福岡県農業総合試験場研究報告 2661（2007）

黒毛和種雌牛における卵胞刺激ホルモン皮下１回投与による過剰排卵誘起法
第１報 水酸化アルミニウムゲル吸着卵胞刺激ホルモン投与牛における血漿中卵胞刺激ホルモン濃度の推移および過剰排卵誘起効果＊磯崎良寛 ・稲田１）

２）

３）

淳・浅田研一・古賀鉄也 ・木村康二 ・角川博哉 ・平子

誠

４）

現行の牛過剰排卵誘起（SOV）においては，豚由来卵胞刺激ホルモン（FSH-P）を数日間にわたり多回投与する必要があり，作業者や牛の負担が大きい。そこで，高分子吸着・徐放能を有する水酸化アルミニウムゲル（AG）に吸着させた FSH-P 1 回投与（ワンショット）による SOV 効果について検討した。
30AU（アーマー単位）の FSH-P を AG に吸着（最終アルミニウム濃度: 1.3mg/ml）させた後に黒毛和種雌牛の皮下に投与し，その 2 日後にプロスタグランジン F２α 類縁体製剤を投与することによりワンショット SOV を実施した。血漿中 FSH-P 濃度の推移および胚採取成績について，20AU の FSH-P を 3 日間朝夕漸減投与した群と比較した。FSH-P をワンショットすることにより，漸減投与の場合と同様に 72 時間以上血漿中 FSH-P 濃度が高値を持続し，複数の卵胞が発育した。ワンショットおよび漸減投与により SOV を実施した場合の胚採取総数は，12.0 および 8.2 個/頭 とワンショッ
トの方が有意（P<0.05）に多く，正常胚採取数については，7.8 および 5.8 個/頭とワンショットの方が多い傾向にあった。
本研究の結果より，FSH-P を AG に吸着させて牛皮下に 1 回投与することにより，3 日間朝夕漸減投与と同等の過剰排卵誘起効果が得られることが明らかとなった。
[キーワード：黒毛和種，過剰排卵誘起，水酸化アルミニウムゲル，卵胞刺激ホルモン，ワンショット]
Superovulation in Japanese Black Cow by a Single Subcutaneous Administration of FSH. (1) Changes in Concentration ofPorcine FSH in Plasma and Superovulatory Response Following a Single Subcutaneous Administration of Porcine FSH withAluminum Hydroxide Gel Suspension. ISOZAKI Yoshihiro,Sunao INADA, Kenichi ASADA, Tetsuya KOGA, Koji KIMURA, Hiroya
KADOKAWA and Makoto HIRAKO. (Fukuoka Agricultural Research Center, Chikushino, Fukuoka 818-8549, Japan) Bull.Fukuoka
Agric. Res. Cent. 26:61-64 (2007)
In cattle, conventional superovulation is induced by multiple administrations of follicular stimulating hormone (FSH) for 3-4
days, which is labor-consuming and giving stress to cows. This study was coducted to evaluate the superovulatory effects of asingle subcutaneous administration of porcine FSH (FSH-P) with aluminum hydroxide gel suspension (AG) in Japanese Black Cow.
FSH-P concentrations in plasma increased following a single subcutaneous administration of FSH-P (30AU) with AG containing
1.3mg/ml aluminum, and were maintained at relatively high levels for 72 hours after the administration. These changes FSH-P
concentrations in plasma after the administration were almost the same with those following multiple administrations of FSH-P(20AU) for 3 days. The number of embryos recovered from the cattle superovulated by a single FSH-P administration on wassignificantly more (P<0.05) than that by multiple FSH-P administrations. Furthermome, the number of transferable embryos at thesingle FSH-P administration was almost the same or more, compared with that at the multiple FSH-P administrations. These results
suggest that a single subcutaneous administration of FSH-P with AG induces a superovulatory response in Japanese Black Cow.
[Key words:Japanese Black Cow,superovulation,Aluminum hydroxide gel,FSH, single administration, embryo recovery]

緒言

胚移植技術により牛の改良を促進するためには，優秀な牛から過剰排卵誘起（SOV）人工授精・胚採取により，できるだけ多くの体内受精胚を生産する必要がある。
SOV では血液中の卵胞刺激ホルモン濃度を一定期間高──────────────────────────
＊連絡責任者（家畜部）
１）現福岡県筑後家畜保健衛生所
２）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所
３）現山口大学農学部獣医学科
４）現独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構

