【研究報告】（自然科学部門）

肝グリコーゲン量の変化による脂肪酸合成酵素発現調節三浦

静岡県立大学食品栄養科学部栄養生命科学科緒言進司准教授-GlcNAc 化は、 -GlcNAc transferase（OGT）により食事のリズムは「絶食と再摂食」が繰り返されるこ

UDP-GlcNAc を用いて行われる。UDP-GlcNAc の生合とで形成され、生体は栄養素の代謝動態を変化させるこ成の律速段階はフルクトース-6-リン酸とグルタミンかとにより恒常性を維持している。肝臓は糖質代謝においらグルコサミン-6-リン酸を合成する段階である。フルて中心的な役割を果たし、絶食時には糖新生を促進し、クトース-6-リン酸の供給量は、肝細胞内のエネルギー摂食時には得られた糖質をエネルギーとして利用後、エおよびグリコーゲン貯蔵の充満に伴って増加することがネルギーが充足するとグリコーゲンとして蓄積し、残り予測されるため、UDP-GlcNAc 量が肝グリコーゲン貯の糖質を脂肪に変換している。これらの代謝にはホルモ蔵の充満を反映する分子となる可能性が考えられる。

ンによる制御が関与し、グルカゴンは絶食時の、インス以上の背景から、本研究では「摂食後の肝臓においリンは摂食時の代謝を促進する 1, 2）。インスリンはグリてグリコーゲン貯蔵が充満されるとフルクトース-6-リコーゲン合成酵素を活性化することによりグリコーゲン蓄ン酸供給量が増加し、UDP-GlcNAc 合成とそれに伴う積を促進し、さらに転写因子 sterol regulatory element-LXR の -GlcNAc 化が促進し、SREBP-1c の発現増加をbinding protein（SREBP）-1c を活性化することで脂肪酸引き起こすことにより脂肪酸の生合成が促進される」と生合成系遺伝子の発現量を増加させて糖質からの脂肪酸いう仮説（図 1）を検証する。本研究の成果は、肝臓に3）生合成を促進する 。しかし、生体にとって糖質源の確おけるインスリン非依存的な糖質代謝経路の存在の証明

保は最優先事項であるため、摂食後のインスリン刺激にや、脂肪肝や肥満などの発症機序解明と、新たな治療標より「グリコーゲン貯蔵を充満させる」のと並行して的を見出すための重要な情報となる。

「グルコースから脂肪酸の生合成を行う」ことは合目的ではなく、摂食後に余剰の糖質が生じてから SREBP-1c

方や脂肪酸生合成系遺伝子発現が増加するような、インス

1.

法
マウス飼育・解剖
実験動物は 8 週齢の雄性 C57BL/6J マウス（日本クレ

リン非依存的機序が存在する可能性が考えられる。
我々は、絶食後に再摂食させたマウス肝臓での糖質ア）を使用した。マウスの飼育環境は、12 時間の明暗代謝および脂肪酸生合成系遺伝子発現の経時変化を追跡サイクル、室温 23±1℃を維持し、エサおよび水を自由したところ、再摂食後の SREBP-1c や脂肪酸生合成系遺伝子の発現増加は、血中インスリン濃度増加とは時間的に一致せず、グリコーゲン貯蔵が充満された後に認められるという新知見を得た。SREBP-1c の発現は転写因子
liver X receptor（LXR）によって促進されるが、インスリンは LXR の転写活性化能を増加させる4）。最近インスリン作用の他に、LXRの -linked β- -acetylglucosamine（ -GlcNAc）化がその転写活性化能に影響することが明らかにされ、摂食時の SREBP-1c 発現増加には LXRの -GlcNAc 化が関与することも示唆されている5）。しかし、LXR の -GlcNAc 化がどのタイミングで、どのよ図1

うな機序で促進されるのかは不明である。タンパク質の1

グリコーゲン貯蔵の充満が脂肪酸生合成系酵素の発現量を制御する機序（仮説）

三

浦進司

摂取させた。1 週間の馴化期間の後、解剖前日の 17 : 00cDNA と標的遺伝子のプライマーを用いて定量 RT-PCRから絶食群、再摂食群の餌を抜き 16 時間絶食させ、再法で遺伝子発現量を測定した。

摂食群は翌日 9 : 00 に再摂食を行った（図 2）。絶食群は3.

