高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明
城西大学薬学部

徳留

嘉寛

Skin administration is a simple method of therapeutic and cosmetic application. However, the protective barrier provided by the skin makes it challenging to achieve delivery of high molecular weight compounds. Efforts to improve the penetration of hyaluronic acid (HA) have yielded nanoparticulate polyion complexes of HA with poly-L-lysine (HANP), which
act as vehicles for delivering HA deeper into the skin. However, the mechanism for this effect and the response of HANP to
the skin environment have not been explored. In this study, the penetration of HANP in skin is compared with that of HA,
and differences in the pathways are identified. In addition, the properties of the particles in a simulated skin environment areassessed and HANP are found to show morphological changes in response to ions. These findings are expected to pave theway for future transdermal delivery of other high molecular weight ionic compounds such as proteins.

1．緒

製剤は調製の段階で凍結乾燥を行う必要があり、薬物の変言性が懸念される。

皮膚を介する物質の皮膚透過は、投与の簡便さや中断の本研究では調製が容易であり、有機溶媒や界面活性剤を容易さ、肝初回通過効果の回避が可能であるといった点か使用せずにナノ粒子を形成できる Polyion complex（PIC）

ら注目されている。しかし、皮膚の最外層に存在する角層技術に着目した。PIC は反対に帯電した高分子電解質間のは、物質の透過に対してバリア機能を有しており、経皮吸

強い静電的相互作用により、互いの電荷を打ち消し合って

収における最大の障壁となっている。一般的に受動拡散で形成される集合体であり 9 , 10）、生体適合性の高い試薬を用

皮膚を透過できる物質は分子量が 500 Da 以下で、比較的いることで安全性の高いナノ粒子の調製が可能であると考

脂溶性の高い化合物とされている

1 , 2）。難皮膚浸透性化合物の浸透を向上させるために経皮吸収促進技術が多くの研えられている。また、水に溶解した化合物を加工せずに用いるため、温度による変性等を考慮する必要がない。

究者により盛んに研究されている。経皮吸収促進技術は物PIC を用いた以前の研究で我々は、アニオン性化合物に理的促進法と化学的促進法に大別される。物理的促進法と

HA を用いて Hyaluronic acid nano particle（HANP）を調

3）

4）

等

製することで、HA の皮膚浸透性が向上したことを報告しの技術が高分子化合物の皮膚浸透性を向上させるための研ている 11）。HA は分子量が約数百万の水溶性高分子である究として報告されている。しかし、これらにはわずかに皮ため、一般的には受動拡散での皮膚内への浸透は困難であ膚を損傷させる、あるいは特別な機械を用いるため利便性ると考えられていた。皮膚の水分・弾力性維持に重要なはに欠けるといった問題点がある。一方、化学的促進法としたらきを担っている HA の皮膚浸透性を向上させた HANP

しては、マイクロニードル 、イオントフォレーシス

5）

6）て、良く知られているエタノール やℓ-メントール 等がは、シワやたるみの改善といった皮膚機能改善効果が期待報告されている。しかしこれらは、比較的低分子化合物のされる。しかし、HANP が皮膚をどのような経路を介し応用に限られ、高分子化合物には効果が高くない。その他、て通過しているのか、粒子の形態を保ったまま皮膚に浸透

最近は溶媒としてイオン液体を用いる手法 7）等も報告されしているのかといった具体的な浸透のメカニズムはいまだている。特に高分子化合物の皮膚浸透性の向上は多くの研解明されていない。

究者にとって大きな課題である。九州大学の後藤先生らの本研究課題では、アニオン性化合物に HA、カチオン性グループでは、非侵襲的に化合物を皮膚内に浸透させるた化 合 物 に Poly-L-lysine hydrochloride（PLL）を 用 い てめ、水溶性薬物をナノコーティングし油状基材中に分散さ

HANP を調製し、この粒子を用いて高分子水溶性ナノ粒

8）

せる Oil-in-solid 製剤 が研究されている。しかし、S/O

子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メ
カニズムの解明を目的に検討を行った。

The skin penetration mechanism of highmolecular weight compounds based ont he s k i n p e net r at io n b eh av ior of
hyaluronic acid nanoparticles
Yoshihiro Tokudome, Ph.D.
Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Josai University

