ごあいさつ
化粧品学（コスメトロジ ー ）の確立と発展を活動の目的として設立されました当財団も7年目を迎えることになりました。 この間に6回の研究助成等を行うとともに、 今回 4 号目の研究報告を発行できる運びとなりました。 これもひとえに、 多くの皆様からいただいた暖かいご支援ご協
カの賜であると心から感謝申し上げる次第でございます。
なお咋年 7 月 22 日、 当財団の設立者であり理事長でありました小林孝
三郎氏が脳梗塞のために、 満 98 歳で逝去されました。 氏は明治 45年、 わ
ずか 14 歳の若さで化粧品業界に身をおいて以来、 98 歳まで現役として化粧品ひとすじに歩んで来ただけに、 誰よりもコスメトロジ ー の進展を気にかけておりました。 当財団の活動をさらに充実させていくことが、 個人の遺志に報いることだと考えております。
今回、 本誌に発表させていただきます20 題の研究報告も、 素材・物性
分野から生体作用• 安全性分野、 精神・文化分野までコスメトロシ ー の課題の広がりと深さが感じられる、 いずれも素晴らしい研究成果でございます。 また、 惜しくも選に漏れた課題も膨大な数であり、 その中にもたくさんの優れたテ ー マと研究成果がありました。
このことは、 当財団の活動が多くの若手研究者の方々から高い関心を寄せられている証左であろうと存じます。 これからも、 皆様のご協力を仰ぎまして、 小林孝三郎氏が夢に描いておりました化粧品学（コスメトロジ ー ）のさらなる発展、 進歩のために着実な研究振興活動を推進してまいる所存でございます。
今後とも当財団の活動をご支援くださいますよう心からお願い申し上げます。
平成 8 年 9 月
財団法人

コスメトロジ ー 研究振典財団
理事長

小林

橙次郎

目

次

ごあいさつ
● 研究報告I. 素材， 物性に関する分野• 亜鉛スルホフタロシアニンを利用した光化学治療....•................ .......................•......

東京工業大学生命理工学部
・ヒト血清アルプミン加水分解物由来のテトラペプチドによる
ビタ ミ ンEの抗酸化能の向上 ・・・・・・

大倉

一郎

2

，

水産大学校 幡手 英雄
・層状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による有機色素のカプセル化 ・・・………••• …………

15

早稲田大学理工学部 菅原 義之
・ハ ー ダ ー 腺の分泌するアルキルジアシルグリセロ ー ルの物性解明とその素材としての応用開発 ………………………

21

東京大学医学部 脊山 洋右·植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特にForskolin原料植物Colet1s forslro.カIiiについて一 ... ………...............

28

九州大学薬学部

正山

征洋
・・……·

• 弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、 物性、 機能に関する研究
九州大学理学部

甲斐原

37

梢

…………………

45

京都大学工学部 伊藤 嘉浩
・遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸T ー リノレン酸の
高等植物における多量生産 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・·

50• バイオシグナル分子を固定化し た細胞成長促進ハイプリッド材料の合成

九州大学理学部

II . 生体作用． 安全性に関する分野
・フリ ー ラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の

射

厚

場

………... ……· ・・・・・・・・...…

58

勇
国立公衆衛生院労働衛生学部 市 川…………...
………………
効果
対阻傷害
射)の紫外線照に する
皮• 還元型ネオプテリン(NPH466

老化機構解明に関する基礎的研究

東京理科大学生命科学研究所 ;Jヽ島 周二
・哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究 •••………………

77

一・皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の 開発也
九州大学理学部 野村…...... …...... ………......... …………...

京都大学薬学部 橋• リポソーム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮屑内ラジカル消去への応用
九州大学薬学部田充.. …•……... ...

内海

英雄

84
94

・表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝達:
天疱癒 IgG 誘導表皮細胞間接着離開とカルシウムシグナル伝達

・・・••• ………………………… 103

岐阜大学医学部北島 康雄
・・・・・・・・・・・・••• ………………... ...

• 微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

東京工業大学生命理工学部中・皮膚発現型レチノイン醗受容体のドミナント ー ネガティブ

村

1 09

聡

………………...

118

京都大学医学部田中 俊宏の• 化粧が高温環境下 発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影響 ………............... ......

122

金沢大学医学部田 辺実.................. ...................... .................

130

トランスジェニックマウスを用いた皮膚の成熟過程の検討

・サンスクリーン剤の光Iヽプテンとしての性格

浜松医科大学戸倉
皿精神 ， 文化に関する分野• 色彩の心理学的意味空間の研究

新樹...... . ............................. .................................... ...

136

金沢大学文学部岡本 安晴•.. ……........................ … ・・・・・・・・・・・·
操
福島大学教育学部飛田115• 化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究● 記念講演平成7年度記念講演● コスメトロジー研究雑感
● 付

：：��
録

・・・・・・・・・・・・・・・・ ••• •..•..••. •.•...••. •.•... •. •.... ..
· ·
· ·
·
北星学園大学文学部大坊 郁夫

161...... ... ............ ... ............ ...... ................ ................. ... .........

173

化粧とコミュニケーション.. ... . .. ... ... ... ... ... .. .
. ... ..
. ..
···-亨□門 · · · - · · - · · · · · - · · .
· · · · - - · - · · .- · · - · · - - · - ·.- · ·. - · · · - · · - -. ..
・・.. ... ... ... ... ... . .. .. ... ... ... . .. . .. . .. . .. . .. .. . . .. ... ... ..... ... ... ... .. .. ... ... . . ..

研究助成課題一覧.................. .................. .............................. ............................

�:;

197

． ．

研究報告
I

素材、 物性に関する分野

II

生体作用、 安全性に関する分野

III

精神、 文化に関する分野

r）I . 索材，物性に関する分野

1,亜鉛ス）レホフタロシアニンを利用した光化学治療
東京工業大学大倉生命理工学部一郎

Water-soluble zinc phthalocyanines substituted with different number of sulfonic acidgroups were synthesized. ZnSPcm,x was readily incorporated in HeLa cells. Irradiation of
HeLa cells with ZnSPCmix resulted in cell damaged.
The cellular morphological changes due to irradiation were observed using SEM.

1緒 言

吸光係数が大きい。 一 例として亜鉛テトラスルホ
フタロシアニンの吸収スペクトルを図lに示す。

腫瘍集積性光増感剤を、あらかじめ癌患者に投図には比較のためHpDの吸収スペクトルも点線で光照射により 癌を治療す示してある。図のように フタロ シアニンはポルる、いわゆる光化学療法においては、副作用の少フィリンと異なり長波長領域における吸光係数がない光増感剤の開発が切望されている。光化学療

大きく、深部の癌に対して有用であることが期待

法用光増感剤としては、次の要素を備えていることが必要である。

される。さらに腫瘍組織への集積性もよく I) 、光照射に対して安定であることから、光化学治療用

1)光化学的に安定である。

の新しい感光色素としての期待は大きい。

与し 、その後レーザー

フタロシアニンは中心金属や側鎖を変えること

2)腫瘍選択性が高い。
3)光を照射しなければ細胞に無害である。
4)組織透過性のよい長波長領域(600-800nm)

により様々な種類のフタロシアニンが合成されている 2 -7) 。とくに、アルミニウムや亜鉛を中心金の吸光係数が大きい。
5)励起三重項状態の寿命が長い。
現在、光化学治療用光増感剤の内、 ヘ マトボル
かし、この化合物は組織透過性のよい長波長領域

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＼
l

゜

Photodynamic Therapy by SulfonatedZinc Phthalocyanines

＼ ＼

＼
｀

と類似しているが組織透過性のよい長波長領域の＼フタロシアニンは化学構造的にはポルフィリン

5

なりやすいなどいくつかの問題点がある。

―ZnTSPc········HpD＼／

CIJ:JU8 QJO SQ'v'の吸光係数が小さい。合併症として日光過敏症にf゜

フィリン誘導体が、臨床的に使用されている。し

700

400

lchiro Okura

Wavelength / nm

Faculty of Bioscienceand Biotechnology
Tokyo Institute Technology

図1

-2-

亜鉛テトラスルフォタロシニアン（構造を図2 に示す 。 ZnTSPc) とHpDの吸収スペクトル

亜鉛スルホフタロシアニンを利用した光化学冶療

HPLCによりこれらスルホ基数の異なる化合物の属とするフタロシアニンは光照射に対して安定であり、 光励起三重項寿命が、 他のフタロシアニン

完全分離を試みたが、 完全には単独物質が得られに比べて長いことから、 これらのフタロシアニン

なかったので、亜鉛テトラスルホフタロシアニンが有効であると考えられている。 フタロシアニン（スルホ基数4個の化合物、 ZnTSPcと略記する）とを水溶性にするには側鎖をスルホン化するか、カそれ以外の化合物（スルホ基数1�3 の混合物で平ルボキシル化することが行われる。 とくにスルホ

均スルホ基数2. 3 のものを ZnTSPcm ,, と略記する）

基の結合したフタロシアニンは抗腫瘍活性が高いとに分離し， それぞれについて光化学的挙動と光といわれている 8) 。

化学的治療効果とを比較検討した。

そこで本研究では、中心金属として亜鉛を、 側細胞は、 MH134細胞をマウス腹腔中にて継代培鎖としてスルホ基数が異なるフタロシアニンを合養したもの、 及ぴ対数増殖期にあるHeLa細胞を用成し、その光化学的性質を調べるとともに光化学いた。 培地は GIBCO社製F-10培地をそのまま用い治療における効果を検討した。

た。

2

実

2. 2

験

フタロシアニンの細胞への取り込み

フタロシアニンの細胞への取り込みにはHeLa細
―

2. 1

試

胞を用いた。 フタロシアニンを濃度4xl0 6 1,1とな

薬るように培地に溶解し、この溶液をHeLa 細胞と亜鉛スルホフタロシアニンは、胃 eber らの方法

30 分間接触させた。 培地で細胞を洗浄した後、 アを改良して合成した 9 . I O) 。 構造を図2に示す。 ス

ルカリ水溶液で細胞を破壊し、 蛍光の励起スペク

ルホ基数の異なる亜鉛フタロシアニンは原料化合トルを測定することにより取り込み量を求めた。

物のモル比を変えることにより調製した。

図3は、殺細胞効果に関する実験方法を示したフロ ー チャ ー トである。 まずHeLa細胞をシャ ー レで培養し、その後シャ ー レより培地を抜き取り、 所定の濃度に調整したフタロシアニンの入った培地と交換する。 30 分間インキュベ ー トすることにより、フタロシアニンをHeLa細胞に取り込ませた。
その後、 培地で洗浄し、 レ ー ザ ー 光照射を行った。 レ ー ザ ー 光照射には、アルゴンレ ー ザ ー 励起

DCM色素レ ー ザ ー を用いた。 波長は 680nm 、 出力
は 100m渭/c耐である。 殺細胞効果の判定には、 光
照射後4時間経過したところでトリパンプル ー 染
色を用いて行った。 また、 細胞の形態変化は、 走43.

図2亜鉛フタロシアニンの構造
1:亜鉛モノスルホフタロシアニン
2:亜鉛ジスルホフタロシアニン
3:亜鉛トリスルホフタロシアニン
4亜鉛テトラスルホフタロシアニン

査電子顕微鏡を用いて観察した。
固形腫瘍としては C3H/He 系マウスの側腹部皮下に肝癌由来の M:Hl34 細胞を移植し、 大きさが直経
約 10mmになった固形腫瘍を用いた。 腫瘍び各臓器（肺、 腎、 牌、 肝）における ZnTSPc濃度の経時変化を測定するために、 15mg/kg の ZnTSPc をマウス

(ZnTSPc)

腹腔内に投与した。 ZnTSPc投与2、 4、 6、 12、 24、

ZnSPC m ; 真は1, 2, 3の混合物-3-冒比-�,--,

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700

00
l

図4 ZnTSPcの吸収スベクトル
ZnTSPc濃度： 2. 8 X 10 ― '·mol·dm-•
トリトンX100 、 なし(1) 、 1 (2) 、2 (3) 、 4(4) 、 10(5)

'ゞミ

:4 h

◇i

T.B. staining

600

Wavelength / nm

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Aftcr4

500

oU

ー.gm

n
↓c

が解離して単量体になったためと考えられる。 後＾

fixa1;0", Dchydra110"

述するように細胞に取り込まれたフタロシアニン

SEM Observallonは単量体で存在し、細胞は界面活性剤の添加と同様の効果を示す。

図3 殺細胞効果に関する実験方法のフロ ー チャ ー ト

励起三重項寿命の測定は次の様にして行った。

48時間後に屠殺し、ホモジネイト後腫瘍および各

界面活性剤を含む生理食塩水(TritonX-100; 10%)臓器の蛍光強度を測定した。

にフタロシアニンを溶解し、凍結脱気を5回行い、三重項寿命測定用の試料とした。測定にはYAGレ

3

結果および考察ーザ ー 励起DCM色素レ ー ザ ー （波長680nm)を使用した。その結果、ZnTSPc、ZnSPCm ixいづれも三重
3. 1

吸収スペクトルおよび励起三重項寿命

項寿命は約250応であった。

ZnTSPcの吸収スペクトルは図4に示すように
3. 2

636nm付近に極大吸収を有する。これは、 フタロ

蛍光スペクトル

シアニンの 会 合 体の吸収スペクトルであり、励起波長610nmにおける蛍光スペクトルを図5にZnTSPcは水溶液中で 会合体になっていることを示示す。ZnTSPc水溶液ではほとんど蛍光スペクトルしている。この会合体は光励起寿命が短く、光化が測定されず、会合状態では蛍光がほとんど観測

学治療には不適当である。この水溶液に、中性のされないことがわかる。トリトンX-100を添加す

界面活性剤であるトリトンX-100を添加すると、ると、690nm付近に強い蛍光が観測され、ZnTSPc

吸収スペクトルは2-4の様に変化し、トリトン

が単量体として存在すると強い蛍光が得られるこX-100澄度が10%のときに、5の吸収スペクトルとがわかる。また、図5-BはMH134細胞にZnTSPcをとなった。界面活性剤の濃度を増大させるに従い、取り込ませた前後における蛍光の差スペクトルで636nmの吸収強度が減少し、678runの吸収強度が増ある。図5-Aと比較すると、ZnTSPcは細胞内では加した。これは、界面活性剤の添加により会合体

単量体として存在していることが分かる。

-4-

亜鉛スルホフタロシアニンを利用した光化学冶療

Em. wavelength: 730nm＼

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Difference spectrumof mouse tumor cells

600

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ノ

650

700

Wavelength / nm
図6フタロシアニンの励起スベクトルによる
Hela細胞への取込み量の比較
ZnSPcm,,: 実線 ZnTSPc: 破線
投与 12 時間後で蛍光強度が 最高値を示した。 また腫瘍は 10-24 時間の間、各臓器より も高値であっ

650

700

750

た。

800

ZnTSPc の排泄はきわめて早く、投与30分後には尿Wavelength / nm

中に認められている。 この様に ZnTSPcは、 腫瘍集

図5 ZnTSPcの蛍光(A)およびマウスMH134細胞に
ZnTSPcを取り込ませた前後における蛍光スペクトル(B)

積性が高 く、 腫瘍集積に要する 時間が非常に 短い。 ヒトヘのZnTSPc 応用においても この状況か当ては まるなら、 感光剤投与か ら治療開始までの時
間短縮に大いに貢献するも のと思われる。

3. 3細胞への取り込み
乙,suaiu―① ::>U80S8J0nl
LL

細胞へのフタロシアニンの取り込みは フタロシ
アニンの励起スペクトルを 測定することにより行った。 結果を図6に示す。 実線は ZnSPcm,x 、 破線は ZnTSPc の場合 で ある。 両者を比較する と

ZnSPc m 心 が ZnTSPcに比べ、 はるかに細胞によく 取り込ま れていることが分かる。
固形腫瘍を用いた場合、 マウス腫瘍の蛍光強度
は投与 12 時間後に最 大 となり、 これ以降 24 時間まで の 間は各 臓 器 より高い 値 を保っ た 。 図7にZnTSPc投与 12 時間後 の腫瘍およぴ各臓器 の蛍光ス
ペクトルを、 図8に経時的な蛍光強度 の変化を示す。 固形腫瘍およぴ各臓器におけるZnTSPc の取り

図7 C3Hマウス各細胞におけるZnTSPcの蛍光スペクトルZnTSPc取込み12時間後に測定込み の測定において、 腫瘍を含むすべて の臓器は

-5-

゜

.::1
on1
u1aouaosaJ
全 suai40

20

Time/ h

図8 CJHマウス各組織におけるZnTSPcの蛍光強度

3.4

殺細胞効果

表lに、 殺細胞効果に対する照射エネルギ ー 依
存性およびフタロシアニンの濃度依存性を示す。
表中の数字はトリパンプル ー の被染色率を表し、数字が大きいほどよく死滅していることを示している。ZnTSPcでは、4. Q X 10
射エネルギ

ー

表1

―s

vの浪度のとき、 照が減少するに伴い、 殺細胞効果が滅PDT後のトリバンプル ー 染色
濃度/M
40x!O_. 40x!0-7

照射エネルギー
40x 10ふ/J・cm·2
ZnTSPc 15
100
91
3
30
ZnSPCmtx 15
3

100
100
100

゜゜
゜

゜゜
゜

JOO

100
100
90

100
100

4.0x!O.,゜゜゜

単位：被染色率／％表2 光照射による溶血率
接触液
ZnTSPcZnSPCmix
ZnTSPcZnSPCmix

（無）
(無）
（有）
(有）

23
2.4
2.7
8.2

1時間後
36
4.5
65
90

5時間後
5.0
6.5
10
95<
（単位％）

図9 SEMによるHela細胞の形態観察
a: 光照射前のHela細胞
b:ZnTSPcを用い光照射後のHela細胞
c:ZnSPc m ,, を用い光照射後のHela細胞-6-亜鉛スルホフクロシアニンを利用した光化学冶療

少している。 また、4. 0 X 10-6lif以下の濃度では、

低い浪度、 より低いエネルギ ー においても、優れた殺細胞効果を示すことがわかった。 電子顕微鏡

殺細胞効果が認められなかった。 これに対し、

ZnSPcm ,xを用いた場合には4.0x10-1Mの浪度までによる細胞の致死過程の形態学的観察（図9)、

および溶血実験の結果から、ZnSPc m 1xのおもな作

は照射エネルギ ーに関係なく、強い殺細胞効果を示すことがわかった。 これは、ZnSPc m ,xの方がよ

用部位は細胞膜であり、光照射により細胞膜が大り細胞に取り込まれやすいためと思われる。

きなダメ ー ジを受けるものと思われる。

ZnSPcm 心の方がより低い濃度、 および、より低い
エネルギ ー でも、優れた殺細胞効果を示すことが文

以上により、ZnTSPcとZnSPc m ,xとの比較では

献

1)西坂

他：水溶性亜鉛フタロシアニンを利用した光化学療法の研究(IV)ZnTSPc の臓

判明した。

剛

器集積性について， 日本レ ー ザ ー 医学会誌

997-99 1989

3. 5 光溶血反応

細胞膜のモデルとしてヒト赤血球を用いた光照

2) J. E. van Lier, N. Brasseur, B. Paquete,

こせば、細胞膜が破壊されていることが示唆されRousseau: Phthalocyanines as Sensitizers

したフタロシアニンとを接触させ、洗浄した後、AS! Ser. Hl5435-444 1988

J.

射の実験を行った。 この実験で赤血球が溶血を起R. Wagner, H. Ali, R. Langlois and J.

゜

for Photodynamic Therapy of Cancer. #Ali

る。 実験は、赤血球浮遊液と、生理食塩水に溶解

3) J. R. Wagner,

再懸濁させて光照射を行った。 照射光として、アルゴンレ ー ザ ー 励起DCM色素レ ー ザ ー を用い（波H. Ali, R. Langlois, N. B

rasseur and J. E. van Lier: Biolofica

Activities of Phthalocyanines-IV. Photo

長は680nmである）。 所定時間経過後、遠心分離を行い、 上澄みの吸光度を測定した。 観測は長は415nmである。

oxidation of L-Tryptophan by Selectively

したときの吸光度を100%とした割合で示してあAggregation.

S ulfonated Gallium Phthalocyanine:

Singlet Oxygen Yields and Effect of

結果を表2に示す。 表中の数字は、完全に溶血Photochem. Photobiol.

45587-594 1987
4)N. Brasseu, H. Ali, R. Langlois and J. E.

る。 この結果より、赤血球は、ZnSPcm ,xと接触させ、光照射を行った場合にのみ1時間後に90%、

van Lier:Biological Activities of Phtha­

5時間後には95%以上の溶血を起こすことが判明

locyanines-VII. Photoinactivation of

した。

V-79 Chinese Hamster cells by Selecti­

4

総vely Sulfonated Gallium Phthaloyanines.

肋otoc/Jem. P/Jotobl"ol. 46739-744 1987
5)B. Paquette, H. Ali, R. Langlois and J.

括

E. van Lier : Biological Activities of

本研究では、 スルホ基数の異なる亜鉛フタロシ
アニンを合成し、光化学療法における有用性を検

Pthalocyanines-VDI,Cellular Distribution

in V -79 Chinese Hamster Cells and Photo

討した。 蛍光分析の結果から、フタロシアニンは-toxicity of Selectively S ulfo natedAluminium Phthalocyanines, P,カotochem.

細胞内では単量体として存在し、ZnSPc m ,,方がZnTSPcよりも効果的に細胞に取り込まれているこ

Photobiol. 47215-220 1988
6)N. Brasseur, H. Ali, R. Langlois and J.

とが判明した。
殺細胞効果の比較では、ZnSPcm ,,の方が、より-7-

E. van Lier: Biological Activities of

Rosenthal : Synthesis and Photocytotoxi­of V-79 Chinese Hamster Cells and EMT-6

nines. 肪otoc/Je夙 肋otobiol.

city of Some New Substituted Phthalocya­

Phthalocyanines-VI. Photosensitization

Mouse Mammary Tumor by Selectively Sul­fonated Zinc Phthalocyanines. P,力otoche.夙

肋otobiol. 47705-711 1988
7)H. Ali, R.Langlois, J. R. 渭agner, N.

19899) J. H. 胃eber and D. H. Busch: Complexes
Derved from Strong Field Ligands. XVI.

Magnetic Properties of Transition Metal
Derivatived of 4 4 , 4''. 4'''-Tetra-

Brasseur,B Paquette and J.E.van Lier:

sulfo phthalocyanine, lnorg. Che尻 4 469

Biological Activities of Phthalocyanines-X. Syntheses and Analyses of Sulfonated.

Phthalocyanines. Photoc力em. Photobiol.

47 713-717 1988
8) C. C. Leznoff, S. Vigh, P. I. Svirskaya, S.

49 279-284-471 1965

10) T. Nishisaka, H. Nanasawa, Y.Sakuma andI. Okura : Photodynamic Therapy by Zinchthalocyanine、as Tumor Localizer, 日本
レ ー サ ー 医学会誌， 1311-15 1992

Greenberg, D. M. Drew, E. Ben Hur and I.

-8-

ヒト血清アルブミン加水分解物由来のテトラペプチドによるビタミンEの抗酸化能の向上
水産大学校

幡

手

英

雄

Antioxidative substances play an important role in depression of undesirable oxidat10n m
biological systems as well as in food processing. Although synthetic antioxidants such as
butylated hydroxytoluene are effective for preventing lipid peroxidatione, their safety has beenquestioned. Therefore, many researchers have been screening for useful antioxidants fromvarious natural materials. At present, vitamin E (a -tocopherol) is widely used as a safe natural
antioxidan. Furthermore, it has been demonstrated that peptides from various proteins, such as
soybean protein, sardine myofibril protein, and bovine serum albumin, enhanced the antioxidative
activity of a-tocopherol (Toc). These results suggest that peptides, which are produced
metabolically and incorporated dietetical!y, will serve as an effective synergist in biologicalsystems. Namely, these peptides are supposed to protect in vivo lipid peroxidation in cooperation
with antioxidants such as tocopherols. Nevertheless, the investigation on the synergisms of
peptides originated from human serum albumin (RSA) is not made yet.
In the present study, S-carboxymethylated RSA (CM-RSA) was employed for the
preparation of synergistic peptide, instead of the intact RSA, because the disulfide bridges in the
RSA molecule seemed to prevent the proteolytic digestion. The CM-RSA treated with pepsin
showed strong synergistic effect towards Toc. From the resulting hydrolysates a peptide, having
a strong synergism, was successfully separated by chromatography on a Sephadex G-25 column,
and then high-performance liquid chromatography on an ODS column. This peptide, designatedas HSA-H-5, was again hydrolyzed with a lysyl endopeptidase to give two peptide fragments.
Each fragment thus isolated was tested for its synergistic effect with Toc, and it was found that
one fragment had a potent synergism comparable to the original peptide, HSA-H-5, but the otherone had little effect. The structure of that active fragment was confirmed as the tetrapeptide,
Leu-Gln-Ris-Lys, by amino acid analysis and sequence determination. In addition, HSA-H-5
and the active fragment corresponded to the amino acid residues 103 to 112 and 103 to 106 of RSA,
respectively. Although the role of that active fragment in the HSA was not apparent, it composedof only five amino acid residues. Therefore, it will be advantageous not only for the application
as a useful synergist but also for the elucidation of unknown synergistic mechanism of peptide
synergists

1

緒

言

老化色素さらには皮膚癌との関連が指摘され、 重要な問題になっている。 一 方、 脂質酸化の防止に

過酸化脂質は食品の品質劣化を引き起こすだけ使用されてきた合成抗酸化剤に関して、 発癌作用でなく、 様々な疾病、 老化あるいは発癌などにもなど人体に対する悪影響が報告され、 一 部の合成

関与している。 コスメトロジ

一分野においても紫抗酸化剤の使用が禁止されたり、 使用量が制限さ

外線による活性酸素（フリラジカル）の発生とれる傾向にある。 このような状況から、 様々な分ー

野でこれら過酸化脂質の生成を抑制できる抗酸化性物質の開発が期待されている。 しかし、新たにEnhancement of Antioxidative Acti­
vity of Vitamin E using Tetrapeptide
Derived from Human Serum Albumin

開発された抗酸化性物質の多くは毒性や有効性の点で不充分なもの が 多 く 、 現在もビタミンE(a-トコフェロ — ル； Toe)が抗酸化剤として汎用

Hydrolysates

されているのが実状である。 したがって、新規抗Hideo Hatate
ぷ

酸化剤の探索と同様に、 既存の抗酸化剤の能力をNational Fisheries University

高める物質、 すなわちシナ ー ジストの開発は重要

-9-

た。

な研究課題である。 シナ ー ジストは様々な物質 に存在しており、各種タンパク質の加水分解物も抗2. 3

酸化剤と強い相乗効果をもつことが報告されてい

CM-HSAの加水分解物の調製

CM-HSAを0. 02M HClに 0. 5% (w/v)となるようる 1 -6) 。 筆者は、人体の基本的構成分であり生体に 受け入れやすいヒト血清アルプミン(HSA)をに溶解し、 沸騰水浴中で5分間加熱処理した。 こ

原料とし、 毒性のない有効なペプチ ド シナ ー ジスの0. 5%CM-HSA溶液にペプシンを100: 1 (HSA; 酵トの開発を試みた。 その結果、HSAのプロテ ー ゼ

素、w/w)の割合で添加し、37℃で 9時間酵素反応

処 理に よって生 成 さ れ た各 種の 加 水 分 解物させた。 反応終了後、 沸騰水浴中で5分間加熱し、(HSA-H)は、 予想どおりToeに 対して 強い相乗効

酵素を失活させてCM-HSAの加水分解物(CM-HSA­

果を発現した。 しかし、 生成されたペプチドの分H)を調製した。

子サイズが大きく、 しかも多種類であったために2.4

有効なペプチドシナ ージストの構造解明にはいた

s-s結合をCM-HSA-HのセファデックスG-25による分離

CM-HSA-Hを遠心分離した後 、 こ の上澄液をらなかった。 そこで、 本研究ではHSAの―3

M HC 1を溶出剤とし てセファデック ス

あらかじめ切断して酵素分解を受け易くした還元

1X10

カルボキシルメチル化HSA(CM-HSA)を原料タン

G-25(Super fine)カラム(2. 2cm x 111.5 cm)

パク質 とした。 その結果、 Toeと強い相乗効果をで分画した（流速0.3ml/min)。
なお、 本研究ではペプチド量は、254nmの吸光もつテトラペプチドが分離されたので以下に報告

度あるいはTNBS法 ” で定量したアミノ基量 で評価

する。

した。
2

実

験
2. 5

2. 1

薬

品

CM-HSA-Hの高速液体クロマトグラフィ ー(HPLC)による分離

リノ ー ル 酸（和光純薬製）、HSA (シグマ社製）、

各種ペプチドは胃akosil 5Cl8-200T カラム

ペプシン（プタ胃粘膜、シグマ社製）、 リシル エ(4.6mm X 250mm、 和光純薬製）または TSKg 釦

ンドペプチダゼ(LEP、 和光純薬製）、Toe (和ODS-80Ts(4.6mm x 250mm、 東 ‘ノ ー 製）を用 い七

光純薬製）、2、4、6ー トリニトロベンゼンスルホ

HPLC分析した（検出波長220nm)。 溶出剤と してン酸ナトリウム塩2水和物(TNBS、和光純薬製） 、は0.1 %トリフルオロ酢酸を含む水とアセトニト

ジチオトレイト ル（和光純薬製）。 その他、 高リルの混合液を使用した（流速 0.5 ml/min)。

ーー

純度の市販試薬をそのまま使用した。
2.6
2. 2

HPLCで 分離した有効なペプチドを、LEPで 0. lM

CM-HSAの調製—

0. SMトリス 塩酸緩衝液(pH 8. 5)に 0. 5%(w/v)となるようにHSAを溶解した。 この0. 5%
HSA溶液1ml当たりにジチオトレイトペプチドのLEPによる断片化ーTris-HCl緩衝溶液( pH9. 0)中で、37℃、 3時間加水分解処理して断片化した。

ル3mgを加2. 7

え、 容器内の空気を窒素で置換して室温で2時間

各種ペプチドとToeとの相乗効果の測定

リノ ール酪の最終濃度が2.ox10-31,1になるよう還元した。 還元後、 このHSA溶液1ml当たり、 ヨ ーに、 エ タノ ー ル 2ml、

ド酢酸7.5mgを加え暗所で30分間反応させた。 反0 . 05Mリン酸緩衝液

応終了後、暗所で脱イオン水に対して充分に透析(pH7.0) 2m l、 蒸留水 1mlの混合液を酸化モデルした。 透析内液を凍結乾燥してCM-HSAを調製し系として設定 した。 Toe(50µg)との相乗効果を-10-ヒト血清アルプミン加水分解物由来のテトラベプチドによるビタミンEの抗酸化能の向上

判定するときは、各種 ペ プチド溶液の添加量に応た。このCM-HSA-Hの分離パターンは、還元処理さじてこの酸化モデル系から蒸留水の量を滅じ、 全

れていないHSAを ペ プシン処理して同様に調製し量は常に5mlとした。これをネジ付試験管(20mmた加水分解物の分離パタ ー ンとは多少異なっていXl25mm)で密栓し、60℃の暗所で自動酸化させた。 しかしながら 、強い相乗効果をもつ ペ プチド

ル酸の陸化の程度は、チオシアン酸鉄（画分A)は両者ともほぼ同じ位置に溶出されてお法 . 4) で経日的に測定し、過酸化物価がlOOmeq/

り、CM-HSA-HとHSA-Hに存在する有用 な ペ プチド

kgに達するのに要する日数（誘導期）でToeとのシナ ー ジストが同様あるいは類似の物質であるこ

相乗効果の強さを評価した。

とが示唆された。

2. 8

3. 2

た。 リノ

ー

3

ペプチドのアミノ酸分析およびその配列

CM-HSA-Hからのペプチドシナージストの分離

決定
HClで110℃、24時

Fig. 1に示した強い相乗効果をもつ画分Aを回収

間加水分解し、アミノ酸自動分析計でアミノ酸組し、凍結乾燥して濃縮した。画分A中に存在する

また 、 ペ プチドのアミノ酸配列をToeと強い相乗効果をもつ ペ プチドを単離するた常法により、 ペ プチドを6N成を調べた。

果40

E u ozz :ie a�ueqJosqv

および各画分とToeとの相乗効果ペプシンで37℃ 、9時間加水分解して調製されたCM-HSA-HをセファデックスG-25で分離し、各画分 0. 1mlのToeとの相乗効果を検討した。Fig. 1に示すように、試験管番号23から42の範囲で相乗効果が認められた。その画分中で相対的に少ない ペ

20 0

CM-HSA廿のセファデックスG-25による分離

．

3. 1

結

)\f
察 ）iJl!
UOlil
Jl!

3

＿
一
＿

めに逆相カラムによるHPLC分析を行った。

Edman分解法を用いた自動分析装置で決定した。

プチドの溶出量であるにもかかわらず、強い相乗10効果をもつ一 群のペプチド（画分A)が認められ
A

25

0.2

40

50

60

70

Fig.2

―
E onoEu)dnoJS0u1
E<

30

00
2

ー

5

Fig.1

20

- Am;nog『o,p40

HPLC of fraction A* obtained from CM-HSA-H Co I umn, Wakos i I 5C18-200T;
Flow rate, 0. 5ml/min. *Refer to Fig. 1

Fig. 2に示すように、画分Aには多数の ペ プチドが混在していた。これらをピ ー クごとに回収し、各画分 15nmolのToeとの相乗効果を測定した。すな80

わち、 各画分を凍結乾燥した後、少量の0. 001 M

Tube No. (8.0 mlll,be)

Toe

30

400

一

゜

0
1
10

一

ECマs"冨 ●2 •q』
0●qy

5
1

(
A
S )で 一』●duo11
gnpu1

20

-,

20

Time (min).•.••••.• Aboo巾anco●t254nm

HClに再溶解し、ペプチドの濃度をTNBS法で測定

Separation of CM -HSA-H by chromate­graphy on a Sephadex G-25 column,andsynergistic effect of fractions with
Toc.

して各画分の酸化モデル系への添加量を15nmolに調整した。その結果、ピ ーク1. 5および9がToeと強い相乗効果を示した(Fig. 3)。ピ ー クlおよび

-11-

2

1

0
1
6

一

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

Peak No.

Fig.3

Synergistic effect of fractions 拿·Refer to Fig.2
with Toc.

Fragment 5- b

A:
|＇
,
．
I

゜
2

Euo NN lea::iueqJosqv(b p)poµedU<>tonpu1

0

5
1

Fragment 5- a

:n,t
a:
uo:i.
E ,
苓）a（

0

゜
―
―
―

20

9からは現在のところ有効なペプチドシナ ー ジス
トは単離されていないが、ピ ー ク5からは強い相乗効果をもつペプチドシナ
ーピ

ー

ー

10

ジストが、明瞭な単30

40

Ti me (min)クとして分離された。 以後このペプチドシ

Fig.4

ナージストをHSA-H-5と呼称する。
3.3

20

HSA-H-5のLEPによる断片化

ペプチドシナ ー ジストの実用化あるいは不明な点の多いその機能の発現機構を解明するうえでHPLC of HSA-H-5•atter treatment withlysyl endopeptidase at 37 ℃ for 3h.
Column, TSK gel 0DS-80Ts; Flow rate,
0. 5 ml/min.
·HsA-H-5 corresponded to peak 5 1 n
Figs.2 and 3は、分子サイズのできるだけ小さいペプチドの作製が望まれる。 そこで、CM-HSA-Hから分離されたペプチドシナ ー ジストHSA-H-5をLEPで再度加水分15解した。Fig. 4に示してあるように、LEPを3時間解され、新たに2つのピ ー ク（フラグメント5-aおよび5-b)を生じた。 このことは、HSA-H-5が少な
くとも2つのフラグメントから構成されているこ゜

5-aおよぴ5-bのToeとの相乗効果を示してある。

5とを示唆した。Fig. 5 に HSA-H-5、フラグメント

0ー(�ep) popad uo1
p npu

程度作用させると、HSA-H-5はほぼ完全に酵素分

フラグメント5-aはHSA-H-5と同程度の強い相乗効
果を発現し、LEP処理により断片化（低分子化）されても依然として強い相乗効果を保持していControlた。 一 方、フラグメント5-bは無効であった。 このことは、HSA-H-5の機能発現部位が、フラグメ

Fig. 5ント5-bではなく、 フラグメント5-aにあることを
明示した。

-12-

HSA-H-5

Fragment
5-a
5-b

Synergistic effect of HSA-H-5 andits f r agments 5-a and 5- b with To c.

ヒト血清アルプミン加水分解物由来のテトラペプチドによるビタミンEの抗産化能の向上

3.4

Lysyl endopeptidase

ベプチドシナ ー ジストの構造解析

Table 1 にHSA-H-5、フラグメント5-aおよびのアミノ酸残基から構成されていること、 さ ら< - .....,

H-5は4個および6個のアミノ酸残基からなるフラグメント5-aおよび5-bのみを構成成分とすることFig.6が推察された。この組成と既報 8) のHSA-Hの一次
Table 1 Amino acid compositions of HSA-H-5,
and its fragments 5-a and 5-b
HSA-H-5

Fragment 5·a

Fragment 5-b

(4}'

0 2'

(0)

36

°

(4)

Ser

0.2

(0)

0I

(0)

0.1

(0)

Pro

l.O

(I)

11

(I)

Glu

11

(I)

I0

(I)

Gly

02

(0)

02

(0)

02

(0)

Ala

02

(0)

03

(0)

Val

0I

(0)

02

(0)

しu

23

(2)

I2

(I)

IO

(I)

Tyr

03

(0)

Lys

10

(1)

I0

(I)

His

09

(!)

08

(1)

10

To叫

112

← Fragment 5-a_... �に、アミノ酸残基数やその種類の 一 致からHSA­

38'

106 107

Leu-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu

5-bのアミノ酸組成を示してある。HSA-H-5は10個

Asp

↓

103

Fragment 5-b

�

.,'

'·>

HSA-H-5

Amino acid sequence of HSA-H-5 andits fragments 5-a and 5-b.Amino acidsequence of HSA-H-5 coincided with
HSA residul!S 103-112.
Lysyl endopeptidase hydrolyzed HSA­
H-5 at the peptide bond indicated by
the vertica I arrow.

4

考

察

各種タンパク質やペプチドが抗酸化剤に対して相乗効果を発現することが報告されており、本研究で解明されたテトラペプチドLeu-Gln-His-Lys
構造のみがそれらすべてにとって機能発現に不可

6'Mole rdl.io to l mole of Lys

欠とは考えにくい。さらに、この構造が最小単位"Number in parenthe.,;is indica応an approximate integer.
'Mole『a1io 10 I mole of Leuのペプチドであるか、あるいはHSA分子内におけるその役割なども現在のところ不明である。しか構造とを比較したところ、HSA-H-5はHSAのアミノしながら、このテトラペプチドは、Toeの抗酸化酸配列でアミノ酸残基103から112までの10個のア性を著しく向上し、しかも従来のペプチドシナ ー

ミノ酸残基に一 致した(Fig. 6)。また、フラグ

ジスト 6) にくらべて低分子サイズである。現在でメント5-aはアミノ酸残基103から106の4個に、フも不明な点の多いタンパク質やペプチドの相乗効

ラグメント5-bは107-112の6個のアミノ酸残基に果の発現機構やそれらの生体内における役割を明それぞれ相当した(Fig. 6)。HSA-H-5の断片化にらかにするうえでは優れた研究対象になりうるも使用した酵素LEPは各種のポリペプチドに対してのと思われる。抗酸化剤やシナ ー ジストの効力

Lysのカルボキシル基の関与するペプチド結合のは、使用した実験系や対象とした試料などによりみを選択的に加水分解すると いう基質特異性を異なることが多く、本研究で得られたペプチドシ。すなわち、LEPによりHSA-H-5のア

ナ ー ジストについても各種のモデル実験系で再検

ミノ酸残基106と107との間のペプチド結合が切断討する必要があろう。しかし、HSAを原料とした

され、Lys残基をC末端とするフラグメント5-aを

このペプチドは人体に対して高い安全性が保証さ生じたものと推察される(Fig.6)。さらに、低分れ、今後の研究の進展にともなってさまざまな分

子サイズでToeに対して強い相乗効果を示したフ野での応用が期待される。

もっている

9)

ラグメント5-aのアミノ酸配列を分析し、予想されたテトラペプチドLeu-Gln-His-Lysであることが確認された。

-13-

: .,Yippon s[JJ·.s:即 Ca舷ais.肱 56 1011 1990

文 献1 ) 満田久輝、 安本教博、 岩見公和：栄養と食

6) H. Hatate, K. Kusunoki, and M. Kochi,: J. Jpn. Oil c;力em. Soc. (Yi.倣'ACA%fl) , 42 168

糧、 19 210 1966

19932) 山口直彦、 横尾良夫、 藤巻正夫：日食工誌、
22 431 1974

7) T. Okuyama and K. Satake, : J. Bioc/Jem., 47
454 1960

3) 山庄司志朗、 吉田弘美、 梶本五郎：油化学、
268)

28 1977

Ji'£即 Lett., 58 134 1975

4)幡手英雄、 永田吉充、 河内正通：油化学、
39 42 1990
5)

B. Meloun, L. Moravak, and Y. Kostka :9) T. Masaki, K. Nakamura, M. I sono, and
M. Soejima,: なric. Biol (;j力e111., 42 1443 1978

H. Hatate, Y. Numata, and M. Kochi,- 14-

層状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による有機色索のカプセル化
早稲田大学 理工学部

菅

原

義

之

In order to develop intercalation reactions as encapsulation methods of organic dyes, dyes
containing the azobenzene groups were incorporated into inorganic layered materials. As hostmaterials, rnontrnorillonite and rnagadiite were used, and different synthetic strategies wereattempted. Hornoionic rnontrnorillonite—かarninoazobenzene intercalation compounds wereprepared by solid-state reactions. When interlayer cations were metallic (Na + , Ca圧and Ni2+ ),IR spectroscopy revealed that the amino groups interacted with interlayer cations, indicating theintercalation of p-aminoazobenzene. The adsorption maxima of p-aminoazobenzene shifted
considerably from that ofかaminoazobenzene in solvents, and the color of the products depended
on the interlayer cations. When n-dodecylammonium(DA)-montmorillonite was used as a host,the basal spacing increased by the reaction withかammoazobenzene, indicating the intercalationofかaminoazobenzene. The color and adsorption maximum were consistent with those ofかaminoazobenzene. The irradiation of UV light led to reversible cis-trans photoisomerization in
the interlayer space of montmorillonite. For magadiite, the grafting reaction was attempted toimmobilize the azobenzene group covalently on the interlayer surface. Sodium ions in theinterlayer space of magadiite were exchanged with dodecyltrimethylammonium (DTMA) ionsto form DTMA-magadiite. Then aminopropyltriethoxysilane was reacted with DTMA­
magadiite. IR and solid-state NMR spectroscopy revealed that the aminopropylsilyl (APS) groups
were present in the interlayer space of magadiite and DTMA ions were released, suggesting
successful silylation. When 4-phenylazobenzoyl chloride was reacted with APS-magadiite, thebasal spacing slightly decreased, and the absorption due to the azobenzene groups were observedin the UV -Vis spectrum of the product, implying the possible immobilization of azobenzene
groups by amido-formation in the interlayer space of magadiite.

1

緒 言

成粘土鉱物や他の層状酸化物を用いるなど、新しい研究が展開されている。

粉末化粧品では、有機顔料とともに無機材料で代表的体質顔料である粘土鉱物の多くは、ケイ

ある体質顔料が主成分となる。 有機顔料として酸を主成分とする層状ケイ酸塩である ！） 。 その構は、数多くのものが知られているが、粉末化粧品

造は、ケイ素と4つの酸素からなる(Si04)4―

四面は直接皮膚や粘膜に触れる事から、 ごく限られた体から構成される四面体シ

有機顔料だけが使用されている。 これに対し、体マグネシウムが6つの酸素により八面体型に配位質顔料としては、その優れた使用感触と光学特性されている八面体シ ー トから構成されている。

から、粘土鉱物が広く用いられている。現在まで

1 : 1 型粘土鉱物では、層が 1 つの四面体シ ー トとのところ、天然鉱物が主に用いられているが、合ートとアルミニウムや1つの八面体シ ー トから構成され、2 : 1型粘土鉱物 では、2つの四面体シ ー トが八面体シ ー トを上下から挟み込むことにより層が形成されている。

Encapsulation of Organic Dyes mLayered Minerals by Host-Guest
Reactions―

一方、(Si0 4 ) 4 四面体のみからなる層状構造を持つものに、層状ボリケイ酸塩がある

2)。 層状ポリY oshiyuki Sugahara

ケイ酸塩には、いくつかのものが知られている

Department of Applied Chemistry
Waseda University

が、それらの構造の詳細については、ほとんど解明されていない。

-15-

層状構造を持つ無機化合物の中には、 様々な有機分子やイオン（ゲスト）を層間に取り込むものzが知られており、 この反応をインタ ー カレ ー ショ＝ン、 得られる無機 一 有機複合材料を層間化合物と

゜

hv1

一 ー•

db
N=N

hv2 or△呼ぶ。 この反応は、有機化合物のカプセル化反応として捉えることが可能であり、 有機化合物を溶
スキ ー ム1

出しないように 固定化 することができる。 従っ

アゾペンゼンの異性化反応て、 この手法を用いることにより新しい体質顔料の開発が可能であり、 さらには従来は使用ができとし、 カップリング剤によるシリル化を経てのアなかった有機顔料の使用の可能性が期待される。

ゾベンゼンの修飾を行った。

インタ

ー

カレ

ー

ションのホストとして最も知られ2ている粘土鉱物はモンモリロナイト等のスメクタ

実験イトであり、• その構造は2 : 1型構造である。 層は負に帯電しており、 それを補うために層間に交換

2. 1

原料

性陽イオンが存在する。 一 般には層間の陽イオン

モンモリロナイトには、 クニミネ工業（株）社製はナトリウム等であり、 これらは通常水分子で水“クニピアF" (山形県左沢産）を用いた。 層間の和されている。 層間の陽イオンは様々な陽イオン

陽イオンをイオン交換反応することにより、 単 一で交換することが可能である。 また、 電荷を持たイオン型モンモリロナイト(Na-、Ca-、 Ni-、 n­ない極性分子も、 水分子を置換することで層間にドデシルアンモニウム(DA)-)を調製した。 これ

侵入することが可能である 2) 。 一 方、 層状ポリケ

はそれぞれの塩化物水溶液中にモンモリロナイト

イ酸塩もスメクタイト類似の反応機構でインタ ーを分散し、 遠心分離して回収する操作を3回繰り

カレ ー ション反応が起こる。 これに加え、 表面に返し、 洗浄することにより得た。 パラアミノアゾ存在するシラノ ー ル基(=SiOH)の反応性を活か

ベンセンは東京化成工業（株）社製のものを用いし、 シリル化剤(XSiRa ; X=Cl, OR)との反応により、 層表面にゲストを共有結合させることも可能である。

た。 マガディアイトは小菅らの方法 4) に 従い、Si02 : NaOH: H20=l: 0. 23: 18. 5(モル比）からなる懸濁液をテフロン内筒型密閉容器（耐圧カラ三SiOH+XSi三 → 三Si0Si三十HX

ス工業製TAF-SR-300)中で150℃、48時間水熱反

本研究は、 ホストとして粘土鉱物であるスメク

応させ、 得られた白色沈殺を純水洗浄、 乾燥してタイト、 層状ポリケイ酸塩としては多層構造をも得た。

つマガディアイト(Na2Si 1 ,02 o·x恥0)を用い、これらへの色素分子の取込みについて、 基礎的検

2. 2

合成

討を行った。 ゲストとしては、 代表的有機色素でモンモリロナイトヘのインタ ー カレ ー ションであるアゾベンゼンを用いた。 アゾベンゼンは、 次は固 一 固反応（固体間反応）を利用した。 単 一イのスキ ー ムに示す通り紫外光により異性化し、 こ

オンモンモリロナイトとパラアミノアゾベンゼンの反応は代表的なフォトクロミック反応として知を乳鉢で混合し、 n— ヘキサンで洗浄して生成物とられている 3) 。 スメクタイトでは、 層間のイオンした。

と色素との相互作用を用いて層間へのインタ ー カ

Magadi i te層表面へのアゾベンゼンの固定は、

レ ー ションを行った。 一 方マガディアイトでは層以下の手順でおこなった。 まず、 ドデシルトリメ

表面に色素を共有結合により固定することを目標

チルアンモニウム(DTMA)イオンを層間ヘイオン-16-屈状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による有機色紫のカプセル化

交換で導入し、得られたDTMA型マガディアイトをのIRスペクトルを示す。Na型モンモリロナイトー

中間体として、dryトルエン中、アミノプロピル

パラアミノアゾベンゼン層間化合物のIRスペクト

トリエトキシシラン(APTS)(チッソ）を加え、窒ルでは、 パラアミノアゾ ヘノセンに帰属可能な吸｀ヽ 、素雰囲気下で24時間還流した。同様の操作を再度収帯が観察された。Ca型モンモリロナイト、Ni 型

行い、APS—マガディアイトを得た。さらに、層間

モンモリロナイトでも、反応後は同様なスペクト

ヘアゾベンゼンカルボン酸塩化物を導入し、アミルが得られた。Table. 1にいくつかの吸収帯の波

ド結合を形成させることでアゾベンゼンの固定化

数と掃属ををまとめて示す 5) 。 N-H伸縮振動や変を試みた。APS—マガディアイトをdryトルエンに角振動の吸収帯の位置は、層間の陽イオンの種類分散させて窒素雰囲気下で1時間撹拌し、 ビリジによ り 変 化 し て い る 。層間賜イ オ ン の分極能ンを加えた後、4-phenylazobenzoyl chloride(東(Z/R ; Zは電荷、Rはイオン半径）とN-H変角振動

京化成工業）を加えて、窒素雰囲気下のまま暗中の波数をプロットすると直線関係が得られる。まで60℃、24時間撹拌を行った。反応終了後、遠心

た、 ベ ンゼン環の振動（約690cm-1)はほとんど

分離、洗浄、風乾を経て試料とした。

変化しないのに対し、P位を置換したベンゼン環の振動（約830cm-1)は陽イオンにより変化して2. 3いる。以上のことから、陽イオンとNH2基とがイ

分析

生成物はX線回折分析 (XRD)、赤外吸光分光分

オン一 双極子相互作用していることが明らかとな

析 (IR)、固 体高分解能核磁気共鳴分 光 分 析り、この相互作用がインタ ー カレ ー ション反応の(NMR)等で分析した。

駆動力と考えられる。
生成物の色は、層間陽イオンにより異なり、オ3

レンジ色から赤色を示した。パラアミノアゾベン

結果と考察

ゼンは、 エタノ ー ルに溶解 させると377nmに吸収
Na-、 Ca-、 Ni — 型モンモリロナイトヘのバラ
アミノアゾベンゼンのインタ ー カレ ー ション
Fig. 1 にNa 型モンモリロナイト及びNa型モンモ

3. 1

散反射スペクトルは、大体550nm付近にピ ー クを示し、先の値から大きくシフトした。これは、恐らくは先に示したイオン 一 双極子相互作用によるものと推定している。 この非常に大きいシフトにより、生成物中の異性体の同定は不可能である。
3. 2

bg UBllE! SUBJlーリロナイトーパラアミノアゾ ベ ンゼン層間化合物

極大を示すことが知られているが 6) 、生成物の拡

有機ベントナイトヘのバラアミノアゾベン
ゼンのインタ ー カレ ー ション

有機ベントナイトとは、モンモリロナイトの層
間陽イオンを脂肪族アンモニウムイオンや第四級アンモニウムイオンでイオン交換したものであ

4000

3000

2000

り、交換前と異なり、特に非極性溶媒に膨閥する

Wavenumber / cm-1
Fig. I2)

生成物の赤外吸収スベクトル•(a) Na 型モンモリロナイト 、(b) Na 型モンモリロナイトー
バラアミノアゾペンゼン。（膨潤とは、溶媒か層間に侵入して層間距離が非常に拡大して体積が増大する現象をさす：交換前のモンモリロナイトは親水性であり水で膨潤する）そこで、固体間反応による層間へのバラア

層間化合物．

ミノアゾベンゼンのインタ ー カレ ー ションを行っ
-17-

被数

/

紫外光照射によりトランス体の一 部がシス体へ異cm•

p·A• (;, KB,)

Na·Moat·p-Az

Ca·Moat.·p-A,

N;·Mo, し·p·A,

1617

1628

1634

1636

1598

1600

1601

1601

833

839

0
〈〗
689

屈属

性化したことがわかる。 紫外光を5分間照射後、N·H def.

暗所に5分間保存し再度スペクトルを測定すると(B, Ring)(Fig.2-c)、 トランス体による吸収ピ ー クの強c=c Str.

840

843

C·H de!.
(An Ring)

687

689

C·H def.
(B, Ring)a689

ス体の吸収ピ ー クの強度が大きく減少しており、IR吸収帯の波数と帰属

Tab I e. 1

p·A, : バラアミノアゾペンゼン
Moot.: モンモリロナイト

flz Ring("n-B ) 88UB QJ0 SQ\f←An Ring:_

NH2た。XRD分析の結果、 層間隔が1. 8nmから3. 0nmへ増大し、層間ヘパラアミノアゾベンゼンが侵入したことが明らかとなった。 生成物のIRスペクトルは、 パ ラアミノアゾベンゼン単体と同様の吸収帯を示した。 この反応における駆動力は、層間のアルキル鎖とパラアミノアゾベンゼンとの疎水 一疎水相互作用と考えている。

300

生成物の色はパラアミノアゾベンゼン単体と非定してみると、395nmに吸収ピ

500

600

700

Wavelength / nm

常に類似していた。生成物の吸収スペクトルを測ー400

クを示し、 非極Fig.2性溶媒であるベンゼンにバラアミノアゾベンゼンを溶解した値(377nm)6> とほぼ一致している。 まドデシルトリメチルアンモニウム型モンモリ
ナイト — バラアミノアゾペンゼン層間化合物の吸収スペクトル：(a)暗所1日貯蔵後 ， (b)紫外光5分照射後 ，(c)紫外光5分照射後さらに暗所5分貯蔵後 ，た、 このことは、生成物がトランス体であることを示している。 以上の結果より、Na-、Ca-、Ni­型モンモリロナイト ー パラアミノアゾベンゼン系

度が回復しており、 熱によりシス体がトランス体

では層間陽イオンとパラアミノアゾベンゼンとのへ異性化する逆反応が進行したことがわかる。 こ

間に強い相互作用があったのに対し、DA型モンモの逆反応は、室温では1時間程度を要したが、 温

リロナイト パラアミノアゾベンゼン系ではホス度を60℃とすると数分で完了した。

ート ー ゲスト間の相互作用は比較的弱いことが推定
3. 3

される。

シリル化反応によるアゾベンゼン茎のマガ
ディアイト層間への固定化

DA型モンモリロナイト層間でのパラアミノアゾ
ベンゼンの光異性化反応について検討するため

DTMA型マガディアイトとAPTSとの反応をXRDにに、 紫外光照射前後で 吸収 スペクトルを測定しより検討したところ、層間隔が2. 85nm(DTMA型マ(Fig. 2)暗所で1日保存したサンプルのスペ

ガディアイト）から1.75nmへ減少した。 この値はクトル(Fig.2-a)は、 トランス体による吸収のH型マガディアイトの無水物の層間隔(1. 12nm)7>みが見られる。 これに対し、 紫外光を5分間照射と比ぺて0. 63nm大きいものであり、APS基（最大した直後 のスペクトルでは(Fig. 2-b)、

距離約0. 64nm)が存在するには十分な空間がある

た。

トラン

-18-

層状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による有機色素のカプセル化と考えられる。 一方、 IR分析からは APTSとの反応
後にDTMA イオンによる吸収帯の減少や 1545cm―Iされる。 なお、 426nmの吸収ピ ー クはcis体による＊付n-冗 遷移による吸収極大と思われる。

近における APS基の —N比変角によるものと思われ

cis 体は通常室温では不安定であることから、る新たな吸収帯の出現などが観測された。 さら

生成物において cis体はかなり安定化されているに、 29Si MAS NMR 分析を行ったところ、 反応によりがユニット ((SiO)aSiO うによるピーことが示される。以上より、層間にアゾベンゼン

クが相対が固定化された可能性が示唆されたが、1 8C CP­

的に減少し、新たに 一 56ppm から 一 70ppmの範囲に

MAS NMR 分析によると、アゾベンゼンによる共嗚

Tユニット ((SiO)s-xCO-).SiC- ; x= O. 1) によ

線の出現は 認められず、 明確な確証は得られな

るビ ー クが出現した。 以上より、APS基の固定化かった。

が示された。 しかしながら、 APTSとの反応後にもDTMA イオンが残存することが 1 5C CP-MAS NMR スペ

319nm(:n:-:n:*)クトルから示唆された。
·(
n·e)aoueqJoSq\f

アゾベンゼンカルボン酸塩化物との反応後、生成物は黄土色を呈していた。 反応前後のXRDパターンおよび UV-Vis スペクトルをそれぞれ Fig.3 と1.75 nmA+!
SU8 :j.
Ua)

゜
2 e I ·
Fig. 3

40

50

300

400

500

Wavelength I nm

600

Fig.4 生成物のUV-Visスペクトル：(a) APS — マガディアイト ，(b) 4-pheny I azobenzoy I
chloride処理後．

゜
60(Cu K a)

総

30

20

b)

4

10

b)

426nm (n-冗 ＊ ）括

層状粘土鉱物である モンモリロナイトと層状ポ

生成物のX線回析図：(a) APS-マガディアイト ，(b) 4-phenylazobenzoyl
chloride処理後. (0: NaCl)

リケイ酪塩であるマガディアイトを用い、 異なる手法によりアゾベンゼンの層間への固定を試みた。 モンモリロナイト層間を用いパラアミノアゾ

Fig.4 に示す。 XRDパタ ー ンから反応により層間陽ベンゼンを層間に導入した場合には、層間陽イオ

が 0. 12nm だけ増加し たことがわ か る 。 また、ンが金属イオンの場合は、色調は賜イオンの種類

NaCl による新たな回折ビ

ク(0)が観測された。

により変化した。 一 方、 ドデシルトリメチルアン

方、UV-Vis スペクトルでは、生成物においてモニウム型モンモリロナイト層間へは、色調は単319nm に吸収極大が確認された。 アゾベンゼンカ体とほぼ同様のままインタ ー カレ ー ションした。

一ー

ルボン酸塩化物のトルエン溶液においては327nm

マガディアイトを用いた場合は、層間へのAPS基＊にtrans体による冗 ー 冗 の吸収極大をもつことかの固定には成功したが、 アゾベンゼンカルボン酸

ら、生成物中におけるアゾベンゼン基の存在が示塩化物との反応による固定化の確証は得られな-19-かった。 以上より、 色素のカプセル化手法として、 インターカレーション反応は有用な手法であ4)小菅勝典， 山崎淳司， 綱島群， 大塚良平， 日本セラミックス協会学術論文誌， 100

ることが明らかとなった。

326-

331 1992
5) K. Ueno, J. Am. Chem. Soc,, 79 3205-3208

参考文献

1957

1)須藤俊男， “粘土鉱物学"' 岩波書店Cl 97 4)

6) W.R. Brode, J, H. Gould, and G. M. Wyman,2)加藤忠蔵黒田 一幸編著， “層間化合物の開発

J. Am. Chem. Soc., 74 4641-4646 1952と応用", CMC (1985)
3)堀江一

7) G. Lagaly,

K. Beneke, and A. 胃eiss, A勿JliJJeral. , 6 0 650-658 1975

之， 牛木秀治著， “光機能分子の科学"'

講談社サイエンティフィク(1992)

．、
-20-

，

ハ ー ダ ー 腺の分泌するアルキ）レジアシルグリセロ ー ルの物性解明とその索材としての応用開発
束京大学

脊

山

医学部

洋 右

Fatty acid and alkyl compositions of l-alkyl-2,3-diacylglycerols (ADG) in the Harderian
gland of golden hamster were determined. Fatty acids of male ADG consisted of straight chain
saturated acids. Both even- and odd-numbered acids were observed, indicating that acetyl- andpropionyl-CoAs were equally used as primers in the fatty acid synthesis. In female ADG a large
amount of iso- and anteiso-branched fatty acids were detected. Odd-numbered acids contained
iso- together with anteiso-branchings, and even-numbered acids contained iso-branchings. Thesefindings suggested that isobutyryl-, isovaleryl, and 2-methylbutyryl-CoAs were used as primers
in addition to acetyl- and propionyl-CoAs in fatty acid synthesis in the female gland. Such unusual
primers are catabolic intermediates of valine, leucine, and isoleucine, respectively. Treatment
with testosterone in female led to the disappearance of such branched chain fatty acids. Castration
led to the appearance of iso- and anteiso-branched chain fatty acids. We conclude from theseobservations that the production of branched chain fatty acids in the Harderian gland of golden
hamster is inhibited by testosterone at the step of isovaleryl-CoA dehydrogenase and 2-methyl
branched chain acyl-CoA dehydrogenase. Thus androgens are essential to the control of thecomposition of ADGs in the golden hamster Harderian gland. This organ is a suitable model inthe study of androgen receptor, and the application of such an unique ADG, bioactive lipid, willbe the subject of a further communication.

1

緒肪酸が含まれているという報告があって 2) 、不飽

言

和結合の有無が雌雄差となって現れたものと考え
ハーダー腺は墓歯類の眼裔内に発達した外分泌られてきた。

腺で、脂質を分泌することで知られている l) 。湿ところが、本研究で改めてこの脂質を分析した

重量の 20%以上を脂質が占めている。この脂質はアルキルジアシルグリセロール (ADG) であるこ

ところ、雌のADGには不飽和脂肪酸は存在せず、とが多いが、動物種によりその脂肪酸及びアルキが多量に含まれていることが明らかになった 3) 0

ル残基の組成は異なっている。
本研究の対象となったゴールデンハムスターでこのことは、雌雄差の本態が脂肪酸生合成におけるプライマー の違いにあることを意味していはこの外分泌脂質に雌雄差があることが知られてる。acetyl-CoAがプライマーとして使われると偶いた。その違いについて、これまでは雄では直鎖数鎖の 脂 肪酸 が 合 成 さ れ るのに対して、 i so­の飽和脂肪酸から成るのに対し、雌では不飽和脂

valeryl-CoA、isobutyryl-CoA、2-methylbutyryl­

むしろイソ型およびアンテイソ型の分枝鎖脂肪酸

CoAがプライマー として使われるとイソ型、アン‘’テイソ型分枝鎖が合成されることがわかっている

Characterization of alkyldiacyl­
glycerols from the Harderian gland

ので、これらのCoA誘導体を生成する分枝鎖アミY ousuke Seyama

ノ醗の代謝調節が雌雄によって異なっていることが浮かぴ上がってきた。

:,�Faculty of Medicine,- University of Tokyo

分泌脂質の性差をもたらすべく性ホルモンによって調節されているのは、従来考えられていた-21-

ような脂肪酸不飽和化酵素(desaturase)ではな
く、分枝鎖アミノ酸の分解過程の酵素であることが明らかになったといえよう 4) 。
血小板活性化因子 (PAF) がアルキルリン脂質

ADG .......

であるように、ADGのようなアルキル脂質は生理活性脂質でもある。 本研究はこの脂質に見られる雌雄差の本態を明らかにすることによって、そのChol →

特性を生かした脂質の応用開発の基礎を与えようというものである 5) 0

Orig →

2. 1

験

実

2

1

図1

試料調製および分析方法

コ ールデンハムスタ ー のハ ー ダ ー 腺から脂質を
クロロホルム／メタノ ー ル溶液で抽出し、シリカ
ゲルカラム クロマトグラフィ ー でADGを単離精製した。 ADGをメタノリシスして得られた脂肪酸メ
チルエステル、およびイソプロピリデン誘導体化したアルキル残基はそれぞれガスクロマトグラ
フィ ー 質量分析機(GC/MS)にて同定し、ガスク
ロマトグラフィ ー (GLC)にて定量した。 ADGおよ

2

3

4

5

6

7

ゴ ー ルデンハムスタ ー ハ ー ダー腺脂質の薄層クロマトグラム
1: 雌の粗脂質； 2 : 雌ADG (Fl) ,3 : 雌ADG (F2) ; 4 : 雌の租脂質
5 : 雄ADG (M1);6: 雄ADG (M2) ,7 : 雄ADG(M3)
ADG : 1-alkyl-2, 3-diacylglycerol,
Chol: cholesterol; Orig: origin
プレ ー ト： si I 1ca gel 60 (Merck.Darmstadt)
展開溶媒： hexane-diethylether-acetic acid(80: 20: 1, v/v)
検出： 20%硫酸噴霧後に120℃に加熱

び脂肪酸メチルエステル、アルキルグリセロ ー ル
はc 1a およびH 1 -NMRによっても分析した 3) 。

3. 2

NMRによる分枝鎖の証明

雌のADGをNMRで分析したところグリセロ ー ルの2. 2雄に対する去勢と雌に対するテストステ

3位にイソバレリアン酸が存在すること、およびロン投与

2位にはイソ型、アンテイソ型分枝鎖脂肪酪が多量に含まれていることが示された。 さらに、単離

ゴ ー ルデンハムスタ ー を去勢し、8週間飼雄の腺を摘出してそのADGの分析したアルキルグリセロ ー ルの分析から雌のアルキを行った。 雌にはテストステロン錠剤を頚部皮下ル残基にもこの型の分枝鎖が存在することが明らに埋め込み、8週間飼育後にハ ー ダ ー 腺のADG分析

かになった。

育した後にハ

を 行っ

た4)

ー

ダ

ー

一方、 雄のADGには脂肪酸、アルキル残基とも。

に、このような分枝鎖は認められず、直鎖の成分

結

3
3. 1

から構成されていることが示された。

果

薄層クロマトグラフィ ー にみるADGの雌雄差

3. 3

ADGの脂肪酸組成トにより中性脂質を分離した雄のADGの脂肪酸組成は単純で、直鎖の脂肪酸では、雌のADGが2 つのスから成り、最も多いのは 15 : 0 という奇数酸であっポット (Fl 、 F2) に分かれるのに対して、雄のた。 偶数酸だけではなく奇数酸も存在することが

ADGは3つのスポット(Ml、M2、M3)に分離される特徴である。

シリカゲルプレー

薄層クロマトグラフィ

ー

-22-

ハ ー ダ ー 腺の分泌するアルキルジアシルグリセロ ー ルの物性解明とその素材としての応用開発

18

一
こ C よ ）5-

"

20

15

19

20
21
0
,ー

,5
2

.,,zz,91

(8)

10

16

マ0ヽご ヽ cg

"
＂
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,.

Male

S

Male

(A)

30

20

40

30

(min)

Female
18

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19
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＇

8 マ "I I "6

17"'

ロ
21
人

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。
、orヽc

’’忍 t T·'r!"戸\I

Female

20

(min)

20

25

イ

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b

21

,0
ー

＇

15

30
0
,ー

ハ ー ダ ー 腺ADGの脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラム(A)雄； (B)雌
図中の数字(14-21)は炭素鎖長を示す．
"br"は分枝鎖脂肪酸を意味する．
カラム： OV-1キャビラリ ー カラム(0. 28mmx25m)
流 速： 1 ml/min
温 度： 180℃に1分保った後 ， 5℃/minで250℃
まで昇温

22

20

'
30

40

(min)

図2

ADGに由来するalkylglycerolのi sopropy Ii dene
誘導体のガスクロマトグラム
Ma I e雄； Female雌
図中の数字(14-22) は炭素鎖長を示す．
"br"は分枝鎖脂肪酸を意味する ．
カラム： OV-1キャビラリーカラム(0.28mmx 25m)
流 速： 1 ml/min
温 度： 180℃に1分保った後 ， 5℃/minで250℃まで昇温
図3

これ に対して雌のADG では多量の分枝鎖脂肪酸

一方、 雌の ADG では多量のイソ型およびアンテが含まれており、 しかもその分枝の形がイソ型及イソ型分枝鎖の成分が検出された。 偶数鎖ではイびアンテイソ型であった。 炭素数が奇数のもの でソ型、 奇数鎖ではイソ型およびアンテイソ型の分はイソ及びアンテイソ型、 炭素数が偶数のもので枝であった。

はイソ型の分枝鎖脂肪酸であった。 脂肪酸鎖の中

3. 5

央部分には分枝は存在しない点が我々が以前に報告したモルモットのハ

ー

ダ

ー

テストステロンの効果

雄のゴ ー ルデンハムスタ ー を去勢すると、腺脂質とは異なってハー

ダ ー 腺の ADGは薄層クロマトグラフィ ー 上で 3つのしヽる 6) 。

スポットからなる雄型から2つのスポットの雌型
3.4

ADG のアルキル残基の組成に変わった（図4)。

ADG のアルキル残基の組成にも脂肪酸と対応し

一方、 テストステロンを投与した雌では逆に2つのスポットから成る雌型から3つのスポットのた雌雄差が見られた。
すなわち、 雄のADGでは 18 : 0を主成分として直雄型に変わったことが示された。
そこで、 去勢した雄のハ ー ダ ー 腺の ADGの脂肪鎖のものから構成され、 偶数成分と共に奇数の成酸組成を GLCおよび GC/MSで分析したところ、 イ分も存在していた（図3)。

-23-

＇
}

ADG

ガスクロマトグラフィ ー の同定を誤った結果である。
アルキル残基は脂肪酸から合成されるので、雌のADGのアルキル残基にもイソ型およぴアンテイ
ソ型分枝鎖が多量に存在していた。
4. 2

..

