遺伝子改変動物を用いた脂肪酸受容体の皮膚における作用の検討

京都大学大学院薬学研究科ゲノム創薬科学分野

平 澤明

Free fatty acids are not only essential nutritional components but they also function as signaling molecules. By utilizing
the human genome database and G-protein-coupled receptor (GPCR) deorphanizing strategy, we successfully identified
multiple receptors for free fatty acids (FFAs) which have been proposed to play a critical role in various components ofmetabolic regulation.Among the FFA receptors, we previously showed that GPR120, which is expressed in large intestine,
adipose tissue, lung and skin, functions as a receptor for unsaturated long-chain FFAs such as alpha-linolenic acid (a-LA).
We also developed specific antibody against the extracellular domain of GPR120 and GPR40, respectively. We also foundthat GPR120-deficient mice were obese with high-fat diet feeding, suggesting that GPR120 plays an important role in lipid
metabolism. Furthermore, we have been able to use these antibodies to describe for the first time and in detail the expression
and localization of the GPR120 protein in a number of mouse tissues; skin, lung, large intestine and adipose tissue. This antiGPR120 antibody and selective ligand should prove useful for further analysis of the physiological role of fatty acid receptor
GPR120 in skin.

1．緒言

2．実

脂肪酸は、栄養成分として非常に重要であるのみならず、

験動物：GPR120 受容体の生体内での機能解析を目的として、生体内での情報伝達にも重要な役割を果たすことが明らか

GPR120 をノックアウトしたマウスを gene targeting 法となっている。生体内の脂肪酸制御メカニズムとしては、を用いて作製した。

細胞外の脂肪酸を細胞内へ輸送するトランスポーター、細抗体の作製：マウス GPR120 受容体細胞外第 2 ループ内の胞内の脂肪酸結合タンパク質、核内受容体群の研究が従来26 アミノ酸（177- 202 アミノ酸）にあたるペプチドに、から進められてきた。最近、我々を含む複数のグループにキャリアタンパク質としてKeyhole Limpet Hemocyanin

より、7 回膜貫通型受容体の中に、細胞膜表面に発現し脂（KLH）を付加したものを rabbit に免疫し、その血清か肪酸を検知することで生理機能の調節に重要な役割を果たら抗体を精製した。抗体の反応性は ELISA により確認す脂肪酸受容体群（GPR120、GPR40、GPR41、GPR43）の１）した。

存在が明らかにされた（Table 1） 。我々は特に脂肪酸受GPR120 発現細胞の作製：N 末端に FLAG タグを付加し容体 GPR120 に関して、リガンドの発見から、生理機能のたマウス GPR120 受容体（以下 FLAG - mGPR120）の発現2）ベクターを作製し、HEK293 細胞に一過性に発現させた。

解明までを系統的に研究を進めてきた 。また、リガンドが類似する脂肪酸受容体として、GPR40 も見出されたた

抗 GPR120 抗体の評価：FLAG - mGPR120 発現 HEK293 細め、これと比較しつつ、解析を進めている。その過程で胞を用いた、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、フGPR120 が、皮膚組織および毛根の周辺に存在することをローサイトメトリー、及び免疫染色により本抗体の特異性評価を行った。

見出した。皮脂成分は、表皮中の細菌等による代謝により、水解され脂肪酸として存在する成分も多いため十分高い局

組織分布：各組織の RNA について、RT-PCR により、発所濃度になる可能性がある。従って、脂肪酸受容体が生理現解析を行った。また、GPR40、GPR120 特異体抗体的に機能する可能性は十分ありうる。本研究では、皮膚表を 用 い て 免 疫 組 織 染 色 を 行 い、 局 在 を 解 析 し た。

皮および、毛根に発現する脂肪酸受容体 GPR120 の生理機GPR120 mRNA の発現が報告されている肺において抗能の詳細を明らかにし、コスメトロジーにおける新たな役

GPR120 抗体による免疫染色を行うために、GPR120 野割を見出し、貢献することを目的とする。

生型マウス及び GPR120 欠損型マウスから上記各組織の3、4）パラフィン切片を作製し、DAB 染色を行った。肺組織においては、肺サーファクタント分泌細胞であるクララ細胞特異的な抗体である抗 CC10 抗体と抗 GPR120 抗体

