マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析

サーモフィッシャーサイエンティフィック
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●マイクロアレイ技術の概要 ～ マイクロアレイ解析とは●遺伝子発現解析用ツールの紹介と使用例について●データ解析方法について

マイクロアレイ技術による発現解析

網羅的に遺伝子の発現量の増減を検出⇒多数の遺伝子の発現量を比較したい⇒ある生命現象に関わる遺伝子群の候補を見つけたい⇒全遺伝子の発現プロファイルを調べたい

スクリーニングツールとして利用して遺伝子を絞り込んでいくマイクロアレイ（GeneChip Array） の構造
フォトリソグラフィによる製造

公共データベースの配列情報等

オリゴヌクレオチドプローブが105～106コピー配置されている

Probe Cell

1.28cm6マイクロアレイ製造工程（フォトリソグラフィによる製造）

Lamp

Mask

ウェハー

Wafer

マイクロアレイを用いた実験の流れ
Hybridize

Wash & Stain

ScanSample
Preparation

Hybridization Oven

Fluidics station

Scanner

GeneChip

Data Analysis

Experimental
designGene expression & Alt-splicing

●マイクロアレイ技術の概要 ～ マイクロアレイ解析とは●遺伝子発現解析用ツールの紹介と使用例について●データ解析方法について

遺伝子発現解析アレイのラインナップ
Type

Array

発売年

特徴1

特徴2

・多くの文献報告があり、データベース登録されている・Gene-level解析用・ヒト・マウス・ラット以外の生物種にも対応

・Gene & Exon-level解析用

・Exon予測した領域もプローブをデザイン

3’ IVT 3’ IVT

2003

WT

Exon ST

2004

WT

Gene ST

・Exon ST の簡易版
1.0:2006
・2.0でlncRNA用のプローブを搭載
2.0:2012
・Gene-level解析用

WT

HTA2.0
MTA1.0
RTA1.0・ヒト・マウス・ラット以外の生物種にも対応
・一部のArrayはlncRNA解析にも対応

2013

・Exon-Exonのjunction部分にプローブ ・Alternative splicing解析に適するをデザイン・lncRNA解析も可能
・Gene & Exon-level解析用・デザインに使用したデータベースが新しい・Alternative splicing解析に適する・lncRNA解析も可能
・デザインに使用したデータベースが新しい・安価

WT

Clariom™ D2016

・HTA2.0の進化系
・MTA、RTAは製品名変更のみ
・Gene & Exon-level解析用

WT

Clariom™ S2016

・Clariom Dの簡易版
・Gene-level解析用

過去に取得したデータと比較解析が必要な場合

新規実験におすすめ次世代型マイクロアレイ～Clariom Array～
用
途に応
じて
2種類のフ
ォ❘
マット
が
選
択
可能

・既知の転写産物の網羅的な発現解析を行いたい・Long non-coding RNAの発現や選択的スプライシングの違いも見たい

Content summary
GenesTranscripts
Exons
Exon-exon splice junctions
Total probes
Probes targeting exons
Probes targeting exon-exon
splice junctions

Human>134,700>542,500>948,300>484,900>6,765,500>4,781,200>1,984,300・コストを抑えて既知の遺伝子のみの発現を解析したい
・Long non-coding RNAまで解析
対象ではないContent summary
Genes

