オリゴヌクレオチドのナノデリバリーシステムを用いたアレルギー予防食品素材の開発

下里剛士

信州大学ファイバーナノテク国際若手研究者育成拠点 特任助教
（現 信州大学大学院農学研究科・総合工学系研究科 准教授）

緒言ラジックス社）との連携によりナノ粒子を用いた ODN

微生物由来のゲノム DNA や、その配列に基づき化学のカプセル化というアイディアの着想に至り、酸耐性を合成された、非メチル化 CpG オリゴ核酸（CpG ODN）有する ODN マイクロカプセルの開発を進めてきた。ナは、感染症、ガン、アレルギー、炎症性疾患の予防およノ粒子へオリゴ核酸を包摂することで、未だ解明されてび治療などを目的としたワクチンアジュバント分子としいないオリゴ核酸の経口投与による効果が得られれば、て期待されている 1,2）。2000 年に CpG ODN の受容体

微生物由来の機能性 ODN を新たな機能性食品や飼料素として TLR9 が同定され 、免疫系における CpG ODN材として提案できる。また、優れたワクチンアジュバンの作用について飛躍的に理解が進んできている。さらにトとして、医薬分野における利用性が大いに期待できる。

近年、免疫原性核酸による免疫活性化機構において、様々我が国では、昨今の健康ブームから国の認証を受けた特な核酸結合タンパクを介する機構が発見され、高等生物定保健用食品に対する興味・関心が高まってきている。の有する複雑な自然免疫機構が明らかになりつつある。

現在、健康食品および機能性食品（特定保健用食品、栄また、塩基同士の結合部位をチオール基（S 基）で養機能食品、サプリメント、機能性飲料・菓子など）の修飾するホスホロチオエート結合を導入することで、市場規模は、2 兆円にのぼる。オリゴ核酸は、ヒト腸内ODN を分解から保護できることから、ODN 研究ではに豊富に存在する微生物細菌に由来することからも、消一般的に S 化修飾 ODN が用いられている。これまでに費者意識に配慮した新素材として、新しいマーケットをS 化修飾 CpG ODN を用いて、様々な疾病予防試験が創造できる可能性が高い。本研究は、強力な免疫調節作

in vivo レベルで行われており、投与方法としては、①用を有するオリゴ核酸を、ナノテクを駆使した経口デリ腹腔内投与（i.p.）、②鼻腔に滴下などの手法が一般的で、バリーシステムの構築により新規機能性食品・飼料素材③尾静脈注入による投与（i.v.）例もある。CpG ODNとして提案するための基礎研究であり、21 世紀予防医の投与量としては、100 μg 以上 / マウス 1 匹といった報学の時代に先駆け、農学分野から健康維持・増進のため告が多い。の新規な機能性素材開発のための基盤構築を目指すもの

3）

である。

しかしながら、薬剤や食品素材の in vivo トライアル試験において通例となっている、経口投与による知見はほとんど報告が無く、CpG ODN の発見から 20 年を迎実験方法

えようとしている中で、食品科学分野における価値を見

1ODNの合成ODN の 合 成 は Integrated DNA Technologies, Inc出すまでには至っていない。すなわち、CpG ODN は優（Coralville, IA, USA）社に合成を外注委託した。

れた免疫機能を有しながら、経口的に摂取すると、胃酸・GpC ODN, ODN1612, 5'-G*C*T*A*G*A*G*C*T*T*

や消化酵素の影響により分解されてしまうという最大の弱点があり、これまで経口投与による試験はほとんど行

A*G*G*C*T-3' 4）・CpG ODN, MsST, 5'-C*A*G*G*A*C*G*T*T*G*T*

われてこなかった。
そこで、筆者らの研究グループは、ODN の経口投与

A*T*C*A*C*T*G*A*A-3ʼ 5）・inhibitory ODN（iODN）, iSG3, 5'-C*C*T*C*A*T

において大きな障害となっている胃酸の問題をクリアーするため、バイオマテリアル分野のベンチャー企業（セ*T*A*G*G*G*T*G*A*G*G*G-3ʼ 6）
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下里剛士

