メラノソーム輸送に必須の因子 Slac2-a の分解メカニズムの解明とメラノソーム輸送制御への応用
独立行政法人理化学研究所

福 田

福田独立主幹研究ユニット

光 則

Slac2-a/melanophilin was recently identified as the "missing link" between the small GTPase Rab27A and theactin-based motor protein myosin Va.  Formation of a tripartite protein complex by three molecules is essential
for melanosome transfer from microtubules to actin filaments and subsequent actin-based melanosome transport
in melanocytes.   However, the regulatory mechanisms of the disassembly of the complex after actin-basedmelanosome transport had never been elucidated.  In this study, we discovered that Slac2-a and a closely related
isoform, Slac2-c, contain multiple PEST-like sequences (potential signals for rapid protein degradation) in themyosin Va- and actin-binding domains at the C terminus.  We found that the C-terminal domain of Slac2-a/c ishighly sensitive to low concentrations of proteases, such as trypsin and calpain, in vitro, whereas the N-terminal
Rab27A-binding domain is highly resistant to these proteases.   We further found that endogenous calpains
selectively cleave Slac2-a, but not Rab27A or myosin Va, in melanocytes.  A mutant Slac2-a lacking one of thePEST-like sequences located at the interface between the myosin Va- and actin-binding domains (ΔPEST; aminoacids 399-405) is more stable than the wild-type protein, both in vitro and in melanocytes. Expression of themutant Slac2-a-ΔPEST with an N-terminal green fluorescence protein tag often induced perinuclear aggregationof melanosomes (approximately 40% of the transfected cells) compared with the wild-type Slac2-a.  Our findings
suggest that protein degradation of Slac2-a is an essential process for proper melanosome distribution inmelanocytes.

考えられる。しかしながら、Rab27A・Slac2-a・ミオシン

１．緒言

Va 複合体解離の分子メカニズムはこれまで全く解明され我々の体を紫外線から守ってくれるメラニン色素は、メていなかった。私達は最近、Slac2-a の分子内にプロリンラノサイトと呼ばれる特殊な細胞で合成され、メラノソー（P）、グルタミン酸（E）、セリン（S）、トレオニン（T）ムと呼ばれる小胞に貯蔵されている。核周辺で成熟したメの四つのアミノ酸からなる配列が多数存在することを見ラノソームは、細胞内に張り巡らされた二種類の交通網（微い出した（図１）11）。これらの配列は蛋白質分解のシグナ小管及びアクチン線維）によって細胞膜周辺へと輸送されルとされている PEST 配列と考えられ、Slac2-a 分子が選る。その後、メラノソームは隣接するケラチノサイトある択的分解を受けることにより Rab27A・Slac2-a・ミオシン

いは毛母細胞に受け渡され、皮膚や毛髪の暗色化が引き起Va 複合体の解離が引き起こされる可能性が考えられた。

こされる。これまでの研究で、メラノソーム輸送（特そこで本研究では、メラノサイトにおいてどのようなシグに微小管からアクチン線維へのメラノソームの受け渡しのナルを受けて Slac2-a が分解されるのか、Slac2-a のどの部

ステップ）には低分子量 G 蛋白質 Rab27A、リンカー蛋位が切断されるのか、さらにはどのようなプロテアーゼに白質 Slac2-a（スラックツー）及びアクチン依存性モータより選択的に分解されるのかを解明することを目指した。

ー蛋白質ミオシン Va の三者複合体の形成が不可欠である

また、Slac2-a の相同分子で網膜上皮細胞に発現し、網膜ことが明らかになっている

３）−８）。生体内でこの Rab27A・メラノソームを輸送すると考えられている Slac2-c12）13）にSlac2-a・ミオシン Va 複合体の形成が損なわれると、メラノソ関しても同様にプロテアーゼによる分解の可能性を検討しームを正しく輸送することができず、皮膚や毛髪の白色化た。

１）２）を特徴とするヒト遺伝病 Griscelli 症候群が発症する。

９）10）

従って、もし Rab27A・Slac2-a・ミオシン Va 複合体の解

２．実験

離を人為的に操作することができれば、メラノソームの輸送ひいては皮膚におけるメラニン色素沈着の制御も可能と２．１ Slac2-a/c 分子のプロテアーゼによる in vitro
限定分解

Elucidation of the Degradation
Mechanism of Melanosomal Protein
Slac2-a.

