新規角質保護素材応用へ向けた
抗炎症性スフィンゴ糖脂質の精製と性質解明に関する研究
独立行政法人産業技術総合研究所

奥 田

生物プロセス研究部門

徹 哉

In several vascular inflammatory reactions, inflammatory mediators lead to the activation of vascular endothelial
cells (EC). To date, a number of functional molecules induced on the surface of activated-EC have been identified. In
this study, we found Globotetraosylceramide (Gb4), a glycosphingolipid expressed in EC, as a novel inducible moleculeon EC activated by TNF-a. After TNF-a stimulation for 24 hours, the expression level of Gb4 in activated-EC became
approximately three times higher than that of non-treated EC. MALDI-TOFMS analysis revealed that the enhanced Gb4
predominantly contains C24:0 or C24:1 fatty acids in the ceramide moiety. Isolated caveolae/lipid raft-enriched detergent
insoluble membrane domains in activated-EC predominantly contain this molecular species of Gb4 (C24-Gb4). Real time
RT-PCR analysis revealed that the increased expression of C24-Gb4 was regulated by transcriptional control of key genes for
C24-Gb4 synthesis. These observations suggest that Gb4, especially those containing a very long chain fatty acid, play animportant role in the inflammatory response of EC.

１．緒る成分中に抗炎症活性を有するスフィンゴ糖脂質が含まれ言ると予想し、その検証に向けて解析を進めている。本研究

セラミドやセラミドより合成されるスフィンゴリピッド

期間では、目的とする N-GSL 成分の組成分析及び主要成は、皮膚表面の角質保護成分として利用されている。これ

分の構造決定、更には同定した主要成分の発現制御機構及らは水に対して難溶性であるため、角質層内へ効率よく水び細胞内局在について検討した。

分を維持するための重要なブロックとして機能する。スフ２．実験方法

ィンゴ糖脂質は皮膚に存在するスフィンゴリピッド成分の一つであり、セラミドとこれに結合する糖鎖から成る分子である。なかでも中性糖から構成される中性スフィンゴ糖

２．
１
製

培養細胞からのスフィンゴ糖脂質成分の大量調脂質（Neutral glycosphingolipids：N-GSL）は、難水溶性

HuMedia-EG2 培地にて培養したヒト初代培養血管内皮

かつエタノールなどの極性の高い有機溶媒へ容易に可溶化細 胞（HUVEC）を 検 討 に 用 い た。 培 地 中 に 炎 症 性 物 質できる性質を兼ね備えている。このセラミドよりも加工しTNF-a を終濃度 20 ng/ml に加えて細胞に炎症を惹起し、易い性質から、近年、新規な化粧品素材として注目されて24 時間インキュベートした後に細胞を回収した。

いる。これまでの関連研究では、生体内におけるスフィンゴ糖脂質の発現量を、遺伝子工学的手法に基づき変化させ２．２たマウスにおいて、皮膚の異物に対する反応が過敏になり、スフィンゴ糖脂質の抽出回収した細胞より、クロロホルム：メタノール（2：1）

難治性の皮膚炎が発症することが報告されている１−２）。し溶媒を用いて総脂質を抽出した。この総脂質に含まれるかしながら、スフィンゴ糖脂質の変化と皮膚炎発症との因N-GSL 成分を、Folch 分配法により抽出した。

果関係については未だ不明である。
我々はこれまでの研究過程にて、初代培養下のヒト臍帯

２．３

HPLC を用いた N-GSL の組成分析

由来血管内皮細胞を炎症性サイトカインにより刺激し炎症抽出した N-GSL は rEndoglycoceramidase Ⅱ（タカラバ

応答を惹起させると、細胞の N-GSL 成分が増大する現象イオ）にて酵素消化することで糖鎖部分を遊離させ、これを発見した３−４）。この増大現象は、細胞の炎症応答が衰退を蛍光分子アントラニル酸で標識し、HPLC にて標識蛍光し始める時期に一致して観察されることから、炎症の抑制を指標とした組成分析を行った。HPLC分析にはTSKgelに関与する現象であると推察される。我々は、この増大すAmido-80カラムを用い、移動層には20％100mM ammonium
acetate（pH 3.85）-80％ acetonitrile、
及び20％ 100mM ammonium

