ジチオカルバメート迅速スクリーニング法の開発○安藤 孝 1、小西賢治 2、市来弥生 1、佐々野僚一 2、今井沙紀 3、杉立久仁代 4、穴沢秀峰 4、坂 真智子 5、関口博史 3、石渡 智 3[1(一社)食の安全分析センター、2(株)アイスティサイエンス、3 ホクレン農業協同組合連合会、4 アジレント･テクノロジー(株)、5(一財)残留農薬研究所]【目的】
ホクレン農業協同組合連合会が開発したジチオカルバメート系農薬迅速分析法 1),2),3)（以下、ホクレン LC 法）は、試料溶媒中でメチル化し、QuEChERS 法を基に溶媒転溶を行うことを特徴とした、スクリーニングに有用な迅速試験法である。
今回、ホクレン LC 法の迅速な前処理を生かしつつ、GC-MS/MS で測定するための精製工程を検討した（以下、ホクレン STQ-GC 法）。また、ジチオカルバメート系農薬が実残留した農産物を用いて、通知試験法やホクレン LC 法と比較したので報告する。
【方法】
１.精製工程の検討
ホクレン LC 法はアセトニトリルによる抽出であるため、残留農薬迅速一斉分析
STQ-GCB 法による精製を行なうことで、GC-MS/MS へ注入可能なアセトン/ヘキサン混液に転溶するとともに、固相抽出による精製を行うこととした。
1) C18 ミニカラムによる保持
C18 ミニカラムは、無極性夾雑物を除去できるほか、溶媒の極性を高めることで目的物質を保持させることが可能である。抽出液に NaCl 溶液を混合し、ジチオカルバメート系代謝物 3 種が保持される溶媒比率を検討した。
2) PSA ミニカラムによる精製
C18 に保持したジチオカルバメート系代謝物 3 種を溶出する際に、PSA による精製を行うことで、C18 では除去しきれない極性、イオン性夾雑物の除去が可能となる。
溶出溶媒のアセトン/ヘキサン比率による目的物質の溶出挙動を調査した。
２.ジチオカルバメート系農薬が実残留した農産物での定量性比較
エチレンビスジチオカルバミン酸ジメチル（EBDC）として測定する農薬成分が実残留しているキンカンを用いて、図 1 のとおり定量した。
通知試験法

ホクレンSTQ-GC法

抽出・メチル化精製（詳細は図2）

ホクレンLC法
抽出・メチル化（詳細は図3）↓精製（詳細は図4）↓↓
測定（GC-MS/MS）（詳細は図5）図 1 試験法の精度比較実験フロー↓
測定（LC-MS/MS）（詳細は図6）

試料 100 g、システインーEDTA溶液 100 g 秤量
粉砕・均一化（5,000 rpm、30 sec）↓
10 g 秤量（試料 5 g 相当）※通知法の1/4にスケールダウン↓
システインーEDTA溶液 20 mL添加
ジクロロメタン 12.5 mL 添加↓
激しく振とう 5 min ※通知法ではホモジナイズ↓
遠心分離 4℃、3,500 rpm、5 min↓
システインーEDTA層を回収↓
システインーEDTA溶液 12.5 mL添加↓
激しく振とう 5 min↓
遠心分離 4℃、3,500 rpm、5 min↓
システインーEDTA層を回収↓
硫酸テトラブチルアンモニウム溶液 2.5 mL添加↓
6 mol/L 塩酸で pH 7.5～7.7 に調整↓
水で 50 mLに定容（抽出試料）↓
抽出試料 5 mLに塩化ナトリウム 1 g 添加、溶解↓
多孔性ケイソウ土カラムに負荷、10 min 放置↓
メチル化液 20 mLをカラムに注入
1 mL/minで流下↓
溶出液にアセトン／ジエチレングリコール（99:1）混液 0.5 mLを添加↓
エバポレーターで濃縮↓濃縮液にアセトン 5 mL添加（誘導体化試料）↓
誘導体化試料を中性アルミナカラムに負荷、アセトン 20 mL 注入↓
溶出液にアセトン／ジエチレングリコール（99:1）混液 0.5 mLを添加↓
エバポレーターで濃縮↓窒素を吹き付けて溶媒除去↓
残留物をアセトン 5 mLに溶解

