細胞外マトリックス分解性微生物酵素を用いた動物原料からコスメトロジー素材への実用的アプローチ
京都府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻

渡部邦彦

Among those hard-to-degrade animal proteins, the most major proteins are extracellular matrix proteins (EMPs) andcollagen is one of the representative components. Subsequently to EMPs, a large amount of keratins are also generated
mainly from the poultry processing factories and leather industry. We have studied for collagen and keratin degradationby thermophilic bacteria. In this project, we investigated the possibilities of producing cosmetic materials by use ofthermophilic bacteria we isolated and their enzymes as a practical approach. The main issues we challenged are (i)preparation of EMPs in lower molecular weight with collagenolytic enzymes, (ii) preparation of keratin fragments frompoultry feathers with a thermophilic bacterium, and (iii) investigation of bioactivity for keratin fragments prepared.

１．緒言

細胞外マトリックスタンパク質は、多細胞動物細胞にとって必須な成分で、動物細胞を外側からひとつずつ包みこむことで細胞の形状保護、内部機能の維持、そして細胞集合体である組織形成を可能にする。このタンパク質はいずれも難分解性動物タンパク質で、コラーゲンが最大成分である。表皮や羽毛等の主成分であるケラチンと共に動物由来の難分解性動物タンパク質では二大成分となっており、産業廃棄物として食品加工産業を中心に、国内だけでも年間 200 万トン以上排出される 1）。これらのタンパク質は、難分解性である上に現段階では付加価値のある再生利用先がなく、再生利用につながる研究も進んで来なかったため、Fig. 1大部分が焼却廃棄処分されている。この２つの主要タンパ

コラーゲン及びその分解物から期待される応用

ク質およびその分解物は、細胞発生・接着、ガン浸潤など生体内での多様かつ重要な役割に関わっていることが研究

温で難分解性動物タンパク質に作用する微生物は病原性にの進展と共に明らかになってきており、その生理作用を維関わるものが多いが、好熱性細菌は至適生育温度を 60℃持する付加価値の高い機能を持った化粧品や食品の基礎材以上に持ち、その恐れがないため安全性の高いツールであ料として再生利用の期待が高くなってきている（Fig. 1）。

る。さらに好熱性細菌由来の酵素タンパク質は、常温由来我々は、自然界から難分解性動物タンパク質を強力に分の酵素タンパク質に比べ格段に安定である。本研究では、解する新規好熱性細菌を独自に単離し、動物組織でもっとこのような利点を生かし、コスメトロジー素材への応用をも多量に含まれるコラーゲンおよびトリ羽毛に含まれるケ検討した。

ラチンに絞った分解に取り組んでいる2−3）。そこでは微生

２．実物本体あるいはこれらが生産する酵素タンパク質を用い、験ルドな難分解性動物タンパク質分解を実施し、これらの再２．
１ コラーゲン分解系酵素群による細胞外マトリックス（コラーゲン）分解と産物の解析

生利用を可能にするための研究を展開している。一般に常コラーゲン分解のため我々が京都市左京区から単離した酸アルカリの過激な分解とは異なる微生物機能によるマイPractical applications for production ofcosmetic materials from animal proteinsby employing microbial enzymes thatspecifically degrade animal extracellularmatrix proteins
Kunihiko Watanabe
Division of Applied Life Sciences, Graduate
School of Life and Environmental Sciences,
Kyoto Prefectural University好熱性細菌 Geobacillus collagenovorans MO-1 株が生産するコラーゲン分解性プロテアーゼ、および Pz- ペプチダー
ゼ（Pz-A、Pz-B）を精製した後に用いた 2）。コラーゲン分解性プロテアーゼはコラーゲンを直接分解するエンドタイプの酵素で、オリゴペプチドへの低分化を調査し、Pz- ペプチダーゼは、コラーゲン特異繰り返し配列（Gly-Pro -Ｘ）を認識し、Gly-Pro の直前で加水分解する特性を用いてさ− 46 −

細胞外マトリックス分解性微生物酵素を用いた動物原料からコスメトロジー素材への実用的アプローチ

らに短いペプチドの調製を検討した。コラーゲン分解は、

３．結果および考察

総体積 2.5 ml（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），5 mM CaCl2, 2.5
mg コラーゲン（豚 Type I））、60℃で適宜コラーゲン分解性プロテアーゼを加え 0 または 4 h 反応を行い、煮沸によ３．
１ コラーゲン分解系酵素群による細胞外マトリックス（コラーゲン）分解と産物の解析

