齢にともない、
伸びて縮まない状態、
つまり“し終わった。この要因として、エラスチン線維の足場タンパ

わ”となる。これは、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラス

ク質の低下とトロポエラスチンの分解によると考えられた。

チンなどの結合組織が、加齢・紫外線・活性酸素・ストレ

今後、足場タンパク質として注目されているフィブリリン

スなどで質的・量的変化に起因すると考えられている。一やフィブリン 5 の線維構機序を明らかにすることは、エラ

般に、肌の張りや弾力を保つ弾性線維の主成分はエラスチ

スチン線維形成の機序解明とともに最重要課題であると考ンであり、エラスチンの減少が肌の老化と密接に関与してえる。さらに、トロポエラスチンの分解に関与するエラスいる。スキンケアの多くは、不足した結合組織を補うこと

ターゼや MMP の阻害剤や分解酵素に対して抵抗性のあるを目的としているが、エラスチン線維を標的としたものは組換えトロポエラスチンを用いることで、効率よくエラス少ない。エラスチンの前躯体（トロポエラスチン）を肌にチン線維を構築できると思われる。今後このような視点か処理することでエラスチン線維を補充することができれば、ら研究を進めることで、ヒトの皮膚に対する機能的な弾性より機能的な肌を維持することが可能であると思われる。

線維の再構築に大きく寄与し、いつまでも若々しい肌の維

しかし、エラスチン線維を生体内で再構築した報告は少な持つながる魅力的なスキンケア製品の開発につながること

く、本研究結果からも、培養系でのエラスチン再構築は可を期待する。

能であったが、3 次元培養でのエラスチン再構築は失敗に− 142 −

（星薬科大学臨床化学教室）

コスメトロジー研究雑感

平成 16 年度

研究助成

元皮膚科医？のざれごと
竹田

私は医学部を卒業し、いったん皮膚科医を選択しました

潤二

ら手をつけていいのか皆目見当がつきませんでした。

が、その後、基礎医学研究者に転身しました。本格的に基その欲望は基礎医学に移っても変わる事なく持ち続けて

礎医学に移るとき、ずいぶん悩んだ記憶があります。皮膚いるつもりです。今回の研究テーマもそのラインに沿った科医？だった頃は、主に生化学的手法で研究を行っていまものであることはいうまでもありません。ただ、皮膚の分した。しかし、もっとも興味があったのは、何故あんなに化のメカニズムの秘密を明らかにするには、まだ少々時間

見事に秩序だって基底細胞は分化して行き、最後は垢にながかかるような気がしております。それを明らかにした暁って脱落して行くんだろうということでした。その現象をには、皮膚を内面からきれいにするという概念に少しでもなんとか、実験医学的手法で明らかにしたいという欲望はお手伝いができるかもしれません。
（大阪大学

大変大きいものでした。しかし、当時の私の実力では何か

医学系研究科）

平成 17 年度

研究助成

身勝手な提案國貞

少し前にある中堅化粧品企業の研究責任者の方と話をする機会があり、育毛薬もさることながら、数でいえば白髪隆弘

を魚などとにかく維持費の安いものに変えようという話さ
え出てきます。

を気にしている人の方がずっと多く、化粧品のターゲット

いろいろな方の言ういろいろな状況は少なくともある面

としては実に魅力的ということでした。毛染めで十分でしでは事実であり、研究といえども世の中を支えている様々

ょうという問いには、毛染めの手間と効果の短さを考えるなシステムの一部に過ぎず、ことさらに擁護すべきものでと、風呂上がりの頭皮にすり込むだけで色を取り戻せる薬もないのでしょうが、これまでいろいろな方と共同研究なは大変魅力的であるとの返答でした。

