Res. Org. Geochem. 26, 21­29 (2010)

総説

元素分析 / 同位体比質量分析計（EA/IRMS）を用いた
炭素・窒素安定同位体比の測定方法とその応用 *佐藤里恵 **・鈴木彌生子 ***（2010 年 6 月 16 日受付，2010 年 8 月 2 日受理）

Abstract
Continuous-flow (on-line) system has revolutionized the study of natural stable isotope variations in organic
matter and organic compounds. In particular, carbon and nitrogen isotope analysis of bulk samples using elemental
analyzer/isotope ratio mass spectrometer (EA/IRMS) has been widely used in various field of studies, which allows
a simple and rapid analysis of the isotope ratios for all types of organic and a wide range of inorganic samples,with a small amount of sample materials compared to the traditional off-line Dual-Inlet method. However, stability,
accuracy, and precision on the observed isotope ratios strongly reflect various factors associated with continuousflow system, such as peak intensity (i.e., sample weight), memory effect, and He dilution ratio. Unfortunately, thecomplete removal of such uncertainties should not be realistic, particularly in routine isotope measurements of agreat number of samples. Here, we review the principles of stable isotope analysis on the traditional off-line DualInlet and continuous-flow EA/IRMS methods, and also show an applicable calibration and standardization sequence.
We hope that this paper is useful for routine application of EA/IRMS technique to various studies in geochemistry,
ecology, biology, food science, and other area of sciences.

Epstein, 1978, 1980; Minagawa et al., 1984）が 主 流

1.はじめにであり，装置にかけるまでの前処理に多くの手間

かつて有機物の安定同位体比（水素：D/H，炭素：13C/12C，窒素：15N/14N など）分析は，ごく一部と時間を要し，非常に取り扱いにくかった。そのの科学者だけが扱える特殊な技術であった。1990（例えば，著者らのラボでは一週間で 10 〜 20 試料

年代中頃までは，試料をケルダール法・封緘燃焼程度）。

法・低温精製法など，高度な技術を要する複数の前処理を組み合わせて，CO2 や N2 などのガスとため，得られる測定結果の数も極めて少なかった

しかし近年の技術発展，とくに元素分析 / 同位して精製したのち，Dual Inlet タイプの同位体比

体比質量分析計（EA/IRMS）に代表される，前処理装置と IRMS をオンラインでつなぐ連続フロー

質量分析計（IRMS）で同位体比を測定するという方法（例えば，Wada and Hattori, 1976; DeNiro and（continuous-flow）タ イ プ の 測 定 機 器（ 例 え ば，Preston and Owens, 1983; Fry et al., 1992; Brenna et* Carbon and Nitrogen stable isotope analysis by EA/IRMS** SI サイエンス株式会社，〒 345-0023 埼玉県北葛飾郡杉戸町本郷 473 番地 3
Rie Sato: SI Science CO., LTD. 473-3 Hongo, Sugito-Machi, Kitakatsushika-Gun, Saitama, 345-0023, Japan*** 日本認証サービス株式会社，〒 224-0033 神奈川県横浜市都筑区茅ヶ崎東 4 丁目 5 番 17 号
		Yaeko Suzuki: Japan Certification Services, Inc. 4-5-17 Chigasaki-Higashi, Tsuzuki, Yokohama, Kanagawa, 224-0033, Japan
Corresponding author. Rie Satoe-mail: r-sato@shoko.co.jp Tel: +81-480-35-2915; Fax: +81-480-35-2930−21−佐藤里恵・鈴木彌生子δ 値 = [ (R 試料 / R 標準物質 ) − 1 ] × 1000

al., 1997; Brand, 1998）の開発の発展・普及により，多くの研究者が比較的簡単に，短時間でたくさんの測定値を得られるようになった（例えば，著者らのラボでは一日で 100 試料程度）
。

