STQ法の固相カートリッジによる精製効果について

QuEChERS法とSTQ法の違い（分配型と分配分離型。それぞれの固相抽出法）

分配型-固相抽出法

分配分離型-固相抽出法（QuEChERS法）（STQ法）
夾雑物 農薬1000 10

液相固相

夾雑物 農薬液相 2008

固相 8002液相固相
夾雑物：1000

農薬：10

分散SPEは分配のみによる精製だが、固相カートリッジは分配に分離機能が加わるため夾雑物から農薬を効率よく精製することができる。
2

C18精製によるLC分析カラムの負担軽減★アセトニトリル濃度による精製効果の違い❑ 固相C18を用いない場合
ACN：水（5:95）

ACN：水（95:5）

グラジエント分析
夾雑物（極性）

100%ACN（無極性）❑ 固相C18による精製の場合
夾雑物（極性）＜C18ミニカラム
による精製効果80%ACN/水C18による除去成分●低極性の夾雑物 ●高級脂肪酸エステル●緑色素を除去。
メリット● HPLCカラムの劣化を防ぐ● ピーク形状の維持● 分析時間の短縮
3グリホサート・グリホシネートの分析法の検討

構造と物性グリホサート：Glyphosate
化学式：C3H8NO5P
分子量：169.1

LogPow=＜-3.2(pH2-5，20℃)
pKa=5.77±0.03、2.18±0.02(20±0.2℃)

グルホシネート：Glufosinate
化学式：C5H12NO4P
分子量：181.1
LogPow：アンモニウム塩のLogPow：＜0.1(pH7、22℃)
pKa1＜2、pKa2＜2.9、pKa3＜9.8

前処理のフロー抽出
試料10ｇ（ 穀類 5g + 水10mL)
添加 メタノール-水(1/1) 25ｍL
振とう

分取液 0.5mL
添加 アセトニトリル 1mL

10min

振とう 1min

遠心分離 10min
上清除たんぱく（検討中）

高速遠心分離 14000rpm 3min

残渣
添加 メタノール-水 (1/1) 20mL振とう 10min
遠心分離
上清50mLに定容

10min

抽出液

前処理フロー【コンディショニング】

PBX-10㎎＋SCX-30㎎＋PSA-50㎎
添加

①アセトン

②メタノール-水(1/9) 2mL

水２mL

負荷[保持] 抽出液 全量 (試料0.1g相当)
洗浄2mL※リザーバー内で水と混合

メタノール-水(1/9) 1mL

PBX-10㎎ （PBXとSCXを取り外しPSAのみにする）
溶出

0.14%アンモニア水 0.9mL

添加 10%ギ酸 15µL

定容(1mL)水で調整

精製工程

GLY

GLU

それぞれの固相の機能と役割①PBX-10mg

GLY・GLU

脂質など低極性夾雑物を吸着して除去②SCX-30mg（陽イオン交換）陽イオン夾雑物を吸着して③PSA-50mg（陰イオン交換）

グリホサート・グリホシネート（リン酸,カルボニル基：⊖）をPSA（アミノ基：⊕）で保持除去

溶出③PSA-50mg（陰イオン交換）
0.14%アンモニア水

塩基性水溶液を通液することで、PSAの官能基（アミノ基）を非解離とし、グリホサートのイオン結合を切り離す

GLY・GLU
8測定条件装置：UHPLC(Nexera X2)及びLCMS-8045 (島津製作所)
分析カラム：TSKgel

SuperIC-AP (4.6mmID×75mm) （４級アミン基）移動相：(A) 2mMギ酸アンモニウム-水(B) 0.2％ギ酸-水(pH2-3)

流速：0.8mL/min.
注入量：2μL
カラム温度：40℃
分析時間：17分
グラジエントプログラム：
B.Conc 20％(0.5min)→95％(2-9min)→5％(10-13min)→20％(14-17min)
MRM:pos

LC配管のリン酸コーティング方法と注意点
リン酸コーティング
プローブとエレクトロードを引き抜いた状態で、2%のリン酸を0.05mL/minで12時間通液する。
（絶対にリン酸をMS部に導入しないでください）※石渡氏（ホクレン農業協同組合）の資料より。

当該方法をお試しの前に、まずは、ご使用のLC-MS/MSメーカーにグリホサート測定条件のご確認をお勧めいたします。メタルフリーの配管等が販売されている可能性があります。
リン酸コーティングをお試しの際は、分析カラムを外してください。コーティング後は、水および測定移動相を2時間程度送液し、流路系からリン酸を除いてください。
コーティングの効果は数カ月以上維持を確認しております。（当社使用装置の場合）
10

