メラニン産生の制御機序の解析を介して新しい美白剤を開発するための研究
中部大学生命健康科学部生命医科学科環境衛生学

加 藤昌 志Malignant melanoma is one of the most aggressive tumors. Incidence of melanomas is increasing byupregulation of ultraviolet irradiation. Therefore, it is necessary to establish a new drug for preventing against
and curing melanoma though the clarification of its mechanism. We established the RET-transgenic mouse line
(304/B6), in which spontaneously develops benign melanocytic tumor(s) without exception. About 70% of thebenign tumors will be changed to malignant melanomas. We investigated the role of c-Kit in the hereditarymelanoma developed in the RET-transgenic mice (line 304/B6). In Wv/Wv-RET (304/B6)-transgenic mice, inwhich c-Kit function was severely impaired, development of melanoma was strongly suppressed. Whereas 31 of
the 44 original RET-transgenic mice died of rapidly growing melanoma within 12 months after birth, only 8 of
the 44 Wv/Wv -RET-transgenic mice developed slowly-growing melanocytic tumors with a greatly prolonged
mean tumor-free period, two of which died of melanoma at a late stage. Even Wv /+-RET-transgenic mice had aclearly prolonged tumor-free period and a definitely reduced frequency (6/61) of tumor death within 12 months
after birth. Melanin production in the skin of these mice was not strongly impaired, suggesting that c-Kit affects
the development of melanomas in these mice with only minor effects in melanin production. More importantly, asingle injection of anti-c-Kit antibody (ACK2) into RET-transgenic mice soon after birth caused a surprisingly
long-lasting suppression of development of melanoma, greatly prolonging the tumor-free period, and none of the28 ACK2-treated RET-transgenic mice had died from tumors at 12 months of age. The c-Kit function needed formelanin production was also suppressed for an unusual long time in ACK2-treated RET-transgenic mice. These
results suggest that c-Kit can be a unique target molecule to prevent against melanoma. In the next step, weshould clarify whether c-Kit can be a target of therapy for the developed melanoma or not.

１

部解明することに成功した９）。

緒言

本研究では、申請者らが樹立した RET- トランスジェ

生活水準が向上に伴い、ヒトは外見に気を配るようになニックマウス ２） と c-Kit の機能の 80％以上低下しているる。服装にもこだわるが、最終的には一般的に自身の美しWv- マウスと交配させる。これにより、RET キナーゼとさ重視するようになる。シミ（肝斑）、ソバカス（雀卵斑）、Kit キナーゼが個体のメラノサイト増殖やメラニン産生アザ（広範囲にわたる先天母斑）などは、自身の美を障害において、どのように影響し合うかを調べる。また、抗するものとして、しばしば大きな問題となる。これらの疾c-Kit 抗体を用いて、メラノサイトやメラニンの個体レベ患には、すべてメラノサイトとメラニンの過剰産生が関与ルでのコントロールをめざす。

している。ゆえに、メラノサイト増殖やメラニン産生のメカニズムを探ることは、より質の高い安全な化粧品（美白剤）を提供するために不可欠である。一方、メラノサイト増殖やメラニン産生には c-Kit 分子（チロシンキナーゼ）１）が関連していることが知られている 。申請者らは近年全２実験方法

RET- トランスジェニックマウス（黒色毛）と Wv- マ

身の皮膚黒色症を必発する RET- トランスジェニックマウウス（白色毛）を交配することにより c-Kit の機能の著しく低下した RET- トランスジェニックマウス（Wv/Wv-スを樹立し２）、RET チロシンキナーゼも c-Kit チロシンキ

RET- トランスジェニックマウス）を作製することにより、ナーゼと同様にメラノサイト増殖やメラニン産生に深く関RET と c-Kit の相互作用を個体レベルで解析する。さらに、

３−８）。さらに、最近ではマウスの検体を用いてウエスタンブロット、免疫沈降、キRET- トランスジェニックマウスにおける IL-6 の役割を一ナーゼアッセイ、免疫組織染色等の手法を用いて RET と与していることを報告してきた

c-Kit の相互作用を分子レベルで解析する。
The research to establish the drug forwhite skin through analysis of melanin
production

