光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進
静岡県立大学薬学部薬物動態学分野

尾上誠良

Photoreactivity and dermal/ocular deposition of compounds have been recognized as key considerations for evaluating
the phototoxic risk of compounds. Because some drugs are known to cause phototoxic reactions via generation of potent
phototoxic metabolites, photosafety assessments on parent drugs alone may lead to false predictions about their photosafety.
This study aimed to establish a new photosafety assessment strategy for evaluating the in vivo phototoxic potential of both aparent substance and its metabolites. The in vivo phototoxic risk of fenofibrate (FF) and its metabolites, fenofibric acid (FA)and reduced fenofibric acid, were evaluated based on photochemical and pharmacokinetic analyses. FF and FA exhibited
intensive UV absorption, with molar extinction coefficient values of 17 , 000 ( 290 nm) and 14 , 000 M- 1 cm- 1 ( 295 nm),respectively. Superoxide generation from FA was significantly higher than from FF, and a marked increase in superoxide
generation from FF was observed after incubation with rat hepatic S 9 fractions, suggesting enhanced photoreactivity of
FF after metabolism. FA showed high dermal/ocular deposition after oral administration ( 5 mg/kg, p.o.) although theconcentration of FF was negligible, suggesting high exposure risk from FA. On the basis of these findings, FA was deduced
to be a major contributor to phototoxicity induced by FF taken orally, and this prediction was in accordance with theresults from in vitro/in vivo phototoxicity tests. Results from this study suggest that this new screening strategy for parent
substances and their metabolites provides reliable photosafety information on drug candidates and would be useful for drug
development with wide safety margins.

1. 緒

産生された singlet oxygen や superoxide 等の活性酸素種

言（Reactive oxygen species；ROS）による生体内物質の酸

薬剤性光線過敏症は特定の薬剤投与後の露光により引き化反応が薬剤性光線過敏症の発症原因の一つとして考えら起こされる皮膚および眼の異常反応であるが，近年，オゾれている．これらの光化学反応の標的が細胞膜上の各種生ン層の破壊によって太陽から地表に到達する紫外線（UV）

体成分である場合には光刺激性を誘発し，また DNA の酸

1）

量が増加していることから，本症の懸念が増大している ．

化あるいは塩基修飾によって光遺伝毒性や光がん原性が発体内に取り込まれた光毒性物質はまず皮膚組織に到達し，現する（Fig. 1B）．励起された薬物がハプテンとなりタン

薬剤の分子内 chromophore，あるいは代謝によって獲得

パク質と光付加物を形成した際には，免疫原性を示すことされた chromophore が皮膚深部まで到達した光によってになり，最終的に光アレルギー反応を惹起するものと考え照射されると，基底状態の S0 から励起一重項状態 S1 に励られる．いずれにせよ，薬剤性光線過敏症の機序を考える

起される（Fig. 1A）．励起一重項状態の寿命は極めて短く，とき，最も重要なトリガーとなるのは太陽光の吸収，そしすなわち蛍光を発して直ちに基底状態 S0 に戻るか，項間てそれに伴う化合物の励起であろう4）．

交差により励起三重項状態 T1 に遷移する．励起三重項状
2）

多くの場合，薬剤性光線過敏症は薬物本体によって引き態にある化合物はりん光を発して基底状態 S0 に戻る ．基起こされるが，一部の薬剤においては代謝物の関与が報告

底状態ではまったく化学反応をしない条件でも，高い光エされている．これらのケースにおいては，親薬物も光反応

ネルギーを獲得した励起分子は，そのエネルギーを駆動力性を有しているため，代謝によって薬物の光感受性が増強として結合の解裂や生成または組み換えなどの化学反応されたこと，あるいは生体内，特に露光組織において代謝

1，3）．そのような過程を光化学過程

物の存在比率が高いことに起因するものである．また，現といい，ラジカル反応である Type I 反応と，一重項酸素

在までのところ 5-aminolevulic acid を除き，代謝によって反応である Type II 反応とに分けられる．酸素分子は励

新たに chromophore が形成される薬物は報告されておら起エネルギーのアクセプターとして機能し，それに伴いず，親薬物が光反応性を有していなければ，その代謝物もを起こすことができる

