植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能
神戸大学大学院農学研究科

水野雅 史、久 世雅樹

We have reported that a glycosylceramide (GlcCer) showed improvement in skin barrier function in mice. Only the
GlcCer from pineapple (P-GlcCer) showed the activity among other plant-derived GlcCers. We supposed the specificactivity would be originated from the chemical structure of P-GlcCer, especially the moiety of sphingadienine (SD) would
have the responsibility for the specificity. Here, we reported the investigation of the structure-activity relationships between
the cis/trans geometries of sphingadienines (SD- 1 ~ 4 ) and their biological activities. The challenge was initiated to establish
the stereoselective synthesis of sphingadienines (SD- 1 ~ 4 ). The stereoselective hydrogenolysis of ene–yne was employed
to construct the diene moiety. The ene–yne units were prepared by stereoselective addition of acetylide ions of ene–yne
units to Garner’s aldehyde. Wittig reaction and Johnson–Claisen reaction afforded the required starting ene–ynes. Lindlar
catalyst reduced alkyne to afford cis olefin, on the other hand, Red-Al reduction afforded trans olefin. By combination of
Wittig/Johonson–Claisen reactions and Lindlar/Red-Al reductions, stereoselective syntheses of SD- 1 ~ 4 were achieved.
Cytotoxicity of SD- 1 ~ 4 was checked by MTT assay. These compounds showed no cytotoxicity against RBL- 2 H 3 cells
at the concentration of 4 . 71 µg/ml. To confirm the anti-allergic activity of SD- 1 ~ 4 , RBL- 2 H 3 cells were preincubatedwith each geometric SDs before sensitization of anti-DNP IgE and challenge of DNP-albumin. β-Hexosaminidase released
into supernatant was measured as an index of its degradation. It was demonstrated that 4 cis, 8 cis-SD possessed the highest
activity compared with the other three ones.

1. 緒

養系腸管疑似モデル 2）を用いることで、グルコシルセラミ

言ドが直接作用しているのではなく、腸上皮細胞から吸収さスフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、皮膚角質層のれる際に生成された脱グルコース化したセラミドそのもの

主要な細胞間脂質として約 50 % を占めており、高い保湿が機能していること、および小腸でのインターロイキン

効果とバリア機能で肌トラブルを防ぎ、うるおいを保ち健（IL）- 23 mRNA 発現が間接的に関与していることも明ら康な肌を維持することから、美肌成分として多くの基礎化

かにしている。そこで各種植物由来グルコシルセラミドに粧品に配合されている。また最近になり、これらを経口摂も、同様の機能があるかをこのモデル系を用いて確かめた

取した際にも抗腫瘍や抗炎症効果を示すなど、食品機能成

ところ、P-GlcCer でのみ活性が認められた。一般に植物分として注目を集めている。我々の研究グループでは、植由来グルコシルセラミドは構造上スフィンゴイド塩基部分

物由来のセラミド成分に着目し、その皮膚炎症状の改善効が多様であり、スフィンガジエニン中にシス体とトランス

果における作用機序を解明することで、皮膚バリア機能の体が存在することが知られている。このことを加味すると、改善・向上を可能にするコスメとして将来的に利用するた

P-GlcCer のみに活性が認められた要因がスフィンゴイド

めの学術基盤の形成を目指している。

塩基部の構造に起因していると考えられた。そこで我々

皮膚に乾燥症状を引きおこす特殊飼料 HR-AD を食餌とは P-GlcCer の代謝物が皮膚炎の回復に寄与しているのでして与えられたマウスに、パイナップル由来グルコシルはないかという仮説を立て、セラミド中のスフィンゴイ

セラミド（P-GlcCer）を経口投与すると皮膚炎症状の改善

ド塩基部分、特に 4 , 8 - スフィンガジエニンの二重結合が1）がおこることを報告している 。さらにその作用機序は、

cis:cis, cis:trans, trans:cis, trans:trans の四種異性体を合成

HR-AD によって引きおこされる血中 TGF（Transforming

し、共培養系腸管疑似モデルを用いて IL- 23 mRNA 発現

Growth Factor）-β 量の減少を P-GleCer が元の状態まで回を指標に、食品成分であるグルコシルセラミドのうちどの復されるためであることを明らかにした。またその作用

