大分工業高等専門学校紀要

第 46 号(平成 21 年 11 月)

教育 GP：環境技術者育成を目的とした遺伝子解析セミナー
ーゴミ固形燃料の微生物相解析
小原裕治１

西山正晃２

高見徹３

山田健太郎４ 小西忠司５

1機械工学科，2都市システム工学科，3都市システム工学科，４大分大学，５機械工学科

ゴミ固形燃料－Refuse Derived Fuel(以下RDF)とはJIS Z 7302で，廃棄物を原料として，圧縮成型，押し出し成形などによって固形化した燃料とされているリサイクル燃料である．RDFを貯蔵するサイロでは火災や爆発事故が度々発生しており，事故の原因の1つとしてRDFに生息している微生物による生物学的発熱や水素などの可燃ガスの発生が挙げられている1)．本セミナーではRDFに生息する微生物のDNAを抽出し，Polymerase ChainReaction法(以下PCR法と言う)で16S リボソームDNAを増幅，その後クローニングを経て微生物のDNAの塩基配列を決定した．その後データベースに公開された微生物のDNAの塩基配列情報と比較することでRDFに生息する微生物の同定を行った．

キーワード : 火災，RDF，微生物相解析

１．緒言

情報量を持つ，全生物に共通する塩基配列を持つと同時に種に固有な塩基配列も持つ，保存性が高いというような特国内でのRDF貯蔵サイロの事故は2003年8月に三重県桑性があるためである．

名市で火災爆発事故が，同年9月に福岡県大牟田市で火災

第2のステップとして，16S リボソームDNAを増幅した事故が，さらに同年10月に石川県羽咋郡で燻焼事故が発生

のちクローニングを経て微生物のDNAの塩基配列を決定している．このうち三重県桑名市のRDF貯蔵サイロの火災する．クローニングではPCR法で増幅された16S リボソー

爆発事故では死者2人，負傷者5人という悲惨な結果を招い

ムDNAは多数の微生物の16S リボソームDNAが混合してた．火災に至る過程は，生物学的発熱により室温近傍から80℃までRDFの昇温が開始し，温度上昇に伴い酸化反応等いるため，クローニング過程で微生物1種ごとの16S リボによりRDFの昇温が継続．100℃近傍で生物学的発熱が終転換，コロニーダイレクトPCRの3つの工程に分けられる．

息した後，酸化反応等でさらにRDFが昇温していき着火にライゲーションとは制限酵素でベクターと呼ばれる環状DNAの一部を切断し，ベクター切断部に任意のDNAを組2)至ったと推定されている ．Fig.1には三重県多度町RDF貯蔵サイロで使用されていたものと同等のRDFの写真を示す．
今回のセミナーではRDFに存在する微生物のDNAを解析することで微生物を同定することが目的である．

ソームDNAを得る．クローニングはライゲーション，形質み込んだ後，リガーゼと呼ばれる酵素でベクターと任意のDNAを固定することである．その後DNAを取り込み得る能力を持つコンピテントセルと呼ばれる細胞にライゲーションしたベクターを取り込ませる．形質転換とは抗性物最初のステップとして，RDFに生息する微生物のDNA質耐性など本来持たない形質を持つようになることであを抽出し，PCR法で16S リボソームDNAを増幅する．PCRる3)．コンピテントセルにはCa処理した大腸菌が多く用い法とは2本鎖DNAの加熱すると2本の1本鎖DNAになり冷られている．コロニーダイレクトPCRではコンピテントセ

却すると相補的な塩基が結びつき再び1本の2本鎖DNAにルにコロニーを形成させコンピテントセルが外来のDNAなる特性を利用しており，DNAの増幅範囲を決定する役割を取り込んでいるか否かを調べた上で，コンピテントセルを も つ プ ラ イ マ ー ， DNA 合 成 酵 素 の 一 種 で あ る Taqに取り込まれている外来DNA をPCR法で増幅する．今回

Polymeraseを加えた後PCRサイクルを繰り返し行い変性，はベクター切断部にPCR法で増幅した16S リボソームアニーリング，伸長の3行程からなるDNA合成反応をさせDNAを固定することで，微生物1種ごとの16S リボソームることでDNAを増幅する手法である．また，16S リボソDNAを得る．

