骨髄細胞を用いた皮膚の構築

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞生物学分野

許南 浩

Recently we demonstrated the participation of whole bone marrow cells from adult mice in the reconstitutionof skin including the epidermis and hair follicles (Kataoka et al., Am J Pathol 163:1227-1231, 2003). To get an
insight into cell populations that give rise to the epithelial components of the reconstituted skin, we fractionatedbone marrow cells derived from green fluorescent protein-transgenic mice by density gradient. Unexpectedly,
we found that a substantial amount of mononucleated cells (~30%) was recovered in the pellet fraction and thatthe cells in the pellet fraction preferentially differentiated into epithelial components of skin than the cells
in the mononuclear cell fraction. The pellet fraction contained more CD45-negative (thus uncommitted to thehematopoietic cell lineage) cells than the mononuclear cell fraction. These results indicate that the density
gradient fractionation results in significant loss of specific progenitor cells into the usually discarded pellet
fraction.

ことは、皮膚の生理、病理、さらにはコスメトロジーの観１．緒言点からも、大きな意義を持つ。

近年、骨髄に由来する細胞が血液細胞以外の様々な組織

我々は、ヌードマウスの背部皮膚切除部に特殊なシリコ細胞、例えば骨、軟骨、筋肉、肝臓、肺、心臓、脳、皮膚ンチャンバーを装着し、その内部に細胞浮遊液を播種するなどの細胞に分化する能力をもつことが明らかにされた。

ことによって比較的短期間に皮膚組織を再構築する実験系

このことに対応して、骨髄から複数の幹細胞・前駆細胞がを樹立した。本研究はこのシステムを用いて、骨髄細胞の単離同定されている。血液幹細胞は血液細胞のみでなく、中でどのような細胞集団が効率よく表皮角化細胞をはじめ肝臓や皮膚細胞にも分化しうる。間葉系幹細胞は骨、軟骨、とする皮膚構成細胞に分化するのかを明らかにしようとい

脂肪、腱、筋肉の他に、神経細胞まで生み出す能力があうものである。

ることが示された。また、Verfaillie 等が単離した MAPC（multipotent adult progenitor cells） と 呼 ば れ る 細 胞 は、

２．実験

分裂能力も高く、多様な細胞に分化する。さらに、薬剤排出能力が高いことを指標に単離される SP 細胞も、多分化２．１能を示す。このように骨髄は、最も豊かな幹細胞の供給源であると考えられる。

マウス

骨髄細胞は、GFP- トランスジェニックマウス（阪大、岡部勝教授より提供を受けた）から調製した。このマウス

骨髄の他にも、多様な成体組織から多分化能を持つ幹細は強力なプロモーターの下流に GFP を繋いだベクターが胞が単離されている。しかし、現在のところ、その生理的導入されており、全身殆どの細胞が蛍光をあてると緑色に意義は十分明らかではない。皮膚は独自の幹細胞を保持し光る。胎児皮膚細胞の調製には、胎生 16.5 日の ICR マウており、傷害を受けるとそれらを動員して組織を修復しうスを用いた。組織構築は、成体 BALB/c ヌードマウスをる。それでは何故、他の体組織に皮膚に分化しうる幹細胞用いて行った。

が存在しているのであろうか？

また、どのような幹細胞２．２が最も効率よく皮膚構成細胞に分化するのであろうか？

胎児皮膚細胞の調製

皮膚にもともと存在していた幹細胞から分化した表皮細胞胎児皮膚を切り出し、0.05％コラゲナーゼ、４度で一晩と、他の組織幹細胞から分化した表皮細胞では、その性質消化した後、実体顕微鏡下で表皮を真皮から剥離した。そに違いがあるであろうか？このような問題を明らかにする

れぞれをピペッティングによって浮遊し、メッシュを通して細胞浮遊液とした。

Reconstitution of skin using bonemarrow-derived cells
Nam-ho Huh
Department of Cell Biology, Okayama
University Graduate School of Medicine,
Dentistry and Pharmaceutical Sciences