２．方法

2. 1. 実験材料
ヒアルロン酸ナトリウム（FCH- 120 , M.W. 1 , 200 kDa,
純度：99 . 9 %）はキッコーマンバイオケミファ（東京、日本）を用いた。ポリリジン（PLL）、アセトアルデヒド、シクロ− 150 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

ヘキシルイソシアニド、コレステロール、パルミチン酸、を HPLC で定量した。

コレステロール硫酸はシグマ製（St. Louis, MO, USA）のも

上清中の HA は、YMC-Pack Diol- 300 カラム（300 × 8 . 0のを使った。5 -アミノフルオレセイン、ケラチンは東京

mm, S- 5 µm, 30 nm）を用いたHPLCによって確認した。移動化成工業（東京、日本）から購入した。ジパルミトイルフォ

相は 10 mM 酢酸アンモニウム：メタノール＝8：2、流速は 1 mL/

スファチジルコリンは日本精化（兵庫、日本）から供与されminに設定した。注入量は 50 µLとし、210 nmの波長で紫外たものを用いた。その他溶媒は、富士フィルム和光純薬工

線検出を行った。

業（大阪、日本）
から購入した。その他の試薬は特級グレー
ド以上のものを精製せずに用いた。

2. 6. HAのケラチンへの吸着性の評価

2. 2. 蛍光標識ヒアルロン酸の調製

1 mL 添加し、24 時間撹拌した。0 . 45 µm のフィルタでケ

ケラチンパウダーに HA 水溶液、または HANP 水溶液をFluorescence-labeled HA（FL-HA）は、アルデヒド、アミン、イソシアニド、カルボン酸の 4 成分縮合反応で調製

ラチンパウダーを濾過し、（リン脂質リポソーム）と同様の条件でろ液中の HA を定量した。

した 12）。調製した HL-HA 中に未反応の 5 -FL の混入を除た。FL-HA 溶液を凍結乾燥し、FL-HA 粉末とした。

2. 7. 角層細胞間脂質リポソーム（SCLL）への吸着性の評価

2. 3. ヒアルロン酸ナノ粒子の調製

ル（25 %）、パルミチン酸（25 %）、コレステロール硫酸（10 %）

くためにセルロースチューブを用いて 24 時間透析を行っクロロホルムに溶解したセラミド（40 %）、コレステロー
1 mM の FL-HA 水溶液と 0 . 1 mM の PLL 水溶液を FL-を混合し、溶媒を減圧留去して薄膜を作製した。精製水でHA：PLL ＝ 1：2 となるように混合し、室温で 15 分間撹

水和後、超遠心機により、289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分

拌することで FL-HANP を得た。また、0 . 1 mM の HA 水

間遠心分離した。得られた沈殿に精製水を 1 mL 加えて再溶液と 0 . 1 mM の PLL 水溶液を HA：PLL ＝ 1：1 となるよ

分散したものを SCLL とした。SCLL 分散液と HA 水溶液

うに混合して HANP を得た。

または HANP 水溶液が 1：19 の比率になるように混合し、

2. 4. In vitro 皮膚浸透性試験

分離し、上清の HA を HPLC で定量した。

24 時間撹拌した。289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分間遠心
動物の取り扱いは城西大学動物実験管理委員会により承ウスは、株式会社星野試験動物飼育所（茨城、日本）から購

2. 8. 全反射型フーリエ変換赤外分光法による角層細胞間脂質の流動性の評価

入した。マウスから採取した全層皮膚と、採取後にテープ

ヘ ア レ ス マ ウ ス の 全 層 皮 膚 を 採 取 し、 精 製 水、0 . 05

ストリッピングによって角層を除去した角層除去皮膚を使

mM HA 水溶液、0 . 05 mM PLL 水溶液、HANP 水溶液、認された方法に従って実施した。6 週齢の雄性ヘアレスマ

2用した。縦型フランツ拡散セル（有効透過面積：1 . 77 cm ）FL-HANP 水溶液に 1、6、24 時間浸漬させ、FTIR で測定に表皮側を上にして皮膚を装着した。レシーバ側を 5 mLを行った（測定条件；積算回数：40、分解能：0 . 9 cm- 1、の精製水で満たし、ドナー側に FL-HA 水溶液または FL-