ームDNAとは16S リボソームRNAをコードしたDNAで約最後のステップとしてデータベースに公開された微生1600塩基対からなる．16S リボソームDNAを選択して増物のDNAの塩基配列情報と比較することでRDFに生息す幅するのは，塩基配列から系統樹を作成するために十分なる微生物を相解析する．

―12―大分工業高等専門学校紀要

第 46 号(平成 21 年 11 月)(3)電気泳動による 16S リボソーム DNA の確認，回収
電気泳動は DNA が負に帯電している特性を利用している．TBE

Buffer に浸したアガロースゲルに DNA とマーカーを注入後電流を流すことで，負に帯電している DNAが－極側から＋極側へと泳動する．このときアガロースゲ
１cm

ルの作用により長い塩基対からなる DNA の泳動距離は短く，短い塩基対からなる DNA の泳動距離は長くなるためDNA の塩基長が判別される．従って約 1600 塩基対の 16S

Fig.1 Photograph of RDF

リボソーム DNA が増幅していることがわかる．
16S リボソ－ム DNA を増幅後，4 本の PCR 用チューブ

２．RDFに含まれる微生物と真菌のDNA抽出から 10μl ずつ DNA を取り，それぞれ 96well プレートに注入し，注入した DNA にローディングダイ(Biolabs 社，RDFを蒸留水100mlで懸濁し，80μmのプレフィルターN3200S)を 2μl ずつ注入，混合し各 12μl とする．電気泳(Millipore社，AP2504700)でろ過した標準サンプル，標準動 装置 (ア ドバンス 社， Mupid-2pluｓ )に使用 済み TBE

サンプルにLB基礎培地を加えて37℃で好気培養した好気Buffer を加え，0.8%アガロースゲル(以下ゲルと言う)を設サンプル，同様に嫌気培養した嫌気サンプルの3種類とし置する．設置後，ゲルのウェル部にローディングダイを混た．サンプルからのDNA抽出はZRFungal/Bacterial DNA Kit

合した DNA を 12μl 注入し 100V で 30 分間電気泳動する．

(ZYMO RESEARCH)を使用し，各サンプルから100μlの30 分後， 16S リボソーム DNA が正しく増幅されているDNAを抽出した．抽出手順は同キット添付のプロトコール

ことを．UV トランスイルミネーター(UVP 社，LM-20)でに従った．

確認する．電気泳動の結果は Fig.2 に示す.濃い赤色バンド部に 16S リボソーム DNA がある．
確認後，TBE Buffer を未使用のものと取り替え確認時と３．PCR法による16S リボゾームDNAの増幅同様に電気泳動をする．電気泳動後，バーナーで火炎滅菌したカッターでゲルの濃い赤色バンド部を 1 つずつ切り(1) PCR用MasterMixの作製出しそれぞれ 1.5ml のマイクロチューブへ入れる．切り出

1.5mlのマイクロチューブ(以下MasterMixチューブと言したゲルの質量を電子天秤で測定し，ゲル質量 100μg にう)にDNase-RNase-Free水(インビトロジェン社，10977

つ き 200 μ l の 割 合 で NT3( 日 本 ジ ェ ネ テ ィ ク ス 社 ，-015)を147μl注入する．10×Ex Taq Buffer(タカラバイオ社，740609-50)をゲルが入ったチューブへ注入する．注入後

RR001A)をスピンダウンした後，20μlを, MasterMixチュー55℃に設定したブロックインキュベーター (アスッテクブへ注入し良く混合する．混合後，dNTP Mixture(タカラバ社，BI-525A)にチューブを設置しゲルを溶解する．溶解しイオ社，RR001A)を同様にスピンダウンし16μlをたゲルをそれぞれ回収チューブの上部へ移し，遠心分離機MasterMixチューブへ注入，混合する．次にプライマーで 12000r.p.m.で 1 分間遠心する．回収チューブの下部に分16S-27F(greiner bio-one社),10uMをスピンダウンし4μlを離された液体を捨て，回収チューブの上部に洗浄 Buffer

MasterMixチューブへ注入し良く混合する．同様にを 600μl 注入し，遠心分離機で 12000r.p.m.で 1 分間遠心

16S-1492R(greiner bio-one社),10uMをスピンダウンした後4する．回収チューブ下部の液体を捨て，何も入れずにさらμlをMasterMixチューブへ注入し良く混合する．最後に冷に遠心分離機で 12000r.p.m.で 2 分間遠心する．回収チュー

凍庫からEx Taq(タカラバイオ社，RR001A)を取り出しEx

ブ下部を新しいチューブに取り替え，TE Buffer を 15μl

Taq1μlをMasterMixチューブに注入し良く混合し192μlの注入し 1 分間静置する．静置後，遠心分離機で 12000r.p.m.

