化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：
ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工
関西学院大学理工学部生命医化学科

平井洋平

Primary cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEK) have been widely used for evaluation of activities ofcosmetic components, however, these cells have considerable lot-to-lot variations and readily to lose differentiation potential
upon serial passages. This study aimed to prepare a novel iPS-derived cell system for effective screening of cosmetic
compounds. We generated iPS cells that were stably transfected with tet/dox-inducible expression cassette for BMP4 (TetBMP4-iPS), so that these cells can be maintained as iPS cells in conventional medium, but undergo differentiation into
ectodermal lineages after treatment with retinoic acid (RA) and subsequently into krt14-positive keratinocyte progenitors
upon treatment with dox. We found that thus generated keratinocyte progenitors were unstable and spontaneously differentiate
into several epidermal lineages. To detect the appearance of the specific epidermal lineage, e.g., hair cortex, Tet-BMP4-iPS
cells were further introduced with differentiated cell-specific promoter, e.g., KRT31 promoter for hair cortex, which had beenconnected with luciferase reporter. When treated simultaneously with RA, dox and soluble factors from dermal papilla cells,
Tet-BMP4-iPS cells quantitatively increase the expression of luciferase up to three days, suggesting that activity of any solublecomponents for hair cortex differentiation could be evaluated by this cell system. To find the optimal condition of RA and dox
treatment for sensitive detection of hair differentiation, we then developed a model of differentiation process of pluripotent
iPS cells into terminally differentiated hair cortex cells.

１．緒を発現誘導できるような仕掛けを予め施し、導入した

言

BMP 4 の遺伝子発現をオフの状態で十分量にまで増殖さ本研究は、初代培養細胞や細胞株に比べ遥かに優れた次せ、そこに外胚葉への分化を促すためのレチノイン酸と、世代の化粧品評価モデルを創出し、最終的には種々の化粧

外胚葉から表皮系列に向かわせる BMP 4 を発現誘導する品研究に新たなブレークスルーを与えることを目指したもことにした。また、得られる細胞には表皮前駆細胞以外ののである。現在、業界として実験動物が使えないため化粧細胞も含まれると考えられるため、表皮前駆細胞からの品材料の評価には培養細胞に多くを頼らざるを得ない状況

分化プロセスを高感度にモニターできるように、表皮分がある。一方で、汎用される初代培養ケラチノサイトはヘ化マーカーのプロモーターにレポーター遺伝子を連結させテロな分化状態の細胞が混在しているだけでなく、継代可た遺伝子の導入も併せて行った。本研究では、表皮前駆能回数に限りがあるため遺伝子操作による均一細胞の樹立

細胞から変化する分化細胞として、特に培養系での分化誘も難しい。本研究では、未分化な表皮前駆細胞が十分量確導が困難とされる毛／毛包に着目し、毛のケラチンである

保でき、さらに表皮構成成分への分化を容易にモニター可KRT 31 のプロモーターを適応させることにした。さらに、

能な系の確立を試みた。具体的には、低分子化合物の添加

万能細胞の分化数理モデルを作成してその分化誘導効率ののみで ES/iPS 細胞から表皮前駆細胞を作製し、かつ、表向上についても検討した。本研究のコンセプトによって作皮前駆細胞から目的細胞への分化を容易に定量追跡できる成された iPS 細胞は、培養液に 2 種類の安価な低分子化合系を確立することにした。分化万能性を有する ES/iPS 細物を添加し、レポーター遺伝子の発現追跡を行うだけで分胞が表皮前駆細胞に分化するためには、まず中・内胚葉で化状態を定量的に把握できるため、薬剤候補物質をこの系はなく外胚葉へ変化し、次に神経系ではなく表皮系へと分に添加することでその分化誘導活性を評価できると期待さ化する必要がある。前者についてはレチノイン酸の添加が、れる。

また、後者については細胞近傍の一時的な BMP 4 の濃度

２．方上昇が効果的であるとされる 1）。
そこで、本研究では必要に応じて iPS 細胞表面で BMP 4

法

2 . 1．iPS 細胞の遺伝子加工Ⅰ
未分化な万能細胞は生理活性分子に敏感に応答することや遺伝子の導入・発現が難しいことを考慮して、テトラThe next-generation screening cells forcosmetic components: ES/iPS cells withmultiple gene-manipulations
Yohei Hirai
Department of Biomedical Chemistry,
Kwansei Gakuin University