Purification and Characterization of Neutral
Glycosphingolipids in Human VascularEndothelial Cells under InflammatoryCondition.
Tetsuya Okuda
Bioproduction Research Institute National
institute of Advanced Industrial Scienceand Technology（AIST）

acetate（pH 3. 85）- 60 % DW-20％acetonitrileを用いた。蛍光検出器は励起波長 360 nm に設定し、蛍光波長 425 nm を検出した。

２．４− 40 −

質量分析によるセラミド構造の解析

抽出した中性スフィンゴ糖脂質成分を a-CHCA マトリ

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クスと混合して結晶化し、質量分析装置（MALDI-TOF-に増加していることが判明した（Fig. 1B）。

MS）にて分析した。標準物質の MS スペクトルとの比較に３．２より構造を決定した。

スフィンゴ糖脂質はセラミド部位の構造にも多様性があ２．
５Real time RT-PCR による遺伝子発現解析

る。その構造について、質量分析装置（MALDI -TOF-MS）

炎症刺激前後の HUVEC より mRNA を抽出し、逆転写を用いて分析した（Fig. 2）。標準物質と比較から、通常培酵素を用いて cDNA を合成した。合成した cDNA を鋳型

養下の HUVEC 由来の Gb4 は、セラミドの脂肪酸部位にパとして、目的糖脂質の生合成に関わる酵素遺伝子群の発現

ルミチン酸（C16：0）、リグノセリン酸（C24：0）、ネルボⓇ

量を、LightCycler 480 システム（ロシュ・ダイアグノスン酸（C24：1）を主成分として有していることが明らかにティックス）を用いた Real Time RT-PCR にて測定した。

なった（Fig. 2, 中段）。これらの Gb4 分子種に由来する MS
スペクトルは、炎症を惹起した後の HUVEC に由来する試

２．
６

脂質ラフト画分の調製料中ではより強く検出された。特に、C24：0 及び C24：1

炎症刺激後の HUVEC を界面活性剤（1%triton-X100）存在下にて Dounce 型ホモジナイザーにて破砕し、５− 40%を有する Gb4（C24 -Gb4）に由来するシグナルの増強が見られた（Fig. 2, 下段）。のショ糖密度勾配にて遠心することで、脂質ラフトが含まれる界面活性剤不溶性膜を分離した。分離後のサンプルは

３．３

10 分画し、各種ラフトマーカー、及びコントロールタン

C24 - Gb4 の発現量の増加が、どのような細胞内制御機構パク質の発現についてウエスタンブロッティング法によりにて調節されているのかを検証すべく、その生合成に関与検討することで、脂質ラフトを含む画分を同定した。同定する酵素遺伝子群の転写レベルについて Real time RT-した画分より N-GSL を抽出し、上記質量分析法により目PCR にて解析した（Fig. 3）。まず C24 - Gb4 の糖鎖の合成酵的とする N-GSL 成分の MS スペクトルを測定した。

素遺伝子群について検討したところ、TNF-a 刺激後（12３．結時間後）に一様に発現量が上昇していた。一方で、C24-果Gb4 と前駆体（LacCer）を競合して合成される酸性糖脂質

３．
１

GM3 の合成酵素遺伝子（GM3S）の発現量には大きな変化

HPLC 分析の結果、通常培養下の HUVEC 由来の N- GSLが見られなかった。次に、セラミド部位の合成酵素遺伝子

成分には、グロボテトラオシルセラミド（Gb4）およびそ群について検討したところ、C24：0 及び C24：1 脂肪酸の生の前駆体であるグロボトリアオシルセラミド（Gb3）が主合成酵素（脂肪酸鎖長伸長酵素）である Elovl1-3 のうち、成分として存在していることが判明した（Fig.1A）。そのElovl1 遺伝子が強く発現上昇していることを見いだした。

