皮膚アレルギーを制御するω3 由来脂肪酸メディエーターの産生・作用機構の解明
東京大学大学院薬学系研究科

河野望

Allergic diseases such as atopic dermatitis and asthma are becoming very common in developed countries. Allergy isassociated with increased serum IgE levels and mast cell activation. Association of an antigen with IgE on the mast cellsurface causes cross-linking of the high-affinity IgE receptor (FcεRI), leading to exocytosis of granule-associated mediatorsand proteases (degranulation) as well as new synthesis of cytokines and lipid mediators. Therefore, uncovering molecularmechanisms that regulate mast cell activation could provide crucial insights into the pathophysiology of mast cell–associateddiseases. We recently found that omega- 3 fatty acid epoxides are produced in mast cells dependently of PAF-AH (II), anoxidized phospholipid-selective phospholipase A 2 and are critical for proper IgE-mediated mast cell activation. In thisstudy, we demonstrated that PAF-AH (II) preferentially hydrolyzed omega- 3 epoxide–containing phospholipids in mastcell membrane to liberate omega- 3 epoxides. We also identified Cyp 4 a 12 a and Cyp 4 a 12 b as enzymes involved in theepoxidation of omega- 3 fatty acids in mast cells. We further reveled that the omega- 3 epoxides promoted IgE-mediatedactivation of mast cells by downregulating Srcin 1 , a Src-inhibitory protein that counteracts FcεRI signaling. Thus, theCyp 4 a 12 –PAF-AH (II)–omega- 3 epoxide–Srcin 1 axis presents new potential drug targets for allergic diseases.

1. 緒ているという、まったく予想外な現象を捉えた。すなわち、

言

PAF-AH（II）が単なる酸化リン脂質の消去酵素ではなく、アトピー性皮膚炎に代表されるアレルギー疾患は、先進諸国において罹患率が過去 20 年間で 2 ‒ 3 倍に急増してお新規の生理活性酸化脂肪酸の産生酵素であることが示唆された。

り、大きな社会問題となっている。マスト細胞はアレルギ

本研究では、マスト細胞機能を制御するエポキシω3 脂ー反応において中心的な役割を担う免疫細胞であり、免疫肪酸の産生機構、エポキシω3 脂肪酸の作用機構を解明す

グロブリン E（IgE）によって感作されたマスト細胞が抗原ることを目的とした。

刺激を受けると、脱顆粒を引き起こし、ヒスタミン、脂質2. 方メディエーター、サイトカインなどの炎症性物質を放出す

法る。これまでに、抗原刺激を受けたマスト細胞が脱顆粒に骨髄由来マスト細胞は、マウス骨髄細胞を IL3 存在下で至るまでの細胞内シグナル伝達経路は非常によく研究され培養することにより得た。骨髄由来マスト細胞の活性化ているものの、このマスト細胞活性化シグナルを調節するは IgE と抗原（ジニトロフェニル化ヒト血清アルブミン）因子については、未解明の部分が多い。

により刺激後、β ヘキソサミニダーゼの放出を常法に従い私は、これまでに生体膜リン脂質の酸化防御に関する研検出した。骨髄由来マスト細胞における Srcin1 の RNAi。その中で、酸化リン脂質に選択的は Srcin1 に対する shRNA を発現するレトロウイルスをなホスホリパーゼである PAF-AH（II）のノックアウト（KO）感染させることによりおこなった。エポキシω3 脂肪酸おマウスを樹立し、PAF-AH（II）が酸化リン脂質を分解する

よびエポキシ脂肪酸を持つリン脂質の測定には UHPLC-ことにより、過度な酸化ストレスによる組織障害に対すQTRAP4500 を用いた。エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質る防御機構として機能することを示してきた。最近、この分解アッセイは、エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質を含の KO マウスでは、皮膚アレルギー反応が減弱しているこむ培養マスト細胞膜画分にリコンビナント PAF-AH（II）をとを見いだし、さらに PAF-AH（II）はマスト細胞において作用させることによりおこなった。Cyp4a12a/b 二重欠損

EPA や DHA といったω3 脂肪酸がエポキシ化された酸化マウスは Cyp4a12a/b に対する sgRNA と Cas9 mRNA を脂肪酸を選択的に産生し、マスト細胞活性化を正に制御し受精卵にインジェクションすることにより得た。

