Thermus-Deinococcus 属ゲノムアノテーションデータベースによる新規 DNA 修復遺伝子の検索
久保田千尋 (指導教員：由良敬)

１ はじめに近年、多くの生物のゲノム塩基配列の決定により、大量かつ多T. thermophilus と D.radiodurans は進化的に近縁な種であるのでゲ様なデータが得られ、蓄積された大量のゲノム情報をもとに、生ノムが類似しているが、T. thermophilus には放射線抵抗性はない。

物種間の遺伝子の配列や構成を比較するゲノム解析が行われてい共通祖先由来であるゲノム同士を比較することで、表現型の違いる。異なる生物種間のゲノムを比較することで、生物の多様性がを生み出すメカニズムがわかると考え、まず、ゲノムの比較を行生じた原因となる遺伝子の違いを明らかにすることが可能であろうツールとして、両者を含む近縁種のゲノムに関連するアノテーう。しかし、比較解析に用いるゲノムのデータは膨大であるため、ションデータベースを作成した。生物種、染色体数、遺伝子数、有用な情報を効果的に引き出すためには、コンピュータを用いた

塩基数は図１に示す。

大規模な情報解析技術の活用が不可欠である。つまり、解析に用いるのに必要なデータを取り出したアノテーションデータベースを開発することで、生物種間のゲノムデータの比較がしやすくすることが必要である。本研究では、２種の細菌、Deinococcus
radiodurans [1]と Thermus thermophilus [2]およびその近縁種のゲノムアノテーションデータベースを開発した。
図１: データベースを構築した生物種

2 前提知識2.1 DNA 修復機構

3.2 リレーショナルデータベースの作成方法

DNA は生物の遺伝情報を保持する生体高分子である。DNA は２種の細菌の塩基配列データは、GenBank (NCBI; National二重らせん構造になっている。DNA の情報は、RNA に転写されCenter for Biotechnology Information)が提供している公共のデータベた後翻訳され、タンパク質となり生体内で機能を果たす。DNA はースから取得した。
GenBank から取得したデータから、CDS(protein

放射線照射で損傷する。DNA の損傷は、正常な代謝活動に伴う過cording region :タンパク質の翻訳領域)の情報を取り出し、加工し、程や紫外線の照射などでも発生しているが、細胞には DNA を修復

アノテーションデータベースを作成した。CDS の遺伝子には各々する機構が備わっているため、正常な機能を維持できている。
DNA固有の ID をつけ、以下の 7 つの情報に関するテーブルを作った。の修復には数多くのタンパク質が関与している。
生物の DNA 修復
効率は生物種の違いによって大きく異なっている。

3.3 テーブルの名称と説明 ( )内はテーブル名

2.2 放射線耐性細菌① 遺伝子の塩基配列の情報 (dna)： ID と塩基配列の情報。

Deinococcus radiodurans は、放射線照射に対して非常に強い細菌② アミノ酸配列の情報 (amino_acid)：ID と DNA の塩基配列である。この高い放射線耐性は、放射線による DNA 損傷(二本鎖から翻訳されるアミノ酸配列の情報。GenBank から取得したファ切断)に対して、優れた修復能力を持つことに起因する。しかし、イルのアミノ酸配列の情報に誤りがあったので、正しいアミノ酸

D. radioduransの高効率なDNA修復機構の詳細はわかっていない。

配列に翻訳し直した。

塩基配列の解析の結果、ゲノム自体に特別な物性はなく、機能が③ 遺伝子の開始点、終止点、鎖 (gene)：ID、遺伝子がコード不明のタンパク質が多く存在することがわかった。そこで、D.

されているゲノム塩基配列上の位置、鎖の情報。

radiodurans の強力な DNA 修復機構は、機能未知のタンパク質に④ プロモータの情報 (promoter)：ID、プロモータの塩基配担われていると考えられている。ゲノムから、D. radiodurans の列、プロモータ塩基配列から連続する 5 塩基を取り出した断片

DNA 修復に関与する新規遺伝子とタンパク質を明らかにできれ(fragment)、プロモータの位置の情報。

ば、放射線耐性のメカニズムがわかるであろう。

プロモータは、DNA から RNA の合成の開始に関与する特定領

そこで本研究では、DNA 修復に関与する新規遺伝子の発見を試域の短い塩基配列で、遺伝子の発現に重要な領域である。共通のみる。そのために、新規遺伝子を発見する方法を開発し、その手プロモータに制御される遺伝子は類似の機能を持ち、機能が似て法を Thermus-Deinococcus 属のゲノムに適用する。

いるタンパク質を生成する。
プロモータ配列は、CDS 開始領域の上流 50 塩基とした。

３ 手法⑤ ゲノムから推定されたタンパク質の機能 (protein)：遺伝

3.1 リレーショナルデータベースを構築したゲノム生物種

子の塩基配列に BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)[3]を用い膨大な情報量をもつゲノムの中から、重要な機能に関係のあるてアミノ酸配列の機能を推定した。

