A、B 領域紫外線の直接照射によりSCID マウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防
大阪大学

本行医学部

忠志To study the mechanism and risk of human skin cancer from solar light, we exposed human skin transplanted to severe
combined immunodeficient mice to daily doses of UVA and UVB (dose rate of 2.8 J/m2/sec) for period of approximately 2years and investigated morphological and genetic changes of human skin tissues. Of 18 normal skins, 14 actinic keratoses(77.8%) and 4 skin cancers (3 squamous cell carcinomas and 1 undifferentiated carcinoma) developed, wheras neither
actinic keratosis nor cancer was observed in 15 human skins not exposed to UVA and B. This is the first success ininducing cancer and solar (actinic) keratosis in human skin by UVA , B.
Among p53 mutations at various sites, mutation at codon 242 (cTGC → cCGC; Cys → Arg) was specifically observedin both skin cancers and actinic keratoses. Furthermore, double or triple mutations were induced in all UVA , B-induced
skin cancers and in three of eight actinic keratoses. As well as p53 mutations, 2 of 3 squamous cell carcinomas had also
K-ras and c-kit mutations. So far as we know, c-kit mutation has not been reported in the skin cancer except melanoma.
Mutations of β-catenin gene occurred in 7 human skins, but these were non- specific mutations.

１

緒との相関を解析することにより太陽紫外線によるヒト皮膚言に実際に誘発される障害を確証した。また、これまで考えヒト発がんの実験的研究は、限られた、あるいは不自然られなかった新しい観点からヒトの前癌病変から癌に至るな条件下（ヒト培養細胞、動物実験など）でしか成され得特性とその悪性化機構を明らかにすることを目的とした。

なかった。現在米国で使われている T 細胞、B 細胞の欠損

２した SCID（Severe Combined Immunodeficiency）マウス
は、若年で白血病を多発し（約 30％）、また、T、B 両細

２. １

実験

ヒト正常皮膚の継代・維持胞ともに一部正常に戻ってしまうため（約 30％）
、マウス

ヒト正常皮膚は、大阪大学附属病院およびその関連病院

皮膚の allograft すら生着しにくいことがわかっている。野の外科、皮膚科、泌尿器科および神戸大学大学附属病院皮村らは、1986 年より IgG, IgM が検出限界以下の C.B17-scid

膚科において、乳がん患者、包茎患者および老人性角化症マウスを 20 代以上 Selective Inbreeding（ホモ交配）した患者の手術切除片で廃棄されるものを了解を得て用いた。

改良 SCID マウスに、最も観察の容易なヒト正常皮膚を移ヒト正常皮膚は、我々の改良 C.B17/N-scid に加え、我々の植し、長期間にわたり太陽紫外線類似の A, Ｂ領域紫外線作成した C3H/HeJ/N-scid を用い、ヒト正常皮膚のより健（UVA, UVB）を連日照射したところ、ケラトーシスが高率常な継代・維持を行った。にヒト皮膚に発生し、１〜２年間の連日照射により、ヒト皮膚がんを世界で初めて実験的に誘発するのに成功した１）。

２. ２

A, B 領域紫外線（UVA, B）照射

また、本行らは、放射性同位元素を使わず、従来の方法

TOSHIBA 健康ランプ FL-20 S.E（20W）４本を用い、に比べ、迅速・簡便・高感度・安価に遺伝子変異を検出しKodacel TA407 (Eastman 社 ) にて 290nm 以下の波長の得る独創的な Cold SSCP 法を開発しており２）、キャピラ

紫外線を全面的にカットし、地上に到達する太陽光と類似リーシークエンサーと共に普通の実験室で容易に遺伝子変させた。月、水、土曜日に 8000 J/m2、火、木、金、日曜

異解析が可能となっている。

日に 2000 J/m2 を線量率約 2.8 J/m2/sec で照射した。

本研究では、ヒト皮膚組織移植 SCID マウスを用い、UVA, B によりヒト皮膚に誘発された全ての突然変異のシー

２. ３

クエンスを行い、UV 照射、時間的変化、病理組織学的経過
Gene mutations induced by UVA, B light inhuman skin maintained in severe combined
immunodeficient mice

病理組織学的検索

ヒト正常皮膚を改良 SCID マウスに移植し、UVA, B 照
射を行い、継代移植時に biopsy をとり、パラフィン包埋切片の H-E 染色にて病理組織学的検索を行った（Fig. 1 参照）。

Tadashi Hongyo

２. ４

遺伝子変異検索Department of Medical Genetics andRadiation Biology, OsakaUniversity,Graduate School of Medicine.

