皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析

星薬科大学薬学部臨床化学教室

輪千浩史

Elastin（ELN）is an insoluble extracellular matrix protein and the core protein of the elastic fibers that provide
elasticity to elastic tissues such as arterial, lungs, skin and ligaments. It is secreted from cells as a soluble protein of
approximately 70-kDa referred to the extracellular space as tropoelastin.
The purpose of this study was to investigate the elastic fiber assembly in human skin fibroblast cells on twoor three-dimensional culture. We demonstrated elastic fiber assembly on the neonatal normal human dermal
fibroblast cells（NHDF-Neo）or the adult normal human dermal fibroblast cells（NHDF-Ad）Immunofluorescencestaining showed that NHDF-Ad is difficult to make elastic fiber in contrast to NHDF-Neo in two-dimensional culture
resulting from the activity of tropoelastin degradation is high. Furthermore, the formation of cross-linking aminoacid in NHDF-neo significantly increased by the addition of recombinant human tropoelastin（HTE）. On the otherhand, it was not able to observe the elastic fiber assembly on NHDF-Neo in three-dimensional culture. In addition, itrevealed the gel greater contraction in the presence of HTE.
Taken together, these observations contributed to the clarification of mechanisms of elastic fiber assembly on
the dermal fibroblast cells in two- or three-dimensional culture.

１．緒は、ほとんど報告されていない。近年、網膜上皮色素細胞

言（Pigmented Epithelial cells: PE 細胞）がエラスチンを産

皮膚は表皮・真皮・皮下組織から構成されている。真皮

生せずマイクロフィブリルやリジルオキシダーゼを産生しは、厚い層で毛細血管、皮脂腺、汗腺など大切な付属器官ている細胞にエラスチン遺伝子を導入の導入や組換えトロがあるが、組織の大部分は膠原繊維（コラーゲン）や弾性ポエラスチンの添加により、エラスチン線維を免疫蛍光染繊維、その他の細胞外マトリックスで構成されている。膠色で確認すると共に、エラスチン線維固有の架橋アミノ酸

原繊維や弾性繊維は真皮の中に分散している繊維芽細胞かであるデスモシンの形成もアミノ酸分析により明らかとなら作られ、肌の張りと弾力のもとであるばかりでなく、皮った 1-3）。そこで、本研究では、組換えトロポエラスチン

膚の運動にも大きく関わっている。特に、エラスチンは皮を皮膚繊維芽細胞に処理し、2 次元培養におけるエラスチ

膚、血管、肺などの組織や臓器に存在し、弾性力の源としン繊維形成に対する加齢の影響と 3 次元培養におけるトロて重要な機能を果たしている。皮膚は身体の表面を被ってポエラスチンの役割について検討した。

おり、常に外的刺激にさらされている。したがって、老化

２．実に伴い皮膚にたるみやしわが増加する。このような加齢による皮膚の変化が見られる時は弾性繊維の変化が著しいと２･ １考えられている。

験抗体と試薬抗体に関しては anti fibrillin-1 polyclonal antibody, anti

エラスチンは、前駆体である可溶性トロポエラスチン

His-G monoclonal antibody は Invitrogen（Carlsbad,として細胞外に分泌された後、トロポエラスチン分子の自USA）から、anti tropoelastin monoclonal antibody（MAB2503）

己集合、フィブリリン−１やフィブリン−５と呼ばれる糖は Chemicon International, Inc.（Temecula, USA）から、Alexaタンパク質との分子間相互作用、銅を補酵素とする Lysyl

Fluor 546 goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 goat anti-oxidase による分子内または分子間架橋形成の過程を経て

mouse IgG は Molecular Probes（Eugene, USA）から HRP不溶性のエラスチン繊維になると考えられている。トロポ

conjugated anti mouse IgG antibody は Amersham

エラスチン遺伝子発現については様々な研究が報告されて（Buckinghamshire, UK）から購入した。試薬に関しては、コいるが、エラスチン繊維形成における加齢の影響について

ラーゲンゲル培養キットは新田ゼラチンより、Human TGF-β1
は和光純薬より、Protease inhibitor cocktail tablets は Roche

Analysis of elastic fiber formation andthe cell functions of tropoelastin on theskin.
Hiroshi Wachi
Department of Clinical Chemistry, Hoshi
University School of Pharmacy andPharmaceutical Sciences.

