トランス脂肪酸による細胞内オルガネラおよびストレス感受性に及ぼす影響の解析

井沢

京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科緒真吾准教授

pH6.8) に懸濁し、H2O2、熱ショック (42˚C)、冷凍解凍

言トランス脂肪酸の過剰摂取は心疾患リスクの上昇や認ストレス ( − 30˚C で冷凍保存後、室温で解凍 )、エタノー

知機能の低下をもたらすといわれ、2003 年以降、食品

ル、浸透圧ストレスで処理した。経時的にサンプリング中のトランス脂肪酸レベル明記の義務化や使用の規制がを行い、YPD plate (2% glucose, 2% peptone, 1% yeast各国で行われるようになった。トランス脂肪酸の過剰摂extract, 2% agar) に塗布し死滅率を計測した 。

取による生体への影響は、疫学調査や実験動物の病理学

DNA マイクロアレイ解析2)的解析によるデータを中心に議論されてきたが、分子レオレイン酸およびエライジン酸培地で培養した酵母細ベル・細胞レベルでの解析データは非常に乏しいのが現胞より、それぞれトータル RNA を抽出し、マイクロア状であり、トランス脂肪酸の摂取に対する細胞の応答機

レイ解析 (3D-Gene Yeast Oligo Chip 6K, Toray Industies

構等はほとんど未解明のままである。

Inc., Tokyo Japan) により転写レベルの比較を行った。

そこで、本研究ではトランス脂肪酸の摂取および代謝オルガネラ形態解析

時における細胞内の応答機構について、オルガネラの機

オ ル ガ ネ ラ 形 態 は GFP-fusion タ ン パ ク 質 を 発現さ能・形態やストレスへの感受性等を中心に解析を行い、せ、蛍光顕微鏡 (Leica, AF6500 system) によって観察・分子レベルで新しい情報の収集に取り組んだ。研究には解析した。ペルオキシソームにおける 3-oxoacyl CoA

真核細胞の優れたモデル系であり、食品製造業においてthiolase である Pot1p の GFP-fusion プラスミドは、プも重要である出芽酵母を利用した。出芽酵母は、発酵食

ライマーセット品の製造や酒類醸造等に広く利用され、安全性も高いこ5’-TCTCTAACTCTAGACCGACCAACTGCAAGCCAGCGGCA-3’ ととが証明されている点に加え、分子生物学・生化学・細5’-AAGTATTCTCGAGATTCTTTAATAAAGATGGCGGCGGC-3’

胞生物学・遺伝学的な解析が容易であり、効率的な研究により増幅した POT1 遺伝子を染色体組み込み型ベクの遂行が可能である。また、脂肪酸のみを炭素源として

ター pAUR-GFP の XbaI/XhoI サイトに挿入して構築し、生育することができることから、トランス脂肪酸の生体

BsiWI による線状化後、酵母細胞に形質転換した。リピッ1)

への影響を解析する上で様々な利点を有している 。

ドボディや小胞体膜上に局在するエルゴステロール合成系酵素である Erg6p の GFP-fusion プラスミドは、法5’-TATAATGCGGCCGCACATTCCTACTATAACGTCGT-3’ と菌体および培地

5’-ATCTAGTCTCGAGATTGAGTTGCTTCTTGGGAAGTT-3’

方

実験には出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae W303-のプライマーセットで増幅した ERG6 遺伝子を染色体組1A 株を用いた。シス脂肪酸としてオレイン酸、トランみ込み型ベクター pJK67 の NotI/XhoI サイトに挿入しス脂肪酸としてエライジン酸を用いて、これらの脂肪酸て構築し、XbaI による線状化後、酵母細胞に形質転換を唯一の炭素源として酵母細胞を培養した。脂肪酸培した。

地組成は 0.67 % YNB w/o amino acid, 0.15% Tween 40,

同 様 の 方 法 で、 ミ ト コ ン ド リ ア、 小 胞 体、 ゴ ル ジ

0.15% oleic acid or elaidic acid を用い、適宜アミノ酸と体、液胞、エンドソーム、ペルオキシソーム、核小体、塩基を添加して 28˚C で培養を行った。

P-body、ストレス顆粒、膜ミクロドメインを観察する

ストレス耐性の解析

GFP 融合タンパク質を発現するゲノム組込み型のプラス対数増殖期まで培養した細胞をリン酸緩衝液 (50 mM

ミドをそれぞれ構築した。
1井結沢

真吾

おかれていると考えられた。実際に、マイクロアレイ解

果トランス脂肪酸による P-body とストレス顆粒の形成

析やウェスタンブロット解析では、ヒートショックプロ

真核生物の細胞質における翻訳と mRNA の分解は密テイン (HSP) などのストレスタンパク質の発現量がエラ1.

接に連携しており、その制御はストレス条件下においてイジン酸培地で増加していた。

特に重要である。ストレス条件下で非翻訳状態の mRNA

2.

