皮膚ABC 膜輸送体に及ぼす化粧品添加物の影響

金沢大学

医薬保健研究域薬学系

加 藤

分子薬物治療学研究室

将 夫

The skin represents physical and biochemical barrier between the body and the environment, serving to exclude
xenobiotics and microorganisms and to prevent unregulated water loss from the body into the atmosphere. The physicalbarrier is mainly localized in stratum corneum (SC) whereas a biochemical barrier also exists in skin epithelial cells
beneath the SC. The biochemical barrier includes metabolic enzymes and transporters that mediate detoxification andefflux of xenobiotics. This barrier has an important influence on absorption of xenobiotics, though the mechanisms of its
effects on the absorption generally remain to be fully established. We have recently clarified the role of two ATP binding
cassette (ABC) transporters, P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP), in transdermal absorptionof a typical substrate in vivo. This finding may imply the possible interaction of these ABC transporters with cosmetic/
pharmaceutical excipients, leading to the change in transdermal permeation of constituents/drugs. Therefore, the purposeof the present study was to clarify the inhibition potential of several cosmetic excipients on P-gp and BCRP. The inhibitory
effect was assessed by the uptake study of a typical BCRP substrate Hoechst33342 in MDCKI cells stably transfected with
BCRP gene (MDCKI/BCRP). In the presence of several excipients, uptake of Hoechst33342 in MDCKI/BCRP cells washigher than that in their absence, suggesting that BCRP is inhibited by those excipients. Such inhibition profile was found tobe concentration-dependent for the excipients. The inhibition was further demonstrated by the transcellular transport studyof Hoechst33342 in MDCKI/BCRP cells in the presence or absence of those excipients. It was found that the inhibition
potential is partially correlated with a certain physicochemical parameter. Thus, our findings suggest that some of cosmetic
excipients inhibit the function of BCRP. Further studies are required to clarify the relevance of such inhibition with thechange in transdermal permeation of cosmetic constituents and pharmaceutical drugs.

１．緒

我々は皮膚に膜輸送体が存在し、ある種薬物の表皮側

言から血液中への吸収や、血液中から皮膚への分布に関与

皮膚は表皮、真皮及び皮下組織から構成され、毛嚢、汗することを示してきた 4−7）。中でも P-glycoprotein（P-gp）腺、脂腺などの付属器官が表皮から真皮を貫通する（図１）。と breast cancer resistance protein（BCRP）は、 と も に

皮膚は外界から体内への外因性物質の侵入を防ぐバリアとATP の加水分解で生じるエネルギーを駆動力として多種考えられている。表皮の中で最も外層の角質層は脂質とケ多様な物質を細胞内から細胞外へ排出する ATP binding

ラチンで満たされており、外因性物質の経皮吸収に対してcassette（ABC 膜輸送体）である。P-gp はマウス 6，7）および最も高いバリア能を有する。角質層は、有害物質の侵入やヒト 8）で真皮に存在し、マウスにおいては真皮の血管内皮物理的外傷、感染症から生体内の環境を守る働きがある 1，2）。に存在する 7）。一方、BCRP はマウスにおいて真皮の血管脂溶性の高い外因性物質は角質層に一部が分配内皮に、ヒトでは表皮の基底層や真皮の血管内皮に局在す（partition）し、 分 配 し た 物 質 の 一 部 は さ ら に 単 純 拡 散る 7）。

（passive diffusion）により血液方向へ移行しうる（図１）。

興味深いことに、これら P-gp と BCRP はともに基質を角質層が物理的バリアであるのに対し、角質層より下層は表皮側から真皮側へ輸送する（図１）8）。このことは、基生きた皮膚組織であり、生物的バリアとして働くと考えら質である蛍光物質 rhodamine 123（R- 123）を経皮投与しれている。生物的バリアには、皮膚に発現する代謝酵素やた際に、皮膚内あるいは血液中への R- 123 の透過が、P-gp膜輸送体が挙げられる。実際、皮膚には cytochrome P 450