ACK2 のハイブリドーマをヌードマウスに注射し、腹水を採取することにより、高濃度で多量の抗 c-Kit モノクロ

Masashi Katoーナル抗体を作製する。生後１日以内の RET- マウスに抗Department of Environmental andPreventive Medicine, Research Instituteof Life and Health Sciences, Chubu
Universityの色を観察する。さらに、に抗 c-Kit 抗体を注射されたマc-Kit 抗体（ACK2）を注射すると、マウスの毛色や皮膚ウスの皮膚について、免疫組織染色、ウエスタンブロット、− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

免疫沈降、キナーゼアッセイ等の方法を用いて、抗 c-Kitａ−５）RET- トランスジェニックマウス（図２B：RET）

抗体がどのようなメカニズムで毛色に作用するのかを解析

では、100％のマウスに腫瘍が発症し、70％の腫瘍が悪性する。

転化をおこし、メラノーマを発症している。ところが、

３

c-Kit 機能の一部低下した RET- トランスジェニックマウス（図２B：Wv/ ＋− RET）では 30％以上のマウスで、結果と考察ａ）Wv- マウスと RET- トランスジェニックマウスを交配させることにより、c-Kit 機能の低下した RET- マウスを作製し、毛色と腫瘍の大きさを調べる
a―1）RET- トランスジェニックマウス（黒色毛）と Wvマウス（図１A：左端の白色マウス）を交配することにより c-Kit の機能の著しく低下した RET- トランスジェニックマウス（図 A：右側の３匹）を作製すると、このマウスの毛色は黒色毛と白色毛が混じったパンダ様となった。
これは、c-Kit の機能低下によるメラニン産生の低下が、RET キナーゼにより部分的に補われる可能性を示している。
a―2）c-Kit の機能の著しく低下した RET- トランスジェニックマウスでは、白毛部分のメラニン産生は見られない（図１：B1）。一方、黒毛部分では、毛根からこぼれ落ちるほどのメラニン過剰産生が観察される（図１：B2）。これは、オリジナル RET- トランスジェニックマウスの毛疱と同じ表現型である。少なくとも毛疱に関しては、白毛部分は Wv- マウスの、黒毛部分は RET- マウスのモザイクになっているかもしれない。
a―3）生後８ヶ月 RET- トランスジェニックマウスでは図１C の下段に示すように腫瘍が発症している。しかし、生後 c-Kit の機能の著しく低下した RET- マウスでは、生後８ヶ月になっても通常腫瘍の発症はみられなかった。この結果は、RET- マウスにおいて c-Kit 機能が低下することにより、腫瘍の発症を抑制する事ができる可能性を示している。これを証明するためには、数を増やして統計学的検討が必要となる。
a―4）RET- トランスジェニックマウス（図２A：RET）、c-Kit 機能の一部低下した RET- トランスジェニックマウス（図２A：Wv/ ＋− RET）
、c-Kit 機能が著明に低下した RET- トランスジェニックマウス（図２A: Wv / Wv-RET）の寿命を生存曲線にて比較すると通常の RET- マウスに比較して c-Kit 機能の一部低下した RET- トランスジェニックマウスの寿命は統計学的に有意に延びていた。
c-Kit 機能が著明に低下した RET- トランスジェニックマ
ウスでは、さらに有意に寿命が延びた。

図１
Ａ：4 週 齢 の Wv/Wv- マ ウ ス（ 左 端 ） 及 び 同 腹 の Wv/WvRET- トランスジェニックマウス（右側の３匹： Wv/Wv 遺伝子を持つ RET- トランスジェニックマウス）。
Ｂ：Wv/Wv-RET- トランスジェニックマウスの白色毛部分の皮膚（B-1）と黒色毛部分の皮膚（B-2）の組織像。
C：生後８ヶ月の RET- トランスジェニックマウス（上段）とWv/Wv-RET- トランスジェニックマウス（下段）（Kato M
et al. Cancer Res 64:801-806, 2004 の Fig.1 を改変して掲載）。

