創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価
大阪府立大学大学院理学系研究科

森英樹

We evaluated the migration ability of fibroblasts and vascular endothelial cells by scratch assay. To evaluate the cell
migration ability, cell images were acquired over time as the cells were cultured after cell detachment by scratch treatment.
Since both cells filled the detached area by proliferation and migration within 48 hours, the migration rate and direction ofeach cell was determined by image analysis and calculation based on the temporal images of the cells during 48 hours ofculture. Compared to fibroblasts, vascular endothelial cells tended to migrate more perpendicular to the boundary with thedetached area. In addition, the migration rate of vascular endothelial cells was slower than that of fibroblasts. By analyzing
the migration characteristics of individual cells, we were able to find differences in the migration characteristics of different
cell types, which cannot be determined by the conventional method of measuring the total area covered by cells. To investigate the effect of covering with a soft hydrogel as a wound dressing on cell migration, a scratch assay was performed on
vascular endothelial cells covered with gelatin-alginate gel after cell detachment. The gel-covered vascular endothelial cells
lost their polarity in the direction of migration, and their migration rate became slower. Covering with a soft gelatin-alginate
gel seemed to have the effect of delaying the migration of cells to re-cover the wound.

1．緒に細胞の移動能がどのように変化するかを調べることを目言的とした。

創傷治癒には、皮膚を構成する線維芽細胞やケラチノサ

２．方イトだけでなく、血管を構成する血管内皮細胞など多くの細胞が関わる。外傷の治療に用いられる創傷被覆材には繊法

2. 1. 細胞の培養

維や軟らかいハイドロゲルなどが用いられるが、その材質実験にはマウス線維芽細胞の株化細胞である SNL とマや硬さ（粘弾性）はそれらの細胞の移動や形態を含めた様々ウス血管内皮細胞の株化細胞である b.End 3 と UV ♀ 2 をな挙動に影響を与えると考えられる。近年、物理的刺激の用いた。細胞は 10 % FBS および抗生物質を含む DMEM

1 つとして細胞の足場の硬さに対する細胞の応答メカニズ

培地を用い、ポリスチレン製培養皿上に播種し、炭酸ガスムが明らかになってきているが、細胞種によってその応答インキュベータ内で 37 ℃、5 ％ CO 2 条件下で培養した。

性は異なる 1 - 3）。複数種類の細胞からなる生体組織の再生を促すために用いられる生体材料の選定には、それぞれの2. 2. スクラッチアッセイ細胞の材料の硬さに対する応答性も考慮する必要がある。

細胞を 3 cm 培養皿上で 80 ％コンフルエントの状態にな

近年の情報科学技術の進歩に伴い、研究に利用できる性能るまで培養し、滅菌済ピペットチップの先で接着した細胞をもったカメラやコンピュータを比較的安価に入手できるの上を１回引掻くことで、幅約 700 µm の直線状の傷をつようになり、比較的情報量の大きい経時的な培養細胞の画けるように細胞を剥がした（図 1）。更に、その細胞を引き像データを簡便に保存、解析できるようになった。培養細続き 2 日間培養する様子を、炭酸ガスインキュベータ内に胞の経時的な画像は個々の細胞の移動や形態などに関する非常に多くの情報を含んでいると考えられる。そこで本研
究では、インビトロ創傷治癒アッセイ法として利用されているスクラッチアッセイを用いて、線維芽細胞と血管内皮細胞の運動能の違いを調べるとともに、創傷被覆材などに利用されるアルギン酸カルシウムゲルで細胞を被覆した時

Evaluation of the effect of mechanostressby soft materials on cellular behaviors
related to wound healing
図1

Hideki Mori
Graduate School of Science, Osaka
Prefecture University− 175 −細胞の剥離方法（A）細胞の剥離方向と（B）剥離した細胞の画像（scale bar= 100μm）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

設置した細胞顕微観察装置 CytoWatcher（ アトー社製）を用いて、20 分間或いは 30 分間隔で経時的に撮影した。

2. 3. 細胞の画像解析
経時的に得られた細胞画像をもとに、画像解析プログラ
ム ImageJ を用いて各画像における各細胞の座標を求めた。
連続的に細胞を撮影することができた計 110～130 個の細胞の座標データから各細胞の 6 時間毎の移動方向と移動距離を求めた。図 2 には細胞の移動方向 θ と移動距離 l を図−1示した。細胞の移動速度 v = l ×（t 1 − t 0）とした。

2. 4. ゼラチン-アルギン酸カルシウム混合ゲルの作製
アルギン酸ナトリウムが１％、ゼラチンが 8 ％になるよ

図2

うに蒸留水に溶解し、ゼラチン - アルギン酸ナトリウム混画像解析による細胞移動の距離と移動方向の表し方合液を作製した。ゼラチン - アルギン酸ナトリウム混合液をアルミ製円筒形金型に入れ、18 ℃ 24 時間、10 ℃ 2 時間、4 ℃ 24 時間の順に冷却し、直径 15 mm、高さ 5 mm の円筒形ゲルを作製した。更にこのゲルを 0 . 5 M 塩化カルシウ
ム溶液に 24 時間浸漬した後にオートクレーブ処理を施し、HEPES 緩衝液に 3 日間浸漬したものを実験に用いた。ス
クラッチアッセイを実施する直前に、観察する細胞の上からゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲル（ハイドロゲル）を被せた（図 3）。

