機能食品成分によるＴ細胞分化のエピジェネティクス制御機構の解明

関亦

山形大学医学部看護学科

緒言正幸非常勤職員が存在しており、これらの働きがあってはじめて時間的、免疫システムは我々の身体を多種多様な病原体から空間的な遺伝子発現が制御できると考えられている 3）。

守っており、ヘルパー T（Th）細胞はこのシステムに腸管粘膜において重要な役割を果たしている IL−22 の発おいて司令塔的役割を担っている。Th 細胞は侵入した現調節においては、これまでにプロモーターについて病原体の種類に応じて機能の異なるエフェクター細胞の解析が報告されているに過ぎない 2）。本研究では、機（Th1、Th2、Th17）に分化し、特有のサイトカインを能食品成分に含まれる低分子化合物によるエピジェネ産生することで病原体排除に最適な免疫応答を誘導すティックなＴ細胞分化制御の分子基盤の構築を目指してる。例えば、Th1 細胞はインターフェロンガンマ（IFN-いる。そこで、本研究目標遂行のための第一歩として、γ）を産生することで細胞性免疫に関与し、Th2 細胞

IL−22 遺伝子の発現制御に関与するプロモーター以外のはインターロイキン 4（IL−4）を産生することで抗体未知なるシス調節領域を同定し、これらシス調節領域に産生の調節に関与する 。このように、Th 細胞の産生よるエピジェネティックな IL−22 遺伝子発現調節機構するサイトカインは免疫応答のメディエーターとして重の解明を進めた。

1）

要な役割を果たす一方で、その不適切な産生は様々な免結疫疾患の原因となる慢性炎症を誘発する。
炎症性サイトカイン IL−22 は IL−10 ファミリーに属

1果IL-22遺伝子シス調節領域の同定するサイトカインであり、IL−10R2 と IL−22R1 からな

シス調節領域には、主に二つの特徴があることが知らるヘテロ二量体を受容体とする。IL−10R2 の発現が多れている。一つは、染色体 DNA 上のタンパク質非コー岐にわたるのに対し、IL−22R1 の発現は小腸・呼吸上ド領域に存在しているにも関わらず、様々な生物種間で皮細胞、皮膚角化細胞、肝臓細胞などの非造血系細胞に高度に保存されていることである。もう一つは、転写限局している。このことから、IL−22 の標的となる細胞因子が結合できるように、細胞分化特異的に開いたクは、様々な病原体に暴露される上皮系細胞と考えられてロマチン構造に変換していることである 3）。そこで、こいる。約１０００種類もの細菌が生息している腸管におれら２つの特徴に基づいて、IL−22 遺伝子近傍に潜む未いて、主に Th17 細胞から産生される IL−22 は、病原知のシス調節領域の単離を試みた。まず、ウェブ上で体からの防御機能や損傷組織の修復再生に重要なサイト提供されている VISTA プログラムにより、ヒトとマウカインである。ところが、長期にわたる IL−22 の過剰ス間で高度に保存された配列を検索し、IL−22 遺伝子上産生は、IL−17 や IFN−γなどの他の炎症性サイトカイン流に３つの非コード保存配列（Conserved Noncodingと協調作用することで、炎症性腸疾患を引き起こすと考Sequence：CNS） を 同 定 し た（ 図 １）
。 一 方、IL−22えられている。このような背景から、IL−22 の遺伝子発遺伝子の下流には CNS は認められなかった。これら

現調節の分子機構を解明し、IL−22 の適切な発現を調節の CNS はマウス IL−22 遺伝子の上流、−18、−25、−できれば、炎症性腸疾患の治療に貢献できるのではない

32kb 領域に、1kb 長程度の断片として存在していた。
同定した CNS のクロマチン状態を、我々がこれまでかと期待されている 。
2）

染色体 DNA 上にはタンパク質をコードしている遺伝に解析報告した DNaseI 超感受性部位のデータと比較

子以外に、遺伝子発現の調節に関与するプロモーター、した。その結果、これらの CNS は Th 細胞分化特異的エンハンサー、サイレンサーなどの様々なシス調節領域に開いたクロマチン構造をしていることが判明した（図1

関

図1

亦正幸

VISTA プログラムによる非コード保存配列（CNS）の同定

VISTA プログラム（http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml）による、ヒトとマウス間で高度に保存された IL-22 遺伝子近傍の非コード保存配列（Conserved Noncoding Sequence：CNS）の同定。CNS は IL-22
プロモーターから 18、25、32kb 上流にのみ存在していた。

図2

DNaseI 超感受性部位決定法によるシス調節領域の同定

Th1、Th2、Th17 細胞の IL-22 遺伝子近傍において、細胞分化特異的に開いたクロマチン構造をしている領域を DNaseI 超感受性部位決定法で解析した。その結果、DNaseI 超感受性部位のピークと３つの CNS 領域が一致していることが判明した。