衰

る脂肪酸合成のプライマ ー

FFA← Cholesterol← Originゴールデンハムスタ ー のハ ー ダ ー 腺におけ雄のゴ ー ルデンハムスターのハ ー ダ ー 腺では偶数鎖及び奇数鎖 の 脂 肪 酸 が 合 成 さ れ る の で、
acetyl-CoAとpropionyl-CoAがプライマ ー として

1

2

4

3

使われていることになる。
こ れに対して雌の場合にはイソ型及びアンテイ

図4

ソ型分枝鎖脂肪酸が合成されるのでisobutyryl­

ー 腺脂質に対する

ゴ ー ルデンハムスタ ー ハ ー ダ
テストステロンの効果
1: 雄； 2 : 去勢した雄； 3 : 雌，4 : テストステロンを投与した雌ADG : 1-alkyl-2, 3-diacylglycerol; FFA : freefatty acid
プレート： si I ica gel 60 (Merck, Darmstadt)
展開溶媒： hexane-diethylether-acetic acid(80:20:1, v/v)
出： 20%硫酸噴霧後に120℃に加憩検‘ソ型およびアンテイ ノ型分枝鎖脂肪酸が多量に検CoA、isovaleryl-CoA、2-methylbutyryl-CoAがプ
ライマ ー として使われ ていることを意味している。 こ れらはそれぞれval ine、leucine、iso­leucineという分枝鎖アミノ酸の代謝中間体であることから、雌では分枝鎖アミノ酸がacetyl­
CoAとpropionyl-CoAにまで代謝されることなく、
こ れらの中間体の段階で蓄積し、脂肪酸合成のプ
ライマ ー として使われたことを意味している。

出され、雌に見られる特徴を有していた。 アルキ
ル残基組成も47%がイソ型およびアンテイソ型分4.4枝鎖を有するものに変わっていた。

ADG組成に雌雄差をもたらす酵素

ゴ ー ルデンハムスタ ーのハ ー ダ ー 腺では雄では一方、テストステロンを投与した雌のADGは直acetyl-CoAとpropionyl-CoAが脂肪酸合成におけ鎖脂肪酸のみから構成され、アルキル残基も直鎖るプライマ ー として使われ、雌では isobutyryl­であるという雄のADGのパタ ー ンに変わっていた。

CoA、isovaleryl-CoA、2-methylbutyryl-CoAがプ
ライマー になる。 このことは、valine、leucine、

4

考

察

isoleucineという分枝鎖アミノ酸の代謝過程における2種類の酵素であ る2-methyl-b ranched­

4. 1

ゴールデンハムスタ ー のADGにおける性差

chain acyl-CoA dehydrogenaseとisoveleryl­

ゴ ー ルデンハムスタ ー のハ ー ダ ー 腺が分泌する

CoA dehydrogenaseが雄では活性発現しているの脂質であるADGに雌雄差があることは15年以前かに対し、雌では活性がないことを示唆しているら知られていたが、 雌に不飽和脂肪酸が存在する（図5)。

ことが違いの本質であるかのように考えられてい即ち、ゴ ー ルデンハムスタ ー の分泌脂質に見らた。 今回の研究により雌のADGに存在したのは不れた雌雄差は分枝鎖アミノ酸の代謝過程が性ホル飽和結合ではなくイソ型およびアンテイソ型の分モンの調節を受けた結果であることが判明したと枝鎖であることが明らかになった。 以前の報告は

いえよう。

-24-

ハーダー腺の分泌するアルキルジアシルグリセロールの物性解明とその素材としての応用開発

CH,'-...
／ CHCHCOOH
I
CH,
NH,
Valine↓↓CH,-CH,"'／ CHCHCOOH
I
CH,
NH,
lsoleucine

CH,"'／ CHC油CHCOOH
I
CH,
NH,
LeucineCH, ーCH2'-.,_／ CHCO-CoA·...
CH,

CH,'-.,.
／ CHC出CO-CoA •••
••
CH,

↓
↓

↓
↓

図5 分枝鎖アミノ酸(val ine, leucine, isoleucine)の代謝
テストステロンによる酵素の発現調節

ロンが存在しないと中間体のisobutyryl-CoA、

ゴー ルデン ハムスタ ー の雄を去勢し、雌に対しisovaleryl-CoA、2-methylbutyryl-CoAが蓄積してはテストステロン投与を行うという実験を行ってイソ型およびアンテイソ型の分枝鎖脂肪酸が合た結果、ハー ダ ー

成される。

4.5

腺のADGが雄は雌型に、雌は雄型に変わることが示されて、前述の2種類の酵素
4. 6の発現を介して脂肪酸組成が変化したことが実証

アンドロゲン受容体の役割された。 即ち、テストステロンが存在する状態でテストステロンは核内に存在するアンドロゲン

はこれらの酵素が働いてvaline、leucine、iso­受容体を介して染色体上の特定の遺伝子部位を活

leucineという分枝鎖アミノ酸はace tyl-CoAと性化し、mRNAの発現、タンパク質の合成をもたら

propionyl-CoAにまで代謝されるが、 テストステすものと考えられている。 ゴー ルデンハムスタ ー-25-

のハ ー ダ ー 腺はまさにこの系を解析する上で格好

よって融点を調節していることが判明した。

のモデルであり、テストステロンがアンドロゲン

不飽和結合は空気中で不安定で、異臭の原因に受容体を介して働いた結果を分泌脂質であるADGもなるが、 イソ型及びアンテイソ型分枝鎖脂肪酸の組成変化としてモニタは安定で扱いやすいという利点を有している。 コーすることが可能である

（図6)。

ー

ルデンハムスタ ー のハ ー ダ ー 腺が分泌するADGの果たす 生理的役割は未だに推定の域を出ない
7が、 創傷治癒に関与する細胞成長因子や . 8) 、 多
testosterone activates transcription ofgene, coding isovale,y/-CoA dehydmgenase
and 2-methy/acyl-CoA dehydrogenase

量に分泌されるポルフィリン、或いはフェロ モンのような生理活性物質の溶剤としての機能が考えられる。
イソ型及びアンティソ型分枝鎖を導人したアル
キルジアシルグリセロ ールは化粧品の素材として適しているのではないかと思われ、今後この方面

1sovaleryl-CoA dehydrogenase
2-methylacyl-CoA dehydrogenase
図6

需の応用開発が期待される。

5

アンドロゲン受容体を介した
acyl-CoA dehydrogenaseの発現調節

総括

ゴ ー ルデンハムスタ ー のハ ー ダ ー 腺の脂質であ

しかも、薄層クロマトグラフィ ー という簡便なるアルキルジアシルグリセロ ー ル(ADG)の雌雄方法で鋭敏に検出することができるので、 アンド

差は雄の場合には直鎖であるのに対し、雌では分ロゲン受容体研究において優れたモデル系といえ枝鎖が存在することによることが示された。 これよう。

は分枝鎖アミノ酸の代謝過程の酵素が雄では発現しているが、 雌では発現していない為にもたらさ

4. 7

ハ

ー

ダ

ー

腺の分泌するADGの素材としてのれた現象である。 雄に対する去勢と、雌に対するテストステロン投与実験により、このことはアン応用
ゴ ルデ ンハムスタ
ー

ー

のハ

ー

ダー腺の脂質はADGであるが、 不飽和結合を全く含んでいないとドロゲン受容体を介したテストステロンの効果であることが判明した。

いう特徴がある。 その代謝の本質は今回の研究で本研究の意義は、ADGの性差の本態をあきらか

明らかになったが、イソ型及びアンテイソ型分枝にして、アンドロゲン受容体研究のモデル系を樹

鎖の存在はこの脂質の素材としての応用を考える

立したことと、 イソ型及びアンテイソ型分枝鎖を上で示唆に富んでいる。
即ち、ADGが直鎖の飽和脂肪酸及ぴアルキル残有するADGの素材としての有効性を提唱した点にある。

基から成っていると、 そのままでは融点が高くてヒトの体温では流動性が乏しいが、イソ型及ぴア

引用文献

ンテイソ型の分枝鎖が導入されることによって融

1)Seyama Y, Kasama T, Yasugi E., et al., :点が下がり、適度な流動性を確保することが可能

Lipids in Harderian glands and theirになる。 因みに、これらの分枝鎖成分を含まない

significance, In : Webb SM, Hoffman RA,

雄では奇数鎖の導入および C2やC3という極端に短Pu ig Doming o ML,

R eiter RJ (eds) :い脂肪酸をグリセロ ー ルの3位に導入することにHarderian g lands,

Spring er-Verlag,-26-

ハ ー ダー腺の分泌するアルキルジアシルグリセロ ー ルの物性解明とその素材としての応用開発

Berlin, 195-217 1992
2) Lin円L, Nadakavukaren MJ, : Harderian

in the Harderian gland of golden hamster,

glandlipids of male and female golden

6) Yamazaki T, Seyama Y, Otsuka H, et al.,hamsters, Comp. .iioc力em. P/Jysio! , 70B,

·Identification of alkyldiacylglycerols

627-630 1981

containing saturated methyl branched

約crosc°"砂庇s. Tecbnol. , in press, 1996

3) Seyama Y, Otsuka H, Ohashi K, et a 1., :chains in the Harderian gland of guinea

Sexual dimorphism of lipids in Harderianpig, J. /Jioc力em, 683-691 1981
7) Yokoyama Y, Kano K, Kaji K, et al., :Purification and characterization of agiands of golden hamsters, J. .iioc/Jem,
117 661-670 1995
1) Seyama Y, Hida A, Hayashi S, et al., :growth fac tor f r o m the guinea pig

Androgenic control of l-alkyl-2, 3-dia­Harderian gland, J. /Jio!. Cbem., 17058-

cylglycerol in the Harderi.an gland of

17063 1989
8) Yokoyama Y, Kano K, Matsuda Y, et. al.,the golden hamster, Mesocricetus auratus,: Effect of Harderian gland derived

J. .iioc/Jem , 11 9 in press, 1996

growth factor on the growth of corneal

5) Seyama Y, Otsuka H, Ohashi K, et al., ·stroma I ce I ls, Come� 11 380-385 1992

Sexual diversity of the lipid metabolism-27-

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究
ー特に Forskolin 原料植物 Coleus forskohliiについて 一
正

九州大学

山

薬学部

征

洋

The effective range of the competitive ELISA for detection of forskolin content in clonallypropagated plant organs of Coleus fo岱kohlii using monoclonal antibodies extends from 5ng/ml
to 5µg/ml.
Shoot tips of C. fo冗kohlii were cultured repeatedly on the MS medium supplemented with
NAA(0.5mg/l) and BAP(0.5mg/1) at 25℃ under the 16hr irradiation for 1 month to form multipe
shoot complex. A correlation between the forskolin accumulation and the growth rate wasinvestigated using the clonally propagated shoots. An increase of forskolin content was noted,
begining at week 6. Flowers, rachises, leaves, stem, tuberous roots and roots were analyzed.
Tuberous root and the stem base contained a higher amounts of forskolin than other organs. The
forskolin content in the stem decreased gradually towards the top of the shoot. Quantitative
determination of forskolin content in the plants cultivated in different temperature wasinvestigated by ELISA. The temperature clearly affected the production of forskolin,demonstrating that the contents of forskolin was highest at 20℃ than at 15℃ and 30℃
An immunoaffinity column chromatography using anti-forskolin monoclonal antibodies
appears to be far superior to previously published separations based on crystallization andchromatography.The capacity of the column is 9µg/ml of gels.Forskolin has been isolated
directly from the crude extractives of tuberous roots and the callus culture of C. forskohlii.

1

緒

言

種の作出等の育種研究を行ってきた。 これら研究の延長線上には各種耐性品種、 例えば耐病性品種

生薬の90%以上を輸入に依存し、 その内の約の育成がタ ー ゲットとなり、 この目的を遂行する

80%は自生種により賄われているという。 この現ため に溶菌酵素遺伝子の導入実験等を行って い

実は何を意味するのであろうか。 一つには資源のる。 一方有効成分の高含有品種の育成も重要であ枯渇が浮上してきている。 それと同時に医薬品でる。 高含有品種の育成を達成するためには、 簡便

ある が故に品質に大きな差が生じ、 製剤の力価にで高感度かつ再現性に優れたアッセイシステムの影響を及ぼす事が容易に想像出来る。 我々は漢方構築が要となることは周知の事で、 このため種々処方に繁用される半夏、 地黄、附子、 粛類、 人参の有用成分 に対するモノクロ ー ナル抗体(MA b)

類や竜胆、 淫羊、 当薬等の原植物に付いて、 上記2点をクリヤーすべく、 バイオテクノロジーの手の作成とそれ を用 いるEnzyme Linked Immuno
Sorbent Assay (ELISA)を確立すべく研究を行っ法により、 ウイルスフリー 品種の育成、 掏質な品ている。
F o r s k olin はインド地方 に自生するColeos/orsko/JJjj (シソ科）の根茎に含有されるラプダ

Productionofbioactivecompoundand
breeding of medicinal plants by planttissue-cell culture-Study on Coleus
forskohlii that produces forskolin

ン型ジテルペンである。 本植物はアユルベーダに

Yukihiro Shoyama

単離された 1) 。Forskol inはadeny1 cyclaseを強Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kyushu University

力に活性化しcAMPを増加する作用メカニズムが明も収載され、 心臓病、 呼吸器疾患、 不眠症等に適用されてきた。 近年活性成分としてforskol inがらかとなり 2) 、 医薬品素材として注目されるに-28-

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特に Forskolin原料植物必/ells forskolJ/ii について至っている。 また、forskolinの著しい色素 細胞

ウスミエロ ー マ 細胞のハイプリド ー マを調製し化 現象が知られているが、この現象を コス メトロ

た。 ハ イプリド ー マのコロニ ーが成長した段階でシーに応用しょうとする試みは皆無である。

培養上清について、forskolin ー ヒト血清アルプ

Forskol inは分子内に アシメ炭素を8ヶ有する事

ミン(HSA)を用いてELISAを行い、陽性コロニ ーから光学活性 体を合成することは極めて困難と考を選抜し 、タイ プとサプタイプを決定 し た

えられる。 このため天然資源から抽出単離を行っ(Table. l)。 ハイプリド ー マ1A9をスケ ールアップている現状である。 また、C. forsko/Jfjjの培養細しproteineAアフィニテイ ー カラムで精製し、MAb

胞からforskolinを生産する研究が行われているを得た。

が、その含量の点から現状のまま
では実用化の可能性は極めて小さいと目されている。 かか る現状

2. ELISAの確立

からforskolin 高含有C. forsko.カJjj品種育成を目

96穴のイム ノプレ ー トにlOOng/rnlのforskol in的としたforskolinのアッセイ 系を構築するため

HSAを1 0 0µlずつ添加し、インキュベ ー ト後、の抗forskolin MAbの作成が必須と なろう 。 本 研

geratin-PBSでプロッキングした。 本プレ ー トに

究では抗forskolin MAbの作製とそ れを用いたfo

各種濃度のfo r s k oli n 溶 液10 0µlと M A b 溶 液

rskolinの高感度なアッセイ系としてELISAを確立(0. 7µg/m I) 50µlを加えてインキュベートしまた一 方ではC. forsko.ヵJjjの培養系を検討た。 洗浄後peroxidaseでラベルした抗マウスニ次

し、 高含有株選抜の手法を確立した。 更に 抗for抗体の千倍希釈液を添加し、1時間インキュベー

skol in MAbを用いた抗体 カラムを 作製し、栽培株トした。 洗浄後基質を添加し15分後に発 色をプレや培養細胞の租エ キスからforskolinをダイ レクーした。

トリ ーダーで測定した。

トに精製出来る方法を開発した。
3. アフィニテ ー カラムの作製

2

実

験

精製したMAb (10mg)のPBS溶液を活性 化CN Br­
Se pharose 4B (600mg)ゲルに加え、室温下2時間

1. 抗forskolin MAb の作成 l . ,,反応した。 反応後未反応甚を グリシンでプロッキ

Forskolinは、免疫源とするためにsuccinateをングし、NaHCOa-NaCI溶液で洗浄した。 遠心し て

リンカ ーとして牛血清アルプミン(BSA)と結合ゲルを集めPBSで洗浄後カラムに充填し、アジトした。 マウスに免疫後、常法により牌臓細胞と マナトリウム溶液を加え保存した。

Table. 1

MAbs
1A9
4G12
9D12
9E12
11A9
12F9

List of monoclonal antibodies
again:;t forskolin.

lsotype
G1
G2b
M
M
M
M

Light
chain

4. アフィニテ ー カラムによる粗抽出エキスから
forskolinの単離
根茎、培養カルスの乾燥粉末(10mg)をジェチ
ルエ ー テルで5回抽出 。 溶媒を留去後メタノ ール

1Cに溶解し、PBSで 16倍に希釈した。 溶液をろ過後、K

アフィニテ ー カラムに添加し、4℃で90分放置後、

1(

洗浄液で繰り返し洗浄した。 過剰のfors-kolinがK流出しなくなったら溶出液(45%メタノ ール 含有

1(PBS)で forskolinを溶出した。

1(

-29-

5

2. 抗forskol in MAbの作成

C. forskoll/りの培養、

C. forsko/J!iiの成長点を無菌的に摘出し、NAA,

直接ELISAでスクリ ー ニングしたところ、 ハ イ

BAP (0.5mg/l)添加MS培地へ置床し、25℃, 16時

プリド ー マ1A9が感度の点で最も優れている事が間日長、1か月培養した。 増殖 したシュ ー ト切片

判明したのでスケ ー ルアップしproteineAアフィ
Jを同一条件下で繰り返し培養した。 増殖シュ ート
をホルモン無添加MS培地で同一条件にて培養し発根させてクロ ー ン植物を得た。
6��uupunqv[M+H]'

C. forsko力／りの栽培

上記のクロ ー ン植物をバイオトロンの各温度室(15、20、30℃)と圃場にて栽培した。

結

3

1.

10000

果

結果、 従来は間接的な測定手段でのみ確認されてきたハプテン 一 蛋 白 コンジュ ゲートで あるforskol inとBSAの結合が極めてクリア ー にされ、結合 モル数を算定することが可能となった。

“辺310000

410000Fig. 2 MALDI mass spectrum of monoclonal
antibody against forskolin

Forskolin-BSAコンジュゲー トをMALDIマス

スペクトルで分析したのがFig.1である。 この2i0000110000

ニテイ ー カラムで精製した。Fig,2は精製したIgG(MAb)のMALDIマスで、 ほぼ純粋な蛋白であることが窺える。

；二

3. ELI SAの確立 4, 5)精製したIgGを用いて競合によるELISAから検量線を作成したのがFig.3である。5ng/ml-5µg/ml
1.0

0.8

E uso�) aoueqJOsqe(

8 uepunqv

0.6

OA

0.2

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

＼

90000

m/2

Fig. 1

：

。｀

o.o 0
J0

lO I

10

2

10

3

concentration (ng/ml)

MALDI co-mass spectrum of forskol1n
BSA conjugate and BSA

Fig_ 3-30-

Calibration curve of forskol1nlO｀

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特にforskolin原料植物wle11s /orsko/Jliiについて

Fig. 4R2
H ACH

forskolin
1-deoxyforskolin(1-DF}
1,9-dideoxyforskolin(1,9-DDF)
6-acetyl-7-deacetylforskolin(6-A-7 DF}
7-deacetylforskolinfl-DF)

H
RH H O

R4
OHOHH OHH

RlACACACH H

凡 H H H ACH

R OHH H OHOH

R1

PS-3
PS-4
PS-7

St ructu r e s of forskolin andrelated diterpenoidsの範囲内で良好な直線性が得られ充分に定量が可果をFig, 5に示す。2週目からforskol in が生合成能である事が明らかとなった。Fig. 4にforskokin

されるが5週目までは0. 01µg/mg dr. wt. 以下と、の類似化合物の構造とTable. 2にcrossreactionを非常に低い値であった。 根の成長が盛んとなる6示している。この結果7-deacetyl forskol in の

週目から含量が暫時増加し、 茎が急速に成長を始

cross-reactionが5. 6%である他は殆ど問題にな

める11週から含量増加が著しくforskolin含量が0. 5g/mg dr. wt. となり、12週では0. 7g/mgdr. wt.

Table. 2

Cross reactivities determinedusing forskolin analogs.

1-DF
1,9-DDF
6-A-7-DF
7-DF
PS-3
PS-4
PS-7

0.63
1.30
1.13
5.57

0.8

E

Cross reactivity(%)

MP 6 /6TI) U!I
I(

Analogs

1.0

0.6

』

, a6EJa.eou
I1
gs Oj jO5

゜゜゜

らない程度低 かった。 このことから本ELISAは
forskol inに特異的でかつ高感度な 定量法である事が判明した。

0.4

0.2

0.0

以上確立したELISAを用いて C. /orslroヵiiiにお

10

11

12

week after transplantation

けるforskol inの挙動を詳細に検討した。
Fig. 5

4. 成長過程におけるforskolinの消長培養により得られたクロ ー ン植物を土壌に移植、栽培し、 forskolin含量をELISAにより追跡した結-31-

Average content of forskol 1n ,nthe cl onally propagated C oleus
forskohl ii plant according t o
growth stage

Leaf 0.003-0.011

unit: µg/mg
1.92

Fig.6

Distribution of forskol1n 1n one­year-old Coleus forskohlii

5. 部位によるforsko Ii n含量の変動に達した。 なお葉にはforskol inを含有しないこ

20 ℃室でクロ ー ン植物を 1 年間栽培し、 Fig. 6にとが明らかとなった。

-32-

植物培養細胞•組線による活性成分の生産と薬用植物の育種に関する研究ー特に Forskolin原料植物 Coleus forskoblii について示す通りの各部位別にサンプリングし、凍結乾燥で栽培し、成長度を調査し、また個体の根茎をした ものを ELISA によりアッセイした。この結果

Table 3に示す如く切断し、乾燥後forskolin含量

花、 花柄等には殆どforskolinは含まれないことをアッセイした結果がTable. 3である。

が明らかとなった。茎には0. 3-4µg/mg dr. wt. の

この結果、特に根茎の生育は20℃が最も良好

マイクロ変動が認められた。茎においては根茎とで、30℃区がこれに続いている。Forskolin含量の境目が最も含量が高く、 上部程低含量であっについても20℃区が最も高く、30, 15℃の順で

た。

あった。

一方根茎においては茎との境界部位が含量高

く、下方程低下することが明らかとなった。また、枝についても同様に大きな変異が認められた。

7. アフィニテ ー カラムの作製とその応用 ”
Forskolinは殆ど水に不溶なのでアフィニテー

cortex0.84µg/mg
vascular四ndle 1.48µg/mg
0.30µg/mg
pitch

カラムに付す場合、有機溶媒の添加が不可欠である。そこでアフィニテ ー カラムのタンパク部分にダメ ー ジが少ないメタノ ー ルを選び、 適切なメタ
ノ ー ル含量を設定したのがFig.8である。Fig. 8から45%メタノ ー ル含有PBSにてforskol inが完全にFig.7

溶出することが判明した。

Distribution of forskolin in tissues

次にアフィニテ ー カラムを用いて租エキスから
forskol inを直接精製することを検討した。

茎を皮部、維管束部、柔組織に分けそれぞれにFig. 9に示すように大過剰のforsklinが洗浄溶付いてアッセイしたのがFig. 7である。維管束部、媒により流出してくる。充分洗浄しforskolinの皮部、 柔組織の順に含量が低下している。

溶出が認められなくなった後に、上記の溶出溶媒6.

を添加する と吸着していたforskolinが溶出し、生育環境とforsko Iin含量 6)

シャ ー プなビ ー クを示した。この溶出パタ ー ンを

バイオトロンにおいて、15、20、30℃各温度室
Table.3

IS土1℃

. ,,
Tu切,ou, ,oot soctJonA•. content.,(;,g/mg dwt)"
2.83Z0.28
1.36土0.39
1.2'±0.23
I.IS土0.16

20土l℃

7.87士0.35

100

”

Temp.

Distribution pattern of forskolin
in different tuberous root segment
in clonally propagat ed co leus
forskohlii''.
Sha匹or tobe,cus ,octヽl

叩
'4

4.0cm

吝

土'·"

号

60

忘

40

ヨ
。

6.SS士1.25

U9土0.4980..

'·"士0.<9

S. 73

*

20

5.49 士 o.:w

S.08土0.65
30 士 1℃

3.83 士 0.38

3.57 土0.24

02.99土 0.30
1.9廷0.42

4.0cm

10

20

30

40

50

60

methanol concentration (%)I) Single clonally prnpagat出plant " indicated in Table I WM used lo, analysi,2) Tho main tubernu, ,oots cultivated at 15 and 30℃ we,e ,oclioned into pieses (10 mmmh). and tho父 at 20℃ wm cut into piece, a, indicated in the ,ha四mpecli,oly
Section No, I shows tho b邸, of lubernu, ,001.
3) A ,inglo pl,nt wa, to,tod individuolly, and tho contont wa, or.p,o,.ed by the'""'"'
ol 3 mmu,omoni.
<) Si.nd.,di,ed tubernu, ,oot w卒"lected and u父d ro, analysi,

Fig.8

-33-

Elution of forskolin by methanol
solution70

8

培養系を用いて高含有株を作出する場合、 選抜

6の内、附子のアコニチン系アルカロイドは採取時
期や栽培温度により大きく変動することを明らかにしてきたが、多くの植物において生育時期や生4

さ suaiu u n1qa�)（方法の選定は最も基本的な重要要件である。 生薬

育環境、また植物の部位等により有効成分が大き2

U !(O>{SJO J

く変動す る事は容易に想像出 来 る 。 こ のため
C. /orsko/Jliiに付いても育種研究をスタ ー トするにあたり、かかる基礎的な研究が必須となろう。
本植物 をインビトロ の 系でマイクロ プロパゲ ー
QO

<

Fig.9

10

, 20

30

40

Washing>< elutionー7
fraction number

シ ョンし育成した株を生育時期を追って定戴した

50

Elution profile of forskol1n

結果、根の成長が盛んとなる6週目から含最が暫時増加し、茎が急速に成長を始める11週から含羅増加が著しくforskol in含鱚が0. 5µg/mg dr. wt.
となることが明きらかとなったので、培養系で変TLCにより検討したのがFig, 10である。 この結果、異源を投与し、 少なくとも11週間栽培し、ELISA

大過剰のforskokinが洗浄溶媒で溶出すると共にでアッセイして、優良株を選抜するマニュアルを

関辿ジテルペン類や未同定の化合物等が吸着する

確立することが出来た。 本プロトコ ー ルに沿ってことなく溶出していることが明らかとなった。

現在優良株の選抜を実施中である。

完全に洗浄後、 溶 出 溶 媒 を添加す る こ と で次にバイオトロンにて栽培した株に付きELISA

forskol inが溶出していることが判明した。 なお、で詳細な検討を行った結果、従来はforskol inは

微晟の7-deacetylforskolinの溶出も認められた。

根茎に最も多量に含有すると信じられていたが、

4

考

察

本研究結果から茎にも多量含有され、その最は根茎との接点辺りが最も高含量であることを明確にした。 反対に根茎は上部程含絨高く、茎との接点

低分子化合物に対するMAbを作製するに当たり部位が最も含最が高いという新知見を得た。 これ

ハプテン ー キャリア ー タンパクの調製が必須であらの発見は実用栽培において原料部位を拡大し、るが、従来ハプテンの結合数の確定は困難であっ収量アップにつながる有益な知見と考える。

た。 本研究ではFig. 1に示すようなMALDIマスを測

アフィニテ ー カラムは極めて特異性が高いた

定 する事によりハプテン数を10と確定した。 まめ、租エキスから目的の化合物を一回のカラムでた、精製したIgGも同様にその精製度を確認 する

単離することが可能と考えられる。C. /orskolzli」の事が可能となり、MALDIマスの有用性が明確となっ

根茎や培接細胞・組織の抽出租エキスを本アフィた。

ニテ ー カラムに付す事により、forskolinを得る

本研究で開発したELISAのcross-reactivityは事が出来た。

類似化合物の内、7-deacetylforskol inが5, 6%でしかし、本MAbが7-deacetyl forskolinに対してあるのみで、他の化合物に対しては感作しておら約5% のcross-reactivity を持つ事から本化合物

ず、特異性の高いアッセイ系である。 また、測定がforskolin画分に微量共存して溶出された。 そ感度も高く、再現性も高い優れたアッセイ系と言こでこの混合物を4℃、 ピリジン中無水酢酸と反える。

応させることにより 7 -deacetyl forskol in を

-34-

植物培養細胞・組織による活性成分の生産と茂用植物の育種に関する研究ー特にForskolinD原料植物Coleus forskob/iiについて

TLC
0 0

令®

0 0

08

0Q 3

1-deoxyforskolln,
1 , 9-dideoxyforskolin

forskolin

6-acetyl7-deacetylforskolin

7-deacetylforskolin

washingbinding

elutionstructure
4
H HH
ROHOO

cc
R3
A
AHH

氏HHHAC

HH
’
HHoo
R

Fig. 10

1-deo�forskolin
1,9-dideo 沖forskolin
7-deacetyl orskolin
6-acetyl-7-deacetylforskolin

Identification of forskolin andits derivertives

forskolinへと変換し、純粋なforskolinを得る事

いる事は自明である。 しかし色素細胞化現象を促が出来た。 本法はforskolinの吸着容量9µg/ml

進する作用に付いては余り知られておらず、本研

ゲルで、回収率85%であった。 キャパシテーは大究の目的の 一 つがこの点にあることを述べた。 こ

きくないが、純粋なforskol inを必要とする場合、の分野の研究に付いてもforskol inが比較的容易

通常のカラムクロマトではかなりの回数繰り返しに得られる環境が出来たので、今後精力的に遂行梢製する必要があるか、本法を応用すれば一度のし、 コスメトロジ ー の領域に応用したいと念じてカラムで達成される。

いる。

5

また、forskolinは分子内にアシメ炭素を8個有する事から、光学活性体の合成は極めて困難と目総括されている。 このため本アフィニテ ー カラムによ
植物組織• 細胞培養技術を応用してforskol in

る光学分割の応用も考えられ、この応用面も進行高含有C. /o.rsko/Jliiの育種研究を展開中である。

中である。
ゼを活性化し、本研究では選抜の基本となる高感度で特異的、 再cAMPを増加することによりその生理作用は多岐に現性良好な、 また、 簡便なアッセイ法として、ー ゲットとなってMAbを用いたELISAを開発した。 これを基にミュ ーForskol inはアデニ ー ルシクラ ー
わたっており、医薬品開発のタ-35-

タントの選抜タイミング等を明確にした。 また、
マイクロプロパゲ ー ションで得られたクロ ー ン植4) Sakata R, Shoyama Y, Murakami H, : Pro­

forskolin を極めて簡便に単離する方法を確立し

cyclase activator, forskolin, Cytote­

duction of monoclonal antibodies andenzyme immunoassay for typical adenylate

物を栽培し、 または培養細胞の抽出租エキスからたことから、 forskolinの応用研究への道が開かれたと考えている。 また、 本研究結果からMAbが有用で多方面に応用が可能なことを認識する事が出来た。 現在アヘンアルカロイド 8) 、 ステロイ
ダルアルカロイド 9) 、 大麻成分 I Ol 等のMAbの作製へと進展中である。 また、 MAbの可変部分のcDNA
クロ ー ニング中で、をこの方面も進展中である。

謝

c/Jnology, 16 101-108 1994

5) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et al.

: Rapid analysis of small samples con­taining forskolin using monoclonal anti­
bodies, Planta Med. ,6) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et a 1.
: Relationship between the content of

forskolin and growth environments inclonally propagated Coleus forskohlii

辞

本研究がコスメトロジ ー 研究振興財団の助成金により成された事を記し、 厚くお礼申し上げまBriq.; Biotronic.s; 24 1-6 1995

7) Yanagihara H, Sakata R, Shoyama Y et al.
: Immunoaffinity column chromatography

す。

using antiforskolin monoclonal antibody

引用文献
1) Bhat SV, Bajwa BS, Dornauer H, et al.
: Structures and stereochemistry of new
labdane diterpenoids from Coleus /ors­
ko力Iii Briq., Tetrahedron left, 19 1669
-1672 1977.
2) Seamon KB, Kenneth B, Seamon HB, et al.
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3) Shoyama Y, Sakata R, Isobe R et al. :Direct determination of forskolinbovines e r u m albumin conjugate by matrix
assisted laser desorption ionization,
Org. Jlass Spectr., 28 987-988 1993

submitted. : 柳原、坂田、正山ら：抗forskolin

and its application, Anal, Chi勿， Acta
モノクロ ー ナル抗体のアフィニテイ ー カラムへの応用、 日本薬学会大115年会講演要旨集、P. 252 1995
8) Shoyama Y, Fukada T, Murakami H : Pro­
duction of monoclonal antibodies Anal.

Chim, Acta and ELISA for thebaine andcodeine, Cytotetec.加ology, in press, 1996

9) Tanaka H, Goto Y, Shoyama Y, monoclonal
antibodies based enzyme immunoassay for

Marihvana (Cannaloinoid) compounds, JI寧unoassay,

in press,

1996lO)Ishiyama M, Shoyama Y, Murakami H, et al: Production of monoclonal antibodies

and development of an ELI SA for solow­
argine Cytotec.加ology, 18 153-158 1996-36-

弾性線維蛋白質工ラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究
九州大学

理学部

甲斐原

梢

Extracellular self-assembly process of tropoelastin, as a key step of the elastogenes1s, canbe mimicked by the temperature-dependent coacervation of elastin-related polypeptides suchas tropoelatin, a-elastin, and block copolymeric model peptide, (Val-Pro-Gly-Val-Gly)n.
Homogeneous aqueous solutions of these polypeptides in low temperature become turbid withelevating temperature by the formations of coacervate droplets. Critical behaviors of the liquid­
liquid phase separation of bovine neck ligamental a-elastin-water system were observed by thelaser light scattering photometry. The critical point was determined to be near O.llmg/ml and
21.5℃ . In the critical region, the estimated hydrodynamic radius was decreased gradually withelevating temperature probably due to the hydrophobic interactions excluding water moleculesfrom the polypeptide assemblies. Then, the hydrodynamic radius increased sharply to induce
liquid-liquid phase separation. On the contrary at the region far from the critical point, gradualdecrease in hydrodynamic radius followed by the additional decrease to induce the phaseseparation. The temperature-dependent coacervation of elastin 寸elated polypeptides arecharacterized by these two types of dynamic behaviors. The same modes of molecular assembly
process were also observed by the rotary viscometric measurements for the critical and off­critical regions. The reduced viscosity of bovine neck ligamental crelastin solution was increased
with elevating temperature in the region near critical point until the liquid-liquid phase separation
was induced. While in the region far from the critical point, the reduced viscosity of aqueous erelastin solution was suppressed to constant levels with elevating temperature. Selective andspecific interactions of calcium ions and copper ions were employed as a tool to survey structureand function of the elastin coacervate. Low diffusion coefficient and high concentration of
calcium ions, seven times higher than that of magnesium ions, within coacervate phase were basedon the selective binding to the electrically neutral backbone Val carbonyl groups. These selective
interactions of calcium ions are tightly correlated with arteriosclerosis induced by the calcium
deposition on the arterial wall elastm. Novel interactions of copper ions with elastm coacervate
stabilized the microcoacervate droplet and the macroscopic phase separation to form coacervate
layer and upper layered equilibrium solution phase. Unique effects of copper ions seem to present
a key to clarify the molecular structural bases of elastomeric mechanisms

1

緒

言

ている。特に、 大動脈壁を構成している血管平滑筋細胞、

エ ラスチン、

コラ ー ゲンの中で、 正常血細胞外マトリックスとしての弾性線維蛋白質工

圧の発生、 維持に寄与しているのは エ ラスチンの

ラスチン は、 コラ ー ゲンに次ぐ量が生体に存在しみであり、 低い圧力では平滑筋細胞が優先的に機ており、 皮用、 動脈壁、 項靱帯等、持続的な弾性

能し、 一方、 高い圧力ではコラ ー ゲンが優先的にが要求される組織に於て、 弾性機能発現を支配し機能して血管壁の剛性が増すと共に弾性が低下
し、 いわゆる動脈硬化と呼ばれる状態になる事がStudies on Structure, Mechanism, and知られている。 即ち、 動脈硬化は、 エラスチンのFunction of Self-Assemblies
of Elastomeric Protein

質的、 量的な変化として捉える事が出来る。 又、胎児期に既に機能している大動脈の エ ラスチンに

Kozue Kaibara
Department of Chemistry, Facultyof Science Kyushu University

は、 加齢と共にカルシュウムやコレステロ ー ル等の脂質の沈着が進行して弾性機能が低下し、 寿命を決定する重要な因子となっている。

-37-

A

リシルオキシダ ー ゼ
+
Cuイオン

>

I
線維芽細胞

ft

規則的集合
態
配列状

トロボエラスチン

i ノ甘

鉗欠乏動物
8アミノプロビオノニトリルi

ふ配列

架橋反応

弾性線維

，

熱誓醸処理、熱アルカリ処理.
ヽ•ヽ....,_一................,,....................................................
,
ー.・．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．、............................................................,,,,,,,.-;........................
........●●●●●●●●....__,.,....-...-...............
;

i

一

プ←
モデルポリペl'_;

昌芦 〇 喜デルペプチド水溶液

コアセルベ ー ト
液滴コアセルベ ー ト
分離厖

人工生体
弾性線維

図1. 細胞外間隙での弾性線維蛋白質エラスチンの生合成過程(A)と温度依存性コアセルベーション(B)の対応
この様に、弾性線維の主要構成分として重要な

ン特有な繰り返し ペプチド配列に基づくプロック

機能を果たしているにも拘わらず、構造、物性、共重合型モデルポリベプチドであるポリペンタペ

機能の何れの面に於ても、エラスチンの特性の多プチド(Val-Pro-Gly-Val-Gly)"等がある。即ち、

くが未解明のままに残されている。その最大の理

これらのポリペプチドの水溶液は、室温以下の低

由は、 エ ラスチンが弾性組織のアルカリ処理残澄

い温度では均 ー な水溶液であるが、温度上昇と共として分離抽出される程に、極度に溶解性が低いに、 コ アセルベ ー ト液滴を形成して白洵し、更事にある。 エ ラスチン生合成過程は、図 lAに模式に、 ペプチドが高度に浪縮されたコアセルベ ー ト

的に示されるが、平滑筋細胞や線維芽細胞内で合下層とペプチド濃度の低い平衡液上層に分離す成された前駆蛋白質トロポエラスチンがエクソサる。

イト ー シスにより細胞外に送出され、規則的集合

細胞外マトリックスと して のエラスチンの弾

配列状態をとった後、銅イオンを補因子とするリ性、細胞遊走性等の多様な機能は、生体内自己組

シルオキシダ ー ゼによる分子内、分子間架橋反応

織化過程で確立される分子集合体の構造 特性にを経てエラスチンとなり、糖蛋白質であるミクロ依っている。従って、エラスチン関連水溶性ボリ

フィブリルと共に弾性線維を構成する。本研究のペプチド —水系の コ アセルベ ー ション、即ち、液ステップであるトロボー液 2 相分離特性を種々の手法により明らかにすエラスチンの自己集合組織化過程が、図1Bに示する事から、弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織エラスチン関連水溶性ポリペプチド ー 水系の温度化集合体の構造、物性、機能に関する知見を得る

基礎は、生合成過程のキー

依存性コアセルベ ー ションとして再現可能な事に事が可能である。

2

ある I> 。 コ アセルベ ー ションが観察されるペプチ
ドとしては、銅欠乏動物より抽出したトロポエラ実験

スチン（アミノ酸残基数-700個）、 トロボエラ
スチン相当の分子量を有するエラスチンの熱篠酸

ウシ項靱帯由来a —エラスチン及びポリペンタ

ラスチン、エ ラスチ

モデルペプチド 、(Val-Pro-Gly-Val-Gly) n を用処理可溶 化断片であるa

—エ

-38-

弾性線維蛋白質工ラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究

い、種々の測定に供した。モデルペプチドについ述べないが、ビデオ記録装置を備えた位相差顕微ては、九州工業大学情報工学部岡元研究室、佐賀鏡による粒径分布変化の観察等が、相分離後期過大学理工学部近藤研究室より提供して頂いた。試

程の・解析に有効である事を確認した。

料溶液は氷温下で調製し、冷蔵庫内に数時間静置
3

して均ーな水溶液とした。何れの測定において結果と考察

も、温度を一定速度で連続的に、あるいは、段階
3. 1

的に注意深く温度を上昇させながら、液ー液2相相分離挙動の光散乱法による観察と解析

図 2Aにウン項靱帯由来a — エラスチンについて、分離に伴う物性変化を観測した。

蛍光分光光度計により波長 400nmでの 90 度散乱光

実験は、通常の獨度測定等の分光学的手法によン ・ プ—
強度の温度及び浪度変化を示す。温度及びa 工

レ ー ト型回転粘度計による測定を行った。相分離

ラスチン濃度増加に伴い、散乱光強度が増加する

る集合体形成過程の追跡を行った他、コ

ー

光散乱測定

が、濃度により二相性の変化が見られる。図 2Bにについては、福岡大学理学部宮川研究室の御協力示す様に、測定で得られた曲線aをbとcに分解しを得た。液 —液 2相分離初期過程に対しては粘度及て見ると、曲線bの立ち上がり温度は吸光光度計

び光散乱測定が有効であるが、洵度増加やコアセで求めた同 一波長での溺度増加の開始温度と一致

過程の解析に威力を発揮するレ

ー

サ

ー

ルベ ー ト液滴形成を伴う相分離か進行した段階でする。これらの結果は、液 ー 液 2相分離を伴うエは適用不可能となるため、今回は結果についてはラスチンペプチドの集合組織化過程で、少なくとも二つの分子過程が進行している事を示していると考えられる。その詳細について調べ、生体内自

0.2:

．．

0
5
0

．．口 ’’゜ ，．．
a•

を行った八

．．

散乱強度Iの角度依存性の測定結果より、次式0.05 •••

を用いて相分離過程の臨界挙動に関する知見が得・;;;;;;;;(;;�:::::: ..。 ..
20

30

°

T/ C

られる 3 。
)

40

so
400

j a-Elostln: O.lmg/ml

r.
0
0
1

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゜「

-40

300

0
0
2

80

•�l:::一� �o
J

’

゜， ，

UIU/�

8

120

514. 5nmのアルゴンレ ー ザ ー を用いた光散乱測定

0.1. • •10B

己組織化過 程に関する 知見を得る ために、波 長

a-Elnstin: m助ml
0.4

0
0
1

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0
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． ......... ....-....

IO

20

30

゜

T/ C

10
40

20

゜

30

40

Tl C

50

図3. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液に於ける濃度揺らぎの相関距雌との濃度及び温度依存性

図2. ウシ項靭帯由来a エラスチン水溶液の90'散乱光強度の濃度及び温度依存性（詳細は本文参照）—-39-

I(q)= I(0)/(1 + f 2

(1)

qり

a-F.I●,i;n,mr,/ml

ここでqは、q=(4 冗 n/入） sin(0/2)(n、れる散乱ベクトルである。 I(O) は前方散乱光強度と呼ばれ浸透圧縮率に比例する量である。どは—
濃度揺らぎの相関距離である。 図3に種々のa 工．

。゜ Oo OO# ゜

100

・。 。
..
e・出ao叶立

ラスチン濃度に於けるどの温度変化の様子を示°10す。 濃度0. llmg/ml、温度21. 5℃付近でどの値が

゜° ゜

..

0.08
oo0oo ooo0°o o0oo
oo 0
Ooo 0 0.2
。 O O O OoOo
6ft
0
o
△ o•o

oo

OOo

..

0.11·

2

入、 0は各々、屈折率、波長、散乱角）で表わさ。

mu[ H.J.

300．．．．．．．．． ．

． ゜

20

00

°
。.s°。

＾

゜°
゜ Ooo臨0oo�Oggoo
゜

30

40

Tl C

発散傾向を示しており、濃度揺らぎが系全体に拡がり相分離へ向かう現象が示されている。この濃図5. 動的光散乱測定より求めた流体力学的半径のa — エラスチン涙度及び温度依存性（臨界濃度とその他の濃度での温度依存性の違いに注意）

度から離れるに従い、どの値は急激に減少し、濃度揺らぎの範囲が局所的である状態へと移行していく事を示している。 ウシ項靱帯由来a — エラス

r は平均緩和速度、ては緩和時間であチン — 水系の温度依存性コアセルベ ー ションが、

ここで、濃度0. llmg/ml、温度21. 5℃付近に臨界点を有す

り、 ぃ／戸は分散指数と呼ばれる。散乱粒子のー

る液 液2相分離過程である事は、図6Aに示す様

拡散係数D、及び、流体力学的半径 r は、以下のに、濃度0. llmg/mlに於いて、前方散乱光強度の逆数が温度21. 5℃付近で0に漸近することからも式で算出される。
D = f /q 2(3)

確認できる。種々の濃度に於いて、濁度測定より

r = kT/6 冗 T/ D

(4)

二相共存温度、前方散乱強度よりスピノ ー ダル温

ここでK、T、 nはボルツマン定数、温度、溶媒の度を求め、最終的にウシ項靱帯由米a —粘度である。図4に拡散係数、図5に流体力学的半

エラスチ

—

径の値を、臨界点近傍、臨界点から充分に離れた

次に、動的光散乱測定により得られた相関関数

点、更に両者の中間の点について得られた結果をg(r)をキュムラント展開し、相分離過程と分子示す。 臨界点近傍では、拡散係数は温度上昇と共集合体の特性を表わす諸量を求めた。

に緩やかに増加した後、急激に減少して相分離に

ン 水系の相図が決定される。

g(て） =exp [-rて+(µz/2!) r 門

至り、ほぼ一 定値を保持する。一方、臨界点から充分に離れた点では、緩やかに増加する拡散係数

a·El"H"'mg/ml
如u,riog心&'"印·

は、更に増加の度合を増して相分離に至る。 従っ

△

＾△

△
,. 0.8

2

1●
1

30

づく水分子排除による減少を経て、急激に進行す

08

0•
・
・
・
・
・

●

゜

Tl C

●
●

20

そらくポリペプチド分子間の疎水性相互作用に基

00
。
。
。
。
。

0

OA

A0

1

10

て、臨界点近傍での流体力学的半径の変化は、お

△

q

△

6

。

•
a
・
。o。
・
。
。
。 ・
。
●
b
o
●
q
o
。
0
q●
。
・
・
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^
•
°
C.

●〇

●0

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.
】
＾
。＾
・

．
．．
．
．
．
．

△

5

W:l 8'O I l d
z:

I'S

10

(2)

る分子集合による増加を伴って相分離に至ると考えられる。臨界点から充分に離れた点での流体力学的半径の変化は、拡散係数の変化に対応したニ40

図4. 動的光散乱測定により求めた拡散係数の
ex -エラスチン濃度及び温度依存性（臨界点近傍と臨界点から充分に難れた点での拡散係数の温度依存性の相違に注意）

段階の持続的な減少となっている。中間点に於ける拡散係数あるいは流体力学的半径の変化は、上に述べた二種類の分子集合挙動の組み合わせとして捉える事が出来る。図6には、臨界点近傍での種々の数値が示す特性をまとめて示した。

-40-

弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、機能に関する研究

A

15

•

2.0

1/. ......・(O)III

10

．

5
1

5

3

S·
E d lll/ U

0
0
3

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．
1

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0
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1

c
4

3
2

O Il d
8,

m:>
,

I's

20

゜

Tl C

60

40

図7. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液のD

粘度の濃度及び温度依存性（曲線1は純粋の粘度 、 矢印2 、 3は各々濃度0. 1 、 0. 4mg/mlに於ける相分離
温度25. 3 、 37. 3℃を表わす）
300

E U/J.

200

6.0

100

°

T/ C

30

40

0,

20

^
3

10

I'

(1,
竺 E p/p a.1

図6. 臨界点近傍での相分離挙動を表わす
諸星の温度依存件（縦釉の諸量については本文参照）

3. 2

粘度測定による分子集合挙動の解析

溶液内での分子集合挙動を調ぺる手段として

4.0

0.05

2.0

は、粘度測定も有効である。 少量の試料溶液で測定可能な事、 剪断応力を変化させた測定等、 微細0.00な細胞外間隙で進行する生体内自己集合組織化との対応が可能な事等を考慮し、 コーン ・ プレ

ー

ト

20

°

T/ C

40

60

型回転粘度計による粘度測定を行った。 種々の濃図8. ウシ項靭帯由来a — エラスチン水溶液の遠元
粘度の濃度及び温度依存性（グラフ内の数値はa — エラスチン濃度を表わす）

度のウシ項靱帯由来a — エラスチン水溶液について、 一定速度でコ ー ンを回転させながら、 温度を段階的に 1-3 ℃づつ上昇させながら粘度の定常値-41-を測定した。 相分離を起こすと思われる温度付近

100

1.6

では、特に1真重な測定を行った。
図7は、種々のa — エラスチン濃度での、温度にの様子を示す。 粘度はa エラスチン濃度減少及—び温度上昇に伴い低下するが、各濃度で特有な屈曲点が現われ粘度が更に低下しており、その温度1.2

Iで液 ー 液2相分離が起こった事を示している。 こ

1.4。

UdW /US·

対する コ ー ン回転数100回転／分での粘度の変化の結果を基に遠元粘度を算出し、温度に対してプ
ロットした結果を図8に示した。 相分離に伴う粘0.8度の変化が現われる温度は、還元粘度一温度プ
ロットでは、より顕著に現われている。 相分離以10後の系は、 コ アセルベ ー ト液滴が分散した不均一

20
°

30

T/ C

系であり、粘度測定の結果から分子集合挙動に関する知見を得る事は困難である。 図8は、臨界点

図9. 臨界濃度近傍でのウシ項靭報由来a — エ
ラスチン水溶液粘度のコ ー ン回転数依
存性（数値はコ ー ン回転数／分をあらわす）

から充分に離れた点では、還元粘度の値は温度に無関係に 一 定の値をとり液 ー 液2相分離に至るのに対して、臨界点に近ずくに連れて、還元粘度が3

温度上昇に対して増加する過程を経て相分離に至る事を示している。 温度上昇に伴う還元粘度増加
は、臨界点付近に於いて、最も顕著である。 これらの結果は、前節で述べた動的光散乱測定の結果に至るのに対して、臨界点から充分に離れた点では粒径は寧ろ緩やかに減少するとの結果と良く対U応している。
粘度測定と動的光散乱測定の結果の間の不一 致ー

老一

力学的半径が急激な増加をする過程を経て相分離

2I·� flllpから導かれた、臨界点付近では分子集合体の流体

は、液 ー 液2相分離の開始温度にある。 粘度一温。

度曲線あるいは還元粘度 — 温度曲線の屈曲点が示
す相分離温度は、何れの漉度に於いても、動的光散乱測定が示す温度に比して、高温側へ移行して10いる。 例えば、臨界点付近のa — エラスチン濃度

20

゜

30

Tl C

0. llmg/1111では、光散乱測定では21._5 ℃であるの

図1 0. 臨界濃度近傍に於けるウシ項靭帯由来
a — エラスチン水溶液の選元粘度のコ ー ン回転数依存性に対して、粘度測定では、25. 5℃へと相分離開始
温度が上昇した。 その原因は、測定時に試料溶液にかかる剪断応力の有無にあると考えられる。 そこで、回転粘度計コ ー ンの回転数を変化させる事

分離開始温度の変化を観察した結果を、図9とにより、異なる剪断応力場中での粘度測定から相図10に示した。 コ ー ン回転数を100、50、20、10-42-

弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、物性、 機能に関する研究

回転／分と変化させるに連れて、粘度の減少と共チンコアセルベ ー トと選択特異的な相互作用をすに、液 ー 液2相分離開始温度が低下 する事が示さる金属イオンは、分子構造解明の有用なプロ ー プ

れている。剪断応力場中での相分離、いわゆる流となる。

動誘起相分離については、種々の測定法の検討がカルシュウムイオンは、動脈壁エラスチンヘの行われ、解析法についても未だ確立されるに至っ沈着が動脈硬化の素因となっている事からも、エていないが、弾性線維蛋白質エラスチンの自己組

ラスチンコアセルベート との相互作用の詳細を明

織化集合体の構造、物性、機能に関する研究に於らかにする事が重要である。エラスチンコアセル

いても、又、生体内自己集合組織化過程の詳細をベート中の輸送現象について、 ナトリウム、 マグ

知るためにも重要であり、現在、粘弾性穎微鏡をネシュウムイオンとの比較を行うと、カルシュウ

用いた研究を始めている。 粘弾性顕微錢は、倒立

ムイオンは、拡散係数か小さく、生理的イオン濃

ー

ン・

ー

度条件下に於けるコアセルベ ー ト内の濃度は、 マ

トアタッチメント付回転粘度計を装着した 装置でグネシュウムの7倍に達した。 このようなカルシュ

あり、細胞外空間の特殊な環境を、ある程度再現

ウムのエラスチンヘの結合は、C-13ラベルを施しし得ると考えている。

たモデルボリペプチド (Val 1-Pro 2 -Gly 3 -Val 4-型顕微鏡のステー

ジ上に、透明なコ

プレ

Gly り n を用いたNMR測定の結果から、選択特異的
3. 3

エラスチンコアセルベートの特異な挙動

生体中に最も多量に存在する蛋白質はコラに3位と5位のグリシンのカルボニル基を介していーゲる事が示された。 即ち、 カルシュウムイオンは、ンであり、 ゲル形成を始め、種々の生化学的、物

ペプチド骨格鎖の電気的に中性なカルポニル基に理化学的特性が活発に研究されて来た。

方、 エ

強固に結合していると考えられる。動脈壁 エ ラス

ラスチンは動脈硬化に深く関わる蛋白質である事

チンヘのカルシュウム沈着による弾性低下機構解から、病理学等、基礎医学的な研究は精力的に行明は、弾性発現分子機構自身を解明するための有

われてきたが、基礎科学的な研究は、エラスチン

力な手掛かりを含んでいるはずであり、更に検討の最も重要な弾性機能発現の分子機構についてもを続けている。

一

確定的な結論が得られていない程であり、多くの弾性線維蛋白質 ー 水系の液 ー 液2相分離に対し課題が残されている。前駆蛋白質トロポエラスチて、 一般的に、アルカリ金属及びアルカリ土類金ンやモデルポリペプチドを用いた架橋重合実験の属イオンは促進効果を示すのに対して、遷移金属

ー

液2相

イオンは抑制効果を示すが、中でも、銅イオンは分離を伴う分子集合過程、即ち、温度依存性コア

相分離温度を数10℃以上も上昇させる顕著な作用

セルベ ー ションを経た場合のみが、弾性機能を有を示した。 更に、銅イオンの最も特徴的な効果する線維様生体高分子が得られる事が報告されては、液 ー 液2相分離過程で、コアセルベート液滴いる。 従って、 エ ラスチンコアセルベ ー トの構造

状態を安定化させ、コアセルベ ー ト下層と平衡液と物性は、弾性線維蛋白質としての多様な機能の上層への分離を阻止する作用にある。ESR測定の基礎となる構造と物性に対応していると考えられ結果、エラスチンコアセルベートはマンガンイオ

る。我々は、種々の金属イオンが相分離挙動や工ンとは配位結合をしないのに対して、銅イオンとラスチンコアセルベ

トの物性に与える影響につは四面体型 の 配 位構造をとる事、上 に述べた

いて各種の測定を行い、各種金属イオンとの相互

C-13ラベルモデルポリペプチドを用いたNMR測定

作用の解明から、弾性発現の基礎となっているエで、銅イオンの磁性によりカルポニル炭素のケミ

ラスチンコアセルベ ー トの構造に関する検討をカルシフトが消失していく中で、2位のプロリン

結果 より、単純な重合過程ではなく、液

行っている

4)

ー

。特に、以下に述べる様な、エラスのシグナルのみが保持される事が、明らかとなっ-43-

た。 このような銅イオンの特異な作用は、 エラス

Soc. .Ip几， 60 1468 1991 : K. Miyakawa,

チンコアセルベートの構造に関する何らかの情報

K. Ito, and K. Kaibara, ./. ?,力'YS. Soc.

を与えており、 又、 架橋酵素リシルオキシダーゼの補因子としての銅イオンは、 前駆蛋白質トロポ.fpn., 62 25 11 1993 ; K. ldiyakawa, M.
Totok i, and K. Kaibara, .8jopo/ymers,

エラスチンの自己集合組織化の重要な役割を果た

35 85 1995
3) H. E. Stanley, "Introduction to Phase

している可能性もあると考えている。

Transitions and Critical Phenornena" ,Oxford Univ. Press, London, 1971.

参考文献
1) K. Kaibara, K. Okamoto, and K. Miyakawa,

4) K. Kaibara, K.Sakai, K.Okarnoto, Y. Uernura,in "New Functionality Materials, Volume
B : Synthesis and Function Control of

K. Miyakawa, and M. Kondo, .8jopo/ymers,
32, 1173 1992 ; K. Kaibara, Y. Akinari,

Biofunctional ity Materials" (T. Tsuruta,

K. Okarnoto, Y . Uernura, S. Yarnarnoto,

M. Doyarna, M. Seno Editors), Elsevior

H. Kodarna, and M. Kondo, .8jop Jymers,
3 9 ifl the press. Cl995)

Science Publisher B. V., 281 1993
2) K. Miyakawa and K. Kaibara, J. 月!Jys.

rヤ

-44-

゜

バイオシグナル分子を固定化した細胞成長促進ハイブリッド材料の合成
伊

京都大学

工学部

藤

嘉

浩

Insulin or epidermal growth factor (EGF) was conjugated with synthetic polymers. One wascoupling with water-soluble polymer, poly(acrylic acid), another immobilized on water-insoluble
polymer, poly(acrylilc aicd)-grated polystyrene film or surface-hydrolyzed poly(methyl
methacrylate) film. While conjugation with poly(acrylic acid) slightly altered the mitogenic
activity of the polypeptides, immobilization on films significantly enhanced the effect. Small
amounts of immobilized insulin and EGF (1 to 10% of the required amount of native insulin andEGF) were sufficient to stimulate growth of mouse fibrobalst STO cells and Chinese hamster
ovary cells overexpressing EGF receptors, respectively.

1

緒

Cell commumcat10ns

呂

多細胞生物は、細胞間、コラ ー ゲンのような細胞間基質、及びホルモン・サイトカイン ・ 成長因子などのバイオシグナル分子の3つの様式で制御され、細胞社会（組織）を形成している(Fig. 1)。
このなか で、最後のバイオシグナル分子による制御だけが溶解状態で行われる

1)。 はたして固体状態でもこの情報は伝達されうるのであろうか。
本研究では、 バイオシグナル分子としてイン乙△乙シュリンと上皮細胞成長因子(Epidermal growth

Extracellular Matrices

factor, EGF)を選び、これらを、種々の合成高
Fig. 1分子とハイプリッド化し、その細胞成長促進活性を検討した。

2実験Hormones
Growtb Factors

細胞機能
細胞間、 細胞間基質、 そして溶解状態のパイオシグナル分子とのコミュニケーションで制御される。

合成した。 インシュリン、ポリアクリル酸（分子インシュリン ・ ハイブリッド材料の合成

量、15、000)、ポリスチレン、アクリル酸モノマ

Fig. 2に示すような二種類のハイプリッド体をーは、シグマ、シグマ、和光純薬、ナカライ・テ

2. 1

スクから各々購入した。
Design and Synthesis of Biomaterials
Hybridized with Biosignal Molecules
to Enhance Cell Growth

インシュリンとポリアクリル酸とのカップリン
グ反応は以下に示すように行った(Fig. 2a)。 まず、ポリアクリル酸の水溶液(200µg/ml)に水

Y oshihiro Ito

溶性カルボジイミド (lmg/ml)を加え、4℃でFaculty of Engmeenng,
Kyoto University

24時間反応させた。 過剰のカルボジイミドは限外濾過で除去した。 このように活性化したポリアク

-45-

h

c

ct
s

g
＂
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08
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OH
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OOCo

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．
4

OOH

COOH

(lmg/ml) を含む種々の濃度のインシュリン水溶液中に 4℃で48時間浸せき し、 固定化を行った。
反応後、 インシュリンの放出がなくなるまで洗浄
1 2 s Iラベル
した。 固定化量の定量、 洗浄 の確認は化インシュリンを用いて行った。

2. 2 EGF ハイブリッド材料の合成
Fig. 3に示すような二種類のハイプリット体を合成した。 EGF 、 ポリアクリル酪（分子量、 15 、 000)
ポリメチルメタクリレ ー トは、 東洋紡、 シ グマ、Fig. 3 EGFとポ

アルドリッチから各々眺入した。

rー

行った (Fig.3a)。 ポリアクリル醗 (250µg/rnl)•-―

リアクリル酸のカップリン グは以下に示すように(5mg/mlを混合し、 室と水溶性カルボジイミド(ius -PAA)

温で30 分間反応させた。 限外速過で未反応のカル
COOH(ins-PSI)
Fig. 2化ポ リ ス チ レ ン 膜 を水 溶 性 カルボジイミド

贔

◎

や

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＇

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＇•
＇•
•
＇

b

a

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PSl

で）洗浄した。 洗浄したボリアクリル酸 グラフト

本研究で合成したインシュリン複合体の合成スキ ー ム(a)ポリアクリル酸とインシュリンの結合、(b)ポリアクリル酸クラフト化ポリスチ
レン上へのインシュリンの固定化。

ポジイミドを除去した後、 EGF (300µg/rnl) と4 ℃で24 時間反応させた。 生成物は限外濾過で梢製した。

EGFの表面加水分解ポリメチルメタクリレ ー ト
膜へ固定化は以下に示すように行った (Fig.3b) 。
まず、 ポリメチルメタクリレ ー ト膜は、 トルエン
WSC

COOH

リル酸水溶液にインシュリン (2mg/ml) を加え、

�

4 ℃でさらに 24 時間反応させた。 さらに活性化カ
ルボキシル基を除くためにグリシン ClOmg/ml)

PAA

.

EGF

..

亨◎
EGF-PAAを加え、 4℃で6時間反応させた。 合成したハイプb

リッド体は限外池過により精製した。
インシュリンの膜への固定化は以下に示すように行った(Fig/2b) 。 まず、 ポリスチレン膜を室

温、 0. 05Torrの減圧下で、

NaOH

wsc

4·c, 2h

閉:Bh

己二’→�二→�→�二
50℃, 90 min

200wの電力でグロ ー 放

電処理 を行った。 クロ ー 放電処理した膜を、 予めPMMA精製し 、 水 溶 液 にし た ア ク リ ル 酸モ ノマ ー

(20wt%) に浸せきし、 脱気し、 窒素置換して封Fig. 3管した。 これを60℃で2時間加熱することにより、
ク� ラフト重合を行った。 反応後、 モノマ ーの溶出がなくなるまで (pH 変化が観測されなくなるま

-46-

4

EGF-PMMA

本研究で合成したEGF複合体の合成
スキ ー ム(a)ポリアクリル酸とEGFの結合、(b)表面加水分解ポリメチルメタ
クリレ ー トヘのEGFの固定化。

パイオシクナル分子を固定化した細胞成長促進ハイプリヅド材料の合成

且 nf
g
n
g
<g8L.CI
9(
0 n9'
h
enq[E
さ麿 u9E(からキャストして得た。膜は4MNaOH水溶液中に

国

50℃で90分間浸せきすることにより表面加水分解を行った。10wt%クェシ醸水溶液中で中和した後、pH変化がなくなるまで十分に洗浄し、固定化反応に供した。膜を水溶性カルポジイミド(5mg/ml)水溶液に4℃で2時間浸せきし、続いて種々の濃度のEGF水溶液中に4℃で48時間浸せきー

ベッコ変法イ ー グル最少必修培地あるいはHam
F-12培地で37℃、5 %炭酸ガス雰囲気下、90%湿

10

15

20

Retention time (min)

度のもとで培養された。 培養後、細胞内のDNA量

F1g.S ポリアクリル酸と結合したEGF (b)のHPLC溶出パターン(a)生来のEGF 、 (b)未精製 、(c)精製ポリアクリル酸結合EGF。
矢印は標準に用いたタンパク質のビ ー ク位置を示す。

を1'、6 ー ジアミジノ ー 2 ー フェニルインド ールで染色し、蛍光法により定星した。

3

士口
租

果

ハイプリッド材料の合成

5゜を用い測定した。各々の細胞は、無血清のダルc

プリッド材料は、EGPレセプタ ー 過剰発現CHO細胞b

進活性は、 マウス繊維芽細胞STOを用い、EGPハイ

ポリアクリル酸がカップリングした複合体のa

細胞成長促進活性の測定

インシュリン・ハイプリッド材料の細胞成長促

3. 1

ー

0且 ＜
E O8N苔 8 日ぷ』

2. 3

ー

EGFを用いて行った。

ーした。固定化後、非固定化EGFがなくなるまで洗I浄した。固定化羅、洗浄の確認は 2 5 Iラベル 化

HPLC測定の結果をFig. 4、5に示す。溶出パタ ー ン
から、インシュリンとEGF のハイプリッ・ド体の分a

約4分子のインシュリンが1分子のボリアクリル
酸と、約1分子のEGFが1分子のポリアクリル酸と結合していることがわかった。

b

Euga iea gueqJ
osqv

子量は各々約4万と2万と見積もられた。

ハ イプリッド体の結合比が異なるのは、 仕込み比が異なるためと考えられる。
Fig. 6には仕込み量と、膜への固定化量の関係510を示す。インシュリン、EGFともに仕込量の増加

15に伴い、固定化量も増加した。

Retention time (min)Fig. 4 ポリアクリル酸と結合したインシュリンのHPLC溶出パタ ーン(al生来のインシュリン、(b)ポリアクリル酸結合インシュリン。

3. 2

ハイブリッド体の細胞成長促進活性

修飾成長因子存在下での細胞成長を調べた結果

-47-

0.4

0.2

100

200

400

300

3.5
3.0
UO!
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BlOdlOOU)

a

0.6

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8s U!Ip ;iq1ospB

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0.8

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600

500

2.5

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Insulin concentration (µg)

10

゜

10

1

10

2

Amount ofinsulin (µg/well)

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100

b

b

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5

10

15

20

゜゜

25

EGF concentration in feed (µg/ml)
FI g. 6�

インシュリン(a)とEGF (b)の仕込み

Fig. 7濃度と固定化量の関係
インシュリンはポリアクリル酸グラフ
ト化ポリスチレン膜上に、 EGFは表面

50

100

150

'500

1000

1500

2000

2500

EGF(nglwell)
ハイプリッド化インシュリン(a)とEGF(b)をFig. 7 に示す。 インシュリン ー ボリアクリル酸の細胞成長促進活性(a): 生来のインシュリン（▲) 、 ポリア
クリル酸結合インシュリン (0) 、固定化
インシュリン（●） 。 (b) : 生来のEGF(●） 、
ポリアクリル酸結合EGF (0) 、 固定化EGF(A)。 インシュリン存在下ではマウス繊維
芽細胞STOをEGF存在下ではEGFレセプタ ー 過剰発現チャイニ ー ズ ・ ハムスタ ー 卵巣細胞を48時間培養し 、 それぞれ表面加水分解ポリ

ハイプリッド体は生来のインシュリンより若干高

メチルメタクリレ ー ト膜、ポリアクリル酸

い細胞成長促進活性を有した(Fig. 7a) 。

グラフト化ポリスチレン膜上での細胞数を1として相対1直として表した。

加水分解ポリメチルメタクリレ ー ト膜
上に水溶性カルポジイミドをカップリング剤として固定化された。

そして固定化インシュリンは1/10から1/100の理活性を有するようになった(Fig. 7b)。EGFの

考

察

4

漉度で生来のインシュリンあるいはそれ以上の生場合は、 ポリアクリル酸が結合することにより若インシュリン、EGFともに固定化により細胞成

干i舌性は低下したが、 固定化によりインシュリン

長促進活性は飛躍的に増大した。 非常に低濃度での場合と同様の効果がみられた(Fig. 7b)。

高い成長促進活性を有するのは、 膜表面の局所濃度が高く、 細胞と有効に相互作用する濃度が高く-48-

パイオシグナル分子を固定化した細胞成長促進ハイプリヅド材料の合成なるためと考えられる。

リッド化は、 これまで非常に多くの研究がなされまた低濃度で有効なばかりでなく、 最大の促進効果も固定化バイオシグナル分子の方が高くなった。 これは、 固定化により、 レセプタ研究 はなかった。 本研究は、

ハ イオングナル分子のダウンをどのような形態の合成高分子とハイプリッド化

ションが抑制されるためと考えられする かによって大きく活性が異なってくることをる 2) 。 この際、 インシュリン固定化より EGF 固定

明確に示した。 本研究の知見は、 今後のハイプ化の方が細胞成長に対する効果が大き かったのリッド生体高分子の設計に有意義であろう。

ー

レキュレ

ー

てきたが、 その作用機構や効果について統一的なー

は、 後者の細胞は EGF レセプターを過剰発現して引用文献

おり、 EGFの影響を受けやすいためと考えられる。
インシュリンとポリアクリル酪のハイプリッド体の活性が生来のインシュリンより高くなったのは、 EGF 複合体の場合と異なり、 ポリアクリル酪1)伊藤嘉浩、：細胞増殖因子固定化材料による無血清細胞培養、 組織培養、
2) Ito Y, Zheng J,

19 520-524 1993

Imanishi Y, Yonezawa K,

1分子がインシュリンを複数分子有する多価リカ

Kasuga M, : Protein-free eel 1 culture on

ンドとなって、 レセプタ ー 凝集を促進して活性化

an artificial substrata with covalently

を誘起しやすかったためと考えられる。

i mmobi 1 i zed i nsu 1 in, Proc. が'atI. Acad.

