皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究
新潟大学医学部

小野輝夫

A novel skin-type fatty acid-binding protein, termed cutaneous(C)-FABP was pu­
rified to homogeneity from rat skin cytosol by DEAE-cellulose chromatography, fol­
lowed by chromatography on Mono S and Superdex 75 gel filtration. Although the par­tial amino acid sequence of C-FABP was homologous to those of known rat FABP fami­ly, especially heart FABP, C-F ABP was distinct from them with respect to the immunological properties and an apparent molecular mass.

ー． 緒 言最近Razaら 4) はネズミ皮膚のエビデルマ ー ルサ
イトゾ ー ル に 分子量14-15kDaのFABPが存

一般に各種動物組織のサイトゾ ー ルにはその細在することを示唆している他、 S churerら 5) は胞 種に 特異的な分子量約15kDaの低分子で、脂ヒト の培養ケラチ ノサ イ トで66 kDaおよび38

肪酸を特異的にリガンドにする脂肪酸結合蛋白kDaの 高分 子FABP の 存在 を 示 唆 し たほか(FABP)のス ー パ ー ファミリ ー 蛋白が発現されM adsen 6> も 乾癬と関連したFABP様蛋白が活ている。 これ らのFABPは細胞の機能発現、脂発に増殖している乾癬真皮で高度に発現されてい肪酸転送、代謝上重要な働きを演じていると考えることを報告しているが、FABPファミリ ー とられるが、これまで肝臓、心朦、骨格筋、脂肪細の関係は明確でない。 我々は皮膚組織を構成す

一胞、腸組織、ミエリン鞘などから 次構造の異なる各種細胞が活発なタ ー ンオ ー バ ー を行っている

る肝型、心筋型、脂肪細胞型、腸型、 シュワン細ことから、脂肪酸も活発に代謝されていると推定

I

胞型が 同定されている . 2) 。 この蛋白ファミリー

し、FABP分子種の検索をネズミ皮膚については脂肪酸の他細胞内に見出される低分子のレチ行った。

ノール、レチノリン応蛋白ス

ーール酸結合蛋白をも包含するミエ2. 実 験

パ ー ファミリ ー と呼ばれている。

この他に もリガンドを既知の脂肪酸やレチノールなどと同定出来 ないが、明らかにこのファミリ ー

2. 1に属するI-15P蛋白も我々の研究室で見出され
3)

ネズミ皮膚サイトゾ ー ルの調製

体重300gスプラグ・ダウリ ー ネズミ(6匹）の背、皮膚組織でのFABPに関部皮膚5cm平方を電気カミソリで剃毛後切り出する報告はこれまで少なく 一次構造は不明である。

し、出来るだけ皮下脂肪組織を除いた後、 氷冷生

報告されているがBasic Studies on lipid metabolism of skin:lden­tification of Fatty Acid-Binding
ProteinTeruo Ono
School of Med1cme
Niigata University

理的食塩水に浸し 細片して30mMトリス塩酸緩衝液pH 7.3 (5mM EDTA、 2 mM PMSF、lmM DTTを含む）内でポリトロンホモゲナイ
ザ ー を用いてホモゲナイズした。 得られたホモゲ
ネ ートは30分lOOOOXg で遠心後さらに125000Xgで90分超遠心してサイトゾ ー ルを調製した。

-115-

2.2法 8) により測定した。 先ずエタノ ー ルに溶解し

C-FABPとH-FABPの純化た放射性脂肪酸と C-FABPあるいはH-FABP

ネズミ皮膚 サイトゾ ー ルを 30mMトリス塩酸緩衝液pH8.0(5mM EDTA、 2mM PMSF、 1をlOmM燐酸カ リウム緩衝液pH7.4で37℃1時

mM DTTを含む）で透析後、 上記緩衝液であら間培養した。 培養の最終容量は 500IL 1で 各構成かじめ平衡化したDE-52(2.5cm X 15cm)の陰分の最終濃度はC-FABPあるいはH-FABPはーイオン交換樹脂カラムに適応した。 50mM 2 モ