絶食 16 時間後に、再摂食群は再摂食開始から一定時間

免疫沈降–ウエスタンブロッティング
組織片を Lysis buﬀer 中でホモジネートし、アガロー後にそれぞれ解剖を行った。コントロールとして ad lib

スビーズおよび抗 LXR 抗体を添加し、一晩 4℃で転倒混で摂食した群を用意した。
眼底静脈より EDTA 存在下で血液を採取し、頸椎脱和した。その後、遠心分離と洗浄を数回繰り返し、サン臼をした後に肝臓を採取し素早く液体窒素を用いて凍結プルバッファーに溶解した。アクリルアミドゲルにローした。NIH 実験動物の管理と使用に関する指針と本大ディングして電気泳動を行い、泳動後メンブレンに転写学のガイドラインに従った。

し、LXR および -GlcNAc タンパク量を測定した。

2.

血中インスリン濃度，肝臓グリコーゲン量および4.

mRNA 発現量の測定

肝臓中 UDP-GlcNAc 量の測定
液体窒素で凍結した肝臓を乳鉢で粉状にすりつぶし、（1）血中インスリン濃度の測定

メタノール／水（3 : 1）を添加した。撹拌後、遠心分離

眼底採血により採取した血液を遠心分離し、上清をで上清を採取した。ろ過フィルターで遠心濾過を行い、採取、インスリン測定キット（Morinaga）を用いて血適当な濃度に希釈した後に LC/MS で肝臓中および標準中インスリン濃度を測定した。

品の UDP-GlcNAc 量を測定した。

（2）肝臓グリコーゲン量の測定
5.

過塩素酸に凍結肝臓 1 片を入れ、テフロンホモジナイ

1 型糖尿病モデルマウスの作製

ザーでホモジナイズし、塩酸分解によってグリコーゲン20 mg のストレプトゾトシン（STZ）をクエン酸 1 mlをグルコースへと分解した。得られたグルコースをグルに溶解し、1 匹に 0.1 ml の STZ 溶液を腹腔内投与した。

コース C II-テストキット（Wako）で測定し、グリコー後日、血糖を測定し、血糖値が 300 mg/dl 以下の個体にゲン量とした。

は再び同量の STZ を腹腔内投与した。投与から 1 週間後（3）mRNA 発現量の測定に解剖を行い、血液、肝臓を採取した。

TRIzol（Invitrogen）中に肝臓 1 片を入れ、ポリトロンホモジナイザーで即座にホモジナイズした。遠心分離

結果・考察で上清を採取し、クロロホルムを添加した。攪拌後に遠1.

インスリン非依存的な脂肪酸生合成 mRNA の発現増加

心分離を行い、上層を回収、2-プロパノールを加えて遠心分離で mRNA を沈殿させた。mRNA を 75％エタノー

血中のインスリン濃度は絶食により大幅に低下、再ル で 数 回 洗 浄 し、DEPC 水 で 溶 解 し て mRNA 量 を摂食によって増加し（図 3）、再摂食 2 h 後に血中インス

測 定 し た。mRNA を 一 定 量 に 合 わ せ、 逆 転 写 酵 素

リン濃度はピークを示した。肝臓のグリコーゲン量は絶（TAKARA） を 用 い て cDNA を 作 製 し た。 作 製 し た

食により大幅に減少したが、再摂食の時間経過とともに徐々に増加し、再摂食 2〜4 h 後にかけて摂食群と同等量まで増加した。脂肪酸生合成酵素の転写因子である
SREBP-1c の mRNA 発現量の変化は血中インスリン濃度の変化とは一致せず、肝臓グリコーゲン量の変化と同

図2

様に絶食時には低値を示し、再摂食とともに徐々に増加絶食・再摂食タイムコースした（図 4）。SREBP-1cの標的である、fatty acid synthase
表1Target
18SrRNA
SREBP-1c
FAS

RT-PCR プライマー配列

Sense primer

Antisense primer

5′-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3′5′-CACGGAGCCATGGATTGC-3′5′-GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT-3′25′-GGGTCGGGAGTGGGTAATTTT-3′5′-AGTCACTGTCTTGGTTGTTGAG-3′5′-AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT-3′肝グリコーゲン量の変化による脂肪酸合成酵素発現調節

図3

再摂食時の血中インスリン濃度と肝臓グリコーゲン量

図6

図4

再摂食時の肝臓中 UDP-GlcNAc 量

再摂食時の SREBP-1c、FAS mRNA 発現量
図7

STZ 投与マウスの再摂食時の血中インスリン濃度倍を推移した。
続 い て 絶 食・ 再 摂 食 時 の 肝 臓 中 UDP-GlcNAc 量 をLC-MS を用いて調べたところ、絶食時、再摂食 0.5、4、8 h 時の UDP-GlcNAc 量に差はなかった（図 6）。
図5これらの結果から再摂食 8 h までに LXR の -GlcNAc

再摂食時の LXR の -GlcNAc 修飾

修飾に大幅な変動はなく、また、肝臓中 UDP-GlcNAc量にも変化がないことが明らかになり、再摂食後の脂肪（FAS）の発現量も SREBP-1c の発現量と同様の変動を酸生合成酵素の発現量増加と LXR の -GlcNAc 化には示したが有意な差は認められなかった。これらの結果か関連性が見出せなかった。

ら再摂食後の脂肪酸生合成酵素の発現量増加はインスリ
3.

