コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナルNrf 2 -AREシグナルを介した HO- 1活性化による酸化ストレス軽減
国立沖縄工業高等専門学校生物資源工学科

平良

淳誠

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) binds to antioxidant response element (ARE) induce antioxidant andphase II detoxification enzymes, such as heme oxigenase-1 (HO-1) and glutathione s-transferase under oxidative stress due
to chemicals and exposed to UV-irradiation. Fucoxanthin (FX) and its gastrointestinal metabolite fucoxanthinol (FXOH) aremarine carotenoid from edible brown algae, such as Undaria pinnatifida, Hijikia fusiformis and Sargassum fulvellum. In thisstudy, the activation of compounds on Nrf2-ARE signaling in RAW 264.7 macrophage cells was examined using reporter
assay. The compounds induced in low concentrations (2.5−10 μM) and the western blot analysis showed to Nrf2 transfer intonuclear, resulted in expression of HO-1 protein due to binding to ARE. Interestingly, apoptotic cells with caspase 3/7 activity
in the presence of the compounds also activated the Nrf2-ARE signaling with HO-1 protein expression, which indicated antiapoptotic activity for cell survival. In addition, the activity of FXOH was higher than that of FX as well as antioxidant action
and anti-inflammatory effects will be bioavailable compound in a biological system.

１．緒

言

皮膚は紫外線や乾燥など、環境ストレスを受けやすい組織である。その環境ストレスの一つに、皮膚内で過剰に生じた活性酸素や窒素ラジカルによる酸化ストレスがある。
皮膚の酸化ストレスは、細胞に障害を与えて生理機能の損失、皮膚組織の構造変化を引き起こし、皮膚のしみ、シワの要因をつくる。従来の研究では、抗酸化剤による酸化ストレス軽減を目的に行われ、植物抽出エキスやその活性成分による活性酸素消去作用を有する抗酸化剤の化粧品への開発が行われてきた 1−4）。生体には酸化ストレスに対する防御機構として、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキン等の抗酸化酵素がある。最近の研究
で、Nrf2-Keap1 制御系による環境応答の制御機構転写因図 1 Fucoxanthin（FX）とその代謝体 fucoxanthinol（FXOH）の化学構造

子 Nrf2 が、酸化ストレスに応答し、抗酸化応答配列（ARE）を介して一群の抗酸化及び薬剤耐性の遺伝子発現を活性化

結果、モズクやワカメなどの褐藻類に含まれる海洋性カする酸化ストレス監視機構として働くことが明らかにな

ロテノイドの Fucoxanthin（FX）とその胃腸管代謝物の5）った 。皮膚においては、UVA による皮膚障害の予防に、

Fucoxanthinol（FXOH）（図 1）7）に Nrf2-ARE シグナルを

Nrf2-Keap1 制御系の応答による Nrf2 が重要な役割を担っ介したヘムオキシゲナーゼ 1（heme oxygenase-1：HO-1）

6）ていることが、明らかとなった 。の活性化作用による酸化ストレス軽減作用を明らかにした。

本研究では、著者がこれまでの研究で食歴のある安全評価物質の FX は化粧品素材として活用されている。本研性の高い植物から見出した抗酸化物質について、Nrf2-究の結果は、今回評価した代謝体 FXOH は FX よりも活性Keap1 制御系を指標に酸化ストレス軽減作用の評価を行が高く作用機序が明確なことから、FXOH または FX とのい、有用な酸化ストレス軽減物質の検索を試みた。その併用による機能性化粧品の開発も期待できることを示唆した。

Marine carotenoid reduces oxidative
stress due to HO- 1 expression throughNrf 2 -ARE signaling
Junsei Taira
Okinawa National College of Technology,
Department of Bioresource Technology

２．実験

2. 1. 細胞培養
RAW264.7 細胞の培養
RAW264.7 細胞は DMEM 培地（10 % 牛胎児血清、500U/ml ペニシリン、500 µg/ml ストレプトマイシン）で、37− 78 −

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE シグナルを介した HO-1 活性化による酸化ストレス軽減

量の Caspase-Glo 3/7 Assay kit 試薬（Promega）を添加し℃の CO2 インキュベータ（5 % CO2）で培養した。て、そのマイクロプレートリーダー（GLOMAX MULTI

2. 2. Nrf2-AREシグナルのレポーターアッセイ

Detection system, Promega）で発光強度を測定した。

RAW264.7 細胞のみ及び試験化合物添加の細胞を、12well のマクロプレート（5×105 cells/ml）で 24 時間培養し2. 6. 統計処理た。試験化合物は最終濃度が 2.5、5、10µM になるように添加した。培養細胞に FuGENE 6 を用いてプラスミド実験データは標準偏差 ±SD で示し、有意差は t- 検定で行った。

pGL4.37［luc2P/ARE/Hygro］をトランスフェクションし3．結た。培養 24 時間後に PBS で 2 回洗浄した細胞を 100 µl のlysis バッファーで可溶化した。この可溶化細胞（50 µl）に果