Diagnostics K. K.（Japan）より購入した。

２･ ２細胞培養

正常ヒト新生児皮膚細胞（NHDF-Neo）および正常ヒト成人皮膚細胞（NHDF-Ad）はタカラバイオより購入した。2 次元培養は、NHDF-Neo および NHDF-Ad を FBS− 94 −

皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析（Biowest）、L-glutamine、Penicillin-Streptomycin、MEM２･ ７

Non-Essential Amino Acids、Sodium pyruvate（Gibco）を含む 10% FBS-DMEM 培地で培養した。3 次元培養は、エラスチカ・ワンギーソン染色３次元培養したゲルをマイルドホルムで固定後、パラフィン置換し切片を作製した。

NHDF-Neo を コ ラ ー ゲ ン ゲ ル に 包 埋 し、10% dialyzed-脱パラフィン後、ヘマトキシリン液と塩化鉄液、ヨウ化FBS DMEM で培養した。また、N 末端に 6×His が付加カリウム液、滅菌精製水を 20：3：8：5 で混合した溶液をした大腸菌組換えヒトトロポエラスチン（HTE）は前報切片に添加した。滅菌精製水で洗い塩化鉄液と滅菌精製水

1）にしたがって作製したものを用いた 。

を 3：37 の割合で混合した溶液を切片に添加し分別し、ワンギーソン液を添加後、脱水し乾燥して封入した。

２･ ３

蛍光免疫染色３．結4% Paraformaldehyde で固定した後、Block Ace（Roche）

果抗体（モノクローナル抗体）、または抗エラスチン抗体（ポ３･ １ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン繊維形成リクローナル抗体）、V5-tag に対する V5 抗体（モノクロNEDF-Neo お よ び NHDF-Ad の HTE の 未 添 加、 添ーナル抗体）、および Fibrillin-1 に対する抗 Fibrillin-1 抗加 に よ る エ ラ ス チ ン 繊 維 形 成 を、 抗 Elastin 抗 体 と 抗体（ポリクローナル）で処理し、Alexa Fluor 546 goat

Fibrillin-1 抗体を用いて蛍光免疫染色で確認した。HTEanti-rabbit IgG と Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG

未添加の場合、NHDF-Neo ではエラスチン繊維を確認すで処理し、蛍光位相差顕微鏡にて観察した。

ることができたが、NHDF-Ad ではエラスチン繊維をほとでブロッキングした細胞に、エラスチンに対する MAB2503

んど確認することができなかった。しかし、NHDF-Ad に２･ ４ RNA 抽出と reverse transcriptase-polymerase
chain reaction（RT-PCR）

HTE を添加することでエラスチン繊維の確認できた（図１）。また、NHDF-Neo において HTE を添加することで、

４）

全 RNA は AGPC 法 で 抽 出 し た 。RT-PCR は、 １µg/10µℓ の全 RNA に 10 mM dNTP、Oligo dT をそれぞれA

NHDF-NeoNHDF-Ad

NHDF-NeoNHDF-Ad

１µℓ ずつ加えたものを 65℃で５分間 熱変性後、氷上で５分間冷却した。その後、これに 5×1st Strand buffer 4µℓ、Elastin

100 mM DTT 2µℓ、RNase Inhibitor 1µℓ を加えた。２分間 37℃でプレインキュベートし、Reverse Transcriptase（M-MLV）を 1µℓ 加えて cDNA を合成し、各遺伝子に特異的なプライマーを用いて遺伝子を増幅した。

２･ ５ウェスタンブロッティング

Fibrillin-1

培 養 上 清 を 30% 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム で 塩 析 し た 後、
Laemmli sample buffer（1% SDS、5% glycerol、0.01%BPB、0.1 M DTT 含有 0.01M Tris-HCl pH7.4）を加えて溶解したものをサンプルとした。サンプルを 7.5% ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。ニトロセルロース膜

Bに転写した後、５% スキムミルク含有の T-TBS（50mM
Tris-HCl、pH 8.0、0.9% NaCl、0.05% Tween 20） で 処Elastin

理 し た。 次 に、 抗 His-G 抗 体 で 処 理 し、ECLTM キ ッ ト（Amersham, Buckinghamshire, UK）で検出した。

２･ ６

架橋アミノ酸定量

培養細胞を剥離した後、6N 塩酸で 110℃、18 時間加水Fibrillin-1分解した。加水分解物を乾燥後、精製水に溶解し架橋アミノ酸測定試料とした。この資料中の架橋アミノ酸量は、テキサス大学 Starcher 博士に依頼し、前方に従ってラジオイムノアッセイ５）によって測定した。

