2017年11月9日 第113回 日本食品衛生学会学術講演会 技術セミナー

食品におけるメタボローム分析〜固相誘導体化技術による簡易化、⾃動化〜

株式会社アイスティサイエンス本日の内容1, 従来法との比較
2, 固相誘導体化技術とは その1〜アミノ酸、有機酸〜
3, 固相誘導体化技術とは その2〜アミノ酸、有機酸と糖の⼀⻫分析〜
4, 固相誘導体化の⾃動化
2

1, 従来法との比較〜操作性向上、時間短縮〜3メタボロミクスの現状と課題

4

従来の前処理法の課題
抽出
試料
メタノール・水・クロロホルム
インキュベーション︓抽出
遠⼼分離
上澄分取・水添加
遠⼼分離

脱水・誘導体化
上澄み分取
減圧濃縮遠⼼分離
凍結乾燥（16時間）
メトキシアミン/ピリジン溶液
インキュベーション︓誘導体化反応
誘導体化試薬︓MSTFA
インキュベーション︓誘導体化反応
遠⼼分離▲ 脱水に一晩(16時間)

上澄分取▲ 誘導体化に2時間

GC-MS測定︓1μL（スプリット1:50）
5当社提案分析法
抽出
試料
アセトニトリル・水インキュベーション︓抽出
遠⼼分離

脱水・誘導体化
上澄み分取︓50µL
Presh-SPE ACX︓代謝物保持
アセトニトリル・水通液（糖除去）
アセトニトリル通液（水除去）
メトキシアミン/ピリジン含侵
固相誘導体化MSTFA含侵
固相誘導体化▲ 脱水＋誘導体化約10分︕▲ 抽出にクロロホルム使用なし

溶出︓ヘキサン（溶出液を測定バイアルに受ける）
希釈︓ヘキサン
GC-MS測定︓⼤量注⼊10μL（スプリット1:50）
6

操作写真

7

固相誘導体化法 お試しキット

8

2, 固相誘導体化技術とは その1〜アミノ酸、有機酸〜

9固相誘導体化法（アミノ酸、有機酸など）
STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

試料負荷＆保持洗浄

脱水／１分

誘導体化／２分

溶出

アミノ酸と有機酸をイオ
ン交換相互作用により固相に保持

水-ACNで固相に残存している非イオン性化
合物を除去

ACNで 固 相 に 残 存 している水分を除去

誘導体化試薬を固相に含侵させて、目的成分を固相中で誘導体化

試料

水-ACN

ACN

MSTFA

-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝-SO3 ⊝-N ⊕アミノ基⊕NH3-R
カルボキシル基-N⊕ ⊝OOC-R(CH3)3(CH3)3

-N ⊕

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3⊝ OOC-R

非イオン性化合物

-N ⊕

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3
H2O⊝ OOC-R

-N ⊕

ヘキサン

TMS-NH-R

-N⊕
(CH
3)3
TMS-OOC-R(CH3)3-SO3 ⊝
-N ⊕

-N⊕
(CH
3)3
(CH3)3
R-NH-TMS
R-COO-TMS

特許登録︓（株）アイスティサイエンス

10⾼濃度の糖類が分析に及ぼす影響【測定機器について】
・注⼊口が汚れる・フィラメントが切れやすくなる
・感度低下
・メンテナンス頻度が⾼い
・GCへの注⼊量を増やせない。
【解析について】
・定量イオンが限定される。
・ピーク形状が崩れる。
・低濃度の目的成分が分析できない。
・解析に時間が掛かる。
・リテンションタイムが重なると解析できなくなる。
・リテンションタイムが重なる物質は測定対象から除外する。
・リテンションタイムがずれる。

糖類を除いた「アミノ酸」と「有機酸」の分析測定機器を安定に保ち、メンテナ
ンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。
解析の時間短縮が図れ、精度の⾼い分析が可能となる。
低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

11

試料負荷時の水濃度と固相への保持について【糖とAX固相】

Relative peak Area

100
50
0

2.5%

5%

10%

20%

50%

Ala-2TMS

Water concentration
Gly-2TMS
Val-2TMS

Ile-2TMS

Pro-2TMS

Ser-3TMS

75% 97.5%
Leu-2TMS
Thr-3TMS

Relative peak area

【アミノ酸とCX固相】

0

0.5%

1%

2%

5%

10%

Water concentration

Xylose-4TMS
Rhamnose-4TMS
Fructose1-5TMS

20%

50%

Arabinose-4TMS
Fucose-4TMS
Fructose2-5TMS【有機酸とAX固相】
Relative peak area

100

20%水-アセトニトリル溶液では糖類を除去して、
アミノ酸と有機酸を保持することが可能。

50
0

1%

2%

Pyruvate-2TMS
Succinic-2TMS

5%

10%

50%

75%

90%

Water concentration
Oxalic-2TMS
Maleic-2TMS
Fumaric-2TMS
Malic-3TMS

12固相抽出技術による糖類の除去効果
糖類

試料抽出液量︓10uL
2%水-アセトニトリル
測定機器を安定に保ち、メンテ
ナンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。

