弾性線維蛋白質工ラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究
九州大学

理学部

甲斐原

梢

Extracellular self-assembly process of tropoelastin, as a key step of the elastogenes1s, canbe mimicked by the temperature-dependent coacervation of elastin-related polypeptides suchas tropoelatin, a-elastin, and block copolymeric model peptide, (Val-Pro-Gly-Val-Gly)n.
Homogeneous aqueous solutions of these polypeptides in low temperature become turbid withelevating temperature by the formations of coacervate droplets. Critical behaviors of the liquid­
liquid phase separation of bovine neck ligamental a-elastin-water system were observed by thelaser light scattering photometry. The critical point was determined to be near O.llmg/ml and
21.5℃ . In the critical region, the estimated hydrodynamic radius was decreased gradually withelevating temperature probably due to the hydrophobic interactions excluding water moleculesfrom the polypeptide assemblies. Then, the hydrodynamic radius increased sharply to induce
liquid-liquid phase separation. On the contrary at the region far from the critical point, gradualdecrease in hydrodynamic radius followed by the additional decrease to induce the phaseseparation. The temperature-dependent coacervation of elastin 寸elated polypeptides arecharacterized by these two types of dynamic behaviors. The same modes of molecular assembly
process were also observed by the rotary viscometric measurements for the critical and off­critical regions. The reduced viscosity of bovine neck ligamental crelastin solution was increased
with elevating temperature in the region near critical point until the liquid-liquid phase separation
was induced. While in the region far from the critical point, the reduced viscosity of aqueous erelastin solution was suppressed to constant levels with elevating temperature. Selective andspecific interactions of calcium ions and copper ions were employed as a tool to survey structureand function of the elastin coacervate. Low diffusion coefficient and high concentration of
calcium ions, seven times higher than that of magnesium ions, within coacervate phase were basedon the selective binding to the electrically neutral backbone Val carbonyl groups. These selective
interactions of calcium ions are tightly correlated with arteriosclerosis induced by the calcium
deposition on the arterial wall elastm. Novel interactions of copper ions with elastm coacervate
stabilized the microcoacervate droplet and the macroscopic phase separation to form coacervate
layer and upper layered equilibrium solution phase. Unique effects of copper ions seem to present
a key to clarify the molecular structural bases of elastomeric mechanisms

1

緒

言

ている。特に、 大動脈壁を構成している血管平滑筋細胞、

エ ラスチン、

コラ ー ゲンの中で、 正常血細胞外マトリックスとしての弾性線維蛋白質工

圧の発生、 維持に寄与しているのは エ ラスチンの

ラスチン は、 コラ ー ゲンに次ぐ量が生体に存在しみであり、 低い圧力では平滑筋細胞が優先的に機ており、 皮用、 動脈壁、 項靱帯等、持続的な弾性

能し、 一方、 高い圧力ではコラ ー ゲンが優先的にが要求される組織に於て、 弾性機能発現を支配し機能して血管壁の剛性が増すと共に弾性が低下
し、 いわゆる動脈硬化と呼ばれる状態になる事がStudies on Structure, Mechanism, and知られている。 即ち、 動脈硬化は、 エラスチンのFunction of Self-Assemblies
of Elastomeric Protein

質的、 量的な変化として捉える事が出来る。 又、胎児期に既に機能している大動脈の エ ラスチンに

Kozue Kaibara
Department of Chemistry, Facultyof Science Kyushu University

は、 加齢と共にカルシュウムやコレステロ ー ル等の脂質の沈着が進行して弾性機能が低下し、 寿命を決定する重要な因子となっている。

-37-

A

リシルオキシダ ー ゼ
+
Cuイオン

>

I
線維芽細胞

ft

規則的集合
態
配列状

トロボエラスチン

i ノ甘

鉗欠乏動物
8アミノプロビオノニトリルi

ふ配列

架橋反応

弾性線維

，

熱誓醸処理、熱アルカリ処理.
ヽ•ヽ....,_一................,,....................................................
,
ー.・．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．、............................................................,,,,,,,.-;........................
........●●●●●●●●....__,.,....-...-...............
;

i

一

プ←
モデルポリペl'_;

