無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立とin vivo 薬効評価系の構築
明治薬科大学微生物学研究室

松本靖彦

Cutibacterium acnes is a causative agent of inflammatory skin diseases such as acne vulgaris. In this study, weestablished a silkworm infection model to evaluate the host toxicity caused by C. acnes, and the efficacy of antibacterial
drugs. Silkworms infected with C. acnes died when reared at 37˚C. The dose of injected bacterial cells required to kill
half of the silkworms (LD50) was determined under rearing conditions at 37˚C. The viable cell number of C. acnes wasincreased in the hemolymph and fat body of the infected silkworms. The survival time of silkworms injected with C. acnes
was prolonged by the injection of antibacterial drugs such as tetracycline and clindamycin. Acute melanization, an innate
immune response of silkworm, was induced by infection of C. acnes, but not by that of Staphylococcus aureus that causesa skin disease such as atopic dermatitis. Co-infection of C. acnes and S. aureus on the skin surface of silkworms led to skinmelanization. These findings suggest that the silkworm C. acnes infection model can be used to evaluate host toxicity andinnate immune response caused by C. acnes.

１．緒

難な化粧品開発において重要な代替動物になると考えられ言る。一般にカイコなどの無脊椎動物は、哺乳動物と比べて、皮膚は多数の細菌から構成される細菌叢によって健常な1 動物を飼育するためのコストが低い皮膚バリア機構を維持している。しかし、バランスを保っ2 狭いスペースで大量の個体が飼育可能ている皮膚細菌叢が何らかの原因によって崩壊することで3 脊椎動物に比べ殺傷に対する倫理的問題が少ない

尋常性ざ瘡やアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患が発

4 個体サイズが小さく、実験に必要なサンプル量が少ない症 す る。Cutibacterium acnes（Propionibacterium acnes）
が尋常性ざ瘡の起因菌であると考えられており、これまでなどの利点が挙げられる。また、化合物のカイコへの毒性にマウスを用いた尋常性ざ瘡の実験モデルが確立されていや抗生物質の治療効果は、マウスやラットなどの哺乳動物

1）る 。このような動物を用いた化合物の評価系は化粧品やと類似している 3 , 4）。よって、カイコは、化合物の薬効や医薬品の開発に重要である。

毒性に関する研究を行う上で有用な実験動物である 5）。し哺乳動物を使った動物実験の場合、国際指針である 3 Rs
（Reduction, Refinement, Replacement）を遵守して研究を
2）

かし、これまでにカイコを用いた炎症性皮膚疾患モデルは確立されていない。

遂行しなければならない 。すなわち、多数の哺乳動物をカイコにおける自然免疫機構の一つに体液のメラニン化用いて実験を行うことは動物愛護などの倫理的側面から困反応がある。メラニン化は、細菌や真菌などの外来の異物難になってきており、有効な化合物の探索研究などの基礎が体内に侵入すると体液内でメラニンを生成させて、侵入研究を行う上で生じる倫理的な問題が今後はもっと深刻にした異物を凝集させる反応である。このカイコにおける体なると予想される。

液のメラニン化と Toll 経路を介した免疫応答は同じシグナ

我々は、これらの問題点を克服する方法の一つとして、無脊椎動物であるカイコの利用を提案している。無ル伝達経路を介する 6）。よって、カイコにおけるメラニン化反応は、自然免疫誘導の指標となり得る。

脊椎動物であるカイコを用いることは、Replacement の中本研究で我々は、カイコを用いて C. acnes に対する治療で記載されている下等生物を用いた代替実験手法の確立

薬の薬効を評価できるカイコ感染モデルを確立した。また、（Relative Replacement）のコンセプトと合致している。よカイコの体液のメラニン化を指標とした C. acnes の免疫活って、カイコは哺乳動物を用いた基礎研究を行うことが困性化の評価系を構築した。さらに、C. acnes と黄色ブドウ球菌の共感染によるカイコの皮膚のメラニン化が誘導される感染実験系を確立した。

Development of an in vivo drug efficacy
evaluation system and a skin infectionmodel using an invertebrate
Yasuhiko Matsumoto
Meiji Pharmaceutical University

