Agilent BioHPLC カラムと消耗品
生体分子分析に最適アジレントのすべてをお客様のもとに世界中のあらゆるラボ、あらゆる場面で。

サービス、消耗品、ラボ全体のリソース管理から構成される CrossLab は、ラボの効率の向上、運用の最適化、機器の稼働時間の延長、ユーザースキルの開発などを支援します。

Agilent CrossLab は、アジレント機器だけでなく主要な他メーカーの機器もサポートしています。また、ワークフローの実現、ラボ解析、コンプライアンス、在庫管理、移設
サービスを含めた資産管理のためのコンサルティングサポートを提供しています。

Agilent CrossLab の詳細と、「見えない価値」が優れた成果を生み出した例について
は、ホームページをご覧ください。www.agilent.com/crosslab

CrossLab ストーリーでは、お客様を支えるアジレントの具体的な活動をご覧いただ
けます。

CrossLab リアルストーリー

Agilent CrossLab サービスのエンジニア
は、お客様とのあらゆるやり取りの中から見えない価値を引き出そうと努めることで、効率性の改善、リソースの最適化、連続稼働

時間の最大化、ユーザースキルの向上をお手伝いします。Agilent CrossLab が世界中のお客様に知見と価値をお届けした事例をご紹介します。

www.agilent.com/chem/
crosslabstories

2

Agilent BioHPLC カラム

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目次
1 バイオカラム選択 ガイドライン

進化し続ける生物製剤の特性解析という課題
生体分子とはバイオカラムとは

カラム選択フローチャート

アデノ随伴ウイルス（AAV）分析

2 生体分子の分離タンパク質の分離
グリカン分離ペプチド分離アミノ酸および培地の分析
アミノ酸

アデノ随伴ウイルス（AAV）

DNA および RNA オリゴヌクレオチドの分離

3 バイオ医薬品分析のための機器

アジレントが提供する包括的なワークフローソリューション

1260 Infinity II バイオイナート LC システム
1260 Infinity II Prime Bio LC システム
1290 Infinity II Bio LC システム
1290 Infinity II Bio 2D-LC システム
1260 Infinity II Bio-SEC システム
1260 Infinity II マルチ検出器 GPC/SEC システム
1290 Infinity II Bio 分析スケール LC 精製システム
1260 Infinity II Prime Bio 分析スケール LC 精製システム
Load & Lock 分取用 HPLC カラム
6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF システム
6230B 飛行時間型（TOF）LC/MS
MassHunter BioConfirm ソフトウェア
OpenLab ソフトウェアスイート
InfinityLab LC 消耗品

4 クロマトグラフィーを使ったインタクトタンパク質分析
逆相および 疎水性相互作用

インタクトまたはサブユニットレベルでのタンパク質の不純物分離に必要な選択性と分離能
逆相

逆相分離用カラムの選択肢

疎水性相互作用クロマトグラフィー

親水性相互作用液体クロマトグラフィー

AdvanceBio RP-mAb
PLRP-S
AdvanceBio 脱塩 RP カートリッジ
ZORBAX 300 Å StableBond
ZORBAX 300 Å Extend-C18
Poroshell 300
ZORBAX 300 Å HILIC

疎水性相互作用クロマトグラフィーによるインタクト分析

AdvanceBio HIC
製品の詳細情報

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5
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38
45
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52
55

5 ペプチドのマッピングと分析

アミノ酸配列、翻訳後修飾、および合成関連の不純物を正確に判断

AdvanceBio ペプチドマッピング
CrossLab リアルストーリー

アジレントのペプチド品質管理用標準試料

AdvanceBio ペプチドプラス
製品の詳細情報

6 電荷変異体の分析

タンパク質およびその他の荷電分子の精製

60
60
61
63
65
65
71

72

IEX による電荷変異体の分析
Bio MAb HPLC カラム
Bio IEX HPLC カラム
PL-SAX 強アニオン交換カラム
PL-SCX 強カチオン交換カラム
バイオモノリスイオン交換 HPLC カラム

72
72
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84
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88
90

7 凝集およびフラグメントの分析

95

製品の詳細情報

生体分子の凝集とフラグメンテーションの正確な測定

アプリケーションに適した SEC カラムの選択

AdvanceBio SEC
CrossLab リアルストーリー
Bio SECPROTEEMA カラム
MAB
SEC のタンパク質標準
製品の詳細情報8 グリコシル化の特性解析

N-グリカンのサンプル前処理
AdvanceBio シアル酸のプロファイリングと定量
Glycobiology 標準およびライブラリ
糖鎖生物学酵素

AdvanceBio Glycan マッピングカラム
親水性ペプチドと糖ペプチドの分析
製品の詳細情報

9 抗体価測定

95
95
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134

バイオモノリス HPLC カラム

堅牢で確実な抗体価測定

134
139
141

10 細胞培地とアミノ酸の分析

142

製品の詳細情報アジレントの細胞培地分析ソリューション

AdvanceBio アミノ酸分析（AAA）
AdvanceBio アミノ酸分析標準およびキット
AdvanceBio MS スペントメディア
製品の詳細情報

143
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145
146
149
（続く）

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www.agilent.com/chem/jp3

目次（続き）11 タンパク質除去

アジレントのタンパク質分画システムとプロテオミクス用試薬

マルチプルアフィニティ除去システム

マルチプルアフィニティ除去システムスタータキット

製品の詳細情報12 オリゴヌクレオチド
はじめに

DNA および RNA オリゴヌクレオチドのカラムの選択

イオンペア逆相分離

強アニオン交換製品の詳細情報13 ベクターベースの医薬品分析

インタクトベクターから 1 つのアミノ酸の修飾までの特性解析
カプシドタンパク質の同定確認

アデノ随伴ウイルスの空の AAV カプシド/フル AAV カプシドの分析
ベクターベースの治療薬の凝集体分析

製品の詳細情報

4

Agilent BioHPLC カラム

14 メソッド開発のガイドライン

151

一次構造の分析メソッド

151
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154

逆相 LC/MS メソッド

電荷変異体の分析メソッド

Agilent Buffer Advisor ソフトウェアによる電荷変異体の分析メソッド
凝集およびフラグメントの分析メソッド

オリゴヌクレオチド分析

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アデノ随伴ウイルス（AAV）分析

156
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166

グリカンおよび親水性/糖ペプチド分析

抗体価の測定と細胞培地の最適化メソッド
高感度キャピラリーカラムのメソッド

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15 アジレントのソリューション

196

16 アジレントのサービスとサポート

200

バイオカラム選択ガイドライン 1

バイオカラム選択ガイドライン
進化し続ける生物製剤の特性解析という課題

生物製剤は、健康促進のための大きな可能性を秘めています。この重要な薬効分類が、これまでにない医学上のニーズに対応するために、治療用タンパク質および抗体の承認数は世界中で増え続けています。ただし、バイオ

医薬品の発見と開発は容易ではありません。科学者は多くの課題に直面しており、知識の進化や技術の向上に関する最新情報を把握するだけでなく、複雑な政府規制の変遷にも対応する必要があります。このため正しい判断を迅速に下すことが重要です。アジレントは、疾病研究から QA/QC、製造までのプロセスのあらゆる段階で、治療法を適切に市場に投入するうえでの正しい選択を支援しています。これは、正確で再現性の高い結果を生み出す信頼性の高い機器と消耗品だけによるものではありません。アジレントはバイオ医薬品のワークフローを理解し、研究、発見、開発のエンジンとしてシームレスに連携して機能する製品ファミリーを提供することで、バイオ医

薬品の候補物質の研究に貢献しています。

タンパク質バイオ医薬品が非常に不均一であるという前提に基づき、多くのクロマトグラフィーメソッドによって医薬品有効成分（API）を正確に特性解析する必要があります。メソッドとしては、二量体と凝集体の定量用のサイズ排除クロマトグラフィー、電荷変異体の分析用のイオン交換クロマトグラフィーなどがあります。完全な特性解析の一部として、一次アミノ酸配列と、精製や製剤の段階で発生しうる配列への翻訳後修飾も調査の対象です。アジレントは、主要な特性解析ワークフローで完全かつ再現性の高い高品質な分析を実現するため、幅広
い種類のカラムと消耗品をご用意しています。

生物製剤の特性解析をシンプルにするアジレントのソリューション

本書は、特性解析ワークフローに適したカラムを見つけることができる包括的なガイドです。メソッド開発、溶媒選択、移動相修飾、最適化、および多くの分離例についてのアドバイスやヒントも含まれていますので、カラム選
択やメソッド開発にお役立てください。

アジレントは、お客様のニーズに適したあらゆるソリューションをご用意しています。このような製品ラインには、
サンプルパスに金属を使用しない Agilent 1260 Infinity II バイオイナート LC、UHPLC アプリケーションに最高の速度や分離能、超高感度を提供するように設計された Agilent 1290 Infinity II LC などがあります。構造が複雑な生体分子でも、Agilent HPLC カラム、システム、消耗品を使用すれば分析が容易です。

ヒントとツール
バイオカラムポートフォリオ全般のアプリケーションの例については、重要品質特性のアプリケーション総覧（5991-9072JAJP）をご覧ください。

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5

1 バイオカラム選択ガイドライン

生体分子とは

生体分子は、生きた組織で生成される化合物です。生体分子には、アミノ酸や低分子脂質、さらに DNA や RNA などの高分子ポリヌクレオチドなど、さまざまなサイズがあります。

重鎖

このセクションでは、次の分離について説明します。
タンパク質

サイズ排除クロマトグラフィーによるサイズ、イオン交換クロマトグラフィーによる電荷、および逆相または疎水性相互作用クロマトグラフィーによる疎水性に基づく分離。

軽鎖

s

s

s

s

Fab
グリコシル化部位

ペプチド

全範囲のペプチド（全サイズ範囲の疎水性、親水性、塩基性、および酸性ペプチドを含む）の分析および精製用のバイオカラム。ならびに HPLC と UHPLC によるペプチドマッピング

用カラム。

アミノ酸

AdvanceBio AAA カラムにより、24 種類のアミノ酸について高効率の分析ソリューション

を提供。通常の分析時間は 75 mm カラムで 14 分、150 mm カラムで 24 分です。

DNA/RNA オリゴヌクレオチド

DNA および RNA オリゴ用の逆相およびイオン交換オプションに対応。さらに、粒子ポアサ

イズにより全サイズ範囲のオリゴヌクレオチド（小さな合成オリゴから大きなプラスミドまで）に対応。

アデノ随伴ウイルス （AAV）

一本鎖 DNA ゲノムをカプセル化する 20 面体のタンパク質の殻からなる、大きな分子複合体。製品全体の品質と安全性を確保するためには、タンパク質カプシドとカプセル化された DNA それぞれに、専用の分析技術が必要。

6

Agilent BioHPLC カラム

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Fc

モノクローナル抗体

バイオカラム選択ガイドライン 1

バイオカラムとは
バイオクロマトグラフィーカラム（バイオカラム）は、 ペプチドとタンパク質、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド、およびその他の生体分子と複合体などの生体化合物の分離に使用される液体クロマトグラフィーカラムです。バイオカラムは生体分子の分析に特化した大きいポアサイズで設計されているため、より大きな分子サイズにも対応できます。メディアは成分の非特異的な結合を最小化できるように設計されているため、回収率が向上します。分離メカニズムを選択して、生物学的機能を維持して分析中に生理活性が失われないようにするか、あるいはこれを一次構造特性解析用に意図的に変性させるかします。

アジレントのバイオカラムなら、生体分子分析に必要な、あらゆる主要な特性解析手法に対応できます。例えば、次のような手法です。

抗体価の測定電荷変異体の分析術を使用して、抗体価の測定と細胞株の最適化を析用に最適化されたケミストリ（正確なアイソフォーム

Agilent バイオモノリスプロテイン A などの独自技実行します。

Agilent イオン交換カラムには、モノクローナル抗体分

分析用の Bio MAb および Bio IEX など）が含まれます。

逆相によるインタクトおよびサブユニットの純度

糖鎖分析

PLRP-S などの主要技術を使用することで、一次構（HILIC）カラムによって、正確で再現性の高い糖

AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 Å、Agilent 親水性相互作用液体クロマトグラフィー

造特性解析や、インタクトタンパク質または断片化

鎖および糖ペプチド分析が可能です。

されたタンパク質の分析において、信頼性の高い結果を得ることができます。

アミノ酸と細胞培地の分析

AdvanceBio AAA による LC/UV ベースのワークフ

疎水性相互作用によるインタクト分析

ロー、または AdvanceBio MS スペントメディアにAdvanceBio HIC カラムによって、mAb 中の酸

よる LC/MS ベースのワークフローを用いて、細胞化（翻訳後修飾）や抗体薬物複合体（ADC）

培地の重要な成分を分析します。

で見られる薬物抗体種などのさまざまなタンパ
ク質変異体を分離します。

オリゴヌクレオチド分析

DNA/RNA 分析用の堅牢で効率性の高いソリューションです。

ペプチドマッピング

AdvanceBio ペプチドマッピングを用いて、消化されたタンパク質サンプル中の主要な翻訳後修

飾を検出および同定します。

アデノ随伴ウイルス （AAV）

インタクトカプシドタンパク質と翻訳後凝集体とフラグメントの分析

AdvanceBio SEC を用いて、凝集体（二量体、三量体、四量体など）を正確に測定し、分子量の大きいタ

ンパク質から低分子賦形剤や不純物を分離します。

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修飾（PTM）向けに最適化された逆相ソリューション。フルカプシドと空カプシ

ドの強アニオン交換分析、および凝集体とフラグメントの分析のための SEC として使用できます。

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7

1 バイオカラム選択ガイドライン
カラム選択フローチャート

生体分子アプリケーションに最適なカラムを選択するには、以下のフローチャートに記載されているページをご覧ください。

生体分子の分離に最適なカラムの選択は次の手順で行います。まずは分子サイズを確認します。分子サイズによって、分離に使用する HPLC メソッ

ドのポアサイズが決まります。次に、分子の溶解性を考慮します。その後で、分離メカニズム、サイズ、疎水性、電荷を確認します。

一次構造の
分析

電荷変異体の分析

モノクローナル抗体
または
その他のタンパク質

凝集およびフラグメントの分析

参照：72 ページ

親水性相互作用液体

クロマトグラフィー（HILIC）

抗体価の測定プロテイン A

（アフィニティ）

マルチプルアフィニティ除去

タンパク質除去

Agilent BioHPLC カラム

イオン交換（IEX）

クロマトグラフィー（SEC）

特性解析

8

参照：26 ページサイズ排除

グリコシル化のオリゴヌクレオチド

逆相カラム（MARS）

参照：117 ページ

参照：134 ページ

参照：151 ページ

RP

参照：158 ページ

アニオン交換参照：164 ページ

不純物分析

目次に戻る

参照：95 ページ

バイオカラム選択ガイドライン 1

アデノ随伴ウイルス（AAV）分析
インタクト

カプシドタンパク質の

ID 確認

タンパク質

ペプチド

マッピング

（PTM）

AAV
空/フル
分析

凝集体
分析

ワイドポア

逆相

ナローポア

逆相

参照：172 ページ

参照：172 ページ

イオン交換

参照：175 ページ

SEC

参照：177 ページ

ヒントとツール
アジレントコミュニティは、質問への回答や実践的なアドバイスをアジレントのエキスパートや他のユーザーから受けられる、貴重なオンラインリソースです。生体分子の分離に関するベストプラクティスやトラブルシューティングのヒントを見つけるには、このコミュニティで「AdvanceBio Blog」を検索してください。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp9

1 バイオカラム選択ガイドライン
Agilent AdvanceBio カラム
Agilent AdvanceBio カラムは、モノクローナル抗体とその他のインタクトタンパク質、SEC による凝集体、IEX による電荷変異体、逆相によるインタクト質量、一次構造、翻訳後修飾（PTM）の特性解
析、および親水性相互作用液体クロマトグラフィーによる切断グリカン分析を、高精度で高速に実行できるように設計されています。

このガイドでは、すべての Agilent バイオカラムポートフォリオの詳細と、生物製剤の正確な特性解析に適した AdvanceBio ファミリー製品の選択について説明します。

ヒントとツール
お客様の特性解析のニーズに適した AdvanceBio ファミリーのカラムおよび各種ツールについては、ホームページをご覧ください。

10

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る生体分子の分離

2

生体分子の分離タンパク質の分離タンパク質は複雑な分子で、完全な特性解析には複数の手法が必要です。タンパク質は三次元構造
として存在し、これらの構造によって生物活性がもたらされます。

アミノ酸鎖のシーケンスがタンパク質の一次構造を定義します。続いて一次構造のアミノ酸間の水素結合によって二次構造が生まれます。二次構造は通常、アルファヘリックスとプリーツシートの形状です。さらに二次構造の領域間の一連の相互作用、水素結合、イオン性、疎水性、およびジスルフィドブ

リッジによって、三次タンパク質構造または三次元構造が生まれます。タンパク質がいくつかのアミノ酸鎖で構成される場合、これらの鎖間の相互作用によって四次構造が生まれます。

このため図 1 からわかるとおり、タンパク質の特性解析メソッドを検討する場合は、三次構造や四次構造を破壊せずに未変性状態のままタンパク質を特性解析する手法が必要です。また、三次元構造をなくした完全な変性状態で一次アミノ酸配列を評価する手法も必要です。

タンパク質の一次構造

アミノ酸の配列です。

アミノ酸

水素結合
プリーツシート

アルファヘリックス

プリーツシート水素結合

イオン性相互作用

疎水性相互作用ジスルフィドブリッジ

アルファヘリックス

タンパク質のニ次構造

アミノ酸の配列が水素結合によって結合されると発生します。

タンパク質の三次構造

アルファヘリックスとプリーツシートの間に特定の引力が存在すると発生します。

タンパク質の四次構造

複数のアミノ酸鎖で構成されるタンパク質です。

さまざまなレベルのタンパク質構造の概略図

目次に戻る

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2 生体分子の分離
タンパク質の分離での注意事項

タンパク質の環境によって、この構造が影響を受けたり、安定化または破壊されたりする場合があります。考慮すべき要素としては、pH、温度、塩

濃度、水性溶媒や有機溶媒の含有量、および一部のタンパク質では安定化した低分子や金属イオンの存在などがあります。またタンパク質構造は、-S-S- 結合を破壊するスルフヒドリル還元剤や、尿素またはグアニジン HCI などのカオトロピック試薬を使用することで破壊される場合もあります。
三次元構造を決定するタンパク質と分子内相互作用は複雑であるため、タンパク質分子とその他の個々の分子およびそれらの接触面との間で分子間結合が発生することも予測できます。この結果、（HPLC カラムおよびシステムの表面を含む）表面にタンパク質の複合体、凝集体（場合により沈殿物を含む）、堆積物が発生する場合があります。したがって、タンパク質が維持される処理と環境を考慮する必要があります。

タンパク質のカラムセレクションガイド

アプリケーション

手法

アジレントのカラム

注意事項

一次構造の分析UHPLC/HPLC 逆相

AdvanceBio RP-mAb

逆相分離では、タンパク質の変性によってアミノ酸配列とアミノ酸修飾（翻訳後修飾を含む）に関する分離

PLRP-SZORBAX RRHD 300 Å

詳細情報を取得します。

Poroshell 300 Å
ZORBAX 300 ÅAdvanceBio ペプチドマッピング
電荷変異体の分析

イオン交換分離

Agilent Bio IEXAgilent Bio MAb
PL-SAX
PL-SCX

凝集およびフラグメントの分析
グリコシル化のサイズ排除分離

Bio SEC-3
Bio SEC-5

親水性相互作用液体

特性解析

クロマトグラフィー

抗体価測定

アフィニティ分離

タンパク質除去

AdvanceBio SEC

アフィニティ精製

AdvanceBio グリカンマッピング
ZORBAX RRHD 300 HILIC
バイオモノリスプロテイン A

バイオモノリスプロテイン G

MARS Human-14
MARS Human-7
MARS Human-6

個々のアミノ酸の比率によって、タンパク質分子の正味電荷が決まります。正味電荷がゼロの pH は等電点（pI）と呼 ばれます。溶媒の pH が pI 未満であるとタンパク質が正電荷（酸性）になり、溶媒のpH が pI を超えるとタンパク質が負電荷（塩基性）になります。イオン交換分析では、溶出液の pH と

pI を 1 pH 単位以上離すことを推奨します。イオン交換カラムによるタンパク質分析には、緩衝液入り
移動相と、溶出用の塩グラジエントまたは pH グラジエントが必要です。

タンパク質バイオ医薬品の主な懸念事項は凝集体です。凝集体によって免疫原性反応が引き起こされ、最終的な製剤の組成に影響する可能性があるためです。

免疫原性の影響とバイオ医薬品の安全性のため、タンパク質と mAb のグリコシル化とグリカン構造を理解することの重要性が高まっています。HILIC クロマトグラフィーではサンプルの親水性部分が維持されるため、逆相カラムにオーソゴナルな情報が提供されます。

高コストの分取や大量のプロテイン A を使用する際に細胞培養上清のモノクローナル抗体の力価と収率をモニタリングするには、小規模（分析スケール）の手順を使用して、モノクローナル抗体の力価を測定し、モノクローナル抗体を採取する最適な時間を特定する必要があります。

生体サンプルから高濃度タンパク質を除去します。高濃度タンパク質を除去することで、分析のダイナ

ミックレンジが効果的に広がり、後続の LC/MS 分析や電気泳動分析の感度が向上します。

MARS Human-6 大容量
MARS Human-2
MARS Human-1
MARS Mouse-3

12

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る生体分子の分離

2

グリカン分離グリカンプロファイリング

バイオ医薬品の特性解析にはグリコカン分析が必要です。グリコシル化パターンが最終製品の安全性と効能に影響する可能性があるためです。

インタクト糖タンパク質は PNGase F などの酵素によって処理され、タンパク質からグリカンが切断されます。次に蛍光色素によってグリカンがラベル化されます。グリカンは本来 UV や蛍光によって目視できな
いためです。次のラベリング、クリーンアップ手順を実行して、サンプル混合液から過剰な試薬と脱グリコシル化タンパク質を除去します。精製および遊離されたグリカンサンプルの分析方法としては、蛍光または

質量分析検出による親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）が最も一般的です。

クロマトグラフィープロファイルは糖タンパク質の開始サンプルごとに特有のものであり、複雑さが大きく異なる可能性があります。AdvanceBio グリカンマッピングカラムは、短時間での高分離能分離に最適です。

s

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s

s

ペプチド分離ペプチドマッピング

ペプチドマッピングは、タンパク質の特性解析に必要です。ペプチドマッピングは、タンパク質の同定と、翻訳後修飾の同定および定量に使用されます。

精製されたタンパク質はまずトリプシンなどの酵素によって消化され、さまざまなペプチドフラグメントが生成されます。酵素切断の特異性によって、タンパク質に特有のペプチドのフィンガープリントができます。
ペプチドフラグメントの同定によってタンパク質を同定し、 ペプチド分解物のプロファイルの変化を使用して、製造または精製プロセス中に発生した可能性があるタンパク質への翻訳後修飾を同定できます。

逆相 UHPLC/HPLC は、MS または UV 検出によるペプチド分解物の分析に適した技術です。LC/MS は、
ペプチドフラグメントの同定と配列カバー率の測定に使用されます。LC/UV は一般的にモニタリング/QC

セグメントのペプチドマッピングの比較に使用されます。

ペプチド分解物は複雑な混合物であり、完全にカバーするには （つまり個々のペプチドを分離するには）

高効率/高分離能カラムが必要です。AdvanceBio ペプチドマッピングカラムは、タンパク質同定および翻訳後修飾の特定に役立つ高分解能のペプチドマップが得られるように設計されています。タンパク質の一次配列に含まれるアミノ酸の置換/修飾をすばやく分離し、同定することができます。

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2 生体分子の分離
アミノ酸および培地の分析

生物製剤タンパク質の作製中に細胞培地をモニタリングし、作製タンパク質の発現に適した栄養素のバラ

ンスとレベルが維持されるようにします。アミノ酸はタンパク質の構成要素であり、重要な原料成分である
ため、作製プロセス中にモニタリングして調整する必要があります。アミノ酸は極性化合物の多様性のある 1 グループです。すべてのアミノ酸がアミンとカルボン酸官能基を持つグループと類似した構造骨格を共有していますが、側鎖の構造は異なり、塩基性、非極性（疎水性）、極性非荷電、酸性などがあります。

これらの異なる物理化学的性質がクロマトグラフィーによる分析を困難なものにしていますが、アジレントの AdvanceBio ソリューションはさまざまな方法でこの難問に対処します。AdvanceBio アミノ酸分析カラムと誘導体化試薬キットにより、信頼性と再現性の高い逆相クロマトグラフィーソリューションを得られます。一方、AdvanceBio MS スペントメディアカラムでは、非誘導体化アミノ酸の分析に HILIC 分離と質量分析検出の組み合わせを使用します。

アミノ酸

His

H
155.16137.14C6 H9N 3 O2

D
133.10115.09C 4 H7 NO4

ヒスチジン
R
174.20156.19C6 H14N 4O2

Arg
アルギニン

K
146.19128.17
C6H14N 2 O2

Lys

アスパラギン酸

PheF
165.19147.18C9 H11NO2

Ile

A
89.09
71.08
C3H7NO2フェニルアラニン

LeuL
131.17113.16C6H13NO2

リジン
I
131.18113.16C6H13NO2

Asp

Trp

C
121.16103.14
C3H7 NO 2 S

アラニン
M
149.21131.20C5H11NO2 S

ロイシン
W
204.23186.21
C11H12N 2 O2

Ala

Met

Pro

G
75.07
57.05
C 2 H5 NO2

システイン
N132.12114.10C4H8 N 2O3

メチオニン
P
115.1397.12
C5 H9NO2

Cys

Asn

Q
146.15128.13C 5 H10N 2 O3

グリシン
S
105.0987.08
C3 H7 NO3

アスパラギンV
117.1599.13
C 5 H11NO2

Gly

Ser
セリン

Gln

E
147.13129.11C 5 H9 NO4

グルタミン
Y
181.19163.17C9 H11NO3

Tyr

Glu
グルタミン酸T
119.12101.10C 4 H9 NO3

チロシン

Thr
トレオニン

Val
ﾠ塩基性

ﾠ非極性（疎水性）
イソロイシン14

トリプトファン

Agilent BioHPLC カラム

プロリン

バリン

目次に戻る

ﾠ極性、非荷電
ﾠ酸性生体分子の分離

2

アデノ随伴ウイルス（AAV）

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、新しい治療送達プラットフォームで、遺伝子治療のベクターとして非常に広く用いられ、遺伝性網膜疾患や脊髄性筋萎縮症の治療で大きな成果を上げています。AAV は、約 4.7

kb の線状一本鎖 DNA ゲノムを含む 20 面体のタンパク質の殻で構成されています。インタクト AAV は、

オリゴヌクレオチド治療薬を保護して送達する運搬役を務めます。治療送達プラットフォームとしての AAVの開発は継続中なので、AAV の重要な品質特性すべてのモニタリングが不可欠です。製品全体の品質と安全性を確保するためには、タンパク質カプシドとカプセル化された DNA それぞれに、専用の分析技術が必要とされます。

AAV カラムの選択手法

アジレントのカラム

逆相カラム

ワイドポアカラム

ZORBAX RRHD

インタクトカプシドタンパク質の高効率な逆相分離と特性解析のための 1.8 µm 300 Å ZORBAX

ナローポア

AdvanceBio

最適な効率と分離能のための 2.7 µm Poroshell 粒子。

空/フル強アニオン交換

Agilent Bio SAX

Agilent Bio SAX 強アニオン交換カラム。AAV カプシドの空とフルの分離に最適。

凝集体分析

サイズ排除クロマトグラフィー

Agilent Bio SEC-5

ポアサイズ 1,000 Å の Agilent Bio SEC-5 は AAV 凝集およびフラグメントの分析と精製に最適。

アプリケーション

カプシドタンパク質のID 確認：インタクト

タンパク質

カプシドタンパク質

ID：ペプチドマッピング（PTM）

カプシド分析

ワイドポア

逆相ペプチドマッピング

注意事項

RRHD StableBond C18 および Diphenyl カラムのオプション。

ヒントとツール
アジレントのバイオイナート消耗品により、メタルフリーのサンプル流路を構成し、生体分子との相互作用を最小限に抑えることができます。

詳細については、ホームページをご覧ください。

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15

2 生体分子の分離

DNA および RNA オリゴヌクレオチドの分離

オリゴヌクレオチド（オリゴ）が治療薬として有望であることが研究で示され、バイオ医薬品市場では、オリゴへの関心が高まっています。これらのオリゴは、サイズ、配列の複雑性、全体的な修飾の点で幅広い範囲に及んでいます。小さなオリゴヌクレオチドは合成が可能で、サイズは数個のヌクレオチドから 40 ま

たは 50 塩基までにおよび、RNA 修飾の DNA は多様です。化学合成プロセスでは、省略、挿入、化学修

飾を含む密接に関連した配列を持つさまざまな不純物が生み出されます。gRNA や NGS プライマーおよびプローブなどの大きなオリゴのサイズは 50 から 200 塩基の範囲で、特定の用途に対して多様な修飾やタグを有しています。RNA 治療薬は、数千塩基の長さの配列を持っている場合があり、精製に関して独自の配慮が必要です。このような多様性の結果、液体クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチドの分析

および精製は複雑になり、さまざまな手法やカラムケミストリ、粒子支持体が使用されます。
オリゴヌクレオチドの分離には、以下のような UHPLC/HPLC 手法が使用されます。

トリチルオン–この手順では、 ジメトキシトリチル （DMT）基が結合したままの全長ターゲットオリゴを、脱保護された不完全配列から分離します。得られる分析情報が限られるため、精製メソッドとして考えられています。

トリチルオフの脱保護オリゴのイオン交換分離 – このメソッドではオリゴの主鎖上の負電荷を利用して分離を促進します。短鎖オリゴは良好に分離しますが、鎖長が長くなるにつれて分離能は低下します。また、この手法では水溶性溶出液を使用しますが、オリゴは高帯電性であり、カラムからの溶出に高濃度の塩が必要です。

トリチルオフの脱保護オリゴのイオンペア逆相分離 – 有機溶媒と揮発性イオンペアリング剤を使用します。LC/MS に適しています。この手法は高効率粒子に最適です。オリゴを完全に変性させ、相補的配列との関連付けを防ぐ条件が必要です。このため高温での分離を推奨します。

DNA および RNA オリゴヌクレオチドのカラムの選択

アプリケーション

トリチルオフオリゴヌク
レオチドの特性解析/

手法

イオンペア逆相分離

精製

トリチルオフ凝集およびフラグメントの分析

イオン交換分離アジレントのカラム

AdvanceBio オリゴヌクレオ

チド

Agilent BioHPLC カラム

2.7 µm と 4 µm の表面多孔質粒子を備えており、オリゴヌクレオチドとその不純物の高分離能分
析と精製が可能です

PLRP-S

さまざまな粒子サイズやポアサイズのマクロポーラスポリマー粒子で、pH と温度について最高のAgilent Bio IEX

親水性コーティングされた非多孔質のポリマー性粒子で、質量移動の問題を解消し、卓越した性

安定性を示します。

能を提供します。 分析スケールおよびラボスケールの分取機能に対応できるよう、さまざまな粒
子サイズが用意されています。

PL-SAX

16

注意事項

強アニオン交換基を持つ全多孔質のポリマー性粒子。バルク充填剤を含め、分析から分取スケー

ルまで利用できます。

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生物製剤のための機器

3

バイオ医薬品分析のための機器

アジレントが提供する包括的なワークフローソリューション

LC カラムは多くの精製または分析の特性解析ワークフローで重要な器具ですが、突き詰めれば、1 つのコンポーネントにすぎません。Agilent は、多数の生体分子ワークフローに対し、サンプル前処理、バイア

ルなどの消耗品、機器、データ分析および管理ツールなど、包括的なソリューションとエキスパートによるサポートを提供します。

1260 Infinity II バイオイナート LC システム

完全な （生体）不活性度を必要とするアプリケーションのためのシステム

1260 Infinity II バイオイナート LC は完全なバイオイナート仕様です。金属との相互作用を排除し、きわめて困難な化合物の分析にも容易に対応できます。溶媒送液システムに耐腐食性のチタンが、またサンプル流路にメタルフリーの材料が採用されており、ルーチンバイオアプリケーションにおいて生体分子の完全性が保たれます。ICP-MS 分析のためのフロントエンドシステムとしても最適です。

– 60 MPa でのメタルフリーのサンプル流路では、信頼性の高い生体サンプル分析結果が得られます。これは、貴重なサンプルはまったく金属面に触れず、表面における不要な作用を最小限に抑えると同時にカラム寿命を延長できることを意味します– UV および蛍光検出用のイナートフローセル、およびマルチメソッド/マルチ特性分析用のイナート溶媒とカラム選択バルブによって、多様な機器が使用可能になり、最高の適応性を実現します– 高塩濃度耐性（2 M）と広い pH 範囲（1 ～ 13、短時間での 14）、そしてアクティブシール洗浄機能と 4 種類の溶媒ブレンド機能により、高い柔軟性を実現します– 新しいバイオイナートキャピラリーと接続デザイン、および InfinityLab クイックコネクト/クイックター
ンカラムフィッティングにより使いやすくなります

1260 Infinity II Prime Bio LC システム
日々の分析で高い柔軟性を実現

生体適合仕様の 1260 Infinity II Prime Bio LC システムは、生体分子の分離に適した汎用 HPLC です。

バイオ分析用 HPLC およびエントリーレベルのクォータナリバイオ UHPLC としてご利用いただける、機能性と操作性に優れた分析システムです。

– 生体適合性溶媒とサンプル流路によって生体分子の完全性を確保し、不要な表面相互作用を最小化します– 高塩濃度耐性と広い pH 範囲により柔軟性と堅牢性が向上し、機器の稼働時間を増大できます– 最大 80 MPa の高耐圧と最大 5 mL/min の高流量を兼ね備えたパワーレンジ（圧力流量範囲）により、最高の UHPLC 性能を実現します– シャローマイクロプレート用の引き出しによって最大 6,144 のサンプルを収容でき、優れたサンプル
キャパシティを実現できます

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3 生物製剤のための機器

1290 Infinity II Bio LC システム
複雑な分析で卓越した性能を発揮

1290 Infinity II Bio LC システムでは、1290 Infinity II Bio ハイスピードポンプまたはフレキシブルポンプをご利用いただけます。きわめて要求の厳しいアプリケーションを想定して設計されており、非常に緩やかなグ

ラジエントに対応し、優れた性能、精度、信頼性を発揮します。また、生体適合性を備え、システムの堅牢性を維持しながら生体分子の完全性を確保できます。

– あらゆるアプリケーションに対応する柔軟性 - 広いパワーレンジ、温度範囲、拡張可能な自動注入量範囲、グラジエントオプション（2 種類および 4 種類の溶媒混合）によって実現します– システム全体のディレイボリュームが非常に少ないため、クロマトグラフィー分解能を最大化し、分散を最小限に抑制できます– 広範な Bio 熱交換器、Bio キャピラリーキット、Bio ループ、分析ヘッドをなど、多様な Bio アクセサリによって、さまざまなアプリケーションニーズにすべて対応し、機器の汎用性と効率を向上します– 最大 130 MPa の超高耐圧と最大 5 mL/min の高分析流量を兼ね備えたパワーレンジにより、最高の
UHPLC 性能を実現します– 性能と持続可能性のための選択肢：1260/1290 Infinity II LC システムファミリは、製品のライフサイク
ル全体が環境に与える影響を検証する独立監査の結果、My Green Lab の ACT （Accountability = 説

明責任、Consistency = 整合性、Transparency = 透明性）ラベルを取得しました

1290 Infinity II Bio 2D-LC システム

生体適合仕様の 2D-LC システムが持つ究極の分離能力

1290 Infniity II Bio 2D-LC システムは 2D-LC システムの非常に優れた分離能力とピー

クキャパシティ、そして Bio LC システムの生体適合性を兼ね備えています。

– サンプルが、共溶出する化合物について優れた分離能を必要としていたり、従来の（U） HPLC では効率的に分解できなかった化合物を多数含んでいたりする場合でも、2D-LC が最適な選択肢です– Agilent InfinityLab 2D-LC ソリューションは、専用の 1290 Infinity II ハードウェアと特別なソフトウェア製品をベースに、最高の性能と品質、使いやすさを提供します– バイオ医薬品も他業界のアプリケーションも、サンプル、溶媒、試薬について、厳しい条件を使用します。生体適合仕様の 2D-LC システムは、このようなアプリケー

ションに対し、優れた分離性能と堅牢性を提供します。Bio 2D-LC 流路では、セラ

ミック、PEEK、金などの貴重な材料とともに MP35N が使用されます。これらの材料は、生体分子との表面結合や相互作用を低減します。また、溶媒やサンプル、試薬などの広い pH 範囲や高塩濃度のような厳しい条件にも対応します– 生体適合仕様のバイオイナート LC モジュールとパーツはすべて、1290 Infinity II
Bio 2D-LC システムで使用できます18

Agilent BioHPLC カラム

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生物製剤のための機器

31260 Infinity II Bio-SEC システム

メタルフリーの流路とオプションの高度な検出器を使い、生体ポリマーを確実に分析

1260 Infinity II Bio-SEC システムは、生体ポリマー分析の課題に対処できるように設計されたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）システムです。高度な検出機能を使った、タ

ンパク質のモル質量、純度、凝集の分析には完璧なソリューションです。

– メタルフリーのサンプル流路が生体ポリマーの堅牢な特性解析を可能にします– 高塩濃度耐性と広い pH 範囲、そしてアクティブシール洗浄機能と 4 種類の移動相ブレンド機能が、高い柔軟性を実現します– 専用の SEC カラムサーモスタットが大容量と冷却機能をもたらします– 多角度光散乱（MALS）検出器を柔軟に追加できるため、生体 ポリマーの凝集体、サイズ、形状の特性解析が可能になります– WinGPC ソフトウェアによるコンプライアンスソフトウェアのサポートが、専用の SEC
ソフトウェアプラットフォームを提供します

1260 Infinity II マルチ検出器 GPC/SEC システム

光散乱検出によりタンパク質と生体分子を正確かつ高い再現性で特性解析

屈折率、光散乱、粘度測定を自由に組み合わせることができます。正確な絶対分子量と分子サイズが得られ、分子量範囲や溶媒に関係なく、幅広いポリマーの分析に使用できます。

– 正確な分子量 – 光散乱検出ではカラムキャリブレーションが不要です。GPC/SEC

カラムと組み合わせることで、真のポリマー分子量、サイズ、形状、長鎖分岐の測定が可能です– サイズと構造を正確に測定 – 粘度測定により、広い分子量範囲にわたって Rg（サンプルの回転半径）やサンプル構造を測定できます– 低分子量サンプルの分析 – 粘度計では、シリカおよび圧力トランスデューサ技術の最新の進歩により、百台という低い分子量を測定できます– トリプル検出が究極のポリマー分析を実現 – 光散乱検出によって絶対分子量を測定し、光散乱検出器と粘度測定検出器から分子サイズと溶液の挙動を測定できます

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3 生物製剤のための機器

1290 Infinity II Bio 分析スケール LC 精製システム
生体分子を保護する高性能で生体適合仕様の分析 LC 精製システム

1290 Infinity II Bio 分析スケール LC 精製システムは UHPLC、バイナリ、またはクォータリで、バイ

オ医薬品で使用される生体適合性材料で構成されています。高塩濃度および極端 な pH の条件を使って化合物単離を行うための、特に柔軟性と汎用性に優れたソリューションです。

– 生体適合性溶媒とサンプル流路によって生体分子の完全性を確保し、不要な表面相互作用を最小化します– 高塩濃度耐性と広い pH 範囲により柔軟性と堅牢性が向上し、機器の稼働時間を増大できます– マイクロタイタープレートに最大 4 x 96 個のフラクションを、または、4 種類の外径の試験管を使用可能なコレクタでガラス製試験管に最大 216 個のフラクションを採取できます– 統合された自動フラクションディレイセンサ技術により、採取したフラクションの純度と回収率を向上させます– 需要に基づいてフラクションキャパシティをアップグレードできます。単離された化合物からのみ入手できるオーソゴナル分析情報により、ラボの効率が向上します1260 Infinity II Prime Bio 分析スケール LC 精製システム
圧力範囲最大 800 bar、生体適合仕様の分析用 LC 精製システム

1260 Infinity II Prime Bio 分析スケール LC 精製システムは、生体分子の分離に適した汎用 HPLC です。機能性と利便性に優れており、耐圧最大 80 MPa、最大流量 5 mL/min のバイオ分析用 HPLC お

よびエントリレベルのクォータナリバイオ UHPLC としてご利用いただけます。

– 生体適合性溶媒とサンプル流路によって生体分子の完全性を確保し、不要な表面相互作用を最小化します– 最大 80 MPa の高耐圧と最大 5 mL/min の高流量を兼 ね備えたパワーレンジ（圧力流量範囲）
により、最高の UHPLC 性能を実現します– VWD、DAD、FLD、または LC/MS 検出用の多様なフローセルによる広範な高感度光学検出機能があり、適応性に優れています– 統合された自動フラクションディレイセンサ技術により、採取したフラクションの純度と回収率を向上させます– 需要に基づいてフラクションキャパシティをアップグレードできます。単離された化合物からのみ入手できるオーソゴナル分析情報により、ラボの効率が向上します20

Agilent BioHPLC カラム

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生物製剤のための機器

3

Load & Lock 分取用 HPLC カラム

充填剤の優れた安定性と高度な流量分布で大容量サンプルのルーチン精製に最適

アジレントは、ラボスケールの幅広い Load & Lock カラムと可動式充填ステーションを提供しています。お客様が高効率の分取カラムをすばやく簡単に充填できるように設計されており、医薬品成分、ペプチド、および天然物の開発アプリケーションに最適です。Load & Lock カラムは、生産性を最大限に高めるために、独自の流体/サンプ

ル分布システムを備えています。これにより、充填剤の表面全体にサンプルが効率的に拡散し、カラムの性能が高まります。

– 卓越した性能：独自の流量分布システムにより高品質の結果を達成します– 優れた柔軟性：同じ可動式充填ステーションで動的軸圧縮（DAC）または静的軸圧縮（SAC）により 1 イン
チ、2 インチ、3 インチの Load & Lock カラムに充填可能です– 使いやすさ：カラムの充填または充填剤除去が数分で完了できます– 最大限の可動性：カラムと充填ステーションをホイール付きベースにまとめ、いつでも簡単に移動可能です

DAC および SAC のデュアルモード充填フォーマットにより、簡単な操作で高性能のカラムを確実に作成できます。

アジレントのラボスケールの Load & Lock カラムは、充填剤の優れた安定性と高度な流量分布を兼ね備え、最大限のスピード、柔軟性、使いやすさで最高品質の精製を実現します。

Load & Lock 充填ステーションは、圧縮空気のみで動作します。電源が不要なため、危険な環境用に選択したあらゆる種類の溶媒や溶液を安全に使用することができます。クイックリリース式のシングルボルトクランプにより、充填剤の充填および除去作業をわずか数分で簡単に行えます。

Load & Lock 分取用 HPLC カラム
説明

Load & Lock カラム
可動式充填ステーション（空気駆動油圧式）

ウォータージャケットあり

内径 x 長さ（mm）

部品番号

27.0 x 500

PCG93LL500X25WJ

スペア部品キット

PCG931AAKIT
PCG93LLSTAND123

ヒントとツール
アジレントのセレクションガイド（5991-9153EN）で、InfinityLab LC 分取精製システム、モジュール、
カラム、充填剤、物理的仕様、性能特性を比較できます。

www.agilent.com/chem/lc-purification-selection-guide

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3 生物製剤のための機器

6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF システム
大規模な生体分子分析に特化した設計

Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF システムは、バイオ医薬品の特性解析で複数のワークフ

ローを処理できるように設計されています。インタクトプロテインレベルでの詳細情報を取得し、ペプ

チドマッピングを介して配列を自動的に確認して、自信をもって PTM を理解する必要がある場合、アジレントの UHPLC Q-TOF が役立ちます。

飛行時間型技術を使って、主要プロテオフォームと微量プロテオフォームを正確にプロファイリングし、

インタクトタンパク質の質量分析で新たなレベルの精度と感度を実現します。反復 MS/MS 操作モー

ドで、ペプチド分解物を簡単に掘り下げることができます。6545XT AdvanceBio Q-TOF は、バイオ

医薬品のために設計された包括的なツールセットにおける分析基盤です。

– 超高真空（10E-8）の TOF により、タンパク質に対して優れたスペクトル分離能を実現します– SWARM オートチューンにより、ワンクリックで高分子用に最適化できます– 30k m/z までの可変質量範囲により、非常に大型の分子も分析可能です– ビーム光学の改良により 50k の分離能を達成しました– キャピラリーの取り外し時に大気開放が不要なため、メンテナンスが容易です

6230B 飛行時間型（TOF）LC/MS
生体分子のための精密質量 TOF LC/MS

Agilent 6230B 飛行時間型 LC/MS（TOF LC/MS）システムは高分解能精密質量システムで、高度な分析能力を提供します。最高 20,000 までの質量電荷比のフルスペクトルを同時測定することにより、高速、高感度を実現します。TOF LC/MS のフル質量スペクトルをスキャンすることで、生体分子特性解析に必要な情報がすべて取得できます。6230B TOF LC/MS は、最適化されたインタクトタン

パク質の特性解析、ペプチド、グリカン、オリゴヌクレオチド分析に使用される Agilent バイオイナー

ト HPLC システムと互換性があります。高分離能の精密質量により、溶出物や浸出物などの不純物の検出と同定が可能になります。直感的なソフトウェアツールのおかげで、だれでも信頼できる結果を必ず出すことができます。6230B TOF LC/MS MassHunter ソフトウェアスイートはコンプライア

ンス対応です。

– モノクローナル抗体（mAb）を高い質量精度と分離能で分析し、グリコフォームや切断を探します– 最大 20,000 m/z の広い質量範囲により、高分子の生体化合物も分析できます– 直観的な MassHunter WalkUp ソフトウェアにより、管理タスクとリスクを削減でき、LC/MS の専門知識も不要になります– キャピラリー電気泳動、SFC、および 2D-LC に対応しており、最高のパフォーマンスを発揮します– Agilent Jet Stream 技術と低ピコグラムのオンカラム感度により、極めて低濃度で不純物を検出
できます

22

Agilent BioHPLC カラム

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生物製剤のための機器

3

MassHunter BioConfirm ソフトウェア

生体分子の特性解析で大きな一歩を

Agilent MassHunter BioConfirm ソフトウェアは、 オリゴヌクレオチド分析やインタ

クトプロテイン分析、 ペプチドマッピング、ルーチンのグリカンプロファイリングのワー

クフローに最適化されており、生体分子のルーチンの特性解析が可能です。この LC/

Q-TOF 用のバイオ医薬品ソフトウェアは、モノクローナル抗体やオリゴヌクレオチドといったバイオ医薬品の包括的 な質量分析ソリューションの一部です。アジレントのバイ

