紫外線による Ret チロシンキナーゼ活性化のメカニズム
名古屋大学

医学部免疫

加

昌

藤

志

The cellular proto-oncogene c-RET encodes a receptor-tyrosine kinase. The catalytic activities of Ret kinases as the productsof oncogene RET with multiple endocrine neoplasia type 2A (Ret-MEN2A) or 2B (Ret-MEN2B) mutations and the hybrid genefrom c-RET and RFP (Rfp-Ret) were higher than those of c-Ret. Here we demonstrate that ultraviolet light (UV) irradiationinduced activation of c-Ret and superactivation of genetically activated Ret-MEN2A, Ret-MEN2B and Rfp-Ret. The UV-induced
activation and superactivation of Ret was closely associated with the redox reaction-mediated dimerization or polymerization of
the Ret proteins. UV also induced intracellular dimerization and activation of the extracellular domain-deleted mutant Ret (RetPTC-1). Overexpression of Cu/Zn superoxide dismutase in cells due to gene transfection prevented the promotion of UV-mediateddimerization and the superactivation of Ret-MEN2A kinase. These results suggest that the UV-induced intracellular oxidative
condition mediates dimerization and the activation of Ret kinases.

１

緒

２. １

言

Ret 変異体蛋白質を発現した細胞株の樹立

Figure １に示すように、c-RET（Figure 1 A）、RET-

皮膚の老化は、シワやシミ（肝斑）を誘導し、美容上のMEN 2 A（c-RET の 634 番目のシステインをアルギニンに大きな問題となる。紫外線は、酸化ストレスの一種１、２）で、変異；Figure 1 A）
、RET-MEN 2 B（c-RET の 918 番目の皮膚の老化を促進したり、悪性黒色腫などの皮膚癌を誘発

メチオニンをスレオニンに変異；Figure 1 A）および細胞する可能性が、古くより報告されている。近年、紫外線が外領域を欠損した RET-PTC- 1（Figure 1 B）
、RET-PTC-

細胞内シグナル伝達の初期段階であるチロシンキナーゼを

1 -C 365 A（RET-PTC- 1 の 365 番目のシステインをアラニ活性化することが、報告された 。Src などのチロシンキ

ンに変異；Figure 1 B）
、RET-PTC- 1 -C 376 A（RET-PTC- 1

ナーゼの活性化は、コラーゲン分解酵素の生成を誘導するの 376 番目のシステインをアラニンに変異；Figure 1 B）

ので、紫外線は、チロシンキナーゼを活性化を介しての遺伝子を NIH 3 T 3 細胞に導入し、これらの Ret 変異体

コラーゲン分解酵素の生成と活性化を誘導し、シワを誘導

蛋白質を発現した細胞株の樹立した。また、HA のタグを２）

３）する可能性がある。ゆえに、紫外線によるチロシンキナー
ゼの活性化のメカニズムを解明することは、紫外線によるシワの形成などを防ぐために有用であると考えられる。
c-RET は、レセプタータイプのチロシンキナーゼをコードしており、腎臓や腸管神経節の形成に不可欠な遺伝子である４- ６）。c-RET は、点変異やリアレンジメントを起こすことにより、ヒトの多発性内分泌腺腫 2 A 型（MEN 2 A）
や 2 B 型（MEN 2 B）および甲状腺癌（PTC）の発生に関与していると考えられている７- 12）。
本研究では、紫外線が Ret キナーゼを活性化するメ
カニズムを一部解明した。さらに、Cu/Zn superoxide
dismutase（SOD 1）が、紫外線による Ret チロシンキナーゼ活性化作用を抑制できることを示した。

２

実

験

Control of ultraviolet light-mediated Ret
tyrosine kinase activation
Masashi Kato
Department of Immunology, Nagoya
University School of Medicine

