構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換
名古屋大学大学院創薬科学研究科構造分子薬理学分野

廣明

秀一

Tight junction (TJ) is an inter-cellular adhesion machinery that is maintained by epithelial cells in a dynamic equilibrium
between biogenesis and degradation. Biogenesis of TJ is mainly proceeded by ZO- 1 (and its paralogs ZO- 2 / 3 ), whereas
TJ degradation is promoted by LNX 1 . In detail, two PDZ domains in ZO- 1 and LNX 1 are competing each other amongmolecular interaction against claudins’ C-termini. Inhibition of either ZO- 1 or LNX 1 interaction to claudin may result in
TJ-opening or TJ-closure, respectively. In this study, we screened compounds from natural products that binds ZO 1 -PDZ 1 .
We found glycyrrhizin binds ZO 1 -PDZ 1 with a reasonable affinity, while baicalin, baicalein, hesperetin and naringenin
exhibited weak affinity against ZO 1 -PDZ 1 . Among these four flavonoids, baicalin and baicalein showed significant
reduction CLD- 2 from the intercellular membrane between two adjacent cells. Naringenin exhibited a marked increase in
CLD- 2 density between two adjacent cells. Baicalin and baicalein are candidates for drug absorption enhancers, whereas
naringenin is a promising candidate for TJ barrier enhancer.

1. 緒

れる PDZ ドメインと CLD の C 末端の相互作用によりスイ言ッチされているという点である（図 1 C）。

タイトジャンクション（TJ）は、上皮細胞の細胞間の頂

筆者らのグループでは、2009 年より、コスメトロジー

端部に形成される強固な細胞間接着装置である。TJ の機研究振興財団の支援のもと、TJ 抑制因子である LNX 1

能は臓器の種類により異なる。例えば水やイオン分子以の PDZ ドメインの構造決定に成功した（論文投稿準備中）。

外の物質を透過させない強固なバリアとして機能する一方

他方、TJ 形成促進因子 ZO‒ 1 の PDZ ドメインについてもで、特定のイオンの再吸収のみを促す選択的細胞間チャネ

NMR 解析を進め 2）、その PDZ ドメインにホスファチジ

ルとして機能するなど、多彩な機能を担う。その主要成分

ルイノシトールリン酸が結合し、CLD 結合と拮抗する作は生体内にヒトゲノム中に 27 種類あると考えられている用を持っていることを明らかにした 3）。更に上記 PDZ ド

4 回膜貫通タンパク質クローディン（CLD）と、同じく 4 回

メインの構造情報をインシリコ創薬手法に活用し、新規

膜貫通タンパク質であるものの機能が未知のオクルーディの非ペプチド性 LNX 1 阻害薬、NPL‒ 1010、NPL‒ 1011、ン、その裏打ちタンパク質で分子内に PDZ ドメインを 3

NPL‒ 3009 の化合物を同定した 4）。これら阻害剤はモデル個有する ZO‒ 1 / 2 / 3 などである（図 1 A）
。TJ は、皮膚に上皮細胞で TJ 形成を増強した。また化合物探索の過程で、おいては表皮・顆粒細胞層において皮膚バリア機能を担っ類似骨格を有する類縁化合物から、TJ 形成促進因子であている。これまで TJ は、その生化学的実験における難溶

る ZO 1 ‒PDZ 1 に結合し、TJ を減弱させバリアを緩和する性と電子顕微鏡により観察された強固な構造から、TJ は化合物も発見することができた 5）。

生理的に「安定」な構造体であると信じられてきた。2007

しかし、筆者らが発見した「第一世代 TJ 制御低分子」は年に生理研（岡崎）の古瀬らは、CLD を特異的にユビキチ

いずれも合成低分子であり、ヒト皮膚などに対する刺激性・ン化してエンドサイトーシスするタンパク質 LNX 1 を発安全性などは未確認であるため、化粧品原料として必ずし見した（図 1 B）。これにより、TJ は、エンドサイトーシス・も望ましくはない。そこで本研究では、インシリコ手法の分解経路による分解と、新規合成・重合促進による形成の、一つである化合物骨格転換（スキャフォールドホッピング）