Slac2-a 及び Slac2-c は共に三つの機能ドメイン（アミノMitsunori Fukuda
Fukuda Initiative Research Unit, RIKEN

末端側の Rab27A 結合ドメイン（SHD）、中央部分のミオシン結合ドメイン（MBD）、そしてカルボキシル末端側のアクチン結合ドメイン（ABD））により構成されている ５）14）。
PEST 様の配列は Slac2 分子の中央部分からカルボキシル末端側にかけて多数存在している（図１）。アミノ末端− 78 −

メラノソーム輸送に必須の因子 Slac2-a の分解メカニズムの解明とメラノソーム輸送制御への応用実験を行った。

２．３

PEST 配列欠損 Slac2-a 分子の作成

Slac2-a 分 子 の MBD と ABD 領 域 の 境 界 に 存 在 す る
PEST 様配列（STSSEDET：アミノ酸 399 〜 406）を欠損させた Slac2-a-ΔPEST 変異体を下記の変異プライマーを用いて２ステップ PCR 法 17）により作成した（5’-GGTACCATCTGGCTTGGTGGAACCACTGATGTTGCTGG-3’ 及 び
5’-GGTACCTTCCTTGGAGGGTC-3’）。 作 成 し た Slac2-a図１ Slac2-a 及び Slac2-c の分子構造と PEST 様配列
Slac2 分子はアミノ末端側の Rab27A 結合ドメイン（SHD,synaptotagmin-like protein homology domain）、中央部分のミオシン結合ドメイン (MBD, myosin-binding domain)、カルボキシル末端部分のアクチン結合ドメイン（ABD, actinbinding domain）により構成されている。特に MBD 領域において Pro, Glu, Ser, Thr（PEST）の四つのアミノ酸の含量が多く、矢頭で示した site 1 〜 3 でまずプロテアーゼによる分解を受けると考えられる。

ΔPEST の cDNA を pEGFP-C1 ベ ク タ ー（BD Clontech）
及 び pEF-T7 ベ ク タ ー 18） に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た。
Slac2-a-ΔPEST 変異体のプロテアーゼに対する抵抗性は上
記 2.1 の手法により確認を行った。

２．４

メラノソーム凝集アッセイ

ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 前 日 に 1×10５ 個 の melan-a 細胞 を 3.5 ㎝ シ ャ ー レ に 培 養 し、 ２ ㎍ の 各 種 発 現 ベ ク ター（pEGFP-C1, pEGFP-C1-Slac2-a, pEGFP-C1-Slac2-a-Δ

側に T7 タグ、カルボキシル末端側に FLAG タグを付加PEST）を３µℓ の FuGene ６（Roche）を用いて遺伝子導したリコンビナント Slac2 分子をアガロースカラムに固入した。二日後に細胞を４% パラホルムアルデヒドで 20定化し、低濃度のトリプシン（Sigma; 10 〜 250ng/ ㎖分間固定し、GFP の蛍光を指標に遺伝子導入された細胞

in 50mM HEPES-KOH, pH7.2；25℃ , 30 分）及び µカルを同定し、メラノソームの分布（細胞膜周辺あるいは核周パイン（Calbiochem; 5 〜 500nM in 50mM HEPES-KOH,辺に凝集）を観察した（詳細は文献５を参照）。

pH7.2 + 0.75mM CaCl2；30℃ , 15 分）溶液中でインキュベーションした 11）。酵素消化後の Slac2 分子を 10% SDS

３．結果

電気泳動に流し、分解の様子を抗 T7 タグ抗体（Novagen）及び抗 FLAG タグ抗体（Sigma）を用いてイムノブロット法でモニターした。

３．１

PEST 配列依存的 Slac2-a/c 分子の分解

Slac2-a/c の分子内には多数の PEST 様配列が存在することから（図１）、まずこれらが実際に蛋白質分解のシ２．
２ メラノサイト内在性カルパインによる Slac2-a分子の分解グナルとして機能するのかを検討した。リコンビナント

