ごあいさつ
このたび、コスメトロジー研究振興財団として 27 冊目の研究報告書を刊行いたしました。
本財団を設立して以来、コスメトロジー（化粧品科学）の発展をめざす研究テーマへの助成活動を滞りなく継続できたましたことは、多くの関係者の皆様のご理解とご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
そもそも化粧品科学は、医学、生理学、化学、薬学、心理学、社会学など幅広い学問領域を基盤に成り立っており、これらの専門分野の研究者が新たに化粧品分野の研究にも参画していただくことで、今日のコスメトロジーが形作られたと申し上げることができます。
本財団が支援した研究テーマも、皮膚科学から新素材開発、機能評価、化粧心理、文化論など多種多様であり、それぞれ独創的で波及性のある研究成果をお示しいただきました。この活動により、これまで本財団がコスメトロジーの発展に微力ながら貢献できましたことは、私どもの大きな喜びとするところでございます。
今回の報告書では、2016 年度から 2017 年度に助成を受けられた先生方 35 名の研究報告を掲載しております。また、昨年秋の第 29 回表彰・贈呈式にてご講演いただいた早稲田大学齋藤美穂先生の講演録、および今回助成を終えられた先
生方の所感をまとめた「コスメトロジー研究雑感」を合わせて掲載しています。
この研究報告書 COSMETOLOGY 誌をご高覧いただきまして、皆様にコスメ
トロジーの更なる発展に向けてご活用いただきますことを祈念しています。
引き続き本財団は、化粧品科学の発展のために、優れた研究に対して積極的に助成を進めて参る所存でございます。
今後とも、皆様のますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

2019 年 9 月
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・･サンスクリーン剤の紫外線防御能を普く正確に in vitro 評価する測定方法の確立･････････････････････ 4慶應義塾大学理工学部 朝倉 浩一
・･MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測･････････････････････ 10
富山大学大学院医学薬学研究部（薬学） 大貫 義則
・･抗菌性と生体適合性を併せ示す生糸織物の開発･･････････････････････････････････････････････････ 17
東京医科歯科大学生体材料工学研究所 川下 将一
・･化粧品の評価・開発に資する微小な力を検知する水溶性の分子集合体の開発･･･････････････････････ 24
北海道大学電子科学研究所 相良 剛光
・･抗酸化物質から成る Cubosome の開発およびミクロ・メソ・マクロ特性の評価･････････････････････ 30
恵嗣
大阪大学大学院基礎工学研究科 菅・･渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換･････････････････････････････ 36
神戸大学大学院理学研究科・滋賀医科大学医学部・内蒙古医科大学薬学院 津田 明彦
・･ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジット設計･･･････････････････････････ 40
大阪薬科大学 戸塚 裕一
・･顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法および透過性スクリーニング法の構築･･･････････････ 47
明治薬科大学 藤井 美佳、深水 啓朗
・･カラフルな反射色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製･････････････････････････････････ 52
東京理科大学理学部第一部応用化学科 古海 誓一・･アミノ化合物によるナノ結晶（粒子）の成長抑制技術の開発･････････････････････････････････････ 58
山形大学大学院理工学研究科 増原 陽人
・･マイコスポリン様アミノ酸誘導体の電荷共鳴吸収を基盤とする新規天然由来サンスクリーン材料･････ 64
直大阪大学大学院工学研究科 森・･ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析･････････････････････････････････････････ 68
富山大学和漢医薬学総合研究所 森田 洋行
・･メーキャップ化粧品の光学的機能評価に向けた人工皮膚の開発･･･････････････････････････････････ 75
純
芝浦工業大学工学部機械工学科 山田
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・･ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析･････････････････ 84
東京都健康長寿医療センター研究所 今江 理恵子
・･女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築･･････････････････ 90
東京工科大学応用生物学部 岩渕 徳郎
・･ヒト培養表皮におけるアスコルビン酸の経皮吸収および紫外線 UVB による細胞障害に対する予防、回復効果の検討･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 96
東京都健康長寿医療センター研究所 近藤 嘉高・･皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討･･･････････････････････････ 98
和歌山県立医科大学皮膚科 神人 正寿

・･皮膚における自己反応性 CD4+ T 細胞による標的抗原認識機構の解明･････････････････････････････ 104
慶應義塾大学医学部皮膚科 高橋 勇人
・･皮膚制御に関わる新規機能性脂質の同定と脂質フローによる皮膚疾患制御機構の解明･･････････････ 108
東京大学大学院医学系研究科分子細胞生物学専攻細胞情報学分野 武富 芳隆
・･化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築－マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価－･･････････････････････････ 113
静岡県立大学 徳村 雅弘
・･ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および平面脂質膜法による解析･･････････ 120
大阪府立大学大学院工学研究科物質・化学系専攻化学工学分野 仲村 英也
・･増殖因子による毛包休止期制御機構の解明･････････････････････････････････････････････････････ 127
国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射線医学総合研究所
組織再生治療研究プログラム 中山 文明
・･皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割････････････････････････････････････････････ 132
雄二
京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 原・･構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換･･････････････････ 137
名古屋大学大学院創薬科学研究科構造分子薬理学分野 廣明 秀一
・･刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成････････････････ 145
岩手大学理工学部細胞工学・分子遺伝学研究室 福田 智一
・･創傷治癒過程において、血管網の再構築が表皮幹細胞の分裂制御に果たす役割････････････････････ 152
神戸学院大学大学院薬学研究科 水谷 健一
・･メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発･････ 155
名古屋市立大学大学院薬学研究科 保嶋 智也
・･紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する････････ 161
輝希北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室 柳・･表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発･･････････････････････････････････････････ 169
大阪大学大学院薬学研究科 渡利 彰浩
Ⅲ．精神、文化に関する分野
・･化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用に関する行動経済学的アプローチ･･････････････････････ 176
広島大学大学院総合科学研究科 有賀 敦紀・･他者からの評価を推論するメカニズムがその人物に対する選好の形成に与える影響････････････････ 180
サウサンプトン大学心理学部、日本学術振興会、北海道大学保健科学研究院 伊藤 文人
・･眼瞼裂幅測定による耳鼻咽喉科心身症患者の客観的評価のこころみ･･････････････････････････････ 185
独立行政法人国立病院機構東京医療センター耳鼻咽喉科 五島 史行・･サーサーン・ガラス成立の背景〜ユーフラテス川以東へ流入した地中海周辺地域の化粧文化を探る〜････････････････････････････ 189
岡山市立オリエント美術館 四角 隆二
・･認知症の妻・母へスキンケアをする男性の特性･････････････････････････････････････････････････ 194
福岡大学医学部看護学科 西尾 美登里
・･香りの記憶形成・固定化メカニズムの解明･････････････････････････････････････････････････････ 200
同志社大学研究開発推進機構 眞部 寛之

■記念講演・第 29 回表彰・贈呈式記念講演「日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩」･･･････････････････････････････････････････････････････ 209
早稲田大学常任理事 齋藤 美穂■コスメトロジー研究雑感・･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 219
■付

録

事業報告書

････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 2412018 年度

研究助成を受けられた方々 ････････････････････････････････････････････････････････････ 243

役員一覧･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 246−4−●
Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

サンスクリーン剤の紫外線防御能を普く正確に
in vitro 評価する測定方法の確立
慶應義塾大学理工学部

朝倉浩一

Concerns have increased for the establishment of reliable and reproducible in vitro evaluation method of UV protection
efficacies of sunscreens, since it gives results more quickly, is less expensive and is more ethical. In this study, attempts weremade to establish accurate and universal in vitro evaluation method of UV protection efficacies of sunscreens. Two subjects,hydrophilicity of the substrate surface on which sunscreens are applied and surface roughness of the cosmetic standard
PMMA UV evaluation plates, were studied to analyze their influence on the value of in vitro UV protection efficacies.
Corona-discharge treatment was conducted on the quartz plate, and it was succeeded to make the surface superhydrophilic to have a contact angle of water at 0 degree. The contact angle exponentially recovered to the initial value andits half life was around 5 d. Four types of commercially available sunscreens, water gel type, mist spray type, silicone/water type, and non organic UV absorber type, were applied onto the quartz plate exhibiting different hydrophilicity. It was
found that the wettability of each sample differed and the values of in vitro UV protection efficacies drastically changed bychanging the hydrophilicity of the surface.
Surface structures were analyzed for three cosmetic standard PMMA UV evaluation plates: Helioplates HD 6 (Sa = 6 μm)
and ISO plates (Ra = 2 and 5 μm). Solution of acrylsilicone resin was added dropwise onto the plates and the solvent wasevaporated. The plates were cut and the cross section was analyzed using SEM-EDS. The maximum depth of penetrating ofacrylsilicone resin was larger than Ra and cracks into which the acrylsilicone resin penetrated were observed. Clear solution
type pseudo-sunscreen samples containing acrylsilicone resin were deposited on the plates. It was found that the addition ofacrylsilicone resin drastically changed the UV transmission.

1. 緒

サンスクリーン剤を用い、塗布層に形成された空間周期パ言

ターンが in vitro 測定値に与える影響を検討してきたもの

サンスクリーン剤の SPF および UVA-PF を in vitro 測であった。ところが、市販のサンスクリーン剤はエマルシ定する方法 1 , 2）、すなわち規定量のサンスクリーン剤を基ョン系や無機粒子混合系など多相系である場合が多く、相板上に塗布し、その塗布層の紫外線吸光度を測定して紫外間界面での屈折や反射あるいは無機粒子表面での散乱など、

線防御効果を評価する方法の開発が、測定コストの低減お紫外線透過に影響を与える因子が複数となる。また、紫外よび倫理的観点から世界的に期待されている。ところが、線吸収剤分子は複数の相に分配平衡値に依存した濃度で分

これまでに in vitro 測定法の再現性および信頼性に対し多布し、この濃度分布は紫外線透過光強度の局所的な変動を3）もたらす。さらに、基板との親和性の問題から、塗布層のそのような中、本著者らは、サンスクリーン剤の塗布形成が困難なサンスクリーン剤も存在する。そこで、本研の際にヴィスコスフィンガリングと呼ばれる現象により究では、様々な性状のサンスクリーン剤について、その紫くの問題点が指摘されてきた 。

4 , 5）

し、この形

外線防御能を普く正確に in vitro 評価する方法の開発を目

6）状により紫外線吸光度が変動することを示してきた 。ま指した。また、すでに ISO 法となった UVA-PF の in vitro

た、米国で近年導入された Broad Spectrum の認定をする

測定法 2）ならびに Broad Spectrum の認定をするための臨ための臨界波長の測定 7）に対しても影響を及ぼすことを見

界波長の測定法 3）では、粗い表面構造を持つ PMMA プレ

いだした 8）。さらに、空間周期パターンの自発的発生が起ートに試料を塗布して紫外線透過光強度を測定する。そこ

こらないサンスクリーン剤の塗工法を見いだし、正確な in

で、この表面粗さが測定値に与える影響についても検討し

vitro 測定法の開発に成功してきた 9）。

た。

空間周期パターンが塗布層に自発的に発生

ただし、これまでの研究では、純粋に紫外線吸収剤分子2. 方による紫外線吸収しか存在しない理想的な溶液化した擬似Establishment of accurate and universal
in v it ro eva luat ion met hod of U V
protection efficacies of sunscreens
Kouichi Asakura
Department of Applied Chemistry,
Faculty of Science and Technology,
Keio University

法

2 . 1. 石英基板の親水性化ならびにその基板表面に形成されたサンスクリーン剤塗布層の紫外線遮蔽能の測定
石英基板にコロナ放電処理を施すことで、基板表面の超親水性化を試みた。また、その後その基板を放置して水の接触角の経時変化を測定した。つづいて、4 種の市販のサンスクリーン剤（a：Water gel type、b：Mist spray type、c：−4−サンスクリーン剤の紫外線防御能を普く正確に in vitro 評価する測定方法の確立

Silicone/water type、d：Non organic UV absorber type）の差により異なった体積で埋めることで、紫外線透過光強を表面の親水性が異なった石英基板に塗布し、その塗布層度がどのように変動するかを検討する数値シミュレーショ

の構造を観察するとともに、SPF アナライザーを用いてそンを試みた。

の紫外線透過光強度を測定した。

3 . 結果と考察

2 . 2 . in vitro 紫外線遮蔽能測定用標準 PMMA 基
板の表面粗さの評価

3 . 1. 石英基板の親水性化ならびにその表面に形成されたサンスクリーン剤塗布層の紫外線遮蔽能に対する影響

一辺の長さ 5 cm の正方形の Helioplates HD 6（Sa= 6 µm）（HD 6）ならびに ISO plates（Ra= 2 および 5 µm）（ISO 2

コロナ放電処理を石英板表面に施すとその表面上に置かおよび ISO 5）の 3 種の in vitro 紫外線遮蔽能測定用標準れた水の接触角が 0 °となり、表面が超親水性化されるこ

PMMA 基板について、その断面の SEM 観察を行った。つとが認められた（Fig. 1）。その後この基板を放置すること

づいて、この表面にアクリルシリコーン樹脂の溶液を滴下で徐々に接触角は元の値へと戻り、初期値との差の半減期

し、溶媒蒸発終了後にその断面を走査型電子顕微鏡（SEM）

は約 5 日であった。したがって、表面の親水性の調整は比で観察するとともに、SEM/ エネルギー分散形 X 線分析装較的簡単であった。また、プラズマ処理によっても同様に

置（EDS）元素マッピング法を用いて Si 元素の PMMA 基板

石英板表面は超親水性化された。

表面から深さ方向への分布を測定した。

このようにして作製した親水性の異なった石英板表面
上に 4 種の市販のエマルション型サンスクリーン剤を塗布

2 . 3 . 標準 PMMA 基板の表面粗さの in vitro 紫外線遮蔽能測定に与える影響の評価

し、紫外線吸光度の測定を行った。その結果、いずれの試

数種類の異なった濃度のアクリルシリコーン樹脂の溶液

類によりその傾向が異なることが認められた（Fig. 2）。特に同一量の紫外線吸収剤を溶解させ、これらを擬似サンスに Water gel type および Mist spray type の試料は、基板クリーン試料とした。これら試料を in vitro 紫外線遮蔽能がある程度以上の親水性とならないと、その紫外線吸光度測定用標準 PMMA 基板 ISO 5 上に滴下し、溶媒蒸発終了が顕著に低下した。それぞれの塗布層の表面を観察したと後、その表面の粗い構造が試料で埋まる様子を観察するところ、これら 2 種の試料については、基板の親水性が低い

ともに、SPF アナライザーを用いてその紫外線透過光強度

場合、試料層にディウェッティングが起こり、試料で覆わを測定した。また、同一量の紫外線吸収剤を含む擬似サン

れておらず紫外線が全く遮蔽されない領域が出現することスクリーン試料が、標準 PMMA 基板の粗い表面を樹脂量が認められた。

料の紫外線吸光度も表面の親水性に大きく影響を受け、種Fig. 1 Difference of the wettability by water on the original quartz surface
and the super-hydrophilic quartz surface prepared by corona-discharge
treatment.

−5−コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 2 . in vitro 紫外線遮蔽能測定用標準 PMMA 基
板の表面粗さの評価ならびにその紫外線遮蔽能測定に与える影響3 種の標準 PMMA 基板である HD 6 ならびに ISO 2 および ISO 5 について、SEM 観察ではそれら表面構造の顕著な違いは認められなかったが、SEM/EDS 元素マッピング法による Si 元素の基板表面から深さ方向への分布は、各基板毎に異なる様子が観察された。Fig. 3 の黄色い部分はそこに Si 元素が存在していることを意味しており、ISO 2
および ISO 5 は比較的単純な表面粗さを有しているのに対し、HD 6 は孤立して Si 元素が存在している領域があり、このことは基板に亀裂がありそこへアクリルシリコーン樹
脂の溶液が侵入したことを示している。そして、アクリル
シリコーン樹脂の溶液を滴下し溶媒を蒸発させた HD 6 の断面について、表面から深さ方向の何点かにおいて、Si 元
素の存在量の Si、C、O の全元素存在量に対する比を測定したところ、その値は表面から漸近的に減少するのではな
く、局所的にその比が高い領域が存在することが認められた（Fig. 4）。このことからも、HD 6 の表面付近には、アクリルシリコーン樹脂の溶液が侵入し易いような亀裂が存在していることが確認された。
つづいて、数種類の異なった濃度のアクリルシリコーン
樹脂の溶液に同一量の紫外線吸収剤を溶解させた擬似サンスクリーン試料を作製し、標準基板 ISO 5 上に滴下して溶媒を蒸発させたところ、当然の結果ではあるが、試料中の樹脂量の増加に伴い標準基板表面粗さの凹部がより多く埋められていく様子が確認された（Fig. 5）。そして、これらの紫外線透過光強度を石英板を参照として測定した結果、試料に添加した紫外線吸収剤では紫外線吸収が起こらない
波長においても透過光強度が減衰することが認められ、その傾向は樹脂を添加しなかった試料において極めて顕著であることが認められた（Fig. 6 ⒜）。したがって、この透過
光強度の減衰は標準基板の粗い表面における乱反射によるものであり、その度合いは試料中の樹脂量の増加に伴って低下したと判断された。そこで、試料と同量のアクリルシ
リコーン樹脂のみを溶解させた試料を滴下して溶媒を蒸発させた標準基板を参照として、再び紫外線透過光強度を測定した結果、これら試料の紫外線吸光度が測定されたと言える結果が得られた（Fig. 6 ⒝）。
そして、ここで試料 1 〜 5 はいずれも同量の紫外線吸収剤が含まれているにもかかわらず、紫外線吸光度は大きく異なり、アクリルシリコーン樹脂量の減少に伴い大きく低下する傾向が見られた（Fig. 6 ⒝）。試料中のアクリルシリ
コーン樹脂量が少なくなると、試料はより標準基板の表面
Fig. 2 UV absorbance of applied sample sunscreen layers
on the quartz plate having different contact angle of water.
(a)：Water gel type, (b)：Mist spray type, (c)：Silicone/water type, (d)：Non organic UV absorber type.

粗さの底部に集中する傾向が観察され（Fig. 5）、したがって紫外線吸収剤がより局所的に偏在するようになると言える。これまでに本著者らは、サンスクリーン剤の塗布の際−6−サンスクリーン剤の紫外線防御能を普く正確に in vitro 評価する測定方法の確立

Fig. 3 SEM - EDS mapping images of the cross section of HD6, ISO2, and ISO5 on
which acrylsilicone resin was deposited. Yellow color represents the existence of Si
atom. Amount of acrylsilicone resin per unit area was 2.0 mg cm-2.

Analyze Si atomic ratio Depth
point No. in O, C, Si / % / µm

001

001
002
003
004
005
006
007

002
003
004
005
006
007

3.36
0.15
0.31
0.07
0.05
0.02
0.04

0
36
65
91
114
140
166

Fig. 4 SEM image of the cross section of HD6 on which the acrylsilicone resin was deposited（1.3 mg cm-2），and the and Si atom ratio at different depth from the surface of HD6 determinedby the point analysis.

−7−コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 5 Digital microscope image of the surface of ISO5 on which pseudo-sunscreen sample was deposited. All the pseudosunscreen samples consisted of 1.0 mg of the same UV absorbers and 0.80 mL of hexane, while the content of acrylsilicone
resin in the sample 1, 2, 3, 4, and 5 was 40, 30, 21, 11, and 0 mg, respectively.

Fig. 6 Values evaluated as UV absorbance of the cosmetic standard PMMA UV evaluation plates on which pseudo-sunscreen
sample was deposited. (a)：Using a flat quartz plate as a reference. (b)：Using the plates on which the identical amount of
resin was deposited.

−8−

サンスクリーン剤の紫外線防御能を普く正確に in vitro 評価する測定方法の確立

2011.

のヴィスコスフィンガリング現象により空間周期パターン
が塗布層に発生すると、それに伴い紫外線吸収剤の存在量

2） International Standards Organization, ISO 2 4 4 4 3に空間的な分布が発生し、その分布の度合いが大きくなる

Cosmetics –Sun protection test methods–

ほど紫外線吸光度が低下することを実験的に確認し、またDetermination of sunscreen UVA photoprotection in

理論的にも証明してきた

6 , 8）

vitro, 2012.

。本研究で見出された、紫外線吸収剤が同量の試料が粗い表面を持つ標準基板に塗布さ3） M. Rohr, E. Klette, S. Ruppert, R. Bimczok, B.

れた際、その体積が小さくなることで紫外線吸光度が低下

Klebon, U. Heinrich, H. Tronnier, W. Johncock, S.

する現象は、この以前の研究結果と合致する。なお、本研Peters, F. Pflucker, T. Rudolph, H. Flosser-Muller, K.

究においても、試料体積と紫外線吸光度の関係は、理論的

Jenni, D. Kockott, J. Lademann, B. Herzog, S. Bielfeldt,

なシミュレーションによりほぼ再現できることが確認でき

C. Mendrok-Edinger, C. Hanay, L. Zastrow, Skin

ている

10）

Pharmacol. Physiol. 23, 201-212（2010）
．

。

4. 総

4） A. Kuroda, T. Ishihara, H. Takeshige, K. Asakura, J.

括Phys. Chem. B 112, 1163-1169（2008）．

本研究によって、実際の市販のサンスクリーン剤の紫外

5） 朝 倉 浩 一 , 黒 田 章 裕 , 武 重 日 香 里 , 石 原 司 , 特 許 第5283819 号．

線遮蔽能を in vitro 評価するには、適切な親水性度の基板を使用する必要があることが明らかとなった。また、現在

6） K. Fujikake, S. Tago, R. Plasson, R. Nakazawa,認定されている in vitro 性能評価用の標準 PMMA 基板のK. Okano, D. Maezawa T. Mukawa, A. Kuroda, K.

表面粗さについては、例えば紫外線吸収剤含有量の同じ試

Asakura, Skin Pharmacol. Physiol. 27, 254-262（2014）．

料であってもその体積が変動しただけで大きく測定値が変7） U. S. Food Drug Administration and（FDA）,

動することが確認されたため、その妥当性については検討

Sunscreen drug products for over-the-counter humanが必要であると思われる。なお、以上の研究成果を、The

uses; Final rules and proposed rules. Federal Register

Asian Conference on Oleo Science, Tokyo（Sep. 2017）、．
76, 35623-35665（2011）IFSCC 2017 Conference, Seoul（Oct. 2017）、IFSCC 20188） M. Wakabayashi, K. Okano, T. Mukawa, D. Maezawa,

Congress, Munich（Sep. 2018）にて学会発表した。また、こA. Kuroda, K. Asakura, Photochem. Photobiol. 92, 637-の間に執筆した 2 報の公刊論文が学術誌に掲載された
さらに、本課題が採択される直前に出願した特許

13）643（2016）．

11 , 12）。

につ9） 朝倉浩一 , 黒田章裕 , 特許第 5825654 号 .

いて、本研究の成果に基づいて優先権 PCT 出願し、この

10）K. Sakai, T. Banno, N. Sato, N. Nakamura, D.

国際出願特許 14）を日本、米国、フランス、イタリアヘ各Maezawa, S. Yahagi, H. Masaki, A. Kuroda, K. Asakura,

国移行申請した。今後は、本研究で得られた成果に基づいProceeding of IFSCC 2018 Congress, #P-S 2 - 302 .

て、コスメトロジー技術に関わる諸機関との連携を強め、

11）K. Asakura, A. Kuroda, IFSCC Magazine 21 , 53 - 57

最終的には、サンスクリーン剤を普く正確に in vitro 性能（2018）．

評価する日本発の世界標準法の確立に繋げたい。

12）A. Kuroda, K. Sakai, S. Yahagi, T. Mukawa, N. Sato,N. Nakamura, D. Maezawa, H. Masaki, T. Banno, K.

（引用文献）

Asakura, J. Oleo Sci. 68 , 175 - 182（2019）．

1） C O L IP A G uid elin e, I n vitro met h od f o r t he13）朝倉浩一 , 黒田章裕 , 特願 2016 - 174084 .

determination of the UVA protection factor and14）朝倉浩一 , 黒田章裕 , PCT/JP 2017 / 3162 .

“critical wavelength” values of sunscreen products,−9−

MRI と時間温度換算則を応用した
エマルション化粧品の高精度乳化安定性予測
富山大学大学院医学薬学研究部（薬学）大貫義則

The time–temperature superposition principle (TTSP) was applied to the destabilization kinetics of an emulsion. A
cream preparation that is clinically used for the treatment of dermatological diseases was tested as the model emulsion. Afterstorage at temperatures ranging from 30 to 45 °C for designated periods, the emulsion state was monitored using magnetic
resonance imaging, and then the phase separation behaviors observed were analyzed according to the Arrhenius approach
applying TTSP. The Arrhenius plot showed a biphasic change around 35 °C, indicating that the separation behaviors of
the sample were substantially changed between the lower ( 30 – 35 °C) and higher ( 35 – 45 °C) temperature ranges. This
study also monitored the coalescence behavior using a backscattered light measurement. The experiment verified thatthe destabilization was initiated by coalescence of oil droplets and then it eventually led to obvious phase separation via
creaming. Furthermore, we note the coalescence kinetics agreed well with the phase separation kinetics. Therefore, in thecase of the sample emulsion, the coalescence behavior has a dominant influence on the destabilization process. This study
offers a profound insight into the destabilization process of pharmaceutical emulsions and demonstrates the promising
applicability of TTSP to pharmaceutical research.

1. 緒

教室ではこれまでに、エマルション製品の保存安定性を言

非破壊的かつ高感度に評価するため、核磁気共鳴画像法

エマルションは互いに混じり合わない 2 成分以上の液体（magnetic resonance imaging, MRI）を応用した新規エマの一方を微粒子（分散相）
として他方の液体（連続相）
中に分

ルション製剤の評価方法を構築してきた 2 , 3）。MRI は核磁散させた多相系であり、医薬品や化粧品の基剤として広く

気共鳴（nuclear magnetic resonance, NMR）現象の原理を1）利用されている 。熱力学的に不安定であり、不安定化機

応用した分子イメージング技術であり、分子運動性を反映

構には油相と水相の比重差によって生じるクリーミング、する MR パラメーター（T 1 および T 2 緩和時間や、拡散係

粒子間に働く引力によって生じる凝集・合一、オストワル数など）を用いて画像化すると、検体内部に含まれる水分

ド熟成と呼ばれる分散相の分子拡散などを経て、最終的に子などの分子運動性を可視化することも可能である。MRI

分散相と連続相の 2 相に分離してしまう。なお、スキンクを応用した新規評価手法は、容器内部で起こるクリーム剤

リームなどのエマルション製剤においては、クリーミング

本来の劣化挙動を非破壊的に可視化できる点や、劣化挙動などの軽微で可逆的な変化であっても、製品の品質（外観に対する感度が目視観察と比較して良好であるといった点

や有効成分の含量均一性など）を、著しく損なう恐れがあにおいて、他の評価手法よりも優れている。以上のようなる。そのため、エマルション製剤の設計において、優れた研究によって、エマルション製剤の保存安定性評価手法は、保存安定性を確保することは、有効性と安全性の確保に並要求を十分に満たすレベルの手法が構築されつつある。

ぶ重要な課題である。エマルション製剤の長期保存安定性

一方で、エマルション製剤の長期保存安定性を予測する

を正確に理解するためには、わずかな乳化状態の変化を検手法については、これまでにほとんど研究が行われておら出できる高感度かつ高精度な評価手法と、経時的な乳化状ず、十分な予測手法が確立されたとは言い難い。一般的に態の変化挙動を取り扱える優れた時系列解析手法との融合

エマルションの長期保存安定性を予測したい場合、加速試が必要であると考えられる。

験が適用される。最も容易な加速試験は高温加速試験と呼エマルションの保存安定性評価手法としては、最も簡ばれる高温条件（例えば 40 ℃など）でエマルションを保存

便な目視による評価の他に、粒子径測定法、動的光散乱

し評価する方法である。しかし、現時点では、これら加速法、濁度法などの様々な手法が提案されている。また、当試験で得られたエマルションの不安定化挙動を扱う解析手

Precise prediction of the kinetic analysis
of destabilization of pharmaceuticalemulsions using magnetic resonancei mag i ng a nd t i me –temperatu resuperposition principle
Yoshinori Onuki
Graduate School of Medical and Pharmaceutical Science, University of Toyama法が構築されていないため、得られたデータから試料の長期保存安定性を定量的に予測することは極めて困難である。
以上の背景から、本論文ではエマルションの高精度な長期保存安定性予測を目指し、高温保存および遠心分離法を利用した加速試験による乳化状態の変化挙動について速度論的な解析を試みた。なお、速度論的な解析を行うために、本研究では時系列データ解析手法の 1 つである時間 - 温度

− 10 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測

換算則（time-temperature superposition principal, TTSP）に着目した。TTSP は、ある事象に対する時間と温度の影

Table 1 Formulation of the menthol and diphenhydramine
cream.

響が等価であることを前提とした経験則である 4 , 5）。高分子素材の機械的および電気的緩和挙動の解析にしばしば用いられる。温度依存性を示す事象の経時的変化について、速度定数を求めずに、アレニウスプロットを用いた解析を行えるなどの利点がある。これまでに高分子素材などの素
材化学の分野では、経時的な物性変化を評価するために盛んに用いられてきた。エマルションの劣化挙動は TTSPが活用できると考えられるものの、今のところ製剤物性
6）が 14：86 となるよう秤量し、ハイブリッドミキサー（Model

評価への応用例は極めて限られている 。そこで、我々はHM- 500 ; Keyence, Osaka, Japan）を用いて自転 800 rpm、

TTSP を応用してエマルション製剤の保存安定性を詳細に

公転 2 , 000 rpm で 5 分間混合した。

評価することとした。
メントール配合ジフェンヒドラミンクリームは、市販ジ

2 . 3 . MRIを用いた相分離挙動の観察

フェンヒドラミンクリームにメントールなどの清涼物質を調製した試料を 1 mL ずつアシストチューブに分注し、恒配合したクリーム剤であり、慢性腎臓病に伴う掻痒症の治

温器（Mini Incubator MI-100/G; Yonezawa Inc, Shizuoka,

療のために院内製剤として広く処方されている。本製剤

Japan）で任意の時間保存した。保存温度は 30、33、35、は、患者からの薬効面での評価は高いものの、その一方で、38、40、43 および 45 ℃とした。経時的に試料を取り出し、我々の過去の検討から保存安定性に課題があることが指摘

核磁気共鳴装置（MR mini SA; DS Pharma Biomedical Co.,されている 7 , 8）。そこで、本研究では、この相分離挙動をLtd, Osaka, Japan）を用いて T2 強調画像を作成した。繰

TTSP によって詳細に評価することとした。検討では、調り返し時間（repetition time; TR）を 2 , 000 ms、エコー時製した試料を異なる温度で保存し、経時的に試料の MRI

間（time to echo; TE）を 89 ms、撮像視野（field of view;

画像を撮像した。そして、MRI 画像によって観察されるFOV）を 60 × 60 mm2、マトリックスサイズを 128 × 256、

相分離挙動に TTSP を適用し、本製剤の相分離機構につい積算回数を 1 回、スライス厚を 1 mm に設定した。撮像て詳細な評価を行った。さらに、本研究ではスタビリティ

した T 2 強調画像を基に、メントール配合ジフェンヒドラ

ーテスターを用いて試料中の油滴の合一挙動を評価し、本ミンクリーム中の水相の比率を算出した。画像処理には製剤の相分離機構への関与についても詳細な検討を行った。

Image j（Bethesda, MD, USA）を用いた。

2. 方

法

2 . 4 . スタビリティーテスターを用いた合一挙動の観2 . 1. 試料および試薬

察

レスタミンコーワクリーム 1 % は興和株式会社（Aichi,

メントール配合ジフェンヒドラミンクリームの合一挙

Japan）より購入したものを用いた。d- カンフルは小堺製

動は、スタビリティーテスター（ST- 1; Eko instruments,

薬株式会社（Tokyo, Japan）
より購入したものを用いた。エTokyo, Japan）を用いて測定した。スタビリティーテスター

タノールはヤクハン製薬株式会社（Hokkaido, japan）よりはレーザー光（λ=870 nm）を試料に照射し、その透過光およ購入したものを用いた。l- メントール、チモールはマイラ

び後方散乱光強度の経時的変化から、エマルションの分散

ン製薬株式会社（Tokyo, Japan）
より購入したものを用いた。

安定性を評価可能である。試料をおよそ 7 mL ずつサンプル
管に分注し、30、33、35、38、40、43 および 45 ℃の条件下

2 . 2 . メントール配合ジフェンヒドラミンクリームの調製
メントール配合ジフェンヒドラミンクリームの処方をにおいて、任意の時間間隔で測定した。

2 . 5 . 光学顕微鏡による粒子観察

Table 1 に示した。まず d- カンフルを 30 % 溶解させたエモデル試料の乳化粒子の状態を観察するために、35℃で 0、タノール溶液を調製した。続いて、メントール溶液は l- メ

50 および 100 分間保存した試料の一部を採取し、光学顕微

ントール、チモール、ハッカ油および d- カンフルを 30 %鏡（VHX- 700 FSP1344 ; Keyence, Tokyo, Japan）を用いて観溶解させたエタノール溶液をそれぞれ全量の 7、0 . 4、0 . 9

察を行った。

および 1 . 75 % となるよう調製し、処方に対して全量が14 % となるようエタノールを加え調製した。最後にメン

2 . 6 . TTSPによる解析

トール溶液およびレスタミンコーワクリーム 1 % の混合比

− 11 −

MRI およびスタビリティーテスターによって得られた測コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

(a)

(b)

(c)

aT

20℃

aT

20℃

2

30℃

1.5

Ln[at]

aT

Degree of degradation

Degree of degradation

2.5

50℃
40℃
30℃

Ea
R

1

0.5

0

0

Ln[Time]

40℃
50℃

Ln[Time]

1/T

Fig. 1 Flow chart of TTSP.（a）The value of shift factor（aT）at various temperature wascalculated from the difference between the regression curves at reference temperature and themeasured degree of degradation.（b）Time-course model of degree of degradation superposedwith the regression curves at 50℃ using the aT value.（c）Typical example of Arrhenius plotusing the aT of the TTSP.

定結果に対し TTSP4, 5 を適用した。TTSP による解析手順

3. 結を大まかに記す。例えば、様々な保存温度で保存した時の果

対数時間の曲線として表す。続いて、これらの曲線の 1 つ

3. 1. TTSPによるメントール配合ジフェンヒドラミン
クリームの相分離挙動解析

をマスターカーブとして設定し、このマスターカーブに重本研究では、調製したメントール配合ジフェンヒドラミ

なるように他の曲線を水平移動し、1 つの曲線を作成する

ンクリームを異なる温度で保存し、経時的に試料の T 2 強（Fig. 1 ⒝）。

調画像を撮像して、それらの相分離挙動を観察した（Fig.

事象変化を測定した場合、まず、Fig. 1 ⒜のように特性値 -この時の時間軸上の水平移動量はシフトファクター（aT）

2）
。撮像した画像から、すべての実験条件下で相分離が観察された。なお、我々の過去の研究から、上層はクリーと呼ばれ、以下の式（1）によって表される。

ム相、下層は水およびエタノールで構成された水相を示し

t（1）
aT = t ref ……

ている 7）。本試料を 45 ℃で保存した場合、4 時間以内に明T

ここで、tref は基準とした温度（Tref）での時間で、tT は任らかな相分離が観察された一方で、30 ℃で保存した場合、意の温度（T）で同様の特性値を得るのに必要な時間である。

相分離が生じるのに要した期間はおよそ 3 日であった。こなお、一般的にシフトファクターと測定温度の関係は、アのように、本試料の相分離挙動には保存温度依存性が確認

レニウス式
（2）
として表すことができる。

されたため、TTSP による詳細な解析を行うこととした。

( ）Fig. 3 ⒜は、Fig. 2 の結果から得られた各保存温度におE
lnk = lnA− RTa ……（2）ける、試料の水相面積の比率と時間の関係を表している。

ここで、k は反応の速度定数、A は頻度因子、Ea は見か

45 ℃で保存した場合で水相面積の比率の最大値が観察さけの活性化エネルギー、R は気体定数および T は絶対温度れたため、45 ℃を基準温度 Tref とした。Fig. 3 ⒝は 45 ℃のを表す。なお、式（1）、（2）を組み合わせると、シフトファ回帰曲線と aT を用いて水平移動した各温度のプロットを

クターは式
（3）
と定義される。

示した。各温度のデータは 45 ℃のマスターカーブに収束Ea

しており、得られた aT の妥当性が示された。aT の対数に

［ R（T1 −T1 ）］……（3）

aT = exp

対して各温度の逆数をプロットすることでアレニウスプロ

ref

ここで、Tref および T は絶対温度である。式（3）から、ットを作成した（Fig. 3 ⒞）。作成したアレニウスプロット

シフトファクターの対数と絶対温度の逆数の間に存在するは、35 ℃付近を境に二相性を示したことから、メントー

直線の傾きから、見かけの活性化エネルギーを算出するこル配合ジフェンヒドラミンクリームの相分離機構は高温側とや、任意の保存温度におけるシフトファクターを算出す（35 〜 45 ℃）と低温側（30 〜 35 ℃）で異なることが示唆さることが可能である（Fig. 1 ⒞）。

れた。回帰直線の傾きから相分離挙動の見かけの活性化エ

Tref を 45 ℃とした。マスターカーブから各プロットの水

ネルギーを算出すると、35 〜 45 ℃では 89 . 1 kJ/mol、30

平移動量を算出し、各プロットの平均水平移動量を aT と〜 35 ℃では 416 kJ/mol であった。よって、低温側での保した。得られた aT の対数値と絶対温度の逆数からアレニ存と高温側での保存ではおよそ 330 kJ/mol ほど見かけのウスプロットを作成した。

活性化エネルギーの差が存在すること明らかとなった。

− 12 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測

Fig. 2 Continuous monitoring of the phase separation of thementhol–diphenhydramine cream
The test creams were stored at different temperatures
ranging from 30°C to 45°C，and then their T 2 weighted
images（T 2WIs）were acquired at designated intervals using
M R I . T h e a c q uisitio n p a ra m ete r s we re a s follows ;T R = 2 0 0 0 ms , T E = 8 9 ms , FOV= 6 0 X 6 0 m m 2 , matrix
size =12 8 X 25 6 , number of excitation =1 and slice
thickness=1mm.

Fig. 3 Kinetic analysis for the phase separation behavior of thementhol–diphenhydramine cream based on the Arrhenius approach
applying TTSP.
（a）Time-course change in % area of aqueous phase during theaccelerated testing at different temperatures ranging from 30 to 45°C.
Each value represents the mean ± S.D.（n=3）．
（b）Superposed data concerning % area of aqueous phase using the aT
at each temperature. The data were shifted to a best-fit curve at
45°C.
（c）Arrhenius plot of shift factor, aT, obtained from the empirical time–
temperature superposition.

− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 2 . 保存温度の上昇に伴うメントール配合ジフェン
ヒドラミンクリームの相分離機構の変化
3 . 1 . の結果から、実験した温度範囲（30 〜 45 ℃）では、たと考えた。
そこで、本検討では、スタビリティーテスターを用いて、試料中の油滴の合一挙動を詳細に評価することとした。ス

試料の乳化状態の変化挙動には異なる 2 つの機構が存在す

タビリティーテスターは多重光散乱現象を用いて試料の分る可能性が示された。本製剤の不安定化は、油滴の上方へ

散および保存安定性を評価する装置である。Fig. 4 は 30 ,の移動によって生じるクリーミングが主な原因であると考35 , 40 および 45 ℃で保存した時の試料の後方散乱光強度えられる。クリーミング速度はストークスの式（5）で表すの経時的な変化を示している。縦軸は測定開始時の値を0 % とした場合の後方散乱光強度の変化率を示し、横軸は1）ことができる 。

試料の高さ方向の位置を示す。各サンプリング時間は、カ2

v = 2 r （ρ−ρ0 ）g/ 9 η……（5）
ここで、v はクリーミング速度、r は粒子径、ρ0 は連続

ラースケールで表されており、赤および紫のプロファイル

相の密度、ρは分散相の密度、η は粘度、g は重量加速度をはそれぞれ初期値および実験終点の測定結果に対応する。

示す。ストークスの式によると、クリーミングを防ぐ方法

いずれの試料においても、実験開始直後は、後方散乱光強として平均粒子径の減少、連続相と分散相間の密度差の減度がベースラインに並行に低下した。その後、30 および少および連続相の粘度の増加が挙げられる。特に、エマル

35 ℃といった低温保存の試料では、それぞれおよそ 18 時

ション中の油滴径がその安定性に大きく影響することがよ間後および 2 時間 40 分後から、試料底部の後方散乱光強く知られている。本実験における温度変化によって、連続度が急激に低下した（Fig. 4）。実験開始直後のベースライ相と分散相間の密度差および連続相の粘度の変化はほとん

ンの低下は油滴の合一を、また、その後の急激な後方散乱どないと考えられるものの、油滴の粒子径は大きく変化す

光強度の低下は相分離が開始したことを示していると考える可能性が考えられる。すなわち、35 ℃付近を境に油滴られる。事実、35 ℃での保存試料について顕微鏡によるの合一挙動が変化し、その結果として相分離機構が変化し油滴観察を行ったところ、ベースラインの低下のみが観察

Fig. 4 Changes in backscattering profiles of the menthol–diphenhydramine cream during the accelerated testing at (a) 30°C, (b)35°C, (c) 40°C, and (d) 45°C. The X-axis represents the position of the sample bottle; the position “0” corresponds to thebottom of the sample. Line profiles measured at different times are color-coded: the initial and the last sampling times
correspond to red and purple lines, respectively.

− 14 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測された 100 分後までの試料からは、時間の経過と共に油滴Fig. 3 で観察された低温領域と高温領域における相分離挙径は増大し、合一が進んでいる様子を確認することができ動の相違には油滴の合一挙動が深く関与していると考えた（Fig. 5）。一方で、高温保存（40 および 45 ℃）では実験られる。そこで、続いての検討では、両者の関係について

時間が短かったため急激な後方散乱光強度の低下は観察さ

詳細な検討を行った。Fig. 6 ⒜に、相分離が観察されるまれなかったものの、油滴の合一に伴うベースラインの低下

での試料中間部分の後方散乱光強度の変化を示した。すなに続き、徐々に試料底部から上部にかけて勾配が観察されわち、このグラフの後方散乱光強度の低下は、合一が進み、た。これは合一した粒子が上方へ移動したことに起因して油滴径が増大していく様子を表している。結果より、後方

おり、試料底部で油滴密度が減少し、相分離が開始したこ

散乱光強度の低下は温度依存的であり、45 ℃の時に最もとを示している。

速やかな後方散乱光強度の低下が観察された。したがって、以上の検討結果から、スタビリティーテスターによって試料中の油滴の合一挙動を評価できることが示された。

保存温度の上昇に伴って油滴の合一速度が増大している様子が確認された。

Fig. 5 Microscopic images of droplets dispersing in emulsions stored at 35°C for（a）0 min,（b）50 min
and（c）100 min（250× magnification）
．

(a)

-1

45℃
43℃
40℃
38℃
35℃
33℃
30℃

-2
-3
-4
-5
0.01

5

(c)

1

Time (h)Intensity of backscattered light(% change from the initial)

Intensity of backscattered light(% change from the initial)

0

100

(b)

-1
-2
-3
-4
-5

-4

T (℃)

at

30
33
35
38
40
43
45

27.5
5.98
3.69
2.23
1.97
1.5
1

-2

Ln[Time]

45℃
43℃
40℃
38℃
35℃
33℃
30℃

0

Fig. 6 Kinetic analysis of coalescence behavior of the sample
emulsion based on the Arrhenius approach applying TTSP.
（a）% change in baseline of the backscattering profiles of Fig. 4
from the reference level, 0 h, during the accelerated testing at
3
different temperatures ranging from 30 to 45°C. The baseline
value was calculated as the average of the middle part of the2
sample（5–13mm）．The monitoring was continued until a
gradient light intensity in the vertical direction was observed.
1
Each value represents the mean ± S.D.（n=3）．
（b）Superposed data of % change in baseline using the aT at each0temperature. The data were shifted to a best-fit curve at 45°C.
3.10 3.15 3.20 3.25 3.30 3.35 （c）Arrhenius plot of shift factor, aT, obtained from the empiricaltime–temperature superposition.
1000/ T (K-1)

4
Ln[at]

0− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

続いて、Fig. 6 ⒜で得られた油滴の合一挙動について
TTSP による解析を試みた。相分離挙動の場合と同様にた公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に心より感謝
申し上げます。

45 ℃を Tref として選択し、各保存温度における aT を算出した。Fig. 6 ⒝は、45 ℃の回帰曲線と aT を用いて水平移（引用文献）

動した各温度のプロットを示した。33 〜 43 ℃のプロット

1） Aulton, M.E., Taylor, K.M.G., 2013, Aulton’ s Pharmaceutics:

は、45 ℃のマスターカーブによく収束しており、aT の妥

The Design and Manufacture of Medicines, Elsevier,

当性が示された。一方で、30 ℃のプロットは、マスター

Edinburgh.

カーブと若干異なる挙動を示した。これは、測定開始時の2） Onuki, Y., Horita, A., Kuribayashi, H., Okuno, Y.,

後方散乱光強度の低下が比較的緩やかだったため、aT のObata, Y., Takayama, K., 2 0 1 4, Non-destructive

ばらつきが増大したことが原因と考えられる。Fig. 6 ⒞はmonitoring of creaming of oil-in-water emulsion-based

アレニウスプロットおよびその回帰直線を示す。合一挙動

formulations using magnetic resonance imaging, Drug
Dev Ind Pharm, 40, 937‒943.

から作成したアレニウスプロットも 35 ℃付近を境に二相性を示した。この検討によって、本試料の相分離において、

3） Onuki, Y., Kida, C., Funatani, C., Hayashi, Y.,

35 ℃付近を境に油滴の合一挙動が変化したことが明らか

Takayama, K., 2 0 1 6, MRI as a promising tool forとなった。なお、回帰直線の傾きから合一挙動の見かけのevaluation of the stability of cosmetic emulsions, Int J
Cosmet Sci, 38, 272‒278.

活性化エネルギーを算出すると、35 〜 45 ℃では 97 . 9 kJ/
mol、30 〜 35 ℃では 318 kJ/mol であった。この活性化エ

4） Ding, H.-Z., Wang, Z.D., 2 0 0 7, Time–temperature

ネルギーの値は MRI を用いた相分離挙動の解析で得られsuperposition method for predicting the permanence

た値と類似した。このことより、本試料の相分離挙動は、

of paper by extrapolating accelerated ageing data to

試料中の油滴の合一挙動に強く支配されていると結論付け

ambient conditions, Cellulose, 14, 171‒181.
5） Alwis, K.G.N.C., Burgoyne, C.J., 2 0 0 6, Time–

た。

4. 総

temperature superposition to determine the stress-括

rupture of aramid fibres, Appl Compos Mater, 1 3,
249‒264.

本研究では、慢性腎臓病に伴う掻痒症の治療のために院内製剤として用いられるメントール配合ジフェンヒドラ

6） Mochizuki, K., Takayama, K., 2014, Prediction of color

ミンクリームの製剤安定性をより深く理解するため、MRI

changes using the time–temperature superposition

およびスタビリティーテスターなどを活用して相分離挙動

principle in liquid formulations, Chem Pharm Bull, 62,を評価し、さらに TTSP による時系列解析を行った。本研1225‒1230.

究成果によって TTSP による時系列解析がエマルション製

7） Onuki, Y., Machida, Y., Yokawa, T., Seike, C.,剤の製剤安定性を評価する上で非常に有用であることが明Sakurai, S., Takayama, K., 2 0 1 5, Magnetic resonance

らかになった。相分離機構が同じ範囲であれば本手法によimaging study on the physical stability of menthol andってエマルション製剤の相分離挙動を予測することは可能

diphenhydramine cream for the treatment of chronicである。さらに、解析結果から、エマルション製剤の安定

kidney disease-associated pruritus, Chem Pharm Bull,
63, 457‒462.

化機構をより深く議論することもできる。本手法は、エマルションに限らず、様々な製品物性の評価に応用可能であ8） Onuki, Y., Yokokawa, M., Utsumi, S., Obata, Y.,

ると考えられる。そのため、今後、様々な用途でのさらなMachida, Y., Seike, C., Hayashi, Y., Takayama, K., 2016,
Effect of surfactants and thickeners on the stability

る応用が期待される。

of menthol-diphenhydramine cream identified by謝

辞

magnetic resonance imaging, Chem Pharm Bull, 6 4,

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援をいただきまし− 16 −

1616‒1621.

抗菌性と生体適合性を併せ示す生糸織物の開発
東京医科歯科大学生体材料工学研究所

川下将一

Raw silk can be doped with metal element such as Ca and Zn due to high affinity of sericin, outer layer of the raw silk.
Thus, raw silk doped with metal element is expected to show various functions favorable as biomaterials. In this study, weinvestigated to apatite-forming ability in simulated body fluid (SBF) and antibacterial activity against Escherichia coli of
metal-doped raw silk fabric. The samples were prepared by soaking in the aqueous solution containing Ca, Cu or Zn ion.
Cu-doped and Zn-doped raw silk fabric showed antibacterial activity, suggesting antibacterial agents of Cu and Zn released
from the samples killed the bacteria. On the other hand, Ca-doped raw silk fabric showed both apatite-forming ability andantibacterial activity. The apatite formation on fabric is might be because Ca ion released from the sample increased a degreeof supersaturation of SBF to respect with apatite and accelerate the apatite formation. Also, it is considered that release of Ca
ion causes pH increase locally and the bacteria hardly survive at the sample surface. Therefore, Ca-doped, Cu-doped and Zndoped raw silk fabric are useful as antibacterial biomaterials. Further, Ca-doped raw silk fabric has potential to bond to living
bone.

1. 緒

アパタイトのそれらと大きく異なる 10）ため、生体内で優言れた骨結合性を示さない可能性がある。一方、CaO-SiO 2 -

生糸は蚕の繭を構成する天然繊維であり、フィブロイン

P 2 O 5 系ガラスやケイ酸カルシウムで処理したエチレン-ビをセリシンが覆ったタンパク質の 2 層構造を取っている 1）。

ニルアルコール重合体は、材料中から Ca イオンが溶出す

これまで生糸表面のセリシンはアルカリ溶液やセッケン水ることによって、SBF 中でもアパタイトを形成する 11 , 12）。

などにより除去および廃棄されてきたが、セリシンには従って、生糸に Ca イオンを導入できれば、SBF 中におい

3）ても生糸がアパタイトを形成する可能性がある。さらに、胞の接着促進効果 4）などが最近報告されているようになり、

生糸を織物にすれば、生糸中心部のフィブロインが機械的

近年では様々な医用材料への応用が期待されている。また、強度に優れる 1）ことから、高荷重のかかる腱や靭帯などのセリシンに含まれるセリンやアスパラギン酸は側鎖にヒド代替材としての応用を期待できる。

創傷治癒効果2）や抗酸化作用 に加え，ヒト皮膚線維芽細

ロキシ（OH）基あるいはカルボキシル（COOH）基を含むた

一方、近年、人工材料埋入時の手術創部の感染症（SSI：

め、カルシウム（Ca）や亜鉛（Zn）などの金属元素と高い親surgical site infection）が問題となっている。整形外科領和性を示す 5）。従って，生糸表面に金属元素を導入すれば、域においては、脊椎手術では 0 . 6 〜 11 . 9 %、初回人工関節

生糸がバイオマテリアルとして有用な様々な機能を発現す置換術では 0 . 2 ~ 2 . 9 %、人工関節再置換術では 0 . 5 ~ 17 . 3

る可能性がある。

% の SSI 発症が報告されている 13）。一度 SSI を発症してし骨結合性材料は、生体内においてその表面に骨類似アパ
タイトを形成し、それを介して生体骨と結合する

6 , 7）

まうと、埋入した人工材料の再置換が必要となり、患者に。人大きな負担を強いることから、人工材料自体が抗菌効果を工材料のアパタイト形成能を評価する方法として、ヒトの発揮することが望ましい。近年では、抗菌元素として知ら血漿とほぼ等しい無機イオン濃度を有する擬似体液（SBF：れる銀（Ag）や銅（Cu）、Znなどを材料に担持させる方法 14 -16）

simulated body fluid）に試料を浸漬する方法がある 8）。こや、酸化チタン（TiO 2）の光触媒による酸化作用を利用す

れまでに SBF のイオン濃度を 1 . 5 倍にした 1 . 5 SBF 中にる方法 17）が試みられている。後者の方法では光の届かな

おいて、生糸織物表面にアパタイトが形成することが見い生体内における抗菌効果は期待できないが、前者の方法

9）出されている 。しかし、1 . 5 SBF 中で生糸織物表面に形であれば生体内でも抗菌効果を期待できる。そこで本研究成されたアパタイトは、その Ca/P 比や格子定数がヒトのでは、Ca、Cu あるいは Zn を導入した生糸織物の SBF 中におけるアパタイト形成能および大腸菌に対する抗菌性を評価することにより、骨結合性や抗菌性を示す生糸織物をDevelopment of raw silk fabric with
antibacterial activity and biocompatibility
Masakazu Kawashita
Institute of Biomaterials and Bioengineering
Tokyo Medical and Dental University

得る基礎的条件を調べた。

2. 方

法

2 . 1. 試料の作製− 17 −

いずれも特級試薬の塩化カルシウム（CaCl 2）、塩化銅（II）コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

二水和物（CuCl 2 · 2 H 2 O）あるいは塩化亜鉛（ZnCl 2）を蒸留のイオン濃度の変化をICP-AESを用いて測定した。

水に溶解させることにより、1 M の CaCl 2、CuCl 2 あるいは ZnCl 2 水溶液を調製した。1 cm 四方に裁断した市販の生2 . 5 . ハロー法による抗菌試験

糸織物（R-Silk）を各水溶液 30 mL に 36 . 5 ℃で 24 時間浸漬

JIS L 1902：2015 を参考にして、ハロー法によって試料した後、取り出し、蒸留水で洗浄してから室温で自然乾燥の抗菌性を定性的に評価した。蒸留水に肉エキス、ペプト

させた。CaCl 2、CuCl 2 あるいは ZnCl 2 水溶液に浸漬したンおよび塩化ナトリウムを加えてブイヨン培地を作製し試料の名称は、それぞれ R-Ca、R-Cu あるいは R-Zn とした。

た。大腸菌（Escherichia coli）1 コロニー分をブイヨン培地

なお、後述の抗菌試験には、1 . 5 cm 四方の試料に上記処理

20mL に移植後、18 時間一次培養し、さらに菌液 0 . 4 mL をを行ったものを用い、1 cm 四方の試料の場合と単位面積

新しいブイヨン培地 20 mLに移し替え、4 時間二次培養した。

あたりの液量を合わせるため，1 . 5 cm 四方の試料を浸漬す蒸留水で 20 倍に希釈したブイヨン培地を用いて二次培養後る CaCl 2、CuCl 2 あるいは ZnCl 2 水溶液の量は 67 . 5 mL との菌液を 100 倍に希釈し、これを抗菌試験に用いた。調製した。

した菌液 1 mL をペトリディッシュに加え、その上から普通
寒天培地 15 mL を加えてよくかき混ぜた。普通寒天培地上

2 . 2 . 試料表面の形状および元素分析に試料を静置し、36 .5 ℃で 24 時間培養した。培養後、試料

R-Silk および 2 . 1 . で得られた試料の表面を電子走査型顕微鏡（SEM）を用いて観察した。また、5 日間真空凍結乾の周りのハロー（菌の発育阻止帯）の有無を確認し、大腸菌に対する試料の抗菌性を評価した。

燥した R-Silk、R-Ca、R-Cu および R-Zn の表面に存在する元素を X 線光電子分光分析装置（XPS）を用いて調べた。

2 . 6 . 菌液吸収法による抗菌試験

2 . 3 . 試料の溶出試験

料の抗菌性を定量的に評価した。蒸留水に肉エキスおよび

JIS L 1902：2015 を参考にして、菌液吸収法によって試1000 mLの蒸留水に 6. 118g のトリス（ヒドロキシメチル）

ペプトンを加えて、ニュートリエント培地（NB）を作製した。

アミノメタンを溶解させ、そこに水溶液の pH が 7.4 になる

大腸菌 1 コロニー分を 2 . 5 . と同様の方法で NB にて一次培

ように 1 M 塩酸を加え、これをトリス塩酸緩衝液（TBS）と養および二次培養を行った。蒸留水で 20 倍に希釈した NB

した。R-Ca、
R-CuまたはR-Znを 30mLのTBSに 36.5℃で 1、を用いて、二次培養後の菌液を 1000 倍に希釈し、これを抗3 あるいは 7 日間浸漬した。その後、TBS から試料を取り菌試験に用いた。

出し、それぞれの TBS 中における Ca、Cu あるいは Zn イオ

バイアル瓶に入れた 6 検体に、上記で調整した菌液 50µL

ンの濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ICP-AES）をそれぞれ数か所に分けて接種した。3 検体は 36 .5 ℃で 18によって測定した。また、TBS に 7 日間浸漬した試料の表

時間培養、残りの 3 検体はポリソルベート 80 を添加した生面に存在する元素を、XPS を用いて調べ、TBS に 7 日間浸理食塩水を加え 30 回手振りして菌を洗い出した。続いて、漬した試料から溶出したCa、Cu あるいはZnの割合を式（1）洗い出した菌液から 10 倍希釈系列を作製した。それぞれのによって見積もった。

倍率で希釈した菌液 1 mL をペトリディッシュに加え，その（C −C 7）
溶出割合（%）= 0× 100 ……（1）C0

上から混釈平板培養法用寒天培地（EA）を 15 mL加えてよく

C 0：TBS 浸漬前の試料表面の Ca，Cu あるいは Zn の存

トリプトン、D（+）- グルコースおよび寒天を加えることでかき混ぜた。EA は、蒸留水に脱水酵母エキス、カゼイン製作製した。36 .5 ℃で 24 時間培養後、コロニー数を数えた。

在率を炭素
（C）
の存在率で規格化した値。
C 7：TBS 浸漬 7 日後における試料表面の Ca、Cu ある菌液を接種して 18 時間の培養を行った 3 検体について

いは Znの存在率をC の存在率で規格化した値。

も上記と同様の方法で大腸菌のコロニー数を数えた。その後、JIS L1902：2015 に従って、菌増殖値（F）および抗菌活2 . 4 . 擬似体液
（SBF）浸漬試験

性値（A）を算出した。なお，コントロールには 1 .5 cm四方

ISO23317：2014 に 準 拠 し、pH 7 . 4 に 調 製 し た SBF を作製した。R-Ca、R-Cu あるいは R-Zn を 30mL の SBF にの R-Silk を用いた。有意差の評価については、Tukey の方法を使用し、有意水準は 5 % とした。

36. 5 ℃で 3、5 あるいは 7 日間浸漬し、その後、試料を取り

3. 結出し、蒸留水で洗浄した後、室温で自然乾燥させた。SBF
浸漬後の試料の表面構造をSEMおよびX線回折装置（XRD）

果

3 . 1. 試料表面の構造および元素分析を用いて調べた。SBF に 7 日間浸漬した試料については、

Fig. 1 に各試料の SEM 写真を示す。R-Ca および R-Cu

エネルギー分散型 X線分光器（EDX）を用いて表面の元素分の表面形状と R-Silk のそれに差異は見られなかったが、析を行った。また、試料浸漬によるSBFのCaおよびリン（P）

R-Zn の表面には析出物（矢印）が確認された。Table 1 に− 18 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測

Fig. 2 Ca 2p XPS spectrum of R-Ca (a), Cu2p XPS spectrum of R-Cu (b) and
Zn2p XPS spectrum of R-Zn (c).
Fig. 1 SEM photographs of R-Silk,
R-Ca, R-Cu and R-Zn.

Table 1 Surface abundance of elements on samples which
was measured by XPS.

XPS による各試料表面の元素分析の結果を示す。R-Ca、
R-Cu あるいは R-Zn について、それぞれ微量の Ca、Cu あ

Fig. 3 Concentrations of Ca, Cu and Zn released from
R-Ca, R-Cu and R-Zn into TBS, respectively.

るいは Zn が検出された。また、全ての試料において、ケ
イ素（Si）が検出された。
Fig. 2 に R-Ca，R-Cu あ る い は R-Zn の Ca 2 p、Cu 2 p あ る

Table 2 Surface abundance of elements on samples after
soaking in TBS for 7 days which was measured by XPS.

いは Zn 2 pXPS スペクトルを 示 す。R-Ca は、347. 6 および351 . 1 eV付近にCa 2 + に帰属されるCa 2 p ピークを与えた 18 , 19）。
また、R-Cu は、932 . 9、934 . 8 および 944 . 6 eV 付近に Cu+
および Cu 2 + に帰属される Cu 2 p ピークを与えた 19）。さらに，
R-Zn は、1022 . 0 eV 付近に酸化亜鉛（ZnO）および／あるいは水酸化亜鉛（Zn（OH）2）に帰属される Zn 2 p ピークを与えた 19 , 20）。

3 . 3 . 試料のアパタイト形成能3 . 2 . 試料の金属イオン溶出特性

Fig. 4 に、SBF 浸漬後の R-Ca、R-Cu あるいは R-Zn のFig. 3 に種々の期間 TBS に浸漬した各試料から溶出した

SEM 写真を示す。R-Ca では、SBF 浸漬後 3 日後にその表

Ca、Cu あるいは Zn イオンの濃度を示す。R-Ca、R-Cu あ

面に析出物（矢印）が観察され、浸漬後 5 日後から 7 日後にるいは R-Zn を浸漬した TBS において、それぞれ Ca、Cu

かけて R-Ca の表面全体が析出物によって覆われた。R-Cu

あるいは Zn イオンの濃度が上昇した。また、いずれの金では、SBF 浸漬前後においてその表面構造に変化は見ら属イオンの場合も、TBS 浸漬 1 日後と浸漬 7 日後でその濃れなかった。R-Zn では、SBF 浸漬前から表面に見られた度はほぼ同じであった。Table 2 に TBS に 7 日間浸漬した析出物（Fig. 1）が浸漬後 7 日後にも残存していた。

各試料の表面の XPS による元素分析の結果を示す。Table

Fig. 5 に、SBF 浸漬後の R-Ca、R-Cu あるいは R-Zn の1、2 および式（1）から、R-Ca 中の Ca は 73 . 3 %、R-Cu 中

XRD パターンを示す。SBF に 5 あるいは 7 日間浸漬したの Cu は 33 . 2 %、R-Zn 中の Zn は 35 . 7 % 程度、TBS 中に

R-Ca では、水酸アパタイト（HAp、Ca 10（PO 4）6（OH）に2）溶出したと見積もられた。

帰属される回折ピークが観察された 9 , 21）。一方、R-Cu お
よび R-Zn では、SBF 浸漬後 7 日までの間に XRD パター− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 7 EDX spectra of R-Ca, R-Cu and R-Zn after soaking in SBF for 7
days.

Fig. 4 SEM images of R-Ca, R-Cu and R-Zn after
soaking in SBF for various periods. Arrows indicate
precipitates.

Fig. 5 XRD patterns of R-Ca, R-Cu and R-Zn after soaking
in SBF for various periods.

Fig. 8 Results of qualitative antibacterial tests for R-Ca,
R-Cu and R-Zn before and after culture.

オンの濃度低下は見られなかった。また、R-Zn を浸漬した SBF においても Ca および P イオン濃度の顕著な低下は確認されなかった。
Fig. 7 に，SBF 浸漬 7 日後の各試料の EDX スペクトルを示す。R-Ca では、Ca と P の EDX ピークが見られたが、Fig. 6 Change in calcium and phosphorus concentration of
SBF after soaking R-Ca, R-Cu and R-Zn for various
periods.

R-Zn では、それらのピークは確認されず、Zn の EDX ピ
ークがわずかに見られた。また、R-Cu においては、Cu の
EDX ピークがほとんど見られなかった。

3 . 4 . 試料のアパタイト形成能

ンに変化は見られなかった。
Fig. 6 に、試料浸漬による SBF の Ca および P 濃度の変Fig. 8 に、ハロー法による抗菌試験の結果を示す。培養化を示す。R-Ca の浸漬によって SBF 中の Ca および P イオ

24 時間後において、R-Cu および R-Zn ではハロー（矢印）

ンの濃度が顕著に低下したが、R-Cu では、Ca および P イが見られた。従って、これらの試料は大腸菌に対して抗菌− 20 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測

Viable bacteria count / CFU

108

**

**

**

**

Table 3 Growth value (F) and antibacterial activity value (A)for R-Ca, R-Cu and R-Zn. R-Silk was used as control.

: Before culture: After culture

106

104
配位すると考えられる。従って、R-Ca 中の Ca は主にアスパラギン酸の側鎖に担持されている可能性が高い。また、

102

R-Cu 中の Cu はとして存在していると考えられる。Cu 2 +の一部が Cu+ に還元された理由については不明だが、これらイオンは Ca と同様に、主にアスパラギン酸の側鎖に担

1R-Silk(cont.)

R-Ca

R-Cu

持されていると推察される。さらに、R-Zn 表面の析出物

R-Zn（Fig. 1）は、ZnO および／あるいは Zn（OH）
2 と考えられる。

Fig. 9 Results of quantitative antibacterial tests for R-Ca,
R-Cu and R-Zn.（**P < 0.01）

4 . 2 . 試料の金属イオン溶出特性
Fig. 3 に 示 す よ う に、R-Ca、R-Cu あ る い は R-Zn のTBS への浸漬によって、TBS の Ca、Cu あるいは Zn イオ

性を示すことが分かる。Fig. 9 に、菌液吸収法による抗菌

ンの濃度が上昇したことから、それぞれの試料に導入した試験の結果を示す。コントロールとして用いた R-Silk で金属イオンが TBS 中へ溶出したことが分かる。また、いは、培養前後で大腸菌が有意に増殖したが、R-Ca、R-Cu

ずれの金属イオンの場合も、TBS 浸漬 1 日後の濃度と浸および R-Zn においては、培養前後で大腸菌の生菌数が減

漬 7 日後のそれがほぼ同じであったことから、各試料から少した。さらに、各試料間の培養後の生菌数を比較するの金属イオンの溶出は TBS 浸漬 1 日以内に終わると考えと、R-Ca，R-Cu お よ び R-Zn の 生 菌 数 は R-Silk の そ れられる。

よりも有意に小さかった。Fig. 9 の結果から菌増殖値（F）と抗菌活性値（A）を算出した結果を Table 3 に示す。JIS

4 . 3 . 試料のアパタイト形成能

1902 : 2015 では、2 . 0 ≦ A ＜ 3 . 0 となる試料に抗菌効果がFig. 4 および 5 より、R-Ca は SBF 中においてアパタイ認められ、A ≧ 3 . 0 となる試料には強い抗菌効果が認め

ト形成能を示すが、R-Cu および R-Zn はアパタイト形成られると定義されていることから、R-Ca，R-Cu および能を示さないことが明らかとなった。Fig. 6 に示すよう

R-Zn は、大腸菌に対して強い抗菌性を示すことが分かった。

に、R-Ca の浸漬によって SBF 中の Ca および P イオンの4. 考

濃度が顕著に低下したことから、Ca や P イオンが R-Ca の察

表面に取り込まれ、アパタイトが形成されたと考えられる。

4 . 1. 試料表面の構造および元素分析

なお、Ca および P イオンの濃度低下が R-Ca の浸漬 3 日後

R-Ca、R-Cu あるいは R-Zn の表面にそれぞれ微量の Ca、にすでに生じていたことから、SBF 浸漬 3 日後に R-Ca 表

Cu あるいは Zn が検出された（Table 1）ことから、CaCl 2、面に見られた析出物（Fig. 4）は低結晶性のリン酸カルシウ

CuCl 2 あるいは ZnCl 2 水溶液浸漬によって R-Silk に Ca、ムであると考えられる。R-Cu を浸漬した場合は、Ca お

Cu あるいは Zn を導入できたことが分かる。また、全てのよび P イオンの濃度低下は見られなかった（Fig. 6）ことか

試料において検出された Si は、生糸織物にわずかに含ま

ら、R-Cu においては、Ca や P イオンが表面に取り込まれず、れる無機物に由来すると考えられる 22）。

従ってアパタイトが形成されなかったと考えられる。なお、

2+

Fig. 2 より、R-Ca 中の Ca は Ca として存在していると

SBF 浸漬後の R-Cu の EDX スペクトル（Fig. 7 ⒝）に Cu の考えられる。セリシンの OH 基あるいは COOH 基は Ca とEDX ピークがほとんど見られなかったことから、R-Cu

キレート結合を作ると考えられている 5）が、セリシンの等に導入された Cu は 7 日間の SBF 浸漬によってほとんど溶

電点が 4 . 3 程度である

23）

ことから、COOH は CaCl 2 水溶液-

2+中において電離して COO となっており，そこに Ca が出したと考えられる。R-Zn を浸漬した場合でも Ca および P イオン濃度の顕著な低下は確認されなかったことから、− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

SBF 浸漬後の R-Zn 表面に見られた析出物（Fig. 4）は、SBF長における最適な pH は 6 ~ 8 であることから 28）、培地を浸漬後にも残存した ZnO および／あるいは Zn
（OH）
2 と考え

アルカリ化することによって菌を死滅し得る 29）。

られる。このことは、SBF 浸漬後の R-Zn の EDX スペク

5. 総

トルにおいて、Zn の EDX ピークが僅かに見られた（Fig. 7⒞）ことからも示唆される。

括

本研究では、Ca、Cu あるいは Zn イオンを導入した生糸以上より，R-Ca においては，CaCl 2 水溶液処理によっ

織物の SBF 中におけるアパタイト形成能および大腸菌にて導入された Ca イオンが TBS 中（Fig. 3）と同様に SBF 中

対する抗菌性を調べた。Ca イオンを導入した生糸織物をに溶出することで SBF に対するアパタイトの過飽和度をSBF に浸漬すると、同織物はその表面にアパタイトを形上昇させたため、Ca イオンが試料表面に取り込まれ、ア成した。これは、同織物からの Ca イオンの溶出によって、パタイトが形成したと考えられる 11 , 12）。一方、R-Cu や

アパタイトに対する SBF の過飽和度を上昇させたためと

R-Zn においては、Cu または Zn イオンが TBS 中（Fig. 3）

考えられる。また、Ca、Cu あるいは Zn イオンを導入したと同様に SBF 中に溶出したと推測されるが、それにも関

生糸織物は、大腸菌に対して強い抗菌性を示した。Ca 導

わらず試料表面に Ca イオンは取り込まれず、アパタイト

入試料においては Ca イオンの溶出に伴って試料表面付近は形成しなかったと考えられる。これは、Cu または Zn イの pH が上昇したことによって、Cu 導入試料においては抗オンの溶出に伴って SBF 中の Ca イオンとのイオン交換が菌元素である Cu イオンが溶出したことによって、また Zn生じているとしても、SBF 中には Ca イオン以外にもヒド導入試料においては、Zn イオンの溶出と活性酸素の生成

ロニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マによって抗菌性が発現したと考えられる。

8）

グネシウムイオンなどが存在しており 、これらイオンがCa イオンの試料表面への選択的導入を阻害した可能性が（引用文献）
1） G. H. Altman, F. Diaz, C. Jakuba, T. Calabro, R. L.

ある。

Horan, J. Chen, H. Lu, J. Richmond, D. L. Kaplan, Silk-

4 . 4 . 試料の抗菌性

based biomaterials, Biomaterials, 24（2003）401-416.

Fig. 8 に示すように、ハローが形成された R-Cu および

2） P. Aramwit, A. Sangcakul, The effects of sericin

R-Zn においては、試料から抗菌元素である Cu イオンまたcream on wound healing in rats, Biosci. Biotechnol.

は Zn イオンが溶出したことにより、抗菌性が発現したとBiochem., 71（2007）2473-2477.

14）。これらの抗菌メカニズムを既往の研究か

3） N. Kato, S. Sato, A. Yamanaka, H. Yamada, N.

ら推察すると、R-Cu については、溶出した Cu イオンがFuwa, M. Nomura, Silk protein, sericin, inhibits lipid

タンパク質の変性や酵素機能の阻害を引き起こし，細菌のperoxidation and tyrosinase activity, Biosci. Biotechnol.

考えられる増殖を抑制した可能性がある

Biochem., 62（1998）145-147.

24 , 25）。また、
R-Zn については、Zn イオンの溶出によって、能動輸送の阻害やアミノ酸の4） K. Tsubouchi, Y. Igarashi, Y. Takasu, H. Yamada,

代謝機構および酵素機能の阻害などが生じた可能性があSericin enhances attachment of cultured human skinるfibroblasts, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69（2005）403-

26）。さらに、R-Zn では、溶出した Zn イオンだけでな

405.

く、表面に形成された亜鉛の化合物も抗菌性に寄与していると考えられる。ZnO は暗所においても活性酸素を生成

5） M. Sasaki, H. Yamada, N. Kato, Consumption of silk

し 27）、細菌の細胞壁を破壊する。従って、R-Zn 表面の形

protein, sericin elevates intestinal absorption of zinc,

成物に ZnO が含まれているとすれば、ZnO が抗菌性に寄

iron, magnesium and calcium in rats, Nutr. Res., 2 0

与した可能性がある。一般に活性酸素は飛程距離が短く不（2000）1505-1511.

安定であるが、ZnO が寒天培地中に拡散することによって、

6） M. Neo, S. Kotani, T. Nakamura, T. Yamamuro, C.

試料から離れた細菌に対しても抗菌効果を示したと考えら

Ohtsuki, T. Kokubo, Y. Bando, A comparative study

れる。これは、ZnO が水に不溶であることや、R-Zn 周囲

of ultrastructures of the interfaces between four kindsに生じたハローが白く濁っていた（Fig. 8）ことからも示唆

of surface-active ceramic and bone, J. Biomed. Mater.

される。また、R-Ca については、ハロー法では抗菌性をRes., 26（1992）1419-1432.

示さなかったが菌液吸収法（Fig. 9）では強い抗菌性を示し

7） L. L. Hench:, Bioceramics, J. Am. Ceram. Soc., 8 1

た。これは、R-Ca に担持された Ca イオンが培地中に溶出（1998）1705-1728.

することで、R-Ca のごく表面に存在する H+ がイオン交換

8） T. Kokubo, H. Takadama, How useful is SBF in

によって試料中に取り込まれ、試料表面付近の pH が上昇

predicting in vivo bone bioactivity? Biomaterials, 2 7したためと考えられる。既往の研究によれば、大腸菌の成（2006）2907-2915.

− 22 −MRI と時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測

9） A. Takeuchi, C. Ohtsuki, T. Miyazaki, H. Tanaka, M.

19）J. F. Moulder, W. F. Stickle, P. E. Sobol, K. D.

Yamazaki, M. Tanihara, Deposition of bone-like apatite

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20）J. Duchoslav, R. Steinberger, M. Arndt, D. Stifter,

fluid, J. Biomed. Mater. Res. A, 65（2003）283-289.
10）H. M. Kim, K. Kishimoto, F. Miyaji, T. Kokubo, T.

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product of zinc: rapid X-ray induced conversion intoand structure of the apatite formed on PET substrates

zinc oxide, Corros. Sci., 82（2014）356 - 361 .

in SBF modified with various ionic activity products, J.

21）A. Takeuchi, C. Ohtsuki, T. Miyazaki, M. Kamitakahara,
S. Ogata, M. Yamazaki, Y. Furutani, H. Kinoshita, M.

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simulated body fluid, J. Non-Cryst. Solids, 143（1992）22）M. Mondal, K. Trivedy, S. N. Kumar, The silk

84 - 92 .
12）A. Oyane, M. Kawashita, K. Nakanishi, T. Kokubo,proteins, sericin and fibroin in silkworm, Bombyx mori

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modified with silane coupling agent and calcium
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24）R. B. Thurman, C. P. Gerba, G. Bitton, The molecular13）K. Matsushita, S. Abe, T. Ishi, S. Kajiyama, A.

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Review on zinc oxide nanoparticles: antibacterial

Mater. Med., 9（1998）129 - 134 .

activity and toxicity mechanism, Nano-Micro Lett., 7

+

2+

2+

16）C. Prinz, M. Elhensheri, J. Rychly, H. G. Neumann,（2015）219 - 242 .

Antimicrobial and bone-forming activity of a copper27）K. Hirota, M. Sugimoto, M. Kato, K. Tsukagoshi,

coated implant in a rabbit model, J. Biomater. Appl., 32

T. Tanigawa, H. Sugimoto, Preparation of zinc oxide（2017）139 - 149 .

ceramics with a sustainable antibacterial activity17）K. Gupta, R. P. Singh, A. Pandey, A. Pandey,

under dark conditions, Ceram. Int., 36（2010）497 - 506 .

Photocatalytic antibacterial performance of TiO 2 and28）E . P a d a n , D . Z i l b e r s t e i n , S . S c h u l d i n e r , p H

Ag-doped TiO 2 against S. aureus. P. aeruginosa andhomesstasis in bacteria, Biochim. Biophys. Acta, 6 5 0

E. coli, Beilstein J. Nanotech., 4（2013）345 - 351 .

（1981）151 - 166 .

18）W. Gu, D. W. Bousfield, C. P. Tripp, Formation of29）J . F . S i q u e i r a , H . P . L o p e s , M e c h a n i s m s o fcalcium carbonate particles by direct contact of Ca

antimicrobial activity of calcium hydroxide: a critical（OH）2 powders with supercritical CO 2 , J. Mater.

review, Int. Endod. J., 32（1999）361 - 369 .

Chem., 16（2006）3312 - 3317 .

− 23 −

化粧品の評価・開発に資する微小な力を検知する水溶性の分子集合体の開発
北海道大学電子科学研究所

相良剛光

Molecular assembled materials that change emission properties in response to tiny mechanical forces are valuable todevelop various cosmetic products. In this study, we developed a green-emissive, one-dimensional supramolecular fiber
consisting of fluorescence dumbbell-shaped amphiphile 1 having 9 , 10 -bis(phenylethynyl)anthracene as the emission core.
Mechanical grinding leads to emission color change from green to yellow on glass substrates under ambient condition. The
emission spectrum shows a further red-shift when the ground sample was exposed to water vapor. Interestingly, the green
fluorescence recovers after exposure to methanol vapor. Emission lifetime measurements and steady-state spectroscopic
measurements reveal that the observed color change from green to yellow is ascribed to mechanical stimuli-induced
excimer formation between the fluorescent cores. Infrared spectroscopic measurements clarified the amide groups are
involved in hydrogen bonding and closer inspection revealed that a peak corresponding to C=O stretching becomes broad
after mechanical grinding, which suggested that a linear hydrogen-bonds become disordered ones upon grinding. Onedimensional linear supramolecular fibers with width of ca. 5 nm were observed in transmission electron microscope images
for the initial samples, while micellar structures were found to attach the both edges of short fibrous structures for groundsamples. These results indicated that mechanical stimuli cut the supramolecular fiber and the micellar molecular assemblies
form at the cut positions. The emission cores never form excimer in the initial fibers. In contrast, excimer should form in
the mechanical stimuli-induced micellar molecular assemblies. Because the green-emissive fibers do not dissolve in water,
we searched suitable amphiphilic molecular structures. Though we were not able to find the best amphiphiles, correlation
between the dendritic structures and the molecular assembled structures in water have been partially clarified.

1. 緒

ある。

言

我々はこれまでに、約 15 ～ 20 個の両親媒性分子で構成

化粧品は成熟した人類社会ではなくてはならないものでされる水溶性の繭状分子集合体を設計・開発し、水中でそあり、化粧品市場がさらに拡大することが容易に想像できの繭状分子集合体が機械的刺激を受けて内部の蛍光部位のる。市場の拡大と共に化粧品に求められるのは、より安全

集積構造が変化し、蛍光スペクトルが短波長シフトするこで、高機能な化粧品であることは言うまでもない。そのよとを見出している 3）。この繭状分子集合体は市販のリンカ

うな最先端の化粧品開発において重要であるのは、その機ー化合物を用いることで、表面にアミノ基を持つガラスや能評価である。化粧品を肌に塗布する際には機械的刺激がポリマー材料、さらには生細胞に共有結合を介して導入す発生しているが、印加される機械的刺激を細胞レベルで評ることができ、十分な力がガラスやポリマー材料に印加さ価することは極めて難しい。

れると繭状分子集合体の発光色が変化することが確認でき

本研究では、きわめて小さい力を鋭敏に検出できる親水た。しかし、この繭状分子集合体が機械的刺激に応答して性かつ蛍光性の分子集合体を開発することを目指している。

示す蛍光スペクトル変化は非常に小さく、そのため生細胞

近年、機械的な刺激により蛍光色が変化する有機分子集合にかかる力を正確に評価できなかった。

1）体の報告例が、我々の報告に端を発し 、世界的に増えてそこで本研究課題では、先行研究の結果を踏まえ、よりいる 2）。観察される蛍光色変化は、機械的な刺激により蛍

大きな蛍光色変化を示し、生細胞に作用する機械的刺激を

光団の共有結合が切断されることが原因ではなく、材料内鋭敏に検出することができる水溶性の分子集合体を創製すの蛍光団の集積構造が変化することで達成されている。こることを目指した。

のような材料は、比較的大きな力を必要とする共有結合の2. 方切断を伴わずに蛍光色変化を達成できるため、皮膚に印加される微小な力を評価・可視化する際には、とても有望で

法

2 . 1. 両親媒性分子１の合成
先行研究 3）において開発した両親媒性分子は、1 , 6 -bis

Development of water-soluble molecularassemblies that detect tiny mechanicalforces to evaluate and prepare cosmetic
products
Yoshimitsu Sagara
Resea rch I nst itute for Elect ron ic
Science, Hokkaido University（phenylethynyl）pyrene を発光部位として持ち、水溶性のデンドロン構造がアミド基を介して二つ導入された分子構造となっている。そこで、本研究では発光部位を 9 , 10 bis（phenylethynyl）anthracene 骨格に変更し、先行研究と同じデンドロンを蛍光団の長軸方向ではなく、60 °ねじれた位置に導入した新規の両親媒性分子１を設計・合成し− 24 −

化粧品の評価・開発に資する微小な力を検知する水溶性の分子集合体の開発

図1

新しく合成した両親媒性分子 1 の分子骨格た（図 1）。

2 . 2 . 両親媒性分子１の機械的刺激に対する応答性評
価
新しく設計・合成した両親媒性化合物 1 が示す刺激応答
発光特性をバルクの状態で調べた。図 2 に外部刺激に応答
して 1 の発光色が変化する様子を示す。
化合物 1 は 365 nm の励起光照射下、初期状態では緑色の発光を示す。これをスパチュラなどでこすると発光色が黄色に変化する。この発光色変化は、先行研究の繭状分子集合体が示した応答特性とは全く異なり、長波長側にシフ

図 2 化合物 1 が固相で示す、外部刺激に応答して発光色が変化する様子トしていることがわかった（先行研究では短波長シフト）。
さらに黄色に変化した発光色は、水蒸気に曝露することで発光色が橙色まで変化する。また、面白いことに、その後メタノールの蒸気にさらすと元の緑色の発光色が回復する。
一方で、初期状態のサンプルを機械的刺激を印加せずに水蒸気にさらしても発光色変化は観察されない。橙色の発光色を得るには最初に機械的刺激を印加することが必要要件となることがわかった。
次に、固相での発光スペクトル測定を行った（図 3）。機械的刺激を印加する前は 537 nm にピークを持つスペクトルが観察される。一方で、機械的刺激を印加すると、発光スペクトルは大きく長波長シフトし、そのスペクトルの形
状はブロードとなった。これは機械的刺激を印加されて、発光部位がエキシマーを形成できるようになったことを示唆している。さらに水蒸気にさらすと、蛍光スペクトルがより長波長側にシフトすることがわかった。一方でメタノ− 25 −

図3

化合物 1 の固相での発光スペクトル変化

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

ール蒸気にさらした後は蛍光スペクトルが大きく短波長シ
フトし、機械的刺激を印加する前のスペクトルと同じ波長領域に観察されるようになった。
機械的刺激を印加したのちに得られる発光色が発光部位のエキシマー形成に起因しているかどうかを確かめるため、蛍光寿命測定を行った。溶液及び固相で機械的刺激を印加する前後の減衰曲線を図４に示す。クロロホルムとメタノールの混合溶媒（混合比 1：1）中では 2 . 9 ns の単一成分が観察される（黒線）。一方で固相での減衰曲線は溶液の減衰曲線とは大きく異なっており、それぞれ triexponential
decay function でのフィッティングを行った。機械的刺激を印加する前（緑線）では 0 . 8，2 . 9，9 . 3 ns の成分が観察され、機械的刺激を印加したのちは（黄線）、1 . 2，6 . 0，23 ns

図4

蛍光減衰曲線の寿命成分が観察される結果となった。機械的刺激を印加した後の 23 ns の成分が発光部位のエキシマーに対応していると考えられる。以上より、機械的刺激を印加した際に、発光部位がエキシマーを形成できる相関配置となった結果、発光色が緑から黄色に変化したのだと結論付けた。
さらに、化合物 1 が形成する分子集合構造中でアミド基が水素結合を形成しているかを明らかにするために、IR測定を行った。結果を図 5 に示す。固相で機械的刺激を印加する前後で 1650 cm- 1 付近にアミド基の C=O 伸縮振動に対応するピークが観察され、固相ではアミド基間で水素結合が形成されていることがわかった。しかし、そのピークの形状は機械的刺激を印加する前後で大きく異なっている。
印加前はシャープなピークが観察されるのに対して、印加
後はピークがブロードニングすることがわかった。これは、機械的刺激を印加する前はリニアな水素結合が形成されていたが、機械的刺激を印加されることにより、ある程度乱図5

機械的刺激印加前後の IR スペクトルれた水素結合モードに変化したことを意味している。
化合物 1 がどのような分子集合構造を形成しているかを明らかにするために、透過型電子顕微鏡観察を行った。得られた像を図 6 に示す。均一な太さを持つファイバー状の分子集合体が観察され、このファイバーの幅はおよそ5 nm であり、これは化合物 1 の分子長とほぼ同じ大きさであった。すなわち化合物 1 は機械的刺激を印加する前は隣接する分子のアミド基間でリニアな水素結合を形成し、超分子ファイバーを形成することがわかった。さらに面白いことに、機械的刺激を印加したサンプルでは、ファイバーが切断されている箇所が著しく増加しており、切断箇所に繭状の分子集合体が形成されていることがわかった。この繭状の分子集合体は先行研究で観察されたミセル状の分子集合体とよく似ていた。先行研究では、ミセル内でエキシマーが形成されていたため、化合物 1 が切断箇所で形成する繭状の分子集合構造内でも発光部位がエキシマーを形成していると考えられる。
以上の実験事実より、機械的刺激により発光色が変化− 26 −

図6

透過型電子顕微鏡での観察結果

化粧品の評価・開発に資する微小な力を検知する水溶性の分子集合体の開発するメカニズムは次のように考えられる。化合物 1 は最初、ての分子をエキシマー形成できる相関配置に変換しなくと一次元の超分子ファイバーを形成し、そのファイバー内でも、全体としての発光色変化が達成される。つまり、化合

発光部位は規則正しく並び、エキシマーは形成されず緑色

物 1 では機械的刺激に対する蛍光特性変化が増幅されるのの発光色が観察される。しかし、いったん機械的刺激が印である。スペクトル変化の大きさも、化合物 1 の方が先行加されると、ファイバーが切断されると同時に切断箇所で研究のシフト幅と比較して大きいことと併せて、1 が形成分子の再配列が起き、発光部位がエキシマーを形成できる

した緑色蛍光超分子ファイバーは、水には不溶ではあるが、相関配置となることで発光色が緑から黄色に変化したと考

機械的刺激のセンシング材料として非常に有望である。
次に、初期状態での緑色蛍光超分子ファイバーに水溶性えられる。

を付与することを目的とし、分子骨格の探索を行った。デ

2 . 3 . 構造を変えた両親媒性分子の探索

ンドロンの導入位置が重要ではないか考え、デンドロンを両親媒性分子 1 は先行研究の繭状分子集合体とは異なり、導入する位置は化合物 1 と同じとし、デンドロン構造の異一次元の超分子ファイバーを形成し、切断されることによなる分子 3 - 5 を合成したが、残念ながら緑色の発光を示

り発光色変化が達成される全く新しい特性を示す分子とな

す超分子ファイバーの形成は確認できず、おそらく先行研った。しかし、初期状態では水には不溶となってしまった。

究と同様に繭状の分子集合体を形成していることが考えそこで、次に化合物 1 が示す、
「機械的刺激を受けて蛍光スられる。以上の知見から 1 のデンドロンの枝分かれ構造が、ペクトルが長波長シフトする」という特性を維持したまま、緑色の蛍光色を示す超分子ファイバーの形成に重要な役割

水溶性を付与することを試みた。まず、化合物 1 に導入しを担っていると考えられる。今後は、1 の分子骨格を大きた水溶性デンドロンの世代を 1 世代増やした化合物 2 の合く変更せずに、形成される超分子ファイバーに水溶性の付成を試みたが、水酸基を保護した状態のデンドロン骨格が与を目指したい。

かさ高過ぎたため、9, 10- ジブロモアントラセンとアセチ

4. 総

レン基を持つデンドロン構造との間の薗頭反応がうまく進括

行せず、目的化合物を得ることはできなかった。そこで脂本研究では、きわめて小さい機械的刺激を検知して蛍光

溶性骨格の構造やデンドロンの世代を変更した化合物 3 ～色が変化する親水性の分子集合体の開発を目指した。もし5（図 7）を設計・合成した。しかし、いずれの化合物も化

鋭敏に力を検出し、大きな発光色変化を誘起できる材料が合物 1 が初期状態で形成する緑色発光を示す超分子ファイできれば、化粧品を肌に直接塗布する際に発生するきわめ

バーを形成せずに、黄色の発光を示す水溶性の分子集合体て小さい機械的刺激を、細胞レベル、さらには分子レベル

を初期状態から形成してしまうことがわかった。

で可視化・評価することができるようになるのではないか

3. 考と考えている。これまでに多数の機械的刺激応答性蛍光材

察料が開発されているが、それらは疎水性の高い材料であり、両親媒性分子 1 では先行研究の分子とは異なり、初期状

生体に応用することはできない。また、限られた分子数で態で緑色の蛍光色を示す超分子ファイバーを形成した。先ユニット化されていないため、蛍光色変化を誘起するため

行研究の分子から、水溶性デンドロンの導入位置を変更し、に必要な力が大きかった。本研究で目指している、きわ

蛍光団を変更しただけであるが、その刺激応答発光特性はめて鋭敏な機械的刺激応答性蛍光材料は、これらの課題を大きく変化した。先行研究では、分子が 15 〜 20 個程度集

すべて解決することになり、化粧品を肌に塗布する際に重まり、発光部位がスタックすることでエキシマーを形成し、要な因子となっている機械的刺激の影響を製品開発の段階

黄色の発光色が観察されていた。機械的刺激が印加されるで定量的に評価できるようになることが期待できる。最近と、発光団がエキシマー形成できない相関配置に置かれ、我々のグループが報告したロタキサン型超分子メカノフォ

発光色が緑色となる。ここで重要な点は、先行研究では発ア 4）などと併せて、個々の細胞が生み出す力や印加される

光色変化を誘起するために、繭状分子集合体を形成するす力を定量的に評価できるようになれば、化粧品を肌に塗布べての分子でエキシマー形成を阻害する必要があるといする際に起きる細胞内の様々な機械的刺激によるシグナル

うことである。少しでもエキシマーサイトが残っていると、伝達を解明することができるようになり、それらの知見は、そこにエネルギー移動が起きてしまい、分子集合体からのより安全・高品質な化粧品の開発に生かされることになる。

発光色に変化は観察されない。一方で化合物 1 では、機械本研究では研究実施期間中に、先行研究の発光特性変化

的刺激を受けて発光部位がエキシマーを形成していない相より、大幅に機械的刺激に対する応答性が改善された 1 次関配置から、エキシマー形成できる相関配置に変化する。

元超分子ファイバーを形成できる化合物 1 の特性評価を行

ファイバーが少しでも切断されれば、付近のエキシマーをい、そのメカニズムが解明された。残念ながら水溶性の形成していないサイトからのエネルギー移動が起き、すべ

1 次元超分子ファイバーを形成することができる化合物の− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図7

新しく設計・合成した両親媒性化物３- ５の分子骨格− 28 −

化粧品の評価・開発に資する微小な力を検知する水溶性の分子集合体の開発

発見には至らなかったが、デンドロン構造と分子が最初に（引用文献）

形成する集合体の発光特性との相関に関する知見を多く得

1） Y. Sagara, T. Mutai, I. Yoshikawa, K. Araki, J. Am.

ることができた。引き続き、機械的刺激を受けて切断され、Chem. Soc., 129, 1520-1521（2007）; Y. Sagara, T. Kato,

発光色変化が達成されるような超分子ファイバーの創製に

Angew. Chem. Int. Ed., 47, 5175-5178（2008）．

取り組む予定である。

2） Y. Sagara, T. Kato, Nat. Chem., 1, 605-610（2009）; Y.

最後に、本研究はコスメトロジー研究振興財団の助成金

Sagara, S. Yamane, M. Mitani, C. Weder, T. Kato, Adv.

によって、はじめて推進することができました。私の研究
課題を採択して頂いた財団の方々、選考委員の先生方に厚Mater., 28, 1073-1095（2016）．
3） Y. Sagara, T. Komatsu, T. Ueno, K. Hanaoka, T. Kato,

く御礼申し上げます。

T. Nagano, J. Am. Chem. Soc., 136, 4273-4280（2014）．
4） Y. Sagara, M. Karman, E. Verde-Sesto, K. Matsuo, Y.
Kim, N. Tamaoki, C. Weder, J. Am. Chem. Soc., 140,
1584-1587（2018）．

− 29 −

抗酸化物質から成る Cubosome の開発
およびミクロ・メソ・マクロ特性の評価
大阪大学大学院基礎工学研究科物質創成専攻化学工学領域

菅恵嗣

Cubosomal self-assemblies, composed of monoolein (MO) and fatty acid, were prepared by the pH titration method. The
assemblies including 25 – 50 mol% of MO showed gel-like high viscosity at pH 5 . 0 . Various kind of self-assemblies weresystematically characterized by Raman spectroscopy and fluorescent probe analyses. The membrane property of cubosomal
assembly was highly packed and less hydrated state. As application, cubosomal self-assembly could be prepared using
functional lipids, e.g. linoleic acid (anti-oxidant), polymerizable lipid (precursor of polydiacethlene).

1. 緒

言

2. 方

脂肪酸は、生体内で脂肪組織を形成し栄養源として活用

法

2 . 1. Cubosome 調製されている。また、脂肪酸の両親媒性構造は、脂質膜の骨超純水にオレイン酸（OA）、リノール酸（LiA）、重合成

格を形成するのに適しており、生体膜や始原細胞系をモ

脂肪酸（10 , 12 -Tricosadiynoicacid（TCDA））およびモノオ

デル化するための研究として注目されている 1）。一般的にレイン（MO）を添加し（総脂質濃度：100 mM、OA/MO=は、オレイン酸のような脂肪酸は水にとけないが、pH 滴（1 / 1））、40 ℃で 24 時間攪拌した。1 M NaOH で鹸化した後、定等の所定の手順によって分子集合体を形成し水中に分散

HCl を用いて pH を調整した。

2）可能となる 。このような脂質分子集合体は、薬剤分子や栄養素の輸送担体としての活用が期待されている 3）。目的

2 . 2 . 脂質膜パッキング密度の解析

物質が水溶性分子の場合、ベシクル（あるいはリポソーム）

共焦点ラマン顕微鏡を用いて、各 pH における脂質分子をキャリアとして活用できるが、脂溶性分子の輸送におい集合体のラマンスペクトルを測定した。CH 2 対称伸縮振動ては、疎水場体積に限りがあり、担持できる物質の容量にに由来するピーク（2850 cm- 1）および CH 2 非対称伸縮振動限界がある。ベシクル同様に 2 分子膜構造を有し、かつ膨に由来するピーク（2890 cm- 1）を測定し、脂質分子のパッ

大な疎水場を形成する自己組織系として、共連続相を有す

キング密度 R（=I 2890 /I 2850）7）を解析した。

る Cubic 相が報告されており、物質輸送や物質分離への応用が期待されている 4, 5）。一方、Cubic相やCubosomeの「膜」

2 . 3 . 膜界面の極性環境解析に着目した研究例は少なく、物理化学的な膜特性に関する

蛍光プローブ Laurdan は周囲の水分子との相互作用により蛍光特性が変化する 8）。10 µL の脂質分子集合体（総知見は乏しい。
本研究では、脂肪酸を基本骨格とする膜材料の開発を目

脂質濃度 100 mM）を純水で希釈し、10 µL の Laurdan 溶液

的とし、Cubosome の調製手法ならびに評価手法の開発を（1 mM（inEtOH））を 1 mL のサンプルに添加した。暗所で行った。不飽和脂肪酸であるオレイン酸やリノール酸は、

5 分間静置した後、励起波長は λex= 340 nm、400 - 600 nm

分子自体が酸化されやすいため、radical 補足剤として働の波長範囲において蛍光スペクトルを測定した。さらに、く。即ち、高濃度で不飽和脂肪酸を担持させた膜材料にはLaurdan の蛍光スペクトルを Peakfit（Systat SoftwareInc.、

抗酸化能力があり、なおかつ物質輸送に活用できると期待

CA、USA）を用いて 2 つのスペクトルにデコンボリュー

される。これまでに脂質 Cubic 相や Cubosome の膜に着目ションした。1 つは無秩序相（500 nm 付近のピーク、親水した研究例は少なく、基礎的な集合体の物性を俯瞰的に解性環境、A 1）に局在する Laurdan に由来し、もう 1 つは秩6）析するための方法論について検討した 。

序相（450 nm 付近のピーク、疎水性環境、A 2）に局在する
Laurdan に由来する。ピーク面積から、次式により膜界面M icro -, Meso -, a nd Macro - scopic
Characterization of Cubosomal SelfAssemblies Composed of Antioxidantsの親水性を算出した。
Φm=A 1 /（A 1 +A 2）

3 . 結果および考察

Keishi Suga
Division of Chemica l Eng ineering,G r a du at e S c h o o l o f E ng i n e e r i ng
Science, Osaka University

3 . 1. OA/MO 集合体の相挙動− 30 −OA/MO 集合体について pH 滴定を行い、相挙動を解析

抗酸化物質から成る Cubosome の開発およびミクロ・メソ・マクロ特性の評価

Figure 1 OA/MO 分散液の pH 滴定曲線。
（a）［OA+Oleate］、（b）［OA+Oleate］/MO=（3/1）
、（c）［OA+Oleate］/MO=（1/1）、（d）［OA+Oleate］/MO=（1/3）、（e）MO のみ。
（i）
、
（ii）
、
（iii）
および（iv）
は、滴定曲線の変曲点を示す。

Figure 2

OA/Oleate/MO 自己集合系の相図した（Figure 1）。pH 滴定曲線における変曲点近傍では集いて電離した状態（Oleate、R-COO-）である。従って、集合体の相転移がおこる。MO 25 mol% では 4 つの変曲点が合体の相挙動は OA/Oleate/MO のモル比によって記述で観察され、pH に応じてミセル⇄ベシクル⇄ O/W エマルジ

きる（Figure 2）。ここでは、ミセル、ベシクル、O/W エョンへと相転移したと考えられる。一方、MO 50 mol% お

マルジョンの 3 状態を示している。［OA+Oleate］/MO=

よび 75 mol% ではベシクル⇄エマルジョンの変曲点のみが（1 / 1）、pH 5 . 0 の条件下で、ゲル状集合体の形成が確認さ観察された。MO の headgroup は小さく、集合体においてれた。O/Wemulsion 領域内に存在するが、懸濁液の粘性

コーン型分子と同様の役割を果たすと考えられる。

に大きな差がみられた。この粘性の増加は、cubic 相の形

ここで、オレイン酸（OA、R-COOH）は pH>pKa にお成を示唆している 9）。

− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 2 . 分子集合体の物理化学的特性評価

においては、ゲル相（solid-ordered 相）においてR > 1 とな

脂質膜の物理化学的特性として、i）ラマン分光解析に基る 7）。従って、ゲル状分子集合体においては、脂質分子がづく脂質膜パッキング密度、ii）蛍光プローブ Laurdan を

秩序高く密にパッキングされた状態であるといえる。また、用いた膜極性を検討した。ラマン分光解析では、炭化水素

蛍光プローブ Laurdan スペクトル解析により、膜内部の鎖（2800 - 3000 cm ）由来のピーク強度より脂質膜のパッキ

親水性度 Φm について評価した（Figure 4）。ベシクルやミング密度を評価可能である。ゲル状集合体（［OA+Oleate］

セルでは親水的な膜特性を示した（Φm> 0 . 5）一方、ゲル状/MO= 1 : 1、pH 5 . 0）において、顕著なパッキング密度の増集合体や Cubic 相の場合、比較的疎水的な膜界面を有する

大が観察された（R > 1）
（Figure 3）。リポソーム 2 分子膜

ことがわかった（Φm< 0 . 5）。

-1

Figure 3 （a）［OA+Oleate］/MO=（1/1）分子集合体のラマンスペクトル。破 線：pH9.0（vesicle）、点線：pH7.0（vesicle）、太線：pH5.0（gel）。
（b）R 値の pH 依存性。

Figure 4 ［OA+Oleate］/MO 分子集合体の Laurdan スぺクトル（a-c）ならびに親水性度 Φm（d：［OA+Oleate］、e：OA+Oleate］/MO=（1/1））。

− 32 −

抗酸化物質から成る Cubosome の開発およびミクロ・メソ・マクロ特性の評価

上述のとおり、分子集合体の相転移に伴い膜特性（R、

3 . 4 . 不 飽 和 脂 質 およ び 重 合 成 脂 質 を 導 入した
Cubosome の調製

Φm）は変化する。特に、R> 1 かつ Φm< 0 . 5 を満たす集合体

MO 分子は Cubic 相形成において重要な役割を担う。所は粘性が高くゲル状である。既報の知見と合わせると、ゲ

定量の脂肪酸（オレイン酸（OA）、ラウリン酸（LaA）、リ

ル状集合体は Cubosome（Cubic 相）と考えられ、その膜特ノール酸（LiA））と混合し pH を調製することで戦略的に性は水溶液中に形成される 3 次元ネットワーク構造を反映

Cubosome を調製できることがわかった（Figure 6）。特に、している。ここでは、既報に基づき構成する脂質が異なる

リノール酸は複数の C=C 結合を有する多価不飽和脂肪酸

3 . 3 . 俯瞰的な膜特性解析に基づく分子集合体の評価

Cubosome を調製し10 , 11）、各種の分子集合体について、俯であり、食品や化粧品分野でも活用できる抗酸化物質とし瞰的に R 値および Φm 値を比較した（Figure 5）。興味深いて期待されている。従来では、リノール酸は油状または乳ことに、一般的に認知されている Cubosome 集合体はいず

液状で製品化される場合が多かったが、Cubosome を調製

れも R> 1 かつ Φm< 0 . 5 を満たすことがわかった。従来ですることでゲル状物質（Figure 6、Entry 12、13）として取は Cubic 相構造を評価する方法は Cryo-TEM 観察あるいり扱うことが可能となる。

は X 線散乱解析に限定されていた。本研究の知見より、脂一方、Cubosome ゲルは温度および pH 変化により簡単

質膜の物理化学的な特性に基づき Cubic 相形成を観察できに sol 化するため、bulk 材料として活用するためには機械る可能性が示された。

的特性の改善が課題となる。そこで重合成脂質 TCDA を

Figure 5 分子集合体の俯瞰的な膜特性解析。
a）［OA+Oleate］、pH11.0、b）［OA+Oleate］、pH7.0、c）［OA+Oleate］/MO=1/1、pH7.0、d）［OA+Oleate］、
pH5.0、e）［OA+Oleate］、pH7.0、f）［OA+Oleate］/MO =1/1、pH7.0、g）［OA+Oleate］MO=1/1、pH6.6、500mM+stabilizer10）、h）［OA+Oleate］/MO=1/1、pH7.0、270mM+stabilizer11）、i）［OA+Oleate］/MO=4/1、pH6.5、340mM+stabilizer10）、
j）［OA+Oleate］/MO=1/1、pH5.5、500mM+stabilizer10）、k）［OA+Oleate］/MO=9/1、pH7.0、270mM+stabilizer11）、
l）［OA+Oleate］/MO=1/9、pH7.5、273mM+stabilizer10）、m）［OA+Oleate］/MO=1/9、pH7.0、270mM+stabilizer11）、
n）［OA+Oleate］/MO=1/1、pH5.0。
これら集合体のうち i、j、k、l、m、n は Cubic 相である。

Figure 6 各種の脂質から成る Cubosomeの膜特性（Top）および写真（Bottom）6）。

− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

修飾し、集合体内部に化学架橋を導入することでゲル安法ならびに蛍光プローブ（Laurdan）法に基づき、集合体の定性を向上させることができる（Figure 7）。UV 照射に“ソフトな” 膜特性を体系的に評価することで、メソスケー

より形成されるポリジアセチレンは，刺激応答性材料とルの脂質膜特性と集合体の相挙動の相関を明らかにした

してセンサー等へ応用が可能であり，本研究で開発した（Figure 8）。Cubosome 集合体は、水溶性物質・脂溶性物

Cubosome 調製手法は各種の機能性脂質を担持できる材料

質の双方を輸送できる担体として期待される。ゲル状集合設計戦略としても期待される。

体は bulk 材料としても活用できる。用途に合わせて物質

4. 総性状を設計することにより、Cubosome 集合体が医療、食括品、化粧品各分野へと応用されることを願う。

本研究では、モノオレイン（MO）と各種脂肪酸を混合した分子集合体の調製手法について検討し、戦略的に Cubic

謝相（Cubosome）を設計できる可能性を示した。ラマン分光

辞
本研究の遂行にあたりご尽力いただきました大塚葉子氏

Figure 7 重合成脂質 TCDA を導入した Cubosome の熱安定性 11）。
（Left）TCDA/MO1/1pH5.0、（Right）［OA+Oleate］/MO=1/1、pH5.0。

Figure 8

メソスケール膜特性と各種集合体の相挙動。

− 34 −

抗酸化物質から成る Cubosome の開発およびミクロ・メソ・マクロ特性の評価（大阪大学）、
吉田健悟氏（大阪大学）、
小嶋一輝氏（大阪大学）in Dispersed Oleic Acid/1-Oleoylglycerol Self-に心より感謝申し上げます。また、研究設備の提供ならびAssemblies: Systematic Characterization Using Ramanに研究評価にご協力いただきました馬越大教授（大阪大学）

Spectroscopy and a Laurdan Fluorescent Probe,に感謝申し上げます。

Langmuir, 34（5），2081-2088, 2018.

