Ｄ−アミノ酸で評価する太陽紫外線による皮膚タンパク質の損傷と老化
京都大学原子炉実験所

藤井紀子

We previously reported that biologically uncommon D-aspartyl residues are present in sun-damaged skin fromelderly people, possibly in elastin. Here, we report the kinetics of Asp racemization in model peptides corresponding
to elastin sequences from exons 6 and 26A. We estimated the activation energy（E）of racemization of Asp residues,
the racemization rates（RR）at 37℃ and the time（t）required for the D/L ratio of Asp to approximate to 1.0（D/L ratio of Asp=0.99）at 37℃ . For an exon 6 peptide, E=29.0 kcal/mol, RR=2.59 × 10-2/yr and t=101.0 yr. For an exon
26A peptide E=26.2 kcal/mol, RR=4.27 × 10-2/yr and t=61.3 yr; and for a second exon 26A peptide E=25.7kcal/mol,
RR=5.55 × 10-2/yr and t=47.0 yr. These results suggest that racemization of Asp residues in elastin could occur withina human life span. We propose that D-Asp could be a useful molecular indicator of aging.

1.

顔の皮膚

はじめに
9歳

生体を構成するタンパク質はすべてＬ - アミノ酸から構59 歳

86 歳

背中の皮膚（85 歳）成されているが、近年、老化に伴って眼の水晶体 [1,2]、脳 [3,4]、動脈壁 [5]、歯 [6]、軟骨 [7]、皮膚等 [8,9] の代謝の遅い組織のタンパク質中で、本来生体内には存在しないはずのＤ - アスパラギン酸（D-Asp）が増加することが明らかとなってきた。Ｌ - アミノ酸から構成されているタンパク質中でＬ - アミノ酸の光学異性体である D- アミノ酸が生成されれば、タンパク質の立体構造は大きく変化し、Fig. 1 ヒトの皮膚に存在する D-beta-Asp 含有蛋白質（赤色部分）不溶化、凝集が生じ、機能低下を引き起こすと考えられる。
上記の組織ではこの様な一連の変化によって白内障、アル線照射部位で特にその傾向が著しいことを見いだした [8]。

ツハイマー病、動脈硬化が惹起されたものと考えられていさらに、老人の顔の皮膚より D-β-Asp 含有タンパク質る。筆者らは水晶体主要構成成分である α- クリスタリンを抽出し、D-β-Asp 含有タンパク質を特異的に認識する中で Asp 残基が著しく D- 体化し、同時に異性化（α-Asp抗体を用いて 2 次元電気泳動により Western blotting を行→ β-Asp）している部位を発見し、この反転反応がなぜ、ったところ、本タンパク質はエラスチンと考えられたの生じるのかを詳細に検討した。その結果、１）タンパク質で、本研究ではエラスチン中に含まれる Asp 残基周辺と中の Asp の隣接残基が立体障害の少ないアミノ酸であると同一配列のペプチドを３種類合成し、そのペプチドを用いき、Asp 残基が５員環イミドを経由して反転する。２）タて Asp 残基のラセミ化反応のキネテイクッスを解析した。

ンパク質自身の立体構造が D-Asp を誘導する反応場を形成2．実しているという機構が明らかとなった [10]。これは従来の生体内での D- アミノ酸生成反応は体温における単純なラセ2-1ミ化反応の結果であるという考えとは一線を画するものでサンプル合成したペプチドは下記の通りである。

あり、条件さえ整えば容易に他の組織でも D- アミノ酸が生

１）Exson 6：GVADAAAA,成されるということを示している。申請者らは Fig. １に示す

２）Exson 26-1：REGDPSSS,

ように、老化した皮膚に、D-β-Asp が多量に蓄積され、紫外

３）Exson 26-2：AGADEGVR

The evaluation of for sun-damaged skin by
D-amino acid
Noriko Fujii
Research Reactor Institute, Kyoto
University験

