SOD1 ノックアウトマウスに発症する皮膚炎への活性酸素の関与の解明
山形大学大学院医学系研究科生命環境医科学専攻

藤 井

生体分子機能学

順 逸Superoxide dismutase (SOD) is a principal enzyme to protect cells from cytotoxic effects of reactive oxygenspecies. We first examined mechanism of singlet oxygen-induced cell damage and also established detection
systems for oxidized Trp and glutathionylated proteins.   SOD1-deficient mice showed accelerated aging,such as inflammation in facial skin.   Keratinocyte from SOD1-deficient mice was less capable of adhesion andproliferation in primary culture probably due to elevated oxidative stress.

するナフタレン誘導体エンドペルオキシドを用いることに１．緒言

よって、細胞への一重項酸素の効果を純粋に評価すること

酸素呼吸を行う生物においては活性酸素種が不可避的が可能となった４）。に生じ、それが生体を傷害し老化の原因となると考えられ本研究では、（１）このナフタレン誘導体エンドペルオている。こうした活性酸素から生体を防御する抗酸化物質

キシドを用いて、アポトーシスとその誘導にかかわるカスや抗酸化酵素が幾つか知られている。中でも Superoxide

パーゼならびにチトクローム -c（cyt-c）に対する一重項酸

disumutase（SOD）は酸素分子が一電子還元を受けて生素による細胞傷害作用について検討した。また、（２）シ

じる最初の活性酸素・スーパーオキシドを消去するため、ステインプロテアーゼであるカスパーゼと活性基との関連酸化ストレスからの防御の上で中心的な役割を果すと考えを調べるために、ヒト皮膚線維芽細胞のリソソーム酵素でられてきた 。しかし一方で、SOD の中でも最も量の多あるカテプシン群での検討を行った。さらに、（３）皮膚い Cu, ZnSOD の遺伝子 SOD1 を欠損するマウスは、老化の光老化現象と酸化ストレスの関連を調べるために、酸化その他について顕著な表現型を示さないと報告されており、アミノ酸とグルタチオン化タンパクの２つの酸化ストレスその役割について疑問が投げかけられている 。

マーカーの検出法を開発した。
（４）そして活性酸素から

１）２）活性酸素種の生成量はストレスなどにより増し、皮膚では特に紫外線（UV）照射により生成し、皮膚がんや光老の防御の上で重要と考えられている SOD1 を欠くマウスの皮膚への影響について検討を行った。

化に関わると考えられている。UVB がスーパーオキシドやヒドロキシルラジカルといった細胞傷害性の高い活性酸２．実験素種を生成するのに対して、UVA は主にフラビンやヘムなどの色素化合物と反応して一重項酸素（1O2）の生成に２−１一重項酸素による細胞傷害性の解析関係する。UVB は様々な化学反応を起こすため影響が現ヒト由来培養細胞 HepG2 を用いて、ナフタレン誘導体れやすく、それに関する研究は多数ある３）。しかし一重項エンドペルオキシドから生じる一重項酸素による細胞傷害酸素については、その効果を厳密に評価することができな活性を調べた。ミトコンドリアからの cyt-c 流出・クロマ

いため解明が遅れている。これまでは一重項酸素に関するチン凝集・DNA ラダー形成・カスパーゼ活性化といった研究のほとんどが色素に光を照射して生成させる光増感反アポトーシスの指標となる項目について検討し、細胞をエ応に頼っていた。しかしこの方法では生成量のコントロー

トポシド処理して典型的なアポトーシスを誘導させた場合ルが難しい上に、副産物として他の活性分子種が生成すると比較した。

ため、一重項酸素の影響だけを純粋に評価することは難し

また、精製ウマ cyt-c を用いて、その酸化還元（レドッい。最近、共同研究者の開発した、一重項酸素のみを生成クス）状態とアポトーシス誘導能との関連について解析した。さらに、細胞抽出液を用いた無細胞再構成系を用いて、Investigation on Involvement ofReactive Oxygen Species in Dermatitis
Developed in SOD1-Knockout Mice
Junichi Fujii
Department of Biomolecular Function,
Major of Environmental Life Science,
Graduate School of Medical Science,
Yamagata University

