皮膚ホメオスタシス制御に向けた
アレルゲンセラピーの基盤研究とその応用
金沢大学医薬保健研究域 薬学系 衛生化学研究室

鈴木亮

Allergy is an inappropriate immune response to allergens. Allergy requires initial sensitization with a specific allergen.
The subsequent exposure to the same allergen result in patho(physio)logical responses mediated by immunoglobulin E (IgE)
and mast cells. We have investigated high-affinity receptor for IgE (FcεRI) signals that control mast cell activation, especially
focusing on the complexity of FcεRI activation and of the signaling network in response to different affinity of allergens.
What we found is that IgE and FcεRI activate a complex regulatory network by the affinity of allergens that governs thetype of allergic disease symptoms. In the mouse model, both high- and low-affinity allegens led to similar levels of immune
cells infiltrating the site of inflammation. However, the types of infiltrating cells differed depending on whether the allergens
used were high- or low-affinity. Whereas neutrophils were the dominant cell type infiltrating under a high-affinity antigen
challenge, monocyte/macrophages were more abundant with the low-affinity antigen challenge. The physiological relevanceof the differences in immune cell recruitment is still unclear. In this study, we explore the roles of different immune cell
recruitment on physiological relevance on allergic diseases. Thus, we develop novel theories for allergen affinity-dependent
immunotherapy for keeping skin homeostasis.

1. 緒言

人類は太古から「美」を追求し、様々なコスメティックを研究・開発してきた。現代社会において化粧は、単に「美しくなる」という目的を超え、社会的・医学的に大きな役割を担うようになってきた。例えば「コスメティックセラ
ピー」という言葉に代表されるように、心理・健康面においても多大な影響を及ぼすことが、経験的そして科学的にも明らかになりつつある。
「化粧」には、その基本となる健康的な皮膚が不可欠であることは明らかである。ところが近年、住環境（乾燥、紫図 1 マスト細胞の活性化と分泌反応外線など）や生活環境（食生活、多種のコスメティックなど）の変化によって、我々の皮膚は様々なトラブルを抱えることが多くなってきている。そして、アトピー性皮膚炎、接促進されアレルギー反応が惹起される（図 1）。

触性アレルギーをはじめとするアレルギー性皮膚炎、花粉

我々は、アレルギー疾患モデル動物を用いた in vivo 解症が起因となる皮膚炎症症状など、皮膚の健康維持（ホメ析から、アレルゲン親和性が浸潤細胞の種類に大きな違いオスタシス）に多大なダメージを与え大きな社会問題になを生じさせ、皮膚炎症反応を調節・制御していることを明っている。

らかにした。高親和性アレルゲンでは好中球が、一方、低これら多くのアレルギー疾患には、マスト細胞が重要親和性アレルゲンでは単球・マクロファージが浸潤していな役割を担っている。マスト細胞は細胞膜上に IgE 受容体ることを見いだした 1）。一般的に、好中球は、細菌・真菌（FcεRI）を発現し、アレルゲン特異的 IgE と結合している。

を異物として貪食・分解することで生体防御反応を担ってアレルゲンによって IgE 受容体が架橋・凝集することによいる。また、単球・マクロファージは死細胞や変性物質のって、マスト細胞が活性化される。その結果、分泌反応が補食・消化などクリーナーとしての役割を持つ。このことは、アレルゲン親和性選択的な浸潤細胞が、皮膚アレルギー炎症の病態（終息、増悪）決定に多大な影響を及ぼしていNew insight on allergen immunotherapy
for keeping skin homeostasis
Ryo Suzuki
Institute of Medical, Pharmaceutical andHealth Sciences, Faculty of Pharmaceutical
Sciences, Kanazawa Universityることを強く示唆していた。しかしながら、これらの病態決定におけるマスト細胞と浸潤細胞の相互作用の生理機能は全く明らかになっていない。
そこで本研究では、アレルゲンによって誘導される浸潤細胞とマスト細胞の相互作用という視点から、アレルギー− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

疾患の実体を明らかにし、皮膚ホメオスタシス制御機構を2. 5. 走査型及び透過型電子顕微鏡による撮影明らかにすることを試みた。

2. 方

電子顕微鏡による相互作用の解析には、マトリゲルをコートしたカバーガラス上で共存培養した細胞を用いた。

法

走査型電子顕微鏡のサンプルは 1% グルタルアルデヒド、

2. 1. 骨髄由来マスト細胞の分化と骨髄好中球の単離・精製方法〜 100 % エタノールで脱水処理した。透過型電子顕微鏡の骨髄由来マスト細胞（BMMC：bone marrow-derived mast

