ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発
長岡技術科学大学技術科学イノベーション専攻

大沼清

Safety is one of the most fundamental criteria that cosmetics must fulfill. People, who may become pregnant, areconcerned about the safety of themselves and the fetus. Recently, human pluripotent stem cells have gained attention fordeveloping in vitro tests of teratogenicity and malformation because using animals for testing cosmetics is prohibited now.
However, the effect of toxicity on the whole body (teratogenicity) is not easy to assess because it is difficult to form amacroscopic spatial pattern from human pluripotent stem cells (hPSCs). The cause of the difficulty is that the movement ofmorphogens, which are responsible for the cell-cell interaction and cell differentiation, cannot be controlled by a standard
culture dish. We previously applied unidirectional-microfluidics to control the advection-diffusion of the morphogen andsucceeded in making a macroscopic pattern where the upstream cells differentiated but downstream cells did not. However,
the mechanism is not well understood.
We made an "in vitro organizer formation hypothesis" and tested it. In vivo, the organizer secretes inhibitors of
mesoderm induction signal, which form a concentration gradient of signal, resulting in a macroscopic differentiation pattern.
To test the hypothesis, we measured the signaling inhibitors in the supernatant of the cultured hPSCs. We found that thecells secrete a BMP inhibitor, Noggin, secreted from the organizer. However, the concentration of secreted Noggin is too
low to inhibit BMP action. Thus, we assumed that diffusion on the cell surface is slow because proteoglycans such as
heparan sulfate bind Noggin and BMP. Based on this assumption, experimental results could be explained by the reaction
advection-diffusion model, supporting our hypothesis. Moreover, using a potent teratogen, thalidomide, we found that many
genes, including cardiomyocyte marker ACTC1, were up- and down-regulated, suggesting these genes could be used as
teratogenicity markers.
Our findings may use to develop in vitro tools that help the safety test of cosmetics.

１．緒

近年、マイクロ加工技術によりヒト PS 細胞を制御し、言

全身のパターン形成を模倣する研究が試みられている 2）。

安全性は、化粧品の満たすべき基本条件である。特に、我々もこれまで、ヒト iPS 細胞を無血清培養やマイクロ流妊娠の可能性のある女性にとっては、自身はもちろんのこ路で制御する手法を研究してきた 3 - 5）。そして、一方向性のと、胎児への影響も気になる。したがって、妊娠の可能性

マイクロ流路を用いて、分化途中のヒト iPS 細胞からの分のある女性にも安心して使用してもらうためには、成人に泌タンパクの移動拡散を一方向化し、ヒト iPS 細胞から巨対してだけでなく胎児や胚に対しても、材料となる成分の視的な空間パターンをもって分化させることに成功した 5）。

毒性（催奇形性）
テストが必要となる。ところが近年、動物そして以上の実験から我々は、以下の「in vitro オーガナイ

愛護の点から化粧品の動物実験は禁止されている。そこで、

ザー形成仮説」を考えている（図１）。この仮説ではまず、胎児の体になる部分（胚盤葉上層）に近い性質をもつヒト

上流から BMP を流すと、上流のヒト iPS 細胞が中胚葉にの胚性幹細胞や人工多能性幹（induced pluripotent stem:

分 化 す る。 次 に、 中 胚 葉 の 細 胞 が BMP 阻 害 剤 で あ るiPS）細胞などの多能性幹（pluripotent stem: PS）細胞を用いて胚を模倣し、催奇形性のテストをする方法が注目されている 1）。ところが、ヒト PS 細胞は、空間的な巨視的パターンができにくいという欠点がある。つまり、全身のパターン形成への影響がわからない。その原因は、通常の培養皿を用いては、細胞間の相互作用を担う分泌タンパクなどの移動拡散の制御ができない点にある。
Development of in vitro teratogenicity
test method by imitating macroscopic
pattern of the human embryo
Kiyoshi Ohnuma
Department of Science of Technology
I nnovation , Nagaoka University ofTechnology

図 1 「in vitro オーガナイザー形成仮説」
概念図
細胞が中胚葉分化シグナルの阻害タンパク質を分泌することで、生体内では背腹・頭尾の軸が決定するように、マイクロ流路内でも巨視的パターンが出現する。
この現象を利用することで、マイクロ流路内で胚を模倣する“Embryo-on-a-chip”を構築することが可能となる。