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コスメトロジ

7） Fox C.B., Uibel R.H., Harris J.M., Detecting Phase

ー研究振興財団よりご助成いただきましたことを心より感Transitions in Phosphatidylcholine Vesicles by Raman

謝申し上げます。

Microscopy and Self-Modeling Curve Resolution, J.
Phys. Chem. B, 111, 11428-11436, 2007.

（引用文献）

8） Parasassi T., Gratton E., Membrane lipid domains

1） Walde P., Building artificial cells and protocell

and dynamics as detected by Laurdan fluorescence, J.

models: Experimental approaches with lipid vesicles,
BioEssays, 32, 296-303, 2010.

Fluoresc., 5, 59-69, 1995.
9） Kulkarni C.V., Wachter W., Iglesias-Salto G.,2） Morigaki K., Walde P., Fatty acid vesicles, Curr.

Engelskirchen S., Ahualli S., Monoolein: a magic lipid?,

Opin. Colloid Interface Sci., 12, 75-80, 2007.

Phys. Chem. Chem. Phys, 13, 3004-3021, 2011.

3） Cyrus S.R., Kai E.L., Materials chemistry: Liposomes10）Salentinig, S., Sagalowicz, L., Glatter, O., Self-

derived from molecular vases, Nature, 4 8 9, 3 7 2-3 7 4,

assembled Structures and pKa Value of Oleic Acid in2012.

Systems of Biological Relevance, Langmuir, 26 , 11670 -4） B a r r i g a H . M . G . , H o l m e M . N . , S t e v e n s M . M . ,11679 , 2010 .

Cubosomes: The Next Generation of Smart Lipid

11）Nakano M., Teshigawara T., Sugita A., Leesajakul

Nanoparticles?, Angew. Chem. Int. Ed., 58（10）, 2958-

W., Taniguchi A., Kamo T., Matsuoka H., Handa

2978, 2019.

T. Dispersions of Liquid Crystalline Phases of5） Deshpande S., Venugopal E., Ramagiri S., Bellare

the Monoolein/Oleic acid/Pluronic F 1 2 7 System,

J.R., Kumaraswamy G., Singh N., Enhancing cubosome

Langmuir, 18 , 9283 - 9288 , 2002 .

functionality by coating with a single layer of12）Suga K., Otsuka Y., Yoshida K., Umakoshi H.,

poly-ε-lysine, ACS Appl. Mater. Interfaces, 6, 1 7 1 2 6-

Smart Preparation of Polydiacetylene Hydrogel

17133, 2014.

Based on Self-Assembly of Tricosadiynoic Acid and6） Suga K., Otsuka Y., Okamoto Y., Umakoshi H., Gel
Phase-Like Ordered Membrane Properties Observed− 35 −

1 -Oleoylgrycerol（Monoolein），J. Chem. Eng. Japan.,52（3），311 - 316 , 2019 .

渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換
1

2

神戸大学大学院理学研究科 、滋賀医科大学医学部 、内蒙古医科大学薬学院

津田

3

明彦

Natural nanofibers attract much attentions in the field of nanocosmetics. In this study, we have studied formation
controls and structural transformations of the bionanofibers such as collagen and amyloid fibrils by torsional flows of vortex.
Linear dichroism (LD) spectroscopy allowed spectroscopic visualization of the flow-induced alignment of the nanofibers inthe solution. Although collagen showed poor LD response, insulin amyloid fibril provided strong LD response upon stirringof the solutions. We found that insulin molecules self-assemble to form a nanofiber that enables flow-induced alignment in
the vortex flows, but form fibrous aggregates that show no alignment without stirring of the solution. The results obtained inthis study suggest the importance of fluid flows in the process of protein fibrillations.

1. 緒

本研究課題において我々は、「コラーゲンナノコスメ」
への言展開を目標に、メカニカル撹拌によって生じる渦のねじれ

植物のパルプから抽出されるセルロースナノファイバーは、高い粘性と大きなチキソトロピーインデックスを有し流を用いることによるコラーゲンナノファイバーの形成制
御と形態変換を企てた。

ているため、流動性のないゲル状であってもスプレー噴霧

我々の研究グループでは、これまでに生体高分子を模倣でき、タレ止めに応用できる。肌の上でしっかり定着する

した様々な超分子ナノファイバーを創製し、分子化学的な化粧下地や、振って液状にしたものを顔に吹きかけ固まる

視点からそれらの構造解析と機能開拓を行ってきた。それ

美容パックなどへの応用が可能である。さらに水中での乳らの超分子ナノファイバーは溶液の流れに沿って配向し、化・分散安定効果に優れるため、各種オイルの乳化安定化

直線二色性（LD）を誘起する 1 - 5）。一方向にねじれた構造をや、金属箔、金属酸化物など高比重の粒子の沈降防止、分持つナノファイバーは、撹拌によって生じる渦の流れに沿散安定化など、リキッドファンデーションや日焼け止めなってねじれ配向して、ファイバーと渦のねじれ方向が一致

どへの応用が期待されている。化粧品にナノファイバーがする時、より効率的に配向することができる。またその時、配合された「ナノコスメ」
関連商品が社会で広がりを見せよ形成するナノファイバーのサイズも大きくなる。そのよううとしている。

な現象を見出し、我々は、動物体内に大量に存在するバイ

ナノコスメにおいて植物性ナノファイバーに期待と関心

オ線維として知られているコラーゲンと、渦の流れの不斉が集まる一方で、コラーゲンなど動物性線維への関心が薄

流体力学的相互作用に着目した。体内におけるコラーゲンれつつある。コラーゲンは、美容や健康を目的としたサプ線維の形成や分解には、血液、リンパ液、および組織液なリメントやドリンク、様々なコスメアイテムに配合され、どの体液の流れ（体内流）が深く関わっている。したがって、現在も数多くの商品が存在する。しかし、分子化学的な視

コラーゲンによる体内流刺激のメカノセンシングと体組織点から、コラーゲン線維からミクロフィブリル（ナノファによる体内流統制のメカノバイオロジー機構の研究が、コ

イバー）を取り出し、その構造や形態をナノレベルで修飾・ラーゲンナノコスメにおける全く新たな技術と概念を生み制御して、機能を引き出している例は数少ない。これまで出す可能性を秘めている。

に商品化されているコラーゲン配合化粧品の多くは、その

我々は、上記の目標を掲げてコラーゲンナノファイバー

効用として肌の保水効果をうたっている。しかし、コラーの開発を行った。コラーゲン水溶液の加熱による変性コラ

ゲンナノファイバーには、上記セルロースナノファイバーーゲン（ゼラチン）の形成過程、および、その溶液の冷却にと同様の機能に加え、その高い柔軟性や伸縮性、人体とのよる変性コラーゲンの再凝集過程において、溶液の撹拌をより高い親和性などを活かした様々な新機能が期待される。

行うことにより渦の流れを生み出し、その流れとの流体力

Formation control and morphology
conversion of collagen nanofibers bytorsional flows of vortex

学的相互作用による変性コラーゲンの凝集形態の制御を企てた。本研究期間において我々は、流体力学的な相互作用によってコラーゲンが渦の流れに沿って配向することを見Akihiko Tsuda

出したが、コラーゲンナノファイバーの構築までには至ら

Graduate School of Science, Kobe University1/
Department of Chemistry, Shiga University of
Medical Science 2 /School of Pharmaceutical
Sciences, Inner Mongolia Medical University 3なかった。しかし一方で、タンパク質のインスリンを用いることによって当該目標を達成することができた。

− 36 −

インスリンは熱変性によってアミロイド線維を形成する

渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換ことが知られている。アミロイド線維は、タンパク質のミ化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 0 . 2 mL を 添 加 し、0 . 14 mM の イ

スフォールディングにより形成されるタンパク質の集合体

ンスリン濃度 , 3 mL, pH 3 ,［NaCl］= 0 . 28 mM のサンプであり、アルツハイマー病やパーキンソン病などの疾病にルを調製した。また、加熱・撹拌の測定は温度：75 ℃，

関わる物質として高い関心を集めている。アミロイド線維撹拌子の回転速度：1400 rpm の条件下で行った。

の形成プロセスは、モノマーから部分的に構造変化した中3. 結間体を経て核を形成し、さらには集合化による線維化が起果きる経路が最も支持されている（図 1）6 , 7）。我々は、渦の①無撹拌条件下、10 ℃あるいは 20 ℃でコラーゲン水溶液

流れによるマクロな流体力学的相互作用がミクロなアミロの LD スペクトルを測定しても、LD シグナルを観察す

イド線維の核形成に寄与し、その線維の形態を大きく変化ることはできなかった。しかし、撹拌条件下においてさせることを見出した。

測定を行ったところ、コラーゲンの吸収帯に相当する

2. 方

200 nm 付近に誘起 LD を確認することができた。撹拌

法の ON‒OFF に応じて、LD スペクトルも即座に変化した。

加熱・撹拌条件下におけるコラーゲンやインスリンの温度を一旦 75 ℃まで上昇させて、再度 20 ℃にまで冷却線維化に伴う配向現象を観測するために、それらの水溶し、LD を測定したところ、撹拌条件下において誘起 LD

液中での加熱・撹拌前後の紫外 - 可視光吸収スペクトルと強度の著しい減少が確認された。一方、ゼラチン水溶液

LD スペクトルを測定した。インスリンの配向挙動は LDを用いて同様の実験を行っても、撹拌による誘起 LD を

スペクトルを用いて測定することができる。LD の強度は確認することはできなかった。

LD=A｜ − A⊥ で表される。A｜ は縦方向の直線偏光の吸収②加熱撹拌条件下におけるインスリンの線維化に伴う配向

強度、A⊥は横方向の直線偏光の吸収強度を示す。LD の測現象を観測するために、水溶液中におけるヒトインスリ

定には φ 8×11 mm の円柱状のネック部分がある 10×10 ×ンの加熱・撹拌の前後における紫外 - 可視吸収スペクト

40 mm の光学セル（1 mm の厚さの石英ガラス製）を使用しルと LD スペクトルを測定した（図 2）。276 nm と 283 nm

た。撹拌子はテフロン製の φ 3 × 8 mm を使用した。

に極大吸収波長が得られ、LD スペクトルでは吸収スペ①コラーゲンと液体の流れによる流体力学的相互作用を期

クトルに対応した負の誘起 LD が得られた。次に撹拌が待し、左右の撹拌によって生じる不斉な渦の流れにおけ線維の配向挙動にどのように寄与しているのか調べるた

るコラーゲン分子（三重鎖および一重鎖）のねじれ配向挙

めに、加熱撹拌により生成したアミロイド線維に対し

8）て撹拌状態を切り替えながら LD 強度の経時変化を測定

動をフロー誘起 LD スペクトル法で調査し 、コラーゲ
ンと渦の流れの流体力学的相互作用およびキラルセン
シング機構を明らかにした。石英セルに 0 . 05 mg/mL のコラーゲンもしくはゼラチン水溶液を 3 mL 加え、φ 2 ×
5 mm のスターラーバーで溶液を 1300 rpm の回転速度で撹拌し、LD スペクトルを測定した。
②インスリン 0 . 4 µmol（2 . 5 mg）を 25 mM 塩酸 0 . 2 mL に溶かし、超純水 2 . 6 mL に希釈した。その後、14 mM 塩

図1

アミロイド線維形成プロセスの概略図

図 2 加熱・撹拌によるインスリン水溶液の LD スペクトルおよび
紫外 - 可視吸光スペクトルの変化 . 加熱・撹拌前（---），加熱・撹拌後（—）．

− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 3 撹拌のスイッチングによる波長固定（276 nm）LD スペクト
ルの変化

図 4 加熱開始から 10 分間（---）および 15 分間（—）の撹拌、加熱開始後 75-90 分（---）に撹拌を行った際に得られた経時変化
LD プロファイルした（図 3）。無撹拌状態では LD 不活性だったが、撹拌解離したゼラチン状態では配向現象を与えないこともわ
かった。

状態では負の LD シグナルが現れ、左右の撹拌で異なった強度の LD が現れた。次に撹拌が線維形成のどの過程②インスリン水溶液に加熱・撹拌を行うと、線維化を生じ、に作用しているのかを明らかにするためにインスリン水形成した線維が渦の流れに応答して配向することが明ら

溶液の加熱初期に一定時間だけ撹拌を ON にし、その後かとなった。撹拌を行わずに加熱するだけでもインスリ

OFF にして、LD 強度の経時変化スペクトルを測定したンの集合化が生じるが、撹拌を行うことで線維形態のア（図 4）。成長の初期に撹拌を行うと溶液の流れに配向す

ミロイド線維への成長が促進された。また興味深いことる線維が形成していることが明らかになった。

に、撹拌による渦の流れの物理刺激が核形成過程におい4. 考て関与しているという可能性が得られた。

察①上記の結果より、三重鎖構造を持つコラーゲンは、比較

上記の研究結果は、タンパク質の線維化プロセスにおけ的剛直で硬い構造を持つため、溶液の流れに沿って配向る溶液の流れの重要性を示している。今後、変性コラーゲすることができ、誘起 LD を与えたと考えられる。一方、ンの再凝集過程を溶液の流れで制御することによる変性コ

ゼラチンは、コラーゲンの三重鎖がほどけた構造を持ち、ラーゲンの凝集形態の制御をさらに検討したい。

剛直性が低く柔らかい構造のため、溶液の流れに沿って配向することができなかったと考えられる。実際にそれ（引用文献）

を支持する結果として、三重鎖構造を持つコラーゲンを

1） Tsuda A, Alam M A, Harada T, Yamaguchi T, Ishii

加熱すると、三重鎖が解離してゼラチンと同じ状態とな

N, Aida T. Spectroscopic visualization of dynamic

り、誘起 LD の強度が弱まることが確認できている。

vortex flows using a dye-containing nanofiber. Angew.
Chem. Int. Ed. 46: 8198-8202.（2007）②上記の結果より、撹拌によってアミロイド線維の成長が線維の伸長方向に促進され、線維が渦の流れに沿って

2） Ando Y, Sugihara T, Kimura K, Tsuda A. A self-

配向しているものと考えられる。また、図 3 の結果から、assembled helical anthracene nanofibre whose P- andアミロイド線維の高次のねじれ構造が渦の流れの方向に

M-isomers show unequal linear dichroism in a vortex.

対して非等価な流体力学的相互作用を生じているのでは

Chem. Commun. 47: 11748-11750.（2011）

ないかと考えられる。
図 4 において、成長の初期（〜 17 分）3） TsujimotoY, Ie M, Ando Y, Yamamoto T, Tsuda A.

に撹拌を行うと溶液の流れに配向する線維が形成していSpectroscopic visualization of right- and left-handed

ることがわかる。加熱撹拌によって生じる溶液の流れと

helical alignments of DNA in chiral vortex flows. Bull.

インスリンの流体力学的相互作用が線維状に成長する核Chem. Soc. Jpn. 84: 1031-1038.（2011）
4） Yamamoto T, Tsuda A. Vortex-induced alignment

形成段階に関与していると考えられる。

5. 総of a water soluble supramolecular nanofiber composed括of an amphiphilic dendrimer. Molecules 18: 7071-7080.

①本研究から、三重鎖構造を持つコラーゲンが溶液の流れに沿って配向することが明らかになった。一方、それが（2013）
5） Tsuda A. Hydrodynamic helical orientations of− 38 −

渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換

nanofibers in a vortex. Symmetry 6: 383‒395.（2014）
6） Ahmad A, Uversky V N, Hong D, Fink A L. Early
events in the fibrillation of monomeric insulin. J. Biol.

with insulin mutants. Biochemistry 4 0: 8 3 9 7-8 4 0 9.
（2001）
8） Adachi R, Yamaguchi K, Yagi H, Sakurai K, Naiki

Chem. 280: 42669-42675.（2005）

H, Goto Y. Flow-induced alignment of amyloid7） Nielsen L, Frokjaer S, Brange J, Uversky V N, Fink
A L. Probing the mechanism of insulin fibril formation− 39 −

protofilaments revealed by linear dichroism. J. Biol.
Chem. 282: 8978-8983.（2007）

ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジット設計
大阪薬科大学戸塚裕一

We investigated the formulation design of nanocomposite structure for the effective cosmetic utilization of quercetin.
Especially, we focused on the improvement of water solubility of quercetin (QUE) by preparing amorphous solid dispersionof ternary dispersed system with transglycosylated rutin (Rutin-G) and isoquercitrin (IQC). The solubility enhancement
effect of IQC addition on QUE solubility was investigated. Evaporated particles (EVPs) were prepared by rotary evaporator
with QUE, Rutin-G, and IQC. Differential scanning calorimetry and powder X-ray diffraction analysis indicated theamorphization of QUE and IQC by evaporation with Rutin-G. No characteristic diffraction peaks were observed in EVPs
even after storage in sealing condition for 8 weeks at 40 ºC. The amount of dissolved QUE from the physical mixture wasenhanced according to the increase of Rutin-G ratio because QUE was solubilized in the aggregated structure of Rutin-G, anassociated nanocluster of Rutin-G, formed in proportion to Rutin-G concentration. The concentration of dissolved QUE fromthe EVP samples increased when IQC was added in QUE/Rutin-G binary formulation. The concentration of dissolved QUEfrom EVPs of QUE/Rutin-G/IQC ( 1 / 7 / 3 , w/w/w) and QUE/Rutin-G/IQC ( 1 / 5 / 5 , w/w/w) was much higher than that with
QUE/Rutin-G/IQC ( 1 / 10 / 0 , w/w/w). These results suggested that IQC inhibit the re-crystallization from an amorphous
QUE in dissolution medium, resulted in the enhancement in stability of an amorphous QUE in the supersaturated state. In
conclusion, the addition of IQC into QUE/Rutin-G binary system could obviously improve the water solubility of QUE byforming nanocomposite structure.

1. 緒

化作用は化粧品開発において興味深い性質である。現在、

言化粧品などに使用されている紫外線吸収剤は、光毒性や累化粧品への天然物の有効利用を考慮したとき、食品成分

積刺激性などの問題や、物性および安全性の面での懸念が中には有用な化合物が多く存在する。そのうち、安価でかあるものも存在するが、ケルセチンは、化粧品に有効でかつ有効利用可能な化合物として、難水溶性ポリフェノール

つ食品加工にも使用できる、安全で効果的な紫外線防御物が挙げられる。ポリフェノールは抗酸化作用を有するもの

質として効果が期待される化合物である。ケルセチンは化が多く、食品などから簡単に抽出可能である。ところが、粧品に配合して日焼け止め効果のある化粧品を作ることな

ポリフェノールには水中への溶解度が低いものも多く、化どにも有用な化合物と考えられるが、前述したように、最粧水などの水系に溶解させる場合にはハンドリングに問題

大の問題点は水に極めて溶けにくい点にあり、その溶解度があり、界面活性剤などを用いて難水溶性のポリフェノーは、水中では 0 . 4 µg/mL と報告されている 2）。したがって、ルを溶解させることが必要となる。しかし、界面活性剤にケルセチン含有化粧品の開発を試みた場合には、安全な手は細胞毒性などの問題から使用上限が設けられる。本研究

法で水系に溶解させる技術が必要となる。

の目的は、界面活性剤を用いることなく難水溶性のポリフ

これまで、我々は Rutin に対して酵素処理によって糖をェノールを可溶化させることであり、化粧品開発時に難水付加した糖転移化合物（transglycosylated rutin：Rutin-G）

溶性化合物を水系に溶解させる新しい技術を提案することを添加剤として用い、ナノコンポジット形成現象により、にある。

難水溶性のフラボノイドの溶解度を飛躍的に改善すること

今回は難水溶性ポリフェノールのターゲットとして、野を報告してきた 3 - 9）。本研究では Rutin-G に加え、QUE に

菜や果物中に存在する身近なフラボノイドであるケルセチ

単糖が付加されたイソケルセチン（isoquercitrin：IQC）をン（quercetin：QUE）に着目した。ケルセチンには様々なさらに処方中に添加することで複合粒子を作製し、更なる効果が期待されており、抗炎症作用や抗酸化作用などがそ

溶解性の向上を検討した。

1）の代表的な効能と考えられている 。そのうち、特に抗酸

2. 方

法

2 . 1. 使用物質
Evaluation of nanocomposite structure
for the effective cosmetic utilization ofquercetin
Yuichi Tozuka
Osaka University of Pharmaceutical
Sciences

ケルセチン水和物（QUE, Figure 1 ⒜）、イソケルセチン（IQC, Figure 1 ⒝）および α- グルコシルルチン（Rutin-G,
Figure 1 ⒞）は東洋精糖株式会社から供与いただいたものを使用した。用いたそれぞれの添加物の構造式および構造類似性に関して Figure 1 に示した。

− 40 −

ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジット設計

Figure 1

Chemical structure of（a）quercetin（QUE），（b）isoquercitrin（IQC），and（c）α-glucosyl rutin

Figure 2

Preparation method of QUR involved evaporated samples（EVPs)

2 . 2 . 溶媒留去物（Evaporated samples：EVPs）の調製法

2 . 3 . 溶媒留去物の形状観察調製した試料の形状観察は走査型電子顕微鏡（Scanning

QUE と IQC は超音波照射下でエタノール溶媒中に完全

electron microscopy：SEM；TM 3 0 3 0，HITACHI，Japan）に溶解させ、精製水中に添加剤（糖転移化合物：Rutin-G）を用いて行った。減圧下で白金蒸着させた試料を用いて、を溶解させた後、混合させ、ロータリーエバポレーター

加速電圧：15 kV 条件で測定した。

（R- 3；Buchi, Tokyo, Japan）を用いてエタノール溶媒を留去し（102 mbar, at 50 ºC）、その後（20 mbar, at 50 ºC）で全

2 . 4 . 溶媒留去物の結晶性の評価

残留溶媒を留去することにより溶媒留去物を調製した。調溶媒留去物の結晶性の評価に関しては、粉末 X 線回製した試料中に含まれる化合物の存在割合は Figure 2 に

折 測 定（Powder X-ray diffraction：PXRD，Miniflex 600

示すとおりである。

powder X-ray diffractometer, Rigaku Corporation,− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019Japan）および示差走査熱分析装置（Differential scanning

3. 結

calorimetry：DSC；Diamond DSC, Perkin Elmer, USA）
を用いて評価した。 それぞれの測定条件は下記のとおりである。

果3 . 1. 溶媒留去物の物理化学的特性（QUE/Rutin-G/
IQC：3 成分混合系）

PXRD：Scanning rate 4 º/min, 2 θ range of 5 º - 35 º.

Figure 3 に は、 未 処 理 の QUE、IQC、Rutin-G、 お よDSC：10 mg of sample powder was placed in aluminum

び QUE/Rutin-G/IQC の 3 成分系の溶媒留去物について

open-pan. Heat from 35 ºC to 200 ºC at 20 ºC/min, aの SEM 写真を示す。未処理の QUE は針状の形状を示し、nitrogen flow rate of 40 mL/min.

Rutin-G は球状の形状を示している。また、未処理の IQC
は微細粒子が凝集している様子が観察された。調製したす

2 . 5 . 溶媒留去物からのケルセチンの溶解性の評価

べての溶媒留去物は、滑らかな表面を有する凝集塊を形成

溶解度試験は蒸留水中で 37 ºC 条件において振とう速度100 s/min で行った。QUE 原末、物理的混合物（PM）おしており未処理の QUE の形状とは異なることが確認された。

よび調製した各複合粒子製剤（QUE 量 20 mg）（EVPs）に

DSC および PXRD 測定により溶媒留去物の結晶性につ対して精製水 10 mL を加え、1 時間および 4 時間振とう

いて検討した結果を、それぞれ Figure 4 および Figure 5

後（37 ºC）における溶解度を HPLC（SPD- 10 A, Shimadzuに示した。DSC による分析の結果、未処理の QUE およびco., Ltd., Japan）により定量した。HPLC 測定条件は以下の

IQC においては、結晶の融解に伴う吸熱ピークが観察されとおりである。

るのに対し、溶媒留去物においては、融解に伴う吸熱ピー

Mobile phase：0 . 1（w/w）% acetic acid and acetonitrile

クが観察されなかった（Figure 4）。一方、PXRD 測定にお（6 5：3 5 v/v），F low rate：1 . 0 m L /m in , C olumn

いても、未処理の QUE および IQC においては、結晶性のTemperature：40 ºC，UV：254 nm，Injection volume：

回折ピークが認められるのに対し、溶媒留去物において10 µL）

は、いずれの試料においても QUE および IQC の結晶由来

Figure 3 Scanning electron microscope（SEM）photographs of evaporated particles（EVPs).（a) untreated quercetin（QUE）（b），
untreated isoquercitrin（IQC）（, c）α-glucosyl rutin（Rutin-G）（, d）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/10/0）（, e）EVPs of QUE/
Rutin-G/IQC（1/9/1）（, f）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/7/3）and（g）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/5/5）− 42 −

ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジット設計

Figure 4 Differential scanning calorimetry（DSC）plots ofevaporated particles（EVPs）（a）． untreated quercetin（QUE），（b）untreated isoquercitrin（IQC）（， c）α -glucosyl rutin（Rutin-G）（d）， EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/10/0），（e）
EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/9/1），（f）EVPs of QUE/
Rutin-G/IQC（1/7/3）and（g）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/5/5）Figure 6 Powder X-ray diffraction（PXRD）patterns ofevaporated particles（EVPs）after storage in sealing
condition for 8 weeks at 40℃．
（a）untreated quercetin（QUE），（b）untreated isoquercitrin（IQC），（c）α-glucosyl
rutin（Rutin-G），（d）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/10/0），（e）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/9/1），（f）EVPs of
QU E /Rutin - G/IQC（1/ 7/3）and（g）E V Ps of QU E /Rutin-G/IQC（1/5/5）

3 . 2 . 溶媒留去物からのケルセチンの見かけの溶解度の評価
物理的混合物における QUE の溶解度変化、および溶
媒留去物における QUE の溶解度変化についての結果を、
Figure 7 および Figure 8 にそれぞれ示した。なお、ケルセチンの見かけの溶解度の評価は 37 ℃の蒸留水中でのQUE/Rutin-G/IQC の 3 成分混合系からの QUE の溶解度変化の結果であり、今回の検討においては、in vitro の胃
内条件、腸内条件や模擬消化管を用いた検討は行えていな
Figure 5 Powder X-ray diffraction（PXRD）patterns ofeva p o rate d p a r ticle s（E V Ps）af te r p re p a ratio n .（ a）
untreated quercetin（QUE），（b）untreated isoquercitrin
（IQC）
（c）
， α-glucosyl rutin（Rutin-G）（d）， EVPs of QUE/
Rutin-G/IQC（1/10/0），（e）EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/9/1）（f）， EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/7/3）and（g）
EVPs of QUE/Rutin-G/IQC（1/5/5）

い。
物理的混合物は、一定割合の QUE/Rutin-G/IQC を単純に vortex mixer を用いて 1 分間混合したものを使用した。
Figure 7 の一番左のデータに示すように、37 ℃・水中での 4 時間振とう後の QUE の溶解度は、およそ 1 . 4 µg/mL
であり、水への溶解度が極めて低いことが確認された。前述したように、QUE は極めて疎水性が高い化合物であり、の回折ピークは認められなかった（Figure 5）。したがって、消化管内での溶解度も極めて低いため、消化管からの吸収

DSC および PXRD 測定の結果から、QUE/Rutin-G/IQC の性も乏しいと考えられる。そのため、もし経口摂取した

3 成分混合系の溶媒留去物において、QUE および IQC はQUE を体内で有効に活用するためには、溶解性を改善し非晶質状態で存在することが示唆され、非晶質の粒子としてバイオアベイラビリティを改善する必要がある。Figureて存在しているか、あるいは分子分散した状態で系中に存7 に示すように、37 ℃で 4 時間インキュベートしたときの在することが考えられた。

物理的混合物における QUE の溶解度は、QUE/Rutin-G/

Figure 6 に は 閉 鎖 系 で 40 ℃・8 週 間 保 存 し た 試 料 のIQC（1 / 1 0 / 0）、QUE/Rutin-G/IQC（1 / 9 / 1）、QUE/

PXRD パターンを示した。いずれの試料においても QUE

Rutin-G/IQC（1 / 7 / 3）および QUE/Rutin-G/IQC（1 / 5 / 5）

および IQC の結晶由来の回折ピークは認められず、ハロの 値 が そ れ ぞ れ、101 . 5 ± 2 . 6，69 . 1 ± 2 . 6，73 . 4 ± 3 . 4ーパターンを維持したまま、結晶析出は起こっていないこ

および 56 . 3 ± 4 . 6 µg/mL であり、Rutin-G の存在によって、とが示唆された。

単純混合操作のみでも見かけの溶解度の上昇が認められた。

− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019の存在割合との相関は認められなかった。また、溶媒
留 去 物 か ら の QUE 見 か け の 溶 解 度 は、QUE/Rutin-G/
IQC（1 / 7 / 3）、QUE/Rutin-G/IQC（1 / 5 / 5）においては、
QUE/Rutin-G/IQC（1 / 10 / 0）に比べて明らかに高い溶解度上昇効果が認められている。これらの結果は、非晶質状態からの溶出によって QUE が過飽和の状態で液中に存在していることに起因すると考えられた。

4. 考

察

非晶質状態は結晶状態と比較して、熱力学的なエネルギ
ー状態が高く不安定であるので、薬物が保存中に非晶質状態で保存したい場合には、非晶質から結晶へと変化してしまう結晶転移が起こらないようにしなくてはならない。非晶質状態からの薬物の水中への溶出は、結晶状態と比較し
Figure 7 The solubility study of quercetin from physicalmixtures（PMs）at 37℃ in distilled water. Each data
represents the mean ± S.E.（n=3）．Solubility study was
performed in distilled water at 37 degrees C under shaking
at 100 s/min. Samples at a QUE concentration of 20 mg
were added in 10 mL distilled water.

て溶出性に優れるため、保存中に結晶転移が起こることは溶出性が変化してしまう、すなわち水中で薬物が溶けにく
くなってしまうことを意味している 10）。本研究では、非晶質
QUE の皮膚への塗布を想定した応用を目指しているため、QUE の非晶質状態の維持は大事な課題である。非晶質が結晶化する現象、すなわち非晶質状態の安定性に影響する因子としては、保存温度が大きな要因となり得る。非晶質状態にある物質が高温条件にさらされたときには、分子運動性が上がることにより結晶化が促進される 11）。Figure6 に示すように、本研究においては 40 ℃・8 週間の保存においても、PXRD 測定において QUE の再結晶化に伴うピークは観察されておらず、溶媒留去法によって、比較的安定な非晶質固体分散体が調製できたと考えられる。しかしながら、非晶質固体分散体の安定性に関して、三成分目として添加した IQC が固相中でどのような効果をもたらしているのかは不明であり、今後の課題として検討が必要である。
本研究の最も興味深い点は、Figure 7 および Figure 8に示されるように、QUE を含有する溶媒留去物が非晶質
固体分散体を形成し、QUE の見かけの溶解度を最大で数

Figure 8 The solubility study of quercetin from evaporated
particles（EVPs）at 37 degrees C in distilled water. Eachdata represents the mean ± S.E.（n=3）．Solubility study
was performed in distilled water at 37 degrees C undershaking at 100 s/min. Samples at a QUE concentrationof 20 mg were added in 10 mL distilled water.

百倍まで上昇させることに成功している点である。この現象には 2 つの要因が影響しているものと考えられ、一つはRutin-G が水中で形成するナノ集合体の存在であり、もう一つが IQC を含む非晶質固体分散体が過飽和状態を保持することが推察される。Figure 9 に示すように、QUE は
Rutin-G の添加量に応じて直線的に見かけの溶解度が向上する。我々はこの現象が Rutin-G が水中で 5 mg/mL の濃Figure 8 には、QUE/Rutin-G/IQC の 3 成分混合系の溶度でナノ集合体を形成することに関連することを報告し

媒留去物からの QUE 見かけの溶解度変化の結果を示した。

ており 3）、Figure 10 に模式図として示すように、そのナ

Figure 7 と比較すると明らかなように、溶媒留去物からノ集合体構造内に難水溶性の化合物を取り込むような形で、の QUE 見かけの溶解度は、物理的混合物と比較して顕著

ナノコンポジット構造（< 5 nm）を形成することを報告してな上昇が認められている。溶媒留去物からの QUE 見かけいる。したがって、Figure 7 のQUE/Rutin-G/IQC（1/10/0）の溶解度は、物理的混合物のケースとは異なり、Rutin-G

において、単純に物理的混合を行ったのみで QUE の溶解− 44 −

ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジット設計

Figure 9

Relationship between the amount of quercetin dissolved and transglycosylated additives

Figure 10 The plausible scheme of soluibilization mechanism of poorly watersoluble compound by a nanocomposite formation of Rutin-G

度が大きく向上した現象は、Rutin-G の存在による水中でされていることが関与していると推察される。この要因ののナノコンポジットの形成に起因することが考えられる。

一つは、Figure 1 に示すように、IQC と Rutin-G の化学構

一方、Figure 4 および Figure 5 の DSC および PXRD の造が QUE と類似していることにも起因すると考えられる。

結果から、QUE は溶媒留去物中では非晶質状態で存在し詳細な相互作用様式や、水中での 3 成分のそれぞれの状態ていると推察される。非晶質状態は熱力学的に不安定であは明らかにはなっていないが、3 成分目に添加した IQC がり、結晶のような長秩序の規則性を持つ構造もなく、結晶

QUE もしくは QUE と Rutin-G の両者と比較的強い相互作と比較して、水への高い溶解度と水への高いぬれ性を示す用で水中に存在し、結晶化の抑制に働いているのではない

ことが報告されている

12）。しかしながら、非晶質からのかと推察している。

薬物の溶解度は一旦上昇するが、水中での再結晶化により

5. 総

薬物溶解度は大きく減少することがしばしば認められる。

括

この再結晶化は、水溶性高分子の添加によって抑制される

今回の研究結果から、従来報告してきたナノコンポジッ

ことなども報告されている。Figure 8 の結果に示すように、ト形成現象は、3 成分目に結晶化を抑制するような化合物

今回の我々の結果において、QUE の溶解度が大きく上昇を添加することにより、難水溶性化合物の溶解度の向上

した現象は、Rutin-G のナノコンポジット形成と、非晶質と維持に関して発展的な成果を出せることが示唆された。

状態からの QUE の過飽和状態が IQC の添加によって維持

QUE を化粧品中の紫外線防御物質として活用するために− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

は、Rutin-G と IQC を添加して、一旦全成分が溶解した状

6） M. Fujimori, K. Kadota, K. Kato, Y. Seto, S. Onoue,

態から、溶媒留去して非晶質状態を形成させればよいこと

H. Sato, H. Ueda, Y. Tozuka, Low hygroscopic spray-

がわかり、また、今回の 3 つの成分は、それぞれが抗酸化

dried powders with trans-glycosylated food additives

作用を有する物質で、かつ食品添加剤であるため応用性がfor enhanced solubility and oral bioavailability of a
ipriflavone, Food. Chem., 190, 1050-1055, 2016

期待される結果が得られたと確信している。
なお、今回の助成により得られた成果は Environmental

7） K. Kadota, S. Otsu, M. Fujimori, H. Sato, Y. Tozuka,

Control in Biology, 56 , 161 - 165 , 2018 に掲載されており、Soluble hydrolysis-resistant composite formulation

公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深謝します。

of curcumin containing α-glucosyl hesperidin andpolyvinylpyrrolidone, Adv. Powder Tech., 27, 442-447,（引用文献）2016

1） A.W. Boots, G.R. Haenen, A., Bast, A., Health effects8） K. Kadota, K. Semba, R. Shakudo, H. Sato, Y. Deki, Y.

of quercetin: From antioxidant to nutraceutical. Eur. J.

Shirakawa, Y. Tozuka, Inhibited photodegradation of

Pharmacol., 585, 325-337, 2008.

highly-dispersed folic acid nanoparticles by antioxidant
effect of transglycosylated rutin, J. Agr. Food. Chem.,

2） Y. Zheng, I.S. Haworth, Z. Zuo, M.S.S. Chow, A.H.L.

64, 3062-3069, 2016

Chow, Physicochemical and Structural Characterizationof Quercetin-β-Cyclodextrin Complexes. J. Pharm. Sci.

9） K. Kadota, H. Arima, R. Shakudo, K. Semba, H.
Uchiyama, K. Sugiyama, Y. Tozuka, Emergent

94, 1079–1089, 2005.
3） Y. Tozuka, K. Higashi, T. Morita, M. Nishikawa,composite structures following the amorphization of

H. Uchiyama, J. Zhang, K. Moribe, K. Nishikawa, H.

itraconazole with transglycosylated rutin by over-Takeuchi, K. Yamamoto, Transglycosylated Rutin-

grinding, Powder Technol., 323, 69-75, 2018

Specific Non-Surface-Active Nanostructure Affects10）S.M. Wong, I.W. Kellaway, S. Murdan, Enhancement

Absorption Enhancement of Flurbiprofen, Euro. J.

of the dissolution rate and oral absorption of a poorly

Pharm. Biopharm., 82, 120-126（2012）

water-soluble drug by formation of surfactantcontaining microparticles, Int. J. Pharm. 3 1 7 , 6 1 - 6 8 ,4） M. Fujimori, K. Kadota, K. Shimono, Y Shirakawa, H.

2006 .

Sato, Y. Tozuka, Enhanced dissolution of quercetin byforming composite particles, J. Food Eng., 149, 248-254,

11）B.C. Hancock, S.L. Shamblin, G. Zografi, Molecular
Mobility of Amorphous Pharmaceutical Solids Below

2015

Their Glass Transition Temperatures. Pharm. Res., 12 ,5） H . S ato , M . Fuji mor i , H . Su z u k i , K . K adot a ,799 ‒ 806 , 1995 .

Y. Shirakawa, S. Onoue, Y. Tozuka, Absorption
improvement of tranilast by forming highly soluble12）B.C. Hancock, M. Parks, What is the true solubility

nano-size composite structures associated withadvantage for amorphous pharmaceuticals? Pharm.

α-glucosyl rutin, Euro. J. Pharm. Biopharm., 92, 49-55,

Res., 17 , 397 ‒ 404 , 2000 .

2015− 46 −

顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法
および透過性スクリーニング法の構築
明治薬科大学藤井

美 佳、深 水啓朗

In this study, lipid structural change was monitored using Raman spectroscopy during heat treatment, along with theimpact of lipid states on the structural and physical properties during the preparation process of the intercellular lipid
model (MODEL) in stratum corneum. Moreover we demonstrated the availability of the MODEL for an evaluation ofskin permeation mechanisms for skin permeation enhancers. The lipid states in preparation process was monitored byvaluable temperature (VT) -Raman spectroscopy and differential scanning calorimetry. The Raman spectra were analyzed
by perturbation correlation two-dimensional correlation spectra. The microstructure of MODELs prepared different
temperatures and the structural changes of MODELs after application of skin permeation enhancers (vesicle and micellesolution) were detected by small angle X-ray scattering and powder X-ray diffraction measurements. The microstructuresof the MODEL changed depending on the melting of lipid ingredients in the preparation process. It was recognized that VTRaman spectroscopy is a useful and attractive tool for the sensitive monitoring of lipid state changes and lipid melting. These
results suggested that monitoring lipid structural changes during the heating step is important to precisely prepare target
MODEL. The MODEL structure changed after application of skin permeation enhancers. Especially the vesicle solution that
promote skin permeation of low molecular weight compounds rather than micelle solution, was made the model structure
disorder. It is expected that the MODEL would apply for the elucidation of skin permeation mechanisms.

1. 緒

びコレステロール（CHOL）を構成脂質とした MODEL 3 , 4）に言ついて，調製過程における脂質の構造変化をラマン分光法

皮膚の最外層に存在する角層は，生体内への病原体・異でモニターし，調製温度が及ぼす MODEL 構造への影響を

物の侵入抑制および生体内からの水分蒸散抑制における重調べた．また，経皮吸収促進剤の適応による MODEL の構要な役割を担っている．特に角層細胞間脂質は低分子化合

造変化を観察し，皮膚透過性評価における MODEL の有用物の経皮吸収における主な経路となることが知られてお性を検証した．

り，化合物の経皮吸収メカニズムの解明には，化合物と細2. 方

胞間脂質の相互作用評価が重要である．しかしながらヒト
角層は，採取する部位，被験者の年齢，性別および人種に

2 . 1. 材

法

料

よる構造および組成のばらつきが大きく，由来の異なる角

CER として（2 S, 3 R）
-2（
- 2 -Hydroxyhexadecanoyl）amino

層検体間での評価結果を単純に比較することが難しい．まoctadecane- 1 , 3 -diol（Takasago International Corporation,

た 2009 年以降，EU において動物実験を実施した化粧品

Tokyo, Japan）を使用した．PA（PALMAC 98 - 16）およびの販売が禁止され，化粧品開発においては動物皮膚の使用

CHOL は，Acidchem International Sdn Bhd（Penang,

も難しい状況にある．このような背景から，ヒトおよび動Malaysia）
およびFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

物の角層細胞間脂質の代替として，構造や組成の偏差が少（Osaka, Japan）
からそれぞれ購入して使用した．

ない細胞間脂質モデル（MODEL）が注目されており，様々

経皮吸収促進剤として，イソステアリルグリセリルエ

な MODEL が開発されている 1 , 2）．MODEL の組成や調製ーテル（Penetol Ⓡ GE-IS, Kao, Tokyo, Japan, 以下 , GE-IS）

条件の違いは，その構造および物性に大きく影響するため，

およびポリオキシエチレン（60）硬化ひまし油（HCO- 60 ,

望ましい構造またはプロファイルを示す MODEL をデザイ

Nikko Chemicals, Tokyo, Japan, 以下 , HCO- 60）を用いた．

ンするためには，調製過程における構成脂質の構造変化を

2 . 2 . 細胞間脂質モデル（MODEL）の調製

詳細に理解することが重要と考えられる．
本検討では，セラミド（CER），パルミチン酸（PA）およ

まず CER/CHOL/PA（42：15：43 , w/w）の物理混合物を調製した．これらの物理混合物をクロロホル
ム／メタノール溶液（2：1）に溶解後，ガラスConstruction of evaluation method
for human stratum corneum andscreening method for percutaneousadsorption by Raman spectroscopy

プレートに滴下した．32 ℃で溶媒を揮発させ，Mika Y. Fujii, Toshiro Fukami

製した．同様に MODEL 120 は，LM を 120 ℃

Meiji Pharmaceutical University

で 30 min 加熱した後，室温まで冷却して調製− 47 −

脂質膜（LM）を得た．MODEL 80 は，LM を 80
℃で 30 min 加熱した後，室温まで冷却して調コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

（λ=1.5418Å）
で真空下にて測定した．Repeat distance
（d）
は，

した．

d=2 π/qより算出した（q：散乱ベクトル）．

2 . 3 . 脂質膜（LM）および MODELの物性評価

2 . 4 . 経皮吸収促進剤によるMODEL 構造の変化

2 . 3. 1. 示差走査熱量計（DSC）
示差走査熱量計（DSC）はMettler Toledo DSC 1（Mettler

経皮吸収促進剤には，5 wt% GE-IS / 5 wt% HCO-60 にToledo International Inc.）を用いた．LM を 20 ℃から 80 ℃

よるベシクル溶液，5 wt% HCO- 60 によるミセル溶液を用または 120 ℃まで，5 ℃/min（40 mL/min., N 2 環境下）の速い，溶媒にはそれぞれ 50 mM クエン酸緩衝液を使用した．

度で昇温する過程の熱量変化を測定した．

MODEL（10 .5 mg）に，各溶液を 20 µL滴下し，室温で 24h

2 . 3 . 2. 温度可変顕微ラマンスペクトル測定

静置後，SAXSで測定した．

温度可変顕微ラマンスペクトル測定は，顕微ラマン分光装3 . 結果および考察

置（Work StationTM, Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor,
UK）を用いた．ヒートステージ上に LM をセットし，20 ℃

3 . 1. 調製過程におけるLM 中脂質構造のダイナミク
ス

から 120 ℃まで昇温した．昇温速度は 10 ℃/min とし，10

ラマン分光法は脂質炭化水素鎖の C-C 結合や CH 2 結合

℃毎に 2min間保持した後にラマンスペクトルを測定した．

等，対称性の高い振動モードの検出を得意とし，ラマンス

ラマン分光装置は，照射レーザー波長 785nm，積算回数

ペクトルの変化から炭化水素鎖の周辺環境の変化を検出で3 回，露光時間 30s，測定範囲 300-3500cm- 1，100 倍の対きる．加熱過程における LM の構造変化をより詳細に調べ

物レンズを用いて測定した．得られたラマンスペクトルは，るために，20 ℃から 120 ℃まで LM の温度を変化させ，そ2 Dshige version 1. 3 を使用して，摂動相関二次元相関スペの過程をラマン分光法でモニターし，PC 2 D で解析した．

クトル（PC2D）を得た．各温度のラマンスペクトルは，ガPC 2 D は，摂動に対するスペクトル変化を捉えることが可MI, USA）
および 10083（Linkam Scientific Instruments Ltd.,-1

ラス基板に由来する 1698. 6 cm のピーク強度が一定になる能であり，スペクトル強度の変曲点を把握するのに有効でように規格化した．

ある 5）．

2 . 3 . 3. 粉末Ｘ線回折（PXRD）

昇温過程における LM 中脂質のラマンスペクトル変化おPXRD は，MiniFlex 6 0 0（Rigaku Corporation, Tokyo,

よび熱挙動を Figure 1 に示す．DSC 曲線では，58 . 6 ℃のJapan）を使用した．2θ側測定範囲 2 -28 °，ステップサイズ

吸熱に続いて，71 . 2 ℃および 81 . 4 ℃の吸熱ピークが認め

0 .02 °
，スピード 4 °/min，X 線出力 管電圧 40kV，管電流られた．ラマンスペクトルでは，脂質炭化水素鎖の C-C

15 mA，線源 Cu-Kα（λ= 1 . 5418Å）
で測定した．

伸縮振動に由来する 1061 cm- 1 あるいは 1128 cm- 1 のピー

2 . 3 . 4. 小角 X線散乱
（SAXS）

ク強度が 70 - 80 ℃で低下した．これらのピークは，脂質SAXS は，SAXS space（Anton paar，Graz，Austraria）

炭化水素鎖の運動性を示していることから 6），DSC 曲線でを使用した．露光時間 1min，積算回数 4 回，線源 Cu-Kα

認められた 81 . 4 ℃の吸熱ピークはゲル－液晶相転移を示

Figure 1

昇温過程における LM の PC2D スペクトル− 48 −a）および DSC 曲線 b）

顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法および透過性スクリーニング法の構築していると考えられる．また，2852 cm- 1 の CH 2 対称伸縮
-1LM, MODEL 80および MODEL120のPXRDおよび SAXS

振動のピーク強度は 70 - 80 ℃，2888 cm の CH 2 逆対称伸パ タ ー ン を Figure 2 に 示 す．LM お よ び MODEL 80 の

縮振動のピーク強度は 70 ℃で急激に低下することが明ら

PXRD パターンから，直方晶および六方晶を示す約 21 . 5 °おかとなった，これらのピークは細胞間脂質の充填構造のよび 23 . 8 °の回折ピークが認められた．またこれらの充7）

情報を反映することが知られており ，DSC 曲線で認めら

填構造に加え，約 19 . 6 °，23 . 5 °および 24 . 6 °に回折ピーれた 71 . 2 ℃の吸熱ピークは，充填構造の変化に起因するクが認められたことから，複数の複格子構造が混在するとと推察される．一方，DSC 曲線で吸熱ピークが観察され考えられる．一方，MODEL 120 ではこれらのピークは消た 58 . 6 ℃では，ラマンスペクトルに大きな変化は認めら失し，直方晶および六方晶のみが認められた．LM およびれなかった．このピークは構成脂質単独の吸熱ピークとは

MODEL 80 の SAXS パターンでは，4 . 32 - 4 . 38 nm の d 値一致しないことから（data not shown），共晶の構造変化にを有する構造（ⅰ）および，3.60nmのd値を有する構造（PA）

よる吸熱ピークと考えられる．また，ラマンスペクトルのが観察された．PA の単斜晶は約 3 . 60 nm の d 値を有する

ピーク強度は 90 ℃付近で一定となることが明らかとなり，ことから 8），当構造は PA が単独で形成する結晶によると

約 90 ℃で LM が完全に融解したと考えられる．

考えられる．ヒト角層では，CER：脂肪酸：CHOL はお
よそ当モル比で存在することから 9），当 MODEL は PA の3 . 2 . MODELの周期構造解析

配合量が多いことが分かる．つまり，過剰に存在する PA

ラマンスペクトル（Figure 1）の結果から，調製温度の違が単独で結晶構造を構築したと考えられる．一方，構造ⅰ

いによって MODEL 形成までに経験する構造変化が異なる

は CER，PA および CHOL の共晶によるピークと推察されことが示唆された．そこで 80 ℃または 120 ℃で得られた

る．MODEL 120 では 4 . 60 nm（Ⅰ），4 . 00 nm（Ⅱ）および各 MODEL について，ラマン分光法では得ることができな

3 . 60 nm（PA）の d 値を有する構造が認められた．3 . 6 nm

いより長距離の周期構造を PXRD および SAXS を用いては，PA の結晶由来と推察され，PA 結晶は調製温度に因評価した．

らず，当 MODEL 中に存在することが明らかとなった．構

Figure 2 LM（a), MODEL 80（b）および MODEL 120（c）の PXRD および
SAXS パターン（HEX：六方晶，ORTH：直方晶，PA：パルミチン酸の結晶）− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

造ⅠおよびⅡは CER，PA および CHOL の共晶による構造

ピークトップを Table 1 に示す．

と考えられるが，特に構造Ⅰの構造は CER のヘアピン構

当研究で使用したベシクル溶液はミセル溶液と比較し造による結晶であると推察される（CER ヘアピン構造の分て，低分子化合物の皮膚透過量を 1 . 5 - 3 倍向上させるこ

子長：約 2 . 1 - 2 . 3 nm）．以上の結果より MODEL の構造はとが明らかとなっている（data not shown）．Table 1 より，調製温度によって異なり，特に共晶構造および充填構造は50 mM クエン酸緩衝液適応後の MODEL は，4 . 48，3 . 98，

MODEL 80 と MODEL 120 で大きく異なることが分かっ

3 . 58 および 2 . 26 nm の d 値を有しているが，ベシクル溶

た．Figure 1 より，調製過程において構成脂質は 90 ℃以液の適応により，Second peak（3 . 98 nm 付近）が消失し上で完全に融解することが明らかとなっており，調製過程た．ミセル溶液においてもピーク強度は減少したが，そのの脂質の融解状態が MODEL 構造に影響すると推察され構造は完全には消失しないことが明らかとなった（Figure

る．ヒト角層細胞間脂質の充填構造は六方晶と直方晶から3）．また PXRD 測定の結果から，ベシクル溶液を適応し成ると考えられている

10）．そこで，六方晶および直方晶

たMODELの広角側に，ハローパターンが認められ（Figure

を充填構造として有していると考えられる MODEL 120 を3），MODEL が非晶質化したことが示唆された．これより，使用し，経皮吸収促進剤の適応によるモデルの構造変化を細胞間脂質の構造が一部乱されたことが，ベシクル溶液に評価した．

よる低分子化合物の皮膚透過性促進作用の機序の一つであると考えられる．

3 . 3 . 経皮吸収促進剤によるMODEL 構造の変化

4. 総

ベシクル溶液，ミセル溶液および 50 mM クエン酸緩衝液を適応した MODEL の SAXS patterns を二次微分したTable 1

本研究では先ず，調製過程における MODEL 構成脂質の各製剤を適応した MODEL 120 の d 値（nm)50 mM citricacid buﬀer

VesicleFirst peak

4.48

4.51

4.48

Second Peak

3.98

‑

3.96

Third Peak

3.58

3.59

3.57

Forth peak

2.26

2.25

2.27

MicellEach data was gained by second derivative of SAXS patterns（Figure 3).

Figure 3各溶液を適応した MODEL の SAXS および PXRD パターン− 50 −

括

顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法および透過性スクリーニング法の構築

状態変化を温度可変ラマン分光法でモニターし，調製温度（引用文献）

が及ぼす MODEL 構造への影響を調べた．調製過程で LM

1） D. Groen, et al., Langmuir, 26, 4168-4175（2010）．

を完全に融解することで，ヒト角層細胞間脂質に類似した

2） A.P. Ramos, M. Lafleur, Langmuir, 31, 11621-11629

充填構造を有する MODEL を調製できることが明らかと（2015）．

なった．加熱過程における LM の構造変化を分子レベルで

3） H. Watanabe, et al., Chem. Pharm. Bull., 5 8（3），312-317（2010）．

理解することは，適切な MODEL を調製するうえで必要不可欠であり，温度可変ラマン分光法はその構造変化を in

4） X, Wang, et al., Coll. Surf. B, 78, 92-100（2010）．

situ モニタリングできる有効なツールであることが示され

5） M. Thomas, H. H. Richardson, Vib. Spectrosc. 24, 137146（2000）．

た．次に，当 MODEL に経皮吸収促進剤であるベシクルおよびミセル溶液を適応し，MODEL の構造変化を評価した．

6） A. N. C. Anigbogu, et al., Int. J. Pharm., 1 2 5, 2 6 5282（1995）．

低分子化合物の皮膚透過性を亢進させる，ベシクル溶液を適応すると，MODEL の構造が一部消失し，非晶質化する

7） R. Koynova, M. Caffrey, Biochim. Biophys. Acta,．
1255, 213-236（1995）

ことが示唆された．経皮吸収促進剤が MODEL に与える影響については，更に詳細な検証が必要とされるものの，本8） X, Wang, et al., Coll. Surf. B, 78, 92-100（2010）．

MODEL は経皮吸収促進剤等の浸透促進メカニズムの解明

9） A. Weerheim, M. Ponec, Arch. Derm. Res., 292, 191199（2001）．

に応用が期待される．

10）S. Ramakrishman, et al., Mater. Res. Soc. Symp.
Proc. EXS-A H 6 . 2 . 1（2004）.
．

− 51 −

カラフルな反射色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製
東京理科大学理学部第一部応用化学科

古海

誓一

This report describes the syntheses and reflection properties of cellulosic derivatives with permanently colorful reflection
characteristics. Cellulosic derivatives tethering appropriate side chains are well known to form cholesteric liquid crystals
with visible reflection features in line with Bragg’s law. When hydroxypropyl cellulose (HPC) was chemically modified byvarious aliphatic groups in the side chains, the reflection peak monotonously shifted to longer wavelength upon stepwise
heating process. This happened from the increase in CLC helical pitch. By using crosslinkable HPC derivatives tethering
acryloyl side chains, we succeeded in the permanent preservation of periodic helical CLC structure with visible reflection
features by photocrosslinking reaction between the acryloyl groups, resulting in facile fabrication of full-color imaging films.
Such films of cellulose derivatives could be also applied to intriguing sensors with respect to mechanical stress and surface
roughness. This report provides promising clues to fabricate the next-generation photonic devices from an environment- andhuman-benign biomass of cellulose.

1. 緒

コースユニットが隣り合うグルコースユニットと交互にグ

言

ルコースの環平面の上下の向きを変えながら結合しており、私たち人間の生涯で最も触れる化合物は、何であろう

直鎖状の高分子になっている。デンプンもグルコースからか？液体では「水」になるが、固体であれば「セルロース」かできた天然高分子であるが、デンプンとセルロースの大きもしれない。なぜならば、セルロースは古代から現代にわな違いは、モノマーユニットであるグルコースの化学構造

たる日常生活において人間と密着しているからである。人がそれぞれ α- グルコースと β- グルコースで構成されてい間は衣類に使われている綿を身に付けることがあり、何かることである。人間は α- グルコースからできたデンプンを書き記すときには紙を使う。建物や家具に木材を使うこを栄養源として食べることができるが、β- グルコースかともある。これら綿、紙、木材の主成分は、セルロースでらなるセルロースを食べても分解できず栄養源にならない。

ある。さらに、文房具として古くから身近なセロハンテー

すなわち、セルロースは人間にとって非可食性の天然資源

プは、セルロースを水酸化ナトリウムと二硫化炭素で反応である。しかしながら、自然界には、セルロースをグルコさせたビスコースから製造されている。セルロースと無水ースに変換できる酵素をもった草食動物や昆虫も数多く存

酢酸を反応させた酢酸セルロースは半合成繊維であるアセ

在している。

テート繊維として知られており、難燃性という特徴がある

このような研究背景があるなか、本研究者らは最近、セため繊維だけでなく、電線の中の絶縁体やたばこのフィル

ルロースの側鎖を化学修飾することにより室温付近で鮮やターにも使われている。さらに、今日の生活で一日に一度

かな反射特性を示す新しいコレステリック液晶の合成に成は目にする液晶ディスプレイの中には直線偏光子が組み込

功した 1）。コレステリック液晶はキラルな液晶分子が平行まれているが、その保護フィルムとして、光学異方性がほ配列した層を有し、隣り合う層と連続的に回転することでとんどないセルローストリアセテートが採用されている。

全体として分子らせん構造を自発的に形成することができセルロースは、水と二酸化炭素を使った植物の光合成にる（図 1 ⒝）。このように、コレステリック液晶の分子らせよって作られる天然高分子である（図 1 ⒜）。地球表面の約ん構造は屈折率（誘電率）が周期的に変調しているので、液1 割は森林により覆われており、この森林、すなわち植物

晶の中に侵入した光は干渉を起こし、ブラッグの条件を満の質量の約 4 割はセルロースが占めていることからも、セ

たすある特定の波長領域の光だけが反射される。この光のルロースが地球上に最も豊富に存在する天然高分子である

反射現象は、ブラッグ反射と呼ばれている。この反射光のことがわかると思う。セルロースの化学構造は、β- グル

中心波長（λRef）は、コレステリック液晶の平均屈折率（nAv）と分子らせんピッチ（p）でおおよそ決定でき、ブラッグの法則を満たす次式で表すことができる。
λRef = nAv × p ……（1）Cellulose Derivatives with Permanently
Colorful Reflection Characteristics
Seiichi Furumi
Department of Applied Chemistry,
Faculty of Science, Tokyo University of
Science

分子らせんピッチが数百ナノメートルのコレステリック
液晶に白色光を照射すると、可視波長域に現れたブラッグ
反射を目で観察できる。流動性の高い低分子コレステリッ
ク液晶は温度、電場、磁場といった外部刺激によって分子− 52 −

カラフルな反射色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製

図1(a) セルロースとヒドロキシプロピルセルロースの化学構造式 .
(b) コレステリック液晶における分子らせん構造とブラッグ反射の模式図 .

らせんピッチを容易に伸縮することができるので、ブラッアセチルを用いた滴定によって 2 . 3 .であることを確認した 4）。

グ反射を任意にコントロールすることで反射型ディスプレ

エステル化反応で用いる溶媒と塩基は、和光純薬工業㈱製イ、光メモリー、レーザーへ応用できる

2 , 3）の脱水アセトンまたは脱水テトラヒドロフランと脱水ピリ。

本研究課題の目的は、地球環境や人体に優しいセルロー

ジンをそのまま用いた。

スに着目して、新しい架橋性セルロース誘導体の合成とフルカラーイメージング材料への応用である。不飽和二重結

2. 2. 測定合を有する官能基でセルロースの側鎖を化学修飾すると、赤外吸収スペクトルは、日本分光㈱製フーリエ変換赤ブラッグ反射が全可視波長領域で発現するだけでなく、光外分光光度計 FT/IR- 4600 により測定した。1 H-NMR ス

架橋反応を施すとカラフルな反射色を永続的に維持した固ペクトルは、BRUKER 製 ULTRASHIELD 400 PLUS を用

体膜になることを見出した。しかも、ある種の架橋性セル

いて測定した。HPC および HPC 誘導体の重量平均分子量

ロース誘導体はコレステリック液晶由来の反射色だけでな（MW）と分子量分布（MW/MN）は、東ソー製高速ゲル浸透ク

く、ゴム弾性も有したセルロース・コレステリック液晶エ

ロマトグラフィー（GPC）システム HLC- 8220 GPC を使用

ラストマー膜（以降、「セルロース液晶エラストマー膜」とし、テトラヒドロフランを溶離液として用い測定した。標呼ぶ）になることがあり、圧力や凹凸のセンシングへの応

準スチレンの検量線を基準として、MW と MW/MN の値を用も実証することができた。

換算した。

2. 方
2 . 1. 試

液晶セルの透過スペクトルは、Ocean Optics 製 HALOGEN

法

LIGHTSOURCE HL-2000 を光源ランプとして液晶セルに料

法線方向から照射し、2 枚のアクロマティック集光レンズで集光

図 1 ⒜に示すようなヒドロキシプロピルセルロース
4（HPC；MW：2 . 8 × 10 ；MW/MN：1 . 6）は和光純薬工業㈱1製を用いた。 H-NMR 測定から HPC の β- グルコースモ

した透過光を Ocean Optics 製小型分光器 USB 2000 +で透過スペクトルを測定した。液晶セルの温度は、METTLERTOLEDO 製ホットステージ HS 82 で制御した。

ノマーユニットにおけるヒドロキシプロピル基の平均数（MS）は 4 . 0 であり、モノマーユニットにおける置換され

2 . 3 . HPC 混合エステルの合成

たヒドロキシ基の平均数（DS）はイソシアン酸トリクロロ− 53 −

HPC 混合エステルは、次に述べるような簡便な方法でコスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

合成した 1）。

以下の温度領域で鮮やかなブラッグ反射を示す新しいコレ

たとえば、HPC プロピオニル・ブチリル混合エステル

ステリック液晶の創製を目指した。

（HPC-Pr/Bu）の合成では、減圧下、50 ℃で 12 時間以上

HPC に 塩 化 プ ロ ピ オ ニ ル や 塩 化 ブ チ リ ル と い っ た

乾燥した HPC 3 . 0 g を三口フラスコに秤量し，脱水アセト

種々の酸塩化物と反応させて、図 2 のようなさまざまなン 50 mL に撹拌しながら溶解した。このとき，β- グルコ

HPC-R’ エステルを合成した。1 H-NMR スペクトルから、ースモノマーユニットにおけるヒドロキシ基のモル数はHPC 混合エステルにおける 2 種類の官能基のエステル化

MS 値から 23 mmol と計算することができる。脱水ピリジ度を算出することができる。HPC における一つのグルコン 3 . 7 mL（46 mmol）を入れた後、塩化ブチリル 1 . 2 mLースユニットには 3 つのヒドロキシ基が存在しているので、（12 mmol）を加えた。55 ℃のオイルバス中で 4 時間反応さ理論的にはそれぞれのエステル化度の総和は 3 . 0 になるはせた後、塩化プロピオニル 2 . 6 mL（30 mmol）を加え、さずであるが、1 H-NMR スペクトルにおける積分値を使っらに 20 時間反応させた。反応終了後、反応溶液を 1 . 0 L のたエステル化度の算出値には約 0 . 1 の誤差が生じることが超純水に投入し、白色の生成物を得た。超純水で生成物ある 1）。

の洗浄を 2 回行った後、乾燥した。引き続き、少量のアセトンで生成物を溶解した後、1 . 0 L の超純水に再析出した。

3 . 2 . HPC 混合エステルの温度による反射特性変化

生成物を超純水で洗浄した後、乾燥することで、HPC プ

2 枚のガラス基板に HPC-R’ エステルを挟み込むことでロピオニル・ブチリル混合エステル（HPC-Pr/Bu）を得た。

液晶セルを作製し、温度を変化させながら透過スペクトル

同様の合成手順で、他の HPC 混合エステルも合成した。

を測定した。図 3 ⒜は、HPC をプロピオニル基単独で十分にエステル化した HPC プロピオニルエステル（HPC-Pr；

2 . 4 . 液晶セルの作製

PrE= 2 . 97）の透過スペクトルの変化である。HPC-Pr の液液晶配向膜材料は Aldrich 製ポリビニルアルコール
（PVA；
4

4

晶セルを 90 ℃に加熱すると、紫外波長領域である 390 nm

MW：1 . 3 × 10 〜 2 . 3 × 10 ，87 〜 89 % hydrolyzed）を用付近にブラッグ反射のピークを観察することができた。そい、1 . 0 wt% 水溶液を調製した。Active 製スピンコーターの後、10 ℃ずつ昇温すると、ブラッグ反射の波長は連続

ACT- 220 D II を用いてスライドガラスに 1 . 0 wt% PVA 水

的に長波長側にシフトし、緑色の 500 nm を経て、130 ℃

溶液を 800 rpm で 4 秒間，続けて 2000 rpm で 7 秒間スピでは赤色の 620 nm までシフトした。これは、HPC-Pr はン塗布した。その後、キュプラで巻いた棒を用いて PVA

サーモトロピックなコレステリック液晶特性を示し、昇温塗布基板の表面を一軸方向に 10 回擦り、ラビング処理をすることで分子らせんピッチが伸張し、これに付随して反施した。110 ℃から 120 ℃に加熱したホットステージ上

射波長が長波長シフトしたと解釈できる。一方で、プロ

で、2 枚のラビング処理 PVA ガラス基板の間に 200 µm のピオニル基よりも炭素数が一つ増えたブチリル基単独でPTFEスペーサーとともにHPCエステルを挟んだ。さらに、十分にエステル化した HPC ブチリルエステル（HPC-Bu；

せん断配向処理を施すことで、均質に配向した液晶セルを

BuE= 2 . 95）では、可視波長のブラッグ反射が現れる温度得た。

は HPC-Prよりも低い 70 ℃から 120 ℃になり、さらに、ブラッグ反射波長のシフト範囲は拡大し、480 nm から 780 nm

3 . 結果と考察の波長範囲でシフトすることがわかった（図 3 ⒝：●）。

3 . 1. HPC 混合エステルの合成と構造解析

この実験結果を踏まえて、HPC 側鎖をプロピオニル基

本研究者らは HPC の側鎖を化学修飾することで、100 ℃

図2とブチリル基の 2 種類の官能基を異なるエステル化度で混ヒドロキシプロピルセルロースのエステル化物の化学構造式 .

− 54 −

カラフルな反射色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製合修飾した HPC-Pr/Bu 混合エステル（PrE：BuE= 1 . 56：

してわずか 4 . 7 % のコレステリル基をエステル化で導入し、

1 . 41，PrE：BuE= 0 . 45：2 . 49）を合成して、温度変化に残りをプロピオニル基で化学修飾した HPC 混合エステル

よるブラッグ反射の波長シフトを調査した。その結果、単について昇温過程における透過スペクトルを測定すると、

独で官能基をエステル化した HPC-Pr（図 3 ⒝：◯）と30 ℃から 80 ℃の比較的低い温度範囲においてブラッグ反HPC-Bu（図 3 ⒝：●）の反射波長シフトの間の値を保ち射を観察することができた 1）。しかも、温度を変えることながら、HPC-Pr/Bu 混合エステルの反射波長はシフトしで、ブラッグ反射のピーク波長は 400 nm から 800 nm の全た（図 3 ⒝：■，□）。したがって、HPC 側鎖をプロピオ

可視波長域で連続的にシフトすることも見出した。

ニル基とブチリル基を有する 2 種類の酸塩化物でエステル
射のピーク波長はシフトすることがわかった。さらに、図3 . 3 . 架橋性 HPC 誘導体によるフルカラーイメージ
ング

3 ⒝の実験結果を詳しく考察すると、一定温度におけるブ

前述のように、鎖長の異なるアルキル基で混合エステル

ラッグ反射の波長は、ブチリル基の導入量が増加するにつ化した HPC 混合エステルは、その化学構造を最適化する

れて長波長側に現れた。この実験結果から、HPC をエスと 100 ℃以下の比較的低い温度範囲で可視波長のブラッグテル化する酸塩化物のアルキル鎖長が長い程、コレステリ

反射が現れた。しかし、当然ながら、ある温度に加熱してック液晶の分子らせんピッチを拡大していると推察できた。

観察できたコレステリック液晶由来の反射色は、異なる温化することで、それらが相分離を起こさずに、ブラッグ反

実際に、図 2 ⒜の R’の官能基として、分子的に嵩高く、度にすると変色してしまう。そこで、図 2 ⒜のようなコン

かつ分子キラリティーを有するコレステリル基を導入したセプトで、HPC 混合エステルの官能基として不飽和二重HPC 混合エステルを合成した。HPC のヒドロキシ基に対結合を有するアクリロイル基を導入することで、ポリマー
ネットワーク間における架橋反応を利用してコレステリッ
ク液晶の反射色の固定化を試みた。
たとえば、図 4 ⒜に示すように、側鎖の一部をアクリロイル基で残りをブチリル基で混合エステルした架橋性セル
ロース誘導体、すなわち HPC-Ac/Bu 混合エステルを合成した。アクリロイル基とブリチル基の混合比で異なるが大半の HPC-Ac/Bu では、30 ℃から 110 ℃の温度範囲において、400 nm から 800 nm の全可視波長領域におけるブラッグ反射を示した。しかも、HPC-Ac/Bu をコレステリック
液晶相温度に加熱しながら紫外線を照射すると、誘導体側鎖のアクリロイル基間で光架橋反応が進行し、コレステリック液晶由来の分子らせん構造、すなわち反射色を永続的に固定化できることを発見した。また、アクリロイル基の導入量が多い HPC-Ac/Bu では 100 ℃程度に加熱し続けると、アクリロイル基間で熱架橋反応が起き、分子らせん構
造を固定化できた。一方、アクリロイル基の導入量が比較的少ない HPC-Ac/Bu では、一度、100 ℃程度に加熱した後に降温しても、ブチリル基の導入量が多いことでアクリロイル基の過度の架橋反応を抑制し、反射波長は可逆的に短波長シフトすることも見出した。
この現象を利用すると、図 4 ⒝に示すように、架橋性セルロース誘導体を用いて多種多様なフルカラーイメージン
グを作製することに成功した。まず、架橋性セルロース誘導体の液晶セルをある液晶相温度に加熱しながらフォトマ
スクを通じて紫外線を照射し、フォトマスクのパターンを

図 3 （a）HPC-Pr（PrE=2.97）の液晶セルを 90℃から 130℃に昇温した時の透過スペクトル変化．
（b）HPC-Pr エステル（○：PrE=2.97）、HPC-Bu エステル（●：BuE=2.95）、HPC-Pr/
Bu 混 合 エ ス テ ル（ □：PrE：BuE=0.45：2.49, ■：PrE：
BuE=1.56：1.41）における反射ピークの温度依存性 .

ある反射色で固定した。続いて、異なる液晶相温度にして全体に紫外線を照射することで、先のパターンの色とは異なる反射色の背景などを創り出すことができた。このように、架橋性セルロース誘導体はブラッグ反射特性で赤・緑・− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

たとえば、初期状態で赤色の反射、すなわち約 630 nmの反射波長を示すセルロース液晶エラストマー膜を用意して透明なプラスチックスプーンで押しつけると、興味深い
ことに、圧縮した部分だけが赤色から緑色の反射に変化した。このときの反射波長は約 480 nm であった。しかも、押しつけていたスプーンを膜表面から取り去れば、緑色の反射は初期状態の赤色に直ちに戻った。圧縮と解放を繰り返しても、この反射色の変化は可逆的であることも確認した。この現象は、機械的圧力によってセルロース液晶エラ
ストマー膜の膜厚を縮めたことで、コレステリック液晶の分子らせんピッチ（p）も同時に収縮し、式（1）にしたがってブラッグ反射の中心波長（λRef）が短波長側にシフトしたと推察できる。
この現象を利用すると、物体表面の凹凸を可視化することができた 7 - 9）。たとえば、黒いゴムシート上にセルロー
ス液晶エラストマー膜を作製し、10 円硬貨の表面上にこの黒いゴムシートを載せた。圧縮前は赤色の反射を示したが、透明なアクリル板を介してセルロース液晶エラストマ
ー膜を圧縮すると、図 4 ⒞のように 10 円硬貨の表面上に刻まれた数字や模様が緑色の反射として浮かび上がり、物
体表面の凹凸を可視化することができた。なお、10 円硬貨の表面上の凹凸の高さの差はおおよそ 100 µm である。
今後、セルロース液晶エラストマー膜をさらに最適化すれば、より微細な表面の凹凸を可視化することができるはずである。
本研究で発見したセルロース液晶エラストマー膜をトン
ネルや高速道路の外壁などに貼り付ければ、外壁にクラッ
クや歪みなどが生じたときに反射色が瞬時に変化するので、いち早く崩落の危険性を視覚的に察知することができる。
図 4 (a) 架橋性セルロース誘導体である HPC-Ac/Bu 混合エス
テルの化学構造式 . (b) 架橋性セルロース誘導体によるフルカ
ラーイメージングフィルム . (c) 架橋性セルロース誘導体を用いた物体表面上の凹凸の可視化 . 圧縮前、赤色の反射を示すフィ
ルムに 10 円硬貨を押し付けると、緑色の数字と模様が浮かび上がり、10 円硬貨表面のわずかな凹凸を反射色の変化で可視化できる．

さらに、人体の表面に貼り付ければ、ウェアラブルセンサーとして活用でき、脈拍や血圧などリアルタイムでモニターができる可能性がある。これらに加えて、圧電素子を使えば、簡便で低環境負荷な反射型フルカラーディスプレイ
への応用も期待できる。

4. 総

括

青の「光の三原色」を表現でき、光照射による架橋反応を利

本報告では、セルロースを原料にしたコレステリック液

用することでフルカラーイメージングを実証することがで晶の創製とフルカラーイメージングや凹凸センシングへのきた 5）。

応用について紹介した。
本発表者らは低環境負荷なセルロースに着目して、セル3 . 4 . 架橋性 HPC 誘導体による凹凸センシング

ロースの側鎖を適切な官能基で化学修飾すると、100 ℃以

前述した架橋性セルロース誘導体のさらなる特長として、下という比較的低い温度領域で鮮やかなブラッグ反射を示

ブラッグ反射特性のみならずゴム弾性を有したセルロース

す新しいコレステリック液晶を創製することができた。さ液晶エラストマー膜になることが挙げられる。2 枚のガラ

らに、ある種の架橋性セルロース誘導体は全可視波長領域、

ス基板の間で作製したセルロース液晶エラストマー膜を 2すなわち赤・緑・青でブラッグ反射を示し、加熱しながら枚のガラス基板から剥離すると、この膜は反射色を保ちつ

光架橋反応を起こせば、フルカラーイメージングへの応用

6）

つゴム弾性も有していた 。

も実証することができ、今後、人体に優しい化粧品の色材− 56 −

カラフルな反射色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製への応用を目指す。しかも、これだけでなく、機械的な圧力を加えることで反射色が変わるセルロース・コレステリ（引用文献）
1） T. Ishizaki, S. Uenuma, and S. Furumi, Kobunshi
Ronbunshu, 72, 737（2015）．

ック液晶エラストマー膜になることも発見し、物体表面の

2） S. Furumi, Chem. Rec., 10, 394（2010）．

凹凸センシングも可能であった。

3） S. Furumi, Polym. J., 45, 579（2013）．
謝辞4） M. Fukawa and S. Furumi, EKISHO, 22, 214（2018）．

ここで紹介した研究は当研究室のメンバーの協力による

5） https://www.nikkan.co.jp/articles/view/00495823.

成果であり、メンバー各位に心よりお礼を申し上げます。

6） 古海 誓一 , 鈴木 花菜 , 石﨑 拓郎 , 特願 2016-186266.

また、本研究課題を遂行するにあたり、公益財団法人コス7） 古海 誓一 , 鈴木 花菜 , 府川 将司 , 特願 2018-014066.

メトロジー研究振興財団のご支援を頂きましたことに深謝

8） 古海 誓一 , 府川 将司 , 鈴木 達也 , 鈴木 花菜 , 特願
2018-063259.

を申し上げます。

9） 古海 誓一 , 鈴木 花菜 , 府川 将司 , 早田 健一郎 , 古川
真実 , 青木 瑠璃 , 川口 茜 , PCT/JP2019/003267.

− 57 −

アミノ化合物によるナノ結晶（粒子）の成長抑制技術の開発
山形大学大学院理工学研究科

増原陽人
Recently, the demand for cosmetics combined with nanomaterials is increasing to realize the quality that consumer’s
needs. By achieving the nano-sized materials for cosmetics, it is expected that stretchability, texture, and transparency will
be improved in cosmetic efficacy and their nano-sized cosmetics enable to bring the active ingredient to the dermis. On theother hand, fullerene (C 60 ) is greatly expected to be used for cosmetic products owing to its antioxidant effects for humanskins. In order to maximize the antioxidant effect, down-sizing of C 60 is an effective way to penetrate C 60 molecules into thedermis through the skin. Various techniques have been reported for preparing nanosized C 60 crystals, however considering
the penetration into the skin, a technique without using a surfactant is required. We have already succeeded in suppressing
crystal growth of C 60 nanocrystals by using amine compounds in the reprecipitation method which is a simple andconvenient method to prepare the nano-sized various organic crystals under the atmosphere. And we have already prepared
the many kinds of organic nanocrystals by the method and also controlled crystal sizes and shapes. However, the suppression
mechanism of C 60 crystal growth by amine compounds is not clear. Thus, in this study, it was found that carbamino
compounds produced by the reaction of amino solvents and carbon dioxide play an important role in the suppression of
crystal growth. By TGA and IR analysis of the obtained nanocrystals, it was revealed that C 60 and a compound with acarbamino compound suppress aggregation between C 60 nanocrystals.

1. 緒素の反応を利用することで、C 60 ナノ結晶の結晶成長抑制

言が可能であることを偶然発見した。具体的には、再沈法に

ここ数年、ナノマテリアルを配合した化粧品の数は増加おける任意の良溶媒・貧溶媒を用いて C 60 ナノ結晶分散液傾向にある。ナノサイズにすることにより、伸び、広がりを作製し、その直後に（S）-（−）- 1 -phenylethylamine を添

やすさ、感触、透過性等の向上が期待できることに加え、加することで、結晶成長が抑制された（図 3）。この結晶成

角層を越え真皮にまで有効成分を到達させることが可能な長抑制効果は、二酸化炭素を排除したグローブボックス中ことが理由である（図 1）。本研究では、化粧品における有での検討では確認できない（図 4）ことから、本抑制効果は、

効成分の到達領域を決める重要な要素である精緻な有効成分のサイズ制御を目的とする。
有効成分として、ビタミン C の 172 倍の抗酸化機能及びその効果が 12 時間を超える等の高い持続性に特徴を有す
る C 601 , 2）を選定した。ナノ化対象化合物とした C 60 は、これまでにも、我々が扱ってきた物質であり、知見も深い。
この C 60 を、これを極めてシンプルなナノ結晶作製手法である “再沈法 3 , 4）” により、精緻なナノ結晶のサイズ制御を試みた（図 2）
。本手法にアミノ化合物を添加し、従来、ナノ結晶サイズの制御に必須であった界面活性剤を導入する

図1

ナノ化により、肌の奥へ有効成分が到達ことなく、目的とするナノ結晶を所望のサイズで直接作製する技術を開発する。一般的に、ナノ化対象化合物が結晶性化合物である場合、結晶成長速度が速いため、目的サイズのナノ結晶を得るには、結晶成長を如何に抑制するかがポイントとなる。我々は最近、アミノ化合物と二酸化炭

Development of techniques suppressing
c r y st a l g r ow t h for n a no c r y st a l s（particles）using amines
Akito MasuharaG r a du a t e S c h o o l o f S c i e n c e a ndEngineering, Yamagata University− 58 −

図2

再沈法の概略図

アミノ化合物によるナノ結晶（粒子）の成長抑制技術の開発

図3

図4

大気下での再沈直後と 2 日間静置後の C60 ナノ結晶
（S-（−）-1-phenylethylamine/acetonitrile）

グローブボックス内での再沈直後と 2 日間静置後のナノ結晶（S-（−）-1-phenylethylamine/acetonitrile）（S）-（−）- 1 -phenyl-ethylamine と空気中や分散液中に溶

象化合物、アミン系溶媒と二酸化炭素の 3 物質の有無の条存している二酸化炭素が反応したことにより生成する白色件下で作製したナノ結晶の内部及び表面の構造を比較す化合物が要因である可能性が高い。この白色化合物は、カる。C 60 ナノ結晶のサイズ・形状測定には走査型電子顕微

ルバミノ系化合物の一種であると思われるが、詳細な化学鏡（SEM：Scanning Electron Microscope，JSM 6 7 0 0 M/

組成等に関して未解明である。これら生成した白色化合

JEOL）を用いた。試料は、再沈後に得られた分散液をメ

物の化学組成等を明らかにし、ナノ結晶の結晶成長抑制効

ンブレンフィルター上に通して吸引濾過した後、導電性カ果の要因を解明し、ナノ結晶サイズを精緻に制御できれば、ーボンテープで試料台に固定した。また、測定試料のチャ

所望のサイズのナノ結晶を簡便且つ迅速に作製でき、化粧ージアップ現象発生を防ぐ為、オートファインコーター

品は当然のこと、他の有機化合物へも応用が可能となり、（JFCM- 1600 /JEOL）を用いて白金によるスパッタ処理

今後のナノ結晶の応用範囲拡大への大きな一助となる。

（10 nm）を行った。（測定条件：真空下、加速電圧：15 kV、2. 方

放出電圧：10 A）法

ナノ結晶の結晶成長抑制効果の要因を解明する為、以下

2 . 3 . 成長抑制原因物質の同定

2 . 1 . 〜 2 . 3 . に簡単な本研究における研究方法を示す。

再沈法における導入溶媒に、200 µl のアミン系溶媒を加えた混合溶媒に対し、所定量の二酸化炭素を溶解、反応さ2 . 1. 結晶成長抑制作用の検討

せ、生成物を固体 NMR 等にて評価し、生成化合物を同定

結晶成長抑制効果が見込まれるアミン系添加試料に着する。IR スペクトルの測定には、フーリエ変換赤外分光光

目し、4 種のアミン系溶媒（R-（+）- 1 -phenylethylamine，度計（FT-IR：Fourier Transform Infrared Spectroscopy，

2 -phenylethylamine，N- 1 -methylaniline，aniline）を用

IRPrestige- 21 /SHIMADZU）を用いた。測定法は KBr 錠

いて、C 60 ナノ結晶を作製し、アミノ化合物と二酸化炭素剤法、ATR 法で行った。熱重量減衰の測定には熱重量測の反応により生成する化合物の結晶成長面への付着によ定装置（TGA：Thermo Gravimetry Analyzer，TG/DTAる抑制効果を検討する。作製した C 60 ナノ結晶の表面解析、

6200 /SII）を用いた。白金パンを用い、窒素雰囲気下で上生成化合物の同定等により、抑制因子の解明を進める。

限 900 ℃まで温度を上げて測定を行った。また下記手順にて、測定サンプルを作製した。まず、C 60（80 mg）
を S-（−）

2 . 2 . 形状解析

- 1 -phenylethylamine（100 ml）中に投入し溶液を作製し 4

C 60 ナノ結晶を分散液より回収・解析し、ナノ結晶化対

日間攪拌した。次いで、エバポレーターを用いて大部分− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019の溶媒を除去し、タール状の物質を得た。methanol を注
ぎ遠心分離にかけて上澄み（S-（−）- 1 -phenylethylamine，
methanol）と沈殿物に分離させた。沈殿物を乾燥させ、茶褐色の粉末を得た。この茶褐色粉末を toluene に投入し、再び遠心分離にかけ、上澄み（C 60 ，toluene）と沈殿物に分離させた。その後、乾燥させ黒色粉末を得た。

3 . 結果と考察
3 . 1. カルバミノ系化合物の生成が C 60 ナノ結晶の結晶成長抑制作用に与える影響
再沈法における最適な良溶媒・貧溶媒種の組み合わせに関して、鋭意検討中であるが、S-（−）-1-phenylethylamine
を添加剤としてではなく、良溶媒として導入した場合でも貧溶媒に methanol, ethanol を選択した場合、再沈直後から結晶成長が抑制できることを確認した。この条件に

図 5 用いた良溶媒の構造式（a）R-(+)-1-phenylethylamine（b）2-phenyl-ethylamine（c）N-1-methylaniline（d）anilineて析出するナノ結晶の分子量を測定すれば、C 60 とS-（−）-1-phenylethylamine 間の化学結合・修飾 2）状態を明らかにできる。そのため、ナノ結晶の質量分析を行ったところ、
C 60 と S-（−）-1-phenylethylamine の間に化学結合・修飾 2）の有無の確認を行った。しかし、得られた MS スペクトルから確認できた分子量は C 60 のみであり、化学結合は確認できず、C 60 と S-（−）-1-phenylethylamine との相互作用- 1 -phenylethylamine と同様に顕著に結晶成長抑制効果をの特定には未だ至っていない。

発揮する。これらアミノ系溶媒の検討により、アミノ化合

そこでまず、二酸化炭素とアミノ系化合物が反応し生成するカルバミノ系化合物による結晶成長抑制効果を検討す

物と二酸化炭素から生成するカルバミン酸塩が結晶成長抑制の重要因子である可能性を見出した。

るため、SS-（−）-1-phenylethylamine と類似した分子構し、その後、条件等を相互比較することで、結晶成長抑制

3 . 2 . カルバミノ系化合物が修飾した C 60 ナノ結晶の溶解性作用の解明を試みた。S-（−）-1-phenylethylamine と類似

代表的な C 60 誘導体である PCBM（テトラヒドロフラ

した分子構造を有するアミノ系溶媒として、（a）R-（+）

ン［6 , 6］-Phenyl-C 61 -Butyric Acid Methyl Ester（ フ ェ- 1 -phenylethylamine，（b）2 -phenylethylamine，（c）

ニル C 61 酪酸メチルエステル））5） が、C 60 とは全く異な

N- 1 -methylaniline,（d）aniline を選定した（図 5）。その結る溶解挙動を示しことを参考に、カルバミノ系化合物修果、aniline，N- 1 -methylaniline では、結晶成長抑制効果

飾 C 60 ナノ結晶の溶解性を評価した。溶解性の検討とし造を持つ新たな 4 種の溶媒を使用し、C 60 ナノ結晶を作製が確認できない一方、（a）R-（+）- 1 -phenylethylamine，（b）て、試料として 2 . 3 . の手順で得た黒色粉末、溶媒として

2 -phenylethylamine で は、R-（+）- 1 -phenylethylamine

Tetrahydrofuran（THF）を用いて検討を行った。純粋なと同様に、結晶成長抑制効果が確認でき、用いるアミノ系

C 60 の THF に対する溶解度は、0 . 000 mg/ml である。その溶媒の級数や二酸化炭素との反応性が結晶成長抑制作用ため、図 6（左）に示すように、THF に溶解することなく、に著しく寄与するといえる。アニリンでは、電子供与性沈殿物が生じる。一方、黒色粉末を THF に添加したところ、であるアミノ基が芳香環に直結していると N 原子上の非黒色粉末は溶解し、茶色を呈する溶液となり、明らかに溶

共有電子対の電子が芳香環に供与されることで、アニリ解性を示している。これにより、カルバミノ系化合物修飾

ンが共鳴構造をとり安定化することが知られている。そC 60 ナノ結晶が、PCBM 同様に、溶解性が向上し、THF にのため、二酸化炭素との反応が低下し、カルバミン酸系

溶解し易くなったためであると考えられる。

化合物は生成しないと考えられる。その結果、C 60 と相散液中に存在せず、結晶成長は抑制されない。その一3 . 3 . カルバミノ系化合物とC 60 ナノ結晶との化学結
合方、二酸化炭素と反応しカルバミン酸系化合物を生成する

C 60 ナノ結晶とカルバミノ系化合物間の化学結合を評価

phenylethylamine や benzylamine を用いた場合、R-（+）

するため、2 . 3 . の手順で得た黒色粉末を使用し、FT-IR

互作用し得るカルバミン酸系化合物が、ナノ結晶成長分− 60 −

アミノ化合物によるナノ結晶（粒子）の成長抑制技術の開発の測定を行った。FT-IRによる測定の結果を図 7 に示す。C 60
由来のピークは 525 cm- 1，575 cm- 1，1180 cm- 1 , 1427 cm- 1，
1538 cm- 1 の 5 つであるが、黒色粉末では 525 cm- 1 のみが確認できた。これは純粋な C 60 が大幅に減少した、あるいはなくなったことを示している。低波数側のピークのみが確認できるのは、C 60 の誘導体としてよく知られている
PCBM と同様 1）である（図 8）。また、1722 cm- 1 に新しく
カルボニル -C=O のピークが出現している。カルボニルの出現はアミノ化合物と二酸化炭素との反応によるものだと 考 え ら れ る。 ま た、S-（-）- 1 -phenylethylamine で は
図 6 THF に対する溶解性（左：C60，右：S- （−） -1-phenylethylamine_C60）

3300 cm- 1 付近にあった２本の NH 伸縮が黒色粉末では１本になっている。これは、アミノ基 -NH 2 が何かと結合し、-NH になったことが理由だと考えられる。

（赤）：S-(-)-1-phenylethylamine 修飾 C60（青）：S-(-)-1-phenylethylamine（黒）：C60 pristine

図7

図8

FT-IR スペクトル

PCBM の FT-IR スペクトル− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 4 . カルバミノ系化合物の C 60 ナノ結晶への修飾が重量減衰に与える影響
カルバミノ系化合物の C 60 ナノ結晶への修飾が、重量減を確認できないのは、代表的な C 60 誘導体である PCBM と同様の挙動 2）である。

黒線が C 60、赤線が黒色粉末の重量減衰曲線である。C 60

3 . 5 . カルバミノ系化合物によるC 60 ナノ結晶の結晶成長抑制メカニズムに関しては 800 ℃で大きな重量減衰を確認することができ

カルバミノ系化合物修飾 C 60 ナノ結晶の溶解挙動、化学る。一方、黒色粉末では、確認できない。また、黒色粉結合および重量減衰の評価を元に、カルバミノ系化合によ

末の 300 ℃付近までの減衰は残留溶媒、それ以降の減衰は、る C 60 ナノ結晶の結晶成長抑制メカニズム（図 10）を提案す

衰に与える影響を評価した。図 9 に得た TGA 曲線を示す。

カルバミノ系化合物修飾 C 60 ナノ結晶の減衰に由来するとる。はじめに、C 60 とアミン化合物が反応し、化学結合を考えられる。また、C 60 同様に、800 ℃で大きな重量減衰形成する。C 60 とアミン化合物の化学結合後、アミノ基が図 9 PCBM の TGA 曲線（赤）：S-(-)-1-phenylethylamine 修飾 C60（黒）：C60 pristine

図 10

カルバミノ系化合物による C60 ナノ結晶の結晶成長抑制メカニズム− 62 −

アミノ化合物によるナノ結晶（粒子）の成長抑制技術の開発

二酸化炭素と反応し、カルバミノ系化合物と C 60 ナノ結晶される。本研究で明らかにした成長抑制因子の特定は、再との新しい C 60 誘導体が生成すると考えられる。この反応

沈法を用いたナノ結晶の精緻なサイズ制御を多くの有機化

が、C 60 ナノ結晶表面で起こり、立体障害により、C 60 ナ合物で達成にも応用できると考えている。
余計な操作、化合物を使用することなくナノ結晶のサイ

ノ結晶の結晶成長が抑制されると考えられる。

4. 総

ズを精緻に制御できれば、化粧品における添加剤使用量の括削減に繋がり、本来所望する効果発現を増大させるだけで本研究では、高い抗酸化作用を有し化粧品への応用が期待される C 60 を対象に、界面活性剤フリーでの C 60 ナノ結

なく、添加剤による生体への悪影響も減少させることが可能と考える。

晶作製技術の開発を目指し、C 60 ナノ結晶の結晶成長抑制
メカニズムを検討した。電子顕微鏡を用いて、C 60 ナノ結晶成長抑制効果を有するのは、アミノ基が芳香環に直結し（引用文献）
1） 篠原久典 , 齋藤弥八 , “フラーレンの化学と物理” , 名古屋大学出版会（1997）．

ていないアミノ化合物であり、大気下でカルバミノ系化合物を形成するアミン系溶媒であることを明らかにした。ま2） 谷垣勝己 , 菊地耕一 , 阿知波洋次 , 入山啓治 , “フラーレた、アミノ化合物と二酸化炭素が反応し生成するカルバミ

ン ~ 魅惑的な新物質 群、C60 とその仲間達 ~” , 産業図

ン酸化合物が C 60 ナノ結晶の成長抑制に関わっている可能書（1992）．

性を見出した。結晶成長抑制された C 60 ナノ結晶（黒色粉3） E. Kwon, H. Oikawa, H. Kasai and H. Nakanishi,
Cryst. Growth Des., 7, 600（2007）．

末）の溶解性、化学結合、重量減衰挙動を評価することにより、次に示す C 60 ナノ結晶の結晶成長抑制メカニズムが

4） H. Kasai, H. S. Nalwa, H. Oikawa, S. Okada, H.

提案できる。はじめに、C 60 とアミノ化合物が化学結合を

Matsuda, N. Minami, A. Kakuta, K. Ono, A. Mukoh and形成し、アミノ化合物のアミノ基部分と二酸化炭素が反応

H. Nakanishi, Jpn. J. Appl. Phys. 31, L1132（1992）．

し、カルボニル基を持つ C 60 誘導体が形成する。この反応

5） K. Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 1193（1993）．

が C 60 ナノ結晶表面の至る所で生じ、立体障害が大きくな

6） 松尾豊 , “有機薄膜太陽電池の科学” , 化学同人
（2011）．

る結果、他の C 60 分子間の接近を阻害し、結晶成長が阻害− 63 −

マイコスポリン様アミノ酸誘導体の電荷共鳴吸収を基盤とする
新規天然由来サンスクリーン材料
大阪大学大学院工学研究科

森直The UV-protective ability of mycosporine-like amino acids (MAAs) has been well documented, but not much explored
nor investigated. Indeed, this effect is believed to serve as a protecting capability of marine organisms from solar radiation.
Nevertheless, the effective UV absorption by MAAs has not been easily correlated to neutral MAA structures. In this study,
the origin of UV-protecting ability of MAAs was elucidated by experimental spectroscopy and theoretical investigations.
The absorption maxima of mycosporine-related molecules in the UVA region were practically unaffected over a wide
range of pH 4 - 10 and only slightly blue-shifted at pH 1 - 2 . It was revealed that the zwitterionic nature of the aminoacid residue facilitates the protonation to the chromophoric 3 -aminocyclohexenone and 1 -amino- 3 -iminocyclohexene
moieties and the operation of the charge resonance in the protonated species well accounts for their allowed low-energy
transitions in the UVA region. The theoretical calculations for the protonated forms well reproduced the observed transitionenergies and oscillator strengths of MAAs with slight systematic overestimations. This study clearly demonstrated that the
3 -aminocyclohexenone as well as 1 -amino- 3 -iminocyclohexene moieties, which are readily protonated at a wide range ofpH, are responsible for the UV-protective ability of aqueous solution of MAAs. Based on these considerations, together withthe study on the stability and photoliability of the species, we further tried to develop the novel sunscreens that absorb in the
different wavelength that covers whole the UVA regions.

