アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する
新規皮膚炎モデルの開発
広島大学原爆放射線医科学研究所

神沼修

Stimulating activity for skin, including that of patients with atopic dermatitis, is one of the most important issues for thedevelopment of cosmetics. I have recently proven that antigen-specific T cells have potential to induce allergic inflammation in various tissues including skin, without assistance of IgE/mast cell-dependent pathway. Here, I aimed to establish anew mouse model of skin inflammation that enable to evaluate the stimulating and protective effects of cosmetics on atopic
patients’ skin. Hairless mice in which antigen-specific T cell receptor (TCR) is expressed on all peripheral T cells is generated by mating BALB/c-background Hr mice with cloned mice that we recently established from mite-specific T cells.
Th1 and Th2 cells were differentiated from splenic CD4+ T cells of ovalbumin (OVA)-specific TCR-transgenic mice by invitro stimulation culture. BALB/c mice were adoptively transferred with the antigen-specific Th1 and Th2 cells, then theback skin was challenged with topical application of OVA solution. In addition to the inflammatory features observed in thehistological specimens, accumulation of eosinophils and antigen-specific Th2 cells, evaluated by the elevation of eosinophil
peroxidase activity and by flow cytometry, respectively, in the skin was induced by antigen challenge, despite the absenceof antigen-specific IgE. Neither antigen-specific Th1 nor naive CD4+ T cells induced eosinophil accumulation, although Th1
cells by themselves migrated into the skin. The accumulation of eosinophils and Th2 cells in the skin was suppressed by administration of dexamethasone and FK506, indicating an essential role for Th2 cells in the eosinophil recruitment. Based on
the rapid development of atopic dermatitis-like pathological features and its responsiveness to therapeutic drugs prescribed,
the usefulness of our skin inflammation model for the evaluation of stimulating and protective effects of cosmetics on theskin of atopic patients was indicated.

1．緒るだけで、皮膚炎を含めたあらゆるアレルギー疾患病態が言発症することを明らかにしてきた 1）。さらに最近、抗原特腐食性を含めた皮膚刺激性は、化粧品を開発する上で最異的 T 細胞由来のクローンマウス樹立に世界で初めて成功も重要な検討項目とされ、さまざまな実験系が実用化されし、そのマウスを用いれば、わずか 3 日という短期間でアている。一方、皮膚のバリア機能が低下したアトピー等のレルギー病態を誘発できることを見いだした 2）。

皮膚炎患者に対する皮膚刺激性の問題も大きいが、現在そそこで本研究は、この新たに樹立した抗原特異的 T 細胞れを的確に評価できる実験系はない。このことから、多くクローンマウスを活用し、化粧品のアトピー患者皮膚に対の化粧品において、アトピー患者等への使用は回避せざるする刺激性や、場合によってはその逆となる保護作用の有を得ない状況となっている。

無ならびに程度を的確に評価できる、迅速かつ安定的に発アトピー患者の皮膚に対する化粧品の影響評価が困難な症する皮膚炎モデルの開発を目指した。その成果を元に、要因として、迅速かつ安定的に発症し、さまざまな化合物健常人だけでなく、化粧品の必要性をより強く感じているの影響評価に資する皮膚炎モデルが樹立されていないこと

アトピー患者達でも安心して利用できる、安全な化粧品のが挙げられる。アトピー性皮膚炎を模した自然発症および開発を後押しするため、本モデルを用いた評価系の普及に抗原誘発動物モデルは多いが、いずれも発症に長期間を要努めてゆきたい。

する上、個体間のバラツキが大きいため、本来影響がない

２．方ことを前提に開発される化粧品類の微細な影響を解析する法

一方、申請者は独自に開発したマウスモデルを用い、ア

2. 1. 抗原特異的TCRを発現するヘアレスマウスの作
出

トピー性皮膚炎発症に重要と考えられてきた IgE ／マスト

クローンマウスのバックグラウンド系統である BALB/c細胞系が活性化されなくても、抗原特異的 T 細胞が存在す由来のヘアレスマウスである Hr と、申請者が独自に開発のに適しているモデルはない。

し、現在維持している８種類の T 細胞クローンマウスのうDevelopment of a new skin inflammation
model useful for the eva luation of
stimulating and protective effects ofcosmetics on the skin of atopic patients
Osamu Kaminuma
Research Institute of Radiation Biologyand Medicine, Hiroshima University

