ヒト表皮角化幹細胞の動態制御を目指した低分子化合物の探索

愛媛大学上級研究員センター

難 波大 輔Reconstruction of epidermal sheets from isolated human epidermal keratinocytes has realized autologous transplantation
onto patients with extensive burns. Isolated keratinocytes from human skin have heterogeneity in their proliferative capacity
and in ability for regeneration of the epidermis. Keratinocyte stem cells have the greatest proliferative capacity and canproduce a progeny large enough to entirely reconstitute the epidermis of an adult human for a lifetime. The stem cells arealso available for gene therapy against inherited epidermal disorders such as junctional epidermolysis bullosa. Therefore,
increasing self-renewal of keratinocyte stem cells in culture facilitate regenerative medicine using autologous keratinocytes.
To address these issues, we explored small molecules that can expand keratinocyte stem cells in vitro. We screened anumber of compounds and found three molecules that could increase the number and size of keratinocyte colonies. Thesemolecules enhanced attachment speed but not efficiency of keratinocytes after inoculation, suggesting that rapid adhesion ofkeratinocytes is crucial for maintenance and self-renewal of human epidermal keratinocyte stem cells.

1．緒

方法を開発するため、我々が見出したクローナル・コンバ

言ージョンに伴うヒト表皮角化幹細胞の変化に着目し（難波

表皮角化細胞の培養技術の開発によって、重度の広範囲
1）

ら、論文投稿中）、本研究において、その変化に影響を与熱傷患者の救命が可能となった 。表皮は細胞が常に分裂える低分子化合物の中から、ヒト表皮角化幹細胞を培養上を繰り返して維持されている組織であるが、作製された移でより増幅する、またはより長期に渡って維持する活性を植表皮は生涯に渡って維持される

2、3、4）。この事実は、生体持つ分子の探索を行った。

より単離された表皮角化細胞の中に幹細胞が存在し、体外

２．実での培養表皮作製期間中もその能力を失うことなく維持されていることを示している。表皮角化幹細胞は、培養上で2. 1

験

表皮角化細胞培養

高い増殖能を示し 5）、機能的な培養表皮シートの作製に必

ヒト表皮角化細胞（KURABO より購入）を、フィーダ須である 6、7）。またその幹細胞に対する遺伝子導入は、先ー細胞としてマイトマイシン C で処理したマウス 3T3 線維

8）

天性表皮疾患の治療に応用されている 。このように表皮芽細胞を用いて培養した。DME 培地と F12 培地の 3：1 混

角化幹細胞は治療にとって必須であるにも関わらず、培養合培地に 10 % ウシ胎仔血清を含む培養液を用い、37℃、上で継代を重ねていくごとに失われていく。この現象はク10 % CO2 の条件で培養を行った。

9）

ローナル・コンバージョンとして知られており 、表皮角化幹細胞培養における最大の問題点である。また培養にお2. 2

コロニー形成能測定

いて幹細胞特性を維持することが、培養上皮シートを用いヒト表皮角化細胞を 200 個、６cm 細胞培養ディッシュた移植医療の成否に最も重要であることが角膜上皮細胞の（IWAKI）に播種し、12 日間培養後、10％フォルマリン溶10）

再生医療研究から明らかとなっている 。再生医療におけ液で固定し、１% ローダミン B 溶液で染色することでコロる細胞培養は熟練した技術者に負うところが大きく、それニーを可視し、個数の計測を行った。またコロニーの面積故、再生医療そのものが熟練者の数に制限される。容易には画像解析ソフト Volocity（PerkinElmer）を用いて計測幹細胞性を維持できる細胞培養技術を開発することによっした。て、幹細胞移植による再生医療が大きく発展するものと考

