樹状細胞分子 SHPS-1による皮膚免疫制御とその皮膚アレルギーへの治療的応用
群馬大学生体調節研究所バイオシグナル分野

的 崎尚SHPS-1 is a transmembrane protein that binds the protein tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2 and is abundant+on the surface of CD11c dendritic cells (DCs). We recently showed that SHPS-1 is essential for priming by DCs of+
CD4 T cells and for development of Th17 cell-mediated experimental autoimmunity. We have now further evaluated theimportance of SHPS-1 and that of its ligand CD47 in contact hypersensitivity (CHS) to 2,4-dinitro-1-fluorobenzene (DNFB).
Whereas the DNFB-induced CHS response was impaired in mice that express a mutant form of SHPS-1 lacking most of thecytoplasmic region, it was unaffected in CD47-deficient mice. Moreover, treatment of wild-type mice with mAbs to SHPS1 that either block or do not block the binding of SHPS-1 to CD47 inhibited the CHS response, whereas that with a mAbto CD47 had no such effect. The 2,4-dinitro-benzenesulfonic acid-induced proliferation of, and production of IFN-γ or IL17 by, T cells from DNFB-sensitized wild-type mice were inhibited by either mAb to SHPS-1 but not by that to CD47. In
contrast, the blocking mAbs to SHPS-1, but not that to CD47, inhibited an allogenic mixed leukocyte reaction. These results
suggest that SHPS-1 is essential for development of CHS, likely as a result of its positive regulation of the priming by DCs+of CD4 T cells. However, such regulation by SHPS-1 does not appear to require its interaction with CD47.

5）

１．諸

明らかとなっている 。私共はこれまでに、この SHPS-1

言が樹状細胞による T 細胞活性化に関与することを明らか
5）

化粧品などにより誘導される皮膚アレルギーの要因とにしている 。特に、SHPS-1 KO マウスでは、DNFB 誘なる化学物質には様々なものが知られているが、皮膚ア導性皮膚炎や MOG 誘導性脳脊髄炎（Th17 誘導性）の発レルギーの実験的マウスモデルとしては、DNFB あるい症が顕著に抑制されることを見出しているは TNCB 誘導性皮膚炎などがよく知られている。従来こDNFB で感作したマウスリンパ球における IL-17 産生が、れらの化学物質誘導性の皮膚炎は、Th1 誘導性であると考SHPS-1 KO マウスでは減弱することを見出している。以

えられてきたが、最近になり Th1 細胞とは全く異なる Th上の実験結果は、Th17 細胞の誘導には、樹状細胞に発現細胞亜群と考えられ IL-17 を特異的に産生する Th17 細胞する SHPS-1 が T 細胞上の CD47 と相互作用して機能するの重要性が示唆されている。実際、IL-17 の遺伝子欠損ことが重要であることを強く示唆している。また興味深い（KO）マウスでは、DNFB や TNCB 誘導性の皮膚炎やこれことに、DNFB 誘導性皮膚炎の発症抑制が抗 SHPS-1 モノらの化学物質誘導性の皮膚炎の発症が著しく抑制されるこ

クローナル抗体投与により認められ 、抗 SHPS-1 抗体がとが報告されている 。Th17 細胞の誘導には、ナイーブ

化学物質誘導性皮膚炎の治療に有効性を持つ可能性が示唆

CD4 T 細胞が樹状細胞から抗原提示を受けた後、TGFb、されている。

1-3）

4）

+が重要であるとされている。しかし、この Th17 細胞誘。さらに、

6）

そこで本研究では、接触性皮膚炎発症に SHPS-1、まIL-6、IL-23 などのサイトカインが協調的に作用すること
1-3）

6, 7）

た CD47-SHPS-1 系 が ど の よ う に 関 与 す る か に つ い て 検

導の分子機構は未だ十分に明らかにされておらず、また、討を行なうとともに、化学物質誘導性皮膚炎の治療に抗Th17 系が様々な化学物資誘導性の皮膚炎発症に関与してSHPS-1 抗体を応用するための基礎的研究を行なった 。

8）

いるか否かも明らかとはなっていない。

２．実

SHPS-1 は樹状細胞に強く発現する細胞膜型分子であり、T 細胞などに発現する細胞膜型分子である CD47 と相互作用することで細胞 - 細胞間でのシグナル伝達を担うことがRegulation by dendritic cell SHPS-1 of skinimmunity and its therapeutic application
for skin allergy