動的平衡によって保たれているという新しいモデルが示さの技術を用いて、TJ を強化または減弱させる作用を持つ

1）

れた 。この作業仮説で特徴的なのは、TJ の形成促進と、天然物由来あるいは食品由来の成分を新たに探索すること

TJ の内在化・減弱が、ともに TJ の制御タンパク質に含まとした。その際、下記の 2 つのアプローチによる研究を計画した。

Scaffold conversion of tight junction
enhancers into ready-to-use compounds
based on 3 D-structure of PDZ domains
Hidekazu Hiroaki
Laboratory of structural and molecular
pha rmacolog y, Graduate school ofpharmaceutical sciences, Nagoya University【アプローチ１】
既知情報を活用した化合物探索：すでに筆者らは、天然物である真菌フシジウム・コキネウム培養上清から単離された四環系トリテルペノイド抗生物質、フシジン酸（FUS）が、複数の PDZ ドメインに結合することを発見− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 1 TJ 形成促進因子 ZO1 ならびに TJ の抑制分解因子 LNX1 のドメイン構成（A, B）と、CLD の C 末端相互作用の拮抗による TJ 動的制御仮説（C）

し報告している 6）。そこで、米 NCBI が公開している化

2. 方

合物 DB である PubChem を利用して、トリテルペノイド化合物のリストを作成し、FUS と似た負電荷を持つ法

2 . 1. NMR 試料の調製

グリチルレチック酸（GA）ならびにグリチリチン（GRZ）

mZO1‒PDZ1 の発現は、当研究室で作成したpGEX‒ 6 P 3 ‒に着目し、ZO 1 ‒PDZ 1 ドメインとの相互作用解析、なPRESAT/mZO1‒PDZ 1 プラスミドを使用した。このプラス

らびにイヌ腎臓尿細管上皮細胞 MDCK II 細胞に対するミドを用いて大腸菌 BL 21（DE 3）に形質転換した。LB 寒

薬理作用を観察した。

天培地に生えたコロニーを数個拾い、LB 培地（50 µg/mL
ampicillin）10 mL に添加し、37 ℃で約 5 時間培養した。そ【アプローチ２】の後、15 NH 4 Cl（0 . 5 g/L）を唯一の窒素源とするM 9 培地

既報の相互作用の文献情報を活用した化合物探索：筆1 L に培養液を加え、O.D. 60 0 = 0 . 4 になるまで培養した。そ者らはアミノベンジルまたはアミノベンゾイル構造を分の後、温度を 20 ℃に下げ再び培養した。O.D. 60 0 = 0 . 45 の子内に有するジクロフェナクならびにフルフェナミン酸

時に終濃度が 0 . 5 mM になるように IPTG を加えて発現誘導

が、ZO 1 ‒PDZ 1 のみならず複数の PDZ ドメインに弱くし、20 ℃で一晩培養した。

結合することを見だしている。そこで、ZO 1 ‒PDZ 1 と回収した菌体 1g に対して 20 mL の破砕バッファー（50 mM

配列が類似した他の PDZ ドメインに結合する天然物をTris‒HCl, 500 mM NaCl, 0 . 3 % Triton X– 100 , pH 7. 2）を

文献情報より探索し、その天然物ならびに類縁化合物

加え、懸濁し、Bioruptor（Cosmo Bio）で超音波破砕した（onと ZO 1 ‒PDZ 1・LNX 1 ‒PDZ 2 の相互作用を実験によりtime 30 sec/off time 30 sec, total 10 min× 4 回）。 破 砕

検証する、という手法で、新規相互作用の探索を行った。

後、遠心分離し（20000 rpm, 20 min, 4 ℃，KUBOTA 3700）、

具体的には、PSD‒ 95 の PDZ ドメインと、生薬オウゴ

上清を回収した。回収した上清をDEAE Sepharose Fast

ンに含有されているフラボノイドの直接相互作用が報告

Flowカラム（GE Healthcare）とGST‒accept カラム（nacalai

7）

されていた 。そこで、主要なオウゴン含有フラボノイ

tesque）に流し、GST 融合 ZO1‒PDZ 1 をレジンに結合させドならびに、類似のフラボノイド計 13 種を購入し（図 2）、た。カラムに 150 µL の PreScission Protease を添加して 4