昌芦 〇 喜デルペプチド水溶液

コアセルベ ー ト
液滴コアセルベ ー ト
分離厖

人工生体
弾性線維

図1. 細胞外間隙での弾性線維蛋白質エラスチンの生合成過程(A)と温度依存性コアセルベーション(B)の対応
この様に、弾性線維の主要構成分として重要な

ン特有な繰り返し ペプチド配列に基づくプロック

機能を果たしているにも拘わらず、構造、物性、共重合型モデルポリベプチドであるポリペンタペ

機能の何れの面に於ても、エラスチンの特性の多プチド(Val-Pro-Gly-Val-Gly)"等がある。即ち、

くが未解明のままに残されている。その最大の理

これらのポリペプチドの水溶液は、室温以下の低

由は、 エ ラスチンが弾性組織のアルカリ処理残澄

い温度では均 ー な水溶液であるが、温度上昇と共として分離抽出される程に、極度に溶解性が低いに、 コ アセルベ ー ト液滴を形成して白洵し、更事にある。 エ ラスチン生合成過程は、図 lAに模式に、 ペプチドが高度に浪縮されたコアセルベ ー ト

的に示されるが、平滑筋細胞や線維芽細胞内で合下層とペプチド濃度の低い平衡液上層に分離す成された前駆蛋白質トロポエラスチンがエクソサる。

イト ー シスにより細胞外に送出され、規則的集合

細胞外マトリックスと して のエラスチンの弾

配列状態をとった後、銅イオンを補因子とするリ性、細胞遊走性等の多様な機能は、生体内自己組

シルオキシダ ー ゼによる分子内、分子間架橋反応

織化過程で確立される分子集合体の構造 特性にを経てエラスチンとなり、糖蛋白質であるミクロ依っている。従って、エラスチン関連水溶性ボリ

フィブリルと共に弾性線維を構成する。本研究のペプチド —水系の コ アセルベ ー ション、即ち、液ステップであるトロボー液 2 相分離特性を種々の手法により明らかにすエラスチンの自己集合組織化過程が、図1Bに示する事から、弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織エラスチン関連水溶性ポリペプチド ー 水系の温度化集合体の構造、物性、機能に関する知見を得る

基礎は、生合成過程のキー

依存性コアセルベ ー ションとして再現可能な事に事が可能である。

2

ある I> 。 コ アセルベ ー ションが観察されるペプチ
ドとしては、銅欠乏動物より抽出したトロポエラ実験

スチン（アミノ酸残基数-700個）、 トロボエラ
スチン相当の分子量を有するエラスチンの熱篠酸

ウシ項靱帯由来a —エラスチン及びポリペンタ

ラスチン、エ ラスチ

モデルペプチド 、(Val-Pro-Gly-Val-Gly) n を用処理可溶 化断片であるa

—エ

-38-

弾性線維蛋白質工ラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究

い、種々の測定に供した。モデルペプチドについ述べないが、ビデオ記録装置を備えた位相差顕微ては、九州工業大学情報工学部岡元研究室、佐賀鏡による粒径分布変化の観察等が、相分離後期過大学理工学部近藤研究室より提供して頂いた。試

程の・解析に有効である事を確認した。

料溶液は氷温下で調製し、冷蔵庫内に数時間静置
3

して均ーな水溶液とした。何れの測定において結果と考察

も、温度を一定速度で連続的に、あるいは、段階
3. 1

的に注意深く温度を上昇させながら、液ー液2相相分離挙動の光散乱法による観察と解析

図 2Aにウン項靱帯由来a — エラスチンについて、分離に伴う物性変化を観測した。

蛍光分光光度計により波長 400nmでの 90 度散乱光

実験は、通常の獨度測定等の分光学的手法によン ・ プ—
強度の温度及び浪度変化を示す。温度及びa 工

レ ー ト型回転粘度計による測定を行った。相分離

ラスチン濃度増加に伴い、散乱光強度が増加する

る集合体形成過程の追跡を行った他、コ

ー

光散乱測定

が、濃度により二相性の変化が見られる。図 2Bにについては、福岡大学理学部宮川研究室の御協力示す様に、測定で得られた曲線aをbとcに分解しを得た。液 —液 2相分離初期過程に対しては粘度及て見ると、曲線bの立ち上がり温度は吸光光度計

