逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究
静岡県立大学

経営情報学部

五綾

島子

Reversed micelles can control the size of water pools and the physical property of water by changing
Wo(=[water]/ [surfactant]). The property of bound water and its function were studied based upon the enzymatic
catalysis and the dimerization of cysteine by the irradiation in water pools. Sodium bis(2-ethylhexyl)
sulfosuccinate (AOT), hexadecyltrimethyl ammonium chloride(HTAC) and octaethylene dodecylether(C 12E8)
were used as anionic, cationic and nonionic surfactants, respectively. Hexokinase(HK) and polynucleotide
phosphorylase(PNPase) were used as enzymes. The electrostatic effect due to the inner surfaces of AOT and
HTAC reversed micelles increased with increasing Wo, leading to the suppression of the HK activity. On theother hand, high HK activity was revealed in hydrated ethyleneoxide chains of C12E8. The PNPase could also
polymerize ADP in C12E8 reversed micelles by using a small amount of Fe3+ in stead of Mg2+. Furthermore, it was
found that the formed poly(A) was precipitated with increasing temperature. This means that the formed poly(A)can be isolated easily from the reversed micellar solution. This phenomenon is closely related with appearance of
free water molecules due to elevation of temperature.
The effect of bound water on the conversion of cysteine by UV irradiation was studied. It was assumed thatthe solubilized cysteine in water pools was easily converted into cystine in bound water by UV irradiation. The
results suggested a long life time of activated oxygens produced by UV irradiation in bound water region.

１．緒

紫外線、放射線によるラジカル発生の関係についても成果言が現在期待されている。

肌の保水効果を維持する化粧品の研究開発とともに、近本報告書においては水の構造化と機能を逆ミセルの年では水自体の性質が紫外線照射による皮膚の生理機能とwater pool を用いて二つの視点で捉えた研究成果を報告すの関連も推測され、一層水と化粧品との関わりが深くなりる。一つは逆ミセルの water pool に酵素を溶解し、水のつつある。水は大きく分けて自由水と構造化された結合水構造化が酵素活性に及ぼす影響を明らかにする。酵素としに分けられる。結合水は自由水に比べ、蒸発しにくいなどては細胞に幅広く存在し、糖代謝に深く関わる基本的な酵

その一般的な性質はよく知られている。しかし結合水は総素、ヘキソキナーゼ（Hexokinase, HK）と著者らのグル称であり、構造化の程度や性質は親水基やイオンの種類にープが研究対象として検討してきたポリヌクレオチドフオ

より異なることが予測されているが、系統的な研究はなさ

スフォリラーゼ（Polynucleotide phosphorylase, PNPase）

れていない。その理由として水溶液中では自由水が多量にを用いた８〜 10）。さらにもう一つの研究は紫外線や放射線存在するので、結合水の性質を直接特定できないからであの照射により活性酸素が発生するが、この発生と水の構造る。

化との関係を明らかにするため、逆ミセルの water pool

油の中で界面活性剤と少量の水により形成される逆ミセにシステインを溶解し、その重合化から検討した。

ルにはその内殻の界面活性剤の親水基近傍に構造化された

２．実験の部

結合水が存在し、Wo（＝［水］／［界面活性剤］）を変えることにより、結合水／自由水の割合を調整することがで

２. １

きる。一方、界面活性剤の親水基の構造を変えたり電荷を試薬

ヘキソキナーゼを用いた実験持たせたりすることで、逆ミセル界面に構造化された結合界面活性剤として Sodium bis（2—ethylhexyl）sulfosuccinate

水の直接的な情報を得ることができる１〜７）。水の構造化と（AOT, Sigma）、Hexadecyltrimethyl ammonium chloride（HTAC, Merck）及び Octaethylene glycol dodecyl ether

Study of Hydration and its Function by
Using Reversed Micellar Systems
Ayako Goto
School of Administration and Informatics（C12E8, 日光ケミカルズ）を用いた。HTAC はアセトンーメ
タノール混合溶媒で再結晶した。ヘキソキナーゼ（Hexokinase,
HK、Boeringer Mannheim）は酵母由来である。Adenosine
5'—diphosphate trisodium salts（ATP, Fluka）, 2—Deoxy—D—（＋）glucose（DG, Sigma）やその他の反応基質は Fluka や関東から購入した。

−2−

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

実験％アガロースゲルで行い、各々のゲルの断片中の放射能

逆ミセル溶液の調製；Isooctane に乾燥した AOT を適量を液体シンチレーションカウンターで測定した。キャ

当量溶解した溶液に Wo に応じて 50mMTris ／HCl 緩衝

ピラリー電気泳動は充填剤に Oligonucleotide Polymer液（pH8.0）を溶解する。HTAC 逆ミセルの調製は有機溶

Solution A、泳動緩衝液として Oligonucleotide 緩衝液を媒として Isooctane/octanol（85：15v/v）を、C12E8 逆ミ

用いて、HP 3DCapillary Electrophoresis System（Hewlett

セルの調製は Isooctane/octanol（90：10v/v）を用いた。

PACKARD 社）で 30 分測定した。

酵素反応；逆ミセル系の酵素反応は AOT 及び Wo が同じ溶液を二つ調製し、一方には DG と HK を、他方には逆ミセルのサイズ分布の測定は２. １で述べたものと同じであった。

ATP と MgCl2 を溶解し、両者を 0.5 mL づつ混和後、37℃で反応を開始した。ATP 及び DG の water pool におNMR は 500MHzFT—NMR17O プ ロ ー ブ（ 日 本 電 子、
GSX500）で測定した。

ける最初の濃度は 10mM 及び 30mM であり、MgCl2 のwater pool における濃度は 20mM であった。なお HK の２. ３

water pool における濃度は AOT 及び HTAC に関して試薬

は 1.74 mg/mL であり、バルク水溶液及び C12E8 の場合は界面活性剤は２. １と同様なものを用いた。Cysteine は0.0174 mg/mL であった。酵素活性は反応溶液 0.1mL を緩システインの光重合反応