２）。以上のことから、同定した３つ CNS が IL−22 遺の 他 の CNS−18、CNS−25 に は、IL−22 プ ロ モ ー タ ー

伝子のシス調節領域として機能している可能性が示唆さに対する特異的な活性は認められなかった。

れた。
32

シス調節領域の機能解析

転写因子IκB-ζによるCNS-32エンハンサー機能の調節

同定した３つ CNS の機能を、ルシフェラーゼレポー

次に、CNS−32 エンハンサーの機能を発揮するためターベクターを用いたマウス胸腺腫細胞 EL−4 細胞へのに必要な分子機構の解明を行った。Genomatix プログ

トランスフェクション活性測定法で解析した 。マウス

ラムを用いて、CNS−32 エンハンサーに結合し、そのIL−22 プロモーターをクローニングして、その上流に各活性調節に関与すると思われる転写因子の検索を試み

CNS を組入れたルシフェラーゼレポーターベクターをた。これまでに他の研究者による解析から、IL−22 プ作製し、転写されるルシフェラーゼ酵素活性を指標とし

ロ モ ー タ ー に 結 合 す る STAT3 (Signal Transductionてこれら CNS の機能を解析した。その結果、CNS−32

and Activator of Transcription)、c−Maf、AHR (arylのみに IL−22 プロモーター活性を強く促進するエンハhydrocarbon receptor)、RORγt (RAR−related Orphan

ンサー活性があることが判明した（図３）。しかし、そReceptor Gamma)、Batf (Basic Leucine Zipper

4）2機能食品成分によるＴ細胞分化のエピジェネティクス制御機構の解明

図3

CNS-32 のエンハンサー活性測定とベクターの模式図単離した IL-22 プロモーターと各 CNS を組込んだルシフェラーゼレポーターのベクターをマウス EL-4 細胞にトランスフェクション後、転写されるルシフェラーゼ酵素の活性を測定した。その結果、CNS-32 のみにエンハンサー活性があることが判明した。

図4

フローサイトメーターによる IL-22 の発現解析

IL-1 β、IL-6、IL-23 刺激による Th17 細胞の分化誘導後、フローサイトメーターによって細胞内 IL-22 の発現解析を行った (B)。対象として、ニュートラルな Th0 細胞の発現解析を行った (A)。転写因子 IκB-ζは IL-1
β刺激によって発現誘導されることが知られている核内 NF-κB 結合分子であり、Th17 細胞において IL-22 の転写活性の増強に関与している可能性が示唆された。FSC は前方散乱光を示している。

Transcription Factor, ATF−like)、IRF4 (Interferon

ることが知られている IL−1β刺激 Th17 細胞では、IκBRegulatory Factor) などの転写因子が IL−22 遺伝子発−ζが高発現していることが報告されている。我々のフ5）

現調節に重要な役割を果たしていることが知られている

ローサイトメーター解析においても、IL−1β刺激 Th172）。これらの転写因子の結合配列も、CNS−32 エンハン細胞では IL−22 の高発現が観察された（図４）。以上のサーに存在していることが Genomatix プログラムによことから、転写因子 IκB−ζ分子は NF−κB と相互作用すり確認できた。今回、新たに転写因子 NF−κB の結合配ることで IL−22 遺伝子の転写調節に何らかの関与をし列を、CNS−32 エンハンサーに新たに同定することがている可能性が示唆された。そこで、IκB−ζ発現ベクターできた。この NF−κB 結合配列は、様々な種間で高度にを用いて、共発現法によるルシフェラーゼレポーター活保存されていた。転写因子 NF−κB は広範囲な細胞に発性を測定した。IL−22 プロモーターの影響を排除してエ現が認められ、様々な炎症反応に関与している分子であンハンサーの機能のみを純粋に観察するために、SV40る。一方、
NF−κB の核内結合パートナー IκB−ζ分子（遺最小プロモーターの上流に IL−22 の CNS−32 エンハン

伝子名 NFKBIZ）は IL−1β刺激後に誘導される NF−κBサーを連結したレポーターベクターを新たに作製した。

調節因子である 。興味深いことに、この IκB−ζ分子と解析の結果、転写因子 IκB−ζには濃度依存的な転写増IL−22 の発現には相関関係がみられ、IL−22 を高発現す強活性が認められた（図５）。以上の結果から、IκB−ζ