3. 1. Nrf2-AREシグナルのレポーターアッセイルシフェリン（50µl）を添加して、発光強度をマクロプレ

図 2 に、試験化合物存在下での Nrf2-ARE シグナル活性ートリーダーで測定した。また同試料のタンパク定量は試験の結果を示した。FX と FXOH によるシグナル活性が、BCA 法（Thermo Fisher Scientific, Inc., IL）で行い、タン有意に濃度依存で示された。また、FXOH の活性は FX にパク量当たりの比活性として示した。

比べて高かった。この結果から、両化合物の Nrf2-ARE シグナルによる転写因子 Nrf2 による抗酸化酵素群の発現が2. 3. 細胞毒性試験示唆された。

試験化合物の細胞毒性は MTT 法で測定した。レポー
ターアッセイで調製した培養細胞に、0.05% MTT 試薬を

3. 2. Nrf2-AREシグナル活性化に伴うHO-1タンパク発現

500 µl 添加して、CO2 インキュベータで 3 時間培養した。

図 3 に、化合物による Nrf2-ARE シグナル伝達におけ

培養後に上清を完全に取り除き、50µl の DMSO でミトコる HO-1 タンパク発現の結果を示した。HO-1 タンパクは、ンドリアによる MTT 還元物のホルマザンを抽出して、そFX と FXOH 存在下で顕著な発現を示した（図 3A）。このの UV 吸収波長 540nm と対照波長 655nm の吸光度をマイ

タンパク発現量を図 3B に示した。HO-1 タンパクは化合クロプレートリーダー（model 680XR、BIO-RAD）で測定物の濃度に依存して有意に発現した。これらの結果から、した。細胞生存率は、試験化合未処理の細胞生存 100% に

FX と FXOH は Nrf2-ARE シグナルを活性化させて HO-1対する各試験化合物処理の細胞生存率を算出した。

タンパク発現をすることで、酸化ストレスを軽減させていることが示された。FX と FXOH の HO-1 タンパク発現は、

2. 4. ウェスタンブロット分析

Nrf2-ARE シグナル活性試験の結果と同様に、FXOH の存レポーターアッセイと同様に処理した培養細胞は、PBS在下で高かった。

で洗浄後に lysis バッファーで溶解して遠心（13800g、5min）を 行 い、SDS（ 4 − 12 % SDS-polyacrylamide、Invitrogen）ゲ3. 3. 核内の Nrf2ルを用いて電気泳を行った。泳動後のゲルはニトロセル化合物存在下で、Nrf2-ARE シグナルにおける Nrf2 の核ロース膜（iBlot Gel Transfer Mini, Invitrogen）に転写した（iBlot Gel Transfer Device、Invitrogen）。転写膜はimmunodetection system（Invitrogen） を 用 い て マ ニ ュアル手順により処理した後に、ウサギポリクロナールのHO-1（Santa Cruz Biotechnology, Inc）及 び Nrf2（SantaCruz Biotechnology, Inc）のマウスモノクロナール抗体と、各々反応させて二次抗体処理で検出した各タンパクの質蛍光強度を、Image Quant LAS 4000（GE Healthcare LifeSciences）装置を用いて検出、定量した。

2. 5. カスパーゼ活性試験
カスパーゼ活性は、ルシフェリンをもつ基質 Z-DEVD を添加して ATP 存在下で、室温で反応させる。反応後にルシフェラーゼを添加して活性化カスパーゼ 3/7 で切断された基質から発光する発光強度を測定した。本試験では、レポーターアッセイで調製した培養細胞懸濁液 50µl に、同− 79 −

図 2 FX と FXOH の Nrf2-ARE シグナル活性*control に対する有意差、p<0.01

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

内への移行を調べた。図 3 に、細胞質及び核内の Nrf2 タ

3. 4. 化合物の細胞毒性

ンパク発現とその発現量を示した。細胞質に多く存在する試験濃度における化合物の細胞毒性の結果を図 5 に示

Nrf2 は、シグナル活性に伴い核内に移動していることがした。10 mM の化合物処理で細胞毒性が認められた。また、示された（図 4A）。また、FXOH が FX に比べて核内に移

両化合物とも、細胞毒性を示した濃度においても Nrf2-動した Nrf2 タンパク量も多く（図 4B）、この結果は、Nrf2-ARE シグナルの活性を示した（図 3）。