2. 3

えられる。
我々は培養ヒト表皮角化幹細胞の幹細胞性を維持させる

免疫蛍光抗体法

ヒト表皮角化細胞を４% パラフォルムアルデヒド溶液を用いて固定、0.5% Triton x-100 溶液処理し、１% ウシ血清アルブミン溶液でブロッキングを行った。その後、１次抗Exploring small molecules that modulate
behaviors of human epidermal keratinocyte
stem cells
Daisuke Nanba
Senior Research Fellow Center, Ehime
University

体を室温で１時間、または４℃で約 16 時間反応させ、対応する２次抗体で室温下 1 時間処理を行った。また画像はAxiovert 200M（Zeiss）を用いて取得した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

3．結

時間後の細胞接着効率に変化がないことから、これら化合

果物は、播種後の細胞接着速度を増大させる働きがあること

3. 1 低分子化合物のヒト表皮角化細胞コロニー形成能への影響我々が見出した培養ヒト表皮角化幹細胞のクローナル・が明らかとなった。

3. 4

低分子化合物の細胞死への影響

コンバージョンにおける細胞生物学的な変化（難波ら、論低分子化合物の細胞死に対する影響を明らかとするため

文投稿中）に影響を与える市販の低分子化合物を 10 種類選に、細胞死（アポトーシス）の際に見出される活性型カス択し検索した結果、３種類の化合物が細胞播種後 24 時間のパーゼ３を認識する抗体と、角化細胞のみを特異的に認識処理で、コロニー数（図１a、b）とコロニーの面積の増大する凡ケラチン抗体で二重染色を行い、角化細胞中でアポをもたらした（図１a、c）。

トーシスを起こしている細胞の割合を計測した。その結果、培養開始後 12 時間で、コントロールと化合物を加えたも

3. 2

ヒト表皮角化細胞クローンへの影響のに有意な差は観察されなかった（図３c）。

特にコロニー形成能に対して影響の大きかった化合物Ａに関して、角化細胞のクローンに対して実験を行った結果、ほぼ全てのクローンのコロニー形成能を増大させた
（図２）。

3. 5

低分子化合物の処理時間の検討

見出した低分子化合物は細胞接着を早く起こさせることによって、コロニー形成能を増大させていると考えられる。

3. 3

低分子化合物の細胞接着能への影響

特に化合物ＡおよびＢは、細胞播種後 1 時間で接着率を最各低分子化合物の細胞接着能に関する影響を調べるため、大化させている。十分効果的な低分子化合物の処理時間を細胞播種後 0.5、1、3、6、12 時間後にそれぞれ細胞を固定検討するため、細胞播種後に 1、3、6、12 時間で通常培地し、角化細胞のみを特異的に認識する凡ケラチン抗体で免交換を行った。その結果、低分子化合物の処理時間は１時疫染色を行い、単位面積あたりの接着細胞を測定した。そ間で十分効果的であることが明らかとなった（図４）。まの結果、化合物ＡおよびＢは、細胞播種後 1 時間で最大のたコントロール実験においても播種後１時間の培地交換で細胞接着をもたらすことが明らかとなった（図３a、b）。ま大きなコロニー形成能の低下は起きていないことから、コた化合物Ｃも同様に、細胞接着速度を増大させた（図３a、ロニーを形成する角化細胞は、播種後約１時間で接着するb）。コントロールと化合物を加えたものでは、播種後 12細胞であることが強く示唆された。

図１ 低分子化合物によるコロニー形成能の増大a）6cm の細胞培養ディッシュに 200 個のヒト表皮角化細胞を播種し、同時に 3 種類の低分子化合物を最終濃度 10μM で添加した。培養開始から 24 時間後に培地を交換し、さらに 11 日間培養を行い（計 12 日間）、細胞を 10% ホルマリンで固定後、1% ローダミン B で染色した。スケールバー：10 mm。
b）培養 12 日後のコロニー数。
c）培養 12 日後の面積が 7mm2 以上のコロニーの割合。低分子化合物Ａ、Ｂ、Ｃを培養開始後 24 時間添加することによって、コロニー数と各コロニー面積の増大が観察された。