バイオシグナル分子と合成高分子とのハイプ-49-

Sc1:, !IS/4 93 3598-3601 1996

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸yー リノレン酸の
高等植物における多量生産
九州大学

射

理学部

場

厚

Vegetative oils are of economic importance as human and animal foods and m many
mdustrial applications. As the fatty acid compositions of most vegetative oils are not optimalfor these uses, there is a broad interest in controlling the fatty acid compositions of higher plants.
w-3 fatty acid desaturase, which catalyzes the conversion of linoleic acid (18:2) to Iinolenic acid
(18:3) in lipids, are located in the microsomes and plastid membranes. Transgenic tobacco plants
were produced that express the transcripts of a tobacco microsomal w-3 fatty acid desaturase
gene (NTFAD3) in antisense and sense orientations under the control of the califlower mosaic
virus 35S promoter. The antisense construct has the 0.5-kb fragment of the NTFAD3 cDNA
containing a 3Lflanking region and a part of the coding region in antisense orientation. The
antisens-transformant lines showed decreases of the steady-state NTFAD3 mRNA level to 30%of the control plants. In these lines, the 18:3 content decreased to about 80% in root tissues andto about 70-80% in leaf tissues when compared with the control plants. The sense construct has
the 1.4-k厨ull-length cDNA of NTFAD3. In one of the sense-transformants lines, the 18:3 content
increased by about 1.5-fold in root tissues and by about 1.1-fold in leaf tissues. These results
indicate that the up- and down-regulation of the transcript level in the microsomal w-3 fatty
acid desaturase gene is useful to modify the 18:3 content in the vegetative tissues of加gher plants.

1

緒

長されると考えられている 1 . 2) 。

言

r- リノレン酸の直接摂取は、 このような状況の予防に役立つこ7ーリノレン醗は必須脂肪酸（ビタミンF)の一とが期待されるが、 通常の植物から摂取される機種として知られており、 植物中に主として存在しているリノール酪がプロスタグランジン (PG 〉に会はほとんどない。 現在、 7 ー リノレン酸は月見草種子から抽出された油脂として市販されている

転換する中間物質である。 したがって、 rーリノ

が、 品種改良されて作られた月見草種子は海外のレン酸は必須脂肪酸としての生理機能とともに、一部企業に独占され、 生産量も少なく価格も高

PG 合成の前駆物質としてPGの持つさまざまな生理作用に関与している。 一方、 糖尿病、 ガン、 ウイい。 また、 最近微生物（糸状菌）によるr — リノレン酸の生産も行われているが、 グルコースなど

ルス感染、 老化などは、 プロスタグランジン前駆の炭素源に対する油脂生産の収率（対糖収率）は体の生合成経路において、 その律速段階であるリノ ール酸からrーリノレン酸に変える不飽和化酵

高だか30%で、1キログラムの油脂を作るのに3キ素（△6脂肪酸不飽和化酵素）の活性を弱め、 そ

糖質価格では、 糖質からの油脂生産は大豆など のの結果、 PG合成が抑制され、 さらに健康障害が助

植物油にコスト面で太刀打ちできないのが現状でログラムの原料が必要である。 それゆえ、 現在のある。 本研究においては、 高等植物における r­
リノレン酸生成のキーエンザイムである△6脂肪Modification of fatty acid composi­tion by over and antisense-expressionof a microsomal w -3 fatty aciddesaturase gene in transgenic tobacco

研究技法の開発を行った。 また、 遺伝子工学的手Koh Iba法を用いて、 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高等植

Faculty of Science
Kyushu University

物に導入し、 不飽和脂肪酸組成改変の可能性につ酸不飽和化酵素遺伝子をクロ ー ニングするためのいて検討した。

-50-

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪醸rーリノレン陸の高等植物における多盈生産2

グリセロ ー ルを加え ー 80℃で保存した。植物体に験実存在する脂肪酸不飽和化酵素タンパクと類似の構
2. 1

形質転換タバコの作製造を持つペプチドは、上記特異抗体を用いてウエ

Hicotiana tabacu.屈 cv.SR-1株をTiープラスミドバ

スタンプロ ティング法により解析した。

イナリ ー ベクタ ー を持つAgrobacteriu.幻 tumefaciens
LBA4404 を用いて、 リ ー フディスク法により形質
転換した

3)

。Ti

ー

3

結果と考察

プラスミド バイナリ ー ベクター
3. 1

は、コ ントロ ー ル としてpBI121、また図lに示す

w-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入によように、pBI121のT-DNA領域におけるカリフラ

る高等植物におけるa: ー リノレン酸含皇のワ ー モザイクウイルス35Sプロモ ー タ ー の下流に制御

タ バコ 小胞体局在型w-3脂肪酸不飽和化酵素遺

w-3脂肪醗不飽和化酵素遺伝子は、 小胞体膜と伝 子(HTf'Af}J)をセンス、アンチセンスの向き

葉緑体膜にそれぞれ局在し、 リノレン酸などのジに挿入したコンストラ クト（それぞれ、pTFlS、

エン脂肪酸からa ー リ ノレン酸などのトリエン脂

pTFlAS500)を用いた。再生したシュ ー トから形肪醗へ直接不飽和化する酵素である。 一般に、高質転換個体 を カナマイシンに よ り選抜した 。

等植物においては、小胞体局在型酵素を/?Ai汐逍Primary transformants(RO)を自家受粉させ得

伝子、葉緑体局在型をFAP7およぴFA加遺伝子がら れ た R l 種子を2 6 ℃に お い て連続光照射下それぞれコ ー ドしている 5) 。Tiプラスミドバイナ(3000lux)MS培地により発芽させた。

リ ー ベクタ ー (pBI121)のT-DNA領域におけるカリフラワ ー モザイクウイルス35Sプロモ ー タ ー の

2. 2

下流にタバコ 小胞体局在型w-3脂肪酸不飽和化酵

脂質脂肪酸の解析とノ ー ザン解析

素遺伝子(#TFAP.J)をセンス、アンチセンスの

Rl植物の葉組織に含まれる不飽和脂肪酸はガス
クロマトグラフィ ー 法により分析した

4)

向きに 挿 入 し た コ ンストラ クト（それぞれ、

0

、実験の項
pTFlS、pTFlAS500)を作製し(Fig. 1)

ノ ー サン解析用のRNA(ト ー タルRNA)は、26℃で述べたようにアグロバクテリムを介したリ ー フ

で30日間生育させた幼苗から調製した。

ディスク法にタ バコに導入した。pTFlAS500(ア2. 3ペプチド特異抗体の作製とウエスタンブロ

ンチセンス）を導入した形質転換植物は26系統得

ティングによる解析

られ、それぞれの脂肪酸組成を調べた結果、3系ペプチドシンセサイザー

統(AS5、AS9、AS18)においてトリエン脂肪酸のを用いて合成した人工ペプチドを、架橋剤N-(e -maiermidocaproyloxy)。特に、AS5系
著しい減少が観察された(Fig. 2)

succinimideを用いてヘモシアニンに結合させた。

統においては、18 : 3含量は根組織で6%、葉組織

ペプチドが結合したヘモシアニンは、セファデッ

で14%の減少がみられた。 一 方、pTFlS(センス）クスG-25を担体に用いたゲル クロマトグラフィーを導入した形質転換植物は7系統得られ、そのうによって精製・濃縮した。 この抗原にアジュ バン

ち4系統(Sl, S7, SlO, Sl4)において、トリエ

ジ ランドホワイト・ン脂肪酸の増加が観察された(Fig.3)。特に、

オス·3kg)に注射した。抗原の接種後、2週間おSlO系統においては、18 : 3含量は根組織においてきに3回続けてアシュ ハントを加えた抗原をさら10%以上の増加が確認された。

トを加え、ウサギ（ニューーに接種した。 初回の接種後、1週間目から採血をこれらのトリエン脂肪酸含量の変動と、 導入さ行い、l晩室温で保存した血液を遠心分離によっれた遺伝子の発現量との関係を調べるためにノ ーて血清を取り出し、フィ ルタ ー 滅菌の後、等量の。センス形質転換植物
ザン解析を行った(Fig. 4)-51-

CaMV 35S

NtFAD
:�

200 bp
I
I

�
-

Fig.1

22

゜

一

�18
00

1
6

1

1

2

て

Fig.2

NtFAD3pTF1AS500

NOS-ter

B

゜ ゜
8 ゜
゜
゜ ，゜ 8 ゜゜゜ ゜ ゜ ゜゜゜'-'ENOS- r;

Structure of chimaeric genes for expression of NTFAOJ in sense andantisense orientations. The sense construct, pTFlS, contains a fulI­
length cDNA of NTFAOJ. The antisen·se construct, pTF1AS500, contains a
0.5-kb fragment of the NTFAOJcDNA in antisense orientation behind the
CaMV 35S promoter. The translation initiation codon (ATG) of the NTFAOJ
cDNA are shown, and the 3'-f\anking regions are indicated by cross­hatching. Restriction sites shown are for BamHI (B), EcoRI (E) and Sac\1(S). NOS-ter indicates the terminator from the nopaline synthase gene.

A＾ふ゜ 20

pTF1S

冨蘊謳饂

,.,

CaMV 35S

E

B
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B

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〗
゜

＾ふ゜ 60一゜゜ ゜゜，゜ ゜゜゜10 13 23 5
A STransgenic line

，

゜ 8 ゜

§

§

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40

30

18

゜
8

1
1
I

2
I

で

＇

10

13 23 5
A STransgenic line

゜ §
゜
゜゜
，

18

Contents of 18:3 in antisense transgenic plants with pTF1AS500. Contentsof 18:3 in molar percentage of total fatty acids in whole roots (A) andin whole fourth leaves (B) of 30-day-old kanamycinresistant Rl seedlingsof the antisense transgenic plants. Each open circle represents the 18:3
content of a single transformant (n = 3 or 4). Control transformants with
pBl 121 (Cl and C2) are incIuded for comparison.
-52-

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸7 ー リノレン酸の高等植物における多量生産

35

1

A

i」

§゜

21�
15

Fig. 3

1

I

2
I

C-

7

STransgenic line
I

＇

10

B

|。
゜
60
゜ 1。

゜

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...

ふ

一

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゜

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8

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2

1

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E
、50-

゜
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C'>

4030

14

＇

1

ー百―

STransgenic line

10

14

Contents of 18:3 in sense transgenic plants with pRFlS. Contents of 18:3
in molar percentage of total fatty acids in whole roots (A) and in whole
fourth leaves (B) of 30-day-old kanamycin-resistant Rl seedlings of thesense transgenic plants. Each open circle represents of the 18:3 content
of a single transformatnt (n = 3 or 4). Control transformants with pBI 121(Cl and C2) are included for comparfson.

NtFAD3 RNA�antisense RNA

..,.

Fig.4

70

゜
゜
゜
゜ ゜
゜
゜
゜゜゜

C—2
1

10· 1323

9-5 10—s- 14

100 107

91

138

26

27

AS-

戸ロ
71

805 687

RNA gel blot analysis of the !l'TFA!JJcDNA. The transgenic line is shown above
each lane. The steady-state level of the NTFA!JJmRNA is given as a percentageof that in the control plant Cl below each lane.
蓄積は殆ど見られなかった。これらの知見は、形体(S10とS14)においては、””加のmRNAレベ
ルは、コントロー増加が見られた。

質転換タバコにおけるトリエン脂肪酸レベルの増

ル植物体と比べおよそ7-8倍の一減を、内在性あるいは導入したw-3脂肪酸不飽和方、アンチセンス形質転換植化酵素遺伝子の発現量を調節させることによって物体で、特にトリエン脂肪酸含量の低下が著しい
系統(AS5, AS9)においては、A'TFAfJ.JのmRNAの-53-

人為的に制御可能であることを示している。

脂肪酸不飽和化酵素に対するペプチド特異6>(Fig. 5) 。この配列は他の植物種からクローニ

シロイヌナズナからクローニングされたw-3脂

保存されていた。このため、植物から原核生物でよびラン藻からクローニングされた△ 12脂肪酸不不飽和化酵素の機能に必須な共通領域であること

3. 2

ングされた脂肪酸不飽和化酵素遺伝子においても抗体の作製あるラン藻まで多種の生物種にわたって、脂肪酸

肪酸不飽和化酵素遺伝子(/i'AJJ,J, fi'AJJ1, /i'AJJ8)お飽和化酵素遺伝子(JJ£SA)のDNA配列から推定さが推定された。筆者らはこの領域において、N端

基中11ア ミ ノ 酸が一致す る領域を見い出したに対するペプチドをペプチドシンセサイザーを用側から10番目までのアミノ酸配列(FVLGHDCGHG)

れたアミノ酸配列を比較した結果、13アミノ酸残

9ゆ7.

1

rゆ7. 61
FAD3.
紐Gl.
D言SA・

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DESA・ 9ヽ＇ゆ7.181＇心3.116紐Gl.115
口SA.108

ヽ

7.2 1
FAD3.176
紐Gl.175
OBSA・168＇ゆ60

GBLLBSSILVPYBGWRISBRTBBQNBGI:匹NDBSWBPMSE!tIYNTLD!tPTRn'RFヰPLV 240••I ・ ・ ・F ·・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・・ ・ ••V·LP ・ ·L ・ ltN•PBS ・ :ML•Y•V· •P 175··I ・ .·L ・ ・ .·N ・ ・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ X ・ ・••V•LT ・ •V•ltN ・ •OM ・ ·ML•YSF•FP 174••IAFAPLIY ・ F•S ・ •ユ•OB ・ ·LBTN!tI•V ・ 皿•O•W•VBAF(込SP紅 V•L•YRAIRGP 167
・・

M-LAYPFYLWARSPGUGSBYBPOSOLFL匹RltDVLTSTACW'l'AMAAヰVCLNFTIGP- 298·-····I ・ ・ ·Y ・ ・ ... :g ・ ・ ・ PN·Y·S ・ ·A·S ・ ••LIA ••·T ・ •SI·L•T ・ ·Y• S•LVD·- 233
I-F·・ ・ ・ ・ ••N ・ ・ ・ ・ ·B ・ ••PN·Y•N ・ •S•G ・ ・.• G•V•••L ・ •GIVLSV·LY•SL ・ ・ ・ ·- 232!'WWTGSIPB·------SLM·!'J←-LSN•AQRD•Nlt ・ ltL•I•V-VFLF·AIAFPALI ・ 'l"l'G 218

9ゆ7.299
9心3.23紐Gl.233〇言SA・219

I-QI虹ぶLYGIPYWINVMWLDP'V'rYLBBBGBEO江PWYRGDWSYLRGGL-TTLDROYGLI 356
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・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ •OB ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・· -F ・ ・ ・ ・ ••V ・ •L ・ F• ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ·YTB ・ ・ ・ ・ .. ·Q·. ・ ・ ・ ・ ・ .·-· ·V ・ ・ ・ ·•W· 290
V訊';FV•FWLM•WLVYBF•MSTF·IV ・ ·TIP•IRF-R-PAAO ・ 山U!:AQ· NG·VBC ・ • PRW 276

rゆ7.357
rゆ3.292

紐Gl.291〇言SA・277

NNIB-BDIGTBVIBBLPPQIPBYBLVBA匹AA!tPVLG!tYYRBPD!tSGPLPT,RL立ILA!tS 415• • • ·-· •· ・ ・ ・ ・ ・ ・ J.. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・• ·O·•R ・ . •B ・ ・ •R ・ ・ ・ .•JCT ・ ・ 紅·I··V•S·VA• 350··V·-· ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ .. •JCS ・ ·S ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ .·Q ・ ・ ・ ・ ・ ・ F· ・ ・ ltY •LQ• 349
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OP·BG •RTPGSLJぶV 351

ヽ V-'rv·•V• •V •I r ···A

Fig.5

・

・

ヽ

・

Comparison of the deduced amino acid sequence of the protein encoded by FAIJ
gene and related gene products. Identical amino acid residues are indicatedby a dot, and spaces introduced to facilitate alignments are indicated by adash. The PESA sequence encodes a D12 desaturase from Synechocystis PCC 6803.
The'4.RGl sequence is from an anonymous cDN'4. from mung bean.'4. region of very
high sequence identity among all four proteins is boxed.

-54-

ー 一―ー•一

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸r ー リノレン酸の高等植物における多量生産導入によって、形質転換植物におけるトリエン脂

066肪酸含量の増加が可能であることが明かにされた。 また、脂肪酸不飽和化酵素のアミノ醗共通配列をもとに作製したペプチド特異抗体によって、0•54植物に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素蛋白質を同定することが可能であることが示された。 今
後、月見草やボラ ー ジ草など、 △6脂肪酸不飽和

7
4
3化酵素を持つと思われる植物種のcDNAライプラリーを作製し、ペプチド特異抗体を用いたスクリ ー

ニングによって、同酵素遺伝子のクロ ー ニングを

司
D
k
（

試みたい。 もし、 この遺伝子がクロ ー ニングされれば、他の植物種への導入によって7 ー リノレン
醸の低コスト多砿生産が実現すると思われる。

引用文献
Fig. 6 I den t i f i cat ion of the w - 3 fat tyacid desaturase and its homologuesin
extracts of leaf tissues. Blots of
total proteins from tobacco (left)
and Arab idopsis(right)were probedwith the peptide (GHDCGH) s pecificantibody.

1)後藤浩樹：特定保健用食品素材としての r ーリ
ノレン酪、 ジャパンフ ー ドサイエンス、1993-11, 60-65 1993
2)長谷川昌康：

r- リノレン醗とその効用、New

Food Industry、 35 1-5 1993
3) Horsch R. B.,

Fly J. E., Hoffman N. L.,

E ichho I tz D. , Rogers S. G. , Fraley R. T. :いて作製し、実験の項に述べた方法によってペプ

A simple and general method for trans­

チド特異抗体を作製した。 シロイヌナズナ、 タバ

ferring genes into plants. Sdencc; 227

コにおいて、 ウエスタンプロッティング法によっ

1229-1231 1985て、 w-3脂肪醸不飽和化酵素あるいはその類似ペ

4) Lemieux B ., Miquel !ii., Somervilie C.,

プチドの存在を調べた(Fig. 6)。 その結果、これ

Browse J. : Mutants of Arabidopsis with

らの植物種において、同酵素に対応すると思われalterations in seed lipid fatty acidる50キロダルトンのペプチドの他に、およそ50-

composition. Tbeor. -Appl Ce11et. 80 234-

60キロダルトンの領域において複数のペプチドがこの特異抗体によって認識 されることが分かっ

240 1990
5) Somerville C., Browse J.: Plant lipid:

た。 現在、 これらのペプチドの性質などについmetabolism,て、二次元電気泳動法などを用いて解析を行ってScience; 252 1071-1079 1982

いるが、内在する他の脂肪醗不飽和化酵素に対応

mutan ts, and membranes.

6) Iba k., Gibson S. Nishiuchi T., Fuse T.,するペプチドを認識しているものと思われる。

Nishimura !ii,, Ar ondel V., Hugly S.,
Somervi I le C., :A gene encoding a chloro­

5

総plast omega-3 fatty acid desaturase括

com plements alterations in fatty acid
本研究において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のdesaturation and chloroplast copy number-55-

of the J"ad1
幼'Biiana.

mutant of Arabidopsis

J. .Biol.

Chem. 268 24099-24105

1993.

-56-

II. 生体作用， 安全性に関する分野

フリ ー ラジカルとポルフィリン代謝に関連する
皮膚の老化機構解明に関する基礎的研究
国立公衆衛生踪

労働衛生学部

栄疫生化学部市川勇・近藤雅雄

Basic experimental studies on production of active oxygens from porphyrin compounds by
UV irradiation in relation to aging of the skins were carried out.
Detailed conditions in analytical methods with electron spin resonance(ESR) for species andintensity of the active oxygens were examined. Production of hydroxyl radical was observed fromonly uroporphyrins at pH7.8. Singlet oxygen was produced more from coproporphyrins thanothers at the same pH. Production of superoxide anion was shown from urophorphyrins andcoproporphyrin lll after 120 s. of the UV irradiation.
It was shown clearly with two UV-cut filters that hydroxyl radical from uro- andcoproporphyrins and singlet oxygen from coproporphyrins were produced by UV-A from a xenon
lamp having a similar spectrum from sunlight.
In blood of rats administrated orally with griseofluvin for one week,which is an inducer ofprotoporphyria, the concentration of protoporphyrin IX was increased twice, but any active
oxygens from this porphyrin were not detected.

1

緒

言

ン、 チトクロ ー ムP-450、 カタラ ー ゼ、ペルオキシ
ダ ー ゼ等多くの蛋白や酵素の補欠分子族として重皮膚の老化現象は、 長期間日光、 特に紫外線に要な役割を果たしている 1) 。 また、 光増感作用をよる被爆と血液中の因子により皮膚細胞の増殖が有するが、 この作用が強いヘマトポルフィリン誘抑制され、 また壊死が生じるなど多くの加齢段階

導体等を投与後、 集積し易い癌細胞に光照射するを経た結果であると考えられる。 本研究では、 皮ことにより生成する活性酸素がその細胞を酸化壊

膚と光との関連性において血液因子としてのポル
フィリンの代謝異常およびそれに伴う活性酸素種

2
死に到らしめる光化学療法が 行われている - 4) 。
1
その際発生する活性酸素種は、 一重項酸素( 伍）の発生に注目し、 老化機構の一部分について解明だけでなく、 ス ー パオキシドラジカルCO 2 ー）やを行うことを目的とした。

ヒドロキシルラジ カ ル(• O H) も報告さ れていポルフィリン類は、 ヘム合成の中間代謝物あるる 5) 0いは副生成物として骨髄、 肝臓、 皮膚等多くの組

一方、 ポルフィリン類は、 光等外因性剌激およ織、 細胞内に存在し；ヘモグロビン、 ミオグロビ

ぴ種々の内因性剌激に対して微妙に変化して、 皮膚および造血組織に多くの障害を引き起こすことも知られている。 光照射による障害は、 ポルフィ

Relationship between Production of
Active Oxygens from Porphyrins andAging of Skin

リンから発生した 釘や• OHが生体成分に作用し、
1

生体膜脂質過酸化等を経て種々の炎症を引き起こすことによると考えられているが6)、詳細な機序Isamu Ichikawa

に関する研究報告はまだ少ない。 また、 健康な皮Department of Industrial Health
The Institute of Public Health膚に対して 紫 外 線 を照 射 し 、 電子スピン共鳴(electron spin resonance, ESR)による測定を-58-

フリ ー ラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の老化機構解明に関する基礎的研究

4-� • O Hの発生を検出してい3[2

l 飢、0 2

こ

行った結果、

5

血液中に蓄積されるばかりでなく、 尿中に多量排2
H

ボルフィリン患者では、 ボルフィリンが皮膚や

Cペ Hz
〗

い なし'ozC[ 7

Hる ” が、 ポルフィリンとの関連性の検討はされてPorphyrinogenPorphyrln

泄される。 患者の皮膚を光に曝すと、 発疹、 水
l'orphyrln

図1に投与することで、 骨髄性プロトボルフィリン症

M= -CII,,PPH-

A= -Cll,COOII, P= -c11,c11,coo11,として抗徴剤であるgriseofulvin(GF)を経口的

p ム P JiH

翌

Proしoporphyrln IX (PP。 代表的なもの

pp p ppO)(UP-Ill)(CP-1)HM H

ン症を起こさせる必要がある

JII

Coproporphyr I II I

Coproporphyr I II Ill (CP-111)

その研究を行う場合には動物に実験的ボルフィリ
I

Uro1,orphyri no I u I7 I B

pのポルフィリン症は比較的希な疾患であるので、I (UP-I)

A_P

リンの構造に依存すると言われている . 9) 。 ヒト

Uroporphyrinp p p >一8

A A M H "＂胞、 腫瘍ができ、 その程度は、 蓄積するポルフィ

V= -Cll=CII,

使用したポルフィリン化合物の構造式を誘発出来ることが報告されている l l)
本研究では、 5種類 のポルフィリン化合物 、は和光純薬工業から睛入した。 0 2 ―発生用の酵素

uroporphyri n I及びill(UP- I及ぴill), copro­

基質hypoxanthi ne(6-hydroxy-purine,HPX)はシ

porphyrin I及びill(CP- I及び皿）及び proto­

グマ社から、 またキサンチンオキシダ ー ゼ(XOD 、

porphyrinIX(PP-IX)に対して紫外線(ultra­

牛ミルク由来 ）はベ ー リンガ ー マンハイム社（ドviolet, UV)を照射し、 発生する活性醗素の種類イツ）から購入した。 和光純薬工業から購入した
りん酸ニナトリウム ー 水素• 12水和物及びりん酸

及び量を電子スピン共鳴( electron spi n reso­

ーnance, ESR)装置を用いて、 スピン捕捉剤などの醗緩衝液を、またクエン酸ナトリウム ・2水和物及試薬の濃度並びにpH等の測定条件について検討し

びりん酸ニナトリウム ー 水素• 12水和物によりた。 更に、 波長の違いに基づくUVの種類(UV-A,

pH3.0のクエン酸りん酸緩衝液を調製した。

B, C)による活性酸素種の発生に関して検討を行った。 また、 ラットにGFを経口投与して、 実験

2. 2

的ポルフィリン症の誘発を試みたので報告する。

2
2. 1

実

ナトリウムニ水素. 2水和物によりpH7. 8のりん

装

躍ESR装置は、 日本電子のJES-FR80型を使用した。
測定条件は、 マイクロ波出力及び共鳴マイクロ波

験

周波数8m胃及び 9.41GHz、 中心磁場及ぴ磁場掃引幅335. 1士5. OmT、 掃引時間2分、 変調周波数及び磁化合物

ポルフィリン化合物(UP- I及びm、並びにCP ­場変調lOOkHz及び0. lmT、 増幅2 X 100、 応答時間

I及び皿の二塩酸塩、PP-IX )は、PORPHYR IN PRO­

0. 1秒、 測定温度は室温であった。

DUCTS社(USA)から購入した。 その構造式を図l

UV照射装置はES-UXLlO(ランプ： ULX-lOOOD-0に示した。 スビン捕捉剤の5,5-dimethyl-l-py­

キセノン、ウシオ電機）を使用した。 発生したUV

roline-N-oxide(DMPO)は同仁化学研究所から、の試料に対する照度の実測値は、 感度波長域が6 -tetr a- methyl piperidone

200-320nmであるUIT-110(受光器UVD-254P、 ウシ(TMPD)ー塩 酸 塩及び安定化剤のdi ethy l e n e ­オ電機）により5. 5(直読式）及び6 .5(算出式）

triaminepentaacetic acid(DETAPAC)はシグマ

mW/c耐であった。 紫外線透過フィルターは、 東芝

ネ土(USA)から、またdimethyl sulfoxide(DMSO)

硝子社のUV-35 (315nm以上）、 また紫外線透過可

また2, 2,6,-59-

視光線吸収フィルタ ー としてUV-D33S(230-440nm)を使用した。 実際に透過した紫外線の量は、それぞれのフィルタ ー 使用で3.57及び5.49mW/cm

2(算出式）であった。
2. 3

活性酸素測定 5 ). . ""

ポルフィリン化合物それぞれを蒸留水に溶解,.f'O,'I

し、pH6-7に水酸化ナトリウム溶液で調整し、最終
浪度をlmMとした。
2. 3. 1''°

·OHの測定332

図2

pHの影蓉は、2% (18mM) DMPO水溶液50µ1に20mMのクエン酸•りん酸緩衝液pH3.0またはりん酸
緩衝液pH7. 8を100µ1、 ポルフィリン溶液50µ1をヒポキサンチン — キサンチンオキシダ ー ゼ反応によるス ー バ ー オキシドアニオン及びヒドロキシルラ
ジカル発生に関するDMPO付加体のESRスベクトルにおける経時的変化

加え撹拌混合して検討した。 次に、pH7.8におけ以上の反応混合液を、ESR用偏平セル(200µ1容る ·OH 発生量の 検討は、3種類の反応液を用いて量、有効測定部160µI、ラボテック社）に採り、行った。 即ち、 ポルフィリン溶液50µ1に9.2M­

ESR装置の空洞共振器（キャビテイ）部分に挿入

DMPO溶液15µ1、5.5mM-DETAPAC溶液35µl、りん

設定し、反応液を混合してから40秒後に測定を開酸緩衝液100µlを加えて(a)反応液とし、DMPO始した。 図2に02-及び ·OHの経時的発生状態をとDETAPAC溶液に2mM-HPX溶液50µlを加えた場合

DMPOのスビン付加体スペクトルとして示した。 まは、りん酸緩衝液を50µIを加えて(b)反応液とた、図3に叫の 発生をTMPDの付加体スペクトルとした。 また、DMPO、DETAPAC、HPX溶液に50%DMSして示した。

O溶液及びりん酸緩衝液25µlずつ加えて(c)反それぞれのラジカルの強さ（量）は、 最初に現れる（共嗚位置g値：• OH 2. 0200、02- 2.0187、

応液とした。

叫2. 0161)スペクトルの高さをラジカルの強さ
2. 3. 20 2 ーの測定(radical intensity, RI)とし、キャビテイ内

pHの影響は、 ポルフィリン溶液に2%DMPO溶液、に設定したESRマ ー カ ー としてのMnOの左端のスペ

50%DMSO溶液、クェシ酸りん酸緩衝液またはりん酸緩衝液をそれぞれ50µ1加え撹拌混合して検討, ·2.0,UT

2.0,88

2"°6S

L9"6

した。 また、pH7. 8における0 2 ―発生量の 検討は、

O.00 <,, ,.rno "",.
,.00 ••
JJS.' .,
Fa
5's.000 ●TST
2. 0 ""
9冒o. ,0000●TG
200. 00
TC
O. ,0 •••

5.5mld-DETAPAC溶液35µ1、2mM-HPX溶液50µl、..

'"·0 o.'"
'os..
,. "'
S1'
O. 80

50%DMSO溶液25µ1にりん酸緩衝液25µ1を加えた

S

P● ●K

● ""

・ . ,. ""後、撹拌して行った。
I

.,
,.,,
'""'"'·
T

ポルフィリン溶液50µl、9. 2M-DMPO溶液15µ1、2. 3. 3

..

L08"

恥の測定
"'

ポルフィリン溶液に50mM-TMPD溶液、50%DMSO
溶液、りん酸緩衝液をそれぞれ50µlずつ加え撹

図3

拌混合して発生量を測定した。
-60-

,,.

"·』"<•n'"'"'●0

コプロポルフィンから紫外線照射により発生する
一重項酸素のTMPD付加体のESRスベクトル

フリ ー ラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の老化機構解明に関する基槌的研究

3

クトルの高さとの比の値（試料のRI/MnOのRI)

結果及び考察で表わ した。 なお、ESRのデ ー タ処理は、ESR
DATA ANA L YZER SYSTEM (ラボテック社） により行

3. 1

われた。

3. 1. 1

ポルフィリンからのUV照射による·OH発生
pHの影響

図4に示した様に、スピン捕捉剤2%DMPO及び
2.4

pH3.0またはpH7.8の緩衝液存在下、それぞれのポ実験的ポルフィリン症誘発

Jcl:Sprague-Dowley系雄ラットにgri seofu 1 vin

ルフィリン化合物に UV照射を行うと、pH3.0では(GF、和光純薬工業）の生理食塩水懸渇液を50mg

いずれの化合物からも• OHの発生は殆ど見られな/ml/kg体重で1日おきに経ロゾンデにより投与をかった。 pH7.8ではウロポルフィリン (UP)類の行った。1週間後にラットをネンプタ ル麻酔下、みに ·OHの発生が見られた。UP-IはUV照射時間ー

右腋商静脈切断によりヘパリン加採血した。全血60秒を最高に滅少してしまったが、UP-illではそについて前述のESR法により発生する活性酸素の種類及び量を測定した。また、近藤等の方法 I 2)

れ以降も増加を続けた。

で、 高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によりポ期の産物であるUP類のみから、特にヘム合成に関

生理的環境の中性下で、ポルフィリン代謝の初

ル フィリンの種類と量を測定した。即ち、ポン

60秒を最高に減少してしまったが、UP-illではそプ、 イジェクタ ー 及び プログラムはTRIRO -TA R

れ以降も増加を続けた。

SR 2HPLCシステム、検出器はFP-llOD蛍光検出器

生理的環境の中性下で、ポルフィリン代謝の初（励起波長404nm、蛍光波長620nm)、脱気装置DG-期の産物であるUP類のみから、特にヘム合成に関3510を用いた （以上日本分光工業社）。溶離液は係するUP-IDから多くの• OHが発生したこと は輿アセトニトリル ー 酢酸ー水(80: 7: 13, v/v/v、

味深いことである。

50mM酢酸アンモニウムを含む）を用いた。 カラム
3. 1.2はODS-H-1151(4.6¢x50mm、センシュウ科学）にー

中性下での発生条件の検討

ー

9.2 M-DMPOにDETAPAC存在下 、ボルフィリンにキット（医理 化機器 社）に装着し た 。 流速は

UV照射を行うと、UP類のみから 照射30秒後に最高

1.Oml/min、温度25℃で行った。

値を示した（図5-a) 。 この反応液(a)にHPXを0.45µmメンブランフィルタ

5

北皿丸 芯
pp

ep
eP
up
up
�

(pH7.8) (pH30)
りー-0

o-·っ

. .

.—噌

△

,,,_心
�—●

_,.

o-o

o--0

·
-----------------

加えてUV照射を行うと、UP類からの • OH 発生は照

5
2

゜

aa
e1
pel:Ja>,
e:i
u11
sua1
,
dwes)A1
ouw\a1
(

゜

んDMPO
2,

をプレフィルタ

図5
図4

紫外綜照射によるポルフィリン化合物からのヒド
ロキシルラジカル発生に及ぽすpHの影響-61-

中性における紫外線照射によるポルフィリン化合
物からのヒドロキシルラジカル発生に関する測定
条件の検討

au
-eua U―1eo,
peH a>m"�
W \S) Al!
(．． ．．．．

〇ー<>

6.--0

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•-•

O·O

UP-t o-o
UP-Ill: ..-.
OMSO.OMPO,HPX,l CP-1: ,,__,.
CP-111: _.,—▲
DETAPAC,P8S(pH7.B)
PP-IX: o-a

一

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--こ,<"、’ヽ、

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UP-t
UP—鷺
CP-t
CP-lltPP-IX,

50

り

so,んDMS0,2¼DMPO(pH7.8) (pH3.0)

0 10

120

60

30

U V Irradiation (sec)
紫外線照射によるポルフィリン化合物からのス ー
バ ー オキシドアニオン発生に及ぽす pHの影響

図6

射後60秒後も増加を続け、CP類からも照射10秒後後、UP類及びCP- Iは60秒後に最高値を示したが、はUP類の約半分量の• OHが、またPP-IXからも除々に発生の増 加が見 られた（図 5-b)。 更に、• OHの消去作用を持つDMSOを加えると、PP-IXからの• OHの発生は見られず、他のポルフィリン化

始時に小さなピ ー クがある二相性を示した。
I

ポルフィリンからのUV照射による 恥発生

スビン捕捉剤TMPDに• OH消去剤DMSOを加え、中（図5-c) 。

3. 2. 1UP- IとCP- Iは照射5秒後、またUP-illでは照射開3.3

合物か ら の 発 生 も 6 0 秒 後 に は抑制さ れ た

3. 2

中性における紫外線照射によるボルフィリン化合物からのス ー バ ー オキシドアニオンの発生

図7

性条件下でUV照射を行うと、ポルフィリンではCP類のみから 1 恥発生が多く、UP類からは僅かなポルフィリンからのUV照射による02―発生

発生し か観察されなかった（図8)。 なお、pH3. 0

pHの影響

ではいずれのポルフィリンからも 1 船は検出でき

図6に示した様に、2%DMPOに0 2 ―経由の·OHを

／
Fi

....
＿—

n

I
c­
s

゜

紫外線照射によるポルフィリン化合物からの一重項酸素の発生

。

―

ov

- 300
―

―-[

-62-

/

図8

（図7)。 即ちPP-IXはUV照射5秒後、CP-IDは30秒/ものを用いたが、 短い照射時間で発生を示した/／

0 2 ーの測定では、・ OH測定用反応液(c)と同じ

60 U

中性下での発生条件の検討／

3. 2. 2゜
゜

定最の発生を示した。

5

り多くなった。CP- Iは僅かであったが、 ほぼ一

0は経時的に増加を続け、照射300秒後にはUP-IDょ/

及びCP ー 皿から最高最の0 2 ーが発生したが、UP- I[

以降減少した。て方、pH7. 8 (実線）では、UP-ID

予日

UP-ID以外、PP-IXは6昧少以降、またCP- Iは120秒

0

からUV照射 60秒ま で02ーの 発生が見られたが、

1(
QUII\I\a1dEes)A1
1
sua1
u二eO!
Petia>mlea8

行うと、pH3. 0 (破線）ではUP-ID、CP- I、PP-IX/ →―鼠巨 1/ ]

衝液存在下、 それぞれのポルフィリンにUV照射を／／なかった（図8の300秒時点に表示）。

消去する50%DMSOを加え、pH3. 0またはpH7. 8の緩フリーラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の老化機構解明に関する基礎的研究

3.4

UV照射によるポルフィリンから発生する活てより多くのラシカルを発生させ易いと考えられ性酸素の測定に関する考察

るので、ここで得られた結果より一 層明瞭な 変動

中性条件下では、検出された • OH量が3. 1. 1でが予想される。

行った実験より約4倍多かったのは 、 使用 した
DMPOの濃度も50倍高かったためと思われる。 ま3. 5

ポルフィリンからの活性酸素発生に関わる

た、 加えたHPXは、 図2に示した様に0 2 ーを発生す

UVの波長

るXODの基質であり、この0 2 ーは更に • OHに移行す

キセノンランプによるUV照射は、270nm以上のるので、UV照射によりポルフィリンから発生した

波長スベクトラムとして示され（図9、 実線）、地

0 2 -経由での • OHを捕捉している可能性も考えら

上の日光（破線）と類似している。UVの種類を波れる。

長により分類すると、400 -3 15nmはUV-A、 315-

uv照射によるポルフィリン類からの02―発生は、280nmはUV-B及び280-200runはuv-cであり、面積比

用いた化合物の構造式との関係を明確に説明出来からそれぞれ76. 5、20. 7、2. 8%とな る。 キセノ

ない部分も示されたので、今後他の誘導体を用いンランプによる照度 (UV照度計UIT-110、受光器て実験を重ねる必要性がある。

UVD-254P)は、平均値5. 63m屑/cm 2 であり、 また以上の試験管内実験で、UV照射によりポルフィ

フィルタ—UV-35(- • -)及びUV-D33S (- • • -)リン化合物から活性酸素種の発生が観察されたを使用してUV照射した場合のそれぞれの照度は、か、 酪性域よりも生理的条件の中性域でラシカル

3. 57及び5. 49m屑le正を示した。

発生量が大きいことは、皮膚組織にそれら化合物

ESR装置のキャピテイ部分に設定した偏平セルが多く存在している場合にUV照射があると、影響

内のポルフィリン溶液にUV照射を行い、発生したも大きいことが推測てきる。

活性酸素の種類と量を測定した。 図10に示した様

試験管内の単純系反応（図5-a、6、8)では、に、UP類とCP類からの ·OH及びCP類からの 1 船のいずれもポルフィリンのIII型が1型よりやや多目発生か多いことか明らかであるか、2種類のフィに発生していたことは、 III型がヘム代謝では主経

ルタ ー を用いた場合、活性醗素発生にはUV-Aか主路であるので、UV照射によるヘム代謝に対する影たる要因になっていることが示された。

響も大きい可能性を示唆している。 また、使用したポルフィリン化合物は図1に示した様に酸化型

3. 6であり、UV照射は生体内で還元型の化合物に対し実験的ポルフィリン症誘発

GFを1日おきに1週間経口投与したラットから採
51

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図9

図 10

キセノンランプによる照射紫外線波長スペクトルと UV カットフィルタ ー 及び検出器の有効領域

UV カットフィルタ ー によるポルフィリン化合物か

らの活性酸素種発生に関わる紫外線波長領域

-63-

’ 〇2

1

取した血液について、HPLCによりポルフィリン類

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WS
(

の種類及ぴ量を測定したクロマトグラムを図11に示す。 既知濃度の標準物質CP、 亜鉛PP (ZPP)及びppにより、 溶出位置(A、B、C)から順次CP、のピ ー クの面積から量を算出したが、対照群(a)に比較して、 GF 投与群 (b) は 2. 09、103. 9、

22. 1µg/dl であり、 ppのみが2 倍に増加していた。
更に、 これらの血清中にUVを照射した場合、含まれるポルフィリン化合物から発生する活性酸素の種類と量をESRを用いて調べ、その結果を図125のそれぞれの濃度 (2. 33、 98.6、 11. 3µg/dl)

゜

Plasma . NG
UV lrra. 30sに示した。 GF投与により発生量が増加した活性酸素種と しては、UV30秒照射による • OH ( a反応A系）及び60秒照射による0 2 ―であり、それぞれ

ol(N)
Contr
tlil�·:•Griseofulvi
n(G)

゜
゜
一

ZPP、ppである種類 を確定した。 また、それぞれ

0.1

UP類及びUP類とCP類からのものであることが示唆

NG

60s

30s

NG

60s

ば？芯心 ·OH(a)-OH(b)·OH(c) o;

図12

された。

NG

NG

300s
10
2

グリセオフルピン1週間経口投与ラット血漿ポル
フィリンからの紫外線照射による発生活性酸素種

従って、ここでラットを用いて行った短期間のしたとは言えず、今後、GFの投与期間を延長するにより確認されたので、ポルフィリン症が誘発さことが必要であると考えられる。 実験的ポルフィれた可能性が示唆された。 しかしながら、発生増リン症が誘発された後、UV照射による皮膚の障害

加した活性酸素種からはppの関与が示されなかっを防止するための抗酸化作用物質等を用いての実たことから、ポルフィリン症を実験的に十分誘発験を行う予定である。

4

°

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ロ

実験において、PP-IXの増加がクロマトグラフィ

総括

皮因と光との関連性においてポルフィリンの代
謝異常とそれに伴うi舌性酸素種の発生に注目し、皮膚の老化機構の一部について基礎的な検討を行い、 次の結果を得た。

\
．
．

～

＼

i

.

1) 5種類のポルフィリン化合物、UP- I、UP-ill、
CP- I、CP-ill及びPP-IXに対してUV照射を行い、発生する活性醗素種の種類及び量を ESRで測定す
る条件を検討した。

E 1 u t i o rr

t i ID e• OH、02 ー、 1妬とも酸性条件下での発生は少なく、中性条件下で多くの発 生を

Cm i n)示した。
図112)中性下、・ OHはUV照射30秒でUP類から多く発生

グリセロフルピン投与ラット血液中ポルフィリンの高速液体クロマトグラム

し、HPXが存在すると60秒照射でCP類からも発生-64-

フリ ー ラジカルとポルフィリン代謝に関迷する皮膚の老化檄構解明に関する基磋的研究: Synthes i s of fluorine analo gs ofが見られた。02ーは5秒の照射により PP-IXやCPとUPのI型から、 また、60秒後にはCP類やUP類から

p or phyri ns p ote ntially useful for

発生が見られた。 1恥はCP類から照射が120秒以後

diagnosis and therapy of tumors. 同上誌

多く発生し始め 、300秒後でも増え続けた。 これ

1 243-248 1992
5)

らの結果を基に、それぞれの活性酸素種の適切な石原聖也、沼田道一、三好憲雄、岡本博明、

測定条件を選んだ。

新井達郎、徳丸克己、市村厚ー、小林孝嘉、

3)太陽光 線 の波長パタ ー ンに類似し、 U V -A

光田慶一、 山田真砂子、河野雅弘、福田優、(315-400 nm )が全UVの約77%を占めるキセノン．光励起により生成する種々の光増感剤からランプによるUV照射時 、UV-A及ぴUV-AtUV-Bの波

吉川敏一編集、の活性酸素系検出． 小倉良平、

長領域を透過させる2種類のフィルタ ー を使用し磁気共鳴と医学た場合、CP類とUP類からの • OH及びCP類からの1992

3 86-90日本医学館、東京、

6) 上出良一、ポルフィリンによる光線過敏の発叫の発生が観察された。
4〉GF投与による実験的ポルフィリン症をラット

生機序 ． 今村貞夫、田上八朗、西川武二、
吉に試みたが 、1週間程度の投与ではPP-IXの星が川邦彦編、現代皮膚科体系、年刊版、89-A,
pp229-234,中山書店、東京、1989

2倍に増加しても、UV照射ではPP-IXから発生する
7)

特徴的な活性醗素種が 検出出来なかったことか

小倉良平、 山正康、紫外線とi舌性酸素・ フリ

ら 、投与期間を更に延長する必要性が提示されージカル ．

た。

270-277 19928)

文

する最近の知見 ． 医学のあゆみ

皮膚科MOOK

10 153-160 19879)

155 859-

市橋正光：光線過敏症分類 、佐藤吉昭編、光線過敏症、pp40-41. 金原出版、東京、1991

863 1990
秀雄、 竹村 健、 阪田

進、林

2)中島

3

野中庶雄、大神太郎、村山史男：代謝異常と皮府 — ボルフィリン ．

献1) 近藤雅雄、青木洋祐：ポルフィリン代謝に関功、

ppl29-136 1991

11)野中蹂雄、下山時生 、本多哲三、広渡徳治、ニズムと新しい癌診断、治療法への応用 ． ポ

堀

1 223-228 1992

ルフィリン10)野中蒜雄、大神太郎：実験的ポルフィリン症、同上誌：ポルフィリン誘導体腫瘍組織集積性のメカ

3)

活 性 酸 素・ フリ ー ラジカル

貞、野北通夫：実験的ポルフィリン症

泉、高田弘之、池内昌子、

マウス の光線過敏症 ー グリセオフルビン投与

健、小清水弘一、時におけるポルフィリンの動態と実験的ポル：ポルフィリン関連化合物と腫瘍組織親和性

フィリン症マウスに対する光照射時におけるに関する研究(ill)光線力学的治療(PDT) の皮膚老化． 日皮会誌

阪田

功、丸山

中島
乾裕史、

進、竹村

12)近藤雅雄、広沢実ー：高速液体クロマトグラ

ための光増感剤の簡単な評価法 同上誌

フィ ーによる赤血球ポルフィリンの高感度迅

235-242 19924) A.

An do,

M.

87 585-598 1977

Ornote,I.

速定最法． 臨床化学

Kurnadaki,-65-

17 36-39 1988

゜

還元型ネオフ テリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果
束京理科大学小島

生命科学研究所周Effect of the reduced form of neopterin (NPH4) on human fibroblast cell and mousemelanoma (B-16) cell injuries induced by long-wave length ultraviolet light (UV-A) irradiation
was examined.
The reduced form of neopterin, NPH4, didn't inhibit the incorporation of 3圧proline into
collagen of human fibroblast cells induced by UV-A irradiation, but dose-dependently did thelowering of 3H-thymidine (3H- TdR) incorporation into DNA fraction of the B-16 cell injury
On the other hand, the oxidized form of neopterin, NP, drastica!Iy elevated the reduction of bothprecusors induced by UV-A irradiation at a high concentration. Radical oxygen species (ROS)
which induced the cell injuries in B-16 cell. Among various kinds of ROS, scavengers, only catalase,a scavenger for hydrogen peroxid, protected the cells from the injury, suggesting that hydrogen
peroxide may involve in the cell injury induced by UV-A irradiation. In the in vitro analysis ofchemiluminescence induced by hydrogen peroxide, NPH4 reduced the siginal intensity in dose­
dependent manner, while NP dramatically enhanced the signal intensity at a high concentration.
In hydrogen peroxide-induced B-16 cell injury model, almost the same data were obtained aswell as in UV-A irradiation. These results suggest that neopterin would be applicable toprotecting skin from ultraviolet-induced injury and skin cancer therapy

1

緒

言

一方、 近年、 心筋梗塞、 動脈硬化、 糖尿病、 ア
ルツハイマ ー 病、 癌、自己免疫疾患等の成人病・

ネオプテリンは分子量253の2ー アミノ-4 ー ヒドロ

難病 の 発症に 生体内で 産 生 され る 活 性 酸 素 種

キシプテリジン誘導体の1つで、 核酸(GTP)由来(ROS)が関与していることが明らかとなってきの補酵素（ピオプテリン）の前駆休であり、 食細た。 これらの多くは、 先に述べたネオプテリン高胞の1つであるマクロファ ー ジより、 インタ

フェ値を示す疾患であり、 かつ、 同一細胞より両物質

ロン r の剌激により遊離されることが明らかとが遊離されることから、 ネオプテリンが食細胞でなっている。 ネオプテリン の生理活性につい ての活性酸素の産生・遊離の制御に関与している可は、 いまだ解明されていないが、 これまで、能性か示唆された。 すなわち、 我々は本物質を食AIDSをはじめとする種々の感染症、 悪性腫瘍、自細胞での活性酸素の産生および遊離活性酸素に対ー已免疫疾患、 異種臓器移植の拒絶反応、 川崎病、するスカベンジャ ー （抗酸化剤）と推定した。 こ

糖尿病等の患者血中および尿中に顕著に増加するの仮定の下で、 ネオプテリンの抗酸化能を種々のことことから、 これら疾患の診断に用いる試みが系で測定したところ、 本物質の遠元体である5、なされている。

6、7、8 ー テトラハイドロネオプテリン(NPH4)に極めて強い活性があることを見いだした 1 - 3) 。 また、 酸化型ネオプテリン(NP)もマクロファ ー ジ

Effect of the reduced form of〗neopterin (NPH4) on the skin 1111ury
induced by ultraviolet lightの活性酸素産生過程に作用し、 この発生を抑制することを既に明らかにしている 4) 。 これらの結果

Shuji Ko11ma

は、 過剰生産されたROS、 あるいは、 これらに対Research Institute for Biosciences,

する生体の防御系の低下・欠損等による正常細胞

Science University of Tokyoの傷害、 いわゆる「活性酪素ストレス」に対する-66-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

2. 3

生体の持つ「巧みな防御機構」の発見につながる

紫外線の照射UV-A (東芝、FL-20S、BL/DMR)の照射はカバばかりでなく、先に記載した活性酸素関連疾患にー対する治療薬への応用も大いに期待される。

プレ ー トを付けた状態で、2. OmW/cm 2 の線量率で所定の時間照射した。

ところで、紫外線暴露による皮膚の炎症あるいは皮府癌等の発生についても、 その詳細については明らかではないが、 紫外線照射により発生する

2.4

ROSの関与が示唆されている 5 - 7) 。 そこで、本研

ヒト線維芽細胞の紫外線照射によるコラ ー
ゲン生成量の測定

究では紫外線による皮膚傷害に対するネオプテリ

ヒト真皮線 維芽 細胞（森永乳業製 ）を、 ハム

ンの効果を抗酸化活性と関連付け、 ヒト線維芽細

F l2Cl0% FCS含有）培地に懸洵し、24ウェルに

胞およぴマウス ・ メラノー

2xl炉個ずつまき、37℃のco パンキュ ベ ー タ(5%マ(B-16)細胞を用い

C0 2 /95%Air)中で、4-5日コンフルエントにな

検討した。

2

実

験

るまで培養する。UV-A照射

co、80、160、および240分）後、培地を除き、PBSで3回洗浄、 sH ープロ
2. 1

ESRによるネオプテリンの抗酸化活性の解析

リン(0. 2µCi/ml)を各ウェルに入れ、さらにスピント ラップ剤と しては 5,5-d imethyl­

24時間培養する。培地を除去し、PBSで細胞を3回

pyr r oline-1- oxide(DMPO)を用い、日本電子製

洗後、50µg/mlプロテア ー ゼK(含〇. 25%N ーラウ

RADICAL Bio-SENSOR (JES-FR80)にて解析した。

を各ウェルに100µl
リルザルコシン・25mM EDTA)

ス

ー

パ

ー

オキサ イド アニオンはヒポキサンチン加える。細胞が完全に溶 解した後、ピペッテング(HPX)(0. 5mM〉とキサンチンオキシダー ゼ(XOD)

し、100µlを液体シンチレ ーションカウンター 用(0. 25V /ml)の反応にて生成させた。ヒドロ キ

バイアルに取り、シンチレ ー タ(10ml)を入れ、ー

放射能を測定した。つぎに、本合成を約30%抑制

ンルラジカルは、予め、硫酸第一鉄と金属キレタであるDiethylenetriaminepentaaceticacid

する照射線量(29J/cm 2 =240分照射）にて、(DETAPAC)を等モル(lmM)反応させておいた水

NPH4および NPのコラ ー ゲン合成に対する作用を検溶液(Fe-DETAPAC)と過酸化水素の反応で生成さ

討した。

せた。
2. 5
2. 2

細胞の培養

細胞傷害の測定

細胞傷害の程度は、照射細胞をPBS(-)で3回マウスメラノ ー マ細胞を理研細胞バンクより入洗浄後、 aH ーチミジン( 3 H-TdR)のDNA画分への取グルMEM(10%FCS含有）培地を用い、込活性から評価した。すなわち、UV-A照射後の洗37℃のCO 2 インキュベ ー タ(5%C0 2 /95%Air)中浄B-16細胞に 3 H-TdRを各ウエルに18. 5KBq/mlにで、コンフルエントあるいはセミ コンフルエン

なるように加え、1時間CO 2 インキュ ベー タで培養

手し、イ

ー

ト、になるまで培養した。つぎに、0. 25%トリプ

する。 ハンクス液で2回洗浄した後、0. 25%トリ

シン/0. 02% EDTA溶液を用い細胞を回収し、プシン/0. 02%EDTA溶液50µ1を各ウエルに加え、PBS (-)で3回洗浄後、2 x 10 6 ce11s/田1 MEM

1-2分インキュ ベー タ内に放置し、1mlのハンクトにまく。

ス液を加え、細胞をガラスチュ ー プに回収する。

さらに、12時間培養したのもに、ネオプテリンを各チュ ー プ に10% TCA 1mlを加え、30分問氷上に加え、紫外線(UV-A)を照射した。

放置する。ガラスフィルタ ー (Whatman、GF/C)

細胞懸菊液を調製し、1mlを24穴プレーをセットした濾過器で、TCA不溶画分を回収し、5%TCA、エタ ノ ー ル／エ ーテル(1 : 1)およびエ-67-

テルの順で各々2回ずつ洗浄する。 フィルタ ー1% H2船を加え反応を開始した。 蛍光体からの蛍を室温で放置し、十分乾燥後、バ イアルビンに移光をルミネッセンスリ ー ダ(Atoka BLR102)で連し、トルエンシンチレ ータ10mlを加え、放射能を紛もH勺しこ言ci泉した。

ー測定する。なお、各々の活性はDNAに取り込まれた放射能 (CPM/wel 1)あるいは、非照射群に対す(A) Control

る割合（％）として表示した。
2. 6

抗酸化酵素• 酸化剤の細胞傷害活性に対する作用

B-16細胞でのUV-A傷害 および酸化型ネオプテリ
ン (NP)によるこの促進効果に関与するROSを同定する為、SOD (lOOOU/ml)、 カタラ ー ゼ(CAT、200U/ml)、 a — フェニ ー ル ー N-t ー プチ ー ルニトロン(PBN、100µIii)およぴマニト ー ル(MAN、100µIii)(B) NPH4 (0.5 mM)を培地に添加した細胞について、UV-Aを2. OmW/
cm2 の線量率で、10分間照射し、傷害活性を比較
した。
2. 7

過酸化水素によるB-16細胞傷害に対するネ
オプテリンの作用

l、10、 および100'µMの過酸化水素を含むMEM培
地を調製し、B-16細胞を10分間過酸化水素に暴露させた後、PBS (-)で十分洗浄、 3H-TdRを含む(C) NPH4 (1.0 mM)

培地を各ウエルに加え、1時間CO2インキュベータで培養する。 その後の操作は2. 5に従い、過酸化水素によるB-16細胞に対する傷害を検討した。
さらに、過酸化水素濃度を10µMに固定し、先に述ぺたUV-A照射と同様の方法でNPの作用を検討した。
2. 8

Fig.l[A]. ESR spectra of DMPD spin adducts
formed in a hypoxanthine/xanthineoxidase (HPX/XDD) system w ithout(A) or w I th NPH4 of 0. SmM (B) andl.Dm M (C).
Each spectrum was obtained at 60
sec after adding XDD.
Si gnals appearing both at highand low field are due to Mn(II)i n s t a I Ie d i n t he c a"v i t y a s areference.
the main species present include
DMPD-DDH and DMPD-DH.

ケミルミネッセンスによる過酸化水素の反応性の検討

Weissらの方法

8)に従い、濃度のことなるNPH4

およびNPを0. lM PBS (pH7. 5)にとかし調製した。
蛍光体として、lOmM 5 ー アミノ ー 2, 3 ー ジヒドロ —l, 4 ー フタラジンジオンをDMSOに溶かしたのもをス
トック溶液とし、用時、PBSで40µMに希釈したものを用いた。650µ1のPBS、150µlの蛍光体溶液
およびネオプテリンを含む反応溶液に100µlの-68-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚侶害に対する効果

Neopterin Kit (INCSTAR)を用い定量した。 残存(A) Control

NP量は照射前のNP量を100とした際の割合（％）
で表示した。
2. 10

チロシナ ー ゼ活性の測定

50mM PBS(pH6. 8) 0.8ml、チロシナ ー ゼ(Sigma
社製、750µg/ml)0. 5ml、ネオプテリン0. 5mlをガラス製セルに入れ、2分間プリインキュベートする。 この反応液に0. 05%L-D0PA 0. 5mlを添加し、反応を開始する。 反応開始後、37℃でイン
キュベートしながら475nmの吸光度の変化を2分間(B) NPH4 (0.5 mM)記録し、初速度より活性を求めた。

士ロ
象

3

3. 1

果

ESRによるネオプテリンの抗酸化活性の解析

HPX/XOD反応系及びFe-DETAPAC/H 2 船反応系により、それぞれ、02―ラジカルおよび• OHラジカ
120

d
3
:>』
U.I
Ol
QlJ
UO:>.Ilぶ）一o』（(C) NPH4 (1.0 mM)

Fig.l[B]. ESR spectra of DMPO spin adducts
f o rm ed in the F enton rea c t i on
without (A) or with NPH4 of O .SmM
(B) and 1. OmM (C) .
E a ch spectrum was obtained at 60
sec after adding hydroperoxide.
S ignals appearing both at highand low field are due to Mn (II)i n s t alled in th e c avity a s arefe r e n c e . t h e m a in s p e c i e spresent is DMPO-OH.
2. 9

100
80

60
40
20

80

160

24 0

Irradiation time (min)Fig.2. Effect of UV-A irradiation times on
the incorporation of 'H-pro Iin into
human fibroblast cell.
Resu lts were expressed as relative
percent of UV-A-irradiated cells tothe onirradiated cells.
···statistica lly significant diffrence
from the nonirradiated group(p<O. 001, Student, t-test).

ネオプテリンのUV-Aに対する安定性

NPをlOOng/ml PBSに調製、2. OmW/cがの線量率でUV-A を時間を変えて照射した。 残存NP量は-69-

ルを発生させ"'還元型ネオプテリン(NPH4)とのすように、 ヒト線維芽細胞にUV-Aを照射するとコ反応性をESRにて検討した。 この結果、Fig. 1に示

ラ ー ゲン合成量は照射時間の増加と共に、減少しすように、NPH4は、 いずれのラジカルに対してた。 つぎに、UV-A照射時間を240分とし、ネオプ

も、極め て高 い 反 応 性 を 示 し 、 濃度依存的にテリンの存在下での、コラ ー ゲン合成量を測定しDMPO-OOH (Fig. l[A])およびDMPO-OH (Fig. l[B])た。Fig. 3に示すように、 ネオプテリンの存在にのピよりコラ ー ゲン合成量は抑制され、とりわけ、酸ークを低下させ．、た。

一

方、酸化型ネオプテリ

ンには、 これらラジカルとの反応性は認められな化型ネオプテリンに顕著であった。

かった。
3. 3
3. 2

ヒト線維芽細胞のUV-A照射によるコラー

ゲ

害に対するネオプテリンの作用
つぎに、細胞を紫外線に対しより感受性の高いン生成量の変化コラ ー

マウス ・ メラノマ(B-16)細胞の紫外線傷

ゲンは、主としてプロリンとハイドロプ

マウス ・メラノマ(B-16)細胞にかえ、UV-Aの細ロリンからなるアミノ酸配列の規則的な繰り返し

胞傷害に対するネオプテリンの作用を検討した。

から構成されている。 そ全で、 aH標識プロリンのFig.Aに示すように、2. OmW/cm 2 の線量率で5分以細胞内取り込みにより、UV-Aによるコラ ー ゲンの上照 射 す る と 、 非照 射群と比較し 、 有意

生合成の変化を測定した。 この結果、Fig. 2に示(p< 0. 05)な H-Tdrの取り込み活性の抑制がみ

3

6

120

4

80

一

3

40

20

UV-A

NPH4

Fig.3. Effects of the reduced and the ox1d i zed f o rm of ne opt eri n on the 'H­
prolin incorporation into human fib­roblast cell irradiated with UV-A.
The eel Is were exposured for 240 min
in the presence of NPH4 and NP at
30りµ,r.; by UV-A. •••st atisticallysignificat difference from the non­
irradiated control group (p<0.001,
Student, t-test).

10

20

30

Irradiation time (min)NP

UV-A irradiation

5

。
。

Cont

60

ー

3J
U 3J.I

2

ー。

g=PBH

d p l() Al!A!Pn {l JO（ぷ ） 一 0』JU OJ ;

5

zeE

(＜

100

Fig. 4. Effect of UV-A irradiation times on
the mouse melanoma(B-,16) cell injury.
The eel I damages were evaluated inviyro by measuring用 — thymidine ('H­
TdR) incorporation into eellular DNA
of the ce 11 s. Resu Its were expressed
as relative percent of UV-A-irradia­
ted eel Is to the nonirradiated eel Is.
・・Statistically significat diffe­
rence from the nonirradiated control
group (p<O. 01, Student, t-test).

-70-

還元型ネオプテリン (NPH4) の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

120

120
で 25) I O』JU OJ 3q J JO

80

100
80

60

一

60

。

20

Cont

UV-A

10

U 3JJ3^I40

ーg 』3d.

(S ) I O』 lU O;> aq l JO lU

100

100

40
20

Cont UV-A

1

10

100

UV-A + NP (µM)

UV-A + NPH4 (µM)

Fig_ 6. Effect of doses of the oxidized fromof neopterin(NP) on the UV-A-induced
B-16 cell injury.
The eel I damages were evaluated 1n
vitro by measuring 3H-thymidine ( 3 H­
TdR) incorporation into cellular DNA
of the ce11 s. Resu I ts were expressed
as relative percent of UV-A-inradi­
ated cells with or without NP to thenonirradiated cells. "Statisticallys1gnificat difference from the non­
irradiated control group (o<0 .01,
Student, t-test). *"Statisticallysignificat difference from the non­
irradiated group(p<0.001, Student, t-test).

Fig.5. Effect of doses of the reduced fromof neopterin (NPH4) on the UV-A­
i nducued B-16 ce11 injury.
The ce 11 damages were eva I ua ted In
vitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into cellular DNA
of the cel Is.
Results were expressed as relative
percent of UV-A-inraddated c ellswith or without NP to the nonirra­
diated cells.
*Statistically significat difference
from the nonirradiated control group(p(O. 05, Student, t-test).

られ、10-30分の照射で非照射群の約70%の値を示した。 次に、 照射時間を10分(1. 2J/cmりに傷害を促進する結果について、 種々のラシカル・固定し、 この細胞傷害に対するNPH4およびNPの作

スカベンジャ ー を用い、 さら に検討を加えた。 こ

用を、 検討した。 Fig. 5に 示すように、 還元型ネの結果、 Fig_ 7に示すように、 それぞれ、1出、オプテソンであるNPH4は濃度依存的にこの細胞傷

02→および ·OHに対する スカベンジャ ー である害を抑制した。 一方、 酸化型ネオプテリンは、PBN、 SOD、 およびMANには 細胞傷害の抑制は全く

lOµMまでは顕著な作用を示さないものの、見られず、 過酸化水素に対するスカベンジャ ー で100µ1,! では、 この傷害を顕著 に促進した(Fig. 6)。

あるCATにのみ顕著な傷害活性の解除がみられた。

還元型ネオプテリンの抗酸化活性については、 す

この結果、 このUV-AによるB-16細胞傷害の発生に

でに、明らかにしたように、 極めて強い 抗酸化活は、 紫外線照射 により発生するROSのうち、 主と性があること、 および本実験にて明らかとなった

して、 過酸化水素が関与することが示唆された。

ように、 NPH4がUV-Aによる細胞障害を抑制することより、 この障害の発生に活性酸素の関与が推定された。 そこで、 酸化型ネオプテリンによる細胞

-71-

8
(E dg )� J
BU6!
S!
SUCIIU!I6[Al NPH4 (µM)—←
60---0--

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一

4

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0.1
1.0
10
100

2

2

p g =P8ll
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E d品 ） A 1l
3A l
I
(

--- ゜
----

80

。

゜

0.0

0.2

0.4
0.6
Time (min)

0.8

1.0

Cont UV-A PBS SOD CAT MAN PBN
UV-A + NP (µM)

3. 4

ネオプテリンの過酸化水素の反応性に対す

UV-A照射によるB-16細胞傷害の発生に過酸化水素の関与が示唆され、 酸化型ネオプテリンによる傷害の増強が過酸化水素の細胞傷害活性の促進を介する事が推定された。 そこで、 過酸化水素の反--o-- 1.0-- 10,,_,... ・ 100

50

゜

る作用

[Bl NP (µM)

ー。
ーー 。.100
ー(E d9 1)A1
1
sua1
u11
eu61
s

Fig.7. Effect of radical scavengers on the
UV-A-induced B-16 eel I injury.
The ce 11 damages were eva Iua ted , nvitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into eel lular DNA
of the cells.
Results were ex pressed as radio­
activity (cpm) incorporated into thecel 1/wel I. PBS, PBS(-); SOD, super­o xi d e dismutes (1000U/ml); CAT,ca ta Iase (200U/m I); MAN, mann ito I(100µ,M); PBN, a-phenyl-N-t-butylni 一
trone (100µ,M),**Statistically significat difference
from the nonirradiated control group(p(O. 01, Student, t-test).
·**statistically significat difference
from the noni rradiated control group(p(O. 001, Student, t-test).

150

0.0

0.2

0.4
0.6
Time (min)

0.8

1.0

Fig.8. Effect of neopterins on the signal
i n t e n s i t y ind u c e d by hy d r o gen
peroxide.
The signal intensity was measured byluminoldependent chemiluminescence.
The light output after addition ofhydrogen peroxide containing luminol
with or without neopterins was con­tinuously record for 1 min.
The s igna I intensity was expressed
as counts per minut (cpm) at eachtime interval.
[A]NPH4, reduced form of neopterin;[B]NP, the oxidized form of neopterin.

応性に対するネオプテリンの作用をケミルミネッ
センス法により検討した。 この結果、 Fig. 8に示の、100µ, Mては、 著しくこのシグナル強度を高めすように、 PN H4が過醗化水素によるシグナル強度た。 この結果は、 先に示したUV-A照射による細胞NPは0. 1-

傷害に対するNPの傷害促進効果の発現結果と良くを浪度依存的に抑制するのに対し、10µMの濃度範囲では顕著な作用を示さないもの

一致した。

-72-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射皮膚傷害に対する効果

120

10

40

2

。

゜
゜

20

4

60

6

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8

(
W U\
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P go=
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一

J8d
0 E U8::In J
OJ U0::>01e 6) I

100

10

100

Cont

Cone. of hydrogen peroxide (µM)

NP

NP+CAT
H202

Fig.9. Effect of doses of hydrogen peroxideon B-16 cell injury.
The eel I damages were evaluated 1n
vitro by measuring 'H-thymidine ('H­
TdR) incorporation into eellular DNA
of the ce II s.
Results were expressed as relative
percent of hydrogen peroxide-treatedcells to the untreated cells.
*Statistically significat difference
from the untreated group(p(O. 05, Student, t-test).
**Statistically significat difference
from the untreated group(p(O. 01, Student, t-test).
3. 5

H202

Fig. 10. Effect of doses of hydrogen pero­
xide-induced B-16 cell injury by
the oxidized form of neopterin andits abolishment by catalase.
The ce 11 damages we re eva I ua led In
vitro by measuring 'H-thymidine ('H-TdR) incorporation into cellular
DNA of the cells.
The cells were treated with 10µ.M
hydrogen peroxide 10 min with orwithout NP. Results were expressed
as radioactivity (cpm) incorporated
into the cells/well. Catalase (CAT,200U/ml)was added to 10µ.M hydrogen
peroxide-treated cells with NP,·S tatisti·ca I I y significat di f f erence
from the untreated group(p<O. 05, Student, t-test).
.. Statistically significat difference
from the untreated group(p<O. 01, Student, t-test).

