慢性皮膚炎モデルにおける HDC 遺伝子レポーターマウスを用いたヒスタミン産生細胞の同定
東北大学大学院工学研究科

大津浩

Reducing the rate for contact dermatitis caused by cosmetic materials is crucial in cosmetology. Histamine is one ofthe physiological substances which produce itching sensation in contact dermatitis. We generated histamine-deficient miceby knocking out the gene for histamine producing enzyme, histidine decarboxylase (HDC), to be used for the analysis ofhistamine activity in vivo. The mechanisms of histamine activity in contact dermatitis were analyzed in mouse model which
was produced by the repeated ointment of trinitro-chlorobenzene (TNCB) on their back skin. The inflammation of histidine
decarboxylasae knock out (HDC-KO) mice were milder compared to their wild type counterpart. The number of regulatory
T cells (Tregs) in the dermis was found to be reduced by the existence of histamine. This control mechanism appeared to betransmitted by TGF-β 1 for its positive effect on the number of Tregs. The action of histamine is known to be transmitted
through 4 types of histamine receptors (H 1 to H 4 ). H 1 and H 4 receptors among these receptors were pharmacologicallyfound to transmit the signal of inflammation in this contact dermatitis model 1 ). Including these information histamine is a
key substance for producing noxious symptom in dermatological diseases e.g. chronic inflammation, would healing andcontact dermatitis. The regulatory mechanisms of histamine synthesis, however, in their pathological contexts have notbeen completely clarified because of lack of experimental materials. We lately produced the reporter mice which produce
fluorescent signal according to their expression of histidine decarboxylase gene. Since these gene-manipulated mice emit
fluorescent signal when they are active in transcription of histamine-synthesizing gene, we could analyze the timing andsource of cells for histamine production in disease model through observation of fluorescence using this reporter mice.
Previously we generated plasmid-based reporter mice to this purpose, however, the mice were prove to be useless, since
the emission of fluorescence was not limited to histamine producing cells. We produced lately a BAC (bacterial artificial
chromosome)-based transgenic mice to dodge this problem. We will produce a model of contact dermatitis in the newtransgenic mice and discuss the role of histamine producing cells in contact dermatitis.

1. 緒

膚炎の程度が軽快することを示している 1）。ヒスタミンは言

マウス皮膚において慢性炎症、皮膚創傷治癒、接触性皮膚化粧品学において、皮膚の炎症は化粧品を開発していく上において重要な問題点である。皮膚の炎症を動物レベル炎など多岐に渡り影響を与えることが報告されており、化粧品学的にも重要であることがわかっている。

で解析していくために、私たちは、trinitro-chlorobenzene

ところがヒスタミンの生体内での産生調節機構について（TNCB）などのハプテンを繰り返してマウス背部皮膚に塗は不十分な点が多い。本研究ではヒスタミン産生源を明ら布して慢性の接触皮膚炎を誘導し、表皮肥厚を起こすことかにすべく HDC 遺伝子の発現をモニターするレポーターを観察している。ヒスタミンは炎症において皮膚反応をマウスを作製した。このマウスを使うことによって、産起こす重要な生体内アミンである。ヒスタミンの合成酵

生細胞および産生の調節機構を明らかにしようとしてい素であるヒスチジン脱炭酸酵素（histidine decarboxylase

る。そのために HDC 遺伝子のレポーター遺伝子を工夫し、HDC）をノックアウトさせた HDC-KO マウスを作製して、今回は BAC（Bacterial Artificial Chromosome）を利用し、この接触性皮膚炎モデルを誘導し、野生型マウスと比較す

プロモーター領域に蛍光色素のレポーター遺伝子を繋いだ

ることによって、モデルにおけるヒスタミンの役割につい

HDC 遺伝子全体を含むような DNA でトランスジェニックて検討している。その結果、HDC-KO マウスに接触皮膚マウスを作製し、上述した皮膚疾患モデルを再現する。ヒ

炎を起こすと炎症の度合いが野生型に比較して弱く、ヒススタミンは必須アミノ酸の一種であるヒスチジンから生体タミンが接触皮膚炎を悪化させていることが判明している。

内では唯一の酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素（HDC）を

その後、４種類のヒスタミン受容体（H1-H4 受容体）のうち、介して産生されるため、この遺伝子の発現をモニターする

特に、H1 受容体とともに H4 受容体もこのモデルにおいことによりヒスタミンの産生について考察することが可能て重要であり、H1 受容体阻害薬や H4 受容体阻害薬で皮

である。

2. 実

験

Identification of the histamine-producing cells in chronic
allergic contact dermatitis model using HDC-gene reporter
mice.