欠 損 マ ウ ス あ る い は P-gp と BCRP 両 方 の 欠 損 マ ウ スなどの代謝酵素が機能的に発現する 3）。一方で膜輸送体に（mdr 1 a/ 1 b/bcrp-/-）において顕著に低下したことからもついては皮膚における発現の報告が散見されるものの、そ示される 6，7）
（図２の control）。P-gp と BCRP はともに皮膚の皮膚内での機能は永らく不明であった。

のみならず、小腸や腎臓の刷子縁膜、脳血管内皮細胞の血液側膜、肝臓の胆管側膜等に発現し、多くの薬物の排泄（小腸や脳においては吸収、分布の障壁）に働くことが示されEffect of Cosmetic Excipients on ABC
transporters in the skin
Yukio Kato
Department of Molecular Pharmacotherapeutics , Faculty of Pharmacy,
Kanazawa Universityている。従って、皮膚においてもこれら膜輸送体が、角質層に分配し表皮に到達した外因性物質の真皮・血液方向への移行に関与する可能性がある（図１）。
化粧品や医薬品には数千種類以上におよぶ添加物原料が用いられる。これらが P-gp や BCRP に影響した場合、結− 56 −

皮膚 ABC 膜輸送体に及ぼす化粧品添加物の影響

図１

皮膚における物質透過の概念図

図２ P-gp と BCRP 阻害剤 Itraconazole による表皮から真皮への R-123 移行阻害

果として経皮からの外因性物質の吸収や化粧品自身に含まれる成分の皮膚内動態に影響を及ぼす可能性がある。P-gpや BCRP が幅広い構造を認識する膜輸送体であることを考えると、この可能性は十分に考えられる。しかしこれまで、添加物が皮膚に発現する P-gp や BCRP にどのような影響を及ぼすかについて検討された例はほとんどない。本研究は、化粧品添加物の安全性の担保を目的として、P-gp とBCRP に及ぼす添加物の影響を解析した。

２．実
２.１

験

試薬および実験動物

R- 123、Hoechst 33342（H- 33342） 及 び Ko 143 は Sigma
図３

Chemical Co. Ltd.（St. Louis，MO）より、itraconazoleはLKT

In vivo 経皮吸収実験の概念図

Laboratories Inc.（St. Paul，MN）より購入した。FVBマウス（FVB/NJcl、 雄 性、7 〜 8 週 齢 ）は 日 本 ク レ ア（Tokyo，Japan）、mdr 1 a/ 1 b/bcrp-/-（FVB 系 統 雄 性、7 〜 8 週 齢 ）取り皮膚を採取した。採取した皮膚をアルミで包み、ガラは Taconic Farms Inc.（Germantown，NY）より購入した。

スシャーレに挟み 1 分間 55℃で温めた。その後 18 G の針動物はすべて標準食で飼育され、水及び食餌は自由に与えで表皮側をこそぎとった（図３）。

られた。すべての動物実験は金沢大学動物実験指針に従っR-123 の定量て行った。

皮膚サンプルはホモジネート後遠心分離し、上清を移動
In vivo 経皮投与実験（図３）相で除タンパクした。血漿サンプルは酢酸エチルを用い実験に用いたマウスは全て、実験を開始する 72 時間前液々抽出した。これらサンプル中 R- 123 濃度は HPLC を用に除毛を施した（図３）。ペントバルビタールを皮下投与

いて定量した 7）。

して麻酔をかけ、動物用バリカンで胴体の毛を剃った後、除毛クリームを適量塗り、37℃の温水で丁寧に洗い流した。

BCRP 安定発現 MDCKI 細胞による取り込み実験（Dish

除毛 72 時間後、エチルエーテル吸入麻酔下で、セロテー法）

プを用いてマウス腹部皮膚の角質層を剥離した（図３）。

BCRP ないし空ベクター安定発現 MDCKI 細胞（MDCKI

その後、投与液 100 µL を均一に染み込ませたパッチを腹/BCRP、MDCKI/mock）を 4 well plate に 培 養 し た。5 分部に貼付し、パッチの上からエラストポアを巻き付けた。

