表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝達：
天疱癒IgG誘導表皮細胞間接着離開と力）レシウムシグナル伝達
岐阜大学

北島医学部

康雄•清島真理子

The signal transduction involved in the regulation of eel卜cell contacts is supposed to play
an important role in kertinocyte differentiation. To elucidate signaling mechanisms to regulate
keratinocyte functions, we employed pemphigus vulgaris (PV), which is a bullous disease causedby disruption of desmosomes (a cell-cell junction), as a model. In this disease, autoantibodies bindto the desmosomal junctional proteins, so that cell-cell detachment is induced. However, noprecise mechanism for this phenomenon after the antibodies bind to the antigen has been known.
In this study, the effects of PV-IgG on the intracellular concentrations of Ca ++ and inositol 1,4,5tris-phospate and secretion of plasminogen activator (PA) were studied in cultured
keratinocytes. PV-lgG caused inrecases in these second messengers and PA secretion, which wereinhibited with phospholipase C (PLC) inhibitor; U73122. These results may suggest that PLC andCa++ singnaling pathway is involved in cell-cell detachment in PV.

要性の細胞内カルシウムの増加が観察された。 この

約反応は、EGTA前処理により細胞外のカルシウムを天疱癒およぴ類天疱癒において抗体が表皮細胞キレ ー トしても変化はなかった。 したがって、細表面に結合後にどのような過程を経て水疱形成に胞内プ ー ルよりのカルシウムの動員によって、細至るかについては、最終段階でプラスミノ ー ゲン

胞内カルシウムの一過性の増加を引き起こすことアクチベータが分泌され、プラスミンが活性化さが示唆された。

れ．、これによる細胞間接着の消化が関与するということが推察されているものの不明な点が多い。
本研究では、抗体結合後の細胞内シグナル伝達を一方、 類天疱癒IgG 8 例中 7 例、健常人IgG 14例

中 12 例では細胞内カルシウムは変化しなかった。

さらに、この天疱癒IgGは添加後 20 秒をピ ー クと解析した。 培養表皮細胞の培地に天疱癒IgGを添するI氏の産生を誘導した。 この反応は類天疱癒、4, 5

正常lgGでは見られなかった。 また、天疱癒IgGに加し、細胞内カルシウム、 イノシトー—三リン酸(IPりの濃度、プラスミノル1,ゲンアクよって誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇、チベ ー タの分泌の 変化を検討した。 その結果、天I凡産生の増加およびプラスミノ ー ゲンアクチベ

疱癒IgGでは 8 例中 7 例で 20 秒をピータの分泌増加がホスリパ ー ゼC (PLC)阻害剤でーークとする一過ある D73122によって抑制された。 このことから、
天疱循I g G に より誘導 され るシグナル伝達系にSignal transduction involved in theregulation of cell-cell junction anddifferentiation in keratinocytes
Involvement of calcium signaling in
pemphigus lgG induced acantholysis
Yasuo Kitajima
Department of Dermatology
Gifu University School of Medicine

PLCが関与していることが示唆された。
以上から、 自己抗体結合後の天疱癒水疱形成メカニズムには、カルシウムを介したシグナル伝達系が関与している可能性が示唆された。 また、天疱癒と類天疱癒の発症過程において明らかな差異があると考えられた。

-103-

Effects of lgGs from PV, PF.BP and表1

はじめに

norma I天疱癒の水疱形成には抗デスモソ ー ム抗体が原PV因と考えられており、尋常性天疱癒 (PV) では抗デスモグレイン皿抗体が、葉状天疱癒 (PF) では抗デスモグレインI抗体がその発症に大きな役割

Age Sex IF
34 F 〉40XI
2
U F 〉40x
3 65 M >40x415557

F >640x 150KD
M ND
F 〉40X 150KD

I30UU6960
437565

MFFFFFMM

45678らの抗体が表皮細胞表面に結合した後に、如何なる機序によって、天疱癒に特有な表皮の棘融解が1B ea'•Res＋130KD
130KD＋130KDPF 123BPを果たす ことが知られている 1 - 3〉。 しかし、これsera on [Ca2+]
�e Sex Ca''Res
37 F
60 M
57 F
48 F
51 F
33 F
42 M
45 M
30 F
35 F
43 M
63 M
69 M
70 F

