化粧品としてのヒアルロン酸およびその誘導体の物性と生理的安全性に関する研究
千葉大学大学院薬学研究院

戸 井 田敏 彦

Hyaluronan（HA）is a non-sulfated glycosaminoglycan（GAG）that plays an important biological andphysiological role in normal and pathogenic states.   The physiological function of HA is highly dependent on
its molecular weight（MW）． As a normal constituent of the extracellular matrix（ECM）, and in its nativeform, HA exists as a high MW polysaccharide, typically in excess of 106 Da, where it is associated with thestructural fluid dynamic, homeostasis and maintenance of tissue connective tissue integrity.  In biological fluids
such as blood or lymph, or at sites of inflammation or disease, the molecular weight of HA is often significantlylower.   Both intermediate（200-500 kDa）and smaller MW HA（<20 kDa）are involved in cellular processes,
in particular as signaling molecules for angiogenesis, induction of inflammatory gene expression, wound repair,cell proliferation and migration. These processes are important in inflammation and tumor invasion. On the otherhand, hyaluronan is very popular as one of cosmetic materials based on its physiological and physical property,
however, the physical and chemical stability of hyaluronan which is used as cosmetics and/or functional food isstill unclear.  The objective of this work is: 1）to obtain the knowledge of the physical stability of hyaluronan
under several pH conditions by using polyacrylamide electrophoresis（PAGE）, capillary electrophoresis（CE）and nuclear magnetic resonance（NMR）spectroscopy; 2）to investigate its physiological safety by orally
administration to rats. We have found that the chemical stability of HA and the oral availability of hyaluronan
by the grant.   Interestingly, orally administered HA is existing as a complex with plasma proteins in blood
circulation. The metabolic fate and function of the orally administered HA will be investigated in detail in thenear future.

GAG を用いた新しい医薬品の創製，および化粧品も含め１．緒言た生体工学への応用が期待されている．

グリコサミノグリカン（GAG）はヘキソサミン（D- グ

HA は ウ シ の 眼 球 の 硝 子 体 成 分 と し て 1934 年 Karl

ルコサミン（GlcN），D- ガラクトサミン（GalN））とウロン

Meyer 博士により発見され 6），皮膚，軟骨，腱，筋肉，血管，酸（D- グルクロン酸（GlcA），L- イズロン酸）または D-脳など広範囲に存在している 7）．その構造は GlcA と N-ガラクトースとの二糖の繰り返し構造からなる，分子量数

アセチル -D- グルコサミン（GlcNAc）が ß-1, 3 結合した二千から数万の枝分かれのない直鎖の酸性多糖類である 1）．

糖の繰り返し構造を有し，硫酸基を含まず，タンパク質にGAG はその構成糖の種類や硫酸化修飾の部位，程度によ結合していない遊離の多糖として，細胞膜で合成されるとり，コンドロイチン硫酸（CS），デルマタン硫酸，ヘパラ

いう点で他の GAG とは一線を画す．HA はきわめて単純ン硫酸（HS），ヘパリン（HP），ケラタン硫酸，ヒアルロな構造であるにも関わらず，さまざまな HA 結合タンパ2）ン酸（HA）に分類される ．HA を除く GAG はコアタン

ク質や PG との相互作用を有することで免疫細胞の接着やパク質に結合したプロテオグリカン（PG）として生合成

細胞内シグナル伝達活性化など幅広い生物活性を示す 8-10）．

され，生体内に広く存在し，組織中の水分保持，イオン代

生体に存在する HA は分子量が 60 万〜 100 万と極めて大謝を担っている．また，細胞外では細胞接着に関わるタきく，高度に水和された分子として存在する．HA が溶液

ンパク質とともに細胞外マトリックスと呼ばれる複合体を中で大量の水と水和する現象は，関節における潤滑剤やシ形成し，中枢神経系組織の発達および維持に関わり，細胞ョック吸収剤として働くのに役立つ極めて特徴的な物理的表面や細胞内では，各種細胞増殖因子と相互作用して，構性質である 11）．さらに HA はコラーゲン，フィブロネク

造維持，細胞接着，細胞運動性，発生，血液凝固など，多チン，プロテオグリカンとともに細胞外マトリックスを構

くの生命現象に関わると考えられている

3 − 5）．そのため築するほか，特異的な受容体 CD44 を介して細胞の移動などを制御していることが知られている 12）．また臨床面にStudy on physical property andphysiological safety of hyaluronan andits derivatives as cosmetic materials
Toshihiko ToidaGraduate School of PharmaceuticalSciences, Chiba University