光反応性を有していないと考える 5）．一方で，親薬物が光Development of photosafety testing
strategy and its strategic harmonization
Satomi Onoue
D ep a r t m e nt o f P h a r m a c o k i net i c s
a nd Ph a r m a c o dy n a m ic s , S c ho o l of
Pharmaceutical Sciences, University of
Shizuoka

反応性を有している場合には，代謝による光化学的反応性の増強が生じる可能性を否定できず，親薬物のみに着目していると in vivo における光毒性リスクを見誤る可能性があると考える．実際に我々は，薬物本体のみの光化学的および薬物動態学的特性に着目して光安全性評価を行った結果，代謝物が光毒性に寄与することが知られているクロル− 60 −

光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進

Fig. 1 Possible mechanisms for drug-induced phototoxicity.
A Jablonski diagram. S: singlet state; T: triplet state; IC: internal conversion; and ISC: intersystemcrossing. Each line among singlet states indicates the excited vibrational states, and excited rotational
states were not shown. B Several phototoxic responses caused by photo-activated drugs.

プロマジンにおいて予測の過誤を生じた．従って，親薬物が光反応性を有している限り，創薬において代謝物の光安
全性評価も実施するべきであると考えるが，一方で ICH
S10 では代謝物に関する評価の必要性について述べられていない．さて，Fenofibrate（FF）は経口高脂血症治療薬として汎用されている薬物であり，その副作用として光線過敏症が報告されている．FF の光毒性においてはその代
謝物や光分解物が関与する可能性が報告されているが，invivo におけるそれらの寄与は明らかとなっていない．また FF は，経口投与後速やかに carboxylesterase（CES）
1A1 によって活性代謝物である fenofibric acid（FA）に代謝され，FA はさらに CYP 3A4 により reduced fenofibricacid（RFA）へと代謝されることが知られており（Fig. 2），
これらが FF の主要代謝物であることが知られている 6，7）．
従って，FF の光線過敏症に対する主要代謝物の寄与を明らかにすることが，代謝物の光毒性リスク評価系の構築につながると考える．そこで，本研究では代謝物を含めた包括的光安全性評価系の構築を目的とし，FF とその主要代謝物である FA および RFA に対して，光化学的 / 光生物学
的特性および体内動態の面から光安全性評価を実施した．

2. 実

験

Fig. 2 Chemical structures of each test compound andmetabolic pathways.

2. 1. 試薬類
Acetic acid，DMSO，ethanol（EtOH），formic acid，FF，
imidazole，ketoprofen，NBT，p-nitosodimethylaniline，

Ontario，Canada）より購入した．10% fetal bovine serum

quinine HCl 2H2O，NaH2PO4 2H2O，Na2HPO4 1 2H2O は（FBS），dulbecco's modified eagle medium（DMEM），

和光純薬工業（大阪，日本）より購入した．ACN（HPLC

earle's balanced salt solution（EBSS），neutral red（NR），

grade）は Honeywell Japan（東京，日本）より購入した．

sulisobenzone は Sigma-Aldrich Japan（東京，日本）
より購

FA は AK Scientific Inc.（Union City，CA，USA）より購入

入した．Pooled IGS Sprague-Dawley rat liver S9 fraction，

した．RFA は Toronto Research Chemicals Inc.（Toronto，

pooled IGS Sprague-Dawley rat intestinal S9 fraction，− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）

S9 fractions で 処 理 し た FF が 30 µM と な る よ う NBT-regenerating system は積水メディカル（東京，日本）より（50 µM）を含む 20 mM NaPB（pH7.4）と混合した．その購入した．その他のすべての試薬は市販品を用いた．ROS

混合液 200 µL を 96-well microplate（旭硝子，東京，日

assay 用 reaction container は Ozawa Science（愛知，日本）

本；code number：3 8 8 1-0 9 6；clear，untreated，flat-より提供された．

bottom）に分注し，析出物の有無を確認後，560 nm の吸光値を SAFIRE microplate spectrophotometer（TECAN，

2. 2. ROS アッセイ

Mannedorf，Switzerland）を用いて測定した．その後，プ

擬 似 太 陽 光 の 照 射 に は Xe arc lamp を 備 え た Atlas

レートを reaction container に入れ石英の蓋を装着し，擬Suntest CPS+（Atlas Material Technologies LCC，