Role of free fatty acid receptor GPR120
in skinAkira Hirasawa
Kyoto University Graduate School of
Pharmaceutical Sciences Department of
Genomic Drug Discovery Scienceとの連続切片染色を行った。マウス皮膚組織は表皮、真皮、皮下組織を毛乳頭を含めて切片を作成し、免疫染色により観察を行った。
表現型解析：通常食及び高脂肪食の給餌状態で野生型と遺− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Table 1

Free fatty acid receptors family

伝子欠損マウスの体重の推移を比較した。さらに、白色の組織像については野生型と GPR120 ノックアウトマウス

脂肪組織について、ヘマトキシリン・エオシン染色法及の間に顕著な差は見られなかった。免疫染色により、マウび組織免疫染色法で染色、観察した。

ス肺においては、GPR120 は終末気管支の上皮細胞に発現していることを初めて同定した。さらに、肺サーファクタ

3．結果と考察ント分泌細胞であるクララ細胞特異的な抗体である抗GPR120 は中長鎖遊離脂肪酸をリガンドとする G タンパク質共役型受容体（GPCR）であり、その生理機能は現在CC10 抗体との連続切片免疫染色により、GPR120 はクララ細胞に特異的に発現していることが示された。

判明している腸管からの GLP -1 分泌促進だけでなく、脂また脂肪細胞においては、GPR120 は大半の細胞膜上に質代謝調節など多岐に渡ると推定される。今回我々は強く発現していることを見出した。GPR120 ノックアウト

GPR120 ノックアウトマウスの脂肪組織、肺及び皮膚につマウスおよび野生型の体重を、通常食の給餌時と高脂肪食いて組織レベルおよび細胞レベルで観察し、野生型と比較の給餌時において生後 5 週間から 16 週間までの体重の推移した。

を比較したところ、通常食を給餌している状態では野生型

これまでの研究により、GPR120 の mRNA は大腸、肺おと GPR120 遺伝子欠損マウスの間に有意な差は観察されなよび脂肪細胞に強く発現することが確認されたが、タンパかった。しかし、高脂肪食を給餌して同様に比較したとこ

ク質レベルでの検出、解析はほとんど行われていない。まろ、野生型と比べ、GPR120 遺伝子欠損マウスでは顕著かず、我々は GPR120 受容体に対する抗体を作製し、その特つ有意な体重の増加が認められた。これは、脂肪の蓄積に異性を免疫沈降、ウエスタンブロッティング、フローサイよるものであった。また、脂肪細胞径の増加、マクロファトメトリー、及び免疫染色によって確認した。

ージの浸潤も認められた（Fig. 1B）。

トランスフェクションにより一過性に FLAG-mGPR120

さ ら に、 皮 膚 組 織 に つ い て RT -PCR を 行 い、 皮 膚 にを発現させた HEK293 細胞の可溶画分を抗 GPR120 抗体まGPR120 が発現していることを確認した（Fig. 2A）。免疫染たは抗 FLAG 抗体により免疫沈降、引き続き同抗体によ色により、GPR120 は毛乳頭付近に特異的に発現しているりウエスタンブロッティングを行った。その結果、単量体ことを同定した（Fig. 2 B）。毛乳頭細胞は毛髪の伸長に関と考えられる約 35kDa、二量体と考えられる約 70kDa、及わる細胞であることから、GPR120 は毛髪の伸長に関与しび多量体と考えられるスメアなバンドを検出した。さらに、ている可能性がある。皮膚組織については形態上顕著な差

抗 GPR120 抗体によるフローサイトメトリーおよび免疫細は認められなかった。

胞染色においても、対照細胞と比較し、GPR120 発現細胞4．総で強い蛍光シグナルの検出に成功した。これらの実験によ括り、本抗体は免疫沈降、ウエスタンブロッティング、フロ皮膚において GPR120 が発現していることを RT - PCR にーサイトメトリー、細胞免疫染色に用いることが可能であより確認し、免疫染色によって GPR120 は毛乳頭付近に特ることを確認した 。

