皮下組織のコラーゲンが体の温度適応に与える影響
甲南大学理工学部／統合ニューロバイオロジー研究所

久原篤、太 田茜

Temperature is important environmental information. Animals therefore have acclimation and habituation mechanisms
for changing environmental temperature. In this study, we used nematode Caenorhabditis elegans for studying temperatureacclimation mechanisms. We found that a collagen known as a essential cortical component in many animsls involved incold acclimation, implying that our experimental system is useful for studying fundamental cosmetology research.

1. 緒

約 1mmの土壌中に生育する非寄生性の線虫である 1）。また、

言

全塩基配列が決定されており、ゲノムサイズはモデル動物

温度は生物にとって重要な環境情報であるため、生物はの中でも特に小さい約 100Mb である。全遺伝子の約 36%

環境温度の変化に適応し、生存するメカニズムをもっていがヒトの相同遺伝子であるため、線虫で機能する遺伝子をる。その中において、皮膚を構築する皮下組織の状態とそヒトと対応付けしやすい。C. elegans の生活環は短く（野の変化は、表皮の乾燥状態や柔軟性およびそれらによって生型では 20 ℃で約 3.5 日）、通常は雌雄同体で系統維持が起きる変化にとって重要なものである。本研究では、シン簡単なことに加え、0.1% の頻度で出現する雄を利用してプルな実験動物である線虫 C. elegans を用いて、低温適応交配が可能であるため、遺伝的解析にも適している。

を介した温度適応メカニズムに関わる分子をスクリーニン

C. elegans の高温に対する耐性のひとつとして、耐性幼グしたところ、皮質成分として知られているコラーゲンを虫形成機構があげられる。C. elegans の生育温度は約 13コードする遺伝子が多数単離されたため、その解析の現状〜 27 ℃で、それよりも高温になると大多数の個体が耐性を記載する。

幼虫になる 2）。耐性幼虫では体は細く、活動が鈍くなり生物の環境への適応として、高温環境や低温環境に対すエネルギー状態も低くなる。一方、ある温度で飼育される適応があげられる。そのうち、低温環境に対する適応た C. elegans は低温でも生育できることが最近見つかっ（低温適応）の研究は、高等動物だけでなく、植物や昆虫等てきた 3-5）。具体的には、15 ℃で飼育した C. elegans は 2においても行われている。低温適応とは、通常の生育温度℃で 48 時間の低温にも耐えられるが、25 ℃で飼育した C.

よりも低温の環境でも生存できる性質のことであり、植物

elegans は低温に耐えられず、死滅してしまう（図 1）。低にも昆虫にも共通してみられる低温に対する耐性機構とし温適応の分子生理機構がこれまでに解析されてきており、て、生体膜の不飽和脂肪酸含有量が多いことや、細胞内に頭部に存在する ASJ 感覚ニューロンが温度を受容すると、アミノ酸などの凍結しにくい物質をもつことなどがあげら

ASJ からインスリンが分泌され、腸や神経系がインスリンれる。温度適応に関して、温度受容とアウトプットの代謝を受容し、低温適応が制御されていることが明らかとな等についての解析は進んできたが、皮下組織のコラーゲンっている（図 2）3）。一方で、他の組織や分子機構についての観点からは未開拓であった。その理由は、個体を構成すは未知の点が多い。そこで、C. elegans の低温適応の実験

る細胞数が多い場合、特定の組織の一部と体全体との関係系を利用して、新規の分子の同定を目指した。本研究では、性を明らかにするためには時間を要するためであった。そその最新のスクリーニングのなかで、コラーゲンをコードこで、本研究では、シンプルな実験系を使い、温度適応にする遺伝子が多数見つかってきた。

関わる新規分子の同定を行った。その中で、皮下組織の重要因子として知られているコラーゲンが単離された。
線虫 C. elegans は、959 個の体細胞で構成され、体長が2. 実

験

2. 1. 低温適応テスト
20 ℃で飼育した野生型の C. elegans を、４個体ずつ新しい NGM プレートに植え継ぎ（P0）、各飼育温度（15、20、Collagen in hypodermis affects temperatureacclimation of animal
Atsushi Kuhara, Akane Ohta
Faculty of Science and Engineering, &Institute for Integrative Neurobiology,Konan University

