【研究報告】（自然科学部門）

細菌の獲得免疫機構 CRISPR/Cas システムを利用した高度ファージ耐性乳酸菌の開発

丸山

東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科（現緒京都大学大学院医学研究科

史人准教授准教授）

実験方法

言
ヨーグルトやチーズといった乳酸菌を利用した発酵CRISPR の特徴として、約 30 bp の反復配列の間に、乳製品の製造において、乳酸菌へのバクテリオファージ免疫対象となる外来 DNA の短い配列（約 30 bp、スペー（細菌のウイルス、以下、ファージと呼ぶ）感染は、酸サーとよぶ）を持ち、このスペーサーと同一配列を持つ生成の低下や発酵の遅延、発酵乳製品生産の品質低下をファージを排除する。つまり、排除したいファージの任

引 き 起 こ す。 こ う し た 発 酵 不 良 を 防 止 す る 目 的 で、意の一部配列をスペーサーとして CRISPR に組み込むだ

ファージ耐性遺伝子の導入やこの増殖を妨害する様々なけで、そのファージに対する耐性菌を創出することがで遺伝子を用いてファージの被害を最小限に抑える試みもきる。スペーサー数も数個から数 100 個と任意で、乳酸行われてきた。しかしながら、ファージに関する情報、菌の生息環境中の全てのファージ（メタゲノム）データ知見は極めて限られており、無数に存在する未知のの配列のうち保存性の高い配列をスペーサーとすることファージへの対応は困難であるのが現状である。

で、乳酸菌ファージとしてデータベースに登録されてい近年、約半数の真正細菌や 90％以上の古細菌が有するな い、 未 知 の フ ァ ー ジ も カ バ ー で き る。 加 え て、Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats

CRISPR のベクターとしてファージを使用しているた（CRISPR）と呼ばれるゲノム上の反復配列と、CRISPRめ、同じ環境中にいる近縁種の乳酸菌にもファージ感染関連遺伝子群（CRISPR-associated genes: Cas 遺伝子群）を介して免疫を付与できる点で大きな利点となり得る。

が、乳酸菌に分類されるにまた、特別な遺伝子発現を利用せず、菌本来が持っていおいて、ファージに対する獲得免疫機構として機能してる Cas 遺伝子とファージ由来の CRISPR 配列を利用する

1）

ため、開放系での組換え体の安全性も確保できる。

い る こ と が 明 ら か に な っ た 。2006 年、 こ の CRISPRのゲノム内のプロファージ（感そ こ で、 ど の よ う な プ ロ フ ァ ー ジ、 フ ァ ー ジ 上 に染したファージ DNA がバクテリアゲノム内に組み込ま

CRISPR が存在するのかを同定し、配列の特徴、周辺領が、

2）域を解析し、データベース化を行った。

れた状態のもの）内に発見され 、その後、segmented
ﬁlamentous bacteria のゲノムにおいても報告されている 3）。 こ れ は、CRISPR が 細 菌 ゲ ノ ム 上 だ け で な く、結果

ファージゲノム上においても機能することを示唆していま ず 図 1 に 示 す よ う に、 遺 伝 子 デ ー タ ベ ー スる。そこで、この CRISPR を持つファージを人工合成（GenBank）より、原核生物の全ゲノム、全ドラフトゲし、乳酸菌に感染させることで、安全かつ高効率で高度ノム、プラスミドゲノム情報を取得、さらに Humanファージ耐性の乳酸菌を作製できるのではないかと考Microbiome Project, MetaHIT より、ヒトメタゲノムえ、本課題の起案に至った。すなわち、本研究では、乳データを取得し、Pophage Finder により、プロファー酸菌と同一環境中のファージゲノム配列データベースをジ領域の予測を行い、CRT により、CRISPR の予測を構築、利用することで、未知の乳酸菌ファージへの耐性行った。さらに、CRISPRFinder マニュアルでの確認を菌の作製の基盤構築を目指した。

することで、26 個のプロファージ上に 43 個の CRISPRを同定することができた。
そ の プ ロ フ ァ ー ジ の 宿 主 は、 図 2 の 通 り で あ る。
1

丸

図1

図2

山史人

図4

プロファージ上の CRISPR のリピート配列の特徴

図5

プロファージ上の CRISPR のスペーサーの由来

CRISPR を持つプロファージの探索

CRISPR を持つプロファージの宿主

ムからもCRISPR の存在が確認され、また、Microcystis、
Ralstonia と い っ た 水 圏、 土 壌 に 存 在 す る 細 菌 種 のファージ、唾液や腸管のファージといった幅広い環境中のファージが CRISPR を保有することが明らかとなった。
そこで、さらに細菌ゲノム上のプロファージが粒子形成能を持つ可能性を探るために CRISPR のリピート配列の特徴を図 4 のように調べた。その結果、プロファー
ジ 上 の CRISPR に 含 ま れ る リ ピ ー ト の 変 異 率 は、CRISPR 関連遺伝子の有無に関わらず、その他のゲノム

図3領域にある CRISPR リピートよりも、有意に高いことが

CRISPR を持つファージゲノムの探索わかった。
Clostridium、Xanthomonas、Streptococcus といった細さらに、プロファージ上の CRISPR のスペーサーにつ菌属に加え、Methanobrevibacter といった古細菌からいて、その免疫対象を調べた。その結果、図 5 にまとめも CRISPR を持つプロファージを検出することができたように、プロファージ上のスペーサーは他のファーた。