培養メラノサイト（melan-a 細胞）は Drothy C. Bennettンで処理すると、濃度依存的な Slac2 分子の分解が観察さ

博 士（St. George’s Hospital Medical School, London, UK）れた（図２）。アミノ末端側を認識する抗 T7 タグ抗体でよりご供与頂いた

Slac2-a 及び Slac2-c を低濃度のトリプシン及び µカルパイ。10 ㎝シャーレに培養した melan-a

分解過程をモニターすると、多数の分解産物が観察された細胞（培養条件の詳細は文献５に記載）を 500µℓ のプロが（図２A、site 1 〜 3、白矢頭）、カルボキシル末端側をテアーゼインヒビターを含まないバッファー（50 mM

認識する抗 FLAG タグ抗体では分解産物は全く検出され

15）

HEPES-KOH, pH 7.2, 1mM MgCl2, 150mM NaCl）中でホず、全長の Slac2 分子のみが特異的に認識された（図２B、モジェナイズした。最終濃度１% Triton X-100 で蛋白質黒矢頭）。つまり、Slac2 分子は PEST 様配列が多数存在を可溶化後（4℃ , １時間）、不溶性画分を遠心により除去する MBD 及び ABD の領域でプロテアーゼによる分解をした（15,000rpm，10 分）。得られた細胞抽出液を２mM受け易く、PEST 様配列を含まない SHD では分解を受けEGTA あるいは 0.75 mM CaCl2 存在下で 30℃，１時間イにくいことが明らかとなった。また、Slac2 分子の分解産ンキュベーションした。反応溶液を 10％ SDS-PAGE に流し、物の分子量から類推して、Slac2 分子は MBD 領域（PEST

Slac2-a 分子の分解の様子を抗 Slac2-a-SHD 抗体を用い含量が最も高い領域）に存在する site 1 〜 3 でまず切断さてイムノブロット法で評価した。また、内在性 µカルパイれると考えられた（図１、矢頭）。さらに、site 3 に相当ンによる分解を確認するため、反応溶液中に µカルパインすると考えられる PEST 様配列（STSSEDET：アミノ酸インヒビター（10µM calpastatin peptide あるいは calpain

399 〜 406）を遺伝子工学的手法により欠損させた Slac2-a-inhibitor III、いずれも Calbiochem）を共存させて同様のΔPEST 変異体ではプロテアーゼに対する抵抗性が強くな

16）− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

ることから、Slac2 分子の PEST 様配列が蛋白質分解のシ損した Slac2-a-ΔPEST 変異体を作成し、培養メラノサイグナルとして機能している可能性が強く示唆されたトに発現させた（図４）。Slac2-a-ΔPEST 変異体は一部の。

11）

次に、メラノサイトに内在性の Slac2-a 分子が実際にプPEST 様配列を欠損するため、野生型よりも安定してメラロテアーゼによる分解を受け易いのかを検討してみた。予ノサイトに発現し、主にアクチン線維上に蓄積していた（野想通り、メラノサイトの細胞抽出液をカルシウム存在下で生型の Slac2-a では主にメラノソーム上に存在する）。さ30℃ , 1 時間処理すると Slac2-a 分子が選択的に分解されらに、Slac2-a-ΔPEST 変異体を発現する約 4 割の細胞でメた（図３）。この条件下では、総蛋白質量（アミドブラッ

ラノソームの凝集が観察され、正常なメラノソーム分布をク染色）、アクチン、ミオシン Va、Rab27A のいずれにも維持するためには Slac2-a 分子の分解が不可欠である可能影響が無いことから、分解は Slac2-a 分子に特異的と考え性が示唆された。

られた 11）。カルシウム依存的に PEST 配列を分解するプロテアーゼの候補としては μ カルパインが考えられたので 19）、

４．考察

µ カルパインインヒビター存在下で同様の実験を行ったと
ころ、Slac2-a 分子の分解が完全に阻害された（図３、レーン３及び４）。

モーター蛋白質ミオシン Va は積み荷であるメラノソームを直接認識するのではなく、リンカー蛋白質 Slac2-a を介してメラノソーム上の Rab27A と結合している。アク３．２ Slac2-a-ΔPEST 変 異 体 に よ る メ ラ ノ ソ ー ム
凝集の誘導