図 2 通知試験法の前処理フロー

試料 100 g、システイン－EDTA溶液 100 g 秤量
粉砕・均一化（5,000 rpm、30 sec）↓
20 g 秤量（試料 10 g 相当）↓
6 mol/L 塩酸 500 µL を加え混和↓
ヨウ化メチル 60 µL を加え混和、10min 振とう↓
アセトニトリル 10 mL を加え混和、5min 振とう↓
塩化ナトリウム 2 g
無水硫酸マグネシウム 4 g↓
激しく振とう 1 min↓
遠心分離 4℃、3,500 rpm、5 min↓
アセトニトリル層を 15 mL 遠沈管に回収

図3 ホクレンSTQ-GC法及びホクレンLC法の抽出･メチル化フロー

図 4 ホクレン STQ-GC 法の精製フローGC
カラム
オーブン温度
注入口温度
ライナー
注入方法
トランスファーライン温度
キャリアガス流量
コリジョンガス
ヘリウムクエンチガス

7890B（アジレント・テクノロジー）
VF-5MS 30m×0.25mm I.D., 膜厚0.25μm（アジレント・テクノロジー）
60℃(3min)-10℃/min-125℃ -25℃/min-300℃ (2.5min) (total 14分)
250℃
シングルテーパ ウルトライナートライナー ガラスウール入り
パルスドスプリットレス(170kPa, 1分) 2μL注入
290 ℃
1.0mL/min (コンスタントフロー)N2 1.5ml/min
2.25ml/min

MS
測定モード
イオン源温度
四重極温度

7000C（アジレント・テクノロジー）
MRM
250℃
150℃
DBDC
135>88 10V
135>73 35V

定量イオン
確認イオン

PBDC
158>86 10V
158>88 24V

EBDC
144>72 8V
144>88 20V

図 5 通知試験法及びホクレン STQ-GC 法における GC-MS/MS 測定条件

HPCL

NexeraX2（島津製作所）

注入量

5 μl

カラム

SimPack FC-ODS 3μm 2mm×150mm（島津製作所）

ｵｰﾌﾞﾝ温度40 ℃

移動相

A: 5mM 酢酸ｱﾝﾓﾆｳﾑ水溶液、B: 5mM 同メタノール溶液

流量0.3 ml/min

ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ条件

B%(min) = 10(0)→10(1.5)→60(7.5)→60(12)→90(12.01)→90(15)→10(15.01)→10(22)MS

LCMS-8040（島津製作所）

MRM

DMDC(+): 136 > 88, 73
EBDC(-): 239 > 58, 191
PBDC(-): 253 > 58, 205

図 6 ホクレン LC 法における LC-MS/MS 測定条件

【結果および考察】
１．精製工程の検討
1) C18 ミニカラムによる保持
サンプルをアセトニトリル/水（80/20, v/v）で 1 段目の C18 固相カートリッジに通液することで夾雑物を除去し、その後、10%NaCl 水を混合することで 2 段目の C18固相カートリッジに農薬成分を保持する工程において、全流量中のアセトニトリル比率による保持効果の変化を調べた。
サンプル 0.5 mL をアセトニトリル/水(80/20) 0.4 mL（0.02mL/sec）で通液し、10%NaCl 水 8.1 mL（0.18mL/sec）を混合（全流量中のアセトニトリル比率 10％）したときに保持が最も良好であった（図 7）。

図 7 C18 固相カートリッジへの保持条件の検討
2) PSA ミニカラムによる精製
GCK+PSA 固相カートリッジでの通液溶媒のアセトン/ヘキサン比率を変化させた
ところ、アセトン比率が増えるほど、農薬成分の溶出量が増え、アセトン/ヘキサン（3:7, v/v）でほぼ全量溶出した（図 8）。

図 8 GCK+PSA 固相カートリッジでの溶出条件の検討結果

3) 添加回収試験
上記 1), 2)で検討した最適条件にてオレンジを用いた添加回収試験を行ったところ、
表 1 のとおり、良好な回収率が得られた。
表 1 ホクレン STQ-GC 法での添加回収試験結果（オレンジ）

２．ジチオカルバメート系農薬が実残留した農産物での定量性比較表 2 のとおり、ホクレン LC 法及びホクレン STQ-GC 法は、通知試験法に比べて高くなる傾向が見られたが、その要因は、農産物に含まれる脂質や糖類によるものと推察され、このことについては、今後も検討していく。
表 2 各試験法での実残留試料の定量結果
EBDC
通知試験法