測定温度：32 ℃）。

HANP 水溶液を 1 mL 適用した。セルの温度は 32 ℃に保ち、
24 時間皮膚浸透性試験を行った。24 時間後に、角層除去

2. 9. HANPの形態観察

皮膚と全層皮膚からそれぞれ凍結切片を作製し、蛍光顕微

HANP の形態を 2 % リンタングステン酸溶液によるネガ

鏡で皮膚中の蛍光を観察した。さらに全層皮膚からは角層

ティブ染色を用いて、透過型電子顕微鏡（Transmissionを剥離し、顕微鏡で角層の表面を観察した。

Electron Microscope：TEM）（JEM- 1 4 0 0 Plus、JEOL Ltd.、
東京、日本）で観察した。また、PBS を最終濃度が 150 mM

2. 5. リン脂質リポソームへの吸着性の評価となるように添加した HANP の形態を TEM により観察しDipalmitoyl phosphatidylcholine（DPPC）をクロロホルた。

ムに溶解し、溶媒を留去することで薄膜を作製した。精製
水で水和後、凍結融解後、超遠心機により、289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分間遠心分離した。得られた沈殿に精製

2. 10. 統計分析
全てのデータは少なくとも 3 回の独立した結果からの平水を 1 mL 加えて再分散させたものをリン脂質リポソーム

均±標準偏差（SD）とした。Student’s t-test、Dunnett’sとした。リン脂質リポソームと HA 水溶液または HANP 水

test で統計処理を行った。

溶液が 1：19 の比率になるように混合し、24 時間撹拌した。
289 , 000 ×g、4 ˚C の条件で 15 分間遠心分離し、上清の HA− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結性を調査した。FL-HA 適用群では皮膚表面に FL-HA 由

果

来の蛍光が観察された。FL-HANP 適用群では非粒子の3. 1. ヒアルロン酸ナノ粒子の調製

HA よりも皮膚深部への FL-HA の浸透が観察された。こFL-HA と PLL から FL-HANP を、HA と PLL から HANPを調製した。FL-HANP は粒子径が 242 . 5 ± 22 . 7 nm、PDIの結果より、HA を粒子化することによる皮膚への浸透性の向上が示された（Fig. 1 a, b, c and d）。

が 0 . 58 ± 0 . 10、ゼータ電位が−49 . 8 ± 3 . 9 mV のナノ粒子

また、全層皮膚に FL-HA 水溶液または FL-HANP 水溶であった。HANP は粒子径が 92 . 2 ± 7 . 8 nm、PDI が 0 . 20液を適用し、皮膚浸透性試験を行ったところ、FL-HANP± 0 . 03、ゼータ電位が−29 . 5 ± 2 . 6 mV のナノ粒子であっ

適用群で角層に強い蛍光が確認された。しかし、角層以下

た（Table 1）。

への FL-HA の浸透は見られなかった（Fig. 1 e, f, g and h）。
皮膚表面から角層を剥離し、表面を観察したところ、

3. 2. In vitro皮膚浸透性試験

FL-HA 適用群では角質細胞に、FL-HANP 適用群では角角層除去皮膚を用いて FL-HA、FL-HANP の皮膚浸透
Table 1
SampleFL-HANP
HANP

Fig. 1層細胞間脂質に FL-HA 由来の蛍光が観察された（Fig. 2）。

Physical properties of HANP and FL-HANP

Particle diameter（nm）
242.5 ± 22.7
92.2 ± 7.8

PDI0.58 ± 0.10
0.20 ± 0.03

Zeta potential（mV）− 49.8 ± 3.9− 29.5 ± 2.6

Cross-sectional fluorescence image of hairless mouse skin.