これらのペプチドを 50, 60, 70, 80, 90℃で 32 日間保温した。８日間ごとに各温度での Asp の D/L 比を調べ、上記試料における各温度での Asp のラセミ化反応速度定数（k）を求めた。各温度の速度定数（k）から Arrhenius 式を用
い各試料での Asp のラセミ化反応の活性化エネルギーを求め、体温（37℃）で Asp の D/L 比が 1.0 に達する時間を求めた。

− 29 −

2-2

アミノ酸の D/L 比の分析

コンタミネーションを防ぐため、全てのガラス器具を 500℃で４時間加熱処理した後、使用した。加水分解は Pico
Tag Work Station（Waters Tokyo）を用いて６N-HCl、108℃で７時間加熱することによって気相加水分解をおこなった。次いで、加水分解物の試料に 0.13M borate buffer（pH 10.3）を加え、この溶液に o-phthalaldehyde（OPA）とN-tert-butoxycarbonyl-L-cysteine（Boc-L-Cys）を反応させ、ジアステレオマ−を形成させた。このジアステレオマ−を、
Nova-Pak ODS, 3.9×300mm（Waters Tokyo）のカラムを使

Fig. ２ 60℃における Exon 6、26A-1、26A-2 中のAsp 残基のラセミ化反応

用した RP-HPLC（Shimazu、LC-10A）で分析し、蛍光検出計（励起波長 344nm、蛍光波長 433nm）でそれぞれ検出

Table１ Comparison of racemization constants(k)of elastin mimic peptides at 50℃～90℃

した。溶媒は 0.1M acetate buffer ／３％ tetrahydrofuran ／acetonitrile を用い、acetonitrile の濃度が７− 47％の linear

2k × 10 day-1gradient になるように流速 0.8 ml/min、30℃で分析し、D/L比はピーク面積の比によって求めた [11]。

2-3ラセミ化反応速度

ペプチド中のアスパラギン酸のラセミ化は可逆的な一次平衡反応で次のように示すことが出来る。
− d[L]/dt = k[L] − k[D]（1）t℃

Exon 6

Exon 26A-1

Exon 26A-250607080900.050.210.681.787.720.070.240.56
1.87
7.04

0.090.290.75
2.337.47［L］と［D］は、それぞれ L-Asp と D-Asp の濃度を表し

プチド中の Asp のラセミ化反応速度定数ｋは、Fig. ２におており、ｋはラセミ化反応の速度定数を表している。このける近似直線の傾きの 1/2 に相当することがわかる。この式を積分により解くと以下のような数式が得られる。

ことから、60℃での exon ６中の Asp ラセミ化反応速度定

ln [(1+D/L)/(1 − D/L)] = 2kt + ln [(1+D/L)/(1 − D/L)] t0 （2）数 k60 は 0.21×10-2 day -1、exon 26A-1 の k60 は 0.24×10-2 day 、
exon 26A-2 の k60 は 0.29×10-2 day -1 であることがわかった。

t は反応時間をあらわし、t 0 は t ＝ 0 を表している。この1

t0 時のラセミ化は酸による加水分解によって引き起こされこの結果は、exon 26A-2 中の Asp 残基が最もラセミ化しやたものである。

すく、exon ６中の Asp 残基が最もラセミ化しにくいこと示

本研究では、測定した D/L 比とこの（2）式を用いて、している。

３つのペプチド（Exon 6、26A-1、26A-2）中に存在する同様に、50℃、70℃、80℃、90℃の全ての温度で、各ペAsp 残基のラセミ化反応速度定数を、各温度（50℃、60℃、プチド中の Asp 残基のラセミ化反応速度定数を算出した。

70℃、80℃、90℃）ごとに算出した。

その結果を Table １に示した。

他方、Arrhenius の式（3）を用いて、各ペプチドにおい３つのペプチドのラセミ化反応速度定数が温度に依存して Asp がラセミ化反応する活性化エネルギーを算出した。ていることから Arrhenius の式を用い、ラセミ化反応の活ln k = ln A−E/RT（3）性化エネルギーを算出した。
次に Table １に示した各温度でのラセミ化反応速度定数

E は活性化エネルギ−、R は気体定数、A は頻度因子、Tと Arrhenius の式を用い、各ペプチド中の Asp がラセミ化は絶対温度を表している。

3.

