非アルコール性脂肪性肝炎から肝発癌における腸内細菌叢と肝自然免疫の役割の解明と治療応用へ向けた基礎的検討

三浦

秋田大学大学院医学系研究科医学専攻腫瘍制御医学系消化器内科

緒

言

光一

特任講師

カイン受容体を分子生物学的手法にて解析する。さらには TLR のリガンドの源と推定される腸内細菌叢をター

非アルコール性脂肪性肝炎（以下 NASH）はメタボゲットにした治療戦略を検討する。

リック症候群の肝臓での表現型とされ、肝硬変や肝臓癌へ進展する可能性のある疾患である。近年、NASH 患

方者数は増加傾向にあり、今後重要な健康問題となると予想されるが、いまだ有効な治療法は少ない。NASH 発法
今回は採択研究課題のうち、NASH におけるマクロ症メカニズムに関して不明な点が多いことから、その解ファージの動態について行った実験方法を示す。

明が有効な治療法の開発につながると考えられる。

NASH の原因が「マクロファージ説」であることをNASH 発症メカニズムとして Day らが提唱した two

証明する手がかりとして、NASH 発症におけるマクロhits theory が広く浸透している。これによると、まずファージ性質を検討した。次にマクロファージ誘導に栄養過多により脂肪肝が生じ、肝細胞での貯蔵限界を超重要な役割を果たすケモカイン MCP-1 とその受容体えると酸化ストレスが生み出され、それが肝細胞障害をである CCR2 について検討を行った。CCR2 KO マウ引き起こし、NASH に進展するという説である。すな

スに NASH 誘導食であるコリン欠乏食を投与し、病わち NASH の原因は肝細胞で、そこに貯蔵される脂肪態評価とマクロファージ誘導の状況を検討した。次にの量や質であるとされてきた。しかし、軽度の脂肪肝でCCR2 阻害剤による NASH の治療効果を検討した。さも酸化ストレスマーカーが上昇することから、Two hits

らに MCP-1 - CCR2 の上流に位置する TLR4、TLR9,

theory のみで NASH とその後の肝発癌の発症機序を説

MyD88 の各遺伝子欠損 (KO) マウスにおける MCP-1明しにくいのも現状である。

および CCR2 発現、さらにはマクロファージの浸潤の1）

我 々 が 注 目 し て い る の は マ ク ロ フ ァ ー ジ で あ る。

程度を評価した。

NASH においては腸内細菌叢が増大し、さらに腸管壁結透過性亢進も加わることで、多量の腸内細菌産物が門脈

果

コリン欠乏食誘導NASHで炎症性マクロファージの浸に流入し、肝臓に達する。それらによりマクロファージ潤が著明であるが刺激を受け、炎症性サイトカインやケモカインを産生し続ける。我々はマクロファージから産生される様々なWT マウスにコリン欠乏食を 22 週投与すると著明な因子が肝細胞に対し障害を与え、NASH の病態を生み脂肪肝、炎症細胞浸潤、肝細胞の風船様変化が認めら出していると考えている 2）。また NASH で「病的状態」れた ( 図 1A)。また線維化や活性化星細胞のマーカーでの根源は肝細胞よりもむしろマクロファージで、その「病あるαSMA 発現が増加した（図 1A）。NASH 進行に伴的マクロファージ」を生み出しているのはマクロファー

い CCR2 陽性細胞、マクロファージの代表的マーカー

ジ自身に発現する Toll-like receptor( 以下 TLR) やケモである F4/80、骨髄由来炎症性マクロファージのマーカイン受容体でないかと我々は考えている。

カーである Ly6C の陽性細胞が NASH において増加しそ こ で 我 々 は NASH 発 症 の メ カ ニ ズ ム を マ ク ロた（ 図 1A, 1B）。 肝 臓 中 の mRNA レ ベ ル で も CCR2

ファージの動態からアプローチし、治療応用を含めたの リ ガ ン ド で あ る MCP-1 や CCR2、F4/80、CD68 発検討を行う。「病的マクロファージ」が生じるメカニズ