2. 1

験マウス

SHPS-1 KO マウスは SHPS-1 の細胞内領域をほぼすべて欠失した SHPS-1 を持つマウスであり、野生型 C57BL/6 と 5または６世代戻し交配を行ったマウスを SHPS-1 KO マウスとして用いた。CD47 KO マウスは、10 世代以上 CD57BL/6

Takashi Matozakiと戻し交配を行ったマウスであり、Oldenborg 博士（UmeåLaboratory of Biosignal Sciences,
Institute for Molecular and CellularRegulation, Gunma University大学、スウェーデン）より供与していただいた。野生型
C57BL/6 マウスおよび BALB/c マウスは日本 SLC より購入した。

− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

2. 2

3接触性皮膚炎モデルマウスの作製

細胞に取り込まれた［ H］チミジンの量を測定することで、８〜 12 週の雌マウスの背部に 0.5% DNFB を塗布し、5T 細胞の増殖の程度を定量化した。

日後に 0.2% DNFB を耳介に塗布した。0.2% DNFB 塗布 24

３．結時間後に耳介部の腫脹を計測した。また、DNFB による耳介部の腫脹に対する抗体投与の効果は、0.5% DNFB 塗

3. 1

果接触性皮膚炎発症への SHPS-1 と CD47 の関与

布の直前に、100 mg の抗 SHPS-1 抗体（mAb 97、p84）、抗接触性皮膚炎の発症における SHPS-1 と CD47 の重要性

CD47 抗体、または正常ラット IgG 抗体をマウスの腹腔内を検討する目的で、SHPS-1 KO および CD47 KO マウスに投与することで検討した。

における DNFB 誘導性皮膚炎の誘導を試みた。その結果、以前の報告と同様に SHPS-1 KO マウスでは、DNFB 塗布

2. 3

リンパ球のサイトカイン産生と増殖による耳介の腫脹が野生型マウスに比べ有意に低下した

８〜 12 週の雌マウスの背部に 0.5% DNFB を塗布 5 日後（図 1A）。一方、CD47 KO マウスでは、野生型マウスと同に、所属リンパ節よりリンパ球を回収した。回収したリン程度の耳介の腫脹が認められた（図 1B）。これらの結果か

パ球を 10 mg/ml の抗 SHPS-1 抗体、抗 CD47 抗体、またはら、接触性皮膚炎の発症には CD47 ではなく、SHPS-1 が正常ラット IgG 存在下で、DNBS（30 mg/ml）、または IL-2重要であることが示唆された。

（50U/ml）により 72 時間刺激した時点での培地中に含まれる IFN- γ および IL-17 の産生量を ELISA 法にて測定した。

3. 2

抗 SHPS-1 抗体による接触性皮膚炎の抑制

また、リンパ球の増殖の程度は、DNBS または IL-2 刺激 60

SHPS-1 と CD47 はそれぞれ細胞外領域を介して細胞間時間後に培地に［ H］チミジンを添加して、さらに 12 時間で結合し、細胞間シグナル CD47-SHPS-1 系を形成してい培養した時点でのリンパ球に取り込まれた［ H］チミジンる。CD47 と SHPS-1 との結合が、接触性皮膚炎の発症にの量を測定することで定量化した。

関与するかを検討する目的で、CD47 と SHPS-1 の結合を33阻害する抗 SHPS-1 抗体である mAb97、両者の結合を阻

2. 4

リンパ球混合試験

害しない抗体である p84、および CD47 と SHPS-1 との結+野 生 型 C57BL/6 マ ウ ス の 脾 臓 よ り CD11c 樹 状 細 胞合を阻害する抗 CD47 抗体である miap301 をそれぞれマウを、野生型 BALB/c マウスより CD4 T 細胞を単離し、抗ス腹腔内に投与し、これら抗体の DNFB 誘導性皮膚炎のSHPS-1 抗体、抗 CD47 抗体、または正常ラット IgG をそ発症に与える影響について検討した。抗 SHPS-1 抗体であれぞれ 10 mg/ml を含む培地で、両細胞の混合培養を行なる p84 および mAb97 を腹腔投与したマウスでは、DNFBった。培養 72 時間後に T 細胞から分泌された IFN-γ の産生塗布による耳介の腫脹の程度が有意に低下した（図 2A, B）。