２．方法

2 . 1. 菌の培養本研究で我々は、C. acnes ATCC6919 株、及び黄色ブドウ球菌Newman株を使用した。C. acnes ATCC6919 株の培− 142 −無脊椎動物を用いた革新的な皮膚感染モデルの確立と in vivo 薬効評価系の構築

養では、菌を GAM 寒天培地に塗布し、嫌気条件、37 ˚C に色ブドウ球菌の生菌をオリーブオイルで懸濁して、ガーゼおいて 3 日培養した。黄色ブドウ球菌 Newman 株の培養でに染み込ませて消毒した部位に貼付した。カイコを 37˚C では、菌を TSB 寒天培地に塗布し、好気条件、37˚C で 1 日培飼育し、24 時間後にガーゼを剥がしてカイコの背面の写真養した。

を撮った。

3．結2 . 2 . カイコ感染実験カイコの卵は、愛媛蚕種から購入して、消毒後に 25 ˚C で果3 . 1. カイコ感染モデルの開発孵化させた。カイコは、Silkmate 2S という抗生物質を含変温動物であるカイコは、飼育温度を変えることでカイむ人工餌を与えられた。5 齢のカイコを実験に用いた。5コの体温を調節でき、病原微生物ごとにカイコに対する齢のカイコに人工餌である Silkmate 2 S を 1 日給餌させた。

病原性に至適な飼育温度が異なる 7）。C. acnes は皮膚上でGAM 寒天培地上で生育した C. acnes を生理食塩水で懸濁しはおよそ 32 ˚C で生存し、ヒトの体内では 37 ˚C で生存する。

た。C. acnes の懸濁液 50µL を 1mL ツベルクリンシリンジ

そこで我々は、C. acnes がカイコに対して病原性を示す飼を用いてカイコに接種した。C. acnes を接種したカイコを育温度を検討した。C. acnes のカイコへの接種後 37 ˚C での27 ˚C、もしくは 37 ˚C で飼育し、カイコの生存数、もしくは飼育では、カイコに C. acnes を接種して 40 時間後に全て体液中の C. acnesの生菌数を測定した。のカイコが死亡し、32 ˚C での飼育条件より早くカイコが死亡した（図 1 A、B）
。37 ˚C での飼育条件における C. acnes

2 . 3 . カイコの体液のメラニン化試験のカイコを半数を死亡させるために必要な接種菌量である人工餌を一晩摂食した 5 齢のカイコに C. acnes や黄色ブLD 50 値は、1 - 4 × 108 細胞であった（図 1 C）
。これらの結果

ドウ球菌の菌液を注射後にカイコの体液を回収した。96 ウから、37 ˚C 飼育条件の方が、C. acnes の接種によりカイコェルマイクロプレートにカイコの体液を 50µL と生理食塩が死亡しやすく、その条件で定量的な病原性の評価に利用

TM水を 50µL を添加した。BaioRad の iMark

マイクロプレーできるLD 50 値が算出できることが示唆された。次に我々は、
C. acnes の接種によるカイコの死が、カイコの体内での菌トリーダーを用いて 490nm の吸光度（A 490）を測定した。

数の増加による感染であるか検討した。C. acnes をカイコ

2 . 4 . カイコの表皮感染によるメラニン化に接種して 1 時間後より 24 時間後の方がカイコの体液中、人工餌を一晩摂食した 5 齢のカイコの背面の体表を 70 %及びカイコの脂肪組織である脂肪体での C. acnes の生菌数エタノールで清拭し、30 分間室温に置いた。C. acnes と黄が多かった（図 2）。また、C. acnes のオートクレーブ処理

図 1 C. acnes によるカイコの感染死
カイコに C. acnes を接 種 後 に 32˚C（A）、及び 37˚C（B）で飼育し、それぞれの条件におけるカイコの⽣存率を経時的に測定した。
（C）
カイコ感染実験における C. acnes の⽤量依存性試験。独⽴した 3 回の実験結果を⽰した。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