Figure 1. Schematic illustration of mutant RET cDNA constructs.
(A) RET cDNA encoding a long (1114 amino acids) isoform inwhich cysteine at codon 634 was replaced by arginine (C634R;
RET-MEN2A), or methionine at codon 918 by threonine (M918T;
RET-MEN2B). (B) Mutant RET cDNA encoding a long isoform inwhich the extracellular domain was deleted (RET-PTC-1). RETPTC-1 in which cysteine at codon 365 or 376 was replacedwith alanine (Ret-TPC-1-C365A, Ret-TPC-1-C376A). SS, signal
sequence; CAD, cadherin-like domain; CYS, cysteine-rich region;
TM, transmembrane domain; TK1, tyrosine kinase domain 1; TK2,
tyrosine kinase domain 2; aa, amino acids.
（参考文献 1 より引用）− 64 −

紫外線による Ret チロシンキナーゼ活性化のメカニズム

つけた Cu/Zn superoxide dismutase（HA-SOD 1）遺伝子

トアンプメーター（UVR- 3036 /S; Topcon Corporation,

を RET-MEN 2 A 遺伝子と同時に NIH 3 T 3 細胞に導入し、Tokyo, Japan）にて測定した。

Cu/Zn superoxide dismutase（SOD 1）と Ret-MEN 2 A の

３

蛋白質を両方発現した細胞株も作製した。

３. １
２. ２

結

果

Ret キナーゼは遺伝子レベルの変異により活性化される

ウエスタンブロット、免疫沈降、キナーゼアッセイFigure ２に示したように、Ret-MEN 2 A および Ret-

本研究で施行したウエスタンブロットについては、以前記載した方法に準じた。また、免疫沈降およびキナー

13）

MEN 2 B は、Figure １で示したような遺伝子レベルの変異により、c-Ret に比較して２倍から数倍活性化されていた。

ゼアッセイについても、同様に以前記載した方法に準じて施行した 14、15）。

３. ２

Ret キナーゼは紫外線により活性化される

２. ３

た（Figure 3 A-C）
。さらに興味深いことには、遺伝子レ

c-Ret は、紫外線 B 照射後５分後に、著明に活性化され紫外線照射細胞に対する紫外線の照射は、Dhanwada et al. の方法

ベルの変異によりすでに活性化されている Ret-MEN 2 Aに準じて施行された。紫外線 B の照射量はミクロボル

および Ret-MEN 2 B は、紫外線 B の照射によりさらに活16）

Figure 2. Comparison of kinase activity between c-Ret,
Ret-MEN2A, and Ret-MEN2B.
Lysates from NIH 3T3 cells transfected with cRET (lane 2 in A-C), RET-MEN2A (lane 3 in A-C)
or RET-MEN2B (lane 4 in A-C) and non-transfected
control NIH 3T3 cells (lane 1 in A-C) were immunoprecipitated with anti-Ret antibody. Then, those were
subjected either to Western blotting with anti-phosphotyrosine antibody (A) or anti-Ret antibody (B) or toin vitro kinase assay (C). SDS-PAGE was done in 5
% (A-B) or 13 % (C) polyacrylamide gel. pRet (doubletband): autophosphorylated c-Ret, Ret-MEN2A or RetMEN2B; pMBP: phosphorylated MBP. All measurements were repeated 4 times with basically the same
results. Representative results are provided.（参考文
献 1 より引用）