マウス皮膚炎モデルでの実験

Hiroshi Ohtsu
School of Engineering, Tohoku University

によって皮膚炎を起こし、HDC - KO マウスと野生型マウ

私たちはマウス皮膚にハプテンを繰り返し塗布すること− 50 −

慢性皮膚炎モデルにおける HDC 遺伝子レポーターマウスを用いたヒスタミン産生細胞の同定

スの反応と比較することにより、皮膚炎におけるヒスタミ
ンの役割について検討している

1-3）

プラスミッドを用意する。そのためには、HDC gene の入った BAC（bacterial artificial chromosome）クローンを購。

以前にはプラスミッドを用いた HDC 遺伝子発現のレポ

入し、HDC 遺伝子の転写開始点より 637 番目の塩基より、ーターマウスを用意したが、このマウスはヒスタミン産

1777 番目の塩基まで PCR を用いて増幅する。増幅され生細胞以外にも非特異的に蛍光発光をするため、その後た DNA を pGEM-T Easy に挿入し、クローン化する。こBAC を用いたトランスジェニックマウスを作製することの TA vector を、multiple cloning site にある２種類の制に予定を変更した。

限酵素配列部位 Sal I と ApaI で消化すると、HDC 遺伝子

計画は、接触皮膚炎モデルをトランスジェニックマウスの PCR 増幅部位を含む断片が切り出される。切り出されで作製し、蛍光色素の強度と部位を病変部位で観察するこた断片を予めクローン化していた HDC 遺伝子のプロモーとである。近年Ｔ細胞、中でも制御性Ｔ細胞の皮膚アレル

ター約 1kb を含む pBlue Script の HDC プロモーターの下4）ギー反応における重要性が明らかになってきており 、ヒ流にある SalI および ApaI site に挿入し、クローン化する

スタミンはアレルギー反応の惹起相ばかりではなく、炎症（plasmid 1 と命名）。GFP（green fluorescence protein）
をの感作相にも重要であることが明らかにされつつある。しmultiple cloning site に含んだ 7.1 IS GFP 3rd Version より、たがって、このアレルギー反応モデルにおいて感作相から

XhoI と XbaI にて double digestion し切り出した GFP 遺伝

惹起相に至る反応全体の中で、ヒスタミンの産生細胞は複子を、pBlue Script の同様の制限酵素部位に挿入し、クロ

数回、複数の種類の細胞に陽性にでることが予想でき、どーン化する。このプラスミッドの XbaI site で再度酵素処の細胞のどの時相にでているかが興味深いと考えられる。

理し、直鎖上にしたプラスミッドを Klenow によって平端

その反応において、細胞特異的な表面マーカーを染色し、化しておく。pBS-FRT-Neo-FRT より KpnI と EcoRV で切FACS にて解析し、蛍光の発光細胞の種類とその数についり出しKpnI siteをT4 DNA polymeraseしてこちらも平端て同定する。

化した Neo 遺伝子断片を、予め平坦化しておいた GFP を

さらに、ヒスタミンの反応経路において、その受容体で含むプラスミッドに blunt end ligation し、GFP の下流にある H1 ～ H4 のうち、どの受容体を経由して皮膚疾患のNew 遺伝子が挿入されたプラスミッドを用意する。この増悪がみられるのかについて、それぞれの受容体のアゴニ

