Apollon による細胞老化の制御機構

東京大学分子細胞生物学研究所

内 藤

幹 彦

Apollon is a large protein containing baculoviral-IAP-repeat and ubiquitin-conjugating enzyme domains at theamino- and carboxy termini, respectively. Apollon inhibits apoptosis by facilitating proteasomal degradation ofcaspase-9 and SMAC. Homozygous disruption of apollon gene in mice results in embryonic lethality, and the mutant
embryos showed polymorphic phenotype including growth retardation and defects in vasculogenesis. Here we showthat embryonic fibroblasts from apollon-deficient mice showed earlier replicative senescence and over-duplicationof centrosome. The time required for completion of mitosis was extended in the apollon-deficient cells comparedwith wild-type cells. Thus, cell cycle regulation is affected in the apollon-deficient cells, which may be involved in theearlier replicative senescence.

１．緒

サスペンドして 10 ㎝ディッシュにまき、炭酸ガス培養器

言で培養する。

IAP（inhibitors of apoptosis）ファミリーの 1 つである

genotyping 用 に と っ た 胎 仔 の １ 部 に 60uL の Lysis

Apollon は N 末 端 側 に BIR（baculovirus IAP repeat）ドBuffer 加え、55℃、1 時間処理する。95℃で 20 分処理後、メインを、C 末端側に UBC（ubiquitin-conjugating enzyme）

15000 rpm、10 分間遠心し、上清１ul に genotyping 用プドメインを有する分子量 530 Ｋの巨大なタンパク質である。

ライマー、PCR Buffer、dNTPmix、polymerase、を加え、これまでの研究で、Apollon は BIR、UBC ドメインを介PCR にかける。反応産物を２% agarose gel（エチジウムして Caspase ９や SMAC をユビキチン化し、プロテアソブロミド入り）で泳動し、バンドを観察する。

ームによる分解を促進することによりアポトーシスを阻害1）することが明らかとなっている 。しかし、BIR、UBC ド

2・2

細胞老化の観察メイン以外の広大な領域の機能は未知であり、また、当研

2・2・1

究室で作成した Apollon 欠失マウスは胎生致死であること

MEF の初代培養を始めた日を０日とし、２日後から３から、Apollon には細胞死制御以外似も様々な機能がある

日毎に細胞数を計測し、MEF（+/+）は５×105cells/10と推測される。

㎝ dish で、MEF（-/-） は 7×10 cells/10 ㎝ dish で ま き

本研究では、主に Apollon 遺伝子を欠損したマウス胎児累積の細胞増殖曲線

5続けた。

繊維芽細胞（MEF）を解析し、Apollon 欠損 MEF が早期に増殖を停止し老化した表現型を示すこと、Ｍ期の進行が2・2・2遅延していること、中心体が過剰複製されていることを見

MEF の初代培養を始めた日を 0 日とし、初代培養開始後、さま出した。

ざまな時間に細胞を固定し、senescence β-galactosidase

２．実
2・1

senescence β-galactosidase 染色

staining kit（Cell Signalling）の protocol に従い、染色を験行った。

MEF の初代培養と Genotyping

耐性 14.5 日のマウス胎児を摘出し、ハサミで細かく切2・3

免疫染色

り刻んでから、一部を genotyping 用に分ける。トリプシ細胞を PBS で洗った後、４％パラホルムアルデヒドでンを加え室温で 40 分間振倒した後、DMEM を加えて遠固定する。PBS で３回洗浄した後、0.1％ TritonX-100 お心（1000rpm、５分）し、上清を除く。沈殿を DMEM によび３％ BSA 入りの PBS で浸透化とブロッキングをする。
Blocking Buffer に 1 次抗体を希釈し、室温で２時間処理

Regulation of replicative senescence byapollonする。PBS で 10 分 × ３回洗った後、蛍光標識 2 次抗体と、

Mikihiko Naito

再び PBS で 10 分 × ３回洗浄し、Poly-Mount 液とカバー

Institute of Molecular and Cellular
Biosciences, The University of Tokyo

hoechst も同様に希釈し、遮光して室温で１時間処理する。
ガラスを用いて封入する。

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

2・4Time-lapse microscopy

期に老化するのか検討した。正常細胞は分裂回数を重ねる

MEF は顕微鏡下、37℃、25mM HEPES-KOH（pH7.3）

３．結
3・1ごとに CDK インヒビターの p16、p21 タンパクの発現が増加し、p21 は完全に老化すると減少することが知られて含有 DMEM で培養し、3 分毎に撮影を行った。

いる。初代培養を開始後経時的に MEF の lysate を調製し果Western blot で解析した結果、野生型 MEF と比較して、Apollon 欠損 MEF の初代培養

