脂質を中心とした非蛋白抗原に対する皮膚免疫応答機構の解明とその制御法の確立
京都大学ウイルス研究所

杉 田昌 彦Human group 1 CD1 molecules (CD1a, CD1b, CD1c) are expressed prominently in dendritic cells, and mediate
presentation of non-protein lipid antigens to T cells. Langerhans cells are epidermis-resident dendritic cells thatplay a pivotal role in skin immunity. These cells are unique in their abundant expression of the CD1a protein, but
its role in skin immunity remains to be determined. The principal investigator of this project previously isolatedLangerhans cells from the human skin, and observed their striking ability to activate microbial lipid-specific T cells.
To extend this finding further, this project has aimed to address whether CD1a-positive Langerhans cells mediate
lipid-specific immune responses in vivo. To accomplish this, we have attempted to reconstitute by a transgenic
technology CD1a-dependent immunity in mice that have deleted genes for CD1a. Generation of mice carrying thehuman CD1A genome has been completed, and we found that the human CD1a protein was expressed specificallyin epidermal Langerhans cells. In addition, microbial lipid-specific, CD1a-restricted T cell responses were readily
detected in these mice, suggesting that the positive selection for CD1a-restricted T cells indeed occurred as inhumans. Therefore, these mice provide a valuable opportunity for our evaluating CD1a function in vivo.

１．緒

これまでに研究代表者は、比重遠心法を用いてヒトラン言

ゲルハンス細胞を単離する技術を確立し、それを用いたイ主要組織適合抗原（MHC 分子）が、蛋白断片であるペ５）６）ンヴィトロでの機能解析を行ってきた。その結果、ヒ

プチド抗原を結合し、Ｔ細胞に抗原提示する現象は、近代

ト表皮より単離したランゲルハンス細胞は、CD1a 分子を免疫学が確立した中心的パラダイムのひとつである。感染介して細菌脂質をＴ細胞に提示することにより、脂質特異免疫や癌免疫、アレルギーや自己免疫疾患の病態がこのパ的 CD1a 拘束性Ｔ細胞を活性化する能力を有することが初ラダイムに基づいて説明されてきた。これに対して、研究めて実証された。

代表者らの最近の解析から、脂質に対して特異的に応答す一方、これらのインヴィトロでの解析とは別に、脂質特る免疫経路の存在が明らかとなりつつある。ヒト CD1 分子

異的な皮膚免疫応答を生体レベルで実証するにはそれに適（CD1a、CD1b、CD1c）は、脂質抗原を結合し、Ｔ細胞に抗した実験動物が必要である。研究代表者はこれまでモルモ原提示する新しいタイプの抗原提示分子であるットがヒト脂質免疫応答の解析に適した実験動物であるこ

１）２）３）４）。

これらの CD1 分子は樹状細胞に発現して、脂質抗原特異とを示し、抗酸菌感染モルモットにおける脂質免疫応答を的なＴ細胞応答を惹起する役割を担う。

実証してきた 。しかしモルモットの免疫解析手法は限ら

７）

ヒト表皮には、ランゲルハンス細胞と呼ばれる樹状細れていることから、細胞レベル、分子レベルでの詳細な解胞が分布し、皮膚免疫応答において中心的な役割を担う細析は困難である。免疫研究に多用されるマウスやラットは、胞として知られている。この表皮ランゲルハンス細胞は、ヒト CD1a に相当する分子を欠如している。したがって、CD1a 分子を多量に発現した生体内でも稀な樹状細胞であマウスにヒト CD1A 遺伝子を導入することにより、CD1aる。そのため、CD1a 分子はランゲルハンス細胞のマーカ依存的免疫応答をマウスに再構築すれば、CD1a 分子を介ーとして長らく注目されてきたが、その機能は不明であっした皮膚免疫応答の生体レベルでの解析が可能になると考た。研究代表者は、ヒト CD1 分子の基礎解析成果を基に、えられる。

CD1a 陽性ヒトランゲルハンス細胞は皮膚における脂質特このような学術的背景と考察を基に、本研究課題におい異的免疫応答を惹起する細胞であるとの作業仮説を立て、て、ヒト CD1A 遺伝子を導入したトランスジェニックマその検証を試みてきた。