現増加を認めた（図 1C）。またコントロールマウスおム解明のため、マクロファージに発現する TLR やケモ

よび NASH マウスよりマクロファージを分離すると、
1三浦光一図 1 NASH で炎症性マクロファージの浸潤が著明である
標準食 (Standard diet)、CSAA 食 ( コリン欠乏食のコントロール食 )、CDAA 食 ( コリン欠乏食 ) を 22 週投与
した WT マウスの所見 (A) 上段から HE,HE 拡大、α SMA 免疫染色 , Sirius red 染色、CCR2 免疫染色、F4/80免疫染色、Ly6C 免疫染色。(B) CCR2、F4/80、Ly6C の各陽性細胞数。(C) Real-time PCR による肝組織中遺伝
子発現比較 (D) CSAA および CDAA 食投与マウスから分離したマクロファージの遺伝子発現。Real-time PCR2

非アルコール性脂肪性肝炎から肝発癌における腸内細菌叢と肝自然免疫の役割の解明と治療応用へ向けた基礎的検討

図 2 CCR2KO マウスで NASH 改善する
WT および CCR2KO マウスにコリン欠乏食を 22 週投与した所見。(A) 左より HE 染色、Oil red O 染色、
α SMA 免疫染色、Sirius red 染色 (B) 血清 ALT (C, D) Real-time PCR による肝組織中遺伝子発現比較

NASH 由来マクロファージでは TNFα、IL-1βなどの維化関連遺伝子発現も KO マウスで低値であった（図炎症性サイトカイン、MCP-1、CCR2 発現が増加して2D）。以上の所見より CCR2 は NASH の進行に密接にいた（図 1D）。これらのことから炎症性マクロファー関与していることが判明した。

ジが NASH において重要な役割を果たしていると考え

CCR2 は NASH において炎症性マクロファージを誘られた。

導する。
CCR2KO マウスで脂肪性肝炎が軽減したことから、肝臓におけるマクロファージ数を計測した。F4/80 陽性

CCR2KOマウスでNASH改善する
次にマクロファージの誘導が NASH に及ぼす影響を細胞や Ly6C 陽性細胞は WT マウスで NASH 進行とと検討するため、CCR2KO マウスにコリン欠乏食を 22もに増加したのに対し、CCR2KO マウスでは増加は軽週投与した。CCR2KO マウスでは脂肪肝、炎症細胞浸微であった（図 3A,3B）。肝組織での mRNA レベルで潤、肝細胞の風船様変化が軽減した（図 2A）。血清中も MCP-1、F4/80、CD68 などのケモカインやマクロの ALT 値も KO マウスで低値を示した（図 2B）。肝ファージのマーカーは CCR2KO マウスで低下した（図臓組織内の炎症性サイトカインの mRNA 発現レベル

3A,3B）。

においても KO マウスで TNFαや IL-1βが低値であった（図 2C）。次に進行した NASH の所見である肝線維TLRシグナルはMCP-1産生を介してNASHを促進する化の評価を行った。KO マウスでは NASH に特徴的な

次に TLR と炎症性マクロファージとの関連を検討す

perisinusoidal ﬁbrosis やαSMA 発 現 が 軽 減 し た（ 図るため、TLR4KO, TLR9KO、さらにはそれら下流の2A）。さらに肝組織でのコラーゲンや TIMP-1 などの線アダプター分子である MyD88 の KO マウスを用いて3三浦光

一

図 3 CCR2 は NASH において炎症性マクロファージを誘導する
WT および CCR2KO マウスにコリン欠乏食を 22 週投与した所見。(A) 上段より F4/80 免疫染色 (CSAA 食 ),F4/80 免疫染色 (CDAA 食 ), Ly6C 免疫染色 (B) F4/80 陽性細胞数および Ly6C 陽性細胞数 (C) Real-time PCRによる肝組織中遺伝子発現比較