ような立体構造を有していれば皮膚改善能をもたらすのか

は、我々の研究室で新たに構築した培養細胞を用いた共培を明らかにすることを目的とした。

＊

Structural Property and Improvement
Activity of Skin Barrier Function by
Sphingoid Diene in Plant-Derived
Glucosylceramide
Masashi Mizuno＊, Masaki Kuse
Graduate School of Agricultural, Kobe
University− 140 −

2. 方法

2 . 1. スフィンガジエニン異性体の完全化
学合成

スフィンガジエニンの異性体が四種合成できれば、P-GlcCer の異性体は既知の手法で合成できる。このスフィンゴイド塩基部分を効

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

率よく化学合成するために収束的な合成経路を立案した。

4 , 8 -sphingadienine をそれぞれを SD- 1 ~ 4 と呼ぶ（Figure

一般にアルキンを還元する際、①水素化アルミニウムリ

１）。

チウムではトランス還元が、② Lindlar 触媒ではシス還元

SD- 1 ~ 4 は、中間体（1 , 2）における 4 - 5 位炭素であるアが選択的に進行するので、目的とする異性体を選択的にルキン部分を、cis もしくは trans 選択的に半還元（アルキ合成できる。そこで、あらかじめ選択的オレフィン化反ンをアルケンに還元）することで合成できると考えた。そ応により合成した末端アルキンと、セリンから誘導した

して、中間体（1 , 2）は Garnerʼs アルデヒド（3）への末端アGarner’s aldehyde とを結合し、cis あるいは trans のオレルキン（4 , 5）のアセチリドイオンのジアステレオ選択的なフィンを持つ末端アルキンをそれぞれ用意し、それらを付加反応により得られると考えた。末端アルキン（4 , 5）は、

①および②の方法を用いて選択的に還元することでスフ

目的物において 8 - 9 位炭素に該当する二重結合が cis もしィンゴイド塩基の異性体四種を合成することにした。4 - 5

くは trans として選択的に合成されている（Scheme 1）。

位炭素と 8 - 9 位炭素が cis/trnas で作り分けられた 4 種のFigure 1 P-GlcCer と 4 種類の 4,8-sphingadienine の異性体（SD-1~4）

Scheme 1 4 種類の 4,8-Sphingadienine の幾何異性体の逆合成解析− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

2 . 2 . 各異性体の細胞毒性

3. 考

4 種の SD の細胞毒性は、MTT アッセイにより評価した。RBL- 2 H 3 細胞を 2 . 0 × 105 cells/well で 24 穴プレー察

3 . 1. Garner’s aldehyde の合成

トに播種し、RPMI 1640 培地中にてオーバーナイトでイ報告されている方法に基づいて Garner’ s aldehyde（3）ンキュベートした。培地を除去し、試験試料を含む培地をの 合 成 に 取 り 組 ん だ 4 , 5）。N-Boc-L- セ リ ン メ チ ル エ ス

添加して 37 ℃で 6 時間インキュベートした。培地を除去し、テル（6）（Boc: t-Butoxycarbonyl）を出発原料とし、ジメ

MTT 溶液（1 . 21 mM in RPMI 1640 , 110 µL）を細胞に添加

トキシプロパン、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体

し 2 時間後、MTT 溶液を除去し、DMSO（200 µL）
を添加（BF 3 · OEt 2）と反応させ、環状アミナール（7）
を収率 98 ％でした。マイクロプレートリーダーで 570 nm の吸光度を測得た。得られた環状アミナール（7）を水素化アルミニウム定した。細胞生存率はコントロール群と比較して算出した。

リチウム（LiAlH 4）で還元することでアルコール（8）を収率

2 . 3 . 抗アレルギー活性測定

89％で得た。このアルコール（8）を種々の条件下でPCC（ピ

3）

リジニウムクロロクロメート）と反応させたが、副反応がRBL- 2 H 3 細胞を 2 . 0 × 10 cells/well で 24 穴プレート

起きてしまい、精製を行っても純粋な目的物を得ることはに播種し、RPMI 1640 培地中にて一昼夜培養した。試験難しかった。そこで、Swern 酸化での酸化を試みたところ、試料を含む培地を添加して 37 ℃で 2 時間インキュベート

反応が良好に進行し、収率 93 ％で Garnerʼs aldehyde（3）した。終濃度 200 ng/mL の抗 TNP IgE 抗体を添加し、4を得た（Scheme 2）。