Nor 1235678，>40x IBOKD＋>40x 180KD
640x 230KD
640x 230KD
180KD
ND180, 230KD ND
ND 180, 23CKD 180KD
ND

1011121314

生じるかについては不明な点が多い 3) 。 ところでを培挫液に添加し、ア ー カ

最近、Cキナ ー ゼの阻害剤であるH7が、天疱癒抗製した lgG (lmg/ml)

体による棘融解形成を抑制したという報告 4) があス 100 ー イメ ー シング蛍光顕微鏡および画像解析

り、天疱癒の棘融解形成において、カルシウムー装置（浜松ホトニクス）を用いて細胞内カルンウ

c- キナ ー セを中心としたシグナル伝達メカニズム

ム濃度の変化を検討した。

が関与することが示唆されている。 そこで、われ
われは天疱痛抗体結合後の表皮細胞において細胞

イノシト ー ル 、 1 、 4 、 5三リン酸の測定
l.8mMカルシウムを含有するイ内カルシウムが変化するか否かについて検討しー6)

グル培挫液で培養したヒト表皮細胞の培養液にIgG を加え、一た。

定時間後に10%過塩素酸により反応を停止した。
I 氏の定最は I 凡特異的結合蛋白質を含む IPa アッ

材料と方法

セイキット（アマシャム）を用いて行っ た。
lgGの精製尋常性天疱癒プラスミノゲン ・ アクチベ ー タ ー 活性の測定(PV) 5例、葉状天疱癒 (PF )DJM-1細胞の培養液に IgG およびu13122 00-43例、水疱性類天疱癒 (BP) 8例および健常人(N)を 添 加 し た。 コントロ ー ル と してー
プロテインAーア
14 例の血清より、 ハ イトラップ-1 0-5M)

フィニテイ ー カラム（ファルマシア社）を用いて073122 の不活性アナログである073343 oo-s M)

lgG 画分を得た。

lgGの精度については免疫電気泳を添加した。 その 9,24 および36時間後に培15,動で確認した。 なお、天疱癒および類天疱痛の診養液を採取し、液中に含まれるプラスミノゲン・断は、臨床症状、病理組織、直接および間接免疫

アクチベ ー タ ー

蛍光法、さらに、ヒト表皮細胞あるい はDJM-1 細lytic assay ·s> を用いて測定した。

(PA)

活性を two-step amido­

7胞を基質としたウエスタンプロット法によって行われた（表1)。

結細胞内カルシウム濃度の測定

ヒト表皮細胞およびDJM-1細胞を継代した後2 日間、1. OmMカルシウム入りイ果5)ー天疱癒および類天疱癒 lgGよる細胞内カルシウムグル培養液で培旋濃度の変化し、subconfluentな状態で測定を行った。 5µMフ

無刺激時の細 胞内カルシウム濃度は98. 8 土

ラ2/AM (同仁化学）を 37 ℃で1時間加えることに20. 2nM (n =85)

より、 フラ2を細胞内に取り込ませ、洗浄後、 精ると PVIgG 5例中 4例、PF 3例全例でヒト表皮細-104-であった。

IgG 添加後の変化をみ

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するングナル伝達：天疱癒 lgG誘導表皮細胞間接着離開とカルシウムシグナル伝達

胞、 DJM-1細胞ともに20秒をビ ー クとする、 一 過なった。 このような 天疱癒lgGによる 細胞内カル性のカルシウム濃度の上昇とその後のゆっくりとシウムの一 過性の増加が細胞外からのカルシウムした下降が観察され、4-5分後には無刺激時の値の流入によるのかという点について検討した。に復した。PVIgG1例では、 両細胞とも カルシウ

0. lmMEGTAを含む、すなわち細胞外 カルシウム をム濃度 は 5分後まで変化しなかった。BPigG添加後

キレ ー トした培養液で5分間前処理した 後に天疱には8 例中7例でカルシウム濃度に変化は みられな

痘IgGを加えたところ、1. 8mMの場合と同様の変化かった。1例ではPV あるいはPFlgG添加時と同様のを示した（図 2 ) 。

変化が観察された。 正常(N)IgGを添加した際には14例中12 例でヒト表皮細胞、 DJM-1 細胞ともにに細胞内カルシウムが増加した（図1)。

50
PV 2''
NCI)

Also PVJ-5

PF 2PF I287

゜弓）（。
Also BP3-842TIME (m;,)

