色素系化合物の光毒性を抑制する新たな手法の開発

東京大学大学院薬学系研究科

寺 井琢 也When dye molecules are excited by UV or visible light, singlet oxygen (1O2) is generated via energy transfer fromexcited triplet state of the molecules. Because the photo-generated 1O2 is known to cause damage to cells, it is important toestablish methods to decrease the amount of generated 1O2, or to erase 1O2 by chemical reaction. We believe such methods
will be useful not only in bioimaging but also in cosmetology. Hence, in this research, we studied on the singlet oxygeneliminating effect of lanthanide ions that are co-existent in the system. The idea was that when lanthanide ions that could
accept energy from the excited dyes were present nearby, the ions would work as surrogate acceptors in place of molecularoxygen, whereby decreasing the efficiency of 1O2 generation. In order to verify this hypothesis, we firstly synthesized several
fluorescent compounds and their lanthanide complexes, and measured characteristic luminescence of 1O2 at 1270 nm. The
results indicated that 1O2 generation is attenuated when the compounds chelate a specific kind of lanthanide ions, supporting
our hypothesis. Also, we have demonstrated that some lanthanide ions are capable of decreasing the amount of generated
1O2 through intermolecular interactions. As far as we are concerned, these findings are unprecedented, and worth furtherinvestigation.

１．緒

以上の一重項酸素を消去することはできない。更に、これ

言らの還元剤は化学的に不安定であることが多く、取り扱い太陽光などに含まれる紫外線は、細胞内の生体分子（DNA、タンパク質など）を光励起して活性酸素の一種で1も容易ではない。従って我々は、化粧品への応用や蛍光イメージング技術への貢献を念頭に、①安定な構造を持ち、ある一重項酸素（ O 2）を発生させ、生体に対して皮膚の老②一重項酸素と化学的に反応することがない、新たな消去化を初めとする悪影響を及ぼすことが知られている。従っ手法の開発を目指し研究を開始した。て、アスタキサンチンに代表されるように一重項酸素消去

ところで一重項酸素は、色素（あるいは蛍光分子）の光能を持つ化合物を配合した化粧品が近年上市され、効果を励起に引き続く項間交差によって励起三重項状態が生じ、発揮している。

この状態から分子酸素へのエネルギー移動が起こることで一方、蛍光色素を用いた細胞や動物個体の光イメージン生成するとされる。そこで我々は、生じた励起三重項状態

グは、生体内での目的分子の挙動をリアルタイムで解析すを酸素との反応以外の失活経路によって速やかに消失さるための強力な研究手法であり、今日の生命科学研究におせることにより一重項酸素の発生自体を抑制する、といういて不可欠な役割を担っている

1），2）。しかしながら、多くの蛍光色素は光励起に伴い生体分子と同様に一重項酸素
1

新しい発想（Fig. 1）で上記の課題を解決することを着想した。具体的には、光増感反応と競合する失活経路として、（ O 2）を産生する（光増感反応）。先にも述べたとおり、一色素の励起三重項状態より低い位置に励起状態を有する化

重項酸素は細胞に対して酸化ストレスを与えて細胞死を導合物、特に Nd 3 + や Yb 3 + といった希土類イオン（Ln 3 +）に3）

いたり 、近傍のタンパク質と反応してその活性を消失さ対するエネルギー移動を考えた。これらのイオンは一重項せたりする性質（光毒性）を有しており 4）、そうした悪影

酸素とほぼ同じ低い位置に励起状態が存在するため、一旦響を抑えることは蛍光イメージングにおいても重要な課題（酸素分子ではなく）希土類イオンへのエネルギー移動がの一つである。