プラスミッドを XhoI と NotI で消化し、Klenow 処理をしストとアンタゴニストをもちいることにより明らかにする。

て、NotI site を平端化しておく。この DNA 断片は GFP のこれによって、どのような薬剤が皮膚のアレルギー反応の下流に Neo 遺伝子が繋がった断片である。plasmid1 を SalI

どの時相に効果があるのかについて推測する。そして、そ

お よ び HincII site で 消 化 し た HDC promoter と HDC 1stの後化粧品を塗布して同様の実験を行なうことにより、化

Intron が入った断片と、GFP ＋ Neo 断片を ligation すると、

粧品によってヒスタミン産生細胞が出現するかどうかにつ

XhoI site と Sal I site がコンカテマーであるために繋がり、いての検討も進める。

HDC promoter と HDC 1st Intron の 間 に GFP と Neo を 含

3. 結む pBlue Script ができ上がる。このプラスミッドを NotI

果

site で切り出すと、HDC promoter と HDC 1st Intron の間

3. a. BAC を用いた HDC 遺伝子トランスジェニック
マウスについてに GFP および Neo を含む断片ができて、その断片と HDCを含む BAC DNA との間で homologous recombination を

トランスジェニックマウスの作製起こさせる。その結果、HDC promoter と 1st Intron の間

ヒスタミン合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素（HDC）に GFP および Neo 遺伝子の入った BAC が完成する。この遺伝子はマウスの Chromosome 2 に存在する全長約 23kb

BAC clone の入った大腸菌を Arabinose 存在下で培養するの遺伝子である。この遺伝子は 12 エクソンからなる遺伝と Neo 遺伝子の両端に存在下 CRE が互いに反応して Neo

子で、エクソン 1 に既に翻訳開始点が存在するため、そ遺伝子のない BAC が完成する。完成した BAC clone の簡の翻訳開始点直前より GFP 遺伝子が入るように工夫した単な構造を示す（Fig. 1）。

Fig. 1 完成した HDC-GFP BAC clone− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

この、BAC クローンを mouse 受精卵に打ち込みその個確認する。その結果、HDC 遺伝子が発現する細胞群（脳：体を発生させることにより、レポーターマウスが完成する。

TMN（結節乳頭核）細胞、胃：ECL 細胞など）で、GFP が発生してきた個体の尾からゲノム DNA を抽出し、PCR 法

染色されていた（Fig. 3：TMN cells 結節乳頭核、ECL エに て 個 体 に GFP gene や Chloramphenicol resistant gene

ンテロクロマフィン様）。
さらにここで、脳視床下部や胃体部における GFP 発の存在の有無を確かめたところ、高率に BAC クローンが現は免疫染色で確認しているが HDC 産生細胞と一致し存在するマウスが発生してきた（Fig. 2）。

ているかどうかについて確認が必要であった。レポータ

3. b. トランスジェニックマウスの確認

ーマウスから摘出した胃における GFP と HDC の免疫染

3. b. 1. 遺伝子の確認

色を遂行した。近接する切片を使って GFP の一次抗体

受精卵への打ち込みにより発生した７個体の内、No（Cell Signaling Technology） と HCD の 一 次 抗 体（Acris

569 と No572 の２個体のマウスに BAC DNA が挿入されAntibody）を反応させ、その後、ペルオキシダーゼを標識ていることが確認された。

した二次抗体と反応させ、DAB 染色キットを用いて二次

3. b. 2. 蛍光の確認

抗体が結合した部位を褐色に発色させた。染色パターンは次に、このレポーターマウスの各臓器の切片を用意して、HDC 産生細胞が蛍光を発するかどうかを蛍光顕微鏡にて

GFP と HDC で一致していることが判明した。また小腸壁での細胞においては、肥満細胞の他に、好酸球や好塩基球

Fig. 2. 初代マウスの遺伝子解析
挿入遺伝子内 GFP gene, Cam r gene の PCR による確認

Fig. 3 GFP の免疫染色− 52 −

慢性皮膚炎モデルにおける HDC 遺伝子レポーターマウスを用いたヒスタミン産生細胞の同定にも蛍光の発光がみられ、現在まで考えられていた以上にである。

多種類の血液細胞にヒスタミンが存在する可能性が出てき

4. 考ている。このため、今後様々な病態モデルを使った実験においても新たなヒスタミン産生細胞を認める可能性が高いと考えている。

察

ヒスタミンはアナフィラキシー様の反応を示す物質として約１世紀前に発見され，研究史が長いものの、最近まで知られているヒスタミン受容体は H1 と H2 の 2 種類のみ

