細胞外マトリックス糖タンパク質による皮膚の再生・修復のグリコバイオロジー
お茶の水女子大学大学院・糖鎖科学教育研究センター

小 川温 子We discovered that the survival of rat hepatic stellate cells (rHSC) were suppressed on vitronectin (VN) which had
been synthesized in the early stage of liver regeneration after partial hepatectomy1). The changes in glycosylation of VN,
especially decreased sialylation plays a modulatory role for rHSC spreading. In this study, we aimed at elucidating whether
VN regulates the dermal fibroblast adhesion and motility during the tissue-remodeling. Primary culture of the mouse dermal
fibroblast (MDF) was isolated and analyzed for adhesion and spreading on glycosylation-modified VNs. It was found that
decreased sialylation of VN not only attenuated the cell adhesion and spreading but changed the cellular signaling of dermal
fibroblasts, MDF and Swiss 3T3.

１．緒細胞（MDF、Swiss3T3）に着目した。MDF は VN レセプ

言ターである av インテグリンを発現するので、初代培養に組織再生時において細胞外マトリックス（ECM）の分子より MDF を単離し、組織再生時に重要な細胞の接着・伸性状は、糖鎖合成に関わる多くのタンパク質の発現と活性展ならびに形態変化を中心に、VN の糖鎖調節機構を明らが変動するために正常組織のものとは異なる。ECM 分子かにすることを目的とした。

は生物過程や疾患において多くの役割を果たしているが、２．実

主要な ECM 分子の１つであるビトロネクチン（VN）は主に肝臓で産生され、血漿中や組織中に存在する多機能性糖験１）ラットの部分的肝切除手術と血液採取タンパク質である。VN は多くのリガンドと結合とする（図５週齢の Male Wistar rats（平均体重約 110 g、日本生１）。細胞表面のインテグリンと結合して細胞接着や細胞物材料）を、飼育室（23.5℃，明 6：00−18：00，暗 18：00−6：運動に関わるほか、１型プラスミノーゲン活性化因子阻害00）で 飼 育 し た。70% 部 分 肝 切 除 は エ ー テ ル 麻 酔 後、因子（PAI-1）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子

Higgins と Anderson の方法 6）に従って行った。シャム手（uPA）、および uPA 受容体（uPAR）と結合して組織溶解術は体外に肝臓を出し、切除せずに再び肝臓を体内に戻すに関連する細胞挙動を調節するなど、組織再生において重操作を行った。何も処置をしていないラットを非手術要な役割を果たす。VN はこのようなリガンド結合ならび（Non- operated：NO）と し た。 術 後 24，48，72 時 間 経 過に組織溶解系、血液凝固系の調節を介してマトリックスの後に、採血量の約 10 %（v/v）の 3.8 % クエン酸ナトリウム再構築に関わる。またその N- 型糖鎖結合部位はよく保存を抗凝固剤としてそれぞれ腹部大動脈より採血を行った。

され、シアリル化糖鎖の存在は動物種間で共通性が高い 2）

これを 4℃で 1, 200 xg、10 分間遠心分離により、上清を集（図１）。

め血漿とし、−80 ℃で保存した。

当研究室ではこれまでに、ラット肝再生初期過程における VN のシアリル化の低下がコラーゲン結合性を増強する

２）血漿ビトロネクチンの精製

一方 3, 4）、肝星細胞の生存につながる接着伸展を著しく抑Yatohgo らの方法 7）に従い、非手術（NO）、シャム手術

制し、その過剰な活性化を抑制調節していることを報告し

24 時間後（SH）、部分肝切除 24 時間後（PH）のラット血漿た1）。同時期のフィブロネクチンでは、VN の様な糖鎖変化は観測されなかった 5）。

あ る い は ブ タ 血 漿 か ら VN の 精 製 を 行 っ た。 ヘ パ リ ン-Sepharose 4B は還元アミノ化法で調製した。血漿に 1/50

