ごあいさつ
コーセーコスメトロジー研究財団の 28 冊目の研究報告書をお届けします。
本財団は、1990 年、株式会社コーセーの創業者小林孝三郎により設立され、今年 30 周年を迎えます。この間、本財団がコスメトロジー（化粧品科学）の発展をめざして研究助成活動を滞りなく継続できましたことは、多くの関係者の皆様のご理解とご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
昨年には、コスメトロジー研究振興財団からコーセーコスメトロジー研究財団に名称を変更させていただいております。
化粧品科学は、医学、生理学、化学、薬学、心理学、社会学など幅広い学問領域を基盤に成り立っており、これら様々な専門分野の研究者が集って化粧品分野の研究に参画していただくことで、今日のコスメトロジーが形作られてきたといえます。
これまでに本財団が助成した研究テーマも、新素材や物性評価などの工学的なテーマから、皮膚科学・安全性をはじめとする医学・生命科学、さらには化粧心
理や化粧文化に至るまで多種多様であり、それぞれ大変有意義な研究成果を発表していただきました。この活動を通して、本財団がコスメトロジーの発展に微力ながら貢献できましたことは、私どもの大きな喜びとするところでございます。
今回の報告書は、2017 年度から 2018 年度に助成を受けられた先生方 38 名の研究報告を掲載しております。また、昨年秋の第 30 回表彰・贈呈式でご講演い
ただいた帝京大学の奥直人先生の講演録、および、今回報告された先生方による所感「コスメトロジー研究助成を受けて」を掲載しています。
皆様には、この研究報告書 COSMETOLOGY 誌をご高覧いただきまして、コ
スメトロジーの更なる発展に向けてご活用いただきますことを願っております。
引き続き、本財団は、化粧品科学の発展のために、独創的で波及性ある研究テーマを積極的に助成してまいる所存でございます。
今後とも、皆様のますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

2020 年 9 月
公益財団法人 コーセーコススメトロジー研究財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・･紫外光照射下での酸化チタン粒子からの活性酸素を制御するナノ構造コーティングの開発････････････ 4
啓
広島大学大学院先進理工系科学研究科 犬丸・･シクロデキストリンを用いたサーファクタントフリーエマルションの安定化メカニズムの解明････････ 9
明治薬科大学 井上 元基
・･ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討
─放射光 X 線を用いたアプローチ─･･･････････････････････････････････････････････････････････ 14
静岡県立大学薬学部臨床薬剤学分野 内野 智信
・･化粧くずれの低減を目的とした新規な非水素結合性有機ゲル化剤の開発･･･････････････････････････ 24
山口大学大学院創成科学研究科 岡本 浩明
・･テラヘルツ波を用いた皮膚への化粧水浸透評価手法の開発･･･････････････････････････････････････ 29
岡山大学大学院ヘルスシステム統合科学研究科 紀和 利彦
・･テラヘルツ分光で切り拓く角質中に必要な水の “質”の解明･････････････････････････････････････ 33
理化学研究所生命医科学研究センター 白神 慧一郎
・･皮膚疾患に有効な新規骨格を有するビタミン D 誘導体の創製･････････････････････････････････････ 38
綾
お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系 棚谷・･撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発･････････････････ 43章
東京工業大学物質理工学院 中島・･化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工･･･････････････････ 53
関西学院大学理工学部生命医化学科 平井 洋平
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・･微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索･･･････････ 62
岐阜薬科大学 五十里 彰・･太陽光紫外線に暴露された毛髪の酸化度の X 線イメージングによる画像化･････････････････････････ 68
敦
東海大学工学部原子力工学科 伊藤・･イオン導入時の微弱電流による皮膚組織炎症への影響と安全性の検証･････････････････････････････ 73
徳島大学大学院医歯薬学研究部 小暮 健太朗
・･細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージング･････････････････････････････ 77
東京大学大学院農学生命科学研究科 佐々木 栄太
・･メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用への展開･･･････････････････････････ 83
慶應義塾大学理工学部応用化学科 清水 史郎
・･革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発･････････････････････････････････････････････ 87浩
弘前大学大学院医学研究科生体構造医科学講座 下田・･ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節･････････････････････････････････････････ 94
北海道公立大学法人札幌医科大学 白土 明子− II −

・･動物実験の 3Rs に寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開発･･･････････････････････････････ 97
静岡県立大学薬学部薬剤学分野 世戸 孝樹
・･プロシアニジン B2 による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明･･･････････････ 105
信州大学農学部 田中 沙智
・･皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索･･････････････････････････ 113
同志社大学生命医科学部 野口 範子
・･加齢に伴う皮膚のステロイド合成系の変容が皮膚機能に及ぼす影響･･････････････････････････････ 119
昭和大学医学部生化学講座 原口 省吾
・･ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発････････････････････････････ 124仁
東北大学大学院医学系研究科 樋浦・･皮膚保湿マーカー遺伝子 FABP5 の発現と機能制御機構の解析･･･････････････････････････････････ 130
博
信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所 藤井・･制御性 T 細胞による皮膚恒常性維持メカニズムの解明･･････････････････････････････････････････ 136
昌平
東京大学大学院薬学系研究科免疫・微生物学教室 堀・･植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能････････････････ 140
神戸大学大学院農学研究科 水野 雅史、久世 雅樹
・･カルシウムイオンの生体内観察・操作による KID 症候群の病態解析･･････････････････････････････ 148
京都大学医学研究科皮膚科学講座 村田 光麻・･皮膚の酸化ストレス障害に対する間葉系幹細胞の治療効果と制御機構の解明･･････････････････････ 151
群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学 茂木 精一郎
・･皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明････････････････････････････････････ 154
近畿大学薬学総合研究所 森山 博由
・･表皮細胞間接着分子の発現増強条件と皮膚機能の総合的検討････････････････････････････････････ 158
淳
慶應義塾大学医学部皮膚科学教室 山上・･プラズマローゲン型リゾリン脂質代謝系を基軸とした皮膚の恒常性と疾患調節の作用機序の解明････ 162
圭徳島大学大学院社会産業理工学研究部（生物資源産業学域） 山本
・･化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発･････････････････････････････････････････････ 167
東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門 善本 隆之
・･栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物
による pro-oxidant 活性･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 175
藤田医科大学医療科学部 若松 一雅
Ⅲ．精神、文化に関する分野
・･香りの文化と法的保護･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 186典
九州大学芸術工学研究院 麻生・･化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題････････････････････････････････････････････ 191
関西大学商学部 小井川 広志
・･懐かしい香りを用いた回想法の効果検証および脳メカニズム解明････････････････････････････････ 199
東北大学加齢医学研究所 大場 健太郎
・･生物・化学と経営の異分野融合による若年層男性に求められる化粧品に関する研究････････････････ 204
宇部工業高等専門学校物質工学科 廣原 志保、根岸 可奈子− III −

・･顔面神経麻痺患者に対するメーキャップ治療の有効性の検討････････････････････････････････････ 208
北海道大学大学院医学研究院耳鼻咽喉科・頭頸部外科学教室 藤原 圭志
・･化粧がもたらす社会的効用 ─その神経基盤を探る･･････････････････････････････････････････････ 211
福島県立医科大学医学部システム神経科学講座 藤原 寿理・･ハイブリッド相同モデルによる result-oriented な顎顔面手術シミュレーション法の開発････････････ 217
九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎顔面外科学分野 山田 朋弘■記念講演・第 30 回表彰・贈呈式記念講演「リポソーム研究の魅力」･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 225直人
帝京大学薬学部長・教授 奥■コスメトロジー研究助成を受けて・･････････････････････････････････････････････････････････････････ 235
■付

録

事業報告書

････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 261

2019 年度

研究助成を受けられた方々 ････････････････････････････････････････････････････････････ 263

役員一覧･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 266− IV −

●
Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

紫外光照射下での酸化チタン粒子からの活性酸素を制御する
ナノ構造コーティングの開発
広島大学大学院先進理工系科学研究科

犬丸啓

Coatings with a unique nanostructure was applied to the surfaces of titanium oxide (TiO2) particles, and the reaction ofactive oxygen inside the nano channels was traced using methyleneblue (MB) dye molecules as a probe under UV irradiation.
Titanium oxide particles were covered with mesoporous silica (MPS) and 6-O-palmitoyl-L-ascorbic acid (PAA, an active
oxygen scavenger) molecules were retained inside the nano channels of MPS. Under UV irradiation active oxygen weregenerated by TiO2 and the consumption of MB reflects the competitive reaction with PAA and MB. In this study we could
intentionally retain the hydrophobic organic molecules in the nanostructured coatings and succeeded in detecting the reactionof active oxygen by using a small organic molecules as a reaction probe.

1. 緒

言

酸化チタンはエネルギーギャップが約 3 . 0 eV の半導体であり紫外光を吸収するため、化粧品等において紫外光吸収剤としてすでに多用されている。酸化チタンは、無毒であり化学的にも安定である優れた紫外光吸収剤であるが、高い光触媒活性をもつことが紫外光吸収剤としては欠点と図1なる。酸化チタンが紫外光を吸収すると、価電子帯から電MPS-TiO2 の構造の模式図

子が伝導帯へ励起されその電子が還元反応を、価電子帯に観点から長らく研究を行ってきた。酸化チタンの光触媒作生成した正孔（ホール）
が酸化反応を表面で引き起こす。水用に有機分子を選んで分解する分子選択性を付与すること

溶媒中では、溶存酸素が還元された超酸化物イオン（O 2−）、に、粒子状の酸化チタンでは初めて成功した 2 - 5）。我々の水酸化物イオン（OH −）が還元されたヒドロキシラジカル

これらの研究をきっかけとして、この新しい研究分野が形（·OH）などのいわゆる「活性酸素」が生成するといわれてい成されその後大きく発展した 6 , 7）。シリカによる表面被覆

る。さらに過酸化水素（H 2 O 2）のような酸化剤となる分子においては、直径 3 nm の円筒状細孔（ここではナノ細孔との生成も報告されている 1）。このような化学種は、有機物呼ぶことにする）が規則的に（ハチの巣のように）並んだ多分子を酸化分解する作用をもつので、これを利用して例え孔質材料（メソポーラスシリカとして知られる）で酸化チタ

ば水中有機物分子の分解除去・水の浄化への応用が研究

ン粒子を包含した複合体（図 1）を開発し、アルキルフェノ

されている。一方、化粧品に関しては、基剤中の有機分子

ール類の光触媒的分解に分子選択性を発現することを報告

を分解変質させてしまうため光触媒作用は逆に問題となる。

した 3 - 5）。

これを防止する対策の一つが、酸化チタン粒子表面をシリ

本研究では、コスメティック材料として貢献できる、メカ（SiO 2）などの皮膜で被覆し表面を不活性化することであ

ソポーラスシリカの特異な細孔構造を利用した新しい材料る。しかし、表面を SiO 2 で単純に被覆して「活性酸素」の開発の可能性を検討することを目的とする。一つのメルク生成を完全に抑制することは必ずしも容易ではない。SiO 2

マールとして、「活性酸素」の生成を制御するためのナノレ−2被覆により、生成する化学種（O , · OH と H 2 O 2）の割合がベルで構造が設計されたコーティングの可能性を探るため、変化し、シリカ被覆によりむしろ反応性の高い · OH や O 2−

抗酸化剤となる有機物を組み込んだナノ構造コーティング

1）の合成を行いその構造を調べた。さらに、プローブ分子との生成量・生成速度が増加するという報告もある 。
我々は、表面の化学修飾による光触媒の機能制御というしてメチレンブルー（MB）を用い、「活性酸素」との反応を観測することにより、ナノコーティングの作用機序に関する考察を行った。これにより，コスメティック新材料開Designing nanostructured coating of TiO 2
particles for control of active oxygen
release under ultraviolet irradiation

発に貢献できる学理構築に資することを目的とした。

２．方Kei Inumaru
Graduate School of Advanced Science andEngineering, Hiroshima University

法

市販の酸化チタン（TiO 2）粒子（P 25）にゾルゲル法によりシリカを被覆した試料 SiO 2 /TiO 2 と、さらにそれをメソ−4−

紫外光照射下での酸化チタン粒子からの活性酸素を制御するナノ構造コーティングの開発

ポーラスシリカ（MPS）により包含被覆した複合試料 MPS-と称する。この場合、最下層の SiO 2 には多数のミクロ細SiO 2 /TiO 2（図 2）を調製した。さらに，この複合体に、抗孔が開いており、TiO 2 の光触媒作用により生成する「活性酸化剤として知られる 6 -O- パルミトイル -L- アスコルビ

酸素」が通り抜けて、MPS のナノ空間細孔中に拡散してくン酸（PAA）分子をナノ細孔内に保持させた試料の合成をる。そこで、本研究では、さらにこのナノ細孔壁に、疎水試みた。反応性を調べる対象有機分子として、シリカに対性の抗酸化剤である PAA を吸着保持させた「複合ナノ構造

する吸着性の高いメチレンブルー（MB）を用いた。空気をコーティング」を試みた。合成の目的は、MPS-SiO 2 /TiO 2

十分バブリングした所定の濃度の 300 mL の MB もしくはの粒子外にはほとんど PAA の固体が析出することなくフェノール水溶液に試料を酸化チタン成分が 10 mg になる

ナノ細孔内に PAA 分子を均質に吸着保持させることにあ

量を分散し、暗所で 1 h 攪拌し吸着平衡に到達させたのち、る。これにより、細孔内に保持した PAA 分子の「活性酸素ブラックライトにより波長 365 nm の光を照射し、有機物補足」の効果を測定することができる。PAA の保持の方法の濃度の経時変化を上澄みの UV-Vis 測定により追跡した。

として、種々の溶媒に PAA を溶解させ、MPS-SiO 2 /TiO 2と混合し、その混合物を蒸発乾固またはろ過洗浄する方法

３．結果と考察を試行錯誤した。蒸発乾固法では、種々の混合比を検討し３．
１．ナノ構造コーティング試料の合成たものの、どの試料でも粉末Ｘ線回折測定で PAA の結晶

種々の粒子を MPS で包含する我々の技術を活用して、の回折ピークが観測され、MPS-SiO 2 /TiO 2 粒子の外部に

従来、TiO 2 粒子を直接 MPS で包含した MPS-TiO 2（図 1）

PAA の固体が析出していた。種々の溶媒、条件検討の結果、を合成してきた。これに加えて、本研究ではさらに構造のアルコールと水の混合溶媒に PAA を溶解し MPS-SiO 2 /異なる 3 種類のナノ構造コーティングを施した試料を合成

TiO 2 と混合、洗浄した試料で、PAA の細孔内保持に成功

した。

した。

図 2 にそれらの構造模式図を示す。まず、ゾルゲル法によりシリカコーティングした TiO 2（SiO 2 /TiO 2）を合成し３．２．ナノ構造コーティング試料の解析た。次に、この SiO 2 /TiO 2 粒子の外側を MPS で被覆包含

図 3 に、MPS-SiO 2 /TiO 2 および、PAA を吸着保持したした構造を構築した。この構造を以下、MPS-SiO 2 /TiO 2

試料（以下、PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 と称する）の 77 K での

図2

図3

本研究で構築したナノ構造コーティングの構造の模式図

各試料の窒素吸着等温線から BJH 法により求めた細孔径分布−5−コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

窒素吸着等温線を BJH 法で解析して得た細孔径分布を示に つ い て、TiO 2 , SiO 2 /TiO 2 お よ び MPS-TiO 2 へ の 吸 着す。細孔直径 10 nm 以下を拡大して示してあるが、これ等温線を測定した。TiO 2 には MB はほとんど吸着しなかより大きな細孔径の位置には両試料ともに全く細孔がない。

った。SiO 2 /TiO 2 には多量の MB が吸着し、吸着等温線

MPS-SiO 2 /TiO 2 が細孔直径 2 . 7 nm の位置にシャープなは Langmuir 型吸着式でフィッティングできた。SiO 2 の等

ピークを与えていること、それに比べて、PAA-MPS-

電点は約 2 であるので、中性に近い今回の反応条件ではSiO 2 /TiO 2 は細孔容量が減少し、明らかに細孔径分布のピ

SiO 2 は負に帯電していると考えられ MB はカチオン性の色

ークが小さい方へシフトしている。細孔径の減少は、細孔素分子なので、静電的な相互作用により SiO 2 表面に MB

内への PAA 分子が吸着保持されたことを示している。αsが多量に吸着し Langmuir 型の吸着等温線を示すことは理プロットから求めた細孔容積は、MPS-SiO 2 /TiO 2 および解できる。一方、MPS-TiO 2 は表面積がはるかに大きい

PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 の細孔容積はそれぞれ 0 . 352 およにもかかわらずこの試料への MB の吸着は SiO 2 /TiO 2 への3−1

び 0 . 312 cm gとなり、PAA の導入により細孔容積が大

吸着より大幅に少なく、Langmuir 型には従わないことがきく減少している。ここで問題になるのは、試料に導入分かった。このことから、MPS のナノ細孔内では、MB 分

された PAA のうち、どれくらいの割合が細孔内に保持さ子は、細孔壁に強く捉えられることなくルーズに保持されれているか、である。PAA の添加により全重量が増えれていると考えられる。そのため、MPS 細孔内の MB 分子

ば、見かけ上、試料重量あたりの細孔容積が減少する方向の反応速度を測定することは、ナノ細孔内での「活性酸素」に変化する。細孔内に入っている PAA のみを正確に定量のプローブとして好適であると考えられる。

することには困難が伴うが、分析と考察の結果、試料に導次に、実際に光照射下における MB 分解反応速度の測入された PAA の大部分が細孔内に保持されているとの結定 を 行 っ た。 図 4 が そ の 結 果 で あ る。 コ ー テ ィ ン グ し論に達した。すなわち、PAA の密度をパルミチン酸の値て い な い TiO 2 を 含 め、MPS-TiO 2 、MPS-SiO 2 /TiO 2 、そ0 . 85 gcm− 3 と置けば、細孔内への PAA 吸着量と細孔外のし て PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 に つ い て の 結 果 を 示 し て あ

PAA 存在量の比と細孔容積の減少量の関係が導ける。こる。図４⒜が濃度の経時変化、⒝ がその一次プロットでれと細孔径の変化の大きさ、および外表面積が両試料である。まず、時間 0 min における MB 濃度の差について考ほとんど同じである事実をすべて説明できることとして、察する。これは、試料を MB 水溶液に投入後、吸着平衡に

MPS-SiO 2 /TiO 2 に対して重量で約 3 % の PAA が試料に導到達させるよう時間をおいてから測定した値であり、従っ入され細孔内に吸着保持されていると考えられた。PAA-て、初期濃度 1 × 10− 5 mol dm− 3 との差が吸着量の目安に

MPS-SiO 2 /TiO 2 の粉末 X 線回折測定では PAA の結晶が観なる。TiO 2 には MB はほとんど吸着しない。実際、時間測されないこともこの結論と矛盾しない。以上のことから、

0 min において、初期濃度の低下は TiO 2 では見られない。

図 2 に 示 し た MPS-SiO 2 /TiO 2 お よ び PAA-MPS-SiO 2 /MPS-TiO 2 、MPS-SiO 2 /TiO 2 では、ある程度の吸着が見ら

TiO 2 のナノ構造コーティングを実現することができたこ

れ、MB 分子が MPS の細孔空間へ濃縮されていることがとが分かった。

分かる。前述の通り、この場合の濃縮は、MPS 細孔内壁への吸着というよりは、ナノ細孔空間にルーズに捉えられ

３．
３．MB をプローブ分子とした「活性酸素」との反応ていると考えられる。ただし、細孔容積で吸着量を割り付の追跡けると、この 2 つの試料においてもバルク溶液に比べて大まず、MB の水溶液を用いて試料への吸着を調べた。MB

幅に濃縮されていることになる。

⒜

⒝

図4

メチレンブルー水溶液中の ⒜ 濃度経時変化とその ⒝ １次プロット−6−

紫外光照射下での酸化チタン粒子からの活性酸素を制御するナノ構造コーティングの開発

一方、PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 の 0 min の MB 濃度を見る

場合、MB 分子がその細孔に入っているかは不明であるが、と、ここで調べた試料の中で、一番濃度変化が大きい。つPAA 分子はそのミクロ細孔に入れない大きさであること

まり、MB の吸着性としては、は明らかである。従って、この点は、両者の競争反応におTiO 2 << MPS-TiO 2 , MPS-SiO 2 /TiO 2 , < PAA-MPS-

いて MB 分子にどちらかというと有利に働くであろう。こSiO 2 /TiO 2のことを考慮すると、この競争反応において細孔内に吸着の序列となる。PAA のナノ細孔への吸着保持により、MB保持した PAA が「活性酸素」のスカベンジャーとしての大の吸着が促進される効果があることが分かる。すなわち、きな効果を発揮していると解釈することができる。

MB 分子は PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 のナノ細孔空間におい一方で、解釈が複雑な実験事実が 2 点ある。それは、⑴て、PAA 分子と共存しながら高い濃度まで濃縮されてい前 述 の PAA の 効 果 が あ る に も か か わ ら ず PAA-MPS-

ることになる。吸着量の比較から、細孔内での MB 分子濃SiO 2 /TiO 2 の MB 反応初速度は、TiO 2 単味のそれとほと

度 は、MPS-SiO 2 /TiO 2 と 比 べ て PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2

んど差がないこと、さらに、⑵ PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 のの場合かなり高くなっていることになる点に注目しておく

経時変化の特徴も TiO 2 と似ていること、である。⑴ につ必要がある。

いては、理由を定量的な証拠と共に明示することは現段

さて、このような状態において、光の照射を開始した場

階のデータだけでは困難であるが、今回用いた MB 分子が合、TiO 2 から放出される「活性酸素」がナノ細孔空間に拡PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 のナノ細孔空間の深くまで侵入可散してきたとき、TiO 2 粒子近傍にある PAA 分子と MB 分

能な程度の大きさの分子であることから、粒子外に放出さ子とで「活性酸素」との反応における競争反応になると考えれる「活性酸素」量という観点では TiO 2 との直接の比較をられる。すなわち、MB が細孔内で「活性酸素」と反応すれすべきではなく、その検討をするためには細孔に侵入できば、そこで消費された MB に相当する量の MB が細孔外かないくらい大きな分子径をもつプローブ分子で比較するの

ら吸着平衡により供給され、外部の溶液の MB 濃度減少とが良いことに注意すべきである。つまり、細孔内部を反応して観測される。PAA が「活性酸素」と反応すればその分場とした場合においても PAA の効果が大きく表れている「活性酸素」が消費され MB の反応速度が低下するので、こという図 4 ⒜ の解釈は成り立つと考えられる。一方、⑵の MB の反応速度は、細孔内 PAA と「活性酸素」の反応速については、さらに複雑である。図 4 ⒝ は、図 4 ⒜のデー度を反映するプローブとなる（もちろん MB 分子の存在のタを対数軸とした、いわゆる 1 次プロットである。MPS

影響を受けたうえでの速度、という意味である）。

で包含被覆したナノ構造をもつ 2 つの試料 MPS-TiO 2 、MB の反応速度について、初速度とその後の経時変化を

MPS-SiO 2 /TiO 2 は１次プロットが、反応初期には直線に区別して考えることが重要である。MB が光触媒から放出

乗るが、反応が進むにつれ下に凸に湾曲してくる。これは、された「活性酸素」と反応すると完全に無機化（CO 2 と水ま従来の我々の解釈は、MB が酸化された中間生成物のナノで完全に分解されること）するまでに中間生成物を経るこ

細孔内での濃度が上昇してくると、「活性酸素」がその中間とになり、その中間生成物の酸化分解にも「活性酸素」が使生成物の更なる酸化分解にも使われるので、MB の反応速われる。反応初速度は中間生成物が存在しないため「PPA

度が 1 次反応から外れて減速する、TiO 2 の場合は中間生

vs MB」の「活性酸素」との競争反応の速度を正確に反映す

成物がバルク溶液中へ拡散希釈されるのでその影響が少なる。一方、その後の反応速度の経時変化は、ナノ細孔空間

い、というものであった。実際、MB の分解反応が進むにの中での反応場としての状況に関する別の情報を与えるとつれ、反応液の UV 吸収スペクトルの吸収の形が変化し短考えるのが良い。

波長側にシフトする変化が観測されている。今回、PAA-

図 4 ⒜ の経時変化のうち、初速度を比較すると、MPS-

MPS-SiO 2 /TiO 2 と TiO 2 の 1 次プロットが、反応率が高い

TiO 2 と MPS-SiO 2 /TiO 2 の初期速度は同等であった。これ領域でも直線性を保つという両者の類似性は、我々の従来は、下層の SiO 2 層の有無で MB の分解初速度が変化しての解釈の改訂を迫る結果かもしれない。すなわち、MB のいない、ということになり、今回合成した下層の SiO 2 下分解の中間生成物の蓄積が、MPS-SiO 2 /TiO 2 などでは起層の有無は「活性酸素」の生成速度にはほとんど影響してこるが、PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 では起こらない、といっいないことを示唆する。SiO 2 下層がミクロ細孔を有しそたことがない限り従来の考えの延長で説明することは難し

こを通って「活性酸素」
が拡散してくるものと考えられる。

い。この点に関しては、今後の検討を要する。

さて、PAA をナノ細孔内に吸着保持した試料すなわち

４．総

PAA-MPS-SiO 2 /TiO 2 の MB 反 応 初 速 度 は、MPS-TiO 2と MPS-SiO 2 /TiO 2 の 5 分の 1 程度まで低下した。

括

酸化チタン（TiO 2）粒子の表面に、特異なナノ構造を有MPS-SiO 2 /TiO 2 と SiO 2 下層がミクロ細孔を有しそこをするコーティングを施し、色素分子（MB）をプローブ分子通って「活性酸素」
が拡散してくるものと考えられる。このとした活性酸素との反応の追跡を行った。特異なナノ構造−7−

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020とは、酸化チタン粒子をメソポーラスシリカ（MPS）で包ができなかったため至らなかった。しかし、本研究で得ら含被覆し、そのナノ細孔空間に活性酸素スカベンジャー（あれた知見は、ナノ構造を設計したコーティングによる活性

るいは抗酸化剤）の役割が期待される 6 -O- パルミトイル

酸素種の反応制御とそのモニターの実証例として、コスメ-L- アスコルビン酸（PAA）
分子を吸着保持させた構造であ

ティック材料の設計開発に資するものであると信じている。

る。種々の方法を系統的に検討した結果、PAA 分子をナ

本研究は広島大学大学院生であった定森早紀氏、同じ研究

ノ空間に導入保持させることに成功した。この試料を用い、室の同僚の片桐清文教授との共同研究である。

光照射下で生成する「活性酸素」と MB の反応を、MB 濃度の経時変化を追跡することによりモニターした。MB は、
PAA を保持した試料においてもナノ細孔に侵入可能であ（引用文献）
1）J. Oguma, Y. Kakuma, S. Murayama, Y. Nosaka, Appl.

り、MB 濃度変化は、ナノ細孔空間の内部における PAA

Catal. B, 129, 282-286（2013）．

と MB の「活性酸素」との競争反応の結果、すなわち、ナノ2）K. Inumaru et al., Appl. Catal. B, 52, 275-280（2004）．

細孔空間の奥深くで起こっている反応の状況を反映してい3）笠原，犬丸，山中，第 42 回セラミックス基礎科学討る。本研究により、ナノ細孔空間に意図的に疎水性の有機論会 1F-04（2004）; 特許第 5194249 号．

分子を保持し、酸化チタンから生成する活性酸素と反応さ

4）K. Inumaru et al., Chem. Commun., 2131-2133（2005）．

せることができ、その効果を他の有機小分子をプローブと

5）K. Inumaru et al., J. Mater. Chem., 21, 12117-12125

して用いて検出することができることを実証した。小分子（2011）．

が侵入しない構造の合成・構築まで至らなかったことから、

6）M. A. Lazar and W. A. Daoud, RSC Adv., 3, 4 1 3 0-

当初の目標として掲げた粒子外部において「活性酸素の放4140（2013）．

出を完全に抑制する」ことができているか、を検証するま7）J. Kou et al., Chem. Rev., 117, 1445-1514（2017）．

でには、それを可能とする大分子径のプローブ分子の設定−8−シクロデキストリンを用いたサーファクタントフリーエマルションの安定化メカニズムの解明
明治薬科大学井上

元基

Surfactants are essential to prepare emulsions. However, some kinds of surfactants show adverse effects on the humanbody or environments. Consequently, many researchers are attempted to prepare emulsion without use surfactants calledsurfactant-free emulsions. Emulsion stabilized by cyclodextrins has been reported by many researchers in 90 s. Althoughthese reports focus on preparation and application for practical use, improving the physical property of the emulsion has
many problems due to a lack of the formation mechanism. In this study, the formation mechanism of emulsion using
cyclodextrin as emulsifier was investigated by physicochemical and spectroscopic methods. Water in oil type emulsion
was prepared in the case of the use of hydrophobic group modified cyclodextrin. From the stability tests and droplet size
measurements, the emulsion was destabilized by creaming. The surfaces of droplets were covered with precipitates by cryoSEM observation. Therefore, this emulsion was classified as Pickering emulsion, which defined as stabilized by adsorptionof solids on the surface of the droplets. In the second section, α-cyclodextrin was used as an emulsifier that forms theinclusion complex with oil molecules. We focused centrifuge precipitates in the oil in water type emulsion. From Raman
spectra, centrifuged precipitates and absorbed at the surface of droplets showed similar spectra. From the PXRD, precipitatesand original cyclodextrins showed different patterns. Therefore, the precipitate at the surface on the droplets derived from
cyclodextrins and related to form the emulsions.

１．緒

言

２．方

一般にエマルションの調製には界面活性剤の使用が不可

２．
１．試

法

薬

欠である。しかし、界面活性剤の種類によっては、人体にα および β-CDは、
日本食品化工㈱製のものを減圧乾燥（100

対して悪影響をおよぼすものや高い環境負荷のものもある。

℃, 12 h）した。n-octane、n-dodecaneおよびn-hexadecane

そのため、界面活性剤を使用しないサーファクタントフリ

は、関東化学㈱製の特級品をそのまま使用した。疎水化

ーエマルションの開発が望まれている。シクロデキストリ

CDとしてheptakis（2 , 3 , 6 -tri-O-propanoyl）-β-CD（以下、ン（CD）はグルコースが α- 1 , 4 結合した環状オリゴ糖でTP-β-CD）を選択し、Hirayamaらの方法に従い、β-CDを内側に疎水部を有する。外側は親水性であるため高い水溶ピリジン中で無水プロピオン酸と反応させることにより調性をもち、疎水部の内洞が疎水性化合物を包接することに製した 3）。

より包接複合体を形成する。CDと油分子が包接複合体を形成し、親水部を水相、疎水部を油相に吸着することで液２．２．エマルションの調製

滴を安定化するためエマルションを形成すると考えられて
1）

所定量のCD、水およびn-alkane類をホモジナイザー

きた 。しかしながら、液滴の安定化にはCD由来の析出（10000 rpm, 5 分間）で撹拌しエマルションを調製した。25

物の析出が不可欠であるため、固体が油／水界面に析出す℃恒温下、1 時間静置後の相状態を目視および光学顕微鏡

ることで形成されるPickeringエマルションであることが観察し、三成分系状態図を作成した。なお、エマルション

わかっている 2）。これまでの検討では、エマルションの形の型の判別は電気伝導度法および希釈法により行った。

成には固体の存在が不可欠であることはわかっているものの、油／水界面における固体の化学的な性質の直接的な解

２．３．安定性試験および液滴粒子径の測定

明はなされていない。本研究は、CDを乳化剤としたエマ

バイアルに入れたエマルションを 25℃恒温下にて静置

ルションの実用化に向け、分光光学的手法を用いて基礎物

し、経時的にエマルション相の高さを測定することで評価性を明らかにすることを目的とした。

した。エマルションの粒子径は、エマルションの光学顕微
鏡写真を元に、ImageJを用いて計測した。

２．４．クライオ走査型電子顕微鏡および偏光顕微鏡
観察

Formation mechanism of surfactant-freeemulsion stabilized by cyclodextrins

エマルションの液滴表面の状態はクライオ走査型電子顕Motoki Inoue

微鏡（SEM）により観察した。エマルションを試料ステー

Meiji Pharmaceutical University

ジに挟み込み、液体窒素中（−196℃）に突入させ急速凍結−9−コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

させ物理的な固定を行った。ステージに挟み込まれた試

Figure 2 はエマルション中液滴の粒子径の経時変化を料を、クライオユニット内で割断処理し、クライオSEM示す。いずれのn-alkaneを用いた場合も直径 50 - 60 μmの（JSM- 6301 F、日本電子㈱製）の加速電圧を 12 kVに設定し、液滴が確認された。その大きさはn-alkaneのアルキル鎖

断面を観察した。エマルションの液滴表面は偏光顕微鏡に

長 に よ っ て わ ず か に 異 な り、n-octane>n-dodecane>n-より観察した。

hexadecaneの順に粒子径が大きかった。エマルションの不安定化に合一が認められず連続相の分離のみであること、

２．５．エマルション中に生じた析出物の粉末X線回折（PXRD）測定

液滴の平均粒子径は調製28日後までほとんど変化がない

10000 rpm、30 minでエマルションを遠心分離した後、主にクリーミングにより引き起こされることが明らかとな生じた析出物を減圧乾燥させ測定試料とした。試料をSi単ことから、TP-β -CDを用いたエマルションの不安定化は、った。

結晶製の無反応試料プレートに充填し、粉末X線回折装置（Miniflex、理学電機㈱製）Cu-kα 線（30 kV, 15 mA）を用
いて走査速度 4° /minで測定した。

３．２．エマルション液滴表面の観察ならびに表面化学的特性
液滴断面を視覚的に明らかにするためにエマルションを

２．６．ラマンスペクトル測定

凍結後に割断し、走査型電子顕微鏡（SEM）で直接的に液ラマン分光装置は光源波長 785 nmレーザー、スペクトル

滴表面を観察した。Figure 3 は液滴表面のクライオSEM

分解能 4cm- 1 のWork StationTM（Kaiser Optical Systems）を像を示す。液滴径は 100 μm程度で液滴表面の一部に卵殻用いた。なお、レーザー出力は 400 mW、露光時間は 1 sと状の析出物が吸着していることを確認した。このことより、した。

TP-β-CDを乳化剤として用いたエマルションは、油／水

３．結

界面に吸着した析出物により安定化するものと考えられた。

果

エマルション中の析出物により油および水へのぬれ性が３．
１．エマルション液滴の安定性

異なる理由について詳細に調べるため、表面自由エネルギ

疎水性CD誘導体であるTP-β -CDを乳化剤としてエマル

ー γ sを算出した。ここで、γ sは分散力成分（γ ds ）と極性力

ションを調整すると油中水（W/O）型となった。Figure 1成分（γ sp）の 2 成分に大別され 4 , 5）、2 種の物質同士の各成はエマルションの経時変化を示す。この検討では、調製直分の値が近いほど物質間に相互作用が働きやすいといわれ

後のW/O型エマルションの高さを 100 %とし、残存するエている。なお、析出物のγ sdおよびγ spは、分散力成分およびマルションの割合を百分率で表した。エマルション割合

極性力成分が既知のプローブ液体を用いて接触角を測定し、は 7 日後まで徐々に低下し、それ以降ほぼ一定値を示した。

以下のFowkesの式（式⑴）により算出した。

なお、この検討では連続相であるn-alkaneのみの分離がみられた。その分離の傾向は鎖長により異なり、短いものほどエマルションの安定性が低いことが明らかとなった。

Figure 1 Volume fraction of the W/O
emulsion phase for 4 weeks. Weightratio of the emulsion is n-alkane/TP-β-CD/water= 0.4/0.2/0.4.

⑴
ここで、γ SLは液体と固体の界面張力、γ Lは液体の表面

Figure 2 Time course of the water Figure 3 Cryo -S E M images of W/Oemulsion. Weight ratio of the emulsion isdroplet size in the W/O emulsions.
n-alkane/TP-β-CD/water= 0.4/0.2/0.4.
Weight ratio of the emulsion isn-alkane/TP-β-CD/water= 0.4/0.2/
0.4.

− 10 −

シクロデキストリンを用いたサーファクタントフリーエマルションの安定化メカニズムの解明

張力、γ sdおよびγ spはプローブとして用いた液体の表面

したがって、この析出物は結晶性の化合物であることがわ

張力の分散力成分および極性力成分である。Figure 4 はかった。

TP-β-CDを用いたエマルション中析出物のγ sdおよびγ spのp値を示す。n-alkaneの鎖長の増加に伴って析出物のγ s 値dここで生じた析出物を採取し、ラマンスペクトルを測定した。Figure 6 はエマルションを遠心分離により収集しは減少し、γ s は増加した。これはTP-β-CD由来の析出物

た析出物、n-octane/水界面に生じた析出物および原料でがn-alkaneの影響を受け、分散力が高まり極性力が小さくあるα-CDのラマンスペクトルを示す。α-CDのスペクトルなったと考えられる。

は複数のピークを有しており、特徴的な形状であった。一方、いずれの析出物のスペクトルにもα-CD由来のピーク

３．3．エマルション中析出物の分光光学的な分析は確認されず、1350 cm- 1 付近の幅広いピークのみが確認

油と包接化合物を形成しやすいα-CDを用い、n-alkane

された。油／水界面に生じた析出物はα-CD結晶ではなくエマルションについて検討を行った。α-CD水溶液の上にCDとオクタンによる包接複合体であることが推察された。

n-alkaneを積層すると油/水界面に目視で確認できる程度

さらに結晶について詳細な検討を行うためエマルションの白濁を確認した。Figure 5 はn-octane/水界面の偏光顕を遠心分離して得られた析出物を乾燥し、PXRD測定した。

微鏡像であり、α-CD由来不溶性析出物は複屈折を示した。

いずれの析出物もCD単独のX線回折パターンとは異なる

Figure 4 Dispersion force component（γsd）, and polar force
component（γsp）of precipitates in n-alkane/tripropanoyl β- CD/water systems at 25℃. The precipitates were
centrifuged from the emulsion consisting n-alkane/TP- β-CD/water= 0.4/0.2/0.4.

Figure 5 Polarized microscopic photographs of precipitates
generated at the interface between n - octane andsaturated α-CD solution.

Figure 6 Raman spectra of precipitates and α-CD. The
precipitate generated at the interface between n-octane
and saturated α-CD solution and centrifuged fromn-octane emulsion.

Figure 7 PXRD patterns of precipitates in emulsion and α-CD. The composition of the emulsion is 0.4/0.08/0.52(n-octane /α-CD/water).

− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

パターンを示したため、CD単独とは異なる結晶格子であた 8）。しかしながら、Pickeringエマルションの場合、水とることが示唆された。したがって、CDを用いたエマルシ

油の界面張力が大きいほど固体は油／水界面に吸着しやすョン中の析出物はCD由来の包接錯体であることが確認さくなる。ここで、仮にミクロクリスタルがエマルション形

れた。したがって、シクロデキストリンを乳化剤としたエ成に関与していれば、析出物を取り除き、残った水相と油マルション形成にはα-CD単独ではなく包接複合体の結晶相を再び撹拌することで、液滴が形成されると考えた。フ

による寄与が大きいことが示唆された（Figure 7）。

ィルター（孔径 0 . 45 μm）ろ過後、水相と油相を撹拌した

4. 考が液滴の形成は見られなかった。したがって、本エマルシ

察ョンは主に固体が油／水界面に吸着することでエマルショ

CDを乳化剤として用いたエマルションは界面活性剤

ンを形成することが考えられた。析出物の油水界面でのぬを使用しないサーファクタントフリーエマルションでれ性を評価するため、固体の表面自由エネルギーを算出しあるため、近年、基礎研究のみならず実用化に関するた。エマルション調製に用いたn-alkaneの鎖長の増加に伴研究も行われている。Pavnovらはこのエマルションをい分散力が増加するものの、極性力は低下した。これは「Cyclodextrinosome」と名付け、水／油界面に吸着した

n-alkaneの物性の傾向と一致しており、析出物は用いた油

不溶性の包接複合体についてSEMならびに色素を使った相の種類に影響されることが推察された。次に、油分子と6）染色による詳細な検討を行っている 。Leclecqらは抗真包接複合体を形成するα-CDを用いて油／水界面で形成さ菌薬の基剤として応用するための検討を行い、従来の外用れる析出物の直接的な観察を行った。偏光顕微鏡による観性基材と比較して遜色ないほど安定で、界面活性剤を乳化

察では、油／水界面に複屈折を示す析出物の吸着が見られ剤としたエマルションと比較して刺激も低いと報告していた。この結晶をエマルション状態で化学的に検討するため、

7）

る 。CDを乳化剤としたエマルションは香粧品のみなら

ラマンスペクトルを取得した。エマルション中から沈殿とず外用剤としても有用であることが期待されるにも関わらして得た析出物および油／水界面に生じた析出物のスペク

ず、実用化には至っていない。それはエマルションを形成

トルを比較すると、油／水界面に生じた析出物はα-CD結した際の析出物の物性が明らかになっていないためであ晶ではなくCDとオクタンによる包接複合体であることがる。本研究では疎水化CDおよび天然のCDを用いて、CD推察された。したがって、シクロデキストリンを乳化剤とを乳化剤としたエマルションの形成メカニズムを詳細にしたエマルション形成にはα-CD単独ではなく包接複合体検討した。W/O型エマルションの不安定化を検討したとの結晶による寄与が大きいことが示唆された。CDを乳化

ころ、油相の分離が徐々に起こるものの水相の分離は起こ剤として用いたエマルションはFigure 8 に示すように固らなかった。したがって、このエマルションの不安定化は体微粒子が油／水界面に吸着して液滴を安定化すると考え合一ではなく、クリーミングにより引き起こされているとられる。すなわち、油／水界面に吸着するあるいは析出し、推察された。液滴表面を観察したところ、油／水界面に析

液滴を覆い尽くすと、連続相に分散して 3 次元構造を形成

出物が見られPickeringエマルションであることが推察さする。塗布時に液滴の破壊が起こるため、油相を効果的にれた。ZhangらはCDによるエマルションの形成は水／油塗布ができるといった特徴があるため、クリーム性基剤と界面張力の低下と不溶性複合体が形成するミクロクリス

して応用できる可能性がある。今後は析出物が生成する条タルによる水／油界面への吸着によるPickeringエマルシ件を検討することで、実用化に近づけると考えられる。

ョンの形成の 2 つのメカニズムにより安定化すると報告しFigure 8 The formation mechanism of emulsion stabilized by cyclodextrins. (a) wateror oil droplets, (b) precipitates generate and adsorb on the surface of droplets, (c)surface of the droplets were covered with generated precipitates and contributed to
the formation of the three-dimensional network structure in the dispersed phase.

− 12 −

シクロデキストリンを用いたサーファクタントフリーエマルションの安定化メカニズムの解明

謝辞4） Fowkes, F. M. The Journal of Physical Chemistry
1962, 66, 382-382.

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援をいたただきま
した公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心よ

5） Fowkes, F. M. Industrial & Engineering Chemistry
1964, 56, 40-52.

り感謝申し上げます。

6） Mathapa, B. G.; Paunov, V. N. Physical Chemistry（引用文献）

Chemical Physics 2013, 15, 17903-17914.

1） Kazuko, S.; Kimiko, K.; Junko, I.; Takashi, N. Food

7） Leclercq, L.; Nardello-Rataj, V. Eur. J. Pharm. Sci.
2016, 82, 126-137.

Science 1992, 57, 655-656.
2） Inoue, M.; Hashizaki, K.; Taguchi, H.; Saito, Y. Chem.

8） Li, X.; Li, H.; Xiao, Q.; Wang, L.; Wang, M.; Lu, X.;
York, P.; Shi, S.; Zhang, J. Physical Chemistry Chemical

Pharm. Bull. 2008, 56, 668-671.
3） Hirayama, F.; Yamanaka, M.; Horikawa, T.; Uekama,
K. Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 130-136.

− 13 −

Physics 2014, 16, 14059-14069.

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討 ─放射光 X 線を用いたアプローチ─
静岡県立大学薬学部臨床薬剤学分野

内野智信

We have developed drug loaded nanoparticle formulations for the improvement of drug permeation across the skin.
Recently, we have investigated drug permeation mechanism across the skin by synchrotron X-ray diffraction. In this study,
phospholipid nanoparticles (PNs) containing vitamin C, 3-O-cetyl ascorbic acid (VCCE) were examined. Tocopherol acetate(TA) and sodium cholate (SC) were also loaded in PN formulations as model drug and charge inducer at a molar ratio of
20/80/5/6 (VCCE/Soya PC/SC/TA). Glycerol (GL) or diglycerol (DG) were also added to improve the skin accumulation of
TA. Three TA loaded PNs (TA-PNs) were evaluated using a dynamic light scattering, Nuclear Magnetic Resonance (NMR),
Transmission Electron Microscope (TEM), skin accumulation test for TA, and small-angle X-ray diffraction (SAXD) analysis.
TA-PN formulations (150 nm) were stable for two weeks and they encapsulated 1.8 mg/mL of TA. TEM and SAXD analysis
revealed that the nanoparticles formed a spherical multilayer structure. 1H-NMR spectra indicated that GL and DG enhanced
the proton mobility of choline groups of soya PC molecules located on the membrane surface of TA-PNs. TA accumulationin the dermis was increased by adding GL and DG. SAXD analysis revealed that GL and DG promoted the formation of newlamellar structures on the stratum corneum, which contributed to improving the skin accumulation of TA.

1. 緒

言

薬物が角層を浸透する場合、薬物は細胞間脂質間の分配を繰り返しながら浸透していく（細胞ルート）のではなく、細胞間隙を浸透している（細胞間隙ルート）と考えられている。
これまでにこの角層のバリア能を効率的に突破する手法の一つとして、
100 nm 程度の粒子径をもったナノ粒
子に薬物を封入することにより、封入された薬物の皮膚浸透性を向上させる
検討が多数行われているが 1 - 3）、薬物
皮膚浸透性メカニズムの詳細は未だ議論の最中である 4）。
本研究の最終的な目的は、薬物輸送担体として有効性があるといわれておFig. 1

Structure of stratum corneum and drug permeation route

り、一方において角層に浸透するかどうかに関する議論の角層の細胞間脂質は、主としてセラミド、脂肪酸、コレあるナノ粒子が角層に作用する際に角層構造にどのようなステロールからなり、自己組織化により規則性をもつラ

影響を与えているかについて、放射光を用いた小角広角 X

メラ構造を形成する。そのラメラ構造には周期が 13 nm の線散乱の時間変化測定により明らかにし、皮膚浸透性機構、

長周期ラメラ構造と 6 nm の短周期ラメラ構造が存在する。

さらに有効性を解明し、この分野の発展に資することであ

また、炭化水素の充填構造（ラテラル構造）として、六方晶る。

（格子定数 0 . 42 nm）と直方晶（格子定数 0 . 42 nm、0 . 37 nm）
Investigation of the effect of differences inphysical properties of nanoparticles on theinteraction between nanoparticles and thestratum corneum using X-ray diffraction
Tomonobu Uchino
Department of Clinical Pharmaceutics,
School of Pharmaceutical Sciences,
University of Shizuoka

が報告されている 5）。
これまでに我々は、二重層構造をもったベシクルをヒト角層に作用させた後の X 線散乱の時間変化測定を行ったと
ころ、ナノ粒子は角層の細胞間脂質の短周期ラメラ構造と相互作用しており、角層浸透過程においてそれらの構造を乱すこと、ナノ粒子の弾力性が高いほうが短周期ラメラ構
造の周期を伸長させる効果が大きいことを報告した 6）。封− 14 −

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討

入薬物の皮膚浸透性を改善するナノ粒子は、弾力性は同程

─放射光 X 線を用いたアプローチ─

たものを用いた。

度でも、用いる界面活性剤の物性により薬物の浸透性が異なることが明らかにされている 3）。これは、ナノ粒子の構

２．３．TA-PNs の形状観察

成成分によってナノ粒子が角層を浸透する過程におけるナ

各 TA-PNs の形状の観察を目的に、ネガティブ染色法

ノ粒子と角層の相互作用が異なることに由来すると推察さ

にて透過電子顕微鏡（TEM）（HT- 7700 , 日立製作所）観察

れるが、その詳細は明らかとなっていない。

を行った。各TA-PNsをフォルムバール膜貼付メッシュ（日

そこで本申請では、引き続き放射光 X 線の時間変化測新 EM 株式会社）に 5 µL 滴下し、5 分間静置後水分を拭き定を用い、ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけ取り、次に 1 % モリブデン酸アンモニウム溶液を 5 µL 滴下るナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討を行う

し、1 分間静置したのち 1 時間乾燥した後、TEM を用いことを目的の中心として研究を行った。本報告書において観察を行った。観察時の加速電圧は 80 kV とした。

ては、ビタミン C 誘導体膜であるビタミン C セチルエーテからなるリン脂質ナノ粒子（phospholipid nanoparticles:

２．４．TA-PNs の平均粒子径、PDI、ゼータ電位の測定

PNs）の構成成分として配合し、ビタミン E 誘導体である

各TA-PNsの平均粒子径、PDI、ゼータ電位は、Zetasizer

トコフェロールアセテート（TA）を封入薬物に用いたナノNano ZX（Malvern Instruments Ltd.）を用いて動的光散粒子、その粒子にグリセロール（GL）およびジグリセロー

乱法（dynamic light scattering：DLS）により調製から 2 週ル（DG）粒子を添加した PNs を角層に作用させた事例につ間後に測定した。全ての製剤は、0 . 1 % EDTA- 2 Na 含有

いて報告する。なお、報告する PNs の物性の違いを明確

50 mM クエン酸緩衝液（pH 5 . 0）を用いて 50 倍希釈した後、にするために、一部放射光 X 線回折測定以外のデータを紹測定を行った。ゼータ電位は同一の機器を用いてレーザー

介させていただくことをご容赦頂きたい。

ドップラー電気泳動法により測定した。

ル（VCCE）と大豆由来のホスファチジルコリン（Soya PC）

２．方
２．
１．試

法

２．５．TA 封入率の決定

料

各 TA-PNs に 封 入 さ れ て い る VCCE お よ び TA の 封

ビ タ ミ ン C 誘 導 体 で あ る VCCE は 日 光 ケ ミ カ ル ズ 株

入 率 の 測 定 に は、0 . 1 mL 用 の Slide-A-LyzerTM MINI

式会社より供与された。ビタミン E 誘導体である TA は

Dialysis Device（カットオフサイズ：2000 , Thermo Fisher

Sigma-Aldrich より購入した。膜の構成成分として用いた

Scientific Inc.）を用いた。透析膜上部に各 TA-PNs を充填

Soya PC は，Lipoid GmbH（Ludwigshafen，Germany）よした。各 TA-PNs の透析液はそれぞれの製剤の再分散溶り供与された。電荷誘起剤として用いた Sodium cholate

液 4 . 2 mL を 5 mL のポリプロピレンチューブに充填し、先（MW 431）は、和光純薬工業株式会社（Tokyo, Japan）よりの製剤を充填した Slide-A-LyzerTM MINI Dialysis Device

購入した。ポリオールである GL および DG は、阪本薬品をセットし、室温で 2 時間透析処理を行った。透析後の工業株式会社（Osaka, Japan）より供与された。その他の試それぞれの溶液に含有している VCCE および TA を下記の薬は、特級品を用いた。

HPLC 法により定量した。VCCE および TA の封入率は透析後薬物量（the amount of drugs after dialysis）および透２．
２．TA- PNs の調製方法

析前薬物量（the amount of drugs before dialysis）を用い

TA-PNs は、これまでの我々が用いてきた手法を改変
し

2 , 3 , 7）

、薄膜法により調製した。あらかじめ調製した

VCCE、Soya PC、SC、TA の エ タ ノ ー ル 溶 液 を VCCE/て、次式により算出した：
薬物封入率 EE% =Soya PC/Sodium cholate/TA の モ ル 比 が 20 / 80 / 5 / 6 になるよう混合した後、ロータリーエバポレーターを用い

the amount of drugs after dialysis
the amount of drugs before dialysis

× 100

1

２．６． H-NMR 測定て減圧下、40 ℃で有機溶媒を除去した。得られた薄膜に

各 TA-PNs の 1 H-NMR は、JEOL ECA- 500（日本電子

0 . 1 % EDTA- 2 Na 含有 50 mM クエン酸緩衝液（pH 5 . 0）を株式会社）を用いて、共鳴周波数 500 MHz で測定した。全

加えてバス型ソニケーターを用いて超音波処理を 5 分間行ての測定は、ヒトの平均的な皮膚表面温度と同様の 32 ℃

い、薄膜を懸濁させた後、Extruder を用いて懸濁液を孔で行った。Relaxation delay は 5 秒、積算は 100 回で測定

径 100 nm のポリカーボネートフィルターから押し出す操した。Data point は 16384 とした。試料調製は２．２．の作を 10 回行い、TA-PNs を調製した。GL および DG を添方法に準じて行い、再分散溶液には軽水の代わりに重水を加する場合は、再分散溶媒として 0 . 1 % EDTA- 2 Na 含有

使用した。

50 mM クエン酸緩衝液（pH 5 . 0）にそれぞれを 30 % 添加し− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．７．TAの in vitro 皮膚浸透性試験および皮膚貯留性試験
In vitro 皮 膚 浸 透 試 験 に は ユ カ タ ン マ イ ク ロ ピ ッ グ（YMP）を用いた、YMP 皮膚膜は角層側をドナー側、真皮側をレシーバー側となるようにしてフランツ拡散セル（有効拡散面積：0 . 38 cm 2）に装着した。ドナーコンパー
トメントに各製剤 500 µL を適用し、レシーバー溶液として 30 % エ タ ノ ー ル 含 有 PBS（pH 7 . 4）5 . 0 mL を 使 用 した。試験中、レシーバー溶液はスターラーで連続的に撹拌し、恒温送水ポンプを用いて温度を 37 ℃に保った。皮膚に製剤を適用した後、ドナーコンパートメントをパラフ
ィルムで覆い、閉塞（occlusive）条件にした。皮膚透過性試験では、0、1、2、4、6、24 時間ごとにレシーバー相より 200 µL 溶液を採取し、採取後に同量のリザーバー溶液を補充した。貯留性試験では、24 時間後の適用部位の皮膚（0 . 38 cm 2）を使用した。実験後に皮膚上の適用製剤を十分にふき取った後、皮膚をスライドグラスに挟み、60 ℃

Fig. 2 Schematic image of sample measurement using
solution cellで 12 分間加温し、表皮と真皮に分離した 8）。表皮と真皮
測定は、八田らの開発した「溶液セル」を使用した 9）（Fig.

をそれぞれチューブに入れ、内部標準物質を含むエタノール溶液（Ergocalciferol 5 µg/mL）を 1 . 0 mL 加えた。その後、

2）。

ホ モ ジ ナ イ ザ ー（IKA ULTRA-TURRAX T 10，IKA

TA-PNs の処方の X 線回折測定の場合には、製剤を溶液

ジャパン株式会社）を用いてホモジナイズし、10000 rpm

セル内に注入し、TA-PNs の X 線スペクトルの測定を行っで 10 min 遠 心 分 離 を 行 い、 上 清 を 採 取 後 フ ィ ル タ ーた。サンプルの X 線の露光時間は 5 秒とした。

®

（TORAST Disc SyringeFilter，疎水性 PTEE メンブレン，

TA-PNs と角層の相互作用解析の場合、溶液セルの中央

直径 13 mm，孔径 0 . 45 µm）でろ過し、HPLC を用いて TA

部に約 1 × 2cmの高水和（78.8% w/w）
または低水和（22.3%

量を測定した。

w/w）のヘアレスマウス角層（数 mg）を充てん後、X 線回折装置にセットした後、シリンジ部分に処方溶液を作用さ

２．
８．HPLC によるVCCE および TAの定量

せ、適用から 30 分後までは 1 . 5 分ごと、30 分後から 123

HPLC システムは、ポンプ（LC- 20 AD，島津製作所）、

分後までは 3 分ごと X 線を測定し、製剤適用後の経過時間

オートインジェクター（SIL- 20 AC，島津製作所）、UV 検に伴った角層および、ベシクルの構造変化を測定した。サ

出器（SPD- 20 A，島津製作所）、解析システム（CBM- 20 A，ンプルの X 線の露光時間は 5 秒とした。なお、Fig. 8（c）

島津製作所）から構成されているものを使用した。カラムおよび（d）では、得られたプロファイルの S= 0 . 1 nm- 1 のピ

は TSK-gel ODS- 100 Z 3 µm（100 × 2 . 0 mm， 東 ソ ー 株ークから、積分強度および半値幅を算出し、サンプル適用

式会社）、ガードカラムは TSK-gel guardgel ODS- 100 Z

後の経過時間に対してプロットした。

3 µm（10 × 2 . 0 mm，東ソー株式会社）を使用した。移動

３．結果および考察

相は、メタノール（0 . 1 % トリフルオロ酢酸）：水（0 . 1 % ト
リフルオロ酢酸）を 97：3（v/v）の比率で用いた。流速は３.１．TA-PNs のキャラクタリゼーション

0 . 2 mL/min、UV 波長は 285 nm と設定し、カラム温度はTable 1 に調製した 3 種類のTA-PNsの粒子特性を示した。

40 ℃とした。この条件における TA の保持時間は 10 min

調製した TA-PNs の平均粒子径は 105 . 1 ～ 131 . 6 nm で、であった。内部標準物質として Ergocalciferol（測定波長

PDI は 0 . 13 以下の値であったことから、調製したナノ粒

245 nm）
を用い、内部標準法により TA の濃度を算出した。

子は均一な分散系として存在することが示された。また、調製した各製剤のゼータ電位は−0 . 04 ～ 0 . 22 mV と、絶２．９．放射光 X 線回折測定

対値は小さいが調製直後と調製から 2 週間後の間に変化は

測定は、兵庫県の大型放射光施設「SPring- 8」のビーム

なく、安定な粒子として存在することが示された。各 TA-

ライン BL 40 B 2（構造生物学）を使用した。X 線回折プロ

PNsのTA封入率は 94.0～95.9%と高値を示した。このこと

ファイルは、30 cm×30 cm のイメージングプレートを使から、PNs 中に薬物を十分に封入できたことが確認され用した。

た。また、ポリオール未添加の系とくらべると、GL や DG

− 16 −

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討

─放射光 X 線を用いたアプローチ─

添加に伴い平均粒子径が小さくなっていた。このことから、ことが確認でき、Fig. 4 で示した SAX 測定の結果も TEM

ポリオールは TA-PNs の粒子径に影響を与えているものの結果と一致していた。また、観察した粒子の粒子径は、と推察された。

動的光散乱法で測定した結果とほぼ一致していた。次に、Fig. 3 に調製した TA-PNs の TEM 写真、Fig. 4 にそれついて検討するため、各 TA-PNs の 1 H-NMR スペクトルらの SAX 測定の結果を示した。
Fig. 3 の結果から、粒子は球状の多重層構造をしている
Table 1

Fig. 3

Table 1 で示したポリオールが各 TA-PNs に与える影響に測定を行った。その結果を Fig. 5 に示した。

Particle characterization of TA-PNs formulation（n=3）

TEM images for (a) TA-PNs, (b) GL containing TA-PNs, (c) DG containing TA-PNs.

Fig. 4 Small angle X-ray diffraction（SAXD）p rofiles of (a) TA-PNs, (b) GL-containing TA-PNs,
and (c) DG-containing TA-PNs− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Soya PCのCD 3 OD各溶液のNMRスペクトルの結果から、PNs とはメチル基のプロトンの運動性に違いがあることが3 . 2 ppm のシグナルは Soya PC のコリン基の末端のメチル認められた。また、DG 添加 TA-PNs は GL 添加 TA-PNs

基のプロトン由来であるものと帰属された。各製剤でコリにくらべピーク強度が強く、DG の方が GL にくらべ、メン基の末端のメチル基のプロトンのケミカルシフトは異なチル基のプロトンに与える影響が強いことが推察された。

っており、GL 添加 TA-PNs および DG 添加 TA-PNs では
シグナルがシャープになっていることが観察され、TA-以上の結果から、TA-PNs の脂質膜表面で起こっている現象の模式図を Fig. 6 に示した。
Fig. 6 に示したように、GL および DG 分子は TA-PNs の膜表面において Soya PC の O-P 基と相互作用することにより、コリン基の端末のメチル基の運動性を高め、脂質膜表面の流動性を向上させることが推察され、またその効果
は DG で特に強いことが推察された。
以上 Table 1 および Fig. 3 ～ 6 の結果から、調製した 3
種の TA-PNs の物性はそれぞれ異なるものと推察された。

３. ２．各TA-PNsからのTAのYMP皮膚貯留性評価
各製剤適用から 0、1、2、4、6、24 時間後の各レシーバ
ー相の TA の濃度を HPLC によって測定したところ、全てのサンプルにおいて TA は検出されなかった。このことか
ら、TA は脂溶性が高いため、24 時間では皮膚透過が起こ
りにくいことが推察された。次に、皮膚重量で補正した適用 24 時間後の TA の真皮および表皮における皮膚貯留量を測定した。その結果を Fig. 7 に示した。
Fig. 7 の結果から、TA の表皮への貯留量については各製剤間で有意差は見られなかった。しかし真皮への貯留量については、対照群に対し、GL 添加 TA-PNs および DG
添加 TA-PNs で有意差が見られたのに加え、TA-PNs と
DG 添加 TA-PNs の間にも有意差が見られた。このことから、TA-PNs への DG の添加により、封入薬物である TA

Fig. 5 1H NMR spectra of methyl region in (a) Soya PC
CD 3OD solution, (b) TA-PNs, (c) GL containing TA-PNs
and (d) DG containing TA-PNs.

Fig. 6 Speculated interaction between GL or DG and PC
molecules in TA-PNs formulations− 18 −

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討

─放射光 X 線を用いたアプローチ─

膚に適用した際、処方中の水分の蒸発に伴ってベシクル構造がラメラ構造に変化することを報告している 3）。今回の事例は溶液セル中での実験であり、製剤適用後の水分の蒸発は伴わないものの各 TA-PNs をヘアレスマウス角層に作用させることによって角層上で多重層のベシクル構造がラメラ構造へ変化しているものと推察された。Fig. 8 ⒞および ⒟ における赤矢印で示した S= 0 . 10 nm- 1 付近の積分強度および半値幅の時間経過に伴う変化を、Fig. 9 に示した。
Fig. 9 ⒜ に示したように、積分強度については、123 分
後のピーク強度は DG 添加 TA-PNs では GL 添加 TA-PNsに比べ、約 2 倍となっていた。このことから、角層と製剤の接触面が DG 添加 TA-PNs では GL 添加 TA-PNs にくらFig. 7 TA amount in the epidermis and dermis of YMP skinafter 24h of permeation study.（ mean＋S.D.（ n= 6），*p<0.05）

べ約 2 倍の広さになっていることが推察された。半値幅についてはどちらの製剤においても時間経過に伴う変化が見られなかった。このことから、角層上での製剤の積層の高さには差がないことが推察された。

の皮膚貯留性を向上させることが可能となった。Pham ら
は、GL を角層に作用させた場合、角層の細胞間脂質と角Fig. 10 にヘアレスマウス角層に各処方適用後の広角 X
線の時間変化測定の結果を示した。

層細胞の両方に作用し、それぞれの構成成分の運動性を上Fig. 10 ⒜ においては、炭化水素の充填構造（ラテラル構

昇させることで、薬物の皮膚浸透性を向上させることを報造）として、S= 2 . 4 nm- 1 および 2 . 7 nm- 1 に六方晶（格子定告している 10）。DG に関しては、そのような報告はされて数 0 . 42 nm）と直方晶（格子定数 0 . 42 nm、0 . 37 nm）に由来

いないが、DG は GL のダイマーであることから、類似のするピークが観察された。各 TA-PNs を角層に適用した効果があるものと推察され、その効果は GL よりも強いも

場合、報告されている溶液セル中に処方が満たされることのと示唆された。

によってベースラインの上昇が認められたものの、ピーク
位置や半値幅に変化は認められなかった。よって、これら

３. ３． 放 射 光 X 線を用いた角層 浸 透 過 程におけるTA-PNsと角層の相互作用評価の TA-PNs は、ラテラル構造に影響を与えないことが推Fig. 8 にヘアレスマウス角層およびヘアレスマウス角層状態の影響について検討するために、低水和量ヘアレスマに各 TA-PNs を適用した後の SAX の時間変化測定の結果

ウスの角層を溶液セルに装着し、Fig. 8 と同様の実験を行を示した。

った。その結果を Fig. 11 に示した。

察された。次に、TA の真皮への貯留に及ぼす角層の水和Fig. 8 ⒜に示したように、◆で示した位置に、13 . 6 nm

しかし、高水和された角層に GL および DG 添加 TA-の格子間隔をもつ長周期ラメラ構造の 1 ～ 5 次反射のピー

PNs で見られたベシクルからラメラ構造への転移は観察さクが観察された。各 TA-PNs を強水和角層に適用した際れなかった。このことから、Fig. 8 で見られた積層には角の SAX 測定の結果を、Fig. 8 ⒝ ～ ⒟に示した。いずれの層表面の水分子が関与しているものと推察された。さらに、-1製剤を適用した際にも、青の矢印で示した S= 0 . 16 nm 付

Fig. 12 に TA を封入していない各 PNs をヘアレスマウス角

近のピーク強度が時間経過とともに減少していることが認層に作用させた結果を示した。

められたが、この領域は長周期および短周期ラメラ構造に

いずれの系においても、ベシクルからラメラ層への相転由来するピーク、そして赤で示した処方由来のピークがオ移は観察されなかった。以上 Fig. 8 ~ 12 の結果から、TA-ーバーラップしているため、変化の解析は不可能であっ

PNs のベシクル構造からラメラ構造への構造変化は角層上-1た。次に、緑の矢印で示した S= 0 . 31 nm 付近に長周期ラの水分と TA の浸透が関与しているものと推察され、Fig.

メラ構造の 4 次反射に由来するピークが認められた。また、

13 に示したような TA の角層への浸透メカニズムが推察-1

製剤適用後に赤矢印で示した S= 0 . 10 nm 付近では、時された。

間経過に伴いピーク強度の上昇が見られた。特に GL 添加

角層サンプルは水分含量が 25 %（w/w）で水和されるこ

TA-PNs および DG 添加 TA-PNs ではその作用が強く、新とが報告されていることから、Fig. 8 の高水和量の角層表

たなピークが出現していた。我々は、これまでに sucrose-

面では多量の自由水が存在しているものと考えられる。よlaurate ester を基盤としたベシクルを非閉塞系で YMP 皮って、ベシクルが角層上に接触すると、角層上の自由水と− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Fig. 8 SAXD profile by hairless mouse stratum corneum (a) and change in the SAX profiles after application of (b) TAPNs, (c) GL containing TA-PNs and (d) DG containing TA-PNs for the strongly hydrated hairless mouse stratum
corneum. Black and red line showed stratum corneum and each formulation, respectively. The change from dark blue togreen indicate that of the SAX profile from 0 to 123 min.
Red allow in Fig. 8 (b), (c) and (d) shows the structure due to the new lamellar phase.

− 20 −

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討

─放射光 X 線を用いたアプローチ─

Fig. 9 Change in the (a) integrated intensity, and (b) full width half maximum for the peak at S=0.10
nm-1 in the SAX profiles after GL containing TA-PNs（●）and DG containing TA-PNs（●）application.

Fig. 10 Wide angle X-ray Diffration(WAXD) profile by hairless mouse stratum corneum (a) andchange in the WAX profiles after application of (b) TA-PNs, (c) GL containing TA-PNs and (d) DG
containing TA-PNs for the strongly hydrated hairless mouse stratum corneum. The change fromdark blue to green indicate that of the SAX profile from 0 to 123 min.

− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Fig. 11 Change in the SAXD profiles after application of (a) TA-PNs, (b) GL containing TA-PNs and (c) DG
containing TA-PNs for the weakly hydrated hairless mouse stratum corneum . Black and red line showed stratum
corneum and each formulation, respectively. The change from dark blue to green indicate that of the SAX profile
from 0 to 123 min.

Fig. 12 Change in the SAXD profiles by (a) TA-PNs, (b) GL containing TA-PNs and (c) DG containing TA-PNs forthe strongly hydrated hairless mouse stratum corneum. Black and red line showed stratum corneum and each
formulation, respectively. The change from dark blue to green indicate that of the SAX profile from 0 to 123 min.

− 22 −

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討

─放射光 X 線を用いたアプローチ─

Fig. 13 Speculated mechanism for the effect of polyol in the TA-PNs formulationon the lamination forming (a) TA-PNs, (b) GL containing TA-PNs, (c) DG
containing TA-PNs.

の相互作用により、ベシクル構造からラメラ構造への構造変化が起こり、角層上に積層することで TA の浸透が起（引用文献）
1） Uchino T., Murata A., Miyazaki Y., Oka T., Kagawa

こるものと推察された。1 H-NMR の結果から、GL や DG
は TA-PNs の表面に存在し、脂質膜の流動性に変化を与Y., Chem Pharm Bull. 63, 334-340（2015）．
2） Uchino T., Lefeber F., Gooris G., Bouwstra J., Eur J
Pharm Biopharm. 86, 156-166（2014）．

えていることが明らかとなっている。そのため、ポリオ
ールはベシクル構造からラメラ構造への転移を促進する

3） Uchino T., Matsumoto Y., Murata A., Oka T., Miyazaki
Y., Kagawa Y., Int J Pharm. 464, 75-84（2014）．

効果があるものと推察された。また Fig. 7 の解析結果から、-1

S= 0 . 10 nm に出現したピーク強度が GL と DG で 2 倍とな

4） El Maghraby G. M. M., Williams A. C., Barry B. W., Journalっていたこと、TA の真皮への浸透量は DG 添加系の方がof Pharmacy and Pharmacology. 58, 415-429（2006）．

多かったことを考えると DG の方がベシクル構造からラメ

5） Ohta N., Ban S., Tanaka H., Nakata S., Hatta I., Chem
Phys Lipids. 123, 1-8（2003）．

ラ構造への促進効果が高いものと考えられ、このベシクルからラメラ構造への構造変化のしやすさが DG 添加系にお6） Uchino T., Hatta I., Miyazaki Y., Onai T., Yamazaki T.,
Sugiura F., Kagawa Y., Int J Pharm. 521, 222-231（2017）．

ける TA の皮膚浸透性向上の一助となっているものと推察

7） Uchino T., Lefeber F., Gooris G., Bouwstra J., Int J

された。

４．総

Pharm. 412, 142-147（2011）．

括8） Wester R. C., Christoffel J., Hartway T., Poblete N.,

以上一連の結果から、放射光 X 線を用いることにより物

Maibach H. I., Forsell J., Pharm Res. 15, 82-84（1998）．

性の異なる TA-PNs が TA の皮膚浸透を促進するメカニズ

9） Hatta I., Nakazawa H., Obata Y., Ohta N., Inoue K.,

ムを明らかにすることが可能となった。この一連の研究成Yagi N., Chem Phys Lipids. 163, 381-389（2010）．

果は、コスメトロジー研究の発展の一助となると考えられ

10）Pham Q. D., Björklund S., Engblom J., Topgaard D.,
Sparr E., Journal of Controlled Release. 232 , 175 - 187る。

（2016）．

− 23 −

化粧くずれの低減を目的とした
新規な非水素結合性有機ゲル化剤の開発
山口大学大学院創成科学研究科

岡本浩明

Novel organic gelators without hydrogen-bonding functional groups were developed and investigated for application tocosmetic materials. It was found that these organic gelators form fluorous solvent gels with an addition amount of less than
5%. The fluorous gels are physical gels that undergo a sol-gel transition, thermo-reversibly, and the transition temperaturechanges from 120°C to room temperature depending on the amount of the organic gelator. From the dynamic viscoelasticity
measurements of the fluorous solvent gels, it was found that the gels exhibited a relatively liquid property while exhibiting ahigh viscosity.

１．緒

コール性溶媒や炭化水素系溶媒のみならず、低分子量の有言機化合物では、ゲル化が困難とされてきた高誘電率有機

化粧くずれは、汗や皮脂といった生体からの分泌物によ

溶媒やイオン液体や高誘電率有機溶媒などの多様な有機溶る化粧膜の濡れや、雨や埃などの付着や衣服に接触し、す媒を達成している。この有機ゲル化剤から構築したゲルは、れるなどの物理的摩擦により生じるとされている。外観上

加熱・冷却により、ゾル（液体）・ゲル（擬固体）に変化するの化粧くずれは、あぶらが浮いてくる、肌がてかる、色が物理ゲル（図 1）である 1 - 9）。本研究課題ではこれらの先行

くすむといった現象とされており、特に、
「てかり」
に化粧

研究において開発した有機ゲル化剤を礎に、フルオラス溶

くずれを感じる人が多いとされている。このような化粧く媒のゲル化を達成するべく、水素結合性の官能基を含まなずれは、てかりと関係が深い皮脂がもっとも問題視されてい「非水素結合性」の有機ゲル化剤を開発し、形成したゲル

おり、皮脂の分泌により化粧膜がくずれないため考えられの熱物性を解析した。その上で、化粧品として使い心地をている。この化粧膜が皮膚から分泌される皮脂（脂成分）と考慮し、構築したフルオラス溶媒ゲルのレオロジー特性のなじまなければ、化粧くずれは起こらないため、最近で解明を試みた。

は、フッ素化合物による処理が期待されている。ところが、本研究を達成するために、図 2 に示すようなエステル基

はつ油性の高いフッ素化合物は、耐皮脂性に優れるものの、の配向方向とペルフルオロアルキル鎖長の異なり、水素結

肌への親和性が低く、密着性に乏しいといった欠点も指摘

合性の官能基を含まない化合物 1 -n および化合物 2 -n をされている。すなわち、これらのフッ素化合物の肌への親分子設計した上で、本研究課題を遂行することとした。

和性と密着性を高めるためには、フッ素化合物をゲル化することによる粘度上昇が効果的であると考えられる。ところが、はつ油性の高いフッ素化合物をゲル化する化合物（有機ゲル化剤）はほとんど知られていない上に、形成したゲルの物性に関する研究例はほとんどない。さらに、有機ゲ
ル化剤が細胞に取り込まれるリスクを考慮して、水素結合性の官能基を分子内に含まない構造とすることで、親水性を低減した分子構造が必要と考えた。

図1

物理ゲル
（熱可逆的ゲル）そこで本研究では、フッ素化合物、特に、高度にフッ素化されたフルオラス溶媒を微量の添加量でゲル化可能な有機ゲル化剤の開発する。すでに、先行研究において、アルDevelopment of new non-hydrogenbonding organic gelators for reducing
makeup deterioration
Hiroaki Okamoto
Graduate School of Sciences andTechnology for Innovation, Yamaguchi
University

図２ 有機ゲル化剤（化合物 1-n および化合物 2-n）の分子構造

− 24 −

化粧くずれの低減を目的とした新規な非水素結合性有機ゲル化剤の開発

２．方G 1000（株式会社 UBM）（図 4）を用い、定常流粘性測法

定では、コーンプレートを用い、プレートギャップは２．
１．有機ゲル化剤の合成方法

0 . 05 mm、 剪 断 速 度 依 存 モ ー ド、 剪 断 速 度 は、0 . 01 ～

下記に示す合成経路（スキーム 1）に従い、化合物 1 -n お

143 s−1 の範囲で測定した。一方、動的粘弾性測定では、よび化合物 2 -n（n= 4 または 6）を合成した。化合物の分

パラレルプレートを用い、プレートギャップは 1 mm、周子構造の同定は 1 H NMR および IR スペクトルなどを用い

波数依存モード、周波数は 0 . 01 ～ 10 Hz の範囲で測定した。

て行い、物性測定には純度が 99 . 9 % 以上の物質を用いた。

２．
２．フルオラス溶媒ゲルの熱物性の測定方法

３．結果と考察

ゲル化の確認は目視により、室温でゲル化するために必

３．
１．化合物 1- n および化合物 2 - n の最低ゲル化濃度とゾル−ゲル転移温度

要な最小添加量を最低ゲル化濃度とし、形成したゲルを加化合物 1 -n および化合物 2 -n の最低ゲル化濃度を表 1 に熱してゾルになる温度をゾル−ゲル転移温度とした。フルまとめた。最低ゲル化濃度とは室温でゲルの状態を維持でオラス溶媒としては、揮発性が小さく、加熱による重量変きる最低のゲル化濃度のことを示し、カッコ内の値が小さTM®︎化が小さい DEMNUM （ダイキン）および Krytox （デいほど、少ない添加量でゲル化できることを示す。したが

ュポン）
を用いた
（図 3）
。

って、値が小さいほど、高性能な有機ゲル化剤と言える。

２．
３．フルオラス溶媒ゲルのレオロジー特性の測定方法

最低ゲル化濃度が低下したことから、ペルフルオロアルキ

フ ル オ ラ ス 溶 媒 ゲ ル の レ オ ロ ジ ー 特 性 は、Rheosol

ル鎖長がゲル化に及ぼす効果が大きいことがわかった。一化合物 1 -n はペルフルオロアルキル鎖長の伸長に伴い、スキーム１

有機ゲル化剤（化合物 1-n および 2-n）の合成スキーム

図３

DEMNUMTM および Krytox® の構造

表1

図４

レオメーター（左、G1000）と測定用プレート（右）− 25 −

化合物 1-n および化合物 2-n の最低ゲル化濃度（wt%）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

方、化合物 2 -n では、ペルフルオロブチル基を持つ化合物

転移温度は上昇し、化合物の分子構造に依存したゾル - ゲ

2 - 4 では沈殿が生じるものの、ペルフルオロヘキシル基

ル転移温度を示すことがわかった。さらに、ペルフルオロを持つ化合物 2 - 6 ではゲルを形成することがわかった。

アルキル基の炭素鎖長の伸長によりゾル−ゲル転移温度は上昇する傾向にあり、有機ゲル化剤の分子内のエステル基

３．
２．フルオラス溶媒ゲルのゾル−ゲル転移温度の配向方向の違いがゾル−ゲル転移温度に大きな影響を与フルオラス溶媒として Krytox® を用いた場合のゾル−ゲ

えることがわかった。

ル転移温度を化合物 1 -n および 2 - 6 の濃度に対してプロ

一方、フルオラス溶媒の分子構造、すなわちペルフルオ

ットした結果を図 5 に示す。化合物 1 - 4、2 - 6 はゾル－ゲ

ロアルキル鎖の分岐の有無はゾル−ゲル転移温度には、大ル転移温度は低く、3 wt％程度の濃度では 30 ℃〜 50 ℃程きな影響を及ぼさないことがわかった。このことは、はつ度であった。一方、化合物 1 - 6 はゾル－ゲル転移温度が油性の高いフッ素化合物においても同様の傾向を示すと考比較的高く、3 wt% 以上の濃度では 100 ℃以上のゾル−ゲ

えられ、化粧品への応用に向けた基礎物性を示した結果とル転移温度となった。

言える。

同様に、フルオラス溶媒として、DEMNUMTM を用いた場合のゾル−ゲル転移温度を図 6 にまとめた。その結果、

３．３．フルオラス溶媒ゲルのレオロジー特性®

フルオラス溶媒として、Krytox を用いた場合と同様に、

上記の結果を踏まえ、構築したフルオラス溶媒ゲルのレ化合物 1 - 4、2 - 6 はゾル－ゲル転移温度は低く、3 wt％程

オロジー特性を測定した。図 7 に DEMNUMTM の定常流粘度の濃度では 30 ℃〜 50 ℃程度であり、化合物 1 - 6 はゾル

度測定の結果を示す。低速領域での粘度は数 Pa·s 程度の－ゲル転移温度が比較的高く、3 wt% 以上の濃度では 100

粘度であり、高速領域では粘度が低下していることがわか℃以上のゾル−ゲル転移温度となることがわかった。これる。再び剪断速度を低速領域へ戻すことで、概ね粘度が回らの結果から、化合物の添加量の増加に伴い、ゾル−ゲル

復していることがわかる。

140

Tgel-sol /

120
100

1-4

80

1-6

60

2-6

40
20
0

0

図５

1

2

3

4

Concentration/wt%

56化合物 1-n と化合物 2-6 のゾル−ゲル転移温度（フルオラス溶媒：Krytox®）

図７

図6

化合物 1- n と 化合物 2-6 のゾル−ゲル転移温度（フルオラス溶媒：DEMNUMTM）

DEMNUMTM の定常流粘度測定の結果− 26 −

化粧くずれの低減を目的とした新規な非水素結合性有機ゲル化剤の開発

このような粘度特性を示す DEMNUMTM に化合物 1 -nおよび化合物 2 - 6 を 5 wt％程度を添加した DEMNUM

TM

ものの、応力を取り除くことにより、粘度が回復することからゲル構造が再構築していることが示唆されている。
さらに、動的粘弾性測定からフルオラス溶媒ゲルの粘性

ゲルの定常流粘度測定の結果を図 8 〜図 10 に示す。
ゾル−ゲル転移温度が比較的低い化合物 1 - 4 や 2 - 6 に要素と弾性要素を測定した。動的粘弾性測定は、上記の定

おいては、低い剪断速度領域では粘度上昇が見られたもの

常流粘性測定と異なり、物質に与える応力およびそれに伴の、高い剪断速度の領域においては、フルオラス溶媒と同うひずみが正弦波である。本実験ではフルオラス溶媒ゲル

程度の粘度を示すことがわかった。高い剪断速度領域からに振動を与え、応力とひずみの位相のピーク値と時間軸上低速の剪断速度領域と変化させた場合、粘度低下が観測さにおける位相差との関係から物体の粘性要素と弾性要素をれた。このような定常流粘度測定におけるヒステリシス特測定した。

性は、化合物 1 - 6 から形成した DEMNUMTM ゲルにおい図 12 および図 13 に、化合物 1 - 4 および化合物 1 - 6 のても観測されるが、剪断速度の低速領域から高速領域の全濃度が 3 wt% における DEMNUMTM ゲルの動的粘弾性の測領域において、化合物 1 - 4 や化合物 2 - 6 よりも二桁程度定結果を示した。貯蔵弾性率（G’）が弾性要素を表し、損失高い粘度を示すことがわかった。

弾性率（G”）が粘性要素を示す。G’ ＞ G” のとき、試料は固さらに化合物 1 - 6 が低濃度（3 wt%）の DEMNUM

TM

ゲル体的であり、G’＜G”のとき、試料は液体的であることを示す。

おいても、全体の粘度は低下するものの、図 11 に示すよ

図 12 に示すように、化合物 1 - 4 の DEMNUMTM ゲルは

うにヒステリシス損が小さいように思われる。これらの結低周波数側から 1 . 2 Hz 程度までは G’ ＞ G” となることから、

果は、剪断応力によりフルオラス溶媒ゲルの構造が崩れる

低周波数のとき固体的な性質が優勢なゲルと言える。一方、

図8

DEMNUMTM ゲルの定常流粘度測定
化合物 1-4 の濃度：5wt%

図9

DEMNUMTM ゲルの定常流粘度測定
化合物 1-6 の濃度：5wt%

図 10

DEMNUMTM ゲルの定常流粘度測定
化合物 2-6 の濃度：5wt%

図 11

DEMNUMTM ゲルの定常流粘度測定
化合物 1-6 の濃度：3wt%− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 12

化合物 1-4 の動的粘弾性

図 13

1 . 2 Hz 以上の高周波数のとき G’ ＜ G” であることから、液謝

化合物 1-6 の動的粘弾性

辞

体的な性質が優勢なゲルとなることがわかった。一方、化

ここで紹介した研究は当研究室の学生諸氏の協力による合物 1 - 6 の DEMNUMTM ゲルの場合には、図 13 に示すよ成果であり、学生各位に心よりお礼を申し上げます。また、

うに全測定周波数（0 . 01 Hz ～ 10 Hz）において G’＜ G” であ本研究課題を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコることから液体的な性質が優勢なゲルであることがわかっ

スメトロジー研究財団のご支援を頂きましたことに深くおた。さらに、化合物 1 - 6 の DEMNUM

TM

ゲルが G’ , G” の礼を申し上げます。

値が、化合物 1 - 4 の DEMNUMTM ゲルよりも全体的に大きいことから、複素弾性率（G*）
が大きいといえる。すなわ（引用文献）

ち化合物 1 - 6 の方が化合物 1 - 4 より、同量を変形させる

1） H. Okamoto, EKISHO, 24, 112-120（2020）．

場合に大きな力が必要なゲルを形成することがわかった。

2） 岡本浩明、森田由紀、特願 2020-37205.

４．総3） B. Cao, C. Shen, Y. Xu, Q. Zhou, Y. Morita, H.

括Okamoto, and Q. Xiao, J. Fluorine Chem., 226, 109348109354（2019）．

①本研究により、フルオラス溶媒をゲル化する低分子量の有機化合物（有機ゲル化剤）
を開発することができた。こ4） B. Cao, C. Shen, R. Wang, H. Ding, R. Yang, H.
Okamoto, and Q. Xiao, Chem. Lett., 48, 312-314（2019）．

れらの化合物は、従来の有機ゲル化剤の分子構造とは異なり、分子内に水素結合性の官能基を含むことなく、両5） A. Ohashi, N. Uematsu, N. Tsukiyama, Y. Morita andH. Okamoto, Chem. Lett., 47, 810-813（2018）．

親媒性の化合物でもない、全く新しい分子設計に基づいた化合物である。これらの有機ゲル化剤は、極めて微量

6） T. Yoshida, A. Ohashi, Y. Morita and H. Okamoto,Mol. Cryst. Liq. Cryst., 647, 299-306（2017）．

の添加量でフルオラス溶媒をゲル化することがわかった。
②本研究により開発した有機ゲル化剤から形成したフルオ

7） B. Cao, Y. Kaneshige, Y. Matsue, Y. Morita and H.
Okamoto, New J. Chem., 40, 4884-4887（2016）．

ラス溶媒ゲルは、有機ゲル化剤の分子構造や添加量によりゾル−ゲル転移温度を制御できることがわかった。そ8） B. Cao, S. Hayashida, Y. Morita, and H. Okamoto,Mol. Cryst. Liq. Cryst., 632, 49（2016）．

の一方で、フルオラス溶媒の分子構造に対するゾル−ゲ9） 森田由紀、岡本浩明、イオン液体のゲル化とイオン液

ル転移温度の変化量は小さいことがわかった。
③有機ゲル化剤を数％程度添加することで、フルオラス溶
24媒の粘度を 10 〜 10 倍程度も上昇することが可能であることがわかった。さらに、動的粘弾性測定からは、比較的液体的な性質が優勢なフルオラス溶媒ゲルであることがわかった。

− 28 −

体ゲルの特性、低分子ゲルの開発と応用、シーエムシー
出版、2016 年、pp. 132-139.

テラヘルツ波を用いた皮膚への化粧水浸透評価手法の開発
岡山大学大学院ヘルスシステム統合科学研究科

紀和

利彦

The penetration speed of a cosmetic liquid into human skin is recognized as an important parameter for developing
cosmetics. A terahertz time-of-flight (THz-TOF) method was applied to nondestructively evaluate the penetration speed.
In contrast to the conventional THz-TOF method that utilizes THz pulses traveling through free space, skins were directly
mounted on the Si-based THz emitter in the THz-TOF method. The difference between penetration speeds for tap water andcoconut oil was clearly observed using the proposed method. Additionally, mixing ratio dependence was observed with respect
to the penetration speed for an ethanol and distilled water mixture. These results indicated that the THz-TOF method with thesilicone-based THz emitter could be a potentially useful option for evaluating cosmetic liquids.

１．緒

２．方

言

法

本研究では，化粧水有効成分の皮膚への浸透速度を高速

図 1 は化粧水浸透評価の概念図である。計測ではセンシ

定量評価する新しい手法を開発する。これまでにない新

ングプレート上に皮膚モデルあるいは，培養皮膚が設置さしい手法として，多層構造材料の深さ方向の定量評価がれている。基板側からレーザーを励起することで，センシ可能であるテラヘルツ波飛行時間測定法（THz-TOF 法：

ングプレートで発生したテラヘルツ波の一部は，直接，空Terahertz Time-of-Flight 法）を採用し，加えて，テラヘ間へ放射する T 1。また，一部は，皮膚モデル中で化粧水

ルツ波放射素子と皮膚試料マウントを一体型にした評価チが浸透した境界で反射し，空間へ放射する T 2。このとップを新しく開発する。

き，テラヘルツ波 T 1 と T 2 の到着時間差を計測することで，皮膚への薬剤浸透を評価することは，化粧水の薬効を知る上で重要である。皮膚は，基底層，有棘層，顆粒層，角どれくらい化粧水が浸透しているかを評価することが可能である。

質層といった構造の異なる組織がわずか 0 . 2 mm の厚さに

図 2 は，本グループで開発したテラヘルツ波計測装置の構成されており，かつ，細胞の粗密，隙間を埋める皮脂の光学システム図および写真である。レーザー光源として状態によって，薬剤浸透が大きく異なるなど複雑である。

は Spectra-Physic 社製フェムト秒一体型モードロックチ

しかしながら，倫理の観点から，人や動物へ直接薬剤を塗タンサファイアレーザーを使用し，そのスペックは出力

布し，評価する実験を探索的網羅的に行うことは出来ない。

800 mW，中心波長 780 nm，パルス幅 100 fs，パルスの繰

これに対して，テラヘルツ波を用いて，非破壊で薬剤浸透り返し周波数は 82 MHz である。出力されたレーザーパルを評価する。これにより，薬剤浸透の経時変化が評価出スはビームスプリッターによってポンプ光とプローブ光に来るようになる。さらに，本研究で開発するテラヘルツ波放射素子と皮膚試料マウントを一体型にした評価チップは，
チップのどの場所からでも任意にテラヘルツ波を放射させることが出来る。この為，同一皮膚モデルの異なる位置に異なる薬剤を塗布することで，それぞれの薬剤の浸透を同時に評価することが出来る 1）。
得られる成果は，病理学的に有用な知見を与えるのみではなく，将来，化粧水の効果を高速・正確に評価する装置を提供することが出来るなど社会的な波及効果が大きい。
Evaluation method of penetration speedof cosmetic liquid into skins using
terahertz technology
Toshihiko Kiwa
Graduate School of Interdisciplinary
Science and Engineering in Health
Systems, Okayama University− 29 −

図1

化粧水浸透評価の概念図

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図2

開発したテラヘルツ波計測装置の光学システム図および写真分けられる。図 2 に示す通りに，ポンプ光はチョッパーによって 2 kHz に変調されて集光レンズによって集光された
後，センシングプレートに入射する。一方で，プローブ光は時間遅延ステージを経由したのち集光レンズで集光され光伝導アンテナに入射する。これによって光伝導アンテナ
から電流を得ることでテラヘルツ波を検出することが出来る。ただし，電流は nA オーダーと非常に小さいため電流
増幅器を経由して増幅したものを検出する。増幅された電流はロックインアンプに入力され，チョッパーの 2 kHz の参照信号と同期検波を行うことで PC で時間波形の取得を行う。ロックインアンプはエフエヌ回路設計ブロック社製

図3（LI 5640），電流アンプは Femto 社製 LCA シリーズ Ultra-

鳥皮膚への浸透評価結果

Low-Noise Current Amplifier（LCA- 40 K- 100 M）を使用している。本研究においてはテラヘルツ波の水蒸気による吸収を軽減することや，レーザーの使用，信号が微弱であることを考慮して，実験は実験環境 21 ℃，湿度 25 % 程度に保たれている電磁波遮蔽室
（シールドルーム）内で行った。

３．結果・考察
図 3 は皮膚モデルとして，鳥皮膚を用い，パームオイル
および水道水を浸透させたときの浸透の時間変化を示している。飛行時間差は，T 1 と T 2 の時間差を意味しており，負に大きくなるほど，浸透していることを意味する。この
結果は，水道水に比べてパームオイルの方が早くに到着時

図4間差が変化し，浸透していることが分かった。また，図中

各エタノール含有量における浸透評価結果に示した直線はデータを線形フィットした結果である。この傾きが大きいほど浸透速度が速いことを表しており，こ0 . 125 g，0 . 250 g，0 . 500 g の 3 つのパターンを用意し，十の結果より，水道水よりパームオイルの方が，浸透速度が分に均一化するために混合したものを 5 分間撹拌して作製速いことが示された。

した。

次に開発した手法を用いて，化粧水のエタノール濃度を変化させたときの，浸透速度への影響を評価した。

図４は各エタノール含有量の浸透の時間変化を示している。エタノール含有量が 0 . 125 g では，ほとんど浸透して精製水，エタノール，グリセリンについて精製水とグリいないのに対して，エタノール含有量を増加せると，浸透

セリンについては 1 . 00 g で固定し，エタノールについては速度が大きくなることが示された。エタノールにより表面− 30 −

テラヘルツ波を用いた皮膚への化粧水浸透評価手法の開発の皮脂膜が除去され，水分が容易に浸透するようになったに対して 0 . 125 g，0 . 25 g，0 . 5 g では近似直線の傾きはマためと考えられる。

イナスになっていた。ただし，全体のプロットに対する線

次のステップとして，人皮膚に近い組織構造を持つ豚皮形フィッティングを施したため，図 5 ⒝ の 0 . 125 g につい膚を用いた計測を実施した。豚皮膚組織として，日本チては計測開始時から 10 分経過まで時間差は増加しているャールズリバー株式会社の Yucatan Micropig Skin を用いことは無視出来ない。計測値のばらつきについては位相進た。生後 5 カ月，メスの半身部分を 10 cm × 10 cm で採取みが見られなかった 0 . 125 g で最大 0 . 7 ps，0 . 25 g，0 . 5 g

したものを使用した。皮膚組織の構成は表皮，真皮，皮下ではおよそ 1 ps であった。ばらつきが少ない部分を見れば，脂肪から成っており，表皮の厚さは 75 ～ 125 µm，角質層

0 . 25 g では計測開始から 10 分経過までの位相進みは信頼

は 10 ～ 40 µm，皮下脂肪は 0 . 5 ～ 1 . 5 cm であった。計測できる値とみなせる。0 . 5 g では計測開始からすぐの位相

対象は角質層である表皮部分を用いるため皮下脂肪を切除

進みは大きいがそれ以降のばらつきはほとんど同じ値であしておよそ 1 mm 以下の厚さに調整した。豚は人と同じ哺るため 5 分経過までは信頼できると思われる。それぞれの乳類であり，皮膚構造が類似しているため in-vitro 透過試

場合の浸透速度を算出してみると，水道水と自作化粧水の験で使用が推奨されている。

間では鳥皮膚を使用した実験と同様に浸透速度，浸透深さ

皮膚組織でエタノール濃度依存性が見られたように，豚に大きな違いがあった。しかしながら，エタノール 0 . 25 g

皮膚組織でも同様の傾向が見られるか確認するため，滴下では−12 . 6 × 10−3，エタノール 0 . 5 g では−12 . 4 × 10−3 と，試料に水道水，およびグリセリン 1 g にエタノール 0 . 125 g，

エタノール含有量の増加に対して浸透速度に差がなかった。

0 . 25 g，0 . 5 g をそれぞれ配合したものを用いた。計測時

鳥皮膚，豚皮膚両方のエタノール含有量依存性評価で算間は 1 分間隔の 30 分間で行っている。この測定を 5 回分出した浸透速度比較のための棒グラフを図 6 に示す。比較

繰り返し行い，1 st パルスと 2 nd パルス間の時間差の平均

結果を見ると，鳥皮膚ではエタノール 0 . 125 g で浸透がほ値，標準誤差を算出してプロットした。なお，計測ごとに

とんど見られず 0 . 25 g で浸透速度が大きく増加しているの皮膚組織は新しく切除したものを使用した。図 5 にその結に対して，豚皮膚ではエタノール . 125 g で鳥皮膚にエタノ果を示す。

ール 0 . 25 g の自作化粧水を滴下したときと同程度の浸透速

水道水は，傾きがマイナスにはならず，30 分経過まで度となった。即ち，豚皮膚は鳥皮膚よりも少量の浸透促進基準とした横軸 0 分（計測開始時）に近い値となった。それ剤で浸透していることが分かる。鳥皮膚と豚皮膚では皮膚

図5

各エタノール含有量の浸透比較⒜水道水，⒝エタノール 0.125g，⒞エタノール 0.25g，⒟エタノール 0.5g

− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

表面の構造が異なり，鳥皮膚の場合，哺乳類に存在する通8 は，実際の浸透評価の結果である。裏面から計測した場

常の皮脂腺に加えて別の皮脂腺を有しており，羽が水を弾合に対して，傾きが逆になっていることが分かる。以上のくことが出来るようにその皮脂腺から油分を補充している。

様に，本方法では，フェイスマスクを設置することで，化従って，表面の油分量が異なるためにエタノールが少量で粧水の浸透を表面から計測出来ることが示された。

も豚皮膚で浸透促進効果が作用したと思われる。それに加４．総えて，エタノール含有量によって自作化粧水全体としての括粘性も変化している。この粘性も浸透に何らかの影響を与本研究では，多層構造材料の深さ方向の定量評価が可

えていることも考えられる。以上から，鳥皮膚組織の結果

能 で あ る テ ラ ヘ ル ツ 波 飛 行 時 間 測 定 法（THz-TOF 法：と比較して，エタノール含有量に比例した浸透速度，浸透Terahertz Time-of-Flight 法）を採用し，加えて，テラヘ

深さの変化は見られなかったが，エタノール含有量が一定

ルツ波放射素子と皮膚試料マウントを一体型にした評価チ量を超えると浸透速度，深さに違いが現れる，また，鳥皮ップを新しく開発することで，皮膚モデルへの化粧水浸透膚のときよりも少量のエタノールでも浸透していることがの定量評価を実現した。特に鳥皮膚を用いた浸透評価実験確認出来た。豚皮膚の場合でもテラヘルツ波飛行時間測定を行い水道水とパームオイルでの浸透の深さ，速度の差を法が有効となる可能性を示すことが出来た。

計測することに成功した。

以上の結果は，開発した装置により，浸透の評価が可能であることを示している。

今後，人皮膚モデルとして一般に用いられる豚皮膚を用いた計測手順の標準化を行っていく。

ここまでの計測では，皮膚モデルを用いた計測を想定し，
皮膚裏面より計測を実施した。これに対して，皮膚表面か（引用文献）

らの計測を想定した構成を検討した。図 7 は計測の構成図

1） 紀和 利彦 , 神谷 樹 , 飯田 将弘 , 井上 博文 , 堺 健司 , 豊である。テラヘルツ波を放射するセンシングプレートに，

岡 伸一 , 塚田 啓二，テラヘルツ波ケミカル顕微鏡を用

化粧水を浸潤させた市販ファイスマスクを設置，その上にいた生体関連物質評価法 日本レーザー医学会誌，39 巻，

皮膚表皮がファイスマスクに接触するように設置する。図

4 号，p.341-346，2019.1.15

図6 水道水，各エタノール含有量の自作化粧水滴下時の鳥皮膚（橙），豚皮膚（青）それぞれの浸透速度の評価

図7

フェイスマスクを用いた浸透評価の構成図

図8− 32 −

浸透評価の結果

テラヘルツ分光で切り拓く角質中に必要な水の “質” の解明
理化学研究所生命医科学研究センター

白神

慧一郎

Although the moisture content in the skin is of major interest in cosmetology and dermatology, the roles and functions ofwater are yet to be understood at a molecular level. Over more than half a century, physicochemical and biophysical studies
have emphasized the importance of hydration water that surrounds biological macromolecules to prompt their native functions,but such a “quality” of water has been overlooked in biological samples due to experimental difficulty in characterizing thefree/hydration water content in vivo. To settle this issue, in this study we constructed a homebuilt terahertz time-domain
attenuated total reflection spectroscopy system and developed a theoretical algorithm to derive the depth profile of free waterin living skin. Our results showed that the free water content in the stratum corneum of a hairless mouse is kept at particularly
low level, but applying pure water and a cosmetic lotion substantially increases the population of free water albeit temporarily.
Interestingly, the cosmetic lotion (sekkisei) was found to have a greater ability in retaining free water for a longer period,
compared to pure water.

１．緒

通常の水（自由水またはバルク水）とは異なる挙動を示すよ

言うになった水分子を水和水（または結合水や生体水）と呼び，“Water is life's matter and matrix, mother and medium.

水和水は様々な高分子の機能発現や自己組織化に積極的にThere is no life without water.” ─ 1937 年にノーベル生

関与していることが見出されている．このことは，自由水理学賞を受賞した Szent-Györgyi 博士が語ったように，水／水和水という “質”的に異なる水の状態が生命機能を織りは生命を維持する媒質として古くから重要性が認識されてなす場として機能していることを示唆しており，皮膚表皮

1）いた ．水の中で誕生した生命が約 3 億 6 千万年前に陸上内においても “量” にとどまらず水の “質” の観点から議論すに進出して以降，気相環境に適応できる体表面の上皮構造ることで保湿の本質的理解に至れる可能性がある．

の変化が進んだことで 2），我々ヒト表皮の最外殻に位置す

しかし細胞や組織中では数多の物質が不均一に分布するる角質層は体内の乾燥を防ぐ最後の砦として身体内の恒常複雑環境であることから，生体中における自由水／水和水

3）性を維持する役割を担っている ．またそれと同時に，角の質的評価を行った例は報告されていなかった．周波数

質層の保湿は健全な皮膚機能を維持するために不可欠であ

0 . 1～10 THz（1011 ～1013 Hz）で定義されるテラヘルツ波はるため，適当量の水を供給・保持することで柔軟性に富ん

近年の技術発展が著しい電磁波帯であり，可視光に比べてだ美しい肌を保つことが化粧品製剤のもつ大きな意義とな1000 倍以上も光子エネルギーが小さい安全な光として生3）っている ．そのため，これまでに角層内に存在する水や物を対象とした応用開拓が進められている．テラヘルツ波角質層から受動的に拡散喪失する水の “量” を評価する技術のもつエネルギーは自由水のピコ秒揺らぎと一致するため，によって保湿状態が定義されてきたものの，角層水分量とテラヘルツ帯の分光スペクトルは自由水の動的状態を直接

経皮水分蒸散量の間に整合性が認められない例も報告され的に反映する一方で，水和水や生体高分子の吸収は自由水

4）ており ，これは水の “量” 的観点だけでは不十分であるこに比べて圧倒的に小さいため，テラヘルツ帯は自由水のみとを示唆している．

を選択的に観測できる電磁波帯であることが近年明らかに- 12）秒という極めて短い時間ス

なってきた．そこで本研究では，皮膚表皮中の水の自由水

ケールで絶えず揺らぎ続けている一方で，タンパク質のよ／水和水評価に向けたテラヘルツ測定系を構築し，化粧水

うな生体分子の表面に位置する水分子は界面に特有の作用が皮膚表皮中の水の“質”に及ぼす影響の定量評価を行った．

液体の水分子はピコ（10を受けることでその動態が著しく遅くなることが明らかに２．方なっている 5）．このように生体分子の束縛を受けることで，法

吸収の大きい試料のスペクトルを測定する手法として，サブ波長程度の深さに局在するエバネッセント光と＂Quality” of water in stratum corneum
investigated with terahertz spectroscopy
Keiichiro Shiraga
RIKEN Center for Integrative Medical
Sciences

試料の相互作用を観測する全反射減衰（Attenuated totalreflection, ATR）測定は赤外分光で広く用いられている．
エバネッセント光の電場強度はプリズムからの距離に応じて指数関数的に減少し，光強度が 1 ⁄ e 2 に減衰する深さ dpは周波数 ν の関数として− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

d（ν）
=
p

c
+ εpsin2 θ−ε'（ν）[（εp sin2 θ−ε'（ν））2 +ε''（ν）2（]−1 （1））√2 πνで与えられる 6 , 7）．ここで，c : 真空中の光の速度，θ : 入射角，TD-ATR 測定を実施した．なお，塗布物の中に含まれる
自由水の影響を把握するために，THz TD-ATR 分光で純水と化粧水（雪肌精）のテラヘルツ帯スペクトルも測定した．

εp : ATR プリズムの誘電率実部であり，測定試料の複素誘３．結果および考察

電率を ε（̃ ν）= ε'（ν）−ί ε''（ν）としている．ATR 分光はテラヘルツ帯で大きな吸収をもつ水の分光測定においても高い

３．
１．化粧水中の水和状態評価

実用性が報告されており，高抵抗シリコン単結晶（εp= 11 . 7）

本研究で構築した THz TD-ATR 系を用いて純水と化粧をプリズムに用いると周波数 ν = 1 THz では dp ≈ 25 μm と水を測定した結果を図 1 左に示す．どちらの試料にも共通なる．この深さは角層厚みと同程度であるため，テラヘル

して，バックグラウンド測定（試料がない場合）に比べてツ帯の ATR 分光では角層中の自由水を選択的に観測でき

テラヘルツパルスの振幅が減少し，またピーク位置が後方ると期待される．そこで本研究では，中心波長 780 nm のに遅延していることが認められる．これは，全反射時にエ

フェムト秒ファイバーレーザー（FemtoFErb 780 , トプテ

バネッセント光として試料内部にもぐり込んだテラヘルツィカフォトニクス株式会社）を励起光に用いてダイポール

波が試料と相互作用し，吸収や位相遅延が起きていること

型光伝導アンテナ（G 10620 - 11，浜松ホトニクス株式会社）を表している．また純水（図中青色実線）と化粧水（赤色実

でテラヘルツパルスの発生・検出を行う全反射減衰テラ線）を比較すると，特に吸収に由来する振幅減少は化粧水

ヘルツ時間領域（Terahertz time-domain attenuated totalに比べて純水の方でより顕著であった．緒言で述べたよう

reflection, THz TD-ATR）
分光測定系を構築した 8）．

にテラヘルツ波は試料中の自由水とのみ相互作用するこ本手法では ATR プリズム近傍に局在する近接場の分光とを鑑みれば，化粧水中には水以外にも様々な基剤が含ま情報を得るため，本研究では高い密着性を期待してヘアれているうえ，一部の水分子は水和水としてそれらの基剤

レスマウスの腹部（20 × 30 mm）を対象として THz TD-

を取り巻いているため，自由水のみからなる純水に比べてATR 測定を行った．実験に使用したマウスは顆粒層 SG 1

テラヘルツ波の吸収が小さくなっていると考えられる．次で 特 異 的 に 発 現 す る Skin aspartic protease 遺 伝 子 を ヘに，THz TD-ATR 測定で得たテラヘルツパルスの電場波

テロで有するヘアレスマウスであり，電気伝導率測定計

形を Fourier 変換し，吸収の大きさを表す複素誘電率の虚ASA-M 3（日本アッシュ株式会社）を用いた予備測定では部（誘電損失スペクトル，ε''（ν））を求めた結果を図 1 右に野生型と同程度の角層水分量をもつことがわかっている．

示す．純水の誘電損失スペクトル ε''（ν）は 0 . 2 ~ 3 . 0 THz のそこで，全身麻酔を投与したマウスの左腹部と右腹部をそ

周波数領域において単調減少する傾向が認められたが，これぞれ交互に 3 回ずつ測定を行い，その平均値を定常状態

れは本測定帯域が～20 GHz に位置する自由水の巨大な吸のマウスの測定値，そして標準誤差を測定の不確かさとみ

収ピークの高周波裾野に対応していることに起因する．赤なした．また，その後にマウスの左腹部と右腹部に純水と外分光や核磁気共鳴とは異なり明瞭なピーク構造が見られ化粧水（薬用雪肌精，株式会社コーセー）をそれぞれ 1 mLず特徴に欠けるスペクトルであるように思えるが，この吸ずつ塗布し，その 1 分後に表面の残留成分を軽く拭き取っ

収の大きさそのものがピコ秒の時間スケールで揺らぐ自由てから左腹部（純水）→右腹部（化粧水）→ 左 →…と左右交

水の量を反映している．また図 1 右では，化粧水も純水と互に 3 回ずつ測定を行い，塗布後 1 分目と 11 分目に THz

類似したスペクトル形状を示しているが，これはテラヘル

図1 （左）THz TD-ATR測定で得られたテラヘルツパルスの電場波形．挿入図はパルスピーク付近の拡大図．
（右）32℃における純水と化粧水（雪肌精）の誘電損失スペクトル．

− 34 −

テラヘルツ分光で切り拓く角質中に必要な水の “質” の解明

ツ帯では化粧品基剤に特有の吸収ピークが現れず，化粧水

在深さ dp が周波数 νに依存していることが原因に挙げられ中の自由水だけが誘電損失スペクトル ε''（ν）に寄与している．式（1）
を用いて実際にエバネッセント光の局在深さ d（ν）
p

ることを表している．したがって，純水に対する化粧水のを計算すると，ν = 0 . 5 THz では dp= 50 . 0 µm，ν = 1 . 0 THz

吸収の比率は化粧水中に含まれる自由水量比に他ならず，では dp= 25 . 6 µm，ν = 2 . 0 THz では dp= 12 . 5 µm となり，高本 THz TD-ATR 測定ではその値が 66 . 1±0 . 05 % である

周波側では局在深さが小さい，すなわちマウス表皮の浅いと見積もられた．しかしこの値は，赤外領域に見られる領域のみを観測していることが理解できる．したがって，

H-O-H変角振動ピーク強度から推定した水分量比（89.9%）

周波数ごとに（マウス）／（純水）の吸収比率が異なるというよりも有意に小さい．ここで，H-O-H 変角振動は化粧水

結果は，マウス表皮内の深さ方向における自由水量の勾配中に含まれる全ての水分子（自由水＋水和水）を観測していを反映していると考えられる．

るのに対し，テラヘルツ帯の誘電損失スペクトル ε''（ν）に吸収の大きい媒質の ATR 分光を行ったとき，プリズム

は自由水しか寄与を及ぼしていないため，そもそも同一の表面から深さ z までの領域が全体の吸収に占める寄与率

水を見ているわけではない．ここで両水分量比を比較する

C0z はと，化粧水中ではその差分に相当する 23 . 8 %（= 89 . 9 −66 . 1）の水分子が水和水となりテラヘルツ波と相互作用しC 0（ν）= 1−exp（−z

なくなっていることがわかる．

で与えられる 6 , 7）．そのため，詳細は省くが式（1）
および
（2）

３．
２．定常状態におけるマウス皮膚中の自由水量評価（図 2 左）からマウス皮膚中における自由水量の深さプロフ

上記の解析手法は自由水のみがテラヘルツ帯の吸収に寄ァイルを求めることができる．その結果，図 2 右に示すよ与していることを前提としているが，これまでの研究では

うにヘアレスマウス皮膚表層 10 µm から 15 µm にかけて自水以外の角質構成成分がテラヘルツ帯でほとんど吸収を示

由水量が急激に増加し，その後 50 µm までなだらかな増加

さないことが報告されている．そのため純水や化粧水に限を経てさらに深い領域では約 30 % で一定に達しているこらず，ヘアレスマウスの誘電損失スペクトル ε''（ν）から角とがわかった．

2z
）
d（ν）
p

（2）

を用いた理論解析計算を行うことで，誘電損失スペクトル

質層内の自由水量を定量解析することも可能であると考えこれまで角層水分量は静電容量や導電率を測定する電気られる．そこで，塗布物を適用する前に測定した定常状的手法や共焦点ラマン分光を用いた評価が行われてきた態のマウス皮膚の THz TD-ATR 測定結果を図 2 左に示す．

が，これらの測定方法では原理的に自由水と水和水を識別

ヘアレスマウスの誘電損失スペクトル ε''（ν）は純水のそれすることができないため，それらの総和（全水量）を出力値と類似した形状を示しているものの，その値は非常に小さとして得ている．ここで，3300 cm- 1 付近に位置する OH

いことがわかった．また，挿入図に示すように純水に対す

伸縮共焦点ラマンスペクトルを用いてヒト前腕の全水量プるマウスの吸収比率は周波数依存性があり，周波数の増加

ロファイルを求めた先行研究結果 9）も図 2 右に示す．今回に応じて自由水量が減少している傾向が見出された．周波の THz TD-ATR 測定ではヘアレスマウス腹部を測定して数ごとに自由水量が異なるという結果には違和感を感じるいるため両者の定量的な比較は困難であるが，共焦点ラマが，これは式（1）で記述したようにエバネッセント光の局ン分光で得た全水量がどの深さにおいても自由水量を大き

図2 （左）純水とヘアレスマウス腹部の誘電損失スペクトル．挿入図は純水に対するヘアレスマウスの誘電損失の比．
（右）マウス腹部におけるバルク水量の深さプロファイル．参照用データとしてヒト前腕の共焦点ラマン
測定結果9）も示している．

− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

く上回っていることが定性的に理解できる．全水量と自由由水量が有意に高いレベルに保たれていることが見出され水量の差は水和水量に相当するため，図 2 右に示した両プ

た．ここで自由水量の増加割合を評価するために，定常状

ロットの差は皮膚表皮内に存在する水和水の量を反映する．

態（塗布前）に対する塗布後の自由水量の比に相当する “相概して言えば，20 µm 以下ではバルク水に対して水和水の

対自由水量” の深さプロファイルを求めた結果を図 3 右に割合が特に多いのに対し，20 µm を超えるとバルク水の割

示す．1 分後の時点では純水塗布と化粧水塗布で酷似した合が徐々に増えて，深さ 50 µm では水和水：バルク水の比

相対自由水量のプロファイルを示し，角質層（深さ 20 µm率がおよそ 3：2 程度に収束している．上述のように，こ以下）では一時的に自由水量がおよそ 3 倍にまで増加する

こでは異なる皮膚試料を比較しているため厳密な議論を行ものの，観測領域が深くなるにつれて自由水量の相対値がうことはできないものの，本結果は顆粒層より深部に存在

1 . 5 倍程度に収束していることがわかる（化粧水におけるする生細胞中では細胞内水の約 6 割程度が水和水として存深さ 10 µm の異常値は皮膚表面でふき取れずに残留してい在しているのに対し，角質層中では自由水割合がさらに減た化粧水の影響であると考えられる）．また純水・化粧水

少して相対的に水和水の比率が高くなっていることを示唆

塗布に共通して，塗布直後 1 分目の時点において 50 µm よしている．生体分子に束縛されている水和水に対して自由り深い領域で相対自由水量が 50 % も増えているというこ水の方が高い蒸気圧を示すことを鑑みれば，タイトジャンとは，皮膚表面に晒された自由水は角質層のバリアをくぐ

クションの外側に位置する角質層内では気化を妨げるバリ

り抜けて急速に深部へ到達していることを示唆している．
塗布直後には純水と化粧水が同様の自由水量プロファイ

アが存在しないため自由水量が低下するという傾向は直感

ルを示すものの，その 10 分後には両者の間に有意な差が的にも納得できるものである．

認められる．純水塗布時には相対自由水量が 1，すなわち３．３．純水・化粧水塗布後におけるマウス皮膚中の自由水量評価（i）塗布した水が蒸発によって失われたこと，また（ii）塗布

次に，定常状態のヘアレスマウスに純水と化粧水（雪肌

した水が水和水に変化したこと，の 2 点が考えられる．た精）をそれぞれ 1 mL ずつ塗布したときの自由水量変化を図だし THz TD-ATR 測定と並行して実施した電気伝導率

塗布前の定常状態にまで戻っているが，この原因としては

3 右に示す．塗布後 1 分目の時点では，純水（上段）と化粧測定では，塗布前（5 . 8 ± 2 . 3 µS）と塗布後 11 分目（5 . 8 ±水（下段）ともに著しい自由水量の増加が認められ，その影

0 . 8 µS）で全水量に有意差が見られないという結果が得ら

響は特に表面付近で顕著であった．しかし塗布後 11 分経

れていることを踏まえれば，可能性（ii）は排除でき，塗布

過では，純水を塗布したマウス皮膚中の自由水量が塗布直した水が全て蒸発したという（i）のシナリオが妥当である

前と同程度まで減少しているのに対し，化粧水塗布では自と考えられる．その一方で，化粧水を塗布した場合は深さ

図3 （左）マウス腹部におけるバルク水量の深さプロファイルと塗布後の経時変化．上段：水を適用した場合，
下段：化粧水を適用した場合．
（右）塗布前に対するバルク水量の相対比．

− 36 −

テラヘルツ分光で切り拓く角質中に必要な水の “質” の解明にかかわらず一様に相対自由水量が 50 % 程度増加してい本研究を助成対象課題として採択していただいた公益財団

ることが見出された．化粧水中の約 1 / 3 は自由水ではな

法人コーセーコスメトロジー研究財団に深謝申し上げます．

い成分（溶質基剤ならびに水和水）で占められているにもかかわらず，純水に比べて化粧水の方がより高い “自由水の1） 上平恒 , 多田羅恒雄 ,「水の分子生理」メディカル・サ

保湿能力”を有していることは非常に興味深い．

４．総（引用文献）
イエンス・インターナショナル（1998）．

括2） 松井毅 , 陸上脊椎動物の皮膚の適応進化と内在性レト
ロウイルス . ウイルス , 66, 31-38,（2016）．

本研究では THz TD-ATR 測定を用いて皮膚表皮内の“自由水” 深さプロファイルを定量的に評価することに成功

3） 安部隆 , 皮膚と水 . 油化学 , 34, 413-419,（1985）．

した．ヘアレスマウスを用いた実証実験では，角質層内の4） T. Matsui et al., SASPase regulates stratum corneum

水の大半は水和水として存在し，自由水の比率は低い値にhydration through profilaggrin-to-filaggrin processing.