（式 1）

R=H/L
HとLはそれぞれ重い（heavy）と軽い（light）
同位体を表す（例えば， 13C/12C, 15N/14N）。

しかしながら，安定同位体比の測定は相対測定であり，得られた結果が正しいのかどうかを，常に注意深く吟味する必要がある。実際に，連続フ

3.DualInlet による炭素，窒素安定同位体比の測定方法

ローにまつわる様々な問題（例えば，メモリー効
果や，レファレンスガスと試料のピークの大きさの相違，He による希釈率）が，測定値の安定性・確

Dual Inlet システムとは，質量分析計分析部へのガス導入部分に 2 つのガスだめを装備し，一方に度・精度に大きな影響を及ぼす（例えば，Bong andLee, 1997; Olsen et al., 2006）。 ま た，EA/IRMS 測比較ガス（レファレンスガス），もう一方にガス化

定では同一の燃焼系で連続して測定するため，燃て測定するシステムである。純粋なガスを複数回焼炉内に燃えかすが蓄積することによって燃焼位

繰り返し測定して値を得るため，一測定の精度はcontinuous-flow システムに比べ，およそ一桁良い

置が上昇し，不完全燃焼を引き起こすという問題もある。そのため，EA/IRMS を用いて，安定同位精製した試料ガスを入れ，交互に分析部へ導入し体比を正確に精度良く測定するためには，同位体が，測定に要する試料が充分確保できる必要があ
る（Table 2）。

比既知の標準試料を用いて EA/IRMS のコンディ

炭素，窒素の安定同位体比を測定するには，何ションを常にモニタリングすることや，適切ならかの方法で試料をガス化し，真空ライン等を使って純粋な CO2 ガスもしくは N2 ガスの形にしキャリブレーション法を用いる必要がある（例えば，Ohlsson and Wallmark, 1999; Schmitt et al., 2003;

なければならない。一般的な有機物の封緘燃焼

力石 , 2008; Ogawa et al., 2010）。一方で，これらの問題の解決に多くの時間と手間をかけすぎてしまうと，決められた費用と時間内で，分析できるサ

Table1. Isotope compositions of international standards.

ンプル数が減ってしまうという問題もあり，とくに多数量の試料をルーチンで測定するような研究室では，大きな問題になる。
本報では，Dual Inlet 法と EA/IRMS 法の原理をレビューし，また，著者らが通常行っている EA/
IRMS による安定同位体比の測定方法（比較的簡Rario, H/L* Value, H/L* H %Vienna Standard Mean
Ocean Water（VSMOW）

0.0003799

0.037999.76206

O/16O

0.0020052

0.20004

99.76206

C/ C

0.01118

1.105698.8944

O/16O

0.0003859

0.038599.7553

16

O/ O

0.0020672

0.206299.7553

N/14N

0.0036765

0.366399.63370

1215* H and L indicate heavy and light isotope components, respectivery.
Ratio Values are taken from Fry (2006).

Table2. Comparison of Dual Inlet and EA/IRMS
Target質は測定対象元素ごと国際的に定められている

Element

Size

C
Dual Inlet

Gas

N

1-3 mmolH

標準物質よりも軽い同位体比に富む（同位体的に軽い）ことを示す。

O/ O

18

安定同位体の天然存在比は標準物質による千分
偏差（δ 値，単位 ‰）で表される（式１）。標準物

い同位体比に富み（同位体的に重い），負であれば99.984426

17

		

（Table.1）。δ 値が正であれば，標準物質よりも重0.015574

13

Air（AIR）

2.安定同位体比の表し方

0.00015576

16

18

単に，効率よくキャリブレーションできる分析方法）を紹介する。

H/1H

2
17

Vienna PeeDee Belemnite（VPDB）L %C
EA/IRMS

−22−

Bulk

N

1-5 μmolO

1-10 μmol

H5-50 μmol

Capacity

Precision（‰)

Preparation

Measurement

0.05-0.1

3 day

15 min0.5-3.0

1 week20 min0.1-0.5
3-10

10 min
1 day
15 min元素分析 / 同位体比質量分析計（EA/IRMS）を用いた炭素・窒素安定同位体比の測定方法とその応用

Pyrex tube forgas collection

Ag
CuO
Sample500℃ 30min
850℃ 2h

Cryogenic trap

Cu
Quartz tube

Hg Toepler
pump
Vacuuming andsealing in quartz tube

Combustion oforganic matter to
N2, CO2, H2O

Cryogenic purification ofN2 and CO2 by using
vacuum line

Fig.1. Schematic of Dual Inlet method for carbon and nitrogen isotope analysis.
Fig.1, Sato et al.