アミノ酸、有機酸

試料抽出液量︓50uL
20%水-アセトニトリル

解析の時間短縮が図れ、精度の⾼い解析が可能となる。
低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

SCANトータルイオンクロマトグラム比較

13

CX固相誘導体化前処理法（アミノ酸）の評価
直線性（R2）と再現性（RSD, n=6）
No. Amino acidPeak area

2.E+06
2.E+06
1.E+06
5.E+050.E+00

0.0

0.5

1.0

1.5

RSD
n=6, %

1

Ala-2TMS

0.9996

7.4

2

Gly-2TMS

0.995813.1

3

Val-2TMS

0.9993

7.5

4

Leu-2TMS

0.9992

6.7

5

Ile-2TMS

0.9995

6.2

6

Pro-2TMS

0.9982

12.5

7

Ser-3TMS

0.99885.5

アミノ酸量とピーク⾯積値の関係

8

Thr-3TMS

0.99904.7

目的成分量0.2, 0.5, 1.0, 2.0 nmol9Asp-3TMS

0.99894.9

10 Met-2TMS

0.9991

7.5

11

Glt-3TMS

0.9911

8.8

12 Phe-2TMS

0.9996

5.6

13

Lys-3TMS

0.9927

32.2

14

Tyr-3TMS

0.9977

4.8

15

Cys-4TMS

0.995029.2

SCANトータルイオンクロマトグラム
3.E+06R2

2.0

Quantity of amino acid (nmol)
Val-2TMS Ile-2TMS Tyr-3TMS

14

AX固相誘導体化前処理法（有機酸）の評価
直線性（R2）と再現性（RSD, n=6）No.

SCANトータルイオンクロマトグラム
1.E+07

Peak area

8.E+06

有機酸量とピーク⾯積値の関係

6.E+06

目的成分量0.2, 0.5, 1.0, 2.0 nmol

Organic acidR2

RSD
n=6, %

1 Pyruvate-2TMS

0.999815.1

2 Oxalic-2TMS

0.9946

6.2

3 Maleic-2TMS

0.9991

1.8

4 Succinic-2TMS

0.958822.0

5 Fumaric-2TMS

0.9991

2.2

6 Malic-3TMS

0.99972.1

7 Tartaric-4TMS

0.99981.9

8 Citric-4TMS

0.99982.5

4.E+06
2.E+06
0.E+00

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Quantity of orano acid (nmol)
Fumaric-2TMS Tartaric-4TMS Citric-4TMS

15

16

3, 固相誘導体化技術とは その2〜アミノ酸、有機酸と糖の一⻫分析〜

17試料負荷時の水濃度と固相への保持について【糖とAX固相】

Relative peak Area

100
50
0

2.5%

5%

10%

20%

50%

Ala-2TMS

Water concentration
Gly-2TMS
Val-2TMS

Ile-2TMS

Pro-2TMS

Ser-3TMS

75% 97.5%
Leu-2TMS
Thr-3TMS

Relative peak area

【アミノ酸とCX固相】

0

0.5%

1%

2%

5%

10%

Water concentration

Xylose-4TMS
Rhamnose-4TMS
Fructose1-5TMS

20%

50%

Arabinose-4TMS
Fucose-4TMS
Fructose2-5TMS【有機酸とAX固相】
Relative peak area

100

1%水-アセトニトリル溶液ではアミノ酸と有機酸と糖類を保持することが可能。

50
0

1%

2%

Pyruvate-2TMS
Succinic-2TMS

5%

10%

50%

75%

90%

Water concentration
Oxalic-2TMS
Maleic-2TMS
Fumaric-2TMS
Malic-3TMS18アミノ酸、有機酸＋糖と対象とする場合
野菜ジュース

試料 10µL（10mg）

１回目分取

添加︓水 190µL

Presh-SPE ACX-3mg

添加︓ACN 800µL（アミノ酸と有機酸を保持）

洗浄︓20%水-ACN 50µL（糖類を洗浄）

インキュベーション（37℃, 30min）
遠⼼分離（14000rpm, 5min）

試料抽出液分取 100µL （20%水-アセトニトリル）

2回目分取洗浄︓ACN 100µL（脱水効果）
試料抽出液分取 5µL（１%水-アセトニトリル）

希釈︓ACN 100µL（糖の保持効果）
試料抽出液（20%水-アセトニトリル）

Presh-SPE ACX-3mg（アミノ酸と有機酸を保持した状態）（糖類を保持）洗浄︓ACN 100µL（脱水効果）
誘導体化試薬を含浸 メトキシアミン/ピリジン 5µL
固相誘導体化反応 3min
誘導体化試薬を含浸 MSTFA 25µL

※適宜希釈
※NaOH水溶液を添加してpH７になるように調整

固相誘導体化反応 1min
溶出︓ヘキサン 100µL
添加︓ヘキサン 400µL
検液 GC/MS︓⼤量注⼊10µL

19

フルーツジュースを用いた各法によるSCANトータルイオンクロマトグラム比較20

本法による野菜ジュースのSCANトータルイオンクロマトグラム[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

TIC : 38568480 - 0

1. Alanine-2TMS
2. Malic acid-3TMS
3. Asparatic acid-3TMS
4. Pyroglutamic acid-2TMS
5. GAVA-3TMS
6. Glutamic acid-3TMS
7. Citric acid-4TMS
8. Fructose1-MO-5TMS
9. Fluctose2-MO-5TMS
10.Glucose-MO-5TMS
11.Glucopyronose-5TMS
12.Sucrose-8TMS

7
3.0E+07212

2.0E+07

8,9,106
3,4,5

1.0E+0711

1
0.0E+00
R.T-->

08:00

09:00

10:00

11:00

12:00

13:00

14:00

15:00

TIC : 1242248 - 95763

1.2E+0678

1.0E+0668.0E+051

9

11

2,3,4,5

6.0E+05

4.0E+05

2.0E+051拡⼤[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

07:00

R.T-->

07:30

08:00

08:30

09:00

09:30

10:00

10:30

10

1. Valine-2TMS
2. Isoleucine-2TMS
3. Proline-2TMS
4. Glycine-3TMS
5. Succinic acid-2TMS
6. Fumaric acid-2TMS
7. Serine-3TMS
8. Threonine-3TMS
9. Asparatic acid-3TMS
10.Tartaric acid-4TMS
11.Phenylalanine-2TMS

21

本法による標準溶液を用いた再現性
No.

