極長鎖脂肪酸含有セラミドの表皮バリア形成における機能と分子機構の解明
大阪市立大学複合先端研究機構

中台（鹿毛） 枝里子
In multicellular organisms, the surface barrier is essential for maintaining the internal environment. In mammals, thebarrier is the stratum corneum. Fatty acid transport protein 4 (FATP 4 ) is a key factor involved in forming the stratum
corneum barrier. Mice lacking Fatp 4 display early neonatal lethality with features such as tight, thick, and shiny skin,and a defective skin barrier. FATP 4 is a member of the FATP family that possesses acyl-CoA synthetase activity for very
long chain fatty acids. How Fatp 4 contributes to skin barrier function, however, remains to be elucidated. In the previousstudy, we characterized two Caenorhabditis elegans genes, acs- 20 and acs- 22 , that are homologous to mammalian FATPs.
Animals with mutant acs- 20 exhibited defects in the cuticle barrier, which normally prevents the penetration of small
molecules. We demonstrated that the incorporation of exogenous very long chain fatty acids into sphingomyelin was reducedin acs- 20 and acs- 22 mutants. In the present study, we further analyzed the skin barrier of acs- 20 and acs- 22 mutants. We
also developed C. elegans infection models against human skin flora such as Propionibacterium and Malassezia.

1. 緒

言

セラミドは表皮の細胞間脂質として表皮バリア形成に重要な役割を果たすと考えられている。実際に、ゴーシ
ェ病やアトピー性皮膚炎患者では皮膚のセラミド含有量が減少し、易感染性や水分保持能低下が起こる。2003 年、
Herrmann らのグループにより、角質細胞において機能する極長鎖アシル CoA シンテターゼ FATP4 のノックアウト
マウスでは、低分子化合物の皮膚透過性が異常な高値を示すこと 1）（図 1）、表皮のセラミドに含まれる極長鎖脂肪酸量が有意に低下することがわかり（極長鎖脂肪酸：一般に炭素数 24 以上の脂肪酸）、セラミドのなかでも極長鎖脂肪

図 1 表皮バリア異常により X-gal で真っ青に染まった FATP4 ノックアウトマウス

酸を含むものが表皮バリア形成に重要な役割を果たす可能性が示唆された。しかし、マウス研究は遺伝学的手法が煩雑であり、研究コストも高いことなどから、表皮バリアと記知見に立脚し、線虫をモデル動物として用いて極長鎖脂脂質に関する分子遺伝学的基盤の全体像は未だ明らかにな肪酸含有セラミドの表皮バリア形成／機能における役割とっていない。

分子的基盤を明らかにすることを目的とする。また線虫をそこで申請者は表皮バリア形成の解析のためのモデル動代替モデル宿主とした、ヒトの皮膚フローラを構成する細物として線虫 Caenorhabditis elegans（C. elegans）を用い菌、真菌の感染実験系を構築し、脂質や表皮バリアの役割ることを着想し、FATP4 ホモログ遺伝子 acs-20 のノックについて明らかにすることを目指した。

アウト線虫の作製および解析を行った。その結果、ノックアウト線虫では Hoechst をはじめとする種々の化合物の表皮透過性が顕著に上昇していた 2）（図 2）。また極長鎖脂肪2）酸含有スフィンゴ糖脂質量が低下していた 。本研究は上

2. 方法

2. 1. 実験動物（線虫）
野生型Caenorhabtidis elegans としてN2株（Caenorhabditis
Genetics Center（CGC）より分与）を使用した。acs-20 変The role of very long chain fatty acidcontaining ceramides in the epidermal
barrier and the underlying molecularmechanisms

異体として、tm3232 株または tm3278 株 2）を使用した。

Eriko Kage-Nakadai
The OCU Advanced Research Instituteof Natural Science and Technology, OsakaCity University

クロインジェクションにより導入し、株化したものを使用

acs-22 変異体として、tm3236 株 2）を使用した。レスキュー実験には、tm3232 株に acs-20 プラスミド DNA をマイした。線虫の飼育は Brenner（1974）に準じて行った。線虫は、餌となる大腸菌 OP50 株を培養した NGM プレー− 108 −極長鎖脂肪酸含有セラミドの表皮バリア形成における機能と分子機構の解明

図 2 acs-20 ノックアウト線虫の表皮バリア破綻
Hoechst バイタル染色により核が簡単に染まってしまう（線虫尾部の写真。白破線で縁をかたどっている）。

ト上で飼育した。飼育温度は、通常の維持では 20 ℃とし、間 37 ℃嫌気培養を行った。寒天上のコロニーをかきとり生存分析および感染実験においては 25 ℃にて行った。

M9 バッファーに懸濁、調整し、10 mg/plate となるように 5 cm NGM プレートに塗布した。他は 2. 3. の方法に準2. 2. 1% SDS 感受性試験じて行った。