NMR による相互作用解析、ならびに MDCK II 細胞に対℃で静置し、GSTタグを切断した。切断後、バッファーで目する薬理作用を観察した。

的タンパク質を溶出した。

− 138 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

図2

探索に用いた 13 種のフラボノイドとグルクロン酸（コントロール）plus（GE Healthcare）を用いてゲルろ過クロマトグラフィ

2 . 3 . MDCK II 細胞を用いたTJ 増強（緩和）効果の観察ー（50 mM Tris‒HCl, 150 mM NaCl, pH 7. 2）により精製し、

6 穴プレートにカバーガラスを入れ、そこに 30 × 104

更に濃縮後、NMR バッファー（20 mM MES, pH 5 . 9）に透個の MDCK II 細胞を播種し、37 ℃、5 % CO 2 環境下で 24

mZO1‒PDZ 1 は限外ろ過器により濃縮後、AKTAprime15

析し、 N mZO1‒PDZ 1 サンプルとした。

時間静置培養した。その後、D‒MEM 培地に 100 µM、d 6 ‒DMSO 濃度 0 . 1 % になるように化合物を混合し、細胞に添2 . 2 . NMR 滴定実験によるタンパク質・低分子化合物相互作用の観察と評価
15加した後、37 ℃、5 % CO 2 環境下で 48 時間、また 96 時間
インキュベートした。96 時間インキュベートの場合、48N 標識した PDZドメイン（0 . 1 mM）に 2 当量、または時間後に化合物を同濃度になるよう混合し直し細胞に添加

10 当量のフラボノイド（5 % d 6 –DMSO, 10 % D 2 O）を添加し、した。血清、抗生物質を含有していない D‒MEM 培地で 1

1H‒15 N HSQC スペクトルを測定し、下記の計算式でシグナ

回洗浄後、4 %‒ パラホルムアルデヒド溶液 ‒ リン酸緩衝液

ル移動度Δδ［ppm］を算出した。各化合物ごとに閾値を決（nacalai tesque）を添加し、室温で 10 分間静置した。PBS定し、閾値以上のシグナル移動度を示す残基をZO1‒PDZ 1

で 1 回洗浄後、透過溶液（0 . 5 % Triton X‒ 100 in PBS）を（PDB : 2 RRM）の立体構造にマッピングし、PyMOLで作図添加し、室温で 5 分間静置した。その後、PBS‒t（0 . 1 %した。マッピングの結果、CLD 結合ポケット部位にマッピン

Tween 20 in PBS）で 3 回洗浄後、ブロッキング溶液（2 %グが集中し、さらに HSQC スペクトルでシグナルの移動が見

BSA in PBS‒t）を加え、1 時間インキュベートした。ブロ

られた化合物に関して、相互作用があったと定義した。測定

ッキング溶液で希釈した 100 µL の一次抗体の上に固定しはBruker社AvanceⅢ 600 MHzデジタルNMR装置を用いた。

た細胞面を下にしてカバーガラスをかぶせ、4 ℃で一晩イ√

Δδ= （δHcom – δH free）2 +（ンキュベートした。翌日、カバーガラスを回収し、TBS‒t

δNcom – δNfree 2）
6

で 3 回洗浄した。その後、ブロッキング溶液で希釈した

ここで、δHcom, δH free, δNcom, δNfree はそれぞれ化合物混合100 µL の二次抗体の上に固定した細胞面が下になるよう時（com）または d 6 –DMSO 添加時、つまり化合物なし（free）にカバーガラスをかぶせ、室温、遮光条件で 1 時間インの水素軸（H）または窒素軸（N）の化学シフト値を示している。

キュベートした。TBS‒t で 3 回洗浄後、封入剤 40 µL を

− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

スライドガラスの上に滴下し、その上にカバーガラスをかぶせ、封入した。これらのサンプルは倒立顕微鏡 IX 71（OLYMPUS 社）を用いて顕微鏡観察した。なお、露光時
間は 1 / 100 秒で固定した。
一次抗体
・Rabbit anti‒Claudin‒ 2 antibody（Sigma‒Aldrich）
1 / 200 希釈
二次抗体
・Anti‒Rabbit IgG, F（ab’）2 flagment‒Cy 3 antibody（Sigma‒Aldrich）1 / 1000 希釈

