亜鉛ス）レホフタロシアニンを利用した光化学治療
東京工業大学

大倉生命理工学部一郎

Water-soluble zinc phthalocyanines substituted with different number of sulfonic acidgroups were synthesized. ZnSPcm,x was readily incorporated in HeLa cells. Irradiation of
HeLa cells with ZnSPCmix resulted in cell damaged.
The cellular morphological changes due to irradiation were observed using SEM.

1緒 言

吸光係数が大きい。 一 例として亜鉛テトラスルホフタロシアニンの吸収スペクトルを図lに示す。

腫瘍集積性光増感剤を、あらかじめ癌患者に投図には比較のためHpDの吸収スペクトルも点線で光照射により 癌を治療す示してある。図のように フタロ シアニンはポルる、いわゆる光化学療法においては、副作用の少フィリンと異なり長波長領域における吸光係数がない光増感剤の開発が切望されている。光化学療

大きく、深部の癌に対して有用であることが期待

法用光増感剤としては、次の要素を備えていることが必要である。

される。さらに腫瘍組織への集積性もよく I) 、光照射に対して安定であることから、光化学治療用

1)光化学的に安定である。の新しい感光色素としての期待は大きい。

与し 、その後レー

ザー

フタロシアニンは中心金属や側鎖を変えること

2)腫瘍選択性が高い。
3)光を照射しなければ細胞に無害である。
4)組織透過性のよい長波長領域(600-800nm)

により様々な種類のフタロシアニンが合成されている 2 -7) 。とくに、アルミニウムや亜鉛を中心金の吸光係数が大きい。
5)励起三重項状態の寿命が長い。
現在、光化学治療用光増感剤の内、 ヘ マトボル
かし、この化合物は組織透過性のよい長波長領域＼＼l

゜Photodynamic Therapy by SulfonatedZinc Phthalocyanines＼ ＼＼｀と類似しているが組織透過性のよい長波長領域の＼フタロシアニンは化学構造的にはポルフィリン5なりやすいなどいくつかの問題点がある。

―ZnTSPc········HpD＼／CIJ:JU8 QJO SQ'v'の吸光係数が小さい。合併症として日光過敏症にf゜

フィリン誘導体が、臨床的に使用されている。し

700

400

lchiro Okura

Wavelength / nm

Faculty of Bioscienceand Biotechnology
Tokyo Institute Technology

図1-2-

亜鉛テトラスルフォタロシニアン（構造を図2 に示す 。 ZnTSPc) とHpDの吸収スペクトル

亜鉛スルホフタロシアニンを利用した光化学冶療

HPLCによりこれらスルホ基数の異なる化合物の属とするフタロシアニンは光照射に対して安定であり、 光励起三重項寿命が、 他のフタロシアニン完全分離を試みたが、 完全には単独物質が得られに比べて長いことから、 これらのフタロシアニンなかったので、亜鉛テトラスルホフタロシアニンが有効であると考えられている。 フタロシアニン（スルホ基数4個の化合物、 ZnTSPcと略記する）とを水溶性にするには側鎖をスルホン化するか、カそれ以外の化合物（スルホ基数1�3 の混合物で平ルボキシル化することが行われる。 とくにスルホ均スルホ基数2. 3 のものを ZnTSPcm ,, と略記する）

基の結合したフタロシアニンは抗腫瘍活性が高いとに分離し， それぞれについて光化学的挙動と光といわれている 8) 。

化学的治療効果とを比較検討した。

そこで本研究では、中心金属として亜鉛を、 側細胞は、 MH134細胞をマウス腹腔中にて継代培鎖としてスルホ基数が異なるフタロシアニンを合養したもの、 及ぴ対数増殖期にあるHeLa細胞を用成し、その光化学的性質を調べるとともに光化学いた。 培地は GIBCO社製F-10培地をそのまま用い治療における効果を検討した。

た。

2実2. 2験

フタロシアニンの細胞への取り込み

フタロシアニンの細胞への取り込みにはHeLa細―2. 1

試胞を用いた。 フタロシアニンを濃度4xl0 6 1,1とな薬るように培地に溶解し、この溶液をHeLa 細胞と亜鉛スルホフタロシアニンは、胃 eber らの方法

30 分間接触させた。 培地で細胞を洗浄した後、 アを改良して合成した 9 . I O) 。 構造を図2に示す。 ス

ルカリ水溶液で細胞を破壊し、 蛍光の励起スペク

ルホ基数の異なる亜鉛フタロシアニンは原料化合トルを測定することにより取り込み量を求めた。

物のモル比を変えることにより調製した。

図3は、殺細胞効果に関する実験方法を示したフロ ー チャ ー トである。 まずHeLa細胞をシャ ー レで培養し、その後シャ ー レより培地を抜き取り、 所定の濃度に調整したフタロシアニンの入った培地と交換する。 30 分間インキュベ ー トすることにより、フタロシアニンをHeLa細胞に取り込ませた。
その後、 培地で洗浄し、 レ ー ザ ー 光照射を行った。 レ ー ザ ー 光照射には、アルゴンレ ー ザ ー 励起