ン非依存的に生じていることが示唆された。さらに、肝STZ モデルマウスの再摂食時の肝臓グリコーゲン量と脂肪酸生合成酵素臓グリコーゲンが充満した再摂食 4 h 後から急激な増加

絶食、再摂食時の脂肪酸生合成酵素の発現量変化がを示したことから肝臓グリコーゲンの充満の後に脂肪酸インスリン非依存的に生じているかを検討するために、生合成が促進している可能性が示唆された。

マウスに STZ を投与し、膵臓 β 細胞を破壊した 1 型糖尿2.

再摂食後の LXR の -GlcNAC 化病マウスを作製した。STZ 投与マウスの血中インスリ

LXR のタンパク発現量は絶食で減少し、再摂食によン濃度は通常マウス（STZ 非投与マウス）に比べ低値り絶食時に比べやや増加した（図 5）。 -GlcNAc–LXRを示した（図 3、7）。肝臓グリコーゲン量は絶食、再摂タンパク質量は絶食時、再摂食時ともに摂食群に比べや食による変動が認められなかった。SREBP-1c およびや 低 下 し た。 各 サ ン プ ル の -GlcNAc タ ン パ ク 量 をFAS の mRNA 発現量の変化は絶食時には低値を示し、LXR タンパク量で除すことで LXR の -GlcNAc 化修飾再摂食とともに徐々に増加した（図 8）。

を定量した。LXR の -GlcNAc 化量は摂食群と比してSTZ 投与マウスにおいて再摂食後の脂肪酸生合成酵絶食時には 2.3 倍に増加、再摂食開始後からは 1.2〜1.4素の発現量が顕著に増加することはこれまでに報告され3三浦進

司グを調べた。その結果、摂食後の脂肪酸生合成酵素のmRNA 発現量はインスリン非依存的に増加することが明らかになった。しかし、脂肪酸生合成の活性化機序の一つとして報告されている LXR の -GlcNAc 修飾および基質として利用される UDP-GlcNAc の肝臓中の濃度は再摂食による変動が認められなかった。また、STZモデルでの検討より絶食、再摂食時の肝臓グリコーゲン量の変化、脂肪酸生合成酵素の発現量変化に相関がな
図8かった。これらの結果から、再摂食後の脂肪酸生合成酵

STZ 投与マウスの再摂食時の SREBP-1c、FAS mRNA
発現量素の発現量増加はインスリン非依存的に生じていること、しかし、肝臓グリコーゲン貯蔵の充満との関連性は6）薄いことが明らかになった。ており 、本研究における STZ 投与マウスの検討からも再摂食後の脂肪酸生合成酵素の発現量増加がインスリン謝非依存的に生じていることが明らかになった。一方で、

辞STZ モ デ ル マ ウ ス で は 絶 食・ 再 摂 食 に よ る 肝 臓 グ リ

本研究にご支援賜りました公益財団法人三島海雲記

コーゲン量の変動が認められなかった。この結果から、念財団に深謝申し上げます。なお、本研究で得られた成再摂食後の脂肪酸生合成酵素の発現量増加は肝臓グリ

果につきましては、現在論文執筆、投稿準備中であるこ

コーゲン量の蓄積の影響を受けていないことが示唆されとを申し添えます。

た。
文
要

約献

1） S. Herzig, et al.:
, 413, 179–183, 2001.
2） M. Foretz, et al.:
, 96, 12737–12742, 1999.
3） J. D. Horton, et al.:, 95,5987–5992, 1998.
4） G. Chen, et al.:
, 101, 11245–11250, 2004.
5） E. H. Anthonisen, et al.:
, 285, 1607–1615,
2010.
6） T. Matsuzaka, et al.:
, 53, 560–569, 2004.

これまで摂食時における糖・脂質代謝は主にインスリンによって調節されるとされてきたが、生体の糖質源確保が最優先事項であることを説明するには矛盾点が多く存在する。本研究では肝臓グリコーゲン貯蔵の充満が脂肪酸生合成促進シグナルを制御するという仮説のもと、関連する転写因子の活性調節機序と、そのタイミン

4