遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸yー リノレン酸の高等植物における多量生産
九州大学

射理学部

場

厚

Vegetative oils are of economic importance as human and animal foods and m many
mdustrial applications. As the fatty acid compositions of most vegetative oils are not optimalfor these uses, there is a broad interest in controlling the fatty acid compositions of higher plants.
w-3 fatty acid desaturase, which catalyzes the conversion of linoleic acid (18:2) to Iinolenic acid
(18:3) in lipids, are located in the microsomes and plastid membranes. Transgenic tobacco plants
were produced that express the transcripts of a tobacco microsomal w-3 fatty acid desaturase
gene (NTFAD3) in antisense and sense orientations under the control of the califlower mosaic
virus 35S promoter. The antisense construct has the 0.5-kb fragment of the NTFAD3 cDNA
containing a 3Lflanking region and a part of the coding region in antisense orientation. The
antisens-transformant lines showed decreases of the steady-state NTFAD3 mRNA level to 30%of the control plants. In these lines, the 18:3 content decreased to about 80% in root tissues andto about 70-80% in leaf tissues when compared with the control plants. The sense construct has
the 1.4-k厨ull-length cDNA of NTFAD3. In one of the sense-transformants lines, the 18:3 content
increased by about 1.5-fold in root tissues and by about 1.1-fold in leaf tissues. These results
indicate that the up- and down-regulation of the transcript level in the microsomal w-3 fatty
acid desaturase gene is useful to modify the 18:3 content in the vegetative tissues of加gher plants.

1緒

長されると考えられている 1 . 2) 。

言r- リノレン酸の直接摂取は、 このような状況の予防に役立つこ7ーリノレン醗は必須脂肪酸（ビタミンF)の一とが期待されるが、 通常の植物から摂取される機種として知られており、 植物中に主として存在しているリノール酪がプロスタグランジン (PG 〉に会はほとんどない。 現在、 7 ー リノレン酸は月見草種子から抽出された油脂として市販されている転換する中間物質である。 したがって、 rーリノが、 品種改良されて作られた月見草種子は海外のレン酸は必須脂肪酸としての生理機能とともに、一部企業に独占され、 生産量も少なく価格も高PG 合成の前駆物質としてPGの持つさまざまな生理作用に関与している。 一方、 糖尿病、 ガン、 ウイい。 また、 最近微生物（糸状菌）によるr — リノレン酸の生産も行われているが、 グルコースなど

ルス感染、 老化などは、 プロスタグランジン前駆の炭素源に対する油脂生産の収率（対糖収率）は体の生合成経路において、 その律速段階であるリノ ール酸からrーリノレン酸に変える不飽和化酵

高だか30%で、1キログラムの油脂を作るのに3キ素（△6脂肪酸不飽和化酵素）の活性を弱め、 そ

糖質価格では、 糖質からの油脂生産は大豆など のの結果、 PG合成が抑制され、 さらに健康障害が助植物油にコスト面で太刀打ちできないのが現状でログラムの原料が必要である。 それゆえ、 現在のある。 本研究においては、 高等植物における r­
リノレン酸生成のキーエンザイムである△6脂肪Modification of fatty acid composi­tion by over and antisense-expressionof a microsomal w -3 fatty aciddesaturase gene in transgenic tobacco

研究技法の開発を行った。 また、 遺伝子工学的手Koh Iba

法を用いて、 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高等植

Faculty of ScienceKyushu University

物に導入し、 不飽和脂肪酸組成改変の可能性につ酸不飽和化酵素遺伝子をクロ ー ニングするためのいて検討した。

-50-

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪醸rーリノレン陸の高等植物における多盈生産2

グリセロ ー ルを加え ー 80℃で保存した。植物体に験実存在する脂肪酸不飽和化酵素タンパクと類似の構
2. 1

形質転換タバコの作製造を持つペプチドは、上記特異抗体を用いてウエ

Hicotiana tabacu.屈 cv.SR-1株をTiープラスミドバ

スタンプロ ティング法により解析した。

イナリ ー ベクタ ー を持つAgrobacteriu.幻 tumefaciens
LBA4404 を用いて、 リ ー フディスク法により形質転換した

3)

