新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞生理学

道上宏之

Topical therapy is the most favored form of treatment for whitening against hyper-pigmentation and sunburn.
However, high-molecular-weight, hydrophilic chemicals are difficult to use as transdermal delivery drugs and the use of
topical drugs has been highly limited. We applied 11-arginine peptide (11R), a cell-membrane-permeable peptide, as atransdermal delivery system with a skin delivery enhanser, pyrenbutyrate. We performed intracellular peptide screening formelanogenesis inhibitors with several kinds of tyrosinase inhibitory peptides from natural sources. Next, we performed daily
repetitive topical application of this LILVLLAI peptide found in gliadin protein, a wheat component, for two weeks against
a UV-induced sun-tanning guinea pig model and confirmed significant melanogenesis inhibition in model skin. We showedthat 11R using a transdermal drug delivery system with melanogenesis inhibitory peptide is a very safe and promising
method for applications from cosmetics to the pharmaceutical industry.

１．緒

ン環を有する脂溶性の部分とカルボニル基を有する水溶性

言の部分を合わせ持つ両親媒性の物質である。これを前処置

タンパク質導入法とは、Protein transduction domain

で使用すると、エンドソーム内のタンパク質が効率良く細（PTD）と呼ばれる 10−20 個のアミノ酸からなるペプチド胞内で拡散することが報告されている 5）。Pyrenebutyrateを融合することによりタンパク質、ペプチド、低分子化合存在下ではエンドソーム内に蓄積することなく、膜透過後、物などの様々な生理活性物質を細胞内に導入し機能させる

速やかに細胞内全体へ導入できる。そのため、エンドソー技術である。タンパク質が直接細胞内に導入されることは、ム内で機能することなく蓄積していたタンパク質や薬物が、

ヒ ト 免 疫 不 全 ウ ィ ル ス Ⅰ 型（HIV-1） が 発 現 す る Trans-

早期に細胞質に拡散し、より迅速で大きな効果が期待出来

activator of transcription protein（TAT タンパク質）の研究

る 6）。

1）

により明らかになった 。TAT タンパク質の 11 個のアミ

今回、我々の研究では、このタンパク質導入法およびノ酸からなる PTD は細胞膜透過性の性質を有していること

Pyrenebutyrate を、経皮的導入法に応用することとした。

が報告されている。TAT domain（MYGRKKRRERRR）の

まず、皮膚は表皮、真皮及び皮下組織の 3 層構造をとって特徴は、11 個のアミノ酸の内、8 個のアミノ酸がアルギニいる。表皮は表層より角質層、顆粒層、有棘層、基底層かンやリジンなどの塩基性アミノ酸で構成されていることでらなる。メラニンを産生するメラノサイトは、表皮の最下ある。このことから、正電荷を帯びていることが膜透過性層である基底層に存在する。角質層は疎水性であり、外因に重要であることが示唆され、7−11 個の塩基性アミノ酸性物質に対するバリアの役割を果たしており、経皮的導入からなる数種類の PTD が発見された。そのうち、11 個のにおいても大きな障害となる 7）。

アルギニン（11R）による PTD が導入効率の面から優れてい2）

外用剤を皮膚に適用した時、含有される薬物の主な皮膚ることを我々の研究室の松下らが報告している （Fig. 1）。

透過・吸収の経路は、毛包や汗腺等の付属器官を介する経PTD による細胞内導入では、エンドサイトーシスの一付属器官ルートと角質層実質を透過する経角質層ルートの種であるマクロピノサイトーシスにより、エンドソームと2 通りが考えられている。付属器官を介した皮膚透過は皮3）いう小胞に包まれた形で細胞内に導入される 。よって、膚実質を通るより速やかであるが、皮膚表面積に対する付PTD を付加したタンパク質や薬物が細胞内で活性を発揮

属器官の割合は 0.1% 以下である 8）。しかしながら、分子量するには、エンドソームから脱出して細胞膜に移行する、500Da 以上の物質や極性物質等では、皮膚実質をほとんど4）さらなるステップが必要となる 。また、前処置として通過出来ないために毛包等の付属器官に集まると言われてPyrenebutyrate という物質を使用した。これは、ベンゼいる 9）。物質が皮膚実質を通る場合は、皮膚透過の最大のバリアである角質層中を拡散する必要がある。角質層を通The development of whitening peptide
with peptide percutaneous drug delivery
systemHiroyuki Michiue
Department of Physiology, Okayama
University Graduate School of Medicine,Dentistry and Pharmaceutical Sciences

