微生物に由来する多糖分解酵索のコスメトロジ ー ヘの応用
東京工業大学中村

生命理工学部聡(3-1,4-Xylans, major components of plant hemicelluloses, are heterogeneous polysaccharides
that have a backbone of (3-1,4-linked xylopyranose units. Xylanases (1,4-(3-D-xylan xylano­hydrolase; EC3.2.l.8) catalyze the hydrolysis of xylan to xylooligosaccharides and xylose.
Recently, we have isolated alkaliphilic Bacillus sp. strain 41M-l from soil. Strain 41M-l secreted
multiple xylanases and one major form of them, termed xylanase J. had an alkaline pH optimum.
In this study, we describe cloning, sequencing and specific mutagenesis of the gene encoding
xylanase J from strain 41M-1
A genomic library of strain 41M-l was screened for xylanase activity to obtain a 2.2-kb Eco
RI-Sph I fragment containing the xylanase J gene. Then, the nucleotide sequence of the 2.2-kb
fragment was determined. The putative xylanase J gene contained an open reading frame of 1,062
bp and encoded a 27-aa leader peptide followed by a 327-aa mature enzyme. The promoter-likesequence and typical Shine-Dalgarno sequence were observed upstream from the possible TTG
start codon. A perfect 14-bp inverted repeat, corresponding to a transcriptional terminator,
occurred downstream from the TAG stop codon
The xylanase J gene was expressed in Escheガchia coli. More than 90% of xylanase activity
was located in the periplasmic space. Characteristics of the E. coli-produced xylanase J were quite
equal to those of the enzyme from strain 41M-1.The deduced amino acid sequence of xylanase
J was compared with the sequences of other bacterial xylanases. The potential catalytic domainof xylanase J was located at the N-terminus and had strong similarity to family G xylanases,suggesting that the enzyme also belonged to the family G hydrolases. A linker sequence rich in
Ser, Thr and Pro occurred between the catalytic domain and an additional domain at the C­
terminus. This (-terminal domain of unknown function showed no significant similarity to any
other proteins.
Two Glu residues, previously identified as essential for catalytic activity in the family G
xylanase from Bacillus purnilus, are conserved in xylanase J at positions 93 and 183. These two
Glu residues were targeted for mutational analysis. Substitution of Glu-93 or Glu-183 by Gln(mutants E93Q and El83Q, respectively) drastically reduced xylanase activity. The carboxylic
residues of these two Glu would probably act by general acid catalysis as has been shown forother hydrolytic enzymes such as lysozyme. The enzyme activity of xylanase J was inhibited by
N-bromosuccinimide, suggesting that Trp and/or Tyr was involved in catalysis. Some of Trp
and Tyr in xylanase J were replaced by Phe. The large decrease in activity were observed withthe mutant enzymes Wl8F, W86F, Y84F and Y95F. These results suggest that Trp-18, Trp-86,
Tyr-84 and Tyr-95 play important roles in binding of the substrate.

1る 1) 。 これらの極限微生物が生産する酵素は極限

言

q

緒

条件においても機能するものが多く、 その応用性

通常の生物が生育できないような極限環境に棲ーー

息する微生物（極限微生物）の存在が知られていに着目した研究が広く行われてきた。 しかしながら、 極限微生物由来の酵素がどのようにして極限

c
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-•

y
゜
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ー

く残されている。 わずかに好熱性微生物に由来す
る酵素について、 その耐熱性機構の解明をめざした研究が進められているものの、 例えば好アルカ

•
-

y
g

に関する研究は、 ほとんど行われていないのが現n

リ性微生物由来の酵素のアルカリ性への適応機構

゜
゜

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環境に適応しているかについては、 不明な点が多

状である。

-109-

/3-1,4 ー キシランは陸上植物の細胞壁中に多くを検討した。 その結果、キシラナ ー ゼJはpH9. 0の含まれる多糖であり、D ーキシロ ー スが/3-1,4結合を介し て連な った主構造をとる。キシラン のアルカリ性領域に反応の至適を有する新規な酵素であることが明らかとなった(Table. 1) i;, 7> o

/3-1.4結合を加水分解 する酵素がキシラナ ー セ

本研究では、アルカリ性条件下で高活性を示す(1, 4-/3-D-xylan xylanohydrolase; EC3. 2. l. 8)

ことからキンロオリゴ糖生韮用の酵素としての 利である。近年、綿実穀・トウモロコシなどから抽用が期待されるキシラナ ー ゼ J を例にとり、 その出した多糖類をキシラナ ー ゼ処理して生産したキ触媒機構や好アルカリ性機構を分子レベルで解明