耐性幼虫を得るため、液体培養にて餌枯渇状態となって3. 結から、さらに 4 日間 20 ℃飼育を行った線虫を用いた。線果

mM potassium phosphate，1 mM CaCl2，1 mM MgSO4，3. 1. acs-20 ノックアウト線虫は 1% SDS 高感受性である

and 0.5 g/L gelatin）を用いて３回洗い、餌のない NGM プ線虫は餌の枯渇した環境や高温度環境において耐性幼虫レート上に置いた。20 ℃ 24 時間培養後、生存する虫の数化することが知られている。耐性幼虫では体表のクチクラをカウントした。

層が口まで覆っており、高温、乾燥、界面活性剤などの薬

虫は 1% SDS 溶液に 15 分間浸した後、M9 バッファー（5剤に耐性となる。そこで、野生型線虫、acs-20 ノックア

2. 3. マラセチア真菌感染実験

ウト線虫、acs-20 のパラログであり主に腸において機能産卵期にある成虫より卵を回収し、孵化同調させた後、する acs-22 遺伝子のノックアウト線虫について耐性幼虫

25 ℃ 3 日間培養し、1 日齢成虫を得た。マラセチア真菌株化条件における 1 % SDS 感受性試験を行った。その結果、として Malassezia furfur NBRC0656 株を用いた。培養はacs-20 ノックアウト線虫は 1% SDS に対し感受性を示すこクロモアガーを用い 28 ℃にて行った。寒天上のコロニーとがわかった。一方、野生型線虫と acs-22 ノックアウトをかきとり M9 バッファーに懸濁、調整、10 mg/plate と線虫においては耐性を示す虫が出現した。acs-20 ノックなるように 5 cm NGM プレートに塗布した。対照群としアウト線虫の 1 % SDS 耐性は、acs-20 の導入により回復して、OP50 株を TSA 培地で 37 ℃一晩培養後、M9 バッフた（図３、図４）。

ァーで調整し、10 mg/plate となるように 5 cm NGM プレートに塗布した。同調した 1 日齢成虫を、各菌株を塗布した NGM プレート上に移し、25 ℃培養を行った。その後 23. 2. マラセチア真菌 M. furfur は線虫 C. elegansに対し病原性を示す

日毎に新しく菌を塗布したプレートに移しながら経日的にマラセチア真菌はヒトや動物の皮膚に常在する担子菌系観察し、ピッカーで軽く触れて反応のない個体を死亡としの不完全酵母である。Malassezia 属のほとんどの種は増殖た。観察により得られた結果は Kaplan-Meier 法により生に脂質を要求することから皮脂の多い部位に定着しやす存率を計算後、Log-rank test により各群間の生存率の差

く、癜風や脂漏性皮膚炎等の原因となる。これまでにマラを比較した。

セチア真菌のモデル宿主として線虫 C. elegans が用いられた報告はないため、本研究において実験系の確立を行った。

2. 4. アクネ菌感染実験

25 ℃において Malassezia furfur NBRC0656 接種群は２日アクネ菌株としてPropionibacterium acnes NBRC107605

ほどで死滅した（図 5）。20 ℃においても同様の結果が得ら株を用いた。液体培養は GAM ブイヨンを用い、アネロパれた（data not shown）。標準的な餌である大腸菌 OP50 株

ックおよびアネロパックジャーを用いて 37 ℃嫌気培養をの接種では寿命は 2 〜 3 週間であることから、M. furfur行った。培養液を GAM 寒天培地上にコンラージし、2 日は線虫 C. elegans に対し強い病原性を示すことが示唆され− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図 3 1％ SDS 感受性試験
白い矢印は１％ SDS に対し耐性を示し、生存している線虫を示す。

図 4 1％ SDS 耐性率（耐性幼虫化率）
Mean ± SE（n=3）

た。acs-20 ノックアウト線虫においては野生型線虫と比acnes NBRC107605 を用いた。その結果、標準的な餌であ較し、生存率が高い傾向はあったが、両者の間に有意な差る大腸菌 OP50 株の接種に比較し、生存率が有意に減少しはみとめられなかった（図 5）。

た（p<0.01）（図 6）。P. acnes は嫌気性細菌であるが、実験環境（好気条件）において少なくとも 2 日間は生菌が回収さ3. 3. アクネ菌 P. acnes は線虫 C. elegans に対し病原性を示す
アクネ菌 Propionibacterium acnes はヒトの皮膚に常在れることも確認した。P. acnes 接種群の生存個体は OP50
接種群と比較し、体が小さく透明度が高かった（data notshown）。