LC-MS/MS測定
LC配管のリン酸コーティングについて

LC流路にグリホサートのリン酸基が吸着し、感度低下、ピークがブロード

リン酸コーティング
流路をリン酸コーティングすることで、吸着が抑制され、感度上昇、ピーク形状改善

誘導体化せずにLC-MS/MS測定可能となった
11

固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC/MSシステムの紹介メタボロミクスの現状

13固相誘導体化法
STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

試料負荷＆保持洗浄

脱水／１分

誘導体化／２分

溶出

アミノ酸と有機酸をイオン交換相互作用により固相に保持

水-ACNで固相に残存している非イオン性化合物を除去

ACN で 固 相 に 残 存 している水分を除去

誘導体化試薬を固相に含侵させて、目的成分を固相中で誘導体化

試料

水-ACN

ACNMSTFA-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝-SO3 ⊝-N ⊕アミノ基⊕NH3-R
カルボキシル基-N⊕⊝OOC-R(CH3)3(CH3)3-N ⊕-N⊕
(CH3)3(CH3)3⊝ OOC-R

非イオン性化合物-N ⊕-N⊕(CH3)3(CH3)3H2O⊝ OOC-R-N ⊕ヘキサン

TMS-NH-R-N⊕(CH3)3
TMS-OOC-R(CH3)3-SO3 ⊝-N ⊕-N⊕
(CH3)3(CH3)3
R-NH-TMS
R-COO-TMS

特許登録：（株）アイスティサイエンス

14従来法と本法の前処理比較
◼ 従来法

◼ 本法
血清 50µL

血清 50µL

添加：H2O/ACN 1000µL

添加：MeOH/H2O/CHCl3 1000µL
振とう抽出（37℃, 30分）

振とう抽出（37℃, 30分）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

１ 時間

分取：上澄み 600µL

添加：超純水 250µL

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

精製

バイアル
装置にセットしてスタートボタンを押すだけ！

0.5 時間オンライン固相誘導体化SPE-GC-MS

減圧濃縮遠心分離（1600rcf, 4℃）

脱水

凍結：液体窒素
凍結乾燥（一晩：16時間）

１ 時間

分取：上澄み 250µL

添加：超純水 300µL

分取：上澄み 400µL（MeOH/水の混液）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

自動前処理時間

10～15 分SGI-M100

17 時間誘導体化試薬添加
メトキシアミン/ピリジン溶液 100µL
誘導体化反応（30℃, 90分）

誘導体化反応（37℃, 30分）

誘導体化

遠心分離（1600 rcf, 4℃, 3分）

3 時間

誘導体化試薬添加：MSTFA 50µL

分取：上澄み 100µL

→

バイアル

測定：GC/MS：注入1µL（スプリット 25:1)

試料
負荷40µL

精製
脱水

誘導体化

LVI-S250
Spiral Insert
スプリット 50:1

GC-MS

15

SPE-GC-MS system16

本法による標準溶液のSCANトータルイオンクロマトグラム

Fig. 3. The SCAN total ion chromatogram of standard solution using SPE-GCMS system with automated SPE-based derivatization method.
＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL

17本法による標準溶液の再現性
Table 1. Reproducibility of peak area with standard solution using SPE-GC-MS system.
No.
12345678910111213141516
17181920212223242526272829

CompoundAlanine-2TMS
Valine-2TMS
Phosphate (3:1)-3TMS
Norleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Proline-oxo-2TMS
Cytosine-2TMS
Aminobutyric acid-3TMS
Ketoglutaric acid-3TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Asparagine-3TMS
Putrescine-4TMS
Aconitic acid-3TMS
Citric acid-4TMS
Ornithine-4TMS
Adenine-2TMS
Lysine-4TMS
Tyrosine-3TMS
Guanine-3TMS

1
2,780,202
3,231,804
1,980,261
3,860,754
3,166,213
3,326,569
2,170,649
3,020,526
1,768,634
2,012,774
1,040,407
485,209527,945
1,317,135
1,972,283
1,164,055
1,903,218
179,954
486,088
1,553,897
264,587
1,097,163
1,068,411
2,509,279
948,801
1,791,455
438,332
2,290,304
1,276,608

2
2,814,678
3,290,271
1,945,488
3,995,800
3,281,486
3,445,278
2,352,541
3,101,538
1,813,725
2,110,285
1,085,291
496,725
521,172
1,376,552
2,178,513
1,199,619
2,080,359
187,293482,193
1,642,952
293,568
1,143,662
1,095,208
2,585,329
1,074,181
1,859,990
487,673
2,415,910
1,325,553

