炎症性腸疾患発症において自然リンパ球は予防的に作用するか？
─新規マウスモデル作成の試みと今後の展望─

澤新一郎

国立成育医療研究センター免疫科 フェロー
（現 東京大学医学系研究科免疫学 助教）緒

言

リア毒素受容体（DTR）を RORγt プロモーター下流で我々哺乳類の腸管には多種多様な細菌が生着し、宿主発現させる単純なトランスジェニックマウスの作成を試との共生関係を実現している。これら細菌は宿主食物消みていた。しかし、RORγt+ILC 特異性がより高い DTR化、代謝経路の一部を肩代わりするだけでなく、生体防発現を可能にするため、既存の T 細胞特異的 -Cre 発現

御に必要な宿主免疫系の発達に重要な役割を果たしていマウスと組み合わせた新規モデルの作成を試みた。

る。近年、マウス腸管における獲得免疫系が細菌叢依存的に発達する機構が明らかになってきた。炎症性サイ実験方法

トカイン IL-17 を産生するヘルパー T（Th17）細胞や1）ﬂox-DTRGFP-ﬂoxカセットの作成
Polymerase Chain Reaction（PCR） を 用 い、DTR-IgA 産生細胞は腸内細菌依存的に分化し、各々腸内免疫EGFP 融合遺伝子の両端に 26 塩基の回文 loxp 配列を系恒常性維持のために重要な役割を果たしている。
申請者らは Th17 分化に必要な核内受容体、RORγt

もつ DNA フラグメントを作成し、TA クローニング法を発現する非 T 細胞リンパ球群（RORγt ILC）をマウ

により pCR2.1 目的遺伝子をベクターにクローニングすス腸管粘膜固有層内に同定し、その表現型解析を行ってる。

+

きた。RORγt ILC は腸管リンパ組織形成に必要である+2）RORγt-DTRGFP ﬂox/ﬂox shuttle vectorの作成のみならず、IL-22 に誘導される上皮からの抗菌ペプチ
ド発現を介し、病原微生物に対する生体防御に重要な役

RORγt 遺伝子の第一エクソン開始コドンの1kb 上流（BoxA）割を果たす事が知られている。RORγt ILC は新生児期および下 流（BoxB）をクローニングし、Bacterial artiﬁcial

マウスにおいて獲得免疫系が出現するまでの間、主要なChromosome（BAC）遺伝子組換えに必要な SK1.1 Shuttle

IL-17 産生細胞であり、カンジダ感染防御ならびに腸内vector にすでに組み込んだ ﬂox-DTRGFP-ﬂox カセットの 5ʼ 側細菌の生着に重要な役割を担っていると考えられる。

および 3ʼ 側に BoxA、BoxB をライゲーションすることで RORγ+t-DTRGFP ﬂox/ﬂox shuttle vector を作成する。

これまで、筆者および複数の研究グループにおいて生体内における RORγt+ILC の解析が行われてきた。例え

3）RORγt-DTRGFP ﬂox/ﬂox BAC Tgマウスの作成

ば RORγt 欠損マウスは RORγt+ILC およびαβ +T 細胞、RAG2 欠損マウスは各々および T、B 細胞を欠損するこ

上 記 方 法 に よ り 作 成 し た RORγt-DTRGFP ﬂox/ﬂoxとから、RORγt+ILC の機能を解析する上で重要な役割

shuttle vector を用い、RORγ遺伝子を持つ BAC クローを果たしてきた。しかし、RORγt ILC 細胞群特異的なン DNA を in vitro において組換える。このように組み分子が同定されていないことから、RORγt ILC 特異的替えを完成させた RORγt-BAC の DNA をラージスケー欠損マウスおよび除去システムはこれまで存在せず、生ルのプラスミド精製法により濃縮単離し、マウス受精卵理的条件下における RORγt ILC の機能的役割について前核に移入する。このようにして作成されたキメラマウは未解明であった。

スから生殖細胞系列にトランスジーンがトランスミット+++され、特に high copy のトランスジーンを持つマウスラ

本研究課題においては、T 細胞の分化に影響を与えずインを選択する。

RORγt ILC を特異的に欠損するトランスジェニックマ+ウス作成を計画した。当初の研究計画においてはジフテ1

澤新一郎に設計されており、RORγt+ILC 特異的欠損マウスモデ4）Lck-Creマウスとの交配
得 ら れ た RORγt-DTRGFP ﬂox/ﬂox BAC Tg マ ウ ス をルの作出に大きな一歩を歩ことができると考えられる。