トランス脂肪酸によるストレス耐性の上昇

はポリソームから隔離され、翻訳制御因子や RNA 分解

エライジン酸培地で培養した細胞内で HSP の発現量装置などとともにストレス顆粒 (stress granule, SG) や上昇が観察されたことから、ストレスに対する感受性をプロセシングボディ (P-body) といった構造体を細胞質検討した。その結果、過酸化水素等の酸化的ストレスやに形成する。両構造体は非翻訳状態の mRNA と RNA 結

エタノールストレス、浸透圧ストレスに対する感受性に合タンパク質によって細胞質に形成される構造体であ大きな違いは観察されなかったが、熱ショック及び冷凍り、P-body が主として mRNA 分解に関わるタンパク

解凍ストレスに対する耐性は、オレイン酸に比べエラ質と複合体を形成するのに対し、SG は翻訳開始因子やイジン酸で培養した細胞の方が有意に高い耐性を示した

40S リボソームサブユニット等と複合体を形成する。そ（Fig. 2）。

れぞれ、ストレス条件下における mRNA の一時的な隔

3.

オルガネラ形態の違い

離・貯蔵やストレス除去時の回復過程における速やかなP-body や SG 以外のオルガネラや構造体の形態につい翻訳再開に関わっていると考えられている。そこで、オても検討を行った。リピッドボディやミトコンドリア形

レイン酸培地およびエライジン酸培地で培養した細胞態については大きな違いは観察されなかったが、ペルオにおける P-body と SG の形成状態を検討した。P-body、キシソームについてエライジン酸培地で培養した細胞でSG のそれぞれのマーカーとして Dcp2p-GFP と Ngr1p-若干の肥大化が観察された。また、細胞膜上に局在するGFP を用いた

3, 4)

膜ミクロドメインについてはエライジン酸による培養時。解析の結果、エライジン酸で培養しに有意な凝集が観察された (Fig. １B)。

た細胞では P-body および SG の形成が顕著であり (Fig.
1A)、オレイン酸培地に比べ高いストレス状態に細胞が（A）（B）

Ngr1p-Top

Can1p-GFP

GFP

Dcp2p-Middle

GFP

Oleic acidElaidic acid

Oleic acidElaidic acid

Fig. 1 Cultivation with elaidic acid induces the formation of P-bodies and SGs and the accumulation of micro domains
Yeast cells were cultured in 100 ml of each medium with shaking (120 rpm) at 28 ˚C. (A) The assembly of SGs and P-bodies
was examined with Ngr1p-GFP (SG marker) and Dcp2p-mRFP (P-body marker). (B) Distribution of micro domains on the plasma
membrane was monitored with Can1p-GFP.
2

トランス脂肪酸による細胞内オルガネラおよびストレス感受性に及ぼす影響の解析

考対する耐性がオレイン酸培地での培養時と差がなかった察
マクロアレイ解析の結果から、トランス脂肪酸（エラのは、両培地ともにペルオキシソームでのβ - 酸化を誘イジン酸）を培地成分として培養することにより、スト導することで各種抗酸化系酵素の発現が上昇したためだ

レス応答性の転写活性化因子 Msn2p/Msn4p の標的遺と考えられた。今回の解析では、トランス脂肪酸を唯一伝子やヒートショックプロテイン遺伝子の転写レベルがの炭素源として培養したため、ヒトのトランス脂肪酸摂上昇したことから、トランス脂肪酸の代謝は酵母細胞に取のケースとは必ずしも同列に比較することはできない

とってストレスに似た負荷がかかった状況を引き起こしが、動物細胞でも似たような影響が引き起こされるのかていると推測された。実際に細胞質では P-body や SG検討する予定である。の形成が誘導されたことから、翻訳抑制を含めて通常の培養条件下とは随分と異なる状態に細胞があると考えら

要約れる。一方で、これらのストレス応答がエライジン酸培オレイン酸培地での培養に比べ、エライジン酸で培養養によって誘導されたことによって、ストレスに対するした酵母細胞は熱ショック及び冷凍解凍ストレスに対す耐性が上昇したのではないかと考えられた。膜構造のる耐性が高く、細胞内に P-body や SG を形成していた。

違いもストレスに対する感受性を大きく左右することか

また、膜ミクロドメイン構造についても両培地での培養ら、トランス脂肪酸の代謝を介して膜脂質組成にも影響で違い確認された。DNA マイクロアレイやウェスタンしているのではないかと推測している。膜ミクロドメイ

ブロット解析の結果、ストレスタンパク質の発現レベル

ンの形態学的違いは両脂肪酸培地による膜脂質組成の違上昇が確認され、エライジン酸で培養した細胞がストレいを反映している可能性が高く、今後、より詳細な分子ス応答した状態に近いと考えられた。

機構の解明に取り組む予定である。また、過酸化水素にFreeze-thaw stress

Time (h)Time(day)Survival(% )Heat shock

Fig. 2 Susceptibility to heat shock and freeze-thaw stress
Cells were treated with various types of stress such as heat shock (42˚C) and freeze-thaw stress ( − 30˚C), andthen samples were diluted and plated on YPD plates to monitor cell viability. Percent survival was expressed
relative to the initial viability prior to the treatment with ethanol. Results are representative of three independentexperiments. White circles, cells grown in oleic acid medium; black circles, cells grown in elaidic acid medium.

3井謝沢真辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜わりました財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。
文献

1) A. Gurvitz, et al, : J. Biol. Chem., 276, 895-903 (2001).
2) S. Izawa, et al, : Appl. Microbiol. Biotechnol. , 75, 533-538 (2007).
3) S. Izawa, et al, : Biosci. Biotechnol. Biochem . 71, 2800-2807 (2007).
4) K. Kato, et al, : submitted .

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