香りが記憶や情動と結びつく際の脳内神経機構に関する研究

産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門

梶 原利 一Olfactory information from the piriform cortex (PC) is relayed to the amygdala and the hippocampus via two parallelpathways. One of which is via the amygdaloid cortex (AC) and the other is via the entorhinal cortex (EC). Since theseolfactory cortices are located in ventral part of the brain, it is difficult to analyze the neural propagation pattern under invivo conditions. For studying these olfactory cortices, the use of the isolated whole brain in vitro preparation is one of theideal methods. By imaging voltage-sensitive dye signals in the isolated whole brain, we can monitor the spread of neuralactivity. In fact, physiological connections among the olfactory cortices (PC, EC, and AC) were successfully investigated in
our laboratory. In the more recent study, we suggested that the AC and EC represent functionally coupled structures in theolfactory stream of information (Kajiwara et al. Eur J Neurosci 2007). However, stimulus frequency dependency, plasticity,and other neural network properties of the olfactory system are still not well understood. In the present study, we stimulated
olfactory nerves repetitively at theta frequency (10Hz), and investigated the change of the spatio-temporal pattern of evokedneural activities in the olfactory cortices. And it was found that the neural activities propagated from the EC to the AC wereenhanced under the influence of the repetitive stimulation to the olfactory nerves.

１．緒

行う事が可能になる

言1- 3）．これまでに我々は，この実験系で嗅索を電気刺激した際の神経活動伝播パターンを解析し，ある香りを入力として受けた時，我々は無意識のうちに情動系（扁桃体）システムの入り口にあたる扁桃体皮質が，過去の記憶と参照し，入力された香りを認識する．多くの記憶系（海馬）システムの一部である嗅内皮質に先行して場合，快・不快のような気持ちさえも抱く．これはどのよ活性化される事を示すと同時に，並列関係にあると思われうな神経機構によるものなのであろうか？これまでに得らたこれら扁桃体皮質と嗅内皮質の間には，実は機能リンクれている嗅覚情報処理に関する知見を総合すると，嗅球かを可能にする神経経路が存在し，この経路が記憶と情動のらの出力信号は，梨状皮質－嗅内皮質を介して海馬へ入情報統合機能に関わっている可能性を示唆している ．本

力する経路（海馬システム）では「認識」に関する情報が，研究では，これまで行ってきた実験を発展させ，嗅索への３）梨状皮質－扁桃体周囲皮質を介して扁桃核に入力する経路

刺激パターンを変化させた時の神経応答パターンを検討す（扁桃体システム）では「情動」に関する情報が，それぞると同時に，イメージングでは捉えられない脳深部の現象れ階層的な段階を経て並列に処理されていると考えられる．

を解析する為の多点神経応答計測装置の開発を試みた．

本研究では，これら神経経路の動作機構を詳細に調べる事２．実を目的とした．
視覚や聴覚などにみられる感覚皮質と異なり，嗅覚系皮2. 1.

験

単離脳標本

質は脳の腹側部に位置している為，in vivo での神経活動実験には Hartley 系モルモット（150 － 250g）を使用し計測が容易ではない．そこで本研究ではモルモット単離脳標本を作製した．まずペントバルビタール（60 mg/kg）の標本の利用により，この問題を克服した．単離脳標本で腹腔投与後，心臓より氷冷した実験液を灌流した．そしは，摘出した全脳は血管系を介して実験液が常に灌流されて頭部が十分に冷却された後，丁寧に脳を取り出し，実ている為，３次元的な神経回路構造とその生理活性が維持

体顕微鏡下にセットした測定用チェンバーに移した．こされている．更に，嗅覚系皮質が頭蓋骨無しで露出されての時点でのチェンバー内の灌流液の温度は 15℃に維持しいる為，電極アクセスが容易になるだけでなく，膜電位感た．次に，椎骨動脈よりカニューレを刺入し，対側の椎骨受性色素で標本を染色すれば，神経活動のイメージングも動脈，内頚動脈，下垂体動脈をシルク糸で縛った後，椎骨動脈から毎分６ml の速度で実験液の灌流を開始した．そして 90 分以上かけてゆっくりと灌流液の温度を 30℃まで

How does the olfactory information input
to the hippocampal and amygdaloid
network?