保たれていることが明らかになった．また，皮膚に純水とEMBO Mol. Med. 3, 320-333,（2011）．

化粧水（雪肌精）を塗布すると，適用直後は両者ともに特5） B. Baguchi, Water dynamics in the hydration layerに皮膚表面で自由水量が著しく増加したのに対し，化粧around proteins and micelles. Chem. Rev. 1 0 5, 3 1 9 7-

水塗布の場合のみ 10 分以上経過した時点でも効果的に “自3219,（2005）．

由水の保湿” が行われていることが見出された．これまで

6） N. J. Harrick, Electric field strengths at totally

水溶液レベルでは示差走査熱量測定（Differential scanningreflecting interfaces. J. Opt. Soc. Am. 5 5, 8 5 1-8 5 7,calorimetry, DSC）などを用いて実験的に自由水／水和水（1965）．

の割合を評価する研究は行われていたが，in vivo で水の7） K. Ohta and R. Iwamoto, Experimental proof of the“質” を評価する研究はほとんど行われていなかった．そのrelation between thickness of the probed surface layer

ため，生体侵襲性の低いテラヘルツ波を用いて in vivo でand absorbance in FT-IR/ATR spectroscopy. Appl.

皮膚中の自由水量を求めるという本技術は従来の水分量評

Spectrosc. 39, 418-425,（1985）．

価技術とは一線を画していると考えられる．今後は共焦点

8） M. Nagai et al., Terahertz time-domain attenuated

ラマン分光などを用いた全水量測定との融合を図りつつ，

total reflection spectroscopy in water and biological

THz TD-ATR 測定系の最適化を進めることで本質的な意

solution. Int. J. Infrared Milli. Waves 2 7, 5 0 5-5 1 5,

味で保湿の重要性を明らかにすることができる可能性があ（2006）．

ると期待している．

9） S. Bielfeldt et al., Assessment of human stratum
corneum thickness and its barrier properties by in-謝辞vivo confocal Raman spectroscopy. IFSCC Magazine

本研究の実施にあたって技術的な御指導，御協力をいた
だいた松井毅博士と横尾里佳氏に感謝申し上げます．また，− 37 −

12, 9 -15,（2009）．

皮膚疾患に有効な新規骨格を有するビタミンD 誘導体の創製
お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系

棚谷綾

Active vitamin D3 (1) plays important roles in many physiological processes, including calcium and phosphate homeostasis,bone metabolism, and immune regulation, via binding to vitamin D nuclear receptor (VDR). Since VDR is involved in
the pathogenesis of various diseases, many VDR ligands have been developed as candidate therapeutic agents. Structurally,
almost all of the developed VDR ligands with high potency have the same secosteroidal skeleton, while non-secosteroidal
VDR ligands are promising candidates for many clinical applications. In this study, we synthesized several derivatives oflithocholic acid (2) that was identified as the second endogenous VDR agonist. Novel compounds were designed by using alithocholic acid derivative 4 with potent vitamin D activity as the lead compound. Among compounds 3– 7 with a different
3-substituent, the compound 5 was more potent inducer of the HL-60 cell differentiation than the lead compound 4. The SAR
study indicated the size and shape of 2-ethyl-2-hydrozy-1-butyl group as the 3-substituent are proper for potent activity. Then,the replacement of the carboxyl group of compound 4 with other functional group was examined. The compounds 8–10
bearing the amide group in the side chain were as potent as active vitamin D3 (1). Further, compounds 11 and 12 with acyclic
1, 3-diol structure, instead of the carboxyl group of compound 4 also showed potent activity in HL-60 cell assay. Since thesenovel lithocholic acid derivatives are one of the most potent non-secosteroidal VDR agonists reported to date, and would haveunique vitamin D functions and different pharmacological properties, compared with the conventional vitamin D derivatives,
they would be promising lead for development of novel drug candidates.

１．緒

イド構造を持たない、新しい骨格を有するビタミン D 誘導

言体の創製が望まれているが、高活性な非セコステロイド型

脂溶性ビタミンに属するビタミン D 3 は、生体内で代謝誘導体としては、米国リガンド社が開発したジフェニルメ

α, 25 - ビタミン D 3、を受けて活性型ビタミン D（1
1、
図１a）
3

タン誘導体 2）と筆者ら（東京医科歯科大学との共同研究）がとなり、特異的核内受容体 VDR（Vitamin D receptor）に開発したホウ素クラスター含有ビタミン D 3 誘導体 3 , 4）など

結合することで、カルシウムやリンの代謝調節や恒常性、数種に限られている（図 1 b）
。本研究では、以上の背景を

1）骨の形成などを担う生体内分子である 。皮膚疾患の領域

もとに、皮膚疾患に対する新たなビタミン D 療法の開発基

では、ビタミン D 3 誘導体が乾癬の特効薬として用いられ盤の構築を目指し、新規非セコステロイド型ビタミン D 誘ている。乾癬はケラチノサイトの異常な増殖、分化を特徴

導体の創製を行った。

とする皮膚疾患であり、近年、その理解が深まるにつれ、

２．方法

ビタミン D 3 の細胞分化誘導作用や表皮細胞増殖抑制作用—分子設計—

ばかりでなく、炎症や免疫機能に対する役割が注目される

2002 年に Makishima らによって二次胆汁酸であるリト

ようになり、ビタミン D 3 の持つ抗炎症作用や免疫機能制

コール酸（2、図 2）が VDR の第二の内因性リガンドである

御に基づく皮膚の健康増進、皮膚疾患治療への応用が期待ことが同定された 5）。しかし、リトコール酸（2）のビタミされている。

ン D 活性は、活性型ビタミン D 3（1）と比べると数千分の一

これまで、皮膚疾患や骨疾患治療薬開発を目的に多くの程度と、非常に弱く、また、高活性なリトコール酸誘導体

ビタミン D 3 誘導体が創製されてきたが、臨床応用されたの報告はなかった 6 - 8）。筆者らは、リトコール酸（2）と VDR

化合物も含めて高活性誘導体はほとんどすべて、天然の活リガンド結合領域との複合体の結晶構造の解析 9）をもとに、性型ビタミン D 3（1）と同じセコステロイド構造を有してリトコール酸の 3 位水酸基を化学修飾した化合物 3 およびいる。セコステロイド構造は、化学合成が煩雑で、化学的4（図 2）を分子設計、合成したところ、ヒト白血病細胞

安定性も低く、取り扱いが難しい。そのため、セコステロ

HL- 60 の分化誘導活性において、化合物 4 がリトコール酸（2）の数千倍で、1 α, 25（OH）2 D 3 よりも高い活性を有することを見いだした 10）。一方で、化合物 4 の血中からの消失が著しく速く、体内動態の改善が必要であることが示唆

D evelopment of Novel Vit a m i n D
Derivatives with Clinical Utilities in the
Field of Skin Diseases

構造展開を図ることとし、まず、化合物 5 〜 7 を合成して

Aya Tanatani

3 位置換基の構造活性相関を明らかとし、次いで、側鎖カOchanomizu University

ルボキシ基を化学変換した化合物 8 〜 12 を設計、合成した。

された。そこで、化合物 4 をリード化合物として、更なる− 38 −

皮膚疾患に有効な新規骨格を有するビタミン D 誘導体の創製

図 1（a）活性型ビタミン D3、（b）
高活性非セコステロイド型ビタミン D3 誘導体の構造

図2

リトコール酸および本研究で創製した誘導体の構造

図3

３．結
３．
１．合

化合物 5 の合成（概略図）

化合物 3 の側鎖カルボキシ基は化合物の ADME に大き果

く関わると考えられるので、その誘導体として、まずアミ

成ド誘導体 8 〜 10 を合成した。化合物 4 をリトコール酸（2）化合物 5 は、リトコール酸（2）を出発原料として、まずより 15 工程で合成した後、メチルエステルとしてからア側鎖カルボキシ基の還元、保護を行った後、3 位の化学変

ンモニアもしくはメチルアミンと反応させて、それぞれ化

換により合成した（図 3）。鍵化合物である 3 位にアルデヒ

合物 8、9 を合成した。また化合物 3 をクロロギ酸エチル

ド基を有する化合物 13 は 3 位の立体が α 体と β 体の混合物

により酸無水物とした後、O -メチルヒドロキシルアミン

として得られ、望みの 3 α 体の比率は約 20 % であった。本と反応させて化合物 10 を得た（図 4）。

混合物をメタノール -THF 中で炭酸カリウム処理すること

リガンド社のジフェニルメタン誘導体や筆者らのカルで混合比を変えることができ、3 α 体の比率を約 70 ％とす

ボラン誘導体（図 1）では、非環式ジオール構造が活性型ビることができた。これらの異性体はシリカゲルカラムクロ

タミン D（1）の環状ジオール構造に対応すると考えられて3

マトグラフィーで分離することができ、生成したアルデヒいる。一方、リトコール酸（2）と VDR リガンド結合領域とド 13 a を用いて化合物 5 へと導いた。化合物 6 および 7 もの複合体の結晶構造では、リトコール酸（2）のカルボキシ

同様の方法で合成を達成した。なお、化合物 6 は 3 位置換基は活性型ビタミン D 3（1）の環状ジオール構造の代替と基中に不斉炭素を１つ持っており、異性体の混合物としてなって、VDR のアミノ酸残基と水素結合を形成している。

活性評価に用いた。

そこで、リトコール酸誘導体 4 のカルボキシ基を非環式 1 ,− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図4

化合物 8 〜 10 の合成

図５

化合物 11、12 の合成

3 - ジオール構造に変換した化合物 11、12 を合成した。リ
トコール酸（2）を出発原料として、5 工程で鍵中間体であるアルコール体 14 へと導いた（図 5）。化合物 14 は 24 位の立体化学の異なる異性体の 1：1 の混合物として得られたため、14 および化合物 11 / 12 合成までの中間体の各ス
テップで異性体の分離を試みたが、いずれの段階でも分離することはできなかった。そこで、化合物 14 の酵素を利用したアセチル化を種々検討したところ、リパーゼとして
CAL_B を用いることで、選択的に 24 S 体のみがアセチル化されることがわかった。精製した化合物 14 a から 13 工程で化合物 11 を、アセチル化体 15 b から 14 工程で化合物

図6

12 を合成することができた。化合物の 24 位の立体化学に

3 位修飾体 4 〜 7 の HL- 60 細胞分化誘導活性

ついては、X 線結晶構造解析により決定し、リパーゼの反応性から予想される立体構造と一致していることがわかっ持っていた。3 位置換基の炭素鎖の長さの違う化合物の比た。

較では、化合物 4 よりも炭素鎖が 1 つ長い化合物 7 では大合成した化合物の構造および純度は、1 H NMR、13 C

きく活性が低下した。合成した化合物の中では、化合物 5が、活性型ビタミン D 3（1）やリード化合物 4 よりも高い活

NMR、質量分析により確認した。

性を示した。水酸基の付け根の炭素についているアルキル

３．２．活性評価

基としてはエチル基が最適と思われ、化合物 4 の持つ 2 つ合成した化合物のビタミン D 活性は、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞 HL- 60 に対する分化誘導能により評価しのメチル基のうち１つを n-ブチル基に変えた化合物 6 は活性が若干低下した（図 6）。

た。リトコール酸（2）は、この試験濃度範囲ではビタミン化合物 4 のカルボキシ基をアミドに変えた化合物 8 〜

D 活性を示さなかった。今回合成した誘導体はいずれも細10 は、いずれもリード化合物 4 の活性よりは低いものの、胞分化誘導活性を有していた。リード化合物である化合物

活性型ビタミン D 3（1）と同等の活性を有していた（図 7 a）。

4 は活性型ビタミン D （1）よりも強い細胞分化誘導活性を
3

一方、カルボキシ基をジオール構造に変えた化合物 11 〜

− 40 −

皮膚疾患に有効な新規骨格を有するビタミン D 誘導体の創製

12 では若干活性は低下したものの、高い細胞分化誘導活

次に、化合物 4 の血中からの早い消失を考慮し、そのカ性を保持していた。ジオール構造の立体化学に関しては、

ルボキシ基を他の官能基に代替した化合物を設計、合成し24 R 体 11 の方が 24 S 体 12 よりも活性が高く、水酸基のた。カルボキシ基をアミドに変えた化合物はいずれも、カ立体化学が細胞分化活性に影響することがわかった。

ルボン酸体 4 よりも活性は低下するものの、活性型ビタミ

４．考ン D 3（1）と同等の高い活性を示した。このことから、リト

察

コール酸誘導体のカルボキシ基は他の生物学的等価性基で本研究では、新規皮膚疾患治療薬開発を念頭に、新規非代替可能であることが示唆された。そこで、カルボキシ基

セコステロイド型ビタミン D 3 誘導体としてリトコール酸

を 1 , 3 - ジオール構造に置き換えた誘導体を合成したとこ

誘導体を設計、合成した。筆者らが既に見いだした高ビタ

ろ、化合物 11 が活性型ビタミン D 3（1）と同等の活性を有ミン D 活性を有する化合物 4 をリード化合物として構造展することがわかった。化合物 11 と 24 位水酸基の立体化学開を図った。まず、リトコール酸（2）の 3 位水酸基をヒドが異なる異性体 12 では活性が若干低下した。このことか

ロキシアルキル基としたことで活性が向上したことから、ら、ジオール構造の置換位置、立体化学が活性に影響する

その構造活性相関を検討した。これまでの研究から 3 位のと考えられ、周辺部位の置換基導入も含め、構造最適化の置換基は α 位に位置する方が、活性が高いことがわかって余地があると考えられる。

いたので、3 α 位にアルキル部分の長さの異なる置換体を今回、合成した化合物については、ヒト急性前骨髄球性持つ誘導体を合成した。その結果、化合物 4 よりも水酸基

白血病細胞 HL- 60 の分化誘導活性を指標に活性を評価しの位置を骨格から離した化合物 7 で活性が著しく低下した。

た。現在、VDR への結合親和性、活性化能、結合様式の水酸基が直接ステロイド骨格に結合したリトコール酸（2）解析等を進めている。また、皮膚疾患治療薬開発のために、や炭素１つを挟んで連結した化合物 3 の活性も化合物 4 よ

体内動態の解析に加え、抗炎症作用や免疫機能制御といっり低いことから、水酸基の位置はステロイド骨格からメた機能の解明を行うことを計画している。

チレン鎖 2 つ分は離れた位置が最適であることがわかった。

５．総

また、化合物 4 の 3 位の水酸基の付け根の炭素に結合した括

アルキル基を比較すると、ジエチル体 5 の活性がジメチル

筆者らが見いだした高活性な非セコステロイド型ビタミ

体 4 よりも高く、さらに長い n- ブチル基を持つ化合物 6ン D 誘導体である化合物 4 をもとに、更に高い細胞分化誘では活性が低下した。以上のことから、3 位の置換基とし導活性を有する化合物 5 を見いだすとともに、3 位におけては、2 -ethyl - 2 -hydroky- 1 -butyl 基が適していると考る構造活性相関を明らかにすることができた。更に、カルえられる。その要因としては、3 位置換基の末端アルキル

ボキシル基を持たない高活性誘導体の創製へと展開するこ

基をメチル基からエチル基に変換したことにより VDR のとができた。これらの化合物の機能を詳細に解析するととリガンド結合ポケットにおける疎水的な相互作用が増加しもに、更なる構造展開により、ビタミン D としての活性プたためと推測している。現在、VDR のリガンド結合領域

ロファイルや体内動態で特徴的な性質を持つ新規化合物のとの共結晶の X 線構造解析により、詳細な結合様式の解明創製が期待でき、皮膚疾患等に対するビタミン D 療法へのを進めている。

応用を目指す。

8

4

10
9

図7

カルボキシ基を変換した化合物 8 〜 12 の HL-60 細胞分化誘導活性− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

（引用文献）

Domoto, H.; Evans, R. M.; Haussler, M. R.; Mangelsdorf,
D. J. Science 2002, 296, 1313-1316.

1） Haussler, M. R.; Whitfeld, G. K.; Haussler, C. A.; Hsieh,
J. C.; Thompson, P. D.; Selznick, S. H.; Dominguez, C. E.;

6） Adachi, R.; Honma, Y.; Masuno, H.; Kawana, K.;

Jurutka, P. W. J. Bone Miner. Res. 1998, 13, 325-349.

Shimomura, I.; Yamada, S.; Makishima, M. J Lipid Res.
2005, 46, 46-57.

2） Boehm, M. F.; Fitzgerald, P.; Zou, A.; Elgort, M.
G.; Bischoff, E. D.; Mere, L.; Mais, D. E.; Bissonnette,

7）Ishizawa, M.; Matsunawa, M.; Adachi, R.; Uno, S.;

R. P.; Heyman, R. A.; Nadzan, A. M.; Reichman, M.;

Ikeda, K.; Masuno, H.; Shimizu, M.; Iwasaki, K.; Yamada,

Allegretto, E. A. Chem. Biol. 1999, 6, 265-275.

S.; Makishima, M. J Lipid Res. 2008, 49, 763-772.

3） Fujii, S.; Masuno, H.; Taoda, H.; Kano, A.; Wongmayura,8）Masuno, H.; Kazui, Y.; Tanatani, A.; Fujii, S.; Kawachi,A.; Nakabayashi, M.; Ito, N.; Shimizu, M.; Kawachi, E.;

E.; Ikura, T.; Ito, N.; Yamamoto, K.; Kagechika, H.

Hirano, T.; Endo, Y.; Tanatani, A.; Kagechika, H. J. Am.

Bioorg. Med. Chem. 2019, 27, 3674-3681.
9）Masuno, H.; Ikura, T.; Morizono, D.; Orita, I.; Yamada,

Chem. Soc. 2011, 133, 20933-20941.
4） Fujii, S.; Sekine, R.; Kano, A.; Masuno, H.; Songkram,

S.; Shimizu, M.; Ito, N. J.Lipid Res. 2013, 54, 2206-2213.

C.; Kawachi, E.; Hirano, T.; Tanatani, A.; Kagechika, H.

10）棚谷綾、佐々木晴江、川崎波留、影近弘之、増野弘幸、
ビタミン D 活性を有するリトコール酸誘導体、PCT/

Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 5891-5901.
5） Makishima, M.; Lu, T. T.; Xie, W.; Whitfi eld, G. K.;− 42 −

JP 2017 / 002902 .

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ
新規酸化物固体材料の開発
東京工業大学物質理工学院

中島章

Effect of atom substitution on the hydrophobicity, antibacterial and antiviral properties of La2Mo2O9 (LMO) wasinvestigated by using Ce (LCMO) with citric acid polymerization method. The sintered bodies showed hydrophobicity byexposure to ambient air. Although antibacterial activity of LCMO was inferior to that of LMO against Staphylococcus aureus
and Escherichia coli, it was sufficient for practical use. On the other hand, LCMO exhibited higher or similar antiviral activity
than LMO against bacteriophage Qβ, and bacteriophage ϕ6. LCMO absorbed ultraviolet with little photocatalytic activity.
This material possesses hydrophobicity, antibacterial, antiviral, and ultraviolet shielding properties, simultaneously. It should
be a promising material for the fusion of makeup and medicine.

１．緒

イルスであるバクテリオファージ Φ 6（以下 Φ 6）のいずれ

言に対しても 6 時間で 2 桁以上（99 % 以上）の抗菌・抗ウイル

近年、新型 Φ コロナウイルス（COVID- 19）の世界的な流ス活性を示す。しかしながら COVID- 19 や新型インフル

行により、様々なウイルスの世界的な大流行（ウイルスパ

エンザと同じタイプである Φ 6 に対する活性は、他の菌やンデミック）の脅威が高まっている。一度ウイルスパンデ

Qβ に比べて低いという問題点があった。

ミックが発生すると、医療機関でワクチンの接種が可能に

本研究では、Φ 6 に対する抗ウイルス活性の向上に加なるのには少なくとも数ヶ月を要するため、「予防」や「拡え、化粧品への応用を意識して紫外線遮蔽性能を併せ持大抑制」
に関する研究は喫緊の課題となっている。

つ、これまでにない酸化物材料の開発を目指して、LMO

無機系の抗ウイルス材料は有機系に比べて歴史が浅い。

の元素の一部を他の元素で置換することを検討した。本研

しかしながら、様々なウイルスに対して効果があり、比較

究では置換する元素として Ce を選択した。Ce は La と同的広い温度範囲で適用可能であり、ウイルスが耐性を獲得

様に比較的安価な希土類元素であり、その酸化物は抗菌活しにくい等の特徴を有することから、近年活発に研究が行性を発現する 19 - 22）とともに紫外線遮蔽能があることが知われている。これまで Ag, Cu 等の金属系 1 - 3）や TiO 2 等のられている 23 - 25）。事前に予備実験を行ったところ、Ce は

6 , 7）

において抗ウイルス活性がCe Ⅲ と Ce Ⅳ の 2 つの価数を持つことから、Ce の添加量報告され、実際に使用されている。しかしながら酸化等にが多くなると、単相の複合酸化物が得られにくいことが分よる着色や活性の低下、使用環境の制限（光の必要性、ア

かった。本報告では La サイトの 10 % を Ce で置き換えた

光触媒系

4 , 5）、ZnO, CaO 等

ルカリ化）などの問題点があり、これらを解決できる、活La 1 . 8 Ce 0 . 2 Mo 2 O 9（以下 LCMO）の粉末を作製し LMO との性の高い新たな無機抗ウイルス材料の開発が望まれている。

活性比較を行った結果について述べる。

ごく最近、我々は希土類酸化物の撥水性 8 - 12）とモリブデ

２．方ンの抗菌性 13 - 16） に着目し、La と Mo の複合酸化物である
La 2 Mo 2 O 9（以下 LMO）の粉末および焼結体をクエン酸重法

２.１．試料の作製

合法 17）と常圧焼結法で作製したところ、この物質が抗ウ出発原料として、La 源にLa（NO 3）
Mo 源に（NH4）6
3・6H 2 O、イルス活性と抗菌性、撥水性を併せ持つ新規の無機抗ウ

Mo 7 O 24・4 H 2 O、Ce 源 に Ce（NO 3）3・6 H 2 O を そ れ ぞ れ

イルス材料であることを見出した

18）。この材料の粉末は、精製せずにそのまま用いた。LMO では、硝酸ランタン

グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌である黄色ブド（2 . 5 g）とモリブデン酸アンモニウム（1 . 0 g）の粉末をそ

ウ球菌、エンヴェロープを持たないウイルスであるバク

れぞれ 10 mL の蒸留水に溶解させ、La と Mo のモル比がテリオファージ Qβ（以下 Qβ）、エンヴェロープを持つウ

La : Mo= 1 : 1 になるようにこれらの水溶液を混合した。

Preparation of hydrophobic complex
oxides with antibacterial, antiviral, andultraviolet shielding properties

LCMO では、硝酸ランタン（2 . 25 g）と硝酸セリウム（0 . 25 g）の粉末をそれぞれ 8 mL, 2 mL の蒸留水に溶解させ、La とCe のモル比が La : Ce= 9 : 1 になるようにこれらの水溶液

Akira Nakajimaを混合した。その後モリブデン酸アンモニウム（1 . 021 g）

Department of Materials Science andEngineering, School of Materials andChemical Technology, Tokyo Institute ofTechnologyの粉末を 10 mL の蒸留水に溶解させ、（La+Ce）と Mo のモル比が（La+Ce）: Mo= 1 : 1 になるように混合した。

− 43 −

続いて蒸留水で溶解させた濃度 2 . 31 mol/L のクエン酸

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

水溶液を金属イオン（La+Ce+Mo）とクエン酸の mol 比が、ウ球菌の栄養を含む寒天である NA（Nutrient Agar）培地（La+Ce+Mo）: クエン酸 = 1 : 2 になるようにこれらの混

上で 37 ℃，18 時間の条件下で培養を行った。その後、栄合溶液に加えて 10 分間撹拌した。その後エチレングリコ

養源の NB（Nutrient Broth）を滅菌水で 500 倍に希釈しールとクエン酸との mol 比が 2 : 3 になるように、上記のて 1 / 500 NB 溶液を作製し、NA 培地上で培養を行った大溶液にエチレングリコールを添加した。この溶液を 80 ℃

腸菌、黄色ブドウ球菌を 1 / 500 NB 中に溶解させ、およそで 6 時間撹拌し、エステル化させることにより前駆体を得

2 . 0×106 cfu/mL の濃度になるように菌液の濃度を調整した。得られた前駆体は 200 ℃で 24 時間、大気雰囲気下でた。粉末を塗布した試料基板上に作製した菌液 50 µL（コ

乾燥し、得られた乾燥粉末を乳鉢で 10 分間粉砕した。こロニー数 = 105 cfu 相当）を乗せ、透明フィルムで密着させた。

の前駆体粉末を 500 ℃（LMO）または 550 ℃（LCMO）で

その後、湿度が調節された室温での環境下で暗所で保持

12 h 大気下で仮焼し、LMO, LCMO の各粉末を作製した。

し、所定の時間（0 , 2 , 4 , 6 時間）が経った試料基板を 5 mL

以後これらを仮焼粉末と記述する。

の SCDLP（soybean casein digest broth with lecithin and

得られた仮焼粉末約 0 . 15 g に成形助剤として体積分率

polysorbate）培地に入れ、2 分間振盪させることにより

2 % のエチレングリコールを混合し、100 MPa, 3 min 保持

試料粉末と細菌間の反応を停止した。続いて細菌を含むの条件で、一軸加圧成形して成形体を得た。得られた成形SCDLP 溶液を PBS（phosphate buffered saline）溶液を用

体は大気雰囲気下で 900 ℃，12 h の焼成を行うことにより、いて希釈を行い、菌希釈溶液を作製した。その後コロニー焼結体を作製した。

数を数えるために NA 培地に 1 mL の細菌を含んだ菌希釈得られた粉末の微構造は走査型電子顕微鏡（FE-SEM,

溶液を添加・混合し、37 ℃で 48 時間培養することにより日本電子 , JSM 7500 F, Japan）を用いて観察した。粉末の細菌のコロニーを形成した。NA 培地上に存在するコロニ

比表面積は窒素吸着法（MicrotracBEL, BEL SORP mini,

ー数をカウントし、得られたコロニー数を希釈倍率でかけJapan）を用いて測定した。粉末の結晶相は Cu Kα 線源

た値を生存菌数として抗菌活性試験前後の細菌の生存数を（40 kV, 30 mA） を 用 い て、X 線 回 折（XRD, SHIMAZU,求めた。粉末試料なし（control）の細菌の生存数はガラス

XRD- 6100 , Japan）より評価した。粉の組成は ICP 発光

基板上に試料粉末を載せずにフィルム密着法による抗菌活分 析 装 置（ICP-OES, 5100 VDV, Agilent Technologies,性を行った。また抗菌試験前に存在していた細菌の存在量USA）で確認した。光吸収性能の評価には、可視紫外分（N 0）は各々の試料の 0 時間における細菌の生存数とした。

光法（V- 660 , 日本分光）を用いた。焼結体の密度はアル

コロニーカウントは 2 度行い、それらの平均の値を採用しキメデス法により算出した。焼結体の表面粗さは、レた。

ー ザ ー 顕 微 鏡（3 D Measuring Laser Microscope, LEXT

２．２．２．抗ウイルス試験

OLS 4000 , OLYMPUS, Japan）で測定した。作製した焼結抗ウィルス活性試験には Qβ（NBRC 20012）と Φ 6（NBRC

体の濡れ性の評価を行うために，3 µL の水滴に対する接105899）を用いた。まず初めに、Qβ と Φ 6 のファージ株

触角（Dropmaster 500 協和界面科学株式会社）を測定した。

は ISO 18061 を参照して用意した。各々培養されたファ

焼 結 体 表 面 の 化 学 組 成 は、XPS（X-ray Photoelectronージは 1 / 500 NB を用いておよそ 2 . 0 × 107 pfu/mL の濃Spectrometer 5500 MT; PerkinElmer Inc., USA）を用いて度になるようにウイルス液の濃度を調整した。粉末を塗評価した。励起 X 線は Al Kα（14 kV, 300 W）
を用いた。

布した試料基板上に作製したウイルス液 50 µL（プラーク
数 = 106 pfu 相当）を乗せ、透明フィルムで密着させた。そ２．２．抗菌・抗ウイルス活性試験（フィルム密着法）の後 , 湿度が調節された室温での環境下で暗所で保持し、作製した LMO, LCMO の各粉末はそれぞれエタノール

所定の時間（0 , 2 , 4 , 6 時間）が経った試料基板を 5 mL ので分散させ、サスペンションを作製した（試料粉末 : エタ

SCDLP 培地に入れ、2 分間振盪させることにより試料粉

ノール = 1 mg : 1 mL）。このサスペンション 0 . 15 mL をガ

末とウイルス間の反応を停止した。続いてウイルスを含む

ラス基板（25 mm × 25 mm）上に均一に塗布し、100 ℃で

SCDLP 溶液を PBS 溶液を用いて希釈を行い、ウイルス希30 分乾燥・滅菌を行った。この塗布〜滅菌までの工程を

釈溶液を作製した。その後、Qβ は緑膿菌（NBRC 14084）

3 度繰り返すことにより試料粉末が均一に載っている試料に、Φ 6 は大腸菌（NBRC 106373）にそれぞれを 10 分間混基板を作製した。

和、感染させた。その後プラーク数を数えるために 1 mL

２．
２．
１．抗菌試験

のウィルスを含んだ希釈溶液を 0 . 5 % LB（Luria-Bertani

抗菌活性試験では黄色ブドウ球菌（NBRC 12732）と大腸

medium）培地ナンカンと混合し、1 . 5 % LB ナンカン培地

菌（NBRC 3972）を用いた。抗菌活性試験では ISO 17094 ,上に添加、37 ℃で 48 時間培養させることによりウイルス

JIS R 1752 に記載されている「フィルム密着法」を用いてのプラークを形成した。その後の LB 培地上に存在するプ

抗菌活性の評価を行った。まず初めに大腸菌と黄色ブド

ラーク数をカウントし、得られたプラーク数を希釈倍率で− 44 −

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発

かけた値を生存ウイルス数として抗ウイルス活性試験前後

用いて粉末を除去し、漏出したイオンのみを含むイオンのウイルスの生存数を求めた。粉末試料なし（control）の溶液を作製した。得られた溶液は pH 測定（HM- 21 P 東亜

ウイルスの生存数はガラス基板上に試料粉末を載せずにフDKK 株式会社）、ICP 発光分析装置（ICP-OES, 5100 VDV,ィルム密着法による抗ウイルス活性を行った。また抗ウイAgilent Technologies, USA）による溶解金属イオン量の測

ルス試験前に存在していたウイルスの存在量（N 0）は各々定を行った。

の試料の 0 時間におけるウイルスの生存数とした。プラー本研究では合成した LMO, LCMO だけでなく、関連す

クカウントは 2 度行い、それらの平均の値を採用した。

る市販の酸化物試薬（La 2 O 3（99 . 99 %），CeO 2（99 . 5 %），フィルム密着法では溶液存在下における細菌・ウイルス

MoO 3（99 . 0 %））についても同一条件で評価を実施した。

との接触試験のために、粉末がイオンとして溶液中に漏出

３．結果および考察する可能性が考えられる。既往の研究報告において、粉末と細菌・ウイルスの“直接的接触”と粉末から溶け出した

３．
１．粉体、焼結体特性および撥水性

イオンと細菌・ウイルスの“間接的接触”では細菌・ウイル得られた試料粉末の X 線回折図形を Fig. 1 に示す。得スの死滅のしやすさが異なるために粉末から溶け出すイられた粉末はいずれも概ね単相の La 2 Mo 2 O 9（card No.

オンの量は非常に重要になる 18 , 26）。そのため作製した各

28 - 0509）であった。SEM 観察の結果、1 次粒子径は 50 -

試料粉末の 1 / 500 NB 溶液に対する金属イオン溶出量と溶100 nm 程度であった（Fig. 2）。ICP 分析から、得られた粉液中の pH 値を測定した。 溶液中での試料粉末の振盪時間

末は仕込み通りの組成比であることが確認された。

は 2 時間とし、100 回 / 分の速さで振盪した。振盪させた

Table 1 に各粉末の ICP-MS によるイオン漏出量 , pH,

粉末を含むイオン漏出液をシリンジで採取しフィルターを

比表面積測定の結果を示す。比表面積は LMO と LCMO は

Fig. 1XRD patterns of prepared powders.

Fig. 2 SEM micrographs of prepared powders and sintered bodies:(a) & (b) LMO, and (c) & (d) LCMO.

− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

7 ～ 10 m 2 /g であった。イオン漏出前の 1 / 500 NB 溶液の

La 2 O 3 > CeO 2 > MoO 3 となり、MoO 3 , CeO 2 はいずれもpH は 7 . 8 であった。MoO 3 , CeO 2 はいずれも、La との複

La との複合酸化物となることで pH が高くなった。
得られた焼結体の結晶相も同様に La 2 Mo 2 O 9 であった。

合酸化物よりも溶解しやすい傾向を示した。MoO 3 の水に27）

対する溶解度は 3 . 4 mmol/L（28 ℃）

であるが、La 2 O 3 ,28 , 29）

アルキメデス法により求めた焼結体の相対密度は LMO はであり、漏出量の96 %, LCMO は 94 % であった。各焼結体の表面の SEM 写

結果は溶解度の違いと概ね一致する。La 2 O 3 は試薬酸化物

真を Fig. 2 に示す。焼結体の平均表面粗さ（Ra 値）は、その中で最も漏出量が低く、Mo, Ce と複合酸化物を形成す

れぞれ 0 . 535 µm（LCMO）、0 . 395 µm（LMO）であり、違ると漏出量が高くなる傾向がみられる。La 2 O 3 の溶解度がいは無視できるレベルであった。焼成後大気下暗所で保低いため、Mo, Ce の溶出が抑制され、これらのイオンに持した際の、保持時間に対する焼結体表面の接触角変化

徐放性が付与されることが分かる。また、合成した複合酸と、保持時間に対する焼結体表面の炭素量の金属元素に対化物では La と Mo の漏出量のオーダーが概ね同程度であする割合を Fig. 3 ⒜ , ⒝にそれぞれ示す。LMO と同様に焼ることから、Mo の溶解が La の溶解を誘発していることが成直後は LCMO は親水的であるが、その後は急速に接触考えられる。MoO 3 は漏出量が多い上に pH を大きく低下

角が増大することが分かる。この現象は、焼成直後の焼結

CeO 2 の溶解度はいずれもほぼ不溶

18）

で考察し

体表面は清浄表面であるため、初期は大気中での濃度が高たように、MoO 3 の溶解によりヒドロニウムイオンの濃度

い水分子の吸着が進行して低い接触角を示すが、時間経過が増大するためである。単純酸化物の pH の変化の序列はに従い、表面の水分子は徐々に大気中の有機物に置き換わさせる効果があることが分かる。これは前報るために生じると考えられる。LCMO は LMO よりも撥水
Table 1 Results of pH and dissolved ion concentration in
the water with 1/500NB solution, with the specific surface
areas of samples.

化が速く、有機物濃度の上昇も速い。これは希土類である
Ce の高い撥水性 9）が影響しているものと思われる。撥水
化した各試料に対し、オゾン照射前後の焼結体の撥水性の変化を確認するために真空紫外光を大気中に照射すること
でオゾンを発生させ、焼結体表面の清浄を行った。結果をFig. 4 に示す。LMO で 2 週間かかっていた撥水性の再現
が LCMO では 8 日に短縮され、撥水化速度の向上が確認

Fig. 3 (a) Contact angle change and (b) the surface carbon ratio for LMO andLCMO ceramics during storage in ambient air after firing.

Fig. 4 Contact angle change of the LMO and LCMO sintered bodies before
and after ozone treatment.

− 46 −

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発された。LCMO はこのように優れた自己撥水性を示すた

効果は、菌に対しては少ないことが明らかになった。しかめ、有機物との親和性が高いことが予想される。

しながら LCMO であっても 6 時間で 3 ケタを超える十分に高い抗菌活性を示すことが分かった。

３．
２．抗菌・抗ウイルス活性Fig. 7 に、本研究で合成した試料および試薬酸化物のFig. 5 ⒜ , ⒝に本研究で合成した試料および試薬酸化物

抗ウイルス活性を示す。Qβ に対しての抗ウイルス活性の、大腸菌に対する抗菌活性を示す。La との複合酸化物

は、LMO は LCMO とほぼ同程度であり、Φ 6 に対してはでは活性序列は、LMO > LCMO であり、試薬酸化物では、LCMO > LMO となった。また CeO 2 はほとんど活性を示

MoO 3 > La 2 O 3 >> CeO 2 となった。CeO 2 には抗菌活性はさないのに対し、La 2 O 3 は一定の活性を示した。試薬酸化殆ど認められなかった。

物の活性序列は、MoO 3 > La 2 O 3 > CeO 2 となった。

La 2 O 3 の抗菌効果については先行研究 30 - 32） があり、リ
31 , 32）

Mo の漏出イオンは pH 6 以下ではポリ酸を形成する可能。

性が高く、また反応液中にはリンをはじめとする各種のイ

LMO に は La と Mo の 相 乗 的 な 効 果 が 見 ら れ、La 2 O 3 やオンも存在することから、Mo はこれらのイオンとヘテロ

MoO 3 よりも高い抗菌活性を示した。抗菌活性の機構を検

ポリ酸を形成している可能性がある。ポリ酸は水溶液中で討するため、我々はフィルム密着試験によるアルカリフ

負の電荷を持ち、抗ウイルス活性を示すことが報告されてォスファターゼ酵素（ALP）の減少率の算出を行った。Fig.

いる 33 - 36）。Jadd らは HIV ウイルス（エンベロープを持つン酸吸着による栄養阻害の効果が報告されている

6 に実験結果を示す。減少率を比較すると MoO 3 , La 2 O 3、ウイルス）に存在する逆転写酵素の活性部位である Lysine

LCMO, LMO が ALP 酵素を多く不活化させていることが残基（Lys 41 , Lys 43 , Lys 55）のカチオン部位にポリ酸が明らかになった。ALP 減少率と抗菌活性値を比較すると静電相互作用的に吸着すると HIV ウイルスを不活化する

大きな傾向は一致しており、抗菌作用の機構には、ALP

ことを報告した 37）。また、宿主と脱着に寄与する部位で酵素などの酵素タンパク質の不活化が影響していることがあるノイラミニダーゼ（NA）の蛋白質分解酵素との結合に考えられた。

は Lysine 残基が必要であることが知られている 38）。そのFig. 5 ⒞ , ⒟に本研究で合成した試料および試薬酸化物

ために、ポリ酸の存在により Lysine 残基の不活化が生じ、の、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を示す。傾向は大腸

宿主から脱着ができずに増殖を抑える可能性が考えられ菌と同様であり、これらのことから Ce の元素置換によるる。一方、ノンエンベロープウイルスの表面にも宿主とのFig. 5 Results of antibacterial activity experiments against (a) & (b) Escherichia coli, and (c) & (d)Staphylococcus aureus.

− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Fig. 6

Relation between antibacterial activity and ALP inactivation rate

Fig. 7 Results of antiviral activity experiments against (a) & (b) bacteriophage Qβ, and (c) & (d)bacteriophage Φ6.

− 48 −

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発

結合に用いられるスパイク（VP 4）の活性部位に正電荷を持つ Lysine 残基が存在する

39）ことから HIV のエンベロープ能性が示唆される。現状では未だ支配的な機構は明確ではないが、Ce の効果はエンヴェロープを有する Φ 6 の方が、ウイルスと同様に、結合部位をポリ酸との静電相互作用にエンベロープを持たない Qβ より顕著であることが考えら

よる強い吸着作用により不活化させる可能性がある。

れる。ポリ酸と Ce イオンの組み合わせは、Φ 6 と同じ型の

また、La Ⅲや Ce Ⅲのイオンには、ホスト細胞がウイル

インフルエンザウイルスや COVID- 19 等に有効である可スの RNA 再生を抑制する効果があることが報告されてい能性がある。Fig. 8 に今回合成した試料の Φ 6 の実際のプ

40）。CeO 2 の活性が低いのは、イオンの多くが Ce Ⅳでラークの変化を示す。6 時間でプラークの数が大幅に減少あるためかも知れない。Φ 6 に対しては、La Ⅲの活性はあしていることが分かる。なお、今回作製した LMO, LCMO

まり見られなかった。ウイルスの特性の違いによるものとは、いずれの試料においても MDCK 細胞（CCL- 34 , イヌ

思われるが、現状では理由は明らかでない。一方、LCMO

腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株）に対する顕著な毒性はが LMO よりも高い活性を示すことから Ce の効果が見られみとめられなかった。

る

る。CeO 2 単独では殆ど活性を示さないことから、Ce イオ

今回作製した La の複合酸化物の水に対する漏出量はンと Mo イオンとの相乗的な効果が関与していることが考Ag 2 O のそれ（0 . 86 µmol/L 48））よりは多いが、MoO 3 よりえられる。

は少ない。いずれも粉末も白色または薄い黄色であるた

希土類元素とポリ酸の組み合わせによる抗ウイルス活性についてはいくつか報告されており

41-43）

め、意匠性を損なう可能性が低く、様々なところに応用が、Liu らはタングステ可能である。MoO 3 は水への溶解度が高いため、初期は抗ン系のヘテロポリ酸において、ポリ酸の W イオンの一部

菌・抗ウイルスを発現すると思われるが、すぐに失活すが還元されたヘテロポリブルーの状態では Ce イオンの方る。成分を徐放する La 複合酸化物は、失活しづらく、撥が La イオンよりも高い抗インフルエンザウイルス活性を水性も与えるため、広い用途に適用できる。今回作製した与えることが報告している 42）。また、Kato や Shiohara らは、

LCMO は薄い黄色を呈し、紫外・可視領域に吸収が見らCe イオンの高い酸化力に起因する Mars - van Krevelenれる（Fig. 9）が、光触媒活性は確認できなかった。このこ機構

44 , 45）

が、Ni や Mn などの多価金属の酸化物と組み合わせることで増大することを報告している

46 , 47）。実際、常とから紫外線吸収効果のある抗ウイルス材料としての用途が期待される。

温で LCMO とアルコールを反応させることで Ce Ⅳ の割合

また、今回の抗菌・抗ウイルス活性の評価は、これらのが減少し、Mo の一部が還元されて Mo Ⅴが生じることが撥水性の寄与は加味されていない。撥水性表面は水と接触

XPS 分析により確認できていることから、Ce 自体の強いしにくいことから抗菌活性が向上することが報告されてい酸化力が関与してポリ酸の抗ウイルス効果を高めている可る 49）。今後、撥水性が抗菌・抗ウイルス活性へ及ぼす寄Fig. 8 Practical photographs of plaques for LMO（a & b）
and LCMO（c & d）against Φ 6 between 0 h (a & c) and 6h（b & d）．

− 49 −

Fig. 9

UV-is spectra of LMO and LCMOコスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

7） K. Motoike, S. Hirano, H. Yamana, T. Onda, T.

与について、定量的な検討を行っていく必要がある。

４．総

Maeda, T. Ito, M. Hayakawa, Antiviral activities of括heated dolomite powder, Biocontrol Sci., 1 3, 1 3 1-1 3 8

本研究で開発した LCMO は、自己撥水性、紫外線吸収能、（2008）．

抗菌・抗ウイルス性を兼ね備えた新規の酸化物粉末材料で

8） G. Azimi, R. Dhiman, H. M. Kwon, A. T. Paxson, K. K.

ある。これまで撥水性や紫外線吸収能を有する化粧品は存

Varanasi, Hydrophobicity of rare-earth oxide ceramics,

在したが、新たな機能として抗菌・抗ウイルス活性が添加

Nat. Mater., 12, 4, 315-320（2013）．

されると、人を彩る「化粧」という活動をする人が、「健康」

9） D. J. Preston, N. Miljkovic, J. Sack, R. Enright, J.

という価値を新たに得ることができるようになる可能性がQueeney, E. N. Wang, Effect of hydrocarbon adsorptionある。これまでも化粧をすることで日焼け等の肌のトラブ

on the wettability of rare earth oxide ceramics, Appl.

ルを防止する機能は得られているが、この材料の化粧へのPhys. Lett., 105, 1, 11601（2014）．

応用は、これまでの概念から一歩進んで、寿命そのものを

10）S. Sankar, B. N. Nair, T. Suzuki, G. M. Anilkumar,

延ばす試み、いわば化粧と医療の融合に繋がる可能性を秘M. Padmanabhan, U. N. S. Hareesh, K. G. Warrier,

めている。単に高齢者へ生きがいを与え、健康寿命を延ばHydrophobic and Metallophobic Surfaces: Highly

すだけでなく、ウイルス感染からの防止を通じて、本当のStable Non-wetting Inorganic Surfaces Based on
Lanthanum Phosphate Nanorods, Sci. Rep., 6 , 1 , 22732

意味での健康獲得に繋がることが考えられる。

（2016）．
（References）

11）G . C a r c h i n i , M . G . M e l c h o r , Z . Ł o d z i a n a , N .

1） S. Galdiero, A. Falanga, M. Vitiello, M. Cantisani, V.

López, Understanding and Tuning the Intrinsic

Marra, M. Galdiero, Silver nanoparticles as potential

Hydrophobicity of Rare-Earth Oxides: A DFT+U

antiviral agents, Molecules, 16, 8894-8918（2011）．

Study, ACS Appl. Mater. Interfaces, 8 , 1 , 1 5 2 - 1 6 0

2） K. Zodrow, L. Brunet, S. Mahendra, D. Li, A. Zhang,（2016）．

Q. Li, P. J. J. Alvarez, Polysulfone ultrafiltration

12）K. K. Oh, L. Kangsik, K. Zonghoon, Y. L. Kyung, W.

membranes impregnated with silver nanoparticles

L. Chang, J. M. Su, M. L. M. Jae, N. Clement, D. Wontae,

show improved biofouling resistance and virus

K. Christian, L. Hyungjun, B. R. Han, Hydrophobicity ofremoval, Water Research, 43, 715-723（2009）．

Rare Earth Oxides Grown by Atomic Layer Deposition,
Chem. Mater., 27 , 1 , 148 - 156（2015）．

3） S. Gaikwad, A. Ingle, A. Gade, M. Rai, A. Falanga, N.
Incoronato, L. Russo, S. Galdiero, M. Galdiero,, Antiviral13）N. Desai, S. Mali, V. Kondalkar, R. Mane, C. Hong,activity of mycosynthesized silver nanoparticles

P. Bhosale, Chemically Grown MoO 3 Nanorods foragainst herpes simplex virus and human parainfluenza

Antibacterial Activity Study, J. Nanomed. Nanotechnol.,virus type 3, Int. J. Nanomedicine, 8, 4303-4314（2013）．

6 , 6 , 1000338（2015）．

4） R. Nakano, H. Ishiguro, Y. Yao, J. Kajiok, A.

14）C . Z o l l f r a n k , K . G u t b r o d , P . W e c h s l e r , J . P .

Fujishima, K. Sunada, M. Minoshim, K. Hashimoto, Y.

Guggenbichler, Antimicrobial activity of transition

Kubota, Photocatalytic inactivation of influenza virus

metal acid MoO 3 prevents microbial growth onby titanium dioxide thin film, Photochem. Photobiol.

material surfaces, Mater. Sci. Eng. C, 3 2 , 1 , 4 7 - 5 4

Sci., 11, 1293-1298（2012）．

（2012）．

5） C. Zhanga, Y. Li, D. Shuai, Y. Shen, D. Wang,

15）K . K r i s h n a m o o r t h y , M . P r e m a n a t h a n , M .

Progress and challenges in photocatalytic disinfection

Veerapandian, S. J. Kim, Nanostructuredof waterborne Viruses: A review to fill current

molybdenum oxide-based antibacterial paint: effective

knowledge gaps, Chem. Eng. J., 355, 399-415（2019）．

growth inhibition of various pathogenic bacteria,6） H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F.

Nanotechnology, 25 , 315101 1 - 10（2014）．

Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand,16）C. C. Mardare, A. W. Hassel, Investigations on

D. Javanmard, S. J. Kiani, M. Esghaei, V. Pirhajati-

Bactericidal Properties of Molybdenum-Tungsten

Mahabadi, A. Ataei-Pirkooh, S. H. Monavari, Inhibition

Oxides Combinatorial Thin Film Material Libraries,of H1N1 influenza virus infection by zinc oxide

ACS Comb. Sci., 16 , 11 , 631 - 639（2014）．

nanoparticles: another emerging application of17）R. A. Rocha, E. N. S. Muccillo, Synthesis andnanomedicine, J. Biomedical Sci., 26:70, 1-10（2019）．

thermal decomposition of a polymeric precursor of the− 50 −

撥水性、抗菌・抗ウイルス性、紫外線遮蔽性を併せ持つ新規酸化物固体材料の開発

Aqueous Molybdate Solutions, At. Energy Soc. Japan,

La 2 Mo 2 O 9 compound,” Chem. Mater., 1 5 , 2 2 , 4 2 6 8 -

8 , 2 , 142 - 153（2009）． [in Japanese]4272（2003）．
18）T. Matsumoto, K. Sunada, T. Nagai, T. Isobe, S.

28）M. Takaya, Y. Shinohara, F. Serita, M. Ono-

Matsushita, H. Ishiguro, A. Nakajima, Preparation of

Ogasawara, N. Otaki, T. Toya, A. Takata, K. Yoshida,hydrophobic La 2 Mo 2 O 9 ceramics with antibacterial

N. Kohyama, Dissolution of Functional Materials andand antiviral properties, J. Hazard. Mater., 378 , 120610

Rare Earth Oxides into Pseudo Alveolar Fluid, Ind.

（2019）．

Health, 44 , 4 , 639 - 644（2006）．

19）A. Arumugama, C. Karthikeyan, A. S. H. Hameed, K.

29）Langeʼs Handbook of Chemistry 1 2thedition, Ed. J.

Gopinath, S. Gowri, V. Karthika, Synthesis of cerium

A. Dean, McGraw-Hill Book Company, New York, ppoxide nanoparticles using Gloriosa superba L. leaf

4 - 38 , 4 - 125 ,（1978）．

extract and their structural, optical and antibacterial30）F. J. Jing, N. Huang, Y. W. Liu, W. Zhang, X. B.

properties, Mater. Sci. Eng. C 49 , 408 - 415（2015）．

Zhao, R. K. Y. Fu, J. B. Wang, Z. Y. Shao, J. Y. Chen,

20）A. Gupta, S. Das, C. J. Neala, S. Seal, Controlling theY. X. Leng, X. Y. Liu, P. K. Chu, Hemocompatibility

surface chemistry of cerium oxide nanoparticles forand antibacterial properties of lanthanum oxide films

biological applications, J. Mater. Chem. B, 4 , 3 1 9 5 -synthesized by dual plasma deposition., J. Biomed.

3202（2016）．

Mater. Res. Part A, 87 A, 1027 - 1033（2008）．

21）Y.-F. Goh, A. Z. Alshemary, M. Akram, M. R.

31）J. He, W. Wang, W. Shi, F. Cui, La 2 O 3 nanoparticle/

A. Kadir, R. Hussain, In-vitro characterization ofpolyacrylonitrile nanofibers for bacterial inactivation

antibacterial bioactive glass containing ceria, Ceram.

based on phosphate control, RSC Adv., 6 , 99353 - 99360

Int., 40 , 729 - 737（2014）．

（2016 )

22）P. Bellio, C. Luzi, A. Mancini, S. Cracchiolo, M.

32）J. Liu, G. Wang, L. Lu, Y. Guo, L. Yang, Facile shape-

Passacantando, L. D. Pietro, M. Perilli, G. Amicosante,

controlled synthesis of lanthanum oxide with different

S. Santucci, G. Celenza, Cerium oxide nanoparticles

hierarchical micro/nanostructures for antibacterial

as potential antibiotic adjuvant. Effects of CeO 2

activity based on phosphate removal, RSC Adv., 7 ,nanoparticles on bacterial outer membrane

40965 - 40972（2017）．

permeability, BBA-Biomembranes 1 8 6 0 , 2 4 2 8 - 2 4 3 533）S. G. Sarafianos, U. Kortz, M. T. Pope, M. J. Modak,（2018）．

Mechanism of polyoxometalate-mediated inactivation23）R. Li, S. Yabe, M. Yamashita, S. Momose, S. Yoshida,of DNA polymerases: An analysis with HIV- 1 reverse

S. Yin, T. Sato, Synthesis and UV-shielding properties

transcriptase indicates specificity for the DNA-binding
cleft, Biochem. J., 319 , 2 , 619 - 626（1996）．

of ZnO- and CaO-doped CeO 2 via soft solution chemical
process, Solid State Ionics, 151 , 235 - 241（2002）．

34）Y. Inouye, Y. Tokutake, T. Yoshida, Y. Seto,

24）F. Caputo, M. De Nicola, A. Sienkiewicz, A.

H. Hujita, K. Dan, A. Yamamoto, S. Nishiya, T.

Giovanetti, I. Bejarano, S. Licoccia, E. Traversa, L.

Yamase, S. Nakamura, In vitro antiviral activity of

Ghibelli, Cerium oxide nanoparticles, combining

polyoxomolybdates. Mechanism of inhibitory effectantioxidant and UV shielding properties, prevent UV-

2 Eu（MoO
4
4 H 2 O）
1（Mo6
7 O 2 4）4）of PM- 1 0 4（NH 4）1 2 H （（induced cell damage and mutagenesis, Nanoscale, 7 ,· 1 3 H 2 O on human immunodeficiency virus type 1 ,15643 - 15656（2015）．

Antiviral Res., 20 , 4 , 317 - 331（1993）．

25）M. Aguirre, M. Paulis, J. R. Leiza, UV screening clear35）M. S. Weeks, C. L. Hill, R. F. Schinazi, Synthesis,coats based on encapsulated CeO 2 hybrid latexes, J.

Characterization, and Anti-Human Immunodeficiency

Mater. Chem. A., 1 , 3155 - 3162（2013）．

Virus Activity of Water-Soluble Salts of26）K. Sunada, M. Minoshima, K. Hashimoto, Highly

Polyoxotungstate Anions with Covalently Attachedefficient antiviral and antibacterial activities of solid-

Organic Groups, J. Med. Chem., 3 , 35 , 1216 - 1221（1992）．

state cuprous compounds, J. Hazard. Mater., 235 - 236 ,36）K. Dan, K. Miyashita, Y. Seto, H. Fujita, T. Yamase,
The memory effect of heteropolyoxotungstate（PM-19）265 - 270（2012）．

pretreatment on infection by herpes simplex virus at27）Y. Inaba, K. Ishikawa, K. Tatenuma, E. Ishitsuka,
Development of99

the penetration stage, Pharmacol. Res., 46 , 4 , 357 - 362

Mo Production Technique by

Solution Irradiation Method Characterization of（2002）．

− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 202037）D. A. Judd, J. H. Nettles, N. Nevins, J. P. Snyder, D.

43）D. L. Barnarda, C. L. Hill, T. Gage, J. E. Matheson,

C. Liotta, J. Tang, J. Ermolieff, R. F. Schinazi, C. L. Hill,

J. H. Huffman, R. W. Sidwell, M. I. Otto, R. F. Schinazi,

Polyoxometalate HIV- 1 Protease Inhibitors. A New

Potent inhibition of respiratory syncytial virus

Mode of Protease Inhibition, J. Am. Chem. Soc., 123 , 5 ,by polyoxometalates of several structural classes,
Antiviral Research, 34 , 27 - 37（1997）．

886 - 897（2001）．
38）H. Goto, A novel function of plasminogen―binding44）M. Lykaki, E. Pachatouridou, S. A.C. Carabineiro, E.

activity of the NA determines the pathogenicity of

Iliopoulou, C. Andriopoulou, N. Kallithrakas-Kontose, S.

influenza A virus, Virus, 5 4 , 4 , 8 3 - 9 1（2 0 0 4）[inBoghosian, M. Konsolakisa, Ceria nanoparticles shape

Japanese].

effects on the structural defects and surface chemistry:
Implications in CO oxidation by Cu/CeO 2 catalysts,39）G. Sutton, J. M. Grimes, D. I. Stuart, P. Roy,
Bluetongue virus VP 4 is an RNA-capping assembly
line, Nat. Struct. Mol. Biol., 14 , 5 , 449 - 451（2007）．

Appl. Catal. B: Environ. 230 , 18 - 28（2018）．
45）S. Scirè, S. Minicò, C. Crisafulli, C. Satriano, A.

40）G. Wengler, G. Wengler, A. Koschinski, A short

Pistone, Catalytic combustion of volatile organic

treatment of cells with the lanthanide ions La , Ce ,compounds on gold/cerium oxide catalysts, Appl.

Pr

Catal. B: Environ., 40 , 43 - 49（2003）．

3+

3+

or Nd

3+

3+

changes the cellular chemistry intoa state in which RNA replication of flaviviruses is46）M. Shiohara, T. Isobe, S. Matsushita, A. Nakajima,

specifically blocked without interference with host-

Decomposition of 2 -naphthol in water by TiO 2 modified

cell multiplication, J. General Virology, 88 , 3018 - 3026

with MnOx and CeOy, Mater. Chem. Phys., 183 , 37 - 43

（2007）．

（2016）．

41）Y.-N. Liu, S. Shi, W.-J. Mei, C.-P. Tan, L.-M. Chen,47）C. Kato, M. Shiohara, K. Sunada, T. Isobe, A.

J. Liu, W.-J. Zheng, L.-N. Ji, In vitro and in vivo

Yamaguchi, S. Matsushita, H. Ishiguro, M. Miyauchi, A.

investigations on the antiviral activity of a series of

Nakajima, Decomposition of 2 -naphthol in water andmixed-valence rare earth borotungstate heteropoly

antibacterial property by NiO and CeOx modified TiO 2

blues, Eur. J. Med. Chem., 43 , 1963 - 1970（2008）．

in the dark or under visible light, J. Ceram. Soc. Jpn.,42）J. Liu, W.-J. Mei, A.-W. Xu, C.-P. Tan, S. Shi, L.N. Ji, Synthesis, characterization and antiviral

127 , 688 - 695（2019）．
48）D. R. Lide, “Handbook of Chemistry and Physics”（81activity against influenza virus of a series of noveled.）．Boca Raton, FL: CRC Press. pp. 4 - 83 , 1998 .

manganese-substituted rare earth borotungstates49）X. Zhang, L. Wang, E. Levänen, Superhydrophobic

heteropolyoxometalates Antiviral Research, 62 , 65 - 71

surfaces for the reduction of bacterial adhesion, RSC（2004）．

Adv., 3 , 30 , 12003 - 12020（2013）．

− 52 −

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：
ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工
関西学院大学理工学部生命医化学科

平井洋平

Primary cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEK) have been widely used for evaluation of activities ofcosmetic components, however, these cells have considerable lot-to-lot variations and readily to lose differentiation potential
upon serial passages. This study aimed to prepare a novel iPS-derived cell system for effective screening of cosmetic
compounds. We generated iPS cells that were stably transfected with tet/dox-inducible expression cassette for BMP4 (TetBMP4-iPS), so that these cells can be maintained as iPS cells in conventional medium, but undergo differentiation into
ectodermal lineages after treatment with retinoic acid (RA) and subsequently into krt14-positive keratinocyte progenitors
upon treatment with dox. We found that thus generated keratinocyte progenitors were unstable and spontaneously differentiate
into several epidermal lineages. To detect the appearance of the specific epidermal lineage, e.g., hair cortex, Tet-BMP4-iPS
cells were further introduced with differentiated cell-specific promoter, e.g., KRT31 promoter for hair cortex, which had beenconnected with luciferase reporter. When treated simultaneously with RA, dox and soluble factors from dermal papilla cells,
Tet-BMP4-iPS cells quantitatively increase the expression of luciferase up to three days, suggesting that activity of any solublecomponents for hair cortex differentiation could be evaluated by this cell system. To find the optimal condition of RA and dox
treatment for sensitive detection of hair differentiation, we then developed a model of differentiation process of pluripotent
iPS cells into terminally differentiated hair cortex cells.

１．緒を発現誘導できるような仕掛けを予め施し、導入した

言

BMP 4 の遺伝子発現をオフの状態で十分量にまで増殖さ本研究は、初代培養細胞や細胞株に比べ遥かに優れた次せ、そこに外胚葉への分化を促すためのレチノイン酸と、世代の化粧品評価モデルを創出し、最終的には種々の化粧

外胚葉から表皮系列に向かわせる BMP 4 を発現誘導する品研究に新たなブレークスルーを与えることを目指したもことにした。また、得られる細胞には表皮前駆細胞以外ののである。現在、業界として実験動物が使えないため化粧細胞も含まれると考えられるため、表皮前駆細胞からの品材料の評価には培養細胞に多くを頼らざるを得ない状況

分化プロセスを高感度にモニターできるように、表皮分がある。一方で、汎用される初代培養ケラチノサイトはヘ化マーカーのプロモーターにレポーター遺伝子を連結させテロな分化状態の細胞が混在しているだけでなく、継代可た遺伝子の導入も併せて行った。本研究では、表皮前駆能回数に限りがあるため遺伝子操作による均一細胞の樹立

細胞から変化する分化細胞として、特に培養系での分化誘も難しい。本研究では、未分化な表皮前駆細胞が十分量確導が困難とされる毛／毛包に着目し、毛のケラチンである

保でき、さらに表皮構成成分への分化を容易にモニター可KRT 31 のプロモーターを適応させることにした。さらに、

能な系の確立を試みた。具体的には、低分子化合物の添加

万能細胞の分化数理モデルを作成してその分化誘導効率ののみで ES/iPS 細胞から表皮前駆細胞を作製し、かつ、表向上についても検討した。本研究のコンセプトによって作皮前駆細胞から目的細胞への分化を容易に定量追跡できる成された iPS 細胞は、培養液に 2 種類の安価な低分子化合系を確立することにした。分化万能性を有する ES/iPS 細物を添加し、レポーター遺伝子の発現追跡を行うだけで分胞が表皮前駆細胞に分化するためには、まず中・内胚葉で化状態を定量的に把握できるため、薬剤候補物質をこの系はなく外胚葉へ変化し、次に神経系ではなく表皮系へと分に添加することでその分化誘導活性を評価できると期待さ化する必要がある。前者についてはレチノイン酸の添加が、れる。

また、後者については細胞近傍の一時的な BMP 4 の濃度

２．方上昇が効果的であるとされる 1）。
そこで、本研究では必要に応じて iPS 細胞表面で BMP 4

法

2 . 1．iPS 細胞の遺伝子加工Ⅰ
未分化な万能細胞は生理活性分子に敏感に応答することや遺伝子の導入・発現が難しいことを考慮して、テトラThe next-generation screening cells forcosmetic components: ES/iPS cells withmultiple gene-manipulations
Yohei Hirai
Department of Biomedical Chemistry,
Kwansei Gakuin University

サイクリン／ドキシサイクリンを添加した時だけ導入遺伝子の発現が可能になるシステム（Tet-on system）を採用
し、強制的にゲノムに遺伝子挿入できる Piggybac トラン
スポゾンの活性 2）を利用することにした。そのため、まずPB-tet ベクターをベースにしたコンストラクトを構築し− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

た（図 1）。次に調製したコンストラクトを rtTA、トラン

包への分化をモデルに選び、その分化プロセスを簡便に追スポゼース、薬剤耐性ベクターと共にマウス iPS 細胞に導跡できる系への展開を試みた。細胞から毛／毛包への分化

入し、テトラサイクリン／ドキシサイクリンの添加によりが高感度に検出できるように、表皮前駆細胞が毛へ分化す

BMP- 4 の発現量が ON/OFF できる安定細胞を作製したる際に発現するケラチン 31 のプロモーター活性を定量追（tet-BMP 4 -iPS 細胞）。また、この細胞がテトラサイクリ

跡できるように、まずゲノムからケラチン 31 のプロモー

ン／ドキシサイクリン非添加状態では未分化状態を保ちなター領域を抽出しルシフェラーゼレポーターを連結したプ

がら通常の iPS 細胞として扱えることを確認し、十分に増ラスミドを作成しこれを細胞に導入した。

殖させたものをストックした。

2．3．ES/iPS 細胞の分化プロセスのモデル化

2．2．iPS 細胞の遺伝子加工Ⅱと分化の検出

まず、多能性幹細胞である iPS 細胞から外胚葉、内胚葉、本研究では、特に培養下で未分化表皮細胞／表皮前駆細中胚葉への 3 胚葉分化と、外胚葉から神経前駆細胞や表皮胞からの分化が困難とされ特殊な表皮付属物である毛／毛前駆細胞への分化、さらには表皮前駆細胞から表皮細胞、毛包・毛髪細胞への分化のプロセスを考慮した細胞系譜図を作成した（図 2）。次に、この図のD32/D33 を目的の毛包・毛髪細胞と設定しグループ分けを行った。グループ分けの第 1 段階として（ステージ 2）group1 の一つの細胞集団が 3種類の細胞に分化すると仮定し、その仮定に基づいて D 32 /D 33 の分化に関与しないグループ（group 2）と関与するグループ（group 3）に分けた。さらに、第 2 段階として（ステージ3）、group 3 の中でもD 32 /D 33 の分化に関与しないグループ（group 5）と関与するグループ（group 6）に分け、group 6 が直接的に D 32 /D 33 に分化するとプログラムした。また、初図1

コンストラクトおよび遺伝子導入細胞（tet-BMP4-iPS）期の細胞数を便宜上 100 個とし、条件として各ステージの細図 2 iPS 細胞から各細胞への分化モデル
左：分化プロセスの区分け
A; 多能性幹細胞（iPS 細胞）（group1） B.C; 内胚葉もしくは中胚葉（group2） D; 外胚葉（group3） B1~B3,
C1~C3: B11~B33 もしくは C11~C33 の前駆細胞（group7） D1,2; D11~D23 の前駆細胞（group5） D3; 表皮前駆細胞（group6） D31; 表皮細胞（group8） D32, D33; 毛包（group9）もしくは毛髪細胞（group10）
右：シミュレーションのパラメータ
分裂割合 ; 事象が起こる際に細胞が分裂する割合。1, 2, 3 への分化割合 ; 事象が起こる際に分化する割合（例えばD が D1 へ分化する割合を 1 への分化割合。D2 へ分化する割合を 2 への分化割合。D3 へ分化する割合を 3 への分化割合としている）。現状維持割合 ; 事象が起こる際にそのステージにとどまり変化をしない割合。

− 54 −

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工

胞は 1 日ごとにそれぞれある割合で（1）“分裂”（2）“次のステ（Tet-BMP 4 -iPS 細胞）はテトラサイクリン（tet）／ドキシサイージに移行”（3）“現状維持”のいずれかの事象を起こすと仮定

クリン（Dox）の添加に応じて BMP4 を発現し、BMP4 の下流した。また、D 32 /D 33 は分裂しないため（1）“分裂”の条件は適の smad 1 / 5 / 8 も速やかにリン酸化されることが確認できた。

用されず、さらに毛包や毛髪細胞は脱核し、mRNAの発現がまた、未分化マーカー nanogと神経前駆マーカー nestin のなくなることから（4）“消滅”を条件として付け加えた（図 2）。

mRNA発現を指標に、この細胞を外胚葉に分化誘導するた

３．結めの至適 RA 濃度を決定した。次に、導入遺伝子の発現誘

果導により表皮前駆細胞への分化が促進されるかを調べること

従来から、分化万能性を有する細胞はレチノイン酸（RA）にした。RAと同時に Doxを添加し神経前駆細胞のマーカーの添加で外胚葉へ、外胚葉は細胞近傍の BMP 4 の刺激で

nestinと表皮前駆細胞のマーカー krt 14 の発現変動をqRT-

各種の表皮由来細胞のソースである表皮前駆細胞に分化しPCR 法にて解析したところ、Dox が RA による神経前駆細やすいことが知られている。そこで、本研究ではフィーダ胞への分化を抑制し表皮前駆細胞への分化を促進することーフリーで安定して増殖させることができるマウス iPS 細が確認できた。次に、RAとDoxを添加し 24 時間、48 時間、

胞を出発材料に選び、これに RA と BMP 4 を作用させる

72 時間で各種マーカーの mRNA発現変動ならびにkrt 14 免

ことで表皮前駆細胞の安定供給を試みることにした。RA

疫蛍光染色やFACS による解析を行った。その結果、分化は低分子化合物で容易に取り扱えるのに対し、BMP 4 は

誘導 24 時間で未分化マーカー nanogの発現が低下し未分化性不安定で高価なタンパク質である。そこで、今回は iPS 細が失われていること、神経細胞マーカー tuj1 の発現は変わら

胞自身に BMP 4 を生産・分泌させる系を構築した。具体ないこと、krt14 の発現が増加していくことがわかった。免的には、低分子化合物によって BMP 4 遺伝子の発現を人

疫蛍光染色やFACS解析では、KRT14 の発現細胞の割合も工的に制御できるように tet on システムを用いて細胞に日を追うごとに増加していくことも判明した（図 3）。次に、安定的な遺伝子導入を行った。樹立した遺伝子導入細胞

Tet-BMP 4 -iPS 細胞由来の表皮前駆細胞は通常の表皮前図 3 tet-BMP4-iPS の分化誘導
上；各種マーカーの発現 nanog（未分化マーカー）、nestin（神経前駆マーカー）、tuj1（神経系マーカー）、gata4（内胚葉マーカー）、t（中胚葉マーカー）N=3 ＊＊＊ p<0.001
krt14（表皮前駆マーカー）N=4 ＊＊ p<0.01
下 : KRT14 の免疫蛍光染色。control では KRT14 ポジティブな細胞が確認できなかったが、RA/Dox による分化誘導によって KRT14 ポジティブな細胞が確認された。

− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

駆細胞と同様に成長因子による増殖や、次のステージへの培養 1 日で krt 75 の発現が増加し、3 日目でピークに達し分化が可能であるかを調べた。Tet-BMP 4 -iPS 細胞を RAた後ゆるやかに発現が減少した。一方、krt 31、krt 33 a のと Dox で刺激する際に同時に keratinocyte growth factor

発現は 4 日でピーク達しその後減少した（図 4）。この結果（KGF）（100 ng/ml）を添加すると、krt 14 の発現がさらには、Tet-BMP 4 -iPS 由来の表皮前駆細胞は毛乳頭細胞と上昇したことから、分化誘導された表皮前駆細胞は KGF

共培養をすることで、まず毛包へ、そして少し遅れて毛により増殖が促されると考えられる。ただし、krt 14 の発髪細胞へと分化することを示唆している。ちなみに、生体

現量は 72 時間を超えると減少に転じ、角化した表皮のマ内でも未分化な表皮から毛包／毛が発生する過程で同様のーカーであるトランスグルタミナーゼ 1（TGase 1）の発現挙動を示すことが知られている。本研究で用いた共培養系が開始されていたことから、得られた表皮前駆細胞はこのにおいては Tet-BMP 4 -iPS 由来細胞は毛乳頭細胞とは多段階で自発的に次のステージへ分化したと考えられた。以

孔質膜を隔てて存在していること、毛乳頭細胞以外の細上の結果より、RA/Dox 非添加系で安定して増殖・維持で胞を使って共培養しても毛包／毛へと分化誘導されない

きる Tet-BMP 4 -iPS 細胞は、RA/Dox の添加に応答してことから、毛乳頭細胞から分泌される液性因子（拡散性因

生体内の表皮前駆細胞と同様な性質を有する細胞へと簡単子）の中に毛包や毛髪細胞へ分化させる物質が存在していに分化することがわかった。次に、Tet-BMP 4 -iPS 由来

ると考えられる。現在、毛乳頭細胞から放出される毛／毛の表皮前駆細胞が、初代培養表皮細胞では分化しにくい毛包形成因子の 1 つとして Wnt 5 a が着目されている 5）。そ

包・毛髪細胞に分化誘導が可能なのかを調べた。生体内にこで、RA/Dox 存在下で単独培養した Tet-BMP 4 -iPS 細

おいて表皮前駆細胞は毛乳頭細胞との相互作用することに胞に WNT 5 a（100 ng/mL）を添加したところ、krt 75 のより毛包・毛髪細胞へと分化することが知られている

3, 4）

。そ

発現は有意に増加したが krt 31 の発現には変化が見られなの現象を模倣するため、多孔膜メンブレンを使って毛乳頭かった。また、前述の KGF については、krt 14 に対する細胞との共培養を行い、Tet-BMP 4 -iPS 由来細胞内の毛krt 75 /krt 31 両方の相対的な発現量変動に影響を与えない

包マーカー krt 75 ならびに毛髪のマーカー krt 31 , krt 33 a

ことがわかった。これらの結果は、WNT 5 a は発毛誘導活の mRNA 発現を qRT-PCR 法で解析した。その結果、共性を有すると考えられるが実際には毛包細胞への分化を

図4 毛乳頭細胞が分泌する因子による毛包・毛への分化誘導
a; 共培養の模式図。Tet-BMP4-iPS細胞は毛乳頭細胞の分泌する発毛誘導因子の影響を受ける。
b; 毛包・毛髪の構造における各遺伝子の発現場所の簡易図。krt75は毛包細胞への分化マーカーkrt31または、
krt33aは毛髪細胞分化マーカーとして使用した。
c~e: 毛包（krt75）／毛髪（krt31, krt33a）細胞分化マーカーの発現変化。これらのマーカーの発現が有意に増加することから、毛包・毛髪細胞への分化が進行していることが確認できる。
N=3 ＊p<0.05 ＊＊p<0.01 ＊＊＊p<0.001− 56 −

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工促進させる一方で毛髪細胞への分化には影響しないこと、KGF によって表皮前駆細胞の数を増やすことにより、さKGF は表皮前駆細胞の増殖のみに関わり毛 / 毛包への分化らに顕著に毛髪細胞分化が追跡できることも確かめられた。

に関わらないことを示唆する。ただし、この実験系では産これらの結果は、Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞を用い、生される表皮前駆細胞の割合が十分とはいえず（表皮前駆毛乳頭細胞との共培養処理の代わりに試験物質の薬剤候補

細胞の割合は 10 ％程度）
、高感度の分化追跡法の確立（以因子を添加することで試験物質の発毛誘導活性を高感度に

下の 3 . 2 .）、ならびに分化誘導条件の再検討（以下の 3 . 3 .）モニターできる可能性を示唆している（図 5）。

が必要と考えられた。

3．3．ES/iPS 細胞の分化モデルと分化誘導条件の検討

3．2．毛への分化の高感度追跡系
前述の通り、表皮前駆細胞の産生効率が低いことを考

Tet-BMP 4 -iPS 細胞から表皮前駆細胞への分化効率を慮し、次に、最終的な表皮由来の目的細胞（モデルケース向上させるためには、RA ならびに Dox の最適添加条件をでは毛髪細胞）への分化プロセスを高感度にモニターでき

決めることが必要と考えられた。そこで、iPS 細胞から毛る系の構築に取り組んだ。具体的には、毛髪細胞への分／毛包への分化プロセスの数理モデル化を行い、そこか化に応答して特異的に発現開始される KRT 31 のプロモー

ら添加条件を抽出することにした。
「2 . 方法」の項で述べた

ターにレポーターのルシフェラーゼ遺伝子を連結したコパラメータから毛包・毛髪細胞（D 32 , 33）の mRNA の発現

ンストラクトを Tet-BMP 4 -iPS 細胞に導入する方法を採パターンはある一定期間増加しピークを迎えた後、ゆるや用した。まず、KRT 31 のプロモーターと予想される領域

かに減少していくと予想できた（図 2）。そこで、この縦軸

1700 bp を PCR でマウスゲノムより取得し、それにルシ（発現量）を上げる、即ち、効率的に毛包・毛髪の細胞へフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトプラスミドの分化を促進させるために group 1（A）から group 2（B,

（KRT 31 pr-Luc）を作製しこれを Tet-BMP 4 -iPS 細胞へ遺C）、group 3（D）への分化パラメータを変化させた。そ伝子導入した（Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞）。このの結果、group 1 から 3（D）への分化割合を変動させる

Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞を RA/Dox で刺激し毛ことで、D 32 の縦軸が大きく変動するが（赤枠で囲った乳頭細胞との共培養処理を行うことで、毛髪細胞分化が高図）、group 1 , 2（B, C）への分化割合を変化させても D 32

感度で継時的にモニターできるようになった（図 5）。また、の変動が小さい結果となり（緑枠で囲った図）、group 1 か

図5 系の概略図
a; tet-BMP4-KRT31-LUC iPS細胞の調製と毛髪細胞への分化追跡 KRT31 プロモーター配列をLucの遺伝子上流に挿入し、tet-BMP4-iPS細胞に導入した。この細胞にRA, Doxと発毛誘導剤を作用させるとルシフェラーゼが発現する。インターナルコントロール, β-gal
b; 毛乳頭細胞からの分泌因子による発毛誘導の追跡 N=3 ＊p<0.05
c; 毛髪細胞への分化能をもつ薬剤スクリーニング系の簡略図。

− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020ら group 3（D）への分化を促すことでより毛包・毛髪の細は極めて単純なアイデアをベースにしたものであり、用い胞への分化誘導効率を上げることができると予想されたたプロモーターを他の目的細胞特異的タンパク質のものに（図 2）。同様の解析を行うと、① group 1 から group 3 への換えることで毛髪以外の表皮由来細胞への分化プロセスも分化を促す、② group 3 から group 6 への分化を促す、③

容易に定量追跡できるはずである。ただし、これまで発毛group 6 から group 9 や 10 への分化を促す、の 3 つのこと活性が認められてきた WNT 5 a には毛髪分化誘導能は検出が最も有効であり、各プロセスを加速させても D 32 /D 33

されず、また、同様の活性が指摘されている Shh 5 - 7）にもの発現はまず増加してピークを迎え、その後ゆるやかに減明らかな活性は認められなかった（データ示さず）。一方で、少するパターンをとると考えられた。これらの結果を鑑み、WNT 5 a には表皮前駆細胞から毛包細胞への分化を促すこ

まず RA のみを 120 時間作用させて外胚葉分化誘導を十分とが確認され、これらの因子群のもつ発毛誘導活性は毛髪にした後に、Dox のみを 72 時間作用させたところ、RAを生み出すことによるのではなく、毛髪細胞の支持細胞をと Dox を同時に 192 時間作用させたものと比べて KRT 14

生み出すことによる間接的なものである可能性もある。

陽性細胞の割合が 14 ％から 34 ％にまで増加した（図 6）。

４．考

本研究では、表皮前駆細胞の状態で安定的に維持することができないことが確認された。この、表皮前駆細胞の自察然分化を引き起こす原因としては培養液中のカルシウム濃本研究で iPS 細胞に多重の遺伝子加工を施すことで、安度が適切でなかった可能性がある。一般的に、未分化な表定して増殖・維持でき、しかも低分子化合物の添加のみで皮細胞は低カルシウムの培養液（0 . 15 mM 以下）で維持さ機能的な表皮前駆細胞を産生できる細胞が準備できるようれ、高濃度のカルシウムイオン存在下（1 mM 以上）では自になった。また、元来表皮前駆細胞は非常に不安定で、特然に分化してしまうことが知られている 8）。本研究で使用

別な分化誘導なしに自発的に各種表皮由来細胞に分化してしている iPS 細胞はカルシウム濃度の低い初代表皮細胞用

しまうが、本研究で得られた細胞は毛髪細胞に変化したと培地中では生存できず、約 1 mM のカルシウムイオンを含

きにのみレポーター遺伝子が発現するため、毛髪分化を加んだ培地を用いて培養を行った。将来的には、分化誘導の速もしくは抑制する因子のスクリーニング細胞として有用あるタイミングで低カルシウムの培養液に交換することがなものと考えられる。もちろん、ここで考案したシステム有効である可能性がある。

図6 RA, Doxの処理条件の最適化
KRT14陽性細胞のFACS解析（上）とそれをグラフ化したもの（下）RAによる外胚葉分化処理を120時間行った後、Doxを72h処理したものは、RA/Dox72h処理に比べてKRT14陽性細胞の割合が増加した。

− 58 −

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS 細胞の多重遺伝子加工

５．総

BA: beta-catenin activity in the dermal papilla括

regulates morphogenesis and regeneration of hair.
Developmental cell 18: 633-642, 2010.

本研究で示した Tet-BMP 4 -KRT 31 -Luc-iPS 細胞は、通常の iPS 細胞として安定して増殖、維持できるだけでな

4） Rendl M, Polak L, Fuchs E: BMP signaling in dermal

く、RA（120 時間）と Dox（72 時間）で前処理することで、

papilla cells is required for their hair follicle-inductive

毛髪への分化誘導に応答してルシフェラーゼを発現するた

properties. Genes & development 22: 543-557, 2008.

め、簡便で優れた発毛剤のスクリーニング系に利用できる

5） Reddy S, Andl T, Bagasra A, Lu MM, Epstein DJ,
Morrisey EE, et al.: Characterization of Wnt geneと思われる。

expression in developing and postnatal hair follicles
謝辞and identification of Wnt5a as a target of Sonic
hedgehog in hair follicle morphogenesis. Mechanisms

本研究は大学院生の城戸拓巳君が中心となって行ったもof development 107: 69-82, 2001.

のであり、数理モデルの構築は関西学院大学の吉野公三准6） Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G,

教授の助言を受けました。ここに感謝いたします。

Birchmeier W: beta-Catenin controls hair follicle（引用文献）

morphogenesis and stem cell differentiation in the skin.
Cell 105: 533-545, 2001.

1） Veraitch O, Kobayashi T Fau-Imaizumi Y, Imaizumi
Y Fau-Akamatsu W, Akamatsu W Fau-Sasaki T,

7） Telerman SB, Rognoni E, Sequeira I, Pisco AO,

Sasaki T Fau-Yamanaka S, Yamanaka S Fau-Amagai

Lichtenberger BM, Culley OJ, et al.: Dermal Blimp1

M, et al.: Human induced pluripotent stem cell-derived

Acts Downstream of Epidermal TGFbeta and Wnt/

ectodermal precursor cells contribute to hair follicle

beta-Catenin to Regulate Hair Follicle Formation andmorphogenesis in vivo.

Growth. J Invest Dermatol 137: 2270-2281, 2017.

2） Randolph LN, Bao X, Zhou C, Lian X: An all-in-8） Elsholz F, Harteneck C, Muller W, Friedland

one, Tet-On 3G inducible PiggyBac system for human

K: Calcium--a central regulator of keratinocyte

pluripotent stem cells and derivatives. Scientificdifferentiation in health and disease. European journal

reports 7: 1549, 2017.

of dermatology : EJD 24: 650-661, 2014.

3） Enshell-Seijffers D, Lindon C, Kashiwagi M, Morgan− 59 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索
岐阜薬科大学五十里

彰Human skin keratinocytes form a tight junction (TJ) in the lateral membrane between neighboring cells. The TJ restricts
the paracellular flux of water, nutrients, and solutes. The architecture of TJ is composed of claudins, transmembrane proteins,and zonula occludens, adaptor proteins. Claudins have four transmembrane domains and comprise a multi-gene family with27 members. Claudin-1 acts as a physiological barrier in the skin. Ultraviolet (UV) light may disrupt the TJ barrier, but
the pathophysiological mechanism has not been clarified well. We found that UVB causes a mislocalization of claudin-1,
decrease in transepithelial electrical resistance, and increase in paracellular permeability of lucifer yellow, a hydrophilic
ﬂuorescent marker, in human keratinocyte-derived HaCaT cells. Similarly, NOC, a NO donor, and SIN-1, a peroxynitrite
donor, caused the mislocalization of claudin-1. PCR showed that opsin (OPN) 2 and 3 mRNAs are expressed in HaCaT cells.
UVB increased intracellular Ca2+, nitric oxide, and peroxynitrite concentration, which were inhibited by OPN2 siRNA. In
addition, the elevation of Ca2+ concentration was inhibited by the siRNA of transient receptor potential vanilloid subtype
1 (TRPV1), suggesting that UVB enhances Ca2+ influx mediated through TRPV1. NOC increased the amount of tyrosine
nitration and ubiquitination of claudin-1.
Our results indicate for the first time that UVB increases intracellular Ca2+, NO, and peroxynitrite concentration, resulting
in the mislocalization of claudin-1. Peroxynitrite may elevate the amount of nitration and ubiquitination of claudin-1. The
compounds, which inhibit nitration and ubiquitination of claudin-1, may have a role in preventing the destruction of the TJ
barrier caused by UV.

１．緒が必要である。

言

クローディン - 1 は足場タンパク質の ZO- 1 とともにタイ

皮膚は体外と体内の境界をなすバリアとして働き、体外トジャンクションに分布するが、傷 害性ストレスなどの負からの病原菌や異物の侵入を防ぐとともに、体内からの水荷によりタイトジャンクションから細胞内へ 移 行する。最分子やイオンの漏出を防ぐ。皮膚にはコラーゲンなどによ

近申請者はクローディン - 1 の細胞局在制御機構を検 討し、って形成される角質層と細胞間接着分子によって形成されタイトジャンクションへの分布に 191 Thr のリン酸化が 必る顆粒層の二重のバリアが存在する。角質層にはヒアル

要なこと、脱リン酸化クローディン - 1 がクラスリン依存性

ロン酸、コラーゲン、セラミドが存在し、皮膚の保湿機能

エンドサイトーシス機構を介して細胞内へ 取り込まれるこが維持される。一方、顆粒層バリアの形成には、タイトジとを解明した 5）。しかし、リン酸化 以外 の翻訳後修 飾のャンクションに発現するクローディンが重要な役割を担

関与やその制御機構は不明である。本 研究では、微弱紫う。クローディンは 27 種類のサブタイプが同定されてお外 線 照 射によりクローディン - 1 がタイトジャンクションかり、組織選択的に各サブタイプが発現する 1 , 2）。クローデら解離することを見出したため、そのメカニズムを検 討し、

ィン - 1 ノックアウトマウスは、脱水症状によって生後ま

クローディン - 1 の局在異常を改善する化合物を探索した。

もなく死亡するため、顆粒層バリアの形成にクローディン

２．方- 1 が重要な役割を果たすことが明らかになった 3）。最近、クローディン - 1 の発現量がアトピー性皮膚炎の症状と逆２．
１．細胞培養相関することが報告され、皮膚疾患との関連も明らかにな4）法

ヒト皮膚由来の不死化角化細胞株の HaCaT 細胞を、37ってきた 。敏感肌・乾燥肌の保湿ケアにおけるコスメト℃、5 % CO 2 条件下の炭酸ガスインキュベーター内で培養

ロジーの観点およびアレルギー性皮膚疾患の治療補助としした。増殖培地として 5 % 熱非働化牛胎児血清、100 U/mlてのファーマコロジーの観点から、クローディン - 1 を起

penicillin-G potassium、1 0 0 µg/ml streptomycin sulfate

点とした顆粒層バリアの構築および病態メカニズムの解明を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いた。
トリプシン溶液を用いて培養皿から細胞を剥離させ、3 ～4 日ごとに継代した。

S ea rch for protect ive comp ou nds
against weak ultraviolet light-induced
dysfunction of tight junction barrier inskin

２．２．RNA 抽出とPCR

Akira Ikari

ReverTraAce を用いて逆転写反応後、ロドプシン（OPN 1、

Gifu Pharmaceutical University

2、3、5）および β -アクチンに対するプライマーを用い細胞を回収後、TRI reagent を用いて RNA を抽出した。

− 62 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索て PCR を行った。PCR 産物をアガロースゲルに泳動し、- 1 の細胞局在を調べたところ、コントロール状態でクロ

OPN の発現を確認した。

ーディン - 1 は細胞隣接部位（タイトジャンクション）に分布していた。5 mJ/cm 2 の微弱紫外線（UVB）照射により、

2+

２．３．細胞内 Ca 、一酸化窒素、パーオキシナイト
ライト濃度の測定

細胞傷害率はほとんど変化しなかったが、クローディン細胞を 96 ウェルプレートに播種し、72 時間培養した。

ャンクションから消失することにより、細胞間バリア機能2+- 1 は主に細胞質に分布した。クローディン - 1 がタイトジ

細胞内 Ca 、NO、パーオキシナイトライト濃度を測定すが低下することが示唆されるため 6）、UVB 照射によるクるため、細胞に Fluo- 8、DAF- 2 または NiSPY を負荷した。

ローディン - 1 の局在異常メカニズムを検討することにし

各指示薬の蛍光強度を、Infinite F 200 PRO（テカン社）をた。

用いて測定した。

３．２．クローディン -1 の細胞局在に対するROS の効果２．
４．免疫沈降とウエスタンブロット
細胞を回収後、lysis buffer を用いて細胞膜を溶解した。

HaCaT 細胞に紫外線を照射すると、一酸化窒素の産生

遠心操作によって核画分を除去し、細胞抽出画分を調製し量が増加する 7）。そこで、クローディン - 1 の細胞局在にた。免疫沈降の際には、細胞抽出画分、プロテイン-G セ

対する一酸化窒素の影響を検討した。HaCaT 細胞を一酸

ファロースビーズ、抗クローディン- 1 抗体を混合し、4 ℃で化窒素産生剤の NOC で処理したところ、タイトジャンク

16 時間インキュベートした。サンプルを SDS- ポリアクリル

ションに分布するクローディン - 1 量が低下した（Fig. 1）。

アミドゲルで電気泳動後、トランスブロットセル （バイオラ同様に、パーオキシナイトライト産生剤の SIN- 1 処理にッド社）を用いて PVDF 膜に転写した。PVDF 膜を抗クロより、タイトジャンクションからクローディン - 1 が消失

ーディン- 1 抗体、抗ニトロ化チロシン抗体、抗ユビキチンした。細胞内の一酸化窒素量を DAF- 2 で測定したところ、抗体でブロットした。EzWestLumi Plus（アトー社）で発NOC 処理により増加が観察された（Fig. 2）。一酸化窒素は

光後、C-DiGit（スクラム社）を用いてバンドを検出した。

スーパーオキシドと反応し、パーオキシナイトライトを産生する。パーオキシナイトライト量を NiSPY で測定した

２．
５．蛍光免疫染色と蛍光観察
カバーガラスを入れた 35 mm 培養皿上に細胞を播種し、96 時間培養した。UVB の照射直前または照射してから 3 時間後、細胞を冷メタノールで固定した。0 . 2 % Triton X- 100 による細胞膜の透過処理と 4 % Block Ace によるブロッキング
後、抗クローディン - 1 抗体を 4 ℃で 16 時間処理した。その後、DyLight 555 標識二次抗体を室温で 1 時間処理した。LSM 700 共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss 社）を用いて、クローディン - 1 タンパ
ク質の細胞局在を解析した。

Fig. 1 Effects of NO and peroxynitrite donors on the localization ofclaudin-1２．
６．細胞間透過性の評価
細 胞 を ト ラ ン ス ウ ェ ル に 播 種 し、96 時 間 培
養した。Volt ohm meter（Millipore 社）を用いて、上皮膜間電気抵抗値（TER）を測定した。また、トランスウェルの上層から下層への lucifer
yellow（LY、水溶性蛍光マーカー）の移行量を指標として、細胞間低分子透過性を評価した。

３．結果と考察３．１．クロ ー ディン -1 の 細 胞 局 在 に 対 する
UVB の効果
共焦点レーザー顕微鏡を用いてクローディン

Fig. 2 Measurement of intracellular concentration of NO andperoxynitrite− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ところ、NOC で増加傾向が、SIN- 1 で有意な増加が観察知されることが報告されている 8）。PCR 法で OPN 1、2、3、された。以上の結果から、クローディン - 1 の局在異常に、5 の発現を調べたところ、HaCaT 細胞に OPN 2、3 の発現

一酸化窒素とパーオキシナイトライト濃度の増加が関与すが確認された（Fig. 4）。細胞に 5 mJ/cm 2 UVB を照射したることが示唆された。

ところ、細胞内 Ca 2 +、一酸化窒素、パーオキシナイトラ
イト濃度が増加した。これらの効果は、OPN 2 siRNA の３．
３．細胞間バリアに対する一酸化窒素の影響

導入によって阻害されたが、OPN 3 siRNA は阻害効果を細 胞をトランスウェルに 培 養し、TER と LY 透 過 性を指 標として 細 胞 間 バリア 機 能を評 価した。NOC または示さなかった。以上の結果から、OPN 2 が UVB のセンサーとして働くことが示唆された。

SIN- 1 で処理したところ、コントロールに比べて有意にTERが低下し、LY透過性が増加した（Fig. 3）。
そのため、一酸化 窒素とパーオキシナイトライト
は、クローディン- 1 の局在異常を介して細胞間バリアを減弱させることが示唆された。一酸化窒素とパーオキシナイトライトの産生を抑制することにより、細胞間バリアの維持に繋がると考えられる
ため、そのメカニズムを検討することにした。

３．４．UVB による一酸化窒素の産生におけるOPN の関与
紫外線などの光は、オプシン受容体によって感Fig. 4

Fig. 3

Effects of NO and peroxynitrite donors on tight junction barrier

Expression of OPN in HaCaT cells− 64 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索

３．５．UVB による一酸化窒素の産生におけるTRPV
チャネルの関与

ゴニストの olvanil は、UVB と同様に細胞内 Ca 2 +、一酸化OPN 受容体の活性化による Ca 2 + 濃度の上昇機序を解明

結果から、UVB 照射によって TRPV 1 を介した Ca 2 + 流入するため、一過性受容器電位チャネルである TRPV チャネが増加し、それによって一酸化窒素とパーオキシナイトラ

ルの関与を検討した。皮膚には TRPV 1 と TRPV 4 の発現

イトの濃度が増加することが示唆された。

窒素、パーオキシナイトライト濃度を増加させた。以上のが報告されているため 9）、それぞれの選択的阻害剤である
AMG 9810 と RN 1734 の効果を調べた。UVB 照射による
2+

細胞内 Ca 、一酸化窒素、パーオキシナイトライト濃度の３．６．UVB による一酸化窒素の産生における NOSの関与

増加は、AMG 9810 処理によって阻害されたが、RN 1734

一酸化窒素は恒常的に発現する NOS 1、NOS 3 または誘は阻害効果を示さなかった（Fig. 5）。また、Ca 2 + キレート

導型の NOS 2 によってアルギニンから産生される 10）。ウ

剤の EGTA も、UVB による細胞内 Ca 2 +、一酸化窒素、パエスタンブロット法で NOS タンパク質の発現量を調べた

ーオキシナイトライト濃度の増加を阻害した。TRPV 1 ア

ところ、NOS 1 は検出限界以下であった（Fig. 6）。NOS 2発現量は UVB や AMG 9810 処理によって変化しなかった。
一方、UVB 照射によって NOS 3 発現量が増加し、この効果は AMG 9810 共処理によって阻害された。また、olvanil
処理によって NOS 3 発現量が増加した。次に、クローデ
ィン - 1 の細胞局在に対する効果を検討した。UVB 照射により、タイトジャンクションにおけるクローディン - 1 の分布量が低下した、この効果は AMG 9810 共処理によって阻害された。また、olvanil 処理によって、UVB と同様にタイトジャンクションからクローディン - 1 が消失した。
以上の結果から、UVB 照射によるクローディン - 1 の局在
異常に、NOS 3 の発現増加が関与すると示唆された。これまでに最小紅斑量の UVB 照射により、NOS 1 mRNA 量が増加することが報告されているが 11）、我々の結果ではNOS 1 の増加が観察されなかった。UVBの照射量によって、
NOS は異なる応答性を示す可能性がある。

Fig. 5 Inhibition of UVB-induced elevation of intracellular
Ca 2+, NO, and peroxynitrite concentration by AMG9810− 65 −

Fig. 6

Effects of UVB on NOS expression

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Fig. 7 Effects of UVB on nitration and ubiquitination of claudin-1

３．７．クローディン -1 の局在異常における翻訳後修
飾の影響

局在異常が関与する可能性がある。UVB 照射によるクロUVB 照射により、クローディン - 1 のニトロ化チロシによって阻害されたため、これらを皮膚に塗布することにン量が増加した（Fig. 7）。同様に、NOC 処理により、ク

より、紫外線による保湿機能の低下が抑制されることが期

ローディン - 1 のニトロ化チロシン量が増加した。クロー

待される。

ーディン - 1 のニトロ化は、数種類のフラボノイドの処理

ディン - 1 の細胞局在はユビキチン化酵素によって制御されるため 12）、ユビキチン化の関与を検討した。その結果、 （引用文献）
NOC 処理により、クローディン - 1 のユビキチン化量が増

1） Mineta, K., Yamamoto, Y., Yamazaki, Y., Tanaka, H.,加した。以上より、一酸化窒素濃度の増加により、クロー

Tada, Y., Saito, K., Tamura, A., Igarashi, M., Endo, T.,ディン - 1 のニトロ化とユビキチン化修飾量が増加し、エTakeuchi, K., Tsukita, S., Predicted expansion of the

ンドサイトーシスが促進されると示唆された。今後、クロclaudin multigene family, FEBS Letters, 585, 606-612

ーディン - 1 のニトロ化およびユビキチン化部位を同定し、（2011）．

両者の関係を解明する必要がある。

2） Turksen, K., Troy, T.C., Barriers built on claudins, J
Cell Sci, 117, 2435-2447（2004）．

３．８．クローディン -1 のニトロ化修飾に対する抑制因
子の探索

3） Sugawara, T., Iwamoto, N., Akashi, M., Kojima, T.,UVB 照射によるクローディン - 1 のエンドサイトーシス

dysfunction in the stratum granulosum leads toに、ニトロ化修飾の関与が示唆されたため、その阻害効果

aberrant stratum corneum barrier function in claudin-

Hisatsune, J., Sugai, M., Furuse, M., Tight junctionを有する食品成分を探索した。フラボノイドの効果を検討

1-deficient mice, J Dermatol Sci, 70, 12-18（2013）．

したところ、数種類のフラボノイドにニトロ化修飾の阻害

4） Gruber, R., Bornchen, C., Rose, K., Daubmann, A.,

効果が観察された（特許申請に関わるため化合物名は非公

Volksdorf, T., Wladykowski, E., Vidal, Y.S.S., Peters,

開）。

E.M., Danso, M., Bouwstra, J.A., Hennies, H.C., Moll,

４．総I., Schmuth, M., Brandner, J.M., Diverse regulation括of claudin-1 and claudin-4 in atopic dermatitis, Am J
Pathol, 185, 2777-2789（2015）．

本研究において、強い細胞傷害を誘発しない UVB 処理
により、クローディン - 1 のタイトジャンクション局在量

5） Marunaka, K., Kobayashi, M., Shu, S., Matsunaga, T.,が低下することを見出した。これまでに我々は、クローデ

Ikari, A., Brazilian Green Propolis Rescues Oxidativeィン - 1 の細胞局在の調節にリン酸化が関与することを報Stress-Induced Mislocalization of Claudin-1 in Human
Keratinocyte-Derived HaCaT Cells, Int J Mol Sci, 2 0,

5）

告したが 、他の翻訳後修飾の関与は不明であった。UVB
照射により、OPN 2 を介した TRPV 1 の活性化、Ca 流入、（2019）．

一酸化窒素産生、パーオキシナイトライト産生といったシ

6） Morita, K., Miyachi, Y., Furuse, M., Tight junctions

グナル伝達経路が活性化されることが示唆された。さらに、

in epidermis: from barrier to keratinization, Eur J

2+

Dermatol, 21, 12-17（2011）．

クローディン - 1 のニトロ化修飾やタイトジャンクションからの解離が観察されたため、これらが細胞間バリア機能

7） Liu, W., Wu, S., Differential roles of nitric oxideの低下を誘発すると示唆された。紫外線による皮膚の保湿synthases in regulation of ultraviolet B light-induced

機能の低下に、細胞傷害だけでなく、クローディン - 1 のapoptosis, Nitric Oxide, 23, 199-205（2010）．

− 66 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索

8） Haltaufderhyde, K., Ozdeslik, R.N., Wicks, N.L.,11）Kuhn, A., Fehsel, K., Lehmann, P., Krutmann, J.,

Najera, J.A., Oancea, E., Opsin expression in human

Ruzicka, T., Kolb-Bachofen, V., Aberrant timing in

epidermal skin, Photochem Photobiol, 9 1, 1 1 7-1 2 3

epidermal expression of inducible nitric oxide synthase（2015）．

after UV irradiation in cutaneous lupus erythematosus,
J Invest Dermatol, 111 , 149 - 153（1998）．

9） Ho, J.C., Lee, C.H., TRP channels in skin: fromphysiological implications to clinical significances,

12）Takahashi, S., Iwamoto, N., Sasaki, H., Ohashi, M.,
Oda, Y., Tsukita, S., Furuse, M., The E 3 ubiquitin

Biophysics, 11, 17-24（2015）．
10）Mattila, J.T., Thomas, A.C., Nitric oxide synthase:ligase LNX 1 p 8 0 promotes the removal of claudins

non-canonical expression patterns, Front Immunol, 5 ,from tight junctions in MDCK cells, J Cell Sci, 1 2 2 ,478（2014）．

985 - 994（2009）．

− 67 −

太陽光紫外線に暴露された毛髪の酸化度のX 線イメージングによる画像化
東海大学工学部原子力工学科

伊藤敦

Oxidative damage in human hair induced by the exposure of external oxidants and its protection is one of the important
issues in the health care against ageing of hair. Although many studies on the UV damage to hair have been reported including
structural changes of the outermost part of hair, cuticle area, there are few studies to detect the area of oxidation from cuticle
to the inside areas called cortex and medulla, depending on the kinds of solar UV radiation.
We have developed an imaging method of oxidative damage in human hair by X-ray spectromicroscopy with submicron
resolution at the K absorption edge of sulfur. The method enabled us to obtain the distribution of cysteic acid, one of theoxidation products of cystine, a major amino acid in human hair. In addition, such X-ray imaging method has an advantage inthe detection of oxidative damage deep inside the hair with a thickness of about 0.1 mm. The X-ray spectromicroscopy system
was installed at the synchrotron radiation facilities, Photon Factory at Tsukuba.
The oxidative damage by the black light UVA lamp with an emission peak around 365nm was observed at only the surfaceof the hair at a short exposure, but with prolonged exposure, the damage was extended over the whole area of the hair. Since
the UVA exposure of the short exposure case by the UVA lamp corresponds to about 2 hr exposure of solar UV at noon on theclear day of May at the location of Tokai university Shonan campus, our data strongly suggest that even one day exposure tosolar-UV induces significant oxidative damage to hair. In contrast to UVA, UVB damage by the UVB lamp with an emission
peak around 315nm seems to be limited in the cuticle region, probably because of its low permeability.