Human
>20,800

Transcripts>337,100

Total probes>211,300

Probes targeting genes>205,800

Clariom Arrayシリーズは、ヒト・マウス・ラットの解析に対応！

アレイデザインの比較
Example: COCLA2
Colorectal Cancer Associated 2 Gene

Clariom Array

転写産物全領域に渡って特異的なプローブを複数デザイン

Clariom D
全転写領域に渡ってエクソンごとにプローブをデザイン
エクソンジャンクション部にもプローブがある
ため、選択的スプライシングの解析が可能

Clariom S

これまでのMicroarray
3’末端にプローブを配置しているため、解析できない転写産物アイソフォームもある

3’ IVT

転写領域の重なりが最も多い部分をClariom Dのプローブの中から選択。

3’末端側より600ntの範囲で特異的なプローブを複数デザイン

Assay kits for sample preparation

WT assay kit

TargetRNA amount

GeneChip® WT PLUS Reagent Kit

FF

50-500 ng

GeneChip® WT Pico Reagent Kit
GeneChip® Pico Reagent Kit

微量RNA
FFPE

100 pg -10 ng
500 pg -50 ng• total RNAから事前にrRNAやGlobin mRNAの除去を行う必要はない⇒ Plus 、Pico• 100 pgのtotal RNAからアッセイが可能⇒ Pico• 核酸の分解が進行しているFFPE由来サンプルでもアッセイが可能⇒ PicoWT Pico Kit assay workflow

Software: Transcriptome Analysis Console（TAC）

Primary Analysis

Secondary Analysis

・プローブセットのシグナル強度
・データQCの確認

・遺伝子発現変動の検出・選択的スプライシング解析

Scatter Plot

Volcano Plot

Recommended
PC
スペック

Minimum

Hierarchical Clustering

Alternative Splicing

Pathways

RNA-Seq and Expression Arrays:
Selection Guidelines for Genome-Wide Expression Profiling

アプリケーションや解析目的に応じてMicroarrayとNGSを使い分けることが相乗的に効果的
Minnier J., et al., Gene Expression Analysis, Methods and Protocols, 2018, 7

FFPEサンプルの場合、Microarrayでは専用のアッセイキットを使用してtotal RNAからデータ取得できるが、NGSではtotal RNAの前処理と量が必要になり、解析にも工夫が必要
Stokes T., et al., Advanced Genetics 2023, 2200024

Clariom D Arrayを用いたFFPEサンプルの解析
・脳、腎臓、肺、卵巣、胃の腫瘍生検（FFPE）由来total RNAをClariom D, humanで解析⇒各組織ごとにクラスター化され、同様の発現レベルを示す
・各組織や各腫瘍での特異的な発現パターンがHuman Protein Atlasの公開データと一致⇒LIPF, GIF, GKN1, PGA4：胃腫瘍検体で高発現
SLC1A2, GFAP：脳腫瘍検体で高発現lncRNAの発現プロファイルにおいても公開されたデータと一致性がある
・脳腫瘍 vs 腎臓腫瘍で発現差の高い18遺伝子をTaqManアッセイ（best coverage）で検証⇒2つのプラットフォーム間での相関性が認められるApplication Note: Whole-transcriptome analysis of FFPE samples using Clariom D Assays

進行性尿路上皮癌（aUCC）におけるビンフルニン耐性メカニズム解析（Clariom S, human）

・aUCC：プラチナベースの化学療法 ⇒ ビンフルニンによる維持療法⇒ビンフルニン耐性を示すケースがあるが、メカニズムは不明
・予後良好：9、予後不良：8のFFPEサンプルをClariom S, humanで解析⇒予後良好～downregulate：18、upregulate：13
・GSEAより、予後良好において上皮間葉転換（EMT）とIL6/JAK/STAT3 pathway|FC| > 1.5、 p ≦ 0.05 でFilteringがdownregulate⇒細胞をクルクミン処理でEMTを抑制することでビンフルニンに感作

マイクロアレイ解析で予後良好・不良検体間で発現差のある遺伝子を特定 ⇒ ビンフルニン耐性メカニズムと対処療法の可能性を示唆
Font A., et al., Cancers, 2021, 13, 6235

悪性転換に関するバイオマーカー探索（Clariom D, human）

HIF1A

・エナメル上皮癌（AC）はエナメル上皮腫（AB）の悪性型・ABの悪性化に関連するメカニズムをClariom D, humanで解析
・ACでupregulateしている中からGO termsを使用して、低酸素誘導因子サブユニットHIF1Aとジンクフィンガー転写因子ZEB1に着目
・免疫組織化学解析においてもHIF1AとZEB1はACで有意にupregulate・低酸素状態で誘導されるHIF1AとZEB1でTGF-bが誘導され、上皮間葉転換（EMT）を介したABの悪性転換に関与