似太陽光を 1 h 照射した．照射後のプレートは，振盪後，Chicago，IL，USA）を用いた．Atlas Suntest CPS+ では短

再び 560 nm の吸光値を測定した．

波長の UV をカットし実際の太陽光を模すためのフィルターを用いて CIE85/1989 daylight simulation requirement

2. 3. 動物実験に良好に対応した擬似太陽光を照射している．照射は2

雄性 Sprague-Dawley ラット（11–12 週齢，体重約 300–

28 ℃，250 W/cm , で 1h 行 っ た． 被 検 物 質 は DMSO に

350 g）は日本 SLC（浜松，日本）より購入した．実験まで

溶 解 し（10 mM），stock solution と し て 用 い た．Singletの間，ラットは動物飼育施設において自由に摂餌，飲水がoxygen は imidazole を singlet oxygen の acceptor に用い可能な環境で適切な気温（ 24 ± 1 ℃）および湿度（55 ± 5%）て，p-nitrosodimethylaniline 水溶液の 440 nm における吸管理の下，飼育した．薬物動態学的評価に用いるラットは光値をモニタリングすることで測定した

3，8，9）．測定原理

薬物経口投与前 18 h から絶食した．In vivo 光毒性試験に用いるラットは，試験開始 18 h 前に pentobarbital（50 mg/を以下に示した．
1

kg，i.p.）麻酔下のラット腹部を剃毛した．全ての動物実験

O2 + A →［AO2］→ AO2

は静岡県立大学内の動物愛護倫理委員会の承認を得たガイ［AO2］+ RNO → -RNO + Products
1

ドラインに準じて実施した．

A： O2 acceptor，imidazole

絶食したラットに FF（5 mg/kg）を投与後，血液サンプ

RNO：nitroso compounds
mROS assay に お い て は 被 検 物 質 の 最 終 濃 度 がル（約 300 µL）を 0.5，1，2，3，4，6，8，12，24，48 h において200 µM と な る よ う に 被 検 物 質 の stock solution を，

尾静脈より採取した．血液サンプルを遠心分離（10,000 × g，

p-nitrosodimethylaniline（50 µM） お よ び imidazole（50

10 min，4 ℃）して得られた血漿サンプルは，2.5 倍量（v/v）µM） を 含 む 20 mM NaPB（pH7.4）with 0.5% Tweenの ACN を加え，振盪後，遠心分離（10,000 × g，5 min，4 ℃）
し，20 と 混 合 し た 10）． 酵 素 処 理 後 の ROS assay に お い て

上 清 を 0.20 µm membrane filter（Milex®–LG，Millipore

は rat S9 fractions で 処 理 し た FF が 30 µM と な る よ う

Co., Ltd., Billerica, MA，USA）を通すことでろ過した．得

p-nitrosodimethylaniline（50 µM）
および imidazole（50 µM）

られたろ液に internal standard である ketoprofen（1 µg/

を含む 20 mM NaPB（pH7.4）と混合した．その混合液mL）を含む 50 % ACN と 1：1 で混合し，UPLC/ESI-MS 分

200 µL を 96-well microplate（旭硝子，東京，日本；code

析による定量を行った．皮膚および眼組織は経口投与後

number：3881-096；clear，untreated，flat-bottom）に分注し，

2，4，6，8，10，12，24，48 h 後において，ジエチルエーテ

析 出 物 の 有 無 を 確 認 後，440 nm の 吸 光 値 を SAFIRE

ル麻酔下，下降大動脈より脱血，および氷冷生理食塩水にmicroplate spectrophotometer（TECAN，Mannedorf，

よって還流したラットから採取した．採取した組織サンプ

Switzerland） を 用 い て 測 定 し た． そ の 後， プ レ ー ト をルは重量測定後，ハサミでミンスし，4 mL の ACN を加えreaction container に 入 れ 石 英 の 蓋 を 装 着 し， 擬 似 太 陽

