スキン伝達物質 ATPと皮膚のアンチエイジングに関する研究

山梨大学医学部薬理学

小 泉

修 一

Skin cells release ATP that affects a big variety of functions of adjacent cells. However, the mechanisms underlying its
release remain largely unclear. Here, focusing on VNUT (vesicular nucleotide transporter), we show that skins release ATPby a mechanism of Ca2+-dependent exocytosis in normal human epidermal keratinocytes.

１．緒

ンチエイジング効果を有する薬物の開発に直接結びつく基言

礎データを提示することを目的とする。

老化は避けられない問題であるが、適切な処置で老化を２．実遅らせる所謂「抗老化（アンチエイジング）」により、生活の質（QOL）を格段に高めることができる。皮膚は体を2.１

験

細胞培養

覆う最も大きな臓器であり、体内、細胞内を外界から守る

ヒト正常表皮ケラチノサイト（NHEK）の培養は既報に重要な役割を果たすが、最外層に位置することから美容の従った 1 , 2）。ATP 放出は、既報によるルシフェリンルシフ

側面からも、その老化は重要な問題となる。皮膚は老化にェラーゼ法 3）により行った。また、ATP 開口放出は、蛍より、表皮の代謝回転、角質層の機能不全によるバリア機

光 ATP（MANT-ATP）及び quinacrine をプローブとして能及び水分保持機能が低下し、さらに皮脂の分泌が減少す用い、それぞれ共焦点レーザー顕微鏡及び全反射蛍光顕微る。こうした皮膚の質的な変化等により皮膚の乾燥、シミ、鏡（TIRF）解析により可視化した。

シワ及びたるみが生じる。現在、アンチエイジング効果を3．結果及び考察呈するとして頻用される外用剤に、レチノイドがある。レチノイドによるアンチエイジング効果の分子メカニズムに

3 .１ スキン伝達物質 ATP 放出の分子メカニズムの解明は不明な点が多く、また、レチノイドによる、色素沈着、申請者らは既に、NHEK を用いた研究から、NHEK は炎症等の負の作用も少なからず報告されている。申請者は各種刺激に応じて ATP を細胞外に放出することを明らか

これまでに、細胞外 ATP 及びその受容体である P 2 受容体とした（Koizumi et al. 2004）。そこで、先ず Ca 2 + イオノが表皮ケラチノサイト間の情報連絡で最も重要な因子の一フォア（ionomycin）により惹起される NHEK からの ATPつであること、さらに、ATP/P 2 Y 2 受容体シグナルが各放出を luciferine-luciferase 法により観察した。図１のよう

種刺激及び炎症時に劇的に亢進すること、レチノイドがに、NHEK は ionomycin の濃度依存的に、細胞外に ATP

P 2 Y 2 受容体の発現を亢進させることをこれまでに明らかを放出した。この放出は、細胞内 ATP キレート剤であるとしてきた。レチノイドの副作用に、ATP/P 2 Y 2 受容体BAPTA-AM に よ り 消 失 し、 小 胞 型 H+ATPase の阻害剤シグナルの亢進が示唆されているが、これらのシグナルとbafilomycin A 1 によっても有意に抑制された（図２）。こ皮膚の機能、老化にどのような影響を与えるかについては、

れらは、NHEK からの ATP 放出が Ca 2 + 依存的であること、殆ど解っていない。また、ATP シグナルの引き金となる酸性小胞依存的であることを意味し、ATP 放出が開口放ATP 放出のメカニズムは全く明らかとされていない。本