図１ NHDF-NeoとNHDF-AdにおけるHTE未添加（A）、添加（B）によるエラスチンおよびフィブリリン１の蛍光免疫染色− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

内因性と外因性のエラスチン繊維が確認でき、エラスチンした HTE が、培養上背中でどの程度分解されるかを検討

繊維の指標である架橋アミノ酸の有意な増加も認められた。

するため、HTE 添加後、経時的に培養上清を回収し、添尚、エラスチンの足場タンパク質の一つであるフィブリリ加した HTE のみを検出するため、抗 His-G 抗体を用いてン -1 繊維に大きな変化は認められなかった。
（図２）。

ウェスタンブロット法にて解析した。NHDF-Neo では培
養時間による分解はみられませんでしたが、NHDF-Ad で３･ ２ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン繊維形成関連タンパク質の遺伝子発現は HTE 添加後 48 時間で☆トロポエラスチンの顕著な低下が認められた。そして、この低下はプロテアーゼ阻害剤の存在下で認められなかった（図４）。

加齢によるエラスチン繊維形成能が低下する原因を検討するため、NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養におけるエラスチン関連タンパク質の遺伝子発現を RT-PCR

３･ ４ NHDF-Neo の 3 次元培養におけるエラスチン繊維形成法にて確認した。エラスチン繊維の足場タンパク質として３次元培養における皮膚繊維芽細胞のエラスチン繊維

重要なフィブリリン−１やフィブリン−５、架橋形成に重形成について、２次元培養でエラスチン繊維形成できる要なリジルオキシダーゼと各遺伝子発現に大きな変化は見

NHDF-Neo を用いて検討した。２次元培養と同様に３次られなかった（図３）。

元培養の NHDF-Neo に HTE を添加後、切片をエラスチカ・ワンギーソン染色した。その結果、HTE（20µg/㎖）およ３･ ３ NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養における添加 HTE の分解活性び TGF-β（10ng/㎖）の添加に関わらず、エラスチン繊維は確認できなかった（図５）。

次に、NHDF-Neo および NHDF-Ad の 2 次元培養添加

図２ NHDF-Neo の HTE 添加における架橋アミノ酸、Mean±S.E.
（n=3）、* P<0.05、** P<0.01 （vs. non-treatment, Student’st-test）

図３ NHDF-Neo と NHDF-Ad におけるエラスチン関連遺伝子発現

図４ NHDF-Neo （A）と NHDF-Ad （B）におけるトロポエラスチンの分解
PI: プロテアーゼインヒビター− 96 −

皮膚における弾性繊維形成とトロポエラスチンの細胞機能解析

３･ ５ NHDF-Neo の３次元培養におけるエラスチン関連タンパク質の遺伝子発現

４．考察

３次元培養でのエラスチン繊維形成が確認できない原因

弾性繊維は、皮膚や肺、動脈、靭帯などの軟部組織にを検討するため、２次元培養と３次元培養におけるエラスおいて、弾性の保持に大きく寄与しており、この組織のチン関連タンパク質の mRNA 発現について比較した。そ破綻は、様々な障害や病変を引き起こすことが知られていの結果、３次元培養は、２次元培養と比較して各 mRNAる。弾性繊維は、複数の成分が集合、結合している“機能発現の低下が認められた（図６）。

複合体”であり、その“コア”となる成分のエラスチンとエラスチンとのネットワークを形成する微細繊維（マイク３･ ６ NHDF-Neo の３次元培養におけるトロポエラ
スチンの細胞活性作用

ロフィブリル繊維 ; フィブリリンや microfibril-associated

さらに、３次元培養の NHDF-Neo に対するトロポエラいる。近年、エラスチンノックアウトマウスにおいて大動スチンの役割を検討するため、コラーゲンゲル収縮を指標

脈では内皮傷害が引き起こされることなく内膜肥厚が起ことした細胞活性を測定した。コラーゲンゲルの中に HTEり、生まれて間もなく死亡することが報告された６）。このが存在することでゲルの収縮が増強することが認められたことより、エラスチンが生命の維持にとって必須のタンパ（図７）。

ク質であることが証明された。また先天性のエラスチン遺

図５

glycoprotein、フィブリンなどから成る）から構成されて3 次元培養のエラスチカ・ワンギーソン染色

図７ コラーゲンゲル収縮における HTE の影響。
A：写真観察 B：収縮したゲルの直径

図６ NHDF-Neo の 2 次元培養と 3 次元培養におけるエラスチン関連遺伝子発現− 97 −コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

