皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科分子細胞毒性研究室

矢嶋

伊知朗

Skin is exposed to various environmental factors and various stresses in addition to natural aging, which in turn causes
various types of damage to the skin. Ultraviolet rays are one of the environmental factors well known to cause skin damage,and are known to induce skin keratinization and melanin pigmentation, resulting in adverse effects such as wrinkles, spots,and freckles. It is also known that various heavy metals contained in drinking water and food can adversely affect the skin.
In particular, arsenic is contained in large amounts in marine products (especially hijiki) that Japanese people consume ona daily basis, and many cases of chronic exposure of arsenic inducing skin keratinization and melanin pigmentation havebeen reported in the whole world. The purpose of this study was to ‘clarify the expression pattern of miRNAs related to skinkeratinization and melanin pigmentation in body hair and the relationship between UV irradiation and arsenic-induced skinkeratinization and melanin deposition’. We focused on 11 miRNAs and analyzed their expression patterns in mouse bodyhair and cultured cell lines derived from skin tissues. In body hairs, miRNAs showed characteristic expression patterns inresponse to UV and arsenic exposure, and common expression patterns were also observed. In the cell culture experiments, ahuman skin keratinocyte cell line (HaCaT) and a melanocyte-based cultured cell line (B10F10) were used to analyze miRNA
expression patterns. Keratinocyte-specific or melanocyte-specific expression patterns were identified, as well as miRNAs
which expression was significantly altered by combined exposure to UV light and arsenic. These results suggest that analysisof miRNA expression patterns using body hair may contribute to the prevention and therapy of skin diseases caused by UVand arsenic exposure.

1．緒

るものの、同じしわ・シミ・ソバカスであっても、環境因言子によってその発症機構には大きな違いが存在し、発症原

皮膚は様々な環境因子に曝され、加齢などの自然老化に加えた様々なストレスを受け、それにより皮膚は様々なダメージを受けている。例えば紫外線は誰もが知る皮膚ダメ

因とその機構をあらかじめ知っておくことが、より良い予防や治療には必要不可欠である。
近年、リボ核酸（RNA）の一種で極めてサイズの小さい、ージを引き起こす環境因子の一つであり、皮膚角化やメラマイクロ RNA（microRNA, miRNA）が体内で数千種類発ニン沈着を誘導し、しわ・シミ・ソバカスなどの悪影響を現しており、様々な疾患の発症や抑制に作用していること引き起こすことが知られている。我々もこれまでの研究にが明らかにされている、様々な miRNA の組み合わせで検おいて、紫外線照射が皮膚ダメージ、特に DNA 損傷を誘出することにより、多種の疾患を診断、或いは予知するこ

1）発することをヒト及びマウスのレベルで実証している 。とが可能となっている。また、毛髪中（非侵襲的に採取可能）

また、飲用水や食品に含まれる様々な重金属が体内からに含まれる miRNA の量と種類のパターンが、様々な皮膚皮膚に悪影響を及ぼすことも知られている。特にヒ素は、疾患の診断に利用可能であることが近年報告されている。

例えば日本人が日常的に摂取する海産物（特にヒジキ）に多

我々はこれまでの実験マウスを用いた予備的検討から、量に含まれており、海外ではヒ素の慢性的な摂取が皮膚角紫外線曝露・ヒ素曝露によって体毛中の miRNA 発現（正化やメラニン沈着を誘発するケースが多数報告されている。

確には「含有量」だが、ここでは「発現量」に統一する）パタ

我々の研究でも、ヒ素曝露と皮膚疾患、皮膚メラニン沈着ーンに変化が生じ、特に皮膚角化やメラニン沈着に関与すの関連性をヒトレベルで明らかにし、さらにマウスモデル

る miRNA が大きく変化していることを発見した（図 1 参の樹立にも成功している 2 , 3）。

照）。

これまでの様々な研究により、環境因子による皮膚のし我々は、他研究者による研究や、我々自身の予備的検討

わ・シミ・ソバカスなどの発症機構が明らかにされつつあ結果から、非侵襲的に毛髪を採取（毛根は含まない）しAnalysis of the relationship between skinkeratinization and melanin pigmentationand microRNA levels in hair

miRNA 発現パターンを明らかにすることで、皮膚に現れている（或いはこれから現れるであろう）しわ・シミ・ソバ
カスの発症原因やその発症機構をオーダーメイドで明らか