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Noggin、Chordin などの BMP 阻害剤を放出し、オーガナ
イザーとしての役割を担う。最後に、上流より分泌された阻害剤が、下流のヒト iPS 細胞の分化を抑制する。つまり、生体内におけるオーガナイザーによる体軸形成と同様の現象が起きていると考えている。
本研究の目的は、大きく分けて 2 つある。１つ目は、仮説の検証である。細胞からの分泌物の実測と、シミュレー
ションとを行い、「in vitro オーガナイザー形成仮説」を検証する。2 つ目は催奇形性テストの実証である。心筋分化

こ こ で、t は 時 間、DN、DB、 お よ び DBN は そ れ ぞ れ、

実験と、サリドマイド添加を行い、催奇形性の試験に応用

Noggin、BMP 4、および BMP 4 -Noggin 複合体の拡散係可能なことを実証する。

数であり、q は一方向の灌流マイクロチャンバーを使用し２．方たときの流速である。

法

細胞の分化は、細胞表面のBMP4 が曝露された積算値［総2 . 1. 細胞培養

曝露 BMP］（h ng/mL）が閾値を超えた時点で起こると仮定
6）

ヒト iPSC の培養 hPSC 細胞株 201 B 7 は、理研 BRC セ

した。［総曝露 BMP］は、最初（t = 0 s）でゼロとし、BMP 4

ルバンク（HPS 0063、つくば）から、文部科学省のナショ

濃度（ng/m）の時間（h）で積分していき、閾値として定め

ナルバイオリソースプロジェクトを通じて入手した。細胞た 100 h ng/mL BMP 4 を超えたときに、細胞の分化マー

は、Y- 27632（ロック阻害剤、最終濃度 5 µM、036 - 24023、

カータンパク質の発現が変化すると仮定した。培養上清2

フジフィルム和光純薬株式会社）および 2 . 5 µg/cm ラミ

中の Noggin 濃度は、培地の下限（細胞表面の拡散の抑制

ニン断片（iMatrix- 511 - シルク、タカラバイオ株式会社）

構造の上部、y = ymin）から上限（培地表面、y= ymax）の間のを含む維持培地（StemFit AK 02 N、味の素、東京）を用い、Noggin の空間平均した濃度（［N（ymin < y < ymax ）］）として製造元のプロトコルに従って培養した。

計算した。x と y は、それぞれ培養容器の水平方向と垂直方向である 7 , 8）。

2 . 2 . 培養上清のEnzyme-Linked Immunosorbent
Assay（ELISA）

2 . 5 . サリドマイドの添加回収した培養上清（120 µL）は凍結保存した。解凍した培

未 分 化 の hiPSC を 単 一 細 胞 に 分 離 し て 播 種 し た。 未

養上清を、1000 × g で 2 分間遠心分離し、Noggin 測定用の

分化 hiPSC の場合、播種の 1 日後からサリドマイドを添

ELISA キ ッ ト（SEC 130 Hu、Cloud Clone Corp.、 ヒ ュ ー

加し、4 日目に回収した。中胚葉条件では、播種 1 日後

ストン、米国）を製造元のプロトコルに従い測定した。吸に 培 地 を 50 ng/mL ア ク チ ビ ン、3 µM CHIR 99021（R ＆

光度の測定には、マイクロプレートリーダー（モデル 680、

D Systems）、および Y- 27632 を含む hESF 6 培地に交換

Bio-Rad、カリフォルニア）を用いて 450 nm で測定した 7）。

し た（ 図 2 A）。1 日 目 に CHIR 99021 を 除 去 し、3 日 目 に
Y- 27632 を除去し、0 日目に 0 . 1 ％ジメチルスルホキシド

2 . 3 . 免疫染色

（DMSO）で調製したサリドマイドで細胞を処理した。5 日

細胞を 4 ％パラホルムアルデヒド（163 ‒ 20145、和光）で目に細胞を回収した 9）。

固定し、透過処理し、0 . 2 ％ TritonX とおよび 1 ％ウシ血
清アルブミン（BSA）（019 ‒ 27051、和光、大阪、日本）入2 . 6 . RT-qPCR アレイ分析

りのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でブロックした。続いて、採取した細胞から RNA を抽出し、cDNA を合成した細胞をブロッキングバッファーで一次および二次抗体を薄後、RT 2 SYBRGreen ROX qPCR Mastermix（3 3 0 4 0 4、

めてから反応させた（補足表 TS 2）。細胞は、蛍光顕微鏡

Qiagen）の混合物を RT 2 Profiler PCR アレイヒト人工多能（BZ- 8100、キーエンス、大阪）を用いて撮影した。

性幹細胞（PAHS- 092 ZE- 4、Qiagen）に添加し、7900 HT
FastReal-TimePCR（Applied Biosystems、CA、USA）で

2 . 4 . シミュレーション解析した。45 個の hiPSC 遺伝子、16 個の ESC 遺伝子、4

BMP 4 と Noggin は 1 対 1 で反応（BMP+Noggin ⇔ BMP-個の内胚葉遺伝子、6 個の中胚葉遺伝子、9 個の外胚葉（神Noggin）す る こ と で、BMP 4 の 不 活 性 型 で あ る BMP 4 -経幹細胞を含む）遺伝子などを含む 84 個の遺伝子を標的とNoggin 複合体（BMP 4 -Noggin）を生成しつつ、移流拡散

した 9）。

する。BMP、
Noggin、BMP 4 -Noggin の濃度をそれぞれ［B］、［N］、［BN］
で表すと、以下の式となる。

− 110 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

3．結ような結果が得られているが、それでも 14 倍の差がある。

果

BMP 4 と Noggin は 1 対 1 で反応して BMP 4 が不活性化状

3 . 1. 細胞からの分泌物の実測態になる（BMP 4 -Noggin）場合、この Noggin の放出量はBMP 4 の添加により分化誘導した細胞の培養上清に分非常に低く、BMP 4 による分化を抑えることは難しいと泌される Noggin を ELISA を用いて定量した。Noggin を予想される。実際、シミュレーションしてみても、やはり含まない無血清・フィーダーフリー条件下で、BMP 4 添加・分化を抑えるためには、Noggin の放出量が数十倍足りな

42

無添加の状態で、低細胞密度播種条件（1 × 10 cells/cm ）いことが明らかとなった 7）。したがって、われわれが以前と高細胞密度播種条件（5 × 104 cells/cm 2）で hPSC を培養し、に報告したような高細胞密度での分化の抑制や一方向性の1 日ごとに培養上清を回収して測定し、3 日目に免疫染色

マイクロ流路による下流の分化の抑制などの実験結果は 5）、して細胞状態を確認した。BMP 4 は低細胞密度播種条件

単純な BMP と Noggin の単純な反応・拡散を仮定しては説で細胞分化を誘導したが（SSEA- 1 陽性）、高細胞密度播種

明がつかない。

条件で未分化（SOX 2 陽性）のままであった（図 2 AB）。この結果は、細胞が分化阻害剤を分泌しており、高細胞密度ではその分化阻害剤が細胞分化を抑えるのに十分な濃度に5）達したことを示唆している 。

3 . 2 . 静置培養における拡散障壁の影響
分化抑制現象を説明するのに必要な Noggin の分泌量が足りない問題に対処するため、細胞表面で拡散が遅くな

そこで、高細胞密度播種条件のときに上清中へと分泌さる現象に着目した。細胞の表面は、ヘパラン硫酸を含むれた Noggin を ELISA 測定した結果、Noggin の平均濃度

様々な糖タンパク質が密集しており、BMP や Noggin をは BMP 4 の有無にかかわらず 6 つの条件すべての平均値

含む多くのシグナル伝達分子はこれらに結合する 10）。こは 0 . 69 ng/mL であることがわかった（図 2 C）
。6 つの条件の Noggin と HSPB の結合は生理的塩濃度では非常に強いの平均値の間に有意差はなかった（P= 0 . 54 〜 0 . 99、スチが、少しずつ乖離・結合を繰り返すことで、結果として

ューデント t 検定）。したがって、BMP 4 の有無に関係なく、

Noggin がゆっくりと拡散する 11）。ヘパリンを修飾したビ細胞は常に約 0 . 69 ng/mL の Noggin を分泌していたことーズ表面で Noggin の拡散係数は、水中と比較して 1 / 400を示唆している。