5

時間培養した。すべての培地をシラガニアン緩衝液（SB ;4 0 mM NaOH, 2 5 mM PIPES, 5 . 6 mM glucose, 0 . 1 %3 . 2 . Garner’ s aldehyde への立体選択的なアルキンの求核付加反応

BSA, pH 7 . 2）に置き換えた後、終濃度 20 ng/mL の TNP-得られた Garnerʼs aldehyde（3）に対して、1 - ペンタデ

BSA を添加し、37 ℃で 1 時間反応させた後、プレートをシン（9）をモデルアルキンとして用いて、立体選択的な求氷上に 10 分間静置し脱顆粒反応を停止させた。上清 50

核付加反応の条件検討を行った（Scheme 3）6）。その結果、µL を 96 穴プレートに移し、等量の基質（0 . 2 M クエン酸緩Lam と Mendez らが報告している条件 7）であるエントリー

衝 液 中 に p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide を

4 で最も良い選択性が得られた（Table 1）。

1 1 9 mM NaCl, 5 mM KCl, 0 . 4 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 ,終濃度 1 mM で溶解 , pH 4 . 5）と混合して 37 ℃で 1 時間反100 µL/well で添加し、反応を終了させた。マイクロプレ

3 . 3 . アルキン（10）の 4 位炭素の cis/trans 選択的な半還元反応ートリーダーで 405 nm の吸光度を測定することで、酵素得られたアルキン（10）を用いて幾何選択的に還元を行い、4反応生成物である p-nitrophenol を定量し、これを β- ヘキ位炭素の幾何制御に取り組んだ。まず、trans 体の合成から

ソサミニダーゼ遊離量の指標とした。上清中の β- ヘキソ

取り組んだ。アルキン（10）をRed-Alで還元したが 8 , 9）、反応

サミニダーゼ遊離率は、脱顆粒誘導群の遊離量に対する百は進行せず原料回収という結果であった。Boc 基が大きいた

分率として算出した。

めに Red-Al が反応点に近づくことができないために、反応応させた。停止液（0 . 2 M glycine-NaOH 溶液 , pH 13 . 0）をScheme 2 Garner’ s aldehyde の合成− 142 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能が進行しなかったと考えた。そこで脱保護の後に還元を試行い、モデル体であるアルケン（16）を 2 段階収率 25 ％でみた。まずアルキン（10）を p-トルエンスルホン酸（TsOH）

得た（Scheme 5）。以上により 4 位炭素の幾何制御の方法で処理し、その後トリフルオロ酢酸で処理することでアルが確立できた。

キン（13）を 2 段階収率 34％で得た。得られたアルキン（13）を Red-Al と反応させると、収率 45 ％で目的の trans アルケン（14）
が得られた（Scheme 4）。

3 . 4 . （5 E）- 5 -Pentadecen-1-yne（4）の合成
次に、8 位炭素の cis/trans 幾何制御の方法を確立する

次は cis アルケンの合成に取り組んだ。アルキン（10）を水素雰囲気下、リンドラー触媒存在下10）研究に取り組んだ。市販の decanal（17）を出発原料とし、、メタノール溶

ビニルマグネシウムブロミドと反応させ、アルコール（18）

媒中で撹拌すると、定量的に目的の cis アルケン（15）を得を収率 96 ％で得た。得られたアルコール（18）を過剰のオた。続いて trans アルケンを合成した時と同様に脱保護をルト酢酸トリエチル中、プロピオン酸存在下で加熱する

Scheme 3 Garner’ s aldehyde へのアセチリドイオンの付加
Table 1 立体選択的な求核付加反応の条件検討 .