。Tiー3

結果と考察

プラスミド バイナリ ー ベクター
3. 1

は、コ ントロ ー ル としてpBI121、また図lに示す

w-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入によように、pBI121のT-DNA領域におけるカリフラる高等植物におけるa: ー リノレン酸含皇のワ ー モザイクウイルス35Sプロモ ー タ ー の下流に制御

タ バコ 小胞体局在型w-3脂肪酸不飽和化酵素遺

w-3脂肪醗不飽和化酵素遺伝子は、 小胞体膜と伝 子(HTf'Af}J)をセンス、アンチセンスの向き

葉緑体膜にそれぞれ局在し、 リノレン酸などのジに挿入したコンストラ クト（それぞれ、pTFlS、エン脂肪酸からa ー リ ノレン酸などのトリエン脂pTFlAS500)を用いた。再生したシュ ー トから形肪醗へ直接不飽和化する酵素である。 一般に、高質転換個体 を カナマイシンに よ り選抜した 。

等植物においては、小胞体局在型酵素を/?Ai汐逍Primary transformants(RO)を自家受粉させ得

伝子、葉緑体局在型をFAP7およぴFA加遺伝子がら れ た R l 種子を2 6 ℃に お い て連続光照射下それぞれコ ー ドしている 5) 。Tiプラスミドバイナ(3000lux)MS培地により発芽させた。

リ ー ベクタ ー (pBI121)のT-DNA領域におけるカリフラワ ー モザイクウイルス35Sプロモ ー タ ー の2. 2下流にタバコ 小胞体局在型w-3脂肪酸不飽和化酵

脂質脂肪酸の解析とノ ー ザン解析

素遺伝子(#TFAP.J)をセンス、アンチセンスのRl植物の葉組織に含まれる不飽和脂肪酸はガス
クロマトグラフィ ー 法により分析した

4)

向きに 挿 入 し た コ ンストラ クト（それぞれ、0、実験の項
pTFlS、pTFlAS500)を作製し(Fig. 1)

ノ ー サン解析用のRNA(ト ー タルRNA)は、26℃で述べたようにアグロバクテリムを介したリ ー フで30日間生育させた幼苗から調製した。

ディスク法にタ バコに導入した。pTFlAS500(ア2. 3ペプチド特異抗体の作製とウエスタンブロンチセンス）を導入した形質転換植物は26系統得

ティングによる解析られ、それぞれの脂肪酸組成を調べた結果、3系ペプチドシンセサイザー統(AS5、AS9、AS18)においてトリエン脂肪酸のを用いて合成した人工ペプチドを、架橋剤N-(e -maiermidocaproyloxy)。特に、AS5系著しい減少が観察された(Fig. 2)

succinimideを用いてヘモシアニンに結合させた。

統においては、18 : 3含量は根組織で6%、葉組織ペプチドが結合したヘモシアニンは、セファデッで14%の減少がみられた。 一 方、pTFlS(センス）クスG-25を担体に用いたゲル クロマトグラフィーを導入した形質転換植物は7系統得られ、そのうによって精製・濃縮した。 この抗原にアジュ バンち4系統(Sl, S7, SlO, Sl4)において、トリエジ ランドホワイト・ン脂肪酸の増加が観察された(Fig.3)。特に、オス·3kg)に注射した。抗原の接種後、2週間おSlO系統においては、18 : 3含量は根組織においてきに3回続けてアシュ ハントを加えた抗原をさら10%以上の増加が確認された。

トを加え、ウサギ（ニューーに接種した。 初回の接種後、1週間目から採血をこれらのトリエン脂肪酸含量の変動と、 導入さ行い、l晩室温で保存した血液を遠心分離によっれた遺伝子の発現量との関係を調べるためにノ ーて血清を取り出し、フィ ルタ ー 滅菌の後、等量の。センス形質転換植物
ザン解析を行った(Fig. 4)-51-