過酸化水素によるB - 16細胞傷害とネオプテ
リンの作用

これまでの結果より、UV-A照射によるB-16細胞
傷害の発生に過酸化水素が関与し、 NPH4はこの反応性を抑制、 一方、NPはこれを増強することによ

化水素によるB-16細胞傷害はUV-Aによる細胞傷害が示唆された。 これらの仮定を確認する目的で、と同様、NPにより促進され、当然の事ながら、本実験では、過酪化水素による細胞傷害 を作成の促進効果はCATにより完全に解除された。

こり、それぞれ、UV-A傷害の抑制及び促進をする事し、この像害に対 するNPH4及びNPの作用を検討し3. 6

た。Fig. 9に示すように、10µM以上の過酪化水素

ネオプテリンの吸収スペクトルと紫外線に対する安定性により有意な細胞傷害が惹起された(p<O. 05)。
つぎに、 過 酸 化 水索の浪度を10 µ Mとし、N P

還元型ネオプテリン(NPH4)が、 ヒト線維芽細(lOOµM)およびCAT(200 U/ml)の作用を検討し胞での紫外線によるコラ ー ゲン合成の抑制に対した。 この結果、Fig. 10より明らかなように、過酸ては促進的に、メラノ ー マ細胞でのDNA合成の抑-73-

,-r I二仁戸仁仁仁下―干l丁 1-1 I I I寸十□寸二則丑．＿一ニこ：.·;;;. _:_-::: ==-ニニ+:.:••:••:ご二こ ニニニ.ニ-二亡 ー：：：：：：：：二．ニニ—:�—：ーニ ここ.::::―:二 ― 一 —三三二三三::=-:.:::三二三•三二三三三ニ-三ーニ□三三三 ��口:i一□三デ亨二＝三三三三三三三ロニ戸三三三二三□三―ー•三三戸ニーこ一—ぞニニ三三三三三—□三：三：：i三��=三三□こ三三三三ロ•
一
三 三ニニ三三二三三二： ニ ー＝二三ーニ三三二□三言三三二―ー―-ニ== -�--== ニ：三二口三三
三三 三二三ロニ一 三二丁
二こ ＝ーニ ー 一
一三・
ニニ 二三 ― -==—三― ― ＝ ニー□□一二―-----=―-—-= ニ三 二三＝—二三
ロニ＝一三 一ニ―ロ
三 ＿ニ 一 三二＿＝ ―-三ロニ三ーニ亨三 ＝ 二言・•三三三三
二三三三＝＝三 三 三三ー□三二三ロロし□三□三二三二三 こ――□三三三三三二三戸：：：三三□三三ー＿―ーー—-三三？― -三：ーニ：ニー：三一三□三＿戸•三三三二三三三三三=-� ロニロ ：―-三:�-�・ �―こ二-―こニ-_ ――-• こロニニ：：：-＝＝ ----ーニ亡二ニ：ニーニニ：：ご二．＝＝＝＝―-二.
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1;J

200

300
Fig. 11400

Absorption spectrum of the reduced

nm

form of neopter In

制に対しては防御的に作用すると言う、 矛盾した部(300-400nm)に吸収波長を有するスペクトル結果を示した。 紫外線の傷害活性が活性酸素に起を示した。 また、 Fig. 12 に示すように、 UV-A照射

因することから、 線維芽細胞での紫外線によるコに対するNPの安定性は極めて低く、2. Om屑/c耐のラー

ゲン合成の抑制に対しても、 当然、 NPH4 が防線量率で10分間の照射により、 大部分のNPは分解

御的に作用することが期待された。 この実験で消失した。 また、 NPH4 についても UV-A に対し、 極は、 紫外線のメラノー用と比較し、 コラ

ゲン合成に対し紫外線が抑制

ーマ細胞でのDNA合成抑制作

めて不安定であった。 なお、 分解産物については不明である。

作用を示すのに、 大線量の照射を要することから、 NPH4 が照射中に酸化型ネオプテリン (NP) に

3. 7

変化した、 あるいは紫外線を吸収し、 コラ ー ゲン

ネオプテリンのチロシナ ー ゼ活性に対する作用

合成に対し抑制作用を有する他の化合物に変化しネオプテリンのチロシナ ー ゼ活性に対する作用たことが考えられる。 そこで、 本実験では、を検討したところ、 酸化型および還元型ネオプテ

NPH4の吸収スペクトルおよび紫外線に対する安定

リン、 いずれもl. 0�1000µMの濃度範囲では、 本性を検討した。 Fig. 11 より明らかなように、 紫外

活性には何ら作用しなかった。

-74-

還元型ネオプテリン(NPH4)の紫外線照射反膚偽害に対する幼米

マウス・ メラノマ(B-16)細胞でのDNA合成抑制

100

検討した。

80

一

（
邑 dN o O!J
eJ6u1
u1
eEOU

に対するネオプテリン(NPH4およびNP)の作用を
ヒト線維芽細胞でのコラ ー ゲン合成は大線量(291 /cmりの紫外線照射により、非照射群に対60

し約30%の抑制がみられた。 この抑制は還元型およぴ酸化型ネオプテリンの、いずれによっも解除

40

されず、むしろ増強された。 一 方、B-16細胞でのDNA合成は、1. 2J/ C記(2. OmV/cm 2 で10分間照20射）と極めて少線量の紫外線で非照射群に対し約
5

10

20

30%の抑制が得られた。 この紫外線傷害に対し、

30

還元型ネオプテリンであるNPH4は用量依存的に抑Irradiation time (min)制作用を示した。 一方、酸化型ネオプテリンであFig.12. Decomposition of the oxidized formof neopterin by UV-A irradiation as
a function of time.
One µ,M of the oxidized form of NP
was irradiated for different times
by UV-A at a dose of 2. OmW/cm'.
Remaining NP at each time interval
was assayed by Neopterin RIA kit.
Each point was expressed as rela­tive percent(%) of UV-A-irradiatedsample to the non-irradiated sample
and the mean 士S.E.M. for 3 inde­
pendent assays.

の、高混度(100µM)では、 その傷害をさらに一層促進した。 紫外線の傷害活性が活性酸素に起因することから、線維芽細胞での紫外線によるコラーゲン合成の抑制に対しても、当然、NPH4が防御的に作用することが期待されたが、本実験では、反対にコラ ー ゲン合成の抑制をさらに増強した。
この理由としては、紫外線のメラノ ーマ細胞でのDNA合成抑制作用と比較し、 コ ラ ー ゲン合成に対する紫外線の抑制実験では、照射線量が29/Jcm 2と大線量の紫外線を用いるため、NPH4が照射中に

察

4

考

るNPは低濃度領域では顕著な作用を示さないもの

酸化型ネオプテリン(NP)に変化した、あるいは
紫外線を吸収し、 コラ ー ゲン合成に対し抑制作用

これまで、紫外線による皮膚の炎症をはじめ、を有する他の化合物に変化したことに起因すると皮内癌の誘発・憎悪化等に、照射後、皮膚内に発が考えられる。 NPH4が極めて強い抗酸化剤である

生する種々のROSが関与することが報告されていこと、および、NPが活性酸素種を介した細胞毒性る。 すなわち、細胞に紫外線が照射されることにを高めると言うこれまでの報告 8) から、本紫外線

より細胞内の水分子は励起され、この後に続く連傷害モデルに おいても、これまでの報告のよう鎖反応により、種々のROSを生成、細胞膜の脂質に、この傷害の発生にROSの関与が示唆された。

過酸化等を介し、先に述べた種々の皮膚障害を発

そこで、B-16細胞での紫外線傷害に対する種々の5

生するものと考えられている - 7) 。
一

ラジカル・ スカベンジャ ー の抑制作用を検討し、方、ネオプテリンの抗酸化活性については、
1 -4)

本傷害に関与するROSを推定した。 この結果、過。 そ

酸化水素に対するスカベンジャ ー であるカタラ ー

こで本研究では、紫外線の中でも、比較的、細胞

ゼのみに本傷害に対する回復作用がみられ、過酸に対する傷害活性が低い長波長紫外線(UV-A)を

化水素を介した細胞傷害が示唆された。 この仮定

ー ゲン合成およびは、紫外線に代えて、過酸化水素により惹起した

これまで私共が報告してきた通りである

用い、 ヒト線維芽細胞でのコラ-75-

細胞傷害に対しても、ほぼ同様な結果を示したこ

2) Kojima S, Icho T, Hayashi M, Kajiwara Y

ネオプテリンの紫外線細胞傷害促進の機序として

effectof 5, 6, 7, 8-tetrahydroneopterin
on adriamycin -induced cardiotoxicity.

とからも支持されると思われる。 さらに、酸化型

Kitabatake K, and Kubota K, : Inhibitory

は、NPが紫外線照射により発生した過酸化水素の細胞傷害活性を上昇させた結果によると考えられる。

J Exp肋,gr,勿col乃er 226 1699-1704 1993.

3) lcho T, Kojima S, Shinohara N, Kajiwara

Y, Kitabatake K and Kubota K : Protective

紫外線の細胞傷害に対するNPH4の抑制作用、およびNPの細胞傷害促進作用が明らかとなり、それ

effect of tetrahydroneopterin against

及び皮膚癌に対する紫外線治療の際には、その安及ioc.ヵ喧肪'BF!DBCOJ 45 1953-1958 1993.

free radical-induced injury.

ぞれ紫外線暴露による皮膚炎症に対する防護剤、定性が問題となる。 そこで、ネオプテリンの紫外

4) Kojima S, Nomura T, lcho T, Kajiwara Y,

Kitabatake K and Kubota K: Inhibitory線に対する安定性を検討した。 この結果、ネオプ
テリンはUV-Aの発光スペクトル領域である320-

effect of neopterin on NADPH-dependent­

対し極めて不安定であり、照射後、直ちに分解あmacrophages. /i'E.8S letters 329 125-128

400nmに吸収スペクトルを有し、かつ本紫外線にsuperoxide generating oxidase of rat

るいは他の化合物に変化する事が明らかとなっ
た。

1993.

5) Ogura R, Sugiyama M, Sakanoshita T, andすること、一方、酸化型ネオプテリンがその傷害

oxide of skin exposed ultraviolet I ight.

は、それぞれ、皮膚の紫外線によるsunburn ある(eds). T h e Biological RoleofReactive

Hidaka T: Role of oxygen in I ipid per­以上、還元型ネオプテリンが紫外線傷害を抑制

In : Hayashi 0, Imamura S and Hiyachi Yを促進することが明らかとなった。 これらの作用

いはsuntun等の急性傷害に対する防護剤として、またNPを紫外線と組み合わせることにより、皮膚癌等の局所疾患の治療へ応用することが可能と思

Oxygen Species in Skin, University ofTokyo Press, Tokyo, 1988, pp 495-471.
6) Ogura R and Sugiyama H:Cellular membrane
damage and lipid peroxide following ex­

われる。

posure of the skin to ultraviolet rays.

謝In: Kl igman AM and T akase Y (eds) .

辞

コスメトロジ ー 研究振興財団より研究支援頂き、基礎研究を進める機会が与えられましたことを厚く御礼中し上げます。 お蔭様で、当初の研究

Cutaneous Aging. University of Tokyo

Press, Tokyo, 1988, pp 495-471.
7) Schellreuter KU and胃ood JM:Free radical

reduction in the human epidermis. Ji'ree

予定内容以外に、新たな結果を見出す事かできました。 今後も、皆様方の御指摘ならびに、なおー
層の御支援頂ければ幸いです。

彪d.Boil Jfed6 519-532 1989
8) Weiss G, Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G

引用文献
1) Kojima S, Icho T, Kajiwara Y, and Kubota
K:Neopterin as an endogenous antioxidant.
凡'i'BS letters 304 163-166 1992.

!ates toxicity mediated by reactive

Werner ER, Werner-Fe11mayer G, Semenitz E,
Dierich Hand屑achter H : Neopterin modu­

oxygen and ch 1 oride spec I es. Ji'£ガ:5'letters
321 89-92 1993.

-76-

哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究
九州大学

野

村

理学部

一

也

In this study, we showed that antibodies against human blood group B trisaccharides block
Ca2+ dependent cell-cell adhesion of frog (Xenopus laevis) embryonic cells. We isolated several
different novel pentaglycosylceramides with blood group B activity. The structure is novel inthat it lacks N-acetylhexosamine in its core carbohydrate structure. By using two dimensional
electrophoresis followed by western blot analysis, we identified two series of acidic proteins in
30-60 kDa range. We showed that one series of protein spots represents proteins with glycosyl
phophatidylinositol anchor (GPI-anchor). The effect of phosphatidylinositol specific phospholi­
pase C on Ca2+ dependent cel卜cell adhesion was tested and the enzyme treatment inhibited
Ca2+ dependent adhesion of embryonic cells completely. From these experiments, we concluded
the presence of novel GPl-anchored cel卜cell adhesion molecules with human blood group B
antigens. Blood group B active glycosylceramides were also detected in the nematode
Caenorhabditis elegans . In the nematode and in frog cells, the blood group B active
glycoconjugates colocalized with cadherins. The colocalization is observed in nematode nervous
cells and in frog embryonic cells and in skin cells. The cadherins and blood group B active
glycoconjugates seem to be forming supramolecular complex on cell surface. On the basis of on
our findings, it now seems possible to isolate homologous glycoconjugates (especially GPI­
anchored glycoproteins) from mammalian skin cells. Isolation of mammalian homologues ofthese novel GPI-anchored glycoproteins and glycosylceramides of frog cells will certainly shedlight on the mechanism of skin cell adhesion, thus deepening our understanding of the dynamic
nature of homeostasis of skin cells through differentiation and apoptosis. The possible interactionof signaling pathways through ceramide, cadherin and diacylglycerol is also discussed.

1

緒

シュウムの他にヒトB型血液型物質に対する抗体

言を加えておくといくら待っても細胞は凝集塊を形
私達はアフリカツメガエル(l'enopus laevis)

成せず、 バラバラのままである。この後抗体を洗の初期胚（卵母細胞から胞胚まで）におけるカル

い流してやると細胞は急速に接着をするようにな

シュウムに依存した細胞接着が、 ヒトのABO式血り大きな凝集塊を形成する。抗体の代わりにヒト

液型物質の一つであるB型物質に対する抗体で完

B型血液型糖鎖自体を加えると拮抗阻害により同全に阻害されることを明らかにした。

様に細胞の接着は破壊された。 これらの実験によカルシュウムを除いて細胞 一個ー個がバ ラバラ

り従来機能が無いと考えられていたヒトB型血液になるように解離したカエルの胚細胞はカルシュ型糖鎖は非常に意外なことにカエルでは細胞接着

ウムを加えてやると15分から1時間程度で接着を分子として機能していることが確実となった I) o

始め大きな凝集塊を形成する。 この実験でカルではこのB型血液型糖鎖はいったいどのような分子上に存在しているのだろうか？ヒト血液型

Study on novel glycosylceramides
mediating cell-cell adhesion of

B型物質は主としてアフリカツメガエルの初期胚の膜上に存在する糖蛋白質と糖脂質上に存在してmammalian skin cells-their possible
involvement in apoptosis
Kazuya Nomura
Department of Biology, Faculty of
Science, Kyushu University

おり、 その中の糖脂質について構造決定を行った
ところ、 全く新しし9ヽ構造を有する 5 糖の中性糖脂)質であることが判明した(Fig. 1) I 。 このグリコ
シルセラミドはどのようにして細胞接着に機能し-77-膚由来線維芽細L929細胞にトランスフェクトした

Galal-3
Galf31-3Galf31-4Glcf31-l'Cer
Fucal-2
Fig. 1Novel glycosylceramides foundin frog (Xenopus I eaves)embryonic eel Isているのだろうか？またB型糖鎖を含有している細胞を用いた。スクリ ー ニングの方法としては
B型 糖 鎖 の場合 は 9 6 穴 そ れぞれ の 培 養 上 清 を
ELISAプレ ー トに100µ1入れこれにlxl炉ケのB型
ヒト赤血球を加え直ちにプレ ー トごと遠心する。
赤血球に対する抗体含む上清を加えた穴では赤血球の凝集が遠心終了直後からはっきりと観察できる。この迅速スクリ ー ニング法を採用してからは百発百中で候補を見つけ ることが出来るように

糖蛋白質はどのようなものでどのように細胞接着に関与しているのだろうか？代表的なカルシュウ
ム依存性細胞接着分子であるカドヘリンとは一体どの様な関係にあるのだろうか？
アフリカツメガエル初期胚でみつかったB型糖
鎖含有グリコシルセラミドとB型糖鎖含有糖蛋白
質はツメガエルの皮膚細胞にも存在しておりその機能が皮膚細胞の分化と恒常性の維持に重要な役割を果たしていると考えられる。本研究ではカエなった。また候補がB型物質に特異的であるかど
うかはO型赤血球やA型赤血球を凝集しないことで確認しさらにB型糖脂質との反応性で最終的確認を行った。XBカドヘリンに対するモノクロ ー ナル抗体·(1)スクリ ー ニングには培養上清を96穴培養皿にいれ同時にEDTAで解離した1 X 1炉ケ程度のXBカドヘリンを発現させたマウス皮膚由来L929細胞を同時にまきこんだ。1日培養した後細胞と細胞の接着が阻害されている穴を選び同様の実験を再度

ルの細胞接着に重要な役割を果たしているこれらくりかえすとともに抗体の産生の有無をチェック

B型糖鎖含有複合糖質の研究を通じて哺乳類の皮した。さらに候補の穴で産生される抗体を使いウ膚細胞における相同分子の手がかりを求め、 これ

エスタンプロッティングして確認した。

ら分子の細胞接着とアボト ー シスヘの寄与の可能性を追求した。

2. 2 糖脂質と糖蛋白質の分析

2

実得られた抗体や本研究で用いた抗体がどのよう験

な抗原を認識しているかをさまざまな方法で調べた。糖脂質についてはFolch分配法で抽出分離しナル抗体の作成た後、 薄層クロマトグラフィ-法で展開した I) 。

P3Ulミエロ ー マ細胞と免疫感作したBalb/cマウ

この薄層プレ ー トに抗体液を重層して一晩放置しスの牌臓細胞をポリエチレングリコ ー ル4000 (メたうえでよく洗い流し 、 つぎにアルカリフォス

2. 1

モノクロ

ー

ド）によっ

ファタ ー ゼ標識の二次抗体をかけて数時間以上放て融合させることでハイプリド ー マを得た。融合

置し 、 この二次抗体をよく洗い流した後BCIP/

ルク・カスクロマトグラフィ ー グレ
は文献

2)

ー

NBTの発色剤で発色して観察した。

に正確に従った。 目的とするクロ ンをー

スクリ ー ニングの後、 限外希釈法でクロ ー ニング

蛍光抗体法には3%パラフォル ムアルデヒドでしハイプリド ー マを得た。抗原としてヒトB型糖固定した胞胚のクライオスタット切片を作成し、ナル抗体の作成にはヒト抗体 と 数 時 間 イ ンキュベ ー ト し た後よく洗い

B型赤血球・豚B型ムコ多糖・アフリカツメガエル

FITC標識の二次抗体をかけて更に数時間インキュ

胞胚膜フラクションを用いた。カエルのXBカドへ

ベ ー トした。この切片をよく洗った後レ ー サー共鎖に対するモノクロー

リンに対するモノクロ ー ナル抗体の作成にはクロ焦点顕微鏡(Zeiss LSM410)で観察した。またウーニングしたXBカドヘリンの遺伝子をマウスの皮

エスタンプロッティング法は通常の7. 5%ゲルに-78-

リコシルセラミドがある。セラミドの部分の脂肪

よるSDS電気泳動の後、 セミドラ イのプロッティ
ング装置でニトロセルロー

ス膜に転写するという酸の組成にのみ違いのある2種類の中性糖脂質、は色素染色

およぴ糖鎖の数の多いもう1種合計3種類の主要なー

B型糖鎖含有中性糖脂質が存在することが判明しSによる膜の可逆的染色法により行った。二次元

た。 膜表面に存在するこれらのB型糖鎖含有糖脂

電気泳動にはPharmacia Biotech社製のMulti­

質はかなり大量に存在する糖脂質でありその存在

phorllシステムを使い、 一次元目の等電点電気泳量の多さは重要な機能の存在をうかがわせる。

動にはImmobiline Dry strip (PI 3. 0-10), 二次

A型糖鎖含有複合糖脂質もごくわずかながら存在

元目のSDS電気泳動にはExcel Gel SDS precast

するがB型糖鎖含有糖脂質に比ぺると0.1%以下し方法で行った。転写の効率のモニタ
済みの分子量マーーー

カ をつかうとともにポンソ

gradient gelを利用した。プロッティングはフイ

か存在せず、 またB型糖鎖を含む極微量のガング

ルムリム ー バー

リオシドも検出したがあまりにも微量のためにそ

セミドライプロッティング装置で行った。

の構造解析は不可能であった。

でゲルをはがした後、 ATTO社製の

3

結

次にB型糖鎖を含有する糖蛋白質については二次元電気泳動法と抗B型糖鎖モノクロ ー ナル抗体

果を利用したウエスタンプロッティングで解析した。
3. 1

B型糖鎖に対するモノクロ ー ナル抗体の作製

�ヽ�
ぞ
令

害 する。 しかし市販品の 利用は抗体のアフィニ

��
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．

"
,
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カエルのカルシュウム依存性細胞接着を完全に阻

ー
゜
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"

B型糖鎖に対する市販のモノクロ ー ナル抗体はティ ークロマトグラフィ ー などへの 利用などを考えると経済的ではない。そこで自前で強力な抗B型血液型物質に対するモノクロ ー ナル抗体を作゜成した。 こうして得られた抗体はB型ヒト赤血球を特異的に凝集する他、 胞胚解離細胞のカルシュ
ウム依存性細胞接着を完全に阻害し、 さらに胞胚

fftt* ←58
, ←40のクライオスタット切片をそめてみると見事に膜表面を染色した。また数種類のB型糖鎖含有糖蛋

Fig. 2

白質に対して特異性の違う抗体が得られた。さらに面白いことにヒト B型糖鎖の抗体を作製するには、 カエルの膜フラクションがもっとも抗原性のNovel blood group B active
proteins separated by two­
dimensional electrophoresis

Fig. 2に示すように分子量30-60kDaにわたる 複数点から適していることもわかった。

種の蛋白質がアフリカツメガエルの膜フラクショ
ヒト血液型B型糖鎖を含む複合糖質の同定

ンに 存 在 し て い る ことがわかった。これらはカエルの初期胚に存在するB型糖鎖含有複合糖

fucosidaseやgal�ctosidaseなどB型糖鎖を消化す

質は糖蛋白質と糖脂質からなる。それぞれどのよる酵素で抗原性が失われるのでB型糖鎖を含有しうな分子がB型糖鎖を付加されておりどのようにていることが確認できた。またこれらの蛋白質は

3. 2

細胞接着に関与しているのだろうか？これを調べカエルの皮膚細胞にも存在すること•が分かった。

るため糖脂質と糖蛋白質の分析を行った。糖脂質

このようにB型糖鎖を有する数種類の分子が存在の方の主要分子としてはFig. 1に示した中性のグするわけだがこれらはいったいどのような性質を-79-

えて接着活性に対する効果をみてみた。その結果もった分子なのだろうか？

は劇的で酵素処理した割球は全くカルシュウムがあっても接着せず、カルシュウム依存性細胞接着

3.3 B型糖鎖含有糖蛋白質の性質の解明
アフリカツメガエルの膜を脱脂質するとB型糖性は完全に酵素処理で失われてしまった。また酵鎖に対する抗体による蛍光染色性がかなり弱まる

素を除いてよく洗い2時間程度回復 させると接着ことがわかった。 これはグリコシルセラミドが膜能は回復した。 この実験からアフリカツメガエルから失われることによると当初は考えた。確かにの初期胚の細胞接着には B型糖鎖を付加 さ れ た

グリコシルセラミドは脂質をぬく操作（クロロホ

CPIアンカ ー 型蛋白質が接着分子として働いていI)

水による抽出 ) をすると失ることがわかった。現在この分子の部分的アミノ

われるが、念のために蛋白質もこの操作で抽出さ酸配列の決定を試みようとしているところであれないかどうか調べてみた。すると面白いことにる。

ルム、メタノー ル、

二次元電気泳動で検出されるFig. 2の膜タンパク質群の中で分子量の高い方の一 群の糖蛋白質が消3. 5

えてしまうことが判明したのである。脂質と同じB型糖鎖とカドヘリンは相互作用している可
能性が高い

よう な 操 作 で 抽 出 さ れ る蛋 白質 と し て は G P I

カドヘリンはカエルでは120-140kDa程度の大き(glycosylphosphatidylinositol)アンカ ー 型蛋

な分子量をもつ膜一回貫通型蛋白質でB型糖鎖は白質が考えられる。 そこで さっそくこれら抽出さ付加されていない。しかしカルシュウム依存性細れる蛋白質が、GPIアンカ ー

胞接着の主要分子と考えられており私達の発見し型蛋白質かどうかを調べてみた。結果は明確で、GPIアンカ ー型蛋白

たB型糖鎖含有複合糖質はこのカドヘリンと相互質を特異的に二相分配できる界面活性剤Triton

作用している可能性が高い。そこでこの可能性のX114で膜を抽出すると、B型糖鎖を含む糖蛋白質

追求のためにまずカエルの胞胚型カドヘリンに対はTriton X114がわに分配され、さらに膜をGPIアするモノクロ ー ナル抗体を作製した。方法としてンカ ー を特異的に切断する酵素であるphosphati

は哺乳類皮膚細胞としてマウスの皮膚由来の線維-dylinositol特異的phospholipase C (PI PLCと芽細胞であるL929細胞をえらび、これに熊本大学略）で処理するとこれらは水層側に分配 されるこの但馬達哉助手と私たちの共同研究の結果えられとが判明した。この酵素は蛋白分解酵素活性はな

たアフ リ カ ツ メガ エ ル の初期胚型カド ヘ リ ン

く、かつ極めて特異的であるのでB型糖鎖含有糖(XBカドヘリン）の完全長遺伝子をリポフェクチ

蛋白質の分子量高い一 群はGPIアンカ ー 型糖蛋白ンを利用してL929細胞に導入（京都大学医学部永質であると結論された。

淵昭良先生のプロトコルによる導入ベクタ ー を用いた。）し、カルシュウム依存性細胞接着能を有

3.4

GPIアンカー型B型糖鎖含有糖蛋白質は細胞しかつ約119kDaのXBカドヘリンを発現している細胞株をクロ ー ニングした。 この細胞を用いてマウ接着に関与している
このGPIアンカ ー 型B型糖鎖含有糖蛋白質は細胞スを免疫感作しカエルのXBカドヘリンに対するモ接着に関与しているのだろうか？幸いなことにノクロ ー ナル抗体llDを得た。B型糖鎖に対するモPI PLCは中性付近のpHで活性が保たれており、かノクロ ー ナル抗体とカドヘリンに対するモノクロ

つカルシュウム存在下でその活性があまり阻害さーれない。そこでカルシュウムを除いて胞胚を単 一の胞胚や皮膚細胞ではカドヘリンとB型糖鎖が同細胞にまで解離し、これにカルシュウムを加えてーの細胞接着部位に存在していることが分かっ

再凝集させる実験系（緒言参照）にこの酵素を加

た。

-80-

ナル抗体で二重染色するとアフリカツメガエル

哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

この実験からカドヘリンとB型糖鎖が皮府細胞

糖蛋白質がGPIアンカ ー 型糖蛋白質であることはや胞胚細胞で局在性を同じにして相互作用してい細胞接着にPhospholipaseCやdiacylglycerolを介る可能性が強く示唆されたわ けである。 私達はした信号伝達系が関与していることをうかがわせ

B型糖鎖はカドヘリンと細胞膜上で超分子複合体

る。 カドヘリンを介する信号伝達系としてはショを形成しているものと考え現在弱い相互作用を検ウジョウバエのwingless相同分子からカテニンヘ

出できる最子プラズモン共鳴を用いたバイオセンの信号の流れが詳しく解明されており、 さらに成サー

長因子であるEGFのリセプタ ー がカドヘリンと膜(B!Acore)を利用し、B型糖鎖とカドヘリン

上で会合している可能性が指摘されている 3) 。 その結合定数の決定を行っているところである。

こでEGFをカエルの細胞にかけてみた。
3. 6

B型糖鎖の発現量は細胞周期に依存しており通哺乳類皮膚細胞での細胞接着分子とアポト

常は全細胞集団の20%程度でGl初期とG2、M期にーシスの関係の解明に向けて
アフリカツメガエルを用いて得られた以上の結のみ発現している。 だがこの成長因子をかけると果は胞胚の細胞や皮膚の細胞においてCPIアンカ

24時間で発現量は100%に増加した。 この事実は‘型のB型糖鎖含有糖蛋白質が存在しておりカト

B型糖鎖の発現がEGFからの信号伝達とうまく共役

ヘリンと超分子複合体を形成しながら、細胞接着

していることを示唆している。 この信号伝達系に機能していることを強く示唆している。 現在まはGPIアンカ ー と共役しているのだ ろうか？二次でのところカドヘリンと相互作用する分子として

元電気泳動を利用して判明したGPIアンカ ー では両生類や哺乳類・烏類などすべての脊椎動物でな い 高分子量側の分子群がEGFリセプタ ー 自体細胞質側で結合するカテニン類が知られている。

である可能性も検討中である。 phosphol ipase C

私達が発見したようにグリコシルセラミドやCPIやdiacylglycerolを介した信号伝達系の細胞接着ー型蛋白質か、皮膚の細胞を含む多細胞生への関与の可能性は細胞接着における信号伝達系

物の細胞において、カドヘリンと相互作用していのクロストー クの観点から極めて興味深い。 またることはまったく知られていなかったのである。

成長因子を培養液から除去した際に生ずるアポト

この研究の遅れの原因は一つはグリコシルセラミ

ーシスにおいてカドヘリンの機能はどう変化する

ドの研究者でカドヘリンとの関連を追及する研究のか、またこのアポト ー シスにおいてB型糖鎖を者が私達以外皆無であったこと、もうひとつは有するグリコシルセラミドがどのような変化をみ

CPIアンカ ー

せるのかなどを詳細に調べることで、哺乳類皮膚アンカ

ー型蛋白質やグリコシルセラミドのカ
一蛋白質の相互作細胞とカエル皮膚細胞• カエル胚細胞に共通した用であるため比較的弱く、通常の免疫沈降反応で細胞接着とアポト ー シスの実態が解明できるもの

は複合体として落ちてこなかったことによると思と期待される。

ドヘリンとの相互作用が、糖鎖われる。 ツメガエルの細胞接着機構は哺乳類の皮3. 7

膚細胞の接着機構とカドヘリンに関する限り完全

グリコシルセラミドとカドヘリンの関係の線虫を用いた解析に同ーであり互換性を有することが知られてい‘る。 本研究の結果、カト ヘリンと相互作用すると線虫(C. どlegans)は現在最も遺伝子レベルで考えられる新しいグリコシルセラミドとCPIアン

解析の進んでいる生物である。 その全ゲノムDNAー

カ 型糖蛋白質が同定できた訳で、これらの分子の塩基配列決定計画はヒトゲノムプロジェクトをの相同分子を哺乳類皮膚細胞で検索同定できる可リ ー ドするかたちで進んでおり数年以内には確実

能性は極めて高い。

に全ゲノムの塩基配列が決定されるはずだし、体を構成する細胞1000個あまりがどのように分裂しカドヘリンが相互作用する相手のB型糖鎖含有-81-

て発生するかという細胞系譜が完全に判明していとB型糖鎖の相互作用という事実がさらに一般的る。 また神経細胞（といっても300個ほどしかなに成立することを強く示唆している。線虫はアポい）の配線図がほぼできあがっていることも他のト ー シスの研究がもっとも進んでいる生物であ生物の研究の追随を許さない。 さらに突然変異のり、 アポト ー シスの抑制遺伝子ced-9やアポト ー

系統の蓄租・遺伝解析の進歩も他に類をみない利

シスを引き起こす遺伝子ced-3のホモログとして点である。 この生物は下等とはいえ、 さまざまなそれぞれ、 ヒトのアポト ー シスにかかわるbcl-2

哺乳動物と共通の遺伝子を機能させている。最近

やinterleukin 1 fl converting enzy田e (ICE)なでは癌遺伝子rasへの信号伝達系路の解明に大きどが解明されてきている 6) 。 これらのアポト ー ン

く貢献したことは記憶に新しい 4) 。 この線虫にもスの研究の蓄積を利用してグリコシルセラミドとカドヘリンやグリコシルセラミドはあるのだろう

カドヘリンのアポト ー シスヘの関係を解明し哺乳か？もしこの生物にグリコシルセラミドがあり、類皮JS細胞のグリコシルセラミドとアポト ー シス、

またあわよくば B型糖鎖を持つグリコシルセラミ

そして細胞接着の関連の解明を行いたいと考えてドがあればグリコシルセラミドの合成系路の研究いる。

や遺伝子発現の制御機構の研究がゲノムプロジェ

4

クトやミュ ー タントの蓄積を利用して飛躍的に進考察むと予想できる。 その結果はほとんどの場合ただちに哺乳類にフィ ー ドバッ クできるであろう。 こ

カエルと線虫は哺乳類とは一 見かけ離れた研究の期待のもとに線虫のグリコシルセラミドの研究材料であるか、 意外に哺乳類の研究に役立つものを開始したところ大変期待できる結果が得られである。 皮府細胞の細胞接着とアポト ー シスを媒た。

介するであろう グリコシルセラミドやセラミドの線虫を大量培養したうえで超音波破砕して脂質研究の過程で、 私達は細胞接着分子であるカドへを Felch 分配 5) により抽出した。 薄層クロマト グ

リンと相互作用している新しい グリコシルセラミ

ラフィ ー で脂質を展開し糖を染色するオルシノ ー

ドとGPIアンカ ー 型糖蛋白質の存在を明らかにし

ル試薬で発色すると各種の糖脂質が存在することた。 これらがカエルのみならず哺乳類細胞にも存ー プレ

在することはほぼ確実であると考えられ今後GPIート上での抗体染色法によって検討した結果酸性

アンカ ー 型糖蛋白質の部分的アミノ酸配列の決定

糖脂質分画ではなく中性糖脂質分画にさまざまなによる遺伝子の単離をおこない、 その遺伝子を利B型糖鎖含有糖脂質が存在することが判明した。

用して哺乳類皮I目細胞での相同分子を同定する計

これらの脂質が B型糖鎖構造をもつことはこれら画である。 またカエルと線虫での研究をさらにすが判明した。 さらに薄層クロマトグラフィー

すめて哺乳類におけるアポト ー シスと細胞接着にゼで処理して染色性が失われることで確認した。

おけるGPIアンカ ー 型糖蚕白質の機能の解明を行

ヒト血液型B型糖鎖が線虫C.elegansに存在するこい、 カドヘリンを介した細胞接着とそれに関わると（しかしA型糖鎖やO型糖鎖も確認できなかっ信号伝達系のネットワ ー クを解明したいと考えてた。）はB型血液型糖鎖が非常に基本的な役割を果いる。

の脂質をaガラクトシダ

ー

ゼやaガラクトシダ

たしていることを強く示唆している。 さらに面白
いのは、 古典的カドヘリンとよばれるカドヘリン
一謝辞般に対する抗体が咽頭の神経を染色しさらにその神経細胞にB型糖鎖が局在しているという結果

本研究を多方面にわたり支援していただきましである。 このことはカエルで確認したカドヘリン

たコスメトロジ ー 研究振典財団に心から感謝いた-82-

哺乳類皮膚細胞のアホト ー シスと細胞接活をつかさとるセフミトの研究

821-827 1995

します。 またこの研究のあらゆる局面で相談にのっていただきました理化学研究所国際フロン2)

ティア ・糖細胞情報のチ ー ムリ ー ダ ー 平林義雄先

細胞免疫実験操作法、 川口進•原田孝之訳理工学社

3)

生、 九州大学農学部の伊東信先生、 京都大学農学

第17章

H. H oschuetzky et. al. J. Ce!l lliol.,
127 1375-1380 1994

部山本憲二先生、 その他私たちのすべての共同研
4)

究者の方々に感謝いたします。 また当時ケンプ
リッジ大学におられたChris Wylie教授とJanet

形態形成にかかわる遺伝子群（蛋白質・核
酸・酵素

増刊）、西田育巧

他編、 共立出版、178-190.

Heasman博士、 Adrian Turner博士には筆者の目を5)

糖鎖生物学に向けさせていただいたことについて

R. L. Schnaar and L. K. Needham, Methods
in Enzymology, Vol. 230, p371. Academic

心からの感謝を捧げます。

Press, New York, 1994.

引用文献
1)

K.

Nomura et. al.

6) アポト ー シス実験プロトコ ー ル、 田沼靖ー監
Jlioc力emical .I.,306

修、 細胞工学別冊、 秀潤社-83-皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発
京都大学 薬学部

橋田充

Effectiveness of prodrug-enhancer combination for enhancement of skin penetration of drugs
is proposed and confirmed in this study. Based on a skin diffusion model, we hypothesized thatskin permeation of drug could be the most effectively enhanced by derivatizing into a prodrug
with the optimal lipophilicity for the enhancer, when its action mechanism is elucidated in thesame model. Employing acyclovir as a model drug, the hypothesis was proved by synthesizing
seven types of its prodrugs and evaluating their in vitro permeation in rat skin, pretreated withl-geranylazacycloheptan-2-one(GACH), a penetration enhancer. Among seven prodrugs, thosewith higher lipophilicities (propionate, butyrate, valerate, and hexanoate isovalerate, pivarate
prodrugs) showed larger enhancement in their skin penetration than those of hydrophilic ones
(acetate and acyclovir), when administrated in combination of GACH. In this approach, prodrugs
applied topically were metabolized through the skin, since skin was metabolically active tissues.
We have proposed that a two-layer skin diffusion model with polar and nonpolar route in thestratum corneum, which included metabolic process in the viable epidermis and dermis, could
comprehensively account for skin permeation of acyclovir prodrugs. Concerning the effect of
GACH, the estimated partition parameters of prodrugs in the nonpolar route increased with anincrease in pretreatment dose of GACH, but their diffusivities were little affected being in good
agreement with the theoretical prediction. In addition, GACH was significantly decreased the
enzymatic hydrolysis rate constants of all prodrugs in the skin. These experiments have beenstudied with an in vitro condition, and a goal of in vitro studies is the prediction of in vivo
absorption behavior. We previously demonstrated quantitative in vitro/in vivo differences in skinpenetration in terms of diffusion and partition parameters. However it has not been establishedthese differences concerning metabolic process. So we demonstrated to quantitate in vitro/in vivo
differences in skin penetration and bioconversion of acyclovir prodrugs. In order to confirm thepossibility of this combination approach with an in vivo condition, penetration profiles wasevaluated by a deconvolution method which enabled to estimate first-pass metabolism. Next weanalyzed in vivo skin urinary excretion profile based on a diffusion/bioconversion model, anddiffusion, partition and metabolic parameters were compared between in vitro and in vivo
condition.
In conclusion, skin permeation of prodrugs applied with an enhancer can be predicted andoptimized based on a model analysis. This combined approach would be applicable to a wide
range of drugs, since extreme alteration of physicochemical properties of drugs is not necessary
as is the case of single prodrug application.

1緒 言な課題と なってきた。 しかしながら、 吸収促進法を利用した処方設計は試行錯誤的に進められてい近年、 皮膚の老化防止などスキンケアを目的とるために促進効果も不十分であり、 現在、 吸収とした生理機能賦活物質に対する期待が高まる中その促進を総合的に議論することができる合理的で、 これら物質に対する皮膚浸透性の改善が重要

設計理論の確立が強く望まれている。 我々はこれまでに皮膚の生理学的、 解剖学的特性に基づいてDevelopment of Theoritical Design

構築した皮膚拡散モデルを用いて薬物物性と経皮

for Skin Penetration Enhancement of

吸収動態および経皮吸収促進剤の作用機構を統一的に解析することに成功している I . 2) 。

Drugs
Mitsuru Hashida

こうした数学的基盤に基づきAzone類似体の中Faculty of Pharmaceutical Sciences

から最も優れた促進作用を示した吸収促進剤、

Kyoto University

l-geranylazacycloheptan-1-one (GACH)が0. 5程-84-

皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

2

度 のオクタノ ー ル／水分配係数を有する薬物（生実験

理活性賦活物質）に対して最も有効であることを
2. 1

明らかにした I . 2) 。しかしながら、実用的側面か

試薬

ら見た場合、多様な物理化学的特性を有する薬物

acyclovir(AC) は日本ウエルカム株式会社よりに対し普遍的に適用可能 な吸収促進のアプロー チ

供与されたものを用いた。[ 3H]AC は第一化学薬品の確立が望まれる。 そこで、そのままでは促進剤より購入した。l-geranylazacycloheptan-1-oneの効果が期待できない物性を有する薬物に対して(GACH)は株式会社クラレより供与されたものをも、プロドラッグ化修飾を施し適当な物性を付与用いた。 4-dimethylaminopyridine および炭素数することにより促進剤の効果を最大限に発揮するの異なるacyl chloride は 、 ナカライテスク株式ことが可能になると考えた。 こうした薬物（生理会社より購入した。 その他溶媒、試薬は特級品を活性賦活物質）分子の理論的設計による新規吸収用いた。

促進法の最適化について検証するために、臨床上の ニ ー ズが大きい抗ウイルス剤のacyclovirをモ

2. 2

プロドラッグ設計のシミュレ ー ション

促進剤無処理および処理条件における 、薬物自デル薬物として脂溶性の異なる6種類のプロドラッグを合成し、実際にラット腹部除毛皮喝を用いて身の物性と皮膚透過最と の関係を、皮膚拡散モデin vitro皮膚透過実験を行なった 3 . 4 l。

ルに基づいた理論式と従来の解析結果のパラメ ー

次に皮膚は薬物透過に対するバリヤ ー としてのタを用いてシミュレ ー ションした。 薬物は水溶液

機能に加えて、高い薬物代謝能も備えていることの形で投与した場合を想定し、 促進剤は角質層非から、実際にプロドラッグとして投与した場合に極性 経路への薬物の分配を増加させると仮定しは、皮膚内代謝を考慮した総合的評価か必要であた。

ると考えられる。 そこで代謝過程を考慮した皮膚
2. 3

拡散モデルを構築し、プロドラッグの経皮吸収動

分配係数の測定

態および GACHの促進メカニズムについて代謝過程

溶媒にN,N-dimethylformamide 10mlを用い、を含め て検討し機構面からも本設計理論の妥当性
5)

ACプロドラッグの合成とオクタノ ー ル／水。 さらに、こ うしたin vitro皮旧4-d ime th yla m i n o p y r idineを塩基と し て A C

透過実験の最終目 的は1刀vivoにおける吸収の予

1 m m o 1と 3等量 の炭素数 の 異 な る直鎖の測にあると考えられるが、未だ代謝を伴う薬物のacyl chlorideを 48hr室温で反応させた。 溶媒をin vivo経皮吸収動態の評価に関する報告は少な

減圧留去後、NaOH溶液(pH9. 0士0. 2) 15mlを加え沈く、代謝過程を考慮した両実験系の違いを定量的

殿をろ取する。 得られた租結晶をNaOH溶液で洗浄を検証したに把握することが必要であると考えられる

6)

後、 エタノ ー ル溶液中で再結晶した。そ3 . 4)。 過剰量

こで、 位vivo条件下でのプロドラッグから親薬のプロドラッグを37℃で48hr援拌し、水およびオ物への変換過程を考慮した総合的な検討を行なう

クタノ ー ルに対する溶解度を測定した。 オクタノことを目的として、 プロドラッグのよう な皮膚中ール／水分配係数はそれらの比から計算した。

で代 謝 さ れ る 薬 物 に 対 し ても適 用 可 能 な
deconvolution法を開発し 7) 、吸収の各過程 のレ

2. 4

In /litro皮膚透過実験

ベルでそれぞれの薬物について動態を分離評価をWistar系雄性ラット（体重約200g)をpento bar­

行ない本設計理論の1n vivoでの有用性を検討しbital(40mg/kg,i. p.)で麻酔下、 その腹部を除毛た。

し、ラットを屠殺後皮阻を摘出し、皮下脂肪を取り除いた後、flow-through型拡散セルに装着した-85-

3 - 6)。 ドナ ー 側をGACHのエタノ ー ル溶液で6hr前2.6

静脈内急速投与実験

処理後、 各薬物懸濁液l田lを投与した。 レセプタ

Wistar系雄性ラット（体重約200g)をurethaneー側は常に6rnl/hrでpH7.4リン酸塩緩衝生理食塩(lg/kg, i.p.)で麻酔下、 in vivo経皮吸収実験

水を灌流し、60分毎に12時間レセプタ 側流出液と同様膀脱カニュレ ー ションを施し、ACおよびプをサンプリングした。

ロドラッグの生理食塩水溶液0. 2mlを大腿静脈よーり急速投与した後、ACおよびプロドラッグの尿中2. 5

排泄量を経時的に測定した。

/11 Jlivo皮膚透過実験

in vitro経皮吸収実験は基本的にin vitro吸収実験と対応した形で行なった 6) 。 プロトラッグ

2.7

deconvolution法

としてはvalerateおよびその構造異性体である

経皮投与されたプロドラッグが、 尿中に排泄さisovalerate、pivarateを用いた。Wistar系雄性れるまでの過程をFig. 1に示した。 まずプロドラッ

ラット（体重約200g)をurethane (lg/kg, i. p.)

グを経皮投与した時のプロドラッグの尿中排泄速で麻酔下、その腹部をバリカンで除毛後、 円筒状

度を、 プロト ラッグ静注後のプロドラッグ尿中排のガラスセル（有効表面積3. 14cmりをアロンア

泄速度Gp(t)を用いてdeconvolutionを行ないプ

ルファA (三共株式会社）を用いて除毛部位に固ロドラッグ自身の皮膚透過量を算出する。 次にこ

ルチュ

ブ(i. d. 0. 50mm,のプロドラッグの経皮吸収速度Fp(t)をプロド

o. d. 0. 90 mm ; Dual社）を挿入した。 促進剤のエ

ラッグ静注後のAC尿中排泄速度Gp,d(t)を用いてタノ ー ル溶液で6hr前処理後、 ドナ ー側に薬物水

convolutionを行ないプロドラッグとして皮膚を溶液1ml (0. 018MBq)を投与し、ACおよびプロド

透過後、 体内で代謝されたACの尿中排泄速度を算

ラッグの尿中排泄量を経時的に測定した。 尿のサ出する。 最後に実験により求めたプロドラッグをンプリングはサンプリング時間の前に生理食塩水

経皮投与した時のACの尿中排泄速度からc onvo­

0. 2mlをカニュ ー レを介して1回注入し、 膀脱内を

lutionにより求めたACの尿中排泄速度を引くこと洗浄することにより行なった。

により、皮膚中で代謝されそのまま尿中に排泄さ�1定し、 膀脱にビニ

ー

ー

.,

‘

寧

辛

旦謳

Prodrug

Fig.1

Pharmacokinetic Model to Estimate Prodrug Penetration through the skinafter in Vivo Percutaneous Application Using Deconvolution Method-86-

皮J貴生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

Prodrug design

を高速ラプラス逆変換アルゴリズム(FILT)を利用した非線形最小二乗法プログラムMULTI (FILT)を用いて累積透過曲線に当てはめ、各パラメ ータを算出した l , 5) 。
3結果・考察プロドラッグ設計のシミュレ ー ション(4)Fig. 1は、解析結果に基づくシミュレ ー ション
により予測されるfinite投与条件下における対象
薬物の透過量と脂溶性の関係を整理したもので正常皮膚において、水／オクタノ ー ル間分配係数の対数値が約2となる薬物が最も高い皮内透過量を与えることが示されている。 一方GACHによる皮膚の前処理は、この曲線を左に大きくしシフトさせることによって、極性の比較的高い薬物の皮盾透―の 累積透過量の式を誘導した。さらにこれらの式·▲゜を構築してFickの拡散式を解き、ラプラス次元で

3.1

10

3

される変換過程を仮定した1枚膜皮閲拡散モデル

20

'
’
'
,
＇
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,
..
＇
,

」

以下の層で酵素による親薬物への1次速度式で表

r
e
C
n
a
h

角質層に極性経路と非極性経路を考え、角質層

30

2

モデル解析

+GACH

40

「
●
↑□汀

の皮府透過量を算出した。

-1

M [
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86

deconvolutionを行ないプロドラッグ投与後のAC

•2

=
lJ

-3
50

ACを静注後の ACの尿中排泄速度Gd(t)を用いて

2. 8

゜

log PCocVw of drug

れたACの尿中排泄速度を算出し、この値に対してI> Prodrug 2

Prodrug 1

Fig. 2 Relationship between octanol/waterpartition coefficient of drugs andskin penetration with or without
GACH calculated with penetration
parameters reported previously (1).
Dotted and solid lines represent
skin penetration without and with
GACH.respectively. Skin penetration
is expressed as the amount of drug
penetrating within 24 hr in thefinite dose system.The following
parameters were used in this simu­―
lation: Dp/Ls 2 =40 (hr ');Dnp/Ls'=
1.5 (hr-'); Dd/Ld 2 =0.06 (hr-');
KpVp=O. 000015 (cm') ;KdVd=O.7 (cm');logKnpVnp (cm') =1.3*1ogPCoct/w3.0 (without enhancer); logKnpVnp(cm')=l.l*logPCoct/0.9 (with GACH
25.5µ.mol)

過を大きく促進することが示されている。しかしことなく幅広い薬物に対しても適用が可能になるながら、極性が非常に大きいacyclovirに対してと考えられる。

は、GACHの効果は依然不十分であることも本図は3.2 ACプロドラッグの合成とオクタノ ー ル／

示して おり、そこで我々はG A C H処理に加えて水分配係数の測定

acyclovirをプロドラッグ化し、両者の組み合わ合成されたacyclovirプロドラッグの純度は、せで吸収促進を実現することを試みた。Fig. 1に示すようにacyclovirの吸収改善を化学構造の修

すべて95%以上であることをHPLCを用いて確認し飾のみで実現するためには、脂溶性を分配係数のた。Table. IにはACおよびプロトラッグの棉造式

対数値で —2付近から2付近まで1万倍も上げる必要と物理化学的性質をまとめた。水への溶解度はがあるのに対して、このアプロ ー チでは、物性のButyrateまてはACのほほ2分の1なのに対し、それ変更を最小限にととめることが可能であるため、以上の炭素数を持つプロドラッグでは急激な低下

皮府透過性に重要な分子サイズ等の制限を受けるが見られた(}さらにオクタノ ― ル171<分配係数は‘

-87-

Table. I

Chemical Structures and physicochemical properties of synthesized
Acyc I ov i r prod rugs

；均十C H3(CH2) ,COCI

H�ふJ

n

゜

→

CH :J.CH 2)nCOO
m.p. (°C)

ゞ》

�N:t)

Solubility (mM)

/'vC

a)

PCoct/wb)260-26211. 9

0.0123242-245

4.89

0.05781

218-220

5.73

0.212

AC butyrate2220-222

4.64

0.402

AC valerate3206-208

2.50

0.702

AC hexanoate

4

213-215

0.741

3.352

Acyclovir (AC)AC acetate
AC propionatea) Drug solubility in water was determュned at 37°C.
b) n-Octanol/water partition coefficient (PCoct/w) was calculated
as a ratio of solubilities in water and n-octanol at 37°C.

炭素数の増加と共に有意な上昇が見られた。

る、透過係数の比から促進効果を計算し、先のシ
ミュレ ー ション結果より予測し得るラット皮旧で

3. 3

In /litro皮膚透過実験の促進効果の理論曲線上にプロットした。

このようにして、GACHを様々な浪度で作用させFig. 4 (a)のコントロ ー ル条件においても、実た皮園を用い、ACとそのプロドラッグの透過を測

測値が、理論曲線と良く一致したが、最も親油性定した(Fig. 3)。ここでは、GACHによる促進効を上げたHexanoateの場合でさえ透過係数の変化

果を、AC投与時と比較するために、プロドラッグ

はacyclovirに比べ約2倍程度であったことから、の形で投与した場合の透過量を、レセプタ ー 側に

この程度の脂溶性の変化では顕著な吸収改善につそのままIntactな形で現われたプロドラッグと、ながらないことが明らかとなった。またプロト'

その代謝物であるacyclovirとの和として表した。

ラッグ化とGACH適用とを組み合わせた場合には、

GACH適用によりacyclovirおよびAcetateの場合にFig. 1 (b)示すように、プロドラッグの物性と促はそれほど透過が促進されなかったのに対し、適進効果との間にはベル型の関係が認められ、さら当な親油性を有するPropionateとButyrateの場合に実測値が我々が予測した理論曲線と良く一致しには、顕著な皮膚透過性の改善が見られた。またたことより、こうした吸収促進法の理論的設計がー 側に現われた未変化体プロドラッグと可能であることが示された。また、代謝過程を組レセプタ

代謝物であるACとの割合はプロドラッグの置換基

み込んだ皮府拡散モデルを用いて透過曲線を解析の構造により大きく異なり、さらにGACH適用量依した結果をTable. IIにまとめた。GACHは主として存的に全透過量に対する未変化体プロドラッグの角質屈非極性経路に対して作用し、プロドラッグ

割合が増加することが明らかとなった。Fig. 4にの拡散パラメ ー タをほとんと変化させないのに対はコントロ ー ル条件およぴGACH適用条件におけし、分配バラメ ー タを用量依存的に増大させるこ

-88-

口↓

皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

0
0
4

6

12

Time (hr)Acyclovir Hex1;1no1;1te

0
0
4

T

●

0
0
2

゜゜

．
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Time (hr)

9

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iauad iunoEく
2Acyclovir V�ler �te

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▲△
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▲

Fig_ 3

3

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12
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4

．． ．

Acyclovir Ac etate

0
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．
9

Acyclovir Bvtvr �te

0
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6

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auad iun0Eく(」Time (hr)

〒 △

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● T △
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0
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（
差 opkl'v'!OClュ）pareJi
auad i
unoE<

0
0
6

l
>opk:ivio翌 ）pareJi
auad iunoEく（」Acyclovir

12Time (hr)Time courses of total acyclovir amount penetrating through the rat skinpretreated with ethanolic solution of 0(△） ， 6. 4 (▲）， and 2 5. 5µ_ mo I (●）
of GACH.
Acyclovir and its prodrugs were appiled insuspenslon. in the case of the
prodrug application, the sum of acyclovir and prodrugs appearing in thereceptor is shown. Each point represents the mean 士S.D. value of atleast three experiments.

とが明らかとなった。 これは、 従来のモデル薬物と、 その代謝物であるACの和として表している。

に対する促進効果の解析結果と一致し、 本設計理

AC投与に比ペプロドラッグの形で投与した場合に論の妥当性が促進機構の面からも証明された。

は、GACHと組み合わせることにより有意に尿中排3.4

泄量は増加した。 in vitro条件でのGACHの促進

Ifl Jl/vo皮膚透過実験

効果は最大12倍程度だったのに対し、 JR vivo条

GACHを作用させた皮膚に対し、 acyclovirある

件では、 プロトラッグに対して30倍以上の促進効

いはプロドラッグの形で投与された薬物の、 尿中果が認められた。 両実験系における促進効果の違への累積排泄 一 時間曲線をFig. 5に示した。 プロ

いは、 角質層nonpolar routeに作用するGACHの効

ドラッグの形で投与した場合の排泄量は、 尿中に果か、 水和により角質層のpolar routeが充進しそのまま未変化体の形で現われたプロドラッグているin vitro条件に比べ、 JR vivo条件の方-89-a) Witho1,Jt GACH
i.A.

p

10

-3

log PCocvw of drug

-2

図

゜

n ate

-1

2

-1

20

゜

゜

propionate-2Jbutyrate•-valerateacetate゜hexanoateb) With GACH 25.5µmol

゜

．

ol
uaEQl
gu
e4u山
l
eに i

4
山

30

log PCoct/w of drug

Fig.4 Relationship between octano/water pa�tition coefficient of drug andenhancement effect of GACH under different conditions. In the finite
dose system the enhancement effect is defined as the amount of drug
penetrating within 24 hr with GACH divided by that without GACH. whilein the infinite dose system it is defined as the ratio of permeability
coefficient of drug with GACH to that without GACH treatment (control).
The following parameters were used in this simulation: Dp/Ls 2 =40―(guinea pig) or 60(rat) (hr '); Dnp/Ls 2 =1.5(hr-'); Dd/Ld 2 =0.06 (guineapig) or 0.08(rat) (hr-'); KpVp=0.000015 (guinea pig) or 0.00007 (rat)(cm'); KdVd=O.7(guinea pig) or 3.5(rat) (cm'); logKnpVnp(cm')=l.3*
I ogPCoc t/w3. 0 (without enhancer); IogKnpVnp (cm') =1.1 * IoPCoct/w-0. 9(with GACH 25. 5µ,mol)がより顕著に現われるためと考えられる。 しかした経皮吸収パタ ー ンをFig. 6 (b)に示した。

ながら、 ill vivo実験における薬物の尿中排泄量

isovalerateとpivarate,について、 それぞれの尿は、 薬物の吸収のみでなく、 吸収後の体内での分中排泄パタ ー ンと経皮吸収パタ ー ンは大きく異な

布・代謝·排泄過程をすぺて含んだものと考えらり、特に酵素的に安定なpivarateは6割程度が代れる(Fig. 1)。 吸収後の体内動態は薬物間で大き謝されたacyclovirとして尿中に排泄されたが、く異なるため、 Ill vivoにおけるプロドラッグの皮膚中ではほとんど代謝を受けないことが明らか

経皮吸収動態およびGACHの促進効果について正確となった。 また、 すべてのプロドラッグにおいてに評価するためには、 吸収過程のレベルで議論すコントロ ー ル条件に比べGACH処理により全透過羅

ることが必要であると考えられる。 そこで体内でに対する代謝されたacyclovirの割合が有意に減代謝を受ける薬物に対しても適用可能なdeconvo

少したことより、 in vitro 実験系の場合と同-lution法を開発し

様in vivo実験系においてもGACHは皮眉中の酵素

7)、プロドラッグを静脈内急速活性を低下させることが明らかとなった。

投与実験の結果をもとにdeconvolutionを行ない経皮吸収パターンを得た(Fig. 6)。

コントロ ー

isovalerateとpivarateの尿中排泄曲線に対し、

ル

条件で、 各プロトラッグを経皮投与した時のプロ代謝過程を組み込んだ皮膚拡散モデルを用いて解トラックと代謝されたacyclovirの尿中排泄パタ

析した結果、 角質層nonpolar routeの分配や拡散ーンをFig. 6 (a) に、 deconvolutionにより求めは同じモデル解析から得られたin vitroの結果-90-

皮膚生理楼能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

Table. II

Estimated penetration parameters for Drug penetration through theSkin pretreated with various Doses of GACB

Stratum Corneum
Drug

GACH dose(µrnol)acyclovir

acetatepropionate

85.5

3.86

88.5

2.05

(hr-1)

10.4

Knp'

C)

3

(cm)

0.00010210.7

0.000261

゜

10.6

0.000690
3 d)

80.0

8.35

0.000102

25.5

83.6

stripping

2.05

6.4

80.8

3.86

゜

78.7

2.05

stripping゜

stripping゜

stripping25.5

゜

stripping
6.4
25.5

゜

stripping
25.5

4.34
-1 di
}
Dd'=0.437 (hr

79.4

3.86

4.34
-1 d)
Dd'=0.256(hr )
82.2
77.4

2.05

78.2

3.86

4.34
-1 d)
hr )
.2QQ(
Dd'=0
80.8

76. 2
77.0

2.05

3.86

79.6

4.34
-1 d)
)

75.1

2.05

75.8

3.86

Dd'=0.314(hr

4.34
-1 d)
Dd'=0.314(hr )
78.4

76.2

79.6

2.05

4.34
-1 d)
)

゜

Dd'=0.173(hr゜Dd'=0.207(hrstripping
25.5

mannitol

84.7

3

C)

Enzymatic
Hydrolysis
Rate Constant

4.34
-1 d)
)
(hr
Dd'=0.365

6.4

pivarate

Dnp'

6.4

6.4

isovalerate

)
K p'b

25.5

25.5

hexanoate)(xlO 5cm)

゜

25.5

valerate

Op' aNonpolar ェoute1(hr- )

6.4

butyrate

Polar route

stripping
6.4

25.5

stripping

76.2

2.05

79.6

4.34
-1 d)
l

90.9

2.05

91.8

3.86

4.34
-1 d)
Dd'=0.287 (hr )
95.0

-91-

Kd'=0.177 (cm l8.91

0.000487

8.12

9.03

0.00639
3 d)
Kd'=0.182 (cm lk(hr-1)

1.10
0.590

0.734

0.000138

0.900

8.01

0.000516

0.569

0.00778
8.43
3 d)
Kd'=0.259 (cm)

0.298

9.16

0.000273

8.40

0.001112.44
1.20

0.01093 l d)
Kd'=0.485 (cm0.700

0.00130

0. 9927.24

0.000663

4.04

7.64

0.00391

1.51

7.20

0.0417
3 d)

1.14

7.91

0.000373

0.156

8.34

7.22
7.49

0.000378

0.0170
7.67
3 dKd'=0. 216 (cm) )Kd'=0.247 (cm)7.22

0.0107
3 d)

Kd'=0.371 (cm ）8.48

0.000446

7.62

0.0164
3 d)
Kd'=0.223 (cm)

3 diKd'=0.21-6 (cm)

3.28

0.756

0.06850.02690.0111

o
n
u
1
m
X
E\f
一
8O
8
P
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nU
µ
0u
）
。
;.
a0
o
s
e
(

5
4
3

2

AC lsovalern1e2Time (hr)3

1

AC Pivarntr,

1

2

3

1
0

°。

I

2

0.6

1
2
3
4
5
o o o o o
(
e
s
o
a1
0%二u
n
o
wvp
a
1
e
i
1
a
u
a
d

ー
T△
員
ク

2
0

Fig.5 Ti me c o urses of total acyc1ov1r
amount excreted in the urine pret­
reated with ethanolic solution of
0 (△） and 25.5µ.mol(●） of GACH.in
the case of the prodrug application.
the sum of acyclovir and prod rugs
appearing in the receptor is shown.
ach point represents the mean士S. D.
value of at least three experiments.

30

3

AC lsovalerate

402Time (hr)

4

1

5
0

d
8
U
B
I
J
8
1
8
0%)
o
EVP
n
u
1
a1
o
s
e

」

4

3

0

4

凰択
ィ

0.6 r

0
1

0
1
2

Time (hr)3Time (hr)Time (hr)bl P�rcutaneou,; Pene.trntio�of Acyclovir Pro<irv�,;

0
2

0
2
1

2

3

Time (hr)△ ; Prodrug

Fig.6 Excretion in urine and percutaneous
penetrat i on profiles estimated byde convolution method of acyclovir
prdrugs through In Vivo Rat Skin

1
Enzymatic Hydrolysis Rate Constant (hr -)
0.001

0.01

0.1

1

10

Hyoroly$i$ Rate
isovalerate

pivarate

臼 ， Skin Homogen ate Exp 団 ， In Vitro Penetration Exp. fflう ， In Vivo Penetration Exp
Fig. 7

4

0
3

3
x
:i
J
a
1
a
uVp
o
n
u
1
1
nu
µ
u
e
)
°
`
o'}
o
s
a
(

1

゜
゜

1

」

3

4

0
3

1
u
n
o
(
e
s
o
o%)
e
j
e
J
O
X
3
e
u
u
nU
!
EVp

2

Time (hr)AC Pivara\ij

0 o o
0
0
•
�
1
0
1
e
w
o
n
u
1
EVp
)
1,。
°
0
o1
o
s
e
(

0
1

0
1
1

0.6

0.6 r

0
2

0
2

゜゜

al Excretion in Urine of Acyclovir Prodruos

0
3

0
3

3
x
:i
J
a
1
a
wvp
o
n
u
1
!
nLI
u
u
o%)a
o
s
a
(

Acyclovir

Comparison of Enzymatic Hydrolysis Rate constants btween In Vivo and
In VI tro.

-92-

皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発とほぼ同様の値が得られたが、 in vivoの代謝速度定数に関してはin vitroの結果より約20倍大

stratum corneum: Dose-dependent effectof l-geranylazacycloheptan-1-one on

きな値が得られた(Fig. 7)。 つまり両実験系の生理的 条件の達い からin vivo での酵素活 性 は

drugs with different lipophilicities.
及lo!. P/Jarm. .8/Jん'. 1 6 690-697 1993

in vit.roに比べ有意に高いことか示され、 皮膚

2)山下富義、 小山靖夫、 坂東博人、 高倉喜信、

ホモジネ ー ト実験やin vit.ro透過実験から、

橋田 充：機構論に基づく吸収促進剤適用の最 適化の試み， Drug Delivery System. 8

in vivo条件下での正確な酵素活性を評価することは容易でないことが示唆された。
4

総143 ● 150 (1993)●

3) H. Bando, F. Yamashita, Y. Takakura, and括

M. Hashida., : Skin penetration enhance­

men t of aclovir by prodrug-enhancer

モデル解析に基づき理論的にプロドラッグ化とcombination. .Biol. P/Jar.航 .8lJ/L 17 1141-

吸収促進剤適用との組み合わせにより有効な皮膚透過を得 ることが可能てあり、 また実際に理論的

143 1994
4) H.Bando,T. Takagi,F. Yamashita,Y. Takakura,

予測することも可能であったこと から、 モデル解

Prodrug-Enhancer Combination Based on aに設計したプロドラッグの物性による吸収動態を

and M. Hashida., : Theoretical Design of

析が吸収メカニズムの解明のみでなく、 演繹的にSkin Diffusion Model : Prediction of Per­

経皮吸収促進法の最適設計に対し応用可能である
ことが明らかになった。 in vivo条件において、

meation of Acyclovir Prodrugs Treatedlution法を開発したことより吸収過程のレベルでプロドラッグの動態を把握することが可能とな

5) H. Bando,M.Sahashi, T. Takagi,F. Yamashita,

用性が示された。 さらに代謝過程を組み入れた皮

Prodrugs Based on a Diffusion Model with

with 1 -Geranylazacycloheptan-l-one.

代謝を伴う薬物に対しても適用可能なdeconvo­

り、本アプロ ー チのin肋'8T.夙 Res. 13 417-431 1996

Y. Takakura, and M. Hashida., : Analysis ofvivoにおけるより高い有In Vitro Skin Penetration of Acyclovir膚拡散モデルを用いて薬物の吸収動態を解析する

a Metabolic Process. lilt. J. F/Jarlll. 135

ことで、 両者のアプロー チが皮f目透過に及ぼす影
臨を代謝過程を含めて総合的に議論することが可

91-102 1996
6) F. Yamashita. H.Bando,Y. Koyama,S. Kitagawa.

動態に関するin vivo/in vitro相関について定in vitro analysis of skin penetration

能であるこばかりでなく、 代謝を伴う薬物の吸収

Y. Takakura, and M.Hashida., : In vivo and

量的に評価することが可能となることが明らかとなった。

enhancement based on a twolayer diffu­

引用文献
1) F. Yamashita, T. Yoshioka, Y. Koyama,

11 185-191 1994

sion model with polar and nonpolar rou­

tes in the stratum corneum. ?,力arm. がes.

7) F. Yamashita, H. Bando, Y. Takakura, and
M. Hashida., : A Deconvolution Method for

H. Okamoto, H. Sezaki, and M. Hashida., ·Analysis of skin penetration enhancement

Estimating the First-Pass Metabolism of

based on a twolayer skin diffusion modelwith polar and nonpolar routes in theOrally Administered Drugs. JJiol. P/Jarm.
iJl!/L 1 8 1787-1789 1995

-93-

リポソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカ）レ消去への応用
九州大学

内

海

薬学部

英

雄

Transdermal absorption of drugs entrapped in liposomes and radical scavenging effects ofantioxidants in skin were investigated with ESR spectroscopy. Spectral-spatial and spatial­
spatial 2-D imaging system were developed for this purpose.
Spin-labeled compound entrapped in liposomes was applied on stripped hair-less mouse skinand release of the compound from liposomes was imaged by using spectral-spatial 2-D analysis
system. Liposomes injected infravenously to mouse was measured non-invasively with a L-band
ESR, but it was impossible to measure liposomes applied on skin of live mouse because of lesssensitivity.
Anthralin radical was produced on hair-less mouse skin by treatment of anthralin and UV1rradiation. High resolution spectral-spatial imaging showed that anthralin radical was
generated near skin surface. Intravenous administration of antioxidants prevented thegeneration of the radical. Ascorbic acid and glutathione decreased the generation of anthralin
radical independent of inadiation period, but Trolox showed less effect during first 5 h irradiation.
Action mechanism of these antioxidants seems to be different.

