皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割
大阪大学大学院・医学系研究科

林謙一郎

Skin fibroblasts themselves are the cells that produce extracellular matrix (ECM), but their ability to produce ECM andmotility are low under the normal conditions. In contrast, when skin tissues are injured, they are changed to myofibroblasts.
Myofibroblasts exhibit an enhanced motility and accumulate at the injured area. There, they vigorously produce ECM
for wound healing. Such phenotypic modulation of skin fibroblasts is caused by the inflammatory response as follows.
Skin injury activates the secretion of inflammatory cytokines such as transforming growth factor-βs (TGF-βs) frominflammatory cells and the normal skin fibroblasts stimulated by these cytokines are converted into myofibroblasts.
However, this mechanism has not been fully characterized. In this study, I addressed this molecular event and found thatfactor X (anonymity because of unpublished results) plays a critical role in the myofibroblastic phenotypic modulation ofskin fibroblasts. Novel findings revealed by this study are as follows: 1 ) Myocardin related transcription factors A andB (MRTF-A/B) play a critical role in exhibition of myofibroblastic phenotype of skin fibroblasts, 2 ) In skin fibroblasts,MRTF-A/B are usually localized in the nuclear but their functions remain inactivated because of low level expression offactor X, 3 ) The expression levels of myofibroblasts markers such as αSM-actin and collagens are up-regulated concomitantwith the increase in the expression of factor X in TGF-β-stimulated skin fibroblasts, 4 ) siRNA-mediated knockdown offactor X suppresses the TGF-β-induced up-regulation of these myofibroblastic markers, 5 ) Factor X binds to both of serum
response factor (SRF) and MRTF-A and activates the SRF/CArG-box mediated transcription.

1. 緒

αSM-actin 及びコラーゲンの発現増強は筋線維芽細胞マ言ーカーとして知られている。これらの遺伝子の転写調節領

皮膚は表皮と真皮の 2 層構造になっており、外部からの域（プロモーターやそれと関連した領域［イントロン］）に刺激（紫外線、乾燥や温度変化）から、内部の器官を守り、は CArG-box と呼ばれる転写因子、serum response factor

体温の調節や体内の水分・体液を保持するバリア機能を果（SRF）の結合サイト（シスエレメント）が存在し、SRF/たしている。表皮層はケラチノサイトとそれが分化（角化）

CArG- box を介して正の転写制御を受ける 3）。この転写し上層へ移行した細胞（角質化細胞）から構成されている。

制 御 に は SRF の 転 写 補 助 因 子 で あ る myocardin related

表皮構成細胞はケラチンを多量に含みバリア機能と体内のtranscription factors（MRTF-A 及び MRTF - B［MRTF-A/

水分が過剰に蒸散するのを防ぐ保湿機能を担っている。真B］）の活性化を必要とする。一般的には MRTF-A/ B は

皮層は細胞外マトリクス（ECM）（コラーゲン、エラスチン、細胞内に局在し、Rho の活性化による細胞内での単量体ヒアルロン酸）とこれらを産生する線維芽細胞から構成さG - actin 量の減少（アクチンダイナミクス）に伴い一過性に1）れ、皮膚の形状維持や弾力性を保つ機能を果たしている 。

核内移行する。核内で SRF は MRTF - A または MRTF-B

線維芽細胞は ECM 産生細胞であるが、炎症のない正常状と複合体を形成し CArG-box に結合することで SRF の転態ではこの活性は弱くかつ細胞運動能も低く保たれている。

写因子としての機能を活性化させる。我々の研究グループ

しかしながら、創傷による炎症反応が起こるとマクロファはこのアクチンダイナミクスに依存した MRTF- A /B の活ージなどの炎症細胞からサイトカイン（TGF-β など）が分泌性化（核内移行）の分子機構を解明した。この概略を以下にされる。これらの刺激を受けた線維芽細胞は ECM 産生能記す。MRTF -A / B の核移行シグナル（NLS）は N 末に存在及び運動能の亢進した筋線維芽細胞に形質転換し創傷治癒する G - actin 結合ドメイン（RPEF motifs）の間隙に位置すを促す 。治癒が完了した後は TGF-β 受容体の発現低下にるため G - actin 量の多い状況下では G -actin と RPEL motifs