DCM色素レ ー ザ ー を用いた。 波長は 680nm 、 出力は 100m渭/c耐である。 殺細胞効果の判定には、 光照射後4時間経過したところでトリパンプル ー 染色を用いて行った。 また、 細胞の形態変化は、 走43.

図2亜鉛フタロシアニンの構造
1:亜鉛モノスルホフタロシアニン
2:亜鉛ジスルホフタロシアニン
3:亜鉛トリスルホフタロシアニン
4亜鉛テトラスルホフタロシアニン

査電子顕微鏡を用いて観察した。
固形腫瘍としては C3H/He 系マウスの側腹部皮下に肝癌由来の M:Hl34 細胞を移植し、 大きさが直経約 10mmになった固形腫瘍を用いた。 腫瘍び各臓器（肺、 腎、 牌、 肝）における ZnTSPc濃度の経時変化を測定するために、 15mg/kg の ZnTSPc をマウス(ZnTSPc)腹腔内に投与した。 ZnTSPc投与2、 4、 6、 12、 24、

ZnSPC m ; 真は1, 2, 3の混合物-3-冒比-�,--,( s'蕊〗品8 "□ロi◇ー-�。:�.�;::-,,"'""

05↓ 30 min ;ncubat;ong。
血WU゜.
＾4°o）
m

70000l

図4 ZnTSPcの吸収スベクトル
ZnTSPc濃度： 2. 8 X 10 ― '·mol·dm-•
トリトンX100 、 なし(1) 、 1 (2) 、2 (3) 、 4(4) 、 10(5)'ゞミ:4 h◇iT.B. staining

600

Wavelength / nm222ご 』
1531＿＝=secscesec
1030150xxx
2mcーwmン/

Aftcr4500oUー.gmn↓cが解離して単量体になったためと考えられる。 後＾fixa1;0", Dchydra110"

述するように細胞に取り込まれたフタロシアニン

SEM Observallonは単量体で存在し、細胞は界面活性剤の添加と同様の効果を示す。

図3 殺細胞効果に関する実験方法のフロ ー チャ ー ト

励起三重項寿命の測定は次の様にして行った。

48時間後に屠殺し、ホモジネイト後腫瘍および各界面活性剤を含む生理食塩水(TritonX-100; 10%)臓器の蛍光強度を測定した。にフタロシアニンを溶解し、凍結脱気を5回行い、三重項寿命測定用の試料とした。測定にはYAGレ

3

結果および考察ーザ ー 励起DCM色素レ ー ザ ー （波長680nm)を使用した。その結果、ZnTSPc、ZnSPCm ixいづれも三重3. 1

吸収スペクトルおよび励起三重項寿命

項寿命は約250応であった。

ZnTSPcの吸収スペクトルは図4に示すように3. 2636nm付近に極大吸収を有する。これは、 フタロ

蛍光スペクトル

シアニンの 会 合 体の吸収スペクトルであり、励起波長610nmにおける蛍光スペクトルを図5にZnTSPcは水溶液中で 会合体になっていることを示示す。ZnTSPc水溶液ではほとんど蛍光スペクトルしている。この会合体は光励起寿命が短く、光化が測定されず、会合状態では蛍光がほとんど観測学治療には不適当である。この水溶液に、中性のされないことがわかる。トリトンX-100を添加す界面活性剤であるトリトンX-100を添加すると、ると、690nm付近に強い蛍光が観測され、ZnTSPc

吸収スペクトルは2-4の様に変化し、トリトンが単量体として存在すると強い蛍光が得られるこX-100澄度が10%のときに、5の吸収スペクトルとがわかる。また、図5-BはMH134細胞にZnTSPcをとなった。界面活性剤の濃度を増大させるに従い、取り込ませた前後における蛍光の差スペクトルで636nmの吸収強度が減少し、678runの吸収強度が増ある。図5-Aと比較すると、ZnTSPcは細胞内では加した。これは、界面活性剤の添加により会合体単量体として存在していることが分かる。

