EGF が皮膚炎に与える影響とメカニズム
熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座

押海裕之

Epidermal growth factor (EGF) has been used as a component of many cosmetics. EGF has been believed to promote
the turnover of the skin and has an anti-aging ability. Recently, we found that EGF regulates the expression of pro-inflammatory cytokine expression in a DDX60 RNA helicase-dependent manner. Pro-inflammatory cytokines are well known to increase vessels permeability leading to swelling, redness and pain. Our data imply that EGF can suppresses the inflammationin the skin. In this study, we further assessed the role of EGF on the inflammatory immune responses, and found that EGF
suppressed delayed type hypersensitivity in mice. However, EGF did not reduce the phagocytosis ability of macrophages
required for excluding waste product in the skin. Recently, severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-2 (SARSCoV-2) causes coronavirus disease-2019 (COVID-19). SARS-CoV-2 infects host through mucosal epithelial cells, and thus
it is unclear whether EGF within the cosmetics affect the immune response against SARS-CoV-2. Therefore, we investigatedthe effect of EGF on the antiviral activities of epithelial cells. Interestingly, EGF in the culture medium suppressed vesicularstomatitis virus (VSV)-induced cytopathic effect (CPE) on epithelial cells, although EGF attenuated the IL-6 expression
from VSV-infected cells. EGF-promoted antiviral activities were also observed when cells were infected with seasonal
influenza A virus. EGF attenuated the CPE of cells infected with influenza A virus, and reduced IL-6 expression levels. Interestingly, moderate reduction of SARS-CoV-2 replication was observed when EGF existed in cell culture medium. Thesefindings elucidated novel useful aspects of EGF within the cosmetics.

1．緒ら、EGF の免疫応答に与える影響を新たに明らかとする

言

ことは EGF を化粧品の成分として加えることの効果や、上皮成長因子（EGF: Epidermal Growth Factor）は、様々その安全性を考える上でも重要である。

な化粧品に配合され、美容液、スキンケアクリーム、パッEGF と免疫応答の関連として、特に EGF がサイトカイク、化粧水、ファンデーションなどの成分として加えられ、ン受容体の下流で働く STAT 3 のリン酸化が EGF 受容体

加齢に伴う肌のターンオーバーの遅れの解消やコラーゲンの活性化により促進することは古くから報告されている 1）。の生成を促進するなどの効能が期待されている。一方で、STAT 3 は IL- 6、IL- 8、IL- 35 などによっても活性化し、EGF はその受容体である EGFR は非小細胞肺癌を含め多転写因子として様々な免疫応答を誘導する。一方で、EGF

くの悪性腫瘍で発現が高いため、EGF を過剰に存在するによる免疫制御のメカニズムについては不明な点も多く存ことが発がんなどに与える影響についての指摘などがあり、在する。我々の研究室ではこれまで自然免疫応答の研究をEGF を安易に化粧品の成分として使用することの安全性続けてきており、その中で DDX 60 と呼ばれるヘリカーゼについては懸念もある。しかし、現状として、アンチエイが炎症性サイトカインの産生に重要な役割を果たすことをジングなどを謳い EGF が配合された化粧品は現在でも数発見した 2）。興味深いことにこの DDX 60 について、EGF多く販売されている。

が DDX 60 分子のチロシンリン酸化を誘導することで炎症免疫と肌の透明感やハリなどは密接に関連し合うことがを抑えることを明らかとした 3）。これは EGF が DDX 60 分

近年明らかとなりつつあり、特に、老廃物の除去には強い子の機能を介して炎症を抑える役割を果たすことを示唆す

貪食能を有する皮膚のマクロファージが重要な役割を果た

るが、これらが皮膚炎などの炎症に与える影響についてはすことや、マクロファージなどから産生される過剰な炎症十分に解明されていない。

性サイトカインは局所の炎症を誘導し赤みなどの原因とな一方で 2020 年に始まった新型コロナウイルス感染症ることが知られている。EGF は上皮細胞の成長に影響を（COVID- 19 : coronavirus disease- 2019）のパンデミック与えるのみならず、免疫応答などにも影響を与えることかによりウイルス感染症の問題がある。EGF は化粧水などにも配合されており、新型コロナウイルス（SARS-CoV- 2）が感染する目や鼻や口などの粘膜にも触れる機会が多い。

Effect of EGF on hypersensitivity in theskin and its underlying mechanism
Hiroyuki Oshiumi
Department of Immunology, Faculty ofLife Sciences, Kumamoto University

