新規不整脈性心筋症モデルマウスを用いた抗酸化食材による心筋症予防効果の解析

今井

北里大学薬学部緒言浩

孝准教授

クの成分であるホノキオール、マグノロール、リンゴや活性酸素は様々な疾患の進展や原因として関与していタマネギなどに含まれるフラボノイドの一種、ケルセチることが報告されているが、脂質の酸化が疾患の直接のン、シソ科の植物に含まれるポリフェノール化合物であ原因となるのか、炎症の結果として生じているのかは明るロスマリン酸、オリーブ油果実に含まれるリポキシゲかではなかった。我々は、生体膜リン脂質の酸化１次生ナーゼ阻害物質である 2-（3,4- ジヒドロキシフェニル）成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドをグルタチオンエチルアルコールについて解析を行った。

依存的に直接還元できるリン脂質ヒドロペルオキシドグ
2. リン脂質の自動酸化に対する酸化抑制効果の評価

ルタチオンペルオキシダーゼ（PHGPx）1,2）の心筋特異的欠損マウスを作成したところ、発生過程の 17.5 日で40μM ジリノレオイルホスファチジルコリン（DLPC）心筋細胞死が突然起き致死となること、ビタミン E 添エタノール溶液を、96 穴プレート、イムロン１に 50μl加食を母親に与えると正常に分娩し育つことを見出し加え、さらに２倍希釈系列濃度で作製した食材成分のた。またビタミン E 添加食で正常に成育した心筋特異エタノール溶液 50μl を添加し、３７度で１６時間静置的 PHGPx 欠損マウスを通常食に変えると約 10 日で不し、乾固さらに自動酸化を行った。自動酸化して生成整脈性心不全による突然死を引き起こすことを見出ししたリン脂質ヒドロペルオキシドを、ヒドロペルオキシた。このことは、ビタミン E や PHGPx による脂質酸ドと反応して蛍光を発する蛍光色素ジヒドロローダミン化の抑制系のバランスの破綻により生成する脂質ヒドロ（DHR）123（1μg/ml）を 50μl 添加して 90 分後に蛍光ペルオキシドが心不全の原因となることを意味してい量を蛍光プレートリーダーにて測定した。陽性コントる。この心不全では、心臓の拡張は見られないことから、ロールとしてビタミン E（α−トコフェロール）を用いた。

拡張型心筋症とは異なる。過労死や過度のスポーツなど
3. タモキシフェン誘導型PHGPｘ欠損細胞株を用いたのよる突然死などの原因不明の心不全の原因となる可能脂質酸化が起因となる細胞死の抑制効果性も考えられる。本研究では、抗酸化活性を持つことが報告されている 8 種類の食材成分について、PHGPx

タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損 MEF 細胞は申欠損による細胞死やビタミン E 低下による心筋特異的請者が樹立した MEF 細胞 2）で、LoxP 配列に挟まれた

PHGPx 欠損マウスの突然死に対して予防効果が見られPHGPx ゲノム遺伝子を持つ不死化細胞に CreERT2 遺るのかを明らかにすることを目的に検討を行った。

伝子を導入した細胞である。通常は細胞質に CreERT2蛋白質が発現しているので、遺伝子破壊は起こさず生実験方法存しているが、タモキシフェン（Tam）を添加すると、

1. 食材成分タモキシフェンが CreERT2 蛋白質のエストロジェン

本研究では、抗酸化能を有すると報告のある食材成分

受容体結合部位に結合することにより構造変化し、核のうち、図 1 に示す 8 種類の食材成分について解析を移行シグナルの出現により核へ移行して Cre 活性によ行った。魚類の筋肉の赤色成分や甲殻類の殻に含まれるり LoxP 配列で挟まれた PHGPx ゲノム遺伝子を欠失さカロテノイドの一種、アスタキサンチン、コーヒー豆中せることができる細胞株である。この細胞ではタモキに含まれるクロロゲン酸、マメ科の多年草「甘草」に含シフェンを添加すると 24 時間後に PHGPx 蛋白質の消まれるイソフラボノイド系のグラブリジン、生薬コウボ失に伴い、リン脂質ヒドロペルオキシドの蓄積が起こ
1