量を ELISA 法にて測定した。また、培養 60 時間後に培地

一方、抗 CD47 抗体 miap301 を投与したマウスでは、そのに［ H］チミジンを添加し、さらに 12 時間培養した後、T腫脹の程度に影響は認められなかった（図 2C）。これらの+3

図１ SHPS-1 KO マウスおよび CD47 KO マウスにおける接触性皮膚炎の発症
SHPS-1 KO（A）または CD47 KO（B）の雌マウスの背部に DNFB を塗布 5 日後に、耳介に DNFB を塗布した。耳介の腫脹の程度は、耳介への DNFB の塗布前と塗布24 時間後の耳介の厚みの差を測定することにより求めた。＊＊, P<0.01（野生型マウスとの比較）、NS, 有意差なし− 58 −

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図２ 接触性皮膚炎発症への抗 SHPS-1 抗体および抗 CD47 抗体の効果
野生型マウスの腹腔内に抗 SHPS-1 抗体［p84（A）または mAb97（B）］、抗 CD47 抗体［miap301（C）］、
またはコントロールとして正常ラット IgG を投与後、マウスの背部に DNFB を塗布した。その 5 日後に、さらに耳介に DNFB を塗布し 24 時間後の耳介の腫脹の程度を測定した。耳介の腫脹の程度は、耳介へのDNFB の塗布前と塗布 24 時間後での耳介の厚みの差を測定することにより求めた。＊＊, P<0.01（正常ラット抗体との比較）、NS, 有意差なし

図３ DNBS 刺激によるリンパ球の増殖および IFN-γ、IL-17 産生に対する抗 SHPS-1 抗体および抗 CD47抗体の効果
DNFB をマウス背部に塗布し、5 日後に所属リンパ節よりリンパ球を調製した。リンパ球を含む培地中に抗 SHPS-1 抗体（p84 または mAb97）、抗 CD47 抗体（miap301）、コントロールとして正常ラット IgG を添加後、DNBS（DNFB と同様の抗原性を持つ可溶性物質）または IL-2 にて 72 時間リンパ球を刺激した。
刺激終了 12 時間前に培地中に［3H］チミジンを加えることでリンパ球の増殖の程度（A）を、また培地中に分泌された IFN-γ（B）および IL-17（C）の産生量を ELISA 法により測定した。＊, P<0.05, ＊＊, P<0.01（正常ラット抗体との比較）− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

結果から、抗 SHPS-1 抗体である p84 および mAb97 は接触４．考性皮膚炎の発症抑制効果をもち、その抑制効果はこれら抗体が持つ CD47 と SHPS-1 の結合阻害活性に依存しないことが示唆された。

察DNFB 誘導性皮膚炎の発症における CD47-SHPS-1 系の役割について SHPS-1 KO マウス、CD47 KO マウスを用い解析を行なったところ、SHPS-1 KO マウスでは DNFB 誘

3. 3 DNFB により感作されたリンパ球の増殖、サイトカイン産生に対する抗 SHPS-1 抗体の効果

導性皮膚炎の発症が抑えられたが、CD47KO マウスではDNFB 誘 導 性 皮 膚 炎 の 発 症 に は、 所 属 リ ン パ 節 で の疾患の発症には SHPS-1 と CD47 の相互作用が関与するとDNFB 特異的に反応するリンパ球の増殖やそれによるサ考えられたが 、これらの実験結果から、SHPS-1 は接触イトカイン産生が重要である。抗 SHPS-1 抗体処理により性皮膚炎の発症に重要であるが、CD47 はその発症に必須認められた DNFB 誘導性皮膚炎の発症抑制は、抗 SHPS-1

ではないと考えられた。また、CD47 と SHPS-1 の結合を抗体が所属リンパ節でのこれらリンパ球の反応を抑制し阻害する抗 SHPS-1 抗体である mAb97、および両者の結合たためである可能性が高い。そこで、DNFB 感作後のマを阻害しない抗体である p84 をマウスに投与し、接触性皮ウス所属リンパ節より調整したリンパ球を抗 SHPS-1 抗体