伝子異常疾患として大動脈弁上狭窄症（SVAS）７）や皮膚でなく、HTE の生体応用とより生体に近いエラスチン繊弛緩症（Cutis laxa） が知られており、SVAS ではエラス維を含む３次元皮膚モデルの確立に大きく寄与するものとチン繊維の断片化を伴う動脈平滑筋細胞の異常増殖により考える。

８）

冠動脈の狭窄が起こり、さらに Cutis laxa でもエラスチン繊維の断片化が原因となり皮膚の過伸展が引き起こされる（引用文献）ことが報告されている。これらの報告からエラスチン繊維

１）Wachi, H., Sato, F., Murata, H., Nakazawa, J.,形成不全が血管や皮膚における疾患の重要な病因を担ってStarcher, B. C. and Seyama, Y. (2005) Development of aいると思われる。

new in vitro model of elastic fiber assembly in human

筆者らは、２次元培養において、内因性のトロポエラス

pigmented epithelial cells, Clin Biochem, 38, 643-653.

チンを発現していないヒト網膜色素上皮由来細胞に、外因

２）Kozel, B. A., Wachi, H., Davis, E. C. and Mecham, R.

性のトロポエラスチンを添加しエラスチン繊維を再構築す

P. (2003) Domains in tropoelastin that mediate elastin

る新たなエラスチン繊維構築モデルを確立した。本研究にdeposition in vitro and in vivo, J Biol Chem, 278,

お い て も、HTE を NHDF-Neo お よ び NHDF-Ad に 添 加

18491-18498.

することで、成熟エラスチンの指標である架橋アミノ酸の３）Robb, B. W., Wachi, H., Schaub, T., Mecham, R. P.

増加からもエラスチン繊維の再構築が確認できた。しかしand Davis, E. C. (1999) Characterization of an in vitro

ながら、NHDF-Ad におけるエラスチン繊維構築量は著しmodel of elastic fiber assembly, Mol Biol Cell, 10,

く、この要因として、加齢に伴いトロポエラスチン分解酵3595-3605.

素の関与が示唆された。皮膚繊維芽細胞をコラーゲンゲル

４）Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Single-

内培養したものは真皮モデルとして用いられているが、そstep method of RNA isolation by acid guanidinium

こにエラスチン繊維は存在していないため、より生体に近thiocyanate- phenol-chloroform extraction, Anal

い状態でのエラスチンに関する検討が困難となっている。

Biochem, 162, 156-159.

そこで、2 次元培養でエラスチン繊維形成することができ

５）Starcher, B. C. and Mecham, R. P. (1981) Desmosine

た NHDF-neo を用いて 3 次元培養でのエラスチン繊維形

radioimmunoassay as a means of studying

成を検討した。しかしながら、HTE の添加および未添加

elastogenesis in cell culture, Connect Tissue Res, 8,に関わらず、エラスチン繊維を確認することが出来なかっ255-258.

た。この要因として、3 次元培養では Elastin 関連タンパ６）Li, D. Y., Brooke, B., Davis, E. C., Mecham, R. P.,

ク質の mRNA 発現の低下によりタンパク質量が減少し、Sorensen, L. K., Boak, B. B., Eichwald, E. and Keating,足場タンパク質の成熟が不十分であった可能性が示唆され

M. T. (1998) Elastin is an essential determinant of

た。一方、NHDF-neo の細胞活性に対する HTE の影響を、arterial morphogenesis, Nature, 393, 276-280.

3 次元培養ゲル収縮を指標として検討した結果、ゲル内に７）Urban, Z., Zhang, J., Davis, E. C., Maeda, G. K.,

HTE を加えることによりゲル収縮は増強された。このこKumar, A., Stalker, H., Belmont, J. W., Boyd, C. D. andとから、HTE は細胞活性作用を有し、コラーゲンゲル内Wallace, M. R. (2001) Supravalvular aortic stenosis:に存在することで、より生体に近い状態となる可能性が示

genetic and molecular dissection of a complex mutation

唆された。

in the elastin gene, Hum Genet, 109, 512-520.

以上のことから、足場タンパク質の改良と HTE の分解

８）de Schepper, S., Loeys, B., de Paepe, A., Lambert, J.

を抑制することで、ヒト皮膚への HTE の処理が、機能的and Naeyaert, J. M. (2003) Cutis laxa of the autosomal

なエラスチン繊維の再構築を導く可能性が示唆された。本recessive type in a consanguineous family, Eur J

研究は、加齢に伴う皮膚のエラスチン繊維形成の解明だけ

Dermatol, 13, 529-533.

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