ンロオリゴ糖が、皮膚保湿成分として化粧品に配することを目的とした。すなわち、 キンラナ ー セ

合され、市販されるに至っている。 一般に、キンJ をコ ー トする遺伝子のクロ ー ニングと大/J尉菌にランなどの多糖類はアルカリ性で水に溶けやすくおける発現を行 った。さらに、他酵素とのアミノなることから、植物多糖の分解によるキシロオリ

酸配列比較による機能領域の推定を行い、 タンパ

ゴ糖生産を目的とした場合、アルカリ性条件下でク質工学による活性アミノ醗残基の特定を試み

高活性を有するキシラナーゼが有利であることはた。

論を待た ない。

2

キシラナ ー ゼは、多くの細菌や糸状菌などに実験よって生産される 2 . 3) 。現在までに報告されている微生物由来のキシラナ ー ゼのほとんどは、反応2. 1

菌株 、 プラスミドおよび培地の至適pHを酪性から中性領域に有するものであっ好アルカリ性バシラス属細菌41M-l株 5) はキシた。一 方、好アルカリ性微生物や耐アルカリ性微ラナ ー ゼ生産 菌 で あ る。 宿主と し て は 大 腸菌

生 物 の生産するキシラナ ー ゼも報告されてい

HBlOl株（クロ ー ニング）、MV1184株（逍伝子発る 4) 。 これらのキシラナ ー ゼの中には広い作用

現）、CJ236株およぴBMH71-18mutS株（部位特異pH範囲をもつものもあるが、アルカリ性側に反応的変異）を使用した。大腸菌用ベクタ ー にはプラの至適を有する酵素はこれまで知られていなかっスミドpUC119を用いた。
41M-l株の培養にはアルカリ1生天然培地

た。以前我々は、キシラナ ー ゼ生産菌である好ア
ルカリ性バシラス属細菌41M-I株の分離に成功している

5)。41M-1 株が生産するキシラナ ー ゼの1つ、キンラナ ー

ゼ J の精製を行い、 その諸性質

そして大腸菌の培養にはL培地

8)

5)

を、

を用いた。必要に応じ、キシランやアンピシリンを添加して使用した。

Table. 1

Properties of xylanase J

Molecular mass

36.0 kDapl
Optimum pH

pH 5.3Sambrookら 8) のマニュアルに従って実施した。 部pH 9.0 (at 37 °C)

位特異的変異はKunkel法 9) で行った。

Optimum temperatureso•c (at pH 9.0)

Temperature stability:555°C (at pH 9.0)

Inhibited by

HgCIふ
N-bromosuccinimide

Main products

2:X2

Km value

3.3 mg/ml

Vmax value

1,100µmol/min ・mg

2. 2

クロ ー ニング技術

遺伝子クロ ー ニンクおよび塩基配 列決定は

2. 3

キシラナ ー ゼ活性の評価

大腸菌の培養物を菌体外・ペリプラズム ・ 菌体
内画分に分画 Ill ) した。 各画分に含まれるキンラ
ナ ー ゼの活性測定は、既報 5) に従って実施した。
反応はpH9. 0、37℃で10分間行い、基質キシランの濃度は1 . 2%とした。

-110-

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

各種変異型キシラナ ー ゼJの活性評価には、ペーゼ J 遺伝子の5'上流域に部位特異的変異で塩基

リプラズム画分を用いた。 各ペリプラズム標品に置換を導入した実験から、 その妥当性が確認され含まれる野生型あるいは変異型酵素の定量は、野ている（デ ー タ示さず）。ORFの上流には、細菌に生型キシラナ ー ゼJに対するウサギ抗血清を用いおいて機能しうるプロモ ー タ ー 様配列 (-35領域

た抗原ELISA法にて行った。 活性測定とELISA法におよび ー 10領域） およびShine-Dalgarno配列が認

よるタンパク質定抵の結果から、 比活性を算出しめられた。 そして終止コドンTAGの49塩基下流にた。

は、 タ ー ミネ ー タ ー として機能しうる逆向き反復配列(14塩基x2)が見出された。
3

結果と考察

キンラナ ー ゼJタンパク質のアミノ末端(N末端）
アミノ酸配列 ” との比較により、成熟型酵素はア

3. 1

キシラナ

ー

ゼJ遺伝子のクロー

ニング

ラニンから始まる327アミノ酸から構成されるこ

好アルカリ性バンラス属細菌41M-1株の染色体
DNAライプラリーとかわかった。 成熟型酵素の上流に存在する27アを作製した。 キシランを含む寒ミノ酸は、分泌に関与するシグナルペプチドと考