より筋線維芽細胞の形質発現は減衰し、正常線維芽細胞へとの結合が優先し、importin α / β1 と NLS との結合は拮抗戻る。

的に阻害される。このため、MRTF - A /B は細胞質に留ま2）る。一方、G - actin 量が減少した状況下では importin α /β1と NLS との結合が可能になり、核内移行する 4）。核内から核外への移行は Crm1 を介して行われる 5）。
The roles of MRTF-A/B in the homeostasisof skinKenʼichiro Hayashi
Graduate School of Medicine, OsakaUniversity

MRTF -A / B の 活 性 化 は SRF / CArG -box を 介 し た 転写を促進し、細胞骨格タンパク質及びコラーゲンなどのECM やその受容体タンパク質（integrin など）の発現を誘導する。その結果、細胞運動が亢進する。しかしながら、− 102 −皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割コスメトロジーの観点から皮膚における MRTF -A / B の役の形質発現が抑制されていると考えた。この仮説に立脚す

割及びその制御機構に関する研究は限定的で十分な解析はると核内での MRTF-A/B 機能 on/off 機構の存在が示唆さなされていない。MRTF -A/B による細胞機能制御が皮膚れた。本研究では皮膚線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質の恒常性維持に関わり、傷害に応答した創傷治癒や老化転換における核内での MRTF - A / B の機能制御に焦点を当または紫外線による皮膚機能低下と MRTF-A/B の制御がて解析を行った。

連携すると考えた。この可能性を探究し、コスメトロジー

2. 方に新たな研究視点を導入することを目指して本研究を開始した。本研究を立案した時点で初代培養正常皮膚線維芽細法

2. 1. 細胞培養胞では他の培養細胞とは異なり Rho の活性化に依存せず

ヒト初代培養皮膚線維芽細胞（ATCC CRL-2072）を種々MRTF - A/B は恒常的に核局在することを見いだしていた。の ECM でコートした培養プレートに接種し DMEM-10%

炎症に伴う筋線維芽細胞の慢性的な活性化は線維化疾患

FCS で培養を行った。

（肝硬変、肺腎線維症や強皮症）惹起の要因であると考えられている。筋線維芽細胞のオリジンとして正常線維芽細胞

2. 2. 遺伝子及びタンパク質発現解析の他、間質細胞、血中に存在する骨髄由来の幹細胞や上皮・細胞運動や ECM 産生の関わる遺伝子の発現を mRNA 及内皮細胞が知られている。上皮・内皮細胞から筋線維芽細びタンパク質レベルで解析した。解析方法として定量的胞への形質転換は上皮・内皮間葉転換という概念として研リアルタイム RT - PCR（RT - qPCR）法及びイムノブロッ究が進められており、この場合も TGF- β を介したシグナト法を用いた。指示された条件化で培養した皮膚線維芽ル伝達系の関与が明らかにされている。しかしながら、筋細胞から RNA を抽出・粗精製した後、cDNA 合成を行い、線維芽細胞への形質転換の分子機構の完全解明には至って

SYBR Green により増幅遺伝子を検出する RT -qPCR を行いない（図１）。

った。イムノブロットの場合は 2 % SDS サンプルバッファ

前述したように、正常皮膚線維芽細胞では MRTF-A/Bーで溶解させた細胞総抽出液を SDS- ポリアクリルアミドは恒常的に核局在するため、筋線維芽細胞への形質転換の電気泳動で含有されているタンパク質を分離後、ウェスタ過程での MRTF-A/B の活性化は細胞内局在変化では説明

ンブロット法により PVDF メンブレンに転写し、目的とできない。これまでに得た知見から正常皮膚線維芽細胞でするタンパク質の抗体を用いてイムノブロットを行い解析は MRTF-A/B が恒常的に核局在するが、筋線維芽細胞様した。

図 1 筋線維芽細胞への形質転換経路の概略− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

2. 3. siRNAの導入因子である MRTF-A/B の発現を siRNA の導入によりノッsiRNA はシグマアルドリッチ社から購入した。siRNAの細胞への導入は Lipofectamine RNAiMAX を用いた。

