シアル酸結合レクチンによる食餌性脂質作用の調節西島謙

名古屋大学大学院工学研究科

緒一

助教

路があることが、明らかとなっている。

言
食習慣の欧米化に伴い我が国でも飽和脂肪酸の摂取量

本研究では飽和脂肪酸による弱い炎症がシグレックにが増加傾向にあると推定されている。食後上昇する血中より改善可能であるか検証するとともに、シグレックの脂肪酸は、通常脂肪組織に吸収・蓄積されることで速や発現を増強する条件を探索することをめざした。

かに除去される。しかし、いわゆる生活習慣病においては血中脂肪酸濃度が高い状態が続き、健康を損なう

実験方法もととなる。パルミチン酸など食餌由来の飽和脂肪酸

ヒトシグレック-9 を発現するマウスマクロファージ

は、強い炎症を引き起こす病原菌由来のリポポリサッカ

細胞株 RAW264 細胞 2) を、24 時間培養し、回収したライド (LPS) と同様に、白血球の持つ危険センサーの一上清中の炎症性サイトカイン TNF-α及び抑制性サイト種 TLR4 により弱い炎症を引き起こすことが知られていカイン IL-10 の量を、ELISA 法により測定した。炎症性る。一方、インスリン非応答性 (II 型 ) 糖尿病や心筋梗サイトカインの発現誘導に重要な転写因子 NF-κB の活塞などの生活習慣病は、自覚しない程度の弱い慢性炎症性化は、通常は NF-κB に結合して活性化を抑制していが原因であるとの説が有力となりつつある。そこで、本るタンパク質で、細胞が活性化されると分解される IκB

研究ではシアル酸結合タンパク質の持つ抗炎症機能を利の量をウェスタンブロットで検出することで検証した。

用して、生活習慣病につながる慢性炎症を調節する可能

なお、パルミチン酸はウシ血清アルブミンと結合させて性を検証する。

用いた。

酸性糖の一種であるシアル酸はヒトのほとんどの糖鎖骨髄細胞をマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)

末端に存在する。シアル酸は下等生物にはほとんど見ら存在下 5-8 日間培養しマクロファージに分化させた後、れず、免疫反応における自己と非自己の識別に適した性

24 ウェルプレートに播種し、IL-4 (10U/ml) または IFN-質を持っている。実際、補体系において自己免疫を抑制

γ (100 U/ml) 存在下 LPS (10 ng/ml) により 24 時間刺するための目印としてシアル酸を利用している例が知ら激した。細胞から RNA を抽出し、シグレックの発現量れている。最近発見されたシアル酸結合レクチンであるを RT-PCR により定量した。発現は、GAPDH またはアシグレックは、主に白血球の細胞表面に存在しており、クチン遺伝子によって補正した。

細胞内ドメインに抑制性モチーフをもつことから、シアル酸の持つ免疫調節活性との関連が注目されてきた 1)。

結

現在までに、T リンパ球、B リンパ球、NK 細胞やマス

1.

ト細胞の活性を抑制することが報告されている。

果
食餌由来飽和脂肪酸による炎症反応のシグレックによる抑制

我々は炎症を引き起こす細胞であるマクロファージに白血球が持つ TLR は、本来病原菌の細胞壁成分を識着目し、シグレックが LPS など様々な病原菌由来の炎別するレセプターであるが、パルミチン酸やステアリ症誘導物質に対して、強い抗炎症作用を持つことを初ン酸等の食餌由来飽和脂肪酸は TLR を介して弱い炎症2)めて明らかとしている 。その抗炎症活性は、①マクロを引き起こすことが報告されている。RAW264 細胞を、ファージからの TNF-αなどの炎症物質の産生量を低下