（0 . 2 µm/s 2）に低下することが報告されている 11）。更に、

この Noggin の濃度は、予想を大きく下回るものであっ

ヒト PS 細胞の円形コロニーを用いてやはり Noggin によるた。 添 加 し た BMP 4 は 50 ng/mL に 対 し て、0 . 69 ng/mL

分化抑制効果を調べているグループも、現象を説明するたの Noggin しか検出されていないため、濃度差が 70 倍もあめには拡散速度を水中の 1 / 10 に減らすと良いとの報告をる。以前の実験では、BMP 4 の濃度が 10 ng/mL でも同じしている 12）。そこで我々は、「HSPG などの細胞表面の高図 2 上清中の Noggin の ELISA（A）実験の概略図。BMP4 添加（黒）、無添加（白）の条件で、1、2、3 日目に ELISA 用に上清を回収した。
（B）BMP4 添加（左）、無添加（右）で 3日培養した細胞の免疫染色。
：未分化マーカの SOX2（緑）。中胚葉マーカの Brachyury（赤）。各マーカの DAPI（青）。
（C）ELISA の結果。縦軸は上清中の Noggin 濃度。異なる継代の異なる細胞培養から上清を収集した。
（平均± S.E.、n=4）。水平の点線は、全データの平均（0.69ng/
mL）を示している。

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

分子が拡散の抑制構造として働くことで、細胞から分泌さた実験でも検証してみた。私たちは、ヒト PS 細胞をタンれた Noggin は細胞表面付近長く・高濃度でとどまるため、パク質が一方向に輸送される一方向灌流培養チャンバー内

BMP 4 による細胞分化を抑制するとともに培養上清中のでBMP4 とともに培養した結果、上流の数ミリメートル以内

Noggin 濃度が低くなる（図 3 A）」との作業仮説を新たに立の細胞が分化し、下流の分化が阻害することを示した 5）。こてた。

の結果を、拡散の抑制構造を含む反応・移流拡散の仮説でこの仮説を検証するために、2 つの仮定を新たに加え説明できるかを計算した（図 4 AB）。静培養の計算で使用てシミュレーションをした。一つ目の仮定は、Noggin、した 2 つの仮定に加えて、HSPG 内での Noggin の流速もBMP 4、および Noggin-BMP 4 複合体の拡散係数が細胞水の 1 / 400 に減少するという仮定を新たに追加した。こ

表 面 で 1 / 400 に な る と し た。2 つ 目 の 仮 定 は、 前 培 養の仮定については文献がなかったため、拡散と同様減少す（Day- 1）では BMP 4 を含まない培地で細胞を培養したたるとした（ペクレ数が一定）。細胞からの Noggin 分泌速度

め、分化開始時（Day 0）においては、拡散の抑制構造内は、静置培養の結果から 2 × 10 - 4 から 2 × 10 - 3 amol/cell/sには Noggin のみが存在して BMP 4 は存在してないとしとした。

た。この新しい 2 つの仮定を追加して計算をした。横軸

その結果、拡散の抑制構造がない場合は、2 × 10 - 4 amol/

は細胞表面が BMP 4 が曝露された積算値（［総曝露 BMP］

cell/s の Noggin 分泌速度のときはすべての領域が分化した= 100 h ng/mL 以上で細胞が分化する）、縦軸はバリアよりが、5 × 10 - 4、1 × 10 - 3、2 × 10 - 3 amol/cell/s の Noggin 分 泌

上の培地内における Noggin の濃度の平均値（［N（barrier

速度のときは上流の細胞の約 5、2、1 mm が分化した（図thickness<y<ymax）］= 0 . 69 が ELISA 結果）として、計算

4 CD）ため、広範囲の Noggin 分泌速度で実験結果が定性

結果をプロットした（図 3 B）
。未分化・分化の閾値の垂直的に再現できることを示唆している。それに対して、拡散の線（総露出 BMP 4 = 100 h ng/mL）との交点は、バリアがな

