化粧品による皮膚かぶれを防ぐ菌類成分の探索
千葉大学

藤

本

薬学部

治

宏

In order to protect a person from allergic skin inflammation caused by some cosmetics, survey to discover new fungal immunosuppressive constituents which are helpful to induction of immunotolerance against such allergy, was executed in the use of more than
170 Ascomycetous fungi. On the survey, it was found out that Gelasinospora multiforis, G.heterospora, G.longispora, G.kobi,
Diplogelasinospora grovesii, and Microascus tardifaciens produced appreciably immunosuppressive constituents. Solvent partition
followed by repeated chromatographic fractionations of crude extracts obtained from the six fungi under the guidance of bioassay totest suppressive activity against proliferation of mouse splenic lymphocytes stimulated with mitogens afforded many immunosuppressive
features. Namely, nine new 2-pyrones named multiforisins A-I from G.multiforis, some of the multiforisins together with a known
metabolite sordarial from both G.heterospora and G.longispora, a novel bicyclic sesterterpene named kobiin and three new 2-furanones
named kobifuranones A-C from G.kobi, two known metabolites macrophin and colletodiol together with a new stereoisomer ofcolletodiol named 10-epi-colletodiol from D.grovesii, and six known metabolites, questin, rubrocristin, cladosporin（asperentin）,
cladosporin 8-O-methylether, 5,7-dihydroxy-4-methylphthalide and asperflavin, together with two new 2,5-dioxopiperazines named
tardioxopiperazines A and B from M.tardifaciens, were isolated as immunosuppressive features on this study. It was further examined
whether interleukin-2（IL-2）recovered proliferative suppressions of the lymphocytes caused by eight sample compounds, which wereselected from these immunosuppressive constituents isolated this time from fungi, or not. It has been shown up to now that IL-2 has notrecovered proliferative suppressions of the lymphocytes due to the eight compounds, indicating that they have not inhibited biosynthesis
of IL-2.

１．緒なって都合が良い。本研究では、この様な目的に合う新し言い免疫抑制物質を天然素材から探索することを目指した。

化粧品により皮膚かぶれ（皮膚の炎症）を起こす人が時

探索対象の天然素材としては、既に、いくつかの免疫抑に見られる。この様な皮膚かぶれは、多くの場合、化粧品

制成分が得られて実績がある菌類を考えたが、これまで得中に存在する生体にとって異物の成分（抗原、
アレルゲン）られたものの多くが不完全菌や放線菌から見出されたものに対し、生体が過剰に免疫応答して起きたアレルギ−であであったため、今回は、新しいタイプのものを見出そうと、る。化粧品による皮膚かぶれを防ぐ方法の一つとして、化

従来、比較的成分研究例が少なかった子嚢菌を選んだ。生粧品に対し免疫寛容を誘導することが考えられる。もし、体がアレルゲンの侵入に対し発動させる細胞性、体液性免化粧品中の特定のアレルゲンに対する免疫寛容を誘導でき

疫の一連の免疫応答の開始過程であるアレルゲン刺激によれば、皮膚かぶれを起こさずに化粧品を安全に使えること

る T、B 細胞活性化の in vitro モデルとされるマイトゲンになる。免疫寛容の誘導には、免疫抑制剤を緩和に使用し刺激による T、B 細胞幼若化（増殖）に対する抑制活性（LTてアレルゲン特異的な IgE 抗体の生産を低下させておきな活性）を指標として、これまでに 170 余種の子嚢菌につきがら、生体を徐々にアレルゲンへ曝し、長時間かけて生体検索を行った。その結果、多数の新化合物を含む免疫抑制をアレルゲンへ馴化させて行く方法が考えられる。この際活性成分を見出した。しかしながら、LT 活性には、一般使われる免疫抑制剤には、個々の体質による適不適がある

的な細胞増殖抑制活性も含まれることがある。そこで、検ため、色々な体質の人向けに様々なタイプのものが準備さ体化合物が免疫担当細胞へ特異的な抑制活性を有するか否れていることが望ましい。化粧品による皮膚かぶれに対すかを調べる方法の一つとして、今回、活性化 T 細胞から分る免疫寛容の誘導の様な目的に相応しい免疫抑制剤は、臓泌されて T 細胞の増殖、細胞障害性 T 細胞や B 細胞の活性器移植や骨髄移植などに際して用いられるcyclosporin Aや化などを誘導するリンホカインである interleukin 2（IL- 2）

tacrolimus（FK506）の様な強力なものよりも、作用が比較の存在が、検体によるリンパ細胞増殖抑制を取り止めさせ的緩和なものの方が副作用も少なく長期間の使用も可能とるか否かを in vitro で試験する方法を採用し、本研究で得Search for Fungal Constituents to Protect
a Person from Allergic Skin Inflammation
Caused by Cosmetics