クダウンさせた。この結果、α SM - actin 及びコラーゲンの発現は著明に低下し、細胞運動能も低下した（創傷治癒アッセイによる）（図 2）。

2. 4. プロモーターアッセイ

以上の結果から、通常の培養条件下では皮膚線維芽細胞レポーターとして 3×CArG-luciferase3） を用いて SRF/は筋線維芽細胞様の形質発現することが判明し、この形質CArG- box を介した転写活性の定量的解析を行った。こ

発現は MRTF - A / B に依存することが明らかになった。培のレポーターと指示された発現 plasmids を培養細胞に導養条件が皮膚線維芽細胞の形質発現に及ぼす影響を検討す入し、48 時間後に転写活性を計測した。導入効率の違いる目的で ECM コートしたプレートで培養を行い筋線維芽による luciferase 活性のばらつきを補正する目的で SV40細胞のマーカーの発現を検証した。ECM としてコラーゲ

プロモーターから転写される β -galactosidase 発現ユニッンゲル、コラーゲンフィルム（希釈したコラーゲンを薄くコトがコードされた補正用 plasmid も共に導入した。SRF/ーティング）及びマトリゲルを試した。いずれの ECM でコ

CArG- box を介した転写活性は β -galactosidase 活性で補ートしたプレート上で培養した皮膚線維芽細胞では著明な正した luciferase 活性に基づき比較した。

筋線維芽細胞マーカーの発現低下が認められた。筋線維芽細胞マーカーの発現低下は基質の硬さに影響されなかった

2. 5. 細胞運動能の解析（軟らかい基質：コラーゲンゲル及びマトリゲル；硬い基質：二次元的な細胞運動は創傷治癒アッセイにより解析を行コラーゲンフィルム）。これらの実験結果から接着した基質った。100 % コンフレントな培養細胞の培養プレートをスの硬さではなく ECM との接着が筋線維芽細胞様の形質発クラッチして一定サイズの帯状の創傷を作成し、細胞遊走現を抑制していることがわかった。一般的に MRTF-A/Bによってふさがる様子を観察した。細胞遊走を定量化するの機能発現は細胞内局在変化に依存しているため、上記のため、スクラッチ前と一定期間後の同視野を撮影し遊走面

結果は MRTF - A / B の細胞内局在変化に起因する可能性が積を計測した。

考えられた。このため、MRTF - A / B それぞれの抗体で免疫染色を行い、細胞内局在を検証した。この結果、皮膚線

2. 6. 細胞染色

維芽細胞では恒常的に MRTF - A は核に MRTF - B は核と種々の条件下で培養した皮膚線維芽細胞を 4 % パラホル細胞質の両方に局在することが判明した。EMC の有無にムアルデヒドで固定し、指示された抗体で免疫染色を行っ関わらず、いずれの培養条件下でも MRTF-A/B の局在にた。Alexa Fluor 568 で標識された２次抗体を用いて標的は相違が認められなかった（図 3）。従って、MRTF -A/Bタンパク質を検出した。同時に Hoechst 33342 で核を染色の細胞内局在制御ではなく核内において MRTF-A/B の機した。

能を直接制御する機構の存在が示唆された。

2. 7. タンパク質－タンパク質相互作用

3. 2. 皮膚線維芽細胞の形質発現制御因子の探索と検証

In vitro 転写・タンパク質合成システム（Promega）を用いて調製したそれぞれの Tag 付きタンパク質溶液を混合

更なる検証のため、細胞運動や筋線維芽細胞への形質転し、指示された Tag 抗体を用いて免疫沈降を行った。共換に関連する遺伝子発現の ECM 依存性を RT - qPCR によ沈降した分画に存在するタンパク質を SDS - ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、ウェスタンブロットを行い、指示された Tag 抗体を用いたイムノブロットによりタンパ
ク質 - タンパク質相互作用を解析した。

3. 結果

3. 1. 培養条件に依存した皮膚線維芽細胞の形質発現
初代培養正常ヒト皮膚線維芽細胞（以降、皮膚線維芽細胞と省略する）を通常の培養条件下（コラーゲンなどのECM でコートしない培養プレート培養）で培養を行うと、筋線維芽細胞のマーカーである αSM-actin 及びコラーゲンの著明な発現が認められた。これらの遺伝子は SRF/CArG-box を介した転写制御を受けるため、SRF 転写補助− 104 −図 2 創傷治癒アッセイによる細胞運動能の比較
コ ン ト ロ ー ル (cntl) siRNA 導 入 し た 細 胞 の 移 動 領 域 を100% として表示 .

皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割

図 3 MRTF -A の細胞内局在の比較（通常の培養プレート vs コラーゲンフィルム）
MRTF-B に関しても培養条件の相違による細胞内局在変化は認められない．

図 4 ECM が皮膚線維芽細胞の遺伝子発現に及ぼす影響
通常の培養プレート（ECM なし）で培養した場合を基準にした結果．
（↑：発現上昇、↓：発現減少、−：変化なし）

り比較した。この結果、細胞質と核の両方に局在するタンと結合して NFκB を介した炎症性遺伝子の発現を抑制するパク質（未発表のため X 因子として表記）の発現が ECM 上役割を担っていることを明らかにしている 6）。皮膚線維芽で培養した場合に筋線維芽細胞のマーカーと同様に著明に細胞と血管内皮細胞の間で X 因子の発現を比較すると、血減少することを見いだした（図 4）。

管内皮細胞では X 因子の発現は極めて弱いことが判明しこの因子と筋線維芽細胞形質発現との相関を明らかにた。そこで、血管内皮細胞で 3×CArG - luciferase を用いする目的で TGF - β により誘導される遺伝子発現を解析したプロモーターアッセイを行ったところ、X 因子の発現た。通常の培養条件下で培養した皮膚線維芽細胞を TGF-β

plasmid を共発現させることで luciferase 活性の上昇が認で刺激すると、さらなる筋線維芽細胞マーカーの発現がめられた。この実験結果は前述した X 因子の機能を強く支増強される。予め、皮膚線維芽細胞に X 因子の siRNA を持するものである。

導入しておくと、この TGF- β に依存する筋線維芽細胞マ

X 因子の機能を検証する目的で in vitro でのタンパク質ーカーの発現増強が著明に抑制された。さらに、X 因子の- タンパク質相互作用を調べた。この結果、X 因子は SRF

siRNA を介したノックダウンは細胞運動能を大幅に減弱及び MRTF-A と結合することが判明した。以上の結果かさせた。この結果から X 因子が筋線維芽細胞形質発現に重ら、X 因子は SRF/CArG-box を介した転写活性を促進さ要な役割を果たしていることが判明した。

せる機能を有することが判明した。

この X 因子の関わる現象の分子機構の解明を目指して

4. 考察・総括

解析を続けた。まず、転写レベルでの解析のためプロモーターアッセイを行った。レポーターとしてベーサルプ

本研究で皮膚線維芽細胞の筋皮線維芽細胞への形質転ロモーターの上流に SRF のシスエレメントである CArG-換には MRTF - A / B が重要な役割を担うことを明らかにし、box をタンデムに３個挿入した 3×CArG-luciferase を用いさらに細胞内局在変化以外の新たな MRTF- A / B の活性化た。皮膚線維芽細胞にこのレポーターと MRTF-A と X 因のメカニズムを見いだした。一般的な細胞では MRTF-A/子の発現 plasmids を導入すると著しい luciferase 活性の上B は細胞質に局在し、Rho の活性化した条件下でアクチン昇が認められたが、X 因子の発現 plasmid のみを導入した

ダイナミクス依存性に細胞質から核内に移行することで場合には活性上昇は起こらなかった。以上の結果から、X活性化される。しかしながら、皮膚線維芽細胞では恒常的因子の機能として MRTF-A を介した SRF/CArG - box にに MRTF - A / B は核局在するため、その活性化は細胞内のよる転写調節における正の制御が示唆された。最近の我々局在変化では説明できない。本研究での一連の解析によりの研究で、ヒト初代培養血管内皮細胞（以降、血管内皮細MRTF-A / B の活性化は皮膚線維芽細胞の筋皮線維芽細胞胞と省略する）でも MRTF -A/B は恒常的に核に局在するへの形質転換に重要で、このプロセスに X 因子は決定的なが SRF /CArG - box を介した転写系を活性化せず、NFκB機能を果たすことが判明した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