用いて電気泳動に供した。泳動後、ゲルはSYBR gold

以上の Phosphorothioate（PS）bond ODN を合成しで15min染色し、ゲルイメージャーにより観察した。

た。なお、* は PS bond を示している。

検出されたバンドの大きさ、および濃さから判断して2ODNの最適濃度は5 µg/wellとした。次に、CaイオンのODN-炭酸アパタイト粒子複合体（ODNカプセル）の合成

キレート剤としてEDTAを用いてカプセル成分を崩壊さ

ODN- 炭酸アパタイト粒子複合体（ODN カプセル）

せ、ODNが溶出する濃度を検討した。Final 250mMかの合成は、有限会社セラジックス社に委託した。ODN

ら0.4mMまでEDTAを次々と1/5段階希釈し、ODNカプのカプセル化については、契約の関係上ここに記載できセルを処理した。処理後、3%アガロースゲルを用いてないが、ナノサイズのカルシウム粒子に ODN が吸着し、マイクロサイズにまで成長させた上で、凍結乾燥させた（図 1A）。EDTA のような金属キレートには速やかに溶解するという化学的特徴がある（図 1B,C）。
3

カプセル化によるODN保護作用の検証
反応に用いる Naked ODN および ODN カプセル中の ODN 濃度は 5 μg とした。ODN 5 μg を 0.6mL チュー
ブにとり、DNA 分解酵素、強酸（pH2.0）、強アルカリ（pH12.0）、高温・高圧処理（オートクレーブ , 121℃ ,20min）で処理した。その後、50mM EDTA によりカプセルを溶解し、3% アガロースゲルにて電気泳動に供した。
4ODNカプセルの免疫特性解析
C57BL/6 マ ウ ス、4 週 齢、 雄 マ ウ ス は 日 本 エ ス エルシー株式会社より購入し、6 週齢から実験に使用した。C57BL/6 マウスを、頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出、脾臓細胞を調製した。マウス脾臓細胞を12well plate に 2x106cells/well で 播 き、37 ℃、5%CO2条 件 下 で 3hr 培 養 し た。 そ の 後、GpC ODN、GpC
ODN カプセル、CpG ODN、CpG ODN カプセル（3.0µM）
で刺激し、6 hr 後の細胞を回収した。マウス脾臓細胞から Total RNA を 回 収 し、Total RNA と Prime Script®

図1

RT reagent Kit を用い、逆転写反応により cDNA を合成した。cDNA を鋳型としてマウスβ -actin プライマーとマウス IL-6 プライマーを用いて、リアルタイム PCR法により発現解析を行った。
結1

果ODNカプセルのアガロースゲル電気泳動最適濃度の検討

A. ODN カプセル（凍結乾燥品）画像 , B. ODN
カプセル /PBS 懸濁画像と EDTA(50mM) 溶解画像 , C. ODN 溶解条件の検討 . ODN カプセルが溶解し , ODN が溶出する EDTA 濃度の検討を行った . EDTA を 250, 50, 10, 2, 0.4, 0.08mM になるよう段階希釈し、3% アガロース電気泳動を行った .
ODN は一本鎖 DNA であることから , 一般的なエチジウムブロマイドによる染色ではなく , 一本鎖核酸を染色することができる SYBR Gold を用いて染色した。

電気泳動に供した。泳動後、ゲルはSYBR goldで15min染

アガロースゲル電気泳動に用いるODNの最適濃度を色し、ゲルイメージャーにより観察した（図1C）。検出さ検討した。PS-ODNの濃度を25 μg/wellから0.008 μg/れたバンドの大きさ、および濃さから判断して、カプセルwell まで次々と1/5段階希釈し、3%アガロースゲルをのバーストに用いるEDTA濃度は50mMとした（図1C）。
2

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カプセル化によるODNの保護作用

CpG ODN により誘導された IL-6 mRNA の発現を有意

DNase に よ る 耐 性 試 験 で は、DNaseI（100U/mL）に抑制した（図 3B）。

で 37℃ ,16hr 処理した結果、Naked ODN と比較して
考ODN カプセルはより濃いバンドが検出された。強酸に察よる耐性試験では、HCl 溶液（pH2.0）で 37℃ ,16hr

ODN や siRNA、さらにはプラスミド DNA など、核処理した結果、完全に壊れた Naked ODN と比較して酸成分の細胞へのトランスフェクションには、カチオンODN カプセルはバンドが検出された。強アルカリによ性リポソームなどの脂質分子が長年利用されてきた。しる 耐 性 試 験 で は、NaOH 溶 液（pH12） で 37 ℃ ,16hr