オ医薬品ワークフローは、自動化されたサンプル前処理から分離と検出、データ解析とレポート作成まで、非常に高度な分析を提供します。薬物抗体比（DAR）計算ツール、

柔軟なレポートテンプレート、MassHunter WalkUp との統合により、専門家でなくとも、LC/MS の機能をルーチン分析で使うことができます。

データインテグリティ規格に対応しており、技術管理機能
によって、データの安全な取り込み、処理、報告、格納が可能。FDA 21 CFR Part 11、EU Annex 11、GAMP 5、

ISO/IEC 17025、EPA 40 CFR Part 160 のコンプライア

以下を対象とした包括的なワークフロー：

ンスガイドラインに準拠– インタクトタンパク質（DAR を含む）
– ペプチドマッピング– 遊離グリガン– オリゴヌクレオチド

ヒントとツール
Agilent LC 消耗品で最適な性能と効率性を実現

Agilent InfinityLab の消耗品は InfinityLab LC シリーズのシステムとシー

ムレスに連携し、分析性能、運用効率、ラボの安全性を最大限に高めます。

消耗品の使用を効率的に追跡することで、分析の信頼性が向上します。

カラム消耗品関連カタログ/セレクションガイドをご覧ください。

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3 生物製剤のための機器

OpenLab ソフトウェアスイート

Agilent OpenLab ソフトウェアは、サンプル管理、データ取り込み、データ分析、データ管理、ラボのワークフロー管理などを搭載した統合製品スイートです。

OpenLab CDS – 高分子の分析ワークフローを効率化

OpenLab CDS は、生産性、使いやすさ、およびデータインテグリティをすべて実現するクロマト

グラフィーデータシステムです。カスタムカリキュレータや積分オプティマイザのようなソフトウェア

ツールを使って、オリゴヌクレオチドの純度計算や DAR の測定などのプロセスを自動化し、スプレッ

ドシートにピークデータを手作業で入力する手間を省くことができます。これにより、データを迅速に解釈できるようになり、正確で一貫性の高い結果を得られます。

アプリケーションに特化したツールで、バイオ医薬品ワークフローをサポート– MatchCompare for OpenLab：ユーザー定義の制約に基づいて、未知のサンプルを既知の標準と客観的に比較します– 2D-LC ソフトウェア：二次元測定を実施し、多次元データを分析します– WalkUp ソフトウェア：直感的なサンプルサブミットおよびメソッド選択ソフトウェアにより、
LC および LC/MS システムの利用をこれまで以上に容易にします

OpenLab ECM XT – 全分析データへのシングルポイントアクセス

OpenLab ECM XT は、一元化されたクラウドとオンプレミスでのデータ保管を目的とした科学

データ管理システム（SDMS）ソフトウェアです。MassHunter と OpenLab Server/ECM XT を組み合わせて、安全なストレージにすることにより、ラボは豊富な技術管理機能を生かして、規制当局による監査への対応を強化できます。

– データファイル、メソッド、ワークリスト、レポートテンプレート、結果などの現在使用しているレコードをオンプレミスまたはクラウドのストレージへ安全に保管– 誰が、何を、いつ、どのような理由で行ったかの詳細を含むファイル履歴を明確に示す監査証跡– ユーザーの役割とアクセス可能なデータに基づいてアクセス権を割り当て
ネットワークシステムを使ってデータサイロを解体

mRNA 治療薬か、二重特異性モノクローナル抗体かにかかわらず、大きな分子のモビリティをサポートする分析データは重要です。しかし、スタンドアロンのワークステーションを使っていたのでは、機器データのアクセスや管理が難しくなります。ネットワーク構成へ移行することで、ラボの運用が全体的に向上します。

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Agilent BioHPLC カラム

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生物製剤のための機器

3

InfinityLab LC 消耗品
生体分子分析に最適

Agilent InfinityLab 消耗品は革新的な消費財です。Agilent LC 機器やカラムで簡単に使用でき、バイオ HPLC
分析で最高の効率とパフォーマンスを発揮するように設計されています。
粒子からカラムを保護

粒子はカラムを詰まらせ、クロマトグラフィーの結果の品質を下げ、ダウンタイムを長引かせる原因となります。

このような問題を回避するには、効果的なろ過手法の採用が不可欠です。特に水ベースの緩衝液を使用するときには、未溶解の塩の結晶や微生物などの残留物を除去するために、LC ろ過アセンブリを使って、移動相をフィルタリングできます。

インラインフィルタを設置して、溶媒やサンプル、摩耗したシステム部品から流路に流れてくるあらゆる粒子を捕捉します。InfinityLab クイックチェンジインラインフィルタは工具を使わずに交換できるフィルタディスクで、非常に使いやすく、カチッと音がしたら取り付け完了です。
バイオアプリケーションに最適な接続

InfinityLab ファミリーには、お客様のニーズにあったさまざまな材質の HPLC キャピラリーが用意されています。MP35N、PEEK ライナステンレス、およびチタンで作られたキャピラリーは不活性で腐食耐性があり、バイオアプリケーションに特に適しています。InfinityLab クイックコネクトフィッティングと併用することで、最大

1300 bar の完璧な手締め接続が可能です。最高の分析性能を実現できます。

ラボの化学薬品から出るガスを削減

ラボでは日常的に、アセトニトリルとメタノールをはじめとする数多くの有機化合物に触 れる可能性にさらされています。
InfinityLab セーフティキャップは溶媒が空気中に溶出するのを阻止します。革新的な InfinityLab セー

フティパージボトルと併用すると、最高 4 本の溶媒ラインを使った HPLC パージを安全に行えるようになります。
バイアルはサンプル処理の第一歩 – 適切な選択のできる製品ライン

アジレントはバイアルやキャップ、インサートの包括的な商品ラインを取り揃えています。標準的なホウケイ酸ガ

ラス製バイアルだけでなく、表面が不活性化されたガラスバイアルや、ポリプロピレンバイアルなど、ラボの需要にあったソリューションを用意しています。サンプルの量がわずかな場合は 3 ～ 5 µL のバイアルから、大量にある場合には 1.75 mL のものまで、バイアルの組成のみならず、その性質や使用可能なサンプルの量を反映した
さまざまなデザインのバイアルを提供しています。

ヒントとツール
バイアルを最終決定する際には、バイアルカタログ（5994-4803JAJP）をダウンロード

して、バイアルセレクションツールをご利用ください。

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4 インタクトタンパク質分析

逆相および疎水性相互作用
クロマトグラフィーを使ったインタクト
タンパク質分析

インタクトまたはサブユニットレベルでのタンパク質の不純物分離に必要な選択性と分離能
タンパク質は、通常、
インタクトまたはサブユニットレベルで分析され、不純物のモニタリングや、

LC/MS を使った正確な分子量測定が行われます。 インタクトタンパク質測定に必要なサンプ

ル前処理は、ペプチドレベルの分析と比べ、はるかに少ないことが多く、製品の品質や純度を比較的短時間で評価できます。

アジレントは、世界中の技術サポート専門家やアプリケーションケミストにより支持される、包括的なワイドポア（300 Å、450 Å 以上） BioHPLC 逆相カラムを提供しています。製品ファミ

リーには、400 ～ 1200 bar 用の 1.8、3.5、および 5 µm 多孔質粒子、低圧における UHPLC

分離用の 3 種類の表面多孔質粒子、さまざまな条件下での分析用のポリマーカラム（MS 分
析用のギ酸移動相を含む）が含まれます。

さらに、アジレントはインタクトタンパク質またはサブユニット分離への代替的で補完的なアプローチのために、疎水性相互作用 クロマトグラフィー（HIC）カラムと親水性相互作用クロマト

グラフィー（HILIC）カラムの両方を提供しています。

逆相– AdvanceBio RP-mAb カラムは、mAb の特性解析専用に設計された唯一の逆相カラムです。450

Å ポアサイズ Poroshell の技術と適切な結合相の選択性により、インタクト mAb および mAb フラグ

メントの高速かつ高分離能の特性解析が可能となります。

– PLRP-S カラムにはマクロポーラスポリマー粒子が含まれているため、非常に幅広い pH 範囲でのHPLC 分離が可能です。3 種類のワイドポアサイズと 8 種類の粒子サイズを備えた PLRP-S カラムは、ペプチド、タンパク質、およびタンパク質複合体の分析分取、分離に最適なソリューションです。

– ZORBAX RRHD 300 Å 1.8 µm カラムは 1200 bar での安定性を備え、インタクトタンパク質、タン
パク質断片、および分解物の逆相分離に UHPLC の性能を提供します。

– ZORBAX 300 Å 3.5、および 5 µm カラムは、HPLC および分取精製用の全多孔質カラムです。多くの結合相は 1.8 µm 粒子から拡張できます。

– Poroshell 300 カラムは、ポリペプチドやタンパク質の高速分離を行うための業界初の表面多孔質小粒子カラムです。

26

Agilent BioHPLC カラム

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s

s

s

s

インタクトタンパク質分析

4

逆相分離用カラムの選択肢

相オプション
ポアサイズ

ZORBAXRRHD SB 300

AdvanceBio
RP-mAbPoroshell
300

ZORBAX
300SB

PLRP-S

SB-C3、SB-C8、Diphenyl

C4、SB-C8、Diphenyl

SB-C3、SB-C8

SB-C3、SB-C8、Diphenyl

ポリマー系

300 Å

450 Å

300 Å

300 Å

1000 Å

HPLC
UHPLC
長所

– 最大限の分離能– 独自の Diphenyl 結合相– mAb 向けに設計– 独自の Diphenyl
結合相

– 小さな

球状タンパク質– スループット向上– 堅牢な製品– 独自の Diphenyl 結合相

ZORBAX 300SB

メソッドに更新– MS に推奨 – FA と TFA の両方で卓越したピーク形状を示す– PEEK ライナ SS ハードウェア
オプション

疎水性相互作用クロマトグラフィー– AdvanceBio HIC カラムは逆相分離に対するネイティブモードの代替製品で、独自の 450 Å ポア、
全多孔質 ZORBAX 粒子をベースにしています。 インタクト、かつネイティブで折りたたまれたタンパ

ク質は、疎水性が最も低いところから高いところへ向かって溶出します。

親水性相互作用液体クロマトグラフィー– ZORBAX RRHD 300 Å HILIC カラムは全多孔質の 1.8 µm 粒子で構成されています。逆相カラムへの相補的選択性を持つため、糖ペプチドや糖たんぱく質などの親水性サンプルに対して特に有効です。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp27

4 インタクトタンパク質分析

逆相カラムの選択
アプリケーション

モノクローナル抗体および mAb フラグメント

アジレントのカラム

AdvanceBio RP-mAb
C4
SB-C8
Diphenyl

注意事項
表面多孔質粒子を利用する Poroshell 技術に基づきます。この粒子 は 拡散距離が短く、600

bar システムでも高流量と勾配の大きいグラジエントを使用できるため、分析時間を短縮できます。

ポアサイズが 450 Å であるため、大きい分子で結合相にフルにアクセスでき、優れたクロマト

ABグラフィーを得られます。モノクローナル抗体の分離用に設計された堅固な結合相によって、分離能の最適化を可能にする幅広い選択性が提供されています。

インタクトタンパク質、モノクローナル抗体、

mAb フラグメント、ポリペプチド

PLRP-S 1000 Å

マクロポーラスポリマー PLRP-S は特にギ酸移動相で mAb 分離能が優れているため、MS 検

ZORBAX 300 Å、1.8 µm

充填プロセスの最適化により、1290 Infinity II LC での使用時に最大で 1200 bar の安定性をRRHD 300SB-C18
RRHD 300SB-C8
RRHD 300SB-C3

出に適しています。

実現します。RRHD 1.8 µm カラムには 50 mm と 100 mm の長さが用意されており、非常に複雑なサンプルを高速かつ高分離能で分離できます。

StableBond C18 は、複雑なタンパク質、タンパク質分解物の分離に適しています。

AB

RRHD 300-Diphenyl
ZORBAX 300 Å、
3.5、および 5 µm

高速液体クロマトグラフィーシステムとの使用に最適です。

StableBond C3 および CN は、より大型でより疎水性の高い化合物に最適です。

300SB-C18
300SB-C8300SB-C3
300SB-CN
PLRP-S

ポリマー PLRP-S はシリカベースカラムとは異なる選択性を示します。また、ギ酸移動相でのピーク形状が向上します。

100 Å
300 Å
1000 Å
4000 Å
Poroshell 300
300SB-C18

5 µm の Poroshell 粒子と 300 Å ポアによって、インタクトタンパク質の高速 HPLC 分離が可能です。

300SB-C8

AB300SB-C3
300Extend-C18
オリゴヌクレオチド分析

PLRP-S 100 Å、300 Å、

オリゴヌクレオチドの長さに応じて複数のポアサイズを選択できます。

PL-SAX 1000 Å, 4000 Å

分析分離から分取分離まで拡張可能です。

1000 Å、4000 Å

AdvanceBio オリゴヌクレ

オチド

AB

28

高い温度安定性。

PL-SAX の詳細については、84 ページを参照してください。
高分離能分析分離、および分取スケールの分離に最適。

2.7 µm と 4 µm の表面多孔質粒子を備えており、オリゴヌクレオチドとその不純物の高分離能分離が可能です

AdvanceBio ファミリーの製品

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

AB

インタクトタンパク質分析

4

AdvanceBio RP-mAb– 精度の向上：すべての LC 機器との互換性を維持しつつ、ワイドポア（450 Å）の表面多0.25 µm

孔質粒子（3.5 µm）により、mAb の分離能が向上しています– 高速：同一サイズの全多孔質粒子が充填された他のカラムよりも短時間で分析できます– 柔軟なメソッド開発：SB-C8、C4、ジフェニルなど、さまざまな化学的性質に対応します

3.5 µm

3.0 µm– コストの削減：堅牢な Poroshell 充填剤と 2 µm 注入口フリットにより、注入口の詰まりを防ぎカラム寿命を延 ばすことができます

モノクローナル抗体の特性分析固有の問題に対応するため開発された逆相カラム
インタクトおよび還元型モノクローナル抗体の分析は、治療用タンパク質を特性分析しその効能と安定性を理解するために、重要な測定です。クロマトグラフィー分離が悪いと、再分
析や分析精度での妥協につながります。

分析時間が長いとラボのスループットに悪影響を与え、特性解析結果に基づく意思決定が遅くなります。アジレントはこれらの問題を解決するために、インタクトおよび還元型 mAb 分

析の性能を最適化する逆相カラムを新たに開発しました。AdvanceBio RP-mAb カラムはPoroshell 技術と、ポアサイズと結合相についての独自の技術に基づいています。

高速・高分離能 mAb 分離のために特別に設計された堅牢な粒子

モノクローナル抗体などの大きい生体分子は、通常、そのような拡散の遅い化合物のピークの幅が広くならないようにするため、低速で分離されます。ただし、AdvanceBio RP-mAb カラム

で使用されている Poroshell 技術では、3.0 µm の硬質シリカコアを厚さ 0.25 µm の薄い多孔質シリカ層で覆った表面多孔質粒子を使用しています。このような形態により拡散距離が短くなるため、600 bar システムでも高流量と勾配の大きいグラジエントを使用できます。薄層内のポアの直径が 450 Å と広いため、大きいモノクローナル抗体分子にフルにアクセスでき、優れた
クロマトグラフィーを得られます。モノクローナル抗体の分離用に設計された堅固な結合相である C4 相、SB-C8 相、および独自の Diphenyl 相から選択することができ、分離能の最適化を可能にする幅広い選択性が提供されています。

AdvanceBio RP-mAb カラムは 分離能が高く分析時間も短いため、生物製剤の発見、開発、
QA/QC アプリケーションのためのモノクローナル抗体の分析時に、正確で再現性のある結果を迅速に得ることができます。

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www.agilent.com/chem/jp29

4 インタクトタンパク質分析

カラムの仕様
結合相

ポアサイズ

AdvanceBio RP-mAb C4

450 Å

AdvanceBio RP-mAb SB-C8

450 Å

AdvanceBio RP-mAb Diphenyl

450 Å

温度上限*

pH 範囲*

90 ℃

1.0 ～ 8.0

90 ℃
90 ℃

1.0 ～ 8.0
1.0 ～ 8.0

エンドキャップあり
なし

あり

仕様の数値は代表値です。

* カラムは低 pH で最適に使用できるように設計されています。シリカを基材とするすべてのカラムを pH 6 ～ 8 の領域で最高の安定性を確保しながら使用するには、温度を 40 ºC 未満とし、緩衝液には 0.01 ～ 0.02 M の範囲の低濃度のものを使用します。

ヒントとツール
モノクローナル抗体の一次構造の特性解析の詳細については、逆相 LC 1 次構造の特性解析ワークフロー（資料番号 5991-6321JAJP）を参照してください。

30

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

トラスツズマブ変異体 IgG1 を高速に高分離能で分離
カラム：

AdvanceBio RP-mAb C4795775-904
2.1 x 100 mm、3.5 µm

移動相：

80 ℃

サンプル：

Creative Biolabs 製のヒト化組み換え
トラスツズマブ変異体 IgG1
インタクト
（1 mg/mL）を 5 µL 注入

検出器：

A：0.1 % TFA 含有水:IPA（98:2）溶液
B：IPA:ACN:移動相 A（70:20:10）

流量：

温度：

UV、254 nm

1.0 mL/min

グラジエント：4 分で 10～58 % B、1 分間 95 % B で洗浄、
1 分間 10 % B で再平衡

2 分未満で分析

mAU
140

mAU
12

120

10
8
6

100

4
2
0

80

-2
-4

60

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

40
20
0
1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

AdvanceBio RPmAb C4 により、2 分未満でシャープなピーク形状で詳細に分離できます。

選択性 Diphenyl 相

カラム：
移動相：
流量：

グラジエント：

温度：

検出器：

サンプル：

AdvanceBio RP-mAb Diphenyl
795775-944
2.1 x 100 mm、3.5 µm

A：0.1 % TFA 水溶液: IPA（98:2）
B：IPA:ACN:移動相 A（70:20:10）
1.0 mL/min

4 分で 10 ～ 58 % B、1 分間 95 % B で洗浄、
1 分間 10 % B で再平衡
80 ℃

UV、254 nm

Creative Biolabs 製のヒト化組み換え
トラスツズマブ変異体 IgG1
インタクト（1 mg/mL）を 5 µL 注入

mAU

さらに詳細な分離

12
10
8
6
4
2
0
-2
-4
1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.5

min

www.agilent.com/chem/jp

31

2.2

2.3

2.4

AdvanceBio RP-mAb Diphenyl 固有の選択性によってより詳細に分離できます。

目次に戻る4 インタクトタンパク質分析
インタクトヒト化組み換えトラスツズマブ IgG1 の分離

カラム：
移動相：

AdvanceBio RP-mAb C4795775-904
2.1 x 100 mm、3.5 µm

A：0.1 % TFA 含有水 :IPA（98:2）
B：IPA:ACN:移動相 A（70:20:10）

流量：

1.0 mL/min

グラジエント：温度：

4 分で 10 ～ 58 % B、1 分間 95 % B で洗浄、
1 分間 10 % B で再平衡
80 ℃

検出器：

サンプル：

UV、254 nm

Creative Biolabs 製のヒト化組み換え
トラスツズマブ変異体 IgG1
インタクト（1 mg/mL）を 5 µL 注入

他よりも優れたタンパク質カラム

mAU
10AdvanceBio RP-mAb C4

5
0
-5

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

min

他社製カラム C4、400 Å、3.4

mAU
10

µm

5
0
-5

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

mAU
10

2.1

2.2

min

2.1

2.2

min

2.1

2.2

min

他社製カラム C4、200 Å、3.6

µm

5
0
-5

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

mAU
10

他社製カラム C4、300 Å、2.6

µm

5
0
-5

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

AdvanceBio RP-mAb は mAb 分離専用に設計されており、インタクトタンパク質分離で使用される他社製カ

ラムよりも優れたピーク形状と分離能を備えています。

Poroshell の利点

カラム：
移動相：
流量：

グラジエント：

温度：

検出器：

AdvanceBio RP-mAb SB-C8785775-906
2.1 x 100 mm、3.5 µm

A：0.1 % TFA 水溶液
B：n-プロパノール:ACN:移動相 A（80:10:10）

400

0.8 mL/min

300

5 分で 5 ～ 40 % B、1 分間 95 % B で洗浄、1 分間 10 % B で再平衡
60 ℃

サンプル：

UV、220 nm

Creative Biolabs 製の Fc/Fab、

パパイン消化ヒト化組み換えトラスツズマブ

変異体 IgG1（2 mg/mL）を 1 µL 注入

高精度、低背圧

mAU

350

250

圧力：505 bar

200
150
100
50
0
2

2.25

2.5

2.75

3

3.25

3.5

3.75

4

4.25

min

AdvanceBio RP―mAb カラムのワイドポア Poroshell 技術により、一般的な多くの逆相メソッドの温度である 80 ℃ よりも低い温度で、高効率、短い分析時間、低背圧を実現しています。

32

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

PLRP-S– 再現性の高い結果を提供し、長いカラム寿命を実現する、耐久性の高い堅牢なポリマー粒子を含有します– 熱的および化学的に安定しています– USP L21 に準拠– 低分子から高分子の複合体やポリヌクレオチドの分離に使用できるポアサイズ（100 Å ～ 4000 Å）です

PLRP-S のカラムファミリーには幅広いポアサイズと粒子サイズが揃っており、すべてが同一の結合相と基本的な吸着特性を備えています。粒子は本質的に疎水性です。このため逆相分離に結合相やアルキル結合基は不要です。そのため、残存シラノールや残留重金属は存在せず、分析結果への影響もありません。豊富な製品群から、ボトムアップおよびトップダウンプロテオミクス、分析用分離、前処理精製などのミクロ分離に適したカラムを選択できます。さらに、バルク充填剤を充填したプロセスカラムもご用意できます。

インタクトタンパク質の場合、300 Å を超える大きなポアが一般的ですが、PLRP-S の最初のオプションとしては 1000 Å をお勧めします。小さなポアサイズ 100 Å は通常、ペプ

チドや、小さな非生体分子の逆相分離に使用されます。また、オリゴヌクレオチドの分離には、すべてのポアサイズが有効です。オリゴヌクレオチドの分離における PLRP-S について、詳しくは 162 ページ を参照してください。

A

B

C

PLRP-S 10 µm 粒子の走査型電子顕微鏡写真（SEM）。
ポアサイズの違いが明確にわかります。

A は 100 Å の小さいポアです。
B は 300 Å の大きいポアです。

C は 4000 Å の巨大なポアです。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp33

4 インタクトタンパク質分析

カラムの仕様pH 範囲

1 ～ 14有機溶媒

1 ～ 100 %緩衝液の種類

制限なし

温度上限

200 ℃

最大圧力

3 µm：275 bar/4000 psi

5 µm、8 µm、10 µm：207 bar/3000 psi

10 ～ 15 µm、15 ～ 20 µm、30 µm：103 bar/1500 psi

PLRP-S アプリケーション
ポアサイズ

アプリケーション

小さい分子、合成、およびペプチド100 Å

組み換えペプチド/タンパク質300 Å

大きいプロテイン、およびモノクローナル抗体

1000 Å

大きいオリゴヌクレオチド、または高速分離

4000 Å

化学的安定性 ― TFA 濃度

カラム：
移動相：
流量：

34

2.アンギオテンシン II

PLRP-S 100 Å
PL1512-5500
4.6 x 250 mm、5 µm

0.0025%

A：TFA 水溶液（さまざまな %）B：TFA（さまざまな %）、ACN 溶液
15 分で直線的に 12 ～ 40 % B

ELS（ネブライザ = 75 ℃、蒸発 = 85 ℃、
ガス = 1.0 SLM）

Agilent BioHPLC カラム

1

2

3

3.アンギオテンシン I

0.02%

1.0 mL/min

グラジエント：検出器：

1.アンギオテンシン III

0.1%
0

min

15
VLC0068

目次に戻るインタクトタンパク質分析

化学的安定性 - NH4OH 濃度

カラム：
移動相：
流量：

グラジエント：検出器：

2

PLRP-S 100 Å
PL1512-5500
4.6 x 250 mm、5 µm

1 mM

1.0 mL/min

10 mM

A：NH4OH（さまざまな mM）の水溶液
B：NH4OH（さまざまな mM）の ACN 溶液

2.アンギオテンシン I

3.アンギオテンシン III

ELS（ネブライザ = 80 ℃、蒸発 = 85 ℃、
ガス = 1.0 SLM）

100 mMmin

10

VLC0049

Alberta Peptide Institute のテスト混合物

移動相：
流量：

グラジエント：検出器：

1.アンギオテンシン II

15 分で直線的に 10 ～ 100 % B

0

カラム：

3

1

4

5

1.Ala3-Gly4（遊離アミノ）

2.Gly3-Gly4（Nα-アセチル）

3.Ala3-Gly4（Nα-アセチル）

PLRP-S 100 Å
PL1512-5500
4.6 x 250 mm、5 µm

4.Val3-Gly4（Nα-アセチル）
5.Val3-Val4（Nα-アセチル）

A：0.1 % TFA、99 % 水:1 % ACN
B：0.1 % TFA、70 % 水:30 % ACN

43

1 µL/min
30 分で 0 ～ 100 % B
UV、220 nm

1

2

min

0

30

VLC0050

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp35

4 インタクトタンパク質分析
乳製品サンプル （牛乳）に含まれるタンパク質

カラム：
移動相：

PLRP-S 300 Å
PL1512-3801
4.6 x 150 mm、8 µm

2

A：0.1 % TFA、99 % 水: 1 % ACN
B：0.1 % TFA 1 % 水溶液: 99 % ACN

流量：

1

1. α-ラクトアルブミン

2. β-ラクトグロブリン（B 鎖）

33. β-ラクトグロブリン（A 鎖）

1.0 mL/min

注入量：

10 µL

グラジエント：検出器：

36 ～ 48 % B、0 ～ 24 分、48 ～ 100 % B、24 ～ 30 分
100 % B、30 ～ 35 分、100 ～ 36 % B、35 ～ 40 分
UV、220 nm

0

min

24

分子量の大きい繊維状タンパク質

カラム：

PLRP-S 300 Å
PL1512-3801
4.6 x 150 mm、8 µm

移動相：

21.コラーゲン（分子量 120,000）

A：0.25 % TFA 水溶液
B：0.25 % TFA、5 % 水:95 % ACN

流量：2.フィブリノーゲン（分子量 340,000）

1.0 mL/min

注入量：

10 µL

検出器：

UV、220 nm

グラジエント：1

15 分で 20～60 % B

2
1

PLRP-S 300 Å

036

Agilent BioHPLC カラム

min

目次に戻る

12

PLRP-S 1000 Å

0

min

18

インタクトタンパク質分析

4

AdvanceBio 脱塩 RP カートリッジ
MS 検出前に、オンラインで脱塩操作

モノクローナル抗体などのタンパク質の分析には、アフィニティ、イオン交換（IEX）、およ
びサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）などの手法が広く使用されています。ところが、これらの分析法には、不揮発性塩を含む水性移動相が必要です。この不揮発性塩は、MS 検

出を用いる場合に問題を引き起こします。不揮発性塩によってシグナル抑制が生じたり、塩の堆積により MS 検出器が汚染されたりすることで、メンテナンスの負担や機器のダウン

タイムの増加につながる可能性があるためです。AdvanceBio 脱塩 RP カートリッジなら、MS 検出前に高速かつ効率的にオンラインで塩イオンを除去することができます。このカー

トリッジ型カラムは、採取フラクションを脱塩するために、任意の LC システムと組み合わ

AdvanceBio 脱塩 RP（p/n PL1612-1102）およびカートリッジホルダ（p/n 820999-901）

せて使用することができます。また 1290 Infinity II 2D-LC システムでも使用でき、1 次元側での分離の後に、2 次元側で脱塩を実行します。

ヒントとツール
2D-LC/MS での AdvanceBio 脱塩 RP カートリッジの効果的な使用例については

アプリケーションノート 5991-7066JAJP を参照してください。

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www.agilent.com/chem/jp37

4 インタクトタンパク質分析

ZORBAX 300 Å StableBond
Agilent ZORBAX 300 Å StableBond カラムは、タンパク質とペプチドを再現性良く分離するために理想的です。その主な理由は次の 2 つです。まず、タンパク質やペプ

チド、またはその他の高分子を効率的に分離するには、検体が結合相表面に近接する必要があるため、ワイドポア（300 Å）カラムが必要です。また 300StableBond カ

ラムは 低 pH （TFA を含 む移動相 など）での耐久性 が非常 に優 れているため、通常はタンパク質やペプチドの分離に使用されます。低 pH 範囲での LC/MS 分離では、300StableBond カラムにギ酸や酢酸の移動相溶媒を使用することも可能です。これらのカラムには 5 つの異なる結合相（C18、C8、C3、CN、Diphenyl（DP））が用意されており、タンパク質とポリペプチドの選択性と回収率を最適化できます。分析困難
なタンパク質のサンプル回収率と効率をさらに高めるため、300StableBond カラムは

80 ℃ まで使用できます。StableBond 300SB-C18 カラムと 300SB-C8 カラムは、複雑なタンパク質およびタンパク質分解物の分離に最適です。これらのカラムは、タンパ

ク質分解物の逆相 LC/MS 用に、キャピラリーカラム（内径 0.3 mm および 0.5 mm）とナノカラム（内径 0.075 mm および 0.10 mm）も用意されています。キャピラリー
カラムとナノカラムは、1D または 2D のプロテオミクス分離に使用できます。

カラムの仕様結合相

ポアサイズ

ZORBAX RRHD 300SB-C18

300 Å

ZORBAX RRHD 300SB-C8300 Å

ZORBAX RRHD 300SB-C3300 Å

ZORBAX RRHD 300-Diphenyl

300 Å

ZORBAX 300SB-C18

300 Å

ZORBAX 300SB-C8300 Å

ZORBAX 300SB-C3300 Å

ZORBAX 300SB-CN

300 Å

上限温度*

pH 範囲*

エンドキャップ

80 ℃

1.0 ～ 8.0

なし

90 ℃
80 ℃
80 ℃
80 ℃
80 ℃
80 ℃
80 ℃

1.0 ～ 8.0なし

1.0 ～ 8.0なし

1.0 ～ 8.0あり

1.0 ～ 8.0なし

1.0 ～ 8.0なし

1.0 ～ 8.0なし

1.0 ～ 8.0なし

仕様の数値は代表値です。

* 300StableBond カラムは低 pH で最適に使用できるように設計されています。シリカを基材とするすべてのカラムをpH 6 ～ 8 の領域で最高の安定性を確保しながら使用するには、温度を 40 ºC 未満とし、緩衝液は 0.01 ～ 0.02 Mの範囲の低濃度のものを使用します。中または高 pH では、300Extend-C18 を推奨します。

38

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

結合相が立体的に保護された300StableBondインタクトタンパク質分析

4

インタクトモノクローナル抗体の分離能の向上

カラム：
移動相：
流量：

グラジエント：

温度：

検出器：
サンプル：

ZORBAX RRHD 300SB-C8857750-906
2.1 x 50 mm、1.8 µm

A：H2O:IPA（98:2）+ 0.1 % TFA（v/v）
B：IPA:ACN:H2O（70:20:10）+ 0.1 % TFA（v/v）
0.5 mL/min ～ 1.0 mL/min
マルチセグメントの直線溶出

80 ℃

1290 Infinity LC（オートサンプラ、バイナリ

ポンプとサーモスタットカラムコンパートメント、およびダイオードアレイ検出器（DAD）付）

UV、225 nm

mAU

グラジエント A 0.5 mL/min

250の最適化した分離能

200
150
ショルダ

100
50

分離

0
0

2

4

mAU

6

8

10

min

mAU

350

100

グラジエント B 1.0 mL/min の

80

250

感度の向上

150
50
0

40
20
0

0

2

4

高速分析時間

60

1.2

1.4

6

1.6

1.8

2.0

拡大図

8

2.2

2.4

2.6

10

2.8 minmin

ヒントとツール
モ ノク ロ ー ナ ル 抗 体 の 一 次 構 造 の 特 性 解 析 の 詳 細 に つ い て は、Better Characterization of

Biomolecules Using Agilent AdvanceBio Reversed-Phase Columns（Agilent AdvanceBio 逆相カラ

ムによる生体分子の特性解析の向上）（資料番号 5991-2032EN）を参照してください。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp39

4 インタクトタンパク質分析
還元およびアルキル化された mAb - 軽鎖および重鎖変異体

カラム：

ZORBAX RRHD 300SB-C8866750-906
2.1 x 150 mm、1.8 µm

移動相：

A：H2O + 0.1 % TFA（v/v）
B：n-プロパノール:ACN:H2O（80:10:10）+ 0.1 % TFA
（v/v）

流量：

0.5 mL/min

注入量：

グラジエント：

温度：

検出器：

装置本体：

3 µL（2.5 mg/mL サンプルから）
時間（分）

0
3
4
5
5.1
5.5
6

%Solvent B
20
35
40
40
90
90
25

75 ℃
UV、225 nm
1290 Infinity LC（オートサンプラ、バイナリポンプ、

mAU

HC

350
300
250
200

LC
HC1

150

LC フラグメント

100
50
0
1.0

1.5

2.0

2.5

サーモスタットカラムコンパートメント、およびダイオードアレイ検出器（DAD）付）

ヒントとツール
タンパク質やペプチド分離用の一般的な移動相では、非常に低い pH と TFA（または他の酸）を組み合わせてタンパク質を可溶性にします。StableBond カラムはこれらの条件下でも極めて長い寿命を誇ります。これらのカラムは、300 Å のポアサイズで最大 100 ～ 500 kDa のタン
パク質に使用できます。

40

Agilent BioHPLC カラム

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

min

連続的なクロマトグラフィー分析のため、2 分間のポストランを追加してカラムを再平衡化しました。

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

モノクローナル抗体の再現性の向上
カラム：

移動相：
流量：
温度：

検出器：
サンプル：

グラジエントZORBAX RRHD 300SB-C8857750-906

2.1 x 50 mm、1.8 µm

A：H2O:IPA（98:2）+ 0.1 % TFA（v/v）
B：IPA:ACN:H2O（70:20:10）+ 0.1 % TFA

1 回目の注入150 回目の注入

300

1.0 mL/min
80 ℃

1290 Infinity LC に搭載のダイオードアレイ検出器、
225 nm

200
100

mAb

0

%B

0.00

25

3.00

35

4.00

90

5.00

25

ZORBAX 300SB-C8 により優れたカラム再現性とタン

0.5

1

1.5

2

2.5

3 min

前後 150 回の

mA

時間（分）

パク質の回収率を実現

mA
400

bar
750

注入カラムブランク

700

分析の重ね表示500

500
グラジエント洗浄と

再平衡領域

300

250

100
0

目次に戻る

5

min

www.agilent.com/chem/jp41

4 インタクトタンパク質分析
mAb 特性解析に適した独自の選択性

カラム：

移動相：

ZORBAX RRHD 300SB-C18
858750-902
2.1 x 100 mm、1.8 µm

A：H2O（0.1 % TFA）
（v/v）
B：80 % nPA:10 % ACN:10 % H2O（0.08 % TFA）
（v/v）

注入量：

ZORBAX RRHD 300SB-C3
858750-909
2.1 x 100 mm、1.8 µm

3 µL（2.5 mg/mL サンプルから）

流量：

1.0 mL/min（3.5 µm*）、1.0 mL/min（1.8 µm）

温度：

80 ℃

グラジエント：ZORBAX RRHD 300SB-C8858750-906
2.1 x 100 mm、1.8 µm

25～35 % B、90 % 洗浄

検出器：

UV、215 nm* 低流量ではピーク幅が拡大

ZORBAX RRHD 300-Diphenyl
858750-944
2.1 x 100 mm、1.8 µm

4.287300SB-C18
4.484

100

3.968

3.565

DAD1 A, Sig=210,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\0000019.D)

4.702
4.753

3.740

3.070

25

3.225

2.792

50

3.416

75

0
3

6

7

300SB-C3

2.308

4

4.168

100

5

3.773

3.179
3.278

25

2.644

2.324

50

6

7

300SB-C8
4.914

75

4.605

3

4.774

1
2
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\0000025.D)

3.514

0

1.609

0

1.719

1.443

25

1.965
2.027

75
50

5

3.040

2.592

100

4

2.863

1
2
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\0000034.D)
2.182

0

0
1
2
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=off (Z:\CHEM32\1\DATA\IGG2_\0000038.D)

3

4

5

6

100

7

300-Diphenyl

3.829

2.913

0

75
2.292

25
0
0

42

3.422

50

1

Agilent BioHPLC カラム

2

3

4

目次に戻る

5

6

7

インタクトタンパク質分析

ペプチド/タンパク質：温度上昇の効果

カラム：
移動相：
流量：

ZORBAX 300SB-C3
883995-909
4.6 x 150 mm、5 µm

A：5:95 ACN:水と 0.10 % TFA（v/v%）
B：95:5 ACN:水と 0.085 % TFA（v/v%）
20 分間で15 ～ 53 %、ポストタイム 12 分間

検出器：

UV、215 nm

温度：

サンプル：

室温～ 60 ℃
ポリペプチド2.アンギオテンシン II

1

2

5

3

3.リボヌクレアーゼ A

45 ℃

4

1.0 mL/min

グラジエント：

1.ロイシンエンケファリン

4, 5

室温

4.インスリン（BOV）
5.シトクローム c

67

4

6.リゾチーム

8

7.ミオグロビン

8.炭酸脱水酵素
4

4

35 ℃

0

2

60 ℃

5

4

6

8 10 12 14 16 18 20
Time (min)

0

2

5

4

6

8 10 12 14 16 18 20
Time (min)

短鎖 ZORBAX 300SB-C3 は低 pH、高温で安定

移動相：

ZORBAX 300SB-C3
883995-909
4.6 x 150 mm、5 µm

80 分で 0 ～ 100 % B のグラジエント
A：0.5 % TFA 水溶液
B：0.5 % TFA アセトニトリル溶液
イソクラティックリテンションのテスト

条件：

流量：
温度：

1- フェニルヘプタン 50 % A、50 % B
1.0 mL/min
60 ℃

100
90
% k 残存フェニルヘプタン

カラム：

80
ZORBAX 300 SB-C3

70

他社 C4

60
50
40

0

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

移動相の量（mL）

目次に戻る

6,000

7,000

8,000
LCSB005

www.agilent.com/chem/jp43

4 インタクトタンパク質分析
4 種類の 300SB 結合相で大きいポリペプチドの分離を最適化

カラム A：
カラム B：
カラム C：
カラム D：
移動相：

1

ZORBAX 300SB-C8883995-906
4.6 x 150 mm、5 µm

ZORBAX 300SB-C3
858750-909
4.6 x 150 mm、5 µm
ZORBAX 300SB-CN
858750-905
4.6 x 150 mm、5 µm

1.リボヌクレアーゼ

2, 3

A

5

4

6

A：0.1 % TFA 水溶液
B：0.09 % TFA、80 % アセトニトリル:20 % 水
1.0 mL/min

サンプル：

60 ℃

2.インスリン

3.シトクローム c

8

7

9

4.リゾチーム

5.パルブアルブミン

10

6. CDR

7.ミオグロビン

B

2

1

8.炭酸脱水酵素

6, 7
3

4

5

9. S-100β810. S-100α9直線性のグラジエント、40 分で 25 ～ 70 % B

流量：
温度：

ZORBAX 300SB-C18
883995-902
4.6 x 150 mm、5 µm

C

2

1

3

各タンパク質で 3 µg

4

7

5

6

10

8
9
10

D

2

1

3

0

5

10

4

15

5

7
6

8

20
25
Time (min)

9

10

30

35

40
LCSB006

300SB-C18、C8、C3、および CN 結合相ではすべて、このポリペプチド群を異なる方法で分離します。このため、タンパク質分離を迅速に最適化するための重要なパラメータが追加されます。300SB-CN カラムには、親水性ポリペプチドに対する独自の選択性があります。

44

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

ZORBAX 300 Å Extend-C18– pH 2 ～ 11.5 のポリペプチドとペプチドの堅牢な高 pH および低 pH 分離0– 高 pH および低 pH でさまざまな選択性があります– 高 pH で疎水ペプチドの効率と回収率が高くなります– 水酸化アンモニウム添加の移動相による LC/MS に最適です

ZORBAX 300 Å Extend-C18 は、pH 2 ～ 11.5 のペプチドの高効率分離に適したワイ

ドポア HPLC カラムです。独自の二座型結合相を備えているため、高 pH でも低 pH でも長く使用でき、再現性にも優れています。高 pH ではペプチドやポリペプチドのリテン

ションと選択性が、分子の電荷の変化によって大きく変わる可能性があります。室温およ

Si

0 Si

C18

C18

Silica Support

び高 pH で、疎水性ポリペプチドの高い回収率が得られます。ペプチドとポリペプチドのLC/MS 感度は、水酸化アンモニウムを含むシンプルな移動相を高 pH で使用することで向上させることもできます。

Extend-C18 結合相の新しい二座型 C18-C18 結合相UHPLC カラムの仕様
結合相

ポアサイズ

ZORBAX 300 Å Extend-C18

300 Å

上限温度*

60 ℃

pH 範囲*

2.0～11.5

エンドキャップ

ダブル仕様の数値は代表値です。

*温度上限：60 ℃（pH 8 まで）、40 ℃（pH 8 ～ 11.5）

ヒントとツール
適切 なカラムを選択することは、ソリューション全体の一部にすぎません。アジレントは、

LC ランプなどの主要 な消耗品も豊富にご用意しています。詳細はホームページをご覧く
ださい。

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www.agilent.com/chem/jp45

4 インタクトタンパク質分析
高 pH での長寿命

カラム：
移動相：

ZORBAX Extend-C18
773450-902
4.6 x 150 mm、5 µm

84-クロロ-1-ニトロベンゼン

20 % 20 mM NH4OH、pH 10.5
80 % メタノール

流量：

トリミプラミン

1.5 mL/min

温度：6

時効 24 ℃

10,000 という各カラム容量は、約 1 か月分です。

k値

テスト 40 ℃

4

2

0

0

10,00020,00030,00040,00050,000

移動相のカラム容量

ZORBAX Extend-C18 による高 pH での異なる選択性

カラム：
移動相：

ZORBAX Extend-C18
773700-902
2.1 x 150 mm、5 µm

A：0.1 % TFA 水溶液
B：0.085 % TFA、80 % の ACN 溶液

A：20 mM NH4OH 水溶液
B：20 mM NH4OH、80 % の ACN 溶液

流量：0.25 mL/min

グラジエント：20 分で 5 ～ 60 % B

MS 条件：

陽イオン ESI、Vf 70 V、Vcap 4.5 kV、

温度：

25 ℃

N2、35 psi、12 L/min、300 ℃
4 µL（ペプチドごとに 50 ng）

Extend カラムはペプチドの高 pH 分離に使用できます。高 pH と低 pH では、選択性が大きく異なります。pH を変えるだけで補完メソッドを開発でき、すべてのピークが分離されているかどうかを特定できます。Extend カラムは高 pH でも低 pH でも使用できるため、相補的分離を 1 つのカラムで調査できます。この

サンプルでは、高 pH で MS 選択性も向上します。

A
3E7
2.5E7
2E7
1.5E7
LLL-NH2

1E7
LHG

.5E7
0

0

2

4

6

8

LHL

10

12

14

LLL

LLVF
16

18

20

B
LLL-NH2

3E7

LLL

2.5E7
LHG

2E7
1.5E7

LLVF

LHL

1E7
.5E7
0

46

Agilent BioHPLC カラム

0

目次に戻る

2

4

6

8

10
Time (min)

12

14

16

18

20

インタクトタンパク質分析

Poroshell 300

4AB– 表面多孔質粒子で生体分子を高速分離します– 300 Å ポアにより、タンパク質で高い効率と回収率を実現（最大 1,000 kDa）します

硬質コア、直径 4.5 µm– 低 pH では Poroshell 300SB を、高 pH では 300Extend-C18 を使用して長寿命を実現します– 4 種類の結合相（300SB-C18、300SB-C8、300SB-C3、300Extend-C18）により回収率と選択性を最適化できます

Poroshell 300 カラムは、タンパク質とペプチドの高速分離に最適です。直径 5 µm の

表面多孔質粒子により、シャープで効率的なピークを維持しながら高速流量を使用できるためです。Poroshell カラムと StableBond 結合相を組み合わせれば、TFA とギ酸の移動相での安定性と選択性 が向上します。Poroshell 300Extend-C18 カラムは pH 2

～ 11 で使用でき、他にはない分離能が得られます。これらのカラムは、分析用のタンパ

ク質分離と LC/MS 分離にも使用できます。

多孔性外殻、

厚さ 0.25 µmペプチドやタンパク質は通常、そのような拡散の遅い化合物のピークの幅が広がらないよ

うにするため、低速で分離されます。ただし、Poroshell カラムは、硬質シリカコアを厚さ0.25 µm の薄い多孔質シリカ層で覆った表面多孔質粒子を使用しています。このためタンパク質の拡散距離が短くなり、1260 Infinity II バイオイナート LC などの 400/600 bar

HPLC システムでは、最大 500 ～ 1,000 kDa のペプチドとタンパク質を高速で HPLC
分離できます。

HPLC カラムの仕様
結合相

ポアサイズ

Poroshell 300SB-C18、C8、C3

300 Å

Poroshell 300Extend-C18

300 Å

上限温度*

90 ℃

pH 8 以上で 40 ºC
pH 8 未満で 60 ℃

pH 範囲*

エンドキャップ

2.0～11.0あり

1.0～8.0なし

仕様の数値は代表値です。

* 300StableBond カラムは低 pH で最適に使用できるように設計されています。シリカを基材とするすべてのカラムを pH
6 ～ 8 の領域で最高の安定性を確保しながら使用するには、温度を 40 ºC 未満とし、緩衝液は 0.01 ～ 0.02 M の範囲の低濃度のものを使用します。中または高 pH では、300Extend-C18 を推奨します。

AB

Poroshell 300 カラム

AdvanceBio ファミリーの製品

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www.agilent.com/chem/jp47

4 インタクトタンパク質分析
Poroshell 300 カラムではタンパク質とペプチドを数秒で分離可能

カラム：
移動相：

Poroshell 300SB-C18
660750-902
2.1 x 75 mm、5 µm

A：0.1 % TFA 水溶液
B：0.07 % TFA ACN 溶液

流量：1.0 分で 5 ～ 100 % B

検出器：

UV、215 nm

温度：

サンプル：

2.ニューロテンシン
3.リボヌクレアーゼ

3

4.インスリン

5.リゾチーム

1

0.3 mL/min

グラジエント：

1.アンギオテンシン II

542

70 ℃、260 bar

6

6.ミオグロビン

7
8

7.炭酸脱水酵素

8.オボアルブミン

タンパク質およびペプチド00.5Time (min)1.0

8 種類のポリペプチドとタンパク質を 60 秒未満で分離しました。どのピークもシャープで高効率です。

ヒントとツール
詳細情報：「Characterization of Glycosylation in the Fc Region of Therapeutic Recombinant Monoclonal Antibody（治療用遺伝子組み換えモノ
クローナル抗体の Fc 領域のグリコシル化の分析）」（資料番号 5991-2323EN）「Using the High-pH Stability of ZORBAX Poroshell 300Extend-C18 to Increase Signal-to-Noise in LC/MS （ZORBAX Poroshell