1

緒

言

リポソ ー ムからの薬物の放出・吸収過程を解析するためには、 皮膚におけるリポソーム内薬物の近年、 化粧品分野においてリポソームは、 保湿挙動を遊離薬物のものと区別して解析する必要か

効果並ぴに経皮吸収の向上効果を狙って積極的にある。 スピン標識化合物は、 溶液中に高濃度に存在するときには1本のプロードな電子スピン共嗚用いられるようになった。 しかし、 リボソームを薬剤の吸収担体として用いた場合、 皮膚における(ESR)スペクトルを与えるが、 希釈されるとンャープな3本線へと変化する。 従って、 リポソ ーム

薬物の吸収過程についての詳細はまだ分かっていないのか現状である。 それは、 リボソ ーム製剤の吸収評価を行うには、 薬物のリポソームからの放に高濃度に封入しておけばそのESRスペクトルの変化から薬物のモデルとしてリポソームからの放出 と組織での吸収という2つの過程を解析しなけ

出を解析することが可能である。 また、 ESRは試ればならず、 皮膚におけるリポソーム封入薬物の料を破壊せずにスペクトルを得ることが可能であ

これらの過程を同時に解析するための適切な手段

るため、 皮膚表面におけるリポソーム封入薬物のがまだ存在しないからに他ならない。

変化を経時的に調べることができる。 皮膚におけるリボソームからの放出・吸収過程を同時に解析するためには、 更に皮膚のどの部分のスピン標識

Imaging analysis,,

oftransdermal

化合物が如何なるスペクトルを与えるかをµmのabsorption of liposome-entrappeddrugs and application toradical scavenging in skins

空間分解能で知ることが必要となる。 そのため、Hideo Utsumi法を開発する。 スペクトル ー 空間画像化解析は、

Farnlty of Pharmaceutical Sciences
Kyushu University

Mal tempoら l - 3 >、 Herrlingら 4. 5 >により既に行わ本研究では高分解能スペクトル ー 空間画像化解析れているが、 本研究ではこれを皮膚におけるリポ-94-

リボソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用

ソ ー ムの解析に適応できるように改良を加えた。

理食塩水で懸恐した。

また、 近年生体計測用に開発されL — バンドESRにより、 リポソ ー ム製剤の挙動の無侵襲解析についヘアレスマウスに50mMアンスラリンのアセトンても検討した。
一方、 皮 膚では紫外線によりメラニン色素沈
着、 アレルギー

皮膚におけるアンスラリンラジカルの生成

2. 3

誘発、 皮膚癌生成などが起こるこ溶液500µlを塗布後、 紫外線ランプによりUV-Aあ
るいは uv-cを照射した。

とが知られている。 これらの成因には紫外線が皮膚で生成する活性酸素やフリ ー ラジカルが係わっX バンドESRはJEOL JES RE-lXにより測定した。
—ていることが示唆されているが、 それをin vivoで証明した例やフリーラジカルの抗酸化剤による消去をin vivoで解析した例は未だない。 本研究では、 上記リポソー

ム製剤の放出・吸収過程の解

ESR測定

2. 4
L—

｀

バンドESRはL ― ノ｀ ンドマイクロ波ユニットとループギャ ップ共振器（幅5mm, 内径33mm)を装備したJEOL JES PE-lXにより測定した。

析に加え、 紫外線照射により生成するラジカルの皮膚内存在位置を高分解能スペクトル ー 空間画像

2. 5

ESR画像

化法を用いて調べた。 また更に、 皮商のラシカル

磁場勾配G =tan(e)・△ H/△ L(△ H, △L

生成におよぱす抗酪化剤のin vivoにおける効果

はそれぞれ得ようとするスペクトル ー 空間画像のスペクトル軸， 空間軸の大きさ）で投影角度0のを調べた。

射影スペクトルを得、 filtered-backprojection

2

実

験

法により画像を再構成した。

ミッシングアングル（磁場勾配装置の限界から射影スペクトルを得る
2. 1

実験材料

ヘアレスマウス (HR-1,5週齢，雌性）は、 星野
試験動物飼育所より、 マウス(ddY,3週齢，雌性）

ことのできない正負の限界投影角度から go· までの 角度）に由来する画像のア ー ティファクトは代数的再構成法により取り除いた。

は成和実験動物研究所よりそれぞれ購入した。 プ
レソ ー ムC-1は、 日本精化より恵与されたものを

3

結果および考察用いた。4-trimethylammonium-2,2,6,6-tetra­
methylpiperidine-N-oxyl iodide (CAT-1)は

3. 1

Molecular Probes, Inc. より購入した。 アンス
ラリンはSigma Chemical. Co. より購入した。

スペクトル ー 空間2次元画像化システムの開発

3. 1. 1

高分解能スペクトル ー 空間2次元画像化システムの開発

2. 2

皮膚においてスペクトル ー 空問画像を得るため

リポソ ー ムの調製

プレソ ー ムC-1 (水素添加卵黄レシチン／コレには µmオ ー ダ ー でスペクトルを空間分離するこ

ステロ ー ル(1:1))50mgに150mM CAT-1水溶 液とか必要である。 このために非常に強力な磁場勾500µ1を加え、 水 和させたのち、 凍結融解を5回配コイルと専用キャビティを制作メ ーカ ー に依頼繰り返し、 ポ リカ ー ボネ ー ト膜（ポアサイズ

し、 用いた結果、 数百µ mの解像度を持つ高分解400nm, 2枚重ね）を10回通過させた。 リポソ ーム

能スペクト）レ ー 空間2次元画像化システムの構築に取 り込ま れ な かった C AT- 1 を遠心分 離に成功した。

(100, 000 X g, 60分， 20℃)により除き、 リポソームの沈澱を脂質濃度が70-80mMになるように生-95-

ーN-t:.._

oo

30 °

60°

ヽ

□ 2 mM CAT-1

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ー入·ー

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5

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1.0 mT

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図1

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絵
炉
感". 150 mM CAT-1 in Liposome

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一

120 °

ク

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がJ

リポソーム封入CAT-Iと遊雄CAT-Iとからなるファントムーード
2mM CAT-I水溶、夜（シャ ー ブな3本線スベクトル） と150mM CAT-Iを封入したリポソ ム（プロな1本線スベクトル）をそれぞれ内径I. 6 cmのバイアルびんと内径0. 5 cmの試験管に入れ、 左図のファ—ントムを作成した。 図中に示す6方向はスペクトル 空間画像の空間釉の方向を示す。

3_ 1 _ 2

異種スペクトルを与えるラジカルの2次元の各位値でスベクトルの積分値を求め、 全 CAT-1

空間画像化システムの開発の空間分布を得た。 遊離CAT-1 の空間分布は 3 本線

異種スペクトルを与えるラジカルの分布が1次のうちベ ー スライン補正した低磁場側ピー クの梢

元空間に限定される場合に は スペクトル ー 空間

分値より得、 全 CAT-1 の空間分布からこの寄与を2次元画像化法によりスペクトル分布が解析でき差し引いて、る。 しかし、 分布が2次元へと広がった場合にはした。6方向の スペクトル— 空間画像より得た2種

スペクトル情報をのせた2次元空間画像を得る必スペクトルの 空間情報をそれぞれ別々に再構成要がある。 そこで、 スペクトル

し、ー

空間2次元画像から異種スペクトルの空間情報を抽出して、 巽な

リポソ ー ム封入CAT-1 の空間分布とリボソ ー ム封入CAT-1 、 遊離CAT-1 の 2次元空間画像を得ることができた（図3)。

る スペクトルを与えるラジカル種の2次元空間画
像を得る方法を開発した。 図1に示すように スピ

3. 2

リポソ ー ム製剤の放出・ 吸収過程の解析

ン標識化合物 CAT-1 を封入したリポソ ー ムと遊離

3. 2. 1

リポソ ー ム製剤の111 p/po無侵製解析

の CAT-1 とからなるファントムを作成し、 図中に皮I目に塗布したリポ ノ ー ムを/17 Pivo無侵襲測示す6方向を空間軸として6つのスペクトル ー 空間

定する前段階として、 まず、 リポ ノ ー ムの体内動‘‘

2 次元画像を得た。 得られた画像は、 図 2に示すよ態をJR vivoで無侵襲解析できるか否かを検討しうに2種のスペクトルが分離されている部分と混た。

在している部分が存在する。 この画像から2種ス

スピン標識化合物 CAT-1 を封入したリボソ ー ム

ペクトルの位置情報を得るために、 まず空問軸上をマウスに尾静脈内投与し、 頭部から下腹部まで-96-

リボソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用

ヽ

---·

、

,,,,、 /b ,'メ疇·······-a·········•············•······•·····......
ら

‘

，

s

図2

．

リボソ ー ム封入CAT-1と遊扉CAT-1とからなるファントムより得たスベクトル ー 空間画像と2つのスペク
トル成分の空間分布の抽出
図1のが方向 を空間軸としたスベクトル — 空間画像（左上）の空間軸上の各ポイントでスベクトルの積分値を得 、 か方向の全CAT-1の分布とした（右上a)。 下に示すように、 スペクトルの低磁場側のシャ・ーブなピークのペースライン補正をし 、 その積分値の空間分布を0 方向の2mM CAT-1の分布とした・（右上b) 。 全CAT-Iの分布から2mM CAT-1の分布の寄与を差し引いて150mM CAT-1のO 方向の分布とした（右上a-3b) 。

Free Spin Probes

図3

Liposomal Spin Probes

リボソ ー ム封入CAT-1と遊難CAT-1の分離2次元分布画像
図2に示す方法で6方向のスペクトル ー 空間画像からリボソ ー ム封入と遊躇のCAT-1の6方向の空間分布を得、 それぞれ別々に2次元空間画像を再構成した。

-97-

の各部位におけるシグナル強度の分布を L — バンド

0.5 h

ESR を用いて経時的に調べた。 リポソ ー ムに封人された状態の CAT-1 のシグナルは胸部、 上腹部で高く、 頭部ても検出された。 上腹部以外のシグナ

善ルが経時的に減少したのに対し、 上腹部のシグナ
ル強度は24時間ではほとんど変わらず、48時間後でも70%が残っていた（図4)。投与6時間後に肝
1.5

0

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2h

5

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3h

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Eュ8 S

図4 L — バンドESRにより非侵哉的に測定したマウス
静脈内投与リポソ ー ムの体内分布の経時変化
CAT-1封入リポソ ー ムをマウスに尾静脈内投与し 、幅5mmの共振器を5mm間隔にずらしてリポ‘ノー ム
封入CAT-1のシグナル強度を経時的に求めた。
臓、 肺、 心臓、 胃を摘出し、 ESR 測定したところ、シグナルは肝臓のみに検出され、 このリボソ ー ム

1mT

か肝臓に長期滞留することが示された。 以上のよ
うに、 L— バンド ESR を用いること によりリポソ ー
ムの体内動態を無侵襲で解析することに成功した

図5皮店表面におけるリポソ ー ム崩壊の高分解能スペクトル ー 空間画像
ヘアレスマウスの剥離皮店に綿糸に染み込ませたCAT-I封入リポソ ー ム懸濁液を置き 、
皮虚の深さ方向を空間軸として高分解能スベ
クトル ー 空間画像を経時的に得た。 リポ ‘ノ ー
ム添加0. 5時間後にプロ ー ドな1本線であった
スペクトルが時間の経過と共にシャ ー プな3本線へと変化した。 中央下の小さなシグナルは
皮廂切片の皮下組織側に皮堵させた標準物質(DPPH)のものである。

‘

が、 皮膚に塗布したリポ ノ ー ムのill vivo検出は塗布量が限られているため現在のところ成功してしヽなし 'o3. 2. 2

剥離皮膚表面におけるリポソ ー ム崩壊

皮陪塗布リポソ ー ムの/17 vivo検出ができな‘かったため、 剥離皮府を用いてリポ ノ ー ム崩壊を解析した。 図5は、

ヘ

アレスマウス皮阻切片表面

-98-

‘

りホ ノ ー ム封人楽物の皮旧吸収過程U)序祈と皮膚内フシカル消去へのI心用に綿糸に染み込ませたCAT-1 封入リポ ノ ー ムを密‘着させ、 そのシグナルの変化を高分解能スペクト
ル — 空間2次元画像化システムにより経時的に調べた結果である。

CAT-I のシグナル下側の小さなシ

グナルは皮問の皮下組織側に付着させたDPPHのものである。 リポ ‘ノ ー ム添加直後にCAT-1 のングナ
ルはプロ ー ドな単ーピ ー クとして検出されたか、時間が経過するに従いシャ ー プな3本線ピ ー クへと変化していく様子が確認された。 これは、 CAT

゜
ー

·
(
n
e)�usuai
u―
1
eu61
s

150

50

-1を封入したリポ ‘ノ ー ムか皮附表面で崩壊していくことを意味する。 しかし、

10

CAT-I が皮膚へ浸透

広がりは残念ながら確詔できなかった。

3. 3. 1

30

40

50

irradiation time (hr)

していく様子を示す空問軸に沿った DPPH 方向への

3. 3

20

図 6 皮南におけるアンスラリンラジカル生成に及ぼす紫外線照射の影響
アンスラリンのアセトン溶液を塗布したヘア
レスマウスをUV-A照射下(0) 、 uv-c照射下（●）
あるいは暗所（▲)で飼育し 、 経時的に剥離皮窟をESR測定した。

皮膚生成ラジカルと抗酸化剤
皮膚におけるアンスラリンラジカルの生成

アンスラリンは抗尋常性幹せん治療薬として古くから用いられているが、 一方、 光増感作用があり炎症や発癌等を引き起こす ことも知られて いる。 皮府にアンスラリンを塗布したヘアレスマウによ全sua Uが検出された。 このシクナルは、 Packerら

6)

·
e)
n·
(

で測定するとg値が2. 003の単ービ ー クのシクナル一致した。 アンスラリンラジカルのシグナル強度
は紫外線照射時間の延長に伴い増加した（図6)。

uv :.. c照射

，I、

名

゜

また、 ングナル強度はUV-A照射時に比ぺ時の方が大きかった（図6)。

図7は、 高分解能スペクトル ー 空間2次元画像化.��··-··、

＇

·
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f

一

り報告されているアンスラリンラジカルのものとA

スを紫外線照射し、 その皮府切片を X — バンド ESR＼ヽ.

、ヽ.ヽ. �

50

100

150

200

ヽ

250

300

Distance from Teflon Surface (µm)

システムを用いて、 アンスラリンラジカルの皮旧における生成位龍解析を行った結果である。 ヘア

図7スベクトル —空間画像より得たアンスラリンラ
ジカルの皮店内分布
アンスラリンを塗布し紫外線照射したヘアレ
スマウスの剥甜皮虐を皮下組織側 (A) あるいは表皮側(B)をテフロン支持体に付堵させ 、皮店の深さ方向を空間軸としてスベクトル —空間画像を得、 アンスラリンラジカルのシグナ
ルの積分値よりその空間分布を得た 。

レスマウスにアンスラリンを塗布したのち紫外線照射し、 剥離した皮沼切片をテフロン支持体に付看させて皮膚の深さ方向のスペクトル ー 空間画像を得た。 表皮を支持体側にして皮膚切片を付着させるとアンスラリンラジカルのピ ー クは支持体側に接近した。 このことより、 アンスラリンラジカ
ルが皮屑の表面付近で発生していることが確認さ

-99-

125

60

75

50

骨 曇骨

゜
．゜
．
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25

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100

25

10

20

30

40

irradiation time (hr)irradiation time (hr)UVA 照射時

uvc 照射時50

図8 アンスラリンラジカル生成に及ぽすアスコルピン酸静脈内投与の影饗ァンスラリン塗布マウスに紫外線照射5分前にOmmo I/kg (●）、0. 2mmo I/kg (0)あるいは2mmo I/kg（▲）のアスコルピン酸を尾静脈内投与し、 紫外線照射して、 経時的に剥雄皮膚を ESR 測定した。
拿p(O.05, 拿拿p(0.01. *拿拿p(0.005

れた。 本システムでは数百µmの解像度を得ることができたが、シグナルの線幅の寄与を取り除く

あるTroloxを用い同様に実験を行った結果を図 9に示す。 アスコルヒン酸やグルタチオンが短時間(5 時間以内）において長時間 (24 時間）とことができないためこれ以上の詳細な解析は困難

照射

であった。

同様に有効にラジカル生 成を抑えていたのに対

3. 3. 2

し、 Troloxでは短時間照射ではあまり効果が現れアンスラリンラジカルに及ぽす抗酸化剤

ず、長時間でアンスラリンラジカルの生成を抑制

の効果

した。

皮膚におけるアンスラリンラジカル生成に抗酸

ア ンスラリ ンは光醗化あるい は自動酸化で化剤がin vivoで如何に働くかを調べる目的で、

9-anthron-10-y 1 ラジカルやアンスラリンダイマ

マウスにアンスラリンを塗布する前に種々の抗酸

ーとなりこれがアンスラリン ・ プラウンラジカル化剤を投与し、アンスラリンラジカル生成に及ぼへと変化すると言われているが 7, 8) 、皮膚でのアす効果を調べた。 アンスラリン塗布5分前にアスンスラリンラジカルの生成過程は不明の部分が多コルビン酸を静脈内投与しておくと、投与量依存い。 今回生体に投与した抗酸化剤でラジカル生成

的 に ア ンスラ リ ン ラ ジ カ ル 生 成が 抑 制され たが抑えられたことより、アンスラリンラジカル生（図8)。 この抑制効果は照射した紫外線の種類に

成過程にこれら抗酸化剤により消去される活性種

よらず見られた。 同様な抑制効果はグルタチオンが係わっていることが示唆される。 Troloxは、脂(0. 2mmol/kg体重）の静脈内投与でも見られた。

質のラウリル硫酸ナトリウムミセル中でベロキシ

皮膚におけるラジカル生成に及ぼす抗酸化剤の効

ラジカルを効果的に消去することが報告されてい果をin vivoで評価できたのはこれが初めてである 9) 。 一 方、アスコルピン酸やグルタチオンは種る。

々の水溶性酸化物を還元するほか活性酸素種を直抗酸化剤としてビタミンEの水溶性 アナログで接消去 したり、グルタチオン — アスコルビン酸 ー

-100-

リホソ

ー

ム封人楽初U)反膚吸収近在U)序i/fと反｝膏内フソカル1月去へU)}心用

100

100

CO 75

75

一
一
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25

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15

20

25

irradiation time (hr)irradiation time (hr)uvc 照射時

UVA照射時図910

アンスラリンラジカル生成に及ぽすT ro I ox静脈内投与の影響
アンスラリン塗布マウスに紫外線照射5分前にOmmol/kg (●）あるいは0.2mmol/kg (0)のTro I ox
を尾静脈内投与し 、 紫外線照射して 、 経時的に剥扉皮膚をESR測定した 。
*D(0.05

ヒタミンEレドックス鎖を通して油相のペロキシ

みたところ、 静脈内投与したリポソ ー ムの挙動のラシカルの消去に係わっていることが知られてい解析には成功したが、 皮膚に塗布したリポソ ー ム

る。Troloxの効果を発揮するまでの時間がアスコの検出は感度の制約からできなかった。 皮岡表面

ルピン酪やグルタチオンと異なった理由として、

におけるin vivo測定は、 今後のL — バンドESRのこれら抗酸化剤により消去される活性種の違い、感度の向上あるいは共振器の改良に委ねなければ

これら抗酸化剤がアンスラリンラジカル生成部位ならない。

へ到達するまでの時間の違い、 といったことが考皮膚で紫外線照射により生成したアンスラリン

えられる。 これらのどちらによるかは、 生体に投ラシカルの生成部位をスペクトル ー 空間画像化シ

与した抗酸化剤のアンスラリンラジカル生成抑制

ステムにより課べることができた。 このラジカル機構と共に今後の課題である。

の生成における抗酸化剤の効果をin vivoで検討した結果、 抗酸化剤の種類により効果が現れるま4

総ての時間が異なることが分かった。 この抗酸化剤

括

ESRをリポソ ー ム製剤の皮岡吸収過程並びに皮呵生成ラジカルの解析に応用するにあたり、 数百のラジカル生成抑制機構については今後の研究課
題としたい。

µmの空間分解能を持つスペクトル ー 空間画像化

引用文献システムの開発に成功した。 また、 スペクトル情

1) Maltempo MM, :Differentiation of spectral

報に基づく2次元空間画像化法の開発にも成功し

and spatial components in EPR imaging

た。 高分解能スペクトル ー 空間画像化システムを

using 2-D image rec onstruction algo­

用いて皮膚切片表面におけるリポソ ー ムの崩壊を

rithms, J. J/agn. fleso几 69 156-161 1986

解析することができた。 リポソ ー ム製剤の挙動を

2) Ma 1tempo MM, Eaton SS, Eaton GR, : Spectra 1-—

L バンドESRによりin vivoで解析することを試-101-

spatial two dimentional EPR imaging,/)ermato!, 92 677-682 1989

J. Jfag11. J?eso11. 7 2 449-455 1987

3) Ma 1 tempo MM, Eaton SS,Eaton GR, : Reconst­7) Se E Malo T, Dubertret L, Prognon P,

tional EPR images from incomplete setschemical properties and stability ofruction of spectralspatial two dimen­

Gond A, Mahuzier G, Santus R, : Physico­anthralin in model systems and humanof projections without prior knowledgeof the component spectra, J. Jlag11. l?eso11.

skin, J. Invest. /)ermato!, 80 1-6 1983

8) Reichert U, Jacques Y, Grangeret M,

77 75-83 1988

4) Herr! ing T, Klimes N, Karthe W, Ewert U,

Schmidt R,: Antirespiratory and anti­

pro! iferative activity of anthralin in

Ebert B, : EPR zeugrnatography with modu­
lated magnetic field gradient, J. Jlag!l.

cultured human keratinocyte, J. Invest.

屁S011. 49 203-211 1982
5) Fuchs J, Groth N, Herr! ing T, Milbradt R,/)ermato!, 84 130-134 1985
9) Cast I e L, Perkins -M J, : In hi bit ion

tic resonance (ESR) imaging in skin.

antioxidants in SDS micelles. Evidence

Zimmer G, Packer L,: Electron paramagne­

kinetics of chain- breaking phenolicthat interrnicellar diffusion rates may

Biophysical and biochemical microscopy,
J. !11vest. lJer@atoJ., 98 713-719 1992

6) Fuchs J, Packer L,: Investigations ofanthralin free radicals in model systems
and skin of hai rless mice, J. !11vest.

,.;·

-102-

be ratelimiting for hydrophobic inhibi­
tors such as a -tocopherol, J. Am. Che夙Soc., 108 6381-6382 1986

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝達：
天疱癒IgG誘導表皮細胞間接着離開と力）レシウムシグナル伝達
岐阜大学

北島

医学部

康雄•清島真理子

The signal transduction involved in the regulation of eel卜cell contacts is supposed to play
an important role in kertinocyte differentiation. To elucidate signaling mechanisms to regulate
keratinocyte functions, we employed pemphigus vulgaris (PV), which is a bullous disease causedby disruption of desmosomes (a cell-cell junction), as a model. In this disease, autoantibodies bindto the desmosomal junctional proteins, so that cell-cell detachment is induced. However, no
precise mechanism for this phenomenon after the antibodies bind to the antigen has been known.
In this study, the effects of PV-IgG on the intracellular concentrations of Ca ++ and inositol 1,4,5tris-phospate and secretion of plasminogen activator (PA) were studied in cultured
keratinocytes. PV-lgG caused inrecases in these second messengers and PA secretion, which were
inhibited with phospholipase C (PLC) inhibitor; U73122. These results may suggest that PLC andCa++ singnaling pathway is involved in cell-cell detachment in PV.

要性の細胞内カルシウムの増加が観察された。 この

約

反応は、EGTA前処理により細胞外のカルシウムを天疱癒およぴ類天疱癒において抗体が表皮細胞

キレ ー トしても変化はなかった。 したがって、細表面に結合後にどのような過程を経て水疱形成に

胞内プ ー ルよりのカルシウムの動員によって、細至るかについては、最終段階でプラスミノ ー ゲン

胞内カルシウムの一過性の増加を引き起こすこと

アクチベータが分泌され、プラスミンが活性化さが示唆された。

れ．、これによる細胞間接着の消化が関与するということが推察されているものの不明な点が多い。
本研究では、抗体結合後の細胞内シグナル伝達を一方、 類天疱癒IgG 8 例中 7 例、健常人IgG 14例

中 12 例では細胞内カルシウムは変化しなかった。

さらに、この天疱癒IgGは添加後 20 秒をピ ー クと解析した。 培養表皮細胞の培地に天疱癒IgGを添するI氏の産生を誘導した。 この反応は類天疱癒、4, 5

正常lgGでは見られなかった。 また、天疱癒IgGに加し、細胞内カルシウム、 イノシトー

—三リン酸(IPりの濃度、プラスミノ

ル1,

ゲンアク

よって誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇、チベ ー タの分泌の 変化を検討した。 その結果、天I凡産生の増加およびプラスミノ ー ゲンアクチベ

疱癒IgGでは 8 例中 7 例で 20 秒をピータの分泌増加がホスリパ ー ゼC (PLC)阻害剤でーークとする一過ある D73122によって抑制された。 このことから、
天疱循I g G に より誘導 され るシグナル伝達系にSignal transduction involved in theregulation of cell-cell junction anddifferentiation in keratinocytes
Involvement of calcium signaling in
pemphigus lgG induced acantholysis
Yasuo Kitajima
Department of Dermatology
Gifu University School of Medicine

PLCが関与していることが示唆された。
以上から、 自己抗体結合後の天疱癒水疱形成メ
カニズムには、カルシウムを介したシグナル伝達系が関与している可能性が示唆された。 また、天
疱癒と類天疱癒の発症過程において明らかな差異があると考えられた。

-103-

Effects of lgGs from PV, PF.BP and

表1

はじめに

norma I天疱癒の水疱形成には抗デスモソ ー ム抗体が原PV因と考えられており、尋常性天疱癒 (PV) では抗
デスモグレイン皿抗体が、葉状天疱癒 (PF) では
抗デスモグレインI抗体がその発症に大きな役割

Age Sex IF
34 F 〉40X
I
2
U F 〉40x
3 65 M >40x
41
55
57

F >640x 150KD
M ND
F 〉40X 150KD

I

30
U
U
69
60
43
75
65

M
F
F
F
F
F
M
M

4
5
6
7
8

らの抗体が表皮細胞表面に結合した後に、如何なる機序によって、天疱癒に特有な表皮の棘融解が1B ea'•Res
＋
130KD
130KD
＋
130KD

PF 1
2
3
BP

を果たす ことが知られている 1 - 3〉。 しかし、これsera on [Ca2+]�e Sex Ca''Res
37 F
60 M
57 F
48 F
51 F
33 F
42 M
45 M
30 F
35 F
43 M
63 M
69 M
70 F

Nor 1
2
3
5
6
7
8

，

>40x IBOKD＋>40x 180KD
640x 230KD
640x 230KD
180KD
ND
180, 230KD ND
ND 180, 23CKD 180KD
ND

10

11
12
13
14

生じるかについては不明な点が多い 3) 。 ところでを培挫液に添加し、ア ー カ

最近、Cキナ ー ゼの阻害剤であるH7が、天疱癒抗

製した lgG (lmg/ml)

体による棘融解形成を抑制したという報告 4) があス 100 ー イメ ー シング蛍光顕微鏡および画像解析

り、天疱癒の棘融解形成において、カルシウムー

装置（浜松ホトニクス）を用いて細胞内カルンウ

c- キナ ー セを中心としたシグナル伝達メカニズム

ム濃度の変化を検討した。

が関与することが示唆されている。 そこで、われ
われは天疱痛抗体結合後の表皮細胞において細胞

イノシト ー ル 、 1 、 4 、 5三リン酸の測定
l.8mMカルシウムを含有するイ内カルシウムが変化するか否かについて検討しー

6)グル培挫液で培養したヒト表皮細胞の培養液にIgG を加え、一た。

定時間後に10%過塩素酸により反応を停止した。
I 氏の定最は I 凡特異的結合蛋白質を含む IPa アッ

材料と方法

セイキット（アマシャム）を用いて行っ た。
lgG

の精製

尋常性天疱癒プラスミノゲン ・ アクチベ ー タ ー 活性の測定(PV) 5例、葉状天疱癒 (PF )DJM-1細胞の培養液に IgG およびu13122 00-4

3例、水疱性類天疱癒 (BP) 8例および健常人(N)を 添 加 し た。 コントロ ー ル と してー
プロテインAーア
14 例の血清より、 ハ イトラップ-1 0-5M)

フィニテイ ー カラム（ファルマシア社）を用いて

073122 の不活性アナログである073343 oo-s M)

lgG 画分を得た。

lgGの精度については免疫電気泳を添加した。 その 9,

24 および36時間後に培15,動で確認した。 なお、天疱癒および類天疱痛の診養液を採取し、液中に含まれるプラスミノゲン・断は、臨床症状、病理組織、直接および間接免疫

アクチベ ー タ ー

蛍光法、さらに、ヒト表皮細胞あるい はDJM-1 細lytic assay ·s> を用いて測定した。

(PA)

活性を two-step amido­

7胞を基質としたウエスタンプロット法によって行われた（表1)。

結細胞内カルシウム濃度の測定

ヒト表皮細胞およびDJM-1細胞を継代した後2 日間、1. OmMカルシウム入りイ

果

5)

ー

天疱癒および類天疱癒 lgGよる細胞内カルシウム

グル培養液で培旋

濃度の変化

し、subconfluentな状態で測定を行った。 5µMフ

無刺激時の細 胞内カルシウム濃度は98. 8 土

ラ2/AM (同仁化学）を 37 ℃で1時間加えることに

20. 2nM (n =85)

より、 フラ2を細胞内に取り込ませ、洗浄後、 精

ると PVIgG 5例中 4例、PF 3例全例でヒト表皮細

-104-

であった。

IgG 添加後の変化をみ

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するングナル伝達：天疱癒 lgG誘導表皮細胞間接着離開とカルシウムシグナル伝達

胞、 DJM-1細胞ともに20秒をビ ー クとする、 一 過なった。 このような 天疱癒lgGによる 細胞内カル性のカルシウム濃度の上昇とその後のゆっくりとシウムの一 過性の増加が細胞外からのカルシウム

した下降が観察され、4-5分後には無刺激時の値の流入によるのかという点について検討した。

に復した。PVIgG1例では、 両細胞とも カルシウ

0. lmMEGTAを含む、すなわち細胞外 カルシウム を

ム濃度 は 5分後まで変化しなかった。BPigG添加後

キレ ー トした培養液で5分間前処理した 後に天疱には8 例中7例でカルシウム濃度に変化は みられな

痘IgGを加えたところ、1. 8mMの場合と同様の変化

かった。1例ではPV あるいはPFlgG添加時と同様のを示した（図 2 ) 。

変化が観察された。 正常(N)IgGを添加した際には14例中12 例でヒト表皮細胞、 DJM-1 細胞ともにに細胞内カルシウムが増加した（図1)。

50
PV 2

''
NCI)

Also PVJ-5

PF 2

PF I

287

゜

弓）
（

。
Also BP3-8

4

2
TIME (m;,)

図 1,

Also Nor903

図2, PVJgG添加後の細胞内 Ca" の動員に対する
細胞外 Ca い 除去の影愕
PV : 尋常性天疱痘JgGのみ添加 、PV+EGTA: EGTAを添加したのちに尋常性天疱痣JgGを添加

No, 2

Also NorJ-8. 10-14

2

TIME (min)4゜ ゜·� 287u

Nor I

PV+EGTA

287
50

so

287

PV

287

反応はみられなかった。 しか し、2 例では 一 過性

2TIM£(m;,)天疱癒lgGによるI凡量の変化

各種lgG添加後の細胞内 Ca,. の変動 、PV : 尋常性天疱癒lgG 、PF : 落葉上天疱癒 I gG,
BP : 類天疱癒I gG 、
Nor : 正常ヒトlgG、 数字は症例番号

PV, PF, BPおよび正常(N)IgGの各々症例l、2について、 添加後のDJM-1細胞内I凡量の変化を検討したと ころ、 細胞内カルシウムが増加反応を示した 症例であるPV l、PFl、BP2、 N2のIgGを添加

このような 細胞内カルシウム濃度の変化を数鑓した際には、I応は 20秒をピ ー クと して 一 過性の的に表すために、 ピ ー ク 時における カルシウム濃上昇を示し、 その後2分後には 添加前の値に戻っクのみられない例ではIgGた。 一 方、 細胞内カルシウムの変化を引きおこさ

添加20秒後の増加量の平均を求めた。その結果、なかったPV症例2、PF2、BPIおよびNlのIgGを添加

天疱癒IgGでは99. 9 士63. 9nM (n=8)、 類天疱癒 でした 場合にはI凡量は 変化しなかった（図3A、B)。

度の増加最およびピーは15. 0 士42. 4nM (n=8) 、健常人IgGでは15. 1士
36. 8nM (n = l4)であり、 天疱癒IgGは健常人 およ天疱癒 lgGによる細胞内カルシウム濃度およびび類天疱症IgGと比較して有意に細胞内カルシウ

I凡産生増加に対するU73122の影響

ム濃度 を上昇させる(P<0.001)ことが明らかに-10 5-天疱癒IgGによる 細胞内カルシウム濃度の一 過

A

地

1
TIME lml•)

8

，

5
2

(
s=03vou -OE d)Cdl

弓）NOil｛30--------------

"

PV1

.

2―.

--·- --· . ―

0
2

，

Ci

3

）

8

5
1

s

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O

I

l

TINE (心）

J•ーヤ•『'---elf

2

10

、•一 -

一�

←

d

'
Tl● ,,....,l

TII』[(●.,

2
TIM[(.,•)

TIME 1�0)l5

゜

図4, PV !gG誘導による細胞内Ca'十増加に対するU73122の影響a: MEM, b: 0. 01%DMSO,℃

0 204060

120
INCUBATION TIME (sec)c: 1µ.M U73122, d: 10µ.M U73122,

300

f: 10 µ.M U73343, 各々を添加した30分
後に天疱癒lgGを添加 ，B

e: 10µ.M U73122を添加5分後に天疱歪lgGを添加

5
2
0
2
5
1

(
s=a3PO ご 一OE d)£ di

N2

20
10

300

゜

PV : 尋常性天疱酒IgG 、5

図3A, PV及びPFlgG添加後の細胞内I凡の変動

U73122＋PV-lgG01(s=3ざ o u OE d) £ d

゜120
INCUBATION TIME (sec)

51

5

0 20 40 60

PF : 落葉上天疱癒I gG, 数字は症例番号38、 一過性細胞内カルシウム上昇を来したBP
及びNor I gG添加後の細胞内I凡の変動

I

BP: 類天疱蓬fgG 、 正常ヒトlgG 、
数字は症例番号

I

10-6

10-s

U73122 (M)

性の上昇（図4a, b)はlµM(c)あるいは10µM(d)D73122を30分前処理することにより抑制された。

10―4

図5, U73122による 、 天疱癒lgG誘導性I凡産生の抑制
CtPV-lgG: 0.01匁DMSO+天疱癒IgG 、
U73343tPV-lgG: 10�LM U73343+天疱痣IgG 、また、5分間前処理によっても抑制された(e)。
しかし、10µM D73343では抑制されなかった(f)。
さらに、 天疱癒lgG添加後のIP3産生増加も-106-

CtN-lgG: 0. 01俎DMSO+正常ヒトlgG 、
U73122+PV-lgG: 各濃度のU73122+天疱潅lgG 、各々lgG添加20秒後のI凡量を表す。

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝達：天疱癒lgG誘＃表皮細胞間接着離開とカルシウムシグナル伝達

oo-s - 10-4 M)30分前処理により抑制さ

加は、細胞内プ ー ルからの動員であると考えられれた。 しかし、013343 00-5切 では抑制されなた。 天疱痛8例中l例ではこのような反応がみられかった（図5) r,

なかったが、 その原因については不明であり、今013122天疱癒lgGによるプラスミノゲン

・

アクチベ

ー

後検討したい。

タ類天疱癒8例中7例のIgGでは細胞内カルシウム- (PA)分泌増加に対するU73122の影響
天疱癒IgGは類天疱癒IgGおよび正常ヒトIgGと濃度の変化はみられなかった。 したがって、天疱比較して、24および48時間後に有意にPA分泌を増癒と類天疱癒では、 デスモゾ ー ムとヘミデスモゾ

加させた(p<O. 005)。 この増加は013122 00-4 10- 5 M)に より抑 制 さ れ た(P<O. 0 05)が 、ームという抗体の標的となる構造が異なるのみな
らず、各々の抗体が細胞表面に付着後から水疱形

073343では抑制されなかった（図6)。

成に至る過程に差異のあることが示唆された I ) 00

しかし、 類天疱癒の 1 例（症例2) 、健常人の 2例においても天疱癒と同様な細胞内カル・シウム増加がみられた。 IgG分画には抗デスモゾ ー ム抗体以外

10

5
0
．

•/nl) AllAI
D V Vdにも多数の種類の抗体が存在する可能性があり、

U73343+PV.1gG
PV·loG

15ない。 しかし、 ニ トロセルロ ー ス膜上の類天疱癒

・,,,

UJJlll(IO'Ml+ PV
UJJllll IO"'MI + PV-lgG

抗原によって、BP症例2lgGから類天疱猪抗体を吸U7Jl11CIO"'MI +BP-lgG

収し、 そのIgGを添加した際には、細胞内カルシ:;;•,'

0.5

これらの抗体に対して反応した可能性は否定できI

ウム は変化しなかった。 したがって、一 部の類天36疱癒においては、水疱形成の過程で細胞内カルシ

INCUBATION TIME (h,)

図6 、ウムの変化が関与している可能性が考えられた。

天疱冦lgGによるプラスミノゲンアクチ
ベ ー タ ー 分泌に対するU73122の影響
PV-lgG: 天疱癒lgG 、BP-lgG: 類天疱癒I gG
N-1 gG: 正常ヒトlgG

考

さらに、ホスホリパーゼC (PLC)の阻害剤であるD73122を用いて、天疱癒IgGが表皮細胞表面に結合後に起こるカルシウムを中心としたシグナル伝達系にPLCが関与していることを示した。

案

このように本研究は、天疱癒においては抗体が細胞表面に付着した後に、PLCの活性化およびIP

今回の研究結果から、天疱癒IgGはヒト表皮細3産生を介して細胞内プ ー ルよりカルシウムの動胞内においてカルシウムの急速な一 過性の上昇を員がおこり、細胞内でカルシウムが一 過性に増加引きおこすことが明らかになった。 ところで、一することを示した I I. I 2> が、PLCによってIPaと同般に細胞内カルシウムの上昇は細胞外からの流人時に産生される1, 2 ジアシルグリセロ ー ルの量的と小胞体などの細胞内プールからの動員9)が考え

変化あるいはCキナ ー ゼの活性化、 さらにはリンられており、また、小胞体よりのカルシウムの動酸化される蛋白質があるのかなど未解決の点を多員はIP孔こよって誘導されることがすでに明らかく残している。 今後これらの点について検討したになっている 9) 。 天疱癒IgGによる場合には1Pa鍵が一過性に増加していること、細胞外カルシウムをキレ ー トした際にも細胞内カルシウムは天疱痛lgGにより上昇がみられたことから、天疱術IgGによって誘導される細胞内カルシウムの一 過性の増

し、 ゜
文

献

1)北島康雄：皮膚臨床、35 1177-1186 1993
2)北島康雄：医学のあゆみ、174 95-99 1995

-107-8) Crameri FM et al : Exp f)ermatol, 2 239-

3)北島康雄：皮屑病診療、 17 1024-1028 1995

246 1993

4) Kowalew s ki C et al : E1.1r J i}ermatol, 4238-242 1994

9) Nishizuka Y : Scie11c�258 607-612 1992、

10) Kitaj ima Y et al: /)ermato!ogy, 189 46-49

5) Seishima M et al : Arch l}er, ,ato/ !?es; 285

1994

397-401 1993
6) Seishima M et al : .Bioc/Jem .Biop力ys !?es11) Seishima Met al:J Jnvestf)er@ato!, 104
33-37 1995

Ca卯勿/./11, 156 1077-1082 1988

12)Kitazima Y:£LJrJ/)ermato! 61996 in

7) Leytus SP et al: .Biochemistry, 20 4307-

press

4314 1981-108-

微生物に由来する多糖分解酵索のコスメトロジ ー ヘの応用
東京工業大学中村

生命理工学部聡(3-1,4-Xylans, major components of plant hemicelluloses, are heterogeneous polysaccharides
that have a backbone of (3-1,4-linked xylopyranose units. Xylanases (1,4-(3-D-xylan xylano­hydrolase; EC3.2.l.8) catalyze the hydrolysis of xylan to xylooligosaccharides and xylose.
Recently, we have isolated alkaliphilic Bacillus sp. strain 41M-l from soil. Strain 41M-l secreted
multiple xylanases and one major form of them, termed xylanase J. had an alkaline pH optimum.
In this study, we describe cloning, sequencing and specific mutagenesis of the gene encoding
xylanase J from strain 41M-1
A genomic library of strain 41M-l was screened for xylanase activity to obtain a 2.2-kb Eco
RI-Sph I fragment containing the xylanase J gene. Then, the nucleotide sequence of the 2.2-kb
fragment was determined. The putative xylanase J gene contained an open reading frame of 1,062
bp and encoded a 27-aa leader peptide followed by a 327-aa mature enzyme. The promoter-likesequence and typical Shine-Dalgarno sequence were observed upstream from the possible TTG
start codon. A perfect 14-bp inverted repeat, corresponding to a transcriptional terminator,
occurred downstream from the TAG stop codon
The xylanase J gene was expressed in Escheガchia coli. More than 90% of xylanase activity
was located in the periplasmic space. Characteristics of the E. coli-produced xylanase J were quite
equal to those of the enzyme from strain 41M-1.The deduced amino acid sequence of xylanase
J was compared with the sequences of other bacterial xylanases. The potential catalytic domainof xylanase J was located at the N-terminus and had strong similarity to family G xylanases,suggesting that the enzyme also belonged to the family G hydrolases. A linker sequence rich in
Ser, Thr and Pro occurred between the catalytic domain and an additional domain at the C­
terminus. This (-terminal domain of unknown function showed no significant similarity to any
other proteins.
Two Glu residues, previously identified as essential for catalytic activity in the family G
xylanase from Bacillus purnilus, are conserved in xylanase J at positions 93 and 183. These two
Glu residues were targeted for mutational analysis. Substitution of Glu-93 or Glu-183 by Gln(mutants E93Q and El83Q, respectively) drastically reduced xylanase activity. The carboxylic
residues of these two Glu would probably act by general acid catalysis as has been shown forother hydrolytic enzymes such as lysozyme. The enzyme activity of xylanase J was inhibited by
N-bromosuccinimide, suggesting that Trp and/or Tyr was involved in catalysis. Some of Trp
and Tyr in xylanase J were replaced by Phe. The large decrease in activity were observed withthe mutant enzymes Wl8F, W86F, Y84F and Y95F. These results suggest that Trp-18, Trp-86,
Tyr-84 and Tyr-95 play important roles in binding of the substrate.

1る 1) 。 これらの極限微生物が生産する酵素は極限

言

q

緒

条件においても機能するものが多く、 その応用性

通常の生物が生育できないような極限環境に棲ーー

息する微生物（極限微生物）の存在が知られていに着目した研究が広く行われてきた。 しかしながら、 極限微生物由来の酵素がどのようにして極限

c
a
s

-•

y
゜
p s
゜
ー

く残されている。 わずかに好熱性微生物に由来す
る酵素について、 その耐熱性機構の解明をめざした研究が進められているものの、 例えば好アルカ

•
-

y
g

に関する研究は、 ほとんど行われていないのが現n

リ性微生物由来の酵素のアルカリ性への適応機構

゜
゜

゜

d

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rc 0 Ut k
pa
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P
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° S
Ah
F BT
ct

環境に適応しているかについては、 不明な点が多

状である。

-109-

/3-1,4 ー キシランは陸上植物の細胞壁中に多くを検討した。 その結果、キシラナ ー ゼJはpH9. 0の含まれる多糖であり、D ーキシロ ー スが/3-1,4結合を介し て連な った主構造をとる。キシラン のアルカリ性領域に反応の至適を有する新規な酵素であることが明らかとなった(Table. 1) i;, 7> o

/3-1.4結合を加水分解 する酵素がキシラナ ー セ

本研究では、アルカリ性条件下で高活性を示す(1, 4-/3-D-xylan xylanohydrolase; EC3. 2. l. 8)

ことからキンロオリゴ糖生韮用の酵素としての 利である。近年、綿実穀・トウモロコシなどから抽用が期待されるキシラナ ー ゼ J を例にとり、 その出した多糖類をキシラナ ー ゼ処理して生産したキ触媒機構や好アルカリ性機構を分子レベルで解明

ンロオリゴ糖が、皮膚保湿成分として化粧品に配することを目的とした。すなわち、 キンラナ ー セ

合され、市販されるに至っている。 一般に、キンJ をコ ー トする遺伝子のクロ ー ニングと大/J尉菌にランなどの多糖類はアルカリ性で水に溶けやすくおける発現を行 った。さらに、他酵素とのアミノなることから、植物多糖の分解によるキシロオリ

酸配列比較による機能領域の推定を行い、 タンパ

ゴ糖生産を目的とした場合、アルカリ性条件下でク質工学による活性アミノ醗残基の特定を試み

高活性を有するキシラナーゼが有利であることはた。

論を待た ない。

2

キシラナ ー ゼは、多くの細菌や糸状菌などに実験よって生産される 2 . 3) 。現在までに報告されている微生物由来のキシラナ ー ゼのほとんどは、反応2. 1

菌株 、 プラスミドおよび培地の至適pHを酪性から中性領域に有するものであっ好アルカリ性バシラス属細菌41M-l株 5) はキシた。一 方、好アルカリ性微生物や耐アルカリ性微ラナ ー ゼ生産 菌 で あ る。 宿主と し て は 大 腸菌

生 物 の生産するキシラナ ー ゼも報告されてい

HBlOl株（クロ ー ニング）、MV1184株（逍伝子発る 4) 。 これらのキシラナ ー ゼの中には広い作用

現）、CJ236株およぴBMH71-18mutS株（部位特異pH範囲をもつものもあるが、アルカリ性側に反応的変異）を使用した。大腸菌用ベクタ ー にはプラの至適を有する酵素はこれまで知られていなかっスミドpUC119を用いた。
41M-l株の培養にはアルカリ1生天然培地

た。以前我々は、キシラナ ー ゼ生産菌である好ア
ルカリ性バシラス属細菌41M-I株の分離に成功している

5)。41M-1 株が生産するキシラナ ー ゼの1つ、キンラナ ー

ゼ J の精製を行い、 その諸性質

そして大腸菌の培養にはL培地

8)

5)

を、

を用いた。必要に応じ、キシランやアンピシリンを添加して使用した。

Table. 1

Properties of xylanase J

Molecular mass

36.0 kDapl
Optimum pH

pH 5.3Sambrookら 8) のマニュアルに従って実施した。 部pH 9.0 (at 37 °C)

位特異的変異はKunkel法 9) で行った。

Optimum temperatureso•c (at pH 9.0)

Temperature stability:555°C (at pH 9.0)

Inhibited by

HgCIふ
N-bromosuccinimide

Main products

2:X2

Km value

3.3 mg/ml

Vmax value

1,100µmol/min ・mg

2. 2

クロ ー ニング技術

遺伝子クロ ー ニンクおよび塩基配 列決定は

2. 3

キシラナ ー ゼ活性の評価

大腸菌の培養物を菌体外・ペリプラズム ・ 菌体
内画分に分画 Ill ) した。 各画分に含まれるキンラ
ナ ー ゼの活性測定は、既報 5) に従って実施した。
反応はpH9. 0、37℃で10分間行い、基質キシランの濃度は1 . 2%とした。

-110-

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

各種変異型キシラナ ー ゼJの活性評価には、ペーゼ J 遺伝子の5'上流域に部位特異的変異で塩基

リプラズム画分を用いた。 各ペリプラズム標品に置換を導入した実験から、 その妥当性が確認され含まれる野生型あるいは変異型酵素の定量は、野ている（デ ー タ示さず）。ORFの上流には、細菌に生型キシラナ ー ゼJに対するウサギ抗血清を用いおいて機能しうるプロモ ー タ ー 様配列 (-35領域

た抗原ELISA法にて行った。 活性測定とELISA法におよび ー 10領域） およびShine-Dalgarno配列が認

よるタンパク質定抵の結果から、 比活性を算出しめられた。 そして終止コドンTAGの49塩基下流にた。

は、 タ ー ミネ ー タ ー として機能しうる逆向き反復配列(14塩基x2)が見出された。
3

結果と考察

キンラナ ー ゼJタンパク質のアミノ末端(N末端）
アミノ酸配列 ” との比較により、成熟型酵素はア

3. 1

キシラナ

ー

ゼJ遺伝子のクロー

ニング

ラニンから始まる327アミノ酸から構成されるこ

好アルカリ性バンラス属細菌41M-1株の染色体
DNAライプラリーとかわかった。 成熟型酵素の上流に存在する27アを作製した。 キシランを含む寒ミノ酸は、分泌に関与するシグナルペプチドと考

ー

えられた。

天培地上でのハロの形成を指標として、キシラ

ナ ー セ J 遺伝子を含む陽性クロ ー ンを選抜した。
サプクロ ー ン解析の結果、キシラナ ー ゼJ遺伝子

3. 2

は約2. 2kbのEco Rl-Sph I断片中にコ ー トされてキシラナ ー ゼJ遺伝子の大腸菌における発現いることがわかった。 このキシラナ ー ゼJ遺伝子

プラスミドpAXJ3Rを有する大腸菌 の培挫を行

断片を含む組換えプラスミドpAXJ3Rの制限酵素地い、菌体外• ペリプラズム・菌体内画分に分画し図をFig. 1に示す。

た後、各画分に含まれるキシラナ ー ゼ活性を調べた。 その結果、 41M-l株由来のプロモ ー タ ー の働

0::00
LIJ

'""'

せ
ー
:c

.Q
..
><

きでキシラナ ー ゼJ遺伝子の大腸菌における発現

｀•

一0

g>c;

(I)

..

［

j

が起こり、90. 3%の活性がペリプラズム画分に局-翌工- ..C:(/)Q.

在することがわかった(Table. 2)。 ペリプラズム
画分に含まれるキシラナ ー ゼを精製し、 その性質を調べたところ、大腸菌が産生した組換え型キシラナ ー セ J も41M-l株由来の酵素と同様な性質を有Xylanase J

していた（デ ー タ示さず）。組換え型キシラナ ー
ゼJのN末端 アミノ酸配列 も41M-l株由来の酵素と

1 kb

Fig.1 Restriction map of the plasmid pAXJ3R.
The double I ine represents the chro­mosomal DN>A fragment from strain 41M1. The arrow shows the position of thexylanase J gene.

同一であり、キシラナ ー ゼ J のシグナルペプチドがペリプラズムヘの分泌に際して機能したものと考えられた。
3. 3

キシラナ ー ゼJおよび他酵素のアミノ酸配列
比較

キシラナ ー ゼJ遺伝子を含むDNA断片 の塩基配列を決定したところ、1. 062塩基からなる、354アミ

遺伝子配列より類推されるキシラナ ー ゼ J のノ酸をコ ー ドするオ ープンリ ー ディングフレ ー ム

アミノ酸配列を、 他のキシラナ ー ゼのものと比較(ORF)が見出された(Fig. 2)。 このORFは翻訳開した。 その結果、キシラナ ー ゼJ のN末端側2/3の始コドンとして TTGを使用 しているが、キシラナ

領域は、JJacilillspllmilllsに由来するキシラナ ー-111-•. -―••ATCTATACTTGTTAAAGTGATATTGGGAAAAGAGTTTGATAACATTTAAATGTAAGCGTTTACAAATATTGACTAAAGGAGGTATTCTAG
-35
-10

--

AATTTTCGTTATGATCCAAACCGTAAAAAATTATAGGAGGTATGCCGTTTGAAACAAGTAAAAATCATGTTTTTAATGACGATGTTTTTASD
M K Q V KI M F L M T M F
LGGAATTGGTTTGCTATTTTTCTCTGAAAATGCAGAGGCAGCTATTACTTCTAATGAGATTGGCACACATGACGGATATGACTATGAATTT
GI
G L L FFs
E N A EA IA
I
T s N EI G T H D G y D y E
F I
TGGAAGGACAGCGGTGGTTCTGGAAGTATGACATTAAATAGTGGAGGCACATTTAGTGCTCAATGGAGTAATGTGAACAACATTTTATTCW K D
S .G G S G S M T L N S
G G T FS A
W S N V N N
I
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CGTAAAGGAAAAAAGTTTGATGAGACACAAACTCATCAACAAATTGGAAATATGTCCATTAACTATGGTGCCACTTACAATCCTAATGGAK K F D E
T Q T H Q Q
I G N M SI N Y G A T Y N P
N G

匡二UG

AACTCCTATTTAACTGTATATGGTTGGACAGTAGATCCCTTAGTAGAATTTTATATTGTTGATAGCTGGGGAACGTGGCGTCCGCCAGGTN S Y L T V Y G W T V D P L V E
F Yエ
V D S W G T W R P
PGGGAACACCGAAAGGAACGATTAATGTAGATGGTGGAACTTATCAAATATATGAAACCACACGCTATAACCAACCATCTATAAAAGGAACT
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I N V D G
G T Y QI
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Q Q Y W S V R T
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F R A W ESTTAGGTATGAATATGGGGAATATGTACGAGGTTGCTTTAACGGTCGAGGGCTACCAAAGTAGCGGGAGCGCAAATGTTTATAGCAATACCL
G M N. M G N M Y E V A L T V E
G Y Q S S G S A N V Y S
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F N G V A L Y A N G D N V S F N H S F T K A NSSFS
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L R G
A S N N S
N M A R V D L R I G G Q N R G T F Y F
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N N I
N H G IG N Q L V E L
I V T A D D G T W
GATGCTTATTTAGACTATCTAGAAATAAGGTAGATTATAAGTAAACCTTAAAGACTGTTACAGAATAAATCTCTGATTTAAAAAGGTGAAD A Y L D Y L E
I R.... ....

ATGGAAAAAATTCCATTTCACCTTATCTATTTTTCTAGGTTGTACTGTTAAAGCAGTAGAATCAACTGTTTGTCTTCGTTTTTAATTTAA

Fig. 2

Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence for the xylanase
J gene. The location of the possible promoter (-35 and -10 sites)
and Shine-Dalgarno sequences are shown overlined. A terminator-like,inverted repeat sequence is indicated by arrows facing each other.
The boxed region denotes the N-ter minal amino acid sequence as
determined from xylanase J from strain 41M-1.

ゼ11) と71%の相同性を有していることが明らか

N末端側のファミリ ー G触媒ドメインのさらにカcc末端）側には、約 100残基からとなった。 セルラ ー ゼおよびキシラナ ー ゼは、そルボキシル末端の触媒ドメインのアミノ酸配列 に基づき、11のなるポリペプチド鎖が結合している。 このC末端ファミリーに分類されている 1 2) 。 現在までに全側 1/3 に相当する領域について相同性検索を行っ塩基配列が決定されているキシラナ ー ゼは、すべてファミリ

ー FまたはGに分類されている。

”四!usキシラナー

ゼはファミリー

上述のGに属するこたところ、既知タンパク質との間にアミノ産配列の相同性は認められず、その機能は不明であった。

ゼJのN末端側のキシラナ ー ゼ J の N末端側の触媒ドメインとC末

2/3は他のファミリ ー Gキシラナ ー ゼとも36-69%

端側の機能未知領域との間には、セリン ・ スレオの高い相同性を示したことより (Fig. 3) 、本酵素

ニン ・ プロリンに富む領域が認められた。 この領もファミリ

域は、 ドメイン間に存在し、連結機能を果たすリとが知られている。 キシラナ

ーー

Gに属するものと考えられた。

-112-

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

ンカ ー 配列と考えられた。 以上の解析結果に基づTable.3

Spec1f1c act1v1ty ofくキシラナ ー ゼJのドメイン構成をFig. 4に示した，
3.4

EnzymeActivity

ProteinSpecific activity(U/ml・culture ) (mg/ml-culture)

触媒活性に関与するアミノ酸残基の特定キンラナ ー ゼJの触媒活性に関与するアミノ酸残基を特定する目的て、 その触媒ドメインにアミ

Table.2xylanasemutants(U/mg)

Wild type

4.3

0.033

E93Q

0.20

0.10

20

E1830

<0.001

0.069<0.014

W18F

1.4

0.072

20

W86F

0.98

0.030

32

130

Subcellular distribution of

W100ド

5.6

0.039

140

xylanase activity in E.coli

W103F

2.1

0.013

160

carrying pAXJ3R

W144F

5.2

0.030

170

W165F

7.6

0 081

94

YBOF

8.9

0.066

140

Y84F

0.005

0.048

0.11

Y95F

0.006

0.048

0.13

Activity (U/ml-culture) [%]Fraction
Extracellular

0.495

(9.1)

Periplasmic

4.90(90.3)

Y121F

0.95

0.0051190

Cytoplasmic

0.0300

[0.6)

Y185F

4.4

0 017

260

1
91

* *

*

＊

＊

＊＊

AITSNEIGTHDGYDYEFWKDSGGSGSMTLNSGGTFSAQWSNVNNILFRKGKKFDETQTHQQIGNMSINYGATYNPNGNSYLTVYGWTVDP* * ***

*

*

**

**

* *

* * *** *** ** ***

* **

**

*

*

L癖YIVDSWGTWRPPGGTPKGTINVDGGTYQIYETTRYNQPSIKGTATFQQYWSVRTSKRTSGTISVSEHFRAWESLGMNMGNMYEVAL
＊

90
180

＊＊＊

181噸YQSSGSANVYSNTLTIGGQSGGEQATRVEAESMTKGGPYTSNITSPFNGVALYANGDNVSFNHSFTKANSSFSLRGASNNSNMARV

270

271

327

DLRIGGQNRGTFYFGDQYPAVYTINNINHGIGNQLVELIVTADDGTWDAYLDYLEIRFig. 3

Amino acid sequence of xylanase J. Amino acids
least

70% of known

Putativefamilythat are conserved at

G xylanase sequences are shown by asterisks.

catalytic residues are boxed.

、

Family G catalytic domain

比N 璽・ 冒瓢疇瓢鬱冨響瓢讐鬱麟纏喜聾雪鋼麟夏..
Linker sequence

Fig.4

、

Functionally-unknown region

Structural feature of-113--

xylanase J.

f-COOH、:////////」 こ://////
o·

RO

ニニ

o

J>

:

HO

OH

o

OR

裕

///////�;、�//////＼////,/'//////////

二

RO
:

i

0

E183

0

□

0�E93

O

////////,ニご;::.:////
出/, ,v�r

RO

二；

:H

:

////////;〗
�;:,/////
Fig.5

Putative reaction mechanism of xylanase J.

-114-

微生物に由来する多祖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

ノ酸置換を施した変異型酵素を調製し、野生型酵

ことから(Table. 3)、本酵素においてもGlu93お素との活性比較を行った。 本酵素と相同性の高いよびGlal83が触媒残基として機能していると考え

B. p11mi!11sキシラナ ー ゼにおいては、触媒活性にられた 1 4) 。 細菌細胞壁分解酵素のリゾチ ー ムに関与する2つのグルタミン酸残基が既に同定されている I 3) 。 これらのグルタミン酸残基は他のすペてのファミリ ー Gキシラナ ー ゼにおいても保存

カルボキンル基が関与する触媒機構が明らかにされてい る 15> 0 ll. pumilusキシラナ ー ゼについてもされており、 キシラナ ー ゼJにおいてはGlu93およ

リゾチ ー ムになぞらえた触媒機構が提唱されておぴGlul83が対応している。 これら2つのグルタミ

り、 キシラナ ー ゼJにおいても同様な触媒機構かン酸のクルタミンヘの置換（それぞれ、変異体考えられた(Fig. 5)。

E93QおよびEl83Q)により活性は大きく低下した

F r g. 6

関しては既に詳細な研究がなされており、2つの冒

Tert I ar y str u c t u re of 8. pu1111 /us xylanase. E93, E183, W18, W86, Y84 andY95 indicate the corresponding position of Glu-93, Glu-183, Trp-18,
Trp-86, Tyr-84 and Tyr-95 in xylanase J, respectively.

-ll5-

キシラナ ー ゼJの活性はN-プロモコハク酸イミ

べると共に、C末端側領域の機能解析を行い、本ドによる阻害を受け、トリプトUファンやチロシン酵素の触媒機構と好アルカリ1生機構を解明していなどのアミノ酸残基の活性への関与が示唆されてきたい。

。 そこで、 本酵素の触媒ドメイン中に存在

最近我々が分離した好熱好アルカリ1生バシラス

するトリプトファン ・ チロシンのうち、11カ所に属細菌'「AR-1株は、pH9. 0というアルカリ性条件にいた

7)

アミノ酸置換（フェニルアラニンヘ置換）を施しおいて70℃に反応の至適を有する好熱性アルカリた。 その結果、Trpl8, Trp86, Tyr84およびTyr95

キシラナ ー ゼを生産する I 9-2 I) 。 本研究で実施しの活性へ関与への関与が示唆された(Table. 3)

たようなタンパク質工学的検討を、自然界からの。 キンラナ ー ゼ活性に関与するトリプトファ

スクリ ー ニングと併用することによって、より高ン残基はこれまで特定されておらず、本研究か初温•高アルカリ性条件下で機能するようなキシラ

めての例である。

ナ ー セの取得が可能になるものと確信している。

1 4)

最近になって、B. pum1加sキシラナ ー セの立体
構造がX線結晶構造解析により明らかにされている 1 6) 。それによれば、触媒残基である2つのグルタミン酸は、2枚のBシ ー トに挟まれたクレフトの内部に位置している。本研究で活性への関与が示唆されたトリプトファンおよびチロシンの位置

引用文献
1)

講談社サイエンティフィク，東京，1988.
2)

nisrns: functi ons and a p p lica tions,てみると、全ての残基がクレフトの中央部、触媒いることがわかった(Fig. 6)。 セルラ ー ゼやキシ

ヽ'crobiol. J?ev., 52 305-317 1988

3)

8 353-368.
Torld /.)!fcrobio/、 Biotec加ol.,鎖を有するアミノ酸残基の関与が報じられている>。本研究で活性への関与が明らかとなった

トリプトファンやチロシンも、基質キシランの認

1992
4)

をクロ

ー

ゼJをコ

Nakamura S, Wakabayashi K, Nakai R,
etal. : Production of alkaline xylanase

総括と展望

本研究ではキシラナ

聡：キンラナ ー セ， 掘越弘毅，秋葉眺

タ ー ，東京，1993, 216-213頁
5)

ー

中村

彦揖：好アルカリ性微生物，学会出版セン

識と結合に関与している可能性が示唆された。

4

Bastawde KB: Xylan structure, microbial
xylanases, and their mode of action,

ラナ ー ゼによる基質の認識に際しては、芳香族側I 7. I 8Wong KKY,Tan LUL,Sadller JN : Multipl1 一
city of (3-1, 4-xylanase in rnicroorga­

をB. pumilusキシラナ ー ゼの立体構造にあてはめ残基であるGlu93およびGlul83の近傍に位置して

掘越弘毅：極限微生物：新しい遺伝子資源，、by a newly isolated alkaliphi 1 ic Baciilllsー

sp. strain 41M-l, Torld /. J; 'crobiol. Bio-

ドする遺伝子te幼'llO/., 9 221-224 1993

ニングし、その機能領域の推定を行った。さらに、タンパク質工学的検討を通じて、本

6)

Nakamura S, 胃akabayashi K, Horikoshi K,

酵素の触媒活性に関与するアミノ酸残基を明らか

eta!.: Alkaline xylanase Produced byにすることができた。しかしながら、本酵素の触newly isolated alkaliphilic品ciilllssp.,媒機構が完全に解明されたわけではなく、C末端

In:Visser J,Beldrnan G, Kustervan Sorneren

側に存在するポリペプチド領域の機能も依然としMA,て不明である。今後は、触媒ドメインにアミノ酸

Elsevier Science, Amsterdam, 1992 443-446

罹換を導入した各種変異型酵素の性質を詳細に調

7)

-116-

etal. (eds) : Xylans and xylanases,

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99-100 1995

1995

-117-

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント ー ネガティフ
トランスジェニックマウスを用いた皮膚の成熟過程の検討
京都大学

田

中

医学部

俊

宏

Retinoic acid plays an important role in the development of the organs, including skin. We
constructed a cDNA functioning as a dominant-negative styled retinoic acid receptor andintroduced it into mice. The resultant transgenic mice skin revealed a marked reduction of skinmaturation. Macroscopic examination and microscopic examination of these transgenic mice
showed thinning of the epidrmis with the loss of primary wickels and rete ridge formation of
dermo-epidermo junction. These findings indicate that the retinoic acid act as a strong
physiological maturation factor of the skin. Keratins and filaggrin were analyzed as
differentiation marker. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of purified keratin revealed
normal amount of keratin 1, 10, 5, 14 were expressed both controls and transgenic mice skin
Ectopic expression of keratin 6 and 16 were detected in transgenic mice skin. Although, theexpression of keratin occurs in transgenic mice, the exprssion pattern of these keratin werecompletely different to those of control mice as detected by immunofluorescence study. A
complete depletion of fillagrin was observed with this technique. All these data indicate that
retinoic acid plays an important role in the epidermal layer formation in fetal skin development

緒

言実験は、欠損状態を人為的に作製することである
が、レチノイン酸は生体にとって必須の物質であ

レチノイン酸は完成した皮膚に対して種々の薬ることから、皮膚以外の臓器に影響を及ぽさずに理作用を持つことは既に知られている。 例えば本皮膚にレチノイン酸それ自体の欠乏状態を作り出物質の過剰はhyper vitamine A syndromeをひきすことはできない。われわれはこの問題を解決す

おこし、また、欠乏は、成人皮膚に過角化を生じるために、皮膚のみで特異的に発現するプロモ ーさせる。培養表皮細胞を用いた実験でも本物質のタ ー を用いて、レチノイン酸受容体のドミナント

過剰または欠乏が、種々の遺伝子発現に影響を与ーネガティプの形質をもつ点突然変異体のレチノ

え、特に分化マ ー カ ー であるケラチンの遺伝子発イン酸受容体をトランスジェニックマウスに導入

現に大きな作用を持つことが知られている。しかすることを試みた。

し、本物質の生理作用については、これが真に生

実

理作用をもち機能しているか否かを含めて、不明

験のままであった。生理作用を検定する最も確実な
図 l にトランスジェニックマウス作成に用いたDNAのコンストラクトを示す。 プロモタ ー は皮膚Study of fetal skin maturation withdominantnegative retinoic acidreceptor transgenic mice.