Apollon 欠損 MEF では p16、p21 ともに早期に発現が増

Apollon（+/-）マウスを交配して得られた胎児の細胞を初代培養して、野生型 MEF、及び Apollon 欠損 MEF加していることが明らかになった（Fig. 2B）。また、老化マーカーとして知られる酸性 β-galactosidase 染色を樹立した。PCR により Genotype を解析し、Apollon 欠損 MEF は Apollon タンパク質を発現していないことを確認した（Fig. 1）。XIAP 遺伝子破壊マウスでは、cIAP-1、2）

cIAP-2 が発現上昇していることが報告されている 。そこで、Apollon の欠失マウスで他の IAP の発現を検討したが、野生型 MEF との差は見られなかった（Fig. 1）。

3・2

MEF の老化

ヒトやマウス線維芽細胞を培養すると、細胞は一定期間増殖後、扁平な形態となり、不可逆的に増殖を停止し長期間生存し続ける。このような状態を細胞の老化と呼び、老化した細胞は対数増殖期の細胞とは異なる特徴を示すことが知られている。野生型 MEF は約 30 日間増殖した後細胞分裂を停止したが、Apollon 欠損 MEF は約 10 日で増殖を停止した（Fig. 2A）。そこで Apollon 欠損 MEF は早

Fig.2

Fig.1

MEF の genotyping と IAP の発現

Apollon 欠損 MEF に見られる細胞老化− 46 −3）におApollon による細胞老化の制御機構

いても、野生型 MEF と比較して、Apollon 欠損 MEF で

その結果、Apollon 欠損 MEF では野生型 MEF と比べては早期に強陽性を示す細胞が出現した。
（Fig.2C）。これら

分裂期の開始から終了までの時間が約 1.5 倍に延長していの結果から、Apollon 欠損 MEF は早期に老化することがた（Fig.3B）。１回の細胞周期に要する時間は、ほとんど明らかになった。

同じであったことから、Apollon 欠損 MEF では細胞周期の M 期の進行が特異的に遅れていることが示唆された。

3・3

Apollon 欠損 MEF に見られる細胞分裂の異常

これらの結果から、Apollon は細胞周期、特に G2/M 期の老 化 し た MEF の 培 養 を 長 期 間 維 持 す る こ と に よ り、制御に関与することが考えられた。

自然に形質転換を起こして不死化した野生型 MEF 及び
Apollon 欠損 MEF を樹立した。これらの不死化した MEFの細胞分裂の様子をビデオに撮影して観察した（Fig.3A）。

Fig.3

3・4

Apollon 欠損 MEF に見られる中心体過剰複製

ビデオの観察から、Ｍ期が遅延していることに加えて、Apollon 欠損 MEF に見られる M 期の延長

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

Apollon 欠損 MEF では２つに分裂できない細胞や、１度して機能することが知られている。今後、Apollon によっ３つに分裂した後１つに融合してしまう細胞等、細胞分裂てユビキチン化などの制御を受ける細胞周期制御因子を明に異常を示す細胞も多数観察された（Fig.3A）。細胞分裂らかにすることにより、Apollon による細胞老化の制御機の過程で、凝縮した染色体は分裂中期において赤道面上に構を解析していく予定である。

並び、対極に位置する２つの中心体から紡錘糸が伸びてきて染色体を均等に分配する。しかし、中心体が過剰に存在（文

すると染色体が不均一に分配され、３つ以上に分裂するこ１）Hao, Y., Sekine, K., Kawabata, A., Nakamura, H.,献）とがある。そこで、Apollon 欠損 MEF で中心体が過剰にIshioka, T., Ohata, H., Katayama, R., Hashimoto, C.,

存在するかどうか、γ-tubulin の免疫染色により検討した

Zhang, X., Noda, T., Tsuruo, T., and Naito, M.: Apollon（Fig.4A）。野生型 MEF の中心体はほぼすべての細胞が２ubiquitinates SMAC and caspase-9, and has an個以下であったのに対し、Apollon 欠損 MEF では約 20%

essential cytoprotection function. Nat Cell Biol, 6 (9),の細胞で中心体が過剰複製していた（Fig.4B）。

４．考849-860, 2004.
２）Harlin, H., Reffey, S. B., Duckett, C. S., Lindsten,

察T., and Thompson, C. B.: Characterization of XIAP-Apollon 欠損 MEF の解析から、Apollon が細胞周期（特deficient mice. Mol Cell Biol, 21 (10), 3604-3608, 2001.にＭ期）の制御や中心体複製の制御に重要な機能を持つこ

３）Dimri, G. P., Lee, X., Basile, G., Acosta, M., Scott, G.,とが示唆された。Apollon 欠損によるこれらの制御異常が、

Roskelley, C., Medrano, E. E., Linskens, M., Rubelj, I.,初代培養 Apollon 欠損 MEF に見られた早期老化の原因とPereira-Smith, O., and et al.: A biomarker that identifies

なっている可能性が考えられる。Apollon は UBC ドメイ

senescent human cells in culture and in aging skin in

ンを持ち、Caspase ９や SMAC のユビキチンリガーゼとvivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 92 (20), 9363-9367, 1995.

Fig.4

Apollon 欠損 MEF に見られる中心体過剰− 48 −