生じると、そこからの光増感反応はほとんど起こらないこ

一般に、一重項酸素消去能を有する化合物は、その還元とが予想される。即ち、分子内もしくは分子間にこれらの力により一重項酸素と量論的に反応することでこれを消去イオンを配置して、色素の励起三重項状態からイオンへのする。しかしこの機構を用いる限り、添加した化合物の量エネルギー移動が優先的に起こるようにすれば、光が色素に当たっても一重項酸素が産生されず、毒性が抑えられると考えた。

Development of a novel methodology
to suppress phototoxicity of coloredcompounds
Takuya Terai
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, The University of Tokyo

この方法では、励起された希土類イオンは発光もしくは熱失活過程によりエネルギーを失うため 5），6）、一重項酸素のように生体分子と反応して酸化修飾を引き起こすことは考えにくい。また、３価の希土類イオンは化学的にも安定であるため、従来の不可逆的な還元剤とは異なりこの消去− 103 −コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013を確認した。なお、本報告に登場する化合物の構造を Fig.
2 にまとめて示す。

２. ２

測定装置

吸光測定には島津 UV- 1800 を用いた。蛍光測定には日立 F 4500 も し く は 堀 場 Jobin Yvon Fluorolog- 3 を 用 い た。
一重項酸素生成能の評価（赤外発光測定）には堀場 Jobin
Yvon Fluorolog- 3（InGaAs 検出器）を用いた。また、単一光照射には分光計器 UB- 25 を用いた。波長により多少Fig. 1の違いはあるものの、光量は約 3 mW/ ㎠であった。

研究の概念図２. ３
過程を何度も繰り返すことが可能と期待される。

実験方法

吸光・蛍光・発光測定においては、測定対象化合物のス

本研究では初期検討として、まずは Fig. 1 の系が実際にトック溶液（1 〜 10 mM in DMSO or DMF）を用意し、別機能するのかについて、代表的な色素分子を用いた溶液中途明示する溶媒で希釈することで、吸光・蛍光測定の場合の実験で検討した。には約 1 mM、DPBF を用いた吸光測定もしくは 1 O 2 の発光

２．実
２.１

測定の場合には約 10 mM の溶液を調製した。測定は 20 ～

験25℃で行い、特に明示しない限り脱気等の操作は行わなか試薬った。各種スペクトルは、別途測定した溶媒のみのスペ

市 販 さ れ て い る 試 薬 類 に つ い て は、 和 光 純 薬、 東クトルを差し引いて示した。一重項酸素生成能（発光）に

京 化 成 工 業、 も し く は SIGMA-ALDRICH 社 か ら 購 入

ついては、バックグラウンドシグナルの傾きを考慮してし、 特 に 明 示 し な い 限 り 更 な る 精 製 は せ ず に 用 い た。

1270 nm のピーク高さを算出し、励起波長における吸光度2’, 7’-dichlorocalcein（2）、2 OMe-BODIPY（4）、2 OMe-で補正することで比較した 9）。DPBF を用いた 1 O 2 の定量

BODIPY-DTPA（5）、並びにそれらの金属錯体は文献を参については、メタノール溶媒中における 410 nm の吸光度考に合成を行った

7），8）。合成した化合物については NMRの減少から見積った 10）。

および ESI-MS にて構造の確認を行い、HPLC により純度Fig. 2化合物の構造− 104 −

色素系化合物の光毒性を抑制する新たな手法の開発

３．結
３.１

光蛍光団の一つであり、蛍光プローブの基本骨格としても果汎用されている 12）。そこで我々は、BODIPY についてもFluorescein 誘導体における分子内消光

fluorescein の場合と同様に、希土類イオンの導入によってFluorescein は最も代表的な有機蛍光分子の一つであり、
2）

1O 2 生成能が変化するかどうかを調べた。具体的には、化

様々な蛍光プローブの基本骨格として利用されている 。

合物 4，5、および［Yb- 5］について吸収スペクトルおよ

その一方で、fluorescein 誘導体は一定の増感能を有するこび近赤外発光スペクトルを測定した。

1とが知られており、強い光を当てることで O 2 を産生し細胞にダメージを与える場合がある11）。そこで我々はまず、その結果を Fig. 4 に示す。測定は、BODIPY の溶解性を考慮してメタノール中で実施した。化合物 4 のみ吸光度が分子内に希土類イオンを導入した fluorescein 誘導体［Ln-大きいのは、濃度が他の２つより高いからである（注：励2］が、母化合物である 1 および配位子 2 と比較して低い増起波長における吸光度の値がほぼ一定になるように濃度調感能を持つかどうかについて検討を行った。