られた免疫抑制活性成分中の主なものへ適用してみた。これらの研究結果について、以前の関連研究における結果も含めて以下に述べる。

Haruhiro Fujimoto
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Chiba University

２．実
２. １

験

LT 活性検索用子嚢菌脱脂画分の作製

精白米培地 200 g をいれたルー培養瓶を高圧滅菌し、子− 17 −

嚢菌を接種して、25℃暗所で、時々振り混ぜながら、静置

中圧カラム、高速液体カラム、薄層などによるクロマトグ

培養を、各菌の生育状態により 10 − 30 days 行った。LT 活

ラフィ−を適宜用いて、分画精製を繰り返し行ない、更に性検索には、各菌当り精白米培地 800g（ルー瓶４本）を再結晶等によって精製して、各菌の活性成分を単離した。

用いて行ない、培養終了後、かび米へ AcOEt 1 . 2 L を加え、室温振盪抽出 5 hr を 2 回繰り返して行ない、抽出液を減圧

２. ４

活性成分の構造解明

溶媒留去して、AcOEt エキスを得た。次に、同エキスへ n単離された各菌の活性成分については、mp、[α] D、各−hexane 5 − 10 mL を加え、超音波処理により n−hexane 可種呈色反応、溶解性等の物性を測定し、如何なるタイプの溶成分を溶解させて除去し、n−hexane 不溶性の脱脂画分

化合物であるかを推定し、更に、1 H-NMR、13 C-NMR、IR、を得て、この脱脂画分を LT 活性検索用検体とした。

UV、MS（低分解能の EI-MS、FAB-MS、高分解能の EIMS、FAB-MS）、CD スペクトルを測定して検討した。特２. ２

LT 活性試験に NMR で は、 通 常 測 定 の ほ か に、spin-decoupling

マウス（BALB/C、雄、７− 11 週齢）の脾臓由来リンパ1

H-NMR、NOE 1 H-NMR、二次元の 1 H- 1 H シフト相関

細胞のマイトゲン刺激増殖に対する検体の抑制活性を試験（COSY）、1 H- 13 C シフト相関（HMQC）、1 H- 13 C 遠隔シフした。マイトゲンとしては、T 細胞には concanavalin A

ト相関（HMBC）スペクトルを測定し検討した。その結果、（Con A）を、B 細胞には lipopolysaccharide（LPS）を用

活性成分が既知化合物と推定された場合は、その文献記載

いた。活性の測定には、リンパ細胞をマイトゲン、検体との各種物性やスペクトルデータとの比較を行って、標品が共にマイクロタイタープレートの well 内で、37℃、５％入手可能なら直接比較して同定した。活性成分が新化合物

CO 2 存在下、48 hr 培養した後、[methyl- H]thymidine をと推定された場合は、各種スペクトルデ−タの詳細な検討、培地に添加し、更に 22 hr 培養した際にリンパ細胞中に取誘導体の作製、或いは、X 線解析（10 - epi- colletodiol の場合）り込まれる 3 H 放射能から、細胞増殖抑制率を算出する 3 H

等を適宜用い、化学構造を解明した。

3

標識法（実験の詳細は既報

１）参照）か、又は、上記マイ

クロタイタープレートで培養を 72 hr 行った後、MTT[ 3 -２. ５

免疫抑制活性が IL-2 の存在により拮抗される（4 , 5 -dimethylthiazol- 2 -yl）- 2 , 5 -diphenyltetrazolium

か否かを調べる実験

bromide] を培地に添加し、更に 4 hr 培養した際に、リンリンパ細胞溶液は２. ２の際と同様に作製し、マイトゲ

パ生細胞の mitochondria 内膜中の呼吸鎖関与酵素により

ン と し て は、Con A の 代 わ り に ionomycin と phorbol

MTT が還元されて生成する MTT-formazan の量を 57 nm

12 -myristate 13 -acetate（PMA）を用いた。活性の測定は、で比色定量し（対照波長 630 nm）、細胞増殖抑制率を算出

リンパ細胞をマイトゲン、検体と共にマイクロタイタープ

する MTT 法（実験の詳細は既報２）参照）か、いずれかのレートの well 内で LT 試験に類似した方法で培養して進め方法を用いた（ H 標識法での算出値と MTT 法での算出値られるが、IL- 2 生合成阻害の有無を調べるために、培地はほとんど同じであった）。171 種の子嚢菌の一斉 LT 活性に IL- 2 を添加して培養する実験と添加しないで培養する