ホクレンLC法

ホクレンSTQ-GC法

1回目

3.83.84.2

2回目

3.3

3.84.1

3回目

3.4

4.1

3.8

平均（ｐｐｍ）

3.5

3.9

4.0

RSD（％）

7.2

4.55.5【まとめ】
ホクレン STQ-GC 法は、ホクレン LC 法同様、平均値、RSD 共に良好であった。また、固相抽出による精製工程が入るが、自動前処理装置を使用することで自動化できることから、スクリーニングにおいて有用な試験法であると考える。
【参考文献】
1) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討、第 110回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2015)2) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討（第二法）、第 111 回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2016)3) S.Ishiwata,S.Imai:Simplified Method for the Determination of Dithiocarbamatesin Agricultural Profucts by LC-MS/MS,12th European Pesticide Residue Workshop,
Programme & Book of Abstracts,p.130-131 (2018)

ジチオカルバメート迅速スクリーニング法の開発○安藤 孝1、小西賢治2、市来弥生1、佐々野僚一2、今井沙紀3、杉立久仁代4、穴沢秀峰4、坂 真智子5、関口博史3、石渡 智3[1(一社)食の安全分析センター、2(株)アイスティサイエンス、3ホクレン農業協同組合連合会、4アジレント･テクノロジー(株)、5(一財)残留農薬研究所]

目的
ホクレン農業協同組合連合会が開発したジチオカルバメート系農薬迅速分析法1),2),3)（以下、ホクレンLC法）は、試料溶媒中でメチル化し、QuEChERS法を基に溶媒転溶を行うことを特徴とした、スクリーニングに有用な迅速試験法である。ホクレンLC法の迅速な前処理を生かしつつGC-MS/MSで測定するための精製工程を検討した（以下、ホクレン+STQ-GC法）。また、ジチオカルバメート系農薬が実残留した農産物を用いて、通知試験法やホクレンLC法と比較した。

分析フロー

ホクレン+STQ-GCB法精製工程の検討
通知試験法(メチル化+QuEChERS抽出)

ホクレン＋STQ-GC法

試料 100 g，システイン-EDTA溶液 100 g秤量 ,粉砕・均一化（5,000 rpm，30 sec）

試料 100 g，システイン-EDTA溶液 100 g秤量 ,粉砕・均一化（5,000 rpm，30 sec）

10 g秤量（試料 5 g相当）
※通知法の1/4にスケールダウン

20 g秤量（試料 10 g相当）

システイン-EDTA溶液 20 mL添加,ジクロロメタン 12.5 mL添加
激しく振とう 5 min※通知法ではホモジナイズ

抽出＋メチル化

ホクレンLC法遠心分離 4 ℃，3,500 rpm，5 min

6 moL/L 塩酸 500 μL を加え混和
ヨウ化メチル 60 μL を加え混和、10 min 振とう
アセトニトリル 10 mLを加え混和、５min 振とう

システイン-EDTA層を回収

塩化ナトリウム 2 g ,無水硫酸マグネシウム 4 g

システイン-EDTA溶液 12.5 mL添加

激しく振とう 1 min

激しく振とう 5 min

遠心分離 4 ℃，3,500 rpm，5 min

遠心分離 4 ℃，3,500 rpm，5 min

アセトニトリル層を15 mL遠沈管に回収

システイン-EDTA層を回収
硫酸テトラブチルアンモニウム溶液
2.5 mL 添加

LC-MS/MSで測定

6 moL/L 塩酸で pH 7.5~7.7に調整

検討1 C18ミニカラムによる保持

アセトニトリル濃度が抽出液に10%(w/w)NaCl水溶液を混合しC18ミニカラムに通液した際に、目的物質であるジチ
オカルバメート系農薬代謝物3種が保持されるアセトニトリル濃度を検討した。

10%のとき面積値が最大

C18…無極性相互作用による無極性夾雑物の除去（固相①）
目的物質の保持（固相②）

図2 C18ミニカラムへの保持条件の検討
アセトン/ヘキサン(30/70)で検討2 GCK/PSAミニカラムによる精製

ほぼ全量溶出C18ミニカラムに保持したジチ
オカルバメート系農薬代謝物3
種を溶出するアセトン/ヘキサンの溶媒比率を調査した。
GCK…平面構造相互作用による色素・フラボノイド類の除去
PSA…極性・イオン交換相互作用による脂肪酸類の除去

図3 GCK+PSAミニカラムでの溶出条件の検討

検討3 添加回収試験

表1 ホクレン+STQ-GC法での添加回収試験結果（オレンジ）

上記検討条件でオレンジを用いた添加回収試験によりホクレン+STQ-GCB法の評価を行なった。

3成分とも良好な回収率を得られた。

水で50 mLに定容
抽出試料 5 gに塩化ナトリウム 1g 添加、溶解
多孔性ケイソウ土カラムに負荷、
10 min 放置
メチル化液 20 mLをカラムに注入、1 mL/min で滴下自動前処理※（15分/1件体）