整を行った）。発光スペクトルに関しては、ベースライン各化合物の吸収スペクトルと近赤外発光スペクトルをの傾きを考慮し、更に励起波長である 500 nm の吸光度でFig. 3 に示した。スペクトル測定は、1 O 2 の寿命が通常の補正すると、5 >［Yb- 5］> 4 であることが示唆された。金水よりも長い重水（D 2 O）中で行った。吸収スペクトルに属を含まない化合物 5 と比較すると、Yb 3 + 錯体の増感能のはほとんど変化が見られなかったのに対し、1270 nm 付近低下が認められたものの、前項の実験とは異なりその差がの発光強度は 1 > 2 >>［Yb- 2］の順となり、化合物間で大大きいものではないため更なる検討が必要と考えられる。

きな差異が見られた。化合物を加えない場合にはこの位置にピークを有する発光は全く見られないことから、これ

３. ３

Rose bengalにおける分子間消光

は各化合物の励起状態からエネルギー移動を介して生成すFluorescein に 重 原 子 を 導 入 し た 化 合 物 で あ る rose

る 1 O 2 に由来するものと判断される。なお、［Yb- 2］の発bengal（RB）は、非常に高い 1 O 2 産生能を有する代表的な光スペクトルが短波長側で大きく増大する形状になるのは光増感剤である 13）。３. １、３. ２の検討においては色素分calcein の励起状態を介する Yb 3 + の発光に由来するもので子（蛍光団）が直接希土類イオンに配位している場合を想7）

1あり 、 O 2 とは無関係であることを別途確認している。

定したが、実際の応用においてはそのような場合は稀とこの結果から、［Yb- 2］の 1 O 2 生成量は 1 や 2 と比較し考えられる。そこで本項では、溶媒内に分子間で存在すて小さくなっており、希土類イオンを色素の近傍に配置す

る Ln 3 + により RB の増感能が制御されるか否かについて調ることで元の化合物より増感能が低下することが示唆されべた。具体的には、メタノールに RB と LnCl 3 をそれぞれた。

2 mM、100 mM となるよう溶解させ、530 nm の光照射により産生される 1 O 2 の発光スペクトルを測定した。

３. ２BODIPY 誘導体における分子内消光吸収スペクトルと合わせた測定結果を Fig. 5 に示す。化

BODIPY（化合物 3）は fluorescein と並ぶ代表的な可視合物の吸収スペクトルは希土類イオン添加の有無によりわ

Fig. 3 化合物 1，2 および［Yb-2］の ⒜ 吸収スペクトル、および ⒝ 近赤外発光スペクトル。測定は重水（10 mMHEPES 緩衝液）中で行った。励起波長：500nm。

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

Fig. ４ 化合物 4，5 および［Yb-5］の ⒜ 吸収スペクトル、および ⒝ 近赤外発光スペクトル。測定はメタノール中で行った。励起波長：500nm。

Fig. 5 RB、RB+GdCl3、RB+YbCl3、および RB+NdCl3 の ⒜ 吸収スペクトル、および ⒝ 近赤外発光スペクトル。
励起波長：530nm。

ずかに長波長シフトを示したものの、形状や強度の変化はisobenzofuran（DPBF）を用いた光増感能の評価を行った 10）。

ほとんど見られなかった。一方、近赤外発光スペクトルに本法は O 2 発光測定と比べて間接的ではあるものの、感度おいては Yb および Nd を添加したサンプルのみ有意にには優れている。