ー

えられた。

天培地上でのハロの形成を指標として、キシラ

ナ ー セ J 遺伝子を含む陽性クロ ー ンを選抜した。
サプクロ ー ン解析の結果、キシラナ ー ゼJ遺伝子

3. 2

は約2. 2kbのEco Rl-Sph I断片中にコ ー トされてキシラナ ー ゼJ遺伝子の大腸菌における発現いることがわかった。 このキシラナ ー ゼJ遺伝子

プラスミドpAXJ3Rを有する大腸菌 の培挫を行

断片を含む組換えプラスミドpAXJ3Rの制限酵素地い、菌体外• ペリプラズム・菌体内画分に分画し図をFig. 1に示す。

た後、各画分に含まれるキシラナ ー ゼ活性を調べた。 その結果、 41M-l株由来のプロモ ー タ ー の働

0::00
LIJ

'""'

せ
ー
:c

.Q
..
><

きでキシラナ ー ゼJ遺伝子の大腸菌における発現

｀•

一0

g>c;

(I)

..

［

j

が起こり、90. 3%の活性がペリプラズム画分に局-翌工- ..C:(/)Q.

在することがわかった(Table. 2)。 ペリプラズム
画分に含まれるキシラナ ー ゼを精製し、 その性質を調べたところ、大腸菌が産生した組換え型キシラナ ー セ J も41M-l株由来の酵素と同様な性質を有Xylanase J

していた（デ ー タ示さず）。組換え型キシラナ ー
ゼJのN末端 アミノ酸配列 も41M-l株由来の酵素と

1 kb

Fig.1 Restriction map of the plasmid pAXJ3R.
The double I ine represents the chro­mosomal DN>A fragment from strain 41M1. The arrow shows the position of thexylanase J gene.

同一であり、キシラナ ー ゼ J のシグナルペプチドがペリプラズムヘの分泌に際して機能したものと考えられた。
3. 3

キシラナ ー ゼJおよび他酵素のアミノ酸配列
比較

キシラナ ー ゼJ遺伝子を含むDNA断片 の塩基配列を決定したところ、1. 062塩基からなる、354アミ

遺伝子配列より類推されるキシラナ ー ゼ J のノ酸をコ ー ドするオ ープンリ ー ディングフレ ー ム

アミノ酸配列を、 他のキシラナ ー ゼのものと比較(ORF)が見出された(Fig. 2)。 このORFは翻訳開した。 その結果、キシラナ ー ゼJ のN末端側2/3の始コドンとして TTGを使用 しているが、キシラナ

領域は、JJacilillspllmilllsに由来するキシラナ ー-111-•. -―••ATCTATACTTGTTAAAGTGATATTGGGAAAAGAGTTTGATAACATTTAAATGTAAGCGTTTACAAATATTGACTAAAGGAGGTATTCTAG
-35
-10

--

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I R.... ....

ATGGAAAAAATTCCATTTCACCTTATCTATTTTTCTAGGTTGTACTGTTAAAGCAGTAGAATCAACTGTTTGTCTTCGTTTTTAATTTAA

Fig. 2

Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence for the xylanase
J gene. The location of the possible promoter (-35 and -10 sites)
and Shine-Dalgarno sequences are shown overlined. A terminator-like,inverted repeat sequence is indicated by arrows facing each other.
The boxed region denotes the N-ter minal amino acid sequence as
determined from xylanase J from strain 41M-1.

ゼ11) と71%の相同性を有していることが明らか

N末端側のファミリ ー G触媒ドメインのさらにカcc末端）側には、約 100残基からとなった。 セルラ ー ゼおよびキシラナ ー ゼは、そルボキシル末端の触媒ドメインのアミノ酸配列 に基づき、11のなるポリペプチド鎖が結合している。 このC末端ファミリーに分類されている 1 2) 。 現在までに全側 1/3 に相当する領域について相同性検索を行っ塩基配列が決定されているキシラナ ー ゼは、すべてファミリ

ー FまたはGに分類されている。

”四!usキシラナー

ゼはファミリー

上述のGに属するこたところ、既知タンパク質との間にアミノ産配列の相同性は認められず、その機能は不明であった。

ゼJのN末端側のキシラナ ー ゼ J の N末端側の触媒ドメインとC末

2/3は他のファミリ ー Gキシラナ ー ゼとも36-69%

端側の機能未知領域との間には、セリン ・ スレオの高い相同性を示したことより (Fig. 3) 、本酵素

ニン ・ プロリンに富む領域が認められた。 この領もファミリ

域は、 ドメイン間に存在し、連結機能を果たすリとが知られている。 キシラナ

ーー

Gに属するものと考えられた。

-112-

微生物に由来する多糖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

ンカ ー 配列と考えられた。 以上の解析結果に基づTable.3

Spec1f1c act1v1ty ofくキシラナ ー ゼJのドメイン構成をFig. 4に示した，
3.4

EnzymeActivity

ProteinSpecific activity(U/ml・culture ) (mg/ml-culture)

