エストロゲン受容体を標的とした食品成分による ATL 予防

山崎正

宮崎大学農学部緒夫

助教とが期待される。本研究ではイソフラボンが女性ホルモ

言
宮崎県を含む南九州地区はヒト T 細胞白血病ウイルンの１つであるエストロゲン様活性を発揮することで、ス type I (HTLV-I) の感染者の割合の高い地域として知ATL 発症の予防に貢献できる可能性を示すとともにそのられている。HTLV-I は、同地域において高頻度に発症作用機構の端緒を明らかとした。

が認められる成人 T 細胞性白血病 (ATL) の発症原因ウイルスであり、ATL は南九州の風土病ともなっている。

実験方法

局地的には HTLV-I 抗体の陽性者は 10%程度に達する地細胞培養域がある事に加え、南九州地域以外にも HTLV-I 感染率

ED40515 細 胞、Su9T01 細 胞、Molt-4 細 胞 は そ れの高い地域が日本全国に点在しており、HTLV-I 感染者

ぞれ京都大学前田道之先生、鹿児島大学有馬直道先は日本の全人口の 1％程度にも達すると考えられてい生、宮崎大学森下和広先生より分与いただいた。細胞はる。通常、HTLV-I 感染後、ATL 発症に至るには約 50

10% FBS 含有 RPMI1640 培地で継代を行ったが、実験年もの日がかかるとされ、ATL の生涯発症率も感染者の時には培地および血清中のエストロゲンおよびエストロ5％程度である。一方で、臨床的に ATL のほとんどは治ゲン様活性成分を除去するために、10%活性炭処理 FBS療抵抗性を示し、初回治療に効果を認めた場合でも再発含有フェノールレッドフリー RPMI1640 培地にて培養の危険性が高く、1 年前後で半数が死に至る。このため、を行った。実験時にはフェノールレッドフリー培地に細HTLV-I 感染者においては、その生涯にわたり ATL 発症胞を 1 × 105 cells/ml の密度で播種し、17β-Estradiolの脅威にさらされており、日常的な ATL 発症予防法の(E2) もしくはイソフラボンを終濃度 10開発が期待されている。

なるように添加し 24 時間培養した。生存率の判定にお一方で日本においては HTLV-I 感染者が ATL 発症に至−12〜 10−7Mといてはトリパンブルー染色法により生細胞数をカウント

るまでの期間は、他の HTLV-I 高浸淫地区に比べ長い傾し、死細胞率を測定した。

向があり、日本でのライフスタイルが ATL の発症を遅エストロゲンとして 17β - エストラジオール (E2)、らせている要因となっている可能性が考えられる。われエストロゲン受容体阻害剤として、ICI182,780、G- タ

われはこれまでに食を通じた ATL 発症予防を目的とし、ンパク共役型エストロゲン受容体作動剤として G-1 を様々な食品成分の ATL 発症予防、進展予防効果につい用いた。て検討を行ってきた。その結果、日本では世界的に高い細胞周期解析消費レベルを誇る大豆に含まれるイソフラボンが、ATL

培養終了後、細胞を回収し洗浄後、70 ％メタノール細胞の増殖を in vitro、in vivo において抑制することをおよび 50 ％エタノールで固定した。その後、10μg/見いだした。イソフラボンはエストロゲン様活性を有す

mL RNase で 37 ℃で 1 時間処理した後、PI 染色を行いることから、乳がんなどのホルモン感受性のがんの発サンプルとした。細胞染色後、Flow Cyto Meter Epics

症や進展に少なからず影響することが知られているが、XL で細胞周期の解析を行った。

大変興味深いことに ATL の発症率にも性差があり、男活性型 Caspase の検出

性の発症率は女性の 3 倍にも達する。これらの背景を培養終了後、細胞を回収し細胞溶解した。細胞溶解液

まとめると、女性ホルモンが ATL 細胞に作用した場合を 15,000 × g で 30 分間遠心し、その上清を回収し上ATL の発症や細胞の増殖を負に制御する効果を有するこ清の一部は、タンパク質定量のためのサンプルとした。
1

