””

いわゆる しみ （肝斑など）の発症機構とその増悪因子に関する研究
秋田大学医学部

富田

秋田大学医学部

秋田大学医学部靖• 前田

憲舟• 松永純

Normal human epidermal melanocytes became swollen and more dendritic with an increasein the amount of tyrosinase activity and immunoreactive tyrosinase-related protein 1 (TRP-1)
when they were cultured for 2days with each one of [Nle 4, D-Phe 7] a melanocyte-stimulating
hormone(a MSH), follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH). Estradiol,
estriol, progesterone and ACTH affected the melanocyte morphology and the amount of TRP1, but did not increase the tyrosinase activity. These data suggest that all of those hormones,
especially a MSH, FSH and LH, may be respe!hsible for the induction of facial hyperpigmentationsuch as chloasma.

1

緒

言

わらず、 ヒト色素細胞を用いてこれらのホルモン
種々の女性ホルモンの効果を、 細胞形態の変化、メラニン生成に関与する酵素の増加を指標にして多くの日本人女性は、中年になると顔面の色素沈着、 いわゆる

“

しみ

”

調ぺた。

に悩まされる。 この顔面の色素沈着の大部分は、肝斑と呼ばれる、眼周囲や2頬部の褐色の色素増加で、 早い女性で30歳前後よ実験り出現する。 この肝班の発症機序は不明であるが、妊娠時には増悪すること

1)

2·1

、 女性により月経時に材料、 閉経後の女性に肝斑が見られ実験に使用した主な試薬は以下のとおりである。

ないこと、 避妊用のピルにより肝斑が誘発される

phorbol-12-rnyristate-13-acetate (PMA),insulin,も濃くなることこと

3)2)

h ydrocortisone, N 6 , 0 2 -dib utryl cyclic、 そして男性には極めてまれであることな

どから、黄体形成ホルモン、 卵胞剌激ホルモン、

adenosine3', 5'-rnonophosphate

卵胞ホルモン、黄体ホルモンなどの女性ホルモン[Nle 4 , D-P h e 7 ] a rne lanocyte-stirnulatingが肝斑の発症および増悪に関与していることが推hormone

察される。

stimulating hormone( 以下単 にaMSHと略す），(dbcAMP),follicle­F( SH)以上はSigma製。

さてこれらの女性ホルモンが直接に色素細胞に

fime lanocyte-stimulating hormone{J( MSH)

働いて、 メラニン色素の増加をもたらすのか否か(Bachem Co.), luteinizing hormone

L( H)(UCB

bioproducts), MCDB153 (極東製薬）， epidermalは、 肝斑の発症機序を知る上で重要であるにも関

growth factor
Effect of pituitary and ovarian hormons on
normal human melanocytes in vitro.

( Clonetics Co.), humanb asic fib rob last growth factor(bFGF)(Amersham社）。

Yasushi Tomita
School of Medicme(EGF) (湧永製薬）， bovine

pituitary extract

2·2 色素細胞の培養

Akita University

色素細胞の培養は、 以前に我々が開発した吸引水疱を用いた方法によって行った 4) 。 簡単にその

-79-

士口
徐

3

方法を述べる。健常人男性（年齢20-24オ）の前果の直接作用を調べた報告はいまだにない。 そこで3·1

本研究において、培養ヒト正常色素細胞に対する腕をヒビテンで消毒後、抗真菌剤ビフォナゾ
含有クリ

ー

ー

下垂体ホルモンのTRP-1への影響

まず下垂体前葉から分泌される性ホルモンであルる黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)

ムを滅菌ヘラで塗布する。20mlのディ

スボサプル注射筒の外筒を4ヶ所または8ヶ所皮膚について、同じ下垂体から分泌されるACTHと、 f3に密着し、陰圧(300-350mmHg)で、1時間-2時

色素細胞刺激ホルモン(/3 MSH)とともに比較検討

間吸引すると表皮と真皮が遊離し、吸引水疱が形した。またすでに色素細胞にたいする刺激効果が成される。表皮全層よりなる水疱蓋を無菌 的に切報告されているa色素細胞刺激ホルモン (aMSH)