値に保持する必要があり，現行の豚由来卵胞刺激ホルモン（FSH-P）は効果の持続時間が短い １） ため，3～4 日間連続で 1 日 2 回投与する必要がある。この FSH-P 連続投与は，作業が繁雑であるとともに，牛にも大きなストレスとなっている。これまで，高分子ポリマーであるポリビニルピロリドン（PVP）に FSH-P を混合して牛に投与することにより，1 回の投与で SOV が可能 ７，８） であることが報告されている。しかし，PVP は粘稠性が非常に高いために FSH-P の混合が困難である等の問題があり，実用化には至っていない。
水酸化アルミニウムゲル（AG）は，蛋白質等の高分子を吸着して生体内で徐々に放出する徐放能を有しており，ワクチンのアジュバントや薬剤の賦形剤として利用され62

福岡県農業総合試験場研究報告 26ている。AG は粘性が低いために取り扱いが容易であり，
FSH-P を AG 溶液に混合することにより，AG に FSH-Pが吸着される。Hirako ら ２），木村ら ４） は，徐放能を有す
る AG に FSH-P を吸着させて牛筋肉内に 1 回投与することにより，SOV 効果が得られたことを報告している。この技術が実用化されることにより，SOV の省力化および処理牛のストレス軽減が図られるが，投与部位の違い等が SOV 効果に及ぼす影響については不明である。そこで本研究では，筋肉内投与より体内吸収が緩やかな牛皮下に AG に吸着させた FSH-P を 1 回投与（ワンショット）することが，牛の血漿中 FSH-P 濃度推移および SOV 効果に及ぼす影響について検討した。

材料および方法
試験１

AG 吸着 FSH-P を皮下 1 回投与した牛の血漿中FSH-P 濃度推移
１ 供試牛
当場繋養の黒毛和種雌牛 4 頭（年齢：3.7～6.8 歳，初産分娩後 6～12 回の SOV を実施，供試前 3 回の平均正常胚採取数：3.0～5.3/回）を供試した。
試験区設定および試験方法
SOV は発情後 9～13 日目から開始し，SOV の方法により，漸減投与区およびワンショット区の 2 区を設定した。
漸減投与区では，合計 20AU（アーマー単位）の FSH-Pを 3 日間朝夕漸減法（5,5,3,3,2,2AU）により皮下投与し，初回投与から 48 時間後にプロスタグランジンＦ ２α類縁体製剤（PG）としてクロプロステノール 750μg を筋肉内投与した。PG 投与の 56 時間後に性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH；酢酸フェルチレリンとして 200μg）を筋肉内投与し，PG 投与の 56 および 72 時間後に直腸腟法により人工授精を実施した。
本試験では，アルミニウム濃度が 1.6mg/ml になるよ
うに川崎三鷹製薬が調製した AG 試作品を，FSH-P の徐放剤として使用した。ワンショット区における FSH-P の投与量は，既報 ２，４） と同様に 30AU とした。ワンショット区では，30AU の FSH-P を 2.5ml の生理食塩水に溶解した後，10ml の AG と混和したもの（最終アルミニウム濃度：1.3mg/ml）を皮下投与し，56 時間後に漸減投与区と同量の PG を投与した。PG 投与の 48 時間後に漸減投与区と同量の GnRH を投与し，PG 投与の 48 および 64時間後に人工授精を実施した。
SOV 成績の個体差の影響を少なくするため，4～7 ヵ月の間に供試牛 3 頭を 2 試験区で反転実施した。また，5ml の生理食塩水に溶解した FSH-P 30AU を皮下投与した対照牛 1 頭を設定し，血漿中 FSH-P 濃度推移を試験牛と比較した。

（2007）て，放射免疫測定法により測定した。
試験２ AG 吸着 FSH-P を皮下 1 回投与した牛の SOV 効果
１ 供試牛
当場繋養の黒毛和種雌牛 5 頭（年齢：2.4～7.1 歳，初産分娩後 0～12 回の SOV を実施，供試前 3 回の平均正常胚採取数：1.7～3.7/回）を供試した。
２

