消化管ホルモンの分泌に対する細胞極性の影響
─小腸上皮細胞の極性異常を呈するノックアウトマウスを用いた研究─

原田玲子

大阪大学大学院医学系研究科細胞生物学 特任講師
（現 宝塚医療大学保健医療学部 教授）緒

言は、小腸上皮細胞における頂端側と側底側との連携が非常に重要と考えられるが、その機構は未だ解明されていインクレチンは、食事摂取に応答して腸管から分泌さない。

れ、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進する消化管ホルモンで、糖尿病の新たな治療標的として脚光を浴

我々の研究グループでは以前、低分子量 GTP 結合

びている 。インクレチンの薬理作用に関する研究は盛タンパク質 Rab8a のノックアウトマウス（Rab8a KOんであるが、インクレチン分泌細胞の細胞生物学的研究マウス）を作成・解析し、このマウスの小腸上皮細胞は未だ少ない。

では頂端側への蛋白の輸送が選択的に障害されること

1）

インクレチンには glucagon-like peptide 1（GLP-1）

を Nature 誌 に 発 表 し た 4）。 こ れ ら の 背 景 か ら 私 は、と glucose-dependent insulinotropic polypeptide（GIP）

Rab8a KO マウスがインクレチン分泌機構の細胞生物学があり、食事摂取に伴い GLP-1 は小腸下部の L 細胞、的解明に役立つであろうという着想に至った。そこで本GIP は小腸上部の K 細胞から分泌されることが知られ研究では Rab8a KO マウスを用いて、小腸上皮細胞のている 。インクレチンを産生するこれらの小腸上皮極性異常が SGLT や GLP-1 の局在に及ぼす影響を、細細胞は、頂端側（管腔に面する側）と側底側（血管な胞生物学的手法を用いて解明した。

2）

どに面する側）という極性を有する。図１に示すよう実験方法に、小腸上皮細胞が頂端側において栄養素（主として糖質）を感受すると、インクレチンは側底側（つまり反対本研究で使用している Rab8a KO マウスは、我々の側）から血中に分泌され、血流を介して膵β細胞に作用研究グループが revertible knockout 法を用いて作成しする。糖質を感知する受容体としてはナトリウム依存性たものである 4）。動物実験においては、大阪大学の実験

グルコース輸送体 SGLT が候補として知られているが、動物指針を遵守した。また実験は大阪大学遺伝子組換え

SGLT は小腸上皮細胞において頂端側の細胞膜上に局在実験安全委員会の承認を得て行われた。Rab8a KO マウ

している 。このためインクレチンが正常に作用するにスとしては Rab8-/- マウスおよび Rab8geo/geo マウスを用3）

い、wild-type マウスとしては同腹の Rab8+/+ マウスを用いた。Rab8a KO マウスは生後約４週齢で死亡するため、本研究では全て３週齢のマウスを解析した。
免疫染色実験では、マウスを麻酔下にて固定液（3%Paraformaldehyde / 0.1 M phosphate buffer）で経心灌流固定し、小腸を取り出した。小腸上部としては十二指腸を用い、小腸下部としては大腸境界部付近を用いた。
さらに後固定とクライオプロテクション（20% sucrose /0.1 M phosphate buffer）の後、組織片を凍結し、クラ図1

イオスタットを用いて薄切した。

小腸上皮細胞の極性とインクレチン分泌

免疫染色の一次抗体としては以下の抗体を用いた：小腸上皮細胞の頂端側において栄養素が感受されると、側底側からインクレチンが分泌される。

goat anti-SGLT-1（M-19）（Santa Cruz sc-20582）,
1

原田玲子

goat anti-GLP1（C-17）（Santa Cruz sc-7782）,

ATPase, E- カドヘリン）の分布が正常であるのに対し、Rabbit anti Chromogranin A（94-130）（矢内原研究所

頂端側に輸送される種々の蛋白（dipeptidyl peptidaseY291）。二次抗体としては以下の抗体を用いた：AlexaIV, alkaline phosphatase, peptide transporter 1） で は488-labeled donkey anti-rabbit IgG, Alexa 568-labeled