２．３

骨髄細胞の調製と解析大腿骨の両端を切除し、骨髄を生理食塩水で洗い出すことにより骨髄細胞を採取した。この浮遊液を Histopaque1083 に上層して 400xg 30 分間遠心して、細胞を分画した（Fig. 3）。各分画の細胞を 3 回生理食塩水で洗浄した後、− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006FACS Calibur（BD Biosciences）を用いた細胞の前方お３．結果と考察

よび側方散乱解析と、免疫染色を行った。

３．１
２．
４

細胞移植

骨髄細胞の分画

胎生 16.5 日のマウス胎児皮膚から調製した細胞浮遊液

移植した皮膚細胞は、表皮由来細胞と真皮由来細胞ををシリコンチャンバー内に播種すると、３週間で皮膚組各々 500 万個ずつ混合したものである。実験によってこの織が構築され、表皮は勿論、毛のうや皮脂腺も形成される浮遊液に 500 〜 1,000 万個の骨髄細胞を混入した。ネンブ（Fig. 1）。この細胞浮遊液に GFP- 陽性の骨髄細胞を混入す

タール麻酔下のヌードマウスの背部皮膚全層を直径約１ると、その細胞が周辺の環境の影響を受けて、表皮角化細胞、cm の円形に切除し、下部シリコンチャンバーを装着した毛のう細胞、皮脂腺、血管内皮細胞などに分化した（Fig. 2）。

（Fig. 1）。細胞浮遊液を遠心して可能な限り少量の液に浮この実験では、骨髄細胞を未分画のまま用いたが、どのよ遊した後、チャンパー内に播種し、上部シリコンチャンバうな細胞集団が皮膚構成細胞に分化するのかを明らかにすーをかぶせた。1 週間後にシリコンチャンバーを取り除き、るために、骨髄細胞をまず分画した。
骨髄細胞浮遊液には大量の赤血球が含まれる。従って、経過を観察した。

通常、細胞の分画実験を行うには、まず密度勾配遠心によ２．
５

組織採取、免疫染色って単核細胞分画を調製し、それをさらに分画するのが一細胞を移植して 3 週間後に移植部位に形成された皮般的である。そこで我々もまず単核細胞を調製し、それを膚 組 織 を 切 除 し、 ４ ％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド で 固 定、マウス胎児皮膚細胞と混合して移植し、皮膚組織構築へのTechnovit 8100（Heraeus Kulzer）に包埋した。１サンプ

貢献度を検討した。単核細胞分画というのは骨髄中の有核ルについて切片を少なくとも 20 枚作製し、GFP- 陽性細胞細胞の大部分が回収されると考えられているので、当然未（すなわち骨髄由来細胞）を検索した。GFP- 陽性細胞の計分画の骨髄細胞と同様な結果が得られると期待したが、予測は、写真上で行った。
サイトケラチン（上皮細胞マーカー）

想に反して皮膚の上皮成分への貢献は大幅に低下していた。と von-Willebrand factor（血管内皮細胞マーカー）に対すその原因を明らかにするために、以下の検討を行った。

る抗体を用いて免疫染色を行った。また切片を 60％イソ骨髄細胞を密度勾配遠心によって分画すると、上清、単プロピルアルコールで処理した後、0.18％ Oil Red O で染核細胞分画、中間層、沈渣にそれぞれ０％、62％、7％、色することによって、皮脂腺細胞を同定した。

31％の細胞が回収された（Fig. 3）。赤血球は部分的に溶血しており、単核細胞分画、沈渣中の有核細胞率は、68％とFigure 1 Skin reconstitution assay using a silicon chamber. Bone marrow cells
from adult GFP-transgenic mice were fractionated by density gradientcentrifugation, mixed with embryonic mouse skin cells, and transplanted into skindefects made on the backs of nude mice. MNC, mononuclear cells.

