植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究
ー特に Forskolin 原料植物 Coleus forskohliiについて 一
正

九州大学

山

薬学部

征

洋

The effective range of the competitive ELISA for detection of forskolin content in clonallypropagated plant organs of Coleus fo岱kohlii using monoclonal antibodies extends from 5ng/ml
to 5µg/ml.
Shoot tips of C. fo冗kohlii were cultured repeatedly on the MS medium supplemented with
NAA(0.5mg/l) and BAP(0.5mg/1) at 25℃ under the 16hr irradiation for 1 month to form multipe
shoot complex. A correlation between the forskolin accumulation and the growth rate wasinvestigated using the clonally propagated shoots. An increase of forskolin content was noted,
begining at week 6. Flowers, rachises, leaves, stem, tuberous roots and roots were analyzed.
Tuberous root and the stem base contained a higher amounts of forskolin than other organs. The
forskolin content in the stem decreased gradually towards the top of the shoot. Quantitative
determination of forskolin content in the plants cultivated in different temperature wasinvestigated by ELISA. The temperature clearly affected the production of forskolin,demonstrating that the contents of forskolin was highest at 20℃ than at 15℃ and 30℃
An immunoaffinity column chromatography using anti-forskolin monoclonal antibodies
appears to be far superior to previously published separations based on crystallization andchromatography.The capacity of the column is 9µg/ml of gels.Forskolin has been isolated
directly from the crude extractives of tuberous roots and the callus culture of C. forskohlii.

1

緒

言

種の作出等の育種研究を行ってきた。 これら研究の延長線上には各種耐性品種、 例えば耐病性品種

生薬の90%以上を輸入に依存し、 その内の約の育成がタ ー ゲットとなり、 この目的を遂行する

80%は自生種により賄われているという。 この現ため に溶菌酵素遺伝子の導入実験等を行って い

実は何を意味するのであろうか。 一つには資源のる。 一方有効成分の高含有品種の育成も重要であ枯渇が浮上してきている。 それと同時に医薬品でる。 高含有品種の育成を達成するためには、 簡便

ある が故に品質に大きな差が生じ、 製剤の力価にで高感度かつ再現性に優れたアッセイシステムの影響を及ぼす事が容易に想像出来る。 我々は漢方構築が要となることは周知の事で、 このため種々処方に繁用される半夏、 地黄、附子、 粛類、 人参の有用成分 に対するモノクロ ー ナル抗体(MA b)

類や竜胆、 淫羊、 当薬等の原植物に付いて、 上記2点をクリヤーすべく、 バイオテクノロジーの手の作成とそれ を用 いるEnzyme Linked Immuno
Sorbent Assay (ELISA)を確立すべく研究を行っ法により、 ウイルスフリー 品種の育成、 掏質な品ている。
F o r s k olin はインド地方 に自生するColeos/orsko/JJjj (シソ科）の根茎に含有されるラプダ

Productionofbioactivecompoundand
breeding of medicinal plants by planttissue-cell culture-Study on Coleus
forskohlii that produces forskolin

ン型ジテルペンである。 本植物はアユルベーダに

Yukihiro Shoyama

単離された 1) 。Forskol inはadeny1 cyclaseを強Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kyushu University

力に活性化しcAMPを増加する作用メカニズムが明も収載され、 心臓病、 呼吸器疾患、 不眠症等に適用されてきた。 近年活性成分としてforskol inがらかとなり 2) 、 医薬品素材として注目されるに-28-

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特に Forskolin原料植物必/ells forskolJ/ii について至っている。 また、forskolinの著しい色素 細胞

ウスミエロ ー マ 細胞のハイプリド ー マを調製し化 現象が知られているが、この現象を コス メトロ

た。 ハ イプリド ー マのコロニ ーが成長した段階でシーに応用しょうとする試みは皆無である。

培養上清について、forskolin ー ヒト血清アルプ

Forskol inは分子内に アシメ炭素を8ヶ有する事

ミン(HSA)を用いてELISAを行い、陽性コロニ ーから光学活性 体を合成することは極めて困難と考を選抜し 、タイ プとサプタイプを決定 し た

えられる。 このため天然資源から抽出単離を行っ(Table. l)。 ハイプリド ー マ1A9をスケ ールアップている現状である。 また、C. forsko/Jfjjの培養細しproteineAアフィニテイ ー カラムで精製し、MAb