本研究では、肝とならんで再生能力の高い組織である皮量（v/v）の 1.0 M CaCl 2（終濃度 20 mM）を加え撹拌した

膚組織の再生時に、主要な役割を果たすマウス皮膚線維芽

のち、室温で約１時間放置し血漿を凝固させた。さらに４℃で１時間以上放置した後、凝固した血漿をはさみで細断

Glycobiology of an extracellular matrix
glycoprotein, vitronectin, during skinregeneration and repair
Haruko Ogawa
Graduate School of Humanities and Sciences
and Glycoscience Institute, Ochanomizu
University

し、13,000 g，４℃，で 10 分間遠心分離を行って血清を得た。
この血清にフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）（終濃度 1 mM）とエチレンジアミン-N, N, N', N'- 四酢酸二ナトリウム（EDTA）（pH 7.0, 終濃度 5 mM）を加え、Sepharose 4B カラ
ムをプレカラムとするヘパリン- Sepharose 4B カラムにかけた。通過画分を集め、尿素を最終濃度８M まで加えて− 84 −

細胞外マトリックス糖タンパク質による皮膚の再生・修復のグリコバイオロジー

図１

ラット VN の一次構造とリガンド結合部位溶解し、室温で２時間以上静置した。その後、８M 尿素

ごとに0.25% トリプシン , 0.02% EDTA, PBS（５mL/10cmを 含 む 0.13 M NaCl, PB-EDTA で 平 衡 化 し た ヘ パ リ ン

径ディッシュ）を加えて 37ºC、5 分間処理し、細胞を回収-Sepharose カラムに通過画分をかけ、平衡化溶液で洗浄、して行った。

ついで 10 mM 2 -メルカプトエタノール（2-ME）を含む 0.13②接着伸展実験

M NaCl, PB-EDTA をゲル体積の２倍以上流した後カラム

Adhesion medium： 撹拌しながら５M NaCl，１M KCl，を止め、２時間静置した。その後、同緩衝液で全量でゲル

１M MgCl2，0.5M Na2HPO4,１M KH2PO4 および 1M CaCl2

体積の５倍以上流した後に、0.5M NaCl, Phosphate buffer

を、MilliQ に 対 し て そ れ ぞ れ 終 濃 度 が 150 mM, ３mM，（PB）-EDTA でヘパリン結合タンパク質を溶出した。さら0.5 mM, 6 mM, 1 mM および 1 mM になるように順に加え、に 2.0 M NaCl , PB-EDTA で完全に溶出を行った。各フラ約１時間撹拌した。沈殿が生じていないことを確認してかクションについて 280nm における吸光度を測定すること

ら 0.22 µm 孔径のフィルター（Millex -GV，Millipore）でろによりタンパク質の検出を行い、溶出ピークが現れている過し、以下の操作に用いた。

画分を集め、SDS-PAGE で VN の精製を確認した。回収し継代後の細胞浮遊液を室温で 130 g ，３分間遠心後上清をた画分は透析によって尿素濃度、ついで NaCl 濃度を下げ捨てた。さらに Adhesion medium を加えてよく懸濁したて最終的に 0.13 M NaCl, PB-EDTA に対して透析し、タンのち、再び 130 g で３分間遠心し、上清を捨てた。この操

パク質濃度を BCA 法によって決定し、−20℃で保存した。

作を２回行った後、Adhesion medium を２mL 加え、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。2.0×105cells/mL とな

３）精製 VN のグリコシダーゼ処理

るように Adhesion medium に懸濁し、これを細胞懸濁液①ノイラミニダーゼ（シアリダ—ゼ）処理とした。組織培養プレート（96 穴）の各ウェルに２倍希釈

精製 VN を 4℃で 50mM 酢酸緩衝液（pH 5.3）に対して列（10µg/mL）を作成した VN を 100µL ずつ加え、37ºC で透析し、CaCl2 を加えた（終濃度４mM）。これをタンパク１時間以上あるいは４ºC で一晩固定化させた。組織培養

