FFPEサンプルからのRNA抽出
より良い解析を実現するためのサンプルの取り扱いについて

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FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点

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FFPEサンプルから分子生物学用途の核酸を抽出し、実験に用いるための注意事項〇採材サンプルの迅速な固定処理〇ばらつきのないFFPEブロック作製操作〇新鮮なBufferの準備〇適切環境下でのFFPEサンプルの保管〇最適な核酸抽出法の選択〇適切な核酸のQuality評価
FFPEサンプルの大前提は病理診断目的での使用
核酸抽出に特化したFFPEサンプル作製が目的ではない
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Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020

本日のAgenda

FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点

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FFPEサンプルとはFFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) : ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル

採材した組織をホルマリンなどの固定液を用いて固定し、パラフィンに包埋した標本サンプル。
古くから診断・研究のため、病理学的解析を目的とし作製され、長期保管が可能な臨床検体として広く用いられる標本。
薄切
採材 固定操作 包埋操作
組織や臓器など

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FFPEサンプルの分子生物学的実験への応用
核酸抽出法や品質評価技術の向上と、解析アプリケーションの充実により、FFPEサンプルを組織学的目的のみではなく、分子生物学的用途への利用も拡大している。

採材 固定操作 包埋操作
組織や臓器など

LCM(レーザーキャプチャーマイクロダイセクション)

核酸抽出

下流解析

DNA/RNA〇DNA
NGS/SNPs/Methylation〇RNA
発現解析/NGS/microarray

薄切sample

未薄切
Sample core

組織標本サンプルしか存在しない希少疾患などの貴重なサンプルを用いての分子生物学的研究が可能に！！
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FFPEサンプルの分子生物学用途の実際〇どんなFFPEサンプルでも分子生物学的な解析ができるの？
→できません。
組織の種類、サンプル処理方法、保存状態・保存期間によっては核酸を回収することができないサンプルも存在する。

核酸を抽出することができなければ解析を実施することは出来ません。
また核酸を回収できても、解析に用いるための“Quality”に達していない場合もあります。
どこの組織なのか？
どのくらい固定まで時間を要したか？
まずは対象のFFPEサンプルどのような固定処理がされたか？の情報を確認
どんな状態で保存されていたか？
どのくらい保存されていたか？
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FFPEサンプル作製の工程 (Block作製まで)
3時間以内

数時間～数日

数時間

数時間

採材

固定

脱水・脱脂

キシレン処理数時間

パラフィン置換

自動化可能

採材してからFFPEブロックになるまで少なくとも1日以上は時間を要する

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包埋本日のAgenda

FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点
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FFPEサンプルの核酸の収量と質〇収量：DNA/RNAともに新鮮組織から抽出した際の半分程度の収量※FFPEサンプルの状態に大きく依存します。

※吸光光度計(NanoDrop)で測定した場合、総核酸の量になります。
DNAもしくはRNAの正確な収量の測定には蛍光光度計が推奨(Qubit)。

〇質：DNA/RNAともに断片化が進んでいます。
※RNAは80-100nt程度
DNAは200bp前後をピークとし、数bp～数Kbpの幅広いサイズレンジが回収

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FFPEサンプル由来RNAのQuality〇Sample : Lung cancer(RNA quality : RIN9.5/purification of fresh sample )〇Fresh Frozen：7µm Cryo section〇FFPE：7µm section(Fixation : no)(Fixation : 24hr / Neutral Buffered Formalin

Extraction with MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit

Automation Embedding : 8hr)
Extraction with MagMAX FFPE DNA/RNA Ultra Kit

Frozen Block

7µm section
RNA抽出

Fixation
7µm section

RNA抽出

RNA抽出

(RIN:9.5)
FFPE Block11

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NanoDrop/Qubitを用いた量的評価
Fresh frozen

FFPE

Fresh Frozenサンプル < FFPE sample→Fresh FrozenサンプルはRNaseが残存しており、抽出時に活性化した可能性が考えられる
FFPEサンプルでは固定処理でRNaseが不活性化する為、RNaseによる分解は抑制される

FFPEサンプルの核酸は断片化がされていても大きな量的変化はないのが特徴
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Bioanalyzerによる質的評価
新鮮凍結由来FFPEサンプル由来

rRNA 18S
rRNA 28SSize
RIN 8.7>65% >200nt

RIN 1.8~70% of sample is >200nt

FFPEサンプルのRNAは高度に分解が進んでいる
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Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020※Agilent Bioanalyzer System(Agilent RNA 6000 Pico kit)での評価