胞からforskolinを生産する研究が行われているを得た。

が、その含量の点から現状のまま
では実用化の可能性は極めて小さいと目されている。 かか る現状

2. ELISAの確立

からforskolin 高含有C. forsko.カJjj品種育成を目

96穴のイム ノプレ ー トにlOOng/rnlのforskol in的としたforskolinのアッセイ 系を構築するため

HSAを1 0 0µlずつ添加し、インキュベ ー ト後、の抗forskolin MAbの作成が必須と なろう 。 本 研

geratin-PBSでプロッキングした。 本プレ ー トに

究では抗forskolin MAbの作製とそ れを用いたfo

各種濃度のfo r s k oli n 溶 液10 0µlと M A b 溶 液

rskolinの高感度なアッセイ系としてELISAを確立(0. 7µg/m I) 50µlを加えてインキュベートしまた一 方ではC. forsko.ヵJjjの培養系を検討た。 洗浄後peroxidaseでラベルした抗マウスニ次

し、 高含有株選抜の手法を確立した。 更に 抗for抗体の千倍希釈液を添加し、1時間インキュベー

skol in MAbを用いた抗体 カラムを 作製し、栽培株トした。 洗浄後基質を添加し15分後に発 色をプレや培養細胞の租エ キスからforskolinをダイ レクーした。

トリ ーダーで測定した。

トに精製出来る方法を開発した。
3. アフィニテ ー カラムの作製

2

実

験

精製したMAb (10mg)のPBS溶液を活性 化CN Br­
Se pharose 4B (600mg)ゲルに加え、室温下2時間

1. 抗forskolin MAb の作成 l . ,,反応した。 反応後未反応甚を グリシンでプロッキ

Forskolinは、免疫源とするためにsuccinateをングし、NaHCOa-NaCI溶液で洗浄した。 遠心し て

リンカ ーとして牛血清アルプミン(BSA)と結合ゲルを集めPBSで洗浄後カラムに充填し、アジトした。 マウスに免疫後、常法により牌臓細胞と マナトリウム溶液を加え保存した。

Table. 1

MAbs
1A9
4G12
9D12
9E12
11A9
12F9

List of monoclonal antibodies
again:;t forskolin.

lsotype
G1
G2b
M
M
M
M

Light
chain

4. アフィニテ ー カラムによる粗抽出エキスから
forskolinの単離
根茎、培養カルスの乾燥粉末(10mg)をジェチ
ルエ ー テルで5回抽出 。 溶媒を留去後メタノ ール

1Cに溶解し、PBSで 16倍に希釈した。 溶液をろ過後、K

アフィニテ ー カラムに添加し、4℃で90分放置後、

1(

洗浄液で繰り返し洗浄した。 過剰のfors-kolinがK流出しなくなったら溶出液(45%メタノ ール 含有

1(PBS)で forskolinを溶出した。

1(

-29-

5

2. 抗forskol in MAbの作成

C. forskoll/りの培養、

C. forsko/J!iiの成長点を無菌的に摘出し、NAA,

直接ELISAでスクリ ー ニングしたところ、 ハ イ

BAP (0.5mg/l)添加MS培地へ置床し、25℃, 16時

プリド ー マ1A9が感度の点で最も優れている事が間日長、1か月培養した。 増殖 したシュ ー ト切片

判明したのでスケ ー ルアップしproteineAアフィ
Jを同一条件下で繰り返し培養した。 増殖シュ ート
をホルモン無添加MS培地で同一条件にて培養し発根させてクロ ー ン植物を得た。
6��uupunqv[M+H]'

C. forsko力／りの栽培

上記のクロ ー ン植物をバイオトロンの各温度室(15、20、30℃)と圃場にて栽培した。

結

3

1.