Sigma 製を用いた。

衝液と CHCl3 で抽出し、遠心分離後、水層中の ADP 及び
ATP を HPLC で測定した。HPLC は Shim—packWAX—1

実験方法と Shim—pack プレカラム Doil を用いグラディエント法に

逆ミセルは２. １と同様な方法に従い調製した。逆ミセより検出した。なお HK のみかけの Kinetic parameter はルに可溶化する緩衝液は 50mMTris 溶液（pH ９）を用いた。

Eadie Hofstee plots に従った。

water pool における cysteine 濃度は主に 50mM であった。

ミセルの大きさの測定；逆ミセルの大きさは動的光散乱

UVA、UVB の照射にはアトー社製 HP—30LM、UVC はア（DLS700, 大塚電子）により測定した。

トー社製 HP—50C を用いた。SH 基の変化は蛍光試薬であ２. ２—4500, HITACHI）で測定した。逆ミセル溶液の試料の場

る N—（9—acridinyl）maleimide を用いて、蛍光高度計（Fフォスフォリラーゼを用いた実験

試薬

合はメタノール／水混合溶媒で希釈し測定した。

Polynucleotidephosphorylase（PNPase, E.coli. 由来、Sigma）、

３．結果と考察ADP（Fluka）、14C—Adenosine 5'—diphosphate trisodium salt
（14C—ADP、NEN）などを使用した。NMR 測定には H217O,

３. １

逆ミセルの water pool に溶解した酵素活性と水の構造化との関係

d-octane を用いた。その他は２. １と同じであった。

３. １. １
実験

ヘキソキナーゼについて 11）

ヘキソキナーゼ（Hexokinase；HK）は細胞における糖２. １と同様に AOT は Isooctane に、C12E8 は 12％ v/v

代謝に重要な酵素である。この HK は Mg2+ イオン存在

1—Octanol/Isooctane に溶解し、逆ミセル溶液とした。基下、りん酸基のドナーとして ATP を用いてグルコースの本 的 に は ２. １ で 述 べ た 方 法 に 従 う。ADP を 溶 解 し た

りん酸化を触媒する酵素である 12）。この HK の活性は酵50mM Tris 緩衝液（pH9.5）を 0.2M 逆ミセル溶液に各々素のまわりの微視的環境に大きく依存する。例えば HK はの Wo になるように溶解した。同様に PNPase を同じ Wo

NH2- を末端につけた疎水基を持ち、この疎水基をミトコになるように溶解し、同量の 150μL づつ混和し、反応

ンドリアの生体膜に貫入し、その活性を制御していると言を開始した。14C-ADP と ADP を合わせた濃度を 2.0 mM

われる。またこの HK はグルコースと結合すると、HK の構（1.85kBq）とし、PNPase は 2.5unit を使用した。反応後、造はドラマチックに変化し、水分子が外に追い出されること

反応液を上清と沈殿に分け、それぞれに 0.2％アルブミンも推測されている。すなわちこの HK の活性は水の性質や媒と 10％トリクロロ酢酸を加え、反応を停止した。エタノ体の電場や極性に大きく依存することが推測される 13 〜 16）。

ール 1000μL を加え、ガラスフィルターでろ過し、Tris 緩

そこで界面活性剤として陰イオン性で最もその逆ミセル

衝液とエタノールそれぞれ 1000μL で２回洗浄し、ろ過後、のキャラクタリゼーションが判明している AOT とともに、

液体シンチレーションカウンターでガラスフィルター上の荷電効果を調べるために、陽イオン性の界面活性剤として HTAC、非イオン性の界面活性剤として C12E8 を用いた。

放射能量を測定した。
生成 poly（A）の確認はアガロース電気泳動及びキャFig. １は AOT 逆ミセル溶液における HK の活性に対する

ピラリー電気泳動を行った。アガロース電気泳動は 1.8

Wo の影響を示している。Wo ＝ 10 のところで極大値が認−3−

められる。しかし全体としてバルク水溶液における HK のれ自由水が出現し極性が高くなり、一層電場効果が顕著に活性と比較すると低下し、バルク水溶液のそれをを１とす

現われ、酵素と ATP の距離は離れ HK の活性にマイナス

ると W0 ＝ 10 で 0.015 であった。このように Wo に最適に働く。一方、HK はバルク水溶液中で活性を高く示すので、値が出現する理由として以下のように推測される。反応基

water pool が大きくなり、Wo ＝ 10 を超えると自由水が出

質の ATP は負電荷を持ち、一方、AOT 逆ミセルの内側の現すると有利に作用すると推測される。この相反する二つ界面も—SO3—基の負電荷で覆われ、相互に電気的反発力がの効果により Wo に最適値が出現すると推測される。これ

働き、ATP は water pool の中央に局在するであろう。一は water pool の KCl の濃度の増加させると、HK の活性が方、HK は NH2- 基を疎水基の先端に持っているので、静電増加し、最適 Wo が消えることからも支持された。すなわ

力と疎水結合で AOT 単分子膜層近くに局在あるいは埋め

ち負電荷の AOT 単分子層に K+ イオンが十分吸着され、塩込まれている可能性もある。しかし Wo が大きくなるにつ析効果も働き、HK は膜から追い出され、water pool の中央に局在するようになり、ATP と HK の距離を縮めて触媒

0.45

効果が高まると推測される。

●

0.4

このように AOT 逆ミセル中では HK の酵素活性は低下
するが、Fig. ２に示すように種々の糖を用いた基質特異性

0.35の実験で AOT 逆ミセル中で HK が基質特異性を保持してVo (μmol/mg ・min）

0.3

いることが判明した。それぞれの基質特異性の比率はバル●0.25ク水溶液と同じであった。しかし AOT 逆ミセル中では至●0.2

適 pH はバルク水溶液系のそれに比べ 0.5 アルカリ方向へシ
フトしていた（Fig. ３）。これは AOT の陰イオンの電荷に0.15より H+ が吸着され、water pool 中で H+ の分布が不均一に●0.1なったためであると思われる。