そのため、化粧品に配合された EGF が免疫に影響を与えることで感染に抵抗性や感受性を与える可能性もあり、その検証も喫緊の課題となる。
本研究では「自然免疫」という視点から特に DDX 60 ヘリカーゼと細胞外小胞の機能に焦点をあて、EGF がこれら

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の分子を介して肌のターンオーバーや健康に与える影響を

264 . 7 細胞に対して DDX 60 遺伝子をノックアウトするた解明し、EGF 配合化粧品の新たな効能と機能を解明する

めに CRISPR-Cas 9 の実験系でそれぞれエクソン 11 を除ことを目的として研究を進めた。

去しノックアウト細胞株を作成した。DDX 60 遺伝子がノ２．方ッ ク ア ウ ト さ れ た こ と に つ い て は 定 量 PCR 法 に よ り法

mRNA の発現量で確認した。

2. 1. 接触性過敏反応

野生型と DDX 60 ノックアウト細胞株に対して、その培マウス近郊系として C 57 BL/ 6 系統の野生型マウスと養液に EGF を添加し、それぞれの貪食能を蛍光ラベルしDDX 60 遺伝子をノックアウトしたマウスを実験に使用したビーズの取り込み量で FACS により評価した。その結果、た。動物実験にあたっては熊本大学の動物実験委員会の承EGF 添加により濃度依存的に野生型のマクロファージ細認を得た実験計画書に基づいて実験を実施した。接触性過胞株の貪食能の増加が観察された。一方で、DDX 60 をノ敏反応の実験系として DNFB（dinitrofluorobenzen）の反復ックアウトしてもマクロファージの貪食能は低下しなかっ塗布を実施した。炎症誘導後には EGF を添加し、炎症のた。これらのことは EGF が制御する DDX 60 の機能はマ増悪を組織切片の観察とサイトカイン産生を指標に評価しクロファージの貪食能には関与しないことが示唆された。

た。

3. 2. EGFが過剰な炎症を抑制するメカニズム

2. 2. フローサイトメトリー

DDX 60 分子は通常ウイルス由来の RNA を認識して活マクロファージに与える影響としてTHP-1 やRAW 264 . 7性化するが正常の細胞株にはウイルスは存在しない。しか細胞を用いて、CRISRP-Cas 9 の系を用いて DDX 60 のノ

し DDX 60 の欠損細胞では定常時での炎症性サイトカインックアウト細胞を作成した。貪食に与える影響として蛍光の産生も減少することが明らかとなったため、DDX 60 のラベルしたビーズの取り込みをフローサイトメトリーによ内在性のリガンドを探索した。細胞質内のウイルス認識受り解析を行った。フローサイトメトリーでは FACS キャリ容体である RIG-I と MDA 5 は通常は内在性の LINE- 1 やバーを用いて実験を実施した。

Alu などのレトロエレメントを認識しないが、RIG-I やMDA 5 のアミノ酸変異によりこれらのレトロエレメント2. 3. サイトカイン量の測定を認識することが知られている。MDA 5 の G 495 R 変異はヒト上皮細胞株である HEK 293 細胞や HeLa 細胞株はそAGS の患者で発見されヒトの Alu 配列を過って認識する

れぞれ 10 % の牛胎児血清（FCS）を含む D-MEM（low Glc）

よ う に な る こ と が 知 ら れ て い る。 我 々 は こ の MDA 5 -と Eagleʼs MEM を用いて培養した。EGF についてはそれG 495 R 変異を野生型と DDX 60 の KO 細胞に発現させ I 型

ぞれヒト組換え EGF を用い実験を実施した。炎症性サイインターフェロンと IL- 6 などの炎症性サイトカインの産トカインの測定においては、細胞から RNA を抽出し逆転生量を比較したところ、MDA 5 -G 495 R 変異による IL- 6写後に定量 PCR 法により定量した。また、細胞上清中のの産生は DDX 60 のノックアウトにより減弱することを発サイトカイン量については ELISA 法を用いて実施した。

見した。これらは、内在性のレトロエレメントが DDX 60を介して炎症性サイトカインを誘導すること、また、EGF

2. 4. ウイルスがこれを抑制することで過剰な炎症を制御できることを示

牛水疱性口内炎ウイルス（VSV）は Vero 細胞を用いて増唆する。

殖させた。ウイルスの力価は Vero 細胞を用いたプラークさせた。力価は MDCK 細胞を用いてプラーク法により決3. 3. EGFが過敏反応に与える影響（マウス動物モデル）定した。SARS-CoV- 2 は国立感染症研究所より分与いたマウスの接触型過敏反応の動物モデル実験において野生法を用いた。インフルエンザウイルスは鶏卵を用いて増殖