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骨髄細胞を用いた皮膚の構築41％であった。このような分画パターンは、密度勾配遠心

錘形細胞に分類した。の媒体を変えても、大きな変化は見られなかったので、一３．３

般的な現象だと考えられる。

単核細胞分画と沈渣分画の皮膚細胞への分化

骨髄沈渣分画の細胞は単核細胞分画に比較して、毛のう３．
２

再構築された皮膚組織中の細胞の同定に分化する頻度がはるかに高かった（Table I, Fig. 4）。骨

移植した骨髄細胞によってどのような皮膚構成細胞が形髄沈渣分画を移植した８回の実験ではその全てで毛のう成されたかは、GFP- 陽性細胞の形態、局在、脂肪染色、に分化した細胞が検出できたが、単核細胞分画では 12 回

免疫染色によるマーカータンパク質の検出等によって判定の移植実験中、毛のうに分化した骨髄細胞を検出できた

した（Fig. 2）。 表皮角化細胞と毛のう細胞は、その形態やのは 2 回にとどまっていた。再構築された皮膚に存在する局在に加えてサイトケラチンを発現することが指標となる。

GFP- 陽性細胞（すなわち骨髄由来細胞）のうちの毛のう皮脂腺細胞は Oil Red O 染色陽性である。樹状細胞は表皮細胞の比率は、沈渣分画を移植した場合は 23.1％、単核細内に存在し、その特徴的な形態から容易に同定できる。血胞分画を移植した場合は 4.9％であって、統計的に明確な管内皮細胞は環状構造をなし、von Willebrand factor を有意差があった。同様に、沈渣分画細胞は単核細胞分画に発現する。筋肉細胞と脂肪細胞はその形態と局在から同定

比べて皮脂腺細胞にもより高い頻度で分化した。反対に、した。それ以外の細胞は、その形態によって球形細胞と紡血管内皮細胞に分化する確率は、単核細胞分画が高かった。

Figure 2 Density gradient fractionation of adult mouse bone marrow cells. (A) Density
gradient fractionation divides the bone marrow cells into four fractions. Most of thenucleated cells were recovered in the MNC fraction (low density) and pellet fraction(high density). (B, C) Flow cytometric analysis of the MNC and pellet fractions. Theabscissa and ordinate are forward scatter and side scatter, respectively. GFP-positivecells (viable nucleated cells) are indicated in red. GFP-negative large (viable nucleatedcells) and small cells (erythrocytes and dead cells) are indicated in blue and black,respectively.

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コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

Figure 3 Immunohistochemistry showing multipotent differentiation capacity ofbone marrow cells. (A) Cells composing hair follicles formed by transplantation of
the pellet fraction. Co-localization of GFP signal (A2) and cytokeratin expression(A3). Nuclei were stained with DAPI (A2). (B) Peri-sebaceous gland cells after
transplantation of the pellet fraction. (B1), DAPI staining with dotted lines
indicating the sebaceous glands; (B2), GFP signal present in the outer layer ofsebaceous glands; (B3), a merged image of GFP and Oil red O staining. (C)Endothelial cells after transplantation of the MNC fraction. GFP signal (C1) wasco-localized with von Willebrand factor (C2) as indicated by arrowheads.
Erythrocytes were observed in the vessel lumen (*).

Figure 4 Fluorescent-activated cell sorter analysis of the cells recovered in theMNC and pellet fractions after density gradient fractionation. The antibodies
against CD45 was conjugated with fluorescein isothiocyanate (green; detectedby FL1 covering 515 to 545 nm) and the antibodies against CD117 (c-kit) andCD200 were conjugated with phycoerythrin (red; detected by FL2 covering 653to 669 nm).

