角層細胞間脂質の組成制御による膜透過性ペプチドの経皮吸収に関する研究
千葉科学大学薬学部生命薬科学科

坂 本

一 民

Skin is the largest organ in the body as a barrier to protect life from environment. Key element of the skin barrier
function relies on the structure and function of Stratum Corneum Intercellular Lipids (SCLP). Impairment of SCLP incomposition or structure and function causes malfunction of skin or even diseases such as Atopic dermatitis. On the other
hand, controlled temporal perturbation of skin barrier function could lead desirable Trans Dermal Drug Delivery System(TDDS).  
The objective of this study is to establish a novel method for the Percutaneous Absorption of Cell Penetrating Peptide(or Protein Transduction Domain : PTD) in Relation to the SCLP as an ideal TDDS. Key feature of this TDDS is the
combination of SCLP composition and PTD’s ability of non invasive membrane penetration. Based on the altered ratio of
sphingosine (So) and sphinganine (Sa), which increases from normal to atopic skin condition, model SCLP mixtures arecomposed and evaluated in terms of barrier function and physicochemical properties.
Atopic Skin (AS) model showed impaired barrier function for the release of Rhodamine- B (RhoB) encapsulated in the
SCLP liposome, though there are no differences on the physicochemical properties between AS and Normal Skin (NS) or
3M (Basic SCLP composition without Sphingo lipids). This result, caused by the scares changes of structure and function of
SCLP as a whole, indicates the possibility to control barrier function by means of changing SCLP composition.
PTD is a good candidate to combine SCLP composition with its non-harmful spontaneous penetration through thecell membrane. But little is known for its spontaneous translocation mechanism. We have investigated the effect of surface
curvature of cell membrane by means of changing outer osmotic pressure. As a result, positive curvature change by
decreasing Osmotic Pressure stimulated PTD penetration. Our proposition of the mechanism that PTD introduces local
and temporal dynamic transformation of the membrane structure to mesh phase is thus confirmed. Combination of SCLP
composition change and PTD application would lead us to create a novel and ideal TDDS.

１．緒に、通常イオントフォレシスやソノフォレシス、マイクロ言

ニードルといった物理的な構造破壊手段を用いて薬物の吸1）

皮膚は身体最大の臓器であり、外部環境との境界を成し収促進が行われている 。これらの手法は、化粧品のようている事から、経皮吸収型薬剤投与の有用性は十分認知さに皮膚への作用が緩和である事を前提に万人が使用する製れている。しかしながら、皮膚が生体と外界を隔て正常な品では、頻回塗布（使用）に対する安全性の保証やハンド

生体機能を保護・維持する防御機関であるがゆえに、そのリングの簡便性が実用上の難点である。

構造と機能を損なわずに経皮的に薬剤を投与することは容一方、バリア疾患病と言われるアトピー性皮膚炎（Atopic

易ではない。皮膚は、表面から表皮、真皮、皮下組織の三Dermatitis：AD）の発症要因解析から角層の脂質組成が層からなり、表皮の最外相には角層と称される死んだ細胞

バリア機能の重要な因子であることが判明しつつあり、の累積層が存在する。角層の細胞間隙にはセラミド、コレ

SCLP の組成とその構造及び機能の関係を知ることは、バ

ステロール、脂肪酸などの脂質を構成成分とした角層細胞

リア性欠陥に起因する皮膚疾患の治癒のための薬剤開発お間脂質膜（SCLP ; Stratum Corneum Intercellular Lipids

よび健常性維持のための化粧品の製剤化において意義ある

図１）が存在し、多重ラメラ層を形成することによって皮課題と考えられる。そこで、本研究はまず角層細胞間脂質

膚の主たるバリア機能を担っている。一般に SCLP を通る膜（SCLP） のモデル組成リポソームを構築し、その自己ルートが薬物透過における主な経皮吸収経路と言われてお組織体としての相挙動と形態変化を物理化学的手法で解析

り、薬物はバリア壁として存在している SCLP を透過しなし、バリア性との関係を明らかにする事を試みた、次にそければならない。このような堅固な SCLP を透過するための知見を基に膜透過性ペプチド（PTD） を薬剤担体とし、2）3）