4）

だいた COVID- 19 患者由来のウイルス株を用いた 。ウ型と DDX 60 ノックアウトマウスで比較した。DNFB をマイルスの増殖およびプラーク法による力価測定はウスの耳に反復塗布し、接触過敏反応による腫れの程度をVeorE 6 /TMPRSS 2 細胞を用いて実施した。新型コロナ測定したところ、DDX 60 ノックアウトマウスでは腫れがウイルスのウイルス量については TCID 50 法により測定野生型マウスと比較し緩和されることが示唆された。一方した。

で、この過敏反応に関与する因子としてリンパ節や脾臓の３．結T 細胞数などを測定したが、野生型と DDX 60 ノックアウ

果トマウスでは有意な差が見られず、そのメカニズムの解明

3. 1. EGFがマクロファージ貪食能に与える影響については今後の課題である。

マクロファージ様の細胞株である THP- 1 細胞と RAW− 90 −

EGF が皮膚炎に与える影響とメカニズム

3. 4. EGFによる抗ウイルス作用たのに対し、逆にIL-6 の産生を抑制することが示された（図DDX 60 分子はウイルス感染時のサイトカイン産生に関2）。これは EGF がサイトカイン産生を抑え炎症を抑制し与しており、EGF が DDX 60 依存的なサイトカイン産生をながらも VSV に対して抗ウイルス作用を示すことを示唆抑制することから、ウイルス感染時の免疫応答におけるする。
次に季節性インフルエンザウイルスに対する影響についEGF の役割について検討した。
VSV は実験室で古くから用いられているウイルスであて調べた。EGF を培養上清に加えることで、ウイルスのりヒト上皮細胞を含め様々な細胞に感染する。我々は増殖については抑制する傾向が観察された（図 3）。一方でEGF 存在下で培養した HeLa 細胞へ VSV を感染させ、36

ウイルス感染後のサイトカイン産生に与える影響について時間後に細胞をホルマリンで固定した後にクリスタルバイ調べたところ、I 型インターフェロン産生が EGF により増オレットで染色し生細胞を観察することで VSV の細胞傷加したのに対し IL- 6 を含む炎症生サイトカイン産生は逆害活性（CPE: Cytopathic effect）について調べた。実験のに低下することが明らかとなった（図 3）。

結果、ウイルスによる細胞傷害活性が EGF によって濃度2020 年 に COVID- 19 パ ン デ ミ ッ ク の 原 因 と な っ た依存的に抑制されることが明らかとなった（図１）。一方で、SARS-CoV- 2 に対する影響について次に調べた。国立感EGF は VSV 感染時の I 型インタフェロン産生を増加させ染症研究所より分与された、COVID- 19 患者より単離さ

図1

VSVによる細胞傷害活性におけるEGFの効果

HeLa細胞を図に示す濃度のEGFを含む培養液で培養し、VSVをMOI＝0 , 1, 4で感染させた。感染後36時間の時点で細胞をホルマリンで固定したのちにクリスタルバイオレットを用いて生細胞を染色した。EGFの転化により細胞傷害が抑制されることが示唆された。

図3

図2 VSVによるIL- 6産生誘導におけるEGFの役割
HeLa細胞をVSVでMOI＝1の条 件で感染させ、感染後24時間の時点での細胞上清中のIL- 6のタンパク量についてELISAにより測定した。培養液中のEGFによりIL- 6の産生量が減少した。

インフルエンザウイルス感染に対するEGFの効果

細胞培養液に10 ng/mLのEGFを添加することでインフルエンザウイルスによる細胞傷害が抑制されることが示唆された（図左）。一方で、このときの培養上清中のウイルス量を比較するとEGF存在下ではウイルス量が低下していた。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

れた SARS-CoV- 2 株について、EGF の有無によるウイルた場合には、これらが目などの上皮細胞に触れ、免疫応答ス量の違いについて ACE 2 を過剰発現させた HEK 293 細に影響を与える可能性が考えられた。本研究では EGF が胞を用いて調べた。SARS-CoV- 2 感染 2 日後の細胞上清上皮細胞の抗ウイルス作用に与える影響についても調べた。のウイルス量について TCID 50 法により測定したところ