まとめ：FFPEサンプルの核酸

・FFPEサンプル由来の核酸は収量への影響は低い。
→同じ重量の新鮮組織から抽出した核酸の半分程度の収量
・ FFPEサンプル由来の核酸は質的に大きく変わっている。
→断片化・分解が進んでいる

新鮮組織を用いたFFPEでも抽出した核酸の質に大きく影響する
サンプルの取り扱いによっては、より高度に質の低下が加速し、分子生物学的用途での使用が難しくなることがある

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本日のAgenda

FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点
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FFPE組織作製にて核酸の質に影響を及ぼす工程

サンプリングまでの時間

固定液保存までの時間

固定時間

抽出・精製
FFPEサンプルの保存

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FFPE組織作製にて核酸の質に影響を及ぼす工程

サンプリングまでの時間

固定液保存までの時間

固定時間

抽出・精製
FFPEサンプルの保存

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ガイドライン記載の固定前プロセスの推奨時間

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RNase（RNA分解酵素）によるRNA分解
RNase Aは1本鎖RNAをピリミジン残基の3‘末側で切断。

Image from https://www.x-mol.net/paper/article/405561

４つのジスルフィド結合による強固な安定性

https://www.jstage.jst.go.jp/article/jcrsj1959/14/1/14_1_1/_pdf/-char/ja

RNaseは組織によって含有量が異なる(脳組織内のRNase活性を１としたときのスケール)
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サンプル固定までのプロセス〇Warm ischemia time (温虚血時間)： 血流停止から摘出までの時間〇Cold ischemia time (冷虚血時間) ：虚血してから4℃保存・固定までの時間
Warm ischemia timesampling
これらの工程ではRNaseの影響を受けることが懸念される(RNaseは固定液中では酵素活性は失活し、低温環境下では酵素活性は低下する)
Fixation

Cold ischemia time

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Warm/Cold ischemia timeによるRNA Qualityへの影響
Warm ischemia timeによる影響

Cold ischemia timeによる影響

採材後、PBSにてWashしてから、液体窒素へのSnap Frozenまでの時間

RIN

麻酔後、採材までの時間

Ischemia time

Ischemia time
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Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020固定時のサンプルサイズとRNA Quality〇Cut: 3mm以下にカットし、固定〇Whole:そのまま固定〇固定時間は一晩〇FFPE組織を作製〇10µm sectionからRNA抽出

WholeサンプルでRIN及び長鎖のPCRでの増幅が悪い

Wholeサンプルでは固定液が浸透する前にRNaseが機能したためRNA qualityが低下したと考える
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固定前処理の最適な時間〇採材後は極力早く固定液につける→RNaseによる分解の影響を極力小さくするため可能であれば３時間以内〇固定液に浸漬する前に十分に適切なサイズにトリミングする→固定液の浸透を早くし、RNaseを素早く不活性化するためホルマリンの浸透速度は1mm/hr → 固定前の十分な入割もしくはトリミング(3mm程度)が必要〇固定前処理の最適解は対象組織によって変わる可能性がある→組織ごとにRNase含有は異なるため
膵臓などのRNase含有が高い臓器についてはより迅速な固定前処理が必要※３時間以内の固定前処理は免疫組織解析でも影響が少ないとされている H scoreによる評価
Estrogen receptor

固定までの時間23

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Progesterone receptor

FFPE組織作製にて核酸の質に影響を及ぼす工程

サンプリングまでの時間

固定液保存までの時間

固定時間

抽出・精製
FFPEサンプルの保存

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固定操作によるクロスリンク
FFPEサンプルは固定操作による安定した組織構造を維持している。
一方で、固定組織内の核酸は特殊な状態で存在している。

固定済みサンプルの核酸はタンパク質と架橋された状態で存在！

核酸

未固定サンプル

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固定済みサンプル

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タンパク質

架橋

架橋(クロスリンク)とは？
■組織固定に使用されるホルマリンに代表される固定液はタンパク質－タンパク質を架橋(クロスリンク)し、タンパク質を安定化させる働きを有する
ホルムアルデヒド
OOHCH

HH-CH
H2O

タンパク質- NH2

OH＋

タンパク質

COOHN

R - CH

ホルマリン溶液（メチレングリコール）

NH2nCH2OHNCH

タンパク質

H

ホルマリン溶液（メチレングリコール）

CH2

Schiff-base

H2O＋Methylol
derivative

H2O

Schiff base

タンパク質- H

タンパク質- NHOC N

メチレンブリッジ
(CH2)