Ichiro Yajimaにすることが可能となり、様々な予防法や治療法を提供可

Molecular and Cellular Toxicology, Departmentof Bioscience and Engineering, College ofSystems Engineering and Science, Shibaura
Institute of Technology

能になるのではないかと着想した。この将来的なゴールを見 据 え、 本 研 究 で は、 皮 膚 角 化 や メ ラ ニ ン 沈 着 関 連
miRNA の体毛での発現パターンと紫外線照射及びヒ素誘− 170 −皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

図1 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの体毛中miRNAの紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化（QPCRによる解析）。同じmiRNAでも、環境因子によって体毛中レベルの変化は異なっている。

発性皮膚角化及びメラニン沈着の関連性を明らかにするこ

1 N NaOH/ 10 % DMSO を加え、軽くボルテックスをおことを目的とした。

なった後、80 ℃で 2 時間処理を行う。2 時間後、96 well

2. 方plate に各チューブから 100 µl ずつ分注し、405 nm で吸光法度を測定、メラニン産生量を算出する。細胞生存率データ

2. 1. マウス体毛からのmiRNA精製による補正を行うことで、細胞あたりのメラニン量を計算

マウス背側体毛を剪毛し、エタノールにて洗浄・乾燥後する。

1 . 5 ml tube に 移 し、 凍 結 保 存 し た。miRNA の 精 製 はHigh Pure miRNA Isolation Kit（Roche）
及びTRIzol RNA

2. 4. cDNA合成とQPCR

Isolation Reagents（Thermo Fisher）を使用し、プロトコ

細 胞 か ら の miRNA を 含 む total RNA の 精 製 は Highールに沿って精製を行った。精製した miRNA は−80 ºC に

Pure miRNA Isolation Kit（Roche）を 用 い て 行 っ た。て保存した。

miRNA の cDNA 及 び QPCR は Mir-X ™ miRNA qRTPCR TB Green® Kit（TaKaRa）を使用した。

2. 2. 培養細胞と培養方法

３. 結細胞はヒト正常皮膚角化細胞株（HaCaT）、マウスメラ
ノ ー マ 細 胞 株（B 10 F 10）を 用 い た。HaCaT の 培 養 液 は果3. 1. 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの毛髪中発DMEM+ 10 % FBS、
B 16 は RPMI- 1640 + 10 % FBS で 37 ℃、現量の測定

CO 2 5 % の環境下で培養を行った。曝露試験においては我々の予備的検討結果より、皮膚角化とメラニン沈着両6 -well plate または 24 -well plate に細胞を規定量播種し、方に関与する miRNA（miR-a, -b, -c が紫外線及びヒ素曝24 時間後に 1 % FBS 入り培養液に置換した。その 24 時間

露によって体毛中のパターンに変化が起きることが明らか

後 よ り 曝 露 を 開 始 し た。 ヒ 素 曝 露 に つ い て は 100 mMとなっている（図 1 参照）が、まだ未解析の同様の機能を有stock 溶液を作成、培養液にて希釈して曝露を行った。紫する他の miRNA（miR-d, -e, -f など）の解析を行った。マ

外線曝露では、細胞を PBS で洗浄後、PBS を 2 ml/well 加え、ウスに対し、脱毛部への紫外線照射またはヒ素飲水投与を22紫外線照射（UVB（365 nm）15 mJ/cm または 20 mJ/cm ）6 ヶ月間実施し、回収した体毛（毛根は含まないため抜毛を行った。紫外線照射後、PBS をアスピレーターで吸収し、ではなく剪毛。非侵襲的）を用いて、QPCR によって目的1 % FBS 入り培養液に置換した。その後 37 ℃、CO 2 5 %のmiRNA量及びパターンをQPCR法にて解析を行った（図の環境下で 24 時間培養を行った。

2 - 1 , 2 - 2）
。miR-d は紫外線曝露及びヒ素曝露によって有意に減少し、濃度依存的な傾向が観察された。miR-e は紫2. 3. 細胞生存率測定とメラニン量測定