3. c. 皮膚アレルギー実験であった。神経節前線維に H3 受容体が存在することは提私たちは、TNCB を繰り返し塗布する実験系において、唱されていたが、cDNA のクローニングが発表されたのは通常鱗屑をともなう紅斑が起こり、皮膚の生検をすると表1999 年である。更に H4 受容体が末梢白血球から見つか

皮の増殖と細胞間の浮腫および真皮の線維化および細胞浸り cDNA のクローニングの報告は 2000 年である。このよ

潤が起きていることを確認しているが、ヒスタミンを欠く

うにヒスタミンは長い研究史があるものの、近年、分子生

HDC（-/-）マウスではその程度が減弱することを確認して物学の手法がとられるようになってから新しい機能が次々いる（Fig. 4、参考論文より改変）。トルイジンブルーで染と発見されている。皮膚の炎症において、ヒスタミンはそ色すると、肥満細胞数が減少しており、また、IL-4 の皮膚の進展に重要な影響を与え、発赤、腫脹、痒みなどを促す

内での濃度も優位に抑制されていた。

起炎物質である。私たちはヒスタミン合成酵素であるヒス

また、組織中の制御性 T 細胞の数も CTLA-4 や Foxp3

チジン脱炭酸酵素遺伝子をクローンニングし、ノックアウに対する免疫染色で染色することによって計測すると、トマウスを作製することによって、ヒスタミンを合成不能

HDC（-/-）マウスに優位に増加していることが明らかとななマウスを得て実験を行ない、血管新生、肉芽種の形成にった。次に TGF- ㌼ 1 のレベルを、制御性Ｔ細胞の遊走にはヒスタミンの存在が重要であることと、その反応は H2およぼすサイトカインの代表として測定した。その結果、受容体を介することを明らかにした 5）。従来までは皮膚炎

HDC（-/-）マウスでは TGF- ㌼ 1 の組織内での濃度はノック

は H1 受容体を介すると考えられていたが H4 受容体も重アウトマウスでは増えており、TGF- ㌼ 1 が制御性Ｔ細胞の要であることが報告された 1，6）。このように皮膚炎には３遊走を促している可能性が出てきた。TGF- ㌼ 1 の直接的な種類のヒスタミン受容体すなわち H1、H2 および H4 受容

影響について調べるために、毎日の TNCB の塗布の直前に、体が重要であることがわかる。従って、皮膚炎におけるヒ

TGF- ㌼ 1 やその抗体を直接マウスの背部真皮に注射して制スタミンの作用は単純ではなく、今後、新しいトランスジ

御性 T 細胞の数を測定してみた。その結果は、TGF- ㌼ 1 をェニックマウスを使った実験をすることにより、ヒスタミ

注射することにより制御性 T 細胞の指標となる Foxp3 陽ンの接触性皮膚炎における役割は、より詳細な解析が行な性細胞や CTLA-4 陽性細胞が増え、逆に、高 TGF- ㌼ 1 抗体える。

を注射することによりこれらの陽性細胞数が減弱した。ま皮膚アレルギーの実験系において、ハプテンを繰り返した BALB/c を用いた実験では、H1 受容体拮抗剤であるオ

塗布することによって、皮膚疾患を慢性化させて、CACD

ロパタジン、H4 受容体拮抗剤である JNJ7777120 の作用で、 （chronic allergic contact dermatitis）のモデルとなる 7）。
ともに TGF- ㌼ 1 や Foxp3 陽性細胞が上昇していることが制御性 T 細胞は免疫の恒常性維持や自己免疫反応の予防に分かった（Fig. 4）。

