環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製

筑波大学大学院数理物質科学研究科

吉 冨徹

In this study, a redox nanoparticle (RNP), which is consist of polymeric micelle containing nitroxide radicals, wasdeveloped as nano-sized ROS scavenger for treatment of ultraviolet (UV)-induced skin damage. When RNP was applied
to the skin by iontophoresis, UV-induced damage and melanin production in the skin were prevented. In addition, a redox
injectable hydrogel (RIG) with prolonged drug retention time in the skin was developed for enhancing the ROS scavenging
efficacy, using a redox polyion complex flower micelle containing nitroxide radicals. Both RNP and RIG are anticipated ashigh performance ROS scavengers for treatment of UV-induced skin damage.

１．緒化ストレス疾患に対する RNP の治療・保護効果を明らか言にしてきた 1 − 9）。そこで、これらの成果をベースに RNP

紫外線によって多量に発生する活性酸素種（ROS）は、によるスキンケアの効果に着目した。興味深いことに、肌皮膚を絶えず攻撃している。この過剰な ROS 産生によっの角質層の pH は、酸性（pH 4 . 5 − 7 . 0）であることが知らて、メラニン生成、皮膚癌や炎症などが引き起こされる。

れているため、この RNP を角質層に導入することができ

この皮膚近傍に産生される ROS の消去は、まさにコスメれば、ナノ粒子が崩壊し、抗酸化能が向上することが期待

トロジーの大きな課題の一つである。そこで、効果の高いできる。本研究では、荷電性ナノ粒子の経皮投与法として抗酸化ストレス作用を示すためには、材料を創り込み、最注目を集めているイオントフォレシスを用いて RNP を皮適な素材を提供していくことが非常に重要となる。これま下に導入し、紫外線により惹起されるメラニン生成に対すで各種ビタミンやコエンザイム Q 10 などの抗酸化剤を含る RNP の保護効果を検証した。

んだ薬粧品が市販されている。しかしながら、ROS と反さらに、我々は、次世代のスキンケア素材として、レド応した後、抗酸化能が弱まってしまい、効力が長続きしなックスインジェクタブルゲルを考案した。ナノ粒子の皮下いという問題があった。また近年、触媒的に ROS を消去投与は、低分子化合物に比べ長い滞留性を示す。しかしなする白金ナノ粒子・フラーレンなどの抗酸化ナノ粒子が注がら、粒子径が約 40 nm であるため、最終的にはリンパ系目を集めている。しかしながら、これらの粒子も特有の着へと移行してしまう。治療などを考えた場合には、一度の色や汗による皮膚からの脱離などの問題を有している。そ

処置で、治療効果が数週間持続することが好ましい。そこ

こで、我々は、高機能性スキンケア薬粧品を開発するためで本研究では、皮下で長期に滞留し、機能する ROS 消去に、触媒的に ROS を消去するニトロキシルラジカル（2,2,6,6剤を開発するため、ニトロキシドラジカル含有ポリイオン‐テトラメチルピペリジン‐1‐オキシル：TEMPO）が結コンプレックス（PIC）フラワーミセルを作製し、生体内合したレドックスポリマーを新規に合成した（図１）。こ

環境に応答してゲル化するレドックスインジェクタブルゲのレドックスポリマーは、生体適合性を有するポリエチレル（RIG）を開発した（図２）。

ングリコール（PEG）と TEMPO が結合した疎水性セグメ

２．実ントから成る両親媒性ポリマー（PEG-b-PMNT）であり、水中で自己組織化し、レドックスナノ粒子（RNP）を形成

2 .1

験

紫外線誘発性メラニン生成に対するRNP の効果する。この RNP は、疎水性コアにアミノ基が導入されて本実験では、メラニン生成を惹起するため、メラニン保い る た め、 癌 や 炎 症 組 織 の よ う な 低 pH 環 境 で 崩 壊 し、

有ヘアレスマウス（HOS: HRM2, ♂ , ４週齢）に UV 照射（１ROS を効果的に消去することができる。これまでに、我々−５日目に2 60 mJ/cm2, 5−10 日目に 450 mJ/cm 2）を行った。