RnH

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CH2

Schiff-base

Rnn
Cross-link

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N

H OH

Formalin

OH

タンパク質

タンパク質- NH

H2O

核酸-タンパク間のクロスリンク

固定液によるクロスリンクはタンパク質ー核酸間でも起こる
タンパク質
N

CH2

Schiff-base

タンパク質＋NH

adenine

CH2

H2O

guanineNHcytosine※核酸 – タンパク間のクロスリンク

ChIP (chromatin immune precipitation: クロマチン免疫沈降)で応用されている技術
27Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020固定時間によるRNA質への影響

固定時間が長いほどRNAフラグメント長は短くなる→固定時間が長くなるとRNA抽出までの様々なハンドリング条件を検討
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RNA Qualityが低下

固定時間がRNAの質に影響を与える要因

未固定サンプル

固定済みサンプル
過固定サンプル〇固定時間が長くなるほど”核酸ータンパク質”の架橋箇所が増える→過剰な固定操作による架橋箇所密度の増加は核酸の柔軟性を失し、断片化を促進させる
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Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020固定時間は収量には影響しない

18hr fixation
3month fixation

固定時間はQualityには影響するが、収量には影響しない

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まとめ：FFPEサンプル作製処理による核酸への影響〇サンプリング・固定処理までの時間は核酸の質に影響を及ぼす→RNaseの活性を抑える必要がある〇固定時のサンプルサイズは核酸の質に影響を及ぼす→固定液がサンプル内部に到達するまでの時間を要する〇固定時間は核酸の質に影響を及ぼす→”核酸ータンパク質”間架橋に伴う核酸断片化が進む

FFPEサンプル作製の工程の多くは核酸の質に影響を及ぼすことがある
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FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点
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核酸の質に影響を与える操作の徹底〇採材サンプルの迅速な固定処理〇ばらつきのないFFPEブロック作製操作
固定時間・固定液・包埋にかける時間〇新鮮なBufferの準備
サンプル作製工程はFFPE由来の良質な核酸を得るために最も重要な要素

だが抽出方法も重要
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FFPEサンプルからの核酸抽出
FFPEサンプルは一般的なサンプルとは抽出方法も大きく異なる〇一般的なサンプルからの核酸抽出架橋された状態の核酸は酵素反応を阻害する
nucleic acidsampling
Extraction〇もし同じ方法でFFPEサンプルから核酸を抽出した場合(de-paraffineは実施)

sampling
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FFPE（主にメチレンブリッジが要因)

一般的な抽出方法でFFPEサンプルを処理すると核酸にタンパクが架橋された状態で存在(複雑な構造を取りやすい)de-paraffine

Extraction

Proteinase Kと熱処理による解析可能な核酸の抽出熱処理

Proteinase K

Proteinase K処理で架橋されたタンパク質を分解熱処理によりメチレンブリッジを核酸から外す（メチレンブリッジが外れることで高次構造も解消される）
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精製キットによる抽出工程
キット毎に最適な条件のProteinaseK/熱処理が設定されている
Sectionの厚み

Protease添加量<40µm

4µL (+Digestion buffer 100µL)

40-80µm

4µL (+Digestion buffer 200µL)

50℃15min→80℃15min (extend 2min)
RecoverAll™ Multi-Sample RNA/DNA Isolation Workflow(カラム精製)
製品番号： A26069
Sectionの厚み

Protease添加量<40µm

10µL(+DNase buffer 100µL)>40µm (上限※)10µL(+DNase buffer 200µL)

55℃1hr→90℃1hr※条件は特に設けていないが80µmくらいまでが妥当

MagMAX™ FFPE DNA/RNA Ultra Kit(自動精製装置用：Magnet beads)
製品番号： A31881

製品ごとにProtease濃度の設定は異なる為、処理時間も異なる

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FFPEサンプル抽出での注意点 (FFPE作製工程編)〇固定時間が長い→過固定によりクロスリンク箇所の密度が増加