検索では、各検体は 50、10、2 . 0、0 . 4 µg/mL の濃度にお実験を常に平行させて行う。培養は 37℃、５％ CO 2 存在下、いてそれぞれ triplicate で活性を測定した。

48 hr 培養した後、MTT を培地に添加し、更に４hr 培養し3た後、MTT が還元されて生成する MTT-formazan を比色２. ３

活性成分の単離

定量し、IL- 2 を添加した場合と添加しない場合のリンパLT活性検索で、濃度依存性を示す高い活性を示した菌の細胞増殖抑制活性を比較し、検体による細胞増殖抑制が、中で、活性成分が未解明と考えられた菌については、精白培地への IL- 2 添加により拮抗されるか否かを試験した（実米培地 20 − 60 kg（ルー瓶 100 − 300 本）を用い、２. １と同

験の詳細は既報２）参照）。

様の条件で大量培養を行った。培養終了後、AcOEt 30 −３．結果と考察90 L を用いて室温振盪抽出５hr を２回繰り返して行ない、
抽 出 液 を 減 圧 溶 媒 留 去 し て、AcOEt エ キ ス を 得 た。

３. １

子嚢菌の LT 活性検索と LT 活性子嚢菌からのAcOEt 抽出エキスをn−hexane-AcOEt（１:１, v/v）を用いて免疫抑制活性成分の単離

n−hexane可溶部と不溶部に分け、n−hexane 不溶部は、更に、

当研究室保存の子嚢菌中、不整子嚢菌綱（Plectomycetes）

AcOEt-H 2 O（１:１）を用いてAcOEt可溶部とH 2 O可溶部に分に 属 す るEmericella 属 13 種、Eupenicillium 属 16 種、けた。n-hexane、AcOEt、H 2 O可溶部につき、LT 活性を試験

Eurotium属 16 種、Hemicarpenteles属３種、Neosartorya属５種、したところ、AcOEt可溶部に活性が集約したので、AcOEt可Talaromyces属４種など、並びに核菌綱（Pyrenomycetes）に溶部を、更にLT活性を指標にしながら、順相のsilica gelや属するChaetomium属５種、Gelasinospora属 20 種、Microascus

逆相のoctadecyl silica gel（ODS）を用いたオ−プンカラム、

属３種、Thielavia属４種などこれまでに合計 171 種につき、− 18 −

化粧品による皮膚かぶれを防ぐ菌類成分の探索

リンパ球幼若化抑制活性（LT 活性）の有無を検索した。

り、multiforisin G-I（7 - 9）（Fig. １）と命名された。なお、

その結果、濃度依存性の高い活性を示した菌は 38 種も見

同菌からは、Sordaria macrospora から単離されていた出されたが、それらの中で、新しい免疫抑制活性成分の単

sordarial（10）３）（Fig. １）も活性成分として得られたが、離を目的として、これまで系統立った成分研究が比較的行

側鎖の絶対配置が未定であったので、絶対配置を（3 ' R ,なわれていない属に分類される菌からの系統的な活性本体

4 ' S）と決定した。なお、10 に免疫抑制活性が知られたのの解明を目指した。今回は、その様な菌の中から、核菌綱は 今 回 が 初 め て で あ る。7 - 9 に つ い て は、 そ の 後 G.

の Gelasinospora multiforis、G.heterospora、G.longispora、

multiforis からも得られた。G.longispora からも 1 , 7 - 9 並

G.kobi、Diplogelasinospora grovesii および Microascus

びに 10 が活性成分として単離された２, ４）。

tardifaciensの６種の LT 活性菌について得られた結果につき

新しい免疫抑制活性成分として得られた multiforisin 類
1-9 中、活性が高いものは 1、7、8 である[リンパ球の Con述べる。

A 誘導（T 細胞）、LPS 誘導（B 細胞）増殖に対する 1 の３. １. １ Gelasinospora、Diplogelasinospora 属菌の免IC 50 は 0 . 6、0 . 6 µg/mL]。1 に 比 較 し、1 の acetyl 体

疫抑制活性成分[multiforisin B（2）に一致する ] では活性は大きく低下し、LT 活 性 を 示 す 菌 が 多 数 見 出 さ れ た Gelasinospora、

1 の dihydro 体（11）では活性はやや低下した。multiforisin類

Diplogelasinospora 属の菌については、従来系統立った成分とその誘導体の活性比較から、multiforisin類では、３に研究があまり行なわれていなかったので、これらの属に分hydroxymethyl 基、５に formyl 基が存在するか、３と５のど類される活性菌中、比較的高い活性が示された菌につき活