化合物名

1 Pyruvic acid-MO-TMS
2 Oxalic acid-2TMS

3 Maleic acid-2TMS

4 Succinic acid-2TMS
5 Fumaric acid-2TMS
6 Malic acid-3TMS

アミノ酸および有機酸 0.05nmol/uL 50uL
ST-1

ST-2

ST-3

326,078

272,621

255,639

228,791

247,419

238,435

2,101,596 2,201,338 2,189,384

1,545,773 1,811,758 1,531,092

1,736,037 1,888,235 1,729,101
652,172

715,041

633,750

7 Ketoglutaric acid-M-2TMS 1,743,632 1,766,843 1,692,053
8 Tartaric acid-4TMS
9 Citric acid-4TMS

10 Alanine-2TMS
11 Valine-2TMS

12 Leucine-2TMS

13 Isoleucine-2TMS
14 Proline-2TMS

15 Glycine-3TMS
16 Serine-3TMS

17 Threonine-3TMS

18 Aspartic acid-3TMS
19 Methionine-2TMS

20 Glutamic acid-3TMS

1,373,960 1,441,944 1,313,024

1,230,029 1,294,887 1,202,971

8,640,462 9,028,803 9,243,813

1,643,565 1,598,273 1,795,816
524,794

517,891

555,474

2,145,613 2,184,722 2,256,030

5,966,070 5,815,625 6,337,728
465,546464,208

486,616

6,733,940 6,765,371 7,090,181

1,638,309 1,692,383 1,725,648

7,876,615 7,698,440 8,112,766
401,614403,554

416,804

1,775,455 1,595,572 1,826,798

21 Phenylalanine-2TMS

6,911,026 6,847,395 7,029,301

23 Lysine-4TMS

1,480,711 1,440,106 1,686,430

22 Tyrosine-2TMS

24 Histidine-3TMS
25 Tyrosine-3TMS

5,707,831 5,797,850 5,428,516
138,428

371,747

132,212362,896

152,731416,279

ST-4

Ave

289,516
236,130
2,277,568 2,192,472
1,741,508 1,657,533
1,903,735 1,814,277
696,375 674,335
1,836,823 1,759,838
1,419,340 1,387,067
1,273,394 1,250,320
9,480,040 9,098,280
1,983,400 1,755,264
589,075 546,809
2,403,115 2,247,370
6,947,649 6,266,768
491,786 477,039
7,561,905 7,037,849
1,806,406 1,715,687
8,337,593 8,006,354
439,198 415,293
1,865,958 1,765,946
7,367,841 7,038,891
6,026,842 5,740,260
1,684,583 1,572,958
157,374 145,186
423,004 393,482
303,726

229,875

RSD(%)
10.9

No.

化合物名

26 Xylose-MO-4TMS

3.7

27 Arabinose-MO-4TMS

8.5

29 Fucose-MO-4TMS

3.3
5.2
5.6
3.4
4.1
3.3
3.9
9.9
6.0
5.0
8.0
3.0
5.5

28 Rhamnose-MO-4TMS

糖類 0.2nmol/uL 5uL
ST-1

ST-2

ST-3

1,829,954 1,697,406 1,884,760 1,854,972 1,816,773
1,133,837 1,058,002 1,208,867 1,172,861 1,143,392
915,640

846,252

950,447

2,097,758 2,064,597 2,148,115

32 Mannose-MO-5TMS

4,836,740 4,851,336 4,937,350

34 Glucose-MO-5TMS

3,379,203 3,121,917 3,190,987

36 Sucrose-8TMS

2,622,777 2,662,113 2,631,348

38 Lactose2-8TMS

4,602,143 5,581,471 5,268,097

33 Galactose-MO-5TMS
35 Glucopyranose-5TMS
37 Lactose1-MO-8TMS
39 Maltose1-MO-8TMS
40 Maltose2-8TMS

Ave

2,058,363 1,927,036 2,180,936 2,151,136 2,079,368

30 Fructose1-MO-5TMS
31 Fructose2-MO-5TMS

ST-4

1,643,276 1,635,447 1,695,825

3,865,132 3,869,771 3,920,023
548,010654,027

630,117

3,725,973 3,468,644 3,464,426

4,552,684 4,072,476 4,110,055

3,659,795 4,138,740 3,773,779

909,615
2,143,372 2,113,461
1,747,072 1,680,405
5,090,237 4,928,916
3,996,825 3,912,938
3,180,244 3,218,088
691,119 630,818
2,696,903 2,653,285
3,533,066 3,548,027
5,638,305 5,272,504
4,065,236 4,200,113
4,336,212 3,977,132
926,120