おいて HA は眼科手術補助剤や変形性関節症の治療薬として有用性が認められている 13,14）．最近では，腫瘍細胞の増殖や炎症反応への関与が認められており 15），医療現場での実用化への期待が高まっている．さらに近年，化粧品や洗髪剤にヒアルロン酸を含む製品が市販さている他，食用ヒアルロン酸の作用も注目されている．しかし，HA の−2−

化粧品としてのヒアルロン酸およびその誘導体の物性と生理的安全性に関する研究

体内動態，すなわち腸管吸収の可能性および代謝経路など

血液中の HA の定量には，ヒアルロニダーゼにより分は未だ不明な点が多く，実際に経口投与した HA の薬理解して生成する不飽和二糖（ΔDi-HA）をカーボンカラム的効果は定かでない．

を装着したポストカラム HPLC で分離定量した．血液試

現在，米国 NIH（国立健康研究所）によって，グルコサミンおよびコンドイチン硫酸の経口投与と関節炎治療に関料の前処理は分子量分画用限外ろ過膜を装着した遠心チューブを用いて行った．

する大規模な臨床試験が実施されており近々吸収，効果に関して明確な結論が出されるものとして期待されている 16）．

３．結果

さらに，生体内における GAG の生理活性とその機能が注目されており，特に食用ヒアルロン酸などが健康食品とし３—１

酸 ･ 塩基性条件下での HA の安定性て広く普及していることから，経口投与した GAG の吸収

Table 1 に示す条件に従って HA を保存し，保存１週間に関する解明が必要であると考えられる . また，これまで後，２週間後，４週間後，８週間後，12 週間後に回収し，GAG の体内動態を調べるため，GAG 分析を目的とした前凍結乾燥を行った．HA の保存濃度は 1000 ppm とした．

処理法も検討されてきた．従来法である CPC 沈殿法は煩以下の図中では，Condition（保存条件）を C，保存週

雑な操作に熟練を要し，長時間を必要とする難点があった．

を W と略し，Condition １で１週間保存したものを 1WC1

そこで本研究では，さまざまな条件下で一定期間 HAなどと記載する．

を保存し，その安定性を明らかにするとともに，当研究室で新たに確立された限外濾過膜を用いた前処理法を用いて

３—２

1H-NMR による構造解析

HA の体内動態を明らかにすることを目的とし，ヒアルロ各条件下にて一定期間保存した場合の HA のコンフォン酸を経口投与したラットの血清中 HA の定量を行った．

メーション変化を観察するため，標準品の NMR スペクト
ルを Fig. １に，保存１週目の Condition １〜６の NMR ス
ペクトルを Fig. ２に示す．保存温度によるスペクトルの２．実験
２—１

変化は認められなかったが，酸性条件である Condition ３試料および試薬および６では標準品のスペクトルと比較し，大きな変化が① HA 標準品認められた．

HA（Streptococcus zooepidemicus 由来）は，平均分子量また，Condition ３におけるスペクトルの経時的変化を20,000 および 80,000 の試料を紀文フードケミファ株式会

Fig. ３に示す．保存１週目以降にスペクトルの変化が認め社から購入した．

られないことが確認できる．

②その他の試薬

また，Condition ３においてみられたスペクトルの変化

試薬はすべて市販の特級品を使用した．水はミリポア超が，より緩和な酸性条件でも認められるかどうかを確認す

純粋装置により得られた精製水を用いた．

るため，Condition ７，８にて保存１週目の 1H-NMR を測③実験動物定した．その結果を Fig. ４に示す．

メスの７週令 Balb/c マウスを購入し，1 週間予備飼育して実験に用いた．

３—３ キャピラリー電気泳動（CE）による分子量測定

２—２布の変化を観察するため，CE によって分析を行った．分

HA を各条件下にて一定期間保存した場合の分子量分装置および測定条件①核磁気共鳴（NMR）装置

離 は Normal polarity， 検 出 は UV200nm に て 行 っ た．
1

NMR 装置は JEOL JNM-ECP600 を使用した． H-NMR

Fig. ５に標準品，Fig. ６に保存１週目の Condition １〜６，の化学シフト値は，トリメチルシリルプロピオン酸ナトリ

Fig. ７に NMR スペクトルに変化が認められた Condition

ウムのピーク（δ, 0 ppm）を基準として示した．

３の CE 分析結果を，それぞれの NMR スペクトルと対比②キャピラリー電気泳動（CE）させて示す．CE 分析結果は再現性を考慮し n=3 で行った．

キャピラリー電気泳動装置は Beckman 製 P/ACE 5010

標準品と比較すると，いずれのピークも分子量分布が広が（UV detector 装備）を使用した．キャピラリーはジーっているものの，保存条件による変化は明確には観察されエルサイエンス社製ヒューズドシリカカラム（75 mmなかった．

i.d., 375 mm o.d.） を 用 い た． シ ス テ ム コ ン ト ロ ー ル には Compaq 社製コンピュータ，プログラムは Beckman