（a）Stripped skin, fluorescence image, HA application,（b）Stripped skin, bright field image, HA application,（c）Stripped skin, fluorescence image, HANP application,（d）Stripped skin, bright field image, HANP application,（e）Full thickness skin, fluorescence image, HA application,（f）Full thickness skin, bright field image, HA application,（g）Full thickness skin, fluorescence image, HANP application,（h）Full thickness skin, bright field image, HANP
application. Scale bars indicate 50 µm.

Fig. 2 Skin surface fluorescence image of hairless mouse.
（a）Fluorescence image, HA application.（b）Fluorescence
image, HANP application. Scale bars indicate 50 µm.

− 152 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

これらの結果より、HA は細胞内経路、HANP は細胞間経

は HA よりも有意に高い吸着率を示した（Fig. 3 a）
。したが路を通って皮膚に浸透している可能性が示された。HA をって、HANP は生体膜と強く相互作用する可能性がある

ナノ粒子化することで、透過経路が変化する可能性が示さことが想定された。
次に角質細胞の主成分であるケラチンを用いて HA と角れた。

質細胞の相互作用を調査した。HA は HANP よりも有意に

3. 3. HANPの皮膚構成物の吸着性（in vitroでの検討）

高い吸着率を示した（Fig. 3 b）。したがって、HA は HANP

角層除去皮膚を用いた皮膚浸透性試験の結果より、FL-

最後に SCLL との吸着を確認した。HANP は HA よりも

HANP 適用群で FL-HA の皮膚深部までの浸透が確認され有意に高い吸着率を示した（Fig. 3 c）。したがって、HANP

た。HA をナノ粒子化することで生体膜との相互作用が変は角層細胞間脂質と強く相互作用する可能性があることが化する可能性がある。ここでは、生体膜のモデルとしてリ想定された。

と比較して角質細胞と強く相互作用する可能性がある。

ン脂質リポソームとの吸着を、角質細胞のモデルとしてケ
ラチンとの吸着を、また、角層細胞間脂質のモデルとして、

3. 4. ATR-FTIRを用いた検討
2850 cm- 1 付近に現れる CH 2 対称伸縮振動、2920 cm- 1

角層細胞間脂質から構成したリポソーム（SCLL）との吸着を確認した。

付近に現れる CH 2 逆対称伸縮振動由来のピークが高波数

生体膜の代替としてリン脂質リポソームを用いることで、
HANP と生体膜の間で起こる相互作用を推察した。HANP側へシフトすることで脂質の流動性が上昇することが知られているが、全ての群において、ピークの高波数側への有Fig. 3 Adsorption of HANP and HA on（a）phospholipid liposomes,（b）keratin, or（c）SC lipid
liposomes. Values represent the mean and standard deviation（SD）of three independent results.
Statistical processing was performed using Student’ s t-test. *p < 0 . 05 ; **p < 0 . 01; *** p < 0 . 001.
Table 2 Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR) measurements of CH symmetric (a) and asymmetric (b)stretching vibrations in the stratum corneum after 1, 6 , and 24 h.
（a）

（b）

ControlDistilled water
HA
PLL
HANP
FL-HANP1h
2850.1 ± 0.1
2850.0 ± 0.0
2849.8 ± 0.2
2849.8 ± 0.0
2849.9 ± 0.1
2850.1 ± 0.26h2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.0
2850.1 ± 0.1
2849.8 ± 0.1
2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.1

24 h2849.9 ± 0.2
2849.8 ± 0.2
2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.0
2849.8 ± 0.0
2849.9 ± 0.1

ControlDistilled water
HA
PLL
HANP
FL-HANP1h2917.6 ± 0.3
2917.4 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.8 ± 0.3

6h2917.6 ± 0.1
2917.4 ± 0.1
2918.0 ± 0.3
2917.5 ± 0.0
2917.5 ± 0.4
2917.6 ± 0.2

24 h2917.3 ± 0.2
2917.6 ± 0.4
2917.7 ± 0.2
2917.6 ± 0.1
2917.8 ± 0.6
2918.0 ± 0.1

Samples: Control (stratum corneum only), Distilled water (vehicle), HA(hyaluronic acid), PLL (poly L-lysine), HANP (hyaluronic acid nanoparticle),
FL-HANP (fluorescently labeled HANP). Values represent the mean andstandard deviation (SD) of three independent results.

− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

イオン存在下では形態の変化が観察された（Fig. 4 c, d）。

意なシフトは見られなかった（Table 2）。

物性値も大きく変化した（Fig. 5）。

3. 5. TEMによるHANPの形態観察

４．考

皮膚に適用された HANP は、ナノ粒子の形態を保った

察

まま皮膚に浸透しているのか、結合がほどけて HA として本研究課題では、ヒアルロン酸ナノ粒子を用いて高分子

皮膚に浸透しているのかを調査するため、HANP に PBS

水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物を 添 加 し た。PBS の 最 終 濃 度 が 150 mM と な る よ う にの皮膚浸透メカニズムの解明を目的に検討を行った。

HANP に添加することで、皮膚に接触した後の HANP の形態を推測した。

1 mM の FL-HA と 0 . 1 mM の PLL を 1：2 の比率で混合して調製した FL-HANP をヘアレスマウスの角層除去皮膚

HANP は粒子径 200 nm ほどの球形の粒子であり（Fig.

に適用し、24 時間皮膚浸透性試験を行った。FL-HA 適用

4）、時間が経過しても変化しなかった（Fig. 4 a, b）。共存

群と比較し、FL-HANP 適用群で皮膚深部への FL-HA のFig. 4 Observation of HANP morphology by transmission electron
microscopy（TEM）（a）HANP and distilled water,（b）HANP and PBS（final concentration:
15 0 mM），（c）HANP and distilled water（enlarged view），（d）HANPand PBS（final concentration: 15 0 mM）（enlarged view）．Scale bar
indicates 200 nm.

Fig. 5 Particle diameter, PDI, and zeta potential of HANP and HANP on addition of PBS（final
concentration of 150 mM）．
（a）Particle diameter,（b）PDI,（c）zeta potential. Values represent the mean and standard deviation（SD）
of three independent results.

− 154 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

浸透が確認された。この結果から、一般的に皮膚への浸透動由来のピークとされる。これらのピークの高波数側へのが困難であるとされている水溶性高分子化合物の HA をナ

シフトは、トランス配座からゴーシュ配座への立体配座のノ粒子化することで、皮膚への浸透性が改善されることが変化を表しており、ゴーシュ配座が増加することで脂質の示唆された。

充填効率が低下する。つまり、赤外吸収の波数は脂質の流次いで、角層を除去した皮膚への HA または HANP の浸動性上昇に伴い高波数側にシフトする。Control 群と比較

透メカニズムを解明することとした。角層除去皮膚の表面

して HANP、HANP の構成成分である HA、PLL 等の全サは、生細胞の細胞膜であると考えられるため、リン脂質リ

ンプルで、ピークの高波数側への有意なシフトは確認されポソームを用いた疑似的な生細胞膜への吸着性を調査した。

なかった（Table 2）。すなわち、角層流動性に大きな変化

HA 群と比較して、HANP 群でリン脂質リポソームへの吸はなかったことから、HANP は脂質の流動性を乱して皮着性が有意に高かった（Fig. 3 a）
。この結果は角層除去皮膚に浸透している可能性は低く、従来の浸透促進技術より膚を用いた皮膚浸透性試験により得られた切片画像と似たも皮膚バリア機能に対し大きな影響を与えないと考えられ傾向を示しており、非粒子の HA よりも HANP の皮膚浸透る。

性が高いことを支持する結果となった。このことから、

最後に、皮膚に適用した後の HANP は、粒子化したま

HANP は生体膜へのより強い相互作用によって皮膚浸透

ま皮膚に浸透しているのか、もしくは結合が崩壊して HA性が高まると考えられる。

と PLL 単体として浸透しているのかを調査するために、

皮膚浸透性試験後の全層皮膚から角層を剥離し、皮膚表

HANP に PBS を加えることで生体に接触したときと同条面から蛍光顕微鏡で観察すると、FL-HA 適用群では角質件（PBS 150 mM）を想定し、物性値を測定した。PBS を加細胞に、FL-HANP 適用群では角層細胞間脂質に蛍光が確えることで粒子径と PDI は増大、ゼータ電位の絶対値は減認された（Fig. 2）。このことから、HA と HANP では角層