除し、それを0. 25% I、リプシンEDTA/PBS液で37℃、

8, 9)30分処理して、表皮細胞をバラバラに分離する。

/3MSH、aMSH、ACTH、FSH、LH について、 それぞ

これら表皮細胞の大部分は角化細胞で、色素細胞

れ終濃度がlng/rnl、lOng/rnl、100ng/rnl、lµg

は数％しか含まれていないが、 後述の培地にて培/rnlになるように培地へ加えて培養した後、色素養を続けると、角化細胞は増殖せず分化をとげ死細胞中のTRP-1の相対量を測定し、 それぞれの平

滅し、いずれ色素細胞のみとなる。

均値土SDを図1に示した。
"P<0.05...・・P<0.01
P<0.001.... P<0.0001

色素細胞の形態とチロシナ ー ゼ活性およびチロシナ ー ゼ関連蛋白量の測定

30

□口巴曰●

2·3

を、陽性コントロ ー ルとして加えて検討した。

単離した色素細胞を20ng/mlPMA、 ウシ脳下垂体

゜0.001

0.01
0.1
1.0

抽出液含、EGF、インシュリンとハイドロコルチゾ
L.du 卜ンを含む10%FCS/MCDB153培地で4日間培養後、10%FCS/MCDB153のみの培地に交換し、さらに3'日間培養した。この初代培養ヒト色素細胞に種々のホルモンを添加し、二日間培養した後にメタノー

I r·-T'lll I ·f'II I f-·.1ぎI。 nNone
MSH pMSH ACTH FSH

ル／アセトンで固定した。 これを抗チロシナ ー
5>ゼ関連蛋白1抗体 (TMH-1)

トーとFITC抗ラットlgG抗体で染色し、個々の細胞の一個あたりの相対蛍(tyrosinas e-related protein 1、TRP-1) 量の相対変化を調べた。また蛍光顕徹鏡で写真を撮り、色素細胞の形態変化（樹状突起の数、細胞周
囲長、細胞面積）を イメ ー ジスキャナ ー を用い、すでに報告した方法 6) で測定した。またチロシナ
ゼ活性を前田らの方法 ” で定量した。

2·4

LH

図1. 下垂体ホルモンによる色素細胞内チロシナ ー ゼ関連
蛋白1への影響0.001µ,g/mlから1.0µ,g/mlまでの濃度の種々のホルモンを培地に添加して 、 色素細胞を2日間培養した後 、 細胞を固定し 、 チロシナ ー ゼ関連蛋白 1 (TRP1)の相対岳（細胞1個当たりの平均値＋／ 一 標準偏差）を測定したr
MSHはfimelanocyte-stimulating hormone色素細胞刺激ホルモンを 、 p MSHは[NI e', D-Phe'] a me I anocyte­
stimulating hormoneを 、 ACTHは副腎皮質刺激ホルモ
ンを 、 FSHはfol I icle-stimulating hormone卵胞剌激ホルモンを 、 LHはluteinizing hormone黄体形成ホルモンを示すく光 強 度 を 測 定 して 、 チロシナ ー ゼ 関 連蛋白1

ー

―

統計的処理

個々の色素細胞30個について蛍光強度、 樹枝状

TRP-1は、メラニン生成の場であるメラノソ ー

突起の数、周囲長、面積の それぞれの平均値と標ムに局在し、 チロシナ ー ゼとともにメラニン生成

準偏差を算出した。 有意差検定にはStudent'sに関与している 1 0) 。したがって、TRP-1の増加は、

t-testを用いた。

メラニン生成機能の充進を意味している。

-80-

いわゆる

“

しみ. (/Jf斑なと）の発症機構とその憎 :m 囚fーに関する研究

aMSH 、 ACTH 、 FSH、 LH において、 lng/ml か

全てについて著しい増加を示した。

た。 特に、 lOOng/ml と lµg/ml のFSH では著しい増加を認めた。 一方、 /3MSHは lµg/ml を除き、
図 l 中の無添加のNoneとほほ同し値を示し、 TRP-1