抑制構造が 20 µm、40 µm、160 µmと厚くなるにしたがって、いときは約 70 ng/mL だったが、バリアが高くなるに従いNoggin 分泌速度が少し変化するだけで、分化する部分の長低下して、160 µm バリアにおいては ELISA 結果（0 . 69 ng/

さが大きく変化するとともに上流の狭い範囲内に限定されたmL）とほぼ同じ値となった（図 3 B）
。したがって仮説通り、 （図 4 CD）。ヒト胚の大きさが数百µmであり、その中に様々細胞表面の HSPG などにより拡散が制限されれば、分泌さな細胞が分化・配置されることを考えると、この急激な変化

れた Noggin により BMP 4 による分化を抑制できる可能性

はむしろ生体内に近い変化を示していることとなる。

が示唆された。

3 . 3 . 灌流培養における、細胞表面の拡散抑制の効果
前節で仮説を、一方向灌流マイクロチャンバーを使用し3 . 4 . サリドマイドを用いた、心筋分化への影響
サリドマイドは優れた鎮静剤として販売されたが、催奇形性が高いため、1960 年代に使用が中止された 13）。最近、ヒ

図 3 拡散バリアを備えた静的培養のシミュレーション（A）ヘパラン硫酸などのバリア構造の概念図。細胞表面はヘパラン硫酸により覆われており、Noggin、BMP4、および NogginBMP4 の拡散定数は、へパラン硫酸の中では 1/400 に設定した。
（B）縦軸はヘパラン硫酸などのバリア構造の上にある培地内の平均
Noggin 濃度で、水平の点線は ELISA での測定値（0.69ng/mL）を表す。横軸は細胞が 10ng/ mL の BMP4 に 72 時間曝露された積
算値で、垂直の点線は、細胞分化の閾値を示しており、その右側では細胞が分化する。ヘパラン硫酸などの厚さは、0、40、80、160、320µm とした。

− 112 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

図４ 拡散の抑制を使用した一方向灌流培養のシミュレーション（A）HSPG を使用したバリア構造のスキーム。
（B）灌流培養のシミュレーションの概略図。 下部に配置された細胞（y = 0）は培地で覆われている（y> 0）。 媒体は x=0 で流入し、x 方向に流入する。各正方形は 20µm × 20µm。影付きの領域は、拡散と流れが 1/400であった拡散の抑制領域を示している。
（C）上流からの分化した細胞の面積が示されている。縦軸は拡散の抑制の厚さ 0（未適用）、
20、40、160µm。 横軸は分化した細胞の面積。
（D）t=72 時間での総曝露 BMP4。 縦軸は総露出 BMP4。横軸は上流からの距離。

トのサリドマイドの催奇形性をテストするために、多くのグループがヒト PS 細胞を使用している

14）。我々も以前、

FABP 7 発現を強力に阻害することを示唆している。更に、中胚葉分化条件で大きく（4 倍以上）変化した遺伝子として、サリドマイドが未分化のヒト PS 細胞と中胚葉（心筋への分上方制御されたのは EMX 2（empty spiracles homolog 2化の前段階）のアポトーシスを増加させることを示しましをエンコードする。脳の神経分化と細胞増殖、および四肢た 15 , 16）。今回は、RT-qPCR アレイを使用して、ヒト PS 細の形成に関連する）のみだったが、下方制御された遺伝子

胞の多能性幹細胞マーカーと初期分化マーカーを含む 84

は ACTC 1（心筋のアルファアクチン）、FOXD 3（forkhead個の遺伝子の発現を調べ、どの遺伝子発現を目安に催奇形box protein D 3 , ヒト PS 細胞マーカーの一つである転写性を調べると良いかを検討した。

因子）、FGF 4（線維芽細胞成長因子 4、肢芽の発達を含む

その結果、未分化維持条件で大きく（4 倍以上）変化した

発達に関連、ヒト PS 細胞マーカーの一つ）、CDH 1（未分遺伝子として、上方制御されたのは LEFTY 2（初期発生化ヒト PS 細胞の細胞間接着を担う E- カドヘリン発現の関に重要な TGF-β の抑制タンパク質）と SOX 17（初期の内連）、FOXA 2（初期の内胚葉分化マーカ）であった。以上