結反応する活性化エネルギーを算出した。

果（3）式 ln k = ln A − E/RT から、ln k を縦軸に、1/T（絶例として 60℃の結果を Fig. ２に示した。
（2）式の左辺

対温度の逆数をとったもの）を横軸にとり、各温度（50℃を縦軸に、時間 t を横軸にとり、60℃で、８日間ごとに測〜 90℃）のラセミ化反応速度定数 k の自然対数をとった

定した各ペプチド中に存在する Asp の D/L 比を縦軸（ln値をそれぞれプロットした。

[(1+D/L)/(1-D/L)]）に適用した値を Fig. ２のようにプロッ

Fig. ３に示すように、各ペプチドのプロットから得らトした。プロットから得られた近似直線は、３つのペプチれた近似直線は高い直線性を示しており（r2 ＝ 0.991 〜ドとも高い直線性を示しており（r2 ＝ 0.971 〜 0.999）、こ0.998）、この近似直線の傾きが− E/R に相当することがのことから合成ペプチドのラセミ化反応は、可逆一次反応わかる。このことから、exon ６（GVADAAAA）の活性化であることがいえる。さらに（2）式から、各温度でのペエネルギー E は 29.0kcal/mol、exon 26A-1（REGDPSSS）− 30 −

Ｄ−アミノ酸で評価する太陽紫外線による皮膚タンパク質の損傷と老化

Table 2 Summary of racemization of Asp residues in elastinmimic peptide
PeptideE（kcal/mol）

k37 × 104（day-1）

Year37

Exon 6
Exon 26A-1

29.0
26.2

0.71
1.17

101.0
61.3

Exon 26A-2

25.7

1.52

47.0

E：activation energy
k37：racemization constant at 37℃
Year37：time to approximate a D/L ratio of 1.0（0.99）

Fig. ３ exon6, 26A-1, 26A-2 中の Asp のラセミ化反応速度定数の Arrhenius plots

Exon 6：GVADAAAA
Exon 26A-1：REGDPSSS
Exon 26A-2：AGADEGVR

は 26.2kcal/mol、exon 26A-2（AGADEGVR）は 25.7kcal/molと算出され、exon 26A-2 の活性化エネルギーが最も低く、ラTable３ 他組織の結果との比較セミ化反応が起こりやすいことが明らかとなった（Table 2）。
前述したように、本研究では exon ６（GVADAAAA）、
exon 26A-1（REGDPSSS）、exon 26A-2（AGADEGVR）のk37 year-1
本研究の結果 [12]皮膚のエラスチン

３つのペプチドを合成し、加熱実験によってこれらのペプチド中に存在する Asp のラセミ化反応速度定数と活性化エネルギーを求めた。さらに、Arrehenius の式を用いてヒトの体温（37℃）における各ペプチド中の Asp のラセミ化反応速度定数 k37 を求め、各ペプチド中の Asp の D/L比が 1.0（0.99）に達するのにかかる時間を算出した。その結果を以下に示す。

Exon 6
Exon 26A-1
Exon 26A-2

2.59 ｘ 10-2
4.27 ｘ 10-2
5.55 ｘ 10-2

Ritz-Timme et al. の結果
皮膚のエラスチン [9]黄色靱帯 [7]Powel et al. の結果
動脈壁 [5]4-5Asx ※ の平均
9-10Asx ※ の平均

3.6 ｘ 10-3
4.1 ｘ 10-3

4-5Asx ※ の平均

1.14 ｘ 10-3

Shapiro et al. の結果
肺気腫 [13]