び光散乱測定が有効であるが、洵度増加やコアセで求めた同 一波長での溺度増加の開始温度と一致

過程の解析に威力を発揮するレ

ー

サ

ー

ルベ ー ト液滴形成を伴う相分離か進行した段階でする。これらの結果は、液 ー 液 2相分離を伴うエは適用不可能となるため、今回は結果についてはラスチンペプチドの集合組織化過程で、少なくとも二つの分子過程が進行している事を示していると考えられる。その詳細について調べ、生体内自

0.2:

．．

0
5
0

．．口 ’’゜ ，．．
a•

を行った八

．．

散乱強度Iの角度依存性の測定結果より、次式0.05 •••

を用いて相分離過程の臨界挙動に関する知見が得・;;;;;;;;(;;�:::::: ..。 ..
20

30

°

T/ C

られる 3 。
)

40

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400

j a-Elostln: O.lmg/ml

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0
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300

0
0
2

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8

120

514. 5nmのアルゴンレ ー ザ ー を用いた光散乱測定

0.1. • •10B

己組織化過 程に関する 知見を得る ために、波 長

a-Elnstin: m助ml
0.4

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20

30

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T/ C

10
40

20

゜

30

40

Tl C

50

図3. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液に於ける濃度揺らぎの相関距雌との濃度及び温度依存性

図2. ウシ項靭帯由来a エラスチン水溶液の90'散乱光強度の濃度及び温度依存性（詳細は本文参照）—-39-

I(q)= I(0)/(1 + f 2

(1)

qり

a-F.I●,i;n,mr,/ml

ここでqは、q=(4 冗 n/入） sin(0/2)(n、れる散乱ベクトルである。 I(O) は前方散乱光強度と呼ばれ浸透圧縮率に比例する量である。どは—
濃度揺らぎの相関距離である。 図3に種々のa 工．

。゜ Oo OO# ゜

100

・。 。
..
e・出ao叶立

ラスチン濃度に於けるどの温度変化の様子を示°10す。 濃度0. llmg/ml、温度21. 5℃付近でどの値が

゜° ゜

..

0.08
oo0oo ooo0°o o0oo
oo 0
Ooo 0 0.2
。 O O O OoOo
6ft
0
o
△ o•o

oo

OOo

..

0.11·

2

入、 0は各々、屈折率、波長、散乱角）で表わさ。

mu[ H.J.

300．．．．．．．．． ．

． ゜

20

00

°
。.s°。

＾

゜°
゜ Ooo臨0oo�Oggoo
゜

30

40

Tl C

発散傾向を示しており、濃度揺らぎが系全体に拡がり相分離へ向かう現象が示されている。この濃図5. 動的光散乱測定より求めた流体力学的半径のa — エラスチン涙度及び温度依存性（臨界濃度とその他の濃度での温度依存性の違いに注意）

度から離れるに従い、どの値は急激に減少し、濃度揺らぎの範囲が局所的である状態へと移行していく事を示している。 ウシ項靱帯由来a — エラス

r は平均緩和速度、ては緩和時間であチン — 水系の温度依存性コアセルベ ー ションが、

ここで、濃度0. llmg/ml、温度21. 5℃付近に臨界点を有す

り、 ぃ／戸は分散指数と呼ばれる。散乱粒子のー

る液 液2相分離過程である事は、図6Aに示す様

拡散係数D、及び、流体力学的半径 r は、以下のに、濃度0. llmg/mlに於いて、前方散乱光強度の逆数が温度21. 5℃付近で0に漸近することからも式で算出される。
D = f /q 2(3)

確認できる。種々の濃度に於いて、濁度測定より

r = kT/6 冗 T/ D

(4)

二相共存温度、前方散乱強度よりスピノ ー ダル温

ここでK、T、 nはボルツマン定数、温度、溶媒の度を求め、最終的にウシ項靱帯由米a —粘度である。図4に拡散係数、図5に流体力学的半

エラスチ

—

径の値を、臨界点近傍、臨界点から充分に離れた

次に、動的光散乱測定により得られた相関関数

点、更に両者の中間の点について得られた結果をg(r)をキュムラント展開し、相分離過程と分子示す。 臨界点近傍では、拡散係数は温度上昇と共集合体の特性を表わす諸量を求めた。