Physcotron（Microtech Co. Ltd., 千葉，日本）によりホモ

光を 1 h 照射した．照射後のプレートは，振盪後，再びジナイズした．得られたサンプルに，振盪および超音波処

440 nm の 吸 光 値 を 測 定 し た．Superoxide anion は NBT

理を 10 分間行い，遠心分離（1,300 × g，10 min）した．この還元によって生成する nitroblue diformazan の 560 nmの抽出操作を 2 回行い，上清はガラスチューブに分取しにおける吸光値をモニタリングすることで測定した．測定

たのち，40 ℃で窒素乾固した．残渣を ketoprofen 500 ng/

原理を以下に示した．

mL を含む 50 % ACN で溶解し，0.20 µm membrane filter（Milex ®–LG，Millipore Co., Ltd., Billerica，MA，USA）-

O2 + NBT → O2 + Nitroblue diformazan
mROS assay においては被検物質の最終濃度が 200 µM

を 用 い て ろ 過 し た の ち，UPLC/ESI-MS 分 析 に よ る 定となるように被検物質の stock solution を，NBT（50 µM）

量 を 行 っ た．UPLC/ESI-MS シ ス テ ム は binary solventをむ 2 0 mM NaPB（pH7.4）with 0.5% Tween 2 0

manager，column compartment， お よ び Micromass SQと 混 合 し た．酵 素 処 理 後 の ROS assay に お い て は rat

detector connected with Waters Masslynx v 4.1. を 含 む

含− 62 −

光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進

Waters Acquity UPLC™ system（Waters，Milford，MA,たラットに pentobarbital にて麻酔し（50 mg/kg，i.p.），1.5USA）から構成されており，カラムには Waters Acquity

cm × 1.5 cm サイズ中を切り取ったビニルテープを貼り付

UPLC ™ BEH C18（particle size ：1.7 µm，column size：

け，そこへ被検物質の DMSO 溶液 100 µL を塗布した．塗ϕ2.1 × 50 mm；Waters）を用いた．カラム温度は 40 ℃

付後 4 h において薬液を除去し，水で湿らせたコットンに保った．スタンダードおよびサンプルは Mili-Q waterで洗浄した．ラットは black light（FL15BL-B，National，

containing 0.1% formic acid（A）と ACN（B）から成るグラ

東京，日本）を用いて UVA 照射量が 30 J/cm2 となるまで

ジエント移動相によって分離し , 各化合物の保持時間は

照 射 し た． 照 射 強 度 は UV-Meter（Dr. Hönle AG，UV-

1.1 min（IS）；1.2 min（RFA）；2.0 min（FA）；4.2 min（FF）

Technology，Munich，Germany）を用いた．UV 非照射部であった．グラジエントコンディションは，0 - ­1.0 min，

位はアルミホイルで遮光した．照射終了後 24 h において50% B；1.0­­-5.0 min，50-95% B（linear gradient curve）；

色差計（NF333，日本電色工業，東京，日本）を用いて皮膚5-5.5 min，95% B；and 5.5-6 min，50% B とし，流速は表面の色調を計測した．色差計は皮膚表面 3 次元色反射率

0.25 mL/min とした．MS による検出では化合物に特異的を L*a*b* system（CIE 推奨）により記録する．輝度（L*）は++なイオンの m/z（361.2［M+H］
for FF；319.2［M+H］
for

黒（L* = 0）から白（L* =100）までの間で明るさを表し，色++FA；3 0 3.0［M-OH］ for RFA；and 2 5 5.5［M+H］ for

相（a*）は赤（a* =100）および緑（a* = -100）間のバランスを表

ketoprofen）
を用いた．

し，彩度（b*）は黄色（b* = 100）および青（b* = -100）間のバランスを表す．UV 照射前後の皮膚表面の色差（ΔE）を以下

2. 4. 3T3 NRU PTのように算出し，光毒性の指標とした 11）．

マウス由来不死化線維芽細胞である Balb/c 3T3 cells

ΔE ＝｛√（ΔL* ）2 +（Δa* ）2 +（Δb* ）2｝（CloneA -31）を DMEM に 10 % FBS を添加した培地を用いて継代し，20 継代未満のものを試験に用いた．培養は

3. 結

37 ℃，5 % CO2 に 保 っ た CO2 incubator を 用 い，2 -3 日
おきに継代した．試験は OECD Test Guideline 432 に準果