サイクリン／ドキシサイクリンを添加した時だけ導入遺伝子の発現が可能になるシステム（Tet-on system）を採用
し、強制的にゲノムに遺伝子挿入できる Piggybac トラン
スポゾンの活性 2）を利用することにした。そのため、まずPB-tet ベクターをベースにしたコンストラクトを構築し− 53 −

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た（図 1）。次に調製したコンストラクトを rtTA、トラン

包への分化をモデルに選び、その分化プロセスを簡便に追スポゼース、薬剤耐性ベクターと共にマウス iPS 細胞に導跡できる系への展開を試みた。細胞から毛／毛包への分化

入し、テトラサイクリン／ドキシサイクリンの添加によりが高感度に検出できるように、表皮前駆細胞が毛へ分化す

BMP- 4 の発現量が ON/OFF できる安定細胞を作製したる際に発現するケラチン 31 のプロモーター活性を定量追（tet-BMP 4 -iPS 細胞）。また、この細胞がテトラサイクリ

跡できるように、まずゲノムからケラチン 31 のプロモー

ン／ドキシサイクリン非添加状態では未分化状態を保ちなター領域を抽出しルシフェラーゼレポーターを連結したプ

がら通常の iPS 細胞として扱えることを確認し、十分に増ラスミドを作成しこれを細胞に導入した。

殖させたものをストックした。

2．3．ES/iPS 細胞の分化プロセスのモデル化

2．2．iPS 細胞の遺伝子加工Ⅱと分化の検出

まず、多能性幹細胞である iPS 細胞から外胚葉、内胚葉、本研究では、特に培養下で未分化表皮細胞／表皮前駆細中胚葉への 3 胚葉分化と、外胚葉から神経前駆細胞や表皮胞からの分化が困難とされ特殊な表皮付属物である毛／毛前駆細胞への分化、さらには表皮前駆細胞から表皮細胞、毛包・毛髪細胞への分化のプロセスを考慮した細胞系譜図を作成した（図 2）。次に、この図のD32/D33 を目的の毛包・毛髪細胞と設定しグループ分けを行った。グループ分けの第 1 段階として（ステージ 2）group1 の一つの細胞集団が 3種類の細胞に分化すると仮定し、その仮定に基づいて D 32 /D 33 の分化に関与しないグループ（group 2）と関与するグループ（group 3）に分けた。さらに、第 2 段階として（ステージ3）、group 3 の中でもD 32 /D 33 の分化に関与しないグループ（group 5）と関与するグループ（group 6）に分け、group 6 が直接的に D 32 /D 33 に分化するとプログラムした。また、初図1

コンストラクトおよび遺伝子導入細胞（tet-BMP4-iPS）期の細胞数を便宜上 100 個とし、条件として各ステージの細図 2 iPS 細胞から各細胞への分化モデル
左：分化プロセスの区分け
A; 多能性幹細胞（iPS 細胞）（group1） B.C; 内胚葉もしくは中胚葉（group2） D; 外胚葉（group3） B1~B3,
C1~C3: B11~B33 もしくは C11~C33 の前駆細胞（group7） D1,2; D11~D23 の前駆細胞（group5） D3; 表皮前駆細胞（group6） D31; 表皮細胞（group8） D32, D33; 毛包（group9）もしくは毛髪細胞（group10）
右：シミュレーションのパラメータ
分裂割合 ; 事象が起こる際に細胞が分裂する割合。1, 2, 3 への分化割合 ; 事象が起こる際に分化する割合（例えばD が D1 へ分化する割合を 1 への分化割合。D2 へ分化する割合を 2 への分化割合。D3 へ分化する割合を 3 への分化割合としている）。現状維持割合 ; 事象が起こる際にそのステージにとどまり変化をしない割合。

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胞は 1 日ごとにそれぞれある割合で（1）“分裂”（2）“次のステ（Tet-BMP 4 -iPS 細胞）はテトラサイクリン（tet）／ドキシサイージに移行”（3）“現状維持”のいずれかの事象を起こすと仮定

