人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究
広島大学理学部

吉里

勝利

The mechanism of formation of skin was studied using a reconstituted skin model.
The dermal model was made by culturing fibroblasts in three dimensional lattices ofcollagen (collagen gel culture) . It was found in this model that cells recognize andbind collagen fibrils utilizing their cell surface protein, cellular fibronectin (cFN)
Collagen fibrils induced the synthesis and phosphorylation of specific proteins in cells.
To develop a technique to grow hair follicles in the skin model, dermal papilla cells weresuccessfully immortalized by transfecting them with SV40 viruses. These cell lines
should be useful for identifying a hair-inducing factor.

言緒

•I-．

胞、 真皮線維芽細胞およびECM C主としてコラ ー ゲンとフィプロネクチン）を用いて人工的に動物の器官や組織は細胞と細胞外基質(Extra­再構築する。 この再構築体を用いて表皮細胞と真cellular Matrix, 以下ECM)を構成要素として皮線維芽細胞の相互作用に関する研究を行う。 ②

これらが複雑な様式で結合し、有機的複合体とし皮膚付属器官としての毛をも有する人工皮膚を構て特異的形態をとり種々の機能を果たしている。

築することを目指す。 ③

最近の細胞生物学や生化学の進歩により、これらの形成機構を、特に細胞とECMの結合様式を中の構成要素を純粋な形で分離することが可能と心に解析する。 ④なった。 本研究では、皮膚の構造と機能をより深用を生化学的に調べる。

人工皮膚を用いて皮膚皮膚細胞に対するECMの 作

く理解するために、皮膚から構成要素を分離した

2. 実験材料および方法

後、これらを用いて、皮膚を再構築して人工皮膚を作ることを試みた。 皮膚の主要構成要素の分離およびそれらの性質に関しては、 これまでに多く細胞は正常ヒトまたはラット(Fisher系）の皮の研究がなされてきた。 しかしながら、これら構膚から得られた真皮線維芽細胞または表皮細胞を成要素を用いて生体皮膚に類似の構造と機能を持用いた。 これらの細胞の分離と培養は既に公表しつ人工皮膚を再構築することに成功した研究例はた方法に従った I, 2) 。 人工真皮（線維芽細胞のない。

コラ ー ゲンゲル培養）は既報の方法に従って作製

本研究は次の目的をもって行われた。 ①

生体した 3) 0

皮膚に近似の構造と機能をもつ人工皮膚を表皮細The study on the mechanism of formation of theskin utilizing a reconstituted skinmodel

3. 結 果3. 1

人工真皮における線維芽細胞とコラ ー ゲンの結合様式

Katsutoshi Yoshizato

線維芽細胞をコラ ー ゲンゲルの中で三次元的にFaculty of Science
Hiroshima University

培養するとゲルが収縮し、 生体真皮に類似した形態を示す-86-4)。 ゲルの収縮は線維芽細胞とコラ ー人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究

コ ラ ー ゲン上では 364個のスポットゲンが結合すること、 およびその後の細胞の運動なっていた。などによって引きおこされる。 従ってゲルの収縮を確認できたが、 そのうち 26%はコラ ー ゲン上過程を調べることによって真皮形成過程におけるでのみ合成されており、前2者では合成されてい線維芽細胞と コ ラ ー ゲンの結合・認識機構を明らなかった。 残りのスポットはプラスチック上の細かに することが出来るものと思われる。

胞でも合成されているものであったが、 このうち私達は既にこのゲル収縮を特異的に阻害するモ

26%は コ ラ ー ゲンによってその合成がup-regu­

ノクロ ー ナル抗体A3A5を得ることに成功した 5) 0

lationされており、 23%は逆にdown-regula­

A3A5が認識する抗原は細胞性フィプロネクチン

tionされていた。 残りはプラスチック上のもの(cFN)である。 cFNが確かにゲル収縮過程でと同じ合成率であった。 以上の結果は細胞による重要な働きをしているかどうか検討した。 細胞をタンパク質の合成 パタ ー ンは基質依存的であり、充分量のcFNで処理した後コラ ー ゲンゲル培養