3. 1. 光化学的特性評価

4

一般的に，薬物の光毒性反応においては，薬物分子がcells/well と な る よ う 細 胞 を 播 種 し，CO2 incubator に て

UV/VIS（290 - 700 nm）を吸収し励起状態となることが引

24 h 培養した．培養液をデカントにより除去し，EBSS

き金になり，励起状態となった薬物分子の光化学反応がを 用 い て 希 釈， 調 整 し た 被 検 物 質（FF，FA，quinine：

直接的な原因であると認識されている．そこで FF とそ

positive control，sulisobenzone：negative control）

じて行った．2 枚の 96 well マイクロプレートに 2.0 × 10をの主要代謝物である FA および RFA の光化学的特性につ100 µL 添 加 後，CO2 incubator 内 で 1 h 曝 露 さ せ た． 曝

いて UV 吸収特性と擬似太陽光曝露時の ROS 産生能に着露後，metal halide lamp および UVB を減弱させるため

目して評価した．FF および FA は強い UVA/B 吸収を示の H1 フィルターを搭載した SOL 500 Sun Simulator（Drし，MEC 値はそれぞれ 17,000，14,000（M-1cm-1）と高い

2

Hönle，Munich，Germany）にて UVA 照射量が 5 J/cm値であった（Fig. 3A）．従って FF および FA は高い光励となるよう照射した．非照射群はアルミホイルで遮光起性を有することが明らかとなった．一方で RFA におい

し，静置した．照射後，試験液を除去し，EBSS で洗浄ては弱い UVB 吸収のみを認め，RFA の光励起性は弱いこ

した後，培養液を添加して 24 h 培養した．培養液を除去とが明らかとなった．Henry らは過去に，MEC 値が 1,000

し，NR 液（50 µg/mL in DMEM）を添加後 3 h 静置し，NR（M-1cm-1）を超えない薬物は光毒性を示さない傾向にある液を除去，洗浄（PBS，150 µL）した．NR 抽出液（Acetic

こ と を 報 告 し て い る． 従 っ て，RFA の MEC 値 が 1,000

acid：EtOH：water=1：50：49）を添加し，10 分後に攪（M-1cm-1）を下回っていることから，RFA の光毒性リスク

拌 し た の ち 540 nm に お け る 吸 光 度 を Benchmark Plus

は低いと考える．各化合物の実際の光反応性について精microplate spectrophotometer（BioRad，Hercules，CA，

査すべく，擬似太陽光照射下における化合物からの ROSUSA）を用いて測定した．UV 照射群および非照射群におの産生能を評価した（Fig. 3B）．FF および FA は擬似太陽

ける concentration-response curve に基づいて mean photo

光照射下において強力な ROS 産生を示し，高い光反応性

effect（MEC）values を算出し，光毒性判定に用いた．

を示唆した．一方で，RFA からの ROS 産生は FF および
FA と比較して有意に低値を示し，RFA の低い光反応性を

2. 5. ラットin vivo 光毒性試験示唆した．興味深いことに，FA からの ROS 産生能は FF

皮膚へ塗布する被検物質（FF，FA，quinine：positiveと比較して有意に高く（P ＜ 0.05），FA の光反応性が FF

control，sulisobenzone：negative control）は 100 mg/mLよりも高いことを示唆した．特に FA からの superoxideとなるよう DMSO に溶解した．あらかじめ腹部を剃毛しanion の産生は FF の約 2 倍高値を示し，FA の顕著に高− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

い superoxide anion 産生能を示唆した．これらの結果か
ら，各化合物の光反応性の高さは以下のような順序となった：FA ＞ FF ≫ RFA．FA が FF よりも高い ROS 産生を示したため，FF が生体内での代謝を経て光反応性が変わる可能性について精査すべく，ラット肝 / 小腸 S9 画分で処理した FF からの ROS 産生を評価した（Fig. 3C）．ラット小腸 S9 画分で処理した FF から産生された ROS は熱失活させたもので処理した FF から産生された ROS と比較して有意な差は認めなかった．一方で，ラット肝 S9 画分で処理した FF から産生された superoxide anion は失活させたもので処理した FF の場合と比較して有意に高い値を示
し，すなわち，FF の光反応性は肝代謝を経て増大する可能性を示唆した．