ARE シグナルにおける活性及び HO-1 タンパク発現の結果とも相関していた。

図 3 Nrf2-ARE シグナル活性化に伴う HO-1 タンパク発現
A：FX と FXOH 存在下での HO-1 タンパク発現
B：A における HO-1 タンパク発現量*control に対する有意差、p<0.05

図 4 FX と FXOH 存在下の転写因子 Nrf2 核内移動
A：FX（10μM）と FXOH（10μM）存在下の転写因子 Nrf2 の核内移動
B：A における Nrf2 の核内タンパク量− 80 −

図 5 Nrf2-ARE シグナルにおける化合物の細胞毒性*control に対する有意差、p<0.01

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE シグナルを介した HO-1 活性化による酸化ストレス軽減

3. 5. カスパーゼ活性

高濃度化合物存在下の Nrf2-ARE シグナル活性試験で、試験濃度における化合物のカスパーゼの 3 と 7 の同時活細胞毒性（細胞死）が示された。FX はアポトーシスを誘導性（caspase 3/7 活性）の結果を、図 6 に示した。化合物にすることが報告されている 8−9）。アポトーシスはデスレよる細胞死を認めた濃度で、アポトーシスに伴う caspase

セプターとミトコンドリアを介するカスパーゼ（プロテア3/7 活性の上昇を認めた。従って、化合物による細胞死はーゼ）の活性化（カスパーゼカスケード）に伴い実行される。

アポトーシスによることが判明した。

本研究ではカスパーゼカスケードの下流にあるカスパー4．考ゼ 3 と 7 の活性を同時に測定した。結果に示されるように、

察

FX とその代謝体 FXOH で細胞死に相関してカスパーゼ活

ワカメやモズクなどの食用の褐藻類に含まれている海洋性が認められ、化合物によるアポトーシス誘導が明確に示性カロテノイドの FX と FXOH は、最近の研究で抗腫瘍活された。一方で、アポトーシスを誘導した濃度においてによる抗酸化活性も、Nrf2-ARE シグナル活性は上昇し、また HO-1 タンパなどの生理作用が明らかにされている。本研究では海洋性クも発現した。HO-1 タンパクには抗アポトーシス活性がカロテノイドの FX と FXOH による Nrf2-ARE シグナルの報告されている 12）。また、Nrf2 は ARE の Bcl-2 遺伝子発活性が示された。この時に転写因子の Nrf2 が核内に移行

現に伴う Bcl-2 タンパクによるアポトーシスの抑制が報告

し、ARE を活性化させて抗酸化酵素群の一つ HO-1 タンパされている 13）。即ち、高濃度の化合物処理はアポトーシクを発現することを示した。HO-1 は HO のアイソフォースを誘導したが、同時に Nrf2 を活性化させることで、抗ムの一つで、ヘムをビリベルジン、一酸化炭素、遊離鉄にアポトーシス作用による細胞生存のリクルートが行われて分解する酵素である。ビリベルジンは、ビリベルジン・リいることが推察される。今後の研究では、化合物によるアダクターゼにより、ビリルビンに分解される。ビリベルジ

ポトーシス誘導と Nrf2 による抗アポトーシス関連分子のンとビリルビンには強力な抗酸化作用があり、酸化ストレ発現を明らかにしていきたい。これまでの先行研究におけスなどによる細胞傷害を抑制する。FX と FXOH は Nrf2-る抗酸化活性と抗炎症作用（未発表）の結果と同様に、代謝ARE シグナルを介して HO-1 を発現させてビリベルジンと物 FXOH の活性が FX に比べて高いことから、FX の生体ビルリビンの抗酸化作用により、酸化ストレスを軽減させにおける活性本体は FXOH であることも示唆された。以ていることが示された。また、ビリベルジンはぺルオキシ上の結果と考察から、海洋性カロテノイド FX と FXOH のラジカルと反応しビルリビンになることで、脂質過酸化反酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE における作用機序を応を抑制している。先行実験では FX と FXOH にはぺルオ

図 7 にまとめた。

性8−9）、抗炎症作用10）、ラジカル消去11）

キシラジカル消去活性も明らかにしたが、Nrf2-ARE シグ

５．総ナル伝達の中でも、脂質過酸化反応を制御していることが括推察される。これらの結果から、FX と FXOH には化合物

本研究では、モズクやワカメなどの海藻に含まれる海のもつ抗酸化作用に加えて、Nrf2-Keap1 制御系の調節に洋性カロテノイドの FX とその代謝物の FXOH が、Nrf2-よる酸化ストレス軽減作用が明らかになった。