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メラニン産生の制御機序の解析を介して新しい美白剤を開発するための研究ｂ）抗 c-Kit 抗体を用いて RET- トランスジェニックマウ
スの c-Kit 機能を人為的に低下させた RET- マウスにて毛色と腫瘍の大きさを調べるb―1）RET- トランスジェニックマウスに対し、生後 24時間以内に 0.5mg の抗 c-Kit 抗体（ACK2）を一度だけ注射し、その後の腫瘍の大きさについて注射を受けていない
RET- マウスと比較した（図３A）。ACK2 を注射されたマウス（図３A：RET ACK2(+)）では、ACK2 投与を受けていない RET- マウス（図３A：RET）に比較して、特に生後 11 − 12 ヶ月頃まで、著しく腫瘍増殖が抑制された。
さらに、オリジナルの RET- マウスでは 100％のマウスに腫瘍が発症し、70％の腫瘍が悪性転化をおこし、メラノーマを発症している（図３C：RET ACK2(-)）のに対してACK2 を投与された RET- マウスでは、40％以上のマウスに良性腫瘍さえ発症しなかった（図３C：RET ACK2(+)）。
また、悪性転化した腫瘍は 1/3 程度に抑制された。以上のように本研究では、メラノーマを自然発症する RET- トランスジェニックマウスにおいて c-Kit 機能を調整することによりメラノサイト系腫瘍の発症をコントロールできることをより臨床応用しやすいかたちで示した。
図２
Ａ：RET- トランスジェニックマウス（RET; n=50）、Wv/+RET- トランスジェニックマウス（Wv/+-RET; n=50）、Wv/Wv-RET- トランスジェニックマウス（Wv/Wv - RET; n=25）
における寿命。
Ｂ：RET- トランスジェニックマウス（RET; n=44）、Wv/+RET- トランスジェニックマウス（Wv/+-RET; n=61）、Wv/Wv-RET- トランスジェニックマウス（Wv/ Wv RET; n=44）における悪性腫瘍（Malignant）、良性腫瘍（Benign）の発症率（Kato M et al. Cancer Res 64:801-806, 2004 の Fig.1 を改変して掲載）。

b―2）オリジナルの RET- トランスジェニックマウスでは毛色は一生黒色のままである（図３B：下段マウス）。
生後 24 時間以内に 0.5mg の抗 c-Kit 抗体（ACK2）を注射された Ret- マウスの毛色は一生グレーままであった（図３B：上段マウス）。一方、アダルト RET- マウスに対して 0.5mg の ACK2 を注射しても、ほとんど毛色に変化はなかった。
これらの結果は、c-Kit 分子は恒常的に発現しているのではなく、年齢特異的に発現している可能性があることを示している。

良性腫瘍さえ発症しなかった。良性腫瘍が発症したマウスは全体の 2/3 程度であり、悪性転化をおこしたマウスはb―3）生後 24 時間以内の ACK2 投与によりコントロール40％以下であった。さらに、興味深いことに、c-Kit 機能の C57BL/6 マウス（黒色毛）の毛色はいったん完全に白が著明に低下した RET- トランスジェニックマウス（図２B：Wv/Wv-RET）では、90％以上のマウスが良性腫瘍さ色になるにもかかわらず（図４C の２）、生後 3 −４ヶ月え発症しなかった。また、悪性転化した腫瘍は全体の５％以内に 0.5mg の抗 c-Kit 抗体（ACK2）を注射された Ret-以下であった。

マウスの毛色はグレーのままである（図４C の４）。野生後には黒色毛に戻った（図４C の２）。一方、生後 24 時間型 C57BL/6 マウスと RET- マウスにおける ACK2 に対す
上記ａ−１）〜ａ−５）の結果は、１）c-Kit 分子を介る毛色の違いを説明することは難しい。筆者らは、RET-したメラノサイト増殖メラニン産生は RET 分子により一マウスでは生後 24 時間以内にほとんどメラノサイトの幹部補う事ができる可能性があること、２）メラノーマを自細胞（おそらく c-Kit を発現している）がシンクロナイズ

然発症する RET- トランスジェニックマウスの c-Kit 機能して分化するために皮膚黒色症が誘導される。しかし、野を調整することによりメラノサイト系腫瘍の発症をコント

生型マウスでは生後 24 時間以内に一部のメラノサイトのロールできる可能性があること、を示している。

幹細胞が分化するのみであるので、数ヶ月後には白髪が黒く変化するのではないかと考えている。

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コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

Tumor volumeAC(mm 3 )
15000

RET
RET ACK2(+)

10000

ACK2(-)

ACK2(+)†05000†0† * * ** * * * * *06(Months)