は、脳および腎臓虚血再灌流障害や脳出血などの様々な酸照射後、皮膚切片を作成してマッソン・フォンタナ染色（核：赤色、メラニン保有細胞：黒色）を行い、メラニンの生成

Development of skin care medicine
using environmental-sensitive redox
nanoparticles
Toru Yoshitomi
Depa rtment of Mater ia ls S ciences ,Graduate School of Pure and AppliedSciences, University of Tsukubaを観察した。また、回収した皮膚を 2 M の水酸化ナトリウムを用いて細胞融解し、450 nm におけるメラニン由来の吸収を測定することによりメラニンを定量した。1，4，7日目に、イオントフォレシスによって RNP を経皮投与し、メラニン生成に対する RNP の効果を観察した。

− 62 −

環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製

図1

図２2.2

pH 低下に伴い崩壊するレドックスナノ粒子（RNP）

皮下投与後ゲル化するレドックスインジェクタブルゲル（RIG）

新規 RIG の開発と皮下炎症に対する効果の検証

60 mg/ml（イオン強度 150 mM）に調整し、37℃の水浴中まずはじめに、両末端にメルカプト基を有するポリエチで加熱を行い、ゲル化時間を試験管反転法により測定した。

レングリコールをテローゲンとして用いたクロロメチルス

皮下におけるゲルの滞留性は電子スピン共鳴法（ESR）を

チレンのラジカルテロメリゼーションにより、両末端に反用いて測定した。また、皮下炎症モデルとしてカラギーナ応性ポリクロロメチルスチレン（PCMS）を有するトリブン誘発性炎症をマウスの足底に作製し、RIG の抗炎症効果ロックポリマーの合成を行った（PCMS-PEG-PCMS）。次を痛覚過敏試験、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性及に、4 - アミノ -TEMPO を用いてクロロメチル基のアミノび炎症性サイトカイン量を測定した。

化反応を行い、疎水性 PCMS セグメントに２級アミンを３．結果及び考察介して TEMPO を導入した（PMNT-PEG-PMNT）。得られた PMNT-PEG-PMNT をプロトン化し、アニオン性ポリア

3 .1

紫外線誘発性メラニン生成に対するRNP の効果

クリル酸（PAA）水溶液と混合することによりフラワーミはじめに、UV 照射によるメラニン生成を確認した。図セ ル を 得 た。 得 ら れ た フ ラ ワ ー ミ セ ル 溶 液 の 濃 度 を

3 a に示すように、UV 照射によって基底層を中心とした表− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

皮の肥厚化が確認された。またメラニン量は UV 照射によが活性化されて、急速に重合が進行する。本研究で得られり増加し、メラニン生成関連遺伝子であるチロシナーゼはた結果は、イオントフォレシスによって経皮投与された約 4 倍に増加した（図 3 b および c）。これらの結果により、

RNP が、この皮膚内で ROS を効率的に消去したことによ

本実験で用いた UV 照射条件によって、マウス皮下にメラり、メラニン生成を抑制したものと考えられる。

ニンが生成することが確認された。ここで、RNP を角質層に導入するため、イオントフォレシスを用いた。イオン

3.2

新規 RIG の開発と皮下炎症に対する効果の検証

トフォレシスは、電気の力で荷電性ナノ粒子を皮内に導入

新規 PMNT-PEG-PMNT トリブロックコポリマーの合成することができるため、疎水性コアにアミノ基が導入されは、ゲル濾過クロマトグラフィーと 1 H NMR の結果によており正電荷を帯びている RNP を角質層へ導入することり確認された。表１に示すように、モル比１: １で調製しができる。そこで、RNP をイオントフォレシスにより投た粒子の粒子径およびゼータ電位は、それぞれ 79 nm およ

与し、RNP の効果を観察したところ、コントロールとしび −0 . 119 mV で あ っ た。 こ れ は、 カ チ オ ン 性 PMNT-て用いた正電荷リポソームに比べ、RNP を投与した皮膚PEG - PMNT とアニオン性 PAA との間に静電相互作用がではメラニンの沈着が抑制される傾向が観察された（図働き、ポリイオンコンプレックスコアを有する PIC フラワ

4 a）。また、メラニンの生成量を定量したところ、同様に、ーミセルが形成されたことを示す。このミセルは PEG のRNP がメラニンの生成を抑制していることが明らかとな高い運動性によりミセル同士の凝集を防ぐため、沈殿が生った（図 4 b）。