り反応停止した。さらにこの反応溶液に対し Pz ペプチダ

まず単離したコラーゲン分解性好熱菌 G. collagenovoransーゼの添加後、同温度同条件で二次反応を 0 または 3 h をMO-1 株が生産するコラーゲン分解性プロテアーゼを第 1行い、同様に反応停止させた後、遠心分離（10,000 xg, ５段階に用いてコラーゲンペプチドを調製し、さらに２段階min）後の上清をサンプルとした。C18 カラム（逆相（アセ目としてコラーゲンのトリペプチド特異配列を認識し、コトニトリル／水））による高速液体クロマトグラフィー

ラーゲン分解ペプチドをさらに小さく分解する同菌株の２（HPLC）でペプチドの分離・確認、さらに薄層クロマトグ

つの Pz ペプチダーゼによる分解を行い、反応産物の解析

ラフィー（TLC）によりアミノ酸検出を行った。

を行った。

２．２ コラーゲン分解系酵素の１つ、Pz- ペプチダー
ゼ A（Pz-A）の構造解析

ゼにより、HPLC で検出出来るコラーゲン由来のペプチド

G. collagenovorans MO-1 株が生産するコラーゲン分解い溶出時間帯（Fig. 2A）だけでなく、アセトニトリルの割酵素系には特色ある酵素が幾つもあり、その中で特に Pz-合を増加させた溶出画分でも確認された。また、この酵素

ペプチダーゼ（Pz-A）を中心に、そのＸ線による結晶構造の反応物に対し、さらに Pz ペプチダーゼの添加を行った

解析と特異的阻害剤との共結晶複合体のＸ線結晶構造解析ものでもいずれも顕著な増加が見られた。しかし、コラーにより、反応機構の解析を行った。

ゲンのアミノ酸一次配列は、決して単調な繰り返しではな

Fig. 2 に見られるように、コラーゲン分解性プロテアーが増加していることが確認された。これは親水性の高い短いため、極端に多いペプチドフラグメントに収束すること２．３ ケラチン分解産物を用いたコスメトロジー素材の開発はなかった。
続いて、HPLC で溶出されるペプチドを溶出時間によりトリ羽毛はケラチン蛋白質を 90% 以上含むが難分解性10 画分に分け、遊離と酸加水分解後のアミノ酸を TLC でであるため、その分解物のコスメトロジー素材への検討は検出した。その結果、遊離アミノ酸は２つの酵素反応後も行 わ れ て い な か っ た。 神 戸 有 馬 温 泉 よ り 単 離 し た

極めて少ない量しか検出されないものの、酸加水分解後は、Meiothermus ruber H328 株を用いてトリ羽毛ケラチンの分Gly, Pro, Leu, Ala がこの順で顕著に検出された。さらに解系を構築し、この産物の有効利用を検討した。H328 株

ヒドロキシプロリンも著量観察された。このことは、酵素によるトリ羽毛の分解の培養は、60℃で振盪により、YS反応により遊離アミノ酸ではなく、ジペプチド以上の長さ培地（0.5 %（w/v）yeast extract、0.5%（w/v）sucrose）に、のオリゴペプチドに分解され、コラーゲンの成分比で 50%

３％（w/v）トリ羽毛と、特に 0.5 %（w/v）CaCO3 を添加近くを占める Gly, Pro が最も多いことが判った。さらにコ

し 0 − 6 日間培養を行った。この培養液を遠心、濾過後、ラーゲン分子上で翻訳後修飾により水酸化されたヒドロキ

培養上清として得て、アミノ酸分析、MALDI-TOF-MS 解

シプロリンも確認できることから、ヒドロキシプロリン含析などを行った。

有ペプチドも２つの酵素により断片化されることが示された。

２．
４

新素材のコスメトロジー素材としての検討

分解物に対し、化粧品、薬品、薬品素材としての価値を検

３．２ コラーゲン 分解 系 酵 素：Pz- ペプチダーゼ A4）(Pz-A) の構造解析証するため、２．２でトリ羽毛ケラチン分解物に対し、（i）G. collagenovorans MO-1 株が生産するコラーゲン分解抗菌活性、（ii）抗酸化、酸化抑制効果、（iii）上皮細胞増殖

