ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロール代謝調節機構
東京大学大学院

佐農学生命科学研究科・応用生命化学

藤隆 一 郎In an attempt to identify unknown target genes for SREBP-1, total RNA from a stable CHO cell line (CHO-487) expressinga mature form of human SREBP-1a (amino acids 1 to 487) with a LacSwitch Inducible Mammalian Expression System
was subjected to a PCR subtraction method. One of the fragments was found to have 90 and 86% homology with rat andhuman ATP citrate-lyase (ACL) cDNA, respectively. When Hep G2 cells are cultured under either sterol-loaded or -depletedconditions, expression of the gene is induced approximately 2 to 3-fold by sterol depletion. To investigate the direct effect ofSREBP-1a on transcription, luciferase assays using the promoter of the human ACL gene were performed. These deletion
studies indicated that a minimum 160-base pair segment contains the information required for the transcriptional regulation
brought about by enforced expression of SREBP-1a. Luciferase assays using mutant reporter genes revealed that SREBPdependent transcriptional regulation is mediated by two nearby motifs, the SREBP-binding site (a TCAGGCTAG sequence)and the NF-Y-binding site (a CCAAT box). It was confirmed by gel mobility shift assays that recombint SREBP-1a binds tothe sequence. Data from studies with transgenic mice and reporter assays show that the ACL gene promoter is activatedby SREBP-1a more strongly than SREBP-2 in contrast to the HMG CoA synthase and LDL receptor gene promoters, which
exhibit the same preference for the two factors . Therefore, SREBPs transcriptionally regulates ACL enzyme activity, which
generates the cytosolic acetyl CoA required for both cholesterol and fatty acid synthesis.

１．緒言２．実

皮膚表面は皮脂によりコーティングされた表皮角質層、

２. １

験

ヒト活性型 SREBP—1 を一過的に発現する

CHO 細胞株の樹立

その下層に表皮細胞由来の脂質が多層構造をなし、水分バリヤー機能を担っている。この恒常性が破壊されたとあらかじめ Lac I を安定発現する CHO 細胞株を樹立しき、種々の皮膚疾患が発症することを考えると、皮膚組織（CHO—Lac）、これに Lac I により発現が抑制される発現での脂質代謝調節維持が疾患予防、治癒にとり重要である

プラスミドにヒト活性型 SREBP—1 を組み込んだものを遺ことがうかがわれる。本研究課題では、脂肪酸合成・コレ伝子導入し、IPTG 含有培地で一過的に発現が認められるステロール代謝調節の中心的役割を担う転写因子 SREBP細胞株 CHO—487 を獲得した。

（Sterol Regulatory Element Binding Protein）の機能を、分子細胞生物学的アプローチにより明らかにすることによ２. ２

り、皮膚細胞における脂質代謝調節解明の基礎研究になることを目的とした。

subtract PCR 法による応答遺伝子の単離CHO—Lac ならびに CHO—487 細胞をコレステロールを過剰に含む培地に、1 mMIPTG を添加し、19 時間培養し、SREBP は 互 い に 47 ％ の 相 同 性 を 持 つ SREBP—1 と総 RNA を回収した。定法に基づき、CHO—487 細胞で発SREBP—2 の２種類の蛋白質から成るファミリーを形成現が亢進している遺伝子のフラグメントを獲得した。そのするが、その機能的役割分担について不明な点が多い。

フラグメントを用いて、双方の細胞から回収した RNA をSREBP—1 が主として脂肪酸代謝関連遺伝子、SREBP—2 が用いて Northern hybridization を行い、確かに CHO—487

コレステロール代謝関連遺伝子を転写制御するものと考え細胞で発現の亢進が認められたクローンについてそれらのられているが明確な知見は少ない

１〜３）。我々は、それぞれ塩基配列を決定した。

を一過的に発現する細胞株を樹立し、SREBP—1、—2 のそれぞれに応答する遺伝子を subtract PCR 法にて同定する

２. ３４）ことを試みた 。

Luciferase assay 法による応答領域の決定応答遺伝子として新たに見出された ATP クエン酸リア
Regulation of fatty acid and cholesterol
metabolism in human fibroblast cells
Ryuichiro Sato
Department of Applied BiologicalChemistry,
Graduate School of Agricultural and LifeSciences, University of Tokyoーゼ（ACL）について、ヒト遺伝子の転写開始点から上流 300 bp から下流 29 bp を含む領域をクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した ACL—300 を構築した。PCR 法により− 251 から＋ 29 を含む ACL—251、以下同様にして種々の長さのプロモーター領域を含むレポーター遺伝子を構築した。レポーター遺伝子と活性型 SREBP—1 発現プラスミドを HEK 293 細胞に遺伝子導入し、２日− 97 −