3+3+1

強度の低下が観察された。一方、同じ希土類イオンでも具体的には、RB（10 mM）と LnCl 3（100 mM）のメタノ

Gd を同量添加したサンプルは RB 自体とほとんど変わらール溶液に対して 50 mM の DPBF を添加し、500 nm の光ない増感能を示した。これは、Gd の励起状態が比較的照射に伴う 410 nm の吸光度の減少をモニターした。その高い位置にあるため RB からのエネルギー移動（Fig. 1 参

結果を Fig. 6 に示す。Fig. 5 の結果を裏付けるように、無照）が生じえないためと説明できる。なお、Fig. 5 b にお添加と比較して Yb 3 + 添加では生成する O 2 が半分以下にいて Nd 添加サンプルの 1300 nm 以上の発光強度（これは低下することが示唆された。また、Nd 3 + 添加サンプルで3+3+3+3+1

Nd からの発光である）が大きく上昇していることも、はバックグラウンドとほぼ同程度まで吸光度変化が抑制さRB から Nd へのエネルギー移動を支持するデータである。

れた。一方、Gd 3 + 添加サンプルにおいては 10％程度の低続いて、同様に調製したサンプルについて、1270 nm 発下しか観察されず、これも Fig. 5 の結果と整合するもので

3+1

光測定とは異なる O 2 の定量方法である 1 , 3 -diphenylあった。

− 106 −

色素系化合物の光毒性を抑制する新たな手法の開発

Fig. 6 DPBF を用いた増感能の評価。⒜ RB のみ、⒝ RB+YbCl3 、⒞ RB+NdCl3、および ⒝ RB+GdCl3 の吸収スペクトルの時間変化 グラフ中の数字は 500nm の光照射を行った時間（秒）を表す。

３. ４

BODIPY 誘導体における分子間消光

その結果、複数の fluorescein 誘導体（化合物 2，RB）に44３. ３の結果を受け、BODIPY 誘導体についても希土類おいて、分子間、分子内に拘わらずある種の希土類イオンイオンの分子間添加によって 1 O 2 の生成量に変化が見られ添加による大幅な増感能の低下が観察された。この結果はるかを検討した。実験には Fig. 6 と同様に DPBF を用いた我々が提案する仮説を支持するものであり、化学的にも興評価系を用いた。

味深い現象である。一方、BODIPY 誘導体（化合物 4，5）

その結果を Fig. 7 に示す。化合物 4 は RB と比べて増感を用いた場合には、希土類イオンの添加により一定の増感能が低いため、吸光度変化が全体的に小さくなっているが、能低下は認められたものの、その効果は fluorescein 誘導⒜と⒝を比較すると Nd 3 + 添加による 1 O 2 産生の抑制が認体の場合よりも小さかった。

められる。しかしながら、その効果は RB の場合（Fig. 6）

点で考えられることとして、①化合物によって励起三重項よりもかなり小さいことが示唆された。

４．考

この原因については更なる研究が必要ではあるが、現時状態から酸素分子へのエネルギー移動速度が異なる、②化察合物によって励起三重項状態から希土類イオンへのエネル

本研究では、色素化合物の光励起によって放出される有1害分子である O 2 の生成量を制御する手法として、近赤外ギー移動速度が異なる、③色素と希土類イオンとの静的相互作用（複合体形成など）が生じる、が挙げられる。

領域に発光を持つ希土類イオンに対するエネルギー移動と今後は本研究で提案した手法の一般性と適用限界についいう新たな概念を提唱し、その仮説を検証するための初期て明らかにすべく、UV 領域に吸収を有する化合物を用い検討を行った。

た検討や固体試料における評価を進めていく計画である。

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コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

