天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明
名城大学理工学部

景山

伯春

Mycosporine-like amino acids (MAAs) are a group of water-soluble, low-molecular-weight secondary metabolites
known as a natural biological sunscreen. Since it has been suggested that MAAs possessed multiple bioactivities forhealth and beauty, a universal production process of MAAs from biomass is an important subject. Here, we developed
a broadly applicable and cost-effective method for the purification of MAAs from cyanobacterial cells. Because of theirphotoautotrophic property, the cyanobacteria, which are photosynthetic microorganisms, are of interest as a natural sourceof useful compound production. The purification method presented here was designed and developed by using a halotolerantcyanobacterium Halothece sp. PCC7418, which could produce a rare MAA, mycosporine-2-glycince (M2G). A threestep separation process using low pressure liquid chromatography yielded high-purity M2G. Moreover, the most commonMAAs, shinorine (SHI) and porphyra-334 (P334) could also be successfully purified from commercialized sunscreen reagent
Helioguard®365 by utilizing this method. The experimental parameters obtained in this study might allow for a scale-upof the MAA production process for future commercialisation. From the viewpoint of application as skin care ingredient,antioxidative activities of purified MAAs were evaluated by the 2,2ʼ-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) assay. Inhibitory activities of these MAAs toward tyrosinase, which is known to be an enzyme involved in melaninbiosynthesis, was also investigated.

１．緒活性 3）、酸化ストレスによる細胞死の抑制 3）、コラゲナー

言ゼ活性阻害 4 , 5）や蛋白質の糖化抑制 5）といった活性を示す

シアノバクテリアは光合成によって光エネルギーと二酸化炭素を様々な有機化合物に変換することができる。そことが報告されている。図 1 に M 2 G、SHI および P 334 の分子構造を示す。の光合成能、増殖力および遺伝子操作の容易さから、シ将来的に、さらなる MAA の機能評価を行う際には、高アノバクテリアは有用物質の工業生産への応用が期待さ純度の標品が必須である。これまでに、シアノバクテリアれている。本研究で着目するマイコスポリン様アミノ酸細胞に存在する MAA について、汎用性の高い抽出手法お（Mycosporine-like amino acid, MAA）は水溶性の二次代よび同定方法の提案があった 6）が、広範囲のシアノバクテ謝産物であり、シアノバクテリア、海洋性紅藻、サンゴやリア種に適用可能な単離精製手法については報告されてい陸棲地衣類などの多様な生物において合成されることがなかった。そこで、本研究では株種に関わらずシアノバク

1）知られている 。これまでに 30 種を超える MAA が報告

テリアから効率よく高純度で MAA を獲得するためのプロされており、これらの吸収極大は紫外線（UV）領域であるセス開発を目指した。その結果、コストメリットの高い低圧268 〜 362 nm の範囲に存在する 1）。この特性を利用して、クロマトグラフィーを適用し、耐塩性シアノバクテリアかMAA は UV-A 吸収製剤 Helioguard 365 などとして既に製ら M 2 G を高純度で獲得する手法を確立した。この手法は、品化されている。Helioguard 365 にはリポソーム化されHelioguard 365 に含まれるリポソーム化された SHI およびた紅藻由来の shinorine（SHI）および porphyra- 334（P 334）

P 334 の単離精製にも適用可能だった。また、精製 MAAが含まれている。シアノバクテリアにおける MAA の生理を用いて皮膚のアンチエイジングに関わる生理活性である的な役割はまだ完全には明らかにされていないが、UV 防抗酸化活性およびチロシナーゼ阻害活性の評価を行った。

2）

御や細胞内の浸透圧調節を担うと考えられている 。さら２．方に、近年になって MAA の様々な生物学的活性が報告されている。例えば、耐塩性シアノバクテリアから単離した

法

2 . 1. MAAの抽出

mycosporine- 2 -glycine（M 2 G）は、フリーラジカル消去

耐塩性シアノバクテリア Halothece sp. PCC 7418 の培養液から細胞を回収し、適量のメタノールを加えた後に超Mycosporine-like amino acids as naturalsk i n ca re i ng red ient s : P roduct ion
development and investigation of biological
functions
Hakuto Kageyama
Faculty of Science and Technology, Meijo
University

音波処理を施すことで細胞を破砕した。遠心分離によって得られた上清をメタノール抽出液とした。メタノール抽出液を減圧遠心乾燥した後、乾燥物に純水を加えて溶解した。遠心分離によって不溶性物質を除いた後に得られた上清に対してクロロホルムを若干量加えた。懸濁後、遠心分離によって得られた上層（水層）を回収した。クロロホルム−4−