DNA 抽出を行い PCR-Cold-SSCP 法 ２）３）（Fig. 2 参照）、パラフィン包埋切片あるいは凍結保存サンプルよりDirect sequence 法により、p53, K-ras および c-kit 遺伝子− 46 −

A、B 領域紫外線の直接照射により SCID マウス移植ヒト皮膚に誘発される遺伝子変異とその予防

Transplantation
to SCID mice

Human skin tissue

Re-transplantation toanother SCID mice

UVA, B exposure

UVA, B exposure

BiopsyPathological check
Genaration 1UVA, B exposures

Biopsies

DNA analysis

Original

Maintaining human skintissue by SCID mice

Genaration 2Genaration 3 ﾔ

Fig. 1 Human skin transplantation to SCID mice and UVA, B exposureの変異を経時的に検出し、紫外線によるヒト皮膚のケラ

また、ワイルドタイプ CB17+/+ マウスに UVA, B 照射

トーシス、皮膚がんへの進行過程での関与を調べた。p53,

しても皮膚がんは発生しなかったこと、および、ヒト遺伝

K-ras, c-kit および β -catenin 遺伝子増幅に用いたプライマー

子プライマーにより PCR 産物がえられたことより、がんを Table １に示した。

はマウス皮膚ではなくヒト皮膚より発生したと考えられる。

２. ５

３. ２

皮膚がん高発疾患患者の皮膚の継代・維持

p53 がん抑制遺伝子の特異的変異

各種皮膚がん高発疾患患者の皮膚（ケラトーシス、色素UVA, B 照射により誘発された突然変異の例（Case 5）性乾皮症他）の継代・維持を行い、UVA、B によるヒト皮を Fig. 3 に示した。また、皮膚移植組織の継代移植時の膚の DNA 損傷と修復をマウスの身体をかりて明らかにし、組織および遺伝子変異の経時的変化の一部を Table ２にケラトーシス、皮膚がんの誘発状況と遺伝子変異を調べた。

示した。誘発されたケラトーシス、皮膚がんでは、p53 遺３

伝子に種々の突然変異が検出されており、そのスペクトラ結果と考察

ムを Fig. 4 に示した。特に、codon242 に cTGC → cCGC

３. １ ヒト正常皮膚の継代・維持と UVA, B 照射によるヒト皮膚ケラトーシス、皮膚がんの誘発transition（Cys → Arg）が特異的に誘発されていた。ヒ

改良 SCID マウスへのヒト正常皮膚移植組織の継代・維行 っ た 際 に 発 生 し た 皮 膚 が ん に 高 率 に p53 遺 伝 子 の持は２年以上にわたり可能で、ヒト正常皮膚 110 例中 110

codon242 に全く同じ突然変異が誘発されていることが例（100%）が改良 SCID マウスに生着した。

報告されており（Nataraj, et al., Invest. Dermatol., 1997）、

ト Psoriasis 皮膚に PUVA 療法（Psoralen + UVA）を

UVA, B 照射により、18 例中 14 例に光線角化症（actinic

本実験とよく一致している。codon273 にも変異が多く見keratosis）が見られ、ケラトーシスを経由して皮膚がんへられたが UV 照射とは無関係に発生しており、非特異的と進展が４例に見られた（扁平上皮がん３例、未分化がん１例）。

思われる。

− 47 −

Table 1 The PCR promer pairs for the amplification of p53, K-ras, c-kit and β-catenin genes.

Fig. 3 Cold SSCP and Direct Sequencing of human skin tissue in SCID mouse by UVA,B exposure.