CaMV 35S

NtFAD:�

200 bpII

�-Fig.122

゜一�1800

161

1

2てFig.2

NtFAD3pTF1AS500

NOS-terB゜ ゜8 ゜゜゜ ，゜ 8 ゜゜゜ ゜ ゜ ゜゜゜'-'ENOS- r;

Structure of chimaeric genes for expression of NTFAOJ in sense andantisense orientations. The sense construct, pTFlS, contains a fulI­
length cDNA of NTFAOJ. The antisen·se construct, pTF1AS500, contains a0.5-kb fragment of the NTFAOJcDNA in antisense orientation behind theCaMV 35S promoter. The translation initiation codon (ATG) of the NTFAOJ
cDNA are shown, and the 3'-f\anking regions are indicated by cross­hatching. Restriction sites shown are for BamHI (B), EcoRI (E) and Sac\1(S). NOS-ter indicates the terminator from the nopaline synthase gene.

A＾ふ゜ 20pTF1S

冨蘊謳饂,.,CaMV 35SEB\t�l.

sE
9LVBご→i〗゜＾ふ゜ 60一゜゜ ゜゜，゜ ゜゜゜10 13 23 5A STransgenic line，

゜ 8 ゜§§; soi403018゜811I2Iで＇1013 23 5
A STransgenic line゜ §゜゜゜，18

Contents of 18:3 in antisense transgenic plants with pTF1AS500. Contentsof 18:3 in molar percentage of total fatty acids in whole roots (A) andin whole fourth leaves (B) of 30-day-old kanamycinresistant Rl seedlingsof the antisense transgenic plants. Each open circle represents the 18:3
content of a single transformant (n = 3 or 4). Control transformants withpBl 121 (Cl and C2) are incIuded for comparison.
-52-遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸7 ー リノレン酸の高等植物における多量生産351Ai」§゜

21�
15Fig. 3

1

I

2
IC-

7

STransgenic line
I＇

10B|。
゜60
゜ 1。

゜゜。••
...

ふ一゜§

゜

゜

88

§

2

1

7

E、50-゜
�C'>

4030

14＇

1ー百―

STransgenic line

1014

Contents of 18:3 in sense transgenic plants with pRFlS. Contents of 18:3
in molar percentage of total fatty acids in whole roots (A) and in whole
fourth leaves (B) of 30-day-old kanamycin-resistant Rl seedlings of thesense transgenic plants. Each open circle represents of the 18:3 contentof a single transformatnt (n = 3 or 4). Control transformants with pBI 121(Cl and C2) are included for comparfson.

NtFAD3 RNA�

antisense RNA..,.

Fig.470゜゜゜゜ ゜゜゜゜゜゜C—2110· 13

23

9-5 10—s- 14

100 107

91

138

26

27

AS-戸ロ
71805 687

RNA gel blot analysis of the !l'TFA!JJcDNA. The transgenic line is shown above
each lane. The steady-state level of the NTFA!JJmRNA is given as a percentageof that in the control plant Cl below each lane.
蓄積は殆ど見られなかった。これらの知見は、形体(S10とS14)においては、””加のmRNAレベ
ルは、コントロー増加が見られた。

質転換タバコにおけるトリエン脂肪酸レベルの増

ル植物体と比べおよそ7-8倍の一減を、内在性あるいは導入したw-3脂肪酸不飽和方、アンチセンス形質転換植化酵素遺伝子の発現量を調節させることによって物体で、特にトリエン脂肪酸含量の低下が著しい系統(AS5, AS9)においては、A'TFAfJ.JのmRNAの-53-人為的に制御可能であることを示している。

脂肪酸不飽和化酵素に対するペプチド特異6>(Fig. 5) 。この配列は他の植物種からクローニシロイヌナズナからクローニングされたw-3脂保存されていた。このため、植物から原核生物でよびラン藻からクローニングされた△ 12脂肪酸不不飽和化酵素の機能に必須な共通領域であること

3. 2

ングされた脂肪酸不飽和化酵素遺伝子においても抗体の作製あるラン藻まで多種の生物種にわたって、脂肪酸肪酸不飽和化酵素遺伝子(/i'AJJ,J, fi'AJJ1, /i'AJJ8)お飽和化酵素遺伝子(JJ£SA)のDNA配列から推定さが推定された。筆者らはこの領域において、N端基中11ア ミ ノ 酸が一致す る領域を見い出したに対するペプチドをペプチドシンセサイザーを用側から10番目までのアミノ酸配列(FVLGHDCGHG)れたアミノ酸配列を比較した結果、13アミノ酸残9ゆ7.