正常皮膚線維芽細胞では MRTF -A/B は恒常的に核局在らに、X 因子の機能阻害はこれら線維化疾患の予防や治療するが、ECM の過剰産生や細胞運動の亢進などの筋線維に応用できると思われ、新たな創薬ターゲットになる可能芽細胞的な形質発現を発揮せず恒常性が維持される。わか性がある。このような視点から今後の研究を進めてゆきた

りやすく説明すると、創傷が癒えた後、その傷痕が少しい。

盛り上がった状態で治癒することが見られる。この盛り上がっているのが線維化した皮膚組織である。しかしなが（引用文献）

ら、傷害のない皮膚組織ではこのような状態にならず、正1） Wang Y, Viennet C, Robin S, Berthon JY, He L,常な状態が維持される。つまり、正常皮膚線維芽細胞ではHumbert P. Precise role of dermal fibroblasts on

核局在する MRTF -A /B の機能が抑制されている。本研究melanocyte pigmentation. J. Dermatol. Sci. 88: 159-166.

ではこの抑制された MRTF-A/B 機能発現を活性化する因（2017）

子として X 因子を同定した。X 因子の発現は TGF - β に依2） Glim JE, van Egmond M, Niessen FB, Everts V,存性は発現上昇するが、ECM と接着した状況では発現がBeelen RH. Detrimental dermal wound healing: what

抑制される。従って、ECM を介したシグナル伝達系が X

can we learn from the oral mucosa? Wound Repair

因子の発現を抑制することが示唆されるが、この分子機構

Regen. 21: 648-60.（2013）の解明は今後の課題である。これまでの研究結果から、以3） Morita T, Mayanagi T, Sobue K. Dual roles of下のモデルが提唱できると考えている。正常皮膚組織のmyocardin-related transcription factors in epithelial

線維芽細胞は ECM 層に存在するため、X 因子の発現は抑mesenchymal transition via slug induction and actin

制されるため核内の MRTF -A/ B 機能は阻害された状態remodeling. J. Cell Biol. 179: 1027‒1042.（2007）が維持され、過剰な ECM 産生や細胞運動能の亢進は抑え

4） Nakamura S, Hayashi K, Iwasaki K, Fujioka

られている。しかしながら、皮膚組織傷害による ECM 層T, Egusa H. Yatani H, Sobue K. Importin α/β1の損傷により皮膚線維芽細胞は ECM から剥離し、さらにheterodimer-mediated nuclear import of myocardin

炎症細胞から分泌される TGF- β 刺激を受けることで X 因family members. J. Biol. Chem. 285: 37314-33723.（2010）

子の発現増強が誘起される。この結果、X 因子が SRF 及

5） Hayashi K, Morita T. Differences in the nuclear

び MRTF -A /B と結合し、MRTF-A/B 機能が活性化され、export mechanism between myocardin and myocardin-

皮膚線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換が惹起されrelated transcription factors A. J. Biol. Chem. 2 8 8:る。このモデルは皮膚の恒常性維持に限定されたものでは5743-5755.（2013）

なく、筋線維芽細胞の寄与が示唆されている疾患（肝硬変、6） Hayashi K, Murai T, Oikawa H, Masuda T, Kimura

肺腎線維症、強皮症、網膜症などの線維化症やガン関連線

K, Muehlich S, Prywes R, Morita T. A novel inhibitory

維芽細胞［ガン組織の微小環境に局在する筋線維芽細胞］を

mechanism of MRTF-A/B on the ICAM-1 gene介した扁平上皮ガンの浸潤・転移）の発症・進展にも関わり、expression in vascular endothelial cells. Sci. Rep. 5:

これらの疾患の病態解明にも適応できると考えている。さ10627.（2015）− 106 −