１．緒する X 線顕微鏡による手法を、UVA 及び UVB 照射毛髪に言適用することによって、表面から内部に至る酸化ダメージ

我々が日常的に浴びている太陽光 UV（290 - 400 nm）は、の全容を紫外線の種類に応じて明らかにする。これによっ

長波長領域の UVA（320 - 400 nm）と短波長領域の UVBて将来的な酸化ダメージ防護剤の開発のための基礎的情報（290 - 320 nm）に分類される。これらの UV が毛髪にダメを提供することを目的とする。

ージを引き起こすことはよく知られており、総説にもまと

２．方められている 1 , 2）。特に酸化ダメージについては、UV 暴露による損傷ばかりでなく、oxidative dye による染色のメ法

２．
１．X 線分光顕微法

カニズム、脱染色の防止などの観点からの研究も多い 3 - 5）。

X 線顕微鏡は X 線によって物質の内部を可視光顕微鏡よ毛髪損傷を検出する手段としては、化学的な分析や構造変り高分解能で観察する手段である。波長が可視光より短い

6）化によるものがほとんどであり 、最近の研究では表面のため、原理的に高分解能が達成されること、電子顕微鏡にキューティクル構造の変化を原子間力顕微鏡、走査型電子

比べて物質への透過率が高いため、厚い試料でも観察可能

顕微鏡などで損傷を画像化（可視化）したものが報告されてなこと、などが利点としてあげられる。特に本研究で用いいるが、いずれも高分解能ではあるが表面構造を検出する

た X 線分光顕微法は、分子を識別して画像化する X 線顕微

7）

鏡特有の手法である。我々はこれまでに X 線分光顕微法をのみで、毛髪内部を観察するには至っていない 。
しかしながら、特に UVA は毛髪表面だけでなく、深部毛髪を構成するイオウ含有アミノ酸（シスチンとその酸化にも到達するにもかかわらず、毛髪表面のキューティクル

物システイン酸；図 1 に化学構造式を示す）に適用できるから内部のコルテックス、さらに中心部のメデュラに至る
毛髪全体の酸化ダメージの分布を非侵襲的に観察する手段
がこれまでになかった。本研究では、我々がこれまでに開発してきたブリーチ処理毛髪の酸化ダメージの分布を検出

X-ray imaging of oxidative damage ofhuman hair exposed to solar ultraviolet
radiation
Atsushi Ito
Department of Nuclear Engineering,
School of Engineering, Tokai University

図1 シスチンとシステイン酸の化学構造式
シスチン ⒜ とシステイン酸 ⒝ の化学結合の違いが吸収端微細構造に反映する。

− 68 −

太陽光紫外線に暴露された毛髪の酸化度の X 線イメージングによる画像化ことを報告してきた 8 , 9）。概要を以下に示す。

ーミングが可能な生体試料に適した顕微鏡装置である 10）。

物質の X 線吸収スペクトルを測定すると、含有元素特有

放射光施設は茨城県つくば市のPhoton Factoryを利用した。

の鋭い吸収が観察される（吸収端と呼ばれる）。さらにその吸収端近傍の X 線エネルギー（波長）を細かく測定すると、

２．２．UV 照射

当該元素を含む分子種に特有の吸収微細構造が観察される

UVA 照射にはブラックライト（FL 15 BLB、ニッポ電機）、（Near Edge X-ray Absorption Fine Structure; NEXAFSUVB 照射には UVB ランプ（FGL- 15 E、ニッポ電機）を用と呼ばれる）。毛髪を構成する主なアミノ酸であるシスチいた。それぞれ、UVA 領域に 365 nm をピークとしたブロンのイオウ吸収端における NEXAFS とその酸化物システ

ードな発光スペクトル、UVB 領域に 315 nm をピークとしイン酸の NEXAFS を図 2 に示す。シスチン画像は図の⒜たブロードな発光スペクトルをもつ。UV 強度はそれぞれと ⒝ の X 線エネルギーで撮影した画像の差分により、シ

1 . 40 mW/cm 2 及び 2 . 34 mW/cm 2 であった（UVX Digital

ステイン酸画像は図の ⒞ と ⒟ で撮影した画像の差分によRadiometer, UVP Inc., CA, USA による測定）。さらに、り求められる。一例として、図 3 に女性毛髪における両分

実際の屋外の太陽光 UV の作用を調べるために、東海大学

子の分布を示す。シスチンは毛髪の主成分であることから湘南校舎にて 2019 年 5 月（晴天）の日中での照射も行った。

全体に分布する（メデュラは密度が低いためシスチンが少UV 強度は時刻と天候状況によって変化したが、平均して

ない）
。一方、
システイン酸はキューティクルに多く分布し、UVA が 1 mW/cm 2、UVB が 0 . 5 mW/cm 2 であった。照射

毛髪表面の酸化が大きいことがわかる。

時間は、人が日中現実的に屋外に滞在する場合を考慮して、この手法を我々は X 線光源として放射光と組み合わせた

2 時間、4 時間、6 時間とした。一方、ランプ照射時間に

X 線密着顕微鏡（検出器は X 線ズーミング管）を用いて実現

ついては、屋外での UV 光量とほぼ同程度となるように調した。放射光は強度の高い単色 X 線を得るのに必須であり、節した。表 1 に太陽光 UV の光量をまとめた。

X 線密着顕微鏡は 0 . 5 ミクロンの分解能をもち、視野のズ

図2 シスチンとシステイン酸のイオウK吸収端近傍微細構造（NEXAFS）⒜と⒝ のエネルギーで取得された画像の差分がシスチン画像、⒞と⒟ のエネ
ルギーで取得された画像の差分がシステイン酸画像を与える。

⒜

⒝

表1

図3 人毛髪断面のシスチン及びシステイン酸の分布⒜シスチン画像、⒝システイン画像。白い部分が分子が多い領域を示す。

− 69 −

太陽光UVの照射時間とUVA、UVB光量コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．３．毛髪試料
毛髪は市販の日本人女性由来のものを用いた。X 線顕微
鏡観察のために、照射後の毛髪に対して垂直スライサー（HS- 1、ジャスコエンジニアリング）を用いて約 20 ミクロ
ン厚の切片試料を作製し、エタノールに懸濁後、シリコンフレームに支持された窒化シリコン膜（100 nm 厚、Silson,
UK）上に滴下し風乾させた
（図 4）
。

３．結

果

図 5 に UV 照射を行った毛髪におけるシステイン酸の分布画像を疑似カラーを用いて示した。3 種類のどの UV に

図4 窒化シリコン膜上の毛髪切片
1mm角の窒化シリコン膜（100nm厚）に載せられたX
線顕微鏡観察用の毛髪切片の光学顕微鏡画像。周囲の黒い領域はシリコンフレーム（0.38mm厚）。

図5 X線顕微鏡によるシステイン酸の分布画像（疑似カラー表示）⒜：未照射、⒝：太陽光UV照射（光量108kJ/m2）、⒞, ⒟：UVA照射（光量はそれぞれ201.6kJ/m 2と302.4kJ/m 2）、⒠, ⒡：UVB照射（光量はそれぞれ168.5kJ/m 2と252.7kJ/m 2）。矢印はUVの照射方向。

− 70 −

太陽光紫外線に暴露された毛髪の酸化度の X 線イメージングによる画像化

おいても照射方向部位が最も酸化度が高く、内部に行くにる（図 5 b、図 6 c）
。2 時間の屋外活動は一般的であり、帽つれて低くなった。⒞ , ⒟ の UVA 照射試料ではかなり内子の着用、さらに加えて、皮膚を防護するためのサンスク部まで酸化が進んでいる。特に光量の大きい ⒟ ではほぼリーン剤のような毛髪酸化防止の防護剤の開発が望まれる。

均一に酸化しているように見える。一方、⒠ , ⒡ の UVB照射試料では表面と内部の酸化の差が大きい。これらの結果は、UVA に比べて UVB は透過率が低いことによるもの（a）と考えられる。
これらの画像をもとにキューティクル、コルテックス、
メデュラの 3 領域の酸化度の定量化を試みた。縦軸はシス
テイン酸の吸収の程度（OD; Optical Density）
をシスチンとシステイン酸を合計した全量で規格化したものとした。測定面積は、キューティクルで 1 . 3 ミクロン角、コルテック
スは 5 . 4 ミクロン角、メデュラは 1 . 9 ミクロン角の平均値を求めた。なお、試料周囲のバックグラウンドの数値の補正も行った。キューティクルの酸化度はいずれの UV も光量とともに増加した。興味深いのは UVA ではコルテック
ス、メデュラの内部領域での酸化が光量とともに進行したのに対して（パネル a の赤丸印）、UVB では増加がほとんど見られないことである（パネル b）。また、太陽光 UV の場合、 （b）
最も光量の大きい試料（324 kJ/m 2）の酸化度が他より小さいのは説明し難く再現性を確認する必要があるが、他の 3点を見ると毛髪内部の酸化度が有意に上昇する結果とはならなかった。これらの結果は、実際の太陽光では UVA より UVB の作用が重要と解釈できる。

４．考察

X 線顕微鏡による酸化度分布測定法によって、UVA、UVB、太陽光の 3 種による酸化度分布の違いを求めることができた。また、X 線顕微鏡の高分解能の特徴生かして、
キューティクル、コルテックス、メデュラの 3 領域における酸化度の違いを明らかにすることができた。結果は以下のようにまとめられる。
1） いずれの UV でもキューティクルの酸化が顕著であっ（c）

た。またそれは光量に依存して増加した。
2） UVA は毛髪内部のコルテックス、メデュラでも有意に酸化を誘発した。一方、UVB では酸化はキューティ
クルに限られているように見える。これは UVB の透過度が低いためと考えられる。
3） 太陽光 UV は UVB の光量依存性に近く、内部の酸化は顕著ではなかった。しかし、放射光施設を利用する本実験では、1 年間の限られたビームタイムの関係から多くの試料測定に制限があり、今後、より明確な結論を出すために、再現性向上に向けてさらに測定数を増やすことが必要である。
太陽光 UV の最も低い照射光量試料は、2 時間照射であった。この試料でもキューティクルからコルテックス表層部にかけて有意な酸化が観察されたことは確かな結果であ

図6 キューティクル、コルテックス、メデュラにおけるUVによる
酸化度⒜ UVA、⒝ UVB、⒞ 太陽光UV− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

なお、本成果については以下の学会で英語発表を行った。

5） T. Kojima et al., Dyeing regions of oxidative

M. Torigata and A. Ito, Imaging of oxidative damage

hair dyes in human hair investigated by nanoscalein human hair exposed to solar-UV radiation by X-ray

secondary ion mass spectrometry, Colloids Surf B:

spectromicroscopy at the S-K absorption edge, The 15 th

Biointerfaces, 106, 140-144（2013）．

Symposium of Japanese Research Community on X-ray6） M.N. Chandrashekara and C. Raganathaiah, Chemical

Imaging Optics（第 15 回 X 線結像光学シンポジウム）,and photochemical degradation of human hair: a free-Sendai, 2019 年 10 月 25 日

volume microprobe study, J. Photochem. Photobiol. B:
Biology, 101, 286-294（2010）．

（引用文献）

7） M. Richena and C.A. Rezende, Effect of photodamage

1） V. Signori, Review of the current understanding ofon the outermost cuticle layer of human hair, J.

the effect of ultraviolet and visible radiation on hair

Photochem. Photobiol. B: Biology, 153, 296 -304（2015）．

structure and options for photoprotection, J. Cosmet.

8） A. Ito et al., Application of XANES profiles to X-ray
spectromicroscopy for biomedical specimens: Part I.

Sci., 55, 95-113（2004）．

Discrimination of macromolecules with sulfur atoms, J.

2） A.C. Nogueira et al., About photo-damage of human

X-Ray Sci. Technol., 19, 249 - 260（2011）．

hair, Photochem. Photobiol. Sci., 5, 165-169（2006）．
3） Y. Zhou et al., Protection of oxidative hair color

9） T. Inoue et al., Application of XANES profiles tofading from shampoo washing by hydrophobically

X-ray spectromicroscopy for biomedical specimens:

modified cationic polymers, J. Cosmet Sci., 60, 217-238

Part II. Mapping oxidation state of cysteine in human
hair, J. X-Ray Sci. Technol., 19, 313 - 320（2011）．

（2009）．
4） T. Kojima et al., Investigation of dyeing behavior

10）A. Ito et al., X-ray contact microscopy systemof oxidative dye in fine structures of the human hairfor spectromicroscopy of biological specimens, J.

cuticle by nanoscale secondary ion mass spectrometry,

Synchrotron Radiat., 5 , 1099 - 1101（1998）．

Skin Res. Technol., 21, 295-301（2015）．

− 72 −

イオン導入時の微弱電流による皮膚組織炎症への影響と安全性の検証
徳島大学大学院医歯薬学研究部

小暮

健太朗

Iontophoresis is a non-invasive transdermal drug delivery technology using weak electric current. Although iontophoresis
is widely used in beauty field, its safety has not been investigated. From the previous our research, it was predicted that
iontophoresis will induce inflammation via activation cell signaling. In this study, we tried to study the effect of weak electric
current at iontophoresis on the skin tissue inflammation and safety. The skin cross section after iontophoresis was comparedwith non-treated skin. There was no difference in skin tissue between before and after iontophoresis. Furthermore, to checkthe inflammation induction by iontophoresis, the amounts of various mRNAs relating inflammation, such as tumor necrosis
factor-α and interleukin (IL) -1β. Although statistical significant difference was not recognized, mRNAs of inflammatory
cytokines was not activated by iontophoresis. Interestingly, anti-inflammatory cytokine IL-10 mRNA showed the tendency toincrease after iontophoresis. From these results, it was suggested that iontophoresis does not induce any inflammation in theskin tissue. In conclusion, iontophoresis is safety technology for transdermal drug delivery and skin beauty.

１．緒

に関するものは皆無と言ってよい。すなわち、薬学的観点

言および香粧品開発の観点において、イオン導入の皮膚に及2

微弱な電流（0 . 3 ～ 0 . 5 mA/cm ）を用いて皮膚内にイオ
ン性の物質を送達する技術としてイオントフォレシスが知ぼす影響については、ほとんど手付かずと言ってよいのが現状である。

られており、美容領域においては「イオン導入」として一

我々は、2005 年からイオントフォレシス（イオン導入）

般には認知されている。様々なデバイスが開発されており、の高分子薬物送達への展開に取り組んできた 1 - 3）。当初は、美容整形外科等で用いられている。
イオントフォレシス（イ他の研究者同様に切り取った（死んだ）皮膚を用いて、低分

オン導入）に関しては、これまで低分子薬物を対象とした

子薬物（抗炎症剤）の皮膚透過について検討を行っていたが、研究が盛んに行われており、通常切り取った動物皮膚およ主たる研究者の専門であったナノ粒子（リポソーム）とイオ

び市販のヒト皮膚をフランツ型セルにセットし、上層からントフォレシスとの組み合わせを検討する過程において、皮膚を透過して下層に移行した薬物量を定量する研究が主

生きた皮膚（動物個体）を用いた時、それまで不可能であるである。また、現在の国内化粧品企業では、動物個体を用と考えられていた高分子・ナノ粒子が皮膚内に送達可能いた研究が行えない状況にある。そのため、「死んだ皮膚」

であることを発見した 1 - 3）。従来、イオントフォレシスにを用いることが多く、皮膚の物理的損傷に関しては検討さよる皮膚内への薬物送達機構は、電気的反発とイオンの動れているが、生理的影響、特に炎症性サイトカイン産生やきに伴う水の流れ（電気浸透流）であると考えられていたが、シグナル伝達系タンパク質の活性化等は観察することがで主たる研究者の検討の結果、皮膚組織細胞のシグナル伝達

きない。ヒトでモニターする場合も、皮膚表面の発赤くら系が活性化され、細胞間隙が開裂することによると発見す

いしか検討できない。しかしながら、イオン導入におけるるに至った 4）。すなわち、微弱電流によって皮膚組織の生

微弱電流の皮膚への影響を検討するには、「生きた皮膚」を理機能が変化することが、イオントフォレシス（イオン導用いることが必須であり、特に皮膚組織生理への影響に関入）による薬物の皮内浸透メカニズムであることが明らかしては個体レベルでモニターすることが重要である。イン

になったわけである。さらに、検討を重ねた結果、微弱電

ターネット等でイオン導入に関する記事をよく目にするが、流刺激は、皮膚組織細胞間隙を開裂させるだけでなく、細すべて「ビタミン C 等の美容成分を皮膚内に非侵襲的に導胞の取り込み機構（エンドサイトーシス）を誘起し、細胞外入することができる」という点のみを述べており、イオンの物質を細胞内に取り込ませることも発見している 5- 8）。こ

導入
（微弱電流処理）が皮膚にどのような影響を及ぼすのか、れらのことから、イオントフォレシスにおける微弱電流処
理は、皮膚組織・細胞におけるシグナル伝達経路を活性化
し、組織レベルおよび細胞レベルでの生理機能を変化させStudy of the effect of weak electric
current at iontophoresis on the skintissue inflammation and safety
Kentaro Kogure
Graduate School of Biomedical Sciences,
Tokushima University

ることが明らかとなり、薬物送達に繋がっていることが示
唆されている。そのため我々は、上記検討から薬物送達に繋がる細胞シグナル伝達以外にも、微弱電流は様々なシグ
ナル伝達、特に安全性に関与する炎症関連シグナルを活性化するのではないかと考えた。そこで本研究では、美容領− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

域等で汎用されているイオン導入（微弱電流による皮膚処を行った。微弱電流処理を施した部分の皮膚を回収し、キ理）が、皮膚組織の生理機能、特に炎症性サイトカインのットを用いて RNA を抽出した後、Real-time PCR 法によ発現等に与える影響を検討することで、イオン導入（イオって炎症性サイトカイン等（インターフェロン（INF）-γ、ントフォレシス）の安全性を検証することを目的とした。

腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン（IL）- 6、IL- 1 β、

２．方IL- 33、シクロオキシゲナーゼ（COX）- 2）および抗炎症性法

サイトカイン（IL- 10、腫瘍成長因子（TGF）-β）の mRNA２．
１．微弱電流処理した皮膚の組織学的変化の検討

量を定量解析した。皮膚の採取は、微弱電流処理後 3 時間

Wister ラット（当初計画では、マウスを予定していたが、および 24 時間後とし、各 5 匹以上のラットから回収した

mRNA 定量に必要な量の RNA を抽出するために、より大RNA について解析を行った。さらに、より強力な電流強きいラットに変更して行った）背部皮膚の毛を刈り、露出度（1 . 0 mA/cm 2、1 時間）において処理したラット皮膚にした皮膚上に PBS を浸透させた脱脂綿を置き、その上かついて、処理後 3 時間におけるこれら炎症性サイトカイン

ら心電図用の Ag/AgCl 電極を用いて、これまでの検討で等（IL- 6、IL- 10、TNF-α、TGF-β）の mRNA 発現を定量用いてきた条件（0 . 34 mA/cm 2、1 時間）により微弱電流処解析した。

理を行った。微弱電流処理を施した部分の皮膚を回収し、

３．結

OCT コンパウンド中で凍結固化させたものをクライオス

果３．
１．微弱電流処理した皮膚の組織学的変化の検討

タットを用いて凍結切片とした。得られた切片をヘマトキ
シリン・エオシン（HE）によって染色し、染色後の皮膚切微弱電流処理後、HE 染色を行った皮膚切片について顕片を顕微鏡で観察することで、皮膚の組織学的変化につい微鏡観察したところ、写真で示すように、3 時間後の皮膚て検討した。皮膚の採取は、微弱電流処理後 3 時間および切片は、未処理皮膚と同じであり、微弱電流処理による皮

24 時間後とし、それぞれ回収した皮膚について組織切片

膚組織への目立った影響は確認されなかった（図 1 A）
。さ観察を行った。

らに、微弱電流処理 24 時間後の皮膚についても同様に HE
染色した組織切片観察を行ったが、24 時間後においても２．２．微弱電流処理した皮膚における炎症性サイトカ
イン mRNA 量の検討

未処理皮膚と同じであり、微弱電流処理による組織への影毛を刈った Wister ラットの背部皮膚上に心電図用 Ag/

紫外線障害等の炎症病態では、皮膚表皮領域の肥厚化が確響は認められなかった（図 1 B）。アトピー性皮膚炎や乾癬、

2認されるが、微弱電流処理後の皮膚においては、そのよう

AgCl 電極を置き、微弱電流処理（0 . 34 mA/cm 、1 時間）

図1− 74 −

イオン導入時の微弱電流による皮膚組織炎症への影響と安全性の検証後においても、皮膚組織に目立った変化は認められなかっな変化は認められなかった。

たことから、微弱電流処理による顕著な炎症反応等は誘起

３．２．微弱電流処理した皮膚における炎症性サイトカ
イン mRNA 量の検討

されないことが示唆された。
このことを、より厳密に評価するために、炎症に関与す

微弱電流処理した皮膚中の RNA を回収し、Real-time

る種々の因子の遺伝子発現について定量解析を試みた。今PCR 法によって炎症性サイトカイン等の炎症関連因子

回は、炎症性サイトカインとして INF-γ、TNF-α、IL- 6、（INF-γ、TNF-α、IL- 6、IL- 1 β、IL- 33、COX- 2 お よ び

IL- 1 β、IL- 33、炎症関連因子として COX- 2、抗炎症サイ

抗炎症性サイトカイン（IL- 10、TGF-β）の mRNA 量を定トカインとして IL- 10、TGF-β に着目した。本研究で着目量解析した。微弱電流処理 3 時間後における皮膚組織中のした因子であるが、以下のような特徴を有する。IL- 1 β は、各因子 mRNA を比較すると、それぞればらつきが大きい

アトピー性皮膚炎において、アレルギー感作性の亢進と角が、以下のようになった。COX- 2 および IL- 6 は、変動は質層内 IL- 1 β の増加との間に関連性があると報告されて見られなかった。IL- 1 β、IL- 33、TGF-β、TNF-α は、若いる。IL- 33 は、IL- 33 が著しく増大したマウスはアトピ

干減少しているようであった。一方 IL- 10 は、増加する傾ー性皮膚炎様症状を発症することが報告されている。掻破向が認められた。さらに、微弱電流処理 24 時間後におけされた皮膚が、IL- 33 を分泌し Th 2 炎症を引き起こすこる皮膚中の各因子 mRNA について定量したところ、3 時間

とも報告されている。TNF-α は、関節リウマチや乾癬にで変化のなかった COX- 2 と IL- 6 がやや増加傾向に、3 時関与することが知られている。また、Ⅰ型およびⅢ型コラ

間では若干減少していた IL- 1 β、IL- 33、TGF-β、TNF-α は、ーゲンの産生を抑制する特性を有することも報告されてい3 時間時点よりも多くなり、IL- 1 β と TGF-β は、コントロ

る。IL- 6 は、炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイト

ールレベル、TNF-α は、コントロールよりも若干高めに

カイン両方の作用を有する。TNF-α や IL- 1 によって産生なっていた。3 時間において増加傾向が認められた IL- 10が誘導されるが、それらの活性化を抑制するとともに、そは、やや減少していた。しかし、これらの変動は、ばらつ

れらの内因性阻害物質（sTNFR や IL- 1 ra）の産生を高める。

きが大きいため、いずれも統計的に有意な変化ではなかっ

COX- 2 は、炎症時にサイトカインや増殖因子等の刺激にた。これらのことから、通常のイオン導入処理条件（0 . 3 -より発現が誘導されるため、COX- 2 を介して炎症反応を

0 . 5 mA/cm 2）
では、大きな負の影響は示さないことが示唆進行させる PGE 2 や PGI 2 等の産生が亢進することが知らされたため、当初計画にも示したように、通常条件よりもれている。一方、抗炎症性サイトカインの IL- 10 は、創より強力な電流強度（1 . 0 mA/cm 、1 時間）による処理の傷部の炎症環境では COX- 2 が活性化し、プロスタグラン

皮膚炎症に及ぼす影響を追加検討した。ここでは、IL- 6、

ジン E 2（PGE 2）の産生が上昇することによって、IL- 10

IL- 10、TNF-α、TGF-β に絞って電流処理 3 時間後の皮産生が上昇することが知られている。IL- 10 は、炎症性サ膚における mRNA 発現量の定量解析を行った。その結果、イトカインの産生（マクロファージからの IL- 1 β や TNF-α

検討したすべてのサイトカイン mRNA 発現量が大きく増等）を抑制することができる。また、TGF-β は、線維芽細加することが明らかとなった。

胞によるコラーゲン合成に必要なサイトカインである。そ2

４．考のため、TGF-β の変化は、皮膚中コラーゲンの減少や弾察性の低下に繋がることが予想される。これらの因子につ

我々のこれまでの検討によって、イオン導入（イオント

いて、微弱電流処理後の皮膚から抽出した RNA を用いてフォレシス）処理時の微弱電流が、組織細胞におけるシグ

各 mRNA 量を定量解析した。その結果、得られた結果は、

ナル伝達系を活性化し、様々なタンパク質のリン酸化を誘

ばらつきが大きく、有意な変化は認められなかったものの、起することで、細胞間隙の開裂やエンドサイトーシスが誘炎症性サイトカイン類に関しては、若干減少する傾向がみ

導されることを見出してきた 4 - 9）。そのため、イオン導入られ、また抗炎症性サイトカインの IL- 10 は、増加する傾時の微弱電流は、皮膚組織における炎症性サイトカイン

向が認められた。このことは、組織観察の結果と一致して遺伝子等の発現にも影響を及ぼすのではないかと考えるにおり、微弱電流処理によって、少なくとも炎症が誘起され至り、本研究を実施することとした。過去の検討において、ないことを示唆している。むしろ、抗炎症性サイトカイン

ラット皮膚に炎症を誘起してアトピー性皮膚炎モデルおよの IL- 10 が増える傾向が得られたことから、微弱電流処理

び乾癬モデルを作成した場合、皮膚の表皮層の顕著な肥厚は炎症を鎮める効果を有する可能性も考えられる。

化が認められていたため、微弱電流処理によって皮膚に炎

微弱電流処理による炎症惹起に閾値があるのか確かめる症が誘起される場合には、同様に皮膚組織の肥厚化が見らため、より強力な電流強度（1 . 0 mA/cm 2、1 時間）で処理れるのではないかと考え、微弱電流処理の有無による皮膚した皮膚における炎症性サイトカイン等の発現を追加検討

組織像の比較を行った。その結果、微弱電流処理 24 時間した結果、調査したすべてのサイトカイン（IL- 6、IL- 10、− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

TNF-α、TGF-β）の mRNA 量が大きく増大することが明and persistent transfollicular drug delivery system

らかとなった。このことから、通常条件よりも強力な電流

using a combination of liposomes and iontophoresis.

強度では、やはり皮膚に大きなストレスをかけるため、炎Int. J. Pharm. 403, 57-65（2011）．

症性サイトカイン等の発現が上昇し、炎症が惹起される

3） Kigasawa K, Kajimoto K, Nakamura T, Hama S,

可能性が確認された。すなわち、通常条件（0 . 3 - 0 . 5 mA/

Kanamura K, Harashima H, Kogure K. Noninvasivecm 2）を超えるような電流強度を用いなければ、炎症惹起

and efficient transdermal delivery of CpG-

は防げることが示唆された。

oligodeoxynucleotide for cancer immunotherapy. J.
Control. Release. 150, 256-265（2011）．

当初、炎症性サイトカインが上昇すると予想していたため、それに関連する炎症性シグナル関連タンパク質の活性

4） Hama S, Kimura Y, Mikami A, Shiota K, Toyoda

化や皮膚のアポトーシス等を検討することも考えていたが、M, Tamura A, Nagasaki Y, Kanamura K, Kajimoto K,

1 時間という長時間の微弱電流処理にもかかわらず、通常

Kogure K. Electric stimulus opens intercellular spaces
in skin. J. Biol. Chem. 289, 2450-2456（2014）．

2

条件（0 . 3 - 0 . 5 mA/cm ）でのイオン導入（イオントフォレシス）であれば炎症性サイトカイン等の炎症関連因子の大5） Hasan M, Nishimoto A, Ohgita T, Hama S, Kashida

きな変動もなかったことから、これらの検討は行うに至ら

H, Asanuma H, Kogure K. Faint electric treatment-

なかった。しかし、抗炎症性サイトカイン IL- 10 の若干のinduced rapid and efficient delivery of extraneous

増加等の傾向もみられたことから、今後より詳細な検討をhydrophilic molecules into the cytoplasm. J. Control.

行う必要があると考えている。また、微弱電流が皮膚組織

Release 228, 20-25（2016）．

細胞のシグナル伝達系を活性化することから、皮膚の機能

6） Hasan M, Tarashima N, Fujikawa K, Ohgita T, Hama

性に関連する因子、すなわちセラミドやコラーゲン・エラ

S, Tanaka T, Saito H, Minakawa N, Kogure K. The

スチン等が変化している可能性も考えられる。今後、これnovel functional nucleic acid iRed effectively regulates

らの皮膚機能性に関する因子についても検討を行いたいとtarget genes following cytoplasmic delivery by faint

考えている。

electric treatment. Sci Technol Adv Mater 17, 554-562（2016）．

謝辞7） Hasan M, Hama S, Kogure K. Low electric treatment

本研究の遂行にご支援をいただきました公益財団法人コactivates Rho GTPase via heat shock protein 9 0 andーセーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げます。

protein kinase c for intracellular delivery of siRNA.
Sci. Rep. 9, 4114（2019）．

（引用文献）

8） Torao T, Mimura M, Oshima Y, Fujikawa K, Hasan

1） Kigasawa K, Kajimoto K, Hama S, Saito A, Kanamura

M, Shimokawa T, Yamazaki N, Ando H, Ishida T,

K, Kogure K. Noninvasive delivery of siRNA into the

Fukuta T, Tanaka T, Kogure K. Characteristics of

epidermis by iontophoresis using an atopic dermatitis-

unique endocytosis induced by weak current forlike model rat. Int. J. Pharm. 383, 157-160（2010）．

cytoplasmic drug delivery. Int. J. Pharm. 576, 119010

2） Kajimoto K, Yamamoto M, Watanabe M, Kigasawa（2020）．

K, Kanamura K, Harashima H, Kogure K. Noninvasive− 76 −

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージング
東京大学大学院農学生命科学研究科

佐々木

栄太

Oxidative stress due to cell damage or aging results in lipid peroxidation, which produces various lipid radicals and α,β-unsaturated aldehydes. The highly reactive aldehyde species readily modify specific or unspecific protein sites and maybe
involved in many diseases such as atherosclerosis and cancer. Although many analytical methods have been developed forlipid peroxidation, imaging of the aldehydes in living cells is still challenging due to lack of appropriate chemical probes.
Here, I designed, synthesized an investigated two aryl azide-based fluorescence probes to detect acrolein, the shortest α,β-unsaturated aldehydes with a three carbon unit, and an alkoxyamine-based probe targeting the reactive aldehydes. Oneof the aryl azide-based probes with a 7-nitrobenzoxadiazole scaffold yielded the corresponding formyl triazole productupon reaction with acrolein. The reaction product showed substantially red-shifted absorbance compared to the unreacted
probe, however, instability of the azide group in the probes may limit their use for the imaging of acrolein in living cells.
The other probe containing a rhodamine scaffold with an alkoxyamine substituent showed pH-dependent absorbance andfluorescence spectra, which are characteristic for many rhodamine derivatives due to the open and closed spirocyclic forms inequilibrium. When it was mixed with α, β-unsaturated aldehydes at pH 7, significant increase of absorbance and fluorescence
was observed likely because the open form was stabilized for the reaction product. Thus, the probe was applied to HeLa
cells. Confocal microscopy images showed fluorescence increase in some cellular compartments. Co-labeling the cellswith a lysosome-targeted dye revealed that the probe turned to fluorescence in lysosome, where the local pH is known to be
4.5-5.0. Accumulation of the probe in lysosome may hamper the desired imaging of the reactive aldehyde species. Further
investigation is in progress to determine where the probe distributes in the cells and if it can detect endogenous aldehydes
under oxidative stress.

１．緒

ノ酸残基を化学修飾しうることがわかってきて注目を集め言ている。それによって生成するさまざまなタンパク質修飾

生体組織の酸化還元状態は、酸化物質と還元物質の巧みなバランスによって適切な状態に保たれている。しかし、体の詳細な働きは未だ明らかとなっていないが、疾病や老化に関わる新たな危険因子の可能性がある 1）。

癌や生活習慣病をはじめとする疾患や、加齢などによって本研究では、細胞内に生成する脂質過酸化物を高感度・酸化ストレスが亢進すると、生体内で日常的に発生してい高時空間分解能で検出する方法の開発を目指し、生理的条る反応性の高い活性酸素種が、DNA、タンパク質、脂質件下これらの分子種と反応して蛍光性を獲得する機能性小といった主要な生体構成分子を酸化し、細胞障害を引き起分子プローブを創成することを目的とした。具体的には、
1）

こす。したがって、これらの活性酸素種、またはそれによ

近年アクロレインとの反応性が報告されたアリルアジド基って酸化的な修飾を受けた生体分子を感度良く検出するこを反応部位として含む蛍光プローブ、2）さまざまな炭素鎖とができれば、細胞の健康状態や老化の度合いを判定する長を有するアルデヒド基をターゲットとしたアルコキシア

上で有効である。

ミノ基を反応部位とする蛍光プローブの開発を行った。目

リン脂質やコレステロールエステルなどの生体膜を構成的とする脂質過酸化物感受性蛍光プローブによって、さまする多価不飽和脂肪酸は、特に活性酸素による酸化修飾をざまな酸化ストレス条件下での生細胞イメージングデータ

受けやすい性質をもつ。したがって、これらの脂質が酸化を蓄積することができれば、疾病や老化による細胞障害の的に分解して生じる不飽和アルデヒド化合物（加齢臭の原診断や、新たな病態または加齢メカニズムの解明につなが因として知られる 2 - ノネナールや毒性の高いアクロレイると期待できる。

ンなど）は酸化ストレスの良いマーカーとなりうる。近年、

２．方

これらの高反応性脂質過酸化物が、タンパク質の特定アミ法

２．
１．プローブの合成
アリルアジド基を反応部位として含む蛍光プローブ 1 お
Bioimaging of lipid peroxidation inducedby cell damage or aging
Eita Sasaki
Graduate School of Agricultural andLife Sciences, The University of Tokyo

よび 2（図 1 A）は、4 - クロロ - 7 - ニトロベンゾフラザン
および IR- 780 ヨウ化物をアセトンまたはメタノールに溶解し、アジ化ナトリウムを加えることで合成した。アル
コキシアミノ基を反応部位とする蛍光プローブ 3（図 1 B）
は、ローダミン B をベンジルアルコール誘導体（4）、ベン− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ジルブロマイド誘導体へと変換した後に 2）、N,N- ジメチ

octenal, trans- 2 -nonenal, trans- 2 -decenal）とリン酸緩衝

ルホルムアミド（DMF）中に溶解し、ジアザビシクロウン

液（pH 7）中またはメタノール中で反応させ、波長 560 nm

デセン存在下 N-Boc- ヒドロキシルアミンと反応させ、酸の吸光度をプレートリーダー（ARVO X 3 , PerkinElmer）

による Boc 基の脱保護を行うことによって合成した。それによって測定し、それぞれの溶液を HPLC および質量分析

ぞれのプローブまたはその中間体は、シリカゲルクロマト

装置によって解析した。

グラフィーまたは逆相カラム（C 18）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（JASCO）によって精製した。ま２．３．プローブ 3 のリン酸緩衝液中での光学特性た、得られた化合物の構造は、NMR（JNM-ECA 500 II,

プローブ 3 のジメチルスルホキシド（DMSO）溶液をさまJEOL）および質量分析（JMS-T 100 LC, JEOL）によって同

ざまな pH に調製した 0 . 1 M のリン酸緩衝液（pH 3−11）に定した。

終濃度が 10 µM（1 % DMSO）となるように溶解し、分光
光度計、蛍光光度計を用いてその吸収・蛍光スペクトルを

２．２．プローブとアクロレインやその他のα,β- 不飽
和アルデヒドとの反応
プローブ 1 をテトラヒドロフラン（THF）中でアクロレ分析した。また、対象実験として、ローダミン B とそのベ
ンジルアルコール誘導体（4）の光学特性についても同様に分析した。

インと混合した後、HPLC を用いてその反応物を分析、分光学特性は、分光光度計（U- 3900 , Hitachi）、蛍光光度計

２．４．プローブ 3 による培養細胞（HeLa 細胞）のイメ
ージング（F- 7100 , Hitachi）を用いて分析した。プローブ 2 は、メ

直 径 35 mm の ガ ラ ス ボ ト ム シ ャ ー レ（CELLview,

タノール、DMF、クロロホルム、ジクロロメタン、アセGreiner Bio-One）上に培養した HeLa 細胞をカルシウムとトン、酢酸エチル、アセトニトリル中でアクロレインと混

マグネシウムを含むリン酸緩衝食塩水（PBS（+））で洗浄合し、またはプローブのみで、その吸収スペクトル、蛍光後、1 mL の PBS（+）を加えた。プローブ 3 の DMSO 溶

スペクトルを継時的に測定した。プローブ 3 は、リン酸緩液を 1 mL の PBS（+）と混合し、これを共焦点レーザー

衝液（pH 7 または 8）中でアクロレインを加えた時の吸収ス

顕微鏡（FV 1200 , Olympus）下、シャーレに加え、経時的

ペクトル、蛍光スペクトルを継時的に測定した。さらに、な蛍光観察を行った（プローブ 3 の終濃度 100 nM, DMSO

プローブ 3 をさまざまな炭素鎖長をもつ α, β- 不飽和アルの終濃度 0 . 1 %）
。また、市販のリソソーム染色蛍光試薬

デ ヒ ド 分 子（C 3 - C 10 : acroleine, crotonaldehyde, trans-（LysoTracker Green DND- 26 , ThermoFisher Scientific）

2-pentanal, trans-2-hexenal, trans-2-heptenal, trans-2-による細胞染色は、販売元の取扱い説明書の指示に従っ取した。プローブ 1 およびそのアクロレインとの反応物の図１（A）アジド基を反応部位とする蛍光プローブ1, 2 の構造式（B）アルコキシアミノ基を反応部位とする蛍光プローブ3の構造式− 78 −

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージングて行った。具体的には、HeLa 細胞の培養液に試薬を終濃

タン、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリルなど、多く

度 75 nM で加え、37 ℃で 30 分インキュベートした後に、の溶媒下で化合物 2 のスペクトルに継時的な変化（吸収極PBS（+）
で洗浄した。

大波長 774 nm の減少と吸収極大波長 642 nm の増大）を観３．結測した。しかしながら、当スペクトル変化はアクロレイン

果

無添加でも引き起こされ、光の照射によって加速された。

３．
１．プローブ 1

質量分析などの測定の結果、プローブ 2 とアクロレインとフェニルアジドをニトロベンゾオキサゾール骨格へ導入の期待された反応物は検出されず、プローブ 1 と同様にそしたプローブ 1 を THF 中アクロレインと混合すると、プのアジド基がアミノ基へと変換されていることが確認され

ローブ 1 のホルミルトリアゾール誘導体であると推定された。

る生成物が HPLC および質量分析によって検出された。これを分取精製し、プローブ 1 およびアクロレインとの反応

３．３．プローブ 3

物の吸収スペクトルを測定したところ、アクロレインとのアルコキシアミノ基を有するローダミン B 誘導体である反応によって吸収極大波長が 385 nm から 465 nm へと大きプローブ 3 をさまざまなpHに調製したリン酸緩衝液（pH 3

く長波長側へシフトしていた（図 2 A）
。そこで、459 nm の− 11）に加え、光学特性を分析したところ、pH 依存的な励起波長を用いて蛍光スペクトルを測定したところ、アク吸収スペクトル、蛍光スペクトルの変化が観察された（図ロレインと反応することによって、蛍光極大波長 536 nm

3 A, B）。すなわち、溶液を酸性から塩基性にすることで、の蛍光を発することを観測した（図 2 B）
。以上の結果より、吸光度（吸収極大波長 560 nm）は減少し、それに合わせて

波長 459 nm 付近の光で励起することによって、ホルミル

580 nm 付近の蛍光強度も減少した。吸収極大波長の吸光

トリアゾール体のみが蛍光を発するようなアクロレイン検度を pH に対してプロットしたところ、吸光度の最大値の出条件を設定可能であることがわかった（図 2 B）。

50 % を与える pH（pKcycl）3）は 6 . 2 付近であると見積も次に、プローブ 1 の光安定性を検討するため、1 を水、られた。対象実験として、ローダミン B とプローブ 3 の合

メタノール、または THF に溶解し、室内灯下で吸収スペ成中間体であるローダミン B のベンジルアルコール誘導

クトルを測定したところ、時間依存的なスペクトルの変化

体（4）についても同様の測定を行った。ローダミン B の吸（吸収極大波長〜385 nm の減少と吸収極大波長〜 455 nm

収スペクトルは pH 3−11 の範囲でほとんど変化しなかっの増大）が観測された。質量分析の結果、その原因はプロた。4 の吸光度はプローブ 3 と同様に酸性から塩基性にすーブ 1 のアジド基がアミノ基へと変換されたことに由来することで減少し、そのpKcyclは 8.3 付近と見積もられた（図ると推察された。

3 C）。以上の結果により、プローブ 3 は中性のpH 7 付近
（あるいはそれ以上の pH）では、吸光度、蛍光強度ともに低く

３．
２．プローブ 2

抑えられており、酸性条件下ではそれらが上昇するというフェニルアジドをトリカルボシアニン骨格へ導入したプ

ことがわかった。

ローブ 2 をメタノールに溶解し、アクロレインを加えたが、次にプローブ 3 を pH 7 または 8 に調製したリン酸緩衝

その光学特性に大きな変化は観察されなかった。そこで、液に溶解し、アクロレインを加えると、いずれの場合でプローブ 2 とアクロレインとの反応をさまざまな溶媒を用も吸光度と蛍光強度の経時的な上昇が観察された（図 3 D）。

いて検討したところ、DMF、クロロホルム、ジクロロメ

さらに、プローブ 3 をさまざまな炭素鎖長をもつ α, β - 不

図2 （A）プローブ1およびアクロレイン反応生成物の吸収スペクトル（B）プローブ１およびアクロレイン反応生成物の蛍光スペクトル（励起波長: 459 nm）− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 3（A）
プローブ 3（10μM) の 0.1 M リン酸緩衝液（pH 3 − 11）中の吸収スペクトル（B）
プローブ 3（10μM）の 0.1M リン酸緩衝液（p H 3 − 11）中の蛍光スペクトル（励起波長 : 520 nm）（C）プローブ 3、ローダミン
B のベンジルアルコール誘導体（4）、ローダミン B の 0.1M リン酸緩衝液中の pH 依存的な吸光度（560 nm）
変化（D）0.1M リン酸緩衝液（pH 7 または８）に溶解したプローブ 3（10μM）にアクロレイン（1mM）を加えた時の吸光度（560 nm）の時間変化

飽和アルデヒド分子（C 3−C 10）とリン酸緩衝液（pH 7）ま４．考察とまとめたはメタノール中で反応させたところ、いずれの条件下でも吸光度の上昇が観察された。さらに、それぞれの反応溶

生理的条件下での脂質過酸化物のバイオイメージングを

液を質量分析に供することで、対応するオキシム体へと変可能とする蛍光プローブの基本設計としては、ⅰ α, β- 不換されていることを確認した。

飽和アルデヒド構造をもつ脂質過酸化物と特異的かつ効率

最後にプローブ 3 を共焦点レーザー顕微鏡下、HeLa 細的に反応する「反応部位」、ⅱ 細胞毒性の少ない可視光か胞に加えると、経時的な細胞内蛍光強度の上昇を観察した

ら近赤外光を吸収して蛍光を発する「蛍光部位」、ⅲ 標的（図 4 A）。細胞内の蛍光分布の様子から、プローブ 3 がリ物質と反応することで蛍光強度が増強するようなメカニズ

ソソームに局在している可能性が推測されたため、市販のム、の 3 点を満たすことが理想である。標的とする α, β -リソソーム染色試薬（LysoTracker Green DND- 26）で予

不飽和アルデヒド構造を有する分子種の中で、もっとも短め染色した HeLa 細胞にプローブ 3 を加えたところ、リソ

い炭素鎖（C 3）をもつ分子は、アクロレインである。アクソーム染色試薬で染色していない場合と比較して、細胞ロレインの従来の検出・定量法としては、フェニルヒドラ

内でのプローブ 3 の蛍光強度の上昇の仕方が大幅に遅延しジンとの反応で誘導体化した後に、高速液体クロマトグラ

たが、その蛍光分布には良い重なりが観察された（図 4 B）。

フィーで検出する方法がよく知られている他、アニリンまリソソーム内は pH 4 . 5−5 程度の酸性条件であるために、たはフェニレンジアミンを反応基とする蛍光プローブがプローブ 3 はリソソームに局在することで、その蛍光強度報告されている 4 , 5）。しかし、これらの蛍光プローブを用が上昇したと推察される。

いた検出には、強酸あるいは有機溶媒存在下 80−100 ℃の− 80 −

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージング

図４ （A）プローブ 3（終濃度 100 nM）を HeLa 細胞に添加した直後（5 秒）、1 分後、4 分後の微分緩衝像（DIC）および蛍光像（559 nm レーザー励起）（B）HeLa 細胞を LysoTracker Green とプローブ 3 で共染色した後の蛍光像（左から 488 nm レーザー励起、559 nm レーザー励起、それらの重ね合わせ）

加熱が必要なため、生細胞へ直接応用することは非現実的プローブ 1 はアクロレインと反応することで、吸収スペであった。ところが近年、アクロレインが生理的条件下ア

クトルが約 80 nm 長波長シフトした蛍光性のホルミルトリ

リルアジドと反応することが新たに見出され、これを利用

アゾール体を生成することが確認できた一方、プローブ 2した生細胞内でのアクロレインの蛍光観察が報告された 6）。

については、アクロレインとの反応生成物を検出すること

そこで本研究では、上記反応によって、アジド基がホルミができなかった。現在のところ、アリルアジド基を反応部

ルトリアゾールへと変換されることに着目し、その反応前位とするプローブの設計とその細胞応用には 2 点の問題点

後での電子状態の変化が、吸収・蛍光スペクトルの変化にが挙げられる。1 点目は、そのアクロレインとの反応性が連動するようなプローブを創出することが可能であると考不十分である点である。詳細は省略するが、さまざまなフえ、アクロレインとの「反応部位」であるフェニルアジドと、ェニルアジド置換体を用いて、アジド基とアクロレインの生細胞に応用可能な「蛍光部位」であるニトロベンゾオキサ

反応性を検討したところ、電子供与基、電子吸引基のいずゾールまたはシアニン色素を結合した分子（1 , 2）を設計し、れの置換基においても反応性の向上が見られなかった。しアクロレインとの反応前後での吸収・蛍光スペクトルの変たがって、アクロレインを高感度で検出できるプローブを化を測定した。

設計するためには、さらなる検討が必要である。2 点目は、

− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

プローブ 1、2 のアジド基が、溶媒、光、熱などの影響を応速度は、pH 7 において pH 8 よりも速いことが観察され受け、特定の条件下において容易にアミノ基へと変換された。一般的に、アルコシキアミンとアルデヒドからオキシ

うるという点である。同様の反応はこれまでにも報告されムが生成する反応速度は、pH 4 . 5 付近で最も速くなるこており、光によってアジド基から窒素が放出され、反応性とが知られている 9）。最後にプローブ 3 を HeLa 細胞に応の高いニトレン中間体が生じると考えられており、これを用し、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。ロ

利用した生体分子の光親和性標識法への応用も示唆されてーダミン B は細胞内のミトコンドリアに局在することがよいる

7 , 8）。プローブ 1 においては、アクロレイン反応体（ホく知られている色素だが、共染色の結果、プローブ 3 は極ルミルトリアゾール体）とアミン誘導体の吸収スペクトル

めて効率良くリソソームを染めることが観察された。しかが類似しているため、アクロレイン選択的なイメージング

し、pH が 4 . 5−5 程度であることが知られているリソソー

プローブとしての利用を妨げる要因になりうる。したがっム内では、プローブ 3 はほぼ全てが開環構造（3 open）を形成て、アジド基を用いたアクロレイン検出蛍光プローブをよしていると考えられるため、当初計画していたようなアルり実用化に近づけるためには、アジド基の安定性について

デヒド分子との反応による蛍光強度の増強を期待することさらなる検討と改良が必要である。

は難しい。一方で、プローブ 3 の細胞内分布は明確にはわ

そこで次に、アリルアジドとは異なる「反応部位」によっかっておらず、細胞質やその他の細胞小器官などの中性環て、脂質過酸化反応で生じるさまざまな炭素鎖長を有する

境下にも分布する場合は、酸化ストレス由来のアルデヒド

アルデヒド基を標的とした蛍光プローブの設計を試みた。

分子と反応することで蛍光強度が増強することが期待できアルデヒド基に対する「反応部位」
としては、アルコキシア

る。逆に、プローブ 3 がリソソームに局在している場合は、

ミンとヒドラジンがよく知られており、それぞれ対応する

上述したようにオキシム形成に適した pH であるため、酸

9）オキシムとヒドラゾンを生成する 。これらの「反応部位」

化ストレスを加えた後の細胞溶解液を質量分析することで、を利用したアルデヒド検出試薬は数多く報告されているが、リソソーム選択的な脂質過酸化物の同定が可能になるかも

生細胞の脂質過酸化反応に由来するアルデヒドをイメージしれない。これらの実験については、今後の課題である。

10）。そこで、アルコキシアミノ

以上、本研究課題では、生細胞に応用可能な脂質過酸化

基を「反応部位」とし、細胞イメージングに汎用される蛍光物感受性蛍光プローブの開発を目的とした研究を行った。

色素であるローダミンを「蛍光部位」とする分子（3）を新た本研究で得られた知見をさらに発展させ、生細胞内に生成に設計した。一般的に、ローダミン分子内のキサンテン骨する脂質過酸化物をイメージングすることができれば、さま

格 9 位への求核攻撃は、分子内共役系の切断に伴う吸光ス

ざまな酸化ストレスに伴う肌機能の低下を直接または間接ペクトルの変化及び蛍光の消失をもたらすことが知られて的に推測することが可能になると期待されるとともに、疾いる。アルコキシアミノ基の求核性は溶液中の pH によっ

患や老化の新たなメカニズムの解明にも役立つはずである。

ングした例はほとんどないて大きく影響を受けるが、これまでに報告されているさま
ざまなローダミン系の蛍光プローブの蛍光特性から 3）、3は中性条件下においては、スピロ環化合物（3 closed）として（引用文献）
1） Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R. & Aye, Y.
Chem. Rev. 118, 8798-8888（2018）．

ほぼ無蛍光となることを推測した。平衡状態として一部存在するフリーのアルコキシアミン（3 open）が標的とするアル

2） Luo A. L., Gong, Y. J., Zhang, J., Zhang, C. C., Zhang, X.

デヒド分子と反応してオキシムを形成すると、上記の分子

B. & Tan, W. Talanta, 117, 326-332（2013）．

内環化反応が抑制されるために、蛍光が増強することを期

3） Uno, S. et al. Nat. Chem., 6, 681-689（2014）．

待した。

4） Togashi, M. et al. Org. Lett., 12, 1704-1707（2010）．

実際に、プローブ 3 をさまざまな pH に調製したリン酸

5） Imazato, T. et al. Biomed. Chrom., 2 9, 1 3 0 4-1 3 0 8

緩衝液中に溶解し、吸収・蛍光スペクトルを測定したとこ（2015）．

ろ、予想通り中性・塩基性条件下では吸光度、蛍光強度と6） Pradipta, A. R. et al. ACS Sensors 1, 623-632（2016）．

もに低く抑えられていることが確認できた。また、pH 57） Lord, S. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 9204-9205（2008）．

以下の酸性条件下では吸光度、蛍光強度がほぼ一様に高く

8） Lord, S. J. et al. J. Phys. Chem. B 114, 14157-14167

なることが観察された。したがって、プローブ 3 は pH 7、（2010）．

8 の条件下では、その大部分がスピロ環化合物（3 closed）と9） Kölmel, D. K. & Kook, E. T. Chem. Rev. 1 1 7, 1 0 3 5 810376（2017）．

して存在していることが推測された。ここにアクロレインなどの α, β - 不飽和アルデヒド分子を加えると、期待通り

10）Suchy, M., Lazurko, C., Kirby, A., Dang, T., Liu, G. &アルデヒド分子と反応したオキシム体（開環構造）の形成に

Shuhendler, A. J. Org. Biomol. Chem., 1 7 , 1 8 4 3 - 1 8 5 3

伴う吸光度・蛍光強度の増強が確認できた。また、その反（2019）．

− 82 −

メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用への展開慶應義塾大学理工学部応用化学科

清水史郎

Premelanosome protein (PMEL) is a functional protein as a scaffold for melanin synthesis and pigmentation inmelanosome. PMEL forms non-toxic amyloid fibrils through aggregation of its fragments. In the previous studies, PMEL
has several N-glycosylation and O-glycosylation sites and those are significant for membrane trafficking or fibril formation.
C-mannosylation is a unique type of protein glycosylation, which the alpha-D-mannopyranose is attached to the firsttryptophan residue in the consensus sequence, Trp-Xaa-Xaa-Trp/Cys (Xaa represents any amino acid). PMEL has one
predicted C-mannosylation consensus sequence, Trp 153 -Lys-Thr-Trp, in the N-terminal region (NTR) and Trp 153 is
probably C-mannosylated; however, the presence of C-mannosylation in PMEL has not been reported. In this study, we
first demonstrated by mass spectrometry that PMEL is C-mannosylated at predicted Trp 153 , and also C-mannosylated
at Trp 104 and Trp 156 , which belong to Trp 104 -Val-Asn-Asn and Trp 156 -Gly-Gln-Tyr, respectively. In addition, we
identified that C-mannosylation at Trp 104 can occur near N-glycosylation at Asn 106 . Furthermore, we evaluated the role ofC-mannosylation in PMEL on its function of fibril formation, using C-mannosylation-defective mutant (W 104 F, W 153 F/
W 156 F) PMEL transiently overexpressed HeLa cells. Compared with control and W 104 F, W 153 F/W 156 F especiallydiminished fibrils. Taken together, PMEL is C-mannosylated at Trp 104 , Trp 153 and Trp 156 , and we suggest that the
C-mannosylation of PMEL regulates amyloid fibril formation and/or pigmentation in melanosome.

１．緒る 2）。実際に約 30 の例のうち、半分以上が TSR 領域で言

C-mannosylation されている。そして、TSR 領域内でのヒトゲノムプロジェクトの成果をもとに、ゲノムだけでC-mannosylation 責任酵素として線虫ではdpy-19 が 3）、哺なく転写産物やタンパク質の情報も網羅的に理解すること

乳類では DPY 19 L 1 や DPY 19 L 3 などが報告されている 4 , 5）。

ができるようになってきた。これらの情報は時に様々な疾

一方、TSR 領域以外での C-mannosylation の報告も我々病との関連を明らかにし、治療法ならびに診断法の新規開の研究成果を含めて数例知られている。現在までに TSR発と改良が進められてきた。そして、今後も生命分野の情領域以外で起こる C-mannosylation の責任酵素が DPY 19

報は AI などとの結びつきでさらに発展することが期待さ

ファミリーによるものであるか否かは不明であるが、よりれている。

多くの基質例を提示することで C-mannosylation に対する

また、生命現象の解明に貢献したのはゲノム情報だけで新たな知見が提示できるものと思われる。

はなく、質量分析機器の技術革新によるところが少なくな

メラノソーム内においてメラニン色素沈着の足場としい。例えば、これまでは解析に膨大な時間を要した生体内て重要な役割を担う PMEL タンパク質は、糖鎖修飾をの代謝産物をスピーディーに解析し病態を理解することが受ける糖タンパク質である。PMEL はメラノサイトやメできるようになったり、報告例がない生体内の有機物（核ラノーマ特異的に発現しており、その組織特異性からメ酸やタンパク質の翻訳後修飾など）の発見につながったり

ラノーマ検出のための腫瘍抗原でもある。また、PMELと、その恩恵は計り知れない。

はプロテアーゼによる切断を経てアミロイド繊維を形成

タンパク質翻訳後修飾の 1 つである C-mannosylation
1）

し、それが色素沈着の足場として機能する。そのため、は 1994 年にヒト尿中の RNase 2 より見出された 。これ

PMEL の繊維形成機構を解明することは、メラニン産生までに基質タンパク質は約 30 知られており、分泌、細胞とアミロイド形成の両方の点で重要である。PMEL は N

内局在、フォールディングに関与していることが分かっ

末端に疎水性アミノ酸を多く含むシグナルペプチドを持ている。基質の多くはトロンボスポンジンタイプ I リピー

つ分泌型タンパク質である。PMEL はメラノソームに輸ト（TSR）領域を持ち、その領域内で複数箇所修飾を受け送されたのち、数回の切断を経てメラニン色素沈着のための繊維が形成される。PMEL における糖鎖修飾は、N 型糖鎖修飾（N-glycosylation）、O 型糖鎖修飾（O-glycosylation）

Novel glycosylation of melanin-related
protein and its application
Siro Simizu

ともに存在し、それぞれの役割も解析されているが、C-mannosylation の有無や役割は未解明のままである。

Department of Applied Chemistry,
Faculty of Science and Technology,
Keio University− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．方

時に C-mannosylation 責任酵素の可能性がある遺伝子も導法

入することで酵素の同定を試みた。C-mannosylation の有２．１．PMEL 過 剰 発 現 細 胞 の 樹 立 とリコ ン ビ ナ
ントタンパク質の 精 製 およ び 質 量 分 析 法 に よる
C-mannosylation の確認

無は上述と同様に質量分析法で評価した。

３．結

果

全長のヒト PMEL タンパク質は膜貫通領域があり、過剰

３．
１．PMELタンパク質におけるC-mannosylation

発現させた際に精製するのが困難であると考えられたので、

図 1 にヒト PMEL タンパク質の概略を示す。PMEL は N

C-mannosylationされる可能性が高いPMELのN-terminal

末端側からシグナルペプチド（SP）、N-terminal region

region（PMEL-NTR）をクローニングし、その N 末端に検（NTR）、Polycystic kidney disease domain（PKD）、リピ

出用の Myc 配列と精製用の His 6 配列を導入した発現ベクート領域（RPT）、kringle-like domain（KLD）、そして膜貫ターを作製した。発現ベクターを CHO-K 1 細胞に遺伝子

通領域（TM）があり、細胞が分化する過程で RPT と KLD

導入し、選択培地で培養することで、PMEL-NTR を安定の間でプロテアーゼによる切断を受ける。切断された断片的に過剰発現する細胞株を取得した。樹立した細胞からアはそれぞれ N 末端側が Mα、C 末端側が Mβ と呼ばれる。

フィニティー精製によりリコンビナントの PMEL-NTR を

Mα は細胞外領域に存在し、その中に 153 番目のトリプト大量に得ることに成功したため、得られた PMEL-NTR がファンを含んだ C-mannosylation を受ける可能性があるコ

C-mannosylation されているか否かを質量分析法で確認しンセンサス配列がある。

た。

図 1 の 210 番目のアミノ酸までをクローニングし、さらに検出用の Myc タグと精製用の His 6 タグ配列を導入した

２．２．PMEL に お ける C-mannosylation が そ の機能に及ぼす影響ベクターを作製した。配列が正しいことを確認後、ハムス

ヒト子宮頸がん細胞の HeLa 細胞は PMEL を発現してよるセレクションを経て安定的に過剰発現している細胞株

いないが、PMEL を発現させると本来の機能発現に必要（CHO-K 1 -HM-PMEL-NTR）を樹立した。また並行して、な切断を受けることが知られている。そこで野生型およ全長の PMEL をクローニングし、発現用ベクターを作製

び C-mannosylation されるトリプトファンをフェニルアした。

ター由来である CHO-K 1 細胞に遺伝子導入し、G 418 にラニンに置換した変異型 PMEL を HeLa 細胞に遺伝子導入

PMEL の 153 番目のトリプトファンが C-mannosylation

し、野生型が切断を受ける条件で変異型が切断されるか否

さ れ て い る か を 確 認 す る た め、CHO-K 1 -HM-PMEL-かを評価した。また、ヒトメラノーマ細胞の SK-MEL- 28

NTR 細 胞 よ り リ コ ン ビ ナ ン ト PMEL-NTR を 粗 精 製 し細胞は PMEL を発現しているが、メラノソーム成熟過程た。そして得られたタンパク質の質量分析を行うことでのステージⅡからステージⅢへの移行ができないことがC-mannosylation を検出した。その結果、予想されてい知られている。よって、SK-MEL- 28 細胞の内在性 PMELた 153 番目のトリプトファンだけでなく、104 番目およびをノックアウトし、その後、野生型または変異型の PMEL

156 番目のトリプトファンも C-mannosylation されているを再発現させることでメラノソームの成熟に PMEL のことが示唆された。

C-mannosylation が関与しているか否かを評価した。

２．３．PMEL に お ける C-mannosylation 責 任 酵
素の探索

３．２．PMELタンパク質におけるC-mannosylationの役割

３．
１．の 結 果 を 受 け て、PMEL タ ン パ ク 質 に お け る

C-mannosylation 責任酵素が存在しないことが報告され

C-mannosylation の役割を解析するために、2 つの実験をていたハエ由来の S 2 細胞に PMEL-NTR を発現させ、同行った。1 つは HeLa 細胞に野生型または変異型の PMEL

図1

ヒトPMELタンパク質の概略− 84 −

メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用への展開を発現させてその差を比較する実験であり、もう 1 つはメのトリプトファンを 2 か所ともフェニルアラニンに置換しラノーマ細胞の PMEL をノックアウトし、野生型またはた 2 WF を遺伝子導入すると、断片化された PMEL の量が変異型を再発現させる実験である。３．
２．の実験は全て全減少していた。このことから PMEL タンパク質における特長の PMEL を使用した。

に 153 番目および 156 番目の C-mannosylation が、PMEL

HeLa 細胞を用いた実験結果を図 2 に示す。前述したようが切断されるのに重要である可能性が示唆された。

に HeLa 細胞には PMEL は発現していないため、空ベクタ

2 つ目の実験である、メラノーマ由来 SK-MEL- 28 細胞ーを導入した neo のレーンには PMEL は検出できない。まにおける PMEL のノックアウト実験は、現在までにノッた野生型（wt）を発現させた場合は、全長を検出できる E- 7

クアウト細胞を樹立し、その後に wt、WF、または 2 WF

抗体で 100 kDa 付近にバンドが確認でき、さらに HMB 45を再導入した細胞を樹立中である。なお、ノックアウト細抗体で Mα および細かく切断された PMEL を認識すること

胞における電子顕微鏡像から、これまでの報告通り、II 型ができた。同条件で 104 番目のトリプトファンをフェニルのメラノソームが検出できなくなっていることは確認した

アラニンに置換した WF を遺伝子導入した際は wt を導入し

（図 3）。

た時との差があまりなかった。一方、153 番目と 156 番目

図2

図3

HeLa細胞を用いたPMELタンパク質におけるC-mannosylationの役割の解析

SK-MEL-28細胞におけるステージIIのメラノソーム電子顕微鏡像の例− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

３．３．PMEL に お ける C-mannosylation 責 任 酵素の探索されていないものである可能性が高いことが分かった。

これまでに我々は新たな C-mannosylation 責任酵素ととが知られている S 2 細胞に PMEL を遺伝子導入するだ

して DPY 19 L 3 を報告しているが、その際にハエ由来のけで、（DPY 19 ファミリータンパク質を導入しなくても）S 2 細胞を使用したノックイン実験を行っている。つまC-mannosylation された。本研究で、責任酵素の同定まり、S 2 細胞には C-mannosylation 責任酵素が欠損しておでには至らなかったが、新規 C-mannosylation 責任酵素

り、基質とともに酵素を導入すると、基質タンパク質がの存在が示唆された。

すなわち、C-mannosylation 責任酵素が欠損しているこ

C-mannosylation されていた。そのことを利用し、PMELの C-mannosylation 責任酵素も同様に探索することとし謝辞た。具体的には、S 2 細胞に PMEL だけ、または同時に責

質量分析は理化学研究所・環境資源科学研究センター・

任酵素の候補である DPY 19 L 1 ～ L 4 のそれぞれを導入し、生命分子解析ユニットの堂前直先生、鈴木健裕先生との共PMEL における C-mannosylation の有無を質量分析により同研究によるものです。また、電子顕微鏡像は東京医科歯確認した。その結果、予想に反し PMEL だけを導入した科大学・難治疾患研究所の清水重臣先生、荒川聡子先生とS 2 細胞由来のリコンビナント PMEL が C-mannosylationの共同研究の成果です。

されていた。また、DPY 19 ファミリーを共発現してもそ

本研究成果により、日本糖質学会より第 20 回日本糖質の C-mannosylation の程度が変化しなかった。このことか

学会ポスター賞（第 36 回日本糖質学会）を研究室に所属しら、PMEL における C-mannosylation 責任酵素は、これまていた大学院生である小松 良亮が「メラノソーム関連タンでに知られている DPY 19 ファミリータンパク質ではない、

パク質 PMEL における C-mannosylation の解析」と題し受新規なものである可能性が示唆された。

賞している。

４．考また、本研究を遂行するにあたり公益財団法人コーセー察

コスメトロジー研究財団よりご助成いただきましたことに本研究では、メラニン生成関連タンパク質である PMEL

感謝申し上げます。

における C-mannosylation の役割を解析した。その結果、（引用文献）

大変興味深い研究成果を得ることに成功した。
Ⅰ）PMEL は C-mannosylation されることを世界で初めて

1） Hofsteenge J, Müller DR, de Beer T, Löffler A,

明らかにすることができた。また、予想された 153 番目

Richter WJ, Vliegenthart JF. New type of linkage

だけではなく、104 番目と 156 番目のトリプトファンも

between a carbohydrate and a protein: C-glycosylation

C-mannosylation されていた。さらに、104 番目と 156

of a specific tryptophan residue in human RNase Us.

番目の C-mannosylation は、我々のこれまでの研究からBiochemistry 33, 13524-30（1994）．

も提唱されているコンセンサス配列以外で起こったこと

2） Niwa Y, Simizu S. C-mannosylation; previous studies

から、C-mannosylation のコンセンサス配列に関する有and future research perspectives. Trends Glycosci.

益な情報を提供することができた。

Glycotechnol. 30, E231-8（2018）．

Ⅱ）PMEL の C-mannosylation は繊維形成の前段階である

3） Buettner FF, Ashikov A, Tiemann B, Lehle L, Bakker

プロテアーゼによる切断に関与している可能性が示唆さ

H. C. elegans DPY-1 9 is a C-mannosyltransferase

れた。以前の報告で、アラニン・スキャンにより PMEL

glycosylating thrombospondin repeats. Mol. Cell 50, 295-

中の重要なトリプトファンをスクリーニングしている報302（2013）．

告があり、153 番目と 156 番目のトリプトファンを他の

4） Niwa Y, Suzuki T, Dohmae N, Simizu S. Identification

アミノ酸に置換すると PMEL としての機能が著しく低

of DPY19L3 as the C-mannosyltransferase of R-spondin1

下することは分かっていた。しかし、本研究成果により、

in human cells. Mol. Biol. Cell 27, 744-56（2016）．

その原因が C-mannosylation である可能性を示唆するこ

5） Shcherbakova A, Tiemann B, Buettner FF, Bakkerとができた。詳細は PMEL ノックアウト細胞に様々な

H. Distinct C-mannosylation of netrin receptor

変異型 PMEL を再発現させることで明らかになると考thrombospondin type 1 repeats by mammalian DPY19L1

えられる。

and DPY19L3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, 2574-9

Ⅲ）PMEL の C-mannosylation 責任酵素はこれまでに同定（2017）．

− 86 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発
弘前大学大学院医学研究科生体構造医科学講座

下田浩

Establishment of full-thickness human cutaneous three-dimensional ( 3 D) equivalent containing blood and/ or lymphatic
vasculature is required for drug discovery and development of chemicals and cosmetics, because microcirculatory system innature human skin plays an important role in regulating cutaneous morphogenesis and physiological function. The present
study employed our developed layer-by-layer (LbL) nanofilm coating and unique collagen gel cell-accumulation techniques
to fabricate human epidermis on dermis-like cellular and fibrous tissue with or without blood or lymphatic capillary network.
Our constructs without vascular network exhibited a well-organized epidermal tissue involving cellular differentiation of
keratinocytes and distinctive layer formation with cornification on basement membrane of dermal connective tissue and ahigh barrier function after exposure to a cytotoxic corrosive. Additional equipment of horizontal capillary network within
the dermal tissue by LbL coating method facilitates formation of every layer in epidermis, as well as dermal tissue, toincrease thickness of each tissue. Three-dimensional configuration of the vascular network introduced by collagen gel cellaccumulation procedure further accelerates maturation and thickening of both tissues. However, the lymphatic network
prepared by the current LbL coating method was somewhat different in its form from that in normal nature human skinand leave little impression on both epidermal and dermal structure in the engineered cutaneous tissue, so that improved
procedure for building lymphatic vasculature, being closely like that in nature dermis, has been currently developed. The
present results consequently demonstrate that our peculiar tissue-engineering methods afford in vitro full-thickness humancutaneous 3 D model like nature skin simply and substantial vascular network, being effective in tissue maturation, in ashorter period than that described previously. Our vascularized cutaneous tissue constructs are expected as next-generationin vitro skin models for drug and cosmetic development and as biomaterials for regenerative medicine.

１．緒

化される、再現性の高い簡便な技術の確立が不可欠である。

言

このことは化粧品などの化成品の開発のみならず、医薬品

化粧品の開発において、EU では既に動物実験が禁止さや再生医療材料の開発においてもきわめて大きな意義を有れ、本邦でも自主規制が強化されている。また、評価成績する。我々の研究グループは独自に開発した細胞集積法 9）のヒトへの応用を考慮した場合、皮膚構造が異なる実験動によりこれまで心筋 10）、腹膜 11 - 12）、動脈 13）など様々なヒ物ではなくヒトにおける研究が好ましいのは明白であるが、ト三次元組織を創製するとともに、その内部に数日で血管

このことは倫理的に困難な問題を含んでいる。これに対しやリンパ管のネットワークを自己組織化させることに成功

1）て近年、ヒト表皮細胞を分化・重層化した表皮組織 が汎している。この 3 D 組織構築技術を応用し、化粧品・医薬用されているが、最近ではよりヒト皮膚に近い構築を模倣品の開発と再生医療への応用性に優れた、高度な機能解剖する真皮様結合組織に表皮組織を積層した擬似皮膚相同体

学的特性をもつ血管・リンパ管網含有 3 D ヒト皮膚モデルの開発が報告されている

2 - 9）。しかし、その多くは体液のを確立することが本研究の目的である。

通路と生体反応の環境を提供する微小循環系（血管・リン

2. 方

パ管）
を真皮組織内に装備しておらず 1 - 6）、組織内における脈管の組織化に乏しい例 7）と脈管の構築に特殊なデバイス

2 . 1. 細胞培養

や多種多様な生理活性添加剤、加えて長い期間と多数の煩雑な工程を要する例

8）法

ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF；Lonza, NJ, USA）
、ヒト

を見るに止まっている。これらの課

臍帯静脈内皮細胞（HUVEC；Lonza）、ヒト皮膚リンパ管

題を同時に解決するには、血管やリンパ管が解剖学的正確

内皮細胞（HDLEC；PromoCell, Heidelberg, Germany）、正

性をもって配置された真皮組織と優れた機能形態を有する

常ヒト表皮角化細胞（NHEK；Kurabo, Japan）を 37 ℃、5 %表皮組織から成る三次元（3 D）構造体が短期間で自己組織

CO 2 濃度下で、それぞれの専用培地（10 % fetal bovine serum（FBS）含有 DMEM（Lonza），EGM ™ - 2 MV, NHEK 増殖添

Development of progressive humancutaneous 3 D model

加剤含有 EpiLife ™（Thermo Fisher Scientific, MA, USA））
を皮膚モデルの作製に供した。

Hiroshi Shimoda
Department of Anatomical Science,N e u r o a n at o my, C e l l B i o l o g y a n d
Histology, Hirosaki University Graduate
School of Medicine

2 . 2 . LbL・細胞集積法による三次元皮膚モデルの構築
細胞表面にフィブロネクチン（Sigma-Aldrich, MO, USA）とゼラチン（Wako Pure Chemical Industries, Japan）による− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

多層性（layer-by-layer；LbL）ナノフィルムコーティング®

リンパ管網含有皮膚モデルについては、HUVEC の代わを施した NHDF を 24 -well 用 Transwell insert（Corning,

りにコーティングを施していない 0 . 5 層分の HDLEC を用

NY, USA）に 8 層となるように播種・積層化し、翌日～

いて上記と同様の操作を行うことによりリンパ管網含有皮

数 日 後 に NHDF 積 層 組 織 表 層 を Type IV collagen 溶 液

膚モデルを構築した（図 1）。

（0 . 04 mg/ml；Sigma-Aldrich）でコーティングした後、そ
翌 日 よ り 10 % FBS 含 有 DMEM と EpiLife ™ の 等 量 混 合2 . 4 . コラーゲンゲル・細胞集積法による血管網含有
三次元皮膚モデルの構築

培 地 に 25 µg/ml ア ス コ ル ビ ン 酸（Wako Pure Chemical

コラーゲンゲル溶液（3 mg/ml；collagen from human

Industries）を添加した培地を用いて air-lift による培養を

placenta；Sigma-Aldrich）に NHDF（1 × 105）と HUVEC

7 日間行い、真皮と表皮より成る皮膚モデルを構築した（図（0 . 5 × 105）を浮遊させ、遠心平衡化（1100 G, 15 分）した後、

1）。

24 -well 用 Transwell® insert に播種し，翌日より 2 . 2 . との上層に NHEK を 3 層性に播種した（図 1）。NHEK 積層

同様に NHEK の培養を 7 日間行い、血管網含有皮膚モデ

2 . 3 . LbL・細胞集積法による血管（リンパ管）網含有
三次元皮膚モデルの構築
NHDF および HUVEC の細胞表面に 2 . 2 . と同様のコールを構築した（図 2）。

2 . 5 . 光学顕微鏡的解析

ティングを行い、1 層の HUVEC を各 4 層の NHDF でサン2 . 2 . ～ 2 . 4 . において構築した各種三次元組織（各 3 体）

ドイッチ状に挟み込むように播種・積層化した（図 1）。翌

を 4 % パラホルムアルデヒド溶液で固定し、5 µm 厚のパラ

日～数日後に 2 . 2 . と同様に NHEK の培養を 7 日間行い、フィン包埋組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン

血管網含有皮膚モデルを構築した（図 1）。

（H. E.）染色ならびに下記の免疫染色に供した。また、2 . 3 .

図 1 LbL・細胞集積法による血管（リンパ管）網含有 3 D 皮膚モデルの構築。主にフィブロネクチンとゼラチンによる多層化（Layer-byLayer；LbL）ナノフィルムコーティングを行ったヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）またはヒト皮膚リンパ管内皮細胞（HDLEC）を積層化した後、上層に正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を播種し、air-lift の状態で分化・誘導する。

図 2 コラーゲンゲル・細胞集積法による血管網含有 3 D 皮膚モデルの構築。コラーゲンゲル溶液にヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と浮遊・遠心し、積層化した後、上層に正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を播種し、air-lift の状態で分化・誘導する。

− 88 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発～ 2 . 4 . において構築した血管網含有皮膚モデル各 2 体をデヒド溶液で固定した後、常法に従い超薄切片を作製し、4 % パラホルムアルデヒド溶液で固定後、whole-mount 標

JEM 1250（JEOL, Tokyo）で観察した。また、SEM 解析に本として下記の免疫染色に供した。

ついては、上述のパラフィン包埋組織より組織切片を作製した残りの組織を 1 % オスミウム酸溶液で導電染色した後、

2 . 6 . 免疫染色

凍結乾燥と白金コーティングを行い、JSM- 6510 LV（JEOL,

2 . 2 . で構築した皮膚モデルの組織切片をクエン酸緩Tokyo）で観察した。

衝液（0 . 01 M, pH 6 . 0）で煮沸した（121 ℃，15 分）後、antioccludin IgG（abcam, Cambridge, UK）、anti-desmoglein

2 . 8 . 皮膚刺激性評価試験

IgG（Heiderberg, Germany）、anti-laminin IgG（Sigma-

三次元皮膚モデルのバリア機能を評価するために、2 . 2 .

Aldrich）を一次抗体として、各一次抗体の動物種に特異的で構築した三次元皮膚モデルならびに NHDF のみで構成さな IgG に蛍光物質（fluorescein isothiocyanate, Cy 3 , Cy 5）

れた三次元真皮モデルに対して生理食塩水ならびにドデシルを結合させた二次抗体を用いてレーザー共焦点顕微鏡で各

硫酸ナトリウム（SDS）溶液（1 , 2 , 4 , 10 , 50 mg/ml）を組織表

タンパクの局在を可視化した。

面に暴露し，18 時間後 に洗浄した後，常法通りにMTT（3 -2 . 3 . ～ 2 . 4 . の whole-mount 標 本 に つ い て は、anti-［4 , 5 -dimethylthiazol- 2 -yl］- 2 , 5 -diphenyltetrazolium

CD 31 IgG（DAKO, Glostrup, Denmark）
を一次抗体として、

bromide）アッセイを行い、得られた測定値から細胞生存度（各Cy 3 を結合させた特異的二次抗体を用いてレーザー共焦

濃度の SDS 溶液暴露後の検体の吸光度 /生理食塩水暴露後

点顕微鏡で血管網を可視化した。

の検体の吸光度×100（%））
を算出した。

2 . 4 . で構築したリンパ管網含有皮膚モデルの組織切片

3. 結をクエン酸緩衝液で煮沸した後、anti-LYVE- 1 IgG（R&D
Systems, MN, USA）を 1 次抗体として、peroxidase を結果

3 . 1. 三次元皮膚モデルの構造合させた特異的二次抗体を用いて 3 . 3’-diaminobenzidine

本研究で用いた細胞集積法は 10 日以内に真皮様結合組を免疫反応産物として LYVE- 1 の局在を光学顕微鏡で可織と表皮様組織から成る 3 D ヒト皮膚モデルを構築する視化した。

ことができた。24 -well insert 内に構築された 3 D 組織は
1 cm の径をもち、多数の線維芽細胞と細胞外マトリクス

2 . 7. 電子顕微鏡的解析から成る 80 ～ 100 µm 厚の真皮様組織とその上に形成さ2 . 2 . で構築した皮膚モデル各２体を透過型電子顕微鏡れた基底層から角質層の各層が識別される 50 ～ 70 µm 厚（TEM）および走査型電子顕微鏡（SEM）による解析に供の表皮組織で構成されていた（図 3 A, B）。表皮組織においした。TEM 解析については、検体を 2 . 5 % グルタルアルて基底層と有棘層は明瞭であったが、顆粒層はやや乏しく、

図 3 3 D皮膚モデルの構造。A. LbL・細胞集積法で構築された三次元皮膚モデルの組織切片の全体像。
B. A. の一部の拡大像。線維芽細胞と細胞外マトリクスから成る真皮様組織上に細胞分化と角質化を伴う表皮組織が見られる。C. ヒト表皮角化細胞のみで分化誘導した表皮様組織。細胞分化による層形成が乏しく、重層化されない。A. − C. H.E. 染色− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

角化層には扁平な細胞核をもつ錯角化を示す細胞も散見さの特性を有する細胞がデスモゾームを備えた細胞間橋を無れた（図 3 B）。真皮様組織を構築せずに NHEK のみで作製数に発達させて基底層と有棘層を構築し、基底膜の形成した構造体は表皮としての分化傾向を呈したが、組織化さに伴いヘミデスモゾームをもつ基底細胞が散見された（図れなかった（図 3 C）。

4 A）。顆粒細胞内ではトノフィラメントの間に大小のケ

LbL・細胞集積法により構築された皮膚モデルの表皮組

ラトヒアリン顆粒が散在し、その上層には扁平な細胞が屋

織では、トノフィラメントをはじめとするケラチノサイト

根瓦様に堆積する角質層が形成されていた（図 4 A, B）。ま

図 4 3 D 皮膚モデルの TEM 像（A）、SEM 像（B）
、desmoglein（赤）・occludin（緑）・laminin（青）に対する免疫染色像（C）、皮膚刺激性試験（D）．A- 1 . 表皮から真皮にかけての全体像。 A- 2 . A- 1 . の表皮角質層から顆粒層の拡大像。A- 3 . A- 1 . の表皮顆粒層の拡大像。A- 4 . A- 1 . の表皮有棘層の拡大像。A- 5 . A- 1 . の表皮有棘層か
ら基底層の拡大像。A- 6 . A- 1 . の表皮基底層から真皮にかけての拡大像。矢頭は基底膜とヘミデスモゾーム様構
造を指す。B. 角質層の表層は扁平な細胞の屋根瓦状の堆積から成る。C. desmoglein、occludin、laminin はそれ
ぞれ表皮全体、表皮表層、表皮と真皮の境界層および真皮全体に局在が見られる。D. 青曲線と赤曲線はそれぞれ真皮様結合組織と 3 D皮膚モデルに対するSDS各濃度溶液（横軸）
暴露後のMTTアッセイ後の吸光度
（縦軸）
を示す。

− 90 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発た、基底層から有棘層の細胞間でデスモゾームが発達する

3 . 3 . 血管網含有三次元皮膚モデルの構造のに対し、顆粒層から角質層では desmoglein などのデス

LbL またはコラーゲンゲルを用いたいずれの細胞集積手

モゾーム構成タンパクに加えて occludin を含む閉鎖結合構法においても毛細血管網を有する全層性の 3 D 皮膚モデル

成タンパクが密に分布していた（図 4 C）
。一方、真皮様結を 10 日以内に構築することができた（図 5）。LbL 法によ合組織では表皮組織との境界面に laminin を含む基底膜がる皮膚モデルの真皮様組織では、二次元的に広がる毛細血形成されたが、laminin は結合組織深層にも散在性に分布

管網が中層部に形成され、その厚さは血管網を有しないしていた（図 4 A, C）。

モデルの真皮様組織より約 1 . 5 倍に増加していた（100 ～150 µm；図 5 A, B）。同モデルの表皮組織は、明瞭な顆粒

3 . 2 . 三次元皮膚モデルのバリア機能の評価層を形成する細胞分化を呈し、血管網をもたない皮膚モ

SDS 溶液と MTT アッセイを用いた 3 D 皮膚モデルのバデルに比べて約 1 . 5 倍に肥厚していた（約 100 µm；図 5 A）。

リア機能評価において、NHDF のみで構築した 3 D 結合組

また、角質層は細胞核をもたない扁平な細胞の堆積のみで織では暴露される SDS 溶液の濃度上昇に伴い急激に細胞構成され、その上層はしばしば脱落していた（図 5 A）。

生存率が減少し、1 mg/ml 溶液で 50 ％未満になるのに対一方、コラーゲンゲル法で構築した 3 D 皮膚モデルは、し、真皮様組織上に表皮構造が形成された 3 D 皮膚モデル

真皮様組織内に三次元的に広がる毛細血管網が形成され、は SDS 溶液濃度の上昇に対してより緩やかな細胞生存率

LbL・細胞集積法による毛管網含有皮膚モデルよりさらの減少を示し、細胞生存率が 50 ％に低下する溶液濃度はに真皮様組織の厚み（約 150 µm）が増していた（図５C, D）。

4 ～ 7 mg/ml であった
（図 4 D）。

また、本モデルの表皮組織は LbL 法による皮膚モデルと同様に明確な細胞分化と角化を呈し、その厚さは 120 ～150 µm に達していた（図 5 C）。

図 5 血管網含有 3 D 皮膚モデルの構造．A. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織中層に管腔を形成する血管が見られる。H.E. 染色 B. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの真皮様組織内で２次元的に広がる血管網。Whole-mount 標本における
CD 31 に対する免疫染色 C. コラーゲンゲル・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織の浅層から深層にわたり管腔を形成する血管が見られる。H.E. 染色 D. コラーゲン
ゲル・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの真皮様組織内で三次元的に広がる血管網。
Whole-mount 標本におけるCD 31 に対する免疫染色− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

3 . 4 . リンパ管網含有三次元皮膚モデルの構造

膚モデルの結合組織内に血管網の付与を行った。我々のLbL 法によりリンパ管網を含有する全層性の 3 D 皮膚モ

LbL・細胞集積法は立体組織内に血管・リンパ管網を組織

デルを 10 日以内に形成することができた（図 6）。真皮様化することに優れ、これまで微小循環系を内蔵する様々な組織の中層部を中心に、リンパ管内皮マーカーの一つであ

3 D 組織を創製している 10 - 13）。先行研究の脈管網含有皮膚るLYVE-1 陽性の拡張した毛細リンパ管網が二次元的に発相同体がその作製に煩雑な操作と 28 日以上の長い期間を達していたが、真皮様組織の厚さは 80 ～ 100µmと血管・リ要する 9） のに対して、LbL・細胞集積法は 10 日以内に真ンパ管網をもたない皮膚モデルとほぼ同等であった（図 6A,

皮様組織内に 2 次元的に広がる毛細血管網を有する皮膚モ

B）。その表皮組織では紡錘状の細胞への分化傾向と角質層デルを作製し、さらに新たに開発したコラーゲンゲル・細（20µm）の形成が明瞭であったが、その厚さは約 70µmで血胞集積法は同期間内に真皮全層に広がる 3 次元的毛細血管

管網を有する皮膚モデルより薄い傾向を示した（図 6A）。

網を構築した。コラーゲンゲル法による 3 D 皮膚モデルは

4. 考

LbL 法に比べて線維芽細胞の密度を抑えて細胞外マトリク察スの増加と分散配置を図ることにより、より生体真皮に近我々の研究グループが独自に開発した細胞外マトリクス

い組織を構築することが可能であり、このことが血管網は、真の 3 次元化に働いていると推測される。結合組織内に血管皮様結合組織上でケラチノサイトが生体と同様の分化・成網が構築されたことにより皮膚モデルの真皮様組織が厚く熟と角質形成を呈する全層性の皮膚組織を構築した。本構なるとともに、表皮組織が明確な細胞分化による肥厚を示

造体は、特殊なデバイスや多種多様の添加剤を用いることしたことは、血管網の形成と配置が真皮組織だけでなく表なく、細胞自身が自己組織化することにより形成され、ヒ

皮組織の機能形態形成にも深く関与することを示唆していト生体皮膚に類似する組織学的特性を有していた。加えて、る。コラーゲンゲル法による 3 D 皮膚モデルではさらに真の LbL・コーティング技術を用いた細胞集積法

9 - 13）に比べて、簡便に 10 日以内で構築で皮、表皮ともにその厚みを増していたことから、血管網のきることも大きな特徴である。本法では線維芽細胞が分布

三次元化は栄養素やガスの各組織への供給を迅速に有効化

する真皮様組織上においてのみ表皮が形成されることから、することで皮膚組織の分化・成熟を促進すると思われる。

従来の皮膚相同体

2 - 8）

本構造体はケラチノサイトの表皮形成に真皮との接触・相

生体の皮膚には血管系だけでなく、細胞の代謝物、異物

互作用を必要とする生体皮膚 14）と同様の微小環境を提供などを含む組織液の排導や高分子物質と細胞の輸送に関わすることでヒト表皮と相同の細胞・組織構造と分子発現をるリンパ管が配備され、近年では皮膚の恒常性の維持や再現していると思われる。このことが、細胞毒性基準物質

免疫の機能調節に密接に関与することが知られている 16）。

より高いバリア機

これより、3 D 皮膚モデルの結合組織内にリンパ管網を構能を発揮することに寄与していると考えられる。しかし、築し、皮膚組織の形態形成について解析を行ったが、血管表皮の分化と角質形成は未だ十分とは言えず、真皮様組織

網の場合と異なり、脈管を有さない皮膚モデルとの間に明においても微小循環系をはじめとする組織構築が不足してらかな差は見られなかった。このことは脈管本来の機能的おり、生体皮膚に代わる評価系の確立にはこれを解決する

差異によるものかもしれないが、今回構築されたリンパ管必要があると思われる。

網は拡張した管腔による平面的な洞様構造を呈し、生体皮に対して本構造体がヒト表皮モデル

15）

上記の課題に応えるために、本研究ではさらに全層性皮膚のリンパ管網の機能形態と乖離していることがその結果

図 6 リンパ管網含有 3 D 皮膚モデルの構造。A. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織中層を中心に洞様に拡張したリンパ管が見られる。H.E. 染色 B. Aの隣接切片におけるLYVE- 1 に対する免疫染色像。LYVE- 1 陽性の内皮細胞が管腔を形成する。

− 92 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発に影響している可能性が否定できないことから、より解剖

3D skin models. Adv Healthcare Mater 7, 1701405, 2018

学的に正確なリンパ管網含有 3 D 皮膚モデルを構築すべく

6） Groeber F, Holeiter M, Hampel M, Hinderer S, SchenkeLayland K: Skin tissue engineering – in vivo and in vitro

現在その技術改善を行っている。

5. 総

applications. Adv Drug Deliv Rev 128 : 352-366, 2011

括7） Black AF, Berthod F, Heureux NL, Germain

本研究成果は独自に開発した立体組織構築技術がヒト生

L, Auger FA: In vitro reconstruction of a human

体皮膚に類似した in vitro 3 D 皮膚モデルを簡便に短期間

capillary-like network in a tissue-engineered skinで構築できることを示している。加えて、解剖学的に高い

equivalent. FASEB J 12: 1331-1340, 1998

相同性をもつ毛細血管網を本構造体の真皮内に装備するこ8） Bourland J, Fradette J, Auger FA: Tissue-engineeredとにより真皮組織だけでなく、表皮組織の分化・成熟と機

3D melanoma model with blood and lymphatic capillaries

能性を亢進させることが明らかになり、微小循環系を内蔵

for drug development. Sci Rep 8 : 13191, 2018する本皮膚相同体は in vitro における薬剤や化粧品・化成

9） Matsusaki M, Fujimoto K, Shirakata y, Hirakawa S,

品の開発に高い有用性をもつ実験動物代替ヒト皮膚モデル

Hashimoto K, Akashi M: Development of full-thickness

として、さらには再生医療材料としての応用が期待される。

human skin equivalents with blood and lymphlike capillary networks by cell coating technology. J

謝辞Biomed Mater Res A 103A, 3386 - 3396, 2015

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援を賜りました公

10）Narita H, Shima F, Yokoyama J, Miyagawa S,

益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝

Tsukamoto Y, Takamura Y, Hiura A, Fukumoto K,

申し上げます。

Chiba T, Watanabe S, Sawa Y, Akashi M, Shimoda H:

また、本研究は当教室の高橋一人氏と成田大一氏の尽力

Engraftment of vascularized human iPS cell-derived

によるものであり、研究の遂行にあたり明石満教授（大阪

3 D-cardiomyocyte tissue after xenotransplantation.

大学生命機能研究科）と松崎典弥教授（大阪大学工学研究

Sci Rep 7 : 13708 , 2017

科）に温かいご指導を頂きました。この場をお借りいたし

11）Asano Y, Odagiri T, Oikiri H, Matsusaki M, Akashi
M, Shimoda H: Construction of artificial human

まして厚く御礼申し上げます。

peritoneal tissue by cell-accumulation technique and（引用文献）

its application for visualizing morphological dynamics
of cancer peritoneal metastasis. Biochem Biophys Res

1） Alépée N, Grandidier MH, Cotovio J: sub-categorizationof skin corrosive chemicals by the EpiSkin

TM

Commun 494 : 213 - 219 , 2017reconstructed human epidermis corrosion test method

12）Oikiri H, Asano Y, Matsusaki M, Akashi M, Shimoda

according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline

H, Yokoyama Y: Inhibitory effect of carbonyl reductase

431. Toxicology in Vitro 28: 131-145, 2014

1 against peritoneal progression of ovarian cancer:
evaluation by ex vivo 3 D-human peritoneal model.

2） Black AT, Hayden PJ, Casillas RP, Heck DE, Gerecke ER,

Mol Biol Rep 46 : 4685 - 4697 , 2019

Sinko PJ, Laskin DL, Laskin JD: Expression of proliferative
ans inflammatory markers in a full-thickness human13）Shima F, Narita H, Hiura A, Shimoda H, Akashi M:skin equivalent following exposure to the model sulfur

Construction and histological analysis of a 3 D humanmustard vesicant, 2-chloroethyl ethyl sulfide. Toxicol

arterial wall model containing vasa vasorum using

Appl Pharmacol 249: 178-187, 2010a layer-by-layer technique. J Biomed Mater Res A.
105 : 814 - 823 , 20173） Thakoersing VS, vanSmeden J, Mulder AA, Vreeken
RJ, El Ghalbzouri A, Bouwstra JA: Increased presence of14）Liu N, Matsumura H, Kato T, Ichinose S, Takada

monounsaturated fatty acid in the stratum corneum of

A, Namiki T, Asakawa K, Morinaga H, Mohri y,human skin equivalents. J Invest Dermatol 133: 59 - 67, 2013

De Arcangelis A, Georges-Labouesse E, Nanba D,4） Falanga V, Isaacs C, Paquette D, Downing G, Kouttab

Nishimura EK: Stem cell competition orchestrates skinhomeostasis and aging. Nature 68 , 344 - 350

N, Butmarc J, Badiavas E, Hardin-Young J: Wounding of
bioengineered skin: cellular and molecular aspects after

15）化学物質の試験に関する OECD ガイドライン 439 invitro 皮膚刺激性：再構築ヒト表皮試験法

injury. J Invest Dermatol 119: 653-660, 2002
5） Pupovac A, Senturk B, Griffoni C, Maniura-Weber K,16）下田Rottmar M, McArthur AL: Toward immunocompetent− 93 −

浩：リンパ管の解剖学と老化．アンチエイジン

グ医学 14：191 - 196，2018

ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節
北海道公立大学法人札幌医科大学

白土明子

Some nanomaterials in cosmetic products act as UV-filters for skin. It is known, however, that some types ofnanomaterials can induce skin inflammation. The inflammation is thought to be due to the harmfulness of the nanomaterials
themselves. On the contrary, we considered another hypothesis on the action of nanomaterials in the skin damages. Thatis, nanomaterials would alter gene expression of indigenous bacteria in skin and they would induce inflammation indirectly.
We investigated influence of some nanomaterials on the action of membrane receptors of Escherichia coli, and found levelof two receptors activities were reduced by treatment of two nanomaterials ZnO and TiO 2 . Lack of the receptors in E.
coli altered bacterial virulence to model host Drosophila. These results suggested that some nanomaterials have roles forregulation of bacterial virulence through change the activity of the membrane receptors.

１．緒の実体や制御機構の知見の蓄積が多い。そのため，活性変言化する情報経路がわかると，細菌の性質変化をある程度予

近年，ナノマテリアルが利用されている化粧品が増えて測することも可能となる。また，細菌の情報経路は細菌種

おり，中でも，日焼け止めやファウンデーションなどの，を超えて共通する種類も多く，各種のモデル細菌系で得ら皮膚に直接に触れる面積の広い種類へ配合される例もある。

れた成果は，他の細菌にも当てはまる可能性が高い。これ

そのため，ナノマテリアルの毒性評価は化粧品の安全性にらのことから，ナノマテリアルが細菌の情報経路に与える重要な要素とされてきている。

作用を評価した。

近年，毒性が低いとされる細菌が，皮膚や傷に付着した

２．方

際に皮膚炎や傷害，強い毒性を与える場合のあることが報告されるようになった。細菌には環境を感知する仕組みが

２．
１．材

法

料

あり，環境中の化学物質や宿主内の物質の認識により，遺グラム陰性細菌のうち，遺伝子発現制御機構がもっとも伝子発現を変化させて環境変化に適応して生存生育する。

よく知られている大腸菌の実験株の BW 25113 株を材料と皮膚表面には常在細菌を含め多くの細菌が存在しており，

し，また，これを親株とする遺伝子欠損菌株を，国立遺伝ナノマテリアルが細菌の生理状態を変化させることで，皮学研究所ナショナルリソースセンターより入手して用いた。

膚への炎症や傷害の状態に影響を与えている可能性が提唱

大腸菌の環境感知を行う情報経路は二成分制御系と呼ばれ，されているが

1 - 3），直接の作用はまだ十分に調べられては

細胞膜受容体と転写調節因子の 2 種類のタンパク質の組み合わせで構成され，約 50 の因子を持つ（Fig. 1 前が受容体、こなかった。
本研究では，ナノマテリアルによる細菌の遺伝子発現変後が転写調節因子の名前を示す）。それぞれの経路により動と生理的性質の変化，および宿主組織への影響を解析す

正に制御される遺伝子を選び，これらの転写プロモーター

ることとした。細菌の細胞膜には環境物質を認識する膜受配列の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェ

容体があり，これが活性化すると特定の転写調節因子の活ラーゼを発現するプラスミドpBR322 を準備し，それぞれを性状態を変化させ，支配下遺伝子群の発現を正または負に保持させた大腸菌株を用意した（Fig. 2）4）。ナノマテリアルと調節する。また，
特定の情報経路はストレス応答，
輸送体群，

して，サンスクリーン剤に利用される MZ- 500（ZnO）およ

呼吸関連，代謝などの，ひとまとまりの働きを発揮する遺伝子群を一括して制御する 4）。特に，遺伝子発現制御系の解析が進んでいる遺伝学モデル細菌では，制御下遺伝子群

Role for nanomaterials of bacterial gene
expression and infectious state of hostorganisms

Akiko Shiratsuchi
Fig. 1

Sapporo Medical University− 94 −

ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節

在で活性化程度の高い二成分制御系を調べた。そのために，それぞれの受容体経路で活性化することの知られる遺伝子の転写プロモーター制御下に蛍光タンパク質を発現するプラスミドを構築し，これを大腸菌に保持させたライ
ブラリーを準備した。それぞれのプラスミド保持菌株をモ
デル宿主ショウジョウバエの体腹に注入し，蛍光強度を画像解析した。その結果，ストレス応答性遺伝子を制御する EnvZ-OmpR と CpxA-CpxR, 代謝に関連する PhoBYuhU/YpdA, 呼吸に関連する EnvS-EvgA と PhoQ-PhoPを含む数種類の経路がが高い活性を示した。このうち，細Fig. 2菌の毒性や免疫耐性を念頭におき，ストレス応答に関連すび TiO 2 を用いた。 宿 主との接 触を模 倣するために，宿 主る２種類の経路に着目した。EnvZ-OmpR, CpxA-CpxR

血液および血清を用いた。また，個体レベルの実験では，ヒのそれぞれで正に制御される遺伝子を選びその転写プロモトと同じ自然 免 疫 機 構を持つキイロショウジョウバエの野 生

ーター活性を調べると，宿主の血液成分により活性化する

5 , 6）

ことがわかった（未発表データ）。つづいて，受容体が体液型として Oregon R 系統（Kyorin Flyより供与）を用いた。

により活性化していることを，リン酸化を指標として調べ

２．
２．遺伝子転写プロモーター活性の測定た。そのために，当該受容体を FLAG との融合タンパク

大腸菌株は LB 液体培地で培養し，ここに様々な濃度の質として発現させる大腸菌株を準備し，ここに体液を作用

ナノマテリアルを加えた試料も作成する。培養時間経過にさせたのち，抽出液を調製して Phos-tag-SDS-PAGE によ

伴う 600 nm の吸光度を測定して，細菌増殖に影響のない

り分離し，抗 FLAG 抗体を用いたウエスタンブロットを濃度を設定した。定常期まで培養した大腸菌は，バッファ行った。Phos-tag はリン酸基を捕獲して SDS-PAGE によーで一度すすいでから，測定用の新たなバッファーに懸濁る易動度を小さくする。大腸菌抽出液からは二本のバンドした一定濃度になるよう希釈してからマルチウエブプレーが得られ，易動度の大きいシグナルを非リン酸化体，小さトに分注し，ここに試料群を加えて共培養した。つづいて，いシグナルをリン酸化体として評価した。体液が存在する

GFP の蛍光強度，もしくは，ルシフェラーゼの酵素活性を，と，易動度の小さいシグナルの割合が大きくなったことか

プレートリーダーを用いて測定した。それぞれをレポータ

ら，EnvZ のリン酸化体の割合が増え，活性化程度が亢進4）ーとして，測定値を転写プロモーター活性の指標とした 。

したと判断した（Fig. 3）。この結果は，体液から血球成分

一方，細菌のそれぞれの受容体経路の下流には，当該経路を除いた液性成分だけでも，さらにこれを 100 ˚C で 5 分間

でのみ，かつ正の制御を受ける遺伝子群が存在する。その処理した成分でもこの性質が保持された（Fig. 4）。これらような遺伝子と内部コントロールとして DNA ポリメラー
ゼアルファサブユニットの mRNA レベルを解析して，受容体活性化の mRNA レベルでの指標とした 6）。

２．
３．モデル宿主を用いた in vivo 感染系での毒性解析
キイロショウジョウバエ成虫オスを炭酸ガスで麻酔し，ハエの腹に窒素ガス制御性マイクロインジェクターに接続したキャピラリーを用いて，バッファーに懸濁した一定数の大腸菌，もしくはバッファーのみを注入した。覚醒後のハエは，餌を入れたバイアルに移し，29 ℃で飼育した。
飼育時間に伴う生存率を調べて毒性の指標とした 7 , 8）。また，ハエを PBS 中でホモジナイズして粗抽出液を調製し，LB 寒天培地に塗布して得られたコロニーを計測して，コロニー形成菌数を生菌の指標とした 6）。

３．結

果

３．
１．宿主遭遇時の大腸菌膜受容体経路活性の変化
ナノマテリアルの作用を知る前提として，宿主体液の存− 95 −

Fig. 3

コスメトロジー研究報告 Vol.28, 2020

Fig. 4のことから，体液中の加熱に耐性の液性成分の中に，二成分制御系の膜受容体 EnvZ を活性化する因子が存在するとFig. 5考えられた。CpxA-CpxR に関しても同様の解析が進行し親菌株 BW 25113 株と比較して，多くのハエを殺すとわかている。

った（Fig. 5）。一方，cpxA-cpxR 遺伝子欠損菌株は親菌株

３．２．大腸菌の生存増殖に影響しないナノマテリアル
処置条件の設定

BW 25113 株と比較して，ハエの生存率が低い傾向があり，

LB 液体培地に様々な濃度のナノマテリアル ZnO またはかった（未発表）。これらのことより，EnvZ-OmpR は宿主

TiO 2 を添加し，大腸菌 BW 25113 株を 37 ℃で空気中でしへの毒性に抑制的に働き，CpxA-CpxR は宿主の免疫へ抵

んとう培養し，時間経過に伴う 600 nm における吸光度を抗に働くと考えられた。今回解析に用いたナノマテリアル

定常期に達するまで測定した。その結果，試料の吸光度はにより活性変動する受容体経路の中に，宿主への毒性を調培養時間の経過に伴って増加し，
5％（w/v）
以内の濃度では，節するものが見出された。

また，マクロファージにより早く貪食殺菌されることがわ

両者ともにコントロールとした PBS との違いはなかった。

４．考察および総括

また，大腸菌に ZnO または TiO 2 を添加して暴露させ，LB
寒天培地でのコロニー形成菌数を調べると薬剤なしとの顕大腸菌は体液成分を感知して情報経路の活性を変化させ著な違いはなかった。これより，ZnO および TiO 2 は，5て遺伝子発現パターンを変えることが示され，宿主への毒％（w/v）で大腸菌の生存増殖を阻害しないと判断し，今後性や免疫感受性を変化させる。そして，ZnO および TiO 2 は，の実験ではこの濃度を用いて解析を行った。

これらの経路の働きを変化させる作用を有することが判明した。皮膚表面には多くの常在細菌を含む細菌が付着して３．３．ナノマテリアルによる大腸菌情報経路活性への作用

おり，サンスクリーン剤に含まれるナノマテリアルは，細ここまでに得られた知見を元に，大腸菌液に ZnO およる作用を持ち，これが細菌の性質を変化させる可能性があび TiO 2 を添加して EnvZ-OmpR 経路への働きを調べた。

る。今後は，例えば，宿主への傷害に関連する細菌遺伝子

宿主導入時の当該経路下流遺伝子の転写プロモーターの活の働きを抑える作用など，これまでに見出されたこなかっ

性は，ナノマテリアルの存在により抑制傾向を示し，コた，ナノマテリアルの働きが見出される可能性がある。

菌の情報経路の活性変化を通じて，遺伝子発現を変化させントロール群と比較して TiO 2 添加群では 91 ％，ZnO では
72 ％であり（n= 3，有意差あり）その働きは ZnO の方が大（引用文献）きかった。このことから，ナノマテリアルは EnvZ-OmpR1） Kinoshita, R., et al. Yakugaku Zassi, 132, 319-324（2012）

経路を抑制し，この経路による細菌遺伝子発現の変化を通2） Lee, N-Y., et al. Front. Pharmacol., 10, 1153（2019）

じ宿主への作用を変化させる可能性がある。

3） Yallet-Regi, M., et al. Int. J. Mol. Sci., 20, 3806（2019）4） Pukklay, P., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.

３．
４．大腸菌膜受容体経路の宿主毒性への作用

438, 306-311（2013）

次に，宿主体液で活性化する EnvZ-OmpR および CpxA-5） Nainu, F., et al. Journal of Center of Medical

CpxR の宿主感染時の働きを調べるために，キイロショウ

Education, Sappro Medical University 10, 21-32（2019）

ジョウバエ Oregon R 系統の成虫オスの腹に envZ-ompR6） Hashimoto, Y., et al. J. Immunol., 183, 7451-7450（2009）

遺伝子，cpxA-cpxR 遺伝子のそれぞれを欠損した大腸菌

7） Shiratsuchi, A., et al. J. Immunol., 192, 666-675（2014）

株を注入した。その結果，envZ-ompR 遺伝子欠損菌株は

8） Shiratsuchi, A., et al. J. Immunol., 197, 1298-1307（2016）− 96 −

動物実験の 3Rs に寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開発
静岡県立大学薬学部薬剤学分野

世戸孝樹

Drug-induced phototoxicity is caused by exposure to sunlight after topical and/or systemic administration ofphotosensitive chemicals. Both photoreactivity of chemicals and its distribution to sunlight-exposed tissues are key
determinants of drug-induced phototoxicity. Recently, 3 Rs principle (replacement, reduction, refinement) tends to becompliance in pharmaceutical and cosmetic industries. In this study, a new photosafety screening strategy based on
the combined use of a reactive oxygen species (ROS) assay and an in vitro skin permeation test was developed as analternative to animal experiments. The phototoxic risk of 6 phototoxic compounds, acridine (ACD), furosemide (FSM),
hexachlorophene (HCP), 8 -methoxypsoralen (MOP), norfloxacin (NFX), and promethazine (PMZ), were evaluated basedon photochemical and in vitro skin deposition properties. An in vivo phototoxicity test in rats was undertaken to verify
the prediction capacity of the proposed system. All tested compounds exhibited strong absorption in UVA/B regions, andgeneration of significant ROS from all tested chemicals were observed under simulated sunlight exposure. The steady-state
concentration (Css) values of tested compounds in removed rat skin were estimated on the basis of the skin permeability.
The Css values of ACD, FSM, HCP, MOP, NFX, and PMZ were calculated to be 69 , 2 . 8 , 57 , 50 , 3 . 2 , and 59 , respectively.
On the basis of the ROS data and Css values of tested compounds, the phototoxic risk of tested compounds was predicted.
The predicted phototoxic risk by proposed screening system (ACD ˃ HCP ˃ MOP ˃ PMZ ˃ FSM≒NFX) was mostly inagreement with the observed in vivo phototoxicity (ACD ˃ HCP ˃ MOP ˃ FSM≒PMZ ˃ NFX). From these findings, thephototoxic risk of tested compounds could be predicted by combined use of ROS assay and in vitro skin permeation test, andthe new photosafety screening system would contribute to product development and animal welfare.