一重項酸素処理した cyt-c によるアポトーシス誘導能について検討した。

２−２

ヒト皮膚線維芽細胞のカテプシンアイソザイ

ムに対する一重項酸素の影響
正常ヒト皮膚線維芽細胞ならびにその細胞抽出画分をエ− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

ンドペルオキシド処理し、生成した一重項酸素のカテプの活性化といったアポトーシスの過程で起こる現象は、エシン B、L/S, D/E 活性に対する影響を検討した。さらに、

トポシド処理した場合に比較して著しく低く、アポトー

精製ヒトカテプシン B を用いて活性測定ならびにタンパ

シス経路はむしろ抑制されていた５）。詳細な解析を行った

ク化学的解析を行った。

結果、一重項酸素はカスパーゼ活性を阻害すること、さらに cyt-c により活性化される apoptosome の形成を阻害し、２−３酸化ストレスマーカーの検出系の開発

典型的なアポトーシスとは異なる細胞死をもたらすことが酸化に弱いアミノ酸のうち、Met, His, Tyr, Trp の４種分った（図１）。

類を、一重項酸素・スーパーオキシド・ヒドロキシラジ

cyt-c はアポトーシスを誘導するが、結合しているヘムカルの各活性酸素種に曝し、生成する酸化物の構造決定が還元型と酸化型のいずれでアポトーシスを誘導するかにを行った。その中の一つで、Trp の主要な酸化物であるついては一致した見解が得られていなかった。そこで精製

N-formylkynurenine（NFK）に対する抗体を作成した。

ウマ cyt-c を用いて、結合しているヘムの酸化還元（レドGlutathione S-transferase（GST）がグルタチオンを特ックス）状態について解析した。その結果、酸化型 cyt-c異的に認識・結合することを利用した検出系の開発を行にのみアポトーシス誘導能が認められ、還元型 cyt-c にはった。ビオチン化した GST をグルタチオン化タンパクなかった（図２）６）。一重項酸素処理することによってアに 結 合 さ せ、horse radish peroxidase（HRP） 標 識 し た

ポトーシス誘導能は不可逆的に消失し、タンパク中のカルstreptavidin で検出した。

ボニル含量が増加した。以上の結果は、ヘムの酸化還元ではなく、タンパクの酸化的修飾が cyt-c のアポトーシス誘

２−４

SOD1 欠損マウスの解析

導能喪失の原因となっていることを示している７）。

SOD1 欠損マウスの加齢に伴い、皮膚の炎症の出現、体重、臓器重量の変動といった表現型がどのように変化する

３−２か観察・測定した。貧血との関連が疑われたので、赤血球細胞内小器官であるリソソームに含まれる酸性プロテ含量について計測した。また、皮膚よりケラチノサイトをアーゼ・カテプシンに対する一重項酸素の影響を解析した

初代培養し、細胞分裂能や接着性ならびに栄養要求性につところ、システインプロテアーゼ群に属するカテプシン B

いて調べた。と L/S 活性のみが阻害され、アスパラギン酸プロテアーゼ群に属する D/E 活性はまったく影響を受けなかった８）。
システインはこの一重項酸素による阻害効果に対して極め３．結果て有効な保護作用を示した。しかし、一重項酸素処理で失３−１活したカテプシン B と L/S 活性は還元剤処理によって回ナフレン誘導体エンドペルオキシドを用いた解析から、一重項酸素は強力な細胞傷害作用を有することが分った。

復しなかった。精製カテプシン B を用いた場合でも同様の結果が得られた（図３）。

この細胞傷害過程でミトコンドリアからの cyt-c 流出を促進することから、その細胞傷害の機構としてはアポトー３−３酸化ストレスマーカーの検出系の開発

シスが疑われた。しかし、DNA ラダー形成・カスパーゼ

酸化に弱い Met, His, Tyr, Trp の４種類のアミノ酸を各

図１ 一重項酸素によるアポトーシス経路の抑制

図２ cyt-c は酸化型でのみアポトーシスを誘導する。一重項酸素はアポトーシス刺激を受けた細胞でもアポトーシスを中絶させる。

− 64 −

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図３ 精製ヒト・カテプシンＢの一重項酸素（MNPE）による阻害：濃度依存性（A）、経時変化（B）、不可逆性（C）、アミノ酸修飾の解析（D）