る経路には角質細胞内を通る経細胞ルート（transcellularroute）と細胞間隙を通る細胞間ルート（intracellular route）がある。角質層バリアの克服こそが経皮導入の最大の課題となっている。
現在、薬物の経皮的導入法は物理的促進法と化学的促進法に大別される。物理的促進法としては、例えばイオント− 117 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 1

Fig. 2
Table 118）

フォレシス 10）やマイクロニードル 11）が挙げられる。イオントフォレシスは、皮膚の離れた 2 点に陽極、陰極をセットし、酸性薬物（負に帯電）では陰極側に、塩基性薬物（正に帯電）では陽極側の基剤に封入する。その後低電圧を負荷させることで、比較的電気抵抗の低い部分である毛嚢や汗腺等の付属器官を介し、角質下の水分に富み電気電導率の高い（電気を通し易い）表皮・真皮部に電流が流れ、同時に荷電した薬物が電気泳動の要領で表層から皮膚深部へと移動し、経皮吸収される。マイクロニードル法は、角質層（10 ～ 20 mm）のみを通過する針を有する剣山のようなものを皮膚に適用することで、神経に到達させずに角質層に穴を開け、バリア機能を低下させる方法である。
化学的促進法としては、例えば、リポソーム 12）や界面活性剤 13）が挙げられる。リポソームは、リン脂質からなる数十から数百 nm の粒径をもつ微小なカプセルであり、その内部に様々な分子を封入することができると共に、生体適合性や生分解性にも優れていることから、その発見以来、薬物や生理活性物質の理想的な運搬体と考えられている。しかし、薬物の極性、分子量に依存しない経皮的導入法は確立されていない。
次に、日焼け後の色素沈着やシミ、ソバカスについて説
明 す る。 こ れ ら の 原 因 と な る 紫 外 線 は、UVA（320−れるものとされている 14）。Whitening 効果を得るためのタ400 nm）、UVB（290−320 nm）、UVC（200− 290 nm）にーゲットとしては、主に三つの機序（Fig. 2）があり、一つ大別される。これらは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺目は、メラニン合成抑制 15）、二つ目は、メラニン排出促

激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚基底層

進 16）、三つ目は、メラノサイト刺激物質抑制である 17）。に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が亢進

今回、一つ目のメラニン合成を抑制する機序に焦点を当て、した結果、生じるものと考えられている。また、このメラメラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼに着目した。

ニンはメラノサイトの中で生合成される銅含有酵素チロシ

チロシナーゼ活性を抑制するペプチドに関しては、単体アナーゼの働きによって、チロシンから DOPA、DOPA かミノ酸及び 8 つ連結したアミノ酸（Table 1）によるチロシ

ら DOPA quinone に変化し、さらに中間体を経て形成さナーゼの活性阻害と結合能が論文において報告されている。

− 118 −

新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発

さらにその論文において、単体アミノ酸では、バリン、ロ50uL）に塗布し、経時的に観察した。青色は、ヘキストにイシン、イソロイシンといった疎水性アミノ酸がチロシナーよる核染色、赤色は、テトラメチルローダミンで蛍光標識ゼの活性を阻害すると報告している。しかし、これは試験した 11R ペプチドである。観察は、共焦点レーザー顕微管レベルでの報告しかされていない18）。そこで、我が研鏡（FV300、OLYMPUS）で行った。

究室の手法である、11R を連結させて細胞内へ導入することで検討を行い、細胞レベルでのスクリーニングを行った。

２．実

2. 6. 日焼けモデル動物の作成
日 焼 け モ デ ル と し て 褐 色 モ ル モ ッ ト（Guinea pig,験Weiser-Maples, female, 8w）を採用した。これは、動物の2. 1. ペプチドの作製

