【研究報告】（自然科学部門）

食品機能性成分ブテインの抗成人 T 細胞白血病効果と作用機序の解明

石川千

琉球大学亜熱帯島嶼科学超域研究推進機構
緒言

恵助教

HTLV-1 感 染 T 細 胞 株（MT-4、HUT-102）、ATL 由 来

成人 T 細胞白血病（ATL）は発がんウイルスである細胞株（TL-OmI）および健常人末梢血単核球（PBMC）

ヒト T 細胞白血病ウイルス 1 型（HTLV-1）によって引を用いて検討した。細胞生存率の解析は発色基質である

き起こされる予後不良の疾患である。HTLV-1 は主に乳水溶性テトラゾリウム塩を利用した生細胞数測定法であ児期に母乳を介して感染する。生体内での宿主細胞は免る WST-8 法で行った。

疫担当細胞である CD4 陽性 T リンパ球であり、HTLV-1
細胞周期の解析2.

はプロウイルスとして自身のゲノムを宿主ゲノム内に組み込む。このためいったん感染が成立すると排除されるブテインの細胞周期に与える影響を検討した。細胞ことはなく、生涯宿主細胞とともに存続する。感染後約周期の解析はヨウ化プロピジウム（PI）で核を染色後に20〜80 年の潜伏期間を経て一部の感染者（2〜10％）がフローサイトメトリーで行った。また、細胞周期関連タ1）

ンパク質の発現についてウエスタンブロット法で検討しATL を発症する 。

た。

HTLV-1 感染者は全世界に約 2,000 万人いると推定されている。感染者の割合は地理的偏りがあり、日本、カ3.

リブ海諸島、中央アフリカなどが高浸淫地域である。そアポトーシスの解析の中で日本は唯一の先進国である。日本では 108 万人のブテインによるアポトーシス誘導に関して検討した。

感染者がいるとされる。これまで九州・沖縄が感染者のアポトーシスの検出はアポトーシス早期にミトコンドリ多い地域とされていたが、最近の研究では人口移動に伴ア膜上に出現する APO2.7 抗原に対する蛍光標識抗体をい大都市部でも感染者の増加が明らかになっている。日用いて行い、これをフローサイトメトリーで解析した。

本では年間約 1,200 人が ATL を発症しており、今後も感核を Hoechst33342 で染色し、アポトーシスによる核の染者からの ATL 発症が予想されることから、その発症形態変化を顕微鏡で観察した。さらに、アポトーシス誘2）導について、カスパーゼ分子の切断をウエスタンブロッ

予防薬・治療薬の開発は急務である 。
ATL 細胞では細胞内生存シグナルの異常な活性化がト法で検討した。カスパーゼ活性は、ρ-ニトロアニリドあり、これまで筆者はそれらの解析に基づいた ATL 治で標識したカスパーゼに最適な切断配列を持つ合成ペプ療法の開発に努めてきた。食品機能性成分ブテインはカチドを基質として、放出された ρ-ニトロアニリドを分光ルコン構造を持つ黄色色素であり、細胞内シグナルであ光度計で測定した。カスパーゼ依存性は全カスパーゼ阻る NF-κB、STAT3、JNK 等を標的とした抗がん・抗炎害剤（Z-VAD-FMK）を用いて検討した。またアポトー3）症作用が報告されている 。ブテインのこれらの作用はシス関連タンパク質の発現についてもウエスタンブロッ

ATL 細胞に対しても有用であると考えられた。そこで、

ト法で検討した。

本研究では試験管内実験および動物実験によりブテイン
4.の抗 ATL 効果を検証した。

シグナル伝達経路の解析
ATL 腫瘍細胞で重要な細胞内シグナル経路 NF-κB、実験方法
1.