酵素系の中で、特に Pz- ペプチダーゼ（Pz-A）について、活性化因子について効果を調査した。

そのＸ線による結晶構造解析と特異的阻害剤との共結晶複微生物由来の細胞外マトリックス分解性酵素群を用いた合体のＸ線結晶構造解析により、反応機構の解析を行った。

２．
５

ケラチン分解酵素の各種薬剤に対する耐性調査

これまで、コラーゲンまたはコラーゲン分解物であるコ

M. ruber H328 株が生産するケラチン分解酵素を、細胞ラーゲンペプチドを、コラーゲン分解性酵素に添加して共培養液から抽出し、各種薬剤（界面活性剤、有機溶媒など）結晶構造を解析したものは報告されていなかった。そこでに対する耐性を、60℃で処理し、その残存する活性を測定

コラーゲン特異配列 Gly-Pro を２回も含む Gly-Pro-（L,D）

することで調査した。

-Phe（PO-Gly-Pro-Nle を阻害剤に用いて、その共結2CH2）晶構造の解析を行い、反応機構解析を行った。

− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

Fig. 2 コラーゲン分解物の逆相クロマトグラフ (A. 1.5-4 min 溶出 ; B, 12-21 min 溶出 )− コラーゲン分解性酵素反応 0 h、− 同 4 h, − Pz-A 反応 0 h、− 同 3 hFig. 3 Pz- ペプチダーゼＡの結晶構造 4)
α へリックスをねじ状コイル、β ストランドを矢印で表示した。中央のボールは活性中心の亜鉛原子を、活性中心には阻害剤 Gly-Pro-（L,D）-Phe（PO2CH2）-Gly-Pro-Nle を含んだ複合体結晶となっている。

まず本酵素は、ほ乳類の類似酵素 thimet oligopeptidase

ように本酵素は基質が入り込むための顕著な溝はなく、球（TOP）とは、二次構造的には多くの類似点を有していな状タンパク質の形状を取る。さらに、共結晶に用いた阻害がら、全体構造としては、大きく異なることが分かった。

剤の構造から、側鎖を持たない Gly 残基と a 水素を持たな

TOP は、共にメタロペプチダーゼ M3 に属する酵素でありい Pro 残基を活性中心にはめ込むために、他の残基は入りながら２枚貝様の構造をしているのに対し、Fig. 3 に示す込めない立体構造をとることをつきとめた。そして、コラ− 48 −

細胞外マトリックス分解性微生物酵素を用いた動物原料からコスメトロジー素材への実用的アプローチ

ーゲンペプチドの入口と出口を、基質の通るトンネル構造質に変換されたりすることのないことが示された。

を明らかにすることによって特定した。これらの構造は、この他、ブロイラー鶏の白色羽毛に対しても同様の分解

今後コラーゲンペプチドの酵素合成に有用な知見を与える反応を調査したところ、地鶏羽毛と遜色なく分解することものと期待できる。

が判った。

３．３ Meiothermus ruber H328 株を用いたトリ羽毛の液化分解羽毛の構造変化を観察したところ、著しい羽毛構造崩壊が我々は、兵庫県神戸市にある有馬温泉から、難分解性タン着が観察され、この吸着が羽毛分解に効果的であることがパク質であるエラスチンを積極的に分解する M. ruber示唆された。

さらに、走査型電子顕微鏡により培養 12 日間にわたる培養と共に確認された。また、H328 株菌体の羽毛への吸H328 株を単離している。この菌株は、グラム陰性、好気性、培養濾液中に含まれるペプチド成分として、トリ羽毛ケ無胞子で、赤色の色素を生産し、至適生育温度と pH を、ラチンから得られる中間生成物を調査・解析するため、0それぞれ 50−65 ℃そして pH 7.5−10 付近にもつ桿菌である。

− 6 日間の培養濾液サンプルに対し、産業技術総合研究所

Thermus 属細菌と近接する 16S rRNA を有するが、生育関西センターの協力を得て、MALDI-TOF-MS 解析を行っ温度でやや低い温度帯を持つことが特徴である。これまでた。培養とともに、培養スタート時には見られなかった分