かしながら、脂質性のトランスフェクション試薬は非常処理した結果、Naked ODN と比較して ODN カプセルに高価であることから、近年では、ポリケタル粒子、金は同レベルのバンドが検出された。高温・高圧による耐ナノ粒子、カーボンナノチューブや四塩化ケイ素ナノ粒性試験では、121℃ , 15min（オートクレーブ）処理し子と核酸成分との結合・包接技術が開発され、哺乳類細た結果、バンドが検出されなかった Naked ODN と比胞への新たな遺伝子導入技術として期待されている。と較して ODN カプセルはバンドが検出された（図 2）。

くに（1）DNase による分解から ODN を保護する（2）ODN の生体内における滞留時間を延ばす（3）ODN のODNカプセルの免疫特性解析

エンドサイトーシスによる取り込み効率の向上（4）標C57BL/6 雄 マ ウ ス か ら 脾 臓 細 胞 を 調 製 し、CpG的細胞に ODN を届ける（5）長い時間をかけて ODNODN、コントロールとして GpC ODN、GpC ODN カをゆっくりと運搬体の外へと放出する（6）ODN 量をプセル、CpG ODN カプセルで 6 時間培養後、リアル抑えることによるコストダウン、以上のような ODN のタイム PCR 法を用いて炎症性サイトカインである IL-6優れた運搬媒体が検討されている。本研究では ODN のを測定した。GpC ODN と比較して、CpG ODN では経口投与を目指すことから、以上の検討課題に加え、胃naked も capsule も IL-6 の 発 現 増 加 が 見 ら れ た（ 図酸を想定した強酸試験を評価項目に加えた。

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まず初めに、ODN カプセルのアイディアを達成する3A）。さらに、免疫抑制型 ODN の iSG3 カプセルは、

図2

カプセル化による ODN 保護作用の検証 . A. 無処理 , B. DNaseI 処理（100U/mL,37℃ , 16hr 処理）、C. 強酸処理（HCl 溶液（pH 2.0）で 37℃ , 16hr 処理）、D. 強アルカリ処理（NaOH 溶液（pH 12.0）で 37℃ , 16hr 処理）、E. 高温・高圧処理（オートクレーブ、121℃ , 20min 処理）。処理後、50mM EDTA によりカプセルを溶解し、3% アガロースゲルにて電気泳動に供した。ODN(naked)：カプセル化していないODN, ODNcap：カプセル化 ODN.

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下図3

里剛士

マウス脾臓細胞における CpG ODN カプセル（A）および免疫抑制型（iSG3）ODN カプセル（B）による刺激による IL-6 の発現解析。GpC: ODN1612（免疫刺激性の無いコントロール ODN）4）、Cap：カプセル , ODN（naked）: カプセル化していない ODN,ODNcap: ODN カプセル、CpG：Streptocococcus thermophilus 由来 ODN（免疫刺激性有り）5）、iSG36）: 免疫抑制型 ODN. 異なる英文字で示された記号（i.e. a, b, c）は有意差あり（P<0.01）を示す。

ため、遺伝子導入用ナノ粒子「アパキャリー１」の開発

カプセル化により、すべての評価項目において優れ実績があるベンチャー企業セラジックス社との交渉を開た ODN 保護作用が認められた。とくに、胃酸を想定し始した。さらに、横浜市立大学医学部付属病院 佐藤隆

た強酸（pH 2.0）による耐性試験では、HCl 溶液（pH博士を加えた研究チームでディスカッションを重ね、理2.0）で 37℃ , 16hr 処理した結果、完全に分解が進んだ

論上 [10 μg ODN]/[mg 複合体 ] で炭酸カルシウム粒子にNaked ODN と比較して、ODN カプセルでは ODN を包摂することが可能であるとの結論に達した。納品形体示すシグナルが検出された。このことは、ODN カプセは、乾燥パウダー 1 グラムとし、試験の際には PBS 等

ルは胃酸による消化に耐え、十二指腸、小腸へとデリバのバッファーで洗浄・再分散させた後、実験に用いるこリーされる可能性が高まったことを示している。しかし、ととした。粒子の合成には、[ 試薬調製→エマルジョン

