マイクロエマルションを利用したポリフェノールの皮膚へのデリバリーと光老化防御神戸薬科大学北河修治

To improve the efficiency of the intradermal delivery of polyphenols, we tried to clarify the usefulness of microemulsion
by in vitro study on excised guinea pig dorsal skin and Yucatan micropig skin. Using microemulsion consisting of isopropyl
myristate, 150 mM NaCl solution, Tween 80 and ethanol as a vehicle, the solubility of all the polyphenols such as quercetin,genistein and chlorogenic acid markedly increased and significant amounts of polyphenols were delivered to the skin. For
hydrophobic polyphenols water-in-oil microemulsion was more effective. On the other hand, for hydrophilic polyphenols
oil-in water microemulsion was more effective. Polyphenols retained in the skin significantly inhibited lipid peroxidationin vitro dose-dependently. Furthermore, pretreatment of guinea pig dorsal skin with polyphenols such as genistein andchlorogenic acid, which were contained in microemulsion gel, prevented UV irradiation-induced erythema formation. Thesefindings indicate the potential use of microemulsion for the delivery of polyphenols to protect skin against UV-induced
oxidative damage.

1．緒

待するこれらのポリフェノールは、できるだけ皮膚に留ま言り、血中へは移行しないことが要求されるため、皮膚透過種々の物質の中で抗酸化剤として知られるポリフェノー性についても検討を行った。また、ポリフェノールの皮膚ルに光老化に対する防御作用が期待されている。しかしな移行に伴う、皮膚の過酸化反応に対する防御作用、紫外線がら、実際にポリフェノールを皮膚に適用する場合には、照射による皮膚の紅斑形成に及ぼす影響について in vitro

皮膚移行性が問題となる。ポリフェノールは水にも有機溶及び in vivo で観察した。

媒にも溶解しにくい化合物であり、また、代表的なポリフ

２．実ェノールであるフラボノイド類は比較的分子量も大きいことから皮膚への移行性は低い。したがって、皮膚への効率

2. 1.

験

実験試料的な移行を目的とした場合、何らかの吸収促進系を用いる

ポリフェノールは試薬会社より購入したものを用いた。

必要がある。近年、マイクロエマルションが薬物の経皮吸

神戸薬科大学動物実験指針に従ってハートレー系モルモッ

収に有用であることが明らかにされてきた。マイクロエマ

ト（オス、３週齢）皮膚より麻酔下、バリカンによる除毛後、ルションは、油相、水相、界面活性剤、補助界面活性剤よ背部皮膚を摘出し、脂肪を除去して用いた 3, 4）。ユカタン

り構成される熱力学的に安定な分散系であるが、薬物の溶

マイクロピッグ皮膚は日本チャールスリバーより購入し、解度を増大するとともに経皮吸収性を増加することから

1, 2）、脂肪及び皮下組織を藤井らに従って除去して用いた 5）。

水にも有機溶媒にも難溶性のポリフェノールの皮膚への効率的なデリバリーを目指す場合、有望な促進系であると考

2. 2.

えられる。

マイクロエマルションの調製

油相としてミリスチン酸イソプロピル（IPM）、水相とそこで、本研究では、分子量、化学構造、疎水性の異なして 150 mM NaCl 水溶液、界面活性剤としてポリオキシる種々のポリフェノール（Fig. 1 に構造を示す）の皮膚へ

エチレンモノオレエート（Tween80）、補助界面活性剤とのデリバリーについてさらに研究を行い、マイクロエマルしてエタノールを用いた。これらをふた付き試験管に加えションによるポリフェノールの皮膚移行性に対する改善効て、37℃に加温し、ボルテックスミキサーにより撹拌を行果を観察した。マイクロエマルションには水中油型（o/w

い 調 製 し た。 マ イ ク ロ エ マ ル シ ョ ン と し て は、IPM、型）と油中水型（w/o 型）があるが、ポリフェノールの疎150 mM NaCl 水溶液、Tween 80、エタノールの質量比が 8：水性と有効な型についても観察した。また、局所作用を期

25：20：47 及び 4：51：30：15 で o/w 型のマイクロエマル
ション A 及び K、上記構成成分の質量比が 33：7：30：30
で w/o 型のマイクロエマルション D を用いた。

Enhanced skin delivery of polyphenols
by microemulsion and prevention against
photoaging

2. 3.