300Extend-C18 の高 pH 安定性による LC/MS での S/N 比の向上）」（資料番号 5989-0683EN）

48

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

MicroBore Poroshell 300 カラムで実現する高感度 LC/MS

カラム：
移動相：
流量：

Poroshell 300SB-C18
661750-902
1.0 x 75 mm、5 µm

A：水 + 0.1 % ギ酸
B：ACN + 0.1 % ギ酸

5.5 分で 20 ～ 100 % B

MS 条件：

LC/MS：

80 ℃

ドライガス流量：
ドライガス温度：
ネブライザ：

フラグメンタ電圧：
スキャン：

ステップサイズ：サンプル：

80000000
0.5
0.75
1.0
2.5
5.0

600 µL/min

グラジエント：

温度：

1EB

ピーク幅：

1 µL

60000000
陽イオン ESI、Vcap 6,000 V
12 L/min
350 ℃
45 psi140 V
600 ～ 2,500
0.15 amu
0.06 分

40000000

20000000
0

0.5

1.0

1.5

2.0
2.5
Time (min)

3.0

3.5

4.0
LCPO003

Poroshell カラムと 2.1 mm、1.0 mm、および 0.5 mm のナローボア直径の組み合 わせは、LC/MS に最適です。サンプル量が限られている場合は、内径 1.0 mm または 0.5 mm のPoroshell カラムを使用すれば LC/MS 分析で高感度を得ることができます。Poroshell カラムでは、0.5 ～ 5 pmole という少量のタンパク質でも、高感度の MS 分子量測定が可能です。また Poroshell カラムは、安定剤や組織培地が存在する場合でも、インタクトタンパク質の高速な MS 同定に使用されてきました。

ヒントとツール
アジレントは、ポリプロピレンや不活性ガラス、シリコンガラスなどのバイアルやサンプ

ル容器を豊富にご用意しています。詳細については、資料番号 5994-4803JAJP を参照してください。

カラム消耗品関連カタログ/セレクションガイド

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www.agilent.com/chem/jp49

4 インタクトタンパク質分析

ZORBAX 300 Å HILIC
Agilent ZORBAX 300 Å HILIC カラムは、逆相 ZORBAX RRHD カラムと同じ全多孔性の 1.8 µm 粒子をベースにし、
UHPLC による分離の際、低い ｐH や高圧でも卓越した安定性を示します。HILIC 選択性は、最後ではなく最初に溶出するような最も疎水性の高い物質を使用して、逆相分離を高いレベルで相補します。また、HILIC は親水性の高いペプチドやグリコシル化されたタンパク質のような、逆相ではあまり保持されなかった物質を保持できます。300 Å ポアにより、この

HILIC カラムは小さなペプチドと同時に、それよりも大きなインタクトタンパク質にも適合します。
カラムの仕様
結合相

粒子サイズ

ポアサイズ

HILIC

1.8 µm

300 Å

pH 範囲

最大圧力

1～8

1200 barペプチドとタンパク質の分離におけるその他の選択性
×105
9

×10 4
1.4

カウント

6

Counts

8
7

HILIC

1.2
1

0.4

4

0.2
0

P3

P4

0.6

5
3

P8

0.8

10.259

P6
0.4

0.5

0.6

0.7

P1

0.8

Acquisition time (min)

2

P7

1

P2

P5

0
5

6
カウント

5
4
3

×10 6
4
3.6
3.2
2.8
2.4
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0

5.8

6.2

7.4

2

2.05

2.1

2.15

2.2

2.25

Acquisition time (min)

1

8.6

9

9.4

9.8

10.2

10.6

11

逆相
2.3

2.35

P6

22.870 P8

P5
14.5

15

15.5

16

16.5

17

17.5

18

両方のカラムに入った 8 つのペプチドのリテンションタイムと分離能を比較

50

7.8
8.2
取り込み時間（分）

P1-P4

2

0

7

6.6

P7

Counts

×106
7

5.4

Agilent BioHPLC カラム

18.5

19

19.5

取り込み時間（分）

20

目次に戻る

20.5

21

21.5

22

22.5

23

23.5

インタクトタンパク質分析

HILIC の条件

カラム：
溶出液：

4

Agilent ZORBAX ラピッドレゾリューション
High Definition 300-HILIC、2.1 x 100 mm、1.8 µm（部品番号 858750-901）
A：95 % ACN + 5 % の水；
B：50 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.0

流量：

グラジエント：温度：

0.4 mL/min

時間（分）

0
15
15.1
20

55 ℃

%B
0
100
0
0

ペプチド

シーケンス

疎水性

P1

APPR

P2
P3

RP リテンション

HILIC リテンション

タイム（分）

タイム（分）

1.83

2.103

10.259

GKLK

3.84

2.118

8.437

ALGAQK

4.57

2.119

9.181

P4

AVSGLR

9.15

2.13

8.316

P5

YLLEAK

19.64

15.6988.014

P6VYSNFLRGK

23.14

18.7426.583

P7

SLTTLLR

24.79

20.1097.492

P8

VNFYAWKR

27.64

22.87

0.587

ペプチドは両カラムで共通です。

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www.agilent.com/chem/jp51

4 インタクトタンパク質分析

疎水性相互作用クロマトグラフィーによる
インタクト分析
AdvanceBio HIC
AdvanceBio HIC カラムでは、インタクトレベルの天然タンパク質を高い分離能、堅牢性、再現性で分離できます。

ZORBAX 全多孔質粒子と独自の結合技術が組み込まれているため、疎水性と多目的の単一結合相を備えており、モノクローナル抗体（mAb）、抗体薬の複合体（ADC）、その他の遺伝子組み換えタンパク質など、非常に分析が困難な分子にも対応しています。

AdvanceBio HIC と 1260 Infinity II バイオイナート LC システムと組み合わせることで、特性解析やバリ

デーションにおいて非常に優れた性能を発揮し、データの一貫性を確保します。

– 最適な選択性：mAb 酸化変異体と ADC の薬物抗体比に対応します– 単一結合相：CQA ごとの複数のカラムスクリーニングが不要です– 堅牢性の強化：カラム寿命の向上により、分析結果の信頼性が飛躍的に向上します– 優れた性能：すべての充填剤バッチが NIST mAb 標準でテスト済みです– 高品質：すべてのカラムが個別に試験済みで、効率的なパッキングを保証します– 生産性の向上：短いカラムにより、従来と同じ分離性能で分析の高速化を実現します

カラムの仕様
ポアサイズ

粒子サイズ

温度上限

450 Å

3.5 µm60 ºC（pH 7 の場合）

pH 範囲
2.0 ～ 8.0

（35 ℃ の場合）

圧力上限

400 bar（推奨使用圧力は200 bar 未満）*場合によっては、流量を 0.3 mL/min に下げてグラジエント時間を延長すると、さらに分離能が向上します。

52

Agilent BioHPLC カラム

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流量*

0.5 ～ 1.0 mL/min（内径 4.6 mm）

インタクトタンパク質分析

流量：
温度：

注入量：
検出：

カラム：
溶出液 A：
溶出液 B：

グラジエント：

流量：
温度：

注入量：
検出：

αキ
モ
ト
リ
プ
シ
ノ
ー
ゲ
ン

%B
0
100
100
0
0

0.5 mL/min

1

30 ℃

2

3

A

%A
100
0
0
100
100

4

5

6

リ
ボ
ヌ
ク
レ
ア
ー
ゼ

時間（分）

0
20
25
30
40

A

リ
ゾ
チ
ー
ム

50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0
C

溶出液 B：

グラジエント：2 M 硫酸アンモニウム、
50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

ミ
オ
グ
ロ
ビ
ン

溶出液 A：

AdvanceBio HIC
4.6 x 100 mm、3.5 µm

シ
ト
ク
ロ
ー
ム

カラム：

4

7

8

9

10

11 12

13

14 15

16

17 18

19

20 21

22

23

24

16

17

19

20

22

23

24

リテンションタイム [分]5 µL

UV、220 nm

AdvanceBio HIC
4.6 x 100 mm、3.5 µm

2 M 硫酸アンモニウム、
50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0
時間（分）

0
20
25
30
40

%A
50
0
0
50
50

%B
45
75
75
45
45

%C
5
25
25
5
5

1

2

3

4

5

0.5 mL/min

6

7

8

9

10

11
12
13
14
Retention time [min]

15

18

21

30 ℃
5 µL

UV、220 nm

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www.agilent.com/chem/jp53

4 インタクトタンパク質分析
MS 分析で AdvanceBio HIC DAR 値を正確に確認

LC ネイティブ MS メソッドでは、システイン結合 ADC DAR も測定できます。アジレントでは、ネイティ

ブ LC/MS 条件下でインタクトシステイン結合の DAR を特性解析するための D-LC/MS メソッドを開発しました。ワークフローでは、一次元目で Agilent AdvanceBio HIC カラム、二次元目で脱塩カラムとしてAgilent AdvanceBio SEC カラム、および高感度の MS メソッドを使用して、さまざまな DAR を持つすべての ADC のインタクト質量を正確に測定します。

Counts×103
1.0

デコンボリュートした MS スペクトルDAR 0算出した MW:
148,082.46 Da

148,083.76

0.5
0

×103
Counts2.0

DAR 2算出した MW:
150,715.26 Da

150,716.88

1.5
1.0
0.5
0

×102
8

DAR 4

算出した MW:
153,348.52 Da

153,348.88

Counts6420Counts

×102
4

DAR 6
155,985.94

3
2
1
0

145,000 146,000 147,000 148,000 149,000 150,000 151,000 152,000 153,000 154,000 155,000 156,000 157,000 158,000 159,000 160,000 161,000
Deconvoluted mass (amu)

さまざまなブレンツキシマブベドチン DAR（DAR 0 ～ DAR 6）のネイティブ SEC LC/MS 分析のデコンボリュートした MS スペクトル54算出した MW:
155,981.78 Da

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るインタクトタンパク質分析

4

製品の詳細情報
AdvanceBio RP-mAb カラム
（mm）

寸法

（µm）

粒子サイズ

AdvanceBio RP-mAb C4

AdvanceBio RP-mAb SB-C8

AdvanceBio RP-mAb Diphenyl

USP L26

USP L7

USP L11

4.6 x 150

3.5793975-904

783975-906

793975-944

4.6 x 100

3.5795975-904

785975-906

795975-944

4.6 x 50

3.5799975-904

789975-906

799975-944

2.1 x 150

3.5793775-904

783775-906

793775-944

2.1 x 100

3.5795775-904

785775-906

795775-944

2.1 x 75

3.5797775-904

787775-906

797775-944

2.1 x 503.5799775-904

789775-906

799775-944

PLRP-S HPLC カラム
（mm）

寸法

（µm）

粒子サイズ

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

USP L21

USP L21

USP L21

USP L214.6 x 250

8

PL1512-5800

PL1512-5801

PL1512-5802

4.6 x 150

8

PL1512-3800

PL1512-3801

PL1512-3802

PL1512-3803

4.6 x 50

8

PL1512-1801

PL1512-1802

PL1512-1803

4.6 x 250

5

PL1512-5500

PL1512-5501

4.6 x 150

5

PL1111-3500

PL1512-3501

4.6 x 505

PL1512-1500

PL1512-1501

PL1512-1502

PL1512-1503

4.6 x 150

3

PL1512-3300

PL1512-3301

4.6 x 50

3

PL1512-1300

PL1512-1301

2.1 x 250

8PL1912-5801

2.1 x 150

8

PL1912-3801

PL1912-3802

PL1912-3803

2.1 x 508PL1912-1801

PL1912-1802

PL1912-1803

2.1 x 250

5

PL1912-5500

PL1912-5501

2.1 x 150

5

PL1912-3500

PL1912-3501

2.1 x 505

PL1912-1500

PL1912-1501

PL1912-1502

PL1912-1503

2.1 x 150

3

PL1912-3300

PL1912-3301

2.1 x 503

PL1912-1300

PL1912-1301

1.0 x 50

8

PL1312-1802

PL1312-1803
（続く）

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www.agilent.com/chem/jp55

4 インタクトタンパク質分析
PLRP-S HPLC カラム
（mm）

寸法

（µm）

粒子サイズ

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

USP L21

USP L21

USP L21

USP L211.0 x 50

5

PL1312-1500

PL1312-1501

PL1312-1502

PL1312-1503

1.0 x 105

1.0 x 150

3

PL1312-3300

1.0 x 503

PL1312-1300

PL1312-1301

PLRP-S ガードカートリッジ、PL1612-1801

PL1612-1801

PL1612-1801

PL1612-1801

カートリッジホルダ、PL1310-0016

PL1310-0016

PL1310-0016

PL1310-0016

PL1C12-2502

3.0 x 5.0 mm 用、2 個

3.0 x 5.0 mm カートリッジ用

ZORBAX 300 Å StableBond カラム
説明

内径 4.6 mm分析カラムとガード

寸法

粒子サイズ （µm） 300SB-C18

300SB-C8300SB-CN

300SB-C3

300-Diphenyl

USP L1

USP L7L10USP L56

USP L11

4.6 x 250

5880995-902

880995-906

880995-905

880995-909

4.6 x 150

5883995-902

883995-906

883995-905

883995-909

4.6 x 505860950-902

860950-906

860950-905

860950-909

4.6 x 12.5

5820950-921

820950-918

820950-923

820950-924

4.6 x 150

3.5863973-902

863973-906

863973-905

863973-909

865973-905

865973-909

（mm）

分析
分析
分析

ガードカートリッジ、
4 個*

ラピッドレゾリューション
ラピッドレゾリューション

4.6 x 100

3.5861973-902

861973-906

ラピッドレゾリューション

4.6 x 503.5865973-902

865973-906

ソルベントセーバプラス

3.0 x 150

3.5863974-302

863974-306

ソルベントセーバプラス

3.0 x 100

3.5

ナローボア

2.1 x 250

5881750-902

2.1 x 150

5883750-902

883750-906

883750-905

883750-909

2.1 x 12.5

5821125-918

821125-918

821125-924

821125-924

内径 3.0 mm分析カラムとガード

863974-309

861973-306

内径 2.1 mm分析カラムとガード

ナローボア

推奨ガード

カートリッジ、
4 個**ガードハードウェアキット（部品番号 820999-901）が必要です56

Agilent BioHPLC カラム

（続く）

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インタクトタンパク質分析

ZORBAX 300 Å StableBond カラム
説明

4

寸法

粒子サイズ （µm） 300SB-C18

300SB-C8300SB-CN

300SB-C3

300-Diphenyl

USP L7L10USP L56

USP L112.1 x 150

3.5863750-906

2.1 x 100

3.5861775-902

861775-906

2.1 x 50

3.5865750-902

865750-906

2.1 x 150

1.8863750-902

866750-906

863750-914

863750-944

2.1 x 100

1.8858750-902

858750-906

858750-909

858750-944

ナローボア RRHD

2.1 x 501.8857750-902

857750-906

857750-909

857750-944

マイクロボア

1.0 x 2505861630-902

1.0 x 150

3.5863630-902

863630-906

1.0 x 503.5865630-902

865630-906

マイクロボア RRHD

1.0 x 50

1.8

セミ分取

9.4 x 250

5880995-202

880995-206

880995-205

880995-209

推奨ガードカートリッジ、2 個*

9.4 x 157820675-124

820675-124

820675-124

820675-124

PrepHT カートリッジ

21.2 x 250

7897250-102

897250-106

897250-105

897250-109

21.2 x 150

7897150-102

897150-106

897150-109

21.2 x 150

5895150-902

895150-906

895150-909

21.2 x 100

5895100-902

895100-906

895100-909

21.2 x 50

5895050-902

895050-906

895050-909

PrepHT ガード、2 個*

17.0 x 7.55820212-921

820212-918

820212-924

キャピラリー

0.5 x 150

55064-8264

0.5 x 35

55064-8294

0.5 x 150

3.5

5064-8268

0.5 x 35

3.5

5065-4459

ナローボア RR
ナローボア RR
ナローボア RR

ナローボア RRHD
ナローボア RRHD（mm）

USP L1

内径 1.0 mm分析カラムとガード

マイクロボア RR
マイクロボア RR

965600-944

セミ分取カラムとガード

PrepHT カートリッジカラム（フィッティングキット 820400-901 が必要）とガード
PrepHT カートリッジ
PrepHT カートリッジ
PrepHT カートリッジ
PrepHT カートリッジ

キャピラリーガラス管カラム

キャピラリー

キャピラリー RR
キャピラリー RR*ガードハードウェアキット（部品番号 820999-901）が必要です（続く）

ヒントとツール
アジレント機器を最大限に活用するには、www.agilent.com/chem/biolc-columns-user-guides をご覧ください。

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www.agilent.com/chem/jp57

4 インタクトタンパク質分析
ZORBAX 300 Å StableBond カラム
説明

寸法

粒子サイズ （µm） 300SB-C18

0.3 x 150

55064-8263

0.3 x 35

55064-8295

0.3 x 555065-9913

5065-9914

0.3 x 150

3.5

5064-8267

5065-4460

0.3 x 1003.5

5064-8259

5065-4461

キャピラリー RR

0.3 x 503.5

5064-8300

5065-4463

ナノ RR

0.1 x 150

3.5

5065-9910

0.075 x 150

3.55065-9911

0.075 x 50

3.55065-9924

キャピラリー（mm）

キャピラリー

トラップ/ガード、
5 個**
キャピラリー RR
キャピラリー RR

USP L1300SB-C8300SB-CN

300SB-C3

300-Diphenyl

USP L7L10USP L56

USP L11

ナノカラム（PEEK フューズドシリカ）

ナノ RR
ナノ RR

*ガードハードウェアキット（部品番号 820999-901）が必要です**ガードハードウェアキット（部品番号 5065-9915）が必要です

ZORBAX 300 Å Extend-C18 カラム
説明

寸法

分析
分析

ラピッドレゾリューション
ラピッドレゾリューション
ラピッドレゾリューション
ナローボア RR
ナローボア RR
ナローボア RR

ガードカートリッジ、4 個
ガードカートリッジ、4 個

ガードハードウェアキット

58

Agilent BioHPLC カラム

（mm）

（µm）

粒子サイズ

部品番号

4.6 x 250

5770995-902

4.6 x 150

5773995-902

4.6 x 150

3.5763973-902

4.6 x 100

3.5761973-902

4.6 x 503.5765973-902

2.1 x 150

3.5763750-902

2.1 x 100

3.5761775-902

2.1 x 503.5765750-902

4.6 x 12.5

5820950-932

2.1 x 12.5

5821125-932
820999-901

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5065-9923

インタクトタンパク質分析

Poroshell 300 カラム
説明

寸法（mm）

ナローボア

マイクロボアキャピラリー

ガードカートリッジ、4 個*

粒子サイズ

Poroshell

Poroshell

Poroshell

Poroshell

300SB-C18

300SB-C8300SB-C3

300Extend-C18

2.1 x 755660750-902

660750-906

660750-909

670750-902

1.0 x 755661750-902

661750-906

661750-909

671750-902

0.5 x 7552.1 x 12.5

5

（µm）

4

5065-4468
821075-920

821075-918

821075-924*ガードハードウェアキット（部品番号 820999-901）が必要です

ZORBAX 300 Å HILIC カラム
説明

部品番号

ZORBAX 300 Å HILIC, 2.1 x 100 mm、300 Å、1.8 µm

858750-901

ZORBAX 300 Å HILIC, 2.1 x 50 mm、300 Å、1.8 µm

857750-901

Agilent AdvanceBio HIC カラム
説明

部品番号

AdvanceBio HIC、4.6 x 100 mm、450 Å、3.5 µm

685975-908

AdvanceBio HIC、4.6 x 100 mm、3.5 µm、メソッドバリデーションキット

685975-908K

AdvanceBio HIC、4.6 x 30 mm、450 Å、3.5 µm

681975-908

AdvanceBio HIC、4.6 x 30 mm、3.5 µm、メソッドバリデーションキット

681975-908K

AdvanceBio 脱塩 RP カートリッジ
説明

部品番号

AdvanceBio 脱塩-RP、2.1 x 12.5 mm、2 個

PL1612-1102

カートリッジホルダ

820999-901

ヒントとツール
ガードカラムとフィルタを使用すると、詰まりの原因となる微粒子からカラムや機器を保護できます。詰まりがあるとシステム圧力が上がって性能が低下し、日々のワークフローの妨げになります。アジレントの UHPLC カラムおよび Bio LC カラム用の新しい Fast Guard を使用すれば、カラムを保護してカラム寿命を延 ばし、ワーク

フローの中断を最小限に減らすことができます。

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www.agilent.com/chem/jp59

5 ペプチドのマッピングと分析

ペプチドのマッピングと分析
アミノ酸配列、翻訳後修飾、および合成関連の不純物を正確に判断
モノクローナル抗体などのタンパク質を完全に特性解析するには、一次アミノ酸配列と、メーカーの精製や製剤の段階で発生しうる配列 への翻訳後修飾（PTM）を調 べる必要があります。疎水性に基づいてペプチド内の 1 つのアミノ酸修飾を分離する能力と、質量確認のための MS 検出との互換性の両面から、一般に好まれる手法は逆相分離です。

アジレントは、グローバルなペプチドマッピング分析、脱アミド化 PTM の詳細観察、UV またはMS 検出、高または低 pH 移動相条件など、個々のユーザーの分離ニーズに応えるため、複数のペプチド分析用カラムオプションを用意しています。

逆相カラムの選択
アプリケーションタンパク質分解物中のペプチド

アジレントのカラム

AdvanceBio ペプチドマッピング

合成ペプチドの不純物分析

AdvanceBio ペプチドプラス

合成ペプチドの精製または不純物分析

PLRP-S 100 Å、300 Å

宿主細胞タンパク質分析

注意事項

さまざまな分子量域のペプチドの同定に最適な 120 Å ポアサイズです。分析が困難なペプチド混合物を使用した試験により性能を保証しています。アジレント独自の Poroshell 技術により、全ペプチド配列を短時間に高分離能で分析できます。

AdvanceBio ペプチドマッピングとは異なる選択性を持つ帯電表面 C18 結合相。このカラムは、脱アミド化ペ

プチド変異体の分離や、ギ酸移動相および高いロード量条件下での分離に優れています。

分析分離から分取分離まで拡張可能です。

pH 安定性に優れているため非常に高い pH でも使用できます。また、耐熱性にも優れておりオートクレーブでの滅菌処理も可能です。

ヒントとツールペプチドの HILIC 分離では、ZORBAX RRHD 300Å HILIC をご検討ください。詳細については、59 ページを参照してください。

PLRP-S について、詳しくは「インタクトタンパク質分析」セクションの「PLRP-S」セクション（55 ページ）を参照してください。
部品番号と製品情報については、71 ページの表を参照してください。

60

Agilent BioHPLC カラム

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ペプチドのマッピングと分析

5

AdvanceBio ペプチドマッピング– 分析信頼性の向上：AdvanceBio ペプチドマッピングカラム充填剤の各バッチは、厳密なペプチド混合物を使用したテストを実施しているため、適合性と再現性が確保されており、複雑なペプチドマッピングで主要ペプチドを同定できます– 分析時間の短縮：全多孔質 HPLC カラムより 2 ～ 3 倍高速です– すべての機器の機能を向上：内径 4.6、3.0、および 2.1 mm のカラムは 600 bar まで安定しているため、UHPLC 装置を最大限に活用できます。従来の 400 bar の装置でも優れた性能を実現します– 柔軟性の向上：すべての HPLC にギ酸移動相を使用することで MS 感度を上げます

これらの高度なバイオカラムの特徴は、120 Å のポアサイズと 2.7 µm の表面多孔質粒子です。このカラムでは、分析が困難なペプチド混合物を使用して特別にテストを実施し、信頼性の高いペプチドマッ
ピング性能を保証しています。また AdvanceBio ペプチドマッピングカラムと UHPLC を組み合わせると、分離能と速度が大幅に向上します。従来の HPLC で使用しても優れた結果を得ることができます。

カラムの仕様結合相

ポアサイズ

EC-C18

120 Å

上限温度

60 ℃

pH 範囲

2.0～8.0

エンドキャップ
ダブルﾠ仕様の数値は代表値です。

ヒントとツール
AdvanceBio ペプチドマッピングカラムの使用方法については、次の資料を参照してください。

N

Amano, M. et al.Detection of Histidine Oxidation in a Monoclonal Immunoglobulin
gamma（IgG）1 Antibody. Analytical Chemistry, 2014, 86 (15): 7536-7543

B

N

R

L

A
P

D

I

R

A

H
M

T

N

P

N

T

A
P

K

D

R

A
R

T

Leah G. Luna and Katherine Coady, Identification of X. laevis Vitellogenin Peptide
Biomarkers for Quantification by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry.
J. Anal Bioanal Tech, 2014, 5:3

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www.agilent.com/chem/jp

61

B

R

5 ペプチドのマッピングと分析
エリトロポエチンタンパク質分解物の高分離能ペプチドマップ

カラム：
移動相：

AdvanceBio ペプチドマッピング
651750-902
2.1 x 250 mm、2.7 µm

A：H2O + 0.1 % ギ酸（v/v）
B：アセトニトリル + 0.1 % ギ酸（v/v）

流量：

グラジエント：

mAU
300

250

0.4 mL/min
時間（分）

0
28
33
34

%B
3
45
60
95

200

150

100

温度：

サンプル：

55 ℃
5 µL（2 µg/µL）

50

0
0

5

10

15

20

25

30

min

IgG の高速で効率的なペプチドマッピング

カラム：

AdvanceBio ペプチドマッピング
653750-902
2.1 x 150 mm、2.7 µm

移動相：

A：H2O + 0.1 % FA（v/v）
B：90 % ACN + 0.1 % FA（v/v）

流量：条件により異なる

注入量：

15 µL

温度：

検出器：

AdvanceBio ペプチドマッピング
655750-902
2.1 x 100 mm、2.7 µm

40 ℃

サンプル：

UV、215/220 nm

1290 Infinity LC システムと6530 Accurate-Mass 四重極飛行時間型 LC/MS

2.1 x 150 mm AdvanceBio ペプチドマッピングカラム

mAU
160

%B
-50 %

140
120
100
80
60
40
20
0

0

mAU

10

20

30

40

50

60

2.1 x 100 mm AdvanceBio ペプチドマッピングカラム

160
140

min

%B
-50 %

120
100
80
60
40
20
0

0

2

4

6

8

10

12

AdvanceBio ペプチドマッピングカラムの最適化による高速ペプチドマッピング分析の実現。グラジエント 10～ 40 % B、DAD：215 nm、40 ℃。上図、2.1 × 150 mm カラムを用いた 75 分の分離により 59 ペプチド

ピークを生成（流量 0.2 mL/min、211 bar）。下図、2.1 × 100 mm カラムを用いて最適化した 14 分の分

離により 57 ペプチドピークを生成（流量 0.6 mL/min、433 bar）。

62

Agilent BioHPLC カラム

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min

ペプチドのマッピングと分析

5

Agilent ペプチド混合物を使用した品質管理テスト

カラム：
流量：

グラジエント：

温度：

検出器：

サンプル：

AdvanceBio ペプチドマッピング
653750-902
2.1 x 150 mm、2.7 µm
3 µL

140
120

A、H2O（0.1 % TFA）、B、ACN（0.1 % TFA）、0 ～ 25 分、
15 ～ 65 % B、25 ～ 26 分、65 ～ 95 % B

6

100

55 ℃

5

ペプチドマッピング標準混合物

60

部品番号 5190-0583

40（ペプチドごとに 0.5 ～ 1.0 µg/µL）

7

3

80

220 nm2

1.ブラジキニンフラグメント（1 ～ 7）
2.ブラジキニン酢酸
3.アンギオテンシン II
4.ニューロテンシン
5.アンギオテンシン I
6.レニン
7.[Ace-F-3,-2 H-1] アンギオテンシン（1 ～ 14）
8.セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ（15 ～ 31）
9.[F14] セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ（15 ～ 31）
10.メリチン（ハチ毒）

8

4

9
10

1

20
0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

AdvanceBio ペプチドマッピング充填剤の全バッチにテスト用混合物を使用。混合物は分子量の範囲が 757 ～
2845 Da の 10 種類の親水性、疎水性、および塩基性ペプチドを含有。すべてのカラムは低分子プローブを使用したテストにより効率性を保証

CrossLab リアルストーリー
生化学分野での活用例

大幅なダウンタイム短縮とユーザーの信頼性向上を実現した、実際のラボの事例をご覧ください。

www.agilent.com/chem/story25

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www.agilent.com/chem/jp63

5 ペプチドのマッピングと分析
200 回の注入後のロット間再現性

カラム：

AdvanceBio ペプチドマッピング
651750-902
2.1 x 250 mm、2.7 µm

流量：0.5 mL/min

注入量：

1 µL

グラジエント：A、H2O（0.1 % TFA）、B、ACN（0.08 % TFA）、0 ～ 8 分、10 ～ 60 % B、8.1 ～ 9 分、95 % B で保持

温度：

55 ℃

検出器：

220 nmサンプル：

Sigma HPLC ペプチド標準

シリカロット PEP1227229
注入1（39.5 MPa）

Norm

注入200（388 bar）

200

注入

1.Gly-Tyr

1

2.Val-Tyr-Val

2

150

3

4

5

RT3

RT4

RT5

（分）

（分）

（分）

3.Met Enk

1

4.Angio II

200

3.52

4.48

4.70

5.02

5.Leu Enk

3.39

4.36

4.59

4.90

注入

PW2

PW3

PW4

PW5

50

1

0.020

0.021

0.020

0.022

0

200

0.020

0.021

0.019

0.021

100

1

2

3

4

5

6

7

8

ロット B12169
注入1（397 bar）

注入

注入200（405 bar）

1

200

2

150

3

4

50
0
1

2

3

4

5

6

7

8

ロット間および分析間の優れた再現性。2.1 x 250 mm AdvanceBio ペプチドマッピングカラムを使用することで、最大の分離能を達成しました。

Agilent BioHPLC カラム

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RT2

RT3

RT4

RT5

（分）

（分）

（分）

（分）

200

3.24

4.18

4.41

4.74

注入

PW2

PW3

PW4

PW5

1

0.019

0.020

0.019

0.020

200

0.019

0.020

0.019

0.020

1

5

100

64

RT2

（分）

3.36

4.29

4.52

4.85

ペプチドのマッピングと分析

5

アジレントのペプチド品質管理用標準試料

10 種のペプチドを含むこの品質管理用標準試料は、アジレントがカラムの QC に用いているものと同じ試料です。この標準試料を使えば、カラム使用期間を通してカラム性能が確認できます。この標準試料は HPLC および LC/MS に使用できます。1 バイアルあたりの注入回数は約 20 回です。

AdvanceBio ペプチドプラス

AdvanceBio ペプチドプラスカラムは、ターゲットペプチドと不純物、翻訳後修飾の分離用に最適化された、逆相表面多孔質粒子 HPLC カラムです。ハイブリッドエンドキャップ処理された C18 固定相でポアサ

イズ 100 Å の 2.7 µm 粒子を修飾することにより、帯電表面を形成しています。帯電表面を持つ C18 カラムを使用すれば、脱アミド化ペプチドとその未修飾変異体の分離度が劇的に向上し、従来の C18 カラ
ムよりも脱アミド化ペプチドと未修飾型ペプチドに対する選択性が大幅に強化されます。

脱アミド化では、アスパラギンがアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に変換されます。脱アミド化 ペ

プチドでは 1 Dalton の質量シフトがよくあるので、このような小さな質量変化を検出するために LC/MS

手法がよく使われます。アスパラギンが対応するカルボン酸性基に変換されても、低 pH では疎水性が大きく変化しないため、脱アミド化ペプチドが未修飾型と共溶出する可能性があります。これが脱アミド化ペプ

チドの定量と検出を妨 げたりする可能性があります。質量分析自体は脱アミド化 ペプチドを分離できない
ため、分離が重要であることに注意してください。

分離能の優れた信頼性の高いペプチドマッピング分離を実現するうえで最も重要な点は、適切なカラムを選択することです。ペプチド分離に適したカラムのポアサイズは 100 Å ～ 120 Å で、一般的に最適な相は

C18 です。生物製剤分野を中心に、生物学的分離に表面多孔質カラムが使われることも増えています。これは、表面多孔質カラムでは、タンパク質やペプチドの質量拡散に伴う制約に対応できるためです。表面

多孔質カラムでは、拡散経路が短くなるため、小さい粒子のカラムで生じがちなシステム背圧の上昇を引き起こさずに、大きな分子を高線速度で分離することができます。一般に、ペプチドの逆相分離は、低 pH（pH<3）および高温（>40 ℃）で実行されます。

PTM または不純物

脱アミド化変異体の分離 – プラスに帯電した表面を持つ C18 により、脱アミド化変異体の選択性が向上

します

データ精度

ピーク形状と MS 感度 – 帯電表面により、ギ酸で良好なピーク形状を実現します

卓越したロード量

低存在量のペプチドを同定 – 帯電表面 C18 相は高いロード量に対する耐性が向上しています

データ品質

優れた見識を持つ科学者のニーズを満たす強力な QC プロセスが可能です

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5 ペプチドのマッピングと分析
脱アミド化変異体の選択性向上
パラメータ

Agilent 1290 Infinity II LC

カラム

Agilent AdvanceBio ペプチドプラス、2.1 × 150 mm、（部品番号 695775-949）

カラム温度

60 ℃

移動相

Agilent AdvanceBio ペプチドマッピングカラム、2.1 × 150 mm、（部品番号 653750-902）
A）0.1 % ギ酸水溶液

B）0.1 % ギ酸アセトニトリル溶液

流量0.4 mL/min

グラジエント

時間（分）

%B

0

3

2

3

40

40

50.5

100

53

3

ポストタイム7分

パラメータ

Agilent 6546 Q-TOF

ガス温度

323 ℃

イオン源

Agilent Jet Stream を使用

乾燥ガス流量13 L/min

ネブライザガス35 psi

シースガス流量

11 L/minシースガス温度
キャピラリー電圧

ノズル電圧

フラグメンタ電圧

275 ℃
4,000 V
0V
125 V

スキマ電圧

65 V

Oct 1 RF Vpp

750 V

質量範囲

m/z 300 ～ 1,700MS スキャンレート（スペクトル/秒）

取り込みモード5
ポジティブモード、拡張ダイナミックレンジ（2 GHz）

セントロイドデータフォーマット

ペプチド

シーケンス （非脱アミド化型）[M+2H]2+ の m/z

A

NQVSLTCLVK

581.8103B

FNWYVDGVEVHNAK

839.4047C

VVSVLTVLHQDWLNGK

904.5071

D

NTAYLQMNSLR

655.8300E

GLEWVGYIDPSNGETTYNQK

1136.0323

66

Agilent BioHPLC カラム

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ペプチドのマッピングと分析

Agilent AdvanceBio ペプチドプラス

5

Agilent AdvanceBio ペプチドマッピング

A

A
A*
A*
A*
A*
11

12

13

14

15

16

17

時間（分）

18

19

20

21

B

B

B* B*
B*

B*

13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0
時間（分）

C
C*

C
C*
C*

C*

C*
C*
20

21

22

23

24

25

26

時間（分）

27

28

29

D

D
D*
D*

D*

D*

11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0
時間（分）

E

E
E*
E*
E*
E*
E*
18.0

18.5

19.0

E*

19.5

20.0

20.5

21.0

時間（分）

21.5

22.0

22.5

23.0

23.5

24.0

Agilent AdvanceBio ペプチドマッピングカラムと Agilent AdvanceBio ペプチドプラスカラムの比較。未修飾 ペプチド

（各ペプチドは、表 １ のアルファベットを表記）とその脱アミド化ペプチド（表 １ のアルファベットに * を示す）を同条件（0.1 % のギ酸による移動相調整）で分離。

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www.agilent.com/chem/jp67

5 ペプチドのマッピングと分析
HPLC 条件

カラム

Agilent AdvanceBio ペプチドプラス、2.1 × 150 mm（部品番号 695775-949）
A）0.1 % ギ酸水溶液

移動相
グラジエントB）0.1 % ギ酸アセトニトリル溶液
0 分：17 % B
2 分：17 % B

22 分：37 % B
24 分：95 % B
26 分：95 % B
ポストタイム

流量26.1 分：17 % B
5分

0.4 mL/min

カラム温度

注入量

60 ℃

5 µL（UV）、1 µL（MS）

パラメータ

Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

ガス温度

350 ℃

イオン源

デュアル Agilent Jet Stream

乾燥ガス流量10 L/min

ネブライザガス30 psi

シースガス流量12 L/minシースガス温度
キャピラリー電圧

ノズル電圧

フラグメンタ電圧

275 ℃

4,000 V
0V
125 V

スキマ電圧

65 V

Oct 1 RF Vpp

750 V

質量範囲

m/z 100 ～ 1,700（MS）、MS スキャンレート

8 スペクトル/秒

MS/MS スキャンレート
取り込みモード

コリジョンエネルギー

68

Agilent BioHPLC カラム

m/z 50 ～ 1,700（MS/MS）
3 スペクトル/秒

ポジティブ、拡張ダイナミックレンジ（2 GHz）

3.6 ×（m/z）/100 – 4.8

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ペプチドのマッピングと分析

ビバリルジンペプチドサンプルの分離プ

×102

ロファイルの経時変化

Response (mAU)

2.4
2.2
2.0

×103

2

0.9
0.8
Response (mAU)

5

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0

5

2
3

0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
4.0

4

1

4.4

4.8

5.2

5.6

6.4

6.0

6.8

7.2

7.6

8.0

8.4

8.8

9.2

9.6

18

19

10.0

Retention time (min)

0.7
0.6
0.5
×102
1.2 A

0.4
0.3
0.2
1

0.1

3 4

1.1

5

1.0
0.9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Counts (%)

0

0.8

90.7

10

11

12

13

14

15

17

16

20

Retention
time (min)0.6

ピーク 1 は 17 位または 18 位でグルタミン酸を失う

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

主製品の MS スペクトル （ピーク 2）、

0の MS/MS スペクトル （ピーク 1）、不純物
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700

不明のグルタミン酸残留物の位置が判明
Mass-to-charge (m/z)

1.1

×102
1.2 B

1.0

1.1

0.9

1.0

0.7

0.9

0.6

0.8

0.4
0.3
0.2
0.1

b15
1,530.6915

0.7
0.6
0.5
0.4

100

200

300

400

500

600

700

800

900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700

Mass-to-charge (m/z)

0.3

y2

0.2

295.1771

0.1

不純物の MS スペクトル （ピーク 1）

0

×102
1.2 A

200

300

400

b152+
709.2704

01,025.9829

500

600

700

800

1,401.6542

0.5

y4
521.2696

650.3117

Counts (%)

Counts (%)

0.8

y4
FPRPG G G G NGDFEE IPEYL
b15

960.9192×102
1.2

765.8518

FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL

900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800
Mass-to-charge (m/z)

1.1
1.0

Counts (%)

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700

Mass-to-charge (m/z)

y4
FPRPG G G G NGDFEE IPEYL
b15

×102
1.2 B
1.1
1.0

y4

1,025.9829

521.2696

0.8

b15
1,530.6915

0.7
0.6

7

unts (%)

0.9

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp69Counts (%)

0.9

5 ペプチドのマッピングと分析

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

0
の MS/MS
ピーク
不純物）、 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700
100
200 300 スペクトル400 500 （600
700 1800

Asn 脱アミド化の位置が判明

FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL
×102

1.1

0.8

0.9

0.7

0.8

0.3
0.2

0.6
0.5
y2

0.4

0.1
100

200

300

400

500

600

700

800

295.1755

0.3
900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700

0.2

Mass-to-charge (m/z)

0.10

不純物の MS スペクトル （ピーク 5）

200

300

400

500

b192+

b152+
768.34940.4

650.3100

0.7

600

700

841.4026

0.5

b15

y5

519.2186

0.6

1,090.9962

1,531.6760

1.0Counts (%)

0.9

356.1533

1.0

800

b14

1,025.4507

1.1Counts (%)

y5
FPRPG G G G DGDFE E IPEEYL
b15

×102
1.2 B

1.2

0

Mass-to-charge (m/z)

1,418.5957

主製品の MS スペクトル （ピーク 2）、

900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800
Mass-to-charge (m/z)

×102
1.2 A
1.1
1.0

Counts (%)

0.9
0.8

ピーク

質量（Da）

1

2,049.95

22,178.99

52,179.97

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2

100

200

300

400

500

600

700

800

Glu 欠失製品

脱アミド化

ターゲット質量（Da） 質量誤差（ppm）

2,049.94

1.71

2,178.99

1.65

2,179.97

2.02

ピーク 5 は脱アミド化を示す – 9 位の Asn は Asp に変換

0.10

ピーク ID900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700

Mass-to-charge (m/z)

y5
FPRPG G G G DGDFE E IPEEYL
b15

×102
1.2 B
1.1

1,090.9962

0.9
0.8

650.31000.6

01,025.4507

b14

ペプチドマッピングは、組み換えタンパク質をはじめとするタンパク質同定試験に広く用いられている優 れた手法です。再現性が高く正確
1,418.5957

0.1

768.3494

0.2

b192+

b152+

841.40260.3

y2

519.2186

0.4

356.1533

0.5
295.1755

Counts (%)

ヒントとツール
0.7

b15

y5

1,531.6760

1.0なペプチドマッピングのためには、カラム選択の他にいくつかの点を考慮する必要があります。例えばタンパク質分解、サンプル前処理、メ

300 400 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800
ソッド
最適化などです。

200

Mass-to-charge (m/z)

ペプチドマッピング手順で使用される基本的な手法とペプチドマッピング分離を最適化する際の考慮事項については、「最適なペプチド分析のために：ペプチドマッピングの基礎」（資料番号 5991-2348JAJP）を参照してください。

70

Agilent BioHPLC カラム

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ペプチドのマッピングと分析

5

製品の詳細情報

AdvanceBio ペプチドマッピング
説明

部品番号

4.6 x 150 mm、2.7 µm

653950-902

3.0 x 150 mm、2.7 µm

653950-302

2.1 x 250 mm、2.7 µm

651750-902

2.1 x 150 mm、2.7 µm

653750-902

2.1 x 100 mm、2.7 µm

655750-902

1 x 150 mm、2.7 µm

863600-911

0.075 x 150 mm、2.7 µm

5065-9925

4.6 x 5 mm、Fast Guard*

850750-911

3.0 x 5 mm、Fast Guard*

853750-911

2.1 x 5 mm、Fast Guard*

851725-911

0.3 x 50 mm、Fast Guard*5065-9946*Fast Guard カラムを使えば、分離スピードや分離能を損なわずに、カラム寿命を長くすることができます。

アジレントのペプチド品質管理用標準試料
説明

ペプチド品質管理用標準試料、
71 µg、2 mL バイアル中

AdvanceBio ペプチドプラス
説明

AdvanceBio ペプチドプラス 2.1 x 150 mm、2.7 µm
AdvanceBio ペプチドプラス 2.1 x 250 mm、2.7 µm
AdvanceBio ペプチドプラス 2.1 x 50 mm、2.7 µm

AdvanceBio ペプチドプラス 3.0 x 150 mm、2.7 µm
AdvanceBio ペプチドプラス 4.6 x 150 mm、2.7 µm

AdvanceBio ペプチドプラス、2.1 x 150 mm、2.7 µm、メソッドバリデーションキット
UHPLC ガードカラム、AdvanceBio ペプチドプラス、2.1 mm、2.7 µm、3 パック
UHPLC ガードカラム、AdvanceBio ペプチドプラス、3.0 mm、2.7 µm、3 パック
UHPLC ガードカラム、AdvanceBio ペプチドプラス、4.6 mm、2.7 µm、3 パック

部品番号5190-0583

部品番号695775-949
693775-949
699775-949
693975-349
693975-949
695775-949K
821725-954
823750-952
820750-940

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www.agilent.com/chem/jp71

6 電荷変異体の分析

電荷変異体の分析

タンパク質およびその他の荷電分子の精製

イオン交換クロマトグラフィー （IEX）は、イオンと極性分子を電荷に基づいて分離する高感度な手法です。

IEX は SEC と同様に、タンパク質を未変性状態のまま分離できます。

IEX による電荷変異体の分析

抗体の生成および精製時には、アミノ酸置換、グリコシル化、リン酸化、その他の翻訳後修飾や化学修飾により、抗体の電荷均一性に変化が生じることがあります。

タンパク質の分析では、特定の pH における電荷の変動は、分子の一次構造が変化したことを示しています。こうした構造の変化により、分析対象のタンパク質に別の形態が生じます。これらはアイソフォーム（または電荷変異体）と呼 ばれます。

このような変化は安定性と活性に影響を与えることがあるほか、免疫上マイナスの反応を引き起こすこともあるため、電荷変異体の分析はバイオ医薬品にとってきわめて重要です。

安全で効果の高い医薬品を提供するためには、品質と一貫性が欠かせません。バイオ医薬品業界を支えるメーカーとして、

アジレントは、最高の分離能とスピード、再現性を提供するカラムを通じて、医薬品の迅速かつ効率的な開発をサポートします。

ここからは、アジレントの弱/強イオン交換（アニオンおよびカチオン）製品ファミリーについて説明します。

– 非多孔質 Bio IEX カラムは、高分離能、高効率、高回収率で分離できるように設計されています。
– Bio MAb カラムは、モノクローナル抗体の電荷アイソフォームの分離用に最適化されています。

– Porous IEX カラム（PL-SAX および PL-SCX）は化学的に安定しており、2 種類のポアサイズがあります。このためペプチド、オリゴヌクレオチド、および非常に大きいタンパク質を分離できます。

– 特にバイオモノリス IEX カラムは、抗体、ウイルス、DNA の分離に最適です。

– Buffer Advisor ソフトウェアは、イオン強度グラジエントによる自動的なタンパク質分離に最適なソリューションです。

ヒントとツール
Agilent Buffer Advisor ソフトウェアの詳細については、資料番号 5991-1408EN を参照してください。

72

Agilent BioHPLC カラム

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電荷変異体の分析

イオン交換カラムの選択

アプリケーション

アジレントのカラム

モノクローナル抗体

Bio MAb

6

注意事項
モノクローナル抗体を徹底的に特性解析するためには、酸性および塩基性アイソフォームを同定し、モニタリングする必要があります。Bio MAb HPLC カラムには電荷の違いをもとにモノクロー
ナル抗体を高分離能分離するために設計された独自の樹脂が充填されています。