遺伝子部分を探すには、ゲノムが類似している近縁種同士のゲノ⑥ 生物種名 (species)：ID と対応する生物種名の情報。

ムを比較することが有力な手段となる。D. radiodurans の近縁種と⑦ タンパク質の機能の種類 (p_function)：タンパク質の名称

して、高度高熱菌の T. thermophilus が存在する。

および ID(s_id)と対応するタンパク質の機能の情報

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3.4 検索の目的と流れ
現在機能が未知である遺伝子の中から、DNA 修復に関与すると

promoter のテーブル (一部)予想される遺伝子の検索を行った。プロモータの塩基配列が類似している遺伝子にコードされているタンパク質は関連する機能を持っている場合があることから、プロモータの塩基配列に着目した。検索の手順は以下に示す。

(1)

DNA 修復に関与する既知の遺伝子検索

DNA 修復に関与する遺伝子のプロモータにおけるfragment の頻度

log2

(1)
全遺伝子のプロモータにおけるfragment の頻度

遺伝子の塩基配列から予測されるタンパク質の中で、DNA 修復に関与する既知の遺伝子を検索した。
類似するプロモータを持つ遺伝子検索(2)(1)の検索で得た遺伝子のプロモータ配列と類似のプロモータ配列を持つ遺伝子を検索した。
(3)

機能未知の遺伝子検索(2)の検索で得た遺伝子のうち、機能が未知のタンパク質をコードする遺伝子を検索した。
図 2：DNA 修復の遺伝子に多く存在するfragment と式(1)による値
以上の検索によって、機能が未知の遺伝子の中で、DNA 修復に関与する遺伝子が推測される。

4

実行結果

4.1

DNA 修復に関与する既知の遺伝子検索

4.3

機能未知の遺伝子検索

protein のテーブルには、BLAST の検索結果により、機能が推定された遺伝子の情報が登録されている。したがって、機能が未知のタンパク質の遺伝子のID は、protein のテーブルに登録されていprotein テーブルと p_function テーブルに対して、以下のSQL 文

ない ID である。4.2 の検索で得た 773 個の遺伝子の ID のうち、を用いて検索を実行した。

protein のテーブルに登録されていない ID を検索した。その結果、

・ 検索文

219 個の遺伝子の ID が特定された。この遺伝子のうち、図 2 のselect distinct id from protein,p_function where p_function.function likefragment を多数持っている遺伝子は、DNA 修復に関与する遺伝子‘%DNA repair%’ and p_function.s_id=protein.s_id and expect <=0.0001;である可能性が高いと考えた。
219 個の ID の中で、図 2 の fragmentprotein のテーブル (一部)

を 3 つ以上持っている遺伝子のID を検索した。検索の結果、図３に示すように 4 個の遺伝子の ID が得られた。

p_function のテーブル (一部)

図３: DNA 修復機能を持つと推測される遺伝子と fragment の数
expect は機能推定の信頼度を意味する数値であり、今回は 10−４に設定した。以上の操作により、316 個の DNA 修復に関与する遺５ まとめと今後の課題

伝子の ID が 53.26 秒で検索できた。

本研究の結果、Thermus-Deinococcus 属のゲノムアノテーション

4.2 類似するプロモータを持つ遺伝子検索

データベースを開発し、DNA 修復に関与すると推測される新規遺類似するプロモータは、同一の5 塩基断片(＝fragment)の有無伝子を検索することができた。今後は、データベースを活用して、により判別した。4.1 の検索で特定した DNA 修復に関与する既知

D. radiodurans と T. thermophilus のゲノムを比較し、表現型の違いの遺伝子において、そのプロモータが持つ fragment を検索した。

を生じるメカニズムを推定したい。

検索の結果、1008 種類の fragment が検索された。
1008 種類の fragment うち、DNA 修復に関与する遺伝子のプロ参考文献

モータに多く存在する fragment を特定した。特定の方法は、各[1] White,O.,et al. (1999) Genome sequence of the radio resistant bacterium

fragment に対し、式(1)の値が 1.3 以上のものとした。この結果、Deinococcus radiodurans R1, Science, 286 (5444), 1571-1577.

DNA 修復に関与する遺伝子に多く存在するfragment を5 つ同定す

[2] Henne,A., et al. (2004) The genome sequence of the extreme thermophile

ることができた。同定された fragment とそれぞれの式(1)による値

Thermus thermophilus, Nature Biotechnol., 22 (5), 547-553.

を図 2 に示す。図 2 に示した fragment を持つ遺伝子の ID をプロモ

[3] Altschu,l S.F., et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation

ータのテーブルから検索した結果、773 個の遺伝子の ID が検索さ

of protein database search programs, Nucleic Acids Research,25 (17), 3389-3402.

れた。

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