25 ℃）で 5 時間飼育し産卵させる。P0 を除去し、卵（F1）を各飼育温度で飼育する。F1 が adult まで成長したら、NGM プレートの蓋を上に向けた状態で、氷上に 20 分間置
く。NGM プレートをタッパーに入れ、メディカルキャビ
ネット内で 48 時間、低温刺激温度（2 ℃）で飼育する（cold− 78 −

皮下組織のコラーゲンが体の温度適応に与える影響

低温刺激（2℃48 時間）

25℃飼育

低温適応死滅3 時間

低温刺激（2℃48 時間）

15℃飼育

生存
図 1 線虫の低温適応
15℃で飼育した C. elegans は 2℃で 48 時間の低温にも耐えられるが、25℃で飼育した C. elegans は低温に耐えられず、死滅する。

RNAseq 用 の cDNA ラ イ ブ ラ リ ー 作 製。SMARTseq
v4 Ultra Low Input（タカラバイオ）にて cDNA 合成後、Agencourt AMPure XP kit（Beckman）にて cDNA 断片を精製した。

図 2 線虫の低温適応の分子組織ネットワーク
頭 部に存 在する ASJ 感 覚ニューロンが 温 度を受容すると、ASJ からインスリンが分泌され、腸や神経系がインスリンを受容し、低温適応が制御されている。

2. 4. 多段階温度シフト解析（例 :15 ℃→ 25 ℃（3 時間）→ 2 ℃）
実 験 で 使 用 す る adult の C. elegans を、 １ 個 体 ず つ 新
しい NGM プレートに植え継ぎ（P0）、飼育温度（15 ℃）で24 〜 30 時間飼育し産卵させた。P0 を除去し、卵（F1）がadult になるまで、各飼育温度で飼育し続けた（15 ℃ではshock）。cold shock 後、キャビネットからタッパーを取り約 6 日）
。F1 が adult まで成長したら、25 ℃インキュベー出し、15 ℃で一晩置き、翌日生存個体と死滅個体を数え、ター内で 3 時間静置した。その後、NGM プレートの寒天6）側を下にして、氷上に 20 分間おいた。NGM プレートをメ生存率を算出する 。
変異体を使用したテストでも同様の条件で行った。

ディカルキャビネット内で 48 時間、各低温刺激温度（2 ℃）

1 回のテストに、3 枚の NGM プレートを用意し、これで静置した（cold shock）。48 時間後、メディカルキャビネットから取り出し、15 ℃インキュベーター内で 1 日静置を 3 回試行した。

した後、生存個体と死個体を数え、生存率を算出した。

2. 2. 温度適応細胞のトランスクリプトーム解析

3. 結

温度受容に関わる細胞と温度を受容しない細胞それぞれ果に関わる細胞特異的に発現している遺伝子を同定する。

3. 1. コラーゲン遺伝子の変異体が低温適応に異常をもつ

2. 3. Single cell mRNA 解析の方法

個体を用いて、温度受容に関わる細胞と、温度を受容しから、mRNA を単離し、量を比較することで、温度受容7 つのパターンの温度刺激や飼育温度の条件で飼育した
1 細胞からの mRNA 取得法の大部分は、杉らの方法に7）ない細胞のそれぞれから採取した mRNA サンプルを単離し、比較解析を行った。具体的な温度刺激のパターンとし従った 。
温度受容に関わる細胞と、温度を受容しない細胞に遺伝ては、① 15 ℃飼育、② 20 ℃飼育、③ 25 ℃飼育、④ 25 ℃子導入した個体を集収。成虫 4 個体を 6 〜 8 時間産卵させを 3 時間経験後 15 ℃に温度シフト、⑤ 25 ℃を 18 時間経てその後取り除き、各温度で飼育して成虫になった時点で験後 15 ℃に温度シフトし、⑥ 15 ℃を 3 時間経験後 25 ℃

M9 緩衝液で回収した。6cm NGM 1 プレートあたり 100に温度シフト、⑦ 15 ℃を 18 時間経験後 25 ℃に温度シフト、〜 200 個体の成虫を回収した。の 7 つの条件である。これらのmRNAをcDNAに逆転写し、ホモジナイズ。回収して洗浄した線虫を固定後、液体窒次世代シークエンサー解析に用いる cDNA ライブラリーを作製し、それらの cDNA ライブラリーを用いて、次世素で凍結させてからホモジナイズした。
anti-FLAGの つ いたbeads（anti-Flag M2 beads：SIGMA）

