表皮細胞の増殖・分化・細胞死に影響を与える遺伝子群の機能解析システムの構築
大阪大学医学系研究科社会環境医学

竹田潤二

Somatic cells from patients with Bloom (Blm) syndrome show an increased rate of homologous recombinationand therefore, results in generation of bi-allelic mutation from mono-allelic mutation. We have used a tetracyclineregulated Blm allele (Blmtet) to introduce bi-allelic mutations in ES cells (5). Phenotype-based genetics is now
achievable and raises new possibilities for identifying novel gene functions.
Although we would like to apply this system in mice or their somatic cells, addition of doxycyline (dox), an
analogue of tetracycline, to Blmtet mice did not result in sufficient reduction of Blm expression because of leaky Blm
expression in vivo. This leaky expression has been markedly reduced in vitro by using a tetracycline-controlled
trans-silencer. A new tetracycline cassette containing the trans-silencer gene was constructed and inserted into
the Blm gene to generate a new Blm allele (Blmtet-new) in ES cells. We tested the dox-dependent regulation of Blm
expression and possible introduction of bi-allelic mutations in mice or their somatic cells derived from the ES cellline bearing Blmtet-new and found that sister chromatid exchange (SCE), a hallmark of Bloom gene deficiency, wasmarkedly increased in lymphocytes derived from mice bearing Blmtet-new alleles, suggesting that efficient bi-allelicmutations have been introduced in mice.
We reported that Sleepng Beauty transposon (SB) jumps efficiently in mouse genome (1) and SB-mediatedmutagenesis is possible (3). Moreover, we have been recently repor ted potential of SB for comprehensive
mutagenesis (6). Since the SB transposon system has a unique feature that can introduce various mutations insomatic tissues, this allows us to search for many novel gene functions in a single mouse.
Combination of the two systems described above opens a new research field for “somatic cell genetic biology”.
In this system, SB-mediated transpositions cause many mono-allelic gene disruptions in somatic cells followed by
the introduction of bi-allelic mutations from them.

１．緒

一方、両アレル変異に関しては、ブルーム遺伝子を利用する。

言

ブルーム遺伝子が欠損したブルーム症候群と呼ばれる患表皮は直接外界に接している組織であり、外界からの刺者では高頻度に癌が発症する。患者由来の細胞を観察する

２）

激から生体を防御している 。表皮細胞一つ一つを解析でと、高頻度に相同組み換えが起こり片アレル変異から両アきれば皮膚疾患の病態解明に多大な効果を及ぼすことが期

レル変異に移行しやすく、このことが癌発症に密接に関連待される。

していると考えられる。

そのために我々は、二つの手法を組合わせて個体の表皮遺伝子の機能を個体で解析するときには、遺伝子が欠損細胞などの体細胞での遺伝子機能を効率良く解析するためしているアレルをホモにする必要がある。通常それは、ヘの手法を開発しようとしている。

テロマウス同士を交配することにより達成される。我々は、一つ目はランダムに変異を効率良く導入する手法であり、ブルーム遺伝子を欠損させることにより交配をしなくても二つ目は、導入された変異をもう片方のアレルにも導入し遺伝子の機能を解析できる手法を開発しようとしている。

（両アレル変異導入）、遺伝子機能解析に供するというもの

ES 細胞を利用してその原理が正しいことを証明できた５）。

である。

上記で述べた二つの手法を組み合わせ、マウス個体の体細ランダム変異導入は、我々が世界に先駆けてマウス個体胞で遺伝子の機能を効率良く解析しようとするものである。

で効率良く動き回ることを報告した SB トランスポゾンシ

２．実ステムを用いる１）。トランスポゾンシステムは生殖細胞だけでなく、体細胞でも効率良く動き回ることが知られている。

験２- １ マウストランスポゾンが表皮細胞でも効率良く動き回るかどうかの検討
我々はこれまでに生殖細胞系列で SB トランスポゾンがG ener at ion of a novel sy st em forfunctional analysis of genes involved in
growth, differentiation, and cell death inepidermal cells

効率良く動き回り、内在性遺伝子を破壊できることを報告

Junji Takeda

トランスジェニックマウスを作製した。このマウスとトラ

Department of Social and Environmental
Medicine, Osaka University Graduate
School of Medicine

してきた。そこで体細胞である表皮細胞でも効率良く遺伝子移動を可能にするために Keratin-5 トランスポーゼースンスポゾン保有マウスを交配したダブルトランスジェニックマウスを作製し、表皮細胞でその移動効率を測定した。

− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 20072005 年、アメリカの二つのグループが SB トランスポを作製し、その後ホモマウスを作製した。そのホモマウス