じない。よって、高濃度でも体内に注射可能である。得ら

皮膚に強い紫外線に当ると、ROS が発生し、表皮細胞れたフラワーミセルをモル比１: １、濃度 60 mg/mL、pH６、がインターロイキンなどのメラニン生成・放出の情報伝達

イオン強度 150 mM の条件下で 37℃に加温したところ、ミ物質を生成することが知られている。この情報伝達物質がセルが２分間以内に不可逆的にゲル化することが明らかとメラノサイトというメラニンを発生させる場所に届くと、なった（図５）。この結果は、温度の上昇によりミセルが必須アミノ酸の一つであるチロシンが酸化され、チロシンエントロピー的に不安定となり崩壊し、ゲルを形成したとがドーパーに変化し、次いで、ドーパーがキノン、キノン考えられる。そこで、このミセル溶液をマウス皮下に注射がインドールへと反応し、このインドールが重合してシミ、したところ、同様にゲル化することが確認された。RIG は、ソバカスのメラニン色素へと変化する。この反応はすべてESR で検出可能な安定ニトロキシドラジカルを有してい酸化反応であり、ROS が存在すると、酵素チロシナーゼる。よって、体内の RIG 濃度を ESR を用いて調べること

図３ UV 照射によるメラニン生成(a) マッソン・フォンタナ染色（核：赤色、メラニン保有細胞：黒色）矢印はメラニン保有細胞を示す。
(b) メラニン生成量(c) チロシナーゼ量

図４ イオントフォレシスによる RNP の経皮投与後のメラニン生成(a) マッソン・フォンタナ染色（核：赤色、メラニン保有細胞：黒色）矢印はメラニン保有細胞を示す。
(b) メラニン生成量− 64 −

環境応答性レドックスナノ粒子を用いた高機能性スキンケア薬粧品の創製ができる。低分子化合物（4 - アミノ- TEMPO）または RNP

れらの結果は、RIG 自身が炎症惹起を引き起こすことなく、では、それぞれ 1 時間と 12 時間以内に投与部位から消失し安全であることを示している。さらに、RIG は、カラギーたのに対し、RIG は 72 時間後にも 40 % 残存していること

ナン投与により誘発される炎症も、有意に抑制することがが明らかとなった（図６、上図）。また、ニトロキシドラジカルは、確認された。また、RIG は、炎症性サイトカインであるESR イメージングや MRI を用いて画像化することができ

TNF- a と IL- 1 b の発生も有意に抑制し、カラギーナン誘るため、図６（下図）に示すように RIG の経時変化を非侵発性痛覚過敏を効果的に予防した。この結果は、RIG 中の襲的に観察することもできる。この結果は、本研究で開発ニトロキシドラジカルが好中球やマクロファージの産生すした RIG の高い滞留性を示す。そこで、カラギーナン誘発る ROS を効果的に消去していることを示している。

性炎症モデルマウスを用いて RIG の抗炎症効果を評価した。

４．総

まず、ニトロキシドラジカルを含有しないフラワーミセル溶液を皮下投与し ROS 消去能がないゲル（ノンレドックス括

本研究では、高機能性スキンケア薬粧品の開発を目指し、インジェクタブルゲル：nRIG）を形成させたところ、好紫外線誘発性メラニン生成に対する RNP の効果の検証を中球の浸潤の指標である MPO の活性化が確認された。一行った。RNP をイオントフォレシスによって経皮投与す方で、RIG は、その活性化を有意に抑制した（図７）。こることにより、紫外線照射によって生じるメラニン生成を

表１ ニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックス（PIC）フラワーミセルの粒子径と表面電荷（モル比 r ＝ PAAのカルボキシル基のモル量：PMNT-PEG-PMNT のアミノ基のモル量）
Molar ratiorkcps

Pdl

Size/nm

Zeta potential/mV

4：1

207

0 . 2548− 3 . 73

２：12740 . 2555− 2 . 24

１：１6850 . 2379− 0 . 119

１：２7240 . 2589+ 1 . 43

図５ ニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックス（PIC）フラワーミセルのゲル化時間 ( 60 mg/ml, イオン強度
150 mM, r= 1 : 2 , 1 : 1 , 2 : 1 , 4 : 1 )