局在の異常が認められた。糖質を感知する受容体である

donkey anti-goat IgG（Invitrogen）。免疫染色後さらにSGLT は小腸上皮細胞において頂端側の細胞膜上に局在

DAPI を用いて核染色を行った。コンフォーカル写真はしていることが知られているため、Rab8a KO マウスに共焦点レーザー顕微鏡オリンパス FV1000D を用いて撮おいて局在を調べたところ、SGLT も局在異常を示し、影した。

細胞内やや頂端側において広汎に蓄積した染色が大量に認められた（図２）。

結果

1．Rab8a KOマウスにおけるSGLTの異常

2．Rab8a KOマウスにおけるGLP-1の異常

低分子量 GTP 結合タンパク質 Rab8 は、酵母で分泌GLP-1 は、SGLT が小腸上皮細胞頂端側で糖質を感（exocytosis）に重要な Sec4 の相同分子であり、培養細知したのを受けて、小腸下部の L 細胞から分泌される。

胞を用いた過去の実験から、Rab8 は哺乳類では神経のRab8a KO マウスにおいて SGLT が局在異常を示すこ

樹状突起や上皮細胞の側底側への小胞輸送に重要と考えとから、GLP-1 の産生にも異常が生じることが予想さられてきた 。組織や個体での Rab8a の役割を解明すれる。そこで本研究では小腸における GLP-1 の局在をるために、我々は Rab8a を欠損するマウスを作成して解析した。

5）

図３に示すように、Rab8a KO マウスでは小腸下部に解析を行った 。
4）

Rab8a KO マウスは２週齢を少し過ぎてから下痢と体おいて、GLP-1 陽性細胞の数の増加が認められた。ま重減少を呈し、生後３―４週間で殆ど死亡した。各組織

た、wild-type マウスでは小腸上部では GLP-1 陽性細の形態学的観察を行ったところ、小腸は２週齢で大きな胞はほとんど存在しないのに対し、Rab8a KO マウス変化はなかったが、３週齢で微絨毛の短小化が認められでは小腸上部においても GLP-1 陽性細胞が点在していた。小腸以外の組織では大きな変化は認められず、予想た。
このことから Rab8a KO マウスの小腸全体において、されていた神経細胞の樹状突起の異常も認められなかっ

GLP-1 産生細胞が増えていると考えられる。

た。

倍率を上げて観察すると、GLP-1 陽性細胞において、小腸組織をさらに詳細に解析したところ、Rab8a KO

GLP-1 陽性顆粒の局在や、一細胞当たりの顆粒の数にマウスの小腸上皮細胞においては、驚くべきことに側は明らかな差は認められないことが解った。GLP-1 陽底側に輸送される種々の蛋白（LDL 受容体，Na /K性顆粒は wild-type と Rab8a KO マウスの双方におい++-て、核の周辺や細胞の側底側に分布し、調節性分泌経路に典型的な大型分泌顆粒であった。
Chromogranin A は 腸 ク ロ ム 親 和 性 細 胞（ECL 細胞）などの神経内分泌細胞に局在し、調節性分泌経路において分泌顆粒形成に重要な役割を担うと報告されている 6）。そこで小腸上皮細胞を抗 GLP1 抗体および抗 Chromogranin A 抗体で二重染色したところ、wildtype マ ウ ス で は GLP-1 陽 性 細 胞 は Chromogranin A
抗 体 で 染 ま ら な い の に 対 し、Rab8a KO マ ウ ス で はGLP-1 と Chromogranin A との共発現が認められた。
図2

Rab8a KO マウスにおける SGLT 局在の異常

考（ 上 段 ） 小 腸 上 皮 細 胞 に お い て SGLT は、wild-type マ ウ ス
では頂端側の細胞膜上に局在するが、Rab8a KO マウスでは細胞内に異常蓄積する。（下段）LDL 受容体は wild-type マウス、Rab8a KO マウスとも側底側に分布する。スケールバーは 10µm を示す。

