Division of Biofunctional Chemistry
The Chemical Society of Japan
Vol. 30, No.3 (2015. 12. 3)x   i X  ¢¢¢¢¢¢¢¢¢¢¢¢¢M RK ¡ z{~?
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[16] T. Ikegami, Y. Kageyama, S. Takeda, submitted.

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タンパク質特異的ラベル化を利用した電子顕微鏡イメージング法の開発
九州大学大学院薬学研究院

田畑栄一

１． はじめに電子顕微鏡は電子線を用いて対象を可視化する手法である。電子顕微鏡では数 pm という、非常に波長の短い電子線を観察に利用するため、波長が数百 nm の可視光を用いた光学顕微鏡よりもはるかに高い、1 nm 未満の分解能での観察が可能になる。電子顕微鏡で特定の分子を可視化するには、抗原-抗体反応を利用して標的分子を金ナノ粒子のように電子散乱効果の高い物質で標識する、免疫電顕法
が一般的に用いられる。しかし、従来の免疫電顕法では、抗体自身の大きさにより標的分子の位置情報の精度が下がる、ということが名古屋大学の藤田らによって示されている[1]。藤田らは、金ナノ粒子で標識したグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) を免疫電顕法により、異なるサイズの金ナノ粒子で標識して TEM で観察したところ、両者が離れて観察され、その距離は抗体二分子に相当する 16 nmであることを示した (図 1) 。つまり、従来の免疫電顕法では、観察される金ナノ粒子の位置と標的分子の実際の位置は正確には対応しておらず、10 nm 以上もずれる、ということになる。我々は、この問題は標識に抗体を用いる標識法に由来するも
図 1. 従来法で標識した金ナノ粒子と、標的分子の位置関係のであり、抗原-抗体反応以外の標識法に置き換えることで解決可能と考えた。
我々は、これまでに標的タンパク質に融合したペプチドタグと、これを特異的に認識するプローブのペアを利用した特異的タンパク質標識法、リアクティブ・タグ法を開発してきた[2-4]。本手法は、タグの Asp 連続配列とプローブの亜鉛錯体部位との特異的相互作用により近接した際にのみ、プローブの反応基とタグ上 Cys の SH 基が反応して共有結合を形成し、タグ選択的に不可逆的標識を達成するものである (図 2) 。亜鉛錯体部位に機能性分子を連結することでプローブとして利用できるため、金ナノ粒子を連結すれば電顕イメージング用プローブとして利用することができる。特に、本手法ではペプチドタ
グ、プローブ共に分子量は 2 kDa 未満と、抗体を用いた場合に比べて標識のサイズが非常に小さいため、本手法により従来の免疫電顕法の抱える、図 1 のような問題点を解消可能と考えた。
本稿では、我々が現在進めている、リアク
ティブ・タグ法を電子顕微鏡イメージングに応用する試みについて紹介する。

図 2. リアクティブ・タグ法の概要

10

２． 新規タグ/プローブペアの開発
電子顕微鏡では金ナノ粒子 1 コでも見えてしまうため、標的分子を金ナノ粒子で標識するにあたっては非常に高い特異性が要求される。しかし、我々がこれまでに報告している亜鉛錯体プローブでは、反応基として比較的反応性の高いクロロ
アセチル基 (以下、ClAc 基) を採用しており[1]、そのため非特異的な標識が起こりやすい、という問題があった。
そこで、我々は特異性をさらに改善すべく、①低反応性の反応基に対しても効率的に反応する高反応性タグの開発、②プローブの図 3. 高反応性タグの設計における 3 つの戦略