3. 結

果

3 . 1. グリシルリチンは ZO1‒PDZ1と強く特異的に相互作用する
NMR 滴定実験を行った結果、グリシルリチン（GRZ）の添加により ZO 1 ‒PDZ 1 の CLD 結合ポケット周辺の残基に大きな化学シフト変化を観測した（図 3 B）
。GRZ との相互作用の着想の発端となった FUS（図 3 A）と化学シフ
ト移動の度合いを、残基あたりで標準化した平均化学シ
フト変化で比較したところ 0 . 026 ppm（GRZ）に対して
0 . 004 ppm とほぼ 6 倍の移動度の変化であった。またこの値は、我々のグループで既に発見している合成の ZO 1 ‒PDZ 1 阻 害 剤 で あ る NPL‒ 3013 の 平 均 化 学 シ フ ト 変 化（0 . 013 ppm）に較べても大きかった（data not shown）。別の実験により NPL‒ 3013 と ZO 1 ‒PDZ 1 の解離定数（Kd）
はおよそ 60 µM 程度であることがわかっている。ここから概算すると GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の Kd は、30 µM かそれ
よりも小さいであろうと予想された。
GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の分子認識機構をより詳細に検討するために、GRZ 分子内に含まれる２つのカルボキシルグ
ループに着目した。これは PDZ ドメインがもともとタン
パク質の C 末端カルボキシルグループを認識するドメイン
であり、また、ZO 1 ‒PDZ 1 に既に結合することがわかっているすべての分子（ジクロフェナク・フルフェナミン酸・
フシジン酸および NPL‒ 3013）がカルボキシル基を有しているからである。そこで GRZ のアグリコンであるグリチ
ルレチック酸（GA）と ZO 1 ‒PDZ 1 の相互作用を調べたところ、顕著な結合が見られなかった（図 3 C）
。このことから、GRZ と ZO 1 ‒PDZ 1 の相互作用には、GRZ 糖部グルク
ロン酸のカルボキシル基が重要な役割を担っている可能性が示唆された。参考までに、ドッキングソフト GOLD により予測された、FUS と GRZ の ZO 1 ‒PDZ 1 複合体の立体構造モデルを示す（図 3 D, E）。GRZ のテルペノイド部分

図 3 テル ペン 類 化 合 物と ZO1–PDZ1 の 相 互作 用。A 〜 C,
NMR 滴定実験、A, FUS；B, GRZ；C, GA。D, E はドッキン
グソフト GOLD により予測された複合体のモデル図

が PDZ ドメインの溝を覆い隠すように結合しているモデルが得られた。今後、更に詳細に検証する予定である。

MDCK II 細胞を処理した際に、TJ の減弱効果が見られる

こ の よ う に GRZ は ZO 1 ‒PDZ 1 に 結 合 す る た め、 もはずである。他方、GRZ や GRZ を多く含む植物であるカ

し、細胞内で ZO 1 ‒PDZ 1 の機能を阻害するなら、例えばンゾウには、粘膜細胞の保護機能が知られており、これは− 140 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

TJ の機能強化を介している可能性がある。今回、MDCK

クロン酸以外の、化学シフトが変化した化合物（バイカリ

II 細胞の TJ に対する GRZ の効果を調べたところ、当初はン、バイカレイン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、シアニ

わずかながら TJ の強化が観察されたが、実験の再現性はジンクロライド、デルフィニジンクロライド、グリシルリ

得られなかった。他方、MDCK II 細胞を GA に曝露したチン）に関して、ZO 1 ‒PDZ 1 の α 2 へリックスと β 2 シート

ところ、細胞毒性が観察された 。

の間にある CLD 結合ポケットに特異的に結合することが示された。以上の結果を表１にまとめる。また、後述する

3 . 2 . フラボノイドからのZO1‒PDZ1 に相互作用する化合物の探索

ように、TJ に影響を与えた３つのフラボノイド、バイカ
リン、バイカレイン、ナリンゲニンについて、NMR 化学

NMR 滴定実験により、化合物の ZO 1 ‒PDZ 1 への相互シフト変化を ZO 1 ‒PDZ 1 ドメインの残基ごとに図示した作用能を評価した。化合物はバイカリン、バイカレイン