どをしてきて、多くの知的な人には面白い研究に対して他事の真偽はともかく、ではうちのマウスや実験系（そのの何ものに変えがたい魅力を感じる性質があるように思い話の前にＥＳ細胞から無尽蔵に色素細胞幹細胞を取り出すます。研究するという伝統を後世に残すためにも、大学と話などで盛り上げておいたのですが）を使って色素細胞幹企業が今はやりの新製品の開発のみを指向した産学協同で細胞の研究をしませんかという段になると急に話がしぼみ、はなく、たとえば「色素細胞の毛包への移動を制御していおきまりの企業経営者の研究に対する無理解、昨今のデフる分子の探索」のような基礎的なテーマで共同研究を行う

レに伴う企業収益の低下、はては製品化までにかかるコス

状況が生まれないかと考えます。修士で就職が基本の日本

トの上昇など、全ての社会状況が基礎的な研究をしない理の学生には継続的で蓄積的な高度な基礎研究は困難で、医由になるのだなと感心したものです。我々も同じで、講座

学部では基礎研究を選ぶ医師も激減しています。企業にと運営費の一律カット、研究の重点化、教育への一層の傾注、っては、アメリカなどの大学や研究機関との共同研究が、納税者への説明責任を果たすための様々な自己評価、学生

こと生物科学の基礎研究に関しては合理的な選択とも思いの学力の低下などをすべて研究をしないこと、してもうまますが、20 年先日本の大学生は留学する以外医学生物学のく行かないことへの正当化に利用してしまいます。昨今の基礎研究（ひょっとしたらかなりの応用研究も）をすると研究費の不正利用を受け、研究費の執行は厳密を極め、未いう選択肢はないという状況になったら、寂しいことです。

使用研究費の納入業者への預け金などもってのほか（法的面白い研究をするのにそうお金がかからないことは、実際にはもちろん当然のことですが）、私のように臨床との関多くの企業の研究者の方もご存じと思います。たとえば、わりが少ない者にとっては、もし科学研究費が取れなけれ企業の研究者が本来の研究のほかに一つ基礎的な研究テー

ば、その年はマウスが維持できないことになり、研究対象

マを持ちそれに関して 3 割程度の時間を割く自由があれば、− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

継続的で深みのある基礎研究が行えると思います。そうい

まり役に立ちそうもないけれど語りだしたら止まらない研

う時間で我々との共同研究をしませんかという誌面を借り究テーマを持っているというのは楽しいでしょうね。
（岐阜大学大学院医学系研究科）

た誠に身勝手な提案なのですが、企業の多くの研究職があ平成 16 年度

研究助成

私の化粧歴
吉田

寿美子

私と化粧の歴史は大学に入ってから始まった。化粧水と室に通って勉強もした。その後化粧療法に関する研究を通乳液を使用してスキンケアを行うようになった。20 歳のして、高齢者への化粧や化粧教室での指導も行った。今ま記念には母からメイクアップの道具を貰った。早速化粧をで色々な研究を行ってきたが、これ程喜ばれた研究はなかしてみた。その頃は化粧の仕方も分からず、自己流で行っった。研究を通して化粧を行う自分も幸せな気分になった。

たところ、却ってブスになったように感じた。しかも、翌指導した高齢者はどんどんきれいになっていく。何より表

日肌がボロボロになってしまった。顔中に赤い湿疹ができ

情が明るくなる。「化粧はすごい。」と感じた。しかし、私て、皮膚科を受診して治療を受けなければならなくなった。

の化粧は高齢者程の成長はなく、ある程度の化粧技術を身これをきっかけに「化粧」は恐い、化粧は塗ったり落としにつけてからは、スキンケアが主な化粧に戻ってしまった。

たりと面倒なことと思うようになった。自分の結婚式や披

但し、スキンケアは丁寧になり、肌に負担にならない程度

露宴に招待されたときは肌が荒れるのを覚悟でプロに化粧の日焼け止めをほぼ毎日つけるようにはなった。きれいにを依頼していた。

化粧をしている人をみると「すてきだな。
」と思えるよう転機が訪れたのは、平成 15 年に現在所属する大学の健にもなった。

康福祉学科に異動した時である。
「これからは健康や福祉

今は仕事が忙しく自分に化粧をする余裕がない。私は本に関する研究も行わなければ」と考えていたところ、同僚格的な化粧は 60 歳を過ぎてからと考えている。研究からから高齢者の化粧療法を聞いた。また、担当する学生にそ化粧は良好な老い（の受容）に貢献する可能性があると感の話をしたところ大変興味を示し、一緒に研究しようといじたからである。

