動脈硬化症を予防する食品機能成分の探索と作用機構に関する研究

塚本佐知子

熊本大学大学院生命科学研究部（薬学系） 教授

緒言

ら血管閉塞を生じ、心血管疾患の発症へとつながる。このように動脈硬化症は多段階で進行するが、本研究では日本でも、長寿社会の到来や生活習慣の欧米化により、動脈硬化、高脂血症、肥満などのメタボリックシンドロー

初めに食品の抽出物を調製し、⑤のマクロファージが泡ム（生活習慣病）が大きな社会問題になっている。特に、沫細胞へと変化する段階に着目したスクリーニングを行

虚血性心疾患や脳血管障害等の血管病変を主体とする循う（図 2）。そして、動脈硬化症の予防効果を示す機能環器疾患は、今後さらに増加することが予想され、その成分の網羅的探索を行う。さらに、得られた食品機能成予防・治療薬の開発は社会的要請が極めて高い研究課題分の標的を明らかにする（図 3）。

である。そこで、本研究では、粥状動脈硬化症（アテロー天然成分

ム性動脈硬化症）を予防する食品機能成分に関する研究[3H]-CE 蓄積を行う。動脈硬化症の初期病変過程は図１に示すとおりである。

マクロファージ

末梢単球

図 2 泡沫化阻害試験①接着内皮細胞食品

Ox-LDL④取込み 食品成分⑤泡沫細胞形成
マクロファージ

MeOH 抽出濃縮⑥プラーク（粥状硬化病変）形成③分化
血管平滑筋細胞

泡沫細胞

AcLDL

LDL

②侵入

[3H]- オレイン酸

EtOAc 層泡沫細胞

水素

図 1 動脈硬化症の初期病変過程
1. 泡沫化阻害試験
2. 阻害成分の精製
3. 阻害成分の構造決定
4. 阻害機構の解明

血管内腔に存在する末梢単球は、高コレステロール症、高血圧、喫煙、糖尿病および感染など種々の危険因子により内皮細胞が活性化されると、内皮細胞表面に接図3着する（図 1 の①）。さらに、末梢単球は内皮細胞間隙研究の概要

より内皮下に侵入して（②）
、マクロファージへと分化実験方法

する（③）
。マクロファージは、変性した LDL（Ox-LDL

1. 食品からの抽出物の調製等）を取込み（④）
、泡沫細胞を形成し（⑤）
、内部にコレステロールエステル（CE）を蓄積する。プラーク（粥22 種類の食品を MeOH 抽出し、エバポレーターで濃状動脈硬化病変）の初期には泡沫細胞が主体であるが縮後の水溶液を EtOAc で分配した。そして、それぞれ（⑥）
、粥状動脈硬化症の進展にともない、本来は中膜にの食品について EtOAc 層と水層の両方をサンプルとし存在していた血管平滑筋細胞が遊走し、泡沫細胞を囲むて用いてスクリーニングを行った。用いた食品は以下のように増殖する。やがて、プラークが破綻し血栓形成かとおりである。玉ねぎ、長ネギ、大根、りんご、みか1

塚

本

佐知子

ん、イチゴ、バナナ、紅茶、キウイ、晩白柚（皮と果肉[3H] oleic acid（5×103 dpm/nmol） を 含 む 3 % BSA-部分からサンプルをそれぞれ調製した）、キャベツ、シーPRMI 中で 24 時間培養した。その後、細胞を PBS でクヮーサー、セロリ、白菜、金柑、きゅうり、人参、に洗浄し、脂質抽出液（hexane:2-propanol, 3:2）で 30

んにくの芽、アボガド、トマト、ブルーベリー、かぼちゃ。

分間処理することにより細胞に含まれる脂質を抽出した。脂質抽出液を窒素ガスで乾固した後、100 μL の2. LDL の調製と化学修飾法

2-propanol で再懸濁した。その一部（20 μL）を標品

健常者のヒト血漿から連続遠心（36,000 rpm, 20 hr,（AcLDL）とともに TLC シートにスポットし、展開溶4℃）により LDL（d=1.019-1.063 g/mL）を分離し、直媒（hexane:diethylether:acetic acid, 90:10:1）を用い