今O

1．アスタキサンチン

HO井浩

孝

7．ロスマリン酸

4．ホノキオール
HOOH

OHO

HOO

2．クロロゲン酸
O

HO
HO

O

HOOH

O
OH

HO

9．α―トコフェロール（ビタミン E）

OH
OH

O

HOO

HOOH

OHOH

OHHO

6．ケルセチン3．グラブリジン

HOOH

8．2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エチルアルコールOHOHOHO

5．マグノロールOH

HOH3CH3COO OHH3C

CH 3CH 3O

CH 3 CH 3CH 3CH 3CH 3O

図 1 スクリーニングを行った抗酸化活性の報告のある食材成分の構造式

り、48 時間後から 72 時間後の間で新規細胞死により致シドが蓄積し、不整脈性心不全を引き起こし突然死を死となる。食材成分の細胞死の抑制効果は、2x10 cells/引き起こす。本実験では、上記 2 つのスクリーニング

６穴 dish で細胞をまき、次の日に Tam 添加（1 μ M）系でともに陽性であったホノキオールを添加した CE-2と同時にそれぞれの食材成分の濃度の希釈を取り添加し食（0.003%w/w 添 加 CE-2） を、 通 常 食 に 変 え て 与

72 時間後に付着している細胞を生存している細胞としえ、致死となる時期が延びるのかについて検討を行っ

オールインワン顕微鏡にて細胞を撮影して細胞数をカウた。心筋特異的 PHGPx ヘテロマウスをコントロールマントした。Tam を添加した場合（細胞死抑制効果）とウスとして、ホノキオール添加食に毒性が見られないTam を添加しない場合（食材成分の毒性評価）を比較かを同時に検討した。このコントロールマウスでは通して、食材成分の細胞死抑制効果を検討した。いずれも常食（CE-2）に変えても致死 は起きない。統計学的評

食材成分を添加しない場合の Tam 未添加の 72 時間後

価では Wilcoxon 検定を行い、50％生存期間（Medianの細胞数を 100％として、生存率を算出した。

Sarvival Time, MST）を算出した。

4. ビタミンE低下による不整脈を伴う心筋症モデルマ

結4ウスを用いた突然死の予防効果

1. 食材成分によるリン脂質の自動酸化によるリン脂質ヒドロペルオキシド生成の抑制効果の評価

心筋特異的 PHGPx 欠損マウスは、研究代表者が作製したオリジナルなマウスであり、PHGPx loxP マウス

果本研究で用いた図 1 に示した 8 種類の食材成分は、いと心筋特異的 Cre 発現マウス（MCK-Cre）を交ずれも抗酸化活性があることが知られているが、リン脂配して作製したマウスであるが、本マウスは発生過程質の自動酸化によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成2-4）の 17.5 日に心筋細胞死を引き起こして致死となる。しに対する同じ評価系で比較されてはいない。PHGPx 欠

か し、 母 親 を ビ タ ミ ン E 添 加 食（0.1%w/w VE 添 加

損による細胞死では、リン脂質ヒドロペルオキシドの生CE-2）で飼育すると正常に生まれ生育する。ビタミン成が、致死の起因となることから、まず、リノール酸をE 添加食で飼育した 3-4 週齢の心筋特異的 PHGPx 欠２つもつジリノレオイルホスファチジルコリンの自動酸損マウスを、ビタミン E 添加食から通常食（CE-2）に化によるリン脂質ヒドロペルオキシド生成に対して、各変えると約 10 日後に、心筋にリン脂質ヒドロペルオキ

食材成分がビタミン E と比べてどの程度抑制効果が見ら
2ジヒドロキシエチルアルコール

100

5025

12.5

6.25

3.125

1.563

00

食材成分の濃度（µM）

5025

マグノロール

100050

ケルセチン

100

ホノキオール20025

ロスマリン酸200

ビタミン E300

12.5300

500
400

6.25

ビタミン E

3.125

400

600

0.78

500

7000600

DHR 蛍光 485/530nm

食材成分の濃度（µM）

700

0.78

DHR 蛍光 485/530nm

食材成分の濃度（µM）

12.5

00

50

25

12.5

6.25

3.125

1.563

00200

6.25

クロロゲン酸100

グラブリジン

300

1.563

200

ビタミン E

3.125

アスタキサンチン

300

5004001.563

ビタミン E

600

0.78

500
400

DHR 蛍光 485/530nm

6000.78

DHR 蛍光 485/530nm

新規不整脈性心筋症モデルマウスを用いた抗酸化食材による心筋症予防効果の解析

食材成分の濃度（µM）

図 2 食材成分によるリン脂質自動酸化の抑制効果
乾固したジリノレオイルホスファチジルコリンのプレート上での自動酸化で生成したリン脂質ヒドロペルオキシドをジヒドロローダミン 123（DHR）と反応させた。どの食材もリン脂質の自動酸化を抑制する活性を持つことが示された。