ゾンを体細胞で移動させ癌遺伝子の同定に成功したことがからリンパ球を取り出し、組み換え頻度が上昇しているか

Nature 誌に報告された。その際、体細胞（表皮だけでなどうかを姉妹染色体間の組み換えで測定したところ、顕著

く体細胞全体）での移動効率を高めるために、トランスポに頻度が上昇していることが観察された７）。

ーゼース遺伝子を Rosa-26 遺伝子座にノックインしたマ

４．結語および今後の展開ウスが作製されていた。我々も同様のマウスを独自に作製したのでそのマウスを用いて表皮細胞で移動効率が高まっているかテストした。

二つのシステムを融合して表皮細胞で遺伝子の機能を解析するものであるが、それぞれのシステムは完成に近づきつつあると考えられる４）８）。それらが融合できた時にこれ２- ２ ブルーム遺伝子欠損による表皮細胞における両アレル変異導入効率の検討

までにない新しいシステムが誕生し、今後新規遺伝子群が多数同定されることが期待される。

我々は、これまで ES 細胞においてブルーム遺伝子を条件付き（テトラサイクリン類似体を添加した時だけで遺伝（参考文献）子がオフになるいわゆる tet システム）で破壊することに１）Horie, K., A. Kuroiwa, M. Ikawa, ほか 4 名：Efficientより両アレル変異導入が可能であることを示してきた。そchromosomal transposition of a Tc1/mariner-like

こでその ES 細胞からマウスを樹立し、体細胞を取り出しtransposon Sleeping Beauty in mice. Proc. Natl. Acad.

ES 細胞と同様両アレル変異導入が可能か検討した。

Sci. USA 98: 9191-9196, 2001
２）Takagi, S., H. Tojo, S. Tomita, ほか 9 名：Alteration

３．結果および考察of the 4-sphingenine scaffolds of ceramides in

３- １ マウストランスポゾンの表皮細胞での移動効率

keratinocyte-specific Arnt deficient mice affects skin

実際の移動効率は、遺伝子の挿入で検討しなければいbarrier function. J. Clin. Invest. 112（9）: 1372-1382.

けないが、マウストランスポゾンはランダムに移動する

2003

ので挿入効率を測定するのは困難である。そこで挿入す３）Horie, K., K.Yusa, K.Yae, ほか 10 名：Characterization

る前のトランスポソン切断効率で移動効率を類推した。他

of Sleeping Beauty transposition and its applicationの実験でトランスポゾンが切断されたもののうち、半分

to genetic screening in mice. Mol.Cell.Biol.23(24):は実際に遺伝子挿入が起きていることが証明されている。

9189-9207, 2003

Keratin-5 トランスポーゼーストランスジェニックマウスと

４）Yusa, K., J. Takeda, and K. Horie ; Enhancement of

トランスポゾン保有マウスを交配したダブルトランスジェ

Sleeping Beauty Transposition by CpG Methylation:

ニックの表皮細胞での移動は 10 〜 100 個の細胞に一個ぐ

Possible Role of Heterochromatin Formation, Mol.

らいの頻度で起こっていることが想像された。この頻度は、Cell. Biol., 24; 4004-4018, 2004

表皮での遺伝子機能解析が可能であることが考えられる。

５）Yusa, K., K. Horie, G. Kondoh, ほか 4 名：Genome-wide
phenotype analysis in ES cells by regulated disruption

３- ２

表皮細胞における両アレル変異導入効率of the Bloom's syndrome gene. Nature 429, 896-899,

表皮細胞を培養することが簡単ではないためモデル系と2004

して初期線維芽細胞での両アレル変異導入効率を検討した。

６）Keng, V.W., K. Yae, T. Hayakawa, ほか 10 名：Region-

ブルーム遺伝子欠損は、両アレル変異導入だけではなくてspecific saturated germ-line mutagenesis in mice using

姉妹染色体間の組み換え頻度も同時に上昇するので我々は

the Sleeping Beauty transposon system. Nat. Methods.

実際には初期線維芽細胞での姉妹染色体間の組み換え頻度

2 ; 763-769, 2005

で両アレル変異導入効率を検討した。しかし、ES 細胞で

７）Hayakawa T, Yusa K, Kouno M, ほか 2 名：Bloom’s

みられた組み換え頻度の上昇は見られなかった。その原因

syndrome gene-deficient phenotype in mouse primaryがブルーム遺伝子の Leaky な発現によるものだと考えら

cells induced by a modified tetracycline-controlled

れたので、それを押さえるために tet システムのサプレッ

trans-silencer. Gene,. 369; 80-89, 2006

サーを新たにシステムに加えてテストしたところ姉妹染色８）Ikeda R., C Kokubu, K Yusa, ほか 3 名：Sleeping Beauty

体間の組み換え頻度の上昇がみられた。

transposase has an affinity for heterochromatin

そこで、サプレッサーを組み込んだコンストラクトを新conformation, Mol. Cell. Biol., 27 : 1665-1676, 2007

たに作製し、ES 細胞にノックインし、それ由来のマウス− 100 −