必要であるとともに、エフェクターＴ細胞を抑えて接触皮これらの基礎的な実験を踏まえて来年度はトランスジェ

膚炎を改善させることが証明されている 8）。ところが、制ニックマウスを用いた皮膚アレルギー実験を試行する予定

御性Ｔ細胞はCACDにおける働きがよくわかってはいない。

Fig. 4 HDC-KO マウスの慢性接触皮膚炎におけるサイトカインや制御性Ｔ細胞数の増強作用（引用文献 11 より改編）− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

今回の実験によって、ヒスタミンは制御性Ｔ細胞の皮膚組織への遊走をおそらく TGF - ㌼ 1 を介してコントロール

皮膚アレルギーモデルを作製し、ヒスタミンの産生源となる細胞の同定を行なっていく予定である。

することが分かった。制御性Ｔ細胞における Foxp3 は炎症の制御に重要であることはこの遺伝子の機能を無くさせ（引用文献）

る変異をいれたマウスでは多臓器における炎症反応が起き

1） Seike M, Furuya K, Ohmura M, Watanabe K andることが示されているからである 9）。制御性Ｔ細胞を動物

Ohtsu H. Histamine H4 receptor antagonist amelioratesに外部から加えると接触性皮膚炎におけるマスト細胞の遊chronic allergic contact dermatitis induced by repeated

走や活性を抑え、炎症性サイトカインの産生を抑制するこ

challenge. Allergy 65, 319-326, 2010.

10）。このことは、CACD でもどうよう

2） Seike M, Ikeda M, Kodama H, Terui T and Ohtsuに考えられ、わたしたちの今回の報告でもマスト細胞の遊H. Inhibition of scratching behavior caused by contactとが知られている

走や IL-4 のレベルが抑えられていた

11）

dermatitis in histidine-decarboxylase gene knockout。制御性 T 細胞のmice. Exp Dermatol 14, 169-75, 2005.

抑制効果は CTLA - 4 を経由している可能性があることがCTLA- 4 への抗体を使った実験で示されている 12）。気管

3） Hamada R, Seike M, Kamijima R, Ikeda M, Kodama

支喘息のモデルにおいて、制御性 T 細胞は IL-10 の産生をH and Ohtsu H. Neuronal conditions of spinal cord

介して Th2 細胞主体のアレルギー反応を抑えることが報

in dermatitis are improved by olopatadine. Eur J

告されているが

13）

Pharmacol 547, 45-51, 2006.

、私たちも HDC（-/-）マウスでは IL-10が組織で上昇してきたことを考えると、もし同様の機構

4） Gomez de Agüero M, Vocanson M, Hacini-Rachinelが起きているとすると CACD の皮膚肥厚反応の抑制がF, Taillardet M, Sparwasser T, Kissenpfennig A,

IL-10 を介して起きている可能性があると考えている。まMalissen B, Kaiserlian D, Dubois B. Langerhans cells

た、TGF - ㌼ 1 が制御性 T 細胞を誘導してくる際に IL-2 がprotect from allergic contact dermatitis in mice by、TGF- ㌼ 1 を加えたマ

tolerizing CD8(+) T cells and activating Foxp3(+)

必要であることが示されており

14）

ウスが IL - 2 が上昇してきた結果を鑑みるに、これらのサ

regulatory T cells. J Clin Invest 122, 1700-11, 2012.

イトカインが相乗的に制御性Ｔ細胞を増やし、それによっ

5） Ghosh AK, Hirasawa N, Ohtsu H, Watanabe T andて CACD においてはエフェクターＴ細胞をコンロトール

Ohuchi K: Defective angiogenesis in the inflammation

する機構も考えられる。

granulation tissue in histidine decarboxylase-deficient
mice but not mast cell-deficient mice. J Exp Med 195,

本研究の中心課題は遺伝子改変マウスを用いたヒスタミ

973-982, 2002

ンの接触皮膚炎に与える影響の研究である。これは化粧品
を皮膚に塗布した際に起こりがちな接触皮膚炎をコントロ

6） Dunford PJ, Williams KN, Desai PJ, Karlsson L,ールするために重要な情報を提供する。私たちが作製した

McQueen D and Thurmond RL. Histamine H4 receptor

新しいトランスジェニックマウスはヒスタミン合成が転写

antagonists are superior to traditional antihistamines

レベルで活性化したときに蛍光を発するためこのマウスでin the attenuation of experimental pruritus. J Allergy

接触皮膚炎を起こし、蛍光顕微鏡を用いて観察すれば１）

Clin Immunol 119, 176-83, 2007.