クリン（Dox）の添加に応じて BMP4 を発現し、BMP4 の下流した。また、D 32 /D 33 は分裂しないため（1）“分裂”の条件は適の smad 1 / 5 / 8 も速やかにリン酸化されることが確認できた。

用されず、さらに毛包や毛髪細胞は脱核し、mRNAの発現がまた、未分化マーカー nanogと神経前駆マーカー nestin のなくなることから（4）“消滅”を条件として付け加えた（図 2）。

mRNA発現を指標に、この細胞を外胚葉に分化誘導するた

３．結めの至適 RA 濃度を決定した。次に、導入遺伝子の発現誘

果導により表皮前駆細胞への分化が促進されるかを調べること

従来から、分化万能性を有する細胞はレチノイン酸（RA）にした。RAと同時に Doxを添加し神経前駆細胞のマーカーの添加で外胚葉へ、外胚葉は細胞近傍の BMP 4 の刺激で

nestinと表皮前駆細胞のマーカー krt 14 の発現変動をqRT-

各種の表皮由来細胞のソースである表皮前駆細胞に分化しPCR 法にて解析したところ、Dox が RA による神経前駆細やすいことが知られている。そこで、本研究ではフィーダ胞への分化を抑制し表皮前駆細胞への分化を促進することーフリーで安定して増殖させることができるマウス iPS 細が確認できた。次に、RAとDoxを添加し 24 時間、48 時間、

胞を出発材料に選び、これに RA と BMP 4 を作用させる

72 時間で各種マーカーの mRNA発現変動ならびにkrt 14 免

ことで表皮前駆細胞の安定供給を試みることにした。RA

疫蛍光染色やFACS による解析を行った。その結果、分化は低分子化合物で容易に取り扱えるのに対し、BMP 4 は

誘導 24 時間で未分化マーカー nanogの発現が低下し未分化性不安定で高価なタンパク質である。そこで、今回は iPS 細が失われていること、神経細胞マーカー tuj1 の発現は変わら

胞自身に BMP 4 を生産・分泌させる系を構築した。具体ないこと、krt14 の発現が増加していくことがわかった。免的には、低分子化合物によって BMP 4 遺伝子の発現を人

疫蛍光染色やFACS解析では、KRT14 の発現細胞の割合も工的に制御できるように tet on システムを用いて細胞に日を追うごとに増加していくことも判明した（図 3）。次に、安定的な遺伝子導入を行った。樹立した遺伝子導入細胞

Tet-BMP 4 -iPS 細胞由来の表皮前駆細胞は通常の表皮前図 3 tet-BMP4-iPS の分化誘導
上；各種マーカーの発現 nanog（未分化マーカー）、nestin（神経前駆マーカー）、tuj1（神経系マーカー）、gata4（内胚葉マーカー）、t（中胚葉マーカー）N=3 ＊＊＊ p<0.001
krt14（表皮前駆マーカー）N=4 ＊＊ p<0.01
下 : KRT14 の免疫蛍光染色。control では KRT14 ポジティブな細胞が確認できなかったが、RA/Dox による分化誘導によって KRT14 ポジティブな細胞が確認された。

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駆細胞と同様に成長因子による増殖や、次のステージへの培養 1 日で krt 75 の発現が増加し、3 日目でピークに達し分化が可能であるかを調べた。Tet-BMP 4 -iPS 細胞を RAた後ゆるやかに発現が減少した。一方、krt 31、krt 33 a のと Dox で刺激する際に同時に keratinocyte growth factor

発現は 4 日でピーク達しその後減少した（図 4）。この結果（KGF）（100 ng/ml）を添加すると、krt 14 の発現がさらには、Tet-BMP 4 -iPS 由来の表皮前駆細胞は毛乳頭細胞と上昇したことから、分化誘導された表皮前駆細胞は KGF

共培養をすることで、まず毛包へ、そして少し遅れて毛により増殖が促されると考えられる。ただし、krt 14 の発髪細胞へと分化することを示唆している。ちなみに、生体