●

Fig. ４は HTAC 逆ミセル溶液における HK の活性に対0.050する Wo の影響を示している。AOT 逆ミセルと同様に Wo
0

10

20

30

＝ 10 付近で極大値を示すが、HK の活性は AOT 逆ミセ

40

ルの活性に比べ、全体にわたり２倍高い。これは陽電荷のWo
Fig.1 Effect of Wo on HK activity in 0.1M AOT/isooctane reversed micelles at 37℃

表面は負電荷の表面に比べ HK 活性の発現に有利に働くと推測される。水溶液中で陰イオン性界面活性剤ミセルにより HK は容易に可溶化されるが、陽イオン性界面活性剤ミセルには HK は可溶化されないことが知られているので 17）、

1

0.8

0.5

0.6

■

0.4

0.2

●
▲
●
▲

■

■ ▲
●
●
▲
◆
◆
○ □
○
■ □
●
▲
◆
0 ○
0
10

◆
□
○
20
30
40
50
Incubation time (min)

◆
□
○
60

0.3

●

●

6.5

7

●

●

●

0.2

0.1

70

Fig.2 Substrate specificity of HK in 0.1M AOT/isooctane reversed micelles (Wo=10) at 37℃■ , D-(+)Glucosamine;●

0.4
Vo (μmol/mg・min)

ADP/(ADP+ATP) ratio■● ,1-Thio-D-glucose; ▲ ,2-Deoxy-

D-glucose; ◆ ,Fructose; □ , D Mannose; ○ , N-Acetyl-Dglucosamine

−4−

0

6

7.5
pH

8

8.5

9

Fig.3 Effect of pH on HK activity in 0.1M AOT/isooctane
reversed micelles (Wo=10) at 37℃

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

同様に HK の—NH2 により HTAC 逆ミセルの膜界面に HK

いて pH 効果を検討した結果、至適 pH はバルク水のそれは深く貫入せず、HK のコンフォメーションが変化しやすと等しく H + の分布はバルク水の H + の分布と等しいと推測いことがあげられる。また HTAC 逆ミセルの方が AOT 逆された。しかし C12E8 の濃度効果を検討した結果、HK の活

ミセルに比べ、そのサイズが大きいことも HK の活性発現

性は濃度の増加とともに増加した（Fig. ６）。通常 Wo を一に有利に働くように思われる。

定にしておけば、界面活性剤の濃度を変化させても、water

C12E8 逆ミセル系では Wo が 20 まで徐々に HK 活性は上pool の状態は変わらないはずである。界面活性剤の濃度と昇し、その後なだらかに増加し、Wo ＝ 30 で最大値を示しともに活性が低下する場合は、酵素が逆ミセルの膜と結合た（Fig. ５）。C12E8 逆ミセル中の酵素活性は AOT 逆ミセル

している場合が多い 18）。AOT 系での HK の活性に対するや HTAC 逆ミセルのそれらに比べ非常に高く、ほぼバルク

AOT 濃度の効果はこれに相当する（データは示されてい水のそれと等しかった。また極大値を示した Wo ＝ 30 におない）。しかし反対に界面活性剤濃度とともに活性が増加する場合は、逆ミセルや水の構造の変化が起きている場合

1.4

で、酵素は膜と結合していないと推測される。C12E8 逆ミ●

Vo (μmol/mg・min)

1.2

セルの場合は後者に相当する。
表１は AOT、HTAC 及び C12E8 逆ミセル、バルク水

1溶液の見かけの Vmax 及び Km を示している。見かけのVmax は AOT<HTAC<<C12E8 逆ミセル < バルク水溶液

0.8の順であった。みかけの Km は C12E8 逆ミセル中ではバル●ク水溶液のそれと等しいが、AOT や HTAC 逆ミセルの

0.6

HK と基質の相互作用がバルク水溶液とほぼ等しく、AOT や
HTAC 逆ミセルの場合と大きく異なることを示している。

0.2
0

それらよりかなり低かった。これは C12E8 逆ミセル中では

●

0.4
●
0

10

20

30

25

40

●

Wo
Fig.4 Effect of Wo on HK activity in 0.1M HTAC/isooctane-octanol reversed micelles at 37℃

30

25

●
●

20

Vo (μmol/mg・ml)●

Vo (μmol/mg・ml)

20

15
●
10

5

●

15
0

●
0

0.05

10

0

0.15

0.2

0.25

0.3

Fig.6 Effect of C12E8 concentration on HK activity in C12E8 /isooctane-octanol reversed micelles (Wo=30) at 37℃

●

0

0.1

Concentration of C12E8

●
5

●

10

20

30

40

Table 1 Apparent kinetic parameters of HK in three kinds ofreversed micellar solution

Wo
Fig.5 Effect of Wo on HK activity in 0.1M C12E8 / isooctaneoctanol reversed micelles at 37℃−5−bulk water

AOT

HTAC

C12E8

km（μmol/ml）

0.99

3.69

2.79

1.02

Vmax（μmol/min）

26.81

5.11

13.48

18.93

HK は前述したようにミトコンドリア表面に疎水結合と質と結合し、反応が進行していくと推測される。in vivo に

静電力で結合し、HK がグルコースを抱き込むと、そのコおいて脂質膜はポリサッカライドとその結合水で覆われ、ンフォメーションが大きく変化すると推測されているが、この状態はエチレンオキサイド層からなるマントルと類似

三種類の逆ミセルの中での酵素活性から、HK の活性は微していると考えられる。HK の活性は HK の微視的環境例

視的環境に大きく依存することが判明した。上記の結果かえば、疎水性、静電効果、結合水のような因子に影響を受ら、AOT、HTAC、C12E8 逆ミセルにおける酵素反応のス

けることが判明した。C12E8 逆ミセルの場合は、Wo ＝ 30

キーム（Fig. ７）を示す。AOT 逆ミセルの場合は HK のアぐらいまでは結合水からなると推測されるが、Wo ＝ 30 をルキル基とその末端のアミノ基により HK が膜に結合し、超えると、活性が低下するのでエチレンオキサイド層から埋め込まれたような状態となり、HK のコンフォメーショ

なるマントルにおいては結合水が有利に働くと推測された。

ンが変化しにくく反応が進行しにくいことがまず第一にあ
３. １. ２ ポリヌクレオチドフオスフォリラーゼについて 21)