1. 緒

言

紫外線（UV）は、急性皮膚反応や皮膚がんなどを誘発することが知られており、特に太陽光の大半を占める UVA（320 ～ 400 nm）は、天候に関わらず年中一定量が地表に達するため、また、ガラスをも透過して室内に侵入することが問題となっている。したがって、「日常的な UVA からの保護」が社会的ニーズとなってきている。国内外において、様々な種類の UV 防御剤（サンスクリーン）が市販されているが、現行製品は、主に芳香族系合成有機化合物が使用されており、

図1①光励起によるメラニンの生成、付随するかゆみやアレ
ルギーの誘発の問題②合成化学物質が化粧品に利用されることによる消費者

な吸収材となることが古くより知られている。MAA は海産藻類が産することが知られていたが、天然からはごく微

イメージの悪化量しか得ることができず、またいわゆる有機合成的手法に③光安定性・分解物の副作用などの問題などの課題が残っている。一方、サンスクリーン市場は国よる生成は困難であった。ところが最近、遺伝子組換放線

内だけで 340 億円にも達しており、国外市場も考えると、菌を用いた生物学的合成（微生物による合成）により、代表

その改善策を確立することができればコスメトロジーに与的な MAA であるシノリンの大量生産が可能となり、工業

えるインパクトは極めて大きいものと考えられる。

化への展望が開けた。しかしながら、サンスクリーンとしマイコスポリン様アミノ酸（MAA、図 1）は芳香族基をての製品化やさらなる開発・改良に必要とされる MAA の有しない天然物であり、UVA 2（320 ～ 340 nm）の効果的

物性研究は、ほとんどなされていないのが現状である。まNew Natural Sunscreens based on
Biologically Produced Mycosporine-like
Amino Acids through their Efficient
Charge Resonance Absorption

UVA 1（340 ～ 400 nm）といった全波長領域の紫外線をカ

Tadashi Mori

本研究では、MAA に特徴的な吸収機構を解明し、それをDepartment of Applied Chemistry,
Graduate School of Engineering, Osaka
University

た、シノリン単独の素材のみで UVB（280 ～ 320 nm）やバーすることはできないため、MAA の吸収機構を活用した、より広範なサンスクリーン剤の開発が望まれている。
活用することで類縁体構造を有するこれら波長域の新たな
紫外線吸収材の開発を行い、これまでの有機系サンスクリ− 64 −

マイコスポリン様アミノ酸誘導体の電荷共鳴吸収を基盤とする新規天然由来サンスクリーン材料

ーンに置き換わる、天然由来の新規サンスクリーン材を開ル吸光係数の向上と、他の波長領域（UVB や UVA 1）に大発することが目的である。

きな吸収能を有する化合物の設計および開発が必要である。

2. 方

量子化学計算を用いる分子構造・スペクトル予測を活用し法

た先述の方法論により、合理的なターゲット誘導体を提案

本課題では新規な天然由来 UV 防御材（サンスクリーン）し、高機能材料の開発スピードの向上に結び付ける。

の開発にあたり、主として次に挙げる３つの目標を定めて研究を進めた。

2 . 1. マイコスポリン様アミノ酸（MAA）誘導体の吸収機構の解明
・各種分光測定に加え、最先端の量子化学計算を併用し、

2 . 3 . MAA 誘導体の分解挙動、物性研究を鍵とする
人体に優しいサンスクリーンへの展開
・熱、酸素などに対する安定性を精査し、分解様式の特定を進める。
・分解物に関し各種分光学的手法を用いてその物性を明らかにする。

通常では容易に理解できない MAA の吸収メカニズムを・種々の要因による分解機構を解明、フィードバックし、解明し、以下の研究に資する理論的基盤を得る。

より安定な誘導体を設計する。
高精度の量子化学計算を用いることで、様々な化学種の電子状態の予測が可能となってきた。しかしながら、よくMAA は実験的には一定の安定性を有することがわかっ用いられる TD-DFT 計算などは、比較的良好な結果が高ているが、商品化においては長期的な保存や多様な条件下速で得られるという報告が散見される一方、電子状態の記での安定性評価など、さらなる詳細な検討が必要である。

述において様々な不具合も指摘されている。本研究ではよ

MAA は電子密度の高いオレフィン部位を持ち、酸素やラり高精度なクラスター展開型の計算を併用することで、よジカルに対し不安定となりうるため、保存状態によってはり厳密に遷移エネルギーを見積もることを検討する。また、分解物を生成する。このような分解産物の特定と物性研究

溶媒効果についても理論的なアプローチを試みる。実験的は、化粧品素材として展開する予定の MAA の安全性を担には、有機溶媒と水中でのスペクトル変化を考察するとと保する上で必須であるだけでなく、分解を抑制する条件探もに、水溶液の pH 依存性を検討し、吸収機構の足掛かり索にも資すると期待できる。複雑な分解機構すべてを解明を得る。

することは難しいが、その主要なプロセスを明らかとすることで、将来的には屋外壁面部材の退色防御剤といった2 . 2 . より吸収特性の良い MAA 誘導体の創出

汎用的工業用製品だけでなく、生体適合性を発揮でき得る

・先の結果を踏まえ、量子化学計算を併用しながら、280

医療用光学材料などへの展開をも視野に入れることができ、～ 400 nm における特定の波長の紫外線を強く吸収する

経済的波及効果も大きいものと考えられる。

複数の誘導体の最適構造を設計、または設計指針を取得

3 . 結果と考察する。
・吸光度の確保に関して、溶媒極性など環境因子の効果の検討を進める。

3 . 1. マイコスポリン様アミノ酸（MAA）誘導体の吸収機構の解明

・吸収波長、吸収能力を担保しながら生物合成の優位性を活かせる設計へと転換する。

本研究の主たる検討対象である MMA の UV 吸収帯を形成する基本骨格は、3 - アミノシクロヘキセノン、または
1 - アミノ - 3 - イミノシクロヘキセンである。中性状態にシノリンは MAA の一種であり、芳香環は有していない

おいて、これらの系では、単純な置換アルケンに比較すれが、330 nm 付近に極大吸収波長を有し、特に皮膚へ UV のばπ系の共役のため遷移エネルギーの低下が期待されるも影響が大きい UVA 2（320 ～ 340 nm）の効果的なサンスクのの、サンスクリーンとして機能するほどのエネルギー領

リーンとなる。このような単一の化学種の吸収は、通常 1

域には到底及ばない。理論計算による予測では、置換基なつの吸収帯のみで構成されているため、単独の素材のみでどの存在により吸収波長の多少の移動は認められるものの、UVB（280 ～ 320 nm）や UVA 1（340 ～ 400 nm）といった最大 300 nm までの吸収にとどまると示唆された。すなわ

全波長領域の紫外線をカバーすることは難しい。MAA 類

ち、この化合物の構造そのままで作用する機構は考えにく

縁体構造を有するこれら波長域の新たな紫外線吸収材の開い。また、極めて高い UV 吸収能を考えると、この化合物

発が進めば、例えば複数の誘導体を混在させるなどにより、から分解して生成する不純物による機能とも考えにくい。

サンスクリーンとしての用途の飛躍的な拡大が見込まれる。

検討の経緯の詳細は省略するが、最終的に、3 - アミノ

そのためには、シノリンの吸収帯である UVA 2 領域のモ

シクロヘキセノンあるいは 1 - アミノ - 3 - イミノシクロヘ− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

キセン骨格がプロトン化され、連続する 5 元素間で電荷法、クラスター展開法による高精度量子化学計算を行った。

共鳴を起こすことで遷移エネルギーの著しい低下がみら

母体シノリンのカバーする UVA 2（320 ～ 340 nm）以外のれ、サンスクリーンに必要とされる UV 吸収能を取得する

波長領域に吸収を持つ化合物として、一群の誘導体が見出

ことが明らかとなった（図 2）。この状態では、分子全体にされ、UVB（280 ～ 320 nm）と UVA 1（340 ～ 400 nm）を

HOMO および LUMO 軌道が非局在化することで、遷移エそれぞれ吸収領域とする有効な誘導体に分類するとともに、ネルギーの低下が引き起こされるとともに、吸光係数も飛構造物性相関を詳細に検証した。さらに多角的に解析によ

躍的に増大する。このような化学種を想定した理論計算をって、相当数の候補化合物群を提案するとともに、吸収波行うと、見事に実験的に得られるスペクトルを再現するこ長や吸光度における物性マッピングを達成することができとができた。すなわち、MAA の特異的な UV 吸収能はそた。今後のバイオ技術改良により入手ルートにおける問題のプロトン化体の電荷移動共鳴が鍵であることを世界で初解決を図りつつ、より容易かつ安価に入手可能な誘導体の1）

めて明らかとすることができた 。また、さらに興味深い

分子設計へとフィードバックすることで、より効果的、効ことに、アミノ酸残基のツビッターイオン性により、水中率的な材料開発へとつなげたい。

では広範な pH 領域（pH= 4 〜 10）で、MAA 誘導体がプロ

3 . 3 . 分解挙動、物性研究を鍵とする人体に優しいサンスクリーンへの展開

トン化状態を維持できることも明らかとなり、このことが本質的な溶液状態における強い UV 吸収能の獲得につながっていることも明らかとすることができた。このような作より人体に優しいサンスクリーンへと発展させるために用機構に基づく UV 吸収は斬新でありかつインパクトの強は、サンスクリーンを実際に利用するシーンにおける安

いものであったため、関連分野内外において様々な研究に定性などがあわせて問題となる。そこで、MAA 誘導体の引用されている。また、総説や書籍にも発表直後から引用

種々の要因（加熱や光など）による分解機構を解明するととされ始め、本分野での先導的な研究となったものと自負しもに、より安定な誘導体の設計へとフィードバックし、まている

2 , 3）

た、分解物に関し各種分光学的手法を用いてその物性を明。

らかにすることとした。多数の少量分解物が含まれており

3 . 2 . より吸収特性の良い MAA 誘導体の創出

困難を極めたが、反応系における可能な化学反応プロセスの考察、質量分析、紫外可視、円二色性、蛍光スペクトル、より吸収特性の良いマイコスポリン様アミノ酸（MAA）
誘導体の創出に関しては、種々のシノリン誘導体候補に関

核磁気共鳴スペクトルによる追跡、ならびにクロマトグラ

して、まずは従来型の経験的考察による分子設計を行い、フィーなどの結果を総合的に勘案することで、少なくともそれらのうちの代表的な選定化合物に関して汎密度関数

主要な複数の酸化性分解物の特定に至った。これを足掛か

図2− 66 −

マイコスポリン様アミノ酸誘導体の電荷共鳴吸収を基盤とする新規天然由来サンスクリーン材料

りに、作用機構の考察へとフィードバックし、一連の分解～ 320 nm）や UVA 1（340 ～ 400 nm）をそれぞれ吸収領域物の推定が可能となった。また、これら分解物の各条件下とする有効な誘導体も確認できた。さらに、化学構造とスでの生成量の追跡などの詳細を検討することで、その作用

ペクトルの波長シフトの相関、典型的な置換基効果などに機構の詳細をも明らかとすることができた。これらの知見

関する知見も得ることができた。また、MAA の精製、安を活用して合理的にシノリンの安定性向上を検討すること

定性、および分解物の解明に関して、化学反応プロセスのが可能となり、必要条件も明らかとなった。今後の継続検考察、質量分析、紫外可視、円二色性、蛍光スペクトル、討により、商品化へもつながるものと期待している。また、

核磁気共鳴スペクトルによる追跡、ならびにクロマトグラ

本研究の主題であるコスメトロジー、即ち化粧品材料へのフィーなどの結果を総合することで、いくつかの酸化性分展開にとどまらず、コスト面での問題が解決すれば、工業解物の特定に至り、主要なプロセスの確立に成功した。ま用・建材用 UV 防御剤（壁面などの退色防止剤）への展開もた、これら分解物の各条件下での生成量の追跡などの詳細視野に入ってきた。

を検討することで、その作用機構の一端を明らかとするこ

4. 総とにも成功した。これらの知見を用いて安定性を向上させ

括る条件探索を合理的に行い、分解を一定程度遅延させる保有機物や無機物を用いたサンスクリーンの開発は、国内存条件をも見出すことができた。
本研究で得られた知見は効果的な UV 防御能を有する

外で精力的に進んでおり、とくに企業での研究が盛んである。製品としても、化粧品業界から多数のものが市場に出

MAA 誘導体の設計指針となり、世界的なトレンドである

回っている。日焼け止め化粧品は、国内外ともに、今後大「天然由来」・「環境にやさしい」・「安全・安心」といった付きな発展が見込まれる市場であるのは言うまでもなく、国加価値のあるサンスクリーンの開発を可能とするものであ

内市場は 340 億円程度【富士経済・化粧品マーケティング

る。さらに解析、開発が進めば、現存のサンスクリーン市

要覧 2014 より】、世界市場としては 58 億ドル【Chipalkatti,

場に置き換わる技術・製品ともなりうるものと期待される。

1 3 th International Sun Protection Conference, 2 0 1 5 ,本研究の成果が今後のサンスクリーン業界、ひいてはコスLondon】であり、さらに成長する可能性が高い。一方、こメトロジーにわずかならず影響を与えることを期待する。

れらのほとんどは、芳香族性の有機物合成化学品を基盤にしたものであり、アレルギーなどの実害にもつながって謝辞いるなど、人体に優しい生物由来の製品とはなっていな

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コスメト

い。一時的な利用であれば十分な性能を有しているが、有ロジー研究振興財団に篤く御礼申し上げます。また、実質害な紫外線のうち、太陽光の大半を占める UVA（320 ～的な共同研究者である長瀬産業松山恵介氏、大阪大学西嶋

400 nm）は、天候に関わらず年中一定量が地表に達し、ガ政樹氏に感謝いたします。

ラスをも透過して室内に侵入するため、UVA からの保護の目的としては、「日常使い」
可能なサンスクリーンの開発（引用文献）

が急務といえる。また、幼児などへの用途も急増している。

1） Matsuyama, K.; Matsumoto, J.; Yamamoto, S.;

このような点で、現在主流な有機物、無機物を主成分とす

Nagasaki, K.; Inoue, Y.; Nishijima, M.; Mori, T. pH-

るサンスクリーンに代わる、生物由来のサンスクリーンのIndependent charge resonance mechanism for開発が望まれている。しかしながら、その学術的、応用的

UV protective functions of shinorine and related

研究は、国内外ともにほとんど進んでいない。本研究は、mycosporine-like amino acids. J. Phys. Chem. A 1 1 9,

放線菌を利用する生体的な合成法が最近になり確立された、12722-12729（2015）．

マイコスポリン様アミノ酸（MAA）の主成分である、シノ2） Shailendra, R.; Jainendra, P. S.; Sinha, P. R. P

リンに着目したものであり、代替サンスクリーン開発への

Cyanobacterial factories for the production of green

実現可能性が最も高いものと期待される。

energy and value-added products: An integrated
approach for economic viability renewable and

本研究では、その特異な吸収機構を、理論的検証を交え

sustainable Energy Reviews 69, 578-595（2017）．

ながら世界で初めて明らかとすることができた。また、類縁体の構造・スペクトル予測による新規構造体の探索に

3） Kageyama, H.; Waditee-Sirisattha, R. Mycosporine-

関して、化学的、理論的考察に基づいた種々のシノリン

like amino acids as multifunctional secondary

誘導体に対して、汎密度関数法、クラスター展開法による

metabolites in cyanobacteria: From biochemical

高精度量子化学計算を行い、母体シノリンのカバーする

to application aspects, Studies in Natural Products

UVA 2（320 ～ 340 nm）
以外の波長領域として、UVB（280

Chemistry, 59, 153-194（2018）．

− 67 −

ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析
富山大学和漢医薬学総合研究所

森田洋行

The bark and wood of Hesperethusa crenulata Roem., Naringi crenulate (Roxb.) Nicols., Limonia acidissima Linn.
belonging to Rutaceae, as well as Premna integrifolia Linn. (Verbenaceae) have been used to produce traditional cosmetics,
also known as “Thanaka” cream, for over 2000 years in Myanmar. Applying the paste to the skin of the face, arms, and legs
have been believed to make it smooth, clear, and cool, and also increases the production of collagen and elastin to prevent
wrinkles and skin aging, excessive facial oil, serious acne, pimples, blackheads, and whiteheads. Among the plants used
as “Thanaka”, the most popular ones among customers are the former three, whereas the last one is especially popular in
the Tanintharyi Region, in the southern part of Myanmar. However, P. integrifolia has not been investigated in a scientific,
evidence-based manner. Hence, we evaluated in vitro melanin deposition regulatory, anti-inflammatory, antibacterial, andantifungal activities of the water, methanol, and chloroform extracts of P. integrifolia, and found that all extracts showed theabove mentioned activities. In particular, the chloroform extract showed the highest potency in the anti-melanin deposition
and anti-inflammatory activities, suggesting the cosmetic effectiveness of this plant. In order to further clarify the cosmetic
effectiveness of this plants from the chemical component point of view, we carried out the isolation of the compounds fromthe chloroform extract, and obtained 21 compounds including six new lignans. Interestingly, ten compounds exhibitedstrong or moderate anti-melanin deposition activities, providing new insight into the effectiveness of this plant as a cosmetic
ingredient. Additionally, five compounds showed weak melanogenesis enhancing activities. The present results also suggestthat the cosmetic anti-melanin deposition efficacy of the P. serratifolia wood should be discussed with consideration of themelanogenesis enhancing activities of the chemical constituents in this plant.

1. 緒

かになった 2）。また、同時に、細胞毒性の極めて弱いこと

言が報告されるに至り、H. crenulatax の美肌化粧品素材とミャンマーでは、ミカン科植物 Hesperethusa crenulatax

しての有効性が間接的に示唆されている。産地は不明であRoem の枝木・樹皮・根のペーストが “タナカ” という名でるが、同植物に含まれるクマリン誘導体が抗菌活性や抗酸

伝統的に天然美肌化粧品として用いられている。現地では、化作用を示すことも報告されている 3）。P. integrifolia に

この化粧品には、毛穴収縮作用と皮脂の過剰分泌阻害作用

ついては、アルカロイドやポリフェノールなどの単離が報による肌の保湿効果、抗酸化作用による肌荒れの軽減効

告されている 4 − 13）。しかし、化粧品素材として検証した

果、さらには皮膚病予防の効果があると言われている。ま例は極めて少ない 4 , 10 - 12）。伝統的に使用されてきた天然資

た、日焼止めとして、肌の老化防止効果を目的に使用され源の中には、経験的に効果が認識されて長年用いられていている。一方、ミャンマー南部のベイやダウェイでは、クるものが数多くあり、その科学的検証により医薬品及び化

マ ツ ズ ラ 科 植 物 Premna integrifolia L.（ 異 名：Premna

粧品の開発に繋がっているものが多々ある。また、同一のserratifolia）がタナカとして利用されている。この植物は、植物であったとしても、天然資源の化学成分は気候風土にインドでは美肌化粧品には利用していないが、解熱、解よって左右され、他の地域のものとは異なった効能を示す

毒、貧血改善、皮膚障害治療、健胃薬、抗炎症、肝障害改ことがあることから、ミャンマー産の P. integrifolia には、善、便秘、強心薬などの多岐に亘る症状に有効なアーユル

新たな美肌化粧品天然素材としての可能性が大いに期待

1）

ヴェーダ生薬の一つとして、頻繁に利用されている 。既される。本研究では、ミャンマー産の H. crenulatax と P.

に、タイ産 H. crenulatax については、水や有機溶媒抽出

integrifolia の化粧品素材としての機能性を比較することで、液が強い抗炎症・抗酸化作用、比較的強いチロシナーゼ

P. integrifolia に新たな美肌化粧品素材としての科学的根阻害活性、及び、弱いながらも抗菌活性を示すことが明ら拠を与えることを目的とした。

2. 方
Verification of whitening ef fect ofMyanmar herb and analysis of whitening
component
Hiroyuki Morita
Institute of Natural Medicine, Universityof Toyama法2 . 1. 化合物抽出液の調整
ベイとヤンゴンで購入したミャンマー産のP. integrifolia
及び H. crenulatax の木部・樹皮・根を破砕機を用いて粉末化し、水、メタノール、クロロホルムに各々一晩浸すことで化合物の粗抽出液を調整した。

− 68 −

ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析

2 . 2 . 抽出液の生物活性評価と単離した化合物のメラ
ニン産生調節活性評価

25、50、100、及び 200 µM）を、Sigma 社から購入した

メラニン産生調節活性は、細井らの方法に準じ 14）、

せ、37 ℃の条件下で、492 nm の吸光度を 3 分毎に 30 分間

100 µMの α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）と 0 . 25 µM

80 units/mL のマッシュルーム由来チロシナーゼに作用さ測定することでチロシナーゼ阻害活性を評価した。

の 3 - イソブチル - 1 - メチルキサンチン（IBMX）にてメラ養液に抽出液を加え、1 N NaOH で細胞融解後に 360 nm

2 . 5 . 化合物 14 と 21 の cAMP 伝達経路阻害活性評価の吸光度を測定することにより、メラニン色素産生に及ぼ100 µM の α- メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）とニン色素の産生を誘導した B 16 -F 10 マウス黒色細胞の培す影響を評価した。メラニン産生調節活性には、アルブチ

0 . 25 µM の 3 - イソブチル - 1 - メチルキサンチン（IBMX）

ンをコントロールとして用いた。単離した化合物のメラニ

にてメラニン色素の産生を誘導した B 16 -F 10 マウス黒ン産生調節活性評価についても同様に行った。抗炎症作用

色細胞の培養液に、100 µM の化合物 14 または 21 を加え、は、予め抽出液を作用させたマウスマクロファージ様細胞

37 ℃で 24 時間培養後、mRNA を抽出した。次いで、抽RAW 264 . 7 細胞にリポ多糖（LPS）で炎症を誘起した場合出した mRNA を鋳型として逆転写反応を行い、得られたと、LPS で炎症を誘起した RAW 264 . 7 細胞に抽出液を作

1 本鎖 DNA を鋳型として、色素細胞の分化増殖制御因子

用させた場合の一酸化酸素産生抑制能を測定した

15）

。抗

（MITF）、チロシナーゼ（TYR）、チロシナーゼ関連タンパ

菌作用は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌、セレウス菌、

ク質 1（TRP- 1）、チロシナーゼ関連タンパク質 2（TRP-

大腸菌、及び肺炎桿菌、抗真菌作用はカンジダの培養液に2）遺伝子に特異的なプライマーを用いて各遺伝子を増幅

抽出液を加え、これらの増殖阻害を測定することにより評し、その発現量を精査した。３リン酸デヒドロゲナーゼ

価した（GADPH）の mRNA の発現をコントロールとした。

16 , 17）。

3. 結

2 . 3 . 化合物の単離・構造決定
クロロホルム抽出液をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーに供して分画した後、さらに、カラムクロマトにおい果

3 . 1. P. integrifoliaと H. crenulatax 粗抽出液の生物活性評価
P. integrifolia と H. crenulatax の木部・樹皮・根に係る水、て分画操作を繰り返すことにより、化合物を単離・精製した。得られた化合物の化学構造は、NMR、HR-ESIMS 等

メタノール、及び、クロロホルム粗抽出液について、メラの各種スペクトル分析、化学変換、及び計算化学を用いてニン産生調節活性、抗炎症活性、抗菌活性、抗真菌活性を決定した。

測定した。その結果、いずれの粗抽出液においても、弱い抗炎症作用と抗菌活性が認められた。それらの中でも、ク2 . 4 . 化合物 14 と 21 のチロシナーゼ阻害活性評価

ロロホルム粗抽出液については抗炎症作用が最も強かっ

2 . 5 mM の L- 3、4 - ジ ヒ ド ロ キ シ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン

た。さらに、興味深いことに、P. integrifolia 木部のクロ（L-DOPA） と 化 合 物 14 ま た は 21（ 終 濃 度 6 . 25、2 . 5、

ロホルム粗抽出液が、81 . 3 µg/mL の穏和なメラニン産生

Fig. 1 Anti-melanin deposition
activities of chloroform, water,and methanol extracts of theP. integrifolia wood against
α - MSH and IBMX-induced
melanogenesis and protein
contents in B16-F10 cell line.

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

抑制活性を示すことが明らかになった（Fig. 1）。これまで

一方、この精製課程において、本クロロホルム粗抽出液にに、P. integrifolia の化粧品素材としての検証が行われては、単離した量が少なかったので化学構造を決定するまでいないが、本結果は P. integrifolia の化粧品としての効果には至らなかったものの、セサミン類縁体が含まれているを示唆するものである。

可能性が 1 H NMR による解析により示された。

3 . 2 . P. integrifolia 木部由来クロロホルム粗抽出
液の化学成分の単離と化学構造決定の P. integrifolia 木部から新たに得たクロロホルム粗抽出

そこで、P. integrifolia の木部 3 kg から得たクロロホル

結果、上記の化合物に加え、10 種のリグナン premnan A

ム粗抽出液を各種クロマトグラフィーを用いて化合物の精（1 1；1 . 7 mg）、premnan B（1 2；1 . 6 mg）、tauntangyiol

製を繰り返し、10 種の精製化合物を得た 18）（Fig. 2）。こC（1 3；3 . 0 mg）、7 , 9 -dihydroxydolichanthin B（1 4；

れらについて、各種スペクトル分析を用いて化学構造を

8 . 1 m g ）、 p r e m n a n C （ 1 5 ； 2 . 1 m g ）、（ 3 R 、 4 S ）決定した結果、2 種の新規テトラヒドロフラン型リグナン- 4 -（ 1 , 3 - b e n z o d i o x o l - 5 - y l c a r b o n y l ）- 3 - ［（ R ）taungtangyiols A（1；20 mg）と B（2；4 mg）、及び 8 種の- 1 -（1 , 3 -benzodioxol- 5 -yl）- 1 -hydroxymethyl］

既知フロフラン型リグナン asarinin（3；10 mg）、
sesamin（4；tetrahydro- 2 -furanone（1 6；1 . 6 mg）、（-）-aptosimon

5 5 mg）、paulownin（5；2 0 mg）、4 α-hydroxysesamin（1 7；3 . 4 mg）、（-）-diasesamin-di-γ-lactone（1 8；

さらに、他の含有成分について検討するため、4 . 5 kg
液について、再度、化合物の単離 ･ 精製を進めた。その（6；5 0 mg）、4 α, 8 α-dihydroxysesamin（7；2 . 5 mg）、

17 . 1 mg）、（+）-epi-sesaminone（19；4 . 0 mg）を、2 種のxanthoxyol（8；10 mg）、
1 α-hydroxy- 6 -epipinoresinol（9；既知トリテルペン oleanonic acid（20；4 . 2 mg）と（2 α, 3 α）

15 mg）、1 α-hydroxypinoresinol（10；7 mg）であること-dihydroxyolean- 12 -en- 28 -oic acid（21；3 . 3 mg）とともが判明した。セサミンやその類縁体には、強い抗酸化作用に得ることができた 19 , 20）（Fig. 2）。新たに得たリグナンのや抗炎症作用、メラニン産生調節活性が報告されている。

うち、11 - 14 は新規リグナンであった。また、16 についFig. 2

Structures of isolated compounds from chloroform extracts of the P. integrifolia wood.

− 70 −

ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析ては、合成品として既に報告されていたが、天然資源からの穏和なメラニン産生抑制活性を示すことが明らかになっ得られたのは今回が初めてである。一方、15 は、抽出液

た（Table 1）。

の HPLC 分析においては存在を検出できなかった。このこ

次に、化合物 11 - 21 について、メラニン産生調節活性とから、5 は、抽出 ･ 精製課程において生じた人工物であを評価した結果、新規テトラヒドロフランリグナン 14 及ると推測される。

び既知トリテルペン 21 が各々 18 . 4 µM と 11 . 2 µM の IC 50
値で、B 16 -F 10 マウス黒色細胞に細胞毒性を示さずに

3 . 2 . P. integrifolia 木部から得た化合物のメラニン産生調節活性評価

メラニン産生を抑制できることが判明した（Fig. 3）。また、既知トリテルペン 20 は、50 µM の濃度では B 16 -F 10

まず、単離した 1 - 10 について、メラニン産生調節活

マウス黒色細胞に細胞毒性を示すものの、それ以下の濃度性を測定した 18）。その結果、既知フロフラン型リグナンにおいては、B 16 -F 10 マウス黒色細胞のメラニン産生を

4 - 8 が 10 µM 以下の IC 50 値で B 16 -F 10 マウス黒色細胞の17 . 7 µM の IC 50 値で抑制することが示された（Fig. 4）。

メラニン産生を強く抑制すること、及び、新規テトラヒド

一方、これらの化合物とは逆に、新規フェニルナフタレ

ロフラン型リグナン 1 と 2 が IC 50 値で 50 . 7 µM と 40 . 9 µM

ン型リグナン 11、新規フロフラン型リグナン 12、新規テトラヒドロフラン型リグナン 13 と 14、及び既知フロフラ
ン型リグナン 16 が、弱いながらもメラニン産生増強活性Table 1

Antimelanin deposition activities of 1-10.

CompoundIC50（µM)

CompoundIC50（µM)

1
2
3
4
5
α
Arbutina

50.7
40.9
<10.0
<10.0
<10.0
364.4

6
7
8
9
10

< 10
< 10
< 10
> 100
> 100

を示すことが明らかになった（Fig. 3）19）。

3 . 3 . 化合物 14 と 21 のチロシナーゼ阻害活性評価
メラニン産生抑制活性を示した化合物のうち、新規テトラヒドロフランリグナン 14 と既知トリテルペン 21 について、チロシナーゼ阻害活性を評価した。しかし、いずれの化合物もチロシナーゼ阻害活性を示さなかった（Fig. 5）。

apositive control.

αFig. 3 Melanin deposition regulatory activities of 11-21 against α-MSH and IBMX-induced melanogenesis and protein
contents in B16-F10 cell line.

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 4 Anti-melanin deposition activity of 20 against α-MSH and IBMX-induced melanogenesis
and protein contents in B16-F10 cell line.

Fig. 5 Tyrosinase inhibitory activities of 14 and 21

Fig. 6 Effects of 14 and 21 on the expression of key
melanogenesis mRNAs.

− 72 −

ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析

3 . 4 . 化合物 14 と 21 の cAMP 伝達経路制御機構の解析

P. integrifolia 以外にも、他のミカン科植物である Naringi

化合物 14 と 21 のメラニン産生抑制活性のより詳細な機で伝統的化粧品として利用されている。H. crenulatax は構の解明を目指し、メラニン合成経路の一つである cAMP

ミカン科に属すことから、これらの植物中にもクマリン誘伝達経路に及ぼす影響を、MITF、TYR、TRP- 1、及び導体が含まれ、化粧品としての効果を発揮している可能性

TRP- 2 の mRNA の発現量を精査することで評価した。そはあるが、これらの植物の化学成分と化粧品としての相関の結果、化合物 14 が TYR mRNA の発現を抑制すること関係についても興味が持たれるところである。

crenulate と Limonia acidissima の木部などもタナカの名により、メラニン産生抑制活性を示していることが示され5. 総た。一方、化合物 21 は、その上流にある MITF mRNA の本研究においては、P. integrifolia が、H. crenulatax と発現に影響を及ぼすことにより、メラニン産生抑制活性をは異なった含有成分により、伝統的化粧品としての効果を制御していることが明らかになった（Fig. 6）
。

4. 考

括

発揮している可能性が示された。しかし、本研究は、P.

察

integrifolia のメラニン産生調節活性について検討している本研究において、P. integrifolia 木部のクロロホルム粗が、抗酸化作用や抗炎症などの効果について詳細に検討す抽出液が、その樹皮や根の水及びメタノール抽出液よりもるには至っていない。今後、精製した化合物の抗炎症作用

強い抗炎症作用を示すことに加え、穏和なメラニン産生抑や抗菌活性の評価を進めるとともに、P. integrifolia と H.

制活性をも示すことが明らかになった。ミャンマーでは、

crenulatax の各抽出液、及び単離・精製した化合物のジフ

伝統化粧品であるタナカは、その木部をペースト状にし、ェニルピクリルヒドラジルラジカル（DPPH）消去活性を指顔などに塗布するやり方で用いられている。ペーストとし標とした抗酸化作用や抗炎症作用などについて、他の化粧ての利用は、脂溶性化合物の効果も期待できる使用法であ品としての効果についても詳細に検討する必要がある。

る。本研究における結果は、P. integrifolia の化粧品としての効果を示唆するだけでなく、そのペーストとしての利謝

辞
計算科学を用いて化合物の絶対配置を決定するにあたり、用方法についても科学的根拠を与えたものと考える。
さらに、本研究においては、P. integrifolia 木部のクロご支援賜りました東京大学大学院薬学系研究科教授 阿部ロホルム粗抽出液から化合物の単離 ･ 精製を行うことによ

郁朗先生及び大学院生 星野翔太郎氏に心より感謝申し上り、P. integrifolia に含まれるセサミンなどのリグナン類

げます。

がそのメラニン産生抑制活性を示すことで、化粧品として本研究を助成対象課題として採択いただきました公益財の効果をもたらしている可能性が示された。しかし、本研団法人コスメトロジー研究振興財団に心から御礼申し上げ

究において、単離した化合物の中には、弱いながらもメラます。

ニン産生増強活性を示すものが見い出されている。クロロ
ホルム抽出液ではメラニン産生抑制活性が示されているこ（引用文献）とから、P. integrifolia の化粧品としての効果は示唆され

1） Mali P.Y. Premna integrifolia L.: A review of its

るが、そのメラニン産生抑制活性においては、本植物に含biodiversity, traditional uses and phytochemistry. Anci.
Scie. Life, 35, 4-11（2015）．

まれるメラニン産生抑制活性化合物と増強活性化合物の総和的効果によって、適度に化粧品としての効果を発揮し

2） W a n g t h o n g S . , P a l a g a T . , R e n g p i p a t S . ,ているものと推定される。また、化合物 14 と 21 において、

Wanichwecharungruang S.P., Chanchaisak P.,

メラニン産生抑制の制御機構に違いが見られる。メラニン

Heinrich M. Biological activities and safety of

合成は、Wnt シグナル伝達経路によっても制御されるため、Thanaka （Hesperethusa crenulata） stem bark. J.

他のメラニン産生抑制活性を示した化合物についても含め、

Ethnopharmacol., 132, 466-472（2010）．

cAMP 伝達経路のみならず、Wnt シグナル経路について

3） Nayar M.N.S., Bhan M.K. Coumarins and otherも詳細に検討し、その総和的効果を解明していくことが必constituents of Hesperethusa crenulata. Phytochemistry,

要である。

11, 3331‒3333（1972）．

一方、P. integrifolia の木部 H. crenulatax の主成分及び4） Rathore R.S., Prakash A., Singh P.P. Premna

化粧品としての活性本体については、クマリン誘導体の可integrifolia Linn, a preliminary study of anti-能性が指摘されており、成分の違いによる H. crenulatax

inflammatory and anti-arthritic activity. Rheumatism,と P. integrifolia の化粧品としての効果の違いに興味が持

12, 130‒134（1977）．

たれる。また、ミャンマーにおいては、H. crenulatax と

5） Gopal R.H., Purushothaman K.K. Effect of plant− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Res., 45 1474 ‒ 1478（1985）．

isolates on coagulation of blood: an in vitro study. Bull.
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15）Morita H., Nishino H., Nakajima Y., Kakubari Y.,

6） Dash G.K., Patrolm C.P., Maiti A.K. A study on

Nakata A., Deguchi J., Nugroho A.E., Hirasawa Y.,

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Kaneda T., Kawasaki Y., Goda Y. Oxomollugin, acorymbosa. Rottl. J. Nat. Remedies, 5, 31‒34（2005）．

potential inhibitor of lipopolysaccharide-induced nitric

7） Jothi E.T., Suryalakshmi P.K.P.V., Srinivasababu P.

oxide production including nuclear factor kappa B
signals. J. Nat. Med., 69 , 608 ‒ 11（2015）．

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Premna serratifolia wood. Fitoterapia, 1 3 3 , 3 5 ‒ 4 213）Biradi M., Hullatti K. Bioactivity guided isolationof cytotoxic terpenoids and steroids from Premna（2019）．
20）Woo S., Wong C.P., Win N.N., Hoshino S., Prema,

serratifolia. Pharm. Biol., 55 , 1375 ‒ 1379（2017）．

Ngwe H., Abe I., Morita H. A new tetrahydrofuran14）Hosoi J., Abe E., Suda T., Kuroki T., Regulation oftype lignan from Premna integrifolia wood. Nat. Prod.

melanin synthesis of B 1 6 mouse melanoma cells by
1 α, 25 -dihydroxyvitamin D 3 and retinoic acid, Cancer− 74 −

Commun., 14 , 113 ‒ 116（2019）．

メーキャップ化粧品の光学的機能評価に向けた人工皮膚の開発
芝浦工業大学工学部機械工学科

山田純

In the current cosmetics industry, when developing make-up cosmetics and evaluating its appearance, a visual assessment
has been performed by applying the cosmetics to human’s skin. An evaluation using artificial skin using a resin material
has been attempted, but it is not used for final evaluation of cosmetics. Since the present artificial skin cannot completely
reproduce the characteristics of light propagation inside and surface of the living human skin, the appearance of the artificial
skin is different from the living skin. In this study, we proposed a method that can individually adjust three optical properties
and surface structures to create the artificial skin reproducing the appearance of the living human skin.
As for the absorption coefficient, it was shown that the mass concentration of dye and the absorption coefficient havelinearity, so that the absorption coefficient can be controlled. With regard to the scattering coefficient and phase function,
it was suggested that the scattering coefficient and phase function of the skin can be reproduced by controlling the particle
diameter and particle volume fraction based on Mie theory. From these results, it was shown that artificial skin reproducing
the optical properties of living human skin can be created by individually controlling the absorption coefficient by some dyes
and the scattering coefficient and scattering phase function by white particles.
Three machining methods such as cutting, sandblasting and shaking were tried on the A 5052 substrates to reproduce
the characteristics of surface reflection on the human skin. Subsequently to the developing the surface structure, the surface
structure data was measured using a laser microscope. These data indicated that it is possible to create a structure that can
reproduce the optical characteristics on the human skin surface by combined several machining methods appropriately.

1. 緒

た場合，実際の人の皮膚の持つ透明感などの質感を感じら

言れないことが課題とされていた．そこで，近年では皮膚現在の化粧品業界では，メーキャップ化粧品を開発し，内部での散乱光を二方向散乱面反射分布関数（BSSRDF：

その見栄えを評価する場合，実際に人の皮膚に化粧品を塗

Bidirectional Scattering Surface Reflectance Distribution

1 ‒ 3）．しFunction）を CG に適用したモデルが注目されるようになかし，この方法では被験者ごとの肌の違いや，同一被験者ってきた 6 , 7）．これらの研究結果から，皮膚─空気界面でであっても，肌の状態が変化するために，定量的な評価はの光反射性質だけでなく，皮膚内部での散乱及び吸収（光困難である．

物性）を考慮した反射光を再現することにより実際の人の布した際の仕上がりを視感によって評価している

これまでに，樹脂素材を使用した人工皮膚が製作されて皮膚に近い質感が再現されることが示された．

おり，それを用いた評価も試みられている．しかし，化粧人工皮膚作製に関する従来の研究は，化粧分野では，化品の最終評価には利用されていない．これは，現在ある人

粧品の塗りやすさの試験や評価 8）を目的としたものがある．

工皮膚では，皮膚内部の光伝播が十分に考慮されていない

また，医療分野では，
レーザー治療や画像診断技術の研究 9），からである．色味は似ていても，実際の皮膚の質感と異な

超音波診断や針・メスなどの医療器具の練習用 10）としてっていることが一つの理由である．

人工皮膚の開発が行われてきた．これらの人工皮膚では，人の皮膚の見え方については，Computer Graphics（CG）
分野を中心に盛んに研究が進められている

4 - 7）

人の皮膚の硬さや動摩擦係数など機械的性質の再現に関す．従来の研る研究が多く，光学特性に着目したものでも皮膚の見た目究として，皮膚の見え方を再現する手法の一つとして，二の再現が目的ではなく，使用するレーザーや x 線など限定

方 向 反 射 率 分 布 関 数（BRDF：Bidirectional Reflectance

的な波長での光学特性の再現とされている．一方，人の皮Distribution Function）を CG に適用したモデルが考えられ

膚の見た目を再現することを目的とした人工皮膚の作製にてきた

4 , 5）．しかし，この技術を用いて人の皮膚を再現し関する研究は少ない．Iva ら 11）は，人工皮膚で人の皮膚の分光反射率を再現することを目的に研究を行った．その結果，シリコーン樹脂に馬の血液と脂肪乳剤の主成分の一つ

Development of artificial skin for optical
performance evaluation of makeup
cosmetics
Jun Yamada
Department of Engineering, Shibaura
Institute of Technology

であるイントラリピッドを用いて，人の皮膚に近い分光反射率を持った独自の 9 層の人工皮膚を開発した．また，今後は，真皮層及び皮下組織も同様に色再現を行っていく必
要があることを結論として述べている．前述したように，
人の皮膚の見え方（質感）を再現した人工皮膚の作製には，− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

分光反射率の調整だけでなく，皮膚─空気界面での光反射

具体的な手法として，透明な樹脂を母材とし，吸収係数

性質と皮膚内部での散乱及び吸収を再現することが不可欠

を染料で，散乱係数及び散乱位相関数を可視光において吸である．

収のない白色粒子で，独立に制御することにより光物性の

筆者ら

12）

は皮膚表面の構造が光反射性質に与える影響を再現を試みる．

調べ，皮膚の持つ皮溝と皮丘にある細かい凹凸の傾きの方向分布を決定することで，人の皮膚の空気─皮膚界面での光反射性質を再現できることを示した．また，筆者ら

2 . 2 . 空気 – 皮膚界面での光反射性質の制御方法

13 , 14）は，筆者らは，共焦点レーザー顕微鏡によって取得した皮膚

非侵襲で生きた人の皮膚の光物性を計測する手法及び計測

表面構造の形状データ（Fig. 1）を用いて，空気─皮膚界面装置の開発を行い，多数の日本人の皮膚の光物性の計測をでの光反射性質を予測できる解析モデルを構築してきた 12）．

行ってきた．本研究では，これらの計測データに基づき，

図 1 ⒜のような，皮膚表面形状データは，一定間隔で記

人工皮膚において人の皮膚の質感を再現するために，空気録された高さデータ群から構成される．この形状データの，─皮膚界面での光反射性質及び皮膚の光物性を再現する手

隣り合うデータを結んだ三角形の表面要素（図 1 ⒝）を考え，法の確立を目的とする．

その法線ベクトルの傾斜角度を算出する．そして，傾斜角2. 方度に関する確率密度関数としてまとめる．この確率密度関法

数は，M を表面要素の数，Mtot を一つの形状データに含ま

2 . 1. 光物性の制御方法

れる，全表面要素数，ΔΩe を表面要素の法線ベクトルが向人の皮膚では，外から皮膚に入射した光のうち，一部はく θe，φe 方向まわりの立体角として，（2）式で表される．

皮膚表面で反射されるが，残りは皮膚内部に浸透する．内……（2）部に浸透した光には，散乱されて再び皮膚の外に出ていく
もの，あるいは，吸収されて熱に変わるものがある．このこれによって算出された二方向反射率は，実験から得らことから，皮膚は散乱・吸収性を持つ連続媒体と考え，次れた皮膚表面の光反射性質と一致することが分かった．つの光輸送方程式により取り扱われることが多い

15）．

まり，表面構造の光反射性質は，その表面要素の傾斜角度…（1）2

ここで，I（W/m ･sr）は光の強度，Ω（−）は光の進行方向を表す単位ベクトル，s（m）はその方向の距離である．

に関する確率密度関数を算出することによって評価できる．
本研究では，人工皮膚作の表面形状データ（表面要素の傾斜角度に関する確率密度関数）が，実際の皮膚と同等となる人工皮膚の製作を目指す．

こ の 輸 送 方 程 式 に は， 吸 収 係 数 α（mm- 1）， 散 乱 係 数 σs

一般的に，人工皮膚の作製では，皮膚色に調整したシリ（mm- 1），散乱位相関数 p（-）といった光物性が現れる．こコーン樹脂やウレタン樹脂を形成容器に流し込み，硬化されら 3 つの光物性が皮膚内部での光伝播を特徴付ける．

せて作られる．よって，目的とする人工皮膚を実現するた

これまでの人工皮膚の製作では，上記の光物性の再現とめには，空気─皮膚界面での光反射性質を再現できる構造いう視点がなかったことに加えて，製作された人工皮膚が，を付与するための鋳型を作製する必要がある．本研究では，

実際の皮膚と同等であることを，光物性レベルで評価され鋳型となる金属表面に様々な加工方法を用いて細かい凹凸ることはなかった．本研究では，散乱係数，吸収係数の可を作製し，どのような加工方法が皮膚の表面構造の再現に視光域におけるスペクトルが実際の皮膚と同等となる人工適しているかを検証した．

皮膚の製作を目指す．

Fig. 1 （a）Surface morphology data of human skin and（b）
analytical model of surface structure.

− 76 −

メーキャップ化粧品の光学的機能評価に向けた人工皮膚の開発

3 . 結果と考察
3 . 1. 人工皮膚における光物性の再現
3 . 1 . 1 . 吸収係数の線形性
透明樹脂に添加する染料の質量濃度を変化させたサンプルを作製し，透過率 τ を分光光度計（株式会社日立
ハイテクサイエンス，U- 5100）を用いて測定し，以下のLambert-Beer の法則に基づき，染料の吸収係数を計測した．
……（3）
式中の sd（m）は光路長である．ここで，染料は母材の透明樹脂に溶解し，散乱を生じないものを用いる．そうする
ことで，減衰係数 β（mm- 1）のうちの散乱係数 σs が 0 となり，透過率から吸収係数が測定可能となる．本研究では，染料と透明樹脂との相性を考慮し，透明なウレタン樹脂（株式Fig. 2

Absorption coefficient of green dye samples.

Fig. 3

Reproduction of skin absorption coefficient.

会社ポリシス，PC- 00）と，日本化薬株式会社製；Yellow
GN，Red B， 有 本 工 業 株 式 会 社 製；Plast Blue，Plast
Green，Plast Orange の 5 種類の染料を使用した．
Fig. 2 に染料（Plast Green）の質量濃度と吸収係数のグラフを示す．Fig. 2 の結果から，質量濃度と吸収係数が線形性を持つことが示された．同様の計測を行った結果，全ての染料において，質量濃度と吸収係数の線形性が示された．
3 . 1 . 2 . 染料の足し合わせによる吸収係数の制御
3 . 1 . 1 . 項の結果から，染料の質量濃度を調整すること
で吸収係数を制御可能であることが確認された．そこで，前述した 5 種類の染料をウレタン樹脂に混ぜ，人の皮膚の吸収係数の再現する人工皮膚を作製し，そのときの光物性を，本研究室で開発した光物性計測装置 13）で計測した（Fig.
3）．この際，Fig. 2 の濃度に対する吸収係数の傾き αλ を全ての染料について算出し，非負の最小二乗法 16）を用いて，必要とされる染料の配合する質量濃度を求めた．その結果，人工皮膚の吸収係数は，予め計算した染料の足し合わせで得られることが確認できた．吸収係数の制御が本手法で可能である．
3 . 1 . 3 . Mie 理論による散乱係数の計算
媒質中の散乱係数は球形の粒子を用いた場合，Mie 理論
から導かれる粒子一つの散乱断面積と，粒子数密度を与えることで求められる．これまでの筆者らの研究 17）で，粒子の粒径分布を考慮した Mie 理論を適用することで，粒子の平均直径 DN（µm）と体積分率 fv（-）から，Fig. 4 に示す
ように，人の皮膚の散乱係数スペクトルに近い値を再現できると予測された．しかし，この結果を基に製作した人工
皮膚の散乱係数スペクトルは，大きさ，プロファイルとも
予測値とは異なった．この原因は，散乱位相関数の波長依存性にある．
3 . 1 . 4 . 散乱位相関数の影響を考慮した散乱係数の制御
皮膚の光物性を計測した手法（RSPM）13） では，波長− 77 −

Fig. 4

Calculated scattering coefficient by Mie theory.

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

λ= 633 nm の培養皮膚の散乱位相関数 7）を与えて，逆解析
を通じて散乱係数，吸収係数を推定している．しかし，実際の散乱位相関数には波長依存性があり，Mie 理論においても波長の関数として散乱位相関数が導かれる．先に述べた，人工皮膚で散乱係数を再現できなかった原因は，Mie理論での予測と計測における逆解析で，散乱位相関数が異Fig. 5なっていたためである．

Simulation flow.

そこで，Fig. 5 に示すモデルを用いて，Mie 理論から算出された散乱係数（σsa），吸収係数及び散乱位相関数を皮膚の物性値として割り当て，培養皮膚の散乱位相関数を用いて逆解析により推定される値（σse）を数値シミュレーションにより求めた（Fig. 6）．Fig. 6 の結果から，散乱位相関数が異なる場合，σsa と σse に大きな差が生じることが分かる．
また，このシミュレーションから，粒子径が 0 . 1 - 0 . 2 µmの Al 2 O 3 粒子を用いれば，σse が人の皮膚について計測された散乱係数スペクトルを再現できると考えられる．
本解析の検証として，DN= 0 . 6 µm の Al 2 O 3 粒子（住友化学株式会社，アドバンストアルミナ AA- 05）を使用したサンプルを作製し，そのときの光物性を RSPM で計測した（Fig. 7）
．Fig. 7 の結果より，シミュレーションから予想される結果と人工皮膚の計測結果の値と傾きはよく一致し，この手法から散乱係数・散乱位相関数の制御が可能である
ことが示された．

Fig. 6

Simulation of influence of scattering phase function.

Fig. 7Comparison of simulated result and artificial skin.

3 . 2 . 人工皮膚における空気- 皮膚界面での光反射性質の再現
3 . 2 . 1 . 鋳型の製作方法
鋳型となる形成容器の一面に機械加工を施し，その加工法に応じて，どのような光性質を持つ表面が作られるか検討する．Table 1 に，今回行った加工法を示す．鋳型は，アルミニウム合金で作製することを想定し，大きさ 50 ×
50 × 3 mm の A 5052 基板を対象としてその表面に加工実験を行う．
3 . 2 . 2 . 試作した鋳型の評価及び光性質の予測
Fig. 8 に，各加工法で処理された表面の拡大画像，Fig.
9 に，各表面構造のプロファイルの一例を示す．加工法 1（切削）では，約 15 µm 程度のピーク形状が見られる．加工法
2（サンドブラスト加工）では，不規則で細かい凹凸が形

Table 1 Machining to construct the surface structures on A 5052 substrates.
加工法 1：切削（Cutting）

カッターナイフによってランダムな方向に溝状の傷を付与する

加工法 2：
砥粒径 φ = 425‒600µm のアルミ系サンドブラスト用砂を，噴射ノズルから加工する A5052
サンドブラスト加工（Sandblasting） 基板表面までの距離を約 50mm に固定した状態で，噴射圧 0.3 MPa，8 分間吹き付ける．
加工法 3： 揺動（Shaking）

大きさ W73 × D73 × H80 の容器底部に両面テープで A5052 基板を貼付け，その中に粒
径 φ = 1.6mm の 球 状のステンレス投 射 材を入れて，手 動で上下に揺 動させることによってA5052 表面に凹凸構造を付与する．上下の揺動幅は約 110mm，振動数は 1 分間に約 200 回とした．

− 78 −

メーキャップ化粧品の光学的機能評価に向けた人工皮膚の開発

Fig. 8 Surface image of A5062 substrates after machining and humanskin surface.

成されているが，その深さは約 6 - 12 µm 程度と見積もられる．加工法 3（揺動）は，サンドブラスト加工と類似して，不規則で細かい凹凸が見られるが，その構造は，サンドブ
ラスト加工と比較してかなり小さく，ほとんど平滑であった．これは，手加工の方が，投射材の速度が遅かったためだと考えられる．
Fig. 10 に，各加工法によって形成された表面形状デー
タから算出した，傾斜角度に関する確率密度関数 psurf（θe ,φe）を示す．この図より，実際の皮膚の表面構造の psurf（θe ,φe）は，傾斜角 θe = 45 ˚ 付近でゆるやかに上昇する傾向が見られた．これは，皮溝の斜面に起因すると考えられる．同様に，切削加工の psurf（θe , φe）で θe = 75 ˚ 付近に小さなピ

Fig. 9 Surface profile of A5052 substrates after machining
and human skin.

ークが現れるのも，溝構造の斜面によるといえる．そして，前述の確率密度関数をもとに，各表面に，光を入射角
θin = 45 ˚ で入射させたときの光反射性質を予測した結果を，Fig. 11 に示す．全ての加工法において，皮膚表面の光反射性質と異なる結果となった．特に，揺動加工で作製した表面構造の光反射性質は，Fig. 11 に示されるように，正反射方向付近の二方向反射率が急激に上昇した．Fig. 10の結果より，これは，表面がほとんど傾斜のない構造であったことが原因だと考えられる．
これらの結果から，投射材形状や加工法により，表面構
造の特徴を制御できることが示された．よって，これらの適切な組み合わせが明らかになれば，実際の皮膚表面構造
を人工皮膚に転写せずとも，皮膚表面構造による光性質を再現する可能性があることが示された．

Fig. 10 Probability density function for machining surface
structures and human skin.

3 . 2 . 3 . 表面構造の違いが内部での光伝播に与える影響
次に，皮膚内部での光伝播も再現した人工皮膚作製に向け，Fig. 10 に示すような，表面傾斜角度の確率密度関数の違いが，皮膚内部での光伝播にどの程度影響を及ぼすかを，数値解析によって検討した．この光伝播解析は，Fig.
12 のような解析モデルに対して，Monte Carlo 法によって行う．これは，光を，エネルギーを持つ光束とし，解析モデルに入射させる試行を繰り返すことで近似的に解を求める解析方法である．皮膚表面での光挙動は，前述のように，表面形状データから算出される，傾斜角度の確率密度関数 psurf（θe , φe）よりに決定した．光の入射角度は θin = 45 ˚とし，光束が皮膚 - 空気界面に到達したとき，Fig. 5 の確

Fig. 11 Bidirectional reflectance for machining surface
structures and human skin obtained by numerical analysis.

− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

率密度関数をもとに，これが出くわす表面要素，及び，その表面要素上で反射するか，あるいは透過して皮膚内部に進むかが決定される．解析モデルの大きさは，一般的な皮膚の厚みとされる 1 . 9 mm とし，その周囲は周期境界とした．そして，光束が，皮膚内部で吸収されるか，あるいは再び皮膚－空気界面に達して皮膚外に射出されるまで追跡する．
表面構造による光性質の違いが，皮膚内部での光伝播に与える影響を調べるために，実際の皮膚を含む各表面構造について，表面構造を透過した直後の二方向透過率を Fig.
13 に，皮膚内部で散乱されて，再び皮膚外に射出された光が到達した最大の深さと光量の関係をFig. 14 にまとめた．

Fig. 12 Analytical model to analyze the influence of thestructure of the skin surface on light propagation inside theskin.

Fig. 14 の結果より，光がより深くまで到達したのは，揺動加工によるものであった．この加工法によって作られた表面構造は，Fig. 9，10 の結果より，ほとんど傾斜がない．
そのため，光がこの構造表面を透過しても，その指向性が大きく変化せず，その結果として，深さ方向に進む光が減
少しなかったためである．逆に，皮膚表面を透過した光は，
その指向性が低下したため，皮膚の深くまで進む前に皮膚から射出されたと考えられる．これらの結果から，皮膚表面構造は，皮膚内部の光伝播にも影響を与えることが明らかとなった．

4. 総括

本研究では，生きた人の皮膚内部での光伝播及び空気 ‒Fig. 13 Light transmittance for each direction on thesurface structures obtained by the numerical analysis.

皮膚界面での光反射性質を再現した人工皮膚の作製を目的とし，吸収係数や散乱係数・散乱位相関数の 3 つの光物性を制御する方法及び表面構造を転写する鋳型の加工方法を検討した．
吸収係数については，人工皮膚の母材となる透明樹脂に溶解する染料を用いた場合，質量濃度と吸収係数が線形性を持ち，複数の染料を組み合わせることで，吸収係数を制御可能であることが示された．散乱係数については，散乱位相関数が Mie 理論と計測における逆解析とで異なっているため，その違いを考慮した新たな解析モデルを導入した．
その結果，この解析モデルから計算した値と，作製したサンプルの光物性の計測値を比較した結果，散乱係数スペク
トルの一致が確認された．これらのことから，吸収係数をFig. 14 Influence of the surface structure on the lightpropagation inside the skin.

染料で，散乱係数・散乱位相関数を白色粒子で，独立に制御することにより，人の皮膚の光物性を再現した人工皮膚が作製可能であることが示された．

本研究では，人工皮膚の光学的な性質を生きた人の皮膚

また，様々な加工方法を用いて，金属盤上に様々な表面と同等のものにするための手法を，内部と表面を個別に分構造を作製し，その構造が生じさせる光反射性質を分析しけて検証した．ここでは，作製した人工皮膚の質感の評価た結果，一種類の加工方法では人の皮膚の光反射性質を再までは行えておらず，その作製方法の検証のみであったが，現することができないが，複数の加工方法を組み合わせる

これらの内部と表面の製作方法を合わせて一つの人工皮膚ことで，人の皮膚の光反射性質を再現可能であることが示を作製することで，より生きた人の皮膚の質感を再現したされた．

物を作製可能になると考えられる．また，本研究では，光− 80 −

メーキャップ化粧品の光学的機能評価に向けた人工皮膚の開発

学的な性質を個別に制御する手法を提案しているため，本8） 菅沼薫 , 丹羽雅子：マッサージクリームの触感と物手法を利用することで，個人差が大きく，人によって異な理物性との関係 . 日本化粧品技術者会誌 , 24, 212-219,

る皮膚の光学的な性質に合わせて，化粧品の評価に使用す1991.
9） Jędrzejewska-Szczerska M, Wróbel MS, Galla S, Popov

るための様々な種類の人工皮膚の製作できる．

AP, Bykov AV, Tuchin VV, Cenian A. Investigation
謝辞of photothermolysis therapy of human skin diseases

本報告書の作成にあたり，共同研究者である河野貴裕氏

using optical phantoms. 1 8th Int. School on Quantum（芝浦工業大学）に多大な貢献をいただいた．ここに記してElectron.: Laser Phys. Applications, Int. Soc. Opt.
Photonics, 9447, 2015.

謝意を表す．

10）Aminzadeh R, Saviz M, Shishegar AA. Theoretical（引用文献）and experimental broadband tissue-equivalentphantoms at microwave and millimetre-wave

1） N i s h i m u r a H , T a k a s u k a Y , Y a m a m o t o M .

frequencies. Electron. Lett., 50 , 618 ‒ 620 , 2014 .

Optical properties of skin gloss and developmentof mizumizushii-looking makeup foundation. Int. J.

11）Iva S, Tanabe A, Maeda T, Funamizu H, Aizu Y.
Development of non-deterioration-type skin tissue

Cosmet. Sci., 29, 67, 2007.

phantom using silicone material. Opt. Rev., 2 1 ,2） Nishikata, N., Nishimura, H., Mohri, K., Nakamura, N.

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Eng. Conf., Hawaii’ s Big Island, 15111 - 1 ‒ 5 , 2016 .

− 81 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析
東京都健康長寿医療センター研究所

今江

理恵子

Phosphatidylinositol (PI) is a versatile lipid that not only serves as a structural component of cellular membranes, butalso plays important roles in signal transduction through distinct phosphorylated derivatives of the inositol head group. PI
contains stearic acid (18 : 0 ) as the predominant fatty acid at the sn- 1 position. This fatty acid composition is formed throughfatty acid remodeling by sequential deacylation and reacylation. We previously identified acyltransferases responsible for theincorporation of stearic acid into the sn- 1 position of PI in C. elegans (acl- 8 , acl- 9 and acl- 10 ) and mice (lycat). However,the biological significance of the enrichment of stearic acid at the sn- 1 position of PI is largely unknown. In this study, we
analyzed the phenotypes of acl- 8 acl- 9 acl- 10 triple mutants in C. elegans and found that the epithelial morphology was
disrupted. The mutants showed defects in the amount and localization of actin filaments at the apical junction of epithelial
cells. In addition, PI (4 , 5) P 2 was significantly accumulated at the apical junction of epithelial cells. Furthermore, ourgenetic screen identified the ether lipid biosynthetic pathway genes acl- 7 /DHAPAT and ads- 1 /AGPS as suppressor genes ofacl- 10 mutants. We found that acl- 7 mutation rescued both the reduced amount of stearic acid at the sn- 1 position of PI andthe defects at the apical junction of epithelial cells in acl- 8 acl- 9 acl- 10 triple mutants. Taken together, these results indicate
the important role of stearic acid in the sn- 1 position of PI in the epithelial cell integrity through proper actin filament
organization.

1. 緒

リン酸導入に関わる酵素として、ホスホリパーゼ A 1（ipla-

言

1）、
脂肪酸転移酵素（acl-8, 9, 10）を世界に先駆けて同定し、皮膚の恒常性は、表皮幹細胞から表皮角化細胞が分裂、線虫表皮幹細胞の非対称分裂において PI の sn- 1 位の脂肪分化して剥がれ落ちる “ターンオーバー” の繰り返しや、バ酸組成が重要な役割を果たすことを明らかにしている 2）。

リア構造の形成等によって維持される。一方、加齢によっさらに、acl- 8 , 9 , 10 の哺乳動物相同分子である LYCATて表皮幹細胞数が減少することや、表皮のターンオーバーについても、マウスにおいて PI の sn- 1 位の脂肪酸組成をが遅くなることが知られている。また、バリア構造の破綻規定していることを明らかにした 3）。しかし、PI の sn- 1

はアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を引き起こす。角質バリ位の脂肪酸組成がどのようにして上皮細胞の恒常性に寄与

アにおいては、セラミドに代表される細胞外脂質が重要なしているか、その分子メカニズムについては未だほとんど働きを担っていることが知られている。脂質は生体膜の重明らかになっていない。本研究では、PI の特徴的な脂肪要な構成成分でもあり、膜タンパク質機能の調節因子とし酸組成が上皮細胞の恒常性において果たす役割を分子レベて、あるいはシグナル分子として、細胞機能に必須の役割

ルで解明することを目的とした。

を果たす。しかし、皮膚の恒常性において生体膜脂質がど

2. 方のような役割を果たすのかについては、あまり明らかにな

法

2 . 1 . アクチンフィラメントの観察っていない。
私は、生体膜リン脂質の一つであるホスファチジルイノ

young adult 期の線虫を回収後、ホルムアルデヒド、アシトール（PI）の特徴的な脂肪酸組成を規定する酵素群のセトンにて固定後、Alexa Flior 546 -phalloidin で染色した。

同定及び機能解析を行ってきた

1 - 3）。PI は、グリセロール

観察は共焦点顕微鏡ライカ TCS SP 8 を使用した。

骨格の sn- 1 位にステアリン酸（18：0）、sn- 2 位にアラキドン酸（20：4）を持つ分子種が圧倒的に多い。これまでに、モデル生物である線虫を用いて、PI の sn- 1 位へのステア

2 . 2 . xhIs 3503 [dpy- 7 p::PLCδ 1 -PH::GFP] の作成

MoSCI 法にて、線虫ゲノム（IV 番染色体の特定の部位）にシングルコピーで外来遺伝子（上皮細胞特異的 dpy- 7
promoter の下流に PLCδ 1 -PH::GFP をつないだ DNA 配列）
The roles of the characteristic fatty acidcomposition of phosphatidylinositol in the
homeostasis of skin
Rieko Imae
Tokyo Metropolitan Geriatric Hospitaland Institute of Gerontologyを挿入した株を作成した。

2 . 3 . サプレッサー遺伝子の同定
線虫（Bristol N 2 株）の近縁種である Hawaiian 株を用いた Snip-SNPs 法を用いて、原因遺伝子の染色体、ゲノム− 84 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析

領域を絞り込んだ。該当するゲノム領域に存在する遺伝子

る adherence junction にアクチンフィラメントが局在してについて、feeding RNAi 法にて発現抑制し、原因遺伝子いることが知られている。そこで、細胞間接着部位のアクと考えられる遺伝子についてサンガー法にてシークエンス

チンフィラメントを観察した。野生株では細胞間接着部位解析し、原因変異の同定を行った。

にアクチンフィラメントが一様に存在しており、詳細に観察すると細かいドットが連なったように配置している（図2 . 4 . 脂質解析

1 B）。一方、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では、細胞間接着部

線 虫 を 回 収 後、 超 音 波 処 理 に よ り 破 砕、Brigh and位におけるアクチンフィラメントが大きな不定形のドット

Dyer 法にて脂質を抽出した。個々のリン脂質脂肪酸量の状に局在し、細胞間接着部位に一様には存在しないこと

定量については、TLC にて各リン脂質を分離後、メチルが分かった（図 1 B）。また、細胞間接着部位におけるアクエステル化して GC-MS にて解析した。また、リン脂質脂チンフィラメントの量を解析したところ、acl- 8 , 9 , 10 三肪酸分子種の測定には LC-MS を用いた。

重変異体では顕著に増加していることが分かった（図 1 C）。

3. 結

アクチンフィラメントの大きなドットは、seam cell の分果断が生じている部分と完全ではないが一致したことから、

3 . 1. acl- 8 ,9,10 三重変異体は上皮細胞のapicaljunction 部位のアクチンフィラメントの量や局在に異常を示す

アクチンフィラメントの制御が異常になったことにより、細胞間接着部位に異常な張力が生じ、上皮細胞の形態に異常が生じた可能性が考えられる。

線虫を用いて、上皮細胞における PI の sn- 1 位の脂肪酸期から成虫期になる段階で、上皮細胞の一種である seam

3 . 2 . acl- 8 , 9, 10 三 重 変 異 体 は 上 皮 細 胞 のapical junction 部位の PI（4 , 5）P 2 の量が顕著に増加するcell が互いに融合し、細長い多核の細胞になる。seam cell

PI は、極性頭部のイノシトール環がリン酸化されるこは、隣接する大きな上皮細胞である hypodermal cell ととで様々な phosphoinositide に変換され、シグナル伝達や

adherence junction を形成しており、アピカルジャンクシ

小胞輸送等、細胞内の様々な現象に関与する。PI の sn- 1

ョン複合体の構成分子である AJM- 1 ::GFP を発現する株

位の脂肪酸組成が変動すると、phosphoinositide の産生や

（syIs 78）を用いて観察すると、AJM- 1 ::GFP は２本の平行分解、あるいは phosphoinositide の局在等に影響が生じるなラインとして観察される（図 1 A）
。一方、acl- 8 , 9 , 10

可能性が考えられる。一方、アクチン調節タンパク質には、組成の役割を明らかにするため、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体
を用いて上皮細胞の形態を観察した。野生株では、幼虫

三重変異体では、seam cell が途切れてギャップが生じる

phosphoinositide の一つである PI（4 , 5）P 2 によって活性様子や、小さく分断されている様子が観察された（図 1 A）。

制御を受けるものが多い。そこで、acl- 8 , 9 , 10 三重変異

acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では seam cell 同士の融合の過程

体の上皮細胞で、PI（4 , 5）P 2 の量や局在に異常がないには異常が見られなかったことから、seam cell が融合しか解析した。PI（4 , 5）P 2 に結合する PLCδ 1 の PH ドメ

た後、何らかの原因で細胞の形態が維持できなくなり、分インに GFP を結合したプローブ（PLCδ 1 -PH::GFP）を上皮断が生じたものと考えられる。

細胞で発現させた株（xhIs 3503）を作成し、acl- 8 , 9 , 10細胞の形態維持には、アクチンフィラメントの裏打ち構

三重変異体バックグラウンドと比較して観察した。同時造が重要である。上皮細胞においては、細胞接着に関わにアクチンフィラメントの染色も行い、PLCδ 1 -PH::GFP

図1

acl-8, 9, 10 三重変異体は上皮細胞の apical junction におけるアクチンフィラメントの量や局在に異常を示す− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019の局在との関連を調べた。xhIs 3503 では、アクチンフを観察し、成虫期において途切れのない系統を選別した。

ィ ラ メ ン ト が 存 在 す る apical junction 部 位 に 弱 く PLC

44000 haploid genome をスクリーニングし、サプレッサ

δ 1 -PH::GFP が局在する様子が観察された（図 2 A）
。一方、

ー変異体として 2 系統を単離した。うち 2 系統（原因遺伝acl- 8 , 9 , 10；xhIs 3503 では apical junction 部位に PLC

子変異：xh 25 及び xh 26）（図 3 A, B）について、バックク

δ 1 -PH::GFP がドット状に集積する様子が観察された（図ロスを 2 回行った後、近縁種との SNPs を利用した原因遺2 B, C）。興味深いことに、この PLCδ 1 -PH::GFP のドット

伝子のマッピングを行った。その結果、xh 25 についてはとアクチンフィラメントのドットの位置は、完全ではない

acl- 8 , 9 , 10 と同じ AGPAT acyltransferase family に属が一致していた。以上の結果から、acl- 8 , 9 , 10 三重変異する acl- 7 における exon/intron 境界での G → A の置換で体では、apical junction 部位において PI（4 , 5）P 2 が過剰あり、exon/intron 構造が乱れ、フレームシフトが起こり、に集積しており、それによってアクチン調節タンパク質がpremature stop となる変異であった（図 3 C）。xh 26 につ活性化され、アクチンフィラメントが過剰に動員された可いては、ads- 1 の exon 中での C → T の置換であり、進化能性が考えられる。

的に保存されたPがLに置換するP281Lの変異であった（図3 D）。acl- 7 , ads- 1 の RNAi でも acl- 10 変異体の表現型

3 . 3 . acl-10 変異体のサプレッサー遺伝子として、エーテル型リン脂質合成酵素 acl-7 と ads-1 を同定の抑圧が観察されたことから、acl- 7（xh 25），ads- 1（xh 26）
は loss /reduction of function となる変異であると考えら

PI の sn- 1 位の脂肪酸組成の上皮細胞における役割の分れる。acl- 7 と ads- 1 は、エーテル型リン脂質を合成する

子メカニズムをさらに探る目的で、acl- 8 , 9 , 10 と遺伝

初発段階の酵素である（エーテル型リン脂質とは、sn- 1 位

学的に相互作用する分子のスクリーニングを行うことにの脂肪酸の結合様式が通常のリン脂質のようにエステル結した。acl- 8 , 9 , 10 のうち、acl- 10 は上皮細胞にメイン合ではなくエーテル結合であるものを指す）。このことかに発現しており、acl- 10 変異体は単独でも AJM- 1 ::GFP

ら、acl- 10 変異体の表現型はエーテル型リン脂質合成とのパターンに異常を示す（図 1 A）
。そこで、遺伝学的操

何らかの関わりがあることが示唆された。

作を簡便にするため、acl- 10 変異体を用いてサプレッサ
然変異剤（EMS）を処理し、表現型が回復する個体を単離

3 . 4 . acl-7,8 ,9,10 四重変異体では PI の脂肪酸
組成、apical junction 部位の異常が共に回復する

して原因遺伝子をマッピングする、という方法で行った。

サプレッサー遺伝子を用いてさらに解析を進めるため、

acl- 10 変異体は、低張液に浸すと体が破裂しやすいとい

acl- 7 の deletion mutant を作成した（tm 3252）（図 4 A）。

う特徴があり、スクリーニングにはこの表現型を利用しtm 3252 は acyltransferase motif の下流に欠失部位があるた。変異剤処理した acl- 10 変異体の F 2 世代から、1 st ス

が、フレームシフトを起こして premature stop となるこ

クリーニングとして水に浸しても生存している個体を単とが予想されるため、ACL- 7 の局在部位であるペルオキー遺伝子のスクリーニングを行った。acl- 10 変異体に突nd

離し、2 スクリーニングとして AJM- 1 ::GFP のパターン

シソームに局在できず、null になると考えられる。実際、

図 2 acl-8, 9, 10 三重変異体では上皮細胞の apical junction における PI（4, 5）P2 の量が顕著に増加する− 86 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析

図 3 acl-8, 9, 10 三重変異体のサプレッサー遺伝子として、エーテル型リン脂質合成酵素 acl-7 とads-1 を単離

図4acl-7, 8, 9, 10 四重変異体では ajm-1::GFP のパターン及び PI の脂肪酸組成が回復している− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019acl- 7（tm 3252）ではエーテル型リン脂質の一つであるアの比率が野生株と同程度まで戻っていることが分かった

ルケニル型 PE の量が検出限界以下であったことから、機（図 4 E）。以上の結果から、サプレッサー変異体では PI の能喪失型変異体であることが確認された。acl- 7（tm 3252）

脂肪酸組成が野生株と同様に戻ったことにより、表現型がと acl- 8 , 9 , 10 ; syIs 78 を交配して作成した acl- 7 , 8 , 9 ,回復したと考えられた。近年、線虫のエーテル型リン脂質

10 ; syIs 78 についても、AJM- 1 ::gfp のパターンの異常は合成の変異体を単離し、解析した報告 4）において、脂肪酸

顕著に回復していることが確認できた（図 4 B, C）。acl- 7合成の促進、SCD（Stearoyl-CoA desaturase）（fat- 5 , 6 ,（tm 3252）による表現型の抑圧が、脂質組成が戻ったこと

7）の発現低下により、脂質全体で 18 : 0 / 18 : 1 ratio が増によるのかどうかを判別するため、acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重加していることが報告されている。実際、PE についても

変異体の脂質解析を行った。まず、GC-MS を用いてリンGC-MS で脂肪酸の量を定量したところ、acl- 7（tm 3252）

脂質の脂肪酸組成を解析した。その結果、PI の脂肪酸組

では 18 : 0 の量が劇的に増え、18 : 1 n- 7 の量が減少して成において、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では 18 : 0 の量がいた。PI においても acl- 7（tm 3252）における 18 : 0 / 18 :

減少し、18 : 1 n- 7 の量が増えているが、acl- 7 , 8 , 9 , 10

1 n- 7 ratio の増加傾向が見られており（図 4 D）、これによ四重変異体では、18 : 0 の量が野生株と同程度まで増加って acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重変異体における PI の脂肪酸組成

し、18 : 1 n- 7 の量も野生株と同程度まで減少しているこがレスキューしたものと考えられた。さらに、acl- 7 , 8 ,とが分かった（図 4 D）。さらに、LC-MS を用いて PI の脂

9 , 10 四重変異体では、上皮細胞接着部位におけるアクチ

肪酸分子種を解析した。野生株では 18 : 0 / 20 : 5 が major

ンフィラメントの集積や、PI（4 , 5）P 2 の集積について

で 18 : 1 / 20 : 5 が minor ピークとして存在するのに対し、もレスキューしているかを検証した。その結果、これら

acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では 18 : 1 / 20 : 5 が major ピーの表現型についてもレスキューする傾向が見られた（図 5）。

クとなり、18 : 0 / 20 : 5 はマイナーピークとして存在する。

この結果から、上皮細胞接着部位におけるアクチンフィラ

一方、acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重変異体ではこの二つの分子種

メント及び PI（4 , 5）P 2 の量の制御は、PI の sn- 1 位の脂

図 5 acl-8, 9, 10 四重変異体では上皮細胞の apical junction におけるアクチン
フィラメントの量、PIP2 の蓄積が回復する− 88 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析

肪酸組成が重要な役割を果たしていることが強く支持され酸組成変化が原因となっている場合も存在すると考えられた。

るが、本研究により異常発症の分子メカニズムの一端が明4. 考らかになった。この結果は、皮膚恒常性破綻の予防法や治察療法の開発に貢献できるものと考えられる。

本研究から、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では上皮細胞間接着部位において PI（4 , 5）P 2 が過剰に蓄積していること、 （引用文献）
また、その蓄積部位に高頻度でアクチンフィラメントが集

1） Lee HC, Inoue T, Imae R, Kono N, Shirae S, Matsuda

積していることが明らかになった。このアクチンフィラメ

S, Gengyo-Ando K, Mitani S, Arai H. Caenorhabditis

ントの過剰な集積が引き起こす収縮力によって、上皮細胞

elegans mboa-7, a member of the MBOAT family, is

形態に異常を来した可能性が考えられる。PI（4 , 5）P 2 は、

required for selective incorporation of polyunsaturated

アクチンフィラメントの重要な制御因子である Rho ファミ

fatty acids into phosphatidylinositol. Mol Biol Cell. 19（3）:1174-84, 2008.

リー低分子量 G タンパク質（RHO- 1 , RAC- 1 , CDC- 42 等）を正に制御することから、過剰に蓄積した PI（4 , 5）P 2

2） I m a e R , I n o u e T , K i m u r a M , K a n a m o r i T ,はこれらの分子の活性化を介してアクチンフィラメントのTomioka NH, Kage-Nakadai E, Mitani S, Arai H.

集積を引き起こした可能性が考えられる。その他にも、PI

Intracellular phospholipase A1 and acyltransferase,（4 , 5）P 2 の effector で、アクチンフィラメントの重合を

which are involved in Caenorhabditis elegans stem

制御する分子は多数存在するので、そうした分子の活性化

cell divisions, determine the sn-1 fatty acyl chain ofを介している可能性も考えられる。

phosphatidylinositol. Mol Biol Cell. 21（18）: 3114-24,
2010.

生細胞において観察されるPI（4 , 5）P 2 シグナリングは非
常に早い応答であり、高度にコンパートメント化されてい3） Imae R, Inoue T, Nakasaki Y, Uchida Y, Ohba

る。PI の sn- 1 位の 18：0 が 18：1 に置換されると、上皮Y, Kono N, Nakanishi H, Sasaki T, Mitani S, Arai

細胞間接着部位において PI（4 , 5）P 2 のドット状の集積

H. LYCAT, a homologue of C. elegans acl-8, acl-9,が観察されたことから、PI の脂肪酸組成は局所における適and acl-1 0, determines the fatty acid composition of

切な PI（4 , 5）P 2 の制御に重要であると考えられる。すphosphatidylinositol in mice. J Lipid Res. 53（3）: 335-

なわち、
PIのsn-1 位の脂肪酸組成が異常であると、PI（4, 5）

47, 2012.

P 2 の産生酵素あるいは分解酵素の基質認識に異常が生じ、

4） Shi X, Tarazona P, Brock TJ, Browse J, Feussner

異所性に PI（4 , 5）P 2 の産生が起きる、あるいは PI（4 ,I, Watts JL. A Caenorhabditis elegans model for ether

5）P 2 の分解が妨げられる可能性がある。また、脂肪酸

lipid biosynthesis and function. J Lipid Res. 5 7（2）:組成が異常な PI（4 , 5）P 2 は、生体膜における局在化（コ265-75, 2016.

ンパートメント化）に異常を来し、mis-localizasion が起き

5） Huang LS, Mathew B, Li H, Zhao Y, Ma SF, Nothてしまうことも考えられる。一方、AJM- 1 ::GFP や他のア

I, Reddy SP, Harijith A, Usatyuk PV, Berdyshev EV,

ピカルジャンクション構成分子（E-Cadherin/HMR- 1 やKaminski N, Zhou T, Zhang W, Zhang Y, Rehman

α-catenin/HMP- 1）はアピカル側に正常に局在していたこ

J, Kotha SR, Gurney TO, Parinandi NL, Lussier YA,とから、上皮細胞の極性そのものには大きな異常はないと

Garcia JG, Natarajan V. The mitochondrial cardiolipin

思われる。

remodeling enzyme lysocardiolipin acyltransferase isa novel target in pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit

近年、ヒトやマウスにおいて、acl- 8 , 9 , 10 の相同分子

Care Med. 189（11）: 1402-15, 2014.

である LYCAT が肺線維症や喘息に関わることが報告されている 5 , 6）。acl- 8 , 9 , 10 三重変異体で上皮細胞の細胞間

6） Huang YT, Liang L, Moffatt MF, Cookson WO, Lin X.

接着部位の異常が見られたこと、細胞間接着は上皮バリア

iGWAS: Integrative Genome-Wide Association Studies

機能の形成に重要な役割を担うことから、マウス肺におof Genetic and Genomic Data for Disease Susceptibility

いても、PI の sn- 1 位の脂肪酸組成が異常になると、細胞Using Mediation Analysis. Genet Epidemiol. 3 9（5）:間接着に異常を来し、肺胞上皮や気道上皮バリア機能が破347-56, 2015.

綻した結果、肺線維症や喘息が引き起こされる可能性が考7） Ulmann L, Mimouni V, Roux S, Porsolt R, Poisson

えられる。ヒト皮膚バリア機能においても同様に、PI の

JP. Brain and hippocampus fatty acid composition insn- 1 位の脂肪酸組成は重要な役割を担っている可能性がphospholipid classes of aged-relativecognitive deficit

高い。また、加齢による PI の脂肪酸組成変化の報告もあrats. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 6 4（3）:7）

る 。このように、皮膚の疾患や美容において、PI の脂肪− 89 −

189-95, 2001.

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムのin vitro 解析系の構築
東京工科大学応用生物学部

岩渕徳郎

Development of in vitro evaluation system for telogen-anagen transition was attempt. The respiration activity of mixed
monolayer-culture of human dermal papilla cells (hDP) and human outer root sheath cells was significantly increased in
10 days, however, that of sphere-formed hDP and human outer root sheath cells was significantly decreased. The results on
respiration activity of sphere indicated that characteristics of the sphere-formed hDP was similar to the hair bulb in telogen
phase. Gene expression profile of hair cycle regulating-factors in sphere suggested that the profile of sphere-formed hDP was
similar to hDP in telogen phase. When cyclosporin A which is a powerful hair growth inducer was added to sphere-formed
hDP, gene expression profile for hair cycle regulating-factors was similar to hDP in anagen phase. The results suggested thatsphere-formed hDP might be used as an in vitro system to evaluate for new hair induction. This system would be useful for
screening of hair regrowth reagent for female hair loss.

1. 緒

本研究は女性の薄毛で重要な課題である発毛を解析可能

言な in vitro 評価系を構築することを目的とした。そのため、ヒ男性だけでなく、女性でも薄毛は大きな毛髪悩みである。
男性の薄毛は毛髪径の減少の影響が大きいが、女性の薄毛ト毛包由来の細胞および関連細胞を用いてスフェアを形成させ、その特性を解析した。

は毛髪密度の低下の影響が大きい 1 , 2）。これは、女性では発2. 方毛が重要であることを示唆している。これまで男性の薄毛研
究の結果、「太く、長く」を訴求する薬剤が探索されてきたが、法

2 . 1. 細胞、培地、細胞培養

3）

女性の薄毛の研究例は少ない 。

細胞は、間葉系細胞としてヒト女性毛包由来の毛乳頭細ヒトの毛髪には毛が成長する成長期、毛が成長しない休止胞（hDP- 49 F）を使用した。上皮系細胞としてヒト女性毛包期、成長期から休止期へ移行する退行期の 3 つの期があり、由来の外毛根鞘細胞（hORS- 40 F）または正常ヒト角化細胞

生涯を通して成長期、退行期、休止期を繰り返す。これを毛（hKC）を使用した。

周期と言う

4 - 6）。発毛とは毛周期の休止期から成長期への移培地は、間葉系細胞用の基礎培地として DMEM（Life行であり、新たな毛球部の形成が上皮系細胞- 間葉系細胞間Technologies） を 使 用 し、 栄 養 培 地 と し て 10 % FBS-の相互作用によって起こる現象である 7）。発毛評価法は現時

DMEM を使用した。上皮系細胞用の基礎培地として、

点ではマウスの in vivo 発毛試験のみが実用化されているが、Life Technologies 社 指 定 の サ プ リ メ ン ト を 添 加 し な い

動物実験廃止の流れにそぐわず、ヒト頭髪とマウス体毛の差

Keratinocyte-SFM（K-SFM；Life Technologies）を、栄異の説明も難しい。

養培地としてサプリメントを添加した K-SFM を使用した。

報告者らのこれまでの研究により、2 種の毛包由来細胞

全ての培地には抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B）を添加した。

（毛乳頭細胞［hDP］と外毛根鞘細胞［hORS］）を用いて、細 胞 の 3 次 元 培 養 法として、 非 接 着 性 丸 底プレート① 3 次元培養（スフェア形成）を行うと毛包様構造を形成（PrimeSurface 96 U プレート、以下 PS- 96 U プレート；住すること② hORS が hDP を取囲むように配置すること

友ベークライト）を使用し、本プレートの各ウェルに細胞を③既知発毛薬剤で hORS のみが増殖刺激を受けること

2000 播種した。細胞播種後、37 ℃ - 5 % CO 2 で培養し、が確認されている。これらより、ヒト毛髪細胞の 3 次元培

スフェアを形成させた。対照実験として、通常の細胞培養用

養で発毛様のイベントを解析できる可能性が示唆された。

プレートで単層培養を同条件で行った。

2 . 2 . 遺伝子発現解析
Development of in vitro evaluation system
for telogen-anagen transition in female
hair cycle
Tokuro Iwabuchi
Faculty of Bioscience and Biotechnology,
Tokyo University of Technology

遺伝子発現の解析は、形成させたスフェアおよび単層培養細胞から、ISOGEN（日本ジーン）で mRNA を調製した後、SuperScript Ⅲ（Invitrogen）を用いて、cDNA を調製した。
調製した cDNA を鋳型に real time PCR で被検遺伝子の発現量を単層培養と 3 次元培養の場合とで比較した。

− 90 −

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築

発毛薬剤である cyclosporin A（CsA）に対する応答性に

洗浄後、2 次抗体反応を行い、DAPI を含有したマウント

対する培養方法の比較は、3 次元培養および単層培養した剤を添加し、蛍光顕微鏡で観察した。毛乳頭細胞検出用

hDP に CsA（終濃度 50 ng/ml）を添加し、37 ℃ - 5 % CO 2には間葉系細胞マーカーとして Vimentin［Anti-Vimentin

で培養後、遺伝子発現を real time PCR で比較した。

（D 21 H 3；CST ジャパン）］を、上皮系細胞検出用には上皮系細胞マーカーとして Pancytokeratin［Cytokeratin Pan

2 . 3 . 細胞増殖測定

Monoclonal Antibody（PAN-CK; Life Technologies）］を細胞の増殖性は細胞の呼吸活性を指標に、AlamarBlue

選定した。

（BioRad）を用いて測定した。単層培養は 96 well プレート

3. 結

で、3 次元培養（スフェア形成）は PS- 96 U プレートで行った。いずれのプレートとも、1 種の細胞を培養する時は 1
well あたり 3000 細胞を、2 種の細胞を培養する時は 1 well果

3 . 1. 毛包由来細胞の単層培養とスフェアでの呼吸活
性の違い

あたり両細胞とも 2000 細胞（計 4000 細胞）を播種した。培hDP 単独での単層培養とスフェアにした場合の経時で養後、1 well の培地量の 1 / 100 量の AlamarBlue を添加しの呼吸活性変化を図 1 に示した。単層培養では、経時的に4 時間 37 ℃ - 5 % CO 2 インキュベーターで静置したのち測有意に呼吸活性は増加したのに対し、スフェアでは細胞播定した（Ex. 560 nm, Em. 590 nm）。スフェアの呼吸活性測

種後 6 日では変化はなく、10 日目に有意に減少を示した。
混合培養（hDP+hORS）での単層培養とスフェアにした

定時は、96 well プレートに全量移して測定した。

場合の経時での呼吸活性変化を図 2 に示した。単層培養で2 . 4 . 細胞染色

は、経時的に有意に呼吸活性は増加したのに対し、スフェ

O. C. T Compound でスフェアを凍結固定後、ミクロト

アでは細胞播種後 6 日以降有意に減少を示した。

ームでスフェア切片を作成し、スライドグラスに固定し切片を固定し、TritonX- 100 処理を行い、3 % BSA-PBS

3 . 2 . 毛乳頭細胞と上皮系細胞から形成したスフェアの内部構造（-）に 60 分間浸漬し、1 次抗体反応を行った。PBS（-）で前項の検討から、hDP 単独および hDP+hORS 混合のス

た。さらに、4 % パラホルムアルデヒド（PFA）でスフェア

図1

単層培養とスフェアでの呼吸活性比較（毛乳頭単独培養）

図2

単層培養とスフェアでの呼吸活性比較（混合培養）− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

フェアはいずれも、呼吸活性が低下し、休止期状態の毛再度平板上で培養し細胞の生存性を観察した。図 4 に平板球部と似ている状態であることがわかった。次に、混合に静置後 1 日の hDP スフェア（左）を、静置後 10 日の hDP

スフェアを作成した時のスフェアの構造を解析した。本スフェア（右）を示した。hDP スフェアから明らかに hDP

実験では上皮系細胞として、hORS に代えて hKC を使用

がアウトグロースしており、インタクトな毛乳頭を単離しした。hDP を特異的に認識する抗 Vimentin 抗体を、hKCて培養した時と同様の様子を示した。結果から、スフェアを特異的に認識する抗 Pancytokeratin 抗体を使用し、抗化した hDP は生存しており、単に呼吸活性が低下しただ

Vimentin 抗 体 を 検 出 す る 2 次 抗 体 に は FITC が、 抗けの状態であることが確認された。

Pancytokeratin 抗体を検出する 2 次抗体には Alexa Fluor
594 が 蛍 光 物 質 と し て 結 合 し て い る。 な お、 細 胞 核 は
DAPI で蛍光染色した。

3 . 4 . 毛乳頭細胞単独の単層培養とスフェアでの毛周期関連遺伝子の発現特性

hDP+hORS 混合スフェアの切片の染色像を図 3 に示し

hDP のスフェアと単層培養細胞を作成し、休止期維持た。中心部が緑色（FITC）を示したことから、hDP が中因子（BMP- 4）8）、成長期維持因子（FGF 7、アルカリ性

心部に凝集し、それを取り囲むように外側に赤色（Alexa

フォスファターゼ［ALP］）9 , 10）、退行期誘導因子（TGF-β 2、Fluor 594）を示したことから hKC が配置していることがFGF 5）11 , 12）の発現を real time PCR で評価した（図 5）。単確認された。実際の毛球部では、中心に毛乳頭細胞があり、層培養からスフェアに変化することで、①休止期維持因子

毛乳頭と隣接するように局在する。このことから毛球部のBMP- 4 の発現は有意に亢進、②成長期維持因子 FGF 7 と細胞局在と類似した、スフェアであると考察した。本実験

ALP は有意に低下、③退行期誘導因子 TGF-β 2 と FGF 5は実際の毛球部を再現することが重要であるので、評価には有意に低下した。これらの結果は、① BMP- 4 の発現亢用いることができる可能性を示した。

進はスフェアになることによって休止期に近い状態、②
FGF- 7 と ALP の発現低下はスフェアが成長期初期から中3 . 3 . スフェア化した hDP の生存性期以外の時期に似ている、③ TGF-β 2 と FGF 5 の発現低hDPをスフェア化すると呼吸活性が低下することが 3 . 1 .の下は成長期後期から退行期以外の時期に似ていることを示

検討で明らかとなった。これは、細胞が生存していない可唆していた。以上より、スフェア化 hDP は成長期初期か能性を疑わせた。そこで、スフェア形成後 10 日経過し十ら退行期以外の期、つまり休止期であることを示唆してい分に呼吸活性が低下してスフェア化した hDP を取り出し、

た。

図3

図4

スフェア内の間葉系細胞（hDP）と上皮系細胞（hKC）の局在

静置 1 日の hDP スフェア
（左）、および静置 10 日の hDP スフェア

− 92 −

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築

3 . 5 . 毛乳頭細胞単独のスフェアに CsAを添加した
時の毛周期関連遺伝子の発現特性（ALP、血管内皮細胞増殖因子［VEGF］）14）、退行期誘導

スフェア化した hDP に発毛薬剤 CsA 13） を添加（50 ng/

た（図 6）。スフェア化した hDP に CsA を添加（50 ng/ml）ml）の有無での休止期維持因子（BMP- 4）、成長期維持因子

することで、①休止期維持因子である BMP- 4 の発現は有図5

図6因子（TGF-β 2、FGF 5）の発現を real time PCR で評価し単層培養とスフェアした hDP での各種毛周期関連遺伝子の発現比較

スフェア化 hDP に CsA を添加した時の各種毛周期関連遺伝子の発現比較− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

意に低下、②成長期維持因子である ALP と VEGF は有意（引用文献）に亢進、③退行期誘導因子である TGF-β 2 と FGF 5 は有

1） Ishino A, Takahashi T, Suzuki J, Nakazawa Y,

意に低下した。これらの結果は、① BMP- 4 の発現低下は

Iwabuchi T, Tajima M. Contribution of hair density

CsA 添加によって成長期極初期に近い状態になることを、

and hair diameter to the appearance and progression② ALP と VEGF の発現更新は CsA 添加によって成長期極of androgenetic alopecia in Japanese men. Br. J.

初期に近い状態になることを、③ TGF-β 2 と FGF 5 の発

Dermatol. 171: 1052-1059.（2014）

現低下は成長期後期から退行期以外の時期に似ていること

2） Tajima M, Hamada C, Arai T, Miyazawa M, Shibataを示唆していた。以上より、スフェア化した hDP に発毛

R, Ishino A. Characteristic features of Japanese

薬剤 CsA を添加すると、成長期初期に類似した遺伝子発

women's hair with aging and with progressing hair

現特性を示すことが明らかとなった。

loss. J. Dermatol. Sci. 2007: 45: 93-103.（2007）

4. 考

3） Birch MP, Messenger JF, Messenger AG. Hair察

density, hair diameter and the prevalence of female

女性由来の毛乳頭細胞を用い、3 次元培養（スフェア化）

pattern hair loss. Br. J. Dermatol. 144: 297-304.（2001）

を行うことによって in vitro 発毛評価系の構築を試みた。

4） Courtois M, Loussouarn G, Hourseau C, Grollier

毛乳頭細胞を単独および上皮系細胞と混合でスフェア化す

JF. Hair cycle and alopecia. Skin Pharmacol. 7: 84-89.

ると呼吸活性が低下し、休止期毛包と類似した状態となっ（1994）た。さらに、混合でのスフェアは実際の毛球部と同様に毛5） Silver AF, Chase HB. DNA synthesis in the adult

乳頭細胞が中心部に凝集し、その周囲を上皮系細胞が取りhair germ during dormancy（telogen）and activation（early anagen）. Dev. Biol. 21: 440-451.（1971）

囲む構造を呈した。
ヒトの毛乳頭細胞を単離し、初代培養を行うと細胞が集6） Tezuka M, Ito M, Ito K, Tazawa T, Sato Y. Investigation

塊を形成し盛り上がってくる現象が観察される。また、こof germinative cells in generating and renewed anagenの盛り上がり部には ALP が強く発現していることが知ら

hair apparatus in mice using anti-bromodeoxyuridine

れている。毛乳頭細胞は凝集化すると形質が変化する性質

monoclonal antibody. J. Dermatol. Sci. 2: 4 3 4-4 4 3.

があることが予想される。本検討において、3 次元培養に（1991）

よって細胞集塊（スフェア）
を人為的に形成させることによ

7） Mohammadi P, Youssef KK, Abbasalizadeh S,って何らかの変化を生じさせたことが考えられた。これら

Baharvand H, Aghdami N. Human hair reconstruction:のことから、形態的には毛乳頭細胞のスフェアを用いて inclose, but yet so far. Stem Cells Dev. 2 5: 1 7 6 7-1 7 7 9.

vitro での発毛評価系を構築できる可能性が出てきた。

（2016）

スフェア化した毛乳頭細胞における毛周期関連遺伝子の8） Zhang J, He XC, Tong WG, Johnson T, Wiedemann

発現特性を検討した結果、休止期に類似した遺伝子発現特LM, Mishina Y, Feng JQ, Li L. Bone morphogenetic性を示していることが確認された。さらに、発毛薬剤 CsA

protein signaling inhibits hair follicle anagen induction

によって、遺伝子発現特性が成長期の極初期に類似した状

by restricting epithelial stem/progenitor cell activation

態に変化することが確認された。毛乳頭細胞のスフェア化

and expansion. Stem Cells. 24: 2826-2839.（2006）

によってなぜこのような反応が起こるのか詳細は不明だが、

9） Danilenko DM, Ring BD, Yanagihara D, Benson

細胞接着が毛周期関連遺伝子の発現に関与している可能性

W, Wiemann B, Starnes CO, Pierce GF. Keratinocyteが考えられる。細胞接着を強くし過ぎないように働くコン

growth factor is an important endogenous mediator of

ドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種であるバーシカン

hair follicle growth, development, and differentiation.

が、毛乳頭細胞の毛包誘導能の維持に関与している例があNormalization of the nu/nu follicular differentiation

る 15）。何らかの毛乳頭細胞間の接着機構が単層培養の毛defect and amelioration of chemotherapy-induced

乳頭細胞とスフェア化した毛乳頭細胞の特性の違いとなっalopecia. Am. J. Pathol. 147: 145-154.（1995）
10）Hamada K, Suzuki K. Evaluation of biochemicalて現れていると思われた。

indices as a hair cycle marker in C 3 H mice. Exp.

形態学的特性、スフェア化による毛周期関連遺伝子の発Anim. 45 : 251 - 256 .（1996）

現特性変化、発毛薬剤による毛周期関連遺伝子の発現特性変化の結果から、スフェア化した毛乳頭細胞はヒトでの発11）Soma T, Tsuji Y, Hibino T. Involvement of transforming

毛を in vitro で評価できる実験系と成り得る可能性が強く

growth factor-beta 2 in catagen induction during the

示唆された。

human hair cycle. J. Invest. Dermatol. 1 1 8 : 9 9 3 - 9 9 7 .
（2002）− 94 −

女性頭髪における休止期 - 成長期移行シグナルメカニズムの in vitro 解析系の構築

growth. J. Dermatol. Sci. 9 : 64 - 69（1995）

12）Hébert JM, Rosenquist T, Götz J, Martin GR. FGF 5
as a regulator of the hair growth cycle: evidence from

14）Yano K, Brown LF, Detmar M. Control of hair growthtargeted and spontaneous mutations. Cell. 7 8 : 1 0 1 7 -and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis. J.

1025 .（1994）

Clin. Invest. 107 : 409 - 417 .（2001）

13）Iwabuchi T, Maruyama T, Sei Y, Adachi K. Effect of15）Kishimoto J, Ehama R, Wu L, Jiang S, Jiang N,

immunosuppressive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase

Burgeson RE. Selective activation of the versican（PPIase）inhibitors, cyclosporin A, FK 506 , ascomycin

promoter by epithelial-mesenchymal interactions

and rapamycin, on hair growth initiation in mouse:

during hair follicle development. Proc. Natl. Acad. Sci.

immunosuppression is not required for new hair

U. S. A. 96 : 7336 - 7341 .（1999）− 95 −

ヒト培養表皮におけるアスコルビン酸の経皮吸収および
紫外線 UVB による細胞障害に対する予防、回復効果の検討
東京都健康長寿医療センター研究所

近藤嘉高

Several studies have reported the effects of vitamin C (L-ascorbic acid, AA) on ultraviolet B (UVB)-induced cell damage
using cultured keratinocytes. However, the epidermis consists of multiple cell layers, and the effect of AA on UVB-induced
damage to the human epidermis remains unclear. Therefore, we investigated the effect of AA on UVB-induced skin damage
using reconstituted human epidermis. The reconstituted human epidermal surface was treated with 100 and 500 mM AA
and cultured for 3 h before (pre-AA treatment) or after (post-AA treatment) 120 mJ/cm 2 UVB irradiation. Pre- and postAA treatments of the epidermal surface suppressed UVB-induced cell death, apoptosis, DNA damage, reactive oxygen
species (ROS) production, and the inflammatory response by downregulating tumour necrosis factor-α (TNF-α) expression
and release. Moreover, the pre-AA treatment was more effective at preventing UVB-induced skin damage than the post-AA
treatment. In summary, pre- and post-AA treatments of the epidermis prevent UVB-induced damage.