菌体ではカイコが死亡しなかった（図 3）。これらの結果かカイコに抗菌薬であるテトラサイクリンやクリンダマイシら、カイコに対する C. acnes の病原性が細胞壁などの菌体ンを投与すると、カイコの生存時間が延長した（図 4）。こ成分によるショック死ではなく、生菌であることが必要なの結果から、C. acnes のカイコ感染モデルを用いて in vivo感染であることが示唆された。

での抗菌薬の薬効評価が行えることが示唆された。

3 . 2 . カイコ感染モデルを用いた抗菌薬の評価

3 . 3 . C. acnes によるカイコの体液のメラニン化

次に我々は、C. acnes によるカイコに対する病原性に対

C. acnes によるカイコの体液のメラニン化を免疫誘導能して抗菌薬が効果を示すか検討した。C. acnes を接種したの指標として評価できる条件の検討を試みた。C. acnes の

図 2 カイコの体液、及び脂肪体における C. acnes の増殖（A）コ感染実験のスケジュールを⽰した。カイコに C. acnes を接種して 1 時間後、及び 24 時間後に体液（B）、及び脂肪体（C）を採取し、C. acnes の⽣菌数を測定した。

図 3 熱処理による C. acnes のカイコに対する毒性の消失（A）
カイコに C. acnes の⽣菌、及び⾼圧蒸気滅菌した C. acnesを接種してカイコの⽣存率を経時的に測定した。
（B）C. acnesの菌体サンプルを接種して 48 時間後のカイコを⽰す。

図 4 抗菌薬の投与による C. acnes が感染したカイコの延命効果
カイコに C. acnes を接種後、すぐにテトラサイクリン（A）、及びクリンダマイシン（B）を接種し、⽣存率を経時的に測定した。

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カイコへの接種後に 37 ˚C の飼育条件で 3 時間以内にカイ皮膚でのメラニン化が誘導された（図 7）。これらの結果は、

コの体液の黒色化が確認された（図 5）。次に C. acnes 以外

C. acnes によるカイコの皮膚上でのメラニン化の誘導に黄のグラム陽性細菌と免疫誘導能を比較するために、表皮に色ブドウ球菌が補助的な役割を演じる可能性を示唆してい存在してアトピー性皮膚炎の増悪化に関わる黄色ブドウ球る。

菌を用いて検討した。C. acnes を接種した方が黄色ブドウ4．考

球菌よりカイコの体液のメラニン化が亢進していた（図 6）。
以上の結果は、C. acnes が黄色ブドウ球菌よりカイコの免疫を強く誘導する活性があることを示唆している。

察

本研究で我々は、C. acnes の宿主障害性を評価するための実験条件を見出し、C. acnes のカイコ感染モデルを用いた抗菌薬の薬効評価系を確立することができた。また、カ3 . 4 . C. acnesと黄色ブドウ球菌の共感染によるカイコの皮膚のメラニン化

イコの免疫応答であるメラニン化の亢進を指標に C. acnes

C. acnes の菌体をカイコの皮膚に塗布することでカイコ

C. acnes と黄色ブドウ球菌の共感染により、カイコの皮膚の皮膚でのメラニン化が起こるか検討した。C. acnes や黄にメラニン化が起こる条件を見出した。我々は、C. acnesの過剰免疫応答を評価できることが示唆された。さらに、

色ブドウ球菌の単独感染ではカイコの皮膚上のメラニン化の誘導は起こらなかった（図 7）。一方、C. acnes と黄色ブドウ球菌をカイコの皮膚上で共感染させることでカイコの図 5 C. acnes によるカイコの体液のメラニン化
カイコに C. acnes を接種し、カイコの体液を経時的に採取し、490 nm の吸光度を測定した。

図 6 カイコの体液のメラニン化の誘導における細菌間の⽐較
カイコに C. acnes、及び⻩⾊ブドウ球菌（S. aureus）を接種して 3 時間後にカイコの体液を採取し、490nm の吸光度を測定した。