１．緒内に存在するタンパク，脂質および DNA と反応し，細胞・言

組織障害を引き起こす．反応する生体内分子に基づき光毒

薬剤性光線過敏症は特定の化合物を全身または局所投与

性は光刺激性，光遺伝毒性および光アレルギーに大別され後，太陽光曝露により惹起される皮膚および眼におけるる．生体内には O 2 も豊富に存在しており，O 2 自身が光エ1）異常反応である ．本症は患者が視覚的に認知でき，本症

ネルギーの acceptor として光化学的反応に関与することに対する様々な処置が必要となるため，患者の quality ofもある．光励起化合物と O 2 が反応することで産生する活life の低下を招きうる．光毒性は医薬品のみならず，様々性酸素種（reactive oxygen species; ROS）は反応性が非常な化学物質が原因となることが報告されており 2），創製・に高く，化合物の光毒性反応に関与すると考えられている．

開発される製品について適切な光毒性リスク予測およびそ化合物の光安全性評価法はこれまで数多く開発されての回避が求められている．光毒性反応は UVA/B（UVB,おり，光毒性の発現機序に基づく評価系が存在する 5）．特290 ‒ 320 nm; UVA, 320 ‒ 400 nm） お よ び 可 視 光（visibleに，UV/VIS 吸 収 特 性 評 価 6），in vitro 3 T 3 neutral red

light: VIS, 400 ‒ 700 nm）領域の光エネルギーを化合物が吸

uptake phototoxicity test（3 T 3 NRU PT）7），ROS assay 8）

収することが引き金となる．光励起された化合物はエネル

は化学物質の光安全性評価にて広く用いられる評価系であ

ギー的に不安定な状態であり，吸収した光エネルギーのる．2014 年 に は International Council for Harmonisation

放出を蛍光，燐光，熱および光化学的反応を介して行う 3）．

of Technical Requirement for Pharmaceutical Human

皮膚もしくは眼に存在する化合物が太陽光曝露にて励起す

Use（ICH）より医薬品の光安全性評価に関するガイドラ

ることで生体内分子と光化学的反応を引き起こす可能性がイン（ICH S 10）が施行され，医薬品候補化合物の光安全性ある．この光化学的反応は反応様式によりエネルギー転移

評価の流れを示し，上記の評価方法などが推奨されている．

を介する type I 光化学反応およびフリーラジカル産生をま た， 当 研 究 室 で 開 発 し た ROS assay は，2019 年 に in4）

介する type II 光化学反応がある ．光励起化合物は生体
Strategic development of a photosafety
ev a lu at i o n s y st e m for c h e m i c a l scontributing to 3 Rs principle in animal
experiments
Yoshiki Seto
Laboratory of biopharmacy, School of
Pharmaceutical Sciences, University of
Shizuokachemico 光反応性評価法として Organisation for Economic
Co-operation and Development（OECD）におけるテスト
ガイドライン化（TG 495）に成功した．
光毒性化合物は生体内にて太陽光へ曝露されなければ光毒性反応を引き起こす可能性は低く 9），露光部位である皮膚や眼などへの曝露も光毒性発現に強く関わる．以前の研究にて，化合物の光化学的および薬物動態学的特性の統合的解析により化合物の光毒性リスクを効果的に予測できる− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ことを報告した 10）．さらに，薬物動態試験におけるコスト，

8 -methoxypsoralen（MOP），norfloxacin（NFX）および

動 物 実 験 の 3 Rs（reduction, replacement, refinement）

promethazine（PMZ）を用いた（Fig. 1）．6 種の被験物質

および評価スループットの観点からの改善を指向し，1はそれぞれ異なる母骨格を持ち，分子量および Clog P 値

匹の実験動物に複数化合物を同時に投与することで生体は幅広い物性値を示す．被験物質の光化学的特性は UV-

サンプル中の複数化合物濃度の測定を可能にする in vivo

VIS 吸収測定および ROS assay により評価した．ラット摘

cassette-dosing 薬物動態試験を導入することで新たな統

出皮膚を用いた in vitro 皮膚透過性試験を実施し，各被験合的光安全性評価法を提案し，複数化合物の光毒性リスク

物質の Css を算出した．各被験物質の ROS data ならびにを高効率的かつ高精度に予測できることを報告し，光反応

Css を用いた統合的解析により被験物質の光毒性リスクを性および皮膚曝露の両特性に着目した光安全性評価は医薬予測し，in vivo 光毒性試験の結果と比較し，本評価系の品候補化合物の光毒性リスク予測ツールとして高い有用性

予測能を検証した．

を示した

11 - 14）．一方で，cassette-dosing 法においても皮２．方

膚内濃度推移を得るには一定数の実験動物の使用は必要であり，動物福祉とスループットの観点から更なる改良が必２．
１．実験材料要であった．経皮適用化合物の開発では候補化合物の皮
膚透過性評価として Franz 型拡散セルを用いた in vitro 皮
15）法

ACD は Alfa Aesar（Haverhill, MA, USA）より購入した．
FSM，NFX および PMZ は富士フィルム和光純薬より購入

膚透過性試験（OECD TG 428） などが用いられる．さらした．HCP および MOP は東京化成工業より購入した．そに皮膚透過性評価を応用し，化合物の皮膚透過速度が定常の他の試薬は市販品を購入して用いた．

状態に達した際の皮膚中濃度（steady-state concentration;Css）を算出する方法が報告されている 16）．しかしながら，

２．２．実験動物

経皮適用化合物の光毒性リスク予測にて皮膚曝露の指標としての Css の適用可能性は不明である．

Sprague-Dawley 系 雄 性 ラ ッ ト（9 ‒ 14 週 齢， 体 重 約300 ‒ 450 g）は日本 SLC より購入した．ラットは室温 24±1

そ こ で 本 研 究 で は ROS assay と in vitro 皮 膚 透 過 性℃，湿度 55±5 % ならびに明暗サイクル 12 h で維持された試験を組み合わせた統合的光安全性評価法を新規に提動物飼育施設にて自由摂餌と飲水が可能な環境で飼育され

案 し， 本 評 価 法 の 経 皮 適 用 化 合 物 の 光 安 全 性 評 価 へた．全ての動物実験は静岡県立大学実験動物倫理委員会のの 適 用 性 に つ い て 精 査 し た． 被 験 物 質 と し て acridine

ガイドラインに準じて実施した．

（ACD），furosemide（FSM），hexachlorophene（HCP），

Fig. 1

Chemical structures and physicochemical properties of test compounds.

− 98 −

動物実験の 3Rs に寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開発

２．
３．UV-VIS 吸収スペクトル測定

２．６．皮膚滞留性予測

各被験物質濃度（20µM）
を 20mM sodium phosphate buffer

皮膚透過パラメーターを用いて化合物の皮膚透過速度が（NaPB, pH 7 . 4）に溶解し，石英セル（光路長：10 mm）に移定常状態の際の皮膚中濃度を算出できる 16 , 18）．まず，被した．各被験物質の UV-VIS 吸収スペクトルを HITACHI

験物質のレセプター溶液中蓄積量（accumulated amount;U- 2010 spectrophotometer（株式会社日立ハイテクノロ

Q）は以下のように示すことができる．

ジーズ）
により記録した．

２．
４．ROS assay

K，
L，
CvおよびDはそれぞれpartition coefficient，
thickness，

２．
４．
１．擬似太陽光照射装置

chemical concentration in applied solution および diffusion

擬似太陽光照射装置として Atlas Suntest CPS+（Atlas
Material Technology LCC）を用いた．装置は 1 , 500 W の

coefficient を示す．分配（K・L）および拡散（D/L 2）は最小二乗法を用いて算出した．

Xenon arc lamp および短波長の UV をカットするフィルターを備えたものを使用した．照射強度は UVA detector

透過係数（permeation coefficient; P）は以下の式にしたがって算出した．

である Dr. Hönle # 0037（Dr. Hönle）を用い，UVA 強度として約 2 . 0 mW/cm 2 であることを確認し，Atlas Suntest
各摘出皮膚に対する P の関係を以下に示す．Ptot，Psc お

CPS+ 内の温度は 28 ℃に保った．
２．
４．２．評価方法

よび Pved はそれぞれ permeability coefficient through whole

光 照 射 に よって 被 験 物 質 か ら singlet oxyge お よび
17）skin，permeability coefficient through stratum corneum おsuperoxid 産生を測定した ．Singlet oxygenについて，被よび permeability coefficient through viable epidermis を意験 物質（200 µM），p-nitrosodimethylaniline（50 µM）および味する．

imidazole（50 µM）を含む 20 mM NaPB（pH 7. 4）200 µLを
96 -well microplateに分注し，440 nmの吸光値をSAFIRE
microplate spectrophotometer（TECAN）を用いて測定し上記式を用いて算出した被験物質の皮膚透過性のパラメ

た．その後，プレートを reaction container にセットし，擬ーターを用いて，透過速度が定常状態となった際の皮膚中

似太陽光を 1 h 照射した．照射後，440 nmの吸光値を測定

濃度 Css を以下の式を用いて算出した．

し，440 nm の吸光値の減 少を singlet oxygen 産生の指標とした．Superoxide について，被験物質（200 µM）およびnitroblue tetrazolium（50µM）
を含む 20mM NaPB
（pH7.4）200 µL を 96 -well microplate に 分 注 し，560 nm の 吸 光

Ltot，Lsc と Lved はそれぞれ mean thickness of whole skin，mean thickness of stratum corneum と mean thickness of

値 を SAFIRE を 用 い て 測 定 し た． そ の 後， プ レ ー ト を

viable epidermis を表す．Ksc およびKved はそれぞれpartition

reaction container にセットし，擬似太陽光を 1 h 照射した．

coefficients to stratum corneum および partition coefficients

照射後，560 nm の吸光値を測定し，560 nm の吸光値の増

to viable epidermis を示す．

加を superoxide 産生の指標とした．

２．
７．In vivo 光毒性評価

２．
５．In vitro 皮膚透過性評価

試 験 開 始 24 h 前 に ラ ッ ト 腹 部 を 剃 毛 し， 被 験 物 質

Isoflurane 麻酔下でラット腹部皮膚を採 取し，未処置の（100 mg/mL） を 含 む dimethyl sulfoxide（DMSO）溶 液

摘出皮膚ならびにテープストリッピングを 20 回行うことでを 調 製 し， 各 被 験 物 質 の DMSO 溶 液 100 µL を 塗 布 し角質を除去した皮膚を実験に用いた．レセプター液としてた．DMSO 溶液塗布 3 h 後に除去し，麻酔下でラット腹polyethylene glycol 400（PEG 400）を 40 % 含むリン酸緩衝部にブラックライトを用いて UV を照射した．UV 照射強液（phosphate-buffered saline；PBS，pH 7. 4）を 用 い， 試

度 の 測 定 は UVA detector で あ る Dr. Hönle # 0037（Dr.

験 中は 32 ℃に保った．全被 験 物質
（ 各 1 mg/mL）を 含 む

Hönle）を用いて行い，約 2 . 7 mW/cm 2 の照射強度で照射

propylene glycol 溶液を摘出皮膚の上部に添加し，透過性量が 30 J/cm 2 となるまで UV 照射した．照射前および照試験を開始した．試験開始から 0，0 . 5，8，10，12，18 お

射終了 24 h 後の皮膚表面の色調を測定し，UV 照射前後

よび 24 h 後にレセプター溶液 100 µLを採取した．得られたの ΔE 値を光毒性評価の指標とした．色差は Commission

サンプル中の各被 験物質濃度を ultra-performance liquidInternational delʼs Eclariage（CIE）により推奨されていchromatography equipped with electrospray ionization

る L*a*b* system により記録する色差計（NF 333，日本電

mass spectrometry（UPLC/ESI-MS）
を用いて測定した．

色工業）を用いて測定した．色差計は白色およびゼロ補正− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020をした後にラット腹部皮膚表面の色差を測定した．測定し11,200（HCP），24,900（MOP），24,900（NFX）と 6,600（PMZ）

た輝度（L*）
，色相
（a*）
および彩度
（b*）
の値を基に色差（ΔE）

M- 1 · cm- 1 であった．290 ‒ 700 nm の波長において MEC がを以下のように算出した．

1 , 000 M- 1 · cm- 1 上回らない化合物は直接的な光毒性を引き起こす懸念はないと定義されており 19），6 種の被験物
質は高い光励起性を持つと判断した．ROS assay におい

２．８．データ解析て，HCP を除く全被験物質が擬似太陽光照射により強いIn vivo 光 毒 性 試 験 に お い て， 各 被 験 物 質 の UV 照 射

singlet oxygen および superoxide の産生を認め，HCP は

お よ び 非 照 射 群 間 の 統 計 処 理 は student’s t 検 定 を 実 施

singlet oxygen のみ産生する結果を得，その程度は全被験し，危険率 5 % 以下（P ＜ 0 . 05）を持って有意とした．脂溶

物質中最も高い値を示した（Fig. 2 B）
．いずれの被験物質性の指標である Clog P は ChemBioDraw 16 . 0 software

も以前の検討にて設定した criteria（ΔA 440 nm × 103 : 25 for（PerkinElmer, Waltham, MA, USA）に各被験物質の構造

singlet oxygen and/or ΔA 560 nm ×10 3 : 20 for superoxide）
20 , 21）

式を入力することで算出した．

３．結を超えており，強い光反応性を有していた．特に，ACD は singlet oxygen および superoxide のどちらの産生果も非常に高く，被験物質中で最も高い光反応性を有してい

３．
１．光化学的特性評価

た．

全被験物質は UV 領域に強い吸収を持ち（Fig. 2 A）
，極
大吸収波長での MEC 値は 19 , 500（ACD），14 , 900（FSM），

３．２．In vitro 皮膚透過性評価および Css の算出
経時的にレセプター溶液中の各被験物質濃度を測定した
結果，MOP は両方の摘出皮膚で最も高い累積量を示した（Fig. 3）
．一方で，NFX の透過量は両摘出皮膚において全Fig. 2 Photochemical properties of test compounds. （A）
UV absorption spectra of test compounds（20μM）in 20
mM sodium phosphate buffer（pH7.4）. Thick solid line,
ACD; thick dashed line, FSM; thick dotted line, HCP; thinsolid line, MOP; thin dashed line, NFX; and thick dotted
line, PMZ. （B）Generation of ROS including singlet oxygen（filled bars）and superoxide（open bars）from test
compounds（200μM）exposed to simulated sunlight（250W/m 2）for 1 h. QN, quinine（positive control）; and SB,
sulisobenzone（negative control）. Data represent themean±S.D. of 3 experiments. N.D., not detected.

Fig. 3 I n vit r o skin permeability of test compounds.
Accumulated amount of test compounds that permeatedthrough（A）whole skin and（B）stripped skin. 〇, ACD; △,FSM; □, HCP; ▽, MOP; ◇, NFX; and ×, PMZ. Data
represent mean±S.E. for 4–6 experiments.

− 100 −

動物実験の 3Rs に寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開発

被験物質中最も低値であった．被験物質の累積量プロファ

HCP 投与群の色調変化が他の 4 種の被験物質と比較して-4-5大きかった．各被験物質における UVA 照射時および非照-4-6

イルに基づき，Ptot は 1 . 6 × 10 （ACD），2 . 3 × 10 （FSM），-5

9 . 3 × 10 （HCP），1 . 0 × 10 （MOP），4 . 6 × 10 （NFX）-4

および 1 . 0 × 10 （PMZ）cm/s であり，Pved は 3 . 1 × 10
-4

-4射時の ΔE 値の差を基に，in vivo 光毒性の強さは ACD ≒HCP ＞ PMZ ＞ MOP ＞ FSM ＞ NFX であると判断した．

-4

（ACD）
，7 . 8 × 10 （FSM），4 . 3 × 10 （HCP），2 . 3 ×

４．考

10 - 4（MOP），1 . 4 × 10 - 5（NFX）
および 4 . 5 × 10 - 4（PMZ）
cm/s であった（Table 1）．

察

本研究では in vivo 皮膚内動態評価を in vitro 皮膚透過性

得られた皮膚透過性パラメーターを基に被験物質のラ試験に代替した光安全性評価系を提案し，光反応性およびット摘出皮膚における Css を算出したところ，ACD，FSM，

in vitro 皮膚曝露データを用いて 6 種の被験物質の光毒性

HCP，MOP，NFX お よ び PMZ の Css は そ れ ぞ れ 69 . 1，

リスクを予測することで，本光安全性評価系の適用可能性

2 . 8，57 . 3，50 . 7，3 . 2 および 59 . 1 µg/mL であった（Fig. 4）．

を精査した．

したがって，ラット皮膚における in vitro 皮膚曝露は ACD

全被験物質は UV 領域において強い光吸収を示し，MEC
値は ICH S 10 で定める基準値を大きく超えており，光励＞ PMZ ＞ HCP ＞ MOP ＞ NFX ＞ FSM であった．

起により化合物は光化学的反応を引き起こすことを示唆

３．
３．In vivo 光毒性評価

した．光化学的反応によ ROS 産生は化合物の光毒性発現

各被験物質の in vivo 光毒性を評価すべく，ラットを用に関与することが報告されている 2）．ROS assay より，全いた in vivo 光毒性試験を行った．本試験では，UVA 照射

被験物質が高い光反応性を示し，光毒性リスクを有するこ

前後のラット腹部の皮膚表面における色調変化を評価すとを示唆した．6 種の被験物質のうち，ACD および HCPることで in vivo 光毒性を評価した（Fig. 5）．全被験物質はの光反応性が高く，FSM および NFX の光反応性は中程度

UVA 照射により有意に皮膚表面の色調が変化した．特にであった．MOP および PMZ は強い ROS 産生を示したが，UVA 照射群では，全ての被験物質で Δa 値が正の変化を示

他の被験物質と比し低値であった．光安全性評価のためのしたことから塗布部の赤みが増したことを示しており，単criteria に基づく ROS assay の陽性検出率は 100 % である

回投与により UVA 照射にて紅斑反応を誘発することを認ことが報告されている 20 , 21）．本検討で用いた被験物質はめた．すなわち，全被験物質は経皮投与により生体内ですべて光毒性を惹起することが報告されており，得られた

光毒性を引き起こすことを示唆した．特に，ACD および

結果は以前の報告を裏付ける結果であった．

Table 1 Parameters for skin permeation of test compounds

Fig. 4 Css values of test compounds in the intact rat skin.
Data represent the mean±S.E. of 4–6 experiments.

Fig. 5 Colorimetrical changes in the rat skin caused byirradiated and non-irradiated test compounds. Filled bars,
irradiated group; open bars, non-irradiated group. Data
represent the mean±S.E. of 4 experiments. *, p＜0.05; **,p＜0.01; and p＜0.001 vs. corresponding non-irradiatedgroup.

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

In vitro 皮膚透過性試験では全被験物質が摘出皮膚を透反応に起因すると考える皮膚の色調変化を観察した．提案

過した．一般的に全身曝露を指向した経皮投与には分子量した評価系の予測精度を検証すべく，予測した光毒性リス

22）

クおよび in vivo 光毒性の結果を比較したところ，比較的経皮投与された化合物は主に角質層および表皮・真皮層良好に対応することが明らかとなった（Table 3）．本知見の細胞間隙および細胞内ルートを Fick の拡散則に従い透より，提案した評価系の経皮適用化合物の光安全性予測に過することで全身循環へ移行する 23）．Clog P 値が正であ対する有用性を示唆した．本検討では良好な結果が得られる 5 種の被験物質は主にラット摘出皮膚の細胞間隙およびたが，皮膚曝露評価では UV 曝露部位における化合物の最細胞内ルートを透過しレセプター溶液中へ移行したと考え

大濃度および滞留時間の両方が光毒性発現のリスクとなり500 以下および適度な脂溶性を持つ化合物が適切である．

る．一方，NFX の Clog P 値は - 0 . 78 であり，脂溶性が低い．

得る．今回算出した Css は化合物の皮膚透過速度が定常状

水溶性化合物や高分子化合物の皮膚透過には主に毛嚢およ態となった際の皮膚中濃度に相当するため過小評価となる

び汗腺を介したルートの寄与が報告されており 24），脂溶懸念がある．経皮投与化合物の皮膚中濃度および滞留時間性の低い NFX はこれら付属器官を介して皮膚を透過したはその脂溶性に依存することが報告されている 25）．したと考える．

がって，今回構築した評価系についてはさらなる適用可能化合物が持つ光反応性および皮膚曝露は光毒性のリス性の検証が必要であろう．ROS assay および in vivo 体内

クファクターである．したがって，ROS assay および in

動態評価を用いた光安全性評価系と比較し，動物実験を用

vitro 皮膚透過性試験より得られた結果を統合的に解析すいない本評価系は光安全性評価に必要な実験動物数の削減ることで被験物質の光毒性リスクを予測した（Table 2）．

および評価スループットの向上に寄与すると考える．光反

強力な光反応性を有する ACD および HCP は高い in vitro

応性および in vitro 皮膚曝露に基づく光安全性予測法は候

皮膚曝露を示したことから光毒性リスクは高いと判断した．

補化合物選択において開発初期のスクリーニング法として

特に ACD の光毒性リスクが最も高いと予測した．MOP お

有用であろう．

よび PMZ は比較的低い光反応性を示したが，in vitro 皮膚
曝露については ACD および HCP と同程度の Css を示した．

本研究助成により得られた成果

したがって，MOP および PMZ の光毒性リスクは今回用い

1） Y. Iyama, H. Sato, Y. Seto, S. Onoue: A new photosafety

た被験物質中では中程度であると判断した．FSM および

screening strategy based on in chemico photoreactivity

NFX の ROS 産生は被験物質中では中程度であったが，他

and in vitro skin exposure for dermally-appliedの 4 種の被験物質と比較し，in vitro 皮膚曝露は非常に低chemicals, Toxicology Letters, 317: 45 ‒ 52, 2019

い値を示したことから，FSM および NFX の光毒性リスク

2） Y. Iyama, H. Sato, Y. Seto, S. Onoue: Photochemical andは今回用いた被験物質中では比較的弱いと考えた．すなわ

pharmacokinetic characterization of orally administered

ち光毒性予測は Table 3 に示すとおりである．ラットを用

chemicals to evaluate phototoxic risk, Journal of

いた in vivo 光毒性試験にて，すべての被験物質で光毒性

Pharmaceutical Sciences, 108（3）:1303‒8, 2019

Table 2 Decision matrix

Table 3 Prediction capacity of the proposed photosafety screening system− 102 −

動物実験の 3Rs に寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開発

3） Y. Seto, H. Ohtake, H. Sato, S. Onoue: Phototoxic
risk assessment of dermally-applied chemicals withphototoxicity characterization of fluoroquinolones, AAPSJ., 13（3）: 482 ‒ 492（2011）

structural variety based on photoreactivity and skin12）S. Onoue, M. Kato, R. Inoue, Y. Seto, S. Yamada.

deposition, Regulatory Toxicology and Pharmacology,

Photosafety screening of phenothiazine derivatives

113 : 104619, 2020

with combined use of photochemical and cassettedosing pharmacokinetic data, Toxicol. Sci., 1 3 7（2）:謝辞469 ‒ 477（2014）

本研究を遂行するにあたり，公益財団法人コーセーコス

13）Y. Seto, H. Ohtake, M. Kato, S. Onoue. Phototoxic

メトロジー研究財団（旧 公益財団法人コスメトロジー研究

Risk Assessments on Benzophenone Derivatives:

振興財団）よりご援助いただきましたことに深く感謝申し

Photobiochemical Assessments and Dermal Cassette-

上げます．

Dosing Pharmacokinetic Study, J. Pharmacol. Exp.

（引用文献）

14）Y. Iyama, H. Sato, Y. Seto, S. Onoue. Photochemical

Ther., 354（2）: 195 ‒ 202（2015）
1） R.S. Dawe, S.H. Ibbotson. Drug-induced photosensitivity,and Pharmacokinetic Characterization of Orally
Administered Chemicals to Evaluate Phototoxic Risk,

Dermatol. Clin., 32（3）: 363‒368（2014）2） S. Onoue, Y. Seto, G. Gandy, S. Yamada. Drug-induced
phototoxicity; an early in vitro identification of phototoxic
potential of new drug entities in drug discovery and

J. Pharm. Sci., 108（3）: 1303 ‒ 1308（2019）15）OECD. Test No. 4 2 8 : Skin Absorption: In Vitro
Method.（2004）

development, Curr. Drug Saf., 4（2）:123‒136（2009）16）T. Hatanaka, S. Yoshida, W.R. Kadhum, H. Todo, K.

3） A. Jablonski. Efficiency of Anti-Stokes Fluorescence

Sugibayashi. In Silico Estimation of Skin Concentration
Following the Dermal Exposure to Chemicals, Pharm.

in Dyes, Nature, 131: 839‒840（1933）
4） C.S. Foote. Definition of type I and type II
photosensitized oxidation, Photochem. Photobiol., 54（5）Res., 32（12）: 3965 ‒ 3974（2015）17）ROS assay Validation Management Team. REACTIVEOXYGEN SPECIES（ROS）ASSAY TO EXAMINE: 659（1991）
5） Y. Seto, K. Hosoi, H. Takagi, K. Nakamura, H. Kojima,

PHOTOREACTIVITY OF CHEMICALS.（2013）

S. Yamada, S. Onoue. Exploratory and Regulatory18）K. Sugibayashi, H. Todo, T. Oshizaka, Y. Owada.

Assessments on Photosafety of New Drug Entities,

Mathematical model to predict skin concentration

Curr. Drug Saf., 7（2）: 140‒148（2012）of drugs: toward utilization of silicone membrane

6） D.E. Moore. Mechanisms of photosensitization by

to predict skin concentration of drugs as an animal

phototoxic drugs, Mutat. Res., 422（1）: 165‒173（1998）

testing alternative, Pharm. Res., 27（1）: 134 ‒ 142（2010）7） H. Spielmann, M. Liebsch, B. Doring, F. Moldenhauer.

19）B. Henry, C. Foti, K. Alsante. Can light absorption

First results of an EC/COLIPA validation project of inand photostability data be used to assess the photosafety

vitro phototoxicity testing methods, ALTEX, 11（1）:risks in patients for a new drug molecule? J.

22‒31（1994）

Photochem. Photobiol. B, 96（1）: 57 ‒ 62（2009）8） S. Onoue, Y. Tsuda. Analytical studies on the20）S. Onoue, K. Hosoi, S. Wakuri, Y. Iwase, T. Yamamoto,prediction of photosensitive/phototoxic potential of

N. Matsuoka, K. Nakamura, T. Toda, H. Takagi, N. Osaki,

pharmaceutical substances, Pharm. Res., 23（1）: 156‒164

Y. Matsumoto, S. Kawakami, Y. Seto, M. Kato, S. Yamada,（2006）

Y. Ohno, H. Kojima. Establishment and intra-/inter-9） J.H. Epstein. Phototoxicity and photoallergy in man,laboratory validation of a standard protocol of reactive
oxygen species assay for chemical photosafety evaluation.

J. Am. Acad. Dermatol., 8（2）: 141‒147（1983）
10）Y. Seto, S. Onoue, S. Yamada. In vitro/in vivo

J. Appl. Toxicol., 33（11）: 1241 ‒ 1250（2013）

phototoxic risk assessments of griseofulvin based on21）S. Onoue, K. Hosoi, T. Toda, H. Takagi, N. Osaki,

photobiochemical and pharmacokinetic behaviors, Eur.

Y. Matsumoto, S. Kawakami, S. Wakuri, Y. Iwase, T.

J. Pharm. Sci., 38（2）: 104 ‒ 111（2009）

Yamamoto, K. Nakamura, Y. Ohno, H. Kojima. Intra-/11）Y. Seto, R. Inoue, M. Ochi, G. Gandy, S. Yamada, S.

inter-laboratory validation study on reactive oxygen

Onoue. Combined use of in vitro phototoxic assessments

species assay for chemical photosafety evaluation using

and cassette dosing pharmacokinetic study for

two different solar simulators, Toxicol. In Vitro, 28（4）− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Sugibayashi. Contribution of the Hair Follicular Pathway: 515 ‒ 523（2014）22）J.D. Bos, M.M. Meinardi. The 500 Dalton rule for theskin penetration of chemical compounds and drugs,

to Total Skin Permeation of Topically Applied andExposed Chemicals, Pharmaceutics, 8（4）（2016）25）A . Y a m a m o t o , K . S e t o h , M . M u r a k a m i , M .

Exp. Dermatol., 9（3）: 165 – 169（2000）
23）T. Higuchi. PHYSICAL CHEMICAL ANALYSIS OF

Shironoshita, T. Kobayashi, K. Fujimoto, N. Okada, T.

PERCUTANEOUS ABSORPTION PROCESS FROM

Fujita, S. Muranishi. Enhanced transdermal delivery

CREAMS AND OINTMENTS. J. Cosmet. Sci., 11（2）:of phenylalanyl-glycine by chemical modification with85 ‒ 97（1960）

various fatty acids, Int. J. Pharm., 250（1）: 119‒128（2003）

24）F. Mohd, H. Todo, M. Yoshimoto, E. Yusuf, K.

− 104 −

プロシアニジン B2 による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明
信州大学農学部

田中

沙智

Psoriasis is a chronic, immune-mediated inflammatory skin disease characterized by cutaneous parakeratosis andhyperproliferation of epidermal cells. Psoriasis is a disease caused by infiltration of immune cells into the epidermis
and dermis and increased production of inflammatory cytokines. Imiquimod is a low-molecular-weight compound withimmunostimulatory activity, and is known to be able to induce psoriasis by applying a cream containing imiquimod to theskin of mice. In this study, we established an imiquimod-induced psoriasis model mouse and verified the preventive effect of
EGCG and Procyanidin B 2 gallate (PCB 2 DG) on psoriasis.
When the mouse back skin was treated with imiquimod cream, psoriasis symptom including erythema, thickening
and scales were observed on the mouse back skin. These psoriasis symptoms were reduced by administration of EGCG.
In addition, histological analysis of the skin showed that hypertrophy of the spinous layer of the epidermis due to thedevelopment of psoriasis was reduced by the administration of EGCG. Mouse spleen cells were increased by imiquimod
treatment, but decreased by administration of EGCG. Furthermore, the administration of PCB 2 DG also reduced thesymptoms of psoriasis.
These results suggested that we could establish an imiquimod-induced psoriasis model mouse and showed thatadministration of EGCG or PCB 2 DG reduced the symptoms of psoriasis. In the future, we would like to evaluate thepsoriasis prevention effect of other food-derived polyphenols using imiquimod-induced psoriasis model mice.

１．緒

担う T 細胞の機能異常や自己免疫反応により病態が形成さ言れると考えられている 4）。T 細胞のうち、他の免疫細胞に

乾癬は、角化細胞の分化不全と過剰増殖を特徴とする慢

対して活性化の誘導や抗体産生を促すヘルパー T（Th）細性皮膚疾患であり、患者の割合は世界人口の約 2 ～ 3 ％で胞として機能する CD 4 陽性 T 細胞は、エフェクター機能あると推定される。乾癬の典型的な症状として、皮膚表面の違いによりさらに Th 1、Th 2、Th 17、制御性 T 細胞のがわずかに隆起する肥厚、そこに境界の明瞭な赤い発疹で4 つのサブセットに分類される。その中でも乾癬では特にある紅斑ができ、その表面に乾燥した銀白色の角質が付着

Th 17 が発症や慢性症状に関与することがわかってきていする鱗屑がある1 , 2）。乾癬の症状が最も顕著に現れる皮膚る 5）。

は、表皮、真皮、皮下組織から構成されており、表皮はさ

乾癬の治療には紫外線療法や CD 4 陽性 T 細胞やマクロらに基底層、有棘層、顆粒層、角質層に分けることができる。

ファージの活性化を抑制するシクロスポリン製剤のような角化細胞は基底層で分裂後、上層に向かって移動しなが免疫抑制剤や、乾癬に関与するサイトカインに作用する抗ら有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞へと分化し、皮膚から剥

TNF-α、IL-12、IL-23、IL-17 抗体などの生物学的製剤などが3）離する角化システムによって表皮の機能を維持している 。

使用されており、症状の軽減や早期治療による効果は認め

乾癬患者の皮膚において、通常の約 10 倍の速さで角化細られているが乾癬の根治には至っておらず、強い免疫抑制胞が分化することにより、角質が剥がれ落ち、角化細胞の作用による副作用や治療の長期化が問題となっている 6 - 8）。

核が分解されず角質層に残存する不全角化が起こると同時

乾癬はイミキモドの塗布により誘発されることが知られに、細胞の過剰増殖による有棘層の肥大化が慢性症状としている 9）。イミキモドは、イミダゾキノリン系の低分子化て現れる。また、乾癬の特徴として表皮の肥大化に伴い表合物で、樹状細胞やマクロファージが発現するトル様受容皮突起が規則的に伸長することが知られている。乾癬の発体（TLR）7 のアゴニストである。イミキモドをマウスの症原因は特定されていないが、原因のひとつとして遺伝的皮膚に塗布することで TLR 7 に認識され、樹状細胞やマ要因と環境要因が関与しており、免疫応答の中心的役割を

クロファージを活性化させる。それにより、ナイーブヘル
パー T 細胞の Th 1 への分化を誘導する IL- 12 や Th 17 への分化を誘導する IL- 6、IL- 23 などのサイトカインの産生、

Anti-inflammatory effects of Procyanidin
B 2 on dermatitis in mouse model
Sachi Tanaka
Graduate School of Agriculture, Shinshu
University

炎症性サイトカインである TNF-α の産生誘導、インター
フェロン制御因子によるⅠ型インターフェロンの産生が起こる 10 - 13）。これらのサイトカインにより T 細胞の Th 1、
Th 17 への分化が誘導され、Th 1 から IFN-γ や、Th 17 から IL- 17、IL- 22 が産生される。IFN-γ が角化細胞を活性− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

化し、IL- 17 や IL- 22 が角化細胞の増殖を誘導することで皮膚炎症や分化不全が誘導されることが知られている

14）。

２．２． イミキモドの 塗 布による乾 癬 の 誘 発 および
EGCG および PCB 2 DG の投与

また、活性化した免疫細胞から産生されたサイトカインに

イミキモド誘発乾癬モデルマウスは、
マウス背側の皮膚によりケモカインが産生され、皮膚への免疫細胞の浸潤が起62 . 5 mg のイミキモド 5 ％を含有するクリーム（BESELNA

こる。イミキモドによって誘発された皮膚炎症では、紅斑、CREAM 5 %, 持田製薬株式会社 , Tokyo, Japan）を 5 日間

角化細胞の過剰増殖による表皮肥厚や分化不全による鱗屑

連続して塗布することで構築した。乾癬モデルマウスにが観察される。これらの症状がヒトにおける乾癬の症状とおける EGCG の効果を評価するために、マウスを無作為

非常によく似ていることから、イミキモドを用いたマウスに 3 群に分け、コントロール群（CON, n= 3）、PBS 投与

乾癬モデルが広く利用されている

15 - 17）。

イミキモド塗布群（IMQ, n= 5）、EGCG 投与イミキモド塗乾癬の治療において、副作用の少ない新たな治療法の開布群（EGCG, n= 4）とした（図 1）。PCB 2 DG の乾癬抑制効発が課題となっており、免疫抑制作用を有する食品由来成果を検証するために、同様にマウスを 3 群に分けて実験分であるポリフェノールが着目されている。乾癬抑制効果を行った。マウスをイソフルランにより麻酔後、背部のをもつ食品由来成分として、マンゴスチン由来ポリフェノ

体毛を電気シェーバーで剃毛した。剃毛の翌日から IMQールであるイソガルシノールやブロッコリーやケールな群 は 200 µL の PBS、EGCG 群 は EGCG（2 . 5 mg/ 200 µL）、

どに含まれるフラボノイドであるケンペロールが報告され

PCB 2 DG 群は PCB 2 DG（2 mg/ 200 µL）毎日経口投与し、ている

18 , 19）。また、緑茶中に最も多く含まれるカテキン

剃毛 3 日後から毎日 CON 群はワセリン、IMQ 群、EGCG類であるエピガロカテキンガレート（EGCG）は抗酸化活性、群および PCB 2 DG 群は 5 ％イミキモドクリームを 62 . 5 mg

抗腫瘍効果、抗炎症効果などの生理活性を示すことが知ら塗布した。EGCG は、ナガラサイエンス（Gifu, Japan）よりれている

20 - 22）。そこで本研究では、イミキモド誘発乾癬

モデルマウスに EGCG を投与した際の乾癬予防効果につい購入し、PCB 2 DG は信州大学農学部の真壁秀文教授より供与頂いたものを使用した。

て検証を行った。
ポリフェノールの一種でありブドウやカカオ、お茶に含２．３．乾癬様皮膚炎症の重症度スコア

まれるプロシアニジン B 2（PCB 2）および PCB 2 ガレート

重症度指数（PASI：Psoriasis Area Severity Index）を用（PCB 2 DG）による炎症抑制効果について研究を進めてき

いて背部皮膚の炎症状態を評価した。スコアは炎症面積をた。PCB 2 の中で、特にガレート基をもつ PCB 2 DG は炎考慮せず評価を行った。紅斑、鱗屑および皮膚の厚さは 0症性 T 細胞で過剰に産生される IL- 17 などのサイトカインから 4 の範囲（0：なし、1：軽度、2：中程度、3：重症、4：23）

極めて重症）で採点した。総合スコアは上記 3 つの項目の産生を抑えて、抗炎症効果をもつことを報告している。

しかしながら、PCB 2 DG が生体内で炎症を抑制すること

合計（0 ～ 12）で表した。

を確認できていない。そこで、イミキモドで誘導する乾癬
のマウスモデルを用いて PCB 2 DG による乾癬予防効果を

２．４．皮膚の組織学的解析

明らかにすることを目的とした。

２．方

7 日間投与した後、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、背部の皮膚を採取した。サンプルを 4 ％パラホルムアルデヒ

法ドで 18 時間固定し、1 mL の PBS 中で保存後、HE 染色標

２．
１．実験動物本を作成し、光学顕微鏡による組織学的観察に供した。

C 57 BL/ 6 マウス（雌）は CLEA Japan（Tokyo, Japan）より購入した。マウスは、室温 23±2 ℃、明期 12 時間、暗期 12 時間の環境で飼育を行った。飼育は、信州大学動物実験委員会の定める指針に従った（承認番号 019023）。

図1２．５．脾臓細胞の調製屠殺したマウスから脾臓を摘出してほぐし、脾臓細胞を単離した。その懸濁液を 40 µm ナイロン製セルストレ

実験スケジュール

− 106 −

プロシアニジン B2 による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明

ーナー（BD Falcon, Franklin Lakes, NJ）に通した。次く、血管拡張が抑制されていることが示された（図 2 B）。

に、赤血球を除去するために、0 . 83 % NH 4 Cl を含む 0 . 17

乾癬を評価する際に利用される PASI を用いてマウス背M Tris-HCl 緩衝液（pH 7 . 65）で細胞を処理した。遠心分部皮膚の炎症状態を評価した。CON 群と比較して IMQ 群、離後、細胞は 10 %FBS とペニシリン G（100 U/mL）、ス

EGCG 群で紅斑・肥厚・鱗屑および総合のスコアの増加がトレプトマイシン（100 µg/mL）（Sigma, St. Louis, MO）、

みられ、IMQ 群に比べ EGCG 群でややスコアが低く、特2 -Mercaptoethanol（Sigma） を 含 む RPMI- 1640 培 地に鱗屑のスコアの増加が大きく抑制されることが確認され（Sigma）を加えて再懸濁した。単離した脾臓細胞のうち、た（図 3 A）
。体重増加率は CON 群で変化がなく、IMQ 群、

6

8 ×10 cells をフローサイトメトリー解析に用い、残りの

EGCG 群で Day 0 から Day 2 にかけて減少がみられ、その細胞を CD 4 陽性 T 細胞の単離に使用した。

後 IMQ 群で回復がみられたが EGCG 群では回復しなかった（図 3 B）。

２．
６．統計解析

実験終了時に、マウスの背部皮膚を採取して HE 染色を有意差検定は、Student の t 検定を用いて行い、有意水

施し、組織学的解析を行ったところ、IMQ 群で表皮の肥大化と表皮突起の下方への伸長がみられ、EGCG 群で表皮準は P< 0 . 05 とした。

３．結の肥大化および表皮突起の伸長が軽減した（図 4）。以上の果結果から、EGCG の経口投与はイミキモド塗布による乾癬

３．
１．EGCG 投与乾癬モデルマウスにおける皮膚症状

様皮膚症状を軽減することが確認された。

イミキモド誘導乾癬モデルマウスにおける EGCG の効果
PBS または EGCG を経口投与し、剃毛 3 日後から 5 日間毎

３．２．EGCG 投与乾癬モデルマウスにおける脾臓の重量および細胞数日ワセリンまたはイミキモドクリームを背部皮膚に塗布

マウスから脾臓を採取し、重量および細胞数の測定をした。マウス皮膚の外観から、IMQ 群で肥厚、鱗屑の症

行ったところ、CON 群と比較して IMQ 群では脾臓が肥大状がみられ、EGCG 群で症状の抑制が確認された（図 2 A）。

化し、EGCG 群で脾臓の肥大化がやや抑制された（図 5 A）。

また、皮膚の血管分布を観察したところ、IMQ 群で太い

また、IMQ 群で脾臓重量および細胞数が有意に増加し、血管が発達しているのに対し、EGCG 群では血管がやや細

EGCG 群でそれらが有意に抑制された。（図 5 B）。

を調べるため、マウス背部を剃毛し、翌日から 7 日間毎日

図2

イミキモド誘発乾癬モデルマウス皮膚の外観− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図3

イミキモド誘発乾癬モデルマウス皮膚の重症度スコア

図4

図5

イミキモド誘発乾癬モデルマウス皮膚のHE染色

イミキモド誘発乾癬モデルマウス皮膚の脾臓の外観および脾臓重量・細胞数− 108 −

プロシアニジン B2 による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明

３．
３．乾癬モデルマウスにおけるPCB 2 DG の効果
イミキモド誘導乾癬モデルマウスにおける PCB 2 DG（図り皮膚の乾癬様症状、表皮の肥大化が抑制されることを確認した。

6 A）の効果を調べるため、マウス背部を剃毛し、翌日か

イミキモドを皮膚に塗布することで皮膚に炎症反応が起

ら 7 日間毎日 PBS または PCB 2 DG を経口投与し、剃毛 3

こり、角化細胞の増殖を促進し、分化異常を引き起こすこ

日後から 5 日間毎日ワセリンまたはイミキモドクリームをとが報告されている 15 , 16）。また炎症に伴い血管の拡張や背部皮膚に塗布した。マウス皮膚の外観から、IMQ 群で毛細血管が増加することも知られており、Th 17 からのサ

肥厚、鱗屑の症状がみられ、PCB 2 DG 群で症状の抑制がイトカインが血管増殖因子を活性化することによるもので確認された（図 6 B）。乾癬を評価する際に利用される PASIあると考えられている 24）。本実験において、イミキモド

を用いてマウス背部皮膚の炎症状態を評価したところ、の塗布により、紅斑・鱗屑・肥厚の症状および皮膚の血管

IMQ 群と比較して PCB 2 DG 投与により紅斑、肥厚、鱗屑

拡張がみられたことから、イミキモドの塗布により活性化

および総合のスコアが低下傾向にあった（図 6 C）。

した免疫細胞により乾癬が誘発され、分化した Th 17 から４．考産生されたサイトカインによる血管増殖因子の活性化によ察って血管が拡張したと考えられる。また本実験において、本実験において、マウスの背部を剃毛し 5 ％イミキモド

EGCG を経口投与することで、皮膚の乾癬様症状が軽減し、クリームを 5 日間塗布することにより、乾癬の特徴である

皮膚の血管拡張も抑制されることが示された。EGCG は、肥厚、紅斑、鱗屑、表皮の肥大化が確認され、イミキモド

ナイーブヘルパー T 細胞の Th 17 への分化を抑制すること誘発乾癬モデルマウスの確立、それを利用した実験系の確が報告されていることから 25）、EGCG によるナイーブヘル

立に成功した。また、EGCG および PCB 2 DG の投与によパー T 細胞の分化調節作用により皮膚症状および血管拡

図6PCB2DGを投与したイミキモド誘発乾癬モデルマウスの皮膚の外観− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

加したところ、IL- 17 や TNF-α、IL- 6 などのサイトカイ

張が抑制されたと考えられる。
表皮は基底層、有棘層、顆粒層、角質層で構成されておン産生を抑えることを報告している 23）。また、PCB 2 DGり、角化細胞が基底層から角質層へと移動しながら分化す

は LPS 刺激で誘発する炎症性サイトカインの産生を抑えることで、表皮の機能が維持される。一方、乾癬を発症しることも確認している。そのため、PCB 2 DG の投与によた皮膚においては、角化細胞の正常な分化に関与するカスるイミキモド誘発乾癬の抑制効果のメカニズムとしては、

パーゼ 14 の発現が低下し、角化細胞の分化不全や過剰増

IL- 17 や炎症性サイトカインの低下によるものであると考26）えられる。今後は、PCB 2 DG の乾癬抑制効果に関わるサ

本実験において PASI スコアを算出した結果、肥厚と鱗屑

イトカイン産生の抑制について、マウスの脾臓や皮膚組織はイミキモドを塗布してから 3 日目以降観察され、その後で、サイトカイン mRNA 発現ならびに免疫組織学的解析

も経時的に悪化したが、紅斑はイミキモドを塗布して 2 ～を実施することにより、詳細を明らかにする必要がある。

殖が起こり、症状として鱗屑、肥厚、紅斑などが現れる。

3 日目で一時的に悪化し、その後は徐々に改善されること

５．総が示された。一方、EGCG の投与により、肥厚と紅斑のス

括

コアは個体差があったものの IMQ 群と比較してやや低い

本実験で確立したイミキモド誘発乾癬モデルマウスの解値を示し、鱗屑と総合スコアは EGCG 群で顕著に低い値を析および EGCG および PCB 2 DG による乾癬抑制作用の検示し、症状の軽減が確認された。EGCG はカスパーゼ 14

証により、過去の知見と同様の結果が得られたことから、合成促進作用および活性化作用を有し、角化細胞の正常なイミキモド誘発乾癬モデルマウスを用いた実験系の確立に分化を誘導することが報告されている 27）。そのため、成功した。この実験系を用いて、ポリフェノールをはじめ

EGCG を投与することによってカスパーゼ 14 の合成が促とする様々な食品由来成分による乾癬への影響を評価する

進され、角化細胞の分化不全や過剰増殖を抑制することで、ことにより、過剰な免疫反応や慢性炎症などを特徴とする

皮膚症状を軽減したと考えられる。

皮膚疾患を改善する成分の発見やメカニズムの解明、それTh 17 の分化に関して、炎症に伴い樹状細胞やマクロを利用した機能性食品の開発が期待される。

ファージから産生される IL- 6 によりナイーブ T 細胞のSTAT 3 が活性化し、転写因子である RORγt の発現によっ謝辞て Th 17 は分化する。また、Th 17 は IL- 17 や IL- 22 を産PCB 2 DG をご供与頂きました信州大学農学部の真壁秀

生し、IL- 22 も STAT 3 を活性化し、乾癬症状の悪化を引文教授に深く感謝申し上げます。また、本研究の遂行にあき起こすことが報告されている

17）。また、STAT 3 は角化細胞の増殖シグナルとしても知られている

28）。皮膚の HEたり、ご援助を賜りました公益財団法人コーセーコスメト
ロジー研究財団に深く感謝申し上げます。

染色の結果、イミキモド誘発乾癬モデルマウスにおいて表皮の肥大化および表皮突起の伸長が観察され、EGCG の投（引用文献）

与によりそれらが抑制されることが示された。イミキモド

1） Rosa P, Deborah P.M. S, Christopher E.M. G, Darrenの塗布により IL- 6 が産生され、STAT 3 が活性化したこ

M. A. Global Epidemiology of Psoriasis: A Systematicとで Th 17 が増加し、IL- 22 産生量の増加に伴う STAT 3

Review of Incidence and Prevalence. Journal ofのさらなる活性化により、角化細胞の肥大化が誘導された

Investigative Dermatology, 2013, 133, 2, 377 -85.

と考えられる。また、EGCG は STAT 3 シグナルを阻害す
る効果をもつことが報告されていることから 29 , 30）、EGCGの投与により STAT 3 シグナルの阻害および Th 17 の分化

2） Boehncke WH, Schon MP. Etiology and Pathogenesisof Psoriasis. PlumX Metrics, 2015, 386, 983-94.
3） Vanessa LP, Karen Y, Brian JZ, Katherine LJ, Paul
AK. Genetic pathways in disorders of epidermal

抑制により表皮の肥大化が抑制されたと考えられる。
一般的に全身性の炎症反応によって脾臓が肥大化するこ

differentiation. Trends in Genetics, 2013, 29, 1, 31-40.

とが知られており、イミキモド誘発乾癬モデルマウスにお4） Michelle A. L, Anne M. B, James G. K. Pathogenesis

いても脾臓の肥大化が報告されている 。本実験において、

and therapy of psoriasis. Nature, 2007, 445, 866-73.

イミキモドの塗布により脾臓が肥大化し、脾臓重量、脾臓

5） Leslie F, Sabine M, Jane SAV, Marius K, Louis B, Jon

細胞数が有意に増加したことから、全身性の炎症反応が起DL, Ferry C, Anne-MM, Edwin F, Errol PP, Erik L.

こったと考えられる。また、EGCG は抗炎症作用を有する

Imiquimod-Induced Psoriasis-Like Skin Inflammation

5）

ことが報告

21）

されていることから EGCG の抗炎症作用により全身性の炎症反応が抑制され、脾臓の肥大化が抑制さ

in Mice Is Mediated via the IL-2 3/IL-1 7 Axis. J
Immunol ,2009, 182, 9, 5836-45.
6） Papp KA, Tyring S, Lahfa M, Prinz J, Griffiths

れたと予想される。
これまでに、T 細胞を刺激した条件下で PCB 2 DG を添

CEM, Nakanishi AM, Zitnik R, Van De Kerkhof PCM.

− 110 −

プロシアニジン B2 による皮膚炎の治療効果の検証と抗炎症作用のメカニズムの解明

1994 , 13 , 71 - 76 .

A global phase III randomized controlled trial ofetanercept in psoriasis: safety, efficacy, and effect of17）Lowes, Bowcock MA, Krueger AM. Pathogenesis

dose reduction. British journal of Dermatology, 2 0 0 5,

and therapy of psoriasis. Nature, 2007 , 445 , 866 - 873 .
18）Shanzao C, Kesheng H, Hu L, Juren C, Yanfang Y,

152, 6, 1304-127） Mark L, Bruce S, Alan M, Kenneth G, Jolanta W,

Hezhen W, andQun W. Isogarcinol Extracted from

Dr.Med., Lluis P, Kim P, Lynda S, Darryl T, Francisco

Garcinia mangostana L. Ameliorates Imiquimod-

K, April W. A, Georg S. Phase 3 Studies Comparing

Induced Psoriasis-like Skin Lesions in Mice. J. Agric.

Brodalumab with Ustekinumab in Psoriasis. N Engl J

Food Chem. 2017 , 65 , 4 , 846 - 857 .
19）Liu C, Liu H, Lu C, Deng J, Yan J, Chen H, Wang Y,

Med, 2015, 373, 1318-28.
8） Kenneth BG, Andrew B, Kim AP, Richard GL,

Liang C.L, Wei J, Han L, Dai Z. Kaempferol attenuates

Thomas L, Mamitaro O, Kristian R, David A, Susan

imiquimod-induced psoriatic skin inflammation in a

GB, Daniel KB, Gregory SC, Janelle E. Phase 3 Trials

mouse model. British Society for Immunology, 2 0 1 9 ,of Ixekizumab in Moderate-to-Severe Plaque Psoriasis.

198 , 3 , 403 - 15 .
20）Katiyar SK, Afaq F, Perez A, et al. Green tea

N Engl J Med, 2016, 375, 345-56.
9） Wu, JK, Siller G, Strutton G. Psoriasis induced bypolyphenol（-）-epigallocatechin 3 -gallate treatment

topical imiimod. Australas. J. Dermatol. 2004, 45, 47-50.

of human skin inhibits ultraviolet radiation-induced10）Gilliet M, Conrad C, Geiges M, Cozzio A, Thurlimann

oxidative stress. Carcinogenesis, 2001 , 22 , 2 , 287 - 94 .

W, Burg G, Nestle FO, Dummer R. Psoriasis triggered21）Dayong W, Junpeng W, Munkyong P, Siminby Toll-like receptor 7 agonist imiquimod in the

N.M. Green tea EGCG, T cells, and T cell-mediatedpresence of dermal plasmacytoid dendritic cell

autoimmune diseases. Molecular Aspects of Medicine,

precursors. Arch. Dermatol, 2004 , 140 , 1490 - 95 .

2012 , 33 , 1 , 107 - 18 .

11）Palamara F, Meindl S, Holcmann M, Luhrs P, Stingl22）Meeran SM, Akhtar S, Katiyar SK. Inhibition ofG, Sibilia M. Identiﬁcation and characterization of pDC-

UVB-induced skin tumor development by drinking

like cells in normal mouse skin and melanomas treatedgreen tea polyphenols is mediated through DNA repair

with imiquimod. J. Immunol, 2004 , 173 , 3051 - 61 .

and subsequent inhibition of inflammation. J Invest

12）Schon MP, Schon M. Imiquimod: mode of action. Br.

Dermatol, 2009 , 129 , 5 , 1258 - 70 .
23）Tanaka S, Furuya K, Yamamoto K, Yamada K,

J. Dermatol. 2004 , 157 , 8 - 13 .
13）Gibson SJ, Lindh JM, Riter TR, Gleason RM, Rogers

Ichikawa M, Suda M, Makabe H. Procyanidin B 2

LM, Fuller AE, Oesterich JL, Gorden KB, Qiu X,

gallates inhibit IFN-γ and IL- 17 production in T cells

McKane SW. Plasmacytoid dendritic cells produce

by suppressing T-bet and RORγt expression. Int

cytokines and mature in response to the TLR 7

Immunopharmacol. 2017 44 , 87 - 96 .

agonists, imiquimod and resiquimod. Cell Immunol,24）Azael TC, Isaí MT, Sandra RM, Fernando GC,
Juan C, Cancino-D, Ernesto AVS, Mario E. Cross

2002 , 218 , 74 - 86 .
14）Katia B, François-X. B, Martine G, Austin L. G,

Talk between Proliferative, Angiogenic, and Cellular

Jean-C. L, Franck M. IL- 2 2 Inhibits Epidermal

Mechanisms Orchestred by HIF- 1 α in Psoriasis.

Differentiation and Induces Proinflammatory GeneMediators of Inflammation, 2015 , 607363 , 11 .

Expression and Migration of Human Keratinocytes. J25）Dayong W, Junpeng W, Munkyong P, Simin
NM. Green tea EGCG, T cells, and T cell-mediatedImmunol, 2005 , 174 , 6 , 3695 - 702 .
15）Fujisawa H, Shivji G. M, Kondo S, Wang B, Tomai

autoimmune diseases. Molecular Aspects of Medicine,2012 , 33 , 107 - 18 .

M. A, Miller R. L, Sauder D. N. Effect of a novel topicalimmunomodulator, S- 28463 , on keratinocyte cytokine

26）Lippens S, Kockx M, Knaapen M, Mortier L,

gene expression and production. J. Interferon Cytokine

Polakowska R, Verheyen A, Garmyn M, Zwijsen

Res, 1996 , 16 , 555 - 59 .

A, Formstecher P, Huylebroeck D, Vandenabeele16）Kono T, Kondo S, Pastore S, Shivji GM, TomaiP, Declercq W. Epidermal differentiation does not

MA, McKenzie RC, Sauder DN. Effects of a novel

involve the pro-apoptotic executioner caspases, but is

topical immunomodulator, imiquimod, on keratinocyte

associated with caspase- 1 4 induction and processing.

cytokine gene expression. Lymphokine Cytokine Res,

Cell Death & Differentiation, 2000 , 7 , 1218 - 24 .

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

27）Stephen H, Douglas D, James B, Douglas S. Walsh,29）Gyuman P, Byung S Y, Jai H M, Bona K, Eun K J,

Joseph W, Haiyan Q, Julia W, Henna P, George S, Wendy

Sejong O, Hyunggee K, Hea J S, Joo Y N, ChilHwan O,

B. Bollag. Green tea polyphenol induces caspase 1 4

Seungkwon Y. Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-in epidermal keratinocytes via MAPK pathways and3 - Ga llate Suppresses C ollagen Production andreduces psoriasiform lesions in the flaky skin mouse

Proliferation in Keloid Fibroblasts via Inhibition of themodel. Experimental Dermatology, 2007 , 678 - 84 .

STAT 3 -Signaling Pathway. Elsevier, 2 0 0 8 , 1 2 8 , 1 0 ,2429 - 41 .

28）Shigetoshi S, Keith SC, Steve C, John C, Mary P,
Kaoru K, Satoshi I, Brian J N, John D G. Stat 3 links30）Yang W, Xuequn R, Chaoyang D, Lu Y, Erfu Y, Taoactivated keratinocytes and immunocytes required for

G, Yanmin L, Marvin X X. Mechanism of the inhibition

development of psoriasis in a novel transgenic mouseof the STAT 3 signaling pathway by EGCG. Oncology

model. Nature Medicine, 2005 , 43 - 49 .

Reports, 2013 , 30 , 6 , 1021- 335− 112 −

皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索
同志社大学生命医科学部

野口範子

PARK 7 /DJ- 1 is a multifunctional protein which is involved in gene transcription regulation and anti-oxidative defense. DJ- 1
plays an important role in protection against UV irradiation and oxidative stress in the skin. Although DJ- 1 lacks the secretory
signal sequence, it is secreted and plays important physiological and pathophysiological roles. Whereas secretory proteins lacking
the endoplasmic reticulum-targeting signal sequence are secreted from cells by the unconventional secretion mechanism, thespecific processes responsible for DJ- 1 secretion across the plasma membrane have remained unclear. In the present study, we
found that DJ- 1 secretion was increased by treatment with 6 -hydroxydopamine ( 6 -OHDA) via the unconventional secretory
pathway in human neuroblastoma SH-SY 5 Y cells and mouse embryonic fibroblast (MEF) cells. We also found that 6 -OHDAinduced DJ- 1 secretion was suppressed in Atg 5 -, Atg 9 -, or Atg 16 l 1 - deficient MEF cells or ATG 16 L 1 knockdown SH-SY 5 Y
cells, indicating that the autophagy-based unconventional secretory pathway is involved in DJ- 1 secretion. We moreover observedthat 6 -OHDA induced decrease in glutathione levels, which was suppressed by pretreatment with antioxidant N-acetyl-L-cysteine(NAC), and that NAC treatment suppressed autophagy and DJ- 1 secretion. We also observed that 6 -OHDA-induced autophagy
was associated with activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and ULK 1 (unc- 51 like autophagy activating kinase 1 )via a pathway which was independent of mechanistic target of rapamycin kinase (mTOR). Collectively these results suggest that
6 -OHDA enhances oxidative stress followed by AMPK-ULK 1 pathway activation and induction of secretory autophagy for theunconventional secretion of DJ- 1 .

１．緒する細胞は UV や活性酸素による障害に強い抵抗性を示す

言

ことを明らかにしてきた 2）。さらにヒトの皮膚レベルで観DJ- 1 は生体の酸化ストレス防御に重要な因子であり、察したところ、角層中 DJ- 1 レベルの高い被験者のほうが、

DJ- 1 の発現量が低下すると細胞は酸化ストレスに脆弱に

UV により変化した皮膚の色素沈着が早期に回復し、赤みなる。逆に発現量が増加すると、高レベルの酸化ストレスや紅斑が早期に低下することを見出しており、皮膚におけ下でも細胞は生存できる。また、DJ- 1 は酸化ストレス下

る DJ- 1 レベルが酸化ストレス耐性を示す優れたバイオマ

で自身が酸化され、酸化 DJ- 1 を生じる。DJ- 1 は全身のーカーとなることが明らかとなっている 2）。

どの細胞にも広く発現分布するタンパク質であり、その機

DJ- 1 は主に細胞質に存在するが、細胞外に分泌される能にはほかにも、転写調節能、シャペロン活性、プロテア

ことも知られている。細胞外では抗酸化因子やシグナル伝ーゼ活性等、多機能タンパク質として知られる。さらに達等のはたらきを示すと考えられている。通常、細胞外にDJ- 1 をコードする遺伝子 PARK 7 は家族性パーキンソン

分泌されるタンパク質はアミノ末端側にシグナル配列をも

1）

病の原因遺伝子として注目されており 、国内外で盛んにち、小胞体やゴルジ体を経由して、小胞輸送により細胞外研究されている。パーキンソン病の発症・進展には酸化スへと分泌される典型的経路をたどる。一方で、サイトカイトレスが関与すると考えられているが、DJ- 1 はドーパミンであるインターロイキン - 1β（IL-1 β）や IL - 12 等のシグン産生神経細胞の酸化ストレスの緩和に働き、その機能喪ナル配列をもたない細胞質局在タンパク質も、細胞外へ分失はパーキンソン病の発症に関与すると考えられている。

泌されることが知られており、これらの分泌経路は非典型

皮膚は、紫外線（UV）等の外因性因子により障害を受け的経路と呼ばれている 3 , 4）。非典型的経路により分泌されやすく、酸化ストレス障害の多い臓器の一つに挙げられる。

るタンパク質には生理的に重要な役割を果たすタンパク質

くり返し UV を浴びることで皮膚老化が促進するが、UV にが多く含まれているにもかかわらず、水溶性である細胞質より発生した活性酸素種（Reactive Oxygen Species：ROS）

局在タンパク質がどのように脂質二重層である細胞膜を通は、脂質の過酸化やタンパク質の変性等の酸化障害を引過して細胞外に分泌されるか、その分泌機構は未知な点がき起こす。これまで我々は、角層中で DJ- 1 が高濃度存在多い。DJ- 1 はシグナル配列をもたないことから、小胞を介さない非典型的な経路によって分泌されると考えられるが、その分泌機構は不明であった。そこで本研究において

The secretion mechanism of skin cellprotecting protein
Noriko Noguchi
Faculty of Life and Medical Sciences,
Doshisha University

我々は、皮膚の酸化ストレス防御において重要な役割を果たすと考えられる DJ- 1 の細胞外分泌メカニズムについて解析することを目的とした。また、その分泌を促進する化合物を見出すことで、細胞防御タンパク質の分泌促進による皮膚の健康増進法を開発することを目指した。

− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．方２．３．細胞内還元型 Glutathione（GSH）量の測定

法

6 ウェルプレートで培養した細胞に対して、刺激を行い、

２．
１．細胞とその培養法回収した細胞を 0 . 2 M 過塩素酸溶液で溶かし、氷上で 30

ヒト神経芽細胞種（SH-SY 5 Y）細胞は ECACC から購入-/-

5）

分インキュベートした。遠心後、上清を 1 M CH 3 COONa

した。マウス野生型 MEF 細胞および atg 5 MEF 細胞 は、を用いて pH 3 付近になるよう調整し、フィルターろ過後、水島昇教授（東京大学）からご供与いただいた。atg 9 -/- とSC- 5 ODS カラムを用いて HPLC により定量した。エレン-/-

atg 16 l 1 MEF 細胞

6 , 7）

は、審良静男教授（大阪大学）からトとして 99 % 0 . 1 M sodium phosphate buffer, pH 2 . 5 , 1 %

ご供与いただいた。基礎培地として DMEM/F 12 培地を用

methanol, 100 mg/L sodium octanesulfonate, and 50 mg/L

い、10 % FBS と抗生物質を添加した。培養は 37 ℃、5 %EDTA- 2 Na 溶液を用い、標品として還元型 GSH を用いた。

CO 2 環境下で行った。

２．４．免疫細胞染色、電子顕微鏡観察

２．２．細胞処理と分泌評価法

カバーガラス上で培養した細胞を、冷メタノールで固定、分泌誘導刺激として、6 -hydroxydopamine（6 -OHDA）

BSA でブロッキング後、一次抗体として抗 DJ- 1 抗体、抗を用いた。6 ウェルプレートで培養した細胞に対して、

LC 3 抗体、二次抗体として Alexa 標識抗体を用いて染色

50 - 100 µM 6 -OHDA で 3 時 間 処 理 し、 さ ら に serum-

後、Zeiss LSM 710 共焦点顕微鏡を用いて、細胞を観察した。

free 培地で 2 時間培養した。N-acetylcysteine（NAC）処

また、電子顕微鏡観察の場合、細胞は 2 % グルタルアルデ

理は、2 mM NAC で 2 時間前処理を行った。処理後、細ヒドで固定し、JEM- 1200 EX による TEM 観察を行った。

胞と培養上清をそれぞれ回収し、細胞から可溶化バッファ３．結ー（1 0 mM Tris-HCl, pH 7 . 4 , 1 5 0 mM NaCl, 1 % NP- 4 0 ,果を用いて、whole cell lysate を回収した。培養上清は、遠３．１．6 -OHDA 処 理 は、 酸 化 ストレス 依 存 的 にDJ-1 の分泌を促す

心 後、 回 収 し た 上 清 1 mL に 1 mg の BSA と 終 濃 度 10 %細胞からの分泌メカニズムを明らかにするため、評価

Trichloroacetic acid（TCA）
を加え、TCA 沈殿により濃縮系が確立している SH-SY 5 Y を用いた。分泌誘導刺激としを行い、サンプルバッファーに溶解し、SDS-PAGE 用サて、内在性のカテコールアミン作動性神経毒であり、パンプルとした。タンパク質は BCA 法により定量し、SDS-

ーキンソン病発症モデル化合物として広く用いられていPAGE、二次元 PAGE、ウエスタンブロット法により解析

る 6 -OHDA を用いた。その結果、6 -OHDA の濃度依存的

0 . 1 % SDS, 5 mM EDTA- 2 Na, protease inhibitor cocktail）

した。また、Lactate dehydrogenase（LDH）法を用いて、 （0 - 100 µM）に DJ- 1 の細胞外分泌が亢進した（図 1 A）
。ま
培養上清中の LDH 活性を測定することにより、細胞膜破

た、6 -OHDA 刺激下においても、通常小胞体に存在する綻の判定を行った。

ribophorin 1（RPN 1）（図 1 A）や細胞質に存在する LDH

図1（A）SH-SY5Y細胞における6-OHDA刺激によるDJ-1分泌への影響。
（B）6-OHDA刺激によるDJ-1分泌とLDH releaseに対する影響。n=3; mean±S.D.; *, p<0.05.（C）6-OHDA誘導性DJ-1分泌亢進に対する
brefeldin Aの影響。
（D）細胞内GSH含量。n=5; mean±S.D.; **, p<0.01.（E）6-OHDA誘導性DJ-1分泌亢
進に対するNACの影響。

− 114 −

皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索

活性の培養上清中での上昇が認められなかったことから

ころ、6 -OHDA の濃度依存的に LC 3 -II が増加しているこ（図 1 B）、DJ- 1 分泌が膜破綻によるものではないことがとが確認された（図 2 A）。そこで DJ- 1 分泌に対するオー確認された。分泌経路について、典型的分泌経路の阻害剤

トファジーの関与を明らかにするため、オートファジー研

である Brefeldin A を用いて解析したところ、Brefeldin A

究でよく用いられている野生型 MEF 細胞に 6 -OHDA 刺の共処理は、6 -OHDA 誘導性の DJ- 1 分泌に影響を与えな激を行い、DJ- 1 の分泌に対する影響を調べた。その結果、かった一方で、典型的経路により分泌されることが知られ

6 -OHDA 濃度依存的に DJ- 1 の分泌が亢進した（図 2 B）。

ている fibronectin 1（FN 1）の分泌は顕著に減少していた

また、培養上清中の LDH 活性の上昇は起きていなかったことから、DJ- 1 は非典型的経路により分泌されているこ（data not shown）。さらに 75 µM 6 -OHDA 刺激で、LC 3 -とが明らかとなった（図 1 C）。

II 型の増加が確認された（図 2 C）。そこで、電子顕微鏡観6 -OHDA は速やかに H 2 O 2 と 6 -OHDA quinone に分解察を行ったところ、6 -OHDA 刺激を加えた細胞では、隔され、細胞内酸化ストレスを上昇させることが知られて離膜やオートファゴソーム、オートリソソームと考えられいることから、細胞内の GSH 濃度を測定した。その結果、る構造が観察された（図 2 D）。また、蛍光顕微鏡を用いて100 µM 6 -OHDA 刺激により、GSH 濃度が有意に減少し免疫細胞染色を行ったところ、6 -OHDA 刺激により DJ- 1ていることを確認した（図 1 D）
。そこで細胞内 GSH 濃度をと LC 3 が共局在することが観察された（図 2 E）。以上の結増加させることが可能な N-acetyl cysteine（NAC）で前処果から、DJ- 1 の分泌を促す 6 -OHDA 刺激下では、オー理を行うと、6 -OHDA により亢進した DJ- 1 の分泌が抑制

トファジーも誘導されていることが明らかとなった。

された（図 1 E）
。以上の結果から、6 -OHDA による酸化ス
トレスの上昇が DJ- 1 の分泌を亢進させることが示唆された。

３．３．DJ-1 の分泌は、オートファジー欠損 MEF 細胞で抑制される
次に DJ- 1 分泌に対するオートファジーの関与を明ら

３．
２．DJ-1 の分泌を促す 6 -OHDA 刺激は、オートファジーを誘導する

かにするため、オートファジー進行に必要な因子である
Atg 5、Atg 9、Atg 16 L 1 を そ れ ぞ れ 欠 損 し た MEF 細 胞

さらに詳細な 6 -OHDA 誘導性の DJ- 1 分泌機構を明らを 用 い て、6 -OHDA の 効 果 を 検 証 し た。 そ の 結 果、 野

かにするため、非典型的な分泌機構への関与が指摘されて生型（WT）細胞と比べ、Atg 5 欠損細胞（図 3 A）や Atg 9、いるオートファジーに着目した。オートファジー進行のマAtg 16 L 1 欠損細胞（data not shown）において、LC 3 -IIーカーとして LC- 3 の I 型から II 型への変化を解析したと型 が 減 少 す る と と も に、6 -OHDA 刺 激 に よ る DJ- 1 の

図2（A）SH-SY5Y細胞における6-OHDA 刺激によるLC3への影響。
（B、C）MEF細胞における6-OHDA刺激によるDJ-1分泌（B）、LC3（C）への影響。
（D）MEF細胞における6-OHDA刺激時の電子顕微鏡観察。i：コントロール刺激、ii-v:6-OHDA刺激、iii隔離膜、iv:オートファゴソーム、v:オートリソソーム。
（E）MEF細胞における6-OHDA刺激時の免疫細胞染色。

− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図3（A）WTおよびatg5 -/- MEF細胞における6-OHDA 刺激によるDJ-1分泌への影響。
（B）SH-SY5Y細胞におけるATG16L1ノックダウンによるDJ-1分泌への影響。
（C、D）WT MEF細胞における6-OHDA誘導性
DJ-1分泌亢進（C）、LC3（D）に対するNACの影響。

分 泌 亢 進 が 観 察 さ れ な か っ た。 さ ら に、siRNA に よ り

さらに NAC 前処理は AMPK のリン酸化を抑制したこと

ATG 16 L 1 をノックダウンした SH-SY 5 Y 細胞においても、から、6 -OHDA 誘導性酸化ストレスが mTOR 非依存的に同様に 6 -OHDA 誘導性 DJ- 1 分泌が抑制された（図 3 B）。

AMPK、ULK 1 のリン酸化を引き起こしていることが示

これらの結果から、オートファジーの進行が、6 -OHDAされた（図 4 B）。また AMPK の活性化は、AMP：ATP 比

誘導性の DJ- 1 非典型的分泌に重要な役割を果たすことがにより調節されていることから、AMP と ATP レベルを解

明らかとなった。

析したところ、6 -OHDA 刺激は AMP:ATP 比を上昇させまた、MEF 細胞においても、NAC の前処理は 6 -OHDAていた（図 4 C）。

誘導性 DJ- 1 分泌亢進を抑制し（図 3 C）
、LC 3 -II 型の増加

次に 6 -OHDA 誘導性オートファジーや DJ- 1 の分泌にも抑制していた（図 3 D）ことから、酸化ストレスの上昇が、対する ULK 1 阻害剤 MRT 68921 の効果を検討した。そのオートファジーの誘導や DJ- 1 の分泌に関与していること

結 果、MRT 68921 の 共 処 理 は、6 -OHDA に よ る LC 3 -IIが明らかとなった。

型の増加を抑制するとともに（図 4 D）、DJ- 1 の分泌亢進も抑制した（図 4 E）
。これらの結果から、AMPK-ULK 1

３．４．AMPKとULK1 の活性化が、6 -OHDA 誘導性のオートファジーや DJ-1 分泌亢進に重要である

経 路 の 活 性 化 が 6 -OHDA 誘 導 性 の オ ー ト フ ァ ジ ー や
DJ- 1 の分泌亢進に関与していることが示された。

そこで 6 -OHDA による酸化ストレスの上昇が、なぜ
オートファジーを誘導するのか明らかにするために、オートファジーのシグナル伝達経路と酸化ストレスの双３．５．トレハロースはオートファジーや DJ-1 分泌を促す

方 に 含 ま れ る 制 御 因 子 で あ る AMP 活 性 化 プ ロ テ イ ン

最後に 6 -OHDA 以外の刺激でも DJ- 1 の分泌が亢進す

キナーゼ（AMPK）とその下流の unc- 51 like autophagy

るか検証した。天然の糖質であり皮膚の保湿効果があるこ

activating kinase 1（ULK 1） の 活 性 化（ リ ン 酸 化 ）、 おとが知られるトレハロースは、AMPK-ULK 1 経路を活性よびオートファジーの負の制御因子である mechanistic

化し、mTOR 非依存的にオートファジーを誘導すること

target of rapamycin kinase（mTOR） の 活 性 に 着 目 しが知られていること 8 , 9） から、DJ- 1 の分泌に対する効果

た。その結果、比較対象として用いた mTOR の阻害剤でを検討した。その結果、トレハロース処理は濃度依存的に

あ る rapamycin 処 理 は、AMPK や ULK 1 の リ ン 酸 化 に

LC 3 -II 型の増加を誘導し（図 5 A）、200 mM トレハロース

影響を与えずに、mTOR の標的である p 70 S 6 K のリン酸

は 6 -OHDA と同程度に DJ- 1 の分泌を亢進した（図 5 B）。

化を抑制した（図 4 A）
。一方で 6 -OHDA 刺激は、AMPK

４．考の Thr 172 のリン酸化と ULK 1 の Ser 555 のリン酸化を誘導したが、p 70 S 6 K のリン酸化には影響していなかった。

察

本研究では DJ- 1 の分泌メカニズムを明らかにするため− 116 −

皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索

図4（A）WT MEF細胞における6-OHDA 刺激によるAPMK、ULK1、p70S6Kのリン酸化への影響。
（B）WT
MEF細胞における6-OHDA とNAC共処理によるAMPKのリン酸化とLC3に対する影響。
（C）WT MEF細胞
における細胞内AMP:ATP比。n = 3; mean ± S.D.; *, p < 0.05.（D、E）SH-SY5Y細胞における6-OHDAとMRT68921共処理によるLC3（D）とDJ-1分泌（E）に対する影響。

図 5（A）WT MEF 細胞におけるトレハロース刺激による LC 3（A）と、DJ- 1 分泌（B）に対する影響。

に神経細胞と線維芽細胞を用いた。その結果、6 -OHDAによる細胞内酸化ストレス上昇が AMP：ATP 比率を変化させ、AMPK を活性化させたことで、オートファジーの進行に関わる ULK 1 のリン酸化が起き、分泌性オートフ
ァジーによる DJ- 1 の分泌が起きることを見出した。これ
らの結果から通常細胞質に存在する DJ- 1 の分泌機構として、オートファジー性の小胞に囲まれ、その後小胞が細胞膜と融合することで DJ- 1 の細胞外への非典型的分泌が起こるという可能性が示唆された（図 6）。また、DJ- 1 分泌促進剤として、化粧品原料としても用いられるトレハロー
スを同定した。なお本報告書は文献 10 の内容をもとに作成した。
今回我々が新規に明らかにした分泌性オートファジーによる DJ- 1 の分泌機構が、UV 刺激による酸化ストレスの上昇に伴う皮膚細胞からの DJ- 1 の分泌に関わるか今後明らかにする必要がある。また、本研究で見出したトレハ
ロースをはじめ、DJ- 1 の分泌を促進する化合物の探索や、
DJ- 1 とともに分泌されるタンパク質の同定やその機能が明らかになれば、皮膚細胞の保護タンパク質の分泌促進につながることが期待される。

図6− 117 −

6-OHDA刺激によるDJ-1の非典型的分泌機構の模式図

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

（引用文献）

translocation of STING and the innate immune

1） Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O,
Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, Squitieri F,

response. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1 0 6, 2 0 8 4 220846, 2009.

Ibanez P, Joosse M, et al. Mutations in the DJ-1 gene7） Saitoh T, Fujita N, Jang MH, Uematsu S, Yang BG,

associated with autosomal recessive early-onset

Satoh T, Omori H, Noda T, Yamamoto N, Komatsu M,

parkinsonism. Science 299, 256-259, 2003.

et al. Loss of the autophagy protein Atg16L1 enhances

2） Ishiwatari S, Takahashi M, Yasuda C, Nakagawa M,
Saito Y, Noguchi N, Matsukuma S. The protective roleendotoxin-induced IL-1beta production. Nature 4 5 6,264-268, 2008.

of DJ-1 in ultraviolet-induced damage of human skin:8） DeBosch BJ, Heitmeier MR, Mayer AL, Higgins CB,

DJ-1 levels in the stratum corneum as an indicator of

Crowley JR, Kraft TE, Chi M, Newberry EP, Chen Z,

antioxidative defense. Arch. Dermatol. Res. 3 0 7, 9 2 5-

Finck BN, et al. Trehalose inhibits solute carrier 2A

935, 2015.

（SLC2A）proteins to induce autophagy and prevent

3） Zhang M, Schekman R. Unconventional secretion,

hepatic steatosis. Sci. Signal 9, 21, 2016.

unconventional solutions. Science 340, 559-61, 2013.

9） S a r k a r S , D a v i e s J E , H u a n g Z , T u n n a c l i f f e4） Malhotra V. Unconventional protein secretion: an

A, Rubinsztein DC. Trehalose, a novel mTOR-

evolving mechanism. EMBO J. 32, 1660-1664, 2013.

independent autophagy enhancer, accelerates the5） Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakayaclearance of mutant huntingtin and alpha-synuclein. J.

H, Yoshimori T, Ohsumi Y, Tokuhisa T, Mizushima
N. The role of autophagy during the early neonatal

Biol. Chem. 282, 5641-5652, 2007.
10）Urano Y, Mori C, Fuji A, Konno K, Yamamoto
T, Yashirogi S, Ando M, Saito Y, Noguchi N.

starvation period. Nature 432, 1032-1036, 2004.
6） Saitoh T, Fujita N, Hayashi T, Takahara K, Satoh6 -Hydroxydopamine induces secretion of PARK 7 /T, Lee H, Matsunaga K, Kageyama S, Omori H, Noda

DJ- 1 via autophagy-based unconventional secretory

T, et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic

pathway. Autophagy 14 , 1943 - 1958 , 2018 .

− 118 −

加齢に伴う皮膚のステロイド合成系の変容が皮膚機能に及ぼす影響
昭和大学医学部生化学講座

原口省吾

The sex steroids, androgens and estrogens, play essential roles in many health conditions of men and women. However, thelevel of circulating sex steroids decreases with advancing age, mainly due to the aging of gonads in both sexes. Moreover, in men,a decline in testosterone is associated with many physiological signs of aging, such as a decrease in muscle mass and strength, bonemass, skin thickness, and hair; poor wound healing; and an increase in fat mass, especially visceral adipose tissue. However, thechanges in the production and secretion of sex steroids with age in several steroidogenic organs, muscle, bone, skin in men are notwell documented.
Therefore, to uncover the changes in steroidogenesis in skin with age, we analyzed the changes in the levels of sex steroids inyoung and aged male mice. First, we demonstrated that cutaneous testosterone levels were higher in aged mice than in young mice.
Then, we demonstrated that Hsd 17 b 3 localized in sebaceous glands is responsible for the upregulation of cutaneous testosterone
levels in aged mice. Inhibition of hyperproduction of cutaneous testosterone by treatment with an inhibitor of Hsd 17 b 3 increased
the hair length of aged mice. Finally, we demonstrated that the suppression of hair length by elevated testosterone levels wasmediated by ZIP 9 , but not by the androgen receptor, in hair follicle cells of aged mice.

１．緒

減少が、皮膚局所のステロイド産生系へどのような変化を言引き起こすのか高齢マウスを用いて解析した。その結果、加齢に伴う生殖腺の機能低下により、男性では血中の高齢の雄マウスでは、若齢の雄マウスに比べて、血中テス性ステロイドであるアンドロゲンが 40 代後半から漸減し、トステロン濃度は低下していた。一方で、高齢マウスは皮男性更年期障害と言われる加齢性腺機能低下症（late-onset

膚のテストステロン濃度が上昇していた（図 1）。これまで、

hypogonadism：LOH 症候群）が発症する。LOH 症候群は、加齢に伴う性腺機能の低下によって、体内のテストステロ

うつをはじめとした様々な精神症状や、性機能低下をはじ

ン濃度は低下する一方であると考えられてきたが、皮膚局めとした様々な身体症状が出る。そこで、アンドロゲン

所では加齢に伴いテストステロン濃度が上昇することがわ

補充療法が行われるが、その治療効果には疑問の声も多い。

かった。さらに、研究代表者はイメージング質量分析法に

それは、LOH 症候群の病態が複雑であり、アンドロゲン

より、加齢時の皮膚テストステロンの増加は真皮層で生じの低下だけでは説明できない症例が多いことに起因するとていることを明らかにした。この加齢時の皮膚テストステ

考えられている。そのため、より効果的な治療法開発に向ロンの増加は、テストステロン合成酵素の一つである 17β-

けて、世界的に加齢時の体内ホルモン環境に対するエビデヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプ 3（hsd17b3）が責任

ンスの蓄積が求められている 1 - 3）。

遺伝子であり、HSD 17 B 3 タンパク質は皮脂腺細胞に高発生殖腺や副腎以外にステロイドを産生する器官として皮膚が知られている。皮膚で産生されたステロイドは、生殖現していることを明らかにしている。
このように研究代表者は、加齢時の皮膚にはテストステロ腺や副腎から血流を介して皮膚に到達するステロイドと協ンが高濃度に存在し、その責任遺伝子が hsd17b3 であるこ

働し、皮膚の生理機能を精緻に制御している。皮膚におけとを明らかにしていた。しかし、加齢に伴い皮膚で増加するステロイドの代表的な作用として、発毛や皮脂分泌、コるテストステロンにどのような生理的・病態生理学的意義が4 - 6）。LOH 症候群の徴候の一つ

あるのかは不明である。そこで、本研究では、次の 2 つのに「体毛と皮膚の変化」があり、体毛量の変化、皮膚の乾燥

研究項目を設定し、それらを明らかにすることを目的とした。

や異常な発汗等が症状として現れる。

研究項目① 高齢時に皮膚でテストステロンの過剰産生・蓄

ラーゲン産生の制御がある

そこで研究代表者は、加齢時の精巣由来アンドロゲンの積が生じる分子機構の解明
研究代表者は「加齢に伴う精巣機能の低下・老化はテス
トステロン産生の低下を引き起こし、血中テストステロン

The effects of changes in cutaneous
steroidogenesis with advancing age on
the function of skin
Shogo Haraguchi
Department of Biochemistry, Showa
University School of Medicineの減少を引き起こす。しかし、皮膚には性腺とは独立したステロイド産生系がある。従って、血中テストステロンが減少すると、皮膚ステロイド産生系が皮膚機能を維持するために（恒常性維持のために）亢進し、皮膚局所でステロイド供給を増やそうとするのではないか？」との仮説を立て− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図1 高齢マウス皮膚におけるホルモン恒常性の破綻によるテストステロン過剰産生機構
加齢に伴い血液由来のテストステロンやエストラジオールは慢性的に少ない状態になる（①）。しかし、皮膚ではホルモン環境を維持するために、エストラジオール産生を促すようにフィードバック機構が働き（②）、テストステ
ロン合成酵素Hsd17b3の発現が誘導される（③）。しかし、テストステロン代謝に関わるアロマターゼや5α-リダクターゼ等のステロイド代謝酵素の発現が老化に伴い低下しているため（④）、皮膚でテストステロンの過剰産生・蓄積が生じる（⑤）。

た。本研究項目では研究代表者の仮説の妥当性を検討した。

２．３．皮膚組織中のステロイド合成酵素 mRNAの測定

研究項目② 高齢時の皮膚に存在する高濃度テストステロン

マウスの皮膚全層を採取後、total RNA を抽出し逆転が関与する皮膚疾患の解明写を行った。皮膚組織中の mRNA はリアルタイム PCR

上述のように皮膚においてステロイドホルモンは、発毛（StepOnePlus, Applied Biosystems 社）で測定した。

や皮脂分泌の制御、コラーゲン産生等に関わる。高齢者皮膚でも発毛周期の変容や脱毛、皮脂成分の変化、コラーゲ

２．４．毛包幹細胞の単離とアポトーシスの解析

ン産生の低下等が知られている。そこで皮膚局所に高濃度

マウス背部皮膚全層を採取したのち、PBS で軽く洗浄で存在するテストステロンが、これらへ影響を与え皮膚疾

後、60 分間酵素処理を行った。酵素処理後、皮膚表面患に関与するのか解析した。

をメスでかきとり、皮膚の細胞群を回収した。この皮膚

２．方
２．
１．動

の細胞群の中から毛包幹細胞の特徴を示す細胞（Sca- 1 -/法

CD 34 + 細胞）を磁気細胞分離法（ミルテニー社 ; Sca- 1 抗物

体, # 14 - 5981 - 82 , eBioscience社; CD 34 抗体, # 14 - 0341 -実験にはマウス C 57 BL/ 6 J（若齢 3ヵ月齢）と C 57 BL/ 6 J-

82 , eBioscience 社）により回収した。この細胞に対して、6Aged（高齢 22ヵ月齢）の雄を日本チャールス・リバー社か

時間のテストステロン処理を行い、6 時間後のアポトーシ

ら購入して用いた。3ヵ月齢は個体として成熟しており、ス量を ELISA 法（ApoStrand ELISA アポトーシス検出キ

ヒトにおける 20 歳程度、22 ヵ月齢はヒトにおける 65 歳程

ット , Enzo 社）により測定した。

度に相当する。若齢・高齢マウスは各種疾患の発症が見ら

２．５．皮膚組織を用いた免疫組織化学染色による解析

れない健康な加齢個体を用いた。

マウス皮膚は 4 %PFA で固定後、定法に従いパラフィン

２．２．血清中・皮膚組織中のステロイド濃度の測定

ブロックとし、10 µm 厚の組織切片を作製した。脱パラフ

血清と皮膚組織は、それぞれメタノール中でホモジナイ

ィン後、自家蛍光低減処理（TrueBlack リポフスチン自家

ズ後、ISOLUTE SLE+（Biotage 社）によるステロイドの蛍光クエンチャー , Biotium 社）を行い、免疫組織化学染色

抽出・精製を行い、AB Sciex 社の LC/MS/MS（TripleTOFに 用 い た。ZIP 9 抗 体 は、# 17607 - 1 -AP, Proteintech 社

4600）で解析を行った。

を用いた。Hsd 17 b 3 抗体は川崎医科大学解剖学講座 嶋雄− 120 −

加齢に伴う皮膚のステロイド合成系の変容が皮膚機能に及ぼす影響の皮膚疾患の発症に関与し得るのかを解析した。高齢マ一教授より分与頂いた抗体を用いた。

３．結

ウス皮膚へHSD17B3 阻害剤を塗布し、高齢マウス皮膚の果

皮膚厚変化（組織学的解析）、コラーゲン産生量（Collagen３．
１．高齢時に皮膚でテストステロンの過剰産生・蓄積が生じる分子機構の解明

I mRNA 変化）、細胞増殖量の変化（Ki 67 発現変化）、体毛

加齢に伴い血中のテストステロンやエストラジオールがおいて HSD 17 B 3 の働きを阻害することで、テストステ減少する。一方、皮膚ではテストステロンの増加が見られロン合成を抑制すると体毛の伸長が見られた。従って、高た。従って、皮膚ではエストラジオールやその他の性ステ

濃度のテストステロンは体毛の成長を抑制的に制御するとロイドの減少が、テストステロン増加の引き金となってい考えられた。男性型脱毛症 AGA では毛乳頭細胞に発現すると考えられた。

るアンドロゲン受容体を介したアンドロゲンの作用が頭髪の長さの変化等を解析した。その結果、高齢マウス皮膚にそこで高齢マウス皮膚へエストラジオール、プロゲステの成長を抑制することが知られている 7）。そこで、高齢時

ロン、5 α-DHT 等の主要な性ステロイドを塗布し、皮膚のテストステロンの作用機序を明らかにするためにアンドのテストステロン産生に変化が見られるかを解析した。こロゲン受容体の局在解析を行った。しかし、高齢マウスのの際、皮膚局所のステロイド産生系の作用であることを確

毛包細胞・毛乳頭細胞にはアンドロゲン受容体の発現が見認するために、血中の性ステロイド濃度には影響を与えなられなかった。これに関しては先行研究でも同様の結果がいことを確認した。その結果、エストラジオールを塗布し報告されている 8）。従って、テストステロンはアンドロゲ

た場合に高齢マウス皮膚のテストステロン濃度が低下した。

ン受容体以外の何らかの情報伝達経路を介して体毛の成長

従って、高齢マウス皮膚のテストステロン産生の増加は、を抑制していることが考えられた。最近、前立腺がん細胞

皮膚におけるエストラジオール低下が引き金となっているを用いた研究から、テストステロンが亜鉛トランスポータ

ことが考えられた。

ー ZIP 9 に作用し、アポトーシスを誘導する作用を発揮す

そこで次に、ヒト皮脂腺細胞（SZ 95 細胞）を用いて長期ることが報告されていた 9）。そこで、高齢マウスの皮膚に的なエストラジオール欠乏が Hsd 17 b 3 発現を変化させる

おける ZIP 9 の局在解析を行ったところ、体毛の成長の制のかを解析した。その結果、通常の FBS を用いた細胞に比御に関わる毛包幹細胞に ZIP 9 の発現が見られた。従って、

べて、チャコール処理（活性炭にステロイド等を吸着させ、高濃度テストステロンは毛包幹細胞に発現している ZIP 9

FBS 中のステロイド等を除いた）FBS では、SZ 95 細胞でを介して、体毛の成長に抑制的なシグナルを伝えているこ

Hsd17b3 mRNAとHSD17B3 タンパク質の発現量が増加した。

とが示唆された。そこでマウス毛包幹細胞を単離し、高濃さらに、チャコール処理 FBS で培養した SZ 95 細胞へエス度テストステロン処理を行ったところ、アポトーシス誘導

トラジオールを添加すると、Hsd17b3 発現が抑えられた。

因子の発現量が増加するとともに、アポトーシスの誘導作

加えて、これらの変化は皮脂腺細胞に発現するエストロゲ用が見られた。

ン受容体を介した作用であることも明らかにした。

４．考

次に、長期的なエストラジオールの欠乏がHsd17b3 発現察を増加させるのか、エストラジオール合成酵素アロマタ

男性型脱毛症 AGA では、思春期以降に精巣で合成・分ーゼをノックアウトしたマウス（Aromatase Knockout ;泌されたテストステロンが、頭皮に発現する 5 α -リダクタ

ArKO）を用いて解析した。その結果、ArKO マウスではーゼにより 5 α-DHT へと代謝され、前頭部や頭頂部の毛

皮膚の Hsd 17 b 3 発現が増加するとともに、皮膚テストス

乳頭に高発現するアンドロゲン受容体へ作用する。毛乳頭

テロン濃度がワイルドタイプマウス（WT）に比べて著しく

では 5 α-DHT の働きにより、TGF-β などの発現が誘導さ高かった。

れ、それらが毛母細胞の増殖を抑制することで、毛の成長

これらの結果から、加齢に伴う皮膚でのエストラジオーが阻害され男性型脱毛症が発症する（図 2）。

ルの減少が、皮膚のステロイド産生系を皮膚ステロイド量

一方で、加齢に伴うびまん性の脱毛、老人性脱毛症ではを維持しようとする方向に働かせ、その結果、皮膚におけ

エストラジオールの低下に応答した皮膚ステロイド産生系

るテストステロンの過剰産生・蓄積を引き起こしたと考えの亢進により、テストステロン濃度が増加する。このテスられる。

トステロンが毛包幹細胞に発現する ZIP 9 を介して体毛の成長を妨げるために、前頭部や頭頂部に限局されないびま

３．２．高齢時の皮膚に存在する高濃度テストステロンが関与する皮膚疾患の解明

ん性の脱毛が生じると考えられる（図 2）。
本研究によって、男性型脱毛症と老人性脱毛症の発症に

次に、高齢マウス皮膚に蓄積したテストステロンが皮膚はどちらの場合も性ステロイドであるアンドロゲンが関わ機能へどのような変化を引き起こすのか、それが老人性ることが分かったが、その発症機序は全く異なるものであ− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図2 若齢時と高齢時の脱毛症発症機序の違い
加齢に伴い皮膚局所でテストステロンが過剰産生・蓄積され出す（図1）。病的高濃度に達したテストステロンは、本来の受容体ではない亜鉛トランスポーター（ZIP9）に作用し、毛包幹細胞の細胞死を誘導することで老人性（びまん性）の脱毛を引き起こす。

った。男性型脱毛症では 5 α- リダクターゼの阻害剤である

謝

辞

フィナステリド、あるいはデュタステリドが治療に用いら

今回の助成により得られた結果は、原著論文として投稿れるが、これらが老人性脱毛症に対しても有効であるとい中であり、本報告書では個々のデータにつきましては掲載

う報告は殆どない。これは本研究成果を考えれば当然であを見送らせて頂きました。ここまで研究をまとめることがり、5 α- リダクターゼを介さない発症機序である老人性脱出来たのは公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団

毛症では 5 α- リダクターゼ阻害剤の効果は少ないと考えらよりご助成頂いたおかげであり心より感謝申し上げます。

れる。

５．総

（引用文献）

括1）「加齢男性性腺機能低下症候群診療の手引き」日本泌尿

加齢に伴う生殖腺の機能低下・老化により、血中の性ス

器科学会 / 日本 Menʼs Health 医学会編

テロイドが減少することはヒトでもマウスでもよく知られ

2） Snyder PJ, Bhasin S, Cunningham GR, Matsumotoている。しかし、体内には様々な内分泌器官があり、生殖AM, Stephens-Shields AJ, Cauley JA, Gill TM,腺由来のホルモンと協働しつつ、各器官が独自の機能を発Barrett-Connor E, Swerdloff RS, Wang C, Ensrud KE,

揮することで生体機能を精緻に制御している。また、生殖Lewis CE, Farrar JT, Cella D, Rosen RC, Pahor M,

腺機能は、加齢に伴う細胞老化などの影響を受けて低下す

Crandall JP, Molitch ME, Cifelli D, Dougar D, Fluharty

ると考えられているが、本研究で対象とした皮脂腺細胞はL, Resnick SM, Storer TW, Anton S, Basaria S, Diem

全分泌という特殊な分泌様式により皮脂を供給しているたSJ, Hou X, Mohler ER 3rd, Parsons JK, Wenger NK,

め、高齢になっても活発に増殖を続けている。従って、加

Zeldow B, Landis JR, Ellenberg SS. Testosterone Trials

齢に伴う生殖腺の機能低下により、血中の性ステロイドレ

Investigators: Effects of Testosterone Treatment in

ベルが大きく低下するが、各内分泌器官は必ずしも器官老Older Men. N. Engl. J. Med., 374, 611-624（2016）．

化・細胞老化を起こしているわけではなく、それぞれの持

3） Yeap BB, Page ST, Grossmann M. Testosterone

つ特性に基づいてそれぞれの臓器の機能的な恒常性を保つ

treatment in older men: clinical implications andように働いていると考えられる。

unresolved questions from the Testosterone Trials.

本研究の成果から、高齢になっても元気に働いている器

Lancet Diabetes Endocrinol., 6, 659-672（2018）．

官・細胞が体内に多く残っていることが示唆された。従っ4） Smith QT, Allison DJ. Changes of collagen contentて、今後の老化研究では臓器や細胞が衰える面にばかり着in skin, femur and uterus of 1 7β -estradiol benzoate-

目するのではなく、体内の器官・細胞が正常に働けるように補助するような新たな観点からのアンチエイジング医学の発展が期待できる。

treated rats. Endocrinology, 79, 486-492（1966）．
5） Nikkari T, Valavaara M. The production of sebum
in young rats: effects of age, sex, hypophysectomy
and treatment with somatotrophic hormone and sex− 122 −

加齢に伴う皮膚のステロイド合成系の変容が皮膚機能に及ぼす影響

induced sebaceous gland differentiation is controlled

hormones. J. Endcrinol., 43, 113-118（1969）．
6） Thornton MJ. The biological actions of estrogens onby an androgen receptor/p5 3 axis. Cell Rep., 3, 4 2 7441（2013）．

skin. Exp. Dermatol., 11, 487-502（2002）．
7） Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, Yoshikawa K,

9） Thomas P, Pang Y, Dong J, Berg AH. Identification

Itami S. Identification of androgen-inducible TGF-β 1

and characterization of membrane androgen receptors

derived from dermal papilla cells as a key mediatorin the ZIP9 zinc transporter subfamily: II. Role ofin androgenetic alopecia. J. Investig. Dermatol. Symp.

human ZIP9 in testosterone-induced prostate andProc., 8, 69-71（2003）．

breast cancer cell apoptosis. Endocrinology, 155, 4250-

8） Cottle DL, Kretzschmar K, Schweiger PJ, Quist SR,

4265（2014）．

Gollnick HP, Natsuga K, Aoyagi S, Watt FM. c-MYC-− 123 −

ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた
合成香料の安全性評価システムの開発
東北大学大学院医学系研究科

樋浦仁

Recently mouse embryonic stem cells have been applied as system for toxicity testing in Europe. However, a mouse ES
cell test (EST) may not be sufficiently rigorous for human toxicity testing, while the use of human ES cell presents an ethicalproblem. Tests using human trophoblastic stem (TS) cells, which are derived from the placenta, sidestep a potential to theseissues. A test based on human TS cell would have relevance to the human embryo during pregnancy and could therefore be
useful in testing low-dose toxic substances, which may alter the epigenome. The purpose of this study is to establish whether
human TS cell have relevance to epigenetic teratogenicity testing. We have developed a new toxic screening methods using
human TS cells to evaluate the effect of the synthetic perfume Hydroquinone (HQ) , 1,3,4,6,7,8-Hexahydro-4,6,6,7,8,8hexamethylcyclopenta[g]- 2 -benzopyran solution (HHCB) and Methyl P-Hydroxybenzoate (MP) 1 ) the rate of cell growth:
human TS cells were more sensitive in growth rate than human ES cells (IC 50 ). 2 ) the rate of trophoblast differentiation:
the differentiation marker, hCGB was increased with dose-dependent manner. 3 ) mRNA expression: micro RNAs (miR1323 , miR- 518 b) are sensitive, with the substance. 4 ) DNA methylation: DNA methylation of imprinted genes (H 19 ,PEG 3 ) are increased with dose-dependent manner. We concluded that we have first establishment human TST method andestablishment of bioassay system of TST. We next will apply the TST method to human disease-specific TS cells.

1. 緒法を確立することを目的とした。

言

2. 方

合成香料は、難分解性で環境中に残出し、食物連鎖を介法

し、ヒト体内に蓄積される傾向にある。また、エストロゲ

2 . 1. 合成香料

ン作用により、胎児の涙腺、肝臓、骨などの奇形の増加も・標準品：多環リスク（HHCB：Sigma-Aldrich 社製）、メ

報告されている 1 , 2）。これらの物質は、妊娠中胎盤を通して、チルパラベン（MP：Sigma-Aldrich 社製）、ハイドロキ

長期間蓄積し、胎児に移行することで、胎児の発育や出生ノン（HQ：㈱和光純薬製）。

後の成長および精神・神経学的な発達に影響を及ぼす可能性もある。従来、動物実験で人体への有毒性を予測してい・標準溶液：標準品を精秤し、エタノール溶液に溶解、標
準原液を調整した。

たが、新法の制定に伴い、ヒト正常培養細胞等を用いて毒性試験を行う必要性が高まっている。しかしながら、ヒト
胎児への細胞毒性機序や代謝動態を in vitro において評価

2 . 2 . ヒト未分化幹細胞株
正常ヒト TS 細胞（男児由来）を供した。

するための、国際基準に基づく毒性試験は未だ確立してい2 . 3 . 細胞へのばく露濃度ない。
最近我々は、世界で初めてヒト胎盤由来未分化幹（TS）
3）

HHCB の場合は、血中濃度 0 倍（溶媒のみ、対照区）、（5細胞の樹立に成功した 。ヒト TS 細胞は、通常分娩後破nM） の 100 倍（500 nM）、500 倍（2 . 5 µM）、1 , 000 倍（5棄される胎盤組織を細胞源とするため、入手に伴う倫理的µM）、5 , 000 倍（25 µM）、10 , 000 倍（50 µM）について検討な問題、量的問題は比較的少ない。そのため、分化誘導系

した。

の確立したヒト TS 細胞の特性を生かし、短期間に低コス

MP、HQ の 場 合 は、0（ 溶 媒 の み、 対 照 区 ）、0 . 01、トで正確な細胞毒性を評価すること（TST 法（図 1））が可能

0 . 05、0 . 1、0 . 5、1 µM を、それぞれ TS 細胞培養液に添加であると期待される。本研究では、化学物質の低濃度かつした。

長期間ばく露による子宮内の有害性評価法として、TST

2 . 4 . 培養条件
ガ ラ ス 4 -well プ レ ー ト は、2 種 類（BD Falcon 社 製、Development of cosmetics safety test
using human trophoblast stem cells
Hitoshi Hiura
Graduate School of Medicine, Tohoku
University

Nunclon Surface 社製）で検討した。培養液には蒸散防止のため Sydney IVF culture oil（Cook 社）を無血清積層し、37 ℃、5 %CO 2 条件下で細胞培養を実施した。1 ウェルあたり 5 × 104 個の TS 細胞を、TS 細胞培養液にて播種後、翌日に化学物質を含んだ TS 細胞培養液に培地交換し、培− 124 −

ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発

図 1 TST 法の概要
細胞増加抑制と化学物質濃度などの相関について検討し、安全域と危険域を設定する。

養を行った。

（倫理面への配慮）

2 . 5 . 培養条件

「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」
および各

ヒトゲノム・遺伝子解析研究にあたっては、関係法令と培養液は血清無添加で、増殖因子は必要最小限とした。

研究機関の規程に従い、東北大学大学院医学系研究科ヒト
ゲノム・遺伝子解析倫理審査委員会の審査を経たのち、実2 . 6 . バイオアッセイ系の検討施した。ヒト胎盤幹（TS）細胞は、試料提供者の利益・不2. 6. 1.

利益を十分に説明した上で同意書を取得して実施した。法

細胞増殖能

血球計算盤を用いて細胞数を計測し、50 % 阻害濃度

心の注意を払い、本研究を実施した。

（IC 50）を算出した。
2. 6. 2.

令、指針、規定を遵守し、試料管理・個人情報保護には細

細胞分化能

3. 結

10 視野における巨細胞（合胞体性栄養膜細胞）の出現数を測定した。また、分化マーカー遺伝子（TP 63、HLA-G、

3 . 1. バイオアッセイ系の検討（急性毒性試験）

hCGB）の発現量を定量化した。
2. 6. 3.

果ヒ ト TS 細 胞（46 XY） に 血 中 濃 度 を 参 考 に 化 学 物 質

遺伝子発現の解析（HHCB、MP および HQ）を 5 段階の濃度で培養液に添加し、インプリント遺伝子および低分子 RNA（miRNA）の遺

ガラス製培養ディッシュにて、3 日間培養した。培養終了

伝子発現量を定量化した。H 19 , IGF 2 , MEST, PEG 3 お

時に細胞形態を観察および細胞数を計測し、micro RNA

よびヒト 19 番染色体上の miRNA クラスター C 19 MC をを含む total RNA およびゲノム DNA を抽出した。以下の構成し、インプリンティングを受ける miRNA（miR- 520 h,

4 つのバイオアッセイ系で評価し、プロトタイプを開発した。

miR- 1323 および miR- 518 b）の発現量を検討した。イン

3. 1. 1.

細胞増殖能

プリント遺伝子には GAPDH を、miRNA には snoRNA で

TS 細 胞 に お け る 50 % 阻 害 濃 度（IC 50） は、HHCB：

ある RNU 44 を用いて内部補正した。インプリント遺伝子0 . 06 µM、HQ：3 . 80 µM であった。また、ヒト ES 細胞のの発現アレルについては、gDNA および cDNA を用いて

HHCB の IC 50 は 0 . 5 µM で あ り、HQ 50 µM で、TS 細 胞

PCR-RFLP（制限酵素多型解析）を用いて定量解析した。

の方が高感変性であることが判明した。細胞の細胞数は対2. 6. 4.

照区と比較して 25 . 6 ％しか減少しなかった（図 2）。

DNA メチル化解析

5 種類のインプリントを遺伝子の制御領域であるアレ
ル 特 異 的 メ チ ル 化 領 域（DMR）（H 19 , PEG 3 , MEST,

3. 1. 2.

細胞分化能

分化マーカーの遺伝子発現は、HHCB 添加 TS 細胞では、C 19 MC, IG-DMR）について、COBRA 法にて DNA メチル

hCGB（合胞体性栄養膜細胞マーカー）は濃度依存的に発化レベルを定量した。また、ゲノムレベルの DNA メチル

現が亢進し、対照区と比較して hCGB は最大 4 . 62 倍まで化解析には、LINE- 1 のメチル化について解析した。

亢進していた（図 3）。

− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 2 細胞増殖能
50％阻害濃度（IC50）：0.06µM（HHCB）, 3.80µM（HQ）

図 3 細胞分化能
濃度依存的に分化能は亢進している。

3. 1. 3.

3 . 2 . 遅発性効果試験の検討

遺伝子発現

インプリント遺伝子の発現では、HHCB 添加 TS 細胞でヒト未分化幹細胞（TS 細胞）に化学物質（HHCB, MP,

は、miR- 1323 および miR- 518 b は濃度依存的に発現減少HQ）を血液濃度を参考に 100 倍濃度までの単独で 5 段階希し、miR- 1323 は対照区と比較して最大 0 . 35 倍まで減少し、釈法により培養した。TS 細胞は、3 日目、7 日目、14 日目、

miR- 518 b は対照区と比較して最大 0 . 52 倍まで減少した。

21 日目に回収し、ゲノム DNA を抽出した。細胞形態学

一方、HQ 添加 TS 細胞では、miR- 1323 は濃度依存的に発的特性と 5 種類のインプリンティングを受ける遺伝子のア

現亢進し、対照区と比較して最大 2 . 33 倍まで亢進していレル特異的メチル化領域（H 19 , PEG 3 , MEST, C 19 MC,た（図 4）。また、ヒト TS 細胞の遺伝子多型がいずれもホIG-DMR）を対象としたエピゲノム（DNA メチル化）の定量

モ接合型であったため、発現アレルについては明らかにす解析を行い、TST 法による細胞毒性評価の有用性についることができなかった。

て検討した。基準値の 100 倍濃度の化学物質の添加では、

3. 1. 4.

顕微鏡学的に細胞形態の変化や増殖能に著しい変化はみら

DNA メチル化解析

HHCB 添 加 TS 細 胞 で は LINE-1 , H 19 , IG-DMR,

れなかった。DNA メチル化の定量解析では、血中濃度おPEG 3 , C 19 MC が濃度依存的にメチル化はわずかに亢進しよび 10 倍濃度で培養の期間に関わらず、インプリント遺ていた。一方、HQ 添加 TS 細胞では LINE-1 , H 19 および伝子に顕著な変化はみられなかった。しかし、血中濃度のPEG 3 が濃度依存的にメチル化はわずかに亢進していた。

100 倍濃度の HHCB を添加した場合には、培養期間が長期に及ぶと IG-DMR のメチル化が低下することが確認された（図 5）。

− 126 −

ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発

図 4 遺伝子発現解析
一部のインプリント遺伝子の発現は濃度依存的な変化を示す。

図 5 遅発性効果試験
血中濃度の 100 倍濃度のハイドロキノン（HQ）を添加した場合には、培養期間が長期に及ぶと IG-DMR のメチル化が低下することが確認された。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

4. 考

表１

察

化学物質による DNA メチル化への影響

最近の毒性評価試験では、動物実験の代替法として、invitro 発生毒性試験法が求められている。本研究では、分化誘導型ヒト胎盤幹（TS）細胞を用い、単一な化学物質ば
く露ではなく、低濃度でも長期間および複合ばく露による細胞毒性について、様々な異常に対する毒性評価法を確立することを目的とし、TST 法のプロトタイプを開発した。

三角（▲）は、メチル化の変化（15% 以下）を示す。

特に、エピゲノム変異検出系は、低用量でも残留性、遅発性の有害事象の指標として、有用な子宮内環境評価法となれている開発品品目数は 2004 年度末で 576 品目（医薬産業る可能性がある。

政策研究所ニュース No. 19 2006 年）であることから、年間

急性、遅発性効果試験のメチル化の変化の結果のまとめ

5000 億円以上の市場が見込まれる。加えて、動物福祉のを表 1 に示す。化学物質ばく露における急性、遅発性効果

観点からも現行の動物実験に代わるシステムの実用化が求について、インプリント遺伝子のメチル化に変化がみられめられている。2007 年時点で、動物実験代替システムのたことから、本法の有用性について確認することができた。

市場は 6 億円（日経バイオ年鑑 2007 年）と見積もられていしかし、複数の細胞での確認や、複合ばく露の影響についるが、今後急速な伸長が見込まれている。したがって、本ては、さらなる検討を行う必要がある。TST 法は、細胞研究開発により、TST 法を用いた有用な毒性試験システ

を分化誘導することで異常が生じる過程を培養下に詳細にムを構築することで、新有効成分含有医薬品の承認にかか観察し、評価することが可能であるため、動物実験代換シる費用や期間が削減できることに加え、動物代替システム

ステムとして、医薬品、食品、化粧品開発においての毒性として広く利用可能であり、今後、様々な研究の発展への評価に大変有用であると期待される。

貢献が期待できる。

国内の新有効成分含有医薬品の承認数は、2005 年で 175. 総件であり、1994 年のピーク時から半分以下に減少してい括る。一方、研究開発費は 1990 年以降、年々上昇しており、ヒト未分化胎盤幹細胞は、低用量でばく露された有害物

2005 年は、1990 年時の 2 . 5 倍の約 9 , 000 億円に達してい質の影響を検出するための、新たな薬物毒性評価法の細胞る（日本製薬工業協会

DATE BOOK 2007）。これは、臨源を提供する。同時に、ヒト疾患との関連性を解明してい

床段階における安全性や優位性の評価が問題となることが

く上でも有用であると考えられる。さらに、エピゲノム変原因といわれており、世界的にも同様の傾向を示している。

異は、先天性疾患に限らず、乳幼児の行動や発達障害（自この問題を解決するためには、化学物質の安全性、有効性

閉症、ADHD 等）にも影響を与えるため、TST 法は、疾患を早期に確認することが重要であり、臨床試験の前段階との発症予防のための国際基準に適合する重要な解析法とななる非臨床試験の結果により、薬剤の安全性が十分に確りうる。今後はさらなる性能評価を行うとともに、EST保される必要がある。非臨床において、ヒト TS 細胞を用法との比較を行う。また、可能であれば機能未知の化学物いた評価を行うことで、動物実験や従来のマウス ES 細胞質についても TST 法による評価を加えていく。

の試験

4 , 5）とは異なり、種による薬物反応の違いを解消し、

ヒト胎盤幹細胞を用いたエピゲノム変異検出系による化より生体内の反応を反映した検査を行うことが可能となる。

学物質毒性評価法は、多様な非特定化学物質の影響を単一

また、ヒト ES 細胞など、ヒト由来細胞を使用する場合は、細胞の分化・形態変化および遺伝子修飾機構として鋭敏に入手の難しさや倫理的問題が想定されるが、通常分娩後に反映するため、短時間かつ容易に解析が可能な信頼性の高廃棄される胎盤より作り出される TS 細胞の場合は、これい試験法と期待できる。また、単に個別物質の安全性評価

らの問題が解消され、短時間で測定が可能となることからを行うものではなく、低用量でかつ長期間ばく露された有コスト面でも有用である。

害物質や複合ばく露汚染などの影響も検出可能な、体系的、

医新有効成分医薬品の場合、毒性試験は ⑴ 単回投与毒統合的な胎児・胎盤の評価手法となる可能性が高い。今後、性試験、⑵ 反復投与毒性試験、⑶ 遺伝毒性、⑷ 生殖発生

妊娠中の様々な基礎化粧品や植物オイルなどが胎児に及ぼ

毒性試験を実施することが求められる。1 つの開発品におす影響についても、応用することが可能となると考える。

けるこれらの毒性試験に要する費用は、最低でも 10 億円といわれている（平成 16 年度～平成 17 年度調査報告「ヒト（引用文献）

等の細胞を使った化学物質の影響評価試験手法の現状と課

1） Eisenhardt S et al. Nitromusk compounds in women

題に関する調査（バイオ分野）」）。国内で臨床開発が進めらwith gynecological and endocrine dysfunction. Environ− 128 −

ヒト未分化胎盤幹細胞を用いた合成香料の安全性評価システムの開発

4） Buesen R et al. Trends in improving the embryonicRes. 87 : 123-130.2001.
2） Kalfa N et al. Is Hypospadias Associated with
Prenatal Exposure to Endocrine Disruptors? A French

stem cell test（EST）: an overview. ALTEX. 21（1）: 1522. 2004.