EGF は DDX 60 の機能を抑制しサイトカイン産生を抑制す

EGF 存在下ではウイルス量がやや減少する傾向が観察さることから、DDX 60 依存的な抗ウイルス作用を抑制するれた。

ことが懸念されたが、実験の結果は反対に EGF が上皮細４．考胞の抗ウイルス作用を強めることを発見した。ウイルス実察

験で古くから用いられている VSV に対しては EGF が上皮

EGF は上皮の成長を促し肌のターンオーバーなどを促細胞のウイルスによる細胞傷害活性を抑制することが示さ進することから一時期は多くの化粧品に配合され使用されれ、季節性インフルエンザについてはその増殖を抑制するており、アンチエイジングを謳う数多くの商品にも配合さことが示唆された。一方で COVID- 19 のパンデミックとれていた経緯がある。一方で、悪性腫瘍で EGF の受容体なる SARS-CoV- 2 に対する影響では、ウイルスの増殖をが過剰発現するなど健康への影響についても懸念が指摘さやや抑制する傾向が見られた。これらの結果、EGF はれることがある。

DDX 60 依存的なサイトカイン産生を抑制するものの上皮

EGF と免疫との関連についてはこれまで十分に解明さ細胞の抗ウイルス活性は抑制せず、むしろ活性化することれてこなかった。創傷治癒の過程で初期の傷口では外来かが示唆された。これらは EGF を配合する化粧品などが新らの病原体などの異物が免疫応答により排除される。その型コロナウイルス感染に対しては特に悪影響がないことを際には高い貪食能を示す好中球に加えてマクロファージな示唆する。

どの細胞も重要な役割を果たす。その過程ではオプソニン

５．総化された異物の貪食に加えて、炎症を誘導する IL- 1 β、括IL- 6、TNF-α などの炎症生サイトカインが産生される。

EGF の効果については肌のターンオーバーを促進しア一方で異物が除去され上皮細胞の増殖とともに創傷治癒がンチエイジング効果があると謳われる一方で、悪性腫瘍の完了する段階では EGF が重要な働きをする。この EGF が増殖促進など負の側面があることも懸念されている。本研

上皮の成長を促す以前の免疫応答にどのような影響を与え

究では EGF の効果として肌に影響を与える炎症を抑制するのかについては十分な役割が解明されてこなかった。こる効果があることを示した。さらに、近年問題となっていのような状況の中で我々は以前に EGF が DDX 60 分子のる新型コロナウイルス感染に対する免疫応答にも悪影響をリン酸化を誘導し、それにより炎症生サイトカインの産生示さないことが示唆された。これらは化粧品に EGF を配が抑制され、炎症の抑制につながることを発見した。

合することの効果や効能についての根拠を提示するもので本研究では EGF の DDX 60 分子を介した免疫制御機構について調べたところ、1）EGF はマクロファージの貪食あり、化粧品の安全性や機能についての理解と安心につながると期待される。

を促すが、DDX 60 分子は関与しないこと、2）EGF は内在性レトロエレメントによる DDX 60 依存的な炎症性サイト（引用文献）

カイン産生を抑制すること、3）EGF は過敏反応の抑制に

1） Zhong, Z., Wen, Z. & Darnell, J.E., Jr. Stat3: a STAT

弱 い な が ら 寄 与 す る こ と、 な ど が 明 ら か と な っ た。

family member activated by tyrosine phosphorylation

DDX 60 が制御する TNF-α や IL- 6 などの炎症性サイトカ

in response to epidermal growth factor andインは毛細血管の内皮細胞の透過性を亢進し、炎症を誘導

interleukin-6. Science 264, 95-98（1994）．

することが知られている。これらのことから、EGF はマ

2） Miyashita, M., Oshiumi, H., Matsumoto, M. & Seya,

クロファージの貪食能の亢進による老廃物の除去を促し上T. DDX60, a DEXD/H box helicase, is a novel antiviral

皮の成長を促進する効果があることに加え、赤み、かゆみ、

factor promoting RIG-I-like receptor-mediated

腫れなどの原因となる炎症を抑制する働きがあることが示

signaling. Mol Cell Biol 31, 3802-3819（2011）
．

唆された。

3） Oshiumi, H. et al. DDX6 0 Is Involved in RIG-I-

2020 年に入り SARS-CoV- 2 による COVID- 19 のパン

Dependent and Independent Antiviral Responses, andデミックが世界的な問題となっている。SARS-CoV- 2 はIts Function Is Attenuated by Virus-Induced EGFR

粘膜上皮細胞に感染すると考えられており、上気道と下気Activation. Cell Rep 11, 1193-1207（2015）．

道より感染する。一方で、他の粘膜上皮から感染するウイ

4） Matsuyama, S. et al. Enhanced isolation of SARS-

ルスと同様に目などの粘膜からも感染すると考えられていCoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acadる。そのため、化粧水やパックなどに EGF が含まれてい

Sci USA 117, 7001-7003（2020）．

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