異的に発現していることを同定した。毛乳頭細胞は毛髪の4）

GPR120 ノックアウトマウスの皮膚および白色脂肪組織、伸長に関わる細胞であることから、GPR120 は毛髪の伸長肺、腸管について組織レベルで観察し、野生型と比較したにも関与している可能性がある。また最近、脂肪酸受容体上で組織分布を調査した。肺組織を解剖により単離し、組である GPR120 が脂肪センサーとして正常に機能すること織切片を作製した。これらの標本について、ヘマトキシリで、脂質生合成調節を通じて体内のエネルギー代謝のバラン・エオシン染色法で染色した後観察した（Fig. 1A）。肺ンスを保っていることを明らかにした。この成果は Nature 誌− 94 −

遺伝子改変動物を用いた脂肪酸受容体の皮膚における作用の検討

Fig. 1

A Immunohistochemical staining of sections of the ling of GPR120+/+ and GPR120-/- mouse with antibodies ageinst GPR120 and CC10.
B H&E staining of epididymal white adipose tissue from 16-week-old GPR120-/- orwild-type (WT) mice fed a standard diet or 16-week-old mice fed a high-fat diet.

Fig. 2

A RT-PCR により、skin に GPR120 が発現していることを確認した。
B 免疫染色により、GPR120 は毛乳頭付近に特異的に発現していることを同定した。

− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 20125）

and regulation of protein expression of the free fattyに掲載された 。

acid receptor GPR120, Naunyn Schmiedebergs Arch

肺および皮膚では、現在のところ野生型に対して顕著なPharmacol., 379, 427-434, 2009.

変化は観察できていないが、アレルギー感作時などでの検討によって、今後未知の機能が明らかになることが期待さ

５）Ichimura A, Hirasawa A, Poulain-Godefroy O, et al.,れる。今後、ノックアウトマウスを用いた更なる解析と、: Dysfunction of lipid sensor GPR120 leads to obesity

特異的な化合物の開発とを組み合わせることにより、詳細

in both mouse and human, Nature., 483 (7389), 350-354,な生理機能が明らかにされ、特に皮膚における機能を明ら

2012.
６）Gotoh C, Hong Y H, Iga T, et al., : The regulation ofかにできるはずである。

5．謝adipogenesis through GPR120, Biochem Biophys Res

辞Commun., 354, 591-597, 2007.

本研究を実施するにあたり、ご支援いただいた財団法人

７）Suzuki T, Igari S, Hirasawa A, et al., : Identificationof G protein-coupled receptor 120-selective agonists

コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたします。

derived from PPARgamma agonists, J Med Chem., 51,（参考文献）

7640-7644, 2008.

１）Hirasawa A, Hara T, Katsuma S, et al., : Free fatty８）Hara T, Hirasawa A, Sun Q, et al., : Flow cytometry-acid receptors and drug discovery, Biol Pharm Bull.,based binding assay for GPR40 (FFAR1; free fatty acid31, 1847-1851, 2008.

receptor 1), Mol Pharmacol., 75, 85-91, 2009.

２）Hirasawa A, Tsumaya K, Awaji T, et al., : Free fatty９）Hara T, Hirasawa A, Sun Q, et al.,: Novel selectiveacids regulate gut incretin glucagon-like peptide-1

ligands for free fatty acid receptors GPR120 andsecretion through GPR120, Nat Med., 11, 90-94, 2005.

GPR40, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.,380, 247-255, 2009.

３）Hirasawa A, Itsubo C, Sadakane K, et al., : Productionand characterization of a monoclonal antibody against

10）Sun Q, Hirasawa A, Hara T, et al.,: Structure-Activity

GPR40 (FFAR1; free fatty acid receptor 1), Biochem

Relationships of GPR120 Agonists Based on a Docking

Biophys Res Commun., 365, 22-28, 2008.

Simulation, Mol Pharmacol., 78, 804-810, 2010.

４）Miyauchi S, Hirasawa A, Iga T, et al., : Distribution− 96 −