げられる。HTAC 逆ミセルの場合は、HTAC の陽電荷とHK のアミノ基の電気的反発力により比較的 water pool の

逆ミセルの water pool の中に酵素、ポリヌクレオチドフオ

中央に位置するとともに、動的光散乱の測定から、AOT 逆スフォリラーゼ（Polynucleotide Phosphorylase, PNPase）、

ミセルの大きさに比べ、HTAC 逆ミセルの大きさは大きい

FeCl3、ADP を溶解し、RNA 合成を検討し、water pool のので、酵素がコンフォメーションが変化しやすいことが考水の性質との関係を検討した。通常は ADP の酵素的重合えられる。さらに陰イオン性、陽イオン性の界面活性剤かには Mg2+ イオンが有効であるが、今回は低濃度の Fe3+ イ

らなる逆ミセルの water pool は静電力が強く、特に Wo がオンを用いたことが特徴的である。その理由の一つとして、大きくなると自由水が増加しその傾向は強くなる傾向にあBeljanski22）が PNPase による核酸塩基の重合化は Fe3+ イオる。従って反応基質の ATP や H+ の water pool における分ンの方が Mg2+ イオンに比べ効果があることを報告してい布が電荷のある表面膜に強く影響を受け、反応基質と酵素るからである。二つ目の理由は、微量の二価、三価鉄塩をの距離や pH を変化させることになり、HK の触媒の作用

含む πWater は実体は不明であるが、特異な生理活性を持を抑制する。

つと言われ、その点でも興味深いからである。

他方、非イオン性 C12E8 逆ミセルは HK の触媒活性に有Fig. ８は 0.2MC12E8 逆ミセル溶液の酵素的 ADP 重合化に利であった。その理由として二つあげられる。１）静電場

対する Fe3+ と Mg2+ イオンの存在下における 25℃及び 37℃

効果がないので、反応基質、HK、H + の分布が逆ミセルのの結果である。ここで water pool の Fe3+ イオン濃度として中で比較的均一に分布する。２）C12E8 逆ミセルの特異的なFeCl3 の飽和濃度の 0.05mM を用いているが、Mg2+ イオン

構造が挙げられる。C12E8 逆ミセルははっきりした境界領域

濃度が water pool において 10mM 濃度を用いた。その理由が分かれた water pool を持っているのではなく、殆どの水は Fe3+ イオン濃度と同じ Mg2+ イオン濃度が 0.05mM にお分子は Wo ＝ 30 ぐらいまでは、エチレンオキサイド鎖に水いては殆ど反応が進行しなかったので、最も反応が進行し和している。エチレンオキサイド基はアルキル基より

19、20）

た 10mM の濃度を用いた。縦軸の重合率は最初に加えた
C—ADP の全放射能量に対する生成された重合体の放射長く、エチレンオキサイド鎖と水和水からなるマントル層14であり、この中に酵素も反応基質も存在し、容易に反応基能量の割合である。Fig. ８の結果が示すように poly（A）

AOT

HTAC
+
+
+

+

+ + +

H12E8
+

+
+
+

：ATP

：Enzyme

+

+ + +

：AOT

+

+
+
+
+
+
+

+

：HTAC

Fig.7 Models of reversed micelles containing HK and ADP−6−：C12E8

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究[Fe 3+ ]80[Mg 2+ ]=0.05mM

w

=10mM

80

37℃

70

25℃

37℃

70

60

60

50

50

Yield of poly A (%)

Yield of poly A (%)

w

40
30
20

25℃

40
30
20

10

10

0

0

24

0
Incubation time (h)

0

24

24

supernatantFig. 8precipitate

Effect of Metal Ions and Temperature on ADP Polymerization in C12E8 Reversed Micellar Solution

生成物は沈殿物と逆ミセル溶液の上澄み液の両者に存在し80た。この時の逆ミセルの大きさや water pool の特徴を示

70

すでに報告してある AOT 逆ミセル系で Mg2+ イオンを用60いた場合、Wo ＝ 20 の場合が最も重合化が進行したから。結果は示していないが、Beljanski

９〜 11）

がすで22）に報告したように、Tris 緩衝液中では Fe3+ イオンは Mg2+
イオンに比べ２倍効果を示しており、37℃では重合化の程度はほぼ 10％であることが確認された。しかし結果は示

Yield of poly A (%)

す Wo（＝［水］／［界面活性剤］）は 20 である。これは

である

0
24
Incubation time (h)

○
●
○

40
30
20

Fe3+ イオンに比べ圧倒的に効果が高く、しかも 37℃に比100

それに対して Fig. ８に示されるように、C12E8 逆ミセル系●● precipitate

50

していないが、AOT 逆ミセル系では Mg2+ イオンの方がべ 25℃の方が生成した poly（A）が沈殿する割合が高い。

○ supernatant○
05

では Mg2+ イオンに比べ約２倍 Fe3+ イオンの方が効果的

●
10

●
15

20

●
25

○
○

30

35

40

45

Temperature (℃）

であった。また Fe3+ イオンの場合、C12E8 逆ミセル系の重Fig.9 Effect of temperature on polymerization after 24h

合率は水系に比べ６倍の 60％の重合率を超え、しかも 37℃で poly（A）が沈殿し、生成された生成物を容易に分取

ト状でないかと推測される。水溶液中の通常のエチレンオ

しやすくなることが判明した。

キサイド系非イオン性ミセル系においては、Fe3+ イオン

AOT 逆ミセル系においては Fe イオンがほとんど効果

はエチレンオキサイド鎖の水和水と置換してエチレンオキを示さなかったのは、AOT 逆ミセルの water pool のミク

サイド基に結合することが知られているので、逆ミセルにロ界面が陰イオン性で、特に Fe イオンは３価のために、おいても Fe3+ イオンはエチレンオキサイド基の親水層にSchultz—Hardy の法則に従い、そのミクロ界面に吸着されADP とともに存在し、反応が進行すると推測される。こやすくなり、water pool の中央は Fe イオンの濃度が極のように C12E8 逆ミセル系では Fe3+ イオンの方が活性があめて低くなるためと推測される。一方、反応基質の ADPり、かつ 37℃で沈殿しやすいので、この現象をさらに詳