RSD(%)
4.6
5.5
5.7
4.9
1.9
3.1
2.4
1.6
3.5
9.6
1.3
3.5
9.0
5.6
7.9

4.1
3.5
4.2
6.8
3.3
4.3
8.3
8.1
7.8

22

本法による野菜ジュースを用いた再現性
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

化合物名

野菜ジュース 10uL/1mL 4倍希釈
PJ-１

Succinic acid-2TMS
53,618
Fumaric acid-2TMS
13,489
Malic acid-3TMS
794,415
Ketoglutaric acid-MO-2TMS 10,287
Tartaric acid-4TMS
9,313
Citric acid-4TMS
1,966,814
Alanine-2TMS
2,845,774
Valine-2TMS
101,107
Leucine-2TMS
15,321Isoleucine-2TMS
63,155
Proline-2TMS
458,672
Glycine-3TMS
21,668Serine-3TMS
476,122
Threonine-3TMS
78,341
Aspartic acid-3TMS
4,686,933
Glutamic acid-3TMS
4,736,619
Phenylalanine-2TMS
257,196
Tyrosine-2TMS
31,487
Fructose1-MO-5TMS
2,062,980
Fructose2-MO-5TMS
1,711,374
Mannose-MO-5TMS
51,091
Glucose-MO-5TMS
2,535,728
Glucopyranose-5TMS
742,148
Sucrose-8TMS
1,847,061

PJ-２

48,21911,865
724,4119,840
8,245
1,935,224
2,768,258
88,755
14,91650,295393,806
22,811
443,964
78,1394,643,713
4,882,719
257,661
35,662
1,994,412
1,647,589
49,2982,186,072
786,844
1,746,771

PJ-３

53,185
12,732
793,269
10,4158,340
1,934,789
2,657,313
87,413
12,93653,582425,565
20,153407,985
72,696
4,436,285
4,744,648
234,500
32,902
2,042,655
1,673,083
51,4292,194,972
801,596
1,728,064

PJ-４

55,224
12,848803,023
10,414
8,706
1,938,684
2,774,700
92,007
14,241
58,315442,178
23,835449,604
78,255
4,519,353
4,812,985
255,148
37,777
1,997,072
1,650,628
49,616
2,152,255
816,807
1,720,861

PJ-５

１回目100uL

50,265
11,804
722,560
9,592
7,902
1,909,637
2,662,174
74,19912,27947,137347,122
22,879381,791
70,1694,386,816
4,716,805
244,192
33,5182,008,716
1,653,134
49,4842,144,596
827,676
1,710,034

PJ-６

53,96512,087
788,610
10,145
8,655
1,948,231
2,694,419
87,422
14,52049,470412,539
21,285429,997
74,5584,574,875
4,689,354
261,769
39,8442,003,833
1,638,625
49,3352,346,947
759,322
1,725,824

２回目5uLPJ-７

51,095
13,646
791,110
10,393
8,584
1,949,949
2,777,270
102,797
14,842
57,837434,530
20,946474,545
77,714
4,786,882
4,954,272
278,415
43,1092,146,394
1,689,720
50,9892,809,710
625,699
1,789,754

Ave
52,224
12,639773,914
10,1558,535
1,940,475
2,739,987
90,52914,151
54,256416,345
21,940437,71575,696
4,576,408
4,791,057
255,554
36,3282,036,580
1,666,308
50,1772,338,611
765,727
1,752,624

RSD(%)
4.7
5.9
4.5
3.2
5.2
0.9
2.6
10.6
7.9
10.6
8.9
5.9
7.8
4.3
3.1
2.0
5.4
11.5
2.7
1.6
1.9
10.7
9.0
2.8

23

まとめ
固相カートリッジを用いた新規GC/MSメタボローム解析用試料調製法を開発した。
当該固相誘導体化法を用いることで１．固相に対象物質を保持させて、洗浄することで、脱水操作を簡易かつ迅速に⾏うことが可能となった。
２．対象物質を保持した強イオン交換系固相に誘導体化試薬メトキシアミ
ン溶液およびMSTFA誘導体化試薬を直接添加して含浸させることにより、固相上で速やかに誘導体化反応が進んだ。
３．水分除去及び誘導体化の操作時間は10分と従来法(19時間)に比べて⼤きく短縮された。
24

4, 固相誘導体化の自動化
オンラインSPE-GC/MSシステム

25

目的
従来のメタボローム分析は、採取した試料を溶媒抽出、遠⼼濃縮、凍結乾燥、誘導体化等の前処理⼯程が煩雑であるため、⻑時間を要するとともに熟練された技術が必須となる．
また、多検体の前処理をバッチ処理した場合、GC/MSでの測定はそれらの検体を順次測定していくため、それらの検体において誘導体化後から測定までの時間が異なってしまう。これらは分析バッチ間の系統誤差の要因となり、多サンプルのメタボローム解析を遂⾏する上で致命的な短所である．
そこで、本研究では、迅速な⾃動誘導体化とその誘導体化からGCMSへの直接試料導⼊を目指して、固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC/MSシス
テムの開発を⾏ったので報告する。

26

オンラインSPE-GC-MSシステム
前処理ユニット

SGI-M100

Sampling

送液ユニットOnline SPE-GC-MS System

Flash-SPE

Injection

27

なぜGC-MSなのか
メタボローム分析におけるGC-MS測定のメリット
・幅広い成分を対象とできる・フラグメントから化合物を同定（推定）可能（ライブラリが充実）
欠点と解決法・煩雑な誘導体化が必要 → ⾃動化が解決︕
・水分除去がシビア→ 固相抽出が解決︕
・誘導体化後の再現性→ ⾃動化が解決︕
28