Shuji Kitagawa

IPM、150mM NaCl 水溶液に過剰量加え、37℃で 20 時間

Kobe Pharmaceutical University

インキュベーションを行った後、12,000 ×g で１分間遠心溶解度の測定

ポ リ フ ェ ノ ー ル を マ イ ク ロ エ マ ル シ ョ ン A、D、K、− 26 −

マイクロエマルションを利用したポリフェノールの皮膚へのデリバリーと光老化防御

Fig.1 Polyphenols tested in this study(a) quercetin, (b) genistein, (c)chlorogenic acid.

を行い、上清のポリフェノール濃度を HPLC（島津 LC-10-行させ、脂質過酸化に及ぼす影響について、硫酸アンモニ

AS）で測定した。HPLC 分析には、逆相カラム RP-18 GP

ウム鉄（Ⅱ）とクエン酸ナトリウムを用いてチオバルビツ（4.6mm i.d.、150 mm）を用い、クェルセチン及びゲニスール酸試験によって観察を行った。

テインの定量は、移動相として、水、メタノール、りん酸（容積比 100：100：1）を用いた。クロロゲン酸の定量は、

2. 7.

UV 照射による紅斑形成の観察

移動相としては、水、メタノール、りん酸（容積比 140：

モルモットの背部皮膚を除毛後、ぬるま湯につけて垢取60：1）を用いた。UV 検出器の波長は、クェルセチンはりを行った。24 時間後、ポリフェノールを含有し、ゲニ

360 nm、ゲニステインは 260 nm、クロロゲン酸は 327 nm

ステインについては 8.3％エアロジル R972 によってゲル様とした。trans -フェルラ酸を内部標準とした。としたマイクロエマルションを、クロロゲン酸については、1.0％カルボポール 987 によってゲル化したマイクロエマル

2. 4.

マイクロエマルションの粒子径の測定ションを、それぞれモルモット背部の片側に、もう一方にマイクロエマルションの粒子径の測定は、粒径アナライ

ポリフェノールを含有しないマイクロエマルションゲルをザー（大塚電子 FPAR-1000）によって行った。マイクロエ塗布した。20 時間後、マイクロエマルションゲルをふきマルション A、D、K の平均粒子径は、それぞれ 39.8、42.5、取り、皮膚を乾燥後、138µW/cm2 の強度で UV-B ランプ12.3 nm であった。

（GL20SE）による 24 分間の UV 照射を行った。紅斑形成の評価は写真及び色差計による赤みの計測によって行った。

2. 5.

皮膚中移行量の測定

３．結

ポリフェノールの皮膚中移行量の測定は、中央にモルモット背部摘出皮膚あるいはユカタンマイクロピッグ皮膚を

3. 1.

果

マイクロエマルションによる溶解度の改善装着したフランツ型拡散セルを用いて行った。12 時間皮Table 1 に示すように、疎水性の高いポリフェノールで膚をプレトリートメント後、ドナー側にポリフェノールをあ る ク ェ ル セ チ ン、 ゲ ニ ス テ イ ン と も IPM、150 mM

懸濁した試料を入れ、モルモット皮膚の場合は 20 時間後、NaCl 水溶液における溶解度は低く、飽和溶解度でポリフ

ユカタンマイクロピッグの場合は 40 時間後、皮膚を取りェノールを適用した場合、マイクロエマルションを用いる

出し、氷冷メタノールで洗浄後、皮膚をホモジェナイズし、ことで有意に改善した 3, 4）。特に w/o 型のマイクロエマル抽出試料を遠心し、上清のポリフェノール濃度を上述の条ション D は o/w 型のマイクロエマルション A に比べて、件で HPLC によって測定した。

より効果的であった。一方、親水性のポリフェノールであるクロロゲン酸は、150 mM NaCl 水溶液においても比較

2. 6.

