微生物代謝工学に基づく必須および 新規脂肪酸の大量生産

筑波大学

小応用生物化学系

林

達彦

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) play important roles as structural components of membrane phospholipids, andas precursors of the eicosanoids of signaling molecules including prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes. Theprincipal PUFAs are dihomo-g-linolenic acid (n-6 PUFA; ∆8, ∆11, ∆14-20:3), arachidonic acid (n-6 PUFA; ∆5, ∆8, ∆11, ∆1420:4), and eicosapentaenoic acid (n-3 PUFA; ∆5, ∆8, ∆11, ∆14, ∆17-20:5). All mammals synthesize eicosanoids which areinvolved in the inflammatory response, reproductive function and so on. Therefore, studies on PUFAs are importantin both the medical and pharmaceutical fields. We have studied the fatty acid metabolism in the filamentous fungus,Mortierella, which produces some C-20 PUFAs (e.g., dihomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid).
In this study, at the gene level, we investigated desaturase and elongase involved in PUFA metabolism of this strain. We
cloned ∆9-desaturase b gene from the gene library of this Mortierella strain. The predicted amino acid sequence showedsimilarity to those of other ∆9-desaturases including stearoyl-CoA desaturase from several living organisms including
yeast, rat and so on. This sequence also contained a cytochrome b5-like domain at the C-terminus, being different from
the Mortierella ∆6-desaturase which has the corresponding domain at the N-terminus. This finding suggests that thisdomain in the desaturase would play the role of a unique electron transport system, binding a heme group. We also cloned
a part of the elongase gene from the Mortierella strain for the first time. Further works would lead to the overproduction ofvarious PUFA through gene manupulation in the Mortierella strain.

１． 緒須のステップを担う（炭素鎖 18 から 20 へ鎖長を延長する）

言

鎖長延長酵素を対象とし、分子レベルでの検討を行った。

必須脂肪酸である γ- リノレン酸はアトピー性皮膚炎

これらの PUFA の生合成に関わる酵素・タンパク質遺伝等アレルギーの軽減作用があり、また、アラキドン酸は子を遺伝子工学の手法を用いて親株の Mortierella で特異的皮膚の乾燥抑制効果がある。これらの高度不飽和脂肪酸に発現させることや遺伝子破壊などの方法を組み合わせる（PUFA）は、これらの作用だけでなくコスメトロジーにことによって、様々な PUFA を選択的に生産あるいは新おける重要な素材である。近年、これらの PUFA を化粧規な PUFA を代謝工学的に生産できる可能性がある。

品分野で利用せんとする試みが世界的規模で進行している

２． 実 験 ・結果・考 察が、これらの油脂類の供給源に目を向けると、魚介類以外には有効な供給源すら知られていない。また、我が国では

３. １不飽和化酵素遺伝子の解析

有効な生産手段を持たず、海外からの供給に対する依存度

SuperCos 1 cosmid vector を 用 い て 作 製 し た 糸 状 菌が高く、気候などの変動による供給量、品質などの変動をMortierella のゲノムライブラリーに由来する大腸菌ライ受けやすいこと、また、海洋汚染による資源自体の汚染もブラリーに対して、（本研究者らによって）既にクローン問題となりつつある。

化している ∆9-Desaturase cDNA a をプローブとした指標

Mortierella 属糸状菌はアラキドン酸などの炭素鎖が 20によってポジティブクローンを取得した。本クローンにの PUFA を生産することができる１）。本研究者らは現在、対して、上記のプローブを用いて切り縮めを行った結果、糸状菌 Mortierella における PUFA 生合成に関わる酵素・タ4,988 bp から成る一つのオープンリーディングフレームを

２- ７）

ンパク質を分子レベルで検討しつつある。本研究では、認めた（図１）。また、真核生物に一般的な転写開始部位脂肪酸の ∆9 の位置に二重結合を導入する ∆9 不飽和化酵の近傍によく見られ、RNA ポリメラーゼの転写効率を上素、および、炭素鎖が 20 以上の PUFA の生合成において、昇させると考えられる特異配列である CAAT box と TATA

C18 脂肪酸生産微生物の C20 脂肪酸生産株への変換に必box を検索した結果、TATA box は認められなかったが、Overproduction of essential and new
fatty acids through microbial metabolicengineering

CAAT box に類似の配列（ATCCAAT）が開始コドン ATGの 359 bp 上流に存在することが判明した。
得 ら れ た 遺 伝 子 か ら 推 定 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は、Michihiko Kobayashi∆9-Desaturase a や（ラットや Saccharomyces などの）のUniversity of Tsukuba

