【研究報告】（自然科学部門）

茶カテキンの脳機能低下抑制作用における機構解明―脳移行に関する検討―

海野

静岡県立大学薬学部緒

言けい子
准教授

しかし、緑茶に含まれる種々のカテキン分子の中で最もアルツハイマー病を含む認知症は加齢に伴い増加す多いものは EGCG であり、その構造からカテキンやエピることから、「加齢」は最大の危険因子であり、「老化」カテキンとは BBB 透過性が異なる可能性が考えられるはそれを促進する。したがって「老化予防」は認知症予ことから、本研究では EGCG の脳への移行性に焦点を当防の重要な戦略となる。老化の一因として酸化ストレスて、脳に対する作用の解明をめざした。さらにその成果の重要性が指摘されていることから、われわれは強力なとともに、マウスおよび培養神経細胞を用い抗酸化作用を有する緑茶カテキンに着目した。これまで

よびに、緑茶カテキン摂取により脳内の酸化傷害が軽減さカテキンによる脳機能低下抑制作用の機構解明をめざしれ、加齢に伴う脳の萎縮および学習・記憶能の低下が抑た。

おの両面から EGCG 等の作用を検討し、緑茶制されることを、老化促進モデルマウス（SAMP10）を用い明らかにしてきた 1 5）。ラットに緑茶カテキン（エ実験方法

ピガロカテキンガレート，EGCG）（図 1）を経口投与す1.

–

実験動物，緑茶カテキンの投与および学習判定
老化促進モデルマウス（SAMP10、4 週齢、雄）は日ると、極微量ながら脳から EGCG が検出されることが報
6–8）、緑茶カテキンが脳内にどの程度取本エスエルシー（株）より購入し、12 月齢になるまで飼込まれ、またどのようなカテキンが有効であるのか、十育した。1 ケージ 6 匹ずつで飼育し、固形飼料（CE-2、告されているが分な解明には至っていない。最近エピカテキンおよびカ

日 本 ク レ ア（株）） は 自 由 摂 取 と し た。 緑 茶 カ テ キ ン

テキンについて、マイクロダイアリシスによるサンプリ（Sunphenon 70S、太陽化学（株））は 0.2 mg/mL の濃度

ング法9）、ラットおよびヒトの血液脳関門（BBB）モデで水に溶解した。EGCG、EGC（太陽化学（株））および10）

ル細胞を用いた検討 が行われ、少なくともカテキンおGA（MP Biomedicals）は 0.1 mM の水溶液を、飲水とよびエピカテキンは BBB を通過することが示された。

してマウスに自由摂取させた。11 月齢になった時点で、ステップスルー装置（MGS-003、室町機械（株））を用いた受動回避試験により学習能を判定した。動物実験は静岡県立大学における実験動物に関する指針に従って行った。
2.

カテキンの脳内移行性
カ テ キ ン 類 の 脳 内 移 行 性 の 検 討 は、BBB キ ッ ト（RBT-24, ファーマコセル（株））（図 2）を使用した。イ
ンサート内側（血管腔側）に EGCG、EGC あるいは GAを終濃度 30 μM となるように加え、30 分間 37℃で静かに振とうした。プレートのウェル側（脳実質側）から900 μL、インサート側の培養液から 200 μL を回収し、速やかに凍結した。回収した血管腔側および脳実質側の図1画分について、EGCG 等の濃度を LC-MS/MS にて測定

緑茶中のカテキン類
1

海

図2

野けい子

血液脳関門モデル

ファーマコセル（株）ホームページより引用。

した。脳への移行性が高いことが知られているカフェインをポジティブコントロールとして 3 回実験を行い、EGCG 等の透過係数ならびに脳内移行性（透過率％）を求めた。
3.

培養神経細胞図3

DMEM : F-12（1 : 1）/10％ FBS 培地に懸濁したヒト

マウスの学習能に対する緑茶カテキンの効果

緑茶カテキン（Catechin）は 0.2 mg/mL の濃度で水に溶解した。
EGCG、EGC、GA は 0.1 mM の濃度で水に溶解した。老化促進モデルマウス（SAMP10）に緑茶カテキン等を自由摂取させ、11 月齢の時点でステップスルー受動回避試験により、学習能を判定した。学習に要した時間が長いほど、学習能が低下していることを意味する（*, ＜0.05）。