上昇させた後，測定を開始した．液温調節は，チェンバー下にセットしたペルチェ素子の制御により行った．尚，実験液として以下の組成の，低分子デキストラン入り人工脳

Riichi Kajiwara

脊髄液を使用した．（in mM）NaCl, 126；KCl, 3；KH2PO4,Biomed. Res. Inst., AIST

1 . 2；MgSO4, 1.3；CaCl2, 2.4；NaHCO3, 26；glucose, 15；− 90 −香りが記憶や情動と結びつく際の脳内神経機構に関する研究

HEPES, 2.1；and ３％ dextran（M.W. 70 000）
，saturated

微鏡を使用したが，この顕微鏡では，第一及び第二対物レ

with 95％ O / ５％ CO ．

ンズの組み合わせを変える事によって，倍率を 0.5 倍，１22倍，及び２倍に切り替えられる．また，安定化電源を用い

2. 2.

神経活動の電気的及び光学的計測

たハロゲン光源からの光は光ファイバーを介して顕微鏡へ

単離脳標本において，嗅球の出力繊維（LOT）への電気送りこまれるが，535 nm（±20 nm）の帯域通過フィルタ

刺激により惹起される嗅覚ネットワークの神経応答を，電ーを通して後，ダイクロイックミラー（580 nm で 50％透過）

気生理学的手法と神経活動イメージング手法の二つの手法で反射，標本に照射される．また，標本からの蛍光はダイにより計測した．刺激電極には，双極性タングステン電極

クロイックミラーを透過して後，長波長域通過フィルター（直径 25mm，先端間隔 100mm）を使用した．0.9％ NaCl 液（600 nm で 50％透過）を通して CCD で受光される．

を充填したガラス電極（電極抵抗は ５–10MΩ）を，細胞３．結外誘導記録用電極として使用した．神経活動のイメージン

果Molecular Probes）により標本を染色した．膜電位感受性

3. 1. 嗅索刺激により誘発される神経応答の刺激強度依存性

色素の調整法は，冨永らの報告に従った ．Di-4-ANEPPS

モルモット単離脳標本において外側嗅索（LOT）を刺激

５mg を１ml エタノール及び 0.5 ml クレモフォア EL10% 水

すると，神経興奮はまず前梨状皮質（APC）から後梨状皮溶液により溶解し，ストック液とした．ストック液 40 ml質（PPC）へ伝播する．その後，神経興奮は内側径路を介を 0.5 ml 仔ウシ血清と 0.5 ml の実験液に溶かしたもの（最して扁桃体皮質（AC）へ，外側経路を介して嗅内皮質（EC）

終濃度 0.2 mM）を直接脳表に滴下して標本を染色した．尚，へと伝播する．これまでこれら二つの経路の関係は，完全標本を膜電位感受性色素で 25 分間染色した後，30 分以上に並列であると思われていたが，最近の我々の研究灌流液を流す事により，細胞膜に取り込まれず残った不要よって，嗅内皮質に惹起された神経興奮は，吻側方向へ戻な色素を洗い流した．光計測は，KODAK 製 CCD イメーるように伝播し，扁桃体皮質を再び活性化させることがジセンサ（KAI - 1003）を基に我々が開発した装置によりわかった（図 1A 赤矢印）．つまり，嗅内皮質と扁桃体皮質行った．光計測を行うための光学系は自作のタンデム型顕は，機能的に結び付いているのである．我々は，この嗅内グを行う際は，膜電位感受性色素Di-4-ANEPPS（Invitrogen /４）

図１ 外側嗅索（LOT）刺激により誘発される神経応答の刺激強度依存性
A. モルモット単離脳を腹側より見た模式図．嗅索刺激により惹起された神経興奮は，二つの経路（直接的な内側経路と嗅内皮質を介する外側経路）を経由して扁桃体皮質へ送られ統合される．OB: 嗅球，LOT: 外側嗅索，
APC: 前梨状皮質，PPC: 後梨状皮質，AC: 扁桃体皮質，EC: 嗅内皮質，破線で囲まれた領域は観測領野．
B. 20µA ( 上 ) および 35µA( 下 ) で刺激した際の嗅覚皮質における神経興奮伝播パターン．
C. 扁桃体皮質の任意のピクセルにおける光シグナル（上）と集合電位（下）．