8-9Asx ※ の平均

1.76 ｘ 10-3

Table ２ に 示 す よ う に、 ヒ ト の 体 温 で の 速 度 定 数 k37※ Asp と Asn の総称

は exon ６ で は 0.71×10-4 day -1、exon 26A-1 で は 1.17×
10-4 day -1、exon26A-2 で は 1.52×10-4 day -1 と 算 出 さ れ、ヒトの皮膚、黄色靱帯、動脈、肺気腫のような様々な組織

exon26A-2 での速度定数 k37 は exon ６での速度定数 k37 ので報告されており、このことからもエラスチン中のアスパ約２倍の値を示した。さらに、各ペプチド中での Asp 残基ラギン酸のラセミ化反応は非常に起こりやすいと考えるこの D/L 比がヒトの体温（37℃）で 1.0（0.99）に達する時間は、とができる。また、エラスチン中で D-Asp の量が増加しexon ６で 101 年、exon 26A-1 で約 61 年、exon 26A-2 で 47 年

老化皮膚中に蓄積されるのは、エラスチンの代謝が非常にかかることが明らかになった。仮に皮膚中のエラスチンに遅いためであると予想することができる。

存在する Asp のラセミ化反応が、本研究の合成ペプチドとTable ３の Ritz-Timme らの結果は、本研究の結果と比同じように起こっているのならば、エラスチン中の Asp 残べて一桁低い値を示しているが、これは彼らの結果が、全基は、ヒトの一生の間にラセミ化反応を起こしうるのに十Asp の平均として表されているのに対し、我々の示した値分な反応速度を有していることになる。

は部位特異的なラセミ化を扱っているためと考えられる。

４.

結Ritz-Timme らの値は 4-5Asx 残基の平均値であるので、部論特異的なラセミ化が存在するならば、本研究の結果と比べ

本 研 究 に お い て、 ３ つ の ペ プ チ ド（GVADAAAA、て Ritz-Timme らの値は非常に良い一致を示しているとい

REGDPSSS、AGADEGVR）での Asp ラセミ化反応は可逆える。D-β-Asp 含有タンパク質は異常なタンパク質で有り、的な一次平衡反応であることが確認できた。さらに、これその光学的性質のために酵素が認識できず、組織中に蓄積らのペプチド間での違いは小さく、ペプチド中に存在するされるのではないかと考えられる。また、D-β-Asp 含有

アスパラギン酸の D/L 比が 1.0(0.99) に達する時間は約 50

タンパク質は紫外線によっても増加し蓄積され、エラスチ年から 100 年であることが分かった。このことからエラスン抗体とも交叉反応を示した。この結果は、皮膚のエラスチン中の全てのアスパラギン酸が、ヒトの一生の間で非常チン中における D-β-Asp の形成が、老化だけでなく紫外にラセミ化反応を起こしやすいということが示唆された。

線とも密接な関係にあることを示している。

Table ３に本研究の結果とすでに報告されている結果を以上のことから、我々は、D-β-Asp が老化や紫外線にまとめた。エラスチン中のアスパラギン酸のラセミ化は、よる皮膚のダメージを知る上での分子マーカー（指標）と− 31 −

1976;262(5566):279-81.

して応用できるのではないかと考えている。

７） Ritz-Timme S, Laumeier I, Collins M. Age estimation
based on aspartic acid racemization in elastin from the謝辞

yellow ligaments. Int J Legal Med 2003;117(2):96-101.

本研究を遂行するに当たり、ご支援を頂きました（財）
コスメトロジー研究振興財団及び共同研究者に深く感謝い８） Fujii N, Tajima S, Tanaka N, Fujimoto N, Takata T,
Shimo-Oka T. The presence of D-beta-aspartic acid-

たします。

containing peptides in elastic fibers of sun-damaged
skin: a potent marker for ultraviolet-induced skin aging.

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２） Fujii N, Ishibashi Y, Satoh K, Fujino M, Harada K.

10） Fujii N, Harada K, Momose Y, Ishii N, Akaboshi M.

Simultaneous racemization and isomerization at specificD-amino acid formation induced by a chiral field within aaspartic acid residues in alpha B-crystallin from the aged

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