ARE シグナル伝達を介し、転写因子 Nrf2 による抗酸化応

図 6 Nrf2-ARE シグナルにおける化合物の caspase 3/7 活性*control に対する有意差、p<0.01

図 7 海洋性カロテノイド FX と代謝体 FXOH の Nrf2-ARE シグ
ナルを介した抗酸化と抗アポトーシス機構− 81 −

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答配列 ARE との結合により抗酸化タンパク HO-1 を発現

2activation in dermal fibroblasts: protective role in

させ、酸化ストレスを軽減させていることを明らかにしUVA-induced apoptosis, J Invest Dermatol, 1 2 4, 8 2 5–た。高濃度の化合物処理は、カスパーゼ 3/7 活性を伴うア

832, 2005.

ポトーシス誘導をしたが、Nrf2-ARE シグナル活性も上昇

７）Sugawara T, Baskaran V, Tsuzuki W, Nagao

した。従って、Nrf2-ARE シグナル活性に伴う HO-1 の発A,: Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed to現による抗アポトーシス活性も示された。また、先行研究

fucoxanthinol during absorption by Caco-2 humanにおける抗酸化活性と抗炎症作用の結果と同様に、代謝物

intestinal cells and mice, J Nutr, 132, 946–951, 2002.

FXOH の活性が FX に比べて高いことから、FX の生体に

８）Hosokawa M, Wanezaki S, Miyaguchi K, Kurihara,H, Kohono H, Kawabata J, Kawabata J, Odashima S,

おける活性本体は FXOH であることも支持された。

Takahashi K,: Apoptosis-inducing effect of fucoxanthin（引用文献）

on human leukemia cell line HL-6 0, Food Scie TechRes, 5, 243-246, 1999.

１）Taira J, Ikemoto T, Yoneya A, Hagi A, Murakami A,Makino, K,: Essential oil phenyl propanoids. Useful as９）Hosokawa M, Kudo M, Maeda H, Kohno H, Tanaka

・OH scavenger? Free Rad Res Commun, 197-204, 1992.

T, Miyashita K,: Fucoxanthin induces apoptosis and２）Taira J, Ikemoto T, Yoneya A, Hagi A, Murakami

enhances the antiproliferative effect of the PPAR

A, Makino, K,: Hydroxyl radical formation by UV-

γ ligand, troglitazone, on colon cancer cells, Biochim

irradiated epidermal cells, J Biochemistry, 17, 693-695,Biophys Acta, 1675, 113–119, 2004.
10）Kim KN, Heo SJ, Yoon WJ, Kang SM, Ahn T-H Y,

1992.
３）Taira J, Ikemoto T, Mimura K, Hagi A, Murakami

Jeon Y-J,: Europ J Pharmacol, Fucoxanthin inhibits theA, Makino K,: Effective inhibition of hydroxyl radicals

inflammatory response by suppressing the activation

by hydroxylated biphenyl compounds. Free Rad Resof NF-κB and MAPKs in lipopolysaccharide-inducedCommun, 71-77, 1993

RAW 264.7 macrophages, 649, 369-375, 2010.

４）Fujita S, Taira J,; Biphenyl compounds are hydroxyl11）Sachindra NM, Sato E, Maeda H, Hosokawa M,

radical scavengers: Their effective inhibition for UV-

Niwano Y, Kohno M, Miyashita K,: Radical scavenging

induced mutation in Salmonella Typhymurium TA102,and singlet oxygen quenching activity of marine

Free Rad Biol Med, 17, 273-277, 1994.

carotenoid fucoxanthin and its metabolites, J Agric
Food Chem, 55, 8516-8522, 2007.

５）Kimura S, Warabi E, Yanagawa T, Ma D, Itoh K,Ishii Y, Kawachi Y, Ishii T,: Essential role of Nrf212）Busserolles J, Megias J, Terencio MC, AlcarazIntin keratinocyte protection from UVA by quercetin,

MJ,: Heme oxygenase-1 inhibits apoptosis in Caco-2Biochemical and Biophy Res Commun, 3 8 7, 1 0 9–1 1 4,cells via activation of Akt pathway, Int J Biochem Cell2009.

Biol, 38, 1510–1517, 2006.

６）Hirota A, Kawachi Y, Itoh K, Nakamura Y, Xu

13）Niture SK, Jaiswal1 AK,: Nrf2 Protein up-regulates

X, Banno T, Takahashi T, Yamamoto M, Otsuka F,:antiapoptotic protein Bcl-2 and prevents cellular

Ultraviolet A irradiation induces NF-E2-related factor

apoptosis, J Biol Chem, 287, 9873-9886, 2012.

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