1rゆ7. 61
FAD3.
紐Gl.
D言SA・MANLVLS!:CGIRPLPRIYTTPRSNP'LSNNNKPRPSLSSSSYltTSSSPLSPGLNSRDGl"TR

血ALNVSTPLTTPIP'E!:SPLEEDNltQR!'DPGAPPPl'NLADIRAAIPJtBCWVJtNPWP:SLSY 120
1 MVVA.MDQRSNVNGDSGARD!:G ・ ••S•Q·•·JtIG ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ •S• LR·M ・ • 55
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口SA.108

ヽ

7.2 1
FAD3.176
紐Gl.175
OBSA・168＇ゆ60

GBLLBSSILVPYBGWRISBRTBBQNBGI:匹NDBSWBPMSE!tIYNTLD!tPTRn'RFヰPLV 240••I ・ ・ ・F ·・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・・ ・ ••V·LP ・ ·L ・ ltN•PBS ・ :ML•Y•V· •P 175··I ・ .·L ・ ・ .·N ・ ・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ X ・ ・••V•LT ・ •V•ltN ・ •OM ・ ·ML•YSF•FP 174••IAFAPLIY ・ F•S ・ •ユ•OB ・ ·LBTN!tI•V ・ 皿•O•W•VBAF(込SP紅 V•L•YRAIRGP 167・・M-LAYPFYLWARSPGUGSBYBPOSOLFL匹RltDVLTSTACW'l'AMAAヰVCLNFTIGP- 298·-····I ・ ・ ·Y ・ ・ ... :g ・ ・ ・ PN·Y·S ・ ·A·S ・ ••LIA ••·T ・ •SI·L•T ・ ·Y• S•LVD·- 233
I-F·・ ・ ・ ・ ••N ・ ・ ・ ・ ·B ・ ••PN·Y•N ・ •S•G ・ ・.• G•V•••L ・ •GIVLSV·LY•SL ・ ・ ・ ·- 232!'WWTGSIPB·------SLM·!'J←-LSN•AQRD•Nlt ・ ltL•I•V-VFLF·AIAFPALI ・ 'l"l'G 218

9ゆ7.299
9心3.23紐Gl.233〇言SA・219

I-QI虹ぶLYGIPYWINVMWLDP'V'rYLBBBGBEO江PWYRGDWSYLRGGL-TTLDROYGLI 356・ ・・・ ・ ・ ・ ・ ·-··I ・ ・ ・ ・ ·IF 291
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V訊';FV•FWLM•WLVYBF•MSTF·IV ・ ·TIP•IRF-R-PAAO ・ 山U!:AQ· NG·VBC ・ • PRW 276

rゆ7.357
rゆ3.292

紐Gl.291〇言SA・277

NNIB-BDIGTBVIBBLPPQIPBYBLVBA匹AA!tPVLG!tYYRBPD!tSGPLPT,RL立ILA!tS 415• • • ·-· •· ・ ・ ・ ・ ・ ・ J.. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・• ·O·•R ・ . •B ・ ・ •R ・ ・ ・ .•JCT ・ ・ 紅·I··V•S·VA• 350··V·-· ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ .. •JCS ・ ·S ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ .·Q ・ ・ ・ ・ ・ ・ F· ・ ・ ltY •LQ• 349
VBVLC••• NV •IP ・ ・ ·SVA•·S·N•RL• BGSL•B叩•PFLY•RT!'NWQ·MQQISGQCBLY 336＇心7 • 416
FAOJ.351
紐Gl.350
OBSA・337

