サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析
昭和大学

吉薬学部毒物学教室

田武

美The induction of contact sensitization is associated with the movement of epidermal Langerhans cells (LC) from the skinand their migration to draining lymph nodes where they accumulate as immunostimulatory dendritic cells (DC). It has
been reported that interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor α(TNFα) are key cytokines for LC migration and/or
maturation. This study has determined the effect of 2,4,6-trinitrochlorbenzene (TNCB) on contact sensitization in IL-1α/βgene
deficient (IL-1KO) and TNFαdeficient (TNFαKO) mice. IL-1KO mice showed weak ear swelling response (about 85% ofwild). LC existed in IL-1KO epidermis appeared to be morphologicaly similar to that observed in wild. The migration ratio of
LC in IL-1 was almost the same as that seen in wild. These results suggest that IL-1 may not be a key factor of the contact
sensitization in mouse skin. Additionally, we preliminary found that functional changes in immune reaction in TNFαKO mice,
however, the findings will be required further study.
Ultraviolet A (UVA) is known to induce the expression of many stress responsive genes due to the generation of reactive
oxygen species (ROS). However, UVA's role in inducing metallothionein (MT) gene expression has not been studied.
Furthermore, Ishizaki et al. (1996) demonstrated that UVA enhanced 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-mediatedinduction of ornithine decarboxylase (ODC) activity in mouse skin1). Considering these facts, we examined the interaction of
UVA, TPA and antioxidants on the induction of MT and ODC mRNA in mouse skin. UVA (19J/cm2 ) induced MT mRNAin mouse skin. The study using antioxidants suggest that ROS produced by UVA exposure may contribute to its ability to
induce MT mRNA. UVA enhanced TPA-mediated ODC enzyme activity and TPA-mediated MT mRNA induction. Alphatocopherol pretreatment inhibited the induction of ODC enzyme activity by TPA treatment combined with UVA exposure(TPA+UVA). In addition, pretreatment of mouse skin with curcumin resulted in the almost complete inhibition of TPA- and/or UVA-mediated gene expression. These results demonstrate that UVA can induce MT gene expression and enhance TPAinduced ODC and MT gene expression. The data further suggest that these effects are partially mediated by ROS.

１．緒

きく関与していることがそれぞれのサイトカインに対する

言

抗体を用いた研究などで報告されている２）。しかしながら、皮膚は生体内外からの様々な刺激に対する防御機能を果

その詳細については不明な点もあり、サイトカイン遺伝子

たすと共に、生体内の生理的病的症状の表現の場でもある。

欠損動物モデルを用いた研究によりその役割に関する情報

皮膚組織には、インターロイキン１（IL- 1）をはじめ多くが得られると予想される。そこで、本研究では Il- 1 α ／ βのサイトカインが存在し、生体内外からの刺激に対し生理ノックアウトマウス（IL- 1 KO マウス）および TNFα ノ

的かつ防御的応答の情報伝達に重要な役割を果たしている

ックアウトマウス（TNFαKO）を用いてアレルギー性接と考えられている。例えば、遅延性アレルギーを獲得する

触皮膚炎や感作の成立過程におけるサイトカインの役割を上で重要な感作の過程においては、IL- 1 β と TNFα がト検討した。

リガーとなりその主要な役割を果たしていると言われている

UV による細胞障害や数々の毒性反応は良く知られた事２）実である。しかしながら、UVA はその光毒性は比較的弱く、は成されていない。

作用機序も UVA により産生された活性酸素に起因する事。しかしながら、遺伝子欠損マウスを用いた詳細な研究
アレルギー性接触皮膚炎は、皮膚に存在するランゲルハ

から、UVB や UVC とは光毒性の強さも性質も異なるとンス細胞（LC）が抗原を局所リンパ節に提示することが発報告されている。また、毒性の強い UVB や UVC には古症メカニズムの第一段階であると言われているが、このラくから数多くの研究報告があるが、UVA はそれに比べる