基底細胞層に特異的な発現を示す Kl4 プロモ ー ターを用いた。これにたいしてベ ー タ ー ガラクトン

ダ ー ゼ、正常なレチノイン酸受容体、点突然変異'Toshihiro Tanaka

を持つレチノイン酸受容体をそれぞれコ ー ドする

Faculty of Mecl1cme

cDNAをつなげた。ベ ー タ ー ガラクトシダーゼは発Kyoto University

現が正しく行なわれていることを確認する目的-118-

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント ー ネカティプトランスジエニックマウスを用いた皮膚の成熱過程の検討

a
�gal
RAR-E
RARa
TR-E
--i

K14 p而巫r

庄歪三王

TR-E0

三

b
p
H GS BH GSPB

図1. トランスジェニックマウス作成に為のcDNAコンストラクトとコントロ ー ルのペ ー タガラクトシダ ー ゼの発現。
A: コンストラクト。 ケラチン14ブロモー
タにたいして 、 ペ ー タガラクトシダ ーゼ、 点突然変異体レチノイン酸受容体、正常なレチノイン酸受容体および点突然変異体をもつ甲状腺ホルモン受容体をそれぞれコ ー ドするcDNAをつなげた。
B : コントロ ー ルのペ ー タガラクトシダ
ーゼの発現をトランスジェニックマウス
で観察したもの。 基底細胞層のみが染色されている 。

図2. トランスジェニックマウスのマクロ、ミクロの所見。
A: マ クロの所見。 上段はコントロ ー
ル マ ウ ス 。 撻康な皮 膚 を も つ。 下 段
は点 突 然 変 異 体 レ チ ノ イ ン 酸 受 容 体を導入したトランスジェニックマウス。
皮溝は消失し、 真皮の血管が透けてみえる。
B: ヘマトキシン ー エオジン染色による
ミクロの所見。 上段はコントロ ー ルマ
ウスの皮膚。 下段はトランスジェニック。
皮膚は著明に薄くなっている 。 一次皮
溝 は消退しレ ー テリッジは平坦となっている。

で、 正常なレチノイン酸受容体は過剰発現による影響がないことを確認するために用いた。 これらの cDNAに続いて Kl4遺伝子由来のポリ A シグナルを導入した。 トランスジェニックマウスの作成は常法通りに行なった ！） 。生まれたトランスジェニッ
クマウスはサザン法にて導入した外来遺伝子の挿入を確認した。 マウスの形質の観察は、 肉眼的所見およびヘマトキシン ー エオジン染色による光顕所見によった。 トランスジェニックマウス表皮に発現されているケラチンは加熱により表皮を真皮から剥離した後 Steinert らの方法に準じて精製し、 10%SDS ボリアクリルアミドゲル電気泳動後

クマシ ー プリリアントプル ー にて染色した 2) 。 各

-119-

a

ケラチンの同定は、おのおのにたいして特異的に反応する抗体を用いて、前述の方法で得たケラチ

97K-

N

A

K1

K10

K5

K14

K6

K16

NA

NA

NA

NA

NA

NA

ンを免疫プロット法にて同定した。 ケラチンの分
布はトランスジェニックマウス皮屑をFuchsらの方法に準じてカルモイ固定を行った。 そ の後おの
50K一

おのにたいして特異的に反応する抗体を第一抗体とし、さらにFITC標識された坑マウス抗体または坑ウサギ抗体にて染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。

結図 3. 精製したケラチンの SDS ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動と抗体を用いた同定 。 左は電気泳動後のゲルをクマシ ー プリイアントプル ーで染色したもの 。
N: コントロ ー ルマウス皮虜由来のケラチン 。
A: トランスジェニックマウス皮虚由来のケラチン。 右は左の蛋白をそれぞれ上段にあるケラチンにたいする抗体で免疫プロットをおこなったもの 。

果

図l下段にベ ー タカラクトシダ ー ゼの発現様式を示す。 これまでの報告どうりにKl4 プロモ ー ターは皮膚に特異的な発現を示す。 作成したトラン
スジェニックマウスのマクロの所見を図 2上段に、ミクロの所見を図2下段に示す。 コントロ ー ルマ
ウス（上）に比べて、外来性DNAの挿入があり、いて免疫ブロット法を行ったのが上の図である。

かつ発現のあるトランスジェニックマウス（下）これより各々のケラチンは免疫学的にも同定されの皮rt'¾は、ひ薄であり、かつ危弱である。 真皮のた。 これらのケラチンのうちKl/KIO、K5/Kl4 はと―血管が透過される。 このト フ ンス ソェニックマウ

もにコントロ ー ルマウスでもトランスジェニック

スは皮膚より急速に水分を失い生後(El9. 5にて

マウスでも発現しているが、それらが表皮細胞の帝王切開にて出産）数時間で死亡するのが特徴で

terminal differentiationをつうじて正しい位置ある。 これらの変化は皮膚のみで生じ、他の臓器で発現しているかどうかを、これらケラチンの局には特筆すべき変化はない。 光顕所見ではコント

在を調べることを通じて検討したのが図4である。

ロ ー ル（上）に比べてトランスジェニックマウス

図4は左が正常コントロ ー ルマウス皮屑を基質と（下）は、1)一次皮溝の消失、2)マルビギ ー 層したもの右がトランスジェニックマウス皮固であの著名な減少、3)顆粒層の減少、4)表皮一真皮る。 免疫プロットの結果に対応して、K6/Kl6はコテリッジの消失が特徴としてあげられントロ ー ルマウスでは検出されない。 一 方ケラチる。 なお正常レチノイン酸受容体を導入したトランの分析ではコントロ ー ル、トランスジェニック

ンスジェニックマウスの皮府には変化はない。

ともに発現されているKl/KIO、K5/Kl4 は発現の局間のレー

図3にトランスジェニックマウス表皮より精製

在が変化していることが示 された。 すなわちトラ

したケラチンのSDS-PAGEの結果を示す。 左がクマンスジェニックマウス皮膚では、Kl/KIO はコント

シ ー ブリリアントプル ー 染色である。 発現されてロ ー ルよりおくれて発現を開始しK5/Kl4 はコント

いるケラチンはコントロ ー ルでは主として Kl/

ロ ー ルより遅れて消失することが明らかと なっKIO 、K5/Kl4 であるが、トランスジェニックマウ

た。

スでは、Kl/KIO、K5/Kl4 に加えてK6/Kl6が発現している。 これらのケラチンは分子量から明らかであるが、各々について特異的に反応する抗体を用-120-

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント--ネカティプトランスジエニックマウスを用いた皮膚の成熱過程の検討

ca内のトランスクリプションファクタ ー である。 培
養細胞を用いた実験からこの受容体はケラチン遺伝子に直接働きその発現を制御することが知られている。 我々の作成したトランスジェニックマウ
ス表皮では免疫プロット法で見る限りケラチン
l、10、5、14は正しく発現しているように見える。 しかし蛍光抗体法でその発現局在を検討するとノントランスジェニックマウスと比較して明らかに発現のタイミングが異なっていることが分かった。 同時に分化のマ ー カ ー であるフィラギリdbンの発現が全く見られなくなっていることがあきらかとなった。 すなわち発生過程における分化をつかさどる一群の調節機構に変化が生じると考えられる結果である。 肉眼的所見ではこのマウスは皮膚の非薄化と脆弱性を示す。 。 光学顕微鏡を用いた観察でも、このトランスジェニックマウスは表皮の非薄化を示す。 すなわち、 ヘマトキシン 一
工オジン染色標本の観察では、マルピギ ー 層の著明な減少と一次皮溝の消失およびレ ー テリッヂの消失が観察される。 これらの変化は、胎生16から17にかけて見られる形態学的特徴と 一 致してお図4. 蛍光抗体所見。
a : コントロ ー ルマウス皮虐をKIOにたいする抗体で検出。
b : コントロ ー ルマウス皮膚をK14にたいする抗体で検出。
C : トランスジェニックマウス皮虐をKIO
にたいする抗体で検出。
d : トランスジェニックマウス皮膚をK14にたいする抗体で検出。

考り、この観点からは胎児期の皮膚分化の阻害と考えられる。 フィラグリンの発現も胎生16ていどに始まるとされており分化マ ー カ ー からも成熟化の遅延がうかがわれる。 これらの観察よりレチノイン酸は皮膚の発生に生理的に重要な役割を演じておりかつそれは胎生皮膚発生での皮膚の成熟化を司ると考えられた。

文察献1) Gordon jw in guide to techniques inーネガティプ法に

mouse development (eds Wa ssarman PM &よりレチノイン酸とその受容体の相互作用が失わ

DePamphilis ML) 747-771 (Academic Press,

われわれの用いたドミナントれることにより皮膚の発生にあきらかな異常が生じることが明らかとなった。 レチノイン酸受容体

San Diego 1993)
2) Steinert. P et al, .BjoclJemical .I. 149 39-48

はDNAに直接働きかけて遺伝子発現を制御する核

1975

-121-

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ばす影響
金沢大学

田辺

医学部

実• 永坂

鉄夫

Six healthy males were subjected to the following two experiments in a climatic chamber
at ambient temperature of 28℃ .
Experiment 1) To confirm whether the makeup of the face suppresses sweating responses
during exercise atl.5,2.5and3.5kp.Thefrequency of sweat expulsion (F5w) and sweat rate (Msw)
on the forehead of right (makeup) and left (non-makeup) sides were measured. Fsw on the make­up side always synchronized with Fsw on the non-makeup side. There was no difference of Msw
between both sides.
Experiment 2) To investigate whether this suppression of evaporative heat loss from thehead hinders the selective brain cooling during hyperthermia induced by head-out sauna
Tympanic (Tty) and esophageal (Tes) temperatures and blood flow in the angularis oculi vein
(Q。v) were measured. When a hood was applied over the head of subjects after thermal equilibrium
was obtained, Tty became to be higher than that of Tes, even with a gradual increase of Q。V・
These results suggest that cosmetics on the face do not suppress evaporative heat loss
from the face during exercise. When the whole head is covered, however, it would be dangerous
for the brain cooling.

1

緒

言

で、 低温の動脈血が脳組織を冷却する。ヒト 3 -4)の選択的脳冷却機構は偶蹄類の それとはやや異

脳は代謝の高い臓器であると同時に、 熱に極めな っている。高体温時、ヒトは頭部や顔面に多量て弱く脳温が39. 5-40. 5℃に達するとその機能障の汗をかく。汗の蒸発に伴い、 頭皮や顔面、 およ

害が発生し、 意識喪失、 血圧低下などのショック

ぴ同部皮下の静脈血が冷却される。低温の静脈血状態を起こす。これを防ぐ機構として、 生体にはは眼角静脈や導出静脈を経由して頭蓋底の静脈叢

高体温時に脳温だけを選択的に低く保つ機構が発（海綿静脈洞）に流入し、 その結果、 頸動脈血温達している（選択的脳冷却機構）。偶蹄類 l - 2) なが低下し、 脳温は低く保たれる（図1)。

どではパンティングにより多量の静脈血が鼻粘膜

通常、 化粧に用いられるいわゆるファンデーで冷却され、 頭蓋底の静脈叢に流れ込む。頸動脈ションなどは皮旧に比較的厚く塗られるため高体は網状にこの静脈叢を貫通しており、 脳に向かう

温時の顔面の汗の蒸発を阻害すると共に、 その成動脈血は静脈叢を通過する際に冷やされ、 次い

分によっては顔の 皮膚と外気の間の熱絶縁層となり、 顔面からの熱放散の減弱、 ひいては導出静脈
血流による脳の冷却効率を弱める可能性がある。

Effect of cosmetics on sweating and

しかし、

selective brain cooling inとの程度影響されるのかを温熱生理学的立場から

hyperthermic humans
Minoru Tanabe
Faculty of Medicine,
Kanazawa University

ヒトの選択的脳冷却効率が化粧によって詳細に検討した報告はない。
本研究では、 化粧の有無が暑熱負荷時の体温上昇に伴う前額部の発汗反応、 眼角静脈の血流動態及び脳冷却効率にいかに影響するか検討した。

-122-

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影響

眼角静脈

顔面静脈

内頸静脈

図1

2

実

頭蓋内外の静脈の走行

2. 2. 1 実験手順

験

被験者は毎回定められた時刻にショ ー ツのみを本研究はすべて環境温28. 0土0.5℃、 相対湿度

着用した裸体で人工気象室に入室した。 下記の化

40土3%に調節した人工気象室(TBS-6-S、Tabai

粧の手順に従って被験者の顔面の右半面に化粧を-ESPEC、Osaka)にて行った。

行った。 その後、自転車エルゴメ ー タ ー のサドル

2. 1被験者

に前額の左右に発汗カプセルを両面テ ー プで貼付に座り少なくとも30分以上の安静を得た。 この間
本実験の被験者は、 健康な成人男子6名であっした。 温度平衡が得られた後、 毎分50回転のリズ

た。 著しい肥満、痩身者は被験者から除いた。 被ムで自転車エルコメ ー タ ー 運動を30分間行った。

験者には、実験の主旨、 手順を十分に説明した上運動強度は10 分毎に段階的に1. 5kp、2. 5kp、で、 実験に際して危険性がないことを理解しても3.5kpと増加させた。

らい、実験に協力してもらった。 実験に際して食2. 2. 2

事性熱産生の影響を取り除くため実験開始前3時
間は絶食とした。

化粧の手順

2. 2. 2. 1

化粧用コットンに約2mlの柔軟化粧水を含ませ、顔面皮膚を十分に拭く。

2. 2

運動実験

2. 2. 2. 2 化粧用コットンに約2mlの乳液を含ま自転車エルゴメ ー タ ー 運動により被験者の深部
体温を体内から段階的に上昇させた。 この体温上せ、顔面の右半面につける。
2. 2. 2. 3

収れん化粧水をコットンに約2ml含ま

昇に伴う発汗反応（発汗拍出頻度、 発汗量）が化せ、軽く叩くようにしながら顔面の粧の有無によりいかに影響されるか検討した。

右半面につける。

-123-

2. 2. 2. 4

2. 2. 2. 5
2. 2. 2. 6

その後ファンデ ー ションをやや厚め

度 センサ ー (HMP36ASPF、 バ イサラ社、東京）にに顔面の右半面にのばしながらつけより測定し、記録器(INR-6041、TOA、東京）にる。

チャ ー トスビ ー ド6cm/minの速さで記録し、同時バフに十分量のパウダ ー をとり、にフロッピーにlOHzのサンプリング周期で収録し顔面皮膚全体に叩くようにつける。

た。発汗拍出頻度は左右の2ケ所の相対湿度の変以上の化粧は同一化で同期した発汗波について各運動強度の終了前

験者が 各被験者

1分間の値を計測した。

に行った。
2. 2. 3

2. 3

測定項目

発汗量 (m ,w): 前額の中心から左右にそれぞ

体加温実験

体加温装置によりに被験者の深部体温を体外よプで貼付り加温し維持した。汗の蒸発に伴う熱放散量が抑し、換気カプセル法により出 o w を測定した。カプ

制された時の選択的脳冷却効率と眼角静脈の血流

セル内の空気の絶対湿度はその相対湿度から以下

動態を検討する目的で、被験者の頭部全体を 一 時の式にて算出した。

的にフー ドで覆った。

れ4cm の部位に発汗カプセルを両面テ

H

D= 100•804•

1 + 0. 00366t

ー

Es

Flow

Po

area

2. 3. 1

但し、 D: 絶対湿度(g/m )=(mg/1)
3

実験手順（図2)

人工気象室内に設置した市販の体加温装置（ス、H: 相対湿度（％）

エット、M.A-800、ファミリ ー 社）内に、被験者はt : 環境温度（℃）

ショ ー トパンツのみを着用し、頭部のみを露出しEs: t℃における飽和水蒸気圧(mmHg)

た状態で座位にて30分以上の安静を得た。そのPo: 標準気圧(mmHg)

後、顔面に送風をし つつ体加温装置内の温度をFlow: カプセル内の気流量(0. 51)

50℃まで上昇させ全身を40分間加温した。その後

area: カプセルの面積(0. 785cmり

深部体温が一定になるように加温装置を 調節し圧縮N2ガスから減圧弁を介してカプセル内に流た。深部体温、発汗巖が平衡状態に達した後、(SEC-

10分間一 時的に被験者の頭部全体をビニ ー ル製の400MK3、エステック、京都）により毎分500士

フ ー ドで覆い顔面・頭皮からの汗の蒸発を抑制し2叫に調節した。カプセル内空気の相対湿度は湿た。

入する気流量はマスフロ

ー

コントロ

ー

ラ

ー

[:

Protocol

r--ff
-30

゜

Ta 28 ° C, 40% RH
fanning (1.5 mis)

body warming
40
TIME (min)図2体加温実験の手順

-124-

60

70

80

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影響

2. 3. 2工業、横浜）に収録し、 サ ー モ分析システム（サ測定項目

食道温(T.,): 躯幹部の深部体温の指標としてー

モスキャナ ー プログラム、金沢コントロ ー ル機

T, ●を用いた。 鼻孔から 42cm挿入し食道内の右心器、 金 沢）を介し、 30秒毎にコンピュ ー タ ー

房位で最も高い 温度を示す位置 に留置したT,'測(PC-9801VX、 日本電気、東京）に入力した。

定素子(PZL-74、Technol Seven、横浜）で測定した。

鼓膜温 (T I y) : 脳温の指標としてTI yを用いた

5)

。 耳鏡により鼓膜の位置を確認した後、T I

平掏皮

re 温(T,,) : 上記の全身7ケ所で測定したT,,に それぞれの部位の面積比を乗じ、 以下の式より算出した。
T., = O. 07T1+0.14T2+0.05Ta+O.35T1+0.19Ts+

測定素子 (PZL-74、Technol Seven、横浜）の先

0.13T6+0. 07T1

端が鼓膜光錐部にあたったことを確認してから、（但し、T1は前額、店は前腕、Tsは手、T1は胸、外耳道を脱脂綿で塞いでリ ー ド線を固定し、断熱

店は大腿、Tsは下腿、T1は足の各T,,)の目的で四角く切った脱脂綿で耳介部全体を覆った。

眼角静脈血流(Q。 V) : Q。 V の方向と速度は超音
波ドップラ ー 血流計(Model 909、Parks、Oregon): サ ー ミスタ ー 温度素子により、により連続測定した。 測定プロ ー プは、8MHzの静全身7ケ所（前額、前腕、手、胸、大腿、下腿、脈血流用のダイレクトモ ー ドに合わせ、 眼角静脈足）の皮膚で測定した。 サ ー ミスタ ーは、先端部上の皮旧に対して垂直に近い角度をもって接触さ分を皮膚に 接触させてその上からサーせて固定した。 内側をスポンジで覆ったアルミニ

プを一重にして皮膚に貼付した。 これらT,,は、

ウム製のヘッドバンド（幅 3cm) で素子を固定し

サ ー ミスタ ー 温度デ ー タ収録装置 (K923、タカラ

た。

皮膚温(T,,)

ー

ジカルテ

-

exercise
1.5 kpintensity
sweating= 13/minャ FSW
expulsions
·j

「- I

, て..:
I

I

!

. .↓

:

苓9

a」
eF
全 PEmq a>-

I I
; |＇
，
I

2.5 kp3.5 kp

:

.

I

|

I

図 3 前額の発汗カブセル内の相対湿度の変化．
上線：化粧なし（左顔半面）、
下線：化粧あり（右顔半面）、
運動強度： I. Skp, 2. Skp, 3. Skp 、F,. : 発汗拍出頻度

-125-

1 min

2.4

38

統計処理

各 変 量 の 時間 経過に伴う変 化 は 、 one-way

G゜ 36

ANOVAで検定し、有意性が認められた時、paired

の
I- 34

．

Student's t-testを行った。 変量は全てmean土

32

SEとして求め、統計的有意水準は5%とした。
3
3. 1

結

38 1

G 31s

凸｀ 375

果

a,

37 2

運動実験

36 9

図3は前額に貼付したカプセル内の相対湿度の変化について、各運動強度の終了前1分間の左（化��粧なし）と右（化粧あり）の前額の2ケ所で同期ごIした発汗波を線で結んで示した。 発汗拍出頻度は0.3°゜ 咄,.

••• ,疇H

I-臨 -0.3

運動強度1. 5kpで13/min、2. 5kpで20/min、3. 5kp

80
70
60
TIME (min)
図5 フードで頭部全体を覆った時の平均皮唱温(T',)、 前額皮虐温(T hoad) 、鼓膜温(T ")、 食道温(T")、T T"の経時的変化
HOOD : フードで頭部全体を覆った1 0分間
50

で28/minであったV 発汗拍出は化粧なしの部位と化粧ありの部位で同期し、 この同期は運動強度か増加しても常に 一 致した（図2)。
図4は前額の発汗量の経時的変化を1分毎に6名豆―の平均値で示した。 運動時の発汗潜時は化粧なし

一被験者において発汗潜時は化粧の有無に関係なく 一致した。 発汗鼠は化粧ありの方が化粧なしよ4

り若干少ない傾向にあるが有意差はなかった。

6

(
':>
as;E':>)>
00

被験者において発汗潜時にばらつきがあるが、同

12 10 8で415土30秒、化粧ありで415土30秒であった。 各

2
0

fl

12

!� 。1.0
一．

t- 。

.8 -

.6 .,

"';: 0.4
E
02ョ
00 ←’
-5

図6

゜

5

10

15

TIME

(min)

20

25

30

図4 前額発汗量（ふ,w)の経時的変化．
〇：化粧なし（左顔半面）、● ：化粧あり（右顔半面）

-126-

50

55

70
65
60
TIME (min)75

フードで頭部全体を覆った時の眼角静脈血流
CQ" .)の経時的変化. Q い はプラス側が顔面側から頭蓋内への流入を、 マイナス側が頭蓋内から顔面側への流出を示す 。
in : Q。"の頭蓋内への流入成分 、
OU l : Qぃの頭蓋外への流出成分 、△ Qo, : Q。. (J)フード装培前10分間に対する変化分80

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぽす影醤

3.2

体加温実験

面皮膚側への流出成分(out)はフ ー ドで頭部全図 5 はT'' 、 前額皮膚温、 T, y 、 T,, 及び T,, からT,, の値を差 し引いた値についてフー

体を覆った時ほとんど変化せず(3. 08士0.45cm/

ドで頭部全secから3. 11土0. 68cm/sec)、 流入成分(in)よ

体を覆う前、 中、後の経時的変化 を6名の平均値

りも小さかった 。 眼角静脈を経由して頭蓋内の海と標準誤差で示した。 頭部全体をフ

ー

ドで覆った

綿静脈洞へ流れる血流はフ ー ドで頭部全体を覆っ

時、 前額皮膚温は33.44土0. 37℃から36. 65土た10分間に6. 97土0. 76cm/secから8. 23士0. 81ml

0. 22℃に急激に上昇した。 フ ー ドで頭部全体をsecに約18%増加し、その変化分は有意であった。

覆っている10分間に、T,, はほとんど変化しなかっ

図7は安静時より約0. 6℃高いT…の状態で維持たが、T,, は37. 36士0. 09℃から37.51士0. 05℃ ヘ

し、 フ ー ド装着後に失神直前の症状を起こした被と0. 18℃上昇しT,, より高くなった。T,'からT.,

験者について のデ ー タである。フ ー ドで頭部全体を差し引いた値は+O. 09℃から-0.16℃へと有意にを投った間、 この被験者のTぃは常にT, • よりも低下降した。

く保たれた。 この被験者のQ。 はフ ー ドで頭部全V

図6は眼角静脈の血流動態 についてフートで頭体を覆った時、海綿静脈洞への流入成分が徐々に部全体を覆う前、 中、後の経時的変化を6名の平増加する傾向を示した（図8)。

均値と標準誤差で示した。 眼角静脈の頭蓋内の海綿静脈洞への流入成分(in)はフ ー トで頭部全体4

考を覆った10分間に10. 05士0.49cm/secから11. 33土
0.55cm/secに増加した。 眼角静脈の頭蓋内から顔

4. 1

察

運動実験

前額部の発汗の拍出は化粧なしの部位 と化粧あ

faintりの部位で同期し、 その頻度は運動強度に依存して増加した（図3)。Sugenoyaら G lはmicroneuro­
graphyによる皮膚交感神経活動と発汗拍出頻度との関係について、発汗の拍出は皮膚交感神経の発

faint

4

4
0
2
0

0

0
0

ー
―

4
2
0

sa1
L'
O。)A←
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8

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OO
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(Q o )

7 4
3 0
637 37 37 36⑱

l .t|i ．-＇t:t

射と常に 一致し、発汗中枢機構の活動を示すこと

56

HQQD
58

60

62

64

66

68

-4

70

TIME (min)
図754

フ ー ド装看実験で失神を起こした被験者の平均皮麻温(T") 、 前額皮序温(T ocad)
鼓膜温(T .,) 、 食道温(T',) 、 T,,-T.,

図8、の経時的変化．矢印：被験者が失神し実験を中断した 。 記号は図Sに準じる 。

-127-

一
HOOD

56

58

60

62

TIME (min)64

66

フ ー ド装渚で失神を起こした被険者の眼角静脈血流(Q…）の経時的変化 ，
矢印：被験者が失神し実験を中断した。
記号は図6に準じる。

68

”は発汗拍出頻度が発汗遠心路者に比べてフ ー ドのある方で有意に高くなった。

における干渉が汗の拍出頻度や同期性には影響せこの結果は汗の蒸発効率が悪いと脳温が下がらずず、拍出波の大きさにのみ影響すること、たとえ運動能力が減退することを示唆する。本被験者のばー側側胸部の圧迫により、同側上半身の発汗量

内省報告では化粧の有無による頭部の温度感覚、は減少するが、 その際対側の発汗と比べ拍出の同湿度感覚の違いが得られなかった。このことか期性は失われず、拍出波の波高が低下しているこら、運動時の化粧は発汗効率を抑制させず、運動とを報告した。本研究で前額部の発汗拍出が化粧

パフォ ー マンス、精神的疲労度に影磐しないと推ありの部位と化粧なしの部位でまったく同期して察される。

を報告した。小川いることから、少なくとも発汗遠心路においては化粧の有無による影器はないと考えられる。

4. 2

体加温実験

前額部で化粧ありの部位の発汗量は化粧なしの

頭部全体をフ ー ドで覆い汗の蒸発による熱放散

部位に比ぺて僅か に少くないことが観察されたを抑制した時、前額T, kが急激に36. 65℃に上昇し（図4)。多量発汗または高湿環境下で発汗を続けた（図5)。皮下深層の静脈血の温度はこれよりもると、発汗星が次第に減少する。これは表皮の湿さらに高いと考えられる。 フ ー ド で頭部全体 を潤に関連した局所的な現象とみなされ、発汗漸減覆っている間、高体温で眼角静脈を経由して頭蓋

hidrorneiosisと呼ばれている。発汗漸滅は水の浸内の海綿静脈洞へ流入する血流はさらに増加した透によって角質層が膨張し、汗腺導管の汗口部の（図6)" この時のT,, はほとんど変化しなかった

狭窄ないし閉塞か起こるためと考えられる 8 - 9 >。

が、T .,.は徐々に上昇しT…よりも高いレベルに達発if漸滅の速度は最高発汗時の無効発汗最が多い

し、T…からT,, を差し引いた値（選択的脳冷却のほど速い こ と 、 発 汗 漸 減 に よ り 無 効 発 汗量効率）はプラスからマイナスに転じた（図5)。導(dropping)のみが減少し有効発汗量 （皮洞から出静脈には静脈弁かなく血流は頭蓋骨を挟んで内の蒸発量）は変化しないこと、発汗漸減は無効発外のどちらの方向にも流れうる。偶蹄類では眼角汗温がなくなるまで進行し、 その後は発汗量は滅-

静脈の血流の方向が中枢神経により調節されたも少しなくなることか知られている 1 0 1 1) 。 このこのであること、この眼角静脈の血流の方向の転換とから、化粧をした部位の発汗量の僅かな減少はは高体温で顔面静脈の平滑筋が強く収縮し眼角静皮府と化粧の間における湿濶が発汗漸減現象を起脈が拡張して、鼻粘膜からの静脈血が総て眼角静こした可能性か示唆される。しかしながら、化粧脈 経 由 で頭蓋底の 静 脈裳に至る よ う に な るこの有無で発汗塁には有意差かないことから、化粧と I -2) 、ラクダでは顔面静脈の組織温度が上昇しは有効発汗量に影響せず、蒸散性熱放散量を抑制

その部の平滑筋の収縮が起きることが報告されてしないと考えられる。

いる。 ヒトでは、眼角静脈の機械的閉塞で脳温がCabanacとCaputa 1 2> は暖かい環境で被験者に自著しく上昇すること 3) 、眼角静脈から頭蓋内の海転車エルゴメ ー タ ー 運動を行わせた。この自転車

綿静脈洞への血流の流入は、末梢皮Jjjからの温度は被験者自身が最も1曹ぎやすい負入力に関係なく、深部体温がある温度レベルに達荷羅を自分で調節できるような装愉であった。被すると決まって急激に始まる 4 )。今回の結果か

エルゴメ

ー タ ー

験者には一回はプラスチックのフ ー ドを被って頭ら、 高体温で眼角静脈の流入の方向が頭器内へ転部に風が当たらないようにし、他の―回は頷に小換した後、顔面、頭皮の静脈血が十分に冷却され型扇風機で風を送ったが、フ ー ドを着用した被験ず高い値を保つ時 には、眼角静脈血流の流入が増者は自転車を漕ぎはじめて間もなくペダルの負荷

加して脳温をさらに上昇させる危険性のあること

量を軽減した。TI y は顔に風が当たっている被験が推察される。

-128-

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影饗

during exercise in humans, Eur. J. Appl.

フ ー ドで頭部全体を覆った時に失神を起こした
被験者の眼角静脈は徐々に増加したが、T'rは常にT•'よりも低く保たれていた（図8)。 この被験1., 64 92-97 1991
5) Brinnel H and Cabanac M, : Tympanic

脈を経由した血流の頭蓋内への流入増加で頭蓋内·防'}'S心者で失神を惹起させた誘因の 一 つとして、 眼角静6) Sugenoya J, lwase S, Mano T and Ogawa T,

圧が上昇し脳を圧迫する可能性が考えられる。 こ: Identification of sudomotor activity
in cutaneous sympathetic nerves usingの点についてはさらに検討が必要であり、 高温環

境下での脳障害や熱中症の発生の機序を解明して

sweat expulsion as t �e effector res­、ponse, Eur. J. Appl. P/Jysiol., 61 302-308

いく上で今後極めて重要な課題といえる。
5

謝temperature is a core temperature inman, J. T/Jer,、,. p,力,ysiol., 14 47-53 1989

1990

辞

ご援助いただきましたコスメトロジ ー 研究振興

財団、本実験の被験者諸氏に深謝します。

7) 小川徳雄、：発汗活動に影磐する中枢性および末梢性要因、 日本生理誌、48 1-13 1986
8) Sarkany L, Shuster S and Stammers M, :Occlusion of the sweat pore by hydra­

引用文献1) Johnsen HK, : Nasal heat exchange, anexperimental study of effector mecha­
nisms associated with respiratory
heat loss in Norwegian reindeer (Rangi­
fer tarandus), 1/nJ°v. of T.romso, がb.rll'ay, 72-87 1988
2) Elkward AO, Al-Zaid NS and Bou-Resli MN,: Facial vessels of desert camel(Camelus
dromedarius): role in brain cooling, A尻J. P/Jysio!., 2 58 R602-R607 1990
3) Nagasaka T , Hi rashita M, Tanabe M,
Sakurada S and Brinnel H: Role of theveins of the face in brain cooling
during body warming in human subjects,
Jpn. J. /Jia認teor., 27 113-120 1990
4) Hirashita M, Shido O and Tanabe M,:
Blood flow through the opthalmic veinstion, Brit. J. 先rmatol., 77 101-104 1965

9) .Kerslake DMck,: The stres s of hotenvironments, Cambridge University
Press, London, 1972

10) Candas V, Libert JP and Vogt JJ, :Sweating and sweat decline of resting

men in hot humid environments, Eur. J.

App/. P/Jysiol., 50 223-234 1983
11) O g a w a T , A s a y a m a M, S u g e n o y a J,
Fujimatsu H, Miyagawa T and Terai Y,:

Temperature regulation in hot-humid
environments, with special reference tothe signif icance of hidoromeiosis,

J. Jj力erm. Biol., 9 121-125 1984
12) Cabanac M and Caputa M, : Open 1 oop-129-

increase in trunk temperature producedby face cooling in working humans,
1 月l;ysiol., 289 163-174 1979

サンスクリ ー ン剤の光ハプテンとしての性格
浜松医科大学戸倉新樹

Sunscreen agents are widely used for photoprotection of patients with photosensitivity as
well as normal individuals receiving intense sun exposure. However, some of these agents arealso known to induce photoallergic contact dermatitis as an adverse effect. To evaluate thephotoallergenicity of sunscreens, including benzophenone-3, Parsol 1789, p-aminobenzoic acid,and 2-ethy卜hexyl-p-methoxycinnamate, we examined the ability of epidermal cells photo ・
modified with these sunscreen agents to evoke delayed-type hypersensitivity in mice. For
preparation of sunscreen-photomodified epidermal cells, murine epidermal cells were suspended
in aqueous solutions of these sunscreens and irradiated with ultraviolet A. Mice were sensitizedwith subcutaneous injection of the sunscreen-photomodified epidermal cells and challenged withthe photomodified epidermal cells into hind pad. The footpad swelling was measured 24 h after
injection of the photomodified cells. Benzophenone-3-photomodified epidermal cells successfully
immunized and elicited delayed-type hypersensitivity in mice, whereas no significant footpad
swelling was induced by the other three sunscreen agents. This suggests that some of sunscreen
agents have a potential to induce photoallergic contact sensitivity and that the present method
is useful to estimate the photoallergic potency of sunscreens

1

緒

言

場合と、 より顕著な皮膚炎をおこす光アレルキ ー
3

性機序でおこる場合とがある . 4) 。

光毒性は様々

光線過敏症は日光なとの照射を受けた皮膚に生なill vitroの方法で検討しうることが知られてしる皮膚炎の総称であり、原因的には、1)内因いるが、 光アレルギ ー 性を人体を使わず調べる方

性の光感受性物質生成（ポルフィリン症）、 2)外法は確立したものがなく重要な 課題とされてき

因性光感受性物質投与（薬剤性光線過敏症、 光接た。

触皮膚炎）、3)DNA修復機序の異常（色素性乾皮

前提として使用されるため、 その光線過敏性、 特症）、4)その他原因不明のもの（日光尊麻疹、 種に光アレルギ ー能は検討されるべき課題である。

痘様水疱症、 多形日光疹、 慢性光線性皮膚炎） な

事実、

どに分けられるI) 。

光接触皮膚炎はある物質が皮膚炎の症例はかなり報告されており、 臨床的に非旧に塗布され、 同部位に光が照射されて生ずる皮常に注意を払うべき点となっている - 7) 。 今回我サンスクリ ーン製剤はそれ自体、 日光照射をサンスクリ ーン剤によって生じた光接触皮52)

膚炎である 。 近年、 光接触皮膚炎をおこす物質々はマウスの遅延型過敏症を用いてサンスクリ ーの種類は新しい化粧品や薬の登場とともに増加ン剤の光アレルギー能を評価することを試みた。

し、 新製品開発の段階で光線過敏症をおこすボテ

2

ンシヤルがあるか否かの検討は重要となってきて
3.

いる

4)

。

実

験

光接触皮膚炎には光毒性機序でおこる
2. 1

被験物質とその溶液の調整

Photohaptenic properties of sunscreen
agentsの吸収剤である2-hydroxy-4-methoxy-benzophe­

Yoshiki Tokura

none (benzophenone-3, oxybenzone, 和光純薬）、

Department of Dermatology,
Hamamatsu University School

4-tertiary-butyl-4'-methoxydibenzoylmethane(Parsol 1789、 和光純薬）、 中波長紫外線(UVB)

of Medicineの吸収剤であるp-aminobenzoic acid (PABA,

サンスクリ ーン剤として、 長波長紫外線(UVA)-130-

サンスクリ ー ン剤の光ハプテンとしての性格

東京化成）、2-ethyl-hexyl-p-methoxycinnamate

胞は強い蛍光が認められた。典型的な光ハプテン(2-EHMC, 和光純薬）を用いた8) 。陽性コントロであるTCSAは同時に強い光毒性を有しているたールとして すで に光アレルギ ー性物質であること

め、TCSA 光修飾細胞のviabilityは著しく低いがが明らかとなっている3, 4 , 4',5-tetrachloro­

1 5) 、

salicylani 1ide(TCSA)9>, afloqualone(AQ)1 0' 、

2-EHMC,

lomefloxacin(LFLX),
ニュ キノロン系薬剤である

FLRX, ENX,

ciprofloxacin (CPFX), norfloxacin (NFLX),示した（表1)。

eBnzophenone-3,

ー

AQ,

LFLX,

Pars o l 1789, PABA,

CPFX, NFLX, OFLX, LVFX,SPFXはUVA照射でも高いviability を

ofloxacin (OFLX), le v o floxacin (LVFX),
fleroxacin (FLRX), enoxacin(
ENX),

sparflo­表1. 各被験物質光修飾表皮細胞のvi ab i Ii ty＊トリバンプル 一 色素排除による

xacin (SPFX) を用い3 . I I 〉、陰性コントロー ルとしてnaproxen(NPX) を使用した。各製剤(0.4mll)

被験物質をリン酸緩衝液(PBS, p H7.4 )にて 溶解した。
2. 2

Benzophenone-3
Parsa! 1789

被験物質と表皮細胞との光結合

PABA

7- 8週齢BALB/cマウス耳翼よりトリプシン処理

2-EHMCにて作製した表皮細胞 2)を各被験物質(0.4mM)

TCSAのPBS溶液に5xl 06/rnl で 浮遊させた。これをプラ/
5 cm
スティ ックディ ッシュに移し、 UVAを1. J

2

AQ
NPX
LFLX
CPFX
NFLX
OFLX
LVFX
FLRX

照

射した。その後PBSで 3回洗浄して薬剤光修飾表皮細胞として 用いた。
2. 3

被験物質光修飾表皮細胞による遅延型過敏ENX症の感作と惹起

SPFX

BALB/cマウス左下背部に被験物質光修飾表皮細胞 (1炉/ 0.2ml

PBS/マウス）を皮下投与し感作

5 目に同光修飾表皮細胞 (4xl叩10. 02ml
後、日PBS/マウス）を足蹄に皮内投与し惹起した。2 4時

3. 2

の誘導

たl 3) 03

結

被験物質光修飾表皮細胞による遅延型過敏症(delayed-type hypersensitivity, DTH)

間後に足鎚腫脹を計測し遅延型過敏症の程度とし

3. 1

73
75
78
81

471877485717172716353

1

Viability(%)*

各被験物質光修飾表皮細胞を皮下投与すること
l l. l 4)、 誘導されたにより マウスを感作、 惹起し果DTH反応の程度を調ぺた。 アレルギ ー性光感作物
質として知られるAQ, ニュー キノロン系薬剤8 種

被験物質と表皮細胞とのUVA光結合

マウス耳翼より作製した表皮細胞を各被験物質

p<O. 05 ) DTH反応を 誘導した（図1)。
は有意な(のPBS溶液に浮遊させ、 これにUVAを照射した。—

AQ, TCSAにおいて交叉反応があるか否かを検討し部の被験物質は紫外線照射下で 蛍光を発するた

たところ、 感作と惹起の両方において 同じ薬剤光

め、 蛍光顕微鏡下で 物質が 表皮細胞に結合するこ

修飾表皮細胞を用いた場合のみ有意なDTH反応がAQ, LFLX, CPFX,

みられ、 抗原特異的な反応であることが 確認されIとを確認できた I. 1 4) 。TCSA,

た。

NFLX, OFLX, LVFX, FLRX,ENX では光修飾表皮細

-131-

LFLX

Benzuph•none-3

CPFX

NFU(
OFLX

Sensiti�ation

C,:hallen�e

＋

＋

忽

LVFX

•

FLRX

-

＊＊

Parsol 1789

Sensiuzation Challenge

+

ENX

＋

＋

PABA

＋

2-EHMC

SPFX
JO

図2. サンスクリ ー ン剤の光修飾細胞によるDTH反応 'p<0.05,.. D〉0. 1, 惹起のみのグル ー プと比較して。

AQ

NPX

20

・1

Footpad swelling+ SD (xlO·cm)

TCSA

゜

旱

10

30

20

Footpad swelling士SD (xlO

-3

40

50

cm)

分画を、280nm、320nmの吸光度でモニタリングす図1 . TCSA, AQ, ニュ ー キノロン剤の光修飾細胞によるDTH反応'p<O. 05, "p〉0. 1, 惹起のみのグル ー ブとると�UVAを照射したときのみAQはBSAとともに高分子フラクシ ョ ンに溶出され、 UVAによりAQ と比較して 。

BSAが光共有結合することを確認しうる以上の陽性コントロ ー ルにおいてマウスを被験外に もニュ

ー

IO)

。 AQ以

キノロンをはじめとする光線過敏性

物質修飾表皮細胞にて感作、惹起できることが明

薬剤はUVA照射により蛋白と共有結合し、 薬剤ーン剤の光蛋白複合体を形成することが明らかとなっている

らかになった ため、4種のサンスクリー

3. 11) 。

修飾細胞のDTH反応感作能を検討した。

この性格はアレルギ ー 性光線過敏 性物質

図2に示すように、benzophenone-3はマウスを感のかなりの部 分に共通の特性と考えられる。 この作可能であったが、 他の3種類のサンスクリ ー ン

特質のため被験物質溶液中に浮遊させた表皮細胞剤を用いた場合には、 有意なDTH反応は認められにUVAを照射すると、 同剤は表皮細胞 の 細胞膜、なかった。

細胞質の蛋白に共有結合し、 当該物質光修飾細胞を作ることができる。

考

光アレルギ ー 性物質を光修飾した表皮細胞を同察系マウスに皮下投与し感作後、 同修飾細胞を足鎚
単純化学物質の光アレルキ

ー性は、 同剤が光ハに注入することにより、 遅延型過敏症を誘導する

プテンとしての性格、 すなわち紫外線照射下で近ことができた。 このことは同光修飾表皮細胞か高傍の蛋白と共有結合し完全抗原となるという性質

い抗原性を有していることを表しており、 実際のを持っているために起こると考えられる 2) 。 代表

光線過敏性皮膚炎でも光修飾表皮細胞上に、光ア

クを持レルギ ー 性物質がその 一部を担う抗原が存在する

つが、 UVAを照射するとそのビ ー クは長波長側にことを示唆する。 光修飾細胞が抗原性を持つとい移動する。 このAQ由来の吸収波長は牛血清アルプ

うことは、 代表的な光ハプテンであるTCSAの場合

ミン(BSA)と光結合したAQ-BSA複合体でもみらと同じであり 2. 9) 、 こうした物質が光ハプテンと的な例としてAQは297nmに吸収波長のピー

れ、 280nmにおいて はB S A とAQ-BS A複合体を、しての性 質を備えて い る こ とを 示 して い る 。

320nmにおいてはAQ-BSA複合体のみを検出するこLFLX, CPFX, NFLXにおいて、それぞれの薬剤の光とができる。 スペクトロフォトメ ー タを用いて修飾表皮細胞で感作したマウスより得たリンパ節

Sephadex LH-20クロマトグラフィで分けた各溶出細胞をresponderとし、 stimulatorとし て対応す-132-

サンスクリ ー ン剤の光ハプテンとしての性格

Eur. J !Jermatol. 3 87-91 1993

るニュ ー キノロン光修飾ランゲルハンス細胞を用いin vitroで培養すると、 responderである感作

3. 戸倉新樹 ：ニュ ー キノロンによる光線過敏症 ．
臨皮49 1 7-21 1995

リンパ球の増殖反応か得られる 3 . 1 l) 。 このこと

4. Tho m ps o n G,

は光修飾細胞がin vitroにおいても高い抗原性、

Mai bach H,

Ep stein J:

すなわち光アレルギ ー 反応を引き起こす性質をAllergic contact dermatitis from sun­

持っていることを示している。 TCSAは光アレルギ

screen preparations complicating photo­

一性とともに強い光毒性を有しているためTCSA光dermatitis. Arc/J.!Jermatol. 113 1252-1253

修飾表皮細胞のviabilityは1%以下となり、 他の1977

生きた抗原提示細胞に新たにプロセッシング、 プ
リゼンテー

5. Holzle E ,Plewig G: Photoal lergische

ションされないと responderT細胞を剌

kontaktdermatitis durch benzophenon­Iha 1 tige Soonnenschutzpraparate.

激できない

5)

。

一

方 LFLX, CPFX, NFLXの光修飾

表皮細胞のviabilityは高くTCSAに比ぺ細胞毒性は弱い。 従って他の抗原提示細胞を添加しなくて33 391-393 1982
6. Knob ler E, Almeida L, Ruzkowski AM, Heldもin vitroでの増殖反応を誘導することができJ,ると考えられる。

benzophenone.

ンスクリ

ン剤のあるものは光アレルギ

ー

能を有Harber L, Deleo V: Photoal lergy toArch. !Jerma to/.

1 2 5 801-804

1989

こうしたマウスDTHの実験系を用いた結果、 サー

1/autarzt

7. De 1 eo VA,

Suarez SM,

Maso MJ : Photo­

することが明らかとなった。 今回の4種の検討で

allergiccontact dermatitis. Arch. !Jermatol.

はbenzophenone-3が最も強い光ハプテンとしての128 1513-1518 1992

性格を持っていた。 このサンスクリ ー ン剤はすで

8. Tokura Y, Yagi H,

Ihda H, Takigawa M:

性光接触皮膚炎をおこす

Evaluation of ultraviolet-A protection

ことが報告されており - 7) 、 今回のマウスを用い

b y sunscreen agents using a mouse model

た検討と符号する。 サンスクリ

of contact photoallergy.

に臨床的にもアレルギー
4ー

ン剤は日光が照射される皮膚に用いられることが前提であり、 そJ !Jermatol. Sci

7 39-44 1994
9. Tokura Y,の使用には注意が必要となる。

Satoh T, Takigawa M, Yamada M: Genetic control of contact photosensi­

マウスの遅延型過敏症を利用したこの実験系
は、 ある物質が光アレルギ ー 能を有するか否かを

tivity to tetrachlorosalicylanilide.

人体を用いずに課べうることを示している。 またPreferential activation of suppressor T

当該物質による光線過敏症が、 光ハプテンとして

ce 11 s i nの性格を持っているために起こうているか否かも

J Invest. !Jermatol.

I.

1 ow re s p o n d er H-2k mic e.
94471-476 1990

検討可能である。 さらには感作リンパ球を用いて10. Tokura Y, Ogai M, Yagi H, Takigawa M:

in vitroの実験系でも可能であり今後有用な方法

A f 1 oqua lone photosensitivity: I mmuno­と考えられる。

genicity of afloqualone-photomodi f ied
epidermal cells.

文

献

60 262-267 1994

1. 戸倉新樹：光線過敏症: rnedicina 32 606 607

P/Jotoc/Je夙 P/Jotobiol.

11. 戸倉新樹、 西島貴史、 八木宏明、 滝川雅浩：

1995

2. Tokura Y,

薬剤の光アレルギ ー 能：マウス遅延型過敏症
Takiga wa M: Im munologicalmechanism of contact photosensitivity.

による評価。 臨床薬理26 219-220 1995
12. Tokura Y, Satoh T, Yamada M, Takigawa hi-133-

: Genetic control of coritact photosensi-tivity to tetrachlorosalicylanilide. JI.

678 1993
14. Tokura Y, Takigawa M, Yamada M: Induction

Igh comples controls the sensitivity inof contact photosensitivity to TCSA

duced by photohapten-modified spleenusing photohaptenmodified s yngeneic

cells but not epidermal cells. Cell.

spleen cells. Arch. /)ermatol・ l'es. 280 207

fmIJJUIJO/. 135 195-207 1991

-213 1988

13. Tokura Y, Yagi, Satoh T, Takigawa Ii! :15. Tokura Y, Satoh T, Yamada M, Takigawa M

Inhibitory effect of melanin pigment on: In vitro activation ot immune lymph

sensitization and elicitation of murine

node cell pro! iferation by photohap­

contact photosensitivity: mechanism of

tenmodified cells in murine contact

low responsiveness in C57BL/10 back­posens1tivity. Arch. /)ermato! l?tS. 283

ground mice. J. i1Jvest l)ermato/. 101 673-

203-209 1991

-134-

III. 精神， 文化に関する分野

色彩の心理学的意味空間の研究
金沢大学

文学部

本

安

岡

晴

Unfolding methods to analyze semantic space were introduced and applied to color
symbolism data. One of the unfolding methods uses the criterion of the fourth quantification
method by Hayashi, and the other a penalty function. Color symbolism data were collectedindividually from subjects, who sat in front of a CRT display and were shown stimulus pairs to
be rated one by one. The experiment consisted of two sessions, session 1, where color-word pairs
were presented, and session 2, where color-color pairs presented. Subjects rated fitness of color
for a word of color-word pairs and similarity of colors of color-color pairs. Unfolding analysisof the data from session 1, using the penalty function, produced successful configuration of colors
and words. Color configuration formed a circle, like one in color science, and words configuration
was reasonable. Modified Spearman rank correlation coefficient of the data and the distances
estimated by the model was peiiect. Applicability of unfolding methods to individual diffenrencesin preference was also noted.

1

緒

言

意味空間を調べる方法としてはsemantic dif­ferential (SD)法がある が、 岡本1. 2. 3. 4. 5. l は

素肌の美しさ•健康を保つ、 さらにより良い状SD法を更に発展させて展開法による分析法を提案

態になるように努めることは化粧の基本の一つでしている。これらの新しい分析法の可能性を探るあろう。それと共に、 与えられた素肌の状態をもことも本研究の目的の1つである。展開法によるとに自分をどのように見せるかということがある

分析の場合は、 概念の評定に用いるものは形容詞

が、 自己の演出としての化粧においてはこの後者

対以外のものでもよい。本研究では、 色彩の意味の問題の方が主要な問題となりうる。化粧の自己空間を象徴語との関連においてとらえることとす

演出としての効果は複数の要因の複合によって惹る。色彩と象徴語の関係を調べているものとしてき起こされるものとして理解されなければならな

大山 6) のものがあるので、 まずそのデ ー タを数量

いが、 研究の出発点におし疇ヽては個々の要因につい

化4類の基準による展開法によって分析してみる。

て個別に行うのも1つの方法である。化粧の効果

その分析結果に基づいて本実験で用いる剌激の選に係わる要因としては、 人間の五感からみた場定を行う。本実験では、 色と象徴語との適合度の合、 日本人においてはまず視覚、 そして嗅覚に関

評定デ ー タの収集を行い、 展開法による分析を試するものがあげられよう。本研究では、 視覚に関みる。

係するもののうち色をとりあげ、 色彩の主観的意
味構造を調べる。
A study on semantic space of color

2
2. 1

準

備

数量化4類の基準による展開法

対象間の（非）類似度デ ー タから対象の空間内
Yasuharu Okamoto
Faculty of Arts
Kanazawa Universityの大まかな布置を求めるものとして数量化4類

7)がある。数量化法の細かい問題点は種々指摘されている 8 , 9 lが、 データの示す傾向を大づかみに捉える IO) ものとしての実用性は研究の出発点にお-136-

色彩の心理学的意味空間の研究

い- d, ,/ ) I L d/1)

いて極めて有効である。数量化4類は各対象間の類似度デ ー タを分析の対象とするが、対象が2つのグル ー プに分かれていて異なるグル ー プに属する対象間の類似度デ ー タのみが与えられているときは欠損値を含むデ ー タの特別な場合であり展開法と呼ばれる分析法となる。展開法に数量化の考え方を適用すると次のようになる I I. I 2) 0
対象 i と対象jの類似度％が与えられているとき、次の目的Q関数を設定する。
Q=

うここ
M

N

•=I /=Ie,f·{x(i)-y(j)}

2 2

ここで
¢(z) = 1/(1 + exp(-c·z))である。
Pを与える式の右辺において、ゆの左隣の こ
は (il,jl) と(i2,j2) のすべての組み合わせにわたり、同じく右辺のこ礼は！とjの組み合わせ全体に対して和がとられる。
¢(z)の定義式における定数Cは近い値同士の e,1あるいは 丸 の順位関係に対する p e n altyの厳し2

ここ で、 x(i)とy(j) は対象Iと対象jの座標であり、対象1の属するグル ー プにはM個のものがあり、対象jの属するグル ー プにはN個のものがあるとする。
対象Iと対象jの布置はQを最大にするx(i) とy(j)の値として与えられるが、さらに数量化4類における考え方 ” に倣ったスケ ー リングが行われる 1 2) 0
2.2

2

P = I¢((e,l.Jl ―e,2.1 2 )·(d,さの程度を与えるものであり、Cの値が大きいほ
ど厳しいものとなる。
座標値{x;,}、 {Yp}はPの最小化によって求

められる。
2.3

Individual Difference Scaling (INDSCAL)

剌激間の（非）類似度の知覚における個人差を扱う多次元尺度構成法としてINDSCAL 1 S) がある。
ここでは次の形で用いる。
刺激jの座標値を(xp)、被験者Iの第1次元に対するPenalty基準による展開法

2.#1と］の類似度デ タ ％と分析モデルの空間
ー2内における隔たりむ= {x(i)-y(j)} との関係が重みを心で表わし、被験者1における剌激jとKの距離心を次 式で与える。

数凪化4類の基準（目的関数）では内積として表2d悶＝｛こ叫(x1, -X 人,) }わされている。多次元尺度構成法においては e リと丸との 単 調 関係を直接扱う方法 と し て 非計量_ (nonmetric)変換がある I 3. I 4) が、この方法を展開法に適用した場合には退化(degeneration)の問題の生じることがよく知られている。

e ;,と丸との単調関係を扱う方法としては非計鼠変換の他にNonmetric INDSCALでは非類似度デ ー タがj,k) にi

対応するようにnonmetric変換された値がりとj,kd『}の値の差の2乗和が最ー小に な るように布置(xi,)と重み(w,;)が求められる。モデルの当てはまり具合は次のStress Sによって表わされる。

penaltyによるものがある 5 , 9. I 5 >。ここではこの
penaltyを用いた展開法として次の形のもの 5) を

S=

用いる。

d:

=こ (x,,-yi')

i

とおく。

ここ向l-d悶）
I

(d『1)
ここ
J<k

2

J<k

2

I

2点Iとjの類似度を％ 、Iと）の座標値{x,,}と{yjl }から算出される距離を的で表わし

112

CarrollとWish 1 5>は色知覚のデータをINDSCAL
によって分析したものを紹介しているが、被験者の色覚異常がその重み叫の値の偏りとして表わされている。

このときpenaltyPを次式で与える。

-137-

2.4

大山(1964)のデータの分析

鳳

本研究の目的の1つ は色の情緒的意味空間を展開法を用いて調べることであるが、そのために用いる刺激の選定 を行う。 大山 6) の象徴語に対する⑭

色紙の選択傾向を調べたデ ー タの分析を 2. 1 の 数
罷化 4類の基準による展開法によって行い、その結果に基づいて使用する色と語を決める。 大山のデ ー タは、 14語の象徴語それぞれについて 16枚の色紙からもっとも適したものを選ばせるということを 145 名の被験者に対して行われたものであるが、その選択度数を類似度として分析すると図l、図2の布置が得られる。 円内の記号が表わす象徴
語と色はそれぞれの図の下に示す通りである。
図l と図2 を重ねれば色と象徴語の同時分布（同じ

図2. 象徴語の布翌。 円内の文字は次のものを表わす。
怒→怒り；嫉→嫉妬；罪→罪；永→永遠
幸→幸福：孤→孤独；平→平静；郷→郷愁
家→家庭：愛→愛：純→純潔：夢→夢
不→不安；恐→恐怖。

空間内における布置）が得られる。
図l に 表 わさ れ て い る 色 の布 置 に お い て 、「白」、「中灰」、「黒」の無彩色は他の「赤」などの有彩色の集まりから離れた位置にある。 本研究においては展開法による分析が行われるが、その分析が成功するためには刺激の布置がな るぺ＜
一様であること が望ましい。 又、無彩色、特に「白」 は刺激の提示されるCRTディスプレイのバッ®

以上のことから、「白」、「中灰」、「黒」 の無彩
色は本研究では用いないことにする。 有彩色の方

⑤

ー
ロ胄

クグラウンドの色も白であるので不適切である。

はそれぞれの色相に応じてバランスよく布置が与えられている（図l)。 本研究の剌激としてはCRT
ディスプレイに提示する関係から 「赤」、「黄」、「緑」、「シアン」、「青」、「マジェンタ」の 6 色 1 7)を用いる。
象徴語の方は、除かれた無彩色に近接した位置

I Iにあるもの「純潔」、「恐怖」、「罪」、「不安」 の4語を除いた残り10語を用いる（図2)。

3
図1. 色の布置。 円内の文字は次のものを表わす。
黒→黒；灰→中灰；白→白；ビ→ピンク
赤→赤；橙→橙；YO→黄橙；黄→黄YG→黄緑；緑→緑；gB→緑味青；青→青BP→青紫；紫→柴； BG→青緑； RP→赤紫実

験

2. 4の分祈結果に基づいて選定された色と象徴
語の適合度評定 デ ー タ を個別実験により収集した。 この適合度評定実験を第1セッン コンとし、それに続けて、12色に増やされた色について色同-138-

色彩の心理学的意味空間の研究

士の類似度評定デ ー タ収集の実験を第2セッショ

第1セッシ ョンでは最大の大きさのウィンドウ

ンとして行った。

画面において、 左側に6色のうちのl色によって塗・り潰された正方形が提示され、 その右側に象徴語

被験者

大学生13名（男子 4 名、 女子 9 名）。

が表示された（図3)。 画面の下部には6つのボタン

装置：が横に並べられ、 左から「非常によく合う」、「合タ (PC-9821 Ap2,う」、「やや合う」、「やや合わない」、「合わなNEC)による制御の下で行われ、 剌激はパーソナル
コンピュ ー タ用ディスプレイ (PC ボMl 72, NEC) 上い」、「全く合わない」のそれぞれの評定語がボに提示された。 実験の制御プログラムは Turbo­

並べられている色と語の組み合わせに対して最もPascal for 『 indows (Borland) によって作成さ適した評定語のボタンをマウスの左ポタンでクれた。

リックするという方法で評定を行うことが求めら方法：れた。 6色と10語の組み合わせは60通りであるが、

実験はパ

ー

ソナルコンピュー

タン内に記入されていた。 被験者はボタンの上に刺激として用いた色は Windows API 関数 RGBに60対の組み合わせをランダムに並べ換えたものをAPI 関数 RGBでは、 赤 (R)、緑

20セット作成し、 その中から同じ色または語がで(G)、 青 (B) の輝度を0から255の範囲の値で指定きるだけ3つ以上続かないもの、 先頭あるいは末することにより色が決められる。 赤、緑、 青の指尾の10対に6色がなるべく均等に現れるものを1つ定値が vl 、 v2 、 v3 であることを(v1/R, v2/G,

選んだ。 第lセッションでの提示J順序はこの選ば

v3/B) で表わせば、 本実験の第 1 セッションで用いた 6 色の指定は次のようになる：赤 (255/R,0/

れた1セットとその逆順のもののいずれかが用い

よって指定された。

られた。 各提示順序において、 その末尾の10対とG, 0/B 入黄 (255/R,255/G, 0/B)、緑 (O/R,255/

同じものがそのままの順序で先頭の前に付け加え

G,0/B)、 シアン (0/R, 255/G,255/B)、 青 (0/R,
O/G,255/B)、 マジェンタ (255/R, O/G,255/B)。

られ練習用とされた。 それらに対する評定デ ー タ
は分析には用いなかった。
第2セッションにおいては色同士の類似度の評--··--、』；···-�-今-が'" ・ ·-い•い...., ..,』;__ ... ,,..、9、 .....ぺ．．．．』；｀．．

平静
厨疇 I

•

図3. 第1セッションでの剌激提示画面。
左側の黒い正方形は評定用の色で塗り漬され、 右側の象徴語は黒で表示された 。 バックグラウンドは白(255/R 、 255/G 、 255/B)であった 。 この剌激提示用ウインドウは17インチディスプレイ上に最大サイズで表示された。

定デ ー タがとられた。 よく似た色を増やすため第lセッシ ョンでの6色にさらに6色を加えて12色が用いられた。 色名あるいは記号を付けて以下に示 ．
す。

red (255/R,O/G,O/B) 、 r_y (255/R, 128/G,

0/B) 、 yellow (255/R,255/G,O/B) 、 y_g (128/R,
255/G,O/B)、 green (0/R,255/G, 0/B)、 g c_ (0/R,
255/G, 128/B) 、 cyan (O/R,255/G,255/B) 、 c_b(0/R, 128/G, 255/B) 、 blue (0/R, 0/G, 255/B) 、
b_m<I28/R, 0/G, 255/B)、 magenta (255/R, 0/G,
255/B)、 m _r (255/R,O/G, 128/B)。 12色から2 色を選びそれぞれの色で塗り潰した正方形が最大サイズのウィントウ画面の上部に2つ並べて提示され、その下側に6つのボタンが横に並べて表示された（図4)。 各ホタンには左のものから順に「同じ」、「似ている」、「やや似ている」、「やや異なる」、「異なる」、 「全く異なる」の評定語が記入され-139-

表［ 第2セッションにおける男女13名による色の類似度評定データを非計量INDSCALによって分析したときの各次元数に対するStressの値。

\·1

次元数

Stress1

0. 3556
0. 1144
0. 0857
0. 0659
0. 0511
0. 041023456

図4. 第2セッションでの刺激提示画面。
左右の黒い正方形はそれぞれ評定用の色で塗り漬されていた。 バックグラウ
ンドは白(255/R, 255/G, 255/B)であった。 この剌激提示用ウインドウは17イ
ンチディスブレイ上に最大サイズで表示された。

れて い る。 表 l に おける 次 元 数の増加に伴うStressの値の変化の度合から判断すると次元数が3のモデルが適当であると思われる。 次元数3のとていた。 被験者は上部に提示されている2つの正方形の色の関係について6つのボタンの評定語か

横軸―- >第 1次元

ら最も適切なものを選んでそのボタンをマウスで縦軸―- >第 2次元

クリックすることが求められた。

12色から作られRoss 18) の方法によって決める対の提示順序は、◎◎られたものの間に、 同じ色同士の対を同色の提示
か対間において続かないように挿入して作成された78対よりなる系列とこれを逆の順序にしたものの 2系列が用意された。 各系列の先頭にはred、green、 blueの 3色から作られる 3組の対と同じ色同士の対3組の計6組の対よりなる系列が付け加えられていたが、 これらの6対に対するデ

ー

タは練

◎
⑲

喜

◎

◎

＠

＠＠

習用のものとして分析には用いなかった。
第2セッションは第1セッション終了後に続いて
行われた。
4

結

果

被験者個人個人の色覚の特徴を調ぺるため、
第 2 セ ッシ ョ ン の男女 13 名のデ ー タが非計量

INDSCALによって分析された。「同じ」から「全く異なる」までの6つの評定に0から5までの整数値を対応させた。 次元数と Stressの関係が表 l に示さ

-140-

◎
図5. 第1次元と第2次元による色の布置NDSCAL)
図中の記号の表わす色は次の通りである; RD (255/R, 0/G, 0/8), RY (255/R, 128/G,
0/B), Ye(255/R, 255/G, 0/8) YG(128/R,
255/G, 0/8), Gr(O/R, 255/G, 0/8), GC(O/R,
255/G, 128/8), Cy (0/R, 255/G, 255/B),
C8(0/R, 128/G, 255/8), 81(0/R, 0/G,
255/8). 8M(128/R, 0/G, 255/B), Ma(255/R,
0/G, 255/8), MR(255/R, 0/G, 128/8),

色彩の心理学的意味空間の研究>第1次元

肢に6から1までの整数 を 対応させたときの女子

縦軸ー

一＞第2次元

9 名による評定の中央値を表2に示す。
表 2 のデ ー タを 2. 2 のpenalty Pを目的関数とす

①⑨

＠

-

⑮ )

横軸―

る展開法により分析する。 C =a 1558. 44のときの各次元数に対するP、 及び評定デ ー タとモデルに⑦®©

よる距離のSpearman順位相関係数を表 3に示す。

®

但し、 順位相関係数の算出における順位付けは、
一方 のスコアが tie であっても他方のスコアがtieでない場合はそのtieでない方のスコアによって順位付けを行った。 この修正された順位付けによる相関係数を用いる方がモデルのデータに対する適合状況がよく分かる。
図6. NDSCAL解による各被験者の重み で左下隅が(0, 0)である r 記号A-Iは女子 、 J-Mは男子のものを表わす r

表3. Penalty関数による展開法によって表2の●）データを分析 したときの各次元数に対す●●る P と順位相関係数 ）。
亀●）• l C 司 558. 44
順位付けにおいて一方のスコアがtieであっても他方がtieでない場合．
はそのいeでない方の順位が用いられた。

きの布置を第1次元と第2次元に対して図示したもー黄の次元に対応していることが分かる。 同じ第

次元数

1 2 3

1次元、 第2次元に対する各被験者の重みを図示したものが図6である。 左下隅が (0,0) を表わす。
図6の重みの分布から特に色覚に問題のある被験者は含まれてい なかったことが分かる。

pのが図5である。 横軸が赤 一 緑の次元、 縦軸が青

順位相関係数..

390.81-0. 900

231. 91-0. 993195. 64-1 000次に、 第1セッシ ョンのデ ー タの分析を行う。
データは女性被験者のものを用いる。「非常によ表3によれば表2の適合度評定値の順序関係と次く合う」から「全く合わ ない」までの6つの選択

元数 3 のときにモデルから算出される距離の順序関係に矛盾が全く無くなることが分かる。 次元数

表2. 色と象徴語の適合度評定データ（女性） 。
「非常によく合う」から「全く合わない」
までの6つの評定語に6から1までの整数値を順に対応させ 、 女性被験者9人の中央値を求めたもの。

3 のときの距離と評定値の関係を図7に示す。 又、このときの色と象徴語の分布をそれぞれ図8、9と
図10、 11 に示す。 ユ ー クリッド距離が用いられているので布置の解釈が容易なように回転を行うこ

象花U
怒り

限独

5

6

2

5

4

2

6

1

1

5

5

<

<

:,

2

1

4

fi

3

3

4

3

3

3

5

4

4

が示されている。 色と象徴語は同一空間内にあるが、 図8と 10、 あるいは図 9 と 11 を重ねること に1

よって色と象徴語の同時分布 (joint map) が得

55とが出来るが、 図8-11 では回転を行わずに布置

3

4

3

5

4

2

4

ヽI

3

2

4

4

f

5

2

娯妬

3

父

3

ギば

3

*庭

6

l'

4

IIi a
9ジェンク

五愁

CJ

赤
シアン

r.,

6

平

5

永遠

られる。

-141-

oo=

�’’

横戟—

-

>第1次元

縦軸—

-

>第3次元

《''"●''"

CO!!DOOOO O <D

＠a,:,oo@゜0 ,,,,,,..

.=.

ooa,

9, 、_'
1 1 11

叶

®

0
匂

距離の2乗
＂

令

図7.

次元数3のときの距難と評定値の関係

図9.

色の布置（展開法）

横軸—-)第1 次元横軸ー ー〉 第1次元縦軸ー

一） 第2次元

縦軸— -

)第2次元

⑮

-142-

@

⑯

図I 0.

色の布置（展開法）

＠
闘

魯

図8.

網

®

®

ーロ

®

。

＠

象徴語の布置（展開法）

色彩の心理学的意味空間の研究

負の対角線方向が青ー黄の次元に対応しているこ

縦軸— - >第3次元とが分かる。 図8にみられる「赤」から「マジェ＠

横軸- - ) 第］ 次元ンタ」に至る円環構造は色彩科学 I 9) で説明されているものに合うものである。
第3 次元を縦軸と す る 図9 か ら は第3次元はValdez & Mehrabian 20l のpleasure水準に対応し

孤

®}

⑯®

pleasure水準に関係しているという解釈は図9 に対応する図11における象徴語の分布の様子とは合

® ⑯
＠

®@

てい る よ う で あ る 。 し か し 、 こ の第3 次 元 がわない。
色と象徴語の関係は図8と10、図9と11を重ねて得られる色と象徴語の同時分布から視覚的に読み取ることができる。「赤」は「愛」、「怒り」、 嫉
妬」に近く激しい色であることが分かる。「青」
は「孤独」と近い。「緑」と「シアン」は「夢」、

図11.

「永遠」、「郷愁」といった語に比較的近い。「黄」

象徴語の布置（展開法）

5

考は「幸福」に近く、「家庭」にも比較的近い色である。

察

このように、 展開法による分析によって、色の6)

タ布置と象徴語の布置のそれぞれに対する解釈と、を数量化4類の基準による展開法によって分析し両者の布置を重ねて得られる同時分布における色たものに基づいて刺激を選ぶという方法は成功しと象徴語の関係の解釈を視覚的に行うことが可能たといえる。

となる。

4. 結果に示されているように、大山のデー

におけるINDSCALによる分析

本研究では展開法が意味空間の分析のために用

結果では色覚の異常が重みの偏りとして表わされいられたが、展開法はもともと主として選好デ ーている。 本 研 究 で も 被 験者個人個人の色覚 のタの個人差の分析法として提案されたものであチェックのため、 第2セッションの色の類似度デる 2 I) 。 従って、本研究て用いられた数最化4類のタがINDSCALによって分析された。 特に問題の基準による展開法、及びpenalty関数による展開

Carroll & Wishー

16>

法は、 消費者別の商品に対する選択パタ ー ンの分ある被験者は含まれていなかった。
第1セッションの女性9名による色と象徴後の適析にも用いることができる。

合度評定の中央値がpenalty関数を目的関数とする展開法によって分析されたが、表3に示されて引用文献

いるように次元数3のときにデ ー タの順序関係とl) 岡本安晴(1992) SD法への展開法の適用について距離の順序関係の間に全く矛盾の無い解が得られた。 これ は展開法においてpenaltyを目的関数とすることの有効性を示すものである。

2)

日本心理学会第56回大会発表論文集

岡本安晴(199 2)確率的展開法のSD法への適用について ．

次元数3のときの色の布置を見てみると、 第1次

日本行動計量学会第20 回大会発表論文抄録集 ．

元（横軸）と第2次元（縦軸）の関係 を 表わす

3 ) 岡本安晴(1994)色彩と象徴語の関係の展開

図8において正の対角線方向が赤ー緑の次元に、法的分析． 日本基礎心理学会第13回大会発表．

-143-

metrika, 29 115-129 1964

4) 岡本安晴(1994)展開法の重み付き確率モデ
ルについて 日本行動計量学会第22回大会発15)北條 弘(1993)順位づけ反応モデルに基づく多次元展開法 日本心理学会第57回大会発表論文抄録媒．

表論文集16) Carroll, J. D. & Wish, M. (1974) Medels and5) 岡本安晴(1994)色彩空間の展開法的分析．
日本心理学会第58回大会発表論文集．
正：色彩象徴に関する 一研究． 色彩研
究， 11 55-59 1964

methods for three-way multidimensional

7) 岩坪秀一(1987)数量化法の基礎 ． 朝倉書店．

Luce & P. Suppes (Eds.) Contemporary

8) 丘本正・戸田準：数量化理論4類と主座標

developments in mathematical psychology,

分析法． 日本統計学会誌， 3 41-53 1973
9) Saito, T., : Contributions to e; ;typeVol. II :Measure-ment, psychophysics, andqu antification and a new method of

cisco :屑. H. Freeman and Company, 57-105.

multidimensional scaling . .Be力avior­17) Murch, G.(1986) Color displays and color

6) 大山

認

scaling. In D. H. Krantz, R.C. Atkinson, R. D.

neural information processing. SanFran­science. In H. J. Durrett (Ed.), Colort.rika, 12 63-83 1982

10)林知己夫・飽戸弘（共編） (1976)多次元

and the computer. Boston:Academic Press.