は負電荷を持つため、AOT 逆ミセルの陰イオン界面と反細に検討した。

3+

3+

3+

発し、むしろ water pool の中央に存在する割合は高くな

Fig. ９と Fig.10 はそれぞれ C12E8 逆ミセルの poly（A）

り、重合化が進行しにくいと推測される。前述したように生成に及ぼす温度と反応時間の影響を調べたものである。

C12E8 逆ミセル系では AOT 逆ミセル系に比べ電場効果は

低温の 10℃では重合化は殆ど進行しないが、反応温度がなく、８ケのエチレンオキサイド基の親水層がアルキル鎖

30℃以上になるとほぼ 60％重合し、それ以上温度を上昇より長く、水素結合により水分子が水和している厚いネッ

させても総重合率は変化しなかった。しかし 37℃以上で−7−は急激な沈殿量の増加が認められた。一方、反応時間の効

15 では重合化は速やかに進行する。すなわちある程度の果を調べると（Fig.10）、６時間以上で重合化は 60％に達し、逆ミセルの大きさと自由水の存在が重合に好ましい。しかそれ以後変化しない。しかし６時間から９時間の間に生成し Wo ＞ 15 で沈殿した poly（A）と上澄み液中の poly（A）

物は沈殿した。すなわち重合化にはある程度の熱が必要でを併せた総重合率はほぼ一定であり、自由水が多けれれあるが、生成物の沈殿には熱とともにある程度の時間が必ば多いほど、重合化が進行するとはいえない。データは要であった。エチレンオキサイド鎖をもつ界面活性剤の水示していないが、0.2MC12E8 逆ミセルの Wo に対して水の溶液における通常のミセルは温度の影響を強く受け、温度

H2 17O の NMR の半値幅をプロットすると、Wo が 10 付近を上昇していくと相分離し、水溶液全体が濁ることはよく

で屈曲点を示し、Wo ＜ 10 では、逆ミセル中の殆どの水知られている。これはエチレンオキサイド鎖が脱水和するはエチレンオキサイド基に水和している。しかし Wo>10

ため、疎水性と親水性のバランスが変化し、疎水性の性質

で自由水が増加してくることが推測される。すなわち Woが高まり、相分離するのである。従って逆ミセルのエチレ＜ 10 では水が強く構造化され、重合化に対して不利に働

ンオキサイド鎖の結合水が温度上昇に伴い、脱水和によりくようである。

逆ミセルの構造が変化し、その結果、酵素反応に影響する

以上より C12E8 逆ミセル中においては Wo ＞ 15 においと推測された。言い換えればエチレンオキサイド鎖をもつて 37℃で６時間以上の反応時間で poly（A）の重合化が界面活性剤の逆ミセルの water pool は温度制御可能な酵最も高くしかも圧倒的に沈殿することが判明した。この沈素の反応場であることを示唆している。

殿現象は重合体の単離に都合がよい。そこでこの沈殿現象

次に 37℃で 24 時間後の重合化に及ぼす Wo の影響をの機構を検討した。

調べた。Wo の増加とともに逆ミセルのサイズとともに

Fig.12 は Wo ＝ 20 の 場 合 の C12E8 逆 ミ セ ル 中 の 水 のwater pool のサイズが増加することはよく知られている

H2 17O の NMR の半値幅を温度に対してプロットしたもの

１）。よく研究されてきた AOT 逆ミセル系については、特である。温度の上昇とともに H217O の NMR の半値幅は低に Wo が 10 以下では結合水が存在し、Wo が 10 以上では下し、水の運動性が増加するが、約 35℃以上で H217O の

water pool の中央に自由水が出現してくることが知られ

NMR の半値幅は一定値に近づく。データは示していな。すでに報告したように、AOT 逆ミセル系でいが、温度が上昇すると、逆ミセルのサイズは大きくな

は Mg2+ イオン存在下、poly（A）の生成は Wo が 20 で極り、特に water pool に Fe3+ が存在すると、逆ミセルはさ大を示し、ある大きさの water pool が必要であり、結合らに大きくなった。我々はすでに AOT 逆ミセル系につい。すなて Wo が増加し、水の運動性が増加すると、逆ミセルが集

わち Wo ＝ 20 では、結合水と自由水が半々ぐらいの状態合する Flocculation の現象が起こることを Cryo- 電子顕微

ている

１、
６）

水だけでは重合化は進行しないことが判明した

10）で存在し、これが重合に有利に働くと推測された。しかし
Fig.11 が示すように、C12E8 逆ミセルの poly（A）生成は

100

Wo ＜ 10 では重合化はわずかにしか進行しないが、Wo ＞

90

supernatant80

precipitate

70

70

Yield of poly A (%)●
50

Yield of poly(A) (%)

60
●

○
○

40
30

○ supernatant

50
40
30
20

● precipitate

20

60

10
10
●
0

0

3

●

○

6

9

○
12

21

24

Incubat ion t ime ( h)Fig.10 Time course of polymerization at 37℃

0
27

10

10

15

15

20

20

25

25

30

30

W
0
Fig.11 Effect of W0 on the precipitation of poly(A) in C12E8 reversed micellar solution at 37℃−8−逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

鏡で観察したが７）、C12E8 逆ミセル系についても、温度が現象を示すことが知られているが、この現象はエチレンオ

上昇と Fe の存在が逆ミセルの Flocculation を引き起こ

キサイド系界面活性剤逆ミセルの水もその効果を示し、温している可能性が推測される。これが温度が 37℃以上で、度を変化させることにより逆ミセルの水の性質を制御し、かつ Fe が存在すると、PNPase により生成された poly