MasterMixを作製した．

で 1 分間遠心し 16S リボソーム DNA を回収する．

(2) PCR法による増幅16S リボソームDNAの増幅

Table.1

PCR conditions Ⅰ

PCR 用チューブ(Axygen 社，PCR-02-C)を 4 本用意し，

1 cycle:94℃-2:00min

それぞれに MasterMix を 48μl ずつ注入する．3 本の PCR

35 cycle:

94℃-0:30min

用チューブに 3 サンプルから抽出した DNA をそれぞれ 2→55℃-0:30minμl ずつ注入する．残りの PCR 用チューブ 1 本には→72℃-1:30min

DNase-RNase-Free 水を注入する．注入後は PCR 用チュー
ブの底部に気泡が付着していないことを確認し，PCR に設置し Table.1 の条件で 16S リボソーム DNA を増幅する．

―13―

1 cycle:72℃-5:00min
4℃-∞大分工業高等専門学校紀要

第 46 号(平成 21 年 11 月)

ートに接種し37℃インキュベーターで1晩静置する．
嫌気 好気

翌日，コロニーが形成されていることを確認した後，10×Ex Taq Buffer16μl ，dNTPMix12.8μl ，Primer ，(M標準 ﾏｰｶｰ13rev ,10mM)3.2μl ，Primer(M13-40,10mM)3.2μl， EX
Taq0.8μl，DNase-RNase-Free水124μlを混合し計160μlの2000kbp
1500kbp1000kbp

PCR用MasterMixを作製する．作製後MasterMixをPCR用チューブ8本に20μlずつ注入し，各々にLB/Ampプレートに形成された白色コロニーからランダムに7つ選びそれぞれのサンプル名をD1～D7としてPCR用チューブ1本につき1Fig.2つずつ注入し混合した．その後Table.2の条件で16S リボソ

The result of ElectrophoresisームDNAを増幅する．

４．クローニング
クローニングの概略図をFig.3に示す．今回のセミナー
では，標準サンプルから十分な量の16S リボソームDNAが回収できたため，バイアスのかかった好気サンプル，嫌気サンプルのクローニングは行わず，標準サンプルのみをクローニングした．
(1)ライゲーション-80℃で冷凍保存された pT7 Blue T-Vector(ベクター) (タカラバイオ社，69820-3)と Ligation Mix(リガーゼ) (タカラバイオ社，6023)を取り出し，氷上におき解凍する．解凍後，遠心分離機でスピンダウンし，ライゲーション溶液用チューブへ回収した 16S リボソーム DNA の PCR 生成物を 4μl 注入する．次に pT7 Blue T-Vector を 1μl 注入し混合，続いて Ligation Mix を 5μl 注入し混合する．混合が終了したら 16℃に設定したブロックインキュベーターに 1
時間ライゲーション溶液用チューブを入れライゲーションする．
(2) 形質転換-80℃で冷凍保存された SOC(タカラバイオ社，69820-3)を取り出しチューブに 1ml ずつ分注する．-80℃で冷凍保存されたコンピテントセル(TOYOBO，DNA-903)を氷中で解凍する．解凍後，遠心分離機でスピンダウンしコンピテ
ントセル 50μl をライゲーション溶液用チューブへ注入し混合する．混合後氷中に 5 分間静置し，その後 42℃に設定した恒温槽に 45～60 秒間浸すことでヒートショックをFig.3

Cloning outline4)加え，その後 2 分間氷上に静置する．SOC1ml が入っているチューブに移し混合する．

Table.2
1 cycle:(3) コロニーダイレクトPCRPCR conditions Ⅱ94℃- 5:00min

30 cycle:

94℃- 0:30min

SOCとコンピテントセルの混合溶液50mlをクリーンベ→

55℃- 0:30min

ンチ内で乾燥させたLB/Ampプレートに入れ，火炎滅菌し→72℃- 1:30min

たコンラージ棒でLB/Ampプレートに混合溶液をストリークする．その後別のLB/Ampプレートに混合溶液量を100mlを入れて同様にストリークする．全混合液をLB/Ampプレ―14―