現量は 72 時間を超えると減少に転じ、角化した表皮のマ内でも未分化な表皮から毛包／毛が発生する過程で同様のーカーであるトランスグルタミナーゼ 1（TGase 1）の発現挙動を示すことが知られている。本研究で用いた共培養系が開始されていたことから、得られた表皮前駆細胞はこのにおいては Tet-BMP 4 -iPS 由来細胞は毛乳頭細胞とは多段階で自発的に次のステージへ分化したと考えられた。以

孔質膜を隔てて存在していること、毛乳頭細胞以外の細上の結果より、RA/Dox 非添加系で安定して増殖・維持で胞を使って共培養しても毛包／毛へと分化誘導されない

きる Tet-BMP 4 -iPS 細胞は、RA/Dox の添加に応答してことから、毛乳頭細胞から分泌される液性因子（拡散性因

生体内の表皮前駆細胞と同様な性質を有する細胞へと簡単子）の中に毛包や毛髪細胞へ分化させる物質が存在していに分化することがわかった。次に、Tet-BMP 4 -iPS 由来

ると考えられる。現在、毛乳頭細胞から放出される毛／毛の表皮前駆細胞が、初代培養表皮細胞では分化しにくい毛包形成因子の 1 つとして Wnt 5 a が着目されている 5）。そ

包・毛髪細胞に分化誘導が可能なのかを調べた。生体内にこで、RA/Dox 存在下で単独培養した Tet-BMP 4 -iPS 細

おいて表皮前駆細胞は毛乳頭細胞との相互作用することに胞に WNT 5 a（100 ng/mL）を添加したところ、krt 75 のより毛包・毛髪細胞へと分化することが知られている

3, 4）

。そ

発現は有意に増加したが krt 31 の発現には変化が見られなの現象を模倣するため、多孔膜メンブレンを使って毛乳頭かった。また、前述の KGF については、krt 14 に対する細胞との共培養を行い、Tet-BMP 4 -iPS 由来細胞内の毛krt 75 /krt 31 両方の相対的な発現量変動に影響を与えない

包マーカー krt 75 ならびに毛髪のマーカー krt 31 , krt 33 a

ことがわかった。これらの結果は、WNT 5 a は発毛誘導活の mRNA 発現を qRT-PCR 法で解析した。その結果、共性を有すると考えられるが実際には毛包細胞への分化を

図4 毛乳頭細胞が分泌する因子による毛包・毛への分化誘導
a; 共培養の模式図。Tet-BMP4-iPS細胞は毛乳頭細胞の分泌する発毛誘導因子の影響を受ける。
b; 毛包・毛髪の構造における各遺伝子の発現場所の簡易図。krt75は毛包細胞への分化マーカーkrt31または、
krt33aは毛髪細胞分化マーカーとして使用した。
c~e: 毛包（krt75）／毛髪（krt31, krt33a）細胞分化マーカーの発現変化。これらのマーカーの発現が有意に増加することから、毛包・毛髪細胞への分化が進行していることが確認できる。
N=3 ＊p<0.05 ＊＊p<0.01 ＊＊＊p<0.001− 56 −

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工促進させる一方で毛髪細胞への分化には影響しないこと、KGF によって表皮前駆細胞の数を増やすことにより、さKGF は表皮前駆細胞の増殖のみに関わり毛 / 毛包への分化らに顕著に毛髪細胞分化が追跡できることも確かめられた。

に関わらないことを示唆する。ただし、この実験系では産これらの結果は、Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞を用い、生される表皮前駆細胞の割合が十分とはいえず（表皮前駆毛乳頭細胞との共培養処理の代わりに試験物質の薬剤候補

細胞の割合は 10 ％程度）
、高感度の分化追跡法の確立（以因子を添加することで試験物質の発毛誘導活性を高感度に

下の 3 . 2 .）、ならびに分化誘導条件の再検討（以下の 3 . 3 .）モニターできる可能性を示唆している（図 5）。

が必要と考えられた。

3．3．ES/iPS 細胞の分化モデルと分化誘導条件の検討

3．2．毛への分化の高感度追跡系
前述の通り、表皮前駆細胞の産生効率が低いことを考

Tet-BMP 4 -iPS 細胞から表皮前駆細胞への分化効率を慮し、次に、最終的な表皮由来の目的細胞（モデルケース向上させるためには、RA ならびに Dox の最適添加条件をでは毛髪細胞）への分化プロセスを高感度にモニターでき