サンプル0.5 mLを固相①C18-50に通液
アセトニトリル/水(80/20) 0.4 mLで固相①C18-50を洗浄流出液を10%NaCl水8.1 mLで希釈しながら固相②C18-50に通液

溶出液にアセトン/ジエチレングリコール(99:1)混液 0.5 mL を添加

超純水1.5mLで固相②C18-50を洗浄

エバポレーターで濃縮

N2ガスを吹き付けて固相②C18-50を乾燥濃縮液にアセトン 5 mL 添加（これを誘導体化試料とする）

精製

誘導体化試料を中性アルミナカラムに負荷、アセトン 20 mL を注入
溶出液にアセトン/ジエチレングリコール(99:1)混液 0.5 mL を添加

固相②C18-50と固相③GCK-20 + PSA-30を連結してアセトン/ヘキサン(3/7)1mLを通液
アセトン/ヘキサンで1mLに定容

GC-MS/MSで測定

エバポレーターで濃縮窒素を吹き付けて溶媒除去
残留物をアセトン 5 mL に溶解

実残留試料による定量性の比較※自動前処理全自動固相抽出装置：ST-L300 またはST-L400（アイスティサイエンス）
固相カートリッジ：Smart-SPE C18-50，PSA-30，GCK-20（アイスティサイエンス）

GC-MS/MSで測定

図1 試験法の精度比較実験フロー

エチレンビスチオジカルバミン酸ジメチル(EBDC)として測定する
農薬成分が残留しているキンカンを用いて通知試験法、ホクレンLC法、ホクレン+STQ-GCB法で分析し定量値を比較した。

表2 各試験法での実残留試料の定量結果

EBDC
通知試験法

ホクレンLC法

ホクレンSTQ-GC法

1回目

3.8

3.8

4.2

2回目

3.3

3.8

4.1

3回目

3.4

4.1

3.8

平均（ｐｐｍ）

3.5

3.9

4.0

RSD（％）

7.2

4.5

5.5

測定条件
【GC-MS/MS測定条件】【LC-MS/MS測定条件】

GC：7890B(アジレント・テクノロジー)
カラム：VF-5MS 30 m x 0.25 mm I.D., 膜厚0.25 μm(アジレント・テクノロジー)
オーブン温度：60 ℃(3 min)-10 ℃/min-125 ℃-25 ℃/min-300 ℃(2.5 min)（total 14分）
注入口温度：250 ℃
ライナー：シングルテーパ ウルトライナートライナー ガラスウール入り
注入方法：パルスドスプリットレス（170 kPa，1 min) 2 μL注入
トランスファーライン温度：290 ℃
キャリアガス流量：1.0 mL/sec(コンスタントフロー）
コリジョンガス：N2 1.5mL/min
ヘリウムクエンチガス：2.25 mL/min

HPLC：NexeraX2 （島津製作所）
注入量：5μL
カラム：SimPack FC-ODS 3μm 2mm x 150 mm（島津製作所）
オーブン温度：40 ℃
移動相：A:5mM 酢酸アンモニウム水
B:5mM 酢酸アンモニウム含有メタノール
流量：0.3 mL/min
グラジエント条件：
B%(min)=10(0)-10(1.5)-60(7.5)-60(12)-90(15)10(15.01)-10(22)MS：7000C (アジレント・テクノロジー)
測定モード：MRM
イオン源温度：250 ℃
四重極温度：150 ℃

MS : LCMS-8040（島津製作所）

まとめ
ホクレンLC法を基に、STQ-GCB法の固相抽出操作を加えたホクレン＋STQ-GCB法を検討した。オレンジでの添加回収試
験で良好な回収率が得られた。ジチオカルバメート系農薬が残留したキンカンを試料に用いて通知試験法、ホクレンLC法、ホクレン+STQ-GC法を比較したところ、いずれの分析法であっても再現性良く分析可能であった。通知法とホクレンLC法
およびホクレン＋STQ-GC法の定量値に差が見られたが、試料由来の夾雑物によるものと推察され、今後調査する。ホクレン+STQ-GCB法では固相抽出による精製工程が入るが、自動前処理装置を使用することで自動化できることから、スクリーニングにおいて有用な試験法であると考える。
【参考文献】
1) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討、第110回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2015)2) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討（第二報）、第111回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2016)3) S.Ishiwata,S.Imai:Simplified Method for the Determination of Dithiocarbamates in Agricultural Products by LC-MS/MS,12th European Pesticide Residue
Workshop, Programme & Book of Abstracts,p.130-131 (2018)