20

*4060

80100 (%)
MalignantBenignNo tumor*12†† † † †18

図３Ａ：抗 c-Kit 抗体 0.5 mg を生後 24 時間以内に皮下に注射された RET- トランスジェニックマウス（RETACK2(+): n=21）及び注射を受けていない RET- トランスジェニックマウス（RET: n=42）の月齢と腫瘍サイズ（*; P<0.0001、†; P<0.01）。
Ｂ：８ヶ月齢の抗 c-Kit 抗体 0.5mg を生後 24 時間以内に皮下に注射された RET- トランスジェニックマウス（上段）と同腹の注射を受けていない RET- トランスジェニックマウス（下段）のマクロ所見。
Ｃ：抗 c-Kit 抗体 0.5mg を生後 24 時間以内に皮下に注射された RET- トランスジェニックマウス（RETACK2(+): n=22）及び注射を受けていない RET- トランスジェニックマウス（RET: n=46）の悪性腫瘍（Malignant）、 良 性 腫 瘍（Benign） の 発 症 率（*; P<0.0001、†; P<0.005）（Kato M et al.
Cancer Res 64:801-806, 2004 の Fig.3 を改変して掲載）。

図４
Ａ - Ｄ：抗 c-Kit 抗体 0.5mg を生後 24 時間以内に皮下に注射されたコントロール C57BL/6 マウス（B-D: No.2） と RET- ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス（B-D: No.4）、 注 射 を う け て い な いC57BL/6 マウス（A-D: No.1）と RET- トランスジェニックマウス（A-D: No.3）のマクロ所見（Kato
M et al. Cancer Res 64:801-806, 2004 の Fig.4 を改変して掲載）。

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メラニン産生の制御機序の解析を介して新しい美白剤を開発するための研究

４

Dermatol 114: 599-601, 2000a.

結語５）Kato M, Iwashita T, Takeda K, et al. Ultraviolet light

RET と c-Kit の両チロシンキナーゼは、メラノサイトのinduces redox reaction-mediated dimerization and

増殖及びメラニン産生において相補的に作用していると考

superactivation of oncogenic Ret tyrosine kinases. Molえられる。

Biol Cell 11: 93-101, 2000.
６）Kato M, Liu W, Akhand AA, et al. Ultraviolet Radiation（参考文献）

Induces Both Full Activation of Ret Kinase and Malignant

１）K a t o M , T a k e d a K , K a w a m o t o Y , T s u z u k i T ,Melanocytic Tumor Promotion in RFP-RET-Transgenic

Hossain K, Tamakoshi A, Kunisada T, Kambayashi Y,
Ogino K, Takahashi M, Nakashima I. c-Kit-targetingimmunotherapy for hereditary melanoma in amouse

Mice. J Invest Dermatol 115: 1157-1158, 2000.
７）Kato M, Liu W, Yi H, et al. The herbal medicine Shosaiko-to inhibits growth and metastasis of malignant
melanoma primarily developed in ret-transgenic mice. J

model. Cancer Res 64:801-806, 2004.
２）Kato M, Takahashi M, Akhand AA, et al. Transgenic
Mouse Model for Skin Malignant Melanoma. Oncogene

Invest Dermatol 111: 640-644, 1998.
８）Kato M, Takeda K, Kawamoto Y, et al. Repair bySrc Kinase of Function-impaired RET with Multiple17: 1885-1888,３）Kato M, Liu W, Akhand AA, et al. Linkage between

Endocrine Neoplasia Type 2A Mutation withmelanocytic tumor development and early burst ofSubstitutions of Tyrosines in the COOH-Terminal Kinase

Ret protein expression for tolerance induction inDomain for Phenylalanine. Cancer Res 62:2414-22,

metallothionein-I/ret transgenic mouse lines. Oncogene

2002.
９）von Felbert V, Cordoba F, Weissenberger J, Vallan C,

18: 837-842, 1999.
４）Kato M, Isobe K, Dai Y, et al. Further characterization

Kato M, Nakashima I, Braathen LR, Weis J. Interleukin-6of the Sho-saiko-to-mediated anti-tumor effect on

gene ablation in a transgenic mouse model of malignant

melanoma developed in RET- transgenic mice. J Invest

skin melanoma. Am J Pathol 166:831-41, 2005.

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