発現により観察される人為的な現象なのか、細胞内コレ後にルシフェラーゼ活性を測定した。

ステロールの増減に応じて起こる SREBP の活性化によっ３．結果と考察ても引き起こされるのかについて、ヒト肝細胞 Hep G 2 にCHO—487 細胞で SREBP—1 を一過的に過剰発現させ転よる解析を行った。Hep G 2 細胞をコレステロール過剰培写が亢進した遺伝子を subtract PCR 法により単離し、そ地もしくはコレステロール合成阻害剤を含む培地で培養の塩基配列を決定した。その結果、これまで報告のあるし、RNA を回収し、Northern Blot 解析を行った（Fig. ２）。

SREBP 応答遺伝子の他に ACL 遺伝子が見出された。エ

ACL は細胞内のコレステロールの増加に伴い発現が低下

ネルギー過剰状態でミトコンドリア内で生成されたアセチし、減少に伴い発現増加が認められた。以上の知見は、生ル CoA は、そのままの形では細胞質へと移行できず、ク理的条件での細胞内コレステロール量の変動に伴う内因性エン酸へと変換後細胞質へ移行し、細胞質で ACL の働き

SREBP の活性化、不活性化に伴い、本遺伝子が転写調節により再びアセチル CoA へと変換される。このアセチルを受けうることを意味している。

CoA は脂肪酸、コレステロール合成の基質となる。従っ続いてヒト ACL 遺伝子のプロモーター領域をクローて、脂肪酸、コレステロール合成経路を調節する SREBP

ニングし、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポがその初発酵素の転写を制御することは、十分にあり得ーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイを行い、ることと言える。そこで新たな応答遺伝子として同定さSREBP—1 による転写調節応答領域の同定を試みた。転写れた ACL、SREBP の制御を受ける HMG CoA synthase

開始点から 131 bp 上流までは SREBP—1 による調節を受けmRNA の変動をそれぞれの CHO 細胞株を用いて検討したが、94 bp まで短くするとその調節は失われた（Fig. ３）。

た。CHO—Lac 細胞、CHO—487 細胞をコレステロールを

そこで、131 から 94 bp の塩基配列中、SREBP の応答

過 剰 に 含 む 培 地 に IPTG を 添 加 し、19 時 間 培 養 し、 総配列の候補部位を３ヶ所、SREBP 結合部位の近傍に存在RNA を回収し、アガロースゲルにて電気泳動し、それぞし協調的に働く NF—Y の結合部位１ヶ所にそれぞれ変異れのプローブを用いて Northern Blot 解析を行った（Fig.

を入れたレポーター遺伝子を構築し、ルシフェラーゼア１）。いずれの細胞でも過剰のコレステロールのために内ッセイを行った。その結果、上流 110 bp 付近の配列に応因性の SREBP は不活性化状態であり、CHO—487 細胞で、それに近接する答するとともに（ACL—131 SREbKO）

のみ IPTG により外因性のヒト活性型 SREBP—1 が発現さCCAAT 配列も調節に必須であることが明らかになった

れている。この状況下で、HMG CoA synthase mRNA は（Fig. ４）。SREb 配列への SREBP の結合はゲルシフトア

CHO—Lac 細胞では検出限界以下まで減少し、一方 CHO—ッセイにより確認した。

487 細胞では外因性 SREBP—1 によりバンドが検出された。

ACL は脂肪酸合成、コレステロール合成の出発物質でACL については HMG CoA synthase mRNA と同様な濃あるアセチル CoA 生成を触媒する酵素であり双方の経路

淡のパターンは認められたものの、コレステロール過剰状に重要であるが、インスリンへの応答等これまでの知見か

況下の CHO—Lac 細胞でも発現が確認され、SREBP—1 はらエネルギー過剰状況下で脂肪酸合成等を誘導するリポジ転写の一部を調節していることが推察された。

ェニック酵素として認識されている。従って、コレステ

この様な ACL 遺伝子の転写制御が、SREBP—1 の過剰
Fig.1 Northern blot analysis for the ACL
and HMG CoA synthase gene in CHO-Lac
and CHO-487 cells. CHO-LacA and CHO487B cells were cultured with 1μg/mL of25-hydroxycholesterol, 10μg/mL of cholesterol and 1 mM IPTG for 19 h. Twentyμg total RNA samples were fractionated
on 1％ agarose gel, transferred to nylon
membrane, and hybridized with a DIGlabeled riboprobe for ACL, HMG CoA
synthase or S17. The fold change in ACL
mRNA, relative to that in CHO-Lac cells,
was calculated after correction for loading
differences with S17. Signals were quantified with a FluorImager 595. In three
separate experiments the same relative
mRNA levels were obtained.

