特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用
早稲田大学先進理工学部化学・生命化学科

小出隆規

Many collagen-binding peptides have been reported to date. However, most of them seem to be below a practical level.
Some do not possess enough affinity to detect collagen, and the others show little binding-specificity to collagen. We report
here novel collagen-binding peptides that hybridize to denatured portions of collagen. They are parallel dimers of collagenlike peptides both ends of which are tethered by covalent linkages. The peptides, named cyclic collagen-mimetic peptides(cCMPs), showed approximately two orders of magnitude higher collagen-binding affinity than single-chain counterparts
reported by Yu and co-workers. The collagen-detecting sensitivity of cCMPs was comparable to commercially available anticollagen polyclonal antibodies in western blotting, and fluorescent staining of cultured cells. No collagen type selectivity
was found, and the peptide recognized all types of collagen tested. In contrast, the peptides showed strong preference todenatured collagen. The results strongly support the common hybridizing mechanism targeting unfolding strands of collagen
triple helix. Molecular dynamic simulations of the hybridized products suggested that the cCMP-collagen hybrid has higher
stability than that of the corresponding hybrid with single-chain CMP. Some diseases such as osteoporosis and malignant
cancer are suggested to be accompanied by collagen denaturation and/or degradation. It is also suggested that inflammationand mechanical stress also induce collagen denaturation. We expect practical applications of cCMPs to detecting
conformational status of collagen in vivo.

１．緒言

コラーゲンは動物体内のいたるところに豊富に存在するタンパク質である。コラーゲンに特異的に結合する分子は、生体内でのコラーゲンの検出や描出あるいは、薬物をコラーゲンリッチな組織に停留させるといった目的で有用であると期待されている。これまでに多くのコラーゲン結合ペプチドが様々なソースから探索されてきたが、実用に耐え

図 1 CMP の変性コラーゲン結合モデルa) 一本鎖、 b) 二本鎖および環状 CMPる特異性あるいは親和性を有するものはほとんどなかった。
その中で、Yu（ユタ大学）らのグループは、Gly-Pro-Hyp（Hyp： 4 - ヒドロキシプロリン）の繰り返し構造を持つ、典型的なコラーゲンモデルペプチド（CMP）が、変性コラーモデルとして利用されてきたことからもわかるとおり、水ゲンに結合することを見出し、これを上記のような用途に溶液中で容易に自己集合して、三重らせんを形成してしま利用しようとする研究を展開している。CMP はコラーゲう。そして、一旦三重らせんを形成した CMP は、コラーンの三重らせん構造がほどけた部位を認識し、ハイブリッゲン結合能を失うという問題点がある。

ド三重らせんを形成することで結合すると考えられている今回私たちはコラーゲン結合ペプチドとしての CMP の（図 1 a）。彼らはこの CMP を用いて、周辺でコラーゲンの能力を格段に向上させることを目的として、CMP を二本分解が亢進していると考えられている悪性腫瘍を埋め込ん平行に束ねた二本鎖 CMP を設計した。一本鎖の CMP は変1）だマウスの in vivo 蛍光イメージングに成功している 。ま

性コラーゲン中の二本のポリペプチド鎖と三重らせんを形た彼らは、マウスの尾の腱を引っ張ることによって腱のコ成する（1 + 2 hybrid）と考えられる。その一方で二本鎖ラーゲンが変性することを定性的に評価することに成功し

CMP は変性コラーゲンの一本のポリペプチド鎖と三重ら2）ている 。しかしながら、CMP は、古くからコラーゲンせんを形成する（2 + 1 hybrid）と期待できる（図 1 b）
。私たちは三重らせん分子内部のペプチド間を共有結合で架橋させると三重らせん構造が安定化する 3 - 6） ことから、2 + 1

Molecular design, synthesis and applicationof the peptides that specifically recognize
collagenhybrid の方が 1 + 2 hybrid よりも安定であり、結果としてTakaki Koide
Department of Chemistry and Biochemistry,
School of Advanced Science and Engineering,
Waseda University