Meiothermus 属細菌には、強力なプロテアーゼ活性やトリ子量 1000 以下のシグナルが見られた。しかし、特異なバ羽毛ケラチン分解を報告されているものはない。

ンドが見られることはなく、アミノ酸レベルにまで分解さトリ羽毛は、方法に記されている培養により、６日間でれるものも少なくないことが判った。その中で、分子質量ほぼ原形を留めることなく分解され泥状の形状になった656 付近のバンドが培養と共に上昇していることを見いだ（Fig. 4）。これを濾過により濾液と残渣に分け、濾液成分し、これをトリ羽毛ケラチンのプロテインデータベースでのアミノ酸・ペプチド量とアミノ酸組成を分析した。アミ

検索を行ったところ、Ser-Ala-Pro-Thr-Pro-Leu-Ala というノ酸組成については遊離アミノ酸、加水分解アミノ酸組成配列である可能性が最も高いことが判った。今後、これ以を㈶日本食品分析センターに分析依頼し、プロテインデー外のケラチン断片の単離を試み、大量生産の可能性を追究

タベースにあるトリ羽毛ケラチンタンパク質のアミノ酸組したい。また、実用的な分解への応用として、家庭用ゴミ成比と比較し、よく近似した値が得られた。6 日間培養後処理機を用いたトリ羽毛の分解促進も可能であることを示の培養濾液中の遊離および加水分解アミノ酸が培養に伴いしている 5）。

大きく増加した。加えて、培養上清 100 g あたりの遊離総アミノ酸が 432 mg、加水分解総アミノ酸が 1730 mg に達していることが判り、培養上清に含まれるアミノ酸が、羽毛分解に基づくこと、培地に添加した羽毛ケラチン重量の３．４ トリ羽毛分解物の生理活性検索分解系の検討に引き続きトリ羽毛分解物の生理活性を検討した。

14.4 %、57.7 % が、アミノ酸またはペプチドとして可溶化

まず H328 株の 2, 4, 6 日間培養後の培養濾液を用いて、したことを示した。また培養濾液には、羽毛に多く含まれEscherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus

る Ser、Gly、Val が遊離アミノ酸として比較的多く存在しoryzae の３菌株に対し、ペーパーディスクに培養濾液を加ており、トリ羽毛ケラチンが H328 株の生産するプロテアえ、成育阻害を調べることにより抗菌活性試験を行った。

ーゼにより分解され、この菌株により資化され他の化学物

しかし 100 倍希釈までのものには有意な成育阻害・抗菌活Fig. 4 Meiothermus ruber H328 株によるトリ羽毛の分解。培養前（左図）と 60℃ , ６日間培養後（右図）の培養液。

− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011性は検出できなかった。

Table 1

ケラチン分解酵素の各種薬剤に対する耐性調査

さらに、トリ羽毛ケラチンが皮膚細胞へ正の効果を持つ可能性を調査するため、H328 株の 0 および 10 日間培養後の培養濾液を正常ヒト線維芽細胞（NHDF）に加え、[3H]thymidine の取り込みを測定することにより細胞増殖効果を調べた。0.03 % および 10−5 % 添加したサンプルが、コントロールに対し 30 ないし 60 % 程増殖効果を示した結果が得られたが、添加量に呼応した dosage effect が見られず、
また 0 日培養濾液と有意な差が見られなかったため、本サンプルに含まれるトリ羽毛分解成分に NHDF 細胞増殖に効果があるものは見いだせなかった。
過酸化水素によるラット PC12 細胞死誘導に対して、予備実験からトリ羽毛から高温高圧加工された feather mealのケラチン分解産物に弱い抑制効果が認められた。そこでトリ羽毛の直接分解物を含む培養濾液の効果を検討した。
40 倍希釈系列にすることにより、過酸化水素に対する効果は認められなかった。また、培養濾液で 24 h 細胞を前処理した後、過酸化水素を加えてさらに 24 h 培養後、MTT法で生細胞数を測定する系についても検討を行った。しかしながら、前処理することにより培養濾液での細胞毒性が強く認められ、過酸化水素に対する効果を見いだせなかった。予備実験では、同じ PC12 細胞で細胞毒性は認められ４．今後の実用化への展望ておらず、10 倍希釈でも効果が認められている。再び今
度は 20 倍希釈で検討したが、培養濾液に含まれる成分が難分解性動物タンパク質を分解する特異な好熱性細菌を細胞毒性を示すと考えられた。このことからトリ羽毛分解単離し、これらがもつ分解系酵素群の生化学的性質を基礎物の細胞死誘導に対する抑制効果を認めることは出来なかに、細胞外マトリックスの分解生成物から化粧品等の素材った。