ペプチドおよびタンパク質

Bio IEX

Bio IEX カラムには、非多孔質のイオン交換ポリマー

粒子が充填されています。Bio IEX カラムは、高分離能、高回収率、高効率の分離を実現するように設計されています。

タンパク質、ペプチド、および脱保護

合成オリゴヌクレオチド

PL-SAX

化学的安定性の高い全多孔質ポリマーにより、広い動作 pH 範囲を実現します。アニオン交換容• 1000 Å

す。30 µm メディアは中圧での液体クロマトグラフィーに適しています。

• 4000 Å
球状タンパク質およびペプチド

PL-SAX 1000 Å

非常に大きい生体分子/高速

PL-SAX 4000 Å

小さなペプチドから大きなタンパク質、

PL-SCX 1000 Å

および非常に大きい生体分子

量が pH に左右されることもありません。合成オリゴヌクレオチドの場合は、温度、有機溶媒、高pH の変性条件を使用した分離にも対応できます。5 µm メディアでは高分離能での分離が可能でPL-SCX は、マクロポーラス型のポリスチレン/ジビニルベンゼンポリマーに親水性の被膜を施し強カチオン交換基を化学結合させた、ポリマー系の陽イオン交換 HPLC カラムです。このプロセスでは、幅広い生体分子の分析、分離、および精製に最適な密度で強カチオン交換基が結合されるようにコントロールされています。5 µm メディアでは高分離能での分離が可能です。30 µm メディアは中圧での液体クロマトグラフィーに適しています。
抗体（IgG、IgM）、プラスミド DNA、ウイルス、ファージ、

その他のマクロ生体分子

バイオモノリス

強カチオン交換相、強および弱アニオン交換相。バイオモノリス

HPLC カラムは InfinityLab LC シリーズと互換性があります。

• バイオモノリス QA• バイオモノリス DEAE
• バイオモノリス SO3

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6 電荷変異体の分析

Bio MAb HPLC カラム– 硬い球状の高度に架橋されたポリスチレン/ジビニルベンゼン（PS/DVB）非多孔質ビーズで構成された充填剤を使用しています– 粒子に親水性ポリマー層を被膜しているため、抗体タンパク質の非特異的な結合がありません– 弱カチオン交換相と粒子を異なるプロセスを用いて階層化しているため、Bio WCX カラム粒子より高密度です– モノクローナル抗体の電荷アイソフォームの分離のために、特別に設計されました

モノクローナル抗体を徹底的に特性解析するためには、酸性および塩基性アイソフォームを同定し、モニタリ

ングする必要があります。Bio MAb HPLC カラムには、電荷の違いをもとにモノクローナル抗体を高分離能分離するために設計された独自の樹脂が充填されています。これらのカラムは、水溶液バッファ、アセトニトリ

ル/アセトン/メタノール、および水の混合液と互換性があります。一般的に使用される緩衝液はリン酸、トリス、

MES、酢酸です。

Bio MAb カラムには 1.7、3、5、および 10 µm サイズがあり、小さい粒子ほど分離能が高くなります。
カラムの仕様
結合相

弱カチオン交換（カルボン酸塩）

内径2.1 および 4.6 mm

粒子サイズ

1.7、3、5、および 10 µm

10 mm

5 µm

21.2 mm

5 µm

pH 安定性

使用温度上限流量

2 ～ 1280 ℃

2.3 ～ 4.7 mL/min

2 ～ 122 ～ 1280 ℃

80 ℃

0.1 ～ 1.0 mL/min

10.6 ～ 21.2 mL/min

ヒントとツール
モノクローナル抗体の電荷変異体分析のスループットを上げたい場合は、次の資料を参照してください。
「Reducing Cycle Time for Charge Variant Analysis of Monoclonal

Antibodies（モノクローナル抗体の電荷変異体分析のサイクル時間の短縮）」（資料番号5991-4722EN）。

74

Agilent BioHPLC カラム

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電荷変異体の分析

一貫性のあるイオン交換 mAb 分離

カラム：
移動相：

検出器：

UV、225 nm

サンプル：

Bio MAb、PEEK
5190-2407
4.6 x 250 mm、5 µm

1 mg/mL インタクトまたは C-末端分解 IgG1、5 µL

装置本体：

1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC または
1100 シリーズ LC

A：リン酸ナトリウム 10 mM、pH 5.5
B：A + 塩化ナトリウム 0.5 M

流量：0.85 mL/min

10 ～ 35 % B、0 ～ 25 分
（特に記載のない場合）

13.563

グラジエント：6

IgG1 インタクト

総面積 = 3770.2

17.5085

15.482

12.12410

12.754mAU

15

16.86115.093

20

0
2.5

5

7.5

10

変異体

503.3

15

メイン

ピーク

17.5

塩基性

20

C 末端分解516.848

総面積 = 3785.8

17.48914.92015.21715.47312.67312.037mAU

10

25 min

707.6

20
15

22.5

変異体

2559.313.494

ピーク面積：

12.5

酸性

0
2.5

5

7.5

10
ピーク面積：

酸性

変異体

541.6

12.5

メイン

15

ピーク

2950.9

塩基性

17.5

20

22.5

25 min変異体

293.3

Bio MAb 5 µm カラムを装着した 1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC による C 末端分解 IgG1 の計算

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www.agilent.com/chem/jp75Response

2.8
2.4

6 1.6 電荷変異体の分析
2.0

A3

1.2

A5
A4

0.8
0.4

A1 A2

0

トラスツズマブ12 電荷変異体
3
4
5 の
6 分離
7 の
8 再現性
9 10

B1
B2
B3 B4

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Retention time (min)Main

精度（RSD）

RT（%）

面積（%）

1.0

A1

0.033

1.793

0.9

A2

0.016

0.701

A3

0.026

0.403

A4

0.023

0.813

A5

0.032

0.327

メイン

0.033

0.313

B1

0.038

0.329

B2

0.048

0.254

B3

0.046

3.549

B4

0.051

0.812

×101

1.1

B

A3

Response (mAU)

0.8
0.7

B1

A5

0.6
0.5

B2

0.4

A4

0.3
A2

0.2

B3

A1

0.1

B4

0
-0.1
6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Retention time (min)
7 回の連続分析において 0.66 % B/min（3.3 mM/min）のグラジエント勾配でトラスツズマブの電荷変異体を分離した際の再現性の実験結果

トラスツズマブの Fab および Fc フラグメントの WCX 分離
カラム：
移動相：

A：20 mM MES、pH 5.6
B：20 mM MES、pH 5.6 + 300 mM NaCl

流量：170 µL/min

注入量：

グラジエント：

温度：

装置本体：

76

Bio MAb、PEEK
5190-2411
2.1 x 250 mm、5 µm

mAU

Fab

1000

800

16 µL

時間（分）

0
39.5
40
50
50.5
60

30 ℃
1100 シリーズ

Agilent BioHPLC カラム

%B
0
80
100
100
2
2

600

400

Fab（KTH 欠損）
Fc

Fab

200

（脱アミド化）

0

18

20

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22

24

26

28

30

32

min

電荷変異体の分析

6

Buffer Advisor ソフトウェアによるメソッド開発 - 最適な pH の測定

カラム：

Bio MAb、PEEK
5190-2407
4.6 x 250 mm、5 µm

装置本体：
緩衝液：

1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC

グラジエント：PBS（リン酸緩衝液生理食塩水）に溶解したタンパク質 3 種の混合液、pH 7.4

注入量：

A：H2O
B：NaCl 3 M
C：MES（2-N-モルホリノエタンスルホン酸水和物）60 mM
D：MES-Na（2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）35 mM

サンプル：

リボヌクレアーゼ A：13,700 Da、pI 9.6

10 µL

サーモスタット：

4℃

DAD：

280 nm/4 nm

温度 TCC：

シトクローム c：12,384 Da、pI 10 ～ 10.5
リゾチーム：14,307 Da、pI 11.35

流量：0 分 – 20 mM NaCl
5 分 – 20 mM NaCl
30 分 – 500 mM NaCl
35 分 – 1,000 mM NaCl
36 分 – 20 mM NaCl

1 mL/min

25 ℃

リファレンス：オフ

ピーク幅：0.05 分以上（1.0 秒のレスポンス時間）（5 Hz）

1.リボヌクレアーゼ A

12

mAU
250

2.シトクローム c
3.リゾチーム

200

50

pH 6.2pH 6.42

2

pH 6.6pH 6.8

150
100

2

2

2

pH 5.8
pH 6

1

1
3

3

3

1

1

1
3

3

3

0
min
3 種のタンパク質からなる混合液の分離を目的とした、動的に混合される 4 成分グラジエントを用いた pH スカウティング

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6 電荷変異体の分析
リテンションタイムのばらつきを解消
カラム：
移動相：
流量：

Bio MAb、ステンレス
5190-2413
4.6 x 250 mm、10 µm

A：10 mM リン酸ナトリウム、pH 6.0
B：A + 1.0 M 塩化ナトリウム1.0 mL/min

グラジエント：0 ～ 100 % B、42 分

検出器：

UV、214 nm

温度：

1.シトクローム c

3

2.リゾチーム

3.リボヌクレアーゼ A

ロット A

ロット B

25 ℃

しっかりと管理された樹脂生産、カラム表面の結合相、カラム充填剤により、カラム間
およびロット間でのリテンションタイムのばらつきを解消しています。

78

2

1

Agilent BioHPLC カラム

ロット C

0

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2

4

6

8

10

12

14

16

18

min

電荷変異体の分析

6

Bio IEX HPLC カラム– 高度に架橋された硬質の非多孔質ポリスチレン/ジビニルベンゼン（PS/DVB）粒子に親水性ポリマー層を被膜しているため、非特異的な結合がありません– 均一の高密度で充填されたイオン交換基が親水性層（アンカーあたり複数のイオン交換基）と化学的に結合されているため、カラム容量が増加します– 耐高圧性に優れた粒子、被膜層、および結合相により、分離能および分離スピードが向上します– 複数のイオン交換基が 1 つのアンカーと結合されるため、容量が増加します

Bio IEX HPLC カラムには非多孔質ポリマー性のイオン交換粒子が充填されており、ペプチド、

オリゴヌクレオチド、タンパク質を高分離能、高回収率、高効率で分離できるように設計されています。

Bio IEX ファミリーには、強カチオン交換（SCX）、弱カチオン交換（WCX）、強アニオン交換（SAX）、および弱アニオン交換（WAX）相が含まれます。すべての相に、1.7、3、5、および10 µm の非多孔質粒子が用意されています。
カラムの仕様
結合相

内径

粒子サイズ

pH 安定性

使用温度上限WCX（弱カチオン交換）–COOH

2.1 および 4.6 mm

1.7、3、5、および 10 µm

2 ～ 1280 ℃

21.2 mm

5 µm

2 ～ 1280 ℃SCX（強カチオン交換）–SO3H

SAX（強アニオン交換）– N(CH3)3

10 mm

5 µm

WAX（弱カチオン交換）– N(C2H5)2

2 ～ 12

流量0.1 ～ 1.0 mL/min
2.3 ～ 4.7 mL/min

80 ℃

10.6 ～ 21.2 mL/min

ヒントとツール
電荷変異体の分析の最適化の詳細については、「分析の手引き」が記載されたアジレントのバイオカラムのアプリケーション総覧の 5 ページ
めを含め、この総覧の「Charge Variant Analysis（電荷変異体分析）（資料番号 5994-0034EN）」を参照してください。

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www.agilent.com/chem/jp79

6 電荷変異体の分析
高速でシンプルな電荷変異体ワークフロー

カラム：

移動相：

流量：

Bio WCX、ステンレス
5190-2443
4.6 x 50 mm、3 µm

注入量：

グラジエント：Bio SCX、ステンレス
5190-2423
4.6 x 50 mm、3 µm

A：水
B：塩化ナトリウム 1.5 M
C：リン酸一ナトリウム 40 mM
D：リン酸二ナトリウム 40 mM
Buffer Advisor ソフトウェアにより事前に決定した割合で C と D を混合することにより、目的とする pH 範囲とイオン強度の

温度：

10 mM
15 mM
20 mM
25 mM

0

1

2

3

4

5

min

モノクローナル IgG 分離のクロマトグラムのスクリーニングによる pH 6.5 における緩衝液強度の最適化

80

Agilent BioHPLC カラム

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室温

UV、220 nm

サンプル濃度：2 mg/mL（リン酸ナトリウム緩衝液 20 mM、pH 6.0）

装置本体：

1.0 mL/min

提示したクロマトグラムの条件：

pH 5.0 ～ 7.0、緩衝液強度 10 ～ 25 mM
塩化ナトリウム（NaCl）0 ～ 500 mM、0 ～ 15 分
塩化ナトリウム（NaCl）500 mM、15 ～ 20 分
DOE 実験
pH 5.0 ～ 7.0
0 ～ 200 mM、0 ～ 250 mM、および 0 ～ 300 mM の
NaCl

検出器：

サンプル：

緩衝液を調製。

10 µL

IgG モノクローナル抗体1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC

電荷変異体の分析

6

小さい粒子と短いカラムによる分析の高速化 ― 分離時間を 30 % 短縮

カラム：

移動相：
流量：

注入量：

Bio WCX、ステンレス
5190-2445
4.6 x 250 mm、5 µm

4.リゾチーム

2

800 mM NaCl

3

Bio WCX 3 µm、4.6 × 50 mm

4

1.0 mL/min

10 µL

検出器：

UV、220 nm

装置本体：

3.シトクローム c

1

A：リン酸ナトリウム 20 mM、pH 6.5
B：A + 塩化ナトリウム 1.6 M

0 ～ 50 % B

サンプル濃度：2.リボヌクレアーゼ A

Bio WCX、ステンレス
5190-2443
4.6 x 50 mm、3 µm

グラジエント：温度：

1.オボアルブミン

室温0 mM NaCl

00.5 mg/mL

5

10

15

20

25

30

min

1

1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC

2

800 mM NaCl
Bio WCX 5 µm、

43

4.6 × 250 mm

0 mM NaCl

0

5

10

15

20

25

30

min

Bio WCX 4.6 x 50 mm、3 µm カラムと Bio WCX 4.6 x 250 mm、5 µm カラムにおけるタンパク質分離（流量 1.0
mL/min）。小さい粒子サイズと短いカラムにより、分析時間が短縮されています。サンプル溶出時間は、長いカラムでは17 分ですが、短いカラムでは 12 分です。

ヒントとツール
詳細については次の資料をご覧ください。

「アジレントの弱陽イオン交換カラムを使用したタンパク質分離の最適化」（資料番号 5990-9628JAJP）「Faster separations using Agilent weak cation-exchange columns （Agilent 弱カチオン交換カラムを用いた分離の高速化）」（資料番号 5990-9931EN）「pH グラジエント溶出によるモノクローナル抗体電荷変異体の分離の向上」（資料番号 5990-9629JAJP）「Optimizing protein separations with cation-exchange chromatography using Agilent Buffer Advisor （Agilent Buffer Advisor を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質分離の最適化）」（資料番号 5991-0565EN）

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6 電荷変異体の分析
小さい粒子サイズにより分離能が向上

カラム：

Bio WCX、ステンレス
5190-2443
4.6 x 50 mm、3 µm

Bio WCX、ステンレス
5190-2441
4.6 x 50 mm、1.7 µm

移動相：

A：リン酸ナトリウム 20 mM、pH 6.5
B：A + 塩化ナトリウム 1.6 M

注入量：

10 µL

グラジエント：0 ～ 50 % B

温度：

室温

検出器：

UV、220 nm

サンプル濃度：

0.5 mg/mL

装置本体：

1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC
1.オボアルブミン

2.リボヌクレアーゼ A

2
1

0

3

1

2

3

800 mM NaCl

4

4

1

800 mM NaCl

4

3

3

1

4.リゾチーム

4

800 mM NaCl

Bio WCX 3 µm

Bio WCX 1.7 µm

Bio WCX 1.7 µm

0 mM NaCl

0 mM NaCl

0 mM NaCl

5

6

min

0

1

2

3

4

5

6

min

0

1

左と中央：Bio WCX 3 µm カラムと Bio WCX 1.7 µm カラムにおけるタンパク質分離（流量 1.0 mL/min）
右：流量を 1.7 mL/min に上げたところ、分離時間が 3 分未満に短縮（Bio WCX カラムを使用）
流量を上げることで分析時間が短縮され、ピーク形状や分離能の低下なし

ヒントとツール
緩衝液および移動相は、調製後にアジレントの溶媒フィルタでろ過し、粒子を除去することをおすすめします。
詳細情報：溶媒フィルター／脱気装置

82

3.シトクローム c

22

Agilent BioHPLC カラム

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2

3

4

5

6

min

電荷変異体の分析

6

Agilent 1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC システムを用いたアニオン交換カラムによるタンパク質の分析

カラム：
緩衝液：

グラジエント 1 M：
グラジエント 2 M：

ストップタイム：

Bio WAX、PEEK
5190-2487
4.6 x 250 mm、5 µm

A：20 mM トリス、pH 7.6
B：20 mM トリス、pH 7.6 + 2 M NaCl、
1 M KCl、1 M CH3COONa、
1 M [(CH3 )4N]Cl

5 分 – 100 % A
20 分 – 70 % B
25 分 – 100 % B

5 分 – 100 % A
20 分 – 35 % B
25 分 – 50 % B
25.01 分 – 100 % B
30 分

ポストタイム：20 分

流量：0.5 mL/min

DAD：

280 nm

温度：

注入量：
ピーク幅：

1.ミオグロビン、pl 6.9

2.コンアルブミンアイソフォーム A、pl 6.24mAU
70

3.コンアルブミンアイソフォーム B、pl 6.09

1

4. α-ラクトアルブミン、pl 4.560

5.トリプトシンインヒビター、pl 4.5

50
40

3

30

4

20

RSD（%）

ミオグロビン

5

2

10

0.073

RSD 面積（%）

0.413

コンアルブミンアイソフォーム A 0.080

0.809

a-ラクトアルブミン

0.081

n/a

0.075

1.024

コンアルブミンアイソフォーム B 0.066
トリプトシンインヒビター

n/a

0
-10
0

5

10

15

20

25

図 1. 2 M NaCl を溶出塩として使用した、直線グラジエントによる AEX でのタンパク質分離

25 ℃

min

5 µL
0.025 分（0.5 秒のレスポンス時間）（10 Hz）

詳細については、アプリケーションノート

5990-9614EN を参照してください。

mAU
80

1
4

70

ミオグロビン

60
50
30

5

2

20

0.105

0.066

コンアルブミンアイソフォーム A 0.027

n/aa-ラクトアルブミン

0.023

0.66

0.33

1.492

コンアルブミンアイソフォーム B 0.015

340

RSD（%） RSD 面積（%）

トリプトシンインヒビター

n/a

10
0
0

5

10

15

20

25

図 2. 1 M KCl を溶出塩として使用した、直線グラジエントによる AEX でのタンパク質分離

min

4

mAU
120

RSD（%） RSD 面積（%）

ミオグロビン100
80

a-ラクトアルブミン

0.040

4.606

0.074

0.628

トリプトシンインヒビター

40

3

n/a

5

2

20

2.346

n/a

コンアルブミンアイソフォーム B 0.033

1

60

0.077

コンアルブミンアイソフォーム A 0.035

0
-20
0

5

10

15

20

25

min

図 3. 1 M [(CH3)4N]Cl) を溶出塩として使用した、直線グラジエントによる AEX でのタンパク質分離

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www.agilent.com/chem/jp83

6 電荷変異体の分析

PL-SAX 強アニオン交換カラム– 小さい粒子によりクロマトグラフィー性能が優れています– 幅広い粒子サイズと 2 種類のポアサイズにより、分析から精製まで柔軟に対応できます– 優れた安定性により長寿命を実現しました

PL-SAX -N(CH3)3+ は、変性条件でのタンパク質、ペプチド、脱保護合成オリゴヌクレオチドのアニオン交換 HPLC 分離に最適です。化学的安定性の高い全多孔質 ポリマーにより、広い動作 pH 範囲を実現します。アニオン交換容量が pH に左右されることもありません。合成オリゴ

ヌクレオチドの場合は、温度、有機溶媒、高 pH の変性条件を使用した分離にも対応できます。

PL-SAX を使用すれば、凝集体やヘアピン構造に関連しうる自己相補配列や G-rich 配列オリゴ

ヌクレオチドのクロマトグラフィーを改良できます。5 µm カラムを使用すれば、n および n-1 配列を効率的に分離できます。幅広い粒子サイズとカラムサイズが用意されているため、分析にも精製にも使用できます。水酸化ナトリウム溶媒の使用時にも優れた化学的および温度的安定性を維持できるため、カラムを長期間使用できます。

カラムの仕様結合相

内径（mm）

粒子サイズ（µm）

ポアサイズ（Å）

pH 安定性

使用温度上限強アニオン交換

2.1、4.6、7.5、5、8、10、301000 Å および

1 ～ 1480 ℃

25、50、100

4000 Å

ヒントとツール
オリゴヌクレオチドの分離について、詳しくは本カタログの第 12 章を参照してください。

分取レベルでの PL-SAX については、5994-4723EN を参照してください。

84

Agilent BioHPLC カラム

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電荷変異体の分析

標準イオン交換 タンパク質分離

カラム：
移動相：

2.ウシ炭酸脱水酵素

検出器：

UV、220 nm

3.オボアルブミン

3

A：10 mM tris HCl、pH 8
B：A + 350 mM 塩化ナトリウム、pH 8

0 ～ 100 % B、20 分

流量：

1.ミオグロビン

PL-SAX 1000 Å
PL1551-1502
4.6 x 50 mm、5 µm

グラジエント：6

4.大豆トリプトシンインヒビター

4

2

1

1.0 mL/min

0

25

min

VLC0070

オボアルブミンおよび大豆トリプトシンインヒビターの分離

カラム：

PL-SAX 1000Å 8 µm

流量：1.0 mL/min

緩衝液：

0.01 M トリス、pH 8 、溶出塩 NaCl
1.オボアルブミン

2.大豆トリプトシンインヒビター

流量（mL/分）

Rs

0.5

3.79

1.0

4.27

1.5

4.46

2.0

3.68

3.0

3.37

4.0

3.09

2

2
0.5 mL/min

1.0 mL/min

分

4.0 mL/min

1

1

1

0

2

2

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0

分

2

0

分

www.agilent.com/chem/jp285

6 電荷変異体の分析
コリンキナーゼの分析

カラム：
移動相：

PL-SAX 4000 Å
PL1551-1803
4.6 x 50 mm、8 µm%B100

A：20 mM トリス 5 % エチレングリコール、pH 7.5（以下は酵素活性を維持するために必要）

酵素活性1.0 mM エチレングリコール四酢酸
2.0 mM ß-メルカプトエタノール
0.2 mM フッ化フェニルメチルスルホニル
B：A + 1 M 塩化カリウム

流量：3.0 mL/min

検出器：

UV、280 nm
00

T ポーターの分離、パデュー大学（米国）

代表的な乳清タンパク質の分析

カラム：
移動相：
流量：

1.炭酸脱水酵素

12. α-ラクトアルブミン

3. β-ラクトグロブリン B

2

4. β-ラクトグロブリン A

A：20 mM トリス HCI、pH 7
B：A + 500 mM 酢酸ナトリウム、pH 7

グラジエント：

検出器：

PL-SAX 1000 Å
PL1551-1802
4.6 x 50 mm、8 µm

1.0 mL/min

10 分で直線的に 0 ～ 50 % B
UV、280 nm

4
3

0

86

Agilent BioHPLC カラム

min

min

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18

40

電荷変異体の分析

6

PL-SCX 強カチオン交換カラム– 生体分子の効率的な分離に最適な設計です– さまざまな溶質サイズに適したポアサイズがあります– 優れた安定性により長寿命を実現しました

PL-SCX -SO3 は、マクロポーラス型のポリスチレン/ジビニルベンゼンポリマーに親水性の被膜を施し強カチオン交換基を化学結合させた、ポリマー系の陽イオン交換 HPLC カラムです。このプロセスは、小さいペプチドから大きいタンパク質まで幅広い生体分子の分析、分離、および精製に最適な密度で強カチオン交換基が結合されるようにコントロールされています。5 µm メディアでは高分離能での分離が可能です。30 µm メディアは中圧での液体クロマトグラフィーに適しています。

カラムの仕様結合相

内径（mm）

粒子サイズ （µm）

ポアサイズ

pH 安定性

使用温度上限強カチオン交換

2.1、4.6、7.5、25、

5、8、10、301000 Å

1 ～ 1480 ℃50、100

標準的なタンパク質の分離

カラム：
移動相：

1.ミオグロビン

2.キモトリプシノーゲン A

3

3.シトクローム c
4.リゾチーム

A：20 mM リン酸二水素カリウム、pH 6.0
B：A + 1 M 塩化ナトリウム

グラジエント：0 ～ 100 % B、20 分

検出器：

UV、280 nm

流量：2PL-SCX 1000 Å
PL1545-1502
4.6 x 50 mm、5 µm

14

1.0 mL/min

0

目次に戻る

min

25

VLC0046

www.agilent.com/chem/jp87

6 電荷変異体の分析
バイオモノリスイオン交換 HPLC カラム– マクロ生体分子分離のために設計されたポリマーベースのモノリス HPLC カラムです– 分離が流量に左右されず、また拡散、ポア、ボイドボリュームがないため移動相と固定相の間を高速移動できます– 連続的なチャンネルを備えたモノリスディスク（5.2 x 4.95 mm、カラム容量 100 µL）により、拡散に起因する物
質移動を排除します– 超高速分離によりメソッド開発時間を短縮してコストを削減できます。メソッドパラメータの固定化で時間と緩衝液の大幅な節約が可能です

バイオモノリスイオン交換 HPLC カラムは、抗体（IgG、IgM）、プラスミド DNA、ウイルス、ファージ、その他のマクロ

生体分子の高速高分解能の分離を実現します。この製品ファミリーには、強カチオン交換相、強および弱アニオン交換
相が用意されています。バイオモノリス HPLC カラムは InfinityLab LC シリーズと互換性があります。

バイオモノリス HPLC カラム選択ガイド

カラム

バイオモノリス QA

説明

第 4 級アミン結合相（強アニオン交換）は使用 pH 範囲 2 ～ 13 で完全に荷電し、負電荷により生体分子と結合します。

–
–

–
–

バイオモノリス SO3

ジエチルアミノエチル結合相（弱アニオン交換）は、使用 pH 範囲 3 ～ 9 で負電荷–スルホニル結合相（強カチオン交換）は使用 pH 範囲 2 ～ 13 で完全に荷電し、–を帯びるため、生体分子の選択性が向上します。

正電荷により生体分子と結合します。

カラムの仕様外寸

100 µL

最低/最高温度

使用温度：2 ～ 40 ℃

最大圧力

推奨 pH

エンドトキシン除去のモニタリング

HSA 純度分析

バクテリオファージ精製のプロセスモニタリングと品質管理

プラスミド DNA 精製のプロセスモニタリングと品質管理
タンパク質や抗体などの大型生体分子の高速高分離
ヘモグロビン A1c の高速分析

使用範囲2 ～ 13

定置洗浄：1 ～ 14

カラー識別リング

バイオモノリス QA：青Agilent BioHPLC カラム

DNA 不純物除去のモニタリング

保管：2 ～ 8 ℃

ハードウェア：ステンレス製

88–

IgM 精製のモニタリングと品質管理

150 bar（15 MPa、2,200 psi）

使用材質

保管期限/使用期限–

アデノウイルスのプロセスモニタリングと品質管理

5.2 mm x 4.95 mm

カラム容量

充填剤：ポリ（グリシジルメタクリレート-co-エチレンジメタクリレート）多孔質モノリス

バイオモノリス DEAE：緑
バイオモノリス SO3：赤

SO3、QA、DEAE：24 ～ 36 か月

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HPLC カラム

主要アプリケーション–

バイオモノリス DEAE

バイオモノリスイオン交換電荷変異体の分析

A/B：図の凡例を参照

流量：

グラジエント：

検出器：

装置本体：

1 mL/min

図の凡例を参照

260 および 280 nm での UV

Agilent 1100 シリーズ HPLC システム

ダイオードアレイ検出器（DAD）を搭載

B

100

260 nm80
280 nm
緩衝液 B
Agilent バイオモノリス
QA カラムでの Ad5 細胞溶解液の分析。黒の実線は 260 nm での吸600
60
光度、灰色の線は 280 nm での吸光度。条件：（A）緩衝液 A：20 mM トリス、pH 7.5、緩衝液 B：20 mM トリス、1.5 m NaCl、pH 7.5。19 カラム容量（CV）分、0 ～ 100 % 緩衝
40040
液 B へ直線グラジエントし、続けて 2 CV 分、100 % B で保持。
（B）緩衝液 A：20 mM トリ
ス-HCl 緩衝液 + 0.1 M NaCl、pH 7.5、緩衝液 B：20 mM トリス-HCl 緩衝液 + 2 M NaCl、
200
20
pH 7.5。ステップグラジエント：20 % 緩衝液 B で 22 CV 分保持し、57 % 緩衝液 B で 22
2Time (min)

20

3

4

1

吸光度（mAU）

2
Time (min)

3

4

80
60

40
100

0

0

0

0

200

20

0

1

2

3

4
5
Time (min)

6

7

8

9

0

発酵中のファージ生成のモニタリング

流量：グラジエント：

検出器：

装置本体：

A：125 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0
B：125 mM リン酸ナトリウム緩衝液 + 1 M 塩化ナトリウム、pH 7.0

時間：36 分
時間：158 分
時間：191 分% 緩衝液 B

45
40
35

1 mL/min

2

100

80

30

100 % 緩衝液 A（2.5 分）
0 ～ 100 % 緩衝液 B（10 分）
100 % 緩衝液 A（2 分）
UV、280 nm

12050% グラジエント

移動相：

バイオモノリス DEAE
5069-3636
5.2 x 4.95 mm

相対吸光度（mAU）

カラム：

25

60

ファージなどの化合物

20

40

15

高圧グラジエント HPLC システム、Agilent 1200 Infinity シリーズ

3

1

10

20

5
0
0

2

4

6

8

10

12

0

min

ファージ増殖が進むにつれて、宿主細胞が溶解されるため、ゲノム DNA（gDNA）濃度は高くなります。発酵の最終段階で、gDNA は断片に分解しはじめます。精製培地ではこれらの gDNA 断片

を簡単に除去できないため、gDNA の分解前に発酵サイクルを停止させることが重要です。上記は、36 分、158 分、191 分にバイオリアクターから採取した 3 種類のサンプルのクロマトグラムです。

ピーク 1 はファージ、培地、宿主細胞、ピーク 2 はインタクト gDNA、ピーク 3 は断片化された gDNA を表します。

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www.agilent.com/chem/jp

200

100

100

260 nm
280 nm
緩衝液 B

300

緩衝液 B (%)

吸光度（mAU）

CV 分保持。流量：1 mL/minサンプル：Ad5 細胞溶解液。注入量：25 µL。

1

200

400

300

60

40

0

B

80

400

400

800

0

600

0

A 1,000

0

260 nm
280 nm
緩衝液 B

800

緩衝液 B (%)

移動相：

100

緩衝液 B (%)

Agilent Bio-Monolith Column QA、
5.2 mm id × 4.95 mm（部品番号 5069-3635）

吸光度（mAU）

カラム：

A 1,000

吸光度（mAU）

アデノウイルス 5 型粒子の分析

689

6 電荷変異体の分析

製品の詳細情報
Bio MAb HPLC カラム
寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

21.2 x 250

55190-6885

10 x 250

55190-6884

4.6 x 250

105190-2415

4.6 x 50105190-2416

4.6 x 250

55190-2407

4.6 x 5055190-2408

4.6 x 50

Bio MAb PEEK

圧力上限

圧力上限

Bio MAb ステンレス

275 bar、4000 psi
275 bar、4000 psi

275 bar、4000 psi

5190-2413

275 bar、4000 psi

400 bar、5800 psi

5190-2405

400 bar、5800 psi

35190-2403

551 bar、8000 psi

4.6 x 501.75190-2401

4.0 X 10、ガード

105190-2414

55190-2406

4.0 X 10、ガード
4.0 X 10、ガード

275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi

35190-2404

4.0 X 10、ガード

1.7

5190-2402

2.1 x 250

105190-2419

2.1 x 50105190-2420

2.1 x 250

55190-2411

2.1 x 5055190-2412

400 bar、5800 psi

Bio IEX HPLC カラム、PEEK

600 bar、8700 psi
275 bar、4000 psi
413 bar、6000 psi
551 bar、8000 psi
600 bar、8700 psi

275 bar、4000 psi
275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi

寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

圧力上限

Bio SCX

Bio WCX

Bio SAX

Bio WAX

4.6 x 250

10275 bar、4000 psi

5190-2435

5190-2455

5190-2475

5190-2495

4.6 x 50105190-2436

5190-2456

5190-2476

5190-2496

4.6 x 250

55190-2427

5190-2447

5190-2467

5190-2487

4.6 x 5055190-2428

5190-2448

5190-2468

5190-2488

2.1 x 250

105190-2439

5190-2459

5190-2479

5190-2499

2.1 x 50105190-2440

5190-2460

5190-2480

5190-2500

2.1 x 250

55190-2431

5190-2451

5190-2471

5190-2491

2.1 x 5055190-2432

5190-2442

5190-2462

5190-2492

90

Agilent BioHPLC カラム

275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi
400 bar、5800 psi
275 bar、4000 psi
275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi
400 bar、5800 psi

部品番号

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部品番号

部品番号

部品番号

電荷変異体の分析
Bio IEX HPLC カラム、ステンレス
寸法（mm）

粒子サイズ （µm）

圧力上限

Bio SCX

Bio WCX

Bio SAX

Bio WAX21.2 x 250

5413 bar、6000 psi

5190-6879

5190-6881

5190-6883

5190-6877

10 x 250

55190-6878

5190-6880

5190-6882

5190-6876

4.6 x 250

105190-2433

5190-2453

5190-2473

5190-2493

4.6 x 250

55190-2425

5190-2445

5190-2465

5190-2485

4.6 x 150

3

4.6 x 503

4.6 x 50

1.7

4.0 x 10、ガード

10

4.0 x 10、ガード
4.0 x 10、ガード
4.0 x 10、ガード

5
3
1.7

413 bar、6000 psi
275 bar、4000 psi
413 bar、6000 psi

部品番号

部品番号

部品番号

551 bar、8000 psi
551 bar、8000 psi
600 bar、8700 psi
275 bar、4000 psi
413 bar、6000 psi
551 bar、8000 psi
600 bar、8700 psi

6

部品番号

5190-6875
5190-2423

5190-2443

5190-2463

5190-2483

5190-2421

5190-2441

5190-2461

5190-2481

5190-2434

5190-2454

5190-2474

5190-2494

5190-2426

5190-2446

5190-2466

5190-2486

5190-2424

5190-2444

5190-2464

5190-2484

5190-2422

5190-2442

5190-2462

5190-2482

バイオモノリス HPLC カラム選択ガイド

部品番号

カラム

バイオモノリス QA

5069-3635

バイオモノリス DEAE

5069-3636

バイオモノリス SO35069-3637

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www.agilent.com/chem/jp91

6 電荷変異体の分析
PL-SAX 強アニオン交換カラム
寸法（mm）

粒子サイズ （µm）

圧力上限

PL-SAX

PL-SAX

1000 Å

4000 Å

100 x 30030

207 bar、3000 psi

PL1851-3102

PL1851-3103

100 x 300

10

PL1851-2102

PL1851-2103

50 x 150

30

PL1751-3702

PL1751-3703

50 x 150

10

PL1751-3102

PL1751-3103

25 x 150

30

PL1251-3702

PL1251-3703

25 x 150

10

PL1251-3102

PL1251-3103

25 x 50

10PL1251-1102

PL1251-3103

7.5 x 150

8

PL1151-3802

PL1151-3803

7.5 x 150

8

PL1151-1802

PL1151-1803

4.6 x 250

30

PL1551-5702

PL1551-5703

4.6 x 150

30

PL1551-3702

PL1551-3703

4.6 x 250

10

PL1551-5102

PL1551-5103

4.6 x 150

10

PL1551-3102

PL1551-3103

4.6 x 150

8

PL1551-3802

PL1551-3803

4.6 x 508

PL1551-1802

PL1551-1803

4.6 x 505

PL1551-1502

PL1551-1503

2.1 x 150

8

PL1951-3802

PL1951-3803

2.1 x 50

8

PL1951-1802

PL1951-1803

2.1 x 50

5

PL1951-1502

PL1951-1503

1.0 x 50

5PL1351-1502

PL1351-1503

92

Agilent BioHPLC カラム

207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
275 bar、4000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi

目次に戻るPL-SAX 強アニオン交換充填剤バルク量

粒子サイズ （µm）

10 g

30

10 g

10

100 g

30

100 g

10

1 kg

30

1 kg

10

PL-SCX 強カチオン交換カラム
寸法（mm）

粒子サイズ （µm）

100 x 30030

100 x 300

1050 x 15030

50 x 150

1025 x 15030

25 x 150

1025 x 5010

7.5 x 508

4.6 x 25030

4.6 x 15030

4.6 x 25010

4.6 x 150

10

4.6 x 150

8

4.6 x 508

4.6 x 505

2.1 x 150

8

2.1 x 508

2.1 x 505

圧力上限

PL-SAX 1000 Å

PL-SAX 4000 Å

PL1451-2702

PL1451-2703

PL1451-2102

PL1451-2103

PL1451-4702

PL1451-4703

PL1451-4102

PL1451-4103

PL1451-6702

PL1451-6703

207 bar、3000 psi

PL1451-6102

PL1451-6102

圧力上限

PL-SCX 1000 Å

207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi

207 bar、3000 psi

207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi

電荷変異体の分析

6

www.agilent.com/chem/jp

93

PL1845-3102
PL1845-2102
PL1745-3703
PL1745-3102
PL1245-3702
PL1245-3102
PL1245-1102
PL1145-1802
PL1545-5703
PL1545-3702
PL1545-5102
PL1545-3102
PL1545-3802
PL1545-1802
PL1545-1502
PL1945-3802
PL1945-1802
PL1945-1502

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6 電荷変異体の分析
PL-SCX 強カチオン交換充填剤バルク量

粒子サイズ（µm）

100 g

30

100 g

10

1 kg

30

1 kg

10

圧力上限

207 bar、3000 psi

207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi

PL-SCX 1000 Å
PL1455-4702
PL1455-4102
PL1455-6702
PL1455-6102

ヒントとツール
アジレントのワークフローのオーダーガイドには、ヒントとコツ、初期条件、特定のア

プリケーションのためのカラムやアクセサリーの部品番号が記載されています。

最新のイオン交換ワークフローのオーダーガイドには、PL-SAX カラムを使ったオリゴ精製と、Bio MAb カラムを使った mAb の電荷変異体分析についての資料（資料番号 5994-4636JAJP と 5994-6053EN）が含まれています。

94

Agilent BioHPLC カラム

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凝集およびフラグメントの分析

7

凝集およびフラグメントの分析
生体分子の凝集とフラグメンテーションの正確な測定
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）では、水溶性溶離液を使用して、タンパク質やオリゴヌクレオチドな
どの複雑な生体高分子をサイズの違いによって分離します。この分析法は、タンパク質生物製剤中に存在する凝集体の定量に不可欠です。二量体などのタンパク質凝集体のサイズは、単量体タンパク質と大きく異なることから、SEC によってさまざまな形態を分離することが可能です。実際、タンパク質凝集体の定量には、SEC と UV または光散乱検出器が標準的な手法として使用されています。

モノクローナル抗体などのバイオ医薬品の製造は複雑なプロセスであり、培養、単離、精製、および製剤の過程でタンパク質の凝集体が問題になることがあります。凝集体形成は、 ジスルフィド結合を介して共有結合されることもありますし、されないこともあります。二量体やそれ以上の凝集体が存在すると、最終製品の効能や安全性に悪影響がおよぶ可能性があるからです。そのため、プロセス開発段階で、凝集体の含有量を定量し、製品の重要な品質特性（CQA）を確立する必要があります。また、最終製品の特性解析において、凝集が最小化され、安全なレベルに抑えられていることを確認しなければなりません。

アプリケーションに適した SEC カラムの選択

アジレントは 30 年以上にわたり、SEC 用のカラムおよび機器分野をリードしてきました。優れた分離
バイオ医薬品の迅速かつ効率的な開発をサポー
能とスピードを実現するアジレントの SEC 用カラムは、トします。このセクションでは、タンパク質生体高分子分析用の幅広い SEC カラムファミリーを紹介します。

– AdvanceBio SEC では、タンパク質とペプチドの凝集体とフラグメント分析用に 2 種類の粒子サイズが用意されています。ルーチンの SEC-UV または SEC-LS 測定には、2.7 µm 粒子カラムが推奨されます。1.9 µm 粒子は 600 bar までは安定的で、高分離能、高スループットの SEC-UV またはSEC-MS 分析で堅牢性が保証されます。どちらの粒子も親水性ポリマーで被膜されているため、二次的作用が最小限に抑えられます– Bio SEC-3 および Bio SEC-5 カラムは、多様なポアサイズが用意されており、UV または MS 検出器を使用したタンパク質の分析にも適しています。3 µm の Bio SEC-3 カラムでは、5 µm の Bio

SEC-5 カラムより高い分解能が得られます– AAV、ウイルス様粒子、大型のオリゴヌクレオチドなど、高分子構造の SEC 分析のために、Bio
SEC-5 カラムでは 500 Å ～ 2000 Å のポアサイズを利用できます– PROTEEMA カラムと MAB カラムはジオール SEC カラムで、USP L20 が必要とされる場合に推奨されます。100 ～ 1000 Å のポアサイズと、バイオイナートカラムハードウェアをご用意しています

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7 凝集およびフラグメントの分析

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
アプリケーション

注意事項

アジレントのカラムペプチド、タンパク質、凝集体の分析

USP

AdvanceBio SEC 2.7 µm

堅牢な親水性コーティングで二次的作用を最小限に抑えます。ポアサイズは 130 Å とAdvanceBio SEC 1.9 µm

同様に堅牢な親水性コーティングがされていますが、分離能とスループット向上のため、 L59

300 Å の 2 種類があります。

L59

粒子フォーマットが小さくなっています。 1.9 µm 粒子は 620 bar まで堅牢で、ポアサイズは 120 Å と 200 Å の 2 種類です。

Bio SEC-3

ポアサイズ 100 Å、150 Å、および 300 Å の 3 µm 粒子が分離能と分離スピードを高L59

PROTEEMA

3 µm 粒子と 100 Å、300 Å、または 1000 Å ポアサイズのジオール SEC 相です。

L20

めます。 内径 21.2 mm まで拡張できます。

3 µm 粒子のミックスジオール SEC 相

MAB
AAV や VLP などの生体高分子、または複数の分子量の成分を持つサンプル

L20

幅広い分析に対応する多くのポアサイズオプション（100 Å、150 Å、300 Å、500 Å、Bio SEC-51000 Å、2000 Å）があります。 内径 21.2 mm まで拡張できます。

L59

ポアサイズの選択肢

アジレントでは、幅広い SEC カラムを取り揃えています。分析する成分やメソッドパラメータに応じて、分解能を最大限に高める最適なカラムをお選びください。このチャートには、一般的な分子の種類について最善の結果が得られるポアサイズの範囲がまとめられています。メソッド開発の際は、最初

AA
V

サ
イ
ロ
グ
ロ
ブ
リ
ン

G
lg

ミ
オ
グ
ロ
ビ
ン
オ
ボ
ア
BS ル
A ブミ
ン

イ
ン
ス
リ
ン

に AdvanceBio SEC カラムを使用することをおすすめします。

AdvanceBio SEC 1.9 µm 120 Å
AdvanceBio SEC 1.9 µm 200 Å
AdvanceBio SEC 2.7 µm 130 Å
AdvanceBio SEC 2.7 µm 300 Å
Bio SEC 500 Å
Bio SEC 1000 Å
Bio SEC 2000 Å

100D

1kD

100kD

1,000kD

10,000kD

MW 分離範囲（タンパク質）

ペプチド

96

10kD

Agilent BioHPLC カラム

球状タンパク質

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生体高分子

凝集およびフラグメントの分析

7

AdvanceBio SEC
AdvanceBio SEC カラムは、mAb やその他のタンパク質、ペプチドの凝集体およびフラグメント分析において、正確かつ高精度の定量分析を実現するよう最適化されています。アジレントが設計、開発したこの革新的なサイズ排除クロマトグ

ラフィーカラムにより、メソッドの堅牢性と信頼性が高まります。サンプルの再分析が不要になるため、ラボの生産性が向上します。カラム間、バッチ間およびラボ間で一貫した結果を得られるため、異なる部門または事業所においても確実にメソッドを移管できます。

AdvanceBio SEC 2.7 µm カラムはルーチンの SEC ニーズに対応した堅牢なカラムで、アジレント独自の親水性コーティ

ングにより、移動相に余分な塩や有機溶媒を加えることなく、サンプルと固定相の間の二次的作用を最小限に抑えます。

ADC のような粘着性のあるサンプルでも、このカラムは二次的作用を最小限に抑えて、正確な結果を導きます。ポアサイ

ズは 300 Å と 130 Å の 2 種類で、タンパク質やペプチドの高感度で再現性に優れた凝集体分析に最適です。

AdvanceBio SEC 1.9 µm カラムは、SEC 分離を 1 つ上のレベルに引き上げます。小さい粒子と親水結合相が、効率よく、分離能の高い分離を実現します。最高 620 bar の安定性が、高スループットに必要な高速の流量をもたらします。200 Åのポアサイズは、徹底的な mAb 特性解析に必要な二量体、単量体、フラグメントの同時分離に最適化されたものです。

SEC-MS および極 めて困難 な SEC アプリケーションの場合 は、AdvanceBio SEC 1.9 µm カラムを内径 2.1 mm の
PEEK ライナステンレスハードウェアでご利用いただくこともできます。このバイオイナートでメタルフリーな流路は、金属と反応しやすい、またはネイティブモードの SEC-MS 分析に最適です。

– 分析スピードが向上し、納期を遵守できます– 分離能が向上し、さらに正確な定量が可能です– 感度が向上し、低レベルでも凝集の定量が可能です– 再現性が向上し、再分析のリスクが減らせます– AdvanceBio SEC カラム用に独自設計された標準試料により、最適なキャリブレーションと性能評価が可能です– 粒子サイズは 2.7 と 1.9 µm。それぞれ、ポアサイズのオプションが 2 種類あります– PEEK ライナステンレスハードウェアはバイオイナートな流路で使用可能です

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www.agilent.com/chem/jp97

7 凝集およびフラグメントの分析

カラムの仕様
粒子サイズ

ポアサイズ

分子量範囲

2.7 µm130 Å100 ～ 120,000 Da

2 ～ 8.540 MPa（推奨使用圧力は2.7 µm300 Å5,000 ～ 1,250,000 Da

2 ～ 8.540 MPa（推奨使用圧力は

1.9 µm120 Å1,000 ～ 80,000 Da

2 ～ 8.5

1.9 µm200 Å2,000 ～ 700,000 Da

pH 範囲

2 ～ 8.5

最大圧力

20 MPa 未満）
20 MPa 未満）
620 bar620 bar

流量0.1 ～ 2.0 mL/min（内径 7.8 mm）
0.1 ～ 0.7 mL/min（内径 4.6 mm）
0.1 ～ 0.5 mL/min（4.6 x 300 mm）
0.1 ～ 0.7 mL/min（4.6 x 150 mm）

0.05 ～ 0.1 mL/min（内径 2.1 mm）

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CrossLab チームが、メーカーの異なる多様な機器で構成される大規模な医薬品ラボの運営を効率化しました。