た。また、二本鎖 CMP のもう片方の末端も束ねた環状

二本鎖 CMP は一本鎖 CMP よりも高い結合能を持つと考え
CMP も同時に合成し、これらのコラーゲン結合能を評価した。

− 16 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用

2. 方における吸光度を測定することでコラーゲン結合能を評価法した。

2 . 1. 環状 CMP の合成にチロシン残基を導入し、ペプチド溶液の濃度を吸光度か

2 . 3 . 環状 CMPを用いたコラーゲンの検出（westernblotting）

ら求められるようにした 7）。枝分かれ部分には Fmoc-Lys

コラーゲン検出能の比較においては、サンプルとしてⅠ（Fmoc）-OH を用い、ペプチドを二本に分岐させた。分岐型コラーゲンを用いた。Ⅰ-Ⅴ型コラーゲンの検出におい部分のスペーサーとして 6 - アミノヘキサン酸（Ahx）を導ては、300 ng のⅠ-Ⅴ型コラーゲンに対してタンパク質分入した。コラーゲン様配列としては三重らせんモデルして子量マーカーを混合したものを用いた。これらサンプルを最も典型的な Pro-Hyp-Gly を採用し、トリペプチドの繰り8 % SDS-PAGE により分離したのち、ニトロセルロース返し数が 4 回のものから 7 回のものまでを合成した。また、膜上に転写した。その後 5 % スキムミルク溶液を用いてブN 末端側に Cys（Acm）基を導入し、ジスルフィド結合をロッキングし、20 µg/mL のビオチン標識環状 CMP 7、一用いて環化できるようにした。N 末端はピリジンと無水酢

本鎖 CMP 溶液または抗コラーゲン抗体を添加し、室温で酸を用いてアセチル化した。ペプチド鎖は脱保護カクテル

1 時間放置した。環状 CMP 7 および一本鎖 CMP は使用直（TFA : H 2 O : m-cresol : thioanisole : ethanedithiol = 82 . 5

前に 95 ℃で 5 分間加熱した。続いて CMP を添加したもの: 5 : 5 : 5 : 2 . 5 , v/v）を用いて脱保護すると同時に樹脂からに対してはビオチン - ストレプトアビジン相互作用を用い切り離した。て alkaline phosphatase（AP）を標識し、抗体を添加した

ペプチド鎖は Fmoc 固相法を用いて構築した。C 末端側

二本鎖ペプチドは 6 M グアニジン塩酸塩下においてヨウも の に 対 し て は goat anti-rabbit IgG（H+L）secondary

素で処理することによりジスルフィド結合を形成させるこ

antibody-AP conjugates を添加して 30 分間結合させた。とで環化した。得られた粗ペプチドは、逆相高速液体クロ

続いて AP-conjugate substitute kit（BioRad）を用いてバマトグラフィーを用いて精製した。環状 CMP は検出のたンドを検出した。また、コラーゲンを転写したニトロセル

め、ビオチンまたはフルオレセインを標識した。

ロース膜は同時に、CBB 溶液を用いて染色した。

2 . 2 . enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）
によるコラーゲン結合能の評価

2 . 4 . コラーゲンの蛍光染色
マウス線維芽細胞（MEFs）は L- グルタミン酸、フェノーコラーゲン溶液（AteloCell I-PC, 高研）を 10 mM 酢酸水

ルレッド含有 DMEM（low-glucose）に 2 % FBS、100 units/を用いて 10 µg/mL に希釈し、溶液を 95 ℃で 5 分間加熱処

mL ペニシリン - ストレプトマイシンおよび 200 µM L- アス

理を加えたもの（変性コラーゲン溶液）と、加えてないものコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩を添加した培地（コラーゲン溶液）の二種類を用意した。96 -well plate にこ

で 3 日間培養したものを用いた。

れらの溶液を 50 µL ずつ添加し、2 日間放置することでそ線維芽細胞が分泌したコラーゲンの検出に際し、コラーれぞれをコートした。0 . 5 % スキムミルク溶液を用いてブゲンの変性を目的として 95 ℃に加熱した PBS を添加した。

ロッキング処理を施した後、5 µg/mL に調整したビオチン細胞は 4 % パラホルムアルデヒドで 15 分間処理すること標識環状 CMP 溶液を添加した。その際、CMP 溶液を使用で固定し、3 % BSA 溶液で 1 時間処理することでブロッキ直前に 95 ℃で 5 分間処理し 4 ℃で 1 分間冷却したものと、ングした。その後、蛍光標識した一本鎖 CMP、環状 CMP 7

加熱処理を施さないものの 2 種類を用いた。西洋わさびペを 95 ℃で 5 分間加熱し氷上で 1 分間冷却したもの、またルオキシダーゼを結合させたストレプトアビジンをさらには抗Ⅰ型コラーゲン抗体を添加し 1 時間室温で結合させた。