３—４P/ACE Station ver.1.0 を用いた．
③ HA の HPLC 分析

ゲル電気泳動による分子量測定

分子量分布の変化をより詳細に検討するため，ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った．ゲル濃度は−3−コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

Table1 Conditions of HA preservation.

Fig.1 NMR spectrum of an HA standard.

Fig.2 NMR spectra of HA in each condition.

Fig.3 NMR spectra of HA in condition 3.

−4−

化粧品としてのヒアルロン酸およびその誘導体の物性と生理的安全性に関する研究

Fig.4 NMR spectra of HA.

Fig.5 Capillary electropherogram of an HA standard.

Fig.6 Capillary electropherogram of HA in each condition.

−5−コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

12.5％ゲルを用い，0.005％ Stains-all in 50％ EtOH で染色３−５

経口投与した HA の血液中存在状態

した結果を Fig. ８に示す．中性で保存したものは標準品

HA の経口吸収の有無を明らかにするため，雄性 ddYと同様の分子量分布を示したが，アルカリ性，中性，酸性マウス６週齢に対して HA 250 mg/kg（body weight）をの保存条件の違いにより，分子量分布は変化することが確

単回経口投与し，5, 15, 30, 60, 120, 240 分後に大静脈より認された．

採血を行った．HA は本来血漿中に僅かしか存在していな

また，アルカリ性および酸性条件にて保存した HA はいことが知られている．そこで，HA 投与前後で血中 HA濃縮ゾーンを通過しにくいという特徴が見られたため，試濃度の挙動を分析することによって血中への吸収を観察料の pH 調整を行い，すべて中性条件で電気泳動を行った

した．消化管吸収の際の消化管膜通過を考慮し，比較的低が，変化は認められなかった．

分子量の 20kDa の HA を用いて投与実験を行った．採取

Fig.7 Capillary electropherogram of HA in condition 3.

Fig.8 SDS-PAGE pattarns of HA in each condition.

−6−

化粧品としてのヒアルロン酸およびその誘導体の物性と生理的安全性に関する研究した血漿は限外濾過膜を用いて前処理し，コンドロイチナ

HA の生理機能の解明に重要であると考えられる．今後のーゼ ABC で特異的に分解される不飽和二糖のうち HA 由検討が期待される．

来の ΔDi-HA を HPLC により定量し，マウス血漿中 HA 分析を行った．その結果，HA は経口投与によって投与前よ（引用文献）

りも血中濃度が上昇し，経口吸収されることが明らかとな

１） Kjellen L, Lindahl U.:“Proteoglycans, structures andり，最高血中濃度は 120 分後であった．一般に，CS およinteractions.”Ann. Rev. Biochem., 60 ,443-75（1991）.

び HA を静注投与した際の消失は数分から十数分と比較

２） Hook M, Kjellen L, Johansson S.:“Cell-surface的早いことが知られている．しかし経口投与では比較的長glycosaminoglycans.”Ann. Rev. Biochem., 53 ,847-869

時間後に HA の上昇が観察された．採血時に偶然 HA が（1984）.

血中に存在することは考えにくく，投与した HA のまま

３） Zako M, Iwaki M, Yoneda M, Miyaishi O, Zhao

で血中に存在している可能性は低いと予想できる．すなわJ, Suzuki Y, Takeuchi M, Miyake G, Ikagawa H,ち，経口投与した HA が体内で何らかの修飾を受け，血Kimata K. Molecular cloning and characterization

中に存在している可能性が示唆される．

of chick sialoprotein associated with cones androds, a developmentally regulated glycoprotein ofinterphotoreceptor matrix. J. Biol. Chem., 277, 25592-600

４．考察
1（2002）.

