加齢臭成分のバイオマーカーとしての応用研究

名古屋大学大学院生命農学研究科

内 田浩 二Trans-2-nonenal is an unsaturated aldehyde with an unpleasant greasy and grassy odor endogenously generated during
the peroxidation of polyunsaturated fatty acids. 2-Nonenal covalently modified human serum albumin through a reactionin which the aldehyde preferentially reacted with the lysine residues. Using high performance liquid chromatography withon-line electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI/MS/MS), we established a highly sensitive method for
detection of a 2-nonenal-histidine adduct and confirmed that the adduct was indeed formed during the lipid peroxidationmediated modification of protein in vitro.

１．緒成が加速されることから“加齢臭”として知られている 1）。

言

2 - ノネナールは多価不飽和脂肪酸から脂質過酸化反応を介脂質過酸化反応により、多岐にわたるアルデヒド類が生して生成されることが報告されており、ヒトの体臭として成することが、これまでによく研究されている。脂質過酸の 2 - ノネナールも脂質過酸化反応を介して脂肪酸（パル化の初期産物である脂質ヒドロペルオキシドは、遷移金属ミトレイン酸）から生成されるものと推定されている。ま存在下においてアルコキシラジカルを経て炭素－炭素結合た、2 - ノネナールは品質劣化したビールや長時間加熱した開裂を起こす。その結果、エステル化されていない主に炭リノール酸を豊富に含む食用油からも検出されている。一素数３−９の脂質アルデヒドと、末端がエステル化された方、2 - ノネナールは a , b - 不飽和アルデヒド構造を有するアルデヒドが生成される。脂質アルデヒドには、ケトアルことから、タンパク質などの生体成分と反応性を有する。

デヒド、n-アルカナール、2-アルケナール、4-ヒドロキシ - 2 -これまでに、グリセルアルデヒド 3 - リン酸脱水素酵素やアルケナールのような脂質アルデヒドが含まれ、それらはチロシン脱リン酸化酵素類の酵素活性低下などのタンパク生体内のタンパク質の修飾に関する重要な活性種であると質との反応性に関する報告もなされているが、その化学作認識されている。これらの脂質アルデヒドは、細胞機能を用の詳細は不明である。本研究課題では、加齢臭 2 - ノネ担う生体分子や DNA への変異導入により細胞ダメージをナールがどのような脂肪酸を起源として生成されるのかを蓄積させるものと考えられている。また、LDL 中の apo B解明し、その生成抑制に至る技術方法の開発を目的に、2 -へのアルデヒドの付加は、粥状動脈硬化症を引き起こすメノネナールのタンパク質との反応性を詳細に検討するととカニズムであるマクロファージの泡沫細胞への変化を誘導もに、2 - ノネナール修飾タンパク質を高感度に検出する測する。

定系の開発を目的として開始された。初年度では、加齢臭揮発性のアルデヒド化合物である 2 - ノネナール（Fig. 1）成分の一つである 2 - ヘキセナールについて、その修飾タは特有の芳香性を持ち、中年期以降のヒトにおいてその生ンパク質に対するモノクローナル抗体の開発を行い、抗体が認識する 2 - ヘキセナール - ヒスチジン付加体の化学構造を解明し、それらの付加体のバイオマーカーとしての有用性について検討した。最終年度では、より高感度に定量を行うことが可能な液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析装置（LC-MS/MS）を用い、2 - ノネナール修飾タンパク質の加齢臭マーカーとしての意義を見いだすことを目Fig. 1

的に、2 - ノネナール - ヒスチジン付加体（Fig. 2）の高感度2- ノネナールの化学構造検出法の開発を行った。

２．方Study on senescent product as a biomarker
Koji Uchida
Graduate School of Bioagricultural Sciences,
Nagoya University