結合させたのち、ABTS と反応させて発色させ、405 nm

抗体を添加した細胞に関してはさらに、goat anti-rabbit

表1
名称

一本鎖二本鎖 CMP 4
二本鎖 CMP 5
二本鎖 CMP 6
二本鎖 CMP 7
環状 CMP 4
環状 CMP 5
環状 CMP 6
環状 CMP 7

合成した CMP の構造
構

造

Ac-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Tyr-Lys-NH 2
Ac-（Pro-Hyp-Gly）n -AhxAc-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Lys-Tyr-Lys- NH 2

Ac-Cys-Ahx-（Pro-Hyp-Gly）n -AhxAc-Cys-Ahx-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Lys-Tyr-Lys- NH 2− 17 −n1045674567コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

IgG（H+L）secondary antibody-FITC conjugates を 30 分

ラーゲンの三重らせん構造がほどけた部分に結合している間結合させた。細胞は共焦点顕微鏡で観察した。

ことを示唆している。さらに環状 CMP 7 と一本鎖は、コ細胞内のコラーゲンの染色に際しては、細胞を固定したラーゲンに対して濃度依存的な結合を示した（図 2 c）。こ

後に 0 . 5 % Triton X- 100 で 5 分間透過処理を施し、上記のの結果から環状 CMP 7 のコラーゲンおよび変性コラーゲ方法でブロッキング処理を施した。その後蛍光標識した環ンに対する解離定数（KD）を算出したところ、変性コラー状 CMP 7 お よ び 抗 コ ラ ー ゲ ン 抗 体（ ラ ビ ッ ト ） を anti-ゲ ン に 対 し て 6 . 6×10 - 8 M、 コ ラ ー ゲ ン に 対 し て 1 . 1 ×

GM 130（Mouse）antibody（ゴルジ体マーカー）、または

10 - 7 M と求められた。また、一本鎖 CMP は最大結合量がanti-KDEL（Mouse）antibody（小胞体マーカー）存在下環状 CMP 7 と同じだと仮定することで、変性コラーゲンで上記の方法で添加し、1 時間結合させた。続いて細胞にに対して 9 . 5×10 - 6 M と算出されたが、コラーゲンに対しgoat anti-rabbit IgG（H+L）secondary antibody-FITCては求めることができなかった。これらの結果から環状conjugates および goat anti-mouse IgG（H+L）secondary

CMP 7 は既報の一本鎖 CMP よりも 100 倍以上結合能が高®

antibody, Alexa Fluor 594 conjugates を添加し、30 分結いことが示された。
これらの CMP の 4 ℃における二次構造を円偏光二色性合させた。細胞は共焦点顕微鏡で観察した。

３．結（CD）スペクトル分析したところ、225 nm における正のコ果ットン効果が観測された 8）。この結果から CMP は 4 ℃に

3 . 1. 環状 CMP 7 は変性コラーゲンに対して強い結合能を示す

おいて自己集合して三重らせん構造を形成していると考え

水溶液中 4 ℃で保存しておいたビオチン標識 CMP の I 型ン結合能をもたないことが示唆された。よって以降の実験

コラーゲンに対する結合能を ELISA により評価したとこ

では CMP 溶液を使用直前に加熱してペプチド同士の自己ろ、これらはほとんどコラーゲンに結合しなかった（図集合を解消させてから使用した。

2 a）。そこで一本鎖 CMP に関する先行研究

1）られ、図 2 a と合わせて考えると自己集合産物はコラーゲを参考にラーゲンに対する有意な結合が検出された（図 2 b）
。3 種

3 . 2 . 環状 CMP 7 は western blotting でコラーゲンを検出することができるの分子デザイン中では環状 CMP がもっとも結合能が高く、環状 CMP 7、一本鎖 CMP および市販の抗コラーゲン抗CMP 内部の Pro-Hyp-Gly 繰り返し数が多いほど顕著な結体を用いて、Ⅰ型コラーゲンの検出感度をwestern blotting合能を示した。また、これら CMP はコラーゲンよりも変で比較した（図 3 a）。結果環状 CMP 7 は一本鎖よりも高い性コラーゲンに強く結合した。この結果は CMP が変性コ検出感度を示し、30 ng を泳動したコラーゲンの α 1 鎖とCMP 溶液を使用直前に加熱変性させたところ、CMP のコ