ち 1）、ダニ抗原（Der f）特異的な２種類の T 細胞クローンマウス（Df# 1 , Df# 2）を交配した。尾ゲノムを抽出してPCR を行うことにより、産仔の遺伝子型判定を行った。

2. 2. T細胞依存性皮膚炎病態の解析− 93 −T 細胞クローンマウスおよび卵白アルブミン（OVA）特コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

異的 T 細胞受容体（TCR）遺伝子を導入したトランスジェ前に皮下投与した。

ニックマウスの脾細胞より、磁気細胞分離システムを用い３．結てCD4＋ T細胞を分離した。それをそれぞれ特異抗原および果X 線照射した BALB/c マウス脾臓細胞と共培養することに

Hr マウスと Df# 1 および Df# 2 マウスを交配し、遺伝子より、OVA 特異的 T 細胞を in vitro で樹立した。その際、型判定を行うことにより、ダニ抗原特異的 TCR およびヘTh 1 および Th 2 細胞を分化誘導するために、それぞれアレス遺伝子の双方をヘテロに持つ雌雄マウスが確保でき

IL-12 ＋抗 IL-4 抗体および IL-4 ＋抗 IFN-γ 抗体を培養開た。

始時に添加して 7 - 10 日間培養した。樹立した抗原特異的

また、そのヘアレスクローンマウスの樹立を待つ間、TT 細胞を回収し、5（and 6）-carboxyfluorescein diacetate

細胞依存性皮膚炎病態の解析を進めた。In vitro で樹立しsuccinimidyl ester（CFSE）で染色した後、BALB/c マウス

た抗原特異的 Th 1 および Th 2 細胞を BALB/c マウスに移に尾静脈より移入した。その 24 間後、除毛した背部皮膚入し、その皮膚に抗原チャレンジすると、皮膚組織の肥厚または耳介に抗原溶液を投与した。陰性コントロールとしおよび炎症細胞浸潤を伴う皮膚炎病態を惹起できた（図 1）。て、分化誘導前のナイーブ CD 4＋ T 細胞移入マウス群およナイーブ CD 4＋ T 細胞を移入したコントロール群では、明び非特異的抗原であるウシ血清アルブミン（BSA）投与群

らかな炎症応答はみられなかった。皮膚における好酸球浸を設定した。抗原チャレンジに伴う皮膚炎病態の発症を、潤に伴う EPO 活性の変化を解析した結果、Th 2 細胞を移病理組織学的変化を指標として評価した。また皮膚組織へ入した場合には好酸球が多く浸潤するが、Th 1 細胞移入の 好 酸 球 浸 潤 を、 組 織 ホ モ ジ ネ ー ト 中 の eosinophil

マウスでは著しい好酸球浸潤はみられなかった（図 2 A）。

peroxidase（EPO）
活性を測定することにより評価した。組

一方、移入した T 細胞は、Th 1 および Th 2 細胞移入マウ

織に浸潤した抗原特異的 T 細胞は、フローサイトメーター

スの両者で、抗原チャレンジに伴い皮膚局所への有意な浸で CFSE 陽性細胞を計数することにより解析した。

潤がみられた（図 2 B）。
Th 2 細胞移入モデルにデキサメサゾン（Dex）およびタク

2. 3. T細胞依存性皮膚炎モデルに対する薬剤の効果ロリムス（FK）を投与したところ、いずれも抗原誘発皮膚2 . 2 . で樹立した皮膚炎モデルに対する各種薬剤の効果

好酸球および抗原特異的 T 細胞浸潤を有意に抑制した（図を検討した。ステロイド薬である dexamethasone および3）。アトピー性皮膚炎に対するステロイド薬および免疫免疫抑制薬であるタクロリムス（FK 506）を phosphate-抑制薬の効果が、Th 2 細胞移入モデルで再現できた。

buffered saline（PBS）に懸濁し、抗原チャレンジの 30 分

図１ T細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚炎反応
In vitroで樹立したOVA特異的ナイーブCD 4＋ T、Th1およびTh 2細胞を移入したマウスの背部皮膚にOVAチャレンジした。チャレンジ96時間後に皮膚組織を採取し、H&E染色を行って弱拡大（上段）および強拡大（下段）で鏡検した。スケール；50μm。矢印；
好酸球。