Figure 3. UV irradiation induces superactivation of mutant Ret.
Lysates from the NIH 3T3 cells transfected with c-RET (A-C), RETMEN2A (D-F) or RET-MEN2B (G-I) after sham or UV irradiation were
immunoprecipitated with anti-Ret antibody, and the resulting immunoprecipitates were subjected either to Western blotting with antiphosphotyrosine antibody (A, D, G) or anti-Ret antibody (B, E, H) or toin vitro kinase assay (C, F, I). SDS-PAGE was done in 5 % (A, B, D, E,
G, H) or 13 % (C, F, I) polyacrylamide gel. (A-I) lane 1: sham irradiation; lane 2: 5 min after 600 J/m2 of UVB irradiation. pRet (doubletband): autophosphorylated c-Ret (C), Ret-MEN2A (F) or Ret-MEN2B(I); pMBP: phosphorylated MBP. All measurements were repeated 3-4times with basically the same results. Representative results are provided. The exposure times to X-ray film for autoradiography for Figure
A, D and G, and for Figure C, F and I were adjusted to develop bands
with comparable density for lane 1 as sham irradiated control; see
Figure 2 for comparison of the density of bands among c-Ret, RetMEN2A and Ret-MEN2B which were developed by the same exposure time.（参考文献 1 より引用）− 65 −

性化された。我々は、この反応を紫外線によるスーパーア

３. ４

紫外線は Ret 分子の二量体形成を促進させ、Ret キナーゼを活性化させる

クティベーションと呼んだ。

Figure ５および Figure ６に示したように、紫外線 B は、

３. ３

Ret キナーゼの下流に位置するシグナル伝達

c-Ret、Ret-MEN 2 A、Ret-MEN 2 B 分子の SS 結合を介し分子も紫外線により活性化されるた二量体形成の促進し、それらのキナーゼを活性を亢進さ

Figure 4 A-H に示したように、Ret-MEN 2 A の下流に位せた。

置するシグナル伝達分子である ERK、JNK、p 38、cJun は、
c-Ret のそれらに比較して活性化されていた。紫外線 B の

３. ５

Ret 分子の細胞内領域は、紫外線のターゲッ

照射は Ret-MEN 2 A の下流に位置するシグナル伝達分子

トになるを、さらに活性化（スーパーアクティベーション）させた

Figure ７に示したように、紫外線 B は細胞外領域を欠（Figure 4 I-L）。

落した Ret-PTC- 1 の SS 結合を介した二量体形成の促進し、

Figure 4 UV irradiation promotes phosphorylation of MAPK family
and c-Jun.
Lysates from the NIH 3T3 cells transfected with c-RET (lane 2 inA-H) or RET-MEN2A (lane 3 in A-H, lane 4 and 5 in I-L) and nontransfected control NIH 3T3 cells (lane 1 in A-H) without stimulation (lane 1-3 in A-H, lane 4 in I-L) or 10 min after 600 J/m2 of
UVB irradiation (lane 5 in I-L) were subjected to Western blottingwith anti-ERK (A), anti-phospho-ERK (E, I), anti-JNK (B), anti-phospho-JNK (F, J), anti-p38 (C), anti-phospho-p38 (G, K), anti-c-Jun(D) and anti-phospho-c-Jun (H, L) antibodies. SDS-PAGE was donein 10 % polyacrylamide gel (A-L). All measurements were repeated
3 times with basically the same results. Representative results areprovided.（参考文献 1 より引用）− 66 −

Figure 5 UV promotes dimerization of c-Ret.
Lysates from NIH 3T3 cells transfected with cRET after sham or UV irradiation were subjected toWestern blotting with anti-Ret antibody (A, B) or toin vitro kinase assay (C-E) after immunoprecipitation
with anti-Ret antibody. SDS-PAGE was done under
reducing (A, C, E) or unreducing (B, D) conditionsin 5 % (A-D) or 13 % (E) polyacrylamide gel. (A-D)
lane 1: sham irradiation; lane 2: 5 min after 600 J/
m2 of UVB irradiation. (E) Ret proteins were immunoprecipitated from the lysate of the transfectants
that had received 600 J/m2 of UVB irradiation 5
min before. The immunoprecipitated Ret proteins
were untreated (lane 1) or treated with 5% 2ME for
30 min (lane 2), followed by 5 times washing forremoving 2ME, and then subjected to in vitro kinase
assay. pRet (doublet band): autophosphorylated cRet; pMBP: phosphorylated MBP; M: monomer Ret;
D: dimer Ret. All measurements were repeated 3
times with basically the same results. Representative results are provided.（参考文献 1 より引用）

