皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響
甲南大学大学院自然科学研究科／統合ニューロバイオロジー研究所

太田茜、高 垣菜式

Animals senses temperature information for acclimation and habituation to dynamically changing environmental temperature conditions. However, their molecular and cellular machinery has not been well known. In this analysis, nematode
Caenorhabditis elegans was utilized to study molecular and cellular machinery of temperature tolerance. Through the analysis, chemical receptor expressing in cuticle was involved in temperature acclimation of the body.

1．緒

せたり、細胞膜の組成を不飽和脂肪酸に置き換えることで言

低温耐性を獲得していると考えられている。このように、温度は生体に影響を与える重要な環境情報であり、体温低温への適応や耐性に関して、最終的な脂質や糖の蓄積にの 1 ℃の変化が生体の状況に大きな影響を与える。これまよる不凍化が知られている一方で、このような不凍化を引でに環境温度に対する生体調節について、主に生化学的なき起こすまでの温度情報の受容や温度情報伝達に関しては、視点から解析が行われてきたが、その分子機構については、未知の点が多く残されている。その理由として、膨大な細未知の点が多く残されている。そのような背景において、胞によって構成される生物種では、それらの細胞からなる従来の神経系に加えて表皮や皮下組織における温度の受容細胞間ネットワークと温度適応との相関性を解明するためやその制御が、個体の温度に対する適応や耐性に重要であのタイムスケールが大きくなるためである。そのような背る可能性が考えられている。そこで、本研究では、全細胞景をふまえて、本研究においては、シンプルなモデル動物

数が約 1000 個と非常に少ない線虫 Caenorhabditis elegans

C. elegans を利用して、温度適応を司る新規分子の同定をを解析系として、表皮で発現している受容体が個体の温度目指した。

耐性に関わるかどうかを、分子遺伝学的に検証した。特に、

C. elegans は土壌自活性の体長が約 1 mm の非寄生性のヒトにおいて神経系や表皮で発現している機械刺激受容体線虫であり、その体は 959 個の体細胞で構成されている。

が実際に温度を受容して、個体の温度耐性を制御している

ゲノム DNA は、モデル動物の中でも小さく、約 100 Mbかを調べ、その変異体における体内の脂肪酸比率を測定しである。C. elegans の全遺伝子の約 36 % は、ヒトにも相同たため、その現状を記載する。

遺伝子が存在し、ヒトと対応付けした解析が行われている。

我々ヒトを含む動物が生息している地球上では、その地

C. elegans のライフサイクルは 25 ℃で約 2 . 5 日、15 ℃で域や昼夜によって劇的に温度が変化する。例えば、砂漠地

約 7 日とモデル動物の中では短く、精子と卵を一個体中に区では日中の温度差が約 50 ℃を超えることもあり、一年持つ雌雄同体であるため、系統維持が非常に容易であり、の最低と最高の気温差を見ると日本でも約 40 ℃近い温度

約 0 . 1 % の頻度で雄が出現するため、それを利用した交配の変化幅の中で生活をしている。このような生物の機構とを行うことで遺伝学を用いることができる。

して、高温適応や低温適応が存在する。そのなかでも低温

C. elegans の温度に対する応答としては、温度走性や高適応については、植物から動物まで幅広く研究が行われて温耐性が 40 年以上前から解析されているが 1）、近年、低いる。生物が示す低温への適応としては、普段生息してい温耐性や低温馴化と呼ばれる現象が報告され、その分子組る温度よりも低い温度で生息すると、より低温にさらされ織機構が少しずつ見つかってきている 2）。例えば、25 ℃でてもダメージが少ない現象である。このような現象は、植飼育した個体は 2 ℃に置かれると死滅してしまうのに対し物や昆虫でも観察され、それらにおいては、細胞内において、15 ℃で飼育した個体は 2 ℃でも生存することができるて凍結しにくいトレハロースなどの糖やアミノ酸を集積さ（図 1）3）。さらに、25 ℃で飼育された個体をわずか 3 時間から 5 時間だけ 15 ℃に置くことで、2 ℃に置かれた際に生＊Effects of skin- expressed chemical
receptors on body temperat u reacclimation＊

Akane Ohta, Natsune Takagaki

Graduate school of Natural Science /Institute for Integrative Neurobiology,
Konan University