グラフならびに立体構造に結合部位をマッピングした図をの構造に似たフラボノイドを全 13 種類選定した。ZO 1 ‒示す（図 4 A 〜 4 C）。

1

15

PDZ 1 溶 液 に 対 し、2 当 量 の 化 合 物 を 添 加 し て H‒ N
HSQC スペクトルを測定した。その結果、バイカリン、バ3 . 3 . オウゴン由来フラボノイドによるTJ 緩和効果

イカレイン、ヘスペレチンを添加したときにシグナルの

前述の NMR 実験で顕著な化学シフト変化をもたらした

化学シフトが変化した。また、ヲゴニン、クリシン、（–）–

フラボノイドのうち、オウゴン由来フラボノイドである

エピカテキンはタンパク質溶液を添加した際に沈殿が生じ

バイカリン、バイカレイン、ヲゴニンについて、MDCKた。シグナルは観測できたが、シグナルの化学シフトの変II 細胞に曝露し、TJ への影響を調べた。具体的には、化化は観測できなかった（data not shown）。D‒ グルクロン

合物（100 µM）で 48 時間曝露後に細胞を固定し、CLD‒ 2酸、 ナリンゲニン、 シアニジンクロライド、デルフィニジ

抗体を用いた免疫染色実験により、TJ の変化を観察した。

ンクロライドでは 2 当量の添加でわずかなシグナル変化がContorol では細胞膜に CLD‒ 2 が局在する様子が観察され観測された。そのため、化合物の濃度を 10 当量に変更し、たが、バイカリン、バイカレイン曝露では CLD‒ 2 の消失

1H‒ N HSQC を測定し直したところ、10 当量ではシグナが観察された（図 5 A 〜 C）
。ヲゴニン曝露でも CLD‒ 2 のルの化学シフトが変化した（表１）。その他の化合物ではシ消失が観察されたが、同時に細胞毒性も観察され、細胞グナルの化学シフト変化は観測できなかった 。

の培養ディッシュへの接着も不十分であったため、純粋な15

ZO 1 ‒PDZ 1 における化合物の結合部位を決定するため

TJ による影響ではないと考えた（data not shown）。

に、化合物を添加した際に化学シフトが変化した残基（閾前述の NMR 滴定実験をさらに精密に行ったところ、値以上のシグナル移動度を示した残基）を同定し、ZO 1 ‒ZO 1 ‒PDZ 1 と バ イ カ リ ン の 解 離 定 数 は お よ そ 1 . 8 mM

PDZ 1 の結晶構造にマッピングした。その結果、D‒ グルと試算された。細胞内への化合物の吸収を考えると、

表1

フラボノイドによる ZO1-PDZ1/LNX1-PDZ2 の NMR 滴定実験のまとめ− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 4 フラボノイドとZO1‒PDZ1の相互作用のNMR 滴定実験による確認（左）と立体構造へのマッピング（右）。A, Baicalin, 2 eq., B, Baicalein, 2 eq., C, Naringenin, 10 eq.

100 µM 濃度での TJ 緩和活性は、ZO 1 ‒PDZ 1 阻害のメカ

なかった一方で、ナリンゲニン曝露後 48 時間で CLD‒ 2 がニズムでは説明しづらい。先行研究によると、岐阜薬科大学

細胞膜に集積し、細胞境界線がはっきりした様子が観察さの五十里らが、MEK/ERK 経路の活性化によって MDCKれた（図 5 J 〜 K）。このナリンゲニンによる TJ 強化はヒト

8）II細胞でCLD‒ 2 が減少したことを報告していた 。そこで、小腸細胞である Caco– 2 細胞でも報告されているが MDCKMEK 1 阻害剤である U 0126 を用いて、バイカリン、バイII 細胞での観察は今回が初めてである 9）。ナリンゲニンに

カレインによる TJ 減弱化が MEK/ERK 経路の活性化によ

よる TJ 強化は、異なる由来の上皮細胞でも普遍的である

るものかどうかについて検討した。その結果、U 0126 を可能性がある。今後、より化粧品への応用に近い、皮膚用いても CLD‒ 2 の減少は回復しなかった（図 5 D 〜 I）。こTJ に対するバリア機能強化の可能性について調べていきの結果は、バイカリン、バイカレインによる TJ 緩和機構