に緩やかに増加した後、急激に減少して相分離に

ン 水系の相図が決定される。

g(て） =exp [-rて+(µz/2!) r 門

至り、ほぼ一 定値を保持する。一方、臨界点から充分に離れた点では、緩やかに増加する拡散係数

a·El"H"'mg/ml
如u,riog心&'"印·

は、更に増加の度合を増して相分離に至る。 従っ

△

＾△

△
,. 0.8

2

1●
1

30

づく水分子排除による減少を経て、急激に進行す

08

0•
・
・
・
・
・

●

゜

Tl C

●
●

20

そらくポリペプチド分子間の疎水性相互作用に基

00
。
。
。
。
。

0

OA

A0

1

10

て、臨界点近傍での流体力学的半径の変化は、お

△

q

△

6

。

•
a
・
。o。
・
。
。
。 ・
。
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b
o
●
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o
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0
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・
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●0

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・

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．．
．
．
．
．

△

5

W:l 8'O I l d
z:

I'S

10

(2)

る分子集合による増加を伴って相分離に至ると考えられる。臨界点から充分に離れた点での流体力学的半径の変化は、拡散係数の変化に対応したニ40

図4. 動的光散乱測定により求めた拡散係数の
ex -エラスチン濃度及び温度依存性（臨界点近傍と臨界点から充分に難れた点での拡散係数の温度依存性の相違に注意）

段階の持続的な減少となっている。中間点に於ける拡散係数あるいは流体力学的半径の変化は、上に述べた二種類の分子集合挙動の組み合わせとして捉える事が出来る。図6には、臨界点近傍での種々の数値が示す特性をまとめて示した。

-40-

弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究

A

15

•

2.0

1/. ......・(O)III

10

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5
1

5

3

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0
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4

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,

I's

20

゜

Tl C

60

40

図7. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液のD

粘度の濃度及び温度依存性（曲線1は純粋の粘度 、 矢印2 、 3は各々濃度0. 1 、 0. 4mg/mlに於ける相分離
温度25. 3 、 37. 3℃を表わす）
300

E U/J.

200

6.0

100

°

T/ C

30

40

0,

20

^
3

10

I'

(1,
竺 E p/p a.1

図6. 臨界点近傍での相分離挙動を表わす
諸星の温度依存件（縦釉の諸量については本文参照）

3. 2

粘度測定による分子集合挙動の解析

溶液内での分子集合挙動を調ぺる手段として

4.0

0.05

2.0

は、粘度測定も有効である。 少量の試料溶液で測定可能な事、 剪断応力を変化させた測定等、 微細0.00な細胞外間隙で進行する生体内自己集合組織化との対応が可能な事等を考慮し、 コーン ・ プレ

ー

ト

20

°

T/ C

40

60

型回転粘度計による粘度測定を行った。 種々の濃図8. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液の遠元
粘度の濃度及び温度依存性（グラフ内の数値はa — エラスチン濃度を表わす）

度のウシ項靱帯由来a — エラスチン水溶液について、 一定速度でコ ー ンを回転させながら、 温度を段階的に 1-3 ℃づつ上昇させながら粘度の定常値-41-を測定した。 相分離を起こすと思われる温度付近

100

1.6

では、特に1真重な測定を行った。
図7は、種々のa — エラスチン濃度での、温度にの様子を示す。 粘度はa エラスチン濃度減少及—び温度上昇に伴い低下するが、各濃度で特有な屈曲点が現われ粘度が更に低下しており、その温度1.2

Iで液 ー 液2相分離が起こった事を示している。 こ

1.4。

UdW /US·

対する コ ー ン回転数100回転／分での粘度の変化の結果を基に遠元粘度を算出し、温度に対してプ
ロットした結果を図8に示した。 相分離に伴う粘0.8度の変化が現われる温度は、還元粘度一温度プ
ロットでは、より顕著に現われている。 相分離以10後の系は、 コ アセルベ ー ト液滴が分散した不均一