自動固相誘導体化オンラインSPE-GC-MSシステム
自動前処理時間 （精製・脱水・誘導体化）: 10 min
誘導体化から注入までの時間が常に一定

溶出・注入
Flash-SPE
AOS
LVI-S250
Spiral Insert
コンディ
ショニング

試料負荷

洗浄・脱水

誘導体化

GC-MS

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29

前処理フロー
試料︓ 50µL（50mg）
添加 水 150µL
添加 ACN 800µL
振とう （37℃, 30min）
遠⼼分離（14000rpm, 5min）
分取︓上澄み液︓ 250µL
添加 水 250μL
バイアル

バイアル
分取 : 40µL
Flash-SPE AOS-3mg

Automation
Online SPE-GC-MS System
コンディショニング
水 100μL
アセトニトリル 100µL

洗浄 水-ACN（1/4）100µL
脱水 ACN 100µL
含侵 Methoxyamine-Pyridine-MSTFA 8µL
固相誘導体化反応 2min
溶出 アセトン-ヘキサン(1/4) 40µL
GC-MS︓ LVI-Split（1:50）

30

SPE-GC-MS条件

31

⼤量注⼊-スプリット モード

1st Stage

注⼊注⼊口温度を溶出溶媒の沸点より低く設定し、溶出液を注⼊する。

2nd Stage

濃縮

溶出溶媒を気化してさせながら排出し、目的成分を濃縮していく。

3rd Stage

スプリット導⼊注⼊口温度を上げて、ス
プリットしながら目的成分をカラムへ導⼊する。

4th Stage

除去
⾼沸点の夾雑成分はスプリットで除去する。

スパイラルインサートの形状は固相カートリッジからの溶出液全量を一時的に受け止めることができる。
32

Relative peak area

固相誘導体化時間

Fig. 1. Relations of derivatization time in sorbent and the relative peak area.
33

Relative peak area

誘導体化試薬について

Fig. 2. Relations of the derivatization reagent and the relative peak area.
34

Methoxyamin/Pyridine-MSTFAの効果
O
O

Si
Si

Si

NH
O

NH

Si

O

Si

Si

N
O

O

Si

Si

N

N

Si

Si

Si

Glycine-3TMS

Ornithine-4TMS

Lysine-4TMS
Si

Si

O
N
Si

Si

O

Aminobutyric acid-3TMS

Si

N
N

Si

Si

Putrescine-4TMS

Methoxyamin/pyridineをMSTFAに混合することで誘導体化が促進された物質-CH2-NH2の基に対してしっかりと-CH2-N-2TMSに、グリシンの⽴体障害を受けない-C(-NH2)-についても-C(-N-2TMS)-になりました。

35

本法による標準溶液のSCANトータルイオンクロマトグラム[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ] TIC : 5977585 - 0

24,25

5.0E+06
11

3,4

15,16

10

4.0E+06125 8
73.0E+06

6

17

26
14

2.0E+06

29
27

1

18
19 21

13

1.0E+06

07:00

1.Alanine-2TMS
2. Valine-2TMS
3. Phosphate-3TMS
4. Leucine-2TMS
5. Isoleucine-2TMS

28

9

2

0.0E+00
R.T-->

23

20

08:00

6. Proline-2TMS
7. Glycine-3TMS
8. Succinic acid-2TMS
9. Fumaric acid-2TMS
10. Serine-3TMS

09:00

10:00

11. Threonine-3TMS
12. Malic acid-3TMS
13. Aspartic acid-3TMS
14. Methionine-2TMS
15. Proline-oxo-2TMS

11:00

22

12:00

16. Cytosine-2TMS
17. Aminobutyric acid-3TMS
18. Ketoglutaric acid-3TMS
19. Glutamic acid-3TMS
20. Phenylalanine-2TMS

13:00

14:00

21. Asparagine-3TMS
22. Putrescine-4TMS
23. Aconitic acid-3TMS
24. Citric acid-4TMS
25. Ornithine-4TMS

15:00
26. Adenine-2TMS
27. Lysine-4TMS
28. Tyrosine-3TMS
29. Guanine-3TMS

Fig. 3. The SCAN total ion chromatogram of standard solution using SPE-GCMS system with automated SPE-based derivatization method.
＊標準溶液バイアル中濃度︓0.01nmol/μL36

本法による標準溶液の再現性

Table 1. Reproducibility of peak area with standard solution using SPE-GC-MS system.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

CompoundAlanine-2TMS
Valine-2TMS
Phosphate (3:1)-3TMS
Norleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Proline-oxo-2TMS
Cytosine-2TMS
Aminobutyric acid-3TMS
Ketoglutaric acid-3TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Asparagine-3TMS
Putrescine-4TMS
Aconitic acid-3TMS
Citric acid-4TMS
Ornithine-4TMS
Adenine-2TMS
Lysine-4TMS
Tyrosine-3TMS
Guanine-3TMS

1
2,780,202
3,231,804
1,980,261
3,860,754
3,166,213
3,326,569
2,170,649
3,020,526
1,768,634
2,012,774
1,040,407
485,209527,945
1,317,135
1,972,283
1,164,055
1,903,218
179,954
486,088
1,553,897
264,587
1,097,163
1,068,411
2,509,279
948,801
1,791,455
438,332
2,290,304
1,276,608