反応基を ClAc 基からより穏やかな反応基に置換する、というタグ/プローブ両方の改良を進めてきた。
まず、タグの反応性を向上させるに当たり、3 つの戦略に基づいて改変を行った。1 つ目としては、
D-ヘリックスの双極子モーメントの利用である。
従来の D4-tag が Asp 連続配列であったのに対し、i+4位に Asp を配置することで、亜鉛錯体との相互作用に伴いD-ヘリックスを形成することを我々は見いだした。D-ヘリックスの N 末端側は双極子モーメントにより電荷がプラスに幾分偏っており、これによりタグの N 末端側に配置した Cys の SH 基の pKa が低下すると考えた。2 つめは、カチオン性アミノ酸によるチオレートの静電的安定化である。タグ上 Cys の近傍に Lys を配置し、Lys 側鎖のカチオンによりチオレートアニオンを安定化することで、SH 基の pKa が低下すると考えた。3 つめは、酸化還元酵素の活性モチーフの利用である。酸化還元酵素の活性部位には「CXXC」というモチーフ配列
が広く保存されており、モチーフ中 N 末端側の Cys の SH 基の pKa は 6 未満まで低下していることが知られている[5]。この低い pKa にはモチーフ配列のアミノ酸側鎖との相互作用が関与しているという指摘があり[5]、我々は酸化還元酵素の 1 つである、グルタレドキシンの活性モチーフ「CPYC」をタグに組み込んだ。ただし、分子内ジスルフィド結合の形成を避けるために、C 末端側の Cys は Ser に置換した「CPYS」とした。以上の様にして設計した新たなタグ「hD2-tag」は、合成ペプチドでの評価において、D4-tag に比べて亜鉛錯体結合時の pKa が 8.2 から 7.1 に低下し、SH 基の検出試薬である
モノクロロビマンに対する反応速度定
数も 7 倍向上していた。
一方、プローブについては従来の
ClAc 基に変わる、より穏やかな反応基の探索を行った。反応性の評価は、亜鉛錯体に反応基をそれぞれ組み込み、
hD2 ペプチドに対する反応が飽和の半
図 4. 新規反応基の探索の結果分まで達するのに要する時間 t50 を比較することで行い、ClAc 基の t50 が 0.2 h であったのに対し、ジメチルアミノクロトン酸アミドは 4.0 h とかなり穏やかであり (図 4) 、この反応基に置換することにした。
最終的に、hD2-tag は Cys の位置を調節するために Ala をリンカーとして挿入した「hD2(A2)-tag」とし、プローブは
L-Pro をリンカーとしてジメチルアミノクロトン酸アミドを導入することでそれぞれ構造を微調整し、新規タグ/プローブ
図 5. 新規タグ/プローブペア
ペアとした。

11

３． リアクティブ・タグ法の電子顕微鏡イメージングへの応用
以上のようにして開発した新規タグ/プローブ
ペアを、電子顕微鏡イメージングに応用すべく検討を進めている。我々は、モデルタンパク質として、
これまでに本手法で選択的蛍光標識に成功している[2]ブラジキニン受容体
B2R を用い、図 6 のような手順で標識した。
HeLa 細 胞 膜 上 に
hD2(A2)-B2R-EGFP を強制発現させ、まずディッシュ上で 4%(w/v)パラ
ホルムアルデヒド,
0.1%(v/v) グ ル タ ル ア ル
デヒドによる固定化を行
図 6. hD2(A2)-B2R-EGFP の標識手順った。その後、ビオチンを組 み込んだ プ ローブ、 そし て ストレプ トアビジン -酸化鉄 (10 nm) コンジ ュゲート の順 に
hD2(A2)-tag をラベル化した。ここで、比較対象として EGFP を従来法で標識するにあたり、ディッ
シュ上では細胞内の EGFP を標識することは難しいと考え、unroofing 法[6]という手法を用いて細胞膜を回収した。この方法では、細胞質側が露出した状態で細胞膜を回収できるため、細胞内に位置する
EGFP の標識が可能になる。このようにして露出させた EGFP を anti-GFP 抗体、そして金ナノ粒子(10 nm) 担持二次抗体で標識し、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果、同じ領域に anti-GFP 抗体に由来する金ナノ粒子の標識と、プローブに由来する酸化鉄ナノ粒子の標識が観察された (図 7 左) 。
一方、タグ/プローブ相互作用を阻害するピロリン酸共存下でプローブの標識を行うと、酸化鉄ナノ粒子の標識が顕著に減少することから (図 7 右) 、プローブはタグ特異的に標識できていることが示唆された。また、遺伝子導入していない細胞に対して、濃度などの反応条件を統一して従来の ClAc 基のプ
ローブと新規プローブとで標識し、非特異標識の起こりやすさを比較したところ、新規プローブでは明らかに非特異標識の数が減少しており、特異性が改善していることも示唆された。

