生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立
自治医科大学分子病態研究部

西村智

We visualized skin-lesions in living mice by two photon microscope, and observed inflammatory responses after scratch
injuries. We also developed hand-held skin imaging device which can cover broad time-and-space scale. System can be
minimized to hand-held size, and weighs less than 300 g. This device can replace current pathological and radiographic
examination, and daily outpatient skin lesion observations. Skin barrier or immune functions can be recorded with outlooks
in real-time, after skin treatment or drug administrations.

1. 緒

微鏡を用いて皮膚観察を行った。マウスの広い皮膚を観察

言

対象とする際でも、三次元的な取得情報を増やしていく際

我々は非線型光学現象を用いたイメージングシステムにには、生物用の瞳の小さい顕微鏡レンズや光学系、現在のより、多様な疾患領域でのバイオイメージングを行っていサイズの素子を用いるとかならず一定の理論的限界が存る。基礎的には、血管イメージングでは生体スキャンの高在することが初期検討で明らかになった。生体の質感を十速性を活かして、リアルタイムで広視野・高解像度でのイ分に表すことはしばしば困難であった。皮膚外観はミクロメージングを行っている。本研究ではまず生体皮膚に特化での質感と、マクロでの大きな形態情報、の両者が重要でして二光子顕微鏡をベースとしたイメージングデバイスのあり、二光子顕微鏡での視野の狭さは大きな限界であった。

作り込みを行った。元来、生体皮膚はイメージングの良い従来の観察システムは、高解像度では 0.1 mm 視野であり、適応であり、皮膚疾患の治療から化粧品作用の検証まで広サイズを広げていくと画質・解像度の劣化が著明であった。

く用いることができた。二光子顕微鏡では生体親和性が高皮膚全体、マクロ・ミクロの統合的な外見解析のためにく、平均エネルギーの低い近赤外レーザーで局所的に光励は、広視野・高解像度の光学的な両立が欠かせない。従起が可能であり、生体皮膚の良好な画像が我々のシステム

来の顕微鏡では、光路がわずか φ25 mm に固定されており、でも得られた。同時に、生体皮膚に傷害をくわえ、創傷治なおかつ視野範囲と解像度にはトレードオフが存在してい癒の全過程をイメージングするなど、皮膚機能や外観の解た。ダーマトグラフィとして使用するためには視野範囲の析が行われた。

拡大が必須と考えられるため、その制約を外すことを検討

一方で、皮膚科外来診療での皮膚病変の観察・記録や、した。一眼レフカメラ、半導体用レンズ、あるいは、天体あるいは、美容分野での皮膚観察に焦点をあて、最小化し望遠鏡のようなサイズの光学系を考えると、マウスのマクた顕微鏡システムを開発した。本システムでは、手持ちサロ観察に必要な要件を達成することができる。そこで、我々イズで、完全オートフォーカス、完全オートシャッター、は、・広視野・低倍率・高 NA レンズによる顕微鏡ミクロイ無限焦点可変、無限倍率可変を実現した。一見、荒唐無稽メージングにみえる広スケールのイメージングを新規光学デザインに・低 F 値・高倍率・低収差マクロレンズによる体表スキより可能にしているため、独自性が高く今後の展開に期待ャンが持たれた。

を行った。

2. 二光子顕微鏡による生体皮膚観察について（方法・結果）三次元的な光線追跡再現まで視野にいれ生体皮膚質感のミクロ情報は主に二光子顕微鏡を用いてスキャンを行った。

まず、我々は、血管イメージングで実績のある二光子顕皮膚に最適化を行い、空間解像度 200 nm、30 fps でのリアルタイム４色イメージングを皮膚で達成した。
図 1・図 2 のように手指や腹部皮膚のイメージングを行い、体表面から皮膚角質全層、さらには、皮下結合組織・血管

Development of two photon microscopeand imaging systemfor evaluation of skinoutlooks and functions after treatment.
Satoshi Nishimura
Jichi Medical University

まで可視化が可能であった。画質は観察部位に大きく依存したが、皮膚前処置や皮膚表面のコーティング、液浸レンズの使用により改善が可能であった。
さらに図３のように固定処理を行えば、特定のタンパク− 98 −

生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立

図 1 マウスの足の指表面の二光子励起顕微鏡画像
CAG-eGFP マウスに Rhodamin-B デキストランを静脈注射後、麻酔下で顕微鏡ステージに乗せ、足指先皮膚の深部観察を行った（緑：表皮・機械受容器、赤：血流）。指先の皮膚は0.2 mm 程の厚い表皮に覆われており、その下には触覚受容器様の小体（被包神経終末）と思われる構造物が観察できた。

図 2 マウス腹部の皮膚の二光子励起顕微鏡画像
CAG-eGFP マウスに Rhodamin-B デキストランを静脈注射後、腹部を脱毛し、麻酔下で腹部皮膚の深部観察を行った。図１の指先の画像とは異なり、腹部では皮膚真皮のコラーゲン線維網（白）が、第２高調波測定により詳細に観察できた。また、コラーゲン線維に密に包まれて点在する毛包受容器（緑）や血管の走行（赤）も詳細に観察できた。