生体に不快な負荷を与えず部位選択的かつ放出制御下に薬Pe r c ut a n e o u s Ab s o r pt i o n o f C e l l
Penetrating Peptide in Relation to the
Lipid Composition of Stratum Corneum
Intercellular Lipids
Kazutami Sakamoto
Faculty of Pharmacy, Chiba Institute of
Science

効成分を経皮的に投与する、新たな経皮 DDS システム
4）

（TDDS）を構築する事を目的に実施した （図１）。
AD は湿疹の発生や皮膚の異常乾燥といった角層バリアの機能欠陥による皮膚疾患であるが、近年生命科学的視点からの AD 患者及び健常者の比較研究で、SCLP におけるセラミドの組成や種類が大きく関与している事が明らかに− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

されてきた。内田らは AD モデルマウスの角層中のセラミ見出されてきた。これは、生体膜のバリア機能を超越する

ドおよびスフィンゴ脂質含有量を分析した結果、セラミド現象で、新たな DDS キャリアとしての期待から多くの研の代謝物であるスフィンゴ脂質組成が健常マウスと異なる究がなされている。PTD は塩基性アミノ酸に富むペプチ

ことを明らかにし、AD におけるバリア機能低下と関連す

ドで HIV ウイルス由来の TAT ペプチド5）8）

6 , 7）

やそのモデルるとの仮説を立てた 。ここで明らかになった脂質全体の物質としての Arg の８量体（R 8） など多種の存在が知らわずか４−６mol % を構成するスフィンゴ脂質の組成変化れている。PTD はそれ自身のみならず、タンパク質や種々とバリア機能に注目してモデルリポソームを構築し、SDSの薬物さらにはリポソームなどを結合させても、さまざまの作用による内包された蛍光標識物質の透過性を検討したな細胞膜を透過することが実証されているが、その機構に結果、微量構成成分であるスフィンゴ脂質の組成が AD についてはいまだに定説がない。PTD の膜透過方式には小おけるバリア機能低下と相関する事を見出した 。本研究

胞体として内包化されるタイプの種々の Endocytosis（Eはこれらの結果を踏まえ、スフィンゴ脂質の組成の違いが透過）と、膜を越えて直接細胞質に移行する Cytosolysis（C

膜物性に影響を与えていると考え、これを透過機序解明に透過）が知られ（図２）、E 透過では細胞内部でさらに細胞繋げることを目的にモデル組成の脂質膜に関する物理化学

質（Cytosol）への移行を必要とする 。一方、C 透過は直的な視点による解析を行った（図１）。

接的な透過故に DDS キャリアとしてより有効である。

5）9）

一方、人体における角層の役割と同様に細胞における生

このような背景の下、筆者らは数年来経皮デリバリーに
2 , 10 , 11）

命維持の基本は細胞質（Cytosol）が細胞膜によって外界と関わる研究を推進してきた隔てられ、物質の膜内外への移動の制御と細胞内での代謝を物理化学（界面科学）的視点から統合して SCLP の脂質が恒常的に調節されている事にある。ところが、近年チャ組成による構造と機能の変化を理論的に解析・実証し、ネルやレセプターなどの関与なしに直接細胞内に透過する

SCLP に対する PTD の透過性を随意に制御できるインテ

物質として、種々の膜透過性ペプチドドメイン（PTD）がリジェント経皮薬物送達システム（DDS）開発の研究基盤。本報ではこれらの研究

図１ 角層細胞間脂質（SCLP）の組成制御による膜透過性ペプチド（PTD）の経皮吸収シス
テムの構築

図２ PTD の膜透過機構（A）：Endocytosis および（B）：Cytosolisis R8-Alexa to Hella Cell
9）
Futaki et al, PNAS , ACS Chem. Biol. 1（5），299-303（2006）− 72 −

角層細胞間脂質の組成制御による膜透過性ペプチドの経皮吸収に関する研究

2 , 5）

確立を目指す（図１）。なお、本報告では PTD については

いた

SCLP への適用の前段階として、通常の生体膜成分である成を用いたモデルリポソームを調製した（表１）。リポソ

リン脂質（PC）を用いた巨大リポソーム（GUV）に対するームは各脂質をクロロホルムに溶解させ混合、N 2 ガスに膜透過機構解明を行い、その理論を応用した PTD の SCLP