ちに EDTA を含む生理食塩水（EDTA- 生理食塩水 ; 0.15て展開後、ヨウ素で発色させ cholesteryl [3H] oleate 部

M NaCl and 1 mM EDTA（pH 7.4））を用いて透析し分を切り取り回収した。同時に、展開しない 20 mL 分使用した。AcLDL の調製は以下のように行った。20の脂質抽出液の放射活性を測定することにより、細胞内mg の LDL に 5 mL の飽和酢酸（LDL と等量の飽和酢酸に取込まれた [3H] oleic acid 量を算出した。各々の放を加えた）を加え、その後、氷上にて穏やかに撹拌しな

射活性は、回収した TLC シートに 3.5 mL の液体シンがら無水酢酸を 20 μL 以下ずつ滴下した。次に、溶液チレーションカクテルを加えた後、液体シンチレーショを攪拌しながら氷上で 1 時間反応させ、5 N の NaOHンカウンターにて測定した。また、脂質抽出液の細胞タを滴下して pH を 6.5~7.0 に調整した。その後直ちにンパク量を BCA 法にて測定することで、
cholesteryl [3H]EDTA- 生理食塩水を用いて透析し、限界濾過法によりoleate 量の補正を行なった。すなわち、500  μL の 0.1濃縮した 。

N NaOH を脂質抽出後の細胞に加えることで細胞を可1）溶化し、その一部（50  μL）に BCA 試薬を 1 mL 加え、3. ヒト単球由来マクロファージの調製

37℃ で 30 分間保温した後、562 nm の吸光度を測定した 3）。

ヒト抹消血由来の単核球は、Ficoll 密度勾配遠心分離法（Ficoll-Paque: Amersham bioscience）を用いて結果・考察分離した。単球は平衡塩類溶液で洗浄後、Connor らの方法（4℃で凝集した単球とその他の単核球に分離する

22 種類の食品から得られた 46 種類のサンプルを用方法で低温単球凝集法とよばれている）にしたがっていて、100  μg /mL の濃度でスクリーニングを行った（図単離した 。単離した単球は、2×10 cell/mL で RPMI4）。その結果、最も強く CE の蓄積を阻害したのは、ア1640 に 再 懸 濁 し、6 cm dish に 2×10 cells、 ま た はボガドで、次いで、きゅうり、ニンニクの芽、りんご、2）6624 well plate に 2×10 cells/well（Falcon-PRIMARIA

白菜、セロリであった。そして、いずれも EtOAc 層に

dish and plate: Becton Dickinson, Franklin Lakes,活性があった。これらのうちアボガドについては、豊NJ, USA）の密度で播種した。37℃で 1 時間付着させた

富に含まれる脂質 4）の影響で、CE へと取込まれる [3H]後、培養液を 10% 非働化ヒト血清及びストレプトマイ

oleic acid の量が減少したと考えられる。また、きゅうシン硫酸塩（0.1 mg/mL）とペニシリン G（100 units/りにはトリテルペンが豊富に含まれていることが既に報mL）を添加した RPMI 1640（glucose または mannitol

告されている。5,6）そして、植物に含まれるトリテルペを含む）に交換した。その後、培養液は 3 日毎に交換し、ンが CE の蓄積を阻害し、さらに動脈硬化を自然発症す7~10 間培養したものをヒト単球マクロファージとしてる粥状動脈硬化症モデルである ApoE 欠損マウスに経実験に使用した。細胞は 5% CO2 存在下、37℃で培養口投与すると、動物レベルで動脈硬化症の改善作用が認した。

められることが明らかとなっているので 7,8）、きゅうり

5抽出物に含まれる CE 蓄積阻害成分はトリテルペンであ4. [3H] Oleic acid を用いた細胞内コレステロールエる可能性が高い。一方、りんごにもトリテルペンが豊富