真核生物由来の Stearoyl-CoA desaturase と高い相同性を示し（図２）、従って、∆9-Desaturase b 遺伝子と命名した。
他の生物由来の Stearoyl-CoA desaturase とは相同性は低− 12 −

微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大 生産

図１ ポジティブクローンの制限
酵素地図
矢印は、Δ9-Desaturase b ゲノム遺伝子

図２ Δ9-Desaturase b と各生物由来の不飽和化酵素のアミノ酸配列上の比較
DES9b, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase b
DES9a, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase aYEAST, Saccharomyces cerevisiae の Stearoyl-CoA desaturase
MOUSE, マウスの Stearoyl-CoA desaturase
RAT, ラットの Stearoyl-CoA desaturase− 13 −

図３Δ9-Desaturase b のアミノ末端領域と各生物由来の Cytochrome b5 の部分アミノ酸配列の比較
DES9, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase bCb5M, Mortierella sp. の Cytochrome b5
Cb5M, ラットの Cytochrome b5
Cb5M, Saccharomyces cerevisiae の Cytochrome b5
矢印は、高度に保存されているヒスチジン残基

いものの、ヘム鉄が配位結合すると考えられる２ヶ所のヒスチジン残基とヘム鉄を包み込む領域はよく保存されていた。本 ∆9-Desaturase b のアミノ酸配列は、植物の脂肪酸不飽和化酵素と相同性がなく、ラットや Saccharomycesの Stearoyl-CoA desaturase と相同性を示したことから、∆9-Desaturase b はアシル -ACP やリン脂質ではなくアシル-CoA を基質とすることが推測された。
さらに、∆9-Desaturase b は、∆9-Desaturase a や酵母のStearoyl-CoA desaturase と同様に、カルボキシル末端領域はラットや Saccharomyces の Stearoyl-CoA desaturaseより 110 アミノ酸残基ほど長く、また、互いによく保存されており、他生物由来の Cytochrome b5 の一部と相同性を示した。ラットや Saccharomyces の Cytochrome b5と、∆9-Desaturase b のカルボキシル末端領域とは約 30%の低い相同性であったが、ヘム鉄が配位結合すると考えられる２ヶ所のヒスチジン残基と、ヘム鉄を包み込む領域はよく保存されていた（図３）。さらに、Cytochrome b5family に属する Nitrate reductase とも相同性を示したが、∆9-Desaturase b が Cytochrome b5 様ドメインを含んでいることも鑑みると、脂肪酸不飽和化の際に独自の電子伝達を行っている可能性が示唆された。続いて、Hydropathy
プロット解析を行った結果、上記のいずれのタンパク質を比較しても疎水パターンの形状は似通っており、特に、
Stearoyl-CoA desaturase に関しては、小胞体膜に結合していると考えられる疎水性の高い領域もよく保存されていた（図４）。
また、∆9-Desaturase b の遺伝子には 5' 末端が GT で 3'末端が AG の 94 bp から成るイントロンが一つ存在することが推察された。∆9-Desaturase a は Δ9-Desaturase bと同様に唯一一つのイントロンを持つが、イントロンの塩基配列は互いに相同性が低く、∆9-Desaturase b のイントロンが 94 bp であるのに対し、∆9-Desaturase a のイントロンは 153 bp であり塩基数も異なっていた。しかしながら、興味深いことに、イントロンの挿入部位は、ラ

図４ 各生物由来の Δ9 不飽和化酵素のアミノ酸配列の Hydropathy プロットの比較
DES9b, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase b
DES9a, Mortierella sp. の Δ9-Desaturase aYEAST, Saccharomyces cerevisiae の Stearoyl-CoAdesaturase
MOUSE, マウスの Stearoyl-CoA desaturase
RAT, ラットの Stearoyl-CoA desaturase
丸囲みは、小胞体膜に結合していると考えられる領域− 14 −

微生物代謝工学に基づく必須および新規脂肪酸の大 生産

ットや Saccharomyces の Stearoyl-CoA desaturase でよく謝保存されている最も N 末端側のヒスチジンに富む領域の辞同じ部位に挿入されており、これらを鑑みるに、２つの本研究を遂行するに当り、ご支援をいただきました（財）∆9-Desaturase の起源は同じであるが進化の過程で非翻訳

コスメトロジー研究振興財団および共同研究者に深く感謝部位であるイントロンの修飾が独自に行われたのではない申し上げます。

かと推察された。
（引用文献）

３. ２１） Shimizu, S., Ogawa, J., Kataoka, M. and Kobayashi,

鎖長延長酵素遺伝子の解析（炭素鎖 18 から 20 へ鎖長を延長する）鎖長延長酵素のM.   : Screening of novel microbial enzymes for the

遺伝子クローニング実験に関しては、まず、鎖長延長酵

production of biologically and chemically useful

素欠損変異 Mortierella 株の変異の相補性を指標とし、本酵compounds,   In :   Scheper, T. (ed):    Advances in素遺伝子のクローン化を目指したが、うまくいかなかっ

Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.58, Springer-た。従って、以下のように戦略を変えた実験を行い、本酵

Verlag.  Berlin,  45-87, 1997.