Scheme 4 4-5 位アルキン部における trans 選択駅な半還元

Scheme 5 4-5 位アルキン部における cis 選択駅な半還元− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ことで、Johnson-Claisen 転位反応を引きおこし、アルケ

ド（27）を NaH で処理し、アルデヒド（24）と Wittig 反応さン（19）を trans 選択的に収率 84 ％で得た。得られた E- ア

せたところ 11）、収率 47 ％でオレフィン（5）を得た（Scheme

ルケン（19）を LiAlH 4 と反応させて、収率 96 ％でアルコ7）。以上により 8 位炭素の cis/trans 幾何制御を達成した。

ール（20）を得た。続いて得られたアルコールと PCC を反ヒド（21）とトリフェニルフォスフィン、亜鉛、四臭化炭

3 . 6 . スフィンガジエニンの 4 種異性体
（SD-1~ 4）の合成

素との反応により収率 13 ％でジブロモアルケン（22）を得

すべての合成単位の選択的な合成経路が確立できたので、応させ、収率 80 ％でアルデヒド（21）を得た。このアルデた。さらにこのジブロモアルケン（22）を n-BuLi で処理すSD- 1 ~ 4 の合成に取り組んだ。

る Corey-Fuchs アルキン化反応により収率 56 ％で（5 E）

3 . 6 . 1. （E）- 4 , 8 -スフィンガジエニン（SD-1, 2）の合成- 5 -pentadecen- 1 -yne（4）を得た（Scheme 6）。

Garnaer’ s アルデヒド（3）に対して、アルキン（4）のアセ
チリドイオンを付加させて、化合物 28 を得た。脱保護し3 . 5 . （5 Z）- 5 -Pentadecen-1-yne（5）の合成て化合物 29 へと誘導したのち、Red-Al で還元することで、次に cis 体の合成に取り組んだ。アルコール（23）から

trans/trans のスフィンガジエニン（SD- 1）の合成を達成しPCC 酸化によりアルデヒド（24）を収率 72 ％で得た。次にた（Scheme 8）。

ブロモデカン（25）をアセトン溶媒中で NaI と反応させるこ

次に、アルキン（4）のアセチリドイオンを Garner’s アとで収率 95 ％でヨードデカン（26）を得た。得られたヨー

ルデヒド（3）に付加させ、化合物 28 を合成した。これをドデカン（26）をトリフェニルホスフィンとトルエン溶媒

Lindlar 触媒下、加水素分解により 30 を合成した。最後に中、還流条件下で 24 時間反応させることで、ホスホニウ

脱保護することで、cis/trans スフィンガジエニン（SD- 2）

ムヨージド（27）を収率 99 ％で得た。ホスホニウムヨージの合成を達成した（Scheme 9）。

Scheme 6 （5E）-5-Pentadecen-1-yne（4）の合成

Scheme 7 1-Bromodecane からのビルディングブロック（5）の合成− 144 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

3 . 6 . 2 . （Z）- 4 , 8 -スフィンガジエニン（SD- 3 , 4）の合成

ルデヒド（3）に付加させ、化合物 31 を合成した。これをGarnaer’s アルデヒド（3）に対して、アルキン（5）のアセ

Lindlar 触媒下、加水素分解により 33 を合成した。最後にチリドイオンを付加させて、化合物 31 を得た。脱保護し脱保護することで、cis/cis スフィンガジエニン（SD- 4）のて化合物 32 へと誘導したのち、Red-Al で還元することで、合成を達成した（Scheme 11）。

trans/cis のスフィンガジエニン（SD- 3）の合成を達成した（Scheme 10）。

以上、4 - 5 位炭素と 8 - 9 位炭素が cis/trans で作り分けられた 4 種の 4 , 8 -sphingadienine（SD- 1 ~ 4）の完全化学

最後に、アルキン（5）のアセチリドイオンを Garner’ s ア

合成を達成した。

Scheme 8 SD-1 の合成

Scheme 9 SD-2 の合成

Scheme 10 SD-3 の合成− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Scheme 11 SD-4 の合成

3 . 7. 異性体四種の抗アレルギー効果
P-GlcCer の代謝物が皮膚炎の回復に寄与しているのではないかという仮説を立て、セラミド中のスフィンゴイ
ド塩基部分、特に 4 , 8 - スフィンガジエニンの二重結合が
cis:cis, cis:trans, trans:cis, trans:trans の四種異性体を合成し、共培養系腸管疑似モデルを用いて IL- 23 mRNA 発現を指標に、食品成分であるグルコシルセラミドのうちどのような立体構造を有していれば皮膚改善能をもたらすのかを明らかにすることを目的とした。しかしながら、実際共培養系を用いて管腔側から試料を添加した際、Caco- 2 細胞によって代謝されるため、IL- 23 mRNA 発現を指標にす