Collaborative Controlled Study of a Cohort of 3 0 0

5） Genschow E, et al. Validation of the embryonic stem

Consecutive Children Without Genetic Defect. Eurcell test in the international ECVAM validation study

Urol. 68（6）: 1023-30. 2015

on three in vitro embryotoxicity tests. Altern Lab

3） Okae H et al. Derivation of Human Trophoblast

Anim. 32（3）: 209-44. 2004.

Stem Cells. Cell Stem Cell. 22（1）: 50-63. 2018.

− 129 −

皮膚保湿マーカー遺伝子 FABP5 の発現と機能制御機構の解析
信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所

藤井博

The fatty acid-binding proteins (FABPs) are a family of low-molecular weight, intracellular lipid-binding proteinsconsisting of ten isoforms. FABPs are involved in uptake and transport of fatty acids. Recent studies have shown that FABPs
play important roles in the regulation of gene expression, cell growth and differentiation.
In the present study, we have shown that epidermal fatty acid-binding protein (FABP 5 ), of these isoforms, is specifically
expressed in undifferentiated and differentiated human epidermal keratinocytes. Its expression level in differentiatedkeratinocytes is higher than that in undifferentiated cells. To clarify mechanisms of FABP 5 gene expression and its
function during epidermal keratinocytes differentiation. As a result, the methylation status of CpG island in FABP 5 genepromoter was almost the same between before and after keratinocytes differentiation. Furthermore, c-Myc and Sp 1 ,potent transcription factors involved in FABP 5 gene expression were unchanged during keratinocytes differentiation.
Therefore, other unknown factors could be responsible for the regulation of FABP 5 gene expression during keratinocytes
differentiation.
To clarify function of FABP 5 during the course of differentiation of epidermal keratinocytes and in the differentiatedepidermal keratinocytes, we have next tried to do the knockdown of FABP 5 gene with siRNA. As a result, we have shownthat FABP 5 knockdown reduced expression levels of the differentiation marker such as Keratin 10 , suggesting that FABP 5
might play an important role in regulating human keratinocytes differentiation. In addition, we showed that nuclear receptor
ERRα which have been shown to crosstalk with FABP 5 are involved in regulation of keratinocytes differentiation.  Further
studies should be needed to clarify its mechanisms in the future.
Thus, the present study suggests that FABP 5 could be a promising molecular target to study homeostasis, aging andinflammation in human epidermal keratinocytes.

1. 緒

湿において重要な機能を果たしていることを明らかにし言た 1 - 3）（図 1）。一方、脂肪酸の細胞内輸送に関与している

皮膚の表皮基底層幹細胞は、皮膚の恒常性維持において

FABP 5 は転写因子 c-Myc とともに、TA 細胞のマーカー

重要な機能を担っている。また、表皮基底層幹細胞が分化遺伝子として同定されていることから、表皮角化細胞のした TA 細胞（Transit amplifying cell）は、幹細胞に比べ

FABP 5 遺伝子の恒常的な発現と機能制御が、健康的な皮て高い細胞増殖・分化能をもち、皮膚の創傷治癒力や老化膚（しわのない弾力性に富んだ肌）の形成と抗老化においてにおいて重要な機能を果たしていると考えられているが、重要であると考えられる。著者らは、がん細胞において、その分子基盤は明らかにされていない。したがって、皮膚FABP 5 が転写因子 c-Myc の標的遺伝子であることを明らの幹細胞・TA 細胞・表皮角化細胞の恒常性維持機構の解かにしていることから 4）、本研究課題では、皮膚表皮角化

明は、コスメトロジーの発展（アンチエイジング化粧品の細胞の保湿や抗老化における c-Myc 依存的な FABP 5 遺伝開発など）に貢献するだけでなく、皮膚の健康維持・増進、子の転写制御機構とその生理的意義の解明を目指している。

皮膚疾患の予防・治療法の開発などにも貢献する可能性が期待される。

また、著者らは、正常細胞では発現していない FABP 5が転移能を獲得した悪性がん細胞（前立腺がん、乳がん、皮膚の水分保護バリアー形成や脂質代謝は、皮膚の保大腸がんなど）においてエピジェネティックな機構（DNA 脱湿において重要である。詳細な分子機構は不明である

メチル化）で高発現し、FABP 5 の発現レベルとがんの増が、著者らは皮膚の表皮有棘層、顆粒層および皮脂腺な殖能・転移能獲得が密接に関係していることを見出した 4 - 9）。

どの細胞で発現している上皮細胞型脂肪酸結合タンパク

さらに、FABP 5 が核内受容体 ERRα シグナルとクロスト質（FABP 5 : Fatty acid-binding protein 5）が、皮膚の保ークし、エネルギー代謝系やミトコンドリアの機能を制御

Expression and functional analyses ofmoisturizing gene FABP 5 in the skin
Hiroshi Fujii
Department of Interdisciplinary Genome
Sciences and Cell Metabolism, Institute for
Biomedical Sciences, Interdisciplinary
Cluster for Cutting-Edge Research, Shinshu
University

することによって、がん細胞の増殖促進に関与することを明らかにした 10）。したがって、このシグナル伝達経路が、表皮基底層幹細胞・TA 細胞や表皮角化細胞でも機能しているかどうかを検証することは、これらの細胞のエネルギ
ー代謝や恒常性維持機構を解明する上で重要である。
前述したように、FABP 5 は表皮基底層幹細胞や TA 細胞のマーカー遺伝子としても同定されているが、表皮基− 130 −

皮膚保湿マーカー遺伝子 FABP5 の発現と機能制御機構の解析

図 1 皮膚細胞における FABP5 の発現
文献 1 を一部改変。ラット皮膚組織における FABP5 の発現を解析した。mRNA（左）とタンパク質（右）の発現を、それぞれ In situ hybridization、Immunohistochemistryで解析した。表皮細胞では、主に有棘層や顆粒層の細胞で発現していた。また、皮脂腺でも強い発現がみられた。

底層幹細胞・TA 細胞や表皮角化細胞の分化過程におけSp 1 の発現レベルを qPCR で解析した。表皮角化細胞の分る FABP 5 遺伝子の発現制御機構や機能は解明されていな化マーカーとして、Keratin 10 などを用いた。

い。一方、著者らは、FABP 5 遺伝子が正常ヒト前立腺細胞のがん化過程で、転写因子 c-Myc および Sp 1 の誘導とFABP5 遺伝子プロモーター領域の DNA 脱メチル化によっ

2 . 4. ヒト表皮角化細胞の分化過程におけるFABP5の細胞内局在て高発現し、前立腺がん細胞の増殖・転移能獲得において重未 分 化 および 分 化した 表 皮 角 化 細 胞をそれぞ れヒト

要な機能を果たしていることを見出している 4 , 10 - 11 , 13）。した

FABP 5 抗 体 と 反 応 さ せ、 分 化 前 後 の 細 胞 に お け る

がって、本研究課題では、正常ヒト新生児表皮角化細胞の

FABP 5 の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で評価した。

分化過程および分化した表皮角化細胞における FABP 5 遺細胞核は、Hoechst 33342 で染色した 10）。

伝子の発現制御機構と機能の解明を目的とした。

2. 方

2 . 5 . FABP 5 遺伝子プロモーター領域（CpGアイランド）のメチル化状態の解析法

2 . 1. ヒト表皮角化細胞の培養

未分化および分化した表皮角化細胞を一定時間培養後、本研究では、増殖能と分化能を有する正常ヒト新生児表各細胞からゲノム DNA を調製後、バイサルファイトシー

皮角化細胞（NHEK（NB）、クラボウ）を表皮角化細胞としクエンス法で、ヒト FABP 5 遺伝子プロモーター領域
（CpG

2+

て用いた。また、表皮角化細胞の分化は、培地に Ca （最アイランド）のメチル化状態を解析した 5）。

終濃度 1 mM）を添加し、一定時間培養後、分化マーカー
遺伝子の発現を解析することによって評価した。表皮角2化細胞は、2500 個 /cm の密度で播き、5 〜 6 日間培養後、30 - 80 % コンフルエントになる前に 2 次培養した。

2 . 6 . ヒト表皮角化細胞におけるFABP 5 遺伝子の機能解析
表皮角化細胞の FABP 5 遺伝子を siRNA でノックダウン
し、48 時間後に Ca 2 + 添加によって分化誘導した。48 時間

2 . 2 . FABP アイソフォーム遺伝子の発現解析

培養後、分化マーカー遺伝子（Keratin 10 など）の発現レベ

未分化および分化した表皮角化細胞からそれぞれ

ルを qPCR で評価した。FABP 5 遺伝子のノックダウンは、

mRNA を調製後、ヒト FABP アイソフォーム遺伝子の発mRNA（qPCR）とタンパク質（ウエスタンブロット）の発現レベルを半定量 RT-PCR で解析した。

現レベルで確認した。

2 . 3 . FABP 5 および他の関連遺伝子の発現解析
表皮角化細胞を一定時間培養後、細胞から mRNA を調2 . 7. ヒト表皮角化細胞における核内受容体シグナルの機能解析

製後、目的遺伝子の発現（mRNA）レベルを qPCR で解析し表皮角化細胞において、核内受容体とその関連遺伝子

た。また、FABP 5 遺伝子の転写制御に関与する c-Myc と（ERRα, β, γ、PPARα, β/δ, γ、PGC- 1 α, β など）の発現を解− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

析した。また、比較的発現レベルの高い ERRα と PPAR β/各細胞からゲノム DNA を調製後、バイサルファイトシー

δ について、表皮角化細胞の分化過程における機能を評価

クエンス法で、FABP 5 遺伝子プロモーター領域（CpG アした。まず、各遺伝子を siRNA によってノックダウンし、

イランド）のメチル化状態を解析した。その結果、両細2+

48 時間後に Ca 添加によって分化誘導した。48 時間経

胞由来の FABP 5 遺伝子プロモーター領域は、ほぼ同程

過後、分化マーカー遺伝子の発現レベルを qPCR で解析し、度に脱メチル化されていた。したがって、FABP 5 遺伝

ERRα と PPARβ/δ の表皮角化細胞の分化過程に与える影子の発現に重要な転写因子 c-Myc の結合サイト（E-box:

響を評価した。

CAGCGTG, 転写開始点下流にクラスター形成）は、未分
化・分化表皮角化細胞で脱メチル化されていることがわか2 . 8 . ヒト表皮角化細胞における FABP 5 と核内受容体シグナルのクロストーク機構の解析
表皮角化細胞において、FABP 5 が核内受容体 ERRα シった（図 3 , 上流（プロモーター + エキソン 1）領域 ; 分化前：98 . 7 ± 0 . 4 %, 分化後：99 . 3 ± 0 . 3 %, 下流（イントロン 1）
領域 ; 分化前：99 . 7 ± 0 . 3 %, 分化後：98 . 5 ± 1 . 3 %）。

グナル伝達系とクロストークしているかどうか解析した。
FABP 5 遺伝子を siRNA でノックダウンし、ERRα の標的遺伝子（mRNA）の発現レベルを qPCR で解析した。

3. 結

3 . 3 . FABP 5 遺伝子の発現に関与している転写因子 c-MycとSp1 の発現解析
次に、未分化および分化した表皮角化細胞における果

c-Myc と Sp 1 の発現レベルを解析した。表皮角化細胞を3. 1. ヒト表皮角化細胞の分化過程におけるFABPア
イソフォームの発現解析

一定時間培養後、分化過程における c-Myc と Sp 1 の発現を qPCR で解析したところ、未分化と分化細胞で各遺伝子

未分化および分化した表皮角化細胞において、10 種類のの発現レベルに有意な差はみられなかった。したがって、

ヒトFABP アイソフォーム遺伝子の発現レベルを半定量 RT-

分化に伴い FABP 5 遺伝子の発現が亢進するのは、表皮角PCR で解析した。その結果、図 2 に示すように、FABP 5化細胞の分化過程で FABP 5 遺伝子プロモーター領域の脱が未分化および分化した表皮角化細胞において、特異的にメチル化や c-Myc と Sp 1 の発現レベルが亢進するためで発現していることがわかった（図 2）。また、未分化細胞にはないことが示唆された。今後、表皮角化細胞の分化に伴比べて分化した細胞の方が、FABP 5 遺伝子の発現レベル

い FABP 5 遺伝子の発現が亢進するメカニズムの解明が必が 3 〜 4 倍高いことがわかった。すなわち、FABP 5 は増殖要である（図 3）。

能と分化能をもつ表皮角化細胞（NHEK）でも少量発現してわかった。したがって、FABP 5 は未分化・分化表皮角化

3 . 4 . ヒト表皮角化細胞における FABP 5 遺伝子の機能解析

細胞において重要な機能を果たしている可能性が示唆された。

これまで、表皮角化細胞の分化過程および分化した表皮

いるが、分化した細胞においてより高発現していることが角化細胞における FABP 5 の詳細な機能は解明されていな

3. 2 . ヒト表皮角化細胞の分化過程におけるFABP5い。したがって、FABP 5 遺伝子の siRNA によるノックダ

遺伝子プロモーター領域のメチル化状態の解析

ウンで、表皮角化細胞の分化マーカー遺伝子の発現レベル

未分化および分化した表皮角化細胞を一定時間培養後、を qPCR で評価し、表皮角化細胞の増殖および分化過程に

図 2 ヒト表皮角化細胞では FABP が特異的に発現する
未分化および分化誘導した正常ヒト新生児表皮角化細胞（NHEK）から mRNA を調製後、ヒト
FABP アイソフォーム遺伝子（mRNA）の発現を半定量 RT-PCR で解析した。ヒト表皮角化細胞では、FABP5 が特異的に発現していた。FABP5 の発現は、未分化表皮角化細胞（（-）， Ca2+ 無添加）
2+では低レベルであったが、分化した細胞（（+），Ca 添加）では、発現が 3 〜 4 倍亢進した。

− 132 −

皮膚保湿マーカー遺伝子 FABP5 の発現と機能制御機構の解析

おける FABP 5 の機能を解析した。その結果、未分化表皮された。

角化細胞において FABP 5 遺伝子のノックダウンによって、表皮角化細胞の分化マーカー遺伝子（Keratin 10）の発現レ
ベルが有意に低下した（図 4）。したがって、FABP 5 は表

3 . 5. ヒト表皮角化細胞の分化過程におけるFABP5の細胞内局在の解析

皮角化細胞の分化や分化マーカー遺伝子（Keratin 10）の発

未分化および分化した表皮角化細胞における FABP 5 の現制御において、重要な機能を果たしている可能性が示唆

細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。その結図 3 ヒト表皮角化細胞における FABP5 遺伝子発現制御機構の解析
未分化および分化誘導した正常ヒト新生児表皮角化細胞 (NHEK) からゲノム DNA を調製し、FABP5 遺伝
子プロモーター領域（CpG アイランド）のメチル化状態を解析した。その結果、ほとんどの領域の CpG アイ
ランドが、いずれの細胞でも脱メチル化されていた（図中○）。また、FABP5 遺伝子の発現に関与する主要な転写因子 c-Myc と Sp1 の発現レベルも、分化・未分化細胞でほとんど変化はみられなかった。表皮角化細胞の分化に伴い FABP5 遺伝子の発現が亢進するメカニズムは不明。

図 4 ヒト表皮角化細胞における FABP5 の機能解析
未分化の正常ヒト新生児表皮角化細胞（NHEK）で発現している FABP5 遺伝子を siRNA でノックダウンし、
48 時間後に Ca2+ 添加によって細胞を分化誘導した。さらに 48 時間培養後、分化マーカー遺伝子（Keratin
10 など）の発現レベルを qPCR で評価した（左）。FABP5 遺伝子のノックダウンの確認は、mRNA（左）とタンパク質（右）の発現レベルで評価した。

− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

果、未分化表皮角化細胞では、細胞質に比べて核内に多までに脂肪酸の細胞内輸送に関与している FABP 5 が表皮

く局在している傾向があった。一方、分化した細胞では、

有棘層、顆粒層、および皮脂腺などの細胞で発現し、皮膚FABP 5 の発現上昇に伴い、核内だけでなく細胞質にも局の水分保護バリアー形成や脂質代謝制御において重要な機在がみられた。未分化および分化後の表皮角化細胞におけ能を果たしていることを見出したが 1 - 3）、その分子基盤やる FABP 5 の細胞内局在と機能の関係について、今後詳細

表皮角化細胞における FABP 5 遺伝子の機能や発現制御機な解析が必要である。

構は解明されていない。
一方、これまでに FABP 5 が転移能を獲得した悪性がん

3 . 6 . ヒト表皮角化細胞における核内受容体シグナルの機能解析

細胞（前立腺がん、大腸がん、乳がんなど）において高発現

次に、核内受容体遺伝子（ERRα、PPARβ/δ など）が表皮

ー領域のメチル化状態と FABP 5 遺伝子の発現レベルが密角化細胞の分化過程に関与しているかどうか検討した。各接に関係していることを明らかにしている 4）。FABP 5 遺遺伝子特異的 siRNA によるノックダウンによって分化マ

伝子プロモーター領域の CpG アイランドががん化過程でーカー遺伝子の発現レベルを qPCR で解析し、これらの核脱メチル化され、E-box（CAGCGTG）の脱メチル化に伴内受容体遺伝子の表皮角化細胞分化過程に与える影響を評って、c-Myc 依存的な FABP 5 遺伝子の転写活性化が起こ価した。その結果、未分化表皮角化細胞の ERRα あるいはることを明らかにした 4）。しかしながら、表皮角化細胞でPPARβ/δ 遺伝子のノックダウンによって、表皮角化細胞

は、分化に伴い FABP 5 遺伝子の発現は有意に上昇していの分化マーカー遺伝子（Keratin 10 など）の発現レベルが有

たが、FABP 5 遺伝子プロモーター領域（CpG アイランド）意に低下した。したがって、ERRα や PPAR β/δ は、表皮角

は、分化および未分化の両細胞間でほとんど差はみられず、化細胞の分化あるいは分化マーカー遺伝子の発現制御にお脱メチル化されていた。さらに、FABP 5 遺伝子の発現いて、重要な機能を果たしている可能性が示唆された。

に重要な転写因子 c-Myc と Sp 1 の発現レベルについても、していることを見出しており、FABP 5 遺伝子プロモータ

分化・未分化細胞間でほとんど差がみられなかった。今後、

3 . 7. ヒト表皮角化細胞におけるFABP 5 と核内受容体シグナルのクロストーク機構の解析

表皮角化細胞の分化に伴い FABP 5 遺伝子の発現が亢進す

未分化表皮角化細胞の FABP 5、ERRα および PPARβ/δ

次に、表皮角化細胞の分化過程、および分化した表遺伝子の siRNA によるノックダウンによって、表皮角化

皮角化細胞における FABP 5 の機能を解明するために、細胞の分化マーカー遺伝子（Keratin 10 など）の発現レベル

FABP 5 遺伝子のノックダウンによって分化マーカー遺伝が有意に低下した。したがって、これらの遺伝子は表皮角子の発現レベルを qPCR で評価した。その結果、未分化表化細胞の分化や分化マーカー遺伝子の発現制御において、

皮角化細胞の FABP 5 遺伝子ノックダウンによって、表皮重要な機能を果たしている可能性が示唆された。

角化細胞の分化マーカー遺伝子（Keratin 10）の発現レベル

るメカニズムの解明が必要である。

次に、表皮角化細胞において、FABP 5 が ERRα シグナが有意に低下した。したがって、FABP 5 は表皮角化細胞

ル伝達系とクロストークしているかどうか解析した。その分化あるいは分化マーカー遺伝子の発現制御において、の結果、FABP 5 遺伝子のノックダウンによって ERRα の重要な機能を果たしている可能性が示唆された。

いくつかの標的遺伝子の発現が有意に低下したことから、

また、未分化表皮角化細胞の ERRα および PPARβ/δ 遺

表 皮 角 化 細 胞 に お い て も、FABP 5 と ERRα シ グ ナ ル が伝子のノックダウンによって、表皮角化細胞の分化マーカ

クロストークしている可能性が示唆された。上記 3 . 5 . でー遺伝子（Keratin 10 など）の発現レベルが有意に低下した

FABP 5 は表皮角化細胞において核内に局在していることことから、ERRα や PPAR β/δ は、表皮角化細胞の分化あから、FABP 5 と ERRδ シグナルのクロストークは、表皮

るいは分化マーカー遺伝子の発現制御において、重要な機角化細胞における FABP 5 の機能発現に重要である可能性能を果たしている可能性が示唆された。今後、表皮角化が示唆された。

細胞における ERRα や PPARβ/δ の機能を解明するために、

4. 考

ERRα や PPARβ/δ の標的遺伝子の同定とその機能解析が必察要である。興味深いことに、FABP 5 遺伝子のノックダウ

表皮基底層幹細胞が分化した TA 細胞は、幹細胞に比べンによって ERRα の標的遺伝子の発現が有意に低下したこて高い細胞増殖能と分化能をもち、皮膚の創傷治癒力や老とから、表皮角化細胞において、FABP 5 が ERRα シグナ

化において極めて重要な機能を果たしていると考えられて

ルとクロストークしている可能性が示唆された。FABP 5いる。FABP 5 は TA 細胞のマーカー遺伝子として報告さは未分化表皮角化細胞では核内にも局在していることから、れているが、TA 細胞における FABP 5 遺伝子の発現制御

FABP 5 と ERRα シグナルのクロストークは、がん細胞の機構および機能は解明されていない

14）。著者らは、これ場合と同様に、表皮角化細胞における FABP 5 の機能発現− 134 −

皮膚保湿マーカー遺伝子 FABP5 の発現と機能制御機構の解析に重要であることが示唆された。今後、詳細な解析が必要

marker and target for tumougigenicity-suppressionである。

Int. J. Oncol. 32: 767-775, 2008

本研究課題は、皮膚の恒常性維持において重要な遺伝子

7） J. Adamson, E. A. Morgan, C. Beesley, Y. Mei, C. S.

として同定された FABP 5 の表皮角化細胞における発現とFoster, H. Fujii, Y. Ke, High level expression of cutaneous

機能制御機構の解明を目指したものである。得られた研究

fatty acid-binding protein in prostatic carcinomas and its

成果は、保湿効果やアンチエイジング作用を有する化粧品

effect on tumorigenecity. Oncogene 22（18）: 2739-2749,の開発など、コスメトロジーの発展に貢献する可能性が期2003待される。さらに、本研究課題の所期成果は、FABP 5 お8） C. Jing, C. Beesley, C. S. Foster, H. Chen, P. S.

よび核内受容体（PPARβ/δ、ERRα など）シグナルの破綻に

Rudland, D. C. West, H. Fujii, Y. Ke, Human cutaneous

起因する皮膚疾患（がん、乾鮮、炎症など）の予防・治療法

fatty acid-binding protein induces metastasis by up-の開発、老化メカニズムの解明などにも貢献する可能性がregulating the expression of vascular endothelial

期待される。このように、本研究課題の成果は、コスメト

growth factor gene in rat Rama 3 7 model cells.

ロジーおよび医療分野におけるイノベーション創出に貢献

Cancer Res. 61: 4357-4364, 2001
9） C. Jing, C. Beesley, C. S. Foster, P. S. Rudland, H.

する可能性が期待される。
最後に、本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーFujii, T. Ono, H. Chen, P. H. Smith, Y. Ke, Identification

セーコスメトロジー研究財団の研究助成をいただき、深謝

of the messenger RNA for human cutaneous fatty

いたします。

acid-binding protein as a metastasis inducer. Cancer
Res. 60 : 2390-2398, 2000

（引用文献）

10）S. Senga, K. Kawaguchi, N. Kobayashi, H. Fujii,

1） R. Watanabe, H. Fujii, A. Yamamoto, H. Yamaguchi,

A novel Fatty acid-binding protein 5 -Estrogen-

T. Takenouchi, K. Kameda, M. Ito, T. Ono, Expression

relatedreceptor α signaling pathway promotes cellof cutaneous fatty acid-binding protein and its mRNA

growth and energy metabolism in prostate cancer cells.
Oncotarget 9（60），31753 - 31770 , 2018

in rat skin. Arch. Dermatol. Res. 288: 481-483, 1996
2） R. Watanabe, H. Fujii, A. Yamamoto, T. Hashimoto,11）S. Senga, N. Kobayashi, K. Kawaguchi, A. Ando, H.

K. Kameda, M. Ito, T. Ono, Immunohistochemical

Fujii, Fatty acid-binding protein 5（FABP 5）promotes

distribution of cutaneous fatty acid-binding protein in

lipolysis of lipid droplets, de novo fatty acid（FA）

human skin. J. Dermatol. Sci. 16: 17-22, 1997

synthesis and activation of nuclear factor-kappa B

3） H. Yamaguchi, A. Yamamoto, R. Watanabe, N. Uchiyama,（NF-kB）signaling in cancer cells. BBA-Molecular

T. Ono, H. Fujii, M. Ito, High transepidermal water loss

and Cellular Biology of Lipids 1863 , 1057 - 1067 , 2018

induces fatty acid synthesis and cutaneous fatty acid-12）K. Watanabe, H. Fujii, T. Takahashi, M. Kodama, Y.

binding protein expression in rat skin. J. Dermatol. Sci.

Aizawa, T. Ono, G. Hasegawa, M. Naito, T. Nakajima,

17: 205-213, 1998

Y. Kamijyo, F. J. Gonzalez, T. Aoyama, Constitutive4） K. Kawaguchi, A.Kinameri, S. Suzuki, S. Senga,

regulation of cardiac fatty acid metabolism throughY. Ke, H. Fujii, The Cancer-Promoting Gene Fatty

peroxisome proliferator-activated receptor α（PPARα）

Acid-Binding Protein 5（FABP5）is Epigeneticallyassociated with age-dependent cardiac toxicity. J. Biol.

Regulated During Human Prostate Carcinogenesis.

Chem. 275（29）: 22293 - 22299 , 2000
13）C. Jing, C. Beesley, C. S. Foster, P. S. Rudland, H.

Biochem. J. 473, 449-461, 20165） K. Kawaguchi, S. Senga, C. Kubota, Y. Kawamura,Fujii, T. Ono, H. Chen, P. H. Smith, Y. Ke, Identification

Y. Ke, H. Fujii, High expression of fatty acid-bindingof the messenger RNA for human cutaneous fatty

protein 5 promotes cell growth and metastatic potential

acid-binding protein as a metastasis inducer. Cancer

in colorectal cancer cells. FEBS Openbio 6（3），190-199,

Res. 60 : 2390 - 2398 , 2000
14）R. F.L. O'Shaughnessy, J. P. Seery, J. E. Celis, A.

20166） E. A. Morgan, S. S. Forootan, J. Adamson, C. S.

M. Frischauf, F. M. Watt, PA-FABP, a novel marker

Foster, H. Fujii, M. Igarashi, C. Beesley, P. H. Smith, Y.

of human epidermal transit amplifying cells revealed

Ke, Expression of Cutaneous fatty acid-binding protein

by 2 D protein gel electrophoresis and cDNA array（C-FABP）in prostate cancer: Potential prognostic

hybridization. FEBS Lett. 486 , 149 , 2000

− 135 −

制御性 T 細胞による皮膚恒常性維持メカニズムの解明
東京大学大学院薬学系研究科免疫・微生物学教室

堀昌平

Foxp 3 -expressing regulatory T cells (Treg) are indispensable for the maintenance of immunological self-tolerance andimmune homeostasis. Recent studies have revealed that Treg cells reside not only in lymphoid, but also in non-lymphoid,tissues including the skin and that skin Treg cells play an important role in maintaining skin homeostasis. However, themolecular mechanisms that regulate Treg accumulation and function in the skin remain elusive. We have previously shownthat the Foxp 3 A 384 T mutation, which was identified in human IPEX patients, impairs accumulation of Treg cells in selective
tissues including the skin and causes inflammation in those sites at least in part by repressing expression of the transcription
factor BATF, which act down-stream of TCR signaling. In this study, by generating and analyzing Treg-specific BATF
conditional knockout mice, we show that BATF is indispensable for the accumulation and suppressive function of Treg
cells in the skin. BATF appears to cooperate with Foxp 3 to control Treg accumulation in the skin by promoting expressionof molecules implicated in leukocyte migration to and retention in the skin. Furthermore, we also show that skewed TCR
repertoire selectively exacerbates skin inflammation in Foxp 3 A 384 T mutant mice, which otherwise develop mild dermatitis. In
summary, our results suggest that interactions between Foxp 3 and the TCR-BATF axis represents an important determinantof Treg accumulation and anti-inflammatory function in the skin.

1. 緒と同様に、2 次リンパ組織を巡回する CD 44 low CCR 7 high言

ナイーブ型サブセットと、抗原刺激を受けて活性化した皮膚は様々な病原体の侵襲から身体を守る免疫応答の場

CD 44 high CCR 7 low エフェクター型サブセットに大別され、であるとともに、組織を傷害する過剰な免疫応答から「自非リンパ組織の Treg は専らエフェクター型 Treg によっ己」を守る免疫寛容の場でもある。
「自己」に対する免疫寛て構成されている。我々は Foxp 3 による Treg 分化と機能

容は制御性 T 細胞（regulatory T cells、以下 Treg）によっの制御メカニズムを明らかにするために、ヒト IPEX 患者て能動的に維持されている。我々は、ヒト自己免疫疾患 IPEX

で同定されている Foxp 3 変異を導入したマウスモデルを（immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy,

作製してその影響を分子、細胞、個体レベルにわたって解X-linked）症候群の原因遺伝子として同定された Foxp 3 が析してきた。その過程で、機能欠失型変異が Treg の分化

Treg 分化と機能を司るマスター転写因子として機能するや抑制機能など広範な性質を障害して皮膚、肺、肝臓などことを世界に先駆けて報告し、Treg の分子基盤と生理的

様々な組織に Th 1 および Th 2 型の炎症を惹起するのに対

1 , 2）。近年、Treg は皮膚にも多数存在

し、Foxp 3 A 384 T 変異（Ala 384 の Thr への置換）が DNA 結

し、Treg の数的・機能的な異常が IPEX を含む様々な皮合特異性を拡大させる機能獲得型変異であり、皮膚・肺・膚疾患（アレルギー疾患、自己免疫疾患など）の発症にかか大腸など特定の組織における Treg の集積を障害し、これわっていることが明らかにされてきた。さらに最近、皮膚らの組織選択的に Th 2 および Th 17 型の炎症を惹起するにおける Treg の機能は免疫抑制に留まらず、創傷治癒やことをみいだした。さらに、Foxp 3 A 384 T マウスにおける

毛包幹細胞の増殖・分化の促進など皮膚組織自体の恒常性

これら組織への Treg の集積障害は AP- 1 ファミリーに属維持にも及ぶことが明らかにされており、皮膚恒常性維持する転写因子 BATF の発現抑制に起因することを明らか

意義を明らかにした

3）

における Treg の役割が注目されている 。しかしながら、にした 4）。しかしながら、BATF がどのように皮膚へのTreg が皮膚に移行・集積し機能する分子メカニズムは未Treg の集積を制御するのか、また、Foxp 3 A 384 T 変異がな

だ十分に解明されていない。

ぜ皮膚や肺などの組織選択的に Treg の集積を障害して組Tregは通常型 Foxp 3 -T 細胞（conventional T cells; Tconv）

織選択的な自己免疫疾患を惹起するのかは明らかでない。

Elucidating the mechanisms of regulatory
T cell-dependent maintenance of skinhomeostasis

まず、BATF による Treg の皮膚への集積制御メカニズム

Shohei Hori

トアは組織間で異なっており、組織集積には TCR 特異性

L a b o r at o r y fo r I m mu n o l o g y a n d
M icrobiolog y, Gradu ate S cho ol of
Pharmaceutical Sciences, The Universityof Tokyoが重要であるという報告に基づき、Foxp 3 A 384 T 変異によ本研究で我々は、これら 2 つの問題の解明に取り組んだ。
とその意義の解明を目指した。そして、Treg の TCR レパ

り皮膚抗原特異的な Treg の TCR クローンが欠失し、そのために皮膚抗原に対する自己免疫応答の制御が破綻するの− 136 −

制御性 T 細胞による皮膚恒常性維持メカニズムの解明

現するケモカイン受容体、サイトカイン受容体、接着分子、ではないかと仮説を立て、その検証を試みた。

副刺激分子などの発現が低下しており、なかでもリンパ球

2 . 方法と結果の皮膚への移行と保持に関与することが報告されている

2 . 1. BATFによるTreg の皮膚への集積メカニズムとその意義
Treg の 皮 膚 へ の 集 積 と 炎 症 制 御 に お け る 転 写 因 子
YFPCre複数の分子の発現が低下していた。このことから、BATF
がこれら分子の発現を制御することにより Treg の皮膚への集積を制御していると考えられた。

マウス

次に、Treg および Tconv において BATF の ChIP-seq

マウスを交配させて Treg 特異的 BATF 欠損マウ解析を行い、ゲノム上の BATF 結合領域を比較した。そス（以下 cKO マウス）を作製した。cKO マウスは生後 8 週の結果、全 BATF 結合領域のうち 18 . 6 % が Treg 選択的に齢までに約半数が死亡し、皮膚、肺、肝臓、大腸などの組結合する領域であった。そしてこれら Treg 選択的 BATF

織において炎症細胞の浸潤を伴う激しい炎症を呈した（図結合領域近傍に存在する遺伝子の Gene Ontology 解析を行++ったところ、Foxp 3 の標的遺伝子が多く含まれることがエフェクター型 Treg、CCR 7 low Foxp 3 - エフェクター型わかった。実際、Treg 選択的 BATF 結合領域の約半数にTconv の割合を検討したところ、前者が著しく減少していFoxp 3 も結合していた。これら Treg 選択的 BATF 結合

たのに対し、後者は逆に顕著に増加していた。以上の結果

領域の近傍にはエフェクター型 Treg 選択的に高発現するから、BATF が Treg の皮膚への集積に必須の役割を担っ遺伝子が多く含まれており、それらの遺伝子近傍の Tregていることが明らかになった。

選択的 BATF 結合領域には、特にエフェクター型 Treg 選

BATF の役割を明らかにするために、Foxp 3と Batfflox1）。このとき各組織の CD 4 T 細胞中の CCR 7

low

Foxp 3BATF による Treg の皮膚への集積メカニズムを明らか

択的に Foxp 3 が結合していた。以上の結果から、BATFにするために、cKO Treg および野生型 Treg の RNA-seq

は Foxp 3 と機能的に協調することによりエフェクター型解析を行い、BATF の標的遺伝子の同定を行った。そのTreg 選択的遺伝子の発現を制御する可能性が考えられた。

結果、BATF cKO Treg ではエフェクター型 Treg に高発

以 上 の 結 果 か ら、BATF の み な ら ず Foxp 3 も エ フ ェ

図1 Treg特異的BATF欠損マウスは皮膚炎を伴う致死的な自己免疫疾患を発症する．Treg特異的BATF欠損マウス（cKO）と対照マウス（Ctrl）マウスの生存曲線（上）と皮膚（耳介）のHE染色像（下）．

− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

クター型 Treg の分化と組織への集積に重要である可能性が考えられた。この可能性を検証するために、Foxp 3の DNA 結 合 活 性 を 欠 失 さ せ る amorphic 変 異 で あ る
Foxp 3 R 397 W 変異を導入したノックインマウスを解析した
ところ、この Foxp 3 変異マウスもエフェクター型 Treg を欠いており、皮膚における Treg も激減していた。

2 . 2 . 皮膚炎制御におけるTreg のTCRレパトアの役
割
Foxp 3 A 384 T 変異マウスにおいてなぜ皮膚を含む特定の臓器において Treg の集積に異常がみられ、これらの組織
選択的に炎症が発症するのかを明らかにすることを目指し

図 2 TCRβ鎖固定による Foxp3A384T 変異マウスの皮膚炎増悪．
耳介の厚み
（左）
と白血球数
（右）
．

て研究を進めた。1 つの仮説として、これらの組織に特異ないかと考え、TCRβfixed Foxp 3 A 384 T マウスをH-2 のハプロタ的に発現する（自己）抗原を認識する抗原特異的 Treg がこ

イプごとに分類し、それぞれの皮膚の肥厚、皮膚の Th 1の変異により欠損することが考えられる。この仮説を検証

応答関連遺伝子の発現を比較した。その結果、H- 2 k/k およするために、次世代 DNA シーケンシングにより Treg おび H- 2 k/b 背景の TCRβfixed Foxp 3 A 384 T マウスでのみ顕著な

よび Tconv の T 細胞受容体（TCR）レパトア解析を行うこ

皮膚の肥厚や Th 1 応答関連遺伝子の発現上昇がみられた。

とにした。

3 . 考察・総括

これまでに、独自に樹立した単一の TCR β 鎖を発現す
る TCR β fixed マウスを活用し、TCRα 鎖のレパトアを次世

Treg は炎症抑制のみならず、創傷治癒、発毛など、皮膚代シーケンシングにより網羅的に解析する手法を確立しの様々な生理的、病理的現象に深くかかわっている。従って、ている（TCR β 鎖を固定することで、TCRα 配列を決定す

皮膚におけるTreg の集積と機能のメカニズムを明らかにする

れば個々の細胞の TCR のクローン型を一義的に決定できことは、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの皮膚疾患の治る）。そして、このマウスと Foxp 3 A 384 T 変異マウスを交配療という観点はもちろん、皮膚の美容と健康を保つというコスさせ、TCR β
WT

fixed

Foxp 3A 384 T

マウスでも固定しない（以下A 384 T

メトロジーの観点からも重要な課題である。

マウスと同様の組織選択的

本研究により、Treg の皮膚への集積と炎症抑制機能におな Treg の減少、組織選択的な炎症がみられるかを検討しいて転写因子 BATF が必須の役割を担っていること、BATF

た。炎症の指標としては、組織から単離される白血球数とは Treg の皮膚への移行・保持にかかわることが知られてい炎症性サイトカインを発現する Tconv の割合を計測した。

る遺伝子群の発現を制御することで皮膚への集積を制御してTCRβと表記）Foxp 3

その結果、TCRβ 鎖の固定の有無にかかわらず、皮膚と肺いることが明らかになった。さらに、Treg の皮膚への集積

では Foxp 3 A 384 T 変異により Treg の割合が大きく減少し白には Foxp 3 も重要であり、Foxp 3 は BATFと協調すること

血球数が増加したが、肝臓では Treg の減少と白血球数のでエフェクター分化と皮膚への集積を制御する可能性が示唆

増加は認められなかった。

された。このことは、BATFとFoxp 3 の機能的協調作用をマ ウ ス で は TCR β WT

人為的に強化または阻害することで、皮膚において TregとFoxp 3 A 384 T マウスよりも皮膚（耳介）の厚み、白血球数（特Tconvのバランスを操作することができる可能性を示唆していに好中球数）が選択的に増加することがわかった。またる。両者の機能的協調のメカニズムの詳細を明らかにするこ炎症の程度に大きな個体差がみられた（図 2）。皮膚の炎とで、皮膚における自己免疫疾患やアレルギーなどの病的免症増悪と関連する遺伝子を定量的 RT-PCR で探索した所、疫応答を抑制し、がん免疫を強化するための新しい治療法の一 方 で、TCRβfixed

炎症が増悪した TCR β

Foxp 3fixed

A 384 T

Foxp 3A 384 T

マウスの皮膚では、開発につながることが期待される。

マウスと比べ Th 1 応答に関連するケ

一方、TCR β 鎖を固定した Foxp 3 A 384 T 変異マウスの解析

モカインとサイトカイン遺伝子の発現が特異的に亢進してから、このマウスにおいて皮膚炎が選択的に増悪する個体いた。

がいること、そして皮膚炎の重症化は H-2 k ハプロタイプの

TCR β

WT

Foxp 3A 384 T

研究の過程で、C 57 BL/ 6 背景（MHC ハプロタイプは
b

fixed

H- 2 ）と考えられていた TCRβ
Foxp 3A 384 T

Foxp 3WT

fixed

および TCRβマウスに、B 10 .BR 系統に由来する MHC ハプk

存在に依存していることが明らかになった。現時点では皮膚炎の増悪に Foxp 3 A 384 T 変異とH-2 k のみで十分であるのか、
TCR β 鎖の固定も必要であるのか不明である。この問題を検ロタイプ（H- 2 ）が混入していることが発覚した。そこで、討するために、現在 H-2 k 背景の TCR β WT Foxp 3 A 384 T マウ

皮膚炎の個体差が MHC ハプロタイプの違いによるのではスを作出して病態解析を進めている。いずれにせよ、MHC− 138 −

制御性 T 細胞による皮膚恒常性維持メカニズムの解明

は TCRレパトア選択において中心的な役割を担うことから、
A 384 Tfactor Foxp3. Science 299 : 1057-61, 2003

変異とTCRレパトアの相互作用によ

2） Komatsu N, and Hori S. Full restoration of peripheral

り皮膚炎が重症化することを強く示唆している。これまでのFoxp3+ regulatory T cell pool by radioresistant host

自己免疫疾患の GWAS 解析から、疾患感受性遺伝子として

cells in scurfy bone marrow chimeras. Proc Natl Acad

この知見は Foxp 3

MHC 遺伝子の特定のハプロタイプとCTLA4 やIL 2 Raなど

Sci U S A 104 : 8959-64, 2007の Treg 関連遺伝子が同定されている。このことは、特定の3） Kalekar LA, and Rosenblum MD. Regulatory T cells

MHC ハプロタイプによるTCRのレパトアの偏りとTreg の異常in inflammatory skin disease: from mice to humans. Intが相互作用することで自己免疫疾患の組織選択性が規定されImmunol 31 : 457-63, 2019k

A 384 T

4） Hayatsu N, Miyao T, Tachibana M, Murakami R,

変異の相互作用による皮膚炎増悪のメカニズムを解明するこKimura A, Kato T, Kawakami E, Endo TA, Setoguchi R,とで、自己免疫疾患の組織選択性を規定するメカニズムの解

Watarai H, Nishikawa T, Yasuda T, Yoshida H, and Hori

明の貢献することが期待される。

S. Analyses of a Mutant Foxp3 Allele Reveal BATF asている可能性が考えられる。H-2 ハプロタイプとFoxp 3a Critical Transcription Factor in the Differentiation and（引用文献）

Accumulation of Tissue Regulatory T Cells. Immunity

1） Hori S, Nomura T, and Sakaguchi S. Control of

47 : 268-83 e9, 2017

regulatory T cell development by the transcription− 139 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能
神戸大学大学院農学研究科

水野雅 史、久 世雅樹

We have reported that a glycosylceramide (GlcCer) showed improvement in skin barrier function in mice. Only the
GlcCer from pineapple (P-GlcCer) showed the activity among other plant-derived GlcCers. We supposed the specificactivity would be originated from the chemical structure of P-GlcCer, especially the moiety of sphingadienine (SD) would
have the responsibility for the specificity. Here, we reported the investigation of the structure-activity relationships between
the cis/trans geometries of sphingadienines (SD- 1 ~ 4 ) and their biological activities. The challenge was initiated to establish
the stereoselective synthesis of sphingadienines (SD- 1 ~ 4 ). The stereoselective hydrogenolysis of ene–yne was employed
to construct the diene moiety. The ene–yne units were prepared by stereoselective addition of acetylide ions of ene–yne
units to Garner’s aldehyde. Wittig reaction and Johnson–Claisen reaction afforded the required starting ene–ynes. Lindlar
catalyst reduced alkyne to afford cis olefin, on the other hand, Red-Al reduction afforded trans olefin. By combination of
Wittig/Johonson–Claisen reactions and Lindlar/Red-Al reductions, stereoselective syntheses of SD- 1 ~ 4 were achieved.
Cytotoxicity of SD- 1 ~ 4 was checked by MTT assay. These compounds showed no cytotoxicity against RBL- 2 H 3 cells
at the concentration of 4 . 71 µg/ml. To confirm the anti-allergic activity of SD- 1 ~ 4 , RBL- 2 H 3 cells were preincubatedwith each geometric SDs before sensitization of anti-DNP IgE and challenge of DNP-albumin. β-Hexosaminidase released
into supernatant was measured as an index of its degradation. It was demonstrated that 4 cis, 8 cis-SD possessed the highest
activity compared with the other three ones.

1. 緒

養系腸管疑似モデル 2）を用いることで、グルコシルセラミ

言ドが直接作用しているのではなく、腸上皮細胞から吸収さスフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、皮膚角質層のれる際に生成された脱グルコース化したセラミドそのもの

主要な細胞間脂質として約 50 % を占めており、高い保湿が機能していること、および小腸でのインターロイキン

効果とバリア機能で肌トラブルを防ぎ、うるおいを保ち健（IL）- 23 mRNA 発現が間接的に関与していることも明ら康な肌を維持することから、美肌成分として多くの基礎化

かにしている。そこで各種植物由来グルコシルセラミドに粧品に配合されている。また最近になり、これらを経口摂も、同様の機能があるかをこのモデル系を用いて確かめた

取した際にも抗腫瘍や抗炎症効果を示すなど、食品機能成

ところ、P-GlcCer でのみ活性が認められた。一般に植物分として注目を集めている。我々の研究グループでは、植由来グルコシルセラミドは構造上スフィンゴイド塩基部分

物由来のセラミド成分に着目し、その皮膚炎症状の改善効が多様であり、スフィンガジエニン中にシス体とトランス

果における作用機序を解明することで、皮膚バリア機能の体が存在することが知られている。このことを加味すると、改善・向上を可能にするコスメとして将来的に利用するた

P-GlcCer のみに活性が認められた要因がスフィンゴイド

めの学術基盤の形成を目指している。

塩基部の構造に起因していると考えられた。そこで我々

皮膚に乾燥症状を引きおこす特殊飼料 HR-AD を食餌とは P-GlcCer の代謝物が皮膚炎の回復に寄与しているのでして与えられたマウスに、パイナップル由来グルコシルはないかという仮説を立て、セラミド中のスフィンゴイ

セラミド（P-GlcCer）を経口投与すると皮膚炎症状の改善

ド塩基部分、特に 4 , 8 - スフィンガジエニンの二重結合が1）がおこることを報告している 。さらにその作用機序は、

cis:cis, cis:trans, trans:cis, trans:trans の四種異性体を合成

HR-AD によって引きおこされる血中 TGF（Transforming

し、共培養系腸管疑似モデルを用いて IL- 23 mRNA 発現

Growth Factor）-β 量の減少を P-GleCer が元の状態まで回を指標に、食品成分であるグルコシルセラミドのうちどの復されるためであることを明らかにした。またその作用

ような立体構造を有していれば皮膚改善能をもたらすのか

は、我々の研究室で新たに構築した培養細胞を用いた共培を明らかにすることを目的とした。

＊

Structural Property and Improvement
Activity of Skin Barrier Function by
Sphingoid Diene in Plant-Derived
Glucosylceramide
Masashi Mizuno＊, Masaki Kuse
Graduate School of Agricultural, Kobe
University− 140 −

2. 方法

2 . 1. スフィンガジエニン異性体の完全化
学合成

スフィンガジエニンの異性体が四種合成できれば、P-GlcCer の異性体は既知の手法で合成できる。このスフィンゴイド塩基部分を効

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

率よく化学合成するために収束的な合成経路を立案した。

4 , 8 -sphingadienine をそれぞれを SD- 1 ~ 4 と呼ぶ（Figure

一般にアルキンを還元する際、①水素化アルミニウムリ

１）。

チウムではトランス還元が、② Lindlar 触媒ではシス還元

SD- 1 ~ 4 は、中間体（1 , 2）における 4 - 5 位炭素であるアが選択的に進行するので、目的とする異性体を選択的にルキン部分を、cis もしくは trans 選択的に半還元（アルキ合成できる。そこで、あらかじめ選択的オレフィン化反ンをアルケンに還元）することで合成できると考えた。そ応により合成した末端アルキンと、セリンから誘導した

して、中間体（1 , 2）は Garnerʼs アルデヒド（3）への末端アGarner’s aldehyde とを結合し、cis あるいは trans のオレルキン（4 , 5）のアセチリドイオンのジアステレオ選択的なフィンを持つ末端アルキンをそれぞれ用意し、それらを付加反応により得られると考えた。末端アルキン（4 , 5）は、

①および②の方法を用いて選択的に還元することでスフ

目的物において 8 - 9 位炭素に該当する二重結合が cis もしィンゴイド塩基の異性体四種を合成することにした。4 - 5

くは trans として選択的に合成されている（Scheme 1）。

位炭素と 8 - 9 位炭素が cis/trnas で作り分けられた 4 種のFigure 1 P-GlcCer と 4 種類の 4,8-sphingadienine の異性体（SD-1~4）

Scheme 1 4 種類の 4,8-Sphingadienine の幾何異性体の逆合成解析− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

2 . 2 . 各異性体の細胞毒性

3. 考

4 種の SD の細胞毒性は、MTT アッセイにより評価した。RBL- 2 H 3 細胞を 2 . 0 × 105 cells/well で 24 穴プレー察

3 . 1. Garner’s aldehyde の合成

トに播種し、RPMI 1640 培地中にてオーバーナイトでイ報告されている方法に基づいて Garner’ s aldehyde（3）ンキュベートした。培地を除去し、試験試料を含む培地をの 合 成 に 取 り 組 ん だ 4 , 5）。N-Boc-L- セ リ ン メ チ ル エ ス

添加して 37 ℃で 6 時間インキュベートした。培地を除去し、テル（6）（Boc: t-Butoxycarbonyl）を出発原料とし、ジメ

MTT 溶液（1 . 21 mM in RPMI 1640 , 110 µL）を細胞に添加

トキシプロパン、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体

し 2 時間後、MTT 溶液を除去し、DMSO（200 µL）
を添加（BF 3 · OEt 2）と反応させ、環状アミナール（7）
を収率 98 ％でした。マイクロプレートリーダーで 570 nm の吸光度を測得た。得られた環状アミナール（7）を水素化アルミニウム定した。細胞生存率はコントロール群と比較して算出した。

リチウム（LiAlH 4）で還元することでアルコール（8）を収率

2 . 3 . 抗アレルギー活性測定

89％で得た。このアルコール（8）を種々の条件下でPCC（ピ

3）

リジニウムクロロクロメート）と反応させたが、副反応がRBL- 2 H 3 細胞を 2 . 0 × 10 cells/well で 24 穴プレート

起きてしまい、精製を行っても純粋な目的物を得ることはに播種し、RPMI 1640 培地中にて一昼夜培養した。試験難しかった。そこで、Swern 酸化での酸化を試みたところ、試料を含む培地を添加して 37 ℃で 2 時間インキュベート

反応が良好に進行し、収率 93 ％で Garnerʼs aldehyde（3）した。終濃度 200 ng/mL の抗 TNP IgE 抗体を添加し、4を得た（Scheme 2）。

5

時間培養した。すべての培地をシラガニアン緩衝液（SB ;4 0 mM NaOH, 2 5 mM PIPES, 5 . 6 mM glucose, 0 . 1 %3 . 2 . Garner’ s aldehyde への立体選択的なアルキンの求核付加反応

BSA, pH 7 . 2）に置き換えた後、終濃度 20 ng/mL の TNP-得られた Garnerʼs aldehyde（3）に対して、1 - ペンタデ

BSA を添加し、37 ℃で 1 時間反応させた後、プレートをシン（9）をモデルアルキンとして用いて、立体選択的な求氷上に 10 分間静置し脱顆粒反応を停止させた。上清 50

核付加反応の条件検討を行った（Scheme 3）6）。その結果、µL を 96 穴プレートに移し、等量の基質（0 . 2 M クエン酸緩Lam と Mendez らが報告している条件 7）であるエントリー

衝 液 中 に p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide を

4 で最も良い選択性が得られた（Table 1）。

1 1 9 mM NaCl, 5 mM KCl, 0 . 4 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 ,終濃度 1 mM で溶解 , pH 4 . 5）と混合して 37 ℃で 1 時間反100 µL/well で添加し、反応を終了させた。マイクロプレ

3 . 3 . アルキン（10）の 4 位炭素の cis/trans 選択的な半還元反応ートリーダーで 405 nm の吸光度を測定することで、酵素得られたアルキン（10）を用いて幾何選択的に還元を行い、4反応生成物である p-nitrophenol を定量し、これを β- ヘキ位炭素の幾何制御に取り組んだ。まず、trans 体の合成から

ソサミニダーゼ遊離量の指標とした。上清中の β- ヘキソ

取り組んだ。アルキン（10）をRed-Alで還元したが 8 , 9）、反応

サミニダーゼ遊離率は、脱顆粒誘導群の遊離量に対する百は進行せず原料回収という結果であった。Boc 基が大きいた

分率として算出した。

めに Red-Al が反応点に近づくことができないために、反応応させた。停止液（0 . 2 M glycine-NaOH 溶液 , pH 13 . 0）をScheme 2 Garner’ s aldehyde の合成− 142 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能が進行しなかったと考えた。そこで脱保護の後に還元を試行い、モデル体であるアルケン（16）を 2 段階収率 25 ％でみた。まずアルキン（10）を p-トルエンスルホン酸（TsOH）

得た（Scheme 5）。以上により 4 位炭素の幾何制御の方法で処理し、その後トリフルオロ酢酸で処理することでアルが確立できた。

キン（13）を 2 段階収率 34％で得た。得られたアルキン（13）を Red-Al と反応させると、収率 45 ％で目的の trans アルケン（14）
が得られた（Scheme 4）。

3 . 4 . （5 E）- 5 -Pentadecen-1-yne（4）の合成
次に、8 位炭素の cis/trans 幾何制御の方法を確立する

次は cis アルケンの合成に取り組んだ。アルキン（10）を水素雰囲気下、リンドラー触媒存在下10）研究に取り組んだ。市販の decanal（17）を出発原料とし、、メタノール溶

ビニルマグネシウムブロミドと反応させ、アルコール（18）

媒中で撹拌すると、定量的に目的の cis アルケン（15）を得を収率 96 ％で得た。得られたアルコール（18）を過剰のオた。続いて trans アルケンを合成した時と同様に脱保護をルト酢酸トリエチル中、プロピオン酸存在下で加熱する

Scheme 3 Garner’ s aldehyde へのアセチリドイオンの付加
Table 1 立体選択的な求核付加反応の条件検討 .

Scheme 4 4-5 位アルキン部における trans 選択駅な半還元

Scheme 5 4-5 位アルキン部における cis 選択駅な半還元− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ことで、Johnson-Claisen 転位反応を引きおこし、アルケ

ド（27）を NaH で処理し、アルデヒド（24）と Wittig 反応さン（19）を trans 選択的に収率 84 ％で得た。得られた E- ア

せたところ 11）、収率 47 ％でオレフィン（5）を得た（Scheme

ルケン（19）を LiAlH 4 と反応させて、収率 96 ％でアルコ7）。以上により 8 位炭素の cis/trans 幾何制御を達成した。

ール（20）を得た。続いて得られたアルコールと PCC を反ヒド（21）とトリフェニルフォスフィン、亜鉛、四臭化炭

3 . 6 . スフィンガジエニンの 4 種異性体
（SD-1~ 4）の合成

素との反応により収率 13 ％でジブロモアルケン（22）を得

すべての合成単位の選択的な合成経路が確立できたので、応させ、収率 80 ％でアルデヒド（21）を得た。このアルデた。さらにこのジブロモアルケン（22）を n-BuLi で処理すSD- 1 ~ 4 の合成に取り組んだ。

る Corey-Fuchs アルキン化反応により収率 56 ％で（5 E）

3 . 6 . 1. （E）- 4 , 8 -スフィンガジエニン（SD-1, 2）の合成- 5 -pentadecen- 1 -yne（4）を得た（Scheme 6）。

Garnaer’ s アルデヒド（3）に対して、アルキン（4）のアセ
チリドイオンを付加させて、化合物 28 を得た。脱保護し3 . 5 . （5 Z）- 5 -Pentadecen-1-yne（5）の合成て化合物 29 へと誘導したのち、Red-Al で還元することで、次に cis 体の合成に取り組んだ。アルコール（23）から

trans/trans のスフィンガジエニン（SD- 1）の合成を達成しPCC 酸化によりアルデヒド（24）を収率 72 ％で得た。次にた（Scheme 8）。

ブロモデカン（25）をアセトン溶媒中で NaI と反応させるこ

次に、アルキン（4）のアセチリドイオンを Garner’s アとで収率 95 ％でヨードデカン（26）を得た。得られたヨー

ルデヒド（3）に付加させ、化合物 28 を合成した。これをドデカン（26）をトリフェニルホスフィンとトルエン溶媒

Lindlar 触媒下、加水素分解により 30 を合成した。最後に中、還流条件下で 24 時間反応させることで、ホスホニウ

脱保護することで、cis/trans スフィンガジエニン（SD- 2）

ムヨージド（27）を収率 99 ％で得た。ホスホニウムヨージの合成を達成した（Scheme 9）。

Scheme 6 （5E）-5-Pentadecen-1-yne（4）の合成

Scheme 7 1-Bromodecane からのビルディングブロック（5）の合成− 144 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

3 . 6 . 2 . （Z）- 4 , 8 -スフィンガジエニン（SD- 3 , 4）の合成

ルデヒド（3）に付加させ、化合物 31 を合成した。これをGarnaer’s アルデヒド（3）に対して、アルキン（5）のアセ

Lindlar 触媒下、加水素分解により 33 を合成した。最後にチリドイオンを付加させて、化合物 31 を得た。脱保護し脱保護することで、cis/cis スフィンガジエニン（SD- 4）のて化合物 32 へと誘導したのち、Red-Al で還元することで、合成を達成した（Scheme 11）。

trans/cis のスフィンガジエニン（SD- 3）の合成を達成した（Scheme 10）。

以上、4 - 5 位炭素と 8 - 9 位炭素が cis/trans で作り分けられた 4 種の 4 , 8 -sphingadienine（SD- 1 ~ 4）の完全化学

最後に、アルキン（5）のアセチリドイオンを Garner’ s ア

合成を達成した。

Scheme 8 SD-1 の合成

Scheme 9 SD-2 の合成

Scheme 10 SD-3 の合成− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Scheme 11 SD-4 の合成

3 . 7. 異性体四種の抗アレルギー効果
P-GlcCer の代謝物が皮膚炎の回復に寄与しているのではないかという仮説を立て、セラミド中のスフィンゴイ
ド塩基部分、特に 4 , 8 - スフィンガジエニンの二重結合が
cis:cis, cis:trans, trans:cis, trans:trans の四種異性体を合成し、共培養系腸管疑似モデルを用いて IL- 23 mRNA 発現を指標に、食品成分であるグルコシルセラミドのうちどのような立体構造を有していれば皮膚改善能をもたらすのかを明らかにすることを目的とした。しかしながら、実際共培養系を用いて管腔側から試料を添加した際、Caco- 2 細胞によって代謝されるため、IL- 23 mRNA 発現を指標にす

Figure 2

ることができないことが分かった。そこで合成した異性体

スフィンガジエニンによる細胞毒性

四種の生理活性を明らかにするため、感作された肥満細胞
RBL- 2 H 3 に対する合成した 4 種のスフィンゴイド塩基の抗アレルギー効果を検討した。
桑田ら 1） の報告では、P-GlcCer を Caco- 2 細胞に添加した際、54 . 8 % が代謝されると報告している。したがって、本実験では、グルコシルセラミド 80 µg/mL の濃度でCaco- 2 細胞に添加した場合に、代謝産物がすべて 4 , 8 - ス
フィンガジエニン（SD）に変換されたと仮定して、その濃度（4 . 71 µg/mL）における RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒に与える影響を評価した。4 , 8 -SD の RBL- 2 H 3 細胞活性化抑制
効果の評価を行うにあたり、まずは四種 SD が 4 . 71 µg/mLで細胞毒性を示すかどうかを確認した。その結果、Figure2 に示すとおり所定濃度では細胞毒性は認められなかった。

Figure 3

スフィンガジエニンによる肥満細胞活性化抑制効果

次に、四種 SD の立体異性体による RBL- 2 H 3 細胞の βヘキソサミニダーゼ放出率を評価した。抗原抗体添加群

4. 考（Positive control）で β- ヘキソサミニダーゼ放出率は有意察に増加し、4 cis, 8 trans-SD、4 cis, 8 cis-SD を添加したと

本研究では、収束的な合成経路によるスフィンゴイド塩

ころ β -ヘキソサミニダーゼ放出率は有意に抑制され、特基の異性体四種（SD- 1〜 4）の化学合成経路の確立を目指に 4 cis, 8 cis-SD において最も抑制率が高く約 10 % であっした。4 - 5 位アルキン部分の還元では、モデル化合物を用た（Figure 3）。

いて条件検討を重ねた結果、トランス還元では Red-Al に− 146 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

よる還元が最適条件であった。この際、出発物質の保護基

effects of food factors through the intestine. J.

はすべて脱保護しておくことが必須であった。それは、立Immunol. Meth., 435, 1-6, 2016.

体障害による Red-Al の接近を妨げないことが重要であっ

4） P. Garner, J. M. Park, E. Malecki, A stereodivergent

たと考えられた。シス還元では、Lindlar 触媒による水素

synthesis of D-erythro-sphingosine and D-threo-

化反応が有効であった。アルカンまでの過剰な還元反応を

sphingosine from L-serine, J. Org. Chem., 5 3, 4 3 9 5-防ぎつつ、シス選択的に還元することができた。SD- 1 〜

4398, 1988.

4 の前駆体は、Garner アルデヒドへの ene–yne のアセチ

5） P. Herold, Synthesis of D-Erythro- and D-Threo-

リドイオンの付加反応が効果的に進行した。反応条件につSphingosine Derivatives From L-Serine, Helvetica

いて精査した結果、−40 ℃の低温で反応を行うと高選択

Chimica Acta, 71, 354-362, 1988.

的に付加反応が進行し、前駆体を得ることができた。アセ

6） M. Passiniemi, A.M. P. Koskinen, Garner’ s aldehyde

チリドイオンの原料となる ene–yne の合成では、Johnson

as a versatile intermediate in the synthesis ofClaisen 反応を利用すると trans の ene-yne が選択的に合成

enantiopure natural products, Beilstein J. Org. Chem.,

できた。Wittig 反応を利用した cis の ene-yne 合成が最も

9, 2641-2659, 2013.

難しい段階であった。種々の反応条件と出発物質を精査す

7） L. Wong, Sheryl S. L. Tan, Y. Lam, A. J. Mendez,

ることで、cis の ene–yne 合成手法が確立できた。こうして、

Synthesis and Evaluation of Sphingosine Analogues as

cis/trans の 4 種類立体異性体である SD- 1 〜 4 の合成経路

Inhibitors of Sphingosine Kinases, J. Med. Chem., 5 2,を確立することができた。また、肥満細胞由来の培養細胞

3618-3626, 2009.

RBL- 2 H 3 を用いた 4 種類立体異性体の抗アレルギー活性8） I. V. Overmeire, S. A. Boldin, F. Dumont. S. V.

を測定した結果、4 cis, 8 cis-SD に最も高い活性が見られた。

Calenberrgh, G. Slegers. D. D. Keukeleire, A. H.
Futerman, P. Herdewijin, Effect of Aromatic Short-（引用文献）

Chain Analogues of Ceramide on Axonal Growth in1） T. Kuwata, T. Hashimoto, N. Ohto, H. Kuwahara, J.
W. Lee, T. Bamba, M, Mizuno, A metabolite of dietary

Hippocampal Neurons, J. Med. Chem., 4 2, 2 6 9 7-2 7 0 5,
1999.

glucosylceramide from pineapples improves the skin9） M. Moreno, C. Murruzzu, A. Riera, Enantioselective

barrier function in hairless mice, J. Funct. Foods, 3 0,Synthesis of Sphingadienines and Aromatic Ceramide
Analogs, Org. Lett., 13, 5184-5187, 2011.

228-236, 2017.
2） T. Tanoue, Y. Nishitani, K. Kanazawa, T. Hashimoto,10）M. L. Fanani, J. V. Busta, J. Sot, J. L. Abad, G.

M. Mizuno, In vitro model to estimate gut inflammation

Fabrias, L, SAiz, J. M. G. Vilar, F. M. Goni, B. Maggio,

using co-cultured Caco-2 and RAW2 6 4.7 cells,

A. Alonso, Langmuir, 34 , 11749 - 11758 , 2018 .

Biochem. Biophys. Res. Commun., 374, 565-569, 2008.

11）T. Kawate, N. Fukuta, A. Nishida, M. Nakagawa,3） S. Yamashita, Y. Yokoyama, T. Hashimoto, M.

Synthesis of Sphingosine Analogues: Stereoselective

Mizuno, A novel in vitro co-culture model comprised

Synthesis of 3 -Deoxysphingosine and cis-Isomers,of Coco-2/RBL-2H3 cells to evaluate anti-allergic

Chem. Pharm. Bull., 45 , 2116 - 2118 , 1997 .

− 147 −

カルシウムイオンの生体内観察・操作による KID 症候群の病態解析
京都大学医学研究科皮膚科学講座

村田光麻Connexins (Cxs) make gap-junction/hemichannel that mediate cell-cell/cell-extracellular movement of water-soluble
molecules such as calcium ions (Ca 2 +). In some of hereditary diseases caused by mutations in Cxs, marked thickening ofcorneal layer of the skin occurs (Cx-related keratoderma), resulting in significant cosmetic and functional disadvantages.
It is revealed that gain of function mutations that induce hyperactive hemichannels cause Cx-related keratoderma, andthat keratinocytes-specific introduction of pathogenic mutant Cx reproduce the hyperkeratosis in mice, indicating that Cxmutations in keratinocytes are responsible for the hyperkeratosis. However, it is still elusive how hyperactive hemichannels
on keratinocytes result in hyperkeratosis. Here, using a mouse model of Cx-related keratoderma in combination with twophoton microscope, we show a close association between hyperkeratosis and distinct dynamics of cytoplasmic Ca 2 + in Cxmutant keratinocytes in vivo. We made an inducible mouse model of KID syndrome, one of the representative Cx-related
keratoderma, by crossing Cx 26 S 17 F mice and K 14 creERT mice. In this model, hyperkeratosis at the footpads of the paws
was observed within 2 weeks after the induction of mutation. We then crossed the mice with transgenic mice systemically
expressing a Ca 2 + indicator (GCaMP 3 ) and evaluated the cytoplasmic Ca 2 +-dynamics in keratinocytes throughout thecourse of disease development. In normal keratinocytes, a transient elevation of cytoplasmic Ca 2 + preceded the cornification
at granular layer uniformly at a single-cell level. In contrast, in keratinocytes with Cx mutations before the formation of
hyperkeratosis, patterns of cytoplasmic Ca 2 + elevation were heterogenous spatiotemporally. Subsequently, we identified
intense elevation of cytoplasmic Ca 2 + in the granular layer just before the formation of hyperkeratosis. Our results not only
demonstrate the plausible role of aberrant Ca 2 +-dynamics in the hyperkeratosis of Cx-related keratoderma, but also suggest
the importance of strictly regulated Ca 2 +-dynamics for epidermal homeostasis.

1. 緒

言

皮膚の最表面は死細胞によって構成される角層であり、その異常を示す疾患には、ありふれた胼胝
（タコ）
から稀な
先天性疾患まで多数が存在するが、いずれの疾患も難治である。その原因の 1 つに、表皮細胞の角化による角層形成のメカニズムが未解明であり、特異的な治療がないことがあげられる。報告者はこれまでに、生体マウスの皮膚内で角化細胞内の細胞内カルシウムイオン（Ca 2 +）
濃度を直接観察することで、角化直前に表皮細胞が Ca 2 + 濃度を上昇させることを見出した 1）。この現象は皮膚の恒常性維持メカ

図1

ニズムに重要な視点を与えるとともに、角層の異常を来す疾患の病態解明・治療法の開発の糸口になることが期待される。

候群の病態を明らかにし、治療薬の候補をあげるため、以Keratitis-Icthyosis-Deafness（KID）症候群は、角層肥厚・角膜炎・難聴を特徴とする先天性の難病で、コネキシ
2）ン 26 や 30 をコードする遺伝子の変異による 。顔面を含下の 2 つを明らかにしたいと考えた。
① KID 症候群における表皮細胞内 Ca 2 + 動態の異常の有無② Ca 2 + 動態と角化の異常との因果関係

む全身が侵され醜形を来すため、角層肥厚の病態の解明と2. 方治療法の開発が強く望まれている（図 1）。そこで、KID 症
A n a ly s i s of pat hog e ne s i s of K I D
syndrome by in vivo observation andmanipulation of cytoplasmic Ca 2 + ion
concentration
Teruasa Murata
Department of dermatolog y, Kyoto
University

法

2 . 1. 変異コネキシン 26 の導入による表皮細胞内2+
Ca 濃度の変化の観察
現存する KID 症候群のモデルマウスを改良し、後天的に KID 症候群の変異コネキシン 26 が導入されるマウスモデルを作成した。具体的には、Cx 26 S 17 F マウス 3） とK 14 Cre-ERT マウス 4）を交配し、得られた成体マウスに
タモキシフェン（0 . 1 mg/g BW, 5 日連続 , 腹腔内）を投与− 148 −

カルシウムイオンの生体内観察・操作による KID 症候群の病態解析した。このマウスに、カルシウムレポータータンパクである GCaMP 35）した。病変の分布は、KID 症候群患者における角層肥厚が著明な部位と一致しており、KID 症候群をよく模倣する系と、形態を観察するための tadem-dimerと考えられた（図 2）。

Tomato（tdTomato）のそれぞれの全身発現マウスを交配2+し、2 光子顕微鏡で、生体マウスの表皮細胞内 Ca 濃度を

3 . 2 . KID 症候群の病変形成過程における表皮細胞
2+
内 Ca 動態

観察するとともに形態学的解析を行った。

2 . 2 . 表皮細胞内の Ca
厚との因果関係の検証

2+

濃度の制御異常と角層の肥タモキシフェン投与直後から、フットパッドの表皮細胞の細胞質 Ca 2 + 濃度を測定した。すると、意外なことに

次に、生体マウスの表皮細胞内の Ca 濃度を特異的に細胞質 Ca 2 + 濃度は角層の最下層から上昇し始め、その後、上昇させるため、Chemogenetics の手法を用いた。化学物

顆粒層、有棘層へとその上昇が拡大していた。重要なこと

質（Clozapin-N-oxide: CNO）の投与により活性化し細胞内に、顆粒層の細胞質 Ca 2 + 濃度の上昇の直後に角層の肥厚

Ca 2 + を上昇させる G タンパク共役型レセプター（hM 3 Dq）が起こっていた。この時間的な関係は、顆粒細胞の Ca 2 +2+を発現するマウス

6）を用い、表皮細胞特異的にこれらの分濃度が角化の亢進に関与していることを示唆する。

子を発現するようにしたマウスを作成した。具体的には、こまた、角層肥厚よりも 1 週間以上前から、角層最下層のれらのloxP-stop-loxP マウスと、IVL-CreERT 2 マウスとを細胞質 Ca 2 + 濃度が上昇していたことから、角化の亢進の交配し、タモキシフェン（0 . 1 mg/g BW, 週 2 回、腹腔内）を結果として Ca 2 + 濃度の上昇が起こったのではなく、ヘミ投与し、2 光子顕微鏡で観察中に、CNO（1 mg/kg BW, 皮下）チャネルによる Ca 2 + 動態の異常が先に生じると考えられ、を投与した。

実験系が想定通り成立したと考えられた（図 3）。

3. 結

果

3 . 3 . 細胞質 Ca

3 .1. KID 症候群モデルマウスにおける表現型

2+

濃度を操作する実験系の確立

さらに、細胞質 Ca 2 + 濃度と角化亢進との因果関係を in

KID 症候群モデルマウスでは、タモキシフェン投与 3−vivo で証明するためのモデルマウスを作成した。CNO 投

4 週で肉眼的な病変が前後肢のフットパッドを中心に出現

与により、速やかに表皮細胞の細胞質 Ca 2 + は上昇し、生図2

図3− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

理的な角化中（図 4 , 矢印）に匹敵する濃度となった。しかし、その位置は、顆粒層の中層から有棘層にとどまり、肝心の角化前の顆粒細胞ではその上昇は軽度に留まり、因果関係を検討する実験系は完成していない。現在、投与する
薬剤や投与経路の変更による改善を試みている。

4. 考

察

KID 症候群モデルマウスを用いた生体内観察により、角層の肥厚と細胞質 Ca 2 + 濃度の異常との、時間的に密接な関係が明らかになった。この結果は、KID 症候群の病態の中心に顆粒層の Ca 2 + 濃度の異常があることを強く示唆する重要なものである。今後、ヘミチャネルの阻害薬を含めた治療薬の開発が期待されるが、顆粒層に作用させるためのドラッグデリバリーの検討も重要と考えられた。

図4

表皮の上皮細胞の最終分化（細胞死）の誘導メカニズムは未だ明らかではない。今回得られた結果は、細胞質 Ca 2 +（引用文献）

濃度の上昇が最終分化の単なる結果ではなく、その誘導メ

1） Murata, T. et al. Transient elevation of cytoplasmic

カニズムの一端である可能性を示唆した。今後、上述の in

calcium ion concentration at a single cell level precedes

vivo の系に続き、in vitro の系での因果関係の検討を計画

morphological changes of epidermal keratinocytes

している。

during cornification. Sci. Rep. 8, 6610（2018）．

表皮において、個々の細胞は互いに時間的、空間的に前2） Lilly, E., Sellitto, C., Milstone, L. M. & White, T. W.

後しながら継続的に分化するため、分化に関わるシグナル

Connexin channels in congenital skin disorders. Semin.

や酵素反応は組織のごく一部に限局する。そのため、従来

Cell Amp Dev. Biol. 50, 4-12 (2016).

の方法では真の現象とノイズとの区別が難しかった。本研

3） Bosen, F. et al. Altered epidermal lipid processing and

究は、このような時間的・空間的に稀な現象に着目する新calcium distribution in the KID syndrome mouse model

しい形態学的アプローチであった。また、現象間の因果関

Cx26S17F. FEBS Lett. 589, 1904‒1910（2015）．

係や薬理作用まで生体内で検証し、細胞間相互作用を見落

4） Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B. & Fuchs, E.

とすことなく評価する点に本研究の特色がある。さらに、The magical touch: genome targeting in epidermal stem

観察中に遺伝子変異を導入することで、変異タンパクが病

cells induced by tamoxifen application to mouse skin.

態を形成するまでの過程全体を捉えようとする点は前例がProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 8551‒8556（1999）．

ない。この方法は原因遺伝子が知られているものの病態が5） Ebina, T. et al. 3D clustering of GABAergic neurons

明らかになっていない疾患の解析方法の一例となると考え

enhances inhibitory actions on excitatory neurons inられる。

the mouse visual cortex. Cell Rep. 9, 1896‒1907（2014）．
6） Zhu, H. et al. Cre-dependent DREADD（Designer

謝辞Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コーセー

mice. genesis 54, 439‒446（2016）．

コスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げます。

− 150 −

皮膚の酸化ストレス障害に対する間葉系幹細胞の治療効果と制御機構の解明
群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学

茂木

精一郎

Cutaneous ischemia-reperfusion (I/R) injury is associated with the early pathogenesis of cutaneous pressure ulcers(PUs). The objective of this study was to investigate the effect of mesenchymal stem cells (MSCs) injection on the formationof PUs after I/R injury and determine the underlying mechanisms. We found that the subcutaneous injection of MSCs into
areas of I/R injured skin significantly suppressed the formation of PUs. I/R-induced vascular damage, hypoxia, oxidative
DNA damage, and apoptosis were decreased by MSCs injection. Oxidative stress signals detected after I/R in OKD 48(Keap 1 -dependent oxidative stress detector, No- 48 -luciferase) mice were decreased by the injection of MSCs. In cultured
fibroblasts, MSCs-conditioned medium significantly inhibited oxidant induced reactive oxygen species (ROS) generation andapoptosis. Furthermore, endoplasmic reticulum (ER) stress signals detected after I/R in ERAI (ER stress-activated indicator)
mice were also decreased by the injection of MSCs. These results suggest that the injection of MSCs might protect against
the development of PUs after cutaneous I/R injury by reducing vascular damage, oxidative cellular damage, oxidative stress,
ER stress, and apoptosis.

1. 緒

言

加齢による変化によって血管量低下や血管機能障害が生じ、皮膚への血流量が低下して皮膚が虚血になりやすくな
ることが知られている。さらに、外部からの圧迫や紫外線照射などの外的刺激によって皮膚の虚血が誘導され、低酸素に至りやすくなる。例えば、ベッドなどによる外的圧迫
じょくそう

によって生じる皮膚の虚血性潰瘍である
「褥瘡」
（いわゆる
「床ずれ」
）は高齢者に生じやすく治りにくい。持続的な圧迫による虚血に加えて、虚血に陥った組織に血液が再還流すると、活性酸素などが発生し、血管内皮細胞や周囲の組織を傷害し、より広範囲に血流障害・組織障害を来すこと

図1が知られており、これを「虚血再還流障害」と呼び、酸化ス
トレス障害がその病態に深く関わっている。
褥瘡は皮膚潰瘍が生じる前の「急性期褥瘡」と生じた後の観察していく以外に全く方法がない。この急性期褥瘡の機「慢性期褥瘡」に分類される（図 1）。褥瘡の発生直後は紅斑序を明らかにし、組織障害の進行を防ぐ治療法を開発できや紫斑を呈するが、組織壊死が進行し皮膚潰瘍が出現する

れば、その後の潰瘍の発生、拡大を防ぐことができる画期までに 1 ～ 3 週間かかり、この時期を「急性期褥瘡」と呼ぶ。

的な治療・予防が期待できる。

これまでに、皮膚潰瘍が生じた後の「慢性期褥瘡」に対す

今回、我々は間葉系幹細胞（MSC）に注目した。MSC はる数多くの治療法が開発されてきたが、皮膚潰瘍が生じる

皮膚創傷治癒においては、血管や表皮細胞への分化、細胞前の「急性期褥瘡」
に対する治療法はガイドラインでも、除外基質の産生リモデリング、炎症性サイトカインの抑制、圧と創部の保護だけでありエビデンスレベルの高い治療法

血管新生の促進、M 2 マクロファージの誘導などを介してがない。従って、せっかく皮膚潰瘍に至る前の褥瘡を早期創傷治癒を促進させることが知られている（図 2 参照）1）。

に発見することができても、残念ながら、潰瘍になるまで

近年、間葉系幹細胞（MSC）と虚血再還流障害に関する様々な研究がなされている。脳、肝臓、腎臓などの虚血再還流

Elucidation of therapeutic effect andregulatory mechanism of mesenchymal
stem cells on oxidative stress disorder ofskin
Sei-ichiro Motegi
Department of Dermatology, Gunma
University Graduate School of Medicine障害モデルにおいて MSC がアポトーシス細胞や酸化スト
レス、一酸化窒素合成酵素などを抑制することが知られている。しかし、皮膚の虚血再還流障害に対する MSC の治
療効果とその機序は不明である。そこで、今回の研究では、
間葉系幹細胞による皮膚虚血再還流障害（酸化ストレス障
害）の治療効果と制御機構を明らかにすることを目的とした。

− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

2. 方

その状態を 12 時間持続させ、その後、磁石を外すことで法

虚血部位に再還流を生じさせる。我々は、これまでに、こ

我々はこれまでにマウスを用いた皮膚虚血再還流障害のの皮膚虚血再還流障害（急性期褥瘡）モデルマウスを用いて実験系を確立してきた。方法としては、2 つの磁石を用い検討した結果、圧迫部位に多数の血栓が生じ、血管障害にてマウス背部の皮膚を挟み、圧迫された部分を虚血させる。

よる血管量の低下が起こり、虚血、低酸素による酸化ストレスが生じることを明らかにしてきた 2 - 4）（図 3 参照）。また、圧迫虚血部位に副腎皮質ホルモンを外用したところ、血管数低下、酸化ストレス障害、アポトーシス細胞数が増加し、潰瘍が増悪することも明らかにしてきた 4）。

3. 結

果

皮膚虚血再還流障害（急性期褥瘡）モデルを用いて、MSC 投与群とコントロール（PBS）投与群における虚血再還流障害後に生じる皮膚潰瘍形成を比較した。再還流させた直後に MSC もしくは PBS を虚血再還流部に局注した。
その結果、MSC の皮下投与によって皮膚虚血再還流障害（急性期褥瘡）の後に生じる皮膚潰瘍の形成が抑制されたことを見出した（図 4）。また、MSC による制御機構を解明
図2するため、虚血再還流後の潰瘍部を含む皮膚組織を検討した結果、MSC 局注によって血管障害が抑制され、さらに、皮膚の低酸素領域や酸化ストレス障害によるアポトーシスが抑制されることを見出した。
また、我々は、共同研究者の金沢医科大学

岩脇隆夫教

授より酸化ストレス可視化マウス（OKD 48 マウス）を供与いただいている。これらのマウスを用いて、皮膚虚血再還流障害を起こしたところ、MSC の皮下注入によって、急性期褥瘡部位の酸化ストレス、小胞体ストレスが抑制されることも見出した（図 4 上）。酸化ストレスにより誘導され

図3

図4− 152 −

皮膚の酸化ストレス障害に対する間葉系幹細胞の治療効果と制御機構の解明

る因子である HO- 1 や活性酸素の産生を調節する因子であて、皮膚の虚血障害によって生じる病変（褥瘡や末梢循環

る NOX 2 の発現量も MSC の皮下注入によって抑制された。

障害など）を有する患者数も増大し、予防・治療・管理のまた、マウス線維芽細胞を用いて、酸化ストレス障害に対重要性はこれまで以上に高まると考えられる。老化によるする MSC の影響について in vitro の検討を行った結果、過皮膚の虚血、酸化ストレス障害に注目し、その後の皮膚障

酸化水素刺激による ROS 産生亢進が、MSC の細胞培養上

害・皮膚潰瘍の発生を少しでも予防、抑制できるような薬清によって抑制された。これらの結果より、MSC の皮下剤を開発することができれば、医療費や人件費、労働量の注入によって、急性期褥瘡部位に生じる血管障害や低酸素削減につながるのではないかと考え今回の研究を着想した。

による酸化ストレスが抑制され、皮膚潰瘍の形成が抑制さ

今回の研究成果から、MSC の皮下注入が、皮膚虚血再還4）

流障害によって生じる血管障害を抑制し、酸化ストレスやれることが示唆された 。
また、小胞体ストレス可視化マウス（ERAI マウス）を用

小胞体ストレスを軽減させて、皮膚潰瘍の出現を有意に減いて検討したところ、急性期褥瘡の発生部位では小胞体ス

少させることを見出した。MSC が急性期褥瘡の新たな治

トレスが増加し、MSC 皮下注入によって抑制されること療法に応用できる可能性が示唆された。さらに今回の研究

も見出した
（図 4）
。さらに、小胞体ストレス因子（GRP 78 /成果は、紫外線などで誘導される皮膚酸化ストレス障害に

BiP、CHOP など）が急性期褥瘡部位で増加し、MSC 皮下よって促進される皮膚老化を予防できるような革新的な薬注入によって抑制されることも明らかにした。これらの結品、化粧品の開発に貢献できることが予想される。

果より、MSC の皮下注入が、皮膚虚血再還流障害によって生じる血管障害を抑制し、酸化ストレスや小胞体ストレスを軽減させて、皮膚潰瘍の出現を有意に減少させることを見出した。MSC が急性期褥瘡の新たな治療法への応用

1） Motegi S, et al. Journal of Dermatological Science
2017; 86: 83-89.
2） U c h i y a m a A , Y a m a d a K , e t a l . J o u r n a l o fが期待できると考えている。

4. 考（引用文献）

Investigative Dermatology 2015; 135: 1157-65.

察3） Uchiyama A, Yamada K, et al. Scientific Reports

加齢により皮膚の虚血が生じやすい理由として、血管量の低下、血管機能の低下、組織（皮膚・脂肪・筋肉）の量と機能が低下し、脆弱となること、骨突出が生じること、知覚低下などが挙げられる。さらに、老化に伴う創傷治癒力、免疫力低下は、高齢者の皮膚潰瘍が治りにくい原因と考えられる。既に人口の 4 分の 1 が 65 歳以上という超高齢者社会を迎えている我が国においては、人口の高齢化に伴っ2015; 5: 9072.
4） Uchiyama A, Yamada K, et al. Experimental
Dermatology 2016; 25: 678-683.
5） Uchiyama A, Motegi S, Sekiguchi A, et al. J DermatolSci. 2017; 86: 187‒197.
6） Motegi S, Sekiguchi A et al. Scientific Reports 2017;
7: 17186.

− 153 −

皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明
近畿大学薬学総合研究所

森山博由

We have shown that skin tissue aging is caused by normalized chronic skin stress, such as exposure of the skin toultraviolet light in sunlight and repair (wound healing) of the skin from abrasions and lacerations. Ultraviolet rays (UV)from sunlight exposure can cause cell apoptosis in the skin epidermis, resulting in the disruption of the barrier. Previously,
we have demonstrated that BNIP 3 stimulates autophagy in epidermal keratinocytes and has a protective effect in these cells
upon UVB irradiation. In this study, we found that the accumulation of reactive oxygen species (ROS) by UVB irradiation
was sufficient to trigger the activation of JNK and ERK mitogen- activated protein kinase (MAPK) in human primaryepidermal keratinocytes. In turn, activated JNK and ERK MAPK mediated the upregulation of BNIP3 expression. Treatment
with an antioxidant reagent or a specific inhibitor of MAPK, U 0126 , and a JNK inhibitor significantly attenuated theexpression of BNIP 3 triggered by UVB, followed by the induction of cell death by apoptosis. Furthermore, UVB-induced
apoptosis was significantly stimulated by chloroquine or bafilomycin A 1 , an inhibitor of autophagy. Moreover, BNIP 3 wasrequired for the degradation of dysfunctional mitochondria upon UVB irradiation. These data clearly indicated that BNIP 3 induced autophagy, which occurs via UVB-generated ROS-mediated JNK and ERK MAPK activation, has a crucial role in
the protection of the skin epidermis against UVB irradiation.

1. 緒

組みの鍵となるメカニズムの提示には至っていない。そこ

言で我々は、皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制

加齢とともに物理的ストレスは蓄積し、体を構成する組御機構を解明すべく、UV ストレスや創傷などの皮膚の恒織にダメージを与え続ける。その影響を最も受け続けてい常性を破綻させうる各種ストレス暴露における、Notch-

る組織の一つが体表面を被う皮膚である。皮膚は加齢ととHes 1 の発現パターンの解析をおこない、ストレス暴露時

もに構造変化をきたし変容する、いわゆる老化する組織でにおける Notch-Hes 1 経路のオートファジー誘導能に与えある。その皮膚構造の変化・変容そのものが外見に反映さる影響および Hes 1 ノックアウトマウスにおける表皮ストれる唯一の臓器といえる。加齢とともに表層化し易くなる

レス耐性解析をおこなった。その結果、Notch-Hes 1 経路

皮膚ダメージは、心身快活な長寿ライフを阻害する直接的は UVB の照射量が強くなるほど活性化し、それにともな

な発現要因（悩みの種）
として捉えることができる。それゆってアポトーシスによる細胞死が増えること、また、生体

え、皮膚の正常な新陳代謝メカニズム（皮膚恒常性）をポイ

における全損欠損創ストレス下では、創傷部位の表皮におントアウトすることが嘱望されている。

いて Hes 1 の発現が上昇していることを見出した。これら

我々はこれまで、太陽光に含まれる紫外線の皮膚へのの結果は、皮膚恒常性を破綻させる日常ストレスに対する照射、皮膚が擦過傷や裂傷から修復（創傷治癒）などの常皮膚が有する恒常性維持メカニズムについての新知見であ態化した慢性皮膚ストレスにより皮膚組織の老化が引きる。これらの知見は、皮膚恒常性維持の分子機構に基づく起こされることを明らかにしてきた。このとき、皮膚を新たな機能性香粧品研究開発にも活用が可能であり、老い構成する細胞間のシグナル伝達に必要な Notch シグナルのに付帯する不安要因の緩和や老化にともなう皮膚脆弱性か

標的分子（Hes 1 転写因子）の発現が上昇することも報告しらの寛解・堅牢性の再獲得など、これからの長寿社会にもてきた。また、Hes 1 が細胞内の恒常性を司ると考えられ大きく寄与できるものと考えられる。

るオートファジーを促進する因子（Bnip 3）の発現を抑制す

2. 方ることで、オートファジーが抑制されることも見出してきた。しかしながら、これらの役者が寄与する皮膚老化の仕法

2 . 1. ヒト 表 皮ケ ラ チノサ イト に お ける NotchHes1 および関連因子の解析
初代ヒト表皮ケラチノサイトは CELLnTec 社より購入

Elucidation of the novel regulation
mechanism in autophagy that contributes
to the prevention of skin aging
Hiroyuki Moriyama
Pharmaceutical Research and Technology
Institute, KINDAI University

し、CnT-PR（CELLnTec 社）で培養した。培養にて安定化させたヒト初代表皮ケラチノサイトに UVB の照射強度を変化させ照射した後、4 時間後にタンパク質を回収してウェスタンブロッティング法をおこない、活性化型
Notch 1、Hes 1、Bnip 3、Cleaved Caspase 3 の発現量を確− 154 −

皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明認した。また、Bnip 3、Hes 1 発現用アデノウイルスベク

BNIP 3 の発現量を調べたところ、10 mJ/cm 2 で発現量のターを感染させた後、UVB 照射をおこない、LC 3 B に対ピークを迎えることがわかった（図 1）。また、Cleaved

する免疫染色をおこない、オートファジー活性を測定した。

Caspase 3 の発現量は 20 mJ/cm 2 から急激に増加することが判明した（図１）。つまり、Notch-Hes 1 経路は UVB の2 . 2 . 生体でのストレス応答時におけるHes1 の発現解析

照射量が強くなるほど活性化し、それにともなってアポト

全損欠損創は以下のように作成した。マウスはイソフル

一方、BNIP 3 と HES 1 のオートファジー活性について

ランによる麻酔下のもと、背部皮膚に直径 5 mm の生検ト

調べたところ、HPEK に BNIP 3 を強制発現させると、我々

レパンで全損欠損創を作成し、シリコンリングを創の周辺の以前の報告どおりオートファジーが誘導された 1）（図 2）。

に縫い付けた。創はテガダーム™トランスペアレントフィ

しかし、HES 1 を強制発現させると、オートファジーのルム（3 M）と包帯で保護し、5 日ごとに創を撮影した。創誘導が抑制されていることが明らかとなった（図 2）。以前

傷治癒率は Image J で傷の大きさを測定し、算出した。

の結果より、UVB 照射時による BNIP 3 の発現増加は、オーシスによる細胞死が増えることが示唆された。

マ ウ ス 皮 膚 は 4 %PFA/PBS で 固 定 し た 後、20 % シ ョートファジー誘導による損傷ミトコンドリアの除去によ

糖 /PBS 溶液に一晩つけてから OCT compound で包埋しり、抗アポトーシスとして働くことが示唆されている 1）。

た。10 µm 厚で凍結切片を作成した後、PBSMT（2 % ス

また、Notch-Hes 1 経路の活性化は、BNIP 3 の発現を抑キムミルク, 0 . 1 % TritonX- 100 含有 PBS）でブロッキング

制する働きがあることも突き止めている 2）。このことから、

し、１次抗体としてラット免疫抗 Hes 1 抗体、ニワトリ免

10 mJ/cm 2 の UVB 照射量では、BNIP 3 の発現が優位に働

疫抗ケラチン 14 抗体、ウサギ免疫抗ケラチン 10 抗体をくため、紫外線照射によるアポトーシスがあまり誘導され使用した。２次抗体として Alexa 488 標識抗ラット IgG 抗ないものの、20 mJ/cm 2 の UVB 照射量では Notch-Hes 1

体、Alexa 555 標識抗ウサギ IgG 抗体を用いた。封入には経路の活性化により BNIP 3 の発現量が抑制され、オート

Prolong Gold Antifade Kit with DAPI（LifeTechnologies

ファジーも抑制されることからアポトーシスによる細胞死社）を用いた。撮影は LSM 800 共焦点顕微鏡（Zeiss）でおこが増えていることが示唆された。また、損傷ミトコンドリなった。

アの除去により、活性酸素も除去されていることが予想さ

3. 結れる。このことから、Notch-Hes 1 経路の阻害が、抗老化

果につながることも期待される。このように皮膚恒常性をヒト表皮ケラチノサイト（HPEK）を用いて、UVB 照射

脅かすストレスは、Notch-Hes 1 経路に影響を及ぼしていにおける Notch-Hes 1 経路の活性化についての発現解析

ることがわかる。このことは、皮膚恒常性ストレスにおいをおこなった。まず、UVB 照射後 Notch-Hes 1 経路が活て、Notch-Hes 1 経路が重要な役割を担うことを大いに示

2

性化する UVB 照射量を調べたところ、20 mJ/cm で活性

唆するものである。そうであれば、それは他のストレス要化のピークを迎えていることがわかった（図 1）。対して、因でも観察される現象に他ならない。そこで、生体におけ

図1

図2− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020も抑制されることからアポトーシスによる細胞死が増えていることを示唆する。またこの時、損傷ミトコンドリアの除去により、活性酸素などの細胞老化因子も除去されていることも予想されるため、Notch-Hes 1 経路は抗老化作用の主要な細胞内シグナル伝達経路と捉えられ、この経路の効果的な阻害が新たな抗老化の作用点となることが期待される。
このように、Notch-Hes 1 経路には皮膚の恒常性に広範に寄与する新たなキーメカニズムの可能性が見出された。
皮膚の恒常性を即座に脅かす外的ストレス要因の筆頭は、皮膚が傷ついて破綻する作用、いわゆる創傷作用である。

図3

そこで、生体における Hes 1 のストレス応答を観察するためにマウスに全損欠損創を作成し、Hes 1 の発現解析をおる Hes 1 のストレス応答を観察するために、マウスに全損こなったところ、創傷部位の表皮において Hes 1 の発現が欠損創を作成し、Hes 1 の発現解析をおこなった。全損欠

大きく上昇していることがわかった。創傷早期に誘起され損創を作成した 2 日目に皮膚を回収し、Hes 1 に対する免る Hes 1 の発現上昇とその生理的・分子生物学的メカニズ

疫染色をおこなったところ、図 3 に示すように、創傷部位

ムについては、解析を進めているところであるが、Notch

では非創傷領域と比べ、表皮での Hes 1 の発現が優位に上

シグナルや Hes 1 およびその関連分子が皮膚恒常性に係る昇していることを見出すに至った（未発表データ）。

現象をいくつか発見するに至っている。これらを総じて、

4. 考

今回の研究成果は、基礎皮膚科学や臨床皮膚研究などの医察療の観点はもとより、人々の心身の健康をひろく支える香UVB 照射が皮膚に与える分子制御機構について、ヒト

粧品の評価機材の開発 3）や新規機能性香粧品の創製、さらの表皮ケラチノサイトでは Notch-Hes 1 経路の活性化が起には長寿社会を支える新たな社会基盤研究の一助に通じる

こり、それにともないアポトーシス細胞の増加が顕著とな萌芽的成果として捉えることができる。

2った。これらを誘起する UVB 照射量は 20 mJ/cm でピー

5. 統

クを迎えることもわかった。これは日常生活で受ける照射括量の範疇であり、特に夏場には UVB 照射量はこれを大き

昨今の一億総活躍社会実現の積極的推奨の観点からも拙

く超える時間帯もあることから、皮膚構成細胞のうち特に速に進みつつある使役勤労長寿社会化において、心身のス

表皮ケラチノサイトにおける Notch-Hes 1 経路が、その後トレスを背景にした老化の問題はつぶさに喫緊に対処すべに引き起こされるアポトーシスによる細胞死の抑制に寄き深刻な社会的課題である。唐突ではあるが、この課題に与することが考えられる。面白いことに、一般にアポトー

踏み込む切り口のひとつが「皮膚の恒常性と老化」、その科

シス誘導などに関連する BNIP 3 の発現は、UVB 照射量が学的探究と考える。体表を被う皮膚は、多様な外部環境や

2

10 mJ/cm でピークを迎えることもわかった。これらのストレスに速やかに応答する直接的な防御壁である。皮膚

分子間での発現制御機構とバランスが、皮膚のターンオー

は身体的健康を維持する生体恒常性を維持するバリア装置

バーにおける皮膚恒常性を制御する鍵となるかもしれない。

である。それとともに、外見として他者の視覚的意識にもそれゆえ、我々は皮膚恒常性にとって鍵となる生命現象反映される臓器ゆえ、精神的な健康にも影響を及ぼす心理を広く捉え、その因子のひとつとしてオートファジー制御

的なバリア装置ともなり得る。老化に伴う皮膚機能の破綻機構に着目した。実際、BNIP 3 と HES 1 のオートファジ

は、理想とする容貌や容姿の破綻だけでなく、生体内部のー活性について調べたところ、HPEK に BNIP 3 を強制発機能破綻、強いては生命の破綻までつながるトリガーでも

1 , 2）

現させるとオートファジーが誘導される（図 2） 。しかし、ある。圧倒的な長寿人口社会の負の問題のリスクヘッジとHES 1 の強制過剰発現は、オートファジー誘導を抑制した

して「皮膚の抗老化」は極めて重要な研究課題として捉える（図 2）。さらに、我々のこれまでの研究成果より、UVB 照

ことができる。

射時に引き起こされる BNIP 3 の発現増加は、オートファ

我々の求める研究成果は、老いに付帯する不安要因の緩ジー誘導による損傷ミトコンドリアの除去を誘導するなど和や老化にともなう皮膚脆弱性からの寛解・堅牢性の再獲

抗アポトーシス作用因子として働くことも示している 1 , 2）。

得など、これからの長寿社会に寄与できるものと考えられこれらの結果は、紫外線照射による Notch-Hes 1 経路の活る。これらの観点は終局的に、⑴ 我が国が初となるオー性化により BNIP 3 の発現量が抑制され、オートファジー

トファジー皮膚恒常性機構の解明、⑵ 長寿社会での社会− 156 −

皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明

保障費・医療費の削減、⑶ 予防医療受診への啓蒙、⑷ 褥

Y, Goto A, Morita T, Hayakawa T. BNIP3 upregulation

瘡や加齢皮膚疾患等に対する特効薬開発や治療法の開発に

via stimulation of ERK and JNK activity is required

波及的な効果を及ぼすことが期待できるものと考えている。

for the protection of keratinocytes from UVB-induced
apoptosis. Cell Death Dis, 2017. 8（2）: p. e2576.

（引用文献）

3） Moriyama M, Sahara S, Zaiki K, Ueno A, Nakaoji

1） Moriyama M, Moriyama H, Uda J, Matsuyama A,

K, Hamada K, Ozawa T, Tsuruta D, Hayakawa T,

Osawa M, Hayakawa T. BNIP3 plays crucial roles

Moriyama H. et al., BAdipose-derived Stromal/Stemin the differentiation and maintenance of epidermal

Cells Improve Epidermal Homeostasis. Sci Rep, 2019. 9

keratinocytes. J Invest Dermatol, 2014. 134（6）: p.1627-35.

（1）: p. e18371.

2） Moriyama M, Moriyama H, Uda J, Kubo H, Nakajima− 157 −

表皮細胞間接着分子の発現増強条件と皮膚機能の総合的検討
慶應義塾大学医学部皮膚科学教室

山上淳This study aimed to comprehensively evaluate skin function by examining the conditions for enhancing the expressionof epidermal intercellular adhesion molecules. Our results suggested the effect of steroid administration on enhancing
desmoglein expression and would help with understanding the adhesive function of epidermal cells. Steroid effects onother molecules making up desmosomes, cytoskeleton and other barrier structures, and compounds other than steroids are
expected to be clarified on the basis of this study when the exhaustive search system of mRNA expression, which are still
underway, is set up. The ultimate goal of this study is the accumulation of information needed to maintain skin health for alonger period of time, and the conditions for maintaining skin with a stronger adhesion function. Because epidermal cellcell adhesion is an important basic function of the skin, we are going on our efforts to disseminate new information about
the direction of skin care. From another point of view, it was very meaningful to obtain new knowledge directly related tothe pathogenesis and treatment of pemphigus and pemphigoid, state-designated intractable diseases. We have been able tocollect information on epidermal cells not only from healthy skin but also from diseased skin that has caused blisters anderosions form various angles, and would like to contribute to cosmetology, which is expected to become more diversified in
the future.

1. 緒

これまでに行われてきた研究の結果からは、天疱瘡にお言いて自己抗体が抗原に結合してから水疱形成に至るまでの表皮細胞同士の接着にはデスモゾームが大きな役割を果機序として、大きく 2 つの説が考えられている。1）自己抗たしている。デスモゾームでは、細胞外でデスモグレイン

体の結合により Dsg の機能を空間的に直接阻害する steric（Dsg）およびデスモコリンといったデスモゾーマルカドヘ

hindrance 説と、2）自己抗体が Dsg に結合することで細胞リンと呼ばれる細胞接着分子同士が結合し、細胞膜部で内内シグナルを誘導して Dsg のリン酸化を介して細胞膜上側からプラコグロビン、デスモプラキン、プラコフィリンから細胞内に引き込まれる、あるいは p 38 MAPK などにといった細胞裏打ちタンパクに支えられることで、表皮細よって二次的に活性化されたプロテアーゼにより棘融解が胞間接着が保持されている。天疱瘡は、主に Dsg に対する惹起されるというシグナル伝達説である。近年、病原性の自己抗体によってデスモゾームの機能が障害されることにあるモノクローナル抗体がシグナル非依存性に水疱を形成より、粘膜・皮膚に水疱・びらんを生じる自己免疫疾患でする一方で、ポリクローナルな抗体からなる天疱瘡患者血ある。我々は、これまで天疱瘡の診療・研究に従事してき清は p 38 MAPK を介して Dsg を凝集させてエンドサイト

たが、天疱瘡に罹患した皮膚が副腎皮質ステロイドの外用ーシスを起こすことがわかってきており、患者内では上記によって上皮化が促進され、治癒する症例を多数経験しての 2 つの機序が混在しながら水疱形成を起こしていると考きた。従来より、副腎皮質ステロイドの天疱瘡に対する作

えられる 1 , 2）。これを受けて、副腎皮質ステロイドの作用用機序として、原因となる自己抗体の産生を低下させる免として、1）表皮角化細胞における Dsg などのタンパク発現

疫抑制作用が主に考えられてきた。しかし、抗体産生細胞

に対する影響、2）シグナル伝達に対する影響があることがへの作用のみであれば、効果発現までに時間がかかるのに予想された。以上のような背景から、副腎皮質ステロイド

対して、ステロイド外用剤の皮膚症状への効果は投与開始の濃度などを中心に、表皮細胞間接着に関わる遺伝子およ

後数日で現れることは、多くの皮膚科医の知るところであびタンパクの発現を増強させる条件を検討することにより、る。そのため、抗体産生細胞への作用以外に、水疱形成を

皮膚機能を総合的に評価することを目的として、本研究を抑制し上皮化を促進させる機序が関与している可能性が示計画した。

唆されてきた。

また、天疱瘡は Dsg に対する自己抗体によって表皮細胞間接着が傷害されて水疱が形成される疾患だが、同様の機Comprehensive study on the skin function
a nd cond it ions for en ha nci ng t he
expression of epidermal cell-cell adhesion
molecules
Jun Yamagami
Department of Dermaotology, Keio
University School of Medicine

序で皮膚および粘膜に水疱および紅斑を生じる自己免疫疾
患に水疱性類天疱瘡（bullous pemphigoid; BP）がある。表皮基底膜部（basement membrane zone; BMZ）の構成タンパクである BP 180（XVII 型コラーゲン）および BP 230 に対する IgG 自己抗体が原因で、BP 患者の皮膚では BMZ への IgG・補体の線状沈着を認め、血清からはこれらの自己− 158 −

表皮細胞間接着分子の発現増強条件と皮膚機能の総合的検討

抗原特異的な IgG 抗体が検出される。加えて、一部の BPの皮膚への沈着との関連を検討した。BPDAI のスコアは、

患 者 で BP 180 特 異 的な血清中の IgE 抗体や、BMZ へ のびらん／水疱（erosion/blister）、紅斑／膨疹（erythema/

IgE の沈着を認めたという報告が以前より散見され、BP

urticaria）に分けて記録されているので、IgE の BMZ へのにおける水疱および紅斑の形成、病態への IgE の関与が示

沈着が皮膚症状として水疱と紅斑のどちらに寄与したのか

唆されてきている。本研究で、表皮内に水疱を形成する天を、ある程度判別することが可能と考えられた。

疱瘡との対比として、表皮下に水疱を生じる BP での IgG

3. 結および IgE の病態における役割を比較検討することで、皮膚機能の総合的理解が深まることが考えられた。

2. 方

果

培養したヒト表皮角化細胞に水疱形成を誘導する Dsg 3に対するモノクローナル抗体（AK 23）を加えて細胞接着障法

害の程度を観察する in vitro dissociation assay を用いて、

2 . 1. 培養表皮角化細胞における細胞接着分子発現
条件の検討

接着分子の発現および機能に対するステロイドの作用を観ステロイドおよび他の化合物の表皮細胞への影響を評価

ロン（PSL）およびヒドロコルチゾンの存在下で検討したとするため、培養したヒト表皮角化細胞を用いた in vitro のころ、培地中の PSL 濃度が 0 . 001 mM の時に、AK 23 によ系を用いた。基礎的な実験として、培養したヒト表皮角化って生じる細胞断片の数が最も小さくなり、水疱形成抑制

察した。0 . 00001 mM から 1 mM までの濃度のプレドニゾ

細胞にさまざまな濃度および種類の副腎皮質ステロイド効果が最も高いと推測された。ヒドロキノンでも 0 . 1 mM

（プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）を加え、Dsg 1 およの存在下で水疱形成抑制効果が見られたが、臨床現場で天び Dsg 3、デスモコリン、デスモプラキン、プラコフィリ

疱瘡に対して第一選択で投与される PSL を用いて実験をン、プラコグロビンといったデスモゾームを構成する分子続けることとした。

の mRNA 発現の経時的変化、また培地中の副腎皮質ステ

水疱形成抑制の機序を解明するため、培養ヒト角化

ロイド含有濃度との関連性についてリアルタイム PCR 法

細 胞 に 0 . 0001 mM か ら 0 . 1 mM ま で の 濃 度 の PSL を 加で評価した。

え、Dsg、デスモコリン、デスモプラキン、プラコグロビ
ン、プラコフィリンといったデスモゾームを構成する分子2 . 2 . 抗 Dsg 3 抗体の水疱形成抑制作用の検討の mRNA 発現をリアルタイム PCR 法で検討した。デスモステロイドの用量および時間経過の条件検討の後に、各

コリン、デスモプラキン、プラコグロビン、プラコフィ

化合物存在下における抗 Dsg 3 抗体の水疱形成作用の変化

リン、Dsg 1 に関しては、PSL 存在下での変化は観察されを検討した。我々の研究室では、抗体の水疱形成能を定量なかったが、Dsg 3 の mRNA は、PSL 添加後 8 時間後から的に評価する系として、培養ヒト角化細胞に表皮剥奪毒12 時間後にかけて、生食を加えた時に比べて有意に上昇

素（exfoliative toxin A; ETA）を入れて Dsg 1 の接着機能をしていることがわかった。ただし、ピークの PSL 濃度は消失させた後に、抗 Dsg 3 抗体を加えてピペッティングに

0 . 0001 mM で、in vitro dissociation assay におけるピーク

よる機械的ストレスを与えた際の細胞断片数を測定する inである 0 . 001 mM と異なっていた。

vitro dissociation assay が確立されている。さらに天疱瘡

これらの結果を受けて、複数の天疱瘡患者血清および患者の血清、天疱瘡患者およびモデルマウス由来の多様なAK 23 以外のモノクローナル抗体（AK 23 よりも病原性の病原性を有する Dsg 3 に結合するモノクローナル抗体を多弱い AK 18、落葉状天疱瘡患者から単離された Dsg 1 のみ数所有しており、in vitro dissociation assay で加えた抗体に反応する PF 1 - 8 - 15 など）の水疱形成機能を抑制させるの種類およびステロイドの濃度に応じて、シグナル伝達物

効果を示す、表皮角化細胞培養中の PSL 濃度を調査しな質およびデスモゾーム構成タンパクの mRNA 発現を検討

がら、その機序を解明するためのリアルタイム PCR の条した。

件について、現在検討を重ねている。
ま た、BP 患 者 53 例 の 皮 膚 凍 結 標 本 を 用 い て DIF で

2 . 3 . 水疱性類天疱瘡の水疱形成におけるIgE の役
割の検討

BMZ への IgE の沈着を調べた。53 例中 10 例（18 . 9 ％）で皮 膚 BMZ へ の IgE の 沈 着 と BP の 病 態 と の 関 連 を 調への顆粒状の弱い IgE 沈着を認め（IgE ±群）、両群を合わ

べ る た め、 当 科 で 皮 膚 生 検 を 行 い、BP と 診 断 さ れ た

せると 23 例（43 . 4 ％）となっていた。次に 53 例のうち、診BMZ への強い IgE 沈着（IgE+ 群）、13 例（24 . 5 %）で BMZ

53 例 の 患 者 の 凍 結 皮 膚 切 片 を 直 接 蛍 光 抗 体 法（direct

断時に未治療だった 15 例に関して臨床症状スコアである

immunofluorescence; DIF）により IgE で染色した。診断時

BPDAI を比較した。IgE+ の症例群では、沈着を認めなかに未治療だった症例に関しては、臨床症状スコアであるった症例（IgE- 群）に比べて有意にびらん／水疱の BPDAI

bullous pemphigoid disease area index（BPDAI）と IgE

スコアが高かった一方で（IgE+; 38 . 0 ± 20 . 8、IgE-; 18 . 0− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020± 11 . 2、p< 0 . 05）、膨疹／紅斑の BPDAI スコアには有意高い検討が可能となったと考えられる。BP の診断基準に差を認めなかった。さらに、IgE+ または IgE ±の症例群

は、IgG および補体（C 3）の BMZ への沈着が含まれているでは、IgE−の症候群に比べてステロイド内服開始後にびが、実際の BP の病態において IgG と IgE のどちらの関与

らん／水疱の BPDAI スコアが治療前の 25 % 以下に減少すがより大きいのか、というのは非常に興味深い疑問点であるまでにより長く時間がかかり、ステロイド治療に対するる。今回の研究のみからは結論づけることはできないが、反応性の低さが示唆された（IgE+ および IgE ± ; 20 ± 8 . 0

臨床症状を比較した 15 例においては、全例で典型的な BP［日］、IgE− ; 9 . 4 ± 3 . 8［日］、p< 0 . 05）。また IgE+ の症と同様に BMZ への IgG および C 3 の沈着が見られており、例群では、IgE ±および IgE−の症例群に比べて、ELISA

それに加えて IgE の BMZ への沈着が生じることで、さら法で測定した血清中の BP 180 特異的 IgE 抗体価が有意になる症状の増悪および治療抵抗性につながっている可能性高かった（p< 0 . 05）3）。

が推測された。ただ、今回の研究では IgE の BMZ への沈4. 考

着は陽性、弱陽性、陰性の 3 段階で評価しているのに対し、

察

IgG の沈着は陽性、陰性の 2 段階でしか評価していないの

本研究の結果から、ステロイドの投与により Dsg 3 のは問題点と考えられた。今後は、これまでの臨床・研究でmRNA 発現が上昇し、細胞間接着が補強されることによあまり注目されてこなかった BMZ への IgG の沈着量にもり、自己抗体による水疱形成が抑制されることが示唆さ着目して、IgG 沈着の定量法を確立するとともに臨床症状れた。これまでの研究でも、培養細胞をステロイドで処

スコアとの関連があるかなど、多方面から検討すべきであ

理してから天疱瘡血清を加えた後の、デスモゾームの構成

ろう。

因子の発現を検討することが行われていたが、本研究では一般的に IgE は Fcɛ 受容体を介して免疫応答を起こし、

steric hinderance 説に基づき、直接的に細胞間接着を障害

肥満細胞の脱顆粒などを通じて臨床症状を生じると考えするモノクローナル抗体における機序に関する理解が深まられている。今回の研究の結果からは、その経路とは別った点が非常に意義深い。

に、生体内で自己抗原に直接結合した IgE が、水疱形成を

Dsg 分 子 の 細 胞 内 取 り 込 み を 調 節 す る 因 子 と し て、

通じて BP の発症および増悪に関与する可能性が示唆されprotein kinase C（PKC）、RhoA、c-myc、プラコグロビ

た。BMZ に沈着している IgE が水疱を起こす機序についンなどのシグナル伝達経路の関与がこれまでに言及されてては、現時点で明確な解答があるわけではないが、過去

おり、よく知られている p 38 MAPK の活性化機構とともの報告からは BMZ に存在している IgE により BP 180 の細に、さらなる検討を進めていく予定である。今後の実験

胞内移行が起こり、表皮真皮間の接着強度が低下すること、の精度を高めるとともに、ステロイド投与からの時間経

さらに皮膚への好酸球や好中球の浸潤が促進され、タンパ

過、ステロイドの種類の違い、天疱瘡血清およびモノクロ

ク分解が誘導されて水疱が形成されることなどが考えられーナル抗体の病原性の違いなどが、デスモゾーム構成分子

る。実際に、BP 患者の血清や水疱液中で、IL- 4 や IL- 5の mRNA 発現にどのように作用するか検討を進め、水疱

などの Th 2 関連のサイトカインの上昇はしばしば認めら

形成機序に特化した治療標的を探索していきたいと考えてれるため、いわゆるアレルギー疾患を起こす何らかの反いる。

応が、BP の発症に関連している可能性はあり、そのカスBP での成果に目を向けると、BP 180 に特異的な IgE のケードの中で IgE が大きな役割を果たしている可能性が示抗体価と BP の病勢の関連を検討した報告は過去にも存在唆されている。実際に、IgE に対するモノクローナル抗体する。以前の研究や蕁麻疹での IgE の役割から、IgE 自己であるオマリズマブは、主に血清 IgE 高値、好酸球増多を

抗体は BP の紅斑の形成に関わっていることが予想された。

認める BP の症例に奏効した報告がある 4）。今後 BMZ に沈

しかし、今回の結果で BMZ への IgE の沈着は、BPDAI の

着する IgE 抗体に関連した病態生理の解明により、抗 IgE

膨疹／紅斑スコアよりもびらん／水疱のスコアとの関連

抗体をはじめとして、BP 患者に対するより安全で有効な、が見られたため、紅斑よりもむしろ水疱の形成と増悪おステロイドに依存しない新規治療法の確立が期待される。

よび治療抵抗性に関係していることが示された。今回の5. 統

研究では、DIF で皮膚の BMZ に結合している IgE を検出

括して評価することが重要なポイントとなっている。ただ

本研究は、表皮細胞間接着分子の発現増強条件の検討かし、BP における自己抗体の最も重要な標的タンパクであら総合的に皮膚機能を評価する計画であり、ステロイドのる BP 180 に特異的な IgE を検出できる ELISA とは異なり、投与による Dsg 発現増強の効果を確認できたことは、大き抗体の特異性については DIF のみでは判定できない。今回な成果であったと考えられる。めざしていたマイクロアレ

は、DIF と ELISA の結果と組み合わせることにより、IgE

イのセットアップは研究期間内には間に合わなかったため、自己抗体の BP の病態における役割について、より精度のデスモゾームを構成する他の分子、細胞骨格や他のバリア− 160 −

表皮細胞間接着分子の発現増強条件と皮膚機能の総合的検討

構造を司る分子、ステロイド以外の化合物の影響などにつdependent and independent mechanisms in pemphigus

いては、現在も進めている理想的な条件検討が終わった段vulgaris blister formation. PLoS One 2012; 7（12）: e50696

階で、今後解明されることが期待される。表皮細胞間接着２）Yoshida K, Ishii K, Shimizu A et al. Non-pathogenicは皮膚の重要な基礎機能であり、本研究の最終的な目的は、

pemphigus foliaceus（PF）IgG acts synergistically with

より強固な接着機能を持つ皮膚を保つための条件、長くa directly pathogenic PF IgG to increase blistering

皮膚の健康を維持するために必要な情報の蓄積である。スby p3 8MAPK-dependent desmoglein 1 clustering. J

キンケアの方向性に関する新しい情報を発信できるように、

Dermatol Sci 2017; 85（3）: 197-207
３）Kamata A, Kurihara Y, Funakoshi T et al. Basement

努力を続けたいと考えている。
また別の視点から考えると、天疱瘡・類天疱瘡という国

membrane zone IgE deposition is associated with

指定難病の病態・治療に直結する新知見が得られたことは、

bullous pemphigoid disease severity and treatment

非常に有意義であった。健康な皮膚だけでなく水疱・びら

results. Br J Dermatol 2 0 1 9; doi: 1 0.1 1 1 1/bjd.1 8 3 6 4.