素遺伝子の一部のクローン化に成功した。一般に脂肪酸

２） Kobayashi, M., Sakuradani, E. and Shimizu, S.   :の C 鎖長延長反応は、アシル -CoA とマロニル -CoA からGenetic analysis of cytochrome b5 from arachidonic

3- オキソアシル -CoA を生成する 3-Oxoacyl-CoA 合成酵素、

acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4:  Cloning,

3- オキソアシル -CoA を D-3- ヒドロキシアシル -CoA に変

RNA editing and expression of the gene in Escherichia

換する 3-Oxoacyl-CoA 還元酵素、D-3- ヒドロキシアシル

coli, and purification and characterization of the geneproduct. J. Biochem., 125: 1094-1103, 1999.

-CoA をエノイル -CoA に変換する 3-Hydroxyacyl-CoA 脱水酵素、エノイル -CoA をアシル -CoA に変換する Enoyl-CoA３） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S.   :

還元酵素から成る。初発酵素である 3-Oxoacyl-CoA 合成酵∆6-Fatty acid desaturase from an arachidonic acid-素の一部を、他生物の脂肪酸合成に関わる本酵素のアミノ

producing Mortierella fungus: Gene cloning and its

酸配列の情報を基に合成オリゴヌクレオチドプライマー

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Gene,（センスプライマーおよびアンチセンスプライマー）を作

238: 445-453, 1999.

製し、Mortierella のゲノム DNA を鋳型として Polymerase４） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S.   :chain reaction（PCR）法を用いて、本酵素遺伝子のクロー∆9-Fatty acid desaturase from arachidonic acid-ニングを試みた。

増幅した DNA 断片を電気泳動ゲルかproducing fungus: Unique gene sequence and its

ら回収し、ベクターにサブクローニングし、DNA シーク

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Eur. J.

エンサーで本 DNA 配列を決定した結果、大腸菌などの他Biochem., 260: 208-216, 1999.

生物由来の 3-Oxoacyl-CoA 合成酵素遺伝子と高い相同性を

５） Sakuradani, E., Kobayashi, M., Ashikari, T. and示し、本遺伝子の一部がクローン化できたことが示唆されShimizu, S.  : Identification of ∆12-fatty acid desaturase

た。しかしながら現在のところ、完全長の遺伝子クローニ

from arachidonic acid-producing Mortierella fungus by

ングには至っていない。

heterologous expression in the yeast Saccharomyces
cerevisiae and the fungus Aspergillus oryzae. Eur. J.
Biochem., 261: 812-820, 1999.

一方、以下の実験を併せて行ったが、成果を挙げること

６） Sakuradani, E., Kobayashi, M. and Shimizu, S.   :ができなかった。
（ıÀ）∆6-Desaturase 遺伝子を導入した Mortierella 株は本酵

Identification of an NADH-cytochrome b5 reductase gene

素を発現することができず、γ- リノレン酸（∆6, ∆9, ∆12-from an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella18:3）生産が増強されなかった。

alpina 1S-4, by sequencing of the encoding cDNA and（ıÃ）Mortierella 株から既に本研究者らが取得している各

heterologous expression in a fungus, Aspergillus. Appl.
Environ. Microbiol., 65: 3873-3879, 1999.

不飽和化酵素遺伝子に対して亜硝酸法によってランダム変異を行い、（産業的に重要な微生物である）Aspergillus

７） Certik, M., Sakuradani, E., Kobayashi, M. andoryzae 産に導入し、得られた形質転換体とコントロール

Shimizu, S.   : Characterization of the second form ofに対して各 PUFA の含量の変化を検討したが、特に生産

NADH-cytochrome b 5 reductase gene from arachidonic

量の変化は見られず、また、新規な脂肪酸と思われる物質

acid-producing fungus Mortierella alpina 1S-4.  J. Biosci.

は検出されなかった。変化を与える変異に至らなかったこ

Bioeng., 88: 667-671, 1999.とが示唆された。

− 15 −