過固定サンプルを規定量使用した場合、マニュアル通り抽出を実施してもタンパク分解と架橋の加水分解がキット指定のマニュアルでは処理が追い付かない。
結果的に質の低下した核酸が抽出精製されることで、以降のアプリケーションで問題となる可能性が高い
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FFPEサンプル抽出での注意点 (サンプル精製編)〇適切ではないサンプル量→Kit指定のサンプル量以上を使用した場合、収量・質ともに低下する
収量・質が低下する要因〇脱パラ不良→脱パラが不十分だと精製効率が低下する〇Proteinase K処理不良→架橋を外す処理が不十分になり、以降のアプリケーションに支障が生じる〇精製時のCapacity over→Column、磁気ビーズへの核酸吸着に問題が生じ、結果的に収量・質の低下した核酸になる
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FFPEサンプル抽出での注意点(Qualityの正確な評価)
精製した核酸の正確なQuality評価は以降のアプリケーションを進めるための重要な情報

吸光光度計

蛍光光度計

フラグメント解析装置(NanoDrop series)(Qubit series)(Bioanalyzer Agilent社)

目的に合わせて最適な測定法の選択が重要

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測定法の違い

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吸光光度計蛍光光度計

フラグメント解析装置

核酸収量〇260nmでの評価〇核酸(DNA/RNA)を測定〇RNA抽出においてDNAが残存していると過大評価される〇低濃度では測定が難しい〇任意の核酸(RNAなど)の特異的な収量の測定が可能〇低濃度でも測定可能〇RNAの場合、18S/28Sの蛍光値から算出する為正確性に欠ける

核酸Quality〇各波長のスペクトルを表示〇吸光を有する
コンタミネーションの判定可能(例：タンパク質・塩類など)〇分解の評価は出来ない
分解されていてもスペクトルに大きな変化はない

FFPEサンプルの評価〇タンパク質などのコンタミネーションの確認には最適〇収量の評価は過大評価される可能性がある

Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020〇Qualityの評価は難しい〇濃度が少ないFFPEサンプルでも正確に目的とする核酸の収量を測定できる〇核酸分解の指標としてRIN※値での評価が可能(※RNA Integrity Number)〇分解の程度評価については最
適な手法

FFPEサンプルから分子生物学的解析が可能な質の高い核酸の抽出〇採材サンプルの迅速な固定処理〇ばらつきのないFFPEブロック作製操作
固定時間・固定液・包埋にかける時間〇新鮮なBufferの準備〇抽出Kitに沿った抽出方法・Quality評価（サンプル量・キット工程の順守と目的に合わせたQuality評価）

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FFPEサンプルを用いた遺伝子発現解析
・FFPEサンプルとは・FFPEサンプルにおける核酸の特徴
・FFPEサンプル作製処理による核酸への影響
・質の高い核酸を得るためのFFPEサンプル作製での注意点
・FFEPサンプル作製後の注意点
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FFPE組織作製にて核酸の質に影響を及ぼす工程

サンプリングまでの時間

固定液保存までの時間

固定時間

抽出・精製
FFPEサンプルの保存

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核酸の質は保存環境・保存期間にも依存する
室温保管(22℃)では保管期間が長くなるほど抽出したRNAの質は低下する
室温または4℃に保管したFFPEから抽出したRNAを用いてのバイオアナライザーによるRIN値評価

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室温または4℃に保管したFFPEから抽出したRNAを用いてのRT-qPCR(GAPDH)

核酸の量は保存期間にも依存する

2010/2015/2017年に作製したFFPEサンプルが対象
FFPE作製手法は同じ
25℃50%湿度環境にてFFPEブロックを保存

2018年にRNA抽出を実施(保管期間1/3/8年)→保管期間が長いサンプルほど収量が少ない
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FFPE Blockの最適な保管環境〇室温保管でも３年以内であれば核酸に大きな影響はない〇長期保管(3年以上)のサンプルを用いる場合は保管期間による質・収量の低下がある事がある

保管期間・保管条件によって、抽出核酸の収量・質に影響を及ぼす可能性がある。
→解析の際には保管期間・保管条件も考慮する必要がある場合がある
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Proprietary & Confidential | authoremail@thermofisher.com | 21-October-2020

まとめ：FFPEサンプルを用いた分子生物学実験で注意したい事〇採材サンプルの迅速な固定処理（採材後3時間以内が望ましい）〇ばらつきのないFFPEブロック作製操作(固定前サンプルサイズ調整・固定時間の順守)〇新鮮なBufferの準備（新鮮な固定液が望ましい）〇最適な核酸抽出法の選択（FFPEに対応した抽出キットの選択）〇適切な核酸のQuality評価（測定法の違いによるメリット・デメリットを加味しての評価）〇適切環境下でのFFPEサンプルの保管（高温多湿ではない環境、もしくは4℃環境）
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