察本研究により、Rab8aKO マウスの小腸上皮細胞において、糖質を感知する受容体である SGLT が頂端側の細胞膜上に局在せずに、細胞内に異常蓄積すること2

消化管ホルモンの分泌に対する細胞極性の影響 ─小腸上皮細胞の極性異常を呈するノックアウトマウスを用いた研究─

図3

Rab8a KO マウスにおける GLP-1 の異常（低倍率画像）（左 2 列）小腸下部において、GLP-1 陽性細胞（矢印で示す）は Rab8a KO マウスの方が wildtype マウスより多く認められた。（右 2 列）小腸上部において、GLP-1 陽性細胞は wild-type マウ
スではほとんど存在しないが、Rab8a KO マウスでは点在していた。下段は DAPI による核染色像である。スケールバーは 100 µm を示す。

図4

Rab8a KO マウスにおける GLP-1 の異常（高倍率画像）

左 2 列に Rab8a KO マウスの GLP-1 陽性細胞を 2 個、右 2 列に wild-type マウスの GLP-1 陽性細胞をそれぞれ 2 個ずつ示した。抗 GLP-1 抗体（上段）と抗 Chromogranin A 抗体（下段）による二重染色である。スケールバーは 10 µm を示す。

が認められた。また小腸全体において、GLP-1 産生細果に対しては以下の二つの仮説が考えられる：1）ECL胞の増加が認められた。GLP-1 は SGLT からの情報を細胞など、L 細胞以外の内分泌細胞が GLP-1 を産生す得て分泌されるため、SGLT が機能しないことによりるようになった、または 2）L 細胞において調節性分泌GLP-1 の産生は抑えられると予想されたが、GLP-1 産経路が活性化されて Chromogranin A の発現量が上昇生細胞の増加は、このシステムがより複雑なものであるした。これらの可能性をさらに探究するには、今後の経ことを示唆するものである。今後は血中 GLP-1 濃度の時的、定量的な解析が必要である。
本研究で観察された GLP-1 産生細胞の増加は非常に測定を行い、GLP-1 の分泌が Rab8aKO マウスにおい興味深い現象である。さらなる研究によって、この増加て阻害されていないか調べる必要がある。
さらに本研究では、Rab8aKO マウスにおいて GLP-1の機構が解明されて、GLP-1 産生細胞の数を増やすこと Chromogranin A との共発現が認められた。この結とが可能になれば、それは糖尿病の新薬の開発につなが3原

田玲ることも期待される。

子経路が活性化された可能性が考えられる。さらなる研究によって GLP-1 産生細胞を増加させる機構が解明され

要約

たなら、それは糖尿病の新薬の開発につながることも期

インクレチンは糖尿病の新たな治療標的として脚光を待される。

浴びている消化管ホルモンである。小腸上皮細胞の頂端謝側において、糖質を感知する受容体である SGLT が栄辞養素を感受すると、インクレチンは側底側から血中に分本研究の遂行にあたり、ご支援を賜りました公益財団

泌されるため、頂端側と側底側との連携が重要と考えら法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に深く感謝れるが、その機構は未だ解明されていない。

申し上げます。貴財団の助成金は金銭的および精神的に

我々は以前、低分子量 GTP 結合蛋白 Rab8a の KO大きな助けと励みになりました。また、本研究では大阪

マウスにおいて小腸上皮細胞の頂端側への蛋白輸送が選大学医学研究科の原田彰宏教授および細胞生物研究室の択的に障害されることを解明した。そこで本研究ではこメンバーにご助力頂いており、感謝致します。のマウスを解析し、小腸上皮細胞の極性異常がインクレ
文チンの産生に及ぼす影響の解明を試みた。
Rab8a KO マウスの小腸上皮細胞においては、SGLT

献1）J. E. Campbell, & D. J. Drucker, : Cell Metabolism, 17,819-837, 2013.
2）A. M. Habib, et al, : Endocrinology, 153, 3054-3065,2012.
3）F. Reimann, et al, : Cell Metabolism, 8, 532-539, 2008.
4）T. Sato, et al, : Nature, 448, 366-369, 2007.
5）原田彰宏 : 生化学 , 80, 830-832, 2008.
6）渡部剛ほか : 顕微鏡 , 43, 29-34, 2008.

が頂端側の細胞膜上に局在せずに、細胞内に異常蓄積することが認められた。また小腸全体において、GLP-1産生細胞の増加が認められた。Rab8a KO マウスにおいては GLP-1 と Chromogranin A との共発現が認められたことから、L 細胞以外の内分泌細胞が GLP-1 を産生するようになった可能性や、L 細胞において調節性分泌4