山崎正夫

サンプルは SDS-PAGE に供したのち、ウエスタンブロッ細胞および Su9T01 細胞と急性リンパ性白血病細胞株トを行ったのち Cleaved Caspase-3 の検出を行った。検である Molt-4 細胞は培養が可能であった。これらの細出には ECL-Plus を用い、得られた画像のバンドの強度胞を E2 で培養したところ、いずれの細胞株に対してもを Image J ソフトウエアを用いて解析した。発現量の定生細胞数を減少させることが明らかとなった。さらに量解析は caspase-3/β-actin の比率により計算を行った。

genistein も 1-100 nM という非常に低い濃度で生細胞ER 受容体の発現 (RT-PCR)

数を減少させることが明らかとなった ( 図１)。
そこで、E2 や genistein が細胞周期の進行に及ぼす影

フェノールレッドフリー RPMI1640 培地に細胞を 2 ×510 cells/ml の密度で播種し、37℃、48 時間培養した後、響を検討したところ、これらのサンプルは各細胞周期にRT-PCR 法を用いて、ERαおよび ERβの mRNA 発現解おける細胞集団の比率に影響を与えていないことが明ら析を行った。

かとなった。このことから E2 や genistein が細胞死を誘導していることが推察された。

結

そこで、apoptosis による細胞死が起こっている可能

果
活性炭処理血清含有フェノールレッドフリー性を考え、apoptosis の実行分子である caspase-3 の活

RPMI1640 での ATL 細胞を試みたところ、いくつかの性化に及ぼす E2、genistein の効果を検討した。その結果、細胞株においては生育不能であり、血清の活性炭処理にgenistein 添加によって、caspase-3 の活性断片の顕著なよってこれらの細胞株の生存に必須の成分が除去され発現を見いだすことができ、apoptosis による細胞死がると考えられた。一方で、ATL 細胞株である ED40515起こっていることが推察された（図２）。

図1

ゲニステインおよび 17β- エストラジオールが ATL 細胞の増殖におよぼす影響
異なる文字間に有意差あり (P < 0.05)

2

エストロゲン受容体を標的とした食品成分による ATL 予防制効果を有することが明らかとなった。

これらの細胞株におけるエストロゲン受容体 (ER) のmRNA 発現を RT-PCR で確認したところ、これらの ATL細胞株は ERα , ERβとも発現していた。そこで、ER の考察阻害剤である ICI182,780 と E2 および genistein の共存

われわれは以前の研究で、大豆イソフラボンが ATL効果を検討したところ、E2 および genistein の細胞致死細胞の増殖を抑制することを in vitro、in vivo の両面か効果は ICI182，780 によってキャンセルされた（図３）。

ら明らかとしてきた 。しかしながらこの研究で用いた

近年、E2 の non-genomic な作用として G- タンパクイソフラボンの濃度は 3 〜 30μM であり、生理的濃度

共役型 ER (GPER) を介した経路が注目されている。そに比べると高いレベルにあり、日常の食生活で現実的にこで、GPER のアゴニストである G-1 の効果を検討した到達しうる濃度ではないように思われた。日本人におけところ、G-1 は 1μM において有意に生細胞数を減少さる血中 genistein の濃度は 320 nM 程度であるとの報告せることが明らかとなった（図４）。もあり、μM オーダーでの作用発現は起こりにくいと

1)

また、genistein とともに大豆イソフラボン中の主要推察される 2)。一方、genistein は nM オーダーでもエ成分である（大豆中には配糖体の形で含まれる）ダイゼストロゲン様活性を発揮し、in vitro でエストロゲン感インの効果を検討したところ、ダイゼインも細胞増殖抑受性の乳がん細胞の増殖を亢進させ、このような効果はin vivo でも確認される。今回得られた genistein の ATL
細胞致死効果は nM オーダーで認められる結果であり、AGenistein0110100 (nM)in vivo での実現性が高いものと思われる。