紫外線による Ret チロシンキナーゼ活性化のメカニズム

キナーゼ活性を亢進させた。これは、Ret 分子の細胞内領亢進を抑制できた。

域が、紫外線の標的になることを示している。

３. ６

４

Ret-PTC-1 分子の 376 番目のシステインは、

考察

本研究では、試験管内において紫外線が c-Ret のみでな

紫外線のターゲットになる

くすでに遺伝子の変異により活性化されている MEN 2 A

Figure ８ に 示 し た よ う に、 紫 外 線 B は Ret-PTC- 1 -型 Ret（Ret-MEN 2 A）や MEN 2 B 型 Ret（Ret-MEN 2 B）

C 365 A の SS 結合を介した二量体形成の促進し、そのキを活性化する（スーパーアクティベーション）ことを示

ナーゼ活性を亢進させた。しかし、紫外線 B 照射によりした１）。さらに、紫外線が、Ret 分子の SS 結合を介した

Ret-PTC- 1 -C 376 A の二量体形成とキナーゼ活性の亢進は二量体形成を促進し、その活性を増強することを示すととおこらなかった。これらの結果は、Ret-PTC- 1 分子の 376

もに、紫外線の標的となるアミノ酸を一つ特定した。また、番目のシステインが、紫外線の標的であることを示していSOD 1 を用いて、これらの紫外線の作用を緩和することにる。

成功した。これらの結果は、皮膚の老化や悪性黒色腫などの皮膚癌を誘発する紫外線に対する防護対策をこうじるた

３. ７ SOD1 は、紫外線を介する Ret のスーパーア

めの基礎データとして、有益であると考えられる。

クティベーションを抑制できる

一方、我々は Metallothionein-I（MT）をプロモーター

Figure ９に示したように、Ret-MEN 2 A と SOD 1 を同時に導入することにより紫外線 B 照射による SS 結合を介した Ret 分子の二量体形成を阻害し、そのキナーゼ活性のFigure 6. UV promotes dimerization of Ret-MEN2A and RetMEN2B.
Lysates from NIH 3T3 cells transfected with RET-MEN2A (AE) or RET-MEN2B (F-I) after sham or UV irradiation were subjected either to Western blotting with anti-Ret antibody (A, B, F,G) or to in vitro kinase assay (C, D, E, H, I) after immunoprecipitation with anti-Ret antibody. SDS-PAGE was done under
reducing (A, C, E, F, H) or unreducing (B, D, G, I) conditionsin 5 % polyacrylamide gel. (E) The dimerized bands in D were
cut out from the gel and separated under reducing condition.
(A-I) lane 1: sham irradiation; lane 2: 5 min after 600 J/m2
of UVB irradiation. M: monomer Ret; D: dimer Ret. For directcomparison of kinase activity between Ret-MEN2A and RetMEN2B, see Figure 2. All measurements were repeated 3
times with basically the same results. Representative results
are provided.（参考文献 1 より引用）

Figure 7. UV promotes activation and dimerization of extracellular domain-deleted Ret.
Lysates from NIH 3T3 cells transfected with RET-PTC-1 after
sham or UV irradiation were analyzed either by Western blotting with anti-Ret antibody (B, C) or in vitro kinase assay after
immunoprecipitation with anti-Ret antibody (A, D, E). SDSPAGE was done under reducing (A, B, D) or unreducing (C, E)
conditions in 7 % (B-E) or 13 % (A) polyacrylamide gel. (A-E)
lane 1: sham irradiation; lane 2: 5 min after 600 J/m2 of UVB
irradiation. M: monomer Ret; D: dimer Ret. All measurements
were repeated 3 times with basically the same results. Representative results are provided.（参考文献 1 より引用）− 67 −