んを生じた病的な皮膚からも、表皮細胞の情報を多角的に［Epub ahead of print］

収集できたことは大きく、今後ますます多様化が求められ４）Balakirski G, Alkhateeb A, Merk HF et al. Successful

るコスメトロジーに少しでも貢献できればと考えている。

treatment of bullous pemphigoid with omalizumab as
corticosteroid-sparing agent: report of two cases and（引用文献）

review of literature. J Eur Acad Dermatol Veneol 2016;１）Saito M, Stahley SN, Caughman CY et al. Signaling

30（10）: 1778-82− 161 −

プラズマローゲン型リゾリン脂質代謝系を基軸とした皮膚の恒常性と疾患調節の作用機序の解明
徳島大学大学院社会産業理工学研究部（生物資源産業学域）

山本圭

Epidermal lipids play important roles in skin homeostasis and diseases. We herein report that lysoplasmalogen (P-LPE),
preferentially produced by group IIF secreted phospholipase A2 (sPLA2-IIF; an “epidermal sPLA2”) that is expressed in the
suprabasal epidermis, promotes epidermal hyperplasia. In both mice and humans, the expression of sPLA2-IIF is increased ininflamed skin in correlation with that of several inflammatory markers such as S100A9 and TNF. Pla2g2f -/- mice had a fragile
stratum corneum and were strikingly protected against psoriasis, atopic dermatitis. Conversely, global and keratinocytespecific Pla2g2f-transgenic mice developed psoriasis-like epidermal hyperplasia spontaneously. Primary keratinocytes fromPla2g2f -/- mice showed defective differentiation and activation. sPLA2-IIF was induced by calcium or Th17 cytokines (IL17A and IL-22) in keratinocytes and preferentially hydrolyzed ethanolamine plasmalogen secreted from keratinocytes togive rise to P-LPE. Treatment with P-LPE restored defective activation of Pla2g2f -/- keratinocytes both in vitro and in vivo,
while forcible degradation of P-LPE by topical application of recombinant lysophospholipase D from Thermocrispum,a lysoplasmalogen-specific hydrolase, prevented psoriasis and atopic dermatitis by in wild-type skin. Moreover, P-LPE
markedly facilitated upward proliferation and differentiation of human primary keratinocytes in three-dimensional culture.
Diagnostically, the increase of several P-LPE species, but not other lysophospholipids, was readily detectable in the tapestripped stratum cormeum obtained from psoriatic and atopic skins. Overall, our results highlight P-LPE as a previously
unrecognized bioactive lysophospholipid and point to the sPLA2-IIF/P-LPE axis as a novel drug or biomarker target forpsoriasis and atopic dermatitis and possibly other epidermal-hyperplasic diseases.

1. 緒で、表皮角化細胞の間隙に分泌される表皮リン脂質代謝酵

言素（sPLA 2 -IIF）がプラズマローゲン型リゾホスファチジル

皮膚、とりわけ表皮は体内の生命環境と非生命環境とのエタノールアミン（リゾプラズマローゲン：P-LPE）を産間の境界バリアの役目をもち、体内からの水分の蒸発、体生し、この P-LPE が表皮角化細胞の分化に寄与すること、液の漏出あるいは病原体などの侵入から体を守っている。

さらに表皮肥厚性疾患を惹起する新規リゾリン脂質である

表皮角質層は表皮角化細胞（ケラチノサイト）の周囲をセラ

ことを報告した 3）（図１）。しかし表皮における P-LPE のミドやコレステロールからなる角質細胞間脂質により満た機能については未だ未解明な部分が多い。そこで本研究でされているために物理的・化学的刺激に対して非常に安定

は P-LPE の分子メカニズムを詳細に解析することを目的であり、また脂肪酸などにより表皮は酸性に保たれている。

とした。

しかし、一旦ケラチノサイトの分化および増殖のサイクル

2. 方が壊れると皮膚のバリアが乱れ、魚鱗癬などの重篤な角質不全疾患を呈する他に、乾癬やアトピー性皮膚炎などの慢法

2 . 1. ヒト表皮角化初代培養細胞

性炎症性皮膚疾患につながり、その克服が望まれている。

実験には不死化ヒト表皮角化細胞株 NHEK/SVTERT 3 - 5

栄養素として摂取された脂肪酸はグリセロール骨格に結（Evercyte）を用いた。細胞の継代は正常ヒト表皮角化細胞合した形でリン脂質や中性脂肪に蓄えられ、必要時に脂質増殖用培地 HuMedia-KG 2（クラボウ）を用いて 37 ℃、7 %分解酵素群によって遊離される。我々は、リン脂質分解

CO 2 条件下でおこなった。三次元培養は、角化細胞分化専

酵素の一群であるホスホリパーゼ A 2（PLA 2）群の網羅的用培地CnT-PR-3D：CnT-Prime 3D Barrier（CELLnTEC）

欠損マウスの表現型解析に脂質質量分析（リピドミクス）に 懸 濁 し た 細 胞 を 2 . 0 × 105 cells/well に な る よ う に 24を用いることで、各 PLA 2 により動員される疾患固有のwell セルカルチャーインサートに播種し、翌日、セルカル

脂質代謝とその生物学的意義を解明してきた

1 , 2）。その中Elucidat ion of mecha n ism of sk i nhomeostasis and disease regulation byplasmalogen-type lysophospholipid pathway

チャーインサート内の培地を除去した後、気相培養をおこなった。siRNA による抑制実験では、三次元化する前日に Lipofectamine RNAiMAX Reagent（Thermo）を用いてsiRNA を導入した細胞を用いた。三次元培養開始から 3 日

Kei Yamamoto

後、終濃度 10 ng/mL の TNF-α、IL- 1 β、IL- 22、IL- 17 A、Division of Bioscience and Bioindustry,
Graduate School of Technology, Industrial
a n d S o c i a l S c i e n c e s , To k u s h i m a
University

IL- 17 F、IL- 6（PEPROTECH）、あるいは 10 nM P-LPEを加え、48 時間培養した。

− 162 −

プラズマローゲン型リゾリン脂質代謝系を基軸とした皮膚の恒常性と疾患調節の作用機序の解明

図 1 sPLA 2-IIF/p-LPE 経路は皮膚バリアを構築するマスターレギュレーターである

2 . 2 . 創傷治癒モデルに再びカルシポトリオールを塗布して翌日に解析した。阻実験には C 57 BL/ 6 背景の野生型マウスおよび sPLA 2 -害剤および LyPls-PLD 4）は後述に従って塗布した。ビデオを使用した。バリカンを用いてマカメラを用いて 30 分間マウスを撮影し、前肢および後肢

ウス背部の体毛を剃り、露出させた皮膚に 5 mm 生検トレによる耳介の掻痒回数を測定した。耳介厚の測定およびパンを用いて穿孔し、経時的に穿孔径を測定した。また、回収した耳介から mRNA を抽出し定量的 PCR 法を用いて

sPLA 2 -IIF 遺伝子欠損マウスの患部に 10 nM P-LPE（5 %sPLA 2 -IIF ならびにアトピー性皮膚炎に関わる遺伝子をエタノール / 生理食塩水）を添加し、遺伝子欠損による表測定して評価した。

IIF 遺伝子欠損マウス

3）

現型の回復を評価した。

2 . 5 . 角質脂質を用いたリピドミクス解析
2 . 3 . 乾癬モデル

マウス耳介から 1 検体につきテープ約 0 . 7 cm × 0 . 7 cm、Balb/c 背 景 の 野 生 型 マ ウ ス お よ び sPLA 2 -IIF 遺 伝 子

5 枚分の角質を採取した。ヒトの場合は健常者、アトピ欠損マウス 3）の耳介に 5 % イミキモド（ベセルナクリーム、ー性皮膚炎患者、乾癬皮膚炎患者から 1 検体につきテー

持田製薬）を 5 日間連続して塗布して乾癬モデルを作成し

プ約 2 . 5 cm × 6 cm、5 枚分の角質を採取した。裁断したた。阻害剤およびリゾプラズマローゲン特異的ホスホリパ

テープから総脂質を抽出し、質量分析装置（4000 QTrap,

ーゼ D（LyPls-PLD） は後述に従って塗布した。耳介厚Sciex）を用いて分析した 3）。内部標準としてd 7-LPE（18 : 1）、の測定を行うとともに、回収した耳介から mRNA を抽出

d 5 -EPA を用い、各測定値はサンプルの総蛋白量を用いし定量的 PCR 法を用いて sPLA 2 -IIF ならびに乾癬に関わて補正した。

4）る遺伝子を測定して評価した。

3. 結

果

Balb/c 背景の野生型マウスおよび sPLA 2 -IIF 遺伝子欠3 . 1. ヒト表皮角化初代培養細胞における sPLA 2 IIF/P-LPE 経路の役割

損マウス 3）の耳介に 80 nM カルシポトリオール（MC 903、

表皮角化細胞株 NHEK/SVTERT 3 - 5 を高密度の濃度でCayman）を連続 3 日間かつ 3 週繰り返して塗布し、4 週目

トランスウェルに播種し、三次元化専用培地の CnT-PR-

2 . 4 . アトピー性皮膚炎モデル− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

3 D を用いて、気相培養をおこなった。その結果、細胞のトの活性化が抑制され、病態が有意に改善した 3）。sPLA 2 -著しい三次元化の亢進および分化マーカー KRT 1 の誘導IIF は乾癬の表皮肥厚部に発現していることから、sPLA 2 -が認められるものの基底層の KRT 14 の発現には変化は

IIF の酵素反応産物である P-LPE は表皮角質に局在するなく、細胞の三次元化が適切におこなわれていることがことが想定される。そこで、Balb/c マウスの耳介にイミ示された。この条件下において sPLA 2 -IIF の発現は細胞キモドを塗布し、塗布 5 日目の表皮角質のリピドミクスの三次元化に伴って増加した。表皮細胞の PLA 2 G 2 F を解析をおこなった。その結果、P-LPE 群がイミキモドをノックダウンすると細胞の三次元増殖および分化マーカ

塗布した表皮角質で増加し、そのうち LPE（P- 18 : 0）はー KRT 1 の発現増加が抑制されたが、KRT 14 の発現に

7 . 0 pmol/cm 2 で あ っ た。 さ ら に sPLA 2 -IIF 欠 損 マ ウ ス

は影響がなかった。さらに、三次元化した表皮角化細胞にの角質では野生型で増加した P-LPE 群は有意に低下した。

Th 17 応答性のサイトカインを含む 6 種類のサイトカイン

以上の結果から、P-LPE が表皮角質層に局在し病態に応（TNF-α, IL- 1 β, IL- 22 , IL- 17 A, IL- 17 F, IL- 6；各 10 ng/

じた変化が認められたことから、P-LPE は乾癬のバイオmL）を添加して乾癬を誘導させると、細胞活性化マーカ

マーカーとして期待できることが示唆された。

ー S 100 A 9 とともに sPLA 2 -IIF の発現が著しく増加した。

リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼ D（LyPls-

この S 100 A 9 の発現増加は PLA 2 G 2 F のノックダウン

PLD）は P-LPE を特異的に分解しプラズマローゲン型リゾにより抑制された。一方、乾癬は JAK/STAT 3 経 路 を 介

ホスファチジン酸（P-LPA）を産生する放線菌由来の酵素

し て 惹 起 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る。 本 実 験 モ デ ル

である 4）。精製した組換 LyPls-PLD を乾癬を惹起させたにおいてサイトカイン添加によるSTAT3 リン酸化の亢進はマウス耳介に外用塗布すると P-LPE の低下を伴って、表PLA2G2Fのノックダウンにより消失した。さらにsPLA 2 -皮の肥厚および炎症マーカー TNF の発現が低下した。こIIFノックダウン細胞にP-LPEを添加すると細胞活性化マーの低下のレベルはデキサメサゾンによる表皮の肥厚抑制とカー S100A9 の発現が増加し、ノックダウンによる影響を同程度であった。すなわち sPLA 2 -IIF/P-LPE 経路は乾癬

レスキューした。以上の結果から、sPLA 2 -IIF/P-LPE 経に寄与すること、この経路はデキサメサゾンに代わる新規路は表皮角化細胞の活性化に寄与することが示された。

創薬ターゲットになる可能性があることが示唆された。

3 . 2 . 創傷治癒におけるsPLA 2 -IIF/P-LPE 経路の役割

3.4. アトピー性皮膚炎におけるsPLA 2 -IIF/P-LPE
経路の役割

sPLA 2 -IIF/P-LPE 経路はケラチノサイトを活性化し、アトピー性皮膚炎は、好酸球や Th 2 細胞の増多、高 IgE皮膚バリアの形成に寄与する重要な役割をもつことが示唆血症などの症状が認められる表皮肥厚性疾患であり、皮膚されていることから、皮膚創傷治癒に関与することが想定の肥厚に加え痒みが特徴で、掻くことによりさらにバリアされる。バリカンを用いてマウス背部の毛を剃り、背部皮機能が低下するという悪循環に陥ってしまう。胸腺間質性

膚に 5 mm の生検パンチで円形の創傷を作成し経時的に観リンパ球新生因子（TSLP）はケラチノサイト由来のアトピ察した。創傷面積の測定を行い創傷閉鎖の動態を元の創傷

ー性皮膚炎の病態を形成する最も重要なケモカインの一つ

面積に対する割合として評価した。その結果、野生型マウとして位置付けられ、ビタミン D 受容体アナログのカルシ

スの創傷部は経時的に改善され創傷から 3 日目にそのほとポトリオール（MC 903）の反復塗布により TSLP が誘導さんどが閉じたが、sPLA 2 -IIF 遺伝子欠損マウスの創傷閉れアトピー性皮膚炎モデルが成立する。Balb/c マウスに鎖速度は野生型マウスと比較して有意に遅延した。さらに

アトピー性皮膚炎モデルを適用すると耳介の肥厚、Tslp、

sPLA 2 -IIF 遺伝子欠損マウスの創傷部に 10 nM P-LPE を

Tnf、S 100 A 9、Il 31 の発現の亢進とともに、sPLA 2 -IIF

塗布すると創傷閉鎖の遅延が有意に回復した。以上の結果が増加した。野生型マウスの掻痒行動は 30 分あたり 22 . 8

から、sPLA 2 -IIF/P-LPE 経路はケラチノサイトの分化に回であったが、sPLA 2 -IIF 欠損マウスでは有意に低下し寄与し創傷治癒を促進することが明らかとなった。

6 . 6 回であった。sPLA 2 -IIF 欠損マウスに P-LPE を塗布
すると掻痒行動が有意に増加した。免疫抑制剤のタクロリ

3 . 3 . 乾癬におけるsPLA 2 -IIF/P-LPE 経路の役割

ムス（FK 506）を耳介に塗布すると、マウスの掻痒行動が乾癬は Th 17 応答を介する表皮肥厚性疾患であり、表皮濃度依存的に低下し、0 . 01 ％ FK 506 の塗布で sPLA 2 -IIF

角化細胞の異常増殖と異常角化や毛細管の拡張、T 細胞や欠損マウスと同じレベルになった。この結果は、アトピー

好中球などの浸潤を特徴とする。マウスの皮膚にイミキモ性皮膚炎のモデルにおいて、sPLA 2 -IIF の阻害が FK 506

ドを連続塗布することによりヒト乾癬と類似した皮膚炎がの効果と匹敵するほどの抑制効果をもつことを示唆して誘導される。乾癬モデルを sPLA 2 -IIF 欠損マウスに施行いる。上述の LyPls-PLD を MC 903 反復塗布アトピー性

すると、野生型と比較して表皮の肥厚およびケラチノサイ

皮膚炎モデルに塗布すると表皮角質の P-LPE 低下を伴っ− 164 −

プラズマローゲン型リゾリン脂質代謝系を基軸とした皮膚の恒常性と疾患調節の作用機序の解明て掻痒行動が有意に低下した。以上の結果から、sPLA 2 -欠損および過剰発現マウスを用いて、本酵素の免疫抑制機

IIF/P-LPE 経路がアトピー性皮膚炎の掻痒に寄与するこ能の普遍性について検証すると sPLA 2 -IID はリンパ組織と、タクロリムスに代わる新規創薬ターゲットになる可能の脂質バランスを構成的に免疫抑制の方向にシフトさせる性があることが示唆された。

ことにより、リンパ節炎症（急性炎症）、接触性皮膚炎
（Th 1
応答）
、乾癬（Th 17 応答）の各炎症病態を改善する。一方

3 . 5 . ヒト慢 性 皮 膚炎 症 疾 患に おける sPLA 2 -IIF/
P-LPE 経路の役割

で、抗腫瘍免疫を抑制して皮膚癌を促進する。このことは、

ヒト角質検体を用いて P-LPE 量を測定した結果、健常

作用は病態に応じて体に良い方向にも悪い方向にも作用

人の角質では P-LPE が 0 . 84 pmol/mg、アトピー性皮膚炎

し得ることを示唆している 10）。ω 6 脂肪酸のアラキドン酸の検体では P-LPE が 3 . 54 pmol/mg の量で検出され、健常代謝産物である 12（S）- ヒドロキシヘプタデカトリエン酸

人と比較してアトピー性皮膚炎の患者で有意に高値であ（12 -HHT）は表皮角化細胞の遊走を制御することで皮膚バった。一方、乾癬検体の P-LPE は健常人と比較して若干リア機能を制御することが報告されている 11）。

ω 3 脂肪酸代謝物動員酵素としての sPLA 2 -IID の免疫抑制増加していたが、無疹部と皮疹部には差がなかった。こ

本研究では、sPLA 2 -IIF が表皮顆粒層から角質層にかのことは乾癬の病態において無疹部と皮疹部の区別なけて分泌され、角質細胞の細胞間隙に P-LPE を動員する

く P-LPE が増加しており、乾癬の素地がある皮膚ではことにより、皮膚バリアの恒常性維持に重要な役割をもつ

P-LPE が多いことを示している。この結果は、マウスをことを示した。この P-LPE が過剰に産生すると表皮角化用いた実験によって提唱された乾癬およびアトピー性皮細胞が活性化され、Th 17 応答性の乾癬や環境因子の暴露

膚炎における sPLA 2 -IIF/P-LPE 経路がヒトにも存在する

による過剰な Th 2 型免疫応答性のアレルギー性皮膚疾患

ことを示唆している。まだ例数が少ないため測定検体をにつながる。すなわち角質に局在する sPLA 2 -IIF/P-LPE

増やす必要があるが、P-LPE が慢性皮膚炎症疾患のバイ経路は外来からの攻撃を守る役割を担う皮膚バリアを構築

オマーカーとして、またテープストリッピングを用いたするマスターレギュレーターであることが示唆された（図P-LPE の検出法が P-LPE を標的とした軽微侵襲測定法と1）。またこの sPLA 2 -IIF/P-LPE 経路は角質に局在するこして活用できる可能性がある。

とから、本経路を標的とした軽微侵襲性診断法としての医4. 考

療応用が期待できる。

察

このように表皮に局在する脂質代謝酵素は、特徴的な基

体表全体を覆う皮膚は、外界からの病原菌、アレルゲン、

質特異性ならびに産生されるリゾリン脂質分子種の違いに

環境物質の侵入ならびに体内からの水分の蒸散を防ぐ物質

より、厳密に生命現象を制御している。最近のリピドミク

透過性バリアを形成するとともに、外界から侵入した異物

ス解析技術の急速な進歩が、これまで想定されなかった未5）に対する免疫応答が始まる場でもある 。皮膚は他の臓器

知の脂質代謝経路を紐解き、それぞれの脂質代謝酵素が生には見られないユニークな脂質分子を多く含み、また皮膚体内の異なる局面で固有の脂質代謝を動かし、多彩な生命だけに発現している脂質代謝酵素が多数存在する。このこ現象に関わることが明らかになりつつある。今後は、ヒトとは、皮膚は新しい機能性脂質を探索するための宝の山で疾患との関連性を含めて解明することで、新たなバイオマ

あり、脂質を標的とすることで皮膚疾患の新しい診断法のーカーや創薬への展開が期待される。

開発や創薬が可能であることを示唆している。
リン脂質代謝酵素のうち、表皮角化細胞に発現している（引用文献）

細胞内酵素 PNPLA 1（カルシウム非依存性ホスホリパー

1） Murakami, M., Yamamoto, K., Miki, Y., Murase,

ゼ A 2 の一つ）
はアシルセラミドの生合成を通じて角質バリ

R., Sato, H., and Taketomi, Y. The roles of secretedアの形成に必須の役割を担う 6）。体毛に発現する細胞外型

phospholipase A 2 gene family in immunology. Adv.

ホスファチジン酸ホスホリパーゼ A 1 α（PA-PLA 1 α）は 2 -Immunol. 132, 91-134（2016）．

アシル型のリゾホスファチジン酸を産生し、リゾホスファ

2） Murakami, M., Miki, Y., Sato, H., Murase, R.,

チジン酸受容体（LPA 6）を介して、体毛の形成に重要な機

Taketomi, Y., and Yamamoto, K. Group IID, IIE, IIF

能をもつ 7）。また体毛に発現する sPLA 2 -IIE は高度不飽和and III secreted phospholipase A2s. Biochim. Biophys.

脂肪酸をもつリゾホスファチジルエタノールアミン（LPE）

Acta, 1864, 6, 803-818（2019）．

8）の産生を介して体毛形成に寄与している 。一方、リンパ3） Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, M., Taketomi, Y.,

組織の樹状細胞に高発現している sPLA 2 -IID は、抗炎症

Nishito, Y., Taya, C., Muramatsu, K., Ikeda, K.,

性の ω 3 脂肪酸代謝物を構成的に動員することで接触性皮Nakanishi, H., Taguchi, R., Kambe, N., Kabashima, K.,

9）

膚炎における Th 1 免疫応答を抑制する 。sPLA 2 -IID のLambeau, G., Gelb, M.H., and Murakami, M. The role

− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020of group IIF secreted phospholipase A2 in epidermal8） Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, H., Nishito, Y., Gelb,

homeostasis and hyperplasia. J. Exp. Med. 212, 1901-

M.H., Taketomi, Y., Murakami, M. Expression and1919（2015）．

function of group IIE phospholipase A2 in mouse skin.

4） Matsumoto Y, Kashiwabara N, Oyama T, Murayama

J. Biol. Chem. 291, 15602-15613（2016）．

K, Matsumoto H, Sakasegawa SI, Sugimori D.

9） Miki, Y., Yamamoto, K., Taketomi, Y., Sato, H., Shimo,

Molecular cloning, heterologous expression, andK., Kobayashi, T., Ishikawa, Y., Ishii, T., Nakanishi, H.,

enzymatic characterization of lysoplasmalogen-specific

Ikeda, K., Taguchi, R., Kabashima, K., Arita, M., Arai,

phospholipase D from Thermocrispum sp. FEBS Open

H., Lambeau, G., Bollinger, J.M., Hara, S., Gelb, M.H.,

Bio. 6, 1113-1130（2016）．

Murakami, M. Lymphoid tissue phospholipase A 25） Dainichi T, Kitoh A, Otsuka A, Nakajima S, Nomura

group IID resolves contact hypersensitivity by driving

T, Kaplan DH, Kabashima K. The epithelial immune

anti-inflammatory lipid mediators. J. Exp. Med. 2 1 0,

microenvironment（EIME）in atopic dermatitis andpsoriasis. Nat Immunol. 19, 1286-1298（2018）．

1217-1234（2013）．
10）Miki, Y., Kidoguchi, Y., Sato, M., Taketomi, Y.,

6） PNPLA1 has a crucial role in skin barrier function

Taya, C., Muramatsu, K., Gelb, M.H., Yamamoto, K.,

by directing acylceramide biosynthesis. Hirabayashi

Murakami, M. Dual roles of group IID phospholipase

T, Anjo T, Kaneko A, Senoo Y, Shibata A, Takama H,

A 2 in inflammation and cancer. J. Biol. Chem. 2 9 1 ,Yokoyama K, Nishito Y, Ono T, Taya C, Muramatsu K,

15588 - 15601（2016）．

Fukami K, Muñoz-Garcia A, Brash AR, Ikeda K, Arita

11）Liu M, Saeki K, Matsunobu T, Okuno T, Koga T,

M, Akiyama M, Murakami M. Nat Commun. 8, 14609

Sugimoto Y, Yokoyama C, Nakamizo S, Kabashima（2017）．

K , Na r u m iy a S , S h i m i z u T, Yoko m i z o T. 1 2 -7） Inoue A, Arima N, Ishiguro J, et al. LPA-producing

Hydroxyheptadecatrienoic acid promotes epidermal

enzyme PA-PLA（1）alpha regulates hair follicle

wound healing by accelerating keratinocyte migration

development by modulating EGFR signalling. EMBO J.

via the BLT 2 receptor. J Exp Med. 2 1 1 , 1 0 6 3 -1 0 7 830, 4248-4260（2011）．

（2014）．

− 166 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発
東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門

善本

隆之

Recently, several in vitro assays to predict the respiratory sensitizing potential of chemicals were developed, because
the use of animal models in safety testing of chemicals is significantly limited. However, these alternative methods cannot
distinguish chemical respiratory sensitizers and skin sensitizers, although the risk management systems for them are quite
different. Therefore, in the present study, we aim at developing a novel in vitro assay, which can discriminate chemical
respiratory sensitizers from skin sensitizers by taking advantage of the fundamental differences between their modes offunction; development of helper T (Th) 2 immune responses, which is critically important for respiratory sensitization.
We have established a novel 3 -dimensional ( 3 D) coculture system using scaffold, which consists of human airway
epithelial cell line, immature dendritic cells (DCs) derived from human peripheral blood CD 14 + monocytes, and humanfibroblast cell line. The present results indicate that this DC coculture system can discriminate the respiratory sensitizing
potential of chemicals from their skin sensitizing potential by means of more enhanced expression of key costimulatory
molecule OX 40 ligand, which is important for Th 2 differentiation, as a marker in DCs. Moreover, we have also developed
a novel DC/T coculture system, which consists of the sensitized DCs and allogenic naive CD 4 + T cells. In this system, we
have great advantage that IL- 4 up-regulation can be used as a marker for the prediction of respiratory sensitizing potential.
Indeed, our data suggest that selective up-regulation of IL- 4 was observed by the stimulation with respiratory sensitizer ascompared to that with skin sensitizer.
Taken together, the present results suggest that our 3 D coculture systems consisting of epithelial cells, DCs, fibroblast
cells, and T cells would be useful for in vitro evaluation of allergenic sensitizing potential of chemicals. We are currently
trying to further improve the versatility of these systems by using iPS technology.

1. 緒膚および呼吸器感作性の AOP の Key event（KE）1 〜 3

言に相当する初期の機序を反映した方法であるため、生体内

近年、動物実験を用いない 3 Rs の世界的な潮流により、でのアレルギー発症により近い KE 4 の T 細胞の活性化や医薬品や化学物質などの安全性評価に関する in vitro 試験

分化誘導を反映した方法の方がより確度が高いと考えられ代替法の開発が産業界のみならず社会的にも急務とされてる。ところが、これまでにいくつか検討されているが、未いる。皮膚感作性試験代替法としては、蛋白質との結合性だその方法の確立には至っていない 6）。

を評価する DPRA 法、ケラチノサイトのストレス応答を

最近、我々は、ヒト気道上皮細胞株とヒト末梢血 CD14 +評価する KeratinoSens 法、樹状細胞の活性化を評価する

単球由来未成熟樹状細胞（DC）、ヒト線維芽細胞株の 3 種

h-CLAT 法などが、最近、OECD のテストガイドライン

類の細胞を、Scaffold（足場材）を用いてそれぞれ 3 次元培に採択された（図１）1 - 3）。ところが、これら既存の代替法は、養した後順に重ね、気道上皮組織をより忠実に模倣した生

例えば、危機管理体制が大きく異なる呼吸器感作性［ヘル体により近い 3 次元DC共培養系を開発した（図 2）。そこで、

パー T（Th）2 反応優位］と皮膚感作性（混合 Th 1 /Th 2 /本研究では、複数の代表的感作性化学物質を用いて、皮膚Th 17 反応）の違いを識別できず、現在、これらの感作性と呼吸器の感作性の違いを、これらの作用機序の違いを示の違いを識別可能な方法の開発が望まれている。さらに、す Th 2 分化および反応の誘導に係わる分子の発現増強のこれらの代替法は、それぞれ単独では、従来の動物を用い違いで識別できないか検討した。さらに、この 3 次元 DC

る GPMT 法や LLNA 法などの試験法を代替することは不共培養系に T 細胞も加えた 3 次元 DC/T 共培養系の構築の可能であるとされ 1-3）、そのため、有害性発現経路（AOP）4）に可能性についても検討を行った。

基づいた複数の方法の組み合わせ（IATA）によるより厳密

2. 方な評価が必要とされている 5）。これら既知の代替法は、皮法

2 . 1. 細胞株
Development of in vitro evaluation systemof allergenic sensitizing potential ofchemicals
Takayuki Yoshimoto
Depa rt ment of I mmu noreg ulat ion ,Institute of Medical Science, Tokyo
Medical University

ヒト気 道 上 皮 細 胞 株 BEAS-2 B（CRL- 9609） とヒト肺線維芽細胞株 MRC- 5（CCL-171）は、ATCCより購入し、10 %FCSを含むMEM 培地で培養した。ヒト健常人末梢血CD14 + 単球は、10 %FCSを含むRPMI 1640 培地で培養した。

− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 1 感作性化学物質による呼吸器アレルギー発症までの有害性発現経路（AOP）と、既存の各試験法と本研究で開発中の 3 次元 DC 共培養系と 3 次元 DC/T 共培養系の位置づけ

図 2 気道上皮組織をより忠実に模倣するため、気道上皮細胞株、末梢血単球 CD14+ 単球由来未成熟 DC、肺線
維芽細胞株を用いてより生体に近い３次元 DC 共培養系を構築

2 . 2 . 感作性化学物質（DNCB）｝ は、 全 て Sigma-Aldrich 社 よ り 購 入 し た。 始

3 種類ずつの代表的な呼吸器感作性化学物質｛ortho-

め に DMSO に 溶 解 後、 共 培 養 用 培 地（MEM 培 地 とphthaldialdehyde（OPA），hexamethylene diisocyanate（HDI），

RPMI 1640 培地を 1：1 に混ぜた培地）で希釈し、至適濃度

trimellitic anhydride
（TMA）
｝
と、
皮膚感作性化学物質｛oxazolone

を検討後使用した。

（OXA），formaldehyde（FA），2 , 4 -dinitrochlorobenzene− 168 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

2 . 3 . Scaffold（図 3）

2 . 6 . 3 次元 DC 共培養系の作製（図 4）

市販のポリスチレン性の多孔質 Scaffold（Reinnervate

まず、ヒト気道上皮細胞株 BEAS- 2 B とヒト肺線維芽細社 の Alvetex® Scaffold 24 well plate、Alvetex® Scaffold

胞株 MRC- 5 を、1 . 5 × 106 個ずつ個別の 12 well insert の

12 well insert）
を用いた。

Scaffold 内で 3 日間培養した。一方、精製した未成熟 DC を、
0.7 〜 1 × 106 個 12 well insertのScaffold内で 1 日間培養後、+

2 . 4 . ヒト健常人末梢血 CD14 単球由来未成熟 DCの調製方法

無菌的にそれぞれの Scaffold を脱着し、次に、上から順に

東 京 医 科 大 学 医 学 研 究 倫 理 委 員 会 の 承 認（ 受 付 番 号の Scaffold を順番に重ねて 1 つの 12 well insert に装着した。

気道上皮細胞株、未成熟 DC、肺線維芽細胞株とそれぞれ3323、課題：アレルゲンの in vitro 感作性評価法の開発）

次に、始めに DMSO に溶解後、共培養用培地（MEM 培地の下、健常人ボランティアの同意の後、末梢血 50 ml をヘと RPMI 1640 培地を 1：1 に混ぜた培地）で希釈した感作

パ リ ン 存 在 下 で 採 血 し、Lympholyte-H（Cedarlane 社 ）性化学物質を 5 µl ずつ一番上の Scaffold に均等に 6 箇所添に重層後、比重勾配遠心法により単核球を分離した。そ加し、そのまま 30 分放置後、共培養培地 2 ml をプレートの後、抗 CD 14 抗体のマイクロビーズ（Miltenyi 社）を反応の方から一番上の Scaffold の所まで静かに加えた。9 時間

後、AutoMACS Pro で CD 14 + 細胞を精製（純度 > 99 %）後には、リアルタイム RT-PCR 解析用のサンプルを回収し、+した。次に、この CD 14 単球を GM-CSF（50 ng/ml）と24 時間後には、免疫組織学的解析用のサンプルを回収した。

IL- 4（10 ng/ml）で 6 日間培養後、抗 CD 11 c 抗体のマイ
クロビーズを反応後、AutoMACS Pro で未成熟 DC を精製（純度 > 99 %）した。

2 . 7. 3 次元 DC/T 共培養系の作製（図 5）
上述の（2 . 6 .）の 3 次元 DC 共培養系で 24 時間反応後、DC の Scaffold だ け を 無 菌 的 に 取 り 出 し、 新 し い 24 well+

2 . 5 . ヒト健常人末梢血ナイーブCD 4 T 細胞の精製

plate の底に置き、アロジェニックなナイーブ CD 4 +T 細胞

上述（2 . 4 .）のようにヒト健常人末梢血より分離した単核（1 . 5 × 106 個）を含む 10 %FCS 含有 RPMI 1640 培地 50 µl

球から、ヒトナイーブ CD 4 +T 細胞アイソレーションキッ

を 加 え、2 日 後 に さ ら に 100 µl 同 じ 培 地 を 加 え、4 日 後+ト（Miltenyi 社）を用いて、ナイーブ CD 4 T 細胞を精製（純にはさらに 200 µl 同じ培地を加えて培養した。5 日後に、

度 > 95 %）した。

Scaffold および培養液中の細胞から、リアルタイム RTPCR 解析用のサンプルを回収した。

図 3 ポリスチレン性の多孔質足場材である Alvetex® Scaffold は、生体内の３次元的な細胞間相互作用を反映
し、Scaffold 膜の無菌的脱着が可能− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 4 3 次元 DC 共培養系の構築方法：まず、個々の Scaffold で培養後、3 つを重ね合わせ、その一番上から、感作性化学物質を添加し 30 分放置後、培地を加えて培養、解析を行う

2 . 8 . リアルタイム RT-PCR 解析

刺激 24 時間後、各 Scaffold の組織切片を作製し、HE 染色

各Scaffoldおよび細胞よりtotal RNAをRNeasy Mini Kitや抗 CD 11 c 抗体、Hoechst などを用いた免疫組織学的解（QIAGEN 社）を用いて調製し、SuperScript III Reverse

析により、刺激 24 時間後も、上の上皮細胞の Scaffold やTranscriptase（Thermo Fisher Scientific 社）で cDNA を下の線維芽細胞の Scaffold へ、真ん中の DC の Scaffold 中®

II お よ び Perfectの DC が移動することは、殆ど見られなかった（data not

Real Time サポートシステムのプライマーセット（Takara

shown）。そこで、刺激 9 時間後に、各 Scaffold より RNA社）を用いたリアルタイム -RT-PCR で標的分子の mRNAを回収し、DC の成熟化や Th 2 分化、Th 2 反応の誘導に発現を解析した。

関わる分子｛ 副刺激分子で DC の成熟化マーカーでもある®

TM

作 製 し、TB Green Premix Ex Taq

CD 80 や CD 86、MHC クラス II の HLA-DR、ナイーブ T

2 . 9. 免疫組織学的解析

細胞のリンパ節への遊走に重要なケモカインレセプターで各 Scaffold を OCT コンパウンドで包埋し液体窒素で凍DC 成熟化のマーカーでもある CCR 7、接着分子 ICAM- 1、結した後、10 µm の切片を作製し、ホルマリン固定後、ヘ上皮細胞から産生され DC 上に OX 40 L 発現を誘導するサ

マトキシリン・エオジン（HE）染色、抗 CD 11 c 抗体によるイトカイン TSLP、ナイーブ CD 4 +T 細胞の Th 2 分化誘導

DC の免疫組織学的染色、Hoechst を用いた核染色を行った。

に重要な副刺激分子 OX 40 L、炎症性サイトカイン IL- 1 β

3. 結

や IL- 8、抑制性サイトカイン IL- 10、Th 1 分化に重要な

果

ヘテロダイマーサイトカイン IL- 12 の 2 つのサブユニット

3 . 1. 3 次元 DC 共培養系を用いた呼吸器および皮膚の感作性化学物質の識別IL- 12 p 35 と IL- 12 p 40、上皮細胞から産生され Th 2 反応を増強する自然リンパ球（ILC 2）の分化増殖に重要なサイ

まず、代表的な呼吸器感作性化学物質として OPA、代トカインIL- 25 や IL- 33 など ｝の mRNA 発現をリアルタイ

表的な皮膚感作性化学物質として OXA を用いて、それぞム RT-PCR を用いて調べた。その結果、OPA と OXA 刺れの濃度を振って、
刺激 9 時間後にRNAを回収し、リアルタ激により、副刺激分子 CD 80 や CD 86 の発現増強は両者でイム RT-PCR により、内部標準であるハウスキーピング

同レベルであったが、Th 2 分化の誘導に重要な OX 40 L の

遺 伝 子 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

発現増強が、OXA に比べ OPA 刺激で有意に高かった（data（HPRT）の mRNA 発現が、非刺激時の 10 分の 1 以下にな

not shown）。次に、HDI と FA、TMA と DNCB の組み合

らない濃度を決めた（図 4）。そして、その濃度を用いて、わせで同様な検討を行ったところ、やはり、調べた上記の− 170 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

図 5 3 次元 DC 共培養系にさらに T 細胞も加えた新しい 3 次元 DC/T 共培養系を用い、T 細胞を指標にした呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別する評価系の構築

分子の中で、CD 80 や CD 86 の発現増強は両者で同レベル以上の結果は、本研究の 3 次元 DC 共培養系において、であったが、FA や DNCB 刺激に比べ、HDI や TMA 刺激で、呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別に上皮細胞のバリヤ

OX 40 L の発現増強が有意に高かった（data not shown）。

ー機能や免疫調節機能の重要性を示唆している。

そこで、これら 6 種類の代表的な呼吸器と皮膚の感作性
CD 86 と OX 40 L 発現を調べたところ、非刺激に比べいず

3 . 3 . 3 次元 DC/T 共培養系を用いた呼吸器および皮膚の感作性化学物質の識別れの感作性化学物質刺激でも CD 86 発現増強は同レベルで生体内では、気道上皮で抗原に感作されると、その抗あったが、OX 40 L 発現増強のレベルが 6 種類の感作性化

原を DC が取り込み、成熟化して、所属リンパ節へ遊走し、学物質が 2 グループに分かれ、OXA や FA、DNCB の皮膚

そこで初めて抗原特異的なナイーブ CD 4 +T 細胞を刺激し、感作性化学物質の刺激に比べ、OPA や HDI、TMA の呼吸

増殖とエフェクター細胞への分化が誘導され、獲得免疫系

器感作性化学物質の刺激で、有意に OX 40 L 発現増強が強が始動する。即ち、生体内では、抗原を捕らえた DC が所

かった
（図 6）
。

属リンパ節へ移動することは極めて重要である。上述の検化学物質の至適濃度を用いて、この 3 次元 DC 共培養系で以上の結果は、本研究の 3 次元 DC 共培養系は、DC で討より、本研究の 3 次元 DC 共培養系では、感作性化学物の OX 40 L 発現増強を指標に、呼吸器と皮膚の感作性化学

質で刺激 24 時間後には、DC が刺激により他の Scaffold へ

物質の識別が可能である可能性を示している。

の遊走が殆ど見られず留まっていたことより、生体内でのDC の移動を再現するため、24 時間後、DC の Scaffold だ

3 . 2 . 3 次元 DC 共培養系における上皮細胞の重要性

け取り出し、新しい 24 well plate の底に入れ、その上から次に、この 3 次元 DC 共培養系が有効である理由を調べ

ナイーブ CD 4 +T 細胞を加え、反応させることにした。まず、るため、同じ Scaffoldを用いた DC だけの 3 次元 DC 単独培

CD 4 +T 細胞としてシンジュニックな細胞を用いたところ、

養系と、OPAとOXAを用いて比較検討した。その結果、3反応が弱かった。そこで、アロジェニックな細胞を用いた次元 DC 共培養系では上述と同様に、CD 86 発現増強は両ところ、いわゆる、アロの混合リンパ球反応（MLR）
により、者で同じレベル発現増強が見られ、OXAに比べ OPA 刺激

両者を混ぜただけで、T 細胞の活性化が見られ、T 細胞ので OX40 L 発現増強がより強く見られたが、3 次元 DC 単独

活性化マーカーである CD 69 や Th 1 分化のマーカーであ

培養系では、CD 86 発現増強は両者で同じレベル見られたが、る IFN-γ の発現増強が見られた。しかし、そこへ、呼吸器

OX40 L 発現増強は、両者で有意な差が見られなかった（図 7）。

感作性化学物質 OPA と皮膚感作性化学物質 OXA を加える

− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 6 6 種類の代表的感作性化学物質刺激で、CD86 発現増強は同程度、呼吸器感作性物質で OX40L 発現が有意に増加し、OX40L 発現増強の違いで 2 グループに識別可能

図 7 3 次元 DC 共培養系と 3 次元 DC 単独培養系を比較すると、選択的 OX40L 発現増強は DC 単独培養系では見られず、上皮細胞のバリヤー機能や免疫調節機能が重要と、OXA 刺激に比べ OPA 刺激により IFN-γ 発現のさらな以上の結果は、本研究の 3 次元 DC/T 共培養系は、T 細胞

る増強と、OPA 刺激に比べ OXA 刺激により Th 2 分化マ

での IL- 4 発現増強を指標に、呼吸器と皮膚の感作性化学ーカーである IL- 4 発現のさらなる増強が見られた（図 8）。

物質の識別が可能である可能性を示唆している。

− 172 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

図 8 ヒトプライマリー細胞を用いた新しい 3 次元 DC/T 共培養系を用い、T 細胞での IL-4 発現増強の違いにより呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別が可能

図 9 ヒト末梢血単球由来 DC を用いた 3 次元 DC 共培養系により、DC での OX40L 発現増強の違いにより皮膚と呼吸器の感作性化学物質の識別が可能

4. 考

DC 共培養系への応用を試みている。さらに、そこへ、T 細察胞ハイブリドーマや不死化した Th 細胞を加えて、同様な結

現在、さらに、複数の感作性化学物質を用いる検討や、果が得られれば、より有用な評価系になることが期待される。

これらの系の汎用性を向上させるため、iPS 由来のDCを複

これまでに、呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別可能数作製し、LPS や OK- 432 による刺激後の成熟マーカーのな方法として、皮膚感作性評価法のゴールドスタンダードで発現解析や抗原提示能力などについて比較検討し、3 次元あるマウスを用いた LLNAで刺激開始 6 日後に所属リンパ− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

節でのリアルタイムRT-PCR 解析する方法が唯一報告され
7 , 8）

Pathway for Sensitization of the Respiratory Tract by。この系では、皮膚感作性化学物質に比べ呼吸Low-Molecular-Weight Chemicals: Building Evidence to

器感作性化学物質の刺激で、Th 2 分化や Th 2 反応の誘導

Support the Utility of In Vitro and In Silico Methods in aに重要な IL- 4 や IL- 4 R、IL-10、OX 40 L、TSLP などの

Regulatory Context. Appl Vitro Toxicol, 3（2017）．

ている

分子の発現がより増強されることが示された

7 , 8）。ところが、

このような呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別可能な in9）vitro 動物実験代替法は、今のところ開発されていない 。

5. 総

5） OECD Guidance document on the reporting of defined
approaches and individual information sources to be usedwithin integrated approaches to testing and assessment（IATA）for skin sensitization. Paris, France: Organisation

括for Economic Cooperation and Development.（2016）．

本研究では、気道上皮組織を模倣した気道上皮細胞と6） van Vliet, E., Kuhnl, J., Goebel, C., Martinozzi-Teissier,

DC、肺線維芽細胞から構成される新しい 3 次元共培養系

S., Alepee, N., Ashikaga, T., Blomeke, B., Del Bufalo, A.,を構築し、この系を用いて、DC での Th 2 分化誘導に重要

Cluzel, M., Corsini, E., Delrue, N., Desprez, B., Gellatly,

な OX 40 L 発現増強を指標に、6 種類の代表的な感作性化

N., Giese, C., Gribaldo, L., Hoffmann, S., Klaric, M.,

学物質を呼吸器と皮膚の感作性化学物質の 2 グループに識Maillere, B., Naisbitt, D., Pallardy, M., Vocanson, M. &10）

別可能であることが示された（図 9） 。さらに、この系

Petersohn, D. State-of-the-art and new options to assessにアロジェニックなナイーブ CD 4 T 細胞を加えた 3 次元

T cell activation by skin sensitizers: Cosmetics Europe

DC/T 共培養系では、T 細胞での IL- 4 発現増強を指標に、Workshop. ALTEX 35, 179-192（2018）．

+

呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別が可能である可能性

7） Adenuga, D., Woolhiser, M. R., Gollapudi, B. B. &が示唆された。免疫反応は複雑なため、アレルギー感作性

Boverhof, D. R. Differential gene expression responsesの評価には、本研究のような生体内のキーになる反応をよdistinguish contact and respiratory sensitizers andり忠実に模倣した 3 次元共培養系が有効と考えられ、そのnonsensitizing irritants in the local lymph node assay.

汎用性を上げるべく現在も検討を続けている。

Toxicol Sci 126, 413-425（2012）．
8） Cumberbatch, M., Clelland, K., Dearman, R. J. & Kimber,（引用文献）

I. Impact of cutaneous IL-1 0 on resident epidermal

1） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442C:
In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity
Assay（DPRA）．Paris, France: Organisation for Economic

Langerhans' cells and the development of polarized
immune responses. J Immunol 175, 43-50（2005）．
9） North, C. M., Ezendam, J., Hotchkiss, J. A., Maier, C.,
Aoyama, K., Enoch, S., Goetz, A., Graham, C., Kimber, I.,

Cooperation and Development.（2015）．
2） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No.

Karjalainen, A., Pauluhn, J., Roggen, E. L., Selgrade, M.,

4 4 2D: In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase

Tarlo, S. M. & Chen, C. L. Developing a framework

Test Method. Paris, France: Organisation for Economic

for assessing chemical respiratory sensitization: A

Cooperation and Development.（2015）．

workshop report. Regul Toxicol Pharmacol 80, 295-309

3） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442E:（2016）．

In Vitro Skin Sensitisation: human Cell Line Activation

10）Mizoguchi, I., Ohashi, M., Chiba, Y., Hasegawa,

Test（h-CLAT）．Paris, France: Organisation for Economic

H., Xu, M., Owaki, T. & Yoshimoto, T. Prediction of

Cooperation and Development.（2016）．

Chemical Respiratory and Contact Sensitizers by4） Sullivan, K. M., Enoch, S. J., Ezendam, J., Sewald, K.,

OX 4 0 L Expression in Dendritic Cells Using a Novel

Roggen, E. L. & Cochrane, S. An Adverse Outcome

3 D Coculture System. Front Immunol 8 , 929（2017）．

− 174 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびに
エクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性
藤田医科大学医療科学部

若松一雅trans-Resveratrol ( 3 , 5 , 4 ’-trihydroxy-trans-stilbene, RES), a naturally occurring polyphenol, is well known for its
antioxidant, anti-platelet, anti-inflammatory, anti-aging, cardioprotective and cancer chemopreventive properties and has
recently attracted increased interest as a health-beneficial agent. However, the recent incidence of rhododendrol-induced
leukoderma highlights the risk of using compounds having p-substituted phenols because of their rapid conversion to
toxic o-quinones. Based on its p-substituted phenol structure, RES is also expected to be a substrate for tyrosinase and to
produce a toxic o-quinone metabolite. In fact, RES was found to be a good substrate for tyrosinase. The results of this study
demonstrate that the oxidation of RES by tyrosinase produces 4 -( 3 ’, 5 ’-dihydroxy-trans-styrenyl)- 1 , 2 -benzoquinone(RES-quinone), which decays rapidly to an oligomeric product (RES-oligomer). RES-quinone was identified after reduction
to its corresponding catechol, known as piceatannol. RES-quinone reacts with N-acetylcysteine, a small thiol, to form a
diadduct and a triadduct, which were identified by NMR and MS analyses. The production of a triadduct is not common
for o-quinones, suggesting a high reactivity of RES-quinone. RES-quinone also binds to bovine serum albumin throughits cysteine residue. RES-oligomer can oxidize GSH to GSSG, indicating its pro-oxidant activity. These results suggestthat RES could be cytotoxic to melanocytes due to the binding of RES-quinone to thiol proteins and the cosmetic useof RES should be considered with caution. Equol ( 7 , 4 -dihydroxy-isoflavan) is one of the end products of the intestinalbacterial biotransformation of the isoflavone daidzein which is phytoestrogen found in soy and soy-derived products, anda nonsteroidal estrogen of the isoflavone family. Equol is not a natural constituent of plants, but established as a bacterial
metabolite of daidzein. Since equol has the p-substituted phenol structure as well as RD and RES, it is expected to bea substrate for tyrosinase and to produce a toxic o-quinone metabolite. In order to examine whether equol produces theo-quinone, we performed the tyrosinase-catalyzed oxidation of equol. UV/visible spectra showed the unstable quinone
absorption at 420 nm within 15 min. Converting the o-quinones produced by tyrosinase oxidation of equol in the presenceof ascorbic acid to more stable catechols, we could obtain three compounds by preparative HPLC at UV detection. Althoughthese compounds have been known to be metabolized from equol using human liver microsomes, it is the first time that thesecompounds are formed by tyrosinase-catalyzed oxidation of equol.

1. 緒を触媒する重要な酵素であり，メラノサイト中のメラノソ

言ームと呼ばれる特殊なオルガネラ内で，メラニン色素であtrans-Resveratrol（レスベラトロール，3 , 5 , 4’ - トリヒ

るユーメラニンおよびフェオメラニンの産生をもたらす

ドロキシ -trans- スチルベン，以下 RES と略す、図 1 の（1）（Ramsden and Riley, 2014）。チロシナーゼは，天然の基は，ブドウ，ベリー，ピーナッツなどの植物中から得られ質である L- チロシンだけでなく，多数の p- 置換フェノー

る天然のポリフェノールである（Baur and Sinclair et al.,ルおよびカテコールを酸化して，オルトキノンを生成す

2006）。RES（1）は，その抗酸化，抗血小板，抗炎症，抗ることができる。o- キノンは非常に反応性の高い化合物

老化，心臓保護および癌の予防特性により，健康に有益

で，チオール酵素と結合し，活性酸素種（ROS）を生成するな薬剤として最近関心が高まっている（Baur et al., 2006 ;ことにより細胞毒性を発揮する（Bolton et al ., 2000）。まJang et al., 1997）。RES（1）は，皮膚を光保護し，光発た，o- キノンは，メラノソーム内のタンパク質と共有結がんを抑制することも示されている（Afaq and Katiyar,

合してネオ抗原を生成するハプテンとしても作用し，免2011）。特に多機能性色素沈着低下剤として皮膚化粧品に疫反応を引き起こすことが知られている（Westerhof et al.,

使用する目的で RES（1）を使用することへの関心が，近2011）。実際，多くのフェノール化合物が，o- キノンへの

年大幅に高まっている（Na et al., 2019）。

活性化を通じて，ヒトの皮膚に白皮症を誘発することが知チロシナーゼは，L- チロシンのドーパキノンへの酸化られている。これらのフェノールのうち，4 - メトキシフ
ェノール（Riley, 1969），モノベンゾン（4 - ベンジルオキシ

Ty rosi na se - cat a lyzed ox idat ion of
resveratrol produces a highly reactive
ortho-quinone: implications for melanocyte
toxicity
Kazumasa Wakamatsu
Department of Chemistry, Fujita Health
University School of Medical Sciences

フェノール）（Manini et al., 2009）、4 -tert- ブチルフェノール（James et al., 1977），ロドデンドロール［4 -（4 -ヒド
ロキシフェニル）- 2 - ブタノール，以下 RD と略す］
（Ito
et al., 2018; Sasaki et al., 2014）
およびラズベリーケトン［4ヒドロキシフェニル］- 2 - ブタノン］（Ito et al., 2017 a）が知られている。

− 175 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

S（-）-EQ（Equol, 6）
図 1 チオールの存在下，または非存在下における RES（1）のチロシナーゼ酸化の反応経路

図2

本研究では，RES キノン（2）をまず同定し，チオールタン

でチロシナーゼ（50 U/mL）により酸化し，吸収スペクトル

パク質であるウシ血清アルブミン（BSA）を含むチオールの変化を定期的に 60 分間追跡した。酸化は，1000 µM アス

化合物との反応を調べることを目的とした。続いて，RES

コルビン酸または 200 µM または 300 µM NAC の存在下での酸化生成物（RES オリゴマー）の pro-oxidant 活性（酸化も行った。反応を還元的に終結させるために，200 µL の

促進活性）
を調べた。

一定量を 20 µL の 10 ％ NaBH 4 と混合し，続いて 180 µL

エクオール（EQ, 7 , 4 - ジヒドロキシ - イソフラバン , 図 2の 0 . 4 M ギ酸を混合した。アスコルビン酸，CySH またはの 6））は，大豆および大豆由来製品に含まれる植物エスト

GSH の存在下での実験では，NaBH 4 の添加は省略した。

ロゲンであるイソフラボンダイゼインの腸内細菌の生体内変換の最終産物の 1 つであり，イソフラボンファミリーの非

2 . 2 . DiNAC-RES-カテコール（4）および TriNAC-

ステロイド性エストロゲンである（Lephart, 2017）。エク

RES-カテコール（5）の分離

オールは植物の天然成分ではなく，ダイゼインの細菌代謝

RES（1 , 20 . 5 mg, 0 . 09 mmol），RES- カテコール（3 , 2 . 5

産 物 で あ る こ と が 知 ら れ て い る（Setchell, and Clerici,

mg, 0 . 01 mmol），NAC（163 mg, 0 . 4 mmol）のエタノール

2010 ; Lephart, 2016）。EQ（6）
は，RD と RES と同じように，

2 mL 溶液を 98 mL 50 mM リン酸ナトリウム（pH 6 . 8）と混

p- 置換フェノール構造を持っているため，チロシナーゼ合した。混合物を 37 ℃で激しく振盪し，それに 1 mL の緩の基質となり，毒性のある o- キノン代謝物を生成し，酸

衝液中のチロシナーゼ（20 , 000 U）を加えた。酸化の 30 分化促進作用を示すことが推測される。天然の EQ
（6）
は，S-

後，2 mL の 6 M HCl を添加して酸化を停止し，混合物を（-）- 体と R（+）- 体の二種類のエナンチオマーが存在する。

100 mL の 1 - ブタノールで 2 回抽出した。減圧下で 1 - ブ

そこで，エクオールが o- キノン体を生成するかどうかを

タノールを蒸発させた後，残渣を HPLC 溶出緩衝液に溶調べるために，今回は，S（-）-EQ（6）のチロシナーゼ触媒

解し，分取 HPLC にかけた。分取した画分の凍結乾燥によ酸化反応を行い，次に酸化促進活性も同様に調べた。

り，DiNAC-RES- カテコール（4，HPLC 純度 97 ％）として

2. 方

13 . 6 mg（22 ％収率），および TriNAC-RES- カテコール（5，法

HPLC 純度 99 ％）として 18 . 3 mg（24 ％）が得られた。

2 . 1. L-アスコルビン酸または N-アセチルシステイン

100 µM RES（1）
または RES- カテコール（3）の溶液（2 mL）

2 . 3 . 2 , 5 - ジ -S-［（N-アセ チル）システ イニ ル］- 3 , 4 , 3’ , 5’ - テトラヒドロキシトランススチルベン（DiNAC-RES-カテコール, 4）を 50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6 . 8 または 5 . 3）中，37 ℃

DiNAC-RES- カテコール（4）は，1 H NMR スペクトルと（NAC）の非存在下または存在下でのチロシナーゼによるRES（1）または RES-カテコール（3）の酸化− 176 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

13

C NMR スペクトルおよび高解像度 LC-MS より構造を確

RES- カ テ コ ー ル B（1 . 7 mg，31 ％）， お よ び MonoGSRES- カテコール A（それぞれ 1 . 0 mg, 18 ％）を得た。GSH認した。

置換の数は，高解像度 LC-MS 分析によって確認した。

2 . 4 . 2 , 5 ,6 -Tri-S-［（N-アセチル）システイニル］- 3 , 4 , 3 ′, 5 ′- テトラヒドロキシトランススチレン（TriNAC-RES-カテコール, 5）

13

2 . 6 . RES 酸化生成物，RES- オリゴマーの酸化促
進活性

TriNAC-RES-catechol（5）は，1 H NMR スペクトルと

過去に報告したように（Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Ito,

C NMRスペクトル，
高解像度LC-MSより構造を確認した。

Okura et al., 2017），RES オリゴマーと RD オリゴマーは，前駆体 RES（1 . 1 mM）および RD（1 mM）から 50 mM ナト

2 . 5 . RES キノン（2）とシステイン（CySH）およびグ
ルタチオン（GSH）との付加反応リウムリン酸緩衝液（pH 7 . 4）中で調製した。チロシナー
ゼ（200 U）を各前駆体溶液 2 mL に加え，反応混合物を 37

RES カテコール（3，2 . 5 mg，0 . 01 mmol）および CySH

℃で 120 分間インキュベートした。対照としてチロシナー（4 . 9 mg, 0 . 04 mmol）の 10 mL 50 mM リン酸ナトリウムバ

ゼのみ（100 U/mL）も使用した。メラニン溶液（2 , 000 µL）

ッファー（pH 6 . 8）溶液を 37 ℃で激しく振盪した。その中を 10 mM GSH（200 µL、1 mol 当量）と混合し、37 ℃でイに 1 mL のバッファーに溶かしたチロシナーゼ（2 , 000 U）

ンキュベートした。0，30 および 60 分の反応時間で，反を加えた。10 分の酸化後，0 . 2 mL の 6 M ギ酸を添加して応混合物を 100 µL 取り出し，0 . 4 M HClO 4（800 µL）と酸化を停止し , 混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残渣を混合して酸化を停止した。酸化反応物中の GSH と GSSG

HPLC で使用する緩衝液に溶解し，分取用 HPLC カラムでは，我々の HPLC 法を使用して分析した（Imai et al., 1987 ;分取した。最も早く溶出した画分，次に溶出した画分，最Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Ito, Okura et al., 2017）。酸化

後に溶出した画分を凍結乾燥して，それぞれ，DiCyS-

反応物（20 µL）中の過酸化水素を pH 7 . 4 緩衝液（180 µL）で

RES- カテコール（0 . 8 mg，17 ％収率）
，MonoCyS-RES-

希釈した後，分光測光法で分析した。希釈した混合物を

catechol-B（1 . 3 mg，36 ％）， お よ び MonoCyS-RES- カ

Ampliflu ™ Red 試薬（200 µL）と反応させ、568 nm の吸収

テコール -A（0 . 6 mg，17 ％）を得た。CySH 置換の数は，極大を持つ赤色色素を生成させた（Zhou et al., 1997）。

高解像度 LC-MS 分析によって確認した。

3. 結

RES- カテコール（3，2 . 5 mg，0 . 01 mmol）と GSH の溶

果

カラムで分取した。最も早く溶出した画分，次に溶出し3 . 1. RES（1）の チロシ ナー ゼ 触 媒による酸 化 は
RES- キノン（2）を生成する

た画分，最後に溶出した画分を凍結乾燥して，それぞれ，

チロシナーゼ（50 U/mL）による RES（1 , 100 µM）の酸化

DiGS-RES- カテコール（2 . 8 mg，33 ％収率）
，MonoGS-

は、pH 6 . 8 の 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液中、37 ℃で液（12 . 4 mg，0 . 04 mmol）を同様に処理し、分取用 HPLC

図3 RES（1）およびRES-カテコール（3）のチロシナーゼ酸化反応と生成物のHPLC分析− 177 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020実施した。UV/ 可視スペクトルの変化を 60 分間追跡したにより酸化された時，酸化は 5 分以内に急速に進み，450

ところ，単調な吸収を持つオリゴマーの迅速な生成が示さnm 付近に最大吸収波長を持つ o- キノン色素が生成したれ（図 3 a），o- キノン酸化生成物の非常に速い二次反応が（図 5 a）。これはかなり驚くべきことである。なぜなら，2示されたので，pH 5 . 3 で酸化を行うことで反応を遅くした。

mol 当量のチオールの存在下でのフェノール（およびカテ

図 3 b に示すように，実際に反応は遅くなった。UV/ 可視コール）のチロシナーゼ酸化は，通常、主な生成物としスペクトルの変化が複雑に現れたので，次に，pH 5 . 3 でて無色のモノチオール付加物を生成するからである（Ito,の酸化を 310 nm での UV 検出器を使用して HPLC で追跡

Hinoshita et al., 2017 ; Ito and Prota, 1975）。したがって、した。図 3 c に示すように，RES（1）は，15 分以内に消費NAC 濃度を 3 mol 当量（300 µM）に増やしたところ，450

され，HPLC での保持時間 5 . 5 分（RES は 6 . 9 分に現れた）

nm での吸収は 3 分の 1 に減少し，2 mol 当量の NAC を使を持つ新しい化合物が現れた。その構造は RES- カテコー

用した場合よりも 318 および 282 nm での 2 つの吸収極大

ル（ピセアタンノール，3）と推定された。RES- カテコール

はより明確になった（図 5 b）。2 当量の NAC を使用した場（3）の構造は，HPLC による市販のピセアタンノールとの合，5 分間の反応時間での HPLC 分析により，3 付加体と同時注入により確認された。この RES- カテコール（3）の2 付加体の保持時間がそれぞれ 4 . 8 分と 9 . 6 分である 2 つ

同定により，4 -（3’ , 5’ - ジヒドロキシ - トランス - スチレの主要な化合物の生成が示された（RES（1）は 11 . 7 分に出ニル）- 1 , 2 - ベンゾキノン（RES キノン，2）として 485 nm現した（図 5 c）
。しかし，ほとんどの生成物は，キノン型へので吸収極大を示す直後の生成物の構造が確認された。図

酸化により15 分以内に消失した。3 当量のNAC が使用された

3 c に示すように，RES キノン（2）は非常に反応性の高い化

場合，
これら 2 つの生成物は，安定した状態であった（図 5 d）。

合物であると思われ，RES キノンから可能なオリゴマー

これらの付加物の構造を同定するために，4 mol 当量の生成物を分離する試みはうまくいかなかった。図 3 d に示

NAC（4 mM）の存在下，RES（1，1 mM）の酸化を行った

すように，その酸化により，2 分以内に 485 nm に吸収ピが，十分速く進行しなかったので，生成物を取り出すこークを持つ化合物が急速に生成した。

とはできなかったので，RES- カテコール（3，0 . 1 mM）を

チロシナーゼ酸化中，RES カテコール（3）の生成は，pH触媒として添加した。その後，急速に反応は進行して 2 つ

5 . 3 での 10 mol当量のアスコルビン酸（1 , 000 µM）
存在下で，の主生成物を生成し，それらを分取 HPLC で分離した。こ100 µM RES（1）を酸化することによりさらに確認された。

れらの化合物の構造は，1 H-NMR，2 D-NMR，13 C-NMR，

図 4 a に示すように，RES（1）の UV スペクトルは，2 〜 5

高分解能 MS 分析により同定した。これらにより，この分で RES-catechol（3）の UV スペクトルに置き換えられた。

TriNAC 付加物の構造（7）を同定した。

反応混合物の HPLC 分析により，RES カテコール（3）が 5
分間で高収率（80 ％）に急速に生成し，RES カテコールは，
RES キノン（2）に酸化された。その後，アスコルビン酸はす
べて RES キノンとの酸化還元交換により消費された（図 4 b）。

3 . 3 . RES- キノン（2）とBSAを含む他のチオールとの反応
次に，CySH または GSH との反応性を調べた。3 mol 当量の CySH または GSH の存在下，RES（1）（100 µM）の反応

3 . 2 . RES キノン（2）とNACとの反応は，二付加体

は，フェノールの酸化におけるチオールの阻害作用によりと三付加体を生成する

非常にゆっくりと進行することがわかった（Naish-Byfield

次に、RES キノン（2）がチオール化合物と結合するかど

et al., 1994）。RES カテコール（3）（100 µM）は，pH 5 . 3 でうかを調べた。RES（1）（100 µM）が，pH 5 . 3 で 2 mol 当

3 mol 当量（300 µM）のチオール存在下で，チロシナーゼ

量の NAC（200 µM）の存在下で，チロシナーゼ（50 U/mL）（50 U/mL）により酸化した。図 6 a, b に示すように，CySH

図 4 アスコルビン酸存在下，RES（1）のチロシナーゼ酸化反応と HPLC 分析− 178 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

図 5 NAC 存在下，RES（1）のチロシナーゼ酸化反応と反応生成物の HPLC 分析

図 6 チオール存在下，RES- カテコール（3）のチロシナーゼ酸化反応と HPLC 分析− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 7 ウシ血清アルブミン（BSA）
存在下，RES- カテコール（3）のチロシナーゼ酸化と GSH は急速に反応して無色で比較的安定なチオール付化された RD オリゴマー（または RD ユーメラニン）が，合加物を生成した。HPLC分析は，3 つの主生成物の生成を示し

成フェオメラニンと同じくらい強力な酸化促進活性を持った。その収率は，60 分の酸化中ほぼ一定であった（図 6 c, d）。

ていることを示した（Ito, Hinoshita et al., 2017）。したがCys- 付加物とGSH- 付加物のHPLC 分析は，
3 つのピークをって、RES（1）のオリゴマー酸化生成物である RES オリ

示し，
それらは質量分析により構造決定した（図 6 e, f）。

ゴマーが酸化促進活性を有するかどうかを調べた。 RES

次に，BSA と RES キノン（2）の反応性を調べた。BSA

オリゴマーと RD オリゴマー（陽性対照として使用）は，には，17 個のシスチン残基に加えて 1 個のシステイン残それぞれ 1 mM RES（1）または RD を pH 7 . 4 で 120 分間，基が含まれている。BSA は，そのシステイン残基の反応

チロシナーゼ（100 U/mL）で酸化することにより調製した。

性が広く研究されており，o- キノンの反応に敏感である

各オリゴマーは，1 mol 当量の GSH と 60 分間反応し，ことが判明したため，代表的なチオールタンパク質としGSH と酸化型グルタチオン（GSSG）の残量は，GSH 量をて使用した（Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Manini et al., 2009）。

測定するための DBBQ を使用する我々の特別な HPLC 法

BSA 付加物は 314 nm で大きな吸収極大を持つが，300 nm

によって分析された（Imai et al., 1987 ; Ito, Okura et al.,

未満の BSA による大きな吸収は，小さなチオールからの2017）。図 8 a に示すように、GSH 量は時間依存的に，そ吸収よりも明確ではなかった（図 7 a）
。314 nm での吸収は，して，RES オリゴマーおよび RD オリゴマーとの 60 分間

BSA のシステイン残基を経由して生成した付加物と帰結のインキュベーションで，それぞれ約 50 ％および 90 ％まできる。それは，モノチオール付加物のスペクトルとの類で減少した。GSH の減少の大部分は，GSSG への酸化に起似性に基づいている（図 6 e、f）
。400 nm 付近に生成した弱因するが，減少の一部は，GSH の酸化生成物とキノンとい吸収は，おそらくキノン型に起因するものと推測される。

の結合を経由して進行しているように見える。次に，これ

RES キノン（2）への結合にシステイン残基が関与しているらのオリゴマーにより GSH の酸化中に過酸化水素が生成可能性を確認するために，システイン残基を N- エチルマ

されるかどうかを調べた。図 8 b に示すように，26 µM 過レイミド（NEM）で修飾した BSA と RES キノン（2）を反応

酸化水素が GSH との 30 分間の反応中に RD オリゴマーかさせたところ（図 7 b）
，RES キノン（2）の 390 nm での 0 . 60

ら生成したが，RES オリゴマーからはわずか 6 µM 過酸化の吸光度は，天然の BSA（400 nm で 0 . 20）の吸光度と比水素（コントロールと同じ量）が生成した。ただし、このべて約 3 倍大きかった。NEM 修飾 BSA からのこの大きな

RES オリゴマーからの過酸化水素の生成の減少が、過酸

吸収は，NEM-BSA と RES- キノン（2）のアミノ基間のキ化水素を生成できないことによるのか，RES オリゴマー自ノイド発色団の生成に起因する可能性がある。これらの結体による過酸化水素の除去によるのかは，現在不明である。

果から，RES キノン（2）の大部分がシステイン残基を介し

3 . 5 . EQ（6）のチロシナーゼ酸化て BSA に結合することを示している。

EQ（6）のチロシナーゼ酸化を追跡したところ，UV/ 可

3 . 4 . RES オリゴマーは GSH を GSSG に酸化し，

視スペクトルで 15 分以内に 420 nm での不安定なキノン

pro-oxidant 活性（酸化促進活性）を有する

吸収が現れた。アスコルビン酸の存在下，還元して o- キ

合成フェオメラニンと同様に天然のフェオメラニンは，

ノンをより安定したカテコールに変換後，HPLC 分取に

強力な酸化促進活性を持つことが知られている（Panzellaよ っ て 6 -hydroxy-EQ（12 %），3’ -hydroxy-EQ（25 %），et al., 2014）。我々は，以前，RD のチロシナーゼ触媒で酸

6 , 3’ -dihydroxy-EQ（25 %）のカテコール体が得られた（図− 180 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

図 8 RES オリゴマーと RD オリゴマーによる GSH の酸化

図 9 EQ（6）のチロシナーゼ酸化物

図 10 EQ（6）および 3’ -hydroxy-EQ の NAC および GSH 共存下のチロシナーゼ酸化物９）。生成物の構造は，1 H-NMR，13 C-NMR および高分解
能 ESI-TOF 質量スペクトルにより同定した。これらの化

3 . 6 . EQ（6）のチロシナーゼ酸化によるNAC およびGSHとの反応

合物は，すでにヒト肝ミクロソームを使用した EQ（6）か

触媒 量の 3’ -hydroxy-EQ（0 . 01 mmol）存 在下，EQ（6，らの代謝により生成することが知られているが，EQ（6）0 . 09 mol）とチロシナーゼを触媒として，NAC（0 . 4 mmol）のチロシナーゼ触媒酸化によって生成することがわかったと反 応させ， 生 成 物の 構造を 1 H-NMR および 高 分 解能のは最初の実験結果である。以上の結果は，p- 置換フェLC-MS 質量スペクトルにより同定した。5’ -mono-NAC-3’

ノール体である EQ（6）が酸化により，細胞毒性を示す o--hydroxy-EQ（12 %） と 5 , 5’ -diNAC- 6 , 3’ -dihydroxy-EQ

キノンを生成することを示している。

（5 %）が得られた（図 10）。一方，エクオール（6）とGSHと− 181 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 11 EQ オリゴマーによる GSH の酸化と過酸化水素量の変化の反応は，3’ -hydroxy-EQ（0 . 01 mmol）に 4 等量の GSHを有意に抑制したことを発見した。Lei ら（2017）は，RES

存在下，チロシナーゼ酸化したところ，モノGSH 付加体が（1）が HT- 144 ヒトメラノーマ細胞の増殖を 5 〜 10 µM の59 %，ジ GSH 付加体が 3 ％の収率で得られた。これらのIC 50 で強く阻害したことを発見した。同様に，Okura ら

1

構造は，NAC 体との比較で H-NMR， C-NMR および高（2015）は，RES（1）が B 16 F 1 マウスメラノーマ細胞およ

分解能 ESI-TOF 質量スペクトルから構造決定した。

び NHEMb ヒト表皮メラニン細胞の増殖をそれぞれ 27 . 1

13および 38 . 2 µM で阻害した。その値は，ハイドロキノン

3 . 7. EQ（6）の酸化促進活性（28 . 3 および 9 . 4 µM）に匹敵する値である。一方，RES

EQ（6）の酸化促進活性を測定した（図 11）。図 8 と比較
して，酸化促進活性が，RES オリゴマーと RD オリゴマー（1）の細胞毒性はかなり弱いことがわかり，別の研究ではIC 50 は≫ 100 µM であった（Lee et al., 2014）。

の中間的な結果が得られた。一方，過酸化水素の産生にRES（1）の局所適用は，一般に，皮膚に有害というよ

ついては RD オリゴマーとほぼ同様な結果が得られた（図りも有益であると考えられている（Na et al., 2019）。しか11 b）。この結果は，EQ（6）オリゴマーが，RA オリゴマー，

し，我々の研究では，チロシナーゼが効果的に RES（1）RES オリゴマーと同様に酸化促進活性を有することがわ

を酸化し，反応性の高い RES キノン（2）を生成できることかった。

を示している。高い反応性は，その急速な減衰（図 3）と，
DiNAC-RES-catechol（4）および TriNAC-RES-catechol

４. 考察と総括（5）の定量的収率での生成によって示される。ジ付加体のRES（1）は，一般に基質よりもむしろチロシナーゼの生成も CySH と GSH に対して確認された。これらの結果は，優れた阻害剤と考えられている（Na et al., 2019）。例えば、RES（1）が RES キノン（2）のチオールタンパク質への結合

Park ら（2014）は，RES（1）は，マッシュルームチロシナ

によりメラニン細胞に対して細胞毒性を示す可能性があるーゼを 1 . 8 µM の IC 50 で強く阻害することを示した。しかことを示唆している。RD オリゴマーほど強力ではないが，し，本研究は，RES（1）がマッシュルームチロシナーゼの

RES オリゴマーの酸化促進活性は細胞毒性に寄与する可優れた基質であり，反応性 o- キノンである RES キノン（2）能性がある。

を生成することを示している。ヒトを含むさまざまなもの

EQ（6）は，チロシナーゼの基質となり，o- キノンを産に存在するチロシナーゼは，さまざまな p- 置換フェノー

生しカテコール体を生成することが今回の実験からわかっ

ルを酸化して o- キノンを形成することができる（Ito et al.,た。このことは，EQ（6）がメラニン細胞に対して，細胞2014 ; Ramsden and Riley, 2014）。

毒性を示す可能性があることを示している。EQ オリゴマ

p- 置換フェノールのメラノサイトへの細胞毒性の可能

ーの酸化促進活性は，RES オリゴマーと RD オリゴマーの性にもかかわらず，多くの研究が RES（1）の色素沈着低

中間的であり，一方，過酸化水素の産生については，RD

下効果を報告している。たとえば, Leeら（2014）
は，
RES（1）

オリゴマーとほぼ同様な結果が得られた。EQ（6）は，大がメラノーマ細胞におけるメラニン形成関連タンパク質の豆食品を食べた時に大豆イソフラボン（ダイゼイン）
が，お発現を低下させ，RES（1）の局所適用は，in vivo におけなかの中で腸内の EQ 産生菌によって代謝され生成する

る紫外線 B で刺激されたモルモットの皮膚の色素沈着過剰ことが知られている（Setchell and Clerici, 2010 ; Lephart,− 182 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性2016）。EQ（6）は女性ホルモン（エストロゲン）と構造

8） Ito, S., Yamashita, T., Ojika, M., & Wakamatsu,が似ているため，体内で女性ホルモンと似た働きをする。

K.（2 0 1 4a）．Tyrosinase-catalyzed oxidation of

EQ（6）の効果は，①骨粗鬆症予防，②血管内皮作用，④rhododendrol produces 2-methylchromane-6,7-dione,

更年期症状の改善，③目尻のシワが改善するなど，皮膚老the putative ultimate toxic metabolite: implications

化予防，美肌効果，④抗酸化作用などが知られているが，

for melanocyte toxicity. Pigment Cell and Melanoma

上記に述べたように，RES（1）と EQ（6）の構造は酸化さResearch, 27, 744-753.

れやすいフェノール骨格を持ち，チロシナーゼ酸化で細胞

9） Ito, S., Hinoshita, M., Suzuki, E., Ojika, M., &毒性を示す o- キノン体を生成し，RES（1）および EQ（6）Wakamatsu, K.（2017a）．Tyrosinase-catalyzed oxidationのチロシナーゼ酸化により生成したオリゴマーが強い酸化of the leukoderma-inducing agent raspberry ketone

促進活性を示すことがわかった。以上の観点から，RES（1）produces（E）-4-（3-oxo-1-butenyl）-1,2-benzoquinone:

および EQ（6）を美白剤として皮膚に塗布した場合，これImplications for melanocyte toxicity. Chemical

らの化合物がチロシナーゼの基質になり，毒性代謝物を産Research in Toxicology, 30, 859-868.

生する可能性を示唆できた。RES（1）および EQ（6）を皮10）Ito, S., Okura, M., Wakamatsu, K., & Yamashita,

膚へ塗布する危険性について注意を喚起する必要がある。

T.（ 2 0 1 7 b）．The potent pro-oxidant activity ofrhododendrol-eumelanin induces cysteine depletion

謝辞in B 1 6 melanoma cells. Pigment Cell and Melanoma

本研究を推進する上で，藤田医科大学伊藤祥輔名誉教授，
岐阜医療科学大学田中ひとみ助教，化学教室卒論生の藤木Research, 30 , 63 - 67 .
11）Ito, S., Agata, M., Okochi, K., & Wakamatsu, K.（2018）．

C-NMR おThe potent pro-oxidant activity of rhododendrol-

よび高分解能 ESI-TOF 質量スペクトルを測定して頂いた

eumelanin is enhanced by ultraviolet A radiation.

名古屋大学大学院生命農学研究科小鹿一教授に重ねて深謝

Pigment Cell and Melanoma Research, 31 , 523 - 528 .

1

優衣氏に感謝申し上げます。また， H-NMR,

1312）James, O., Mayes, R. W., & Stevenson, C. J.（1977）．

申し上げます。

Occupational vitiligo induced by p-tert-butylphenol: a（引用文献）

systemic disease? The Lancet, 310 , 1217 - 1219 .

1） Afaq, F., Katiyar, S. K.（2 0 1 1）．Polyphenols: Skin

13）Jang, M., Cai, L, Udeani, G. O., Slowing, K. V.,

photoprotection and inhibition of photocarcinogenesis.

Thomas, C. F., Beecher, C. W. W.,

Mini Review in Medical Chemistry, 11, 1200-1215.

M.（1 9 9 7）．Cancer chemopreventive activity of2） Baur, J. A., Sinclair, D. A.（2 0 0 6）．Therapeuticpotential of resveratrol: the in vivo evidence. Nature… Pezzuto, J.

resveratrol, a natural product derived from grapes.
Science, 275 , 218 - 220 .
14）Lee, T. H., Seo, J. O., Baek, S. H., & Kim, S. Y.（2014）．

Review Drug Discovery, 5, 493-506.
3） Baur, J. A., Pearson, K. J., Price, N. L., Jamieson,

Inhibitory effects of resveratrol on melanin synthesis

H. A., Lerin, C., Kalra, A., … Sinclair, D. A.（2006）．

in ultraviolet B-induced pigmentation in guinea pig

Resveratrol improves health and survival of mice on askin. Biomolecules & Therapeutics, 22 , 35 - 40 .
15）Lei, M. J., Dong, Y., Sun, C. X., & Zhang, X.

high-calorie diet. Nature, 444, 337-342.
4） Bolton, J. L., Trush, M. A., Penning, T. M., Dryhurst,

H.（2017）．Resveratrol inhibits proliferation, promotesG., & Monks, T. J.（2000）．Role of quinones in biology.

differentiation and melanogenesis in HT-144 melanoma

Chemical Research in Toxicology, 13, 135-160.

cells through inhibition of MEK/ERK kinase pathway.

5） Imai, Y., Ito, S., & Fujita, K.（1987）．Determination

Microbial Pathogenesis, 111 , 410 - 413 .

of natural thiols by liquid chromatography after16）Lephart, E.D.（2016）．Skin aging and oxidative

derivatization with 3,5-di-tert-butyl-1,2-benzoquinone.

stress: Equolʼs anti-aging effects via biochemical andJournal of Chromatography 420, 404-410.

molecular mechanisms. Ageing Research Review. 3 1 ,
36 - 54 .

6） Ito, S., & Prota, G.（1 9 7 5）．A facile one-step
synthesis of cysteinyldopas using mushroom

Resveratrol, R-equol, Racemic Equol or S-equol astyrosinase. Experientia, 33, 1118-1119.
7） Ito, S., & Wakamatsu, K.（2 0 1 8）．Biochemicalmechanism of rhododendrol-induced leukoderma.
International Journal of Molecular Sciences, 19, e552.

17）Lephart, E.D.（2 0 1 7）．
Resveratrol, 4 0 Acetoxy
Cosmeceuticals to Improve Dermal Health. International
Journal of Molecular Sciences, 18 , 1193 .
18）Manini, P., Napolitano, A., Westerhof, W., Riley,− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

P. A., & d’ Ischia, M.（2 0 0 9）．A reactive ortho-

the four oxidation states of the active site and their

quinone generated by tyrosinase-catalyzed oxidation

relevance to enzymatic activation, oxidation andof the skin depigmenting agent monobenzone: self-

inactivation. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2 2 ,coupling and thiol-conjugation reactions and possible

2388 - 2395 .

implications for melanocyte toxicity. Chemical Research24）Riley, P. A.（1969）．Hydroxyanisole depigmentation:
in-vivo studies. The Journal of Pathology, 97 , 193 - 206 .

in Toxicology, 22 , 1398 - 1405 .
19）Na, J. I., Shin, J-W., Choi, H. R., Kwon, S-H., &25）Sasaki, M., Kondo, M., Sato, K., Umeda, M., Kawabata,Park, K-C.（2 0 1 9）．Resveratrol as a multifunctionalK., Takahashi, Y., … Inoue, S.（2014）．Rhododendrol,

toical hypopigmenting agent. International Journal ofa depigmentation-inducing phenolic compound, exerts

Molecular Sciences, 20 , E 956 .

melanocyte cytotoxicity via a tyrosinase-dependent20）Naish-Byfield, S., Cooksely, C. R., & Riley, R.A.（1994）．

mechanism. Pigment Cell and Melanoma Research, 27 ,754 - 763 .

Oxidation of monohydric phenol substrates by tyrosinase:effect of dithiothreitol on kinetics. Biochemical Journal,26）Setchell, K. D. R. & Clerici, C.（2010）．Equol: History,
chemistry, and formation. The Journal of Nutrition,

384 , 155 - 162 .

140 , 1355 S -1362 S.

21）Okura, M., Yamashita, T., Ishi-Osai, Y., Yoshikawa,
M., Sumikawa, Y., Wakamatsu, K., & Ito, S.（2 0 1 5）．

27）d’ Ischia, M.（2011）．The haptenation theory of vitiligo

Effects of rhododendrol and its metabolic products

and melanoma rejection: a close-up. Experimental

on melanocytic cell growth. Journal of Dermatological

Dermatology, 20 , 92 - 96 .
28）Zhou, M., Diwu, Z., Panchuk-Voloshina, N., & Haugland,

Sciences, 80 , 142 - 149 .
22）Park, J., Park, J. H., Suh, H-J., Lee, I. C., Koh, J., & Boo,R. P.（1 9 9 7）．A stable nonfluorescent derivative of

Y. C.（2014）．Effects of resveratrol, oxyresveratrol, andresorufin for the fluorometric determination of trace

their acetylated derivatives on cellular melanogenesis.

hydrogen peroxide: applications in detecting theArchives of Dermatological Research 306 , 475 – 487 .

activity of phagocyte NADPH oxidase and other23）Ramsden, C. A., & Riley, P. A.（2014）．Tyrosinase:oxidases. Analytical Biochemistry, 253 , 162 - 168 .

− 184 −

香りの文化と法的保護
九州大学芸術工学研究院

麻生典

This research is exploring the legal protection of fragrances while paying attention to the cultural background of fragrances.
The legal protection of fragrances under the Patent Law, the Trademark Law, the Copyright Law, and the Unfair Competition
Prevention Law would be conceivable. Among of them, the legal protection by the Patent Law or the Unfair Competition
Prevention Law is restrictive and insufficient, whereas, regarding to the legal protection by the Trademark Law, it was expectedtrademark applications of fragrances would increase when the requirement of graphical representability of the Community
Trademark Regulation and Directive was discarded. However, the EUIPO still keeps the status not allowing fragrances to beregistered as a trademark. Nevertheless, analyzing the component of fragrances would be possible technically, so there is apossibility that expressing fragrances objectively and clearly is not so difficult technically. If such objectivity and clarity are
ensured, the legal protection of fragrances under the Trademark Law seems to be worth considering.
On the other hand, the legal protection of fragrances under the Copyright Law is sometimes emphasized from the cultural
aspect. In France, fragrances are valued traditionally focusing on perfume, and considered to be a perfumer's creation. In Japan,
the traditional culture of Kodo (Japanese incense) can be evaluated to have a cultural aspect of fragrances. However, even in
France, the legal protection of fragrances under the Copyright Law is claimed by masking the industrial aspect of fragrances withthe cultural aspect. Then, we should consider an approach to protection from the industrial aspect, not from the cultural aspect.
Therefore, it seems that the legal protection of fragrances under the Trademark Law should be aimed.
In any case, it is strange that the legal protection of fragrances hasn’t been so appealed in Japan, despite that the cultural andindustrial importance of fragrances are well recognized. These points are for further study.

１．緒る）破毀院で争われるなど、その議論は非常に活発である。

言

他方、香りはその国の文化の反映でもあると考えられる。

本研究は香りの文化的背景に留意しつつ、香りの法的保護を探求しようとするものである 1。

人間が絶対的に心地良いと感じる香りも存在すると考えられるが、好まれる香りは各国で差異があり、そこには各国

産業界において、独自の香りを開発し、その香りを基にで積み重ねられた文化的背景が影響している可能性が高い。

利益を得ることは通常行われている。例えば、芳香物質そこのように、香りの保護を考える際には、法的保護のあのものには、しばしば特許権が取得されている。しかし、り方と、その前提となる文化的背景の分析が必要である。

特許権の保護は、特許化された物質と同一の物質にしか及そこで、本研究は、フランス法および欧州法を比較対象

ばないことから、特許権に基づいては結果的に同じ香りをとして、香りの文化的背景と、その法的保護を探求するこ有する他の物質の製造を差し止めることはできない。そのとを目的とした。

ため、特許権による香りの保護は間接的なものに過ぎない。

２．方

そこで、香りを直接的に保護するために訴求されるのが、商標法による保護と著作権法による保護である。しかし、商標法による保護は欧州法の下では認められている一方で、研究手法は、外国法研究を含むため、比較法研究の手法を採用した。

我が国では認められていない。また、我が国では香りの著

３．結

作権法による保護に関する議論はほとんど存在していない
が、フランスにおいては幾度となく（日本の最高裁にあた1

化粧品分野における香りの重要性は従来から指摘されるところである（例えば、Fragrance journal 2005 年 4 月号の特集「最近香りの研
究と化粧品への応用」を参照）。

法

果３.１．著作権法による保護
３.１.１．フランスにおける議論
フランスにおいて著作物として香気が問題となることを明らかにし、香気に対する著作権による保護を初めて
明 確 に 認 め た 裁 判 例 が Thierry Mugler Parfums c/GLB
Molinard 事件である2。そして、そこで示された論理がフランスの後の諸判決での基礎とされることとなる。そのThe culture of fragrances and the legal
protection
Tsukasa Aso
Faculty of Design, Kyushu University

意味で Thierry Mugler Parfums c/GLB Molinard 事件は、2Thierry Mugler Parfums c/ GLB Molinard, T. com. Paris, 24 sept. 1999 ,RIPIA, 2000 , p. 71 . 2008 年頃までのフランスにおける議論状況については、拙稿「香気の著作物性─フランスにおける議論を中心に─」。

− 186 −

香りの文化と法的保護

2006 年の破毀院判決までのリーディングケースとなった。

他方で、フランスにおいては香水に代表されるように、とはいえ、創作性の判断基準についてはその後の諸判決に香りがその文化の一部を形成している。調香師の社会的地

おいても相違があり、学説でもそれは同様であった。学説

位も認められており、Que sais-je シリーズでも調香師をの態度は Thierry Mugler Parfums c/GLB Molinard 事件

代えて香りの創造についての２度書籍が出版されている 6。

の理論を受け継ぎ香気の保護に好意的であったが、保護否

そして、産業的にも、実際に香りの保護について訴訟を提定説も若干ながら存在していた。

起しているのは香水を提供する会社である。しかし、こう

破毀院が香気の保護についてなした最初の判決が、した動きが例えばファンデーションなど化粧品全般にまで2006 年 6 月 13 日の判決である。破毀院は、「ノウハウの及び、多数の訴訟が提起されているわけではない。その理

単なる実行から生じる香水の香りは、上述の［知的財産法

由は明らかではなく、今後は社会学的分析が必要となろう。

典 112 条−１、112 条−２の］意味において、著作権法にいずれにしても、フランスでは文化的にも産業的にも香りよる精神的著作物の保護の利益を受けることができる表現の保護の社会的要請は強いという状況にあるが、どちらに3形式の創造を構成しない」 として香りの保護を拒絶した。

主眼が置かれているかと言えば、それはやはり産業的側面

本判示は、香りはノウハウの実行に過ぎないとして香りのと言わざるをえない。むしろ、産業的側面からの著作権保著作権による保護を否定したものであり、このような判示

護の主張を隠すために香水の香りの文化的側面を強調して

4

は破毀院でその後幾度となく繰り返され 、破毀院の香りいるとも言えるかもしれない。その意味で、フランスにおの著作権法による保護を断固として否定するという態度をいては純粋な文化的保護を指向することで香りの著作権に見て取れる。

よる保護を望むものではなく、あくまで著作権を道具とし

ただし、香りを著作物としては保護しないという結論は変わらないものの、その理由づけには若干の変化も見られた産業的投資の保護の指向であるように思われる。
３.１. ２．欧州の状況る。2013 年の破毀院判決では「著作権は、知覚可能な形式

欧州においては欧州全体に及ぶ著作権の保護はなく、情がその伝達を可能とするために十分な明確さと共に確認し報社会指令 7 と呼ばれる指令により各国法の調和が図られうる場合に限り、知覚可能な形式における創造を保護する。

ているに過ぎない。そのため、味覚・嗅覚によって知覚さ香水の香りは、それ自体は著作物とならない精製という手れる無体物が著作物として保護されるかも各国に委ねられ法の外縁で、この特徴を表明する形式を有さず、著作権にるが、その解釈については欧州司法裁判所が示すことがで

5よる保護を受けることはできない」 。2006 年の破毀院判きる。

決における香気はノウハウの実行にすぎないという理由づ

最近、香りではないものの食品の味に関する欧州司法裁

けから、香りはその不明確さから知覚可能で形式とは言え判所の判決がなされた。著作権法による著作物としての保ないという理由づけに変化しているのである。2006 年の護の議論の枠組みで言えば、著作物として例示されていな

破毀院判決に対する学説や下級審の批判に対応したものとい嗅覚・味覚で知覚される無体物が著作物として保護対象考えられるが、2013 年の破毀院判決に対してもなお、嗅となりうるのか、という点に関連するものである。

覚に訴えかける香りがなぜ知覚可能とは言えないのか、と本件は、オランダの会社が提起した訴訟についてオラン
ダの裁判所が欧州司法裁判所に対して先決裁定を求めたもいう批判は見られるところである。
このように、フランスにおいては、香りの著作権法によのであるが、実はオランダは香りに対して著作物性を最高る保護は学説・下級審では強く主張されているものの、破裁が認めた国でもある 8。そのため、味覚で知覚できる食毀院はこれを一貫して否定してきた。理由づけに変化が見

品の味という無体物についても著作物として著作権法の保られるとしても、著作権法による保護についてはフランス

護対象となる可能性を期待して、訴訟が提起されたというでは困難な状況にあると言えよう。

事情があろう。結論から言えば、欧州司法裁判所は食品の法学政治学論究 78 号 317 頁以下を参照。
3
Cass 1 re civ., 13 juin 2006 , Bull. civ.Ⅰ. n° 307 , p. 267 .
4Cass com., 1 re juill. 2008、, Juris-Data 07 - 13952 , Cass 1 re civ., 22 janv. 2009 , Juris-Data 08 - 11404 . その背景には、2006 年の破毀院判決後も下級審では香気の著作権法による保護が肯定されていたという事情がある（例えばBPI c/ Senteur Mazel, TGI Bobigny, 28 nov. 2006 , inédit, cité par
J.DALEU, D. 2007 , AJ. p. 736 , BPI c/ Senteur Mazel, CA Paris, 4 ech., 14 févr. 2007 , Juris-Data 06 - 09813 , Lancôme c/ Argeville, CA Aix en。
Provence, 2 ech, 13 sept. 2007 , Juris-Data 05 - 23579 .）5
Cass com., 10 déc. 2013 , Juris-Data 11 - 19872 .
6
Edmond Roudnitska, Le parfum, PUF, 1980 , Jean-Claude Ellena, Le parfum, 5 .éd., PUF, 2017 .
7
Directive 2001 / 29 /EC of the European Parliament and of the Council of 22 May 2001 on the harmonisation of certain aspects of copyrightand related rights in the information society.
8
オランダ最高裁 2006 年６月 16 日判決（H.R. 16 juin 2006 , LJN AU 89 / 40）参照。さらにそこでは創作性の証明責任が侵害者側に転換されている（Kamiel KOELMAN, Parfum ou forme dʼexpression artistique ? , Magazine de lʼOMPI, oct. 2006 , n° 5 , p. 3）。

− 187 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

味の著作物性を否定したが（CJUE, 13 novembre 2018 , aff.

３. ２．商標法による保護 10

C- 310 / 17 , Levola hengelo BV C/smilde Foods BV.）、よでは、商標法による香りの保護はどうか。欧州各国の商り重要なのはその理由づけである。欧州司法裁判所は、著

標法は欧州共同体商標指令によって調和されているため、作権法における保護対象である表現は必ずしも永続的であ

欧州共同体商標指令の解釈に従うこととなる。また、欧州

る必要はないが、十分に明確で客観的でなければならない。

全体で効力を有する商標権に関する欧州共同体商標規則が食品の味の識別は本質的に、感情と主観的で変わりやすい存在する。欧州共同体商標指令と欧州共同体商標規則にお味覚的経験、すなわち、年齢、好み、消費習慣、食した際いて基本的に商標の登録要件は異ならないことから、両者の状況・環境に左右されることから、明確性と客観性が欠を区別せず検討する。

けている。それゆえ、食品の味について著作物性は認められないとした。

まず、欧州では香りの商標の登録例が存在したことが注目に値する。すでに権利としては消滅しているが、指定商

本判決が重視しているのは、知覚対象物の客観性と明確品をテニスボールとし、刈ったばかりの草の香りを商標と性である。言い換えれば、その知覚が主観的なものであっした商標権の存在である（登録番号 : 428870）。本商標登録てはならないということである。こうした論拠は、人によについては、旧欧州共同体商標指令 2 条の「写実的表現可って受け取られ方が異なることから香りは著作物としての能性」要件を満たすと判断されたが、出願書類では香りに保護を受けられないとする批判としてフランスにおいて従ついて文章だけで表現されたものであった。

来から見られるものであるが、本判決には香りの商標につしかし、この文章だけで写実的表現可能性を満たすといいての登録を拒絶した欧州司法裁判所の判決の影響もあろう点については、本商標登録とは別の出願にかかる事件にう（CJCE、12 déc. 2002、aff. C- 273 / 00、Ralf Sieckmann

おいて欧州司法裁判所で否定されることとなった。欧州司

c/ Deutsches Patent-und Markenamt：この点について

法裁判所は、香りの商標に関して、旧欧州共同体商標指は後述）。

令 2 条の「写実的表現可能性」要件を充足するためは、明白、いずれにしても問題は、この判決が香りの著作権法によ

明確、自己充足的、入手容易、理解容易、永続的、かつ、る保護の議論にどのような示唆を与えるのか、ということ客観的でなければならないとした（CJEU, 12 déc. 2012 , aff.

である。もちろん、香りも味と同様に客観性と明確性といC- 273 / 00）。当該判決における明白性等の内容は非常にう観点から著作物性を満たさないという評価も可能であろ厳格なものであり、香りの商標についてこの写実的表現可う。他方で、香りについては技術的な成分分析から明確性

能性を満たすことは現実的には不可能と言えるものであっと客観性を保つことも可能との評価もありえようし、香りた。実際、本判決後においては、香りの商標が欧州においは味ほど個人の経験に左右されないと評価できる可能性もて保護されることはなかった。

ある。欧州司法裁判所の判決の射程は、事案からして食品

他方で、この写実的表現可能性要件が 2015 年の欧州共の味にしか及ばないと解されるが、香りの著作権法による同体商標指令および欧州共同体商標規則によって削除され保護についても、知覚対象物の明確性と客観性が欠けていたことにより 11、商標の登録要件が緩和されたと理解するるとして欧州司法裁判所で否定的な評価がなされる可能性向きがあった。言い換えれば、香りにかかる商標については高まったように思われる。そして、この欧州司法裁判所の保護可能性が開かれたという期待があったのである。しの判決は、香りに関する著作物性についての各国の著作権

かし、現実にはそうはならなかった。

法の解釈に影響を与える可能性が高まったと言えよう。
３.１. ３．我が国の状況

2015 年の欧州共同体商標規則 4 条では、商標は「明確、かつ、正確な主題を判断することができる態様」12 で表

我が国では香りの著作権法による保護についての裁判例

示されることが必要とされている（欧州共同体商標指令 3は存在せず、学説においても十分な議論は存在しない 。

条も同旨）。さらに、欧州共同体商標委員会実施規則 3 条

9は、「商標は、管轄当局及び公衆に対して、明確性及び正9拙稿
「香気の著作権法による保護」『著作権・著作隣接権論文集 第７回』
、著作権情報センター、1 頁以下、2009 年。
商標による保護の概論を示したものとして、反町ボルド祐美「諸外国における香りの商標の現状と TPP11 協定」
パテント 72 巻 8 号 152 頁。
11
Directive（EU）2015/2436 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2015 to approximate the laws of the Member
States relating to trade marks, Regulation（EU）2015/2424 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2015 amending
Council Regulation（EC）No 207/2009 on the Community trade mark and Commission Regulation（EC）No 2868/95 implementing Council
Regulation（EC）No 40/94 on the Community trade mark, and repealing Commission Regulation（EC）No 2869/95 on the fees payable to
the Office for Harmonization in the Internal Market. また、Regulation（EU）2017/1001 of the European Parliament and of the Council of 14
June 2017 on the European Union trade mark。
12
邦訳は特許庁の諸外国・地域・機関の制度概要および法令条約等から引用（2020 年 3 月 27 日最終確認）（https://www.jpo.go.jp/system/laws/
gaikoku/document/mokuji/ec-shouhyou_rijikai.pdf.a）。
10− 188 −

香りの文化と法的保護確性を伴って所有者に付与される保護の主題を判断するこそのものであり、他の物質が同じ香りを発したとしても特とが可能になるように、明確、正確、自己充足的、入手容許権の効力は及ばないことから、香りを保護するためには易、理解容易、永続的で、かつ、客観的な方法で管理簿に特許権の実効性は薄い。

再現するべく一般的に利用可能な技術を用いて何らかの
13

他方で、フランスの裁判例ではノウハウに言及されてい適切な様式で表示される」と規定している 。そして、こるが、ノウハウが営業秘密に該当するような場合には香りれらの条文の解釈として欧州知的財産庁（EUIPO）の商標

は保護を受けることが可能である。フランスでは営業秘密

ガイドラインにおいては、「現在のところ、嗅覚と味覚のに関する欧州共同体指令をうけて 15、2018 年に制定され商標は受け入れられない。というのは、その表現は、それた「営業秘密の保護に関する法律第 2018 - 670 号」に基づい自体が明確、正確、完全であり、容易にアクセス可能、理て営業秘密の定義等を設け 16、商法典に具体的な規定が設解可能、継続可能、そして、客観的でなければならず（欧けられた（商法典 L. 151 - 1 以下）。当該法律が成立する以州共同体商標委員会実施規則 3 条第 1 段落）、技術の現状前から、フランスでは判例によって民法 1240 条（旧 1382 条）

はこの種の商標をそうした方法で表現することはできなに基づいた不正競争訴訟または寄生競争訴訟で営業秘密がいからである。その上、欧州共同体商標委員会実施規則

保護されており、それは営業秘密に関する指令後でも変わは、サンプルまたは見本の寄託を適切な表現と認めていらない 17。我が国においては、営業秘密に該当する場合にない。商標の記述は表現に代替できない。なぜなら香りは不正競争防止法による保護を受けることが可能であるが、の記述は明確でも、正確でも、客観的でもないからであ香りが商品等表示に該当するかは検討を要する事項であり、る［12 / 12 / 2002 , C- 273 / 00、Sieckmann, EU:C: 2002 : 74 ,また、民法 709 条に基づく不法行為での保護を受ける可能§ 69 - 73 ; 04 / 08 / 200 , R 120 / 2001 - 2 , THE TASTE OF

性は高くない 18。

ARTIFICIAL STRAWBERRY FLAVOUR（gust.）］。 そ

４．考

れゆえ、あらゆる嗅覚または味覚の商標の出願は、欧州知察的財産庁によって欧州共同体商標登録出願として扱われな

本研究の申請時点においては、欧州で欧州共同体商標指い（出願でないとみなされる）。なぜなら、その出願は出願日令および欧州共同体商標規則が改正され「写実的表現可能14の取得のために要求される要件を満足しないからである」

性」要件が削除されたことにより、香りについての商標出とされている。

願が欧州で増加するのではないかという期待があった。しそのため、欧州では「写実的表現可能性」
要件が削除されかし、実際には、そうした動きは広がっているとは言い難

たにもかかわらず、旧欧州共同体商標指令２条の解釈としい。実際、欧州知的財産庁では、現状、香りの商標は登録て 2012 年の欧州司法裁判所で示された解釈が現在の欧州しないとしており、裁判例も存在していないことから、香共同体商標指令および欧州共同体商標規則の条文の解釈とりについて商標出願してその解釈を裁判所で争うほどの意

しても維持されており、現状、欧州では香りを商標権で保味まではないと欧州の企業も考えている可能性が高い。も護することは不可能な状況にある。

ちろん、上記で検討したように、特許権または営業秘密と

３. ２. ２．我が国の状況しての保護を各国で受ける可能性もあるが、その保護には

我が国では香りは商標法における保護を受けることはで限界があり十分な保護とは言い難い。
他方で、香りの成分分析などは十分に技術的に可能であきない（商標法 2 条）。

り、香りを客観的かつ明確に表現することも技術的にはそ３. ３．他の方策

れほど困難でない可能性もある。そうした客観性と明確性

香りについて芳香物質としての特許権による保護は当然に可能であり、この点についての疑義は存在しない。ただし、先にも述べたように、特許権が及ぶのはその芳香物質が確保されるのであれば、商標法での保護は十分に検討に値するように思われる 19。
一方で、香りの文化的側面から著作権による保護が強調

13

邦訳は特許庁の諸外国・地域・機関の制度概要および法令条約等から引用（2020 年 3 月 27 日最終確認）（https://www.jpo.go.jp/system/laws/
gaikoku/document/mokuji/ec-shouhyou_iinkai.pdf.）。
14
https://guidelines.euipo.europa.eu/ 1803430 / 1799014 /directives-des-marques/ 9 - 11 - 2 ---------- 9 - 3 - 11 - 2 -marques-olfactives-et-marquesgustatives.
15
DIRECTIVE (EU) 2 0 1 6 / 9 4 3 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 8 June 2 0 1 6 on the protection ofundisclosed know-how and business information (trade secrets) against their unlawful acquisition, use and disclosure.
16
解説として、安藤英梨香「【フランス】
営業秘密の保護に関する法律」、外国の立法、No. 279 - 2、12 頁、2019。
17拙稿「フランスにおける寄生概念」
瀬川先生・吉田先生古稀記念『社会の変容と民法学の課題下』、成文堂、691 頁、2018。
18
最判平 23 年 12 月 8 日民集 65 巻 9 号 3275 頁［北朝鮮映画事件］。
19
技術的に色で香りを表現することで、客観性と明確性を担保することもありえよう（Amandine Esquis, De la marque traditionnelle à la marqueatypique : l'exemple de la marque olfactive, 2014 , thèse, Université de Lorraine, p. 284 以下）。

− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020されることがある。フランスでは香水を中心に香りを伝統考えるのではなく、産業的側面から保護のアプローチを考的に重視し、それを調香師の創作であると考える立場も有えるべきである。そのため、基本的には、商標法での香り力である。我が国でも香道という伝統文化からすれば、香の保護が指向されるべきであるように思われる。

りが文化的側面を有すると評価できる。ただし、結局のといずれにしても、香りの文化的重要性、産業的重要性がころフランスでも、香りの産業的側面を文化的側面で覆いこれほど認識されているにもかかわらず、その保護がこれ隠して著作権による香りの保護が主張されていると言える。

ほど訴求されないというのも不思議な状況である。それらそうであるとすると、文化的側面から保護のアプローチをの点は今後の検討課題としたい。

− 190 −

化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題
関西大学商学部

小井川

広志

This study focuses on the palm oil as one of the most important ingredients for cosmetic and personal care (CPC) products.
My approach is mainly based on social science, particularly economic and management, examining the view of palm oil producers
toward their perspectives of CPC markets.
Palm oil is currently the largest in production volume among all oils and fats. This is because it is versatile in terms ofapplicability to a number of oils and fats-based products such as frying oil, margarine, shortening, confectionery, cocoa butter
equivalent, detergent, biofuel and other edible as well as non-edible items. However, surprisingly, palm oil is the newest comerin these, including CPC, markets as it was not commercially developed until the late 1960 s. This means palm development was
highly successful to penetrate the markets above. Based on this historical background, this study intends to examine the interactionof palm development and the promise of CPC market.
My fieldwork was conducted for two weeks in Malaysia in March 2018 , where several interviews and data collection weresuccessfully completed. Malaysia was chosen as it used to be the largest palm oil producer (until 2005 , surpassed by Indonesia)
and still a global leader in palm oil-related technologies. MPOB, formerly named as PORIM, a government agency, continuously
conducted intensive research and development efforts on palm oil related-technologies. CPC markets have been one of the mostimportant targets for MPOB to penetrate, as its products are highly valued. Regarding the cosmetic application, two important
technological developments have been witnessed; namely, technologies related to DHSA ( 9 , 10 -dihydroxystearic acid) andtocotrienol. These are exclusively palm-based and can be developed as functionality cosmetics. MPOB expects, due to its
aesthetically appealing, multifunctional and safe nature, they should be welcomed by potential customers.
In conclusion, the markets for CPC products are highly promising for palm oil producers and suppliers; however, this study
notices several issues remained.