食餌中に含まれる代表的な脂肪酸であるパルミチン酸させるだけでなく、②強い炎症抑制作用を持つサイトカ存在下 24 時間培養した。培養後の上清中に含まれる

イン IL -10 を多量に作らせるという二つの独立した経TNF-αの量を測定した。その結果、シグレックを発現
1

西島

謙

一させていない RAW264 が有意に TNF-αを産生していた

シグレックによる TNF-α産生量減少は NF-κB 活性化ののに対し、シグレック発現 RAW264 ではほとんど TNF-抑制によることが示唆された。同じ TLR により活性化αの産生が認められなかった（図１A）。パルミチン酸

されるパルミチン酸の場合も、同様に NF-κB 経路によの濃度依存性について検討したところ、シグレック非発る抑制であることが推定された。我々は既にシグレック

現 RAW264 細胞では 400 - 1000 μM の範囲で徐々にが TNF-αだけでなく他の炎症性サイトカイン IL-6 や抗TNF-αの産生量が増大するのに対し、シグレック発現ウイルス作用を持つ IFN-βの産生も抑制することを報告

RAW264 細胞ではほとんど変化が認めらなかった（図している 2) が、これらのサイトカイン共通の転写因子１B）。シグレック発現・非発現細胞ともに、低濃度のとして NF-κB があげられる。今回の知見はシグレック

パルミチン酸により若干の TNF-α産生量の減少が認めが炎症性サイトカインを抑制するための共通のメカニズられた。

ムとして NF-κB を調節している可能性を示唆するもの

シグレックによる TNF-α産生量減少のメカニズムとである。

して、TNF-α遺伝子の発現を活性化する転写因子 NF-

一方、我々のこれまでの研究においてシグレック発現κB の関与の可能性を検討した。TNF-α産生量の大きい

RAW264 細胞において産生が強く認められた抑制性サLPS による刺激を用いて、細胞の活性化にともない分解

イトカイン IL-10 は今回の条件では検出限界以下であっされる IκB の量の変化を検討した。シグレック非発現た（データ省略）。IL-10 産生の欠如が LPS やペプチド細胞では、約 15 分で IκB の量が顕著に減少しているこ

グリカンなどの強い刺激とパルミチン酸による刺激とのとが確認された（図２）。
シグレック発現細胞においても、質的な差違なのかについては今後の検討が必要である。

同様のタイムコースで IκB の量は減少したが、その減これらの結果から、シグレックを発現したマクロ少の程度は明らかに弱いものであった。このことから、ファージでは食餌性脂肪酸による TNF-αの生産量が低いことが示された。慢性的に生産される低レベル TNFαは、動脈硬化や心臓疾患など様々な生活習慣病の増悪因子であることが示唆されていることから、マクロファージのシグレック発現量を増強させることが出来れば、これらの疾患の悪化防止等に役立つ可能性が示唆された。
2.

シグレックの発現を誘導する成分の探索

ある種のシグレックはマクロファージや樹状細胞などの白血球が成熟していく過程で発現が増すことが知られる。しかし、その発現を調節する仕組みは全く明らかにされていない。そこで、マクロファージのシグレック発現を制御する食物因子の検索に先立ち、マクロファージ

図1

図2

シグレックによるパルミチン酸誘導 TNF-α産生の抑制

シグレックによる NF-κB 経路の抑制

シグレック発現 / 非発現（コントロール）RAW264 を 500

シグレック発現 / 非発現（コントロール）RAW264 を LPS により

μ M パルミチン酸存在下 24 時間培養し、上清中の TNF-αを定量表示した時間刺激し、細胞質中に存在する抑制因子 IκB の量をウェした。

スタンブロットにより検出した。（アクチン：ローディングコント

(B)

ロール）

(A)

同様にパルミチン酸の濃度依存性を検討した。
2シアル酸結合レクチンによる食餌性脂質作用の調節活性を調節するサイトカインによるシグレックの発現量ファージのマーカーとして、誘導した細胞の性質を確認変化を検討した。

した（図３A）。この際のシグレックの発現を RNA レベ

骨髄細胞を in vitro で M-CSF により刺激することでルで定量した。その結果、IL-4 誘導型マクロファージで分化させたマクロファージを用いた。通常の炎症を誘シグレック-G の発現が増すことが認められた（図３B）。