定量した後ノイラミニダーゼを加え（VN 0.8mg に対しプレートから VN 溶液を排液し、細胞懸濁液を 100µL ずつ0.02 U）、37℃で 24 時間消化したのち、TBS に対して透析加え、37ºC, ５% CO2 条件下で 60−120 分間インキュベートした。

した。ピペットで各ウェルから 50 µL ずつ液を吸引、排液② N- グリコシダーゼ F（PNGase F）処理し、ただちに 12.3 ％パラホルムアルデヒド溶液を 50µL 加

精製 VN を４℃において 0.13M NaCl, PB-EDTA に対しえ、室温で 30 分以上固定した。ウェルを PBS で満たし、て透析し、N- グリコシダーゼ F を加え（VN 0.3mg に対し 2スライドガラスを乗せ、位相差顕微鏡で観察した。各ウェ

U）、37℃で 48 時間消化したのち TBS に対して透析した。

ルで３視野ずつ、各視野ごとに細胞 100 個前後中の伸展している細胞数を数え、伸展率（%）= 伸展細胞数 / 全細胞数４）細胞接着伸展活性の測定を求めた。同一の培養細胞について少なくとも３回、異な①細胞継代培養る２回の培養細胞でそれぞれ実験を行った。

生後３日目の新生マウスの皮膚より初代培養を行い、MDF③細胞接着伸展形態の観察
滅菌したカバーガラス上に種々濃度の VN をコートし、を単離した。MDF と Swiss3T3 細胞（お茶の水女子大学宮本泰則准教授より提供）を以下の条件下で継代、培養を行洗浄後、細胞を播種し、37℃, 5％ CO2 条件下で 90 分間イった。

ンキュベートした。3.7 % パラホルムアルデヒド溶液で 20

10 % FBS, １%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM分間固定し、PBS で洗浄した。0.1％ Triton X-100/ リン酸培地中で、37ºC、５% CO2 条件下で培養し、継代は３−４日緩衝液で 5 分間、透過処理を行い、PBS 洗浄後、10％ BSA− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

/PBS で室温にて 60 分間ブロッキングした。PBS により洗しく異なる状況を示唆された。そこで細胞骨格を形成する

浄後、1.5% BSA/PBS に溶解した抗ヘパラン硫酸抗体またストレスファイバーの状態を比較した。ラット血漿からのは Alexa488 -フ ァ ロ イ ジ ン と 室 温、60 分 間 反 応 さ せ た。

VN 精製量は少ないため、正常なブタ血漿から精製した

PBS により洗浄後、10 % BSA/PBS に溶解した二次抗体とVN（pVN）を用いて、ノイラミニダーゼ処理、または N- グ反応させた。蛍光顕微鏡 FSX-100（オリンパス）で観察、リコシダーゼ処理により糖鎖を除去し、各 VN 基質上で接撮影した。

着伸展した MDF 細胞において、アクチンストレスファイ３．結バーをファロイジンにより染色し、蛍光顕微鏡で観察した。

果

ノイラミニダーゼ処理 pVN 上では、未処理 pVN 上で伸１）VN 上での MDF の細胞接着伸展活性展した MDF 細胞と比較して、アクチンフィラメントの短70% 肝切除手術（PH）、コントロールとしての偽手術（SH）小化と辺縁部への分布の変化、および伸展面積の有意な減を行い、術後 24 時間後のラット及び非手術（NO）ラット

少が見出され、ラメリポディア（糸状仮足）の形成が示唆から血漿を採取し、肝手術（PH）・シャム手術（SH）・非された（図３上段）。このような伸展形態の変化から、細手術ラット（NO）の各精製 VN 基質上での MDF ならびに胞上のレセプターが異なる可能性が考えられた。以前の細Swiss 3T3 細胞の接着伸展率を測定した。その結果、肝切胞 伸 展 と シ グ ナ ル 伝 達 に 関 連 す る Saoncella8）な ら び に