ちらか一方に hydroxymethyl 基、他方に acetoxymethyl 基性成分の単離を目指した。

が 存 在 す る と 高 い 活 性 を 示 す が、 ３、 ５ が 共 に先ず、G.multiforisについて、溶媒分画によって LT 活性

acetoxymethyl 基である 8 の acetyl 体（12）では活性がやの集約した AcOEt 可溶部から、主活性成分として単離さや低下し、共に hydroxymethyl 基の 9 では活性が大きく低れた化合物は構造研究の結果、
5 -formyl- 3 -hydroxymethyl- 4 -下する、2 -pyrone 環と共役した６位側鎖中の二重結合は活

methoxy- 6 （1- E - propenyl ）- 2 -pyrone の構造を有する新性の増強に寄与することなどが判明した（Fig. １、Table １）。

2 -pyrone（α-pyrone）と判明し、multiforisin A（1）（Fig. １）

一方、10 は 1、7、8 等に比べ活性は低かった（Table １）。

と命名された。同菌からは、更に同族体 5 種が単離され、Table １には、本研究で見出された LT 活性代謝産物についそれぞれ multiforisin B-F（2 - 6）と命名された。続いて、て の Con A、LPS 誘 導 増 殖 に 対 す る IC 50 の 値 を 数 種 の

同 属 のG.heterosporaよ り 単 離 さ れ た 活 性 成 分 ３ 種 もpositive control 化合物のそれと共に示す。

multiforisin 類と構造関連の新 2 -pyrone であることが分か

G. kobiからは LT 活性を示す成分として、15 員環と 5 員

Fig. １− 19 −

環から成る新 sesterterpenetriol が単離されて kobiin（13）（18）7 - 11） 及び 18 の 10 位立体異性体と判明した新化合物と命名され絶対配置を含めて構造が決定されたほか、新10 -epi-colletodiol（19）が得られた（Fig. ３）12）。なお、

2 -furanone が３種得られて kobifuranone A、B、C（14 - 16）

17、18 に免疫抑制活性が知られたのは今回が初めてであと名付けられた（Fig. ２） 。13 の活性は中程度であるがる。D.grovesii の主活性成分 17 が multiforisin 類と構造類（Table １）、大環状のユニ−クな構造を有しており興味深

似の 2 -pyrone 化合物であったことは構造活性相関の意味

い。14 - 16 の活性は 13 のそれよりも低かった（Table １）。

から興味深く、その活性も multiforisin 類と同様に高かっ

D. grovesii からは主活性成分として、Macrophoma

た（17 の Con A、LPS 誘 導 増 殖 に 対 す る IC 50 は 0 . 4、commelinae から得られていた macrophin（17） が単離

0 . 3 µg/mL）（Table １）。一方、18、19 の活性はやや低かされたほか、Colletotricum capsici や Chaetomium funicola

った。

５）

６）

から得られていた 14 員環を有する大環状化合物 colletodiol

Fig. ２

Fig. ３− 20 −

化粧品による皮膚かぶれを防ぐ菌類成分の探索

３. １. ２

M.tardifaciens の免疫抑制活性成分

産 物 で あ り、20、21 は anthraquinone、22、23 は

M.tardifaciensからは、８種の活性成分が得られたが、そoctaketide に属する。M.tardifaciens から新化合物としてれらの中の６種は既知菌類代謝産物に一致するものであっ得られた２種のものは、いずれも 2 , 5 -dioxopiperazine でた。即ち、それらは Penicillium frequentans等から得られてあることが判明し、tardioxopiperazine A（26）、B（27）といた questin（20） と Aspergillus cristatusから得られてい命名された（Fig. ４）19）。anthraquinone 類の免疫抑制にた rubrocristin（21）14）、Cladosporium cladosporioides や

ついては、既に emodin での例が知られているが 20）、今回、Aspergillus flavusから得られていたcladosporin（asperentin）

20、21 にも活性が見出され、いずれも高い活性を示した（22）、Aspergillus flavus から得られていた cladosporin（Con A、LPS 誘導増殖に対する IC 50 は 20 は 0 . 3、0 . 3、

13）

15 - 17）

8 -O -methylether（23） 、Aspergillus flavus から得られ21 は 0 . 8、0 . 1 µg/mL）（Table １）。多数の関連するて い た 5 , 7 -dihydroxy- 4 -methylphthalide（24） とanthraquinone 化合物との活性の比較から、β 位に遊離のasperflavin（25） であるが、これらのいずれについても