導する刺激としては IFN-γ存在下 LPS を加えた。一方、

一方、IFN-γと LPS の刺激ではシグレック-G の発現は組織再生を起こすとされる M2 マクロファージを誘導し減少した。また、シグレック -F は IFN-γと LPS の刺激やすい条件として IL-4 を用い、24 時間培養することでで、シグレック-E は IL-4 刺激で減少した。シグレック

シグレックの発現量が変化するかどうかを RNA レベル-H、CD33（シグレック-3）はどちらの刺激でもやや減で検定した。

少した。

LPS の刺激によって大量に産生される一酸化窒素合成酵素 (iNOS) を炎症性マクロファージの、またレクチン

考察
古くから炎症を引き起こす細胞としてとらえられていの一種であるマンノースレセプターを組織修復型マクロ(A)

(B)

図3

サイトカインによるシグレック発現量の変化

骨髄から M-CSF により分化させたマクロファージを図に示した条件下で 24 時間培養し、RNA の発現をリアルタイム RT-PCR 法により定量した。
（A）炎症型、組織修復型マクロファージマーカーの発現検定。結果は刺激なしの条件（none）を１とした相対値で示した。
（B）マウスシグレックファミリーの発現強度の検定。
3

西島

謙

一

今後解析を行う予定である。

たマクロファージには多様性があることが明らかとなりつつあり、炎症を減弱する活性を持つ細胞も存在するこ
3)とが注目されている 。本研究においてはマクロファー

要約ジ表面上で糖を認識するレクチンタンパク質シグレック

食餌由来の飽和脂肪酸は、弱い炎症を引き起こす活性を用いて、マクロファージの性質を抗炎症性に変換し、が知られ、インスリン非応答性糖尿病などの生活習慣病食餌性脂質の生理作用をコントロールする可能性が示さの原因となる可能性が指摘されている。本研究ではマクれたと言える。食餌中の脂質は優れたエネルギー源であロファージが持つ細胞性レクチンシグレックが飽和脂肪るにもかかわらず、食習慣を含めた現在の生活の変化に酸による弱い炎症を抑制可能であることが示唆された。

より、健康を損なう原因となるケースが増えている。「炎一方、初代培養マクロファージを用いた解析では、炎症症体質」改善にむけて、シグレックの発現を増強できる抑制効果と関連すると想定されるシグレックの発現をサ物質が利用可能であると考えられる。本研究では IL-4

イトカインなどの添加により変化させられる可能性が示などのサイトカインによりシグレックの発現が変化しうされた。今後、シグレックの発現調節物質の検索により、ることが示唆されており、今後食成分等よりその発現をこうした炎症を人為的に制御する方法を模索してゆきた制御できる物質が見つけられれば、サプリメントなどへい。の利用が期待できる。現在、このような物質の検索を進めている。

謝辞

一方、今回の実験条件ではいくつか存在するシグレッ

本研究の遂行にあたり、財団法人三島海雲記念財団よクファミリー分子全てを同時に増強あるいは抑制できり学術研究奨励金のご支援を賜りました。心より御礼申る条件は見つかっておらず、個々の発現変化がマクロしあげます。

ファージそのものの性質に及ぼす影響について今後詳細に検討してゆく必要がある。現在それぞれのシグレック

文

献の役割を直接明らかにするために、調製した初代培養マ

1) P. R. Crocker et al.: Nat. Rev. Immunol ., 7, 255-266, 2007.

クロファージにレンチウイルスベクターによりシグレッ2) M. Ando et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun ., 369, 878–883,
2008.

ク遺伝子を導入・発現させるための準備を進めている。

3) D. M. Mosser and J. P. Edwards: Nat. Rev. Immunol ., 8, 958-969,

ウイルスベクターコンストラクトの作製は済んでおり、

2008.

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