Figure 2

ることができないことが分かった。そこで合成した異性体

スフィンガジエニンによる細胞毒性

四種の生理活性を明らかにするため、感作された肥満細胞
RBL- 2 H 3 に対する合成した 4 種のスフィンゴイド塩基の抗アレルギー効果を検討した。
桑田ら 1） の報告では、P-GlcCer を Caco- 2 細胞に添加した際、54 . 8 % が代謝されると報告している。したがって、本実験では、グルコシルセラミド 80 µg/mL の濃度でCaco- 2 細胞に添加した場合に、代謝産物がすべて 4 , 8 - ス
フィンガジエニン（SD）に変換されたと仮定して、その濃度（4 . 71 µg/mL）における RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒に与える影響を評価した。4 , 8 -SD の RBL- 2 H 3 細胞活性化抑制
効果の評価を行うにあたり、まずは四種 SD が 4 . 71 µg/mLで細胞毒性を示すかどうかを確認した。その結果、Figure2 に示すとおり所定濃度では細胞毒性は認められなかった。

Figure 3

スフィンガジエニンによる肥満細胞活性化抑制効果

次に、四種 SD の立体異性体による RBL- 2 H 3 細胞の βヘキソサミニダーゼ放出率を評価した。抗原抗体添加群

4. 考（Positive control）で β- ヘキソサミニダーゼ放出率は有意察に増加し、4 cis, 8 trans-SD、4 cis, 8 cis-SD を添加したと

本研究では、収束的な合成経路によるスフィンゴイド塩

ころ β -ヘキソサミニダーゼ放出率は有意に抑制され、特基の異性体四種（SD- 1〜 4）の化学合成経路の確立を目指に 4 cis, 8 cis-SD において最も抑制率が高く約 10 % であっした。4 - 5 位アルキン部分の還元では、モデル化合物を用た（Figure 3）。

いて条件検討を重ねた結果、トランス還元では Red-Al に− 146 −

植物由来グルコシルセラミド中のスフィンゴイドジエンの構造特性と皮膚改善機能

よる還元が最適条件であった。この際、出発物質の保護基

effects of food factors through the intestine. J.

はすべて脱保護しておくことが必須であった。それは、立Immunol. Meth., 435, 1-6, 2016.

体障害による Red-Al の接近を妨げないことが重要であっ

4） P. Garner, J. M. Park, E. Malecki, A stereodivergent

たと考えられた。シス還元では、Lindlar 触媒による水素

synthesis of D-erythro-sphingosine and D-threo-

化反応が有効であった。アルカンまでの過剰な還元反応を

sphingosine from L-serine, J. Org. Chem., 5 3, 4 3 9 5-防ぎつつ、シス選択的に還元することができた。SD- 1 〜

4398, 1988.

4 の前駆体は、Garner アルデヒドへの ene–yne のアセチ

5） P. Herold, Synthesis of D-Erythro- and D-Threo-

リドイオンの付加反応が効果的に進行した。反応条件につSphingosine Derivatives From L-Serine, Helvetica

いて精査した結果、−40 ℃の低温で反応を行うと高選択

Chimica Acta, 71, 354-362, 1988.

的に付加反応が進行し、前駆体を得ることができた。アセ

6） M. Passiniemi, A.M. P. Koskinen, Garner’ s aldehyde

チリドイオンの原料となる ene–yne の合成では、Johnson

as a versatile intermediate in the synthesis ofClaisen 反応を利用すると trans の ene-yne が選択的に合成

enantiopure natural products, Beilstein J. Org. Chem.,

できた。Wittig 反応を利用した cis の ene-yne 合成が最も

9, 2641-2659, 2013.

難しい段階であった。種々の反応条件と出発物質を精査す

7） L. Wong, Sheryl S. L. Tan, Y. Lam, A. J. Mendez,

ることで、cis の ene–yne 合成手法が確立できた。こうして、

Synthesis and Evaluation of Sphingosine Analogues as

cis/trans の 4 種類立体異性体である SD- 1 〜 4 の合成経路

Inhibitors of Sphingosine Kinases, J. Med. Chem., 5 2,を確立することができた。また、肥満細胞由来の培養細胞

3618-3626, 2009.

RBL- 2 H 3 を用いた 4 種類立体異性体の抗アレルギー活性8） I. V. Overmeire, S. A. Boldin, F. Dumont. S. V.

を測定した結果、4 cis, 8 cis-SD に最も高い活性が見られた。

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