試験区設定および試験方法
試験 1 と同様に，漸減投与区およびワンショット区の2 区を設定した。漸減投与区の FSH-P 投与方法は，試験1 と同様とした。また，ワンショット区では 30AU の FSH-Pを 1ml の生理食塩水に溶解した後，4ml の AG と混和したもの（最終アルミニウム濃度：1.3mg/ml）を皮下投与した。PG は，FSH-P 投与開始から 48 時間後に試験 1 と同量を筋肉内投与した。GnRH 投与および人工授精方法
は両試験区とも既報 ３） と同様に PG 投与の 48 時間後にGnRH（試験 1 と同量）を投与し，PG 投与の 56 時間後に人工授精を実施した。SOV 成績の個体差の影響を少なくするため，3～11 ヵ月の間に漸減投与区→ワンショット区の順番で反転実施した。

２３

調査項目
FSH-P 投与開始前および投与の 10 分～80 時間後において，血液を経時的に採取して遠心分離（4℃，3000 回転/分，30 分）により血漿を分離し，-40℃以下で凍結保存した。漸減投与区において，血液採取と FSH-P 投与が重複する場合には，FSH-P 投与前に血液を採取した。血漿中 FSH-P 濃度は，独立行政法人畜産草地研究所におい３⑴

調査項目
卵巣反応
SOV 開始時および SOV により誘起された発情時におけるサイズ別卵胞数について，超音波診断装置（5MHz経腟コンベックスプローブ）を用いて調査した。卵胞サイズについては，直径により大：10 ㎜以上，中：5 ㎜以上 10 ㎜未満，小：5 ㎜未満に分類した。
⑵ 胚採取成績SOV により誘起された発情の７日後に，頸管経由子宮灌流法により胚を採取し，正常胚数，変性胚数および未受精卵数を調査した。各採取数についてはｔ検定を，正常胚，変性胚，未受精卵の割合についてはχ ２ 検定を用いて解析した。

結果および考察試験１

AG 吸着 FSH-P を皮下 1 回投与した牛の血漿中
FSH-P 濃度推移
供試牛 3 頭（123,131,134 号）および対照牛（139 号）の血漿中 FSH-P 濃度の推移を第 1 図に示した。
123 号牛では，漸減投与区における血漿中 FSH-P 濃度の変動が大きく，投与の際に一部が筋肉内投与になったことが推察されたため，データを除外した。ワンショッ
ト区では，SOV 開始の 4 時間後から血漿 FSH-P 濃度が上昇して，80 時間後まで高値（本報告では，FSH-P 濃度が0 より高い場合を「高値」とする。）が持続していた。
131 号牛では，漸減投与区の血漿中 FSH-P 濃度が SOV開始 6 時間後から上昇して，80 時間後まで高値を持続したが，ワンショット区では SOV 開始の 4 時間後から上昇して，72 時間後まで高値が持続していた。
134 号牛の血漿中 FSH-P 濃度は，漸減投与区およびワンショット区ともにほぼ同様に推移し，SOV 開始 2 時間後から上昇して，80 時間後まで高値が持続していた。
以上の結果から，FSH-P を AG に吸着させて牛皮下に

63

黒毛和種雌牛における卵胞刺激ホルモン皮下１回投与による過剰排卵誘起法
1 回投与することにより，血漿中 FSH-P 濃度が 3 日間朝夕漸減投与法の場合と同様に推移することが判明した。
30AU の FSH-P を生理食塩水に溶解して皮下に 1 回投与した 139 号牛では，血漿中 FSH-P 濃度が投与直後から上昇して 8 時間後に非常に高い濃度（2.5ng/ml）に達し，ワンショット（投与：0h）
0.5

１２３号牛
FSH-P濃度（ ng/ml)

0.4

0.3

0.2

0.10.04h

08162432404856647280

FSH－P投与後時間（h）

漸減投与（投与：↓）

ワンショット(投与：0h）

0.5

１３１号牛
FSH-P濃度 (ng/ml)

0.40.30.24h0.10.008162432404856647280

FSH－P投与後時間（h）0.5１３４号牛FSH-P濃度 (ng/ml)