神 経 芽 細 胞 腫 SH-SY5Y 細 胞（ACTT、CRL-2266 株）（1.0×105 cells/mL）500 μL を、24 well プ レ ー ト の 各well に播種した。EGCG、EGC および GA は DMSO に溶解 し、 各 well に 1 μL を 添 加 し た。 こ の と き、EGCG、EGC および GA の最終濃度が 0〜1.0 μM になるように適宜希釈した。細胞を 5％ CO2 存在下、37℃で 48 時間培り有意に抑制された（図 3）。緑茶カテキン水溶液中の養した。

EGCG の濃度は 0.1 mM であり、緑茶カテキンと EGCG培地を除去した後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で（0.1 mM）を摂取していた場合と比較した結果、ほぼ同洗浄した。各 well にトリプシン 80 μL を加え接着してい等の学習能低下抑制作用が認められたことから、脳機能た細胞を浮遊させた後、DMEM : F-12（1 : 1）/10％ FBS低下抑制作用において主要な役割を担っているカテキン培地 500 μL を加えた。細胞懸濁液をサンプルチューブ

は EGCG であることが示された（図 3）。に移し、1200 rpm で 5 分遠心した。上清を除き、細胞にEGCG は、腸内細菌によりエピガロカテキン（EGC）DMEM : F-12（1 : 1）/10％ FBS 培 地 を 100 μL 加 え た。と 没 食 子 酸（GA） に 分 解 さ れ る こ と か ら11）、EGC、得られた細胞懸濁液 10 μL にトリパンブルー液 10 μL をGA、ならびに EGC と GA を同時に摂取した場合につい加え、セルカウンターを用いて生細胞数を計数した。て、マウスの脳機能に対する作用を比較した。その結EGCG 等 を 加 え な い と き（DMSO の み） の 細 胞 数 を果、EGC あるいは GA を摂取していたマウスでは効果が100％として、細胞増殖の程度を相対値として示した。

認められなかったが、EGC と GA を同時に摂取していた
場合は、EGCG と同程度に脳機能の低下が抑制された

統計解析（図 3）。

結果は平均値±標準誤差で表し、一元配置分散分析
2.

を行った後、ボンフェローニ多重比較検定により比較をカテキン類の BBB 透過性緑茶カテキン類がどの程度脳内に取り込まれるのか行った。 値が 0.05 未満の場合に統計的に有意に差があを明らかにするため、BBB キットを用い EGCG、EGCると判断した。

および GA について、透過係数ならびに 30 分間の透過率
実験結果1.

を測定した。カフェインは脳への移行性が高いことが知マウス脳機能に対する緑茶カテキンの作用られており、本実験においてカフェインの透過係数は緑茶カテキンを自由摂取させた老化促進モデルマウ

31.3±2.49（10−6 cm/s）であった。EGCG および EGC のス（SAMP10）について、脳機能を評価した結果、加齢透過係数は、各々9.31±0.32および11.56±1.05（10−6 cm/s）

時に認められる学習能の低下が、緑茶カテキン摂取によで あ り、 両 者 の 透 過 係 数 に は 有 意 な 差 は な い こ と、2

茶カテキンの脳機能低下抑制作用における機構解明―脳移行に関する検討―

表1

カテキン類の BBB 透過性サンプル

共存サンプル

透過係数（10−6 cm/s）

脳内移行性（％）（30 min）

EGCG
EGCG
EGC
EGC
EGC
GAGA
Caﬀeine̶EGC̶
EGCGGA̶
EGC̶

9.31±0.32
7.29±0.35*
11.56±1.058.58±0.88
4.16±0.89*
21.97±1.9218.68±1.5631.30±2.49

2.77±0.10
2.16±0.11*
3.43±0.31
2.25±0.31
1.53±0.50*
6.52±0.57
5.55±0.46
9.30±0.74

BBB キット（RBT-24, ファーマコセル（株））における、EGCG、EGC および GA 単独、あるいは共存サンプル存在下での透過係数および脳内移行性。EGCG あるいは EGC 単独の場合に比べ、共存サンプルにより有意に低下（ ＜0.05）が見られた場合を * で示した。

図4

神経細胞の増殖に対する EGCG の作用

5培養神経細胞（SH-SY5Y）（1.0×10 cells/ml）500 μL を 24 well プレートの各 well に播種した。EGCG、EGC および GA は DMSO に溶解し、最終濃度が 0〜1.0 μM になるように適宜希釈し、各 well に 1 μL を添加した。細胞を 5％ CO2 存在下、37℃で 48 時間培養した。
各 well にトリプシン 80 μL を加え接着していた細胞を浮遊させた後、得られた細胞懸濁液 10 μL にトリパンブルー液 10 μL を加え、セルカウンターを用いて生細胞数を計数した（*, ＜0.05）。

EGCG および EGC は、わずかであるが脳内に移行するかとなった。得られた透過係数を基に脳内移行性を求めことが示された（表 1）。GA の透過係数は高く、容易にた結果、EGCG と EGC の脳内移行性は各々 2.8％と 3.4％脳内に移行していることが示された。次に、EGCG とであった（表 1）。

EGC が共存した場合の透過性への影響を検討した結果、3.