の方法を Fig. 1 に示す。有機物を，酸化銅・還元

Table3. International references and their δ13C and δ15N values.

銅・銀と共に石英管に真空封入後加熱し（500℃で30min，850℃で 2h），CO2，N2，H2O に分解する。
これらのガスを真空ラインと寒剤を使って分離精製し，安定同位体比質量分析計 Dual Inlet システム

Name

Abbreviation

Isotope ratio（‰）δD VSMOW δ18O VSMOW δ13C VPDB

15

δ N AIR

Inaternational standard（from IAEA and NIST）に導入して測定する。一般的に，CO2 のトラップとして，液体窒素（−196℃），H2O のトラップとし

VSMOW Water00

SLAP2 Water

-428

-55.5

-189.5-14.8

GISP Water
Benzoic Acid

IAEA-601

Benzoic Acid

IAEA-602いる。また，N2 は，寒剤でトラップすることが難Polyethylene

IAEA-CH-7

しいため，水銀ポンプで回収する。

Cellulose

IAEA-CH-3

Sucrose（ANU）

IAEA-CH-6

TS-Limestone

NBS 19Ammonium Sulfate

IAEA-N-1

0.4

Ammonium Sulfate

IAEA-N-2

20.3

Porassium Nitrate

IAEA-NO-3て，ドライアイス / エタノール（−72℃）などを用

レファレンスガスには，PDB などの標準物質から精製したガスを使用するのが理想的である。
しかし実際には PDB などはすでに入手不可能であるため，代替として同位体比の明らかな別の物
質（標準試料）から精製したガスを使用する。一

23.3
71.4
-100.3

-32.2
-24.7
-10.4
28.7

1.95

25.6

4.7

Other reference materials（from Indiana Univ.）
Acetanilide #1

-29.5

1.18

Acetanilide #2

-29.5

19.6

Acetanilide #3

-29.5

40.6

Urea #1

-34.1

0.26

たガスを用いる。これらは測定用標準試料（ワー

Urea #2

-8.02

20.2

キングスタンダード），測定用標準ガス（ワーキン

Urea #3

11.7

40.6

般には IAEA が管理・販売している国際標準試料（Table 3）か，これらの国際標準試料を用いて値を決めた孫世代の標準試料（二次標準）から精製しグレファレンスガス）などと呼ばれ，自作する研究室も多い。また，現在では値付けされたガスがOztech 社から販売されている。いずれの場合におBenzoic acid #A

23.1

-28.8

Benzoic acid #B

71.3

-28.9

Other reference materials（from SI science）
L-Alanine

-19.6

1.54

いても，国際標準試料を用いて，レファレンスガ

Histidine

-11.4

-7.6

スの同位体比の定期的な検証を行っておくことがGlycine

-33.8

1.3

L-Alanine N enriched

-19.6

20.0

望ましい。
−23−

佐藤里恵・鈴木彌生子

釈をするための He ガスの導入も ConFlo 部で行う。
IRMS へ導入されたガスは Ion Source でイオン

4.EA/IRMS による安定同位体比の測定方法化され，マグネット部で質量分離された後，3 つ

4.1.原理
EA/IRMS の概略を Fig. 2 に，得られるクロマト
グラムを Fig. 3 に示す。
EA/IRMS は EA 部で試料の導入，燃焼，ガス分の検出器で同時に検出される。N2 測定モードでは，m/z 28，29，30 が測定され，m/z 28，29 の強度（ピーク面積）は，それぞれ式 2，3 に対応し，離を，ConFlo 部で流量調整とレファレンスガスの信号を送ると EA 部のオートサンプラーが動き，
サ ン プ ル は 1000 〜 1050 ℃ の 酸 化 炉（Ox 側 ）に

29 = N N + N N
14

14

（式 4）

また，m/z 30 で NO などの還元不足による生成物をモニターする。
一方，CO2 測定モードで測定される m/z 44，45，
46 の強度は，式 5，6，7 に対応し，（式 5）45 = 13C16O16O + 12C17O16O + 12C16O17O （式 6）44 = 12C16O16O