ンゲルハンス細胞の遊走及び成熟に IL- 1 β や TNFα が大と報告も多くない。さらに、UVA は活性酸素を産生する
事から、活性酸素により発現するストレス応答タンパク質The study on immune reaction and stressresponse in cytokine knockout mouse skin.
Takemi Yoshida
Department of Biochemical Toxicology,
School of Pharmaceutical Sciences, Showa
Universityに影響を及ぼすのではないかと考えた。そこで本研究では、UVA により発生した活性酸素が皮膚におけるストレス応
答タンパク質、特にストレス応答タンパク質としてよく研
3）やオルニチン脱炭
究されているメタロチオネイン（MT）

酸酵素（ODC）の遺伝子発現にどの様に影響しているかについて皮膚研究に比較的多く用いられている CD- 1 マウスを用いて検討した。

− 110 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

２．実
２. １

305 / 365 Dradiometer（クリニカルサプライ社）を用いて

験

測定した。

アレルギー性接触皮膚炎の実験

２. １. １

実験動物および繁殖２. ２. ３
４）

UVA 照射および抗酸化物質処置

及び本研究で用いた抗酸化物質は、1 , 4 -diazabicyclo-[ 2 , 2 , 2 ]-Wild マウスを用いた。サイトカイン遺伝子欠損マウスは、、α- ト コ フ ェ ロ ー ル（ ２×octane（DABCO；10 - 4 M）

東京大学医科学研究所、岩倉洋一朗教授より供与された親、クルクミン（10 - 4 M）であり、いずれもアセト
10 - 4 M）

株を当大学実験動物研究施設内で交配させ、PCR によるンに溶解し、脱毛したマウス背部皮膚に 100 µL 塗布した。

遺伝子チェックを行ってそれぞれのサイトカイン遺伝子欠12 -O-tetradecanoylphorbol- 13 -acetate（TPA）は、ジメチ

損マウス株および Wild マウス株を得、系統維持繁殖を行

ルスルフォキシドに溶解した後アセトンで 40 倍希釈したもった。本研究では、雌雄マウスを使用した。

のを 100 µL（８nmol TPA）塗布した。対照動物には同量

実験には 10 週齢前後の IL- 1 KO

、TNFαKO５）の溶媒を塗布した。UVA は固定したマウスに 19 J/cm 2 照
２. １. ２

Ear Swelling Test

射した。また、UVA 照射開始時間を 0 時間と表示した。

マウスの腹部の毛を刈り 3％ 2,4,6-trinitrochlorobenzene
２. ２. ４（TNCB；アセトン：オリーブ油＝４：１の溶媒に溶解）

RNA 調製およびノーザンブロット法

溶液を 100 µL 塗布した。その６日後に片方の耳に１％処置一定時間後のマウス背部皮膚を取り、グアニジン

TNCB をもう片方の耳に溶媒を 25 µL ずつ塗り、24 時間

チオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出法 ６） に後に耳厚をダイアルシックネスゲージ（㈱ミツトヨ）で測て total RNA を採取した。total RNA（20 µg）を 1 . 2％ア

定しその耳厚差を表示した。

ガロース - ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ノーザンブロット法に用いたプローブは、オルニチン脱炭

２. １. ３

マウスの耳介表皮シートの免疫染色酸酵素（ODC；0 . 72 kb, pMK 934 mODC cDNA の EcoRI

0 . 5％ TNCB と溶媒をマウスの耳それぞれに 25 µL ずつ

fragment）、メタロチオネイン - 1（MT- 1；0 . 4 kb, マウ

塗布し、その約 16 時間後に耳介を採取した。試薬を塗布

ス pMT- 1 cDNA の HindIII ／ EcoRI fragment）、グリ

した側の耳介を 20 mM EDTA 含有 PBS 処理した表皮シ

セルアルデヒド -3- フォスフェートデヒドロゲナーゼートを得、冷アセトン溶液で固定した後、ビオチン化抗（GAPDH；0 . 5 kb, GAPDH cDNA の Pst 1 fragment）
である。

マウス IAd 抗体（ファーミンジェン社）で一次染色した。
抗体はペルオキシダーゼ標識した後、DAB により発色さ

２. ２. ５

せ立体光学顕微鏡で写真撮影（対物 × 20、接眼 × 2 . 5；

定法

0 . 336 mm 2）を行い、その写真を用いて LC 数を数え、１
mm 2 当たりの LC 数を求めた。

表皮サンプル採取法および ODC 酵素活性測

マウス表皮は、O'Brein 等の方法により採取した７）。す
なわち、採取したマウス皮膚を冷水に 60 秒間浸漬した
後、55℃の温湯に 30 秒間浸し、再び冷水に浸漬した。こ２. １. ４