図 1,Also Nor903

図2, PVJgG添加後の細胞内 Ca" の動員に対する細胞外 Ca い 除去の影愕
PV : 尋常性天疱痘JgGのみ添加 、PV+EGTA: EGTAを添加したのちに尋常性天疱痣JgGを添加

No, 2Also NorJ-8. 10-14

2TIME (min)4゜ ゜·� 287u

Nor I

PV+EGTA287
50so287

PV287

反応はみられなかった。 しか し、2 例では 一 過性2TIM£(m;,)

天疱癒lgGによるI凡量の変化

各種lgG添加後の細胞内 Ca,. の変動 、PV : 尋常性天疱癒lgG 、PF : 落葉上天疱癒 I gG,
BP : 類天疱癒I gG 、Nor : 正常ヒトlgG、 数字は症例番号

PV, PF, BPおよび正常(N)IgGの各々症例l、2について、 添加後のDJM-1細胞内I凡量の変化を検討したと ころ、 細胞内カルシウムが増加反応を示した 症例であるPV l、PFl、BP2、 N2のIgGを添加

このような 細胞内カルシウム濃度の変化を数鑓した際には、I応は 20秒をピ ー クと して 一 過性の的に表すために、 ピ ー ク 時における カルシウム濃上昇を示し、 その後2分後には 添加前の値に戻っクのみられない例ではIgGた。 一 方、 細胞内カルシウムの変化を引きおこさ添加20秒後の増加量の平均を求めた。その結果、なかったPV症例2、PF2、BPIおよびNlのIgGを添加

天疱癒IgGでは99. 9 士63. 9nM (n=8)、 類天疱癒 でした 場合にはI凡量は 変化しなかった（図3A、B)。

度の増加最およびピーは15. 0 士42. 4nM (n=8) 、健常人IgGでは15. 1士
36. 8nM (n = l4)であり、 天疱癒IgGは健常人 およ天疱癒 lgGによる細胞内カルシウム濃度およびび類天疱症IgGと比較して有意に細胞内カルシウ

I凡産生増加に対するU73122の影響

ム濃度 を上昇させる(P<0.001)ことが明らかに-10 5-天疱癒IgGによる 細胞内カルシウム濃度の一 過A地1TIME lml•)

8，52(s=03vou -OE d)Cdl弓）NOil｛30--------------"

PV1.

2―.

--·- --· . ―02，Ci3）851s-�—..

OI

lTINE (心）

J•ーヤ•『'---elf

210、•一 -一�←d'Tl● ,,....,lTII』[(●.,2TIM[(.,•)

TIME 1�0)l5゜

図4, PV !gG誘導による細胞内Ca'十増加に対するU73122の影響a: MEM, b: 0. 01%DMSO,℃0 204060

120INCUBATION TIME (sec)c: 1µ.M U73122, d: 10µ.M U73122,

300

f: 10 µ.M U73343, 各々を添加した30分後に天疱癒lgGを添加 ，B

e: 10µ.M U73122を添加5分後に天疱歪lgGを添加520251(s=a3PO ご 一OE d)£ di

N22010300゜

PV : 尋常性天疱酒IgG 、5

図3A, PV及びPFlgG添加後の細胞内I凡の変動

U73122＋PV-lgG01(s=3ざ o u OE d) £ d

゜120
INCUBATION TIME (sec)

5150 20 40 60

PF : 落葉上天疱癒I gG, 数字は症例番号38、 一過性細胞内カルシウム上昇を来したBP
及びNor I gG添加後の細胞内I凡の変動

I

BP: 類天疱蓬fgG 、 正常ヒトlgG 、数字は症例番号I10-610-s

U73122 (M)

性の上昇（図4a, b)はlµM(c)あるいは10µM(d)D73122を30分前処理することにより抑制された。

10―4

図5, U73122による 、 天疱癒lgG誘導性I凡産生の抑制
CtPV-lgG: 0.01匁DMSO+天疱癒IgG 、U73343tPV-lgG: 10�LM U73343+天疱痣IgG 、また、5分間前処理によっても抑制された(e)。
しかし、10µM D73343では抑制されなかった(f)。
さらに、 天疱癒lgG添加後のIP3産生増加も-106-