脂質過酸化の測定的高い溶解度を示した。マイクロエマルションを用いるこポリフェノールを２時間インキュベーションし皮膚に移とで溶解度はさらに増大したが、疎水性のポリフェノール− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011とは異なり、o/w 型のマイクロエマルション A を用いるこることが示唆された。また、Table 2 にゲニステインにつとで溶解度は、150 mM NaCl 水溶液に比べて約８倍に増いて示すように、これらの疎水性フェノールについては、大し、より顕著に改善した。皮膚刺激性を減少するためにw/o 型のマイクロエマルション D の方が、o/w 型のマイクアルコール含量を減らした o/w 型のマイクロエマルショ

ロエマルション A よりも、皮膚移行性の改善効果がよりン K では、クロロゲン酸の溶解度は 344.9±8.1mM と、マ大であった。

イクロエマルション A よりは少し低いものの、150 mM

一方、親水性のポリフェノールであるクロロゲン酸につNaCl 水溶液に比べて溶解度は約７倍に増大し、顕著な溶いては、Fig. 3 に結果を示すように、150 mM NaCl 水溶液解度改善効果を示した。

を vehicle とした場合にも 1.49 µmol/g skin とクェルセチンやゲニステインに比べて高い皮膚移行量が得られた。この

3. 2.

マイクロエマルションによる皮膚中移行の改善

理由の一つとして、150 mM NaCl 水溶液でもクロロゲン

Fig. 2 にクェルセチンについて、Table 2 にゲニステイ酸が比較的高い溶解度を示すことがあげられる。しかしなンの結果を示すように、マイクロエマルションを用いるこがら、150 mM NaCl 水溶液からのクロロゲン酸の皮膚移行とで、これらの疎水性のポリフェノールの皮膚中移行量は量は、Fig. 2、Table２に示したマイクロエマルション D3, 4）。また、Fig. 2 にクェルセチンについてを vehicle として用いた場合のクェルセチン、ゲニステイ示すようにマイクロエマルションの構成成分であるンの皮膚移行量よりも少なく、そのためマイクロエマルシ

Tween80 やエタノールの単独での皮膚移行促進効果は小ョンによる改善を試みた。その結果、Fig. 3 に示すように、さく、マイクロエマルションとして皮膚移行を促進してい特に o/w 型のマイクロエマルションＡあるいは K を用い顕著に増大した

Table 1 Effects of Microemulsions on Solubility of Polyphenols

Fig.2 Effects of microemulsion on skin accumulation ofquercetin in guinea pig skin applied as a suspension in either
150 mM NaCl solution (a), or isopropyl myristate (b), in avehicle consisting of Tween80 and 150 mM NaCl solution(30:70) (c), in a vehicle consisting of ethanol and 150 mM
NaCl solution (30:70) (d), at 20 mM in microemulsion D (e),at saturated concentration (78.6 mM) in microemulsion D (f).
Data are the means± S.D. of four experiments. ***p < 0.001,
significantly different from the values in other conditions.

Fig.3 Skin accumulation of chlorogenic acid in guinea pig skinapplied at saturated concentration in 150 mM NaCl solution(a), isopropyl myristate (b), microemulsion D (c), microemulsion
A (d), , microemulsion K (e), and microemulsion K gel (f).
Data are the means ± S.D. of four experiments. **p < 0.01,***p < 0.001, significantly different from the values in NaClsolution and isopropyl myristate. #p < 0.05, ###p < 0.001,
siginificant difference present between data.