H-NMR に よ る 構 造 解 析 の 結 果， 保 存 １ 週 目 に お い４） Taylor K. R., Gallo R. L.:“Glycosaminoglycans andて，酸性条件 pH３で保存した Condition ３では，標準品

their proteoglycans: host-associated molecular patternsと比較し，3.6ppm 付近の GlcA の３位のシグナルが低磁

for initiation and modulation of inflammation.”FASEB J.,

場にシフトし，また 3.7 〜 3.9ppm 付近の GlcA の４位と20, 9-22（2006）.

GlcNAc の３位と６位，GlcNAc の２位，GlcNAc の４位

５） Fuster M. M., Esko J. D.:“The sweet and sour ofのシグナルが重なりあい，大きく変化している．それに対cancer: glycans as novel therapeutic targets.”Nat. Rev.
Cancer, 5, 526-542（2005）.

し，pH ５で保存した Condition ７の NMR スペクトルは，標準品とほぼ同様であった．このことから，酸性条件にお６） Meyer K., Palmer J. W.:“The polysaccharide of the

けるコンフォメーション変化には，比較的厳しい酸性条件

vitreous humor.”J. Biol. Chem., 107, 629-634（1934）.

が必要であることが示唆される．また，Condition ３にお７）“The Chemistry, Biology and Medical Applications

いて NMR スペクトルの経時的変化は認められないことかof Hyaluronan and its Derivatives”（Laurent T. C., ed）

ら，酸性条件におけるコンフォメーション変化は HA 保

Wenner-Gren International Series, Vol 72, Portland Press,

存後すぐに起こるものであり，その後はそのまま変化しな

London（1998）.
８） Scott J. E., Cummings C., Brass A., Chen Y.:

いと推定される．
CE による分子量測定の結果，各条件で保存した HA は，“Secondary and tertiary structures of hyaluronan in

標準品と比較し，分子量分布が広がっていると考えられる

aqueous solution, investigated by rotary shadowing-

ものの，保存期間や保存条件の違いによる分子量分布の変electron microscopy and computer simulation.

化は明確には確認されなかった．そのため，分子量分布のHyaluronan is a very efficient network-forming polymer.”

変化をさらに詳細に検討すべく，ポリアクリルアミドゲル

Biochem. J., 274: 699-705（1991）.

を用いて電気泳動を行った．その結果，中性条件で保存し９） S c o t t J . E . : “ S u p r a m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n o f

た HA は標準品と同様の分子量分布を示したが，アルカ

extracellular matrix glycosaminoglycans, in vitro and in

リ性，酸性で保存した HA はそれぞれ異なる分子量分布

the tissues.”FASEB J., 6, 2639-2645（1992）.

を示した．さらに，試料を pH 調整し，すべての試料を中10） Toole B. P.:“Proteoglycans and hyaluronan in

性条件において電気泳動を行ったが，結果は同様であった．

morphogenesis and differentiation.”In: Hay E., ed. Cell

このことから，保存条件の違いにより，分子量分布は変化

Biology of Extracellular Matrix, 2nd edition. New York:することが示唆される．

Plenum Press, 1991:305-341.

一方，現在に至るまで，GAG の経口吸収についてはそ

11） Weissman B., Meyer K.:“The structure of hyalobiuronicの詳細は明らかにされておらず，その生理的作用を期待すacid and of hyaluronic acid from umbilical cord.”J. Am.

る場合も，量的な変動と効果の相関はみられていない．しChem. Soc., 76, 1753-1757, 1954.

かし，HA が経口によって体内に吸収されることが判明し

12） Sherman L., Sleeman J., Herrlich P., Ponta H.:

た今，その存在量および存在様態を明らかにすることが“Hyaluronate receptors; key players in growth,−7−コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

differentiation, migration and tumor progression.”Curr.

14） Miller D.,“Viscocanalostomy procedures.”Arch.
Ophthalmol., 123, 1455-1456（2005）.

Opin. Cell Biol., 6, 726-733（1994）.
13） Gotoh S., Onaya J., Abe M., Miyazaki K., Hamai

15） Zeng C., Toole B. P., Kinney S. D., Kuo J. W.,

A., Horie K., Tokuyasu K.:“Effects of the molecular“Stamenkovic I: Inhibition of tumor growth in vivo byweight of hyaluronic acid and its action mechanisms on

hyaluronan oligomers.”Int. J. Cancer. 77, 396-401（1998）

experimental joint pain in rats.”Ann. Rheum. Dis., 52, 817-.

822（1993）.

16） http://nccam.nih.gov/news/19972000/121100/qa.htm−8−