代 DNA シークエンサーにより解析した（図 3）。その結果、で 免 疫 沈 降 後、mRNA を 採 取（RNeasy Min Elute Kit：

20 ℃飼育個体の温度受容に関わる細胞と、温度を受容しQIAGEN）。

ない細胞を比較解析し、温度受容に関わる細胞で特異的− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図 3 Single cell mRNA 解析方法
細胞特異的プロモーターを使い、mRNA のポリ A に結合するタンパク質である PAB-1（polyA binding protein）を発現させた。この PAB-1 には、FLAG タグを３つ つないだ。この系統に様々な温度刺激を与え、固定した後に、ホモジェナイズし、FLAG タグを用いて免疫沈降によって mRNA を単離した。それを基に、RNA-seq 用の cDNA ライブラリを作成し、次世代シークエンサーで解析した。

図 4 RNA-sequencing の比較解析
20℃飼育個体の温度受容に関わる細胞と、温度を受容しない細胞を比較解析し、温度受容に関わる細胞で特異的に発現変動の高い遺伝子として、約 613 個の遺伝子が単離された。に発現変動の高い遺伝子として、約 300 個の遺伝子が単離させるタイムコース解析を行った。その結果、この条件でされた（図 4）。他の温度刺激条件においても多数の遺伝子温度刺激を与えた場合には、野生株は、ほぼ全ての個体がの発現変動が観察された。これらの遺伝子には、コラーゲ死滅したのに対して、bli-6 変異体は、大多数の個体が生ン、神経ペプチド様タンパク質、インスリンなどをコード存する異常が観察された（図 5）。

する遺伝子が含まれていた。そこで、コラーゲンをコードする bli-6 変異体について低温適応を測定したところ、15

3. 2. 低温適応時の脂質構成率の変化℃で卵から成虫まで飼育後に 2 ℃で 48 時間の低温刺激を低温適応の制御に関して、神経系と腸以外に関与する組与えると、野生株と同様にほぼ全ての個体が生存した。ま織が分かっていなかったため、DNA マイクロアレイ解析

た、25 ℃で卵から成虫まで飼育後に 2 ℃で 48 時間の低温でインスリン経路の下流ではたらく遺伝子を同定し発現領刺激を与えると、野生株と同様にほぼ全ての個体が死滅し域を調べた。その結果、生殖組織、特に精子で発現する遺た。これらの結果からは顕著な異常が観察されなかったた伝子が多いことが明らかとなった。精子変異体の解析で低め、15 ℃で卵から成虫まで飼育後に、25 ℃を 3 時間経験温適応異常が見られたことから、精子が低温適応に影響を− 80 −

皮下組織のコラーゲンが体の温度適応に与える影響の関与が示唆される。この bli-6 遺伝子は、感覚ニューロンだけでなく、他の多くの細胞でも発現しているため、今回見つかった低温適応の異常がどの細胞の異常によるかについては、今後の細胞特異的な回復実験などで明らかになると考えられる。さらに、bli-6 以外のコラーゲンの遺伝子の変異体や RNAi 処理系統において、低温適応を測定し
図 5 コラーゼン bli-6 変異体の低温適応
bli-6 変異体は、15℃で飼育後に 2℃で 48 時間の低温刺激を与えると、野生株と同様に生存した。25℃飼育後に低温刺激を与えると、野生株と同様に死滅した。15℃で飼育後に、25℃を3 時間経験させた場合には、野生株は死滅したのに対して、bli-6変異体は生存する異常が観察された。縦軸は生存率（%）。

たところ、生存率がコントロールである野生株や、RNAi用の plasmid vector をもつ大腸菌株 HT115 よりも上昇した。遺伝子発現量の増減と低温適応との相関性は、現在解析中である。
今回の解析から、線虫 C. elegans において、精子が低温適応に関わることが見つかった。さらに、他の解析から、与えることが明らかとなった 8）。