除 後 24 時 間 の VN（PH-VN）基 質 上 で は、NO- お よ びHall9）らの研究報告より、図３下段に示すように、細胞のSH-VN に比べ、著しく MDF および 3T3 細胞の接着伸展がストレスファイバー形成と伸展状態の変化には、インテグ低下した（図２）。われわれは以前に、肝再生初期過程にリンとへパラン硫酸プロテオグリカン（シンデカン）が関おける各 VN にはそれぞれ高シアリル化された分子種と、与している。これらはいずれも VN のレセプターであるが、相対的にシアル酸含量が低い分子種が存在し、PH-VN でシンデカン依存的なシグナル伝達と非依存的な伝達では、はいずれのシアリル化も著しく減少することを見出した１）形成されるストレスファイバーの分布が異なることがので、ノイラミニダーゼ処理した NO-VN 上での初代培養

Swiss3T3 細胞を用いて示されている 8, 9）。細胞の接着と移MDF および Swiss3T3 線維芽細胞の接着伸展率を測定し動が行われるためには細胞表面のインテグリンとシンデカたところ、いずれもコントロール処理の約７割以下に減少ンの相互作用が必要であるが、本研究結果から、VN 上のすることが示された（データ示さず）。この結果は、ラッシアリル化の変化がこれらのシグナル伝達を調節する事がト肝再生に重要な役割を担う肝星細胞の接着伸展が、NO-示唆された。一方、細胞のへパラナ―ゼ処理によって細胞および SH-VN と比較して PH-VN 上で約 1/2 にまで減少し、表面のシンデカンのヘパラン硫酸鎖を酵素的に除去したり、VN のノイラミニダーゼ処理によっても同様に細胞接着伸ヘパリンを細胞に添加することにより VN との相互作用を展率が大きく減少したことと一致した。よって MDF および Swiss3T3 細胞ではラット肝星細胞と同様に、VN のシアリル化糖鎖の減少による細胞生存の抑制が示唆された。

２）VN 上の糖鎖によるストレスファイバー形成への影響
VN のノイラミニダーゼ処理前後の変化から、MDF 接着伸展率ばかりでなく、伸展した細胞の形状においても著

図２

肝切除 VN 基質上での MDF 接着伸展活性

図３ VN のアシアロ化による MDF のアクチンフィラメント形成への影響− 86 −

細胞外マトリックス糖タンパク質による皮膚の再生・修復のグリコバイオロジー

阻害すると、pVN 上での MDF の伸展形態に逆の変化が認

ご支援をいただき、心よりお礼申し上げます。

められ、シンデカン依存性シグナルの影響が弱まった（データ示さず）。組織修復時、VN 糖鎖のシアリル化が低下（引用文献）

すると、MDF の接着伸展に対するインテグリンとの相互

１）Sano, K., Miyamoto, Y., Kawasaki, N., Hashii, N.,作用を減弱する一方、シンデカンとの相互作用の寄与が相Itoh, S., Murase, M., Date, K., Yokoyama, M., Sato, C.,

対的に高まる、すなわち細胞活性化を VN の糖鎖が調節す

Kitajima, K., and Ogawa, H, Survival of Hepatic Stellate

る可能性が示唆された。Swiss3T3 細胞についても同様の

Cell during Liver Regeneration is Regulated by the

傾向が認められた（データ示さず）。

Changes in Glycosylation of Rat Vitronectin especially

４．考

the Decreased Hypersialylation. J Biol Chem 285,察17301-09, 2010.

本研究成果から肝再生における VN がその糖鎖変化によ２）Kitagaki-Ogawa, H.,Yatohgo, T.,Izumi, M.,Hayashi,って、マウス皮膚組織の修復においても線維芽細胞の細胞

M.,Kashiwagi, H.,Matsumoto, I., and Seno, N. Diversities

外マトリックスへの接着など、組織修復の多段階を制御しin animal vitronectins. Differences in molecular weight,うる可能性が示唆された。特に我々は MDF の生存シグナ

immunoreactivity and carbohydrate chains Biochim.