外線曝露及びヒ素曝露によって有意に減少し、濃度依存的細胞生存率測定は Cell Counting Kit- 8（DOJINDO）を用な傾向が観察された。miR-f は紫外線曝露では有意に減少いて行った。メラニン量測定は以下の通り。曝露試験を行し、ヒ素曝露によって有意に上昇した。miR-g は紫外線曝った細胞を PBS で２回洗浄し PBS を吸引後 PBS を 500 µl

露によって非常に強く発現量の上昇が観察されたが、ヒ素ずつ加え、スクレイパーで細胞を 1 . 5 ml tube に回収する。

曝露では変化は認められなかった。miR-h は紫外線曝露で2000 g, 1 min の条件で遠心を行い、上清を捨て 500 µl のは紫外線強度依存的に有意に減少したが、ヒ素曝露では濃− 171 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 2-1 皮 膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-d, -e, -f,-g）の体毛中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 2-2 皮 膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-d, -e, -f,-g）の体毛中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

度に関係なく、強い発現低下が観察された。miR-i では紫変化が観察された miR-a, b, c, d, e, f, h, k の８種類を対象

外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量の有意な変化は認められとした。miR-a は紫外線、ヒ素曝露ともに発現量が有意になかった。miR-j は紫外線曝露による発現変化は認められ低下し、複合曝露でも同程度の低下が観察された。miR-b

なかったが、ヒ素曝露では有意な濃度依存的発現上昇が観は紫外線曝露によって発現量が有意に低下し、ヒ素曝露で察された。miR-k は紫外線曝露による濃度依存的発現上昇は有意な変化は観察されなかった。複合曝露では有意な低が観察され、ヒ素曝露では濃度に関係なく、強い発現低下下が見られた。miR-c では、紫外線曝露、ヒ素曝露、複合が観察された。

曝露ともに有意な変化は観察されなかった。miR-d では、紫外線曝露によって有意な発現低下が観察され、ヒ素曝露

3. 2. 培養細胞株における紫外線曝露及びヒ素曝露にでは低レベルではあるが、有意な発現上昇が観察された。

よるmiRNA発現パターン解析

複合曝露では発現量に有意な減少が観察された。miR-e はin vivo 実験より同定された体毛中の miRNA がどのよう

紫外線曝露及びヒ素曝露でともにわずかな発現上昇が観察な機構で発現制御されているのかを、培養細胞を用いて解され、複合曝露では極めて強い発現の上昇が観察された。

析をおこなった。紫外線曝露やヒ素曝露による皮膚疾患は

miR-f は、紫外線曝露では発現が強く抑制され、ヒ素曝露

皮膚角化細胞及びメラノサイトでの発症が大きく、本研究では変化は観察されなかった。複合曝露では発現が強く抑ではそれらの影響を細胞レベルで解明するために、ヒト皮制された。miR-h では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量

膚角化細胞株（HaCaT）及びマウス B 16 F 10 メラノーマ細の有意な低下が観察され、複合曝露では最も強く発現が抑胞株に対して紫外線及びヒ素を個別及び複合曝露し、制された。miR-k では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに発現量miRNA の発現パターンを解析した（図 3 , 4）
。まず、メラの有意な低下が観察され、複合曝露では最も強く発現が抑ノサイトへの影響を調査するためにメラノサイトのモデル制された。

細胞として多用されている B 16 F 10 細胞株を用いた発現

次に、皮膚角化細胞への影響を調査するために、角化細パターン解析を行った（図 3 - 1 , 3 - 2）
。なお、本実験では胞モデルである HaCaT 細胞を用いた発現パターン解析を3 . 1 . で調査した miRNA のうち、発現パターンに大きな行った（図 4 - 1 , 4 - 2）。miR-a では、紫外線曝露、ヒ素曝露、− 172 −

皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

図 3 - 1 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-a, -b, -c-d）の B 16 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 3 - 2 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-e, -f, -h,-k）の B 16 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 4 - 1 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-a, -b, -c-d）の HaCaT 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化。

図 4 - 2 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNA（miR-e, -f, -h,-k）の HaCaT 細胞中 miRNA の紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝
露（As）
による変化。

複合曝露ともに同レベルで有意な発現低下が観察された。

4. 考

miR-b では紫外線曝露、ヒ素曝露、複合曝露ともに有意な変化は観察されなかった。miR-c では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに有意な発現上昇が観察され、複合曝露ではより強察