CtN-lgG: 0. 01俎DMSO+正常ヒトlgG 、U73122+PV-lgG: 各濃度のU73122+天疱潅lgG 、各々lgG添加20秒後のI凡量を表す。

表皮細胞の細胞接着と角化制御に関するシグナル伝達：天疱癒lgG誘＃表皮細胞間接着離開とカルシウムシグナル伝達oo-s - 10-4 M)30分前処理により抑制さ加は、細胞内プ ー ルからの動員であると考えられれた。 しかし、013343 00-5切 では抑制されなた。 天疱痛8例中l例ではこのような反応がみられかった（図5) r,なかったが、 その原因については不明であり、今013122天疱癒lgGによるプラスミノゲン・アクチベー後検討したい。

タ類天疱癒8例中7例のIgGでは細胞内カルシウム- (PA)分泌増加に対するU73122の影響
天疱癒IgGは類天疱癒IgGおよび正常ヒトIgGと濃度の変化はみられなかった。 したがって、天疱比較して、24および48時間後に有意にPA分泌を増癒と類天疱癒では、 デスモゾ ー ムとヘミデスモゾ加させた(p<O. 005)。 この増加は013122 00-4 10- 5 M)に より抑 制 さ れ た(P<O. 0 05)が 、ームという抗体の標的となる構造が異なるのみならず、各々の抗体が細胞表面に付着後から水疱形

073343では抑制されなかった（図6)。

成に至る過程に差異のあることが示唆された I ) 00

しかし、 類天疱癒の 1 例（症例2) 、健常人の 2例においても天疱癒と同様な細胞内カル・シウム増加がみられた。 IgG分画には抗デスモゾ ー ム抗体以外

1050．

•/nl) AllAI
D V Vdにも多数の種類の抗体が存在する可能性があり、

U73343+PV.1gG
PV·loG15ない。 しかし、 ニ トロセルロ ー ス膜上の類天疱癒

・,,,

UJJlll(IO'Ml+ PVUJJllll IO"'MI + PV-lgG

抗原によって、BP症例2lgGから類天疱猪抗体を吸U7Jl11CIO"'MI +BP-lgG収し、 そのIgGを添加した際には、細胞内カルシ:;;•,'0.5

これらの抗体に対して反応した可能性は否定でき

Iウム は変化しなかった。 したがって、一 部の類天36疱癒においては、水疱形成の過程で細胞内カルシINCUBATION TIME (h,)

図6 、ウムの変化が関与している可能性が考えられた。

天疱冦lgGによるプラスミノゲンアクチ
ベ ー タ ー 分泌に対するU73122の影響
PV-lgG: 天疱癒lgG 、BP-lgG: 類天疱癒I gG
N-1 gG: 正常ヒトlgG

考

さらに、ホスホリパーゼC (PLC)の阻害剤であるD73122を用いて、天疱癒IgGが表皮細胞表面に結合後に起こるカルシウムを中心としたシグナル伝達系にPLCが関与していることを示した。

案

このように本研究は、天疱癒においては抗体が細胞表面に付着した後に、PLCの活性化およびIP今回の研究結果から、天疱癒IgGはヒト表皮細3産生を介して細胞内プ ー ルよりカルシウムの動胞内においてカルシウムの急速な一 過性の上昇を員がおこり、細胞内でカルシウムが一 過性に増加引きおこすことが明らかになった。 ところで、一することを示した I I. I 2> が、PLCによってIPaと同般に細胞内カルシウムの上昇は細胞外からの流人時に産生される1, 2 ジアシルグリセロ ー ルの量的と小胞体などの細胞内プールからの動員9)が考え変化あるいはCキナ ー ゼの活性化、 さらにはリンられており、また、小胞体よりのカルシウムの動酸化される蛋白質があるのかなど未解決の点を多員はIP孔こよって誘導されることがすでに明らかく残している。 今後これらの点について検討したになっている 9) 。 天疱癒IgGによる場合には1Pa鍵が一過性に増加していること、細胞外カルシウムをキレ ー トした際にも細胞内カルシウムは天疱痛lgGにより上昇がみられたことから、天疱術IgGによって誘導される細胞内カルシウムの一 過性の増し、 ゜
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