高分子生成物の単離が可能であることを示した。

3+3+（A）が沈殿する現象の一つの要因として推測された。
逆ミセル系での酵素反応に関する多くの研究は AOT 逆

３. ２

膜界面におけるチオール化合物の光重合 23）

ミセル系についてであった。ここに述べた研究例はエチレ

環境中に存在する紫外線は UVA 及び UVB で、UVC は

ンオキサイド基をもつ非イオン性界面活性逆ミセルは系全殆ど存在していないが、近年のオゾン層破壊にともない体が油の系であるにもかかわらず、酵素反応に有利である

UVB の増加が観察されており、さらに破壊が進行し UVC

ことを示している。特にエチレンオキサイド基のまわりのが増加することも懸念されている。紫外線は細胞膜の膜

結合水は温度感受性で温度の上昇とともに脱水和して曇点

タンパク中の SH 基の酸化（主に S—S 結合の生成）をきた
し、レセプターの clustering や膜酵素の不活性化さらに紫外線の情報伝達にも関与している可能性が報告されている300。本研究では膜タンパク中の SH 基の変化に膜界面の24、25）■

近傍の水の状態（結合水や自由水）と静電場の影響を検討

250するため逆ミセルを用い、cysteine の SH 基は容易に酸化され、二量化する性質に着目して以下の仮説を立てた。紫Half width(Hz)200

外線の照射により脂質膜近傍で産出される活性酸素によ■り cysteine が cystine に酸化されやすいという仮説の基に■
150

AOT 逆ミセルを中心にしてその water pool 中に cysteine■を溶解し、紫外線照射後の cysteine の変化量を蛍光法に

■

■

100

■

より検討した。特に逆ミセルの単分子膜を膜モデルと考え、■Wo を変化させて膜界面の水の性質を連続的に変化させて検討した。
cysteine バルク水溶液および water pool 中に cysteine50を溶解した逆ミセル溶液に紫外線（20J/cm2）を照射後のSH 基減少率を測定した（Fig. 13）。バルク水溶液と逆ミ

0
25

30

35
Temperature(℃)

17

Fig.12 Plots of O line of the H2
micelles against temperature4045セル溶液では SH 基の減少（酸化）に顕著な差が観察された。バルク水溶液においては UVA では SH 基の変化はほ17

O signal of C12E8 reversed

とんど見られなかったが、UVB では約 20％、UVC では
約 60％の減少であった。この減少は cysteine の SH 基がResidual cysteine (% of control)

120
100

UV-A:20J/cm 280

UV-B:20J/cm2

60

UV-C:20J/cm 2

40
20
0
AOT

HTAC
HTAC

C12E8
C 12 E 8

Aqueous
Aqueousbulk
bulk
solutionsolutionFig. 13 Conversion of cysteine in reversed micellar solution and in aqueous solution by UV-irradiation−9−

Residual cysteine (% of control)

AOT
100
80

■

60

●

100

■ UV-A● UV-B▲ UV-C

1

2

3

4

■
▲
●

●

5

▲

▲
■
●

0

0

■
●
▲

60

■

20

●
▲

■
●
▲

80

40

20
▲

100

60

■
▲

C12E8

■
●
▲

80

■
●

40

0
0

HTAC

■
●
▲

1

■

40

●
▲

20

■
●
▲

2

3

●
■
▲
4

■
●
▲
5

0

0

■

1

●

■

▲

●
▲

2

3

■
●
▲
4

■
●
▲
5

2

Irradiation dose (J/cm )Fig.14 Conversion of cysteine as a function of irradiation dose

酸化されたことを意味するが、バルク水溶液に比べ、Wo ＝ 20 の AOT 逆ミセル系では顕著に進行
cystine への酸化であることを薄層クロマトグラ
フィーにより確認した。また紫外線の種類による減少率の違いは個々の紫外線がもつエネルギーの差によると考えられる。すなわち、UV のエネル
ギーが大きいほど酸化しやすいことを示している。
また逆ミセルでは 20J/cm2 照射で３種類の紫外線とも SH 基減少率が 90％以上となったが、線量依存性があることも確認した。この結果は cysteineの変化に AOT 逆ミセルの water pool が重要であることが示唆された。
Fig. 14 に示したように 0.2MAOT 逆ミセル（Wo＝ 20）では UVA および UVB2J/cm2 照射時にほぼ 50％の減少率となり、UVC に対してはさらにResidual cysteine (% of control)

することは大変興味深い。この反応が cysteine の

100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0

UV-A:2J/
UV-B:2J/
UV-C:0.5J/

AOT

HTAC

C12 E 8

3

5

7

10

15

20

30

Wo
Fig.15

Conversion of cysteine in reversed micellar solution of various Wo
by UV-irradiation

0.2MHTAC 逆ミセル（Wo ＝ 20）の場合は 2J/cm2 照射時が大きくなるすなわち自由水の割合が増加するとともにに UVA で約 60％、UVB では 90％以上の減少率を示した。

cysteine の SH 基減少率が低くなり光重合が進行しにくい

UVC 照射では 1J/cm 照射でもかなり反応が進行していた。

ことが判明した。これは逆ミセル溶液は圧倒的に有機溶媒

非イオン性の 0.2MC12E8 逆ミセル（Wo ＝ 20）の場合は 2J/が多い状態であるにもかかわらず、内殻水の状態により SH

cm 照射時に UVA は約 40％、UVB では約 70％の減少率

基減少率に差があったことを意味する。このことよりこのを示し、UVC ではほとんど cysteine が酸化されていた。こ反応は有機相より水相が重要であること即ち結合水が重要の結果より、紫外線の場合 HTAC ≧ AOT >C12E8 の順にであることが確認された。従って Wo の増加とともに反応

cysteine の変化が起こりやすいと言える。この反応が静電率が低下するのは cysteine が自由水中に多く存在すること

場により影響を受けていることを示唆した。

により、反応が進行しにくくなるためと推測された。同じ減少率が高くなり、1J/cm2 照射でほぼ反応が終了
していることが観察された。一方、陽イオン性の22

このように cysteine の UV による酸化には膜界面の関Wo 値でも検討した界面活性剤によっても SH 基減少率に差与が示唆されたので、さらに膜界面の水の状態および膜が確認された。全体的に見て HTAC ≧ AOT >C12E8 の順に電荷の影響について検討した。以下の実験では UVA およ

反応が起こりやすいことが観察された。この結果も前述しび UVB では 2J/cm 、UVC では 0.5J/cm の線量で行った。

たように電荷が関与していることを示しており、cysteine22

Wo 値を変えて水の状態の影響を、AOT、HTAC、C12E8 界の逆ミセル界面での配向の仕方が影響していると推測され面活性剤の逆ミセルについて膜電荷の影響を検討した（Fig.