0.40.34h

その後急速に低下して 56 時間後に基底値（0ng/ml）となった。一方，ワンショット区における FSH-P 濃度は，ピークの状態が長時間持続して SOV 開始 72 時間後以降まで血漿中 FSH-P 濃度が高値を持続していた。
AG と FSH-P を混合すると電気的結合により FSH-P がAG に吸着され，その混合物を牛に投与すると，体液中の血清アルブミンと FSH-P が置換されることにより，徐々に FSH-P が血液中に放出される ５）。本試験におけるワンショット区の血漿中 FSH-P 濃度推移から，今回使用したAG についても，このような FSH-P 徐放能が発揮されていたことが推察された。
Hirako ら ２） は，5ml の AG に 30AU の FSH-P を吸着させて黒毛和種雌牛の筋肉内に投与すると，投与後 1 時間以降に血漿中 FSH-P 濃度が上昇して 12 時間後にピークに達した後に低下傾向となり，72 時間後に基底値に戻ったと報告している。本報告におけるワンショット区の血漿中 FSH-P 濃度推移は，Hirako ら ２） の報告に比べて投与後の濃度上昇が緩やかでピークが長く，SOV 開始 72時間後以降でも高値が持続していた。このことから，AGに吸着させた FSH-P を牛皮下にワンショットすることにより，血漿中 FSH-P 濃度は筋肉内投与の場合より緩やかに上昇・低下するものと推察された。
Hirako ら ２） は，20AU および 30AU の FSH-P を AG に吸着させて筋肉内に投与した黒毛和種雌牛の血漿中FSH-P 濃度の推移について比較した結果，30AU 投与時の最高値は 20AU の 1.5 倍であり，30AU 投与牛は 20AU投与牛より高い FSH-P 濃度で推移したと報告している。
この結果を受けて木村ら ４）は，30AU の FSH-P を AG に吸着させて黒毛和種雌牛の筋肉内に投与することにより，漸減投与と同様の SOV 効果があったと報告している。これらの報告と同様に，本報告においてもワンショット区の FSH-P 投与量を 30AU と設定したが，その血漿中 FSH-P濃度推移は 20AU（当場における漸減投与時の慣行投与量）を漸減投与した場合と同様に推移していた。このことから，AG を用いたワンショット SOV における FSH-P投与量は，30AU が適当であると考えられた。

0.22h0.1（％）
1000.0081624324048566472

5mm未満

6.922.7

サイズ別卵胞数割合

30AU/生理食塩水（投与：0h）

１３９号牛
4h

2.0604089.784.3

2001.034.6

SOV １）Heat ２）漸減投与0.5

第２図081624324048566472

FSH-P投与後時間（h）

第１図

27.942.7

FSH-P 投与後の血漿中 FSH-P 濃度推移

8045.626.51.50.03.480

3.0

FSH-P濃度（ ng/ml）

5～10mm

7.18.680

FSH－P投与後時間（h）

2.5

直径10mm以上

SOV

Heat

ワンショット

処理開始時および発情時のサイズ卵胞割合（試験 2）
１）過剰排卵誘起開始時
２）発情時

64

福岡県農業総合試験場研究報告 26
第１表（2007）

FSH-P 投与方法の違いが胚採取成績に及ぼす影響（試験２）

FSH 投与sn２）

採取総数

正常胚数 (%)３）

変性胚数 (%)

未受精卵数 (%)

漸減投与
ﾜﾝｼｮｯﾄ558.2ａ ±1.9712.0ｂ ±2.10

5.8±1.45 (70.7)
7.8±1.15 (65.0)

1.2±0.52 (14.6ｃ )0.6±0.36 ( 5.0ｄ )1.2±1.07 (14.6ｃ )
3.6±1.51 (30.0ｄ )１）表記値は，平均±標準誤差
２）供試頭数（同一供試牛５頭を反転実施）
３）割合（％）は，採取総数に対する割合
４）a, b：同列異符号間に有意差あり（ｔ検定 ，p<0.05）
５）c, d：同列異符号間に有意差あり（χ ２ 検定，p<0.05）