ルと VN の糖鎖修飾の関連に着目し、次のことを明らかにBiophys. Acta, 1033, 41-56, 1990.
３）Sano, K., Asanuma-Date, K., Arisaka, F., Hattori, S.,した。
１．肝再生初期過程において VN ではシアリル化の減少がand Ogawa, H, Changes in Glycosylation of Vitronectin起こる。この変化が肝星細胞（RSC）と同様に、MDF とModulate Multimerization and Collagen Binding

Swiss3T3 細胞の接着伸展活性を減少させた。組織再生

During Liver Regeneration.Glycobiology, 17, 784-794,

時 に お け る VN 糖 鎖 の シ ア リ ル 化 の 程 度 が、RSC と2007.

MDF の生存につながる接着伸展、すなわちインテグリ４）Uchibori-Iwaki, H., Yoneda, A., Oda-Tamai, S., Kato,

ン活性化の調節に共通して重要であることが示された。

S., Akamatsu, N., Otsuka, M., Murase, Kojima,K., K.,

２．ノイラミニダーゼ処理 VN を基質とした MDF 接着伸Suzuki, R., Maeya, Y., and Ogawa.H, The changes

展時のストレスファイバーの形成状態は、コントロール

in glycosylation after partial hepatectomy enhance

VN 上と比較してアクチン線維が短小化し、細胞伸展面

collagen binding of vitronectin in plasma. Glycobiology
10, 865-74, 2000.

積が小さく、ラメリポディアを形成することが示唆された。 こ の こ と か ら、VN の シ ア リ ル 化 の 低 下 に よ り、

５）Sano, K., Yanagibashi M., Hashii N., Itoh S.,

VN で誘導される細胞内シグナルの下流で起こるアクチKawasaki N., Ogawa H, Glycosylation and ligand-ン系の細胞骨格の再構築や接着斑の形成を介したシグナ

binding activities of rat plasma fibronectin during liver

ル伝達経路に変化が生じていることが示された。VN 糖

regeneration after partial hepatectomy. Carbohyd. Res.,

鎖修飾、特にシアリル化が、細胞表面インテグリンとシ343, 2329-2335, 2008.

ンデカンとの相互作用による細胞活性化を調節する可能

６）Higgins, G.M. and Anderson, R.M, Experimental性が示唆された。

pathology of liver. I. Restoration of the white rat

今後、本研究から得られた知見をもとに、皮膚組織修復

following partial surgical removal Arch. Pathol. 12,6-202, 1931.に与える糖鎖による VN 機能の調節機構を、細胞移動性、増殖、線維増生の各段階についても研究する。細胞接着と

７）Yatohgo, T., M. Izumi, H. Kashiwagi, and M. Hayashi,

細胞骨格形成の VN 糖鎖による制御機構を明らかにするこ

Novel purification of vitronectin from human plasmaとで、ECM 分子の糖鎖修飾という観点からの、皮膚再生

by heparin affinity chromatography Cell Struct Functの分子メカニズム解明と細胞接着異常による癌浸潤やケロ13, 281-92, 1988.

イドなどの線維化疾患制圧への手がかりにつながることが８）Saoncella, S., Echtermeyer, F., Denhez, F., Nowlen,
J.K., Mosher, D., Robinson, SD., Hynes, R.O., Goetinck,

期待される。

P.F., Syndecan-4 signals cooperatively with integrins
謝辞in a Rho-dependent manner in the assembly of focaladhesions and actin stress fibers. Proc. Natl. Acad. Sci.

以上の研究は、お茶の水女子大学大学院自然応用科学系

USA. 96, 2805-2810, 1999.の宮本泰則准教授、大学院生でライフサイエンス専攻 糖鎖情報研究室に所属する田邊美音らとの共同研究によるも９）Hall, A, Rho GTPases and the actin cytoskeleton.のです。また、コスメトロジー研究振興財団からは多大な− 87 −Science, 279, 509-514, 1998.