10000

果

結果、 従来は間接的な測定手段でのみ確認されてきたハプテン 一 蛋 白 コンジュ ゲートで あるforskol inとBSAの結合が極めてクリア ー にされ、結合 モル数を算定することが可能となった。

“辺310000

410000Fig. 2 MALDI mass spectrum of monoclonal
antibody against forskolin

Forskolin-BSAコンジュゲー トをMALDIマス

スペクトルで分析したのがFig.1である。 この2i0000110000

ニテイ ー カラムで精製した。Fig,2は精製したIgG(MAb)のMALDIマスで、 ほぼ純粋な蛋白であることが窺える。

；二

3. ELI SAの確立 4, 5)精製したIgGを用いて競合によるELISAから検量線を作成したのがFig.3である。5ng/ml-5µg/ml
1.0

0.8

E uso�) aoueqJOsqe(

8 uepunqv

0.6

OA

0.2

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

＼

90000

m/2

Fig. 1

：

。｀

o.o 0
J0

lO I

10

2

10

3

concentration (ng/ml)

MALDI co-mass spectrum of forskol1n
BSA conjugate and BSA

Fig_ 3-30-

Calibration curve of forskol1nlO｀

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特にforskolin原料植物wle11s /orsko/Jliiについて

Fig. 4R2
H ACH

forskolin
1-deoxyforskolin(1-DF}
1,9-dideoxyforskolin(1,9-DDF)
6-acetyl-7-deacetylforskolin(6-A-7 DF}
7-deacetylforskolinfl-DF)

H
RH H O

R4
OHOHH OHH

RlACACACH H

凡 H H H ACH

R OHH H OHOH

R1

PS-3
PS-4
PS-7

St ructu r e s of forskolin andrelated diterpenoidsの範囲内で良好な直線性が得られ充分に定量が可果をFig, 5に示す。2週目からforskol in が生合成能である事が明らかとなった。Fig. 4にforskokin

されるが5週目までは0. 01µg/mg dr. wt. 以下と、の類似化合物の構造とTable. 2にcrossreactionを非常に低い値であった。 根の成長が盛んとなる6示している。この結果7-deacetyl forskol in の

週目から含量が暫時増加し、 茎が急速に成長を始

cross-reactionが5. 6%である他は殆ど問題にな

める11週から含量増加が著しくforskolin含量が0. 5g/mg dr. wt. となり、12週では0. 7g/mgdr. wt.

Table. 2

Cross reactivities determinedusing forskolin analogs.

1-DF
1,9-DDF
6-A-7-DF
7-DF
PS-3
PS-4
PS-7

0.63
1.30
1.13
5.57

0.8

E

Cross reactivity(%)

MP 6 /6TI) U!I
I(

Analogs

1.0

0.6

』

, a6EJa.eou
I1
gs Oj jO5

゜゜゜

らない程度低 かった。 このことから本ELISAは
forskol inに特異的でかつ高感度な 定量法である事が判明した。

0.4

0.2

0.0

以上確立したELISAを用いて C. /orslroヵiiiにお

10

11

12

week after transplantation

けるforskol inの挙動を詳細に検討した。
Fig. 5

4. 成長過程におけるforskolinの消長培養により得られたクロ ー ン植物を土壌に移植、栽培し、 forskolin含量をELISAにより追跡した結-31-

Average content of forskol 1n ,nthe cl onally propagated C oleus
forskohl ii plant according t o
growth stage

Leaf 0.003-0.011

unit: µg/mg
1.92

Fig.6

Distribution of forskol1n 1n one­year-old Coleus forskohlii

5. 部位によるforsko Ii n含量の変動に達した。 なお葉にはforskol inを含有しないこ

20 ℃室でクロ ー ン植物を 1 年間栽培し、 Fig. 6にとが明らかとなった。

-32-

植物培養細胞•組線による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特に Forskolin原料植物 Coleus forskoblii について示す通りの各部位別にサンプリングし、凍結乾燥で栽培し、成長度を調査し、また個体の根茎をした ものを ELISA によりアッセイした。この結果