. エンハンサーに用い、癌遺伝子 ret を導入することによ（参考文献）り、メラノサイト系良性腫瘍を必発するが、悪性転化しな

１．Kato, M., Iwashita, T., Takeda, K., Akhand, A.A.,

い MT/ret トランスジェニックマウス 192 系を樹立した

Liu, W., Yoshihara, M., Asai, N., Suzuki, H., Takahashi,

17）。さらに、このトランスジェニックマウスに発症したメM . a n d N a k a s h i m a , I . ( 2000 ) . U l t r a v i o l e t l i g h t

ラノサイト系良性腫瘍に対する紫外線照射が、腫瘍細胞にinduces redox reaction-mediated dimerization and

おける Ret キナーゼの活性の増強を伴い、悪性黒色腫へのsuperactivation of oncogenic Ret tyrosine kinases. Mol.

転化を誘導することことを見出した（Kato et al., 投稿中）。

Biol. Cell 11 , 93 - 101 .

これは、紫外線による Ret キナーゼのスーパーアクティベ

２．Devary, Y., Gottlieb, R.A., Smeal, T., Karin, M. ( 1992 ).

ーションの生物学的意義を示していると考えられる。

The mammalian ultraviolet response is triggered by
activation of Src tyrosine kinases. Cell 71 , 1081 - 1091 .

Figure 8. UV does not promote activation and dimerization of
extracellular domain-deleted Ret whose cysteine 376 was
replaced with alanine.
Lysates from NIH 3T3 cells transfected with original RETTPC-1 (lane 4 in D and E), RET-TPC-1-C365A (A, lane 1
in C, lane 1-3 in D) and RET-TPC-1-C376A (B, lane 2 in C,
lane 1-3 in E) after sham or UV irradiation were analyzed
either by in vitro kinase assay after immunoprecipitation
with anti-Ret antibody (A, B) or by Western blotting with
anti-Ret antibody (C-E). SDS-PAGE was done under reducing (A-C) or unreducing (D-E) conditions in 8 % (C-E) or 13% (A, B) polyacrylamide gel. (A, B) lane 1: sham irradiation;lanes 2-4: 5 min (lane 2), 10 min (lane 3) and 15 min (lane4) after 600 J/m2 of UVB irradiation. (D, E) lane 1 and
4: sham irradiation; lanes 2-3: 5 min (lane 2) and 15 min(lane 3) after 600 J/m2 of UVB. pRet: autophosphorylated
Ret-TPC-1-C365A (A) or Ret-TPC-1-C376A (B); pMBP:
phosphorylated MBP. M: monomer Ret; D: dimer Ret. All
measurements were repeated 3 times with basically thesame results. Representative results are provided.（参考文
献 1 より引用）

Figure 9. Over-expression of SOD1 in cells prevents UVmediated superactivation of Ret.
Lysates from the HA-SOD1- (C, lane 1 in A and B) or HASOD1+ (D, E, lane 2 in A and B) NIH 3T3 cells transfected with Ret-MEN2A were analyzed either by Western
blotting with anti-HA (A) or anti-Ret antibody (B, E), or byin vitro kinase assay (C, D) after immunoprecipitation with
anti-Ret antibody. SDS-PAGE was done under reducing (AD) or unreducing (E) conditions in 5 % (E), 10% (A, B) or
13 % (C, D) polyacrylamide gel. (C-E) lane 1: sham irradiation; lanes 2-4: 5 min (lane 2), 10 min (lane 3) and15 min(lane 4) after 600 J/m2 of UVB irradiation. pRet (doublet− 68 −band): autophosphorylated Ret-MEN2A with (C) or without(D) SOD1; pMBP: phosphorylated MBP; M: monomer Ret; D:
dimer Ret. All measurements were repeated 3 times withbasically the same results. Representative results are provided.（参考文献 1 より引用）

紫外線による Ret チロシンキナーゼ活性化のメカニズム

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− 69 −