炉後部に充填された Co3O4/Ag で除去される。NOX
は還元炉（Red 側）で N2 に変換され，H2O は水ト

46 = 13C17O16O + 13C16O17O + 12C17O17O

ラップ：Mg(ClO4)2 で除去される。CO2 と N2 の混合ガスは GC カラムで分離され，ConFlo 部で流量を調整した後 IRMS 部へと送られる。
ConFlo 部 に は レ ファレ ン ス ガ ス（ 超 高 純 度，

15

29/28 = 2 × (15N/14N)

に導入される。導入と当時に超高純度酸素ガス

焼され，充填された酸化剤（Cr2O3）で CO2，NOX，
H2O に変換される。サンプル中のハロゲンは酸化15

これらの式から式 4 が導かれ，15N/14N が得られる。

超 高 純 度（99.9999%）の He キ ャ リ ア ガ ス と 共（99.9999%）が導入され，サンプルを包んだスズの酸化熱でサンプルは 1800℃に達し瞬間的に燃

（式 2）
（式 3）

28 = 14N14N

導入を，IRMS 部で同位体比の測定を行う。
EA/IRMS を制御するための PC からスタート（式 7）+ 12C18O16O + 12C16O18O
これらの式から式 8，9 が導かれる。

（式 8）46/44 = 2 × (13C/12C)(17O/16O) + (17O/16O)2 + 2
45/44 = 13C/12C + 2 × (17O/16O)

99.999% 以上の CO2 とN2 ボンベガス）が接続されており，IRMS 部へ N2 や CO2 ガスが He キャリアーガ

（式 9）× (18O/16O)

スと共に流れ，同位体比を測定するタイミングに合わせてレファレンスガスを導入する。また，炭素・式 8，9 の連立方程式は変数が 3 つあるので，窒素同位体比を同時に測定する場合，一般的にサンプル中の炭素含有量は窒素の含有量よりも多い

このままでは解くことができない。そこで，地球上での 17O/16O と 18O/16O の関係式（式 10）（Craig,ことから，CO2 を測定するタイミングに合わせて希

1957; Santrock et al., 1985）

Auto sampler

Reduction furnace

Oxidation furnace

EA

Quartz wool
Co3O4/Ag
Quartz wool

He He

Quartzwool

Ref. CO2
Ref. N2
MagnetCuO
Quartzwool
Water trap

Quartz wool
Cr2O3

29/28 or 45/44

SampleO2

Cu

Mg(ClO4)2Ion Source

Quartzwool

ConFloCuO
Quartz woolm/z 28 or 44 Intensity (V)He

DetectorIRMS

GC Column

Reference N2

Sample N2

Sample CO2

Reference CO2Time (s)Jump to CO2 mode with He dilution

Fig2. Schematic of EA/IRMS system.

Fig.2, Sato et al.

−24−

Fig3. Representative chromatogram of EA/IRMS.
Fig.3, Sato et al.

元素分析 / 同位体比質量分析計（EA/IRMS）を用いた炭素・窒素安定同位体比の測定方法とその応用（式 10）

O/16O = 0.0099235 × (18O/16O)0.516

17を用いて，13C/12C と 18O/16O を得る。通常，これらの計算は全て，EA/IRMS 付属の PC ソフトウェ
アで自動的に行われ，レファレンスガスに対する試料の δ 値が出力される。ここで得られる同位体

る炭素・窒素同位体比は，実際の値よりも重くなる傾向がある。そのため，正しく同位体比を測定するためには，適切なサンプル量を導入することが必要である。
サンプリング誤差を少なくするために，試料は測定前にできるだけ均一に（微粉末状に）してお