胚葉分化マーカー）の２つであり（図 5 A）
、下方制御されより、心筋関連の遺伝子で ACTC 1 が大きく下方制御されたのは FABP 7（脂肪酸結合タンパク質ファミリーのメンることが明らかとなった。

バーで、主に脳で発現し、レチノイン酸シグナルに関係し、4．考神経発達に関与する）だった 17 , 18）（図 5 B）。驚いたことに、

察

FABP 7 はサリドマイドによって強く（平均で約 300 倍）

今回の研究開発では、2 つの目標を定めていた。１つ目

下方制御されており、サリドマイドが未分化 hiPSC でのの目標は、細胞からの分泌物の実測と、シミュレーショ

− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 5 サイドマイドによる未分化・分化マーカーの変化
未分化なヒト iPS 細胞（AB）と中胚葉分化した細胞（CD）において、上方制御された遺伝子（BC）および下方制御された遺伝子（BD）。

ンとを行い、「in vitro オーガナイザー形成仮説」を検証すを支持しているといえる。

ることであった。ELISA により分泌物を測定したところ、2 つ目の目標は、催奇形性テストであった。強い催奇形

BMP 4 抑制シグナルとし最も有力な Noggin が検出され性をもつサリドマイドを心筋分化初期（中胚葉分化）に添加た。しかしその濃度は BMP 4 の添加に関係なく 0 . 69 ng/

することで、催奇形性の試験に使えるような大きく発現がmL であり、予想より数十倍低い濃度だった。そこで、細変化する遺伝子を探索した。その結果、心筋分化に関する

胞表面に拡散が遅い層（HSPG などによる結合）があるとの遺伝子として、ACTC 1 が大きく下方制御されることが明仮説の下でシミュレーションした結果、実験結果を説明でらかとなった。今回の報告書には掲載しなかったが、ヒトきることが明らかとなった。BMP 4 阻害分子に関しては、

iPS 細胞から心筋分化をしたところ BMP 4 分化と似た現象

Noggin 以外にも分泌している可能性があるため、それらが観察されている 19 , 20）。心筋の分化には、Wnt シグナルの測定が必要となる。また、HSPG などの細胞表面の拡散の活性化とそれに続く抑制が必要であるが、私たちは細胞が遅い層に関しては、実際にどれだけの厚みがあるかの測が Wnt シグナルの阻害タンパク（DKK 1 , DKK 4 , CER 1）を定とともに、その中でのシグナル分子の拡散係数や移動速分泌していることと、それが心筋分化を促進していること度が必要となる。これらの限界はあるために定量的な結果を明らかにした。今後は、上述のマイクロ流路において心とはいえないが、定性的には胚発生過程において中胚葉分筋分化をし、その過程で ACTC 1 などの発現を指標にすれ化に続いて中胚葉分化シグナルの阻害剤が分泌されるオー

ば、分化初期における催奇形性を調べる良い系となること

ガナイザーが形成されることと同様のことが培養皿内で起が予想される。

こっていること、つまり「in vitro オーガナイザー形成仮説」− 114 −

ヒト胚の巨視的パターンの模倣による in vitro 催奇形性テスト法の開発

５ 総括

本研究では、マイクロ流路とヒト iPS 細胞を利用して胚を模倣して催奇形性のテストをする方法の研究・開発をした。そして、マイクロ流路ないのヒト iPS 細胞のふるまいが「in vitro オーガナイザー形成仮説」で説明できること、
つまり、胚発生における体軸形成と同様の現象が起きていることを明らかにした。また、強い催奇形性をもつサリド
マイドを添加したときに、様々な遺伝子が変化することを明らかにした。胚の状態を模倣し、催奇形性をテストで

図 6 本研究の最終目標
ヒト iPS 細胞由来の各種細胞とマイクロ流路を組み合わせ、催奇形性試験を行うシステムを開発することで、すべての人に安心・安全なコスメトロジーの発展に貢献する。

きるシステム “Embryo-on-a-chip” の実現に一歩近づけた。
本研究を継続し「すべての人に安全・安心なコスメトロジ

mediated by BMP4 and its inhibitor noggin secretedー」の実現の一助としたい（図 6）。

from cells. Biochemical Engineering Journal 1 7 6,108159,（2021）．

（引用文献）

9） Shimizu, M. et al. Thalidomide affects limb formation

1） Genschow, E . et al. The ECVAM internationaland multiple myeloma related genes in humanvalidation study on in vitro embryotoxicity tests: results

induced pluripotent stem cells and their mesodermof the definitive phase and evaluation of prediction

differentiation. Biochemistry and biophysics reports 2 6,models. ATLA-NOTTINGHAM- 30, 151-176（2002）．

100978,（2021）．

2） Shahbazi, M. N., Siggia, E. D. & Zernicka-Goetz, M.