チン依存性のメラノソーム輸送が終了すると、Rab27A・Slac2-a の PEST 様配列依存的分解のメラノソーム輸送るが、これまでその分子メカニズムは全く分かっていなにおける役割を検討するため、PEST 様配列の一部を欠かった。今回の研究により、Slac2-a 分子内には複数の図２ μ カルパインによるリコンビナント Slac2-a 分子の分解
精製リコンビナント T7-Slac2-a-FLAG 分子を表示量のカルシウム／ μ カルパインで処理し（30℃ , 15min）、分解の様子を抗 T7 タグ抗体（A）及び抗 FLAG タグ抗体（B）でモニターした。

図３ メラノサイト内在性の μ カルパインによる Slac2-a 分子の分解
培養メラノサイト（melan-a 細胞）の抽出液を 30℃ , 1 時間処理すると Slac2-a 分子が選択的に分解される（二段目のパネル、四角）。この分解は μ カルパインのインヒビターにより完全に阻害された。なお、この条件下ではミオシン Va、Rab27A、アクチン、総蛋白質量には特に影響は見られなかった。

Slac2-a・ミオシン Va 複合体は解離すると考えられてい− 80 −

メラノソーム輸送に必須の因子 Slac2-a の分解メカニズムの解明とメラノソーム輸送制御への応用

PEST 様配列が存在し、内在性のプロテアーゼにより特機構を明らかにすることである。カルパインが細胞膜近傍に MBD の領域が選択的に分解されることが明らかとなっ（すなわちメラノソームの積みおろし場）で活性化されるた。MBD 領域がプロテアーゼにより分解されるとミオシという報告もあり 21）22）、in vivo でも Slac2-a の分解制御

ン Va との結合が損なわれることから、Slac2-a 分子の分に関与する可能性は十分にあるが、他のプロテアーゼの関解は Rab27A・Slac2-a・ミオシン Va 複合体の解離を引き与も否定はできない。今後、他の内在性プロテアーゼによ起こし、輸送終了のシグナルとして機能する可能性が十分る Slac2-a 分子の分解に関しても検討して行く予定である。に考えられる。「リンカー蛋白質を分解することにより積み荷を降ろす」というメカニズムは一見無駄なように思え謝辞るが、酵母の液胞輸送においては、実際に Myo2p という本研究は理化学研究所福田独立主幹研究ユニットの伊藤V 型ミオシンのリンカー蛋白質 Vac17p が PEST 配列依存

敬博士、黒田垂歩博士、菅野栄子氏との共同研究で行われ的に分解されることにより、液胞輸送終了のシグナルとなたもので、ここに深く感謝致します。

ることが最近報告されている。興味深いことに、PEST20）

配列を欠損した Vac17p が液胞を正しく輸送できないよう（引用文献）に、Slac2-a-ΔPEST 変異体も頻繁にメラノソーム凝集を引

１）Marks MS, Seabra MC,：The melanosome: Membrane

き起こすことが明らかになった。詳細な阻害機構は現段階

dynamics in black and white, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2,

では明らかではないが、Slac2-a-ΔPEST 変異体は直接メラ738-748, 2001.

ノソーム輸送を阻害するのではなく、恐らくアクチン線維

２）黒田垂歩 , 福田光則 ,：美白への新たなアプローチ−メ上に蓄積し ABD 領域を介してアクチン線維の束化を促進

ラニン輸送をストップさせる− , BIONICS,2(11), 68-71,

することにより、微小管からアクチン線維へのメラノソームの受け渡しを二次的に阻害するのではないかと推察される。

2005.
３）Fukuda M, Kuroda TS, Mikoshiba K,：Slac2a/melanophilin, the missing link between Rab27

もしこの説が正しいとすると、Slac2-a をターゲットとand myosin Va: Implications of a tripartite protein

するプロテアーゼはアクチン依存性のメラノソーム輸送

complex for melanosome transport, J. Biol. Chem., 277,が終了する時にのみ活性化される必要がある（輸送途中

12432-12436, 2002.