比は，あくまでも暫定値であり，国際スタンダー
ドに対する試料の δ 値ではないことに注意して頂く必要がある。次に，粉末試料を 5 × 9 mm（直径 ×

きたい（国際スタンダードスケールへのキャリブ

元々炭素のブランクをもっており（スズの製作過

レーション法は，4.3 章を参照）。

程でコークスを使用しているため），それらの影高さ）のスズコンテナに秤取る。スズコンテナは

なお，得られる酸素同位体比（δ O）は，主に試響に係わる物質をできるだけ取り除くために，ま料と同時に導入した酸素ガスや酸化剤由来の酸素

た，ブランク値を一定にするためにも，あらかじ18の同位体比である。この値から酸化の状態（不完めメタノール−ジクロロメタン混合溶媒で洗浄，全燃焼になっていないか）をモニターすることが乾燥したものを使用する。試料を秤取ったスズコできる。

ンテナは，空気中の窒素分のコンタミネーションを防ぐため，空気を押し出すようにしてピンセッ
トで丸める。

4.2.試料の調整
EA/IRMS で 1 回の測定に使用する試料の量は，

4.3.補正とキャリブレーション80μg）程度である。これ以下の導入量では，得られる出力が充分ではなく，きちんとした同位体比がガスに対する試料の δ 値（暫定値）であり，国際ス
タンダードに対する δ 値へキャリブレーションす

測定できない場合がある（量依存性がある）。Fig.
4 にサンプル導入量による測定値の変動を示す。

る必要がある。また，EA/IRMS での測定は，Dual
Inlet の測定と異なり He キャリアガスにのせて，

例えば，m/z 44 の出力で 1000 mV 以上，m/z 28 の出
力で 3000 mV 以上では，得られる炭素・窒素同位同一の燃焼炉内で試料を順次燃焼し，ConFlo で一部のガスを細いキャピラリーを通して IRMS に送体比は安定しているが，m/z 44 の出力で 1000 mV
以下，m/z 28 の出力で 3000 mV 以下では，得られり込むため，装置各部における同位体分別（どちPC から出力された同位体比は，レファレンス

らか一方の同位体の優先的導入）や，IRMS 固有(a) Carbon(b) Nitrogen

-19.2

3.0

-19.4

2.5

δ1５N (‰ vs Air)

δ13C (‰ vs VPDB)

一般的な有機物では炭素測定で 0.1 mg（炭素の量で約 30 μg），窒素測定で 1.0 mg（窒素の量で約

-19.6

-19.8

-20.0

2.0

1.5

0

5

10

15

20

25

30

35

1.0

40

m/z 44 Intensity (V)

0

10

20

30

40

50

m/z 28 Intensity (V)Fig.4. Relationship between sample amount and determined d values: (a) carbon and (b) nitrogen.
The marked area indicates the actual value with an error of 0.1‰.

−25−
Fig.4, Sato et al.

佐藤里恵・鈴木彌生子

ならずに一定の傾きを持つ場合があるという問題することができる。そして実試料の測定時に，測定するサンプルの δ 値にあわせて，10 〜 15 試料がある。また，1 つの燃焼炉で連続して試料を酸ごとに 1 〜 3 つのワーキングスタンダードを測定の特性によって，測定 δ 値／本来の δ 値＝ 1.0に化するため，燃焼炉内に燃えかすが蓄積することし，その測定値がずれていないことを確認する。

によって燃焼位置が上昇し，不完全燃焼を引き起このようなキャリブレーション・モニタリング法

こすという問題もある。

を用いると，比較的簡単に正しい同位体比を測定

そのため，EA/IRMS を用いて安定同位体比をすることができる。

正確に精度良く測定するためには，同位体既知の標準試料（国際標準試料が理想的であるが，大量

4.4.炭素，窒素同時測定による He 希釈の影響入手ができないため一般的にはワーキングスタン

炭素と窒素を同時に測定しようとすると，一般

ダード）を用いてこれらの補正と国際スタンダー的な試料では，窒素の含有量が炭素のそれに比べドスケール（窒素では Air，炭素では VPDB）へのて著しく小さいため，導入する試料の量は，窒素

キャリブレーションを行う必要がある。一般的には，Table 4 に示す Sequence-1 のように，δ 値の異なるワーキングスタンダード（できれば 3 種類以上）