より乾燥させた後、溶媒完全留去のため遮光下で１日減圧への適用は今後の課題とした。

乾燥を行い、PIPES 緩衝液を加え 80℃湯浴中でボルテッ

２．実
２.１

（図３）。本研究では内田らが明らかにした脂質組

クス撹拌と超音波照射により調製した。評価は偏光顕微鏡験（PM）、示差走査熱量計（DSC）、小角 X 線散乱（SAXS）、

SCLP の脂質組成による構造と機能の変化

全反射フーリエ変換赤外分光法（ATR-FTIR）、蛍光異方試薬として角層細胞間脂質の主要成分であるセラミド 2性測定を用いて行った（図４）。

（Cer 2：Matrava製）、パルミチン酸（PA：東京化成）、コレステ
ロール（Chol：和光純薬）、またセラミドの代謝関連物質である

２. ２

PTD の PC のリポソーム膜（GUV）透過性

スフィンガニン（Sa、D-erythro-dihydrosphingosine：Matrava）、

リン脂質として卵黄レシチン（E-PC）を用いた。膜透過

スフィンゴシン（So、D-erythro-sphingosine：Matrava）を用ペプチド（PTD）はアルギニン８個のオリゴマーである R 8

図４

図３

モデル SCLP 構成に用いた試薬

表1

SCLP 混合モデルの脂質組成

モデル SCLP リポソームの調製法とその評価法− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013に、蛍光標識としてフルオレセインイソチオシアナート

していた蛍光物質を漏出させるために Triton X- 100 を用（FITC）を付加した FITC-R を用いた（図５）。GUV は定いた（図７）。また、PTD の GUV への透過性実験の際の法で調製し（図６）、外相水の浸透圧はリン酸緩衝液（PBS）

E-PC 膜の安定性は、予め GUV に内包させたローダミン B

濃度で調製した（表２）。透過量測定にあたり、超遠心に（RhoB）の漏出から判定した。

8

よって沈殿させたリポソームの GUV 膜を破壊して、内包

図５
表2

PTD の膜透過機構解明に用いた試薬

PTD 透過性試験における PBS 濃度と浸透圧

図６

図７

PTD の膜透過性試験法− 74 −GUV の調製法

角層細胞間脂質の組成制御による膜透過性ペプチドの経皮吸収に関する研究

温過程においてスフィンゴ脂質添加系の NS、AS では 3 M

３．結果と考察と異なる局所液晶組織像発現を確認したが、組成の相違に

３.１ 微量スフィンゴ脂質の組成による SCLP の構造と機能の変化

基づく明確な液晶発現温度や構造の違いは確認されなかった。

表１に示す各組成のモデル脂質混合物（3 M, NS, AS）か

３つの組成に関する SAXS 測定結果を図 11 に、NS におら生成したリポソームの FF-TEM 像およびこれらのリポ

け る SAXS 測 定 の 温 度 依 存 性 を 図 12 に 示 す。 図 11 よ り

ソームに内包させた Rho B の漏出性を図８に示した。図８

SAXS 測定において、スフィンゴ脂質添加系である NS、から明らかのように、3 M および NS（正常）に比べ、AD

AS のプロファイルはほぼ一致した。各サンプルの小角領

モデルマウスの脂質分析結果に基づく AS は顕著な漏出が域にラメラ相形成を示すピークが確認されたが、3 M では認められ、内田らの SDS を用いた結果と一致する微小なラメラ相の 1 次ピークにスフィンゴ脂質添加系との違いがスフィンゴ脂質比に起因するバリア性の低下が確認された。