（仙台大学体育学部健康福祉学科）

うことになった。学生に引きずられるようにして、化粧教

平成 16 年度

研究助成

心とコスメトロジー
古郷

美しいということはどういうことだろうと考えることがある。オーストラリア

ブリスベンに最近行くことがあり、

幹彦

横顔のラインが美しいとされる。鼻の頂点と上唇の先端、下唇の先端、オトガイの突端を結ぶ直線のことである。こ非常に美しい町であった。この美しいは私にとって心地よ

れらの点が一直線並ぶことである。そのかみ合わせにあわいという意味である。では人が美しいとはどういうことか。

せることが非常に重要となる。その上で化粧をすると客観

外見が美しいというのは、他人が見てか、本人が見てか。

的に非常に美しくなる。ただの唇と鼻を結ぶラインである

やはり美しい人というのは周囲の人が見てであろう。ヒトが、これにたどり着くには非常に苦労する。しかし非常に全体からの雰囲気がなんとなく心地よさを人に与える時、いい雰囲気の患者様がこのラインを獲得した時、治療する

人は美しいというのではないだろうか。今回の研究テーマ

側としては“してやったり”の感がある。今回口唇裂の患である口唇口蓋裂治療でもやはり美しいというのは患者様者様に化粧を指導することにより口唇裂の手術瘢痕を見え

本人の雰囲気が大きく影響しているように思われる。顎のなくして患者様は非常に喜びました。しかし、化粧をする

発育においてもいわゆるイーセティックラインと呼ばれる

前からあなたはイーセティックラインを既に獲得し、美し− 144 −

コスメトロジー研究雑感

いですよと言いたかった。確かに化粧を指導したあと患者係に直視することができました。本研究を助成いただいた様の雰囲気が変わるのを肌で感じることができました。化

コスメトロジー研究財団に心から感謝いたします。

粧が患者様の心まで変化させたのです。同じ人でも化粧後（大阪大学大学院歯学研究科
顎口腔病因病態制御学講座口腔外科学第一教室）

輝いて見えることすらありました。あらためて美と心の関

平成 17 年度

研究助成

香りとコスメトロジー
河合房夫

化粧品には、様々な香料が利用されている。ハーブなどられる。すなわち、匂い物質は嗅細胞だけでなく、中枢神の香り成分である精油（エッセンシャルオイル）は、アロ経系の神経細胞にも何らかの影響を及ぼす可能性が考えら

マセラピーとしても広く用いられている。これらのエッセれる。しかしながら、そうした仮説を裏付ける科学的証拠

ンシャルオイルの匂い分子を吸入することにより、鼻腔内は、ほとんどない状況である。

の嗅上皮存在する嗅細胞に活動電位が発生し、その電気的我々の研究グループでは、化粧品などに含まれる匂い物

信号が嗅球、大脳辺縁系などに伝達される。その結果、自質が、個体レベルで自律神経系に及ぼす影響の解明を目指

律神経系、免疫系、および内分泌系などに作用することにし、研究している。こうした基礎研究成果は、将来的には、

より、様々な生理的効果が現れる。一方、精油の匂い分子

香りという観点から生理学的に有効な化粧品の開発の足がは肺経由で血液中に溶解することにより、直接的に大脳辺かりになるものと考える。

（藤田保健衛生大学医学部）

縁系および視床下部などの脳神経系に作用する経路も考え

平成 17 年度

研究助成

皮膚ボディイメージとコスメトロジー
檜垣「本当に頭がいいと思う。ボディイメージみたいな複雑

祐子

います。

な概念を、たった 7 つの項目でまとめてしまうなんて」と、CBIS は皮膚のボディイメージを評価するために考案さ共同研究者（精神科医）は言いました。Gupta の考案した