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図２ 角化細胞クローンに対する化合物Ａの効果
角化細胞をクローニングし、各クローンに対する化合物Ａの効果を 12 日間培養することで評価した。化合物
Ａを培養開始後すぐ添加し 24 時間後に培地交換した。(a) と (b) は独立したクローン解析。スケールバー：10mm。増殖活性の異なる角化細胞クローンに対して、化合物Ａはコロニー形成能を増大させた。

図３ 低分子化合物の角化細胞接着および細胞死への影響
a）角化細胞を低分子化合物存在下で播種後、0.5、1、3、6、12 時間後に固定し、角化細胞を特異的に認識す
る凡ケラチン抗体で免疫染色することで、単位面積当たりの接着した角化細胞の数を測定した。
b）培養開始後、１時間後の接着した角化細胞の数。
c）培養開始後 12 時間で細胞を固定し、角化細胞のうちでアポトーシス細胞で検出される活性型カスパーゼ 3を発現している細胞の割合。低分子化合物は細胞接着速度を増大させたが、細胞死を抑制することはなかった。

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４．考おいて評価されるヒト表皮角化幹細胞とは、迅速に接着す察ることができる細胞であると考えられる。この特性を明ら

ヒト表皮角化細胞のコロニー形成能の測定は、個々の角化細胞の増殖能力を容易に可視化できる評価方法である。

かにすることで、新しいヒト表皮角化幹細胞像が見えてくると予想される。

表皮角化幹細胞は特にコロニー形成能が高いことが知られ本研究で見出された低分子化合物は、非常に短い処理時ている 5）。今回、この実験法を用いて、表皮角化細胞のコ間で、ヒト表皮角化細胞の培養効率を改善することができロニー形成能を増大させる低分子化合物の検索を行ったとた。それは特に幹細胞のような非常に増殖能の高い角化細ころ、三種類の化合物を見出すことができた。これらの化胞が増大したためであると推測される。このような化合物合物はすべて細胞のある基本的特性を阻害する。今回の研を用いることで、迅速な培養表皮シートの作製が可能とな

究では、この基本特性の阻害が、角化細胞の迅速な接着をり、広範囲重度熱傷や先天性表皮疾患などへの治療に対し促すことが明らかとなった。細胞基質間の接着を担う b 1て、培養表皮シートの応用可能性が益々増大するものと期インテグリンタンパク質の発現量の高い細胞が、コロニー形待される。

成能の極めて高いヒト表皮角化幹細胞であるという報告 11）

５．総がある。本研究では、化合物によるインテグリン分子の発括現制御に関して実験を行っていないが、化合物処理１時間ヒト表皮角化細胞のコロニー形成能を増大させる低分子という非常に短い時間で十分な効果を発揮することから、化合物を見いだすことに成功した。その作用機序の一部は、コロニー形成能の増大には、インテグリン分子の量以外に角化細胞の接着速度の促進であると考えられる。これらのも重要な要素が存在することが示唆される。

化合物が実際に培養表皮シートの作製に用いるため、さら短時間の化合物処理による迅速な接着がコロニー形成能なる条件検討や安全性の検討が求められる。最後に、本研を増大させる事実は、迅速に角化細胞を培養面に接着させ究の遂行にあたり御支援をいただいたコスメトロジー研究ることによって、どのような増殖活性を持つ角化細胞も増振興財団に深く感謝申し上げます。

殖活性が増大することを示唆している。すなわち培養系に図４ 低分子化合物の処理時間の検討
a）細胞播種後直ちに低分子化合物を添加し、1、3、6、12 時間後に培地交換を行った後、計 12 日間培養を行い、コロニー形成能を測定した。スケールバー：10mm。
b）低分子化合物処理時間と 12 日後の総コロニー数。
c）低分子化合物処理時間と 12 日後の面積が 7mm2 以上のコロニーの割合。1 時間の低分子化合物処理でコロニー形成能に関して、十分な効果が観察された。

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