存できるようになる 2 , 4）。この現象は低温馴化と呼ばれている。低温耐性と低温馴化の分子機構が最近、少しずつ見つかってきている。低温耐性において、環境温度は頭部に存在する ASJ と ADL と呼ばれる 2 対の感覚ニューロンで受容され、ASJ からインスリンやステロイドホルモンが分泌され、それらが腸の受容体で受け取られる（図 2）2 , 5）。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図1

C. elegansの低温耐性

15℃で飼育したC. elegansは2℃で48時間の低温にも耐えられるが、25℃で飼育したC. elegansは低温に耐えられず、死滅する。
25℃飼育個体を3時間以上15℃に静置することで、2℃で48時間の低温でも生存できるようになる。

図2

既知の低温耐性の分子組織ネットワーク

頭部に存在するASJ感覚ニューロンが温度を受容すると、ASJからインスリンが分泌され、腸や神経系がインスリンを受容し、低温耐性が制御されている。

腸においてインスリン受容体情報伝達を介して、フォーク利用して、温度受容に関わる新規の分子の同定を目指した。

ヘッド型の転写因子である DAF- 16 が遺伝子発現を誘導

その中で、皮下組織で発現している GPCR 型の受容体が温し、体内の脂質合成系の遺伝子などを発現する（図 2）2）。

度適応に関与していることが見つかった、また、ヒトの機また、腸からステロイドホルモンが分泌され、それが精子械刺激の受容に関わる DEG/ENaC 型のメカノ受容体が温に働きかけ、さらに、精子が頭部の ASJ 温度受容ニュー度に応答することが見つかり、そのホモログを欠損したシロンをフィードバック制御する 6）。低温馴化に関しては、ンプルなモデル動物 C. elegans では、低温耐性の異常が観ADL 温度受容ニューロンで受容される温度情報が、ADL察され、体内の脂肪酸構成比が変化していることが示唆さと局所神経回路を構築している酸素受容ニューロンからのれたため報告する 9）。

酸素濃度の情報と統合され、環境の酸素濃度依存的な低温２．実馴化の制御が行われる 7）。ADL における温度情報伝達には TRP チャネルと KQT 型カリウムチャネルが関与してい験

低温耐性テストる。これらの ASJとADL 温度受容ニューロンを介した温度15 ℃で飼育された C. elegans の 2 〜 4 個体を新しい培地

情報伝達は、低温耐性や馴化を負に制御する経路である 8）、に乗せ（P 0）、解析目的となる飼育温度で一晩飼育し産卵

一方で、低温耐性を正に制御する分子経路はほとんど未知させる。その後に P 0 個体を取り除き、卵（F 1）を各飼育温であった。本研究では、C. elegans の低温耐性の実験系を度で飼育する。F 1 が成虫に成長した後に、飼育培地を氷− 82 −

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上に 20 分間置き、タッパーに入れ、2 ℃のメディカルキャビネットで 48 時間静置し、低温刺激温度を与える。その後、キャビネットからタッパーを取り出し、15 ℃で一晩置き、生存率を顕微鏡下で測定する 3）。1 回の解析につき、3 枚の飼育培地を用意し、1 系統につき少なくとも 9 枚分の解析を行った。

in vivo カルシウムイメージング
2 %（v/w）アガロースパッドに線虫系統を 1 〜数匹置き、医療用接着剤で固定し、M 9 バッファーに浸して丸型カバーガラスをかぶせた。サンプルを倒立顕微鏡に装備されている ITO ガラスプレートタイプの温度制御装置の上に置いた。W-Viewoptical system を用いて蛍光を観察し、蛍光画像は EM-CCD カメラで撮影した。画像の蛍光強度はMetaMorph により解析した。細胞内のカルシウム濃度の相 対 変 化 は イ エ ロ ー カ メ レ オ ン（yelow cameleon 3.60（YC3.60））のacceptor/donor（YFP/CFP）もしくはGCaMP 8

図3xdh- 1変異体の低温耐性成虫期における、xdh-1変異体の低温耐性解析（アッセイ数
エラーバー : SEM。**p < 0 . 01（Tukey-Kramer）。
xdh-1変異体はが低温耐性異常を示した。

9）。と tag-RFP（pKOB 006 gcy - 5 p::tag -RFP 10））の acceptor/donor（GFP/RFP）蛍光の比で計算した。温度変化刺激は、温度制御装置を用いて与え、約 5 分間ニューロンの細胞体2+わずか 2 対の介在ニューロンにおいて XDH- 1 が低温耐性