10）Häcker, U., Nybakken, K. & Perrimon, N. HeparanSelf-organization of stem cells into embryos: A windowsulphate proteoglycans: the sweet side of development.

on early mammalian development. Science 3 6 4, 9 4 8-

Nature reviews Molecular cell biology 6, 530-541（2005）．
11）Nesterenko, A. M. et al. Affinity of the heparin951（2019）．
3） Yoshimitsu, R. et al. Microfluidic perfusion culture

binding motif of Noggin 1 to heparan sulfate and itsof human induced pluripotent stem cells undervisualization in the embryonic tissues. Biochemical

fully defined culture conditions. Biotechnology andand biophysical research communications 468 , 331 - 336

Bioengineering 111, 937-947,（2014）．

（2015）．

4） Kondo, Y. et al. Compartmentalized microfluidic12）Etoc, F. et al. A Balance between Secreted

perfusion system to culture human induced pluripotent

Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-

stem cell aggregates. J Biosci Bioeng 1 2 4, 2 3 4-2 4 1,

Organization. Developmental Cell 39 , 302 - 315（2016）．
13）Melchert, M. & List, A. The thalidomide saga. Int J（2017）．
5） Tashiro, S. et al. High cell density suppresses BMP4-

Biochem Cell Biol 39 , 1489 - 1499（2007）,．

induced differentiation of human pluripotent stem14）Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S. & Yu, H. A method forcells to produce macroscopic spatial patterning in ahuman teratogen detection by geometrically confined

unidirectional perfusion culture chamber. Journal ofcell differentiation and migration. Sci Rep 5 , 1 0 0 3 8 ,Bioscience and Bioengineering 126, 379-388（2018）．

（2015）．

6） Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem15）Tachikawa, S., Nishimura, T., Nakauchi, H. &cells from adult human fibroblasts by defined factors.

Ohnuma, K. Thalidomide induces apoptosis in

Cell 131, 861-872,（2007）．

undifferentiated human induced pluripotent stem cells.

7） Nakatani, E., Okajima, R. & Ohnuma, K. Slow

In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 53,
841 - 851（2017）,．

diffusion on the monolayer culture enhances auto/
paracrine effects of Noggin in differentiation of human16）T a c h i k a w a , S . , S h i m i z u , M . , M a r u y a m a , K .

iPS cells induced by BMP. Biochemistry and biophysics& Ohnuma, K. Thalidomide induces apoptosis

reports 29, 101195,（2022）．

during early mesodermal differentiation of human8） Nakatani, E., Yamazaki, W., Sugiura, S., Kanamori,

induced pluripotent stem cells. In Vitro Cellular &T. & Ohnuma, K. Modeling of differentiation pattern

Developmental Biology-Animal 54 , 231 – 240（2018）．

formation in human induced pluripotent stem cells17）Storch, J. & Thumser, A. E. Tissue-specific functions− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

in the fatty acid-binding protein family. Journal ofdensity of human-induced pluripotent stem cells. In

Biological Chemistry 285 , 32679 - 32683（2010）．

Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 5 4 ,
513 - 522（2018）．

18）Sharifi, K. et al. FABP 7 expression in normal andstab-injured brain cortex and its role in astrocyte20）Le, M. N. T., Takahi, M. & Ohnuma, K. Auto/proliferation. Histochemistry and cell biology 136 , 501

paracrine factors and early Wnt inhibition promote（2011）．

cardiomyocyte differentiation from human induced19）Le, M. N. T., Takahi, M., Maruyama, K., Kurisaki, A.

pluripotent stem cells at initial low cell density.

& Ohnuma, K. Cardiac differentiation at an initial low

Scientific Reports 11 , 21426（2021）,．

− 116 −