TALK ABOUT 21
札幌医科大学 医療人育成センター 教授 藤井 博匡

生体内で生成するフリーラジカル種とその検出について1 はじめにしていると考えられるようになり，そフリーラジ

れから数年後，白血球が殺菌作用を示カルと呼ばれすとき，白血球膜にある酵素（NADPHる不対電子をオキシダーゼ）は爆発呼吸と呼ばれる持った物質が，急激な酸素消費を起こし，これがスー

今から 110 年

パーオキシドの生成のための酸素消費ほど前，ドイツであることを米国の Babior ら 2）が明の Gomberg により発見された（表１らかにした。その後，ミトコンドリア参照）。フリーラジカル分子では，電子での電子伝達系においてもスーパーオが対を作らない，いわゆる孤立電子の状キシドの生成が明らかとなり，また，態で存在するため，一般に不安定で化学血管の拡張・収縮をコントロールして反応性が高い。このようなフリーラジカ

いる， 血管弛緩因子（EDRF） が一ル分子が反応の過程で生成することが明

酸化窒素 NO であることが明らかにさらかになってきたが，私たちの体の中でれ，21 世紀を前にして，生体内でフは起こりえない反応だと考えられていリーラジカルが生成していることは明た。1960 年代にはいり，酸化還元酵白な事実となった 3）。

素やペルオキシダーゼの反応機構の研究が進むにつれ， 生体の中でもフリーラ

2 生体内で発生するフリーラジジカルを伴う反応が起こっているのではカルについてないか と考えられはじめた。そのよう殺菌時，白血球からのスーパーオキ

1）な折に，米国の McCord と Fridovich

シド生成が見いだされてから，生体内はスーパーオキシドラジカルを消去で作られるフリーラジカルは活性酸素する（つまり，スーパーオキシドを過と呼ばれてきた。活性酸素とは，白酸化水素に不均化する反応）酵素で血球から生成するスーパーオキシドあるスーパーオキシドジスムターゼ（O2 ）や，O2 から二次的に合成され（superoxide dismutase: SOD）がる一連の酸素化合物のことである。し赤血球内に存在することを発見した。

かし白血球から生成された O2 から不SOD は赤血球中に多量に存在するこ均化反応により生成する過酸化水素はとから，赤血球内でスーパーオキシドフリーラジカルではないため，定義上の発生を阻害するために SOD が存在の注意が必要である。活性酸素であり

表1 生体内フリーラジカル発見の歴史について

著者略歴
1979年 東京工業大学大学院理工学研究科（高分子工学）終了 工学博士
1983年 米国オハイオ州立大学
Biochemistry部門客員助教授
1987年 東京都臨床医学総合研究所研究員
1999年 札幌医科大学保健医療学部教授
2008年より現職

主な学会活動・受賞歴
2007年

日本磁気共鳴医学会優秀論文賞受賞

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｜生体内で生成するフリーラジカル種とその検出について｜

フリーラジカル物質であるーのは，O2 ，ヒドロキシラジカル（OH・），脂質過酸化物（LOO・），一酸化窒素（NO

注：通常 NO・とは書かず，孤立電子を省略した記載が多いので，本稿でも省略した記載を用いた）等である。現在は，活性酸素と呼ぶよりも Reactive
Oxygen Species（ROS）と呼ばれている。発見された当時は，生体内で作られーR・は，スーパーオキシド（O2 ）やヒドロキシラジカル（OH・）である。

たフリーラジカルは組織障
図1 スピントラッピング法について害性を示す原因分子である，とだけ考えられていたが，その後，3.2 短寿命のフリーラジカルを如何多量に作られたフリーラジカルは細胞にして検出するか？

障害性を示すのは勿論であるが，少量

3.3 スピントラッピング法 6-8）
活性酸素フリーラジカルは一般に短一般に検出しようとしている

フ寿命である。このような不安定で短寿のフリーラジカル分子は生体内で重要リーラジカル分子は短寿命である。

命なフリーラジカルを定量的にESR法な情報伝達因子として機能しているこ

生体内で生成する代表的なフリーラで観測するためにはフリーラジカルのとも明らかとなってきた。

ジカルであるスーパーオキシドや一寿命を延長させて安定化し，そのESR酸化窒素の水溶液中での寿命（半減スペクトル測定を可能とさせる スピン

3 フリーラジカルの測定法に期）は数秒で，より反応性の高いヒトラッピング法ついてドロキシラジカルになるとマイクロる。その例を図１に示した。スーパー

3.1 フリーラジカル検出手法として秒程度となる。それでは，このようオキシドやヒドロキシラジカルなどのの電子スピン共鳴法

な短寿命ラジカルを如何にして ESR活性酸素フリーラジカルを，DMPO活性酸素フリーラジカルを検出するで検出すれば良いのであろうか？歴6）（5,5-dimethylpyrroline N-oxide），数々の手法が開発されてきた。しかし，史的には，測定対象試料を凍結し低6）PBN（phenyl-tert-butylnitrone），これらの手法の中で常磁性である活温下で ESR スペクトルを測定して観DEPMPO（5（Diethoxyphosphoryl）-性酸素フリーラジカルを直接的に捕測できたラジカル種を同定するとい5-methyl-1-pyrroline N-oxide）7），らえることが可能なのは電子スピンう 手 法 が と ら れ て い た。 本 手 法 はCYPMPO （5-（2,2-dimethyl-1,3-共 鳴 法（Electron Paramagnetic