5）3関図5亦正幸

転写因子 I κ B- ζによる CNS-32 エンハンサーの増強活性SV40 最小プロモーターと各 CNS を組込んだルシフェラーゼレポーターベクターと IκB-ζ（遺伝子名NFKBIZ）発現ベクターのマウス EL-4 細胞への共トランスフェクション後、転写されるルシフェラーゼ酵素の活性を測定した。その結果、転写因子 IκB-ζ分子に CNS-32 エンハンサーの増強活性があることが判明した。

は NF−κB と相互作用することで CNS−32 エンハンサーなエピジェネティクス制御機構の解明がさらに進展するの NF−κB 結合サイトに結合し、IL−22 遺伝子発現を増ものと考える。

強していることが明らかになった。

今回の測定で使用したレポーターアッセイ法では、その他の CNS−18、CNS−25 の機能は解明できなかっ考察た。今後はインスレーターやサイレンサーなど別の活本研究により、世界に先駆け IL−22 遺伝子のエンハ性を測定できるレポーターベクターを用いて、CNS-ンサーを同定することができた。さらに、このエンハン

18、CNS-25 の機能解明も進めたい 7）。さらに、本研究サーに結合すると思われる核内 NF−κB 調節因子 IκB−

で 同 定 し た エ ン ハ ン サ ー CNS−32 と IL−22 プ ロ モ ーζ（遺伝子名 NFKBIZ）が、エンハンサー活性の増強にターの織りなす高次クロマチン構造を、Chromosome関与していることを明らかにした。Th 細胞が分化の過Conformation Capture（3C） 解 析 法 を 用 い て 決 定 し程で産生する IL−22 などの炎症性サイトカインは、宿たいと考えている 7）。同時に、この IL−22 を発現する主の感染防御や感染による組織損傷修復にとって必須のTh17 細胞分化特異的な高次クロマチン構造形成に関与分子である一方で、持続刺激による過剰な発現は様々なしている分子の同定も進めたい。これらの解析により、疾患の引き金となる慢性炎症の原因となっている。以上

高次クロマチン構造によるエピジェネティックな IL−22の理由から、厳密な炎症性サイトカイン遺伝子の発現調遺伝子の「発現と抑制」を調節しているメカニズムの解節の解明が求められている。遺伝子の直上流に位置する明に迫りたいと考えている。

プロモーターの検索と解析は、これまで比較的容易に行

本研究は、高次クロマチン構造のエピジェネティックわれてきた。実際、IL−22 遺伝子のプロモーター解析にな遺伝子発現調節機構を解明することで、機能食品成分ついては、いくつかの報告がなされている 。しかし、による IL−22 発現のスイッチを効率よく制御できる方プロモーターでは遺伝子発現の単純なスイッチのオン・法の確立を目指し研究を開始した。今後、IL−22 エンハ

オフの制御は可能であるが、分化過程での時間・空間特ンサーなどのシス調節領域が形成する高次クロマチンの異的な発現制御や発現量の微調整にはその他のシス調節同定を進め、高次クロマチンを分子標的とした機能食品領域の働きが必須である。今回、IL−22 遺伝子特異的な成分による遺伝子発現制御法を確立したいと考えていエンハンサーをはじめて同定できた。さらに、このエンる。そして、この制御技術を IL−22 発現量の調節法にハンサーに結合する転写因子 IκB−ζを同定できたこと

応用することで炎症性腸疾患やアレルギーの新たな治療で、IL−22 遺伝子の分化特異的で発現量の微調整に必要法開発につなげていきたい。

2）

4

機能食品成分によるＴ細胞分化のエピジェネティクス制御機構の解明

要文

約
本研究は、腸管粘膜における感染防御や組織損傷修

1）L.H. Glimcher, et al,:Genes Dev., 14, 1693-1711, 2000.
2）S. Rutz, et al,:Immunol. Rev., 252, 116-132, 2013.
3）C.B. Wilson, et al,:Nat. Rev. Immunol., 9, 91-105, 2009.
4）J.R. Schoenborn, et al,:Nat. Immunol., 8, 732-742,2007.
5）K. Okamoto, et al,:Nature, 464, 1381-1385, 2010.
6）K. Ghoreschi, et al,: Nature, 467, 967-971, 2010.
7）M. Sekimata, et al,:Immunity, 31, 551-564, 2009.

復において主要な役割を果たしている Th17 細胞の産生する炎症性サイトカイン IL−22 遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構を解析した。その結果、IL−22 遺 伝 子 の 上 流 32kb に 位 置 す る CNS−32 エ ン ハ ンサーを同定した。さらに、核内 NF−κB 調節因子 IκB−
ζが、CNS−32 エンハンサーへの結合を介して、IL−22遺伝子発現を正に制御しているトランス因子であることを解明した。
謝献

辞本研究の遂行にあたり、貴重な研究助成を賜りました

公益財団法人三島海雲記念財団に深く感謝いたします。

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