コ ラ ー ゲンは細胞のタンパク質合成の質と量のいを行ったところ収縮の促進がみられた。 逆に コ

ずれにおいても多大な影響を及ぼすことを示してラーゲンをcFNであらかじめ処理した後ゲル培いる ” 。

養を行うと収縮は抑制された。 これらの事実はゲ

コラ ー ゲンと細胞の接触が刺激となって細胞のル収縮過程でcFNが重要な働きをしていることタンパク質合成の量的および質的変化を引き起こを示唆している。

しているものと考えられる。 この刺激の細胞内伝プを決達の仕組みの 一端を知る目的で細胞内タンパク質定することは、 cFNと コ ラ ー ゲンの結合様式をのリン酸化の パター ンを調べた。 この時以下の理知る上で重要である。 FNをV8プロテア ー ゼや由でEGFの剌激伝達に対する コ ラ ー ゲンの影響トリプシンでi肖化して断片化した。 得られた断片を見るという方法でこの問題にアプロ ー チするこのうちで A3A5と反応する最小分子量を持つものととした。のアミノ 酸 シー クエンスを決定することでこの問で顕著な も の の 一 つは分裂抑制である 8) 。

題を解決しようとしている。 現在の段階ではまだ

ラ ー ゲンの農度依存的に細胞のDNA合成は顕著結論が得られていない。に抑制される 3 , 9) 。 一方EGFは線維芽細胞のcFN分子上の A3A5に対するエビトー

コ ラ ー ゲンの細胞に対する効果のうち
コ

mitogen の 一 つで あ る 。 そ こ で EGFに よ る
線維芽細胞に対するコラ ー ゲンの作用

DNA合成の活性化の過程に コ ラ ー ゲンはどのよ

皮膚形成の過程でECMは細胞と結合し、種々うな影響を示 すか調べることによってコラ ー ゲンの影響を細胞に与えているものと考えられる。 ヒによって引き起こされる変化を追跡することにし3.2ー

卜真皮由来の線維芽細胞をコラ ゲンを基質とした。

てこの上で培養し、 細胞にどのような変化が表れ低血清濃度(3%)培養液で線維芽細胞を培養るか検討した。 コント ロ ー ル基質としてプラスしてEGFを 3ng/叫の濃度で添加するとDNA合チック上およびゼラチン上で細胞を培養して、 コ成が高まる。 この時、 タンパク質のリン酸化の パ細胞を sーメチ
ラオニンで標識し、 二次元電気泳動をO'Farrell

ター ンを調べた。 細胞を32 pの無機リン酸で標識の方法に従って行った。 360から 420個のタ ンパ電気泳動を行った。 この時細胞はプラスチックあク質スポットを得ることができた。 ゼラチンとプるいはコラ ー ゲンの上で培養した。 リン酸化タン

ラスチック上の細胞の二次元パター ンはよく似てパク質の二次元電気泳動パター ンを両者で比較しー ゲン上のものと比較した。

s5ーしてタンパク質を可溶化して既述の方法で二次元いた。 ところがコラ ゲン上で培養された細胞のた。 パタ ー ンはほとんど同じであったが、 分子量

タンパク質 パタ ー ンはそれらと比べるとかなり異27,000のタンパ ク質の挙動に興味が持たれた l O)