れ、皮膚の外見、色つや、髪、爪に関する必須の７項目で皮膚ボディメージ評価尺度 Cutaneous Body Image Scale

構成され、皮膚に関するボディイメージを大まかに把握す（CBIS）をはじめて見たときのことです。

るのに適しています。皮膚疾患があって外見の変化を伴う

ボディイメージの形成には、自分で見て、知覚できる自分自身の外見だけでなく、個人のそれまでの経験や社会的場合のみならず、一般人のボディイメージの評価にも使用できるものと考えています。

背景も影響を及ぼします。小麦色の肌が美しいとされたり、CBIS が皮膚ボディイメージ評価のためのツールとしてあくまでも白い肌がもてはやされたり、その時々で変化す

今後広く用いられ、皮膚に関するボディイメージに対するる社会の価値観に左右されて個人のボディイメージは変動

関心が高まり、この分野の研究の発展につながれば、ボデするわけです。ボディイメージはこのように多面的で、非ィイメージの問題に悩む人たちに役立つのではないかと考常に複雑な概念であるため、その評価には困難がつきまとえます。

− 145 −

（東京女子医科大学女性生涯健康センター）

●
事業報告書（平成18年度）
役

員●

事業報告書事 業 報 告 書

（自平成 18 年 4 月 1 日

至平成 19 年 3 月 31 日）《研究助成等の選考関連》
2006

5

8

公募開始

全国 265 ヶ所の大学・病院・研究機関等、関係学術雑誌８誌、当財団 HP
他２HP に掲載

7

3

公募締切り

応募数 88 件

9

8

選考委員会（分科会１）

素材、物性に関する分野の選考

9

7

選考委員会（分科会２）

生体作用、安全性に関する分野の選考

9

11

選考委員会（分科会３）

精神、文化に関する分野の選考

921

本選考委員会

各分科会の結果を総合的に判断して研究助成 23 課題、国際交流援助１課
題を選考

11

16

表彰贈呈式

記念講演：｢ 顔と心と体について ｣フェイシャルセラピスト・歯学博士・REIKO KAZKI 主宰

11
2007

16 〜

2 中旬

かづきれいこ先生

助成課題の公表

関係学術雑誌７誌、当財団 HP に掲載

持ち回り企画委員会

平成 19 年度の研究助成課題選考に関して

通常理事会

平成 17 年度事業報告ならびに収支決算報告、第９期評議員の選任、理事長《理事会関連》
2006

6

14

及び専務理事の互選、選考委員の選任、株主としての議決権行使について、
報告事項
11

16

通常理事会

平成 18 年度（第 17 回）研究助成者等の承認、
平成 19 年度事業計画及び予算案の承認《評議員会関連》
2006

6

14

通常評議員会

平成 17 年度事業報告及び収支決算報告、第９期理事及び監事の選任、報
告事項

11

17

通常評議員会

平成 18 年度（第 17 回）研究助成者等の承認、
平成 19 年度事業計画及び予算案の承認

《その他》
2006

3

末

6

末

12
2006

5

19

財団活動の情報更新

当財団 HP へ平成 18 年度事業計画を記載
当財団 HP へ平成 17 年度事業報告を掲載

コスメトロジー研究報告「コスメトロジー研究報告」14 号の概要を当財団 HP に記載

基本財産

保有株式が無償分割により 1,163,323 株から 1,279,655 株へ− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