AP-1、Akt について、ブテインによる影響を検討した。

細胞生存率の解析

転写因子である NF-κB および AP-1 については、DNAブ テ イ ン の 細 胞 生 存 率 に 対 す る 影 響 に つ い て、結合能をゲルシフトアッセイにて検討し、関連タンパク
1

石

川

千恵

質の発現やリン酸化についてウエスタンブロット法で検作用させると G1 期の細胞の割合が増加し、S 期の細胞討した。Akt の発現やリン酸化についてもウエスタンブの割合が減少した。すなわち、ブテインはこれらの細胞ロット法で検討した。

株に濃度依存性の G1 期での細胞周期停止をもたらした。
また、アポトーシス細胞と示唆されるサブ G1 期の集団

5．動物モデルでの検討の増加もブテインの濃度依存性に認められた（図 2）。

SCID マウス（5 週齢のメス）の頭部に HTLV-1 感染

細胞周期関連タンパク質では、ブテインにより G1 期かT 細胞株 HUT-102 を皮下移植し、ATL モデルマウスをら S 期 へ の 進 行 に 関 わ る 分 子 で あ る CDK4、CDK6、作 成 し た。 ブ テ イ ン は 大 豆 油 に 懸 濁 し、 一 匹 あたり

cyclin E の発現量が濃度依存性に低下していた。

0.7 mg を週 3 回、腹腔内に投与した（投与群 6 匹）。対照
3.

群（6 匹）には溶媒のみを投与した。細胞移植翌日よりアポトーシスの解析

ブテインを投与し、1 週ごとに体重および腫瘍体積を計

ブテインは MT-4、HUT-102、TL-OmI 細胞株におい測した。移植 4 週後に腫瘍重量を比較した。ATL のサて時間依存性・濃度依存性にアポトーシス誘導をもたら

ロ ゲ ー ト マ ー カ ー で あ る 血 清 可 溶 性 IL-2 受 容 体 α 鎖した。核染色後に顕微鏡で観察したところ、アポトーシ（CD25）および可溶性 CD30 の値を ELISA で測定し、対ス細胞にみられるクロマチンの凝集化や核の断片化を認

照群と投与群とで比較検討した。また、摘出した腫瘍組めた。MT-4 においてブテインを作用させることで、カ織に HE 染色や TUNEL 染色を行い、組織内アポトーシ

スパーゼ-3、-8、-9 の活性化が認められ、全カスパーゼ阻ス細胞を観察した。

害剤を前処理することでブテインによる細胞生存率低下が抑制された。ウエスタンブロット法による検討では、結1.

果MT-4、HUT-102 細胞株において、ブテインを作用させ細胞生存率の解析ることでカスパーゼ-3、-8、-9 の切断およびカスパーゼ-3ブテインは MT-4、HUT-102、TL-OmI 細胞株の生存の基質である PARP の切断が濃度依存性に認められた。

率を時間依存性・濃度依存性に低下させた（図 1）。こまた、抗アポトーシスタンパク質である survivin およびれらの細胞株において、ブテイン添加 72 時間の時点でXIAP の発現低下も濃度依存性に認められた。の 50％阻害濃度（IC50）は 7.0〜9.8 μM であった。一方
4.

で健常人 PBMC での IC50 は 27.8 μM、PHA 刺激活性化シグナル伝達経路の解析

PBMC で 18.5 μM であり、ブテインは健常人 PBMC と比CDK4、CDK6、cyclin E、survivin、XIAP の 発 現 は

較して HTLV-1 感染 T 細胞株に対してより低い濃度で殺NF-κB により制御されている。そこで、MT-4、HUT-細胞効果を示した。

102 細胞株において NF-κB の DNA 結合能をゲルシフトアッセイにて検討した。ブテインにより、これらの2.

細胞周期の解析DNA 結合能は濃度依存性に低下していた。なお、抗体

MT-4 および HUT-102 細胞株において、ブテインを

図1に よ る バ ン ド の シ フ ト か ら、 結 合 し て い る NF-κB はブテインによる殺細胞効果

HTLV-1 感染 T 細胞株（MT-4、HUT-102）および ATL 由来細胞株（TL-OmI）の細胞生存率に対するブテインの影響を WST-8 法で検討した。
2

食品機能性成分ブテインの抗成人 T 細胞白血病効果と作用機序の解明

図2

ブテインによる細胞周期の停止

ブテインの細胞周期に与える影響を検討した。ヨウ化プロピジウム（PI）で核を染色後にフローサイトメトリーで解析した。

p50、p65 および RelB であった。ウエスタンブロット法の 可 溶 性 CD25 濃 度（対 照 群 8,022 pg/mL、 投 与 群による検討から、NF-κB 阻害タンパク質である IκBα お4,642 pg/mL、 ＜0.05）および可溶性 CD30 濃度（対照