認められた。広角領域では各サンプルにおいて、ヘキサゴ

次にこれらモデル組成の物理化学的性質を調べた 。３ナル側方充填を示す q= 17 nm （○）のピークと、斜方晶

つの SCLP モデル組成の結果を代表する NS の偏光顕微鏡

側方充填を示す q= 17 nm （○）及び 15 nm （●）のピー（PM）観察結果を図９に、DSC 測定結果を図 10 に示す。

ク が認められた。

2）

−1

−1

−1

2）

これらの測定は１℃ /min、25℃～ 120℃の温度プログラ

また、各サンプルとも温度上昇に伴うラメラ相を示すピムで実施した。パルミチン酸由来と示唆される昇温におけークの位置及び形状変化が認められ、温度上昇により脂質

る DSC の吸熱ピーク前後の温度領域では固体から液晶及の充填が緩み液晶状態となったことが示唆された（NS のび液体の共存状態への変化が見られ、降温における二つのみ図 12 に表示、AS、3 M は省略）。これは偏光顕微鏡観察

発熱ピーク間の温度領域では液体状態のサンプル中にマルの結果（図９）と相関するものである。ATR‐FTIR 測定

ターゼクロスの形成が見られた。これらの結果より偏光顕からアシル鎖のメチレン基に由来する CH 2 伸縮振動によ微鏡画像と DSC との相関が確認され、脂質混合物は局所って側方充填のコンホメーションの秩序を知ることができ

相分離を引き起こしていることが明らかとなった。また昇る。また、CH 2 はさみ振動によりヘキサゴナル側方充填な

図９

図８ 各モデルリポソームの FF-TEM 像（A）：NS、（B）：AS、（C）：3M およびリポソームからのRhoB 漏出率（３時間後）− 75 −

図 10

SCLP 混合物の偏光顕微鏡 (PM) 観察結果
（NS モデル組成）

SCLP 混合物の DSC 測定結果（NS モデル組成）

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

らシングレット、斜方晶側方充填ならダブレットとなるこ

以上の結果、リポソームからの溶出試験では AD におけとも知られている。しかしながら各組成ともこれらのピー

るスフィンゴ脂質の微小組成変化に対応するモデルでバリクの強度や形に差異は認められなかった。
（データ省略）ア性低下を再現したが、物理化学的手法での構造及び機能

３つの組成に関する蛍光異方性測定結果を（図 13）に示

解析では３つのモデル間に差異を認めることはできなかっす。DPH を蛍光プローブとして用いた蛍光異方性の温度た。これは系全体を平均化して測定判別する DSC や SAXS

依存性を各組成サンプルについて比較検討した。その結果、では組成間の顕著な相違は見られない、すなわち脂質組成

図 13 に示すように３組成とも同様の温度依存性を示した。

により脂質膜全体の構造変化は起こらないが、PM 観察で

図 11

図 12

SCLP モデル組成の SAXS 測定における組成依存性（25℃）

SCLP モデル組成の SAXS 測定における温度依存性（NS モデル組成）

図 13

蛍光異方性測定結果（蛍光プローブ；DPH）− 76 −

角層細胞間脂質の組成制御による膜透過性ペプチドの経皮吸収に関する研究示唆されたように局所的な充填密度の不均一さといった微

その組成と添加量を変えることによる SCLP のバリア性の小領域での膜物性変化が生じ、これにより AD におけるバ

制御あるいは改善の可能性を示唆するものと期待される。

リア性低下が生じているものと推定される。
比（So/Sa）を一定に保ちながら全体に占める割合を表１

３. ２ リポソーム 膜（GUV） を生体 膜モデルとした
PTD の透過機構の検討の約５% から段階的に増加することによるバリア性および緒言で述べた通り、PTD の膜透過方式には膜を越えて物理化学的性質への影響を継続検討している。その結果、直接細胞質に移行する Cytosolysis（C 透過）と、小胞体とスフィンゴ脂質の増加に伴っていずれの組成においてもリして内包化される種々の Endocytosis（E 透過）とが知ら