1. 緒のくらい表皮に吸収されるのか、吸収された表皮のアスコ

言

ルビン酸は活性酸素種を消去して細胞障害やアポトーシス、

皮膚は、表皮、真皮、皮下脂肪という構造をとる。表皮炎症を抑制するのか、塗布するタイミングはいつが効果的の角質層は、保湿や異物の侵入を防ぐバリア機能を担う。

なのかなど、科学的な知見が不足しているのが現状である。

地上に届く太陽光には、表皮から真皮上層までしか到達し本研究では、ヒト正常皮膚細胞より再構築された 3 次元培ない紫外線 UVB（280 - 320 nm）と、真皮深層まで到達す

養表皮を用いて、アスコルビン酸の経皮吸収および UVB

る UVA（320 - 400 nm）が含まれる。私たちは、紫外線をによる日焼けに対する予防、回復効果を明らかにする。

浴びると日焼け、すなわち、皮膚が赤く炎症を起こす急性2. 方症状とメラニン色素の沈着が起こる。この時、表皮細胞で発生する種々の活性酸素種によって、細胞障害さらにはア

法

2 . 1. ヒト培養表皮へのアスコルビン酸の取り込み

ポトーシスが起こり、炎症が惹起される。また、表皮細胞

初めに、皮膚に塗布したアスコルビン酸が経皮吸収されるの DNA は、紫外線により傷害されて、その蓄積は皮膚がかどうかを明らかにするため、ヒト正常皮膚細胞より再構築

んの原因となる。従って、第一の対策としては、日焼け止された 3 次元培養モデルの表皮を用いてアスコルビン酸の経

めを皮膚に塗り、サンスクリーンによって紫外線を遮断する

皮吸収を調べた。培養カップ内のヒト培養表皮は、最下層ことが重要である。しかし、完全には紫外線を遮断できなの基底膜側にはアスコルビン酸を含まない培地を入れ、最いことから、第二の対策として、細胞内で発生する活性酸

上層の角層はバリア機能を持つため空気と接した状態で培素種を消去できる抗酸化物質を摂取することが肝要となる。

養した。表皮上にアスコルビン酸ナトリウム溶液（0 , 10 , 100 ,アスコルビン酸（ビタミン C）は、紫外線で生ずる一重項

500 , 1000 mM）を添加して、3 時間後および 6 時間後に表酸素をはじめ、種々の活性酸素種を消去できる水溶性の強皮を回収した。表皮中の総アスコルビン酸（アスコルビン酸と力な抗酸化物質である。私たちヒトは、進化の過程でアスデヒドロアスコルビン酸）は、高速液体クロマトグラフィーお

コルビン酸の合成能を欠損したため、食事など外からア

よび電気化学検出器を用いた方法により高感度に定量した。

スコルビン酸を摂取する必要がある。従って、紫外線対策としては、アスコルビン酸の経口摂取にくわえて、アスコ

2 . 2 . UVB 照射によるヒト培養表皮の細胞障害評価

ルビン酸が含まれる日焼け止めを利用することも有効であ

次に、ヒト培養表皮に UVB（50 , 80 , 120 mJ/cm 2）を照ろう。しかし、ヒトの皮膚に塗布したアスコルビン酸がど射して、24 時間後に細胞障害を評価した。細胞生存率は、
MTT アッセイで測定した。表皮の厚さは、培養表皮の凍結切片をヘマトキシリン・エオシン染色した後、染色画像

Protective effect of pre- and post-vitamin
C treatments on UVB-irradiation-induced
skin damageの表皮厚を測定した。表皮の層構造は、凍結切片を用いたシトルリン化タンパク質や filaggrin、loricrin、keratin
10、keratin 14、collagen type IV、trichohyalin の 免 疫

Yoshitaka Kondo

蛍光染色により評価した。アポトーシス頻度は、凍結切Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology

片を TUNEL 染色した後、TUNEL 陽性細胞数を定量した。

− 96 −

ヒト培養表皮におけるアスコルビン酸の経皮吸収および紫外線 UVB による細胞障害に対する予防、回復効果の検討

DNA 損傷は、DNA 二重鎖切断の指標である γ-H 2 A.X の前に添加した培養表皮は、照射後に添加した時に比べて、免疫蛍光染色により、陽性細胞率を定量した。

UVB による細胞障害がより抑制された。

4 . 考察、総括

2 . 3 . UVB 照射によるヒト培養表皮の細胞障害に対するアスコルビン酸の効果

ヒト 3 次元培養表皮に添加したアスコルビン酸は、経皮

ヒ ト 培 養 表 皮 に UVB（120 mJ/cm 2）を照射す る 前 ま

吸収されることが明らかとなった。アスコルビン酸は、角たは後の 3 時間、アスコルビン酸ナトリウム溶液（100 ,層のバリアがあるものの、おそらく細胞間隙を通過して表500 mM） を 表 皮 表 面 に 添 加 し た。UVB 照 射 24 時 間 後

皮中に入り、ナトリウム依存性ビタミン C トランスポータに、細胞生存率やアポトーシス頻度、DNA 損傷、酸化ー（SVCT）により角化細胞に取り込まれると考えられる。

ストレスを評価した。酸化ストレスは、脂質過酸化の指

3 次元培養表皮は、ヒトの表皮構造を再現したモデルであ

標 で あ る 4 -hydroxynonenal（4 -HNE） の 免 疫 蛍 光 染 色ることから、ヒトの皮膚に塗布したアスコルビン酸も経皮により、活性酸素種は、スーパーオキシドアニオンを検吸収されることが示唆される。

出する dihydroethidium（DHE）染色により評価した。まこれまでに、表皮の角化細胞を用いた単層培養の試験かた、UVB 照射 3 時間後に定量的 PCR 法により培養表皮のらは、抑制効果と増悪効果のいずれも報告されており、議TNF-α 遺伝子発現量を、照射 9 時間後に ELISA 法により論が続いていた。しかし、生体内により近いヒト 3 次元培

培養上清の TNF-α タンパク質量を測定した。

養表皮を用いた本研究により、経皮吸収されたアスコルビ

3. 結

ン酸は、UVB による細胞障害を抑制することが明らかと果なった。表皮中のアスコルビン酸は、UVB により産生さアスコルビン酸を添加しないヒト培養表皮では、表皮中れる活性酸素種を消去することにより酸化ストレスを抑制に総アスコルビン酸は全く検出されなかった。一方、アス

して、DNA 損傷やアポトーシスなどの細胞障害を防いだ

コルビン酸を添加したヒト培養表皮では、総アスコルビンと考えられる。さらに、アスコルビン酸塗布のタイミング酸が検出され、添加濃度（10 , 100 , 500 , 1000 mM）が高いについて、UVB 照射の前の方が後よりも効果的であるこ群ほど、総アスコルビン酸量は多かった。

とも明らかとなった（図）。この研究成果は、皮膚における

次に、ヒト培養表皮に UVB（50 , 80 , 120 mJ/cm 2）を照射して、24 時間後に細胞障害を評価した。照射量が多い

アスコルビン酸の機能解明や紫外線対策に貢献することが期待される。

培養表皮は、細胞生存率が低く、アポトーシス細胞や細胞の空胞化、DNA 損傷が多かった。しかし、表皮の厚さ（引用文献）や層構造に明らかな差は認められなかった。一方、UVB

1） Kawashima S, Funakoshi T, Sato Y, Saito N,

照射の前または後にアスコルビン酸を添加した培養表皮

Ohsawa H, Kurita K, Nagata K, Yoshida M, Ishigami

は、添加しない群に比べて細胞生存率が高く、アポトーシ

A. Protective effect of pre- and post-vitamin C

ス頻度や細胞の空胞化、DNA 損傷、酸化ストレス、活性treatments on UVB-irradiation-induced skin damage.

酸素種が少なかった。特に、アスコルビン酸を UVB 照射

Sci Rep. 8（1），16199（2018）

図 皮膚へのアスコルビン酸塗布は、紫外線照射による細胞障害を抑制
UVB 照射の前または後にアスコルビン酸を表皮表面に添加すると、表皮にアスコルビン酸が取り込まれて、UVB 照射による細胞障害を抑制した。特に、UVB 照射
前にアスコルビン酸を塗布した方が、後から塗布するよりも効果的であった。
AA：アスコルビン酸、ROS：活性酸素種、UVB：紫外線− 97 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討
和歌山県立医科大学皮膚科神人

正寿

Skin senescence may be induced by various factors including intrinsic aging and extrinsic aging. In this study, we
compared the expression of exosome and microRNAs in the serum and skin between young and senescent people. Exosome
expression was determined using ELISA and immunostaining. microRNA expression was evaluated by PCR array, real-time
PCR analysis, and in situ hybridization. microRNA was forcedly overexpressed using microRNA mimics. Cell senescence
was examined by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal).
We could not find significant correlation of age with exosome expression of serum or skin in young and senescentpeople. However, according to the result of microRNA PCR array, miR- 124 was the most increased microRNA in senescentskin when compared to young skin. in situ hybridization revealed that the signal for miR- 124 was evident in keratinocytes ofsenescent skin, but not in the young skin.
Cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEKs) overexpressed with miR- 124 mimic changed theirmorphology to an enlarged and irregular shape. In addition, SA-β-Gal positive NHEKs were significantly increased by thetransfection of miR- 124 mimic.
The expression of miR- 124 was increased in the UVB-irradiated NHEKs compared to control cells in a dose-dependent
manner. Taken together, our results indicated that miR- 124 is increased by UV irradiation in keratinocytes, which causes cellsenescence.

1. 緒

基 程度の microRNAであり、様々な mRNAの three prime

言

untranslated regions（3 ' UTRs）の相補的配列に結合し翻

他臓器の老化と比しての皮膚の老化の特徴として、intrinsic

訳を阻害することで蛋白発現調節をしている。ヒトゲノムにはaging（内因性老化）とextrinsic aging（外因性老化）の 2 つ

2 , 000 種類以上の microRNA が存在することが分かっておの要因が存在する点がある。前者では加齢による細胞の機り、60 % 以上の遺伝子を制御しうると考えられている 1）。近年、能低下により皮膚の萎縮や細かいシワの形成がみられる一方

microRNA が生体内で様々な遺伝子発現を調節することで細で、後者の主な原因は紫外線の影響により生じるphotoaging

胞増殖や分化において重要な働きをしていることが明らかに（光老化）であり、表皮の肥厚と深いシワ、シミ、さらには毛なっているが、microRNAの各疾患における役割も検討され

細血管拡張などをきたす。しかしこのような複雑な老化に対つつある。例えば、全身性強皮症では miR-29 a が低下してする科学的アプローチは進んでおらず、シワ・シミなどの変化

おり、targetであるコラーゲン遺伝子などの発現を増加させのそれぞれに特異的に関与する分子メカニズムは未だ分かっることで線維化に関与している 2）。microRNA 関連の研究論ていない。

文は H 31 . 2 月現在 Pubmed 上で約 82000 編と急速に増加し皮膚老化には上記のように遺伝素因と環境素因が発症にており、研究代表者らもmicroRNAと皮膚疾患に関してこれ関与すると考えられているが、研究代表者らはその環境素因

まで 46 編の研究論文を発表している。その中で我々は皮膚を媒介するものとしてnon-coding RNAに注目してきた。ヒ

老化とmicroRNAの関連についての研究報告を他の研究室

トの細胞には蛋白質をコードしていないnon-coding RNA がにさきがけて行ってきた。具体的には老化皮膚にみられる血存在しこれまで「ゴミ」と思われてきたが、実は DNA（遺伝素

管異常であるcherry angiomaでは血管内皮細胞が増殖して因）を後天的に修飾することで環境因子として DNA-mRNA-

いるが、その血管内皮細胞で miR- 424 の発現が減少してお蛋白発現をオン／オフする機構であるエピジェネティクスにり、そのためにMEK 1 とcyclin E 1 が増加することで細胞増関わる（図 1）。小分子 RNAを主体とするものと比較的長い殖能が活性化し内皮細胞の腫瘍性増加をきたすことを見出し、RNAを主体とするものに分類され、前者の代表が平均 22 塩

このような経路の阻害が本腫瘍の新しい治療につながる可能性を示した 3）。さらに老化皮膚・紫外線暴露で多く出現する
有棘細胞癌におけるmicroRNAの関与も明らかにしている 4）。

The role of exosome in skin aging and its
implications to therapy
Masatoshi Jinnin
Department of Dermatology, Wakayama
Medical University Graduate School of
Medicine

一方、H 29 年 7 月に国立がん研究センターが血液 1 滴に含まれるmicroRNA から 13 種類の癌を早期発見する新しい検査法を開発したことがプレスリリースされ注目された。従来、microRNAを含むRNAは体液中では RNase の働きにより直ちに分解されると考えられてきたが、実際には体液中の− 98 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

図1

coding RNA と non-coding RNA の相関

microRNA は比較的安定して検出できる。近年の研究によ射することで皮膚に強発現させるとブレオマイシンによる線維り、その理由は microRNA がエキソソームなどに保護されて化を抑制できることを示した。

いるからではないかと考えられている。エキソソームは細胞か

さらにエキソソームそのものについても、我々は最近全ら細胞外に分泌される 0 . 1 µm 以下の小胞で、血液、唾液、尿、身性強皮症の皮膚線維化にエキソソームが関係することを関節液、さらには乳汁など様々な体液中に存在し、脂質二重初めて証明する 10）とともに、現在難治性皮膚潰瘍に対す膜で形成されているため非常に安定している（4 ℃で 2 週間保るエキソソームの臨床試験を行っている（NCT 02565264）

存が可能）。内部には microRNAのほか、蛋白質や mRNAが、これは現時点で国内唯一のエキソソームの臨床応用のを含有している。その後分泌元の細胞の情報を持つエキソソ試みである。

ームがほかの細胞に取り込まれることによって細胞間コミュ

以上のような取り組みを経て、本研究計画において我々

ニケーションが行われていることも判明しており、様々な疾患

は、皮膚老化においても microRNA やエキソソームの量、の病態における役割が精力的に研究されるようになった。例あるいはエキソソームの質（microRNA、蛋白質、あるい

えば悪性腫瘍において腫瘍細胞の転移先の臓器特異性を決は mRNA の発現プロファイル）が変化し、皮膚を構成する定するメカニズムはこれまで不明であったが、エキソソームに各細胞（角質細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など）の変化

含まれるインテグリンにより規定されていることが報告され 6）、を誘導している可能性に注目し、皮膚老化と血液中・皮膚

エキソソーム解析による早期癌の検出・診断やエキソソーム

組織中の microRNA あるいはエキソソームの量および質治療などの可能性が示唆されている。

の相関を調べた。

我々もこれまで microRNA が多数の皮膚疾患の病態に関

2. 方

わるのみならず、その血中あるいは毛髪中濃度が全く新しい
診断あるいは病勢マーカーになりうると同時に、治療のター法

2 . 1. 血清および皮膚組織

ゲットとなる可能性を明らかにしてきた。たとえば尋常性乾癬

血清サンプルは、13 名の 27 〜 56 歳の正常人から採取しにおいては表皮の増殖をcyclin E 1 やMEK 1 を介して制御すた。また、0 ～ 10 歳の若年者と 80 ～ 100 歳の高齢者の顔るmiR- 424 の血清濃度がバイオマーカーとなることをみいだ

面の手術時の余剰皮膚をそれぞれ 3 例収集しホルマリン固

7）した 。また、重症薬疹の皮疹部表皮では miR-124 が増加

定・パラフィン包埋したものを研究に使用した。また、非露し、アポトーシスに抑制的に働くBCL 2 L 10 発現を抑えて皮光部の正常皮膚サンプルもそれぞれ 3 例ずつ用意した。

膚のアポトーシスを誘導するとともに、血清中 miR-124 濃度が重症度と相関することを明らかにした 8）。同様に、全身性2 . 2 . エキソソーム解析

強皮症の硬化皮膚では let-7aの発現が低下しており、皮膚血清中のエキソソームは ExoQuick（SBI 社）を用いて収線維芽細胞においてtargetであるコラーゲン発現を増加させ集した。 さらにそれぞれ のサンプルについて ExoELISAることで線維化に寄与している 9）。さらに血清 let− 7a 濃度はkit（SBI 社）
を用いたenzime-linked immunosorbent assay

疾患の活動性と逆相関し、またマウスの腹腔内にlet-7aを注（ELISA）を行い、定量を行った。

− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20192 . 3 . microRNA PCR Array

2 . 8 . microRNA mimic

PCR アレイには細胞の分化および発生に関する 88 種類

内在性 microRNAの機能を模倣するようにデザインされの microRNA に対するプライマーがセットされた 96 -well

た合成二本鎖 RNAであるmicroRNA mimicは Qiagen 社か

RT 2 miRNA PCR Array Kit（SABioscience 社）を使用した。

ら購入した。本研究では miR- 124 に特異的な microRNA

Kit に含まれる house keeping gene を用い比較 Ct 法で解析

mimicおよびcontrol microRNA mimicを使用し、transfection

した。

reagent としては lipofectamine RNAiMAX（invitrogen 社）
を用いて細胞に導入した。

2 . 4 . real-time PCR
Takara Thermal Cycler Dice（TP 800）により real-time
PCR 法を行った。プライマーとしては miR- 124 およびU 6 を使用した。

2 . 9. 細胞数測定
細胞数測定に際しては、接着細胞をトリプシン処理で浮遊させ、Coulter Particle Counter（Beckman Coulter 社）
で細胞数をカウントした。

2 . 5 . in situ hybridization
miR- 124 に相補的な配列を持つ 5’ -locked digoxigeninlabeled nucleic acid probe（Exiqon 社 ） を 使 用 し て、
4 µm に 薄 切 し た パ ラ フ ィ ン 包 埋 組 織 に 対 し て in situ

2 . 10 . 統計解析
統計解析として、中央値の比較には Mann-Whitney testを使用し、p 値 < 0 . 05 を統計学的に有意とした。

hybridization を施行した。

3. 結

2. 6. senescence-associated β-galactosidase（SA-β-Gal）
染色

果3 . 1. 年齢とエキソソーム量の相関
最初に、27 〜 56 歳の正常人から血清中のエキソソーム

Cellular Senescence Assay Kit（Chemicon Internationalを抽出し、その抽出物を ELISA 法にて定量した。年齢とInc 社）
を用いて行った。細胞に fixing solution を投与し 15

血清中エキソソーム量の相関を調べたが、明らかな相関を

分間室温でおいた後、SA-β-gal Detection Solution を加え、認めなかった（R= 0 . 18 , P= 0 . 55 , 図 2）。また、免疫染色を37 度で１晩培養した。

施行したが老化皮膚とエキソソーム発現量を見いだすことができなかった（data not shown）。

2 . 7. in situ hybridization

そこで次に老化皮膚における microRNA 発現の検討を

正 常 ヒ ト 表 皮 角 質 細 胞（normal human epidermal

行った。

keratinocytes; NHEK）は Lonza 社から購入した。KGMGold Bullet Kit を用いて、5 % CO 2 インキュベーターで培養を行った。

3 . 2 . 老化皮膚とmicroRNAの検討
まず、若年者（0 ～ 10 歳）と高齢者（80 ～ 100 歳）の顔面

図2

正常人における、年齢と血清中エキソソーム量の相関− 100 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

皮膚組織 3 例ずつから抽出した microRNA を等量混合した化細胞の形態が大型化し細胞老化の兆候を示した（図 5）。

サンプルを用意し、それぞれの皮膚における microRNA のSA-β-gal にて老化細胞の核を染色すると miR- 124 mimic

発現パターンを PCR アレイで評価した。アレイに含まれを導入した細胞ではコントロール細胞よりも SA-β-gal 陽る 88 種類の microRNA の中で若年者に比べ高齢者の顔面皮膚で発現が増加しているものとして、let- 7 a, miR- 18 a,miR- 124 , miR- 192 , miR- 196 a, miR- 206 , miR- 208 , miR215, miR-219-5p, miR-302c, miR-488, およびmiR-518b
がリストアップされた。この中で最も発現の差が大きかった miR- 124 に注目した。アレイの結果を validate するためにサンプル数を増やし、miR- 124 に特異的なプライマーを用いて real-time PCR を行ったところ、miR- 124 は若年者に比べて高齢者の顔面の皮膚において発現が上昇しており、統計学的な有意差もみられた（図 3）。そのため、
PCR アレイの結果が再現されたと考えられた。
次に、miR- 124 が老化皮膚のどの細胞で増加しているか局在を調べた。若年者および高齢者の正常顔面皮膚組織の in situ hybridization では、高齢者の表皮基底層が miR124 のプローブで染色されたが、若年者のほうでは染色されなかった（図 4）。つまり、miR- 124 は老化皮膚の表皮基底層で増加していると考えられた。
続いて、老化皮膚における miR- 124 の機能を調べた。
miR- 124 mimic を 強 発 現 さ せ る と 培 養 ヒ ト 正 常 表 皮 角

図4

図 3 若年皮膚（n=3）と高齢者皮膚（n=6）における miR-124 発
現量の比較 *p<0.05

in situ hybridization 法による、若年者および高齢者の正常顔面皮膚組織の miR-124 発現の比較

図5

miR-124 強発現下での、細胞形態の変化− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 6 miR-124 強発現下での、培養正常表皮角化細胞の SA-β-gal
染色率の変化 *p < 0.05

図 7 培養正常表皮角化細胞における、miR-124 発現量に対す
る UVB 照射の影響 *p < 0.05

性細胞の率が有意に高くなった（図 6）。つまり、miR- 124

皮膚老化における関与の有無を再度確かめたいと考えていは表皮角化細胞において細胞の老化を誘導している可能性る。
本報告書は文献 11 の内容をもとに作成した。

が示唆された。
最後に、miR- 124 が老化皮膚で増加するメカニズムを検討した。培養正常表皮角化細胞に UVB 照射を 3 日間連（引用）

続で行い、その 24 時間後に細胞から microRNA を回収し

1） Friedman, R.C., et al. Most mammalian mRNAs are

た。miR- 124 の発現は、UVB の照射量に比例して上昇し、

conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-

コントロール群と 10 mJ 照射群では有意差が見られた（図105（2009）．

7）。逆に、非露光部の正常皮膚組織を用いて real-time2） Maurer, B., et al. MicroRNA-2 9, a key regulator of

PCR を行ったが、若年者と高齢者で miR- 124 発現に有意

collagen expression in systemic sclerosis. Arthritis

差は認めなかった（data not shown）。この結果により、紫Rheum. 62, 1733-1743（2010）．

外線暴露が老化皮膚での miR- 124 の発現上昇に関係して

3） Nakashima, T., et al. Down-regulation of mir-4 2 4contributes to the abnormal angiogenesis via MEK1いると示唆された。

4. 考

and cyclin E1 in senile hemangioma: its implications to察therapy. PLoS One 5, e14334（2010）．

本 研 究 に お い て 我 々 は microRNA の う ち miR- 124 が4） Yamane, K., et al. Down-regulation of miR-1 2 4/-

老化皮膚において紫外線の影響で増加し、それによって

2 1 4 in cutaneous squamous cell carcinoma mediates

細胞老化を誘導していることを示した 11）。皮膚老化の予

abnormal cell proliferation via the induction of ERK. J.

防・改善はコスメトロジーの重要なテーマである。これ

Mol. Med. (Berl) 91, 69-81（2012）．

まで我々は基礎研究として、例えば老化の原因となる活

5） Shimozono, N., et al. NUP1 6 0-SLC4 3A3 Is a Novel

性 酸 素 を 除 去 す る Superoxide dismutase の 皮 膚 疾 患 にRecurrent Fusion Oncogene in Angiosarcoma. Cancer

おける研究歴を有する 12 - 14）。そして、この研究により皮Res. 75, 4458-4465（2015）．

膚老化の microRNA を介した分子機序が明らかになれば、

6） Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins

microRNA による皮膚老化・肌年齢の定量化や客観的評価

determine organotropic metastasis. Nature 5 2 7, 3 2 9-に加え、microRNA による皮膚老化のコントロールが可能

335（2015）．

になる可能性がある。さらに、microRNA による皮膚老化

7） Ichihara, A., et al. microRNA-mediated keratinocyteの予防は美容という観点のみならず、皮膚老化に伴う様々

hyperproliferation in psoriasis vulgaris. Br. J. Dermatol.

な疾患（皮膚癌や皮膚掻痒症など）の予防につながる可能．
165, 1003-1010（2011）性もある。今後、miR- 124 のターゲットの同定も必要と

8） Ichihara, A., et al. Upregulation of miR-1 8a-5p

なるが、たとえば web 上のプログラムである Targetscan

contributes to epidermal necrolysis in severe drug

（http://www.targetscan.org/vert_ 72 /）では ERK 2 など細eruptions. J. Allergy Clin. Immunol. 1 3 3, 1 0 6 5-1 0 7 4

胞増殖に関わる分子がターゲットと予測されている。

（2014）．

一方、エキソソームについても今後さらに皮膚および血9） Makino, K., et al. The downregulation of microRNA

清サンプル数を増やして実験を繰り返すことで、将来的に

let-7a contributes to the excessive expression of type

− 102 −

皮膚老化におけるエキソソームの働きの解明と治療応用の可能性の検討

I collagen in systemic and localized scleroderma. J.

12）Jinnin, M., et al. Elevated serum levels of manganesesuperoxide dismutase in patients with eosinophilic

Immunol. 190, 3905-3915（2013）10）Nakamura, K., et al. Altered expression of CD 6 3
and exosomes in scleroderma dermal fibroblasts. J

fasciitis. Clin. Rheumatol. 22 , 505（2003）．
13）Jinnin, M., et al. Serum levels of manganesesuperoxide dismutase in patients with localized

Dermatol Sci. 84 , 30 - 39（2016）．
11）Harada, M., et al. The expression of miR-124 increases

scleroderma. Exp. Dermatol. 13 , 357 - 360（2004）．

in aged skin to cause cell senescence and it decreases

14）Jinnin, M., et al. Serum levels of manganese superoxide

in squamous cell carcinoma. Biosci. Trends 1 0 , 4 5 4 -dismutase in patients with mixed connective tissue459（2017）．

disease. Clin. Exp. Rheumatol. 23 , 549 - 550（2005）．

− 103 −

皮膚における自己反応性 CD4+ T 細胞による標的抗原認識機構の解明
慶應義塾大学医学部皮膚科

高橋勇人

Interface dermatitis is a pathological term that consists of lymphocyte infiltration into dermo-epidermal junction,
exocytosis, liquefaction degeneration of keratinocytes in the basal layer, Civatte body. This pathological change is commonlyand frequently seen in several inflammatory skin diseases such as lichen planus, graft-versus-host disease, dermatomyositis,
lupus erythematosus, severe drug adverse eruption and so on. However, the details on the pathomechanism of the diseaseremains still unclear. Recently we developed Dsg 3 -specific T cell receptor transgenic mice (Dsg 3 H 1 mice) that T cells
recognize Dsg 3 , epidermal targeted autoantigen by pemphigus vulgaris. Dsg 3 H 1 CD 4 + T cells can recognize Dsg 3 in vivo
and attack epidermal keratinocyte when they are transferred into Rag2–/– mice. In this study, we investigated pathomechanismof interface dermatitis by using Dsg 3 H 1 T cells. When factor X is knocked-out in Dsg 3 H 1 CD 4 + T cells, recipient Rag 2 –/–mice did not develop interface dermatitis. However, Dsg 3 H 1 CD 4 + T cells vigorously proliferated in skin-draining lymph
nodes and prominent lymphadenopathy was observed. This result suggested that factor X is important for Dsg 3 H 1 T cells
to leave lymph nodes to target tissue but not to recognize the antigens and proliferate. On the other hand, how Dsg 3 H 1
CD 4 + T cells recognize epidermal autoantigen and damage keratinocytes is another question. Antigen presentation by MHC
class II on keratinocytes is believed to mediate this action. But supportive evidence is very limited. Using animal model ofinterface dermatitis, this fundamental question can be answered. The investigation to obtain a conclusion is still under way.
In conclusion, through this study, factor X was identified as crucial molecule to achieve interface dermatitis.

1. 緒

ウスを組み替え Dsg 3 タンパクで免疫する。免疫された言

Dsg 3 –/– マウスは容易に抗 Dsg 3 抗体を産生するが、標的Interface dermatitis（ID）は扁平苔癬、移植片対宿主病となる Dsg 3 がないため PV の病態は再現できない。そ（GVHD）、膠原病（皮膚筋炎、全身性エリテマトーデスな

こで Dsg 3 –/– マウスのリンパ球を Rag 2 –/– マウスに移入し、ど）、重症薬疹（Stevens-Johnson 症候群、中毒性表皮壊死

移入されたリンパ球が Rag 2 –/– マウスで発現する Dsg 3 を症）などに認める皮膚炎の一型であり、皮膚病理学的な分認識し、抗 Dsg 3 抗体を産生するようになり、PV の病態類である。ID は様々な疾患に共通して認める病理学的変が再現される 2）。

化であるため、日常診療において比較的遭遇する頻度の高

Dsg 3 特異的 T 細胞はこの PV モデルを利用し、以前にい皮膚炎である。しかしその発症メカニズムの詳細に関しクローンが樹立された。そのクローンのいくつかは Dsg 3 –/–て、明確には理解されていない。

マウス由来の B 細胞と一緒に Rag 2 –/– マウスに移入すると以前より、私たちは尋常性天疱瘡（PV）自己抗原であ1）

B 細胞からの抗 Dsg 3 抗体の産生を誘導し、PV フェノタ

る Dsg 3 に対する自己反応性 T 細胞の研究を行ってきた。

イプを再現することができ、病原性を持つクローンである

Dsg 3 は表皮角化細胞に発現し、デスモゾームを構成する

ことがわかった 3）。次に、このクローンが持つ Dsg 3 特異

カドヘリン型膜タンパクであり、角化細胞同士の細胞接的 T 細胞受容体遺伝子を単離し、これを利用して Dsg 3 特

着に重要な働きを持つ。PV では抗 Dsg 3 自己抗体が産生

異的 T 細胞受容体トランスジェニックマウス（H 1 マウス）

され、Dsg 3 の細胞接着が障害されることで、角化細胞がを作成した 4）。H 1 マウス由来 CD 4 +T 細胞は B 細胞と一緒

バラバラとなり、口腔粘膜などに水疱・びらんが生じる自に Rag 2 –/– マウスへ移入すると皮膚炎が著明に生じた。し己免疫疾患である。Dsg 3 特異的 T 細胞の解析は PV モデ

かし、病理学的に観察しても抗 Dsg 3 抗体の産生や PV フ

ルマウスを用いて解析された。PV モデルの作成には、まェノタイプは認めなかった。その代わりに、移入された

ず Dsg 3 に 対 す る 免 疫 寛 容 が 成 立 し て い な い Dsg 3–/–

マ

T 細胞自身が皮膚に浸潤し、とくに表皮真皮境界部への浸潤と、基底層角化細胞の液状変性、Civatte body などが観察され、観察された皮膚炎は ID であることがわかっ

Analysis on the mechanism of antigen
recognition by autoreactive CD 4 + T cells
in the skin
Hayato Takahashi
Depa rt ment of Dermatolog y, Keio
University School of Medicine

た。これを実験的自己免疫性皮膚炎（EAD; experimental
autoimmune dermatitis）と呼んでいる。一方、H 1 マウス
を Dsg 3 –/– マウスと交配し、Dsg 3 非存在下で H 1 T 細胞を分化させ、これを B 細胞と一緒に Rag 2 –/– マウスへ移入すると抗 Dsg 3 抗体の産生や PV フェノタイプが誘導され− 104 −

+

皮膚における自己反応性 CD4 T 細胞による標的抗原認識機構の解明た。すなわち Dsg 3 特異的 T 細胞はある条件下においてウスを交配し、X–/– ‒H 1 マウスを作成する。このマウス由来

は PV フェノタイプと ID の両方の病理学的変化を誘導でのX–/–-H 1 CD 4 + T 細胞を単離後、Rag 2 –/– マウスへ移入し、きることがわかった。通常 PV では ID は観察されないが、ID の状態を観察する。また移入後にレシピエントマウスの脾paraneoplastic pemphigus（PNP）では PV フェノタイプと臓やリンパ節を観察する。

ID が同時に観察される。以上の過去の成績から Dsg 3 特異
的 T 細胞による ID は PNP における ID を考察するうえで、重要なモデルであると考えられた。
従来、T 細胞による組織傷害性は CD 8 +T 細胞が主に担+2 . 2 . Interface dermatitis の発症に重要な抗原提示細胞の解析
組織における、CD 4 + T 細胞の抗原認識機構を明らかにうものとされてきたが、EAD では CD 4 T 細胞が組織傷害するため、抗原認識に必須の分子であるMHC class II 分活性を持つ。CD 4 +T 細胞は MHC class II 分子からの抗原

子を皮膚の様々な細胞から欠損させるマウスを作成する。各

提示を受けて、抗原認識を行う免疫細胞である。H 1 T 細

マウスの中で、EAD が生じるか否かを評価することにより、胞は肝臓など Dsg 3 を発現しない組織は傷害せず、Dsg 3

CD 4 + T 細胞が末梢組織を傷害する際に必要な抗原提示細を発現する表皮を傷害する。一方、表皮角化細胞は IFN-γ胞を明らかにしていく。具体的には、野生型マウス、MHCの刺激により MHC class II 分子を発現するが、角化細胞

class II‒KO マウス、Langerin‒DTAマウス、Rag 2 ‒KO マ

が自己抗原を適切に処理し、MHC II 分子上に提示できるウスなどを交配し、骨髄移植を組み合わせることにより、角抗原提示細胞としての機能は十分には知られていない。そ化細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状 細胞などが MHC

こで本研究では EAD を利用し、CD 4 +T 細胞がどのようにclass II 分子を欠損する、あるいは、細胞が存在しないこと

末梢組織で抗原を認識し、組織を構成する細胞（角化細胞）

により抗原提示がされない状況を作成できる。これらのマウ+を傷害するのか、その過程を詳細に解析し、CD 4 T 細胞

スをレシピエントとして H 1 T 細胞を移入して EAD の誘導をによる組織傷害過程に関わる細胞集団や機構を第一の目標

試み、EAD 発症の有無を確認する。

として明らかにする。
一方、臨床の現場においては、全身性ループスエリテマ

2 . 3 . EAD の病態におけるB 細胞の役割の検討

トーデス（SLE）に対してリツキサン（抗ヒト CD 20 モノク

Dsg 3 H 1 マウスより Dsg 3 H 1 T 細胞を単離し、Dsg 3 –/–ローナル抗体）が有効であることが報告されている。SLE

マウス由来 B 細胞と一緒に Rag 2 –/– マウスへ移入すると ID

は自己抗体が出現する自己免疫疾患ではあるが、自己抗体が生じる。この時、B 細胞を一緒に移入しない群を同時にのみで病態が形成されるわけではなく、T 細胞の浸潤を各作成し、移入後に観察される体重減少、皮疹重症度のスコ病変組織で認める。SLE で生じる皮膚炎は ID の病型をとア、14 日後の病理学的変化を両群で比較検討する。このるが、皮膚においても T 細胞が浸潤し組織傷害を及ぼす

実験により表皮に対する細胞性免疫における B 細胞の重要ことで病変が形成され発疹が生じていることがわかってお性が検討できる。

り、自己抗体で皮膚炎が生じるとは考えられていない。こ3. 結のような臨床的な事実から、T 細胞が介する炎症においても、B 細胞がその病態において重要であることが示唆されるが、純粋に T 細胞のみで生じる自己免疫の病態における果

3 . 1. Interface dermatitis における因子Xの役
割の検討

B 細胞の重要性については十分に理解されていない。そこ

因子 X は T 細胞が Th 1 に分化する際に重要な働きを持で、EAD をモデルに、T 細胞依存性皮膚炎の病態においつ分子である。この因子Xを欠失した H 1 T 細胞を Rag 2 –/–ける B 細胞の役割を第二の目標として検討していく。

マウスに移入し、レシピエントマウスの皮膚症状を観察しこれらの解析結果により ID を効果的に抑制する新たなたところ、コントロールマウスに比べて症状が軽微であっ方法を開発する基礎的データを構築することを本研究の目た。またレシピエントマウスの皮膚所属リンパ節を観察す的とする。

ると、コントロールマウスのリンパ節に比べて、X–/–‒H 1

2. 方

CD 4 + T 細胞を移入されたマウスのリンパ節は著明に腫脹法していた。またリンパ節に存在する X–/–‒H 1 CD 4 +T 細胞

2 . 1. Interface dermatitis の発症に重要なT 細の IFN‒γ 産生はほとんど観察されなかった。これらの結果

胞因子の同定から、因子 X は EAD において Th 1 への分化に大事である

H 1 T 細胞は IFN-γ 依存性に IDを誘導することからEAD

ことがわかった。またリンパ節内での抗原認識自体には因は Th 1 型の炎症であると考えられている 4）。そこで、T 細子 X は関連しないため、リンパ節内で X–/–‒H 1 CD 4 + T 細

胞が Th 1 に分化するのに必要な因子Xの ID における重要胞は抗原刺激をうけ増殖するが、リンパ節から皮膚へ遊走性を検討するために、因子Xのノックアウトマウスと H 1 マ

できなくなっている機序が考えられた。

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 2 . Interface dermatitis の発症に重要な抗原提示細胞の解析
本研究を進めていく中で、MHCII–/– マウスに野生型から骨髄移植したマウスは 2 〜 3 ヶ月かけて全身に炎症が生じることがわかった。このマウスには CD 4 + T 細胞は通常通り分化している。炎症が生じる機序として分化した T 細胞に対する免疫寛容機構が通常通り働かない状態となっていることが想定された。さらに、末梢組織における MHC
class II 分子は発現できない状況にあるが、それにもかか図 1 骨髄移植で作成したレシピエントマウスで生じた ID（左）Rag2–/– マウスから Rag2–/– マウスに骨髄移植したマウスに ID を誘導した。表皮内に細胞浸潤を認める。
（右）はコントロール。明らかな細胞浸潤を認めない。

わらず、末梢組織の炎症が観察されることから、末梢組織での MHC class II 分子は末梢組織の炎症が惹起されるうえで無関係である可能性が示唆された。しかし、このマウ

4. 考

スでは CD 8 + T 細胞が炎症を惹起している可能性もあり得

T 細胞は interface dermatitis だけでなく、湿疹、接触性

るため、さらなる検討が必要と考えられた。
一 方、Rag 2–/–察

マ ウ ス と Langerin‒DTA マ ウ ス を 交 配

皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎や乾癬、その他

マウスを作成した。Langerin‒のほぼ全ての炎症性皮膚疾患の病態にかかわり、自己抗原

DTA マウスではランゲルハンス細胞を欠失する。このマ

あるいは外来抗原特異的に免疫応答を開始する。本研究をし Langerin‒DTA‒Rag 2–/–

ウスに H 1 CD 4 T 細胞を移入したところ、EAD の症状

通じてなされる、皮膚における T 細胞の抗原認識機構のが増悪することがわかった。またランゲルハンス細胞と理解は interface dermatitis のみならず、湿疹やアトピー+

CD 4 T 細胞を共培養すると制御性 T 細胞が有意に増殖す性皮膚炎などの疾患制御の観点から重要であるだけでなく、ることがわかった。これらの結果から、ランゲルハンス細皮膚の健康維持のために大きく役立つと考えられる。

+

胞は制御性 T 細胞の誘導と関わり、EAD の症状に対して本研究では因子 X の interface dermatitis における重要性が明らかになったが、それ以上に因子 X が欠損すると、抑制的に働いていることがわかった。
最後に、MHCII–/– マウスに Rag 2 –/– マウスから骨髄移植

T リンパ球がリンパ節外に出ることができず、リンパ節内し、角化細胞などの radio‒resistant な末梢組織を構成するにとどまって、増殖を続けることがわかった。現在、その細胞で MHC class II 分子が欠損した状態で、かつ T 細胞メカニズムについては検討中であるが、少なくとも、この→ MHCII ］マウス）

結果は、因子 X を阻害するような治療は症状の緩和には有を作成した。コントロールとして Rag 2 –/– マウスに Rag 2 –/–用である可能性はあるが、自己免疫応答自体を止めることと B 細胞を欠失したマウス（［Rag 2
マウスから骨髄移植した［Rag 2

–/–

–/–

–/–

–/–

→ Rag 2 ］
マウスでは通ができないことを意味し、因子 X を阻害する戦略は、治療→ MHCII ］
マ

としては不完全なアプローチになりうることがわかった。

ウスに H 1 CD 4 + T 細胞を移入すると、軽度の EAD が生じ次に本研究では、まだ最適な条件ではないものの、角化

常通りの EAD が生じた。一方で、［Rag 2–/––/–→ MHCII ］

細胞の MHC class II 分子が欠損した状態でも、interface

マウスを解析すると骨髄移植が完全ではなくレシピエント

dermatitis が生じうることが示唆された。このことは、T側の血球も観察し得たことから、観察された EAD の程度

細胞が角化細胞を認識し、傷害するためには、角化細胞由が軽微であった理由として、制御性 T 細胞の残存や、ラン来の抗原を認識する必要があるが、角化細胞自身が抗原

ゲルハンス細胞残存の影響など角化細胞以外の影響の存在

提示をしなくても、角化細胞が認識され傷害されることをも考えられた。今後は、実験条件の改善が結論を得るため意味する。現在のところ、想定される機序は不明であるが、に必要と考えられた。

新しい抗原認識機構が存在する可能性がある。

ることが観察された
（図 1）
。しかし、
［Rag 2

–/–

–/–

5. 総

3 . 3 . EAD の病態におけるB 細胞の役割の検討

括

H 1 マウスより H 1 CD 4 + T 細胞を単離し、Dsg 3 –/– マウ

本研究を通じて、interface dermatitis が生じるために必ス由来 B 細胞と一緒に Rag 2 –/– マウスへ移入した群と、T要な分子や新たな抗原認識機構の可能性が明らかになった。

細胞のみを移入した群を作成し、両群を比較した。その結今後、より詳細なメカニズムが明らかになれば、皮膚の健果、T 細胞と B 細胞を両方移入した群でより著しい体重減

康増進に貢献できると考えられた。

少と皮疹重症度のスコアの悪化を認めた。この実験結果から、T 細胞による表皮に対する細胞性免疫においても、B細胞の存在が重要であることがわかった。

（参考文献）
1） Amagai M., Klaus–Kovtun V. and Stanley J. R.

− 106 −

+

皮膚における自己反応性 CD4 T 細胞による標的抗原認識機構の解明

Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in

system evaluating in vivo pathogenicity of desmoglein

pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell

3‒reactive T cell clones using murine pemphigus

1991; 67（5）: 869‒77.

vulgaris. J Immunol 2008; 181（2）: 1526‒35.

2） Amagai M., Tsunoda K., Suzuki H. et al. Use of4） Takahashi H., Kouno M., Nagao K. et al. Desmoglein

autoantigen–knockout mice in developing an active

3‒specific CD4 T cells induce pemphigus vulgaris andautoimmune disease model for pemphigus. J Clin

interface dermatitis in mice. J Clin Invest 2011; 121（9）:Invest 2000; 105（5）: 625–31.

3677‒88.

+

3） Takahashi H., Amagai M., Nishikawa T. et al. Novel− 107 −

皮膚制御に関わる新規機能性脂質の同定と脂質フローによる皮膚疾患制御機構の解明
東京大学大学院医学系研究科分子細胞生物学専攻細胞情報学分野

武富芳隆

Epidermal lipids are important for skin homeostasis. However, the overall view of the roles of lipids, particularly
nonceramide lipid species, in epidermal biology still remain obscure. Here we show that epidermal sPLA 2 (Ep-PLA 2 ), afunctionally phospholipase A 2 expressed in the stratum granulosum of the mouse and human epidermis, regulates epidermal
permeability barrier homeostasis and protects against atopic dermatitis through mobilization of polyunsaturated fatty acids(PUFAs). In a survey of knockout mouse lines of the various PLA enzymes, global and keratinocyte-selective Ep-PLA 2
knockout mice has a defect of the epidermal barrier, due to reduced synthesis of natural moisturizing factor, combined withabnormal type 2 immune responses and showed exacerbated antigen-induced atopic dermatitis. Primary keratinocytes from
Ep-PLA 2 -null mice had signs of aberrant cell proliferation, differentiation, and activation in association with skin barrier
defect. Several screening approaches by lipidomics analysis of mouse skin, phenotypic analyses of mouse lines deficient invarious lipid receptors and biosynthetic enzymes, and gene expression profiling in keratinocytes revealed that Ep-PLA 2 iscoupled with the production of a large pool of cutaneous PUFA-derived lipid mediators. The constitutive levels of PUFAs
and their metabolites in the skin were lower in Ep-PLA 2 -null than in wild-type mice. Actually, an abnormality in epidermal
permeability barrier observed in mice lacking Ep-PLA 2 were phenocopied in lipid X receptor-deficient mice. The expressionof Ep-PLA 2 and the lipid receptor are upregulated during keratinocyte differentiation. Treatment with the lipid receptor
agonist restored defective differentiation and/or activation of Ep-PLA 2 -null keratinocytes. In human atopic dermatitis
lesions, the expression levels of Ep-PLA 2 was inversely correlated with the severity of atopic dermatitis. Thus, our results
underscore a previous unrecognized role of nonceramide lipid species in skin allergy, and the novel role of a particular EpPLA 2 -driven lipid metabolism in epidermis.

1. 緒ームは、数多く存在する PLA 2 分子群の固有の機能に着目

言し、本酵素群の欠損マウスの網羅的な導入と各欠損マウス

環境因子に常に曝されている皮膚には、皮膚バリアによが発症する表現型の一斉解析を実施すると同時に、これって異物の侵入や水分蒸散を防ぐなどの固有の防御機構がに PLA 2 を起点とした脂質代謝フローを同定するための脂備わっている。皮膚のバリア機能が損なわれることにより

質網羅的分析（リピドミクス）を組み合わせた解析アプロー

環境因子が過度に体内に侵入すると、2 型免疫系が過剰にチを展開することにより、各種 PLA 2 に固有の脂質代謝産活性化し、難治性の慢性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎

物の同定とそれにより制御される生体応答の動作原理を解へと遷移するとともに、遠隔組織に喘息や鼻炎などの様々明してきた。皮膚との関連について我々は、①リンパ組なアレルギー性疾患を招く。したがって、皮膚バリアある

織中のⅡ D 型分泌性 PLA 2 がドコサヘキサエン酸（DHA）

いはその異常に基づく過剰な免疫応答を適切に統制するこなどの ω 3 脂肪酸あるいはそれ由来の脂質メディエーター

とは、皮膚の健康の増進のみならずアレルギー性疾患の克の動員を介して Th 1 型または Th 17 型免疫応答依存的に服を目指す上で重要である。

接触性皮膚炎または乾癬を抑制すること 1 , 2）、②毛包のⅡ

脂質の量的・質的な異常は皮膚の調節に大きな影響を与E 型 sPLA 2 が毛の育毛に関わること 3）、③表皮角化細胞由えるが、皮膚における生理的環境下での機能性脂質の固有来のⅡ F 型分泌性 PLA 2 が表皮中にリゾリン脂質（プラズの動員経路やその生物学的意義は体系的に理解されている

マロージェン型リゾホスファチジルエタノールアミン）をとは言いがたい。脂質メディエーターをはじめとする生動員することにより乾癬や皮膚癌などの表皮肥厚疾患を増理活性脂質の多くはホスホリパーゼ A 2（PLA 2：グリセロ

悪すること 4）、④表皮角化細胞に発現している細胞内酵素

リン脂質を分解して脂肪酸とリゾリン脂質を生成する酵

PLPLA 1（カルシウム非依存性 PLA 2 の一種）がアシルセ

素群）により量と質が規定される。著者が所属する研究チラミドの生合成を通じて角層バリアの形成に必須の役割を担うこと 5）、などを報告した。我々はさらに、PLA（PLA 1

Epidermal phospholipase A 2 -driven lipid
metabolism regulates skin barrier
homeostasis and atopic dermatitis
Yoshitaka Taketomi
D epa r t ment of B io chem ist r y a nd
Molecular Biology, Graduate School of
Medicine, The University of Tokyoまたは PLA 2）群欠損マウスの皮膚の網羅的解析の過程において、epidermal PLA 2（Ep-PLA 2）が皮膚のバリア機能の調節に関わる予備的知見を得た。
そこで本研究では、PLA 2 の新機能を切り口として、未解明であった皮膚における機能性脂質の動員機序とそれによる皮膚の恒常性・変容の新しい制御機構を解明すること、− 108 −

皮膚制御に関わる新規機能性脂質の同定と脂質フローによる皮膚疾患制御機構の解明

ならびに当該脂質代謝の量的・質的な変動がアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に占める位置付けを確立することを目比べ一次刺激性皮膚炎の増悪が認められた。
これらの PLA 群欠損マウスの網羅的スクリーニングを通じて、Ep-PLA 2 が皮膚バリアの調節に関与する可能性

的とした。

2. 方

が浮上した。

法2 . 1. マウスの皮膚バリア機能

3 . 2 . 皮膚におけるEp-PLA 2 の発現

マウスの皮膚のバリア機能は、①テヴァメーターを用いた皮膚は表層より表皮、真皮、皮下組織に分けられ、この

経 表 皮 水分 蒸散、②ラマン分 光法による皮膚中の角質細うち表皮は下層から表層へ向けて基底層、有棘層、顆粒層、

胞間脂質（セラミドやコレステロール）、天然保湿因子の測定、角層の 4 層から構成される。マウス皮膚を用いた免疫染色③タンパク質抗原の皮膚透過試験、④一次刺激性皮膚炎にの結果、Ep-PLA 2 は主に表皮に発現しており、顆粒層マ関する表現型、などにより評価した。

ーカーであるロリクリンと同一の局在性を示した。マウス2 . 2 . アトピー性皮膚炎モデル

分化に伴い表皮角化細胞に特有の分化マーカー（ケラチンまたはヒトの表皮角化細胞において、Ep-PLA 2 の発現はアトピー性皮膚炎モデルとして抗原誘導アトピー性皮膚炎1 など）と同様に誘導された。したがって、Ep-PLA 2 は表を採用した。マウスの皮膚への抗原の反復塗布により生じる

皮角化細胞の分化に伴い発現誘導され、顆粒層に局在する

Th 2 型免疫応答（血中の抗原特異的 IgEや所属リンパ節におことが明らかとなった。

けるTh 2 サイトカイン（IL- 4、IL- 5、IL-13）産生など）なら
びに皮膚におけるアレルギー性炎症（好酸球浸潤や皮膚肥厚など）について解析した。

3 . 3 . Ep-PLA 2 欠損マウスが呈する皮膚バリア異常
皮膚のバリア機能の維持にはセラミドを中心とする脂質ラメラによる角層バリアと、タイトジャンクションを中心

2 . 3 . 表皮角化細胞を用いた解析とする顆粒層の表皮バリアが関わる。角質細胞間脂質（セ表皮角化細胞は、新生児マウスの皮膚より単離した初代

ラミド、脂肪酸、コレステロール）および天然保湿因子は

培養表皮角化細胞またはヒト表皮由来初代角化細胞を用い、角層で水分を保つ上で重要な働きを担う。これらの成分にカルシウムによる分化刺激に伴う応答性について解析した。

ついて解析した結果、Ep-PLA 2 欠損マウスではセラミドやコレステロールは野生型マウスと同様に正常であったが、

2 . 4 . リピドミクス解析

天然保湿因子が減少していた。さらに、野生型マウスの皮

マウスの皮膚中の高度不飽和脂肪酸（PUFAs）やそれ由膚にタンパク質抗原を塗布すると表皮の顆粒層バリアによ来の脂質メディエーター、アシルセラミドなどの脂質成分って抗原の浸透が妨げられたが、欠損マウスでは抗原が容

は液体クロマトグラフィー／質量分析法 LC-MS/MS を用易に顆粒層を超え真皮にまで達した。
欠損マウスの皮膚では、表皮の基底層マーカー（ケラチ

いて測定した。

ン 5）の発現は正常であったが、有棘層マーカー（ケラチ

2 . 5 . ヒト検体を用いた解析

ン 1）の発現が野生型マウスより増加し、反対に顆粒層マ

東京大学医学部附属病院皮膚科との連携のもと、ヒトア
トピー性皮膚炎の皮膚検体を用い、脂質代謝関連分子の発ーカー（ロリクリン）の発現が減少しており、分化異常を生じていた。
我々はコンディショナル Ep-PLA 2 欠損マウスを樹立し、現を検討した。

3. 結

表皮角化細胞（ケラチン 14 プロモーター）選択的に本酵素

果を欠損させ、当該皮膚解析を実施した。その結果、全身性

3 . 1. 皮膚バリアに関わるPLA の網羅的スクリーニ
2の Ep-PLA 2 欠損マウスにおいて認められる表皮バリア異

ング

常は皮膚選択的 Ep-PLA 2 欠損マウスにおいても同様に認皮膚のバリア機能が損なわれると体内の水分が損失し、められた。したがって、表皮角化細胞に発現している Ep-

乾燥状態が生じる。通常飼育環境下における成体の PLA

PLA 2 が表皮バリアの恒常性の維持に重要であることが強群欠損マウスの経表皮水分蒸散量を測定した結果、唯一く示唆された。

Ep-PLA 2 欠損マウスで経表皮水分蒸散の亢進が認められ

3 . 4 . Ep-PLA 2 欠損マウスの表皮角化細胞の異常た。
皮膚バリアの乱れによって刺激物質に対する過敏反応がマウスの皮膚より表皮角化細胞を単離し、表皮角化細生じるが、経表皮水分蒸散の場合と同じく、PLA 群欠損胞の機能における Ep-PLA 2 欠損の影響について解析した。

マウスの中で Ep-PLA 2 欠損マウスでのみ野生型マウスと欠損細胞では野生型細胞と比べ増殖および遊走能が低下し− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019ており、分化刺激に対して分化マーカー（ケラチン 1、ケ受容体の欠損マウスの中に Ep-PLA 2 欠損マウスと同様の

ラチン 10）の発現誘導が亢進した状態、すなわち分化異常

表現型を示す系統が存在するはずである。そこで我々は、（過分化）を生じた。さらに、欠損細胞では 2 型免疫応答に

各種脂質代謝酵素・受容体の欠損マウスの皮膚バリア機能

関わるサイトカイン（IL- 33、TSLP）の発現（活性化の指標）を網羅的に解析した。その結果、ある PUFA 由来の脂質が亢進した。

メディエーターの受容体の欠損マウスにおいて Ep-PLA 2

マウスの皮膚あるいはそれ由来の表皮角化細胞を用いたマイクロアレイ解析の結果、Ep-PLA 2 欠損では細胞間接欠損マウスと同様の皮膚バリア異常、すなわち経表皮水分
蒸散の亢進と一次刺激性皮膚炎の増悪が認められた。

着分子（クローディンやタイトジャンクションタンパク質

皮膚バリアに関わる責任脂質受容体は表皮角化細胞に発など）の発現が全体的に減少傾向を示すと同時に、これら現しているはずである。そこで、マウス皮膚由来表皮角の分子を分解するプロテアーゼ（カリクレインなど）の発現化細胞の分化に伴い発現誘導される脂質受容体を定量的が野生型より増加していたことから、顆粒層のバリアが損

PCR により網羅的にスクリーニングしたところ、当該脂

なわれていることが想定された。

質受容体の発現が表皮角化細胞の分化に伴い最も著明に誘これらの結果から、Ep-PLA 2 欠損マウスの表皮角化細胞は、増殖分化異常、活性化亢進、遊走不全、ジャンクシ
ョン形成不良を生じることが示唆された。

導された。
以上の結果を統合すると、Ep-PLA 2 は表皮中においてPUFA 由来脂質メディエーター経路を始動することが考えられる。

3 . 5 . Ep-PLA 2 欠損マウスのアトピー性皮膚炎に関する表現型

3 . 7. Ep-PLA 2 を起点とした脂質代謝フローの検証

Ep-PLA 2 欠損による表皮バリア異常ならびに 2 型免疫

Ep-PLA 2 欠損による表皮角化細胞の異常は当該脂質シ応答の増強がアトピー性皮膚炎などの慢性アレルギー病態

グナルの低下を原因として生じることが想定される。そこを進展させるかについて検討した。Ep-PLA 2 欠損マウス

で、上記 3 . 4 . の Ep-PLA 2 欠損マウスの表皮角化細胞の異にアトピー性皮膚炎モデルを施行した結果、野生型マウス

常が、当該脂質受容体シグナルの賦活化によって正常化すと比べ抗原曝露に伴う血中の抗原特異的 IgE の産生が亢進るかについて検証した。欠損表皮角化細胞の分化培養系にするとともに、所属リンパ節における抗原依存的な Th 2

当該脂質受容体の作動薬を添加したところ、Ep-PLA 2 欠

サイトカインの産生が増強され、Th 2 型免疫応答が亢進損により生じる表皮角化細胞の分化（過分化：ケラチン 10していた。さらに、欠損マウスでは抗原曝露に伴う皮膚肥の発現亢進）および活性化（2 型免疫亢進：IL- 33 の誘導増厚や真皮中への好酸球浸潤の増多などのアトピー性皮膚炎強）の異常が野生型細胞が示す応答性と同等まで正常化しに特徴的なアレルギー性炎症の増悪が認められた。これら

た。したがって、当該 PUFA 由来脂質シグナルは表皮角一連の結果より、Ep-PLA 2 欠損マウスでは表皮バリアの化細胞の適切な分化および過剰な 2 型免疫応答の抑制に関恒常性が異常を生じることで、抗原曝露に伴う 2 型免疫系

与することが示唆された。

の活性化が亢進し、アトピー性皮膚炎の慢性アレルギー病

3 . 8 . ヒトアトピー性皮膚炎におけるEp-PLA 2 の発態が進展したものと考えられる。

3 . 6 . Ep-PLA 2 が動かす脂質代謝経路の包括的探現Ep-PLA 2 のヒトアトピー性皮膚炎との関連について検索討を行った。健常人ならびにアトピー性皮膚炎患者の皮Ep-PLA 2 欠損マウスは通常飼育下で表皮バリア異常を膚検体における Ep-PLA 2 の発現を免疫染色あるいは定量

呈することから、Ep-PLA 2 の下流で機能する責任脂質はPCR により解析した。健常人の皮膚において、Ep-PLA 2欠損マウスの皮膚中で構成的に減少していることが予想さの染色はマウス皮膚の場合と同様に表皮に強く認められた。

れた。そこで、通常飼育下の野生型および Ep-PLA 2 欠損

一方、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では表皮全体が弱く染

マウスの皮膚を用いてリピドミクス解析を行ったところ、色され、これに加え真皮に浸潤した免疫細胞にも陽性所見

野生型マウスと比べ欠損マウスの皮膚中では、PUFAs（リが認められた。定量解析において、Ep-PLA 2 の皮膚にお

ノール酸、アラキドン酸、ω 3 脂肪酸など）
ならびにそれらける発現は、健常人では発現分布および強度ともに健常人由来の代謝物の多くが部分的に減少していた。したがって、と比べアトピー性皮膚炎では減少した。本酵素の発現強度

Ep-PLA 2 は正常皮膚において PUFAs またはその代謝物をは、健常人では表皮の厚さと正の相関を示したのに対し、動員することが示唆された。

アトピー性皮膚炎患者では表皮の肥厚度（病態の重症度）とEp-PLA 2 の下流で産生される何らかの責任脂質が表皮バリアに関わるならば、
脂質メディエーターの生合成酵素・逆相関した。
さらに、Ep-PLA 2 mRNA の発現は角層で分解されて天− 110 −

皮膚制御に関わる新規機能性脂質の同定と脂質フローによる皮膚疾患制御機構の解明

然保湿因子を生成するフィラグリンあるいは当該脂質受容の欠乏は重篤な皮膚バリア異常をもたらすことが広く知ら体の mRNA 発現と正の相関を示した。

れてきた 6）。また、リノール酸はさらに不飽和化・伸長化

したがって、Ep-PLA 2 の皮膚における発現は皮膚バリを受け、アラキドン酸や ω 3 脂肪酸などの PUFAs に代謝

アと連関すること、ならびにアトピー性皮膚炎の発症進展され、生体膜に取り込まれる。しかしながら、一旦リン脂に伴い減少することが明らかとなり、Ep-PLA 2 欠損マウ

質に取り込まれた PUFAs が皮膚局所環境のいつ、どこで、スの結果と合致した。

いかなる経路を通じてどのような機能性脂質に変換され、4. 考

皮膚の恒常性または変容機構の調節にどのように関わるの察かについては定見が得られていなかった。これまでに、免Ep-PLA 2 は表皮顆粒層において表皮角化細胞から分泌

疫応答との関連を中心にこれらの PUFA 由来脂質メディ

され、PUFAs ならびにそれら由来の脂質メディエーター

エーターの機能が解析されてきたが、表皮角化細胞におけを動員することにより、皮膚バリアの恒常性の維持に重要る役割については未解明な点が多い。最近、アラキドン酸

な役割を担うことが明らかとなった（図）。この Ep-PLA 2

代謝物である 12 -HHT が表皮角化細胞の遊走制御を通じを起点とする脂質代謝に不全が生じると、顆粒層の表皮バて皮膚恒常性に関与することが報告され 7）、改めて非セラリアが損なわれ、環境因子の曝露に対して過剰な 2 型免疫ミド脂質による表皮角化細胞の調節に関心が向けられてい応答が生じることによってアレルギー病態が慢性化し、アるが、本研究で見出した機能性脂質の受容体の欠損による

トピー性皮膚炎へと遷延化するものと考えられる。本研究

皮膚バリア機能の異常は 12 -HHT の欠損と比べてはるかの結果から、Ep-PLA 2 の下流で動員される脂質経路を賦に顕著である。総じて本研究は、皮膚恒常性の調節に関わ活化する戦略は、皮膚バリアを向上させることでアトピー

る新しい PLA 2 依存的脂質メディエーター経路を明らかに性皮膚炎を予防するのに役立つことが期待される。また、したものである。今後は、Ep-PLA 2 が始動する脂質経路

Ep-PLA 2 の発現は皮膚の健康状態の診断マーカーあるいの異常による皮膚バリアの破綻からアトピー性皮膚炎、さはアトピー性皮膚炎の病態バイオマーカーとなり得る。

らには肺における喘息など遠隔組織へとアレルギーが伝播

角質細胞間脂質のひとつである脂肪酸の皮膚における役

するプロセスをさらに解明し、「皮膚の新規脂質経路によ割においては、リノール酸が皮膚バリア機能に必須なアシるアレルギーマーチの統制」に関する論文としてまとめた

ルセラミドに構成要素として取り込まれる必要があり、こい。

図Ep-PLA2 は表皮バリアの恒常性を維持することによりアトピー性皮膚炎を抑制する− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

（引用文）

group IIF secreted phospholipase A 2 in epidermal

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５）Hirabayashi, T.   Anjo, T., Kaneko, A., Senoo, Y.,

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４）Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, M., Taketomi, Y.,

12-Hydroxyheptadecatrienoic acid promotes epidermal

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wound healing by accelerating keratinocyte migration

Nakanishi, H., Taguchi, R., Kambe, N., Kabashima, K.,

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Lambeau, G., Gelb, M. H., Murakami, M. The role of（2014）．

− 112 −

化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築―マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価―
静岡県立大学徳村雅弘

Phosphorus-based compounds are ubiquitously found in indoor environment owing to their various applications (e.g.,plasticizer and flame retardant), which are taken via various exposure routes. Conventionally, dust ingestion and inhalation
are known as dominant exposure routes for these compounds. In this study, the dermal exposure to phosphorus-based
compounds via using nail polish was quantitatively investigated as an alternative exposure route. The concentrations ofphosphorus-based compounds in 45 nail polishes purchased from Japanese market were determined. Triphenyl phosphate(TPhP) were detected from the nail polishes made in USA, whose concentrations ranged 1 . 1 – 1 . 8 wt%. The potential
dermal exposure rates of TPhP via using the nail polishes were estimated by using ConsExpo (Consumer Exposure Modelv 5 . 0 ). The potential dermal exposure rates ranged 200 ( 5 %ile)– 1700 ( 50 %ile)– 5000 ( 95 %ile) ng kg-bw– 1 day– 1 ,which were more than 1400 times higher than the exposure rates via dust ingestion and inhalation previously reported.
Margin of exposure (MOE) was 3 . 6 × 105 ( 5 %ile)– 4 . 1 × 104 ( 50 %ile)– 1 . 4 × 104 ( 95 %ile). As a comparison, the potential
dermal exposure rates of dibutyl phthalate (DBP) and acetyltributylcitrate (ATBC), which are conventional and alternative
plasticizers, respectively, were also estimated. The potential dermal exposure rates of DBP and ATBC ranged 360 – 3500 –
14000 and 430 – 4100 – 17000 ng kg-bw– 1 day– 1 , respectively. MOEs of DBP and ATBC were 4 . 1 × 103 – 4 . 2 × 102 – 1 . 1 × 102
and 2 . 3 × 105 – 2 . 4 × 104 – 5 . 9 × 103 , respectively. The dermal exposure to TPhP via using nail polish could be a significant
exposure route and source for phosphorus-based compounds.

1. 緒

リン酸トリフェニル（TPhP）は，フタル酸ジブチル（DBP）

言の代替として，マニキュア用の可塑剤として使用され始めたリン系化合物は，可塑剤や難燃剤として多くの室内製品

17）。Young et al.（2018）18）によれば，米国で販売されていで使用されている 1 - 6）。これらリン系化合物は，室内空気るマニキュア中の TPhP 濃度は，< 0 . 0 02 - 7940 µg g − 1 でを介した経気曝露とハウスダストを介した経口曝露が主なあったと報告している。一方，Mendelsohn et al.（2016）17）

曝露経路として考えられていた 7 - 9）。しかし，近年，経皮は，マニキュアを使用した人と使用していない人の尿中曝露がリン系化合物の重要な曝露経路の一つである可能性の TPhP 代謝物濃度を測定し，マニキュアの使用に伴うが示唆されている

10 - 13）

14）

。例えば，
Cequier et al.（2014） は，

TPhP の経皮曝露量は，経気曝露量より多かったと報告

皮膚に付着したハウスダストを介したリン系化合物の経皮している。しかし，米国製以外のマニキュアに含まれる曝露量が，経口曝露量と同等であったと報告している。また，

TPhP の情報はなく，定量的な曝露量評価に関する研究は

15）

Pelletier et al.（2017） によれば，空気との接触に伴う気行われていない。

相中リン系化合物の経皮曝露量が，呼吸に伴う経気曝露量

本研究では，日本で購入したマニキュア液 45 サンプルと同等であることを報告している。以上の様に，ハウスダ

中の，TPhP を含む 15 種のリン系化合物を測定し，マニ

ストや空気を介したリン系化合物の経皮曝露に関する研究

キュアの使用に伴う TPhP の経皮曝露量の推算を行った。

は行われているものの，リン系化合物を含む製品との直接

経皮曝露量の推算には，オランダ国立公衆衛生環境研究所

接触に伴う経皮曝露に関する研究は，ほとんど行われてい（RIVM）が，消費者製品中に含まれる化学物質の曝露評価ない。化学物質の移動速度（拡散速度）
は，媒体間の濃度差を行うために開発した無料ソフトウェアである ConsExpoに比例することを考えると，ハウスダストおよび空気中と（バージョン 5 . 0）を使用した 19）。比較のため，被代替可塑比べてリン系化合物濃度が非常に高い製品との直接接触に剤である DBP と，代替可塑剤であるクエン酸アセチルト

伴う経皮曝露は，リン系化合物の主要な曝露経路となりえ

リブチル（ATBC）の経皮曝露量も推算した 20）。

る 16）。

2. 方

法

2 . 1. 試薬とサンプル
リン酸トリブチル（TBP）-d 27，リン酸トリス（2 - エチ

Estimation of Dermal Exposure Rates of
Cosmetic Ingredients -Risk Tradeoff
Assessment for Plasticizers in Nail
Polish-ルヘキシル）（TEHP）-d 51，TPhP-d 15，リン酸トリクレ

Masahiro Tokumura（TCEP）-d 12 を林純薬品工業株式会社から購入し，内部標

University of Shizuoka

準として用いた。アセトニトリル，メタノール，およびジル（TCsP）-d 21，およびリン酸トリス（2 - クロロエチル）− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

アセトンは，富士フイルム和光純薬株式会社から購入した。

とが報告されているため 27），爪の周りにはみ出たマニキュ

日本で販売されているマニキュアの代表的なサンプルを得

アのみの経皮曝露を考慮し，その面積は文献から得た値にるため，売上や人気に基づいて購入するマニキュアを選択基づいて決定した 27）。マニキュアの塗布量や曝露時間，使した。マニキュアは，フランス製が 9 サンプル，日本製が用頻度の値は文献から得た 27）。可塑剤の皮膚透過係数は，17 種，中国製が 2 種，台湾製が 6 種，韓国製が 2 種，アConsExpo に搭載されている定量的構造活性相関（QSAR）

メリカ製が 9 種であった。

モデルにより，分子量とオクタノール／水分配係数（Log
KOW）から推算した。マニキュアの使用に伴う可塑剤の経皮

2 . 2 . 分析方法

曝露のリスクを評価するため，曝露マージン
（MOE）
（-）
を用

分析用の試料を調製するため，およそ 10 mg のマニキ
ュア液を 10 mL 試験管に入れ，5 mL のアセトンに溶解し，いた。MOEは，参照用量（RfD）を，経皮曝露量で割ることで求めた 28）。

10 分間超音波処理した後，3000 rpm で 10 分間遠心分離

3 . 結果と考察した。次に，上清み 50 µL に 930 µL のアセトニトリルおよび 20 µL の混合内部標準溶液を加えた。液体クロマト

3 . 1. マニキュアに使用されている可塑剤の調査

グラフ−タンデム質量分析装置（LC-MS/MS）（Thermo

マニキュア容器に貼られているラベルの成分表による

Fisher Scientific Inc.）を用いて，試料中のリン系化合物と，主要な可塑剤としては ATBC（45 本中 33 本），TPhPの分析を行った。イオン化には，大気圧化学イオン化法（2 本），トリメチルペンタニルジイソブチレート（2 本），（APCI）を用いた。カラムには Accucore Vanquish C 18

DBP（1 本），スクロースベンゾエート（1 本）が使用されカラム（長さ：100 mm，内径：2 . 1 mm，粒径：1 . 5 µm；ていた。また，2 種類の可塑剤が含まれていた場合もあり，

Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いた。分析条件は我々

トリメチルペンタンジイルジベンゾエート（6 本），スクロの既往研究と同様に行った 5 , 21 , 22）。注入量は 10 µＬとした。

ースベンゾエート（6 本），カンファー（3 本），ATBC（2 本），

移動相には水（溶媒Ａ）と 20 % アセトニトリル／メタノー

TPhP（1 本）が含まれていた。DBP が含まれていたマニキ

ル溶液（溶媒 B）を用い，流速は 300 µL min

−1

とした。カ

ュアも存在した。

ラム温度は 50 ℃に保持した。

3 . 2 . マニキュアに含まれるリン系化合物の調査

2 . 3 . 精度管理

マニキュア中の 15 種類のリン系化合物濃度を測定し-1

リン系化合物の検量線は，3 - 1000 ng mL （3，10，30，-1

た 結 果 を 図 1 に 示 す。 米 国 製 の 3 つ の マ ニ キ ュ ア か ら

100，300，1000 ng mL ）の濃度範囲において直線性を示

TPhP が検出された（1 . 1，1 . 4，1 . 8 wt%）。低濃度ではあした（r 2 > 0 . 99）。すべてのサンプルにおいて内標準物質

るが，リン酸クレジルジフェニル（CsDPhP）も検出されたの回収率は良好であった（101 − 109 %）。リン系化合物の（0 . 040，0 . 019 wt%）。他のリン系化合物は，いずれのサ検出下限値は，シグナル／ノイズ比（S/N 比）が 3 - 10 のブンプルにおいても検出されなかった。既往研究においても，

ランクサンプルを 5 回注入したときの標準偏差の 3 倍としMendelsohn et al.（2016）17）は，米国製のマニキュアからた。本研究で測定対象としたリン系化合物は，ブランク試

TPhP を検出している（0 . 49 − 1 . 7 wt％）。

料中からは検出されなかった。

3 . 3 . マニキュアに使用されている可塑剤の経皮曝露量の推算

2 . 4 . 経皮曝露量およびリスクの推算方法-1-1

マニキュア中の可塑剤の経皮曝露量（ng kg-bw day ）はTPhP，DBP および ATBC の経皮曝露量の推算結果を図ConsExpo を用いて計算した。パラメータとしては，マニ2 に示す。TPhP，DBP および ATBC の経皮曝露量はそれキュア中の可塑剤濃度（wt%），塗布したマニキュアの量（g），

ぞれ 200（5 ％ile）- 1700（50 %ile）- 5000（95 %ile），360 -使用頻度（year- 1），塗布面積（cm2），可塑剤の皮膚透過係数3500 - 14000 および 430 - 4100 - 17000 ng kg-bw- 1 day- 1 で（cm h- 1）および使用者の体重（kg）を用いた。ConsExpo であった。TPhP の経皮曝露量（例えば 50 %ile 値）が最も少な

は，入力パラメータは個々の任意の確率密度分布を与える

く，ATBC が最も多かった。ConsExpo に搭載されている

ことができるので，各々のパラメータの確率密度分布に従QSAR により推算された可塑剤の皮膚透過係数は，本研って 10 万回のランダムサンプリングを行い，経皮曝露量

究で対象としている 3 種類の可塑剤の分子量（TPhP: 326，

分布を求めた。マニキュア液中の DBP（0. 7 - 7 . 0 wt%）と

DBP: 278，ATBC: 402）と Log KOW（TPhP: 4 . 59，DBP:

ATBC（0. 8-7. 0wt%）の濃度分布は，既往研究より得た 23 - 25）。

4 . 50，ATBC: 4 . 29）が同等であったことから，差異は小使用者の体重として，一般的な日本の成人女性の体重を用さかった（TPhP: 0 . 089，DBP: 0 . 097，ATBC: 0 . 076 cm

いた

26）

。温度は室温とした。可塑剤は，爪は透過しないこh- 1）29）。 一方，マニキュア中の ATBC 濃度の範囲（0 . 8 - 7 . 0− 114 −

化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築－マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価－

図1

日本で購入したマニキュアに含まれるリン系化合物

図 2 マニキュアに含まれる可塑剤の経皮曝露量分布（TPhP：リン酸トリフェニル，DBP：フタル酸ジブチル，ATBC：クエン酸アセチルトリブチル）wt％）は，TPhP 濃度の範囲（1 . 1 - 1 . 8 wt％）よりも高かったことから，マニキュア中の可塑剤の経皮曝露量を決定するための重要なパラメータであることが示唆された。

3 . 5 . 他の曝露経路との比較本研究で推算した TPhP の経皮曝露量を，既往研究で報告されている他の曝露経路からの曝露量と比較した 6 , 14 , 33 38）。その結果を図 4 に示す。本研究で推算したマニキュア

3 . 4 . マニキュアに使用されている可塑剤のリスク評

1を介した TPhP の経皮曝露量は 1700 ng kg-bw- 1 day-（50価％ile）であり，空気を介した経気曝露や，ハウスダストやマニキュア中に含まれる可塑剤の経皮曝露に対する食品を介した経口曝露，皮膚に付着したハウスダストを介

MOE の 推 算 結 果 を 図 3 に 示 す。TPhP，DBP お よ び

した経皮曝露と比較し，およそ 1400 倍以上も多いことがATBC の MOE の範囲は，それぞれ，3 . 6×105（5 %ile）―

示唆された。一般的なハウスダスト中の TPhP 濃度と比べ

4 . 1×104（50 %ile）― 1 . 4×104（95 %ile），4 .1×103 ― 4 . 2×

（数百 ng g- 1），マニキュア液中の TPhP 濃度は 1 . 1 - 1 . 8 wt

102 ― 1 . 1×102 および 2 . 3×105 ― 2 . 4×104 ― 5 . 9 ×103 で％と非常に高い。Fick の法則によると，媒体間の濃度差あった。ATBC の経皮曝露量が最も多かったが，リスクに比例して TPhP の移行速度が上昇することから，ハウスに関しては DBP がもっと高かった。これは，DBP の RfD

ダストと比べてより高濃度の TPhP を含むマニキュア液と値が最も低かったためだと考えられる（TPhP : 70 , 000 , 000

直接接触することで経皮曝露量が多くなったと考えられる。

ng kg-bw-1day- 1 3 0）

，DBP: 1 , 5 0 0 , 0 0 0

3 1），ATBC:

4. 総

100,000,00032））。2 つの代替可塑剤（TPhPおよびATBC）は，
被代替可塑剤（DBP）
よりも低い MOE であった。

括

本研究では，化粧品の例としてマニキュア，化粧品成分の例として可塑剤をとりあげ，皮膚との直接接触に伴う経− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 3 マニキュアに含まれる可塑剤の曝露マージン（MOE）
分布（TPhP：リン酸トリ
フェニル，DBP：フタル酸ジブチル，ATBC：クエン酸アセチルトリブチル）

図 4 TPhP の曝露経路ごとの曝露量の比較
14） 2，* Yang et al.（2014）38），*3Tokumura et al.（2017）6），*4Wu et al.（2016a）13），*1Cequier et al.（2014）*5Brommer and Harrad（2015）33），* 6 Kim et al.（2011）34），*7Malarvannan et al.（2015）36），* 8 Liu etal.（2017a）35）

皮曝露量の推定方法のスキームを開発した。本研究結果よ最後に，本研究で得られた研究成果の一覧を下記に示す。

り，TPhP を高濃度で含むマニキュアとの直接接触により，

原著論文

他の曝露経路と比較して，多量の TPhP を曝露する可能性

1） Masahiro Tokumura, Makiko Seo, Qi Wang,が示唆された。

Yuichi Miyake, Takashi Amagai, Masakazu Makino,

現在，本研究で構築した経皮曝露量推算スキームで求め

Dermal Exposure to Plasticizers in Nail Polishes: An

た経皮曝露量の正確さを調べるため，人工皮膚などを用い

Alternative Major Exposure Pathway of Phosphorus-

た皮膚透過試験を実施している。これにより，より正確な

Based Compounds, Chemosphere, 226, 316-320, 2019.

経皮曝露量の推算が行えるようになるだろう。

（IF=5.108）

化粧品は主に皮膚に直接塗布して使用するものが多いた

2） Masahiro Tokumura, Sayaka Ogo, Kazunari

め，本研究の成果の活用範囲は広範囲にわたると考えられ

Kume, Kosuke Muramatsu, Qi Wang, Yuichi Miyake,る。例えば，経皮曝露量を正確に見積もることは，化粧品

Takashi Amagai, Masakazu Makino, Comparison ofの安全性の向上だけでなく，機能性の向上にも重要である

Rates of Direct and Indirect Migration of Phosphorusと考えられる。経皮曝露量を正しく推算することで，化学

Flame Retardants from Flame-Retardant-Treated

物質の薬用をより詳細に考察でき，より効果的な化粧品のPolyester Curtains to Indoor Dust, Ecotoxicology and開発にも貢献できると考えられる。

Environmental Safety, 169, 464-469, 2019.（IF=4.527）− 116 −

化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築－マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価－

国際会議

国内会議

1） Kosuke Muramatsu, Masahiro Tokumura, Sayaka

1） 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 小郷 沙矢香 , 久米 一成 , 王 斉 ,Ogo, Kazunari Kume, Qi Wang, Yuichi Miyake, Takasi

三宅 祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野 正和 , カーテン中に含まれる

Amagai, Masakazu Makino, Novel effective method

リン系難燃剤の反応速度論的解析 , 平成 30 年室内環境学会学術大会 , 東京 .（2018 年 12 月）

to evaluate risks of phosphorus flame retardant, The
4th International Conference on Pharma and Food

2） 新堂 真生 , 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三宅 祐一 , 雨（ICPF2018），Shizuoka, Japan.（November, 2018）

谷 敬史 , 牧野 正和 , 室内製品との直接接触に伴うリン系

2） Kosuke Muramatsu, Masahiro Tokumura, Sayaka

難燃剤の経皮曝露量スクリーニング法の開発 , 平成 30
年室内環境学会学術大会 , 東京 .（2018 年 12 月）

Ogo, Kazunari Kume, Qi Wang, Yuichi Miyake, Takasi
Amagai, Masakazu Makino, Development of screening

3） 新堂 真生 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三宅 祐一 , 雨谷 敬史 ,method to evaluate resks of flame retardants in indoor

牧野 正和 , 身の回りの製品に含まれる化学物質の経皮

environments, THE 2 3rd Shizuoka Forum on Health

曝露量測定法の開発 , 富士山麓 A&S フェア 2018, 富士

and Longevity, Shizuoka, Japan.（November, 2018）.（2018 年 11 月）

3） Masahiro Tokumura, Kosuke Muramatsu, Qi Wang,

4） 新堂 真生 , 寺尾 琴音 , 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三

Yuichi Miyake, Takashi Amagai, Masakazu Makino,

宅 祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野 正和 , 製品中難燃剤の直接接触

Comparison of Rates of Direct and Indirect Migrationに伴う経皮曝露量推算のための測定デバイスの開発 , 環

of Phosphorus Flame Retardants from Flame-

境科学会 2017 年会 , 東京 .（2018 年 9 月）

Retardant-Treated Polyester Curtains to Indoor Dust,

5） 徳村 雅弘 , 瀬尾 真紀子 , 王 斉 , 甲斐 葉子 , 三宅 祐一 ,the 3 8th International Symposium on Halogenated雨谷 敬史 , 牧野 正和 , マニキュア液中に含まれる可塑剤

Persistent Organic Pollutants（POPs） & 1 0thの経皮曝露を考慮した確立論的リスク評価 , 第 27 回日

International PCB Workshop（Dioxin 2018），Kraków,本臨床環境医学会学術集会 , 三重 .（2018 年 7 月）
6） 新堂 真生 , 寺尾 琴音 , 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三

Poland.（August 2018）4） Mai Shindo, Kotone Terao, Kosuke Muramatsu,

宅 祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野 正和 , 製品中難燃剤の直接接触

Masahiro Tokumura, Qi Wang, Yuichi Miyake, Takashiに伴う経皮曝露量測定デバイスの基礎的検討 , 第 27 回

Amagai, Masakazu Makino, Estimating Potential

環境化学討論会 , 那覇 .（2018 年 5 月）

Dermal Exposure to Organophosphorus Flame

受

Retardants via Direct Contact with Products, the 38th1） 富士山麓 A&S フェア 2018 最優秀ポスター発表賞 , 新賞International Symposium on Halogenated Persistent

堂 真生 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三宅 祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野

Organic Pollutants（POPs）& 1 0th International PCB

正和 , 身の回りの製品に含まれる化学物質の経皮曝露量測定法の開発（2018 年 11 月）

Workshop（Dioxin 2 0 1 8），Kraków, Poland.（August2） 平成 30 年室内環境学会学術大会 優秀ポスター賞 , 村

2018）5） Mai Shindo, Kotone Terao, Kosuke Muramatsu,

松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 小郷 沙矢香 , 久米 一成 , 王 斉 , 三宅

Masahiro Tokumura, Qi Wang, Yuichi Miyake, Takashi

祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野 正和 , カーテン中に含まれるリン

Amagai, Masakazu Makino, Device for Measuring

系難燃剤の反応速度論的解析（2018 年 12 月）

Dermal Exposure Rate of Flame Retardants via

3） 平成 30 年室内環境学会学術大会 優秀ポスター賞 , 新

Direct Contact with Products, The 1 2th Asia Impact

堂 真生 , 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三宅 祐一 , 雨谷

Assessment Conference（AIC 2018），Shizuoka, Japan.

敬史 , 牧野 正和 , 室内製品との直接接触に伴うリン系難（August 2018）

燃剤の経皮曝露量スクリーニング法の開発（2018年12月）

6） Masahiro Tokumura, Sayaka Ogo, Kazunari Kume,4） 第 27 回環境化学討論会 RSC（英国王立化学会）賞 , 新Kosuke Muramatsu, Qi Wang, Yuichi Miyake, Takashi

堂 真生 , 寺尾 琴音 , 村松 孝亮 , 徳村 雅弘 , 王 斉 , 三宅

Amagai, Masakazu Makino, Migration Mechanism of

祐一 , 雨谷 敬史 , 牧野 正和 , 製品中難燃剤の直接接触に

Phosphorus Flame Retardants from Flame-Retardant-

伴う経皮曝露量測定デバイスの基礎的検討（2018 年 5 月）

Treated Polyester Curtains to Indoor Dust, the 1 5th
Conference of the International Society of Indoor Air
Quality &amp; Climate（ISIAQ）（Indoor Air 2018），
Philadelphia, PA, USA.（July 2018）謝辞
本研究は公益財団法人コスメトロジー研究振興財団よりご援助をいただき，実施されました。

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

（引用文献）

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Comparison of rates of direct and indirect migration

flame retardants; implications for human exposure.

of phosphorus flame retardants from flame-retardant-− 118 −

化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築－マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価－

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− 119 −

ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および平面脂質膜法による解析
大阪府立大学大学院工学研究科物質・化学系専攻化学工学分野

仲村英也

In next generation cosmetics utilizing nanoparticles, the nanoparticles are often required to translocate across a cell
membrane. Application of the external electric field has been utilized to increase the cell membrane permeability, however,damage to the cell can be a great concern. Using a molecular dynamics simulation, we here show that even under a weakexternal electric field that is lower than the membrane breakdown intensity a cationic nanoparticle directly translocatesacross a model cell membrane without membrane disruption. We then reveal its physical mechanism. At the contact
interface between the nanoparticle and the cell membrane, the electric potential across the membrane is locally enhanced
by superimposing the nanoparticle surface potential on the externally applied potential, resulting in the nanoparticle directtranslocation. Our finding implies that by controlling the nanoparticle-induced local enhancement of the membrane potential
the cellular delivery of nanoparticles via non-endocytic and non-disruptive pathway can be realized.

1. 緒にこの小胞ごと細胞内にナノ粒子が取り込まれる。一方、

言

直接透過経路は、ナノ粒子が小胞化されずに細胞内に直接ナノ粒子を利用した治療・診断技術の開発が活発に行わ輸送される透過経路である。生細胞にナノ粒子が作用した

れている。ナノスケールのサイズと、それに起因して発現場合の多くは、エンドサイトーシスが最もよく発現する主する特異的な諸特性を利用して、薬物や遺伝子の送達キャ

要な透過経路であることが分かってきた。しかしながら、

リア、ハイパーサーミア、フォトサーマル治療、バイオイ

エンドサイトーシスによって取り込まれたナノ粒子は小胞

1）メージングなどへの応用が精力的に研究されている 。化から脱出できず、結果的に送達効率が低下してしまうとい粧品においても、ナノ粒子を活用したいわゆるナノ化粧品

う課題がつきまとう。一方で、直接透過経路は小胞にトラの開発が活発化している。これらのナノ粒子医療技術やナップされずにナノ粒子を細胞内部に送ることができるため、

ノ化粧品においてその効果を最大限に引き出すには、ナノこれを実現できれば高い送達効率が期待できる。しかしな粒子は標的となる細胞の内部に送達される必要がある。そがら、直接透過は自発的には起こりにくい透過経路であるのためには、ナノ粒子は細胞を覆う最も基本的な生体障壁

ため、これを何かしらの工夫で促進する必要がある。

である細胞膜を透過しなければならない。一方で、ナノ粒直接透過を促進する手法として、電場・超音波・磁場な子の種類によっては、粒子が細胞膜を透過して細胞内部まどの外力場を印加する物理的手法がこれまで提案されていで到達すると、生体へのリスクが高まる場合もある。すなる。その中で、電気穿孔法（エレクトロポレーション）
は、

わち、十分な効能と安全性の両方を兼ね備えたナノ粒子医

細胞に外部から電場を印加することで、一時的に膜透過性療技術やナノ化粧品を実現するには、ナノ粒子が細胞膜をを向上させ、エンドサイトーシスを介さずに物質を細胞内透過する現象を理解し、これを精密に制御するための学理部に直接送達する手法である。近年では、ナノ粒子の細胞

1）

内送達への応用も多数報告されており、粒子を高効率でが必要である 。
ナノ粒子と生細胞との相互作用は幅広い分野において関細胞内に直接送達できることが見出されている 2）。一方で、心が高く、最近の研究をまとめると、ナノ粒子の細胞膜透

過度な高電場の印加は、細胞死を引き起こすことが欠点と過経路はエンドサイトーシスと直接透過の大きく 2 つに大なる。従って、電場印加環境におけるナノ粒子の細胞膜透別されることが分かってきた 1）。エンドサイトーシスは生過を適切に制御し、高い送達効率と低侵襲性を両立するこ

細胞固有の生物的取り込み機能として知られている。細胞とが望まれる。しかしながら、電場印加時のナノ粒子の細膜が変形してナノ粒子を包み込んで小胞を形成し、最終的胞膜透過メカニズムは明らかとなっていない。
以上の背景のもと、本研究では電場印加環境におけるナ

Understanding of direct translocation of
nanoparticle across cell membrane:
a n a ly s i s by m o l e c u l a r dy n a m i c ssimulation and planer lipid bilayer method
Hideya Nakamura
Department of Chemical Engineering,Osaka Prefecture University

ノ粒子の細胞膜透過現象に焦点を当て、これを分子動力学（MD）シミュレーションにより詳細に解析した。その結果、「微弱な電場の印加によってナノ粒子が細胞膜を直接透過する」新奇な透過現象を見出し、そのメカニズムを明らかにしたので報告する 3）。加えて、平面脂質膜法を用いた実験系の構築にも取り組んだので、これについても報告する。

− 120 −

ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および平面脂質膜法による解析

オンを挿入し、生理食塩水と等張な 154 mM NaCl aq. とし

2 . 計算方法

た。ナノ粒子には、様々な治療・診断へ活用されているア

本研究では、粗視化分子動力学法（Coarse Grained-Molecular

ルカンチオール修飾正帯電性金ナノ粒子 6）をモデルナノ粒

Dynamics: CG-MD）により、電場印加時のナノ粒子の細胞子として用いた。ここで、本透過現象において粒子の表面

膜透過現象を解析した。粗視化分子動力学法は、複数の原電位は重要な因子である。そこで、末端が正電荷を持つア子をある 1 個の相互作用点（粗視化サイト）で代表させ、こンモニウム基で修飾された 8 - アミノ - 1 - オクタンチオールの粗視化サイトのダイナミクスを追跡することで系全体の（amino-OT）と、電荷がゼロの無極性 1 - オクタンチオール

分子のダイナミクスを計算する手法である。これにより、（OT）の割合（amino-OT: OT）を変化させて、表面電位が異本研究で必要となるナノ粒子、細胞膜、溶媒層からなる比なる粒子を用意した（Fig. 1 C and D）。ナノ粒子の粒子径は

較的大きな計算領域（一辺が 20nm 以上）を扱うことができどれも同等で約 4 nm である。これらを用いて、ナノ粒子のる。粗視化サイト間の相互作用を規定する力場には、生体表面電位が透過現象に及ぼす影響を解析した。ナノ粒子は

4）

を用い

細胞膜の上部に配置し、計算の初期状態を得た。電場 E のた。Fig. 1 に、本研究で用いた計算系を示す。モデル細胞膜印加を計算に考慮するため、電荷 qi を有する系内の全粗視には、生細胞膜の基本骨格である脂質二重膜を用いた。脂化サイトに外力 F=qiE を付与した。電場 E は膜の法線方向

質二重膜は、両イオン性リン脂質 DPPC および負帯電性リ

下向きに印加した。電場の印加によって発生する膜電位（膜ン脂質 DPPG の 2 成分で構成し、一般に表面が負に帯電しの内表面を基準とした外表面の電位差）を、印加膜電位Δている実際の生細胞膜を模擬した。このモデル細胞膜をψappl と定義した。ここで、印加膜電位はΔ ψappl=Ed により2 つ配置し、互いに独立した 2 つの溶媒区画を設けて、こ算出した。d は細胞膜の膜厚であり、本研究では d= 4nm でれらを細胞の内外に見立てた。各溶媒区画には分極を考一定とした。また、膜の穿孔・破壊が起こり始める臨界印

慮した粗視化水分子 5）とナトリウムイオンおよび塩化物イ

加膜電位をΔψappl, C と定義し、粒子を含まない条件で計算を分子用に近年開発された MARTINI 粗視化モデル

Fig. 1 Simulation system used in this study.（ A）Initial configuration. Water
molecules are not displayed for clarity.（B）Individual coarse-grained molecules.（C）Snapshots and（D）physical properties of nanoparticles.

− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

た計算系断面を表している。amino-OT : OT = 1 : 9 および行いΔ ψappl, C を予め決定した。その結果、Δ ψappl, C =230mVであり、この値は実験値とおおよそ同じであったことから、

4 : 6 のナノ粒子の場合、ナノ粒子表面が比較的疎水性であ計算の妥当性が確認された 7）。本研究では、印加膜電位がることから、下向きへの強制移動に伴い粒子は細胞膜の疎臨界電位を超えない条件（Δψappl <Δψappl, C ）で計算を行った。

水部に侵入した。さらに下向きに移動させると、粒子は内すなわち、外部電場の印加だけでは膜の穿孔は起こらない

部溶媒層に到達したが、このとき、細胞膜は元の平面膜か

微弱な電場の範囲に絞って検討を行った。

ら大きく変形し、一部に欠損も見られた。一方、表面電位が比較的高い amino-OT: OT = 7 : 3 および 10 : 0 のナノ粒

3 . 結果および考察子の場合は、粒子は膜表面に付着した後、さらに粒子を膜比較のため、はじめに、電場を印加しなかった場合のナに対して強制的に押し込んでも、粒子は膜に包まれたまま

ノ粒子の挙動を解析した。Fig. 2 A に、電場は印加せずにで、膜を透過することはなかった。以上より、電場を印加粒子のみに一定の外力を付与して下向きに強制的に移動さしない場合、amino-OT: OT= 7 : 3 および 10 : 0 のナノ粒子せた pull シミュレーションの結果を示す。図は z 軸に沿っは細胞膜を透過できないことが分かった。また、amino-

A

Without external electric field(Δψappl = 0 mV; biased MD simulation)

B

With external electric field(Δψappl = 207 mV = 0.9Δψappl, c)
21 ns

24 ns

200 ns

11 ns

21 ns

42 ns

200 ns

38 ns

40 ns

44 ns

148 ns

34 ns

45 ns

67 ns

99 ns

1:9

Electric field

Pull

10:0

Amino OT: OT
7:3
4:6

18 ns

C
Occurrence probability [%]100 amino-OT : OT = 1 : 9
80
60
40
20
0

100 amino-OT : OT = 4 : 6
80
60
40
20
0
0 46 92 138 161 184 207

100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0

amino-OT : OT = 7 : 3
NP

No adhesion Membrane
Adhesion on outer surface
amino-OT : OT = 10 : 0

Internalization
Adhesion on inner surface
Direct permeation
with self-resealing

0

46 92 138 161 184 207

Applied membrane potential, Δψappl [mV]Fig. 2 Interaction of NP with cell membrane under external electric field. Dynamics of NPs（A）without
external electric field and（B）with external electric field（Δψappl = 207 mV = 0.9 Δψappl , c）．Water molecules
were not shown for clarity. Snapshots are cross-sectional side view.（C）Occurrence probabilities of fivemodes of final fate of each NP as a function of applied membrane potential.

− 122 −

ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および平面脂質膜法による解析

Fig. 3 Dynamics of solvent molecules during the direct permeation of NP across the cell membrane. Cyan dots show
water molecules. Purple and cyan beads are sodium and chloride ions, respectively. In the case of the NP with aminoOT:OT = 7:3 under Δψappl = 207 mV = 0.9 Δ ψappl , c. Snap shots are cross-sectional side view.

OT: OT= 1 : 9 および 4 : 6 のナノ粒子の場合は、粒子に外力

in Fig. 3）。粒子が膜を透過した後は、水分子チャネルはを付与することで細胞膜を透過する可能性が示されたが、消失し、膜は自己修復した（60 . 0 ns in Fig. 3）。以上より、透過の際には膜の変形および欠損が著しかったことから、ナノ粒子の細胞膜直接透過は、ナノ粒子と細胞膜表面の接ダメージが大きい透過経路であると考えられる。また、ナ触界面直下で水分子ワイヤーが形成されることにより誘発

ノ粒子にのみ外力を付与することそのものが、実際には極されることが明らかとなった。この溶媒分子のダイナミク

めて困難であることも粒子すべき点である。

スは、典型的なエレクトロポレーションにおけるものと非

一方、電場を印加すると、ナノ粒子の細胞膜透過挙動は常に類似している 8）。しかしながら、本研究で印加してい大きく変化した。Fig. 2 B に、粒子の典型的な細胞膜透過

る膜電位は、穿孔が起こる臨界値よりも低い電位であり、挙動を示す。Fig. 2 C には、計算系に種々の電位を印加しナノ粒子が存在しない場合、水分子ワイヤーは生成しないた際の、各粒子挙動の発生頻度を示す。なお、
この計算では、ことが特徴である。

ナノ粒子には印加電場から受ける静電気力以外の外力は以上の結果より、まず、ナノ粒子の細胞膜直接透過には作用していない。結果より、興味深いことに、pull シミュ

ある大きさ以上の電場の印加が必要であることが分かっ

レーションでは膜を透過しなかった amino-OT : OT= 7 : 3

た。さらに、ナノ粒子の透過は、典型的なエレクトロポレ

および 10 : 0 のナノ粒子が、電場を印加することで細胞膜ーションと類似して、ナノ粒子と細胞膜表面の接触界面を直接透過することが分かった。Fig. 2 B に示すように、直下における水分子ワイヤーの形成に誘発されることも

amino-OT : OT= 7 : 3 および 10 : 0 のナノ粒子は、細胞膜表分かった。これらの知見を踏まえて、我々は、ナノ粒子面に付着した後、膜の構造が変形し、二重膜を貫通する親と細胞膜表面の接触界面電気現象の変化が、ナノ粒子の細水性の細孔が生成した。そして、粒子は脂質膜小胞にトラ

胞膜直接透過を引き起こしているという仮説を立てた。そップされたり、脂質分子を膜から引き抜いたりすることなして、この仮説を検証するため、ナノ粒子と細胞膜表面

く、親水性の膜貫通孔を通じて細胞膜を直接透過した。さの接触界面における局所的な膜電位を解析した。Fig. 4 B

らに着目すべき点として、粒子の侵入により膜に生成しに、ナノ粒子を含まない計算系に電場を印加した際の膜電た細孔は、粒子透過後に瞬時に縮小し、膜が自己修復す

位分布を示す。結果より、電位を印加しない場合、膜電位

ることが分かった。すなわち、細胞膜をほとんど損傷しはおおよそ 0 mV であったのに対し（Fig. 4 A）、電場を印ない透過経路であると言える。Fig. 2 C より、この直接透加すると、印加膜電位（この場合、Δψappl ＝ 184 mV）より過経路が発現するには、161 mV 以上の印加膜電位（Δ ψappl

も高い約 300 mV の膜電位が発生することが分かった。こ≥ 161 mV= 0 . 7 Δ ψappl, C）が必要であることも分かった。以れは、溶媒中のイオンの電気泳動による膜表面の電荷のイ

降では、この新奇なナノ粒子の細胞膜直接透過経路に焦点

ンバランスに起因している。すなわち、外部電場の印加にを当てて、さらに詳細な解析を行った。

よって溶質イオンは電気泳動するが、細胞膜を透過できな

Fig. 3 に、粒子が膜を透過した際の水分子の挙動を示す。

いため、カチオン（Na+）は細胞膜の上側（外層）表面に、アナノ粒子が細胞膜に侵入し始める前に、水分子のワイヤ

ニオン（Cl-）は下側（内層）表面に局在する。その結果、細ー状のクラスターが膜を横切って形成された（17 . 9 ns and

胞膜表面電荷のインバランスが生じ、付加的な膜電位が発19 . 1 ns in Fig. 3）。この水分子クラスターはさらに成長し生したと考えられる。本研究では、この膜表面電荷のインて、水分子チャネルとなり（20 . 0 ns in Fig. 3）、この水分バランスに起因する膜電位をΔψsci と表記する。Fig. 4 C, D子チャネルを通じてナノ粒子は細胞膜を透過した（30 . 0 nsに、ナノ粒子が細胞膜表面に付着した際の膜電位分布を示− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

膜電位と膜穿孔が起こる臨界膜電位の比較を行った。Fig.

す。結果より、ナノ粒子と細胞膜との接触界面においては、
印加膜電位にナノ粒子の表面電位が重畳することで、膜電5 に、接触界面における総膜電位Δψoverall と印加膜電位Δ位が局所的に増強されることが明らかとなった（Fig. 4 C のψappl の関係を示す。図中のΔψoverall, C は膜破壊が起こり始め

Δ ψNP）。以上の結果より、ナノ粒子と細胞膜の接触界面

る総膜電位の臨界値であり、膜表面電荷のインバランスににおいては局所的に高い膜電位が発生し、その総膜電位（Δ

起因する電位Δψsci を考慮して予め求めたところ、本計算ψoverall）は、①印加膜電位（Δ ψappl）、②膜表面電荷のインバ

系ではΔψoverall, C = 337 mV であった。結果より、ナノ粒子

ランスに起因する電位（Δ ψsci）、③ナノ粒子の膜表面へのが細胞膜を直接透過したΔψappl ≥ 184 mV の範囲においては、付着によって生じる電位（Δ ψNP）の 3 種類の総和となるこ

ナノ粒子と細胞膜の接触界面における総膜電位Δψoverall はとが分かった（i.e., Δψoverall =Δψappl+Δψsci+Δψ NP）。最後に、

臨界電位Δ ψoverall, C を超えていることが分かった。すなわ

この接触界面における膜電位増強とナノ粒子の細胞膜直接

ち、細胞膜の破壊が起こらない微弱な電場を印加したにも透過を定量的に関係付けるために、接触界面における総関わらず、ナノ粒子と細胞膜の接触界面における局所的なElectric field
Electric field

Outer surfacez

20

Inner surface

300
200
100
0
-100

0

4

8

12

16

20 0

4

8

12

20
16

B

400

300
200
100

Δψappl + Δψsci

0-100 0

4

8

12

16

20 0 4

8 12

16

20

ΔψNP

300
200
100

D

Δψoverall [mV]380

Top view

16

C

400

y [nm]

x

Overall membrane potential, Δψoverall [mV]A
400

Overall membrane potential, Δψoverall [mV]Overall m em brane potential, Δψoverall [m V]yΔψappl + Δψsci

335

12

290
8

245

Projected area of NP

40-100 0

4

8

12

16

20 0

4

8

12

16

20

0

0

4

8
12
x [nm]

16

20

200

Fig. 4 Typical contour maps of the calculated overall membrane potential（Δψoverall）along the membrane surface:（A）without external electric field and without NP;（B）under external electric field without NP;（C, D）under external
electric field with NP adhesion on the membrane surface. In the case of Δψappl =184 mV = 0.8 Δψappl, c and NP withamino-OT: OT =10:0. Δψsci is the membrane potential derived from imbalance of the membrane surface charge. Δψ NP
is the enhanced membrane potential arising from the NP adhesion.