0.3µM、 エタノ ー ルは容量比で1%、 脂肪酸 0.2

ルフォリンエタ ン硫酸緩衝液pH5.5で溶出させ-20µM C比活性 12000dpm/nmol)を用いた。

た時の非吸着画分を集めて透析後、 同じ緩衝液で10分間氷冷後反応混液に氷冷 50%Lipidex懸i蜀

あらかじめ平衡化させたベットボリュウム 1ml

液 75叫を添加し 4℃10分間培養した。 LipidexのMono Sカラムにかけ、 同じ緩衝液で洗浄後、は15000 X g 5分遠らで除き上清の200叫を液体各緩衝液 60mlを用い 0-0.5MNaClのリニアグ

シンチレ ー ションカウンタ ーで 放射能を 測定した。

ラジエントで溶出した。 180-190mM NaClに3. 結果と考察相当する画分をプ ー ルし 50mM燐酸カリウム緩衝液pH7.0であらかじめ平衡化したHiload 26/60ス ーパ ー デックス 75カラム(2.6cm X 62cm)に3 .1分子的性状適応した。 C-FABPはSDS PAGE上単ーな分

ネズミ皮膚より調製した各精製段階でのc­

子量 約 15kDaの蛋白として精製された。 心筋型

FABP標品のトリ シン SDS PAGEパタ ー ンをのH-FABPは既に報告した方法で ネズミ心筋よ図lに示した。 ネズミ皮膚のサイトゾ ー ル試料に”り精製した。

混在した血清 アルプミンは陰イオン交換樹脂に吸着して除かれたが、 C-FABPは非吸着画分とし2.3

アミノ酸配列の決定て回収され、 陽イオン交換樹脂に吸着することか精製したC-FABPをリジルエンドペプチダ ー

ら C-FABPの等電点は塩基性かそれに近い値をゼ(Achrobacter lyticus)で酵素／基質蛋白比1:持つと推定された。 純化したC-FABPのSDS20(重量比）で 80mMトリス塩酸緩衝液pH8.5中PAGE上の移動度は純化したH-FABPよりもで 25℃8 時間i肖化を 行った。 得られたリジルエンやや遅かった。 6匹のネズミ皮膚（各 5cm X 5ドペプチダ ー ゼペプチドは高速液体クロマトのcm)より1.0�1.2mgのC-FABPを得 たがこれCH Capcellpackカラム(0.46 X 15cm)で分画しは総サイトゾ ー ル蛋白の約1%に相当した。 従っ

た。 容量で 0.1% TFA中に アセトニト リルのリて C-FABPは他のFABP分子種と同様に正常ニアグラジエントで溶出させた。 ペプチドの溶出な ネズミ皮膚サイトゾ ー ル中に豊富に存在する蛋は214nmの吸光度で追跡した。 アミノ酸配列の白の一つといえよう。

分析は120Aフェニルヒダントイン分析計を備えたアプライドバイオシステムの470Aガス相配列

3 .2

部分一次構造精製したC-FABPは既知の一 次構造を異にす分析装置で行った。

る FABP 分 子種で あ る 、2. 4

H-FBAP 、 L­

FABP、 I-FABP、 aP2、 I-15Pに対するポ脂肪酸結合能の測定

Lipidex 1000および[1-14cJステ アリン酸

リクロナル抗体を用いたウエスタ ー ンブロット分はシグマおよびアマ ー シャムから購入した。

析で全く検出されず、 免疫学的に明らかに識別さFABP蛋白からの脱脂およびC-FABPと H­れ、 新しいファミリ ー蛋白である可能性 が示唆さ

FABPに対する脂肪酸の結合は教室の人見の方れた。 他のネズミ FABP分子種と 一 次構造を 比-116-

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

5432ー(kDa),

97.4-66.245.031 . 0-

21. 514. 4-

L-FIIDP
1-F八DP
11-FIIBP
C-Fl\BP19 2129 31181
MNFSGKYQVQSQENFEPFM
l\MG!.l'EDLl
KGKIJ I Kt'V
KMGlNVVKRMIIFUGTWKVYRNENYEKFMLGIIIIDN!.K
SLGVGFATR
ADIIFVGTWKLVIJSKNFODYM
VIISM'l'KP'I'
ELGVGL紅R
WRLVESIIGFEDYM
MGAM八KPD

t.-FIIDP
1-FIIBP
H-Fl\HP
C-FIIBP79 10967
127
l'l'N'l'MTLGUlVYKRVSKR lEECELE'l'M'l'GEKVl.lOTY'l'YEGVP.I\KHlFKKE
VDFI\YSLIIDG'l'EI,VEFDEVTI\DlJRKVI. I 1.1'!.'l'IIGNVVSTR匹EKE!\lJVVEXVMNNI\J XTRVYETEXFXTFLDGI\LV