サンプルの場合には、2 % グルタルアルデヒド、2 % 四酸cell）は成体マウス（C57BL/6）の大腿骨から骨髄細胞を採取

化オスミウム、30 〜 100 % エタノールで処理後、エポキシ

0.5 % タンニン酸及び 1 % 四酸化オスミウムで処理後、70し、1 0% FBS、IL-3、SCF、MEM Non-Essential Amino

樹脂で包埋した。作製したサンプルは、走査型電子顕微鏡

Acids、Sodium Pyruvate、Penicillin、Streptomycin を 加（HITACHI, S-4300）及び透過型電子顕微鏡（花市電子顕微

えた RPMI Medium 1640 中で 37 ℃、5 ％ CO2 の条件下で鏡技術研究所 HITACHI, H-7600）により撮影した。

１ヶ月間培養し、マスト細胞に分化させた。骨髄好中球は

3. 結

マウス骨髄細胞を同様に採取し、赤血球溶血後 Percoll を用いた密度勾配遠心分画法により単離・精製した。

2. 2. フローサイトメータによるマーカー蛋白質の解析

果3. 1. マスト細胞と好中球のin vitro 共存培養システ
ムの確立
我々の研究から、アレルゲン親和性選択的な浸潤細胞がマウス骨髄細胞から分化及び単離・精製した骨髄由来マ

アレルギー疾患の病態を制御していることが明らかになっスト細胞と骨髄好中球の確認には、フローサイトメータをた 1）。特に、高親和性抗原の場合には好中球が有意にアレ用い、マーカー蛋白質の発現解析により行った。マスト細ルギー炎症部位に浸潤しマスト細胞と相互作用していた。

胞の確認には、マスト細胞のマーカー蛋白質である IgE 受

そこで、マスト細胞と浸潤細胞（好中球：高親和性抗原）と容体（FcεRI）を用い、IgE 受容体 α 鎖に対する特異的抗体の相互作用を追究するため、マウス骨髄由来マスト細胞とを用いて行った。また、好中球の解析には、マウス好中球単離・精製マウス好中球を用いた in vitro 共存培養システのマーカー蛋白質である Ly6G に対する特異的抗体を用いムの確立を試みた。

た。これらマーカー蛋白質の定量的な発現解析にはフローサイトメータ（FACS Verse）を用いた。

マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、骨髄由来マスト細胞への分化を行った。骨髄細胞は、SCF 及び IL - 3 の存在下で１ヶ月間培養を行い、骨髄由来マスト細胞を得た。骨2. 3. In vitro 共存培養システムの確立

髄由来マスト細胞の分化レベルの確認には、マスト細胞骨髄由来マスト細胞（1.0 × 106 cells）と骨髄好中球（6.0 ×マーカー蛋白質である FcεRI を用い、α 鎖に対する特異的6抗体によるフローサイトメータ解析を行った。その結果、

10 cells）をマトリゲルコートのガラスボトムディッシュ上で 24 時間共存培養し実験に用いた。共存培養した骨髄95% 以上の細胞でマスト細胞に分化していることが明ら由来マスト細胞を抗 DNP（Dinitrophenyl）-IgE 抗体で感かになった（図 2）。また、マウス骨髄好中球の単離・精製作し、抗原（DNP - HSA）刺激に伴う両細胞の細胞間相互作には、マウス大腿骨の骨髄細胞について Percoll を用いた用を追究した。

密度勾配遠心分画法により行った。骨髄好中球の確認には、マウス好中球マーカー蛋白質である Ly6G を用いた。フロ

2. 4. 細胞内カルシウムイオン動態と細胞骨格蛋白質の局在解析
骨髄由来マスト細胞と骨髄好中球の細胞内カルシウムイーサイトメータで解析した結果、約 85% の細胞で Ly6G の発現が確認され、骨髄から好中球の単離・精製に成功したと考えられた（図 2）。