Fig. 5 Overall membrane potential at the contact interface between the NP and themembrane surface as a function of the applied membrane potential. Error bar
corresponds to the max-min within five independent simulation runs. Δψoverall, c isthe critical overall membrane potential for the membrane breakdown. The Δψoverall, c
was preliminarily determined as 337 mV. Detail about the determination of Δψoverall, ccan be found in Supplementary Text and fig. S4.

− 124 −

ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および平面脂質膜法による解析

膜電位は、膜穿孔に必要な臨界電位を超えうることが示さ研究では、人工細胞膜（すなわち純粋なリン脂質２重膜）をれた。Fig. 6 には、ナノ粒子が細胞膜を透過する直前およ用いた実験系の構築に取り組んだ。その中でも、膜を介しび直後の膜電位を示す。結果より、ナノ粒子が細胞膜をた物質の透過を電気的に測定可能である平面脂質膜法に着透過した後は、粒子が細胞膜から脱離するため透過前に見目した。平面脂質膜の作成には、比較的安定した膜を簡便られた局所的な膜電位増強が粒子透過後には消失し、系全に形成できる液滴接触法 9）を用いた。Fig. 7 A に、液滴接体の膜電位は臨界強度をΔψoverall, C を下回った。その結果、触法により作成した脂質膜の模式図を示す。リン脂質デカ

細胞膜はエネルギー的に安定な二重膜の構造へと自己修復

ン溶液を図の左右の各区画に予め注入し、ここに KCl 水溶することができたと考えられる。

液をさらに注入することで、リン脂質分子で安定化された W/O 型の水滴を 2 個作成した。これらの水滴を接触さ4 . 平面脂質膜法を用いた実験系の構築

せると、接触界面で平面脂質膜が形成される。この平面脂MD シミュレーションの結果を検証するために、実験系

質膜を作成するための実験装置として、Fig. 7 B に示すアの構築にも取り組んだ。以下ではその概要を報告する。本レイデバイスを独自に試作した。デバイスは PMMA 製で、Fig. 6 Contour maps of the calculated overall membrane potential（Δψoverall（A）） before and（B）after membrane-crossing of the NP. Δψoverall, c is the critical overall membrane potential forthe membrane breakdown. In the case of the NP with amino-OT : OT=10:0 under Δψappl =184 mV =0.8Δψappl, c.

Fig. 7 Developed experimental set-up.（A）Schematic of droplet contact method.（B）Multi-well device and multi-channel electrode used in this study.（ C）Applied
voltage and measured current when bilayer was formed.

− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

直径 250 µm の小孔が開いたフィルムを内径 4 mm の 2 つを進めていきたい。

のウェルで挟み込んだ基本ユニットが 8 個設けられている。
このウェル内部に 7 . 5 µL のリン脂質デカン溶液と 16 . 5 µL

謝辞の KCl 水溶液をピペッティングするだけで、フィルムの小本研究を行うにあたり、多大なるご援助を賜りました公孔を介して水滴が接触し脂質二重膜を簡便に形成すること

益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝申し上ができる。また、各ウェルには Ag/AgCl 電極が埋め込まげます。

れており、この電極は電圧印加装置、8 ch 同時測定が可能な微小電流検出アンプ、データロガーに接続されている。

（引用文献）

このセットアップで、電圧を印加することによって脂質膜

1） Nakamura H, Watano S: Direct Permeation ofを介して流れる微小電流をアンプで増幅して測定すること

Nanoparticles across Cell Membrane: A Review,ができる。すなわち、検出された電流変化やそこから算出

KONA Powder Part. J., 35, 49‒65, 2018.

される膜比容量から、物質が脂質２重膜を介して移動する様子を捉えることが可能である。

2） Zu Y, Huang S, Liao WC, Lu Y, Wang S: Gold Nanoparticles
Enhanced Electroporation for Mammalian Cell

脂質二重膜は、その構造から抵抗とコンデンサが並列に接続された RC 並列回路と電気的に等価と見なすことがでTransfection. J. Biomed. Nanotechnol. 1 0, 9 8 2‒9 9 2,
2014.

きる。これを利用して、Fig. 7 C に示すような三角波電圧

3） Nakamura H, Sezawa K, Hata M, Ohsaki S, Watanoを印加した際に測定される微小電流の矩形波から、膜比容

S: Direct permeation of nanoparticle across model cell量を算出した。その結果、本装置で測定された平均膜比容

membrane by nanoparticle-induced local enhancement2

量は 0 . 37 ± 0 . 19 µF/cm となった。これは液滴接触法を

of membrane potential, submitted.

用いた膜比容量の文献値 10）（0 . 4 - 0 . 6 µF/cm 2）と同等であ

4） Marrink SJ, Risselada HJ, Yefimov D, Tieleman, de

り、これより構築した実験系で、脂質二重膜が形成できる

Vries AH: The MARTINI Force Field: Coarse Grained

ことを確認できた。今後はこの実験系を用いて、電場印加

Model for Biomolecular Simulations, J. Phys. Chem. B,

環境下におけるナノ粒子の細胞膜透過を解析していく。

5. 総

111, 7812‒7824, 2007.
5） Yesylevskyy SO, Schäfer LV, Sengupta D, Marrink

括

SJ: Polarizable Water Model for the Coarse-Grained

本研究では、微弱な電場印加環境下におけるナノ粒子の細胞膜透過現象を分子動力学シミュレーションにより解析

MARTINI Force Field, PLoS Comput. Biol., 6, 1‒1 7,
2010.

した。その結果、以下のメカニズムでナノ粒子が細胞膜を6） Elahi N, Kamali M, Baghersad MH, Recent biomedical

直接透過することを新たに見出した。①まず、ナノ粒子がapplications of gold nanoparticles: A review, Talanta,

細胞膜表面に付着することによって、ナノ粒子と細胞膜と184, 537‒556, 2018.

の接触界面において膜電位が局所的に増強される。そして、

7） Shimizu K, Nakamura H, Watano S: MD Simulation②この増強された膜電位が臨界電位を超えた際、ワイヤー

Study of Direct Permeation of a Nanoparticle across状の水分子クラスターが接触界面近傍で生成し、これがナ

the Cell Membrane under an External Electric Field,

ノ粒子の細胞膜直接透過を引き起こす。さらに、③ナノ粒子の膜透過後は、局所的に高い膜電位が消失するため、細Nanoscale, 8, 11897‒11906, 2016.
8） Tieleman DP: The molecular basis of electroporation.
BMC Biochem. 5, 1‒12, 2004.

胞膜は自己修復する。
細胞にダメージを与えることなく、細胞内に物質を直接

9） Kawano R, Tsuji, Sato K, Osaki T, Kamiya K, Hirano

送達することは、理想的な送達方法である。ここで、物質

M, Ide T, Miki N, Takeuchi S: Automated Parallel

が細胞膜を透過する際に生じてしまう欠損をできるだけ小Recordings of Topologically Identified Single Ion

さくし、ナノメートルスケールにすることができれば、理Channels, Sci. Rep., 3, 1995, 2013.

想的な低侵襲送達が実現できると思われる。本研究で得ら

10）Funakoshi, K, Suzuki H, Takeuchi S: Lipid Bilayer

れた知見は、外部から印加した微弱な電場に、ナノ粒子のFormation by Contacting Monolayers in a Microfluidic

表面電位を重畳させることで、前述したナノメートルスケ

Device for Membrane Protein Analysis, Anal. Chem.,

ールの細胞膜穿孔を実現できる可能性も示唆している。今78 , 8169 - 8174 , 2006 .

後も、ナノ粒子と細胞膜との界面電気現象に着目した研究− 126 −

増殖因子による毛包休止期制御機構の解明
国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射線医学総合研究所 組織再生治療研究プログラム

中山

文明

The expression of several Fibroblast growth factors (FGFs) is synchronized with the hair cycle in the skin and some
FGFs play a key role in regulation of the hair cycle. In particular, the expression of FGF 18 peaks in the telogen phase, andmaintains the telogen phase to determine its duration. Although the expression of FGF 13 also peaks in the telogen phase,the role of FGF 13 in the hair cycle remains unknown. This study investigated the involvement of recombinant FGF 13 in
the duration of the telogen phase and produced Fgf 13 hemizygous knock-out mice using CRSPR-Cas 9 system to examine
the physiological effects of FGF 13 . Recombinant FGF 13 was administered intraperitoneally to three-week-old female
C 57 BL/ 6 mice harboring uniform telogen phase hair follicles three times a week and the duration of the telogen phase
was determined by assessing the dynamics of skin color changes in a previously shaven telogen skin. FGF 13 significantly
prolonged the telogen phase to delay the transition into the anagen phase. In addition, FGF 13 pretreatment of eight-weekold mice harboring uniform telogen phase hair follicles suppressed the proliferation of hair follicle cells to delay the processof anagen phase induced by depilation. In contrast, Fgf 13 gene knock-out using CRISPR-Cas 9 system failed to produce
homozygous Fgf 13 knock-out mice, but produced only heterozygous knock-out mice. However, heterozygous Fgf 13 knockout mice did not significantly show the prolongation of the telogen phase. These results indicate that recombinant FGF 13
prolongs the telogen phase, suggesting that FGF 13 plays an essential role in maintaining the telogen phase. Assessing the
fetuses from the edited embryo suggested that constitutive Fgf 13 knock-out mice might be embryonic lethal. Therefore,
conditional keratinocyte-specific Fgf 13 knock-out mice must be generated to examine the physiological mechanism of thehair cycle regulation by FGF 13 .

1. 緒

言

毛周期は、休止期、成長期、退行期の 3 つの時期からなり、種々の線維芽細胞増殖因子（FGF）の発現変動と連動
し 1）、FGF に制御されていることが明らかになってきた（図図 1 毛周期と FGF。各毛周期で 発 現 が増 加する FGFを示した。多くの FGF が毛周 期 を 前 に 進 め る が、FGF18 は抑 制 的に働き休止期を維持する。

1）。特に、FGF 18 は毛包幹細胞が存在するバルジ領域で発現し 2）、休止期で発現が増加し、成長期で低下することで 1）、休止期を維持していることが明らかになった 3）。一方、
FGF 13 も FGF 18 と同様に休止期で発現が多く、成長期で発現が低下している 4）。しかも、Ｘ連鎖性先天性多毛症では毛包において FGF 13 遺伝子の発現が著しく低下し、この FGF 13 発現低下が多毛症の原因と考えられていること
5）

胞内 FGF” とよばれ、細胞外での作用は全く知られていなから 、FGF 13 も毛周期制御に関係し、FGF 18 と同様にかった。ところが、我々は、この FGF 11 サブファミリー

休止期の維持に重要な役割を担っていると推定される。しの FGF が細胞外から細胞内に容易に移行できることを見かしながら、FGF 13 の毛周期に対する機能は未だ証明さ出した 6）。この発見は、何らかの機序で FGF 13 が細胞外

れていない
（図 1）
。

に放出されれば、FGF 13 も FGF 18 と同様に細胞に作用でFGF 13 を含む FGF 11 サブファミリーの FGF は、他のきることを意味し、FGF 13 のシグナル分子としての可能FGF と異なり FGF 受容体と反応できない。しかも、その性を飛躍的に広げることになった。そして、組み換え体

分泌機序も不明なことから、FGF 11 サブファミリーは “細FGF 13 を生体に投与することで、FGF の毛包周期への役割を探索できる可能性を示した。
FGF 13 の生体での役割を知るために、その遺伝子のノThe Regulation of Hair Cycle Resting
Phase by Growth Factors

ックアウトマウスを調べることは非常に有用である。しかFumiaki Nakayama

しながら、FGF 13 は、脳神経系で発現が多いことが知ら

Regenerative Therapy Research Program,
National Institute of Radiological Sciences,
National Institute for Quantum andRadiological Science and Technology

れているが、そのノックアウトマウスの表現型の報告がない 7）。すなわち、FGF 13 遺伝子の全身性ノックアウトマ
ウスが誕生し、長く生存できるか未だ不明である。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

以上、他の FGF と同様に、FGF 13 も毛周期制御に関与を購入して使用した。マウスの毛包は、出生後しばらく毛している可能性が考えられた。そこで、本研究では、組周期が同調しており、3 週齢の C 57 BL/ 6 では休止期に揃

み換え体 FGF 13 を利用して、FGF 13 の毛周期への関与をっている。この 3 週齢のマウスを項部から背部 1 / 3 にか検討した。近年、CRISPR‒Cas 9 システムにより、ノック

けて電動バリカン（Pet club ER 803 , Panasonic）で剃毛し、アウトマウスの作成が迅速、簡便化されてきたことから、項部の皮膚の色調の変化を観察することにより、毛周期の

CRISPR‒Cas 9 システムにて FGF 13 ノックアウトマウス

変化を判定した。すなわち、休止期では皮膚がピンク色だ作成も試みた。

が、成長期に移行するに従って毛包のメラニンが増加し、

2. 実

皮膚は青色に変化することで判定した。マウス 1 匹あたり験

10 µg の FGF 13 を 0 . 5 mL の 5 ％マウス serum 含有生理食2 . 1. 組み換え体 FGF13 タンパク質の作成

塩水に希釈して、マウス腹腔内に投与した。コントロール

ヒト FGF 13 には種々の splicing variant が存在するが、マウスには、0 . 5 mL の 5 ％マウス serum 含有生理食塩水

本研究では transcript variant 3（NM_ 001139501）配列ののみ投与した。FGF 13 は剃毛後 2 日目から週 3 回、計 8

FGF 13 を用いた。この遺伝子配列を Gateway pDEST 17

回投与し、皮膚の写真撮影も週に 3 回麻酔下で実施した（図

Vector に 組 み 込 み、pET 発 現 シ ス テ ム に よ り、 大 腸 菌

2 A）。

（BL 21（DE 3）pLysS）
内で His タグ付き FGF 13 蛋白質を大量に産生させ、Ni Sepharose カラムで精製した 6）。さらに、
PBS で透析した後、‒ 80 度に分注保存し、用時解凍して使用した。

2 . 3 . FGF13 投与による成長期誘導後の細胞分裂の検出
日本クレアから 8 週齢のメス C57BL/ 6 NJcl を購入して使用した。8 週齢の C57 BL/ 6 は生後 2 サイクル目の休止期に

2 . 2 . FGF13 投与中のマウス毛周期の測定

毛包が揃っている。この 8 週齢のマウスの背部を抜毛する

マウスは、日本クレアから 3 週齢のメス C 57 BL/ 6 NJclと、休止期の毛包は成長期へと誘導させる。抜毛 24 時間前

図 2 FGF13 投与による毛包休止期の延長。3 週齢マウスの背部を剃毛し、週 3 回 FGF13 を投与しながら、項部の毛周期を皮膚色で判定した。

− 128 −

増殖因子による毛包休止期制御機構の解明に 100µgの FGF13 を腹腔投与し、抜毛後 24 時間と 72 時間

剃毛した皮膚の色調はすべてピンク色だった。生理食塩水に皮膚を採取した。採取 2 時間前にも BrdU ラベリング液をを投与したコントロール群は 5 日目で軽度青色を呈し、成腹腔に注射して、分裂中の細胞核をBrdU でラベルした。パ

長期の開始が示された（図 2 B）。さらに、9 日目では約半

ラフィン包埋切片を抗BrdU 抗体で免疫組織化学染色し、分数のマウス項部が青色になり、16 日目で全頭が成長期と裂中の細胞を検出した（図 3A）。

なった（図 2 C）。一方、10 µg の FGF 13 を週 3 回腹腔投与した群では、7 日目でもピンク色を保ち、依然として毛包2 . 4 . CRISPR–Cas 9 システムによるFGF13 KO
マウスの作成Alt­-R® CRISPR‒Cas9 System を用いたゲノム編集によ休止期が持続し、9 日目でも 80 % のマウスが休止期を維持した（図 2 C）。よって、FGF 13 投与群では、2 〜 4 日の休止期の延長が認められた。

りFgf 13 遺伝子のノックアウト（KO）マウスの作成を試みた。
マウスは C57BL/6NJcl を用い、gRNA は Fgf13 の variant

3 . 2 . 組み替え体 FGF13 による成長期誘導の阻害

1 ～ 4 の共通部分を壊すように設計した。そして、Cas 9

8 週齢の C 57 BL/ 6 の毛包も休止期に揃っており、抜毛Nuclease と gRNA Complex の複合体をマウス受精卵にエレすることで一斉に毛包を成長期に誘導できる。そこで、抜クトロポレーションにて導入し、培養後 2 細胞期の受精卵

毛後 72 時間で毛包角化細胞への BrdU の取り込みを観察

を偽妊娠マウスの卵管へ移植した。19 日後分娩により新生すると、BrdU 陽性細胞が著明に検出できることから、角仔を得た。

化細胞は分裂を始め、毛包は成長期に入ったことが示され3. 結た（図 3 B）。一方、抜毛の 24 時間前に FGF 13 を腹腔注射

果しておくと、BrdU 陽性細胞が極めて少ないことから、細3 . 1. 組み替え体 FGF13 によるマウス毛包休止期の延長
3 週齢の C 57 BL/ 6 では、毛包は休止期に揃っており、胞分裂が抑制されていることがわかった。さらに、毛包の形態変化からも成長期の開始がコントロールに比べて遅延していることが明らかになった（図 3 B）。

図 3 FGF13 投与による成長期誘導の阻害。8 週齢マウスに FGF13 投与後、抜毛による成長期誘導を行い、BrdU の取り込みにより細胞分裂を判定した。

− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 3 . CRISPR–Cas 9 システムによるFGF13 遺伝
子ノックアウトFGF 13 が FGF 18 同様に休止期の維持に大きな役割をはた

CRISPR‒Cas 9 システムによって FGF 13 遺伝子の全身FGF 13 の毛包周期における生理的な役割を調べるため性ノックアウトを試みた。1 匹の妊娠マウスから 7 匹の仔に FGF 13 のノックアウトマウスは有用である。しかしな

マウスが得られたが、FGF 13 遺伝子がホモでノックアウ

がら、FGF 13 遺伝子の全身性ノックアウトマウスについトされた個体は得られず、ヘテロでノックアウトされたて情報がなく、出生できるか不明であった。そこで、本研

雌が 1 匹だけ得られた。一方、別の 2 匹の妊娠マウスを出究では、CRISPR‒Cas 9 システムにより FGF 13 の全身性

産予定日前日に帝王切開したが、着床痕は 20 個以上認めノックアウトマウス作成を試みた。その結果、残念ながらられたものの、胎仔は計 8 匹しか存在しなかった。しかも、FGF 13 遺伝子のホモ欠損マウスを得ることができず、ヘゲノム解析の結果これらの胎児の FGF 13 遺伝子はすべて

テロノックアウトの雌マウスが得られただけだった。雌の野生型で、ヘテロノックアウトマウスも得られなかった。

ヘテロノックアウトマウスで毛包周期を観察したが、野生雌のヘテロノックアウトマウスと野生型マウスとの交配型マウスと有意な違いを認めなかった。毛包で FGF 13 のにより、数匹のメスのヘテロノックアウトマウスが得られ発現が低下しているヒトのＸ連鎖性先天性多毛症では、男た。FGF 13 遺伝子座は X 染色体上にあるため、オスのノ性患者でほぼ全身に強く多毛症の症状が出現しているのにックアウトマウスが得られれば、FGF 13 の発現が完全に対して、変異のある遺伝子座が１つしかない女性キャリア

欠損しているはずだが、オスのノックアウトマウスは生ま

では、ごくわずかに体幹に多毛傾向を示すのみである 5）。よれてこなかった。これらのヘテロノックアウトマウスの背って、FGF 13 遺伝子の雌のヘテロノックアウトマウスに部を剃毛して皮膚色を観察し、休止期の長さを測定した。

何らかの毛の異状を見出すのは困難で、毛包においてさ

生後から 3 周期ほどの観察では、毛包休止期の長さについらなる FGF 13 減少もしくは発現欠損が毛の表現型の異状てヘテロノックアウトマウスと野生型マウスとの間に有意を検出するために必要と考えられた。一方、FGF 13 遺伝

な違いは認められなかった。

子座は X 染色体上にあるため、オスのノックアウトマウ

4. 考

していることを示唆している。

スが得られれば FGF 13 発現のないマウスとなるが、雌の察

ヘテロノックアウトマウスとの交配を繰り返しても、オ

マウス毛包は、3 週齢から休止期が 1 週間続き、その後スのノックアウトマウスは全く得られなかった。生後の成長期が始まる。休止期では毛包は短縮し、毛幹の先端も食殺の可能性も考慮し、出産直前の帝王切開も実施した

毛包から分離して容易に抜ける状態となっている。この時、が、FGF 13 遺伝子ホモノックアウトの胎仔を認めなかっ

毛をバリカンで剃ると、皮膚にはほとんど毛幹が残らないた。胎盤着床痕の数に比べて、胎仔数が少ないことからも、ため、皮膚色はピンク色となる。一方、成長期が始まると、FGF 13 遺伝子の破壊は胚性致死になる可能性が高いと考

毛包が下へ伸長するとともに、毛包先端から黒い毛幹が伸えられた。よって、FGF 13 の毛包周期における生理的なびてくるため、剃毛後の皮膚は青色調を呈する。したがっ役割を調べるためには、皮膚角化細胞だけ FGF 13 を欠損て、実験開始から 1 週間、すなわちマウスが 4 週齢になると、させるコンディショナルノックアウトマウスの作成が必要

無処置のコントロールマウスでは、皮膚色がピンク色かと結論づけられた。

ら青色に変化する（図 3）。ところが、組み替え体 FGF 13

5. 総を腹腔投与した群では、1 週間たってもピンク色のままで、
約 2 ~ 4 日ほど成長期への移行が遅延した（図 3）。すなわち、

括

組み替え体 FGF 13 を用いたマウス実験により、FGF 13

FGF 13 の投与が明らかに毛包休止期の期間を延長した。

が毛包角化細胞の分裂を抑制し、毛包休止期を延長させる

休止期に抜毛することで、毛包は成長期に誘導される

ことが明らかになり、FGF 13 が毛包休止期の維持に重要ことが知られている。そのメカニズムは、毛幹に FGF 18な役割を果たしていることが示唆された。今回、FGF 13などを分泌する細胞が接しているが、抜毛により毛幹との全身性ノックアウトマウス作成を試み、ヘテロノックア

ともにこの細胞が除かれ、毛包の FGF 18 の濃度が低下す

ウトマウスを得られたが毛周期の異状を認めなかった。まることで、成長期に移行すると考えられている。抜毛後

た、FGF 13 全身性ノックアウトマウスは胚性致死になるには FGF 13 の発現も低下することから 1）、FGF 13 につ可能性が高いことも示した。今後、皮膚角化細胞特異的にいても同様の作用が推定されたため、組み替え体 FGF 13

FGF 13 を欠損させたコンディショナルノックアウトマウ

を抜毛前にマウス個体に投与してみた。驚くべきことスを作成することで、FGF 13 による生理的な毛周期制御に、FGF 13 の投与により毛包の成長期への誘導は阻害さ機構の解明につなげていく予定である。

れた。すなわち、FGF 13 の事前投与が抜毛により失われた休止期維持の機構を補ったことを意味している。これは、− 130 −

増殖因子による毛包休止期制御機構の解明（引用文献）

5） DeStefano GM, Fantauzzo KA, Petukhova L, Kurban

1） Kawano M, Komi‒Kuramochi A, Asada M, Suzuki

M, Tadin‒Strapps M, Levy B, Warburton D, Cirulli

M, Oki J, Jiang J, Imamura T: Comprehensive analysis

ET, Han Y, Sun X, Shen Y, Shirazi M, Jobanputra V,

of FGF and FGFR expression in skin: FGF18 is highly

Cepeda‒Valdes R, Cesar Salas‒Alanis J, Christiano

expressed in hair follicles and capable of inducing

AM: Position effect on FGF13 associated with X‒linked

anagen from telogen stage hair follicles, J. Invest.

congenital generalized hypertrichosis, Proc. Natl. Acad.

Dermatol., 124, 877‒885, 2005.

Sci. U. S. A., 110, 7790‒7795, 2013.

2） Hsu YC, Pasolli HA, Fuchs E: Dynamics between

6） Nakayama F, Yasuda T, Umeda S, Asada M,

stem cells, niche, and progeny in the hair follicle, Cell,

Imamura T, Meineke V, Akashi M: Fibroblast growth144, 92‒105, 2011.

factor‒1 2 （FGF1 2） translocation into intestinal3） Kimura–Ueki M, Oda Y, Oki J, Komi‒Kuramochi A,

epithelial cells is dependent on a novel cell‒penetrating

Honda E, Asada M, Suzuki M, Imamura T: Hair cycle

peptide domain: involvement of internalization in theresting phase is regulated by cyclic epithelial FGF1 8

in vivo role of exogenous FGF1 2, J. Biol. Chem., 2 8 6,

signaling, J. Invest. Dermatol., 132, 1338‒1345, 2012.

25823‒25834, 2011.

4） Kawano M, Suzuki S, Suzuki M, Oki J, Imamura T:7） Itoh N, Ornitz DM: Fibroblast growth factors: from

Bulge‒ and basal layer–specific expression of fibroblast

molecular evolution to roles in development, metabolism

growth factor‒1 3（FHF‒2）in mouse skin, J. Invest.

and disease, J. Biochem., 149, 121‒130, 2011.

Dermatol., 122, 1084‒1090, 2004.

− 131 −

皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割
京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻

原雄二

Membrane repair is the fundamental process that is essential for maintaining the homeostasis of live cells. Phospholipids’
distribution has been thought to be dramatically changed during membrane repair, but the detailed mechanisms underlying
the membrane repair is still elusive. To elucidate the role of phospholipids’ distribution in membrane repair, we havefocused on phospholipid flippase that can translocate specific phospholipids from the outer to the inner leaflets of biologicalmembranes, thus generating asymmetric distribution of phospholipids. We first established cell lines lacking phospholipid
flippase by the CRISPR/Cas 9 system, and performed membrane damage assays using a membrane-impermeable dye (FM 1 43 ) or GFP-tagged membrane repair proteins expressed in the phospholipid flippase-deficient cell lines. Phospholipid
probes were also utilized to elucidate the role of phospholipids’ localization in membrane repair. Our results revealed
that continuous influx of FM 1 - 43 was observed in phospholipid flippase-deficient lines after introduction of membrane
damages. Accumulation of one of membrane repair-related proteins to damaged sites was affected in the flippase-deficient
cells, suggesting that the membrane repair was affected by deficiency in the phospholipid flippase. Moreover, during thecourse of this project, we identified PIEZO 1 , a mechanosensitive cation channel that is activated by membrane tension, asa downstream target of phospholipid flippase-dependent phopsholipids’ localization. Our results indicate that phospholipid
flippase plays a role in the membrane repair system, thus providing the therapeutic strategies for a variety of diseases
including skin diseases.

1. 緒

あるリン脂質分子群に焦点をあてた「膜修復素過程の包括

言的理解」が進んでいないことが大きな要因と言える。例え

生体膜は、生命の基本単位である細胞を形づくる構造体

ば膜修復関連タンパク質群による膜損傷後の意義、膜修復である。形質膜の構造が損なわれると、細胞における恒常時における脂質分子群の動態等が未解明であること等が挙性が破綻し、筋ジストロフィーをはじめ様々な疾患が惹起

げられる。

1）

される 。形質膜に対する損傷は骨格筋だけでなく皮膚等

そこで、本研究では皮膚を構成する上皮細胞における膜修復機構に焦点をあてた。特に皮膚への損傷時に膜リン脂

様々な組織で見られる。
機械刺激や炎症等により惹起される形質膜損傷を認識し、直接修復する機構については、脂質結合ドメインを有する
2）質分子そのものの動態やリン脂質分子局在を制御するタン
パク質群の機能解析を行うことで、皮膚修復機構解明を目タンパク質 Dysferlin の発見により端を発した 。同タン指した。具体的にはリン脂質の形質膜内層・外層間の輸送

パク質が筋線維内の小胞とともに形質膜損傷部位に集積し、を制御するリン脂質輸送体群に着目した。リン脂質輸送体

2+

カルシウムイオン（Ca ）依存的に損傷が修復される仮説がは外層から内層にリン脂質を輸送するフリッパーゼ、両方提唱され、脂質結合タンパク質群が膜ダメージ認識に関与

向に輸送するスクランブラーゼ、内層から外層に輸送する

3）すると報告がなされている 。一方、皮膚をはじめとするフロッパーゼからなり、これらの役割によりリン脂質の局上皮細胞に対する保護・修復機構は、組織の構造・機能恒在は決定される。興味深いことに、哺乳動物細胞では内層常性維持に必須である。これまでに損傷部位に集積する免側にホスファチジルセリンやホスファチジルエタノールア

疫細胞から産生されるサイトカイン等の液性因子等様々なミン等が、外層側にホスファチジルコリンやスフィンゴミ

修復関連因子が同定されてきた 4）。しかし膜修復におけるエリンなどが局在し、非対称分布を形成する 5）。

分子機構の詳細は依然明らかではない。それは、膜構造・以上の観点のもと、本研究ではリン脂質輸送体が小胞融

機能破綻を主原因とするにも関わらず、形質膜構成因子で合時のリン脂質局在の制御を行うことで、皮膚細胞における修復に関与するという作業仮説を提唱し、検証を目指した。申請者のこれまでのバックグラウンドをもとに、まずRole of phospholipid translocases inskin repair
Yuji Hara

モデル系として筋芽細胞株を用いた解析を行うことで、皮膚をはじめとする修復過程におけるリン脂質動態の役割の解明を目指した。

Graduate School of Engineering, Kyoto
University− 132 −

皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割

2. 実索するため、骨格筋線維に対して溶解作用を有するカルジ験

オトキシンを用い、その後の再生過程への効果を検討した。

2 . 1. リン脂質フリッパーゼの欠損細胞株の樹立
CRISPR/Cas 9 法により樹立を行った。各遺伝子配列に

2 . 6 . リン脂質フリッパーゼにより制御されるイオン
チャネル群の同定および解析

対するターゲット配列を CRISPR-direct を用いて設計し、リン脂質の非対称分布により制御を受けるイオンチャ

pX 330 ベクター（Addgene）に該当配列を組み込むことでネルとして、我々はカルシウム透過型イオンチャネルの設計を行った。C 2 C 12 細胞株（ATCC）へ pX 330 - ターゲ

関与を検討した。筋芽細胞に発現するイオンチャネルをット配列 -PGK-puromycin カセットを組み込んだベクタ

qRT-PCR 法にて同定後、各イオンチャネルについてアゴーを、ViaFect（Promega）を用いてトランスフェクショ

ニスト刺激後のイオンチャネル活性の計測を行った。今ンした。その後 Puromycin 耐性細胞について、単一細胞回着目したイオンチャネルとして PIEZO 1 が挙げられるが、クローニングを行い、ゲノム DNA を鋳型としたゲノミッ

PIEZO1 特異的アゴニストYoda 16）を用いて、カルシウム指ク PCR を行い、得られた PCR 産物について各遺伝子配列

示薬Fura- 2 を用いてカルシウム測光を行った。

リ ン 脂 質 フ リ ッ パ ー ゼ 欠 損 筋 芽 細 胞 株 に つ い て、をダイレクトシーケンシングすることで、各遺伝子欠損を確認し細胞の樹立を行った。

3. 結

果

3 . 1. 培養細胞系におけるリン脂質輸送体の機能解明

2 . 2 . 細胞膜修復アッセイの構築

本研究遂行にあたり、我々は膜外層から内層にリン脂質膜損傷導入系として、マイクロマニピュレーターにより分子を輸送する「リン脂質フリッパーゼ」に着目した。リン

微小ガラス管を操作し、細胞膜への損傷を与えた。二光子

脂質フリッパーゼは主要ユニットである P 4 -ATPase、補顕微鏡（LSM 780 ; Zeiss 社）下にて二光子パルスレーザを用助ユニットである CDC 50 の各ファミリーよりなる（図 1）。

いる方法、あるいはマイクロマニピュレーターにて微小ガ研究の端緒として、申請者の研究バックグラウンドとしてラス端にて細胞膜にダメージを与える方法を試みた。膜骨格筋における幹細胞として機能する筋芽細胞に着目し、修復に関わる因子群の挙動観察のため、膜修復関連因子検討を行った。筋芽細胞は互いに融合することで、筋管と（MG 53 , ESCRTIII 複合体 , Annexin）について、各 GFP 融

よばれる多核の構造体を形成し、筋線維へと成熟する。リ

合タンパク質の集積を評価した。

ン脂質フリッパーゼの発現プロファイルを検討したところ、
P 4 -ATPase、CDC 50 各ファミリーにて高発現する分子と2 . 3 . リン脂質フリッパーゼ欠損マウスの樹立

して、Atp 11 a および Cdc 50 a 各遺伝子の同定に成功した。

リン脂質フリッパーゼ（Atp11 a）欠損マウスについては、

その結果をもとに筋芽細胞株にて各遺伝子欠損株の樹立

Wellcome Trast Sanger Institute より購入した。同遺伝子

を CRISPR/Cas 9 法にて行い、その機能解析を行った。まの全身性欠損により胎生致死に至ることから、コンディシ

ず筋芽細胞からの分化能を検討した。低血清培地による筋ョナル遺伝子欠損システムとして、Cre-LoxP システムにて、管形成の誘導後、野生株では細長い筋管構造を呈するのに筋芽細胞特異的な Cre レコンビナーゼ（Myf5-Cre）を用いて、対し、各分子欠損株では異常な構造体の形成が認められた。

同マウスの解析を試みた。

タイムラプス観察の結果、野生株では秩序だった融合過程に続き、長軸方向へ正しく伸長する様子が観察された。一2 . 4 . 遺伝子欠損細胞株の増殖能アッセイ

方、リン脂質フリッパーゼ欠損株（Atp 11 a, Cdc 50 a 各欠

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞の増殖能を検討するため、損細胞）では、細胞同士の融合の異常な亢進、および融合

同遺伝子欠損マウスより筋芽細胞を単離し、培養を行った。

後に細胞極性を失うことで、長軸方向への伸長が損なわれコンフルエントになるまで同細胞を培養し、スクラッチア
ッセイを行い、その後の増殖能について観察を行った。また、増殖過程の観察のため、筋芽細胞株を用いて、京都大学医学研究科の共通施設に設置されているインキュベーター型顕微鏡（Olympus LCV110）を用いてタイムラプス観察を行った。

2 . 5 . リン脂質フリッパーゼ欠損マウスの解析
リン脂質フリッパーゼ（Atp11 a）欠損マウスについて、その表現型解析を行った。組織における修復能への影響を探− 133 −

図1

リン脂質フリッパーゼコスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

ることが示された。この結果より、リン脂質フリッパーゼ

ついて解明を試みた。これらの欠損細胞株では細胞形態のは細胞極性の形成に関わりうることが示唆された。

著しい変化が生じたことから、細胞骨格が関わることが想

さらに我々はリン脂質フリッパーゼの下流にて機能する定された。また先行研究により、筋管細胞での形質膜直下分子の同定を試みた。特に膜融合過程では、融合する細胞

でのアクトミオシン（アクチン - ミオシン複合体）の形成が、同士で押し合うことに伴い膜張力が増強し、この力学的秩序だった細胞形態に関わることが示された。実際、アクな刺激が融合促進に関わることが想定されている 7）。そこ

チンの重合をファロイジンにて、およびミオシンの集積をで我々は膜張力を感知する分子群とリン脂質フリッパー

抗ミオシン（NMIIA）抗体にて検出したところ、野生型でゼが機能的に関わると作業仮説を立てた。特に、膜張力感

は形質膜直下での集積が認められたが、各欠損株ではそ知に関わり細胞質内でのシグナル伝達をもたらす機械受の集積が消失することが示された。アクトミオシン形成

容イオンチャネルに焦点を当てた。機械受容イオンチャには、低分子量 G タンパク質 RhoA および Rho キナーゼがネルは細胞膜の張力や、細胞骨格からの力を感知して活活性化され、MLC 2（ミオシン軽鎖）のリン酸化を経ても性化されることが知られており、多くのイオンチャネルがたらされる。そこで各欠損株にて、アクトミオシン形成

該当すると考えられている。特に筋芽細胞株 C 2 C 12 におをレスキューするために、上記経路を活性化させること

いて、PIEZO 1、TRPM 7、PKD 2 などの発現が認められとした。RhoA 活性化剤 CN 03、およびミオシン活性化剤た。これらのうち、PIEZO 1 イオンチャネルはリン脂質フCalyculinA を添加すると、リン脂質フリッパーゼ欠損あ

リッパーゼ欠損により、その機能が大きく減弱することをるいは PIEZO 1 欠損細胞株で見られた筋管形態の異常が、明らかにした（図 2）。同イオンチャネルアゴニストである

少なくとも部分的にレスキューされた。以上の結果より、

6）

Yoda 1 を添加すると、野生株では急激なカルシウム上昇

我々は「リン脂質フリッパーゼによるリン脂質の細胞膜間が見られるのに対し、Atp 11 a 欠損細胞では同チャネル活の輸送は、PIEZO 1 イオンチャネルにより感知され、様々性の減弱が、さらに Cdc 50 a 欠損細胞では、ほぼ完全に同な細胞機能をもたらす」という「フリップ・フロップ

チャネル活性が消失することを明らかにした（図 3）。さらッチ機構」を提唱した 。

スイ

8）に Piezo 1 欠損細胞では、細胞同士の融合が促進し、かつ融合後の形態が損なわれた。以上の結果より、リン脂質フ3 . 2 . 細胞遊走におけるリン脂質フリッパーゼの役割

リッパーゼによるリン脂質動態は、機械受容イオンチャネ

リン脂質フリッパーゼは、リン脂質の細胞膜間の挙動

ルの活性を正に制御することが示された。

を制御することにより、多様な役割を担うと考えられて続いて、リン脂質フリッパーゼ、PIEZO 1 の下流経路に

図2

きた。実際我々は、リン脂質フリッパーゼの一つである

リン脂質フリッパーゼと機械需要イオンチャネル PIEZO1 の機能的連関

図3

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞でのカルシウム測光− 134 −

皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割

ATP 8 A 1 が、CHO-KI 細胞での細胞遊走に関わることを9）

ことに、野生型と比較して細胞遊走能の減弱が認められた示した 。ATP 8 A 1 のノックダウンにより細胞遊走能が（図 4）。また筋芽細胞株 C 2 C 12 を用いた解析により、特著しく減弱すること、さらにこの下流経路として Rac 1 がに Cdc 50 a 欠損細胞株ではラメディポディア（葉状仮足）の関わることを明らかにした。これらの知見のもと、我々形態に変化が見られた。リン脂質フリッパーゼは CDC 50

はリン脂質フリッパーゼ ATP 11 A が筋芽細胞の細胞遊走ファミリーの存在下、正しく局在し機能を果たすことから、能を制御する可能性を追究した。Atp 11 a 欠損マウスより筋芽細胞にて唯一発現する Cdc 50 a を欠損すると、リン脂単離した筋芽細胞にて、コンフルエントになるまで培養

質フリッパーゼの機能はほぼ欠損すると考えられる。以上

し、スクラッチ後の細胞増殖能の検討を行った。興味深いの結果より、リン脂質フリッパーゼは形質膜のリン脂質動態を介して、細胞遊走を正に制御すると考えられる。

3 . 3 . 膜修復機構におけるリン脂質フリッパーゼの役
割
リン脂質フリッパーゼの役割をさらに明らかにするため、我々は膜損傷の修復機構への関連に着目した。形質膜は細胞を外界から隔てる役割を有しており、その構造破綻により内容物の漏出等により細胞死が引き起こされる。細胞死を防ぐため、前述のとおり細胞内には内在性の修復機構が備わっている。特に細胞膜直下の微小小胞が損傷を感知して損傷部位に集積・融合することで、細胞膜が修復される機構が知られている。膜修復機構には ⒜ 膜損傷認識因子群による、膜損傷部位への小胞集積および ⒝ 小胞集積後の膜構造の再編成という機構が考えられている 1 , 3）。

上記の背景のもと、リン脂質フリッパーゼ欠損細胞における膜修復機構の影響について検討を行った。膜損傷
認識因子として MG 53、膜構造の再編成に関わる因子として ESCRTIII 複合体を例として、それぞれの損傷部位への集積の検討を行った。膜ダメージとしてリン脂質フリッパーゼ欠損株では MG 53 の挙動は野性型と変わりなかった。
図4

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞での遊走能評価

図5

一方 ESCRTIII 複合体の集積については、野生型は一過的

CDC50A 欠損株における膜修復機能の低下− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019に集積が解離した（すなわち膜修復が完了した）のに対し、皮膚における触覚感知においては、PIEZO 1 のホモログで同欠損株では ESCRTIII 複合体は解離せず、損傷部位にとある PIEZO 2 が関与することが報告されている 12）。本研

どまったままであった。このことから、リン脂質フリッパ

究をさらに発展させ、リン脂質動態を介したイオンチャネーゼは膜修復機構に関与する可能性が示唆された（図 5）。

ル活性化が皮膚組織の恒常性に関わるという「フリップ・

リン脂質フリッパーゼはホスファチジルセリン、ホスフ

フロップ

スイッチ」機構の解明を目指したい。

ァチジルエタノールアミン（PE）等のアミノリン脂質を基また、本研究では、リン脂質フリッパーゼは膜損傷に対質として、細胞外層から内層への輸送を行う。我々はこれする修復過程に関わること、さらに膜修復機構のうち、主まで外層に露出した PE を特異的に検出する環状ペプチドに膜構造の再編成に関わることを明らかにした。これまで、

9）（Ro 09 - 0198） を用いて研究を行ってきた。興味深いこ

膜修復機構は関連するタンパク質群の同定・解析が主であとに Ro 09 - 0198 はその添加により細胞毒性を示す。我々った。本研究により、リン脂質動態機構が膜修復機構に関は同試薬を用いることで、膜構造の変化を介して細胞毒性わることが示されたことから、膜リン脂質そのものも膜修を示すこと、膜修復タンパク質群の特異的な集積を示すこ

復機構に関わることが示された。細胞膜損傷時から修復過とをそれぞれ明らかにした。

程において、膜の物性が著しく変化することが想定されて4. 考いる。本研究をさらに発展させ、リン脂質フリッパーゼと察

膜物性の相関についても明らかにする必要があり、今後の細胞膜を構成するリン脂質は、膜外層および内層間で異研究が待たれる。

なる局在を示すことが想定されている。この特異的な局在

5. 総により、細胞遊走、細胞分裂、細胞死過程等、様々な細胞

括機能に関わると想定されてきた 10）。本研究ではリン脂質

膜損傷は細胞の恒常性を破綻させることから、膜修復機挙動を司るリン脂質輸送体のうち、特に外層から内層に特構はきわめて重要な役割を果たしている。今後、リン脂

定のリン脂質を輸送するリン脂質フリッパーゼに着目した。

質フリッパーゼ依存的な膜修復機構のさらなる解明（下流

申請者の研究バックグラウンドの関係上、まず筋芽細胞を因子群の同定、遺伝子欠損マウスの解析等）を行うことで、用いた解析を試みることで、皮膚上皮細胞との共通性を示

皮膚細胞においてもその寄与を明らかにすることで、コスす現象について着目した。皮膚には幹細胞が存在し、高い

メトロジー分野への進展に微力ながら貢献したい。

再生能を有すると考えられている。筋芽細胞においても幹最後になりましたが、多大なるご援助を賜りました公益細胞（筋衛星細胞）の存在により、絶え間ない筋収縮に伴う財団法人コスメトロジー研究振興財団様にこの場をお借り

筋線維へのダメージに応じて、高い再生能を有する。本研

して心より御礼申し上げます。

究では、リン脂質フリッパーゼがいかに筋線維再生に関わるのか解明を試みた。その結果、リン脂質フリッパーゼの（引用文献）

一つ ATP 11 A および補助ユニット CDC 50 A 複合体が、秩

1）Davies KE et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 7: 762-773,

序だった筋管形態形成に関わることを明らかにした。その2006.

過程で、フリッパーゼの下流分子として、機械受容イオン

2）Bansal D et al., Nature, 423:168-172, 2003.

チャネル PIEZO 1 が膜張力を感知して活性化することで、

3）Cai C et al., Nat Cell Biol. 11: 56-64, 2009.

細胞骨格の再編成がもたらされることをそれぞれ見出した。

4）Gurtner GC et al., Nature. 453: 314-321, 2008.

PIEZO 1 は上皮細胞や血管内皮細胞に高発現することが知5）Murate M et al., J Cell Sci. 128: 1627-1638, 2015.

られており、上皮機能の維持および血管形成および機能に6）Choung S-Y et al., Biochim Biophys Acta 940: 180-

関わることが報告されている

11）。当研究により、上皮細197, 1988.

胞での機能においても、リン脂質フリッパーゼが機能する

7）Kim JH et al., Dev. Cell 32: 561-573, 2015.

ことで、膜張力などの物理的な力を感知するイオンチャネ

8）Tsuchiya M et al., Nat. Commun, 2049, 2018.

ル PIEZO 1 の活性が制御されることが示唆される。

9）Kato U et al., J Biol Chem, 288: 4922-4934, 2013.

一方、予備検討により、リン脂質フリッパーゼ欠損に伴10）van Meer G et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 9 : 112 - 124 ,2008 .

い、PIEZO 1 以外のイオンチャネルも活性制御されることを見出している。皮膚組織において、
PIEZO1 以外にも様々

11）Wu J et al., Trends Biochem Sci, 42 , 157 - 171 , 2017 .

なイオンチャネルが発現されると考えられている。また、

12）Ranade SS et al., Nature. 516 : 121 - 125 , 2014 .

− 136 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換
名古屋大学大学院創薬科学研究科構造分子薬理学分野

廣明

秀一

Tight junction (TJ) is an inter-cellular adhesion machinery that is maintained by epithelial cells in a dynamic equilibrium
between biogenesis and degradation. Biogenesis of TJ is mainly proceeded by ZO- 1 (and its paralogs ZO- 2 / 3 ), whereas
TJ degradation is promoted by LNX 1 . In detail, two PDZ domains in ZO- 1 and LNX 1 are competing each other amongmolecular interaction against claudins’ C-termini. Inhibition of either ZO- 1 or LNX 1 interaction to claudin may result in
TJ-opening or TJ-closure, respectively. In this study, we screened compounds from natural products that binds ZO 1 -PDZ 1 .
We found glycyrrhizin binds ZO 1 -PDZ 1 with a reasonable affinity, while baicalin, baicalein, hesperetin and naringenin
exhibited weak affinity against ZO 1 -PDZ 1 . Among these four flavonoids, baicalin and baicalein showed significant
reduction CLD- 2 from the intercellular membrane between two adjacent cells. Naringenin exhibited a marked increase in
CLD- 2 density between two adjacent cells. Baicalin and baicalein are candidates for drug absorption enhancers, whereas
naringenin is a promising candidate for TJ barrier enhancer.

1. 緒

れる PDZ ドメインと CLD の C 末端の相互作用によりスイ言ッチされているという点である（図 1 C）。

タイトジャンクション（TJ）は、上皮細胞の細胞間の頂

筆者らのグループでは、2009 年より、コスメトロジー

端部に形成される強固な細胞間接着装置である。TJ の機研究振興財団の支援のもと、TJ 抑制因子である LNX 1

能は臓器の種類により異なる。例えば水やイオン分子以の PDZ ドメインの構造決定に成功した（論文投稿準備中）。

外の物質を透過させない強固なバリアとして機能する一方

他方、TJ 形成促進因子 ZO‒ 1 の PDZ ドメインについてもで、特定のイオンの再吸収のみを促す選択的細胞間チャネ

NMR 解析を進め 2）、その PDZ ドメインにホスファチジ

ルとして機能するなど、多彩な機能を担う。その主要成分

ルイノシトールリン酸が結合し、CLD 結合と拮抗する作は生体内にヒトゲノム中に 27 種類あると考えられている用を持っていることを明らかにした 3）。更に上記 PDZ ド

4 回膜貫通タンパク質クローディン（CLD）と、同じく 4 回

メインの構造情報をインシリコ創薬手法に活用し、新規

膜貫通タンパク質であるものの機能が未知のオクルーディの非ペプチド性 LNX 1 阻害薬、NPL‒ 1010、NPL‒ 1011、ン、その裏打ちタンパク質で分子内に PDZ ドメインを 3

NPL‒ 3009 の化合物を同定した 4）。これら阻害剤はモデル個有する ZO‒ 1 / 2 / 3 などである（図 1 A）
。TJ は、皮膚に上皮細胞で TJ 形成を増強した。また化合物探索の過程で、おいては表皮・顆粒細胞層において皮膚バリア機能を担っ類似骨格を有する類縁化合物から、TJ 形成促進因子であている。これまで TJ は、その生化学的実験における難溶

る ZO 1 ‒PDZ 1 に結合し、TJ を減弱させバリアを緩和する性と電子顕微鏡により観察された強固な構造から、TJ は化合物も発見することができた 5）。

生理的に「安定」な構造体であると信じられてきた。2007

しかし、筆者らが発見した「第一世代 TJ 制御低分子」は年に生理研（岡崎）の古瀬らは、CLD を特異的にユビキチ

いずれも合成低分子であり、ヒト皮膚などに対する刺激性・ン化してエンドサイトーシスするタンパク質 LNX 1 を発安全性などは未確認であるため、化粧品原料として必ずし見した（図 1 B）。これにより、TJ は、エンドサイトーシス・も望ましくはない。そこで本研究では、インシリコ手法の分解経路による分解と、新規合成・重合促進による形成の、一つである化合物骨格転換（スキャフォールドホッピング）

動的平衡によって保たれているという新しいモデルが示さの技術を用いて、TJ を強化または減弱させる作用を持つ

1）

れた 。この作業仮説で特徴的なのは、TJ の形成促進と、天然物由来あるいは食品由来の成分を新たに探索すること

TJ の内在化・減弱が、ともに TJ の制御タンパク質に含まとした。その際、下記の 2 つのアプローチによる研究を計画した。

Scaffold conversion of tight junction
enhancers into ready-to-use compounds
based on 3 D-structure of PDZ domains
Hidekazu Hiroaki
Laboratory of structural and molecular
pha rmacolog y, Graduate school ofpharmaceutical sciences, Nagoya University【アプローチ１】
既知情報を活用した化合物探索：すでに筆者らは、天然物である真菌フシジウム・コキネウム培養上清から単離された四環系トリテルペノイド抗生物質、フシジン酸（FUS）が、複数の PDZ ドメインに結合することを発見− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 1 TJ 形成促進因子 ZO1 ならびに TJ の抑制分解因子 LNX1 のドメイン構成（A, B）と、CLD の C 末端相互作用の拮抗による TJ 動的制御仮説（C）

し報告している 6）。そこで、米 NCBI が公開している化

2. 方

合物 DB である PubChem を利用して、トリテルペノイド化合物のリストを作成し、FUS と似た負電荷を持つ法

2 . 1. NMR 試料の調製

グリチルレチック酸（GA）ならびにグリチリチン（GRZ）

mZO1‒PDZ1 の発現は、当研究室で作成したpGEX‒ 6 P 3 ‒に着目し、ZO 1 ‒PDZ 1 ドメインとの相互作用解析、なPRESAT/mZO1‒PDZ 1 プラスミドを使用した。このプラス

らびにイヌ腎臓尿細管上皮細胞 MDCK II 細胞に対するミドを用いて大腸菌 BL 21（DE 3）に形質転換した。LB 寒

薬理作用を観察した。

天培地に生えたコロニーを数個拾い、LB 培地（50 µg/mL
ampicillin）10 mL に添加し、37 ℃で約 5 時間培養した。そ【アプローチ２】の後、15 NH 4 Cl（0 . 5 g/L）を唯一の窒素源とするM 9 培地

既報の相互作用の文献情報を活用した化合物探索：筆1 L に培養液を加え、O.D. 60 0 = 0 . 4 になるまで培養した。そ者らはアミノベンジルまたはアミノベンゾイル構造を分の後、温度を 20 ℃に下げ再び培養した。O.D. 60 0 = 0 . 45 の子内に有するジクロフェナクならびにフルフェナミン酸

時に終濃度が 0 . 5 mM になるように IPTG を加えて発現誘導

が、ZO 1 ‒PDZ 1 のみならず複数の PDZ ドメインに弱くし、20 ℃で一晩培養した。

結合することを見だしている。そこで、ZO 1 ‒PDZ 1 と回収した菌体 1g に対して 20 mL の破砕バッファー（50 mM

配列が類似した他の PDZ ドメインに結合する天然物をTris‒HCl, 500 mM NaCl, 0 . 3 % Triton X– 100 , pH 7. 2）を

文献情報より探索し、その天然物ならびに類縁化合物

加え、懸濁し、Bioruptor（Cosmo Bio）で超音波破砕した（onと ZO 1 ‒PDZ 1・LNX 1 ‒PDZ 2 の相互作用を実験によりtime 30 sec/off time 30 sec, total 10 min× 4 回）。 破 砕

検証する、という手法で、新規相互作用の探索を行った。

後、遠心分離し（20000 rpm, 20 min, 4 ℃，KUBOTA 3700）、

具体的には、PSD‒ 95 の PDZ ドメインと、生薬オウゴ

上清を回収した。回収した上清をDEAE Sepharose Fast

ンに含有されているフラボノイドの直接相互作用が報告

Flowカラム（GE Healthcare）とGST‒accept カラム（nacalai

7）

されていた 。そこで、主要なオウゴン含有フラボノイ

tesque）に流し、GST 融合 ZO1‒PDZ 1 をレジンに結合させドならびに、類似のフラボノイド計 13 種を購入し（図 2）、た。カラムに 150 µL の PreScission Protease を添加して 4

NMR による相互作用解析、ならびに MDCK II 細胞に対℃で静置し、GSTタグを切断した。切断後、バッファーで目する薬理作用を観察した。

的タンパク質を溶出した。

− 138 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

図2

探索に用いた 13 種のフラボノイドとグルクロン酸（コントロール）plus（GE Healthcare）を用いてゲルろ過クロマトグラフィ

2 . 3 . MDCK II 細胞を用いたTJ 増強（緩和）効果の観察ー（50 mM Tris‒HCl, 150 mM NaCl, pH 7. 2）により精製し、

6 穴プレートにカバーガラスを入れ、そこに 30 × 104

更に濃縮後、NMR バッファー（20 mM MES, pH 5 . 9）に透個の MDCK II 細胞を播種し、37 ℃、5 % CO 2 環境下で 24

mZO1‒PDZ 1 は限外ろ過器により濃縮後、AKTAprime15

析し、 N mZO1‒PDZ 1 サンプルとした。

時間静置培養した。その後、D‒MEM 培地に 100 µM、d 6 ‒DMSO 濃度 0 . 1 % になるように化合物を混合し、細胞に添2 . 2 . NMR 滴定実験によるタンパク質・低分子化合物相互作用の観察と評価
15加した後、37 ℃、5 % CO 2 環境下で 48 時間、また 96 時間
インキュベートした。96 時間インキュベートの場合、48N 標識した PDZドメイン（0 . 1 mM）に 2 当量、または時間後に化合物を同濃度になるよう混合し直し細胞に添加

10 当量のフラボノイド（5 % d 6 –DMSO, 10 % D 2 O）を添加し、した。血清、抗生物質を含有していない D‒MEM 培地で 1

1H‒15 N HSQC スペクトルを測定し、下記の計算式でシグナ

回洗浄後、4 %‒ パラホルムアルデヒド溶液 ‒ リン酸緩衝液

ル移動度Δδ［ppm］を算出した。各化合物ごとに閾値を決（nacalai tesque）を添加し、室温で 10 分間静置した。PBS定し、閾値以上のシグナル移動度を示す残基をZO1‒PDZ 1

で 1 回洗浄後、透過溶液（0 . 5 % Triton X‒ 100 in PBS）を（PDB : 2 RRM）の立体構造にマッピングし、PyMOLで作図添加し、室温で 5 分間静置した。その後、PBS‒t（0 . 1 %した。マッピングの結果、CLD 結合ポケット部位にマッピン

Tween 20 in PBS）で 3 回洗浄後、ブロッキング溶液（2 %グが集中し、さらに HSQC スペクトルでシグナルの移動が見

BSA in PBS‒t）を加え、1 時間インキュベートした。ブロ

られた化合物に関して、相互作用があったと定義した。測定

ッキング溶液で希釈した 100 µL の一次抗体の上に固定しはBruker社AvanceⅢ 600 MHzデジタルNMR装置を用いた。

た細胞面を下にしてカバーガラスをかぶせ、4 ℃で一晩イ√

Δδ= （δHcom – δH free）2 +（ンキュベートした。翌日、カバーガラスを回収し、TBS‒t

δNcom – δNfree 2）
6

で 3 回洗浄した。その後、ブロッキング溶液で希釈した

ここで、δHcom, δH free, δNcom, δNfree はそれぞれ化合物混合100 µL の二次抗体の上に固定した細胞面が下になるよう時（com）または d 6 –DMSO 添加時、つまり化合物なし（free）にカバーガラスをかぶせ、室温、遮光条件で 1 時間インの水素軸（H）または窒素軸（N）の化学シフト値を示している。

キュベートした。TBS‒t で 3 回洗浄後、封入剤 40 µL を

− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

スライドガラスの上に滴下し、その上にカバーガラスをかぶせ、封入した。これらのサンプルは倒立顕微鏡 IX 71（OLYMPUS 社）を用いて顕微鏡観察した。なお、露光時
間は 1 / 100 秒で固定した。
一次抗体
・Rabbit anti‒Claudin‒ 2 antibody（Sigma‒Aldrich）
1 / 200 希釈
二次抗体
・Anti‒Rabbit IgG, F（ab’）2 flagment‒Cy 3 antibody（Sigma‒Aldrich）1 / 1000 希釈

3. 結

果

3 . 1. グリシルリチンは ZO1‒PDZ1と強く特異的に相互作用する
NMR 滴定実験を行った結果、グリシルリチン（GRZ）の添加により ZO 1 ‒PDZ 1 の CLD 結合ポケット周辺の残基に大きな化学シフト変化を観測した（図 3 B）
。GRZ との相互作用の着想の発端となった FUS（図 3 A）と化学シフ
ト移動の度合いを、残基あたりで標準化した平均化学シ
フト変化で比較したところ 0 . 026 ppm（GRZ）に対して
0 . 004 ppm とほぼ 6 倍の移動度の変化であった。またこの値は、我々のグループで既に発見している合成の ZO 1 ‒PDZ 1 阻 害 剤 で あ る NPL‒ 3013 の 平 均 化 学 シ フ ト 変 化（0 . 013 ppm）に較べても大きかった（data not shown）。別の実験により NPL‒ 3013 と ZO 1 ‒PDZ 1 の解離定数（Kd）
はおよそ 60 µM 程度であることがわかっている。ここから概算すると GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の Kd は、30 µM かそれ
よりも小さいであろうと予想された。
GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の分子認識機構をより詳細に検討するために、GRZ 分子内に含まれる２つのカルボキシルグ
ループに着目した。これは PDZ ドメインがもともとタン
パク質の C 末端カルボキシルグループを認識するドメイン
であり、また、ZO 1 ‒PDZ 1 に既に結合することがわかっているすべての分子（ジクロフェナク・フルフェナミン酸・
フシジン酸および NPL‒ 3013）がカルボキシル基を有しているからである。そこで GRZ のアグリコンであるグリチ
ルレチック酸（GA）と ZO 1 ‒PDZ 1 の相互作用を調べたところ、顕著な結合が見られなかった（図 3 C）
。このことから、GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の相互作用には、GRZ 糖部グルク
ロン酸のカルボキシル基が重要な役割を担っている可能性が示唆された。参考までに、ドッキングソフト GOLD により予測された、FUS と GRZ の ZO 1 ‒PDZ 1 複合体の立体構造モデルを示す（図 3 D, E）。GRZ のテルペノイド部分

図 3 テル ペン 類 化 合 物と ZO1–PDZ1 の 相 互作 用。A 〜 C,
NMR 滴定実験、A, FUS；B, GRZ；C, GA。D, E はドッキン
グソフト GOLD により予測された複合体のモデル図

が PDZ ドメインの溝を覆い隠すように結合しているモデルが得られた。今後、更に詳細に検証する予定である。

MDCK II 細胞を処理した際に、TJ の減弱効果が見られる

こ の よ う に GRZ は ZO 1 ‒PDZ 1 に 結 合 す る た め、 もはずである。他方、GRZ や GRZ を多く含む植物であるカ

し、細胞内で ZO 1 ‒PDZ 1 の機能を阻害するなら、例えばンゾウには、粘膜細胞の保護機能が知られており、これは− 140 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

TJ の機能強化を介している可能性がある。今回、MDCK

クロン酸以外の、化学シフトが変化した化合物（バイカリ

II 細胞の TJ に対する GRZ の効果を調べたところ、当初はン、バイカレイン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、シアニ

わずかながら TJ の強化が観察されたが、実験の再現性はジンクロライド、デルフィニジンクロライド、グリシルリ

得られなかった。他方、MDCK II 細胞を GA に曝露したチン）に関して、ZO 1 ‒PDZ 1 の α 2 へリックスと β 2 シート

ところ、細胞毒性が観察された 。

の間にある CLD 結合ポケットに特異的に結合することが示された。以上の結果を表１にまとめる。また、後述する

3 . 2 . フラボノイドからのZO1‒PDZ1 に相互作用する化合物の探索

ように、TJ に影響を与えた３つのフラボノイド、バイカ
リン、バイカレイン、ナリンゲニンについて、NMR 化学

NMR 滴定実験により、化合物の ZO 1 ‒PDZ 1 への相互シフト変化を ZO 1 ‒PDZ 1 ドメインの残基ごとに図示した作用能を評価した。化合物はバイカリン、バイカレイン

グラフならびに立体構造に結合部位をマッピングした図をの構造に似たフラボノイドを全 13 種類選定した。ZO 1 ‒示す（図 4 A 〜 4 C）。

1

15

PDZ 1 溶 液 に 対 し、2 当 量 の 化 合 物 を 添 加 し て H‒ N
HSQC スペクトルを測定した。その結果、バイカリン、バ3 . 3 . オウゴン由来フラボノイドによるTJ 緩和効果

イカレイン、ヘスペレチンを添加したときにシグナルの

前述の NMR 実験で顕著な化学シフト変化をもたらした

化学シフトが変化した。また、ヲゴニン、クリシン、（–）–

フラボノイドのうち、オウゴン由来フラボノイドである

エピカテキンはタンパク質溶液を添加した際に沈殿が生じ

バイカリン、バイカレイン、ヲゴニンについて、MDCKた。シグナルは観測できたが、シグナルの化学シフトの変II 細胞に曝露し、TJ への影響を調べた。具体的には、化化は観測できなかった（data not shown）。D‒ グルクロン

合物（100 µM）で 48 時間曝露後に細胞を固定し、CLD‒ 2酸、 ナリンゲニン、 シアニジンクロライド、デルフィニジ

抗体を用いた免疫染色実験により、TJ の変化を観察した。

ンクロライドでは 2 当量の添加でわずかなシグナル変化がContorol では細胞膜に CLD‒ 2 が局在する様子が観察され観測された。そのため、化合物の濃度を 10 当量に変更し、たが、バイカリン、バイカレイン曝露では CLD‒ 2 の消失

1H‒ N HSQC を測定し直したところ、10 当量ではシグナが観察された（図 5 A 〜 C）
。ヲゴニン曝露でも CLD‒ 2 のルの化学シフトが変化した（表１）。その他の化合物ではシ消失が観察されたが、同時に細胞毒性も観察され、細胞グナルの化学シフト変化は観測できなかった 。

の培養ディッシュへの接着も不十分であったため、純粋な15

ZO 1 ‒PDZ 1 における化合物の結合部位を決定するため

TJ による影響ではないと考えた（data not shown）。

に、化合物を添加した際に化学シフトが変化した残基（閾前述の NMR 滴定実験をさらに精密に行ったところ、値以上のシグナル移動度を示した残基）を同定し、ZO 1 ‒ZO 1 ‒PDZ 1 と バ イ カ リ ン の 解 離 定 数 は お よ そ 1 . 8 mM

PDZ 1 の結晶構造にマッピングした。その結果、D‒ グルと試算された。細胞内への化合物の吸収を考えると、

表1

フラボノイドによる ZO1-PDZ1/LNX1-PDZ2 の NMR 滴定実験のまとめ− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 4 フラボノイドとZO1‒PDZ1の相互作用のNMR 滴定実験による確認（左）と立体構造へのマッピング（右）。A, Baicalin, 2 eq., B, Baicalein, 2 eq., C, Naringenin, 10 eq.

100 µM 濃度での TJ 緩和活性は、ZO 1 ‒PDZ 1 阻害のメカ

なかった一方で、ナリンゲニン曝露後 48 時間で CLD‒ 2 がニズムでは説明しづらい。先行研究によると、岐阜薬科大学

細胞膜に集積し、細胞境界線がはっきりした様子が観察さの五十里らが、MEK/ERK 経路の活性化によって MDCKれた（図 5 J 〜 K）。このナリンゲニンによる TJ 強化はヒト

8）II細胞でCLD‒ 2 が減少したことを報告していた 。そこで、小腸細胞である Caco– 2 細胞でも報告されているが MDCKMEK 1 阻害剤である U 0126 を用いて、バイカリン、バイII 細胞での観察は今回が初めてである 9）。ナリンゲニンに

カレインによる TJ 減弱化が MEK/ERK 経路の活性化によ

よる TJ 強化は、異なる由来の上皮細胞でも普遍的である

るものかどうかについて検討した。その結果、U 0126 を可能性がある。今後、より化粧品への応用に近い、皮膚用いても CLD‒ 2 の減少は回復しなかった（図 5 D 〜 I）。こTJ に対するバリア機能強化の可能性について調べていきの結果は、バイカリン、バイカレインによる TJ 緩和機構

たい。

を解明する上で、重要な足掛かりとなるものと考えられる。

3 . 4 . ナリンゲニンによるTJ 強化効果の発見

4. 考

察

グリチルリチンおよびいくつかのフラボノイドには、腸グレープフルーツなどの柑橘類に含まれるナリンゲニ

管などの粘膜の保護機能や、小腸バリアの強化機能など

ン、ヘスペレチンが ZO 1 ‒PDZ 1 に弱いながら結合したたが知られている。筆者らは既に、LNX 1 ‒PDZ 2 の特異的め、TJ に対する薬理作用をより詳細に調べることにした。

阻害剤である NPL‒ 1011 と、ZO 1 ‒PDZ 1 の阻害剤である

CLD‒ 2 抗体を用いた免疫染色実験により、TJ への影響を

NPL‒ 3004 , NPL‒ 3013 を発見しており、これらの化合物

さらに評価した。ヘスペレチンでは TJ の変化は観察されにより MDCK II 細胞の TJ の強化と減弱をそれぞれ観察し− 142 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

図 5 フラボノイドおよび MEK/ERK 阻害剤 U0126 の MDCK II 細胞の CLD2 局在への影響。A, DMSO
のみ（control）；B, Baicalin（100µM）；C, Baicalein（100µM）; D, DMSO のみ（control）; E, Baicalin（100µM）; F, Baicalin（100µM）+ U0126（5µM）;G, U0126（5µM）; H, Baicalein（50µM）; I,
Baicalein（50µM）+ U0126（5µM）; A, DMSO の み（control）， 再 掲 ; J, Hesperetin（100µM）; K,
Naringenin（100µM），scale bar = 20µm。

ている（論文投稿準備中）。今回、グリチルリチンおよび４

めて低いと考えられる。そのため、細胞外部からの投与で種のフラボノイドと ZO 1 ‒PDZ 1 の直接相互作用を NMR

TJ が変化しなかったと考察した。他方、グリチルレチッにより観察した。そのうち、細胞内で ZO 1 ‒PDZ 1 を阻害

ク酸は ZO 1 ‒PDZ 1 には相互作用しなかったため、少なくすることと矛盾しない TJ 制御効果を示したのはバイカリ

とも 3 位のグルクロン酸は ZO 1 ‒PDZ 1 結合に必須と考え

ン、バイカレインであった。

られる。例えばグリチルレチン酸 3 ‒O‒ グルコニドは、ググリチルリチンによる MDCK II 細胞の効果は、当初はTJ 強化機能であると考えられたがその変化は小さく、実リチルリチンよりも糖が一残基分小さいので、何らかの
TJ 活性を示すかもしれないと予想している。

験の再現性がなかった。グリチルリチンの分子量ならびに

今回 TJ 緩和効果を示した 2 種のフラボノイド・バイカ

極性官能基の数を考えると、いわゆるリピンスキー則からリン、バイカレインについて、その薬理作用について文外れるため、細胞膜と透過して細胞内へ移行する効率は極献検索を行ったところ、すべてが TJ ないし臓器のバリア− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

機能を強化または保護する機能であり、TJ 緩和効果を記した文献はなかった。文献10）にはバイカリンのバリア保護機能の報告の一例をあげる。他方、rat に対する高濃度剤及び該制御剤を含む医薬組成物」、発明者：廣明秀一、
天野剛志、中倉由香子、野田翔太、出願日：2015/7/22（再表）の Baicalin 投与が TGFβ 経路を介して、腎臓の線維化を促

5） 特願 2017‒520717 「タイトジャンクションの緩和剤、進するという副作用の報告があり（文献）、これは EMT を

該緩和剤を含む薬剤吸収補助剤、及び該緩和剤を含む示唆するため、変性の途中で TJ の減弱・分解を含んでい

医薬組成物」、発明者：廣明秀一、天野剛志、野田翔太、る可能性がある。ZO 1 ‒PDZ 1 との結合の弱さから考えて、

出願日：2016/5/24（再表）バイカリン、バイカレインの TJ 減弱効果は ZO 1 ‒PDZ 1

6） Tenno, T., Goda, N., Umetsu, Y., Furuse, M., Ota, M.,

阻害以外の何らかのシグナル伝達系を介していることは間Kinoshita, K., and Hiroaki, H*. Accidental interaction

違いなく、その候補として TGFβ 経路の活性化があげられ

between PDZ domains and diclofenac revealed

る。

by NMR–guided virtual screening. Molecules. 1 8,

他方、今回 TJ 強化を示した Naringenin については、TJ

9567‒9581, 2013.

バリア機能を強化するシグナル伝達系である AMPK を活

7） Tang W, Sun X, Fang JS, Zhang M, Sucher NJ:

性化することを示唆する報告があり、MDCK II 細胞の TJ

Flavonoids from Radix Scutellariae as potential

強化においても同様の機構であると考えられる。その場合、stroke therapeutic agents by targeting the second

フラボノイド分子の作用点がどこか、については、更なる

postsynaptic density 9 5（PSD‒9 5）/disc large/zonula

研究が必要である。今後、柑橘系に含まれる他のフラボノ

occludens‒1（PDZ）domain of PSD‒95., Phytomedicine.

イドとの比較や、AMPK 経路の活性化の確認などを行い

11, 277‒284, 2004.

つつ、皮膚バリア機能強化のための有望な成分として研究

8） Ikari A, Takiguchi A, Atomi K, Sugatani J*:を続ける予定である。筆者らが既に見だしている LNX 1

Epidermal growth factor increases clathrin‒dependentを阻害することによる TJ 強化と、相乗効果が期待できる

endocytosis and degradation of claudin‒2 protein in

かどうかなど、精査したい。

MDCK II cells. J Cell Physiol., 226, 2448‒2456, 2011.

最後に、本研究を遂行するにあたり、ご支援いただきま

9） Noda S, Tanabe S, Suzuki T*: Naringenin enhances

した財団法人コスメトロジー研究振興財団に心より感謝いintestinal barrier function through the expression and

たします。

cytoskeletal association of tight junction protein in（引用文献）

10）Chen J, Zhang R, Wang J, Yu P, Liu Q, Zeng D, Song H,

Caco–2 cells. Mol. Nutr. Food Res. 57, 2019‒2028, 2013.
1） Takahashi S, Iwamoto N, Sasaki H, Ohashi M, Oda

Kuang Z: Protective effects of baicalin on LPS‒induced

Y, Tsukita S, Furuse M*: The E3 ubiquitin ligase

injury in intestinal epithelial cells and intercellular

LNX1p80 promotes the removal of claudins from tighttight junctions. Can J Physiol Pharmacol., 93 , 233 ‒ 237 ,junctions in MDCK cells., J Cell Sci, 122, 985‒994, 2009.

2015 .

2） Umetsu Y, Goda N, Taniguchi R, Satomura K,
1

Ikegami T, Furuse M, Hiroaki H*: H,

13

C, and15N11）Cai Y, Ma W, Xiao Y, Wu B, Li X, Liu F, Qiu J, Zhang
G: High doses of baicalin induces kidney injury andresonance assignment of the first PDZ domain offibrosis through regulating TGF‒β/Smad signaling

mouse ZO–1., Biomol NMR Assign. 5, 207‒210, 2011.

pathway. Toxicol Appl Pharmacol. 333 , 1 ‒ 9 , 2017 .

3） Hiroaki H*, Satomura K, Goda N, Nakakura Y,12）Liu X, Wang N, Fan S, Zheng X, Yang Y, Zhu

Hiranuma M, Tenno T, Hamada D, Ikegami T:

Y, Lu Y, Chen Q, Zhou H, Zheng J: The citrus

Spatial Overlap of Claudin‒ and Phosphatidylinositol

flavonoid naringenin confers protection in a murine

Phosphate‒Binding Sites on the First PDZ Domain ofendotoxaemia model through AMPK‒ATF 3 ‒Zonula Occludens 1 Studied by NMR., Molecules. 2 3,

dependent negative regulation of the TLR 4 signalling

E2465, 2018.

pathway. Sci Rep., 6 , 39735 , 2016 .

4） 特願 2016‒535943 「タイトジャンクション形成制御− 144 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成
岩手大学理工学部細胞工学・分子遺伝学研究室

福田智一

The Draize test has been used on rabbits since the 1960 s to evaluate the irritation caused by commercial chemicals
in products such as cosmetics or hairdressings. However, since 2003 , such tests, including the Draize test for cosmetics,
have been prohibited in European countries because they are considered problematic to animal welfare. For this reason,
replacement of in vivo methods with alternative in vitro methods has become an important goal. In this study, we establisheda corneal epithelial cell line co-expressing a mutant cyclin dependent kinase 4 (CDK 4 ), Cyclin D 1 , and telomerase reverse
transcriptase (TERT). The established cell line maintained its original morphology, and had an enhanced proliferation rate.
Furthermore, the cells showed a significant, dose-dependent, decrease in viability in an irritation test using glycolic acid.
These cells can now be shared with toxicology scientists, and should contribute to increasing the reproducibility of chemical
testing in vitro.

1. 緒

性試験の材料として利用できないかと考えた。しかし初代

言

培養細胞は数回の細胞継代の後に細胞分裂を培養ストレス

刺激性を含む化学物質の安全性を評価することは、化粧品および身の回りのシャンプーなどの生活用品を開発する上で重要な項目である。1960 年代より、様々な刺激性
1）のために停止してしまう。無限に細胞分裂できないことは
ヘイフリック限界と呼ばれている 3）。
細胞老化による分裂停止の限界を乗り越えるために様々を評価する方法が考案されてきた 。これらの方法のうち、な方法が従来用いられてきた。具体的には SV 40 ラージ T

ウサギを用いたドレイズ法は事実上の標準手法であった。

やヒトパピローマウィルス由来の E 6 /E 7 遺伝子産物であしかし 2003 年より欧州ではあらゆる化粧品の安全性試験

る。これらの癌遺伝子産物は腫瘍抑制遺伝子である p 53

においてドレイズ法を含む動物実験が禁止されている。こや RB を不活性化することが知られており、無限分裂させれらの動物実験の禁止は動物愛護の観点から実施されたもる方法として最も一般的である 4）。しかしこれらの SV 40のである。したがって眼を用いた動物の刺激性試験を代替

ラージ T や E 6 /E 7 遺伝子の発現は染色体の異常を誘発すする評価法を考案することは科学的および動物愛護の観点

ることが知られている 5 , 6）。

から重要な課題である。

2011 年に新たな無限分裂の方法が報告された。塩見ら

角膜上皮細胞は眼球組織の最も外側に存在する上皮細胞によると R 24 C 変異を持つサイクリン依存性キナーゼ 4であり、外界からの物質の侵入を防御している。刺激性に（CDK 4），サイクリン D 1，テロメア逆転写酵素（TERT）

よって最初に暴露されるのが組織の特性上、角膜上皮細胞の発現によってヒト筋肉由来細胞の無限分裂が可能になっであり、このことから角膜上皮細胞で試験管内刺激性試験た 7）。これらの細胞は分化能力および元の染色体パターンを実施することは必然性がある。この考えのもとに、ウサを維持していた。この方法は導入する遺伝子の末尾の文字

ギの初代角膜上皮細胞を用いて短期暴露法（STE 法）が開から、K 4 DT 法（変異型 CDK 4 , サイクリン D, TERT）と発された 2）。この方法はウサギの角膜上皮細胞へ被験物質

名付けられた。さらに我々の研究チームは新規に作られたを短時間暴露し、細胞死の割合で刺激性を判定する。しかK 4 DT 法がウシ、ブタ 8）、スイギュウ 9）、サル 10）、アメリ

しこれらの細胞であったとしても、ウサギはウサギであり、

カ平原ハタネズミ 11）を含む様々な動物種で適用可能であ人間とは本質的に異なる。このためにウサギの眼のデータることを示した 12）。この幅広い動物で使用可能である原はあくまでヒトの眼のモデルであり限界がある。このこと

理として、導入する CDK 4 およびサイクリン D 1 遺伝子のから我々はヒト由来角膜上皮細胞によって試験管内の刺激

アミノ酸配列が進化の上で高い保存性を持つことが予想された 12）。本研究ではヒト角膜上皮由来の無限分裂細胞がHuman-derived Corneal Epithelial Cells
Expressing Cell Cycle Regulators as a
New Resource for in vitro Ocular Toxicity
Testing

従来の動物を用いた刺激性試験の代換えになると予想される。本研究は毒性研究ならびに動物愛護の見地から見て重要な研究である。

Tomokazu Fukuda
G r a du a t e S c h o o l o f S c i e n c e a ndEngineering, Iwate University− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

2. 方

は LAS 4000 mini で取得した。

法

2 . 1. 細胞およびその培養法

2 . 4 . Population doubling assay

ヒト角膜 上皮細胞は米国 Lifeline Cell Technology 社か

初代および K 4 D, K 4 DT+T 細胞における細胞増殖活性らクラボウ株 式会社を通じて購入した。培養には Lifelineを測定するために、連続的な細胞継代を行った。詳細にはCell Technology 社が提供する基礎培地および増殖因子を各継代開始時に 5 ×104 細胞を 3 つの 35 mm dish へ播種し使用した。細胞の継代には 1 XPBS にて洗浄し、Stem Pro

た。その後、どれかのウェルがコンフルエントになった

Accutase によって細胞を剥離、分散を行った。剥離、分散

時点で全てのウェルの細胞を accutase 処理し、剥離した。

した細胞は 800 G, 5 分間遠心を行い、ペレット化した後に全てのウェルに存在した細胞数を計測した。測定した細胞新しい培地によって再度分散を行った。

数から PDL 値を算出した。PDL=log 2（A/B）の式に基づいた。B は各パッセージの最初に播種した細胞数、A は各

2 . 2 . レンチウィルスの作製および感染

パッセージの終わりに得られた細胞数である。それらの新規に無限分裂するヒト角膜由来上皮細胞を作製するため

PDL 値を累積として計算した。

に組み換えレンチウィルスの作製および濃縮を行った。組み
換えレンチウィルスの基本骨格として理化学研究所バイオリ

2 . 5 . PCR 解析

ソースセンターの三好博士より分与いただいた CSIIレンチウ

初代ヒト角膜上皮細胞、K 4 D および K 4 DT+T 細胞よィルスベクターを用いた。感染効率をモニタリングするために、りゲノム DNA を抽出した。導入した遺伝子内に設定した発現ベクターのオープンリーディングフレームの下流に IRES

プライマー配列もしくは、ヒト由来結節性硬化症原因遺（Internal Ribosomal Entry Sites）および Venus 蛍光タン

伝子（TSC 2）のエクソン内に設定したプライマー配列をコ

パク質を持つ CSII‒CMV‒MCS‒IRES‒Venus ベクターを使ントロールとして使用した。TSC 2 遺伝子はヒトゲノム上用した。CSII‒CMV‒MCS‒IRES‒Venus のマルチプルクロに 2 コピーしか存在せず、類縁した遺伝子が存在しないこーニングサイトへ変異型 CDK 4 およびサイクリン D のタンパと、偽遺伝子が存在しないことが知られていることから内ク質翻訳領域を 2 A自己消化ペプチドで連結したインサート

部コントロールとして使用した。増幅には東洋紡の KOD‒を挿入した。また、CSII‒CMV‒R 24 CCDK 4 および CSII‒

FX および特異的プライマーを用いて増幅を行った。PCRCMV‒CyclinD、そしてCSII‒CMV‒TERT の３種の遺伝子

産物は分子量マーカーとともに 1 % アガロースゲルにて電をモノシストロニックに発現するレンチウィルスを混合した混気泳動し、エチジウムブロマイドによって検出した。

合組み換えウィルス溶液を作製した。ウィルス作製は 293 T
細胞へのリポフェクション法で行い、詳細に関しては我々の

2 . 6 . F‒アクチンの染色13）

過去の研究報告に準拠した 。TERTを発現するレンチウィ

野 生 型、K 4 D お よ び K 4 DT+T 細 胞 を Lab‒Tek チ ャルスはその他の CDK 4 およびサイクリンD1 を発現するレンチ

ンバースライド中に細胞形態を確認するために播種した。

ウィルスと比較して、4 kbと長いインサートサイズを持つため

4 % パラフォルムアルデヒドで固定後、0 . 2 % Triton ×にレンチウイルスのタイターが低くなる。このためにK4 DT 細100 溶液にてパーミアビライズ処理した後に F アクチンを胞へ追加でハイグロマイシン耐性遺伝子を持つTERT発現レ染色するために 1 / 40 希釈したローダミン標識したファロ

トロウィルスを重感染させ、ハイグロマイシン耐性の K 4 DT

イジン染色によって染色した。核染色を 1 / 300 希釈した細胞をK 4 DT+Tと表記した 14）。

DAPI 溶液を用いて行った。観察はキーエンス社の蛍光顕微鏡 BZ 9000 にて実施した。

2 . 3 . ウェスタンブロッティング
野生型、K 4 D および K 4 DT+T 細胞よりタンパク質を

2 . 7. 細胞周期解析

可溶化させるために、我々は 50 mM Tris‒HCl（pH 7 . 4），

細胞周期解析を行うため、おおよそ 4×105 細胞の野生0 . 15 M NaCl, 1 % Triton X‒100 , 2 . 5 mg/mL の デ オ キ シ型、K 4 D および K 4 DT 細胞を 70 % エタノールにて固定しコール酸を含む溶液を使用した。CDK 4 およびサイクリ

た。野生型、K 4 D および K 4 DT について６回分の細胞かン D 1 のタンパク質レベルを検出するために、それぞれにらデータを得た。固定した細胞は Millipore 社の cell cycle

対する特異的抗体を使用した。またコントロールとして抗assay kit を 用 い て 染 色 を 行 っ た。 検 出 は Millipore 社 のtubulin 抗体を用いて検出した。全ての検出において二次Muse Cell Analyzer を用いた。検出結果はノンパラメト

抗体として anti‒mouse IgG もしくは anti‒rabbit IgG を使

リック法の多重比較である Steel 法を用いて有意差を検出用した。詳細な検出条件は過去に我々の研究室から発表し

した。

14）

た論文の内容に準拠した 。検出は化学発光で行い、画像− 146 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成

2 . 8 . 刺激性試験

K 4 DT 細胞においてのみ、TERT 遺伝子の挿入が認めら

高橋らによって開発された短時間暴露法（STE 法）をれた。

用いて試験管内の暴露を行った 。我々はグリコール酸

Figure 2 A に遺伝子導入後の細胞の形態を示す。変異型を陽性対象物質として用いた。初代培養細胞もしくはCDK 4 およびサイクリン D 1、TERT の導入は細胞形態のK 4 DT+T 細胞に関して、0 . 5 % もしくは 5 % のグリコール変化を認めなかった。さらに詳細な細胞骨格の変化の可能

酸を５分間暴露した。PBS を陰性対象として用いた。PBS性を考慮し、細胞骨格の主要要素である F‒ アクチン染色にて２回洗浄後、アキュターゼにて剥離した。剥離した細を行った。結果を Figure 2 B に示す。その結果、野生型角胞をトリパンブルーによって染色、生存細胞数、総細胞数

膜上皮細胞と比較して有意な F アクチンの分布変化は認めを算出した。細胞生存率は総細胞数における生存細胞数にられなかった。

2）

Figure 3 A に 連 続 的 な 細 胞 継 代 を 行 っ た 結 果 を 示

よって算出した。

3. 結す。野生型細胞は継代１回にて細胞増殖を停止した一方、

果

K 4 DT+T 細胞は PD 20 を超える細胞増殖を示した。さら無限分裂するヒト由来角膜上皮細胞を作製するために、に K 4 D 細胞はおおよそ３回目の継代において細胞増殖をポリシストロニックに変異型 CDK 4 およびサイクリン停止した。Figure 3 B に継代１回目の細胞形態の様子を示

D 1 を発現するレンチウィルス（CSII‒CMV‒CDK 4 R 24 C‒

す。野生型はほとんど細胞増殖を停止しているが、K 4 D

Cyclin D‒IRES‒Venus）およびモノシストロニックに発現するおよび K 4 DT+T 細胞は継続的に細胞増殖していることがレンチウィルスの混合溶液（CSII‒CMV‒CDK4 R 24 C, CSII‒わかる。興味深いことに継代３回目において K 4 D 細胞の

CMV‒CyclinD, CSII‒CMV‒TERT）を用いた。Figure 1 A

一部において上皮から間葉系の細胞への形態変化が認めらに導入したレンチウィルスの遺伝子構造を示す。K 4 DT

れた（Figure 3 C and D）。

の混合レンチウィルスを感染させた後に、前述したように

次に継代１回目の細胞において細胞周期に対する

TERT のウィルスのタイターが比較的低いために、ハイ

CDK 4 , サイクリン D 1 および TERT の発現の影響を評価

グロマイシン耐性遺伝子を持つ TERT の発現レトロウィ

した。Figure 4 A, B, C に示すように細胞周期の解析結果

ルスベクターの追加感染を行った。Figure 1 B に PCR 法を示した。G 0 /G 1 , G 2 /M, S 期の細胞を異なる色で示した。

によるゲノム状の TERT の挿入遺伝子の検出結果を示す。

K 4 D および K 4 DT 細胞において G 2 /M 期の細胞割合の増加と G 0 /G 1 期の細胞の統計学的に有意な減少が野生型細Figure 1 Schematic representation of the different expression vectors used inthis study, and confirmation of genomic integration and protein expression.
（A）
Structure of the expression vectors used to establish the K4D and K4DT+T
cell lines. LTR; long terminal repeat, CMV; cytomegalovirus promoter, Hygro;
Hygromycin resistant gene.（B）Confirmation of the genomic integration of
the TERT expression cassette by PCR: 1; primary cells, 2; K4D cells, 3;
K4DT+T cells. The upper panel shows the specific 500 bp PCR productconfirming the presence of the TERT expression cassette, whereas thelower panel shows the 400 bp PCR product derived from the human
Tuberous Sclerosis Type II gene.（C）Detection of the introduced genes atthe protein level by western blot analysis: 1; primary cells, 2; K4D cells, 3;
K4DT+T cells. Western blots using anti‒CDK4（upper panel）, anti‒Cyclin D（middle panel）, and anti‒tubulin（lower panel）antibodies are shown.

− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Figure 2 Cell morphology of primary, K4D, and K4DT+T
c ells .（ A ） C ell m o r p h o lo g y u si n g p h a s e c o nt ra s t
microscopy at passage 0.（B）Morphological observationof the cytoskeleton（F–actin）and the nucleus, following
staining with rhodamine–labelled phalloidin and DAPI,
respectively. Left–hand panel, EGFP fluorescence, middle
panel, phalloidin staining, right–hand panel, merged imagesof the phalloidin, DAPI, and EGFP stains.

Figure 3 Cell growth status and morphological observationof primary, K4D, and K4DT+T cells.（A）Cell growth andsequential passaging of primary, K4D, and K4DT+T cell.
Cell growth is represented by the cumulative population
doubling value.（B）Morphological observation at passage
1 in the population doubling assay.（C）Cell morphology of
K4D and K4DT+T cells at passage 3. Upper panels, lower
magnification of K4D（left–hand panels）and K4DT+T cells（right–hand panels）． Lower panels, higher magnificationof K4D cells（left–hand panels）and K4DT+T cell（right–
hand panels）．

− 148 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成

Figure 5 Cell morphology and EGFP expression of K4D
cells at passage 3.（ A）K4D cells at passage 3. Cellmorphology by differential interference contrast microscopy（DIC, left–hand panel）, EGFP fluorescence（EGFP,
middle panel）, and merged images（merge, right panel）．
（B）
High magnification view of K4D cells at passage 3 by DIC（left–hand panel）, EGFP fluorescence（EGFP, middle
panel）, and merged images（right–hand panel）．

る。このことから蛍光強度が低下した間葉系細胞においては細胞内の変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 遺伝子の発現量が上皮様形態の細胞と比較して低いと予想される。間葉系の形態を示す細胞の割合は継代数が増加するにつれ増加した。これらの状況からポリシストリロニックに変異型
CDK 4 およびサイクリン D 1 を発現するヒト角膜上皮細胞
は刺激性試験の代換えとして利用するためには安定性に欠けると判断した。
前述したように高橋らはウサギの角膜上皮細胞を利用して短時間暴露法（STE 法）を開発した。これに従って 0 . 5 %および 5 % グリコール酸を用いて野生型および K 4 DT+T
Figure 4 Cell cycle analysis of primary, K4D, and K4DT
cells.（ A）Cell cycle analysis of primary cells.（ B）Cell
cycle analysis of K4D cells.（ C）Cell cycle analysis of
K4DT+T cells.

細胞へ暴露を行い、STE 法によって評価した。Figure 6 Aに示したように野生型および K 4 DT+T 細胞は 0 . 5 % もし
くは 5 % のグリコール酸によって有意に細胞数が低下した。また暴露後の細胞形態では Figure 6 B に示したように細胞質内の空胞化や核の明瞭化を伴い、細胞の変性を示し胞と比較して認められた。これらの結果からヒト角膜上皮ていた。これらの結果から我々の作製したヒト角膜由来の細胞において変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 の発現に

K 4 DT+T 細胞は化学物質の刺激性を判断する上で有用な

よって細胞増殖および細胞回転が加速されていると結論し試験管内検出系になると考えられた。

た。

4. 考

我々は K 4 D 細胞において継代３回目周辺より間葉系細察胞への形態変化が認められた。我々はこの原因を探るた

本研究において我々は新規ヒト角膜由来の無限分裂上めにまず、細胞形態および下流に位置する蛍光タンパク

皮細胞の作製に成功した。作製には変異型 CDK 4、サイク質の発現量を蛍光顕微鏡にて検出を行った。Figure 5 A お

リン D 1 および TERT を用いた。野生型のヒト角膜上皮細よび B に示すように、上皮形態を維持する細胞においては胞は低密度で播種することで１回の細胞継代にも耐えら

EGFP を強く発現していたが、間葉系の細胞形態を示す細れず、細胞分裂を停止した。しかし K 4 DT+T 細胞は低密胞は比較的蛍光強度が弱かった。EGFP と変異型 CDK 4 お度においてもより強い細胞増殖活性を示した。これらのよびサイクリン D 1 の発現カセットは IRES 配列で繋がれK 4 DT+T 細胞の特性は細胞のハンドリングのしやすさをているため、両者の発現量は高い相関を持つと考えられ示しており、再現性の良い試験結果を得る上で有用な性質− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

結合部位である 25 番目のアミノ酸に突然変異を保つために p 16 と結合しないために、p 16 による負の制御を受けることがない 12）。結果的に腫瘍抑制遺伝子蛋白 RB の恒常的リン酸化をもたらし、転写因子 E 2 F の遊離、そして下流の遺伝子の活性化をもたらす。変異型 CDK 4 およびサ
イクリン D 1 の発現は細胞周期の加速をもたらすが、染色体末端のテロメア配列の短縮からは逃れることはできない。
この制限を乗り越えるためにテロメア逆転写酵素（TERT）の発現が必要である。我々が作製した K 4 DT+T 細胞はテ
ロメア発現カセットの導入を確認しているので、無限分裂に至っている可能性が高い。
興味深いことにポリシストロニックに変異型 CDK 4 お
よびサイクリン D 1 を発現するレンチウィルスでは、ヒト
角膜上皮細胞の上皮細胞の形態を維持できず、途中から間葉系の細胞形態を示す変化が認められた。これらの細胞形態の変化は原因として 2 つの可能性がある。1 つめはテロ
メラーゼ活性がないためのテロメア長の短縮である。テロ
メア長の短縮のために細胞増殖が阻害された可能性がある。
もうひとつの可能性は TERT が存在しないため、CMV プ
ロモータの活性が低下したことである。詳細な分子メカニ
ズムは明らかではないが、我々は TERT を同時発現した
際に、CMV プロモータによって発現する変異型 CDK 4 お
よびサイクリン D 1 の蛋白質レベルが明らかに上昇する例を経験した。本研究において認められた間葉系細胞の蛍光
Figure 6 Assessment of glycolic acid（0.5% and 5%）as an
irritant in primary and K4DT+T cells using the short time
exposure（STE）method.（ A）Number of primary and
K4DT cells. The data are expressed as the mean, with theerror bars representing the standard error. Two stars
indicates a statistical significance more than 1%.（B）Cell
morphology of PBS treated（control）primary cells（left–
hand panel）, and 5% glycolic acid treated primary cells（right–hand panel）．
（C）Cell morphology of PBS treated
K4DT+T cells（left–hand panel）and 5% glycolic acidtreated K4DT+T cells（right–hand panel）．

蛋白質の量は上皮様形態を示す細胞のものより明らかに低かった。細胞の上皮様形態を維持するためにはより高いレベルの変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 蛋白質を必要とする可能性がある。
我々は新たなヒト角膜由来上皮細胞の作製の後に、刺激性試験を行った。結果を初代および K 4 DT+T 細胞の間で比較を行った。我々は陽性対象としてグリコール酸を選択した。グリコール酸への曝露は有意かつ容量依存的に生存細胞数の低下を引き起こした。我々の研究データは我々が樹立した K 4 DT+T 細胞が化学物質の刺激性試験に使用できる可能性を示している。無限分裂細胞の使用は刺激性試と考えられる。また初代培養細胞の場合は、比較的短期

験の再現性の向上に貢献すると考えられる。

間で細胞増殖活性を失うために繰り返しサンプリングと4. 考

培養を繰り返さなければならない。このことは試験の再察現性において影響する因子である。一方、我々の作製し我々は変異型 CDK 4、サイクリン D 1 およびテロメア逆た無限分裂細胞は世界中の研究者と研究資産として共有転写酵素の導入により、化粧品を含む様々な化学物質や日化できるため、将来的に標準化のための材料として利用

用品の刺激性を評価する試験管内実験系を構築した。本研できる可能性がある。

究は刺激性試験の再現性の向上へ貢献すると考えられる。

細胞が培養ストレスに晒された場合、p 16 を含む老化蛋
白質が蓄積することが知られている 15）。老化蛋白質 p 16

（引用文献）

は CDK 4 ‒ サイクリン D 1 蛋白質複合体に結合し、キナー

1） Buehler, E . V, and Newman, E . A.（ 1 9 6 4）．A

ゼ活性を抑制する。その結果、細胞周期の G 1 /S 期への突

comparison of eye irritation in monkey and rabbits.

入が抑制される。R 24 C 突然変異を持つ CDK 4 は p 16 のToxicol. Appl. Pharmacol. 6, 7 0 1‒1 0. Available at:− 150 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1 4 2 3 5 8 3 7conservation of endangered midget buffalo（Lowland［Accessed September 3, 2018］．

Anoa, Bubalus quarlesi）by establishment of primary2） Takahashi, Y., Koike, M., Honda, H., Ito, Y.,

cultured cell, and its immortalization with expression

Sakaguchi, H., Suzuki, H., et al.（2 0 0 8）．Developmentof cell cycle regulators. Cytotechnology 68, 1937‒1947.

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00027 ‒ 4 .

創傷治癒過程において、血管網の再構築が表皮幹細胞の分裂制御に果たす役割
神戸学院大学大学院薬学研究科

水谷

健一

Endothelial cells (ECs) form an extensive network of blood vessels that has numerous essential functions in thevertebrate body. In addition to their well-established role as a versatile transport network, blood vessels can induceorgan formation or direct growth and differentiation processes by providing signals in a paracrine (angiocrine) fashion.
ECs are emerging as important signaling centers that coordinate regeneration and help to prevent deregulated, diseasepromoting processes. Vascular cells are also part of stem cell niches and have key roles in hematopoiesis, bone formation,and neurogenesis. Here we established the experimental system to observe vascular networks in skin tissue, and foundthat vascular regularity in the back skin was predominantly disrupted with aging. Furthermore, the wound healing was
significantly delayed in VEGFR- 1 heterozygous knockout mice, suggesting that healing process requires the proper
restoration of vasculature in the skin tissue.

1. 緒

VEGF‒A との結合の強さは VEGFR‒ 1 の方が VEGFR‒ 2

言よりも 10 倍以上強い一方で、チロシンキナーゼ活性につ血管系の発生過程では、脈管形成と呼ばれる、血管内皮

いては、VEGFR‒ 1 は VEGFR‒ 2 に比べて 10 分の１程度

前駆細胞が集合して原始血管叢を形成し、続いて血管新生であることが明らかとなっている。つまり、主要なシグナの過程において、組織構築に伴い低酸素に応答して原始血ル伝達を担うのは VEGFR‒ 2 であり、VEGFR‒ 1 は調節的管叢が無血管領域へと浸潤し、より複雑な毛細血管網を構な役割を果たすことが強く示唆されており、ノックアウト

築する。原始血管叢の発芽領域では、成長中の血管の先端

マウスの解析結果はこれと合致している。また、最近の研に位置する血管内皮細胞が、無数の糸状仮足を無血管領域

究では VEGFR‒ 2 は血管先端内皮細胞や微小血管に優位にに向けて伸展する。この糸状仮足を伸ばす血管内皮細胞を、発現する一方で、VEGFR‒ 1 は中・大動脈内皮細胞に優位

血管先端内皮細胞、その背後から増殖して血管伸長を支えに発現する傾向があることが分かっている。

る血管内皮細胞を血管柄細胞と呼ぶ。血管先端内皮細胞は近年、血管の酸素養分の運搬路という基本的な機能に加無血管領域に発現する血管内皮成長因子（VEGF）の濃度勾

えて、血管によって構築される微小環境（niche）の概念が配に応じて糸状仮足を伸ばしながら遊走し、血管成長の方提唱されており、組織形成の理解において、幹細胞を支持

向性を決定する。一方、血管柄細胞は活発な増殖により後する生物学適所としての血管の役割に注目が集まっている。

続する血管網の細胞数を規定し，両者は可塑性を保ちなが皮膚には、表皮、毛包をそれぞれ生み出す幹細胞が存在し、ら血管網を構築している。こうして形成される血管系を制

肌の恒常性の維持、毛の生え変わり、皮膚損傷の治癒など御するシグナル伝達系に関しては、数多くの研究が行われの役割を担っている。そこで本研究では、皮膚の恒常性のてきた結果、VEGF に加え、アンジオポエチン、エフリン

維持、創傷治癒における細胞外環境としての毛細血管の役

等の諸因子が重要な役割を果たすことが明らかとなってい割を明確化することを目的とした。

る。中でも、VEGF とそのチロシンキナーゼ受容体のシグ

2. 方

ナル伝達系は、生理的血管新生のみならず様々な病態にお法れている。VEGF 受容体の中でも、VEGF‒A は VEGFR‒ 1

2 . 1. 皮膚組織における毛細血管のイメージング技術の確立（Flt‒ 1）と VEGFR‒ 2（KDR/Flk‒ 1）受容体型チロシンキ

組織内の毛細血管を明瞭に観察するためには、薄切切ける血管新生においても中心的な役割を果たすことが知らナーゼを利用し、この２つの受容体には明確な違いがあり、片では断片的な情報しか得られないため、できる限り組織を厚みのある状態で観察すると共に、蛍光免疫染色でInteraction between the capillary-milieu
and the epidermal stem cells regulates
wound healing
Ken-ichi Mizutani
Laboratory of Stem Cell Biology, Graduate
School of Pharmacentical Sciences, Kobe
Gakuin University

はなく高感度で毛細血管を観察する必要がある。このため、VEGFR‒ 1 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 に よ り tDsRed を 発
現するトランスジェニックマウス 1）、および VEGFR‒ 2
プロモーターの制御により GFP を発現するトランスジェニックマウス 2） を用いて背中皮膚組織を採取し、観察した。組織は PBS 中で解剖後、4 % パラホルムアルデヒ− 152 −

創傷治癒過程において、血管網の再構築が表皮幹細胞の分裂制御に果たす役割

ド／ PBS で浸透固定した。固定した組織は、PBS で 2 回

ウスを用いて、若齢期から老齢期における皮膚組織を比較

洗浄後、4 ℃で一晩、30 % スクロース／ PBS 置換を行っし、蛍光蛋白を発現する血管内皮細胞を指標に、加齢に伴た。その後、OTC コンパウンドで包埋し、クライオスタってどのように組織内の密度および分布が変化するかを詳

ットを用いて 100 µm の厚さの凍結切片を作製した。凍結

細に解析した。その結果、若齢期では組織内の血管密度が切片は PBS‒ 0 . 1 %Triton‒X（PBST）で 3 回洗浄後、10 %高く、VEGFR‒ 1 あるいは VEGFR‒ 2 を発現する毛細血管

donkey serum/PBST で室温にて 1 時間ブロッキングをが規則的に毛包に沿って分布することが観察された（Fig.