少した（Fig. 5）。また、TEM 画像においても、PBS を加を通過する経路が異なる可能性を考え、角質細胞および角えることで HANP の形態が変化した（Fig. 4）ことから、層細胞間脂質に対して、それぞれがどのような相互作用を

HANP は共存イオンの影響によって崩壊した可能性があしているのかを調査することとした。まず、角質細胞の主る。この現象はイオンによって PIC の静電相互作用が乱れ成分であるケラチンへの吸着性から、HA または HANP とることが原因で誘発されると考えられるため、HANP を

角質細胞の相互作用を調査したところ、HA 群でケラチン皮膚に適用した際に、皮膚中のイオンと反応して同様の現への吸着性が有意に高かった（Fig. 3 b）
。また、角層細胞象が起こると推測した。このことから、皮膚浸透後に間脂質と組成が類似している SCLL への吸着性から、HA

HANP は崩壊し、皮膚中で HA 単体として水分・弾力性維または HANP と角層細胞間脂質の相互作用を調査したと持の機能を果たすことが期待できる。HANP としての生ころ、HANP 群で有意に SCLL への吸着性が高かった（Fig.

体に対する安全性はいまだ不明であるため、粒子としての3 c）。これらの結果は、Fig. 2（角層表面の顕微鏡画像）の形態を保ったまま皮膚に浸透するよりも、皮膚中で崩壊し画像を支持する傾向を示していた。水溶性高分子であるて非粒子の HA となることで安全性が高まると考えられる。

HA は角質細胞への吸着性が高いため皮膚深部まで浸透せ

しかし、HANP は角層に接触した際に皮膚表面で崩壊す

ずに表面で留まり、HANP は小さな粒子を形成している

るのか、角層に浸透した後に皮膚中で崩壊するのかは定か

ほか、細胞間脂質への吸着性が高いことで細胞間脂質を介ではない。前述のように HANP の崩壊にはイオンが大きして皮膚に浸透することが示唆された。角質細胞を介するく影響すると考えられることから、よりイオン強度の高い

細胞内経路は少なくとも細胞膜を 2 回透過する必要がある。

ところで崩壊する可能性が高い。これらのことから、

また、細胞間脂質の表面積を考慮すると細胞間経路を介す

HANP は皮膚適用直後に崩壊するのではなく、皮膚に浸る浸透の方が有利である。そのため、ナノ粒子化をするこ

透する過程で徐々に崩壊することが予想されるが、引き続とによって、より浸透が有利な経路を介して水溶性高分子き調査が必要である。また、PLL の挙動についてもいまだ化合物を皮膚に浸透させることができる可能性が示された。

不明な点があるため、HANP として皮膚に適用した後のまた、リン脂質リポソームへの吸着性の結果から、HANP

PLL の局在を引き続き調査する必要がある。

は角層を通過した後に、生細胞膜に対して高い吸着性を示

以上の本研究課題結果から、水溶性高分子をナノ粒子化

すことが考えられる。よって、PIC 技術によるナノ粒子は、することで皮膚浸透経路が異なることで高分子の皮膚浸透

非粒子の化合物と比較して、角層を通過した後により皮膚性を向上させた可能性があることがわかった。

深部まで浸透する可能性が示された（Fig. 3 a）。
HANP 適用後の角層の流動性を ATR-FTIR で調査した。 （引用文献）
角層に特異的に検出される 2850 cm- 1、2920 cm- 1 付近のピ

1） Bos J.D., Meinardi M.M., The 500 Dalton rule for the

ークは、それぞれ CH 2 対称伸縮振動、CH 2 逆対称伸縮振skin penetration of chemical compounds and drugs,− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

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