試験２ AG 吸着 FSH-P を皮下 1 回投与した牛の SOV 効果
試験 2 における SOV 開始時および発情時におけるサイズ別卵胞割合を第 2 図に示した。SOV 開始時には漸減投与区およびワンショット区の総卵胞数は 14.0 および 17.4個/頭で，両区とも 84％以上が小卵胞であった。一方，
SOV で誘起された発情時の総卵胞数は 25.3 および 27.2個/頭で，中卵胞：42.7 および 45.6％，大卵胞：22.7 および 27.9％となっており，両区において SOV により複数の卵胞が同様に発育したことが確認された。
試験 2 における胚採取成績を第 1 表に示した。漸減投与区およびワンショット区における胚採取総数は 8.2 および 12.0 個/頭であり，ワンショット区が漸減投与区より有意に多かった（P<0.05）。正常胚数については，5.8および 7.8 個/頭 とワンショット区が多い傾向にあったが，有意差は認められなかった。漸減投与区の変性胚数はワンショット区より多い傾向にあり，変性胚率は有意に高かった(p<0.05)。また，未受精卵数は，漸減投与区がワンショット区より少ない傾向にあり，未受精卵率は有意に低かった(p<0.05)。以上の結果から，ワンショット区においても，漸減投与区と同等の胚採取成績が得られることが判明した。
木村ら ４） は，3.2mg/ml のアルミニウムを含む AG に30AU の FSH-P を吸着させて黒毛和種雌牛の筋肉内ワンショットにより，漸減投与と同様の SOV 効果があったと報告している。また，田川ら ６） は，3.0mg/ml のアルミニウムを含む AG に 40AU の FSH-P を吸着させてホルスタイン種乾乳牛の筋肉内ワンショットにより，SOV 効果があったと報告している。本報告では，1.3mg/ml のアルミニウムを含む AG に 30AU の FSH-P を吸着させて皮下ワンショットによる SOV 効果が実証され，筋肉内より体内吸収が緩やかな皮下に投与することにより，既報 ４，８）よりアルミニウム濃度が低い AG を使用してもワンショッ
ト SOV 効果があることが示唆された。本報告においては，
1 種類の AG 濃度によるワンショット SOV しか調査していないため，皮下投与時における AG 濃度がワンショッ
ト SOV 効果に及ぼす影響は解明されておらず，今後の検討が必要である。
本研究の結果より，FSH-P を AG に吸着させて牛皮下に 1 回投与することにより，3 日間朝夕漸減投与と同等の SOV 効果が得られることが明らかとなった。AG を利用したワンショット過剰排卵誘起法は非常に省力的で牛に対するストレスも軽減できる技術であり，今後実用化に向けた技術の確立が期待される。

引用文献１）Demoustier, N.M., Beckers, J.F., Van Der Zwalmen, P.,
Closset, J., Gillard, J.L., and F. Ectors (1988) Determinationof porcine plasma follitropin levels during superovultion
treatment in cows. Theriogenology 30: 379-386.
２）Hirako, M., Takahashi, H., and K. Kimura (2003) Changein concentration of porcine FSH in bovine peripheral
blood following a single intramusclar injection withaluminum hydroxide gel suspension. Theriogenology 59:526.
３）磯崎良寛・古賀鉄也・稲田淳(2006)性腺刺激ホルモ
ン放出ホルモン製剤による黒毛和種牛過剰排卵処理後の人工授精回数低減．福岡農総試研報 25：121124.
４）木村康二・平子誠・岩田尚孝・青木真理・高橋ひとみ（2004）水酸化アルミニウムゲルを用いた単回投与によるウシ過剰排卵誘起法．日本畜産学会第 103回大会講演要旨：123．
５）木村康二（2004）水酸化アルミニウムゲルを用いたFSH１回投与によるウシ過剰排卵誘起法．畜産技術
590：2-4．
６）田川真人・的場理子・今井敬・木村康二・角川博哉・
米内美晴（2006）乳用牛におけるワンショット過剰排卵処理法の検討．日本畜産学会第 106 回大会講演
要旨：92．
７）Takedomi, T., Aoyagi, Y., Konishi, M., Kishi, H., Taya,K., Watanabe, G., and S. Sasamoto (1995) Superovulationof holstein heifers by a single subcutaneous injectionof FSH dissoleved in polyvinylpyrrolidone. Theriogenology
43: 1259-1268.
８）Yamamoto, M., Ooe, M., Kawaguchi, M., and T. Suzuki(1994) Superovulation in the cow with a single intramusclar
injection of FSH dissolved in polyvinylpyrrolidone.
Theriogenology 41: 747-755.