− 91 −３）にコスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

５）

皮質と扁桃体皮質を結ぶ神経経路が，刺激強度に依存してグ周波数は約 4 – 12 Hz といわれている ．もし外側嗅索どのように活性化されるのかを検証した．図 1B は，LOT（LOT）が繰り返し電気的な刺激を受けると神経応答は，刺激時の神経興奮伝播パターンを表す．上段の結果におどのように脳内へ伝えられるのであろうか？我々はこのいて，刺激後 20ms にイメージ中央の AC の領域が，45 ms問題を検討する為に 10Hz で外側嗅索（LOT）を繰り返しに EC が活性化され，65ms には再び，AC が活性化された．

電気刺激し，これにより惹起される神経応答の活動パター

下段の結果では，刺激後 15 ms に AC，35 ms に EC，50 msンを解析した．図 2A のように，モルモット単離脳標本のには AC が再度活性化された．つまり，LOT への刺激強度

LOT に刺激電極を配置し電気刺激を施した．図 2B は，刺が多少変化しても，扁桃体皮質へ入力する二つの経路（内激により誘導された細胞外記録電位波形である．10Hz で

側径路：PPC → AC，外側経路：PPC → LEC → AC）が活

LOT を６回刺激すると，後部梨状皮質（PPC）および嗅内性化されるという現象に大きな変化は認められなかった．

皮質（EC）では，100 ms 間隔で振幅の大きい下向き集合電

図 1C の波形は，二種類の刺激条件下で得られた扁桃体皮位が６回記録された．扁桃体皮質（AC）では，１回目の刺質の神経応答の時間経過を表している．上が任意の二箇所激に対する応答が極めて小さいものの，２回目以降においから導き出した光シグナル（膜電位変化に比例した蛍光変て，顕著な下向き集合電位が観測された．つまり，繰り返化），下が細胞外記録電極により同時測定した集合電位でし入力が与えられる事によって，AC の反応性が高まったある．光シグナルトレースは二峰性を示し（図 1C 上），こ事が読み取れる．のピーク間隔とほぼ同一の間隔を持つ二つの集合スパイク

ではこのとき，AC の神経応答は，どのような神経経路電位が，電気生理学的な計測によっても確かめられた（図の活性化により増大したのであろうか？我々は，図２の破1C 下）．

線で囲まれた領域において，神経活動イメージングを行った．その結果が図 2C である．繰り返し刺激の一回目，二3. 2. 嗅索への繰り返し刺激により惹起される神経応
答パターン

回目，三回目の刺激に対する応答を上段，中段，下段に齧歯類がニオイの識別や探索を行う際のスニッフィン

られ，85 ms に神経興奮が EC まで伝播している様子がわ示した．上段では，刺激後 25 ms に PPC で神経興奮が認め

図２ 外側嗅索（LOT）を繰り返し刺激した際の嗅覚ネットワークの神経応答
A. モルモット単離脳標本の模式図．
B. 後部梨状皮質（PPC），扁桃体皮質（AC），嗅内皮質（EC）における細胞外記録．
C. 図 A の破線で囲まれた領域で観測した神経活動伝播パターン．

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香りが記憶や情動と結びつく際の脳内神経機構に関する研究

かる．更に，２回目（中段），３回目（下段）と，繰り返し吻側方向へ戻るように伝播し，扁桃体皮質を再び活性化さ

LOT に刺激が入力されると，嗅覚系皮質の全体にわたっせた．今回の研究によって，刺激強度を変化させても，こて神経応答の顕著な増大が認められた．著しい変化が生じの伝播様式が大きく変化しない事がわかった．しかし，刺たのは，EC と AC の領域であった．下段 245 ms のイメー

激強度が強いほど，AC の興奮性は劇的に増大した．特にジの白破線内において，EC の応答の顕著な増大に引きずEC を介した外側経路の影響が大きいようであった．また，られて AC の領域が大きく活性化されることが判明した．

刺激強度が，極めて小さく，EC → AC の伝達経路が，ほとんど活性化されない場合でも，繰り返し入力が与えられ

3. 3.