れるのかについて、食材成分の濃度をふり検討を行った。

欠損し、24 時間後にリン脂質ヒドロペルオキシド生成

リン脂質ヒドロペルオキシドの検出は、ヒドロペルオを起因として、48 時間から 72 時間の間で致死となる。

キシドに反応して蛍光を発するジヒドロローダミン 123

そこで、タモキシフェンの添加の有無と阻害剤の濃度を（DHR）を用いて行った。その結果、図 2 に示すように、ふることにより、阻害剤による細胞毒性効果と PHGPx

ホノキオール、マグノロオール、ロスマリン酸、ケルセ

欠損による細胞死の抑制効果について評価した。図 3 にチン、グラブリジン、クロロゲン酸は、ほぼビタミン E

示すように、タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損 MEFと同程度、自動酸化によるリン脂質ヒドロペルオキシド細胞死を抑制できたのは、ホノキオールとグラブリジンの生成を抑えた。ジヒドロキシエチルアルコール及び、のみであった。またグラブリジンは細胞死を起こす濃度

アスタキサンチンは、ビタミン E よりリン脂質ヒドロペに近い高い濃度でしか抑制できなかったのに対して、ホルオキシド生成の抑制効果は低かった。

ノキオールは低濃度でも有為にこの細胞死を抑制できることが明らかとなった。

2. 食材成分によるタモキシフェン誘導型PHGPｘ欠損

3. ビタミンE低下による不整脈を伴う心筋症モデルマ

MEF細胞における細胞死の抑制効果ウスを用いた突然死の予防効果

新規不整脈性心筋症モデルマウス（ビタミン E 低下による心筋特異的 PHGPx 欠損マウスの突然死モデル）

PHGPx 欠損細胞死における抑制効果が見られたグラは、心筋におけるリン脂質ヒドロペルオキシド生成が起ブリジンとホノキオールのうち、細胞毒性と細胞死抑因となって心筋細胞が細胞死をおこし致死となる。この制濃度が離れているホノキオールについて、ビタミン致死はビタミン E 添加食で抑制される。マウスレベル

E 低下による心筋特異的 PHGPx 欠損マウスにおけるのスクリーニングの前に、細胞レベルでまずスクリー心不全による突然死を抑制できるのかについて評価しニングを行った。タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損た。その結果、図 4 に示すように、ホノキオール添加食

MEF 細胞は、タモキシフェン添加によって PHGPx が（0003%w/w 添加食）では、50％生存期間（MST）で 43

今井浩

アスタキサンチン

Tam‒
Tam+

00.3

3160140120
10080
6040
20030濃度（microM）
グラブリジン

140160140120
10080
604020010080Tam‒
Tam+

6040
2000110Tam‒
Tam+

0100030300

ロスマリン酸

80

Tam‒
Tam+

6040201100110濃度（microM）

100

生存率（%）

生存率（%）

100濃度（microM）

Tam‒
Tam+2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エチルアルコール
1601401201008060402001200300

生存率（%）

160
140120100806040200140030

ケルセチン

生存率（%）

33濃度（microM）

Tam‒
Tam+濃度（microM）

1000

Tam‒
Tam+

マグノロール

0100

ホノキオール濃度（microM）

160
140
120
10080
60
4020010濃度（microM）

生存率（%）

120

クロロゲン酸生存率（%）

生存率（%）

160140120
10080
6040200

生存率（%）

孝

100

Tam‒
Tam+

0

330濃度（microM）

300

図 3 食材成分による PHGPx 欠損細胞死の抑制効果の解析
タモキシフェン（Tam）添加の際に食材成分を同時に添加し、72 時間後のタモキシフェン誘導型 PHGP x 欠損MEF 細胞の細胞死の抑制効果を検討した。
グラブリジン及びホノキオールのみが細胞死を強く抑制した。