図６ （上図）皮下投与後のニトロキシドラジカル残存量（下図）
皮下投与後の非侵襲的 ESR イメージング画像。低分子量の
4 - アミノ -TEMPO, RNP と RIG 残存量を ESR イメージング装置を用いて評価した。

図７ 皮下投与した後の RIG の炎症抑制能試験。MPO の活性を測定した。Carr は、カラギーナン投与を示す。

− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

抑制することが明らかとなった。さらに、長期皮下滞留性

Toh K, Tsurushima H, Hirayama A, Matsumura A,:を有する RIG の開発に成功した。低分子化合物やナノ粒子Newly Synthesized Radical-Containing Nanoparticlesに比べ、RIG は高い局所滞留性を有し、炎症モデルに対し(RNP) Enhance Neuroprotection After Cerebralて高い効果を示すことが明らかとなった。これは次世代のIschemia-Reperfusion Injury, Neurosurgery, 68 , 1418 –1425 , 2011 .

皮下の ROS を長期間消去するスキンケア薬粧品として期待

５）Yoshitomi T, Hirayama A, Nagasaki Y,: The ROSされる。

scavenging and renal protective effects of pH謝辞

responsive nitroxide radical-containing nanoparticles,

本研究は、筑波大学数理物質科学研究科

Biomaterials, 32 , 8021 – 8028 , 2011 .

長崎幸夫教授の御指導のもと、研究を行った成果である。イオントフォ

６）Vong LB, Tomita T, Yoshitomi T, Matsui H,レシスによる RNP の経皮投与およびメラニン生成の実験

Nagasaki Y,: An Orally Administered Redoxに関しては、京都薬科大学

小暮健太朗教授、塩田佳菜子

Nanoparticle that Accumlates in the Colonic Mucosa

氏らとともに行った結果であり、また RIG の実験に関してand Reduces Colitis in Mice, Gastroenterology, 143 ,は、筑波大学数理物質科学研究科

1027 - 1036 , 2012 .

博士前期課程２年プアミンリー氏とともに行った結果である。ここに深く感謝致

７）Chonpathompikunlert P,

Fan CH, Ozaki Y,

Yoshitomi T, Yeh CK, Nagasaki Y,: Redox Nanoparticle

します。

Treatment Protects Against Neurological Deficit（参考文献）in F o c us e d U lt r a s o und-I nduc e d I nt r a c e r ebral
Hemorrhage, Nanomedicine, 7 , 1029 – 1043 , 2012 .

１）Yoshitomi T, Miyamoto D, Nagasaki Y,: Design ofCore-shell-type Nanoparticles Carrying Stable Radicals

８）Chonpathompikunlert P, Yoshitomi T, Han J, Tohin the Core, Biomacromolecules, 10 , 596 – 601 , 2009 .

K, Isoda H, Nagasaki Y,: Chemical nanotherapy:２）Yoshitomi T, Nagasaki Y,: Nitroxyl radical-containing

Nitroxyl radical-containing nanoparticle (RNP) protects

nanoparticles for novel nanomedicine against oxidative

neuroblastoma SH-SY 5 Y cells from aβ- induced

stress injury, Nanomedicine, 6 , 3 , 509 – 518 , 2011 .

oxidative stress, Ther. Deliv, 2 , 585 – 597 , 2011 .

３）Yoshitomi T, Suzuki R, Mamiya T, Matsui H,９）Chonpathompikunlert P, Yoshitomi T, Han J,

Hirayama A, Nagasaki Y,: pH-Sensitive Radical-

Isoda H, Nagasaki Y,: The use of nitroxide radical-

Containing-Nanoparticle (RNP) for the L-Band-EPR

containing nanoparticles coupled with piperine toImaging of Low pH Circumstances, Bioconjugate

protect neuroblastoma SH-SY 5 Y cells from aβ- inducedChemistry, 20 , 1792 – 1798 , 2009 .

oxidative stress, Biomaterials, 32 , 8605 – 8612 , 2011 .

４）Marushima A, Suzuki K, Nagasaki Y, Yoshitomi T,− 66 −