触媒活性に関与するアミノ酸残基の特定キンラナ ー ゼJの触媒活性に関与するアミノ酸残基を特定する目的て、 その触媒ドメインにアミ

Table.2xylanasemutants(U/mg)

Wild type

4.3

0.033

E93Q

0.20

0.10

20

E1830

<0.001

0.069<0.014

W18F

1.4

0.072

20

W86F

0.98

0.030

32

130

Subcellular distribution of

W100ド

5.6

0.039

140

xylanase activity in E.coli

W103F

2.1

0.013

160

carrying pAXJ3R

W144F

5.2

0.030

170

W165F

7.6

0 081

94

YBOF

8.9

0.066

140

Y84F

0.005

0.048

0.11

Y95F

0.006

0.048

0.13

Activity (U/ml-culture) [%]Fraction
Extracellular

0.495

(9.1)

Periplasmic

4.90(90.3)

Y121F

0.95

0.0051190

Cytoplasmic

0.0300

[0.6)

Y185F

4.4

0 017

260

1
91

* *

*

＊

＊

＊＊

AITSNEIGTHDGYDYEFWKDSGGSGSMTLNSGGTFSAQWSNVNNILFRKGKKFDETQTHQQIGNMSINYGATYNPNGNSYLTVYGWTVDP* * ***

*

*

**

**

* *

* * *** *** ** ***

* **

**

*

*

L癖YIVDSWGTWRPPGGTPKGTINVDGGTYQIYETTRYNQPSIKGTATFQQYWSVRTSKRTSGTISVSEHFRAWESLGMNMGNMYEVAL
＊

90
180

＊＊＊

181噸YQSSGSANVYSNTLTIGGQSGGEQATRVEAESMTKGGPYTSNITSPFNGVALYANGDNVSFNHSFTKANSSFSLRGASNNSNMARV

270

271

327

DLRIGGQNRGTFYFGDQYPAVYTINNINHGIGNQLVELIVTADDGTWDAYLDYLEIRFig. 3

Amino acid sequence of xylanase J. Amino acids
least

70% of known

Putativefamilythat are conserved at

G xylanase sequences are shown by asterisks.

catalytic residues are boxed.

、

Family G catalytic domain

比N 璽・ 冒瓢疇瓢鬱冨響瓢讐鬱麟纏喜聾雪鋼麟夏..
Linker sequence

Fig.4

、

Functionally-unknown region

Structural feature of-113--

xylanase J.

f-COOH、:////////」 こ://////
o·

RO

ニニ

o

J>

:

HO

OH

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OR

裕

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O

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RO

二；

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:

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Fig.5

Putative reaction mechanism of xylanase J.

-114-

微生物に由来する多祖分解酵素のコスメトロジ ー ヘの応用

ノ酸置換を施した変異型酵素を調製し、野生型酵

ことから(Table. 3)、本酵素においてもGlu93お素との活性比較を行った。 本酵素と相同性の高いよびGlal83が触媒残基として機能していると考え

B. p11mi!11sキシラナ ー ゼにおいては、触媒活性にられた 1 4) 。 細菌細胞壁分解酵素のリゾチ ー ムに関与する2つのグルタミン酸残基が既に同定されている I 3) 。 これらのグルタミン酸残基は他のすペてのファミリ ー Gキシラナ ー ゼにおいても保存

カルボキンル基が関与する触媒機構が明らかにされてい る 15> 0 ll. pumilusキシラナ ー ゼについてもされており、 キシラナ ー ゼJにおいてはGlu93およ

リゾチ ー ムになぞらえた触媒機構が提唱されておぴGlul83が対応している。 これら2つのグルタミ

り、 キシラナ ー ゼJにおいても同様な触媒機構かン酸のクルタミンヘの置換（それぞれ、変異体考えられた(Fig. 5)。

E93QおよびEl83Q)により活性は大きく低下した

F r g. 6

関しては既に詳細な研究がなされており、2つの冒

Tert I ar y str u c t u re of 8. pu1111 /us xylanase. E93, E183, W18, W86, Y84 andY95 indicate the corresponding position of Glu-93, Glu-183, Trp-18,
Trp-86, Tyr-84 and Tyr-95 in xylanase J, respectively.