図４ （A）Trp は活性酸素により NFK に酸化される。
（B）抗 NFK 抗体の特異性と、kynurenine（Kyn）との反応性。

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コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

活性酸素種に曝し、生成する酸化物の構造決定を行った。

ころ、野生型よりも低く貧血の症状を呈していた。解剖しその中の１つ N-formylkynurenine（NFK）は、Trp からたところ、脾臓の肥大が認められ、組織学的解析から赤血酵素的に kynurenine が精製する際の重要な前駆体である球の破壊とそれを代償するために造血が亢進していると考ため、牛胎児血清アルブミン（BSA）に結合させ抗原とえられた。さらに、顔面に皮膚炎が見られたことからそのしてウサギに免疫し、抗体を作成した 。トリプシンを一原因を解明するために、新生仔皮膚よりケラチノサイトを重項酸素処理してウエスタンブロット解析に用いた場合、単離・培養し、解析を行った。SOD1 欠損マウス由来細胞得られた抗血清は処理時間に依存して反応性が増したことは培養皿への接着性が低下していた。その主な原因としてから、NFK を認識する抗体ができている事が分かった（図は、培養に用いる血清中の成分が関係していることをつき４）。Kynurenine を結合させた卵白アルブミン（OVA）とめた。

９）を用いてウエスタン解析したところ特異的に検出されたことから、本抗体は kynurenine も認識することが分かった。

４．考察

また、日本住血吸虫の GST をビオチン化し、これをプローブとしてグルタチオン化タンパクを検出する系を確立

４−１した 10）。結合したビオチン化 GST は、HRP-streptavidin細胞はアポトーシスを起こす事によって断片化され、マで検出された（図５）。この方法により、グルタチオン化クロファージなどの貪食細胞に取込まれるため、細胞内タンパクを簡便に検出し、酸化ストレスの評価をより詳細容物は細胞外にほとんど漏れ出ない。しかし、ネクローに行うことが可能となった。本法による解析から、S- ニ

シスやアポトーシスが中絶された場合には細胞外に内容トロソグルタチオンが最もタンパクの S- グルタチオン化物が漏れ出る事から、貪食によるアポトーシス細胞の除去を促進することが分った。

が阻害された場合文献 11）と同様に、それが抗原となり、自己免疫疾患を惹起する可能性がある。今回の結果から、

３−４

SOD1 欠損マウスの解析

UVA が一重項酸素の生成をもたらし、それがアポトーシ

SOD1 欠損マウスの全身ならびに皮膚に現れる老化現象

スを阻害することで、死んだ細胞の内容物が細胞外に漏れについて解析した。SOD1 欠損マウスを長期に渡って飼育出ることが UVB による炎症の劇症化につながる可能性をし体重の変動を調べたところ、野生型に比べて有意に軽い示唆している。

ことが分かった。また、赤血球含量の加齢変化を調べたと

図５ 新たに開発した GST によるグラタチオン化タンパク検出系の原理（A）と結果の例（B）− 66 −

SOD1 ノックアウトマウスに発症する皮膚炎への活性酸素の関与の解明

４−２

ただきました共同研究者の皆様に厚く御礼申し上げます。

一重項酸素処理によってカスパーゼだけではなくカテプシン群についても、システインプロテアーゼに属するアイ( 参考文献 )ソザイムのみが阻害された。これはシステインプロテアー

１）Fridovich I. Superoxide radical and superoxide

ゼの酵素活性にかかわるアミノ酸が特異的に酸化された可dismutases. Annu. Rev. Biochem. 64, 97–112, 1995.