決めることが必要と考えられた。そこで、iPS 細胞から毛る系の構築に取り組んだ。具体的には、毛髪細胞への分／毛包への分化プロセスの数理モデル化を行い、そこか化に応答して特異的に発現開始される KRT 31 のプロモー

ら添加条件を抽出することにした。
「2 . 方法」の項で述べた

ターにレポーターのルシフェラーゼ遺伝子を連結したコパラメータから毛包・毛髪細胞（D 32 , 33）の mRNA の発現

ンストラクトを Tet-BMP 4 -iPS 細胞に導入する方法を採パターンはある一定期間増加しピークを迎えた後、ゆるや用した。まず、KRT 31 のプロモーターと予想される領域

かに減少していくと予想できた（図 2）。そこで、この縦軸

1700 bp を PCR でマウスゲノムより取得し、それにルシ（発現量）を上げる、即ち、効率的に毛包・毛髪の細胞へフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトプラスミドの分化を促進させるために group 1（A）から group 2（B,

（KRT 31 pr-Luc）を作製しこれを Tet-BMP 4 -iPS 細胞へ遺C）、group 3（D）への分化パラメータを変化させた。そ伝子導入した（Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞）。このの結果、group 1 から 3（D）への分化割合を変動させる

Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞を RA/Dox で刺激し毛ことで、D 32 の縦軸が大きく変動するが（赤枠で囲った乳頭細胞との共培養処理を行うことで、毛髪細胞分化が高図）、group 1 , 2（B, C）への分化割合を変化させても D 32

感度で継時的にモニターできるようになった（図 5）。また、の変動が小さい結果となり（緑枠で囲った図）、group 1 か

図5 系の概略図
a; tet-BMP4-KRT31-LUC iPS細胞の調製と毛髪細胞への分化追跡 KRT31 プロモーター配列をLucの遺伝子上流に挿入し、tet-BMP4-iPS細胞に導入した。この細胞にRA, Doxと発毛誘導剤を作用させるとルシフェラーゼが発現する。インターナルコントロール, β-gal
b; 毛乳頭細胞からの分泌因子による発毛誘導の追跡 N=3 ＊p<0.05
c; 毛髪細胞への分化能をもつ薬剤スクリーニング系の簡略図。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020ら group 3（D）への分化を促すことでより毛包・毛髪の細は極めて単純なアイデアをベースにしたものであり、用い胞への分化誘導効率を上げることができると予想されたたプロモーターを他の目的細胞特異的タンパク質のものに（図 2）。同様の解析を行うと、① group 1 から group 3 への換えることで毛髪以外の表皮由来細胞への分化プロセスも分化を促す、② group 3 から group 6 への分化を促す、③

容易に定量追跡できるはずである。ただし、これまで発毛group 6 から group 9 や 10 への分化を促す、の 3 つのこと活性が認められてきた WNT 5 a には毛髪分化誘導能は検出が最も有効であり、各プロセスを加速させても D 32 /D 33

されず、また、同様の活性が指摘されている Shh 5 - 7）にもの発現はまず増加してピークを迎え、その後ゆるやかに減明らかな活性は認められなかった（データ示さず）。一方で、少するパターンをとると考えられた。これらの結果を鑑み、WNT 5 a には表皮前駆細胞から毛包細胞への分化を促すこ

まず RA のみを 120 時間作用させて外胚葉分化誘導を十分とが確認され、これらの因子群のもつ発毛誘導活性は毛髪にした後に、Dox のみを 72 時間作用させたところ、RAを生み出すことによるのではなく、毛髪細胞の支持細胞をと Dox を同時に 192 時間作用させたものと比べて KRT 14