測定に合わせた量になる。しかし，そのまま炭素をサンプル十試料毎に測定し，ワーキングスタン

しまうため，炭素のピークの出現前に分析ラインに He を入れて，CO2 の希釈を行う。しかし，こダードの測定で得られた暫定値（レファレンスガ
スに対する δ 値）と本来の δ 値（国際スタンダード
に対する δ 値）から，1 次直線（検量線）を作製し，その検量線を用いて試料の δ 値を計算する。また，
EA/IRMS のコンディションを常にモニタリングすの同位体比を測定しようとすると，炭素の出力が測定できる出力範囲を超えてピークが振り切れての場合，導入される炭素の量と He の量のバランスによって測定値が変動する（Fig. 5）。
そこで一般的には，測定するサンプルの炭素含有量が異なる場合は，できるだけ同一の出力が得るためにも，ワーキングスタンダードを使用する。
しかし一方で，これら補正とキャリブレーショ
ンに多くの時間と手間をかけすぎてしまうと，決Table4. Sequences for δ13C and δ15N analysis

められた費用と時間内で，分析できるサンプル数が減ってしまうという問題もあり，とくに多数量の試料をルーチンで測定するような研究室では，大きな問題になる。そこで，著者らは，Table 4 にWorking standard
for stability check示す Sequence-2 のようなキャリブレーション・モ
ニタリング法を採用している。まず，δ 値の異なるワーキングスタンダード 3 種類を用意する。実Working standard
for calibration

試料を測定する前に１つのワーキングスタンダードを用いて装置・得られる δ 値の安定性・再現性

Sampleを確認し，また同時に，ワーキングスタンダードの本来の δ 値＝出力値となるように，PC ソフトウ
エア上で，レファレンスガスの見かけの δ 値を設定する。その後 3 種類のワーキングスタンダードを測定して，既知の δ 値と得られた測定値（出力Working standard値）との関係式（検量線）を作成する。ここで，３種類のワーキングスタンダードの出力値が既知のδ 値（測定 δ 値 / 本来の δ 値＝ 1.0）を示せば，実試料に対するキャリブレーションは行わずに，出力値をそのまま国際スタンダードスケールの結果と−26−

SampleSequence-1

Sequence-2

A

A

A
A
B
C
1
2
3

A
A
B
C
1
2
3

9
10
A
B
C
11
12

9
10
A

11
12

元素分析 / 同位体比質量分析計（EA/IRMS）を用いた炭素・窒素安定同位体比の測定方法とその応用られるサンプルごとに測定し，導入される炭素の量

し，その影響の有無を調査する必要がある。Fig.6

が大きく異なると予想される場合は，炭素の導入量に著者らのラボの装置のメモリー効果を調査したをサンプルと同様の出力となるようにワーキングス
タンダードを測定し，補正をする。また，十分なサ結果を示す。調査には同位体比が軽い試料と重い試料，それらの中間の試料の 3 種類を用意し，そンプル量を確保できない場合を除いては，炭素・窒の最大差が 20‰ 程度のものを使用した。メモリー

素を同時に測定しないという方法もよく使われて効果が認められる場合，軽い試料を測定した後のいる。著者らのラボでは，後者を採用している。

重い試料の測定結果は，直後では真値より軽い方

4.5.メモリー効果

試料を測定した後の軽い試料の測定結果では逆のへシフトし，2 点目・3 点目から真値を示す。重い
EA/IRMS ではオートサンプラーから連続でサ現象が起きる。著者らのラボではこの影響は許容

ンプルを測定するため，サンプルの性質や装置の特性，測定するサンプルの同位体比の幅によって範囲内に収まっているが，大きな影響がある場合は測定 Method の検討やサンプルを反復測定する

は前のサンプルの影響を受ける（メモリー効果）。

などの対処をしなければならない。

この影響を調べるために，同位体比の離れているワーキングスタンダードを数点ずつ交互に測定

5.産地判別への応用
安定同位体比を用いた研究は，地球化学分野（とくに有機地球化学）を中心に発展してきたが，近年の食品の産地偽装などの社会問題で，食の起δ13C (‰ vs VPDB)

源や安全性に注目が集まり，その判別・判定の一つのツールとして安定同位体比が使われるようになってきた（例えば，Suzuki et al., 2008; Nakashita
et al., 2008）。本稿の最後にその一例を紹介する。
産地判別には膨大なデータベースと，野菜などについては季節変動などを考慮する必要がある（例えば，中野・上原，2006; Anderson and Smith,m/z 44 Intensity (V)Fig5. Relationship between He dilution pressure anddetermined δ13C value.