EGCG は EGC 共存下で有意に透過性が低下することが培養神経細胞の増殖に対する EGCG の作用脳内にとりこまれた EGCG 等が脳神経細胞にどのよ示された。EGC は EGCG の共存により透過性が低下する傾向を示したが、GA 共存により透過性が顕著に低下うな作用を及ぼすのかすることが明らかとなった（表 1）。一方 GA は、EGCと GA は 0.05 μM で細胞増殖を有意に促進した（図 4）。

共存下でもほとんど透過性は影響を受けないことが明ら

一方 EGC は 1 μM より低い濃度では有意な作用を示さな
3で検討した結果、EGCG

海野けい子経細胞に作用することにより、脳機能低下を抑制している可能性が示された（図 5）。マウスにおいて緑茶カテキン摂取により学習能の低下が抑制された有効量を、種差を考慮してヒトの場合に外挿すると、緑茶 7〜8 杯に相当すると考えられる。これはヒトにおいて十分適用可能な摂取量であることから、緑茶の摂取は高齢者の脳の老化予防策として非常に有効であると考えられる。
要約
緑茶カテキンを継続的に摂取した場合、マウスにおいて加齢に伴う脳機能の低下を有意に抑制することが明らかとなった。緑茶カテキンの中で EGCG が脳において主要な作用を示したが、EGC と GA を同時に摂取した場合も効果が見られた。EGCG と EGC は脳血液関門をわ
図5ずかながら透過し、その透過率に有意な違いは認められ

EGCG の脳へのとりこみなかったが、培養神経細胞に対する増殖促進作用は経口的に摂取された EGCG は小腸から取り込まれ、血流を介して脳に至り、血液脳関門を経て脳実質細胞に取り込まれる。また一部の EGCG は腸内細菌により分解を受け EGC と GA となって、血流を介して脳に至る。

EGCG が EGC より低濃度で作用を示した。EGCG は腸内細菌により EGC と GA に分解されるが、EGC と GA の両者が存在した場合は、培養細胞に対しても EGC 単独のときより増殖促進効果が見られた。これらのことからかったが、GA 共存下では作用が増強されることが示さ

緑茶カテキン、特に EGCG は、脳にわずかであるが取りれた。

込まれ作用を発揮するとともに、EGC と GA に分解された場合も脳に対し作用を示すことが明らかとなった。

考察謝本研究により、EGCG が血流を介して脳に至ったと

辞き、その 3％程度は脳内に取り込まれることが示唆され本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益

た。また培養神経細胞に対し EGCG は 0.05 μM で、顕著財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

な増殖促進作用を示した。緑茶を摂取したとき、ヒトで文は摂取量の 0.2〜2.0％のカテキンが血漿中に取り込まれ12）ることが報告されており 、数杯の緑茶を飲んだ場合、

1） K. Unno, et al.:., 39, 1027–1034, 2004.
2） K. Unno, et al.:
, 8, 89–95, 2007.
3） K. Unno, et al.:
, 34, 263–271, 2008.
4） K. Unno, et al.:
, 8, 75–81, 2011.
5） T. Sasaki, et al.:., 7, 459–469, 2008.
6） M. Suganuma, et al.:
, 19, 1771–1776, 1998.
7） T. Kohri, et al.:, 49, 4102–4112,2001.
8） K. Nakagawa, T. Miyazawa:, 43,679–684, 1997.
9） L. Wo, et al.:
, 60, 9377–9383, 2012.
10） A. Faria, et al.:., 2, 39–44, 2011.
11） A. Takagaki, F. Nanjo:, 58, 1313–1321, 2010.
12） K. Nakagawa, et al.:, 61, 1981–1985, 1997.

血漿中のカテキン濃度は 1 μM 程度であると考えられる。
今回得られた結果より、脳に取り込まれた EGCG の濃度において、EGCG は神経細胞に対し増殖促進的に作用している可能性が示された。EGC は EGCG と BBB 透過性に違いはなかったが、およびにおいてEGCG より作用が弱かった。EGCG は腸内細菌によりEGC と GA に分解されるが、EGC は GA 共存下において作用が増強されることが、および献において確認された。これらのことから緑茶を継続的に摂取することにより、EGCG およびその代謝物が直接的に脳神4