フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明
京都大学大学院医学研究科皮膚科学講座

大塚篤司

Allergy March (atopic march) means a series of allergic diseases induced by one allergic disease. In recent years,
atopic dermatitis has attracted attention as a first step of allergy march. From the mouse model or human genetic analysis,
the mechanism of allergy march is gradually being elucidated. In allergy march, percutaneous sensitization is regarded asimportant for the induction of other allergic diseases, and among them, there is a high possibility that the mutation of thefilaggrin gene responsible for the skin barrier function is triggered. The application of zinc-finger nucleases (ZFNs) as agene-targeting technology has been successful in rats, which is faster and more efficient than embryonic stem cell-mediatedknockout technology. Herein, we report the generation and characterization of Flg knockout (Flg KO) rats. FLG KO rats
showed an increase in transepidermal water loss. we found that OVA-induced asthma exacerbated using atopic dermatitisinduced FLG KO rat compared to that of wild type rat. It is expected that new allergy march therapy development focusingon filaggrin expression control will be developed in the future.

1. 緒

ルギー発症のリスクを高め、10 歳でオッズ比が 2.86、18言

歳ではオッズ比が 4.25 にのぼる 7）。ピーナッツアレルギー

フィラグリンは皮膚バリア機能を担う重要なタンパクでのリスクがフィラグリン遺伝子の変異に依存するとの報告ある。アトピー性皮膚炎（AD）の約 20 ‒ 30% の患者にフィもある 8）。アレルギーマーチのメカニズムを説明する上でラグリン遺伝子の変異が認められるだけでなく、アトピー抗原の交差性も指摘されている。ピーナッツのアレルゲン性皮膚炎の患者のほぼ全てでフィラグリンタンパクの発現はスギ花粉などのエアロアレルゲンとの交差性を認める 9）。

が低下している。このことから、アトピー性皮膚炎発症とこのようにアトピー性皮膚炎、特にフィラグリン遺伝子のフィラグリンタンパクの関係は世界中で大きな注目を集め変異とアレルギーマーチの関連を示唆する多くの傍証はあている。我々はこのフィラグリンの発現を亢進する新規化るものの、そのメカニズムに関しての詳細は不明である。

合物を発見し、この化合物を投与したモデルマウスではア

そこで本研究申請課題では、申請者らが作成した新規モ

1）

トピー性皮膚炎が改善することを世界で初めて報告した 。

デル動物であるフィラグリン遺伝子欠損ラットを用いて、アトピー性皮膚炎、特にフィラグリン遺伝子の変異がアフィラグリン遺伝子異常から始まる喘息発症のメカニズムレルギーマーチの誘因に関与する可能性が海外で提唱されを解析し、アレルギーマーチ全貌の解明につなげることをている。エアロアレルゲンの経皮感作マウスでは全身の目的とする。

Th2 免疫応答が誘導され、アレルギー性鼻炎が誘導されやすくなるとの報告がある 2）。さらに、経皮感作によって誘導されたアトピー性皮膚炎モデルマウスでは、経気管支

2. 方法

2. 1. フィラグリンラットの作成
近年、遺伝子ターゲッティング技術としてのジンクフ

3）によるアレルギー反応が誘導されやすくなる 。
ヒトでは、重症 AD 患者の 70% がその後喘息及びアレィンガーヌクレアーゼ（ZFN）が開発され、胚性幹細胞にルギー性鼻炎を併発する 4）。フィラグリン遺伝子変異を持よるノックアウト技術よりも速く効率的な遺伝子改変モ

つ AD 患者はフィラグリン遺伝子に変異を持たない AD 患デルの作成が可能となっている 10）。ラットフィラグリン

者比べ喘息に罹患する可能性が高い 。また、フィラグリ遺伝子の第 2 エキソンを、従来の ZFN 試薬を用いて標的ン遺伝子に変異を持つ喘息患者ほど治療が難治するとの報化した。確認された ZFN mRNA を受精した F344 / Stm 卵5）6）

