真皮幹細胞を利用した皮膚の若返り治療

京都大学大学院医学研究科形成外科

内 藤素 子Intrinsic aging and photodamage of the face result in dull and lax skin with clear and deep wrinkles at rest.
The “aged face” is characterized by poorly organized dermal extracellular matrix, including collagens and elasticfibers. Many young peoples also have skin troubles, such as acne scar. Although ablative and nonablative therapies
of skin resurfacing and rejuvenation are performed against these skin damages, these methods do not achievecomplete remission. Recently, dermal multipotent cells (DMCs) were isolated from the mammalian dermis. Thesecells are able to differentiate into many cell types including osteocytes, chondrocytes, adipocytes and neuros, andare thus suggested to play important roles in wound healing process as an origin of reproduced dermal tissues.
This research project aims to determine whether DMCs have a potency to contribute to skin resurfacing andrejuvenation by differentiating into dermal fibroblastic cells that synthesize de novo matrix. As a first step of theproject, we determine the most effective method to obtain DMCs from adult aged human dermis and chek theirproliferation and abilities to produce matrix proteins. Next, we examine whether DMCs grafted with keratinocytes
can differentiate into dermal fibroblast at skin wound in nude-mice and stimulate wound healing process byreproduction of extracellular matrix. These experiments will contribute to the establishment of new complete
therapy of damaged skin.

1.

緒

膚より採取した線維芽細胞を皮膚のたるみやしわの部分、

言

にきび痕陥凹部に注入することが一部の施設で行われてい近年、皮膚の老化に伴うたるみやしわをとり、皮膚を若る。しかし、たとえ注入細胞が生着しても、時間とともに返らせる、という治療は国民の関心を集めている。また、その数は減り、またマトリックスの産生も減少してしまう

ニキビ痕などの顔面皮膚表面の凹凸に対する種々のレーザことが予想される。申請者らが形成外科診療において行う

ー照射による治療も改良が重ねられ、注目を集めている。 「真皮移植」術においてさえ、移植片は時間の経過とともしわ、たるみに対するコラーゲンやヒアルロン酸の注入、に吸収されてしまう。このことは、「真皮移植」という極神経毒素の注入などの局所注入療法や、ピーリング、レーめて新鮮な状態で、自己の真皮線維芽細胞と細胞外マトリザー療法、Face-Lifting 手術などが行われている。これら

ックスを移植しても、それのみでは術直後の状態を維持すの治療を行う施設は、ここ数年急激に増加しており、女性ることが困難なことを意味する。そこで我々は、移植され誌を開けば、必ずといってよいほどこのような治療に関すた場所で、自己複製し、マトリックスを産生し続ける能力る広告が掲載されており、女性の関心をいかに集めているのある細胞を用いることが肝要であると考え、その候補とかがわかる。しかし、いずれも、効果の程度や持続期間がして真皮幹細胞は最適であると予想した。

必ずしも一定ではなく、持続的効果を期待するためには、真皮幹細胞は、2001 年に Toma１）

らによって初めて報

定期的に処置を受けることが必要である場合が多い。ピー

告されて（Toma. et al., Nat. Cell. Biol. 3: 778-784, 2001）

リングは、しわやたるみ、瘢痕による凹凸をとる、という

以降、数報の発表

ことに関して少ない施術回数で確実な効果を期待するのは化させ、神経系の細胞を誘導して臨床治療に役立てる方向難しい。手術療法は、侵襲が大きく、術後の管理も必要とで研究がなされている。我々は、この真皮幹細胞を皮膚のなり、患者の負担も大きい。最近、自己血液より採取した若返り、あるいは皮膚再生に用いるとことを目的に、研究血小板分画を濃縮し、注入することにより、皮膚の若返りを開始した。

２）, ３）, ４）を図る試みがなされているが、効果の確実性や持続性など

2.

が一定しない点があり、個体差もある。あるいは、自己皮がある。マウス真皮幹細胞を分実

験

2・1 成人ヒト皮膚由来真皮幹細胞の効率的採取方法の検討：

Skin rejuvenation and resurfacing withdermal multipotent cells
Motoko Naitoh
Department of Plastic and Reconstructive
Surgery, Graduate School of Medicine,
Kyoto University

成人ヒト真皮幹細胞は数が少なく、従来の sphere 法
では効率的に採取することが困難である。Joannides ら

４）（Lancet, 364, 172-178, 2004）の報告をもとに、さらに効率よく真皮幹細胞を採取、培養する方法について検討し、得られた細胞の性質も解析した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

2・2 真皮幹細胞が創傷治癒、真皮性状、瘢痕化に与える影響の調査：
真皮幹細胞を血清入り培地にて増殖させて得た細胞多いことが判明した（図２）。

3・2（SDM cell とよぶ）が、創傷治癒、瘢痕化にどのような影

ヌードマウス背部に作製した直径１㎝ の皮膚全層欠損響を与えるかを調べた。ヌードマウス背部に直径１㎝の皮層に、各細胞を移植して６日目で移植部を含むマウス背部

膚全層欠損層を作製し、同部に SDM cell を表皮角化細胞皮膚を採取した。図 3-B に示すように線維芽細胞を移植しとともに移植して経過を観察した。比較対象として、成人た創は、上皮化していない範囲が広いのに対して、SDMヒト皮膚由来線維芽細胞と表皮角化細胞を移植した。創がcell を移植したほう（図 3-A）は、すでに上皮化が完了し縮むことにより治癒する影響を防ぐため、創周囲にシリコている。皮膚質感も周囲皮膚とかわらずしなやかで拘縮はンリングをおき、６- ０ナイロン糸で筋層まで糸を通して認められない。SDM cell は表皮角化細胞によるすみやか縫合固定した。

な上皮化を促し、瘢痕化を伴わない真皮再生に影響を与え3.