よび IκB キナーゼである IKKα/β のリン酸化がブテイン

群 2,800 pg/mL、投与群 1,159 pg/mL、 ＜0.01）も対照により減少しており、ブテインが HTLV-1 感染 T 細胞株群と比較して投与群では有意に低かった。ブテイン投与の NF-κB シグナルを IKKα/β の脱リン酸化により阻害す群の摘出腫瘍組織では、HE 染色でクロマチンの凝集化ることが示された。AP-1 も細胞増殖や細胞生存に重要や核の断片化が顕著であり、TUNEL 陽性細胞が増加しな転写因子であるが、AP-1 シグナルについても、同様ていた。なお、実験期間内の体重変化について両群に差に DNA 結合能の低下を認め、構成分子である JunB おはなく、目立った副作用もみられなかった。

よ び JunD の 発 現 量 が ブ テ イ ン に よ り 低 下 し て い た。
考

Akt は NF-κB の活性化や XIAP の分解抑制に関与してい察

るが、Akt シグナルに関して、ブテインは低濃度ではリ

食品機能性成分ブテインは HTLV-1 感染 T 細胞株おン酸化の抑制を、また高濃度ではタンパク質発現量の低よび ATL 由来細胞株の細胞生存率を低下させた。その下をもたらした。以上の結果より、ブテインは NF-κB、効果は G1 期での細胞周期の停止およびカスパーゼ依存

AP-1 および Akt シグナルを同時に阻害し、細胞周期促性アポトーシス誘導によるものであった。細胞周期関連進タンパク質や細胞死阻害タンパク質の発現を抑制する分子やアポトーシス関連分子の発現や活性は、細胞生存ことが示された。

シグナル NF-κB、AP-1、Akt による制御を受けており、これらのシグナル伝達経路を阻害することで、ブテイン

5.

動物モデルでの検討は抗 ATL 効果を発揮するものと考えられた。ATL 細胞

ブテイン投与群では細胞移植 14 日以降の腫瘍体積ににおいては、これらのシグナル伝達経路が異常活性化状おいて、対照群と比較して有意に増殖が抑制されてい態にあり、ブテインの細胞生存率への影響において、健た。移植 28 日後での腫瘍重量も投与群では対照群と比常人 PBMC との差異は上記の作用によるものと言える。

較して有意に小さかった（ ＜0.01）（図 3）。また血清中

また、動物実験の結果から生体への副作用を生じない投3

石図3

川千恵

動物実験におけるブテインの抗 ATL 効果

ATL モデルマウスおける対照群とブテイン投与群の腫瘍体積の変化（A）と移植後 28 日目の外観（B）。移植後 28 日目の腫瘍重量（C）
および摘出腫瘍（D）。 ＝6。* ＜0.05、** ＜0.01。

要与量での腫瘍抑制効果を得られることが示唆された。単約

一の細胞生存シグナルの阻害に比べて、複数の生存シグ食品機能性成分ブテインは ATL 細胞の特異的生存シナルを同時に阻害すると、より強い抗腫瘍効果が生み出グナルを抑制することで、細胞周期の停止、アポトーシされ、副作用が軽減されることが知られており、ブテイス誘導を引き起こし、腫瘍細胞の生存を阻止する。本研

ンが 3 つのシグナル伝達経路を阻害する事実は、既知の究からブテインは ATL に対する治療薬、発症予防薬とシグナル伝達阻害剤に比べて優位性を有する可能性も期して有望であることが示唆された。

待される。
謝

ATL に対する標準的治療法はいまだ確立していない。

辞本研究ではブテインによる抗 ATL 効果およびその作用

本研究は平成 26 年度学術研究奨励金により遂行され機序を明らかにしており、ATL の新規治療候補薬としました。ご支援賜りました公益財団法人三島海雲記念財てのブテインの可能性が示された。また、ATL 発症に団ならびに関係者の方々に深謝いたします。

はウイルス感染から長い潜伏期間を経るため、長期間に文わたって安全に摂取できる食品由来成分は発症予防薬としての利用が期待され、ブテインはその点でも有用な成

献1） R. Mahieux, A. Gessain:257–264, 2007.
2） T. Watanabe:
3） V. R. Yadav, et al.:2011.

分であると考えられた。

4, 2,, 94, 430–434, 2011.
, 11, 295–309,