2
2,814,678
3,290,271
1,945,488
3,995,800
3,281,486
3,445,278
2,352,541
3,101,538
1,813,725
2,110,285
1,085,291
496,725
521,172
1,376,552
2,178,513
1,199,619
2,080,359
187,293482,193
1,642,952
293,568
1,143,662
1,095,208
2,585,329
1,074,181
1,859,990
487,673
2,415,910
1,325,553

32,805,838
3,270,689
1,842,146
3,961,145
3,263,756
3,452,215
2,219,378
3,047,906
1,790,816
2,078,505
1,075,400
505,695
605,941
1,320,877
2,188,232
1,211,399
1,832,270
167,292
528,880
1,616,874
269,785
1,022,892
1,085,018
2,551,370
928,962
1,930,628
411,966
2,339,399
1,372,469

42,570,446
2,966,049
1,762,489
3,572,341
2,942,720
3,055,493
2,118,024
2,891,328
1,626,601
1,857,176
963,085
464,603439,870
1,165,099
2,213,001
1,081,564
1,718,333
138,034
375,004
1,422,103
215,342
1,069,833
973,865
2,326,885
889,675
1,670,688
389,2632,070,195
1,201,496

5
2,663,543
3,107,653
1,746,163
3,750,253
3,112,611
3,264,503
2,229,077
2,874,284
1,697,384
1,969,420
1,019,290
471,484
548,152
1,233,662
2,171,464
1,154,429
1,911,954
169,160
494,429
1,528,499
260,091
1,140,680
1,026,875
2,437,909
963,445
1,831,552
423,849
2,220,032
1,273,918

6
2,676,876
3,132,760
1,658,840
3,798,730
3,105,804
3,272,235
2,288,729
2,677,718
1,608,388
1,978,512
1,028,004
446,942
689,805
1,299,449
2,218,260
1,179,900
1,983,878
156,600
585,775
1,564,042
264,791
1,218,672
1,009,638
2,410,546
1,025,487
1,839,583
469,2632,300,204
1,292,009

7
2,632,581
3,054,963
1,585,771
3,712,869
3,057,182
3,230,054
2,328,562
2,840,826
1,635,905
1,918,379
988,509451,563
622,430
1,267,142
2,414,150
1,130,354
1,952,195
151,045
510,207
1,507,985
258,735
1,113,605
1,007,640
2,372,287
1,049,537
1,690,694
485,851
2,231,995
1,214,782

8
2,692,127
3,085,131
1,679,471
3,729,371
3,062,330
3,247,932
2,291,359
2,917,558
1,710,549
1,950,455
997,181459,884
590,812
1,274,606
2,348,929
1,140,346
1,884,295
147,256
483,426
1,508,373
249,746
1,075,243
1,025,144
2,395,838
1,005,050
1,722,793
449,843
2,184,577
1,217,067

Ave.
9
RSD, %
2,718,118 2,706,045
3.0
3,160,769 3,144,454
3.4
1,991,253 1,799,098
8.3
3,834,508 3,801,752
3.4
3,129,208 3,124,590
3.4
3,297,886 3,288,018
3.6
2,432,007 2,270,036
4.3
3,180,044 2,950,192
5.2
1,825,272 1,719,697
4.9
1,968,792 1,982,700
3.9
1,024,209 1,024,597
3.8
497,251475,484
4.5
358,848544,997
18.3
1,279,034 1,281,506
4.6
2,386,591 2,232,380
6.1
1,191,227 1,161,433
3.5
2,036,145 1,922,516
5.6
178,112
163,861
10.1
320,272
474,03016.8
1,520,941 1,540,630
4.2
263,337
259,998
7.9
1,130,409 1,112,462
5.0
1,085,668 1,041,941
4.1
2,470,814 2,451,140
3.5
1,047,923
992,5626.3
1,876,276 1,801,518
5.0
475,516
447,9517.8
2,239,834 2,254,717
4.4
1,316,201 1,276,6784.5＊標準溶液バイアル中濃度︓0.01nmol/μL
37

濃度とピーク⾯積値の関係（直線性）
Alanine-2TMS

6.E+06

R² = 0.9985

5.E+06

Peak Area

Peak Area

1.E+06

5.E+05

0

5

10

15

20

25

0.E+00Concentration (pmol/μL)

7.E+06

Succinic acid-2TMS

6.E+06

6.E+06

R² = 0.9972

5.E+06

5.E+06

0

5

10

15

20

25

Concentration (pmol/μL)

Citric acid-4TMS
R² = 0.9956

4.E+06
3.E+06

3.E+06

0

5

10

15

20

25

Concentration (pmol/μL)

0.E+00

10

15

20

25

1.E+06

Lysine-4TMS

8.E+05

R² = 0.9489

2.E+05

1.E+06

1.E+06

5

Concentration (pmol/μL)

4.E+05

2.E+06

2.E+060

6.E+05

Peak Area

Peak Area

4.E+06

0.E+00Peak Area

Peak Area

2.E+06

1.E+06

1.E+06

R² = 0.9952

3.E+06

2.E+06

2.E+06

Tyrosine-3TMS

5.E+06
4.E+06

2.E+06

3.E+06

0.E+00R² = 0.997

3.E+06

4.E+06

0.E+00Methionine-2TMS

3.E+06

0

5

10

15

20

25

Concentration (pmol/μL)

0.E+00

0

5

10

15

20

25

Concentration (pmol/μL)

Fig. 4. Relations of concentration in vial and the peak area.
38

本法によるマウス血清のトータルイオンクロマトグラム[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ] TIC : 4331844 - 0 3,4
4.0E+06711
10