中でも体表面積が大きいこと、またヒトと同様のメラニン今回使用したペプチド18）は、ペプチド合成機を用いてペ形成を行うといった点から褐色モルモットに決定した。脱プチド固相法により作製したもので、近畿大学の研究室に毛したモルモットの背部に、紫外線 UVB 強度測定装置に依頼して合成したものである。本実験には、11R を連結して UV 強度を測定しつつ、UV 照射機により、1 日 1 回紫た候補ペプチドと候補ペプチドのみの両方を使用している。

外線量 0.25J/cm2 を 10 日間照射した。照射面積は一区間2cm×2cm を 4 区間とした。

2. 2. 細胞内スクリーニング
まず、チロシナーゼ抑制効果を有する候補ペプチドに

2. 7. 日焼けモデル動物の治療11R を連結させて、B16 メラノーマ細胞へ導入し、スクリモルモット日焼けモデルに、Propylene glycol にて調整ーニングを行った。実験に用いた B16 メラノーマ細胞は、した 500uM Pyrenebutyrate を前処置で 50uL 塗布した。

マウス悪性黒色腫瘍細胞で、特異的なメラニン産生能を有5 分後、Propylene glycol にて調整した候補ペプチドを各している。1well あたり 1×105 cell を撒き 37 ℃、5% CO250 uL、1 日 1 回、14 日間塗布した。その後、デルマパン下で培養した。一日培養したメラノーマ細胞に希釈した候チ（5 mm、マルホ）を用いて皮膚サンプルを採取した。

補ペプチドを添加した。72 時間後にトリプシンで剥がし、5000 rpm にて 10 分間遠心して細胞を回収した。その後、

2. 8. ヘマトキシリン・エオシン（H.E.）染色

1N 水酸化ナトリウム水溶液、80 ℃、2 時間で細胞を溶解モルモット皮膚サンプルのパラフィン切片を作製し、カさせ、マルチプレート対応スペクトロフォトメーター（DSラッチヘマトキシリン液を滴下し、5 分間静置した。洗浄し、ファーマバイオメディカル㈱）で吸光度（405nm）を測定し、エ オ シ ン 液 を 滴 下 し、30 秒 間 静 置 し た。 洗 浄 し、メラニン定量を行った。

DIGITAL SIGHT DS-U1（Nicon）で観察した。

2. 3. WST-1 assay による細胞毒性の有無の検討

2. 9. フォンタナ・マッソン染色決定したペプチドを用いて、WST-1 試薬を用いて、細モルモット皮膚サンプルのパラフィン切片を作製し、キ胞毒性の有無を検討した。1well あたり、2000cell になるシレンに 15 分間（58 ℃）、10 分間（RT）浸漬し、100% エタようにメラノーマ細胞をまき、一日培養した。実験には、

ノール、95% エタノール、90% エタノールおよび 70% エ96 穴プレートを使用した。翌日、希釈した候補ペプチドタノールを順に各 5 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、2.5%を添加し、72 時間培養した。その後、WST-1 試薬を添加し、フォンタナアンモニア銀染色液を滴下し、遮光して 16 時

30 min、60 min 後に、マルチプレート対応スペクトロフォ間静置した。蒸留水で洗浄し、0.25 % チオ硫酸ナトリウム

トメーター（DS ファーマバイオメディカル㈱）で吸光度水溶液を 1 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、ケルンエヒト（450 nm, 690 nm）を測定した。コントロールは DMSO を使

ロート液を 5 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、70% エタノ用した。

ール 90% エタノール 95% エタノール 100% エタノールを
順 に 各 1 分 間 滴 下 し た。 キ シ レ ン を 5 分 間 滴 下 し、

2. 4. 196 ペプチドのAlanine walk の検討

VECTA MOUNTTM に て 封 入 し、DIGITAL SIGHT

決定した 196 ペプチドを用いて、ペプチドの各アミノ酸DS-U1（Nicon）観察した。

を順番にアラニンに置換する Alanine walk を行った。実３．結験操作は 2. 2. 細胞内スクリーニングと同じである。

果

3. 1. 細胞内スクリーニング
2. 5. モルモットの背部にて 11R の導入の確認

黒いメラノーマ細胞が白くなっている候補ペプチドも数

11R に蛍光標識のテトラメチルローダミンを連結した2ペプチド（TMR-11R）をモルモットの背部（4 cm 区画、各種類確認することが出来た。さらにメラノーマ細胞を水酸化ナトリウムにて溶解させた後、吸光度測定（405nm）を− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