-87-0このタンパク質には等電点の異なる2 つのスポッ

しかも興味あることにこの因子はプラスチック上トが存在していた。 一つは等電点(pl)が5.3でに培養された線維芽細胞に対しては効果を示さず

pp27a、 他はpI5.5でpp27bとそれぞれ名付けた。に、 コラ ー ゲンゲル中の線維芽細胞に効果を持つ

後者はコラ ー ゲン上、 プラスチック上あるいはことである。

EGFの有無に関係なくリン酸化タンパク質としこの分子量48,000を持つタンパク質の本体にて出現するがpp27a は特異的な挙動を示した。

興味がもたれたので、 本研究で次の実験を行った。

EGF添加後、 直線的にリン酸化され15分で最高表皮細胞によるconditioned mediumを調製し、値になり、 その後リン酸化の程度は減衰した。

これを抗原としてマウスを免疫した。牌細胞とミpp27aのリン酸化をプラスチック上とコラ ゲン

エロ ー マを常法に従って融合させハイプリド ー マ上で比較するとコラ ー ゲン上では著しく抑制されを作製した。 このハイプリド ー マの中にコラ ー ゲることがわかった。 最高値レベルで比較すると約ンゲル溶解を阻害するクロ ー ンがあるかどうか検1/4に抑えられていた。 pp27aのリン酸化はH7討したところ、 いくつかのクロ ー ンが得られた。

（プロテインキナ ゼC阻害剤）で抑制される。

この中でも最も阻害効果の高いクロ ー ンに注目し、またジェニステイン（チロシンキナー ゼの阻害剤）

このモノクロ ー ナル抗体に結合するタンパク質のでも70%のリン酸化抑制がみられた。 これらの分析を現在行っているところである。

ーー

結果はpp27aタンパク質のリン酸がコラ ー ゲン
線維土では抑制され、 そのことが細胞のEGF反3.4人工皮虐に毛を導入するための基礎的研究応性を鈍くしている可能性を強く示唆している。

現在までに種々の細胞組み込み型の人工皮膚を3. 3皮儒再構築体の中での表皮細胞と線維芽が分化したものである。 この分化過程で毛乳頭細開発する試みがなされてきた。 毛細胞は表皮細胞胞（真皮毛乳頭細胞の一種）が重要な働きをして細胞の相互作用
3.1 の項で述べた方法によってヒト真皮由来のおり、 この細胞の影響下で表皮細胞が毛母細胞ヘ線維芽細胞をコラ ー ゲン線維の三次元的立体格子分化する 13) 。 毛乳頭細胞が合成する特殊な成長の中に埋め込んで培養することによって真皮様構因子がこの作用をもっているのではないかと考え造を構築する。 この構築体の上面に別途調製したられているが、 その実体は不明である。 人工皮膚表皮細胞を播取し、 皮膚様構造を構築する。 これに毛を導入する技術を開発するに当たって、 このはBell等によって開発された人工的に作られた因子の実体解明が必要と考えられるのでこのため皮膚等価物であるII)の基礎研究を行った。 因子解明の障害となってい。

この皮膚等価物をラット(Fisher)の皮膚細るものの一つは毛乳頭細胞の増殖力である。 毛乳胞を用いて構築したところ次のような現象を見いだした I 2 l 。 表皮細胞や線維芽細胞をそれぞれ単増殖力が弱く、 因子を解明するのに必要な数の細独にコラ ー ゲン上（表皮細胞の場合）であるいは胞を得ることが困難であった。 そこで次の試みをコラー ゲンゲル中（線維芽細胞の場合）で培養し頭細胞をin vitroで培養することは可能であるが行った。 ラットC Fisher)の頬髭を抜き取り、てもゲルの溶解現象はみられない。 ところが皮膚毛乳頭を顕微鏡下にて分取した。 直ちに exp lant

等価物では、 ゲルの溶解が起こる。 この溶解現象

cultureを行い細胞を増殖させp rimary cultureを詳しく調べたところ、 次のようなことがわかっを得た。 この細胞にSV40ウイルス遺伝子を常法ている。 表皮細胞は分子量48,000のタンパク質に従って感染させたところ、 増殖クロ ー ンを7つを分泌しているが、 このタンパク質は線維芽細胞得た。 このクロ ー ンには確かにウイルス遺伝子がによるコラゲナー ゼ合成促進作用をもっている。

組み込まれていることをLarge T抗原に対する-88-人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究