最近、精子が頭部の温度受容ニューロン ASJ に影響を与線虫を含む多くの生物において、体を構成する様々な脂えることで低温適応が調節されることを見つかってきた。

肪酸の比率は低温適応に大きく影響することが知られていこれらの結果から、低温適応の組織ネットワークのメカニたため、野生株と精子特異的プロテインフォスファターズムの一端が見えてきたと考えられる。

ゼ PP1 を欠損する gsp-4 変異体の脂肪酸の脂質割合を測定

5. 総した。野生株と gsp-4 変異体の脂肪酸組成を比較した結果、

括

18：2n-6 や 18：3n-3 などの幾つかの脂肪酸において、野生コスメトロジーにおいて、皮膚および皮下組織の状態変株と gsp-4 変異体の間で弱いながらも優位な差が観察され化は、表皮の乾燥や柔軟性の状態やそれに伴う恒久的な変た 8）。つまり、精子の異常により、体内の膜脂質の構成が化にも繋がる重要なファクターである。その中において、変化し、低温適応に影響を与えている可能性が考えられる。

皮下組織のコラーゲンは、真皮などを構成するタンパクで4. 考あり、その状態は細胞外基質の状態を変化させ、皮膚およ察

び皮下組織に大きな影響を与える重要分子である。コラー

温度シフトにおいてのコラーゲンをコードする複数の遺ゲンは、複数のコラーゲン分子同士が、縄を作るようにお伝子の発現量が変化していた。コラーゲンをコードする

互いに巻き付き、それらが集合することで繊維状構造を作

bli-6 変異体について低温適応を測定したところ、温度適り、皮下組織を構築している。そのため、コラーゲンの状応の異常が観察されたことから、コラーゲンの低温適応へ態を制御する分子を見つけることで、コスメトロジーにお図 6 野生型と精子変異体 gsp-4 との脂肪酸組成の比較解析
野生株と gsp-4 変異体の総脂質を比較。18：2n-6 や 18：3n-3 などにおいて、野生株と gsp-4 変異体の間で優位差。 文献 8）より引用一部改変。

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コスメトロジー研究報告 Vol.25, 20174） P. Murray, S. A. Hayward, G. G. Govan, A. Y. Gracey,

いて大きな波及効果がある。
皮膚は温度に過敏であり、環境温度の状態により、表皮A. R. Cossins, An explicit test of the phospholipidおよび皮下組織の状態は大きく変化する。その際にはコラsaturation hypothesis of acquired cold tolerance inーゲンの構成パターンの変化が必要であることは知られてCaenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA 1 0 4,5489 (Mar 27, 2007).

いるが、これまでにコラーゲンと個体全体の温度の適応に関与することは知られていない。そのため、本研究から皮5） F. R. Savory, S. M. Sait, I. A. Hope, DAF-1 6 and下組織のコラーゲンと温度適応の関係を明らかにすること

Delta9 desaturase genes promote cold tolerance in

で、将来的に、例えば、化粧品含有化学物質と皮下組織とlong-lived Caenorhabditis elegans age-1 mutants. PLoS
One 6, e24550 (2011).

体感温度との関係などが明らかになり、体に良い影響を与えながら、より快適に使用できる化粧品や皮膚薬成分の検6） T. Ujisawa, A. Ohta, O. M., S. S., A. Kuhara, Cold
tolerance assay for studying cultivation-temperature-証などに繋がることが期待される。

dependent cold habituation in C. elegans. Protocol（引用文献）

Exchange, (2014).

1） S. Brenner, The genetics of Caenorhabditis elegans.

7） T. Sugi, Y. Ohtani, Simplified method for cell-specificgene expression analysis in Caenorhabditis elegans.

Genetics 77, 71 (1974).

Biochemical and biophysical research communications

2） N. Fielenbach, A. Antebi, C. elegans dauer formation

450, 330 (Jul 18, 2014).

and the molecular basis of plasticity. Genes Dev 2 2,8） S. Sonoda, A. Ohta, A. Maruo, T. Ujisawa, A. Kuhara,2149 (Aug 15, 2008).
3） A. Ohta, T. Ujisawa, S. Sonoda, A. Kuhara, Light andSperm affects head sensory neuron in temperature

pheromone-sensing neurons regulates cold habituation

tolerance of Caenorhabditis elegans. Cell Reports,

through insulin signalling in Caenorhabditis elegans.

(2016).

Nature communications 5, 4412 (2014).

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