膚炎の発症に対する影響を検討したところ、どちらの抗体存在下で DNBS（DNFB と同様の抗原性を持つ水溶性物によってもその発症が抑制された。一方、CD47 と SHPS-1質）刺激し、リンパ球の増殖およびそのサイトカイン産生との結合を阻害する抗 CD47 抗体である miap301 の投与でについて検討した。その結果、抗 SHPS-1 抗体（p84 またはは抑制されなかった。これらの結果は、SHPS-1 と CD47

mAb97）存在下では、DNBS 刺激を行ったリンパ球の増との相互作用が接触性皮膚炎の発症に重要ではないことを殖が抑制された（図 3A）。さらに mAb97 処理では、リン支持するものである。

その発症の抑制が認められなかった。これまで、自己免疫7）

パ球からの IFN-γ の産生量が低下した（図 3B）。接触性皮抗 SHPS-1 抗体投与により接触性皮膚炎の発症が抑制さ膚炎の発症には IL-17 細胞による IL-17 の産生が重要であれが、これは細胞表面上に発現する SHPS-1 が抗体によるが、mAb97 処理では DNBS 刺激によるリンパ球からのり架橋され、SHPS-1 の機能が阻害されたことによる可能IL-17 産生量の低下も認められた（図 3C）。一方、IL-2 によ性が考えられる。実際、SHPS-1 を発現する培養細胞を抗る抗原刺激に依存しないリンパ球の増殖、IFN-γ、およびSHPS-1 抗体で処理した際、細胞表面上に発現する SHPS-1

IL-17 の産生には、抗 SHPS-1 抗体処理の影響は認められなはエンドサイトーシスされることを認めている。したがかった（図３）。また、抗 CD47 抗体 miap301 処理は、リンって、抗 SHPS-1 抗体処理はランゲルハンス細胞およびパ球の増殖、および両サイトカインの産生に影響を与えな樹状細胞上の SHPS-1 のエンドサイトーシスを誘導するかった（図３）。

ことにより、SHPS-1 の機能を抑制した可能性が考えられる。一方で、抗 SHPS-1 抗体の処置により SHPS-1 はその3. 4 抗 SHPS-1 抗体によるアロ抗原依存的な混合リンパ球培養反応の抑制

細胞内領域にチロシンリン酸化を受けることを確認していSHPS-1 がランゲルハンス細胞などの樹状細胞に高く発の生理機能を負に制御するチロシンホスファターゼ SHP-1

現することから、抗 SHPS-1 抗体処理で認められたリンと結合し、SHP-1 を活性化することが知られている 。しパ球の増殖抑制およびサイトカインの産生抑制は、所属たがって、抗 SHPS-1 抗体処理により SHPS-1 は SHP-1 のリンパ節での樹状細胞による T 細胞の活性化の過程に抗活性化を介して、樹状細胞の生理機能を負に制御すること

SHPS-1 抗体が抑制的に機能している可能性を示すとも考で接触性皮膚炎の発症を抑制している可能性も考えられる。

えられる。そこで、樹状細胞によるアロ反応性 CD4 T 細

しかし、樹状細胞に対する抗 SHPS-1 抗体の作用機構の詳胞の増殖とこれら T 細胞からの IFN-γ の産生に対する抗細については、今後の検討課題である。

+る。SHPS-1 はチロシンリン酸化依存的に血球系細胞の種々
5）SHPS-1 抗体の効果について検討した。C57BL/6 マウス脾

DNFB で感作された SHPS-1 KO マウスより単離したラン臓より調製した CD11c 樹状細胞と BALB/c マウスより調ゲルハンス細胞は、運動能と TNF-a の産生の障害を示す 。

製した CD4 T 細胞の混合培養を抗 SHPS-1 抗体存在下でまた、SHPS-1 KO マウスおよび抗 SHPS-1 抗体処理を行っ行ったところ、mAb97 では CD4 T 細胞の増殖を抑制する

た野生型マウスでは、DNFB 刺激によるランゲルハンス細傾向が認められたが、p84 抗体では認められなかった（図胞の成熟が障害を受けることも報告されている 。これら4A）。また、T 細胞による IFN-γ の産生については mAb97、に加えて、抗 SHPS-1 抗体である mAb97、p84 が、DNFB でp84 のどちらにおいてもその産生量に影響は認められなか感作を受けた野生型マウスより調製したリンパ球の DNBSった（図 4B）。一方、抗 CD47 抗体処理による T 細胞の増殖、刺激による細胞増殖を抑制し、さらに mAb97 はリンパ球