２.１⑴

法

2 - ノネナールとヒスチジンの反応

2 - ノネナール（10 mM）とヒスチジン（10 mM）をリン酸バッファー中（pH 7 . 4）で 37℃、24 時間反応させた。

⑵−4−

反応後、１N の NaOH 水溶液を反応液の 10 分の 1 量加

加齢臭成分のバイオマーカーとしての応用研究

Flow rate：0 . 3 ml/minO
H2N

Solvent A：H 2 O/ 0 . 1 % HCOOH

OHSolvent B：acetonitrile/ 0 . 1 % HCOOH
Gradient：

NNO

Fig. 2Time（min）

026A（%）

9898

52- ノネナール - ヒスチジン付加体の化学構造

２. ４
え、塩基性とした後に 2 - ノネナールに対して大過剰の⑴

タンパク質と2 - ノネナールの反応

NaBH 4 を加え、室温で 3 時間還元処理を行った。

BSA（1 . 0 mg/ml）をリン酸バッファー（pH 7 . 4）中で37℃で 2 -ノネナールと反応させた。時間依存的な測定で還元処理後、１N の HCl を加え、中和した後 HPLC 分

は１mM 2 - ノネナールと 0−24 時間反応させ、2 -ノネナ析を行った。不溶性の塩が析出していた場合、フィルタール濃度依存的な測定では 0−10 mM の 2 -ノネナールとー濾過した後に分析を行った。

24 時間反応させた。

⑶

⑷

⑵

逆相 HPLC 分析条件

反応後、0 . 2 N NaOH を反応液の 10 分の 1 量加え、塩Column：Develosil C 30 -UG- 5（8 φ 100 mm）

基性とした後に 2 -ノネナールに対して大過剰の NaBH 4

Flow rate：2 . 0 ml/minを用いて未反応 2 -ノネナールおよび 2 -ノネナール - ヒス

Detection：200 − 650 nm

チジン付加体を 3 時間還元し、反応を停止した。

Eluent：A，H 2 O/ 0 . 1 %TFA；B，acetonitrile/ 0 . 1 %⑶

0 . 2 N HCl を用いて反応液の中和を行った。なお、熱が発生するのでこの操作は氷上で行った。

TFA
Gradient： Time（min）

040A（%）

10034

B（%）

066

２. ５ 2 - ノネナール修飾タンパク質中の 2 - ノネナール ヒスチジン付加体の定量⑴

反応液と等量の 20 %TCA 水溶液を加え（最終濃度 10%）、軽くボルテクスした後に氷上で１時間静置し、タ２. ２⑴酸加水分解

ンパク質を不溶化した。

ミクロチューブにサンプルを加え、遠心エバポレータ⑵

7 , 000 ×g（10 , 000 rpm, 6 cm）、4℃で 15 分遠心してタンパク質を沈殿させ、沈殿を乱さぬように上清を除いた。

ーにより乾固した。
⑵

加水分解用チューブに 6 N HCl を少量注ぎ、サンプル⑶

200 ml の氷冷アセトンを加えて軽く撹拌した後、同様に遠心して上清を除いた。

入りミクロチューブを入れた後、真空ポンプにより減圧

内部標準物質として 2 - ノネナール - 15 N- ヒスチジン⑷

条件とした。
⑶

110 ℃の乾熱器に入れ、24 時間加水分解した。

を一定量加えた後、前述の条件で酸加水分解を行い、⑷加水分解終了後、ミクロチューブ内に残った HCl をデLC-MS/MS（UPLC-ESI/MS, Acquity TQD tandem

シケーターにより留去した。

quadrupole mass spectrometer）に よ る 解 析 を 行 っ た。
添加した内部標準物質の量と比較し、検量線と照らし合

２. ３⑴

LC-MS/MS 解析

わせてサンプル中の 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体の濃度を測定した。

加水分解後サンプルを MiliQ に溶解し、LC-MS/MS用サンプルとした。

⑵

３．結Retention time、fragmentation を確認した後、Conepotential および Collision energy の最適化を行った。

⑶

LC-MS/MS 分析条件

果2 - ノネナールとタンパク質との反応において、タンパク質中のリジン残基およびヒスチジン残基の減少が顕著であInjection：10 mlった。当研究室において既に、リジン１分子に対して 2 -Cone potential：35 eVノネナールが２分子付加した付加体である 2 - ノネナール -Collision energy：25 eV