ウスの作製を試みた。その結果、ランゲルハンス細胞に特異的に CD1a 分子を発現したマウス系統の樹立に成功した。

Pathways for skin immunity directedagainst lipids and other non-protein
antigens
Masahiko Sugita
Institute for Virus Research, Kyoto
University２．実
２・１験

CD1a トランスジェニックマウスの樹立

すべてのエキソンを含むヒト CD1A ゲノム遺伝子を単離し、エキソン部分については核酸変異がないことを確認した。得られた遺伝子断片をマウス（C57BL/6）受精卵前− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

核中に注入し、仮親の卵管内へ移植を行ってマウスを誕察すると、細胞表面および細胞内の小胞に CD1a 分子の発生させた。得られたマウスの尾よりゲノム DNA を抽出し、現が観察された（図３）。この発現分布のパターンは、研これを鋳型とした PCR 法により CD1A 遺伝子のマウスゲ究代表者がこれまでに行ったヒト樹状細胞の解析結果とよノムへの挿入を確認した。

く符合していた 。

２・２

マウスについて、表皮ランゲルハンス細胞における CD1a２）

さらに交配を重ねて得られた CD1a トランスジェニック

骨髄樹状細胞の単離と解析得られたトランスジェニックマウスより骨髄細胞を採取

分子の発現を検討した。表皮シートを抗 CD1a 抗体を用いし、マウスリコンビナント GM-CSF の存在下で 10 日間培て染色すると、樹状細胞様の形態を保持した細胞において、養することにより、骨髄由来樹状細胞を得た。細胞は抗ヒ特異的なシグナルが検出された（図 4A）。表皮より single

ト CD1a 抗体と蛍光色素で標識した抗マウス IgG 抗体をcell suspension を得て、抗 CD1a 抗体と抗 MHC クラス 2用いてラベルし、フローサイトメトリおよび蛍光顕微鏡に抗体を用いた二重染色をし、フローサイトメトリ測定を行よる解析を行った。

ったところ、MHC クラス 2 陽性細胞が CD1a 分子を発現していることがわかった（図 4B）。以上のことから、この

２・３

表皮ランゲルハンス細胞の解析

CD1a トランスジェニックマウスにおいて、表皮ランゲル

マウス耳介より皮膚を採取し、0.5 M チオシアン酸アンモニウム処理を行ったのち、表皮と真皮を分離した。表ハンス細胞が特異的に CD1a 分子を発現していることが確認された。

皮を冷アセトン固定し、ビオチン化ヒト CD1a 抗体およびこのマウスにおいて、CD1a 拘束性 T 細胞のポジティ

horseradish peroxidase 標識ストレプトアビジンを用いてブセレクションが起こっていることを検証する目的で、蛍光染色を行った。染色組織を封入したのち、蛍光顕微鏡

MAC 感染後の脾臓における MAC 脂質特異的 T 細胞の存下での観察を行った。

在をインターフェロンガンマ ELISPOT 法を用いて調べた。

表皮細胞のフローサイトメトリによる解析には、dispase

その結果、CD1a 陽性骨髄樹状細胞の存在下で脂質抗原特処理を行った皮膚より表皮を剥離し、EDTA 処理を施し異的な応答が観察され、その応答は抗 CD1a 抗体により阻て single cell suspension を得た。細胞の染色は２・２に止された。このことは、この CD1a トランスジェニックマ記載した方法で行った。

ウスにおいて、CD1a 拘束性の T 細胞が生成されていることを示唆している。

２・４

ELISPOT 法

４．考Mycobacterium avium complex（MAC） 感 染 CD1a ト

察

ランスジェニックマウスより脾臓細胞を回収し、MAC 菌

脂質特異的免疫応答の解析には、主としてモルモットが体より抽出した脂質抗原の存在下に骨髄樹状細胞と混合培使用されてきた。しかしその機序の詳細な解析や、蛋白特養した。活性化に伴いインターフェロンガンマ産生する細異的免疫応答との差異を明確にするためには、遺伝子操作胞を市販の ELISPOT キットにより検出した。