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ヒントとツール
緩衝液および移動相は、調製後にアジレントの溶媒フィルタでろ過し、粒子を除去することをおすすめします。
詳細情報：溶媒フィルター／脱気装置のページ

推奨される機器構成、および初期移動相状態とそれに伴うクロマトグラムについては、AdvanceBio SEC 2.7 µm

カラムおよび 1.9 µm カラムのクイックスタートガイド（資料番号 5994-4620EN および 5994-4621EN）を参照してください。

98

Agilent BioHPLC カラム

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凝集およびフラグメントの分析

7

堅牢な AdvanceBio SEC カラムでカラム寿命を延 ばす

移動相：

サンプル：

AdvanceBio SEC 2.7 µm
300 Å、7.8 x 300 mm

150 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

IgG

プロットは 1300 回の注入シーケンスにわたる IgG 単量体と二量体との間の分離能を示しています。

2.60
Resolution factor (monomer / dimer)

カラム：

2.50
2.40
2.30
2.20
2.10
2.00
1.90
1.80
1.70
0

200

400

600
800
Injection number

1000

1200

1400

mAU

Run 1

40
30
20
10
0

2

4

6

8

10

12

14 min

4

6

8

10

12

14 minmAU
40

Run 1300

30
20
10
0

2

IgG サンプルのプロファイルは、1300 回の注入後も変わりませんでした。IgG の単量体と二量体の分離係数と定量についてもカラム寿命を通して動作範囲に収まっていました。

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www.agilent.com/chem/jp99

7 凝集およびフラグメントの分析

AdvanceBio SEC 2.7 µm
300 Å、7.8 x 300 mm

mAU
1600

DAD1A、Sig=220、インタクト
トラスツズマブ
装置本体：
Agilent 1260 Infinity バイオイナートクォータナリ LC
インタクトトラスツズマブ
1500 DAD1A、Sig=220、熱/pHシステム
ストレスを加えたトラスツズマブ
1250 移動相：
PBS、150 mM 塩化ナトリウムを含む
50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4
1000

4

6

8

10

12

0

14 min

2

Norm.
1750
1500
1250

4

6

DAD1A、Sig=220、インタクト
トラスツズマブ
DAD1A、Sig=220、熱/pH
ストレスを加えたトラスツズマブ

12.737

11.586

200

8.067

400

ADC 分解物

8

10

12

mAU
1600
インタクトトラスツズマブ

0

2

4

6

8

10

12

AdvanceBio SEC 2.7 µm の操作パラメータ
使用可能な移動相

150 mM リン酸緩衝液、pH 7.0（推奨開始条件）

高または低塩濃度のさまざまな水性緩衝液を使用できます。
水とアセトニトリルの混合液を使用できます。

pH 安定性
注入量

動作温度範囲推奨使用圧力最大圧力
使用流量（緩衝液成分の溶解性とシステムの圧力を確認すること）

2 ～ 8.5

1 ～ 5 µL（推奨）カラム容量の最大 1 %

20 ～ 30 ℃（推奨）80 ℃（最高）200 bar（2,900 psi）未満（シングルカラム）
400 bar（5,800 psi）

内径 7.8 mm カラムの場合は 0.1 ～ 2.0 mL/min（推奨）内径 4.6 mm カラムの場合は 0.1 ～ 0.7 mL/min（推奨）カラム 2 本を連結して使用する場合は、最大圧力が 400 bar（5,800 psi）を超えないように、必要に応じて流量を下げます。

カラム寿命が短くなる可能性があります。
注意事項：操作パラメータの限度値で使用すると、

100

Agilent BioHPLC カラム

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12.74013.114

11.584

6.610
7.033

250

1200
800

断片

標準

500

1400
1000

1000
750

14 min600
14.4692

UV、220 nm

ADC 標準600

8.049

0 検出器：

800

6.654

0.8 mL/min

インタクト ADC

1000

14.469標準12.74013.114250 流量:10 µL

DAD1A、Sig=220、熱/pH
ストレスを加えた ADC

1200

断片

11.584500 注入量：

室温

6.610
7.033

750 カラム温度:

DAD1A、Sig=220、インタクト ADC

1400

7.141

カラム：

8.049

Norm.
1750

8.106

抗体に最適な親水性 SEC メディア：抗体薬の複合体（ADC）分析

14 min

400
200
0

D

D
ス

凝集およびフラグメントの分析

7

AdvanceBio SEC 1.9 µm の操作パラメータ
パラメータ

設定値

出荷時の溶媒/長期

pH 6.7 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.02 % NaN3 有り

使用流量

4.6 × 150 mm では 0.1 ～ 0.7 mL/min

ストレージソリューション

4.6 × 300 mm では 0.1 ～ 0.5 mL/min

内径 2.1 mm のカラムでは、0.05 ～ 0.10 mL/min

1 ～ 5 µL（推奨）注入量

カラム容量の最大 1 %620 bar（9,000 psi）

最大圧力

2 ～ 8.5

pH 安定性塩濃度≤0.5 M

使用可能な移動相

UV 用 SEC 移動相すべてで使用できます。リン酸緩衝液、pH 7.0 でさまざまな濃度の塩を含む

動作温度範囲20 ～ 40 ℃（推奨）、変性およびネイティブモードのSEC-MS 移動相が使用できます。

80 ℃（最高）

カラム寿命が短くなることがあります。
注意事項：操作パラメータの限度値で使用すると、

高分離能、高スループットの mAb 分離
カラム：
装置本体：
移動相：

AdvanceBio SEC 1.9 µm
200 Å、4.6 x 150 mm
Agilent 1260 Infinity II LC

50 mM リン酸ナトリウム、
200 mM NaCl、pH 7.0

カラム温度：

25 ℃

流量：0.3～0.7 mL/min

注入量：
検出器：

1 µL

UV、220 nm

分解能、単量体の面積 %、サンプルスループットに流量が与える影響（mL/min）

（分）

（bar）

（二量体/単量体）

分離能

二量体

1 時間当たりの 1 日（24 時間）

0.3

6.8

164

1.81

2.33

8～9

0.4

5.2

218

1.79

2.35

11 ～ 12

276

0.5

4.2

272

1.78

2.35

14

342

0.6

3.6

324

1.77

2.39

16 ～ 17

400

0.7

3.0

380

1.58

2.30

20

480

流量

分析時間

背圧

目次に戻る

面積 %

サンプル数

あたりの サンプル数

211

www.agilent.com/chem/jp101

7 凝集およびフラグメントの分析

mAU
×102

mAU
×101

2.0
4
1.5
3

A

1.0
2
0.5
1
0
0
1

2

3

4

5

6

7

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8
mAU
×101

mAU
×102

2.0

4

1.5

3

1.0

2

0.5

1

0

B

0
1

2

3

4

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2

5
mAU
×101

mAU
×102

2.0

4

1.5

3

1.0

2

0.5

1

0

C

0
1

2

3

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2

4
mAU
×101

mAU
×102

2.0

4

1.5

3

1.0

2

0.5

1

0

D

0
1

2

1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6

3
mAU
×101

mAU
×102

2.0

4

1.5

3

1.0

E
2

0.5

1

0

0
1
2
3
Retention time (min)1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0
Retention time (min)SigmaMAb のサイズ排除クロマトグラム。4.6 × 150 mm の SEC カラムを用いて 50 mM リン酸ナトリウム、200 mM NaCl、pH 7.0 で分析。流量はそれぞれ A) 0.3 mL/min、B) 0.4 mL/min、C) 0.5 mL/min、D) 0.6 mL/min、E) 0.7 mL/min

102

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

凝集およびフラグメントの分析

7

サイズ排除分離によるヒト成長ホルモンの特性解析

装置本体：

Agilent 1260 Infinity II バイオイナート LC システム

ソフトウェア：Agilent OpenLab CDS

流量：0.35 mL/min

溶出液：

150 mM リン酸バッファ、pH 7

サンプル：

濃度 1 mg/mL

温度：

RT（分）

（n=2 の平均）

ピークテーリング

ピーク幅

Agilent

6.02

691.81

1.22

0.21

6.54

581.101.33

0.28

他社製 SEC カラム

2 µL

検出：

単量体

総ピーク面積

単量体

単量体

AdvanceBio SEC

25 ℃

注入量：

カラム

1.7 µm

UV、220 nm

A：Agilent AdvanceBio SEC、4.6 x 300 mm、120 Å 1.9 µm

A

x101
3
2.8
2.6

Monomer

2.4

Response [mAU]

2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2

LMWS

1
0.8
0.6
0.4

HMWS

0.2
0
-0.2
-0.4

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

9

9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5

8.5

9

9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5

Retention time [min]B：他社製 SEC カラム、4.6 x 300 mm、125 Å 1.7 µm
x101
3

B

2.8
2.6
2.4

Response [mAU]

2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2

Monomer

非特異的な相互作用により、タンパク質の回収率が低下

1
0.8

LMWS

0.6
0.4

HMWS

0.2
0
-0.2
-0.4

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

Retention time [min]目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp103

7 凝集およびフラグメントの分析

Bio SEC
Agilent Bio SEC は、ポアサイズ 100 Å から 2000 Å、最大内径 21.2 mm の汎用性に優れたポートフォリオで、広い範囲にわたるタンパク質サイズと注入量要件をサポートします。

Agilent Bio SEC カラムは、大型の生体分子に対して、非常に高い分離能を実現し、ポア容積

を高 めるために特別に設計されたパッキングで、ピークキャパシティと分離能をさらに向上させます。

Bio SEC の特徴– 高い分解能、よりシャープなピーク、優れたタンパク質回収率が可能です– 独自の親水性基により卓越した保持容量と回収率を実現します– 卓越した再現性とカラム寿命を実現する、優れた堅牢性があります– 高 pH、高塩濃度、低塩濃度といった条件下でも安定性に優れています– 幅広い水性緩衝液を使用できるため、柔軟なメソッド開発が可能です– 幅広い適合性があり、100 Å から 2000 Å までの幅広いポアサイズによって、小型のタン
パク質やワクチン、高分子量の生体分子に対応します– 粒子が堅牢で光散乱検出器などのマルチ検出器に対応できます– MS に対応しています

Bio SEC-3 カラムには、独自の親水性層で被膜された狭分散性の 3 µm 球状シリカ粒子が充填されています。二次的作用が最小限に抑えられるため、回収率が高まり、一貫性の高い分離結果が得られます。この薄いポリマー層は、厳しく管理された条件下で、高純度で機械的に安定したシリカ粒子に化学的に結合されています。そのため、効率の高い安定したサイズ排除充填剤となっています。

複数の分子量を持つ生体高分子やサンプルの分離には、Bio SEC-5 カラムが最適です。このカラムには、分離効率と安定性に優れた、独自の中性親水性層で被膜された 5 µm シリカ粒子が充填されています。6 種類のポアサイズが用意されているため、幅広い分子量範囲にわたって最適な分離能が得られます。
カラムの仕様
ポアサイズ

粒子サイズ

分子量範囲

100～100,000

100 Å

3 µm

150 Å

3 µm

300 Å

3 µm

100 Å

5 µm

150 Å

5 µm

300 Å

5 µm

500 Å

5 µm

1000 Å

5 µm

50,000～7,500,000

2000 Å

5 µm>10,000,000

104

Agilent BioHPLC カラム

500～150,000

5,000～1,250,000
100～100,000
500～150,000

5,000～1,250,000

15,000～5,000,000

pH 範囲
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5
2～8.5

最大圧力

137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi
137 bar、2000 psi

目次に戻る

流量

カラム内径

4.6 mm
7.8 mm21.2 mm

推奨流量

0.1～0.4 mL/min
0.2～1.2 mL/min

1.0～10.0 mL/min凝集およびフラグメントの分析

7

ポアサイズの選択

同じ充填剤でも、どのポアサイズを選択するかによって SEC の分解能は変わってきます。SEC では、溶液中の分子サイズの違いによって分離が行われるため、サンプルが粒子の多孔質構造に浸透できなければなりません。ポアサイズが小さすぎると、サンプルはポアから排除され、カラムのボイドボリュームで溶出します。一方、ポアサイズが大きすぎる場合は、すべての成分が粒子に完全に浸透し、ほとんど分離されません。
カラム A：
カラム B：
カラム C：
移動相：流量：

Bio SEC-3、100 Å
5190-2503
4.6 x 300 mm、3 µm
Bio SEC-3、150 Å
5190-2508
4.6 x 300 mm、3 µm

検出器：

サンプル：

1500

5

300Å

0.35 mL/min

UV、220 nm

Bio-Rad ゲルろ過標準混合物

7. ビタミン B1242

塩化ナトリウム 150 mm、pH 6.8

1 分間 10 % B で再平衡

3. IgA

6. ミオグロビン

4. γ-グロブリン

mAU
2500

2000

グラジエント： 4 分で 10～58 % B、
1 分間 95 % B で洗浄、

5. オボアルブミン

2. チログロブリン

Bio SEC-3、300 Å
5190-2513
4.6 x 300 mm、3 µm

リン酸ナトリウム 100 mH,

1. サイログロブリンの凝集体

1

6
7

3

150Å

1000

500
100Å

0
0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0
PoreSz_Proteins

ヒントとツール
不活性化/シラン処理済みバイアルは、金属、生体物質、タンパク質との相互作用が起こらず、サンプルの pH を変化させることもありません。
生体物質や光に敏感な化合物には、標準のポリプロピレン製バイアルを使用しないでください。

アジレントのバイアルとキャップでラボの生産性を大幅にアップさせましょう。

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www.agilent.com/chem/jp105

7 凝集およびフラグメントの分析
Bio SEC-3 と Bio SEC-5 の比較

モノクローナル抗体の分析
カラム：

Bio SEC-3、300 Å
5190-2511
7.8 x 300 mm、3 µm

カラム：

Bio SEC-5、300 Å
5190-2526
7.8 x 300 mm、5 µm

移動相：

150 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

流量：

検出器：

1. 二量体mAU

2. 単量体120

3. 単量体フラグメント

3

100
3 µm

80

1

2

60

1 mL/min

サンプル：

UV、220 nm

ヒト化モノクローナル抗体

40
20

5 µm

1

0
0

2

4

6

3

2
8

10

12

14

フラグメントに対して高い分離能が得られています。
3 µm カラムの方が、

16

18

ヒントとツール
タンパク質の凝集体分析メソッドを開発する際は、溶質のサイズと分子量の影響、カラムの選択、移動相に関する重要な考慮事項など、さまざ
まな要因を考慮する必要があります。次の資料では、これらすべての要因について解説しています。

生体分子分析のためのサイズ排除クロマトグラフィー：分析の手引き（資料番号 5991-3651JAJP）

106

Agilent BioHPLC カラム

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min

Mono_Antibody

凝集およびフラグメントの分析

7

検量線 ― Bio SEC-5
移動相：
流量：

検出器：

Bio SEC-5
7.8 x 300 mm、5 µm

1,000,000

1.0 mL/min

100,000

150 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

UV、214 nm

タンパク質

分子量

カラム：

保持ボリューム

分子量1000 Å

500 Å

300 Å

150 Å

100 Å

670,000

10.07

8.23

7.03

5.82

5.77

γ-グロブリン

150,000

10.88

9.80

8.57

6.55

5.79

BSA

67,000

11.13

10.44

9.44

7.29

6.00

オボアルブミン

45,000

11.28

10.83

9.89

7.90

6.40

17,000

11.44

11.28

10.42

8.66

7.05

12,700

11.52

11.41

10.58

8.93

7.32

1,350

12.00

12.59

11.78

11.49

10.30

112

12.08

12.68

12.21

12.13

11.41

チログロブリン

ミオグロビン

リボヌクレアーゼ A
ビタミン B12

ウラシル（浸透限界マーカー）

10,0001000 Å
500 Å
300 Å

1,000

150 Å
100 Å

100

4

5

6

7

8

9

10

11

保持ボリューム（mL）

1213

ウイルス様粒子の凝集体分析

カラム：

移動相：
流量：

カラム温度：
サンプル量：

Agilent Bio SEC-5、7.8 × 300 mm、
5 µm、2000 Å（部品番号 5190-2541）
Agilent Bio SEC-5、7.8 × 300 mm、
5 µm、1000 Å（部品番号 5190-2536）
50 mM リン酸緩衝液（pH 7.4）、
400 mM 塩化ナトリウム0.6 mL/min
室温

5 µL

mAU

30
20
10
0

80

5

220 nm60

HPLC システム：

30 分

Agilent 1260 Infinity II LC システム、

40

クォターナリポンプ付き

40

Agilent Bio SEC-5, 2,000 Å
R = 1.51

100

検出波長：
分析時間：

Agilent Bio SEC-5, 1,000 Å
R = 1.28

120

10

15

20

25

20
0
0

5

10

15

20

25

Time (min)同じウイルス様粒子をAgilent Bio SEC-5、2,000 Å カラム、および Bio SEC-5、1,000 Å カラムを使って分析しました。

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www.agilent.com/chem/jp107

7 凝集およびフラグメントの分析

PROTEEMA カラム

PROTEEMA カラムは、分子量 100 ～ 7,500,000 Da の範囲にある天然および合成タンパク質、ペプチド、酵素、ゼラチ

ン/コラーゲンの水溶液の GPC/SEC 分析に適しています。アプリケーションに応じて、2 種類の粒子サイズ（3 および 5µm）、3 種類のポアサイズ（100、300、1,000 Å）、ステンレスとバイオイナートの両ハードウェアオプションなどさまざまなカラム構成を利用できます。このジオール SEC 相は USP L20 が必要な分離に適しています。

カラムの仕様
粒子サイズ

ポアサイズ

3 または 5 µm

100 Å
300 Å
1000 Å

分子量範囲*

pH 範囲

100～150,000 Da

1000～1,200,000 Da

最大圧力

2～8

温度上限

200 bar（3 µm）

70 ℃

150 bar（5 µm）

1000～7,500,000 Da

最大流量

3 mL/min*タンパク質に基づく

検量線–プルラン（緩衝液）

カラム：

PROTEEMA 100 Å、300 Å、1000 A
MAB、各 8 x 300 mm、3 µm

移動相：

リン酸緩衝液 pH 6.6（34 mmol）+ 0.5M NaCl

流量：

1 mL/min

温度：

23 ℃

検出器：

RI

RadiusPROTEEMA 100ÅPROTEEMA 300ÅPROTEEMA 1000Å
MAB

106

105

104

103

5.5

108

6.0

6.5

Agilent BioHPLC カラム

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

目次に戻る

10.0

10.5

11.0

Elution volume凝集およびフラグメントの分析

7

MAB
MAB カラムは、分子量 100 ～ 1,000,000 Da の範囲にあるモノクローナル抗体、IgG、タン

パク質の水溶液の GPC/SEC 分析に有効です。このミックスカラムは、モノクローナル抗体凝集体とフラグメントの分離用に設計されていて、光散乱検出で迅速に使えるように最適化および平衡化されています。このようにシリカベースのジオール SEC カラムは、USP L20 に分類されます。MAB カラムの粒子サイズは 3 µm で、タンパク質分析に最適です。

カラムの仕様
粒子サイズ

3 µm

分子量範囲

ポアサイズ

混合

pH 範囲

100～1,000,000 Da

最大圧力

2～8

温度上限

最大流量

70 ℃

150 bar

3 mL/min

免疫グロブリン G の凝集体分析

カラム：

MAB、8 x 300 mm、3 µm

サンプル濃度:

2.5 g/L

流量：

1 mL/min

注入量：
検出：

20 µL
UV、280 nm
MALLS（90°）

V

単量体

100
90
80
70
60
50
40

二量体

三量体以上の凝集体

30UV 検出器トレース

20
10
0
4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

mL

低濃度の高次凝集体、MALL（黄色の信号）を使用して検出

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www.agilent.com/chem/jp109

7 凝集およびフラグメントの分析

SEC のタンパク質標準
AdvanceBio SEC 130 Å 用タンパク質標準

厳選された 5 種類のタンパク質・ペプチド（オブアルブミン、ミオグロビン、アプロチニン、

ニューロテンシン、アンギオテンシン II）からなるキャリブラントです。Agilent AdvanceBio

130 Å サイズ排除カラムのキャリブレーション用に設計されています。この標準を使用して、タンパク質の精製や分析を含むさまざまなアプリケーションで、定期的にカラムのキャリブ

レーションや最適なシステム性能の確認ができます。

AdvanceBio SEC 用タンパク質標準、

AdvanceBio SEC 300 Å 用タンパク質標準

厳選された 5 種類のタンパク質・ペプチド（チログロブリン、g-グロブリン、オブアルブミ

ン、ミオグロビン、アンギオテンシン II）からなるキャリブラントです。Agilent AdvanceBio

300 Å または 200 Å サイズ排除カラムのキャリブレーション用に設計されています。この標

準を使用して、タンパク質の精製や分析を含むさまざまなアプリケーションで、定期的にカラムのキャリブレーションや最適なシステム性能の確認ができます。

ヒントとツール
十分 に 特性解析された 性能標準 に 基 づいて、使用している HPLC システムを
定期的 にチェックすると、結果 の 信頼性 が 高 まり、問題 の 迅速 な 特定 に 役立ちます。多くの 化学者 が AdvanceBio SEC 標準 のようなタンパク質混合物 を使用していますが、 モノクローナル 抗体標準 が 使用 される場合 もあります。

Agilent-NISTmAb は少量から購入できるため便利です。

メソッドとクロマトグラムのサンプルについては、Agilent NISTmAb アプリケー

ション総覧（資料番号 5994-1501EN）の 凝集体分析 の 章（資料番号 5994-

2069EN）を参照してください。

110

Agilent BioHPLC カラム

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p/n 5190-9416 および p/n 5190-9417

凝集およびフラグメントの分析

7

SEC によるタンパク質分子量標準品の分離

カラム：

AdvanceBio SEC 2.7 µm
7.8 x 300 mm

サンプル：

AdvanceBio SEC タンパク質標準流量：1.0 mL/min

移動相：150 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0

Agilent AdvanceBio SEC タンパク質標準
1

4.0

2

1
2
3 4

1. チログロブリン
2. g-グロブリン（ウシ）（ニワトリ）
5
53 4 3. オブアルブミン
4. ミオグロビン（ウマ）5. アンギオテンシン II

6.0 4.0 8.0 6.0 10.0 8.0 12.010.0
min 12.0 min

4.0

AdvanceBio SEC 300Å カラムでの AdvanceBio SEC
300Å タンパク質標準の分離

3

3
1 2

1 2
4

5

5
4

1. オボアルブミン
2. ミオグロビン
3. アプロチニン
4. ニューロテンシン
5. アンギオテンシン II

6.0 4.0 8.0 6.0 10.0 8.0 12.010.0
min 12.0 min
AdvanceBio SEC 130Å カラムでの AdvanceBio SEC
130Å タンパク質標準の分離

ヒントとツール
カラムユーザーガイドでは、カラムの使用および取り扱い方法、推奨開始メソッドに関する有益な情報をご覧
いただけます。

www.agilent.com/chem/biolc-columns-user-guides

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www.agilent.com/chem/jp111

7 凝集およびフラグメントの分析

タンパク質標準キット

キット化されたタンパク質標準により、特定の分析やトラブルシューティングの状況に最適なタンパ
ク質標準を選択することができます。PSS-PROKIT では、分子量範囲 243 ～ 670 kDa の凍結乾燥された標準が 10 種類、ボトル入りで提供されます。PSS-PROKITR1 には、3 ～ 4 種類の凍結乾燥された混合済み標準が入った 3 種類のバイアルが 5 本ずつ含まれます。これらのキットにより、独自の混合物の設計や、個々のタンパク質でのトラブルシューティング、完全に分離された標

準をあらかじめ調合した混合物の使用などが柔軟にできるようになります。

PSS-PROKIT の構成
成分名

シチジン

ビタミン B12

アプロチニン

シトクローム C

ミオグロビンΒ-ラクトグロブリン

アルブミン（ニワトリ）
アルブミン（ウシ）
ガンマグロブリン

サイログロブリン

分子量

流体力学半径（nm）

DNA 定量243 Da1 x 0.1 g

1.4 kDa1 x 0.1 g

6.5 kDa1 x 0.1 g

12 kDa1.5

1 x 0.1 g

17.5 kDa

1.8

1 x 0.1 g

35 kDa2.8

1 x 0.1 g

44 kDa3.5

1 x 0.1 g

67 kDa4.4

1 x 0.1 g

158 kDa

5.8

1 x 0.1 g

670 kDa

9.1

1 x 0.1 g

ヒントとツール
アプリケーションメソッドオーダーガイドを見れば、カタログを何冊も調べなくても、分析に必要な消耗品を簡単かつ正確に見つけられます。

mAb 二量体やフラグメントの分析、あるいは SEC-MS については、オーダーガイドをご覧ください。このガイドには必要なあらゆるツールのほか、選択基準、アプリケーションノート、ベストプ

ラクティスなどの便利な情報も記載されています。

112

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

凝集およびフラグメントの分析

7

ReadyCal キットの構成
成分

バイアル

緑キャップ

サイログロブリン、
アルブミン、
シトクローム C、
シチジン

赤キャップ

ガンマグロブリン、
アプロチニンβ-ラクトグロブリン、

白キャップ

アルブミン
ミオグロビン、
ビタミン B12（ウシ）、ReadyCal キットタンパク質標準の重ね表示

カラム：

PROTEEMA 300 A、
8 x 300 mm、3 µm

移動相：

リン酸緩衝液 pH 6.6（34 mmol）、0.5M NaCl

流量：

1 mL/min

温度：

23 ℃

検出：

UV、280 nm

V
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
5

6

7

8

9

目次に戻る

10

11

12

mL

www.agilent.com/chem/jp113

7 凝集およびフラグメントの分析

製品の詳細情報
AdvanceBio SEC カラム、2.7 µm
寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

130 Å

300 Å

4.6 x 300

2.7

PL1580-5350

PL1580-5301

4.6 x 150

2.7

PL1580-3350

PL1580-3301

4.6 x 50、ガード

2.7

PL1580-1350

PL1580-1301

7.8 x 300

2.7

PL1180-5350

PL1180-5301

7.8 x 150

2.7

PL1180-3350

PL1180-3350

7.8 x 50、ガード

2.7

PL1180-1350

PL1180-1301

AdvanceBio SEC カラム、1.9 µm
寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

120 Å

200 Å

4.6 x 300

1.9

PL1580-5250

PL1580-5201

4.6 x 150

1.9

PL1580-3250

PL1580-3201

4.6 x 30、ガード

1.9

PL1580-1250

PL1580-1201

1.9

PL1980-3250PK

PL1980-3250PK

1.9

PL1980-1250PK

PL1980-1201PK

寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

Bio SEC-3

Bio SEC-3

Bio SEC-3

100 Å

150 Å

300 Å

21.2 x 300

35190-6850

5190-6851

5190-6852

21.2 x 50、ガード

3

5190-6854

5190-6855

5190-6856

7.8 x 300

35190-2501

5190-2506

5190-2511

7.8 x 150

35190-2502

5190-2507

5190-2512

7.8 x 50、ガード

3

5190-2505

5190-2510

5190-2515

4.6 x 300

35190-2503

5190-2508

5190-2513

4.6 x 150

35190-2504

5190-2509

5190-2514

4.6 x 50、ガード

3

5190-6846

5190-6847

5190-6848

2.1 x 150、PEEK ライニング SS

2.1 x 50、PEEK ライニング SS、ガード

Bio SEC-3 カラム

114

Agilent BioHPLC カラム

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凝集およびフラグメントの分析

Bio SEC-5 カラム
寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

Bio SEC-5

Bio SEC-5

Bio SEC-5

Bio SEC-5

Bio SEC-5

Bio SEC-5

100 Å

150 Å

300 Å

500 Å

1000 Å

2000 Å

21.2 x 300

55190-6863

5190-6864

5190-6865

5190-6866

5190-6867

5190-6868

21.2 x 50、ガード

5

5190-6869

5190-6870

5190-6871

5190-6872

5190-6873

5190-6874

7.8 x 300

55190-2516

5190-2521

5190-2526

5190-2531

5190-2536

5190-2541

7.8 x 150

55190-2517

5190-2522

5190-2527

5190-2532

5190-2537

5190-2542

7.8 x 50、ガード

5

5190-2520

5190-2525

5190-2530

5190-2535

5190-2540

5190-2545

4.6 x 300

55190-2518

5190-2523

5190-2528

5190-2533

5190-2538

5190-2543

4.6 x 150

55190-2519

5190-2524

5190-2529

5190-2534

5190-2539

5190-2544

4.6 x 50、ガード

5

5190-6857

5190-6858

5190-6859

5190-6860

5190-6861

5190-6862

ポアサイズ（Å）

ステンレス

バイオイナート

PROTEEMA カラム
寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

4.6 x 30

3

ガードカラム：PRM050303

PRM050303BI

4.6 x 250

3100

PRM0525031E2

PRM0525031E2BI

4.6 x 250

3300

PRM0525033E2

PRM0525033E2BI

4.6 x 250

5300

PRM0525053E2

PRM0525053E2BI

8 x 505

ガードカラム：

PRA080505

PRA080505BI

PRA080505LS

8 x 300

5100

PRA0830051E2

PRA0830051E2BI

PRA0830051E2LS

8 x 150

5300

PRA0815053E2

PRA0815053E2BI

8 x 300

5300

PRA0830053E2

PRA0830053E2BI

PRA0830053E2LS

8 x 300

5

1000

PRA0830051E3

PRA0830051E3BI

PRA0830051E3LS

粒子サイズ（µm）

ステンレス

バイオイナート3

MAM050303

MAM050303BI

4.6 x 250

3

MAM052503MC

MAM052503MCBI

8 x 50、ガード

3

MAA080503

MAA080503BI

8 x 300

3

MAA083003MC

MAA083003MCBI

MAB カラム
寸法（mm）

4.6 x 30、ガード

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7

PROTEEMA Lux
光散乱対応

www.agilent.com/chem/jp115

7 凝集およびフラグメントの分析
AdvanceBio SEC 標準試料
説明

AdvanceBio SEC 130 Å

凍結乾燥固体AdvanceBio SEC 300 Å

凍結乾燥固体タンパク質標準

GPC/SEC-キャリブレーションキット,
個別の標準 10 個

5190-9416

ReadyCal キットタンパク質、
1 つあたり 3～4 種類のタンパク質を混合× 5 個

5190-9417

ZORBAX GF-250 および GF-450 ゲルろ過カラム
説明

説明

部品番号

フォーム

タンパク質標準

PSS タンパク質標準寸法（mm）

粒子サイズ（µm）

部品番号

9.4 x 250

4884973-901

4.6 x 250

4884973-701

GF-450、300 Å

9.4 x 250

6884973-902

GF-450 Diol、ガードカートリッジ、2 個

9.4 x 156820675-111

4.6 x 12.5

6820950-911

9.4 x 156820675-111

GF-250、150 Å
GF-250、150 Åフォーム

凍結乾燥固体凍結乾燥固体ガードカラム（ハードウェアが必要）

GF-250 Diol、ガードカートリッジ、4 個
GF-450 Diol、ガードカートリッジ、2 個
分取ガードハードウェアキット

840140-901

ガードハードウェアキット

820999-901

PrepHT カラム

PrepHT GF-250、150 Å
PrepHT GF-450、300 Å

21.2 x 250

6877974-901

21.2 x 250

6877974-910

PrepHT エンドフィッティング、2 個
PrepHT ガードカートリッジ、2 個

820400-901
17.0 x 7.55820212-911

ガードカートリッジハードウェア

820444-901

ヒントとツール
現在ご使用の SEC カラムを AdvanceBio SEC 300 Å にアップデートすることで、分離能を高め、二次的作用を抑えることができます。

詳細については、97 ページ を参照してください。

116

Agilent BioHPLC カラム

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部品番号

PSS-PROKITPSS-PROKITR1

グリコシル化の特性解析

8

グリコシル化の特性解析

N-結合型グリカンの構造がグリコシル化生物製剤の機能に影響を与える場合があり、多くの場合、グリコシル化は重要な品質特性（CQA）になるため、N-グリカンの特性解析は生物製剤の開発プロセスの重要な部分です。

N-グリカン分析では多くの場合、タグにより遊離グリカンをラベリングして N-グリカンを分離した後、蛍光検出（FLD）や、イオン化を向上させて質量分析（MS）検出、および相対定量します。

タンパク質のグリコシル化の構造と形態に関する情報を取得するために、さまざまな分析メソッドが使用されています。

グリコシル化の特性解析メソッド– グリコシル化部位などの構造の同定には、逆相および親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）と質量分析検出を組み合わせて使用します– 遊離 N-グリカン分析では、グリカンは蛍光検出できるように蛍光ラベルを使って誘導体化され、HILIC により分離されます– シアル酸が付加されたグリカンは、より多くの電荷をタンパク質に与えることから、イオン交換クロマトグラフィーでの特性解析が可能です。またアジレントは、蛍光ラベルの付いた遊離シアル酸の調製を、LC/FLD または比色分析で可能にする溶液も提供しています

糖タンパク質および糖ペプチドのフラグメントの特性解析によりグリコシル化部位の数および位置に関する情報が得られたら、個々のグリカンの同定と定量を行う必要があります。そのために、グリカンをタンパク質から切断し、HILIC カラムで分析します。グリカンには発色団がないため、蛍光標識試薬で誘導体化して、FLD 検出によりグリカンの特性解析と定量を行えるようにします。

アジレントはカラム、ソフトウェア、機器のほか、N-グリカンおよびシアル酸サンプル前処理キットや、

酵素、標準物質、ライブラリなど N-グリカンの同定を支援するツールも幅広く取り揃えています。

第3
世代

第2
世代
第1
世代

Gly-X とInstantDyes

1 時間

Gly-X と 2-AB

2 時間

GlykoPrep と InstantDyes
GlykoPrep と従来の還元的アミノ化色素

3～4 時間
4～5 時間
1～2 日

従来の脱グリコシル化と従来の還元的アミノ化色素

N-グリカンのサンプル前処理の進化（右端が時間）

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www.agilent.com/chem/jp117

8 グリコシル化の特性解析

親水性相互作用カラムの選択

アプリケーション

糖タンパク質（モノクローナル抗体）などから切断されたグリカン

親水性ペプチドおよび糖ペプチド

アジレントのカラム

AdvanceBio Glycan マッピング

アミド結合相により、グリカンが迅速に平衡化され選択性が向上

1.8 µm

全多孔質粒子を採用し、高速分離およびハイスループットアプリケーションに適しています。

2.7 µmPoroshell 技術にもとづく表面多孔質粒子を採用しています。拡散距離が短く、低い背圧での高ZORBAX RRHD 300 Å、1.8 µm
AdvanceBio Glycan マッピング

AB

注意事項

1290 Infinity II LC で使用する場合、最大 1200 bar での分析が可能です。

分離能分離が可能です。また、長いカラムを使用することで、分離効率を高めることができます。
ポアサイズ 300 Å のシリカ粒子により、
ZORBAX RRHD 300 Å、1.8 µm 逆相カラムに対してオー

ソゴナルな分離を行えます。

アミド結合相により、小さい親水性ペプチドおよび糖ペプチドを分析できる、もう 1 つの HILIC

機能が可能になります。

AdvanceBio ファミリーの製品

N-グリカンのサンプル前処理
AdvanceBio Gly-X 技術

Agilent AdvanceBio Gly-X（旧 ProZyme）は、溶液内ワークフローを簡素化する次世

代の N-グリカン前処理プラットフォームです。InstantPC 色素や、真空プレートの効率的なクリーンアップステップと組み合わせて、余分な標識色素や変性剤を除去すること

で、UHPLC や LC/MS 用のサンプルの前処理が 60 分以内に完了します。

ヒントとツール
N-グリカンのサンプル前処理の詳細については、以下を参照してください

ワークフローとオーダーガイド – AdvanceBio Gly-X InstantPC サンプル前処理と LC/FLD/MS を用いた生物製剤の糖タンパク質の N-グリカン分析（資料番号 5994-3926JAJP）

ワークフローとオーダーガイド – AdvanceBio Gly-X 2-AB Express サンプル前処理と LC/FLD/MS を用いた生物製剤の糖タンパク質の Nグリカン分析（資料番号 5994-4158JAJP）

Application note – Gly-X InstantPC vs Waters RapiFluor-MS comparison （アプリケーションノート - Gly-X InstantPC と Waters
RapiFluor-MS の比較）
（資料番号 5994-5653EN）

Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC および 2-AB Express サンプル前処理と LC/FLD/MS を用いた生物製剤の N-グリカン分析の効率的なワークフロー（資料番号 5994-1348JAJP）

118

Agilent BioHPLC カラム

AB

目次に戻る

AB

グリコシル化の特性解析

8

グリカンのサンプル
Gly-X
前処理ワークフロー
グリカンのサンプル
Gly-XN-N前処理ワークフロー

Dye

変性

脱グリコシル化

90 ℃ で 3 分間

標識

PNGase F、
50 ℃ で 5 分間

ラベル付き N-グリカン

クリーンアップ

InstantDye、1 分間
50 ℃ で 5 分間

15～20 分（RT）

LC-FLR、LC-MS、CE

InstantPC

還元的アミノ化色素、60 分間（乾燥なし）2-AB
Gly-X N-グリカンのサンプル前処理ワークフローで推奨される初期サンプル量は 1 ～ 40 µg です。これは同様のワークフローの最大サンプル量を上回ります。また、分子によっては、使用するタンパク質を増やすこともできます。サンプルに関する詳しい考慮事項については、個々の Gly-X 製品のマニュアルを参照してください。

リツキシマブ N-グリカン、Gly-X InstantPC

×101
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0

InstantPC でラベル化されたリツキサン N-グリカンの相対面積、標準偏差、および CV 値（n = 4）

G0F

平均相対面積（%）

標準偏差

%CV

G0F-N

0.75

0.01

1.55

G0

1.47

0.02

1.18

G0F

46.82

0.07

0.15

Man5

1.21

0.01

0.83

G1[6]

0.75

0.02

2.67

G1F[6]

31.21

0.11

0.35

G1F[3]

9.27

0.05

0.54

G2F

7.04

0.04

0.51

G2FS1[6]

0.67

0.02

2.29

G2FS1[3]

0.37

0.06

15.98

G2FS2

0.45

0.03

6.67

Response units (%)

G1F[6]

G1F[3]

5

6

7

8

9

10

G2F

11

12

13

14

G2FS2

G2FS1[6]Man5 G1[6]G0F-N G0

15

16
17
18
19
20
Acquisition time (minutes)

目次に戻る

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

www.agilent.com/chem/jp

119

8 グリコシル化の特性解析
GlykoPrep および GlykoPrep-plus N-グリカンのサンプル前処理

2012 年にリリースされた ProZyme GlykoPrep 固相カートリッジは、「インスタント」グリカンラベリングを使用した最初のプラットフォームでした。このカートリッジは、N-グリカンのサンプル前処理をスピンおよび自動化（AssayMAP Bravo）の両形式で合理化し、標準化しました。再現性は LC と CE を使用した 2 つのラボ間研究で実証されました。

GlykoPrep-plus キットにより Agilent AssayMAP Bravo を使った自動化が可能になったため、納入と同時に自動化できるようになり、精度が向上し、無人運転の時間が増えました。GlykoPrep は後継機の Gly-X に取って代わられましたが、アジレントは現在の GlykoPrep のお客様を今後もサポートし続けます。

従来の N-グリカンサンプル前処理のメソッド

これまでの N-グリカンサンプル前処理ワークフローには、PNGase F を使った自然のまたは変性剤による消化、遊離グリカンの精製、蛍光色素分子を使ったラベリング、ラベル付きグリカンの精製などが含まれます。このようなワークフローには 1 ～ 2 日かかるため、高スループットのアプリケーションや自動化には適していません。

Gly-X の導入に伴い、アジレントは 2-AB ワークフローからより高速で、スループットが大きなサンプル前処理

技術への移行をお手伝いしています。しかし、今後も、豊富なグリカンラベリングとクリーンアップツールで、従来のワークフローをサポートし続けます。

AdvanceBio シアル酸のプロファイリングと定量
シアル酸分析の簡略化 – アジレントはシアル酸分析のニーズに対応するため、シアル酸のプロファイリングと定量のためのオプションを提供しています。

ヒントとツール
Agilent AdvanceBio シアル酸プロファイリングと定量の詳細については、以下をご覧ください。

AdvanceBio シアル酸プロファイリングおよび定量キットと LC/FLD/MS を用いた生物製剤糖タンパク質のシアル酸分析（資料番号 59944201JAJP）

生物製剤の糖タンパク質の総シアル酸定量（資料番号 5994-4383JAJP）

Agilent AdvanceBio シアル酸プロファイリング/定量キット – NANA、NGNA の各シアル酸種の高速定量（資料番号 5994-2788JAJP）
Agilent AdvanceBio シアル酸定量キット – サンプル処理の簡素化を実現（資料番号 5994-2789JAJP）
生物製剤中のシアル酸のプロファイリングと定量のワークフローの改良（資料番号 5994-2352JAJP）

120

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るグリコシル化の特性解析

8

Glycobiology 標準およびライブラリ

確 か な 答 えへ の 到 達 を 助 け るグリカン 標 準 - ラ ベ ル なし、 また は InstantPC、2-AB、InstantAB、APTS、2-AA であらかじめラベル付けされた N-グリカン標準とライブラリをご用意しています。

複雑な中性およびシアル化 2 本鎖糖鎖、高マンノース、α-Gal など生物製剤に見られる多くの一般的なグリカンタイプをカバーしています。また、数種類のグリカンライブラリから糖タンパク
質を選択することもできます。例えば以下が挙げられます。

– ヒト IgG– ウシ RNase B– ウシフェチュイン

– ヒト α1-酸性糖タンパク質（AGP）– チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞で作られた遺伝子組み換え IgG（mAb）

グリカンの構造– 3 本鎖糖鎖および 4 本鎖糖鎖シアル化 N-グリカンライブラリ

さらに、α(2,3)- または α(2,6)-結合型シアル酸のどちらかを含む標準も用意しています。

– α(2,3) シアル酸結合は、CHO 細胞で産生された糖タンパク質上で見られます 。

α(2,3) シアル化レベルのグリカンは、α(2,6) シアル酸結合レベルの異性体 N-グリカンよりも短い HILIC リテンションタイムを示します。

– α(2,6) シアル酸結合は、ヒト静注用免疫グロブリン（IVIG）などの糖タンパク質で見られます。

詳しくは、グリカン標準選択ガイド（5994-2202EN）をご覧ください。

2-AB ラベル化デキストランラダーの分離

カラム：

移動相：

FLD：

AdvanceBio グリカンマッピング
859700-913
2.1 x 150 mm、1.8 µm

A：100 mM NH4Fc、pH 4.5
B：ACN
励起 = 260 nm

43

発光 = 430 nm

注入量：

2 µL（総量 10 pmol のグリカン/1 µL 75:25 ACN:

サンプル：

2-AB（部品番号 GKSB-503）

水）

ラベル化デキストランラダー

2

1

0

0

2

4

6

8

時間

%A

%B

流量

0

25

75

1.0

（mL/min）

12

40

60

1.0

12.15

60

40

0.5

12.5

60

40

0.5

12.9

25

75

0.5

13.05

25

75

1.0

15

25

75

1.0

10

12

14

min

アジレントのデキストランラダー標準と AdvanceBio グリカンマッピングカラムを使用した、未知グリカンのリテ

ンションタイムの関連付け

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp121

8 グリコシル化の特性解析

糖鎖生物学酵素

アジレントは遊離グリカンなどの分析ワークフローを支援するために、各種糖酵素の提供を開始しました。酵素のラインナップについては図 8 をご覧ください。その他すべての製品については、アジレントの

ウェブサイトにお越しください。

– エンドグリコシダーゼはグリカンの構造内で切断させます。N-グリカナーゼ（PNGase F、アスパラ
ギンアミダーゼ）は大部分のインタクト N-グリカンを遊離することから、遊離グリカンの研究や脱N-グリコシル化タンパク質の生成に広く用いられています– エキソグリコシダーゼは、露出した、つまり「末端」の単糖残基をグリカンから切断します。一般的に使用されるエキソグリコシダーゼには、脱ガラクトシル化するガラクトシダーゼのほか、遊離グリ

カン、糖タンパク質、細胞を脱シアリル化するシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）などがあります

詳しくは、酵素選択ガイド（資料番号 5994-2202EN）をご覧ください。

選択したエンドグリコシダーゼ（A）とエキソグリコシダーゼ（B）の特異性
A．エンドグリコシダーゼ

N-グリカナーゼ（PNGase F）

O-グリカナーゼ

B．エキソグリコシダーゼ

β‐ガラクトシダーゼ

α-マンノシダーゼ

シアリダーゼ A

シアリダーゼ S

122

β-ヘキソサミニダーゼ

Agilent BioHPLC カラム

α-マンノシダーゼ

目次に戻る

α-ガラクトシダーゼ

グリコシル化の特性解析

8

AdvanceBio Glycan マッピングカラム

AdvanceBio グリカンマッピングカラムおよび標準の他、モノクローナル抗体などの糖タンパク質から N-グリカンを選択的に除去するためのサンプル前処理製品をご用意しています。

分析スピード ― 1.8 µm カラムでは、ハイスループットの N-グリカン分析が可能です。大量のサンプルの分析またはデータの即時性が求められるスピード重視のラボに適しています。

分離能 ― 2.7 µm 粒子が充填された 250 mm カラムを使用することで、高分離能分離が実現します。分離能が向上すると、ターゲットグリカンを正確に定量でき、発現中に発生する可能性があるタンパク質のグリコシル化プロファイルを変えることができます。

包括的なメソッド ― サンプル前処理からクロマトグラフィー分析、データ解析までをカバーし、再現性と精度に優れた同定および定量を行えます。

シンプルな製品体系 ― タンパク質の可溶化から 2-AB ラベル化グリカンの精製まで、サンプル前処理ワークフローに必要なすべての製品を 1 つの部品番号でご注文いただけます。また、サンプル前処理ワークフローの各ステップ用のキットもご用意しています。

カラムの仕様結合相

内径（mm）

粒子

エンドキャップ

pH 安定性

動作温度範囲圧力上限

アミド HILIC

2.1 および 4.6

1.8 µm、全多孔質

なし

2～7

40 ℃

1200 bar

アミド HILIC

2.1 および 4.6

2.7 µm、表面多孔質

なし

2～7

40 ℃

600 bar

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123

8 グリコシル化の特性解析
分析スピード分析スピードが要求されるハイスループット分析には、AdvanceBio グリカンマッピング 1.8 µm カラムをおすすめします。