3.0E+0618
61

2.0E+06

2
19

20,21

23

5

24

1.0E+0615
80.0E+00
R.T-->

07:00

08:00

1.Alanine-2TMS
2. Valine-2TMS
3. Phosphate-3TMS
4. Leucine-2TMS
5. Isoleucine-2TMS

09:00
6. Proline-2TMS
7. Glycine-3TMS
8. Succinic acid-2TMS
10. Serine-3TMS

12

10:00

13

11:00

11. Threonine-3TMS
12. Malic acid-3TMS
13. Aspartic acid-3TMS
14. Methionine-2TMS
15. Proline-oxo-2TMS

12:00

18. Glutamic acid-3TMS
19. Phenylalanine-2TMS
20. Citric acid-4TMS
21. Ornithine-4TMS

13:00

14:00

23. Lysine-4TMS
24. Tyrosine-3TMS

Fig. 5. The SCAN total ion chromatogram of the mouse serum using SPE-GC-MS systemwith automated SPE-based derivatization method.

39

本法によるマウス血清のピーク⾯積値の再現性
Table 2. Reproducibility of peak area with the mouse serum using SPE-GC-MS system.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

CompoundAlanine-2TMS
Valine-2TMS
Phosphate (3:1)-3TMS
Norleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Proline-oxo-2TMS

Cytosine-2TMS

Aminobutyric acid-3TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Citric acid-4TMS
Ornithine-4TMS

Adenine-2TMS

Lysine-4TMS
Tyrosine-3TMS

Guanine-3TMS

1
5,541,262
2,755,712
4,201,912
4,056,211
1,078,007
2,990,521
3,037,839
29,04014,4001,617,736
854,196
20,457
195,51293,568719,078
5,878
87,027
1,268,042
699,562
335,441
663,367
4,077
384,118
739,5513,773

25,554,574
2,771,037
4,356,822
4,080,919
1,080,660
3,000,081
2,895,879
29,234
13,605
1,601,793
855,270
20,641
183,707
94,791
784,164
5,728
83,832
1,206,401
714,084
333,534
673,4443,243
400,505
763,6703,789

35,750,943
2,893,545
4,434,444
4,276,463
1,131,523
3,191,334
3,107,951
29,61014,528
1,691,622
914,762
21,151
208,840
100,427
740,721
5,647
70,197
1,296,449
762,498
337,541
787,729
3,358
466,485
838,1103,207

45,697,229
2,911,101
4,412,647
4,306,038
1,141,625
3,154,192
3,217,887
29,11813,7571,701,792
923,062
21,808210,072
104,122869,323
5,592
83,924
1,342,892
773,628
334,091
789,718
3,410
466,911
848,3093,438

5
5,588,344
2,803,596
4,201,988
4,157,663
1,094,518
3,053,991
3,354,424
26,403
13,4691,664,881
882,377
19,071
204,684
101,698
610,496
5,629
75,857
1,281,052
724,391
312,166
771,4703,217
449,562
773,7372,485

65,721,789
2,871,371
4,259,611
4,270,224
1,124,087
3,162,046
3,293,368
27,322
13,211
1,718,251
911,832
20,283
225,449
103,386
641,127
5,516
76,002
1,393,273
758,118
321,946
808,655
2,885
483,398
850,3072,720

75,850,742
2,926,797
4,389,792
4,312,737
1,139,671
3,244,535
3,059,023
28,53012,847
1,759,025
928,177
20,751
240,856
105,816
674,841
4,974
85,355
1,513,486
786,916
322,681
771,975
3,216
450,203875,8072,968

8
5,681,853
2,853,359
4,266,977
4,223,433
1,121,838
3,101,102
3,070,554
28,003
12,142
1,685,417
920,805
19,941
233,191
97,718868,861
5,028
82,175
1,405,403
753,925
314,421652,659
2,978
364,748
790,0953,136

95,706,369
2,867,084
4,210,194
4,227,870
1,118,968
3,103,402
3,113,071
27,16911,996
1,696,241
914,839
19,094
238,539
99,320
839,473
5,413
87,546
1,516,263
773,827
317,960
737,745
3,005
433,653
852,336
2,457

Ave.
RSD, %
5,677,012
1.8
2,850,400
2.1
4,303,821
2.2
4,212,395
2.2
1,114,544
2.2
3,111,245
2.8
3,127,777
4.5
28,2703.9
13,3286.7
1,681,862
2.9
900,591
3.2
20,355
4.4
215,650
9.3
100,094
4.2
749,787
13.0
5,489
5.6
81,3247.3
1,358,140
8.0
749,661
4.0
325,5313.0
739,640
8.2
3,265
10.8
433,287
9.5
814,658
5.9
3,108
16.1

40

本法によるマウス血清の添加回収試験
No.