行い、10 % donkey serum/PBST で希釈した 1 次抗体で、1）。この際、VEGFR‒ 1 を発現する毛細血管、VEGFR‒ 2

4 ˚C で 一 晩 反 応 さ せ た。PBST で 3 回 洗 浄 し た 後、10 %を発現する毛細血管、両者を発現する毛細血管が各々存在

donkey serum/PBST で希釈した 2 次抗体で、室温で 1 時

し、皮膚組織内を構成する毛細血管が極めてヘテロな集団

間反応させ、PBST で 3 回洗浄後にマウントして観察標本であることが示唆された。一方、老齢になると組織内の毛3）を作成した 。これらの組織切片の観察は、蛍光顕微鏡

細血管の分布が大きく損なわれ、VEGFR‒ 1 を発現する毛IX 81（Olympus）およびコンフォーカル顕微鏡 FV 1000

細血管においても、VEGFR‒ 2 を発現する毛細血管におい（Olympus）
にて行った。

ても何れも組織内の密度が顕著に減少し（Fig. 1）老齢期では無血管な領域も観察された。こうした老齢期における毛2 . 2 . VEGFR‒1 ヘテロノックアウトマウスにおける創傷治癒の解析

細血管の分布異常は、組織内に本来適切に供給されるべき

生後 40 日の VEGFR‒ 1 ヘテロノックアウトマウス 4）およって組織幹細胞が担う様々な生理現象への影響が懸念さよびワイルドタイプマウスを麻酔し、背部に直径 6 mm の

酸素、栄養分が枯渇するばかりでなく、微小環境の破綻にれる。

円形皮膚全層欠損創を皮膚生検トレパン（KAI STERILE

そこで次に、組織内の血管密度が破綻した VEGFR‒ 1 ヘ

DISPOSABLE BIOPSY PUNCHES 口径 6 mm、カイイン

テロ欠損マウスを用いて、創傷後の治癒過程を評価するこダストリー㈱）を用いて作製し、治癒するまでの創傷部をとで、毛細血管の規則的な分布が新生皮膚組織の再構築に

経時的に観察することで完治するまでの日数を評価した。

果たす役割を解析した（Fig. 2）。その結果、VEGFR‒ 1 ヘ

3. 結

テロ欠損マウスでは、ワイルドタイプと比較して、創傷治

果癒が優位に遅延することが確認された（Fig. 2）。現時点で皮膚は老化に伴って表皮や真皮の菲薄化、細胞外マトリは、皮膚の恒常性の破綻と周囲の組織幹細胞の関連性につックスの減少等の組織学的な加齢変化が顕著であること

いては評価できていなが、VEGFR‒ 1 ヘテロ欠損の治癒過が指摘されているが、皮膚を構成する毛細血管の加齢変程では新生血管の遊走や浸潤、周囲の組織幹細胞との物理化については不明な点が多い。そこで本研究では皮膚組的な接触がいかに変化し、結果的に組織の再構築にどのよ

織における毛細血管の規則性と老化に伴う組織学的な変うな影響を及ぼすかについて、現在、解析を進めている。

化を見出すことを目的として、皮膚組織内の毛細血管が本研究課題の成果がさらに発展することで、創傷治癒にお明瞭に観察できる実験系の構築を先ず行った。具体的にける血管新生と組織幹細胞の分化制御の関連性が明確化さは、VEGFR‒ 1 ‒EGFP および VEGFR‒ 2 ‒DsRed BACtg マ

れ、これが様々な組織修復の基盤技術に応用されることがFig. 1

血管リポーターマウスを用いた皮膚組織における毛細血管の加齢変化− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 2VEGFR–1 ヘテロ欠損マウスにおける創傷治癒の解析

いられている 6）。今後、創傷治癒における血管新生と組織期待される。

4. 考

幹細胞の関連性がさらに明確化され、これが様々な組織修察復に応用されることが期待される。

血管は組織細部にわたり栄養分や酸素を運搬する極めて重要な器官の一つであり、一定の組織空間に規則的に分布（引用文献）する。血管が空間に如何に伸展し、その進展を止めるの

1） Matsumoto, K., Azami, T., Otsu, A., Takase, H.,

かという、血管発生を調節する分子機構は未だ未解明のIshitobi, H., Tanaka, J., Miwa, Y., Takahashi, S. & Ema,問題が数多く残されており、最近の研究では、組織・臓器

M. Study of normal and pathological blood vessel

ごとに血管発生・新生を制御する分子機構が大きく異なmorphogenesis in Flt1‒tdsRed BAC Tg mice. Genesis

り、こうした血管内皮細胞の不均一性が、組織・臓器ごと

50, 561‒71（2012）．

の加齢変化の違いと密接に関連している可能性が指摘され

2） Ishitobi, H., Matsumoto, K., Azami, T., Itoh, F.,ている。こうした背景から、本研究では細胞外環境として

Itoh, S., Takahashi, S. & Ema, M. Flk1‒GFP BAC Tgの毛細血管の役割に着目し、VEGFR‒ 1 プロモーターの制

mice: an animal model for the study of blood vessel

御により tDsRed を発現するトランスジェニックマウスと、

development. Exp. Anim. 59, 615‒22（2010）．

VEGFR‒ 2 プロモーターの制御により GFP を発現するト

3） I n o u e , M . , I w a i , R . , T a b a t a , H . , K o n n o , D . ,ランスジェニックマウスを用いて、組織学的に詳細に解析

Komabayashi‒Suzuki, M., Watanabe, C., Iwanari, H.,を行った。その結果、表皮や真皮の組織内で毛細血管が規Mochizuki, Y., Hamakubo, T., Matsuzaki, F., Nagata,

則的に分布することが本研究によって確認された。これまK. & Mizutani, K. Prdm16 is crucial for progression ofでの先行研究では、組織を構築する幹細胞は周囲の血管とthe multipolar phase during neural differentiation of

密接な相互依存性があり、幹細胞が物理的に接することや

the developing neocortex. Development, 144, 385‒399

血管由来のシグナル分子に依存して、幹細胞の分裂・分化（2017）．

が大きく変化することが知られている。たとえば、骨組織

4） Fong, G.H., Rossant, J., Gertsenstein, M. & Breitman,においては、成体の早い時期から特徴的な毛細血管が減少

M.L. Role of the Flt‒1 receptor tyrosine kinase in

することで微小環境が破綻し、これが骨量の減少と密接にregulating the assembly of vascular endothelium.

関連することが報告されている。一方、損傷皮膚組織の治

Nature 376, 66‒70（1995）．

癒過程では、炎症期、増殖期、成熟期を経て損傷を受けた

5） Semenza, G.L., Vascular responses to hypoxia and

組織を元どおりに修復する分子機構があり、この際、新たischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 3 0, 6 4 8‒6 5 2に形成された肉芽組織に酸素と栄養を供給するために血管（2010）．

新生が観察されるが、血管新生の乏しい肉芽組織は創傷治

6） Knighton, D.R., Silver, I.A., Hunt, T.K. Regulation of

癒が遅延、障害され、難治性になることが古くから指摘さ

wound‒healing angiogenesis‒effect of oxygen gradientsれてきた。このため、低酸素環境で血管内皮細胞の動員がand inspired oxygen concentration. Surgery 90, 262‒70

盛んであることに着目して 、低酸素による血管新生促進（1981）．

5）効果を期待した酸素不透過の被覆材が臨床の現場で広く用− 154 −

メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発
名古屋市立大学大学院薬学研究科

保嶋智也

Melanin is produced from tyrosine by tyrosinase localized in melanosomes in melanocytes present at the cutaneous
epithelium. There are also many reports indicating that various amino acid-related compounds other than tyrosine are
involved in controlling melanin synthesis. Based on these, it may be likely that transport of amino acid-related compounds
for the supply or elimination at the melanosomal membrane by a transporter is involved in melanin synthesis as the ratedetermining step. Solute Carrier (SLC) 45 A 2 , which has been identified as a causative gene for Oculocutaneous Albinism
Type 4 (OCA 4 ), is for a transporter that operates for translocation of small molecules across biological membranes. It isalso notable that the OCA 4 patients are present at a quite high frequency among the Japanese. Thus, the designated genetic
polymorphism of SLC 45 A 2 has already been indicated to be linked to a major type of OCA, but the mechanism behind thatremains to be elucidated. We, therefore, attempted to investigate into that possibility and successfully identified putrescine,
an amino acid-related compound as a substrate of SLC 45 A 2 . Putrescine has been reported to suppresses melanin
synthesis by inhibiting tyrosinase. Based on these, it would be possible to hypothesize that melanin synthesis is impaired in
OCA 4 patients because of its extensive accumulation into melanosomes due to the dysfunction of SLC 45 A 2 . Therefore,
elucidation of the function of SLC 45 A 2 and its role in the synthesis of melanin in relation to OCA 4 should be of great help
in the development of melanin synthesis inhibitor.

1. 緒

高水溶性（低脂溶性）である等の物理化学的な性質から、メ言

ラノソーム膜をはじめとする生体膜（脂質膜）を透過する過現代の日本においては、多くの女性が肌を白く保とうと程においては、その分配を要する単純拡散機構の寄与は小する傾向があり、美白を目的とした化粧品・医薬部外品等

さく、トランスポーター（膜内在性輸送タンパク質）によが多く販売されている。しかしながら、それら化粧品・医る担体介在的な機構が関与していると考えられている。

薬部外品等に配合される有効成分は、メラニン合成酵素でそこで、メラノソーム膜に局在しアミノ酸関連化合物

あるチロシナーゼの阻害を標的としているものがほとんどを輸送するトランスポーター群の候補遺伝子を探索し、であり、それ以外の分子標的については、ほとんど明らか

Membrane‒Associated Transporter Protein（MATP）にとなっていないのが現状である。肌の黒色化は、主にメラ

着 目 し た。MATP は OCA 4 型 ア ル ビ ノ の 原 因遺 伝 子 とニン合成の亢進によるが、そのメラニンはチロシンを原して発見され 1）、特に日本人のアルビノ罹患者に最も多料として皮膚上皮細胞のメラノソーム内に局在するチロシくみられる型の一つであることが報告されている 2）。近ナーゼにより産生される。メラニンはその物理化学的性質

年、MATP がメラノソーム内 pH の調整を行い、それによとして水や有機溶媒に不溶で安定な化合物であるため、一ってチロシナーゼの活性を制御しているとの報告がされ度生成されると除去されにくい特徴を有するが、その中でた 3）。このことから、Bin らのグループは MATP が H+ をも特に安定性の高い亜メラニンの生成にはシステインが関輸送基質にしていると考察しているが、明確なデータを与していることが知られている。また、細胞増殖に不可欠示せておらず H+ が輸送基質であるか現在のところ断定さな化合物と知られているポリアミンが、メラニン合成を制れていない。MATP は solute carrier 45（SLC 45）family

御しているとの報告がある。このように、メラニン合成のに属しており、proton‒associated sugar transporter であ

律速段階としてメラノソーム内へのチロシンやシステイン、る SLC 45 A 1 と高い相同性を有している 4）。このことから、

ポリアミン等のアミノ酸関連物質の供給過程が関与していMATP は糖類を輸送基質とすることが予想されたが、こる可能性が極めて高いと考えられる。アミノ酸関連物質はれまでの申請者の検討からそれらを輸送基質としないことが分かっている。また、MATP は有機物（糖類）を輸送す
る SLC 45 A 1 と高い相同性を有することから、無機物であDevelopment of melanin synthesis
inhibitor targeting MATP localized inmelanosomal membrane
Tomoya Yasujima
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Nagoya City University

る H+ を本来の輸送基質にすることは考え難い。以上のような研究現状より、本研究では、MATP の機能解明を行い、メラニン合成阻害の有望な標的分子になりうるかを検証した。

− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

2. 方ligation mix（NIPPON GENE, Japan）を用いてライゲーショ

法

ンし、ヒートショック（42 ℃、1 min）によって大腸菌（DH 5 α）

2 . 1. ヒトMATP（hMATP）のクローニングに導入した。その大腸菌を、ampicillinを添加した LB プレ

hMATP（accession no, NP_ 057264 . 3）の cDNA は、ヒートに播き、37 ℃で一晩培養した後、プレート上のコロニー

ト皮膚の total RNA 試料より RT‒PCR によってクローニンを採取した。そこからプラスミド DNAを抽出し、制限酵素グをした。1 µg の total RNA を用い、オリゴ dT プライマ

処理後、電気泳動を行うことによりインサート部分を確認しーと逆転写酵素 ReverTra Ace（TOYOBO, Japan）によった。予想された長さのインサート部分が確認されたコロニーて cDNA 試料を得た。hMATP の cDNA は GenBank に登から得られたプラスミドの配列は、自動シークエンサー ABI

録されている配列より open reading flame 領域が増幅され

PRISM 3100
（Applied Biosysytems, U. S. A.）により確認し、るよう設計したプライマーを用い、KOD plus polymerase

目的とする部分の塩基配列に変異があることを確認した。

（TOYOBO, Japan）を使用して PCR を行った。得られた
3100（Applied Biosysytems, U.S.A.）にて確認した。発2 . 3 . hMATPとその各種変異体の一過性発現系細胞

現ベクターである pCI‒neo vector（Promega, U.S.A）に

実 験 に は、 イ ヌ 腎 由 来 MDCK Ⅱ 細 胞 を 用 い た。

hMATP の cDNA を 組 み 込 ん で、hMATP プ ラ ス ミ ド

MDCKII 細胞は継代に際し、ビュルケルチュルク盤を用いを 作 成 し た。 ま た、 そ の 際 に N 末 端 に FLAG sequenceて細胞数を計測した後、3×105 cells/ml となるように調製（DYKDDDDK）が付与されるように組み込んだ。

し、24 well プレートに 500 µl/well ずつ播種した。その約

hMATP の cDNA 配列は自動シークエンサー ABI PRISM

1 時間後、導入試薬として 3 µg/well の polyethyleneimine

2 . 2 . hMATP の各種変異体の作製（Polyscience, U. S. A.）を用いて、各プラスミド（hMATP

各種変異体を作製するにあたり、pCI‒neo vector に組みとその各種変異体）を導入した。その後、36 ‒ 48 時間の培込んだ FLAG‒hMATP を鋳型とし、所定の変異が導入さ養によって、一過性にそれぞれのタンパクを発現させ、コれるよう設計したプライマーを用い（Table 1）、PrimeSTAR

ンフルエントに達した状態のものを実験に用いた。また、

Max DNA Polymerase を使用し PCRを行った。得られた対照として pCI‒neo vector のみを導入した mock 細胞をPCR 産物を 37 ℃で 1 時間のDpnI（TOYOBO, Japan）処理作成した。細胞培養培地として、10 % fetal bovine serum、

後、T4 Polynucleotide Kinase（TOYOBO, Japan）、2 ×

1 % penicillin/streptomycin を 含 む Dulbecco’ s modified

Table 1

各種 hMATP 変異体作製のためのプライマー配列− 156 −

メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発

Eagle’ s medium を使用し、37 ºC、95 % air ‒ 5 % CO 2 インを要する場合には、ANOVA の後に Dunnet's test を用いた。

キュベーター内で培養した。

3. 結

2 . 4 . 取り込み実験果

取り込 み 実 験 用緩 衝 液として、10mM HEPES を加えた

3 . 1. MATP のメラノソーム膜局在シグナル配列の探索Hanks’ solution（136 . 7 mM NaCl, 5 . 36 mM KCl, 0 . 952 mM

現在までに MATP の輸送基質は同定されておらず、

CaCl 2 , 0 . 812 mM MgSO 4 , 0 . 441 mM KH 2 PO 4 , 0 . 385 mM

MATP の機能変動に起因する OCA 4 型アルビニズム発

Na 2 HPO 4 , 25 mM D‒glucose）
または、10 mM HEPES を加症の機構については不明なままである。前述したように、

え た Mannitol buffer（5 . 37 mM K‒gluconate, 273 . 4 mM

MATP の輸送基質としてアミノ酸関連物質が予想される

Mannitol, 0 . 4 4 1 mM KH 2 PO 4 , 0 . 8 1 2 mM MgSO 4 ,ため、それら化合物が MATP の輸送基質となるか検証を

0 . 952 mM Ca‒gluconate, 0 . 385 mM K 2 HPO 4 , 25 mM D‒行う必要があるが、MATP はメラノソーム膜に局在する

glucose）を用い、2 M の NaOH を用いて pH 7 . 4 に調整しため、細胞外に暴露された検討対象化合物を輸送することた。この緩衝液中に［3 H］tyrosine（5 nM）または［3 H］

ができない。細胞内小器官に局在するトランスポーターの

putrescine（2 nM）
を加え、取り込み試験液とした。

生体膜透過の検討には、ジキトニンをはじめとした界面活

取り込み実験に際して、まず、well 中の培地を吸い取性剤で細胞表面を処理することにより細胞膜透過性を上昇

り、37 ºC の Hanks’ solution（1 ml）を加えて 5 分間プレイ

させ、検討対象化合物を細胞質内へ移行させ評価する方法

ンキュベーションした。その後、取り込み試験液（250 µl）が一般に用いられている。しかし、界面活性剤処理の条件を加え、取り込みを開始させた。所定の時間経過後、氷冷設定が難しく、再現性や安定性に問題がある。そこで、メした Hanks’ solution（stop solution, 1 ml）を加えることにラノソーム膜に局在させる移行シグナルに着目した。膜貫より反応を停止させ、stop solution（2 ml）で細胞を 2 回洗通タンパクの細胞内ドメインに D/ExxxLL や Yxxφ、KxK

浄した。続いて、0 . 5 % SDS を含む 0 . 2 M NaOH を 500 µl（x：任意のアミノ酸、φ：疎水性アミノ酸）の配列を有す

加え、細胞を可溶化させ、カウンティングバイアルに回収

るとメラノソーム膜やライソソーム膜に局在することがした。そこに液体シンチレーションカクテル 2 ml を加え、知られている 5 , 6）。そこで、MATP のアミノ酸配列を解析

液体シンチレーションカウンター（LSC‒ 5100 , Aloka Co.,

すると、細胞内に複数の YxxL、KxK 配列を有しているこTokyo, Japan）により放射能活性を測定することで取り込とが確認された。また、その配列は種間の保存性が高くむ量を評価した。

MATP のメラノソーム膜への局在制御に関わっている可能性が強く示唆された（Fig. 1）。よって、この配列を Sxxφ、

2 . 5 . データ解析

AxA に変換することでシグナルを除去し、メラノソーム

2 . 5 . 1 . 取り込みデータ解析

膜に発現する MATP を強制的に細胞膜へ移行させること細胞への薬物の取り込み量は以下の式を用いて算出した。
s

m

ct

v

で輸送基質の検討を行うこととした。

3 . 2 . hMATPとその各種変異体によるtyrosine 輸

ここで、Uptake は取り込み量（pmol/mg protein）、As は送能の解析

サンプルの放射能（dpm/well）、Act は取り込み試験液の放メラニンは、メラノソーム内のチロシナーゼの働きに射能（dpm/µl）、Av は細胞のタンパク量（mg protein/well）、より、アミノ酸の一種である tyrosine を原料に合成される。

Cm は取り込み試験液の基質濃度
（µM）
である。

そのため、メラノソーム内へのメラニン供給経路は、生体取り込み量（Uptake）を取り込み時間（t, min）で割ること

におけるメラニン合成において、律速段階になっていると考えられる。アミノ酸は一般的に高水溶性（低脂溶性）
であにより、取り込み速度（V, pmol/min/well）
を求めた。

るため、その物理化学的な性質から、脂質膜で構成される生体膜を透過する過程においては、細胞膜（脂質膜）への分2 . 5 . 2 . 統計処理

配を要する単純拡散機構の寄与は小さい。そのため、トラ

MDCKII 細胞における 1 回の実験のデータは、同時に調ンスポーター（膜内在性輸送タンパク質）による担体介在製した細胞の 2 サンプル（well）における実験値として得た。

的な機構の関与が古くから示唆されており、現在までに多実験回ごとに細胞を調製して、複数回の実験を行い、合計

くのアミノ酸トランスポーターの分子実体が明らかになのサンプル数を例数（n）とした。

ってきた 7）。メラノソーム膜においても例外ではなく、ア

データは、原則として平均値±標準誤差として示した。

ミノ酸などの高水溶性化合物の膜透過過程には、トラン

2 群間の比較には、Student's t–test を用いた。多重比較

スポーターが重要な役割を担っていると考えられる。メ− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 1

MATP の種間の相同性とメラノソーム膜局在シグナル配列− 158 −

メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発

ラノソーム膜におけるチロシン輸送には、トランスポー
8）

によりメラノソーム内からのポリアミン排出が停止し、メターの関与を示唆する報告はあるが 、その分子実体のラニン合成能不全が惹起されている可能性が考えられる。

同定には至っていない。そこで、MATP がこの過程を担

ポリアミンはポリカチオン構造を有することから高水溶

う分子実体であるとの仮説をたて、MATP とその各種変性であるため、その生体膜透過にはトランスポーターが異体による tyrosine 輸送能の解析を行った（Fig. 2）。その必要であると考えられている。そこで、MATP の Y 317 S

結果、Y 317 S 変異体においてわずかながら tyrosine 輸送

変異体を用いて、ポリアミンの一種である putrescine 輸量の増加傾向がみられた。このことから、Y 317 S 変異体

送能の解析を行った（Fig. 3）。その結果、ナトリウムイオ

は MATP のメラノソーム膜局在シグナルが除去され細胞

ン、塩化物イオンを除去した条件では（mannitol buffer）、

膜に局在し、tyrosine 活性を有していることが示唆された。

mock 細胞と比較して Y 317 S 変異体における putrescine 輸

ただ、その活性は非常に弱いことから、他に良好な輸送基送量は有意に上昇した（約 3 倍）。このことから、MATP

質が存在していることが考えられたため、Y 317 S 変異体

はメラノソームからポリアミンを排出し、チロシナーゼのを用いて、他の輸送基質の探索を進めた。

活性の維持に重要な役割を担っている可能性が示唆された。

4. 考

3. 3. hMATPとその各種変異体によるputrescine
輸送能の解析
細胞の増殖等、生理機能の維持に重要であるポリアミン
は、チロシナーゼ活性を抑制しメラニン合成を減少させるとの報告がある

9 , 10）。MATP の遺伝子多型による機能不全

Fig. 2

Fig. 3察

本 研 究 に お い て、hMATP の ア ミ ノ 酸 配 列 の 中 のY

317

XXL 320 がメラノソーム膜局在に重要である可能性が示唆された。また、Y 317 S の変異体は細胞膜に局在し、細胞膜輸送に基づいた簡便で再現性の高い機能評価系のhMATP とその各種変異体による tyrosine 輸送能の解析

hMATP とその変異体（Y317S）
による putresine 輸送能の解析− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Y, Tada J, Kikuchi N, Takata M, Takamori K,
Kishibe M, Tanaka M, Miyamura Y, Ito S, Tomita Y.
Oculocutaneous albinism type 4 is one of the mostcommon types of albinism in Japan. Am J Hum Genet,
74, 466‒471（2004）．
3） Bin BH, Bhin J, Yang SH, Shin M, Nam YJ, Choi
DH, Shin DW, Lee AY, Hwang D, Cho EG, Lee TR.
Membrane–Associated Transporter Protein（MATP）
Regulates Melanosomal pH and Influences Tyrosinase
Activity. PLoS One, 10, e0129273（2015）．
4） Shimokawa N, Okada J, Haglund K, Dikic I, Koibuchi
N, Miura M. Past‒A, a novel proton‒associated sugartransporter, regulates glucose homeostasis in the brain.
Fig. 4

J Neurosci, 22, 9160‒9165（2002）．

メラニン合成に係る MATP の寄与

5） Dietrich J, Kastrup J, Nielsen BL, Odum N, Geisler
C. Regulation and function of the CD3gamma DxxxLL確立に成功した。MATP は tyrosine 輸送能を有していた

motif: a binding site for adaptor protein‒1 and adaptor

が、その活性は弱く、生体における役割においては重要で

protein‒2 in vitro. J Cell Biol, 138, 271‒281（1997）．

はないことが示唆された。一方、ポリアミンの一種であ

6） Guarnieri FG, Arterburn LM, Penno MB, Cha Y,

る putrescine の輸送活性が認められた。MATP の遺伝子

August JT. The motif Tyr‒X‒X‒hydrophobic residue

多型による機能不全は、メラニン合成能が欠損しアルビ

mediates lysosomal membrane targeting of lysosome‒

ノを発症するため、MATP がメラニン合成酵素であるチ

associated membrane protein 1. J Biol Chem, 2 6 8,

ロシナーゼの活性低下に寄与するポリアミンをメラノソ

1941–1946（1993）．

ーム外に排出している可能性が示唆された（Fig. 4）。よっ7） Fotiadis D, Kanai Y, Palacín M. The SLC3 and SLC7て、MATP の阻害剤はメラノソーム内にポリアミンを蓄

families of amino acid transporters. Mol Aspects Med,

積させることに貢献し、チロシナーゼ活性を抑制する可能

34, 139‒158（2013）．

性が示唆された。この知見は、MATP の輸送機能及び分8） Gahl WA, Potterf B, Durham–Pierre D, Brilliant MH,

子特性の解明を進展させ、MATP の機能変動に起因する

Hearing VJ. Melanosomal tyrosine transport in normal

OCA 4 型アルビニズム発症の機構の解明、また、その阻

and pink–eyed dilution murine melanocytes. Piment

害剤がメラニン合成阻害の有望な化合物の開発に役立つ情

Cell Res, 8, 229‒233（1995）．
9） Käpyaho K, Jänne J. Stimulation of melanotic

報の提供につながるものと期待される。

expression in murine melanoma cells exposed to（引用文献）

polyamine antimetabolites. Biochem Biophys Res

1） Newton JM, Cohen‒Barak O, Hagiwara N, Gardner

Commun, 113, 18‒23（1983）．

JM, Davisson MT, King RA, Brilliant MH. Mutations in10）Sunkara PS, Chang CC, Prakash NJ, Lachmann PJ.

the human orthologue of the mouse underwhite gene

Effect of inhibition of polyamine biosynthesis by DL‒（uw）underlie a new form of oculocutaneous albinism,

alpha‒difluoromethylornithine on the growth andOCA4. Am J Hum Genet, 69, 981‒988,（2001）．

melanogenesis of B 1 6 melanoma in vitro and in vivo.

2） Inagaki K, Suzuki T, Shimizu H, Ishii N, Umezawa

Cancer Res, 45 , 4067 ‒ 4070（1985）．

− 160 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する
北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室

柳輝希

Mitochondria exerts a central function in various cellular responses, and repeats fusion and division to change theirmorphology. In recent years, a group of GTP hydrolases involved with fusion and division of mitochondria has been
identified. Mitofusin (Mfn) 1 , Mfn 2 , and OPA 1 are involved in the process of fusion, and DRP 1 (Dynamin Related
Protein 1 ) is involved in the division process. Although it has been reported that DRP 1 is essential for maintaining the cell
division of malignant tumors such as malignant melanoma, the molecular function in ultraviolet-related carcinogenesisof keratinocytes is unknown. Herein we conducted experiments using clinical specimens and cultured cells to analyze
the function of DRP 1 in skin aging, UV-related skin disorders and cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). We
investigated cell proliferation, cell cycle, mitochondrial morphology, and MAPK signaling pathway using cutaneous SCC
A 431 and DJM 1 cells that were transfected with shRNA vectors targeting Drp 1 . The Drp 1 gene-knockdown SCC cells
showed lower cell proliferation than scramble control cells, as assessed by direct cell counting and clonogenic assays.
DNA content analysis showed Drp 1 knockdown to cause G 2 /M arrest. Morphologically, the depletion of Drp 1 resulted
in an elongated,hyper-fused mitochondrial network. The MEK inhibitor PD 325901 suppressed cell proliferation, as
well as inhibiting the phosphorylation of ERK 1 / 2 and Drp 1 (Ser 616 ). Also, PD 325901 caused the dysregulation of themitochondrial network. In tumor xenografts of DJM 1 cells, the knockdown of Drp 1 suppressed tumor growth in vivo, andclinically, the expression levels of Drp 1 were higher in cutaneous SCCs than in normal epidermis, and correlated positively
with the advanced clinical stages. Our findings suggest that the mitochondrial division-related molecule “DRP 1 ” may
become a new biomarker in cutaneous SCC as well as a novel therapeutic target.

1. 緒

言

ミトコンドリアは、酸素呼吸により細胞内のエネルギーをつくりだすオルガネラであり、さまざまな細胞応答において中心的な機能を発揮している。またミトコンドリアは活発に融合と分裂を繰り返し、その形態を変化させている。近年、ミトコンドリアの融合と分裂に機能する GTP
加水分解酵素群が同定された。融合には Mitofusin（Mfn）
1、Mfn 2、OPA 1、 分 裂 に は DRP 1（Dynamin Related

図 1 ミトコンドリアは融合と分裂を繰り返している。DRP1 は分裂を制御する。

Protein 1）
が関与する（図 1）1）。また、DRP 1 が悪性黒色腫などの悪性腫瘍の細胞分裂維持に必須であることが報告された 2）。しかしながら、紫外線発癌や紫外線老化におけるこれらの分子の機能は不明である。本研究では、紫外線発

紫外線、慢性的な炎症、機械的刺激、ウイルス、放射線な癌および皮膚老化（特に紫外線による光老化・皮膚障害）にどが関与する。なかでも、紫外線の関与は大きく、本邦でおけるミトコンドリア分裂関連分子 DRP 1 の機能についも SCC の 6 割が日光露光部に発生し、ますます SCC の発て、各種実験を行った。

生数が増加することが予想されている。SCC は、日光角高齢化のすすむ現代、皮膚癌の頻度は増加の一途をた化症、Bowen 病、熱傷瘢痕、慢性膿皮症などの先行病変どっている。有棘細胞癌（Squamous cell carcinoma、以下の上に発生し、はじめのうちは小丘疹～結節として生じる

SCC と略す）は表皮由来の皮膚癌の一種であり、その発生が、増大すると腫瘤や難治性の潰瘍などを形成するように率は高齢化とともに近年増加している。SCC の発生にはなる。さらに巨大になると、しばしばカリフラワー状と形容され、表面が乳頭状の腫瘤性病変を呈する。また、角質や痂皮、あるいは壊死組織などを付着し、細菌の二次感染

Functions for mitochondrial moleculesin skin aging and tumorigenesisを来たして、悪臭を伴うものも多く、患者の QOL（Quality

Teruki Yanagi

表皮と連続した異型細胞が、個細胞角化や細胞の配列の乱Department of Dermatology, Faculty of
Med ici ne a nd Graduate s cho ol of
medicine, Hokkaido Universityof Life）を大幅に損ねることも多い。病理組織学的には、れ、核異型・細胞分裂・癌真珠などを形成しながら増殖する。未分化になるほど、角化傾向が少なくなり、浸潤・増− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

殖能も強く、一般的には予後が悪くなる。SCC は、低悪

24 時間インキュベートして準備した。24 時間後に蛍光顕性度のうちは、外科的切除で根治が期待できるが、転移を微鏡で green fluorescent protein（以下 GFP と略す）がど伴うような進行例になると、化学療法にしばしば抵抗性をのくらいの割合で入っているかを視認し、トランスフェクシ

示し、治療に難渋することも少なくない。リンパ節転移を

ョン効率を確認した。また、A431、DJM1 細胞を 6cmディッ認める症例においては、リンパ節郭清を根治的に行うこシュに 30 ％コンフルエントになるように播種しておき、24ともあり、外科的切除以外には放射線療法や化学療法など

時間 37 ℃でインキュベートした。293FT細胞から得られたの集学的治療が行われる。近年では、Epidermal growth

ウイルス上清は、45µmフィルタを通して回収した。播種しfactor receptor 阻害剤や種々の免疫チェックポイント阻害ておいた A 431、DJM 1 細胞にウイルス上清を 1 mL ずつ薬を用いた治験などが試みられている。しかしながら、進添加し、puromycin（最終濃度 1 µg/mL）を培地に加えて行期の SCC においては、治療の選択肢は未だ限定的であり、培養し、ウイルス産生細胞株を樹立した。以後、培養液にさらなる治療の研究開発が望まれている。

は puromycin を添加してセレクションをかけて培養した。

2. 方

法

2 . 1. 皮膚有棘細胞癌腫瘍部におけるDRP1 の発現解析（免疫染色）2 . 3 . DRP1ノックダウン時の、ミトコンドリア形態の観察
MitotrackerRedFM（Invitrogen）と BZ‒ 9000（キーエ北海道大学皮膚科にて治療歴のある皮膚有棘細胞癌 30

ンス社）にて、ミトコンドリア形態の観察を行った。ミト

例について、抗 DRP 1 抗体（BD 611133）を用いて、免疫コンドリアの形態は Mito Tracker Red（ThermoFisher）

染色を行った。ホルマリン（Wako）固定パラフィン切片をを用いて、蛍光染色を行い観察した。観察細胞を PBS で

4 µm の厚さで切り出して、免疫染色を施行した。同一観

十分に洗浄した後、Mito Tracker Red を 1 µL 添加し、37

察者（筆者）によりスコアリングは行い、別視野で少なく℃ で 30 分 静 置 し た。 そ の 後、Phenol red の 入 っ て い な

とも 3 回それぞれ 100 個の細胞をランダムに選択して評価

い DMEM（Life Technology）を添加した。観察顕微鏡にした。免疫染色スコアは、proportional score（免疫強度；

は、BIOREVO BZ‒ 9000（KEYENCE） お よ び Fluoview

0 なし，1 0 ‒ 25 %，2 25 ‒ 50 ％，3 50 ‒ 75 %，4 > 75 %）、FV 10 i（Olympus）を使用した。ミトコンドリアの形態は、

intensity score（染色強度；0 なし，1 弱陽性，2 中等度陽性，

ミトコンドリア 1 つあたりの面積で評価した。ミトコン

3 強陽性）の 2 つのパラメータの和で算出した。

ドリアの面積は、画像解析ソフト Image J（developed byWayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda,

2 . 2 . RNA干渉を用いた DRP1ノックダウンによる
皮膚有棘細胞癌株の表現型観察

MD; available at http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を用いて導出し、定量化した。

ヒト有棘細胞癌株 A 431 細胞、DJM 1 細胞、シグマ社
pLKO‒shRNA システムを用いてノックダウン実験を実施

2 . 4 . DRP1 活性化機構の解明した。継続的な Drp 1 のノックダウンには、レンチウイル

MEK 阻害剤（PD 325901）を 0 , 0 . 5 , 1 , 5 , 10 , 50 µM のスを用いた short‒hairpin RNA（以下 shRNA と略す）を

濃 度 で 添 加 し、RIPA Buffer に て 細 胞 内 タ ン パ ク を 抽使用した。細胞のセレクションは puromycin により行っ

出し、SDS‒PAGE・免疫ブロット法を実施した。Drp 1、た。20 ％コンフルエントになるようにあらかじめ 293 FT

MEK 阻害剤として Mdivi‒ 1（Santa Cruz Biotechnology）

細胞（Invitrogen, R 700 ‒ 07）を播種しておき、24 時間 37

お よ び N‒difluoro‒ 2 ‒benzamede（ 以 下 PD 325901 と 表℃ で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後、20 µmol の shRNA vector

記，Cayman Chemical）を使用した。Mdivi‒ 1 は分子量が（pLKO‒ 4 2 3 , 4 2 6 , 1 0 9 7 , scrambled–puromycin, 1 µg/

353 . 22 であり、まず 5 mg を DMSO 1 . 416 mL に溶かして

mL）3 µL と DNAmix（pLP 1 , pLP 2 , pVSVG,

各 1 µg/

10 mM の濃度になるように調整した。本剤を使用していmL）9 µL をそれぞれ 1 mL の Opti–MEM で溶解し、さらる論文では、10 ‒ 50 µM の濃度で投与しているため、さらに Polyethylenimine（以下 PEI と略す）15 µL を加えてよに希釈して各濃度の Mdivi‒ 1 を調整した。また PD 325901

く混合し、室温で 15 分静置した。この混合液を、準備しは分子量が 482 . 2 であり、5 mg を DMSO 1 . 037 mL に溶かた 293 FT 細胞に添加し、24 時間 37 ℃でインキュベート

して 10mMの濃度になるよう調整した。本剤は 10 ‒ 100 µM

した。トランスフェクション効率を確認するため、コンで使用されており、これを希釈して各濃度の調整を行っトロールとして enhanced green fluorescent protein（以た。阻害剤の添加については、40 ‒ 50 % コンフルエントに

下 EGFP と略す）で標識したプラスミドの pcDNA 3 ‒EGFP

なるように対象細胞を 10 cm または 6 cm シャーレに播種（1 µg/mL）3 µL と、PEI 15 µL を 1 mL の Opti‒MEM に混しておき、対象濃度の 1000 倍に調整した Mdivi‒ 1 および合し、室温で 15 分静置した混合液を 293 FT 細胞に添加し、PD 325901 を 10 cm シャーレでは 10 µL、6 cm シャーレで− 162 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する

は 5 µL それぞれ添加した。コントロール群では DMSO を

2 . 9. ウエスタンブロット

投与した（最終 DMSO 濃度が 0 . 1 % になるように調整）。

2 . 9 . 1. ライセートの回収
Lysed buffer に は、RIPA buffer（50 mM Tris pH 7 . 5 ,2 . 5 . DRP1 阻害剤による皮膚有棘細胞癌治療

1 5 0 mM NaCl, NP 4 0 1 %, sodium deoxycholate 0 . 5 %,DRP 1 阻害剤（Midivi‒ 1 , Santa Cruz）を使用して有棘細胞癌株への治療実験を実施した。

SDS 0 . 1 %, NaF, final concentration 1 nM, NaV 3 O 4 , final
concentration 10 µM，Roche）を使用した。対象細胞を PBS
で 2 回洗浄した後、RIPA buffer を添加し、氷上で 30 分静2 . 6 . ATP 活性測定法を用いたCell viability assay

置した。次に、セルスクレーパーを用いて各ウェルの表面対象となる細胞の細胞数を Cell counter（TC 10 TM，を擦過し、融解液をすべて 2 mL のエッペンチューブに回Bio‒Rad）で測定した後、96 ウェルプレートに 5000 ‒ 10000

収した。4 ℃、15000 rpm で 20 分遠心した後、上清を回収

個／ 100 µL・ウェルになるように細胞を播種した。このして別のエッペンチューブに移し、NuPAGE LDS Sample

とき、熱による物理的刺激を避けるため、播種したウェ

Buffer（lithium dodecyl sulfate, pH 8 . 4 , Invitrogen）、

ルの外側のウェルにも PBS を 100 µL ずつ分注・静置し

NuPAGE Sample Reducing Agent（500 mM dithiothreitol

た。48 時間 37 ℃でインキュベートした後、Cell titer glo

at a ready‒to‒use 10 x concentration, Invitrogen）を加え

solution を各ウェルに 100 µL ずつ加えてピペッティング

混和し、ライセートを回収した。

でよく混濁し、室温で遮光しながらさらに 15 分インキュ2 . 9 . 2 . 電気泳動、転写、ブロッキングベートした。各ウェルの混合液を観察用の white 96 well

回収したライセートは、70 ℃で 10 分間ボイルしてヒート

plate に そ れ ぞ れ 移 し 換 え た 後、 吸 光 度 を Spectra Max

ブレイクした後、マーカーとともに SDS‒PAGE 5 ‒ 10 % Gel

Paradigm（Molecular Devices）
を用いてそれぞれ測定した。 （Invitrogen）にセットした。バッファーには MOPS SDS
Running Buffer（# 1908733，Life Technology） を 使 用

2 . 7. 細胞増殖アッセイ

し、電気泳動を行った。その後、iBLOT 2（Invitrogen）
5

細胞を 6 cmディッシュに 1 . 0×10 個ずつ播種し、37 ℃でイ

で polivinylidene difluoride membranes（Invitrogen）

ンキュベートした。1、3、5、7 日後にPBS で洗浄し、750 µLに転写した。転写したメンブレンは、5 % スキムミルクの 0 . 25 % Trypsin‒EDTA（Thermo Fisher Scientific）を（Wako）溶解 1 xTBS‒T（20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0 . 1 %それぞれ加えて、6 分間 37 ℃で静置して細胞をディッシ

Tween 20）に浸し、室温で揺らしながら 60 分間ブロッキ

ュから剥がし、細胞の計測を行った。

ングを行った。

Dead cell ratio の測定においては、死細胞を含む上清2 . 9 . 3 . 1 次抗体、2 次抗体による酵素抗体反応

培養液を一度ファルコンチューブに集めておき、0 . 25 %上述の抗 Drp 1 抗体（mouse, # 611113 , BD Transduction

Trypsin‒EDTA で細胞を剥がしたあとで、集めておいた

Lab）、抗 Drp1Ser616 抗体（rabbit, #611738, Cell Signaling

培養液で再懸濁を行った（HPEKp の細胞株においては，上Technology）、抗ERK1/2 抗体（rabbit, #4695, Cell Signaling

清 の CnT‒PR を 一 度 回 収 し、Trypsin‒EDTA の 反 応 をTechnology）、 抗 ERK1/2 リ ン 酸 化 抗 体（rabbit, #9191,

10 %FBS 添加 PBS でアンインキュベートし、遠心して上Cell Signaling Technology）、 抗 CDK1 抗（mouse, # 610037 ,清を吸引した後、避けておいた CnT–PR で再懸濁した）。

BD Biosciences）、 抗 CDK 2 抗 体（mouse, # 610145 , BD

その後、細胞数を測定し、「dead cell ratio ＝（全細胞数－

Transduction Lab）
、 抗 phospho–histone H 3 抗 体（rabbit,

生細胞数）/（全細胞数）× 100」
として導出した。

# 3377 , Cell Signaling Technology）、抗 ㌼ ‒actin 抗体（mouse,#A 5441 , Sigma）を 1 次抗体として使用し、4 ℃で揺らし

2 . 8 . コロニー増殖アッセイながら、抗原抗体反応行った。1 xTBS‒T で 20 分 3 回洗35 mm の 6 ウェルプレートに、対象細胞を 5 . 0 ×102 個

浄した後、HRP 標識ウマ抗マウス IgG 抗体および HRP 標

ずつ播種し、14 日間 37 ℃で静置した。培地は 7 日目に 1

識抗ラビット IgG 抗体（Cell Signaling Technology）を二度交換した。PBS で 2 回洗浄した後、70 % エタノールを次抗体として 60 分間室温で抗原抗体反応させた。再度

各ウェルに 1.5mLずつ添加して30 分間室温で静置し固定した。

1 xTBS‒T 3 回洗浄した後、Image Quant LAS 4000（GEエタノールをすべて除去し、
0 . 5 % crystal violet dye（100 mL

Healthcare）で撮像した。

あ た り、0 . 5 g crystal violet を 25 ml メ タ ノ ー ル お よ び
75 mL の滅菌水に溶解して精製）を各ウェルに 1 . 5 mL ずつ

2 . 10 . 細胞周期解析

添加し、30 分室温で静置しコロニーの染色を行った。水道細 胞 周 期 は propidium iodide DNA staining を 行 い、

水で洗浄し、直接目視によりコロニー数を計測した。コロ

fluorescence–activated cell sorting（以下、FACS と略す）

ニーは最低 50 個以上の細胞数があるものを有意とみなした。

により解析した。PI solution（Wako）は PBS 1000 µL あた− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

り TritonX‒ 100 1 µL、RNAseA 20 µL、PI 20 µL をそれぞ

分量のホルマリンで固定した後、パラフィン切片を作成

れ添加して調製した。対象細胞は 10 cm ディッシュで培し、Hematoxylin and Eosin（HE）染色により病理組織学

養し、PBS で洗浄した後、1 mL の 0 . 25 % trypsin‒EDTA

的解析を行った。また免疫染色として、Ki– 67 染色およびを加え、37 ℃で 6 分間インキュベートした。血清培地を

TUNEL 染色を行った。免疫染色の評価には、100 か所あ

9 mL 添加して懸濁し、ファルコンチューブに全量を回収たりの陽性細胞を異なる視野で 5 回カウントし、その平均

して 1000 rpm，室温で 3 分間遠心した。上清をアスピレ

値を免疫染色陽性細胞率として算出した。

ーション後、PBS 5 mL で再懸濁した後、1000 rpm，室温

なお、侵襲を伴う処置については、麻酔下に施行した。

で 3 分間再遠心し、上清をすべて除去した。70 % エタノー

麻酔はイソフルレン（Abbi）による吸入麻酔と、抱水クロ

ル 5 mL を添加し、サンプルを固定し 4 ℃に静置した。次に、ラール（Wako）の腹腔内投与（300 mg/kg）を併用した。まサンプルを 1000 rpm，室温で 3 分間遠心した。エタノー

た、鎮静剤として術後 3 日間はアスピリン（Wako）の経口

ルを除去し、さらに PBS で 2 度洗浄した。次に PI solution

投与（150 mg/kg）を行った。

をそれぞれ 500 µL ずつ添加し、37 ℃で 15 分インキュベー

3. 結トした。FACS には、AriaIII（BD Biosciences）を使用し、

果縦軸に細胞数を、横軸に Phycoerythrin（PE）を設定した

3 . 1 . DRP 1 は皮膚有棘細胞癌部で高発現している状態で、サンプル数を 10000 カウントし、ヒストグラム

51 検体（紫外線発癌が疑われる「露光部」の皮膚有棘細胞を描出した。

癌 Squamous cell carcinoma: SCC および正常皮膚）を用いた免疫染色を行ったところ、これらの腫瘍部分においてミ

2 . 11. In vivo 異種移植モデル（Xenograft）

トコンドリア分裂因子である DRP 1 の発現が亢進していた

5 週齢、メスの BALB/cAJcl‒nu/nu（CLEA）を用いて（図 2）。

実験を行った。マウスは北海道大学医学部の動物実験施設
にて管理され、搬入されたマウスは少なくとも 5 日間当施

3 . 2 . DRP1ノックダウンは有棘細胞癌の増殖を抑制する設で飼育し、環境に適応したことを確認して実験に用いた。

皮膚有棘細胞癌細胞 A 431 細胞、DJM 1 細胞において尚、本研究の動物実験申請については、ヘルシンキ宣言にRNAi 法（shRNA）を用いた DRP 1 遺伝子発現ノックダウン

基づき、当院動物実験承認機関で審査承認済である。移植を実施した。2・3 種類の塩基配列にて DRP 1 のノックダする細胞株は、scrambled shRNA/shRNA# 3 をトランスウンを行ったところ、蛋白レベルで 90 ％以上のノックダ

フェクションした DJM 1 細胞を選択した。移植部位 1 か

ウン効率を認めた（図 3）。これらの細胞について、細胞増6所あたり 5 × 10 個の細胞を使用した。対象細胞は PBS で洗浄後、0 . 25 %Trypsin‒EDTA を加えて 37 ℃で 6 分間静置し、DMEM を 9 cc 加えて懸濁した。その後、懸濁液を全てファルコンチューブに回収し、1000 rpm で室温で 3分間遠心させ、上清を全て吸引し、PBS で再懸濁した。細
胞の個数を測定し、1 箇所あたり少なくとも 5 × 106 個の細胞数になるように PBS を加えてトータル 200 µL に調整した。この混合液を 1 cc の注射器（27 G 針）に吸引し、氷上で保存した。これらを速やかにヌードマウスの両側側腹部に皮内注射して異種移植し、Xenograft を作成した。その後、経時的に腫瘍の動態を観察した。

図2

Drp 1 阻 害 剤 添 加 の 実 験 に お い て は、 腫 瘍 の 長 径 が皮膚有棘細胞癌では DRP1 発現が亢進している。

5 ‒ 7 mm に な っ た 時 点 で、1 . 75 mg の Mdivi‒ 1（Santa
Cruz Biotechnology）を DMSO 25 µL に溶解したものを、腫瘍に直接局所注射した。コントロール群には、25 µL のDMSO を投与した。術後、腫瘍の長径・短径を 1 日おきに測定し、腫瘍の容積を“（1 / 2）×（長径）×（短径）2 ”で近似して導出した。移植後 15 日目に頚椎脱臼法によりマウスを安楽殺し、ピンセットと眼科用曲尖を用いて、生着していた皮下の腫瘍を周囲の軟部組織から剥離しながら摘出した後、腫瘍の重量を測定した。摘出した腫瘍組織は、十図 3 皮膚有棘細胞癌細胞株 A431 および DJM1 細胞に対して、
DRP1 ノックダウンを行った（J Dermatol Sci, 88; 298–307,2017）。

− 164 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する

殖能をセルカウントにて評価したところ、DRP 1 ノックダの抑制が認められた（図 5）。次に、DRP 1 阻害剤（Mdivi‒ 1 ,ウン群は、コントロールに比べて有意に増殖能が抑制され

0 ‒ 100 µM）を添加したところ、濃度依存性に細胞増殖がた（図 4）。さらにノックダウン細胞の Clononic assay を行抑制された（Cell viability assay, Clonogenic assay, 図 6）。

ったところ、同様に DRP 1 ノックダウン細胞にて細胞増殖

次に、細胞増殖抑制機序を解明するため FACS を用いた

図 4 DRP1 ノックダウン細胞は細胞増殖が抑制される（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

図5

DRP1 ノックダウン細胞株を用いた Clonogenic assay（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017 を改変）。

図 6 有棘細胞癌株に対する Mdivi–1 を用いた DRP1 阻害実験
88; 298–307, 2017）。

Midivi–1 投与によって細胞増殖が抑制された（J Dermatol Sci,

− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

細胞周期解析を実施したところ（DNA contents analysis）、

ミトコンドリアが観察された（図 8）。以上より、DRP 1 が

DRP 1 のノックダウン細胞では、G 2 /M 期の細胞の割合が

皮膚有棘細胞癌においても G 2 /M 期のミトコンドリアの多くなっており、さらに phospho histone H 3 の発現レベ分裂に関与しており、DRP 1 の欠損あるいは阻害によってルから、G 2 期における細胞周期の停止と考えられた（図 7）。

分裂不全となることが示唆された。

3 . 3 . Drp1の欠損は、長いミトコンドリアネットワーク
を誘導する

3 . 4 . MAPK 経路によりDrp1 は活性化する
DRP 1 は増殖シグナルの一つである MAPK 経路を介しMitotracker（Thermo Fisher Scientific）
をもちいてミトて活性化するという既報告がある 2）。そこで、私たちも皮コンドリアの形態学的評価を実施した。その結果、DRP 1

膚有棘細胞癌において MAPK 経路について観察したとこのノックダウン細胞および DRP 1 阻害剤を加えた細胞でろ、経路の上流に位置する MEK 阻害剤を添加すると、そは、コントロールに比べて長いネットワーク構造を呈したの下流にある ERK と同調して DRP 1 のリン酸化 Ser 616 が

図7

DRP1 ノックダウンによって、G2/M 期での細胞周期の停止が認められる（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017 を改変）。

図8

DRP1 ノックダウンによってミトコンドリア形態が変化する（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

− 166 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する阻害された。この結果から、DRP 1 は MAPK 経路を介し

ろ、DRP 1 の KD 群では、有意に細胞の増殖が抑制された。

て活性化されることが解明された（図 9）。

同様に、DRP 1 阻害剤を腫瘍内に局所注射した、腫瘍の動態を観察したところ、DRP 1 阻害剤添加により、腫瘍の増3 . 5 . 異種皮下移植モデルにおいて有棘細胞癌の細胞増殖は Drp1 欠損により抑制される

殖が抑制された（図 10 ‒ 12）。

4 . 考察・まとめ

ヌードマウスの皮下に皮膚有棘細胞癌 DJM 1 細胞を投与して異種移植を行い、腫瘍の動態について観察したとこ

本研究では、皮膚有棘細胞癌では、他の癌種でも報告されているように、DRP 1 は細胞の増殖、細胞周期、ミトコ
ンドリアの分裂などを調整していることが分かり、有棘細胞癌の新規治療ターゲット分子の候補となりうる可能性が示唆された（図 13）3）。
肺癌、転移性乳癌、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、膵臓癌、および黒色腫を含むいくつかの癌の細胞において、DRP 1の高発現または活性化の更新が観察されている。例えば、
Rehman らは、DRP 1 の喪失は肺癌細胞増殖の減少および自発的アポトーシスの増加をもたらすことを報告した 4）。

図 9 MEK 阻害剤によって DRP1 のリン酸化が抑制される（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）を改変。

図 11 DRP1 ノックダウン腫瘍細胞は生体内でも細胞増殖が抑制された（ 腫瘍体 積）（J Dermatol Sci, 88; 298–
307, 2017）。

図 10 異種皮下移植後の組織抽出物を用いた、免疫ブロット法（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）

図 12 DRP1 ノックダウン腫瘍細胞は生体内でも細胞増殖が抑制された（腫瘍重量）（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

図 13 皮 膚 有 棘 細 胞 癌における DRP1 の 機 能（模 式 図 ）（JDermatol Sci, 88; 298–307, 2017 から改変）− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

また、Inoue‒Yamaguchi らは、DRP1 の消失が結腸癌におけ5）るアポトーシスを増加させることを示した 。皮膚科領域
においては、リン酸化された Drp 1 S 616 は BRAFV 600 E
メラノーマの発生率と相関し、DRP1 の阻害はBRAFV 600 E
6）メラノーマ細胞の生存を抑制することが報告されている 。

（引用文献）
1） Koshiba T, Detmer SA, Kaiser JT, Chen H,
McCaffery JM, Chan DC: Structural
basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes.
Science 305: 858‒862, 2004.

さらに、DRP 1 活性化機構としては、2 つの独立した研究

2） Kashatus JA, Nascimento A, Myers LJ, Sher A,

グループが、Ras‒MAPK シグナル伝達が DRP 1 活性を調

Byrne FL, Hoehn KL, Counter CM, Kashatus DF:

4）

節することを報告した 。皮膚有棘細胞癌では、EGFR は

Erk2 phosphorylation of Drp1 promotes mitochondrial

過剰発現しており、予後不良と相関する 。EGFR は、

fission and MAPK‒driven tumor growth. Mol Cell 57:

Ras‒MAPK の主な活性化因子の 1 つとしても知られてお537‒551, 2015.

7）

り、EGFR‒Ras‒MAPK シグナル伝達は、皮膚有棘細胞癌

3） Kitamura S, Yanagi T, Imafuku K, Hata H, Abe R,

における DRP 1 活性化を調節するための重要な経路である

Shimizu H: Drp1 regulates mitochondrial morphology

可能性が高い。

and cell proliferation in cutaneous squamous cell

ミトコンドリア分裂は、細胞周期停止およびアポトー

carcinoma. J Dermatol Sci 88: 298‒307, 2017.

シスを促進する機構に関連している 。細胞周期において、

4） Rehman J, Zhang HJ, Toth PT, Zhang Y, Marsboom

Drp 1 Ser 616 は主に S 期初期にリン酸化され、ミトコンド

G, Hong Z, Salgia R, Husain AN, Wietholt C, Archer SL:

リア分裂促進に至り、細胞を G 2 /M に移行させる。報告

Inhibition of mitochondrial fission prevents cell cycle

では、DRP 1 の喪失がミトコンドリアの過剰融合を誘導し、

progression in lung cancer. FASEB J 2 6: 2 1 7 5‒2 1 8 6,

8）ATM 依存性の G 2 /M 停止およびアポトーシスを引き起こ2012.

すとされている。今回の私たちのデータは、これまでの研

5） Inoue‒Yamauchi, A. and Oda, H. Depletion of

究結果と一致しており、皮膚腫瘍においても同様の細胞機

mitochondrial fission factor DRP1 causes increased

構があることが考えられた。

apoptosis in human colon cancer cells. Biochem

DRP 1 はまた、いくつかの悪性腫瘍における予後因子とBiophys Res Commun 421: 81‒85, 2012.

なる可能性がある。Chiang らは、DRP 1 の核発現が肺腺

6） Wieder, SY, Serasinghe MN, Sung JC, Choi DC,

癌の不良予後と相関することを報告している 9）。我々の研Birge, MB, Yao JL, Bernstein E, Celebi JT, Chipuk JE:

究では、DRP 1 の発現レベルは、皮膚有棘細胞癌の病期のActivation of the mitochondrial fragmentation protein

進行と相関していた。 DRP 1 の免疫染色スコアと分化度

DRP1 correlates with BRAF（V6 0 0E）melanoma. Jとの間に相関関係に有意差はなかったが、相関の負の傾向

Invest Dermatol 135: 2544‒2547, 2015.

は P= 0 . 08 として示された。DRP 1 の発現レベルも、有棘7） Cañueto J, Cardeñoso E, García JL, Santos-Briz Á,

細胞癌において、低分化病変よりも分化した病変の方が低Castellanos-Martín A, Fernández‒López E, Blanco

かった。

Gómez A, Pérez‒Losada J, Román‒Curto C: Epidermal

私たちは、DRP 1 が皮膚有棘細胞癌における「細胞増殖・

growth factor receptor expression is associated with

アポトーシス・細胞周期」の重要な分子であることを示しpoor outcome in cutaneous squamous cell carcinoma.

た。今後、DRP 1 の正常皮膚組織における解析を進めたい

Br J Dermatol 176: 1279‒1287, 2017.
8） Zhao J, Zhang J, Yu M, Xie Y, Huang Y, Wolff DW,  

と考えている。

Abel PW, Tu Y: Mitochondrial dynamics regulates
謝

辞migration and invasion of breast cancer cells.

本研究はコスメトロジー研究振興財団の助成を得て実施いたしました。深く感謝いたします。

Oncogene. 32: 4814‒4824, 2013.
9） Chiang YY, Chen SL, Hsiao YT, Huang CH, Lin TY,
Chiang IP, Hsu WH, Chow KC: Nuclear expression of
dynamin‒related protein 1 in lung adenocarcinomas.
Mod.Pathol 22: 1139‒1150, 2009.

− 168 −

表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発
大阪大学大学院薬学研究科

渡利彰浩

The tight junction (TJ) is responsible for the epithelial barrier function of the skin. A TJ is composed of membraneproteins such as claudins, occludin, and ZO- 1 . It has previously been thought that only the stratum corneum is responsible
for skin barrier function; however, knock-out mouse analysis has shown that claudin- 1 is essential for skin barrier
function. Furthermore, other TJ components including claudin- 4 and occludin also contribute to the skin TJ-barrier.
Homoharringtonine (HHT) is an alkaloid derived from the evergreen tree Cephalotaxus harringtonia. HHT reduces intestinal
epithelial barrier function by inducing a change in the expression and localization of TJ components. However, the effect of
HHT on the skin TJ barrier remains unclear. In the present study, we investigated HHT’s influence on the skin TJ barrier andthe compound’s potential to enhance transdermal absorption. HHT decreased transepithelial membrane electrical resistance(TEER) values and enhanced the paracellular flux of FD- 4 in NHEK cells in a dose-dependent manner. The protein
expression of TJ components such as claudin- 1 , claudin- 4 , and occludin was decreased by HHT in NHEK cells. HTT also
reduced the expression of TJ components that are important for construction of the skin TJ barrier, including claudin- 1 ,claudin- 4 , and occludin. Examination of the transdermal absorption-promoting activity of HHT in vivo showed that theamount of FD-4 absorbed over 24 h of treatment was increased by HHT in a dose-dependent manner. A time-course of FD-4
absorption indicated that HHT increased the amount of FD- 4 absorbed starting after about 6 h of treatment. Analysis using
model dextrans showed that compounds with molecular weights of up to 10 , 000 were absorbed. These findings indicatedthat HHT acts on the epidermal TJ barrier and may serve as a novel transdermal absorption-promoting agent that permits thepassage of high-molecular-weight drugs such as biopharmaceuticals.

1. 緒

た経皮吸収促進法の開発はほとんど行われていないのが現

言

状である。

昨今の皮膚生理学の進展に伴い、しみやそばかすの要因

当グループはこれまでに、アルカロイドの一種であるや老化に伴うしわなどの生成メカニズムが明らかになって

Homoharringtonine（HHT）が TJ 構成タンパク質である

きており、色素沈着を阻害する物質、抗酸化物質、コラー

CLDN の発現低下や局在変化を誘導することで、腸管上皮

ゲン合成促進物質などが美白成分やアンチエイジング成分

細胞のバリア機能を低下させることを見出している 3）。しとして注目されている。これら有効成分の効果を十分に発かしながら、HHT による表皮 TJ バリア機能制御活性に関揮させるには、皮膚内の作用部位（皮下に存在するメラノ

しては明らかにされていない。そこで本研究は、HHT に

サイトや真皮領域など）まで到達させなければならず、単よる表皮 TJ バリア制御活性の解析、ならびに化粧品有効に皮膚表面に塗布しただけでは目的部位に浸透する割合は成分を見据えた高分子モデル物質の in vivo 経皮吸収活性極めて低い。表皮は大まかに角質層と生きた表皮細胞層かの検証を行うことで、メラノサイトや真皮領域に対して効らなり、生きた表皮細胞層の顆粒層には、隣接する細胞間率的に各種有効成分を送達する経皮吸収促進技術の基盤研に密着結合（タイトジャンクション：TJ）が形成され、TJ究を行った。

により細胞間隙をシールすることで生きた表皮細胞層での2. 方

物質透過が制限されている。近年、TJ を構成する膜タン
パク質 claudin（CLDN）が表皮 TJ バリアの中心的な役割を担うことが明らかとなり

1 , 2）

法

ヒト表皮細胞であるNormal Human Epidermal Keratinocytes、表皮 TJ バリアを制御するこ（NHEK）細胞を用い、HHTの表皮TJバリア制御活性を検証とによる経皮吸収促進法開発の可能性が提唱されている。

するため、TJ バリア機能を評価する方法として汎用されしかしながら、角層バリアを克服するための技術は多く開ている膜電気抵抗値（transepithelial electrical resistance,

発されているのに対し、表皮 TJ バリア制御に焦点を当てTER）の測定、ならびにトレーサー分子の細胞間隙透過性を評価する tracer flux assay を行った。また、HHT の細胞傷害性を評価するため LDH release assay を行った。

Development of transdermal penetration
enhancer by regulating epidermal tightjunction barriers
Akihiro Watari
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Osaka University

HHT 作 用 時 の 細 胞 間 接 着 分 子 へ の 影 響 は、Western
Blotting 法により検証した。HHT を作用させた際のマウス皮膚での TJ 構成タンパク質への影響を組織免疫染色法
により検証した。

− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

3. 結にこの際、Top側に添加した 4kDaのFITC‒dextran（FD‒4）

果の Bottom 側への移行量を測定した。Tracer flux assay の3 . 1. Homoharringtonineの上皮バリア制御能の検証

結果、TER assay の結果と相関して、HHT を添加した細HHT の表皮 TJ バリア制御活性を検証するため、膜電気胞群では、Control に比べ細胞間隙透過性の亢進が認めら抵抗値（TER）および細胞間隙透過性の評価を行った。

れた（Fig. 1 b）。また、LDH release assay により、HHT

TER assay の結果、HHT を 24 時間作用させた時点での添加時の細胞傷害性を確認したところ、バリア機能低下がTER 値が HHT 濃度依存的に低下していた（Fig. 1 a）
。さら

観察された HHT 濃度においても傷害性は認められなかった（Fig. 1 c）。以上の結果から、HHT は NHEK 細胞において細胞傷害性を示すことなく、TJ バリア減弱作用を示し、細胞間隙透過性を亢進することが明らかとなった。

3 . 2 . HHTによる細胞間接着分子への影響の検証
NHEK 細胞における HHT の TJ バリア抑制能が示された た め、HHT 作 用 時 の 細 胞 間 接 着 分 子 へ の 影 響 をWestern Blotting 法により検証した。腸管バリア機能に関する検討において発現が低下していた CLDN‒ 1、‒ 4、または TJ 構成タンパク質の一つである Occludin（OCLN）、
CLDN や OCLN の裏打ちタンパク質である ZO‒ 1、上皮組織における接着装置の一つである Adherens junction の主
要構成因子の E‒Cadherin について検討を進めた。その結果、CLDN‒ 1、CLDN‒ 4、OCLN の発現低下が確認された。
一方、ZO‒ 1 や E‒Cadherin の発現低下は確認されなかった（Fig. 2）。以上の結果から、HHT によるバリア機能減弱
Fig. 1a, b NHEK 細胞における HHT の上皮バリア制御活性の検証(a) NHEK 細胞における HHT による膜電気抵抗値の変化(b) NHEK 細胞における HHT による FD-4 の細胞間隙透過性の変化
NHEK 細胞を transwell plate に播種。細胞がコンフルエントに達してから、l.8mM CaCl2 を含む培地に交換し、さらに 2 日間培養。(a) 0, 10, 50, 100nM の HHT を添加 24 時間後の TERを測定。(b) 0, 10, 50, 100nM の HHT 添加 24 時間後、FD-4
を Top 側に添加し、1 時間インキュベーション後、Bottom 側の培地中に含まれる FD-4 の濃度を測定。Data are means ± SD
（n=3），*P < 0.05 vs. vehicle treated groups.（Dunnett's test）

Fig. 1c NHEK 細胞における HHT の上皮バリア制御活性の検証(c) LDH release assay
Transwell の Top 側、Bottom 側 に ０ , 10, 50, 100nM のHHT を 添 加。24 時 間 後、 非 処 理 群 の Top 側 を 0.2%
Tween-20 に調節した培地に交換。15 分後、全ウェルの Top
側より 1µL を 96-well plate に移し、PBS で 50 倍に 希 釈後、培地中の LDH を検出。

時において、細胞接着分子の中でも TJ 構成因子の発現が低下していることが確認された。

3 . 3 . HHTによるモデル分子の経皮吸収促進活性の評価
表皮細胞を利用した検証により、HHT の上皮バリア制
御能が確認されたため、マウス皮膚での HHT による経皮吸収促進活性の評価を行った。まず、異なる濃度の HHTを作用させた際のマウス皮膚から吸収された血漿中蛍光基
質濃度を調べた。本検証では HHT による表皮 TJ バリアへ

Fig. 2 HHT 作用時の細胞間接着分子発現への影響
50nM の HHT を 添 加 24 時 間 後、SDS page を 行 い、
CLDN-1、CLDN-4、OCLN、ZO-1、E-Cadherin、㌼-actinの抗体を用いて、Western Blotting 解析を行った。

− 170 −

表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発の影響を確認するため、除毛 5 日後に Tape–stripping を 8ころ、皮膚障害性は見られず（Fig. 4）、約 2 週間後には再回行うことにより角質層は除いた C 57 BL/ 6 J ♂ 7 週齢マび体毛が生え変わることも確認された（data not shown）。

ウスの皮膚に貼付体を貼付することにより評価を行った。

Tape‒stripping により角質を除去したマウスの皮膚かHHT（0 mM、0 . 1 mM、0 . 5 mM、1 mM）を作用させてら、HHT の作用により 4 kDa のトレーサーの吸収促進活

0 時間から 24 時間までの FD‒ 4 吸収量を比較した結果、性が確認されたことから、次に、HHT によりどの程度の濃度依存的な AUC の増加が確認された（Fig. 3 a）。この際、サイズのトレーサーが吸収促進できるのかについて検証を

1 mM の HHT 作用マウスにおいて経時的に血漿中蛍光基行った。モデル分子として分子量 4 , 000、10 , 000、20 , 000

質濃度を測定したところ、Tape‒stripping の影響で貼付直（FD‒ 4、FD‒ 10、FD‒ 20）のトレーサーを用い、1 mM の後の吸収増加も確認されるが、貼付約 6 時間後以降に吸収

HHT に よ る 皮 膚 か ら の 吸 収 量 を 調 べ た。 そ の 結 果、量が上昇することが確認された（Fig. 3 b）
。また、HHT を

Control 群と比べて、分子量 10 , 000 までのトレーサー分子作用させて 24 時間後のマウスの皮膚の様子を観察したとが有意に吸収されることが確認された（Fig. 5）。

Fig. 3

HHT によるマウス経皮における FD-4 吸収促進活性(a) HHT 濃度別における FD-4 貼付 24 時間の AUC の比較(b) FD-4 貼付 24 時間までの血漿中蛍光基質濃度の推移
除毛 5 日後、Tape-stripping を 8 回行い、20mg/mL FD-4 を貼付体に染み込ませ皮膚に貼付。0, 1,
3, 6, 12, 24 時間において血漿中蛍光基質濃度を測定。Data are means ± SE（n=6），*P < 0.05 vs.
vehicle treated groups.（Dunnett's test）

Fig. 4

HHT 作用後の皮膚の状態

除毛 5 日後 Tape-stripping を 8 回施行し、HHT を 24 時間作用させた後のマ
ウスの皮膚の様子。

Fig. 5

HHT による各分子量の蛍光基質の吸収量

除毛 5 日後、Tape-stripping を 8 回行い、貼付体にlmM の HHT を含む薬液を染み込ませ、24 時間作用させた。 各 蛍 光 基 質（FD-4、-10，-20） はそれぞれ20mg/mL 含有。０, 1, 3, 6, 12, 24 時間において蛍光基質濃度を測定し、AUC を算出。Data are means± SE（n=6），*P <0.05 vs. PBS treated groups.
（Student t-test）− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 4 . HHTによる表皮 TJ 構成タンパク質への影響

600 程度のトレーサー分子を皮下に注入すると、野生型マ

HHT によるマウス表皮組織でのバリア機能低下作用に

ウスでは、細胞間隙を透過したトレーサー分子が TJ の存

ついてメカニズムを探るために、HHT を作用させた際の在部分でとどまるのに対し、CLDN‒ 1 KO マウスでは表皮TJ 構成タンパク質への影響を蛍光免疫染色法により検証

TJ バリアが破綻しているため、トレーサー分子が細胞間した。ヒト表皮細胞での Western Blotting 解析による検証

隙を透過し、TJ を超え、角質層まで移動することが報告において発現低下が確認された CLDN‒ 1、CLDN‒ 4 につされている 1）。この報告をうけ、HHT を作用させたマウ

いて解析を進めた。その結果、CLDN‒ 4 の発現量や局在スの皮膚でのトレーサー分子の透過性を観察した。その結の変化は観察されなかった。一方、CLDN‒ 1 の局在に変果、Control 群と比べて、HHT を作用させたマウスの表皮化は見られなかったが、顆粒層での発現量が低下しているでは、トレーサー分子が TJ を超え角質層付近まで透過しことが確認された（Fig. 6）。以上の結果から、HHT が表皮ている領域が多くみられたことから、TJ バリア領域におバリア機能を低下させるメカニズムとして、CLDN‒ 1 のけるトレーサー分子の透過率が増加していることが確認さ

発現量低下が関与することが示唆された。

れた（Fig. 7）。以上の結果から、HHT により CLDN‒ 1 の発現が低下することで、上皮バリア機能が抑制され、上皮

3 . 5 . HHTによる経皮透過作用の検証

透過性が上昇していることが示唆された。

これまでの上皮バリアに関する研究において、分子量

Fig. ６ HHT による CLDN-1、CLDN-4 への影響
除 毛 5 日 後、Tape-stripping を 8 回 行 い、PBS（10% DMSO） ま た は 1.0 mM（10%DMSO）HHT を 24 時間作用させた。薬液を作用させた箇所の皮膚組織を回収し、凍結切片を作製した。CLDN-1、CLDN-4 の 1 次抗体、２次抗体 Cy®3 を用いて免疫染色を行った。

Fig. 7

HHT による上皮透過性への影響

生後 2日の新生児マウスにTape-strippingを3 回行い、PBS（10% DMSO）
または1.0 ｍM（10%DMSO）HHTを 24 時間作用させた。貼付体除去後、10 mg/mL の biotinを含む薬液（1 ｍ M
CaCl 2 含）を 50 µL 皮下に投与し、30 分間インキュベーシヨンした。薬液を作用させた箇所の皮膚組織を回収し、凍結切片を作製した。OCLN の 1 次抗体、２次抗体 FITC（OCLN に対して）、Strepttavidin, Alexa Fluor® 555 conjugate（biotinに対して）を用いて免疫染色を行った。

− 172 −

表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発

4. 考とにより、体内への吸収量の調整なども可能であると考え

察

られる。

本研究では、HHT による表皮 TJ バリア制御能を検討す

本研究では HHT の表皮 TJ バリアへの影響を検証するたることで、表皮 TJ の経皮透過における重要性を検証し、め、除毛 5 日後、Tape‒stripping を 8 回行うことにより角

表皮 TJ バリアに焦点を当てた新規経皮吸収促進法開発の質層は除いた皮膚において検証を進めている。今後、より可能性を探るため、in vitro および in vivo における HHT

実用的な非侵襲性投与法として応用するためには、角質層の経皮吸収促進活性の検証、また、HHT 作用時の TJ 構成

バリア透過を可能にする技術と併用する必要がある。例え

タンパクの変動の検証を行った。

ば、透過させたい薬物によって、Azone やエタノールなど

ヒト表皮細胞である NHEK 細胞を用い、TER assay おの化学的吸収促進、イオントフォレシスやソノフォレシス

よび tracer flux assay を行った結果、HHT 濃度依存的ななどの物理的吸収促進法等 4 , 11 , 12）との最適な組み合わせを

TER 値の低下、および細胞間隙透過性が亢進していたこ

検証していく必要がある。

とから、HHT は表皮 TJ バリア制御活性を示すことが明ら4. 総かとなった。また、この際、HHT による細胞間接着分子

括へ の 影 響 を Western Blotting 法 に よ り 解 析 し た 結 果、

本研究では、表皮バリア機能の中でも表皮 TJ バリアに

HHT は CLDN‒ 1 をはじめとした TJ 関連分子の発現低下着目し、表皮 TJ の経皮透過における重要性の検証、また、を誘導することが確認されたため、HHT による表皮 TJ バ

HHT による経皮吸収促進活性、および TJ 構成タンパク質

リア機能の低下は TJ 構成タンパク質の変動によるものでへの影響を検証した。本研究で得られた最も重要な知見は、あると考えられる。続いて、角質層を除いたマウス皮膚に

HHT が CLDN‒ 1 の発現量を低下させることにより表皮 TJ

おいて、HHT による経皮吸収促進活性を評価したところ、バリア機能を抑制すること、また、化粧品有効成分の経皮

分子量 4 , 000 のモデル分子が皮膚から吸収され、血中にま吸収促進活性を示す可能性が示唆されたことである。本研

で移行することが明らかとなった。この際、分子レベルで究では、TJ 構成タンパク質においてのみ、発現の影響のの影響を検証するため、免疫染色法による解析を行ったと検証を行ったが、今後は、HHT を作用させた際の TJ 構成

こ ろ、HHT を 作 用 さ せ た マ ウ ス の 皮 膚 に お い て、タンパク質以外の分子への影響の検証、また、HHT の分

CLDN‒ 1 の 発 現 量 減 少 が み ら れ た。 以 上 の 結 果 よ り、子レベルでの作用機序の解明等さらに詳細な検証を進めてHHT の表皮 TJ バリア制御活性により高分子量の薬物が透いく必要がある。本研究により得られた成果は、皮膚バリ

過可能であることが示された。

ア機能において重要な表皮 TJ バリアに関する基礎知識の続いて、HHT による経皮吸収促進が可能な分子量の検蓄積に資するのはもちろんのこと、近年開発が進んでいる証を行ったところ、分子量 10 , 000 までのトレーサー分子

美白成分やアンチエイジング効果を示す機能性ペプチドやの有意な経皮吸収促進活性が確認された。通常、皮膚は分

既存の有効成分の皮膚内への効率的な送達法開発に繋がる

子量 600 以下のものであれば通過するとされているが可能性を有し、コスメトロジーの分野に貢献するものと期

4 ‒ 6）、

Tape‒stripping を 行 っ た 皮 膚 で は、HHT に よ り 分 子 量待される。

10 , 000 までのトレーサーの吸収が可能であり、低分子医
薬品（分子量 500 以下）やペプチド（分子量 500 ‒ 2 , 000 程（引用文献）度）、
またはタンパク質製剤（分子量 10 , 000 ‒ 30 , 000 程度）や、

1）Furuse M. et al., Claudin–based tight junctions are

核酸医薬品（分子量 3 , 000 ‒ 10 , 000 程度）の一部などのバイ

crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson

オ医薬品を経皮吸収促進する活性を有すると考えられる。

from claudin‒1‒deficient mice., J Cell Biol., 1 5 6（6），

経 皮 吸 収 量 の 経 時 的 変 化 を 検 証 し た 結 果、Tape‒1099‒111, 2002.

stripping の影響で貼付後すぐの吸収も見られるが、HHT

2） Nakajima M. et al., Claudin–1 Binder Enhances

を貼付してから 6 時間以降で有意な吸収促進効果がみられEpidermal Permeability in a Human Keratinocyte

たことから、HHT による吸収促進効果が示されるまでにModel., J Pharmacol Exp Ther., 354（3），440‒7, 2015.

は数時間を要することが分かった。この理由として、TJ

3） Watari A. et al., Homoharringtonine increases

構成因子のターンオーバーが関わっていると考えられる。

intestinal epithelial permeability by modulating specific

HHT は、タンパク質翻訳阻害活性をもつことが知られてclaudin isoforms in Caco‒2 cell monolayers., Eur Jいる

7 ‒ 10）。HHT が TJ 構成タンパク質の翻訳を阻害し、TJ

Pharm Biopharm., 89:232‒8, 2015.

構成因子の発現低下が認められるまで数時間を要するため、

4）Barry B.W., Novel mechanisms and devices to enable

バリア抑制能を示すまでに約 6 時間かかると考えられる。

successful transdermal drug delivery., Eur J Pharm

今後さらに HHT 作用濃度や作用時間などの検討を行うこSci., 14, 101‒114, 2001.

− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20195）Mitragotri S., Immunization without needles., Nat Rev

Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban., 41.5, 485‒490,
2012.

Immunol., 5.12, 905‒916, 2005.
6）Han S., et al., Epidermal kinetics and skin condition: I.

1 0）Kantarjian, H. et al., Effectiveness of Homoharrinhtonine

Stripping technique for quantitating stratum corneum（omacetaxine mepesuccinate）for treatment of acuteturnover in hairless mouse skin., J.Toxicol‒Cut. &myeloid leukemia: a meta–analysis of Chinese studies., Chin,

Oculur Toxicol., 8, 539‒553, 1989‒1990.

Lymphoma Myeloma Leuk., 15, 13‒21, 2015.

7） Perdue, R. E., et al., Cephalotaxus–source of1 1）Veena K., et al., Investigation on the synergistic

harringtonine, a promising new amti–cancer alkaloid.,

effect of a combination of chemical enhancers andAmerican Horticultural Society., 49.3, 19‒22, 1970.

modulated iontophoresis for transdermal delivery of8）Baaske, D.M., and P. Heinstein., Cytotoxicity and cell

insulin., Drug Dveloopment and industrial Pharmacy.,
36 . 8 , 993 ‒ 1004 , 2010 .

cycle specificity of Homoharringtonine., Antimicrob.

12）Brown MB. et al., Transdermal drug delivery system:

Agents Chemother., 12, 298‒300, 1997.
9）Shen, J. P., et al., Cytotoxicity of Homoharringtonine

skin perturbation devices., Methods Mol Biol., 4 3 7 ,on leukemic stem–like cells in AML cell line KG‒1.,

119 ‒ 39 , 2008 .

− 174 −

化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用に関する
行動経済学的アプローチ
広島大学大学院総合科学研究科

有賀敦紀

Faces with light makeup are consistently perceived more attractive as compared to those with heavy makeup or those
without makeup. Given behavioral economic research, however, human judgment regarding the attractiveness of others
depends on the visual similarity among them. This study examined whether an evaluation of the attractiveness would dependon the visual similarity based on the degree (no/light/heavy) of makeup among target faces. In Study 1 , I made stimulus
images comprising no-makeup, light-makeup, and heavy-makeup women. For these images, participants correctly perceived
the degree of makeup, and furthermore evaluated the light-makeup women as more attractive than the heavy-makeup or nomakeup women. In Study 2 , I manipulated the social context based on the visual similarity of the degree of makeup. Morespecifically, two light-makeup women and 1 heavy-makeup woman were simultaneously displayed under a light-makeupdominant condition; that is, two light-makeup women were similar to one another with respect to the degree of makeup. On
the other hand, under a heavy-makeup dominant condition, two heavy-makeup women and 1 light-makeup woman weredisplayed. Participants were required to choose the most attractive women among those targets. Under the light-makeupdominant condition, participants chose the light-makeup woman more likely than the heavy-makeup woman, whereas theheavy-makeup woman was chosen more likely than the light-makeup woman under the heavy-makeup-dominant condition.
These results suggest that the attractiveness judgment does not depend merely on the degree of makeup, but also on thevisual similarity (or social context) based on the degree of makeup.

1. 緒

近年の行動経済学では，人間の価値評価は対象の絶対評

言価ではなく，社会的文脈（選択肢間の類似性）に依存した相化粧の濃さは観察者の印象形成に大きな影響を与える。

対評価にしたがうことが指摘されている。例えば，A，B，

例えば，日本人を対象とした最近の認知心理学的研究では，

C の三つの選択肢を用意し，そのうち二つの選択肢（A，B）

薄化粧の人物は厚化粧やノーメイクの人物に比べてポジテが視覚的に類似している場合，人間はその比較しやすい二1）

ィブな印象形成を促す 。同様の傾向は海外においても見つに注目して相対的な価値評価を行う。結果として，残さられ，薄化粧の人物は厚化粧の人物に比べて魅力的に評価れた選択肢（C）は評価対象にならず，その価値は実際より。さらに，厚化も低く見積もられる 4）。これにしたがえば，薄化粧が流行

粧によって高められた信頼性や魅力は観察時間が長くなる

している現代では，化粧の濃さの側面で互いに類似していにつれて低下するが，薄化粧によって高められた印象は観る薄化粧の人物のみが（上述した例の A，B のように）比較されることが一貫して報告されている

2 , 3）

2）

察時間に依存せず一定であることもわかっている 。つま評価対象とされ，厚化粧の人物は（上述した例の C のようり，現代社会において薄化粧は，厚化粧やノーメイクと比に）評価対象になっていないと考えられる。そして，厚化較してポジティブな印象を観察者に対して持続的に与える。

粧の人物の魅力が低く見積もられた結果，薄化粧の人物の化粧が魅力を高める理由として，先行研究では修正効魅力が高くなっているのかもしれない。つまり，薄化粧の3）

果が指摘されている 。化粧品を使うことによって顔立ち人物が多い現代の社会的文脈は，厚化粧の人物にとっては（配色や肌質，形など）を適切に修正することができるため，不利な環境であると言える。逆に言えば，化粧の濃さに基顔の魅力が高まるという主張である。しかし，もし修正効づいて社会的文脈を操作することができれば，厚化粧の人

果のみが魅力を高める要因になっているのであれば，修正物を薄化粧の人物よりも魅力的に見せることが可能になる量の多い厚化粧の人物の魅力がもっとも高くなるはずであと推測される。

る。したがって，薄化粧の人物の魅力が高くなる要因とし本研究では，薄化粧の人物の魅力評価が高くなる一つの要因として，社会的文脈（化粧の濃さに基づく視覚的類似て，修正効果以外の要因を検討する必要がある。

性）に注目した。これまでのコスメトロジーでは，主に単独の他者に対する観察者の印象が測定されたが，現実場面
A behavioral economic approach to theeffects of makeup-based social contexts
on attractiveness judgement
Atsunori Ariga
Graduate School of Integrated Arts andSciences, Hiroshima University

では複数の他者が同時に存在する。それならば，社会的文脈（化粧の濃さに基づく他者間の視覚的類似性）が価値評価に影響を与えるはずである。本研究は上述した行動経済学的知見をコスメトロジーに応用し，「化粧の濃さによって他者間の視覚的類似性（社会的文脈）が生まれ，それが循環− 176 −

化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用に関する行動経済学的アプローチ

的に個々の魅力評価を歪める」と考え，この仮説を検証すいて化粧が有意に濃いと評定された。なお，実験参加者のることを目的とした。

性別による結果の違いは認められなかった。これらの結果
は，実験参加者は男女ともに化粧の濃さを正確に認知して

2 . 研究１：刺激の妥当性の検討
2 . 1. 方いたことを示しており，本研究で使用する画像において化法

粧の濃さが適切に操作されていることが確認された。

まず 9 名の女性モデル（平均年齢 20 . 4 歳，標準偏差 1 . 0）

続いて，評定された魅力について同様の分析を行ったとのノーメイクの顔を正面から撮影した。次に，モデル自身

ころ，化粧の濃さの主効果が有意であった。多重比較の結の判断で薄化粧，厚化粧をしてもらい，その顔を正面から

果，薄化粧画像がノーメイク画像や厚化粧画像よりも有意撮影した。計 27 枚（ノーメイク画像 9 枚，薄化粧画像 9 枚，に魅力的であると評価された。なお，実験参加者の性別に厚化粧画像 9 枚）のカラー画像を本研究で用いる刺激としよる結果の違いは認められなかった。これらの結果は，薄た。すべての顔は中立表情であり，服装は写っていなかっ化粧の人物はノーメイクや厚化粧の人物よりも魅力的な印た。各画像は 12 . 01 × 8 . 39 cm であった。刺激はパソコン

象を与える，という先行研究 1 ‒ 3）の結果と一致するもので画面上に呈示された。視距離は約 50 cm であった。

あった。

実験参加者（女性 19 名，男性 20 名，平均年齢 19 . 5 歳，
標準偏差 1 . 4 歳）は画面に 1 枚ずつ呈示された顔画像の化
粧の濃さについて 6 件法（ 1＝ノーメイク，6 ＝厚化粧）で回答した。加えて，顔画像の魅力について 4 件法（ 1＝全

3 . 研究２：化粧の濃さに基づく視覚的類似性が人物の魅力に与える影響
3 . 1. 方法

く魅力的でない，4 ＝非常に魅力的）で回答した。呈示さ

研究 1 で作成した薄化粧画像と厚化粧画像の計 18 枚のれた顔画像は，27 枚の画像からランダムに選択された 9

画像を刺激として用いた。これらの中から，3 枚の画像を枚であった。ただし，9 枚の内訳はノーメイク 3 枚，薄化

ランダムに選択して横一列に並べた。このとき，3 枚の画

粧 3 枚，厚化粧 3 枚になるようにし，かつ参加者内で同一像の化粧の濃さに基づいて二つの条件が設けられた。薄人物が繰り返し呈示されることがないようにした。参加者

化粧 2 人条件では，3 枚のうち 2 枚は薄化粧画像，残りのは 9 試行を行った。

1 枚は厚化粧画像であった。厚化粧 2 人条件では，3 枚のうち 2 枚は厚化粧画像，残りの 1 枚は薄化粧画像であった。

2 . 2 . 結果と考察

どちらの条件も，3 枚の画像は互いに異なる人物であった。

モデルの化粧の濃さ（ノーメイク画像，薄化粧画像，厚化粧画像）に基づいて平均評定値を算出し，図 1（評定さ

3 枚の画像の呈示位置は参加者間でランダムに操作された。
実験参加者（薄化粧 2 人条件：女性 58 名，男性 45 名，
平均年齢 18 . 7 歳，標準偏差 1 . 0 歳；厚化粧 2 人条件：女れた化粧の濃さ）と図 2（評定された魅力）に表した。
まず評定された化粧の濃さについて，1 要因 3（化粧の性 74 名，男性 77 名，平均年齢 18 . 8 歳，標準偏差 1 . 2 歳）濃さ）水準の分散分析を行った結果，化粧の濃さの主効果の課題は，紙上にカラーで印刷された 3 枚の画像に写ったが有意であった（有意水準は 5 %，以下の分析も同様）。多人物の中からもっとも魅力的だと思う人物を 1 名選択する

重比較の結果，ノーメイク画像よりも薄化粧画像は化粧がことであった。参加者は 1 試行を行った。

有意に濃いと評定され，薄化粧画像よりも厚化粧画像にお45評定された魅力評定された化粧の濃さ

6

4
3

3

2

2
1

ノーメイク画像
図1

薄化粧画像

1

厚化粧画像

各画像に対して評定された化粧の濃さ

ノーメイク画像
図2− 177 −

薄化粧画像

厚化粧画像

各画像に対して評定された魅力コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

各条件において，薄化粧の人物および厚化粧の人物を選択した割合を実験参加者の性別ごとに算出して，図 3 に表した。Χ 2 検定の結果，条件ごとの実験参加者の性別と各画像の選択率の間に有意な偏りが認められた。残差分析の結果，薄化粧 2 人条件では男性参加者，女性参加者ともに薄化粧画像の選択率（男性：60 . 0 %，女性：55 . 2 %）が期待値よりも有意に高く，厚化粧 2 人条件では女性参加者において厚化粧画像の選択率（71 . 6 %）が期待値よりも有意に高いことがわかった。男性参加者における厚化粧画像の選択率（62 . 3 %）と期待値の間に有意差はなかった。つまり，魅力的な人物として選択された人物の化粧の濃さは，同時に

厚化粧画像
薄化粧画像

（％）
100
魅力的な人物として選択された割合

3 . 2 . 結果と考察

80

60

40

20

呈示された他の人物の化粧の濃さに依存していた。これらの結果は，「化粧の濃さによって他者間の視覚的類似性（社0

会的文脈）が生まれ，それが循環的に個々の魅力評価を歪める」という本研究の仮説を支持するものであった。

男性参加者

女性参加者

男性参加者

薄化粧 2人条件

4 . 総合考察

女性参加者

厚化粧 2人条件

図 3 社会的文脈と実験参加者の性別ごとの各画像の選択率

本研究は行動経済学的知見をコスメトロジーに応用し，「化粧の濃さによって他者間の視覚的類似性（社会的文脈）

まれ，それが循環的に個々の魅力評価を歪める」という仮が生まれ，それが循環的に個々の魅力評価を歪める」と考説を支持するものであった。

え，この仮説を検証することを目的とした。まず研究１でただし研究 2 の結果は，実験参加者が評価対象となる画は，様々な化粧の濃さの刺激画像を作成し，その妥当性を

像をランダムに選択した結果である可能性も考えられる。

検討した。その結果，ノーメイク，薄化粧および厚化粧と薄化粧 2 人条件では薄化粧の人物が多く，厚化粧 2 人条件

いった化粧の濃さが適切に認知されていることが確認されでは厚化粧の人物が多かったため，それらの人物が偶然選た。さらに，薄化粧の人物がノーメイクや厚化粧の人物よ択される可能性が高かっただけかもしれない。しかし，研りも魅力的に評価されることがわかり，先行研究1 ‒ 3）と一究 2 は 1 試行だけの実験であり，実験参加者が適当に課題を行った可能性は低いと思われる。さらに，この可能性を致した結果が得られた。
次に研究 2 では，化粧の濃さに基づいて社会的文脈を操検討するために，研究 2 の各条件における実験参加者の性作し，それが魅力評価にどのような影響を与えるのかを調別ごとに二項検定を行ったところ，薄化粧 2 人条件では男べた。その結果，3 名のモデルのうち 2 名が薄化粧，1 名

性参加者，女性参加者ともに薄化粧画像の選択率はチャンが厚化粧の場合，薄化粧の人物が魅力的であると選択されスレベル（66 . 6 %）よりも有意に低かった。厚化粧 2 人条件る割合が高かった。一方，
3 名のモデルのうち 2 名が厚化粧，

では，男性参加者における厚化粧画像の選択率はチャンス

1 名が薄化粧の場合，厚化粧の人物が魅力的であると選択

レベルよりも有意に低かったが，女性参加者における厚化された割合が高かった。研究 1 および先行研究 1 ‒ 3）の結果

粧画像の選択率はチャンスレベルよりも有意に高かった。

にしたがえば，薄化粧の人物が一貫して魅力的であると評

いずれの条件でも選択率はチャンスレベルと解離していた価されたため，研究 2 のいずれの条件においても薄化粧のため，本研究の結果は，参加者が適当に課題を行った結果

人物の選択率が高くなることが予測された。しかし，実際を反映しているのではなく，化粧の濃さに基づく社会的文の選択率は化粧の濃さに基づく他者との視覚的類似性に依脈に応じて魅力評価を行っていたことを示唆するものであ存した。つまり，化粧の濃さが互いに類似している人物のると考えられる。今後は，3 名のモデル全員について魅力

中から魅力的な人物が選択された。これらの結果は，薄化評定を求める実験や，3 名のモデルのうち 1 名は選択対象

粧の人物がノーメイクや厚化粧の人物よりも常に魅力的ででない事態で研究２と同様の実験を行うことで，本研究のあると評価されるわけではないことを表している。化粧の主張を補強することができると考えられる。

濃さだけが魅力評価を決める要因ではなく，化粧の濃さに

5. 総

基づく社会的文脈も魅力評価に影響を与える一つの要因に括なっていると考えられる。
したがって，
本研究の結果は，「化

本研究では，これまで一貫して報告されてきた薄化粧の粧の濃さによって他者間の視覚的類似性（社会的文脈）が生

ポジティブな影響が，社会的文脈に依存したものであるこ− 178 −

化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用に関する行動経済学的アプローチとを示すことができ，化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用を明らかにすることができた。この成果は，コスメ
トロジーにおける学術的な知見の蓄積としての価値がある

謝辞本研究は，広島大学総合科学部の田中そらさんの協力のもと行われました。ここに謝意を表します。

だけでなく，マーケティング実務における化粧の濃さの戦略的利用，さらには流行を操作する際の手がかりになるこ（引用文献）
1）Tagai, K., Ohtaka, H., Nittono, H. Faces with light

とも将来的に期待される。
近年の日本では東日本大震災の自粛ムードが影響して，

makeup are better recognized than faces with heavy

薄化粧が流行していると言われている。本研究の結果に基makeup. Frontiers in Psychology, 7, 1‒8.（2016）．

づけば，その流行が少数の厚化粧の人の評価を歪めている

2）Etcoff, N. L., Stock, S., Haley, L. E., Vickery, S. A.,（実際よりも低下させている）と言える。つまり，化粧の濃House, D. M. Cosmetics as a feature of the extended

さを操作することで，薄化粧がさらに魅力的に映る社会的human phenotype: Modulation of the perception of

場面を戦略的に設計することが可能になると考えられる。

biologically important facial signals. PLoS ONE, 6,

同時に，薄化粧が流行している現在においても，厚化粧がe25656.（2011）．

魅力的に映る社会的場面を設計することも可能になると考3）Mulhern, R., Fieldman, G., Hussey, T., Lévêque, J.‒

えられる。

L., Pineau, P. Do cosmetics enhance female Caucasian

本研究の知見に基づけば，化粧の適切な濃さに関する科

facial attractiveness? International Journal of Cosmetic

学的なアドバイスを消費者に与えることが可能になるだろ

Science, 25, 199 ‒205.（2003）．

う。近年では男性が化粧をする場合もあるため，化粧の濃4）Ariely, D. Predictably irrational, Harper Perennial.

さ（あるいは有無）が形成する社会的文脈は，今後男性にお（2010）．

ける化粧文化の拡大に促進的に作用する可能性もある。

− 179 −

他者からの評価を推論するメカニズムがその人物に対する選好の形成に与える影響
サウサンプトン大学心理学部、日本学術振興会、北海道大学保健科学研究院

伊藤文人

In the present study, we investigated whether neural processes associated with valuation of faces were preceded by“being-liked” prediction which is associated with predicting other’s preference of the self (i.e., meta-perception). During
the fMRI, participants were asked to simply press a button when presented with photographs of opposite gender faces.
After the scanning, they were unexpectedly asked to perform three impression ratings for each face: 1 ) attractiveness, 2 )preference, and 3 ) willingness-to-talk (WTT) ratings. They were also asked to predict 4 ) the extent to which each person
thinks the subject is attractive, and 5 ) the extent to which each person likes the subject (i.e., being-liked prediction). A
factor analysis revealed that the former three types of ratings (i.e., impressions to others) and the latter two types of ratings(i.e., meta-perception) were classified into distinct factors. A mediation analysis showed a marginally significant mediation
effect for the association between attractiveness rating and preference rating. Parametric modulation analysis based onprincipal component score calculated from the data of the former three ratings showed significant positive correlation in
the ventromedial prefrontal cortex (vmPFC) (p < 0 . 001 uncorrected at peak, p < 0 . 05 FWE corrected at cluster level).
Parametric modulation analysis based on principal component score calculated from the latter two ratings also revealed
significant positive correlations in the vmPFC. Although preliminary, these results suggest that the vmPFC automaticallycodes belief about “being-liked” and subjective preference.