脳深部神経活動計測の為の機器開発

るとこの経路は活性化される事がわかった．

我々の所有する光計測システムで検出する光シグナル

本実験では，標本の特性上，匂い物質を実際に与えて脳は，脳表面からおよそ 300 ミクロンまでの深さにある組織の活動を見ることが出来ないため，電気刺激を擬似的に与全体から発せられる蛍光シグナルを加算したものと考えらえた．刺激強度の強弱は，与えられた匂い物質の濃度の高１）

れる ．本研究では，これよりも深部の脳皮質領域や，更低を表す可能性もあるが，匂いの種類の差を表している可に深部に位置している海馬や扁桃体外側核の神経活動を記能性もある．刺激強度の増大によって，弱い刺激強度では録する為に，多点電極記録システムの構築を試みた．市販

活性化されていなかった LOT の神経線維（つまりその元の 16 チャンネルシリコンプローブの使用を想定し，ヘッにある嗅細胞）が新たに刺激されたと考える事ができるた

ドアンプに電極が直接挿入できるような仕様とした．初段めである．つまり，ある匂い物質については，EC － ACのヘッドアンプ部で 10 倍，後段の信号処理回路部で 10 倍，間の経路を活性化させるには不十分でも，他の匂い物質に合計 100 倍のゲインを有するシステムとした．初段と後段

ついては，この経路を大きく活性化させる可能性を有しての間にはカットオフ 0.1 Hz のハイパスフィルターを配置し，いる事が示唆される．また，繰り返し刺激の実験結果から，後段のアナログ信号処理回路部では，カットオフ２kHz をかすかな匂いでも間隔を置いて，繰り返し与えられる事が，有する４次ローパスベッセルフィルターを構成した．

EC － AC の経路の活性化には，効果的である事も示唆さ

16 チャンネルから記録される集合電位は，市販の AD コれた．

ンバータを介してコンピュータに取り込み，取り込んだデEC は海馬と結び付いて記憶系の情報処理に関わる事がータは Matlab によって，CSD 解析を行えるような仕様と知られるが，AC は，脳深部の扁桃体亜核と結び付いて，した．

情動の情報処理に関与する．本研究で得られた結果は，入４．考力する匂い物質の違いによって，記憶と情動の結び付きに察関与する神経経路が活性化されやすかったり，されにくか

モルモット単離脳標本に膜電位イメージングを適用して，嗅覚神経経路の機能構造解析を行った．外側嗅索（LOT）ったりする事を意味しているのかもしれない．
今回の研究のようにモルモット単離脳標本を用いれば，を電気刺激すると，神経興奮はまず前梨状皮質（APC）かスライス標本の使用では不可能な，複雑な神経ネットワー

ら後梨状皮質（PPC）へ伝播し，その後，神経興奮は内側クの解析が行えるが，脳深部で生じた現象までは，解析す径路を介して扁桃体皮質（AC）へ，外側経路を介して嗅内ることが出来ない．そこで本研究では，脳深部の多点電気皮質（EC）へと伝播した後，EC に惹起された神経興奮は，生理計測を可能にする計測システムを新たに構築した．今図３

開発した多チャンネルアンプ（左）と波形解析ソフトウェア（右）− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

Eur J Neurosci 18, 95-101.

後は，この装置を既存の単離脳標本実験システムと組み合わせて使用し，脳深部の複数箇所からの神経応答解析を進３）Kajiwara R., Tominaga T., & Takashima I. (2007)

める事によって，嗅覚系における海馬や扁桃体ネットワー

Olfactory information converges in the amygdaloid

クの動作様式をより詳しく明らかにしてゆきたいと考えて

cortex via the piriform and entorhinal cortices:いる．

observations in the guinea pig isolated whole-brain
preparation. Eur J Neurosci 25, 3648-3658.

（参考文献）

４）Tominaga T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto,１）de Curtis M., Takashima I., & Iijima T. (1999) Optical

G. & Ichikawa, M. (2000) Quantification of optical

recording of cortical activity after in vitro perfusion ofsignals with electrophysiological signals in neural

cerebral arteries with a voltage-sensitive dye. Brain

activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal

Res 837, 314-319.

slices. J. Neurosci. Meth 102, 11–23.

２）Biella G.R., Gnatkovsky V., Takashima I., Kajiwara５）Kepecs A., Uchida N., & Mainen Z.F. (2007) RapidR., Iijima T., & de Curtis M. (2003) Olfactory input toand Precise Control of Sniffing During Olfactory

the parahippocampal region of the isolated guinea pig

Discrimination in Rats. J Neurophysiol 98, 205-213．

brain reveals weak entorhinal-to-perirhinal interactions.

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