ロール代謝関連遺伝子の転写調節に主に機能する SREBP—2 に比べて脂肪酸代謝関連遺伝子の転写調節に関与するSREBP—1 による支配を強く受ける可能性がある。そこでルシフェラーゼアッセイの系にヒト SREBP—1、SREBP—2 発現プラスミッドをそれぞれ導入し、応答を検討した− 98 −

Fig. 2 ACL mRNA expression is regulated
by cellar cholesterol levels. Hep G 2 cells
were cultured with medium containing
5％ LPDS supplemented with either 1μg/mL of 25 -hydroxycholesterol plus
10μg/mL of cholesterol (sterol-loadedconditions) or 50μM of a HMG CoA
reductase inhibitor, pravastatin plus
50μM of sodium mevalonate (steroldepleted conditions) for 48 h. Northernblo t a n alysis wa s c a r rie d o u t a sdescribed in the legend to Fig. 1.

ヒト皮膚線維芽細胞における脂肪酸、コレステロール代謝調節機構

Fig. 3 Regulation of ACL promoter-luciferase reporter genes by SREBP-1a(1-487). HEK 293 cells were transfected with one of human ACL promoter reporter genes (200 ng), a plasmid encoding b-galactosidase (100 ng),
and an expression plasmid (10 ng), pSREBP1(1-487) for 4 h. The cells were incubated for 48 h and then lysed,and enzyme activities were determined. The ratio of luciferase activity in relative light units (RLU) is divided by
the β-galactosidase activity (U, units) to give a normalized luciferase value (RLU/U). The values given are theaverage of data from more than three experiments performed in triplicate.

Fig. 4 Effect of the mutation of the SRE or the NF-Y binding site on the expression of reporter gene. HEK 293
cells were transfected and cultured as described in the legend to Fig. 3. The fold activation (luciferase activity
with SREBP-1 versus without SREBP-1) is shown. The luciferase activities obtained by the reporter genes werein the range of 400 to 1000 RLU/U. The values given are the average of data from more than three experiments performed in triplicate.

（Fig. ５）
。その結果、ACL は SREBP—1 により高い感受mRNA 量を測定したところ、HMG CoA synthase、LDL性を持って反応した。一方、コントロールで用いた HMG

受容体 mRNA は両トランスジェニックマウス間で差が認CoA synthase、LDL 受容体遺伝子は双方に対してほぼ同められなかったのに対し、ACL mRNA は SREBP—1 トラ等の反応を示した。さらに SREBP—1、SREBP—2 を過剰ンスジェニックマウスで高値を示し、ルシフェラーゼアッ発現するトランスジェニックマウス肝臓中でのそれぞれのセイの結果と一致した。

− 99 −

Fig. 5 Differential sensitivity of the ACL, HMG CoA synthase and LDL receptor promoters to overexpressed SREBP1 a or SREBP- 2 . HEK 293 cells were transfected with one of reporter genes (ACL- 131 , pHMG S and pLDLE;200 ng), a plasmid encoding β-galactosidase ( 100 ng), and an indicated amount of expression plasmid, pSREBP 1 a（1 - 487）or pSREBP 2 ( 1 - 481 ), for 4 h. The cells were incubated for 48 h and then lysed, and enzyme activities
were determined. The fold activation (luciferase activity in the presence of SREBP- 1 a or SREBP- 2 versus in theabsence) is shown. The values given are the average of data from three experiments performed in triplicate.

４．総２）Sato, R., Inoue, J., Kawabe, Y., 他３名：Sterol-括

dependent tr ans c r i pti onal r egul ati on of s t er ol

脂質代謝関連遺伝子の転写を調節する SREBP の新規応答遺伝子として ACL を初めて同定し、その転写調節機構

regulatory element-binding protein- 2 . J. Biol. Chem.
271 , 26461 - 26464 , 1996 .

を明らかにした。同様な調節機構は皮膚線維芽細胞でも存

３）Sato, R., Miyamoto, W., Inoue, J., 他３名：Sterol

在し、皮膚における脂質代謝のダイナミズムに深く関与しregulatory element-binding protein negativelyている可能性がある。今後この様な基礎知見を積み重ねる

regulates microsomal triglyceride transfer protein gene

ことにより、皮膚細胞での脂質代謝の恒常性維持を目指したコスメトロジー研究の発展が期待される。

transcription. J. Biol. Chem. 274 , 24714 - 24720 , 1999 .
４）Sato, R., Okamoto, A., Inoue, J., 他 5 名：Transcriptional
Regulation of the ATP Citrate-lyase Gene by Sterol（引用文献）

Regulatory Element-binding Proteins. J.Biol.Chem. 275 ,１）佐藤隆一郎：膜結合型転写因子 SREBP 蛋白質核酸酵

12497 - 12502 , 2000 .

素 , 45 , 2612 - 2623 , 2000 .

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