オン動態の解析には、カルシウム蛍光指示薬（Fluo4-AM）

先述した方法により得た骨髄由来マスト細胞と単離・精を用い、共焦点レーザ顕微鏡による画像解析により行った。

製した骨髄好中球を用いて、両細胞を用いた in vitro 共存

取得した蛍光強度の解析には Image J を用いた。細胞骨格培養システムの確立を行った。マスト細胞と好中球を共存蛋白質の局在解析には、好中球と共存培養させたマスト細培養すると、どちらの細胞も球形をしており、好中球は胞を抗原により特異的に活性化させたものを用いた。アクマスト細胞（直径：〜12 µm）と比較し、やや小さい（直径：チンの染色には FITC 標識ファロイジンを用い、チューブ〜 7 µm）ことがわかった。そこで、マスト細胞を特異的にリンの染色には Alexa Fluor 647 標識チューブリン抗体を抗原で活性化した際の両細胞間での相互作用について、細用いた。画像の取得には共焦点レーザ顕微鏡（Carl Zeiss）胞形態及び動態を指標にイメージング解析を行った。マスを用い、相互作用の解析には Image J を用いた。

ト細胞を抗原で特異的に刺激すると、抗原によって活性化されたマスト細胞では、脱顆粒反応（ケミカルメディエー− 90 −

皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究とその応用

図 2 フローサイトメータによる骨髄由来マスト細胞と骨髄好中球の確認（A）マスト細胞マーカー蛋白質FcεRIαの発現確認（B）マウス好中球マーカー蛋白質 Ly6G の発現確認

図 3 骨髄由来マスト細胞の抗原刺激応答に伴う骨髄好中球の動態マスト細胞（MC）に好中球（N1‒ 6）が集積し相互作用している。

タの開口放出）が誘導され、それに伴う形質膜の波打現象要な役割を担っている 4, 5）。一方、好中球の細胞膜上には（ラッフリング）が観察された。その後、丸い形態をしてい遊走刺激因子を感知する各種受容体が存在し、受容体の活た好中球が、紡錘形に変化しマスト細胞の方向へ移動する性化にともなう様々なシグナル分子の活性化と細胞内カル様子が観察された。そして複数の好中球が、脱顆粒をしてシウムイオン動態の制御を行っていることが明らかになっいるマスト細胞と相互作用（接着）している様子が観察されている 6, 7）。ここでは、様々な細胞機能において重要な役た（図３）。

割を担う細胞内カルシウムイオンに着目し、両者の接着に伴う相互作用が、細胞間情報伝達においてどのような影響

3. 2. In vitro 共存培養システムを用いた細胞間情報伝達機構の解析を及ぼすのか追究した。その結果、好中球単独培養の場合には、抗原の刺激応答に伴う細胞内カルシウムイオン濃度

細胞内カルシウムイオン濃度は、様々な細胞機能の調節変化は観察されなかった。一方、マスト細胞と共存培養しに関与しており、細胞活性化状態を知る上で極めて重要なた場合においては、抗原でマスト細胞を特異的に刺激する指標になることが、これまでの多くの研究から明らかになと、はじめにマスト細胞でカルシウムイオン濃度の上昇がっている2, 3）。特にマスト細胞においては、抗原依存的な観察された。その後、好中球がマスト細胞に向かって動き、細胞の活性化が小胞体からのカルシウムイオンの放出と細接着する様子が観察された。そしてマスト細胞と接着した胞外部からのカルシウムイオンの流入を引き起こすことに好中球において一過的に細胞内カルシウムイオン濃度が上よって脱顆粒反応が誘導され、各種メディエータ放出に重昇している様子が観察された（Data not shown）。このこ− 91 −

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好中球に細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が誘導されて3. 4. 電子顕微鏡を用いたマスト細胞と好中球の相互作用の追究いる可能性が示唆された。現時点では、これら相互作用に抗原刺激応答に伴いマスト細胞と好中球が接着し、ダイ伴うカルシウムイオン動態変化の生理的役割については不ナミックに相互作用する様子が観察された。そこで、マス明であるが、現在慎重に検討中である。

ト細胞の好中球の接着形態や相互作用をより詳細に観察すとから、マスト細胞と好中球が相互作用（接着）した結果、るために、走査型及び透過型電子顕微鏡を用いて追究した。

3. 3. 細胞間情報伝達を制御する分子基盤の解析

はじめに走査型電子顕微鏡を用いて両者の接着形態を観察

免疫細胞の細胞間相互作用において、様々な分子がそのしたところ、抗原刺激前は球形をしていた好中球が紡錘形相互作用部位において特徴的な局在変化を行い、それら適に形態を変化させ、マスト細胞に密接に接着している様子