− 28 −

マイクロエマルションを利用したポリフェノールの皮膚へのデリバリーと光老化防御ることで、150 mM NaCl 水溶液に比べて 5.5 倍あるいは 3.8

リフェノールでは o/w 型のマイクロエマルションがより倍と顕著に移行量が増大した。また、その際の皮膚移行量有効であり、モルモット皮膚の場合と同様な結果が得られは、マイクロエマルション D を vehicle として用いた場合た。のクェルセチン、ゲニステインの皮膚移行量と比べて同等

また、これらのポリフェノールはフランツセルのレセプあるいはそれ以上であった。マイクロエマルションを皮膚ター側への移行は観察されず、皮膚中に留まることがわかに塗布する場合には、ゲル化することが必要であるが、った。さらに、皮膚の凍結切片を調製し、切片中のポリフFig.3 にマイクロエマルション K をゲル化した場合の例を

ェノール量を測定することで、皮膚の各深さでのポリフェ示すように、ゲル化することで約 80％に皮膚移行量が減ノールの移行量を求めた。その結果、これらのポリフェノ少したものの、顕著な皮膚移行性が観察された。

ールは、皮膚表面付近に多く存在するものの、皮膚の深部モルモット皮膚の場合、毛穴が多く、そこからマイクロへも移行していることがわかった 3）。

エマルションが皮膚内に移行する可能性も考えられる。そッグの皮膚 6）を用いて同様な検討を行った。Fig. 4 にゲニ

3. 3. 皮膚脂質過酸化に及ぼす皮膚中に移行したポリフェノールの影響

ステインの例を示すように、ユカタンマイクロピッグの皮そこで、マイクロエマルションによって皮膚中に移行し膚を用いた場合にもマアイクロエマルションによる皮膚移たポリフェノールの皮膚中での抗酸化作用の発現を観察す

こで、ヒト皮膚に性状が類似しているユカタンマイクロピ行の改善が観察された

3, 4）。また、クェルセチンやゲニスるために、鉄（Ⅱ）とクエン酸イオンを用いて、マロンジテインのような疎水性のポリフェノールでは w/o 型のマアルデヒドの形成を観察することによって、皮膚の脂質過イクロエマルションが、クロロゲン酸のような親水性のポ酸化に及ぼす影響を観察した。その結果、Fig. 5 にゲニス

Table 2 Effects of Microemulsions on Intradermal Delivery of Genistein atSaturated Concentration

Fig.4 Skin accumulation of genistein in Yucatan micropig skinwhen applied as a Suspension in either 150 mM NaClsolution (a) or isopropyl myristate (b) and microemulsion D atsaturated concentration (140 mM) (c).
Data are the means± S.D. of four experiments. ***p < 0.001,
significantly different from the values in NaCl and isopropylmyristate.

Fig.5 Effect of genistein on lipid peroxidation tested byammonium iron(II) sulfate and sodium citrate when appliedwith microemulsion D at 0 mM (a), 20 mM (b) or saturated
concentration (140 mM) (c).
Data are the means ± S.D. of four experiments. **p < 0.01,***p < 0.001, significantly different from the value in theabsence of genistein.

− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

テインの例を示すように、皮膚に取り込まれたポリフェノエマルションによるポリフェノールの皮膚移行の改善機構

ールによって、脂質の過酸化が抑制されていることがわかについてさらに検討を進めるとともに、イオン性の界面活った 3, 4）。

性剤を用いたマイクロエマルションによるより効率的な皮膚取りこみについて検討を進めている。

3. 4. UV 照射による紅斑形成に及ぼすポリフェノールの影響

５．総括

ポリフェノールを含有し、ゲル様としたマイクロエマル

以上の結果、ポリフェノールを含有するマイクロエマルションを皮膚に塗布し、UV 照射による紅斑形成に及ぼすションは、ポリフェノールの溶解性を改善し、皮膚移行性影響を観察した。ゲニステインを飽和濃度で含有しエアロを顕著に高めることによって皮膚の光老化を防御するため

ジル R972 によってゲル様としたマイクロエマルション Dの有用な製剤となりうることが明らかとなった。

あるいはクロロゲン酸を飽和濃度含有しカルボポール 987によってゲル化したマイクロエマルション K をモルモッ謝

辞

ト皮膚に塗布することによって、紅斑形成が抑制されるこ本研究を遂行するにあたり、ご支援をいただいたコスメとが肉眼観察及び色差計による赤みの指標ａ * 値の観察

トロジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます。また、本（ゲニステインの場合、コントロール値 4.5±1.7、飽和濃研究を実施するにあたり協力いただいた神戸薬科大学製剤