が容易なマウス実験系の樹立が必須である。本研究で樹立

３．結された CD1a トランスジェニックマウスの解析をさらに進果めることにより、ランゲルハンス細胞の新しい機能が明ら産まれてきた 17 匹のマウス（オス 10 匹、メス７匹）にかにされることが期待される。接触性皮膚炎を惹起する原ついて、PCR 法による genotyping を施行したところ、メ因分子の多くは非蛋白抗原であり、ウルシオールなど脂溶ス２匹が陽性であった（図 1、#3 と #7）。このうち１匹性の性質を持ったものも見られる。これらの脂質に対するについて骨髄樹状細胞を採取しフローサトメトリ解析を行

応答には CD1a 分子が関与している可能性が高く、その実ったところ、ヒト CD1a 分子の発現が確認できた（図２）。

証は病態の理解だけでなく新たな制御法の開拓にも結びつ

さらにサポニン処理した骨髄樹状細胞を抗 CD1a 抗体とテくことが考えられる。

キサスレッド標識二次抗体でラベルし、蛍光顕微鏡下で観図１

CD1a トランスジェニックマウスの genotyping 結果（本文参照）− 42 −脂質を中心とした非蛋白抗原に対する皮膚免疫応答機構の解明とその制御法の確立

図２ CD1a トランスジェニックマウスより得られた骨髄樹状細胞のフローサイトメトリ解析結果
抗 CD1a 抗体（青線）およびネガティブコントロール抗体（赤地）の染色パターンを示した。樹状細胞の細胞表面に顕著な CD1a 分子の発現が認められた。

A

図３ CD1a トランスジェニックマウスより得られた骨髄樹状細胞の蛍光顕微鏡解析結果（本文参照）

B

図４ CD1a トランスジェニックマウス表皮ランゲルハンス細胞における CD1a 分子の発現(A) 表皮シートを抗 CD1a 抗体を用いて蛍光染色した。 (B) 表皮より得た細胞を抗 CD1a 抗体と抗 MHC クラス 2 抗体を用いて二重染色し、フローサイトメトリにより解析した。

− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

図５ CD1a トランスジェニックマウスにおける、CD1a 拘束性 T 細胞の存在証明
MAC 感染マウス脾臓より T 細胞を単離し、CD1a 陽性あるいは CD1a 陰性樹状細胞の存在下で、MAC 由来脂質抗原による刺激を行った。一部は阻害抗体を加える条件で行った。活性化を受けインターフェロンガンマを産生した T 細胞の数を、ELISPOT 法により測定した。

（引用文献）

deficient cells. Immunity, 16, 697-706, 2002.

１）Sugita M, Jackman RM, van Donselaar E, et al.:５）Pena-Cruz V, Ito S, Oukka M, et al.: Extraction of

Cytoplasmic tail-dependent localization of CD1b

human Langerhans cells: a method for isolation of

antigen-presenting molecules to MIICs. Science, 273,

epidermis-resident dendritic cells. J. Immunol. Methods,349-352, 1996.

255, 83-91, 2001.

２）Sugita M, Grant EP, van Donselaar E, et al.: Separate

６）Pena-Cruz V, Ito S, Dascher CC, et al.: Epidermal

pathways for antigen presentation by CD1 molecules.

Langerhans cells efficiently mediate CD1a-dependent

Immunity, 11, 743-752, 1999.

presentation of microbial lipid antigens to T cells. J.
Invest. Dermatol. 121, 517-521, 2003.

３）Sugita M, van der Wel N, Rogers RA, et al.: CD1cmolecules broadly survey the endocytic system. Proc.

７）Watanabe Y, Watari E, Matsunaga I, et al.: BCG
vaccine elicits both T-cell mediated and humoral

Natl. Acad. Sci. USA, 97: 8445-8450, 2000.
４）Sugita M, Cao X, Watts GF, et al.: Failure oftrafficking and antigen presentation by CD1 in AP-3-− 44 −immune responses directed against mycobacterial lipid
components. Vaccine, 24, 5700-5707, 2006.