リンパ節細胞（LNC）増殖反応の皮膚より表皮を片刃カミソリでかき取り、50 mM リン

0 . 05 〜３％ TNCB をマウスの両耳に 25 µL/ear 塗布し、酸ナトリウム緩衝液（pH 7 . 2 , 1 mM ジチオスレイトール、

その 72 時間後に耳下腺リンパ節より LNC を採取し、トリ

0 . 1 mM ピリドキサールリン酸、0 . 1 mM EDTA 含有）に

チウムチミジンの取り込みを測定した。

集め、ソニケーターでソニケート（19 W, 2 分）した。これを遠心した（30000 g, 20 分間）上清を用いて ODC 酵素

２. ２

UVA によるストレス応答タンパク質の遺伝子活性測定を行った。

発現への影響の実験
２. ２. １ODC 活性は、Russell と Snyder の方法により測定した８）。

実験動物および処置

３．結果と考察

日本チャールスリバーラボラトリーズ㈱より購入した雌性 CD- 1 マウスを用いた。マウスは、実験に用いる２〜３

３. １

IL- 1 KO マウスを用いたアレルギー性接触皮膚

日前に背部の毛をバリカンで刈った後、ヘアリムーバー（資炎の研究生堂㈱）にて完全に毛を取り除いた。

３. １. １

Ear swelling test の検討

アレルギー性接触皮膚炎が IL- 1 KO マウスで生じるか否２. ２. ２

光源

か検討する目的で、アレルギー性接触皮膚炎の指標として

蛍光 Black Blue ライト（FL15 BL-B、ナショナル㈱；300-

汎用されている ear swelling test を行った（Fig. １）。こ

400 nm）を用い、ガラス板にて UVB を除いた。光量は UVRの結果、IL- 1 KO マウスの耳厚差は、Wild マウスのそれ− 111 −

の約 80％と、わずかながら減少した。

が認められなかった。また、TNCB 塗布により、表皮から明らかに LC が減少している事が認められた。実際に

３. １. ２免疫染色による LC 遊走の比較検討

LC 数を計測して比較したところ、IL- 1 KO マウスの方が次に、0 . 5％ TNCB 塗布 18 時間後の耳表皮 LC を抗マ

もともと持っている LC 数が多い傾向にあった。TNCB 処

ウス IAd 抗体で免疫染色を行い、溶媒処置のものと比較

置により LC は、Wild、IL- 1 KO 共に溶媒処置に比較してすることにより LC 遊走を検討した（Fig. ２）。まず、抗約 20％減少した。これらのことは、IL- 1 が存在しなくてIAd 抗体による免疫染色の結果、IL- 1 KO マウスにも LC

も LC は発現し、ハプテンの刺激にも反応して遊走する事が存在し、形態学的観察では Wild の LC と特に大きな差を示している。そこで、次に近位リンパ節で LNC がハプ
テンの信号を受け取って増殖しているかどうかを LNC 増
殖反応により検討した。
３. １. ３

LNC 増殖反応

感作性物質の検出試験法の一つである LNC 増殖反応を0 . 05 から 3％ TNCB で検討したところ、0 . 1％ TNCB の
場合は IL- 1 KO マウスでの LNC 増殖反応は Wild より弱くなる傾向が認められたが、高濃度の TNCB では Wild とほぼ同様に増殖反応が起きていることが明らかになった（Fig. ３）。
本研究の結果、IL- 1 が不在でも LC の遊走や感作は正常
動物と同程度に生じ、IL- 1 を介さない LC 遊走や感作成立の系が存在することが示唆された。しかしながら、遺伝子欠損動物は生まれながらにして特定の遺伝子産物が欠損しFig. 1
Ear swelling response induced by TNCB in IL1KO and wild mice. Three percent of TNCB was painted
on mouse abdomen and one percent of TNCB or vehicle
was applied on each ear 6 days after the sensitization. Ear
thickness was measured 24 hr after the challenge.