急 速 凍 結 法 と 呼 ば れ ，x a n t h i n epropoxy cyclophosphoryl）-5-methyl-Resonance: EPR 法 あ る い はoxidase から生成されたスーパーオ1-pyrroline N-oxide）8）と呼ばれていElectron Spin Resonance: ESR

キシドラジカルの定量化に活用される二重結合を持ったnitrone系の化合法とも呼ばれる。本稿では ESR 法とた。しかし，本手法を生物そのもの物と反応させることによってフリーラする）である。ESR 法は，試料の形には適用しにくく，凍結試料の自動ジカルを安定化させ，その化合物の寿状を選ばない（液体，固体，気体の酸化によるアーティファクトとして命を延ばすという手法がとられてい試料でも測定可能）という特色があのスペクトルの発生などの問題がある。一方，NOの捕獲は，鉄キレートり，特に動物体内で発生する活性酸ることから，現在はほとんど利用さ剤（Fe（ⅠⅠ）とdithiocarbamate誘導

素フリーラジカルについての情報をれなくなった。以下に現在フリーラ体との錯体）にNOを配位結合させる得ることが可能な点が優れている手ジカルの検出に使われている 2 つのことによってNOを安定化させる手法

法である。

手法について記載する。

が用いられている9）。

4-6）が広く利用されていSCAS NEWS 2010 -Ⅰ 4

TALK ABOUT 21
スピントラッピング
法では，スピンアダクト（フリーラジカルとスピントラップ剤とが反応して生成する化合物）の寿命が延長してそのスペクトルを測定できるのはもちろんであるが，アダクトのESR スペクトル解析から捕獲したラジカル種を決定できる点も大図2 DMPOによるスーパーオキシドおよびヒドロキシラジカルの捕獲後のESRスペクトルきな特徴である。図２に，DMPO がスーパーA）ニトロキシドとヒドロキシルアミン体は酸化還元反応で相互変換する。

オキシドとヒドロキシラジカルをそれぞれトC）CMHとxanthine oxidase系との反応（上図は，＋SOD，下図は−SOD）ラップした時のスペクトルを示した。スペク
トル線型の違いからトラップしたラジカル種を識別し同定することが可能である。

B）フリーラジカル検出に利用される代表的なヒドロキシルアミン体CMH

3.4 フリーラジカルの 間 接 的 測 定 法： ニトロキシドの利用について 10,11）
スピントラッピン
グ法によるフリーラ

図3 ニトロキシド化合物の酸化還元反応

ジカル検出は in vitro 系や ex vivo 系

ニトロキシド化合物は還元反応を受けhypoxanthine をヒドロキシルアミンにおいて多くの成果が得られた。しかるとヒドロキシルアミン誘導体へと変体（代表的なヒドロキシルアミン体

し，小動物の体内で発生するフリーラ化する。ニトロキシド化合物は常磁性

CMH を図３B に示した）に添加するジカルをスピントラッピング法で捕獲を持っており ESR 信号が観測できると，ニトロキシドの ESR スペクトルして in vivo ESR 装置でそのスペクトが，ヒドロキシルアミン化合物になるが観測される（図３C 参照）。これは，ルを検出するのは測定感度とアダクトと反磁性体となり ESR 信号を失う。

スーパーオキシドによりヒドロキシル量がごく微量であることから非常にその一方，ヒドロキシルアミン体は酸アミンが酸化されてニトロキシドと難しい。そこで，実験動物を用いた化反応を受けるとニトロキシドに戻りなったためで，この系にスーパーオキ

in vivo 系でもフリーラジカルの検出ESR 信号が再び観測できるようにな

シドスカベンジャーである SOD を添やフリーラジカルが関与する疾患の解り，この特性をフリーラジカルの測定加しておくと，ESR 信号の出現を大析を可能とする間接的手法が開発されに 利 用 す る よ う に な っ た（ 図 ３A）。