4）度の塗布下での値 1.0±0.7**（n=6, **p<0.01） 、クロロゲ

学研究室の大学院生、卒業研究生の諸氏に深謝します。

ン酸の場合、コントロール値 5.0±0.8、飽和濃度の塗布下での値 0.2±0.2***（n=6, ***p<0.001））によって確認された。

４．考（参考文献）
１）Pappinen S, Urtti A: Microemulsions in topical察

drug delivery, In : Smith EW, Maibach HI (eds) :Percutaneous penetration enhancers 2nd ED,CRC,

以上の結果より、マイクロエマルションによって、ポリBoca Raton, 2006, 109 － 116.

フェノールの溶解度が改善し、皮膚移行も顕著に増大し、皮膚中に移行したポリフェノールは抗酸化作用を発現し、２）Heuschkel S., Goebel A., Neubert R H H, : Microemulsions

UV による障害を防御することがわかった。また、疎水性－ modern colloidal carrier for dermal and transdermalのポリフェノールでは w/o 型の、親水性のポリフェノー

drug delivery, J. Pharm. Sci. 97, 603 － 631, 2008.

ルでは o/w 型のマイクロエマルションがより有効である

３）Kitagawa S, Tanaka Y, Tanaka M, et al. : Enhanced

こ と が わ か っ た。 例 え ば、 ク ロ ロ ゲ ン 酸 に お い て は、skin delivery of quercetin by microemulsion, J. Pharm.

vehicle 中に添加したクロロゲン酸のうち皮膚に移行した

Pharmacol., 61, 855 － 860, 2009.

割合は、150 mM NaCl 水溶液、マイクロエマルション D、

４）Kitagawa S, Inoue K, Teraoka R et al.:Enhanced

マイクロエマルション A、マイクロエマルション K で、そskin delivery of genistein and other two isoflavones by

れぞれ 0.31％、0.32％、0.18％、0.15％であり、o/w 型のマ

microemulsion and prevention against UV irradiation-

イクロエマルションでは、少しではあるが減少することがinduced erythema formation, Chem. Pharm. Bull. 58,

わかった。これらの結果を総合して考えると、溶解度の増398 － 401, 2010．

大がマイクロエマルションによるポリフェノールの皮膚移

５）Fujii M, Yamanouchi S, Hori N, et al.:Evaluation of

行改善の最大の要因であることが推定される。しかしながYucatan micropig skin for use as an in vitro model for

ら、一般に、媒体中の溶解度の増加は、媒体中での化合物

skin permeation study, Biol. Pharm. Bull. 20, 249 － 254,
1997.

をエネルギー的に安定化させ、皮膚への分配性を下げ、皮膚移行量の増大には結びつかない。マイクロエマルション

６）Kurihara-Bergstrom T, Woodworth M, Feisullin S, etの場合は、溶解度の増加とともに皮膚移行量も増大する。

al. : Characterization of the Yucatan miniature pig skin

その理由は明らかでない。一つの可能性は、マイクロエマ

and small intestine for pharmaceutical applications,Lab. Animal Sci. 36, 396 － 399, 1986..

ルションが高密度で皮膚表面に吸着し、界面を中心に存在するポリフェノールの皮膚移行性を上げることである。マ７）Delgado-Charro MB, Iglesias-Vilas G., Blanco-Mendez

イクロエマルションの成分が皮膚の角質層脂質と相互作用

J, et al. : Delivery of a hydrophilic solutes through the

し、ポリフェノールの角質層への分配性と角質層の透過性

skin from novel microemulsion systems, Eur. J. Pharm.

を促進している可能性も考えられる 1, 7）。現在、マイクロBiopharm, 43, 37 － 42, 1997.

− 30 −