他、マイナー成分として、Gb3 の前駆体であるラクトシル

一方、脂肪酸をスフィンゴシンに転移しセラミドを合成すセラミド（LacCer）や、構造未同定の N-GSL が数種存在するセラミド合成酵素（CerS）については、C24 脂肪酸を選ることが確認された。炎症を惹起させ 24 時間経過させた択的に転移する CerS2 遺伝子の発現上昇が見られたが、細胞では、これら全てに増加傾向が見られ、特に主要成分

C16 脂肪酸の転移酵素である CerS5 遺伝子についても同様である Gb4 の変化が大きく、炎症惹起前と比較して約３倍に発現量が上昇していた。これらの結果は、C24-Gb4 の発

Fig. 1 TNF-α 刺激後の HUVEC における N-GSL の発現変化 .
（A）HPLC を用いて N-GSL の各分子種の発現量を，TNF-α 刺激前後で比較検討した．未処理 HUVEC（Open bars）及び TNF-α 刺 激 後 の HUVEC（closedbars）に由来する N-GSL 各分子種の発 現 量 を 示 す．Error bars, mean ±SE, n=3, from three independent
experiments, ＊P < 0.05.
（B）N - GSL 各分子種について，炎症刺激後 の 増 加 率（TNF-α 刺 激 後 HUVEC／未処理 HUVEC）を示した．

− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig. 2 MALDI-TOF-MS による HUVEC 由来 Gb4 の測定 .
（上段）標準物質としてヒト赤血球由来精製 Gb4 のMS スペクトルを測定 .
（中段）未処理 HUVEC より抽出した N-GSL 成分中の Gb4 由来 MS スペクトル .
（ 下 段 ）TNF-α に て 刺 激 後 の HUVEC に 由 来 す る
Gb4 の MS スペクトル．HUVEC に発現する Gb4には，脂肪酸構造の差異に由来する分子種（C14：0 〜 C26：1）が存在することが MS スペクトルより 予 測 さ れ， そ の 位 置 を 上 段 に 示 し た（arrowheads）．

Fig. 3 Real time RT-PCR による C24-Gb4 合成酵素遺伝子群の発現解析 .
TNF-α 刺激後（12 時間後）の HUVEC 及び未処理の HUVEC より調製した cDNA を用いて，C24-Gb4 の合成に関与する生合成酵素遺伝子群の発現量を比較解析した．図は，炎症刺激後（12 時間）の増加率（TNF-α 刺激後 HUVEC ／未処理 HUVEC）として示してあ る．C24-Gb4 の 糖 鎖 部 位 の 生 合 成 酵 素 遺 伝 子 と し て Gb3S，Gb4S，B4GalT6，C24 脂 肪 酸 生 合 成 酵 素 と し て Elovl1，3，6，
C24 脂肪酸を基質としてセラミドを生合成する酵素である CerS2に つ い て， そ れ ぞ れ 発 現 量 を 解 析 し た． ま た 比 較 対 象 と し て，HUVEC に存在する酸性スフィンゴ糖脂質の糖鎖合成酵素遺伝子である GM3S，Gb4 の前駆体の糖鎖分解酵素である GLA，C16 脂肪酸を基質としてセラミドを生合成する酵素遺伝子 CerS5，6 についても，その発現増加率を示した．Error bars, mean ± SE, n=4, fromtwo independent experiments.

現量増加においてセラミド合成酵素レベルでの選択性は無スフィンゴ糖脂質は細胞膜内にて脂質ラフトと定義される

く、Elovl1 による C24 脂肪酸合成量の増加が中心的な役割シグナル伝達の足場構造を形成すると考えられている。そを担うことを意味する。

こで生化学的手法により、C24 - Gb4 の脂質ラフトにおける３．４（DIM）を遠心分離した試料を 10 分画し、そのうち脂質ラ局 在 に つ い て 検 討 し た（Fig. 4 ）。界面活性剤不溶性膜細胞の炎症応答における C24 -Gb4 増大の意義についてフトマーカーが検出される画分（Fig. 4A, 2-3）から N-GSL検討するべく、その細胞内における局在について解析した。