ポソームのバリア性低下が観測され、さらに SAXS や蛍光れ（図 14）、E 透過では細胞内部でさらに細胞質（Cytosol）

異方性において温度に依存した構造と機能変化（温度の上への移行を必要とするため、直接的な透過である C 透過が昇で脂質の配向性・運動性が顕著に変化する）も認められ

DDS キャリアとしてより有効である。E 透過についてはている。これはバリア性低下の原因である表 1 のモデル組

種々の機構が提唱され、PTD の透過にも温度変化や受容成における局所的不均一性（ミクロドメイン生成）が、ス

体の影響が確認されているが、C 透過を説明する機構は確

フィンゴ脂質の添加量増加で系全体に影響を示した為と考立されていない。

以上の結果をもとに、現在表 1 のスフィンゴ脂質の組成えられる。他方で、筆者らは角層細胞間脂質膜（SCLP）の

我々は先に PTD をリン脂質系ラメラ液晶に添加すると配向構造と運動性がバリア性の鍵である事を電子スピン共平衡状態での液晶構造が添加量増加とともに臨界充填因子

鳴法（ESR）で明らかにしている。これらの知見を集（CPP：Crytical Packing Parameter） が減少する結果、積し解析することによって、スフィンゴ脂質の役割更には界面の曲率が増大する方向、すなわちラメラ液晶（La 相）

10 , 11）

図 14

図 15

12）

PTD の透過機構

平衡系でのリン脂質が形成する自己組織体の PTD（R8AcOH）添加による構造転移− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013から両連続液晶（V 1 相）次いでヘキサゴナル液晶（H 1 相）ち C 透過が実現する。一方細胞質内の PTD は内相の PC 表

へと変化する事を示した（図 15）。La 相と V 相の間にはメ面に吸着しても曲率が負の方向である為、逆向きのプロセッシュ液晶（M 1 相）の存在が知られており、La 相からスでの外相への漏出は抑制されるので、効率的・効果的なM 1 相への転移エネルギーは極めて少ない事から、生体膜

C 透過が達成され DDS として有用なキャリアとして期待

表面と PTD の相互作用によって局所的かつ一時的な動的

できる。

1

13）

変化として界面曲率の増大により M 1 相が生じれば C 透過

そこで、本研究ではこの仮説を証明する為に、赤血球おが起こりうると考え、界面曲率の調整による PTD の透過

よび GUV を用い、外相の浸透圧調整によってその界面曲性制御法を提案した （図 16）。すなわち強いカチオンで率を変化させた時の PTD の透過性変化を調べた。赤血球ある PTD（R 8）がバルクから生体膜を構成する PC のリンを例に外相の浸透圧変化による形状および膜の曲率変化を酸基との相互作用で膜表面に吸着し、その結果液晶状態に

図 17 に示した。この曲率制御にあわせて PTD の透過性をあって流動性を持ち、配向性にゆらぎのある PC 分子が局調べたところ、図 18 に示すように、いずれの場合も外相

所的・非平衡的にメッシュ相を形成し内相へと移動する。

の浸透圧を下げ、膜の界面曲率を増大させると、PTD が透過した PTD は細胞質（Cytosol）に溶解した状態すなわ

脂質との相互作用により局所的非平衡的に La 相から M 1 相

14）

図 16 PTD の膜透過機構（a）PTD の膜表面吸着、（b）細孔形成（メッシュ構造への転移）、（c）PTD の膜透過、（d）PTD の膜（リポソーム）内移行（R8AcOH）
添加による構造転移

図 18

図 17

外層浸透圧と赤血球の形状変化

PTD の膜透過性における外層浸透圧の影響− 78 −

角層細胞間脂質の組成制御による膜透過性ペプチドの経皮吸収に関する研究への相転移を起こして C 透過しやすくなる事を示した。こにある。すなわち、現象論の吟味とその応用が主なためにれに対し、外相の浸透圧を上げ膜曲率を減少させると、見過ごされてきた PTD の膜透過が「何故おこるか」を、PTD が透過するにはこれに抗して局所の膜曲率を増大さ

PTD と生体膜の相互作用による動的・局所的な自己組織せねばならない為、C 透過が抑制された。GUV を用いた体の構造変化の現象と捉えることで、生体膜の構造と機能

PTD の透過実験において、図 19 に示すように PTD キャリの本質の探索を目指すことが可能になる。さらに、この成アである R 8（アルギニンオリゴマー）の無い蛍光団（FITC）

果に基づき C 透過および E 透過の選択およびそれぞれの透のみでは浸透圧によらず透過しない事、および予め GUV

過性を制御する方法の開発に着手し、TDDS への発展につに内包させた RhoB は同じく浸透圧、更には外相の PTDなげる。すなわち、SCLP の流動性に関する知見から経皮の存在によらず漏出しない事から、この透過実験の過程に吸収を目的とした製剤には、膜の流動性を誘発する材料選