NASH を誘導した。TLR4KO マウス、TLR9KO マウス、中の中性脂肪量も減少でも証明された（図 5D）。また血MyD88KO マウスでは NASH は軽減し、それら肝臓に清 ALT 値、肝組織中 TNF αや IL-1 β発現が減少した ( 図

おいて、MCP-1、CCR2、F4/80 および CD68 発現は低5F)。また遺伝子レベルで線維化マーカーは上昇したが、下した（図 4A）。それら KO マウスでは F4/80 陽性細胞、CCR2 阻害剤により発現低下が認めた（図 5G）。

CCR2 陽性細胞、Ly6C 陽性細胞数は肝臓で減少した（図次に NASH と診断されてからの治療介入をの効果を4B）。肝マクロファージに TLR4 ligand である LPS やみるため、NASH が完成してから CCR2 阻害剤を投与

TLR9 ligand である CpG-DNA で刺激すると MCP-1 発した。早期投与と同様に CCR2 阻害剤にて CCR2 陽性現が増加した、このことから、TLR-MCP-1-CCR2 を介細胞や Ly6C 陽性細胞は減少した（図 6A,6B）。脂肪肝したマクロファージの誘導は NASH 促進のひとつのメは有意に改善しなかったが（図 6A,6C）、炎症細胞浸潤、カニズムと考えられる。

ALT 値、肝線維化が改善した（図 6A, 6D,6E）。よって

CCR2阻害剤はNASHを著明に改善するである。

NASH が完成された状態からでも CCR2 阻害剤は有用
NASH において CCR2 を介した炎症性マクロファー
考ジの誘導が重要との結果より、まずコリン欠乏食開始と察同時に CCR2 阻害剤を 2 週間投与した。CCR2 阻害剤

本 研 究 結 果 か ら、NASH の 発 症 や 進 行 に は マ ク ロ

投与により肝臓における F4/80 陽性細胞、CCR2 陽性ファージの誘導や活性化が重要であることが判明した。

細胞、Ly6C 陽性細胞は減少し（図 5A,5B）、脂肪性肝最近の研究で、マクロファージはおおまかに分けて炎症炎の軽減を認めた（図 5A,5C）。脂肪肝の軽減は肝組織性作用を有する M1 マクロファージと抗炎症作用を有4非アルコール性脂肪性肝炎から肝発癌における腸内細菌叢と肝自然免疫の役割の解明と治療応用へ向けた基礎的検討

図 4 TLR シグナルは MCP-1 産生を介して NASH を促進する
WT、TLR4KO、TLR9KO、MyD88KO マウスにコリン欠乏食および CSAA 食を 22 週投与した所見。(A) Realtime PCR による肝組織中遺伝子発現比較 (B-D) F4/80 陽性細胞数、CCR2 陽性細胞数および Ly6C 陽性細胞数 (E)WT マウスより肝マクロファージを分離し、LPS および CpG で刺激した際の MCP-1 発現。Real-time PCR による遺伝子発現比較する M2 マクロファージが存在することが知られていた。よって組織マクロファージである Kupffer 細胞もる。コリン欠乏食誘導による NASH では肝臓から分離

炎症性マクロファージの誘導に関与し、NASH 発症にされるマクロファージは TNF αや IL-1 βなどの炎症おいて重要な役割を果たしていると考えられた。これら性サイトカインの発現レベルが高いことや骨髄由来炎症CCR2KO マウス、CCR2 阻害剤、さらには Kupffer 細性マクロファージである Ly6C 陽性マクロファージが認胞を除去した場合、脂肪肝の程度も軽減する所見がいくめられる。よって本 NASH モデルで誘導されるマクロつかの実験で認められた。すなわちマクロファージの変ファージは炎症性マクロファージが主体であると推定さ化により直接関係ないと思われた脂肪肝の程度も改善しれる。これら炎症性マクロファージは CCR2 KO マウている。よって脂肪性肝炎でみられる脂肪肝は炎症に付スで誘導が抑制され、その結果 NASH が軽減したこと随する所見であることを示唆する。これらの所見を合わから、MCP-1 および CCR2 を介するマクロファージのせると脂肪性肝炎ではマクロファージをコントロールす誘導が NASH 病態に関わっていることは明らかである。