究に従事してきた1 ‒ 4）

3. 結The mechanisms of production and actionof omega- 3 -derived fatty acid mediators
regulating skin allergy
Nozomu Kono
Graduate School of Pharmaceutical
Science, the University of Tokyo果3. 1 エポキシω3脂肪酸含有リン脂質の測定系の確立
エポキシ脂肪酸を持つリン脂質の高感度な検出・定量系を UHPLC- MS/MS を用いて構築した。その結果、マスト細胞からエポキシω3 脂肪酸を含有するリン脂質分子種を複数検出することに成功した（図 1）。またマスト細胞のリ− 85 −

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図 1 マスト細胞におけるエポキシω3 脂肪酸含有リン脂質の検出（上）エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質（1-palmitoyl-2-17, 18-EpETE PC）を検出する MRM チャネルのイオンクロマトグラム。
（下）* でしめしたピークの MS/MS スペクトル。

ン脂質画分中のエポキシω3 脂肪酸を定量したところ、リン培養マスト細胞のマイクロアレイデータから、マスト細胞脂質中に含まれる全ω3 脂肪酸の 1 % 程度がエポキシω3 脂に発現しておりω3 脂肪酸のエポキシ化に関わる可能性の肪酸であることが明らかとなった。

ある CYP を探索したところ、PAF- AH（II）の組織分布と非常に良く似た分布を示す Cyp4a12a、Cyp4a12b を見出した。

3. 2. PAF-AH（II）によるエポキシω3 脂肪酸含有リ

Cyp4a12a および Cyp4a12b をそれぞれ培養細胞に発現さン脂質の分解せたところ、添加したω3 脂肪酸からエポキシω3 脂肪酸

培養マスト細胞にエポキシω 3 脂肪酸を添加すると、すへの変換が顕著に増加した。Cyp4a12a、Cyp4a12b はアミみやかに膜画分に取り込まれ、エポキシω3 脂肪酸を含有ノ 酸 レ ベ ル で 98% 以 上 の 相 同 性 を 示 し、 ゲ ノ ム 上 でするリン脂質が産生される。このようなエポキシω 3 脂肪酸を100 kb 以内に近接して存在している。そこで、CRISPR /含有するリン脂質に富む脂質膜にリコンビナントPAF-AH（II）

Cas9 法により Cyp4a12a / b の二重欠損マウスを作成したを in vitro で作用させたところ、エポキシω3 脂肪酸を含有すところ、二重欠損マウス由来の培養マスト細胞ではエポキるリン脂質が減少し、遊離エポキシω3 脂肪酸の増加がみ

シω3 脂肪酸の産生の顕著な減少がみられた。

S234Cられた。一方、酵素活性を失った PAF-AH（II）

変異

リコンビナントではそのような活性はみられなかった（図 2）。

3. 4. エポキシω3 脂肪酸によるマスト細胞活性化促進の作用メカニズムの解明3. 3. エポキシω3 脂肪酸を持つリン脂質の産生酵素の同定

シω3 脂肪酸を添加すると、IgE / 抗原刺激時の脱顆粒能がω3 脂肪酸のエポキシ化には複数のシトクローム P450回復する。この作用は IgE / 抗原刺激の直前の添加ではみ（CYP）が関わることが知られており、CYP2 と CYP4 ファられず、添加から 24 時間以上の時間が必要である。この

5）

ミリーの中には脂肪酸を基質とするものが多く存在する 。

ことから、エポキシω3 脂肪酸は遺伝子発現を介してマス

実際、培養マスト細胞に CYP 阻害剤を添加したところ、ト細胞機能を制御していることが示唆された。そこで、脂CYP4 選択的阻害剤 HET0016 を添加したときに、エポキ肪酸をリガンドとする核内受容体であるペルオキシソーム

シω3 脂肪酸を持つリン脂質が顕著に減少した。そこで、増殖因子活性化受容体（peroxisome proliferator-activated

PAF - AH（II）KO マウス由来の培養マスト細胞にエポキ− 86 −

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図 2 PAF -AH（II）によるエポキシω3 脂肪酸含有リン脂質の分解（左）PAF - AH（II）による 17,18 - EpETE の産生。
（ 右 ）*PAF - AH（II） に よ る エ ポ キ シ ω 3 脂 肪 酸 含 有 リ ン 脂 質 の 分 解。
***p<0.001。