リジン付加体を同定しており 2）、この付加体の LC-MS/MS+

Ion mode：ESPを用いた定量法を確立している。しかしヒスチジンについMonitored ion：m/z 298 → 110ては、2 - ノネナールをはじめとする不飽和アルデヒド類とColumn：Develosil C 30 -UG- 5（2 . 0 / 100）反応性を有することが知られているものの、2 - ノネナール−5−コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013とヒスチジンの付加体は未だ同定されていない。そこで今により、定量を行うこととした。ヒスチジン中の窒素原子回はヒスチジンについて、2 - ノネナール付加体の NMR にが安定同位体に置換された安定同位体ヒスチジンを用いて、よる構造解析および LC-MS/MS を用いた検出系の確立を上述の方法で内部標準 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体を試みることにした。2 - ノネナールとヒスチジンをリン酸バ作成した。安定同位体標識されたヒスチジンは、ヒスチジッファー中で 37℃、24 h 反応させ、HPLC 分析を行ったとンと質量数が 3 異なり、LC-MS/MS 解析では異なる物質ところ、新たに生成するピークが確認された。このピークをして検出されるが、ヒスチジンと物性は同じであり、化学分取し、NMR による構造解析を行ったところ、ヒスチジ操作における挙動だけでなく、LC-MS/MS 解析におけるンに対し、2 - ノネナールが 1 分子マイケル付加した 2 - ノネ

イオン化効率、検出感度、フラグメンテーション全てにおナール - ヒスチジン付加体（Fig. 2）であった。続いてこのいてヒスチジンと一致するため、内部標準物質として最適付加体の酸加水分解に対する安定性を評価することとした。

であると考えられた（Fig. 3）。得られた内部標準を一定量

酸加水分解は、タンパク質中のペプチド結合を切断し、アとそれに対し任意の割合の 2 - ノネナール - ヒスチジン付加ミノ酸レベルまで完全分解する操作であり、この操作によ体を混合した後 LC-MS/MS 解析を行い、得られたピーク

りタンパク質中に生成したアミノ酸のアルデヒド付加体を面積比から、2 - ノネナール - ヒスチジン付加体の濃度に対LC-MS/MS により検出・定量することが可能になる。得

するピーク面積比の検量線を作成した。2 - ノネナール - ヒられた付加体の安定性を高めるために水素化ホウ素ナトリ

スチジン付加体の濃度未知試料に対しては、内部標準物質

ウムによりアルデヒド基をヒドロキシ基に還元した後に酸を加えた後 LC-MS/MS 解析を行い、得られたピーク面積加水分解を行い、付加体の安定性を LC-MS/MS により確比を検量線と照らし合わせることで 2 - ノネナール - ヒスチ認した。その結果、この付加体は酸加水分解に対して安定ジン付加体の正確な濃度を求めることが出来る。

であることが認められ、さらに定量限界がおよそ 50 fmol

この方法を用いて、実際に 2 - ノネナール修飾タンパクであったことから、タンパク質中から付加体を高感度に検質中から 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体を定量すること出・定量することが可能であると示唆された。より正確なとした。BSA（1 . 0 mg/ml）に 2 - ノネナールを最大 10 mM定量を行うために、安定同位体標識された 2 - ノネナール -の濃度で、37℃で 24 h 反応させた後、還元処理および酸加ヒスチジン付加体を内部標準物質とした安定同位体希釈法

水分解を行い、LC-MS/MS を用いて 2 - ノネナール - ヒスチ

Fig. 32- ノネナール - ヒスチジン付加体の LC-MS/MS 解析−6−加齢臭成分のバイオマーカーとしての応用研究

ジン付加体を定量した。その結果、2 - ノネナールの濃度依1 mol あたり、2 . 1 mol であった。この条件での 2 - ノネナー

存的に 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体の生成量の増加がルによるヒスチジンの修飾効率はおよそ 12 . 4 % であった。