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骨髄細胞を用いた皮膚の構築

Table I. Differentiation of bone marrow cells into various cell types in skin
Incidence ofdifferentiation events

No. of GFP-positive cells

WholeMNC

PelletNo. of experiments
7
No. of GFP(+) cells counted(Total number of cells counted)
Epidermal keratinocytes
2/7Hair follicle cells
4/7
Sebaceous gland cells
3/7
Dendritic gland cells
7/7
Endothelial cells
4/7
Muscle cells
Adipocytes
Spindle cells
7/7
Round cells
7/7

128

1 / 122 / 123 / 1211 / 1212 / 122 / 122 / 12
12 / 1212 / 12

2/8
8/8
7/8
8/8
3/8
3/8
0/8
8/8
8/8

MNC

Pellet100%(2,455)
0.3%
4.9%
3.3%
4.3%
2.6%
0.3%
0.6%
58.4%
25.9%

100%
(1,579)0.5%
23.1% *8.3% **4.1%
0.9% ***
0.6%
0.0%
52.7%
9.8%*) MNC<Pelletp<0.01**) MNC<Pelletp<0.05***) MNC>Pellet p<0.05(Mann-Whitney test)

Table II. Percentage of cells positive for expression of cell surface
markers in the MNC and pellet fractions.

CD45
CD90
γδTCR
CD34
CD29
CD49f
CD200
CD117

MNC

PelletNo. of experiments

85.7 +/- 2.3
4.5 +/- 1.8
12.0 +/- 1.9
1.2 +/- 1.3
95.2 +/- 2.7
13.7 +/- 2.3
28.4 +/- 0.4
14.0 +/- 2.5

35.5 +/- 4.4
2.6 +/- 0.2
7.4 +/- 1.4
1.5 +/- 0.7
94.0 +/- 0.7
9.0 +/- 2.2
9.3 +/- 0.5
4.9 +/- 1.344344439３．４ 単核細胞分画と沈渣分画に含まれる細胞のマーカータンパク質の解析

３．５*
**

**
***) MNC>Pellet p<0.001**) MNC>Pellet p<0.05(ANOVA method)

本研究の意義骨髄から細胞を採取すると、一般に多数の赤血球が含ま単核細胞分画と沈渣分画にそれぞれどのような特徴をれている。そこで、殆ど全ての実験が密度勾配遠心によっ持つ細胞が含まれているのかを明らかにするため、いろて赤血球を沈渣として取り除き、その上部に層を形成するいろなマーカータンパク質に対する抗体で染色した後に、単核細胞分画を使用した行われている。本研究は、通常行FACS で解析した（Table II）。CD45、CD117、CD200 陽

われている密度勾配遠心の後、赤血球として廃棄されてい性の細胞の頻度は、沈渣分画が単核細胞分画に比較して低る沈渣分画にも単核細胞分画の四分の一程度の有核細胞がかった。CD49f、gdTCR 陽性細胞の頻度の差はわずかで、含まれていること、しかも沈渣分画に回収される細胞集団

CD90、CD34、CD29 の発現は両分画で差が認められなかにはより幅広い細胞系列に分化する幹細胞が含まれているった。二重染色による解析では、CD117 や CD200 の陽性ことを明らかにしたもので、その意義は大きい。

細胞は CD45 陽性細胞集団中にのみ検出され、CD45 陽性

我々の一連の研究によって、骨髄細胞は適当な環境にお細胞集団中の CD117 や CD200 の発現頻度は、両分画で差かれれば短期間に予想以上の頻度で皮膚細胞に分化しうるが認められなかった。以上を総合すると、沈渣分画は血液ことが明らかになった。ヒトで同様なことが起こるのか、細胞に分化するよう決定づけられている細胞を含む頻度がもし起こるとすれば皮膚内部から再生増殖してきた細胞と、低い、言い換えれば血液細胞系以外の幹細胞がより高い頻骨髄をはじめ皮膚外組織に由来する細胞とで機能的にどの度で含まれるという可能性が示唆された。

ような違いがあるのか、このような問題は皮膚の生理・病理を明らかにするだけでなく、コスメトロジーの観点からも非常に興味のある課題である。

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