る。また紫外線で同じ Wo 値の UVA と UVB を比較した場

15）。界面活性剤の種類、紫外線の種類に関係なく、Wo

合には UVB の方がより反応を進行させた。

− 10 −

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

逆ミセルの内殻水中の cysteine の存在場所は、

100
UV-A:2J/いると考えられるが、逆ミセルの界面の電荷により cysteine の配向は若干異なっていると推測される。いずれにしても SH 化合物が膜界面に多く存在すればより反応は進行しやすいと考えられる。そこで長いアルキル側鎖による疎水性のために逆ミセルの膜界面に多く存在すると推測される n—dodecanethiol を用いて検討した（Fig.
16）。紫外線によって cysteine とは逆に Wo が大Residual cysteine (% of control)

両性の電荷を持つためおそらく均一に存在してUV-B:2J/80

UV-C:0.5J/

60

40

20

きくなると SH 基減少率が高くなった。これはWo が小さい場合は膜界面に出ている SH 基が少0ないために反応率が低下し、Wo が大きくなると
内殻水のサイズが大きくなり、膜界面の SH 基が増加したために反応率が高くなったと考えら

3

5

7

10

15

20

30

Wo

Fig. 16 Conversion of 1-dodecanethiol in AOT reversed micellar solution ofvarious Wo by UV-irradiation

れた。n—dodecanethiol の反応率が cysteine に比機溶媒（Isooctane）中に存在しているためと考えられる。
このことは n—dodecanethiol を Isooctane または Methanolに溶解させて、同様に紫外線や放射線を照射して SH 基の変化を検討したが、ほとんど SH 基の減少は見られなかったこのことからも確かめられた。これらの結果はさらに結合水の存在の重要性とともに膜界面の必要性を示した。
以上より逆ミセル中 cysteine の SH 基がで紫外線によって酸化され、主として cystine が生成することが明らかとResidual cysteine (% of control)

べて相対的に低いのは n-dodecanethiol のかなりの量が有control80

素が生成することが報告されている 26 〜 29）。活性酸素の生成には溶存酸素が必要であると考えられるので、まず使N2 substitution

**

*

*

**

**

60

*

***

40

**

20

なった。紫外線照射によって一重項酸素、過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、水酸化ラジカルなどの活性酸

Wo=20

Wo=7

100

0

UV-A UV-B UV-C γ-Ray

UV-A UV-B UV-C γ-Ray*:p<0.001**:p<0.01

Fig.17 Effect of nitrogen substitute on conversion of cysteine
in AOT reversed micelles by UV irradiation

用する溶媒を窒素置換して溶存酸素の影響を調べた。Fig.

100
Residual cysteine (% of control)

17 から明らかなように Wo が 7 および 20 のいずれにおいても、SH 基減少率の低下が確認された。従ってこの
cysteine の変化に酸素が関与していることが示唆された。
また一般的に膜界面には溶存酸素が安定的に存在するとされているので、Wo ＝７のとき回復の割合が Wo ＝ 20 に比べて低いのは、今回行った窒素置換条件では十分に溶存酸素が除去できなかったものと考えられた。
次に一重項酸素の関与をクエンチャーである NaN3 を用いて検討した。UVA、UVB、UVC 共に Wo ＝７および

80

UVC、放射線照射によって一重項酸素は生成しないと考

Wo=20

100

H2O
NaN3 50mM

80

60

60

40

40

20
0

20 で SH 基減少率の低下が観察された（Fig. 18）
。UVB、

Wo=7

20

*
UV-A

UV-B

*

UV-C

0

UV-A

UV-B UV-C*:p<0.05

Fig.18 Effect of NaN3 on conversion of cysteine in AOT
reversed micelles by UV irradiation

えられているので、NaN3 による SH 基減少率の低下はこの試薬が他の生成した活性酸素種を阻害したことによるものと推測している。一例としてハイドロキシラジカル

紫外線でも SH 基減少率が低下した。Wo ＝ 7 と 20 では（OH ラジカル）を阻害することが報告されている。そこ

Trolox の作用に差は認められなかった。これらの結果はでその他の活性酸素の影響をまず親水性の抗酸化剤であ

逆ミセル内殻水に存在する抗酸化剤はある程度活性酸素のる Trolox の作用について検討した（Fig. 19）。いずれの発生を抑制することを示した。さらに疎水性の抗酸化剤− 11 −

Wo=7

Residual cysteine (% of control)

100

control
80

Trolox 5mM

80

明した。
*
*

２）PNPase の酵素活性発現には膜の電荷により、金属触媒の作用は強く依存し、エチレンオキサイド鎖をもつ*

C12E8 逆ミセル系では、Fe3+ が有効に作用し、さらに温

60

60

*

40

度を上昇することにより、エチレンオキサイド鎖の結合

*

40

*
20
0

傍の結合水は HK の酵素活性発現に有利に働くことが判

Wo=20

100

UV-A

UV-B

UV-C

水の状態を制御し、高分子の poly（A）を沈殿させ、単離しやすくできる系であることが判明した。

200３）膜界面の結合水は紫外線により発生した活性酸素の寿命を長くしチオール化合物を容易に酸化することを明ら
UV-A

UV-B

かにし、in vitro のモデル実験は膜蛋白質の SH 基が紫UV-C*:p<0.001

外線により容易に酸化され、膜蛋白質の構造や生体膜のFig.19 Effect of Trolox on conversion of cysteine in AOT reversed
micelles by UV irradiation

状態を変化させ、情報伝達などに影響を与えることを支持した。

である vitamine E は有機溶媒中あるいは膜界面近くに存在すると考えられる。Fig. 19 から明らかなように、UVA、

謝辞

UVB、UVC に対して顕著に SH 基減少率の低下を示した。

本研究は静岡県立大学大学院生活健康科学研究科五島廉

特に Wo ＝ 7 においては Trolox より強く作用している傾輔教授、伊吹裕子助手とそのグループとの共同研究でな向が観察された。従って活性酸素は主として膜界面近傍でされたものであり、ここに謝意を表する。

多く発生すると推測された。
無生物系への紫外線照射によっても活性酸素が発生する（参考文献）

ことが観察され、その発生には膜界面、結合水、電荷など

１）五島綾子 , 逆ミセル内殻水の性質 , 表面 , 32,96(1993).