IltBDBYVSO以冨VVY皿PNLYGBVlCVRAO
46•• !t ・ ・ ・ ・ ·•T•OI •P•BT ・ ·D••VYASO!tS!tIN 383·SQ ・ ・ F ・ ・ ·T ・ DI ・ ・ QT ・ ・ !t •BQOSWT!tS!t 380
OP·BG •RTPGSLJぶV 351

ヽ V-'rv·•V• •V •I r ···A

Fig.5・・ヽ

・Comparison of the deduced amino acid sequence of the protein encoded by FAIJ
gene and related gene products. Identical amino acid residues are indicatedby a dot, and spaces introduced to facilitate alignments are indicated by adash. The PESA sequence encodes a D12 desaturase from Synechocystis PCC 6803.
The'4.RGl sequence is from an anonymous cDN'4. from mung bean.'4. region of very
high sequence identity among all four proteins is boxed.

-54-

ー 一―ー•一

遺伝子工学的手法を用いた必須脂肪酸r ー リノレン酸の高等植物における多量生産導入によって、形質転換植物におけるトリエン脂066

肪酸含量の増加が可能であることが明かにされた。 また、脂肪酸不飽和化酵素のアミノ醗共通配列をもとに作製したペプチド特異抗体によって、0•54

植物に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素蛋白質を同定することが可能であることが示された。 今
後、月見草やボラ ー ジ草など、 △6脂肪酸不飽和743化酵素を持つと思われる植物種のcDNAライプラリーを作製し、ペプチド特異抗体を用いたスクリ ーニングによって、同酵素遺伝子のクロ ー ニングを司Dk（試みたい。 もし、 この遺伝子がクロ ー ニングされれば、他の植物種への導入によって7 ー リノレン
醸の低コスト多砿生産が実現すると思われる。

引用文献
Fig. 6 I den t i f i cat ion of the w - 3 fat tyacid desaturase and its homologuesin
extracts of leaf tissues. Blots of
total proteins from tobacco (left)
and Arab idopsis(right)were probedwith the peptide (GHDCGH) s pecificantibody.

1)後藤浩樹：特定保健用食品素材としての r ーリノレン酪、 ジャパンフ ー ドサイエンス、1993-11, 60-65 1993
2)長谷川昌康：

r- リノレン醗とその効用、New

Food Industry、 35 1-5 1993
3) Horsch R. B.,

Fly J. E., Hoffman N. L.,

E ichho I tz D. , Rogers S. G. , Fraley R. T. :いて作製し、実験の項に述べた方法によってペプ

A simple and general method for trans­

チド特異抗体を作製した。 シロイヌナズナ、 タバ

ferring genes into plants. Sdencc; 227

コにおいて、 ウエスタンプロッティング法によっ

1229-1231 1985て、 w-3脂肪醸不飽和化酵素あるいはその類似ペ

4) Lemieux B ., Miquel !ii., Somervilie C.,

プチドの存在を調べた(Fig. 6)。 その結果、これ

Browse J. : Mutants of Arabidopsis with

らの植物種において、同酵素に対応すると思われalterations in seed lipid fatty acidる50キロダルトンのペプチドの他に、およそ50-composition. Tbeor. -Appl Ce11et. 80 234-

60キロダルトンの領域において複数のペプチドがこの特異抗体によって認識 されることが分かっ

240 1990
5) Somerville C., Browse J.: Plant lipid:

た。 現在、 これらのペプチドの性質などについmetabolism,て、二次元電気泳動法などを用いて解析を行ってScience; 252 1071-1079 1982

いるが、内在する他の脂肪醗不飽和化酵素に対応

mutan ts, and membranes.

6) Iba k., Gibson S. Nishiuchi T., Fuse T.,するペプチドを認識しているものと思われる。

Nishimura !ii,, Ar ondel V., Hugly S.,
Somervi I le C., :A gene encoding a chloro­

5

総plast omega-3 fatty acid desaturase括

com plements alterations in fatty acid
本研究において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のdesaturation and chloroplast copy number-55-

of the J"ad1幼'Biiana.

mutant of Arabidopsis

J. .Biol.

Chem. 268 24099-24105

1993.

-56-