で Slac2-a を分解するとメラノソーム輸送が阻害されてし

４）Wu XS, Rao K, Zhang H, et al.,：Identification of an

まうため）。今後の重要な研究課題の一つは Slac2-a を分

organelle receptor for myosin-Va, Nat. Cell Biol., 4,

解するプロテアーゼ候補 μ カルパインの時空間的活性化

271-278, 2002.
５）Kuroda TS, Ariga H, Fukuda M,：The actin-binding
domain of Slac2-a/melanophilin is required formelanosome distribution in melanocytes, Mol. Cell. Biol.,23, 5245-5255, 2003.
６）Fukuda M, Kuroda TS,：Missense mutations in theglobular tail of myosin-Va in dilute mice partially impair
binding of Slac2-a/melanophilin, J. Cell Sci., 117, 583-591,2004.
７）Kuroda TS, Fukuda M,：Rab27A-binding protein Slp2-a
is required for peripheral, melanosome distribution andelongated cell shape in melanocytes, Nat. Cell Biol., 6,1195-1203, 2004.
８）福田光則 ,：Slac2-a と Slp2-a：メラニン色素輸送のしくみ , 医学のあゆみ , 212, 769-770, 2005.
９）Ménasché G, Pastural E, Feldmann J, et al.,：Mutations

図４

Slac2-a-ΔPEST 変異体によるメラノソーム凝集の誘導
野生型の GFP-Slac2-a 分子はメラノソーム上に発現し、メラノソームの分布には大きな影響を与えないが（上段）、Slac2-a-ΔPEST 変異体は野生型よりも安定に発現し（主にアクチン線維上に蓄積）、約 40% の細胞でメラノソームの凝集が観察された（下段）。スケールバー、10μm。

in RAB27A cause Griscelli syndrome associated withhaemophagocytic syndrome, Nat. Genet., 25, 173-176,
2000.
10）黒田垂歩 , 福田光則：リソソーム関連疾患と低分子量
GTP 結合タンパク質 Rab − Rab27A とミオシン Va の運− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

命的出会い− , 実験医学増刊号「細胞内輸送研究の最前Rab27B regulates amylase release from rat parotid acinar線」, 21, 2039-2047, 2003.

cells, J. Cell Sci., 117, 1945-1953, 2004.

11）Fukuda M, Itoh T,：Slac2-a/melanophilin contains17）Fukuda M, Kojima T, Aruga J, et al.,：Functional

multiple PEST-like sequences that are highly sensitive todiversity of C2 domains of synaptotagmin family:

proteolysis, J. Biol. Chem., 279, 22314-22321, 2004.

Mutational analysis of inositol high polyphosphate12）Fukuda M, Kuroda TS,：Slac2-c (synaptotagmin-likebinding domain, J. Biol. Chem., 270, 26523-26527, 1995.

protein homologue lacking C2 domains-c), a novel linker18）Fukuda M, Kanno E, Mikoshiba K,：Conservedprotein that interacts with Rab27, myosin Va/VIIa, andN-terminal cysteine motif is essential for homo- andactin, J. Biol. Chem., 277, 43096-43103, 2002.

heterodimer formation of synaptotagmins III, V, VI, andX, J. Biol. Chem., 274, 31421-31427, 1999.

13）Kuroda TS, Fukuda M,：Functional analysis of Slac2c/MyRIP as a linker protein between melanosomes and19）Goll DE, Thompson VF, Li H, et al.,：The calpainsystem, Physiol. Rev., 83, 731-801, 2003.

myosin VIIa, J. Biol. Chem., 280, 28015-28022, 2005.
14）Fukuda M,：Versatile role of Rab27 in membrane20）Tang F, Kauffman EJ, Novak JL, et al.,：Regulated

trafficking: Focus on the Rab27 effector families, J.

degradation of a class V myosin receptor directs
movement of the yeast vacuole, Nature, 422, 87-92, 2003.

Biochem., 137, 9-16, 2005.
15）Bennett DC, Cooper PJ, Hart IR,：A line of non-21）Schollmeyer JE,：Calpain II involvement in mitosis,Science, 240, 911-913, 1988.

tumorigenic mouse melanocytes, syngeneic with the B16
melanoma and requiring a tumour promoter for growth,22）Saido TC, Suzuki H, Yamazaki H, et al.,：In situ captureof μ-calpain activation in platelets, J. Biol. Chem., 268,Int. J. Cancer, 39, 414-418, 1987.
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