部分抑えることができ，以上の結果かた。この間接的手法では，ニトロキシスーパーオキシド生成酵素系である

らヒドロキシルアミン体がスーパーオド化合物を利用する（図３を参照）。

xanthine oxidase と 基 質 で あ るキシドを捉えていることが分かる。

5 SCAS NEWS 2010 -Ⅰ

｜生体内で生成するフリーラジカル種とその検出について｜

4 フリーラジカルのイメージング

ニトロキシドをマウスに投与した際のNO アダクトの生成による造影効果にについて撮像例を示した。ニトロキシドは脳内より NO 生成部位が特定できている。

ニトロキシド分子は常磁性であるこへ拡散して画像強度を上昇させているとから，水分子の緩和時間を変化させことが分かる。このようなフリーラジることが可能である。これを利用する

カル分子の造影効果を活用すると，生In vitro 系における ESR 法を利と，核磁気共鳴法による画像化，つま体内で生成するフリーラジカルを画像用 し た フ リ ー ラ ジ カ ル の 検 出 法 と，り MRI（magnetic resonanceとして視覚化することが可能となる。

in vivo 系での MRI によるフリーラジimaging）によりニトロキシド分子の炎症性疾患モデル動物の体内で生成するカルのイメージング法の例を示した。

分布を観測可能である。図４に，濃度NO を画像化した例を図５に示した

12）。

In vivo ESR 法を用いたフリーラジの異なるニトロキシドを含んだ水溶液

敗血症モデルラットの肝臓において生

カルのイメージングは積極的に進めからなるファントムの MRI 画像を示成する NO をスピントラップ剤によりられており，詳細は文献を参考にしした。ニトロキシドは水の縦緩和時間捕獲し，常磁性である NO アダクトのていただきたい ５）。ESR イメージン（T1）を短縮するため造影剤として働造影効果から NO 生成部位を MRI で

グと MRI における融合イメージング

き，濃度とともに画像強度が変化して検出した例である。NO 生成後の肝臓化も進められており，本手法の発展いることが分かる（図４A）。図 4B に，

では，画像強度が著しく上昇しており，が期待されている。

A）5本チューブから成るファントムで，3本のチューブにはニトロキシド水溶液が入っている（10mM, 5 mM, 2.5 mM）。2本のチューブは水のみが入っている。

B）ニトロキシド投与前後でのマウス頭部のMRI画像。

図4 ファントム及びマウス頭部のMRI画像

敗血症モデルラットにNOトラップ剤を投与し経時的にMRI画像を撮像した。
左画像は，NOトラップ剤投与直後でのMRI画像，右画像はトラップ剤投与60分後でのMRI画像。

5 おわりに文 献
1）McCord JM. et al.: Superoxide dismutase. An
enzymatic function for erythrocuprei. J. Biol.
Chem., 244: 6049-6055, 19692）B a b i o r B M. e t a l.: B i o l o g i c a l d e f e n s emechanisms. The production by leukocytes ofsuperoxide, a potential bactericidal agent. J.
Clin. Invest., 52: 741-744, 1973
3）Ignarro LJ. : After 130 years, the molecularmechanism of action of nitroglycerin isrevealed. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:7816-7817, 2002
4）In: Eaton GR. et al. eds. EPR imaging and invivo EPR. Boca Raton: CRC Press, 1991.
5）In: Berliner LJ, ed. Biological magnetic
resonance‒Volume 18: In vivo EPR (ESR)
theory and applications. New York: Kluwer
Academic/Plenum Publishers, 2003.
6）In: Berliner LJ, ed. Biological magnetic
resonance‒Volume 8: Spin labeling theory andapplications. New York: Plenum Press, 1989.
7）Frejaville C. et al.: 5-(Diethoxyphosphoryl)-5methyl-1-pyrroline N-oxide: a new efficientphosphorylated nitrone for the in vitro and invivo spin trapping of oxygen-centered radicals.
J. Med. Chem., 38: 258-65, 1995
8）K a m i b a y a s h i M. e t a l.: S y n t h e s i s a n dcharacterization of a practically better
DEPMPO-type spin trap, 5-(2,2-dimethyl-1,3propoxy cyclophosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline
N-oxide (CYPMPO). Free Rad. Res., 40: 11661172, 20069）Lai CS. et al.: Spin trapping of nitric oxide
produced in vivo in septic-shock mice. FEBSLett., 345: 120-124, 1994
10）Fink B. et al.: A new approach for extracellularspin trapping of nitroglycerin-induced
superoxide radicals both in vitro and in vivo.
Free Rad. Biol. Med. 28: 121-128, 200011）Matsumoto K. et al.: High-resolution Mappingof tumor redox status by magnetic resonanceimaging using nitroxides as redox-sensitive
contrast agents. Clin. Cancer Res. 12: 24552462, 200612）Fujii H. et al.: In vivo imaging of spin-trapped
nitric oxide in rats with septic shock: MRI spin
trapping. Magn. Reson. Med. 42: 235-239,
1999

図5 敗血症モデルラットのMRI画像SCAS NEWS 2010 -Ⅰ 6