Fig.2“一Partial amino acid sequences of rat
FABPs. Numbering is based on the pri 一mary structure of L-FABP. Identicalamino acid residues of C-FABP with other
FABPs are indicated by bold faced types.
Unidentified amino acid residue is ind1cat­
ed as X. L-FABP, liver FABP; 1-FABP,intestine FABP; H-FABP, heart FABP; C-F ABP, cutaneous FABP.

端近傍で も部分的相同性を示したが、 N端近傍に比しややホモロジ ー は低かった。 これらの結果は既知のFABP分子種の構造的特徴を備えており 9) 、 C-FABPがFABP分子種のメンバーであることを強く示唆する。 また興味深いことに

Fig.1

Tricine/ SDS/ PAGE of rat cutaneous
FABP at various stages of purification.
The gel was stained with Coomassie bril. ―liant blue. Lane 1, rat skin high speed su­
pernatant (25µg of protein) ; lane 2, DE52 flow through (10µg of protein) ; lane
3, Mono S fraction (18µg of protein) ;lane 4, purified cutaneous FABP (0.6µgof protein) ; lane 5, purified heart FABP(2µg of protein).と同 ー ではないが進化的に極めて近縁の関係にあることが示された。 さらに極く最近報告されたヒ卜乾癬と関連するFABPと高度の相同性を示し
た 6) 。 しか しヒトの乾癬と関連したFABPはノ ー ザンプロットでは正常のヒトケラチノサイト
では乾癬時のケラチノサイトに比べ極めて発現量は低く、 我々が今回正常ネズミ皮膚より得た c­

較するため にC-FABPの部分アミノ酸配列を決
ペプチダ ー

FABP分子種の中で も C-FABPは H-FABP

ゼFABPは豊富な蛋白であり、 ヒトの乾癬時に増消化とそのペプチドを高速液体クロマ トグラ

加するFABPとの同 一性が今後明らかに されね

フィ ー で分画して得られたペプチドマップの主要ばならないと思われる。 少なくとも乾癬化障害の5つのビ ー クについてアミノ酸配列を決定した。

病理はFABPと密接に結び付いていると考えら

図2にはネズミC-FABPの決定した部分アミノれ、 ケラチノサイトの増殖分化に果た すFABP酸配列の分析結果を示す。 リジルエンドペプ チの役割が今後の研究対象となろう。

定した。 C-FABPのリジルエンド

なダー

ゼ処理C-FABPから遊離された5つのペプチドの配列分析は、 完全配列の約45%を含むと3.3脂肪酸結合能推定された。 C-FABPのN端は他のFABP分純化したC-FABPとH-FABPの放射性ステ子種同様おそらくアセチル化によりプロックされアリン酸結合能を図3に示す。 双方の蛋白ともスc­

テアリン酸結合能を示すが、 H-FABPに比べ若FABPのN端近傍の配列は他のFABP分子種と干C-FABPは親和性は低かった。 ステアリン酸

極めて高い相同性を示した。 一方C-FABPのC以外にパルミチン酸、 オレイン酸、 リノ ー ル酸、て い る と推定され決定出来な か ったが、

-117-

cDNAのクロ ー ニングを行っており、 今後cD­

0.2

NAの構造、 エクソン構成について合わせ報告すの相違点およびケラチノサイト増殖分化での役割ー゜OE u)31\llcl\13 1S O N n O CDる。 ヒトの乾癬と関連して報告されたFABPとが今後の課題である。

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Stear1c acid was incubated with 150 pmol
FABP at 37℃ for lh. Unbound fatty acidwas separated from bound fatty acid byLipidex 1000.
アラキドン酸でも同様な結果が得られた。

c­FABPは脂肪酸をリガンドできるが、 未知のリ

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我々はネズミ皮膚より低分子のFABPを精製し、免疫学的性質、部分アミノ酸配列、 脂肪酸の結合能を基盤にFABPファミリーに属する完全に新しいメンバーの蛋白であることを明らかにした。 目下アミノ酸の部分配列を基にC-FABPの-118-

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