出であることを強く示唆する。そこで、開口放出に関係す研究では、皮膚から放出される「スキン伝達物質」である

る SNARE 蛋白質をボツリヌス毒素により切断したところ、ATP 放出の分子メカニズム、さらに皮膚 ATP/P 2 Y 2 受

やはり ATP の放出は有意に抑制された（データは示さず）。

容体活性化が表皮ケラチノサイトの生理機能に与える影響

従って、NHEK は開口放出のメカニズムにより ATP を細及びその分子機序を精査することにより、新しい皮膚のア胞外に放出していることが明らかとなった。

Anti-aging of skin mediated by skintransmitter ATP
Schuichi Koizumi
Department of Neuropharmacology,
Interdisciplinary Graduate School ofMedicine and Engineering, University ofYamanashi

3.2

スキン伝達物質 ATP 開口放出の可視化

次に、NHEK における ATP 含有小胞の有無、またこのATP 小胞が開口放出により放出される様子を可視化し、皮膚における ATP の開口放出の存在を直接明らかとした。
NHEK を蛍光 ATP アナログである MANT-ATP と８時間インキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡（ex. 405 nm）− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Figure 1 The effects of BAPTA-AM and bafilomycin A1 on ionomycin (IM)-induced release of ATP fromNHEKs
Ionomycin evoked an increase in extracellular ATP in a concentration-dependent manner. The ionomycin（5µM）-evoked release of ATP was significantly decreased by BAPTA-AM, an intracellular Ca2+ chelatoror bafilomycin A1, an inhibitor of vesicular H+-ATPase. ***P<0.001 vs. Basal; ###P<0.001 vs. ionomycin（5µM）．

Figure 2 Visualization of exocytosis of ATP
ATP vesicles were visualized by the fluorescent ATP analogue MANT-ATP (A) and quinacrine (B) in
NHEKs. MANT-ATP and quinqcrine signals were obtained from confocal laser microscopy and TIRFmicroscopy, respectively. (C) Schematic cartoon of exocytosis of quinacrine-positive vesicles. (D) The
time course of the de-staining of quinacrine-fluorescence by ionomycin in single-vesicles in the absence(left) and presence of BAPTA-AM (right).

− 96 −

スキン伝達物質 ATP と皮膚のアンチエイジングに関する研究を用い、蛍光 ATP のシグナルを観察した。図 2 A のように、3.3

スキン伝達物質 ATP 開口放出の責任分子同定

蛍光 ATP は小胞状の形態を呈し、細胞膜近傍に多く観察ATP が開口放出されるためには、細胞内で細胞質のさ れ た。 次 に、 こ の キ ネ テ ィ ッ ク ス を 解 析 す る た め、ATP を小胞に取り込む小胞型 ATP トランスポーターの存

NHEK をよりキネティックス解析に適した quinacrine と在が必要である。2008 年、森山らのグループは、このトラ

15 分間インキュベートし、全反射顕微鏡（TIRF）にてそンスポーターとして SLC 17 A 9 を見出し、VNUT（vesicularの挙動を観察した。図 2 B のように、quinacrine シグナルnucleotide transporter）と命名した 4）。先ず、我々は皮膚も小胞状の形態を呈した。もし開口放出が惹起される場合に VNUT が存在するか否かを確認した。VNUT 抗体を用には、図 2 C にしめすように、この quinacrine 蛍光が、細いた免疫染色法により皮膚切片（図 3 a）及び NHEK（図胞膜（PM）に移動・ドッキング・開口することにより細3 b）に VNUT 陽 性 シ グ ナ ル を 見 出 し、 ま た こ れ は胞外に出て行くため、quinacrine 蛍光の消失が惹起されるWestern blotting によっても特異的バンドとして確認できはずである。Ionomycin を添加すると、quinacrine 蛍光は、た（ 図 3 c）。 こ の VNUT を RNA 干 渉 法（VNUT siRNA）

小 胞 毎 に こ と な る キ ネ テ ィ ッ ク ス で 消 失 し、 こ れ はによりノックダウンすると（図 4 a）、NHEK からの ATP 放BAPTA-AM によりほぼ消失した（図 2 Ｄ）
。以上、NHEK出は有意に抑制された（図 4 b）5）。従って、VNUT が上述は ATP を放出すること、その放出メカニズムは開口放出した皮膚の ATP 開口放出の責任分子であることが明らかであること、さらにその開口放出を可視化することが可能となった。となった。