天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明

中に色素が溶解するため、この操作を行うことで水層の色れる画分を回収した後に凍結乾燥したサンプルを最終精製は濃緑色から無色に近くなる。続いて、限外ろ過によって物とした。

3 , 000 Da 以上の溶解物を除き、これを低圧クロマトグラ

2 . 3 . 精製 MAAの同定フィーに供する M 2 G の抽出液とした。
SHI および P 334 については、Helioguard 365 より抽出精製した MAA は、吸収スペクトル解析および高速液体した。Helioguard 365 はエイチ・ホルスタイン社より提クロマトグラフィー（HPLC）解析によって標準物質と比較し供いただいたサンプルを用いた。まず、Helioguard 365

た。HPLC 分析においては、ShimPack FC-ODS columnを減圧遠心濃縮し、適量の純水と混合した。遠心分離によ（3 µm; 15 0 ×4 . 6 mm）をメインカラムとし、ガードカラムとって不溶性物質を除いた後に得られた上清に対して、上清して ShimPack FC-ODS column（3 µm; 3 0×4 . 6 mm）をと等量程度のクロロホルムを加えた。懸濁後、遠心分離に接続した。カラムを 3 5 ℃に保ち、移動相として 1 % 酢酸水

よって得られた上層（水層）を低圧クロマトグラフィーに供溶 液を用いて流 速 0 . 4 mL/minで分 離した。検出波 長はする SHI および P 334 の混合抽出液とした。

33 0 nmとした。また、LC/MS 解析によって各 MAAの分子量を測定すると共に、AVANCE III HD による核磁 気2 . 2 . MAAの分離共鳴（NMR）解析によって MAA の分子構造を確認した。

２. 2. 1. 溶離液として1%酢酸水溶液を用いた逆相クロマ

2 . 4 . 精製 MAAの抗酸化活性測定

トグラフィー
Cosmosil 40 C 18 -PREP（ナカライテスク社製）をポリカ

2 , 2 ʼ-azino-bis（3 -ethylbenzothiazoline- 6 -sulfonicーボネート製の空カラム（18×300 mm）に充填したカラムacid）（ABTS）法を利用した。ABTS をペルオキソ二硫酸を用いた。溶離液として 1 % 酢酸水溶液を使用して、流速カリウムと反応させて、ABTS ラジカルカチオンを調製し、3 . 0 mL/min で MAA 抽出液を分画した。各画分の吸光度

これを MAA 試料と反応させた。MAA の抗酸化力によっ（330 nm）を分析し、MAA が含まれる画分を回収した後にて消失した ABTS ラジカルカチオン量を吸光度（413 nm）

凍結乾燥した。

により定量し、陽性対照として用いた Trolox の抗酸化力

２．２．２.と比較した。

溶離液として 0.1 M 酢酸アンモニウム水溶液を用いた逆相クロマトグラフィー
2 . 2 . 1 . において凍結乾燥した試料を適量の 0 . 1 M 酢酸

２. 5 . 精製 MAAのチロシナーゼ阻害活性測定

アンモニウム水溶液に溶解し、2 . 2 . 1 . と同様のカラムをメラニン生合成における中間体物質の L-DOPA を基用いて分離した。溶離液として 1 % 酢酸水溶液を使用して、質として用い、マッシュルーム由来のチロシナーゼの触流速 3 . 0 mL/min で対象の MAA を分画した。各画分の吸媒作用によって酸化された DOPA キノンを経て生成した光度（330 nm）を分析し、MAA が含まれる画分を回収した

DOPA クローム量を吸光度（492 nm）により定量した。陽後に凍結乾燥した。

性対照としてコウジ酸を使用し、MAA のチロシナーゼ阻

２. ２. 3.

