〔大学院博士課程（後期）奨学金贈呈者〕

複合培養系を用いた腸管上皮細胞とマクロファージ様細胞の相互作用の解析

石本

東京大学大学院農学生命科学研究科

緒容子

博士課程

ロファージ様 THP-1 細胞からなる複合培養系を構築し

言
腸管は栄養素の吸収器官としての働き以外に異物に対た（図 1）。今までに、①複合培養することで Caco-2 細する防御機構を備えている。その１つが腸管免疫系で胞が傷害を受けること、②その傷害に THP-1 細胞の産あり、腸管上皮細胞とその直下の粘膜固有層等に存在生する TNF- αなどの液性因子が関与していること、③する免疫細胞から構成されている。腸管上皮細胞と免

このとき Caco-2 細胞ではアポトーシスとネクローシス

疫細胞は液性因子などを介して互いに制御しあっておが混在していることが分かってきている 1)。これらの現り、その破綻が腸管の炎症の一因であることが知られて象は炎症時の小腸の状態と類似しており、この複合培養いる。例えば、近年患者数が増大しているクローン病や系を、サイトカインの異常産生により引き起こされる腸潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel

炎症の in vitro モデル系として用い、2 種の細胞間相互Disease；IBD）は小腸や大腸に潰瘍ができる治療困難な作用時に起きる現象の詳細な解析をおこなった。

腸疾患であり、腸管免疫系を制御するサイトカインの産生異常に起因する。特にクローン病では、異常亢進した

実験方法

マクロファージが産生する炎症性サイトカイン TNF- α

腸管上皮細胞、マクロファージ様細胞のモデルとして、により腸管上皮細胞が傷害を受けることが明らかにされそれぞれヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞及びヒト急性単球ており、臨床では抗 TNF- α抗体が症状緩和に効果をあ性白血病由来 THP-1 細胞を用いた。インサート（管腔げている。しかしながらその副作用には十分な注意が必側）の透過性膜上に Caco-2 細胞を単層培養して小腸上要であり、より安全な治療法が期待されている。

皮様に分化させ、その基底膜側に PMA 処理によりマク

本研究では、腸炎症発症の分子メカニズムに関するさロファージ様に分化させた THP-1 細胞を配置することらなる情報取得をめざして、腸管上皮 Caco-2 細胞と腸で複合培養開始とした（図 1）。

管の炎症時に活性化されていることが知られているマク
Caco-2 細胞複合培養することで Caco-2 細胞が受ける影響につい

腸管上皮細胞14 日
複合培養（Coculture）

透過性膜

管腔（apical）側基底膜（basal）側
PMA
4日
THP-1 細胞マクロファージ様細胞

図1

複合培養 (coculture) の方法

インサートの透過性膜上で小腸上皮様に分化させた Caco-2 細胞を、PMA 処理によりマクロファージ様に分化させた THP-1 細胞上に配置することで複合培養開始とした。

1

石本

容

子ては、細胞傷害の指標である LDH 放出量の測定やカス大きい遺伝子として選抜された。次に IEX-1 ならびに

パーゼ 3 活性、real-time RT-PCR により調べると共に、annexin a2 pseudogene 2 をテンプレートにしてパターDNA マイクロアレイを用いて遺伝子発現パターンの変ンマッチングをおこない、相関係数の高い順に並び替え化を調べた。また、レンチウイルスを用いて注目した遺た。並び替えたプローブセットについてそれぞれ上位伝子の発現ベクターを Caco-2 細胞に感染させ、過剰発5％までを選抜しクラスタリングをおこなった結果、複現細胞及びノックダウン細胞を作製した。

合培養初期に発現量が上昇する遺伝子群には、免疫やアポトーシス、プロテインキナーゼカスケードに関わる遺結伝子が、発現量が低下する遺伝子群には、酸化的リン酸

果

複合培養時の Caco-2 細胞における遺伝子発現プロファイル化や転写、翻訳、細胞周期に関わる遺伝子が多く含まれの網羅的解析ていることが分かった（図 2）。ここから、複合培養し複合培養時の Caco-2 細胞層における遺伝子発現パた Caco-2 細胞が炎症状態にあるということ、また初期ターン変化を網羅的に解析すべく、THP-1 細胞と 0、1、防御反応と細胞死へと向かう動きが同時に起こり、結果3、6、24、48 時間複合培養した Caco-2 細胞について的に死んでいくという示唆が得られた。