Figure 3 Expression of VNUT in the human epidermis andepidermal keratinocytes.
Immunohistochemical and immunocytochemical staining offrozen section of human skin (a) and NHEK (b), respectively,
with an anti-VNUT antibody. For western blot analysis, total
cell lysates were prepared and separated by SDS-PAGE.
The antibody that specifically recognizes VNUT protein
detected major bands at 65 kDa and 68 kDa (c).

Figure 4 Inhibition of ionomycin-induced ATP release byVNUT siRNA.
(a) VNUT mRNA was significantly reduced in a timedependent manner in cells transfected with VNUT siRNA（n=3, black bar）．(b) Transfection with VNUT siRNA for 72
hr（n= 3, black bar）significantly decreased ionomycinevoked ATP release versus scrambled RNA-transfection atconcentrations of 2 and 5µM of ionomycin. *p<0.05,***p<0.001 vs. scrambled siRNA.

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コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

細胞外 ATP が種々の疾患と関連すること 3）、シワやシミの治療に用いられるレチノイン酸が ATP 受容体発現に（参考文献）
１）Koizumi S, Fujishita K, Inoue K, et al.: Ca2+waves in

影響すること 6）等、これまで ATP/P 2 受容体シグナルとkeratinocytes are transmitted to sensory neurons: the

皮膚の機能制御に重要な役割を果たすことを示してきた。

involvement of extracellular ATP and P 2 Y 2 receptor
activation. Biochem J. 2004 ; 380 : 329 - 338 .

今回、この ATP が放出されるメカニズムの一端を明らかにすることが出来た。また、この ATP 放出の責任分子

２）Inoue K, Denda M, Tozaki H, et al.: Characterization

VNUT は、これまでの我々の脳における研究により、種々of multiple P 2 X receptors in cultured normal humanの炎症時に発現が著しく亢進することが明らかとなっていepidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 2005 ; 124 :7）

756 - 763 .

る 。今後、VNUT を切り口としてスキン伝達物質 ATP が、老化や疾患とどのように関連性を明らかにする予定である。

３）Kawamura T, Ogawa Y, Nakamura Y, et al.: Severedermatitis with loss of epidermal Langerhans cells in謝辞human and mouse zinc deficiency. J Clin Invest. 2012 ;122 : 722 - 732 .

本研究遂行にあたり、御助成頂いた公益財団法人コスメ
トロジー研究振興財団に心から感謝申し上げます。また、

４）Sawada K, Echigo N, Juge N, et al.: Identification of a

山梨大学医学部薬理学講座、井上かおり、小松龍平、柴田

vesicular nucleotide transporter. Proc Natl Acad Sci U
S A. 2008 ; 105 : 5683 - 5686 .

圭輔、藤下加代子の各氏に感謝致します。

５）Inoue K, Komatsu R, Imura Y, et al . : Mechanism
Underlying ATP Release in Human Epidermal Keratinocytes.

本研究の一部は、すでに以下の様に公表した。

J Invest Dermatol. 2014 ; in press:Inoue, K., Komatsu, R., Imura, Y., Fujishita, K., Shibata, K.,( 2014 ) Mechanisms６）Fujishita K, Koizumi S & Inoue K: Upregulation ofunderlying ATP release in human epidermal keratinocytes.

P 2 Y 2 receptors by retinoids in normal human epidermal

J. Invest. Dermatol., in press.

keratinocytes. Purinergic Signal. 2006 ; 2 : 491 - 498 .

Moriyama, Y. and Koizumi, S.

７）Imura Y, Morizawa Y, Komatsu R, et al.: Microglia
release ATP by exocytosis. Glia. 2013 ; 61 : 1320 - 1330 .

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