3. 2. 薬物動態学的評価
一般的に光毒性反応は皮膚や眼において生じるものであることから，薬物の全身曝露と同様に皮膚 / 目への曝露も in vivo 光毒性を予測する上で重要な指標となる．そこ
で各化合物の薬物動態学的特性について，全身および皮膚/ 眼への曝露に着目して精査した（Table 1）．FF をラットに経口投与後，FF は全ての組織において検出限界（10 ng/
mL，7.1 ng/g tissue）以下であり，ラット体内における FFの速やかな消失を示唆した．FA の血漿中および各組織中濃度は速やかかつ持続的に上昇し，Tmax は 6.0 ‒ 13 h であった．FA の血漿および皮膚における Cmax および AUC0 - ∞ は
RFA と比較し，約 3 ‒ 4 倍高く，RFA と比較して FA の生成速度は速く，また，全身および皮膚曝露量も高いことを示唆した．一方で，RFA の血漿中および各組織中濃度はゆるやかに上昇し，Tmax は 12 ‒ 16 h となり，FA と比較して RFA の生成は遅いことを示唆した．RFA は血漿中および皮膚中からの消失半減期が FA と比較して約 1.5 ­‒ 2.0 倍
長く，RFA は FA と比較して緩やかな消失を示した．よって，RFA は FA と比較して長く皮膚に保持される可能性がある．眼においては FA のみが検出でき，Cmax および
AUC0- ∞ はそれぞれ 100 ng/g tissue，2.6 h･ng/g tissue であった．得られた結果に基づき，各化合物の皮膚および眼Fig. 3 Photochemical properties of FF, FA and RFA. UVabsorption spectra of test compounds (20 µM) in ethanol(A). Solid line, FF; dashed line, RFA; dotted line, FA.
Generation of ROS from FF, FA and RFA (B) and from FF
after incubation with active and denatured rat hepatic/
intestinal S9 fractions (C). Filled columns, generation of
singlet oxygen; Open columns, generation of superoxide.
*P＜0.05, with respect to singlet oxygen of FF; †P ＜ 0.05,
with respect to singlet oxygen of FA; # P ＜ 0.05, withrespect to superoxide of FF; ‡ P ＜ 0.05, with respect tosuperoxide of FA (B). *P ＜ 0.0 5, with respect tosuperoxide in denatured rat hepatic S9 fractions (C). Data
represent the mean ± SD (n=3).

への曝露を次のように順位づけた：FA ＞ RFA ≫ FF．

3. 3. in vitro/in vivo 光毒性試験
FA の光安全性について，光安全性試験代替法としてバ
リデートされ，汎用されている試験法である 3T3 neutral
red uptake phototoxicity test（3T3 NRU PT）， お よ び
ラット in vivo 光毒性試験によって評価した．比較対象
として親薬物である FF に対しても同様の光安全性試験
を 実 施 し た．3T3 NRU PT に お い て， 陰 性 対 照 で あ る
sulisobenzone を曝露した群では UV 照射群と非照射群の間で濃度 – 細胞生存率曲線の有意な変化は認めなかった．

− 64 −

光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進

Table 1

PK parameters in plasma, skin and eyes after oral administration of FF in rats
t1/2（h）

Cmax（µg/mL）or
Cmax（ng/g tissue）

Tmax（h）∞
AUC0-（h･µg/mL）or∞
AUC0-（h･µg/g
tissue）

MRT0- ∞（h）FF

Plasma
Skin
Eye

N.A.
N.A.
N.A.

N.A.
N.A.
N.A.

N.A.
N.A.
N.A.

N.A.
N.A.
N.A.

N.A.
N.A.
N.A.

FA

PlasmaSkin
Eye

6.4 ± 0.40
11 ± 1.5
22 ± 6.9

6.3 ± 1.1
340 ± 17100 ± 5.5

9.7 ± 1.1
13 ± 3.9
6.0 ± 1.4

97 ± 148.5 ± 1.3
2.6 ± 0.33

13 ± 0.70
20 ± 2.1
34 ± 10

RFA

PlasmaSkin
Eye

12 ± 1.0
17 ± 3.3
N.A.