Fig. 7 DPBF を用いた増感能の評価。⒜ 4 のみ、および⒝ 4+NdCl3 の吸収スペクトルの時間変化
グラフ中の数字は 500nm の光照射を行った時間（秒）を表す。

（参考文献）

８）Sunahara H, Urano Y, Kojima H, Nagano T:

１）Lakowicz JR: Principles of Fluorescence Spectroscopy,

Design and Synthesis of a Library of BODIPY-Based
Environmental Polarity Sensors Utilizing Photoinducedrd3 Ed., Springer-Verlag, New York, 2006 .
２）Te r a i T , N a g ano T: Fluorescent probes f o r
bioimaging applications, Curr. Opin. Chem. Biol., 12 ,Electron-Transfer-Controlled Fluorescence ON/OFFSwitching, J. Am. Chem. Soc., 129 , 5597 - 5604 , 2007 .
９）Yamakoshi Y, Umezawa N, Ryu A, Arakane K,515 - 521 , 2008 .
３）Koide Y, Urano Y, Yatsushige A, Hanaoka K,Miyata N, Goda Y, Masumizu T, Nagano T: Active

Terai T, Nagano T: Design and Development of

Oxygen Species Generated from Photoexcited

Enzymatically Activatable Photosensitizer Based on

Fullerene (C 60 ) as Potential Medicines: O 2− • versus 1 O 2 ,Unique Characteristics of Thiazole Orange, J. Am.

J. Am. Chem. Soc., 125 , 12803 - 12809 , 2003 .

Chem. Soc., 131 , 6058 - 6059 , 2009 .

10）Gorman AA, Hamblett I, Lambert C, Spencer B,４）Yogo T, Urano Y, Mizushima A, Sunahara H,Standen MC: Identification of Both Preequilibrium

Inoue T, Hirose K, Iino M, Kikuchi K, Nagano T:and Diffusion Limits for Reaction of Singlet Oxygen,

Selective photoinactivation of protein function throughO 2 ( 1Δg ) , with Both Physical and Chemical Quenchers:

environment-sensitive switching of singlet oxygen

Variable-Temperature, Time-Resolved Infrared

generation by photosensitizer, Proc. Natl. Acad. Sci.,

Luminescence Studies, J. Am. Chem. Soc., 110 , 8053 -U. S. A., 105 , 28 - 32 , 2008 .

8059 , 1988 .

５ ）H ä n n i n e n P , H ä r m ä H ( e d s ) : L a n t h a n i d e11）Keppler A, Ellenberg J: Chromophore-Assisted Laser

Luminescence - Photophysical, Analytical andInactivation of a- and g -Tubulin SNAP-tag Fusion

Biological Aspects, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg,

Proteins inside Living Cells, ACS Chem. Biol., 4 , 127 -2011 .

138 , 2009 .

６）Terai T, Kikuchi K, Iwasawa S, Kawabe T, Hirata

12）Komatsu T, Urano Y, Fujikawa Y, Kobayashi

Y, Urano Y, Nagano T: Modulation of Luminescence

T, Kojima H, Terai T, Hanaoka K, Nagano T:

Intensity of Lanthanide Complexes by Photoinduced

Development of 2 , 6 -carboxy-substituted boron

Electron Transfer and Its Application to a Long-Liveddipyrromethene (BODIPY) as a novel scaffold ofProtease Probe, J. Am. Chem. Soc., 128 , 6938 - 6946 ,ratiometric fluorescent probes for live cell imaging,2006 .

Chem. Commun., 7015 - 7017 , 2009 .

７）Terai T, Urano Y, Izumi S, Kojima H, Nagano T: A13）Lessing HE, Richardt D, von Jena A: Quantitative

practical strategy to create near-infrared luminescent

triplet photophysics by picosecond photometry, J. Mol.

probes: conversion from fluorescein-based sensors,

Struct., 84 , 281 - 292 , 1982 .

Chem. Commun., 48 , 2840 - 2842 , 2012 .

− 108 −