高品質の結果 ― 分析時間は他社製品の 約 60 %

20

80

0.5

25

40

60

0.5

26

100

0

0.5

27

40

80

0.5

17.5

20

22.5

min

17.5

20

22.5

min

11.668

5

7.5

10

12.5

15

7.5

10

12.5

15

7.5

10

12.5

15

16.00016.006

1
LU

1.2
0.8

0

0
0

他社製サブ 2 µm

2.55
グリカンカラム
2.5

5

18.56718.9260.2

18.9260.40

17.0050.6
0.2

17.005

0.61
0.8
0.4

17.5
17.5

23.661

2.5

20

22.5

20

22.5

23.6610

1.2

20.58715

20.58710

19.5507.5

19.55012.5

17.076516.00016.0060
LU

2.5

17.0762-AB ラベル化 N-結合型ヒト IgG
グリカンライブラリ（部品番号 GKSB-005）

018.24018.247

サンプル：流量mL/min18.24018.24718.567

0.2

0.40

%B

13.9661260 Infinity 蛍光検出器（FLD）搭載
1290 Infinity LC

13.966

装置本体：

14.3730.6
0.2

12.98413.3900.35 mL/min

カラム、1.8 µm

14.373

流量：

AdvanceBio グリカンマッピング

0.61
0.8
0.4

12.98413.390励起 = 260 nm

11.66812.01712.01712.348FLD：

発光 = 430 nm

9.612

1
LU

1.2
0.8

12.348

サンプルサーモスタット： 10 ℃

LU

1.2

9.612

2 µL in ACN/100 mM ギ酸アンモニウム（7:3）100 mM NH4 ギ酸中で 2 µL

10.535

注入量：

%A

0

100 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5
B：ACN

11.169移動相：時間

他社製サブ 2 µm グリカンカラム

10.535

カラム B：

AdvanceBio グリカンマッピング
859700-913
2.1 x 150 mm、1.8 µm

11.169

カラム：

min
min

AdvanceBio グリカンマッピングカラムでは、他社製のサブ 2 µm、2.1 x 150 mm カラムよりも分離能が優れており、幅の狭いバンド、高いピークキャパシティが得られた

124

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るグリコシル化の特性解析

8

分離能

高分離能分離が求められる分析には、AdvanceBio グリカンマッピング 2.7 µm 充填剤の長いカラムをおすすめします。

高品質の結果 ― 分析時間は他社製品の 約 60 %

カラム：

装置本体：
緩衝液：

MS 条件：

AdvanceBio グリカンマッピング
859700-913
2.1 x 150 mm、1.8 µm1290 Infinity バイナリ LC

A：100 mM ギ酸アンモニウム水溶液、pH 4.5

B：アセトニトリル
ガス温度：

シースガス

温度：

250 ℃

250 ℃
8 L/min
シースガス流量： 8 L/min
ネブライザ：
25 psiVcap：
3,500 V
ノズル：
1,000 V
フラグメンタ：
200 V
スキマ：
45 V
Oct 1 RF Vpp：
550
コリジョンエネルギー： 15 V および 30 Vモード：
MS およびターゲット MS/MS
ガス流量：

ピーク

6

×101
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5

7
8
2
1
8

9

3

9
4

5

面積 %

1

0.6

2

6.4

3

4.4

4

1.5

5

2.3

6

34.6

7

26.4

8

15.0

9

8.8

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

PNGase F によりフェチュインから切断した N-グリカンを 2-AB で 誘導体化した 後、UHPLC-FLD で 分析。MS によるピークの割り当てから、フェチュインから切断された N-グリカンが、N-アセチルノイラミン酸（NeuAc）を含み、フコースを含まない複雑な 2 本鎖および 3 本鎖グリカンであることがわかった。フェチュ
インの 2-AB ラベル化 N-グリカンを HILIC-UHPLC で分析し、MS.によりピークを割り当てた目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp125

8 グリコシル化の特性解析
機器条件
開始
流量

フェチュインN-グリカン構造の詳細情報

フェチュインのグラジエント

0.5 mL/min

グラジエント

0 分 75 % B

45 分 50 % B

47 分 40 % B、
流量 0.5 mL/min

47.01 分、流量 0.25 mL/min

ピーク

オックスフォード表記

1

A2G2S1

2、3

A2G2S2

4

A3GGS249 分 0 % B

551.01 分 75 % B、
流量 0.25 mL/min

6

51 分 0 % B

ストップタイム
ポストタイム

注入量

サーモスタット

オートサンプラFLD
ピーク幅52.00 分、流量 0.5 mL/min

7

52 分
20 分

A3G3S3、A3G3S2（微量）

A3G3S3、A3G3S2（微量）

A3G3S3、A3G3S4

（微量）

1 µL

8

5℃

A3G3S4、A3G3S3

9A3G3S4

励起 = 260 nm
発光 = 430 nm

構造

フコース

>0.013 分（応答時間 0.25 秒）（37.04 Hz）

ガラクトースマンノース

N-アセチルグルコサミン
N-アセチルノイラミン酸

126

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るグリコシル化の特性解析

8

親水性ペプチドと糖ペプチドの分析

ペプチドの分析には、逆相クロマトグラフィーと同等の高い選択性と分析間再現性が要求されます。ただし、逆相カラムは、糖ペプチドなどの親水性ペプチドに対する保持力と選択性が限られます。ZORBAX RRHD 300-HILIC、1.8 µm カラムは、逆相カラムよりも親水性 ペプチドや糖 ペプチドの保持力が高いため、 ペプチドマッピング実験で有益な情報を見逃すことなく確実に捉えることができます。

この 2 つの手法は相互にオーソゴナルであり、タンパク質の一次構造解析に関する相補的な情報が得られます。

– ZORBAX 300 Å 粒子により幅広いペプチドサイズの分析が可能です– 耐圧 1200 bar の 1.8 µm 粒子で UHPLC 性能を実現します– ZORBAX RRHD 300 Å 逆相カラムとの組み合わせにより、UHPLC で相補的な情報を提供します

カラムの仕様結合相

シリカ

内径（mm）

2.1

粒子サイズ

1.8、全多孔質

エンドキャップなし

pH 安定性1～8

動作温度範囲40 ℃

圧力上限1200 bar

タンパク質生物製剤の特性解析および不純物プロファイリングには、 ペプチドマッピングが使用されています。そのための手法として逆相 UHPLC/

HPLC が一般的ですが、消化物に糖ペプチドなどの親水性ペプチドが含まれていると、有益な情報を見逃す可能性があります。ZORBAX RRHD

300-HILIC カラムは、親水性の糖ペプチドを保持し、質量分析計と組み合わせて使用することで、この重要なタンパク質フラグメント群を同定することができます。

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www.agilent.com/chem/jp127

8 グリコシル化の特性解析
タンパク質トリプシン消化物中の糖ペプチドの同定

カラム：

ZORBAX RRHD 300-HILIC
858750-901
2.1 x 100 mm、1.8 µm

移動相：A：100 % ACN
B：50 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5

流量：0.4 mL/min

注入量：

5 µg

検出器：

UV、280 nm

装置本体：

1290 Infinity LC、6224 精密質量飛行時間型、
デュアル ESI イオン源、ポジティブイオンモード

サンプル：

EPO タンパク質消化物から抽出した糖ペプチド（1 mg/mL）

UV

グラジエント

時間

MS
%A

%B

0

95

5

50 0

15

0

100

15.1

95

5

40 0

25

95

n/a

mAU

5.5
5
4.5
4
3.5
3

30 0

2.5
2

20 0

1.5
1

10 0
0

x105

0.5
2

4

6

8

10

0

12 min

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

UV は、ZORBAX RRHD 300-HILIC 2.1 x 100 mm カラムによるエリトロポエチンタンパク質（EPO）ペプチドマップの分離結果、MS は、一致した EPO の抽出成分のクロマトグラムです。

HILIC-MS データにより、RP-MS では同定できなかった 7 種類のペプチドが同定されました。HILIC は RP に対してオーソゴナルな手法であり、RP では捉えることのできないタンパク質酵素
消化物中の親水性糖ペプチドを分離することができます。

128

Agilent BioHPLC カラム

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8

製品の詳細情報
AdvanceBio グリカンマッピング、1.8 µm、耐圧 1200 bar
サイズ（mm）

部品番号

2.1 x 150

859700-913

2.1 x 100

858700-913

2.1、1.8 µm、Fast Guard

821725-905

AdvanceBio グリカンマッピング、2.7 µm、表面多孔質、耐圧 1200 bar
サイズ（mm）

部品番号

4.6 x 250

680975-913

4.6 x 150

683975-913

4.6 x 100

685975-913

2.1 x 250

651750-913

2.1 x 150

683775-913

2.1 x 100

685775-913

2.1、2.7 µm、Fast Guard

821725-906

GlykoPrep
説明

部品番号

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および InstantPC、24 個

GP24NG-PC

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および 2-AB、24 個

GP24NG-AB

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および InstantPC、96 個

GP96NG-PC

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および 2-AB、96 個

GP96NG-AB

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および InstantPC、96 個、AssayMAP Bravo Automated

GPPNG-PC

GlykoPrep Rapid N-Glycan Prep および 2-AB、96 個、AssayMAP Bravo Automated

GPPNG-ABGlykoPrep スタータラボウェアキット

AM200

GlykoPrep マイクロチューブアダプタキット

AM400

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8 グリコシル化の特性解析

Gly-X
AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep および InstantPC、24 個

GX24-IPC

AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep および 2-AB Express、24 個
AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep および InstantPC、96 個

GX24-2AB
GX96-IPC

AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep および 2-AB Express、96 個
AdvanceBio Gly-X マニホールドスペーサ

GX96-2AB
GX100

シアル酸分析

AdvanceBio シアル酸プロファイリング/定量キット、24 個

GS24-SAP

AdvanceBio 総シアル酸定量キット、48 個

GS48-SAQ

AdvanceBio 総シアル酸定量キット、96 個

GS96-SAQ

グリカン

ProZyme 名

オックスフォード名1

G0-N

NGA2-N

A1

G0

NGA2

A2

G0F-N

NGA2F-N

F(6)A1G0F

NGA2F

F(6)A2

GKC-004301

G0FB

NGA2FB

F(6)A2B

GKC-004311

G1

NA2G1

A2G1

GKC-014300

GKPC-317

GKIB-317

GKSB-317

G1F

NA2G1F

F(6)A2G1

GKC-014301

GKPC-316

GKIB-316

GKSB-316

GKSA-316

GKSP-316

G2

NA2

A2G(4)2

GKC-024300

GKPC-304

GKIB-304

GKSB-304

GKSA--304

GKSP-304

G2F

NA2F

F(6)A2G(4)2

GKC-024301

GKPC-305

GKIB-305

GKSB-305

GKSA-305

GKSP-305

G2FB

NA2FB

F(6)A2BG(4)2

GKC-024311

複雑なタイプの天然型 N-グリカン

G1S1 α(2,3)

130

CFG 構造

ラベルなし 2lnstantAB

GKPC-401

GKC-004300

GKPC-301

GKPC-302

2-AA

GKIB-301

GKSB-301

GKSP-401

GKSA-301

GKSB-402

GKIB-302

GKSB-302

APTS

GKSP-301

GKSP-402

GKSA-302

GKSP-302

GKSB-303

GKSB-306

GKPC-329

目次に戻る

2-AB

GKSB-401

GKPC-402

A2G(4)1S(3)1

Agilent BioHPLC カラム

lnstantPC

GKSP-317

グリコシル化の特性解析

グリカン

ProZyme 名

オックスフォード名1

CFG 構造

ラベルなし 2lnstantPC

G1S1 α(2,6)

A2G(4)1S(6)1

GKPC-319

G1FS1 α(2,3)

FA2G(4)1S(3)1

GKPC-330

G1FS1 α(2,6)

FA2G(4)1S(6)1

GKPC-320

GKPC-321

G2S1 α(2,3)

A1(α2,3)

A2G(4)2S(3)1

G2S1 α(2,6)

A1(α2,6)

A2G(4)2S(6)1

G2FS1 α(2,3)

A1F(α2,3)

F(6)A2G(4)1S(3)2

G2FS1 α(2,6)

A1F(α2,6)

F(6)A2G(4)1S(6)2

G2S2 α(2,3)

A2(α2,3)

A2G(4)2S(3)2

G2S2 α(2,6)

A2(α2,6)

A2G(4)2S(6)2

G2FS2 α(2,3)

A2F(α2,3)

F(6)A2G(4)2S(3)2

G2FS2 α(2,6)

A2F(α2,6)

F(6)A2G(4)2S(6)2

G2F w/2 α-gal

NA2Ga2F

F(6)A2G(4)2Ga(3)2GKPC-318

G1F w/1 α-gal

NA2G 1FGa1

F(6) A2G(4)1Ga(3)1GKPC-403

G2F w/1 α-gal

NA2FGa1

F(6)A2G(4)1Ga(3)2GKPC-404

A3

NGA3

A3

GKC-005300

G3

NA3

A3G(4)3

GKC-035300

GKC-124300

GKPC-311

8

lnstantAB

2-AB

2-AA

APTS

GKIB-311

GKSB-311

GKSA-311

GKSP-311

GKIB-315

GKSB-315

GKSA-315

GKSP-315

GKIB-312

GKSB-312

GKSA-312

GKSP-312

GKIB-313

GKSB-313

GKSA-313

GKSP-313

GKPC-325

GKC-124301

GKPC-315

GKPC-322

GKC-224300

GKPC-312

GKPC-323

GKC-224301

目次に戻る

GKPC-313

GKSP-318

GKSB-318

GKIB-307

GKSB-307

GKSA-307

GKSB-308

GKSA-308

www.agilent.com/chem/jp131

8 グリコシル化の特性解析

グリカン

ProZyme 名

オックスフォード名1

CFG 構造G3S3 α(2,6)

A3(a2,6)

A3G(4)3S(6)3

GKC-335300

GKSB-314

A4

NGA4

A4

GKC-006300

GKSB-309

G4NA4A4G(4)4

GKC-046300

GKSB-310

ラベルなし 2lnstantPC

lnstantAB

2-AB

2-AA

APTS

GKSA-309

高マンノース型天然型 N-グリカン

Man5

MAN-5

M5

GKM-002500

GKPC-103

GKIB-103

GKSB-103

GKSA-103

GKSP-103

Man6

MAN-6

M6

GKM-002600

GKPC-104

GKIB-104

GKSB-104

GKSA-104

GKSP-104

Man7

MAN-7

M7

GKM-002700

GKPC-105

GKIB-105

GKSB-105

GKSA-105

GKSP-105

Man8

MAN-8

M8

GKM-002800

GKPC-106

GKIB-106

GKSB-106

GKSA-106

GKSP-106

Man9

MAN-9

M9

GKM-002900

GKPC-107

GKIB-107

GKSB-107

GKSA-107

GKSP-107

ハイブリッド型天然型 N-グリカン
ハイブリッド

HYBR

M5A1B

GKSB-111

天然型 N-グリカンコア

NF

NF

GKR-001001

NN

NN

GKR-002000

NNF

NNF

GKR-002001

Man1

MNN

M1

GKR-002100

Man1F

MNNF

F(6)M1

GKR-002101

GKSB-100Man3

GKR-002300

GKSB-101

Man3F

GKR-002301

GKSB-102

132

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るグリコシル化の特性解析

グリカン

ラベルなし

lnstantPC

lnstantAB

2-AB

2-AA

APTS

GKLB-005

GKPC-005

GKIB-005

GKSB-005

GKSA-005

GKSP-005

GKLB-001

GKIB-001

GKSB-001

GKSA-001

GKLB-002

GKIB-002

GKSB-002

GKSA-002

8

N-グリカンライブラリ

ヒト lgG N-グリカンライブラリ

CHO mAb N-グリカンライブラリ

GKPC-020

CHO mAb N-グリカンライブラリ＋ CHO mAb 糖タンパク質

ヒト α1-酸性糖タンパク質 N-グリカンライブラリ
ウシフェチュイン N-グリカンライブラリ

GKPC-020-P

RNase B N-グリカンライブラリ（高マンノース型）

GKIB-009

2 本鎖糖鎖および高マンノース分割ライブラリ

シアル化 2 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリ

GKIB-520

GKSB-520

GKSP-520

GKIB-232

GKSB-232

GKSP-232

GKSB-262

GKSP-262

GKSB-233

GKSP-233

GKSB-263

GKSP-263

GKSB-234

GKSP-234

GKSB-264

GKSP-264α(2,6) シアル化 2 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリα(2,3) シアル化 3 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリ

GKPC-233

α(2,6) シアル化 3 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリ

GKIB-233

GKPC-263α(2,3) シアル化 4 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリ

GKPC-234α(2,6) シアル化 4 本鎖糖鎖 N-グリカンライブラリ

GKPC-264

グルコース単位（GU）
ラダー

GKPC-503

GKIB-234

アライメント標準

GKIB-503

キャピラリ電気泳動（CE）用内部泳動標準ZORBAX RRHD 300-HILIC 1.8 µm カラム

GKSB-503

GKSA-503

GKSP-503
GKSP-500

サイズ（mm）

内径（mm）

粒子サイズ（µm）

部品番号

ZORBAX RRHD 300-HILIC

2.1 x 100

1.8858750-901

ZORBAX RRHD 300-HILIC

2.1 x 501.8857750-901

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133

9 抗体価の測定

抗体価測定

アフィニティクロマトグラフィーは、特異性の高い分子相互作用、主に特定のタンパク質同士（抗原/抗体など）の結合を利用して分離する強力な手法です。アジレントは、IgG を単離および定量するための特殊なアフィニティ製品、Protein A および Protein G モノリスカラムや、生体サンプル

中の高濃度タンパク質を除去するためのマルチプルアフィニティ除去システムを提供しています。

バイオモノリス HPLC カラム– あらゆる IgG（ヒトおよびマウス）の分離用に設計されています– 流量に左右されない分離。拡散、ポア、ボイドボリュームがないため、移動相と固定相間の高速移動が可能です– 超高速分離により、メソッド開発をスピードアップしてコストを削減できます– メソッドパラメータを固定化することで分析時間と緩衝液を大幅に削減します

バイオモノリスプロテイン A およびプロテイン G HPLC カラムは、バイオモノリスカラムファミリーの製品です。Protein A および Protein G バイオモノリスカラムは、1100、1200、および 1260 バ

イオイナートクォータナリ LC などの HPLC および分取 LC システムで使用できます。

バイオモノリスプロテイン A カラム、

5069-3639

ヒントとツール
バイオモノリスプロテイン A カラムの mAb 結合の耐塩性および mAb の溶出に使用可能な酸性緩衝液の詳細については、アプリケーションノート（5991-2990JAJP）をご覧く
ださい。

134

Agilent BioHPLC カラム

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抗体価の測定9

カラムの仕様外寸

5.2 mm x 4.95 mm

カラム容量

100 µL

最低/最高温度

使用温度：2～40 ℃

最大圧力

推奨 pH

150 bar（15 MPa、2,200 psi）
保管：2～8 ℃

使用範囲2～13

定置洗浄：1～14

使用材質

ハードウェア：ステンレス製

カラー識別リング

バイオモノリス遺伝子組み換えプロテイン A および天然タンパク質 A：白保管期限/使用期限

12 か月

充填剤：ポリ（グリシジルメタクリレート-co-エチレンジメタクリレート）多孔質モノリス

バイオモノリスプロテイン G：オレンジ

ヒントとツール
詳細情報：

堅牢性と信頼性に優れた遺伝子組み換え Protein A Monolith カラムによる抗体価測定（資料番号 5994-3088JAJP）

Agilent Bio-Monolith rProtein A カラムによる 60 秒での mAb 抗体価測定（資料番号 5994-3969JAJP）

mAb Titer Analysis with the Agilent Bio-Monolith Protein A Column（Agilent バイオモノリスプロテイン A カラムによる mAb タイター分析）（資料番号 5991-5135EN）

バイオモノリスプロテイン A による細胞培養のモノクローナル抗体力価のモニタリング（資料番号 5991-2990JAJP）
バイオモノリスプロテイン A カラムと LC/MS を用いた細胞クローン選択（資料番号 5991-5124JAJP）

Cell Culture Optimization Using an Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS（バイオモノリスプロテイン A カラムと LC/MS を用いた細胞培養の最適化）（資料番号 5991-5125EN）

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135

9 抗体価の測定
さまざまな IgG サブクラスに対するバイオモノリスプロテイン A
およびプロテイン G の結合親和性
抗体

プロテイン A

プロテイン G

ヒト IgG1

++++

++++

++++

++++

–

++++

++++

++++

++

–

++

–

ヒト

ヒト IgG2
ヒト IgG3
ヒト IgG4
ヒト IgAヒト IgD
ヒト IgE++–ヒト IgM++–

マウス IgG1

+

++

++++

++++

++++

+++

+

+++

マウス IgM+/––

ヒト Fab

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

マウス

マウス IgG2a

マウス IgG2b
マウス IgG3

抗体フラグメント
人体 F(ab�)2

ヒト scFv
ヒト Fc
ヒト κ
ヒト λ

++++ = 強い親和性+++ = 中位の親和性++ = 弱い親和性+ = わずかな親和性– = 親和性なし

136

Agilent BioHPLC カラム

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抗体価の測定9

遺伝子組み換えプロテイン A と天然タンパク質 A カラム間の架橋実験

カラム：

バイオモノリス遺伝子組み換えプロテイン A 5190-6903 4.95 × 5.2 mm
バイオモノリスタンパク質 A 5069-3639 4.95 x 5.2 mm

移動相：

A：リン酸ナトリウム緩衝液、50 mm、pH 7.4
B：0.1 M クエン酸、pH 2.6

流量：

1.5 mL/min

検出器：

UV、280 nm

注入量：5～50 µL（ロード量 25 µg）

グラジエント：

0 % B で 0.5 分保持、100 % B で 0.6～2.6 分、0 % B で 2.7～4 分

温度：

25 ℃

サンプル：

チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞培地の上清の遺伝子組み換え IgG

装置本体：

1290 Infinity II Bio LC システム

直線性のあるレスポンス

リテンションタイム
×102
9
8

4,500

A

3,500
Peak area

7
Response (mAU)

y = 50.012x + 73.505
R2 = 0.9998

4,000

天然型

6
5

3,000
2,500
2,000
1,500

4

1,000

3

500
0

2

0

10

20

30

1
0
0.2
×10

2

9
8

0.4

0.6

0.8

1.0
1.2
1.4
1.6
Retention time (min)

1.8

2.0

2.2

2.4

添加サンプル

25 µg（純粋）25 µg（上澄み中）B
rProtein A

50

60

70

80

70

80

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137

測定値

% 偏差

25.25 µg0.99 %

26.09 µg4.35 %

rProtein A カラム：直線性のあるレスポンス

7
6
5

4,000

4

3,500

3

3,000
Peak area

Response (mAU)

40
Injection (µg)

2
1
0
0.2

0.4

0.6

0.8

1.0
1.2
1.4
1.6
Retention time (min)

1.8

2.0

2.2

2.4

2,500
2,000
1,500
1,000
500
0

リテンションタイム（分）
ピーク高さ

天然型

rProtein A

880.9 ± 8.1

881.8 ± 5.3

0.850 ± 0.001

y = 51.218x – 34.128
R2 = 0.9998

0

10

20

30

40

50

60

Injection (µg)
添加サンプル0.850 ± 0.001

25 µg（純粋）25 µg（上澄み中）

天然タンパク質 A カラムと rProtein A カラムのクロマトグラムおよび mAb ピーク結果の比較

測定値

% 偏差

24.94 µg-0.23 %

25.78 µg3.12 %

天然タンパク質 A カラム：直線性のあるレスポンス

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9 抗体価の測定
回収率分析

天然タンパク質 A カラムと rProtein A カラムの回収率の比較に加え、他社製 rProtein A カラム 2 個もこの研究で使用しました。 他社製カラムの動作流量に合わせて、流量を 2 mL/min に調整しました。追加

した mAb サンプルは以下のとおりです。

– Agilent-NISTmAb（部品番号：5191-5744）– Sigma-Aldrich の Sigma SiLu mAb（SiLu Lite、部品番号：MSQC4）

カラムなし（ユニオンあり）の移動相 B で希釈した、精製済み mAb サンプルを注入して、mAb ピークの

ベースライン曲線下面積（AUC）を取得しました。 カラムを用いて、溶出した mAb の AUC を取得しました。 これと同量の mAb サンプルをベースライン AUC として使用しました。

回収率 % =（溶出した mAb の AUC ÷ ベースライン AUC）× 100

Agilent rProA

105%

Agilent nProA
他社 A

100%
95%

97%

他社 B

98%
96%

90%

93%

85%
80%
75%
70%
65%
60%
mAb 回収率の比較

平均回収率

rProtein A カラムの平均回収率は天然タンパク質 A カラムよりも 1 % 低くなっていますが、それでも他の

2 つの他社製カラムを上回る回収率を示しています。回収率では nProtein A カラムがややリードしていますが、3 つの mAb サンプルにわたり最も高い回収率を示したのは rProtein A カラムでした。

138

Agilent BioHPLC カラム

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抗体価の測定9

堅牢で確実な抗体価測定
メソッド条件
HPLC 条件
カラム

バイオモノリスプロテイン A、

結合バッファ
（溶出液 A）

50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4

溶出バッファ
（溶出液 B）

クリーンアップバッファ

グラジエントプロファイル

4.95 × 5.2 mm（部品番号 5190-6903）
100 mM クエン酸、pH 2.6

100 mM リン酸ナトリウム中に 1 M の NaCl、pH 7.4

50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4 中に 20 % の イソプロパノール
時間 % B0～0.5 0（結合）

1.9～4.0 0（再コンディショニング）0.6～1.8 100
流量

（溶出）

1 mL/min

カラム温度

24 ℃

注入量

必要に応じて 1～20 µL

検出

UV、280 nm

7,000

6,000

ピーク面積

5,000

4,000

3,000

2,000

カラム再生/クリーンアップ

1,000

0

0

500

1,000

1,500

注入回数

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2,000

2,500

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3,000

139

9 抗体価の測定
ヒト化モノクローナル抗体の高速定量
カラム：

バイオモノリスプロテイン A

5069-3639
5.2 x 4.95 mm

移動相：A：50 mM リン酸緩衝液、pH 7.4
B：100 mM クエン酸、pH 2.8

流量：

温度：

1 mL/min

注入量：可変（50 µL、IgG1 を含む CHO 細胞

グラジエント：

時間（分）培地上清に最適化）

0～0.5
0.6～1.7
1.8～3.5

%A
100
0
100

室温

検出器：

UV、280 nm

フラクションコレクション： タイムベース
サンプル：

%B
0 結合
100
溶出
0 再平衡化IgG1（1～20 mg/mL）および IgG1 を含む CHO

細胞溶解液（総タンパク質最大 20 mg/mL）

RT（分）

ピーク面積

1

383

1.666

2

372

1.666

8000

3

365

1.665

7000

4

389

1.667

5

383

1.666

6

378

1.666

5000

7

379

1.668

4000

8

377

1.666

9

376

1.667

10

377

1.667

平均値

378

1.667

S

6.52

0.001

%RSD

1.73

0.060

R2 = 0.9999

面積

9000

6000

3000
2000
1000
0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

濃度（mg/mL）

修飾ヒト化トラスツズマブの検量線（パネル A：0 ～ 2 mg/mL、

パネル B：25 ～ 200 mg/mL）

18000

R2 = 0.999

16000
14000

凡例：

レーン 1：分離前の全血清

面積

12000
10000

レーン 2：IgG 標準

8000

レーン 4：ピーク 2（Protein A 結合分画、IgG1

6000

レーン 3：ピーク 1（フロースルー分画）
など）

IgG1

4000
2000

分離により得られた分画の SDS PAGE 分析

0

0

50

100

濃度（mg/mL）

140

Agilent BioHPLC カラム

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150

200

抗体価の測定9

高流量でも優れた結合効率を維持

カラム：

バイオモノリスプロテイン A

mAU

5069-3639
5.2 x 4.95 mm

移動相：A：20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4
B：0.1 M クエン酸、pH 2.8

流量：1.0、1.5、および 2.0 mL/分

4 µL（20 mg/mL の E.coli 上清をスパイクした
2.5 mg/mL の IgG1）
検出器：UV、280 nm

グラジエント：

吸光度（UV、280 nm）

注入量：

0 % B で 0.5 分間保持、100 % B で 0.6～1.7 分、
0 % B で 1.8～3 分

温度：

25 ℃

サンプル：

ヒト化 IgG1 および E. coli 溶解液

装置本体：

E. coli タンパク質（未結合）8001260 Infinity バイオイナート LC

600

IgG1

2.0 mL/min

400

IgG1

1.5 mL/min

200

IgG1

1.0 mL/min

00

未結合タンパク質のIgG1 の面積 未結合タンパク質の IgG1 の相対圧力（mL/min） 面積（mAu/S）

相対面積（%）

面積（%）

（MPa）

1.0

1230

738

63

37

32

1.5

840

492

63

37

47

2.0

636

363

64

36

68

（mAu/S）

1

1.5

2

2.5

リテンションタイム（分）3

バイオモノリスプロテイン A カラムへの IgG1 の結合を複数流量と未結合タンパク質および IgG1 のピーク相対面積の関係
流量0.5の流量で評価しました。クロマトグラムの変化と信号の完全性を容易に観察できるよう、この実験ではさらに多くのサンプルをロードしました。

製品の詳細情報バイオモノリスプロテイン A およびプロテイン G

説明

バイオモノリス遺伝子組み換えプロテイン A、
4.95 x 5.2 mm
バイオモノリスプロテイン G、
4.95 x 5.2 mm
バイオモノリスプロテイン A、
4.95 x 5.2 mm

部品番号5190-6903
5190-6900
5069-3639

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www.agilent.com/chem/jp141

10 細胞培地とアミノ酸の分析

細胞培地とアミノ酸の分析
バイオテクノロジーラボは、アジレントの AdvanceBio カラムを使用することで、サンプルの誘導体

化に関係なく、細胞培地の培養上清に含まれるアミノ酸や代謝物を簡単に分析できます。どちらのソ

リューションのカラムもアミノ酸標準品で試験済みであるため、品質と性能が確保されています。ニーズに合ったワークフローをお選びください。

業界標準の LC/UV 分析用の Agilent AdvanceBio アミノ酸分析キットを選択– 逆相 LC 分離および UV 検出によるアミノ酸のオンライン誘導体化を自動化できます– Agilent LC システムに使用可能です– 機器および専門技術への投資を最小化できます

非誘導体化 LC/MS 高速分析用の Agilent AdvanceBio MS スペントメディアカラムを
選択– 単一メソッドによるアミノ酸およびその他の培地の代謝物の分析：MS 検出による HILIC LC 分離です– サンプルの誘導体化が不要です– あらゆる LC/MS システムに使用できます– MS 検出によるベースラインクロマトグラフィー分離が不要です

ヒントとツール
Agilent InfinityLab ウェルプレートおよびシーリングマットは、ハイスループットの LC/MS アプリケーションに最適なサンプル容器です。
www.agilent.com/chem/well-plates をご覧ください。

142

Agilent BioHPLC カラム

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細胞培地とアミノ酸の分析

10

アジレントの細胞培地分析ソリューション
誘導体化の有無あり

AdvanceBio

なし

アミノ酸分析

調製済み（RTU）試薬

信頼性の高い結果を迅速に取得

AdvanceBio アミノ酸分析逆相

HILIC LC/MS

Rs = 3.0

His
Asp

Glu

Ala
Thr

Gly
Ser
Asn

Tyr

Met

Trp

Lys

Gln

Val

ロイシン

イソロイシン

Arg

Phe

ロイシン
イソロイシン

LC/UVAdvanceBio MS スペントメディア

カウント vs. 取り込み時間（分）アミノ酸

アミノ酸と細胞培地の代謝物

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10 細胞培地とアミノ酸の分析

AdvanceBio アミノ酸分析（AAA）

Agilent AdvanceBio アミノ酸分析（AAA）カラムは、タンパク質加水分解物や細胞培地中のアミノ酸を優れた感度と再現性で高速分離できます。

AdvanceBio AAA には、アミノ酸誘導体化用の実績のある試薬、調製済みアミノ酸標準キット、アジレントの革新的な Poroshell 技術をベースとしたカラム、およびアジレントのエキス

パートによるサポートが含まれています。AdvanceBio AAA は、Agilent InfinityLab LC シ

リーズ機器との併用により、アミノ酸分析の完全なソリューションを提供します。

これらのカラムは、Agilent AdvanceBio ファミリーの製品です。生体分子の特性解析のための革新的なソリューションとして設計されています。

– 信頼性の高い結果：Poroshell の効率的な粒子形態により高分離能分離を実現します– コストの削減：高 pH 耐性を持つ堅牢な化学修飾シリカによりカラムを長寿命化しました– 優れた柔軟性：直径 2.7 µm の粒子を採用し、HPLC および UHPLC の両システムに対応しています– 品質管理：アミノ酸標準によるバッチテストにより AdvanceBio AAA カラムの品質を確保しています– シンプルな製品体系：標準および試薬をキットとして入手可能です– 自動オンラインプレカラム誘導体化：アジレントの一般分析用注入システムを使用しています

カラムの仕様
結合相

粒子サイズ

ポアサイズ

C18

2.7 µm

100 Å

上限温度

60 ℃

pH 範囲

3.0 ～ 11.0

エンドキャップ
ダブル

ヒントとツール
詳しい手順と、アジレントの包括的なソリューションについては、以下をご覧ください。

www.agilent.com/chem/aaa-how-to-guide

144

Agilent BioHPLC カラム

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圧力上限

600 bar細胞培地とアミノ酸の分析

10

LC/UV
アミノ酸分析

4.6 x 100 mm
部品番号 655950-802

温度：

30 ℃

流量：

1.5 mL/min

移動相：

グラジエント：

サンプル：

検出：

低 pH、ポジティブイオンモードの MS 検出：
A = 10 mM Na2HPO4、10 mM Na2B4O7、pH 8.2、B = アセトニトリル:メタノール:水、45:45:10（v:v:v）
時間（分）

0
0.35
13.4
13.5
15.7
15.7
18

%B
2
2
57
100
100
2

終了

ロイシン

カラム

Agilent AdvanceBio

イソロイシンカラム：

タンパク質加水分解物によるアミノ酸の紫外線クロマトグラム。ロイシンとイソロイシンの間の分離能は4.35。この数値は欧州薬局方の要件（1.5 を超える分離能が必要）を完全に充足[European
Pharmacopoeia 9.0 (2.2.56) Amino Acid Analysis]

タンパク質加水分解物

Agilent 1260 Infinity II DAD WR

AdvanceBio アミノ酸分析標準およびキット

キットには、定量に必要な誘導体化試薬とアミノ酸標準がすべて含まれています。必要に応じて、各試薬を個別にご注文いただくこともできます。

各アミノ酸標準には、次のアミノ酸が含まれています。

– グリシン– L-セリン

– L-アルギニン– L-ヒスチジン– L-フェニルアラニン– L-バリン

– L-シスチン– L-チロシン– L-ロイシン– L-メチオニン– L-アラニン– L-グルタミン酸– L-プロリン– L-イソロイシン– L-トレオニン– L-リジン– L-アスパラギン酸

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10 細胞培地とアミノ酸の分析

AdvanceBio MS スペントメディア
Agilent AdvanceBio MS スペントメディアカラムは、高速かつ優れた感度と再現性でバイオプ

ロセッサの細胞培地の非誘導体化アミノ酸やその他の極性代謝物を分離でき、質量分析に最適な HILIC カラムです。

Agilent InfinityLab LC シリーズ機器や Agilent MS 機器との併用により、細胞培地成分分析の包括的なソリューションが実現します。

AdvanceBio MS スペントメディア分析は、Agilent AdvanceBio ファミリの新製品として、生体分子の生成と特性解析のために設計された革新的なソリューションです。

– 迅速な MS ベースのワークフロー– サンプルの誘導体化が不要なため、時間とリソースを節約可能– イナートフローパス用の PEEK ライナ付ステンレスカラムハードウェアにより、分析困難な
イオン性代謝物でも卓越したピーク形状と回収率を達成– ロイシンとイソロイシンの異性体に対するベースラインクロマトグラフィー分離能– 品質と性能を保証するために、アミノ酸でテストされたカラム– MS に適した移動相で優れた分析感度を実現– 2.7 µm の Poroshell 粒子の採用により、HPLC システムと UHPLC システムの両方に対応
カラムの仕様
結合相

ポアサイズ

粒子サイズ

HILIC-Z100 Å

2.7 µm

温度上限

pH 7 で 80 ºC

pH 範囲

3.0 ～ 11.0

（35 ℃ の場合）

圧力上限

600 bar

ヒントとツール
HILIC のベストプラクティスについては、親水性相互作用クロマトグラフィーのメソッド開発およびトラ

ブルシューティング（資料番号 5991-9271JAJP）を参照してください。

146

Agilent BioHPLC カラム

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細胞培地とアミノ酸の分析

10

LC/MS

低 pH、ポジティブイオンモードの MS 検出：
A = 10 % 200 mM ギ酸アンモニウム水溶液
pH 3、90 % 水
B = 10 % 200 mM ギ酸アンモニウム水溶液
pH 3、90 % アセトニトリル
最終的な塩濃度は 20 mM

0.5 mL/min
時間% B（低 pH、

% B（高 pH、

0
15
15.5
20

100
80
100
100

（分）

30 ℃

サンプル：

ポジティブイオンモード） ネガティブイオンモード）

1.00
80
100
100

細胞培地、移動相 B で5 倍に希釈Agilent 6230 飛行時間型 LC/MS

検出：

移動相の堅牢性と一貫性を確保するために、緩衝液の濃縮原液から移動相を調製することをおすすめします。

ロイシン
イソロイシン

Rs = 3.0
Arg
His
Asp

Glu

Gly
Ser
Asn

Ala
Thr

Lys

Gln

Val
Tyr

Met

移動相：

グラジエント：Phe

カラム温度：

流量：

Agilent AdvanceBio
MS スペントメディア
2.1 x 100 mm
部品番号 675775-901

Trp

カラム：

カウント vs. 取り込み時間（分）

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10 細胞培地とアミノ酸の分析
24 種類のアミノ酸を高分離能分離

カラム：

1.Asp
2.Glu
3.Asn
4.Ser
5.Gln
6.His
7.Gly
8.Thr
9.Cit
10.Arg11.Ala
12.Tyr

ZORBAX Eclipse AAA
963400-902
4.6 x 150 mm、3.5 µm

移動相：
温度：

A：40 mM Na2HPO4、pH 7.8
B：アセトニトリル:メタノール:水、45:45:10、v/v/v
2 mL/min
40 ℃

サンプル：

24 種類のアミノ酸

流量：
検出器：

3

蛍光

8

2

7

4

1

10

22

16 17
18
19
15

9

11

12

14

23

20

13.Cys
14.Val
15.Met16.Nva17.Trp18.Phe19.Ile20.Leu21.Lys
22.Hyp23.Sar
24.Pro

24

6

21

5

0

5

10

Time (min)

15

20

25

ここに示すアミノ酸 24 種の高分離能分離が 18 分で完了しました。4.6 x 75 mm の Eclipse AAA ラピッドレゾリューショ
LCPAH01

ンカラムを使用すれば、これらのアミノ酸をわずか 9 分で分離できます。

ヒントとツール
クイックリファレンスガイドには、Agilent InfinityLab LC シリーズの分析効率を最高レベルに維持するために備えておくべき一般的な消耗品が掲載されています。このガイドは、カラム消耗品関連カタログ/セレクションガイドより無料でダウンロードいただけます。

148

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

細胞培地とアミノ酸の分析

10

www.agilent.com/chem/jp

149

製品の詳細情報
AdvanceBio アミノ酸分析（AAA）カラム
説明

部品番号

AdvanceBio アミノ酸分析 100 Å、3.0 x 100 mm、2.7 µm

695975-322

AdvanceBio アミノ酸分析 100 Å、4.6 x 100 mm、2.7 µm

655950-802

AdvanceBio アミノ酸分析 100 Å、3.0 x 5 mm、2.7 µm（3 個、ガード）

823750-946

AdvanceBio アミノ酸分析 100 Å、4.6 x 5 mm、2.7 µm（3 個、ガード）

820750-931

AdvanceBio アミノ酸分析（AAA）標準および試薬
説明

部品番号

標準および試薬キット

5190-9426

キットの内容（単品での注文も可能）

緩衝液、ホウ酸、100 mL

5061-3339

FMOC 試薬、10 アンプル、各 1 mL、AAA 用

5061-3337

OPA 試薬、10 mg/mL、6 アンプル、各 1 mL

5061-3335

ジチオジプロピオン酸（DTDPA）、
5g

5062-2479

アミノ酸標準、
1 nmol、10 個

5061-3330

アミノ酸標準、
250 pmol、10 個

5061-3331

アミノ酸標準、
100 pmol、10 個

5061-3332

アミノ酸標準、
25 pmol、10 個

5061-3333

アミノ酸標準、
10 pmol、10 個

5061-3334

アミノ酸補助キット、各1g

5062-2478

目次に戻る

10 細胞培地とアミノ酸の分析

AdvanceBio MS スペントメディア
説明

部品番号

AdvanceBio MS スペントメディア 100 Å、2.1 x 50 mm、2.7 µm

679775-901

AdvanceBio MS スペントメディア 100 Å、2.1 x 100 mm、2.7 µm

675775-901

AdvanceBio MS スペントメディア 100 Å、2.1 x 150 mm、2.7 µm

673775-901

ZORBAX カラム
説明

部品番号

ZORBAX Eclipse アミノ酸分析、80 Å、4.6 x 150 mm、5 µm

993400-902

ZORBAX Eclipse アミノ酸分析、80 Å、4.6 x 150 mm、3.5 µm

963400-902

ZORBAX Eclipse アミノ酸分析、80 Å、4.6 x 75 mm、3.5 µm

966400-902

ZORBAX Eclipse アミノ酸分析、80 Å、3.0 x 150 mm、5 µm

961400-302

ZORBAX Eclipse アミノ酸分析、80 Å、4.6 x 12.5 mm、5 µm（4 個、ガード）

820950-931

ガードハードウェアキット

820999-901

ZORBAX Eclipse Plus RRHD、95 Å、2.1 x 50、1.8 µm、1200 bar

959757-902

ZORBAX Eclipse Plus RRHT、95 Å、2.1 x 50、1.8 µm、600 bar

緩衝液、ホウ酸、100 mL、

5061-3339

150

Agilent BioHPLC カラム

959741-902

アミノ酸補助キット、各 1 g、5062-2478

目次に戻るタンパク質除去

11

www.agilent.com/chem/jp

151

タンパク質除去

マルチプルアフィニティ除去システムは、クロマトグラフィーによって生体サンプルから高濃度の干渉タンパク質を除去するように設計されています。これにより、血清、血漿、脳脊髄液（CSF）などの生体サンプル中のタンパク質を容易に単離、同定できるようになります。
高濃度タンパク質を除去することで、分析のダイナミックレンジが効果的に広がり、後続のLC/MS 分析や電気泳動分析の感度が向上します。

アジレントのタンパク質分画システムとプロテオミクス用試薬– 生体サンプルの LC/MS 分析に– 電気泳動分析のための前処理に– バイオマーカー探索のためのサンプル前処理に– 機器およびワークフローのバリデーションに– コスト効率の高い免疫枯渇に– サンプルの脱塩、濃縮、分画にAgilent mRP-C18 高回収率タンパク質カラムでは、サンプルの脱塩、濃縮、および分画を簡

単な 1 ステップで同時に行うことができ、従来の RP-HPLC カラムよりも格段に高い回収率を実現します。LC/MS 分析に完全に対応しています。

複合標準、プロテオミクスグレードのトリプシンなど、バイオマーカー探索やその他のプロテオ

ミクスアプリケーションのサンプル前処理用のバリデーション済み試薬もご用意しています。これらの試薬は Agilent LC/MS メソッドに完全に対応しており、追加のサンプル前処理は必要ありません。

アジレントのカスタム構成を通して、大量注文やカスタム寸法のカラムのご注文も承ります。

ヒントとツール
アジレントのサービスプログラム全体については、ホームページをご覧ください。

目次に戻る

11 タンパク質除去
マルチプルアフィニティ除去システム
マルチプルアフィニティ除去システムを使用することで、血清や血漿などの生体サンプル中に存在する有益な微量タンパク質やバイオマーカーを確実に同定および特性解析できるよ

うになります。

マルチプルアフィニティ除去システムは、ヒト生体サンプル中の最大 14 種類の高濃度タン
パク質と、マウス生体サンプル中の最大 3 種類の高濃度タンパク質を特異的に高い再現性で除去します。

マルチプルアフィニティ除去システムは、多様な LC カラム寸法とスピンカートリッジフォー

マットでご利用いただけます。アジレントの最適化された緩衝液、使いやすいスピンフィル
タ、および濃縮機と組み合わせることで、幅広い LC 機器（カラム）やベンチトップ型遠心分離機（スピンカートリッジ）に対応した統合型の自動除去ソリューションが実現します。

マルチプルアフィニティ除去システム

マルチプルアフィニティ除去システムで処理したサンプルは、2D ゲル電気泳動や LC/MSなどの下流分析システムでそのまま分析できます。

Agilent マルチプルアフィニティ除去カラムおよびスピンカートリッジで除去される高濃度タンパク質

トランスフェリン

フィブリノーゲン

IgA
ハプトグロビン

α1-抗トリプシン
補体 C3α1-酸性糖タンパク質
α2-マクログロブリン

IgG

残り 6 % を分析

15 %
アルブミン

アポリポタンパク質 AI
アポリポタンパク質 AI

IgM
トランスサイレチン

152

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るタンパク質除去

11

マルチプルアフィニティ除去システムスタータキット
LC カラムおよびスピンカートリッジ試薬スタータキットには、マルチプルアフィ

ニティ除去システムに必要 なすべての消耗品 が含まれています。これらの緩衝液によって条件を最適化することで、カラム寿命が延び、サンプルの再現性が高まります。

– キットには、4.6 x 50 mm LC カラムの場合は約 200 サンプル分、4.6 x

100 mm LC カラムの場合は約 100 サンプル分、スピンカートリッジを使用する場合は 200 回分の緩衝液 A および緩衝液 B が含まれています。

– 緩衝液 A は、ロード用緩衝液です。タンパク質間の相互作用を最小限に抑えることで、一般に高濃度タンパク質に結合している低濃度タンパク質をカ

ラムから通過させ、ターゲットの高濃度タンパク質を関連する抗体に結合さLC カラム試薬スタータキット、5185-5986

せます。

– 緩衝液 B は溶出用緩衝液です。抗体とタンパク質間の相互作用を妨害し、高濃度タンパク質をカラムから溶出させます。

ヒントとツール
アフィニティクロマトグラフィーのサイクル時間を短縮する方法については、次のアプリケーションノートをご覧ください。Reducing Cycle Time

for Affinity Removal of High-Abundant Proteins in Human Plasma: Alternating Column Regeneration Using an Agilent 1200 Infinity

Series Quick-Change Bio-inert 2-position/10-port Valve and an Agilent 1290 Infinity Flexible Cube （ヒト血漿中の多量タンパク質除去にかかるサイクル時間の短縮 - Agilent 1200 Infinity シリーズ Quick-Change バイオイナート 2 ポジション/10 ポートバルブと Agilent 1290