Table 3に示す如く切断し、乾燥後forskolin含量

花、 花柄等には殆どforskolinは含まれないことをアッセイした結果がTable. 3である。

が明らかとなった。茎には0. 3-4µg/mg dr. wt. の

この結果、特に根茎の生育は20℃が最も良好

マイクロ変動が認められた。茎においては根茎とで、30℃区がこれに続いている。Forskolin含量の境目が最も含量が高く、 上部程低含量であっについても20℃区が最も高く、30, 15℃の順で

た。

あった。

一方根茎においては茎との境界部位が含量高

く、下方程低下することが明らかとなった。また、枝についても同様に大きな変異が認められた。

7. アフィニテ ー カラムの作製とその応用 ”
Forskolinは殆ど水に不溶なのでアフィニテー

cortex0.84µg/mg
vascular四ndle 1.48µg/mg
0.30µg/mg
pitch

カラムに付す場合、有機溶媒の添加が不可欠である。そこでアフィニテ ー カラムのタンパク部分にダメ ー ジが少ないメタノ ー ルを選び、 適切なメタ
ノ ー ル含量を設定したのがFig.8である。Fig. 8から45%メタノ ー ル含有PBSにてforskol inが完全にFig.7

溶出することが判明した。

Distribution of forskolin in tissues

次にアフィニテ ー カラムを用いて租エキスから
forskol inを直接精製することを検討した。

茎を皮部、維管束部、柔組織に分けそれぞれにFig. 9に示すように大過剰のforsklinが洗浄溶付いてアッセイしたのがFig. 7である。維管束部、媒により流出してくる。充分洗浄しforskolinの皮部、 柔組織の順に含量が低下している。

溶出が認められなくなった後に、上記の溶出溶媒6.

を添加する と吸着していたforskolinが溶出し、生育環境とforsko Iin含量 6)

シャ ー プなビ ー クを示した。この溶出パタ ー ンを

バイオトロンにおいて、15、20、30℃各温度室
Table.3

IS土1℃

. ,,
Tu切,ou, ,oot soctJonA•. content.,(;,g/mg dwt)"
2.83Z0.28
1.36土0.39
1.2'±0.23
I.IS土0.16

20土l℃

7.87士0.35

100

”

Temp.

Distribution pattern of forskolin
in different tuberous root segment
in clonally propagat ed co leus
forskohlii''.
Sha匹or tobe,cus ,octヽl

叩
'4

4.0cm

吝

土'·"

号

60

忘

40

ヨ
。

6.SS士1.25

U9土0.4980..

'·"士0.<9

S. 73

*

20

5.49 士 o.:w

S.08土0.65
30 士 1℃

3.83 士 0.38

3.57 土0.24

02.99土 0.30
1.9廷0.42

4.0cm

10

20

30

40

50

60

methanol concentration (%)I) Single clonally prnpagat出plant " indicated in Table I WM used lo, analysi,2) Tho main tubernu, ,oots cultivated at 15 and 30℃ we,e ,oclioned into pieses (10 mmmh). and tho父 at 20℃ wm cut into piece, a, indicated in the ,ha四mpecli,oly
Section No, I shows tho b邸, of lubernu, ,001.
3) A ,inglo pl,nt wa, to,tod individuolly, and tho contont wa, or.p,o,.ed by the'""'"'
ol 3 mmu,omoni.
<) Si.nd.,di,ed tubernu, ,oot w卒"lected and u父d ro, analysi,

Fig.8

-33-

Elution of forskolin by methanol
solution70

8

培養系を用いて高含有株を作出する場合、 選抜

6の内、附子のアコニチン系アルカロイドは採取時
期や栽培温度により大きく変動することを明らかにしてきたが、多くの植物において生育時期や生4

さ suaiu u n1qa�)（方法の選定は最も基本的な重要要件である。 生薬

育環境、また植物の部位等により有効成分が大き2

U !(O>{SJO J

く変動す る事は容易に想像出 来 る 。 こ のため
C. /orsko/Jliiに付いても育種研究をスタ ー トするにあたり、かかる基礎的な研究が必須となろう。
本植物 をインビトロ の 系でマイクロ プロパゲ ー
QO