-4-

亜鉛スルホフタロシアニンを利用した光化学冶療

Em. wavelength: 730nm＼n·-e//\l!
SU8lU

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A

Triton X none (一 ）Triton X 0.5% (··········)
Triton X 5% (一•ー・ー ）550

Difference spectrumof mouse tumor cells

600

I/'ヽ

\ーノ

650

700

Wavelength / nm
図6フタロシアニンの励起スベクトルによるHela細胞への取込み量の比較
ZnSPcm,,: 実線 ZnTSPc: 破線
投与 12 時間後で蛍光強度が 最高値を示した。 また腫瘍は 10-24 時間の間、各臓器より も高値であっ650

700750た。

800

ZnTSPc の排泄はきわめて早く、投与30分後には尿Wavelength / nm中に認められている。 この様に ZnTSPcは、 腫瘍集

図5 ZnTSPcの蛍光(A)およびマウスMH134細胞にZnTSPcを取り込ませた前後における蛍光スペクトル(B)積性が高 く、 腫瘍集積に要する 時間が非常に 短い。 ヒトヘのZnTSPc 応用においても この状況か当ては まるなら、 感光剤投与か ら治療開始までの時間短縮に大いに貢献するも のと思われる。

3. 3細胞への取り込み
乙,suaiu―① ::>U80S8J0nl
LL細胞へのフタロシアニンの取り込みは フタロシアニンの励起スペクトルを 測定することにより行った。 結果を図6に示す。 実線は ZnSPcm,x 、 破線は ZnTSPc の場合 で ある。 両者を比較する とZnSPc m 心 が ZnTSPcに比べ、 はるかに細胞によく 取り込ま れていることが分かる。
固形腫瘍を用いた場合、 マウス腫瘍の蛍光強度は投与 12 時間後に最 大 となり、 これ以降 24 時間まで の 間は各 臓 器 より高い 値 を保っ た 。 図7にZnTSPc投与 12 時間後 の腫瘍およぴ各臓器 の蛍光スペクトルを、 図8に経時的な蛍光強度 の変化を示す。 固形腫瘍およぴ各臓器におけるZnTSPc の取り

図7 C3Hマウス各細胞におけるZnTSPcの蛍光スペクトルZnTSPc取込み12時間後に測定込み の測定において、 腫瘍を含むすべて の臓器は-5-゜.::1on1u1aouaosaJ
全 suai

4020Time/ h

図8 CJHマウス各組織におけるZnTSPcの蛍光強度

3.4

殺細胞効果

表lに、 殺細胞効果に対する照射エネルギ ー 依存性およびフタロシアニンの濃度依存性を示す。
表中の数字はトリパンプル ー の被染色率を表し、数字が大きいほどよく死滅していることを示している。ZnTSPcでは、4. Q X 10
射エネルギー

表1―svの浪度のとき、 照が減少するに伴い、 殺細胞効果が滅PDT後のトリバンプル ー 染色濃度/M40x!O_. 40x!0-7

照射エネルギー
40x 10ふ/J・cm·2ZnTSPc 15
10091
330ZnSPCmtx 15
3100100100

゜゜゜゜゜゜JOO100
10090

100
1004.0x!O.,゜゜゜

単位：被染色率／％表2 光照射による溶血率
接触液
ZnTSPcZnSPCmix
ZnTSPcZnSPCmix

（無）
(無）
（有）
(有）

23
2.4
2.7
8.2

1時間後
364.5
65
90

5時間後
5.0
6.5
1095<（単位％）図9 SEMによるHela細胞の形態観察
a: 光照射前のHela細胞
b:ZnTSPcを用い光照射後のHela細胞
c:ZnSPc m ,, を用い光照射後のHela細胞-6-亜鉛スルホフクロシアニンを利用した光化学冶療少している。 また、4. 0 X 10-6lif以下の濃度では、低い浪度、 より低いエネルギ ー においても、優れた殺細胞効果を示すことがわかった。 電子顕微鏡

殺細胞効果が認められなかった。 これに対し、

ZnSPcm ,xを用いた場合には4.0x10-1Mの浪度までによる細胞の致死過程の形態学的観察（図9)、および溶血実験の結果から、ZnSPc m 1xのおもな作は照射エネルギ ーに関係なく、強い殺細胞効果を示すことがわかった。 これは、ZnSPc m ,xの方がよ用部位は細胞膜であり、光照射により細胞膜が大り細胞に取り込まれやすいためと思われる。