図 3 エポキシω3 脂肪酸と PPARγ アンタゴニスト
GW9662 で共通の遺伝子が発現現減少する。

receptor, PPAR）に着目し、PPAR の各種アゴニスト、アいて、まず Cyp4a12a/b によりω3 脂肪酸からエポキシω3ンタゴニストの添加実験をおこなったところ、PAF -AH脂肪酸が生成し、一旦膜リン脂質に取り込まれた後、PAF-（II）KO マウス由来のマスト細胞に PPAR γ のアンタゴニAH（II）により切り出され、生理活性を発揮していると考スト（GW9662）を添加したときに、脱顆粒能が野生型マウえられる。エポキシω3 脂肪酸がなぜ一旦膜リン脂質に取スと同程度まで回復した。次にエポキシω 3 脂肪酸およびり込まれるのかは不明であるが、エポキシω3 脂肪酸の安GW9662 をそれぞれ処理した PAF-AH（II）KO マスト細胞定性向上や代謝回転の重要性が関係しているかもしれない。の遺伝子発現変化を DNA マイクロアレイにより比較した

リポキシゲナーゼの中には遊離脂肪酸のみならず、リン脂質ところ、GW9662 で 1/4 以下に発現が低下した遺伝子群のに結合した脂肪酸も基質にするものも存在することから 7）、ほとんどがエポキシω3 脂肪酸によっても 1/4 以下に発現

Cyp4a12a/b がリン脂質中のω3 脂肪酸を直接エポキシ化低下していることがわかった（図３）。発現低下した遺伝子している可能性もある。の内、Srcin1（Src kinase signaling inhibitor 1）に着目した。

またエポキシω3 脂肪酸は、Srcin1 の遺伝子発現抑制をSrcin1 は Src と Csk（carboxy-terminal src kinase）に結合介してマスト細胞の活性化を促進しているという、エポキする足場タンパク質であり、Csk は Srcin1 を介して Src とシω3 脂肪酸の作用機構の 1 つが明らかとなった。PPARγ結合することにより、Src の C 末端のチロシンをリン酸化のアンタゴニスト GW9662 はエポキシω3 脂肪酸と同様の6）し、Src を不活化する 。Src ファミリーキナーゼである効果を示したが、エポキシω3 脂肪酸は PPAR γ レポータ

Lyn や Fyn はマスト細胞の IgE / 抗原刺激時の活性化に必ーアッセイにおいて、PPAR γ の活性化を抑制できなかっ須であること、Srcin1 は PAF-AH（II）KO マスト細胞で発た。したがって、エポキシω3 脂肪酸は PPAR γ の直接の現上昇しており、エポキシω3 脂肪酸によってそれが抑えアンタゴニストとして働いているのではなく、別の標的分られたことから、Srcin1 がエポキシω3 脂肪酸の作用に関子があることが示唆された。核内受容体のなかには未だリ与する可能性が考えられた。そこで PAF-AH（II）KO マス

ガンドが不明なものが数多く存在しており 8）、それらの中ト細胞において Srcin1 を発現抑制したところ、KO マストにエポキシω3 脂肪酸をリガンドとするものがあるのかも細胞の活性化不全が WT レベルまで回復した（図 4）。

しれない。

4. 考察

5. 総括

エポキシω3 脂肪酸の産生において、PAF-AH（II）と本研究から、エポキシω3 脂肪酸の産生における PAF-Cyp4a12a/b の重要性が明らかとなった。マスト細胞におAH2 の重要性が明らかとなり、エポキシω 3 脂肪酸が酸化− 87 −

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図 4 Srcin1 はエポキシω3 脂肪酸のエフェクターである。
（右）Srcin1 の定量 PCR。（左）Srcin1 発現抑制による PAF-AH（II）KO マスト細胞活性化不全の回復。***p<0.001

Chem. 283（3）:1628-36, 2008.

リン脂質を介して産生されるという、従来のアラキドン酸カスケードとは異なる脂肪酸メディエーターの産生経路の5） Arnold C, Konkel A, Fischer R, Schunck WH.

9）存在が示唆された 。本経路はマスト細胞を賦活化しておCytochrome P4 5 0-dependent metabolism of omega-6

り、本研究の成果は、皮膚アレルギーを制御する新たな方

and omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids.

法論の開発等へ貢献できると期待される。

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