2006）が，特色のある食材（餌に特徴がある等）に関しては，徐々に解析が進み始めている（例えば，
伊永，2009）。Fig. 7 に，著者らのラボで得られた牛(a) Carbon(b) Nitrogenδ1５N (‰ vs Air)

δ13C (‰ vs VPDB)

Fig.5, Sato et al.

Sample Num.

Sample Num.

Fig.6. Precision and memory effects on the replicate analyses for (a) δ13C and (b) δ15N.

−27−
Fig.6, Sato et al.

佐藤里恵・鈴木彌生子

肉の炭素・窒素安定同位体比を示す。試料採取時に著者らのラボで，ハチミツに異性化糖の添加量を

アメリカ産牛肉の輸入規制があり，アメリカ産牛

変えて混合したときのハチミツ全体と抽出タンパ

肉の入手が困難だったため，ニュージーランド産，

ク質の炭素安定同位体比，その結果から算出された
AOAC 法による数値の変化の結果を Fig. 8 に示す。

オーストラリア産，日本各地の「国産」と表示されていた牛肉を比較した。その結果，ニュージーラン
ド産とオーストラリア産の同位体比の分布は国産

ハチミツのたんぱく質は，10 〜 12 g のハチミツに
4 mL の蒸留水と，2 mL の Na2WO2･H2O と 2 mL ののものとは異なる位置にプロットされた。動物組

0.335 mol/L 硫酸の混合液を加えて，80℃のウォー

織の炭素・窒素同位体比は，主に摂取した食べ物のターバスで反応後，沈殿物を 1500 rpm で遠心分離影響を受ける（例えば，和田，1997）。各国における

し抽出した（たとえば，Jonathan W. White, 1989）。ハ

牛肉の炭素・窒素同位体比の変動は，給餌内容（穀チミツから抽出されたタンパク質の炭素安定同位物肥育・牧草肥育など）が反映されたものと考えら

体比は変化しないが，ハチミツ全体の炭素安定同れる。もちろん，今後，検体数を増やすなどの必要性があるが，この結果は，安定同位体比が，産地判

位体比と C4 植物由来糖分の割合（C4sugar 値）は異性化糖添加により上昇し，異性化糖の添加割合が 12%

別のツールになる 1 つの可能性を示唆している。

を超えたところで C4sugar 値は 7% を超える。

また，炭素安定同位体比の測定でハチミツへの異性化糖の添加を判定する方法がアメリカ分析化

謝学会（AOAC）オフィシャル法として規定されて辞いる。判定はハチミツ全体の炭素安定同位体比

スズの洗浄方法，分析方法について，力石嘉人と，ハチミツから抽出されたタンパク質の炭素安定同位体比を測定し，式 11 で算出した C4sugar 値がにたくさんのアドバイスをいただきました。装置

7% 以上で異性化糖を添加したハチミツであるとの原理について，大堀基己氏（サーモフィッシャー

判定される。

サイエンティフィック株式会社）にご教授いただき

C4sugar = (δ13Cp − δ13CH ) / (δ13CP − (-9.7) ) × 100 （式 11）

博士，小川奈々子博士（海洋技術研究開発機構）

ました。心より厚くお礼申し上げます。

δ13Cp = ハチミツから抽出されたタンパク質のC4sugar (%)

炭素安定同位体比δ13CH = ハチミツ全体の炭素安定同位体比δ13C (‰ vs VPDB)

δ1５N (‰ vs Air)

AustraliaJapan
New Zealandδ13C (‰ vs VPDB)

Sugar %

Fig7. δ13C - δ15N plot of beef samples.

Fig8. δ13C of C4 sugar-contaminated honey.

−28−

Fig.7, Sato et al.

Fig.

元素分析 / 同位体比質量分析計（EA/IRMS）を用いた炭素・窒素安定同位体比の測定方法とその応用

carbon, nitrogen, and oxygen isotope analysis as a

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