たい。

を解明する上で、重要な足掛かりとなるものと考えられる。

3 . 4 . ナリンゲニンによるTJ 強化効果の発見

4. 考

察

グリチルリチンおよびいくつかのフラボノイドには、腸グレープフルーツなどの柑橘類に含まれるナリンゲニ

管などの粘膜の保護機能や、小腸バリアの強化機能など

ン、ヘスペレチンが ZO 1 ‒PDZ 1 に弱いながら結合したたが知られている。筆者らは既に、LNX 1 ‒PDZ 2 の特異的め、TJ に対する薬理作用をより詳細に調べることにした。

阻害剤である NPL‒ 1011 と、ZO 1 ‒PDZ 1 の阻害剤である

CLD‒ 2 抗体を用いた免疫染色実験により、TJ への影響を

NPL‒ 3004 , NPL‒ 3013 を発見しており、これらの化合物

さらに評価した。ヘスペレチンでは TJ の変化は観察されにより MDCK II 細胞の TJ の強化と減弱をそれぞれ観察し− 142 −

構造情報を利用したタイトジャンクション増強剤の実用的な化合物への骨格転換

図 5 フラボノイドおよび MEK/ERK 阻害剤 U0126 の MDCK II 細胞の CLD2 局在への影響。A, DMSO
のみ（control）；B, Baicalin（100µM）；C, Baicalein（100µM）; D, DMSO のみ（control）; E, Baicalin（100µM）; F, Baicalin（100µM）+ U0126（5µM）;G, U0126（5µM）; H, Baicalein（50µM）; I,
Baicalein（50µM）+ U0126（5µM）; A, DMSO の み（control）， 再 掲 ; J, Hesperetin（100µM）; K,
Naringenin（100µM），scale bar = 20µm。

ている（論文投稿準備中）。今回、グリチルリチンおよび４

めて低いと考えられる。そのため、細胞外部からの投与で種のフラボノイドと ZO 1 ‒PDZ 1 の直接相互作用を NMR

TJ が変化しなかったと考察した。他方、グリチルレチッにより観察した。そのうち、細胞内で ZO 1 ‒PDZ 1 を阻害

ク酸は ZO 1 ‒PDZ 1 には相互作用しなかったため、少なくすることと矛盾しない TJ 制御効果を示したのはバイカリ

とも 3 位のグルクロン酸は ZO 1 ‒PDZ 1 結合に必須と考え

ン、バイカレインであった。

られる。例えばグリチルレチン酸 3 ‒O‒ グルコニドは、ググリチルリチンによる MDCK II 細胞の効果は、当初はTJ 強化機能であると考えられたがその変化は小さく、実リチルリチンよりも糖が一残基分小さいので、何らかの
TJ 活性を示すかもしれないと予想している。

験の再現性がなかった。グリチルリチンの分子量ならびに

今回 TJ 緩和効果を示した 2 種のフラボノイド・バイカ

極性官能基の数を考えると、いわゆるリピンスキー則からリン、バイカレインについて、その薬理作用について文外れるため、細胞膜と透過して細胞内へ移行する効率は極献検索を行ったところ、すべてが TJ ないし臓器のバリア− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

機能を強化または保護する機能であり、TJ 緩和効果を記した文献はなかった。文献10）にはバイカリンのバリア保護機能の報告の一例をあげる。他方、rat に対する高濃度剤及び該制御剤を含む医薬組成物」、発明者：廣明秀一、
天野剛志、中倉由香子、野田翔太、出願日：2015/7/22（再表）の Baicalin 投与が TGFβ 経路を介して、腎臓の線維化を促

5） 特願 2017‒520717 「タイトジャンクションの緩和剤、進するという副作用の報告があり（文献）、これは EMT を

該緩和剤を含む薬剤吸収補助剤、及び該緩和剤を含む示唆するため、変性の途中で TJ の減弱・分解を含んでい

医薬組成物」、発明者：廣明秀一、天野剛志、野田翔太、る可能性がある。ZO 1 ‒PDZ 1 との結合の弱さから考えて、

出願日：2016/5/24（再表）バイカリン、バイカレインの TJ 減弱効果は ZO 1 ‒PDZ 1

6） Tenno, T., Goda, N., Umetsu, Y., Furuse, M., Ota, M.,

阻害以外の何らかのシグナル伝達系を介していることは間Kinoshita, K., and Hiroaki, H*. Accidental interaction

違いなく、その候補として TGFβ 経路の活性化があげられ

between PDZ domains and diclofenac revealed

る。

by NMR–guided virtual screening. Molecules. 1 8,

他方、今回 TJ 強化を示した Naringenin については、TJ

9567‒9581, 2013.