1.6 ± 0.10
80 ± 6.7
N.A.

12 ± 0.0
16 ± 4.7
N.A.

33 ± 3.2
2.0 ± 0.60
N.A.

21 ± 1.530 ± 4.2
N.A.

Each value represents the mean ± SEM for 4 -7 rats. N.A., not available due to concentrations below the limit of detection.

一方で，陽性対照である quinine を曝露した群では UV 照

ことが明らかとなり，さらに，3T3 NRU PT の結果と一射により濃度 – 細胞生存率曲線が低濃度側へ大きくシフト

致していた．従って，FA の in vitro/in vivo 光毒性は FF

し，すなわち quinine の 3T3 細胞に対する強力な光毒性をよりも強いことが明らかとなった．

示唆した（Fig. 4A）．Quinine と同様に FF および FA にお4. 考

いても UV 照射による大きな濃度－­細胞生存率曲線の低濃察度側へのシフトを認め，両化合物の強い光毒性を示唆した

光毒性において化合物が太陽光を吸収し，励起される（Fig. 4B）．得られた濃度 – 細胞生存率曲線をもとに mean

過程は光毒性発症メカニズムの第一段階であり，それゆ

photo effect（MPE）値を算出したところ FF で 0.40，FA

え，UV 吸収スペクトルが光毒性リスクの一つの指標となで 0.54 となった．MPE 値は光毒性の有無を判定する基準

りうる．一般的に，化合物の UV 吸収スペクトルは薬物分として用いられており，MPE 値が 0.1 以上であれば光毒子内の π 電子共役系の長さに比例することが知られてい性陽性，0.1 を下回れば光毒性陰性となる．この判定基準

る．FF，FA および RFA の構造に着目すると，カルボニに準ずると，FF と FA はともに光毒性陽性であると判明

ル基を有する FF と FA は強い UV 吸収を示している一方した．また，FA の MPE 値が FF の MPE 値を上回ったこ

で，カルボニル基を欠いた RFA は極めて低い UV 吸収特とから，FA の 3T3 細胞に対する光毒性は F よりも強力で性を示している．従って，カルボニル基は FF および FA

あることが明らかとなった．

の強い UV 吸収特性において重要な役割を担っているといIn vivo における各化合物の光毒性について，ラット皮膚える．それは，カルボニル基が 2 つのベンゼン環の π 電への薬物塗布および UV 照射前後の皮膚色調変化量（ΔE）

子共役系の広がりに寄与しているからであろう．UV/VISを指標として評価した（Fig. 4C）．予備検討において FF おの吸収により励起状態となった化合物は，type I/type II

よび FA 塗布後の皮膚内濃度は 2 – 6 h において増減を認め

光化学反応（e.g. ROS 産生）を起こし，光毒性反応を誘発す

ず，定常状態となっていると想定できるため，皮膚へのる．そのため，光照射下における化合物の ROS 産生能に塗布時間を 4 h と定めた（data not shown）．Sulisobenzone

基づいた光反応性評価は光安全性評価において信頼性の塗布群では，UV 照射 / 非照射群間において皮膚表面の有ある指標として用いることができる．以前の報告によれ

意な色調変化は認めなかった．一方で，quinine は，以前

ば，光励起されたベンゾフェノン類は，type I 光化学反応の報告と同様に UV 照射によって顕著なΔb* の増大を伴う（e.g. superoxide の産生）を介して脂質過酸化を引き起こ

有意なΔE* の増大を示した（P ＜ 0.05）．FF および FA 塗し，光刺激性反応を惹起する．FA の superoxide anion の布群において，Δb* が 6.4（FF）および 5.9（FA）増大した産生能は FF よりも高く，FA は FF よりも高い光刺激性リことによる非照射群に比した UV 照射群におけるΔE の有スクを有しているであろう．また，本知見はラット肝 S9