-ll5-

キシラナ ー ゼJの活性はN-プロモコハク酸イミ

べると共に、C末端側領域の機能解析を行い、本ドによる阻害を受け、トリプトUファンやチロシン酵素の触媒機構と好アルカリ1生機構を解明していなどのアミノ酸残基の活性への関与が示唆されてきたい。

。 そこで、 本酵素の触媒ドメイン中に存在

最近我々が分離した好熱好アルカリ1生バシラス

するトリプトファン ・ チロシンのうち、11カ所に属細菌'「AR-1株は、pH9. 0というアルカリ性条件にいた

7)

アミノ酸置換（フェニルアラニンヘ置換）を施しおいて70℃に反応の至適を有する好熱性アルカリた。 その結果、Trpl8, Trp86, Tyr84およびTyr95

キシラナ ー ゼを生産する I 9-2 I) 。 本研究で実施しの活性へ関与への関与が示唆された(Table. 3)

たようなタンパク質工学的検討を、自然界からの。 キンラナ ー ゼ活性に関与するトリプトファ

スクリ ー ニングと併用することによって、より高ン残基はこれまで特定されておらず、本研究か初温•高アルカリ性条件下で機能するようなキシラ

めての例である。

ナ ー セの取得が可能になるものと確信している。

1 4)

最近になって、B. pum1加sキシラナ ー セの立体
構造がX線結晶構造解析により明らかにされている 1 6) 。それによれば、触媒残基である2つのグルタミン酸は、2枚のBシ ー トに挟まれたクレフトの内部に位置している。本研究で活性への関与が示唆されたトリプトファンおよびチロシンの位置

引用文献
1)

講談社サイエンティフィク，東京，1988.
2)

nisrns: functi ons and a p p lica tions,てみると、全ての残基がクレフトの中央部、触媒いることがわかった(Fig. 6)。 セルラ ー ゼやキシ

ヽ'crobiol. J?ev., 52 305-317 1988

3)

8 353-368.
Torld /.)!fcrobio/、 Biotec加ol.,鎖を有するアミノ酸残基の関与が報じられている>。本研究で活性への関与が明らかとなった

トリプトファンやチロシンも、基質キシランの認

1992
4)

をクロ

ー

ゼJをコ

Nakamura S, Wakabayashi K, Nakai R,
etal. : Production of alkaline xylanase

総括と展望

本研究ではキシラナ

聡：キンラナ ー セ， 掘越弘毅，秋葉眺

タ ー ，東京，1993, 216-213頁
5)

ー

中村

彦揖：好アルカリ性微生物，学会出版セン

識と結合に関与している可能性が示唆された。

4

Bastawde KB: Xylan structure, microbial
xylanases, and their mode of action,

ラナ ー ゼによる基質の認識に際しては、芳香族側I 7. I 8Wong KKY,Tan LUL,Sadller JN : Multipl1 一
city of (3-1, 4-xylanase in rnicroorga­

をB. pumilusキシラナ ー ゼの立体構造にあてはめ残基であるGlu93およびGlul83の近傍に位置して

掘越弘毅：極限微生物：新しい遺伝子資源，、by a newly isolated alkaliphi 1 ic Baciilllsー

sp. strain 41M-l, Torld /. J; 'crobiol. Bio-

ドする遺伝子te幼'llO/., 9 221-224 1993

ニングし、その機能領域の推定を行った。さらに、タンパク質工学的検討を通じて、本

6)

Nakamura S, 胃akabayashi K, Horikoshi K,

酵素の触媒活性に関与するアミノ酸残基を明らか

eta!.: Alkaline xylanase Produced byにすることができた。しかしながら、本酵素の触newly isolated alkaliphilic品ciilllssp.,媒機構が完全に解明されたわけではなく、C末端

In:Visser J,Beldrnan G, Kustervan Sorneren

側に存在するポリペプチド領域の機能も依然としMA,て不明である。今後は、触媒ドメインにアミノ酸

Elsevier Science, Amsterdam, 1992 443-446

罹換を導入した各種変異型酵素の性質を詳細に調

7)

-116-

etal. (eds) : Xylans and xylanases,

Nakamura S, Wakabayashi K, Nakai R, ct al.

限任'fJ}に出木―9 r., 多誼ク序野索V.J -1人メr uソ ー ヘv� 応/tl

:Purification and some properties of an15) Kirby AJ:Mechanis111 and stereoelectronic

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