図 2 4℃における CMP のコラーゲン結合能評価（mean ± SD, n = 3）a）CMP 溶液非加熱、b）CMP 溶液を使用直前に 95℃で 5 分間加熱、c）環状CMP7 と一本鎖の濃度依存的な結合− 18 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用れた。これは推奨濃度（1 / 1000 倍希釈）の抗コラーゲン抗3 . 3 . 環状 CMP 7 は線維芽細胞が分泌したコラーゲンを検出することができる体よりも高い検出感度であり、1 / 200 濃度の抗コラーゲン蛍光標識した環状 CMP 7 と一本鎖 CMP を用いて線維芽抗体に匹敵した。また、環状 CMP 7 は分子量マーカーと細胞が分泌したコラーゲンの検出を試みた。その際、分泌コラーゲンの混合溶液中からⅠ-Ⅴ型のコラーゲンを特異されたコラーゲンを熱変性させることを目的として、細胞的に検出した（図 3 b）
。この結果は環状 CMP 7 がコラーゲ

固定処理前に 95 ℃に加熱した PBS を添加したサンプルをン型間に共通するグリシンが三残基ごとに繰り返すアミノ用意した。結果として 30 µg/mL の環状 CMP 7 は、熱変性酸配列を認識して結合していることを強く示唆している。

した場合のみコラーゲン線維を強く検出し、その検出感度

α 2 鎖をともに検出し、α 1 鎖に関しては 10 ng まで検出さは CMP 濃 度 依 存 的 で あ っ た（ 図 4 a）。 そ れ に 対 し て、

図３ 環状 CMP7 を用いたコラーゲンの検出
a）環状 CMP7、一本鎖、抗コラーゲン抗体の、コラーゲン検出感度の比較 ; b）環状 CMP7 を用いた I‒V 型コラーゲンの検出

図４

線維芽細胞が分泌したコラーゲンの検出（scale bar：50 µm）a）環状CMP 7、b）一本鎖CMP、c）抗コラーゲン抗体− 19 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

30 µg/mL の一本鎖 CMP は同濃度環状 CMP 7 の 1 / 100 程ロコラーゲンを認識していることを示している。また、プ度のシグナルしか観測されなかった（図 4 b）
。この結果はロコラーゲンが小胞体内部で三重らせんにフォールディン

in vitro で環状 CMP 7 は一本鎖 CMP よりも 100 倍程度変グされ、その後ゴルジ体に輸送されることを踏まえると10）、性コラーゲンの検出能が高いことを示している。また、抗環状 CMP 7 は、抗体では検出することが難しい小胞体内コラーゲン抗体は熱変性の有無に関わらずコラーゲン線維部の三重らせん中間体を特異的に検出したと考えられる。

を検出した（図 4 c）
。以上の結果から環状 CMP 7 は変性したコラーゲンを高感度で描出できることが示された。

3 . 4 . 環状 CMP 7 を用いて線維芽細胞の小胞体に存在するプロコラーゲンのフォールディング中間体を検3 . 5 . 環状 CMPとコラーゲンのハイブリッド三重らせんは、一本鎖 CMPとコラーゲンのそれらよりも安定である

環状 CMP が、一本鎖 CMP よりもなぜ高い変性コラーゲ出することができるン結合能を示すのかを調べるために、Ac-（Pro-Hyp-Gly）7

フルオレセイン標識した環状 CMP 7 と抗コラーゲン抗- OH（一本鎖 CMP 7）と環状 CMP 7、二本鎖 CMP 7 または体を用いて、細胞固定処理および透過処理を施した線維芽一本鎖 CMP 7 の複合三重らせんをモデル化した。そして細胞内部のプロコラーゲンの検出を試みた。図 5 a に示し

これらのモデルが三重らせんを形成している場合とほどけ

た よ う に、 環 状 CMP ７ で 検 出 し た 際 の シ グ ナ ル は 抗ている場合のエネルギー差（ΔGbind score）を、分子動力学

KDEL 抗体が検出した小胞体のシグナルと重なった。一方、 （MD）を用いて in silico で求めることで、それぞれの CMP抗コラーゲン抗体で検出した際は抗 GM 130 抗体が検出しの結合エネルギーを評価した。結果として環状 CMP 7 のたゴルジ体のシグナルと重なった（図 5 b）
。この結果は、