意な増大を認めた（P ＜ 0.05）．さらに，FA 塗布群では UV

画分処理により FF からの superoxide anion 産生が増大し照射によってΔa* も 4.7 増大し，顕著な炎症反応を示唆した．

たことと良好に対応し，すなわち，FF が肝臓で FA に変

ま た，sulisobenzone 塗 布，UV 照 射 群 と，FF 塗 布，UV

換され，より強い光刺激性を惹起する可能性がある．皮膚照射群のΔE には有意な差を認めなかった一方で，FA 塗および眼への曝露量に着目すると，FA が顕著に高い曝露

布，UV 照射群のΔE は sulisobenzone 塗布，UV 照射群と量を示したことから，FA は極めて高い光毒性リスクを有比較し有意に増大していた（P ＜ 0.05）．本知見から，FAすると考える．一方で RFA の皮膚曝露は比較的低く，そはラット皮膚に対し FF よりも強い光毒性反応を惹起するの光毒性リスクは FA よりも低いと考える．これらの PK− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

特性は FF の CES 1A1 による速やかな加水分解，さらには FA の CYP 3A4 による比較的緩やかな RFA への代謝によるものであると考える．FA は CYP 3A4 阻害活性を有することが報告されており，FA の代謝による RFA の生
成は FA 自身の CYP 3A4 阻害によって緩やかになっているかもしれない．RFA の皮膚曝露は比較的低いものであるが，RFA も光毒性リスクを有していると考える．なぜなら，RFA の長い皮膚滞留性が慢性投与時の皮膚への蓄積につながり，光毒性を誘発しうるからである．薬物の光毒性リスクは，薬物の光化学的反応性の強さはと露光部位である皮膚 / 眼への到達量の両者を考慮することによって，比較的良好に予測することができる．複数のデータを考慮し，系統的評価を行うことができる手法として
matrix decision approach が用いられており，本研究においても，光化学的特性および薬物動態学的特性のデータを統合し，decision matrix を作成し，光毒性リスク評価に用いた（Table 2）．
Decision matrix においては，光反応性および皮膚 / 眼
曝露量の両データとも高い値であればその光毒性リスクは極めて高く，光反応性あるいは皮膚 / 眼曝露量の一方のみが高いか，どちらも中程度であれば，その光毒性リスクも中程度，光反応性および皮膚 / 眼曝露量どちらも低ければその光毒性リスクは低いことがわかる．FA は光反応性および皮膚曝露の両データにおいて高い値を示していることから，最も高い光毒性リスクを有しているだろう．FF は強力な光反応性を有する一方で，皮膚曝露が極めて低く，FF の光毒性リスクはそれほど高くないと考える．RFA は
光反応性が弱く皮膚曝露も比較的低いが，皮膚滞留性が高いことから FF と同程度の光毒性リスクを有するだろう．
従って，各化合物の光毒性リスクは以下のような順序となった：FA ≫ FF ≒ RFA．この光毒性リスクの高さは invitro/in vivo 光毒性試験の結果とも良好に対応し，代謝物の光安全性評価における本評価系の妥当性を示唆した．また，本知見から FF の光毒性に FA が大きく寄与している
ことが明らかとなった．本研究において提示した包括的光
Fig. 4 I n v i t r o/i n v i v o phototoxicity of compounds.
Photodynamic cytotoxicity of QN: positive control and SB:
negative control (A), FF and FA (B) in 3T3 NRU PT, andcolorimetrical evaluation of phototoxic skin responses inrats treated with FF, FA, quinine (QN) and sulisobenzone(SB) (C). Open symbols and open columns, UVA-irradiatedgroups; filled symbols and filled columns, non-irradiatedgroups. Each value represents the mean of duplicate
measurements (A, and B) and the mean ± SEM of 4
experiments (C). *P ＜ 0.05 with respect to the nonirradiated group of each compound; #P ＜ 0.05 with respect
to UV-irradiated groups of SB.

安全性評価は，信頼性のある医薬品候補化合物の光安全性情報を提供するものと考えられる．
謝

辞本研究を遂行するにあたり，公益財団法人コスメトロジ

ー研究振興財団よりご援助頂きましたことに深く感謝申し上げます．
（引用文献）
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− 66 −

光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進

Table 2

Decision matrix

Each crucial factor was divided into three levels. Black, gray and white cells represent high, moderate andlow levels, respectively. N.A., not available due to concentrations below the limit of detection.

discovery and development, Curr Drug Saf, 4, 123-136,

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