DNA マイクロアレイをおこなった。複合培養初期、特※ こ の 節 の 内 容 は、Biosci. Biotechnol. Biochem., 74, 437-439,
2010. に公表に 1 時間以降発現量が変動する遺伝子を抽出するために、maSigPro という時系列解析用にデザインされた Rのパッケージを用いた。発現量の経時変化が 2 次曲線

IEX-1 による複合培養時の Caco-2 細胞の傷害抑制機構の解析で近似できるプローブセットを抽出したところ、複合培発現量が上昇した遺伝子の中から最も発現量変動が大養初期に発現量が上昇する遺伝子群の中では Immediate

きい IEX-1 に注目し、複合培養時の Caco-2 細胞でみらearly response gene（IEX-1）が、低下する遺伝子群のれる現象にどのように関与しているか調べた。IEX-1 は中では annexin a2 pseudogene 2 が最も発現量変動の細胞周期の促進、増殖、アポトーシスの調節などに関与

図2

THP-1 細胞と複合培養した Caco-2 細胞における発現変動遺伝子のヒートマップ

IEX-1（上図）および annexin a2 pseudogene 2（下図）と発現変動パターンが似た遺伝子についてヒートマップを作製した。遺伝子発現レ
ベルは相対値（Z-score）になおし、発現量の上昇はマゼンダで、減少は緑で表した。挿入した表は発現量が上昇する遺伝子（230 個）と発8)現量が減少する遺伝子（247 個）についてのアノテーションを記したものである。EASE Score は Fisher's Exact p-value を改良したもの 。
2

複合培養系を用いた腸管上皮細胞とマクロファージ様細胞の相互作用の解析

時間依存的な遺伝子発現変化を明らかにすべく、DNAしている初期応答遺伝子で、炎症性サイトカインにより2)転写が誘導されることが知られている 。そこで複合培

マイクロアレイ解析をおこなった。今までに複合培養し養開始時に抗 TNF- αモノクローナル抗体を添加したとた細胞の時系列解析をマイクロアレイでおこなった研究

ころ、複合培養時に増加する IEX-1mRNA 発現量が抑制は報告されていない。加えて、解析にあたり maSigPro

され、THP-1 細胞の産生する TNF- αが Caco-2 細胞におを用いて時間変化というファクターを含んだ発現変動遺ける IEX-1mRNA の発現を誘導していることが示された。

伝子の抽出をおこなっており、この 2 点が本研究の特色である。

次に、複合培養時に生じる Caco-2 細胞の傷害に対する IEX-1 の関与を明確にするために、IEX-1 の発現プラさらに、マイクロアレイデータの解析の結果見出されスミド及び shRNA 発現プラスミドを作製した。作製した IEX-1 に注目して研究を進めたところ、複合培養初期たプラスミドはレンチウイルスを用いて Caco-2 細胞にCaco-2 細胞では IEX-1 の発現量が急増し、これがカス感染させ、IEX-1 を過剰に発現させた細胞（IEX-1 過剰

パーゼ 3 活性の抑制や THP-1 細胞からの刺激の入口で発現細胞）及びノックダウンした細胞（IEX-1 ノックダある TNFR1 の発現の低下に寄与することで、誘導されウン細胞）を作製した。この細胞を用いて THP-1 細胞る傷害を抑制する方向に働きかけている可能性が示唆さと複合培養したところ、過剰発現細胞において LDH 放れた。

出量の減少が、逆にノックダウン細胞においては LDH

一般的に、サルモネラなどの侵襲性細菌に感染したと放出量の上昇がみられ、IEX-1 が複合培養時に Caco-2

き、マクロファージが 1-2 時間以内にアポトーシスを起細胞で引き起こされる傷害の抑制に関与していることがこすのに対し 3,4)、上皮細胞ではアポトーシスの開始ま分かった（図 3）。さらに、IEX-1 ノックダウン細胞にでに 12-18 時間を要する 。ここから、病原菌や炎症おいて、複合培養時にみられるカスパーゼ 3 活性及び性サイトカインに刺激された上皮細胞が IEX-1 の発現上TNFR1 の mRNA 発現の更なる上昇が観察され、Caco-2

昇を通じてアポトーシスの誘導を遅らせ、可能な限り物細胞において IEX-1 がアポトーシスを抑制する方向に働理的バリアーとしての役割を保つことで大量の細菌が生くこと、TNFR1 の発現抑制を介して細胞の TNF- αに対体内に入り込んで感染が急速に拡大するのを避けているする感受性を保つことでアポトーシスから細胞を防御し可能性が考えられる。