ていることから、何らかの他の因子によって代償作用が生じている可能性も否定できないことから、今後その点に関する検討が必要である。

３. ２

その他のサイトカイン KO マウスを用いた研究Fig. 2The effect of TNCB on LC migration in wild andIL- 1 KO mice. TNCB ( 0 . 5 %) or vehicle was painted oneach ear and epidermal sheet was prepared 16 hr after
the treatment. LC was stained with a monoclonal antibody
against IAd and number of LC was counted.

Fig. 3The effect of TNCB on LNC proliferation in IL-1KOand wild mice. TNCB (0.05-3%) was painted on both ears anddraining lymph nodes were excised. LNC was isolated and theincorporated radioactivity of 3H-thymidine was measured.

− 112 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

IL- 1 KO マウスにおけるアレルギー性接触皮膚炎に対す

３. ３. ２

UVA による MTmRNA 誘導に及ぼす抗酸化剤

る応答は、Wild マウスと特に大きな相違が認められなかの影響ったことから、TNFαKO マウスを用いて同様の検討を進UVA は活性酸素を生じることから、この活性酸素がめた。現在まで得られている知見は、最終的に詳細な確認

MTmRNA 誘導におよぼしている影響を検討する目的で、を必要とするものであるが、TNFαKO マウスでは LC に抗酸化剤である α- トコフェロール 11）および一重項酸素捕異常が発生している結果が得られている。さらに本条件下（Fig.
獲剤である DABCO 12）を UVA 照射 30 分前に処置したにおいてもアレルギー性接触皮膚炎を正常動物よりは弱い５）。α- トコフェロールは UVA による MTmRNA 誘導をが明らかに成立しているという重要な成果が得られている。

20％、DABCO は 40％阻害した。この事から、UVA によ

本成果は皮膚 LC のアレルギー性接触皮膚炎における役割

る MTmRNA 誘導は部分的に UVA 照射により生じた活に関して重要な話題を提供するものである。現在強力にそ性酸素 13）、特に一重項酸素が関与していることが示唆さの解明の検討を進めている。

れた。活性酸素以外の要因としては、UVA により産生されると報告されており、またエンドトキシンによる MT

３. ３

UVA によるストレス応答タンパク質の遺伝子

誘導の主な要因といわれている IL- 614）が考えられる。

発現への影響９）
３. ３. １

３. ３. ３

UVA による MT 遺伝子発現の経時変化

UVA の TPA により引き起こされる ODC や

MT 誘導の増強効果ならびに α- トコフェロールによ

ま ず 始 め に、UVA が マ ウ ス 皮 膚 MT に 直 接 的 な 作

る防御作用

用を引き起こすかどうか検討した（Fig. ４）。UVA は、
MTmRNA を照射直後ですでに著しく増加させ、照射開TPA は強力な皮膚発ガンプロモーターとして古くから

始 4 時間後には、対照の約６倍の MTmRNA が認められた。

良く知られた化合物であり、ODC １、７）や MT ３）など様々

その後、徐々に mRNA 量は減少し始め、照射 24 時間後にはほぼコントロールレベルに回復した。UVA はマウス
表皮における ODC 遺伝子発現に、本実験で検討した限りにおいては全く影響しなかった。これは、以前の我々の報
告や他のグループの報告と一致している１、10）。

Fig. 4
Time course study of MT and HO-1 mRNA following
UVA exposure in mouse skin. Mouse dorsal skin wasirradiated with UVA (19J/cm2) and the skin was collected
at the times indicated. Time 0 indicates the starting time of
UVA exposure. Each blot was semiquantified and the signalof MT mRNA was normalized with that of GAPDH. Symbols
represent the mean ± SE for three mice. *Significantly
different from controls at p<0.05. ( 引用文献 9 より )Fig. 5
Effect of antioxidant pretreatment on UVA-mediatedexpression of MT gene in mouse skin. Antioxidants wereapplied to the skin and followed with UVA exposure. The
skin was collected 4 hr after starting UVA exposure. Eachblot was semiquantified and the signal of MT mRNA wasnormalized with that of GAPDH. Symbols represent the mean
± SE for three or four mice. *Significantly different fromcontrols at p<0.05. #Significantly different from UVA alone at
p<0.05. ( 引用文献 9 より )− 113 −