するグラム陽性桿菌である。プロピオン酸を産生することから、寝たきりの高齢者などにみられる悪臭の原因となる。

3. 4. アクネ菌接種による生存曲線は acs-20 ノック菌の特定の株がニキビ発症に関連している可能性が指摘

アウト線虫と野生型線虫とでは異なるキネティクスを示すされはじめた 4）。これまでにアクネ菌のモデル宿主としてアクネ菌接種に対する感受性について野生型線虫と acs-線虫 C. elegans が用いられた報告はないため、本研究にお20 ノックアウト線虫を比較したところ、両者において有いて実験系の確立を行った。実験には Propionibacterium

意な生存率の差はみとめられなかった。しかしながら、両

また近年、ディープシークエンス法の適用により、アクネ− 110 −極長鎖脂肪酸含有セラミドの表皮バリア形成における機能と分子機構の解明

図 5 マラセチア真菌感染実験
1 日齢線虫に標準餌である大腸菌 OP50 またはマラセチア真菌 M. furfur を接種した。
1 群あたりの個体数 n >50

図 6 アクネ菌感染実験
1 日齢野生型線虫 N2 株に標準餌である大腸菌 OP50 またはアクネ菌 P. acnes を接種した。1 群あたりの個体数 n >50

者の生存曲線は異なるキネティクスを示した。acs-20 ノ動物が存在せず、宿主との相互作用について未解決の課題

ックアウト線虫は野生型線虫と比較し観察期間 10 日ころが多く残されている。

までは生存率が高い傾向を示し、10 日以降は逆に低い傾線虫はわずか 1,000 細胞の単純な多細胞生物であるが、筋肉系、神経系、消化管系など多様な組織から構成されヒ向を示した
（図７）
。

4. 考

トと本質的には共通の生物学的特性を持っており、体表の察構造もヒトの皮膚と類似点が多い。体表面には、ヒトの皮皮膚の角質層に存在する細胞間脂質は感染防御に重要な脂と同様に中性脂肪やリン脂質、スフィンゴ糖脂質などで役割を果たすと考えられている。一方でヒトの皮膚の常在構成される脂質層を有する。これまでに、哺乳類において菌には好脂質性、脂質要求性の細菌、真菌が少なくない。

皮膚バリアに重要な役割を果たす極長鎖アシル CoA シン

Propionibacterium acnes（アクネ菌）は皮脂を好み、皮脂テターゼに着目し、その線虫ホモログである acs-20 遺伝腺において増殖する性質を有する。Malassezia 属（マラセ子のノックアウト線虫の作製・表現型解析を行ってきた。

チア真菌）の多くは脂質存在下においてのみ増殖が可能で本研究においては、acs-20 ノックアウト線虫が耐性幼ある。このような菌、真菌については、有効な感染モデル

虫化条件において 1 % SDS 高感受性を示すことを明らかに− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

図 7 acs-20 ノックアウト線虫に対するアクネ菌感染実験
1 日齢 acs-20 ノックアウト線虫に標準餌である大腸菌 OP50 またはアクネ菌 P.acnes を接種した。1 群あたりの個体数 n >50した。この結果は acs-20 ノックアウト線虫の表皮バリア（引用文献）が低下するというこれまでの知見を支持する。また、線虫

1） Herrmann T1, van der Hoeven F, Grone HJ,

C. elegans がヒト皮膚常在菌、真菌の感染モデルとなる可Stewart AF, Langbein L, Kaiser I, Liebisch G, Gosch

能性を考え、種々の細菌、真菌の線虫への感染実験を行っ

I, Buchkremer F, Drobnik W, Schmitz G, Stremmel

た。その結果、マラセチア真菌やアクネ菌が線虫に対してW. Mice with targeted disruption of the fatty acid

顕著な病原性を発揮することが明らかとなった。また acs-transport protein 4 (Fatp 4, Slc2 7a4) gene show

20 ノックアウト線虫は、アクネ菌に対して野生型線虫とfeatures of lethal restrictive dermopathy. J Cell Biol.

異なる生存キネティクスを示した。アクネ菌やマラセチア

161,1105-1115, 2003

真菌は様々な脂質を基質とするリパーゼを分泌し、加水分2） Kage-Nakadai E, Kobuna H, Kimura M, Gengyo-

解により生じた脂肪酸が炎症を誘発、増悪する可能性が指Ando K, Inoue T, Arai H, Mitani S. Two very long

摘されている。以上のことから、acs-20 ノックアウト線

chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-2 0

虫は、リパーゼの基質となる体表面脂質の変化により、アand acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in

クネ菌やマラセチア真菌に対し野生型線虫と異なる反応をCaenorhabditis elegans. PLoS One 5, e8857, 2010

示す可能性が考えられた。

3） Tomida S, Nguyen L, Chiu BH, Liu J, Sodergren E,Weinstock GM, Li H. Pan-genome and comparative
genome analyses of propionibacterium acnes reveal its
genomic diversity in the healthy and diseased humanskin microbiome. MBio 4, e00003-13, 2013

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