１．緒て、パーム油は数多い原料の一つであり、その化学的特性

言などについての研究は進んでいる 1）。しかし、本研究はパ

パーム油は、マレーシア、インドネシアの 2 国で世界総ーム油の香粧品科学的分析を行うものではない。著者の専生産量の 8 割、世界市場シェアの 9 割を占める熱帯原産の門とする社会科学的見地から、パーム油と化粧品の関係を

植物油である。パーム油産業は広範なバリューチェーンを検討していく。加えて本研究のユニークな着眼点は、ユー有し、我々の日常生活の細部に入り込んでいる。例えば、

ザー目線ではなく、生産者・供給者側から見たパーム油の日本人が国内で利用する石けんの多くは、マレーシア産パ

化粧品用途の位置付け・重要性を検証しようとする点にあーム油が精製、加工され日本に輸出されたものである。こる。このような視点からの研究は、国内外でも多くない。

の他にも、インスタント食品の加工や外食産業の厨房で利言うまでもなく供給者側は、パーム油の素材特性を活かす用されるフライ油の多くにはパーム油が利用されている。

ことで他の油脂との差別化をはかり、高付加価値化を模索

マーガリン、菓子原料のショートニング、洗剤などでも同している。本研究は、その実態と研究開発の取り組みを紹様にパーム油由来のものが多い。油ではないが、廃材から介するものである。

作られる木材チップも、バイオマス発電の燃料として日本本研究では、主にマレーシアにおけるパーム油関連の研に多く輸出されている。我々の日常生活は、パーム油とは究開発に焦点を当てる。パーム油生産は、マレーシア、イ

切っても切れない関係にある。

ンドネシアの 2 国が圧倒的シェアを握っているが、中でこのように様々な用途に利用されるパーム油だが、本研も、パーム油に関連する研究開発の殆どは、技術的に先行

究はその中でも、化粧品用途としてのパーム油の役割を検するマレーシアの政府系研究機関である MPOB（Malaysia

討するものである。ユーザーである化粧品メーカーにとっPalm Oil Board）がほぼ一手に担っている。従って、以下
では、パーム油の化粧品用途拡大に向けた MPOB の研究活動と取り組みを中心に議論していく。なお、パーム油は、

The Issues and Perspectives for Palm
Oil as the Ingredient for Cosmetic
Applications
Hiroshi Oikawa
Faculty of Business and Commercee,
Kansai University

狭義にはパーム油とパーム核油の 2 つがあり、化粧品原料はオレオケミカルの元となるパーム核油由来が主となる。
ただし以下では、特に区別して議論する必要のある場合を除いて、2 つを併せて単にパーム油と呼称する。
以下、第 2 節では、本研究のアプローチを説明する。第− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

3 節では、まず、パーム油産業の発展と産業的特徴を、産景には、ゴム、錫など少数の一次産品依存構造からの脱却

業バリューチェーンの枠組みに従って概観する。続けて、を進めようとするマレーシア政府主導の多角化政策があっパーム油産業から見た化粧品用途の位置付けをふまえて、た。その政策の下でパーム油産業は支援を受け、順調に成パーム油化粧品関連製品の研究開発を PORIM モデルとし長した。60 年代、70 年代を通じて作付面積および産出量て定式化し、研究開発の具体例と成果を検討する。第 4 節は共に年平均 20 ％前後の高い成長率で拡大し、その 20 年

では、マレーシア・パーム油産業にとっての化粧品の課題の間にそれぞれ 19 倍、28 倍に急拡大している。80 年代にと展望を議論する。

入り増加ペースはやや鈍化するものの、引き続き年平均

２．方

10 % を超える高いペースで生産を拡大してきている。90法

年代以降は耕作地拡大の制約に直面するが、土地生産性を本研究は、文献調査、データ収集、ならびに関係者への高めることで年平均５% 前後の増産ペースを維持してきた。

インタビュー調査による知見に基づいている。特に歴史的

植物油脂には、大豆油、なたね油、ひまわり油、綿実油、分析に関しては、文献研究に拠るところが大きい。マレー

ココナッツ油、オリーブ油など多くの種類が存在する。そシアでの現地調査は、2018 年 3 月の 2 週間が充てられた。

の中でパーム油は、生産量、消費量共に最大である。各植

政府関係者 5 名（MPOB 技術者 3 名、マーケシング担当者

物油脂の生産量の推移を Fig. 1 から確認する。最新の統計

1 名、MPOC の CEO）
、プランテーション企業 2 社（FELDA、が利用可能な 2018 年時点で、パーム油の生産量は 7 , 200Sime Darby）、日系商社 1 社とインタビューを行った。す万トンを超え世界第１位の生産量を誇る。これに続くのがき間時間は、MPOB 図書室、および National Library にて

5 , 500 万トン余の大豆油、約 2 , 500 万トンのなたね油、約関連文献、統計資料などの複写による収集に充てた。これ

1 , 900 万トンのひまわり油などである。動物油脂の生産量

らの資料を基に、以下で報告するパーム油産業における化は、ここ数十年ほとんど増えていない。Fig. 1 から読み取粧品分野の位置付けが明らかにされた。

れる興味深い特徴は、この間の著しい油脂生産総量の拡大

３．結である。この 10 年間で、植物油脂は約４割の生産量が拡果大した。しかもその大部分は、パーム油と大豆油の生産拡

３．
１．パーム油産業バリューチェーンの検証

大によって担われている。潤沢に供給可能な油脂という視

オイルパーム樹はもともとマレーシア自生ではなく、点から、パーム油はますます注目されていくであろう。

19 世紀後半に西アフリカから持ち込まれた外来の商品作

パーム油関連産業は、栽培から精製、加工まで幅広いバ物である。マレーシアでオイルパームの本格的な商業生産

リューチェーンを包摂し、雇用創出や所得産出の面でマレが開始されたのは 1960 年を過ぎた頃からである。その背ーシア経済に大きく貢献している。2009 年にパーム油関

Fig. 1World Production of Major Oils & Fats 1994-2018− 192 −

化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題

連産業は 527 億リンギットの付加価値を産み出したが、こで対象とする石鹸や洗剤、界面活性剤などは、主にこのパれはマレーシア GNI（国民総所得）の約 8 ％に相当し、エーム核油由来となる。

ネルギー、金融サービス、卸売・小売サービスに次いで部
2）

パーム油産業が、マレーシアの中心的な産業の一つとして一層の飛躍を遂げていくには、これまでの量的な拡大か

門別で 4 番目に大きい 。
パーム油産業バリューチェーンの広がりと奥行きを図示

ら、バリューチェーン全体で質的な高度化を図る必要があしたものが Fig. 2 である 3）。川上部門のオイルパーム樹栽る。現状において、マレーシアは、耕作可能地拡大の制約

培に始まり、搾油、精製過程を経て、最川下の最終製品販に阻まれて産出量拡大が困難な状況にある。そのような事売に到る流れが示されている。川上・川中部門については

情からも、パーム油バリューチェーン全体の高付加価値化

4 , 5）、以下では化粧品、パーソを進めていく誘因は大きい。そのためには、相対的に低付ナルケアと関連する精製および最終財過程について概観し

加価値の食用油からより高付加価値の製品に、パーム油利ていく。

用の最終製品の割合をシフトさせる必要がある。

別の説明に譲ることにして精製は、パーム原油から様々な不純物を除去し、油分をパーム油由来のどのセグメントがより高い付加価値を生取り出す工程である。脱ガム（パーム油中のリン脂質成分

み出すのか。Table 1 は、パーム油最終財の輸出量と輸出の除去）、脱酸、脱色、脱臭などのプロセスを経てパーム

金額、および千トン当たり単価（⒝ / ⒜）を比較したもので精製油が取り出される。精製には物理精製、化学精製の 2ある 6）。この中で、化粧品・健康食品輸出のセグメント（表通りがあり、それによって得られる最終精製油の化学的性

中 ⑻ ）の単価が他部門に比較して突出して高いことが分か

質も異なる。コストなどの面から物理精製の利用度が高い。

る。しかしながら、その輸出量は順調に増えているものの、

パーム原油（Crude Palm Oil）からは、フライ油やショート

その量、額は圧倒的に小さい。当該部門の一層の拡大が望

ニング、マーガリン、ココアバター代替脂などに使われるまれる所以である。

成分を分別していく。果房の核の部分から抽出されるパーム核油（Palm Kernel Oil）は、パーム油とは全く異なる成３．２．研究開発の特徴と現状分特性を持つ。これを加水分解、またはエステル変換する

化粧品原料油脂としてのパーム油・パーム核油の本格的ことで、脂肪酸アルコール、脂肪酸が得られるが、これらな登場はごく最近である。1990 年に発行された香粧品科はオレオケミカルとして非食用の用途に用いられる。ここ

学のテキストには、マイナーな植物油脂まで含めて 21 種

Fig. 2

Versatility of Palm Oil & Palm Kernel Oil in Food and Non Food Applications− 193 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Table 1

Export Volume & Value of Palm - Based Finished Products: 2010, 15 & 18

類の油脂の特性が解説されているが、驚くべきことに、パの興味を引きつけていった。そのためにマレーシアの政府、ーム油、パーム核油はそこで取り上げられていない 。パ研究者、業界関係者の払った努力は甚大であった。ここでーム油の本格的な商業生産が開始されたのは僅か半世紀前はこれを、「PORIM モデル」と名付けよう。PORIM（Palmの 1970 年代に入ってからであり、当時はフライ油、ショ

Oil Research Institute of Malaysia）とは、1979 年に設立

ートニングなどの食用油向けの需要が中心であった。パー

されたパーム油関連の研究開発に特化したマレーシア政府

ム油の生産が拡大し、より多角的な販路拡大が模索され始系の研究機関である（2000 年に、MPOB に改組）
。以下で、めたのは 1980 年代になってからである。その頃から、オそのモデルの構造を説明する。

7）

レオケミカル部門の高付加価値化が模索され始めたのだ

PORIM モデルは、悪く言えばずる賢い。油脂間に化学が、タイミング良く、オイルショックによって価格の高騰

的代替性があることを頼みに、安価で潤沢なパーム油を売したペトロケミカルの代替として、さらには環境問題へのり込み、他の油脂に代替する形で利用を広げていくという関心の高まりを背景として、オレオケミカルへの関心が世モデルである。それを示す典型的な例と言えるものが石鹸

界的に高まっていた時期と符合する。このような経緯の中である。石鹸は、油脂とアルカリを混合して製造するのがで、オレオケミカル部門の中でも、高付加価値化が期待で一般的であるが、かつてこれには主に牛脂が使われてききる化粧品原料油脂としての利用拡大の可能性が模索された。だが、牛脂は安定供給の面で不安を抱えており、そこ始めた。

にパーム油の参入する余地があった。パーム油が石鹸の製

３．２．
１．パーム油の有用性認識を浸透させた PORIM モ

造に有用な原材料油脂であることを示すため、PORIM はデル

地道な研究開発を続け、積極的にその成果を公表していっパーム油は歴史の浅い植物油脂だが、前節で見たように、た。PORIM の技術者は、パーム油利用の可能性のある世

現在、世界で最も生産量・消費量が多い植物油脂となって界中のユーザー企業に足繁く通ってパーム油の有用性を訴いる。高い土地生産性と豊富かつ安定した供給がパーム油

え、何か不調があればそれを研究所に持ち帰って製品の改の国際競争力の源泉である。これが植物油脂利用のユーザ

良につなげた。P&G や Unilever など、先進的な世界的大ー企業に重宝がられ、大豆油など伝統的な他の植物油脂に企業との共同研究も積極的に推進した。パーム油の利用拡

徐々に代替する形で、着実に利用が拡大していった。

大は、このような地道な基礎研究と積極的なマーケティン

しかしながら、パーム油の利用拡大が順風満帆に進んでグ活動の結合の賜物である 8）。食用油、菓子素材、マーガ

いった訳ではない。他の油脂には利用実績があり、新参者

リン、チョコレート原料、バイオ燃料、洗剤など、油脂をのパーム油がそれに食い込んでいくには、それを凌駕する利用するあらゆる製品において、石鹸のケースと同様の試ほどに有用でコストパフォーマンスの優れた原材料であるみが続けられた。新興国がこのような主体的な努力によりことをユーザー企業に認識してもらう必要があった。マレ

海外市場を開拓していった例はマレーシアのパーム産業固

ーシア・パーム油の場合、供給者側が、科学的根拠を提有の試みであり、PORIM モデルとして注目すべきもので示しながらパーム油の魅力を積極的に喧伝し、ユーザー側ある。

− 194 −

化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題

３．
２．２．PORIM モデルの中の Cosmetic Application

れ、最近では健康食品としての利用が期待されている 12）。

化粧品原料の中でも、油脂およびその誘導体は、あらゆ

PORIM および MPOB では、機能性化粧品としてのトコトる化粧品の構成成分として広く用いられており、後発のパリエノールの効能を検証している。その効果は多岐にわたーム油にも参入の余地はあるはずである。この理論上の可り、日焼け止め、脱毛予防、発毛促進の効果が確かめられ能性を現実化させていくことが、PORIM モデルの成否をにている 13）。

ぎる。化粧品用途の需要拡大の応用は、主に 2 つの方向性

このように、PORIM から MPOB へと続く様々な研究開で進められた。第一は、精製過程で生まれる副産物の化粧発から、化粧品原料としてのパーム油の技術的利用可能性品原料としての有効利用の模索、第二は、パーム油に特徴的が模索されてきた。それを一覧にしたものが、Table 2 で

9）な成分の化粧品原料としての応用可能性の模索、である 。
前者に関連して、C 8 -C 14 源のパーム核油はオレオケ
ミカルの原料となるが、ここから C 12 ～ C 14 が抽出されある 13）。

４．考察：パーム油の化粧品原料としての課題と展望て界面活性剤の原料が作られる。ところが Fig. 3 にあるよパーム油産業バリューチェーンが、今後、一層の拡充、

うに、オレオケミカルの 7 割は需要が旺盛な界面活性剤に

高付加価値化を進めていくには、化粧品セグメントの発展

使われており 10）、その生産に比例して、C 16 , C 18 およびが不可欠である。以上で概観したように、これに対するマC 18 : 1 などの副産物が排出されることになる。PORIM でレーシアの取り組みは PORIM モデルの延長としてシステ

は、その副産物から C 8 ～ C 10 を取り除き、純度の高い

マティックかつ積極的であり、一定程度の成果を上げてき

DHSA（9 , 10 -dihydroxystearic acid）に転換する技術を開ている。しかしながら、化粧品セグメントへの期待という発した。これは、安定的で極性のある油相成分であり、顔観点では、いくつかの課題が残されている。

料のコーティングに使った場合塗りやすく、油性感を抑え、第一に、化粧品原料として消費される絶対量が他の用途、肌とも親和するという特性を持っている。PORIM では口

例えば燃料や食用用途に比較して圧倒的に少ない。したが紅やマスカラへの応用で特許を取っている。パーム核油のって、ある程度の高付加価値化が期待できるとしても、化精製過程で副産物として生み出されるオレイン酸の有効利粧品用途の重要性はパーム油バリューチェーン全体の中で用を目指す試みである。

は相対的に低い。もちろんこれは、化粧品原料のような高後者に関しては、パーム油に含まれる微量成分のトコフ級素材には構造的な問題である。その克服には、更なる高ェノールおよびトコトリエノールの有効活用が考えられて付加価値化で需要量の不足を補うような、より革新的な研いる。Fig. 4 で明らかなように

11）、トコトリエノールは他

究開発の成果が望まれる。

の油脂に殆ど含まれない成分であり、これの有効利用はパ

第二に、より根本的な問題として、マレーシア・パームーム油の優位性を決定付ける。トコトリエノールは、強力油産業が飽くまで原料サプライヤーの地位に甘んじているな抗酸化作用を持つことからスーパー・ビタミンEとも呼ば点が指摘できる。化粧品原料を供給することには熱心であFig. 3 The Final Distribution of Oleochemical
Uses（2004）

Fig. 4− 195 −

Vitamin E Content in Vegetable Oils

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Table 2

Cosmetic and Personal Care Ingredients and Their Functions− 196 −

化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題

Table 2

Cosmetic and Personal Care Ingredients and Their Functions（Continued）っても、それを最終製品にまで加工し、より高い付加価値

イスラム圏と西欧圏を結ぶ結節点として重要な役割を果たを付けて高級化粧品として高価格で販売できるブランドしている。今後、イスラム圏では、人口と所得の増加によ力のあるマレーシア企業が全く育っていない。この状況がり化粧品関連の需要急増が見込まれている。非イスラム圏

続けば、化粧品関連から得られる付加価値には限界がある。

の企業がこの需要を取り込むには、イスラム圏とのタイア

ブランド力ある企業の育成は、製造技術力に加えてマーケ

ップが不可欠であり、マレーシアがその筆頭候補になるでティング戦略などの総合的な力量が問われるのだが、新あろう。マレーシア・パーム油産業にとっての化粧品産業

興国マレーシアにこれは荷が重い

14）。この問題は、菓子、洗剤など他のパーム油産業下流部門でも共通に観察されては、イスラム経済圏にその販路を拡大できる重要な役割が期待されている。

いる。MPOB は技術面での研究開発に特化した組織であ以上のように、マレーシア・パーム油産業における化粧

り、PORIM モデルのある種の限界がここに観察される。

品セグメントの位置付けは、いくつかの課題を抱えつつも、

しかしながら、この限界の克服は不可能ではない。現実的な戦略としては、外資との連携が考えられる。マレーシ

技術的、社会文化的に大きな可能性に満ちており、有望な分野と言える。

ア単独で競争力ある化粧品メーカーを創出することは困難であっても、提携あるいは合弁形態で外資を呼び込んでそのノウハウを活用し、例えば新規のブランドを立ち上げて国際展開をはかることは可能である。この点に関連して、（文

献）1） フレグランスジャーナル臨時増刊 Vol.20『化粧品用油性原料－その開発と応用』

パーム油由来の原材料生産地という優位性以外に、マレー

2） PEMANDU（2010）ECONOMIC TRANSFORMATION

シアはある種のアドバンテージを有している点を忘れては

PROGRAMME. Prime Miniserʼs Department, Malaysian

ならない。それは、イスラム圏へのゲートウェイとしてのマレーシアの国際的地位である。世界に広く認められたハ
ラル認証をはじめ、世界の主要金融機関がクアラルンプー
ルにオフィスを置くイスラム金融機能など、マレーシアは

Government3） MPOB（2016）FACT SHEETS : MALAYSIAN PALM OIL.
Kelana Jaya and Kajang, Selangor
4） 寺坂道夫、田原秀雄、安倍裕（2007）「植物性化粧品− 197 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

用油性原料の探索、生産、精製の現状」、上記臨時増刊号、CHARACTERIZATION AND USES. AOCS Monographpp.24-31.

Series on Oilseeds 5 , AOCS Press, Urbana, IL. USA.

5） 加藤秋男（1990）『パーム油・パーム核油の利用』幸書11）Choo, Yuen May, Mei Han Nga, Ah Ngan Maa et al.（2005）"Application of Supercritical Fluid Chromatography in房6） MPOB, MALAYSIAN OIL PALM STATISTICS（各the Quantitative Analysis of Minor Components（carotenes,vitamin E, sterols, and squalene）from Palm年度版）
，Bandar Baru Bangi, Kajang
7） 田村健夫・廣田博（1990）『香粧品科学 －理論と実際

Oil" Lipids, 40（4），429 - 432 .
12）湊貞正（2001）「トコトリエノールの機能と健康食品へ－（第 2 版）』
フレグランスジャーナル社
8） PORIM（1995）PORIM ʼS STRATEGIC PLAN. Bandarの応用」Fragrance Journal, 29（2），43 - 48 .
13）Ismai, Roshah, Ismail Ab. Raman and Hazimah Abu

Baru Bangi, Kajang
9） Ahmad, Salmiah and Luigi Rigano（2004）"A Cosmetic

Hassan（eds.）（2 0 1 1）PALM SECRETS FOR BEAUTY.

Ingredient from Palm Kernel Oil" Oils & Fats

MPOB, Ministry of Plantation Industry andInternational, March 2004, 30-31.

Commodities, Malaysia

10）Yeong, Shoot Kian, Zainab Idris and Hazimah Abu

14）小井川広志（2015）「マレーシア・パーム油産業の発展

Hassan（2 0 1 2）"Palm Oleochemicals in Non-Foodと資源利用型キャッチアップ工業化」アジア経済 56（2），Applications." Ch. 20 in Lai, Oi Ming, Chin-Ping Tan and

41 - 71。特に、p. 63 にその言及がある。

Casimir C. Akoh（eds.）PALM OIL: PRODUCTION,− 198 −

懐かしい香りを用いた回想法の効果検証および脳メカニズム解明
東北大学加齢医学研究所

大場

健太郎

Recently, odor-evoked nostalgia gets a lot of attention from the field of both social psychology and psychological therapy,
since it has positive psychological functions such as mood increment. Thus far, however, the precise neural mechanisms have notbeen demonstrated. We hypothesized that 1 ) retrieval of nostalgic memories have rewarding value and is associated with ventral
striatum activity, 2 ) nostalgic odor has physiological effect and is associated with hypothalamus activity, and 3 ) the combinationof nostalgic memory and odor has synergistic effect and is represented in the hippocampus as the interaction. In the current study,
we addressed these hypotheses using functional magnetic resonance imaging (fMRI). Sixteen right-handed healthy older adults(M = 68 . 8 , SD = 3 . 95 ) who have normal olfaction participated in this study. Before the fMRI experiment, participants selected
two nostalgic and two familiar odors and were interviewed by the experimenter about the autobiographical memory relevant toeach odor. There were two factors (memory and odor) with two levels (nostalgic and familiar) in the experimental task. During
fMRI participants were asked to remember each memory cued by short “title” which was created based on the memory interview
and rate the vividness and pleasantness of the memory remembered. In the behavioral level, there was significant memory*odor
interaction in both vividness and pleasantness. In the neural level, as expected, we found significant 1 ) main effect of memory on
the left ventral striatum, 2 ) main effect of odor on the hypothalamus, and 3 ) interaction on the left hippocampus. These results may
suggest the neural mechanism relevant to the role of nostalgic odor on the reminiscence activities.

１．緒る画像）を用いて懐かしい記憶回想の脳メカニズム研究を言行い、記憶想起と報酬処理に関わる脳領域の協調的活動を

近年、社会心理学の分野において懐かしい記憶の回想が明らかにした 6）。そこで本研究では、嗅覚以外の感覚モダもたらす心理的機能に関する研究が精力的に行われ、懐か

リティを用いた従来の回想に「懐かしい香り」を取り入れる

しい記憶の回想は気分を改善させ、自尊心、社会的つながことが相乗効果を生み出すかどうか、心理学的・脳科学的りの知覚、楽観性、人生への意味付けを高める等の適応的に検証することを目的とした。

1）

心理効果があることが明らかにされてきた 。実際懐かし

我々は回想と香りの組み合わせによる効果に関して、以さは、認知症の周辺症状（抑うつや不安）の低減、または認下の仮説を立てた。1）懐かしい記憶の想起は報酬的価値を知症予防のためアクティビティとして医療機関や地域で広持つため 6）、香りとの組み合わせによらず腹側線条体の活く行われている、回想法という心理療法の重要な要素とさ動が高まる、2）懐かしい香りは様々な保護的な生理作用を2）

れている 。回想法の現場では、多くの場合昔使っていた持つことが報告されていることから 7）、記憶の想起意図に道具や写真、音楽等の視聴覚刺激を手がかりとして過去を関わらず自律神経系や神経内分泌の中枢である視床下部の想起する方法が用いられている 3）。

活動が高まる、3）想起時に懐かしい香りが伴うことにより一方、香りによって引き起こされる懐かしさ体験は特に記憶の検索 8）が促進され（相乗効果）、これを反映した海馬“プルースト効果” と呼ばれ、これまで文学や記憶心理学のの活動が認められる。本研究では、主観評価および機能的分野では注目されてきたが、近年その関心は精神医学や健MRI を用いた脳活動計測の両側面からこれらの仮説の検康科学にも広がりを見せている 4）。香りは音楽やその他の証を行った。

方法よりも約 2 倍懐かしさ体験を引き起こすことも報告さ２．方れている 5）。これらの知見からも、回想法に懐かしい香りを取り入れることは相乗効果を生み出すと考えられるが、

法

２．
１．被験者

その効果および背景メカニズムを多角的に検証した研究は

被 験 者 は 健 康 な 地 域 在 住 の 高 齢 者 16 名（M= 68 . 8 ,ない。我々は先行研究において、視覚刺激（過去に関連す

SD= 3 . 95 , 女性 12 名）であった。以下に該当する方は MRI
撮像の安全面および実験課題への影響を考慮しリクルートから除外した（体内・体表の金属、開頭、開胸、開腹手術

Investigation of the neural mechanismof reminiscence using nostalgic odor
Kentaro Oba
Institute of Development, Aging andCancer, Tohoku Universityの経験、糖尿病、慢性鼻炎、呼吸器疾患、精神・神経疾患、閉所・暗所恐怖症、日常的にタバコを吸う、香りの専門家（アロマセラピスト、ソムリエ等））。嗅覚同定能力の測定（Open Essence ; 富士フイルム 和光純薬株式会社）の結果、全員がカットオフ値（7 / 12 点）以上であった（M= 9 . 44 ,− 199 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

SD= 0 . 81）。被験者には実験参加に先立ち書面および口頭２．５．回想課題・機能的 MRI

で十分な説明を行い、書面で同意の確認を行った。本研究

被験者は、MRI の中で事前インタビューの内容をもとは、東北大学医学系研究科倫理委員会より承認を受けて実に作成した出来事の「タイトル」を手がかりとして自伝的記施した。

憶を思い出す回想課題を行った。課題は、記憶（懐かしい，日常）×香り（懐かしい，日常）の二要因計画で、以下の 4

２．２．リクルート、香り試料の準備条件を設定した。

香りによって自伝的記憶を思い出す人の割合は低い（169）①懐かしい記憶×懐かしい香り％ほど）という報告があることから 、香りと記憶に関す②懐かしい記憶×日常香りるアンケート送付、電話インタビューの 2 段階で被験者の③日常記憶×懐かしい香り

スクリーニングと懐かしい香りの事前聴取を行った。これ④日常記憶×日常香りらの手続きの結果に基づき、被験者ごとに懐かしい香り試

被験者は上記いずれかの条件でタイトルを手がかりとし料（精油や香水）を購入した。また、比較対象となる日常的た回想を 18 秒間行い、その後思い出された記憶の鮮明度な香りとして、身近な環境にある果実や植物の精油を中心と思い出した現在の心地よさを 4 段階（1-4）で評価した（各に事前に香り試料を準備した。

4 秒）。試行間には 15 秒間の休憩をはさみ、その間は空気を流してマスク内に残存する香りをウォッシュアウトした。

２．３．記憶に関するインタビュー

回想課題は PsychoPy（University of Nottingham）で作成

機能的 MRI 実験に先立ち、懐かしい香り／日常的に身した。

の回りにある香りの選別と思い出される記憶の詳細を把握

脳活動の時系列データは 3 テスラ MRI（Philips Achieva）

するために個別にインタビューを行った。リクルートの手を用いて取得した。側頭葉内側前部や眼窩前頭皮質等嗅続きで事前に個別に選別した香り試料および実験者があら覚関連領域周辺は磁化率アーチファクトの影響を受けやかじめ用意しておいた試料を嗅いでもらい、懐かしい香

すいため、その影響を低減させるために dual echo シーク

りを 2 種類選んでもらった。そして、思い出される記憶にエンスを用いて脳機能画像の撮像を行った（TR= 2 , 000 ms,

関連する場所、人物、状況等について詳細を語ってもらい、

TE= 13 / 35 ms）。

その内容をもとにその出来事を表す「タイトル」を作成し取得した脳画像データは、被験者ごとに時系列での脳の位た（例 ,「祖父の木工所でおがくず遊び」）。このタイトルは、

置補正、スライスタイミング補正、MNI（Montreal Neurological

機能的 MRI 実験において記憶を回想する手がかりとして

Institute）標準脳座標空間への変換、スムージング処理等の用いた。また、コントロール刺激として、懐かしくはない

前処理を行った後、脳画像のボクセルごとに各条件の回想が馴染み深く直近 1 年の出来事と関連する香りを 2 種選別

時間と血行動態関数（刺激に対する脳血流の応答）を畳み込し、その出来事についても同様に詳細を伺い「タイトル」をみ積分した関数を回帰子、前処理で算出した頭部の動きを作成した。

共変量とした重回帰分析を行い、各回想条件における脳活動の推定値を算出した。その後、全被験者のデータを用い

２．４．香り提示て 1）懐かしい記憶の主効果、2）懐かしい香りの主効果、3）

MRI 対応の香り提示装置 Olfactometer（Neuro Device）を懐かしい記憶と香りの交互作用の検討を行った。本研究で使用して MRI 内の被験者に香りを提示した。Olfactometerは、各条件における効果の仮説に基づき、関心領域を対象

は、コンプレッサーから送り出した空気を香り試料の入とした解析を行った。1）では先行研究 6）で懐かしい記憶のった試験管内に送り込むことにより、最大 4 種類の香りと回想で活動上昇が示されている腹側線条体 10）、2）では懐空気（ウォッシュアウト用）
を送ることができる装置である。

かしい香りが持つ自律神経系への作用を検討するために視本研究では、試験管に各香り試料を染み込ませたニオイ紙

床下部（Talairach Atlas）、3）では香りによる回想の促進を（第一薬品産業株式会社）を入れた。香りの強さはニオイ紙

検 討 す る た め に 海 馬（Automated Anatomical Labeling;に染み込ませる試料の量を変えることで、楽に感知できるAAL） を 関 心 領 域 と し た。 以 上 の 脳 画 像 の 分 析 に は

匂い（1 無臭〜 4 楽に感知できる匂い〜 7 強烈な匂い , 7 段

SPM 1 2（Statistical Parametric Mapping; Wellcome階評価）になるように調整した。4 種の香りと空気を送る

Center for Human Neuroimaging, UCL）を用いた。

チューブは独立しており、計 5 本のチューブの先端を酸素

３．結マスク（㈱メディカルセンス）につなぎ、被験者はそれを鼻と口が覆われるように装着した。苦しさや違和感がないことを事前に確認した。

果

３．
１．自伝的記憶を回想させる香り
香りを嗅ぎながら過去を回想してもらう事前インタビュ
ーの結果、選別された懐かしい香り、日常の香りを表 1 に− 200 −

懐かしい香りを用いた回想法の効果検証および脳メカニズム解明示した。懐かしい香りとして上位に選ばれたのはリーフア

かしい：M= 6 . 19 , SD= 0 . 77 , 日常：M= 3 . 09 , SD= 0 . 71 , （t 15）

ルコール（青葉アルコール）やスギ（葉部 , 枝葉部）等の草や= 13 . 5 ; p < 0 . 001）。

樹木の香りであり、関連する懐かしい記憶としては幼少期に草原で遊んだこと、刈った草を干して家畜の餌にしたこ

３．２．回想による心理効果と、杉林から枝葉を集めてきて冬場に燃料にしたこと等が回想課題における「記憶の鮮明度」と「心地よさ」
を条件間挙げられた。香水も懐かしい香りとして選ばれ、関連するで比較した結果、どちらの評価においても記憶と香りそれ記憶としてはその香水を使っていた人物との思い出が挙げぞれの主効果は認められなかったが、交互作用が有意であっられた。日常に結びついた香りとしては、ユズやグレープ

た（F（1 , 15）= 8 . 81；p < 0 . 01 , F（1 , 15）= 12 . 1；p < 0 . 01）。

フルーツ等の柑橘系、ラベンダー等の植物等が選ばれ、関また、これらの心理指標においては、条件①と④に有意差連する記憶としては日常の料理場面やガーデニング場面等は認められなかった（図 1）。

が挙げられた。懐かしい香りと日常的な香りの印象評価（7段階）の結果、「好き」（懐かしい：M= 5 . 25 , SD = 0 . 86 , 日常：

３．３．回想課題中の脳活動

M= 5 . 06 , SD= 1 . 15 , （t 15）= 0 . 49 , p= 0 . 32）と「なじみ深さ」

本研究で関心領域とした各脳領域（腹側線条体 , 視床下（懐かしい：M= 5 . 47 , SD= 0 . 78 , 日常：M= 5 . 16 , SD= 0 . 99 ,部 , 海馬）を図 2 に示した。まず、懐かしい記憶の想起は

t（15）= 0 . 37 , p= 0 . 36）では有意差は認められなかったが、香りとの組み合わせによらず報酬的価値を持つという仮説「懐かしさ」は懐かしい香りで有意に高い評定であった（懐のもと、腹側線条体を関心領域として懐かしい記憶の主効

表1

使用した香り一覧

図1 回想課題の各条件における「記憶の鮮明度」と「心地よさ」の評定値①懐かしい記憶×懐かしい香り, ②懐かしい記憶×日常香り, ③日常記憶×懐かしい香り, ④日常 記 憶×日常 香り（* p < 0 . 0 5 , * * p < 0 . 0 1 B o nfe rro ni
corrected, エラーバーは標準誤差を示す）− 201 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図2 脳の関心領域
左腹側線条体（紫）で懐かしい記憶回想の主効果、視床下部（赤）で懐かしい香りの主効果、左海馬（青）で記憶と香りの交互作用が認められた（pFWE < 0.05, small volume correction）。右腹側線条体（黄）, 右海馬（緑）

果（（① + ②）-（③ + ④））を検討した結果、左腹側線条体にる検討が必要である。

有意な関連性が認められた（pFWE < 0 . 05 , small volume

脳活動解析においては、予想通り腹側線条体で懐かしい

correction, peak MNI 座標［- 12 , 12 , 2］）
。次に、懐かし

記憶想起の主効果が認められた。これは、懐かしい記憶のい記憶の想起意図に関わらず懐かしい香りは生理作用を想起は報酬的価値を持つという先行研究 6）の結果を再現す

高めるという仮説のもと、視床下部で懐かしい香りの主る結果である。視床下部における懐かしい香りの主効果は、効果（（① + ③）-（② + ④））を検討した結果、視床下部に先行研究 7）で示されてきた懐かしい香りの生理作用を中枢

有意な関連性が認められた（pFWE < 0 . 05 , small volume

神経レベルで裏付ける結果である。海馬における記憶と香correction, peak MNI 座標［4 , - 4 , - 10］）。さらに、想起時

りの交互作用は香りによって記憶の検索が促進している可に懐かしい香りが伴うことにより記憶の検索が促進される能性を示唆している。しかしながら、海馬単独で記憶の想との仮説のもと、海馬を関心領域として記憶と香りの交起プロセスが実現しているわけではないため、この知見を互作用（（① - ②）-（③ - ④））を検討した結果、左海馬に有手がかりに今後海馬と他の領域との機能的な関連性等を検意な交互作用が認められた（pFWE < 0 . 05 , small volume

討していく必要がある。

correction, peak MNI 座標［- 14 , - 2 , - 14］
）
。

４．考

事前インタビューにおいて被験者に選別された懐かしい
香りは、集団を対象とした回想における香りの効果研究 12）

察と同様の香り（みかん等）がある一方、本研究の被験者特異

本研究では、思い出す記憶と提示する香りの組み合わせ的と思われる香り（アオモリトドマツ；学生時代の登山とを操作することにより、香りによる回想の促進効果を主観の関連、香水；かつて身近にいた特定の個人との関連）もおよび脳活動から検討した。

認められた。このことは、回想に香りを取り入れる際、年回想による心理効果（鮮明度 , 心地よさ）に関しては、④代で共通して懐かしさを喚起させうる香りが確かに存在す

日常記憶×日常香り条件でも評定値が高いという結果が得ることを示唆する一方で、より特異的な思い出と結びついられ、予想していた①懐かしい記憶×懐かしい香り条件特た香りを聴取することでより個別化した深い回想が可能に異的な相乗効果による交互作用のパターンとは異なるもの

なる可能性も示唆している。集団で回想を行う際は前者が、であった。自伝的記憶の想起自体に気分調整効果があるこ

個別に回想（ライフレビュー）を行う際には後者が適していとから 11）、本研究でも日常記憶の回想が促進されることると考えられる。

でこのような気分調整機能が強く発揮された可能性が考え

本研究では回想における懐かしい香りの効果の神経メカられる。一方、記憶と香りが不一致となる条件②③では一

ニズム解明に取り組み、懐かしい記憶の報酬的価値、懐か致条件に比べ評定値が有意に低いという結果が得られた

しい香りの生理的作用、香りによる記憶検索の促進効果のため、これらの条件では相乗効果は認められなかったと考神経基盤の一端が解明された。今回得られた知見をベースえられる。これらの結果は、回想を行う際に記憶と一致すに、香りと記憶想起の神経メカニズムをより詳細に明らかる香りを用いることの有効性を示唆しているが、懐かしいにすることで、香りを用いた回想法に対する科学的根拠の記憶の回想による心理効果は多岐にわたるため 1）（自尊心、提供につなげていきたい。

楽観性の向上など）、今回用いた二つの指標以外に関してはどのような効果の違いが見られるかについては、さらな− 202 −

懐かしい香りを用いた回想法の効果検証および脳メカニズム解明（引用文献）

Lett. 2011; 2（6）: 774 - 780.

1） Sedikides C, Wildschut T. Past Forward: Nostalgia

8） Svoboda E, McKinnon MC, Levine B. The functional

as a Motivational Force. Trends Cogn Sci. 2016 May;

neuroanatomy of autobiographical memory: a meta-20（5）: 319-321.

analysis. Neuropsychologia. 2006; 44（12）: 2189-208. doi:

2） Yamagami T, Oosawa M, Ito S, Yamaguchi H. Effectof activity reminiscence therapy as brain-activating
rehabilitation for elderly people with and without

10. 1016/j. neuropsychologia. 2006. 05. 023. Epub 2006
Jun 27. PMID : 16806314 ; PMCID : PMC1995661.
9） Willander J, Larsson M. Smell your way back tochildhood: autobiographical odor memory. Psychon

dementia. Psychogeriatrics. 2007, 7: 69-75.
3） Woods B, O'Philbin L, Farrell EM, Spector AE, Orrell
M. Reminiscence therapy for dementia. Cochrane

Bull Rev. 2006 ; 13（2）:240-244.
10）Diekhof EK, Kaps L, Falkai P, Gruber O. The
role of the human ventral striatum and the medial

Database Syst Rev. 2018 Mar 1; 3: CD001120.
4） Herz RS. The Role of Odor-Evoked Memory inorbitofrontal cortex in the representation of reward

Psychological and Physiological Health. Brain Sci. 2016

magnitude - an activation likelihood estimation meta-

Jul 19; 6
（3）
: 22.

analysis of neuroimaging studies of passive reward5） Reid CA, Green JD, Wildschut T, Sedikides C. Scent-expectancy and outcome processing. Neuropsychologia.
2012; 50（7）: 1252-1266.

evoked nostalgia. Memory. 2015; 23（2）:157-66.
6） Oba K, Noriuchi M, Atomi T, Moriguchi Y, Kikuchi11）Josephson B. Mood Regulation and Memory:

Y. Memory and reward systems coproduce 'nostalgic'

Repairing Sad Moods with Happy Memories, Cognition

experiences in the brain. Soc Cogn Affect Neurosci.

and Emotion, 1996 , 10 : 4 , 437 - 44412）有園博子，佐藤親次，森田展彰他 ( 1998 ): 高齢者に2016 Jul; 11（7）: 1069-77.
7） Matsunaga M, Isowa T, Yamakawa K, et al.

対するニオイを用いた回想療法の試み . 臨床精神医学，

Psychological and physiological responses to odorevoked autobiographic memory. Neuro Endocrinol− 203 −

27 : 63 - 75 .

生物・化学と経営の異分野融合による若年層男性に求められる化粧品に関する研究
宇部工業高等専門学校物質工学科

廣原

志 保、根 岸可奈子

The world cosmetics market is increasing year by year, and overseas there is also an increase in men's cosmetics. However,
the men's cosmetics market has been sluggish in Japan. If this problem could be solved, the cosmetics industry in Japan would
expand dramatically.
In this study, we take advantage of the characteristics of our students (the number of male students is large, there are students
of a wide range of ages from 15 to 22 years old) and the faculty in different fields (Department of Chemical and BiologicalEngineerin and Department of Business Administration), He worked to identify problems with the spread of male cosmetics andto develop cosmetics required by young men. In this paper, a prototype hand cream was synthesized using oranges produced in
Yamaguchi. We conducted a questionnaire evaluation using this prototype hand cream and two types of commercial products. The
evaluation is conducted in the form of a questionnaire with five-point scale, mainly for those aged 15 to under 20 years.

１．緒

そこで本研究は、上記の本校の特徴に加え物質工学科、

言

経営情報学科の教員すなわち生物・化学、経営分野という世界の化粧品市場は、年々増加傾向に見あり、海外で
1）

は男性用化粧品も好調に伸びている 。しかし我が国では、
2）

男性用化粧品市場は海外と異なり伸び悩んでいる 。この

異分野の専門教員および学生達で協力しながら、我が国の男性化粧品普及のための問題点の抽出および日本人男性が求める化粧品の開発を行った。

男性化粧品普及の妨げになっている原因を見出し、その問２．方題を解決することができれば、我が国の化粧品産業は飛躍的に拡大すると考えられる。

法

本実験では山口県美祢産のゆずおよび山口県周防産のみ

化粧品市場は、企業によって相違点はあるが、一般的に

かんの果皮を使用しみかんオイルを抽出した。抽出したこはスキンケア化粧品、メイクアップ化粧品、ヘアケア化粧

れらの果皮オイルを用い試作品ハンドクリームを調製した。

品およびフレグランス化粧品が主要な製品カテゴリーとし

これら試作品ハンドクリームと、インターネットで人気のて挙げられ、男女とも変わらない状況である。

高い市販ハンドクリーク 2 種類を用い、その使用感についしかしながら男性用化粧品は、女性用化粧品とは異なり、てアンケート調査を実施した。

あらゆる年齢層ですべての上述のカテゴリーを網羅しているとは言えず 3）、また男女あるいは国により化粧に対する
4）

２．
１．果皮オイルの抽出法の最適化

意識も異なっている 。我が国の男性化粧品市場では、依果皮オイルは、細かくちぎったゆずまたはみかんの皮を然としてメイクアップ化粧品には一定のハードルがあり、まず冷凍後、蒸留水とこの冷凍果皮（約 1：2、圧搾法は 2：1）

この分野を普及させるのは困難である。

を家庭用ミキサーで粉砕し粉砕液を得た。これらの粉砕液

そこで本研究では、スキンケアのなかでも年齢層を問わを、①有機溶剤（ジエチルエーテル）による抽出法 5）、②圧

ず男性も気軽に使えるハンドクリームに焦点を当て、その搾法および③水蒸気蒸留法 5）の 3 通りの抽出法を検討し果開発を行った。

皮オイルを得た。

本校 宇部工業高等専門学校は工学系の高等教育機関であり、男子学生が多くまた 15 歳から 22 歳までと幅広い年

２．２．果皮オイル入りハンドクリームの調製

齢層の学生が在籍している。また本校は、機械、静電気、

2 . 1 . で得られた果皮オイルを用い、ハンドクリームの制御、物質および経営分野の幅広い分野の学科が存在し、調製を行い、最適な果皮オイル入りハンドクリームの成分

その専門教員が在籍している。

比の条件検討を行った。
ハンドクリームは、Cafe de Savon より購入したみつろう（晒／ホワイト）と精製シアバター、無印良品より購入しStudy of the young group menʼs cosmetics
by the different field fusion
Shiho Hirohara
Department of Chemical and BiologicalEng i neering, Nat iona l I nst itute ofTechnology, Ube College

たピュアオイル JO（ホホバオイル）、および今回水蒸気蒸
留で抽出した果皮オイルを用いて調製した。
ハ ン ド ク リ ー ム の 試 薬 成 分 比 は、https://felice-kaori.
com/article/ 5555 を参考にし、表 1 の成分比を変えたハンドクリーム作製を検討した。

− 204 −

生物・化学と経営の異分野融合による若年層男性に求められる化粧品に関する研究

まず、みつろう、シアバターおよびホホバオイルをビーカーに入れ、家庭用電子レンジで全て溶解させた。
この溶解液を約 80 度に冷却した後、みかんオイルを加え混合した。混合後素早く、滅菌済プラツボ 5（11 mL, ケーエム化学㈱）に分注した。
ゆずハンドクリームは、ゆずオイル 0.5mLの量で表 1 run

表1

ハンドクリームの調製

シアバター
run みつろう
（g）
（g）
（a）
20
40
（b）
6
20
（c）
7
20
（d）
8
20

ホホバオイル
（mL）
40
40
40
40

みかんオイル
（mL）
0.8
0.8
0.8
0.8

（a）
の条件で調製した。
表2２．
３．アンケート調査
試作品および市販品 2 種類の合計 3 種類に対し、アンケート調査（9 項目）を実施した（表 2）。まず、表 1 run（a）で作製したゆずオイルを用いた試作品で評価を行った後、その結果を踏まえ成分比を改善し、みかんオイルを用いたハ
ンドクリームを用いて評価を行った。
ゆずオイルを用いた試作品に対するサンプル数は 87 名

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

アンケート項目

さらっとしている
脂っぽさが気になる
肌に馴染む
しっとりするヒビ・アカギレに効きそう
自分の肌に合う使ってみたいかたい
好きなにおい

表3
①
②
③
④
⑤

5段階指標

非常にそう思う
そう思う
どちらともいえない
そう思わない全くそう思わないで、そのうち 15 歳以上 22 歳未満が 42 . 4 ％、また無回答
および上記対象外が 57 . 6 ％で、男性 23 名、女性 59 名であった。
一方、みかんオイルを使用した試作品に対するサンプル数は 76 名であった。このアンケートの対象年齢はすべて
15 歳以上 22 未満であった。内訳は、男性 50 名、女性 25
名および無回答 1 名であった。このみかんオイルを用いた試作品のアンケートについては、本研究テーマ 男性用化
粧品の開発観点より、男性のデータのみを使用した。
全てのアンケートは、以下の指標について５段階評価で
行った
（表 3）
。

３．結果および考察

図1 圧搾法で得たみかんオイル（a）および水蒸気蒸留で得たみかんオイル（b）

３．
１．果皮オイルの抽出法の最適化
本実験では、山口県美祢産のゆずおよび山口県周防産のみかんの冷凍果皮を蒸留水とともに家庭用ミキサーで粉砕した溶液を用いて、3 種類の抽出法（①有機溶剤による抽出法 3）、②圧搾法および③水蒸気蒸留法 3））を検討した。
抽出の結果、②の圧搾法は夾雑物が図 1 の写真に示すよ
うに多く、その後に水蒸気蒸留を行い果皮オイルの精製が必要であった。
一方、①、③の方法は、純粋な果皮オイル（図 1）を抽出することができ、特に③の方が多く果皮オイルを抽出することができた。

３．
２．果皮オイル入りハンドクリームの調製

図2 ハンドクリームの作成風景（a）および作成されたハンドクリーム（b）

いとべたべた感があり、男子学生には不評であった。

表 1 の条件に従い、みつろう、シアバターの量を変えた

これらの検討より、ハンドクリームの調製条件として（b）のみつろう（g）、シアバター（g）、ホホバオイル（mL）

４種類の条件でハンドクリームを作製した（図 2）。
みつろうの量を検討したところ、みつろうの量が多くな

およびみかんオイル（mL）の成分比割合は、表 1 run（b）

るに従い硬いクリームになり、（a）のみつろう 20 g の場合、の 6 g、20 g、40 mL、0 . 8 mL が良いことが分かった。また、容器から取り出すことが困難なほど硬いクリームであった。

ゆずオイルはみかんオイルよりも香りが強いため、0 . 6 mL

シアバターの量を検討したところ、シアバターの量が多以内の量で十分な香りを示した。

− 205 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020３．
３．アンケート調査

男女とも高評価であった。一方、試作品は市販品に比べてまず、表 1 run（a）
で作製したゆずオイルを用いた試作品

硬いと感じる回答が多く見られた。

と、インターネットで人気の高い市販ハンドクリーク２種

そこでこの試作品に対する評価を受け、表 1 に示すよう類を用い、その使用感についてアンケート調査を実施した。

に成分比を変化させ、果皮オイルは本実験で多く得られた結果を表 4 , 5 , 6 に示す。各項目について、最も回答がみかんオイルを用いた試作品ハンドクリームを用いてアン

集中した指標を見ると、ほとんど男女差がないことが分か

ケート調査を行った。このアンケートについては、本研究った。

テーマ 男性用化粧品の開発観点より、男性のデータのみ

試作品は否定的な回答は少なかったが、脂っぽさに欠けを使用した。

さらっとした感じという回答が多くみられた。また、アン結果を表 7 , 8 , 9 に示す。前述のゆずオイルを用いた試

ケート項目２の「脂っぽさが気になる」
については，市販品作品で問題となった市販品よりも硬いという点については、と比べ「非常にそう思う」「そう思う」
が低い結果となった。

表 1 run（b）の成分比組成

しかしながら、今後も使用したいという項目において今回作った試作品の方が市販品を上回ったことから、試作品
はおおむね好評価であった。またゆずオイルのにおいは、試作品（ゆずオイル）に対するアンケート結果（男女）アンケート項目

指標（％）
3
12.6
24.1
25.3
20.7
47.1
31.0
24.1
13.8
10.3

1
2
3
4
5
6
7
8
9

1
18.4
5.7
14.9
13.8
13.8
12.6
18.4
20.7
42.5

表6

2
27.6
33.3
48.3
55.2
43.7
27.6
32.2
21.8
14.9

指標（％）
3
19.5
26.4
26.4
21.8
39.1
47.1
41.4
21.8
47.1

4
40.2
27.6
13.8
8.0
8.0
17.2
19.5
41.4
27.6

また表 1 run（b）で作製した試作品は、項目 2「脂っぽさ」

表5

1
2
3
4
5
6
7
8
9

表7
5
2.3
2.3
1.1
0.0
0.0
0.0
2.3
2.3
5.7

1
8.0
6.9
5.7
12.6
6.9
5.7
2.3
10.3
2.3

2
27.6
33.3
48.3
55.2
43.7
27.6
32.2
21.8
14.9

指標（％）
3
19.5
26.4
26.4
21.8
39.1
47.1
41.4
21.8
47.1

4
40.2
27.6
13.8
8.0
8.0
17.2
19.5
41.4
27.6

1
6.9
3.4
8.0
11.5
17.2
2.3
3.4
5.7
6.9

1
2
3
4
5
6
7
8
9

1
14.0
12.0
14.0
16.0
10.0
14.0
10.0
0.0
34.0

表9
5
2.3
2.3
1.1
0.0
0.0
0.0
2.3
2.3
5.7

− 206 −

市販品Ａに対するアンケート結果（男女）
2
28.7
37.9
62.1
69.0
47.1
33.3
31.0
9.2
11.5

指標（％）
3
25.3
32.2
21.8
11.5
28.7
52.9
35.6
29.9
24.1

4
36.8
21.8
5.7
6.9
6.9
10.3
23.0
52.9
40.2

5
2 .3
4 .6
2 .3
0 .0
0 .0
0 .0
6 .9
2 .3
1 6 .1

試作品（みかんオイル）に対するアンケート結果（男女）

市販品Ａに対するアンケート結果（男）アンケート項目

アンケート項目

1
2
3
4
5
6
7
8
9

5
0.0
2.3
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1.1
0.0

市販品Ｂに対するアンケート結果（男女）

1
8.0
6.9
5.7
12.6
6.9
5.7
2.3
10.3
2.3

表8

4
18.4
47.1
2.3
5.7
3.4
0.0
0.0
18.4
0.0

品を用いることで問題点を改善することができた。

アンケート項目

アンケート項目

1
2
3
4
5
6
7
8
9

2
46.0
16.1
51.7
54.0
29.9
51.7
52.9
41.4
42.5

ホホバオイル 40 mL、みかんオイル 0 . 8 mL からなる試作

アンケート項目表4

みつろう 6 g、シアバター 20 g、

1
2
3
4
5
6
7
8
9

2
50.0
26.0
50.0
58.0
34.0
40.0
49.0
26.0
34.0

指標（％）
3
24.0
32.0
28.0
20.0
48.0
36.0
30.0
26.0
20.0

4
10.0
26.0
8.0
6.0
8.0
10.0
14.0
40.0
10.0

5
0 .0
4 .0
0 .0
0 .0
0 .0
0 .0
0 .0
8 .0
2 .0

市販品Ｂに対するアンケート結果（男）

1
18.0
8.0
14.0
24.0
22.0
18.0
14.0
6.0
2.0

2
36.0
34.0
54.0
52.0
28.0
36.0
36.0
16.0
22.0

指標（％）
3
26.0
18.0
28.0
16.0
44.0
26.0
26.0
22.0
58.0

4
20.0
36.0
4.0
8.0
6.0
24.0
24.0
50.0
14.0

5
0 .0
4 .0
0 .0
0 .0
0 .0
0 .0
0 .0
6 .0
4 .0

生物・化学と経営の異分野融合による若年層男性に求められる化粧品に関する研究については市販品よりも「非常にそう思う」という回答が増

今後は、ハンドクリームの成分を変更させよりよい男性

加した、においについては、ゆずオイルを用いた場合と同用ハンドクリームの開発を行うとともに、アンケートサン

様、みかんオイルでも市販品よりも高評価であった。

プル数を全学に拡大していく。

４．総

括

謝

辞

本研究では、スキンケアのなかでも年齢層に問わず男性

本研究は公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団

も気軽に使えるハンドクリームに焦点を当て、本校宇部工よりご援助いただき、実施いたしました。この場をお借り業高等専門学校の学生達の特色（男子学生が多い、幅広い

して、厚く御礼申し上げます。

年齢層、運動系クラブが多い）と異分野（経営情報学科、物質工学科）の専門教員という利点を生かし、男性化粧品の（引用文献）

普及への障害すなわち問題点の抽出や若年男性が求める化

1） 日本貿易振興機構 ,「ジェトロセンサー」（2014/02）．

粧品の性質や性状などを経営学の観点から分析し、試作品

2） 矢野経済研究所 ,『化粧品・マーケティング総監 2018年版』，2018.

ハンドクリームを作製した。
アンケートの結果、男女差はほぼ見られなかった。また、
表 1 run（b）の組成（みつろう 6 g、シアバター 20 g、ホホバ

3） 西岡敦子 ,「男性の化粧は受け入れられるのか―男性の化粧行動から―」，繊維製品消費科学，54（4），332-338

オイル 40 mL、みかんオイル 0 . 8 mL, ゆずオイル 0 . 6 mL）（2013）．

で作製した試作品が高評価を得た。

4） 村澤博人，大坊郁夫，趙鏞珍 ,「日本人と韓国人の化

また、みかんのにおいが高評価であったことから、冬場に多く食べられるみかん皮を再利用できることが分かった。
教育的な面からは学生達が積極的に、最適な果皮オイル抽出法やハンドクリームの最適な試薬組成の検討など、自ら粧観の国際比較研究

男女学生のアンケート調査から」，

コスメトロジー研究報告 , 13, 38-47（2005）．
5） 磯部稔 , et al., フィーザー／ウィリアムソン有機化学実
験書 原書 8 版 , 丸善出版株式会社 , 2000.

かんがえ改善活動に取り組む姿勢が見られた。

− 207 −

顔面神経麻痺患者に対するメーキャップ治療の有効性の検討
北海道大学大学院医学研究院耳鼻咽喉科・頭頸部外科学教室

藤原圭志

Objectives: To investigate the effectiveness of make-up therapy for patients with facial nerve palsy.
Methods: Seven female patients with facial nerve palsy who received specialist make-up therapy were enrolled. The objective of
the make-up therapy was to obtain a symmetrical facial appearance.
Results: Overall score for the Facial Clinimetric Evaluation (FaCE) scale was significantly improved after make-up therapy. There
was a tendency for symptoms of depression to be improved among patients after make-up therapy.
Conclusion: Make-up therapy to improve the symmetry of facial appearance could afford a non-invasive and low-cost treatment
for patients with facial nerve palsy, especially in terms of patient quality of life and psychological condition.

１．緒

QOL の評価としては FaCE スケール 6）、精神面の評価とし

言ては、うつ状態の評価にうつ性自己評価尺度（Self-rating

顔面神経麻痺の後遺症は患者の生活の質（Quality of Life

Depression Scale：SDS）7）を用いた。SDS は 20 問の設問

：QOL）に大きな影響を与え、特に女性において、QOL のからなり、各 1 - 4 点、合計 20 - 80 点となり、点数が高い

1）

低下が大きいことが報告されている 。一般に、後遺症にほど抑うつ傾向が強いと評価される。点数により Group 1

対しては、形成手術やボツリヌス毒素治療、ミラーフィー（40 点未満：正常）、Group 2（40 点以上 50 点未満：軽度

ドバックなどのリハビリテーションが用いられる 2 , 3）。過抑うつ）、Group 3（50 点以上：中等度抑うつ）の 3 群に分4）類された。メーキャップ治療前と治療後 6 ヶ月の時点ででは、精神面への有効性が示されており、また、顔面の色

FaCE スケールと SDS の評価を行った。Wilcoxon の符号

素沈着に対してメーキャップを指導したところ、うつ症状

付順位検定を用いて統計学的検討を行った。

去の顔面神経麻痺患者に対するメーキャップ治療の報告が改善したとする報告もある 5）。今回我々は、顔面神経麻３．結痺患者の QOL や精神面に対するメーキャップ治療の有効3 . 1. FaCE スケール性について検討したので報告する。

２．方果

治療前の FaCE スケールは 19 ～ 50 点（中央値 48 点）、法

治療後は 24 ～ 59 点（中央値 51 点）で、統計学的に有意に対象は、当科顔面神経外来を受診し、メーキャップ治療を施行された女性顔面神経麻痺患者 7 例である。年齢

改善していた（図 1）。社会活動スコアは 7 例中 5 例において改善が認められた。

は 26 - 64 歳（ 中 央 値：46 歳 ）、 疾 患 の 内 訳 は Bell 麻 痺 1
例、Ramsay Hunt 症候群 3 例（Zoster sine herpete を含む）、

3 . 2 . SDS

耳下腺癌 2 例、顔面神経鞘腫 1 例である（表 1）。顔面神経

データ不十分の 1 例を除く 6 例において検討を行った。

麻痺の評価は柳原法および Sunnybrook 法を用いて行った。

治療前は Group 1 が 1 例、Group 2 が 4 例、Group 3 が 1 例

メーキャップ治療は、安静時非対称の軽減を目的に、眉毛であった。統計学的有意差は認めなかったものの、6 例中の高さ、瞼裂の幅、鼻唇溝の深さ、口角偏位に特に留意し4 例で SDS スコアの改善がみられた（図 2）。治療後にはた指導がなされた。メーキャップ治療自体は顔面神経麻痺

Group 3 の 1 例が Group 2 へ、Group 2 の 2 例が Group 1 への発症早期から施行可能ではあるが、麻痺の回復による精と改善した。

神面への影響を除外するために、症状が固定したと考えられた後にメーキャップ治療を施行した症例を対象とした。

3 . 3 . 重症度とメーキャップ治療の効果
7 例を安静時非対称の重度群（Sunnybrook 法

Make-Up Therapy for Patients With
Facial Nerve Palsy

安静時

非対称スコア 10 点以上）の 3 例と軽度群（同スコア 10 点未満）の 4 例の 2 群に分けて検討したところ、FaCE スケール、Keishi Fujiwara

SDS スコアとも 2 群間に大きな差はみられなかった。しかDepartment of Otolaryngology-Head &Neck Surgery, Faculty of Medicine andGraduate School of Medicine, Hokkaido
University

し、SDS が唯一悪化した症例では安静時非対称スコアが15 点と非対称の強い症例であった。

− 208 −

顔面神経麻痺患者に対するメーキャップ治療の有効性の検討

表1

図1

患者背景

図2

治療前後のFaCEスケールの比較

４．考

治療前後のSDSスコアの比較態が軽減され、社会的活動性が増加したと報告している 4）。

察

本検討でもうつ状態を評価する SDS スコアが改善する傾顔面神経麻痺患者における後遺症は、患者の QOL に大向を認め、同様の結果が得られている。Hospital Anxiety

きな影響を与え、精神面への影響も大きいと考えられる。

and Depression Scale（HADS）を用いて、顔面神経麻痺非これまでに顔面神経麻痺患者の精神面の変化を治療前後で治癒例の精神状態と FaCE スケールについて検討したとこ評価した研究はほとんどみられないが、本検討によってメ

ろ、不安やうつのスコアと FaCE スケールに有意な相関をーキャップ治療が顔面神経麻痺患者の QOL や精神面へ有認めたとする報告 10）もあり、精神状態を改善させること

効な可能性が示された。ただし、安静時非対称の強い症例

が QOL の改善につながる可能性が示唆される。

では SDS スコアの改善を認めず、重症例に対してメーキ

なお、本報告書に記載した結果を含む内容で、2019 年に論文発表した 11）。

ャップ治療単独での治療は困難である可能性がある。
顔面神経麻痺患者の QOL を評価する FaCE スケールの治療前後での有意な改善が認められ、メーキャップ治療が顔面神経麻痺患者の QOL を改善することが示された。特に、外出を避けている、など社会活動に与える影響を軽減

謝辞本研究をサポートしていただいた公益財団法人コーセー

コスメトロジー研究財団に深謝致します。

させる効果が期待できると考えられる。医療者側による顔面神経麻痺の評価は、患者側の評価とは必ずしも一致しないと報告されており 8）、QOL の低下の程度は顔面神経麻9）（引用文献）
1） Kleiss IJ, et al: Health-related quality of life in 7 9 4

痺の重症度からは予測できないとする報告もある 。医療

patients with a peripheral facial palsy using the FaCE

者側は麻痺の重症度だけではなく QOL の評価も行い、適Scale: a retrospective cohort study. Clin Otolaryngol 40

切な対応を取ることが求められる。

: 651-656. 2015

Kanzaki らは、2 例の女性顔面神経麻痺患者に対してメ

2） May M, et al : Bellʼs palsy: management of sequelaeーキャップ治療を施行し、うつ状態や劣等感、神経質な状

using EMG rehabilitation, botulinum toxin, and− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20208） Ng JH, et al: The use of the facial clinimetricsurgery. Am J Otol 10 : 220-229. 1989
3） Nakamura K, et al: Biofeedback rehabilitation forprevention of synkinesis after facial palsy. Otolaryngol

evaluation scale as a patient-based grading system inBellʼs palsy. Laryngoscope 123 : 1256 -1260. 20139） Lee J, et al : Assessing impairment and disability of facial

Head Neck Surg 128 : 539-543. 2003
4） Kanzaki J, et al: Effect of corrective make-up

paralysis in patients with vestibular schwannoma.

training on patients with facial nerve paralysis. Ear

Arch Otolaryngol Head Neck Surg 133 : 56-60. 200710）Diaz-Aristizabal U, et al: Correlations between

Nose Throat J 77 : 270-274. 1998
5） Wright ET, et al: Some psychological effects of

impairment, psychological distress, disability, andquality of life in peripheral facial palsy. Neurologia

cosmetics. Percept Mot Skills 30 : 12-14. 1970

34 : 423 - 428 . 20196） Kahn JB, et al: Validation of a patient-graded
instrument for facial nerve paralysis: the FaCE scale.

11）Fujiwara K et al: Make-Up Therapy for Patients
With Facial Nerve Palsy. Ann Otol Rhinol Laryngol

Laryngoscope 111 : 387-398. 2001
7） Zung WW: A SELF-RATING DEPRESSION SCALE.
Arch Gen Psychiatry 12 : 63-70. 1965

− 210 −

128 : 721 - 727 . 2019

化粧がもたらす社会的効用 ― その神経基盤を探る
福島県立医科大学医学部システム神経科学講座

藤原寿理

Cosmetic studies have drawn many attentions not only in beauty business but in social psychology field. Previous studies
indicated that wearing makeup can increase an individual's quality of life and decision confidence. However, it remained unknown
where in the brain represent these makeup effects, and how social information such as majority or minority impacts decisionconfidence. Here, we addressed this open question using fMRI. Students who wear makeup habitually participated in the study.
The experiment was performed on two different days, once with and once without make up. In the fMRI scanner, participants
engaged in commonly used binary decision tasks and provided a confidence rating regarding their decision. We compared the brain
activation related to confidence both with/without make up and with/without social information. Behaviorally, decision accuracy inthe discrimination tasks did not differ across conditions. However, decision confidence significantly increased both in the makeup
condition and social majority condition compared to no-makeup condition and no-influence condition. In the brain, at the timeof the confidence rating, we found that medial prefrontal cortex underpin the decision confidence and basal ganglia-prefrontal
network enhance this confidence by being social majority and waring makeup.

１．緒

有無も含めて行動学的および神経科学的に検討した。

言２．方リハビリメイクのように、事故や手術などで外観に損傷を負った人が化粧をすることで QOL（心の健康度）が向上

法

２．
１．被験者

すること、また社会行動に自信を持つことが知られている。

日常的に化粧習慣のある健常女子学生 15 名（平均年齢

このように化粧が外見の審美性だけでなく内面的な自信や

22 . 3 ± 4 . 9 歳）を対象に実験を行った。すべての被験者に満足など社会行動にポジティブな影響をもたらすことから、ついて、神経・精神疾患の既往、体内金属がないことを確

化粧の社会的効用に期待が高まっている。行動学的先行研

認し、実験の趣旨、内容、fMRI 実験に伴いうる危険性に究により、化粧をする人ほど社交性が高く、また自己に対ついて十分な説明を行い、本人の自由意志に基づき文書に1）する自信が高いことが示されている 。近年、藤原（2017）

よる参加同意を得た。

は同一被験者に対して化粧有無の両条件下における QOLや自信を直接比較し、化粧行為が顕在的にも潜在的にも社
2）

会行動にポジティブな効用を与えることを示した 。さら

２．２．実験手順
実験は同一被験者に対し化粧の有無別に 2 日間行った。

に、自分が少数派か多数派かといった社会的要因を考慮し1 日目と 2 日目の間には 1 週間空け、化粧有無の順番は被た場合、自己の意思決定に対する自信は他者との一致度に

験者ごとランダムにした。実験当日、被験者は化粧の有無影響を受け変化することも示した 3）。一方、機能的磁気共いずれかの条件で朝から過ごし、午前中に一度実験者が化

鳴画像（fMRI）法を用いた先行研究によると、認知課題解

粧有無の確認を行った。被験者は再度夕方に実験室にて化

答後の自信を客観的に判断するメタ認知能力は、課題の正粧有無の確認を受け、TDMS 二次気分尺度質問紙への記

答率に関わらず単独で計測可能であり脳内で独立して表現

入および fMRI スキャナ内にて二者択一弁別課題と自信度4）されていることが示されている 。しかしながらこれまで評価を行った。実験 1 日目と 2 日目の弁別課題は難易度をに化粧がもたらす自信およびその自信が社会的影響（他者

揃え、被験者間でランダムな順番にした。

との一致度）によりどう変化するかについての fMRI 研究

コンピュータを用いた課題は、人物や家屋の写真を用いは未だ行われてこなかった。本研究では化粧の有無で意思た濃淡の弁別およびランダムドットを用いた左右の動き弁決定に対する自信がどう変化するかについて社会的影響の別から構成され、いずれも難易度を高く設定した。被験者
は、弁別課題の解答直後に一問ごと解答への自信度を評価した（社会的影響なし課題）。課題の半分では、弁別課題

Neural mechanisms of social utility by
wearing makeup - fMRI studyの解答後に他の被験者 30 名との一致度を円グラフで呈示

Juri Fujiwara

あわせて検討した（社会的影響あり課題 , 図 1）。社会的影

Fukushima Medical University Schoolof Medicine, Department of Systems
Neuroscience

し、社会的少数／多数の影響が自信に及ぼす影響について響に用いた一致度は実験的に操作した値であり、それぞれ
11、22、33、44 % を少数派、55、66、77、88 % を多数派

− 211 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図1

fMRI実験課題としランダムな順番で呈示した。弁別課題はコンピュータていない状態で過ごした実験当日の夕方の気分を TDMS

上で作動する Presentation ソフトウエア（Neurobehavioral

二次元気分尺度質問紙にて計測した。化粧有無の条件間でSystems Inc.）を用いて作成した。弁別課題の解答時間は気分状態に違いがみられるかについて比較検討した。その5 秒以内、自信度は 3 秒以内と定め、被験者になるべく早結果を図 2 に示す。

く正確に答えるよう指示した。反応は被験者手元のボタ

化粧ありの状態で 1 日を過ごすことにより、化粧なしのン押しにより得た。解答および反応時間はコンピュータ

状態で 1 日を過ごすことに比較して安定度（落ち着いた状に記録し、解析に用いた。課題遂行中の脳活動は全て記録態である）および快適度が有意に高くなることが示された

し、自信度評価のタイミングにおける脳活動を条件ごとに（安定度：t（14）=2.5, p < .05, 快適度：t（14）=2.3, p < .05）。

分けて比較検討した。fMRI 撮像は福島県立医科大学内のまた被験者の個別のデータを条件ごとにプロットしてみ

PET-MRI（SIEMENS Biograph mMR 3 T）にて行い、脳ると、被験者が化粧なしの場合はほぼ平常心エリアに該当

機能データの解析には MATLAB（MathWorks）上で動作するのに対し、化粧ありの場合では活動に適した気分状態

する spm 12（https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/）
ソフトウにあることが分かった（図 3）。

エアを用いて行った。行動データの統計解析には市販のソフトウエア（GraphPad Prism 5 , GraphPad Software, Inc.）

３．２． 二者択一弁別課題と自信度評価

を使用し、被験者内で対応のある両側 t 検定あるいは分散

fMRI スキャナ内にて、化粧の有無とは直接関係のない分析を行った。グラフ中に示したエラーバーは被験者 15

二者択一の弁別課題を行わせ、各問に対し自分の解答にど

名の標準誤差である。

れくらい自信があるかを聞いた。その正答率と自信度につ３．結

いて正答誤答別に図 4 に示す。

果

正答率に関して条件間の差はみられなかった。一方、自３．
１．被験者が 1 日中化粧をした状態あるいは化粧をし分の解答に対する自信の度合いは正答、誤答に関わらず化− 212 −

化粧がもたらす社会的効用 ― その神経基盤を探る

図2

図3

二次元気分尺度

二次元気分尺度（個別データ）

図4

粧なし条件に比べて化粧あり条件で有意に高くなることが行動データの結果（14）= 3 . 3 , p < . 005）。

示された（正答：t（14）= 2 . 1 , p < . 05 , 誤答：t（14）= 2 . 2 , p< . 05）。弁別課題および自信度評価の反応時間に条件間での有意差はみられなかった。

３．３．自信度に関わる脳活動
まず、fMRI スキャナ内にて行った弁別課題中の、自信

社会的少数／多数派の影響別にみると、正答率に差はな

度評価のタイミングにおける脳活動データについて、化粧いものの、自信度評価に関しては化粧の有無に加えてさらの有無条件を比較した。化粧あり条件で化粧なし条件にに多数派であることが自信を有意に高めることが示された

比べて有意な賦活が認められた脳領域は、背内外側前頭（図 5 右上 , 化粧の有無：F（1 , 84）= 14 . 1 , p < . 0005，社

前野（DMPFC, DLPFC）および前頭弁蓋部（Operculum）で会的影響：F（2 , 84）= 10 . 0 , p < . 0001 , 下位検定におけるあった。一方、中脳（Midbrain）においては化粧ありの条

条件間比較の p 値はグラフ内に記載）。さらに、社会的環

件で有意に低い賦活が認められた（図 6 , いずれの賦活も p

境下での自信度を正答／誤答別に比較すると、誤答に比< 0 . 001 uncorrected）。

べて正答に対する自信が化粧ありの場合に有意に増加し次に社会的少数／多数派の影響別にみると、多数派の場た（影響なし：t（14）= 2 . 1 , p < . 05，少数派：t（14）= 4 . 0 ,合に自信度評価において線条体（Striatum）、内側前頭前野p < . 005，多数派：t（14）= 3 . 0 , p < . 05）。化粧による自信（mPFC）、外側前頭眼窩部（lOFC）が賦活し、その賦活はの増加は特に少数派の場合において顕著であった。一方、化粧なしに比べて化粧ありでやや強いことが示された（図誤答への自信度は社会的な影響による差はなく、影響なし

7 上段 , p < 0 . 001 uncorrected）。

条件でのみ化粧による自信の増加がみられた（影響なし：t

一方、両側の島皮質（Insula）および海馬（Hippocampus）− 213 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図5

行動データの結果（社会的影響条件下）

図6

化粧と自信に関わる脳活動− 214 −

化粧がもたらす社会的効用 ― その神経基盤を探る

図7

化粧と自信に関わる脳活動（社会的影響条件下）

においては、情報なし（コントロール）条件に比べて少数

平常心であった気分状態が、化粧をすることにより活動に派の時に賦活し、またその賦活は化粧なしに比べて化適した快適で安定した気分状態へと変化することが示され

粧ありでやや強いことが示された（図 7 下段，p < 0 . 001

た。これにより、化粧が内面の気分状態にポジティブな影

uncorrected）。

響を与えることが明らかになった。

４．考

本研究では fMRI スキャナ内で二者択一の弁別課題を行察うことにより、被験者の意思決定に対する潜在的な自信お

本研究により、日常的に化粧をする習慣のある健常の成よびそれに関わる脳活動の計測を試みた。弁別課題には、

人女性では、化粧をしている状態としていない状態で気分

二枚の写真の濃淡や動きの左右方向を弁別させるという難状態が異なることが示された。化粧をしていない状態では易度の高い課題を用意した。したがって解答に対する自信− 215 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020を認知することは課題同様に難しいことが予想された。結自分に自信が持てるという現象の神経科学的根拠を明らか

果、正答率はチャンスレベルである 50 ％よりもやや高いにする点で社会的に意義があるものであった。化粧をする値であったが、化粧有無の条件間では差がなく、いずれのことで向上することが示された「自信」という内面の社会的条件でも難しい弁別課題であり、正答かどうかを予期する

効用は、より高次な価値判断に関わっていると考えられる

ことは困難であったことが示された。それに対して自信の前頭前野領域で表現されていることが明らかになった。化

度合いは、化粧あり条件の方がなし条件に比べて有意に高粧行動と共に意識的にこの領域の賦活を高めることができ

く、化粧をして過ごすことが判断の難しい問題の解答に対れば、自分に自信が持てるような生活の提供を可能にする

して高い自信を持つことにつながる可能性が示唆された。

かもしれない。また本研究の成果は、リハビリメイクのよ行動データで有意差のあった自信度について脳活動を比うに化粧を用いることで QOL の向上を図る医療の現場だ

較した結果、化粧あり条件で化粧なしに比べて有意な賦活

けでなく、美容・服飾業界をはじめ、化粧品の開発、宣伝が認められた脳領域は、背内外側前頭前野および前頭弁蓋や販売促進の現場において、さらには就職活動をはじめ高部であった。背内外側前頭前野領域は、先行研究で示されいコミュニケーション能力を必要とするような現場においているメタ認知能力（自己の意思決定の正誤を正確に判断ても将来的な戦略を提供することにつながる発展性のあるできているかどうか）の高さと関係のある賦活領域と一致研究であったと考えられる。

4）した 。また、前頭弁蓋部はポジティブな情動情報に関与していることが知られており 5）、これらの領域は、化粧を謝

辞することにより向上した自信の神経科学的背景になってい本研究の遂行にあたり、助成をして下さいましたコーセることを示唆する。一方、化粧ありの条件で特に誤答につーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。助成金

ながる解答に対する自信で低い賦活が認められた中脳は報により遂行された研究成果は今後国内外の学会で発表させ酬関連領域として知られており、間違った解答への自信をていただくとともに、速やかに論文として国際学術雑誌に評価することが報酬低下を示唆し、化粧をしている際はさ投稿し、科学の発展に寄与することを目指します。

らにその賦活が顕著になることが明らかになった。
社会的環境要因を加え、自己の意思決定が社会的に少数（参考文献）

派なのか多数派なのかに分けて自信の変化を調べた結果、

1） Miller, L. C., & Cox, C. L.（1982）．For appearances’

少数派に比べて多数派の場合において自信が高まり、化粧sake: Public self-consciousness and makeup use. Pers

をすることがその自信を助長することが示唆された。脳内Soc Psychol Bull, 8, 748-751.

では、多数派の場合に自信度評価の際に線条体、内側前頭2） 藤原 寿理 . 化粧がもたらす自己の価値および社会行動に

前野、外側前頭眼窩部が賦活したが、いずれも先行研究でおける価値の変化 - 行動学的検討 .（2017）コスメトロジー研

報酬、メタ認知領域、価値判断として知られている領域で究報告 . 25: 170-175.

、化粧をすることにより向上した自信が、多数派

3） Fujiwara J, Tobler PN, Eifuku S. Being in a socialであることを受けさらに社会的な価値が上乗せされ、それmajority enhances decision confidence and activatesに関わる脳領域がネットワークとして関与したことが示唆

frontostriatal neuroarchitecture.（2 0 1 9）．Society for

された。一方、少数派の場合にはネガティブな情動や痛み

Neuroscience abstract.

あり

4 - 7）に関連した領域として知られる島皮質の賦活や記憶に関係

4） Fleming SM, Huijgen J & Dolan RJ.（2012）．Prefrontal

した領域である海馬の賦活が有意に認められた。このこと

contributions to metacognition in perceptual decisionから、少数派であることが自信を答える際にネガティブなmaking. J. Neurosci. 32, 6117-6125.

情動を喚起し、また自分の解答について振り返るために記

5） Fujiwara J, Tobler PN, Taira M, Iijima T, Tsutsui K.

憶を参照したことが示唆された。またそれら賦活は化粧な（2009b）．Segregated and integrated coding of reward

しに比べて化粧をしている際はさらに顕著になったことかand punishment in the cingulate cortex. J Neurophysiol.

ら、基本的な自信に関わる神経ネットワークは化粧や社会

101（6）: 3284-93.

的環境に応じて強化される可能性が示唆された。これらの

6） Vogt, B. A.（2005）．Pain and emotion interactions in

結果から化粧という行為が行動学的だけではなく神経科学

subregions of the cingulate gyrus. Nat Rev Neurosci 6:的な側面からも気分状態や自信をポジティブな方向へ高め

533-544.
7） Howard JD, Gottfried JA, Tobler PN, and Kahnt T.（2015）．

るといった社会的効用を与えることが示唆された。

５．総

Identity-specific coding of future rewards in the human括orbitofrontal cortex. PNAS 21, 112（16）5195-5200.

本研究は、女性が日常的に経験する、化粧をすることで− 216 −

ハイブリッド相同モデルによる result-oriented な
顎顔面手術シミュレーション法の開発
九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎顔面外科学分野

山田朋弘

A homologous model that converts the surface shape of a living body consisting of a huge point cloud into a small numberof parameters (principal component vectors) reflecting anatomical features. In this study, homologous model was applied to themorphology of the facial surface and jawbone and was used in the simulation of oral and maxillofacial surgery, especially jaw
deformity (orthognathic) surgery. From the aimed facial form assumed in advance, we tried to make a prediction model for hardtissue surgery for each patient.
Prior to model creation, the reproducibility of anatomical landmarks of facial soft tissue was verified. The subjects were 10
healthy adults. When reproducibility was examined using ICC (intra-class correlation coefficients), 11 reliable landmarks wereconfirmed.
Based on the CT data of a healthy person (TY), a homology model of hard and soft tissues with 3187 vertices was created as a
hybrid homologous model. Using this as a template, a hybrid homologous model of jaw deformity patients with facial asymmetry
was created.
The difference between the hard tissue morphology predicted from the amount of change in the jawbone calculated from the
aimed facial form of the soft tissue, and the actual post-operative hard tissue morphology had a difference of approximately 5 mmin the mandibular ramus and the lateral part of the chin, which remains asymmetry after the operation.
The result-oriented hard tissue simulation for orthognathic surgery obtained from the aimed soft tissue morphology was usefulfor planning surgery and discussing postoperative problems.

１．緒

言

2．方

顎変形症をはじめとする顎顔面手術では、治療目的が咬合の改善による咀嚼力の向上や歯周組織の健全化であることが多い。しかしながら、副次的な目的の一つにバランス

法

2 . 1. 相同モデル化技術に必要な解剖学的ランドマー
クの確立
ビデオカメラや立体カメラなどで取得できる立体データは、のとれた顔貌がある。ところが実臨床では、予定通りの咬ポリゴンと呼ばれる三角形の集合体でできており、各立体デ合が得られても必ずしも顔貌の満足度が高くない症例が存ータによってポリゴン数にばらつきがあるため、統計処理を在する。特に顔面非対称症例の場合、咬合の緊密化が輪郭することが困難である。そこで各立体データに対して、ポリの対称性に合致しない場合も散見される。

ゴン数を決めた共通のテンプレートデータを、設定した解剖

これまで顎変形症などの治療に用いられていたシミュレ

学的ランドマークに一致させながら各立体データに貼り付けーション法では顎骨の移動量を決めてから骨片の干渉部位

ることにより、すべての立体データのポリゴン数が一致したや骨形態を予測するのみであり、望ましい顔貌が得られる

モデルを作 製 する技 術を相 同 モデル 化 技 術と呼 ぶ 2 - 4 ）か否かは明確にすることができなかった 1）。そこで、事前（ 図 1 ）。この結 果できたモデル（＝相 同モデル）を用いる

に理想
（目標）
顔貌を予測し、軟組織の移動量を逆算して骨ことで多 変 量 解 析などの統 計 処 理 ができ、 解 剖 学 的ランの移動様式をシミュレーションする方法に着目した。理ドマークの設 定 が 困 難な部 位でも形 態 評 価 が 可 能となる。

想的な軟組織形態の獲得を優先させた手術シミュレーショ

顔面軟組織の立体（3 D）データを相同モデル化するためンが可能になれば、治療計画立案のツールに新たな選択肢には、解剖学的ランドマークの設定が重要となる 5）。そこが加わり、より満足度の高い治療が可能になることが期待で、まず再現性の高い解剖学的ランドマークを明らかにすされる。本研究では、ハイブリッド相同モデルを応用し、ることを目的とした。

result-oriented な手術シミュレーション法を開発することを目的とする。

対象は 2016 年 4 月から 2017 年 3 月までに九州大学歯学部に所属した日本国籍の学生のうち男性 5 人、女性 5 人の計 10 人（平均年齢 23 . 6±1 . 2 歳）を対象とした。対象は先Result-oriented simulation for maxillofacial
surgery using homologous modelling

天性疾患、顎顔面外傷の既往および顎矯正手術の治療歴がある学生を除外した。
3 D 画 像 撮 影 解 析 装 置（VECTRA® H 1 , Canfield

Tomohiro Yamada
Section of Oral and Maxillofacial Surgery,
Division of Maxillofacial Diagnostic andSurgical Sciences, Faculty of Dental
Science, Kyushu University

Scientific, Parsippany, NJ）を用いて 3 つのアングルで被検者の顔を撮影し、得られた画像データを 3 D データ構築
ソフト（VECTRA Capture Module, Canfield）で画像を三− 217 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図1

相同モデルの定義

次元構築し、医療画像キャプチャソフトウェア（Mirror®
PhotoFile®, Canfield）を用いて STL（Stereo lithographic）
形式に変換して顔面データとして保存した。得られた顔面
データを相同モデル支援ソフトウェア（HBM-Rugle, メディックエンジニアリング , 京都）に転送し、顔面データ上に、過去の文献を参考にし、以下に示す解剖学的ランドマ
ーク計 26 点（うち左右対称となるランドマークは 9 対 18点）を計測点としてプロットした（図 2）。
プロットする計測者は同一人物とし、それぞれ 1 週間
以上の間隔を空けて計 3 回プロットした。1 回目と 2 回目、2 回目と 3 回目、1 回目と 3 回目それぞれにおける点間距離を測定して同一解剖学的ランドマーク内で比較し、再図2

現性を検討した。計測点の再現性の統計学的検定には ICC

検証した解剖学的ランドマーク（級内相関係数、intraclass correlation coefficients）を採用した。左右対称となるランドマーク 9 対 18 点については、

構築し、3 Matics（Materialise）で STL ファイルに変換した。

左右それぞれにおける同一試行回における点間距離の平均

軟組織表面と顔面骨組織のそれぞれで STL ファイルを作値を算出して 1 対ごとに計測点の再現性を検討した。統計

成し HBM-Rugle で頂点数を 3187 まで間引いてテンプレ®

解析は JMP （SAS Intsitute Inc. Cary, NC）
を用いた。

ートとした（図 3）。

2．2．ハイブリッド相同モデルの作製

2．3．顔面非対称患者の術後硬組織形態のシミュレーション

CT 撮影は九州大学病院放射線撮影室内に設置している
Aquilion（キャノンメディカルシステムズ、大田原）を使相同モデルは頂点同士が対応を持っているため、差分ベ用した。撮影は患者を仰臥位で閉口させ、管電圧 120 kV、クトルを作ることができる。硬組織と軟組織の対応がとれ

管電流 100 mA の条件で行った。撮影範囲は、眼窩上孔たハイブリッド相同モデルを用いることで、なんらかの方から舌骨までの範囲で、眼窩中央より下 3 cm の範囲では、法で術後軟組織の相同モデルが作成できれば、術前後軟組

スライス厚 2 mm、テーブル移動速度 3 mm/sec で撮影し織の差分ベクトルを術前硬組織の相同モデルに加算するこた。顎関節部ではスライス厚 1 mm、テーブル移動速度とにより術後硬組織の予測モデルが作成できる（図 4）。

1 . 5 mm/sec、オトガイ付近ではスライス厚 2 mm、テーブ

3．結

ル移動速度 3 mm/sec で撮影した。基準平面は フランクフルト（FH）
平面を用い、それに平行な断面で計測した。
健常人の被験者 1 名（著者）の撮影から得られた DICOM
データを Mimics（Materialise, Leuven, Belgium）で 3 次元果

3．1．相同モデル化技術に必要な解剖学的ランドマー
クの確立
ICC における再現性は 0 . 40 < ICC ≤ 0 . 60 を “moderate”、− 218 −

ハイブリッド相同モデルによる result-oriented な顎顔面手術シミュレーション法の開発

図3

図4

ハイブリッド相同モデルのテンプレート

ハイブリッド相同モデルによる硬組織形態の決定

0 . 60 < ICC ≤ 0 . 80 を “substantial”、ICC ≥ 0 . 80 を “almost
perfect”とし、“almost perfect”を再現性が高いランドマークとした。本検証にて、N, Ps-R, Ps-L, Ac-R, Ac-L, Sn,
Cph-R, Cph-L, St, Li, Srn は “almost perfect”、Pi-R, Pi-L,
Prn, Ch-R, Ch-L, Po は“substantial”であった（表 1）。
以降の研究において、相同モデル化するための解剖学的ランドマークを “almost perfect” と判定された①’ N, ②’
Ps-R, ③’ Ps-L, ④’Ac-R, ⑤’Ac-L, ⑥’Sn, ⑦’ Cph-R, ⑧’
Cph-L, ⑨’St, ⑩’Li, ⑪’Srn の 11 点とすることにした（図 5）。

3．2．目標軟組織形態からの硬組織シミュレーション
モデルと術後形態の比較

図5

顔面非対称患者に対する従来の方法（目標の咬合から上相同モデル化に使用する解剖学的ランドマーク

下顎骨の移動量を算出）で手術計画をたて、実際に手術を形成の指標はほとんど歯列が中心であり、咬合や咀嚼機能行った（図 6）術後患者において、目標顔貌から硬組織予測の改善に重点がおかれている。それは医療として当然ある形態を作製した（図 7）。この、予測顎骨形態と実際の術後べき姿であると思われるが、機能と形態は一対のものであ

顎骨形態の差を面間距離としてカラーマッピング表示した

るもののどちらかが不完全な状態をとらざるを得ない状況（図 8）ところ、上顎骨、下顎角部、オトガイ部側方で差がも存在する。その代表的な例が顔面非対称を伴う顎変形症

大きいことが明らかとなった。このことは同部位において、の治療であり、術後の顔面軟組織の形態に関しては正確な

軟組織形態の改善に重点をおくと、骨の移動量が不足して予測は困難である。現在の実臨床では、顔貌の予測は側貌いたことを示す。

の一方向に限られることがほとんどであり、非対称症例に4．考

関しては十分な予測はできていないのが現状である。海外察

においては、いくつかのシミュレーション方法が開発され、顎顔面の形成手術、特に顎変形症の手術において、顎骨市販されているものもあるが、いずれも骨の移動量をまず− 219 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

表1

各解剖学的ランドマークの再現性の検証結果− 220 −

ハイブリッド相同モデルによる result-oriented な顎顔面手術シミュレーション法の開発

図6

目標の咬合から顎骨の移動計画をたて手術を行った顔面非対称症例の術前後

図7

シミュレーションモデルと実際の術後形態決定し、それに追随する軟組織の移動を予測するものである 1）。従って、軟組織の最終的な result を出発点とした骨るようになった 9）。
本研究で用いる相同モデル化技術は日本で開発されたもの（（独）産業技術総合研究所）であり、外国での医療目的の組織の移動様式を計画することは不可能であった。
近年、生体の表面形状を相同モデル化する手法が開発さ研究はほとんどない。近年、法医学分野において、この相れ、膨大な点群からなる解剖学的特徴を反映した少数のパ同モデルが復顔に用いられつつあるが、軟組織の必要移動

ラメータ（主成分ベクトル）に変換することにより、これま

量から硬組織（顎骨）の移動様式をシミュレーションするこで不可能であった生体三次元形状の統計的解析ができるよとは、まさに復顔と逆の工程であり、復顔手法を応用した

2 - 7）。われわれは、この相同モデル化技術を顎術後シミュレーション法を考案した。医療分野での類似の顔面の形態解析に応用し、下顎骨を相同モデル化すること試みはほとんどなく、この日本発の相同モデリング技術をにより彎曲を含めた骨形態の定量化を可能にした 8）。さら応用した手術シミュレーションは独創的な研究と思われる。

に、顔面表面データの相同モデル化により、これまで特徴

これまで人体形状の相同モデルを医学研究、特に手術計画

点の取りづらい曲面を中心とした顔面形態を統計的に扱えや評価に応用した研究はほとんどなく、医学分野への波及うになった− 221 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図8

シミュレーションと実際の術後形態の差効果としては、本手法により顎変形症のみならず口腔・顎shape after weight change for health-care services.

顔面の腫瘍切除や再建手術の治療シミュレーションへの応

Proceedings of the 3rd International Conference on

用が期待される。これにより、より予知性の高い手術的治

Applied Human Factors and Ergonomics 217-222, 2010.
5） Allen B, Curless, Popovic Z . Brian The space

療が可能になると思われる。
将来的な波及効果としては、相同モデルでは解剖学的特of hu ma n b ody s hapes : reconst r uct ion a nd

徴がデータ点に反映されるため、アニメーションなど、動parametrization from range scans. ACM T GRAPHIC

画作成への応用が期待される。また、顔面形状の経年的変22（3）: 587-594, 2003.

化によるデータを蓄積すれば加齢による顔貌予測も可能と

6） Kato A, Kouchi M, Mochimaru M, Isomura A, Ohnoなる。このことから、アンチエイジングやコスメトロジー

N. A geometric morphometric analysis of the crown

分野においても多大な成果が期待できるものと考えられる。

form of maxillary central incisor in humans. Dental

今後は、顔面軟組織と骨組織の対応関係を蓄積し、より正確なシミュレーションができるように研究を進め、日常のAnthropology 24（1），1-10, 2011.
7） Matsuoka A, Yoshioka F, Ozawa S , Takebe J.
Development of three-dimensional facial expression

臨床での使用につなげたいと考えている。

models using morphing methods for fabricating facial（引用文献）

prostheses. J Prosthodont Res 63: 66-72 2019.

1） Moehlhenrich SC, Heussen N, Kamal M, Peters F,

8） Inoue K, Nakano H, Sumida T, Yamada T, Otawa

Fritz U, Hoelzle F, Modabber A. Influence of setback

N, Fukuda N, Nakajima Y, Kumamaru W, Mishima K,

and advancement osseous genioplasty on facial outcome:Kouchi M, Takahashi I, Mori Y. A novel measurement

A computer-simulated study. J Craniomaxillofac Surg

method for the morphology of the mandibular ramus

43（10），
2017-2025, 2017.

using homologous modeling. Dentomaxillofac Radiol 44:2） Mochimaru M, Kouchi M. Statistics for 3D humanbody forms. SAE Digital Human Modeling for Design

20150062.
9） Yasuda K, Nakano H, Yamada T, Albougha S, Inoue
K, Nakashima A, Kamata Y, Sugiyama G, Tajiri S,

and Engineering Conference 2000-01-2149, 2002.
3） Kouchi M, Mochimaru M. Inter-individual variations

Sumida T, Mishima K, Mori Y. Identifying differences

in intra-individual shape change patterns. SAE

between a straight face and a posed smile using theDigital Human Modeling for Design and Engineering

homologous modeling technique and the principal

Conference 2006-01-2353, 2006.

component analysis. J Craniofac Surg 3 0（8）: 2 3 7 8-4） Kouchi M, Mochimaru M. Simulation of the body

2380, 2019.