サイエ18) Ross, R. T. : Optimum orders for the11)岡本安晴(1991)数量化lII類の基準による展

paired comparisons. .lournaI o.f£ducation

尺度解析法ーその有効性と問題点 ー．

presentation of pairs in the method of

ンス社 ．

al伶-yc/Jo!ogy, 25 375-382 1934

開法 日本行動計量学会第19回大会発表論文
抄録集 ．

19) Wyszecki,G. & Stiles,W.S. (1982) Color

12)岡本安晴：数量化4類の基準による展開法に

science : Concepts and methods , quant i -おける制約条件について ． 金沢大学文学部論

tat i ve data and formulea (2nd ed.).
NewYork : John Wiley & Sons.

集・行動科学科篇， 13 35-54 1993
13) Kruska 1, J.B. : Multidimens ional sealing20) Valdez, P. & Mehrabian, A. : Effects

by optimizing goodness of fit to a non­of color on emotions. .lournal of£xperi­□

etric hypothesis. Fsyc力omet.rika, 29 1-

27 196114) Kruskal, J.B. :Nonmetric multidimensional

mental Psychology: Ceneral, 123 394-409
199421) Coombs, G. H. (1964) A theory of data.

scaling: A n 暉 erical method. Fsyc/Jo--144-

NewYork: John屑iley & Sons.

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究
稲紛大学 教育学部

飛田操

The purpose of this study was to examine the intrapersonal effects and interpersonal effectof use of cosmetics. In study 1, twenty hundred and forty-one undergraduates completed aquestionnaire that was composed of questions about everyday usuage of cosmetics, reasons ofusing of cosmetics. In study 2, effects of wearing lipstick on self-image were examained. Twenty­
nine female undergraduates participated the experiment.and wear lipstick. And they rated
impression about themselves. As the result of experiment, wearing lispstick influenced therating of self-images. In study 3, 20 male and 20 female rated the effects of lipsticks use uponlikability. Results indicated the positive effects of lipsticks use were varied with the rater's sex.
Also,there were few correspondence between the rated likability and self-rating likability. In
study 4, effects of full makeups on self-image were examined

1

緒

2

言
2. 1

これまで、 化粧行動に関しては、「化粧品の消費行動や化粧行動の動機

・

第一研究

目的

本研究の目的は、(1)大学生女子の化粧品使用理由に関する研究」のほか、「化粧による主観的な状態の変化や自己イの実態を明らかに し、(2)女性が化粧をする理

メージの変化に焦点をあてた研究」、「化粧によ

由、 あるいは、 化粧をしない理由をどのようにとる第三者からみた対人印象や対人魅力の変化に焦らえているのか、 その構造を分析し、 あわせて、点をあてた研究」なと、 さまざまな側面からの心(3)男性は「女性が化粧をする理由」をどのよ

理学的な研究がなされてきたといえよう（鈴木うに認知しているか、 その構造を分析することに(1)、 岩男• 菅原・松井(2)、 松井• 山本・岩ある。

男(3)、 山本・加藤(4))。 本研究は、 これらのうち、特に、 化粧行動の動機・理由の構造を解明し、 化粧による自己イメージの変化と他者から

2. 2

方法

の評価とのあいだの対応を検討することを目的と調査による。質問紙は、 東北地方の国立大学で心している。

理学関連の授業を受講する教育学部の大学2·3·【調奢対象者と調査方法】

本研究は、 質問紙法4年生に対して、 授業中一斉に施行された。 ここでは、 男性105 名、 女性136 名の計 241名（平均年An empirical study of intrapersonal
effect and interpersonal effects of use

齢： 20. 55オ）の有効回答を分析の対象とした。

of cosmetics.

【調査内容】 質問紙は、 年齢、 性別等を問う
フェイス ・ シートの他、 「化粧品使用の実態（女Misao Hida性のみ）」、「化粧をしない理由（化粧をしない

Faculty of Education
Fukushima University

女性のみ）」、「化粧をする理由（化粧をする女性のみ）」、「女性が化粧をする理由について の

-145-

表1

リップ・ クリ ー ム
口紅
ファンデー ション
香水、 オ ー デコロン
マニキュア
アイシャド ー
眉墨
マスカラ
頬紅
アイライナ ー
ペディキュア
つけまつげ

化粧品使用者の割合
ふだんの時

デー トなどの時

時々 つかわ
つかうつかう ない

時々 つかわ
つかうつかう ない

48.5
47.8
52.2
10.3
7.4
13. 2
14.7
2.2
2. 9
1. 5
0.7

35.3
31. 6
25. 7
35.3
36.8
18. 4
9.6
10. 3
5. 9
3.7
10.3

゜ ゜

16. 2
20.6
22. 1
54.4
55.9
68.4
75. 7
87.5
91. 2
94. 9
89. o·
100

48.9
59.3
63.7
14. 1
8. 9
20.7
18. 5
5.2
5.2
2. 2
2. 2

31. 1
28. 1
22.2
40. 7
34. 8
23.0
7. 4
8.9
4.4
5.9
9.6

゜ ゜

20.0
12.6
14.1
45.2
56.3
56.3
7 4. 1
85. 9
90.4
91.9
88. 1
100

推測（男性のみ）」から構成されている。 また、にあたり、 岡崎 5) を参照した。 さらに、 「女性か今回は報告しないが、「自己の顔や身体に対する化粧をする理由についての推測」に関しては、

イメージ（全員）」、

パ ーソナリティ特性として

表3と同じ20項目のそれぞれに対して、「どうして「自蒻心と外向性評定（全員）」が含まれている。

女性はお化粧をするのか、 その理由として最もあ「化粧品使用の実態」は、 表lに示した12種の化粧てはまると思われるところ」を「全くあてはまら品のそれぞれについて、 その使用頻度を「つかない」から「非常にあてはまる」まての5段階尺う」、「時々つかう」、「つかわない」の3つの回

度上に男性にチェ ックさせるものである。

答肢からひとつを選んで回答させるものである。
2. 3

ここでは、 状況や目的のちがいによる化粧品使用【化粧品利用について】のちがいを検討するために、 回答者の「ふだん」
時の化粧品使用と、「デー結果表lに、 136名の女性にトや合コン」時の化粧対しての化粧品を使用する割合を14種の化粧品の品使用のふたつの場面のそれぞれに回答させていそれぞれについて、 日常時での使用割合と、 デ ーる。

トや合コン場面での使用割合ことに示した。

「化粧をしない理由」に関しては、 化粧をしな【化粧をしない理由について】

化粧をしない理

い女性に、 その理由を表2に示した19項目のそれ

由に関する因子分析の結果、 あまり明白ではない

ぞれに対して「全くあてはまらない」から「非常が固有値l以上で5因子が抽出された（表2)。 第にあてはまる」までの5段階尺度上に評定させる

一因子は、「化粧をしたときの女性の反応が気にものである。 また、「化粧をする理由」に関してなるから」「化粧をしたときの男性の反応か気には、 化粧をする女性に対して、 その理由を表3になるから」「化粧をすると自分自身が意識過剰に示した20項目のそれそれに対して「全くあてはまなってしまうから」などの項目に高い負荷を示しらない」から「非常にあてはまる」 までの5段階ている。 この因子は他者からの評価や反応に対す尺度上に評定させるものである。 この項目の作成

る評価懸念や意識に関わる因子と考えられ、 ここ-146-

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

表2 化粧をしない理由の因子分析の結果
因

子
h2

項目

.93 -.05 .09 .08-.15 .90
7化粧をしたときの女性の反応が気になるから.86 -.03 .06 .17 -.00 . 77
6化粧をしたときの男性の反応が気になるから.57-.06 -.09 .04 .15 .36
5化粧をすると自分自身が意識過剰になってしまうから3化粧品が高いから. 53 . 48 -.01 .09 .15 .54
2化粧のやり方がよくわからないから.52 .33 .24-.01 .08 .45. 44 . 11 .44-.11 .03 .41
14化粧をしても、 見せる相手がいないから12学生のうちは化粧などするべきでないと考えているから .33 .15 . 32 .09 . 19 .28
1化粧するのが面倒だから.06 .72 .19 .06 -.02 .56.05 .71-.05 -.12 -.10 .53
19ただなんとなく.30 .60 .06 .09 .40 .63
17化粧をおとすのが面倒だから
8親や友人から化粧をすることに反対されているから.23-.40 .05 .07-.14 .2 3-.12-.01 .97 .08-.02 .97
11周りや友だちがあまり化粧をしないから.17 -.00 .26 .17 .13 .14
15化粧をしている人を見ると嫌な気分になるからー
18スポ ツや運動などですぐ化粧がおちてしまうから. 13-.03 .10 .84 -.20 . 77-.11 .25-.17 .51 . 35 .49
9化粧をしていないときの方が、 気持ちがいいから.14-. 16 .12 . 43 .16 .27
4化粧をしても効果がないから
16化粧をすると息苦しい感じになるから.03 .13 .05 . 11 .65 . 46
13化粧により肌荒れや炎症をおこしたことがあるから.09 -.25 . 14 -. 21 .61 .51.03 .27-.01 .20 . 36 .24
10自分の素肌に自信があるからではこれを 「評価懸念」の因子と呼ぶことにす

おこしたことがあるから」に高い負荷を示している。 第二因子は、「化粧をするのが面倒だから」る。「化粧のマイナス効果」に関する因子と考え「ただ何となく」「化粧を落とすのが面倒だから」られよう。

といった化粧をすることや化粧を落とすことにか【化粧する理由について】化粧をする理由に対わる心理的コストに焦点があてられており、「心する因子分析の結果、 固有値l以上で4因子か抽出

理的コスト」の因子と呼ぶことにする。 第三因子

された（表3)。 第一因子は、「異性の人から注目

は、「周りや友だちがあまり化粧をしていない か

されたいから」「同性の人から注目されたいから」ら」たけに高い負荷を示している。 周囲からの影「男性から魅力的たと思われたいから」「他の同性響性に関わる因子と考えられるが、1項目だけでの人に見劣りしたくないから」「きれいになりたあり、 この因子の解釈は保留したい。 第四因子いから」に高い正の負荷を示しており 「自己顕示は、「スポ ー ツや運動などですぐ化粧がおちてしと魅力性」に関わるものであるといえよう。 第二まうから」「化粧をしていないときの方が、気持

因子は、「化粧をすると積極的な気分になれるか

ちがいいから」「化粧をしても 効果がないから」ら」「化粧をすると自信を持って外を歩けるから」の3項目に高い負荷を示しており、化粧の効果性「化粧をすると自分のストレスが解消できるから」についての認知や評価を示していると考えられ「化粧には自分の顔を創造する楽しさがあるから」る。 ここではこれを 「効果のなさ」の因子と呼ぶ「素顔の自分とは違う自分になりたいから」に高ことにする。 第五因子は、「化粧をすると息苦しい負荷を示しており、「積極性や自信の獲得」に

い感しになるから」「化粧により肌荒れや炎症を関わる因子であると考えることかできる。 第三因-147-

表3 化粧する理由の因子分析の結果

I

項目

因

子

II

ill

IV

h2

15異性の人から注目されたいから
16 同性の人から注目されたいから
4男性から魅力的だと思われたいから
14他の同性の人に見劣りしたくないから
1周りの人からきれいだと思われたいから
2きれいになりたいから.89 .21-.12 .07 .86.81 .24-.17 .05 .75.79 .19-.01-.20 .70
71 .30-.10 .05 .60.71 .17 . 02-.27 .66.55 .14-.02-.57 .65

7化粧をすると積極的な気分になれるから8化粧をすると自信を持って外を歩けるから9化粧をすると自分のストレスが解消できるから
6化粧には自分の顔を創造する楽しさがあるから20化粧をすると気分転換になるから
5素顔のじぶんとは違う自分になりたいから.14 .79-.12 .10 .67.32 .67 .09-.14 .57.08 .66 -.23 .01 .50.22 .64-.18-.27 .56.03 .56 -.30-.37 .54.36 .47-.09-.17 .38

19化粧は女性のみだしなみだから
11女性は美しく装い、 女らしくふるまうものだから
18化粧をすると自分の気持ちが引き締まるから13仕事や立場上、 化粧が必要だから.04 .21-.76-.19 .67.24 .16-.65-.08 .51-.07 .42-.53-.24 .52
34 .06-.43 . 30 .39

17化粧によって自分の肌を守るため-.02-.07-.24-.44 .26
10化粧で肌の色やくすみなどの欠点がカバ ーできるから .09 .20 .02 -.37 . 18
12周りや友人がみんな化粧をしているから， 38 -.08 .22 -.01
.20
3自分の顔や肌を触っていると気持ちがいいから， 14 .25-.21 .07 .13

子は、「化粧は女性のみだしなみだから」「女性はれたいから」「きれいになりたいから」「化粧で肌美しく装い、女らしくふるまうものだから」「化の色やくすみなどの欠点がカバーできるから」「異粧をすると自分の気持ちが引き締まるから」に高性の人から注目されたいから」に高い正の負荷をい負荷を示しズおり、「伝統的性役割観」を示し示している。 これらは、美しくまた魅力的に評価ていると考えられる。 さらに、第四因子は、「化されたいとする欲求に関連する因子であると考え

粧によって自分の肌を守るため」「化粧で肌の色られよう。 第二因子は、「化粧をすると積極的なやくすみなどの欠点がカバーできるから」にやや気分になれるから」「化粧には自分の顔を想像す

高い負荷を示し 「肌の保護と欠点のカバー」に関る楽しさがあるから」「素顔の自分とは違う自分する因子であるといえよう。

になりたいから」「化粧をすると自分のストレス【男性が推定した「女性が化粧する理由」につか解消できるから」に高い正の負荷を示しておいて】

り、 ポジティブな方向への気分の変化に関する因男性が評定した 「女性が化粧する理由」に関す子であると考えられる。 こでは、 これを 「気分変る因子分析の結果、固有値l以上で4因子が抽出さ化」の因子と呼ぶ。 第三因子は、 「女性は美しくれた（表4)。 第一因子は、「周りの人からきれい

装い、女らしくふるまうものだから」「他の同性だと思われたいから」「男性から魅力的だと思わの人に見劣りしたくないから」「化粧をすると自-148-

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

表4 男性が評定した「女性が化粧する理由」の因子分析の結果
因

子
h2

項目

1周りの人からきれいだと思われたいから.89 .10 . 15 .03 . 82
. 83 . 02 .19 .08 .73
4男性から魅力的だと思われたいから.74 . 11 .02 -.08 .57
2きれいになりたいから10化粧で肌の色やくすみなどの欠点がカバ ーできるから .64 .08 .19 .35 _ 57
15異性の人から注目されたいから.58 .01 .40-.06 .50
.57
.51
.47
.64
.19

7化粧をすると積極的な気分になれるから
6化粧には自分の顔を創造する楽しさがあるから
5素顔のじぶんとは違う自分になりたいから9化粧をすると自分のストレスが解消できるから
3自分の顔や肌を触っていると気持ちがいいから.20 . 71 .04 .13.15.09 .69 -.01
.24 .63 -.00 .14- .30 .62 .39 .11-.08 .37 .04 -.22

11 女性は美しく装い 、 女らしくふるまうものだから
14他の同性の人に見劣りしたくないから
8化粧をすると自信を持って外を歩けるから12周りや友人がみんな化粧をしているから
19化粧は女性のみだしなみだから
20化粧をすると気分転換になるから
16同性の人から注目されたいから.19 -.04.40 .11.17 .43.15-.07.04 -.03-. 16 .14
.11 .14.64 .18 . 47
.58 .02 .51.56-.1a .54
32.52 .1.£.49 .43 .43.44 .34 . 35
.39 .03 .18

17化粧によって自分の肌を守るため
18化粧をすると自分の気持ちが引き締まるから13仕事や立場上 、 化粧が必要だから.07 . a 1-.09 .49.08 . 21.04 . 67
.25 . 60
.27 .45

.45
.67
.33

信を持って外を歩けるか ら」「周りや友人がみん

庁ィナ ー てのデ ー ト」などの12の状況や場面で異な化粧をしているから」「化粧は女性のみだしな

なるかどうかを検討している。 本研究では、「ふみたから」に高い正の負荷を示しており、伝統的だんの」時よりも「デ ー トや合コン」時に化粧品

女性役割の追従や周囲への同調傾向を示しているを使用するものの割合が増加するとはいえないこと考えられ、 これを「同調」因子と呼ぶことにすとか示された。 また、「ときとき使う」を合わせる。 そして、 第四因子は、「化枇によって自分のると8割近くの 女性か、「リップ・ クリ ー ム」「ロ

肌を守るため」「化粧をすると自分の気持ちが引紅」「ファンデ ー ン ョン」の3種を使用しているこ

き締まるから」に高い正の負荷を示しているか、と、 さらに、「香水、 オ ー デコロン」と 「マニキュ「保護」に関わる因子と考えられるか、 解釈は不

ア」は「ときどき使う」と回答するものの割合か可能である。

多く、状況やその時の気分なとの要因によって使

2.4 考察れているといえよう。

用に変動がある可能性かあることかそれぞれ示さ
Cashら(6)は、 ファンテ ー ション、 マスカラ、

本研究では、 これまで比較的研究の関心がもた

口紅といった15種の化粧品の使用頻度が、「授業れていなかった「化粧 しない理由」の構造を分析に出席する」、した。「化粧 しない理由」には、 他者からの評価「同性の友人と買い物にいく」-149-

を懇念することや、化粧にともなうコストやマイクアップしていないときよりもメイクアップしてナスの効果が存在することが示された。さらに、いるときの方がその女性は魅力的であるとみなす女性が評定した「化粧する理由」と、男性が評定傾向があることを示している。

した「女性が化粧する理由」の構造をそれぞれ分

このように、化粧により、自己評価や自己イメ

析し、このふたつに若干異なる構造が存在するこーとが示された。この問題については、今後さらに化粧による魅力の向上効果は、男性だけにみら検討する必要があろう。

れ、女性においてはみられない可能性の存在が示

ジは変化すること、ただし、第三者が評定した

唆されているといえよう。
3

第二研究においては、化粧による自己イメ ー ジ

第二研究の変化を検討する。第一研究の結果では、「リッ
3. 1

目的

プ ・ クリ ー ム」、「ファンデ ー ション」、「口紅」

Cox&Glick (7)は、メイクアップした女性のが本調鉦対象者たちの基礎的な化粧品であること

写真は、していないときの写真よりも、より魅力が示された。ここでは、これらのうち、特にその的で、女性的で、そして、セクン 一 てあると第三使用による印象の変化が大きいと考えられる「日者により評定されていたことを示している。

紅」に焦点をあて、「口紅」使用が、自己の印象

ま た 、Miller&Cox (8)は、公的自己意識やイメージ評価に及ぼす効果を検討すること。

(Public Se! f-Consciousness: PSC)と化粧品使
用との関連を検討し 、公的自己意：識の高い女性

3. 2

は、低い女性と比べてメイクアップをよくしてお方法【実験参加者】

国立F大学の女子学生 29 名が個り、また、メイクアップによって自分の容姿の魅別に本実験に参加した。ただし、欠損値かあるた力が上昇するとみなしていること、そして、実際

め、分析によっては人数が異なることがある。

に第三者からも公的自己意識の高い女性の方が低【実験手続き】実験参加者を個別に実験室に入い女性よりも魅力的であると評定される傾向かあ

室させた後、「女性に特徴的と思われる心理学的ることを示している。

行動である「化粧」のなかから、特に口紅に焦点

一方で、Cashら(9)は、自己評価に関しては、をあて、その口紅の効果を検討するものである」

化粧により自分の顛や全体的な容姿に対する満足と説明した。次に、年齢等を問うフェイス ・ シ ー

度が上昇するとみなしてはいるが、ただし、第三トヘの記入を求めた後、口紅をしていない状態

者からの評定に関しては、男性は、同 一の女性がで、沿席した実験参加者の顔のアップをピデオ ・

化粧をしていないときよりも化粧をしているときカメラで撮影した。ヒデオ・カメラから椅子の中により魅力的であると評定したが、女性が評定す

心までの距離は、2メ ー トル 50センチであった。

ると、化粧しているときと化粧していないときとこのとき、なるべく緊張していない自然な状態での魅力に違いがみられないこと、すなわち、第三の顔や表情を撮影するため、日常的な会話が実験者からの評定には性差が存在することを示してい者とのあいだで行われた。撮影時間は、実験参加

る。さらに、Hamid 1 u) も、口紅、アイシャド ー な

者によって異なり、ほぼ 1 分半から 3 分であった。

どのメイクアップをしているときとしていないと

次に、撮影したヒテオを、着席した実験参加者

きの対象人物の女性に対する魅力を検討するなかから 2メ ー トル 10 センチの距離から 29インチ・モ

で、同性である女性は、メイクアップしているか

ニタ ー に再生し、実験参加者は、この録画された

していないかにかかわらず対象人物の女性の魅力

自分の顔や表情をみながら、その印象を「全くあを一定に評価しているのに対して、男性は、メイてはまらない」から「非常にあてはまる」までの-150-

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

5段階尺度上に評定した。 この時、「なるぺく客観練された」の10項目に対しては有意な主効果が認的に 印象を評定して欲しい。 考えすぎるとわからめられている。Newman-Kue ls法による多重比較のなくなるので、 直感的に評定して欲しい」旨の教結果は、 これらの効果は、 いずれも 「口紅無し」

示を行った。

条件といずれ か 一 方あるいは双方の「口紅 使用」

この後、実験者参加者は口紅をつけて、 上と同条件とのあいだに有意差が存在すること、 二種類

様の手続きを繰り返した。 口紅は2種類あり、K社の口紅のあいだの効果には有意差が認められないの中価格帯プラントに属するオレンジl色とビンことをそれぞれ示している。

ク系l色であった（以下、それぞれをオレンジとビンクと略記）。

3. 4

順序効果を相殺するため、 実験

考察参加者のうち半数はオレンジ→ピンクの順に口紅

日紅の使用により、 自己イメ ー ジが変化する側をつけ、 半数はピンク→オレンジの順に口紅をつ

面と、自己イメ ー ジの変化がもたらされない側面けた。

が、 ともに存在することが示された。 特に、 口紅使用により、「暖かさ」や 「やさしさ」は減少す

3. 3

るが、「洗練された」「激しさ」「情熱的な」「美し結果

表5に示した 16項目の形容詞それぞれの印象評さ」が上昇するという結果は興味深い。 今後、 自定の平均に対して、 一要因分散分析を行った。「好己イメ ー ジの変化と第三者 からの印象や魅力の変ましい」、「理性的な」「冷たい」「感情的な」「知化と対応するのかどうかについての検註が必要で的な 」「おちついた」の6項目に対しては、有意なあろう。

主効果は認められす、自己の印象評定に及ぼす口
4

紅 使用の効果は認められな かった。 これに対し、第三研究「情熱的な」「美しい」「派手な」「激しい」「穏や4. 1

かな」「地味な」「醜い」「暖かい」「やさしい」「洗目的第二研究により、 口紅の使用による自己イメ ー
表5

好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
冷たい
派手な
感情的な
激しい
穏やかな
地味な
醜い
知的な
暖かい
やさしい
おちついた
洗練された

ジの変化の特徴か明ら かになった。 そして、 自己

口紅の使用による印象（平均）
口紅無し

オレンジ

ピンク

2.93
2 41
2 17
2.07
2.44
1. 93
3. 14
2 21
3 55
3.07
3. 17
2.41
3.55
3 41
2.56
2.14

3.04
2. 70
3. a 3
2 69
2. 24
3. 13
3.24
2 79
2. 6 2
2 14
2 86
2 69
3. 24
2 93
2 55
2.62

2.86
2. 67
3.34
2. 76
2.10
3. 31
3 24
3 00
2.66
2 21
2 83
2. 79
2. 90
2.97
2.66
2.72

イメ ー ジの変化と第三者からの印象や魅力の変化とが対応するのかどうかについての検討が必要なFことか示された。

0.25
1 90
14.29****
11. 18****1.40
22. 98****
0.15
4.24*
11. 96****
13.59**キ＊
3.40*
2.30
4. 79*
3. 23*
0.09
5. 02**

第三研究の目的は、 口紅使用の有無による第三者 からの印象や魅力の変化を明らかにし、 口紅の使用による自己イメ ー シの変化が、 これら第三者
からの印象や魅力の評定と対応するのかどうかを明らかにすることに ある。
4. 2

方法

【刺激人物】

刺激人物は、 第二研究に参加した

実験参加者のうちの5名の「口紅無し」「オレンジ口紅条件」「ピンクロ紅条件」の3種類のビテオについて、それぞれ 30秒ずつに編集したものであ* p(05; u p(.01; **** p(. 001

る。 刺激人物(5名） X口紅条件（無し、 オレン-15 1-

表6

A

んにつ

ての自己評定と第三者評定

口紅無

15

2 4

...

2 2 2 1 4 2 2 4 4

男性

3 4

一1 4

自己

2 2 2 2 2 2 2 4 3

4 4

女性

2 2 2 2

4 3

し

3.55
い
3.2
5
2. 70
3.40
し 3.20
2.85
2.20
2.50
2.50
3. 30
3.05
3. 95
3. 30
3. 35
3.65
3.45
2.50
2. 90
3. 70

ーー

＿4 2 2＞＇,153045602500106000851090308515 30556525
3 3 2 3 3 3 2 3 2 3 2 3 2 3 3 3 2 2 3

2 3 1 2

いぽた た
し
ぽっ れい
な
な
ら
いなな
し 的 的 い い い な 的 い か な な い い な つ もさ 着
ま性 熱 し わ た 手 情 し や 味 的 か し 楚 人 ど 練 ち
好理 情 美 か 冷 派 感 激 穏 地 知 暖 優 清 大 子 洗 落

さ男性

30252050151510301590305500202595052540
3
3．
2．
3．
3 3．
3•
3•
2•
2•
3 3•3•3•3•3•3•3•3•

自己

4 3 4 3

女性

05206050
4545255080900530059055802515
3 3 3 3 2 2 3 3 3 2 2 3 3 3 3 4 2 3 3

男性

0 0 5 0 5 0 5 0 5 0 0 0 0 0 5 c::,C)0 0
2 5 2 6 1 7 2 2 8 1 3 6 2 1 1 7 4 2 4• • •3 3 3 3 3 2 3 3 2 3 2 3 3 3 3 3 2 3 3

自己

オレンジ

ピンク

女性
3.40
3. 55
3.05
3. 60
2.80
2.85
2.45
2.60
2. 35
3. 00
2. 75
3. 90
3.40
3. 30
3. 35
3. 70
2. 35
3.50
3.60

ン‘ ヽ ピンクの3種類）の計15のビデオのリストか、「暖かい」「優しい」「清楚な」「大人っぽい」「子口紅の使用による順序効果を相殺するようなかた

ともっぽい」「洗練された」「落ちついた」てあっちで作成された。

た。

【実験参加者】

国立F大学、および、 同大学院の学生40名（男20名・女20名）。 いずれも刺激人

4. 3

物と未知、もしくは、 キャンパスで顔を見たことかあるという程度の関係にある。
【実験手続き】
後、「第

一

結果

表6�10に第二研究において得られた自己評定の値と、 第三研究において得られた第三者による実験参加者は、実験室に入室

評定の平均を男女別に示した。 ここでは、特に、印象の実験であること、 素直に評定し好ましさと美しさの評定に関する結果に焦点をあてほしいこと」等の教示を受け、 ピデオに映ったてて記述する。

刺激人物の印象や魅力について、19項目の形容詞

刺激人物Aに関しては（表6)、 本人は、 オレ

上て評定した。 評定は、「非常にあてはまる」か

ンンの口紅の使用により好ましさと美しさが上昇

ら 「全くあてはまらない」の5段階評定とし、「非したとみなしている。 第三者の評定においても男

常にあてはまる」を5点とし、「全くあてはまらな

女とも口紅の使用は美しさの向上をもたらしたとい」を1点として得点化した。 ここで用いられた

みなしているか、 口紅の種類による違いは認めら

形容詞は、「好ましい」「理性的な」「情熱的なJ

れていない。 好ましさ に関しては、第三者による「美しい」「かわいらしい」「冷たい」「派手な」「感口紅使用の有無による評定には有意な違いは認め

情的な」「激しい」「穏やかな」「地味な」「知的な」られていない。

-152-

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

85

65 85059020 8525454570 0010954515707590
3 2 3 2 4 1 2 2 2 3 2 3 4 3 3 2 3 2 230908000006055601 00001005155085308010
3 2 2 3 4 1 2 2 2 4 3 3 4 4 3 1 4 2 3
2 4 4 3 3 3 2 4 3

3 3 4 38565758095209050754560750010105525757010
3 2 2 2 4 1 2 2 2 3 2 3 4 4 3 2 3 2 3

3 3 3 3 4 5 3 4 485852070609520
159570 85 856540 15909595
3 2 2 2 3 1 2 2 2 3 2 2 3 3 3 1 4 2 2

2 3 3 3359555358575455030704055050010 85 151505
3 2 3 3 2 2 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 2 3 3

1 3 5 4 4 14 4 4
5 3 4 44 270707005709565503545301090806540154555
2 2 3 3 2 2 3 3 3 2 23 2 2 2 3 2 2 2

1 4 4 4 3 3 4 4 40 0 0 0 0 5 0 0 0 5 0 5 5 0 0 0 0 0 5
0 3 5 1 5 8 3 4 2 6 1 1 92 80 0 0 1
3 3 3 3 2 2 3 3 3 2 2 3 2 3 2 4 2 3 3

4 4 4 4850505209570 853500056060150000854555 15
3 3 3 2 2 2 2 3 3 2 2 3 3 3 2 3 2 2 3

3 460051590656000351045559080209570457590
2 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 3 2 3 2 2 2

1 2 4 2 5 3 3 4 4

4 3 4 3

-153-

2.75
3. 15
3.60
3.05
2.65
2. 90
3. 75
3.50
3. 25
2. 60
2. 25
3. 05
3. 10
3. 10
2.80
4.05
1. 90
3.00
2.85

女性
男性
自己

穏やかな
地味な
知的な
暖かい
優しい
清楚な
大人っぽい
子どもっぽい

オレンジ
ピンク
口紅無し

女性
女性

派手な
感情的な
激しい

0 5 0 0 5 0 5 5
0 0 0 5 0 0 5 5 5 5 0
0 9 5 8 2 7 7 3 8 0 3 1 1 2 7 0 0 6 5
4 2 2 2 4 1 1 2 1 4 3 3 4 4 3 2 4 2 3

2 2 4 3 4 3 2 4 4
洗練された
落ち着いた

男性
男性

洗練された
落ち着いた

4 3 3 3

地味な
知的な
暖かい
優しい
清楚な
大人っぽい
子どもっぽい

自己
自己

好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
かわいらしい
冷たい

3.70
3. 15
3.00
2. 95
4. 20
1.60
1.65
2.65
2.05
4. 10
3.40
3. 35
4.45
4.45
3.75
1. 90
4.40
2.75
3. 15
派手な
感情的な
激しい
穏やかな

Cさんについての自己評定と第三者評定
表8

女性
自己

男性
女性
自己
女性
男性
自己

オレンジ
ピンク
口紅無し

男性
好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
かわいらしい冷たい

Bさんについての自己評定と第三者評定
表7

4142

005010657065559520905540-25306030654040
4333312223234433233

95509555006525502060456520256545757085
3323412223234433233

95351580758040804095755020406030002045
3333312223234433333

95506535957095309010953530300580402580
3323311214234442333

213134222

14 4 3 2 2 2 2 2C)C)C)5 5 5 5 5 0 5
5 5 5 5 C)C)C)C)5 0
6 4 6 1 8 8 1 6 C) 3 3 1 1 4 9 2 9 03323312224334432323

134342243

4. 35
3. 65
2. 60
3.45
4.05
1.60
1. 95
2.15
1. 65
4.15
2. 80
3. 90
4. 30
4. 30
4.15
3. 30
2.80
3.40
3. 75

女性

3232

女性

3. 15
3.05
2.55
2. 90
3. 35
1. 95
2. 25
2.60
2.05
4. 10
3.45
2. 95
4.00
4. 20
3. 20
2. 75
3.40
2. 70
3. 85

602095n 459025401 70003090950590909585
3•
2•
2•
2•
3•
3•
3•
3•
3•
3•
2•
2•
2•
1•
3•
2 2•
3•
3•

75950575150095258010657065606095105595
2232322323223322322

0505555555000000055
4218197863617489874．．．．．．
3332312223233322223

34

65058590407580258580353585951095957565
3322311213333332223

222243233

20200575558500603585450085901565658565
3332312223333332323

443432233

332332233

男性

3332

-154-

オレンジ
ピンク

口紅無し

女性
男性

男性
自己

自己
女性
女性

男性
男性

自己
自己

好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
かわいらしい
冷たい
派手な
感情的な
激しい
穏やかな
地味な
知的な
暖かい
優しい
清楚な
大人っぽい
子どもっぽい
洗練された
落ち着いた

Eさんについての自己評定と第三者評定
表10

オレンジ
ピンク

口紅無し

自己
女性
自己

男性

好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
かわいらしい
冷たい
派手な
感情的な
激しい
穏やかな
地味な
知的な
暖かい
優しい
清楚な
大人っぽい
子どもっぽい
洗練された
落ち着いた

Dさんについての自己評定と第三者評定表9

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

刺激人物Bに関しては（表7)、 本人は、 口紅のは、 女性は、 口紅の使用による違いを示していな

使用により好ましさが低下したとみなしており、

いが、 男性は、 口紅の使用により美しさが向上し

特に、 ピンクにおいてこの傾向が強い。 第三者のたとみなしている。

評定においても口紅の使用による好ましさの低下

刺激人物Eに関しては（表10)、 本人は、 口紅が詔められているが、 口紅の種類による違いは示の使用により好ましさが低下したとみなしている

されていない。 美しさに関しての自己評定には変ことが示されており、 第三者による評定において化がなく、 また、 第三者による評定においても口もピンクの使用により好ましさが低下したことが紅の有無による美しさの違いは認められていな

示されている。 また、 好ましさの評定に男女差が刺激人物Cは（表8)、 オレンジの使用によ認められており、 男性よりも女性が好ましさを高り好ましさが上昇したとみなしている。 第三者にく評定していることが示されている。 美しさにおよる評定においては、 男性はビンクの使用によりいては、 自己評価においても第三者評価において好ましさが上昇したとしているのに対し 、 女性

も口紅の使用による印象の変化かみられていな

は、 オレンシの使用により好ましさが上昇したと

し、

い。

0

みなしているというように、 第三者の性によって口紅のもたらす向上効果が異なることが示されて

4. 4

考察

いる。 美しさに関しては、 自己評価では、 美しさ

口紅の使用により、 第三者からの好ましさや美の向上効果か認められているが、 第三者による評

しさの評定が上昇する女性と、 上昇しない女性と定では、 有意に近い向上効果しか示されていながともに存在することが示された。 また、 この魅し1カの向上効果は、 評定する性によっても異なる可゜

刺激人物Dに関しては（表9)、 本人はピンクに能性かあること、 そして、 第三者が評定した魅力

より好ましさが上昇し、 オレンジにより低下したの変化は本人の自己評価の変化とが必ずしも対応とみなしている。 ただし 、 第三者による評定でするとは限らないことがそれぞれ明らかになったは、 ピンクでは好ましさの向上は認められず、 オといえよう。 これらの結果は、「似合う」「似合わレンジによる好ましさの向上効果が示されていない」という評価基準とも関連するものと思われる。 美しさに関しては、 本人は、 オレンシの使用る。 さらに検討か必要であろう。

により向上したとみなしている。 第三者評定で表11

実験で使用した化粧品
実験参加者

X

y

z

ファンデ ー ション
フェイス ・ カラ ー
アイ ・ カラ ー

プラウン系
ピ ー チ系
プラウン系
イエロ ー 系

オー クル系
オー キッド系
ブラウン系
イエロ ー 系

マスカラ
アイ ・ ライナ ー
口紅マル ー ン
ブラウン系
オレンジ系

モレル
プラウン系
レッド系

オー クル系
オー キッド系
イエロ ー 系
ブラック系
ピンク系
アクア
プラック系
ロ ー ズ系

-155-

5

第四研究

ンを評定させた。 次に、 アマチュアの大学院生女子の指導のもとで、 化粧をし、 正面からほぼl分

5. 1

目的

間ピデオで撮影した。 次に、 再生されたピテオを第二研究において、 口紅の使用により自己イメー

みながら、 自分の顔のイメ ー 、ンを評定した。

ジか変化すること、 そして、 第三研究により、

この自己イメ ー ジの変化と第三者からの印象の評

5. 3

定とが必ずしも対応するとは限らないことが示さ

結果【実験参加者について】

実験参加者Xは、 19オ

れた。 ただし、 この二つの研究は、 口紅の使用だで、 ふだんの生活においては、 リップ ・ クリ ーけに焦点をあてていた。 そこで、 第四研究においム、 口紅、 ファンデ ー ンョン、 アイシャド ー をとては、 フル ・ メイクアップによる自己イメ ー ジのきとき使用している。 実験参加者Yは、19オであ変化について検討する。

りふたん、 リップ・クリ ー ム、 口紅、 マニュキア、
オ ー デコロンを使用している。 そして、 実験参加

5. 2

方法

者Zは、 19オであり、 ふたん時においては、 リッ【実験参加者】

日頃は、 ほとんど化粧をしていj・クリ ー ムだけの使用てある。

ないと回答した国立F大学の女子学生1年生3名か【メイク ・ アップによる自己イメ ー ジの変化に実験に参加した。

ついて】

表11に使用した化粧品を、 表12に化粧実験室に入室後、 個別に、 日頃による自己評定の変化を示した。3名ともフル ・の化粧品使用の頻度、 ふつうの自分の顔のイメ ー

メイクアップにより「大人っぽい」「情熱的な」【実験手続き】表12

化粧前化粧後化粧前化粧後3 3 5 3 2 3 5 4 4 2 1 3 2 2 2 4 2 4 3-156-

4 3 4 2 3 2 4 4 3 2 2 3 4 3 3 2 4 3 3

大人っぽい
子どもっぽい洗練された
落ちついた

化粧前化粧後3 3 3 3 4 1 4 1 2 3 3 2 4 3 2 4 1 3 4

清楚な実験参加者Z3 2 2 3 3 1 1 2 1 3 2 1 4 3 3 1 2 2 3

知的な
暖かい
優しい

実験参加者Y3 3 3 3 2 3 4 3 3 2 2 2 3 3 2 4 2 2 3

地味な

実験参加者X2 2 1 1 1 3 1 1 1 4 3 3 3 3 3 2 4 2 5

好ましい
理性的な
情熱的な
美しい
かわいらしい
冷たい
派手な
感情的な
激しい
穏やかな

フル・ メイク ・ アップによる印象評定の変化

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証的研究

264 1991「派手な」「激しい」の評定が増加し、「子ともっ5)ぽい」の評定が低滅している。

岡崎晶子：化粧の心理的効用と購買行動、
日本社会心理学会第34回大会発表論文集

XとZは、ともに、化粧により 「美しさ」は上昇

254-255 1993

しているとみなしている。 ただし、「好ましさ」
に関しては、Xは上昇したと、Zは低下したとそれ

6)

Cash, T. F., Rissi, J., & Chapman, R.

ぞれみなしている。 Yは、化粧により 「かわいら1 985 Not just another pretty face: Sex

しさ」や「知的さ」か上昇したとみなしている

roles, locus of control, and cosmetics

が、 「美しさ」や「好ましさ」の変化ないとみな

use. Personality and Social Psychology

している。

励lletin, 11 246-257 1985
7)

5. 4

Cox, C. L., & Glick, W. H. Resume

eva­

luations and cosmetics use:When more is考察

not better. Sex Roles, 14 51-58 1986

フル ・ メイクアップによる自己イメ ー シの変化を検討したところ、化粧か、「大人っぽさ」の上8)

Miller,L.C., & Cox,C.L. For appearances'

昇と 「子どもっぽさ」の減少をもたらしたとみな

sake: Pub Ii c self-consciousness and

していることか明らかになった。 ただし、 化粧に

make-up use.

Personality and Social

Psychology Bulletin, 8 748-751 1982

よる好ましさや美しさの向上効果は、 参加者によって異なることか示されており、今後、 この参

9)Cash, T. F., Dawson, K., Davis, P.,

加者による効果の違いを明らかにするための検討

Bowen, M., & Galumbeck, C. Effects ofが必要であろう りcosmetics use on the physical attrac
tiven ess and body image of Americancollege woman. Journal o/ Social Psy­

引用文献
1)

学、 フレクナンス ・ ジャ
2)

3)

4)

c力ology, 129 349-355 1989

鈴木ゆかり：顔の形態と印象の閾係化粧心理ーナル， 12 4-1 3 310) Hamid, P. N. Some effects of drress cues

1993

on observational accuracy, a perceptual

岩男寿美子・菅原健介• 松井豊：化粧の心理

estimate, and impression formation. Ji力e

的効用<IV)日本社会心理学会第26回大会発

Journal o/ Social Psychology, 56 279-

表論文某， 102-103 1985

289 1972

松井嬰•山本貞 理子・岩男寿美子：化粧の心理的効用、 マ ー ケティンク ・ リサ ー チ， 21【付記】

30-11 1983

藤いずみ、飛田瑞穂、 片岡由佳、 酒井千晶、 岡崎

山本純子・加藤雷枝：化粧に対する意識と被晶子、坂下雪音、武藤はる佳の各氏の協力を得ま

服行動、 椙山女学園大学研究論集 ， 22 251-した。 記して感謝いたします。

-157-

本研究の遂行にあたり、 櫻庭恵理、佐

．

記念講演

大坊郁夫

．

平成7年度記念講演

コスメトロジ ー 研究振興財団
第6回表彰・贈呈式記念講演

化粧とコミュニケ ー ション夫

大坊郁
北星学園大学文学部教授

場所 薬学会館長井記念館
日時 平成7年11月13日(fj)

はじめに

化粧と顔

ご紹介を頂きました大坊でございます。 本日は「化粧とコミュニケー

私は、 魅力という観点から、外見、 特に顔をション」ということでお話扱ってきております。 「化粧」はもちろん顔だけしをさせていただきます。私は、昨年この会で研が対象のことでは無く、 もっとト ー タルなもので究助成金を頂きまして、 化粧に関する実験を現在ありますが、 ここでは顔を中心にお話しいたしま

進行させています。 全体としてはまだ纏まっておす。 顔はその人らしさを優先的に示すものでありりませんが、 本日はこれに関連するお話しをいたます。 個性が反映されます。 誰もが認識しているします。 ご紹介にもありましたが、 私は今、 社会ように自分の看板なのです。 これが総べてではあ

心理学、 対人関係、 特にコミュ ニ ケ_ション、 対

りませんが我々は他者との関係を進めていくに際

人魅力を専門にしている者でございます。 本日し、 まず外見的な情報を受け取ります。内面的なはOHPを中心にお話させていただきます。 お手元

情報は相手との具体的なやり取りがあってから分のレジメをご参照下さい。

かってきます。 ですから、外見的な手掛かりに魅

一般に人との関係において「魅力」は大変重要力を感じるかどうかは大いに重要です。 魅力を感です。 公的な「役割」のある関係であれ、 プライ

じなければその後の展開はありません。 親しくはトな関係であれ、 その相手に魅力を感じなけならないわけです。 引き付けるものがあれば積極

れば、 何事も円滑に進まないわけであります。 言的に結び付きを作ろうとし、 その後の可能性が出

葉を変えますと、 いかにして自分を伝え、 どの様てきます。 このように顔は看板であり、 第一の手に相手を理解するかという連関的な関係が存在し掛かりとなるわけです。 顔の造作は生まれ持ったています。 本日は、 基本的には対人関係を円滑にものです。 もちろん、 多少の手入れは可能です

ションあるいは魅力あるコミュが、 構造的には無理です。 元来持っている顔の特ションに関して、 特に、 化粧が持つ 伝達

徴に如何に工夫を加え、 他者との関係で自分をアベーするコミュ ニ ケ
ニケーー

性、 機能についてお話させていただきます。

ピ ー ルしていくかは大切のことであり、 ここで「化粧」が重要な意味を持ってくるのです。

Make up and Communicat10n

化粧の成立
Ikuo Daibo
Department of Psychology
Hokusei Gakuen University

化粧がなぜ生まれてきたかについては、 化粧文化史に関する著述の中に記載されています。 ひと
つには医療行為が挙げられています。 もともとは-161-

呪術的なものとミックスしていたと思われます。

けです。 もともとの身体に備わっている性的ディ

魔よけ的な意味合い、 病気を払うなと、 積極的にスプレイが化粧的意味合いを持っている例です。

は顔料を顔に塗ることによって疾患を治療あるい

数年来、村澤博人先生（ポ ー ラ文化研究所）と共は予防する意味があります。 健康への関心が化粧

同で、 日本と韓国女性の美意識の比較研究をして

の

ペー ス

ー

ルで括ってみました。 自分らしい特徴を魅力的にあります。 もうひとつを社会的なアピいます。 韓国人の美意識は多彩です。 実に多くの彩色されたお面が昔から用いられています。

バ リに演出して相手にいかにアピ ー ルするかです。 そエ ー ションが豊富で、 多くは面には化粧か施されれから、 腰楽や田楽に見られるのですが、 普段とています。 これは若い女性の例です（写真1)。

は違う自分を演出することによって、 超日常的な姿を作っていく行為があります。 更に、 霊界の神々とのコミュニケ ー ションの手段として顔に施しをします。 これは、 場合によっては個々人の顔を離れ、 定型化された仮面、 彩色されたお面として． ． ． ．．．

残っています。 自分らしさのアピ ー ルは、 言って． ． ． ．．．

ようにこなすのかを表現し、 相手との親しい関係を作っていくためであ り、 魅力が重要になります。 結局、 対人関係を如何に円滑に保つかという◎e e

みれば、 相手との関係において自分の役割 をとのコミュニケ ー ンョンの手段として、 化粧が生まれたということができるわけです。

、·〇
�,·-··-, . e,._• ., ,,..1

化粧の例とお面
呪術的な意味合いのもの、 日常的な魅力作りの例、 「演ずる」場合の化粧、 など、 化粧は紀元前

写真l韓国のお面の例ー化粧した遊女役（ウェジャンニョォ）のお面 一の昔から使われてきた古い歴史をもっています。
このことは多くの方か承知している事だと思います。 演じ分けることに関連して、 一人の人にさま

額、 丸くティフォルメされた唇、 口唇、 額、 頬、

ざまなメイクアップを施し、 同時に髪型、 服装もそして目尻のところに赤が入っています。 全体はタルな形で、 その人の印象を変えるこ

白塗りの化粧になっています。 他に、 かなり戯画とができます。 魅力のうちの基本的要素として、化されたもの 、 化 粧かパタ ー ン化されたものがあ

変えたト

ー

性的なディスプレイがあります。 配偶者選択の目ります。 西域地方の壁画(8世紀初めの作品）に的、異性を引き付ける意味合いです。 例えば、 女も、 頬、 額を赤くする化粧のはっきりした例が示性の赤く彩色された唇は、 疑似的な性的信号をされています。

送っていると、 人類学的には考えられています。

化粧の意味

マンドリルの雄の鼻の部分は男性性器の特徴をそのまま反映しています。 そのほかにある種のヒヒの仲間では、 発情期になると雌の胸に性器と同じ化 粧の意味は、 基本的には二つに分類されま

模様か出ます。 交尾可能だというサインを出すわ

す。 第一は「変身する」です。 日常の自分ではな-162-

化粧とコミュニケーション

表1

化粧の意味
自己の変身と手入れの粧いはそれぞれに化粧の別のスタイル

変身ハレ

自己変革

l

いう実践行動は別枠で考えた方 がいいと思います。 数年前に、 女子学生を対象として、 化粧への

日常からの解放容貌特徴の改変•

関心と態度、 及び実際にどのように化粧するかと態度と関いを調べてみました（大坊• 小西1991)。
因子分析の結果、「メイクアップ重視、 実践」と
「化粧、 美容への関心」は別な因子として抽出さ→メイクアップ化粧れました。 個人の特性との関連で見ると、「人にどの様に見られるか」を懸念する傾向（公的自己自己改善意識）の強い人は後者の因子「化粧、 美容への関容貌特徴の魅力弛化

視、 実践」因子は、 これとは異なり、 如何に自分手入れ[:j常的印象憎理心」と密接に関係しています。「メイクアップ重一基礎化粧を外に表 す か と いう、 自己の表現力の豊か さ

1---―. -- -·一―---- ______ _!

(ACT : 大坊1991)と高い相関を示します。 つまり、 2つの因子は次元が異なると同時に段階的であると考えられます。「人にどの様に見られるか」いものを目指す行為です。 言ってみれば、 日常の生活で演じている役に飽き足らないで、 別なありを気にする人は化粧への関心は高いが、 化粧の実方を目指そうとしています。 「祭り」、 ハ レの場

践には結び付かず、 そこに段階的な違いが認めらであり、 自分からの解放です。 この流れにあるのれます。 今述べた実験の数年前に調査表を用いたが一種のメイクアップ化粧です。 もっと極端にな別の研究を行いました（大坊1990)。 いくつかれば、 整形行為、 お面の様な超日常的な流れになの項目の中から、 化粧に関する因子として、 別角ります。 第二は自分らしさの手入れ、 あるいは自度の因子が二つ抽出されました。「先端的・高感

分のウィ

ー

クポイントの手直し、 一種の「自己改度因子」と「抑制的・中性化因子」です。 前者

善」です。 これは日常の管理であって、 基本的には、 「相手に応じて化粧を変える」とか、「先端は自分らしさの維持であり基礎化粧の流れです。

的なものにすぐ反応して受け入れる」などの質問

趣旨の異なる二つの流れがあるです。

項目がまとまって出てきた因子です。 これに対し山崎(1955)は、「化粧のコスト」の程度からて後者の方は、「香水やメイクを、 他者との関係

分類しています。「塗ること」、 これは化粧としで濃くしすぎない様に」しなから、 それと同時にて日常的です。「飾ること」、 ここにはアクセサ

自分らしさを工夫する意味合いのものです。 このリように、 化粧は、 自己主張の因子と他者との調ー

なとが含まれます。 自分の体を俄つける「タトゥ ー 」（入れ墨）です。 それから「整形手術」の順になっています。 更に「内面の美」があり、和、 配慮因子という、 2重のスキル内容を持っていると考えられます。

これが一番コストが大きいとされています。 つま

これまでのことを、「化粧プロセス」の形に継り化粧は、 立場にもよりますが段階的に考えられめてみました（図1) 。 今まで触れてきました、ます。 山崎先生はコストの概念からこのような指化粧への関心、 化粧の実践、 他者への関心• 懸

摘をしています。

念＜化粧意識・態度などの概念の関係を表しています。 まず、 化粧への関心が必要てす。 化粧行為

化粧プロセスの前提あるいは準備性に当たるものとして、 他者との関係において自己をとのように表現するか、

今まての話から推察できる様に、 化粧に対するがあります。 これが化粧の実践に結びついていく-163-

心と実践とは必ずしも直結するのではなく、 むしj＼ィヒ粗プ＝セ� ネ

ろ前提としての化粧意識がある」となります。 以ィヒ文

ここま で考察を進めますと、 関心がどのように実圧ー ＼他者への関心• 懸念

上が「化粧プロセス」の心理構造についてです。
践に結びついていくのか が大きな課題となります。 現象的に見ても、 多くのステップが予想され感受性ます。 どのような要因が化粧を具体化させるの か（自己評価懇念）’ ’’’ ’ ’’’
鳴I＾

別される数多くの化粧品が使われています。 これ

／

ー

関心

が興味を引きます。 基礎とメイクアップ化粧に大表現力実践．遂行行動らの化粧品をどう使うかについては心理的に見て関係の維持· 進展

も、 かなり多くの要因で細分化されるものと思われます。

化粧意�· 態度／I

化粧行動と自己意識

先端性• 高感度（自己主張）

昨年来、 私の研究室で女子学生を対象として、抑制•中性化 、 調和

実際に化粧を施す実験を行っています。 その一部

如磯分をご紹介いたします。 まだ纏まっているわけで所属のアイデンティティはありませんので、 予備的な研究デー タとお考え（世代 、 •学校・甜場集団など）下さい。 この実験ではまず、 化粧が自分自身にど

図1のような影磐を及ぼすか、 次に、 対人的な影蓉、化粧のブロセスにおける関心と遂行行動の構造。
化粧は 、 背景にある文化の影響を受けながら 、化粧への意識• 関心、 実践行動が形成される。
関心と実践は必ずしも直結するのではなく 、
むしろ前提としての化粧意識がある。

効用が測定されます。 この段階では被験者 一 律に、 ナチュラルメイクとヘビ ー メイクを施し、 ノーメイクを含めた3通りで比較しています。 その心理的な流れであります。 このプロセス全体はその時代、 状況における文化の影響下にあります。

上で、 鏡を見て自己診断し、 評定尺度に回答してもらいます。 その他に、 心理的な変化を、「状態不安得点」の高低で測ってみました。 かなり多く文化的な背景の下で所属のアイデンティティ ー 、
つまり自分が学生であるか、OLであるのか、 どのの差が出ました。 図2の縦軸は「状態不安」（落ち世代であるか、 などが化粧意識・態度に結びつき着きの無さ）です。 ノ ー メイク で最も不安が高ます。
55

他者との関係を円滑する上での社会的スキルは,,苓

もっと一 般的な形で文化的に規定されます。 これに直結するのが、 他者への関心• 懸念、 他者に対する感受性と自分をどれだけ表したいのかという動機です。 そして前者が化粧に対する 関心へ、 後者が化粧の実践に向かっていきます。 つまり、「化40

ヘピー ・ メイク

粧においては、 背景にある文化の影響を受けながら、 化粧への意識• 関心が形成される。 また、 関

-164-

図2

化粧後の状態不安得点の比較

化粧とコミュニケ ー ション

•
·
·
·
"
ン』
岱 3羽 ·
0
0
0
5
●
ワ

文字 数

化粧の自分への効用
更に興味深い研究例かあります。 慶応大学の岩男先生らの個人差を課題に した研究(1985)で問す。 他人からの評価を気にする人、つまり、人か

6SO

らとう見られるかを気にする傾向の人は、 化粧をノ ー ・ メイク

ナチュラル・ メイク

ヘピ ー ・ メイク

すれば、 華やかになる、セクシ ー になる、大人っ

化粧条件

図3

ぽい• 成熟した・社会性のある状態になるなど

化粧条件間での発話文字数の比較と、捉えています。 これに対して、 内省的な傾向い。 ヘヒ ー メイクでも高い。 ナチュラルメイクでの強い人（私的自己意識における評点の高い人）

一番安定しています。 次に話題リストを用意しま

は、 化粧することを、知的なこと、洗練されたこ

して、それに基づいて意見を述べてもらい、一定とと捉らえています。 自蒻心と、社会的に自分が時問にどの程度話したか（発話塁、 文字数など）どう見られるかの自覚に関連して、分岐します。

を測定しました。 実験では他にもいくつかの指標

宇山先生ら(1990)の仕事は、 メイクアップしたをと り ま し た 。「発話の文字数」を 比べ る とと きの気持ちを年代比較しています。 まず、 調壺、（図3)、ナチュラルメイクの場合、一番発言が活

結果の因子分析によって、 積極性が上昇する因発てした。 つまり、 自分の意見を出しいるわけで子、 落ち佑くという因子、他者に向けての気分がす。 ヘヒ ー メイクがその次です。 ノ ー メイクの場

高揚する因子、 自分自身に対する気分が高揚する

合、 明らかに発言は少ないのです。 化粧をすれば

因子、それと安心の因子を見 出しています。 これ

自己表現が活発になるといえます。 そして、学生らを年代比較したところ、20代の人では「積極性であるという、自分たちの状況に似合っているナの上昇」が高くなります。50代の方では、化粧のチュラルメイクの場合、最も積極的になっていま

基本的意味合いが「リラクゼ ー ション」にあります。 この結果に基づき、現在では、 被験者個人個す。 化粧目的か年齢によって変化していきます。

人が持っている基本的 化粧パタ ー ンを考慮した上年を経るにしたがって、積極性から、 内向的な ・で、 化粧の内容を変えた実験を行っています。 化

自慰的な方向に変化していきます。 化粧が本人に

粧が自身に与える効用としては、メイクアップ ・

及ぽす効用の中で、 積極的にハンデを克服するこ

ア ー ティストが行うにしろ、 自分で行うにしろ、と、 皮府疾患を含めた社会的不適応な部分、 障害

肌に触れることにより、「自分自身への関心」がを化粧で積極的に改善して行くことは、特に重要増大します。 これが前提になりまして、 化粧したな点であると思っています。 場合によってはこの姿に自信が出て、行動が積極化してきます。 先程ような化粧操作で飛躍的に心理的な改善が得られの実験にも、これが表れています。

ます。 例えば、廂疾患患者について、かなり長期

次に、「社会性の（足進」か学げられます。 他者的な研究を、 亜松先生ら<1982)が行っていまとの接触に当たり、臆しなくなり、行動が活発にす。 長期的な経過においても化粧によって、持続なり、 自己呈示の手だてを化粧を通じて獲得することになります。 化粧をすることによって、他者から見られている自分のイメ ー ジがはっきりと出てきます。 これも、 化粧者の社会性を促進すると同時に、 緊張を付加する要因になります。 緊張す
ればそれだけ自律的になります。

的安定と栢極性が維持されています。 同志社大学の浜先生(1992)のところでは、 老人性痴呆であるとか、 うつ病患者にコスメティックセラビ ー を行っております。 浜先生のところでは情動活性化という概念を用いています。 うつ病患者さんに適用してますか、かなり長期間、 何週間、 何か月単

-165-

位で、 化粧を続けていきますと、 欝症状が消退し

疇だ力度

4.S

ていきます。 この例ではもっばら顔に対するメイ
クです。 化粧方法の指導から始めて、 自分で化粧2. 47

して行くように仕向けていっています。 最近では
老人性痴呆症の患者さんにも施しています。 施設,,,2. 73

I亡コ如砕：
i!l如せ

匡

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でお年寄りに化粧をすること自体が大きな刺激に図4なります。 縁遠くなった、 普段したことの無いィヒ
粧をすることで非常にいきいきとなり、 夜の徘徊

化粧度に応じた認知評定値の比較(Workman & Johnson. 1991)

も少なくなり、 他者に対しても発言が多くなり、心理学的な尺度を当てはめてみますと、 はるかに

他者の働きかけに対する反応も良くなるなとの明確な迫いかあるのです。外見の魅力と内面性のはっきりした効果が認められています。 これらが関連性でいえば、 必ずしも一致していないわけでコスメティ ックセラビーの事例ですが、 更に最近す。 つまり、 見る側の問題として、 人の魅力を判

では、 病棟に香りを流すことによる効果、 アロマ

断するに際し、 どうも、 ステレオタイプな見方かの効果も積極的に導入されているようでありま（ヂ仕しています。 化粧すると美しく、 魅力的になす。

るが、 それと反比例して、 内面的にはその魅力にこれらの学問的取組はごく最近のことなのです

そぐわないものかあるとする見方です。 これは西が、 珍しいことに地方行政の対応が早く、 北海道

ではないかと思います。 日本の歴史において、 外は、 いくつかの施設を指定いたしまして、 化粧療

見を飾るぺきではない、 外見に惑わされてはいけ

法に補助、 助成をする措置を取っています。 他のないとする、 抑制的な態度が続いてきました。 美

都道府県の状況は分かりませんが、 各自治体レベ的なもの、 美しいもの、 に対する関心は誰れにでルにこの動きがが広がっていくと予想されます。

も ありますが、 これを抑えてきた文化がありま

高齢化社会、 あるいはすでに入っている高齢社会

す。 この傾向は日本において強く、 化粧だけてはにおける大きな化粧の効用、 貢献であろうと思っなく、 顔そのものの魅力に関しても当てはまるこております。

とが我々の研究で明らかにされています。
化粧した顔の人かどういう職種に向くかを調壺

化粧の対人的効用した研究があります(CoxとGlick. 1986)。 この
研究ても外見の魅力と、 内面性はクロスした関係

化粧が持っている対人的な効用の基本は、 化粧にあります。 一般職になら、 化粧した人を採用すの内容にもよ りますが、 他者の感じる魅力を増るとする結果です。 単純化していえば、 化粧する

し、 他者を引き付ける点にあります。 しかし、 世ことによって外見的魅力を高める様な人は一般戦の中にはこれと一 致しない見方があります。 例え止りであって、 総合椴的な、 管理的な立場になりば、 記rkmanとJohnson (1991)は、 化粧は魅力をうる戟種に関してはむしろ採用されにくいという高めるか、 化粧の仕方によってその魅力がどのよ結果です。 これは実際の統計ではなく、 あくまでうに変化するかを検討しています。 大まかに言うも実験的デ ー タで、 シミュレ ー ション的なものでと、 私の場合と同じく、 ノ ー メイク、 ナチュラルあります。 採用において、 外見的魅力を高めるこ

メイクとヘヒ ー メイクの3条件を設定しています。

とはそれなりに意味かあるが、 管理的な能力が期「他者にとっての魅力度」はこの順で高くなりま待される場合はまったく別次元になります。 営理す。「女性性」もほとんど平行して上昇します。

能力こそが重要であり、 外見を飾ることは、 本来ところか「道徳性」は逆に下がります（図4)。

菅理能力に関係ないはずなのに、 むしろ負の関係-166-

化粧とコミュニケ ー ション

で見られています。 外見を飾るような人は仕事の自己効用と対人効用は共に必要です（図5)。

能力の面では低いのではないかと考えようとする

自分だけのための化粧ではあまりに限られたもの傾向があります。 世の中に広くはびこっているスになってしまいます。 他者だけに向けての化粧でテレオタイプ的な見方です。 オ色兼備の人はそん

は、 その日毎にお面をつけ替えるようなもので自なにはいないのだという考え方に基づき、 外面と分がどこかに行ってしまいます。 結局、 対人効用

内面を補完的に扱う

は自分の自尊心（自尊感情）を高めることに関係

一種の偏見です。

して初めて、 満足をもたらします。 つまり、 両方

化粧の効用は循環的とも不可欠であり、 また、 別々のものではなく、相互に柔軟に関係しています。 基礎化粧をベ ー ス

化粧には多くの効用があります。 ネカティプなとし、 メイクアップがあり、 これはむしろ他者と面については今言いました様に、 見る側の態度にの緊張を強いるものであります。 他者との緊張が依存します。 極端には言い切れませんが、 ステレ

なければ大きな自尊心が得られません。 結局は自オタイプ的な見方によります。 それはともかく、分のところにつながります。 自尊心を高めるに

自分自身にとっての有効な役割があります。 ひとは、 化粧によるコミュ ニ ケ ー ションを使い分ける

つには化粧行為により自分を整える点がありま

柔軟性が重要な課題です。 化粧のほかにもいろいす。 背景的には基礎化粧品を含みますが、 自分にろな自己表現の手段があります。 それらとの関連

とっての効用として重要です。 一方で、 我々は社性を含めていかに柔軟にウェイトを置き換えなが会的な存在です。 他者とのさまざまなつながりがら、 化粧を使っていくかがテ ー マとなります。

あります。 家族においても、 職場においても然りです c 他者との関係においていろいろな役割を化粧研究の今後

担っています。 そこで、 いかに自分をうまく伝え
以上、 早口でお話を続けて参りましたが、 今後す。 魅力 をとのように作っていくか、 いかに魅力の方向について触れてみます。 魅力あるコミュ ニ

ある存在になっていくか、-これは、 いかに社会性

ケ ー ションを進めていくために、 心理学の立場かを構砥するかに他なりません。 ここで意味を持つ

ら、 化粧というものに言及しますと次の5つに整

―

_
-

-

一

一
ー

理されます。 即ち、l. 時系列の把握（自己効用と対人効用の循環）、2.