図 3 皮膚の免疫染色画像
マウスの脚を脱毛処理した後、4 mm 角の皮膚を採取して凍結標本を作成した。免疫組織化
学により皮膚断面の構造を共焦点顕微鏡により観察した（青：核、緑：TRPV4 チャネル、赤：アクチン）。触覚受容体の１つである TRPV4 チャネルを染色したところ、表皮・毛包受容器もふくむ皮膚構造だけでなくチャンネル分布もイメージングが可能であった。毛根部位は細胞骨格のアクチンフィラメントを多く発現しており、Rhodamin-pholloidine 色素により観察可能であった。

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コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

質の分布をホールマウントでも切片でも高解像度での皮膚表面での画像化が可能であった。
また、我々は皮膚の機械的傷害を加え実時間で、皮膚反3. 手持ちサイズシステムによる生体皮膚観察について（方法・結果）応を観察し、炎症性の細胞浸潤を画像としてリアルタイム

若年群と加齢群の毛包間表皮を比較したところ、表皮生にとらえている（図 4）。化粧品や美容処置、薬剤投与によ体皮膚観察では、現在ダーマトスコープが頻用されている。

る反応観察にも活用可能と思われた。

しかし、イメージングへのニーズは幅広く十分なソリュー

本システムはきわめて量子効率の高い高感度検出器・フションとはいえない。ユーザー（美容医、皮膚科医、化粧ェムト秒レーザーを用いており、可視化に伴う生体への影品メーカー）の声をまとめていくと、おそらく響は最小限である。マウスにおいて安全性を担保すれば、小さいものから大きなものまで撮影したいヒトにも理論的には用いることができる。しかし、解像度高解像度撮影を簡単に手持ちで行いたいを維持するためにはある程度のサンプル側への制約がある。

フォーカシングや位置だしから解放されたいシステムのサイズやコストからもヒトへの応用にはやや遠手ぶれはいやだ

いと考えられた。なおかつ、極端に広い視野での画像取得調節ダイヤルをあつかいたくないは技術的に困難であり、体表面や皮膚病変全体の一度でのコストは最小限にスキャンは困難である。そこで、次項ではマクロ・ミクロの両極端での広いスケールを網羅しながらも、手持ちサイズで運用可能なシステム開発を目指した。

といったところと予測された。
ダーマトスコープを補完するためにズームタイプのシステムが考えられる。しかし、従来のズーム型の顕微鏡やマ

図 4 皮膚傷害後のリアルタイムイメージング
フレーム間隔は５分。実時間での細胞浸潤が二つの画像例からもよみとれる。より長期には、皮膚の線維化、創傷治癒、炎症反応のすべてを可視化可能とおもわれた。美容処置・化粧品や薬剤投与後のリアルタイムイメージングとしても活用可能である。

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生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立

クロズームレンズでは、ズーム両端（実質的な常用域）ではだけでなく、深部構造の情報まで得られており、顕微鏡結収差により解像度が低下し、像も明るくない。また、これ像の特性が生かされている。

らのカメラ部品は調節箇所が多く、不安定な皮膚を対象と4. 考察および総括

するとハンドリングがきわめて困難である。そこで、我々はあらたな光路設計、結像設計をデザインし、マクロミク

生体二光子顕微鏡観察がごく低侵襲な赤外レーザーでも可能ロを完全にオーバーラップした撮影を可能にした。リアルであることの実証が行われた。これは、美容処置・薬剤投与をタイムで高速で像モードを切り替え、フォーカス、ズーム、行った際の皮膚反応を実時間で観察できるということを意味し像モード転換を一度に行っている。ユーザーの操作部をほている。ヒトにおいても、無染色でも同様のイメージングは理ぼフリーにしているが、解像度やシステム重量とのトレー論的には可能である。残るは、長期的な安全性評価だが、理論ドオフを避け、実効的提案とした。

的には自然光とかわらない範囲と予測できる。化粧品をほどこ最小化した顕微鏡システムでの超高解像度と超広視野のした際に、どのように皮膚のミクロな変化がおきるのか、アレ両立例。生体観察をリアルタイムで行えるため、図５のよルギー反応はおきていないのか、といった評価が行われるため、うに皮膚観察が可能になった。マクロミクロの網羅、全焦開発研究にも用いられる。同時に、皮膚科診療にも大きなメリ点位置での撮影・無限大ズームファクターの恩恵に簡単にットが予測される。悪性腫瘍の鑑別だけでなく、乾癬をはじめあずかれるようになっている。一本一本の毛根、毛包構造、とする皮膚の機能的診断にも本システムは有用と考えられた。

そこにある細胞輪郭まで無染色で可視化されている。表面図 5 生体・ヒト皮膚観察のリアルタイムイメージング− 101 −