IFN-γ の産生量の変化は、全く認められなかった（図４）。

からの IFN-γ と IL-17 の産生を抑制した。また、リンパ球混+++9）6）− 60 −

樹状細胞分子 SHPS-1 による皮膚免疫制御とその皮膚アレルギーへの治療的応用

図４ 樹状細胞依存的な CD4+T 細胞の増殖、IFN-γ 産生に対する抗 SHPS-1 抗体および抗 CD47 抗体の効果
抗 SHPS-1 抗体（p84 または mAb97）、抗 CD47 抗体（miap301）またはコントロールとして正常ラット
IgG を培地中に添加し、図中で示した細胞数のマウス脾臓由来の CD11c+ 樹状細胞とマウス脾臓由来CD4+T 細胞の混合培養を行い、［3H］チミジンの取り込み量により CD4+T 細胞の増殖の程度（A）を測定し、また IFN-γ の産生量（B）を ELISA 法にて測定した。樹状細胞は C57BL6 マウスより調製し、CD4+T 細胞は BALB/c マウスより調製した。＊, P<0.05, ＊＊, P<0.01（正常ラット抗体との比較）+合試験からは、樹状細胞による CD4 T 細胞の増殖の誘導が、specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient

mAb97 処理により抑制されることが明らかとなった。すな

mice, causing suppression of allergic cellular and humoral

わち、抗 SHPS-1 抗体による T 細胞の増殖と T 細胞からのサresponses. Immunity 17, 375-387, 2002.

イトカイン産生の抑制が、抗 SHPS-1 抗体の持つ誘導性皮膚５）Matozaki T, Murata Y, Okazawa H, et al, :Functions
and molecular mechanisms of the CD47-SIRPa signalling炎発症抑制につながる可能性が示唆された。
本研究により、SHPS-1 は接触性皮膚炎の発症に重要で

pathway. Trends Cell Biol. 19, 72-80, 2009.

あり、樹状細胞の運動、成熟、T 細胞の活性化などに関与

６）Fukunaga A, Nagai H, Yu X, et al, :Src homology 2することが示唆された。その一方で、SHPS-1 と CD47 のdomain-containing protein tyrosine phosphatase substrate

相互作用は、その発症には関与しないと考えられた。また、

1 regulates the induction of Langerhans cell maturation.

接触性皮膚炎の発症抑制に抗 SHPS-1 抗体が有効であるこEur. J. Immunol. 36, 3216-3226, 2006.とが明らかとなった。今後、SHPS-1 の樹状細胞における７）Tomizawa T, Kaneko Y, Saito Y, et al, :Resistance

生理機能を明らかにすると共に、接触性皮膚炎の発症をよto experimental autoimmune encephalomyelitis

り効率よく抑制する抗 SHPS-1 抗体の作製が求められる。

and impaired T cell priming by dendritic cells in
Src homology 2 domain-containing protein tyrosine（文献）

phosphatase substrate-1 mutant mice. J. Immunol. 179,１）Weaver CT, Harrington LE, Mangan PR, et al, :Th17:
an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties.

869-877, 2007.
８）Motegi S, Okazawa H, Murata Y, et al, :Essential rolesof SHPS-1 in induction of contact hypersensitivity of skin.

Immunity 24, 677-688, 2006.
２）Kikly K, Liu L, Na S, et al, :The IL-23/Th17 axis:
therapeutic targets for autoimmune inflammation. Curr.

Immunol. Lett. 121, 52-60. 2008.
９）Fukunaga A, Nagai H, Noguchi T, et al, :Src homology
2 domain-containing protein tyrosine phosphatase

Opin. Immunol. 18, 670-675, 2006.
３）Iwakura Y, Ishigame H, :The IL-23/IL-17 axis insubstrate 1 regulates the migration of Langerhans cells
from the epidermis to draining lymph nodes. J. Immunol.

inflammation. J. Clin. Invest. 116, 1218-22, 2006.
４）Nakae S, Komiyama Y, Nambu A, et al, :Antigen-172, 4091-4099, 2004.

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