Infinity フレキシブルキューブを用いた交互カラム再生）（資料番号 5991-4721EN）。

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www.agilent.com/chem/jp153

11 タンパク質除去

製品の詳細情報
マルチプルアフィニティ除去システム選択ガイド
製品

MARS Human-14

除去タンパク質

総タンパク質に

外寸

保持容量

部品番号

アルブミン、IgG、抗トリプシン、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、

94 %スピンカートリッジ

8 ～ 10 µL

5188-6560

20 µL

5188-6557

40 µL

5188-6558

250 µL

5188-6559

12 ～ 14 µL

5188-6408

フィブリノーゲン、アルファ 2-マクログロブリン、アルファ 1-酸性糖タンパク質、

対する除去率

4.6 × 50 mm

IgM、アポリポタンパク質 Al、アポリポタンパク質All、補体 C3、トランスサイレチン

MARS Human-7

4.6 × 100 mm

アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、抗トリプシン、

フィブリノーゲン

88 ～ 92 %10.0 × 100 mm

スピンカートリッジ

4.6 × 50 mm

4.6 × 100 mm

MARS Human-6

MARS Human大容量

アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、抗トリプシン

アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、抗トリプシン

85 ～ 90 %85 ～ 90 %10.0 × 100 mm

スピンカートリッジ

4.6 × 50 mm

4.6 × 100 mm

スピンカートリッジ

4.6 × 50 mm

4.6 × 100 mm

10.0 × 100 mm

14 ～ 16 µL
30 ～ 40 µL
60 ～ 80 µL

5185-5984
5185-5985
5188-5341
5188-5332
5188-5333

5188-8826

65 µL

5188-5334

130 µL

5188-6562

スピンカートリッジ

25 ～ 30 µL

5190-2534

4.6 × 100 mm

75 ～ 100 µL

アルブミン

50 ～ 55 %スピンカートリッジ

4.6 × 50 mm
4.6 × 50 mm
4.6 × 50 mm

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30 ～ 40 µL

5188-5230

100 µLMARS Human-1

Agilent BioHPLC カラム

15 ～ 20 µL

5188-6411

5188-8825

スピンカートリッジ

154

7 ～ 10 µL

50 µL

69 %

80 %

250 ～ 300 µL

5188-6410

5188-5336

アルブミン、IgG

アルブミン、IgG、トランスフェリン

60 ～ 70 µL

5188-6409

最大 340 µL

MARS Human-2

MARS Mouse-3

30 ～ 35 µL

37 ～ 50 µL

5188-5217
5188-5218

タンパク質除去

マルチプルアフィニティ除去システムスタータキット
説明

部品番号

高濃度サンプル希釈用緩衝液、50 mL

5188-8283

LC カラム試薬スタータキットの内容：

5185-5986

および平衡化用、緩衝液 A、ロード、洗浄、
1L

5185-5987

緩衝液 B、溶出用、1 L

5185-5988

0.22 µm 酢酸セルロース、25 個、1 L

5185-5990

限外ろ過ユニット、5K MWCO、4 mL、25 個

5185-5991

マルチプルアフィニティ除去スピンカートリッジ試薬キットの内容：

5188-5254

および平衡化用、緩衝液 A、ロード、洗浄、
1L

5185-5987

緩衝液 B、溶出用、1 L

5185-5988

スピンフィルタ x 2、0.22 µm 酢酸セルロース、25 個

5185-5990

限外ろ過ユニット、5K MWCO、4 mL、25 個

5185-5991

ルアーロック式アダプタ、
2個

5188-5249

プラスチック製シリンジ、
5 mL、ルアーロック式、2 個

5188-5332

マイクロチューブ x 6、
1.5 mL、スクリュートップ、100 個

5188-5251

キャップおよびプラグ、
6個

5188-5252

PTFE ニードル、ルアーロック式、10 個

ルアーロック式シリンジ、5188-5250

115188-5253

ルアーロック式アダプタ、5188-5249

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ルアーロック式ニードル、

5188-5253

www.agilent.com/chem/jp155

12 オリゴヌクレオチド

オリゴヌクレオチド
はじめに

近年、オリゴヌクレオチドへの関心が大きく広がりました。これには長さがヌクレオチド 10 ～ 20 個分から数百、数千個分までの、さまざまなサイズの DNA と RNA の両方が含まれます。小型の分子を合成することはできますが、省略や挿入を持つ密接に関係した配列から、故意の、または副反応による意図しない化学修飾を含む配列まで、さまざまな不純物を含む可能性があります。mRNA などの大きな配列は、酵素的に生成された結果、別の不純物を含むことがあります。

このため、液体クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチドの分析と精製には特有の課題があります。リン酸骨格は分子の親水性が高いことを意味します。つまり、逆相クロマトグラフィーは期待されているほど簡単ではないのです。また、相補的配列との強力な水素結合を形成する能力は、おなじみの古典的な二重らせん構造の作成に欠かせませんが、これらの二次構造を解離させるには、高温でクロマトグラフィーを実施する必要があるかもしれないということでもあります。

精製に関する考慮事項

オリゴヌクレオチドはいろいろな目的で使用されますが、精製に必要なアプローチは、要求される純度によって決まる場

合があります。一部のケース、例えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーでは、オリゴヌクレオチドのサイズは比較的小さく（約 20 ～ 30 ヌクレオチド）、精製は「トリチルオン」生成と呼 ばれる固相抽出法を使って行われます。オリゴヌクレオチドのサイズが大きい別のアプリケーションでは、不純物が生成物と密接に関連しているため、HPLC を使った手法が好まれます。

HILIC カラムオプションについては、AdvanceBio Glycan マッピングカラム、アミドベース HILIC 固定相（123 ページ）、または AdvanceBio MS スペントメディアカラム、両性イオン HILIC 相（146 ページ）をお勧めします。

オリゴヌクレオチド分析および精製で最も一般的なクロマトグラフィー手法は次の 2 つです。

– イオンペア逆相 – 酢酸トリエチルアミン（TEAA）などのカチオン基を、負電荷を持つリン酸骨格とイオンペア化す
ると、従来の逆相カラムに保持できるほど十分に疎水性の高い錯体が得られます。この錯体は、従来の逆相カラム

で簡単に保存できます。有機溶媒を非常に浅いグラジエントで増加させると、オリゴヌクレオチドが非常に良好な分離能で溶出するようになります。

– イオン交換 – 強力なアニオン交換器は、オリゴヌクレオチドの負電荷を持つリン酸骨格と相互に作用します。塩濃度を上げるグラジエントにより、オリゴヌクレオチド種が順次溶出し、十分に分離されることが保証されます。

156

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るオリゴヌクレオチド 12

DNA および RNA オリゴヌクレオチドのカラムの選択
DNA および RNA オリゴヌクレオチドのカラムの選択手法

アジレントのカラム

イオンペア逆相

アニオン交換注意事項

AdvanceBio

効率性の高い 2.7 µm と 4 µm の表面多孔質粒子を備えており、オリゴヌクレオチドとその不純物の高

PLRP-S

さまざまな粒子サイズやポアサイズのマクロポーラスポリマー粒子で、pH と温度について最高の安定

Agilent Bio IEX

親水性コーティングされた非多孔質のポリマー性粒子で、質量移動の問題を解消し、卓越した性能をオリゴヌクレオチド

分離能分析が可能です。
性を示します。

提供します。分析スケールおよびラボスケールの分取機能に対応できるよう、さまざまな粒子サイズが用意されています。

PL-SAX

強アニオン交換基を持つ全多孔質のポリマー性粒子。バルク充填剤を含め、分析から分取スケールまで利用できます。

最適な手法を選択するときに、考慮すべきことがいくつかあります。その手法が分取スケールの精製に必要かどうかを判断するということは、最大容量を提供しながら、必要な純度を実現できるカラムを選択するだけでなく、必要なサイズまでスケールアップできるカラムまたは固定相を要求するということでもあります。もし、MS 検出の使用を想定しているのであれば、移動相に互換性のある手法を使う必要があるでしょう。

オリゴヌクレオチドのサイズは多種多様なので、すべての分子が拡散できる十分なサイズのポアを持つカラム固定相の選択が不可欠です。ポアのサイズが大きすぎると、表面積が小さくなるため、分離能力の一部が失われます。ポアのサイズが小さすぎると、大きな分子が粒子に浸透できなくなります。ただし、非多孔質粒子を分析目的で使用できる場合は例外です。

ヒントとツール
オリゴヌクレオチドの 分離 に 使用 される LC カラムのポートフォリオ（ワークフローとオーダーガイドやト

レーニング資料 を含 む）について、詳しくは、explore.agilent.com/oligonucleotide-chromatography-

solutions-jp を参照してください。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp157

12 オリゴヌクレオチド
イオンペア逆相分離
AdvanceBio オリゴヌクレオチド

脱保護された合成オリゴヌクレオチドを適切に分離するには、高分離能で厳しい条件に耐える堅牢性を備えたカラムが必要です。

Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムは、高効率の 2.7 µm および 4 µm 表面多孔質 Poroshell 粒子が特徴で、2.1 mm ID の分析サイズから 21.2 mm ID の分取カラムまでのサイズが用意されています。アジレント独自のテクノロジーを使用し粒子を化学修飾して、高 pH 移動相に対する耐性を大幅に高 めています。また、エンドキャップ処理を施した C18 相でオリゴヌクレオチドの選択性を高めます。さらに、分離能標準を用いて AdvanceBio オリゴヌクレオチドをバッチテストすることで、一貫した性能を実現しています。

AdvanceBio 製品シリーズは、タンパク質、抗体、複合物、新規生体物質、およびバイオ医薬品の完璧な特性分析のために、一貫性のある卓越した性能を提供できるように設計されています。

このような粒子がもたらす独特なポアサイズ分布と短い拡散距離により、LC-UV（LC-DAD）および LC-MS ア

プリケーションの両方、または 2D-LC 実験の二次元目としての分離を、高い分離能で、最大約 100 ～ 150 ヌ
クレオチド長のオリゴヌクレオチドで実行できるようになります。

ポアは、ワイドポア PLRP-S 充填剤の使用を必要とする mRNA などの非常に大きなオリゴヌクレオチドの分析 ができるほどのサイズではありませんが、AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムを使って、生物製剤

mRNA ベースのワクチンの重要な品質特性である mRNA キャッピングを分析できます。

カラムの仕様
結合相

粒子サイズ

ポアサイズ

C18

2.7 µm

100 Å

C18

4 µm

100 Å

上限温度

pH 範囲

エンドキャップ

65 ℃

3.0～11.0

ダブル

65 ℃

3.0～11.0

ダブル

圧力上限

600 bar
600 bar

ヒントとツール
オリゴヌクレオチドの分離におけるさまざまなイオンペア試薬の影響について、詳しくはアプリケーション

ノート 5994-2957JAJP をご覧ください。

158

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るオリゴヌクレオチド 12

8B
TIC-拡張ベースライン

4
3
2

1,000 V

1

200

0

2

x10
5

C
UV-拡張ベースライン

4
3
2
1
0

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.92

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8

Response vs. acquisition time (min)

x10 5
4.5
4
******TTTGCTGCTGTTTTGCTGT

3.5

FLP-3 to FLP-5

FLP-2
FLP-1

FLP

3

FLP-6

フラグメンタ:3,500

6Time (min)

2

2.1

2.2

2.3

2.5
2
1.5
1

1

1.1

FLP-7

VCap

ノズル電圧:

-ve

4

2

x10
5

1700 m/z

スキャン速度： 3.00 スペクトル/秒
イオン極性：

2

400 m/z

FLP-8

最大範囲：

0

Response

最小範囲：

100

FLP-9

MS

UV（260 nm）

FLP-10

検出：

検出：

200

FLP-13
FLP-12
FLP-11

65 ℃

FLP-16

温度：

300

FLP-15
FLP-1425 mer DNA

400

FLP-17

サンプル：

グラジエント： 0.5 分で 30～40 % B、
5 分で 40～70 % B

500

FLP-180.4 mL/min

UV 原寸

600

FLP-19

B：MeOH：移動相 A（50:50）

流量：

A

700
Absorbance (UV 260 mm)

A：HFIP:TEA（400 mM:15mM）水溶液

3.138
800

Response

移動相：

AdvanceBio オリゴヌクレオチド
2.1 x 50 mm（部品番号 659750-702）

Counts

カラム：

0.5
0

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.4

2.5

2.6

Counts vs. acquisition time (min)AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで分離した 25-mer DNA オリゴヌクレオチドのTIC からの解析データ

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp159

12 オリゴヌクレオチド
AdvanceBio オリゴヌクレオチド標準試料

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで高い分離能を確保するために、すべてのバッチに対してアジレントのオリゴヌクレオチド分離能標準

試料を用いた試験を実施しています。オリゴヌクレオチド分離能試験標準試料には 14、17、20、および 21 mer の合成オリゴヌクレオチドが含まれ、N/N-1 分離能を実証できるよう設計されています。
カラム：

AdvanceBio オリゴヌクレオチド
2.1 x 50 mm（部品番号 659750-702）

温度：

注入量：

A：100 mM TEAA 水溶液
B：100 mM TEAA アセトニトリル溶液
グラジエント： 12 分で 6～8 % B
ストップタイム： 13 分
分析後：
5分
流量：
0.6 mL/min

検出：

アジレントオリゴヌクレオチド分離能標準試料（部品番号 5190-9028）

65 ℃
0.5 µLUV（260 nm）

0.205

移動相：

サンプル：

mAU

8.569

20

5.666

3.291

10

8.092

15

0.359

5
0
0

160

1

Agilent BioHPLC カラム

2

3

4

5

目次に戻る

6

7

8

9

min

オリゴヌクレオチド 12

アジレントは、15、20、25、30、35、および 40 mer の合成オリゴデオキシチミジンを含むオリゴヌクレオチドラダー

標準試料も用意しています。この標準試料を使用することで、カラムの選択性と再現性を実証できます。

カラム：
移動相：

AdvanceBio オリゴヌクレオチド
2.1 x 50 mm（部品番号 659750-702）

温度：

サンプル：

注入量：

A：100 mM TEAA 水溶液
B：100 mM TEAA アセトニトリル溶液
グラジエント： 10 分で 10～14 % B
ストップタイム： 11 分
分析後：
5分
流量：
0.6 mL/min

検出：

65 ℃

アジレントオリゴヌクレオチドラダー標準試料（部品番号 5190-9029）

10 µL
UV（260 nm）

4.036

2.160

15
10

7.782

0.323
0.439
0.502

5

5.406

20

7.159

6.388

mAU

0.189

カラム

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

min

ヒントとツール
サイズ排除クロマトグラフィー – 脱塩や、さまざまなオリゴヌクレオチドクラスの分離に適した SEC は、同等サイズの分子を分離できません。

これは非対話型の技術で、グラジェント溶出を必要としないため、操作がとても簡単です。SEC カラムオプションについては AdvanceBio SEC
カラム（97 ページ）、また、長いオリゴヌクレオチドに向けた大きなポアサイズについては Agilent Bio SEC-5 カラム（104 ページ）をお勧めします。

HILIC （親水性相互作用液体クロマトグラフィー）– オリゴヌクレオチドなど、極めて親水性の高い分子の分離に理想的な手法です。HILIC は習得が「難しい」手法と考えられています。これは固定相の表面で吸収された水性層で分離が起こるからです。この吸収された層を均等に形成し、維持することが重要であるため、カラムの状態に特別な注意を払う必要があります。

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www.agilent.com/chem/jp161

12 オリゴヌクレオチド

PLRP-S– プロセススケール分離の除染条件が過酷であっても、長いカラム寿命を実現し、その寿命をとおして再現性の高い結果を提供し続けられる、耐久性の高い堅牢なポリマー性粒子を含有しています– 熱的および化学的に安定しています– サイズの小さなオリゴヌクレオチドから大きなポリヌクレオチドまで、ポアサイズ（100 Å ～ 4000 Å）
を分離に使用できます– 分析スケールの創薬段階から数 kg の CGMP 製造まで柔軟に対応できます

PLRP-S カラムと充填剤には幅広いポアサイズと粒径が揃っており、すべてが同一のケミストリの場合と同じ基本的な吸着特性を備えています。本質的に疎水性結合相なので、逆相系での分離には結合

相、アルキル結合基は必要ありません。

そのため、残存シラノールや残留重金属は存在せず、分析結果への影響もありません。幅広い製品が揃っているため、分析用の分離から分取精製まで、適したポリマー系逆相カラムがあります。さらに、

バルク充填剤を充填したプロセススケールカラムもご用意できます。

PLRP-S ポリマー結合層は、オリゴヌクレオチドの精製と分析に欠かせない、高い pH と温度との適合性を備えています。

精製のスループットを最大化するうえで、容量と分解能が重要なパラメータになります。ポアサイズの選択肢が多く、さまざまな使用条件を選択できるため、最適なプロセスを得るための可能性が広がります。3 µm から 50 µm の粒子サイズにより、µg スケールから数 kg の CGMP 製造スケールまで対応しています。優れた化学的安定性（最大 1 M NaoH）により、汚染除去と再生が可能で、カラムを長期にわたって利用できます。PLRP-S の充填剤のバッチサイズは最大 600 L であり、複数のカラムに単一バッチの充填剤を充填できます。

アジレントでは、高品質の製品を継続的に提供するための取り組みの一環として、すべての製造を完

全に文書化されたプロセスに従って行い、製造施設の監査を定期的に実施しています。

UHPLC カラムの仕様
pH 範囲

1 ～ 14有機溶媒

1 ～ 100 %緩衝液の種類
温度上限
最大圧力

制限なし

200 ℃

3 µm：275 bar/4000 psi

5 µm、8 µm、および 10 µm：207 bar/3000 psi

10 ～ 15 µm、15 ～ 20 µm、および 30 µm：103 bar/1500 psi

162

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るオリゴヌクレオチド 12

PLRP-S アプリケーション
ポアサイズ

アプリケーション

1000 Å

大きいオリゴヌクレオチド

100 Å、300 Å

サイズの小さなオリゴヌクレオチドから CRISPR ガイド RNA まで

超大型のオリゴヌクレオチド / mRNA / 高速

4000 Å

適切なポアサイズは、分子のサイズに基づいて選択します。大型の分子は、アクセス性と質量移動を向上させるため、大きめのサイズのポアを必要とします。PLRP-S のような全多孔質の粒子では、ポア

サイズが大きいと、内部の表面積が小さくなります。ポアサイズを小さくして、表面積を大きくすると、精製で重要な考慮事項である容量が増える可能性があります。

25 mer50 mer75 mer5045
結合能力（mg/mL カラム容量）

40
35
30
25
20
15
10
5
0

PLRP-S 5 µm 100 Å

PLRP-S 5 µm 300 Å

75 mer は大きすぎてポアに適合できない

PLRP-S 5 µm 1000 Å

PLRP-S 5 µm 4000 Å

ポアサイズが大きいと質量移動は適切（シャープなピーク）になるが、表面積が小さくなる

異なるサイズのオリゴヌクレオチドの結合容量の比較

ヒントとツール
アジレントオリゴヌクレオチド精製ソリューションについて、詳しくは、 カタログ 5994-

4286JAJP をご覧ください。

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www.agilent.com/chem/jp163

12 オリゴヌクレオチド

強アニオン交換
Agilent Bio-IEX– 高度に架橋された硬質の非多孔質ポリスチレン/ジビニルベンゼン（PS/DVB）粒子に親水性ポリマー層を被膜しているため、非特異的な結合がありません– 均一の高密度で充填されたイオン交換基が親水性層（アンカーあたり複数のイオン交換基）と化学的に結合され、カラム容量が増加します– 耐高圧性に優れた粒子、被膜層、および結合相により、分離能および分離スピードが向上します
Bio IEX HPLC カラムには非多孔質ポリマー性のイオン交換粒子が充填されており、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タン

パク質を高分離能、高回収率、高効率で分離できるように設計されています。

Bio IEX ファミリーにはタンパク質の分析に使用されるカチオン交換が含まれますが、オリゴヌクレオチドの負電荷を持つ

リン酸骨格には、強アニオン交換（SAX）が好まれます。すべての相に、1.7、3、5、および 10 µm の非多孔質粒子が用意されています。

ポア構造が存在しないということは、アクセス性と質量移動の問題が解消され、分析での分離の分離能が向上することを

60

60

40

40

20

20

0

0

80

100
未精製未精製
75 mer75 mer
80

60

60

40

40

20

20

0

0

Relative response (%)

100

80

100
未精製未精製
100 mer
100 mer
80

60

60

40

40

20

20

0

0

100

1

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

2 13 24 35 46 57 68 79 810 911 10
12 11
13 12
14 13
15 14
16 15
17 16
18 17
19 18 19
Retention
Retention
time (min)time (min)Relative response (%)

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

Relative response (%)

Relative response (%)

80100
未精製未精製
50 mer50 mer
80

Relative response (%)

100

Relative response (%)

0

Relative response (%)

200Relative response (%)

40

20

Relative response (%)

60

40

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

Relative response (%)

60

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

Relative response (%)

80100
未精製未精製
25 mer25 mer
80

100

Relative response (%)

Relative response (%)

Relative response (%)

Relative response (%)

Relative response (%)

意味しますが、全体的な容量は大幅に減少します。

5

6
5Agilent Bio SAX 5 µm カラムを使用した粗製 25、50、75、100 mer の分析的分離（左）と領域の拡大図（右）164Agilent BioHPLC カラム

目次に戻る

7
6

78

9
10
11
12
8
9
10
11
Retention
Retention
time (min)time (min)

13
12

14
13

14
15

15

オリゴヌクレオチド 12

PL-SAX– 小さい全多孔質粒子により優れたクロマトグラフィー性能があります– 幅広い粒子サイズと 2 種類のポアサイズにより、分析から精製まで柔軟に対応します– 優れた安定性により長寿命を実現しました

PL-SAX は、変性条件下での脱保護された合成オリゴヌクレオチドや、その他の酸性ペプチドやタンパク質のアニオン交換体 HPLC 分離に最適です。化学的安定性の高い全多孔質ポリマーにより、広い動作 pH 範囲を実現します。アニオン交換容量が pH に左右されることもありません。合成オリゴヌクレオチドの場合は、温度、有機溶媒、高 pH の変性条件を使用した分離にも対応できます。PL-SAX を使用すれば、凝集体やヘアピン構造に関連しうる自己相補配列や G-rich 配列オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーを改良できます。また、

5 µm カラムを使用することで、n および n-1 配列を効率的に分離できます。幅広い粒子サイズとカラムサイズが用意されているため、分析にも精製にも使用できます。

水酸化ナトリウム溶媒の使用時にも優れた化学的および温度的安定性を維持できるため、カラムを長期間使用できます。
カラムの仕様結合相

内径（mm）

強アニオン交換

2.1、4.6、7.5、25、50、100

粒子サイズ

ポアサイズ

pH 安定性

使用温度 上限1000 Å および

1 ～ 14

80 ℃

（µm）

（Å）

30

4000 Å

5、8、10、信頼性の高い合成オリゴヌクレオチドの分離 - 10-mer、

15-mer、30-mer、50-mer（メインピーク）をスパイクした
ポリ-t-オリゴヌクレオチドサイズ標準の高分離能分離

カラム：

移動相：
グラジエント：

流量：
温度：

検出器：

2000

10

15
30

50

PL-SAX 1000 Å
PL1551-1802
4.6 x 50 mm、8 µm

A：7:93 v/v アセトニトリル：100 mM TEAA、pH 8.5
B：7:93 v/v アセトニトリル：100 mM TEAA、1 M 塩化アンモニウム、pH 8.5
10 分で 0～40 % B、14 分で 40～70 % B、
25 分で 70～100 % B
1.0 mL/min
60 ℃
UV、220 nm

0

0

min

50

ポリ-t-オリゴヌクレオチドの高分離能分離。ここで用いたグラジエントにより、

VLC0045

15 -mer までで n と n-1 を容易にベースラインで分離することができました。

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12 オリゴヌクレオチド

製品の詳細情報
AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラム
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

部品番号

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラム
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

部品番号

2.1 x 150

2.7653750-702

21.2 x 50

4671050-702

2.1 x 100

2.7655750-702

21.2 x 150

4671150-702

2.1 x 502.7659750-702

4.6 x 150

4693971-702

2.1 x 5、ガード

2.7

821725-921

4.6 x 1004695971-702

4.6 x 150

2.7653950-702

4.6 x 50

4699971-702

4.6 x 100

2.7655950-702

4.6、ガード

4820750-941

4.6 x 502.7659950-702

4.6 x 5、ガード

2.7

820750-921

AdvanceBio オリゴヌクレオチド標準試料
説明

オリゴヌクレオチド分離能標準試料
オリゴヌクレオチドラダー標準試料

PLRP-S HPLC カラム
サイズ（mm）

部品番号

5190-9028
5190-9029

粒子サイズ

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

USP L21

USP L21

USP L21

USP L214.6 x 250

8

PL1512-5800

PL1512-5801

PL1512-5802

4.6 x 150

8

PL1512-3800

PL1512-3801

PL1512-3802

PL1512-3803

4.6 x 50

8

PL1512-1801

PL1512-1802

PL1512-1803

4.6 x 250

5

PL1512-5500

PL1512-5501

4.6 x 150

5

PL1111-3500

PL1512-3501

4.6 x 505

PL1512-1500

PL1512-1501

PL1512-1502

PL1512-1503

4.6 x 150

3

PL1512-3300

PL1512-3301

4.6 x 50

3

PL1512-1300

PL1512-1301

2.1 x 250

8PL1912-5801

2.1 x 150

8

PL1912-3801

PL1912-3802

PL1912-3803

2.1 x 508PL1912-1801

PL1912-1802

PL1912-1803

（µm）

（続く）

166

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るオリゴヌクレオチド 12

PLRP-S HPLC カラム
サイズ（mm）

粒子サイズ

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

USP L21

USP L21

USP L21

USP L212.1 x 250

5

PL1912-5500

PL1912-5501

2.1 x 150

5

PL1912-3500

PL1912-3501

2.1 x 505

PL1912-1500

PL1912-1501

PL1912-1502

PL1912-1503

2.1 x 150

3

PL1912-3300

PL1912-3301

2.1 x 503

PL1912-1300

PL1912-1301

1.0 x 50

8

PL1312-1802

PL1312-1803

1.0 x 50

5

PL1312-1500

PL1312-1501

PL1312-1502

PL1312-1503

1.0 x 105

1.0 x 150

3

PL1312-3300

1.0 x 503

PL1312-1300

PL1312-1301

PL1612-1801

PL1612-1801

PL1612-1801

PL1612-1801

PL1310-0016

PL1310-0016

PL1310-0016

PL1310-0016

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

PL1812-3102

PL1812-3103

PL1712-3702

PL1712-3703

PL1712-3102

PL1712-3103（µm）

PLRP-S ガードカートリッジ、
3.0 x 5.0 mm 用、2 個

カートリッジホルダ、

3.0 x 5.0 mm カートリッジ用

分取・プロセス用 PLRP-S
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

100 x 30030

100 x 300

15～20

PL1C12-2502

PL1812-6200

PL1812-6201

100 x 300

10～15PL1812-6400

PL1812-6401

100 x 300

10

PL1812-6100

PL1812-6101

100 x 300

8PL1812-6800

PL1812-6801

50 x 300

8

PL1712-6800

PL1712-6801

50 x 15030

50 x 150

15～20

PL1712-3200

PL1712-3201

50 x 150

10～15

PL1712-3400

PL1712-3401

50 x 150

10

PL1712-3100

PL1712-3101

50 x 150

8PL1712-3800

PL1712-3801

25 x 300

15～20

PL1212-6200

PL1212-6201

25 x 300

10～15

PL1212-6400

PL1212-6401

25 x 300

10

PL1212-6100

PL1212-6101
（続く）

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp167

12 オリゴヌクレオチド
分取・プロセス用 PLRP-S
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

25 x 300

8

PL1212-6800

PL1212-6801

25 x 15030

25 x 150

10

PL1212-3100

PL1212-3101

25 x 150

8

PL1212-3800

PL1212-3801

25 x 50

10

PLRP-S 1000 Å

PLRP-S 4000 Å

PL1212-3702

PL1212-3703

PL1712-3102

PL1712-3103

PL1212-1102

PL1212-1103

PL1512-5702

PL1512-5703

PL1512-5102

PL1512-5103

PL1512-3702

PL1512-3703

PL1512-3102

PL1512-3103

PLRP-S 4000 Å

PLRP-S メソッド開発カラム
4.6 x 25030

4.6 x 250

15～20

PL1512-5200

PL1512-5201

4.6 x 250

10～15PL1512-5400

PL1512-5401

4.6 x 250

10

PL1512-5100

PL1512-5101

4.6 x 250

8

PL1512-5800

PL1512-5801

4.6 x 15030

4.6 x 150

15～20

PL1512-3200

4.6 x 150

10～15

4.6 x 150

10

PL1512-3100

PL1512-3101

4.6 x 150

8

PL1512-3800

PL1512-3801

PLRP-S 充填剤バルク

PL1512-3201
PL1512-3401

粒子サイズ（µm）

ユニット

PLRP-S 100 Å

PLRP-S 300 Å

PLRP-S 1000 Å

50

1 kg

PL1412-6K00

PL1412-6K01

PL1412-6K02

100 g

PL1412-4K00

PL1412-4K01

PL1412-4K02

30

100 g

15～20

1 kg

PL1412-6200

PL1412-6201

100 g

PL1412-4200

PL1412-4201

1 kg

PL1412-6400

PL1412-6401

100 g

PL1412-4400

PL1412-4401

1 kg

PL1412-6100

PL1412-6101

100 g

PL1412-4100

PL1412-4101

1 kg

PL1412-6800

PL1412-6801

10～15
10

8

カスタムカラムとバルク充填剤のご注文

PL1412-4702

PL1412-4703

PL1412-4102

PL1412-4103

上記の表に、ご希望のポアサイズ/粒子サイズとカラム寸法のカラムまたは必要量のバルク充填剤がない場合は、カスタムオーダープロセスについてお近くのアジレント営業所にお問い合わせください。

168

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るオリゴヌクレオチド 12

Bio SAX HPLC カラム、PEEK
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

4.6 x 25010

4.6 x 5010

4.6 x 250

54.6 x 505

2.1 x 250

10

2.1 x 5010

2.1 x 250

52.1 x 50

5

Bio SAX HPLC カラム、ステンレス
サイズ（mm）

粒子サイズ（µm）

21.2 x 250

510 x 250

54.6 x 25010

4.6 x 250

54.6 x 150

3

4.6 x 503

4.6 x 50

1.7

4.0 x 10、ガード

10

4.0 x 10、ガード
4.0 x 10、ガード
4.0 x 10、ガード

5
3
1.7

圧力上限

275 bar、4000 psi
275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi
400 bar、5800 psi
275 bar、4000 psi
275 bar、4000 psi
400 bar、5800 psi
400 bar、5800 psi

圧力上限

部品番号

5190-2475
5190-2476
5190-2467
5190-2468
5190-2479
5190-2480
5190-2471
5190-2462

部品番号5190-6883
5190-6882
275 bar、4000 psi

5190-2473

413 bar、6000 psi

5190-2465

551 bar、8000 psi

5190-2463

600 bar、8700 psi
275 bar、4000 psi
413 bar、6000 psi
551 bar、8000 psi
600 bar、8700 psi

目次に戻る

5190-2461
5190-2474
5190-2466
5190-2464
5190-2462

www.agilent.com/chem/jp169

12 オリゴヌクレオチド
PL-SAX 強アニオン交換カラム
サイズ（mm）

粒子径（µm）

圧力上限

PL-SAX

PL-SAX

1000 Å

4000 Å

100 x 300

10207 bar、3000 psi

PL1851-2102

PL1851-2103

50 x 150

30

PL1751-3702

PL1751-3703

50 x 150

10

PL1751-3102

PL1751-3103

25 x 150

30

PL1251-3702

PL1251-3703

25 x 150

10

PL1251-3102

PL1251-3103

25 x 50

10PL1251-1102

PL1251-3103

4.6 x 250

30

PL1551-5702

PL1551-5703

4.6 x 150

30

PL1551-3702

PL1551-3703

4.6 x 250

10

PL1551-5102

PL1551-5103

4.6 x 150

10

PL1551-3102

PL1551-3103

4.6 x 150

8

PL1551-3802

PL1551-3803

4.6 x 508

PL1551-1802

PL1551-1803

4.6 x 505

PL1551-1502

PL1551-1503

2.1 x 150

8

PL1951-3802

PL1951-3803

2.1 x 50

8

PL1951-1802

PL1951-1803

2.1 x 50

5

PL1951-1502

PL1951-1503

1.0 x 50

5PL1351-1502

PL1351-1503

207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
275 bar、4000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi
207 bar、3000 psi

PL-SAX 強アニオン交換充填剤バルク
サイズ（mm）

粒子径（µm）

圧力上限

PL-SAX

PL-SAX

1000 Å

4000 Å

100 g

30

207 bar、3000 psi

PL1451-4702

PL1451-4703

100 g

10

PL1451-4102

PL1451-4103

207 bar、3000 psi

ヒントとツール
カラムユーザーガイドでは、カラムの使用および取り扱い方法、推奨開始メソッドに関する有益な情報をご覧
いただけます。

www.agilent.com/chem/biolc-columns-user-guides

170

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るベクターベースの医薬品分析

13

ベクターベースの医薬品分析
インタクトベクターから 1 つのアミノ酸の修飾までの特性解析

バイオ医薬品研究における刺激的で前途有望な新しい方法として、多数の治療送達プラットフォームが登場しました。これらは、細胞および遺伝子治療にオリゴヌクレオチドを提供するタンパク質ベースのカプセ

ルから、ワクチン用のタンパク質ベースのウイルス様粒子や、ワクチンに mRNA を提供する脂質ベースのナノ粒子まで多岐にわたります。

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、細胞および遺伝子治療のために研究されている中でも特に一般的なウイ

ルスベクターであり、遺伝性網膜疾患や脊髄性筋萎縮症の治療で大きな成果を上げています。AAV は治療送達プラットフォームとしての使用を目的に開発されており、治療薬のすべての重要品質特性（CQA）

を確実にモニタリングするために欠かせない要素です。

AAV のよく知られた CQA と独自の CQA という両面

AAV には血清型と呼 ばれる数種類の形態があります。これらはそれぞれ似たような高次構造をしていますが、アミノ酸配列が異なるため、当然のことながら、標的にする細胞の種類も異なります。この当然の選択性により、これらは目的の生物製剤の開発に有益なベクターとなりますが、同時にプラットフォーム分
析メソッドの導入が困難になります。

多くの AAV CQA は、LC/MS やペプチドマッピングによるタンパク質配列確認など、他の単一タンパク質の生物製剤でモニタリングされている CQA と似ていることから、よく知られています。一方、充填された（それも正確に充填された）カプシドと空のカプシドの割合など、その他の CQA は独自的です。このような解析の一部は、AAV の内部にカプセル化されたトランスジェニックの存在により、さらに複雑になります。

ヒントとツール
AAV の CQA 分析に対応したアジレントの LC コラムポートフォリオについて、詳しくは explore.
agilent.com/advancebio-aav-jp を参照してください。

目次に戻る

www.agilent.com/chem/jp171

13 ベクターベースの医薬品分析
カプシドタンパク質の同定確認

AAV カプシドは、3 種類のタンパク質、VP1、VP2、VP3 を約 1:1:10 の化学量論比で含み、カプシド

あたり約 60 コピーのタンパク質で構成されています。これら 3 種類のタンパク質は、すべてが同じ遺伝子からスプライシングされており、高い配列相同性のために、クロマトグラフィーによる分離が困難です。カプシドタンパク質 3 種の比率の評価には、従来、SDS-PAGE ゲル銀染色、または ELISA やイム

ノブロッティングなどの抗体ベースメソッドが用いられてきました。しかし、これらの手法は煩雑でエラーが発生しやすく、AAV のタイプごとに固有の新しい抗体を生成しなければならない場合 があります。

AAV 血清型間の相同性の高さを考えると、識別に必要な特異性を持つ抗体を生成することは、困難となる可能性があります。液体クロマトグラフィー /質量分析法（LC/MS）は、より優れた速度、特異性、精度により、これらの課題を克服できます。アジレントが提供するワークフローソリューションは、インタ

クトタンパク質とペプチドマッピングの両方に対応しており、翻訳後修飾（PTM）の同定と部位決定が可能です。

AAV の逆相分離

AAV カプシドのインタクトタンパク質の分離には、ZORBAX RRHD ワイドポアカラムを推奨します。これらの 1.8 µm 粒子 UHPLC カラムには 4 種類の結合相が用意されています。AAV 血清型の配列の違いが、単一プラットフォームによるメソッドを困難にしていますが、多様 な相ケミストリをうまく利用することで、非常によく似たメソッドを使うことができます。現在、血清型に応じて、ZORBAX RRHD

300SB-C18 と 300-Diphenyl が推奨されています。

ペプチドマッピングは、タンパク質配列の決定と PTM の同定に重要なメソッドで、インタクト質量測定だけの場合よりも、粒度が高くなります。これは、開発と特性解析の段階では MS 検出、リリース済み製品の QC では UV または MS 検出を伴うことがよくあります。

AAV カプシドタンパク質の配列および PTM 同定には、AdvanceBio ペプチドマッピングカラムを推奨します。2.7 µm 表面多孔質 C18 固定相が、小さい背圧での高い分離能を可能にし、サイズや疎水性の点でばらつきが大きいペプチドのマッピングに対して全体的に強力なパフォーマンスを発揮します。

ヒントとツール
カラムの選択とメソッドの詳細、および追加で推奨する消耗品について、詳しくはオーダーガイド

5994-4829JAJP を参照してください。

172

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るベクターベースの医薬品分析

ZORBAX RRHD ワイドポアカラムの仕様
結合相

粒子サイズ

ポアサイズ

300SB-C18

1.8 µm300 Å

300-Diphenyl

1.8 µm

300 Å

粒子サイズ

ポアサイズ

EC-C182.7 µm120 Å

エンドキャップ

80 ℃

1.0～8.0

あり

pH 範囲

エンドキャップ

1.0～8.0

温度上限

60 ℃

2.0～8.0×103
3.5 C
3.0 VP2
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
×104 D

VP3
12.708

A

レスポンス

2.5
2.0
1.5

VP1
13.455

VP2
11.540

1.0
0.5
9

10

12
13
14
Acquisition time (min)

15

16

VP3

レスポンス

×107
1.8 B
1.6 総イオン電流
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
9
10

11

VP1
VP2

3.5
VP3
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
×103 E
5VP1
4Counts0

ダブル66490.24

Counts

蛍光

3.0

なし

59984.80 63429.29

12
13
取り込み時間（分）

14

15

16

82919.83

59976.213270536.37

074947.79

59977.13
1* 脱アミド化（0.9847）

1

1171737.09
74495.57 78512.35
68612.24

Counts

3.5

pH 範囲

80 ℃

AdvanceBio ペプチドマッピングカラムの仕様
結合相

温度上限

13

81885.72

70496.70
56,00060,00064,00079998.3583128.91

68,00072,00074946.6279840.31

76,00080,000

デコンボリュートした質量数（amu）

84,000

Agilent ZORBAX RRHD 300 Å SB-C18 カラムで最適化されたメソッドを使用した変性 AAV-2 カプシドタンパク質の LC/MS の結果。
（A）3 つのカプシドタンパク質を示す蛍光クロマトグラム。

（B）総イオン電流。
（C ～ E）3 つのカプシドタンパク質のデコンボリュートした質量スペクトル。関連する質量ピークはアスタリスクでマークされています。

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www.agilent.com/chem/jp173

13 ベクターベースの医薬品分析

Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18×101
A87 AAV-7

Rresponse

VP3
14.191

6

Rresponse

Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-Diphenyl

5
4

VP2
12.7693
2

VP1
13.491

1
0
11.5

8
Rresponse

7

12.0

12.5

13.0 13.5
14.0 14.5
Acquisition time (min)

B

15.0

7
6

6
VP1
10.846

VP2* 9.023

3

VP2

9

VP1
* 10.712

10

11

14

15

16

AAV-rh10

12

13

14

12

13

14

VP3
* 10.649

543

VP2 VP1
8.647 9.245

2
0

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

7

12.0

8

9

Acquisition time (min)* 13.072 VP3C

6

AAV-DJ

5

VP2
11.90610

11

Acquisition time (min)Rresponse

Rresponse

13

E

1

2

4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0

12

Acquisition time (min)* 10.105 VP3

4

AAV-9

8

AAV-7m8

5

VP3* 11.619D

15.5

Rresponse

×10

–1

2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

VP1
14.123F

VP3* 11.122

AAV-Anc80

4
3

VP2
VP1
9.317
9.720

2
1

10

11

12

13
14
Acquisition time (min)

15

16

17

7

8

9

10
11
Acquisition time (min)（A ～ C）Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18、および（D ～ F）AgilentSB- ジフェニルカラムにおける 6 種類の異なる血清型の変性 AAV カプシドタンパク質の LC/MS の結果

Agilent 1290 Infinity II LC システム

カラム

Agilent ZORBAX RRHD 300 Å StableBond C18

Agilent ZORBAX RRHD 300 Å Diphenyl

部品番号 858750-902

部品番号 858750-944

2.1 x 100 mm、1.8 µm

グラジエント

2.1 x 100 mm、1.8 µm

0 ～ 5 分、28 % B

0 ～ 5 分、33 % B

23 分、32.5 % B

21 分、37 % B

23.5 分、80 % B

0.1 % ギ酸、0.1 % TFA 脱イオン水水溶液

溶媒 A
溶媒 B

カラム温度

流量

23 分、80 % B

90 % イソプロパノール、9.8 % 脱イオン水、0.1 % ギ酸、0.1 % TFA
80 ℃

0.4 mL/min

サンプル量

174

21.5 分、80 % B

26 分、80 % B

1.5 x 1011 ウイルスゲノム/注入

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るベクターベースの医薬品分析

13

www.agilent.com/chem/jp

175

アデノ随伴ウイルスの空の AAV カプシド/フル AAV
カプシドの分析

充填されてフル状態のカプシドと空のカプシドの比率およびペイロードの同定の両方から見たペイロード分析は、AAV などカプシドをベースとした生物製剤固有の重要な品質特性です。フ

ルカプシドと空カプシドの区別だけでも困難ですが、このようなサンプルにありがちな濃度の低さを考えると、この測定はさらに難しくなります。空カプシドとフルカプシドの比率の検証には、

一般に電子顕微鏡と分析用超遠心分離法が使われますが、これらの方法は困難で、時間とコストがかかり、ユーザーは他の手法を探し続けることになります。空カプシドとフルカプシドをクロマトグラフィーで区別するのは難しいことですが、クロマトグラフィーには処理速度に可能性があり、比較的容易な手法であることから、魅力的なアプローチであり続けています。光散

乱検出によるサイズ排除と、蛍光検出によるアニオン交換は 2 つの有望なオプションです。しかし、すべての血清型やペイロードに直接適用できる普遍的なソリューションはないため、理想的な手法については決まっていません。

アニオン交換による AAV の分離

血清型が大きく異なれば最適化する必要がありますが、アニオン交換メソッドは卓越した直線

性と再現性を示します。Agilent Bio SAX カラムでの分離の再現性は、空とフルの AAV カプシ

ドの定量に推奨できる十分なレベルであることが実証されています。

Agilent Bio SAX カラムの仕様
結合相

SAX（強アニオン交換）–
N(CH3)3

粒子

温度

pH 範囲

流量

5 µm

80 ℃

2.0 ～ 12.0

0.1 ～ 1.0 mL/min

サイズ

上限

*AAV で最高の結果を得るには0.1 mL/min を推奨

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13 ベクターベースの医薬品分析
空とフルの AAV カプシドの混合物の測定
10% フル

空

AAV-1

0.9

40% フル

Full

0.8

60% フル

0.7

LU

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Time (min)
0.7

20

21

14% フル

空

AAV-6

19

30% フル
50% フル

0.6
0.5
Full

LU

0.4
0.3
0.2
0.1
0
5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Time (min)Agilent バイナリハイスピードポンプを使用した、フル/空のカプシド比が異なる AAV-1 および AAV-6 サンプルの分離

Agilent 1290 Infinity II Bio LC システム

カラム

Agilent Bio SAX、2.1x50 mm、5 µm

溶媒 A

70 mM Bis-Tris プロパン、pH 9.0

PEEK ハードウェア
2 mM MgCl2

溶媒 B

70 mM Bis-Tris プロパン + 1M テトラメチル塩化アンモニウム、pH 9.0

グラジエント

時間

%B

25 分

27.5 %

0.1 mL/min

100 %0.3 mL/min

100 %0.3 mL/min

2 mM MgCl2
0分

25.1 分
28 分
蛍光
検出

176

15 %

流量

0.1 mL/min

λex = 280 nm、λem = 340 nm

Agilent BioHPLC カラム

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19

20

21

ベクターベースの医薬品分析

13

ベクターベースの治療薬の凝集体分析

凝集体分析は、他のタンパク質ベースの生物製剤と同様に、AAV の CQA でのモニタリングが非常に一般的です。主な違いは、サンプルの凝集を正確に評価するために必要なポアサイズにあります。AAV カプシ

ドの直径は約 250 Å（25 nm）なので、その凝集体は、通常のポアサイズが 300 Å 以下の一般的なサイ
ズ排除カラムのポアに含めるには大きすぎます。これまでの知見から、SEC のポアサイズは、目的の分子の少なくとも 3 倍は必要であることがわかっているため、この場合に推奨されるポアサイズは 750 Å 以上となります。多くのユーザーが AAV にポアサイズが約 500 Å のカラムを採用していましたが、私たちは、

1000 Å ポアを使用することで、モノマーとダイマーの分離度が向上することを発見しました。

アジレントは、500、1000、さらには 2000 Å など、さまざまな高分子生物製剤に適したポアサイズのBio SEC-5 カラム製品を用意しています。

Agilent Bio SEC-5 カラムの仕様
ポア

粒子

分子量範囲

pH

最大

流量

500 Å

5 µm

15,000 ～ 5,000,000

2 ～ 8.5

137 bar、2000 psi

1.0 ～ 10.0 mL/min（内径 21.2 mm）

サイズ

1000 Å

2000 Å

サイズ

5 µm

5 µm

50,000 ～ 7,500,000>10,000,000

範囲

2 ～ 8.5

2 ～ 8.5

圧力

137 bar、2000 psi

137 bar、2000 psi

0.2 ～ 1.2 mL/min（内径 7.8 mm）
0.1 ～ 0.4 mL/min（内径 4.6 mm）

1.0 ～ 10.0 mL/min（内径 21.2 mm）
0.2 ～ 1.2 mL/min（内径 7.8 mm）
0.1 ～ 0.4 mL/min（内径 4.6 mm）

1.0 ～ 10.0 mL/min（内径 21.2 mm）
0.2 ～ 1.2 mL/min（内径 7.8 mm）
0.1 ～ 0.4 mL/min（内径 4.6 mm）

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www.agilent.com/chem/jp177

13 ベクターベースの医薬品分析
AAV-9 と AAV-2 のサイズ排除クロマトグラム
100
90
80

A

9.346

Agilent AdvanceBio SEC 300 Å タンパク質標準

70

γ-グロブリンLU

60

オボアルブミン

チログロブリン50

サイログロブリンの
凝集体

40
30

ミオグロビン

20
10
0
7
6

B

ストレスを受けていない AAV-9

LU

5
4
3
2
1
6
5

C

ストレスを受けていない AAV-2

LU

4
3
2
1
4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

12.0

Time (min)Agilent AdvanceBio SEC 300 Å タンパク質標準とストレスのない AAV-9 および AAV-2 の蛍光クロマトグラム。タンパク質標準にはアンギオテンシン II も含まれていることに注意してください。