1. 緒える」機能に問題があることが示唆されており、この心理

言過程は医学的にも大きな注目を集めている。
興味深いことに、人にとって他者の存在は不可欠なものであり、「人の社会どちらの心理過程にも内側前頭前野の関与が示唆されてい。特に他者とるが 24, 25）、これらの心理過程はそれぞれの文脈において独の相互作用においてどのような認知・神経基盤が役割を果立に検討されることが多く、これらの心理過程に関連があたしているかについては心理学と脳神経科学の両面から多るのか、あるとしたらどのような関連があるのかに関するくの研究が報告されている。

神経科学的なエビデンスは非常に少ない。
「他者に対する主性」については多様な検討がなされてきた

1, 2）

他者との相互作用に関して特に注目を浴びてきた認知過観的な判断」と「他者からどういった印象を持たれそうか

程は２つに大別できる。１つ目は、他者の顔に対する好みの判断」のどちらの心理過程にも内側前頭前野が役割を果の評価など、自己が他者を評価する際に役割を果たす心理

たしているという過去の知見は、これらの心理過程が内側過程である

3, 6, 10）

。他者の顔を好みと感じると、内側前頭前前頭前野において互いに協働しながら「人の社会性」を支野の中でも特に腹側領域（腹内側前頭前野）の活動が上昇えている可能性を示唆しているものの、その詳細は未だ不することが報告されている。この領域は金銭報酬を得た際明である。そこで本研究では、行動実験と機能的磁気共鳴

や、ジュースを飲んだときにも賦活することが知られており、画像法（以下、fMRI）を組み合わせ、この２つの心理過程

全般的な報酬（主観的な好ましさ）の処理に関わっているにどのような関連があるか検討を行うことを目的とした。

ことが示唆されている領域である。２つ目は、「他者からど2. 方

ういった印象を持たれているか」といった、心の理論やメ法

ンタライジングと呼ばれる他者の視点に立って考える際に本研究における fMRI 撮影には、精神疾患および神経疾役割を果たす心理過程である 16, 22, 23）。この心理過程にも内患の既往がない健常若年成人 43 名（女性 21 名、男性 22 名、

側前頭前野が関わっていることが報告されている。発達障

平均年齢 20.39 歳、年齢範囲 20-23 歳）が参加した。全被害の一種である自閉症では、この「他者の視点に立って考験者に対し、ヘルシンキ宣言に基づいた本研究の主旨・内容・実験の安全性および被験者の権利に関する説明を行い、The effect of “being-liked prediction”
on valuation to others’ faces

書面による参加の同意を得た。なお、本研究は北海道大学
保健科学研究院倫理委員会の承認を得て実施したものである。

Ayahito Ito
Department of Psychology, Universityof Southampton. Japan Society for the
Promotion of Science. Department of
Health Sciences, Hokkaido University

事前に上記とは別の健常若年成人 86 名（女性 42 名、男性 44 名、平均年齢 21.97 歳、年齢範囲 20-28 歳）について顔写真の撮影を行った。86 名の参加者全員に対し、事− 180 −

他者からの評価を推論するメカニズムがその人物に対する選好の形成に与える影響

前に写真撮影の趣旨・内容・プライバシーの保護について

撮影終了後、被験者は改めて fMRI 撮影中に呈示された顔説明を行った。その後、全員から書面による参加の同意

写真を PC 画面上に呈示され、その人物がどれくらい魅力を得た。顔写真の撮影は顔が正面を向いた状態で、DMC-

的か（項目①）、その人物の顔がどれくらい好みか（項目②）、

FX7 を使用し行った。また、撮影時にはフラッシュを使その人物とどれくらい話したいか（項目③）どれくらい自用し、解像度は 1920 × 1080 とした。参加者には表情が分を魅力的だと思ってくれそうか（項目④）、どれくらい情動的にならないよう教示した。fMRI 撮影に参加した 43

自分を好きになってくれそうか（項目⑤）の５つの項目に名の被験者も同様に、この顔写真撮影に参加した。すなわ

ついて 7 段階で評定を行った。

ち、この手続きにより 63 名の女性の顔写真、66 名の男性

3. 結の顔写真を取得したこととなる。

果

fMRI 撮 像 は、 約 10 分 間 の ス キ ャ ン を 1 run 実 施 し

行動データの結果は図 1 のとおりである。fMRI 撮影後た。 刺 激 呈 示 お よ び 行 動 デ ー タ の 記 録 は Presentationの評定課題のデータについて、項目①②間および、項目（Neurobehavioral Systems, Albany, CA）を用いて行った。

③④間での t 検定を行った結果、項目③④間のみに有意な

fMRI 撮像中、被験者にはプロジェクターから異性の顔写差が認められた（p < 0.05）（図 1A）。次にこれら 5 種類

真が鏡を介して呈示された。刺激呈示時間は 2.0 秒であり、の評定値について因子分析を行ったところ、項目①〜③

各刺激間には固視点として白い十字を呈示した。固視点のと項目④〜⑤が大別されることが明らかとなった（図 1B

呈示時間は 3.0-9.0 秒間であった。被験者は、顔写真が呈&1C）。

示されたら、できるだけ早く人差し指でボタン押しをする

次に項目①を説明変数、項目②を目的変数、項目⑤をよう教示された。なお、この被験者は fMRI 撮像に先立ち、媒介変数とした媒介分析を実施した（表１）。この媒介

ボタン押しについて説明を受け事前練習を行った。fMRI

分 析 に は Jamovi（https://www.jamovi.org） を 使 用 し

A

C

B

図 1 行動データ
図 1A fMRI 撮像後の評定結果を示す。縦軸は評定値を表し、横軸（p01‒p05）はそれぞれ、①その人物がどれくらい魅力的か、②どれくらい自分を魅力的だと思ってくれそうか、③どれくらい自分を好きになってくれそうか、④その人物の顔がどれくら
い好みか、⑤その人物とどれくらい話したいか、と対応している。各クロスは各被験者における平均値を表している。
図 1B & C 因子分析の結果を示す。第一因子（Component1）
は項目①〜③の評定、すなわち相手に対する印象評定で構成され、第二因子（Component2）は項目④〜⑤の評定、すなわち相手からもたらされる印象の予想で構成されていることが明らかとなった。

− 181 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

表 1 評定項目①、②、⑤を用いた媒介分析の結果。部分媒介傾向が確認された。

野が関与していることが明らかとなった。これらの結果は、他者に対する好み判断に関わる情報が、相手から自分がどう思われそうかに関わる情報処理と密接に関連している可能性を示唆している。
自己が他者を評価する際に役割を果たす心理過程 3, 6, 10）と、「他者からどういった印象を持たれているか」といった、心の理論やメンタライジングと呼ばれる他者の視点に立って考える際に役割を果たす心理過程 16, 22, 23） はこれまで異なる文脈で研究されてきた。しかしながら、どちらの心理過程にも内側前頭前野の関与が示唆されてきた現状があた。その結果、部分媒介傾向があることが確認された。脳る 24, 25）。本研究結果は、内側前頭前野の中でも特に腹側領活動データの解析には Statistical Parametric Mapping 12域がこれらの認知過程に重要な役割を果たしていることを（https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/） を示唆している。また本研究結果は、我々が他者に対する好用いた。項目①〜③の評定および項目④〜⑤の評定に対しみ評価を行う際に、「他者からどういった印象を持たれそて主成分分析を実施し、それぞれの第一主成分スコア（以うか」に関わる情報から影響されている可能性を示した点

下、それぞれスコア①、スコア②と呼ぶ）を用いて、こで、これらの心理過程の関連を行動学的・脳科学的に示唆のスコアと活動が相関する領域を parametric modulation

するものであると考えられる。

analysis を用いて検討した（図２）。

社会心理学における好意の返報性（reciprocal liking）

スコア①を用いた解析の結果、腹内側前頭前野および両に関わる議論において、自分が他者から好意を持たれてい側島皮質を含む領域において有意な相関が確認された（pるとわかるとその相手に好意を持ちやすくなることが明< 0.001 uncorrected at peak, p < 0.05 FWE corrected at

らかにされている 26）。本研究結果は、この現象が相手か

cluster level）。スコア②を用いた解析の結果、腹内側前頭らの実際の評価無しでも起こりうる可能性を示唆している。

前野および左上前頭回を含む領域において有意な相関が確

本研究において被験者はただ他者の顔写真を呈示されるだ認された（p < 0.001 uncorrected at peak, p < 0.05 FWE

けで、それぞれの他者が自分にどういった印象を持っていcorrected at cluster level）。また、これら２つの解析におるかに関わる情報は一切呈示されない。しかしながら、自ける共通領域として、腹内側前頭前野が認められた。

分がその人物から好かれそうだと予想をした際には、その4. 考

人物に好意を抱く傾向が確認された。すなわち、人は相手

察

が自分にどういった印象を持ちそうか自動的に予想を行い、本研究では、他者からの評価を顔から推論することに関相手の自己に対する印象の予想に基づいて相手を評価してわる認知神経基盤と、他者の顔に対する選好に関わる認知いる可能性があると考えられる。さらに、脳機能画像解析

神経基盤の関連について検討を行った。行動データの解析の結果から、この一連の過程に腹内側前頭前野が重要な役の結果、有意傾向ではあるものの、顔に対する魅力度評定割を果たしていることが示唆される。腹内側前頭前野は他と好み評定の関係は、「相手からどれくらい好かれそうか者に好意を抱いたときだけでなく、他者から好意を抱かれ評定」によって媒介される可能性が示唆された。脳機能ていることを認知した際にも活動が上昇することが知られ画像解析の結果、どちらの認知プロセスにも腹内側前頭前ている 27）。このことから、他者を評価することに関わる

図 2 スコア①およびスコア②を用いた相関解析（parametric modulation analysis）の結果を示す。スコア①を用いた解析の結果、腹内側前頭前野および両側島皮質を含む領域において有意な相関が確認され（赤で示された領域）、スコア②を用いた解析の結果、腹内側前頭前野および左上前頭回を含む領域（青で示された領域）
において有意な相関が確認された。

− 182 −

他者からの評価を推論するメカニズムがその人物に対する選好の形成に与える影響

メカニズムと他者からどのような印象を持たれそうか予想

preference in the human brain, Neuron, 78（2013）563-

するメカニズムは共通の神経基盤によって実現されている

573.
8） J.T. Kaplan, S.I. Gimbel, S. Harris, Neural correlatesと考えられる。
しかしながら、上記の可能性を立証する上で、さらなる検証が必要であることも付け加えておきたい。１つ目に、of maintaining one's political beliefs in the face ofcounterevidence, Sci Rep, 6（2016）39589.

本研究では fMRI 撮像中の顔呈示課題終了後に 5 種類の評

9） C.W. Korn, Y. Fan, K. Zhang, C. Wang, S. Han, H.R.

定課題を実施しているのみで、好意の返報性において用い

Heekeren, Cultural influences on social feedback

られてきたパラダイムを使用していない。そのため、本研processing of character traits, Front Hum Neurosci, 8究に参加した被験者において実際に好意の返報性の現象が（2014）192.

起こるかどうかの確認はできていない。２つ目に、腹内側10）M. Lebreton, S. Jorge, V. Michel, B. Thirion, M.

前頭前野において上記の２つの処理が異なるタイミングで

Pessiglione, An automatic valuation system in the

起こっていることは実証できていない。今後は時間解像度

human brain: evidence from functional neuroimaging,に優れた脳磁図のような手法も取り入れながら研究を行っ

Neuron, 64（2009）431 - 439 .

ていく必要があると考えられる。３つ目に、本研究で行っ

11）P.L. Lockwood, M.K. Wittmann, M.A.J. Apps, M.C.

た媒介分析の媒介効果の結果はあくまでも有意傾向に過ぎKlein-Flugge, M.J. Crockett, G.W. Humphreys, M.F.S.

ない。より被験者を多くする等の対策によりさらなる検証

Rushworth, Neural mechanisms for learning self andを行っていく必要があると考えられる。

other ownership, Nat Commun, 9（2018）4747 .

以上のような限界はあるものの、相手に対する印象判断

12）P. Mende-Siedlecki, Changing our minds: the neuralと、相手からもたらされる評判を予想するプロセスの関連

bases of dynamic impression updating, Curr Opin

性を行動レベル・脳レベルで検討した研究は極めて少なく、

Psychol, 24（2018）72 - 76 .
13）P. Mende-Siedlecki, S.G. Baron, A. Todorov,

本研究の意義は大きいものと考えている。

Diagnostic value underlies asymmetric updating of（引用文献）

impressions in the morality and ability domains, J

1） D.L. Ames, S.T. Fiske, Outcome dependency
alters the neural substrates of impression formation,

Neurosci, 33（2013）19406 - 19415 .
14）P. Mende-Siedlecki, Y. Cai, A. Todorov, The neuraldynamics of updating person impressions, Soc Cogn

Neuroimage, 83（2013）599-608.
2） E.D. Boorman, J.P. O'Doherty, R. Adolphs, A. Rangel,
The behavioral and neural mechanisms underlying theAffect Neurosci, 8（2013）623 - 631 .
15）P. Mende-Siedlecki, A. Todorov, Neural dissociations
between meaningful and mere inconsistency intracking of expertise, Neuron, 80（2013）1558-1571.
3） J.C. Cooper, S. Dunne, T. Furey, J.P. O'Doherty,

impression updating, Soc Cogn Affect Neurosci, 1 1

Dorsomedial Prefrontal Cortex Mediates Rapid（2016）1489 - 1500 .

Evaluations Predicting the Outcome of Romantic16）R. Saxe, N. Kanwisher, People thinking about
thinking people. The role of the temporo-parietal

Interactions, J Neurosci, 32（2012）15647-15656.
4） C. Corradi-Dell'Acqua, F. Turri, L. Kaufmann, F.

junction in "theory of mind", Neuroimage, 1 9（2 0 0 3）
1835 - 1842 .

Clement, S. Schwartz, How the brain predicts people's
behavior in relation to rules and desires. Evidence of a17）S.G. Shamay-Tsoory, R. Tomer, B.D. Berger, J.

medio-prefrontal dissociation, Cortex, 70（2015）21-34.

Aharon-Peretz, Characterization of empathy deficits

5） E. Fouragnan, G. Chierchia, S. Greiner, R. Neveu,

following prefrontal brain damage: the role of the right

P. Avesani, G. Coricelli, Reputational priors magnify

ventromedial prefrontal cortex, J Cogn Neurosci, 1 5

striatal responses to violations of trust, J Neurosci, 33（2003）324 - 337 .

（2013）3602-3611.

18）L.H. Somerville, T.F. Heatherton, W.M. Kelley,6） A. Ito, N. Abe, Y. Kawachi, I. Kawasaki, A. Ueno, K.

Anterior cingulate cortex responds differentially to

Yoshida, S. Sakai, Y. Matsue, T. Fujii, Distinct neural

expectancy violation and social rejection, Nat Neurosci,
9（2006）1007 - 1008 .

correlates of the preference-related valuation of
supraliminally and subliminally presented faces, Hum19）S. Suzuki, R. Adachi, S. Dunne, P. Bossaerts, J.P.
O'Doherty, Neural mechanisms underlying humanBrain Mapp, 36（2015）2865-2877.
7） K. Izuma, R. Adolphs, Social manipulation ofconsensus decision-making, Neuron, 8 6（2 0 1 5）5 9 1 -− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

medial frontal cortex and social cognition, Nat Rev

602 .
20）S. Suzuki, N. Harasawa, K. Ueno, J.L. Gardner, N.

Neurosci, 7（2006）268 - 277 .

Ichinohe, M. Haruno, K. Cheng, H. Nakahara, Learning25）O. Bartra, J.T. McGuire, J.W. Kable, The valuation

to simulate others' decisions, Neuron, 74（2012）1125 -system: a coordinate-based meta-analysis of BOLD

1137 .

fMRI experiments examining neural correlates of21）W. van den Bos, A. Talwar, S.M. McClure, Neuralsubjective value, Neuroimage, 76（2013）412 - 427 .

correlates of reinforcement learning and social

26）C.A. Lowe, Goldstei.Jw, Reciprocal Liking andpreferences in competitive bidding, J Neurosci, 3 3Attributions of Ability - Mediating Effects Off（2013）2137 - 2146 .

Perceived Intent and Personal Involvement, Journal of22）C.D. Frith, U. Frith, The neural basis of mentalizing,

Personality and Social Psychology, 16（1970）291 -&.
27）C.G. Davey, N.B. Allen, B.J. Harrison, D.B. Dwyer,

Neuron, 50（2006）531 - 534 .
23）K. Izuma, K. Matsumoto, C.F. Camerer, R. Adolphs,

M. Yucel, Being liked activates primary reward andInsensitivity to social reputation in autism, Proc Natlmidline self-related brain regions, Hum Brain Mapp,

Acad Sci U S A, 108（2011）17302 - 17307 .

31（2010）660 - 668 .

24）D.M. Amodio, C.D. Frith, Meeting of minds: the− 184 −

眼瞼裂幅測定による耳鼻咽喉科心身症患者の客観的評価のこころみ
独立行政法人国立病院機構東京医療センター耳鼻咽喉科

五島史行

The first impression of the men is easily determined by the appearance of the face, especially the eye. In addition thewidth of the eye lid is very important. If the width is narrow, the observer think the man is not so in active. On the contrary if
the width is wide, the observer thinks the man is in active. We try to investigate the utility of the measuring the width of eye
lid in the patients with chronic dizziness before and after the vestibular rehabilitation, which is one of the treatment option.
The subjects were 12 chronic dizzy patients. The width of the eye lid was measured before and after the treatment. The
values were compared afterwards. As a result there was no significant deference before and after the intervention.

1. 緒

い症状や気分状態との関係を調べることを発案し本研究を

言

行った。

日常生活では第一印象で他人の健康状態や気分状態を見2. 方極めることが無意識のうちに行われている。その評価を決法定づける大きな因子として顔面の表情、特に目および眼裂

図 1 にプロトコールをしめした（図 1）。介入前に自覚的の印象は大切である。その印象を決定する要素として眼瞼

評価として DHI（dizziness handicap inventory めまい障

裂幅は重要なものである。医師として実際に外来診療をし

害度質問紙）1）、抑鬱不安を調べる質問紙（HADS; hospitalていて、患者が心身ともに健康になるにつれて眼瞼裂幅のanxiety and depression scale 2））を行う。また客観的評価

開大が認められるという印象を持ち本研究を発案した。眼のため神経耳科学的検査一式および重心動揺検査（アニマ瞼裂幅は意識的な努力により一時的には開大させることがML 5420）による評価を行う。あわせて ICS impulse（図可能である。しかし、リラックスした状態では一定の幅に

2）3） を用いて右眼で眼瞼裂幅測定（測定時間による変化なる。眼瞼裂幅は自律神経の影響を受けることがしられてを防止するため朝 8 時半に測定）を行う（図 2、3）。治療といる。そのため、眼瞼裂幅の測定は心身的健康状態の尺度

して 5 日間の入院によるめまいリハビリテーション 4）を行となる可能性がある。

い、治療後に以下の測定を行う。介入前と同様に質問紙と診療に当たる医師は忘れがちであるが、健康とは身体的・して DHI, HADS および、神経耳科学的検査一式および重精神的・社会的に完全に良好な状態であり、たんに病気あ

心動揺検査、眼瞼裂幅測定を行う。また退院後は 1 ヶ月後

るいは虚弱でないことではなく総合的な健康度を意識するに同様の測定を行う。4 ヶ月後には眼瞼裂幅測定のみを行必要がある。古くから眼は口ほどにものを言うと言い、眼った。統計学的検討には Graph pad prism 3 . 0 を用いて二の印象は人間の心の鏡であると考えられてきた。病院にお群間の比較には対応のある t 検定を用い、多群間比較にはける医療行為では患者の状態は医学的検査による客観的検

Bonferroni 法を用い、P< 0 . 05 で有意な変化がありとした。

査に基づいて行われているが、大まかな心身の健康状態を

3 . 研究の目的判断するためには、ぱっとみた印象（第一印象）
は重要なものである。特に、いわいる「目つき」
は多くの情報を提供しこれまで健康状態の客観的尺度としてはとらえられてこていると考えられる。現在の医療の問題点は、人間の “心”

なかった眼瞼裂幅の測定を患者の健康度の指標として応用の部分を正確に評価していないこと、そして “心” を意識しすることを目的とする。特にリラックスした状態での眼瞼た診断的、治療的アプローチを行っていないことにある。

裂幅を客観的に測定することの臨床応用を目指す。

心を捉える一つの試みとして眼瞼裂幅を測定し患者のめまThe objective evaluation of the patientsw it h psycho s omat ic problem i ndepa r t ment of otola r y ngolog y bymeasuring the width of eye lid
Fumiyuki Goto

4. 対

象

めまいを主訴として耳鼻咽喉科を受診した患者のうち、3 ヶ月以上めまい症状が遷延し改善の認められないめまいの慢性例 12 例（男性 2 名女性 10 名）を対象とする。平均年
齢 51 . 6±15 . 5 歳であった。対象症例を表 1 に示した。

Department of otolaryngology, NHO
Tokyo medical center− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

①神経耳科学的検査一式②DHI（dizziness handicap inventory）③SDS（self-rating depression scale）④STAI（state trait anxiety inventory）⑤HADS; hospital anxiety and depression scale⑥重心動揺検査（アニマML5420）⑦ICS impulseを用いた眼裂幅測定

1
4
図1

方

法

図2

図3

測定画面

表1

症例一覧

疾患名

人数

前庭神経炎

5

メニエール病2

心因性めまい（不安）2

片頭痛関連めまい1

良性発作性頭位めまい症（後半規管）

1

突発性難聴後遺症

1
合計− 186 −

12

測定機器

眼瞼裂幅測定による耳鼻咽喉科心身症患者の客観的評価のこころみ

5. 結

なかった。DHI その他のパラメータについても有意な変化

果を認めなかった（表 3）。1 ヶ月後に眼瞼裂幅の開大を認めはじめに代表的な症例を提示する。50 歳女性の良性発た症例は 3 例、変化無しが 1 例、縮小が 8 例であった。眼

作性頭位めまい症症例（図 4）である。図に示したように眼瞼裂幅の開大を認めた 3 例について介入前と 1 ヶ月後の

瞼裂幅の開大が認められ、それにつれ、DHI も改善を認め

DHI などのスコアについて検討を行ったが有意な改善を認た。しかし表 2 に示したように全例では有意な変化を認めめなかった。

図4

眼瞼裂幅測定の実際

表2

平均（mm）
SD

眼瞼裂幅の変化

介入前
（測定①）
眼瞼裂幅
9.0
1.3

表3

1 ヶ月
（測定②）
眼瞼裂幅
8.6
1.8

各種パラメータの変化

介入前
DHI
DHI
DHI
DHI
STAI
STAI
SDS
HADS
HADS
HADS
軌跡長
軌跡長
外周面積
外周面積

P
E
F
合計
状態不安
特性不安
A
D
合計
開眼
閉眼
開眼
閉眼

平均
13.8
16.2
17.7
47.7
46.3
47.5
41.7
7.4
6.5
13.9
111.8
179.0
8.7
12.1

4 ヶ月
（測定③）
眼瞼裂幅
8.5
1.8

1 ヶ月後
SD
5.1
6.5
9.5
19.3
8.9
8.9
7.3
4.1
2.7
5.5
63.8
164.7
8.3
11.9

− 187 −

平均
10.7
13.0
14.5
38.2
46.0
44.6
42.8
5.9
6.8
12.7
81.2
120.5
4.6
7.4

SD
6.2
6.6
9.9
18.9
8.5
8.4
10.0
5.2
3.0
7.7
27.1
93.5
3.3
10.0

統計
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

6. 考

察

かっと見開いた目は元気な象徴であるが開眼を司るのは動眼神経である（図 5）。動眼神経が上眼瞼を上眼瞼挙筋に
よって挙上させる。逆に加齢による眼瞼挙筋の衰えにより瞼がさがる状態を眼瞼下垂という。上眼瞼挙筋は、眼筋のひとつである。眼球の後方、視神経管の前で眼窩上面で起始し、上横走靭帯（Whitnall 靭帯）を過ぎてから次第に筋成分を失い、結合組織、すなわち腱膜となって上眼瞼および上眼板の上縁に停止する。動眼神経に支配され、上眼瞼を挙上し開眼する。
上瞼板筋（ミュラー筋）は上眼瞼挙筋の先端付近から起こり、平滑筋細胞が数十個ずつ筋束を形成しながら、上瞼板

図5

上端にまで達している。この筋肉は上頸神経節からの交感

眼瞼挙上に関連する筋肉とその支配神経

神経の支配をうけている。驚き、不安など交感神経が興奮すると眼瞼が挙上し、表情が変わることになる。ホルネル症
候群など交感神経の障害では逆に軽度眼瞼下垂が生じる 5）。
本研究ではこのミュラー筋に着目した。これまで健常者の7 . まとめ眼瞼裂幅を測定した報告がある 6）。
今回対象となった慢性めまい患者はめまいの治療のため

眼瞼裂幅が患者の自律神経機能を反映している可能性はにリハビリテーションを行った。その結果自覚的、他覚的ある。しかし今回の検討では患者の活力と眼瞼裂幅の間にめまい症状は改善した。他覚的所見は重心動揺検査によっは直接的な関係は認められなかった。今後は眼瞼裂幅の測て行った。また気分状態も抑うつ、不安が改善した。これ

定法の改良や他の自律神経機能検査と眼瞼裂幅都の関係をらのことから患者の自律神経には何らかの変化が起きるこ調べるなどの検討が必要である。

とが予想される。特に活力が上昇していることから交感神経の活性化があると想像した。しかし交感神経機能を反映すると考えられる眼瞼裂幅には有意な変化は認められなか
った。

（文

献）

1） Goto F, Tsutsumi T, Ogawa K: The Japanese versionof the Dizziness Handicap Inventory as an index of

一方、医師が評価する患者の表情は全例で元気があるという印象を持った。眼瞼裂幅に有意な変化がなかったことから医師の感じるこの元気があるという印象は眼瞼裂幅のtreatment success: exploratory factor analysis. Acta
Otolaryngol 2011; 131: 817‒25.
2） 岡浩一朗 , 山田純生 , 井澤和大 , 他 : 心臓リハビリテ変化によるものではない可能性が考えられた。患者の第一ーション患者における不安・抑うつの評価

印象で元気があるという印象を決めるのは眼瞼裂幅のみでAnxiety and Depression Scale（HADS）日本語版の応用.

はなくその他の複数の因子が関与しているのかも知れない。

Hospital

心臓リハビリテーション 2002; 7: 160‒163.

本研究の問題点として眼瞼裂幅の測定方法があげられる。

3） 小板橋美香 , 五島 史行 , 荒井美希 , 他 : 前庭型片頭痛患今回用いた ICS による方法で手技的な問題がないか、眼瞼

者の前庭動眼反射機能について video head impulse test

裂幅が自律神経機能を直接的に反映しているのかという点（vHIT）を用いた検討 . 耳鼻咽喉科・頭頸部外科 2017;である。また、患者の自律神経機能は介入後どのような変89 : 367‒372.

化を示しているのか、自律神経機能検査によって検討する

4） 五島 史行 , 山本 修子 , 進藤 彰人 , 他 : 高齢者と若年者必要がある。そして自律神経機能と眼瞼裂幅の関係を調べにおけるめまい集団入院リハビリテーションによる治療

る基礎的な実験が必要と考えられた。

効果の比較 . 医療 2014; 68: 175‒181.

今回の結果では眼瞼裂幅がめまいの自覚、他覚症状との関係は明確ではなかった。また、患者の気分状態との関係

5） 宇賀茂三 : 神経眼科入門シリーズ

眼瞼

解剖 . 神経

眼科 2012; 29 : 95‒102.

も明確ではなかった。今後は、眼瞼裂幅の測定方法につい

6） 門屋講司 , 辻川 寛 , 横枕 侑加 : 日本人若年者の外眼部ても検討し自律神経調節障害検査との関係にも着目し眼瞼の生体計測演習の結果について . 東北文化学園大学医療

裂幅測定の自律神経機能検査としての臨床応用を目指した

福祉学部リハビリテーション学科紀要 2017; 13: 33‒39.

い。

− 188 −

サーサーン・ガラス成立の背景〜ユーフラテス川以東へ流入した地中海周辺地域の化粧文化を探る〜
岡山市立オリエント美術館

四角隆二

Sasanian glass is well known as trade products travelled ancient Silk-road. But it is not clear that the definition of
Sasanian glass and the difference between Sasanian and Roman/Byzantine glass, because the study was mainly based onlooted materials. The author has investigated the Sasanian glass collection in UK, which was excavated late 19 th- early 20 th
century. In the course of study, that leads to the hypothesis that the Sasanian glass and the cosmetic culture of Mediterranean
are closely related.
In this study, it is focused on Sasanian glass from Kish archaeological site, 100 km south of Bagdad. As a result oftypological study and X-ray fluorescent analysis, it can be pointed out that the influx of cultures from the Mediterranean
is north high south low, and that it is likely that the Mediterranean cosmetic culture such as scented oil and eye liner havebrought by Christian.

1. 緒

ガラスに関する本質的な理解を妨げてきたのである。

言

報告者らは、6 年前から大英博物館に所蔵されるサーサ

東アジア古代史研究において、「サーサーン朝のガラス」

ーン朝都市遺跡出土ガラスの考古資料化研究に取り組んであるいは「ペルシアのガラス」といえば、教科書にも記述さきた。これらは 19 世紀末から 20 世紀初頭の考古学黎明期、れる正倉院蔵白瑠璃碗を筆頭に、奈良県新沢千塚や福岡県

英国隊が発掘したニネヴェやニムルドといった古代メソポ

沖ノ島からの出土品、伝安閑天皇陵出土品や京都府上賀茂

タミアの著名都市遺跡からの出土したもので、これまでサ神社境内採集品などがよく知られている。こうした事実をーサーン朝を含む上層出土品は顧みられることはなかった。

重視し、サーサーン・ガラスは古代末期のシルクロード交分析の結果、北メソポタミア都市遺跡出土品では、伝イラ

易を代表する交易品と理解する立場から、「サーサーン朝

ン北部古墓由来博物館資料ではあまり知られていない閉塞

は金属器やガラス、染織品などの工芸品を東西に輸出し経器形小型容器（小型瓶）が主体的で、開放器形容器（碗や鉢）

済的利益を上げていた」などとする理解がある（吉水 1992、

は客体的数量を占めるに過ぎないこと、サーサーン朝が支小寺 2012）。

配するユーフラテス川以東でガラス生産が本格化する 3 世

一方、西アジア考古学研究においては、「サーサーン・ガラス」の定義は不明確で、その年代観や帰属文化をめぐ

紀以降も地中海方面から、ガラス容器が流入し続けていたことが判明した。

る議論に対し、研究者間で理解が分かれる場合も散見され地金自体が価値を持つ貴金属器と違い、簡素な作りの小る。そもそも、「サーサーン・ガラス」は「3 〜 7 世紀、サ型ガラス容器そのものが価値を持ったとは考えにくい。ガーサーン朝領域で作られたガラス製品」
である。しかし、1）

ラスが宝物としての扱いを受けた東アジアでの需要と異な1960 年代以降、話題を提供してきた伝イラン北部古墓由り、メソポタミア都市遺跡ガラスの性質は実用の域を超え

来の博物館資料のほとんど全てはいわゆる盗掘品であって、ることはない。だとすれば、当時のサーサーン朝領域の人々

考古学研究に必要な情報を喪失した「美術品」、2）メソポタ

にとって価値を持ったのはガラスではなく、その内容物でミア所在のサーサーン朝都市遺跡出土品は欧米の限られたはなかっただろうか。この理解に立てば、正倉院蔵白瑠璃機関にのみ所蔵され、その公開が不十分、3）
同時代の東地碗で注目を集める厚手のカット容器ではなく、メソポタミ

中海系ガラスの強い影響をうけて成立したサーサーン・ガ

ア出土品の多数を占める小瓶こそが、サーサーン・ガラス

ラスは、器形や製作技法など視覚的属性から両者の区別はの本質を理解する鍵になるのではないか。

困難、4）製作工房の未検出という問題があり、サーサーン・

本研究は、地中海方面からユーフラテス川を越えて流入したとみられる香油と化粧文化の視点から、ユーフラテス
川以東の吹きガラス産業成立と展開を検討しようとするもThe background of Sasanian Glass –In
search of the Mediterranean Cosmetic
Culture flow into beyond Euphrates–
Ryuji Shikaku
Okayama Orient Museum

のである。

2. 方

法

アシュモレアン博物館（英国オックスフォード市）
が所蔵するメソポタミア南部のキシュ遺跡出土品の資料化研究− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019を行った。アシュモレアン博物館より調査許可を得た 110

まず、器形に着目すると、器形判別可能な資料は大きく

点余のうち、84 点について観察、実測・写真撮影を行い、3 分類できる（図 1）。すなわち、小型瓶、碗形容器、台付分類を行った。

杯である。このうち、小型瓶は 22 点で、短頸丸底、長頸さらに 44 点については、研究協力者の阿部善也東京理

平底が含まれる。開放器形容器は 23 点が確認でき、いず科大学講師により、可搬型蛍光 X 線分析装置（OURSTEX

れも口径が 10 〜 15 cm 程度の厚手碗形を呈し、円形切子

100 FA II）によって、非破壊分析を行った。この分析装置

や二重円形切子が施される。台付杯は、器壁の薄い容器部

は、資料を真空に近い条件下（約 500 Pa）に置くことで、軽は失われ、脚台のみが確認できる。

元素領域の感度を高める工夫がなされている。また、国内色調に着目すると、小型容器の大半は淡緑色透明で、厚博物館に所蔵されるサーサーン・ガラスについて、資料化・

手碗形容器には淡褐色を呈する例が含まれる。このうち、

蛍光 X 線分析も継続した。

淡緑色は原料に不純物として含まれる鉄が発色したもので

さらに、
大英博物館
（英国ロンドン市）
所蔵のニネヴェ（モある。一方、淡褐色は消色材として添加されたマンガンースル市近郊）など北メソポタミア出土品と比較検討を行Mn に起因するもので、いずれも意図的に着色された形跡った。

はなかった。

3. 結

これらの出現頻度をグラフ化したのが、図 2 である。小果片のため器形判別が困難な資料が多数含まれるものの、小3 . 1. キシュ遺跡出土ガラス容器の器形と頻度型壺（Bottle）と飲酒器（Bowl, Stemmed Goblet）の出現比率

キシュ遺跡はイラクの首都バグダードの南約 100 km には 2：3 となる。

位置する、大型都市遺跡である。1934 年、メソポタミア

同時代の東地中海系ガラスの器種組成と比較すると、サに所在する都市遺跡として、初めてサーサーン・ガラスがーサーン・ガラスは大型貯蔵容器が欠落する。キシュ出土

報告書に記載された遺跡として名高い。今回、当時の報告

ガラスのうち、器形判別が困難な資料にも大型容器片と推に見られる資料を含め、84 点を考古資料化した。

定できる資料は見られなかった。

3 . 2 . 製作技法
製作技法に目を転じると、サーサーン・ガラスでは容器の製作・成形の両方において、ガラス製パイプ（共竿）を用いる。このため、底部にリング状の痕跡が確認できる（底部を処理したカットガラスでは確認できない）。キシュ
出土品のポンテ竿の痕跡は、直径 1 . 3 〜 1 . 7 cm のものと、kish1969,602
kish1933,1316

直径 2 cm を超える資料が含まれる。一般に、細い吹竿のkish1933,1317

先にとることのできるガラス種は少なく、大型容器を吹く

kish1933,1314のは難しい。
これまでに調査した、北メソポタミア都市遺跡出土品（大英博物館所蔵）では直径 1 . 3 〜 1 . 7 cm が大半で、直径 2 cm

AN1969,626を超える資料は極めて少数だった。キシュ遺跡における大kish1933,1393

kish1969,630.a

kish1933,1327

35
30
25
20

AN1969,613a
kish1933,1324

15
10

0

kish1969,613c

5
5cm

0

kish1969,596

図1

キシュ出土ガラス容器

Bottle

図2− 190 −

Bowl

Stemmed Goblet

Other

キシュ出土ガラス容器の器種組成

サーサーン・ガラス成立の背景〜ユーフラテス川以東へ流入した地中海周辺地域の化粧文化を探る〜

口径のポンテ竿の出現頻度の高さは、厚手切子容器など比較的大型容器が多い事実と無関係ではないだろう。

4 . 1. 北メソポタミア都市の状況
図 4 は、北メソポタミアを中心とするサーサーン朝都市遺跡出土ガラス（大英博物館所蔵）を器形別に分類したもの

3. 3. 装飾である。閉塞器形小型容器が主体的数量を占め、その他のガラスの装飾技法はホット・ワークとコールド・ワークに大別される。前者は、ガラスの温度が下がり、可塑性を

器形は客体的なものに過ぎないことがわかる。図 1 と比較するとその違いは歴然である。

失う前に行う加飾で、後者は製品となった後に施される加これまでのところ、大英博物館所蔵北メソポタミア都市飾である。キシュ出土品では、モール型吹や突起装飾がホ遺跡出土品とキシュ出土品を比較すると、以下の点が指摘

ット・ワークの代表的なものであるが数はそれほど多くなできる。すなわち、1）閉塞器形小型容器はそれほど多くない。カット装飾を持つ厚手の容器片が比較的多く見られる

く、2）開放器形容器が比較的多く、台付杯や厚手のカット

が、いずれも開放器形の飲用器で、薄手の閉塞器形容器にガラス容器などヴァリエーション豊富であり、3）
ユーフラ

はカットは施されない。

テス川以西の西アジアで作られた、いわゆるローマ／ビザ
ンツ・ガラスがほとんど含まれない、である。ニネヴェな

3 . 4 . 蛍光 X 線分析結果

ど北メソポタミア都市では、3 〜 7 世紀頃に年代付けられ東京理科大学阿部善也講師による非破壊蛍光 X 線分析結る、東地中海系の碗形容器が確認できる（写真 1）。代わり果（図 3）によれば、北メソポタミアでは見られない不純物に、キシュではカット装飾の碗形容器が多く見られることの多い組成を示すグループが確認でき（S 1 b‒LP、S 2 ‒LP）、が対象的である。

在地の工房が操業した可能性を支持するものといえよう。

層 位 的 な 発 掘 が 行 わ れ た ウ ェ フ・ ア ル ダ シー ル Veh

すなわち、北メソポタミアの遺跡では見かけない装飾を持Ardasir 遺跡出土ガラスを分析したネグロポンチによれば、つ、厚手あるいは大型の碗形容器にはキシュ特有の消費行動が反映されている可能性がある。

4. 考

察

キシュ出土品は、これまで調査してきた北メソポタミア
出土品と比べ、開放器形大型容器が多数含まれることが特筆される。厚い器壁のカットガラス片が多く見られ、カット文様の多様性も顕著である。メソポタミア全域を視野に入れると、正倉院タイプ円形切子碗はメソポタミア各地に広い分布を示すが、上賀茂神社タイプ二重円形切子碗、沖ノ島タイプ浮出円形切子碗はキシュ遺跡以外での出土は知られていない。このような器形やカットの多様性は、容器を製作する吹きガラス工房と、製品を装飾するカット工房

図4

北メソポタミア都市遺跡出土ガラス容器の器種組成が、キシュ遺跡周辺で操業していたことを推測させる。こ
うした事実は、碗形容器に対する消費者需要の地域性を反映しているものと考えられる。

サーサーン・ガラス S1a
サーサーン・ガラス S1b
サーサーン・ガラス S1b-LP
サーサーン・ガラス S2
サーサーン・ガラス S2-LP
ローマ・ガラスか図 3 キシュ出土ガラスの組成別割合（分析：阿部善也東京理科大学講師）

写真 1− 191 −

ニネヴェ出土東地中海系ガラス

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

3 世紀前半に、吹きガラス産業が成立した。器形や装飾な認でき、いずれもキリスト教会が所在していた（Simpson

ど製作技術は同時代の東地中海ガラスに準じ、長頸・短頸

2005）
。

の小瓶が大半を占め、碗や鉢が大半を占めるという。当

報告者はかつて、サーサーン朝のガラスと銀器がそれ

初、工具やモール型を用いたホットワークの加飾が中心でぞれ、器形や文様に類似性が低いことを指摘した（四角あるが、4 世紀以降、加飾技法はカットへ移行する。5 世

2016）。こうした相違には、それぞれの使用者と場面の違紀中葉に洪水被害にあい、都市が衰退する 6 世紀に至るまい、すなわち、地中海周辺地域の文化に親しんだ人々が主で、器形や装飾はほとんど変化がないという（Negro Ponziに用いたガラス容器と、イラン固有の文化の場面で用いら

1983）
。

れた銀器といった違いが想定できるのではないか。

上記のようなウェフ・アルダシールの状況は、大英博物

今回分析の対象としたキシュでは、東地中海方面から搬

館所蔵ニネヴェ遺跡の出土品と類似し、キシュ遺跡に大型入ガラスは見られない理由については、1）中南部メソポタ

容器が多く見られるのは同遺跡で検出された大型建物の帰ミアにまでは地中海方面からの香油やクフルなどの化粧文

属年代が 6 世紀に比定されていることと無関係ではないだ

化が浸透していなかった可能性、2）分析に使用した遺跡のろう（Harden 1934）。

存続年代の違い、が想定できるが、層位的な発掘が行われここで、ガラス容器の内容物について考えてみたい。また遺跡が少ない現状では、前者の可能性を指摘しておくにず、閉塞器形小型容器は、長頸・短頸で丸底・平底のもの止まる。今後、許可を得た全点について資料化作業と分析があり、一般に香油瓶と考えられている。プリニウスが「軟可能な資料については蛍光 X 線分析を行うことで、メソポ

膏はアラバスター製の箱に入れておくと一番持ちがよい」

タミア全域における実態を明らかになるだろう。

（「博物誌」13 巻 19）と記すように、ガラス容器に香油を保

5. 総存するのは、ガラスの持つ耐酸・耐アルカリ性や気体や液括

体を通さない性質を利用し、劣化しやすい香油の酸化を防

地中海方面からの香油やクフルといった化粧文化の流入

ぐためである。実際、伝イラン北部古墓由来のガラス容器を跡付けるべく、中部メソポタミアのキシュ遺跡出土品のには、アラバスターの縞文様を写したガラス容器が知られ調査を中心に行った。予想に反して、キシュでは比較的大ている。

型の飲用器が多数見られた事実は、サーサーン・ガラスと一方、北メソポタミアのニネヴェでは、地中海周辺地域

地中海方面からの文化流入を考える上で重要である。閉塞に特徴的なクフル（アイライナー）容器の在地模倣品が見ら器形小型容器の内容物は油だったと考えられる。メソポタ

れるなど、西方からの文化流入が顕著であったらしい。こミアにおける油はゴマ油が一般的であるが、サーサーン朝

うした地中海方面からのクフル、香油などの化粧文化はど

時代にゴマ油生産が飛躍的に増大したという記録はないこのような人々が持ち込んだのだろうか。

とから、地中海周辺地域から流入したオリーブ油やオリー

シンプソンは、ニネヴェにはキリスト教会やユダヤ教

ブ油をベースとした香油がその内容物だったと解釈できる。

のシナゴーグがあった可能性を指摘している。また、写ローマ・ビザンツ帝国とサーサーン朝は政治的に対立しあ

真 1 下段のガラス容器片 2 点は、東地中海周辺地域で 4 世ったが、香油やアイシャドウといった化粧文化はユーフラ

紀頃用いられたランプと考えられている。メソポタミアでテス川を越え、東へと波及していったのだろう。

は、ニネヴェとウェフ・アルダシールの 2 遺跡で出土が確

層位的な情報を持つウェフ・アルダシール遺跡では、3
世紀半ばの最下層から 6 世紀に至るまで器種組成に変化がないことが報告されている。大英博物館所蔵の北メソポタ
ミアを中心とする都市遺跡出土品の器形はウェフ・アルダ
シール遺跡の器種組成に準じていたことから、筆者はサーサーン朝において「ガラス容器は香油やワインなど地中海的要素の強い文化と強固に結び」ついて成立し、その性格を変えることはなかったと解釈してきた。しかし、本研究で明らかとなったキシュ遺跡出土品からは、地中海文化的要素は南北メソポタミアで温度差があることを示しており、再検討する必要があることが判明した。今後は、サーサーン朝領域で活動したキリスト教徒やユダヤ教徒の動向について検討する中で、サーサーン・ガラスの成立と展開について考察していきたい。

写真 2

ニネヴェ出土クフル容器− 192 −

サーサーン・ガラス成立の背景〜ユーフラテス川以東へ流入した地中海周辺地域の化粧文化を探る〜

1） Harden, D.B. “Glass from Kish,” in S. Langdon and D.

4） 小寺智津子『ガラスが語る古代東アジア』同成社、2012

B. Harden, ‘Excavations at Kish and Barghuthiat 1933’ ,5） 四角隆二「岡山市立オリエント美術館所蔵突起装飾ガ（主要参考文献）

Angiquity’ . Iraq 67/1: 285‒294. 2005

ラス碗をめぐる考察」『岡山市立オリエント美術館研究

Iraq 1: 131‒36. 1934
2） Negro Ponzi, M. ‘Glassware from Choche（Central

紀要』28、1‒11 頁。岡山市立オリエント美術館、2014

Mesopotamia）’．Arabie orientale, Mésopotamie et Iran

6） 四角隆二「古代末期、東方拡散したサーサーン・ガラ

méridionale de láge du fer au début de la période

スの二面的性格」シンポジウム「古代西アジアと人類史にislamique, R. Boucharlat and J‒F Salles（ed.），Editionsおける『グローバリゼーション』」要旨集、2016
7） 由水常雄「古代のガラス」「世界ガラス美術全集１

Rocherche sur les Civilisations, 33‒40. 1984
3） Simpson, St.J ‘Christians at Nineveh in Late代・中世」求龍堂、1992− 193 −

古

認知症の妻・母へスキンケアをする男性の特性
福岡大学医学部看護学科

西尾

美登里

This study aim to confirm the characteristics of male caregivers who provide skin care a mother or wife with dementia
living at home. Participants were 90 male caregivers of a female family member with dementia who living at home. The
study period was from May 2017 to January 2018 .We investigated the actual state of skin care and, nursing care burden. We
assessed care burden using the question “Do you have a physical, emotion, social, or financial care problem?” and the Zarit
Caregiver Burden Scale-8. Participants self-esteem was assessed using the Rosenberg Self Esteem Scale and the question “Do
you have fun in your life?”
Caregivers who were the husband of the care recipient tended to be older. Those who were sons of the care recipient
tended to be long-team caregivers, their care recipient (mother) tended to be older. Care recipients who were wives received
more skin care.
Male caregivers that provide skin care had higher self-esteem than those that did not.
We found that male caregivers who were husbands wanted their wife to look beautiful or healthy. The key characteristicof male caregivers is treat oneself and mother or wife dementia.

1. 緒

く聞かれた。老年期の皮膚は、皮下脂肪が薄く、皮膚が脆言弱である 8）ため、適切なスキンケアや化粧をすることによ

わが国では、人口構成の変化や社会的要因の変化に伴い、り QOL が向上する 9）。家族会や男性介護者の会などの集

家族の介護役割を担う続柄は大きく変化している 1）。家族

いにおいて、化粧をした妻に対し、男性介護者が手をさすの主介護者は、従来女性の役割とされてきたが、男性のり、頬をなで話しかけるなど愛情深く接している姿を目に主介護者の割合は、1999 年では 18 . 6 % から 2016 年ではすると、母や妻への化粧は、母や妻を健康的で若々しい状

34 . 0 % と 2）、約 15 年で 50 % 程度増加している。男性の家態に保ち、介護継続への意欲に繋がる効果があることが予

族介護者は、介護者役割の継続において、慣れない介護へ想される。しかし日本においては、男性介護者のスキンケの問題を抱えているが3 , 4）、男らしさに固執するため、弱5）アの実態や、介護者としての役割受容との関係は明らかにされておらず、研究も見当たらない。

音を吐かないことが報告されている 。
介護が原因での殺人事件の量的研究によると 6）、殺人

したがって当研究により、妻や母にスキンケアを実施す

事件の原因の第 3 位に介護が挙げられる。続柄で最も多る男性の実態と特性を明らかにし、母や妻にとってスキンいのは夫が妻を殺害する事件であった。また、加害者はケアの効果を検証する。

72 . 3 % が男性であり、被害者の 74 . 3 % が女性であった。

2. 方

これらの数値からも、特に家族を男性が介護することは、

法

2 . 1. 研究対象者

困難を抱えていると言わざるを得ない。
在宅介護を継続するためには、
男性介護者自身の身体的・在宅で認知症の妻または母を介護する男性 90 名。

精神的・社会的健康が必須であり、男性介護者の支援においては、医療だけで対応できるものではなく、男らしさの過剰な意識からの解放が、男性の健康に繋がると言われて

2 . 2 . 調査方法
自記式質問紙調査。

いる 7）。
自宅で女性の家族を介護する男性たちからは、スキンケ
アの方法や化粧品の使用方法について困惑している声が多2 . 3 . 調査項目
2 . 3 . 1. 対象者の基本属性：
介護者との続柄、年齢、就労の有無、経済状況、介護期間、自尊感情Characteristics of male caregivers, whoprovide skin care to a mother or wifewith dementia
Midori Nishio
Faculty of Medicine School of Nursing,
Fukuoka University

要介護者へ実施するスキンケアの有無と所要時間と頻度、介護において身体的・精神的・社会的・経済的困難感、楽しみの有無。
2 . 3 . 2 . 対象者が介護している要介護者の基本属性：
年齢、診断名、介護保険制度における介護度。

− 194 −

認知症の妻・母へスキンケアをする男性の特性

2 . 3 . 3 . 使用尺度の差はなかった。自尊感情平均総得点はスキンケア実施群

介護者の介護負担感：Zarit 介護負担尺度日本語版にが有意に高かった（表 1）。

て 測 定 し た（Zait Caregiver Burden lnterview： 以 下 J‒
ZBI_ 8）。荒井らによって日本語版に翻訳された 22 項目のJ‒ZBI 10）を 8 項目

10 , 11）の短縮版として開発された。介護3 . 2 . 在宅で生活する認知症の女性の概要
被介護者の平均年齢は、妻は 73 歳（SD 6 . 6）、母は 89 歳

をストレッサーとしたときの負担感を測定するものである。 （SD 6 . 2）で有意に母が高齢であった。被介護者の認知症
介護そのものによって生じる項目と介護を始めたために生の診断名は、妻はアルツハイマーが最も多く、次いでレビ

じる負担 , 全体的な介護負担感を問うものである。回答は、

ー、前頭側頭型の順であった。母はアルツハイマーが最も「思わない」「たまに思う」「時々思う」「よく思う」「いつ

多く、次いでレビー、脳血管型の順であった。介護保険にも思う」の 5 件法で、32 点満点である。

おける要介護度は、妻は最も要介護 3 が多く、次いで要介

自尊感情

12 , 13）：ローゼンバーグの自尊感情尺度日本語

護 5 であった。母は最も要介護 4 と 5 が多かった（表 2）。

版（Rosenberg Self Esteem Scale : 以下（RSES‒J））にて測定した。当尺度は 10 項目で構成されている。国外にお3 . 3 . 妻と母へのスキンケアの有無と頻度

いて最も多く用いられている尺度である。国内においてスキンケアを実施している男性は 45 名（49 . 5 %）で、妻

2007 年に日本語版において信頼性・妥当性が検証されて介護群は 34 名（62 %）、母介護群は 11 名（32 %）と有意に妻いる。回答は「全くあてはまならない」「あてはまならない」

がスキンケアを受けていた。スキンケア実施の頻度は、妻「あてはまる」「非常にあてはまる」の 4 件法で 40 点満点ある。

介護群は「毎日」が最も多く 53 %、次いで「外出時のみ」が

2 . 3 . 4 . 分析方法

29 %、「週に数回」が 18 % であった。母介護群は「外出時の項目ごとに基本統計量を求め平均値と標準偏差を用いみ」が最も多く 46 %、次いで「毎日」が 36 %、「週に数回」がた。妻と母の連続係数の群の差は t 検定、加えてスキンケ

9 % などであり、妻は母よりもスキンケアを受ける頻度が2

アの有無において Χ とマンホイットニーの U 検定を用い高かった（表 3）。

た。解析には SPSS 23 . 0 J for Windows を用い有意水準は

3 . 4 . スキンケアを実施する男性の特性

5 % とした。
2 . 3 . 5 . 倫理的配慮

スキンケア実施群は未実施群よりも困難感が低かった。

福岡大学医の倫理審査委員会の承認を得て行われた（承認番号2017 M 040）
。対象者には , 研究協力を依頼する

際は , 研究の趣旨 , 協力の任意性 , 被験者にならなくても不介護における負担感では、群間差が見られなかった。自尊感情はスキンケア実施群が有意に高く、楽しみはスキンケ
ア未実施群が有意に有していた（表 4）。

利益がないこと , 守秘義務 , 学術誌などで発表することな

4. 考

どを調査の依頼文に明記した。調査票の返送をもって調査

察

4 . 1. 在宅で認知症の異性を介護する男性の属性への同意とみなした。

3. 結

要介護者の続柄と各年齢や介護期間から、後期高齢者の果

息子が母親を 7 年以上介護していることを示し、後期高齢

3 . 1. 在宅で認知症の人を介護する男性の概要

者の夫が年下の妻を 4 年以上介護していることを示してい要介護者との続柄は、妻は 55 名
（61 %）、母は 35 名（39 %）る。息子介護者に着眼すると、50 代後半で家族介護者とで妻を介護する男性が多かった。平均年齢は、妻を介護す

いう家庭内での役割を担ったこととなる。現在の日本におる男性は 75 歳（SD 6.6）、
母を介護する男性は 66 歳
（SD 9.4）

ける定年の平均は、60 歳が 79 . 3 %、65 歳が 16 . 4 % であるであり、全体は 72 歳（SD 8 . 9）であった。有意に妻を介護ことから 14）、息子介護者は、社会的役割を担ったまま母する男性が高齢であった。仕事を有する男性数と経済状況の介護が始まった可能性が高い。今後の定年となる年齢は、において、妻介護男性群と母介護男性群の差はなかった。

60 歳定年が 79 . 3 ％と前年度 80 . 7 ％から減少し、65 歳定

介護における身体的困難感がある男性は 55 名（60 . 4 %）、年が 16 . 4 ％と前年度より 1 . 2 ％増加、加えて 66 歳以上定

精神的困難感がある男性は 69 名（75 . 8 %）、社会的困難感

年導入の企業は 1 . 4 ％と前年度より 0 . 4 ％増加しているこがある男性は 35 名（38 . 5 %）、経済的困難感がある男性はとから、長く社会で勤務できる体制が創られることが予想

29 人（31 . 9 %）であった。楽しみを有している男性は 74 人

される。社会的な役割を担う年齢が高齢化するとなれば、（81 . 3 %）であった。介護負担感の平均得点は、差はなかっ

年齢が高くなるほど介護リスクが高まり、介護と仕事の問た。介護期間と 1 日の介護平均時間は、有意に妻を介護す

題に直面する人数も増加することを示唆する。2012 年度

る男性が長かった。

の就労状況基本調査では 15）、介護や看護を理由に離職や情緒的支援平均数において、妻と母の属性や家庭内外と転職をした介護者が増加している。つまり、介護により退− 195 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

表1

在宅で認知症の人を介護する男性の概要
項

目
妻
母

続柄（人）

年齢（歳）

妻
母

総計

n

結果（％）

55
35

（61 . 0）（39 . 0）75
66
72

SD 6 . 6
SD 9 . 4
SD 8 . 9

妻

有職
無職

21
34

（38 . 1）（39 . 0）

母

有職
無職

15
20

（42 . 8）（39 . 0）

身体的
精神的
経済的
社会的

55
69
35
29

（60 . 4）（75 . 8）（38 . 5）（31 . 9）76

（83 . 5）

職の有無

困難感

私は楽しみを有している（人）一日の介護時間（時間）

妻
母

4.0
3.4

SD 1 . 2
SD 1 . 4

平均介護負担感＊妻
母

10 . 5
12 . 8

SD 5 . 1
SD 1 . 2

妻

家族内
家族外

3 . 73 （2 . 4）
3 . 27 （2 . 2）

母

家族内
家族外

4 . 00 （2 . 3）
3 . 70 （2 . 1）

妻十分に生活できる
生活には支障ない
支障あり

26
25
4

（47 . 3）（45 . 6）
（ 7 . 2）

母十分に生活できる
生活には支障ない
支障あり

16
18
1

（45 . 7）（51 . 4）（ 2 . 9）

情的支援者数経済状態（人）

平均介護期間
（月）

妻
母

48
89

SD 42 . 6
SD   6 . 2

平均自尊感情（点）妻母

23 . 824 . 9SD   4 . 6SD   1 . 8＊Japanese version of the Zarit Caregiver Burden Scales Student's-test− 196 −＊

p < 0 . 05＊＊＊＊

SD：標準偏差認知症の妻・母へスキンケアをする男性の特性

表2

在宅で生活する認知症の女性の概要

表3

スキンケアの有無と頻度− 197 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019表4

スキンケアを実施する男性の特性

職せざるを得ない息子介護者が今後増加する可能性がある。

コミュニケーションを、スキンケアの中の化粧は円滑にす

母親を介護する息子の年齢は 40 歳～ 60 歳で有職者であるることや 19 , 20）、社会的な治療効果を期待されることから 9）、

現状 16）から、特に母を介護しながら仕事を有する息子介認知症の妻は母よりも、日常の中で、外部ともコミュニケ

護者に着眼し、介護役割を担う中で問題を抱えていないか、ーションを図られている可能性があると考える。

周囲は注意深く観察する必要がある。現在、介護が原因の虐待の加害者は男性が 7 割で、続柄の 4 割以上が息子介護
6）

4 . 3 . スキンケアを通して看る男性の特性者である 。離職すると貧困となるリスクは否めず、貧困

化粧の身体的効果は、化粧前よりも脳波のパターンが有は医療とのつながりが希薄となり生活破綻や社会的孤立の意に安定化し、不安定となったニューロン活動を安定化さ。従って男性介護者の中でもせる効果があり 21）、皮膚からの感覚刺激は、記憶や人間

特に息子介護者へ焦点をあて、仕事と介護を継続するため特有の高次機能を活性化する効果により神経活動が安定すの支援が必要と考える。

ることから 22）、認知症者特有の不安定な神経活動による原因となる可能性がある

17）

行動を軽減する可能性がある。不安定な神経活動による問4 . 2 . 母と妻が受けるスキンケアの効果

題行動によって、つい手を挙げてしまいたくなる被介護者

お世話をする家族が男性の場合、続柄において、母よりについて、［高崎］らは、ストレス反応を軽減する目的で対も妻のほうがスキンケアを受けている実態が明らかになっ処して、現実は問題解決せずストレス反応と悪循環するとた。スキンケアの一部である化粧の効果は、見た目や本人

述べ 23）、スキンケアは認知症者の問題行動の抑止力となり、の気持ちを若くし、見た目の若さは内臓機能とは有意な相男性の介護者への問題解決となる可能性がある。

関を示すことから、スキンケアは健康であることにも影響を与えているとされる

18）

スキンケア実施群と未実施群において、身体的介護困難。これらから、介護している男

感、精神的介護困難感、社会的介護困難感、経済的介護困性への心理的効果は、妻は母よりも、認知症の家族である

難感の差があるにも関わらず、介護負担感においては差が異性へ美しく若々しくいてほしいという気持ちを、スキンみられない。説明がつかないようにも思えるが、Pearin のケアにより投影されていると考えられる。また、社会的ストレスモデルで考えると、介護負担感は介護ストレッサ− 198 −

認知症の妻・母へスキンケアをする男性の特性ーを測定するものであり、心身の健康や社会や経済の困難

5） 奥田祥子：男性漂流 第 1 版 , 第講談社＋α , 東京 . 2015.

の有無は、介護役割を継続する資源を測定する項目とも考6） 湯原悦子：介護殺人から見出せる介護者支援の必要性 ,えられる。従ってスキンケアを実施する男性はしない男性
よりも、介護を担う資源に恵まれている可能性がある。ま日本社会福祉大学社会福祉論集 , 134：9‒30. 2016.
7） 彦聖美大木秀一：男性介護者の健康に関連する社

た、スキンケア群は有意に自尊感情が高かった。自身の自会的決定要因と支援の方向性 , 石川看護雑誌 , 13：1‒10.

尊感情が高いことは、内的な強さを持ち、内面的強さは、

2016.

から、認知症で

8） 根来佐由美 , 葉山有香 , 井上智子：地域女性高齢者のある異性へ思いやりを持ち介護生活を継続していると考え

皮膚の乾燥状況と乾燥にに関連する生活習慣の実態 , 日

優しさや生き方を認知するという結果

13）

本健康医学雑誌 , 21（4）：237‒243. 2013.

る。

5. 総

9） カルデナス暁東 , 西尾ゆかり , 福井奈央ほか：わが国

括の医療現場におけるメイクセラピーの応用に関する文献

認知症の妻は母よりも有意にスキンケアを受けているこ

検討 , 大阪医科大学看護研究雑誌 , 3：69‒77. 2013.

とが明らかとなった。認知症の妻は母よりも家庭内外でコ

10）Arai Y, Kudo K, Hosokawa T, et al：Reliability

ミュニケーションが図られ、スキンケアを実践する夫は愛and validity of the Japanese version of the Zarit

情深く認知症の妻を介護している可能性がある。一方で、Caregiver Burden Interview. Psychiatry and Clinical認知症の母を介護する息子介護者は、介護と仕事の両立でNeuroscience, 51：216 ‒ 226 . 1997 .
11）荒井 由美子 , 田宮 菜奈子 , 矢野 栄二：Zarit 介護負

悩み、仕事の継続に困難を抱えている可能性がある。
当研究において、介護に問題を抱えていないかなどを見

担尺度日本語版の短縮版（J‒ZBI_ 8）の作成 その信頼性

極める指標の一つに、スキンケアがあると考える。スキンと妥当性に関する検討 , 日本老年医学会雑誌 , 40（5）：ケアは認知症者の問題行動の抑止力となり、男性の介護者497 ‒ 503 . 2003 .
12）Coopersmih S：The antecedents of self–esteem, W.

への問題解決の一助となる可能性がある。

H Freeman, 1967 .

6 . 当研究の限界

13）遠藤辰雄 , 井上祥治 , 蘭千壽：セルフエスティームの今後は、仕事の有無や年齢の違い、介護の経験などの異心理学 第 8 版 , ナカニシヤ出版 , 京都 . 2007 .

なる対象についても調査、比較検討することが必要である

14）厚 生 労 働 省（2017）「 就 労 条 件 総 合 調 査 」（https://と考える。更に対象者を増やし、介護による虐待防止と共

www.mhlw.go.jp/toukei/itiran/roudou/jikan/に介護離職防止に向けた取り組みが必要であると考える。

syurou/ 17 /index.html, 2018 . 7 . 3）.
15）総務省統計局（2012）「就労状況基本調査」（http://謝辞www.stat.go.jp/data/shugyou/ 2012 , 2018 . 7 . 7）．

当研究は、コスメトロジー研究振興財団による研究助成

16）彦聖美 , 鈴木祐恵 , 金川克子ほか：高齢期の妻や親をにより実施された。当研究にご協力いただいた家族会やク介護する男性の介護状況に関する実態調査 , 石川看護雑

リニックの皆様、男性介護者の皆様へ心からお礼申し上げ

誌 , 10：37 ‒ 46 . 2013 .
17）藤田孝典：下流老人 第 13 版 , 朝日新書 ,（東京）2015 .

ます。

18）小原克彦：中・高年の見た目年齢の解析 , コスメトロ（引用文献）

ジー研究報告 , 24 : 59 ‒ 171 . 2016 .

1） 津止正敏：家族介護支援のリアリティ ─男性介護者

19）茂木健一郎：化粧する脳 第 1 版 , 集英社 , 東京 . 2009 .

研究から提言─ , 高齢者虐待防止研究 , 5：32‒38. 2008.

20）大坊郁夫 , 高木修：化粧行動の心理学 化粧する人間の

2） 厚生労働省統計情報・白書（2013）「国民生活基礎調査」（http://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/k–tyosa/k–

こころと行動 , 北大路書店 , 京都 . 2009 .
21）町田 明子 , 白土 真紀 , 高田 定樹ほか：脳波を用いた
高齢者に対する化粧療法の効果検証 , 老年精神医学雑誌 ,tyosa16/dl/05.pdf, 2018. 7.4）．

23（8）：978 ‒ 987 . 2012 .

3） 金子克子 , 彦聖美 , 鈴拓恵：在宅医療助成報告「男性介護者を地域で支える方略に関する調査研究」, 公益財団

療法の効果検証 , 東京工業大学 , 平成 25 年度学位論文 ,法人勇美記念財団 , 東京 , 2010.
4） 永井邦芳 , 堀容子 , 星野順子ほか：男性家族介護者の心身の主観的健康特性 , 日本公衆衛誌 , 58（8）：606–615.
2011.

22）町田明子：脳波を中心とした生理学的指標による化粧東京 . 2013 .
23）高崎絹子：実践から学ぶ高齢者虐待の対応と予防 第１版 , 日本看護協会出版会 , 東京 . 2010 .

− 199 −

香りの記憶形成・固定化メカニズムの解明
同志社大学研究開発推進機構

眞部寛之

It is known that the odor memories are associated with not only what the odor is but also the episode that experienced
when we smelled the odor. However, the neural mechanism of association between an odor and the episode is still unclear.
The piriform cortex, a major part of the olfactory cortex, is known as an association cortex integrating incoming olfactory
sensory information from the olfactory bulb with top-down input from higher regions such as the orbitofrontal cortex. To
reveal the neural mechanisms of association memory between an odor and the episode when the odor was experienced, werecorded the neural activities in the anterior piriform cortex (aPC) of freely moving rats performing an odor-guided go/no-gotask and its reversal learning task. To reveal memory consolidation mechanisms of the aPC, we recorded the neural activities
during the pre- and post-task sleep.
We found that many aPC neurons fired during the odor presentation period and the specific behavioral scene during theodor-induced behavioral go/no-go events, such as the moving to the reward port scene, the consumption of rewards scene,and so on. Such the odor-scene responsive aPC neurons were tuned to a smaller scale scene within each behavioral scene.
After rats learned the reversal task, many aPC neurons respond to the reversed odor-scene combinations. We also found thatthe odor-scene responsive neurons reactivated associated with the olfactory cortex sharp-waves.
These results suggest that the odor-scene responsive aPC neurons have an important role in the memory formation andthe consolidation between the odor inputs and the top-down scene signals related to the odor-guided learned behaviors.

1. 緒質が持つ機能は未だほとんど解明されていない。本研究の言第一の目的は、匂いとエピソードを繋ぐ連合記憶の神経回

匂いの記憶は、単にその匂いがどのような匂いであるか

路機構を明らかにすることである。我々は嗅皮質の中でも、だけでなく、そのときに経験したエピソードも含めて想起

嗅球からの嗅覚情報と、高次領域からのトップダウン入力

されることは我々の日常生活においてもよく経験することを受ける梨状皮質に着目した。匂いを手掛かりとした行動である。この匂いと連合した経験によって、例えば、特定

学習課題遂行中のラット梨状皮質からリアルタイムに神経の香水に対する愛着などがおこると考えられる。匂いに活動をモニターすることで、匂いとエピソードの連合学習

よって過去の経験が想起される心理現象は、「プルーストにおける梨状皮質の役割を検討した。

1）

効果」と呼ばれている 。この名前は、フランスの小説家、

記憶の固定化研究は海馬で進んでおり、海馬においては、

マルセル・プルーストの著書『失われた時を求めて』の中に、経験時の活動パターンがその後の睡眠時（オフライン時）に、主人公が紅茶に浸したマドレーヌを口にした時、幼少期の鋭波と呼ばれる特徴的な脳波に伴って繰り返し再現される体験が鮮明に思い出されるという有名な一節がもとになっ（再活性化される）ことで記憶が固定化されると考えられて2）ている 。小説では、主人公がマドレーヌの芳醇な香りにいる 4）。

よって過去の経験（エピソード）を思い出すが、このたった我々は近年、徐波睡眠時のラット嗅皮質において、海馬

一度の経験でも起こりうる、匂いとエピソードとの連合学とよく似た特徴を持つ鋭波が観察されることを発見し、嗅習と想起システムの脳内機構は全く不明である。

皮質鋭波と名付けた 5）。嗅皮質鋭波の出現と同時に、特定1991 年に嗅覚受容体が発見され 3）、嗅覚系の研究は急の嗅皮質ニューロン群が発火活動を起こすことから、海馬速に発展し、嗅覚受容体を発現する嗅上皮や 1 次中枢であと同様に、嗅皮質鋭波上で睡眠直前に経験した神経活動パる嗅球での情報処理の基本ロジックは明らかとなってきた。

ターンが再活性化されている可能性がある。本研究の第二

しかし、嗅球からの情報が統合される嗅覚 2 次中枢の嗅皮の目的は、徐波睡眠時の嗅皮質鋭波上で再現される情報とその様式を明らかにすることで、匂いとエピソードの長期固定化機構を明らかにすることである。匂いを手掛かりとNeural mechanisms of odor memory
formation and consolidation
Hiroyuki Manabe

した行動学習課題遂行後の睡眠中、梨状皮質で匂いとエピ
ソードの記憶に関わるニューロンが、再活性化するかどうかを検討した。

Organization for Research Initiatives
and Development, Doshisha University− 200 −

香りの記憶形成・固定化メカニズムの解明

2. 方ラット頭蓋骨に穴をあけ、テトロードを真っ直ぐに下ろ法

して前梨状皮質に到達させた。マイクロドライブは接着剤

2 . 1. 匂いを手掛かりとした go/no‒go 行動学習課題と逆転学習、課題前後の睡眠を用いて頭蓋骨に固定した。グランドとリファレンスのために、小脳上の骨にビス電極を埋め込んだ。

本実験のすべては、同志社大学動物実験等の実施に関す

1 週間以上回復期間を設け、その後、匂いを手掛かりる規定に従い、同志社大学動物実験委員会の審査を受け、とした go/no–go 行動学習課題と逆転学習を遂行中、また学長の承認を得た上で実施したものである。

その前後の睡眠中、前梨状皮質のニューロン活動を記録

実験には、雄の Long‒Evans Rat（清水実験材料）成獣した。記録は、多チャンネル記録システム（Neuralynx まを用いた。匂いが出る匂いポートと、水報酬が出る水ポー

たは OpenEphys）を用いて行った。ユニットレコーディン

トが壁に設置されているオペラントボックス（自作）にラッグ用のサンプリングレートは 32 kHz（Neuralynx）または

トを入れた。ラットが匂いポートに鼻を入れると、0 . 5 秒

30 kHz（OpenEphys）であり、取得したシグナルはバン

間匂いを提示し、匂いの内容に応じて 2 種類の行動を学習

ドパスフィルター（600 ‒ 6000 Hz）をかけた。セッション

させた
（図１A）
。

終了後、テトロード電極を 40 µｍまたは 75 µｍ下すことで、・go 行動：匂い A の提示後、2 秒以内に水ポートに鼻を入

日々新たなニューロン集団から記録した。
データは全て Matlab（Mathworks）を用いて解析した。

れて水報酬を得る。
・no–go 行動：匂い B の提示後、水ポートに鼻を入れず 2記録したマルチユニットをオフラインにてスパイクソーテ
ィングすることで、シングルユニットとして解析した。

秒間待つ。
go 行動では、2 秒以内に水ポートに鼻を入れられなかっ3. 結

た場合、no‒go 行動では 2 秒間待てなかった場合、次試行

果

go 試行はランダムに提示し、1 日に 1 セッション、数百試

3 . 1. 匂いを手掛かりとした go/no–go 行動学習課
題遂行中の前梨状皮質ニューロン活動の解析行を行わせた。タスクの制御はコンピューター制御で自動学習が成立したラットは、匂い A が提示されれば、隣化して行った（Bpod、Sanworks）。匂いの制御は自作オルの水ポートに行き水報酬を獲得する行動を行い、匂い B がファクトメーターを用いて行った。オルファクトメーター

提示されれば、水ポートには行かず待つ行動を獲得した。

はタスク制御装置によってコンピューター制御できるよう

この、go/no‒go 行動学習課題遂行中の前梨状皮質から多にした。使用する匂い分子は様々な化合物またはその混合数のニューロン活動を記録した。前梨状皮質ニューロンは、物を使用し、実験ごとに変えた。

行動時の様々な場面で応答した。その中で、記録した 251に移行するまでに 2 秒間の遅延罰を与えた。go 試行と no‒

逆転学習は、上記の匂いを手掛かりとした go/no–go 行

個のニューロンのうち、138 個のニューロンが、匂い提示

動学習成立後、刺激－報酬の連合関係を、セッションの途

区間と、その後の特定の行動状態（シーン）の 2 か所で応答

中で、匂い A → no‒go 行動、匂い B → go 行動の関係にすることが分かった。図 1 B は匂い提示シーンとその他シ突然入れ替えることによって行った。

ーンの 2 か所に応答するニューロンの例（３例）である。匂徐波睡眠中のニューロン活動をモニターするために、行

い提示後のどのシーンに対して応答するかはニューロンご

動学習課題の前後にラットをオペラントボックスに入れたとに異なっていた。図 1 C は、匂い提示時に応答したニュ

まま 1 ‒ 2 時間放置し、ラット睡眠中（前睡眠、後睡眠）のーロンが、その後のどのシーンで応答するかを示した図で前梨状皮質ニューロンの活動を記録した。

ある。正解した試行のみを用い、各行がそれぞれのニューロンの活動パターンを示し、応答のピークが黄色になるよ

2 . 2 . 電気生理とデータ解析

うにカラーマップで示した。ニューロンを、応答のピーク

ケタミン（67 . 5 mg/kg）およびメデトミジン（0 . 5 mg/kg）の順番に並べると、匂い提示後のすべてのシーンをカバーにて麻酔したラットの前梨状皮質に 15 本のテトロード電

するように応答することが分かった（匂いが出るシーンの極を挿入する手術を行った。テトロードは直径 12 . 5 µm の後、黄色い線が、ニューロン間で連続して続いているよう

タングステンワイヤー（California Fine Wire）を 4 本束ねに見える）。また、匂い B に応答するニューロンは、水ポたものを使用した。テトロードは自作マイクロドライブ

ートに行かず待機するシーンのすべてをカバーするようにに取り付け、マイクロドライブ上のケーブル接続用基盤に応答することが分かった。すなわち、これらのニューロン接続した。マイクロドライブは、ネジを動かすことで電極

は、匂い刺激と、特定のシーンとを連合するニューロンでの深度を変えられる装置であり、日々深度を変えることで、あると考えられた。

多くのニューロンの活動を記録できる。これをラット頭部に設置でき、ラットの行動を制限しないサイズに設計した。

− 201 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図1

学習課題と aPC ニューロンの応答

A：匂いを手掛かりとした go/no-go 行動課題
B：課題遂行中の aPC ニューロンで見られた、匂い提示区間とその後のシーンの両方に応答するニューロンの例
C：匂いとその後のシーンの両方に応答するニューロンを、シーン応答のピーク順に並べたもの

3 . 2 . go/no‒go 行動学習課題の逆転学習時の前梨状皮質ニューロンの解析

ーンの両方に応答するニューロンが記録されたが（図 2 C

匂いを手掛かりとした go/no‒go 行動学習課題を充分にる。
）、逆転学習成立後には、匂い A とその後の no‒go 行動

学習したラットを用いた。ある日のセッション中、刺激時の特定のシーンの両方に応答するニューロンが記録され－報酬の連合関係を、匂い A → no‒go 行動、匂い B → go

るようになった（図 2 C 左下）。また、逆転学習前には、匂行動の関係に突然入れ替える逆転学習を行わせ、その際のい B とその後の no‒go 行動時の特定のシーンの両方に応答

前梨状皮質ニューロンの活動を継続的に記録した（図 2 A）。

するニューロンが記録されたが（図 2 C 右上）、逆転学習成

刺激－報酬の連合関係を逆転されると、逆転直後には、そ立後には、匂い B とその後の go 行動時の特定のシーンのれまでの学習で得られた行動を行うため正答率は落ちるが、両方に応答するニューロンが記録されるようになった（図ラットが新しいルールを学習すると共に正答率が上昇した。

2 C 右下）。すなわち、逆転学習によって匂いと行動の新

図 2 B に、ある日の正答率を示す。安定した正答率（80 ％しいルールを学習すると、梨状皮質ニューロンの発火パタ以上）が得られた段階で、匂いと行動との関係を逆転したーンも新しい刺激－行動の連合関係を構築することを意味（図 2 B 赤線）。一旦正答率は落ちるが、数十試行後には高しており、匂いとそれに紐づくシーンの両方に応答するニ

い正答率に達した（図 2 B グレー線）。前梨状皮質の応答は、

ューロンの応答特性は、学習によって形成されると考えら

逆転学習前には、匂い A とその後の go 行動時の特定のシれる。

左上、ここでは、匂いが出たあとのシーンのみを示してい− 202 −

香りの記憶形成・固定化メカニズムの解明

図2

逆転学習と逆転学習による aPC ニューロンの応答変化

A：逆転学習 試行途中から赤矢印の関係に突然変化する
B：逆転学習時の正答率の変化
C：逆転学習前後における、シーンに対する応答変化 上段 ; 逆転学習前、下段 ; 逆転学習後

3 . 3 . 課題後のニューロン再活性化の解析

皮質鋭波に同期して発火するようになった。すなわち、行匂いを手掛かりとした go/no‒go 行動学習課題に加え、動課題で発火した匂い区間とシーンの両方に応答するニュ

その前後の睡眠中の前梨状皮質ニューロンの活動も記録し、ーロンが、課題後の徐波睡眠中、ニューロン発火活動の再覚醒中の課題遂行時に活動したニューロンが、その後の徐活性化を起こしたと考えられる。

波睡眠時に、嗅皮質鋭波に伴って再活性化するかどうかを4. 考検証した（図 3）。匂いを手掛かりとした go/no‒go 行動課

察

題中に、匂いとその後のシーンの両方に応答したニューロ

本研究で見つかった、匂いとそれに紐づくシーンの両方

ン 2 例を示す（図 3 真ん中のヒストグラム）。左右のヒストに応答するニューロンは、匂いとシーンを連合する役割をグラムは、それぞれのニューロンが課題前後の睡眠中、嗅もつニューロンであると考えられる。また、逆転学習の結皮質鋭波に同期して発火したかどうかを示すグラフである。

果から、匂いとシーンの連合関係は学習依存的であると考0 を嗅皮質鋭波のトラフとして、鋭波のトラフ前後に発火えられる。各々の前梨状皮質ニューロンが異なるシーンにしたかどうかを多数の嗅皮質鋭波イベントの加算で表した。

対して応答することから、前梨状皮質のニューロン集団でピンクのラインを越えれば、統計的に有意に発火したとい見ると、匂いとそれに紐づくシーンの集合である、エピソえる。これらのニューロンは、前睡眠中、嗅皮質鋭波出現

ードを表象すると考えられる。すなわち前梨状皮質は、匂時に同期した発火はほぼ見られなかったが、後睡眠では嗅い情報とエピソードの連合学習の場である可能性がある。

− 203 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図３ 課題前後の睡眠時における、匂いとその後のシーンの両方に応答する aPC ニューロンの再活性化

前梨状皮質は、嗅球から直接入力を受ける。また、嗅皮あり、匂いがどのように記憶や行動に結びつくのかについ

質亜領域同士が密に連絡しており、嗅覚情報は嗅球から直てはほとんど不明であった。しかし近年、嗅球の基本的な接、または他の嗅皮質亜領域経由で入力されるので、匂い回路機構が解明され、嗅球の次の高次領域である嗅皮質の提示区間での応答は、これらの経路からの入力であると考機能に注目が集まってきた。嗅皮質は、嗅球からの匂い情えられる。一方、シーン情報はどこから来るのか？最近報を統合するだけでなく、高次野からのトップダウン入力

我々は、内側前頭前野から直接入力を受ける ventral tenia

を受ける領野であり、匂い情報とトップダウン情報の連合

tecta（VTT）と呼ばれる嗅皮質亜領域のニューロンが、様々の場であると考えられてきた。

なシーンに特異的に応答することを発見した 6）。前梨状皮

本研究は、匂い情報とそれに紐づくエピソードとが前梨質で見られたように、シーンに応答する VTT ニューロン状皮質で連合するという新しい仮説を提唱するものであり、を集めると、行動中のすべてのシーンに対応することが本研究を足掛かりとすることで匂い記憶の研究の発展に寄分かった。すなわち、VTT ではエピソードを表象するこ

与したいと考えている。また、本研究は、これまで心理学とが分かった。前梨状皮質は VTT から直接入力を受ける的な考察しかされてこなかったプルースト効果を、神経科ため、シーンの情報は VTT から入力される可能性がある。

学的に解明する糸口になる可能性があり、今後の研究の発また、前梨状皮質は眼窩前頭皮質からの直接入力を受ける。

展が期待できる。今後は、オプトジェネティックスなどを内側前頭前野と眼窩前頭皮質も密に連絡があり、シーン情導入し、匂いとシーンとの連合を阻害したときにどのよう

報は眼窩前頭皮質から入力される可能性もある。

な行動変化が起こるのかを明らかにしたい。

匂いとそれに紐づくシーンの両方に応答する前梨状皮質エピソードの想起は、単に起こったことを思い出すだけ

ニューロンは、課題後の徐波睡眠時、嗅皮質鋭波に伴ってでなく、そのときの心理的な状況（楽しかったや悲しかっ

再活性化することから、嗅皮質鋭波は覚醒時の記憶の固定たなど）も想起される。すなわち、エピソードには、情動化に寄与している可能性がある。

や感情などの情報も内包されると考えられる。匂いの印象

5. 総は大抵、何らかの情動や感情が伴うことが多い。本研究は

括

匂いとシーンの連合に着目したが、匂いとそれによって起これまでの嗅覚研究は、匂い情報をどのように獲得し、こる情動や感情などの連合も梨状皮質上で起こっている可

匂いがどのように脳で表現されるかについての研究が主で能性があり、本研究を発展させることで、我々が嗅いだ匂− 204 −

香りの記憶形成・固定化メカニズムの解明

いに抱く印象がどのようにして起こるのか、その神経回路

2）鈴木道彦 .『プルーストを読む─『失われた時を求めて』の世界』集英社新書 . 2002 ISBN 978‒4087201758.

機構を明らかにできるかもしれない。
徐波睡眠時に起こる、嗅皮質鋭波での再活性化は、成立

3）Back L, Axel R. A novel multigene family may

した記憶の固定化の場としての機能を持つと考えられ、こencode odorant receptors: A molecular basis for odorの再活性化の阻害による記憶定着の阻害実験などを行いた

recognition. Cell. 65（1）: 175‒187, 1991.

いと考えている。また、今回の研究では、前睡眠→課題→

4）Wilson MA, McNaughton BL. Reactivation of

後睡眠を通じて記録できたニューロンの数が少なく、再活

hippocampal ensemble memories during sleep. Science.

性化のルールや、逆転学習後の再活性化様式などは不明の265: 676‒679, 1994.

ままであり、今後の研究で明らかにしたいと考えている。

5）Manabe H, Kusumoto–Yoshida I, Ota H, Mori K.

今後、今回発見した匂いとエピソードの両方をコードす

Olfactory Cortex Generates Synchronized Top–Down

るニューロンの連合学習様式と再活性化様式をさらに解明

Inputs to the Olfactory Bulb during Slow–Wave Sleep.

していくことで、匂い記憶とその固定化の神経機構の基本

The Journal of Neuroscience. 31（22）: 8123–8133, 2011.
6）Shiotani K, Manabe H, Tanisumi Y, Murata K, Junya

ロジックを明らかにしたい。

H, Sakurai Y, Mori K. Tuning of ventral tenia tecta（引用文献）

neurons of the olfactory cortex to distinct scenes of1）Ernst A. The Proust Effect: The Senses as Doorways

feeding behavior. BioRxiv. doi: 10.1101/455089.

to Lost Memories. Perception. 43: 1404‒1406, 2014.

− 205 −

●第 29 回表彰・贈呈式記念講演
●

齋藤 美穂

第 29 回表彰・贈呈式

記念講演（ステーションコンファレンス東京・平成 30 年 11 月 20 日）

日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩
早稲田大学

齋藤

常任理事

美穂

さいとう・みほ1985 年早稲田大学大学院文学研究科博士課程心理学専攻を修了、1996 年早稲田大学人間科学部助教授、2001 年早稲田大学人間科
学学術院教授に就任。2010 年より早稲田大学理事、2018 年から早稲田大学常任理事、2019 年度より名誉教授。先生は、色白肌嗜好の心理学的研究、色彩嗜好の国際比較、色と香りの心理、生理学的効果など、色と香りを通して人の感性を独自の視点でご研究されておられます。
・専門分野：感性認知科学、色彩心理学
・その他：1993 年日本色彩学会色彩学論文賞、1991 年第 2 回コスメトロジー研究助成受賞

皆さまこんにちは、齋藤でございます。ただ今は、素晴でも、感性という言葉が非常に大切なキーワードになってらしいご紹介をありがとうございました。まずは、このよおります。その感性はもしかすると色彩というものがつな

うな素晴らしい場所、そして懐かしいコスメトロジー研究ぎ目になるのではないか、そういう発想から、感性をつな振興財団の表彰式と記念講演でお話をさせていただきます

ぐ色彩の役割を検討しました。その中から、今日は、色とことを、大変うれしく思っております。

香りの調和関係による香りの可視化の研究、こちらのほう

今日お話をさせていただきます内容に関してでございまをご紹介させていただきたいと思っております。盛りだくすが、まずは研究の原点となりました色彩の好みの国際比さんでございますので、少しスピードを上げながら進めて較から始めたいと思います。国際比較を続けておりました

まいります。

時に、日本人が白に対して非常に高い嗜好を示すというこ＊＊とが分かりまして、それを様々に研究しておりました時に、さて、最初は色彩嗜好の国際比較の研究でございます。

嗜好の構造、これは色彩の嗜好だけではなくて、嗜好といこの研究は、日本を中心としたアジアの地域、そして欧米

うものの構造を検討することができました。そしてそれをから幾つかの地域、そして南アフリカ共和国とオセアニア

検討した結果が、私どもの学位論文になりました。私はの地域、あと日系アメリカ人、在日米国人という方たちを1997 年に学位を取得したのですが、ちょうどその時に、対象に、こちらにございます同じ色見本を 1,000 人以上の

第 2 代社長の小林禮次郎さんも早稲田大学で学位を取られ方たちにご覧になっていただき、この中の好きな色と嫌いて学位授与式をご一緒しました。そういった意味でも深いな色を選んでいただいて、その理由を聞くという調査でごご縁を感じている次第でございます。学位を取る前のことざいます。非常に単純なものなのですが、そこのところにですが、白に対する嗜好が高いということが、もしかする

文化的なものが見え隠れするという、私もやっていて非常と色白肌への嗜好、すなわち色の白いは七難隠すという言に面白い研究だと思いました。

い回しは、よく聞かれたことがあると思いますが、その嗜その結果でございます。早速お見せしたいんですが、こ好の心理的背景、そういったものと何らかの関係があるかのスライドの図にあります左側のほうが嗜好色、そして右もしれないと思ったところから、そのような研究をしたい側のほうが嫌悪色になっております。嗜好された色に関しと思った時に、コスメトロジー研究振興財団からの助成金て、日本、中国、韓国、台湾、インドネシア、アメリカ、を頂戴して研究がスタートいたしました。その研究は、確

ドイツ、デンマーク、オーストラリア、パプアニューギニ

か日本人の女子大生を対象とした研究でしたが、その後にア、南アフリカ共和国、日系アメリカ人、在日アメリカ人

日本とインドネシアでの比較をいたしまして、その研究をとございますが、ここで注意していただきたいのは、日本、

日本心理学会が発行する「心理学研究」
で論文として発表い中国、韓国、台湾、インドネシアというアジアの国においたしました。それがきっかけとなり、それをご覧になったて、白が嗜好色の上位に位置しているというところでござ企業の方から、今度は日本と中国で比較をしてみたいといいます。実際のところ日本で調べますと、40 ～ 50 年間ずうオファーがございまして、企業との共同研究、これも始っと、日本では白に対する嗜好が高いというのが、非常にまったわけでございます。ですから、コスメトロジー研究

特徴的なものでございました。それが果たして他のアジア振興財団からのこの研究助成が、私の研究の広がりを作っの国にも共通するのかどうかということを調べた結果、やてくれたというように思っております。

はり共通して白に対する嗜好が非常に高いということが分

もう一つ今日お話をさせていただきますのが、「感性をつなぐ色彩」というものでございます。今は企業でもどこかりました。
もう一点、気をつけていただきたいのは、ここにどこの− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

地域にも共通して出てくる色があるんです。この色という

実は、このような考えに至ったのは、その当時から脳科のが、実は「ビビッドブルー」という「鮮やかな冴えた青」と学というのがだんだんと進んでまいりまして、今はどんどいうものでして、この青というのが、どの国でもどの地域

んと知見が新しくなっておりますけれども、それからデバ

でも共通して好まれるという色でございました。これは私イスも新しくなってまいりましたので、いろいろな知見がの色の好みの研究だけではなく、Faber Birren という色たまってきており、それがベースにあります。今の知見も彩学者がいるのですが、その方も青というのは、恐らく人含めてお話ししますけれども、脳というのは古い皮質があ類にとって普遍的な嗜好色であろうということを言っておって、その上にかぶさるように新しい皮質がございます。

りますし、それから Charles Winick という人が、様々な

これは脳を断面にしたところでございますけれども、古い国でのタブー色を調べた研究がございまして、その研究の皮質というのは、この中心のほうにある、これは人間の本

中でも、青は、唯一タブーにならなかった色ということで能に深く関わりを持っていて、人間の生き死に、すなわちした。いろいろな国でコーポレートカラーでもこういった

自分の生命の維持とか、そういったものにも非常に関係が色が使われるのは、実はある意味、理にかなっているのか深いところであります。そこのところに関係するものは、なと思えるぐらい、この青というのは、どの地域でも好ま

まず中心のものでして、それは人類に普遍的であり、たぶれる、受け入れられやすい色であるということが言えるか

ん固定的であろうと考えられるんですね。その外側というと思います。この 2 つの点に注目しながら、何回かこのよのは脳の新しい皮質、これは学習、経験、そういったもの

うな調査を繰り返してまいりました。その結果、空間や時によってどんどんと獲得的に変化してまいります。それは間の変化にかかわらず、常に好まれる色と、常に嫌われる

社会、文化的な要素でありまして、それが流動性を持って色、これが存在するということが分かりました。つまり様々に私たちの脳というものを形成していると考えられる

10 年後ぐらいに、もう一回同じところで調査をやってみのではないかと思います。そうするとちょうどこの 3 層構

ますと、それでも共通して常に嫌われたり、常に好まれた造というのが、意外にピッタリとします。しかも好みとい

りする色があるということなんです。その一方で、変化すうものの中枢として考えられるのが、扁桃体といわれる、る好みもあるということ、すなわち普遍性と流動性が好み

これは Amygdala と言われるところなんです。こちらの扁には存在するということが分かるわけです。恐らくその普桃体という部位は、実は元々人間がここは危険か安全か、遍性というのは、私たち人類に生得的に備わっている何か

これは食べても大丈夫か、これは生命に関係ないかどうか、に関連しているんではないかというように思います。流動

それを見極めるためのそういう器官でありました。危険な性というのは、学習とか経験による獲得的なもの、これにものは人間にとって不快です。それがやがて嫌いという感

根付いているものではないかというように思うんですね。

情になり、そして安全なものは人間にとって快い、それがそこで嗜好の構造をモデル化し、嗜好を形成する要因と 3

やがて好きというような感情に変わってくるわけですね。

層構造をモデル図にして学位論文で私が発表したものがこ

その扁桃体というところがこの脳の中心のところに位置しちらになります。その図のほうをご覧に入れたいと思いまている、これをちょっと覚えておいていただきたいと思いす。

ます。あとでまた出てまいります。その近くに海馬という、こちらがその 3 層構造でございます。まずは、おそらくこれはご存知だと思いますけれども、記憶の中枢ですね。

人類にとって生得的な嗜好、それは快・不快感情による普ですからある音を聞いたとき、ある音楽を聞いたときに、遍的な嗜好、これが中心核にあって、その外側に年齢とかああ懐かしい音楽だ、これは昔聞いたことがある、あの時

性とか個人的な要因、個体要因による個人的な嗜好があり、はこんなことをしていたなということを、はっと思い出す

これは生得的、プラス獲得的。その外側に環境要因による、ことがありますよね。それは扁桃体に各モダリティーを通

例えば流行とか慣習とか、そういったものによる社会的嗜して得た全ての感覚情報が通過するからなんです。そうし好があり、これは獲得的でございます。こういった 3 層のてここが活性化いたしますと、その近くに海馬、すなわち構造があり、外側に行けば行くほど流動的になる、例えば記憶の中枢がありますので、そこも同時に活性化して、そ流行によって変化するとか、その時の気候とか風土によっういったものを思い出すというような仕組みが生じるわけて変化するとか、外側に行くほど流動的になるけれども、です。こちらにいらっしゃる皆さまは、おそらく人間の快内側に行けば行くほど普遍的であり、固定的であるという感情にご興味があるかと思いますので、もう一つちょっとような、こういう 3 層構造で考えると、嗜好、例えば色に大事な脳の部分をお伝えしたいと思います。ここは赤く記

対する嗜好もそうですし、香りに対する嗜好もそうですし、してありますけれども、側坐核といわれるところです。実

味に対する嗜好もそうですけれども、嗜好というものの構は腹側被蓋野も快感情に関係しているんですが、今日はち造を捉えやすく、何となく具合がいい図であると、私も納ょっと置いておきまして、側坐核というところです。これ得したわけでございます。

が実は、快感情と非常に関係が深いのです。

− 210 −

第 29 回表彰・贈呈式記念講演 「日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩」

さてこちらをご覧になってください。真っ赤なフェラー

ほとんどいないのですが、中国では白に対する好悪、これリです。皆さまはこれをご覧になって、かっこいいと思わが拮抗するという面白い現象もあります。でも白に対するれたでしょうか。もしもそう思われたなら、その時には皆

嗜好は、むしろ中国のほうが実際は高いんです。それでもさま方の脳の側坐核が活性化していたということになりま

一方で、嫌いな人もいると。日本人は、白を嫌う人はほとす。側坐核というのは、大脳の内側に両側性に位置するニ

んどいないですね。というようなことで、やはりそんなとューロンの集合体になります。側坐核は快情動の処理に関ころの文化的な違いというものも見られるかと思います。

与するといわれておりまして、先ほどお話ししました扁桃

白嗜好の文化的な背景というのは、これは文化人類学の体、好き嫌いというようなものに深く関わるところです。

本をひもとくと、いろいろと出てきます。これをお話しし

がん か

きっこう

扁桃体、視床下部、脳幹、眼窩前頭前野、これは前頭眼窩ていますと他のお話に行けませんので、一つだけお話しさ

野ともいいますけれども、Orbitofrontal cortex という、ちせていただくのは、白に対する神聖視、これが日本では際

ょうど目の後ろ側に位置するところでして、こちらが実は、だってあるということです。これは太陽信仰との関わりな

脳の報酬系に関係しています。報酬系というのは、これもんですが、天 照 大御神、日本の国をつくったという太陽神、聞いたことがある方がいらっしゃるかもしれませんけれど

そして白を太陽の光の色という位置づけで考えますと、白も、これは心地良いことが起きたりとか、それから欲求がというものが神聖な色として位置づけられるのは、これは満たされた時や、満たされると分かった時に活性化すると理解可能なことだと思います。ですから神道の素木、これころでして、私たちがいいなと思った時には、この報酬系

はソキと書きますけれども、シラキと呼びますね。素をシがわっと活性化するんです。その報酬系と側坐核というのラと呼びますけれども、シラキのシラというのは、この白は、相互の連携を取っているというところになります。でではなくて、生成りの無垢なものや清らかなものを表して

すから側坐核という場所は脳科学の中で、快感情と非常にいるものです。神道では、御幣とかそういったところにも深いつながりがありますので、一つ覚えておいていただき

白が使用されておりますが、こういったところに端を発したいと思います。

ているものでございます。このような神聖視が、白の希少あまてらすおお み かみ

さて、先ほどの扁桃体のほうに戻りたいと思いますが、性と優位性をより確固たるものにしていくという流れにな

扁桃体というのは、先ほども申しましたように、側頭葉のりまして、それでもう白というもの自体が神聖視の対象と前方内側に位置する神経核複合体で、情動に関与して、快なって、天皇や権力者に献上された祥瑞、これ自体に白いと不快のどちらの情動刺激に対しても人の扁桃体が活動しものが使われることが非常に多くなってくるという、そうます。大脳皮質、あるいは皮質下の経路を経て、全モダリ

いう関係性も出てまいります。

しょうずい

ティーの感覚信号が入力されていきます。それから扁桃体

そこで、この白というものが色白肌にも関係してくるのというのは、後天的に学習して柔軟に対象を広げていくとではないかと思って、研究が始まってきたわけでございまいうことも、最近の脳科学で分かっております。それがゆす。その研究をご紹介する前に、日本人の美人の要素といえに、私どもがここに書きました 3 層構造も矢印をつけまうのを、ちょっとこちらでご紹介させていただきます。江して、これはきっちりと領域が決まっているわけではなく戸時代は、うりざね顔、肩が細くて、やや鼻が低くて平面て、外側からまた内側に入り込んでいく、あるいは外側に的で面長、この要素が美人というように思われていました。

出てくるような、そういうような好みもあるというように、

今とは随分と違うんですけれども、その当時は着物で髷を柔軟に対象が少しずつ変化するというところも取り混ぜて結っています、鬢の張った髪型をしますので、そうするとおります。そんなわけで、このような 3 層構造を皆さまに

このような着物を着るには平板な感じの、平面的な感じのご紹介させていただきました。

ほうがきれいに着られますし、それからやはり面長のほう

まげ

さてちょっとお話を戻します。先ほど色の好みの研究をが鬢の張った髪型には合うんですね。そういった形でこの最初の原点の研究と申し上げましたけれども、その研究の要素が美人。明治時代になりますと、ふっくらした顔とか、中で、白がアジアの地域に共通して好まれている、しかも丸顔というような要素になってまいります。それが大正時非常に高く好まれるということ、これをお話しさせていた代になりますとフェミニズムが台頭してきますので、大きだきました。ですが、白はアジアで共通して好まれるんでな目とか大きな口、やや下がり気味の眉、細い顎というよすが、白を好む理由はそれぞれに異なっています。例えば

うに少し主張する、そのような造作になってくるわけです。

純血というふうな理由が中国、台湾、韓国では非常に高い

それが昭和になりますと、もっと大柄で立体的で、もっとのですが、日本ですと清潔が、やはり清潔好きの国民とい西洋的な感じですね。はっきりとした眉とか、より大きな

われますけれども、清潔という理由が非常に高いです。イ

目とか唇が強調されるとか、そのようになってまいります。

ンドネシアでは、明るいという理由が、非常に多く挙げら

それで現代の日本における魅力的な外見というのが、じれました。またもう一つ、日本では白を嫌う人というのはゃあどのようなものかと。これは多くの方たちに行ったア− 211 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

ンケートを基にまとめられた研究の結果なんですが、多変ことで、白の持つ優位性と特殊性が薄れて、有閑階級の間量解析をした結果、「色白で目元がはっきりしたタイプ」と、では逆に日焼けが流行して、ヨーロッパでは 1930 年代か「ほっそりした目鼻立ちの整ったタイプ」、こういったタイ

ら日焼けした肌色が、肌を焼きに行けるほど裕福で、十分プが美しいと思われる魅力的な外見だという、そういう結な休暇を取ってバカンスをエンジョイできる人を意味する果が得られたわけです。その時に同時にパーソナリティー、ようになるという、こんな逆転現象が出てまいります。日

これは「暗黙のパーソナリティー」というんですが、それは本でも、ガングロとかそういうようなものも流行った時があとでまたお話をさせていただきますが、「こういう外見ありますけれども、今はもう色白肌のほうに、ホワイトニを持っている人は、どんなパーソナリティーだと思います

ング化粧品のほうに随分とシフトされていると考えられるか」という質問をした結果、魅力的、信用できる、素直なかと思います。

という、そういうパーソナリティーだと。これはその人を先ほどの「暗黙のパーソナリティー理論」というものです

知らないのに、一見しただけで感覚的にそのように思われが、これは心理学者の Bruner, J. S. が提唱したもので、人てしまうという、ある種のステレオタイプなのかもしれなの性格に対して、私たちは漠然とした感じで、会った途端いですけれども、そのような結果が得られたということなにこの人はこういう人じゃないのかというのは、何となくんです。

ありますよね。これは多分無意識のうちに、こんなタイプ

ここで魅力的な女性の条件として、色白肌というのが出の人という具合に性格の体系の中に当てはめて認知する私てまいりましたけれども、日本では最初に申しましたよう

たちの傾向なんですね。それはすなわち、第一印象というに、色の白いは七難隠す、七難というのは仏教用語になりものを形成しまして、その体系に当てはめることによってますけれども、七難を隠すということでパーソナリティー

多くの情報を、逆にいえば効率よく処理する、情報処理のの欠点まで覆い隠しますよという、そういうような内容に

1 つの方略であるということで、「暗黙のパーソナリティ

なりますね。中国でも実は同じような表現がありまして、ー理論」というのがございます。

漢字を見ただけでも、1 つの白さが 100 の醜さをカバーす

そこで色白肌というものが、どんなパーソナリティーとるという意味に書かれているようなことわざ、そういった関連して捉えられるのかというのを研究したのが、この研ものもあるわけです。

究になります。日本とインドネシアで行いました。何万人

この白さということに関しては、日本でも古代に色白嗜と取った日本人の肌の色の中間的な肌の色がございまして、好というのが始まってきたのは、おしろいとともに中国大その中の色白、色白寄り、色黒寄り、色黒といった、そう

陸から恐らく伝播されまして、遅くとも 7 世紀末にはそのいう 4 パターンを色紙で用意いたしまして、その上にこの存在は知られていたことになります。白い肌の美意識といように女性に見えるような線画を描きました。これを日本うのが、平安時代に一層に明確となります。これは今のよとインドネシアで、人物を評価する 52 の評価語、こちら

うに室内が明るくないですので、暗い室内で何が映えるかを用意し、この評価語に当てはまるものが何かを選んでもというと、明るさ、すなわち白というのは一番反射率が高らいまして、それでその結果を見たわけでございます。色いですので、そのような暗いところでも一番映えるのは、

白肌だけについて今日はお話しさせていただきますが、日

白い肌になります。黒い髪と対照的な白い肌というコント本とインドネシアで両方とも一番最初に選ばれたのはラストで、それが美しさというものにだんだんと明確に、「弱々しい」という、そういう形容詞でございました。弱々平安時代になると一層明確になってくるという流れを持ちしいというのですが、その後の順位の言葉を見てまいりまます。

すと、ちょっと違いが分かります。日本人の場合は、弱々お化粧ができるほど裕福なのは貴族階級ということで、しいのですが、それが「貴族的、デリケートな、静かな、

貴重なおしろいを塗った結果、白い肌となっていったため

おとなしい、上品な、育ちが良い、消極的な、女性的な、東洋でも西洋でも貴族階級は色白肌であったわけなのです

保守的な」というふうな、こういったものが次に続くようが、しかし欧米では変わってくるんですね。これが面白い

な弱々しさなんですね。ところがインドネシアのほうはところなんですが、日焼け肌のほうが魅力的で好ましいと弱々しいという言葉の後に、「威張ったとか、貴族的な、思われているんです。今もそうです。もちろんホワイトニ