内の Ca 濃度の変化を測定した。

３．結

特異的な回復実験を行った結果、AIN と AVJ と呼ばれるを制御していることが見つかった。AIN と AVJ は介在ニ果ューロンであるため、それらが温度を受容している可能性

1 皮膚で発現する化学物質受容体分子が低温耐性に関与もあるが、一般的にはそれらの介在ニューロンの上流に温低温耐性に関わる新規の分子を同定するために、温度受た。そこで、AIN と AVJ 介在ニューロンの上流に位置す

容ニューロンと味覚ニューロンを用いた 1 細胞トランスクる感覚ニューロンを神経回路データベースから調べたとこリプトーム解析を行った。その結果、温度受容ニューロン

ろ、ASG 感覚ニューロンなどのメカノレセプターが発現でのみ強く発現している化学受容体様分子の遺伝子が見つしている感覚ニューロンが複数存在していた。そこで、メかってきた。その遺伝子の発現を GFP などを用いて解析カノレセプターに焦点を当て、メカノレセプターの変異体したところ、上皮細胞において発現が観察された。さらに、を 用 い て 低 温 耐 性 の 異 常 の 有 無 を 調 べ た と こ ろ、ノックアウト変異体を作成して、その低温耐性を調べたとDegenerin/Epithelial Sodium Channel（DEG/ENaC）タイ

ころ、低温耐性の低下が観察された。この結果から、上皮プのメカノレセプター DEG- 1 の変異体において、低温耐細胞で発現している化学受容体様分子が、個体の温度適応性の低下異常が見られた。DEG- 1 は AIN 介在ニューロン関与している可能性が考えられた。の上流に位置する ASG 感覚ニューロンで発現しているた度を感知する感覚ニューロンが存在する可能性が考えられ

め、Ca 2 + イメージング法を用いて ASG の温度に対する応2 接触刺激を受容する受容体が低温耐性に関与答性を測定した 11 , 12）。野生株の ASG は温度に対して大き低温耐性を正に制御する分子はこれまでにほとんど同定な応答を示した。それに対して、deg -1 変異体ではその反されていなかったため、順遺伝学的解析から低温耐性が低応が低下していた。以上の結果から、DEG- 1 は温度受容下している変異体を単離した。その変異体の原因遺伝子を情報伝達に関与していることが示唆された。実際に、次世代 DNA シークエンサーなどを駆使して同定した結果、DEG- 1 が温度を受容するのかを調べるために温度を受容低温耐性を制御する新規遺伝子 xdh- 1 を同定した。このしない細胞に DEG- 1 を発現させて、温度に応答するよう遺伝子の産物は、ヒトのプリン体代謝経路において、ヒポになるかをカルシウムイメージング法で測定したところ、キサンチンからキサンチン、キサンチンから尿酸への酸化温度に応答するようになった。そこで、DEG- 1 の温度感を触媒する酵素であるキサンチンデヒドロゲナーゼ

受性を直接的に調べるために、Xenopus oocyte に DEG- 1（XDH）のホモログであった。xdh- 1 変異体において、特を発現させて、電気生理解析を行ったところ、温度に対す定の細胞のみで野生型の xdh- 1 遺伝子を発現させる細胞る反応が見られた。さらに、ヒトの DEG/ENaC タイプの− 83 −

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図4

成虫期の野生株と成虫期のxdh- 1変異体の脂肪酸組成比率測定

左図は、成虫期の野生型および成虫期のxdh-1変異体の個々の脂肪酸種の比率を示す。右図は、飽和脂肪酸（SFA）、モノ不飽和脂肪酸（MUFA）、およびポリ不飽和脂肪酸（PUFA）。左右の図共に、各アッセイでN= 3。エラーバーはSEMを示す。 文献9）より引用一部改変。

メカノレセプターである MDEG を Xenopus oocytes に発によるかについては、今後の細胞特異的な回復実験などで現させ、温度変化を与えたところ、温度に対する反応が見明らかになると考えられる。さらに、順遺伝学的解析からられた。つまり DEG- 1 だけでなく、ヒトの DEG/ENaC