おいて、GUV を構成する E-PC からなる二分子膜のバリア定の必要性が認知されている。しかしながら、膜の流動性性は維持されていた事実も上記の仮説をサポートする結果を誘起する物質は、一時的ではなく半永久的（平衡状態）である。以上より、PTD がラメラ液晶状態（La 相）にあるに構造を変化させてしまう可能性がある。これは AD のよ

生体膜を直接透過する機構を明らかにした 。

うなバリア疾患をもたらす原因ともなり、当然ながら皮膚

15）のバリア機能にとって好ましい状態ではない。
“一時的”

４．まとめ

というキーワードがこの点で重要と思われる。ここで、第生体二分子膜の構造制御に基づく TDDS 設計の新たな二ステップである PTD の一過的現象に着目する。PTD は試みとして、PTD による生体膜への直接膜透過（C 透過）

膜の搖動（perturbation）を引き起こすが、それ自身膜にと言う生命にとっては本来抑制すべき現象（生体膜のバリ留まらず、内部へ浸透していく。プロドラッグとしてア機能喪失）が起こる原因を、コロイド界面科学の観点か

PTD に標的薬物を積載すれば、表皮ないし真皮、さらにらせまる学際的アプローチで検討した。その特徴は熱力学

は皮下組織への薬物送達を達成できることが期待される。

的に安定な平衡系では界面活性剤の幾何学構造（CPP）がこのように PTD の曲率変化に基づいた経皮デリバリーシ

自己組織体の曲率と全体構造を規定するとの考えを、生体

ステムは皮膚本来のホメオスタシスを損なわず、薬物を皮膜と PTD との相互作用による膜透過現象にあてはめた点

内に届ける理想のデリバリーシステムと言える。

図 19

Rho B 内包 GUV への PTD の透過の浸透圧依存性− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

謝辞４）山下裕司、坂本一民、千葉科学大学紀要、
６, 105（2013）

本研究は公益財団法人コスメトロジー研究振興財団の研５）Loiseau, N. ; Moradian, S. ; Elias, P.M. ; Holleran W.M.

究助成により達成できたものであり、特に千葉科学大学薬and Uchida, Y. J. Invest. Dermatol. 129 , S 68（2009）

学部における製剤 / 化粧品科学研究室の実働体制確立の初６）A.D.Frankel, et al., Cell 55 , 1189（1988）

期活動に大きな支えとなった事を報告し深謝申し上げます。

７）M.Green, et al., Cell 55 , 1179（1988）

また、本研究のデータは東京理科大学理工学部阿部酒井研

８）S. Futaki, Adv Rev Drug Deliv. 57 , 547（2005）

究室吉野佐江子修士および森下卓学士の研究によるもので、

９）Futaki et al, PNAS , ACS Chem.Biol. （, 299（2006）
1 5）

両氏ならびにその直接指導者である、油井研一博士に心よ10）J. Nakagawa, et al., Spectrochimica. Acta. Part A. 63 ,
816（2006）

り御礼申し上げます。

11）E. Yagi, et al., J. Invest. Dermatol. 127 , 895（2007）（引用文献）

12）J.N. Israelachivili, et al., J. Chem. Soc., Faraday
Trans. II 72 , 1525（1976）

１）P. M. Elias, et al., Semin. Dermatol. 11 , 176（1992）13）S. Hyde, et al.,“The Language of Shape（Chapter 4）”２）K. Aburai, et al., J. Oleo Sci. 60 , 197（2011）

pp. 141 - 176 , Elsevier, Amsterdam（1997）

３）膜透過性ペプチド（PTD）： Cell Penetrating Peptide
から CPP と略称されることもあるが、本研究では界面活14）特開 2005 － 154413、K. Sakamoto, et al., ICAMN 2011
Keynote 講演 Oct. 23 , ’
11

性物質の臨界充填因子 Critical Packing Parameter を CPPとして議論するので、別名称である Protein Transduction15）K. Sakamoto, et al., Chem. Lett., 41，1078（2012）

Domain の略（PTD）を用いた。

− 80 −