図 7. hD2(A2)-B2R-EGFP をプローブと anti-GFP 抗体で二重標識した結果

12

４． おわりに
本稿で紹介した、ビオチ
ン-ストレプトアビジンを利用した系はあくまでもモデル実験であり、リアクティブ・タグ法が電子顕微鏡に応用可能であることを示したに過ぎず、今後はプローブに金ナノ粒子を担持させ、タグに直接金ナノ粒子を標識する手法の開発を進めていく。また、今回紹介したオリゴ Asp 型のタグ/
プ ロ ー ブ ペ ア 以 外 に も 、 図 8. 二種類のタグ/プローブペアによるタンパク質複合体の二重標識
我々はオリゴ His-tag 型のペアの開発にも成功しており[3]、 これらは併用が可能である。将来的には、
これら二種類のタグ/プローブペアにより、タンパク質複合体のサブユニットを異種金属で二重標識する手法への展開を目指している (図 8) 。金属種の違いはエネルギー分散型 X 線分光分析 (EDS) が可能な電視顕微鏡で観察することで識別が可能であり、これが可能になれば、タンパク質複合体を構成するサブユニットの構成比を電子顕微鏡で可視化することが可能になる。タンパク質複合体の構成を解析する手法としては、免疫沈降法や FRET を用いた手法が用いられるが、これらの手法でもサブユ
ニットの構成比を明確にすることは難しい。しかし、電子顕微鏡の分解能であれば、構成比だけではなく、構成比が異なるタンパク質複合体の局在、存在比も可視化することが可能であり、タンパク質複合体の機能解明において、本手法が強力なツールの一つになり得ると期待している。
５． 謝辞
本研究は、九州大学大学院薬学研究院 王子田彰夫教授の研究室にて行われたものです。日頃より多大なるご支援、ご助言を賜りました王子田教授に感謝致します。また、電子顕微鏡観察においてご指導頂きました IST Austria の重本隆一教授、原田春美博士、そして九州大学病院中央形態分析室の金丸孝昭博士にも感謝申し上げます。
６． 参考文献[1]. Fujita, A.; Cheng, J.; Hirakawa, M.; Furukawa, K.; Kusunoki, S.; Fujimoto, T. Mol. Biol. Cell.
2007, 18, 2112.
[2]. Nonaka, H.; Fujishima, S.; Uchinomiya, S.; Ojida, A.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2010,
132, 9301.
[3]. Takahira, I.; Fuchida, H.; Tabata S.; Shindo N.; Uchinomiya, S.; Hamachi I.; Ojida, A. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 2014, 24, 2855.
[4]. Fuchida, H.; Tabata S.; Shindo N.; Takashima I.; Leng Q.; Hatsuyama Y.; Hamachi I.; Ojida,
A. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2015, 88, 784.
[5]. Jao S.; Ospina S. M. E.; Berdis A. J.; Starke D. W.; Post C.B.; Post C. B.; Mieyal J. J.
Biochemistry 2006, 45, 4785.
[6]. Sanan D. A.; Anderson R. G. J. Histochem. Cytochem. 1991, 39, 1017

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URL: http://seitai.chemistry.or.jp/   mail to: seitai@chemistry.or.jp$,. *