<

Fig.9

10

, 20

30

40

Washing>< elutionー7
fraction number

シ ョンし育成した株を生育時期を追って定戴した

50

Elution profile of forskol1n

結果、根の成長が盛んとなる6週目から含最が暫時増加し、茎が急速に成長を始める11週から含羅増加が著しくforskol in含鱚が0. 5µg/mg dr. wt.
となることが明きらかとなったので、培養系で変TLCにより検討したのがFig, 10である。 この結果、異源を投与し、 少なくとも11週間栽培し、ELISA

大過剰のforskokinが洗浄溶媒で溶出すると共にでアッセイして、優良株を選抜するマニュアルを

関辿ジテルペン類や未同定の化合物等が吸着する

確立することが出来た。 本プロトコ ー ルに沿ってことなく溶出していることが明らかとなった。

現在優良株の選抜を実施中である。

完全に洗浄後、 溶 出 溶 媒 を添加す る こ と で次にバイオトロンにて栽培した株に付きELISA

forskol inが溶出していることが判明した。 なお、で詳細な検討を行った結果、従来はforskol inは

微晟の7-deacetylforskolinの溶出も認められた。

根茎に最も多量に含有すると信じられていたが、

4

考

察

本研究結果から茎にも多量含有され、その最は根茎との接点辺りが最も高含量であることを明確にした。 反対に根茎は上部程含絨高く、茎との接点

低分子化合物に対するMAbを作製するに当たり部位が最も含最が高いという新知見を得た。 これ

ハプテン ー キャリア ー タンパクの調製が必須であらの発見は実用栽培において原料部位を拡大し、るが、従来ハプテンの結合数の確定は困難であっ収量アップにつながる有益な知見と考える。

た。 本研究ではFig. 1に示すようなMALDIマスを測

アフィニテ ー カラムは極めて特異性が高いた

定 する事によりハプテン数を10と確定した。 まめ、租エキスから目的の化合物を一回のカラムでた、精製したIgGも同様にその精製度を確認 する

単離することが可能と考えられる。C. /orskolzli」の事が可能となり、MALDIマスの有用性が明確となっ

根茎や培接細胞・組織の抽出租エキスを本アフィた。

ニテ ー カラムに付す事により、forskolinを得る

本研究で開発したELISAのcross-reactivityは事が出来た。

類似化合物の内、7-deacetylforskol inが5, 6%でしかし、本MAbが7-deacetyl forskolinに対してあるのみで、他の化合物に対しては感作しておら約5% のcross-reactivity を持つ事から本化合物

ず、特異性の高いアッセイ系である。 また、測定がforskolin画分に微量共存して溶出された。 そ感度も高く、再現性も高い優れたアッセイ系と言こでこの混合物を4℃、 ピリジン中無水酢酸と反える。

応させることにより 7 -deacetyl forskol in を

-34-

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と茂用植物の育種に関する研究ー特にForskolinD原料植物Coleus forskob/iiについて

TLC
0 0

令®

0 0

08

0Q 3

1-deoxyforskolln,
1 , 9-dideoxyforskolin

forskolin

6-acetyl7-deacetylforskolin

7-deacetylforskolin

washingbinding

elutionstructure
4
H HH
ROHOO

cc
R3
A
AHH

氏HHHAC

HH
’
HHoo
R

Fig. 10

1-deo�forskolin
1,9-dideo 沖forskolin
7-deacetyl orskolin
6-acetyl-7-deacetylforskolin

Identification of forskolin andits derivertives

forskolinへと変換し、純粋なforskolinを得る事

いる事は自明である。 しかし色素細胞化現象を促が出来た。 本法はforskolinの吸着容量9µg/ml

進する作用に付いては余り知られておらず、本研

ゲルで、回収率85%であった。 キャパシテーは大究の目的の 一 つがこの点にあることを述べた。 こ

きくないが、純粋なforskol inを必要とする場合、の分野の研究に付いてもforskol inが比較的容易

通常のカラムクロマトではかなりの回数繰り返しに得られる環境が出来たので、今後精力的に遂行梢製する必要があるか、本法を応用すれば一度のし、 コスメトロジ ー の領域に応用したいと念じてカラムで達成される。