4. 1. 皮膚角化・メラニン沈着関連miRNAの体毛中miRNAの紫外線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）

い発現上昇が観察された。miR-d では、紫外線曝露では強による変化

い発現低下が観察され、ヒ素曝露ではわずかな発現上昇が本研究では、皮膚角化やメラニン沈着関連 miRNA の体観察された。複合曝露では強い発現低下が観察された。

毛での発現パターンと紫外線照射及びヒ素誘発性皮膚角化

miR-e では紫外線曝露、ヒ素曝露ともに僅かな発現上昇が及びメラニン沈着の関連性を明らかにすることを目的とし観察され、複合曝露では非常に高いレベルでの発現上昇がて、曝露実験によるマウス体毛内の miRNA の定量を行っ観察された。miR-f では紫外線曝露では有意に発現量が低た。miRNA の種類によって紫外線曝露とヒ素曝露が同じ下し、ヒ素曝露では有意に上昇した。複合曝露では有意な発現パターンを示す場合もあれば、逆のパターン（片方が発現変化は観察されなかった。miR-k では紫外線曝露、ヒ発現上昇し、もう片方が発現低下）もあり、非常に多様な素曝露、複合曝露ともに発現量の有意な低下が観察された。

発現制御機構を持つことが考えられる。miR-e は今回の候

その中でも、複合曝露が最も発現量の低下が観察された。

補 miRNA の中で唯一紫外線曝露でもヒ素曝露でも発現量− 173 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022が上昇し、かつ濃度依存性を示していることから、miR-eサイトを起点とする疾患発症に関与していると考えられる。

は紫外線曝露とヒ素曝露による疾患の発症メカニズムに共miR-d, -f は B 16 F 10 細胞における miR-b, -d, f と類似し通して関与している可能性を示唆している。一方で、たパターン、すなわち紫外線曝露による発現の減少に大きmiR-a, -d, -h, -k は紫外線曝露でもヒ素曝露でも発現量がく寄与していることから、特に miR-d, -f はメラノサイト有意に減少しており、紫外線曝露とヒ素曝露による疾患のと角化細胞の紫外線曝露に対する応答に共通して機能して発症に共通するメカニズムではこれら miRNA の発現を減いることを強く示唆している。

少させること、つまりはターゲット遺伝子の発現を阻害することが重要な役割を果たすと考えられる。miR-b, -g は4. 3. in vivo研究とin vitro研究の相違について

紫外線曝露でその発現量をそれぞれ低下、上昇させるが、体毛は角化細胞からのケラチン産生とメラノサイトからヒ素曝露での変化は観察されなかったことから、これらののメラニン産生により構成されていることから、体毛でのmiRNA は紫外線曝露関連疾患にのみ関与していることがmiRNA の量的パターンと角化細胞及びメラノサイトでの示唆される。一方、miR-c, j ははヒ素曝露でその発現量をパターンには類似性が存在すると考えられる。本研究では、それぞれ上昇、低下させるが、紫外線曝露での変化は観察

このような類似性についても検討した。miR-a は体毛、メされなかったことから、これらの miRNA はヒ素曝露関連ラノサイト、角化細胞のいずれでも紫外線曝露、ヒ素曝露疾患にのみ関与していることが示唆される。

で発現低下が観察され、miR-e, -k は体毛、メラノサイト、角化細胞のいずれでも紫外線曝露、ヒ素曝露で発現上昇が4. 2. 皮膚角化・メラニン沈着関連 miRNAの培養細胞中 miRNA の紫外 線曝露（UVB）及びヒ素曝露（As）による変化観察されており、miR-a, -e, -k を体毛で検出、解析する

皮膚及び体毛などを対象とした実験は個体への影響を解毛とメラノサイトでの発現パターンが類似していることか析するためには有用だが、細胞種ごとの解析には不適であら、体毛での検出によりメラノサイトでの現象のみを検出る。そのため我々は紫外線曝露やヒ素曝露による皮膚疾患するマーカーとして有効であると考えられる。