図 7 C. acnes と⻩⾊ブドウ球菌の共感染によるカイコの体表のメラニン化
C. acnes、及び⻩⾊ブドウ球菌（S. aureus）をオリーブオイルで懸濁してガーゼに染み込ませてカイコの体表に貼付した。感染させて24 時間後のカイコの体表を⽰す。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022のカイコ感染モデルを用いた抗菌薬の評価やカイコのメラて採用することは次世代の化粧品開発の基盤的技術としてニン化を基軸とした皮膚感染モデルの確立ができたと考え重要性は高いと考えられる。ている。
カイコに病原性微生物を接種させた時に菌体成分による
8）

謝辞

ショック死が起こることがある 。歯周病菌をカイコに接本研究の遂行にあたり、ご支援いただきました公益財団

種するとカイコは死亡するが、その熱処理死菌でもカイコ法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げは死亡する 8）。このショック死の条件だと抗生物質で治療ます。

8）することはできない 。本研究での C. acnes のカイコ感染モデルでは、熱処理死菌の投与ではカイコが死なず、また本研究助成により得られた成果抗菌薬で治療ができることから、カイコの体内で C. acnes

Matsumoto Y, et al, Evaluation of Antibacterial Drugsが増殖することがその病原性に重要であることが考えられUsing Silkworms Infected by Cutibacterium acnes.

る。

Insects, 12 : 619（2021）尋常性ざ瘡は C. acnes による過剰免疫応答による疾患である。哺乳動物細胞において、この C. acnes の菌体成分に（引用文献）

よる過剰免疫応答には Toll like Receptor が関与している。

1） Kolar SL, et al., Propionibacterium acnes-induced

カイコのメラニン化反応も菌体成分を認識して Toll 経路のimmunopathology correlates with health and disease

活性化と並行して起こる免疫応答である 6）。よって、我々

association. JCI Insight, 4:e124687（2019）

はカイコのメラニン化反応を定量することで C. acnes の免

2） Weihe WH. Use and misuse of an imprecise concept:

疫誘導活性を評価できるのではないかと考えている。さらalternative methods in animal experiments. Lab Anim.,に、C. acnes と黄色ブドウ球菌をカイコの皮膚上で共感染

19:19-26（1985）

させることでカイコの皮膚でのメラニン化が誘導された。

3） Usui K, et al, Acute oral toxicity test of chemical

黄色ブドウ球菌は、溶血毒素やプロテアーゼなどの表皮細compounds in silkworms. Drug Discov Ther., 10:57-61

胞を障害するタンパク質を放出する。黄色ブドウ球菌が表（2016）

皮細胞を障害した後に C. acnes のメラニン化の誘導物質が4） Paudel A, et al, Pharmacokinetic parameters explain

真皮に届き、メラニン化を誘導した可能性があると考えて

the therapeutic activity of antimicrobial agents in aいる。

silkworm infection model. Sci Rep., 8:1578（2018）

本研究では、カイコで炎症性皮膚疾患を引き起こす C.

5） Matsumoto Y. Facilitating Drug Discovery in Humanacnes の宿主障害性や免疫誘導活性の評価ができる可能性

Disease Models Using Insects. Biol Pharm Bull.,が示された。今後は抗菌薬や化粧品の候補となる化合物の

43:216-220（2020）
6） Geng T, et al, Lineage-specific gene evolution of

薬効評価が行えるかが課題となるだろう。

５．総

innate immunity in Bombyx mori to adapt to challenge括by pathogens, especially entomopathogenic fungi. Dev

本研究で我々は、C. acnes の体液内への摂取によりカイComp Immunol., 123:104171（2021）

コが死亡すること、並びにそのカイコ感染モデルを用いて

7） Matsumoto Y, and Sekimizu K, Silkworm as an

抗菌薬の薬効評価が行えることを見出した。我々の知見は、

experimental animal for research on fungal infections.

カイコ感染モデルが C. acnes の感染における病原性や抗菌

Microbiol Immunol., 12:619（2019）

薬の薬効評価に有用であることを示唆している。カイコを

8） Ishii K, et al, Porphyromonas gingivalis peptidoglycans用いた実験は哺乳動物を用いた実験より倫理的な問題を回induce excessive activation of the innate immune

避する上で有用であると考えられる。今後さらに厳しくな

system in silkworm larvae. J Biol Chem., 285:33338-47

る動物実験の制限に対応する上で、カイコを実験動物とし（2010）− 146 −