きなダメ ー ジを受けるものと思われる。

ZnSPcm 心の方がより低い濃度、 および、より低いエネルギ ー でも、優れた殺細胞効果を示すことが文

以上により、ZnTSPcとZnSPc m ,xとの比較では

献

1)西坂

他：水溶性亜鉛フタロシアニンを利用した光化学療法の研究(IV)ZnTSPc の臓判明した。

剛器集積性について， 日本レ ー ザ ー 医学会誌

997-99 1989

3. 5 光溶血反応

細胞膜のモデルとしてヒト赤血球を用いた光照

2) J. E. van Lier, N. Brasseur, B. Paquete,

こせば、細胞膜が破壊されていることが示唆されRousseau: Phthalocyanines as Sensitizers

したフタロシアニンとを接触させ、洗浄した後、AS! Ser. Hl5435-444 1988

J.

射の実験を行った。 この実験で赤血球が溶血を起R. Wagner, H. Ali, R. Langlois and J.

゜for Photodynamic Therapy of Cancer. #Ali

る。 実験は、赤血球浮遊液と、生理食塩水に溶解

3) J. R. Wagner,再懸濁させて光照射を行った。 照射光として、アルゴンレ ー ザ ー 励起DCM色素レ ー ザ ー を用い（波H. Ali, R. Langlois, N. B

rasseur and J. E. van Lier: Biolofica

Activities of Phthalocyanines-IV. Photo

長は680nmである）。 所定時間経過後、遠心分離を行い、 上澄みの吸光度を測定した。 観測は長は415nmである。

oxidation of L-Tryptophan by Selectively

したときの吸光度を100%とした割合で示してあAggregation.

S ulfonated Gallium Phthalocyanine:

Singlet Oxygen Yields and Effect of

結果を表2に示す。 表中の数字は、完全に溶血Photochem. Photobiol.

45587-594 1987
4)N. Brasseu, H. Ali, R. Langlois and J. E.

る。 この結果より、赤血球は、ZnSPcm ,xと接触させ、光照射を行った場合にのみ1時間後に90%、

van Lier:Biological Activities of Phtha­

5時間後には95%以上の溶血を起こすことが判明

locyanines-VII. Photoinactivation of

した。

V-79 Chinese Hamster cells by Selecti­

4

総vely Sulfonated Gallium Phthaloyanines.

肋otoc/Jem. P/Jotobl"ol. 46739-744 1987
5)B. Paquette, H. Ali, R. Langlois and J.

括

E. van Lier : Biological Activities of

本研究では、 スルホ基数の異なる亜鉛フタロシアニンを合成し、光化学療法における有用性を検

Pthalocyanines-VDI,Cellular Distribution

in V -79 Chinese Hamster Cells and Photo

討した。 蛍光分析の結果から、フタロシアニンは-toxicity of Selectively S ulfo natedAluminium Phthalocyanines, P,カotochem.

細胞内では単量体として存在し、ZnSPc m ,,方がZnTSPcよりも効果的に細胞に取り込まれているこPhotobiol. 47215-220 1988
6)N. Brasseur, H. Ali, R. Langlois and J.とが判明した。
殺細胞効果の比較では、ZnSPcm ,,の方が、より-7-

E. van Lier: Biological Activities of

Rosenthal : Synthesis and Photocytotoxi­of V-79 Chinese Hamster Cells and EMT-6nines. 肪otoc/Je夙 肋otobiol.

city of Some New Substituted Phthalocya­

Phthalocyanines-VI. Photosensitization

Mouse Mammary Tumor by Selectively Sul­fonated Zinc Phthalocyanines. P,力otoche.夙

肋otobiol. 47705-711 1988
7)H. Ali, R.Langlois, J. R. 渭agner, N.

19899) J. H. 胃eber and D. H. Busch: Complexes
Derved from Strong Field Ligands. XVI.

Magnetic Properties of Transition Metal
Derivatived of 4 4 , 4''. 4'''-Tetra-Brasseur,B Paquette and J.E.van Lier:sulfo phthalocyanine, lnorg. Che尻 4 469

Biological Activities of Phthalocyanines-X. Syntheses and Analyses of Sulfonated.

Phthalocyanines. Photoc力em. Photobiol.

47 713-717 1988
8) C. C. Leznoff, S. Vigh, P. I. Svirskaya, S.

49 279-284-471 196510) T. Nishisaka, H. Nanasawa, Y.Sakuma andI. Okura : Photodynamic Therapy by Zinchthalocyanine、as Tumor Localizer, 日本
レ ー サ ー 医学会誌， 1311-15 1992

Greenberg, D. M. Drew, E. Ben Hur and I.

-8-