合、3. 対人関係段階に応した外見特徴の把握、

I化粧名

";:粧
' 行動/ �す。 ところが日本における化粧に関する心理学的

­

―

―

--

た。 今まで説明しま した様にこれらは車の両輪て研究では、 自己効用に関する研究例が盛冨で、 対

­
―
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ここに自己効用と対人効用の循環と記しま し_..,, Fl尊慇栢�→—- - - -----

5点です。

』

自己効用
整える

礎

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/------------

化・サプカルチャ ー との対応（文化の理解）、 の

'詞足

粧
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マッチング ～ 情報の統4. 健康維持、 回復、 促進のメカニズム、5. 文（メイクアップ化粧｝

I

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一

のがメイクアップ化粧であります。

_て、 いかに円滑な関係を作っていくかが重要で

図5 化粧の「効用」 一 満足度の過程
化粧することは先ず自分の欠点をカパ ー し、
自信を得る。 他人に対してはその関係に応じた役割として粧い 、 関係の強化と社会的な承認を得て満足して行く

人効用についても多少の例がありますが 、 この二つが相互に連動、 関係しあっていることに関する
仕事はわすかです。 自己効用と対人効用の流れを考慮した研究がなされるべきです。

-167-

して、 日常生活における香りの重要性が指摘され2番目に状況マッチングの課題があります。 あている例です。

る人の外見上の手がかりとして、 顔というベ ー ス
があって、 被服があります。 もちろん内面的に別の観点から、 ある雑誌と共同企画で香りを心

ソナリティとか、 個人的能力と理学的に取り上げてみました。 男性に女性の写真いうものかあります。 それぞれが鋭に向かい合うを スライドて見せ、 魅力評定をさせる実験を行い時には、 自分らしさの化粧ということを考えて、ました。 心理学では良く用いられる手法てす。 こ

化粧を施し、 身なりを整えていると思います。 しの時に、 香りを2種類用 意いたしまして回答用紙

かしながら、 現実には更に、 他者とのつながりをに塗り込みました。「香りなし」を含めて3条件のは、 その人のバーンョンが課実験です。「イランイラン」と「マシュラム」を題となっています。 人は他者に無数の情報を発信用いた実験の結果全体では、 それほど大きな香りしています。 その中でも、 外見の情報は重要での影器が詔められませんでした。 次にスライトのす。 それらの情報を相手との関係、 場而によって女性をタイプ分けした上で分析を行いました。 一とのように統合していくのか、 どのように使い分方は成熟した身体的特徴を持っているグル ー プとげていくのか、 に当たって、 化粧か果たす役割の他方を理知的なグル ー プにしたところ、 魅力評定

研究か必要です。 化粧がほかの外見情報との関係に明らかな差か認められました。 なぜであるかはでどのように運用されるへきか、 等のウェイト付

良くわ からないのてすか、 イランイランは男性のけの研究です。 つまり印象情報統合の研究か今後女性に対する関心を高め、 陳租させる作用かある

重要になってきます。 コストがかかる研究で、 今と言われています。 この香りの下では前者のクルまでは十分に手がついていなかったのではないかーと思います。 個々の情報を切り離した単的な研ころが、 後者のグル ー プの人、 清楚な感しの人の究だけではなく、 全体的な関連性を意図研究が、魅力評定は、 鎖静効果があると言われているマより現実に即した検討の為に必要です。

ジュラムの条件で高くなります。 香りの影聡は決考え、 もっとト

ー

タルなコ

ー

ディネ

ー

一

プに属する女性の魅力評定は高くなります。 と3番目に対人関係における段階との関係てす。

して 一 律では無いことか分かります。 この場合は日常生I舌ではいろいろな関係が重層的に成り立っ香りを調査票に塗り込んで条件操作して、 結果をー・導いています。 香りの感じ方は主観性か強く、 研

ウァイプの場面ての関係なとがあります C 化粧に究しにくい分野ではありますが、 もっともっと進よるコニュニケ ー ン ョンの意味はこれらの関係に展してもよいテ ー マであると考えます。

ています。 職場の関係、 友達の関係、 アフタ

深く影響されます。 あるところでは、 あるタイプ

最後に、「文化の理解」が挙げられます。 単純の化粧かフィ ットします。 別の場所ではその化粧に見ても、 国・民族によって化粧の仕方は大きくの意味合いはまるで違ってきます。 対人 関係の深違います。 同じアンアの中でも違います。 例えさ と相手が感じるあろう印象管理の仕分け方 にば、 日本と韓国とを比較すると、 韓国であれば、

よって、 一律ではあり得ません。 いってみれば 化

外見美が推奨されています。「心の美しい人は頑粧は自己の筋便な変身なわけです。 変身性についも美しい」と見なされます。 整形手術も盛んでては個人の特徴と同時に、 他者とのつながりの中す。 入念な化粧、 ヘビ ー メイクが施されます。 そで考えていく必要があります。

次に、 健康の維のままのメイクでは日本では突出してしまうで持、 適応を推進していく効果についてです。 治療

しょう。 日本は抑制の文化を持っています。 ト ー的な意味での化粧に当たります。 例えば、 最近、

タルな顔文化として、 化粧を捉えることて、 そのコミュニケ ー シ ョンの 一環としてアロマテラピ ー

背景にある文化を理解することができます。 文化が喧伝されています。

の種々層では無意識的に侵している相手に対する種の精神治療的な効果と

一

-168-

1L1'.tC--'ミユー7 ー ン’ ヨノ

誤解が数多くあります。 化粧を、 あるいは顔文化

関係を如何に豊かにしていくかを念頭に置きながの研究を進めることで、 これらの誤解を解く切りら、 この種の研究を続けていく所存です。

口が発見できるのではないかと、 最近では期待しご清聴ありがとうございました。

ています。広がりのある研究分野です。 他者との-169-

コスメトロジー研究雑感

研究雑揺

i
募する機会を与えていただき感謝しております。

コスメトロジーと本研究とのつなかり
大倉（東京工業大学）

一郎

コスメトロジ ー と水産大学校（平成6年度）§幡手

コスメトロジ ー 研究振興財団の研究助成に応募した経緯を述べる。筆者は現在生命理工学部生物英雄

工学科に所属しているが、もともとの出身は化学（平成6年度）〉工学科であり、得意な分野はどちらかというと物私の勤務している水産大学校は農林水産省所管の化で、 当然のことですが水産にかかわる教育や研究

ヘの変換」や「種瘍親和性光増感剤を行っています。このようにコスメトロジ ー とはの開発および反応機構の解明」といった分野で、関連のないと思われる環境にいるものが、なぜコ分光学的、反応速度論的な物理化学的な研究手段

スメトロジ ー と多少なりとも関係した研究を行っを取ることが多い。 上の2つの研究テ ー マは全

たか、その要因を考えてみました。本校には漁業

く別々の分野のテマに見えるが、実は可視領域

学科、機関学科、製造学科、増殖学科の4学科との光を有効に使うという点で密接な関係がある。

教養学科があり、1学年の 定員は180名、4年制と両者共に切望されている光増感剤は、光化学的に修士課程相当コ ー スを併設した単科大学です（な理化学である。研究内容は「太陽エネルギ
学エネルキ

ー

ー

ー

安定で、光励起三重項寿命が長い光増感剤であお、平成9年度入学者から学科改組にともなってる。そこで、各種光増感剤の開発や光増感反応の学科名、定員が変更される予定）。水産のもつイ反応機構解明を目指した基礎研究を行ってきた。

メ ー ジは、よくいえば海、男らしさ、逆のイメ ー

このような研究はコスメトロジ ー とは無縁なもジはキッィ、キタナイ、キケンのいわゆる3Kだとのと考えていた。しかし、このような可視光によ思います。事実、十数年前までは、ほとんどが退る光増感反応の機構はコスメトロジ

しい（むさくるしい？）男子学生で、女子学生を

ー

に関係が深

いことが分かった。顔の皮膚のように常に太陽光

キャンパスで見かけることはほとんどありません

線に晒される機会の多い部分は光による光増感反でした。しかし、原因はあきらかではありません

応が起きる可能性が多い。 ポルフィリンを始めとが、ここ数年、女子学生が増えてきており、私のする色素は生体中にも存在するが、皮膚の表面に所属する製造学科では、現在その割合は20%にも外部から吸着したり、付着したバクテリアによっ達しております。このような喜ばしい（？）変化て生産されたりもする。また、化粧品にも光増感は、男子学生と女子学生それぞれのコスメトロジ

反応を起こす成分が含まれている場合がある。 こーのように我々が気付かなかった分野でも我々の基生が極めて少数であったとき、入学した時にはそ礎研究が役立つ可能性があることを知ったわけでれなりのスタイル（化粧）をしていた女子学生がす。コスメトロジ

ー

研究振興財団の研究助成に応

思考に興味ある変化をもたらしました。女子学

短期間で男子学生風に変貌しました。つまり、ス-173-

タイルに無頓着になる傾向がみうけられました。

討してきました。粘土鉱物の中では、スメクタイ

ところが、女子学生の割合がふえてくるにつれト等が優れたホストですが、人工鉱物にもまた優て、男性（私達教戦員も含めて）はしだいにカッれたホストとなりうる層状化合物があります。色コウを気にするようになり、女子学生もより美し調を考えると、不純物のない人工鉱物にも利点がくなるためのさまざまな努力が見受けられるようあると思われます。

になってきました。このような学内でのコスメト

この研究は、インタ ー カレ ー ション反応を無ロジ ー 思考の変化が水産大学校（水産学）の将来

機•有機複合化技術としてとらえ、従来にない化

にとって望ましいことか否かを現時点では判断で

粧品構成材料の合成手法を提案するものでした。

きません。しかし、水産学にこだわってきた私のこの研究の立案にあたり、私たちの研究をコスメ

教育、研究に対する姿勢には有効に作用したこと

トロジ ー の視点から見直し、新しい切り口を見出は確かで、この変化がコスメトロジ ー にかかわるすことかできたと考えています。特に、応用に近本研究に着手させナこ 一

つの要因ではなかろうかとい視点で合成手法の開発に取り組めたことは、と思います。最後に、本研究を遂行するうえで、多ちらかといえば基礎ヘシフトしていた私たちの研大なるご支援をしていただいたコスメトロジー研

究に新たな視点を与えてくれました。我々の研究

究振興財団に厚く御礼申し上げます。

成果がコスメトロジ ー の発展に少しでも寄与できれば、これにまさるよろこびはありません。

（水産大学校）（早稲田大学）

コススメトロジ ー と無機材料
菅原

コスメトロジ ー における
脂質の役割

義之

脊山

（平成6年度）g

洋右（平成6年度）§私たちの研究室では、無機材料や無機一有機ハ
イプリッド材料の合成• 構造・性質を広く研究し脂質はコスメトロジ ー において有効成分を溶かています。科学技術の発展において材料の果たす

す溶剤であり、素材でもある。肌に直接つけて、役割の重要性は非常に大きく、少しでも社会に役

しかも長時間にわたって留まるところから、備え立つ研究を目標に研究を行ってきました。

なければ成らない幾つかの要件がある。 一つは体無機材料と化粧品のかかわりは意外と深く、体温、 こ とに皮府温において適度の流動性を持たな質顔料として粘土鉱物が古くから用いられてきまければならないし、細胞にとって刺激性があってした。また、紫外光を遮断するためにチタニア等もならない。また、空気に触れても酸化されるこの酸化物が使われていることも、広く知られていとなく、安定性は欠かすことのできない条件であます。代表的な化粧品用無機材料である粘土鉱物

る。

の使用量は、化粧品業界全体で1000 tを越えるそ

今回、私どもが研究対象としたゴ ールデンハム

うです。粘土鉱物等の層状化合物の特徴は非常にスタ ー のハ ー ダ ー 腺が分泌する脂質、アルキルジ

薄い層が積み重なった構造にあります。私たち

アシルグリセロ ールはこれらの条件をすぺて満たは、この層状構造に着目し、その層間に様々な化した格好の素材といえよう。

合物を挿入する反応（反応をインタショ(PA F)に象徴されるように、アルキル脂質はン、生成物を層間化合物と呼びます）について検

生理活性脂質であることが多いが、コ ールデンハ

ー

カレ

ー

-174-

血小板活性化因子

た、えげつない内容なのである。

ムスタ ー の場合には不飽和脂肪酸を全く含まない
ので、酸化されることもなく、至って安定な物質

薬学部に勤めている関係上、教室にも女子学生であり、皮膚温での流動性を維持するためにイソが少なくない。彼女達がお化粧をしているのか否

型、アンテイソ型の分枝鎖脂肪酸を構成分としてかは定かでないが、彼女達の研究が軌道にのり、成り立っている。しかも、雌雄差がはっきりして一生懸命頑張っている時は顔の表情にも張りがあいて、雄ではこれらの分枝鎖脂肪酸のかわりに、り、心に戦くものがある。僅かなお化粧で充分魅

短鎖の飽和脂肪酸を導入することによって流動性了するものを感じる。
高齢化時代に入りお年寄りのお化粧にも興味がを維持するという巧みな代謝が行われている。

持てる。洗錬された会話と体全体からほとばしる

この1年間の研究ではアルキルジアシルクリセ
ロール

品格。それらの謡l和 は美しい。お年寄りのお化粧の構造を明らかにすると共に、雄と雌における代謝の違いがアンドロゲン受容体を介して分は素顔か窺える程度の、精神の熟成度が計り取れ

枝鎖アミノ酸の分解過程で調節されていることをる様な薄化粧が心地よい。

明らかにすることができたが、今後、この分枝鎖女性の事ばかり言ってはおれないのである。男脂肪酪を含むアルキルジアシルグリセロ ー ルを化

性のお化粧が確実に増えつつあり、今後益々増加

粧品の素材として応用していく上で大切な情報をする傾向にあるであろう。自分の顔に責任を持つ

ルテンハムス

べき年齢にさしかかり、身体と精神を磨き生活環腺という天然の組織か目的を持っ境を整え、来るべき男性のコスメトロン ー を先取もたらしたものと考えている。ゴ
タ

ー

のハ

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ダ

ー

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りしなくてはと考える昨今である。

て合成し、分泌している脂質に学び、化学合成に（九州大学）

よって大量に得られれは、実用化の途か開けるであろう。

（東京大学）

コスメトロジ ー とエラスチン
甲斐原

コスメトロジ ー 雑感正山梢
（平成6年度）§征洋

エラスチンと呼ばれる蛋白質と、物性化学の立（平成6年度）g

場から付き合い始めたのは昭和から平成へと代るお酒を飲むのが好きなのでよく巷の行き着けの頃であった。なかなかの難物で、専門の異なる同

飲み屋に出かける。数時間カウンタ ー 越しに美女期生と束になって懸かっても正体を微かに垣間見の顔を眺める事になる。話が弾む時の顔には艶がせる程度であり、又、国内では医学分野を除けば感じとれ、お化粧の具合も程良く感じる。反対に

極めて研究者数が限られている事もあり、些か疲

話も途れ途切れとなる日もある。この様な日のおれが出た感があったところに、コスメトロジ ー 研

化粧は乗りの悪さか 一 目瞭然である。お化粧が合究振興財団よりエラスチン研究に興味を寄せて頂わないと嘆く。しかしお化粧のせいでは決して無いたいた事で、再度、態勢を立て直し走り続けてい事は本人が一 番良く知るところであろう。

いるところである。エラスチンとは、皮膚、動脈

通勤にJRを使っているので、毎日多くの美女達

壁、肺胞等の組織で持続的な弾性機能を支配してと会う。お化粧もフィットしており、絶世の美女いる弾性線維蛋白質であり、動脈硬化は動脈壁でとも思える女性の顔をちらちらと見る事になる。

のエラスチンの質的、量的変化そのものである。

その美女が隣の友人と話を始めた途端に幻滅を感

エラスチンは原始蛋白 質的なアミノ酸組成を もじる。話の内容が実に下らない、たわいなく、まち、胎生初期から機能を発揮しているが、既にカ-175-

でない外国の中年女性の写真の対比である。かたルシュウムの沈着が始まっており、加齢に伴う コー ル沈着も加わって、血管壁弾性機能をや徽のない滑らかな肌で、かたや深く年輪が刻ま低下させる事で確実に寿命を決めているとされてれた肌であった。もちろん、生活環境や遺伝的性いる。しかも、 エ ラスチンは正常血圧領域でのみ質が異なる女性の写真から、化粧品を簡単に評価機能し、低血圧では血管平滑筋細胞に、一方、高できるものではないが、少なからず化粧品をみる

血圧ではコラ ー ゲンにさっさと役目を渡して血管目がかわった。このようなことが頭にあったので壁の剛性を高め、動脈硬化に導く我儘者である。

コスメトロジ ー 研究の意義はすぐに理解できた。

レステロ

エ ラスチンとカルシュウムイオンが選択特異的な新しい細胞賦活剤を合成しようとする本研究はコ相互作用に基づき結合するのは、我々の様々な実

スメトロジ ー とは以下の二点で深く関わるものと験手法の全てで確認する事が出来た。当初は冷静ヽ

考える。まずは、化粧品との関係である。効果に，，に眺めていた動脈硬化の進行した大動脈の病理標

ついては賛否両論あろうが、化粧品の中にコラ ー

本や組織写真も、段々と他人事ではなくなってい

ゲンのようなタンパク質が添加されるようになっ

くのを実感する実験結果と時間の経過である。 エて久しい。私が研究材料に用いているのは、これラスチンの特異な弾性機能を再現、代替する生体

らコラ ー ゲンを代表とする細胞間基質タンパク質

機能性材料は未だ現われておらず、 エ ラスチンのゃ、細胞賦活化剤てあるサイトカインや成長因子

タ

バーは50年を超えるとの報告もあり、である。これらタンパク質を混合したり、結合さまさに寿命を決めている蛋白質と言う事になる。

せたりした新しい材料は、細胞をより活性化する

大動脈 エ ラスチンに手を触れて寿命を支配するのことを見いだしてきている。これらは将来、育毛は畏れ多いとしても、せめて皮屑の弾性低下を阻効果からはじまり、肌の活性化にも有効と考えら

止して、もう 一 花咲かせる手立ては等と考えて

れる。

ー

ンオ

ー

も、カルシュウムイオンの選択特異的結合により第二は、人工皮膚の研究との研究である。健康

弾性低下をもたらす分子構造が、諸刃の剣としてのためではなく医療としてのコスメトロジ ー であエ ラスチンの巧妙な持続的弾性発現の起源となっる。火傷治療のために人工皮膚は重要である。本ている事は確実である。自分の研究結果はともか

研究で得られるような新しい材料は皮膚細胞の成く、動脈砥化を防ぐ食物、生活法、アンタイエ ー

長を助け、足場となる。
しかしながら、このような自然科学研究のみな

ジングサプリメントなる男性化粧品等、妙に気になるこの頃である(5らず、 「顔学」のように人文・社会科学も総合し(九州大学）

た、潤いのある、より快適な生活をめざしたコス

コストロジ

ー

メトロジ ー が進展することを期待したい。研究生と本研究活にも潤いが現れるに違いない。

伊藤嘉浩

コスメトロジ ー における本研究の意義（平成6年度）〉コスメトロジー（京都大学）=· . · . · . · . · .· .· . · .· . · . · . · . · . · .· . · . · . · · . · . · . · . . ,,,という言葉は本研究の申請をす

射ることになってから初 め て知った。しかしなが

場

・：
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厚
（平成6年度）［ら、全く認識がなかったわけではない。以前、日本化学会の会誌「化学と工業」で化粧品と化学と7 ー リノレン酸は必須脂肪酸（ピタミンF)の 一いう特集が組まれた。その中で印象に残っている種として知られており、植物中に主として存在しのが、長年化粧をしてきた日本人中年女性とそうているリノ ー ル酸が生体に摂取された後プロスタ-176-グランジン(PG)に転換する中間物質である。 ししかしながら、近年、酸素分子より誘導される反たがって、 r — リノレン酸は必須脂肪酸として の応物質の中には、我々の健康や生命を脅かす原因

生理機能とともに、PG合成の前駆物質としてPGのとなるものが存在することが明らかとなってき方、た。 すなわち、 老化、糖尿病、 アルツハイマ ー あ

糖尿病、ガン、ウイルス感染などはプロスタグラ

るいは癌等の多くの成人病•難病の成因に生体内ンジン前駆体の生合成過程において、その律速段で発生する活性酸素が関与すると言うことであル酪から r ー リノレン酸に変えるる。 我々の生体内での活性酸素産生源としては、

不飽和化酵素（△6脂肪醗不飽和化酵素）の活性白血球あるいはマクロファ ー ジ等の食細胞か良くを弱め、その結果PG合成が抑制され、さらに健康知られている。 これら食細胞は生体が細菌あるい障害が助長されると考えられている。 7 リノレはウイルス等の感染を受けた際には、 多塁の活性

ン酸の直接摂取はこのような状況の予防に役立つ

酸素を遊離し、殺俗することにより、自己を外敵ことが期待されるか、生体の老化プロセスの遅延から守る。 活性酸素は、生体にとっては「毒」で持つさまざまな生理作用に関与している。

階であるリノー

一ーにも効果があるという報告もされており、その点あり、過剰生産された場合には先に述ぺた種々のにおいてコスメトロジと密接に関係していると疾患の発症あるいは進展に関与すると考えられて

般に r — リノレン酪の前いる。 当然、生体内には活性酸素に対する防御系駆体であるリノ ー ル酸産生能力は極めて高いが、（消去系）が存在し、過剰な活性酸素を「無毒ー思われる。 高等植物は

一酸のほとんど全てが植物細胞を構成する化」する。 従って、我々の健康は活性酸素と消去

膜脂質の主要脂肪酸であるa リノレン酸へと変系のバランスの上に成り立っていると言っても過換されてしまう。 本研究は、遺伝子工学的手法を言では無いかも知れない。

リノ

ール

ー

一

皮膚表面が紫外線に暴露することにより、容易

つの遺伝子を生産性の高い栽培植物に導入し、 7にサンバーンあるいはサンタ ー ンと言った種々のーリノレン酸の生産能力を飛躍的に向上させるた炎症、またある場合には皮屑癌が誘発されることめの基礎研究である。 近い将来、このような栽培がある。 これらの成因にも活性酸素の関与が考え植物が開発されれば、 r — リノレン酸の生産が極られており、 古くからビタミンC等の抗酸化剤がr ー リノレン酸

防護剤として用いられてきたのは周知の通りであ含有食品を日常摂取することによって、 ごく自然るが、今日なお、より優れた抗酸化剤が求められに上記症状の予防、治療ならびに老化現象の緩和ているのがコスメトロジ 一 分野での現状のようでがなされるものと考えらる。

ある。 また、近年、 フロンガス等の環境汚染物質用いて、 △6脂肪酪不飽和化酵素遺伝子というめて低コストで実現可能となり、（九州大学）

によるオソン層の破壊により、地球上への紫外線の到達量が増加していると言う事実から、 「紫外コスメトロジ ー と抗酸化剤
小島

線から標的組織である皮膚を如何に守るか？」と言う事が重要課題となろう。

周二抗酪化剤に関する研究が、皮膚疾患はもち論のこと、多くの成人疾患の予防あるいは治療に役立（平成6年度）g

つことを期待したいものである。（東京理科大学）

今から約35億年前、地球上に初めて酸素分子が誕生し、 多くの生物の発生、増殖あるいは進化等に「善玉」として貢献し、つい最近まで「悪玉」としての酸素分子の存在には気がつかなかった。

-177-

研究ですが、今後ますますコスメトロジ ー の研究開発に役だっていくものと確信しています。

カエルの研究とコスメトロジ 一
野村一（九州大学）也

薬学とコスメトロジ 一（平成6年度）〉
アフリカツメカエルの受精卵は上半分が黒っぽ

橋

田

充

い動物極と、下半分の白っぽい植物極からなる直径1. 2mmくらいの小さな卵です。この卵の動物極（平成6年度）g

はなにもしないと皮膚などになりますが、中胚葉薬剤学を研究している立場の我々の分野では、

誘導因子といわれる成長因子が働くと筋肉や血コントロ ー ルドリリ ー ス型 DDSである経皮治療シ液、神経や心臓など多種多彩な組織器官ができてステム(TTS)への評価の高まりと共に、 多くのきます。いまでは動物極の部分を取り出して培養

難吸収性薬物の吸収促進を目的として、吸収促進

し、培養液に適当な成長因子を加えることで自由剤の＿利用やプロドラッグ修飾法の開発などのアプに神経や心臓、あるいは目なとを試験管のなかでロ ー チが活発に進められている。近年、コスメト

作り出せるようになっています。動物極の未分化

ロン 一 の立場からもスキンケアシステムに対するな組織が何もしなければ皮旧になり、成長因子を認識が高まり、数多くの新規化粧品素材（皮膚生いろいろの濃度でくわえれば体をつくりあげるど

理機能賦活物質）の開発が活発に進められていんな組織器官にも分化するというのですから、皮る。医薬品の場合は皮膚表面に投与した薬物の局

盾やその他の組織·器官を作り上げる分子の検索

所的あるいは全身的な薬理効果を発揮させる必要や同定の研究をするのにこれほど適当なものはながあるのに対し、 化粧品はその成分が皮屑表面にいでしょう。実際アメリカではこのシステムを洗留まり皮府に穏やかに働く必要がある。どちらの練して特許を申請し、製薬会社と発生学者との共場合も、こうした素材を有効かつ安全に使用する

同研究をじゃんじゃんすすめているということでためには、如何に望ましい量あるいは速度でそのす。私達もこれに遅れないようにしたいと思って物質を皮盾に浸透させるかが鍵となり、皮r酋透過います。今回の研究ではカエル皮旧に存在してい促進法の開発および皮膚中濃度の評価と予測は必る糖脂質や糖蛋白質が皮膚の細胞の接着やアポト

要不可欠な条件となっている。 現在、経皮吸収型

ー シスにどのように働いているかを明らかにしよ

製剤に比べはるかに多く流通している化粧品の素

うと試みました。たいへん面白いことに新しい接材の多様化および複雑化がめざましく進んでいる

着分子やグリコシルセラミドが同定できましたの状況にある。こうした背景において、皮rB"透過挙で、蛋白質の遺伝子を決めてそのホモロジ ーを利動を予測し合理的に処方設計を行なうための理論用して哺乳類相同分子の検索をしようと考えてい確立が望まれている。本研究は、薬剤学を研究します。上で述べました試験管の中でカエルの皮Tiている立場から、まずプロドラッグ化と吸収促進をつくりあげさせる研究システムをあわせて利用剤の組み合わせと言う新しいアイデアを導入し、すれば、カエルの研究をもとにして、人間の皮膚目的物質の皮府透過性を効率的に改善するアプロの老化や皮膚細胞の生成死滅のメカニズムがあきー

らかになり、女性や男性の膚の健康に大きく寄与

して理論体系化し、さらに実用化を通じてその有することができると期待しています。何の役にた用性を実証しようと考えた。研究分野は異なる

つのか一見わからないように思える発生生物学のが、我々のこうした試みは、化粧品素材の分子設-178-

チを試みた。 次に皮膚透過を物理化学を基本と

計および化粧品処方の最適化に対しても大きく貢献するものと思われる。

部位であることを示すことが出来た。この方法を発展させると抗酸化剤投与経路作用部位間の関係（京都大学）

を明らかにすることも可能である。今後、 コ スメ
トロシ ー 研究の分野でも皮Jj筍内フリ ー ラジカル反ー とコスメトロジ
フリーラジカル内海

英雄

応の解析が一贈重要になるものと考えられるが、我々が行っている生体計測ESRによるラジカル計
測が少しでもお役に立てることが出来れば大変幸（平成6年度）g

甚に思う。

今から20数年前に卒業研究で「ピタミンCとヒ（九州大学）

私のコスメトロジ ー 雑感

トラジンから産生されるフリ ー ラシカルの構造解析」を行った。それ以来、今日に至るまで私はフ北島

リ ー ラジカル並びにその測定手段であるESR (電康雄

子スピン共嗚法）と縁の切れない研究を行ってき（平成6年度）〉た。
最近、皮Jg科学の分野においてもフリ ー ラジカ

私がコスメトロジ ー という分野に興味をもった

ルの研究に関心が持たれている。その理由としてのは、1990年第16回日本香粧品学会のシンポジウ

皮府の老化や発癌などに活性酸素の産生やフリ

ムア「角層は生きている」において、シンボジスー

ラジカル反応の先進が関係することが挙げられトとして依頼され時である。そのとき、「角庖のる。事実、コスメトロジ ー の世界でもラシカル反動的形態とフリ ー ズフラクチャ ー 電顕」というタ

応抑制を謳った商品か市販されていると聞く。 とイトルで、美しい皮膚表面を保つには角層の接着ころが、皮府でのラジカル反応の実態に関してはと自然剥離の健全なバランスが重要で、それかど

学問的には不明の点が多い。皮fijのi性かれているのような機序で制御されているかを講演した。こ環境や皮屑の構造は内臓等の他の組織とは非常にれをきっかけ に日本香粧品学会に入会し、翌年にー ランカル反応は特異的も教育講演で「皮I目研究の最近の進歩」ついて企な面があるものと思われる。どのようなランカル業をはじめ各種研究所や大学の研究者と若干の皮種が皮涸のとの部位で産生しているか、抗酸化剤

府科医で構成されている会員に講演をさせていたを含めたラジカル反応カスケ

ドはどのよう に

だき、いよいよコスメトロジ ー に関心を持つようなっているか、あるいは皮阻障害をもたらすラジになったわけである。それまではコスメトロジ 一

カル側の因子は何かなどは未解決の問題である。

の本質は皮府を美しく見せるための「カバ ー 」のESRはフリ ー ラジカルを直接検出できる測定機開発であろうと思っていた。その目的も皮固その異なることからその フリー器である。 我々は十年程前に生体計測ESR-CTシス

ものは正常であろうと、病的であろう、皮府のたテムを開発し、生理現象や病態発現と生体ラジカめに相性のよい化粧品、刺激や抗原性のない化粧

ル反応との関係を研究してきた。コスメトロジ 一品の開発であると、極論的には病的皮固なら病的の関辿では、皮府でのラジカル生成を実際にESR.

状態はそのままでもただそれをカバ ー し、美しくを用いて直接検出し、塗布ないし経口投与、静脈見せることであると考えていた。 多分、一昔前ま内投与した抗酸化剤がランカル生成を顕著に抑制ではそうであったと思うし、現在もそれはコスメすることを見いだした。また、ラジカルの生成部

トロジ ー の一部分であると思う。

位に関してもESR-CTの手法を応用して皮｝蒋の表皮

しかし、ここ数年コスメトロジ ー に目を開いて-179-

みると、例えば、角層の脂質成分を分析し、美しいる。講座の名称に饂っているように、筆者の専い皮膚の角質成分により近くなるように、欠乏し門は遺伝子工学であり、遺伝子工学・タンパク質ている脂質成分（例えばセラミドのような脂質）

工学技術による有用タンパク質の人工構築をめざを補うという、 「カハー」ではなく、皮膚そのもした研究に携わっている。現在は、極限環境に生のの健康状態を維持（スキンケア？）あるいは回育する微生物（極限微生物）の検索を行い、極限復を期待する研究、すなわち、美しい皮倍のメカ微生物が生産するタンパク質の構造と機能の解析

ニズムの解明からアプロ

を通してタンパク質の分子設計のための方策を模ーチするというような方向の研究が主流であることを知った。

索している。本研究を継続することにより、高さらに、表皮角層、表皮ケラチノサイトにおけ温•高アルカリ i生条件下で機能する多糖分解酵索る細胞間接着や細胞骨格とシグナル伝達（私の専が取得できたならば、化粧品原料としてのオリゴ

門分野）、真皮の膠原線維、弾性線維や脈管系、糖の高効率生産への道が拓けるものと期待され神経系といように、コスメトロジ

る。また、これからの化粧品原料の開発にあたっーの中央に皮府

科学が、疾患という面でなく皮r月の分子生物学とては、 エ ネルギ ー 問題や環境に対する影磐も考慮いう面で参画するように要求されていることを知する必要がある。植物由来の天然多糖類を酵素でるようになった。私自身もこのようなコスメトロ

処理するという本研究の方法は、このような観点

シ ー を念頭において皮膚科学にますます貢献てきからも優れているものと考えられる。今後のコスたらと思う。

メトロジ ー 研究における生命理江学の貢献に、乞（岐阜大学）

うご期待。

生命理工学とコスメトロジ 一
中村（東京工業大学）

コスメトロジ ー と皮膚科

聡田中
（平成6年度）§俊宏（平成6年度）g

今世紀後半における生命科学の飛躍的進歩を受け、生物の優れた機能を工学的に利用する学問分

コスメトロジ ー が受け持つ持つ範囲を、化粧品野が進展した。このような状況を背景として、理つまり今あるものをさらに美しく見せるみせる領工学を基盤として生命科学を体系化する新しい学域に限定すれば、美容を目的とする物質、例えば

際分野「生命理工学」が提唱された。筆者が所属

アサをうまく隠すような製品、が主たる研究対象

する生命理工学部は、わが国で初めての学部としになるであろう。しかし最近のスキンケア ー の考て平成2年に東京工業大学に創設され、その後、え方は、例えばサンスクリ ー ンの開発のようにむ

大学院生命理工学研究科も設置されている。生命しろ予防医学の立場に近ずきつつあるように思え

科学の発展のためには広範囲な学問領域の相互作る。事実、外米でフォロ ー している色素性乾皮症

用が必須であり、本学部教官の出身学部も理学·の患者さんにとっては、サンスクリ ー ンの性能は工学・薬学・医学・農学など、多岐にわたってい

将来の悪性腫瘍の発生をどれだけ防げるかのキイる。研究に広範囲なバックグラウンドが要求されとなる。この点から考えると、こんごあるべきコるという点、コスメトロジ

スメトロジ ー の研究領域には皮膚の解剖的、生理ーと相通しるところがあろう。

的構造と機能とは何かを正しく把握し、それらを筆者は生物工学科遺伝子工学講座に席をおいて維持しまたは増進する立場が盛り込まれるかと考-180-

えられる。もちろん化粧品は医薬品と異なること比較すると男性の方が女性より多く汗をかく。しは薬事法で規定されており、健康な人が対象となたがって、男性の方が女性より脳の冷却能力が大ー ン剤の例

きいはずである。しかし、真偽のほどはわからなる分野ではあるが、さきのサンスクリの 様に健康な皮膚を健康であり続けさせるようなし9゜

女性は化粧をする機会が多く、暑熱下での化粧分野、それには健康とはどのような状態をさすのかを正しく理解する生理的研究を含まれるが、にむけて今後のコスメトロジ ー が向かっていくのではないかと思われる。私達皮膚科の医者とコスメが選択的脳冷却の効率を抑制するか否か今回明らかにした。暑熱下では、積極的に熱放散を促進させ、しかも外界からの熱の流入を遮断する成分での接点は、したがって、非常に地味なこ

化粧することが暑熱下の化粧による女性のためのとであるが、皮膚の健康な状態の把握からはじま（金沢大学）

トロジー

るのではないかと考えられる。

賢い選択的脳冷却といえる。

（京都大学）

私のコスメトロジ ー とのつきあい方

選択的脳冷却と化粧学
田

辺

戸倉

実
（平成6年度）〉新樹（平成6年度）S

私は皮旧科医を生業としていますが、その職業

ヒトでも動物でも、脳を含めた核心部の体温かに相応しいコスメトロシ ー の知識と興味を常に吸上昇すると、それを視床下部の温度センサ ー か感

収、維持、発展している者とは言えません。です

受し、末梢からの温度上昇と併せて分析し、熱放からコスメティクスが原因あるいは誘因で発症し散反応として皮膚血管の拡張、発汗、動物ではバた皮膚炎で来院される患者さんに対して、他人のンティングなどを引き起こす。同時に代謝も抑制
され、体温が元のレベルまで戻される。しかし、強い熱 負荷が長く続いたり、負荷としての環境温
度が高すぎると、視床下部なとの体温調節中枢自体に機能障害が生じ、高体温でありながら皮J目血

受け売り的な指導しかしてきませんでした。ある時、顔面の 一 次剌激性の湿疹と思われる患者さんに対して、化粧品はしばらく止めるように言いましたところ、 「女性は化粧なくして、社会的生活
はおくれない」と私の指埠を窟められました。こ管は収縮し、発汗が停止し、悪寒戦慄までもが起の言い回しに魅力を感じた私は、それ以後、同様こる。

の患者さんに対し、逆にこの 表現を用いて指導す

脳の機能を正常に維持できる上限温度は39. 5℃

るようになり、むやみに化粧を中止することは言から40. 5℃といわれる。核心温は同じでない。偶

わないようになりました。このことはコスメトロ

蹄類のガゼルを暑熱下で疾走させて測定した脳温

ジ ー に関して、私が如何にいい加減な皮固科医では駆幹部の体温より3℃以上も低くなる。ヒトであるかということの証拠を提供するだけでなく、も同様に脳温が低くなる（選択的脳冷却）。

コスメティクスをオロジ ー のレベルに昇華するのヒトを含めた高等な類人猿の顔には毛がなく、毛のある部位に比へ汗をよくかく。同じ男性同士
でも、禿げて毛のない頭からは毛のある頭からよりも多くの汗をかくので、それだけ脳冷却の効率が良いはずである。男性と女性で頭の同じ部位をは少なくとも現場においては未だ容易ではないことを表していると思われます。

私の興味ある学

問分野のひとつに光生物学があります。これは、光量子が如何に細胞に影襄を与えるかという純粋科学的な問題から、もっと軟派な紫外線と皮 r月の-181-関わりを扱う分野まで包含する領域です。 一 層臨によって色や香りなどの種々の剌激特性のもつ情床的には、 光皮膚科学と呼ばれる細分野もあり、緒的意味が客観的、 羅的に求められた空間布躍とこの領域への帰属をアイデンティティとして、 私

してビジュアルに表わされれば、 それに基づいたー

マ

消晋者のニ ー ズの開発が期待されます。 又、 展開

は、 光から皮固を守るという使命を負ったサンス

法は、 個人の好みの違いを商品などの選択されたン剤が、 逆に光と結託して皮膚炎を起こす

ものとの関係によって調べようとするときにも使場合があるという裏切り的行為を検証するものでえますので、 消費者のニ ー ズに合った商品の開発

す。 このことは専門家の間ではよく知られたことにも有効なものです。 消費者のニ ー ズの開発、 あですか、 必ずしも学問的に解明されておりませ

るいはニ ー ズに合う商品の開発ということは生活ん。 多少なりとも研究的戦略を持ち合わせいる者を豊かにすることに繋がることでもあると思いまの分野を意欲を持っす。 いずれにせよ、 コスメトロジ ー の1分野としてこれからも研究していきたいと懺悔しておりまての心理学的方法による化粧の心的側面の研究がは生活しているとも言えます。 今回の研究テクリーとして、 このコスメトロシー

私達の生活を豊かにするために今後ますます盛ん（浜松医科大学）

す。

（金沢大学）になればと思っています。

心理学とコスメトロジ一
岡本

化粧研究の不思議な効果

安晴

飛

田

操

（平成6年度）§（平成6年度）§化粧の「人に見せるもの」としての側面に注目

人と人との関係においては、 特に、 それか異性するとき、 みる人に与える印象を心理学的に研究することが必要になってきます。 もちろん、 化粧とのあいだの関係の場合には、 相手の容姿の美しとその化粧をする人自身との関係の心理学的研究さの程度がさまざまな影習をもたらしています。

が豊かな精神生活の探求において重要な役割を担相手が男性の場合にも容姿の美しさの効果はある

うことを忘れているわけではありません。 化粧ののですが、 相手が女性の場合には、 よりいっそう

第1の側面としてまず思い浮かぶことが「人にどその効果は顕著になります。

のような印象を与えるか」という見せる側面だと美しい女性の方かより好まれるというのはもちいうことです。 このための基礎として、 色、 形、ろんなのですが、 たとえ全く同じ内容のレポ ー ト

香りなどがどのような心的効果をもつのかというを提出しても、 美しくない女性よりも美しい女性研究が考えられます。 研究方法はいろいろありまの方が良い成績であると評価されたり、 全く同しすが、 羅的、 客観的にそれらの効果を調べるもの

犯罪を犯したとしてもその罪を軽く評価されることして計量心理学的方法が使えますし、 分析結果とさえあるのです。
何故、 容姿の美しさが対人関係にさまざまな影をピジュアルに表現するものとして多次元尺度法

態を及ぼしているの でしょう？「顔じゃないよ。

などの利用が考えられます。
第4回の研究助成の1つとして採用して頂いた私心だよ。」という言葉は、 本当なのでしょうか ？

の研究はそのような方法の可能性を探るものです

このような問題を解くための多くの手がかりが、が、 展開法に分類される尺度法で（情緒的）意味空「化粧行動」の中にあるはずです。

間を調べようとするものです。 展開法による研究-182-

ただ、 化粧行動の心理についていろいろ考察してみますと、 上述したような、 相手に与えるさま
ざまな影響という意味での対人的効果が化粧に存在するだけでなく、「本当の自分を演出する」とか「自分をいたわる」といった言葉に示されるよ
うに、 自分自身に対する効果、 つまり個人的効果も同時に存在しているようなのです。
このふたつの効果を同時に検討するような研究ができないだろうか、 という問題意識で化粧行動の効果に関する研究に取り組んでみました。 すると、 思いがけずうれしいことに、 研究室のセミの学生や周囲の人たちか、 男女を問わず、 それそれの立場から経験談を話してくたさったり、 いろい
ろなアドバイスをしてくださったりしたのです。
つまり、 多くの人にとって、 それたけ「化粧行動の心理」についての関心が高いのです。 今回の研究で、 多くのことがわかりました。 でも、 明らかにできなかっ たこともまだまだたくさんあります。 今後も、 たくさんの人たちの協力を得ながら、 化粧行動の不思議な効果について検討していければと思っているところです。

（福島大学）

-183-

録

． ．

付

事業報告書（平成7年度）
役

員

研究助成課題一覧

事業報告書（自平成 7年 4月 1 日

至

平成8年3月 31 日）

I. 6年度事業（平成7年度）
昨年に引き続き以下のような事業を計画し、実行しました。
自然科学や社会科学の各分野にわたり、 ひろくかかわりをもつ化粧品を総合的に体系化することを目的として①化粧品学の調査・研究に関して顕著な成績をあげた研究者や機関に対して功労金をもってこれを表彰する。(1件あたり 100 万円）②皮膚の生理機能や老化機描の解明、 美容に役立つ素材の研究等化粧品学に関連した生命科学、 その他の分野の調査・研究に対する助成を行う。
(1件あたり 200 万円及び 100 万円）③化粧品学の調査・研究にたずさわる研究者の海外派遣や招聘に対して資金援助を行う。

(1件あたり 50 万円）

II. 募集及び選考の経過
本年度の各事業につきましては平成7年5月8日より募集を開始し同7年7月 20 日をもって締切りました。

研究助成事業は本年度も一般公募を原則とし全国 180 ケ所の大学· 病院・研究機関等にダイレクトメ ー ルで推服書を送付するほか、 関係学術雑誌にも広告し、 その結果多数の応募をいただきました。 応募者の研究分野が多岐にわたった為、選考委員会の中に3分科会を設け、 それそれにおいて予備選考を行い平成 7年 9 月 20日（水）ルビ ー ホ ールにおいて本選考委員会を開催し受賞候補者を決定し11月 13日に理事長・理事・評議員の諒承を得て受賞者を最終決定しました。
皿 第6回功労賞・研究助成等の結果
以下のとおり合計 18件が決定され、 功労金100万円、研究助成金 2,600 万円、国際交流援助金 50万円が交付されました。
功労表彰（小林孝三郎賞）

1件

成

16件

国際交流援 助

1件

研

究

助

-187-

W 会議等
理事会
第1 回通常理事会
開催日時

平成7年 6 月 15日（木）午後5 時

開催場所

東京都千代田区丸の内1-9-1

理事総数

12名

本人出席

10 名

監

2名

出席

2名

事

ルビ ー ホ ー ル会議室
委任状出席

l 名（賛成）

審議事項
第一号議案

事業報告ならびに収支決算報告について
平成6年度の事業内容が事務局より詳細に説明された。 続いて収支計算、 財産内容などが詳しく説明された。 次に小田倉監事より上記内容が適正適法である旨の監査結果が表明された。 質疑
応答、 審議の後、 本議案は書面表決者を含め、 全員一致の賛同を得、 可決承認された。

第二号議案

選考委員の選任に関する件
事務局より選考委員1名の追加選任が提案された。 理事会は慎重審議の結果、 追加を認め全会一致で宿崎幸一氏を選出した。

報告事項
平成7 年度の研究助成課題の公募について
研究助成事業の方式について、 昨年との相違点を主とした詳細な説明かな
され、 理事会全員でその趣旨を認めた。
その他
研究業績中間報告集第4 号が披露され、 近く研究報告集第 3 号（収載論文 17編）が発刊される予定であることが報告された。
評議員会
第1回通常評議員会
開
催日時・場所は理事会に同じ。
評議員総数

14名

本人出席

9名

委任状出席

4名（黄成）

上記理事会の決議を全員一致で確認した。

-188-

第2回通常理事会

平成7年11 月 13日（月）午後 2時 30分

開催日時

東京都渋谷区渋谷2-12-15

開催場所
理事総数

11名

本人出席

11 名

監

2名

出席

2名

事

日本薬学会館会議室

審議事項
第 一号議案

理事長の選任について
理事長のご逝去に伴い現在空席となっている理事長について、 寄附行為の定めるところに従い、 理事の互選により選出する運びとなった。 互選の結果、 理事、 小林睛次郎氏か理事全員の賛同により理事長に選出された。

第二号議案

第6回表彰・贈呈者の決定について
表彰・贈呈の候補者について、 選考枠、 選考経過などに及ぶ詳細な説明の後、 分野別の応募状況の確詔などを含めた活発な意見が交換された。 なお今回は功労表彰対象者として、 東京慈恵会医科大学名
誉教授、 皮府科医、 土肥淳 一郎氏が提案された。 しかるのち本議案は書面表決者を含め全員 一 致で原案通り可決された。

第三号議案

平成8年度事業計画案及び予算案について配布された資料に基づき、 事業計画、 予算案について新規事業、 金利動向などにもふれた詳細な説明があり、 前年の事業規模を維持、継承した提案がなされた。 原案は書面表決者を含め、 全員一致の賛同を得た。

第四号議案 株式遺贈申し人れを承認する件
事務局より、 故小林孝三郎氏からコ ー セ ー の株式、 305,801 株遺贈の申し出を受けている旨の報告があり、 これを受け入れ、 基本財産とする提案かなされた。 財団事業の維持発展のため、 必要不可決の資産である点が確認され、 原案は書面表決者を含め全員 一 致の賛同
を得た。
報告事項
選考委員長に関する件
現在委員長である井上選考委員が今期を目処に辞任したい旨の申し出かあり、選考委員会において、 互選により次期の委員長に北原選考委員が選任された旨の報告があった。
理事会はこれを確認した。

-189-

第2回通常評議員会
開催日時・場所は理事会に同じ。
評議員総数

14名

本人出席

6名

委任状出席

5名（賛成）

前記理事会の決議を全員一致で確認した。

"·

-190-

臨時理事会
開催日時

平成 8 年2 月 22日（木）午前 11時30 分

開催場所

東京都千代田区大手町1-5-1
大手町ファ ー ストスクエア23階、 宴「銀河」

理事総数

11名

本人出席

8名

監

2名

出席

2名

事

委任状出席

l 名（賛成）

審議事項
第一号議案

評議員選任の件
任期満了に伴い、 配布された資料に基づき、 再任8名、 新任6名の提案があり、 書面表決者を含めた全員が賛同した。 なお、 被選任者は即時、 就任を承諾した。

第二号議案 選考委員の選任について配布された資料に基づき、 退任3名、 留任10名、 新任4名の提案があり、 書面表決者を含めた 全員の賛同を得た。
動議

専務理事の選任について
花輪理事により、 佐藤専務理事からの伝言が披歴された。 任期満了時点で辞任する ので後任を選出して欲しいとの意向であり、 これを受けて花輪理事か専務理事の選任を提案した。 複数の賛同かあり、 正式の議題であると確認された。1真重な審議の結果、 互選により宮澤理事か第4期（平成 8 年 4 月以降）専務理事に選任された。

報告事項
事務局より平成 8 年度の年間スケジュ ー ルが発表され、 通常理事会の日程が確認
された。

-191-

臨時評議員会
開催日時・場所は理事会に同じ。
評議員総数

14名

本人出席

9名

委任状出席

3名（貨成）

審議事項
第一号議案

理事の選任について

第3期任期満了に伴い、 配布された資料に基づき、 再任8名、 新任5名の提案があり、 書面表決者を含めた全員が賛同した。 ついで、 被選任者は即時、 就任を
承諾した。
報告事項
事務局より平成8年度の年間スケジュ ー ルが発表され、 通常評議員会の日程が確
認された。

-192-

選考委員会
分科会I
開催日時

平成7 年9月18日（月）午後 6 時

開催場所

東京都港区虎の門 1-8-7

審議事項

富田屋会議室

素材、物性に関する分野の選考

分科会II
開催日時

平成7年9月8日（金）午後6時

開催場所

東京都千代田区丸の内 1-9-1

審議事項

ルビ ー ホ ー ル会議室

生体作用、 安全性に関する分野の選考

分科会m
開催日時

平成 7 年 9月 14日（木）午後 6時 30分

開催場所

東京都新宿区西新宿2-2-1

審議事項

京王プラサホテル会議室

精神、 文化に関する分野の選考

本選考委員会
開催日時

平成7 年9月20日（水）午後 6 時

開催場所

東京都千代田区丸の内 1-9-1

審議事項

ルビ ー ホ ー ル会議室

各分科会の結果を総合的に判断して助成候補者が決定された。

表彰贈呈式
開催日時

平成7 年11月13日（月）午後 4 時

開催場所

東京都渋谷区渋谷2-12-15 日本薬学会長井記念ホ ー ル
以

-193-

上

第6回

管理番号

K -95-01

研究助成を受けられたかたがた

CK-功労表彰

IA ー一般研究助成A

JB ー 一般研究助成B

H 一 国際交流援助）

研

題

分

代表研究者

究

課

軟西の経皮吸収理論と香粧品への適用

野

皮屑科学

JA-95-01

材料表面 一生体分子間相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

JA-95-02

脂質皮隣モデルを利用した化粧品及ひ水の浸透と安全性に関する基礎的研究

JA-95-03

小分子化学物質によるアトピ ー 1生皮府炎の発症と予防についての基礎研究

免疫薬理学

JA-95-04

ヒト皮膚移植SCIDマウスを用いた新しいコス
メトロジ ー 研究

実験病理学

JA-95-05

化粧皿を通じた古代ヘレニズム世界における化粧文化の研究

装飾文化

JA-95-06

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究

高分子化学

JA-95-07

JA-95-08

高分子化学
生物物理化学
高分子物性

デザイン

東京慈恵会医科大学名巻教授

土

肥

淳 一郎

九州大学工学部助教授

淳

原

束京工業大学丁学部助教授

谷

岡

明

彦

博

式

岐阜薬科大学教授

井

大阪大学医学部教授

村大成

神戸芸術上科大学助教授

服

部

竺
ザ

作

生体材料学

東京医科歯科大学
医用器材研究所助教 授
石 原 一 彦オリコ糖による皮膚の耐乾媒保護の分子メカニズムに関する基礎的研究

生体分子工学

東京工業大学
生命理工学部

接触皮用炎におけるマスト細胞活性化反応の
解析

生化学

-194-

井

上

義

教授

夫

昭和大学薬学部教授

工

藤

郎

管理番号

研

究

課

題

分

JA-95-09

放射線照射あるいは制癌剤投与による脱毛の抑制

JA-95-10

両親媒性分子が構築する超分子の構造と機能性に関する研究

JB-95-01

皮膚表皮細胞におけるリピドハイオファクタ
ーの機能発現機構

野生化学
放射線生物学代表研究者
星薬科大学講師太田節

超分子物性化学 名古屋大学理学部助教授
高分子物性
生化学
分子生物学

ム
-,

栄

東洋子

新渇大学医学部助教授
藤井博

JB-95-02

光学活性化合物合成を目的とする新規不斉触媒 及び新規不斉触媒サイクルの開発研究

JB-95-03

炎症後色素沈着におけるエイコサノイドによるメラノサイト活性化機構の解明

皮盾科学
生化学

井

JB-95-04

細胞内小器官ペルオキシソ ー ム：エ ー テルリ
ン脂質の生合成と醗素ラジカルスカベンジャー
機能及び欠損症

細胞生化学

九州大学理学部教授

分子生物学

藤

化粧品の表示に関する研究 ー ことに警告表現について 一

社会心理学

JB-95-05

有機合成化学

早稲田大学理工学部助教授

田

H--95-01

多成分油性皮Iii浸透促進シズテムの有効性及び作用機構に関する研究
化粧品及びその基礎素材の物性測定法の研究

製剤学

香粧品科学
製剤学

階

木

久

幸

幸

夫

筑波大学社会工学系講師
JI I

肇

子

城西大学薬学部助教授

林

堅

次

Ch1angMai大学薬学部準教授

Pimporn Leelapornpisid

受人貸任者東京 理科大学薬学部
近 藤
保

（敬称略

-195-

雅

京都大学医学部助教授

t:J

JB-95-06子受付順）

平成8年3月31日現在

員

'rし

1ヌ

林證次郎
大

正

味コ ー セ ー 代表取締役社長

磯

邊

律

男

昧博報堂代表取締役会長

宇

美

昭

次

早稲田大学理工学部教授

大

澤

利

昭

東京大学名誉教授正文

高砂香料工業味代表取締役社長

冨士雄

安田信託銀行閥代表取締役会長

菅
佐
高

山

村
佐
西 川
花

輪
藤
澤

隆

郎

慶応義塾大学医学部教授
慶応義塾大学医学部教授
社会福祉法人福利厚生センタ ー 理事長

元日本化粧品工業連合会専務理事
典哉

公認会計士
弁護士

夫

東京理科大学薬学部教授i隆

桂影 雅 榮 幹 晴

泰雄 保 之 久 子 勇 昭 三 夫 彦 徹

芳孝 宏 文宮

野 隈 方 原 藤 々 橋村 呂 部 崎 崎 本 辺

上大 緒 北 近 佐 高 中 野 廣 宮 山 山 渡

員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員
議議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議

評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評

中

武

正節

事事

監 監

小田倉
原
黒 田

芳

二昭 香

長事 事 事 事 事 事 事 事 事 事事鱈

理専 理 理 理 理 理 理 理 理 理

小

学校法人

名城大学理事明治薬科大学教授
東京理科大学名誉教授
東京理科大学薬学部教授
内科医師
帝京大学医学部教授
早稲田大学人間科学部教授
早稲田大学人間科学部教授
束京大学薬学部教授
東京工業大学理学部教授
千葉大学薬学部教授
神奈川大学理学部教授
日本薬剤師会専務理事-196-

研究助成課題 一 覧

素材、 物性に関する分野
管理番号

研

究

課

題

分

野

J 90-03

リン脂質膜の表面修飾と分子集合体としての機能発現に関する研究

界面物理化学J 90-06

ヒアルロン酸で表面を修飾したリポソ ー ムからの内容物の温度による放出制御

薬品物理化学J 90-07

皮膚DDSとしての高分子脂質リポソ ー ムの
基礎研究

高分子合成

J 90-15

皮膚への作用性を有する各種糖脂質の合成

J 9,0-16

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確
保に関する研究J 91-02

生体適合性逆型ベシクルの生成、 安定化と応用に関する研究J 91-05

新しいDDS剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発有機合成化学

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の開発

J 91-08

化粧品素材としての竹節人参並びに甘草の組
織培径による物質生産並びに大戴増殖に関する研究

J 91-10

界面活性剤を含む溶液混合系の相挙動と濡れの挙動に関する研究

J 91-11

超微粒子分散系の構造と物性及ひ自己制御コ
ロイド系の開発

J 91-20

各種界面活性物質によるマクロ及びマイクロ
エマルションの調製並びに物性に関する物理
化学的研究

-197-

筑波大学化学系助教授

澤

邦

夫

東京理科大学薬学部助手

野

公

子

早稲田大学理工学部教授

出

之

宏

千葉大学薬学部助教授

JI I

子

昌

衛生化学

国立衛生試験所
環境衛生化学部長

溶液論横浜国立大学工学部助教授

界面化学
高分子合成
DDS

J 91-06

代表研究者

応用生物化学
生

薬

薬用生物学
界面化学

田

国

枝

明

信

博

東京理科大学
生命科学研究所助教授

片

則

岡

早稲田大学理工学部専任講師

村光太郎

広島大学医学部助教授

神

田

博

史

九州大学理学部助教授

物理化学

荒

高分子物性

京都大学工学部助手

コロイド物性松

応用界面化学

治

誠

殿

本

孝

芳

東京理科大学理工学部講師

阿

部

正

}ゞ
�

管理番号
J 92-01

研 究

課

分

題

ヒトリゾチ ー ムタンパク質を高分泌する酵母
突然変異体を用いた素材生産の効率化研究

野

代表研究者

分子生物学

広島大学理学部助手

遺伝学

鈴

木

古
.JLヽ

J 92-03

化粧品の紫外線照射による光醗化メカニズムの研究

J 92-04

水素添加大豆リン脂質を用いた油性ゲル及び水性ゲルの保湿作用に関する研究

J 92-05

アスパラギン醗プロテア ー ゼ類の蚕白 工 学的
機能改変によるケラチナ ー ゼの開発

蚕白工学

束京大学理学部助手

生化学

井JA-93-05

細胞膜の脂質の物性と機能の基礎的な研究
ー
リン脂質物性のコスメトロジ ー ヘの応用 一

生体物性学
細胞生物
物理学

東北大学理学部教授

JA-93-06

化粧品基本素材金属酸化物の陵性大気汚染物
質との相互作用

物理化学

千葉大学理学部教授

固体界面化学金

JA-93-07

色素化合物の光照射下での反応の解析

物理化学
界面化学
薬剤学

明星大学理工学部教授
日

高

久

夫

昭和薬科大学薬学部講師

藤

大

井

上

木

子

まき子

英

和

古ノL·

史

夫

美

生物物理化学
光化学治療
光増感化学

東京工業大学生 命理 工 学一部教授
大
郎
倉

糖鎖工学
高分子化学

束京工業大学
生命理工 学部助教授
一畑中研
水産大学校講師

JA-93-08

新規な構造を有するヒアルロン酸類似多糖の開発

JB-93-01

ペプチドシナ ー ジストによるビタミンEの抗酸化能の向上 ー ヒト血清アルプミン由来のペ
プチドシナ ー ジストの開発

脂質生化学

JB-93-02

層状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による有機色素のカプセル化

無機材料化学
枯土科学

プ
目

JA-94-01

ハ ー ダ ー 腺の分泌するアルキルジアシルグリ
セロ ー ルの物性解明とその素材としての応用開発

生化学

東京大学医学部教授

脂質生化学

脊

JA-94-02

植物組織培養法を用いたクチナン植物からの橙黄色色素Crocin及び青色色素イリドイド配糖体の生成に関する研究

-198-

周

食品化学

植物細胞工 学

幡

手

....
央
←

雄

早稲田大学理工学部助教授

原
山

義

洋

之

右

東京理科大学総合研究所助教授
良生 田 安 喜

管理番号

研 究

課

題

分

野

代表研究者

JA-94-04

植物培養細胞・組織による化粧品素材としての活性成分の生産と育種に関する研究

生薬学
植物細胞•
組織培養

九州大学薬学部教授

JA-94-07

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸T ー リノレン俄の高等植物における多量生産

植物生理学

九州大学理学部助教授

JA-94-10遠赤外線の水の構造と物性に及ぼす影響及び
遠赤水の保湿効果に関する研究

JB-94-05

弾性線維蛋白質エラスチンの自己組織化集合体の構造、 物性、 機能に関する研究

JB-9'1-06

バイオシグナル分子を固定化した細胞成長促
進ウンパク質ハイプリッド材料の合成

JA-95-01

材料表面 一 生体分子間相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

JA-95-06

生体膜構造をもつ高分子中の水の構造解析と生体反応の解明に関する研究

JA-95-07

オリゴ糖による皮I酋の耐乾燥保護の分子メカニズムに関する基礎的研究

JA--95-10

両親媒性分子が構築する超分子の構造と機能性に関する研究

JB-95-02

光学活性化合物合成を目的とする新規不斉触媒及び新規不斉触媒サイクルの開発研究-199-

植物細胞工学
物理化学

正

射

山

征

場

厚

静岡県立大学薬学部助教授

山（薬学・医学系）

片

物理化学

九州大学理学部助手

生体物性学

誠

甲斐原

梢

生体材料化学

京都大学工学部助手

高分子化学

伊

，

高分子化学
高分子化学
生体材料学
生体分子工学洋藤'/J·;•.,o�.

茫口

九州大学工学部助教授
尚原淳

東京医科歯科大学
医用器材研究所助教授

石

原

彦

束京工業大学
生命理工学部教授
井 上 義 夫

超分子物性化学 名古屋大学理学部助教授
高分子物性
有機合成化学

A
----,

栄

東洋子

早稲田大学理工学部
助教授

田

雅

久

研究助成課題 一 覧

生体作用、 安全性に関する分野
管理番号
J 90-01

J 90-02

J 90-05

J 90-08

研

究

課

題

分

染毛剤成分の代謝に関する研究

1

薬物代謝

ドレイズ試験代替法の開発 ー ヒト細胞、 昆虫細胞を用いた高感度迅速試験法の開発研究 一
胆汁酸生合成のメカニズムに関する研究

皮眉の老化に伴うエラスチン遺伝子発現の動

熊
�
-J.'

J 90-09

Werner症候群患者皮府由来培養線維芽細胞のサイトカイン細胞成長因子に対する応答性

J 90-10

光化学反応によるフリ ー ラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影聡J 90-11

代表研究者

野

色素性皮府病変に対するレ ー サ ー 療法の研究

組織培捉学

生物有機化学

皮I目科学

皮Jij科学食品薬品安全センタ ー
秦野研究所

中

尾

美津男

I 理化学研究所副主任研究員

野

バI北
土ヽ

夫

東京工業大学理学部助教授

本

善

徊

ヽ じ＾

慶應義塾大学医学部講師

多

島

新

横浜市立大学医学部助手

佐々木

哲

雄

医科学

束京大学医科学研究所教授

生化学

金ケ崎

皮Ii月科学J 90-12

表皮糖脂質の生化学的、 形態学的並びに臨床的研究（エビデルモシド）

J 90-13

生体の酸化的障害に対する防御機構の生化学的研究ービタミンEの活性発現機構の解析 —生化学

J 90-14

皮膚生理機能賦活物質の経皮吸収に対する評
価解析理論の確立

薬剤学

191-01

培養表皮細胞及ぴ線維芽細胞におけるグリコサミノグリカン及ぴコラ ー ゲンの代謝生化学

J 91-03

活性酸素、 フリ ー ラジカルによる生体膜障害の防止に関する研究

有機生化学

-200-

t

皮沼科学
生化学

士

朗

帝京大学医学部助教授

辺晋

山口労災病院皮｝蘭科部長

浜

中

すみ子

東京大学薬学部助手

新

井

洋

由

京都大学薬学部教授

崎仁

東京薬科大学教授

協林木

束京大学先端科学技術
研究センタ ー 教授

二

木

鋭

雄

管理番号

研

究

課

題

分

野

J 91-04

バッチテスト結果のコンピュ ー タ ー 処理シス
テムの開発

J 91-07

皮岡過敏症に対するマスト細胞の役割
ーマスト細胞欠損動物を用いた 検定法の開発 一

実験病理学

J 91-09

マウス悪性黒色腫を用いたチロンナ ー セ抑制
因子の精製と応用

皮膚科学

J91-12
J91-14

接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品
による光アレルギ ー のスクリ ー ニング及びサンスクリ ー ンの効果の評価
メラニン生合成の誤］節

皮盾科学
接触皮府炎

早

JI I

律

j七

幸

村

孝 一郎

山

滝

J91-17

人工皮膚を用いた皮J自の形成機構及び皮屑の反応性試験に関する研究

細胞生物学

J91-18

サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

皮Ji科学

J 91-19

ダイレクトスキンセンサー を用いて測定した
皮溝と加齢の関係

老年病学

J91-22

フリ ー ラシカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の老化機構解明に関する研究

環境科学

J 92-02

光熱変換分光法による薬物の組織及び細胞ヘの非侵襲吸収計i)llj法の開発

J 92-06

神経ペプチドによる皮屑炎症反応の成立機序とその特異的制御

動脈硬化

毒性学
分析化学

,-g.:
�

北里大学医学部講師

皮陪免疫

分子細胞
生物学
医化学

子

大阪大学医学部教授

浜松医科大学教授

分子生物学、-201-

名古屋大学医学部
附属病院分院皮Jtif科長

光生物学

ヒタミンCと上皮成長因子によるヒト皮膚線
維芽細胞の増殖とコラ ー ゲン代謝閥節機構の分子細胞生物学的研究

J91-16

代表研究者

JI I

雅

茫
ロ

東北大学医学部教授

柴

茂

原

樹

東京医科歯科大学助手

隆一郎

畑

広島大学理学部教授

吉

里

勝

禾IJ

京都大学医学部講師

JI I

福

実

慶應義塾大学医学部助手

本

間

聡

起

国立公衆衛生院
労働衛生学部室長

市

J 11

勇

束京大学工学部教授

澤

田

嗣 郎

内科学

千葉大学医学部助手

アレルギ ー 学

岩

本

逸

夫

研 究

管理番号
J 92-07

J 92-08

J 92-09

J 92-10J 92·11課

分

題

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

転移因子を用いたアントシアニン色素生合成
遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析
モノクロ ー ナル抗体を用いた紫外線誘発DNA
損傷の定贔とメラニン色素のサンスクリ ー ン
効果の実験的証明
皮用の老化における染色体構造の変化と遺伝
子修復機構に関する研究
アスコルビン酸2 ー グルコシドの生物学的有用性研究 ー 経皮吸収によるピタミンCi舌性発現
の評価一

野

生化学
分子逍伝学
分子生物学
皮膚科学

細胞生理学

免疫薬理学

代表研究者
新潟大学医学部 教授

小

野

輝

夫

東京理科大学基礎工学部教授

飯

田

滋

奈良県立医科大学大学院生

!]ヽ

林

信

彦

理化学研究所主任研究員

岡

文

雄

岡山大学薬学部 教授

山

本

格

JA-93-01

還元型ネオプテリン(NPH-4)の紫外線照射
皮凋障害に対する効果

放射化学
薬理学
生化学

東京理科大学
生命科学 研究所講師
小 島 周 二JA-93-02

化粧品による光老化の抗酸化的制御に関する
細胞生物学的及ぴ生化学的研究

皮屑科学

群馬大学医学部教授

紫外線生物学宮JA-93-03

太陽光紫外線でヒトDNA中に誘発される損傷とその修復に関する研究

放射線生物学

金沢大学薬学部教授

“

細胞生物学

”

いわゆる しみ （肝斑など）の発症機構とその増悪因子に関する研究

皮阻科学

JB-93-04

尋常性座癒の発症機序の解明のための皮屑の保湿機能と脂質代謝に関する研究

皮涸科学JB-93-05

哺乳類皮情細胞のアボト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

JB-93-06

不飽和脂肪酸とその過酸化生成物の皮膚角質層への作用に関する研究

JA-93-09

-202-

糖生物学
発生生物学
生化学
製剤学

地

良

二階堂

樹

修

東北大学医学部講師

田

上山主
弓

新潟大学医学部助教授

本

綾

子

九州大学理学部助教授

野

村

也

大阪薬科大学薬学部助教授

森

本

洋

管理番号

研

究

課

題

分

野

代表研究者

JA-94-03

表皮ケラチノサイト におけるヒト細胞老化因
子の研究

皮膚科学

JA-91-06

皮膚生理機能賦活物質の合理的吸収促進法の開発

薬剤学

JA-94-08

リポソ ー ム封入薬剤の皮Ti�吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用

JA-94-09

表皮細胞の細胞接消と角化制御に関するシグナル伝達

JA-94-11

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロ
ジ ー ヘの応用

逍伝子工学
生化学

束京工業大学
生命理工 学部助教授
中 村寸
聡

JB-94-01

皮膚発現型レチノイン酸受容体のドミナント
ネガティブ・トランスジェニックマウスを用いた皮膚の成熟過程の検討

皮府科学

京都大学医学部助手

逍伝子工学

田

JB-94-02

化粧が高温環境下の発汗反応及び選択的脳冷却機構に及ぼす影智

環境生理学

金沢大学医学部助手

温熱生理学

田

JB-94-03

サンスクリ ー ン剤の光ハプテンとしての性格

本公

京都大学薬学部教授

田充

生体物理化学

九州大学薬学部教授

生体医用化学

内皮膚科学

岐阜大学医学部教授

細胞生物学

北

皮盾科学

JA-95-02

脂質皮消モデルを利用した化粧品及び水の浸透と安全性に関する基礎的研究

JA-95-03

小分子化学物質によるアトピ ー 性皮膚炎の発症と予防についての基礎研究

免疫薬理学

JA-95-04

ヒト皮膚移植SCIDマウスを用いた新しいコス
メトロジ ー 研究

実験病理学

JA-95-08

接触皮府炎におけるマスト細胞活性化反応の
解析

生化学

-203-

大阪大学医学部助教授

生物物理化学
高分子物性

海

島

中

英

康

俊

辺

＾

雄

雄

宏

実

浜松医科大学医学部講師

戸

犀

新

樹

東京工業大学工学部助教授

谷

岡

明

彦

博

式

岐阜薬科大学教授

井

大阪大学医学部教授
村大成

昭和大学薬学部教授

工

藤

郎

管理番号

研

究

課

題

分

野

代表研究者

JA-95-09

放射線照射あるいは制癌剤投与による脱毛の抑制

JB-95-01

皮 r目 表皮細胞におけるリピドバイオファクターの機能発現機構

JB-95-03

炎症後色素沈着におけるエイコサノイドによるメラノサイト活性化機構の解明

皮廂科学
生化学

井

JB-95-04

細胞内小器官ペルオキシソ ー ム・エ ー テルリ
ン脂質の生合成と酸素ラジカルスカベンジャ
ー機能及び欠損症

細胞生化学

九州大学理学部教授

分子生物学

藤

JB-95-06

多成分油性皮膚浸透促進ンステムの有効性及び作用機構に関する研究

-204-

生化学
放射線生物学
生化学
分子生物学

製剤学

品薬科大学講師

太

田

節

子

新潟大学医学部助教授

藤

井

博

京都大学医学部助孝文授

階

木

幸

幸

夫

城西大学薬学部助教授

林

堅

次

研究助成課題 一 覧

精神、 文化に関する分野
管理番号

J 90-04
J 91-13
J 91-15
J 91-21
Js-92-01
Js-92-02
JA-93-04
JB-93-03
JA-94-05

研

究

課

題

分

化粧が意識性に及ぼす効果の研究

野

心理学

香料に関する定量的解析

感覚生理学

アルツハイマ ー 型老年痴呆症者と、 いわゆる”“ぼけ 症状を呈する人々への化粧による情動活性化の研究感情心理学「色白」の嗜好構造に関する一 考察

心理学
色彩心理学
造形心理学

病院看護における化粧に関する研究

高齢者のおしゃれ行動とその評価に関する研究
色彩の心理学的意味空間の研究

臨床心理学

基礎看護学

人間行動科学
計量心理学
認知心理学
行動計量学

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証
的研究

社会心理学

化粧と痴呆老人に関する基礎的研究

脳神経外科学
心理学

JB-94-04

対人魅力の形成にかかわる顔の構造的特徴と化粧行動の影響の研究

社会心理学

JA-95-05

化粧皿を通じた古代ヘレニズム世界における化粧文化の研究

装飾文化

JB-95-05

化粧品の表示に関する研究ーことに警告表現について 一

対人魅力

デザイン
社会心理学

代表研究者
早稲田大学人間科学部教授木北海道大学薬学部教授
匹
木

原

二
臣

同志社大学文学部教授

浜

治世子

早稲田大学
人間総合研究センタ ー

齋

藤

美

穂

埼玉県立衛生短期大学教授

大河原

千鶴子

北海道教育大学
教育 学部助教授
森 立 男
藤
金沢大学文学部助教授

岡

本

安

睛

福島大学教育学部助教授

田操

産業医科大学名替教授

松

岡

成

明

北星学園大学文学部教授

大

坊

郁

夫

神戸芸術工科大学助教授

服

部

等

作

筑波大学社会工学系講師
ロ

-205-

豊

JI I

紫 子

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。
財団i去人
〒104
電話

コスメトロジー研究振興財団
東京都中央区銀座三丁目5番12号
東京03(3564)6731

コスメトロジー研究報告 Vol.4/'96
1996年9月28日発行
編者

宮澤

発行

財団法人

非売品

香， 宮川安正
コスメトロジー 研究振興財団〒104東京都中央区銀座三丁目5番12号
電話 東京03 (3564) 6731
製作

デ ー タ八十二〒104束京都中央区新富一丁目17番8号
電話 東京03 (3551) 3726 (代表）

印刷

宮崎印刷
©1996

不許複製 禁無断転載-207-