第 17 回研究助成を受けられたかたがた（J：一般研究助成、H：国際交流援助）

管理番号J-06-01

J-06-02

J-06-03

J-06-04

J-06-05

J-06-06

J-06-07

研

究

課

題

分

紫外線カット機能材料の開発と化粧品関連素材（ヘアカラーおよび UV カット用品）への利用に向けての基礎研究
好熱菌由来カロテノイド化合物の生体膜安定効果の研究
圧電材料基板上のマイクロ流路を用いた単分散多相
エマルション生成法の開発

ツバキ油に含まれるトリテルペンの生合成研究

肌の質感を容易に評価するシステムの開発

化粧品素材の皮膚アレルギーにおける新規スクリー
ニング法の開発
中高年者の化粧行動の変動様態と前頭葉認知機能との関連に関する神経心理学的研究

野

染料
染色学
色彩学
界面化学
生体材料学
生物工学
コロイド化学
表面化学
天然物化学

光学
計測工学

神経心理学
認知心理学
皮膚科学
分子生物学

J-05-09

再構築培養皮膚および角膜を用いた遺伝毒性の評価

皮膚科学
遺伝毒性

J-06-11J-06-12

J-06-13

J-06-14

J-06-15

索およびその機能解析
ヒアルロン酸で被覆したキトサン微粒子へのタンパ
ク質のカプセル化と機能評価

各種有効成分の効率的な皮膚内送達方法の開発

心地良い香り、及び不快な香りの慣れ（adaptation）
現象−呼吸パターンと脳内活動部位推定の検討−

老人性色素斑ダーモスコピー画像の自動定量ならびに治療と化粧によるQOL評価改善
光照射による分子集合体の構造変換及びその機能化に関する研究究者

大阪教育大学教授

織

田

博

則

大阪府立大学大学院
理学系研究科生物科学専攻教授

原

正

之

西

迫

貴

志

雅

明

東京大学大学院
薬学系研究科助教授

渋谷

国立木更津工業高等専門学校
機械工学科助教授

小田

生物資源利用学
皮膚科学
分子細胞生物学
生体高分子
糖鎖工学
細胞生物学
薬物送達学
呼吸生理学
神経生理学

皮膚科学

功
健

治

武

志

名古屋大学大学院
環境学研究科教授

八田

東京薬科大学
生命科学部教授

深見希代子

国立医薬品食品衛生研究所安全性
生物試験研究センター薬理部室長

小

島

肇

筑波大学大学院生命環境科学研究科
北アフリカ研究センター助教授

礒

田

博

子

慶応義塾大学
理工学部生命情報学科教授

佐

藤

智

典

昌

夫

大阪大学大学院
薬学研究科助教授

近

藤

昭和大学
医学部第二生理学教室兼任講師

政

岡

ゆ

り

東京女子医科大学
東医療センター皮膚科助教授

田

中

勝

大阪大学大学院

工学研究科生命先端工学専攻助手
光化学
ナノテクノロジー

水− 150 −

研

接触アレルギー 産業医科大学
皮膚科学助教授
光接触アレルギー
椛 島
安全性試験

毛形成におけるホスフォリパーゼCδ１の機能解析

地中海アロマ植物からの白髪予防生理活性物質の探表

ナノ･マイクロ科学 東京工業大学
精密工学研究所助手

J-06-08

J-06-10代

上進事業報告書

管理番号

J-06-16

J-06-17

J-06-18

J-06-19

J-06-20

J-06-21

J-06-22

J-06-23

研

究

課

題

分

野

代

表

研

慢性掻痒性皮膚疾患における表皮内末梢神経伸展因

皮膚科学

富山大学大学院
医学薬学研究部講師

子の探索

神経科学

安

皮膚科学

慶應義塾大学
医学部皮膚科学教授

表皮細胞接着因子のバイオイメージング法の開発

皮膚を覆う「毒素のデパート」ブドウ球菌は、なぜ多様な毒素を作れるのか：ゲノムからのアプローチ

人前化粧における意識

細胞生物学
分子医科学
細菌学
ゲノム科学
社会心理学

皮膚線維化過程における骨髄由来細胞の動員とそのコラーゲン産生能に関する研究
メラノサイト由来リポカリン型プロスタグランジン
Ｄ合成酵素が関与する皮膚組織の恒常性維持機構
化粧品のリスク認知に関する心理学的研究−安全とリスクのバランス−
化粧による高齢者の行動変容：高齢夫婦の女性配偶者の化粧による男性配偶者のquality of lifeの向上と生理学的反応の変化