ことは皮膚での各細胞の現象を検出することとなり、関連疾患マーカーとして有望であると考えられる。miR-b は体で影響を受けやすい細胞である角化細胞とメラノサイト系譜細胞株を用いた細胞種特異的な発現パターン解析を行っ4. 4. 複合曝露とmiRNA発現パターンについてた。メラノサイト系譜である B 16 F 10 細胞では曝露の種

本研究では、培養細胞実験において紫外線曝露とヒ素曝類や複合曝露による大きな変化が観察された。miR-a, -h,露の複合曝露実験も実施した。ヒ素曝露は主に経口摂取よ-k では紫外線曝露、ヒ素曝露、複合曝露ともに発現量のり皮膚に蓄積し、紫外線曝露は屋外活動により日常的に引有意な低下が観察され特に miR-k は各単独暴露の影響がき起こされることから、ヒ素曝露地域では自ずと複合曝露加算されて複合曝露に対する影響となって現れたと考えらが誘発されることになる。今回解析した miRNA のうちれた。これらの miRNA は紫外線曝露、複合曝露関連疾患

miR-e はメラノサイトでも角化細胞でも、単独曝露によるに共通し、メラノサイトを通じて関与している可能性が示効果よりも複合曝露による効果が非常に強く、両曝露に関唆された。miR-b, -d, -f は紫外線曝露では共通して発現量連する疾患に共通するメカニズムに深く関与していることが大きく減少している一方、ヒ素曝露では変化しないあるを示唆している。また、複合曝露が特定の miRNA の発現いはわずかに発現上昇しているのみであることから、これを相乗的に変化させることを示しており、miRNA の解析

らの miRNA はメラノサイトでは紫外線曝露に対してのみにおいても複合曝露を念頭に置いた新たな解析手法が必要応答、機能している可能性が示唆される。miR-e は紫外線であることを示唆している。

曝露、ヒ素曝露ともに発現が僅かに上昇している程度だが、複合曝露ではその発現量が大きく増大している。これらの4. 5. まとめ結果は、miR-e が特に複合曝露によって発現誘導されるこ今回用いた 11 種類の miRNA に対する解析では、4 種類と、複合曝露による疾患発症に特に関与している可能性をの疾患マーカーとしての有望な候補が見いだされた。本研示唆している。

究では 11 種類であったが、他にも皮膚疾患に関連すると角化細胞系譜である HaCaT 細胞でもまた、細胞系譜特考えられる miRNA は多数存在しており、これらの候補を異的な発現パターンが観察された。miR-a, -h は紫外線曝網羅的に検証することでより多くの疾患マーカーの同定が露、ヒ素曝露、複合曝露ともに同程度のレベルで発現がそ可能となると期待できる。本研究で同定された miRNA はれぞれ減少、上昇していた。miR-b は変化が認められなか直接疾患発症に機能的に関与している可能性もあり、ったことから、B 16 F 10 細胞での紫外線曝露特異的発現変

miRNA や mimic RNA を使用した研究を今後実施するこ化という結果とともに考えると、紫外線曝露によるメラノとで、機能との直接的な関わりを証明できると期待できる。

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皮膚角化及びメラニン沈着と毛髪中 microRNA 量の関連性解析

将来的には本研究と今後の応用的研究が皮膚疾患の余地・

Hossain, Nobutaka Ohgami, Masashi Kato. Arsenic-予防に大きく寄与することを期待している。

mediated hyperpigmentation in skin via NF-kappa B/
endothelin-1 signaling in an originally developed（引用文献）

hairless mouse model. Arch Toxicol. 9 1: 3 5 0 7-3 5 1 6.

1） Masashi Kato, Machiko Iida, Yuji Goto, Takaaki

2017.

Kondo, Ichiro YajimaKato M. and Yajima I. Sunlight3） Ichiro Yajima, Mayuko Y Kumasaka, Shoko Ohnuma,

exposure-mediated DNA damage in young adults.

Nobutaka Ohgami, Hisao Naito, Hossain U Shekhar,

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Yasuhiro Omata, Masashi Kato. Arsenite-Mediated2011.

Promotion of Anchorage-Independent Growth of2） Ichiro Yajima, Mayuko Y Kumasaka, Machiko Iida,Reina Oshino, Hiroko Tanihata, Aeorangajeb Al

HaCaT Cells through Placental Growth Factor. JInvest Dermatol, 135: 1147-1156. 2015.

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