を 抽 出 し、MALDI-TOF-MS に て 解 析 し た と こ ろ、C24-− 42 −

新規角質保護素材応用へ向けた抗炎症性スフィンゴ糖脂質の精製と性質解明に関する研究

Fig. 4 細胞膜における C24-Gb4 の局在解析
炎症刺激後の HUVEC より界面活性剤不溶性膜（DIM）をショ糖密度勾配遠心法により分離し ,C24Gb4 の局在を MALDI-TOF-MS により解析した .
(A) ウエスタンブロッティングにより、各画分における脂質ラフト（Flotillin-1,2）及びカベオラ膜（Caveolin-1）のマーカー分子の局在について検討した . また , コントロールとしてアクチンタンパク質（Actin）の局在についても検討した .
(B) 分離した脂質ラフト濃縮画分における C24-Gb4の発現を，MALDI-TOF-MS により解析した .

Gb4 の MS スペクトルが検出された（Fig. 4B）。一方で、非（参考文献）

脂質ラフト画分（Fig. 4A, 7-10）からは、Gb4 に由来するい１）Fukumoto S, Yamamoto A, Hasegawa T, et al:
Genetic remodeling of gangliosides resulted in the

ずれの MS スペクトルも検出されなかった。

４．考enhanced reactions to the foreign substances in skin.

察

Glycobiology, 7, 1111-1120, 1997.

本研究にて、炎症を惹起した血管内皮細胞では超長鎖脂２）Inoue M, Fujii Y, Furukawa K, et al: Refractory skin

肪酸を含有する N -GSL の発現量が増加することが明らか

injury in complex knock-out mice expressing only theとなり、その主成分は C24 脂肪酸を含有する Gb4（C24 -GM3 ganglioside. J. Biol. Chem., 277, 29881-29888, 2002.

Gb4）であった。C24 脂肪酸を含有するスフィンゴ糖脂質

３）Okuda T, Tokuda N, Numata S, et al: Targeted

は、形質膜の脂質二重層構造において、二つの層間に存在

disruption of Gb3/CD77 synthase gene resulted in theする分子の相互作用を媒介する役割があると考えられていcomplete deletion of globo-series glycosphingolipids

る 。一方で、炎症性サイトカインにより炎症惹起した血and loss of sensitivity to verotoxins. J. Biol. Chem., 281,

５）10230-10235, 2006.

管内皮細胞では、脂質ラフトを介したシグナル伝達が細胞
６）の炎症応答に関与することが知られており 、C24 - Gb4４）Okuda T, Nakakita S, Nakayama K: Structuralの脂質ラフトへの局在からもこれらの現象への関与が示唆

characterization and dynamics of globotetraosylceramide

される。また遺伝子発現解析の結果から、炎症時におけるin vascular endothelial cells under TNF-alphaC24 - Gb4 の発現増加は遺伝子転写レベルで制御されていstimulation. Glycoconj. J., 27, 287-296, 2011.

ることが明らかとなり、その脂肪酸構造の異なる各分子種５）Iwabuchi K, Nakayama H, Iwahara C, Takamoriの発現量まで転写レベルで厳密に制御されていることが判

K: Significance of glycosphingolipid fatty acid chain

明した。

length on membrane microdomain-mediated signaltransduction. FEBS Lett., 2584, 1642-1652, 2010.

以上の結果は、炎症下の血管内皮細胞における C24 - Gb4６）Kiely JM, Hu Y, García-Cardeña G, Gimbrone MAの増加が、細胞の炎症応答にて重要な役割を担うことを示

Jr: Lipid raft localization of cell surface E-selectin is唆しており、今後は C24-Gb4 の関与が予想される膜シグ

required for ligation-induced activation of phospholipase

ナル伝達経路を中心に、その機能についてアプローチする

C gamma. J. Immunol., 171, 3216-3224, 2003.

予定である。

− 43 −