ることが治療においても重要であると考えられた。

治療を考慮した場合、CCR2 阻害剤が有用であると考え

今後は骨髄移植によるキメラマウス作製により、マられるが、実際 CCR2 阻害剤により炎症や肝線維化がクロファージに発現する TLR や CCR2 が「病的マクロ改善した。CCR2 阻害剤は海外で糖尿病治療の臨床治験ファージ」を生み出す原因となり得るのかを検討する。

も始まっており、今後治療薬として期待される。一方、

また、TLR ligand の供給源は腸内細菌叢にあると推定

肝臓には組織マクロファージである Kupffer 細胞が存される。よって抗生剤やプロバイオティクス投与により在するが、あらかじめ clodronate で Kupffer 細胞を除腸内細菌叢をコントロールも治療もオプションと考えら去しておくと、その後の NASH 誘導において炎症が軽れ、今後研究を展開していく予定である。

減する 3)。我々の検討では Kupffer 細胞は炎症性サイトカイン産生に加え、MCP-1 産生源であると考えられ
5

三浦光

一

図 5 CCR2 阻害剤早期投与は NASH を著明に改善する
WT マウスに CDAA 食を負荷し、CCR2 阻害剤を 2 週間同時投与した所見。(A) 上段より F4/80 免疫染色 ,CCR2 免疫染色、Ly6C 免疫染色、HE 染色 (B) F4/80 陽性細胞数、CCR2 陽性細胞数および Ly6C 陽性細胞数 . (C)NAFLD activity score. (D) 肝組織中性脂肪量 . (E) 血清 ALT. (F,G) Real-time PCR による肝組織中遺伝子発現比較 .

要約導が抑制された。また CCR2 阻害剤を用いて炎症性マ

NASH の 発 症 原 因 は 不 明 な 点 が 多 く、 そ の 解 明 がクロファージの誘導を抑制すると NASH が軽減した。

有効な治療法の開発につながると考えられる。我々はよって本研究では NASH の発症や進展においてマクロNASH の発症原因としてマクロファージにフォーカスファージの重要と考えられた。

をあて、研究を行った。WT マウスにコリン欠乏食を与えると典型的 NASH が誘導され、肝臓に多数の炎症性マクロファージが浸潤した。CCR2KO マウスでは炎症性マクロファージ誘導抑制と伴に NASH が軽減し た。 ま た MCP-1-CCR2 の 上 流 に 位 置 す る TLR4 やTLR9 の各 KO マウスでは NASH が軽減し、MCP-1 および CCR2 発現が低下し、炎症性マクロファージの誘6

非アルコール性脂肪性肝炎から肝発癌における腸内細菌叢と肝自然免疫の役割の解明と治療応用へ向けた基礎的検討

図 6 CCR2 阻害剤後期投与は炎症および線維化を改善する
WT マウスに CDAA 食を 18 週負荷後に、CCR2 阻害剤を 4 週間同時投与した所見。(A) 上段より CCR2 免疫染色、
Ly6C 免疫染色、HE 染色、Sirius red 染色、α SMA 免疫染色 . (B) CCR2 陽性細胞数および Ly6C 陽性細胞数 . (C)肝組織中性脂肪量 . (D) NAFLD activity score.(E) 血清 ALT

謝辞
本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りました公益財団法人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。
文献１）Day CP and James OF. Steatohepatitis: a tale of two"hits"? Gastroenterology. 1998 ;114:842-5.
２）Miura K, et al. Toll-Like Receptor 9 Promotes
Steatohepatitis by Induction of Interleukin-1beta in Mice.
Gastroenterology. 2010;139:323-334.
３）Miura K, et al. Hepatic recruitment of macrophages
promotes nonalcoholic steatohepatitis through CCR2. Am
J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012;302:G1310-21.

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