間の preincubation 後、種々の濃度の添加物を含む 5 µM

投 与 液 は R- 123 ま た は R- 123 と itraconazole を dimethylH- 33342 溶液を添加し、20 分後に蛍光観察した。画像解析

sulfoxide に溶かし、さらに HBSS で希釈して調製した。投ソフト Image J を用い、蛍光の強さを 10 回繰り返して測与後 6 時間に尾静脈から血液を採取し屠殺後、すばやく定し、これを 3 preparation で行い数値化した。

70 % エタノールを含ませたティッシュで腹部皮膚を拭き− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

３．結３.１

多数の添加物の膜輸送体への作用を、感度良く評価す果ることを目的に、BCRP についてそのスクリーニング系膜輸送体阻害剤の in vivo での効果を構築した。BCRP の典型的基質として H- 33342 を用い添加物が皮膚の膜輸送体に影響するかを検討する前に、た。MDCKI/BCRP 細胞に H- 33342 を添加すると BCRP に膜輸送体に対し阻害活性を有することが分かっている阻害よって効率良く細胞外へ排出されるため、蛍光顕微鏡で観剤 itraconazole を用い、in vivo において阻害剤による膜輸

察しても H- 33342 の蛍光はわずかしか検出されない（図４

送体機能制御の有無を検討した。膜輸送体の機能を評価し左、control）。一方、BCRP 阻害剤である Ko 143 を同時にやすい系として、角質層を剥離した系を用いた。R- 123 の添加すると、BCRP の活性が低下するため H- 33342 が細胞みを経皮投与後の表皮への分布は、wild-type（野生型）と内に検出される（図４右）。一方、BCRP を発現していない

mdr 1 a/ 1 b/bcrp-/- で同程度であった一方、真皮と血漿中MDCKI/mock 細胞を用いて同様の解析を行うと、control-/-への R- 123 の移行は mdr 1 a/ 1 b/bcrp で低下した（図２）。

条件下でも高い蛍光が細胞内に観察され、Ko 143 同時添加

一 方、itraconazol を 同 時 投 与 し た と こ ろ、R- 123 の 皮 膚による影響は見えなかった。以上より得られる画像を定量

分 布 と 吸 収 は、 表 皮、 真 皮、 血 漿 い ず れ も wild-type と化することにより、BCRP の活性変化を可視的に解析する-/--/-

mdr1a/1b/bcrp で同程度であった（図２）。mdr1a/1b/ bcrpことが可能となった。
次 に、 各 添 加 物 を 種 々 の 濃 度 で H- 33342 と と も に

では、itraconazole の影響がほとんど見られなかった（図MDCKI/BCRP 細胞に添加し、同様な解析から添加物濃度２）。
角 質 層 を 剥 離 し な い 系 で も R- 123 と itraconazole を 併依存的な蛍光強度の上昇を観察し、各添加物の BCRP に対用 投 与 し、6 時 間 後 で の 皮 膚 中 濃 度 を 測 定 し た。R- 123する阻害定数（Ki；50％阻害を与えるのに必要な濃度）をの皮膚への分布量は角質層を剥離した系の 1 / 10 程度で求めた。図５には、阻害効果を示した各添加物の Ki 値とあったが、角質層を剥離した系、しなかった系ともに、物理化学的パラメータとの相関を示した。ここで、xlogP

itraconazole 併用により R- 123 の皮膚への分布は control のはオクタノール／水分配の計算値であり、http://www.

半分程度にまで低下した。

ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/ より入手した。また、a 値
は有機概念図を利用して得られる極性の尺度（有機性と無３. ２膜輸送体に及ぼす添加物の影響機性のバランス）である。その結果、阻害定数は分子量、添加物自身の皮膚への浸透性を考慮するため、膜透過性a 値とは明確な相関がなかった一方、xlogP とはやや相関が良いと思われる電気的中性の物質、皮膚表面の電荷と比較的強く相互作用すると思われる極性物質など、幅広い極性を有する構造類似体を検討対象に加えた。これまでに 16 種類（ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、
1 . 3 ブチレングリコール、サリチル酸エチレングリコール、オレイルアルコール、ポリエチレングリコール 400、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、イソステアリン酸、安息香酸、セバシン酸ジエチル、炭酸プロピレン、トリアセチン、アジピン酸ジイソプロピル）について阻害効果を検討した。