32,805,838
3,270,689
1,842,146
3,961,145
3,263,756
3,452,215
2,219,378
3,047,906
1,790,816
2,078,505
1,075,400
505,695
605,941
1,320,877
2,188,232
1,211,399
1,832,270
167,292
528,880
1,616,874
269,785
1,022,892
1,085,018
2,551,370
928,962
1,930,628
411,966
2,339,399
1,372,469

42,570,446
2,966,049
1,762,489
3,572,341
2,942,720
3,055,493
2,118,024
2,891,328
1,626,601
1,857,176
963,085
464,603439,870
1,165,099
2,213,001
1,081,564
1,718,333
138,034
375,004
1,422,103
215,342
1,069,833
973,865
2,326,885
889,675
1,670,688
389,2632,070,195
1,201,496

5
2,663,543
3,107,653
1,746,163
3,750,253
3,112,611
3,264,503
2,229,077
2,874,284
1,697,384
1,969,420
1,019,290
471,484
548,152
1,233,662
2,171,464
1,154,429
1,911,954
169,160
494,429
1,528,499
260,091
1,140,680
1,026,875
2,437,909
963,445
1,831,552
423,849
2,220,032
1,273,918＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL

62,676,876
3,132,760
1,658,840
3,798,730
3,105,804
3,272,235
2,288,729
2,677,718
1,608,388
1,978,512
1,028,004
446,942
689,805
1,299,449
2,218,260
1,179,900
1,983,878
156,600
585,775
1,564,042
264,791
1,218,672
1,009,638
2,410,546
1,025,487
1,839,583
469,2632,300,204
1,292,009

7
2,632,581
3,054,963
1,585,771
3,712,869
3,057,182
3,230,054
2,328,562
2,840,826
1,635,905
1,918,379
988,509451,563
622,430
1,267,142
2,414,150
1,130,354
1,952,195
151,045
510,207
1,507,985
258,735
1,113,605
1,007,640
2,372,287
1,049,537
1,690,694
485,851
2,231,995
1,214,782

8
2,692,127
3,085,131
1,679,471
3,729,371
3,062,330
3,247,932
2,291,359
2,917,558
1,710,549
1,950,455
997,181459,884
590,812
1,274,606
2,348,929
1,140,346
1,884,295
147,256
483,426
1,508,373
249,746
1,075,243
1,025,144
2,395,838
1,005,050
1,722,793
449,843
2,184,577
1,217,067

Ave.
9
RSD, %
2,718,118 2,706,045
3.0
3,160,769 3,144,454
3.4
1,991,253 1,799,098
8.3
3,834,508 3,801,752
3.4
3,129,208 3,124,590
3.4
3,297,886 3,288,018
3.6
2,432,007 2,270,036
4.3
3,180,044 2,950,192
5.2
1,825,272 1,719,697
4.9
1,968,792 1,982,700
3.9
1,024,209 1,024,597
3.8
497,251475,484
4.5
358,848544,997
18.3
1,279,034 1,281,506
4.6
2,386,591 2,232,380
6.1
1,191,227 1,161,433
3.5
2,036,145 1,922,516
5.6
178,112
163,861
10.1
320,272
474,03016.8
1,520,941 1,540,630
4.2
263,337
259,998
7.9
1,130,409 1,112,462
5.0
1,085,668 1,041,941
4.1
2,470,814 2,451,140
3.5
1,047,923
992,5626.3
1,876,276 1,801,518
5.0
475,516
447,9517.8
2,239,834 2,254,717
4.4
1,316,201 1,276,678
4.518野菜ジュースのトータルイオンクロマトグラム

19ビール14製品のメタボローム分析の結果

ビール類：
各メーカー各種類の14製品

リキュール：
生ビール：
生ビール：プレミアム
生ビール：プレミアム
生ビール：プレミアム
生ビール：
生ビール：
生ビール：
醸造酒：
発泡酒：
生ビール：
リキュール：
発泡酒：
リキュール：

代謝成分

ブルーチーズ3種のSCANトータルイオンクロマトグラム比較
有機酸系（短鎖脂肪酸、ジカルボン酸類）誘導体化試薬：MTBSTFA
試料：ブルーチーズ３種

C

12345789112122242526272829

B

A

Methanoic acid-tBDMS
Ethanoic acid-tBDMS
Propanoic acid-tBDMS
Butanoic acid-tBDMS
Pentanoic acid-tBDMS
Heptanoic acid-tBDMS
Lactic acid-2tBDMS
Octanoic acid-tBDMS
Succinic acid-2tBDMS
Decanoic acid-tBDMSDodecanic acid-tBDMS
Tetradecanoic acid-tBDMS
Aspartic acid-3tBDMS
Glutamic acid-3tBDMS
Hexadecanoic acid-tBDMS
cis-9-Octadecenoic acid
Stearic acid-tBDMS

21