5)ている可能性が示された。

また、IEX-1 に関しては、IBD 患者の腸管粘膜のマイクロアレイ解析においても発現量が高いことが示されて考いる 6)。加えて、IEX-1 のマウスホモログである gly96

察
本研究では THP-1 細胞と複合培養した Caco-2 細胞ののノックアウトマウスに DSS を投与したところ、野生A

B2010

Released LDH(% )Released LDH(% )18864216141210864200

Mock

IEX-1

Control

MockIEX-1

ControlshRNA

Coculture

IEX-1
shRNA

ControlshRNA

Control

IEX-1
shRNA

Coculture

Each value is the mean ± SD, n=3, P ＜ 0.05（同じアルファベット記号を有するものは有意差なし）

図3

IEX-1 が THP-1 細胞と複合培養した Caco-2 細胞の LDH 放出に及ぼす影響

Caco-2 細胞に IEX-1 の発現プラスミドあるいは shRNA 発現プラスミドをレンチウイルスで感染させ、IEX-1 過剰発現細胞および IEX-1 ノックダウン細胞を作製した。この細胞を THP-1 細胞と複合培養し、48 時間後に LDH 放出量を測定した（A：IEX-1 過剰発現細胞

B：IEX-1

ノックダウン細胞）。Mock には、IEX-1 発現プラスミドの代わりに CS Ⅱ -MCS-EF-IRES2-Venus を、IEX-1 shRNA 発現プラスミドの代わりに、コントロール用配列を含むネガティブコントロールプラスミドを感染させた Caco-2 細胞を用いた。
3石本容子

次に、マイクロアレイデータを解析した結果最も発型マウスに投与したときよりも重度の炎症が誘導される
7)ことが報告されており 、腸炎症における IEX-1 の重要

現量変動の大きい IEX-1 に注目したところ、IEX-1 の性が示されると共に、本系を詳細に解析することで実際発現に TNF- αが関与していることが示された。また、の腸管で起こっている現象に関して新たな理解が得られ

IEX-1 の過剰発現細胞及びノックダウン細胞を用いたることも示された。

実験から、Caco-2 細胞において IEX-1 が傷害を抑制す

以上より、IEX-1 の発現を誘導する化合物をスクリーる方向に働くこと、TNFR1 の発現抑制を介して細胞のニングすることで、腸炎症の薬や機能性食品のシーズとTNF- αに対する感受性を制御することでアポトーシスして利用できる可能性がある。今後は、IEX-1 による傷から細胞を防御している可能性が示された。

害抑制機構について研究を進めるとともに、腸管上皮細胞における IEX-1 の発現量変化が THP-1 細胞に与える謝影響についても調べていく必要があるだろう。

辞本研究の遂行にあたり、財団法人三島海雲記念財団より学術奨励金のご支援を賜りました。心より感謝いたし要ますと共に厚く御礼申し上げます。

約本 研 究 で は、 今 ま で に 我 々 が 構 築 し た 腸 管 上 皮

Caco-2 細胞とマクロファージ様 THP-1 細胞の複合培養

文系をサイトカインの異常産生により引き起こされる腸炎1）Satsu H, et al, : Exp. Cell Res., 312, 3909-3919, 2006.

症の in vitro モデル系として用い、2 種の細胞間相互作

2）Wu MX, : Apoptosis, 8, 11-18, 2003.

献3）Zychlinsky A, et al, : Nature, 358, 167-169, 1992.

用時に起きる現象の詳細な解析をおこなった。

4）Monack DM, et al, : Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93, 9833-9838,

THP-1 細胞と複合培養した Caco-2 細胞について DNA

1996.

マイクロアレイをおこなったところ、複合培養初期に発5）Kim JM, et al, : J. Clin. Invest., 102, 1815-1823, 1998.

現量が上昇する遺伝子群には免疫やアポトーシス、プロテ6）Costello CM, et al,: PLoS Med., 2, e199, 2005.
7）Sina C, et al, : Inflamm. Bowel Dis., 16, 320-331, 2010.

インキナーゼカスケードに関わる遺伝子が、発現量が低下

8）Hosack DA, et al, : Genome Biol., 4, R70, 2003する遺伝子群には酸化的リン酸化や転写、翻訳、細胞周期に関わる遺伝子が多く含まれていることが分かった。

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