ジャクソン研究所より購入した Lck-Cre マウスと交配

本マウスモデル作成におけるボトルネックは（1）Lck-し、abT 細 胞 以 外 の RORγ 陽 性 細 胞（RORγt ILC）

Cre マウスの Cre 組み替え効率、（2）DTRGFP ﬂox/ﬂox ト

特異的に DTREGFP 融合遺伝子を発現するダブルトラ

ランスジーンの発現コピー数、の２点である。前者の問

ンスジェニックマウスを作成する。本マウスはジフテリ

題に関しては Rosa26-YFP リポーターマウスを用いた検

ア毒素依存的に RORγt ILC を生体内から除去可能であ討から Cre 組み替え効率が 90% 以上を超えることを確る。

認しており、大きな問題はない。しかし、２番目の問題+++点に関しては導入遺伝子コピー数が制御不能であり、運結果まかせの要素が否めない。
今回マウス作成を委託したフェ記載した方法に則り、1）−3）の分子生物学的手法を用

ニックスバイオ社は国内で数多くある BACTG マウス作

いて目的とする組み替え BAC 遺伝子のクローニング

成施設の中で高コピー数の BAC TG マウス作出を得意とに成功した。精製した BAC DNA の濃度測定および組しており、目的とするトランスジェニックマウス系統樹換え部位の確認は、本研究助成を購入費用に充当した立に関して大いに期待している。

Biorad 社製のパルスフィールド電気泳動装置を用いて要行った。BAC DNA のマウス前核への移入はフェニックスバイオ株式会社（宇都宮市）に委託し、現在作成キメ

約
本研究は RORγt+ILC 得意的欠失マウスモデル作成をラマウスのスクリーニングを行っている。

試みた。研究遂行期間内において私の異動（成育医療研究センターから東京大学大学院医学系研究科）も重なり、

考察

機器購入を始めとする研究環境整備に予想外に時間を費

生体内、特に腸管粘膜組織には数多くの細胞亜集団がやした。成体マウス腸管に存在する RORγt+ILC の機能存在するが、その分化発生経路は不明な点が多く、特異的解析特に新生児腸内細菌叢構築における役割を解明す的発現遺伝子も同定されていない。私がこれまでの研究

るうえで本マウスは切り札的なツールとなりうるため、において注目してきた RORγt ILC はそのような特異的今後も継続して本マウスの樹立並びに解析を行っていき遺伝子が明らかになっていないリンパ球亜集団の一つでたい。

+

ある。RORγt ILC を特異的に欠損するマウスモデルは+

謝

これまで存在せず、研究進展の大きな障壁となってきた。

辞

今回私は、従来のノックインマウスに比較して作成が容本研究課題に貴重な研究費を贈呈くださった公益財団

易な BAC トランスジェニックマウス技術を基調とし、法人三島海雲記念財団ならびに選考に携わってくださっ

RORγt 陽性かつ Lck 陰性細胞においてのみジフテリアた諸先生に心より御礼申し上げます。また、BACTG毒素受容体を発現する全く新しいトランスジェニックママウス作成に必要な SK1.1 Shuttle ベクターを供与しウスの作成を試みた。立案、ベクターの作成を始め、組てくださったパスツール研究所（フランス・パリ）のみ替え BAC ゲノム DNA の精製に至るコア作業をすべ

Gerard Eberl 博士、本研究課題の遂行にご理解くださって一人で行ったため、計画遂行はやや遅れた。しかし、た成育医療研究センター免疫科の小野寺雅史部長および貴財団より助成を賜った研究費をもとに購入したパルス

東京大学免疫学教室の高柳広教授に御礼申し上げます。

フィールド電気泳動装置を駆使し、最難関工程であるBAC DNA 精製作業を順調に遂行することができ、立案から約１年で目的トランスジェニックマウスの作成が実現可能となった。スクリーニング作業により生殖系列に目的遺伝子を発現するマウスは RORγt 発現細胞において DTR を発現するが、胸腺細胞および末梢 T 細胞（Lck発現細胞）においては DNA リコンビナーゼ Cre 依存的な DNA 組換えが生じ DTR がループアウトされるよう
2