− 48 −UVB unexposed human skinkeratosis (+) ; ●keratosis (-) ; ○n = 6 (15)
○

120

140

○

160

○

○
○

220

240

●○●

180

200

●
●
●
●
●
●
●
○
○
●
●
●
●
●
●
●●

UVB exposed human skinkeratosis (+) ; ●keratosis (-) ; ○n = 9 (19)○ ●120140●●160●

180200

220

○
○
○
○
○
●
○
○
○ ○

260

280

300

260

280

300

260

280

●
●
●
●
●
○
●

●●

240

UVB-induced human skin cancer
n = 4 (5)
●●
●● ●●

120

140

160

180

●
●

200

Exon 5

Fig. 4

●
●
●
●
●●

220

240

Exon 6●

Exon 7300

Exon 8p53 mutation spectra of human skin tissue in SCID mice

３. ３ UVA, B 照射によるヒト皮膚での K-ras, c-kit
および β- catenin 遺伝子の変異

３. ４ 基底細胞癌におけるヘッジホッグシグナルの特異的異常

上記 UVA, B 照射ヒト皮膚の凍結サンプルを用い、K-ras,基底細胞母班症候群の原因遺伝子 PTCH はヘッジホッc-kit および β-catenin の変異を調べたところ、K-ras codon12

グ蛋白のリセプターであり、一般人に生じる基底細胞癌にに GGT → GCT transversion が２例に起こっており、いずおいても PTCH の変異が報告されている５）。PTCH 変異

れも UVA, B で誘発した扁平上皮癌であった。c-kit codonを代表とするヘッジホッグシグナルの異常が PTCH の発

561 に GAG → GAA transition が２例に誘発されており、現亢進を伴うことを利用して、神戸大学皮膚科で得られた

これも UVA, B 誘発扁平上皮癌であった。更に、codon559

各種のヒト皮膚腫瘍における PTCHmRNA の発現を RT-に GTT → ATT transition が１例に認められたが、これはPCR 法により解析し、その異常の特異性を検討した。そUVA, B 誘発ケラトーシス皮膚であった。c-kit 遺伝子の変の結果 12 例の基底細胞癌全てに高発現を認めたのに対し、４）異は間質系、生殖系や血液系の腫瘍で報告されているが、他の 24 例の腫瘍（有棘細胞癌、メラノーマ、ボーエン病、日光角化症など）では１例のボーエン病を除いて、発現はメラノーマを除いた皮膚がんでは見られていない。
従って、UVA, B にて SCID マウスに移植したヒト正常
皮膚に誘発したヒト皮膚がんには、p53 癌抑制遺伝子の突低く、ヘッジホッグシグナルの異常は基底細胞癌特異的に生じている可能性が強く示唆された。

然変異（codon242 に加え２〜３重の変異）に加え、K-ras,c-kit の突然変異も重複して誘発されていることが新たにわ

３. ５

かった。 β-catenin の変異も７例に見られたが非特異的であった。

今後の方針

正常 p53 遺伝子導入によるヒト皮膚がん遺伝子治療モデルの作成を目的に、紫外線誘発ヒト皮膚がんの培養細胞系− 49 −

analyses. Nucl Acid Res 21:3637-3642, 1993.

を樹立しおり、皮膚がんの治療のみならず皮膚全体の研究

３） Hongyo T, Buzard GS, Palli D, et al. Mutations ofにも役立てたい。

the K-ras and p53 gene in gastric adenocarcinoma
from a high incidence region around Florence, Italy.

（引用文献）

Cancer Res 55:2665-2672, 1995.

１） Nomura T., Nakajima H., Hongyo T., et al. Inductionof cancer, acnetic keratosis, and specific p53 mutations４） Hongyo T., Li T., Syaifudin M., et al. Specific c-kit

by UVB light in human skin maintained in severe

Mutations in Sinonasal NK/T-Cell Lymphoma in China

combined immunodeficient mice. Cancer Res., 57: 2081-and Japan. Cancer Res., 60: 2345-2347, 2000.
５） Ahmed, N.U., Ueda, M., Nikaido, O., et al. High2084, 1997.
２） Hongyo T, Buzard GS, Calvert RJ, et al. 'Coldlevel of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine appear in normal

SSCP': a simple, rapid and non-radioactive method forhuman epidermis after a single dose of ultraviolet

optimized single strand conformation polymorphism

radiation. Brit J Dermatol., 140:226-231, 1999.

− 50 −