が重要な点であることが示された。このことは生体膜にお２）A. Goto and H. Kishimoto, J. Chem. Soc. Perkin Trans.

いても膜界面に存在する SH 基を持つ蛋白質成分が、紫外

2, 1990, 73.

線照射によって影響を受けやすいことを示唆した。

３）A. Goto and H. Kishimoto, J. Chem. Soc. Perkin Trans.

４．結2, 1990, 891.

論４）A. Goto, H. Yoshioka, H. kishimoto, T. Fijita, Langmuir,8, 441(1992).

in vivo の脂質界面の水の性質や電場効果が生理作用とどのように関わるかは重要な課題であるが、in vitro でそ５）A. Goto, S. Harada, T. Fujita, Y. Miwa, H. Yoshioka, andH. Kishimoto, Langmuir, 9, 86(1993).

のモデル実験を構築することはむずかしい。我々グループの研究対象である逆ミセルの water pool の水分子は動６）A. Goto, H. Yoshioka, M. Manabe, and R. Goto,
Langmuir, 11, 4873(1995).

的な柔らかい単分膜に包まれ、Wo が低い領域では界面活性剤の親水基とその対イオンの結合水として存在するが、

７）A. Goto, Y. Kuwahara, S. Suzuki, H. Yoshioka, R. Goto,

Wo がある大きさを超えると、water pool の中央に自由水

H. Iwamoto, and T. Imae, J. Mol. Liquid, 72, 137(1997)が出現するようになる。従って Wo を連続的に変化させる

８）P. Walde, A. Goto, p-A. Monnard, M. Wessicken, and P.
L. Luisi, J. Amer. Chem. Soc., 116, 7541-7547(1994).

と結合水と自由水の割合を制御でき、その上、極性や電場も制御可能であり、脂質界面の水の性質や電場効果が生理

９）A. Goto, K. Hakamda, Y. Kuwabara, R. Goto, P. Walde,

機能との関わりについての知見が期待される。本研究ではP. L. Luisi, and T. Imae, Prog. Colloid & Polymer Science,

脂質界面の水の性質や電場効果が酵素反応に与える影響と106, 245(1997).

紫外線照射に活性酸素の発生への影響を逆ミセルを用いて

10）A. Goto, R. Goto, Y. Kuwahata, H. Hakamada, Y.
Ibuki, P. Walde, P. L. Luisi, and T. Imae, Langmuir, 14,

検討した。

3454(1998)

その結果、以下の点が明らかにされた。
１）in vivo の研究で膜界面や水の性質に大きく依存する11）Y. Kuwahara, A. Goto, Y. Ibuki, K. Yamaguchi, and R.
Goto, J. Colloid Interface Sci., 233, 190(2001).

と推測される HK については、逆ミセルを用いて明らかにすることができた。すなわち強い電場は基質や酵素の12）K. C. Pedley, G. E. Jones, M. Magnani, R. J. Rist, and R.
J. Nabtalin, Biochem. J. 291, 515(1993).

局所的位置を大きく変化させ、特に負電荷の膜は HK の活性発現に好ましくない。またエチレンオキサイド鎖近13）P. G. Plokis, J. E. Wilson, Arch. Biochem. Biophys.

− 12 −

逆ミセルを用いた水の構造化とその機能性に関する研究

236, 328 (1985).

Yamada Conference L. 1999.

14）R. M. Lynch, K. E. Forarty, F. S. Fay, J. Cell Biology,
112, 383(1991).

22）K. Beljanski, J. Mol. Evol., 42, 493(1996).
23）R. Goto, H. Goto Y. Ibuki, A. Goto, 13th International

15）A. E. Aleshin, H. J. Fromm, R. B. Honzatko, FEBS

Congress on Photobiology and 28th Annual Muting

Letter 434, 42(1998).

American Society for photobiology, July, 2000, San16）D. Ardail, J-P. Privat, M. Egret-Charlier, C. Levrat, F.
Lerme, and P. Louisot, J. Biol. Chem. 265, 18797(1990).

Francisco24）Rossette, C. and Karin, M., Science, 274, 1194(1996).

17）E. A. -Foucher, B. Fonte, D. C. Gautheron, Arch.

25）Knebel, A., Rahmsdorf, H. J., Ullrich, A. and Herrlich, P.,

Biochem. Biophys. 232, 391(1984).

EMBO J., 15,18）K. Martinek N. L. Klyyacho, A. V. Kavanov, Y. L.
Khmelnitsk, A. V. Levasov, Biochim. Biophys. Acta, 981,
161(1989)

5314(1996).

26）McCormick, J. P., Fischer, J. R., Pachlatko, J. P. andEisenstark, A., Science, 191, 468(1976).
27）Horio, T. and Okamoto, H., J. Investi. Dermat., 88,19）Z. M. Zhu, K. I. Feng, Z. A. Schelly, J. Phys. Chem. 96,
2382 (1992).

699(1987).
28）Tyrrell, R. M. and Pidoux, M., Photochem. Photobiol., 49,20）S. P. Moulik, M. L. Das, P. K. Bhattacharya, A. R. Das,
Langmuir, 8, 2315(1992).

407 (1989).
29）Masaki, H., Atsumi, T. and Sakurai, H., Biochem.

21）A. Goto, H. Suzumori, Y. Ibuki, K. Yamazaki, and R.
Goto, "Polyelectrolytes" edited by I. Nodaand E. Kokufuta,− 13 −

Biophys. Res. Commun., 206, 474(1995).