Cleaved caspase-3

Genistein 処理によって Caspase の活性化が認められた点、ICI182,780 によって細胞毒性が消失した点を考

β-actin慮すると、genisitein は ER を基点としたシグナル伝達

B経路を介し、apoptosis を誘導していることが示唆されCleaved caspase/β-actin

4る。Genistein は一般に ERαより ERβに対して特異性が高いことが知られており、ATL 細胞においてもこれ3らの ER の発現が確認できたことから、ERb を介した経2路が重要であることが推察される。ER を介していくつかのガン細胞株に対して apoptosis が誘導されるとの報

10告がされている 3)。われわれは今回の研究で genistein
0110100
Genistein (nM)

が NF-kB の活性抑制効果も見いだしており、ER 経路とNF-kB 経路のクロストークを介して genistein の効果が発揮されている可能性も考えられる。

図 2 ゲニステインが ATL 細胞の caspase-3 活性化におよぼす影響
A: ウエスタンブロット像、B: バンド強度を定量化しグラフ化

30

異なる文字間に有意差あり (P < 0.05)

30

Cell number ( × 104/mL)

Cell number ( × 104/mL)

a20
10020

abb

100

c010

100

1000

G-1(nM)

図 3 ゲニステインの ATL 細胞致死効果は ER 受容体阻害剤によりキャンセルされる

図4

異なる文字間に有意差あり (P < 0.05)

3

GPER アゴニストはの ATL 細胞致死効果を有する
異なる文字間に有意差あり (P < 0.05)

山崎正

ま た、 エ ス ト ロ ゲ ン の non-genomic な 作 用 と し て夫謝辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました財団法

GPER の 関 与 を 示 す デ ー タ が 蓄 積 さ れ つ つ あ る。 今人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。

回の結果からも GPER アゴニストである G-1 が E2 やgenistein と同様に ATL 細胞致死活性を有することが明らかとなった。Genistein は GPER を介して甲状腺が文ん細胞の増殖を亢進するとの報告があり、genistein が1）Yamasaki M, Fujita S, Ishiyama E, et al. : Soy-derived isoflavones

献inhibit the growth of adult T-cell leukemia cells in vitro and in vivo.

GPER のリガンドとなりうる可能性が示されている 4)。

Cancer Sci 2007;98:1740-6.

また、われわれの結果のように 2 つの受容体がいずれ

2）Kurahashi N, Iwasaki M, Inoue M, et al. : Plasma isoflavones and5)

も apoptosis シグナルにつながるという報告もあり 、

subsequent risk of prostate cancer in a nested case-control study: The

これらを総合すると ER、GPER の両者が E2 や genistein

Japan Public Health Center. J Clin Oncol 2008;26:5923-9.の標的になっている可能性があり、更なる分子機構の解

3）McPherson SJ, Hussain S, Balanathan P, et al. : Estrogen receptor-beta
activated apoptosis in benign hyperplasia and cancer of the prostate is明が必要である。

androgen independent and TNFalpha mediated. Proc Natl Acad Sci U S A
2010;107:3123-8.

要約4）Vivacua A, Bonofiglio D, Recchia AG, et al. : 17beta-estradiol,

本研究により、大豆イソフラボンである genistein がgenistein, and 4-hydroxytamoxifen induce the proliferation of thyroid
cancer cells through the g protein-coupled receptor GPR30. Mol

エストロゲン受容体を介して、ATL 細胞にアポトーシ

Pharmacol 2006; 70:1414-1423.

スを誘導することが明らかになった。Genistein の標的

5）Chimento A, Sirianni R, Delalande C, et al. : 17beta-Estradiol activates

として核内 ER と GPER の両者が関与している可能性

rapid signaling pathways involved in rat pachytene spermatocytesがあり、さらなる作用機構解明を目指すことで、ER や

apoptosis through GPR30 and ERalpha. Endocrinol . 2010 [Epub aheadGPER を分子標的とした ATL 治療剤の開発につながるこof print]とが期待される。

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