ヒスタミン合成細胞、２）ヒスタミン合成の時期がわかる。

7） Wang G, Savinko T, Wolff H, Dieu-Nosjean MC,

最近の研究によると従来知られているマスト細胞、マクロKemeny L, Homey B, Lauerma AI and Alenius H.

ファージ、神経細胞に加え、好中球、好塩基球もヒスタミ

Repeated epicutaneous exposures to ovalbumin

ンを産生し、皮膚ケラチノサイト、樹状細胞からの産生報

progressively induce atopic dermatitis-like skin lesions
in mice. Clin Exp Allergy. 37, 151-61, 2007

告もある。化粧品によっては、ヒスタミン合成促進あるいは合成抑制に働く可能性があり、基本的に合成抑制の基材

8） Tomura M, Honda T, Tanizaki H, Otsuka A,

を使うように開発を進めるための動物モデルの指標になる。

Egawa G, Tokura Y, Waldmann H, Hori S, Cyster JG,

以上のように、本研究課題の成果は医学的基礎知識を拡充

Watanabe T, Miyachi Y, Kanagawa O and Kabashima

させるとともに、コスメトロジーにおける基材の選択に役

K. Activated regulatory T cells are the major T cell

立たせる上でも重要な情報を提供すると考えている。

type emigrating from the skin during a cutaneous

5. 総

immune response in mice. J Clin Invest. 1 2 0, 8 8 3-9 3,

括

2010

本報告ではトランスジェニックマウスの作製とその評価

9） Lin W, Truong N, Grossman WJ, Haribhai D,

および現在までの皮膚アレルギー実験の結果をまとめた。

Williams CB, Wang J, Martín MG and Chatila TA.

今後、実際用意したトランスジェニックマウスを用いて、Allergic dysregulation and hyperimmunoglobulinemia− 54 −

慢性皮膚炎モデルにおける HDC 遺伝子レポーターマウスを用いたヒスタミン産生細胞の同定

E in Foxp3 mutant mice. J Allergy Clin Immunol. 116,

12）Thornton AM, Piccirillo CA, Shevach EM. Activation
requirements for the induction of CD4+CD2 5+ T cell1106-15, 2005.
10）Su W, Fan H, Chen M, Wang J, Brand D, He X,

suppressor function. Eur J Immunol. 34, 366-76, 2004.

Quesniaux V, Ryffel B, Zhu L, Liang D and Zheng

13）Kearley J, Barker JE, Robinson DS and Lloyd CM.

SG. Induced CD4+ forkhead box protein-positive T

Resolution of airway inflammation and hyperreactivity

cells inhibit mast cell function and established contact

after in vivo transfer of CD4+CD2 5+ regulatory T

hypersensitivity through TGF- ㌼ 1. J Allergy Clincells is interleukin 10 dependent. J Exp Med. 202, 1539-

Immunol. 130, 444-52, 2012

47, 2005.

11）Tamaka K, Seike M, Hagiwara T, Sato A and Ohtsu

14）Davidson TS, DiPaolo RJ, Andersson J and Shevach

H. Histamine suppresses regulatory T cells mediated

EM. Cutting Edge: IL-2 is essential for TGF-beta-

by TGF-㌼ in murine chronic allergic contact dermatitis.

mediated induction of Foxp3+ T regulatory cells. J

Exp Dermatol. 24, 280-4, 2015.

Immunol. 178, 4022-6, 2007.
（財団事務局追記）
著者は本助成研究の期中に所属異動となり、採択課題の継続が困難になったため、中間時の報告を研究完了報告として掲載します。

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