1 cycle:72℃- 5:00min
4℃-∞大分工業高等専門学校紀要

第 46 号(平成 21 年 11 月)(2) Clostridium属とBrevibacillus属の新種と思われる微５．RDFに含まれる細菌と真菌の同定結果生物の存在が明らかになった．
(1) 塩基配列決定
塩基配列決定法にはマクサム-ギルバート法やサンガー法などがある5)が今回の塩基配列決定は株式会社リバネス

Table.3

へ委託した．コロニーダイレクトPCR後溶液を精製し，新D3: Paenibacillus graminis

しい1.5mlマイクロチューブにDNase-RNase Free水を45μl注入し，チューブに精製した溶液を注入，混合して濃度調整をしたのち， D3～D7の5個のサンプルの塩基配列決定

BLAST result

coverage 100%, identities 99% (720/726)
D4: Clostridium beijerinckii
coverageを株式会社リバネスに委託した．

98%, identities 94% (698/739)

gaps 10/739
Clostridium roseum(2) 類似塩基配列決定

coverage

塩基配列決定後に類似塩基配列の決定を行う．類似塩基98%, identities 94% (696/739)

gaps 10/739

配列決定はGENETYXソフトで行った．類似塩基配列決定

Clostridium acetobutylicumを行った結果をTable.3に示す．

coverage

98%, identities 94% (696/739)

サンプル名ごとに類似度の高かった微生物が候補としgaps 10/739て挙げられており，coverageは比較対象となる塩基配列のClostridium diolis

うち何%の塩基配列と比較できたかを表す，またidentities

coverageは類似度の高さと，比較した塩基配列中いくつの塩基が一gaps 10/739

致したかを，gapsは塩基配列中の塩基が切断されていた数

D5: Brevibacillus reuszeriを表している．

coverage

98%, identities 94% (695/739)

96%,identities90%(710/786)

gaps 27/787
Brevibacillus panacihumi

６．結果

coverage

96%, identities90%(708/785)

gaps 25/785
D3はcoverage，identitiesが共に高く塩基配列の違いも726

Brevibacillus brevis

個中6個と少ない．また候補の微生物も1種のみなためD3

coverage

はPaenibacillus graminisと断定した．D4は塩基配列の違い

gaps 29/787が739個中約40個と多くgapsも10個あるため候補の微生物

D6: Clostridium puniceum

ではないとわかった．また候補の微生物が全てClostridium

coverage 100%, identities 99% (737/740)

属に属していることからD4はClostridium属に属している

Clostridium favososporum

新種の微生物と断定した．D5は塩基配列の違いとgapsも多coverage 100%, identities 99% (737/740)

いため候補の微生物ではないとわかった．また候補の微生
物 が 全 て Brevibacillus 属 に 属 し て い る こ と か ら D5 はBrevibacillus属に属する新種の微生物と断定した．D6は96%, identities 89% (707/787)

Clostridium corinoforum
coverage 100%, identities 99% (736/740)
D7:Clostridium beijerinckii

coverage，identitiesが高く，塩基配列の違いも3，4個と少coverage 100%, identities 99% (803/804)

ないが，どの候補も類似した結果を示しているため断定には至らず，D6は3候補のうちのどれかであろうと推測される．D7はcoverage，identitiesが高く塩基配列の違いも804
個中1個と非常に少なく，候補の微生物も1種のみなため，参考文献

D7はClostridium beijerinckiiと断定した．このClostridium

1)

beijerinckiiは水素を発生する水素産生菌である．

独立行政法人消防研究所，消防研究所研究資料71号
RDF火災に関する調査研究報告書(平成15年度)，pp.20，2006.

2)

７．結論

独立行政法人消防研究所，消防研究所研究資料71号
RDF火災に関する調査研究報告書(平成15年度)，pp.9，
2006.

(1) RDFにはRDF貯蔵サイロの爆発原因の1つと考えられ3)ている水素を発生する微生物，Clostridium beijerinckiiが存在していることがわかった．

小野寺一清，野沢明美，海老原充，組換えDNA実験ノート<基本操作編>,pp.127,1991.

4)

―15―

小野寺一清，野沢明美，海老原充，組換えDNA実験ノ大分工業高等専門学校紀要

第 46 号(平成 21 年 11 月)ート<基本操作編>,pp.6,1991.
5)

小野寺一清，海老原充，野沢明美，組換えDNA実験ノート<応用操作編>,pp.131,1995.

―16―