開発へ目を向け、検討を行った。今回の研究ではまだその端緒に着いたばかりで、今後より多様な生理活性の調査・

３．
５

ケラチン分解酵素の各種薬剤に対する耐性調査検討、再利用先の開発・追究が必要である。また化粧品素M. ruber H328 株は、トリ羽毛を含む培地で培養すると材に応用可能な難分解性動物タンパク質として、廃絹分解著量のケラチン分解酵素を生産する。この培養液から硫安物の検討も行っており 6）、今後継続していく計画である。

分画で酵素を集めてくると、すでにかなりの精製度を持っ本酵素群が産業廃棄物である難分解性動物タンパク質の分たケラチン分解酵素が調製できる。このケラチン分解酵素

解・リサイクルのためのツールとして応用可能になれば、は、すでに強力な界面活性剤でタンパク質変性剤でもある我々の提唱する「リサイクルバイオテクノロジー」の意義SDS に対して、驚異的な耐性を有していることを見出しては益々大きいものとなる。

いる。そこでその他の各種薬剤（界面活性剤、有機溶媒など）

５．謝に対する耐性を、60 ℃で処理し、その残存する活性を測定することで耐性を調査した。

辞本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団から基本的に 60℃での処理も、常温処理に比べ相当過酷な御援助賜りましたこと深く感謝申し上げます。

条件である。それにも増して、界面活性剤（Triton X100,Tween 20, CTAB）と有機溶媒（メタノール、エタノール、（参考文献）

ブタノール、アセトン、アセトニトリル、DMSO, ベンゼン、

１）Suzuki, Y., Tsujimoto, Y., Matsui, H., Watanabe, K.

エチル酢酸、クロロフォルム）に対して、30 − 60% の高濃“Decomposition of Extremely Hard-to-Degrade Animal

度で 30 min 以上、中には 16 日以上活性を保ち続けるといProteins by Thermophilic Bacteria”J. Biosci. Bioeng.,

うことが判った。このような耐性を示すプロテアーゼは、

102, 73-81 (2006)報告例がない。今後、なぜこれほどに耐性なのか、その機

２）Miyake, M., Shigeri, Y., Tatsu, Y., Yumoto, Y.,

構解明を進めると共に、応用面への検討を加えていきたい。

Umekawa, M., Tsujimoto, Y., Matsui, H., Watanabe,− 50 −

細胞外マトリックス分解性微生物酵素を用いた動物原料からコスメトロジー素材への実用的アプローチ

K. “Two thimet oligopeptidase-like Pz peptidases

Reaction Mechanism of Bacterial Pz Peptidase A

produced by a collagen-degrading thermophile

Toward Collagenous Peptides”J. Biol. Chem., 285,

Geobacillus collagenovorans MO-1.”J. Bacteriol., 187,34972-34980 (2010)５）Shigeri, Y., Matsui, T., Watanabe, K.“Decomposition

4140-4148 (2005)
３）Matsui, T., Yamada, Y., Mitsuya, H., Shigeri, Y.,

of Intact Chicken Feathers by a Thermophile inYoshida, Y., Saito, Y., Matsui, H., Watanabe, K.

Combination with an Acidulocomposting Garbage-“Sustainable and Practical Degradation of Intact

Treatment Process.”Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,

Chicken Feathers by Cultivating a Newly Isolated

2519-2521 (2009)

Thermophilic Meiothermus ruber H328.” Appl.

６）Suzuki, Y., Matsui, H., Tsujimoto, Y., Watanabe,K.“Enzymatic Degradation of Fibroin Fiber by aMicrobiol. Biotechnol., 82, 941-950 (2009)４）Kawasaki, A., Nakano, H., Hosokawa, A., Nakatsu,
T., Kato, H., Watanabe, K.“Exquisite Structure andFibroinolytic Enzyme of Brevibacillus thermoruber
YAS-1. J. Biosci. Bioeng., 108, 211–215 (2009)− 51 −