得られたヒトの触角刺激受容に関わるメカノ受容体のホモタイプのメカノレセプターである MDEG も機械刺激だけログが低温耐性に関与しており、ヒトの MDEG も温度受9）容に関わっていた。これはヒトを含む動物でメカノレセプではなく温度も受容していることがわかった 。

ター DEG/ENaC が個体の温度耐性を制御している初めて

3 低温適応時の脂質構成率の変化ケースである 9）。今後は、これらの分子が関わる温度受容DEG/ENaC タイプのメカノレセプター DEG- 1 の変異についての生理学的解析がより必要になると考えられる。

体において、体内の脂肪酸構成率の変化が起きているかをMS 解析などで調べた。多くの生物において、体を構成す（引用文献）

る飽和および不飽和脂肪酸の比率は環境温度によって変化

1） A. Ohta, A. Kuhara, Molecular mechanism forするため、野生株と deg- 1 変異体の脂肪酸の脂質割合をtrimeric G protein-coupled thermosensation and測定した。その結果、SFA（飽和脂肪酸）、MUFA（単不飽synaptic regulation in the temperature response circuit和脂肪酸）そして PUFA（多価不飽和脂肪酸）のいずれにおof Caenorhabditis elegans. Neuroscience research 7 6,いても野生株と deg- 1 変異体において差が存在した。さ119-124（2013）．

らに、個々の脂肪酸種に関しもそれらの構成比率を比較し

2） A. Ohta, T. Ujisawa, S. Sonoda, A. Kuhara, Light andたところ、deg- 1 変異体においても 20 : 4 n- 3 の増加が存

pheromone-sensing neurons regulates cold habituation

9）

在した 。つまり、DEG- 1 の異常により、体内の膜脂質

through insulin signalling in Caenorhabditis elegans.
Nature communications 5, 4412（2014）．の構成が変化し、低温耐性に影響を与えている可能性が考

3） T. Ujisawa, A. Ohta, O. M., S. S., A. Kuhara, Cold

えられる。

４．考tolerance assay for studying cultivation-temperature-察

dependent cold habituation in C. elegans. Protocol
Exchange,（2014）．

温度シフトにおいての GPCR をコードする複数の遺伝子の発現量が変化していた。そのなかでも、皮膚で発現する

4） M. Okahata et al., Natural variations of cold tolerance

GPCR をコードする変異体について低温耐性を測定したとand temperature acclimation in Caenorhabditis elegans.
J Comp Physiol B 186, 985-998（2016）．

ころ、低温耐性や馴化の異常が観察されたことから、この受容体の低温耐性への関与が示唆された。この GPCR 遺伝5） T. Ujisawa et al., Endoribonuclease ENDU-2子は、皮膚に加えて幾つかの神経細胞などでも発現していregulates multiple traits including cold tolerance via

たため、今回見つかった低温耐性の異常がどの細胞の異常

cell autonomous and nonautonomous controls in− 84 −

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elegans. PloS one 11, e0165518（2016）．

Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America,9） N. Takagaki et al., Mechanoreceptor-mediated（2018）．

circuit regulates cold tolerance in Caenorhabditis

6） S. Sonoda, A. Ohta, A. Maruo, T. Ujisawa, A. Kuhara,elegans. bioRxiv 5,（2019）．

Sperm Affects Head Sensory Neuron in Temperature10）K. Kobayashi et al., Single-Cell Memory Regulates aTolerance of Caenorhabditis elegans. Cell reports 1 6,

Neural Circuit for Sensory Behavior. Cell Rep 1 4,56-65（2016）．

11-21（2016）．

7） M. Okahata, A. D. Wei, A. Ohta, A. Kuhara, Cold11）A. Kuhara, N. Ohnishi, T. Shimowada, I. Mori, Neuralacclimation via the KQT-2 potassium channel iscoding in a single sensory neuron controlling opposite

modulated by oxygen in Caenorhabditis elegans. Sci

seeking behaviours in Caenorhabditis elegans. NatAdv 5, eaav3631（2019）．

Commun 2, 355（2011）．

8） T. Ujisawa, A. Ohta, M. Uda-Yagi, A. Kuhara,

12）T. Ujisawa, A. Ohta, A. Kuhara, Long-term calcium

Diverse Regulation of Temperature Sensation byimaging of ASJ sensoryneuron controlling cold

Trimeric G-Protein Signaling in Caenorhabditis

tolerance in C. elegans. Protocol Exchange,（2014）．

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