切な局在変化が起こることによって機能的な細胞間相互作が観察された（Data not shown）。また、透過型電子顕微8，9）鏡を用い解析では、抗原刺激により活性化されたマスト細用と情報伝達が行われていることが明らかになっている。

そこで相互作用の足場として重要な細胞骨格に着目し、胞から分泌された顆粒内物質を好中球が貪食している様子

マスト細胞と好中球の相互作用にともなう細胞骨格蛋白質が観察された（Data not shown）。このことから、好中球の局在変化について追究した。ここでは、様々な細胞間相がマスト細胞から放出された炎症性メディエータを貪食し互作用において、接着部位で細胞骨格蛋白質の変化が明らアレルギー炎症応答を制御している可能性が示唆された。

かになっている F アクチンの集積やチューブリンの極性な4. 考

どについて、共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像解析により察追究した。はじめに、チューブリンについて、相互作用マスト細胞と好中球との相互作用を追究するための inに伴うチューブリンの極性変化を免疫染色法によって追vitro 共存培養システムの確立に成功した。確立したシス

究したところ、共存培養を行った細胞と共存培養していなテムを用いた解析から、好中球はマスト細胞の活性化に伴い細胞では明確な極性変化は観察されなかった（Data not

い、遊走し接着することが明らかになった。また、両者のshown）。次に、アクチンについて相互作用に伴う F アク接着部位では細胞骨格をはじめとする様々な機能分子の集チンの局在変化を、ファロイジンを用いた F アクチンの特積が起こっていることが明らかになった。さらに細胞内カ異的染色法により追究した。その結果、マスト細胞と好中ルシウムイオン動態の解析から、両細胞間ではカルシウム球が相互作用（接着）している部分で、F アクチンが顕著にイオン動態を制御する情報交換が起こっていることも明ら集積している様子が観察された（図４）。このような接着面かにした。そして電子顕微鏡を用いた解析からは、好中球での F アクチンの集積は、接着していないマスト細胞や好がマスト細胞の分泌メディエータを貪食することによって中球では観察されなかった。また、マスト細胞・好中球相アレルギー応答を制御している可能性が示唆された。

互作用に関与する分子の同定についても幾つか成功してお5. 総り、マスト細胞と好中球の相互作用には、細胞骨格をはじ括めとする様々な機能分子が関与している可能性が示唆され本研究で確立した in vitro 共存培養システムは、これた。現在は、個々の機能分子について相互作用における役まで明らかになっていなかった細胞間相互作用について、割について検討を行っている途中である。

様々な分子基盤の研究を可能にし、相互作用が担う生理機能を明らかにする上で極めて有用な研究システムであった。
本研究で確立した in vitro 共存培養システムを用い、さらに分子・細胞レベルでの研究を行うとともに、それらの知見を基盤にした in vivo 研究へ展開することによって、相互作用が担う生理機能の一端が明らかになり、皮膚の健康維持に関する戦略的な治療方法の確立を行えるものと考えられる。また in vitro 共存培養システム確立に向けた条件検討段階であるマスト細胞と単球・マクロファージの相互作用研究においても、in vitro 及び in vivo 研究を遂行することによって、これまで不明であった、アレルギー応答に図 4 マスト細胞と好中球の相互作用部位におけるF アクチンの集積マスト細胞（MC）と好中球（N）の相互作用の接着部位において F アクチンの集積が観察された（矢印）。

おける単球・マクロファージの新たな生理機能が明らかになることが予想される。これらの取り組みによって、新たな視点からアレルギー疾患の原因を究明するとともに、「コスメトロジー」における新たな展開をもたらせるものと考− 92 −

皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究とその応用えられる。

degranulation in Fyn-deficient mouse bone marrowderived mast cells. J Leukoc Biol, 88, 863-875（2010）．

謝辞5） Ikeya M, Yamanoue K, Mochizuki Y, Konishi H,

本研究の遂行にあたり、公益財団法人コスメトロジー研

Tadokoro S, Tanaka M, Suzuki R, Hirashima N. Orai-

究振興財団よりご支援を頂きましたことを、心より感謝申

2 is localized on secretory granules and regulates

し上げます。

antigen-evoked Ca2+mobilization and exocytosis inmast cells. Biochem Biophys Res Commun, 451, 62-67（引用文献）（2014）．

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