OH 基を有するものが活性を示すものと考えられた。新化

16）

18）

免 疫 抑 制 活 性 が 知 ら れ た の は、 今 回 が 初 め て で あ る。

合物２種中では、26 がやや高い活性を示した（Table １）。

20 - 25 はいずれも酢酸−マロン酸経路で生合成される代謝

その他の化合物の活性は低かった。

Fig. ４
Table 1 Suppressive Effects of Compounds 1 − 27, and Emodin,
Azathioprine, CyclosporinA, and FK506 on ConA and LPS-Induced
Proliferations of Mouse Splenic Lymphocytes [IC50(μg/mL)]− 21 −

３. ２

免疫抑制活性が IL-2 生合成阻害によるものか否かの検定

粧品による皮膚かぶれを防ぐ目的を始め、色々な目的のために有効に利用できる道を探って行きたい。

上述の３. １で得られた免疫抑制活性成分中、活性が比較的高く、量的にも実験が可能であった化合物につき、そ（引用文献）の免疫抑制活性が IL- 2 の存在によって拮抗されるか否か

１）F u j i m o t o H . , N a k a y a m a Y . , Y a m a z a k i M . :を調べることによって、その免疫抑制活性が活性化 T 細胞

Identification of immunosuppressive components of aにおける IL- 2 生合成の阻害により起きているか否かを検mushroom, Lactarius flavidulus, Chem.Pharm.Bull.,

定 し た。 こ の 検 定 に 用 い た 検 体 は、2 -pyrone ３ 種

41 , 654 - 658（1993）.

[multiforisin G（7）、dihydromultiforisin A（11）、macrophin（17）２）Fujimoto H., Sumino M., Nagano J., Natori H.,]、hexaketideとoctaketide各 1 種[sordarial（10）、cladosporin

Okuyama E., Yamazaki M.: Immunomodulatory（22）]、大環状化合物２種[kobiin（13）、colletodiol（18）]、

constituents from three ascomycetes, Gelasinospora

及びanthraquinone１種[questin（20）]のz合計８種の化合物

heterospora, G. multiforis, and G. longispora, Chem.

である。これらのほかに positive control として，既にそPharm.Bull., 47 , 71 - 76（1999）.

の作用発現機構が IL- 2 生合成の阻害にあることが判明し３）Bouillant M.L., Bernillon J., Favre-Bonvin J., Salin N.:ている FK 506 を用いた。その結果、Fig. ５に示す様にNew hexaketides related to sordariol in Sordaria
macrospora, Naturforsch., 44 c, 719 - 723（1989）.

､FK 506 では、IL- 2 が培地中に存在しない場合はリンパ細
胞増殖は強く抑制されるが、IL- 2 が培地中に存在すると

４）Fujimoto H., Satoh Y., Nakayama M., Takayama T.,

リンパ細胞増殖抑制は IL- 2 により拮抗されるためわずか

Yamazaki M.: Isolation of some immunosuppressiveとなって、IL- 2 が存在しない場合のリンパ細胞増殖抑制

components from an ascomycete, Gelasinosporaと、存在する場合のそれとの間に大きな差異が見られた。

multiforis, Chem.Pharm.Bull., 43 , 547 - 552（1995）.

一方、検体である 8 種の化合物では、いずれにおいても、

５）Fujimoto H., Satoh Y., Yamazaki M.: Four new

Fig. ５に示す 7 と同様に、IL- 2 が存在しない場合のリンパimmunosuppressive components, kobiin and

細胞増殖抑制と、存在する場合のそれとの間に差異は見らkobifuranones A, B, and C, from an ascomycete,

れなかった。それ故、これら８種の化合物による免疫抑制

Gelasinospora kobi, Chem.Pharm.Bull., 46 , 211 - 216

活性は IL- 2 生合成阻害によるものではないと考えられた。

（1998）.

免疫発現の機構は多数の段階から成る複雑なものであり、

６）Sakurai I., Shimizu S., Yamamoto Y.: Studies on

いずれかの段階が阻害されても、総体としての免疫阻害がmetabolites of Macrophoma commelinae. III. isolation of起こる。今後、本研究で見出された多数の LT 活性天然成

new metabolites and biosynthesis of macommelin

分が如何なる機構で活性を発現しているのかを解明し、化group, Chem.Pharm.Bull., 36 , 1328 - 1335（1988）.

Fig 5 Effects of Multiforisin G(7) and FK506 (a Positive Control) on the Proliferation of Mouse Splenic Lymphocytes Stimulated with Ionomycin and PMA in Cultivation with and without Exogenous IL-2

− 22 −

化粧品による皮膚かぶれを防ぐ菌類成分の探索

７）Grove J.F., Speake R.N., Ward G.: Metabolic products

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