− 94 −

アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する新規皮膚炎モデルの開発

図２

T細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚細胞浸潤反応

OVAおよびBSAチャレンジ24時間後における、皮膚組織のEPO活性（A）および抗原特異的T細胞浸潤（B）解析した。

図3

Th 2細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚炎に対する治療薬の作用

Th 2移入マウスにデキサメサゾン（Dex）およびタクロリムス（FK）を1および10 mg/kg皮下投与し、OVAおよびBSAチャレンジして、皮膚組織のEPO活性（A）および抗原特異的T細胞浸潤（B）解析した。

４．考

モノクローナル抗体が気管支喘息を対象に、また IL- 4 お察

よび IL- 13 の受容体に対する抗体がアトピー性皮膚炎に対

これまで、アトピー性皮膚炎を模した動物モデルとして、NC/Tnd（Nga）マウスの他 3）、OVA 他抗原の反復投与に4）5）6）する治療薬として上市されたことによって、臨床的にも実証された。

7）

等

本研究でも、T 細胞移入マウスにおいて、IgE ／マストの遺伝子導入マウス等が報告されている。しかし、いずれ細胞系の関与がなくても明らかな皮膚炎症状がみられたこも発症に長時間を要する上、症状の不均一性や誘発工程のとは意義深い。その迅速かつ安定的に発症する性状に加え、煩雑性等が問題となり、アトピー患者に対する化粧品を含明確な発症メカニズムならびに治療薬応答性の面からも、めた化学物質の安全性を評価するための標準的な試験系と化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する標準的試験系とすることは難しい。

しての高い有用性が示唆された。

よる惹起モデル 、CASP 1、IL- 18および IL- 33

一方、本研究課題を実施する上で、アトピー性皮膚炎に５．総おける発症機構の理解も重要となる。これまでは、多くの括患者で血中 IgE の上昇が観察され、その IgE が抗原を介し短期間に安定して皮膚炎症状が惹起できるアトピー性皮て架橋されることにより、掻痒等を誘発する主物質である膚炎モデルが樹立できた。ヘアレスクローンマウスを確立

ヒスタミンがマスト細胞から放出されるため、IgE ／マスできれば、より簡便に多くの化合物による影響をスクリー

ト細胞系がその病態形成にも重要であると考えられてきた。

ニング的に評価できるようになることから、アトピー患者

しかし申請者はそのパラダイムに逆行し、各種アレルギー皮膚に対して影響がないものだけでなく、それに対する保疾患発症における共通の責任細胞として、T 細胞が重要な護・治癒作用を有する物質を見いだせる可能性がある。す1）

役割を担うことを示してきた 。その成果は最近、代表的なわち、これまでアトピー患者皮膚に対する悪影響を懸念

な T 細胞サイトカインの IL- 5 およびその受容体に対するして試験することも忌避されていた、多くの化粧品材料を− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ライブラリーとした探索研究を実施することにより、コスdermatitis-like skin lesions in mice. Clin Exp Allergy

メトロジー発の新たな皮膚炎治療薬開発に結びつくことも

37: 151-161, 2007.
5） Asahi K, Mizutani H, Tanaka M et al: Intradermal

期待される。

transfer of caspase-1（CASP1）DNA into mouse（引用文献）

dissects: role of CASP1 in interleukin-1beta associatedskin inflammation and apoptotic cell death. J Dermatol

1） Miura K, Inoue K, Ogura A et al: Role of CD4（+）TSci 21: 49-58, 1999.

Cells in Allergic Airway Diseases: Learning from6） Konishi H, Tsutsui H, Murakami T et al: IL-1 8Murine Models. Int J Mol Sci 21, 2020.
2） Kaminuma O, Katayama K, Inoue K et al: Hyper-contributes to the spontaneous development of atopic

reactive cloned mice generated by direct nuclear

dermatitis-like inflammatory skin lesion independently

transfer of antigen-specific CD4 T cells. EMBO Repof IgE/stat6 under specific pathogen-free conditions.

+Proc Natl Acad Sci U S A 99: 11340-11345, 2002.

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3） M a t s u d a H , W a t a n a b e N , G e b a G P e t a l :7） Imai Y, Yasuda K, Nagai M et al: IL-3 3-Induced

Development of atopic dermatitis-like skin lesion with

Atopic Dermatitis-Like Inflammation in Mice IsIgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol 9:Mediated by Group 2 Innate Lymphoid Cells in461-466, 1997.

Concert with Basophils. J Invest Dermatol 139: 2185-4） Wang G, Savinko T, Wolff H et al: Repeated epicutaneousexposures to ovalbumin progressively induce atopic− 96 −2194. e2183, 2019.