コラ ー ゲン線維による細胞のタンパク質合成特異抗体によって免疫染色することによって確認②した。 このうちの1つのクロ ー ンについて次の実の量的および質的制御、③験を行った。 まず頬髭毛胞を別途調製し下半分を質のリン酸化の変化および、④ 人工皮膚への毛切除し上半分のみとした後、 さらに毛幹を抜きの導入に関する基礎研究。 これらの研究は皮膚の取った。 この毛胞の切断面に毛乳頭を挿入しこれ正常な機能と構造を可能にしている仕組みを理解をpositive controlとした。 この実験のnegativeする上で役に立つものと期待している。

コラ ー ゲンタンパクcontrolは無挿入の毛胞である。 実験群はSV40

5. 総 括によって形質転換した細胞（およそlび個）を挿入したものである。 これら毛胞をラット腎臓の皮膜下に植え込んだ。 20日後に開腹し毛胞の変化

本研究は予定の課題に向かって比較的順調に展を調べたところ、 positive controlと実験群では開できたと思っている。 本研究は4つの項目に分白い毛幹の伸長がみられたが、 negative controlけて実施された。 それぞれの項目について最終目

ではそのようなことはみられなかった。 この実験標に達するまでには今後の研究が必要である。 こは形質転換して無限増殖能をもった毛乳頭細胞がれからもこれら項目について研究を継続して理想毛の誘導能を保持していることを示している。 今的皮膚モデルに 一歩でも近づきたいと考えている。

後、 毛誘導因子の実体解明にこの形質転換細胞は引用文献大変有用であると考えている。

1) K. Yoshizato, S. Kikuyama and N. Sh10ya,

4. 考 察Biochim. Biophys. Acta,67,23 (1980) .
2) K. Yoshizato, A. Nishikawa and T.Taira, J.
Cell Sci.,91,491 (1988) .

本研究は人工皮膚をモデル実験の対象として扱

3 ) K. Yoshizato, T. Taira and N. Yamamoto,い、 皮膚の性質を明らかにしようとして行われた。

Biomed. Res., 6,61 (1985).

皮膚は体の表面を覆っており、 美容や外傷などの問題を考えるとき第一4) E. Bell,B. lvarsson and C. Merril,Proc. Natl.に考慮に入れる必要のある

Acad. Sci. USA.,76,1274 (1979).

臓器である。 その意味で皮膚の人工モデルを作る

5) H. Asaga,S. Kikuchi and K. Yoshizato,Expことは重要である。 これまでいくつかの試みが報

Cell. Res.,193,167 (1991).

告されている。 言うまでもなく本物に近いモデル

6) P. H. O'Farrell, J. Biol. Chem., 250, 4007

が理想であるが現状ではほど遠い。

(1975).

この中でもBellらによって開発された人工皮

7 ) N. Koseki and K. Yoshizato, Cell Adhesion

膚は注目に値する。 この人工皮屑は全て生体由来

and Communication,1,355 (1994).の材料で作られているからである。 3項でも述べたごとく、 このモデルはコラー

8) R. Sarber, B. Hull, C. Merrill, T. Sorannoゲン、 表皮細胞、真皮線維芽細胞によって作られている。 非常に単and E. Bell,Mech. Age. Dev. 17, 107 (1981).

純なモデルではあるが、 現実の生体皮膚の性質を

9) K. Yoshizato, A. Makino and K. Nagayosh1,Biomed. Res. 9,33 (1988).

in vitroで再現することができる。 勿論全ての性

10) N. Koseki and K. Yoshizato, in preparation

質の再現には至ってないが重要ないくつかの性質(1994).の研究には優れたモデルであることは間違いない。

11) E. Bell, H. P. Ehrlich, D. J. Buttle and T.

本研究はこのモデルを利用して次の研究を行った。 ① 線維芽細胞とコラ ー ゲン線維の結合様式、-89-Nakatsuji,Science 211, 1052 (1981).

12) K. 8. Nishikawa and K. Yoshizato, Biomed.

13) C. A. B. Jahoda, K. Horne and R. F. Oliver,
Nature311,560 (1984).

Res.11, 231 (1990).

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