確認され、10 mM の 2 - ノネナールにおいて最大となった。

４．考

その生成量は BSA 1 mol あたり、2 . 8 mol であった（Fig. 4）。

察BSA 1 mol 中にヒスチジン残基は 17 残基存在するため、こ2 - ノネナールは不飽和脂肪酸から脂質過酸化反応を介しの条件での 2 - ノネナールによるヒスチジンの修飾効率はて生成されることが報告されており、a, b - 不飽和アルデ

およそ 16 . 5 % であった。続いて、2 - ノネナールとタンパヒド構造を有するためタンパク質などの生体分子と高い反ク質の反応による 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体の生成応性を有している。また、近年、2 - ノネナールは加齢臭の量の経時的な変化を解析することとした。BSA（1 . 0 mg/主要な成分として同定され、中年期のヒトの表皮に存在すml）を 1 mM の 2 - ノネナールと 37℃で最大 48 h 反応させたることが明らかとなってきた。しかしながら、2 - ノネナー

後、同様に還元処理および酸加水分解を行い、2 - ノネナー

ルによるタンパク質修飾反応に関する詳細な研究はこれま

ル - ヒスチジン付加体を定量した（Fig. 5）。その結果、反でほとんど行われていないのが現状であった。本年度の研応時間依存的に 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体の生成量究課題では、LC-MS/MS を用いたタンパク質中の 2 - ノネが増加し、24 h において最大となった。その生成量は BSA

ナール - ヒスチジン付加体の検出法の確立を行った。LC-

Fig. 42- ノネナール - ヒスチジン付加体の LC-MS/MS 解析：2- ノネナール濃度に依存したヒスチジン付加体の生成

Fig. 52- ノネナール - ヒスチジン付加体の LC-MS/MS 解析：反応時間に依存したヒスチジン付加体の生成−7−

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

MS/MS は高速液体クロマトグラフ（HPLC）と質量分析計を介して普遍的に生成されうることを確認した。このよう（MS）を結合させた装置であり、試料中成分の固定相（カに、本研究課題において LC-MS/MS を用いた 2 - ノネナー

ラム）と移動相に対する保持力の差、プリカーサーイオン、

ル - ヒスチジン付加体の高感度定量が可能になったことかプロダクトイオンの三点により、試料成分を分析できる。

ら、今後生体試料などを用いた加齢臭研究への応用が見込

また、一度に複数の成分を分析でき、安定同位体を内部標まれる。

準に用いることで、精製による回収率の差や測定間の誤差を補正できるため、高感度で選択的な定量を行うことが可（引用文献）

能である。本研究では、安定同位体希釈法を用い、2 - ノネ

１）Haze, S., Gozu, Y., Nakamura, S., Kohno, Y., Sawano,

ナール修飾タンパク質中から 2 - ノネナール - ヒスチジン付

K., Ohta, H., and Yamazaki, K. ( 2001 ) 2 -Nonenal newly

加体を実際に検出可能であることを確かめた。0 . 01 〜 10

found in human body odor tends to increase withmM の 2 - ノネナールを BSA と反応させたものから 2 - ノネ

aging. J. Invest. Dermatol. 116 , 520 - 524 .

ナール - ヒスチジン付加体を検出したところ、どちらにつ２）Ishino, K., Wakita, C., Shibata, T., Toyokuni, S.,

いても、2 - ノネナール濃度依存的な生成量の増加がみられMachida, S., Matsuda, S., Matsuda, T., and Uchida,

た。この他、脂肪酸過酸化によるタンパク質修飾、およびK. ( 2010 ) Lipid peroxidation generates a body odor

酸化 LDL などにおける 2 - ノネナール - ヒスチジン付加体もcomponent trans- 2 -nonenal covalently bound to

確認されており、加齢臭 2 - ノネナールが脂質過酸化反応

protein in vivo. J. Biol. Chem. 285 , 15302 - 15313 .

−8−