− 222 −

●第 30 回表彰・贈呈式記念講演●

奥 直人

第 30 回表彰・贈呈式

記念講演（ステーションコンファレンス東京・2019 年 11 月 19 日）

リポソーム研究の魅力
帝京大学

奥薬学部長・教授直人

おく・なおと1980 年東京大学大学院薬学系研究科を修了後、アメリカ・ノースウエスタン大学に留学、摂南大学を経て、1991 年から静岡県立大学
薬学部助教授、その後に教授に就任。この間、静岡県立大学薬学部長、副学長を歴任。2018 年からは帝京大学薬学部教授、現在帝京大学薬学部長に就任。先生はリポソームを利用したドラッグデリバリーシステムの研究で多くの業績を残されておられます。
・専門分野：薬物送達学、リポソーム
・その他：2016 年に日本薬学会賞、2019 年にバンガム賞（Bangham Award）
を受賞

コーセーコスメトロジー研究財団の第 30 回表彰・贈呈

ものができることがわかりました。私がジャイアンツファ

式にお招きいただき、記念講演の機会をいただきまして、ンなので、ジャイアンツリポソーム（GUV）と名前を付けありがとうございます。また本日、財団の助成金を贈呈ささせていただいています。

れました皆さん、おめでとうございます。

バンガム博士はどのような方かというと、リポソームを

今日は、「リポソーム研究の魅力」というタイトルでお話作られた方で、図 1 は彼自身が描いた絵で、英国の王立科しさせていただきます。直接コスメトロジーには関係ない

学研究所でお話しされたときに使ったものです。生命の誕

かもしれませんが、今までやってきた研究について少しお生のときに、最初は多分、両親媒性分子ができて、それが話しさせていただきたいと思います。

だんだん脂質分子らしくなっていって、リン脂質になって、皆さんご存じの方も多いと思いますが、まずリポソー

リポソームみたいなものを作ってきて、この中に様々なもムとは何かについて簡単にお話しして、リポソームが生のを溜めるので、RNA とかが溜まり、これが生命の誕生

体膜モデル、それから DDS キャリアへと移ってきたので、であろうといっています。これより前に、1924 年にオパDDS（薬物送達システム）の話を中心にお話ししたいとーリンがコアセルベートを出したのは有名な話なので、ご思います。DDS の基礎研究から最近やっている応用研究、存じだと思います。そのようなところからも、最初はリポ

私の研究室でやってきたことをお話ししたいと思っていまソームを生体膜のモデルとして用い研究がなされてきましす。よろしくお願い致します。

た。

まずリポソームについて、これは皆さんもちろんご存じ

自分のことをあまりいってもしょうがないですが、私だと思いますが、生体膜はリン脂質を中心にできています。

自身は 1975 年に大学を卒業しましたけれども、74 年に

このリン脂質を取ってきて水で懸濁するとリポソームがで教室配属で入ったときには、4 人の先生方がおられました

きます。先ほどご紹介がありました、イギリスのバンガム
博士が 1964 年に脂質膜を取ってきて、有機溶媒などで脂質を分離し水に懸濁したところ、二重層膜が見えたとのことです。二重層膜が見えて小胞ができましたが、次の年に、この小胞にイオンと水溶性のものが内封されることを見つけたため、リポソームの発見の年は、1965 年とよくいわれています。リポソームの中には、SUV（Small Unilamelar
Vesicle）と呼ばれる小さい一枚膜リポソームから、1 マイ
クロメーターぐらいまでの大きな一枚膜リポソームがあり
LUV（Large Unilamelar Vesicle）といっています。それからもう少し大きな多重層膜リポソーム MLV（Multi Lamelar
Vesicle）と呼ばれているものがあります。コーセーで以前に撮られたMLVの写真がきれいなので、そちらを参考にしていただいたほうが良いと思います（https://www.kose.co.jp/
company/ja/research/secretstory/liposome/）。
もっと大きいものがあるかというと、私がアメリカへ留学していたときに、10 マイクロメーター以上のきれいな図1

生命創造とリポソーム様小胞

バンガム博士の英国王立科学研究所講演（1979 年）で使用：
Bangham A.D. in“Liposome Letters”Academic Press（1983）− 225 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

が、誰一人リポソームはやっていませんでした。この数年ます。これはフリーズフラクチャーという方法で、このよ

前、1972 年に前教授が亡くなられて、5 月に新しい野島庄

うにタンパク質があると二分子膜の間で割れるので、ポツ七教授が決まって来られました。次の年になってから、だ

ポツポツと見えますが、普通のウイルスは図 2（左）の矢印

んだん先生方が他に移られるようになって、1975 年の 5で示したような形です。これをリポソームにかけると、リ月に井上圭三先生が来られて、そして西島正弘先生が来ら

ポソーム上にブツブツがこのように増えることで、相手がれ研究室ががらっと変わりました。このとき、井上先生は、直接二分子膜に融合していることがわかったわけです（図アメリカのワシントン大学セントルイスで、先ほどのバン

2）。

ガム博士の直弟子のキンスキー博士からリポソームを習っ

このようにリポソームを生体膜モデルとして使うことて帰ってきたところでした。リポソームの草分け的な存在

が、ずっとやられていましたが、それ以外に DDS キャリ

である若い井上先生について、私はリポソーム研究を始めアとして使えるのではないかとして、様々なことが始まりることになりました。

ました。ご存じだと思いますが、DDS とは Drug Delivery

最初、リポソームは生体膜モデルだということでいろい

System の略で、薬を必要な量、必要な時間、必要な部位

ろなことをやりました。ドクターのテーマでやったことをに送達する技術で、このような技術があれば、少量の薬で一つだけお話しします。センダイウイルスとか、その他い副作用がなくて効くだろうと、様々なところに使われてきろいろなウイルスがありますが、よく膜融合を起こすウイました。

ルスがあります。膜融合を起こすウイルスは、その膜のと実際には、必要な量、必要な時間、必要な部位に送達す

ころに F タンパク質とか、膜融合に関係するようなタンパる技術としてはどのようなものがあるのかですが、障壁透ク質があります。これが働いて膜融合を起こすのだろうと

過性を変えるものがあります。例えば今まで注射剤でしかいわれていますが、その頃はまだちゃんとわかっていませできなかったものを経口投与ができるようになる、経皮投んでした。タンパク質全盛期の頃ですから、この相手は多与とか経肺から入れられる、また、脳血液関門がある脳の分細胞膜の上にあるタンパク質だろうと、タンパク質が関中にうまく運ぶことができるなどです。それからコントロ

与していて、タンパク質が実際に融合を起こすと考えられールドリリースとか放出を制御するとか、実際に打って患ていたわけです。そう考えていない研究者も結構いました

部だけにリポソームを行かせるなど様々な方法があります。

が、私もその一人で、井上先生もそう考えていませんで、こちらは、どちらかというと患者 QOL の改善をするため

F タンパク質の融合の相手は生体膜だと考えていたというに非常に役立つので、わが国のように超高齢社会になったことです。これはリポソームですけれども、リポソームに国では、より DDS が重要であろうと考え、リポソームのウイルスをかけて、受容体だけは入れていますが、そうす

DDS 研究を始めたわけです。

ると、このウイルスのタンパク質が図 2（右）のように見え

DDS のリポソーム研究については、プラットホームができていないとなかなか発展できなかった
わけですが、バンガム博士がリポソームを発見して以来、どんどんいろいろな人がプ
ラットホームを作っていきました。一つは1970 年に Weissman 博士が初めてリポソームに酵素を入れました。ライソゾームの中に酵素が欠損していると Tay-Sachs 病
とか様々な病気になるわけですけれども、そこに酵素を入れたリポソームを入れてあげれば、ライソゾームの中に酵素が届いて働いてくれるようになるだろうと始めたのが Weissman 博士です。
流動モザイクモデルは、Singer 博士と膜に粒子のあるセンダイウイルスの膜断面
図2

リポソームにウイルスが融合し膜上に粒子拡散

センダイウイルスとリポソーム融合

Oku N, Inoue K, Nojima S, Sekiya T, Nozawa Y: Electron microscopic study on
the interaction of Sendai virus with liposomes containing glycophorin. Biochim
Biophys Acta.
（1982）．

− 226 −

Nicolson 博士が 1972 年に出していますけ
れども、1973 年に Gregoriadis 博士が初めて抗がん剤をリポソームに入れて、抗がん剤とか様々なものに使う研究を始めていました。
リポソーム研究の中でいくつか画期的な第 30 回表彰・贈呈式記念講演 「リポソーム研究の魅力」

ものがありましたが、その一つ、Extruder によるサイジ

さらに、リポソームが長く血中を流れていれば、がんがングについて説明します。これはフィルターに一定のサイあればそのところに溜まるだろうとのことで、長期血中滞

ズの孔が空いていて、そこにリポソームをかけることによ

留性リポソームを Allen 博士がみつけました。リポソームって、そのリポソームのサイズを一定に作る方法です。こを長くもたせるために、最初は糖脂質を使い作りました。

れの利点はそれだけではなくて、例えば 100 ナノメーター

その後で、Huang 博士と、丸山 一雄先生が、ポリエチレ

とか 80 ナノメーターのサイズの孔に通すことで、それでングリコール（PEG）でリポソームを修飾するとやはり長くろ過滅菌ができ、そのままリポソームが使えることです。

血中を滞留するということを見出しました。

その後、多くのリポソームの製剤は、Extruder で、ろ過

そのようなことを背景として、リポソームががんに効くことがわかってきました。普通にマウスにがんを作ってお滅菌して使っています。
次に、リモートローディングについて説明します。リポ

いて、長期血中滞留型リポソームを打ってやると、がんのソーム内に薬などを入れるときに、普通に試験管などでリところに溜まっていきます。一方、長期血中滞留型でなけ

ポソームを作って様々な薬を入れると数パーセント、よくれば、肝臓に溜まるということです。がんのサイズを見るても数十パーセント程度しか入らないのですが、それを変と、未処理だとがんが大きくなりますが、このように溜まえた方法です。例えばプラスにチャージする薬、これはドってくるものに抗がん剤を入れておくと効くようなことを、

キソルピシンという抗がん剤などですけれども、このようわれわれもやっていました。

な薬だったら、リポソームの中の pH を下げておくと、こそのようなことをやりながら、日本でリポソームがだんの薬は疎水性があるのでリポソーム膜を透過して、中に入だん出てくるようになりました。リポソーム製剤として世ったときに、pH が下がっている段階で正電荷になってそ

界で一番最初にできたのがアムビゾームという製剤で、ポのままとどまることができます。これでやるとほぼ 100 ％リエン系の抗生物質アムホテリシン B をリポソームの中に薬を中に入れられます。マイナスになる薬は、逆に pH を入れた製剤です。膜にコレステロールを入れておくと、ア上げるとか、様々な方法がとれます。これはリモートロー

ムホテリシン B がそこに入っていってリポソームができまディングと呼ばれる方法です。これを作ったのは、Cullis

す。それまでは Fungizone といって、界面活性剤を用いて博士と Mayer 博士らです。

溶かしていたので、それで打ってやると溶血などの可能性

さらにもう一歩進めたものが、中に硫酸アンモニウムをもあります。そのようなことを防ぐために、アムビゾー

入れておき、硫酸アンモニウムの硫酸と薬のコンプレック

ムを用いると、真菌に行くとアムホテリシン B がこのようスを作らせて結晶化させた、リポソームの抗がん剤のドキなところで抜けて、カビが持っているエルゴステロールとシルがあります。後でもお話ししますが、これは日本でも穴を作って、それでカビを壊すということです。がんの末海外でも使われており、このような方法で、効率的に中に期症状でよく出る真菌の感染症などに効くことで、最初に結晶化した形で抗がん剤を入れていることになります。

1990 年に世界的に認可されて、日本では 2006 年に認可さそのような方法ができましたが、さらに日本で発見されれています。

た EPR 効果について説明します。現在国立がんセンター

それからドキシルは、先ほど少し説明ましたリモートロ

東病院におられる松村保広先生が、前田浩先生のところでーディングを用いています。リポソームに硫酸アンモニウ

ドクターを取られたときの仕事で、EPR 効果で物をがんムを入れておくことにより、抗がん剤のドキソルビシンがに集めることができる方法です。それを先に説明しますと、結晶化した形で中に入ります。さらに、リポソームの外側

正常細胞は血管が非常にタイトなので、あまりリポソームに PEG を付けてあるため、そのままがんのところに行っは集まりません。がん細胞では新生血管ができて、血管がて効くことになります。カボシ肉腫とか乳がんとか卵巣が非常にグスグスであります。そういうグスグスのところにんとか、様々使われていて、日本ではヤンセンファーマとリポソームが行くと、がん組織中に溜まってきます。それ

か持田製薬から発売されています。

からたまにリポソームが正常組織の血管外に漏れ出すこと

それ以外にも、網膜のところに新生血管ができる加齢性がありますけれども、正常組織では漏れたときにはリンパ黄斑症に対し、ベルテポルフィンという光感受性の薬をリ管に吸収されるので、あまり作用はありません。一方、がポソームに入れて打って、そこに届いたときにレーザーをん細胞ではリンパ管が発達していないので、溜まったとこ

当てて、新生血管を抑える薬も出ています。

ろから、がんに薬が行くだろうことが考えられます。先ほどの松村保広先生がドクターのときの仕事で、がん部位の日本ではこれらの 3 つが認可されていますが、世界的には 20 以上のリポソーム製剤が認可されています。

新生血管のもとで高分子が溜まることを見つけられました。

最近、リポソーム以外のものも DDS キャリアとして使そしてこれをEnhanced Permeability and Retention（EPR）

われておりますが、それも少しお話しします。一つは、以効果といっています。

前から使われておりますが、リピッドマイクロスフェア、− 227 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

リピットナノスフェアと呼ばれるもので、脂肪乳剤ともい

すばらしい商品として出し続けていると聞いて非常に喜んいます。これは周りに一重膜の脂質層があって、内側に中でいます。

性脂肪を入れて、例えば脂溶性のビタミン E などを運ぶた

当時の研究の話にもどりますが、本当にリポソームが皮めに使われています。それから最近、リピッドナノパーテ

膚を透過するかは重要な問題ですので、それを調べること

ィクル、脂質ナノ粒子と呼ばれるものが使われるようになをやらせていただきました。マンニトールの放射標識を使ってきています。これはリポソームの作り方とは少し違っって、フランツ型の拡散セルを用いて、どれぐらい皮膚ていて、非常に細いマイクロ流路と呼ばれているものを使を通るかを調べてみました。マンニトールだけだと 8 時間

います。エタノールでリピッドを溶かしておいて、さらにで 0.1 ％程度皮膚を通りますが、リポソームにマンニトー

何でもよいですけれど例えば遺伝子とか様々なもの、それルを入れてやると、ポジティブチャージのリポソームでも、をマイクロ流路で脂質と混ぜながら作るものです。今後さネガティブチャージのリポソームでも、ニュートラルでもらに使われてくるかと思います。

あまり通らないことから、リポソームが皮膚を透過するこ

ここまでが非常に基本的なところで、これから実際に、私が DDS を目的にやってきた研究の話をします。最初にとは多くなく、8 時間で内封マンニトールの 0.02 ％ぐらいしか透過しないことがわかりました。

海外に行った後に摂南大学へ行きました。ここでコーセー

次に皮膚を上からテープストリッピングをして、どの程の内藤昇様、荒金久美様と一緒にお仕事をさせていただい

度皮膚に入っているかを調べてみると、これよりは多く、たので、その話をしようと思います。実は、去年、静岡をリポソームは皮膚にはある程度入るが、皮下には通りにく

辞める直前に薬学会があり、4 月 1 日からは東京に出なけ

いことがわかってきました。

ればならないことから、ほとんど全部のスライドや資料をさらに、リポソームのホスファチジルコリンを C14 で捨ててきたので資料がありませんでした。実際には、現摂放射標識して、マンニトールは H3 で放射標識して、リポ

南大学薬学部教授の山下伸二先生、それから今は大阪薬科

ソーム自体は通るのか、マンニトールがフリーで通るのか

大学の教授になっていますが、当時大学院在籍の岩永一範など、皮膚透過量と皮内に残る量を詳細に調べてみました

氏と私の 3 人で一緒にやらせていただきました。

（図 3）。皮膚透過量はフリーのマンニトールが最も多く

何の研究をやったのかですが、当時リポソームを化粧品（○）、リポソームに入れても、多少は通りますがこの程度に使うときに、様々なヨーロッパの会社は特許を取ってい（●）です。さらにリポソーム自体は皮膚をほとんど透過しましたが、界面活性剤みたいなものを入れていても平気でていない（▲）ということがわかりました。また、リポソー使っているようなところがあって、リポソームの化粧品とムが皮内に残る量は若干ありそのまま一定時間留まることいいながらリポソームが入っていない。リピッドは入ってがわかってきました（図 3b）。

いるけれどもリポソームになっていないようなものがあったりしたらしいです。
それで、当時の厚生省は、「リポソームの化粧品というためには、リポソームの形のものがちゃんとなければならないこと、それからリポ
ソームの形であることがメリットであることを証明しなさい」といったとのことでした。それ
でリポソームを使うのをやめた化粧品会社もあったようですが、コーセーは、それらを証明して研究を進められたとのことです。当時、内藤様と様々なお話をさせていただきました。
そのときに、本当にリポソームが皮膚を透過するのかどうか、皮膚に対する作用を見てくれないかと相談があって、一緒に研究をやらせていただきました。コーセーでは、最終的にコス
メデコルテのモイスチュアリポソームなどの、今でもすごく人気のあるすばらしい製品を作られたとお聞きしています。リポソームが入っていることを電顕で証明して、それからリポソー
ムがモイスチャーとして働くことを証明して、

図3

リポソームの皮膚透過と皮内蓄積[H - 3] マンニトール内封 [C -14] ホスファチジルコリン含有リポソームを用い、マンニトールとリポソームのモルモット皮膚透過量 (a) と角質除去後の皮膚内蓄積量 (b) をフランツ型拡散セルを用い求めた：〇；遊離 [H-3] マン
ニトール：●；リポソーム化 [H -3] マンニトール : ▲ ; [C-14] ホスファチジ
ルコリン．（リポソーム組成：卵黄 PC/ コレステロール / ジセチルリン酸）：
奥直人、岩永一範、山下伸二：医薬におけるリポソームの応用と皮膚への作用
J Soc Cosmet Chem Jpn, 31, 254-262（1997）．

− 228 −

第 30 回表彰・贈呈式記念講演 「リポソーム研究の魅力」

さらに、ラベルしたリポソームとマンニトールを入れた

一緒に入ってくることがわかりました。ポリエチレンイミ

小さいプラスチック容器を皮膚に貼り付けて、実際に尿にンがついていることにより、ただ単にエンドソームで pH

出てくるリポソームを測ってみました。フリーのマンニトが下がってプラスになるだけではなく、その場で、透過性ールだとある程度尿中に出てきますが、空のリポソームとの高いイオンなどが入ってくるためオスモラリティが上が一緒に入れるとマンニトールの出てくる量は減ります。そって、エンドソームがある程度破裂して、物がより出やす

してリポソームに入れたマンニトールは少量しか尿に出てくなることがわかりました。これを使うと様々なものを細こないことがわかりました。

胞質に送れるだろうと考えました。

当時考察した全体的にいえることとしては、普通の脂溶

実際に、何をやったかですが、下村先生がノーベル賞を性の物質はある程度皮膚を通るが、水溶性の物質は皮膚を受賞された緑色に光るタンパク質を作る EGFP プラスミド

非常に通りにくいこと。それではどこから入るかですが、をリポソームに入れて、細胞にかけてみました。これは細リポソームは毛穴とか汗腺を通って入っていくこと。そし胞の核ですが、それでリポソームのリピッド自体は緑色にて、リポソームにマンニトールがある程度残ることを考えしておいて、それからプラスミド、遺伝子そのものは赤くると、皮内にあるリポソームからマンニトールが横に流れしたものをかけてみました。リポソームは細胞の核の周りていき溜まるだろうと考えたところまでを一緒にやらせてに点在していて、これが先ほど説明したエンドソームです。

いただきました。

ここまでリポソームが行って、ここでプラスミドが出てき

ここからまたリポソームの話に戻ります。最初にリポソて、プラスミドは核の中に入っていきました（図 4 左）。そームの DDS を始めるにあたり、どのようなことをやった

うすると、核の中に入り発現するので、緑色のタンパク質のかをお話ししたいと思います。まず、様々なものを導入ができると考えました。実際こういうものを作って。血中する場合に、どのようなリポソームがよいのかを考えてみに打つと、肺に行って、肺で緑色のタンパク質ができるのました。リポソームに何かを修飾すれば細胞に入りやすいで、肺の細胞に入って遺伝子が発現していることがわかりのではないかと考え研究を進めました、リポソームはマイます（図 4 右）。

ナスチャージの脂質が多いのでポリカチオンであり、プラ

それから、門脈という血管、これは直接肝臓に行きます

スチャージのポリエチレンイミンとかポリアリルアミンとが、そこにこれを入れると、肝臓の中に GFP ができるこかの影響を受けやすいと考え、それらをリポソームにかけとで、遺伝子が発現していることがわかりました。

てみるとリポソームが融合を起こすことがわかりました。

この頃に話があって、静岡県立大学に移らせていただく

そして、リポソームが少なければ少ないカチオンで融合すことになりました。このようなことができるのであれば、るし、リポソームが多くなれば多くのカチオンが必要であ遺伝子の導入で様々な治療ができる、遺伝子治療に持ってることから、リポソームの表面にカチオンが一定量つくと、いくことが考えられるわけですが、遺伝子治療はハードル

初めて融合が起こることがわかってきました。リポソームが高いことがわかっていました。遺伝子治療を下手にするが細胞に入るときには、最初にエンドソームに入って、そとがんになってしまうとか、様々なことがわかってきて、

こで pH が下がることがわかっていましたので、pH が下がなかなか難しいところもありそうだと。

ることによりリポソームがカチオン性になるようにしておくことで、エンドソームの内部でカチオンになるとプラスになってエンドソー
ムと膜融合を起こすだろうと考えました。その結果、物質が細胞質に行くので、例えば薬とか、それから核酸とか、様々なものを細胞質に送れるだろうと考えたわけです。
ちょうどそのときに、先ほどのポリエチレンイミンは、カチオン、すなわちプラスになるだけではな
く、プロトンがいろいろ付いてくるので、マイナスチャージの、例
えば塩素イオンなど様々なものがGFP プラスミド（赤）と NBD 脂質（緑）を含むリポ GFPプラスミドリポソームをマウス尾静脈から投ソーム複合体を、HT1080 細胞に添加し培養。 与し、24 時間後に肺を観察
1612, 136‑143（2003）．
青色は DAPI で染色した核。
1660, 24‑30（2004）．
図4

遺伝子運搬リポソームの細胞内分布とGFP遺伝子導入− 229 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ちょうどその頃に RNA 干渉が世界的にやられるようにで効くことがわかってきました。

なってきました。この RNA 干渉とは何かというと、大体

こういうものにつけて、周りに PEG を修飾して標的化

21 から 23 塩基対ぐらいの短い RNA が RNA 干渉剤ですけするようなものを作れば、目的のところに行って効くだろ

れども、短い RNA、siRNA、スモールインターフェアリうと考えたわけですが、なかなか外側につけておくと安ング RNA と呼んでいます。これを細胞質に入れてやると、定性が悪い。何とかこの siRNA を内側に入れられないか、相補的なメッセンジャー RNA を切っていくことがわかっ

中に入れるためにはどうしたらよいのかですが、まずカチてきていました。それで多くの薬のターゲットは大体タン

オニックコアを作っておいて、そこで一緒に入れる。実際

パク質ですが、そこに効く薬をずっと探していって薬を作には脂肪酸にカチオンが付いたものに siRNA を入れてカることがやられてきた方法ですが、全てのタンパク質に対チオニックコアを作っておき、リピッドの中に入れると中して薬ができるわけでありません。ドラッガブルな標的とに入ります。

ドラッガブルじゃない標的があるといわれていますが、ここういうものを、がんの治療に効かせるためにやりましういう siRNA のようなものを使えば、ほぼ全てのタンパ

た。ただ、今度は外側にリポソームが出ているので標的化

ク質を標的にすることができるので、目的が決まればこうができないため細胞に行かない。ではどうするかですが、いうものができるだろうと考えられるわけです。

細胞に行かせるために、細胞に付いているタンパク質を標

ではこれを薬にするためにどうしたらよいかですけれど的とするような抗体を付けてやる。抗体は大きいので、抗も、もちろん血液に打ったらすぐに血液中の酵素で分解さ体の抗原認識サイトだけを付けました。ここで選んだのはれてしまう。だから細胞に行かないし、細胞に届いても、

HB-EGF で、婦人科がんによく出てくる抗原ですが、そなかなか細胞質にこういうのが入っていかないと考えられれに対する抗体を付けてやる。そうすると、乳がんとか子ました。そのために DDS の技術が必要だろうと、つまり

宮がんとかにつくだろうと考え、乳がんの細胞をネズミにこれをリポソームに入れてやれば、簡単に目的の細胞に行植えておいて、そこに付けて打ちます。中に入れるものは、

くだろうと始めたわけです。

細胞の周期に関するキナーゼを抑える polo-like kinase 1

まずリポソームの周りに siRNA をつけていく方法としで、これはがんで発現していますので、それを抑えてやれては、カチオンを作ってポリマーを 2 本足にして、それでばがんが抑えられるだろうと考えました。実際にがんが増リポソームにつけてやることにより、リポソームの表面に殖するところに、こういうものを入れてやると抑えられる

siRNA がつきます。GFP を発現する細胞にリポソームをことがわかりました。

入れて、そこに GFP を抑えるような siRNA を修飾してどそのような研究の次にやったことは、がん以外に高齢社

うなるかを見ると、GFP の発現を抑えるものがたまに出会で重要になるのは、やはり脳卒中だろうと、脳卒中を治てきます。抑えるものは大体ポリカチオンリポソームのよせるものはないかを考えました。今、脳卒中は、脳梗塞がうな構造をしていて、ポリエチレンイミンと同じ格好です。

大体 6 ～ 7 割で、それから脳内出血、くも膜下出血があって、普通に例えばプラスチャージだけの脂質のリポソームの周

それらを脳卒中といっています。この脳梗塞ですが、初期

りに siRNA を付けるだけだとなかなか効かないが、このの頃であれば血栓溶解剤で治りますが、なかなかよい薬がようなものを使うと非常に効率よく、サイレンシングと呼ないのが現状です。それで、何とかしようと考えて始めたびますが、siRNA が効くようになる。では何が違うのか、のが次の実験です。

このような構造を持っている物は、pH が下がるとずっと

これは、東海大学の川口章先生というお医者さんが始め

カチオニックになってきます。プロテインなどが付いてたことです。テルモがヘモグロビンをリポソームに入れてカチオニックになってくる一方、このようなプラスのもの、

人工赤血球を作っていました。この目的は例えば、病院に

例えば DOTAP が有名ですが、これは全然 pH が変わって連れて行くと輸血ができるかもしれないけれども、すぐにも変わらない。これがプラスになっていくことが一つの成輸血できない現場で輸血ができないときに、一瞬でもいい

果で、そういう物を使っていくと、非常にうまく siRNAから輸血の代わりに人工赤血球を打てれば助かる人が多くを運ぶことができます。

なるのではないかと作ったものであると思います。これをこれは先ほどの説明のものですが、siRNA を緑色、そ

脳梗塞モデルで、ここに脳梗塞を作ってやると、この白いれからリポソームを赤で染める。リポソームが細胞に入っところは脳の死んでいる部分ですけれども、TTC 染色でた後に、まず pH が下がる細胞のエンドソームに入っていは生きているほうを染めていますが、このように人工赤血き、siRNA も一緒に入っていく。最初は黄色になってい球を入れると、矢印の部位が助かることがわかってきましますが、徐々に siRNA だけがここから抜けて細胞質に入

た
（図 5）
。

っていくため細胞質全体が緑になってくる。リポソームは

そのころ我々は、リポソームを簡単に標識する PET プロ

残り、siRNA がうまくエンドソームから脱出して、それーブを作っていて、それで人工赤血球の動態をみたいと話− 230 −

第 30 回表彰・贈呈式記念講演 「リポソーム研究の魅力」

アシアロエリスロポエチンリポソームを打ってやると死ぬ部分がす
ごく少なくなる。これは定量的に見たものですけれども、ある程度助かってくるというのがわかりました。それから運動能も普通だとドーンと下がります。スコアが下がることは、例えば、ぶら下がりができないとか、そういった様々右中大脳動脈塞栓再灌流後、右図ではヘモグロビン内封リポソームを投与、左図は対照、24
時間後に TTC 染色。
38: 1626‑1632
右図では矢印部位の脳障害が回避されている。Kawaguchi, et. al.,（2007）

な観点で点数が下がっていきます。
一方、アシアロエリスロポエチン
リポソームを打っておくと、スコアが健全なノーマルなラットの点数に戻ってくることがわかって、脳梗塞にも効くだろうことがわかりました。
もう一つ、最近やっていることで、これも面白いので、ちょっとだけお話ししますと、標的化というのは、よくリポソームに抗体とか、さっきも一つありましたが抗上手と同様に処理、ただしヘモグロビン内封リポソームはポジトロン標識し、投与 60分後にPET 測定。矢印の部位にリポソームが流入している。
Urakami, et. al. : In vivo distribution of liposome-encapsulated hemoglobin determined bypositron emission tomography.
33, 164‑168（2009）
図5

体などを付けて、それでがん細胞に行かせるとかありますが、逆転の発想で始めた研究です。抗体を付ける代わりに抗原をリポソームに付けたらどうなるか。抗原をリリポソーム製剤による脳梗塞治療の可能性

ポソームに付けると、面白いことがありました。PEG 修飾したリポソームを標識して見ては、これは感作した動物でないと駄目ですけれども、感作

やると、ここのちょうど助かっている部分ですけれども、した動物だと免疫細胞に抗体が出ていますよね。その免疫

リポソームが時間とともに入っていくことがわかりました。

細胞が抗原を認識してリポソームを認識してくれるだろう

つまり、リポソームは血栓ができても血栓を越えて患部と。それだったらここに薬を入れておいて、この感作したに入っていく、それから脳組織内に入っていくことがわか

免疫細胞をやっつけてしまえば、例えば自己免疫疾患とか、ってきました。実際に、ラット中大脳動脈に栓子を入れてそれから花粉症とか、そういうものが治ると考えられます。

血液を止め、栓子を引いて、また血液が流れますが、こう自己免疫疾患のモデルとして、自己免疫性の脳脊髄炎

いうモデルで血流を止めておいて、再灌流したときにリポ（EAE）マウスが使われます。ミエリンのオリゴデンドロ

ソームを打つ。そのときにリポソームが入っていくのかを

サイト糖タンパク質に対する抗体ができて、ミエリンが壊見ました。梗塞をして、再灌流していますが、ここにリポ

れて脳の組織がやられる病気です。ここはモデルですけれ

ソームが溜まってくることがわかりました。リポソームがども、この抗原になるようなミエリンのタンパク質を打っ溜まるので、リポソーム化脳保護薬を使って効果を調べててやると、これに対する抗体とか免疫細胞ができ、実際にみました。アシアロエリスロポエチンは脳細胞などを守る

モデルマウスがだんだん動かなくなる形で臨床症状が出て効果があるので、虚血を起こしておいて、アシアロエリス

きます。だんだんグレードが高くなっていくのが EAE マ

ロポエチン付けたリポソームを打って、脳の障害がどれぐウスです。最初に打ってやると抗原が感作されて抗体とからい出るかを見る。あるいは、1 日後にこのサンプルを打免疫細胞が出てきて脳の神経細胞を傷つけます。そういって、脳梗塞だと運動能が下がりますので運動能がどうなったものを作っておいて、リポソームに抗原つけてやると、るかを見ることをやってみました。

これが今の免疫細胞に働いて、ここでは関係ない抗がん剤

そうすると、例えば普通の脳梗塞を起こして虚血再灌流を入れていますけれども、そうすると免疫細胞を傷害するをすると、処理した側の脳は死んでしまいますけれども、だろうと考えました。実際に打ってみると、グレードが普− 231 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

通に上がっていきますが、リポソームに抗原をつけたもの

れますが、それをわかりやすくしたいと考えました。実際を打ったものは全然上がりません。このように、免疫細胞にサルに高脂肪食を食べさせ、頸動脈のところですがこのが全部やられてしまうので助かるということになります。

ように光る。このようなものを使えば簡単に検診に用いる

最後にもう一つ、リポソームによる動脈硬化の検診につことができるだろうと考えてやっています。なおこの研究

いてお話しします。動脈硬化になるとマクロファージが溜は北海道大学の小川美香子先生とやらせていただきました。

まってくるような不安定プラークができますが、これらをリポソームは使い道がいろいろあるので、病気の治療と認識するために、マクロファージに行くようなリポソーム

か、それから検診とか、病気の診断とか、様々なものに使を作ります。マクロファージに行くと光るリポソームを作えると考えて研究をやらさせていただいています。

ってやるとどうなるか、実際の結果だけ出します。サルに

さいごに共同研究者の方々に感謝致します。今は帝京大

高脂肪食を食べさせておくと動脈のところに不安定プラー

学で、むしろ教育に力を入れてやっています。このあたり

クができ、緑色にチカチカと見えるようになります。こので、雑ぱくでしたけれどもリポソームの話を終わりたいとようなものがあると動脈硬化の可能性がある。我々くらい思います。

の年になると、超音波で見て、それで危なかったらといわ

どうもご静聴ありがとうございました。

− 232 −

コスメトロジー研究助成を受けて2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて犬丸

啓

２年間にわたりコスメトロジー研究助成を頂き、大変あな（例えば科研費でいえば基盤研究など）研究プロジェクト

りがたく感じています。その理由の一つは、やや異分野のでは得にくい体験のように感じます。もう一つは、研究をテーマに踏み出す機会を与えてくれたことです。私は無機続けていると、研究費の谷間というものがどうしてもでき

材料化学の研究者ですが、コスメトロジーをキーワードとることがあり、そういった時に申請できると考えるだけでする研究にはこれまで縁がありませんでした。応募を思い研究者にとっては有難く、ある意味、挑戦的に活動してい立った時、自分の研究のスキルやフィロソフィーに基づいくことを後押しして頂いている気がいたします。そういうたうえで、自分にとっては新たなキーワードの元で研究を意味でも、今回、単年度ではなく、助成期間を２年として立案することは、研究者の視野を広げてくれることになり頂けたことがとてもプラスになりました。また、授賞式にます。私のような年齢（50 代後半）の研究者にとっても、ついても研究分野を異にし、年齢も幅広い他の受賞者、さこのような作業は、研究の活性化につながると感じました。

らには審査員の先生方との懇談の機会を得たことも、刺激

実際、今回の助成を受けて行った研究の中で、従来の延長になりました。最後になりましたが、審査頂いた先生方、とは異なる視点で研究を行ったことにより、逆に自身の得事務局を含む財団ご関係の方々に改めて御礼申し上げ、筆意の研究において従来持っていた考えを改訂すべきと思えをおくことといたします。
（広島大学大学院先進理工系科学研究科）

る結果を得ることができました。このような効果は、自分の得意分野で自分の研究目標に向かって直線的に進むよう2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて井上

元基

本研究はシクロデキストリン（CD）を用いたサーファク析出を経て界面に吸着することで液滴を安定化すると推察

タントフリーエマルションの実用化のため、エマルション

しました。したがって、エマルションの形成条件は限定的の安定化メカニズムの解明を目的としました。本エマルシで、形成される包接複合体の水または用いた油への溶解度

ョンはこれまでの検討では、固体が水／油界面に吸着するが低く析出しやすいことに加え、表面自由エネルギーの値

ことで液滴を安定化する Pickering エマルションの一種でが水または油のいずれとも近くないこと（いずれの相にもあることが明らかになっていたものの、エマルション状態

ぬれにくい）ことが明らかとなりました。本エマルション

での界面における析出物の組成は明らかとなっていません

を医薬品や化粧品として応用するには、上記条件に加え、でした。医薬品の分析法としても一般化しつつあるラマン

添加物との競合包接の可能性を考慮しなければならないと分光法を顕微鏡と組み合わせることでエマルション液滴表

言えます。実用化にはまだまだ課題の多い本エマルション

面の化学状態を検討しました。

ですが、包接複合体の溶解度ならびに表面自由エネルギー、

油／水界面に吸着する固体化合物の分析を行ったところ、包接のしやすさである安定度定数等のファクターを考慮し通常、Pickering エマルションは乳化剤として用いた微粒た機械学習を用いることで実用化に近づける可能性がある子がそのままの状態で水／油界面に吸着するものの、本エと考えています。

マルションは水中に溶解した CD と油分子と包接複合体の− 235 −

（明治薬科大学）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20202017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて内野

智信

この度、「ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけ究の権威である八田一郎先生（名古屋産業科学研究所）、

るナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討─放射光Bouwstra 教授と2014 年から大型放射光施設 SPring-8 に

X 線を用いたアプローチ─」に研究助成をしていただき、て 2 重層構造のベシクルを角層に適用した際の角層のラメ厚く御礼申し上げます。
「ナノ粒子に薬物を封入し、皮膚ラ構造とベシクル自身の構造変化についての知見を得るこから浸透させる」という研究は 1990 年代から盛んに行われとができ、本助成金をエントリーするための基盤となる研ておりますが、実際、「なぜナノ粒子に薬物を封入すると究をすることが可能となりました。その後も、2 重層構造

薬物の皮膚浸透性が向上するのか」というメカニズムに関をもつ多重層のベシクルは角層適用後に角層上で積層するする研究に関しては非常に多くの議論がいまだに続いていことを明らかにすることが可能となったり（本報告書）、2

ると感じておりました。私自身、Bouwstra 教授（オランダ・

重層構造を持たない液晶構造のナノ粒子製剤への本系の応ライデン大学）のもとに留学して以来、「ナノ粒子を用いた用が可能となってきたりと、この分野の研究が益々発展し

薬物皮膚浸透性の改善に関する研究」を続けておりますが、てきていると感じております。コスメトロジー領域におけ皮膚に適用するナノ粒子製剤は、製剤中に（薬物封入）ナノるナノ粒子の利用は今後も増えていくことが予想されるこ粒子として存在していても、実際に皮膚に適用した後、製とから、今後もこの分野の発展に微力ながら寄与していき

剤、薬物、皮膚がどのような状態になっているのか、そしたいと考えております。末筆ながら、本研究にご支援いたて結果的にどうして薬物の皮膚浸透性が改善されるのかをだいたことに重ねて感謝を申し上げるとともに、コーセー

詳細に評価する手法がなかなかなく、研究の進歩に苦慮しコスメトロジー研究財団の今後の益々の発展をお祈り申しておりました。そのような中、放射光Ｘ線を用いた角層研上げます。

（静岡県立大学薬学部臨床薬剤学分野）

2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて岡本浩明

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

えば、「化粧品として応用できる」などとして多様な材料がに採択していただきまして、誠に有り難うございました。

開発されていますが、その目標や目的に、本当に社会的な今回採択していただいた研究テーマは、低分子量の有機化

ニーズがあるのかと不安を覚えることが多々あります。

合物で、有機溶媒に加熱・溶解した後に放冷することで、このような不安を抱えながら、最近、フッ素系油が水に結晶化することなく、有機ゲルを形成する有機ゲル化剤のも油にも相溶しないことから、化粧品に用いられており、開発を目的としています。この有機ゲル化剤は、サーモト

低分子量のゲル化剤の研究例としてもフッ素系油を対象とロピック液晶材料の開発を進めている中で、偶然に発見ししたゲル化は稀有であることから、本研究課題の発想に繋た化合物で、従来から知られているゲル化剤とは大きく異がりました。本研究で開発した有機ゲル化剤は、リオトロ

なり、水酸基、カルボキシル基、アミノ基などの水素結合

ピック液晶材料とは異なるメカニズムでのゲル化が示唆さ性の官能基を分子内に持たない単純な分子構造の化合物でれていましたが、本研究助成を賜ったことで、形成したゲあり、何かしらの応用・展開ができるのではないかと考え

ルに関するレオロジー特性に関する研究は大きく進展するておりました。すでに、アミノ酸系や高分子系の多種・多ことができました。

様な材料が化粧品へのゲル化剤・増粘剤として実用化され新たな研究に対する駆動力を与えていただいたコーセーているようでもあり、そのようなニーズは、もはや存在しコスメトロジー研究財団と関係者各位には重ねて御礼申しないとも考えておりました。一方、大学において、新しい上げます。

物質や材料を研究・開発する際には、遠い目標として、例− 236 −

（山口大学大学院創成科学研究科）

コスメトロジー研究助成を受けて2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
紀和

利彦

私たちは、
「テラヘルツ波」と呼ばれる電磁波を用いた計

皮膚へ浸透するスピードを定量的に評価することが可能と測システムの開発に取り組んでいます。テラヘルツ波は、なりました。これにより従来に比べて化粧水の評価を迅速

300 マイクロメートル程度と可視光に比べてはるかに長い

簡単に実施することができ、新しい化粧水の開発に貢献で波長を持っています。近年、半導体工学、レーザー工学のきると考えています。

発展とともに簡単に利用できるようになってきました。

現在化粧品・美容に関する論文が急増しています。しかテラヘルツ波を用いる技術のひとつとして、断層を可視しながら、科学研究予算の観点では我が国の支援は遅れて化することができます。波長が長いために、可視光に比べおり、今回いただいたような助成は、大変ありがたく、まて散乱が少なく、皮膚などの複雑な構造を有するものに対た分野発展に重要な役割を果たされていると感じています。
引き続き、財団のご発展を祈念しております。

してアドバンテージがありました。

（岡山大学大学院ヘルスシステム統合科学研究科）

コスメトロジー研究助成を受けて、原理実証、基礎基盤技術を確立することができました。これにより、化粧水が2018 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
白神慧一郎

水は我々の生活で最も身近な物質であり、なおかつ H2Oを併せ持つテラヘルツ波は近年急速に応用開拓が進んでおというシンプルな化学構造を持つため現代科学では水の容り、テラヘルツ帯の分光情報が細胞・組織中の水の “質” を態を隅々まで理解できているとお考えの方も多いのではな

映し出すことに着目し、私は「生命に関わる水の役割を解いでしょうか。しかし外面の良さの反面、物理的性質に起き明かす」ことを目指して研究を行っています。皮膚は体源を有する水の本質は謎に包まれており、例えば水の密度

内から水の損失を防ぐバリアとしての役割を持つだけでなが 4 ℃で最大となる理由を巡って未だ長い論争が続いていく、皮膚そのものの機能が水の存在によって支えられています。そのため、今日隆盛を極める分子生物学をもってします。さらに皮膚の潤いは外観にも影響を及ぼす重要な因ても生物中で振る舞う “水” の生物学的な役割や機能に関す子であるため、皮膚の中で振る舞う水を正しく理解するこる知見はほとんど得られておらず、著名な教科書であってとは皮膚科学のみならず化粧品学にも微力ながら貢献を果も生細胞内の大半を占める水に関する記述は数行程度しかたせる可能性があると期待しています。最後になりました

見られないのが現状です。

が、本研究助成に採択していただいたコーセーコスメトロ

私は 2011 年に学部生として研究を始めて以降、主にテラヘルツ分光を用いて細胞中の水の物性評価に従事してきジー研究財団および関係者の皆様に心より感謝申し上げます。

ました。光と電波の中間周波数領域に位置し、両者の性質− 237 −

（理化学研究所生命医科学研究センター）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20202017 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
棚谷綾

この度は、コスメトロジー研究助成に採択いただき、誠子学生がたくさん入学してきます。ただ、学生の興味の大にありがとうございました。今回採択いただいた研究は、部分はメイク・ファッションとしての化粧品の領域に留まビタミン D の新規誘導体を創製する医薬化学研究です。私っており、素人レベルで空回りしていると感じています。

は今は理学部に所属しておりますが、薬学部出身です。私

今回の研究助成を受けたことをきっかけに、なんとか理学の学位の研究は有機構造化学の基礎研究でしたが、学生時部でも、学生の意識や知識、技術の改革を行い、専門的な代の所属研究室ではビタミン A の医薬化学研究を行って観点から化粧品に興味を持ち、将来、化粧品業界に貢献でおり、合成化合物が皮膚疾患やがんの治療に有効性を示す

きる人材の育成ができないかと考えるようになりました。

様子や医薬品化される過程を目の当たりにしてきました。

研究自体は、優秀な学生に支えられ、今回の研究助成の短学位取得後は工学部でのポスドクや東大分生研での助手をい期間にも、手間のかかる誘導体の合成を幾つも達成する

へて現職に就き、現在、主宰する研究室では、構造有機化

ことができました。精一杯頑張ってくれた学生達のために学と医薬化学研究を半々で行っています。医薬化学研究でも、研究成果を社会貢献につなげるとともに、彼女達を育はなかなか基礎研究の域を脱しませんが、今回のような研て社会に送り出すことが大切な使命であるとつくづく実感

究助成に採択されたことを励みに、学生とともに創薬の夢いたしました。研究の推進と、このような思いを抱く機会を持って研究していきたいと感じています。

を与えてくださいましたコーセーコスメトロジー研究財団

私が所属するお茶の水女子大学理学部化学科では、化粧に、心よりお礼申し上げます。
（お茶の水女子大学基幹研究院自然科学系）

品に興味があり、化粧品開発に携わりたいとあこがれる女

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
中島

章

筆者はこれまで「光触媒を用いた環境浄化」と「固体表面は、極めて限定的にしか行われていない。しかしながら一の濡れ制御」に関する研究を実施してきた。これらの知見

度ウイルスパンデミックが発生すると、ワクチンの接種がから、一昨年、希土類を含むモリブデン酸複合酸化物であ

医療機関で可能になるのには 6 か月以上を要し、その間はる LMO を合成空気下で焼成したところ、自己撥水性と抗各自が持ちこたえなければならない。
「予防」や「拡大抑制」

菌活性だけでなく、優れた抗ウイルス活性を長期間、暗所に関する研究は喫緊の課題である。また豚コレラ等の家畜下においても発現する、これまでにないまったく新しい酸へのウイルスの広がりも、人類の食糧供給に深刻な危機を化物環境材料であることを知見した。これらの研究を通じもたらす。たとえワクチンが開発・入手できても、耐性ウて抗菌・抗ウイルス活性の評価に関して KISTEC との共

イルスの発生や、ワクチン投与による食肉の信頼性低下を

同研究体制を確立し、今回の申請に繋がった。

招く。ウイルスとの攻防で今人類に必要なのは、ワクチン

治療法が確立されていない、今回の COVID-19 のよう頼みの発想や体制からのゲームチェンジであり、本研究でな新規ウイルスが我が国に入れば、国の存亡に拘わる危機開発できた抗ウイルス材料は、その切り札となり得る。

となる。これら各種ウイルスに対しては、すべての人が免

今回の貴財団から頂いた助成は、筆者にとっても、この疫を持っていないため、世界的な大流行（パンデミック）が内容に関する研究費が不足していた折であり、非常に有り

起きれば、大きな健康被害とこれに伴う社会的損失をもた難かった。頂いた経費を活用させて頂き、LCMO という新らすことが、今回の事例で明らかになったと言える。

規の抗ウイルス材料を開発することができた。本研究の成ウイルス感染症の治療法に関する研究は医療分野を中心

果はウイルス対策における単なる経済効果だけでなく、人に行われているが、その「予防」
や「拡大抑制」
に関する研究間社会がウイルスとの戦いにおいて新たな盾を手にすると− 238 −

コスメトロジー研究助成を受けて与えることになると確信している。

いう点において、極めて重要であると考える。さらに、近（東京工業大学物質理工学院）

年我が国で頻発する大規模自然災害等の被災地での衛生環
境確保の面においても、本研究の成果は有効な材料技術を2017 年度

研究助成

コスメトロジー雑感平井洋平

このたびは、貴財団から研究助成を賜りまして心より感られた知見をそのまま産業利用するのは危険ではないかと謝いたします。採択頂いた課題は表皮前駆細胞から様々の気になっておりました。また、現在は初代の表皮前駆細胞

表皮由来細胞へ分化誘導できる因子のスクリーニング系をも入手可能な状況にはありますが、この細胞も極めて不安

iPS 細胞から構築するといったものでした。これは、化粧定で高精度の実験が困難である可能性が指摘されていまし

品原料の活性評価には実験動物が使えず、また、表皮幹細た。今回得られた細胞は、正常な万能細胞を出発材料にし胞の未分化状態は安定して維持できないことを鑑みての提たもので、そういった意味では生体の表皮前駆細胞の挙動案でした。おかげさまで、dox/tet による BMP4 の発現誘を調べるのに最適ではないかと考えています。ただし、今導系と、目的分化を遂げた時に発現開始される物質のプロ回用いたのはマウスの iPS 細胞なので所謂プロトタイプにモーターを用いることで安定に維持・増殖できる iPS 細胞

相当し、実用化にはヒト ES/iPS 細胞の系が必要になるとから単純な処理で表皮由来の分化細胞が調製できることが思われます。
コスメトロジーという概念は、皮膚科学を含む極めて広わかりました。
もともと私がこれまでに行ってきたのは、体中の様々な範囲からのアプローチを受け入れるものであり、その中に細胞・組織の形態形成や、それに続く機能発現機構に関す

発生生物学や分子生物学も含まれると思います。これからるものでした。その中で、皮膚の細胞としては HaCaT 細も細胞の分化制御機構研究の深化が「コスメトロジー」の胞や初代表皮細胞を用いた経験があったのですが、培養下発展に大きく寄与できることを心より願います。
（関西学院大学理工学部生命医化学科）でのそれらの細胞挙動があまりにも違っているために、得2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて五十里

彰

この度、2018 年度研究助成をいただきありがとうござ

燥肌の保湿ケアにおけるコスメトロジーの観点及びアレルいました。皮膚顆粒層のバリア形成には、タイトジャンク

ギー性皮膚疾患の治療補助としてのファーマコロジーの観ションに発現するクローディンが重要な役割を担うことが点から、クローディン -1 を起点とした顆粒層バリアの維知られていましたが、その発現や機能の調節機構は大部分

持機構の解明が必要であると考えました。

が不明でした。クローディンには 27 種類のサブタイプが本研究助成において、細胞障害をほとんど誘発しない程同定されており、組織選択的に各サブタイプが発現してい度の紫外線照射や過酸化水素処理により、クローディン

ます。クローディン -1 ノックアウトマウスは、脱水症状-1 の発現量は変化しませんが、細胞局在が異常になるこによって生後まもなく死亡することが報告され、顆粒層バとを見出しました。この異常機構を解析し、プロテインキ

リアの形成にクローディン -1 が重要な役割を果たすこと

ナーゼ C の阻害による脱リン酸化機構が重要な役割を果たが明らかになっています。また、クローディン -1 の発現すことを解明しました。また、E3- ユビキチンリガーゼに量がアトピー性皮膚炎の症状と逆相関することが報告され、よるユビキチン化が、クローディン -1 の局在異常に関与皮膚疾患との関連も明らかになってきました。敏感肌・乾することを突き止めました。クローディン -1 の発現低下− 239 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020を抑制するだけでなく、その細胞局在の異常を改善する化成していただき、コスメトロジーのさらなる発展に寄与し合物は、皮膚の保湿ケアに有用であると考えられるため、ていただくことを期待しております。１年間大変お世話に今後のさらなる検討が期待されます。公益財団法人コーセなり、ありがとうございました。
（岐阜薬科大学生命薬学大講座）

ーコスメトロジー研究財団におかれましては、斬新な発想で重要な課題解決に挑戦するような研究課題を積極的に助2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて伊藤敦

このたびはコスメトロジー研究助成に採択していただき

ロンの高解像度で画像化することを行っております。酸化心より感謝申し上げます。申請課題は X 線顕微鏡による毛ダメージ産物を試料を破壊することなく高解像度で分布観

髪の UV 酸化ダメージの可視化に関する研究です。実験室

察することは他の手段では困難な X 線顕微鏡特有の観察方

内での研究と異なり、大型加速器である放射光の共同利用法です。本研究では UV による酸化ダメージにその手法を実験に参加するため、施設までの交通費、滞在費など、ま適用し、さらに UVA、UVB によって区別される波長領域

た、特殊な薄膜上に試料を装着するために特注品の薄膜にによるダメージの違いを明らかにすることを目的としまし

当初よりかなりの費用がかかるなど、通常の実験にくらべた。結果として、UV の透過度に応じて毛髪表面からのダて予算項目が随分偏ったものとなりました。しかし、本研

メージ分布の違いを示すことができました。加えて、通常

究助成では多様な研究方法にも柔軟に対応していただけたの太陽光照射試料においてもダメージが検出されました。

点は大きな特徴で、大変有り難く感じております。1 年間

このようなデータに基づいて将来的には、皮膚の UV 障害の助成ではありましたが、幸い夏前の第 1 回目の加速器利防止に UVA、UVB それぞれに対応したサンスクリーン剤

用実験からデータが得られはじめ、何とか秋の学会に成果が使用されているように、毛髪においてもそれぞれの UVを発表することができました。さらに短報でも学術雑誌にを考慮した防護剤が開発されるなど、さらに UV 防護の研投稿できればと考えております。

究開発が進展することを願っています。

私たちは X 線を用いて、毛髪の酸化ダメージをサブミク（東海大学工学部原子力工学科）2018 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
小暮

我々の研究をご支援いただき、ありがとうございました。

健太朗

さらに、イオントフォレシスは美容領域において「イオン本研究は、通常の文科省科研費などでは、助成対象になり導入」として認知され汎用されているようですが、ヒトへ難いテーマであるため、研究をご支援いただきとても助かの安全性に問題はないのかと疑問に思っておりました。しりました。これまで我々は、イオントフォレシス（イオンかし、それらの検討には経済的問題があったのですが、科導入）による経皮薬物送達研究に取り組み、高分子化合物

研費や一般の助成では、採択されることはありませんでしやナノ粒子の非侵襲的皮内送達に成功するとともに、イオた。そのような状況下で、貴財団のコスメトロジー研究助

ントフォレシス時の微弱電流が組織細胞の生理機能を変化成に採択していただき、イオントフォレシスによる皮膚へさせ組織細胞間隙の開裂や細胞取り込み誘導が起こることの影響を評価することで、微弱電流処理が皮膚に炎症などを明らかにしてきました。これらのことから、イオントフを惹起しない可能性が示唆され、安全な技術であることがォレシスが皮膚組織を様々に活性化するのであれば、炎症確認できたと考えております。我々は、本研究によってイなども誘起されるのではないかと常々思っておりました。

オントフォレシスの負の効果が否定されたと考えておりま− 240 −

コスメトロジー研究助成を受けてすが、正の効果についても調べる価値があると考えております。今後、これらの点にも着目して微弱電流の皮膚組織ます。すなわち、微弱電流によって皮膚組織細胞のシグナに及ぼす影響を詳細に検討したいと思っております。今後

ル伝達系が活性化されることで、皮膚の機能性関連因子、も、私共の研究へのご高配を賜りますようお願い申し上げ

例えばセラミドやコラーゲン・エラスチンなどの発現が誘ます。

（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

導され皮膚機能性が向上するのではないかと期待しており2017 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
佐々木

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に採択いただき、誠にありがとうございました。財団およ栄太

今後は当財団の研究助成者の名に恥じぬよう、自らの肌ケアにも注意しなければと思う所存です。

び関係者の方々に深く御礼申し上げます。海外でのポスド

さて、本研究課題においては、脂質過酸化物感受性蛍光

ク期間を経て、日本で助教として新しい研究プロジェクト

プローブを創出し、さまざまな酸化ストレスによって細胞を開始した直後のタイミングでこのような助成をいただけ内で生成する脂質過酸化物をイメージングする手法の開発たことは、大変ありがたく、また励みとなりました。

を目指しました。コスメトロジーにおいては、これらの酸

私のこれまでの人生においては、コスメトロジーという化ストレス状態の予防や、酸化ストレス状態から正常状態

言葉自体にあまり馴染みがなく、まずはその意味を検索すへの回復が重要な課題であると認識しております。実用的るところから始めました。公募要領の対象課題分野や過去

なプローブ開発にはまだ道半ばですが、将来的には活性酸の研究報告を調べると、実にさまざまな研究に関連するこ素を分解する働きを持つ抗酸化酵素や、内因性・外因性のとがわかり、財団の懐の深さに敬服するとともに、コスメ

抗酸化物質による肌機能の維持や回復の効果を検証するた

トロジーという分野に興味が湧いてきました。折しも私生

めにも、このような手法が有効なのではないかと考えてい活においても、30 代半ばを過ぎ、人は見た目も大事と説ます。今後もコスメトロジー関連の研究動向に注目しつつ、く妻から、肌の手入れについてレクチャーされるような研究を進めていきたいと考えております。末筆ながら、コ日々でありました。研究助成の採択を一緒に喜んでくれたーセーコスメトロジー研究財団の益々のご発展をお祈り申

妻も、まさか私がコスメトロジー関連の研究に応募していし上げます。

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

たとは思いもよらなかったようで、大変な驚きようでした。

2017 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
清水史郎

この度は、貴財団の研究助成に採択していただき、誠に「日本癌学会」「日本がん分子標的治療学会」「日本がん転ありがとうございました。新たな共同研究として発展する移学会」など “がん” に関連しているものが多く、必然的にことができる挑戦的なテーマに取り組むことができました。

研究対象タンパク質が、がんに関連したものになりがちで

以下、多少抽象的ではありますが 2 年間の雑感を記したいす。中でも着目している研究は C-mannosylation というタと思います。

ンパク質の糖修飾で、これまでにいくつかのがん関連タン

ご存知の通り、質量分析法の発展により微量なタンパク

パク質を解析してきました。そんな時に研究室の学生から

質翻訳後修飾の検出が可能となり、網羅的な解析がなされ「このタンパク質の解析をしたい」とがんに関係ないコスメ

るようになってきましたが、個々のタンパク質に対する検トロジー分野の提案を受け、「やってみよう！」と思いスタ

証はまだ十分ではありません。私は、所属している学会がートしたのが本研究課題です。運よく、目的タンパク質は− 241 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

C-mannosylation されており一安心でしたが、がん関連タてきました。私のコスメトロジー研究は始まったばかりでンパク質ではないので研究の進め方がこれまでと異なり、

すので、これからも様々なものを吸収していきます。
（慶應義塾大学理工学部応用化学科）

解析が止まりそうになりました。そんな折、学外の多くの共同研究者の先生方との縁で、やっと研究のゴールが見え2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて下田浩

解剖学の教育と研究を生業とする小生のバックボーンときのベクトルをもった創る解剖学を目指しています。そこなっているものの一つに「Beauty is truth, truth beauty」

で作られるプロダクトは薬剤・再生医療材料・化粧品・化という言葉があります。イギリスの詩人 John Keats の成品の開発や実験動物代替研究モデルへの応用が期待され

Ode on a Grecian Urn の末節に記された言葉ですが、彼ます。これまで独自の細胞集積法を用いて様々な組織を創は自然や人間の美をこよなく愛し、追求したとされていま出してきましたが、この度拝受いたしました研究助成で脈す。人（自然）の形態を研究対象とする解剖学はまさに人（自管網を有するヒト皮膚に類似した立体組織を短期間で簡便然）の美を追究する学問であり、研究結果が真実かどうかに作製できる新たな手法を開発し、血管網の付与が皮膚組迷う時は常にその言葉をもって美しいものが真実であると織全体の形態・機能の成熟化に有効に働くことも確認する

信じています。そして、その思いは数十年来全く尽きるこことが出来ました。これもひとえにコーセーコスメトロジとがありません。人の美と健康を探究するという姿勢は解ー研究財団の多大なるご支援によるものであり、関係者の剖学とコスメトロジーに共通するものと感じ、今回「革新皆様に改めて深謝申し上げます。美しい皮膚組織の再現に的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発」については未だ改善すべき点も多く、道半ばですが、私共の三次元研究助成申請をさせて頂きました。

皮膚モデルが近い将来必ずやコスメトロジーの発展に貢献

解剖学は一般的に人体の成り立ちを分解していくイメー

できますように、今後も精進していく所存です。

ジが強いように思われますが、私たちはそこで得られた知（弘前大学大学院医学研究科生体構造医科学講座／神経解見を基に人体の美しい組織を創り出す、これまでとは逆向剖・細胞組織学講座）

2017 年度

研究助成

日焼け止め化粧品、肌荒れと日焼けの悩ましい二択
白土
住吉

明子
秀明

海外でポスドクをしている友人を訪ねた際、一番喜ばれ壊されるので強くこすらないようにしましょう」化粧品のたのは、彼女の地元の和菓子でもお茶でもお箸でもなく、パッケージには、このような注意書きがあります。
「日本

旅行カバンに入れたまま使わずにいた日本製の日焼け止め

製は肌にやさしいのよ、どうしてかしらね」と友人と話すでした。友人曰く、こちらは日差しが強く日焼け止めが必

うちに、日焼け止め成分が皮膚の細菌に作用して、バリア

要だが、どれを使っても肌が荒れてしまうそうなのです。

ではなく良からぬ物質を作って肌を刺激しているかもしれ

私自身も日焼け止めで皮膚がかぶれたりかゆみが出ることないと、肌に保湿剤を塗りながらおしゃべりしていました。

が多く、サンプルをいくつも試した上で、今は子供用を使

その後に貴財団の助成金に採択いただくことができ、子供っています。一方で、日焼け止めは防水効果も強く、日焼の頃からの「日焼け止めを塗ると肌が痒くなる、塗らない

け止めを洗い流すためには洗顔料でしっかり洗う必要があと焼けてヒリヒリする、悩ましい問題」への、小さな仮説ります。「皮膚の表面には常在細菌が住んでいてバリアをを調べる機会をいただきました。今回の研究でその全てに作ってお肌を守っています。洗顔しすぎるとこのバリアが答えることはできませんでしたが、日焼け止め成分が、細− 242 −

コスメトロジー研究助成を受けて菌の受容体経路の活性と遺伝子発現を変化させること、そ

肌の恒常性を乱す因子が生じないよう、皮膚の常在菌にものような経路には細菌毒性を担う種類が含まれていたこと着目することにより、これまで以上に安心して利用できるがわかりました。日焼け止めはおしゃれのために肌を白く

日焼け止め化粧品が開発されることを、消費者の一人とし保つことよりも、昨今は皮膚がんをはじめとした健康上のて心待ちにしています。
（北海道公立大学法人札幌医科大学）

リスクを減らすために老若男女多くの方が使っています。
肌で生じた各種のラジカル群やタンパク質分解酵素などの、2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて世戸孝樹

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団（旧コスメ

よる光毒性惹起の重要なファクターとして知られておりま

トロジー研究振興財団）の研究助成に採択していただき、す。露光部位への曝露について信頼性の高い評価を達成す

厚く御礼申し上げます。今回、助成対象としていただきまるには未だ動物実験あるいは今回の研究で使用した動物組した研究は化学物質による光毒性リスク予測に関する研究

織を用いた実験が避けられないのが現状です。しかしながでございます。近年強い関心を集めている動物福祉の観点

ら、科学技術の発展により生体内の組織を模倣した 3D 培から、光安全性評価においても動物実験に依存しない評価

養組織、あるいはヒト皮膚などの生体膜を模倣した人工膜手法を開発し、社会に貢献したいという一心で研究に取りの開発も進んでおり、これらを利用した in vitro 皮膚曝露

組んでおります。特に 2019 年に私が所属している研究室

評価法の確立により、完全に実験動物を使用しない評価系

にて開発しました reactive oxygen species（ROS）assay がの構築が可能になってきつつあります。今後も様々な技術

OECD TG495 として採用され、多くの化学物質の光安全を応用し、化学物質による光毒性のメカニズムの解明なら性試験に適用できるようになりました。本手法は光毒性化

びに実験動物に依存しない光安全性評価系の構築を目指し、合物の特性の一つである化学物質の光化学的な反応性を評

さらなる検討を推進し、光安全性に優れた製品開発に貢献価することで光毒性リスクを予測することができます。一していきたいと考えております。

方で皮膚や眼などの露光部位への分布や蓄積も化学物質に（静岡県立大学薬学部薬剤学分野）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて田中

沙智

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成有し、ポリフェノール類の一種であるプロシアニジン B2に採択していただき、誠にありがとうございました。コス

（PCB2）とガレート基を有する PCB2 に着目し、これらのメトロジーに関連する研究を進めるにあたり、貴財団より

T 細胞の機能制御への関与について解析を行ってきました。

大変心強いご支援を賜りましたことを心より感謝申し上げ

その結果、PCB2 ガレートは T 細胞に直接作用し、慢性炎ます。

症や自己免疫疾患に関わるサイトカインの産生を抑えるこ

私は、食品由来成分の免疫系に対する影響について免疫とを明らかにしました。本研究では、これらの知見を生体学・食品科学の視点から明らかにする研究を展開しており、内で評価するための実験系を確立するために、イミキモド

食による免疫機能調節効果および免疫関連疾患の予防法の誘発乾癬モデルマウスをつくり、ポリフェノール類の摂取確立を目指して研究を進めています。その中で、食品由来

による乾癬抑制効果について検討を行いました。今後は、成分の一つであるポリフェノールの化学構造と生理作用に

PCB2 ガレートによる乾癬抑制のメカニズムについて詳細

関する研究を進めており、りんごやブドウ、緑茶などに含を明らかにしたいと考えています。ご協力くださいました− 243 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

共同研究者の先生方や研究室の学生に深く感謝するととも最後に、本研究をご支援いただいたコーセーコスメトロに、今後は、研究成果を論文や学会などで発表し、その成ジー研究財団および関係者の皆様に心より御礼申し上げま果を社会に還元できるよう邁進していきたいと思っておりす。

（信州大学農学部）ます。

2017 年度

研究助成

視野を広げたコスメトロジー研究助成野口範子

私は、生体の酸化ストレス障害のメカニズムと、ビタミ“オートファジー” が関与する非典型的な分泌機構により、ン E をはじめ様々な抗酸化物質の酸化障害抑制メカニズム

DJ-1 が分泌されることを明らかにしました。今後さらにに関する研究を行ってきました。2000 年前後から、血管研究を重ね、発信をすることにより、DJ-1 というタンパの内皮細胞を様々な脂質酸化生成物や抗酸化物質で刺激しク質を介してコスメトロジーへの関心が高まるよう努力をた時の遺伝子発現について、DNA マイクロアレイを用い続けたいと考えています。私の研究室では、DJ-1 は家族て網羅的解析を行い、動脈硬化を促進もしくは抑制する因性パーキンソン病の発症に関係する遺伝子がコードするタ子の発見に努めてきました。その後、研究対象が動脈硬化

ンパク質として注目してきました。研究は思わぬところでからアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾つながっていたり、面白い流れができたりするものである

患に移行しました。そんな中で、コスメトロジー研究助成

ことを、コスメトロジー研究助成を受ける中で体験するこに出会い、自分の知識や経験そして技術を活かして、どのとができました。最近、私の研究室の学生が就職する業種

ようにコスメトロジーに貢献できるか深く考える機会を得に化粧品関係が増えてきています。興味深いことに、本人て、視野が広がり、また新しい分野に挑戦することができの研究は、直接コスメトロジーをテーマにしているわけでました。今回採択いただいた研究は、皮膚の細胞で保護作はないのです。おそらく研究室のゼミにおいてコスメトロ

用を示すことが明らかになった DJ-1 というタンパク質のジーが話題に出る中で、学生の視野も広がっているのでは分泌機構を明らかにすることを目指したものです。2016

ないかと推察しています。

（同志社大学生命医科学部）

年に大隅良典先生がノーベル生理学・医学賞を受賞された

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
原口

省吾

私はもともと神経科学系の研究を行っており、脳内で合生殖腺や副腎から血流に乗ってやってきたステロイドホル

成されるステロイドホルモン、ニューロステロイドについモンを基質として臓器特異的な代謝を行うことで、臓器のて研究を行っておりました。しかし現所属である昭和大学

機能発現を助けています。

医学部生化学講座に着任したのを期に、それまでとは異な皮膚機能の制御にもステロイドホルモンが重要なことはる研究を立ち上げようとしてはじめたのが、本研究助成をよく知られており、女性ホルモンであるエストラジオール

頂くことになった皮膚でつくられるステロイドホルモンのがコラーゲン産生を促すことから、女性ホルモン様の作用研究です。

を持つ大豆イソフラボンが化粧品に使われたりしています。

ステロイドホルモンというと精巣、卵巣、副腎でつくら他にも男性型脱毛症において頭皮の 5 α- リダクターゼによれることがよく知られていると思いますが、ヒトのほとん

り代謝されてできる 5 α -DHT が脱毛を引き起こすことかどの臓器にはステロイドの代謝に関わる酵素が発現していら、5 α - リダクターゼ阻害剤が治療に使われています。

ます。これらの臓器で発現しているステロイド代謝酵素は、一方で、皮膚にステロイド産生系が存在することは以前− 244 −

コスメトロジー研究助成を受けてより分かっていましたが、血流にのり皮膚にやってくるス

分かってきました。今後は古くから存在が知られていた割テロイドの働きと、皮膚がつくるステロイドの働きの切りに何をしているのかよく分かっていなかった皮膚ステロイ

分けが難しく、皮膚のステロイド産生系の意義には良くわ

ド産生系の機能解析を進めることで、皮膚の健康や美に貢からない部分も多くありました。しかし、本助成により行献できるような研究を展開していきたいと思います。

った研究から、皮膚のステロイド産生系はステロイド濃度の変化を感知するセンサーとしての役割があり、皮膚のス

最後になりましたが、ご支援を頂きましたコーセーコス
メトロジー研究財団に改めて感謝申し上げます。
（昭和大学医学部生化学講座）

テロイド量の恒常性を維持しようとする機能があることが2017 年度

研究助成

妊娠中の化粧品との上手な付き合い
樋浦

仁

妊娠中に使用する化粧品、薬剤は胎盤を通して、長期間し、ばく露回避に必要な基礎資料として活用することで、蓄積し、胎児へと移行する。そのため胎児の発育や出生後リスク管理を実現することが可能と考えられます。また、の成長、精神・神経学的な発達に影響を及ぼす可能性をは

出生児の健康問題に不安を抱く両親に対し適切な情報を提らんでいます。また、我々を含め世界中の数多くの研究者供することもでき、その社会的にも意義は大きいと考えらが、ヒト胎盤に関する研究を行っています。しかし、胎盤れます。また、妊娠中の安全な化粧品の開発に大きく貢献

組織は母体組織の混入が多いため、研究結果に再現性が見するだけでなく、周産期異常をもたらす他の疾患のモデル

られず、研究者間で報告が異なることがしばしば見られま

細胞作製および病態解明へと道を開くものと確信しています。また胎盤の機能解析には、従来初代培養細胞や絨毛癌す。

細胞を使用し、それより得られた様々な情報から正常細胞

最後に、ごく最近、国内の化粧品会社の研究員から相談での機能を類推するという方法あるいは遺伝子変異マウスを受け、当研究室で一緒に研究したいとの依頼を受けまし

胎盤の病理組織学的解析により行われてきました。しかし、た。大学との話し合いの結果、本年 4 月からクロスアポイ

これらの研究結果をそのまま正常の機能と考えるには無理

ントメント制度を利用し、教員として働くことになりましがあります。ヒト胎盤幹細胞は、これらの問題を克服し、た。今回の申請の成果が若手人材育成につながったものとヒト胎盤の発生、機能に関する研究を行う上で必須な細胞

信じています。今回コーセーコスメトロジー研究財団の研ツールとなると考えられます。本研究成果では、ヒト TS

究助成に採択頂き、深く感謝申し上げます。今後更なる努細胞を用い、胎児への有害事項を明らかにすることです。

力を続け、ヒトの健康に関わる成果を上げたいと考えてい

仮に有害であることが判った場合、そのリスク情報を公表ます。

（東北大学大学院医学系研究科）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
藤井博

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス

明を目指したものです。得られた研究成果は、保湿効果やメトロジー研究財団の研究助成をいただき、深謝いたしま

アンチエイジング作用を有する化粧品の開発など、コスメ

す。

トロジーの発展に貢献する可能性が期待されます。

本研究は、皮膚の恒常性維持において重要な表皮基底層

FABP5 は、脂肪酸の細胞内輸送に関与しており、表皮幹細胞および TA 細胞のマーカー遺伝子として同定された

有棘層、顆粒層および皮脂腺などで発現し、皮膚の水分保上皮細胞型脂肪酸結合タンパク質（FABP5）に着目し、表護バリアー形成や脂質代謝制御において重要な機能を果た

皮角化細胞におけるこの遺伝子の発現と機能制御機構の解していることが示唆されていますが、詳細な分子機構は解− 245 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

明されていません。幹細胞が分化した TA 細胞は、幹細胞メカニズムの解明にも貢献する可能性が期待されます。

に比べて高い増殖・分化能をもち、皮膚の創傷治癒力や老また、がん細胞の起源は組織幹細胞であるとする説が提化において極めて重要な機能を果たしていることから、皮唱されていますが、本研究課題の成果は、正常皮膚幹細胞

膚の表皮基底層幹細胞・TA 細胞および表皮角化細胞の恒の老化やがん化のメカニズムの解明にもつながる可能性が

常性維持機構（維持・増殖・分化機構）の解明は、コスメト

期待されます。このように、本研究課題の所期成果は、コ

ロジーの発展に貢献するだけではなく、生命現象の基本的

スメトロジーおよび医療分野におけるイノベーション創出

メカニズムの解明にもつながる可能性が期待されます。さ

に貢献する可能性が期待されます。本研究課題をさらに発らに、本研究課題の所期成果は、FABP5 および核内受容展させるために、今後より詳細な解析を続けたいと考えて体シグナル（PPARβ/δ, ERRα など）の破綻に起因する皮膚います。

疾患（がん、乾鮮、炎症など）の予防・治療法の開発や老化（信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所）

2017 年度

研究助成

Treg 研究とコスメトロジー
堀昌平

このたびはコーセーコスメトロジー研究財団の 2017 年

においても重要な役割を担っていることが明らかにされて度研究助成に採択していただき、誠にありがとうございまいます。このことからも、Treg 研究はコスメトロジーのした。私はこれまで専ら免疫学分野において制御性 T 細胞

世界においても今後重要になってくるのではないかと思っ（Treg）という免疫応答を抑制的に制御する T リンパ球サております。私が Treg 研究に取り組み始めたのは 22 年前

ブセットの研究に取り組んでまいりました。Treg の異常になりますが、当時このような研究の広がりを見せようとは自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、がんなど様々

は夢にも思いませんでした。今回いただいた助成金は専らな疾患の発症に深く関わっていることから、近年世界的に皮膚における Treg の集積機構と炎症制御機構の解析に使大きな注目を集めており、研究が進んでいます。マウスにわせていただきましたが、得られた知見をさらに発展させ、おいてもヒトにおいても Treg 分化と機能を司る “マスター

コスメトロジーの発展に貢献できればと思います。最後に転写因子” Foxp3 の遺伝子変異により激しい皮膚炎が発症なりましたが、本研究をご支援いただいたことに改めて深することからも、皮膚における炎症制御に Treg が中心的

く御礼申し上げるとともに、コーセーコスメトロジー研究な役割を担っていることがわかります。また近年、皮膚に財団のますますのご発展を祈念申し上げます。

は Treg が多数存在しており、その役割は免疫制御を超え（東京大学大学院薬学系研究科）て、毛包幹細胞の維持や創傷治癒など、皮膚の恒常性維持2018 年度

研究助成

有機化学と食品化学の融合がもたらしたもの水野雅史

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

我々の研究室では、これまで腸管からの吸収状態を反映

事業に採択頂き、誠に有り難うございました。今回採択頂させた疑似モデルを開発し、炎症やアレルギーが発症した

いた課題は、皮膚改善効果を有することが知られているセ条件下での食品因子の機能を明らかにしてきた。その成果

ラミド中のスフィンゴイド塩基に相当するスフィンゴジエ

としては、キノコ由来の高分子多糖である β -グルカンがンの立体異性体のうちどの構造が生理活性を有するのかを

腸上皮細胞に発現しているグルカン受容体を介して認識さ明らかにするため、有機合成分野と食品化学分野が融合しれ、基底膜側に存在する腫瘍壊死因子（TNF）-α を認識すて解明にあたった当研究室として初めての試みであった。

る TNF 受容体の発現を抑制することで、炎症状態への反− 246 −

コスメトロジー研究助成を受けて応を緩和していることなどを明らかにしてきた。また、植できた。このことは、今後我々の研究室における研究発展

物由来のグルコシルセラミドに関しても腸上皮細胞から吸の礎になる共同研究として位置づけられ、貴財団研究助成

収・代謝されて生成されたスフィンゴイド塩基が活性成分のお陰と感謝している次第です。

であることを明らかにしてきた。しかしながらこのスフィ最後になりましたが、本研究に対してご支援下さいましンゴイド塩基の部分には立体異性体が存在していて、どのた公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団および関構造が活性に寄与しているかを明らかにする手段がなかっ

係者の皆様に感謝いたしますと共に、化粧品学の発展をおた。しかしながら今回申請をするにあたって、同研究科の祈り申し上げます。
（神戸大学大学院農学研究科食品・栄養化学）

他分野（有機合成）と初めて共同研究をすることで、シス・シス体が最も活性を有していることを明らかにすることが2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて村田

このたびは、コーセーコスメトロジー研究財団より大変貴重な研究助成をいただき、心より感謝申し上げます。
私事ではありますが、大学院博士課程3年次（2014年8月）

光麻その状況では研究に十分な時間をとれなかったため、学術振興会の特別研究員（RPD）に申請するとともに、本研究助成にも応募しました。

に、第一子が誕生しました。双方の両親は遠方に在住し、このような、不安定な状況の駆け出しの研究者に対して

妻も研究者として働いていることから、2014 年10 月- 2015

も、十分な研究の機会をいただけた財団の懐の深さに感銘

年 3 月の半年間、休学して育児に専念し、その後も均等にを受け、なんとか研究者として自立したいと考えてこの期育児をしています。そのため、博士論文の提出が遅れ（博間を過ごしました。今後も、申請者の立場に寄り添った支士過程 5 年次：2017 年 3 月）
、十分な就職活動ができず、援を続けていただけると大変嬉しく思いますし、さらなる2017 年 4 月時点では、自費研修員の立場で、大学病院で医支援の拡大への期待をもって所感といたします。

師として臨床業務を併務しながら研究を継続していました。

（京都大学大学院医学研究科皮膚科学講座）

2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
茂木精一郎

この度は、コスメトロジー研究助成に採択頂きまして誠の虚血、酸化ストレス障害に注目し、その後の皮膚障害・にありがとうございました。お蔭で今後の研究の基盤とな

皮膚潰瘍の発生を少しでも予防、抑制できるような薬剤をる研究成果を得ることができまして、関係者の皆様に心よ

開発することができれば、医療費や人件費、労働量の削減

り感謝致します。

につながるのではないかと考え今回の研究を着想しました。

既に人口の 4 分の 1 が 65 歳以上という超高齢者社会をさらに今回の研究成果によって、紫外線などで誘導される

迎えている我が国においては、人口の高齢化に伴って、皮皮膚酸化ストレス障害によって促進される皮膚老化を予防

膚の虚血障害によって生じる病変（褥瘡や末梢循環障害なできるような革新的な薬品、化粧品の開発に貢献できればど）を有する患者数も増大し、予防・治療・管理の重要性幸いです。

はこれまで以上に高まると考えられます。老化による皮膚− 247 −

（群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20202017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を拝受して森山

博由

本研究助成は、これまで我々が培ってきた基礎皮膚科学

さらに、そこから紡ぎ出せた結果について、それらが例えの研究の歩を支援していただけたことに限らず、いくつか芽吹く程度のものであったとしても、実社会での何らかのの基礎研究成果を実効性の高い実用化研究へ応用することニーズを満たす効能効果にアクセスすることが可能か否かへの思慮を真に見出す契機にもつながるなど、その効果はについて考えを議論する場を与えるなど、若い研究者の卵

資金面から社会貢献の在り方にまで波及するたいへん有りを巻き込んで、基礎研究が社会貢献につながる可能性にも難い福音となった。

考えを巡らすことができるようになったことは、まさに“新基礎研究を推進するには当然にその研究資金の効果的なたな再発見” であった。このようなタイプの研究助成のご配分が必須であり、同時に何をどのように優先的に進めて支援があるからこそ、基礎研究と社会がつながるきっかけ

いくのかが肝要になる。この方向性を再確認させていただが生まれ、社会に寄り添う科学の種が芽吹くのだと実感しいたのも本研究助成の支援が大きい。公的な資金との棲みた。

分けや関連性を意識しながら、研究の歩を着実とするため

本研究助成には是非今後も多くの研究を支援していただの連携・連動性について、改めて認識を深め、適時適所のき、香粧品学の裾野を広げる活動から新規性の高い開発型

再構築を施すことができた。これにより律速があった実験の画期的な研究成果を生み出す原動力となるよう、心からもある程度円滑に稼働できるようになったことは大きく、の御礼とともに今後の研究支援のご事業の発展を心よりおある種研究室を運営する体制づくりの再構成にも貢献した。

祈り申し上げる。

（近畿大学薬学総合研究所）

2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
山上淳

このたびはコスメトロジーの研究助成をいただき、誠に線を担い、真皮の膠原線維と弾性線維が皮膚の弾性に主要ありがとうございました。この研究課題は、表皮細胞間接な役割を果たしていることが知られています。しかし、そ着分子の発現増強条件の検討から総合的に皮膚機能を評価の一方で今まで表皮における細胞間接着が注目されることする計画で、得られた成果はさまざまな側面からコスメトは少なく、今回の研究が新しい分野を開拓する一つのきっ

ロジーの発展に貢献できると考えております。

かけになればと考えております。これからの日本は、かつ表皮細胞間接着は皮膚の基礎機能であり、より強固な接てないほどの高齢化社会を迎えることになります。老齢の着機能を持つ皮膚を保つにはどうすればよいかという知見域に達しても健康でみずみずしい皮膚を保持するのは、すから、長く皮膚の健康を維持するための情報を蓄積していべての日本人にとって大きな関心事になってくるでしょう。

くことが不可欠です。今回の研究で、ステロイドが表皮細今回の研究から得られた表皮細胞間接着強化の条件検討の

胞間接着分子の発現の増加を通じて、細胞間接着の強化に

結果は、将来の日本人の皮膚の健康維持において重要なデ関与することが解明されたことから、ステロイドと同様のータとなることが期待されます。

効果を発揮しうる化合物を探索することにより、新たな化

今回の研究助成をいただいたことへの感謝を忘れず、こ粧品開発戦略・製品品質管理に関する新しい情報を発信でれからますます多様化が求められるコスメトロジーに少しきる、という可能性を提示できました。コスメトロジーにでも貢献できるよう努力してまいります。

関わりの深い分野として、角層が皮膚のバリア機能の最前− 248 −

（慶應義塾大学医学部皮膚科学教室）

コスメトロジー研究助成を受けて2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて山本

圭

このたびは、コスメトロジー研究・研究助成金をいただ

解明する研究に取り組みました。初めて出会った遺伝子改

きまして、ありがとうございました。研究室を 2016 年に変マウスが「禿げ」であったことから皮膚科学領域に興味を立ち上げ 2 年目となる時期に貴財団からの研究助成は大き持ち、10 年かけて皮膚バリアを制御する新しい生理活性な励みになりました。私はこれまでに脂質に着目した基礎

脂質リゾプラズマローゲンの発見に至りました。遺伝子改研究を続けてきたため皮膚を対象とした皮膚科学やコスメ

変マウスの表現型解析は派手な表現型が論文として纏めや

トロジーとは全く無縁でした。大学院の修士課程では屠畜

すく、しかも病態に直結すればなおさらのことです。今回、場からいただいてきたブタの血液から精製した脂質代謝酵

コスメトロジーという観点からこれまでの研究を見直すと素の性質を、放射標識した脂質を基質として調べる研究を

リゾプラズマローゲンに隠れて皮膚の恒常性を制御する新おこないました。博士課程では研究材料はブタから培養細しい生理活性脂質の影が見えてきました。今回の研究報告

胞にかわりましたが、基質とする脂質は相かわらず放射標には載せることは出来ませんでしたが、近いうちに発表し識した脂肪酸でした。大学院を卒業し留学や研究所を渡り

コスメトロジー分野に貢献していきたいと考えています。

歩き、2005 年頃からは脂質代謝酵素ホスホリパーゼ A2 の（徳島大学大学院社会産業理工学研究部（生物資源産業学域））

生体内機能を遺伝子改変マウスや質量分析装置を駆使して2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
善本

隆之

2013 年に発表された EU での化粧品開発における動物するには、より工夫が必要である。例えば、皮膚で抗原刺実験の全面的禁止により、近年、医薬品や化学物質等の安激を受けた樹状細胞は、所属リンパ節に移動して初めてそ

全性評価に関する in vitro 試験代替法の開発が産業界のみの抗原特異的なナイーブ CD4+T 細胞に遭遇し、活性化しならず社会的にも急務とされている。接触皮膚炎を誘導す

増殖と分化を誘導する。さらに、免疫毒性試験法のゴール

る作用機序は、比較的よくわかってきており、その有害性

ドスタンダードと考えられている T 細胞依存性抗体産生

発現経路（AOP）も既に報告されている。それ故、その（TDAR）試験法では、さらに抗原に刺激された CD4+T 細

AOP に基づいた複数の動物実験代替法が既に OECD のテ

胞が B 細胞を刺激し、抗体産生細胞に分化誘導し、産生さストガイドライン（TG）に採択され、正に今日、実際にこれる抗体量を測定する方法である。いずれにおいても、免れらの TG を用いたデータが認可の判断として使われつつ疫細胞の移動を in vitro でも考慮することは重要である。

ある。ところが、これらの代替法は、それぞれ単独では、

最近、この点も考慮可能なマイクロ流路で繋いだチップ上従来の動物を用いる試験法を代替することは不可能である

で人体の生体システム全体を再現する Human-on-a-chipとされ、そのため、AOP に基づいた複数の方法の組み合に関する研究も盛んであり、近い将来には究極の動物実験

わせ（IATA）によるより厳密な評価が必要とされている。

代替法になるのかも知れない。

つまり、OECD の TG は、特殊技能は不要で誰にでもでき

最後に、私どもの研究に対してご支援を賜りました公益

る単純な試験法であることが必要不可欠ではあるが、免疫

財団法人コーセーコスメトロジー研究財団および関係者の反応は複雑で、免疫細胞が時空間的に体全体を移動するこ

皆様に、心より感謝申し上げます。

とにより起こる現象であるため、それを培養細胞系で再現− 249 −

（東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20202018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて若松

一雅

今回の助成のテーマを考えたきっかけは、2013 年にロナーゼ活性と相関するため、チロシナーゼ活性が高い細胞

ドデノールを含有する化粧品による「まだら白斑」の発症例

ほど強い細胞傷害を受けることがわかりました。メラノサが起きたことによります。ロドデノール（RD）は、美白成

イトが特異的に傷害される詳細な機序には、1）RD の o- キ

分として化粧品に含有されていました。なぜ白斑が起こる

ノン体がグルタチオンやタンパク質の SH 基に付加し、修のか、その原因を探るために、RD 代謝物を化学的に検討飾されたタンパク質が抗原となって免疫応答が誘導されメすることになりました。この誌面を借りて当時の RD 研究

ラノサイトを特異的に攻撃すること、2）o- キノン体が小を総括したい。

胞体ストレスを誘導しメラノサイトのアポトーシスを誘導2013 年 RD を配合した薬用化粧品の使用者に白斑の症例すること、3）RD の脱色素斑病変部に認められた CD4 あが確認され、製品との関連が疑われたためメーカーによる

るいは CD8 陽性細胞などの免疫細胞浸潤から細胞傷害性

製品自主回収が行われました。RD はメラニン生成を抑制

T 細胞がメラノサイトを特異的に攻撃することなど様々なする医薬部外品の有効成分（いわゆる美白剤）
として開発さ

報告や考えがありますが、いずれもその引き金となるのはれ、2008 年の承認後 2 ％配合の薬用化粧品が上市されてチロシナーゼの働きで生ずる反応性の高い o -キノン体であいました。問題を受け、厚生労働省研究班、日本皮膚科学ると考えられました。

会を中心に、原因究明のための基礎研究、臨床研究及び疫

皮膚への接触性白斑や色素脱失を誘発する化学物質は学調査が進められ、これらの結果、RD の白斑発症機序がL- チロシンに似た構造を持つフェノールもしくはカテコ

徐々に明らかになってきました。

ール類であると言われています。先にも述べましたが、接RD は、メラニン生成の出発物質 L- チロシンに似た構造

触性白斑の作用機序は単一の経路ではなく、また o-キノンを持ち、チロシナーゼ活性を阻害し、メラニン生成を抑制

体の生成反応以外にも化合物の経皮吸収性や代謝物の細胞します。しかし、RD 白斑部位の病理組織所見では、脱色内蓄積など、化合物の白斑誘発リスクの評価に際して考慮

素斑病変部ではメラニンだけでなく、メラニンを生成するすべき要素は複数あります。今回のレスベラトロールおよ

メラノサイトそのものが減少、消失していました。このメ

びエクオールの研究は、RD の上記の研究結果を元に行う

ラノサイトの減少は、メラノサイト内のチロシナーゼがことができました。今後もフェノール性化合物がチロシナ

RD を代謝し RD - キノンおよびヒドロキシ -RD を生じ、そーゼの基質になり、毒性代謝物の産生を証明し、これらのの強い細胞毒性によって細胞死がもたらされた可能性が示化合物を皮膚へ塗布する危険性について注意を喚起したい唆されました。この RD からの o - キノン体の生成はチロシと思います。

（藤田医科大学）

2017 年度

研究助成

コスメトロジー雑感麻生典

この度はコーセーコスメトロジー研究財団研究助成を頂ものの、現在のフランスの香気に関する産業の一断面をう

きまして誠にありがとうございました。私の専門は法律でかがい知ることができました（フランスにおける香水の調

すが、化粧品学との関係でも法律は切り離せません。その香を知るには、エドモン・ルドニツカ（著）曽田幸雄（訳）『香

中でも私は知的財産法を専門としており、この度は香りのりの創造（文庫クセジュ）』（1988 年、白水社）が非常に良法的保護について研究助成を頂きました。

い本です）。フランスは我が国よりも香りに関する関心が研究助成を頂き、フランスでの香水の調香現場の調査を

産業的観点からも非常に高く、その価値を法的に保護しよ行うことができました。フランスでの香水の文化的意義やうとする指向も強い国です。実際、香りの法的保護につい調香手法などを調香師から直接伺い、香水に限定はされるて多くの論文が公表され（テーズと呼ばれる博士論文も存− 250 −

コスメトロジー研究助成を受けて在しています）、定期的に、その保護のあり方についてシもかかわらず、不思議とその保護を指向する動きが加速す

ンポジウムで取り上げられています。

る気配はありません。

他方、我が国においては、香水だけでなく化粧品等も含

今回の研究では、諸外国の法的保護等の探究に留まり、め、その香りの法的保護についての議論は低調です。特許

我が国でそうした議論が盛り上がらない産業的背景までは権で芳香物質を保護するということは行われていますが、十分にフォローできませんでしたが、今後も研究を継続し著作権や商標権（我が国では今のところ商標権では保護対ていきたいと思います。

象になっていません）での保護についての議論は盛り上が改めて、コーセーコスメトロジー研究財団研究助成を頂る気配を見せません。文化的には香道なども存在するにもき、香りの法的保護について検討する機会を頂きましてあかかわらず、そして、産業的にも市場規模は小さくないに

りがとうございました。

（九州大学芸術工学研究院）

2017 年度

研究助成

コスメトロジーと私のマレーシア研究小井川

伝統あるコーセーコスメトロジー研究財団研究助成の栄に浴しましたこと、記して感謝申し上げます。多くの申請

広志の研究のきっかけを与えられたことは大きな収穫でした。
改めて感謝申し上げます。

の中で私の問題意識が認められましたことは、何よりの励

しかしながら、私の怠惰と能力不足もあり、当初意気込

みとなりました。光栄に存じます。研究助成金のおかげで、んだ研究成果につながっているか、甚だ心許ないところも有意義な研究活動を進めることができました。改めて、おございます。まだまだ、この研究テーマでの探究の手を緩

礼申し上げます。

める訳にはいきません。しかし、おかげさまで新しい研究

開発経済学を専門とする立場から、途上国研究、中でもテーマの発掘にも結びつきました。マレーシアを窓口にし東南アジア地域研究を続けてきた私にとって、今回の研究

た、ハラル化粧品の世界展開です。これには、インドネシ

課題が認められたことは大きな喜びであると同時に、実はアなどの東南アジア・イスラム国も研究の対象となります。

プレッシャーにもなりました。というのも、香粧品科学に

コスメトロジーという切り口で、新たな研究領域に関心を関する専門的な知識がなければ、意味ある研究成果が得ら広げる機会を頂けたことをありがたく思います。

れないと思われたからです。元々はマレーシア地場企業の最後に、2018.9. ～ 2019.9. の一年間、在外研修の機会をフィールドワークを続けていた私が、マレーシアのリーデ

得てイギリスにて別のプロジェクトに従事していました。

ィング産業であるパーム油に関心を持ち、歴史的、経済学

そのため、研究期間の後半には実質的な研究の進展をはか的、経営史的視点から研究を開始してまだ数年足らずでしることができず、また、帰国後は不在分の公務が押し寄せた。パーム油の利用は多岐にわたっているのですが、化粧たことと、さらに、研究の最終盤にはコロナ禍で研究が計品に関する応用分野は特に高度な化学的知識が要求される画通りに進まず、研究成果報告の締め切りを大幅に超過しため、本格的な研究をこれまで避けてきたセグメントでしてしまいました。その結果、事務局の方々に多大な迷惑をた。図らずも、パーム油の化粧品分野での応用可能性をテおかけしたことを謹んでお詫び申し上げます。

ーマとした今回の応募が認められたことにより、この分野（関西大学商学部）

2017 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて大場健太郎

この度は、コスメトロジー研究助成をいただきましたこ

心理効果や脳メカニズムに関する研究を行っております。

とに感謝申し上げます。私は懐かしさを伴う自伝的記憶のこれまでは主に視覚的手がかりを用いて懐かしさを誘導す− 251 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

る方法を用いてきましたが、それは実験手続き的に容易だ

面白さ・不思議さを改めて実感することができました。トから、というのが大きな理由の一つです。しかし香りや匂ラブルもありましたが、懐かしい香りがもたらす心理・生いによって引き起こされる懐かしさがどれだけ強力で魅力

理作用の脳メカニズムの一端が解明できたと考えておりま

的な感覚であるかは自分自身でも経験しており、嗅覚を対す。この経験と知見を元に、さらに香りと記憶の関係の研象にした研究を行いたいと考えていたタイミングでコスメ究を深めていければと思っています。
最後になりましたが、公益財団法人コーセーコスメトロ

トロジー研究助成に採択いただきました。
香りを用いたヒト脳研究は他の感覚に比べ圧倒的に少な

ジー研究財団、および当初予定通りに研究が進まない時もいのが現状です。今回初めて香りの実験をさせていただき、サポートを続けてくださった事務局の方々に心より御礼申

その難しさも実感しましたがそれ以上に実験に参加してくし上げます。

（東北大学加齢医学研究所）ださった被験者の方々の反応から香りが持つ効果や作用の2018 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
廣原志保

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成るので一番ハンドクリームが工学系の男子学生達には普及に採択していただき、誠にありがとうございました。このしやすいはずというコメントよるハンドクリームの開発を研究に携わりました教員だけでなく、本校の物質工学科な行いました。私と物質工学科の卒研生達と果皮よりオイル

らびに経営情報学科の卒研生、特研究生の異分野融合によを抽出し、ハンドクリームの試作品を調製しました。このる研究スキルアップできましたこと心から感謝いたします。

試作品に対するアンケート調査を行いました。アンケート

私はこれまでに、ポルフィリン誘導体とレーザー光を用は経営情報学科の教員と経営情報学科の卒研生達が考えていたがん医療薬の開発を行っておりました。ポルフィリン

くれ、アンケートの解析・分析を担当していただきました。

誘導体は、ご存じの通りがん医療だけでなく、サプリメン

異なる分野の方と研究を進めていくことで、物質工学科のト等、様々な分野に用いることができ、常々ポルフィリン

人間は市場調査法や今後どうやったら製品化できるか等の誘導体を用いた化粧品開発ができないかなと考えておりま

ノウハウを学ぶことができました。また、経営情報学科のした。本助成金のテーマでは残念ながらそこまで発展させ人間は、オイルの抽出法、試作品を作る過程で雑菌処理をることができませんでしたが、本校の経営情報学科の教員する必要がある等学ぶことができ、お互いに刺激しあい研の協力のもと、高専という幅広い年齢層の学生、男子学生

究の幅が広がったのではないかと思います。来年度以降もが多いという利点を生かし、男子学生すなわち若年層男性

この研究を継続し、若年層男性に受け入れられるハンドクをターゲットとした化粧品開発に取り組ませていただきま

リームを作っていきたいと思います。

した。本研究では、まず物質工学科の男子学生にどんな化（宇部工業高等専門学校物質工学科）

粧品なら使いたいかを調査したところ、実験等で手が荒れ2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて藤原

この度はコーセーコスメトロジー研究財団からご支援を賜り、心より御礼申し上げます。

圭志

認められます。後遺症が残った場合、整容面に影響を及ぼし、特に女性において生活の質（QOL）が大きく低下しま

私の研究テーマである顔面神経麻痺は、治療法の進歩にす。後遺症に対してすでにいくつかの治療法が行われていより治癒率は向上しているものの、一定の割合で後遺症がますが、侵襲や費用の面からどなたにも適応できるもので− 252 −

コスメトロジー研究助成を受けてはありません。今回は、顔面の左右非対称を軽減させる目ております。

的でメーキャップ治療を行い、QOL や精神状態を改善さ

左右差を完全に消失させるわけではありませんが、そのせることができるかを検討いたしました。成人の女性であ

簡便性や費用対効果の面から、メーキャップ治療は顔面神

れば多くの方がほぼ毎日自身でメーキャップを行っており、

経麻痺の後遺症に対して有用であると今回の研究で確信し導入するハードルとしては低くなります。ただ、通常のメました。今後は部分的なメーキャップを用いることによっーキャップと異なる点としては、通常は左右同じようにメて、小児や男性例への導入が可能かを検討していきたいとーキャップを行いますが、顔面神経麻痺の後遺症に対する考えています。

場合は左右差を減らすために、患側と健側で異なるテクニ

末筆になりましたが、コーセーコスメトロジー研究財団

ックを要する点となります。慣れるまでには多少の訓練がの益々のご発展を心より祈念申し上げます。この度は誠に必要ではありますが、メーキャップ治療を行うことによっありがとうございました。

て、表情が明るくなった症例や、外出の機会が増えたとお（北海道大学大学院医学研究院耳鼻咽喉科・頭頸部外科学

っしゃる症例を経験し、QOL の改善に寄与できたと考え教室）

2017 年度

研究助成

化粧をすると脳波活発になるの？
藤原寿理

このたびはコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成組み合わせてみることにしました。結果、予想通り多数派に採択いただき、誠にありがとうございました。私は日ごでいることが自信を高めるのはもちろん、化粧をしているろヒトの意思決定や価値判断について社会性を取り入れたことがその自信をさらに高めるという相乗効果があること

脳機能イメージング研究を行っています。2016 年度に初が分かりました。脳活動も、これまでに知られていた自信

めて当研究助成をいただき、それから化粧の価値についてに関係した領域の賦活に加え、多数派でいることが報酬やの研究に携わらせていただけることとなりました。その際

価値関連領域の賦活をもたらし、さらにその賦活が化粧にには「化粧をすることで自分に自信が持てる？」という疑問

よって強まることが示されました。これらの領域がネットに対してその答えとなる行動データを示すことで化粧の意

ワークとして働いている可能性を示すことができたのは非義に説得力を与えることができました。しかしながら、私常に重要な成果だったと思います。
「化粧をすると脳は活の最も興味のある脳機能については未だ解明できずにおり発になるの？」という疑問に対して、「少なくともしていなました。せっかく分かりかけてきた疑問をこのまま放置すい時に比べてより複雑に、ポジティブな意味で活動が増加

るわけにはいかないという思いが強く、再度研究助成申請する」と答えることはできそうです。まだまだ解明できてをするに至りました。前回の成果も後押ししてくれていた

いない部分はありますが大きな前進となりました。本研究

ので、実験手法には自信がありました。そこで、別な研究を遂行できたのも、コーセーコスメトロジー研究財団が化として考えていた社会性を取り入れ、より具体的な状況設

粧に関する研究を化学的・分子生物学的側面だけでなく精定をすることを思いつきました。例えばみんなと違ってい神・文化的側面までサポートしてくださったおかげだと強ると不安で自信がなくなる一方で、みんなと一緒だと安心く思います。心より御礼申し上げます。

して自信が強まるといった他者の影響です。これを化粧と− 253 −

（福島県立医科大学医学部システム神経科学講座）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 20202018 年度

研究助成

機能と審美の両立をめざして
山田

朋弘

今回、
「ハイブリッド相同モデルによる result-orientedから骨組織の手術シミュレーションを行う試みであり、こな顎顔面手術シミュレーション法の開発」ということで 1

れまでに同様の報告はありませんでした。約 1 年間の研究

年間の研究助成をいただきました。私は大学の口腔外科に期間で臨床活動を行いながらの研究でしたが、本助成金で所属しており様々な口腔顎顔面疾患の手術を担当しておりなんとか一定の成果を挙げることができました。まだまだますが、顔貌に与える影響が大きい分野です。美容目的の本格的な臨床応用までには乗り越えなければならないハー

手術はあまりありませんが、咬合改善のための手術は多く、ドルは多くありますが、今回の研究をさらに発展させるべ機能の改善に主眼が置かれます。機能と審美は車の両輪でく今後も頑張りたいと思います。

すが、機能的あるいは骨格的観点から手術計画をたてると、 （九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎時に審美的結果が不十分なことがあります。

顔面外科学分野）

本研究では審美的要件を満たした状況を想定して、そこ− 254 −

コスメトロジー研究助成を受けて● 国際交流助成（１件）
2019 年度

国際交流助成コスメトロジーとの国際交流支援助成の結びつきに関する雑感文
小嶋肇

欧州の規制により、動物実験を用いない化粧品の製造・この試験法に病理組織学的評価を組み込み、弱い刺激性を販売の禁止が施行されてから、6 年が経つ。この間に国際評価する研究が株式会社 化合物安全性研究所（化安研）で的な市場確保の思惑もあり、十分に動物実験代替法が開発進められている。これまでの研究の結果、その可能性が示

されていないにも関わらず、日本の多くの化粧品企業も動唆されてきたことを受け、私は 2017 年に OECD に TG437

物実験の利用を禁止せざる得ない状況になっている。

の改定を提案している。この提案に対し、OECD の専門家

十分に動物実験代替法が開発されていないことはない、

より、病理学的評価のピアレビュー（第三者検証）が求め例えば、眼刺激性試験代替法はすでに OECD（経済協力開られた。そこで、米国の本試験法の専門家である Institute発機構）で試験法が複数標準化されており、選択肢も多い

for In Vitro Sciences, Inc.（IIVS、米国）に病理標本の第との意見が聞こえてきそうである。しかし、実際開発され三者検証を依頼した。

ている試験法は、無刺激性物質または腐食性・強刺激性物

この度、コーセーコスメトロジー研究財団の国際交流支

質の評価が可能なものだけである。新規界面活性剤や、洗援助成を得て、IIVS の副社長である Dr. Hans Raabe を化

顔剤およびシャンプーなどの化粧製品で生じる可能性があ安研に招聘し、日米の病理専門家が所見や判定基準についる化粧品原料や製品の弱い眼刺激性を評価できない。これて議論し、OECD に提出する資料を検討した。この議論ででは、各社とも十分に新製品の安全性を担保できていると合意が得られた基準は、OECD に報告書として提出する予は言い切れない現状である。

定であり、OECD TG437 の改定に有用であると確信して現在、弱い眼刺激性を評価できる最も可能性が高い試験
法が、OECD 試験法ガイドライン（TG）No.437：ウシ摘出いる。この場をお借りして、コーセーコスメトロジー研究
財団のご支援に感謝を申し上げる。

角膜の混濁度および透過性試験法（BCOP）である。現在、− 255 −

（国立医薬品食品衛生研究所）

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

● 学術集会支援助成（３件）
2019 年度

学術集会支援助成

第 11回プロテオグリカン国際会議を終えて渡辺

令和元年 9 月 29 日から 10 月 3 日の日程で石川県金沢市

秀人

表がなされました。

の石川県立音楽堂にて第 11 回プロテオグリカン国際会議

今回目立ったのは若い外国人の発表です。皆さん十分にを開催しました。本会議は西暦奇数年に各国持ち回りで行準備していたようで発表内容は充実していて聴きごたえのわれ、第 1 回が日本、その後はイギリス、イタリア、スウ

あるものばかりでした。本国際会議の重要な目的の一つは

ェーデン、ブラジル、フランス、オーストラリア、ドイツ、若手研究者の育成です。この点で本会議の目的は十分に果韓国、イタリアと続いて今回 20 年ぶりに日本で開催する

たせたと自負しております。

こととなりました。

主催者としてつくづく感じたのは、皆さんが積極的に助参加者は合計 168 名でした。そのうち 69 名が外国人で、けてくださったことです。特に国際組織委員の先生方は忌

合計 20 カ国（出身国を入れると合計 23 カ国）からの参加者

憚のない建設的な意見をたくさん伝えてくださり、たいへが集まり、極めて国際色豊かな会議となりました。

ん参考になりました。また開催地が日本だったことも大き

発表内容に関しては、ヘパラン硫酸の機能に関する発表な利点だったと思います。日本は清潔で治安が良く、公共が目立ちました。その他としてヒアルロン酸、コンドロイ

交通機関は時間どおりに運行し、日本人は親切だという評

チン硫酸の研究成果、コアタンパク質については主として判をよく耳にしました。「日本だから参加する」という人もシンデカンの研究成果が発表されました。日程的な流れと多かったと思います。

して、最新の知見に関するセッションから始まり、へパラ

さて次回の第 12 回は英国にて開催予定です。同研究分

ン硫酸やヒアルロン酸の合成・分解機構に関する発表、炎野には英国の研究者がたくさんいますので、充実した会議

症や癌におけるグリコサミノグリカン、プロテオグリカンになるであろうと今から期待しています。

の役割に関する発表へと続き、最後に治療戦略に関する発（愛知医科大学分子医科学研究所）

2019 年度

学術集会支援助成第 24 回日本病態プロテアーゼ学会学術集会を終えて井上

紳太郎

2019 年 8 月 2 日から 2 日間、岐阜大学サテライトキャ

ンセミナーでの皮膚における肥満細胞由来トリプターゼのンパスで開催された、第 24 回日本病態プロテアーゼ学会

役割など、これまで本学会ではあまり取り上げられてこな（JSPP）
学術集会は、盛会のうちに終えることができました。

かった話題を参加者に提供しました。また、教育講演では

ここに、本学術集会開催にあたりご助成頂きました、コ「実用化に向けた再生医療研究の現状と今後」について皮膚ーセーコスメトロジー研究財団に深く御礼申し上げます。

を中心とした最新の情報を取り上げました。

本学会は、臨床・基礎・企業のプロテアーゼとインヒビお陰様で、この 5 年間では最多数のご参加を頂き、学術

ター研究者がお互いに同等の立場から意見を交換し、この集会後も多くの先生方より新鮮で大変面白い学会だったと領域の研究を発展させ、社会に貢献することを目標に活動

お褒めの言葉を頂いております。この学術集会運営では、しております。この度、第 24 回 JSPP 学術集会を「新たな貴財団の助成金が大変助けになりました。関係各位に深くターゲットプロテアーゼの探求」
をテーマとし、「皮膚：美御礼申し上げます。

と健康のためのプロテアーゼ」についてのワークショップ

末筆になりましたが、昨今種々の要因により学会運営や（化粧品領域、皮膚アレルギー領域）の開催や、シンポジウ

学術集会開催に対する寄付や助成金の支援が減少し、経済

ムでのケロイドに関与するプロテアーゼ、およびランチョ

的困難性が研究者の士気にも関わる問題となっています。

− 256 −

コスメトロジー研究助成を受けて貴財団におきましては日本が研究開発立国として国際的なします。

競争を勝ち抜くための重要な社会的貢献をされていると思（岐阜薬科大学香粧品健康学講座特任教授／学術集会会長）

いますので、今後とも引き続きのご支援を宜しくお願い致2019 年度

学術集会支援助成

第 37 回日本歯科東洋医学会学術大会を終えて長野

哲雄

この度、第 37 回日本歯科東洋医学会学術大会が広島県としては、まれに見る盛会になったことを大変ありがたく

歯科医師会館で、2019 年 10 月 5 日㈯、6 日㈰の両日開催さ思っております（写真）。更に、「冷えという未病」
がテーマ

れました。

の市民公開講座は 300 名を超える参加者が集まり、会場か

今回の学術大会は「未病」をテーマに取り上げており、特ら人があふれ、急遽別室にモニターを設置して何とか急場

別講演 1 件、教育講演 4 件、ワークショップ 6 件 ､ ポスタを凌ぎました。まさに、予想を超える市民講座となりましー発表 12 件そしてランチョンセミナー 2 件の計 25 件行わた。

れ、いずれの講演も参加者に大変好評で ､ 最終日の最後の

今回の学術大会で特に印象に残りましたことは、一般市

ワークショップまで会場は満室の盛況ぶりでした。特に、民を含む参加者の皆様がご自身の健康とともに美容に強い歯科分野では最近口腔機能の軽微な低下などを含むオーラ

関心を持っていることです。健康で、かつ美しく長生きしルフレイルが注目されていますが、口腔機能の維持に心身たいという要望に対して、本学会がどのように応えていくの内面からの若々しさを作り出す化粧・美容の重要性も提ことができるかが問われており、今後のこの学術大会の目起されています。
「オーラルフレイル」
については山口孝二

指すべき方向が明確になった気が致します。

郎先生による教育講演が行われ、さらに「美容にも有効な終わりにあたり、コーセーコスメトロジー研究財団からツボ」（志字良太先生）あるいは「美容を目的とした鍼灸治多額の研究助成金を頂きましたことを厚く御礼申し上げま療（美顎鍼）」（関根陽平先生）についてのワークショップもす。今回の学術大会では、中四国支部としてはじめての開行われ、【コスメトロジー】と深く関係した大会となったこ催であったため、開催経費および参加者等の予想が全く立とが大きな特徴です。

たなかった中で、貴財団からの助成は何よりも力強い支援

実行委員会は 1 年以上前から 10 数回に及ぶ打合せ会議を重ね、今まで学術大会の開催経験のない実行委員が ､ まさに手探りで開催に向けて準備を行ってまいりました。
その結果、予約参加者 197 名そして当日参加者 51 名のとなりました。実行委員一同、大変に感謝しているところです。改めて御礼申し上げる次第です。
末筆になりましたが、貴財団の益々のご隆盛を心より祈念しております。

計 248 名の多数の方々に参加して頂き ､ 本学会の学術大会

学術大会の会場− 257 −

（第 37 回日本歯科東洋医学会学術大会 実行委員）

●
事業報告書
役

員
●

事業報告書

事業報告書（自 2019 年 4 月 1 日

至 2020 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2019

2020

5

7

公募開始

全国 637 の大学、病院、研究機関等へ公募要領および推薦書を送付、関連学術雑誌 2 誌、当財団 HP 他 12 機関 HP に公募要領を掲載
7
8
公募締切り
応募総数125件
7/17 〜 8/23
各選考委員による個別審査
9
5
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9 10
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9 12
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9 30
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成37課題を選考
10
9
臨時理事会（書面）
本選考委員会より答申、助成課題決定
11 19
第30回 表彰・贈呈式
研究助成対象37課題の代表者へ、助成金贈呈書を授与
記念講演
演題 ： リポソーム研究の魅力
講演者 ： 奥 直人先生 帝京大学薬学部長・教授
12 10
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額5,000万円
2
7
選考委員への報告（書面） 2020年度研究助成公募要領他《国際交流助成関連》
2019

3
4
6
7

20
25
21
25

審査
助成金交付
審査
助成金交付

国際交流（招聘）： ㈱化合物安全性研究所会議への招聘
国際交流助成金 50万円
国際交流（派遣）： 米国スタンフォード大学病院皮膚科へ派遣
国際交流助成金 50万円

《学術集会支援助成関連》
2019

1
4
3
4
5
5

8
25
29
25
9
25

審査
助成金交付
審査
助成金交付
審査
助成金交付

学術集会支援 ： 第24回日本病態プロテアーゼ学会学術集会
学術集会支援助成金 50万円
学術集会支援 ： 第11回プロテオグリカン国際会議
学術集会支援助成金 50万円
学術集会支援 ： 日本歯科東洋医学会 第37回学術大会
学術集会支援助成金 50万円

平成30年度事業報告および収支決算報告（含監査報告）の承認
法人名称の変更に関する件
任期満了に伴う評議員候補者の選出に関する件
選考委員の選任に関する件「事務所購入資金取扱規程」の制定、および「30周年記念事業準備資金取扱規程」の一部改定に関する件
30周年記念事業計画を承認する件
株主としての議決権行使について、報告事項
定款の一部変更の件
2019年度（第30回）研究助成者等を承認する件
事務所所在地の移転に関する件
2019年度収支予算書の一部変更を承認する件
2020年度事業計画および予算案を承認する件《理事会関連》
2019

5

23

第一回通常理事会

109

臨時理事会（書面）1119

第二回通常理事会− 261 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019

《評議員会関連》
2019

6

7

10

17

11

22

定時評議員会

平成30年度事業報告および収支決算報告（含監査報告）の承認
任期満了に伴う評議員の選任
臨時評議員会（書面）
定款の一部変更の件
評議員会長の互選に関する件
評議員への報告（書面） 第二回通常理事会議題、報告事項について《その他》
1）報告書発行
2019
5
1
9
1

中間報告書
完了報告書

2）行政届出関連
2019
6 14
6 28
11
8
12 16
2020
1
9
2 19
2 24

内閣府へ平成30年度事業報告書等の提出
内閣府へ変更の届出（評議員の改選）
内閣府へ変更の届出（法人名称の変更）
内閣府へ変更認定申請（公２表彰事業の追加）
内閣府へ変更の届出（公１研究助成事業の追加）
内閣府へ変更の届出（事務所所在地の変更）
内閣府へ令和2年度事業計画書等の提出

研究業績 中間報告集 第28号
コスメトロジー研究報告 Vol. 27（2019）、CD版を作成

3）情報公開（当財団HP）
2019
4
8
公募要領
2019年度コスメトロジー研究助成公募要領を掲載
7
3
事業報告および収支決算 2018年度事業報告書、収支決算報告書および新役員等を掲載
9
2
研究報告書
「コスメトロジー研究報告Vol.27（2019）」を掲載
11 19
予算書一部修正2019年度予算書の一部修正を掲載
11 19
財団名称変更
財団名称変更を掲載
11 29
研究助成者および課題名 2019年度コスメトロジー研究助成者等を掲載
12
2
公募要領
大学講座研究助成公募要領を掲載
2020
2 17
財団事務所所在地変更
財団新所在地電話番号を掲載
3
2
事業計画および収支予算 2020年度事業計画および収支予算書を掲載− 262 −

事業報告書2019年度助成を受けられた方々（1）第 29 回研究助成（37 名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（13 名）
氏

名

殷

澍

所

属

職位

研究課題

東北大学多元物質科学研究所

教授

カラフルな酸化チタン無機顔料の創製と化粧品材料としての機能
評価

上沼駿太郎

東京大学大学院新領域創成科学
研究科

博士
3年生

環状オリゴ糖から成る自己組織性ナノシートの薬物担持・徐放特
性と接着挙動小谷仁司

島根大学医学部医学科免疫学講座

講師

皮膚老化改善作用を持つ天然植物成分の探索と機能解析佐藤康治

北海道大学大学院工学研究院

助教

強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発

田村篤志

東京医科歯科大学生体材料工学
研究所

准教授

超分子架橋による高保水性コラーゲン微粒子の創製

中橋明子

大阪産業技術研究所主任
研究員

楕円状ポリイミド微粒子の紫外線防御剤への応用

中林孝和

東北大学大学院薬学研究科

教授

全反射ラマン顕微鏡を用いた生体膜近傍の水の選択的観測中村真紀

産業技術総合研究所ナノ材料
研究部門

主任
研究員

リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システ
ム

檜垣

勇次

大分大学理工学部共創理工学科准教授

高分子ベシクル積層膜の秩序構造とダイナミクス

福井有香

慶應義塾大学理工学部応用化学科 専任講師

積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリ-システム
の開発

松浪

勝義

広島大学大学院医系科学研究科

教授

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産
物の解析

矢田

詩歩

奈良女子大学研究院自然科学系

助教

ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤を用いた泡のミクロ構造に関する革新的評価技術の確立

和田俊一

公益財団法人微生物化学研究会

上級
研究員

放線菌由来難分解性trehalose類縁体化合物の物性評価と利用法の検討

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（19 名）
氏

名

所

属

職位

研究課題

稲垣

絵海

慶應義塾大学医学部眼科学教室

助教

ヒトiPS由来神経堤細胞による革新的線維芽制御方法の開発

宇賀神つかさ東京医科歯科大学皮膚科学分野

講師

毛染め・化粧品アレルギー患者の原因検索における好塩基球活性化試験の有用性の検討と染毛剤アレルギー患者における痒疹反応
の病態解析

内山

明彦

群馬大学大学院医学系研究科
皮膚科学

医員

転写因子SOX2による皮膚虚血再灌流障害（急性期褥瘡）における制御機構の解明および新規治療法の開発

太田茜

甲南大学理工学部

特別研究員

皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響大沼清

長岡技術科学大学准教授

ヒト胚の巨視的パターンの模倣によるin vitro催奇形性テスト法
の開発

小林

翔

山形大学大学院医学系研究科

助教

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性− 263 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019

氏

名

齋藤

康太

秋田大学大学院医学系研究科情報制御学・実験治療学講座

教授

概日リズムによるコラーゲン分泌制御機構の解析

武尾真

理化学研究所生命機能科学
研究センター

研究員

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発

武元

宏泰

東京工業大学科学技術創成研究院

助教

常在菌フローラ育成を目指す肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸
の開発

立松

健司

大阪大学産業科学研究所

助教

ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立

西江渉

北海道大学大学院医学研究院皮膚
科学教室

准教授

網羅的ゲノム編集を用いた表皮基底細胞XVII型コラーゲン発現制御機構の解明深田俊幸

徳島文理大学薬学部薬学科教授

亜鉛シグナルはどのように表皮バリア機能を制御しているのか？
─ZIP10を標的とするバリア機能制御物質の探索─

松本靖彦

明治薬科大学微生物学研究室

准教授

無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立とin vivo薬
効評価系の構築的場

康幸

安田女子大学薬学部薬学科

准教授

X線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構
の解明

三浦

恭子

熊本大学大学院先導機構／大学院
生命科学研究部

准教授

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の
開発

南

彰

静岡県立大学大学院薬学研究院

講師

シアリダーゼの皮膚における機能解明と経皮送達技術の開発

村上良子

大阪大学微生物病研究所

矢嶋伊知朗
山本

博之

所

属

職位

研究課題

籔本難病
解明寄附 先天性GPI欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発
研究部門

芝浦工業大学システム理工学部生
命科学科

教授

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中microRNA量の関連性解析

日本薬科大学薬学部薬学科准教授

非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析 ─皮膚は色を識別できるのか？─

職位

研究課題第３分野：精神、文化に関する分野（５名）
氏

名

青柳

秀紀

筑波大学生命環境系
生物機能科学専攻

柴藤淳子

星薬科大学先端生命科学研究所

寄附講座
等客員助 サボテンセルエキストラクトの育毛作用と成分分析
教美佐子

東京大学大学院医学系研究科

特任講師 後期高齢者に頻発するスキン-テアの予測方法の考案

臺

所

属

中村

航洋

早稲田大学理工学術院

峯裕一

広島大学大学院医系科学研究科

教授

ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用

日本学術
振興会特
統計的顔画像解析によるメイクアップ効果の数理モデル化
別研究員
PD
講師/
部門長

匠の技の定量化 ─Deep Learningによる先駆的顎顔面補綴支援シ
ステムの開発− 264 −

事業報告書（2）国際交流助成（２件）
実施責任者

派遣・招聘者

招聘目的

国立医薬品食品衛生研究所
安全性予測評価部
小島 肇

Institute for In Vitro Sciences, Inc. ㈱化合物安全性研究所へ招聘
Hans Antony Raabe MS（2019年5月13日から2019年5月17日

慶應義塾大学医学部皮膚科
天谷 雅行

慶應義塾大学医学部
雁金 詩子

米国スタンフォード大学病院皮膚科（Chang 准教授）へ派遣（2020年1月～ 2020年12月 米国カリフォルニア州）（3）学術集会支援助成（３件）
実施責任者

所

札幌市）

属

助成集会

井上

紳太郎

岐阜薬科大学香粧品健康学講座

第24回日本病態プロテアーゼ学会学術集会（2019年8月2日～ 2019年8月3日 岐阜市）

渡辺秀人

愛知医科大学
分子医科学研究所

第11回プロテオグリカン国際会議（2019年9月29日～ 2019年10月3日 金沢市）

岩崎

嘉代

岩崎歯科医院

日本歯科東洋医学会 第37回学術大会（2019年10月5日～ 2019年10月6日 広島市）

− 265 −

コスメトロジー研究報告Vol.27, 2019役

員2020 年 7 月現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

亀山

浩一

（常勤）

理

事

岩橋

槇夫

北里大学名誉教授

理

事

関根

茂

理

事

長野

哲雄

東京大学創薬機構

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

宮地

良樹

静岡県立総合病院参与

監

事

小林

久美

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

元株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

東邦大学

名誉教授

評議員

奥

直人

帝京大学

薬学部教授

評議員

齊藤

勲

評議員

齋藤

美穂

早稲田大学

評議員

仙名

保

慶應義塾大学

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

兵庫医科大学

常務理事

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学

名誉教授

日光ケミカルズ株式会社

代表取締役名誉会長

客員教授

名誉教授
名誉教授
名誉教授

常務取締役

元厚生省大臣官房審議官
常任理事
名誉教授

元厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官− 266 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒 103— 0028

東京都中央区八重洲一丁目 5 番 17 号
八重洲香川ビルディング 4 階
電話 03（6860）2190

コスメトロジー研究報告

Vol. 28／2020

非売品

2020年 9月 1日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

亀山 浩一
公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒103−0028 東京都中央区八重洲一丁目５番 17 号
電話 03（6860）2190
エイエム企画〒171−0014 東京都豊島区池袋四丁目24番７号
電話 03（3590）5375
株式会社プラスコミュニケーション

表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2020

商品デザイン部デザイン室不許複製

禁無断転載