能性を示唆している。調べた限り、触媒中心を形成するシ２）Reaume AG, Elliott JL, Hoffman EK, ほか：Motor neurons

ステインが酸化されていないことから、触媒活性に必要なin Cu/Zn superoxide dismutase-deficient mice develop

ヒスチジンが一重項酸素の標的となっている可能性がある。

normally but exhibit enhanced cell death after axonal
injury. Nat. Genet. 3, 43–47, 1996.

４−３

酸化ストレスマーカーの検出系の開発

３）Halliwell B, and Gutteridge JMC. (eds) Free Radical

Kynurenine は、Trp が脳で酵素的に代謝されてドーパ

Biology and Medicine, 3rd ed. Clarendon Press, Oxford,

ミンに変換される過程で生成する中間体化合物である。こ1999.

れまでに kynurenine を認識する抗体を作成したとの報告

４）Liu W, Ogata T, Sato K, ほか：Syntheses of water-solubleはなく、本報告がはじめてである。本抗体を用いる事によendoperoxides as a singlet oxygen source. ITE Lettersって組織切片での検出が可能となるので、今後の組織学的on Batteries, New Technologies and Medicine 2, 98–101,

応用が考えられる。グルタチオン化タンパクについては、

2001.

従来の方法では放射性同位元素を用いるなど、その検出に

５）Otsu K, Sato K, Ikeda Y, ほか：Abortive apoptotic pathway

は煩雑で特殊な技術ならびに設備を必要とした。しかし、

by singlet oxygen due to the suppression of caspase

今回開発した方法を用いる事によって、免疫学的方法に準activation. Biochem. J. 389, 197-206, 2005.
６）Suto D, Sato K, Ohba Y, ほか：Abolished pro-apoptotic

じた手軽さで、しかも高感度の検出が可能である。

function of cytochrome c by singlet oxygen via heme４−４SOD1 欠損マウスの解析

redox state-independent mechanism. in "NaturalSOD1 欠損マウスは通常の飼育下では目立った表現型は示さないとされていたが、長時間に渡る多数のマウスの観

Antioxidants and Micronutrients"(B Zhao, G Liu, LPacker, eds), Medimond, Bologna, 87-90, 2005.

察結果から、SOD1 欠損は血液や皮膚に老化現象を引き起７）Suto D, Sato K, Ohba Y, ほか： Suppression of the pro-こす事が分かった。初代培養実験から、皮膚の炎症と増殖

apoptotic function of cytochrome c by singlet oxygen via

因子との関連が示唆された。この SOD1 欠損マウスの皮a heme redox state-independent mechanism. Biochem. J.

膚に現れる炎症の原因解明のために、個体・組織・細胞・392, 399-406, 2005.
８）Nagaoka Y, Otsu K, Okada F, ほか：Specific inactivation

そして分子レベルのより詳細な検討を進めている。

of cysteine protease-type cathepsin by singlet oxygengenerated from naphthalene endoperoxides. Biochem.

５．総括

Biophys. Res. Commun. 331, 215-223, 2005.

本研究では、まず活性酸素種の１つ一重項酸素の細胞傷

９）Suto D, Ikeda Y, Fujii J, ほか：Structural analysis of amino

害機構を調べ、光老化を解明する上でタンパク質の酸化的acids, oxidized by reactive oxygen species and an

修飾の解析の重要性を示した。酸化アミノ酸を検出するた

antibody against N-Formylkynurenine. J. Clin. Biochem.

めに有用な、トリプトファン酸化物と反応する抗体を作成

Nutr. 38, 107-111, 2006.

し、またグルタチオン化タンパクの簡便な検出法を開発し10）Cheng G, Ikeda Y, Iuchi Y,

ほか： Detection ofた。SOD1 欠損マウス顔面の皮膚の炎症について、初代培S-glutathionylated proteins by glutathione S-transferase

養を行う事で分子レベルの解析を行った。

overlay. Arch. Biochem. Biophys. 435, 42-49, 2005.
11）Hanayama R, Tanaka M, Miyasaka K, ほか：Autoimmune

謝辞

disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-

本研究にご助成いただきましたコスメトロジー研究振興E8-deficient mice. Science 304,1147-1150, 2004.

財団に深謝申し上げます。また、本研究の遂行にご尽力い− 67 −