る可能性が示唆された。さらに、長期経過観察を行い、7結果および考察

ヵ月後の組織所見を比較したところ、SDM cell 移植部位

3・1

はでは、真皮内には周囲マウス真皮層よりも太く密なコラ

ヒト成人皮膚を細切後、デイスパーゼ処理により表皮をーゲン線維束が観察され、十分な厚さの真皮様組織が形成除去した後、得られた真皮を２㎜角程度に細切し、コラゲされていた（図 3-C）。一方、線維芽細胞移植部（図 3-D）

ナーゼ処理、ストレナーを通して、non-coated dish に播ではコラーゲン線維も細く、成熟瘢痕様組織であり、厚み種した。培養液は、Toma らの方法に順じ、DMEM/F12（1:1）

も SDM cell 移植部と比較して半分以下であった。以上のに B27、bFGF、EGF を含有した培地を用いた。約１週ことから、ヒト真皮由来幹細胞は良好な増殖能とマトリッ間後に、図 1-A に示すごとく真皮幹細胞＝ sphere が形成

クス産生能を持ち、皮膚再生や皮膚若返りに有用である可されてくる。この sphere を取り出し、細胞培養用 coated能性が示唆された。

dish に入れ、血清添加間葉系細胞用培地で培養すると、約２〜３日で sphere は dish 底面にはり付き、そこから細（参考文献）胞が増殖し始める（図 1-B）
。これを我々は SDM cell と呼１）Toma JG, Akhavan M, Fernades KJL, et al,: Isolation

んでいる。sphere と異なり、SDM cell は容易に継代が可of multipotent adult stem cells from the dermis of能である。Joannides ら

mammalian skin. Nat. Cell. Biol., 3, 778-784, 2001.

４）の報告では添加血清は 20％となっているが、我々の系では 10％で十分であると考える。

２）K a w a z o e Y , Y a n a g i Y , T a k a t o T , e t a l , :また、培地中に試薬 A を添加した場合は、少なくとも 14

Characterization of multipotent adult stem cells

週間までは増殖率が衰えることなく継代が可能である。次from the skin: transforming growth factor-β (TGF-β)に、この培養液から、血清をふくまない sphere 用培地へ

facilitates cell growth. Exp. Cell. Res., 295, 194-203, 2004

交換すると、dish 底面にはり付いていた細胞は浮遊し始め、

３）Fernandes KJL, McKenie IA, Mill P, et al,: A dermal

１週間程度でもとの球状の sphere に戻り（図 1-C）
、分化

niche for multipotent adult skin-derived precursor

能でも可塑性を示す。また、SDM cell のマトリックス産cells. Nat. Cell. Biol., 6, 1082-1093, 2004.

生能をみるため、マイクロアレイにてエラスチン、フィブ４）Joannides A, Gaughwin P, Schwiening C, et al,:

リリン１、I 型コラーゲン、の m ＲＮＡ発現量を同一人物

Efficient generation of neural precursors from adultの同部位から培養した線維芽細胞と比較したところ、それ

human skin: astrocytes promote neurogenesis fromぞれ 2.2 倍、1.35 倍、1.7 倍、SDM cell のほうが産生量がskin-derived stem cells. Lancet, 364, 172-178, 2004.

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真皮幹細胞を利用した皮膚の若返り治療

図１ A. sphere 法を用いて 74 歳女性の皮膚より得られた真皮幹細胞。B. sphere を細胞培養用 coated dish で 10％血清入り培地を用いて培養すると、底面にはりつき増殖する。C. 培地を初代 sphere 用培地に転換すると、はりついていた細胞は浮遊し始めsphere に戻る。Bar=100 ㎛

図２ Elastin, fibrillin-1, コラーゲン α1(1) 遺伝子の発現量の相対値。線維芽細胞における各遺伝子の発現量を１としたときの、SDM cell における発現量を数値化した。n=3

図３ A. ヌードマウス背部に作製した皮膚全層欠損層に SDM cell と表皮角化細胞を移植して６日後の状態。創は上皮化が完了し、質感も周囲皮膚と大差なく良好な状態である。B. 線芽細胞と表皮角化細胞を移植したものでは、まだ上皮化が完了していない。
Bar=5 ㎜ C. SDM cell と表皮角化細胞移植後７ヶ月後、HE 染色像。D. 線維芽細胞と表皮角化移植後７ヶ月の結果 HE 染色像。Bar=C,D, とも 100 ㎛。

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