アンギオテンシン II にはトリプトファン アミノ酸が含まれていないため表示されていません。したがって、選択した励起および発光設定では非蛍光です。

178

Agilent BioHPLC カラム

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12.5

ベクターベースの医薬品分析

13

ストレスを受けていない AAV-9 とストレスを受けた AAV-9 の凝集
2.6
2.4
2.2

A

7.948

ストレスを受けていない AAV-9
（拡大）

LU

2.0
1.8
1.6
1.4
1.2

7.148

1.0
1.5
1.4

LU

1.3

B

ストレスを受けた AAV-9
（拡大）

7.959

1.2
1.1
1.0
0.8

9.952

7.101

0.8
4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

12.0

12.5

Time (min)
ストレスを受けていない AAV-9 とストレスを受けた AAV-9 の蛍光クロマトグラム

Agilent 1290 Infinity II LC システム

カラム

移動相

カラム温度

流量
検出

注入量

Agilent Bio SEC-55 µm、1000 Å、4.6 x 300 mm
部品番号 5190-2538

50 mM リン酸緩衝液 + 400 mM NaCl、pH 7.4
80 ℃

0.4 mL/min
蛍光、λex = 280 nm、λem = 340 nm

20 µL

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13 ベクターベースの医薬品分析

製品の詳細情報
インタクトタンパク質分析用 ZORBAX RRHD ワイドポアカラム
説明

部品番号

Agilent ZORBAX RRHD Diphenyl、2.1 x 150 mm、1.8 µm、300 Å

863750-944

Agilent ZORBAX RRHD Diphenyl、2.1 x 100 mm、1.8 µm、300 Å

858750-944

Agilent ZORBAX RRHD StableBond C18、2.1 x 150 mm、1.8 µm、300 Å

863750-902

Agilent ZORBAX RRHD StableBond C18、2.1 x 100 mm、1.8 µm、300 Å

868750-902

ペプチドレベル分析用 AdvanceBio ペプチドマッピングカラム
説明AdvanceBio ペプチドマッピング、2.1 x 150 mm、2.7 µm

653750-902

AdvanceBio ペプチドマッピング、2.1 x 250 mm、2.7 µm

651750-902

AdvanceBio ペプチドマッピングガードカラム、2.1 x 150 mm、2.7 µm、3 個

凝集およびサイズ分布解析用 Bio SEC-5 カラム
サイズ（mm）

粒子径（µm）

部品番号858750-902

Bio SEC-5

Bio SEC-5

Bio SEC-5500 Å1000 Å

2000 Å

USP L59

USP L59

USP L59

21.2 x 300

55190-6866

5190-6867

5190-6868

21.2 x 50、ガード

5

5190-6872

5190-6873

5190-6874

7.8 x 300

55190-2531

5190-2536

5190-2541

7.8 x 150

55190-2532

5190-2537

5190-2542

7.8 x 50、ガード

5

5190-2535

5190-2540

5190-2545

4.6 x 300

55190-2533

5190-2538

5190-2543

4.6 x 150

55190-2534

5190-2539

5190-2544

4.6 x 50、ガード

5

5190-6860

5190-6861

5190-6862

180

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るメソッド開発のガイドライン 14

メソッド開発のガイドライン
一次構造の分析メソッド

このセクションでは、一次構造分析用のカラムの選択方法と、mAb、タンパク質、ペプチドのメソッド開発に関する重要な詳細情報について説明します。
ペプチドとポリペプチド

分子量範囲 <10 kDa

タンパク質
分子量範囲 >10 kDa

削減/断片化
分子量範囲 <50 kDa

分子量範囲 >150 kDa

インタクト

初期結合相
AdvanceBio

ZORBAX 300 Å
StableBond C8AdvanceBio
RP-mAb StableBond C8AdvanceBio
RP-mAb C4

その他：

その他：

その他：

その他：

ZORBAX 300 Å StableBond C18

AdvanceBio RP-mAb C4

AdvanceBio RP-mAb

ペプチドマッピング
ZORBAX 300 Å StableBond C18

PLRP-S

PLRP-S

PLRP-SZORBAX 300 Å StableBond C3AdvanceBio RP-mAb Diphenyl

Poroshell 300 StableBond C18

ZORBAX 300 Å Diphenyl

Poroshell 300 StableBond C8ZORBAX 300 Å StableBond C8

Poroshell 300 StableBond C3

ZORBAX 300 Å StableBond C3
ZORBAX 300 Å StableBond C18

StableBond C8AdvanceBio RP-mAb Diphenyl
Poroshell 300 StableBond C3
Poroshell 300 StableBond C8

初期分離条件移動相：
A：95 % H2O:5 % ACN + 0.1 % TFA
B：5 % H2O:95 % ACN + 0.085 % TFA

移動相：
A：95 % H2O:5 % ACN + 0.1 % TFA
B：5 % H2O:95 % ACN + 0.085 % TFA

グラジエント：30 分で 3～60 %グラジエント：20 分で 5～70 %

温度：40 ℃

温度：80 ℃

内径 2.1 mm の
カラム
粒子サイズ

2.7 µm SPP
流量

0.5 mL/min

内径 4.6 mm の
カラム
粒子サイズ

2.7 µm SPP
流量

2.0 mL/min

内径 2.1 mm の
カラム
粒子サイズ

1.8 µm TPP
3.5 µm TPP
5 µm TPP
5 µm SPP
流量

0.5 mL/min
0.2 mL/min
0.2 mL/min
1.0 mL/min

内径 4.6 mm の
カラム
粒子サイズ

3.5 µm TPP
5 µm TPP
流量

1.0 mL/min
1.0 mL/min

移動相：
A：100 % H2O + 0.1 % TFA
B：10 % H2O:10 % ACN:80 % n-PA

移動相：
A：98 % H2O:2 % IPA + 0.1 % TFA
B：10 % H2O:0 % ACN:70 % IPA

グラジエント：10 分で 5～40 %グラジエント：5 分で 10～60 % B

温度：60 ℃

温度：80 ℃

+ 0.08 % TFA

内径 2.1 mm の
カラム
粒子サイズ

3.5 µm SPP
1.8 µm TPP
3.5 µm TPP
5 µm TPP
流量0.8 mL/min
0.3 mL/min
0.2 mL/min
0.2 mL/min

内径 4.6 mm の
カラム
粒子サイズ

3.5 µm SPP
3.5 µm TPP
5 µm TPP
流量+ 0.08 % TFA

内径 2.1 mm の
カラム
粒子サイズ

3.5 µm SPP
5 µm SPP
流量

内径 4.6 mm の
カラム
粒子サイズ

3.5 µm SPP
流量

5.0 mL/min

1.0 mL/min

4.0 mL/min
1.0 mL/min
1.0 mL/min

SPP = 表面多孔質粒子、TPP = 全多孔質粒子

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14 メソッド開発のガイドライン
低 pH とシンプルな水性/有機グラジエントで開始する
通常は、水:アセトニトリル + 0.1 % のトリフルオロ酢酸（TFA）グラジエントを使用して、すべての対象成分を溶出させます。300 Å ポアサイズカラム

で一般的な高分離能グラジエントを使用した場合は 30 ～ 50 分かかります。AdvanceBio RP-mAb カラムを使用すると、短い分析時間と高い流量で優れた分離能を得ることができます。分離能を上げるには、グラジエント時間を延 ばす、カラムを短くする、流量を増やすなどの方法があります。

LC/MS メソッドでは、TFA を使用すると検出器の感度が下がる可能性があるため、ギ酸アンモニウムやギ酸に置き換えられる場合があります。

サンプル溶解性を最適化する
あらゆる pH で優れたピーク形状と回収率を得るには、サンプルを完全に可溶性にすることが重要です。AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX

300 Å StableBond、Poroshell 300 StableBond、AdvanceBio ペプチドマッピングでは強酸性溶媒か中性溶媒を使用できます。
ZORBAX 300Extend-C18 と Poroshell 300Extend-C18 では中性溶媒か希塩基を使用できます。

タンパク質とペプチドを可溶性にする溶媒の選択

水/リン酸緩衝液

弱希酸（TFA、酢酸または HCI）

中性 pH、6 ～ 8 M グアニジン HCI またはイソチオシアネート
酢酸 5 %/6 M 尿素

希酸 + 水性/有機溶媒（ACE、MeOH、THF）
希塩基（水酸化アンモニウム）DMSO または DMSO を使用して 0.1 % ～ 1 %強ホルムアミド温度を上 げるタンパク質とペプチドの分離は温度の影響を受けます。カラム温度を上げると、タンパク質と疎水性ペプチドおよび凝集ペプチドの分離能と回収率が大幅に向上します。

AdvanceBio RP-mAb: 最大 90 ℃
ZORBAX 300 StableBond、Poroshell 300 StableBond：最大 80 ℃
AdvanceBio ペプチドマッピング：最大 60 ℃

移動相の pH を最適化する
低 pH でうまくいかない場合は中 pH や高 pH を試してみる

最適化された低 pH メソッドで最適な分離能を得られない場合は、中 pH や高 pH の移動相を使用できます。
高 pH では選択性が大きく変わる場合がよくあります。これは酸性アミノ酸が負電荷になり、一部の塩基性アミノ酸の電荷が失われるためです。ZORBAX 300Extend-C18 は中～高 pH の分離に最適です。
カラム：

移動相：

182

Agilent BioHPLC カラム

ZORBAX 300 Extend-C18
4.6 x 150 mm、5 µm
773995-902

A：20 mM NH4OH 水溶液
B：20 mM NH4OH、80 % の ACN 溶液

グラジエント：30 分で 5～60 % B

流量：

1 mL/min

温度：

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25～30 ℃（<60 ℃）

メソッド開発のガイドライン 14

逆相 LC/MS メソッド

タンパク質とペプチドの LC/MS は、タンパク質の特性解析情報の取得、タンパク質の翻訳後修飾の正確な同定、合成ペプチドや天然ペプチドの分子量の測定に使用されます。またプロテオミクスアプリケーションで、2D 分離でのタンパク質同定にも使用されます。このためタンパク質とペプチドの LC/MS は重要な分離分野であり、カラムと移動相の特殊な推奨事項が必要です。LC/MS には小さいカラムサイズがよく使用され、通常は移動相で TFA は使用されません。この移動相添加剤を MS で使用すると感度が下がるためです。

分析 LC/MS アプリケーション
サンプルサイズの制限がない場合は、内径 2.1 mm のカラムを使用すると良好な感度を得ることができます。

Poroshell カラムでは、より小さい内径 1 mm のカラムを使用できます。

高感度/プロテオミクスアプリケーション
キャピラリーカラムは、高感度のタンパク質およびペプチドアプリケーションに使用されます。内径 0.5 mm のカラムは、タンパク質とタンパク質消化物の分離に使用されます。内径 0.3 mm のカラムはタンパク質消化によく使用されます。

これらの成分は、水酸化アンモニウム移動相を使って高 pH で分析できます。ナノカラム（内径 0.1 mm および 0.075 mm）は

2D LC/MS システムでプロテオミクス用によく使用され、最初は C18 結合相を選択します。

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14 メソッド開発のガイドライン

電荷変異体の分析メソッド

このセクションでは、電荷変異体分析用のカラムの選択方法と、mAb、タンパク質、ペプチドのメソッド開発に関する重要な詳細情報について説明します。

Bio Mab カラムとモノクローナル抗体

Bio IEX カラム、カチオン交換（SCX、WCX）、

Bio IEX カラム、

モノクローナル抗体、タンパク質、

アニオン交換（SAX、
WAX）、

ペプチド、
糖タンパク質オリゴヌクレオチド、
タンパク質

推奨初期条件移動相：
A：20 mM リン酸ナトリウム、pH 5.5
B：緩衝液 A + 200 mM NaCl

移動相：
A：20 mM リン酸ナトリウム、WCX で pH 5.0
または
SCX で pH 6.0

移動相：
A：20 mM Tris-HCI、pH 8.5
B：A + 500 mM NaCl

B：緩衝液 A + 500 mM NaCl

グラジエント：50 分で 10～35 % B

グラジエント：1～100 % B 30 分（50 mm カラムの場合）、60 分（250 mm カラムの場合）

グラジエント：2 mg/mL、5 µL 注入

1～100 % B 30 分（50 mm カラムの場合）、60 分（250 mm カラムの場合）

温度：
室温

2 mg/mL、5 µL 注入

検出：
UV、220 nm

温度：
室温

サンプル量：

サンプル量：

2 mg/mL、5 µL 注入

サンプル量：

温度：
室温
検出：
UV、220/280 nm

検出：
UV、220/280 nm

カラム径と粒子サイズに基づいて流量を選択する
内径 2.1 mm のカラム

粒子サイズ、µm

5
1.7

流量（mL/min）

0.1 ～ 0.5

内径 4.6 mm のカラム

粒子サイズ、µm

1.7

0.1 ～ 0.8

3
3.5
10

184

Agilent BioHPLC カラム

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流量（mL/min）

0.1 ～ 0.3
0.1 ～ 0.5
0.1 ～ 0.8
0.1 ～ 1.0

メソッド開発のガイドライン 14条件を最適化する
一部の分離では特定の緩衝液、イオン強度、pH、温度が必要な場合があります。

イオン強度
カラム機能を維持するには、特定のイオン強度が必要です。通常は、最小で 10 ～ 20 mM の塩濃度が必要です。

ただし強度が 20 mM を超えると、生体分子がカラムに吸着しにくくなります。一般的に使用される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸塩です。溶出用の一般的な塩濃度は 400 ～ 500 mM です。

注意事項：背圧が大幅に上がるため、カラムを水だけで洗浄しないでください。

緩衝液と pH の選択

緩衝液と pH の選択

分離の最適化において、緩衝液は重要な役割を果たします。リン酸緩衝液は通常、アニオン交換には pH 8.0 ～ 9.0 の酢酸緩衝液と抗体と多くの生体分子に使用されます。次の MES、トリス、および ACES 緩衝液も推奨します。pH 5.0 ～ 6.5. pH の緩衝液の使用は、通常 +/- 0.2 単位で調整できます。
一部の特定のタンパク質では、より高い pH（>pH 6.5）が必要な場合もあります。

pH の調整にはリン酸、酢酸、HCl、NaOH を使用できます。

リン酸緩衝液の使用を推奨します。pH は通常、+/- 0.2 単位で調整できます。一部の特定のタンパク質では、より高いまたは低い pH の緩衝液が必要な場合もあります。pH の調整にはリン酸、酢酸、HCl、NaOH を使用できます。

溶出には pH グラジエントも使用できます。

溶出には pH グラジエントも使用できます。

添加剤

添加剤

有機溶媒

有機溶媒

その他の類似の溶媒を使用できます。

その他の類似の溶媒を使用できます。

最大 50 % のアセトニトリル、エタノール、メタノール、または洗浄剤

非イオン性、アニオン性、および両イオン性洗浄剤を使用できます。カチオン性洗浄剤は使用しないでください。

最大 50 % のアセトニトリル、エタノール、メタノール、または洗浄剤

非イオン性、カチオン性、および両イオン性洗浄剤を使用できます。アニオン性洗浄剤は使用しないでください。

温度
Agilent Bio MAb および IEX カラムは 80 ℃までは安定しています。ただし、多くのタンパク質と生体分子は易熱性です。
日常的に分離で高温を使用するには、必ずサンプル温度の安定性を確立してください。

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14 メソッド開発のガイドライン

Agilent Buffer Advisor ソフトウェアによる電荷変異体の分析メソッド

Agilent Buffer Advisor は、再現性が高く正確なイオン交換メソッドを可能にするソフトウェアツールです。例えばこのソフトウェアでは、一定の pHの塩グラジエント、または pH グラジエントと塩グラジエントに 4 液混合を使用して、クリーンアップ用のメソッドを生成できます。これらのメソッドは、

Agilent LC 取り込みソフトウェアに直接インポートできます。

推奨初期条件カラム：

塩グラジエント（アプリケーションノート：5991-0656EN を参照）
Bio WCX、4.6 x 250 mm、10 µm
Bio WCX、4.6 x 250 mm、5 µm

移動相：

pH グラジエント（アプリケーションノート：5990-9629JAJP を参照）

カラム：

Bio MAb、4.6 x 250 mm、5 µm

移動相：

A：水

A：水

B：1.6 M NaCl

B：1.6 M NaCl

C. 40.0 mM NaH2PO4
D. 40.0 mM Na2HPO4

C. 40.0 mM NaH2PO4

C と D を事前に決定した割合で混合することで、

D. 40.0 mM Na2HPO4

最適な pH 範囲の緩衝液溶液がC と D を事前に決定した割合で混合することで、最適な pH 範囲のグラジエント：20 mM 緩衝液が作製されます。

0～50 % B、0～20 分（一定の pH、

例えば pH 6.0 など）

50 % B、20～25 分

室温

10 µL

検出：

注入量：

10 µL

装置本体：

1260 Infinity バイオイナート LC

サンプル濃度：2 mg/mL（20 mM リン酸ナトリウムサンプル：

800 mM NaCl、25～30 分

注入量：

室温

検出：

pH 6.0～8.0、0～20 分

0～800 mM NaCl、20～25 分

温度：

0 % B、25～35 分

温度：

選択した緩衝液強度で作製されます。

グラジエント：UV、220 nm

装置本体：

UV、220 nm

1260 Infinity II バイオイナート LC

サンプル：

オブアルブミン、
リボヌクレアーゼ A、
シトクローム c、
リゾチーム

IgG モノクローナル抗体

サンプル濃度：2 mg/mL（20 mM リン酸ナトリウム
緩衝液中、pH 6.0）

緩衝液中、pH 6.0）

注意事項：同様に、上記の方法を Agilent WAX および SCX カラムと修飾に適用できます。
重要品質特性のアプリケーション総覧をダウンロードいただけます。詳細情報：www.agilent.com/chem/cqa-applications

カラム径と粒子サイズに基づいて流量を選択する
内径 2.1 mm のカラム

粒子サイズ、µm

1.7
3
5
10

内径 4.6 mm のカラム流量（mL/min）

粒子サイズ、µm

0.1 ～ 0.3

1.7

0.1 ～ 0.5

3

0.1 ～ 0.8

5

0.1 ～ 1.010

注意事項：必ず低流量とカラムのデフォルトの推奨動作限界から開始してください。

186

Agilent BioHPLC カラム

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流量（mL/min）

0.1 ～ 0.3
0.1 ～ 0.5
0.1 ～ 0.8
0.1 ～ 1.0

メソッド開発のガイドライン 14

凝集およびフラグメントの分析メソッド

このセクションでは、凝集分析用のカラムの選択方法と、mAb、タンパク質、ペプチドのメソッド開発に関する重要な詳細情報について説明します。

タンパク質）のサイズに基づく分離のための生体分子、凝集分析（ペプチド、ポリペプチド、
初期カラムおよび初期条件の選択
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質

ペプチド、ポリペプチド、タンパク質

分子量範囲 >0.1 ～ 1,250 kDa

分子量範囲 >0.1 ～ 10,000 kDa

分子量範囲とポアサイズに基づくカラムの選択
AdvanceBio SEC（2.7 µm）
ポアサイズ

130 Å
300 Å

Bio SEC-3（3 µm）

分子量

ポアサイズ

0.1 ～ 120100 Å

範囲、kDa5 ～ 1,250

150 Å
300 Å

Bio SEC-5（5 µm）

分子量

ポアサイズ

0.1 ～ 100100 Å

範囲、kDa0.5 ～ 150
5 ～ 1,250

150 Å
300 Å
500 Å

分子量

範囲、kDa0.1 ～ 100
0.5 ～ 150
5 ～ 1,250

15 ～ 5,0001000 Å

50 ～ 7,500

2000 Å

>10,000

推奨する初期分離条件
カラム：

AdvanceBio SEC

移動相：

リン酸緩衝液 150 mM、pH 7.0*グラジエント：Bio SEC（3 µm および 5 µm）

15～60 分間のアイソクラティック

温度：
流量：

サンプル量：

推奨 10～30 ℃、最大 80 ℃

0.1～0.4 mL/min（内径 4.6 mm カラムの場合）

0.1～1.25 mL/min（内径 7.8 mm カラムの場合）

1.0～10.0 mL/min（内径 21.2 mm カラムの場合）
総カラム容量の 5 % 以下

* 高および低塩濃度のさまざまな水溶性緩衝液を使用可能

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14 メソッド開発のガイドライン

最初の分離後、分離のさらなる向上、タンパク質溶解度の維持、サンプルとクロマトグラフィー充填剤との相互作用の軽減のために、さらに変更が必要になることがあります。移動相のイオン強度を調整すれば、最適な分離が得られます。pH も通常は + /-0.2 単位で調整可能です。さらに最適化が必要な場合は、範囲を拡張する必要があります。温度の変更や、有機溶媒を追加することも検討します。

その他の塩が必要なプロトコルでは、次の緩衝液が一般的です。
50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 中に 100 ～ 150 mM の塩化ナトリウム50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 中に 100 ～ 150 mM の硫酸ナトリウム50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 中に 50 ～ 100 mM の尿素

その他の類似した塩（KCI など）や塩酸グアニジンも使用できます。

pH 範囲：
2.0 ～ 8.5

添加可能な有機溶媒：

50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 中に 5 ～ 10 % のエタノール（またはその他の類似した溶媒）
50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 中に 5 % の DMSO

一部の水性/有機溶媒混合物は高粘度であるため、過剰な圧力変化が発生しないように特に注意してください。流量を減らすか温度を上げると、問題が発生する可能性を低減することができます。

温度：

一般に、SEC 分離は 20 ～ 30 ℃で行います。タンパク質とペプチドの分離では、タンパク質や疎水性ペプチドの分解能と回収率の両方を上げるために、それよりも高い温度が必要になることがあります。

Bio SEC カラムの最高使用温度は 80 ℃です。

188

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るメソッド開発のガイドライン 14

オリゴヌクレオチド分析
オリゴヌクレオチド
DNA または RNA

検出メソッド
質量分析

UV

分離方法

アニオン交換：UV 検出と組み合わせた大規模精製で効果的なイオンペアリング逆相：
分離能の向上と分離方法

MS に適した移動相

結合相
PL-SAX 1000 A（1 ～ 200 塩基のオリゴに最適）

PL-SAX 4000A

AdvanceBio

オリゴヌクレオチド（2.7µm SPP 120 Å の（200 ～ 5000 塩基のオリゴ向き大きなポアサイズ）

ポアサイズにより、分析特性解析の分離能が向上）

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PLRP-S（調製により、粒子サイズ、ポアサイズ、カラム寸法の柔軟な設定が可能）

www.agilent.com/chem/jp189

14 メソッド開発のガイドライン

初期分離条件
移動相：

カラム

カラム

原液の作成：1 M トリス、pH 8.0、HCI で調整（部品番号 659750-702）

1000 Å

MP A

MP A

MP A

および水 890 mL と混合

HFIP 水溶液

HFIP 脱イオン水溶液

2.7 µm、50 x 2.1 mm

10mM Tris、pH 8.0 +10 % ACN

原液緩衝液 10 mL を ACN 100 mL

15 mM TEA と 400 mM
MP B

MP B

原液緩衝液 10 mL を ACN 100 mL、

メタノール

グラジエント0 ～ 1 分、10 % B

2M NaCl と混合し、1 L になるまで水を加える

グラジエント1 ～ 10 分、10 ～ 40 % B

10 分で B を 20 % から 40 %10 ～ 11 分、40 ～ 95 % B

カラム温度

カラム温度

30 ℃

PLRP-S 5 µm、50 x 2.1 mm、15 mM ジブチルアミン + 25 mM
MP B

15 mM ジブチルアミン + 25 mM
HFIP メタノール溶液
グラジエント0 ～ 1 分、15 % B

1.1 ～ 10.5 分、45 % B

10.6 ～ 11.5 分、90 % B

65 ℃

カラム温度

0.5 mL/min

流量

流量

80 ℃

0.4 mL/min

メソッドを最適化するための変数クロマトグラフィーを最適化するために調整可能な変数：

クロマトグラフィーを最適化するために調整可能な変数：

pH：NaOH を加えて pH を 11 または 12 に上げると、二次的作用を制限し、シャープなピークを得ることができます。pH を上げる

温度：MP とカラムコンパートメントの温度を上げると、MP の粘度が下がり、二次的作用が減少して、ピーク形状が向上します。

とともに、塩濃度を高くすると、溶出されるオリゴが長くなります。

イオンペア試薬：IP-RP はイオンペア試薬、通常は異なる疎水性アルキル鎖を持つアミンを使用します。アミンはアニオン性オリゴと相互 に作用してペアを形成します。このペアは RP 固定相との疎水性相互作
用を通じて保持されます。分離と保持を向上させるには、選択したイオンのペアを調整します。

温度：MP とカラムコンパートメントの温度を上げると、MP の粘度が下がり、二次的作用が減少して、ピーク形状が向上します。

有機 MP 溶媒：アセトニトリル移動相調製剤を追加（10 ～ 15 %）したところ、クロマトグラフィーが向上を示しました。

有機 MP 溶媒：選択したイオンペア試薬によっては、移動相の有機濃度の変化を利用して、分析対象の保持を最適化（延長または短縮）できます。

*pH と温度の上昇 が、不要 なサンプルの劣化を招くことがあります。変更は、不要な不純物をモニタリングしながら、段階的に行う必要があります。

190

Agilent BioHPLC カラム*pH と温度の上昇が、不要なサンプルの劣化を招くことがあります。変更は、不要な不純物をモニタリングしながら、段階的に行う必要があ
ります。

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メソッド開発のガイドライン 14

アデノ随伴ウイルス（AAV）分析
AAV

検出メソッド凝集体分析

カプシドタンパク質の空/フル分析

ID 確認

ペプチドマッピング

（PTM）

SEC

AdvanceBio

イオン交換

ペプチドマッピング

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インタクトタンパク質

ZORBAX RRHD 300Åwww.agilent.com/chem/jp191

14 メソッド開発のガイドライン
初期分離条件
カラム

カラム

カラム

カラム

300 x 4.6 mm 5 µm、1000 Å

50 x 2.1 mm 5 µm

150 x 2.1 mm 2.7 µm

100 x 2.1 mm 1.8 µm

Agilent Bio SEC-5、Agilent Bio SAX、

移動相

MP A

400 mM NaCl、pH 7.4

2 mM MgCl2

50 mM リン酸緩衝液、
カラム温度

80 ℃

AdvanceBio ペプチドマッピング、

70 mM Bis-Tris プロパン、pH 9.0

0.4 mL/min
FLD

λex = 280 nm、λem = 340 nm

MP A

MP B

溶液

0.1 % FA アセトニトリル溶液

70 mM Bis-Tris プロパン +グラジエント1M テトラメチル塩化アンモニウム、

流量

MP A

0.1 % ギ酸脱イオン水水溶液

MP B

0 ～ 3 分、3 % B

pH 9.02 mM MgCl2

50 分、35 % B

グラジエント

62 分、97 % B

0 分、15 % B

流量：0.1 mL/min
流量：0.1 mL/min
流量：0.3 mL/min

MP B

90 % IPA + 9.8 % 脱イオン水 +0.1 % FA + 0.1 % TFA
グラジエント

0 ～ 5 分、28 % B

65 分、3 % B

23.5 分、80 % B

23 分、32.5 % B
26 分、80 % B

60 ℃

カラム温度

0.4 mL/min

流量

流量25.1 分、100 % B

0.1 % FA + 0.1 % TFA 脱イオン水

60 分、97 % B

カラム温度

25 分、27.5 % B

Zorbax RRHD 300A SB C18、

80 ℃

0.4 mL/min

28 分、100 % B

流量：0.3 mL/min

FLD

λex = 280 nm、λem = 340 nm

RP クロマトグラフィーを最適化するために調整可能な変数：
温度

MP とカラムコンパートメントの温度を上げると、MP の粘度が下がり、二次的作用が減少して、ピーク形状が向上します。

有機 MP 溶媒逆相分離では、有機溶媒は 強力 な溶媒です。移動相で有機溶媒の割合を調整すると、溶出強度が影響を受けます。移動相にある有機溶媒の割合が高ければ高いほど、逆相カラムでの疎水性物質の保持期間が短くなります。

カラムケミストリ

固定相 の 選択性 は 変数 で、これを変更して、 ターゲット化合物 の 分離能 を最適化することができます。インタクトカプシドタンパク質 の 分析 のため、Zorbax RRHD

300-Diphenyl には C18 に対して異なる選択性があり、さまざまな血清型に対して、有利に働きます。

192

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るメソッド開発のガイドライン 14

グリカンおよび親水性/糖ペプチド分析
糖ペプチドおよび親水性ペプチド
分子量範囲 <10 kDa

グリカン

分子量範囲 <5 kDa

初期結合相
AdvanceBio グリカンマッピング、AdvanceBio グリカンマッピング、

ZORBAX RRHD 300-HILIC

高速分離およびハイスループット分析用

高分離能およびGlycan マッピングカラム

1.8 µm

2.7 µm

その他：AdvanceBio

250 mm カラム長用
低圧での効率的な分離に適した表面多孔質

初期分離条件移動相：
A：100 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5
B：ACN

移動相：
A：100 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5
B：ACN

移動相：
A：ACN
B：50 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5

12 分で 25 ～ 40 %35 分で 25 ～ 60 % A

15 分で 95 ～ 0 % A

グラジエント：温度：
40 ℃

グラジエント：

温度：
40 ℃

カラム
外寸

2.1 x 100 mm
2.1 x 150 mm

アプリケーション
ハイスループット
速度と分離能グラジエント：

温度：
室温

カラム
外寸

2.1 x 100 mm
2.1 x 150 mm
2.1 x 250 mm
4.6 x 100 mm
4.6 x 150 mm
4.6 x 250 mm

アプリケーション

UHPLC の速度

堅牢なメソッド
UHPLC の分離能
HPLC の速度
堅牢なメソッド
HPLC の分離能

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カラム
外寸

2.1 x 50 mm
2.1 x 100 mm

アプリケーション

速度
分離能

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14 メソッド開発のガイドライン

抗体価の測定と細胞培地の最適化メソッド
Agilent Bio-Monolith Protein A の推奨条件
カラム：

移動相：
グラジエント：

温度：
流量：

注入量：
検出：

サンプル：

バイオモノリスプロテイン A（部品番号 5069-3639）

A：50 mM リン酸塩、pH 7.4、
B：100 mM クエン酸、pH 2.8 mM、または 500 mM 酢酸、
pH 2.6時間（分）0～0.5
0.6～1.7
1.8～3.5

%A
100
0
100

%B
0
100
0

室温

結合
溶出
再平衡化

1 mL/min

可変（50 µL、IgG1 を含む CHO 細胞培地の上清用に最適化）

UV、280 nm

IgG1（1～20 mg/mL）および CHO 細胞溶解液には IgG1 が含まれる（最大 20 mg/mL の総タンパク質）

これより高濃度の塩は、
注意事項：塩化ナトリウムなどのその他の塩は、150 mM まで移動相に追加できます。
実験で測定する必要があります。

ヒントとツール
アジレントは、mAb とタンパク質の分離の品質にはさまざまな要因が影響することを認識しています。このため、最適な分析結果の取得に役立つ一連の「ハウツー」ガイドをご用意しています。詳細については、次の資料をご覧ください。
最適なペプチド分析のために：ペプチドマッピングの基礎（資料番号 5991-2348JAJP）

Ion-Exchange Chromatography for Biomolecule Analysis: a �How to� Guide（イオン交換クロマトグラフィーによる生体分子分析：

ハウツーガイド）（資料番号 5991-3775EN）

生体分子分析のためのサイズ排除クロマトグラフィー：分析の手引き（資料番号 5991-3651JAJP）

194

Agilent BioHPLC カラム

目次に戻るメソッド開発のガイドライン 14

高感度キャピラリーカラムのメソッド
逆相メソッドの移動相の考慮事項

カラム溶出液がカラムから MS 検出器へ直接流れる LC/MS メソッドでは、移動相に揮発性塩と添加剤のみが含まれる

必要があります。また感度を最大化するには、イオン抑制や付加体の生成がないことが必要です。

低 pH

TFA は通常、タンパク質とペプチドの LC/MS 分離には使用されません。TFA によってイオン化が抑制され、感度が下がるためです。通常は最初に TFA を 0.1 ～ 1 %のギ酸に交換します。代替移動相調整剤として、1 % までの酢酸 を使用することもできます。低 pH の場合 は、移動相 で TFA を使用しても分離能 は 良好 なままです

中 pH と高 pH

高 pH はタンパク質 の 特性解析 ではあまり 使 用 さ れ ませ ん が、10 ～ 20 mM のNH4OH を移動相添加物 として 使用 すれば、高 pH でも LC/MS を実行できます。

が、感度が低下します。場合によっては、シンプルなポストカラム法でオンライン脱塩/カウンタイオン交換を行

い、TFA をプロピオン酸などの代替酸にすることができ

ます。

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15 アジレントのソリューション

40 年以上にわたる技術革新により、分析結果を支援
ルーチン分析をサポートする技術標準のレベルをさらに引き上げることにより、アジレントは次のような技術革新の実現に向けて研究開発に取り組んでいます。

– 最新の GC カラムにより、不活性度およびカラム間の再現性のレベルが向上– 条件の厳しいアプリケーションでも必要な感度と信頼性を達成する、種類豊富な LC カラム– 信頼性の高い抽出と濃縮を可能にする最先端のサンプル前処理製品– 対象化合物と未知化合物を同定/確認するための原子分光分析ソリューション

アジレントは長い期間にわたってお客様のサポートに全力で取り組んできました。

今後も絶え間ない技術革新により、お客様がさらにメリットを感じていただけるよう、アジレントは努力していきます。

化学分析ソリューション
食品

食品中の農薬の大容量スクリーニングから、病原体の迅速な同定まで、食品生産、輸出入、規制にかかわるさまざまな分析ニーズに対応します。使いやすいアナライザや最新のスクリーニングライブラリにより、堅牢で信頼性の高いメソッドをすばやく開発することができます。業界をリードするアジレントのガスクロマトグラ

フィーおよび質量分析システムは、さまざまな食品分析に用いられ、その性能の高さが広く認められています。

環境分析

アジレントは、環境分析および法規制に関する専門知識を 40 年以上にわたって提供してきました。土壌中の重金属のルーチン検査から地下水中の医薬品の検出まで、ppm レベルの化合物を正確に測定可能な幅広い分析機器を通して政府研究機関および民間ラボをサポートしています。

196

Agilent BioHPLC カラム

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アジレントのソリューション 15

法医学

法医学的調査のための毒物試験、競技者のドーピングのスクリーニング、麻薬のサンプル分析、事件現場での爆発性残留物の調査、そのいずれにおいても装置の精度が生命や人生を左右します。アジレントは、数千種類もの物質を同定、確認、定量できる包括的なワークステーションソリューションのポートフォリオにより、業界をリードしています。

ラボインフォマティクス

データを生成および格納する方法は、ラボの効率に大きく影響しますアジレントは、お客様のワークフロー

やアーキテクチャに基づく機能豊富なソフトウェア製品を、Agilent OpenLab ソフトウェアで幅広く提供しています。OpenLab は、装置やローカルデータシステムの統一化が可能で、高い拡張性により、投資を有効に活用できます。アジレントは、データの収集、解析、解釈、管理までの各ステップで、高い価値を提供することを約束します。

エネルギーと化学

アジレントは、プロセス産業のニーズに合致した、分離システム、検出装置、スループット、サポートを提供します。システムやアナライザをカスタマイズし、納品後すぐに使える状態でお届けすることも可能です。原

油、天然ガス、および精製から特殊化学品または代替燃料の分野に対し、アジレントは業界の厳しい品質要件を満たすと同時に、エネルギーおよび化学ラボの品質、安全性、および収益性を向上する最新の技術とソリューションを提供します。
アジレントは、絶えず進化を続け、業界標準となる ASTM コラボレーションをリードしています。

材料科学

アジレントでは、先進的な物質の研究、製造、および試験に使用される機器のポートフォリオを新たに拡張しました。原子分光分析、分子分光分析、クロマトグラフィーのすべてが、材料科学の継続的な進歩を支え
ています。

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15 アジレントのソリューション

ライフサイエンスソリューション
バイオ医薬品

バイオ医薬品製剤は健康促進のための大きな可能性を秘めており、これまでに経験のない医学上のニーズに対応するために治療用タンパク質および抗体の数は増え続けています。疾病の研究から QA/QC および製造まで、アジレントは、開発のすべての段階で治療法を市場に送り出すための研究をお手伝いします。アジレントの製品ファミリーは、生物製剤のワークフローにおいて、研究、発見、および開発の原動力としてシー
ムレスに連動します。アジレントは、逆相、サイズ排除、イオン交換、およびアフィニティクロマトグラフィーなど、さまざまなカラムを取り揃え、生体分子の完全な特性分析をサポートします。また、バイオイナート消耗品は、生体分離に最適化されたフローの構築を可能にします。

製薬

新薬候補物質の評価、効能の確認、開発および製造時の安全性およびコンプライアンスの保証のための効率的 なプロセスが必要とされています。アジレントは、すべてのラボで、また世界規模でコンプライアンスの信頼性と再現性を保証するために、長年にわたり医薬品企業と協力してきました。アジレントの医薬品ソリューションは、自動サンプル前処理、業界をリードする HPLC および UHPLC システム、幅広い高速 LC カ
ラムファミリ、オープンアクセス LC/MS、分光分析、および自動溶出により、製品ライフサイクルのすべての段階で高いスループットを提供します。LC 消耗品やランプなどの幅広い製品ファミリは、すべての分析の最適化に役立ち、ラボの生産性をさらに向上させます。

プロテオミクス

多様なタンパク質による生物の健康への影響を解明するには、特殊な分析ツールが必要です。アジレントは、
液体クロマトグラフィー /質量分析計、バイオインフォマティクスシステム、多様なアフィニティタンパク質除去
カラム、OFFGEL 電気泳動用消耗品など、タンパク質同定およびバイオマーカー探索のための優れた分析機器を開発しました。精密質量分析計およびマイクロ流体 HPLC-Chip/MS は、世界中のプロテオミクス研究を加速するアジレントの革新技術です。

メタボロミクス

メタボロミクスは、ゲノミクスやトランスクリプトミクス、プロテオミクスとは異なる補完的な方法で生体系を理解し、分析サンプルの有効性を立証および確認することができます。代謝物内の分子は絶えず変化するた
め、速度、精度に優れた強力な解析機能が求められます。アジレントの GC、LC、および MS 製品は、バイ
オインフォマティクス製品、カスタマイズ可能な LC/MS 用の METLIN 代謝物データベース、業界初の商用
GC/MS リテンションタイムロッキング代謝物ライブラリなどとあわせて、メタボロミクスにおけるニーズに対
応します。

198

Agilent BioHPLC カラム

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アジレントのソリューション 15

ゲノミクス

アジレントは、遺伝子関連疾病の研究で使用されるマイクロアレイ、スキャナ、NGS 試薬における世界的なサプライヤです。SureSelect および HaloPlex ターゲットエンリッチメントシステムは、次世代シーケンシン
グを効率化し、この分野に大きく貢献しています。幅広いカタログ CGH および遺伝子発現マイクロアレイに加え、無償のオンラインツール SureDesign で設計したカスタムアレイを作製する先進的なサービスも提供

しています。アジレントのマイクロアレイは、感度が良く選択性が高い 60-mer プローブを搭載しています。1
スライドあたり最大 8 つのアレイをプリントできるため、1 サンプルあたりのコストを抑えることができます。

ライフサイエンスインフォマティクス

アジレントは機器の品揃えを充実させるとともに、複雑なゲノム、プロテオミクス、メタボロミクスなどの生物学的データを理解するためのバイオインフォマティクスソフトウェアも幅広く提供しています。SureCall お

よび CytoGenomics ソフトウェアは NGS および aCGH データを分析します。GeneSpring スイートは、複雑なデータセットを比較して複数の視点から生物学上の疑問を解決するために役立つ、マルチオミックス分
析および視覚化機能を提供します。GeneSpring スイートには、マイクロアレイに基づく遺伝子発現およびジェノタイピングデータのための GX モジュールとパスウェイ解析およびマルチオミック分析のための PA モ
ジュールがあります。また、プロテオミクスおよびメタボロミクス分析の質量分析データを解析する MPP ソ
フトウェアも含まれています。

ラボオートメーション

アジレントは、ますます高まりを見せているスループットと自動化に対する要求に応えるために、ラボの自動化 への取り組みを大幅に拡大してきました。アジレントのリキッドハンドラとマイクロプレートプロセッサ
製品は、大量のライフサイエンスワークフローの効率向上を目指して設計されています。さらに、LC、GC、
LC/MS、および GC/MS 用のオートサンプラを継続的にアップグレードして機能性と速度を高めることにより、高度な機器の性能を向上させています。

真空機器

高エネルギー物理学の実験からナノ技術用のシステム開発まで、お客様のニーズに応える真空ソリューショ

ンを提案します。アジレントの質量分析機器に加え、他社メーカーの質量分析機器でも使用される真空シス
テムを製造しています。アジレントの真空技術は、ヒッグス粒子の検出に使用された CERN のビッグバンマ
シンにより実証されています。

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16 アジレントのサービスとサポート

サービスとサポート
充実したサポートサービス

アジレントは、お客様のラボのパフォーマンスを最適化するための方法を常に追及しています。だからこそ、お客様の必要とするツールを確実に提供することができます。アジレントにお任せいただければ、幅広いサー

ビスと、ラボの生産性向上に精力的に取り組む経験豊かなアジレント認定サービスプロフェッショナルのグ
ローバルネットワークのサポートにより、投資を最大限に保護することができます。

Agilent CrossLab サービスプラン

アジレントサービス
ギャランティ

メーカーを問わず、Agilent

ご使用のアジレント機器に最適なサービスを提供

CrossLab サービスプラン

Agilent CrossLab サービスは、お客様のニーズと予算に合 わせてお選びいただける包括的 なメンテナンスの 対 象 機 器 を 修 理 できなだけます。

ションプロセスで、機器の無サービスです。アジレントの幅広いサービスプランの中から、お客様に必要なレベルのサービスをお選びいた– Agilent CrossLab ゴールド―基幹システムに最適なプレミアムサービス– Agilent CrossLab シルバー―生産性を最大化し、ワークフローの中断を最小化– Agilent CrossLab ブロンズ―タイムリーな修理サービス、予算をコントロール

Agilent CrossLab バーチャルテクニカルサポートにより、最新のビデオコミュニケーションツールを用いてリかった 場合 は、 エスカレー

償交換 などにより問題 を解消します。**利用規約が適用されます。

モートでライブのテクニカルサポートを受けられます。アジレントの Virtual Assist アプリケーションは、安全なビデオ接続を使用して、お客様とアジレント双方のプライバシーを保護します。このアプリケーションはデジタ

ル注釈をサポートしているため、お客様とアジレントのサービスエンジニアが対象をハイライトできます。リモー

トで問題を解決するために、明確な指示を提供します。これにより、徹底的なトラブルシューティングや故障診断を確実に実施できるようになり、リモートサポートでの解決率の向上とダウンタイムの低減を実現できます。

Agilent CrossLab コンプライアンスサービス

ラボのコンプライアンス確保をサポート

アジレントは、USP <1058> 分析機器適格性評価（AIQ）に 基 づく機器 およびソフトウェア 適格性評価（IQOQ、OQ、RQ）などの包括的なラボコンプライアンスサービスや、コンピュータシステムのバリデーション、
監査/評価、お客様専用の手順書の作成など、幅広いカスタムバリデーションサービスなど、さまざまなサー

ビスを提供しています。お客様のコンプライアンス確保を支援するため、自動コンプライアンスソリューション

を使用して、分析機器適格性評価（AIQ）のプロセス全体をサポートします。自動コンプライアンスエンジン

Agilent CrossLab によりラ ボ のることのできる、監査に対応した電子形式の適格性評価ソリューションです。

agilent.com/chem/crosslab（Automated Compliance Engine: ACE）は、次のようにデータインテグリティと使用目的の要件に対処す– 複数のプラットフォームにわたってプロトコルを調整することで、監査リスクを必要最小限に抑え、適格性

可能性を最大化評価の効率を向上させます– お客様のすべての機器で利用可能で、プロトコルを確実に遵守する堅牢なテスト設計により、コンプライア
ンス業務全体を標準化します– SOP に従ってテストを構成し、仕様を選択できます– 電子形式で適格性評価の計画と報告を行い、確認/承認の時間とコストを削減すると同時に、データイン
テグリティを確保し、データの保管、検索、取得を容易にします

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Agilent BioHPLC カラム

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アジレントのサービスとサポート 16

アジレントの機器トレーニングとメソッドサービス
科学的・経済的に最も望まれる成果をAgilent CrossLab と提携して、ラボ運用を変革し、実務に生かせる実践的スキルを高めましょう。新しい手法の要点を学習し、高度な方法論で実際に役立つ応用事例をマスターしましょう。

– メソッドの開発から維持まで、ワークフローを強化するメソッドおよびアプリケーションサービスを利用できます– 新しい技術や既存の技術に結果を移管して最適化するためのトレーニングやメソッドのサポートは、機器にバンドルする形で、または単独でも提供されています– お客様のニーズやご予算にあった柔軟なトレーニングオプションを提供しています。トレーニングはオンラインまたはクラスルーム形式で、お客様の施設でも受講可能です– お客様はアジレントのオンライン Cloud Lab ソリューションを使用して、ソフトウェアの使い方を学習できます

アジレントバリュープロミス - 製品の価値を 10 年間保証

絶えず進化する製品ラインナップに加え、アジレントは 充実したサポートサービスを提供しています。アジレントバ

リュープロミスは、ご購入の日から 10 年間、製品の性能と価値をサポートするというものです。また、代替モデルにアップグレードする際には、製品の残存価値に見合った導入プランをご提供します。アジレントのシステムを支えるバ

リュープロミスは、最高の投資収益率を実現し、機器を安心してご購入いただけるようにするためのプランです。詳細はホームページをご覧いただくか、アジレントサービスまたは販売店にお問い合わせください。

お客様第一のテクニカルサポート

ハードウェア、ソフトウェア、アプリケーション、機器の修理、またはトラブルシューティングに関する質問にアジレントの技術エキスパートがお答えします。長年に渡るラボ経験を持つアジレントのテクニカルサポー

ト担当者が、深い知識と経験にもとづいてお客様をサポートします。本カタログに掲載された製品に関するご質問は、担当営業またはアジレントの販売店にお問い合わせください。

お問い合わせホームページをご覧ください。

– エキスパートによるテクニカルサポートをご利用いただけるお近くのアジレントオフィスまたは販売店を見つけることができます– お急ぎの場合は、電話でご購入および製品についてご相談いただけます。
– メールによるサポートはオンラインフォームからご利用いただけます

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www.agilent.com/chem/jp

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ホームページ

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カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。
本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。
RA45107.4572916667

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2019-2023
Printed in Japan, October 2023
5994-6123JAJP