20
°

30

T/ C

系であり、粘度測定の結果から分子集合挙動に関する知見を得る事は困難である。 図8は、臨界点

図9. 臨界濃度近傍でのウシ項靭報由来a — エ
ラスチン水溶液粘度のコ ー ン回転数依
存性（数値はコ ー ン回転数／分をあらわす）

から充分に離れた点では、還元粘度の値は温度に無関係に 一 定の値をとり液 ー 液2相分離に至るのに対して、臨界点に近ずくに連れて、還元粘度が3

温度上昇に対して増加する過程を経て相分離に至る事を示している。 温度上昇に伴う還元粘度増加
は、臨界点付近に於いて、最も顕著である。 これらの結果は、前節で述べた動的光散乱測定の結果に至るのに対して、臨界点から充分に離れた点では粒径は寧ろ緩やかに減少するとの結果と良く対U応している。
粘度測定と動的光散乱測定の結果の間の不一 致ー

老一

力学的半径が急激な増加をする過程を経て相分離

2I·� flllpから導かれた、臨界点付近では分子集合体の流体

は、液 ー 液2相分離の開始温度にある。 粘度一温。

度曲線あるいは還元粘度 — 温度曲線の屈曲点が示
す相分離温度は、何れの漉度に於いても、動的光散乱測定が示す温度に比して、高温側へ移行して10いる。 例えば、臨界点付近のa — エラスチン濃度

20

゜

30

Tl C

0. llmg/1111では、光散乱測定では21._5 ℃であるの

図1 0. 臨界濃度近傍に於けるウシ項靭帯由来
a — エラスチン水溶液の選元粘度のコ ー ン回転数依存性に対して、粘度測定では、25. 5℃へと相分離開始
温度が上昇した。 その原因は、測定時に試料溶液にかかる剪断応力の有無にあると考えられる。 そこで、回転粘度計コ ー ンの回転数を変化させる事

分離開始温度の変化を観察した結果を、図9とにより、異なる剪断応力場中での粘度測定から相図10に示した。 コ ー ン回転数を100、50、20、10-42-

弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、 機能に関する研究

回転／分と変化させるに連れて、粘度の減少と共チンコアセルベ ー トと選択特異的な相互作用をすに、液 ー 液2相分離開始温度が低下 する事が示さる金属イオンは、分子構造解明の有用なプロ ー プ

れている。剪断応力場中での相分離、いわゆる流となる。

動誘起相分離については、種々の測定法の検討がカルシュウムイオンは、動脈壁エラスチンヘの行われ、解析法についても未だ確立されるに至っ沈着が動脈硬化の素因となっている事からも、エていないが、弾性線維蛋白質エラスチンの自己組

ラスチンコアセルベート との相互作用の詳細を明

織化集合体の構造、物性、機能に関する研究に於らかにする事が重要である。エラスチンコアセル

いても、又、生体内自己集合組織化過程の詳細をベート中の輸送現象について、 ナトリウム、 マグ

知るためにも重要であり、現在、粘弾性穎微鏡をネシュウムイオンとの比較を行うと、カルシュウ

用いた研究を始めている。 粘弾性顕微錢は、倒立

ムイオンは、拡散係数か小さく、生理的イオン濃

ー

ン・

ー

度条件下に於けるコアセルベ ー ト内の濃度は、 マ

トアタッチメント付回転粘度計を装着した 装置でグネシュウムの7倍に達した。 このようなカルシュ

あり、細胞外空間の特殊な環境を、ある程度再現

ウムのエラスチンヘの結合は、C-13ラベルを施しし得ると考えている。

たモデルボリペプチド (Val 1-Pro 2 -Gly 3 -Val 4-型顕微鏡のステー

ジ上に、透明なコ

プレ

Gly り n を用いたNMR測定の結果から、選択特異的
3. 3

エラスチンコアセルベートの特異な挙動

生体中に最も多量に存在する蛋白質はコラに3位と5位のグリシンのカルボニル基を介していーゲる事が示された。 即ち、 カルシュウムイオンは、ンであり、 ゲル形成を始め、種々の生化学的、物