カプセル化により ODN の免疫機能性が失われていない作成→溶媒留去→光散乱によるサイズ測定→粒子の洗浄かどうか確認する必要が生じた。そこで、マウスから脾と乾燥→納品 ] の流れで、打ち合わせ期間も含めて約 3 ヶ臓細胞を調製し、CpG ODN およびコントロールとして月間を要した。以上の過程を経て、コントロール ODNGpC ODN、GpC ODN カプセル、CpG ODN カプセル（ODN1612 ; 免疫系に対する影響のない ODN）と乳酸菌で 6 時間培養後、リアルタイム PCR 法を用いて炎症性由来 CpG ODN（免疫系に対する刺激性を有するもの）サイトカインである IL-6 を測定した。その結果、GpCを、炭酸アパタイト粒子に包摂することに成功した。最ODN と比較して、CpG ODN では naked も capsule も終収量は、コントロール ODN カプセル、CpG ODN カ

IL-6 の発現増加が見られた。このことは、ODN が完全プセルともに約 1.0 g で、それぞれ 10 mg の DNA を包にカルシウム粒子によって覆われていないことを示唆し摂することに成功した。同カルシウム粒子 -ODN 複合ている。また、ODN カプセルを作成する際、負の電荷体を、「ODN カプセル」と名付け、カプセル化によるを帯びた ODN を、正の電荷を帯びたナノサイズのカルODN の保護作用について詳細に解析を進めた。

シウム粒子の表面に吸着させ、その後ゆっくりと 37℃で4

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マイクロレベルにまで成長させたため、一つ一つの粒子

ODN（Phosphorothioate ODN, S化修飾ODN）とがマイクロサイズであることが、電子顕微鏡画像からも

ODNカプセルをDNA分解酵素, 強酸, 強アルカリおよび明らかとなった。すなわち、ODN カプセルは、細胞培オートクレーブにて処理し、カプセル内のODNの安定養液中において溶解することなく、粒子表面に存在する性について電気泳動に供することで評価した。さらに、ODN が、免疫細胞を直接刺激したとものと考えられる。

ODNカプセルとNaked ODNを用いてマウス免疫細胞

本研究で開発した ODN カプセルは、様々な ODN 配を刺激し、IL-6遺伝子の発現量について定量的PCR法列に対応したカプセル調合が可能である。CpG ODN がにより解析した。【結果】Naked ODNと比較してODN

免疫細胞を刺激し、免疫全体のベースラインを上げる働

カプセルは、DNA分解酵素、オートクレーブ処理に対きがあることに対して、近年研究が進みつつある免疫抑して非常に高い耐性を示し、強酸処理により緩やかに分制型 ODN は、免疫全体のベースラインを下げる働きが解された。すなわち理論上、安定的に腸管局所にデリバある 。すなわち、使用目的に応じて ODN を使い分け、リーされる可能性が高まった。さらに、CpG ODNカプ

様々な疾病モデルマウスを想定し、今後は ODN カプセ

セルは、Naked CpG ODNと同様にIL-6 mRNAの発現ルの経口投与試験を進めていく必要がある。また、蛍光量を増加させたことから、カプセル化により免疫刺激性ラベルした蛍光 ODN カプセルを用いて、経口投与試験は失われないことが明らかとなった。

6）を実施し、ODN カプセルの腸管粘膜内における挙動、謝局在性、さらには標的細胞を明らかにする必要もある。

辞ODN カプセルの将来性は、今後の in vivo 試験の結果

本研究は公益財団法人三島海運記念財団の平成 24 年如何にかかっており、ODN カプセルが優れた機能性素度「学術研究助成金」により行われました。研究助成を材として利用される日が訪れることに期待したい。

賜りました公益財団法人三島海運記念財団ならびに関係者の皆様に心より御礼申し上げます。

要約【目的】 微生物ゲノムDNA配列に基づき化学合成さ参考文献

れたオリゴ核酸（ODN）は、様々な疾病の予防および1）A. M. Krieg, et al,: Nature 374,546-549,1995.
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治療を目的としたワクチンアジュバントとして期待されている。しかし、ODNを経口摂取すると、胃酸の影響により分解されるという最大の弱点がある。本研究では、炭酸アパタイトナノ粒子へODNを包摂した耐酸性ODNカプセルを作出し、ODNの経口投与試験に向けた基礎的知見を得ることを目的とした。【方法】Naked

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