バリア機能を強化するシグナル伝達系である AMPK を活

7） Tang W, Sun X, Fang JS, Zhang M, Sucher NJ:

性化することを示唆する報告があり、MDCK II 細胞の TJ

Flavonoids from Radix Scutellariae as potential

強化においても同様の機構であると考えられる。その場合、stroke therapeutic agents by targeting the second

フラボノイド分子の作用点がどこか、については、更なる

postsynaptic density 9 5（PSD‒9 5）/disc large/zonula

研究が必要である。今後、柑橘系に含まれる他のフラボノ

occludens‒1（PDZ）domain of PSD‒95., Phytomedicine.

イドとの比較や、AMPK 経路の活性化の確認などを行い

11, 277‒284, 2004.

つつ、皮膚バリア機能強化のための有望な成分として研究

8） Ikari A, Takiguchi A, Atomi K, Sugatani J*:を続ける予定である。筆者らが既に見だしている LNX 1

Epidermal growth factor increases clathrin‒dependentを阻害することによる TJ 強化と、相乗効果が期待できる

endocytosis and degradation of claudin‒2 protein in

かどうかなど、精査したい。

MDCK II cells. J Cell Physiol., 226, 2448‒2456, 2011.

最後に、本研究を遂行するにあたり、ご支援いただきま

9） Noda S, Tanabe S, Suzuki T*: Naringenin enhances

した財団法人コスメトロジー研究振興財団に心より感謝いintestinal barrier function through the expression and

たします。

cytoskeletal association of tight junction protein in（引用文献）

10）Chen J, Zhang R, Wang J, Yu P, Liu Q, Zeng D, Song H,

Caco–2 cells. Mol. Nutr. Food Res. 57, 2019‒2028, 2013.
1） Takahashi S, Iwamoto N, Sasaki H, Ohashi M, Oda

Kuang Z: Protective effects of baicalin on LPS‒induced

Y, Tsukita S, Furuse M*: The E3 ubiquitin ligase

injury in intestinal epithelial cells and intercellular

LNX1p80 promotes the removal of claudins from tighttight junctions. Can J Physiol Pharmacol., 93 , 233 ‒ 237 ,junctions in MDCK cells., J Cell Sci, 122, 985‒994, 2009.

2015 .

2） Umetsu Y, Goda N, Taniguchi R, Satomura K,
1

Ikegami T, Furuse M, Hiroaki H*: H,

13

C, and15N11）Cai Y, Ma W, Xiao Y, Wu B, Li X, Liu F, Qiu J, Zhang
G: High doses of baicalin induces kidney injury andresonance assignment of the first PDZ domain offibrosis through regulating TGF‒β/Smad signaling

mouse ZO–1., Biomol NMR Assign. 5, 207‒210, 2011.

pathway. Toxicol Appl Pharmacol. 333 , 1 ‒ 9 , 2017 .

3） Hiroaki H*, Satomura K, Goda N, Nakakura Y,12）Liu X, Wang N, Fan S, Zheng X, Yang Y, Zhu

Hiranuma M, Tenno T, Hamada D, Ikegami T:

Y, Lu Y, Chen Q, Zhou H, Zheng J: The citrus

Spatial Overlap of Claudin‒ and Phosphatidylinositol

flavonoid naringenin confers protection in a murine

Phosphate‒Binding Sites on the First PDZ Domain ofendotoxaemia model through AMPK‒ATF 3 ‒Zonula Occludens 1 Studied by NMR., Molecules. 2 3,

dependent negative regulation of the TLR 4 signalling

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4） 特願 2016‒535943 「タイトジャンクション形成制御− 144 −