Compound

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

Alanine-2TMS
Valine-2TMS
Phosphate (3:1)-3TMS
Norleucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Malic acid-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Proline-oxo-2TMS
Cytosine-2TMS
Aminobutyric acid-3TMS
Ketoglutaric acid-3TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Asparagine-3TMS
Putrescine-4TMS
Aconitic acid-3TMS
Citric acid-4TMS
Ornithine-4TMS
Adenine-2TMS
Lysine-4TMS
Tyrosine-3TMS
Guanine-3TMS

Standard
ST2,395,769
2,857,898
1,691,961
3,402,608
2,801,029
3,037,141
1,800,878
2,958,640
1,676,379
1,769,642
900,834
475,088
440,006
1,186,002
1,684,508
1,069,383
1,425,778
162,941
381,767
1,361,973
212,637
928,721482,874
2,365,829
741,337
1,710,221
344,472
2,171,566
1,112,060

Mause
M

5,539,074
2,759,114
4,279,367
4,067,823
1,086,415
2,998,133
2,966,859
224,256
13,946
1,608,041
852,911
20,319190,845
93,758740,135
5,948
82,936
1,237,713
705,325
35,714
3,083
334,488
668,406
3,660
389,645748,5443,595

Mause +STA

7,703,074
5,744,538
6,787,045
7,424,476
4,096,438
6,301,408
4,603,320
3,375,441
1,869,217
3,632,037
1,865,424
551,360
795,480
1,417,378
3,085,018
1,182,673
1,774,441
163,614
1,524,345
2,285,882
291,982
1,124,501
544,525
3,143,411
1,295,449
1,966,746
680,1113,535,152
1,479,513

REC, %(A-M)/ST
90
104
148
99
107
109
91
107
111
114
112
112
137
112
139
110
119
100
75
116
137
117
112
119
85
115
84
128
133

Table 3. Recoveries of metabolites
added to mouse serum＊添加濃度︓0.01nmol/μL（バイアル中換算）

41

サンプル抽出液の負荷量とピーク⾯積値
Alanine-2TMS

1.E+07

R² = 0.9985

6.E+06
4.E+06

2.E+05
1.E+05

2.E+06

5.E+040.E+000.E+00
20

40

60

80

Succinic acid-2TMS

40

60

0

80

R² = 0.9965

Peak Area

4.E+05

2.E+05
1.E+05

2.E+050.E+000.E+00406080

9.E+05Citric acid-4TMS

8.E+05

R² = 0.9967

7.E+05

6.E+05

3.E+0520

Sample loading volume (μL)

Lysine-4TMS

1.E+06

Peak Area

Peak Area

20

Sample loading volume (μL)

8.E+05

4.E+05

1.E+06

0.E+00

1.E+06

R² = 0.9985

5.E+05

2.E+06

5.E+050

Sample loading volume (μL)

6.E+05

R² = 0.996
2.E+06

2.E+05

Peak Area

Peak Area

8.E+06

Tyrosine-3TMS

3.E+06

R² = 0.9944

3.E+05

1.E+070Methionine-2TMS

3.E+05

Peak Area

1.E+07

6.E+055.E+05
4.E+05
3.E+05
2.E+05
1.E+05

0

20

40

60

80

Sample loading volume (μL)

0.E+00
0

20

40

60

80

Sample loading volume (μL)

0

20

40

60

80

Sample loading volume (μL)

Fig. 7. Relations of sample loading volume and the peak area.
42

本法によるマウス血清の定量イオンクロマトグラムの再現性（重ね描き, n=9）8.0E+05

m/z 116
S-G(3)

m/z 158
1.4E+06 S-G(3)7.0E+05

1.2E+06

6.0E+05

1.0E+06

5.0E+05

m/z 273
1.4E+05 S-G(3)2.0E+05 m/z 174
S-G(3)

1.2E+05
1.5E+05
1.0E+05
8.0E+048.0E+05

1.0E+05

4.0E+05

6.0E+04

6.0E+05
3.0E+05
4.0E+05

2.0E+05

4.0E+04

5.0E+04

2.0E+04

2.0E+05

1.0E+05

0.0E+00
06:38

06:40

06:42

06:44

06:46

06:48

Alanine-2TMS

06:50

06:52

08:24

08:26

08:28

08:30

08:32

08:34

Leucine-2TMS

08:36

13:38

13:40

13:42

13:44

13:46

13:48

Lysine-4TMS

13:50

13:52

12:54

12:56

12:58

13:00

13:02

13:04

13:06

Citric acid-4TMS

Fig. 6. Reproducibility of ion chromatogram of the mouse serum using
SPE-GC-MS system( n = 9 ).

43

分析システムパッケージ44

分析システムパッケージ

45

まとめ
抽出後の本システムによる誘導体化を含めた前処理時間は10分で、かつ、その前処理からGC-MSによる測定まで完全に⾃動で⾏うことができた。
誘導体化してから注⼊するまでの時間が常に⼀定であるため、多検体においても安定した結果を得られると考えられる。
本システムを用いて、スタンダードおよびマウス血清による再現性、直線性を評価したところ、共に良好な結果を得た。
開発したオンライン⾃動固相誘導体化SPE-GC/MSシステムはメタボローム
分析に有効であることがわかった。

46

参考資料
・Metabolomics Conference 2017 2017.06.25-29 in Brisbane
Development of online SPE-GC-MS system with automated SPE-based derivatization method formetabolome analysis.
Ryoichi SASANO1, Koji MACHITANI2, Shusuke OSAKI2, Masahiro FURUNO3, Eiichiro FUKUSAKI3
1; Aisti Science co., Ltd., 2; Industrial Technology Center of Wakayama prefecture,3; Osaka University
・第65回質量分析総合討論会, ポスター発表
固相誘導体化を用いた低濃度のアミノ酸および有機酸と⾼濃度の糖類を含む試料の⼀⻫分析法の開発〇佐々野僚⼀1・⼤崎秀介2・古野正浩3・福崎英⼀郎3
アイスティサイエンス1・和歌山県⼯業技術センター2・阪⼤院⼯34747