幼い、しゃれた、明るい、派手な」とか、どちらかというングの化粧品も出ておりますけれども、でも意外に肌を焼とネガティブな部分も出てくるんですね。インドネシアのくことはそんなにためらわずに焼かれるんですね。どうし方たちにその後に聞いたところ、色白肌というのは確かにてかといいますと、産業革命後に、労働する場所が屋外か好まれるんだけれども、色白の女性というのがなんかちょら屋内に変わります。そうすると労働者の肌の色が白くな

っと威張っているようなところがあって、とてもそういうってしまうんですね。そうすると有閑階級、つまり貴族階印象が強いと。ちやほやされるから、威張っているような級の人の優位性というのがここでなくなってしまうという感じがするという、そういうことで威張ったとか派手なと− 212 −

第 29 回表彰・贈呈式記念講演 「日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩」

か、そういう形容詞や言葉と関連づけられるんじゃないか

ります。それからあとはもちろん聴覚刺激など様々な刺激という、そんなことをアドバイスしてくれました。この調があります。外界を私たちが感受する時、外界を受け取っ

査は、実は色紙を使った調査でしたが、肌の色というのは、ている時というのは、一つの感覚だけではなくて多感覚を決して色紙と同じではないですね。そこに肌理というよう活用していることが多いわけでございます。そこで視覚、な要素もございます。

嗅覚、聴覚などが同時に働いていることが多いということ

きめ

そこで次に日本と中国で行った研究というのが、肌理を加えた研究です。これは 300 ぐらいの女性の頰の部分を撮で、今クロスモーダル知覚という研究が、いろいろなとこ
ろで流行っております。

った写真の画像から、肌理の細やかさと粗さで、こちらにクロスモーダル知覚というのは、異なるモダリティーが行くと、肌理が粗い、色白、色黒という画像、たとえばこ交錯し統合する知覚で、crossmodal perception とか、このビジュアル A は肌理が細やかで、そして色白。ビジュ

んな言い方を外国ではいいますけれども、私も 2000 年頃

アル B は色白だけれども肌理が粗い、ビジュアル C は肌理にオックスフォード大学にまいりました時に、オックスフ

が細かいけれども色黒で、ビジュアル D は肌理が粗くて色ォードでは既にもう、このクロスモーダルのことが盛んに黒という、この 4 つのビジュアルで両国の違いを見たわけ

行われておりまして、あちらでは有名な研究者の方もいらです。日本と中国の両方の国で、面白い傾向が見られまし

っしゃいます。多感覚とは別に、共感覚というのは、これたので、それだけをお伝えさせていただきたいと思います。

はある種の能力です。例えば画家のカンディンスキーとか、

このビジュアル A の色白で肌理が細やかな肌というのは、それから、音楽の好きな方だったら作曲家のスクリャービ

日本人も中国人も、実は共通して美しいと思うし、上品だ

ンとか、そういう方たちは共感覚を持っている方たちですと思うし、好きだと思っています。またビジュアル C のほ

けれども、その研究は別にあるんです。それとは別に、こう、こちらは肌理が細やかで色黒の肌ですが、これに対しれまでの五感の研究を統合的に捉える働き、その動きが、ては中国人も日本人も、愉快な、特色のある、陽気なといこれが心理学、特に知覚心理学とか認知心理学、また神経

うパーソナリティーあるいは外観から受ける印象と結びつ

科学の分野で着目されています。

ク ロ ス モ ー ダ ル

パーセプション

くわけです。ところが派手な、健康的な、明るい、若々し

この色彩というのは視覚情報ですが、実は他の感覚ともいというのは、日本人は色黒肌のほうに持つイメージなん

密接に結び付きます。例えば昔からキーキーキャーキャー

ですね。ところが中国人のほうは、色白肌のほうに持つイいうような声というのは「黄色い声」といいますが、これはメージだということで、ここに両国の違いというものが現

クロスモーダルな表現ですよね。このように確かにクロスれた点としてご紹介できるかと思います。アジアの国でこ

モーダルの表現も存在しますし、黄色い声といわれると、のように白は好まれるし、共通して色白肌というものも受

何となく甲高い声じゃないかというふうに、私たちは感覚け入れられるわけなんですけれども、ただし、そこには微的にそんな感じがいたします。

妙に文化の違いというもの、そんなものも感じられる、そ
ういう結果となりました。
＊

先ほども申し上げましたように、視覚、聴覚、嗅覚、そして味覚、触覚、体性感覚など、入力された全ての感覚情＊報が大脳辺縁系、特にこの扁桃体、これを通過することにさて今日のもう一つのお話ですが、感性をつなぐ色彩によって、人が何かを見たり聞いたりした時に、他のモダリ

ついてお話をさせていただきたいと思います。今までのおティーとも連動するメカニズムが生まれる、そして記憶も話は色彩というものをベースとしまして、文化的な側面を呼び起こされる。こういったメカニズム、これがあるんだ

見ましたけれども、感性というのは文化を越えてわれわれということを念頭に置いた時に、これは何か色彩と結びつ

人類に共通する、そういう一つの感覚であります。感覚とけられないかということで、感覚の中でも明確な分類がでいって申し上げていいのでしょうか、感性という言葉を辞きる色彩と結びつけて考えようと思ったのが、発想の出発

書で調べますと、いろいろと書いてありますが、このこと点でございました。

をまとめていいますと、どうも物事を心に深く感じる働き

これは美術の時間などで、教室に 1 つはあったのではなとか感受性、こういったものが、われわれが一般的に感性いかと思いますが、「色立体」といわれるものでして、色とといっているようなものに近いもののようです。すなわち、いうものは色相、すなわち赤とか黄色とか青とか緑とか、私たちが感性という時には、必ず、まずはそれを感受する

そういったものと、それから明度、明るい赤と暗い赤とい

働きと能力、これが必要となります。

ったような、明るさの度合い、それから鮮やかな赤や濁っすなわち感覚の存在、これが必須なんですね。外界を感た赤というような具合に、彩度、すなわち鮮やかさの度合受する時、この時には、例えば今、この部屋の中でも音声

いというように、この 3 つの属性で説明をすることができは聞こえています。また、視覚刺激がございます。それかます。ですので、ここにある色 1 点は、必ずこの属性、3

ら空調の温度という、そこから来る触感覚というものがあつの属性で説明し、そしてこの立体の中に位置づけること− 213 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019あるということが研究の結果で分かってまいりまして、こができるわけです。
ところが香りの分類というのは、実は非常に困難でして、の関係性を 20 年ほど前から研究しております。

いろんな人がこのように分類をしたりしております。です

その研究の結果、印象の類似しているものは調和するとがなかなかまとまらないんですね。香りというのは非常にいう関係性を明らかにいたしました。また調和関係は、心厄介でして、実は香りというのは周りに飛び散ってしまう

理的にも生理的にも良い効果があることを明らかにいたしんですね。そこでその香りというものをなかなか表現するました。その発想を基盤にして、色彩と香りの調和、色彩ことも難しいですし、それが香りというものの分類が難しと音との調和、これを研究いたしまして、調和というもの

いというように言われる理由なんです。しかし香りにはイを粘着剤として、色に寄り添わせて分類するという研究をメージがあります。色にもイメージというのがあります。

続けております。その先にあるものなんですが、それは色そこでこの色のイメージなんですが、ちょっと皆さま、

彩、香り、音の調和に関する共通軸を見つけまして、そのこちらをご覧になっていただいて、どんなイメージを持た

共通軸に基づいて多感覚が調和する快適空間、これを構築れるか直感で考えてみてください。また、これからあるメ

することにございます。

ンズの香りのついたムエットをお配りします。今この香り

こういった研究がどのように発展していくかということを嗅がれて、どのような印象を持たれたでしょうか？どうですけれども、色と香りの調和の心理的、生理的効果、こでしょうか。まだ前のほうの方しか配られていないと思いういう研究をすることによって、例えば化粧品会社とか、ますが、香りと、この色の感じと何か共通するところがご今は食品会社とも少し関係しておりますけれども、香りのざいましたでしょうか。もしそのように感じていただいた付いた製品のパッケージデザインへの応用ですとか、あるならば、実はこのメーカーの意図に合っているのでございいはデータベースを構築いたしまして、今これも作っています。

ますけれども、そのアプリケーションシステムを、デザイ

これは Dolce & Gabbana の「Light Blue」という名前のメンの提案や応用に活用していただくことも 1 つです。それ

ンズのオードトワレです。こちらがパッケージですが、ラから脳科学的な検討、これは非常に大事でして今の時代、

イトブルーのまさにその色を使っております。このイメー

脳のどこが活性化するか、それは快感情になっているかど

ジに合う色を使ったというのは、実は大正解なんですね。

うかということ、これは商品開発の中でも非常に大事なの

なぜそれが正解かというのも、あとでちょっとご紹介させです。ノーベル賞を受賞した行動経済学の理論から発展していただきたいと思います。このように色にもイメージがて、ニューロエコノミクスのように脳科学と経済学の融合ありますし、香りといったものにもイメージがあるというも進んでおります。そういう形で、調和、快感情に対すること、今匂いを嗅いでいただいて何となく何らかのイメー

脳科学研究への広がりというところに関係してまいります。

ジといったものと、例えばこれがきつい香りだとか、ある

私が何を目指しているかというと、色彩というものを中

いは優しい香りだとか、そんな具合でも結構ですけれども、心軸として、音とか画像とか香りとか、そういったものを

あるいは何かをほうふつとさせたりとか、具体的なものを様々なユーザーの属性とか、嗜好とか、ライフスタイルと連想したりとか。何かイメージとの連合があったと思いま

か、パーソナリティーとか、そういった要素を取り入れます。色もそうなんですね、色も何かイメージと連合してい

して、そしてそれらにプラス、そのイメージですとか、気くということです。

分とか生体情報、こういったものを全部加味して個人の印

そこで、色彩というのが多感覚の結び目になれるのでは象や気分にカスタマイズされた快適空間、もしこういったないだろうかという、こういう発想に気付いたわけです。

ものを提案できるならば、例えば末期がん患者さんに対す色彩というのは先ほども言いましたように、3 属性できちる緩和医療とか、そういったところにもきっと役立てていっと属性が分類できます。ですから、それに「ひも付け」す

ただけるようなことになるんじゃないかと思って、実際にる形で、他の感覚を結びつけてしまうという発想です。たWell being という「より良く生きる」といったことに、どうだし、色の 3 属性に寄り添わせて感覚の分類の可能性を探にかして結び付けたいなと思っているところでございます。

っていきますと、寄り添わせるためには、何らかの媒介がこれは簡単なアルゴリズムですけれども、要するにここ必要です。その粘着剤として、私は「調和」という概念を利のところに各感覚の共通軸を、印象のイメージの共通軸と用しました。

して見つけていきます。その共通軸ができますと、それをなぜ調和にするかというのは、あとでまた申し上げます

統合的に管理するそういった空間、統合管理システムといけれども、例えば優しい色、優しい香りというように、色うものを構築します。そこのところに、これを計算モデルにも香りにも共通するイメージがありますが、優しい香り

によってシステムを構築いたしまして、そこに先ほど申しに調和する香りは、決してきつい香りではないんですね。

ました報酬系の脳内メカニズムといったものをモデル化す

優しい色に調和する香りとなりますと、やはり優しい色でることを加味することによって、人間にとって快適な空間− 214 −

第 29 回表彰・贈呈式記念講演 「日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩」

を作り出そうというところ、こんなところが一つの起点とり方なんですけれども、それでこちらを見ていただきたい

なって研究をしております。

んですが、この赤で示した線分は、ピーチになります。ピ

ではその共通軸の見つけ方なんですが、細かいことは申ーチという香りは想像がつくと思いますが、この赤い線分

しませんけれども、例えば香りと色彩の印象空間をどのよ

はピーチの香り単独のイメージです。大体、真ん中の「どうに作っているかというと、香りと色の印象をたくさん聞

ちらでもない」という辺りをうろうろしているイメージか

きまして、そしてその結果、共通する軸というものを抽出と思います。ところがピーチと非常に相性のいい、すなわ

してまいります。左のほうが香りの印象次元、そして右の

ち調和しているといわれる色があるんですね。それがペー

ほうが色彩の印象次元になりますが、その印象次元を見てルレッドという、いってみればピンクのちょっと赤に寄っみますと、こちらにマイルドとクリアという共通軸、2 つたほうのような、そういうピンクです。それで囲まれた壁の共通する軸が見つかりました。

面の中で、ピーチの香りを嗅いでもらうという実験を行いこの共通軸が見つかりますと、その上に、同じ軸上でこます。その時に印象を聞くと、このように、今まで「女性のように香りをプロットします。今は 200 種類ぐらいの香的な」というのはこの程度だったのが、余計に女性的に感りの結果をプロットしております。それを色彩と香りのこじる。「軽い」という感じも、より軽いと感じる。好きな感の 2 つの軸上にプロットいたしまして、それを最終的に、じも高まる、快い感じも高まる、優しいという感じも高ま色というものの上にプロットするというようなマッピング、るということが分かりました。つまり心理的な面から見ま香りのマッピングをいたしまして、最終的に香りを可視化

すと、色と香りが調和している関係というのは、その香りする、色に寄り添わせた香りの可視化をするという形で実の持つイメージを、相乗的に高めるということが分かりま

験、研究を行っているわけです。例えば、これはオレンジ

す。これは実は、気分評定でも同じでした。ピーチ単独のスイートという香りでございますけれども、オレンジスイ

気分よりも、ピーチと相性のいいペールレッドが加わったートというのは、この香りはこの色と非常に相性がよいと時に、それに対する気分、例えば「穏やかな気分」とか「幸いうような、そういう香りというようにご覧になっていた

福な気分」が、より高まっているということが分かります。

だいて、ある色という、3 次元空間の色に、それぞれの色

その他に、幾つかの生理的な手法も取っております。こにひも付けるような形で、音とか香りとか、その色と相性

ちらは CNV の脳波を取ったものですけれども、このスラのいい、すなわち調和関係にあるものを見つけていくとい

イド、ちょっとお分かりになりますでしょうか、色で囲まう、そういう作業を行っているということです。色に寄りれた領域で、これは皿電極が付いていない状態です。電極

添わせて香りをマッピングして、可視化する可能性というをつけて、今皆さま方に持っていただいたムエットで、あことが、ここで提案できたわけです。先ほども申し上げまる香りを嗅いでいただきます。そしてある香りと調和してしたように、調和関係というものを媒介としておりますのいる色で囲まれた空間、あるいは不調和な空間で囲まれてで、応用範囲も広がるというふうに考えております。なぜいるような時に、どのような脳波の関係性になるかという調和がいいのかということ、最後にそれだけをお伝えさせのを見たり、それから心電図、これは寝ておりますのでこていただきたいと思います。

このところに電極を付けまして、HF 値という高周波成分

調和というものが心理的、生理的にどのような効果をもの変化を見ております。それからあとはストレスを感じる

たらすかというのを研究してまいりました。まず心理的なと、唾液中のクロモグラニン A（CgA）のレベルが上がる

調査といたしましては、心理学ではよく SD 法という手法

んですね、濃度が上がります。それらを見ております。

を使います。Semantic Differential というものの略なんでCNV の、これは覚醒か沈静かを見るものですが、マッ

すが、SD 法は印象を捉えるのにある意味優れた方法です。

チングペアで沈静、ミスマッチングペアで覚醒という結果

この方法というのは、後ろのほうの方はご覧になりにくいを得ました。それから心電図の高周波成分ですね、HF 値、かもしれないんですが、相対する言葉、例えば「重い」に対これは心臓副交感神経活性の指標となっているものですが、

して
「軽い」
ですね、
「暖かい」
に対して
「冷たい」
です。この

ミスマッチングペアで HF 値が低下している、すなわちこように対極にある軸のスケールの中で、ある対象のイメー

れはストレスを感じているということが分かりました。そジを評価してもらいます。たとえば、ここで見ますと、これから、先ほど言いました、唾液中のストレスに敏感な応の 3.0 というのが、真ん中のところです、これがどちらで答物質であるクロモグラニン A、これの濃度がミスマッチ

もないところになる。要するに重くもなく、軽くもない。

ングペアの時には増加しております。ということは、スト次々と形容詞対が、たとえば大人っぽい─ 子どもっぽい。

レスを感じていたということが分かりましたので、多分生嫌いな─ 好きな。浅い─ 深い。個性的な─ 平凡なとかが体にとって、調和しているほうがいいのではないかというございます。対極のスケールの中で、その対象に対してどことが言えそうですね。

んなイメージを持つかということを評定する、そういうやもう少し深くこの辺りを調べたいと思いまして、fMRI− 215 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

を使った研究をしましたので、最後にそちらをご紹介させけでございます。

ていただきたいと思います。fMRI による、脳機能におけということで、このようなところが活性化したというこる香りと色の調和関係の研究をいたしました。これは好きとを総合的に解釈いたしますと、次のようなことがいえるな香りを 1 つ選択して、その香りと提示された色との調和のではないかと思います。調和しているという関係は、ど度を判断している際の脳機能を測定するという実験です。

うやら脳では報酬として受け止められているということ。

被験者の方が自分が好きだと思う香りを、120 種類の香り

よって、多感覚の調和という概念を、製品開発ですとか空の中から選んでいただくんですが、120 種類全部の香りを間の構成等にもっと取り入れることによって、快適な生活

嗅ぐことはできませんので、大体フローラル系が好きです

空間に寄与できるのではないかと考えられます。なぜなら、かとか、柑橘系が好きですかと、おおまかなグループでカ

私たちは多感覚が統合された、そういう環境の中で生活しテゴライズしたものから選んでいただきます。

ているからでございます。
＊

例えば柑橘系が好きだとおっしゃったら柑橘系の中で、例えばグレープフルーツの香りとか、オレンジの香りとか、＊終わりに、今回は少し駆け足ではございましたけれども、レモンの香りとかという具合に、その中で最も好きなもの

まずは色彩嗜好の国際比較を通して、嗜好というものの構を 1 つ選択していただきます。それに色をこうやって用意

造、これを検討いたしました。その構造を検討する中で脳しておきまして、fMRI の中で 9 段階の調和度を香りと調との関係、これも少なからずどこかで関係があるのではな

和していると思った時に、示してもらうというような実験

いかという、そういうモデル図を皆さまにご紹介いたしま

です。

した。

このような実験の簡単な略図なんですけれども、fMRI

そして白に対する嗜好が日本、そしてアジアで高いといの中に横たわった方に、ここに鏡の後ろにスクリーンがごうことから、色の白いは七難隠す、そういった言葉が共通

ざいます、ここに色を提示します。この色は鏡に映し出さして存在するアジアの国で、色白肌嗜好の心理的背景につれてこの鏡を通して被験者のところに届き見えるようにな

いて国際比較研究を行ったものを紹介させていただきましっています。このエアコンプレッサーなんかは、MRI のた。

部屋には絶対に入れられませんので、これは室外に置いてもう一つの今日のテーマといたしまして、今、企業でもおいて、エアコンプレッサーからシリンダーに入った香り

どこでも特に注目を浴びています「感性」というもの、そのを、ブロックデザインに従って、一定の間隔でシュッと送つなぎ目に、おそらく色彩というものが関与できるのではり出します。その時に提示されている色と香りが調和してないかということをお話しさせていただきました。

いると思ったら、スイッチを押してもらうというような、そして特に色彩との調和関係、これがもたらす快適空間
ですとか快適性、こういったものを追究するということは、

そういう手続きで行いました。
その結果、活性化した部位というのが、先ほどの最初の人間にとって非常に大事なことであるのではないかというほうのお話で出てまいりました、眼窩前頭皮質というとここと、こんなところにたどり着いたわけでございます。

ろ、思い出していただけますでしょうか、報酬系というとそのようなわけで、色彩を中心とした私の研究のお話しころに深く関わっているところです。例えば美しいと思うではございましたが、色彩研究というのは人間と関わりが絵を見た時、いいなと思うような、そういう予感とか予想深い分野でございますので、人間とは何かというものを理とか、それから実際に心地良いという感覚を得た時に、こ解するのに、非常に面白い研究分野だと思います。色彩研の辺が活性化いたします。それからもう 1 つ「島」というと究の可能性の深さ、そしてその広がり、これを皆さまにおころ、「島」というのは感覚統合に関するところで、やはり伝えさせていただきまして、ちょうどお時間となりました

報酬に関わるところです。それから中脳ですね、これも中ので、講演のほうを終わらせていただきたいと思います。

枢神経系と密接に関わるところでして、こんなところと多ご清聴、どうもありがとうございました。

とう

とう

感覚の調和は非常に関わりがあるということが分かったわ− 216 −

コスメトロジー研究雑感

平成 28 年度

研究助成

化粧品を使用する場面で発生する挙動・現象を化学するコスメトロジー研究
朝倉浩一

最近の自分自身の言動を客観的に振り返ると、年齢も 50

この度、大変に有難くもコスメトロジー研究振興財団の台後半となったためか、どうしても一言余計に若い学生に対研究助成を賜り、取り組んだ研究は、化粧料使用時を平衡して物申してしまう傾向がある。現在、共同で研究室を運から遠く離れた化学システムと見なし、そこで起こる挙動・営している 30 台半ばの専任講師との差は顕著で、所謂ウ現象を、「散逸構造」の概念に基づいて厳密に物理的およびザいオッサンと感じられていることは間違いない。育った時化学的に解析し制御するものであった。システムはデバイ

代の環境や価値観の相違なども認識して付き合っていかな

スの組み合わせにより構成されるが、平衡から遠く離れたければと思うが、これからも絶対に譲れないことがある。そ化学システムで起こる興味深い挙動・現象について、そのれは、「研究において観察された挙動・現象は、物理的お原因をいとも単純に化学システムを構成する 1 デバイスのよび化学的に、厳密に考察されなければならない」である。

性質に帰着させるような考察をする若い学生の姿勢に対し化粧料を 1 つの化学システムと見なすと、それを使用すては、厳しい態度を取ってきたつもりである。

る場面は「力学的エネルギーが加えられ続け薄層化する」とおかげさまで、国際会議での発表や学術誌への公刊論

か、「外部環境との間に急速に巨大な界面相が形成される」文の掲載に加え、本研究助成を賜る直前に出願した特許とか、「揮発性成分が急速に外部環境へ移動する」など、平について、本研究の成果に基づいて優先権 PCT 出願し、衡から遠く離れた化学システムとなる場合が多い。化学シ

さらに日本、米国、フランス、イタリアヘ各国移行申請するこ

ステムが平衡から遠く離れると、平衡近傍では絶対に起ことができた。ここに、コスメトロジー研究振興財団に対し厚くらない「ゆらぎの成長」が起こり、1977 年のノーベル化学

御礼申し上げるとともに、今後もコスメトロジーの発展に寄与

賞の対象となった概念である「散逸構造」が発生する。

できるよう尽力致す所存である。 （慶應義塾大学理工学部）

平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
大貫義則

このたびはコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採ことを明らかにし、乳化状態を詳細に評価できる新規評価手択していただき、誠にありがとうございます。関係する皆法の構築に成功しました。非常に興味深い成果を得るため様に厚く御礼申し上げます。

のご支援をいただきましたことに心から感謝申し上げます。

採択していただいた研究課題では、MRIという分子イメー

筆者が研究を行っている富山には、医薬品産業を中心とジング技術を応用してスキンクリームなどのエマルション化粧して非常に多くの企業があります。筆者らはそうした地の品の乳化安定性を視覚的に評価いたしました。MRI は核磁

利を生かして実学と基礎科学が融合した実践的な研究を展気共鳴（NMR）現象を利用した非破壊的・非侵襲的な分子開し、実際の製品研究者に有益な情報を提供していきたい

イメージング技術であり、特に医療分野では、今日欠かせなと考えています。なお、本申請課題はスキンクリームを開い画像診断技術です。非破壊的・非侵襲的な画像化技術は、発する企業研究者との対話から見出され、基礎研究の観点

MRI の他にも様々な技術（CT、レントゲン、超音波画像診断

で綿密な実験を実施することで総括されました。筆者の理など）がありますが、検体に含まれる水などの物質の分子運想に近い研究活動が実践できたという意味でも、本研究は動性を可視化できる技術は MRI 固有のものと言えます。筆

印象深いものになりました。貴重な経験を積ませていただ

者は、そのようなMRI の分子運動性可視化技術に着目し、き、本当にありがとうございました。

以前より化粧品や医薬品の物性評価を行ってきました。今回

今後、本研究助成で得られた知見をさらに発展させ、香の検 討では、エマルションのわずかな乳 化 状 態の変 化を

粧品や医療業界の製品開発に少しでも貢献できるよう尽力

MRI の分子運動性可視化技術によって高感度に検出できるしたいと考えています。（富山大学大学院医学薬学研究部）− 219 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
川下将一

この度は、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採した。

択下さり、誠に有り難うございました。今回採択頂いた研

私の研究室では、がんや骨疾患の治療に貢献する（体内究テーマは、生糸織物に抗菌性や生体適合性を付与し、抗埋入型の）医用材料の開発を主に行っていますが、医用材

菌・消臭シート、抗菌性創傷被覆材あるいは組織再生用人料の開発プロセスと化粧品のそれとの間にはいくつかの共工膜の開発に繋げることを目的としています。本研究は、通点があり、医用材料と化粧品の両方に同じ素材が用いら2 年ほど前に学生とのディスカッションの中から生まれた

れることもあります。例えば、コラーゲンはいくつかの市ものであり、この研究助成を頂くまでは、少ない研究費を販の化粧品に含まれていますが、コラーゲンと水酸アパタ

何とかやり繰りして細々と進めてきました。そのような状

イトからなる複合体は人工骨として臨床応用されています。

況の中でコスメトロジー研究振興財団から研究助成金を頂

今回の研究テーマにおいて我々が着目した生糸織物やそのけたことは、本研究を大きく前に進める原動力になりまし

構成成分の一つであるセリシンも、医用材料としてだけでた。お陰様で、本研究は、これまで学術論文 1 報、国際会

なく、化粧品の成分としても有用であると期待されます。

議発表 2 件、国内会議発表 1 件の成果として結実し、本研

今後は、本研究の成果を医用材料だけでなく、化粧品の開究を私と共同で行った学生は国際会議において表彰されま発にも結びつけていきたいと思っています。末筆ながら、した。現在、同学生は大学院博士課程に進学し、本研究をコスメトロジー研究振興財団の今後の益々のご発展をお祈

さらに発展させるべく、研究を進めています。このように、り申し上げます。この度は、誠に有り難うございました。
（東京医科歯科大学生体材料工学研究所）

コスメトロジー研究振興財団の研究助成は、間接的にではありますが、若手研究者の育成にも活用することができま

平成 28 年度

研究助成

機械的刺激に応答して色が変化する材料
相良

剛光

このたびはコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採な要素の一つであると聞いたことがあります。現状ですと、択して頂き、大変ありがとうございました。採択当時は研レオメーターなどの装置を使って評価を行っているのかと究資金が乏しく、非常に助かりました。厚く御礼申し上げ

思いますが、力で発光特性が変化するような材料を用いれます。

ば、より簡便に機能評価できるのではないかと考えていま

さて、私はかれこれ 10 年以上、力（機械的刺激）に応答す。また、より学問的な方向に目を向けますと、近年、メして蛍光特性が変化する分子集合体に関する研究を行ってカノバイオロジーと呼ばれる学問が大きな潮流となりつつきていますが、何とか生体材料に適用できないものだろうあります。極めて小さな力を可視化することのできるメカか？と日々考えてきました。既に多くの結晶性の有機化合

ノプローブ群ができれば、分子レベルでの機械的刺激の伝物や金属錯体が、すり潰すことで発光特性が変化すること達機構や、細胞内外のメカニカルストレスによって引き起が報告されていますが、残念ながら実用化を考える際にはこされるシグナル伝達等を明らかにすることができると考課題が山積していると言わざるをえません。私の研究は実えられ、当該学術領域に大きな貢献ができると思います。

用的なメカノセンサーとしての応用を目指し、「より柔ら

これからも、今回助成して頂いた研究をはじめ、様々な

かく、より小さく、より生体親和性を高く」をモットーに、タイプの実用的なメカノセンシング材料を開発していきた

多様な研究をほぼ一人で進めています。

いと考えておりますので、温かく見守っていただければと化粧品の開発においては、肌触りや塗布感が非常に重要存じます。

− 220 −

（北海道大学電子科学研究所）

コスメトロジー研究雑感

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
菅大阪大学には化学系学部が 3 学科（理、工、基礎工）あり、恵嗣

気づかないうちに我々は Cubosome の恩恵を受けていた可私は基礎工学部（研究科）
・化学工学コース（領域）に所属し

能性は十分にあります。まだ基礎研究段階ではありますが、ています。学生からは「化粧品、食品、化成系メーカーに

脂質および界面活性剤から成る分子集合体のミクロ～メソ

就職したい」といった声をよく耳にします。どうやら彼ら

スケールの特性を制御することで、物質としての性状（Sol（彼女ら）
は漠然と研究開発を志望しているようなのですが、or Gel）を設計できる可能性が見えてきました。本研究助

実際には化学工学系の学生に期待される進路は生産技術や成により得られた知見を活用し，様々な物質についてシー

品質管理などであり、希望する企業に採用されたとしてもンに見合った運用法を提案していくことで、医療・化粧品・研究開発に携わっている卒業生は少ないように思います。

食品等分野に貢献できる科学技術へと発展させたいと思い、

私自身、高校生の頃は医薬品の研究に憧れ、大学時代は化

今後も研究に励みたいと考えております。まだ志半ばでは

粧品・食品分野に大いに興味があったものの、自分の出身ありますが、あの頃は遠かった夢が少しだけ近づいたようからはアプローチの難しい分野であると思いこみ、気がつ

な気がしました。

けば若かりし頃の夢は立ち消え状態となっていました。
現在の研究テーマである Cubosome は、水と油（＋界面活性剤）から成る “乳液” のような物質です。広い意味では、最後になりましが、本研究をご支援いただきました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団および関係者の皆様に心より感謝申し上げます。
（大阪大学大学院基礎工学研究科）

保湿クリームやマヨネーズにも Cubic 構造が含まれており、

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
津田明彦

この度は、貴財団からの研究助成を賜りまして誠にあり

現在、当研究グループでは、光オン・デマンド in situ

がとうございました。本研究助成を得て、新たな挑戦的研

ホスゲン化反応という工業的にも実験室レベルでも非常に究に取り組めましたことに心からお礼を申し上げます。

重要な有機光反応を見出しており、産学官連携でその実用当研究グループは、有機合成化学による機能性材料の創化に向けた研究を行っております。それを用いると、酸素製を目的として、研究に取り組んでおります。化粧品分野の存在下、ハロメタン溶媒に光を照射するだけで、ホスゲへの応用を意識して、本研究課題に取り組んだ経験によっン（工業的に極めて重要な C1 ビルディングブロックであるて、我々が開発した化合物や材料の化粧品への応用を強くが猛毒）を溶媒中に発生させることができ、in situ でそれ意識するようになりました。アカデミアにおける研究では、を即座にアルコールなどの基質と反応させることによって、

例えば「化粧品として利用ことができるかもしれない」など

安全、安価、簡単に、ポリマーやその原料、および医薬品のコメントを付して様々なシーズが生み出されますが、実中間体などが合成できます。この化学と技術は、化粧品分

際に化粧品の製造および販売に関わる企業からのニーズを野にも恩恵をもたらす可能性を秘めており、それらが当該取り込んで生み出されるシーズは数少ないと思われます。

分野で利用されることを目標に、今後ともクリエイティブ

株式会社コーセーを母体とする貴財団と直接関わることがかつイノベーティブに物質合成やプロセス開発に取り組む

できたことで、新たな経験と人脈を得ることができ、そし所存です。

て有機合成に必要とされている化粧品分野からのニーズを（神戸大学大学院理学研究科・滋賀医科大学医学部・内蒙敏感に捉えることができるようになりました。

古医科大学薬学院）− 221 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感戸塚裕一

このたびは、貴財団の研究助成に採択いただき、本研究品の分野でも様々な物質が対象となっています。生体へのを遂行できましたことに厚く御礼申し上げます。私の専門利用を考えるため、毒性がなく、すでに上市されている添分野は製剤学であり、日本の薬学部の中ではマイノリティ

加剤を使用することが我々の研究課題に取り組む際の原点の領域になるかもしれません。製剤学は、人間の体内に投であり、「研究のための研究にならずに、できれば商品化与する際の、薬の形（剤形）に関与するような領域です。しまでつなげたい。でも、科学的なバックグラウンドにはこたがって、錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形の剤形か

だわって、エビデンスに基づく成果としたい」といつも悩ら、ソフトカプセルや液剤などの液体、軟膏剤、クリーム

んでおります。本研究を通して、化粧品産業、食品産業、剤などのエマルションなどを研究領域とするため、界面に医薬品産業の垣根を越えてみると、面白い素材や研究対象

まつわる研究対象も多く、食品や化粧品の分野の研究領域がたくさん存在することを改めて認識できました。今後も、においても共通の悩みを持つことも多く、研究領域がオー

垣根を越えて融合できるような研究内容を見つけていきた

バーラップしている分野でもあります。

いと考えております。最後になりましたが、今回の助成に今回採用いただいた研究内容は、‘水に溶けないものを溶かす’ という新たな試みに関するものです。医薬品のみ

よる成果が、原著論文として報告できましたことを感謝し、貴財団のますますの発展をお祈り申し上げます。
（大阪薬科大学）

ならず、水に極めて溶けにくい（難水溶性）
性質を持つが、人体に役に立つものは自然界にも多く存在し、食品や化粧平成 28 年度

研究助成

薬学とコスメトロジーの製剤学
深水啓朗

筆者が専門とする「製剤学」
は，一般の方々が「薬学」に抱はもちろんのこと，散剤（粉薬）・錠剤に似たファンデーシ

くイメージとしては異端（?）というか，あまり意識されてョンや，性状・形状ともに坐剤と似た口紅（用法は決定的いない分野だと思います．薬学の研究といえば「新薬開発」に異なる）の製造工程を目のあたりにして，その共通点のを最初に想像すると思いますが，開発中の新薬は企業秘密

多さに感動を覚えました．つい最近では，本邦における外の最たるものなので，一般の目に触れることはまずありま用製剤のトップ企業から，頭部の乾癬治療に有効なシャン

せん．大勢の知るところとなるのは新薬として承認された

プー剤が上市されるに至り，医薬品の製剤学とコスメトロ

後で，成功をおさめたほんの一握りといえるでしょう．「製ジーの垣根は取り払われつつあると考えています．含有成剤」も当然ながら高度な技術に支えられて開発されますが，分が表す薬効の程度や，それにともなうレギュレーション

ユーザーが直接的に触れる製品であるため，求められる技の違いはありますが，薬学とコスメトロジーの製剤は，手術は必然的に，ヒトに対する優しさ，すなわちフレンドリをとりあって更に発展できると確信しています．
本助成はその大いなる潤滑油として，ときには研究の情ーさが求められます．
コスメトロジーは，ヒトの Quality of Life を高めるため熱を燃やす油として，今後も持続的な発展を期待していまに，主に物質的な手段を提供するサイエンス
（学問）
だと捉

す．本研究を助成していただきました公益財団法人コスメ

えており，薬学における製剤学とも親和性が高いことをトロジー研究振興財団と関係者各位に，この場を借りて心常々感じています．筆者が共同研究している受託製造の工から御礼申し上げます．（明治薬科大学分子製剤学研究室）

場を見学させていただいた際，クリーム剤やローション剤− 222 −

コスメトロジー研究雑感

平成 28 年度

研究助成

色に魅せられて
古海

私たちの研究室では、「光と物質の相互作用」を考究して、

誓一たいと考え、研究を進めています。特に、今日の環境問題

コロイド、液晶、ゲル、エラストマーといったソフトな有や資源問題を考慮して、今回の提案では「カラフルな反射機材料、いわゆるソフトマターから新しいフォトニックデ

色を永続的に維持できるセルロース誘導体の創製」というバイスを創出する「基礎研究」と「応用研究」
について取り組

題目で研究テーマを申請させて頂きました。

んでいます。このような堅苦しい言葉を使って学生に研究

コスメトロジー研究振興財団からご支援を頂いたお陰で、を説明していますが、単刀直入に言うと、私は「色」に関す最近では面白い研究成果が出ています。植物の主成分である研究をしています。

るセルロースは、地球上において最も豊富に存在する天然

私は幼い頃から「色」に興味を持っていて、絵を描くこと

高分子です。このセルロースを化学修飾すると、鮮やかなが好きでした。異なる色の絵の具を混ぜると違う色に変化

反射色を示すコレステリック液晶になることがあります。

することに、とても驚くとともに、胸を躍らされました。

そこで、私たちは、不飽和二重結合を有する架橋性セルロ

学生の頃には、今では当たり前ですが、ノートパソコンのース誘導体を合成し光架橋すると、カラフルな反射色を永液晶ディスプレイがモノクロからカラーに変わったときに続的に維持したフィルムになること発見しました。これだ

は、いろいろなメーカーの液晶ディスプレイを見比べた記

けでなく、このフィルムは反射色だけでなくゴム弾性も兼憶があります。

ね備えることがあり、フィルムに力を加えると可逆的に変今日の日常生活で「色」
は溢れています。たとえば、同じ色することを発見しました。この研究成果は「テレビ東京・

赤でも異なった表情が現れることがあり、化粧品の口紅でワールドビジネスサテライト」に出演して紹介し、「日経産も時代によってトレンドがあるでしょう。個人的には、化業新聞」、「日刊工業新聞」、「ゴム化学新聞」の記事にも掲

粧品にラメが入っていると、その人の顔の印象は随分変わ載され、広くアピールすることができました。近い将来、ると思っています。このラメのような光沢は、よくマイカ

私たちの研究成果が社会に還元されるよう、学生とともにで目にすることがあります。マイカは無機化合物の結晶で研究に邁進していきたいと思っております。
（東京理科大学理学部第一部応用化学科）

すが、私の興味はソフトな有機・高分子材料で光沢を出し

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
増原陽人2010 年の初旬に独立して研究室を立ち上げることとな

イス作製の研究を展開する環境下で、フランスの会社の方

り、研究室の運営の為、予算の獲得は必須となりました。

が研究室を訪問され、講演会が開催されました。髪への染

それまで、財団による助成金を目を皿のようにして探すこ

色に関する研究といった内容でありましたが、用いる化合とはありませんでしたが、日々チェックを怠ることなく探物は、有機半導体にも使用される材料が多く、研究室メン

すようになった際に、本「コスメトロジー研究振興財団」をバーが活発に質疑応答しているのを目の当たりにし、自分知ることとなりました。しかしながら、自分の研究分野がの視野の狭さを痛感すると同時に、自分の使用している材

有機ナノ材料であり、さらに、“コスメ” との単語から、男料群の中でも、化粧品等の他分野に貢献できる技術やアイ性である私にとって、研究対象として全く注目することはディアがあるのではないかと考えるようになりました。そありませんでした。そんな中、日本学術振興会のプロジェ

んな中、「コスメトロジー研究振興財団」を思い出し、まだクトの採択により、2015 年の夏より、オーストリアで 1

研究シーズになり得るかも分からないデータを駆使して、年半研究する機会を頂きました。滞在した研究室は、世界

自らのアイディアを申請書にぶつけた記憶が今でも鮮明に的に有機太陽電池の研究を行っており、有機半導体やデバ残っております。お陰様で、化粧品への応用が可能かどう− 223 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

かは未だに未知でありますが、有機半導体材料のナノ結晶再認識するきっかけを設けて頂いた本コスメトロジー研究

成長抑制に関する新たな知見を得ることができ、さらには、振興財団は勿論のこと、一緒に研究を行ってくれている学本財団で得た結果を発展させ次のプロジェクトへと繋がる

生をはじめとして、これまでに研究室を支えてくれている

成果を得るに至っております。

方々に深く感謝し、今後も研究・教育活動に邁進していく

自らの視野を広げることが、新たな研究に繋がることを所存です。

（山形大学大学院理工学研究科）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感森直

私の専門は光化学や分子キラリティーですが、本助成金としての将来性を提示できたことはもちろん重要な成果でのもと、アミノ酸を母体とする生体にやさしい新しい光吸

すが、新たに私自身の研究のすそ野を広げることができた

収材の開発を行いました。

こと、また最終的には論文発表などの一定の成果も得るこ

近年、科学研究に対して、いわゆる成果偏重が危惧されとができたことで、新しい分野への挑戦という期待感と同る一方、現実問題としてそのような状況に置かれている

時に、最終的にはこのようなチャレンジを今後も続けてい

我々研究者にとって、成果がうまく得られるかどうか担保

きたい、続けていくべきだという、私自身の自信にもつな

されていない、専門分野外の研究へ手を伸ばすことは、興がる貴重な経験をさせていただきました。

味があってもなかなかためらわれる状況にあります。本光昨今、財団におかれましても様々なご事情があることと吸収材に関する研究では、励起状態化学種に関する考察やは思いますが、今後も自由な発想のわくわくするような研その理論的検証など、私の専門的知識がいかされるであろ究に対してのサポートを継続していただければ、一研究者

うことはわかっておりましたが、いわゆるゴールをある程としてもたいへんありがたく存じます。財団助成金の役割

度きちんと提示することが求められる科研費などの一般的もますます重要になってくるものと感じております。

な競争的資金ではなかなか着手できない派生研究であり、これまでは実際に着手することができずにおりました。

末筆になりましたが、今回のご支援たいへんありがとうございました。

（大阪大学大学院工学研究科）

今回、本助成をいただいたことにより、新しい光吸収材

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
森田洋行

私が薬用や化粧品として伝統的に使用されている天然資

な成分の相互の折り合いにより効果が発揮されているから源に興味を持ち、その効能について、含有成分に着目してです。この複雑性を理解するのは現代の科学技術を持って研究を始めたのは、現所属の富山大学に異動となった 7 年

しても容易なことではないかもしれませんが、この複雑性

前からになります。平成 28 年に貴財団から研究助成をいの解明は、あらたな発想に基づく、医薬品や化粧品の開発

ただいた時には、研究室の研究環境はだいぶ整ってはいたへと繋がる可能性があります。また、伝統薬や伝統化粧品

ものの、本格的に研究を進めるには、まだ不十分でありまの多くは、西洋科学に基づいて調整された医薬品や化粧品した。貴財団より大変心強いご支援を賜り、研究の進展にと比べて、その効果は即効性ではなく、また弱いのが常でご支援くださいましたことに心より感謝申し上げます。

すが、その反面、安全性が高く、かつ多様な効果に富む傾向

私が、各国の伝統的薬用資源に興味を持ったのは、天然にあると思います。科学的根拠が皆無な伝統薬や化粧品は資源の科学的検証が医薬品や化粧品の開発に実際に繋がっ数 多く残っています。例えば、キツネノマゴ 科Rhinacanthusてきたというだけでなく、これらの天然資源の効能が多様

communis 葉の水抽出液は、髪の劣化を防ぐ天然コンディ− 224 −

コスメトロジー研究雑感

ショナーとしてミャンマーで用いられています。さらに、に使用される天然資源を対象とした基礎研究に取り組んで本植物には白髪予防効果があるとして、女性のみならず、いき、社会に貢献したいと考えています。
（富山大学和漢医薬学総合研究所）

若い男性も毛髪剤として使用しています。今後も、伝統的

平成 28 年度

研究助成

化粧品の評価山田純

私が化粧品にかかる研究を始めて，20 年近くが経過しいます．実際，化粧品の開発に携わっている関係者も，こました．振り返って見るとあまり成果は得られなかったよのように考え，いくつも評価項目をあげて，それらが見映うに感じています．私の専門分野は熱工学で，その中で，えにどの程度寄与しているかを調べていました．

ふく射（光，電磁波）の散乱を扱ってきました．メーキャッ

評価項目には，「明るい」，「なめらかな」というような関プ化粧品は様々な粒子からなり，肌の見映えを粒子の散乱

連する物理量を連想しやすいものもありますが，「みずみで制御するわけですから，それまでの研究で得た知見をもずしい」，「透明感のある」といった曖昧なものが多く並びって，この分野に貢献できるのでは，という期待をもってます．他の分野に目を向けてみましょう．自動車をつくる

研究を始めました．しかしながら，難しいですね．「何をとき，例えば，エンジンのパワーやトルクといったわかり

どうすれば，良い化粧品が作れるか？」という問いがあっやすい評価項目で，車の良し悪しを判断しています．このたとして，そもそも「良い」ってなんだろう？と行き詰ま「わかりやすい」は「計測できる」という意味です．それらに

ります．
「良い
（悪い）
」
を
「見映え」
に限定しても，答えを見比較して化粧品はどうでしょう．評価項目の多くは，質感

いだすことはできません．

に係るものが多く，どれもが曖昧で計測することはままな

化粧の見映えは，人の視感によって評価されます．人がりません．自動車業界は，定量的な評価に基づいて開発をどのような評価項目で，見映えを評価しているかは，評価進めることで発展してきました．化粧品業界はもちろんで者本人も明確に意識しているわけではありません．おそら

すが，コスメトロジーの発展にも，化粧に係る質感の定義

く複数の評価項目が（頭の中に）
あって，それぞれに適当なづけ，および，その定量的評価手法の開発が必要に思えま

重み付けをした上で，総合的な評価を下しているのだと思す．

（芝浦工業大学）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
今江理恵子

この度は、貴財団の研究助成に採択していただき、厚く厳密に規定されているのも理由があるだろうと考えていま御礼申し上げます。私はこれまで、生体膜リン脂質の一つした。顕微鏡下で観察される PI の sn-1 位の脂肪酸組成がであるホスファチジルイノシトール（PI）の特徴的な脂肪酸

変動している線虫の変異体は体表にハリがなく、上皮細胞組成に着目して研究を行ってきました。PI は、イノシトに異常がありそうなことは分かるのですが、分子レベルでール部分がリン酸化されることで、シグナル伝達などの重のメカニズムは全く不明でした。この現象のメカニズムを要な役割を担っています。PI は脂肪酸部分においても特何としても解明したいと考えていた折に、この研究助成を徴があり、sn-1 位にステアリン酸、sn-2 位にアラキドン酸

いただけたことは、研究を進める非常に大きな原動力となを持つ分子種が多く存在します。特に sn-1 位のステアリりました。助成期間中にいくつか結果を出すことができ、ン酸の含有量は極めて高く、マウスでは多くの臓器で PI

メカニズムの解明にあたって大きく進歩したと考えておりの sn-1 位の脂肪酸はほぼステアリン酸のみとなっていまます。現在、本研究の成果発表に向けた準備を進めています。PI の重要な役割を考えると、脂肪酸組成がこれだけす。

− 225 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

折しも研究助成期間中に所属が変わり、老化や老化関連

生体膜脂質も同様に重要なファクターになることから、脂疾患に関わる研究所に移りました。PI の脂肪酸組成は厳質も見なければならないと思っています。今後、このよう密に制御されているため、老化などでそれが破綻した時にな観点から研究を進め、コスメトロジー分野に貢献できるは、上皮細胞において異常が生じ、皮膚の恒常性に大きな成果を出していきたいと考えております。
（東京都健康長寿医療センター研究所）

影響を与えることが予想されます。老化や疾患において、タンパク質を中心とした研究は盛んに行われておりますが、

平成 28 年度

研究助成

女性の薄毛問題におけるコスメトロジー研究の役割
岩渕徳郎

皮膚科学的に言えば毛髪は皮膚の付属器であるため、毛

最近 10 年の間に、男性の薄毛と女性の薄毛の特徴の違い

髪科学は皮膚科学の一分野に過ぎません。コスメトロジー

が浮き彫りにされてきました。男性の薄毛は毛が極端に細の分野においても、毛髪分野は皮膚分野に比べてマイナー

くなるのに対し、女性の薄毛は毛の数が減少してしまうのな分野と言えます。しかし、人の印象に与える影響度におが主原因であることが明らかになってきたのです。つまり、いて、毛髪は皮膚やメイキャップに引けを取らない大きな

女性の薄毛ほど「発毛」効果が強く求められるのです。しか影響力があります。ある調査で、女性の見た目の年齢を決し、育毛薬剤の探索・開発現場では薬剤の「発毛」効果を評める要素として何が重要だと思うかという質問に対して、価できる実験系が殆どないのが現状なのです。

肌状態やスタイル（体型）を抑えて「ツヤ、色、ヘアスタイ

このような中、コスメトロジー研究が女性の薄毛問題にルを含めた毛髪」が堂々の第一位だったという結果があり対してなすべきこと、それは「発毛」効果を評価できる実験ます。このような視点から考えると、毛髪は「人の美」にお系の開発と、女性の薄毛の発生原因の究明ではないでしょ

いて単なる学問上の位置づけよりも、ずっと重要な位置をうか。今回私が助成頂いた研究も、これに関する研究でし占めています。特に女性の場合、「髪は女の命」と言われるた。しかし、これらの問題解決にはまだ程遠い状態と言えほど大きな意味を持ちます。

ます。今後もぜひ、女性の薄毛を解決する研究テーマにご女性の薄毛はここ 10～15 年の間に以前より深刻な問題

理解を頂戴できればと思います。いつまでも若く美しくあとなっています。それは、病院の脱毛外来に訪れる女性患

りたい、という女性の願いに少しでも応えていければと思者数の増加からうかがい知ることができます。研究面でもっています。

（東京工科大学応用生物学部）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
近藤
住吉

嘉高
秀明

この度は、本研究課題「ヒト培養表皮におけるアスコル

合成できないマウス（SMP30 ノックアウトマウス）を用いビン酸の経皮吸収および紫外線 UVB による細胞障害に対た研究から、色々な臓器におけるビタミン C の機能や抗老する予防、回復効果の検討」に研究助成をして頂き、厚く化作用を明らかにしてきました。さらに、本研究では、ヒ御礼申し上げます。

ト培養表皮を用いた解析から、表皮に塗布したビタミン C

アスコルビン酸（ビタミン C）は、還元性物質として活性は、しっかりと表皮に取り込まれて、紫外線による細胞障

酸素種の消去や各種の酵素反応の補因子として、様々な組

害を抑制することを示すことができました。また、紫外線

織で色々な働きをしています。しかしながら、その多様性を浴びる前に、ビタミン C を取り込んで備えておくことがゆえに、ビタミン C の機能は、まだまだ分かっていないこ

効果的であることも分かりました。今後、紫外線対策としとが多く残されています。私たちは、ビタミン C を体内でて、紫外線の遮断の他にも、ビタミン C を含む化粧品や日− 226 −

コスメトロジー研究雑感

焼け止めの塗布が予防策として普及することになれば、嬉しく思います。

（東京都健康長寿医療センター研究所）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
神人正寿

和歌山県立医科大学皮膚科では国公立大学初の自費診療

また、今回の検討ではエキソソームそのものと皮膚老化での美容外来を行っており、また以前より美容皮膚科の分の関与を示すことはできなかったが、将来サンプル数を増野で臨床研究・基礎研究による実績を積み上げてきた。一やして再度その関与を示すことができれば、皮膚老化・肌方、私個人は東京大学や熊本大学でこれまで膠原病・コラ年齢の定量化や客観的評価に加え、エキソソームによる皮ーゲンや血管腫の研究に打ち込んできたが、皮膚老化にお膚老化のコントロールが可能になる可能性がある。またエ

いてもコラーゲンや血管などの変化が関与するためこれま

キソソームを外用剤や軟膏、そして化粧品として使用するでの研究経験を活かすことができる分野であると大いに興例はこれまで報告されておらず、その点でも十分な新規性味を抱いていたところ、1 年半前に縁があり和歌山県立医を有する研究課題であると考える。

大に赴任した。

皮膚老化の予防・改善はコスメトロジーの重要なテーマ

本プロジェクトについては今後、紫外線反復照射によりである。幸運にもコスメトロジー研究助成事業のご支援を

皮膚老化を誘導したマウス皮膚に、miR-124 の inhibitor を

得 る こ と が で き、 私 の こ れ ま で の 研 究 テ ー マ で あ る

局所注射・外用して in vivo での皮膚老化に対する抑制効

genetics と epigenetics の知識を武器に、これからも皮膚果の有無を確認し、microRNA 創薬の可能性を検討したい。

老化の臨床・基礎研究の発展に微力を尽くしたいと考え、さらには miR-124 は皮膚老化では増加する一方で有棘細胞審査員の先生方および関係者の皆様にあらためて深謝申し

癌の腫瘍細胞では抑制されており、皮膚老化の制御は皮膚上げる次第である。

（和歌山県立医科大学皮膚科）

癌の予防にもつながると期待している。

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー研究を考える機会を頂いて高橋

この度は、2016 年度のコスメトロジー研究・研究助成金をいただきまして、ありがとうございました。

勇人

するわけですので、健康な皮膚に使用する場合と異なった考えも必要と思います。本研究助成におきましても、対象

コスメトロジー＝化粧品学という分野は今回この研究助課題として素材・物性、生体作用・安全性、精神・文化と成に応募するまでは触れる機会は多くありませんでしたが、あるように、多岐にわたって化粧品学においては検討すべ

改めて考えてみますと、皮膚科医として認識すべき重要なき内容が存在いたします。医療現場にいる一員として、素分野の一つであると感じました。皮膚疾患により外観が損

材・物性・安全性に対する化粧品学の発展を強く願っておなわれますと、患者さんにとっての精神的ダメージは非常ります。また、私達の研究におきましては、皮膚疾患の理に大きいことは多くの方が理解できるものと思います。皮解を通じた皮膚の健康維持を目指しております。疾患が生膚科医として皮膚疾患を治療していくことで、皮膚の健康じるために必要なことは何か？

だけでなく、患者の精神的サポートを心がけてきました。

要なことは何か？

しかし、疾患が必ずしも跡を残さずに治癒しないことも多安全で有効な化粧品の開発が可能になると思います。今後

く、その場合、“お化粧” という形で、精神的サポートをす

も、皮膚科医として皮膚疾患の理解を通じて、コスメトロ

ることが可能です。

ジーの発展に貢献していければと思います。

単に “お化粧” といっても、皮膚疾患を患った部位に使用− 227 −

それを治す方法として必これらを正しく理解することで、より（慶應義塾大学医学部皮膚科）

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 28 年度

研究助成

脂質代謝による皮膚制御の新機軸
武富芳隆

本研究を通じて、表皮角化細胞の分化に伴い発現誘導さや当該脂質受容体の発現と正の相関を示し、アトピー性皮れるホスホリパーゼ A2（Ep-PLA2）が、高度不飽和脂肪酸

膚炎の重症度と逆相関することから、皮膚における Ep-

およびそれ由来の脂質メディエーターの動員を介して天然

PLA2 や当該脂質受容体の発現あるいは非侵襲性に角層中保湿因子が関わる表皮バリアの恒常性を維持することによの当該脂質を定量することが皮膚の健康状態を検査するや、りアトピー性皮膚炎を抑制することが明らかとなってきた。

アトピー性皮膚炎の予見・診断マーカーとなる可能性があ

本研究成果は、Ep-PLA2 を起点とした新しい非セラミドる。これに加え、当該脂質受容体の選択的作動薬、あるい性脂質の産生機構や脂質メディエーターの新しい生理作用は Ep-PLA2 の酵素活性を上昇する天然化合物を発見し、の発見など多くの新知見を含み、脂質および皮膚科学の双これらを皮膚局所に適用することにより、皮膚バリア機能方の研究領域に貢献するものである。

の向上とアトピー性皮膚炎の改善が実現できる可能性があ

本研究成果を基盤として当該脂質シグナルを応用する戦略が、皮膚クオリティの新しい評価系の樹立、より安全なる。今後、これらの健康・医療シーズの創出へ向けた土台を築く研究を展開したい。

化粧品の開発、難治性皮膚疾患の予防に向けた画期的な創最後に、本研究助成を受けることで、皮膚の健康を真剣

薬 な ど に 繋 が る こ と が 期 待 さ れ る。 具 体 的 に は、Ep-に見つめコスメトロジー研究を推進できたことに感謝した

PLA2 の発現は天然保湿因子の産生に関わるフィラグリンい。 （東京大学大学院医学系研究科分子細胞生物学専攻）

平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
徳村雅弘

この度は，コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採でした。今回，助成していただいたことで，化粧品中のリ択していただき，誠にありがとうございます。お陰様で今ン系化合物の実測や，経皮曝露を考慮したリスク評価に関後の研究の基礎となるような，多くの研究成果が得られまする研究を行うことができました。化粧品は主に皮膚に直した。関係者の皆様に心より感謝いたします。

接塗布して使用するものが多いため，本研究の成果を応用

室内環境中のリン系化合物のリスク評価は，世界中で活することで，化粧品の安全性の向上だけでなく，化学物質

発に研究が行われており，環境化学の分野において，現在，の薬用をより詳細に考察できるようになることから，機能

最もホットなトピックの一つにあげられます。しかし，現性の向上など，より効果的な化粧品の開発にも貢献できる状では，室内空気やハウスダスト中のリン系化合物の測定と考えられます。

にとどまっており，室内製品からの直接接触による経皮曝

最後になりましたが，重ねまして，ご援助いただいたこ

露は考慮されておりません。特に，化粧品に含まれるリンとに感謝を申し上げるとともに，コスメトロジー研究振興

系化合物に関しては，ほとんど前例や知見がないのが現状

財団のますますのご発展をお祈りします。（静岡県立大学）− 228 −

コスメトロジー研究雑感

平成 29 年度

研究助成

ナノ粒子と細胞膜の界面現象
仲村英也

近年、ナノ粒子の生体作用・安全性の評価は、動物を用単ではない。界面で何が起きているのか ??

分子レベルのいた in-vivo 実験や細胞・微生物を用いた in-vitro 実験で行メカニズムを把握することができないか ??

そこで着目しわれている。化粧品にも含まれる酸化亜鉛、酸化チタン等

たのが分子シミュレーションである。分子シミュレーショ

のナノ粒子も研究対象として広く検討されている。しかしンでどのようなことが、どこまで分かるのかを、本助成でながら、これらの実験だけでは生体影響を把握することは行った研究で報告させて頂いた。コスメトロジーの分野でできても、生体内で起こる本質的なメカニズムを捉えるこは、理論計算を用いた事例があまりないと（私が知る限りとはできない。また、用いられる動物や細胞・微生物の種は）感じているので、新しい切り口のひとつとして見て頂類は極めて多様で多岐にわたるため、in-vivo, in-vitro 実験

ければ幸甚である。また、ナノ粒子と細胞膜の界面現象にで知見を蓄積してもこれを普遍化・体系化することは難し

関する研究をさらに推進していくためには、理論と実験のい。

融合が重要となると考えている。本助成により、実験系を先程述べた「本質的メカニズム」を規定するには非常に難しいが、その一つは、「粒子と基本的な生体障壁である細立ち上げることもできた。感謝申し上げたい。
最後になりましたが、ご支援を賜りましたコスメトロジ

胞膜との相互作用」
であろう。このような発想のもと、私は、ー研究振興財団に改めて感謝の意を表します。

これまでにナノ粒子と細胞膜の界面現象に焦点を当てた研（大阪府立大学大学院工学研究科物質・化学系専攻化学工究を行ってきた。しかし、実験でこれを把握することは簡学分野）

平成 28 年度

研究助成

めずらしいFGF
中山

文明

私の主たる研究テーマは放射線障害の治療法の開発であていないためか、あまり研究が進んでいない。誰も顧みなり、それは所属機関のミッションである。今回の研究で扱い領域には、それなりに理由があるのだろうが、必要に迫った FGF13 は、FGF11 サブファミリーに属する増殖因子

られて参入し、いろいろ探求してみた。その結果、この領であり、以前同じサブファミリーメンバーである FGF12

域の基礎研究はとても面白く、FGF 分子の別の側面を顧の基礎・応用研究を行っていた経験から派生してきた研究みることができた。さらに、私の所属機関のミッション、

対象である。放射線と関連づけず、本来のミッションから疾患研究、美容研究等へといろいろ応用可能なとても潜在遠いように思われる研究テーマだが、基礎研究がないと応性のあるものに思えてきた。今では私の数少ない基礎研究用も利かないので大切にしている。そのため、この課題にテーマとなったが、今後とも大事にしてゆきたい。

研究費をつけていただけたことは大変有難く、少しでも前最後に、本研究に対してご支援を賜りました公益財団法

進できたことに大いに喜んでいる。FGF11 サブファミリ人コスメトロジー研究振興財団に対し厚く御礼申し上げまーは、典型的な FGF と相違点が多く、重要性が認識されす。

− 229 −

（放射線医学総合研究所）

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
原

この度は、貴財団より多大なるご支援を賜り、心より御礼申し上げます。

雄二な役割を果たしていることが明らかになりつつあります。
最近の私共の研究でも、これまでの研究結果を支持するデ私の研究は、細胞膜の構成成分であるリン脂質について、ータを得ており、皮膚細胞、組織の恒常性維持に、リン脂細胞膜間での局在変動がどのように細胞・生体に影響を与

質局在の制御機構が関わる可能性が示唆されています。リ

えているか研究を行っております。特に細胞膜の外層からン脂質動態および細胞膜物性感知機構の相関について、今内層にて、特定のリン脂質を輸送するリン脂質フリッパー

後もさらに研究を進めていく所存でございます。

ゼを介したリン脂質挙動が、イオンチャネルをはじめとし最後になりましたが、コスメトロジー研究に対し門外漢

た膜タンパク質の活性制御について興味を持っており、こだった私に、多大なるご支援および研究機会を賜りました

れまでに膜張力により活性化される PIEZO1 イオンチャネ

こと、深く御礼申し上げるとともに、貴財団のますますの

ルとリン脂質挙動の関係性を明らかにいたしました。また、ご発展を祈念申し上げます。（京都大学大学院工学研究科）

リン脂質挙動の微細な変化は、細胞遊走、増殖などに重要

平成 28 年度

研究助成

ドラッグリポジショニング手法をコスメトロジー研究に応用する
廣明

私は、コスメトロジー研究振興財団研究助成による助成

秀一

せんでした。

を受けるのは平成 21 年（第 20 回）に引き続き、今回が 2 度

そこで私は、同じように開発コスト削減の強烈な圧力に目です。前回の助成により、LNX1 の PDZ ドメインの立体

さらされている創薬の現場でとられている「ドラッグリポ構造を決定することに成功しました。その後、文部科学省

ジショニング」戦略を取り入れました。具体的には、既に科学技術研究費補助金などに助成されつつ、その PDZ ド

医薬品として認可されている化合物、あるいは化粧品原材

メインを特異的に阻害することで、複数種類の細胞のタイ料として登録されている物質（およびエキスなどに含まれトジャンクションを強化する化合物を、発見するに至りまている成分）に着目して、目指す機能性成分を再発見するした。この化合物を実用化することで、皮膚のバリア障害手法です。これも、私が、創薬科学研究科という創薬技術

やそれに引き続き起こる炎症の治療・予防などが革新的にの最先端の動向を知ることがたやすい部局に所属している

進むのではないか？

からこその発想である、と自負しております。創薬科学研

当時の私は、そのように思い、意気揚々でした。

究科の大学院生の多くは製薬企業を目指して日々知識を研しかし、当該化合物について、企業との共同開発を目指鑚しております。しかし、単一業界に限定した出口だけでして、技術展示会に出展したり、日本医療開発機構などがはなく、化粧品や香料・ファインケミカルといった、幅広主催する DSANJ 商談会などに出席して情報提供を行ってい分野で活躍できる専門家を育てていきたい、と考えておも、社会実装は進みませんでした。それは、タンパク質構ります。

造などの基礎研究などに注力する私の研究室ではマウスな

最後になりましたが、コスメトロジー研究振興財団研究どの動物実験を遂行する予算も人員もなく、せっかく発見

助成を頂き本研究をご支援いただきましたこと、心から感した化合物であっても、in vivo の POC 研究が不十分であ

謝申し上げます。

るからです。それに必要な研究資金はどこからも得られま（名古屋大学大学院創薬科学研究科構造分子薬理学分野）− 230 −

コスメトロジー研究雑感

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感福田智一

このたび、コスメトロジー研究振興財団から支援くださ

換えウィルスを高純度に精製することで乗り越えたのです

りまして心から御礼申し上げます。このたびは動物の刺激が、何とか成果を上げられたのは、共同研究者の先生方な性試験の試験管内検出系としてヒト角膜上皮細胞を使用す

らびに財団のご支援の賜物と考えています。現在、研究成る研究を行わせていただきました。使用した角膜上皮細胞

果を英文論文として投稿中ですが、査読においてさらに追はとても取り扱いが難しく、少し細胞密度が低下するとす

加実験が要求されています。最新の研究成果を発表するた

ぐに細胞増殖能力を失う大変ハンドリングが難しい細胞でめには厳しい査読を乗り越えなければなりません。近年のした。しかし我々が行った無限分裂操作によって、かなり傾向を見ると要求されるデータ量がかなり増加しており、扱いやすい材料へ改変することができました。この改変に厳しい状況が続いています。おそらく最近、生物学の領域

よって再現性の高い試験管内の刺激性試験の実施が可能にでは研究倫理の問題が指摘されており、より厳しい基準になると考えられます。

適合しないと出版させないという動きがあるのだと思いま研究を開始した当初はなかなか研究が思うように進まず、す。現在も本研究は査読を乗り越えるための追加実験を実苦しんだ時期がありました。特に細胞を良い状態に維持し施中であります。近年、我が国の科学技術の低下、英文原たまま、遺伝子導入するための最適化に試行錯誤が必要で著論文数の減少が指摘されています。今後も私どもの研究ありました。角膜上皮細胞は刺激性試験に使用されるほどへご理解とご支援をお願い申し上げます。

感受性が高いために、通常の組み換えウィルスの実験条件（岩手大学理工学部）

では弱ってしまうという矛盾した状態でありました。組み

平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
水谷健一

このたびは貴財団の平成 29 年度研究助成に採択いただ

内皮細胞の集団であることに着目し、固有の性質をもった

きまして、深く感謝申し上げます。一昨年に本所属に異動

血管が特有の生理機能を発現することが、組織の発生・発し、研究室の再始動のための大きな励みをいただきました。

達・老化現象を解く上で重要であるとの観点から、研究を

本研究助成のテーマは、創傷治癒過程における皮膚組織の進めています。今回、これまで研究室で確立していた脳の血管網を観察するという内容で、私自身は脳の発生・形態

組織学的な実験系を皮膚組織に応用し、試行錯誤の結果、学を専門にする研究者ですので、皮膚に関する研究は全く

この一年間で皮膚の組織学実験の系を立ち上げることがでの新規テーマであるため、採択いただけるとは考えていまきたことが何よりの成果だと考えています。皮膚科学の分せんでした。このため、本助成の採択を機に、皮膚研究に

野はまだまだ知識が浅く、学ぶべきことが無数にある段階も取り組めるきっかけをいただいたことに、重ねて御礼申

ではありますが、本助成をきっかけに皮膚組織の血管の形し上げます。

態学的な特徴と創傷治癒における生理機能の一端が明らか

現在、私の研究室が最も興味があることは、毛細血管の発生・発達・老化であり、これが周囲の組織幹細胞の微小環境の構築・破綻にいかに関連性があるのかについて、脳になったことは大きな成果だと考えています。
末筆になりましたが、コスメトロジー研究振興財団の益々のご発展を心から祈念申し上げます。

や皮膚の発生・発達・老化を中心に研究を行っています。
特に、毛細血管が極めて多種多様な性質をもったヘテロな− 231 −

（神戸学院大学大学院薬学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー研究振興財団 研究助成を受賞して保嶋智也

この度は、貴重な研究助成金をいただきまして公益財団たのを覚えております。また、このコスメトロジー研究振法人コスメトロジー研究振興財団に深く御礼申し上げます。

興財団研究助成が私にとって財団からの初めての研究助成

私は、低分子化合物である薬物や生理活性物質など体内動の受賞となり、研究者として大きなステップアップになっ態を司る「トランスポーター」と呼ばれる分子の研究を専門たと感じています。今後とも、多くの研究者の研究を支えとしております。その研究を進めるうちに、メラニン合成

る研究助成事業を行っていってほしいと思います。最後にに関わるトランスポーター分子に関わることになり、貴財なりましたが、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団団の研究助成事業に応募することとなりました。多くの解の益々のご発展を祈念いたしまして、挨拶のお言葉とさせ析を進めるうえで研究資金の不足に悩まされていた当初のていただきます。

（名古屋市立大学大学院薬学研究科）

私にとって、貴財団からの助成金は非常にありがたく感じ

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
柳

輝希

この度は
「コスメトロジー研究助成」
を賜り、誠にありが一方で、正常皮膚組織においてはミトコンドリア分裂関連

とうございました。私は、ミトコンドリアに注目し、紫外分子は細胞死を適切に遂行するために必要な分子と考えら

線曝露による皮膚老化と表皮細胞の発癌について検討いた

れております。したがって、正常細胞と癌性の細胞においしました。従来より、ミトコンドリアは細胞増殖と細胞死ては、その果たす機能が全く異なることが予想されます。

において中心的な機能を持つことが報告されていました。

今後は正常表皮細胞におけるミトコンドリア分裂関連分子本研究にて、紫外線曝露によっておこる皮膚癌（扁平上皮の機能を、別のアプローチで解析していく予定です。

癌）においてもミトコンドリア分裂関連分子が関与していこの度は研究助成を賜り誠にありがとうございました。

ることがわかりました。この成果が、紫外線曝露後に生じ今後も、化粧品学・皮膚科学への研究助成を継続いただけた皮膚癌の治療につながることができれば大変うれしく思れば、大変ありがたく存じます。どうぞよろしくお願い申います。引き続き研究を発展させていきたいと存じます。

し上げます。

（北海道大学皮膚科）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
渡利彰浩

表皮は角層および生きた表皮細胞層で構成されますが、“TJ 制御” という観点から研究を行っていますが、コスメ

生きた表皮細胞層の 1 つである顆粒層では、隣接する細胞

トロジー研究の雑感にあたり、今後の TJ 制御の発展につ間にタイトジャンクション（TJ）が形成され、TJ により細いて述べさせていただきます。

胞間隙がシールされることで生きた表皮細胞層での物質透クローディンをはじめとした TJ バリアを構成する主要過が制限されます。美白成分やアンチエイジング成分等の分子の発見から、様々な TJ modulator が開発されてきま

有効成分を効果が期待できる部位まで届ける方法としてした。これまでの TJ modulator は、2 つの細胞間に形成− 232 −

コスメトロジー研究雑感

される TJ バリアを制御するものでしたが、最近は３つの成果により、クローディンの立体構造をベースとしたより

細 胞 間 で 形 成 さ れ る TJ 構 造 に 着 目 し た 新 た な TJ

精度の高い TJ バリア制御法の開発が始まったと言えます。

modulator が開発され始めています。３細胞間の TJ は２

このような分子生物学的発展が積み重なることにより、効

細胞間の TJ と比較し間隙のサイズが広いことから、より果的で安全な有効成分の浸透法が出てくるものと期待され大きな有効成分の送達経路として利用できるのではないかます。

と推察されます。また、2014 年にクローディンの立体構

最後になりましたが、本研究をご支援いただいた公益財

造 が 明 ら か と な り、2016 年 に は ク ロ ー デ ィ ン と TJ

団法人コスメトロジー研究振興財団及び関係者の皆様に心modulator 複合体の立体構造も解明されました。これらのより御礼申し上げます。

（大阪大学大学院薬学研究科）

平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
有賀敦紀

この度は研究助成をいただき，大変うれしく光栄に思っむことができませんでした。そのとき，ちょうどコスメトております。審査に携われた先生方，日頃からご指導いた

ロジー研究振興財団より助成金をいただけることが決まり，

だいております先生方に感謝申し上げます。

この研究に取り組むことができた次第です。

私は認知心理学を専門としており，化粧の濃さがもたら結果として本研究において，化粧の濃さの魅力は，それす心理的影響に興味がありました。近年の日本では薄化粧だけで決まるのではなく，化粧の濃さに基づく他者との視が流行していますが，なぜ薄化粧が流行しているのか，な

覚的類似性によっても決まることを明らかにすることがでぜ薄化粧が魅力的に評価されるのか，といった点を明らかきました。今回の知見をベースに，今後も高いモチベーシにすることができれば，流行を操作することができるのでョンを持って研究に励みたいと思います。

はと考えておりました。しかし，今回の研究は行動経済学に着想を得ており，私自身，初めてのアプローチでした。

研究の機会を与えてくださったコスメトロジー研究振興財団には，心より感謝申し上げます。

冒険的な研究であったため，なかなか勇気を持って取り組（広島大学大学院総合科学研究科）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
伊藤文人

私は人が社会生活の中でどのように意思決定を行ってい論」も必然的に重要となってくることが明らかです。本研

るのか、背景に脳のどのような機能があるのかという点に究はこうした認知のベースにある脳の機能を明らかにする興味を持ち研究を行って参りました。
本研究で着目した「他ものでありました。化粧をするという行為は相手に良い印者からの評価」は、人が社会生活を送る上で避けられない象を与えるための重要な方略と考えられますが、福島県立ものとなります。この他者からの評価は様々な場面でその医科大学の藤原寿里先生のご研究は、「化粧がその人の内人の人生を左右することになっていきます。例えば、上司面にポジティブな影響を及ぼす」というもう一つ化粧の重から良い評価を得られれば昇進に結びつくかもしれません

要な役割を示唆しております。化粧の役割が他者に与えるし、妻からの良い評価を得られていれば幸せな結婚生活が印象の操作のみならず自己認知の変容にもあるという事実続くかもしれません。つまり、より良い印象を他者に与えは、化粧という慣習の心理学的重要性を再認識させるもの

ることが翻ってより良い人生を送ることにつながると言っであります。もしかすると、「化粧をすると他者が自分にても過言ではないかもしれません。こうして考えると、相良い印象を持ってくれそうだ」という無意識の他者からの手からどう思われているか、つまり「他者からの評価の推評価の予想が、女性の自己認知を変容させ、内面にポジテ− 233 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

ィブな影響を与えているのかもしれません。こうした今後たにも関わらず、長い間サポートをしてくださった事務のの研究につながるアイデアをいただくことができた点でも方々に心より御礼申し上げます。

今回助成していただいて本当にありがたかったと実感して（サウサンプトン大学心理学部、日本学術振興会、北海道

おります。助成してくださったコスメトロジー研究振興財

大学保健科学研究院）

団様ならびに、助成期間中に様々なイレギュラーが発生し

平成 29 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
五島史行

この度、コスメトロジー研究振興財団研究助成をいただのことから患者さんの心の健康度を眼瞼裂幅によって評価

きましたことを心から御礼申し上げます。私は耳鼻咽喉科

することを発想しました。眼瞼裂幅測定による耳鼻咽喉科において、心理治療や心身医学に力を注いでいます。この心身症患者の客観的評価のこころみというテーマで研究を領域は非常に重要なものであると考えておりますが、その行いました。しかし実際に研究を行ってみると、眼瞼裂幅

思いとは裏腹にあまり日の目を見ない領域であります。体は日内変動があり自律神経の影響を強く受けていることがの病気と心は密接に結びついているという考えは現代の医分かりました。今回の研究では一年という短い研究期間で学教育ではあまり強調されていないのが現状です。患者さあったために、日内変動の記録を十分にとることができまんがどのような症状で病院を受診しているかを言葉を交わせんでした。眼瞼裂幅が健康度に影響を与えるという仮説

す前にどのくらい感じることができるかというトレーニンを検証するためにはまだまだデータの収集が必要と感じてグをしばらくしてみたことがあります。その際には診察室います。このことをさらに深め心身医学、行動医学に応用に患者さんが入ってきたときの様子、目の様子を観察するしていきたいと考えています。

ようになります。そのような診療を心がける中で気づいた（独立行政法人国立病院機構東京医療センター）のは心理的な健康状態が眼瞼裂幅に関連することです。こ平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
四角

このたびは、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に隆二

とんど進展することなく、今日に至ります。

採択いただきまして、誠にありがとうございました。私が勤務する岡山市立オリエント美術館には多数のサーサー研究の中心に置いている、サーサーン・ガラスの研究分野

ン・ガラスが所蔵されていますが、いずれも美術市場を介を開拓されたのは、深井晋司氏でした。1959 年以前、欧した購入品であり、考古学情報を喪失しており「美術品」
以米の学界では「古代ガラス」と言えば、いわゆるローマ・ガ上の扱いが困難でした。展覧会開催で知り合った、シンプ

ラス、「西アジアのガラス」と言えば、イスラーム・ガラス

ソン , St, J 大英博物館研究員のご厚意でメソポタミア都市を指していました。深井氏は、イランの首都テヘランの古遺跡出土品の調査を始めたところ、博物館資料サーサーン・

物商の店先で、正倉院タイプ円形切子碗類品を発見するにガラスでは見たことのなかった小瓶の数的卓越に驚いたこ

および、サーサーン朝のガラスである、と発表されたのでとが本研究の出発点です。

す。以後、東西交流史あるいは美術史的側面での理解は進サーサーン朝は文字記録に乏しく、ローマ／ビザンツ勢

みましたが、研究が考古学的情報を喪失した盗掘品に依拠

力との軍事的記録以外の政治経済史は不明確です。ユーフ

していたこと、1979 年のイラン・イスラーム革命とそのラテス川を越えて東方へ流入する東地中海系ガラスの内容

後のイラン・イラク戦争勃発の結果、考古学的な理解はほ物はなんだったのか。いろいろ考えていたところ、大学院− 234 −

コスメトロジー研究雑感

修士時代に調査したシリアの農村遺跡では、村落消費を超

南北メソポタミアで小型容器の出現頻度が異なることを確える規模の大型オリーブ・プレスが出土していたことを思認できたことは大きな成果です。化粧文化が地中海周辺かい出しました。さらにローマ時代にはバラやユリの香りをら同心円状に拡散する現象をキリスト教徒やユダヤ教徒を移した香油文化が花開いたことを学ぶにおよび、西方から結びつける予察を提示しましたが、今後はサーサーン朝領流入した化粧文化の可能性を想定したのです。

域内のキリスト教徒の動向を解明していきたいと思ってい考古資料サーサーン・ガラスを用いた本研究において、ます。

（岡山市立オリエント美術館）

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
西尾

近年の政策により、要介護者である家族を自宅で介護す

美登里

スキンケアと化粧品は母や妻を輝かせることのみならず、る男性が増えています。その中でも、女性である母や妻を男性が母や妻に輝いていてほしいという思いを投影するも多く介護する男性が増えており、この現象の要因は家族構のと考えました。実際に妻にスキンケアをしている男性は、成と役割の変化、政策による女性の社会進出、医療が病院

よく妻に触れて話しかけています。当研究によりスキンケから在宅へギアチェンジされたことによります。それまで

アを実施する男性の特徴が一部ではありますが明らかにな

社会的役割を担っていた男性が家庭で介護者役割を担うこりました。次点の研究は、スキンケアの実施者である男性とになりました。その傾向は今後ますます進展すると感じにとって、母や妻に触れる効果を検証したいと考えます。

ています。

つまり、スキンケアは実施するほうもされるほうも共に健

もともと社会的な評価に価値を置き、外からの援助につ康になるという仮説に沿って研究を進めてまいります。

ながりにくい傾向がある男性が、なんとか自分でうまく介

今後は、男性介護者が化粧品を購入しやすいような多様護しようと努力し、うまくいかなければ自分を責め、恥と性を認める社会となることを望んでいます。当研究結果は感じることが、介護の虐待の原因という仮説に基づき研究

原著論文として報告できる予定です。

を進めています。現に介護が原因での虐待の加害者は約 7

コスメトロジー研究振興財団から研究助成をいただき、割が男性で、被害者は約 8 割が女性です。そこで私は、男

当研究の研究を可能にしていただいたことに深く感謝いた

性の家庭内進出というテーマで、男性がスキンケアや料理、します。

（福岡大学医学部看護学科）

洗濯などができるような活動を研究と同時進行しています。

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
眞部

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択していただき、誠にありがとうございました。本研究助成を得て、研究を展開することができましたことをお礼申し
上げます。

寛之

惹起される脳内機構の解明に向けた研究が本格的に展開され始めたところです。
ある香水の香りを嗅ぐと思いだす人がいたり、花の匂いで懐かしい記憶が呼びさまされたりすることがあるかと思嗅覚の研究は視覚系研究に比べ 30 年は遅れていると言います。この神経回路機構は全く不明でした。本研究は、われており、まだまだ発展途上の分野です。しかし、空気前梨状皮質のニューロンが、匂いとそれに紐づく特定のシ中を漂う匂い分子を認識する受容体が発見されてから約ーンに応答することを明らかにしました。しかも、このよ

30 年を経て、匂いを認識する機構が次々とわかってきまうなニューロンを集めてくると、すべてのシーンに対応しした。そして、匂いの記憶や、匂いで我々の感情や情動をて応答することが分かり、梨状皮質は、匂いと、匂い経験− 235 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019に伴うエピソードとを連合しているのではないかという新構の基本ロジックを明らかにしていきたいと思います。

たな仮説を提唱することができました。これまでの嗅覚系

神経回路を扱う我々のような研究者が、どのようにコス研究は、匂いがどのように認識されるのかに焦点があてら

メトロジー分野に寄与できるのか、基礎的な研究をどう応れていたため、匂い刺激に対してどう応答するかに着目し、用していくか、まだまだ模索していかなければならないこ

匂い刺激に応答したニューロンが他の場面でどのように応とは多いかと思います。しかし、今後とも努力を続け、コ答するかは不明でした。本研究は、匂い記憶という切り口

スメトロジー分野の発展に寄与できればと思います。

で、梨状皮質の新たな機能を見出したと言えると思います。
さらに発展させていくことで、匂い記憶の脳内情報処理機− 236 −

（同志社大学研究開発推進機構）

コスメトロジー研究雑感

平成 30 年度

国際交流助成第 28 回日本色素細胞学会学術大会の報告
永井宏

平成 30 年 10 月 13 日㈯ ～ 14 日㈰ 神戸商工会議所に於講演者と中心とする「Pigmentary Disorders Workshop」をいて、第 28 回日本色素細胞学会学術大会を開催いたしま

実施、また一般演題にも海外発表を加えることで、国内発した。

表者との相互的な交流がより図れるよう工夫いたしました。

本学会は、国際的な色素細胞の研究組織である IFPCS

本学会の公用語は原則英語となっており、休憩時、懇親会（International Federation of Pigment Cell Societies： 国などの交流時間にも、海外講演者を交えて非常に活発に議

際色素細胞連合）を構成する世界の４大色素細胞学会論が行われており、参加者からも大変有意義な会であった

JSPCR（日本）、PASPCR（アメリカ大陸）、ESPCR（ヨと評価を頂きました。

ーロッパ）、ASPCR（アジア）の中核として日本における色素細胞研究の推進と情報発信を担っております。

結果的に全国から会員をはじめとする 130 名以上の色素細胞ならびに色素異常症の研究者・医療従事者が意見交換

本学術大会は世界中の IFPCS メンバーに対して国際機を行う貴重な機会となりました。

関誌（Pigment cell melanoma research 誌）による告知を行

この度、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団から

い、海外からも PASPCR、ESPCR、ASPCR より色素細胞のご支援により、第 28 回日本色素細胞学会学術大会を成研究における世界的なリーダーを招聘し、より国際的なセ功裡に執り行うことができました。学会の開催・運営にはッションを開催することで、日本の若手研究者の研究発表

多額の資金が必要となるため、貴研究財団からのご支援はの場とし、さらには実質的な共同研究の発展の機会とした

本当に心強く有難いものとなりました。この場を借りて、いと考えておりました。本学会では計 7 名を招聘し、海外

改めてお礼を申し上げます。（神戸大学大学院医学研究科）

平成 30 年度

学術集会支援助成第 50 回日本結合組織学会学術大会を終えて
鍋島一樹

平成 30 年 6 月 29-30 日（金、土）の両日、福岡大学病院

Toole 先生にマイスターレクチャーとして講演いただき、長年

メディカルホールにて第 50 回日本結合組織学会学術大会の研究者としての経験に基づいた若い方々へのメッセージもを開催いたしました。あいにくの雨模様にもかかわらず、

発信していただきました。“がんにおける微小環境と相互作用”

201 名の参加を得て、99 の演題について熱のこもった発と題したシンポジウムでも 3 題の講演をいただきました。⑶

表と議論が行われ、盛会裡に終えることができました。

については、“基礎と臨床の融合” と題したシンポジウムを企

本学術大会では⑴目でみえること、⑵細胞・細胞あるい画し、弾性線維と疾患、骨格筋代謝と糖尿病、心臓におけは細胞・マトリックスの連携、⑶臨床と基礎の連携をテーマ

る線維化の３つのテーマについて、臨床と基礎の立場それぞとしました。⑴については、2 光子／多光子顕微鏡を駆使しれより講演いただき、会場からも多くの質疑がありました。

て生体内での 細胞・細胞 あるいは細胞・マトリックス連携

結合組織とマトリックスバイオロジーに関わる基礎と臨を目に見える形で呈 示して頂けるエキスパートのお 2 人、床の研究者が一堂に会して、意見を交換するのがこの学会

Radboudumc /MD Anderson Cancer Center の Peterの特色ですが、今回の学術大会を契機に新たな共同研究がFriedl 先生と自然科学研究機構生理学研究所（岡崎）の鍋倉

スタートしたとの報告も受けており、今回も十分にそれが淳一先生に、それぞれがん細胞の浸潤と脳組織における神行われたものと考えています。若手の育成のための Young

経細胞とグリア細胞の連係について、そのメカニズムと共にinvestigator award（YIA）にも多数の応募をいただき、6

ご講演いただきました。⑵については、細胞・細胞連携に着

名の若き研究者達に賞の授与が行われました。

目したヒアルロン酸および emmprin 研究を長年リードして来られた Medical University of South CarolinaのBryan P.

これも貴財団によります貴重なご支援のお蔭とこころよ
り感謝申し上げます。

− 237 −

（福岡大学医学部病理学講座）

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019平成 30 年度

学術集会支援助成第 36 回日本美容皮膚科学会総会・学術大会を終えて尾見

徳弥

この度、2018 年 8 月 4 日、5 日に東京国際フォーラムで従来の知識の補完となって、さらに一歩踏み込んだ知識の第 36 回日本美容皮膚科学会を開催させていただきました。

習得につなげられ、より充実した美容皮膚科領域の治療に

美容皮膚治療は大きな発展を示し、日本美容皮膚科学会

役立てられたとの声も多数いただいています。その他、新の会員数もほぼ 2,500 名に達し、社会的にも「プチ整形」としい知識を習得できる場として婦人科領域のRejuvenation

して消費者にも広く受け入れられています。近年ではボツ治療など基礎のみでなく最先端の知識を導入できるように

リヌス菌毒素による腋窩多汗症の治療が保険適応となった心がけました。

り、脱毛、美顔を対象とした医療機器が厚労省から認可さまた、美容皮膚科施術に精通していない若手医師のためれるなど診療分野においての普及性も目覚ましいものがあに 8 月 3 日にプレセッションとして「美容皮膚科のいろはのい」

ります。

として光治療の原理、レーザー・光線治療とケミカルピー

今回は、海外の最先端の知識を習得できる目的で、リング・注入剤の 3 つのセミナーを実施し好評でした。

IMCAS 代表の Dr. Asher、アジア皮膚科学会の Professor

おかげさまで、学術大会の参加者は 1,456 名、講演者

Goh、アメリカレーザー医学会の Professor Kauver など海107 名、展示企業 99 社、日本美容皮膚科学会史上最もス

外からの国際学会を代表する先生方とで共同シンポジウム

ケールの大きな学会にすることができました。このようなを実施しました。また韓国皮膚科学会からもドクターを招盛会へと貢献いただけました貴財団のご支援に対し厚く御へいし、日本よりも社会において一般的となっている韓国

礼申し上げます。

の美容皮膚科治療についてのシンポジウムも開催しました。

（クイーンズスクエアメディカルセンター）

平成 30 年度

学術集会支援助成「第 22 回天然薬物の開発と応用シンポジウム」報告
塚本佐知子

本シンポジウムは、薬用天然資源の開拓に始まり、天然薬

井隆一先生に「細胞表面の『生命装置』に作用する水溶性海物の化学構造、合成、生合成、薬効解析、漢方薬や民間薬

洋天然物の探索（低分子編）」という表題で、また東北大学の有効利用など、天然薬物全般に関する研究を対象としてい大学院農学研究科の山下まり先生から「中間体を基盤とします。そして、薬用植物に加えて、微生物や海洋生物を医薬た海産毒の生合成研究」という表題でご講演いただきましシーズとして創薬を目指す研究を討議の対象としております。

た。また、シンポジウムとして、熊本大学薬学部の創薬研

自然豊かな我が国では天然薬用資源からの創薬研究の歴史究に関する新たな取り組み「有用植物 X 創薬システムイン

は古く、今日まで活発な研究が行われてきました。そして、テグレーション拠点推進事業」に関するシンポジウムと、

現在用いられている医薬品の多くが、天然物およびその誘

天然薬物学研究の第一線でご活躍されている 4 名の先生方導体であります。高齢化を迎えた我が国においては、健康による「天然薬物学研究 〜創薬研究の礎〜」と題したシンに関する国民の関心は高く、その社会的要請に応えるためにポジウムを開催しました。さらに、これら特別講演およびも天然薬物からの創薬研究は今後益々重要と考えられます。

企画シンポジウムに加え、天然薬物の開発と応用に関する幅

今回のシンポジウムは平成 30 年10月7日㈰から8日（月・祝）の 2 日間、熊本大学薬学部のキャンパスで開催されました。
6 日には台風 25 号の影響を受け山陽新幹線が一時運転見広い関連分野から 49 題の一般講演とポスター発表がなされ、参加者一同にとって有意義な討論の機会となりました。
最後に、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団には、合わせとなり、到着するまで苦労された参加者もいたようで

本シンポジウムの開催にあたり、多大なご援助を賜りまし

すが、開催日の熊本は快晴の良い天気に恵まれました。

たことを厚くお礼申し上げます。

特別講演として、北海道大学大学院水産科学研究科の酒− 238 −

（熊本大学大学院生命科学研究部）

●
事業報告書
役

員
●

事業報告書

事業報告書（自平成 30 年 4 月 1 日

至平成 31 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2018

2019

5

7

公募開始

全国 617 の大学、病院、研究機関等へ公募要領及び推薦書を送付、関連学術雑誌 2 誌、当財団 HP 他 12 機関 HP に公募要領を掲載
7
9
公募締切り
応募総数120件
7/13 〜 8/24
各選考委員による個別審査
9
3
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9
5
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9
6
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9 27
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成43課題を選考
10
4
第二回臨時理事会（書面） 本選考委員会より答申、助成課題決定
11 20
第29回 表彰・贈呈式
研究助成対象43課題の代表者へ、助成金贈呈書を授与
記念講演
演題 ： 日本人の白嗜好と、感性をつなぐ色彩
講演者 ： 齋藤 美穂 先生 早稲田大学 常任理事
12 10
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額4,500万円
2 19
選考委員への承認（書面） 2019年度研究助成公募要領他《国際交流助成関連》
2018

4
4

5
25

審査
助成金交付

国際交流（招聘）： 第28回日本色素細胞学会学術大会
国際交流助成金 50万円

《学術集会支援助成関連》
2018

2
4
2
4
2
4

21
25
21
25
21
25

審査
助成金交付
審査
助成金交付
審査
助成金交付

学術集会支援 ： 第22回天然薬物の開発と応用シンポジウム
学術集会支援助成金 50万円
学術集会支援 ： 第36回日本美容皮膚科学会総会・学術大会
学術集会支援助成金 50万円
学術集会支援 ： 第50回日本結合組織学会学術大会
学術集会支援助成金 50万円

《理事会関連》
2018

5

23

6

18

10
11

4
20

第一回通常理事会

平成29年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）の承認
任期満了に伴う選考委員の選任
任期満了に伴う理事候補者の選出
任期満了に伴う監事候補者の選出
株主としての議決権行使について、報告事項
第一回臨時理事会（書面） 代表理事（理事長及び副理事長）及び業務執行理事（専務理事）の互選
事務局長の選任、常勤役員の報酬の承認、常勤役員の退職手当の承認
第二回臨時理事会（書面） 平成30年度（第29回）研究助成者等の承認
第二回通常理事会
平成30年度収支予算書の一部変更の承認
平成30年度の事業計画及び予算案の承認、報告事項− 241 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019

《評議員会関連》
2018

6

8

11

27

定時評議員会

平成29年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）の承認
任期満了に伴う理事の選任
任期満了に伴う監事の選任、報告事項
評議員への報告（書面） 第二回通常理事会議決事項、表彰･贈呈式その他の報告《その他》
1）報告書発行
2018
5
1
9
1

中間報告書
完了報告書

2）行政届出関連
2018
6 13
6 22
6 25
2019
1 24

内閣府へ平成29年度事業報告書等の提出
内閣府へ変更の届出（理事、監事の改選）
内閣府による立入検査
内閣府へ平成31年度事業計画、収支予算書の提出

3）情報公開（当財団HP）
2018
4
6
公募要領
6 30
事業報告及び収支決算
9
1
研究報告書
11 22
予算書一部修正
研究助成者及び課題名
2019
3
1
事業計画及び収支予算

研究業績 中間報告集 第27号
コスメトロジー研究報告 Vol. 26（2018）、CD版を作成

2018年度「コスメトロジー研究」公募要領を掲載
平成29年度事業報告書及び収支決算報告書を掲載「コスメトロジー研究報告 Vol. 26（2018）」を掲載
平成30年度予算書の一部修正
2018年度（第29回）研究助成者名及び研究課題名を掲載
2019年度事業計画及び収支予算書等を掲載− 242 −

事業報告書2018年度助成を受けられた方々（1）第 28 回研究助成（43 名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（10 名）
氏

名

所

景山

伯春

笹井
下里

職位

研究課題

名城大学理工学部
教養教育化学教室

准教授

天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基
盤開発と機能解明亮

島根大学総合理工学部准教授

機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答性発色素材の研究開発剛士

信州大学農学部

准教授

乳酸菌オリゴDNAによる上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材へ
の展開

白神慧一郎

属

理化学研究所
生命医科学研究センター

基礎科学
特別テラヘルツ分光で切り拓く角質中に必要な水の“質” の解明
研究員

須原

義智

芝浦工業大学システム理工学部
生命科学科

教授

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製

中島章

東京工業大学物質理工学院材料教授

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発

平野智也

東京医科歯科大学
生体材料工学研究所准教授

強紫外光が照射された部位選択的な治療を可能とする分子システ
ムの開発

森

隆昌

法政大学生命科学部
環境応用化学科教授

化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発

柳澤実穂

東京農工大学大学院工学研究院

特任
准教授

エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測
定法の開発

山元

淳平

大阪大学大学院基礎工学研究科

講師

CRISPR-Cas 9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる多機能光回復酵素の開発

職位

研究課題

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（27 名）
氏

名

所

足利太可雄
飯島

一智

属

国立医薬品食品衛生研究所
安全性予測評価部主任
In vitro/in silico試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値
研究官 （TTC）コンセプトの確立

横浜国立大学大学院工学研究院
機能の創生部門

准教授

シリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発

五十里彰

岐阜薬科大学生命薬学大講座

教授

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索伊藤敦

東海大学工学部原子力工学科教授

太陽光紫外線に暴露された毛髪の酸化度のＸ線イメージングによ
る画像化

伊藤佐生智

名古屋市立大学大学院薬学研究科

准教授

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明

大和田智彦

東京大学大学院薬学系研究科

教授

脂肪酸の構造ダイバーシティを活用する生理活性物質創製

押海裕之

熊本大学大学院生命科学研究部

教授

EGFが皮膚炎に与える影響とメカニズムの解明

神沼

修

山梨大学
医学域総合分析実験センター

准教授

アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する
新規皮膚炎モデルの開発

神戸大朋

京都大学大学院生命科学研究科准教授

メラニン色素合成の解明に向けて～チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究～− 243 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019

氏

名

北村

秀光

木原

章雄

小暮健太朗

所

属

職位

研究課題

北海道大学遺伝子病制御研究所

准教授

神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果

北海道大学薬学研究院

教授

アシルCoA合成酵素ACSVL4 による皮膚バリア形成機構

徳島大学大学院医歯薬学研究部
（薬学域）

教授

イオン導入時の微弱電流による皮膚組織炎症への影響と安全性の
検証

繁森

英幸

筑波大学生命環境系

教授

食薬用植物からの育毛活性物質の探索

島村裕子

静岡県立大学食品栄養科学部

助教

アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析

清水重臣

東京医科歯科大学難治疾患研究所教授

アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発田中沙智

信州大学農学部農学生命科学科准教授

プロシアニジンB2による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明

徳留嘉寛

城西大学薬学部薬科学科教授

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

中村元直

岡山理科大学大学院理学研究科

教授

有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用服部文幸

関西医科大学医学部
iPS・幹細胞再生医学講座

研究教授

ヒトiPS 細胞に由来する若齢および加齢様の性質を示す積層及び立体皮膚オルガノイドの作製

原博満

鹿児島大学大学院
医歯学総合研究科

教授

アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立

原口省吾

昭和大学医学部生化学講座

助教

加齢に伴う皮膚のステロイド合成系の変容が皮膚機能に及ぼす影
響

廣田

豪

九州大学大学院薬学研究院准教授

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響

藤井博

信州大学先鋭領域研究群
バイオメディカル研究所

教授

皮膚保湿マーカー遺伝子FABP5の発現と機能制御機構の解析水野雅史

神戸大学大学院農学研究科

教授

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

森英樹

大阪府立大学大学院理学系研究科

准教授

創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価

山田勇磨

北海道大学大学院薬学研究院准教授

ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発

若松一雅

藤田医科大学医療科学部

特任教授

栄養補助食品として使用されているレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物によるPro-oxidant活性

職位

研究課題

第３分野：精神、文化に関する分野（６名）
氏

名

所

属

上田（石原）
奈津実

名古屋大学大学院理学研究科

講師

香りが認知能力に与える影響

逢阪

聖路加国際大学聖路加国際病院

看護師
臨床
助教授

がん薬物療法に伴う爪の変化に対する、安全なアピアランスケアの検証

星薬科大学薬学部
総合基礎薬学教育研究部門

准教授

桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析

美里

竹ノ谷文子

− 244 −

事業報告書

氏

名

廣原

志保

藤原
山田

所

属

職位

研究課題

宇部工業高等専門学校物質工学科教授

生物・化学と経営の異分野融合による若年層男性に求められる化粧品に関する研究圭志

北海道大学大学院医学研究院

助教

顔面神経麻痺患者に対するメーキャップ治療の有効性の検討

朋弘

九州大学大学院准教授

ハイブリッド相同モデルによるresult-orientedな顎顔面手術シミュレーション法の開発

歯学研究院（2）国際交流助成（１件）
受入責任者

招聘者

神戸大学大学院医学研究科
永井 宏

招聘目的

Center for Cancer Research, NCI,
第28回日本色素細胞学会学術大会へ招聘
NIH, USA（2018年10月13日～同年10月14日、神戸商工会議所）
Thomas J. Hornyak, MD, PhD（3）学術集会支援助成（３件）
実施責任者

所

属

鍋島

一樹

福岡大学医学部
病理学講座

尾見

徳弥

クイーンズスクエア
メディカルセンター

塚本佐知子

熊本大学大学院
生命科学研究部

助成集会
第50回日本結合組織学会学術大会（2018年6月29日～同年6月30日、福岡大学病院メディカルホール）
第36回日本美容皮膚科学会総会・学術大会（2018年8月4日～同年8月5日、東京国際フォーラム）第22回天然薬物の開発と応用シンポジウム（2018年10月7日～同年10月8日、熊本大学薬学部宮本記念館）− 245 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019役

員2019 年 7 月現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

亀山

浩一

（常勤）

理

事

関根

茂

理

事

長野

哲雄

東京大学創薬機構

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

廣部

雅昭

東京大学

理

事

山㟢

幹夫

元新潟薬科大学

監

事

岩渕

信夫

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

元株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

東邦大学

名誉教授

評議員

奥

直人

帝京大学

薬学部教授

評議員

齊藤

勲

評議員

齋藤

美穂

評議員

仙名

保

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

兵庫県立大学

常務理事

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学

名誉教授

日光ケミカルズ株式会社

代表取締役名誉会長

客員教授

名誉教授
名誉教授
名誉教授
名誉教授
学長

常務取締役

元厚生省大臣官房審議官
早稲田大学

常任理事

名古屋工業大学

先進セラミックス研究所

プロジェクト教授

元厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官− 246 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒 104 — 0032

東京都中央区八丁堀三丁目 11 番８号
ニチト八丁堀ビル五階
電話 03（3206）7721

コスメトロジー研究報告

Vol. 27／2019

非売品

2019年 9月 1日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

亀山 浩一
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒104−0032 東京都中央区八丁堀三丁目11番８号
電話 03（3206）7721
エイエム企画〒171−0014 東京都豊島区池袋四丁目24番７号
電話 03（3590）5375
太陽印刷工業

表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2019

商品デザイン部デザイン室不許複製

禁無断転載