害活性を評価した。

ゲルろ過クロマトグラフィー

2 . 2 . 2 . において凍結乾燥した試料を適量の純水に溶３．結解し、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した。SephadexG- 10（GE ヘルスケア社製）をポリカーボネート製の空カラ果

３. 1. M 2 G の単離ム（14 × 500 mm）に充填したカラムを用いた。溶離液とし本研究で確立した手法を用いることで、湿重量 1 . 0 gて純水を使用して、流速 2 . 0 mL/min で MAA 抽出液を分の Halothece sp. PCC 7418 細胞あたり 87〜140 µg の精製画した。各画分の吸光度（330 nm）を分析し、MAA が含まM 2 G が得られた。HPLC 分析における M 2 G のピーク面積

図 1 本研究において用いた MAA の分子構造
M2G、SHI および P334 の分子構造を示す。

−5−

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

は 99 . 8 % 以上となった（図 2）。また、1 H および 13 C NMR
スペクトル解析によっても精製 M 2 G が高純度であることが示された。
3. 1. 1. M2Gの各抽出処理
まずメタノール抽出液の吸収スペクトルを確認したところ、330 nm 付近に M 2 G と推定される吸収極大が検出された（図 3 A）。また、クロロフィルやカロテノイドなどの光合成色素類の吸収極大が 400 〜 700 nm の範囲に検出された（図 3 A）。次に、抽出物を乾燥させて純水に溶解させた後に得られた上清では 400 nm 以上の吸光が著しく低下しており、色素類化合物の大半が除去されていることが分かった（図 3 B）。さらにクロロホルムを添加した後に得られ

図 2 最終 M2G 精製産物の HPLC クロマトグラム
M2G のピーク強度を 1.0 とした相対値を用いたクロマトグラムを示す。

た上層（図 3 C）では、400 nm 以上の波長の吸収はほとんど検出されなくなった。一方、限外ろ過処理をした試料では、処理前と比較して吸収スペクトルに顕著な違いは見出せなかった（図 3 D）。
3. 1. 2. 低圧液体クロマトグラフィーによるM2Gの精製
1 % 酢酸水溶液を用いた逆相モードによる一段階目の精製処理では、260 nm 付近の大きな吸収極大が残存した（図3 E）。その吸収波長から、核酸系の不純物が混入していると推定された。その後、溶離液として 0 . 1 M 酢酸アンモニウム水溶液を用いた逆相モードによって処理することで、これらの不純物と M 2 G を分離することができた（図 3 F）。
最後にゲルろ過クロマトグラフィーによって溶解液を純水に置換して最終産物を得た（図 3 G）。

3 . 2 . SHI および P 334 の単離本研究で確立した手法を用いることで、上述した M 2 Gと同レベルの純度で SHI および P 334 を精製することができた。1 . 0 mL の Helioguard 365 からそれぞれ 110 µg（SHI）および 160 µg（P 334）を取得することができた。

3 . 3 . 精製 MAAの抗酸化活性
本研究で精製した MAA を用いて ABTS ラジカルカチオンの消去能を調査したところ、IC 50 値はそれぞれ 40 µM（M 2 G）、94 µM（SHI）お よ び 133 µM（P 334）と 求 め ら れた。一方で、陽性対照である Trolox の IC 50 値は 10 µM だった。これらの結果から、本研究で確立した手法で精製した MAA が抗酸化活性を保持しているが明らかになった。

3 . 4 . 精製 MAAのチロシナーゼ阻害活性
精製 MAA を用いてチロシナーゼ活性への阻害効果を調査したところ、最終濃度 6 . 4 mM（M 2 G）
、8 . 4 mM（SHI）
および 7 . 5 mM（P 334）で各 MAA をアッセイ系に添加しても阻害活性は検出できなかった。一方で、陽性対照のコウジ酸は 60 µM でチロシナーゼ活性を 50 % 以下まで低下させた。これらの結果から、今回の調査に用いた MAA はチ

図 3 M2G の各抽出および精製ステップにおける試料の吸収ス
ペクトル
各パネルはそれぞれ A: メタノール抽出液、B: メタノール抽出液の乾燥物を水に溶解した後の上清、C: クロロホルム処理後の上清、D: 限外ろ過後の試料、E: 一段階目の逆相分離後の試料、F: 二段階目の逆相分離後の試料、G: ゲルろ過分離後の試料を示す。
スペクトルは、220 〜 800nm の範囲で最も吸光度の大きい値を 1.0 とした相対値で示してある。

−6−天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明

Commun. 14, 1-6. 2019.

ロシナーゼ阻害活性を有しないことが示唆された。

４．考4） Waditee-Sirisattha, R.; Honda, M.; Hibino, T.;

察Kageyama, H. Potential inhibitory effects of plant and

本研究で提案した精製手法は、MAA の抽出液を二段階

cyanobacteria-derived natural products on advancedの逆相クロマトグラフィーに供すものである。逆相クロマ

glycation end-product formation. In A Closer Look

トグラフィーはその分離特性、理論段数および再現性の高at Glycation: A Potential Hotspot for Age-Related

さから広く物質の分取精製に用いられている。しかしな

Complication and Diseases ; ansari, N.A., Ed.; Nova

がら、分取カラムおよび分取 HPLC システムはスケールがScience publishers, Inc.: Hauppauge, NY, USA, 2 0 2 1;

大きくなる程に高価となるため、より低コストの手法が望pp. 201-224.