なストレス応答タンパク質を誘導することが明らかにされより ODCmRNA レベルではなく、酵素タンパクレベルにている。また、TPA は活性酸素を産生する事も報告され作用していることが示唆された。

ていることから、UVA との相互作用に興味が持たれ検討した（Fig. ６）。UVA 照射は TPA による ODCmRNA 誘

３. ３. ４クルクミンの UVA による ODC や MT 誘導増強効果におよぼす影響

導をさらに増加する傾向が認められたのみであった。しかし、ODC 活性誘導は UVA 照射により顕著に増強され、ターメリックの主要な黄色素成分であり、活性酸素捕TPA 単独処置の約 1 . 7 倍の活性を示した。また、TPA

獲作用を有する 15、16） ことが知られているクルクミンのによる MTmRNA 誘導は UVA 照射により著しく増幅し、UVA による TPA 誘導性 ODCmRNA や MTmRNA 増幅

TPA 単独処置の約２倍になった。

作用に及ぼす影響について検討した（Fig. ７）。クルクミ

ここで認められた UVA 照射の TPA 誘導性 ODC やン前処置は、TPA による ODC および MTmRNA 誘導を

MT 増強作用に、活性酸素が関与しているかどうか知る

ほぼ完全に阻害しただけでなく、UVA 照射によるこれら目的で、α- トコフェロールを TPA 塗布直前に処置した。

の増強作用も阻害した。これらの事実は、クルクミンが活

α- トコフェロールは、UVA 照射による mRNA 増幅作用性酸素を捕獲する 16）だけでなく、TPA によるプロテインにはほとんど影響を与えなかった。興味深いことに、α-キナーゼ C を介したシグナル伝達を直接的に阻害 17）してトコフェロールは、UVA 照射により増幅した ODC 活性

いることを示唆している。

を TPA 単独処置による誘導レベルに回復した。この事は、本研究により UVA 照射は皮膚において MT 遺伝子発UVA 照射の TPA による ODC 誘導増幅効果が、何らかの現を誘導するのみでなく、TPA による ODC や MT 誘導

活性酸素により引き起こされていること、またこの活性酸を増幅する作用があることが明らかになった。UVA は皮素が ODC タンパク質のターンオーバーを遅らせるなどに

膚の IL- 6 を増加させるという報告があるが、本研究で認Fig. 6
Effect of α-tocopherol on UVA-mediated enhancement of ODC activity, ODC and MT gene expression after TPA application in mouse skin. α-Tocopherol and/or vehicle was applied to the dorsal skin just before TPA application on the mousedorsal skin. Two hours after UVA exposure, the skin was collected. (a) Blots of ODC and MT mRNA were semiquantified andnormalized with that of GAPDH. Symbols represent the mean ± SE for three or six mice. *Significantly different from controls
at p<0.05. #Significantly different from TPA alone at p<0.05. (b) The epidermis was obtained from the rest of the skin and
ODC activity was measured as described in "Materials and Methods." Symbols represent the mean ± SE for six or ten mice.
*Significantly different from controls at p<0.05. #Significantly different from TPA alone at p<0.05. ##Significantly different fromthe group without ?-tocopherol treatment at p<0.05. ( 引用文献 9 より )− 114 −

サイトカインノックアウトマウスにおける免疫反応とストレス応答を指標とする皮膚機能の解析

所、ヒト疾患モデル研究センター、岩倉洋一郎教授に深く感謝いたします。
（引用文献）
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USA 60 , 1420 - 1427 . ( 1968 )Fig. 7
Effect of curcumin on UVA-mediated enhancementof ODC and MT gene expression following TPA application.
Curcumin was applied just before TPA application. Skin wascollected 2 hr after UVA exposure. For a group without UVA
treatment, skin was collected 4 hr after TPA application. Blots
for ODC and MT mRNA were semiquantified and normalized with that for GAPDH. Symbols represent the mean ±SE for three or six mice. *Significantly different from controls
at p<0.05. #Significantly different from the equivalent group
without curcumin treatment at p<0.05. ##Significantly different from TPA alone at p<0.05. ( 引用文献 9 より )９）O g u r o , T . , a n d Y o s h i d a , T . : P h o t o d e r m .
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