行ったところ、コントロールより低い値を示したペプチド（Fig. 4）。

は、以下の 8 種類であった。また、50% 以上のメラニン合成阻害を示したのは、196 というスポット番号のペプチド3. 3. モルモットの背部にて 11R の導入の確認であった。この配列は、小麦に存在する Gliadin というタ6 時間から 48 時間まで経時的に観察したところ、塗布ンパク質由来のペプチドである（Fig. 3）。

12 時間頃から、表皮基底層にて 11R ペプチドの導入が確認出来た。また、24、48 時間と時間が経過するごとに、

3. 2. WST-1 assay による細胞毒性の有無の検討真皮にまでペプチドが導入出来ていることが確認出来た

WST-1 assay の結果より、決定したペプチドは、コント（Fig. 5）。

ロールと比較して細胞への毒性はないことを確認した

Fig. 3Fig. 4

Fig. 5− 120 −

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3. 4. 動物モデルの検討結果

これらに共通する結論が、“チロシナーゼの活性部位にまた、PB および各薬剤によるモルモット日焼けモデル

存在する銅イオンをキレートすることで、チロシナーゼの皮膚サンプルについて、フォンタナ・マッソン染色を行っ活性を阻害している”であった。こちらは、試験管内レベた。control、11R + No.10L、No.10L-11R を塗布したサンルの報告はあるが、細胞レベルや動物レベルの応用例はな

プルでは、表層から皮膚基底層までメラニン陽性細胞が多い。その理由は、これらの Whitening ペプチドを皮膚基底数観察されたのに対し、11R-No.10L を塗布したサンプル膜にある皮膚色素細胞に送達する手段がないためである。

は、他のサンプルと比較して、メラニン陽性細胞が減少しよって、我が研究室の手法である 11R を用いて、細胞レていることを確認した（Fig. 6）。

ベルそして動物レベルにて検討を行い、さらにスクリーニ

次に、フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細ングを行った。

胞数を 10 ヶ所の視野で、統計学的に検定したところ、PB文献の試験管レベルでのスクリーニングの結果と細胞内および 11R-No.10L を塗布した皮膚において、メラニン陽スクリーニングの結果より、メラニン合成抑制効果におい性細胞数の有意な減少が見られた（Fig. 7）。て異なる結果が得られた。これは、細胞内へ導入する際に４．考

細胞膜通過ペプチド、11R を連結したことで、候補ペプチ察ドに何らかの立体構造の障害が起きたと考えられる。例え新たなペプチドをスクリーニングする際に着目したのが、ば、候補ペプチドにマイナスチャージのアミノ酸を含有しはチロシていた場合、11R の強い塩基性を持つアルギニンとの静電ナーゼの活性部位（Fig. 8）を示したもので、この活性部位を的相互作用により、アミノ酸同士が接着する可能性が示唆阻害する天然素材が報告されている。 例えば、牛乳、小麦、される。決定した 196 ペプチドにおいて、11R を N 末端とチロシナーゼ抑制に関する論文である。下図

19）

はちみつ、絹、ハエといったものが報告されている

Fig. 6

Fig. 718）。

C 末端のそれぞれに連結した場合、N 末端がメラニン合成

フォンタナ・マッソン染色結果

フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細胞数の測定結果− 121 −scale bar： 50μm

Fig. 8

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 9抑制効果を示すことも確認している。さらに、褐色モルモットを用いて、日焼けモデル動物を作製し（Fig. 9）、薬剤

Novel Transdermal Drug Delivery System, Chem BiolDrug Des , 80, 639-646, 2012

塗布の検討を行った。その後、H.E. 染色、フォンタナ・マ

９）Jan D. Bos: The 500 Dalton rule for the skin penetrationッソン染色、メラニン陽性細胞数の統計評価を行い、メラof chemical compoundsand drugs, Experimental

ニン陽性細胞の有意な減少効果を認めた。

Dermatology, 9, 165-169, 2000

本研究成果は、The transdermal inhibition of melanogenesis10）Tomasz Ciach : Buccal iontophoresis : an opportunityby a cell-membrane-permeable peptide delivery system basedfor drug delivery and metabolite monitoring, Drugon poly-arginine. Ookubo N, Michiue H, Kitamatsu M,

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