３．結果細胞の移動特性を知るためにスクラッチ処理によって細胞を剥離した部分は、いずれの細胞でも増殖と移動によっ

図3て剥離後 48 時間程度で細胞が剥離部を埋めた。剥離部を細胞へのハイドロゲルの被せ方

埋めるまでの 48 時間における細胞の移動特性を評価する
ために、12 時間毎の細胞の移動方向と移動速度の分布を解析し、図４および図 5 に示した。線維芽細胞 SNL は、34 μm/h で各培養期間の中で最も高かった（図 5 B）。

スクラッチ処理後 12 時間ではスクラッチ方向に対して垂ヤング率 50 kPa 程度の弾性をもつハイドロゲルである直な方向（0±22 . 5 °）へ向かう細胞が全体の約 8 割を占めてゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲルを細胞に被せたいたが、12 ～ 24 時間では全体の 4 割程度であり、48 時間時の血管内皮細胞 UV ♀ 2 の移動方向と移動速度に関して、以降では移動方向の極性がほとんど見られなくなった（図移動速度が最も高くなるスクラッチ処理後 12 時間におけ4 A）。SNL の細胞移動速度は、スクラッチ処理後 24 時間

る値をもとに解析した。ゲルを被せていない対照条件ではまでは約 9 割の細胞が 130 μm/h より低い移動速度で、様々UV ♀ 2 の移動方向は垂直方向（θ ＝ 0±22 . 5 °）に明らかなな速度の細胞が見られた。細胞移動速度の平均値はスクラ極性が見られたが、ゲルを被せて培養した条件では細胞のッチ処理後 12 ～ 24 時間で 74 μm/h と最も高く、24 時間

移動方向は 360 °を 24 分割したすべての方向にわたってお以降では徐々に低下した（図 4 B）。

り、移動方向に大きな偏りが見られなかった（図 6）。細胞

一方、血管内皮細胞 b.End 3 では、スクラッチ処理後 24の移動速度もゲルを被せて培養した条件の平均値は 20 μm/時間までスクラッチ方向に対して垂直に進む細胞は全体のh で、対照条件の平均値 39 μm/h に比べ低下した（図 7）。

7 割以上を占め、24 ～ 36 時間でも半数の細胞が垂直方向

また、対照条件では細胞移動速度 v= 10 - 20 μm/h が最頻値へ移動しており、SNL に比べて移動方向に極性が見られであるのに対し、ゲルを被せて培養した条件では細胞移動た（図 5 A）。移動速度に関しては大部分の細胞が 80 μm/h

速度 v = 0 - 10 μm/h が最頻値であった。軟らかいゼラチン -よりも低い速度で移動しており、SNL よりも低かった。ス

アルギン酸カルシウム混合ゲルを被せることによって、被クラッチ処理後 12 ～ 24 時間における移動速度の平均値がせられた血管内皮細胞の移動特性に変化が生じた。

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AB

図4 スクラッチアッセイにおける線維芽細胞の移動特性
線維芽細胞SNLの（A）移動方向と（B）移動速度のヒストグラム− 177 −

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AB

図5 スクラッチアッセイにおける血管内皮細胞の移動特性
血管内細胞b.End 3の（A）移動方向と（B）移動速度のヒストグラム− 178 −

創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価

図6 ハイドロゲル被覆培養時の血管内皮細胞UV♀2の移動方向の分布

４．考察

スクラッチアッセイは in vitro で簡便に細胞の移動を評価できる創傷治癒アッセイ法として、皮膚の再生に関わる細胞挙動の研究や塗布薬として効果が期待される低分子化合物の評価など多くの研究に用いられている 4 - 6）。しかし、これらのスクラッチアッセイの評価方法の多くは、スクラッチあるいは専用の型によって細胞培養容器中に細胞剥離部を作製し、その剥離部が細胞によって再び覆われる様子を観察し、細胞の再被覆面積の経時変化を定量するものである 7）。細胞剥離部の再被覆面積の計測は、創傷治癒に対する薬効を簡便に判断できる利用しやすい指標であるが、その細胞による再被覆のメカニズムを知るためには個々の細胞の挙動を注意深く観察し、適切なパラメーターで評価する必要がある。本研究では、細胞の移動方向と移動速度の 2 つのパラメーターに絞って評価した。線維芽細胞由来の SNL と血管内皮細胞由来の b.End 3 では移動方向と移動速度のどちらの特性も異なっていた。細胞剥離部を細胞が再被覆する面積および速度を議論する上で、細胞移動速度

図7 ハイドロゲル被覆培養時の血管内皮細胞UV♀2の移動速度の分布だけでなく、細胞の移動方向の極性についても考慮する必５．総要がありそうである。最近、細胞集団運動の方向性が細胞間におけるセリン／トレオニンキナーゼである ERK の活8）

括スクラッチアッセイによって得られた細胞の経時的な画性伝搬によって決まることが報告された 。血管内皮細胞像をもとに、個々の細胞の 2 種類の移動特性（移動方向、由来の UV ♀ 2 はゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲ移動速度）を評価した。線維芽細胞と血管内皮細胞の間でルを被せたことによって移動の方向性の極性が見られなく細胞種による移動特性の違いを見つけた。また、ゼラチンなったことはゲルの粘弾性が ERK 活性伝搬に何らかの影- アルギン酸カルシウム混合ゲルを血管内皮細胞の上に被響を及ぼしているかもしれない。今後、これらの因果関係せて培養すると、細胞の移動方向に偏りが見られなくなり、について細胞種やパラメーターを増やし、更に研究を進め移動速度を低下させることを見つけた。本研究で用いた 2る必要がある。

つの移動特性は創傷治癒に関する細胞挙動評価パラメータ− 179 −

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ーとして、創傷被覆材を評価する指標になることが期待でanalysis of cell migration in vitro, Nature Protocols, 2,きる。

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