いる。

5

また、forskolinは分子内にアシメ炭素を8個有する事から、光学活性体の合成は極めて困難と目総括されている。 このため本アフィニテ ー カラムによ
植物組織• 細胞培養技術を応用してforskol in

る光学分割の応用も考えられ、この応用面も進行高含有C. /o.rsko/Jliiの育種研究を展開中である。

中である。
ゼを活性化し、本研究では選抜の基本となる高感度で特異的、 再cAMPを増加することによりその生理作用は多岐に現性良好な、 また、 簡便なアッセイ法として、ー ゲットとなってMAbを用いたELISAを開発した。 これを基にミュ ーForskol inはアデニ ー ルシクラ ー
わたっており、医薬品開発のタ-35-

タントの選抜タイミング等を明確にした。 また、
マイクロプロパゲ ー ションで得られたクロ ー ン植4) Sakata R, Shoyama Y, Murakami H, : Pro­

forskolin を極めて簡便に単離する方法を確立し

cyclase activator, forskolin, Cytote­

duction of monoclonal antibodies andenzyme immunoassay for typical adenylate

物を栽培し、 または培養細胞の抽出租エキスからたことから、 forskolinの応用研究への道が開かれたと考えている。 また、 本研究結果からMAbが有用で多方面に応用が可能なことを認識する事が出来た。 現在アヘンアルカロイド 8) 、 ステロイ
ダルアルカロイド 9) 、 大麻成分 I Ol 等のMAbの作製へと進展中である。 また、 MAbの可変部分のcDNA
クロ ー ニング中で、をこの方面も進展中である。

謝

c/Jnology, 16 101-108 1994

5) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et al.

: Rapid analysis of small samples con­taining forskolin using monoclonal anti­
bodies, Planta Med. ,6) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et a 1.
: Relationship between the content of

forskolin and growth environments inclonally propagated Coleus forskohlii

辞

本研究がコスメトロジ ー 研究振興財団の助成金により成された事を記し、 厚くお礼申し上げまBriq.; Biotronic.s; 24 1-6 1995

7) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et al.
: Immunoaffinity column chromatography

す。

using antiforskolin monoclonal antibody

引用文献
1) Bhat SV, Bajwa BS, Dornauer H, et al.
: Structures and stereochemistry of new
labdane diterpenoids from Coleus /ors­
ko力Iii Briq., Tetrahedron left, 19 1669
-1672 1977.
2) Seamon KB, Kenneth B, Seamon HB, et al.
: Forskolin: unique diterpene activatorof adenylate cyclase in membranes andin intact cells, Proc. が'at/. Acad. Sci[!SA, 78 3363-3367 1981.
3) Shoyama Y, Sakata R, Isobe R et al. :Direct determination of forskolinbovines e r u m albumin conjugate by matrix
assisted laser desorption ionization,
Org. Jlass Spectr., 28 987-988 1993

submitted. : 柳原、坂田、正山ら：抗forskolin

and its application, Anal, Chi勿， Acta
モノクロ ー ナル抗体のアフィニテイ ー カラムへの応用、 日本薬学会大115年会講演要旨集、P. 252 1995
8) Shoyama Y, Fukada T, Murakami H : Pro­
duction of monoclonal antibodies Anal.

Chim, Acta and ELISA for thebaine andcodeine, Cytotetec.加ology, in press, 1996

9) Tanaka H, Goto Y, Shoyama Y, monoclonal
antibodies based enzyme immunoassay for

Marihvana (Cannaloinoid) compounds, JI寧unoassay,

in press,

1996lO)Ishiyama M, Shoyama Y, Murakami H, et al: Production of monoclonal antibodies

and development of an ELI SA for solow­
argine Cytotec.加ology, 18 153-158 1996

-36-