ペプチド骨格鎖の電気的に中性なカルポニル基に理化学的特性が活発に研究されて来た。

方、 エ

強固に結合していると考えられる。動脈壁 エ ラス

ラスチンは動脈硬化に深く関わる蛋白質である事

チンヘのカルシュウム沈着による弾性低下機構解から、病理学等、基礎医学的な研究は精力的に行明は、弾性発現分子機構自身を解明するための有

われてきたが、基礎科学的な研究は、エラスチン

力な手掛かりを含んでいるはずであり、更に検討の最も重要な弾性機能発現の分子機構についてもを続けている。

一

確定的な結論が得られていない程であり、多くの弾性線維蛋白質 ー 水系の液 ー 液2相分離に対し課題が残されている。前駆蛋白質トロポエラスチて、 一般的に、アルカリ金属及びアルカリ土類金ンやモデルポリペプチドを用いた架橋重合実験の属イオンは促進効果を示すのに対して、遷移金属

ー

液2相

イオンは抑制効果を示すが、中でも、銅イオンは分離を伴う分子集合過程、即ち、温度依存性コア

相分離温度を数10℃以上も上昇させる顕著な作用

セルベ ー ションを経た場合のみが、弾性機能を有を示した。 更に、銅イオンの最も特徴的な効果する線維様生体高分子が得られる事が報告されては、液 ー 液2相分離過程で、コアセルベート液滴いる。 従って、 エ ラスチンコアセルベ ー トの構造

状態を安定化させ、コアセルベ ー ト下層と平衡液と物性は、弾性線維蛋白質としての多様な機能の上層への分離を阻止する作用にある。ESR測定の基礎となる構造と物性に対応していると考えられ結果、エラスチンコアセルベートはマンガンイオ

る。我々は、種々の金属イオンが相分離挙動や工ンとは配位結合をしないのに対して、銅イオンとラスチンコアセルベ

トの物性に与える影響につは四面体型 の 配 位構造をとる事、上 に述べた

いて各種の測定を行い、各種金属イオンとの相互

C-13ラベルモデルポリペプチドを用いたNMR測定

作用の解明から、弾性発現の基礎となっているエで、銅イオンの磁性によりカルポニル炭素のケミ

ラスチンコアセルベ ー トの構造に関する検討をカルシフトが消失していく中で、2位のプロリン

結果 より、単純な重合過程ではなく、液

行っている

4)

ー

。特に、以下に述べる様な、エラスのシグナルのみが保持される事が、明らかとなっ-43-

た。 このような銅イオンの特異な作用は、 エラス

Soc. .Ip几， 60 1468 1991 : K. Miyakawa,

チンコアセルベートの構造に関する何らかの情報

K. Ito, and K. Kaibara, ./. ?,力'YS. Soc.

を与えており、 又、 架橋酵素リシルオキシダーゼの補因子としての銅イオンは、 前駆蛋白質トロポ.fpn., 62 25 11 1993 ; K. ldiyakawa, M.
Totok i, and K. Kaibara, .8jopo/ymers,

エラスチンの自己集合組織化の重要な役割を果た

35 85 1995
3) H. E. Stanley, "Introduction to Phase

している可能性もあると考えている。

Transitions and Critical Phenornena" ,Oxford Univ. Press, London, 1971.

参考文献
1) K. Kaibara, K. Okamoto, and K. Miyakawa,

4) K. Kaibara, K.Sakai, K.Okarnoto, Y. Uernura,in "New Functionality Materials, Volume
B : Synthesis and Function Control of

K. Miyakawa, and M. Kondo, .8jopo/ymers,
32, 1173 1992 ; K. Kaibara, Y. Akinari,

Biofunctional ity Materials" (T. Tsuruta,

K. Okarnoto, Y . Uernura, S. Yarnarnoto,

M. Doyarna, M. Seno Editors), Elsevior

H. Kodarna, and M. Kondo, .8jop Jymers,
3 9 ifl the press. Cl995)

Science Publisher B. V., 281 1993
2) K. Miyakawa and K. Kaibara, J. 月!Jys.

rヤ

-44-

゜