皮膚線維症治療

分子生物学

社会心理学
神経生理学
自律神経学
脳波解析学

天

東
谷

究

者

嗣

修

雅

行

東京大学大学院新領域創成科学研
究科および東京大学医科学研究所
教授

小

林

一

三

岡山大学大学院
社会文化科学研究科

塩

田

真友子

東海大学
医学部基盤診療学系助教授

稲

垣

豊

東北大学大学院
医学系研究科教授

柴

原

茂

樹

名古屋大学大学院
教育発達科学研究科助手

元

吉

忠

寛

大分大学
医学部脳・神経機能統御講座助教授

徳

丸

治

イリノイ大学シカゴ校教授

H-06-01

細胞情報伝達における脂質・タンパク質相互作用の研究

Wonhwa Cho

受入責任者
昭和大学薬学部教授

工

藤

一

郎

（敬称略・受付順）※第１回〜16回の研究助成課題はホームページ（http://www.cosmetology.or.jp/）でご覧ください。

− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

役

員
平成 19 年３月 31 日現在

理事長

小林礼次郎

専務理事（常勤） 有本
理

監

事

事

評議員

磯邊

亨
律男

㈱コーセー代表取締役会長（元厚生省薬務局安全課長）㈱博報堂 相談役（元国税庁長官）

宇佐美昭次

早稲田大学名誉教授

内山充

有限責任中間法人薬剤師認定制度認証機構理事長

小林

保清

髙橋

久

新村

嘉也

高砂香料工業㈱代表取締役会長

西川武二

慶応義塾大学医学部名誉教授

花輪隆昭

昭和館 館長（元厚生省援護局長）

廣部雅昭

静岡県学術教育政策顧問

牧野利孝

日本化粧品工業連合会専務理事（元厚生省生活衛生局食品化学課長）㈱コーセー代表取締役社長
帝京大学名誉教授

小田倉正典

公認会計士

黒田

節哉

弁護士

石倉

伸治

㈱コーセー常務取締役

上野芳夫

元東京理科大学薬学部教授

緒方宏泰

明治薬科大学教授

北原文雄

東京理科大学名誉教授

近藤保

東京理科大学名誉教授

齊藤

勲

日本製薬団体連合会理事長（元厚生省大臣官房審議官）

多島新吾

防衛医科大学校教授

長野

哲雄

東京大学大学院薬学系研究科教授

西岡

清

野呂

影勇

早稲田大学大学院人間科学研究科教授

溝口昌子

聖マリアンナ医科大学名誉教授

宮崎榮三

東京工業大学名誉教授

山崎幹夫

新潟薬科大学学長

横浜赤十字病院院長（専務理事以外は全員非常勤）− 152 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒103−0027 東京都中央区日本橋三丁目７番20号
電話 03（3278）5561

コスメトロジー研究報告

Vol.15／2007

非売品

2007年９月１日発行

編集責任者
発
行

制

作

印

刷

有本 亨
財団法人

エイエム企画〒170− 0013 東京都豊島区東池袋三丁目15番２号
電話 03（3590）5375

太陽印刷工業

表紙デザイン監修：㈱コーセー
2007

コスメトロジー研究振興財団〒103− 0027 東京都中央区日本橋三丁目７番20号
電話 03（3278）5561

商品デザイン部デザイン室不許複製

禁無断転載