下垂体ホルモンの細胞形態への影響
生体表皮基底層に散在する色素細胞は、紫外線などの刺激により、 メラニン生成か充進し、か

aEl
a1
」"d
a
』d J

3·2

800

ao
11

巌の増加を認めなかった。

つまた周囲の角化細胞ヘメラニン頻粒を盛んに転。 従って細胞形態の変化も色素細胞の活動性の指標にな

600
500
400
300
200

゜

は樹枝状突起を増加させ、かつそれらを延長させ
II)

700

゜

0.001
0.01
0.1
1.0
10

100

送することは周知の事である。 その際、色素細胞
たり、細胞自体が大きくなったりする"P <0.05""P <0.01
000P< 0.001....P < 0.0001

(µm)

ロ
ロ
ロ
回
·
m

ら 1µg/mlで濃度依存的に TRP-1 の増加が認めらにおいて樹枝状突起数、細胞周囲長、細胞面積の

図3

None

下垂体ホルモンによる色素細胞の周囲長への影響
実験条件は図1と同様 C グラフは細胞1個あたりの平均周囲長＋／一標準偏差を示す ぐ
図中のMSHは(3melanocyte-st1mulating hormone色素細胞剌激ホルモンを 、 p MSHは[Nie', D-Phe'J o:mela­nocyte-stimulat ing hormoneを 、 ACTHは副腎皮質剌
激ホルモンを 、 FSHはfol I icle-stimulating hormone
卵胞剌激ホルモンを 、 LHはluteinizing hormone黄体形成ホルモンを示す ぐると考え測定した。 細胞形態の測定として、細胞1個あたりの樹枝状突起の数、細胞周囲長（複数の樹枝状突起の長さの和を反映するものとして）、
細胞面積のそれそれについて定量した。

LHのみか、細胞周囲長に有意の増加を示さなかったことを除けば、全てのホルモンが多少の違いがあっても、いすれも細胞形態を変化させた （図2-4) 。 特に /3MSH と aMSH は、 0. 01-1. Oµg/ml

゜

・P <0.05""P<0.01···p <0.001....P<0.0001

(µm')

0.001
0.01
0.1
1.0
10

3000

□口回 曰匿曰

i

3

゜

0.001
0.01
0.1
1.0
10

2000

1000

H
s

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1M

0

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1

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2

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=0:> Jad eaJ'cf

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7

「
＿
こ――
ー

a:) i
ad sa1ppuaa

図2"P < 0.05""P <0.01···P < 0.00
1....P < 0.0001

None

pMSH

下垂体ホルモンによる色素細胞の樹枝状突起数への図4. 下垂体ホルモンによる色素細胞の胞体の大きさ（面積）への影響

実験条件は図1と同様 ，、 グラフは細胞1個あたりの平均突起数十／ 一標準偏差を示す 』 図中のMSHはf3 me I a­
nocyte-stimulat,ng hormone色素細胞剌激ホルモンを 、 pMSHは[Nie', D-Phe'] amelanocyte-stimulating
hormoneを 、 A_CTHは副腎皮質剌激ホルモンを 、 FSHは
fol I I c I e-st ,mu I ating hormone卵胞剌激ホルモンを 、LHはluteinizing hormone黄体形成ホルモンを示す C

実験条件は国と同様 C グラフは細胞1個あたりの平均面積＋／ 一標準偏差を示す c 図中のMSHは/3 me I anocyte-stimulating l1ormone色素細胞刺激ホルモンを 、 pMSHは[Nie', D-Phe'] o:melanocyte-st imulat ing
hormone. を 、 ACTHは副腎皮質刺激ホルモンを 、 FSHは
fol I icle-stimulat1ng hormone卵胞刺激ホルモンを 、LHはluteinizing hormone黄体形成ホルモンを示す C

里�·迎
月／芦

-81-

ル、 エス トリオーエスル、 プロジェス テロ

6

トラジオ

ー

7

卵巣から分泌される女性ホルモンとして、

ルとエ

ス

トリオ

ー

ル で は、(p<O. 001) に認め

30

0口□口●

"P < 0.05..P<O 01・・・P< 0.001....P< 0.0001

゜

1.0
10

None

0.001
0.01
0.1
1.0

0.1

゜

られた（図5)。

0.01

2

ンに、 TRP-1 量の増加が有意

0.001

3

0. 001-1. 0µMにおいて、 また lµM プロジェステロ

゜

4

トラ ジ オ

ー

5

エ

ス

ppuaa
a�Jad sa1

ン 、 17(0H) ー プロジェステロン について検討した。

口口 回 日 閾 四・P<0.05..P<〇.01···P<0.001····P< 0.0001

3·3 性ホルモンのTRP- 1への影響

Estradiol

Estriol

Proge 17{0H)Pro
sterone gesterone

L'du L図6. 女性ホルモンによる色素細胞の樹枝状突起数への影智
実験条件は図 5 と同様 C グラフは細胞 1個あたりの平均突起数十／一標準偏差を示すぐ

20

10

it:

EstrlolProgesterone·P<0.05..P < 0.01... P <0.001
・P< 0.0001

17(0H)Pro
gesterone=a::iJad J
aaE忘 d

図5. 女性ホルモンによる色素細胞中チロシナ ー ゼ関連蛋
白1への影愕
0. 001µ.M から1. 0µM までの濃度の図中に示すホルモ

600
500

一

ンを培地に添加して 、 色素細胞を2日間培養した後 、細胞を固定し 、 チロシナ ー ゼ関連蛋白 1(TRP-1) の相対岳（細胞1個当たりの平均値＋／一標準偏差）を測定
した r

700

゜

(µm)
800

ー
0 1
0 0 1 00 0． 0． 0． 1． 1

Estradiol00ロロ■已

゜
None

400
300
200

゜

100

3·4

性ホルモンの細胞形態への影響

エストラジオ ー ル、 エ ス トリオ ー ル、 プロジェNone

ステロン 、 17(0H) -プロシェス テロンの細胞形態に対する影孵を下垂体ホルモンの場合と同様に調図7. 女性ホルモンによる色素細胞の周囲長への影啓
実験条件は図 5 と同様 ， グラフは細胞 1個あたりの平均周囲長十／一標準偏差を示すぐべた（図6-8)。

17(0H) — プロジェス テロンの樹枝状突起数と細胞周囲長に対して有意の影態を示さなかった事を除けは、 いずれの性ホルモンも細胞形態へ強い影密を与えていた。 エ ストリオ ー ルにおいては、

lnMから 10µMま定濃度依存性に効果が強まったが、

エストラジオ ー ルでは0.01と0.1µMで強い効果を3·5減少を示している（図6-8)。

胞中のチロシナ ー ゼ活性に対する影勝を検討した。

示し、 それより高濃度の lと10µM では逆に効果がホルモンのチロシナ ー ゼ活性に対する影響

本研究で用いたホルモン全てについて、 色素細

-82-

いわゆる

3000

゜

0.001

考

察

(µm')

しみ. (/Jf斑など）の発症機構とその研也池Ifに関する研究

400 日 口 閾 四·P<0.05.. P<0.01...P< 0.001.... P< 0.0001

“

0.01
0.1

日本人をはじめ黄色人種の中年女性に多い肝班

1.0の発症機序は、現在不明である。 妊娠時の婦人の

0
0
0
2

皮府の色素が増加すること l) 、月経周期の終り頃に眼周囲の色素が増加すること 2) が知られている。
また皮I胄科の日常診療で気付くことであるが、閉

0
0
0
1

叉3 』ad ea』<
一

10

経後の女性には肝斑が減少していくことからも女性ホルモンと肝斑との関係をうかがわせる。 月経時あるいは妊娠時にはMSHのほかにLH(黄体形成ホNoneルモン）、FSH(卵胞剌激ホルモン）、エストロシェン（卵胞ホルモン）、フロジェステロン （黄体ホル

図8. 女性ホルモンによる色素細胞の胞体の大きさ（面積）への影界
実験条件は図5と同様 で グラフは細胞1個あたりの平均面積＋／ 一 標準偏差を示す Cモン） なとの女性ホルモンの血中濃度か増加することから、これらのホルモンが色素沈着に関与していると考えられる。 またアメリカでは避妊用のピルを内服している女性の約29%に肝斑が発症す

図9に示すように、高濃度の/3MSH、aMSH、FSH、れるエストロジェンやブロジェステロンか肝斑のLH、において、チロシナ ー ゼ活性の増加が認められた。 エストラジオー

ジェステロン、17(0H)