マイクロアレイ解析で悪性転換前後検体で発現差のある遺伝子を特定 ⇒ 該当遺伝子群から悪性転換に関わる経路を示唆
Yoshimoto S., et al., Cancer Medicine, 2019, 8, 7822

●マイクロアレイ技術の概要 ～ マイクロアレイ解析とは●遺伝子発現解析用ツールの紹介と使用例について●データ解析方法について

TACを使用したデータ解析の流れ

解析画面が展開される

スキャナーで取得したマイクロアレイデータ（CELファイル）をインポート
PCにインストールしたTACを起動

解析対象の各データを群分けし、Run Analysisボタンをクリックして解析
解析結果の確認

解析進行中

一連の操作は単純で、簡単に結果を導くことが可能

Primary Analysis：Quality control of expression data
疑問点:
▪ ハイブリダイズは成功しているか？
▪ それぞれのサンプルのクオリティはSecondary Analysisを始めるに際して、実験群に含めても問題ないか？

解決法:▪ Primary Analysisによって、サンプル調製実験の状況を明らかにし、はずれサンプルOutlierを見つける
同条件サンプルとの間に同傾向があるかどうか
Secondary Analysisの群間解析等に進めるデータかどうかを判断Primary Analysis： Quality control of expression data
PCA

Labeling Controls

Signal Box Plot
Hybridization Controls

Pos vs Neg AUC

Summary View

Gene View – Scatter Plot

Plot内のdotを選択するとGene Table内の該当するProbe Setがハイライトされる

Plot内のdotを選択するとGene Table内の該当するProbe Setがハイライトされる

Txtファイルでexport可能

PNG formatでexport可能

Gene View – Volcano Plot

Txtファイルでexport可能PNG formatでexport可能

Gene View – Hierarchical Clustering

PNG formatでexport可能

ズームイン

表示は ≦ 5,000 genesに絞り込む必要がある ⇒ Fold Changeやp-valueのフィルタリング条件変更

Gene View – WikiPathways

PNG formatでexport可能

Communityによって構築されているパスウエイデータベースとリンク（インターネット接続が必要）

2つの解析結果から共通の発現変動遺伝子を抽出（Venn Diagramの利用）

199 genes

1,569 genes

2つの解析結果から共通の発現変動遺伝子を抽出（Venn Diagramの利用）①：チェックを入れる②：Nameを入力後、OKをクリック

2つの解析結果から共通の発現変動遺伝子を抽出（Venn Diagramの利用）

Clariom D Array：Alt-Splice View

PNG formatでexport可能

Interaction Network Graph
同じRNAサンプルを使ったmRNA解析データとmiRNA解析データを統合

PNG formatでexport可能

TaqMan AssayとClariom Arrayとのマッピング

TaqMan AssayとClariom Arrayとのマッピング

TACの使い方の動画リンク（YouTube）

TACの使い方： 第1回データ解析の準備と手順
https://www.youtube.com/watch?v=nruX6biI_L4
TACの使い方： 第2回QC結果の確認
https://www.youtube.com/watch?v=r9QvATvPgCE

TACの使い方： 第3回遺伝子発現解析の手順
https://www.youtube.com/watch?v=_9eDxzIIsYI
TACの使い方： 第4回TACの便利な機能
https://www.youtube.com/watch?v=5ZbL0XZ7oCg

マイクロアレイ解析についてご不明な点がございましたらサーモフィッシャーサイエンティフィック テクニカルサポートまでお気軽にお問い合わせください。
テクニカルサポート
TEL：0120-477-392（マイクロアレイ製品 ダイレクト番号:5）
受付時間：月曜日～金曜日 9:00～17:30
Email：jptech@thermofisher.com

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