生み出すことによる間接的なものである可能性もある。

陽性細胞の割合が 14 ％から 34 ％にまで増加した（図 6）。

４．考

本研究では、表皮前駆細胞の状態で安定的に維持することができないことが確認された。この、表皮前駆細胞の自察然分化を引き起こす原因としては培養液中のカルシウム濃本研究で iPS 細胞に多重の遺伝子加工を施すことで、安度が適切でなかった可能性がある。一般的に、未分化な表定して増殖・維持でき、しかも低分子化合物の添加のみで皮細胞は低カルシウムの培養液（0 . 15 mM 以下）で維持さ機能的な表皮前駆細胞を産生できる細胞が準備できるようれ、高濃度のカルシウムイオン存在下（1 mM 以上）では自になった。また、元来表皮前駆細胞は非常に不安定で、特然に分化してしまうことが知られている 8）。本研究で使用

別な分化誘導なしに自発的に各種表皮由来細胞に分化してしている iPS 細胞はカルシウム濃度の低い初代表皮細胞用

しまうが、本研究で得られた細胞は毛髪細胞に変化したと培地中では生存できず、約 1 mM のカルシウムイオンを含

きにのみレポーター遺伝子が発現するため、毛髪分化を加んだ培地を用いて培養を行った。将来的には、分化誘導の速もしくは抑制する因子のスクリーニング細胞として有用あるタイミングで低カルシウムの培養液に交換することがなものと考えられる。もちろん、ここで考案したシステム有効である可能性がある。

図6 RA, Doxの処理条件の最適化
KRT14陽性細胞のFACS解析（上）とそれをグラフ化したもの（下）RAによる外胚葉分化処理を120時間行った後、Doxを72h処理したものは、RA/Dox72h処理に比べてKRT14陽性細胞の割合が増加した。

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５．総

BA: beta-catenin activity in the dermal papilla括

regulates morphogenesis and regeneration of hair.
Developmental cell 18: 633-642, 2010.

本研究で示した Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞は、通常の iPS 細胞として安定して増殖、維持できるだけでな

4） Rendl M, Polak L, Fuchs E: BMP signaling in dermal

く、RA（120 時間）と Dox（72 時間）で前処理することで、

papilla cells is required for their hair follicle-inductive

毛髪への分化誘導に応答してルシフェラーゼを発現するた

properties. Genes & development 22: 543-557, 2008.

め、簡便で優れた発毛剤のスクリーニング系に利用できる

5） Reddy S, Andl T, Bagasra A, Lu MM, Epstein DJ,
Morrisey EE, et al.: Characterization of Wnt geneと思われる。

expression in developing and postnatal hair follicles
謝辞and identification of Wnt5a as a target of Sonic
hedgehog in hair follicle morphogenesis. Mechanisms

本研究は大学院生の城戸拓巳君が中心となって行ったもof development 107: 69-82, 2001.

のであり、数理モデルの構築は関西学院大学の吉野公三准6） Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G,

教授の助言を受けました。ここに感謝いたします。

Birchmeier W: beta-Catenin controls hair follicle（引用文献）

morphogenesis and stem cell differentiation in the skin.
Cell 105: 533-545, 2001.

1） Veraitch O, Kobayashi T Fau-Imaizumi Y, Imaizumi
Y Fau-Akamatsu W, Akamatsu W Fau-Sasaki T,

7） Telerman SB, Rognoni E, Sequeira I, Pisco AO,

Sasaki T Fau-Yamanaka S, Yamanaka S Fau-Amagai

Lichtenberger BM, Culley OJ, et al.: Dermal Blimp1

M, et al.: Human induced pluripotent stem cell-derived

Acts Downstream of Epidermal TGFbeta and Wnt/

ectodermal precursor cells contribute to hair follicle

beta-Catenin to Regulate Hair Follicle Formation andmorphogenesis in vivo.

Growth. J Invest Dermatol 137: 2270-2281, 2017.

2） Randolph LN, Bao X, Zhou C, Lian X: An all-in-8） Elsholz F, Harteneck C, Muller W, Friedland

one, Tet-On 3G inducible PiggyBac system for human

K: Calcium--a central regulator of keratinocyte

pluripotent stem cells and derivatives. Scientificdifferentiation in health and disease. European journal

reports 7: 1549, 2017.

of dermatology : EJD 24: 650-661, 2014.

3） Enshell-Seijffers D, Lindon C, Kashiwagi M, Morgan− 59 −