ル、エストリオーーると報告されていること a) などから、ピルに含ま発症に関わっ．ていると推測される。

ル、プロ

Snellら l 2) の動物実験の結果でも、卵巣を摘除

プロジェステロンにおい

したモルモットにエストロジェンを投与すると、ては、有意の増加か認められなかった。

皮団のメラニンを増加させることか観察されてい0 1
O O． O ．
1ーる。 その場合、少量のプロジェステロンはややメ
ラニンを増加させるものの、大量のプロジェステ
ロンは逆にメラニンを減少させるとい う。Sne11
らの動物実験以来、女性ホルモンの色素生成に対2する影態をみた研究の報告は見当らない。
ところで 、魚類、両生類に おいては、MSHが0

エト — — -11L

1(
＝Jao,nw ) Al!>弓 If aseu1so,A1

D□ l
JD

3

"P<0.05

色素細胞に直接作用して、皮府色の調節に関与している事は、あまりにも有名である。 このMSHが、ヒトの肝斑の発症に関与するのではないのかと考え 、肝斑患者の血中MSH量の測定が行われたようであるが、positive dataが得られていない。

図9. 種々ホルモンによる色素細胞内チロシナーゼ活性岳への影恕
0.001µ.g/ml から 1. 0µ. g/m I までの浪度の MSH(色素細胞刺激ホルモン）、 pMSHA([Nle', D-Phe'] a mela­nocyte-stimulating hormone) 、 ACTH(副腎皮質刺激ホルモン） 、 FSH(卵胞刺激ホルモン） 、 LH(黄体形成ホルモン）を、また0. 001M から 1.OMまでの濃度の図中の女性ホルモンを培地に添加して 、 色素細胞を2日間培蓑した後、細胞を固定し 、 チロシナーゼ活性を測定したr グラフは細胞1個当たりの活性平均値＋／一標準偏差を示す で

例えば、 ビルにより発症し た 肝斑患者の血中MSHは決して高くはなかった 3) 。 そんな訳で現在ではMSHが肝斑 の発症に関係しているとは考えられていない。 しかし培養ヒト色素細胞では、MSHによって細胞内のcAMPが増加することが知られており、またチロシナ ー ゼ活性の増加も報告されている l 3) 。そこで本研究では、このMSHを女

-83-

＇

性ホルモンの効果を比較する上ての、 positive

は肝斑が見られなくなる。 閉経後のホルモン動態

controlとして加えた。

を見ると'.:L ストロ ー ジェンが著しく減少するの

本研究において、検討した3つのバラメ ー タ ー 、に対して、そのnegative feedbackとしてFSH、LH

すなわちは細胞形態の変化とTRP-1そしてチロシが著しく増加する 4 J。 もしFSHとLHか肝斑野出現

ナ ー ゼは、いすれも表皮での色素増加に関係するに関与している とすると、 閉経後のFSHとLHのパラメである。 つまり紫外線照射により皮増加と肝斑の消失は矛盾してくる。 ホルモンの動府のメラニンが増加するが、このとき表皮基底層態からみると、むしろエストロジェンやプロジェに散在する色素細胞が大きくなり、そして樹枝状ステロンが肝斑の形成に関与しているように見え突起が著しく延長し、 周囲の角化細胞にメラニンる。 しかし今回のin-vitroの実験結果では、 エス

I l) 0

トロジェンやプロジェステロンは、色素細胞の形

ー

タ

ー

顕粒を盛んに配送することが観察されている
またチロンナーl

態変化に対して直接刺激効果をそれなりに示して

ゼはメラニン生成の律速酵素、つ番重要な酵素であることははいるが、 TRP-1やチロシナ ー ゼに対しては有あまりにも有名である。 TRP-1は褐色のメラニ

意な作用を示さす、強力な肝斑を引き起こす犯人

ン生成に関与する蛋白として知られていたが、メとするには、もの足らない。 たが エ ストロジェン

ラニン生成経路の下流で働< dihydroxyindoleあるいはプロジェステロンかある細胞に作用して、carboxylic acid oxidase (DHICA oxidase)であ