図５

図４

Image J を用いた BCRP 阻害解析

添加剤の物理化学的パラメータと BCRP に対する阻害定数（Ki）との関係− 58 −

皮膚 ABC 膜輸送体に及ぼす化粧品添加物の影響関係が認められ、xlogP が 3 〜 4 付近で最も強い阻害効果

質層の有無に関わらず、P-gp 基質の皮膚透過を in vivo で（低い Ki）が得られる傾向にあった（図５）。

抑制する。従って、添加物についても今後さらに詳細な検続いて、BCRP に対する阻害効果をより明確に示す目的で、BCRP による H- 33342 の経細胞輸送を評価し、添加討を進め、皮膚の膜輸送体をどの程度阻害しうるかを解明する必要がある。

物の効果を検討した。取り込み試験において阻害効果の化粧品添加物が BCRP を阻害することが実際、生体にど認められた添加物を、H- 33342 とともに MDCKI/BCRP 細のような影響を与えるかについても、さらに検討が必要で胞の basal もしくは apical 側に添加後、反対側に出現したある。BCRP は皮膚においては基質の吸収方向への輸送にH- 33342 を測定したところ、control においては BCRP に関与するため、もし BCRP が全身作用を狙った外用剤に含よる排出を反映して basal から apical 方向（BL-to-AP）がまれる薬物の吸収に関与しているとすれば、添加物は当該逆方向（AP-to-BL）よりも高かったのに対して、添加物薬物の効果に負の影響を与えうる。また、BCRP の遺伝子共存下ではそのような方向性が低下した。同様な実験を

変異は抗悪性腫瘍薬スニチニブによる皮膚毒性と関係する

MDCKI/mock 細 胞 で も 行 い、efflux ratio- 1（BCRP を 介との報告がある 9）。従って、BCRP への阻害作用は同様なした膜透過に比例する値）を算出したところ、control で副作用とも関連する可能性がある。一方で、化粧品は一般

4 . 27、添加物存在下で 1 . 75 となり、半分弱にまで低下がに、角質層や表皮への作用が期待され、真皮や血漿中への認められた。以上より、経細胞輸送の系でも、添加物が成分の移行は望ましくない。その点、P-gp や BCRP を阻BCRP を阻害することが示された。

害することは、表皮から真皮への物質移行を妨げることに

現在、P-gp に及ぼすこれら添加物の影響についても、つながり、化粧品自身の安全性の観点からは、阻害作用が典型的基質である R- 123 の細胞内への取り込みと経細胞輸

むしろ beneficial かもしれない。今後さらなる検討を行う

送に対して評価しており、結果は現在執筆準備中の投稿論ことで、皮膚組織内での添加物の影響を解明し、化粧品の文に掲載予定である。

安全性向上に発展できればと考える。

４．考察

５．総

括

本研究で得られた興味深い知見の一つは、いくつかの添皮膚に発現する ABC 膜輸送体の一部が、添加物によっ加物が BCRP を阻害したことである。これら添加物が、仮て阻害されることが示唆された。一方で皮膚組織中での添に表皮組織内へ Ki 値に近い濃度で分配した場合には、皮加物の作用については、さらなる検討が必要である。添加膚の BCRP を阻害しうることが示唆される。実際に皮膚に物と膜輸送体との相互作用は、化粧品の安全性を考える上発現する BCRP を、添加物が阻害できるか否かについては、で今後さらに解明する必要がある。

今回得られた Ki 値と、添加物自身の角質層への分配、表皮への拡散などの要因も影響するため、今回の結果から謝

ただちに皮膚 BCRP の阻害が見られると結論づけることはできない。しかしながら、図２に示すように、少なくとも

辞研究助成を賜りました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に心より御礼申し上げます。

P-gp や BCRP の阻害剤である itraconazole については、角図６

BCRP による H-33342 経細胞輸送に及ぼす添加物の阻害効果− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

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