ΔGbind scoreは3つのモデルの中で最も小さかった（ΔGbind（環環状 CMP 7 が抗コラーゲン抗体と異なる特異性をもってプ状 CMP 7）：- 147 . 43 kcal mol- 1 , ΔGbind（ 二 本 鎖 CMP 7）：

図5

線維芽細胞内部のプロコラーゲンの検出
a）環状 CMP7、b）抗コラーゲン抗体− 20 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用- 138 . 90 kcal mol- 1 , ΔGbind（ 一 本 鎖 CMP 7）：- 128 . 6 kcal

謝辞mol ）
。これは環状 CMP が、当初の期待どおり、他の 2本研究の遂行に協力いただいた瀧田講（早稲田大学）、藤

つの CMP よりも安定な三重らせんハイブリッドを形成す

井一徳（同）、増田亮（同）、門之園 哲哉（東京工業大学）のることを示唆している。

各氏に感謝する。また、本研究は公益財団法人コスメトロ-1

４．総ジー研究振興財団からの援助を得て実施された。

括

私たちは、コラーゲンに特徴的な Gly-Pro-Hyp 繰り返し

（引用文献）

配列を持つペプチドを二本平行に束ねて環化することで、

1） Y. Li, C. A. Foss, D. D. Summerfield, J. J. Doyle, C. M.

変性コラーゲンに対して特に高い結合能を持つ新規化合物

Torok, H. C. Dietz, M. G. Pomper, S. M. Yu, Proc. Natl.

を開発した。その結合能は ELISA と western blotting によAcad. Sci. USA, 109, 14767‒14772, 2012

り既報の一本鎖 CMP よりも 100 倍程度高いことが示され

2） J. L. Zitnay, Y. Li, Q. Zhao, B. H. San, B. Depalle, S. P.

た。このペプチドを用いて、western blotting ではⅠ- Ⅴ

Reese, M. J. Buehler, S. M. Yu, J. A. Weiss, Nature型までの全てのコラーゲンを検出できることから、環状Communications, 8, 14913, 2017

CMP の認識配列はコラーゲンに共通の Gly-Xaa-Yaa の繰3） G. Melacini, Y. Feng, M. Goodman, J. Am. Chem. Soc.,
118, 10339‒10364, 1996

り返し配列であることが示唆された。環状 CMP は細胞が分泌したコラーゲンの蛍光染色にも利用できることが示さ

4） J. C. Horng, A. J. Hawk, Q. Zhao, E. S. Benedict, S. D.
Burke, R. T. Raines, Org. Lett., 8, 4735–4738, 2006

れ、抗コラーゲン抗体では評価することができなかったコ
ラーゲンの三重らせん変性の度合いを検出できる可能性が

5） I. C. Tanrikulu, R. T. Raines, J. Am. Chem. Soc., 136,13490‒13493, 2014

示された。また、環状ペプチドは抗コラーゲン抗体では検出することが難しい小胞体内部のプロコラーゲンを検出す

6） N. B. Hentzen, L. E. J. Smeenk, J. Witek, S. Riniker,

ることができた。さらに MD 計算により、環状 CMP は他

H. Wennemers, J. Am. Chem. Soc., 139, 12815‒12820,の 2 種類の CMP よりも安定なコラーゲン複合体を形成す2017ることが示された。これらの結果から環状ペプチドは in

7） C. N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley, T. Gray,
Protein Sci., 4, 2411‒2423, 1995

vitro で変性コラーゲンを検出できる有用な化合物であることが示されたと考える。また、ペプチドの内部配列を最

8） C. G. Long, E. Braswell, D. Zhu, J. Apigo, J. Baum, B.
Brodsky, Biochemistry, 32, 11688‒11695, 1993

適化することでコラーゲンの型特異性などを付与できる可

9） A. Miki, S. Inada, T. Baba, K. Kihira, H. Fukada, M.

能性がある。
今回我々が開発した新規ペプチドは、生体中のコラーゲ

Oda, Biosci. Biotech. Biochem., 79, 1603-1607, 2015

ンの蛍光イメージングや薬物のターゲッティングに応用で10）S. Ito, K. Nagata, Sem. Cell Dev. Biol., 62 , 142 ‒ 151 ,きることが期待され、今後実験動物を用いた in vivo での検討を進めていく予定である。

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2017