その細胞か色素生成促進因子を産生して、その結まりメラニン生成で一

る こ とか最近判明した

lO)。 従ってチロシナ ー

果肝斑が生ずる可能性かある。 今後この点に関しての検討を進める必要がある。

ゼとTRP-1の増加は、 色素細胞内でのメ ラニン
生成の冗進を意味しており、また色素細胞の樹枝状突起の延長は、増加したメラニン頼粒の配達の文

献増加を意味していると考えて良い。

l)Snell RS., Bischitz PG., "The rnelanocytes

結果に示したように、LHの細胞周囲長とプロジ

and melanin in human abdominal wall skinェステロンの細胞面積に対して有意の効果を示さ

a survey mad e at different ages in

なかった事を除き、今回調べた全てのホルモンがb oth s e x e s and during preg n a ncy",
J Anal., 97 361 (1963)

色素細胞に剌激を与え細胞形態の変化を誘導した。
2)

TRP-1も/3-MSHとプロジェステロンを除き、他のSnell RS

Turner R"Sk·in p1gmentat1 on

ホルモンで大なり小なりの反応を示した。 特に

in relation to the menstrual cycle",

FSH、
LH、 エ ストラジオ] Invest Dermatol., 47 147 (1966)

ールにおいては、著しい増加を示した。 しかしチロシナー

3)

ゼ活性はaおよび

Resnick CS.,

"Melasma induced by oral

/3-MSH、FSH、LHで有意の増加を示したのみてあっcontraceptive drugs", ].A.M.A .. 199 601

た。 細胞形態の変化とTRP-1そしてチロシナ ー ゼ(1967)の増加の3つのパラメ ー ター4) Tomita Y., Yamamoto H.. Sato C., et al. ,は、 今回調べたホルモンの刺激にいつも平行して反応する訳ではない"Eff i c i e n t c u l t u r i ng o f hu m a nので、これらはそれぞれ異なった、 レセプタ

melanocyt es from suction bli$ters",ーとTohol?11 ].EゅMed., 147 219 (1985)

シグナル伝達系を持っているようてある。 それでもa-MSH、FSHそしてLHの3者は、細胞形態変化、ー

5)Tomita Y., Shibahara S., Takeda A., etタ

al. "The monoclonal antibodies TMH-1 andを増加させた事から、生体内の色素細胞に対し

TMH-2 specifically bind to a protein

チロシナ

ー

ゼ活性、TRP-1最の3つのバラメ

ー

encoded at the murine b·-locus, not toても直接に作用する可能性を強く示している。

the authe ntic tyrosinase encoded at

ところで、 前にも述べたように閉経後の女性に

-84-

いわゆる

“

しみ

”

f-に関する研究（肝斑など）の発症機構とその憎悪囚：：

c-locus", J Invest Dem皿ol., 96 500(1991)
6) Tomita Y., Iwamoto M., Masuda_ T., et al10) Kobayashi T., Urabe K., Winder ., A et

"Stimulatory effect of prostaglandin

interactions with other melanogenic

E2 on configuration of normal human

enzymes", Pig Cell Res., 7 227 (1994)

melanocytes in vitro", ]. Invest. Dermatol.,11) Quevedo WC. Jr, Szabo G., Virks J., etal. "Me lanocyte populations in UV­
irradiated human skin", ]. Invest. Dern叫ol.,

89 299 (1987)
7) Maeda K., Tomita Y., Fukuda M., et al.
"Effects of staurosporine, PMA and
A23187 on human melanocyte cultures withdibutyryl cyclic AMP", Br,J,Der印atol.,al. "DHICA oxidase activity of TRPl and

45 295 (1965)
12) S n e l l RS. "Ho r m ona l cont rol of
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126 118 (1992)
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Oxford, p447, (1996)

a MSH and /3 MSH on the skin color ofman", Nature., 189 176 (1961)

13) Pawelek JM., "Factors regulating growth9) Le e TH., Le e MS., "Stu dies on MSH
induced melanogenesis:effect of longterm

and pigmentation of melanoma cells",

administration of MSH on the melanincont e nt and ty rosinase activity",14)倉智敬―, “女性内分泌機能の異常と皮膚病”
変 現代皮府科学大系2B. 中山書店p96 ,]. Invest. Dermatol., 60 201 (1976)

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