ましい。本研究においては、コストメリットの大きい粒子
径 40 µm の汎用型オクタデシルシリル担体をポリカーボネ

謝

辞ート製カラムに充填し、低圧システムによって分離操作を本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス行うこととした。酸性溶離液（1 % 酢酸水溶液）および中性メトロジー研究財団（旧公益財団法人コスメトロジー研究溶離液（0 . 1 M 酢酸アンモニウム水溶液）を用いた二段階の振興財団）よりご助成いただきましたことに心より感謝申

分離処理により、不純物を効率よく除去することができたし上げます。

（図 3）。同一のカラムを用いた二段階の処理は、低コスト化に貢献できると考えられる。逆相分離に続いて行うゲル（引用文献）

ろ過クロマトグラフィーにおいては溶離液として純水を用

1） Wada, N.; Sakamoto, T.; Matsugo, S. Mycosporine-

いており、凍結乾燥した最終産物には溶離液に由来する化

like amino acids and their derivatives as natural

合物は含まれない。それ故に、本手法によって精製した

antioxidants. Antioxidant 4, 603-646. 2015.

MAA は多様な評価試験に適用可能である。

2） Kageyama, H.; Waditee-Sirisattha, R. Mycosporine-

本研究では精製した M 2 G、SHI および P 334 を用いて抗like amino acids as multifunctional secondary

酸化活性を ABTS 法によって評価し、テストした MAA 全

metabolites in cyanobacteria: From biochemical toてが活性を示すことを明らかにした。一方で、メラニン生

application aspects. Stud. Nat. Prod. Chem. 5 9, 1 5 3-合成に関与する酵素であるチロシナーゼに対する阻害活性194. 2018.

は検出されなかった。しかしながら、皮膚の弾力性やハリ

3） Cheewinthamrongrod, V.; Kageyama, H.; Palaga,を保つコラーゲンを分解するコラゲナーゼの阻害活性を有T.; Takabe, T.; Waditee-Sirisattha, R. DNA damage

することが既に分かっているなど 4 , 5）、スキンアンチエイ

protecting and free radical scavenging properties

ジング剤応用への MAA の期待は大きい。今後も、関連すof mycosporine-2-glycine from the Dead Sea

る物性の評価を行い、ネガティブな結果を含めて知見を積

cyanobacterium in A375 human melanoma cell lines. J.

み上げることが重要である。

Photochem. Photobiol. B 164, 289 - 295. 2016.
4） Hartmann, A.; Gostner, J.; Fuchs, J.E.; Chaita, E.;

本研究助成により得られた成果

Aligiannis, N.; Skaltsounis, L.; Ganzera, M. Inhibition

1） Ngoennet, S.; Nishikawa, Y.; Hibino, T.; Waditee-of collagenase by mycosporine-like amino acids frommarine sources. Planta Med. 81, 813 - 820. 2015.

Sirisattha, R.; Kageyama, H. A method for isolation andcharacterization of mycosporine-like amino acids from5） Tarasuntisk, S.; Patipong, T.; Hibino, Y.; WaditeeSirisattha, R.; Kageyama, H. Inhibitory effects ofcyanobacteria. Methods and Protoc. 1, 46. 2018.
2） Kageyama, H.; Waditee-Sirisattha, R. Antioxidative,

mycosporine-2-glycineisolated from a halotolerantanti-inflammatory, and anti-aging properties ofcyanobacteriaumon protein glycation and collagenase

mycosporine-like amino acids: Molecular and cellular

activity. Lett. Appl. Microbiol. 67, 314 - 320. 2018.

mechanisms in the protection of skin-aging. Mar Drugs

6） V o l k m a n n , M . ; G o r b u s h i n a , A . A . A b r o a d l yapplicable method for extraction and characterization

17, 222. 2019.
3） Patipong, T.; Hibino, T.; Waditee-Sirisattha, R.;of mycosporines and mycosporine-like amino acids

Kageyama, H. induction of antioxidative activity andof terrestrial, marine and freshwater origin. FEMS

antioxidant molecules in the halotolerant cyanobacterium

Microbiol. Lett. 255, 286 - 295. 2006.

Halothece sp. PCC7418 by temperature shift. Nat Prod−7−