ジ、プラスミドなどの外来因子を免疫対象としており、宿主染色体や CRISPR を保有するファージ自身を対象とさらに、粒子形成能を持つことがわかっているファーするものは検出されなかった。

ジやファージのメタゲノム中からの CRISPR の検出を図3 のように実施した。その結果として、ゲノムから切り考出されるか不明であるプロファージに加えて、粒子形成察
本研究により、はじめて、幅広い細菌種、古細菌、メ能を有するファージ、ファージのみが含まれるメタゲノ
2

細菌の獲得免疫機構 CRISPR/Cas システムを利用した高度ファージ耐性乳酸菌の開発

タゲノム中に CRISPR を保有するプロファージの存在が

CRISPR/Cas システムを利用することで、既知のファー示された。さらに、粒子形成能を持つことがわかっていジだけでなく、未知のファージに対しても耐性を示す乳るファージ、ファージのメタゲノム中にも CRISPR が存酸菌を作製するための情報基盤を築いた。すなわち、本在することが示された。プロファージ上の CRISPR リ

研究結果をもとに作製された高度ファージ耐性乳酸菌をピートが宿主のリピートよりも変異が蓄積しているこ利用することで、乳酸菌を利用した食品製造過程で生じと、スペーサーが他の外来因子を標的としていることかる、ファージ感染に伴う様々な品質低下を予防できるとら、これらの CRISPR を持つプロファージは、菌株間を考えられる。時間の制限から、本研究では、安心・安全移動すること、さらに、他の複数のファージに対する免かつ安定的な乳製品の生産に貢献すると考えられる乳酸疫を宿主にもたらすことが情報的に確認することができ菌（た。また、CRISPR の挿入位置から、ファージ形成に影達成することはできていない。しかし、実際に構築でき響を与えない場所を同定することができた。これらのれば食の科学への大きな貢献が可能であると考えていデータベースを用いることで、効率的な CRISPR を持つる。乳酸菌は、日本のみならず、世界中でプロバイオファージ作製の道を開くことができた。今後の展開としティクス研究の中心に位置づけられる重要な細菌であて、乳酸菌ファージに普遍的な配列を見出すことが必須る。本菌の有用性、定着性、病原細菌に対する影響などとなる。さらに、粒子産生性を有しない乳酸菌ファージ数多くの研究が実施されているだけではなく、多くの食を作製できれば、ファージ耐性を持つ乳酸菌の創出が可品メーカーが新たな乳酸菌の単離、有用菌の選定を行っ能となる。ている。プロバイオティクスにおける大きな問題の一つ）の構築原理までしかに定着性の低さが挙げられる。すなわち、乳酸菌を経口要約摂取しても、定着せず、効能が持続しない。この原因と「食の科学」には、食品の機能科学や栄養学、バイオして、様々な説がある。これまでに挙げられていない原テクノロジーを利用した製造、加工方法の開発など、幅因として、筆者らはファージの存在が大きいと考えてい広い分野が含まれるが、本研究内容は特に、乳酸菌を利る。最近の網羅的な腸内メタゲノム解析、特にファージ用した発酵食品製造分野への貢献が期待できる。また、のメタゲノム解析が実施されている。このデータから、乳酸菌を用いたプロバイオティクスにも貢献するものと乳酸菌のファージを含む、未知のファージが細菌よりも考えている。乳酸菌は多くの発酵食品製造に関わり、健多い数存在していることが明らかとなっている。このこ

康効果を有することから、我々に最も身近な有用細菌ととから、乳酸菌を用いたプロバイオティクスの安定的なして知られている。乳酸菌の産業利用のための改良は古定着を阻害している因子として、ファージを考慮する必くから行われてきたが、近年発達したバイオテクノロ要があるということを発案した。つまり、本研究成果にジーを駆使することによって、より高効率で合理的な乳より乳酸菌のファージ抵抗株の作製や理論基盤の構築が酸菌の育種が可能になると期待されている。実際、一部できたならば、プロバイオティクスにおいても大きなブの乳酸菌では遺伝子操作が可能となり、形質転換効率のレークスルーとなることは疑いようがない。本研究成果向上が進み、NICE システムのような、強力なプロモーを用いた多くの学術的な「食の科学」に関する研究が進

ターを用いた目的遺伝子の大量発現系も確立された。しむだけではなく、実際の乳製品の改良が行われ、持続性かし一方で、特にチーズの生産においては、開放系で発の高いプロバイオティクスを可能となるものと確信して酵を行うため、バクテリオファージ（ファージ）感染にいる。

よる溶菌が酸生成の低下や発酵の遅延、発酵乳製品の品謝質低下を引き起こすことが知られている。こうした発酵辞
本研究に対して助成を賜りました公益財団法人三島

不良を防止する目的で、ファージ耐性遺伝子の導入や海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

ファージの増殖を妨害する様々な遺伝子を用いてファージの被害を最小限に抑える試みも行われてきた。しかし文ながら、ファージに関する情報、知見は限られており、

献

1） R. Barrangou, et al.:2） M. Sebaihia, et al.:
3） A. Sczesnak, et al.:

未知のファージへの対応は困難であった。
本研究では、細菌のファージに対する獲得免疫機構
3, 315, 1709–1712, 2007.
, 38, 779–786, 2006.
, 10, 260–272, 2011.