ステル（CE）蓄積量の測定に含まれているが 9）、りんごのポリフェノールや繊維が調製したヒト単球由来マクロファージを、24 well

ApoE 欠損マウスの動脈硬化症を改善するという知見もplates に 播 種 し 分 化 さ せ た 後、100  μg /mL の サ ン

既に報告されている 10）。そこで、私たちは、白菜とセプ ル 存 在 下 で、50  μg /mL の AcLDL お よ び 0.1 mM

ロリを研究対象として CE 蓄積阻害成分を探索し、それ2

動脈硬化症を予防する食品機能成分の探索と作用機構に関する研究

200

180160[ 3 H] CE accumulation（% of control）

14012010080604020

Non Load
AcLDL
玉ねぎ E
玉ねぎ W
長ネギ E
長ネギ W
大根 E
大根 W
りんご E
りんご W
みかん E
みかん W
イチゴ E
イチゴ W
バナナ E
バナナ W
紅茶 E
紅茶 W
キウイ E
キウイ W
晩白柚（皮）E
晩白柚（皮）W
晩白柚（果実）E
晩白柚（果実）Wキャベツ E
キャベツ Wシークヮーサー Eシークヮーサー W
セロリ E
セロリ W
白菓 E
白菓 W
金柑 E
金柑 W
きゅうり E
きゅうり W
人参 E
人参 W
にんにくの芽 E
にんにくの芽 W
アボガド E
アボガド
トマト E
トマト W
ブルーベリー E
ブルーベリー W
かぼちゃ E
かぼちゃ W0

図 4 食品の抽出物（100μg / mL）を用いた泡沫化阻害試験（E, EtOAc 層 ; W, 水層）

要ら成分の標的を明らかにする研究に着手した。

約

初めに白菜 3 個およびセロリ 10 束（1 kg）から得ら

本研究では、粥状動脈硬化症（アテローム性動脈硬化れた MeOH 抽出物を用いて、CE 蓄積阻害作用を指標症）を予防・改善する食品機能成分に関する研究を行っとして分画を行った。その結果、両方のサンプルにおいた。動脈硬化症は多段階で進行するが、本研究においてて、比較的多くの成分が目的の作用を示しているというは、マクロファージが泡沫細胞へと変化する段階に着目知見が得られた。そのため、初めに抽出した量では目的したスクリーニングを行った。そして、スクリーニングの成分を明らかにすることは困難と考えられたので、現した 22 種類の食品の中から、コレステロールエステル

在さらに白菜を 20 個、セロリを 10 kg 抽出して成分の（CE）の蓄積を顕著に阻害した白菜とセロリを用いて阻精製を行っている。また、成分の精製と並行して、白菜害成分の探索を行うこととした。白菜とセロリから既にとセロリの抽出物そのものを ApoE 欠損マウスに経口いくつかの阻害成分を精製したが、得られた量が少な投与し、病態の改善効果が認められるかどうかを調べる。

かったので、さらに白菜とセロリの量を増やして成分の精製を行っている。
3

塚謝

本佐知子

辞5）K. Akiyama, et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 762769, 2002.
6）H. Kai, et al.: Chem. Pharm. Bull. 55, 133-136,2007.
7）Y. Fujiwara, et al.: Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 27,2400-2406, 2007.
8）Y. Fujiwara, et al.: J. Agric. Food Chem. 59, 4544-4552,
2011.
9）H. Xiangjiu, et al.: J. Agric. Food Chem. 55, 4366-4370,
2007.
10）S. Auclair, et al.: J. Agric. Food Chem. 56, 5558-5563,
2008.

本研究の遂行のため、公益財団法人三島海雲記念財団により研究助成を賜りましたことを深く感謝申し上げます。
文献1）A. Miyazaki, et al.: J. Biol. Chem. 269, 5264-5269,
1991.
2）R.I. Connor, et al.: J. Immunol. 145, 1483-1489, 1990.
3）A. Miyazaki, et al.: Biochim. Biophys. Acta. 1082, 143151, 1991.
4）D. Kritchevsky, et al.: J. Am. Coll. Nutr. 22, 52-55,
2003.

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