4新規不整脈性心筋症モデルマウスを用いた抗酸化食材による心筋症予防効果の解析

コントロールマウス

心筋特異的 PHGPx 欠損マウス

カプランマイヤー生存曲線

カプランマイヤー生存曲線

10.8

N=200.4
0.20（MST=10）

ホノキオール（MST=14）

ホノキオール

0.6

N=34
通常食

0.8

通常食

生存確率

生存確率

1

N=200.6

N=200.40.2020

40060

020

生存日数（日）ホノキオール添加食

4060

生存日数（日）0.003%（w/w）

Wilcoxon 検定
計算値：4.058712

P 値：0.01068137
判定：p＜0.005

図 4 ホノキオール添加食による心筋症突然死モデルにおける予防効果
心筋特異的 PHGP x 欠損マウスはビタミン E 添加食から通常食に換えると約 10 日で突然死を起こす。
通常食の代わりに 0.003% (w/w) ホノキオール添加食を与えると生存期間が有為に延びた。

日の延長効果が確認され、統計的に有意差が得られた。

ン E の低下による心筋特異的 PHGPx 欠損マウスによさらに最大寿命は約 2.5 倍伸びた。また、コントロールる突然死に対するホノキオール添加食の予防効果は統計マウスを用いた解析から、このホノキオール添加食投与的に有意差が確認された。しかし、ビタミン E のようによる毒性は確認されなかった。に完全に抑制できるという結果ではなく、致死時期の延長効果が見られる結果に止まったが、これは、今回用い考察たホノキオールの添加量が０.003%（3mg ホノキオー

抗酸化能を有するといわれている図 1 に示した食材

ル / CE-2 100g）とビタミン E 添加食 0.1%（100mg ビ

成分について、In vitro 自動酸化抑制能、PHGPx 欠損

タミン E / CE-2 100g）に比べてかなり低い濃度であっ

MEF 細胞での細胞死の抑制効果、ビタミン E 添加食かたことにもよると考えられる。ホノキオールの添加量をら通常食に変えた時に起きる心筋特異的 PHGPx 欠損マ上げればさらに十分な予防効果も期待できると考えられウスの突然死に対する In vivo での予防効果について解た。今後の検討課題である。

析を行った。いずれの実験系もこれまでの解析から、リ要ン脂質ヒドロペルオキシド生成が、細胞死、個体死を引約き起こす原因となっており、ビタミン E の添加によっ自動酸化によるリン脂質の酸化を抑制できる 8 種類て抑制される。図 2 より、In vitro でのリン脂質の自動の異なる構造式を持つ食材成分について、PHGPx 欠損

酸化に対する抑制効果は 8 種類のいずれの食材成分もMEF 細胞死の抑制効果を調べたところ、グラブリジン抑制効果を示したが、PHGPx 欠損 MEF 細胞死の抑制とホノキオール以外は抑制効果が見られなかった。ホノ効果は、予想外にホノキオールとグラブリジンしか見らキオールは、ビタミン E 低下による不整脈性心不全をれなかった。クロロゲン酸、マグノロール、ケルセチン、伴う突然死に対して低濃度添加食においても統計的に有ロスマリン酸では高濃度では、タモキシフェン未添加で為な予防効果が見られることが明らかとなった。

も細胞毒性が見られているので、細胞死抑制効果が見ら謝れないのは細胞への取り込み量が低いということではな

辞本研究を遂行するにあたり、ご支援を賜りました公益い。細胞内での食材成分の分布量や脂質酸化部位での局財団法人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。

在性が異なることがその原因と考えられた。またマグノ
ロールはホノキオールと構造が非常に似ているが、細胞死の抑制効果は大きく異なったことは興味深い。ビタミ
5

今井浩

参考文献
1）今井浩孝：オレオサイエンス , 11, 11, pp431-439, 20112）H. Imai,: J. Clin. Biochem. Nutr., 46, pp1-13, 20103）T. Ueta, T. Inoue, T. Furukawa, et al,: J. Biol.Chem.,
287, pp7675-7682, 20124）H. Imai, N. Hakkaku, R. Iwamoto, et al,: J.Biol. Chem.,
284, pp32522-32532, 2009

6孝