告もある 。さらに、フィラグリン遺伝子変異は食物アレ母細胞にマイクロインジェクションした後、偽妊娠 Crlj：WI 雌ラット（偽妊娠里親）の卵管に移した。8 匹の新生動物をスクリーニングすると、4 匹（50 ％）が免疫組織化学的染色により確認されたように、FLG タンパク質発現の完

Mechanism of atopic march using filaggrin
knockout rat
Atsushi Otsuka
Department of Dermatology, KyotoUniversity

全な喪失をもたらすフレームシフト突然変異である 7bp 〜2622bp の欠失を含む突然変異を有していることが明らかとなった。

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

2. 2. 喘息モデルの作成

炎反応を亢進することを報告している 11）。しかしながら、アトピー性皮膚炎モデルは、OVA アルブミンタンパク

Flaky tail マウスはフィラグリン遺伝子のみならず mattedを経皮的に感作し続ける OVA-ODT モデルが一般的に広遺伝子の変異を認めるため、フィラグリン遺伝子と皮膚のく用いられている。毛剃りしたマウスの背部に OVA タン表現系の関連性は直接的に証明されていなかった。2012

パクを数日間貼付け密封し、それを 2 週間以上繰り返すこ

年 Kawasaki らによってフィラグリン遺伝子欠損マウスがとで、OVA 特異的 IgE がマウス内で上昇し、OVA タンパ作製され、皮膚に特徴的な所見は認めないことが報告され

クを貼付けた部位には皮膚炎が誘導され、組織学的にはた 12）。我々はこのマウスと人のフィラグリン遺伝子変異にアトピー性皮膚炎に近いことが知られている。そこでまよる表現系の違いが表皮の厚さによるものではないかと考ず、FLG KO ラットと野生型ラットを用いてアトピー性皮え、マウスに比べ表皮の厚いラットを用いてフィラグリン膚炎モデルの構築を行う。皮膚における炎症の評価、全身遺伝子欠損動物を作成した。フィラグリン遺伝子欠損（FLG性 Th2 反応の変化を観察する。続いてアトピー性皮膚炎KO）ラットを作成にあたり、Zink finger protein を用いモデルを誘導したラットを用いて、喘息モデルの評価を行た。ラットフィラグリン遺伝子の第 2 エキソンを、従来のう。密閉した箱内でラットを飼育し OVA タンパクを生食ZFN 試薬を用いて標的化した。確認された ZFN mRNA をに溶解させネブライザーで噴霧させる。この惹起を２回ほ受精した F344/Stm 卵母細胞にマイクロインジェクションど行い、気道内浸潤細胞の評価、肺気道上皮の組織学的解した後、偽妊娠 Crlj：WI 雌ラット（偽妊娠里親）の卵管に析、また Th2 サイトカインの発現の変化を観察する。皮移した。8 匹の新生動物をスクリーニングすると、4 匹（50

膚局所での炎症浸潤細胞とサイトカインの発現変化、また％）が免疫組織化学的染色により確認されたように、FLG肺気道上皮でのそれら変化を比較し、アレルギーマーチのタンパク質発現の完全な喪失をもたらすフレームシフト突誘導に重要な標的物質の同定を試みる。

然変異である 7bp 〜 2622bp の欠失を含む突然変異を有し

3. 結ていることが明らかとなった。

果

このラットは、尾部に絞扼輪を伴い臨床所見を有する（図3. 1. フィラグリン遺伝子変異（FLG KO）ラットの解析1 A）。遺伝子改変ラット（KO）では尾部に絞扼輪を認め背Flaky tail マ ウス と は、 フィラグ リン 遺 伝 子 に 変 異部の皮膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることが（5303delA）を有するマウスであり、申請者が所属する研究わかった。また、ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染室において Flaky tail マウスがダニ抗原を用いた接触皮膚色では、KO ラットのフィラグリン発現が完全に消失して

図1A．遺伝子改変ラット（KO）では尾部に絞扼輪を認め背部の皮膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることがわかった。
B．ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染色。WT：野生型、HT：ヘテロ遺伝子 KO、KO ホモ遺伝子 KO− 64 −

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明いることを確認した（図 1 B）
。このラットを用いて皮膚バ認された ZFN mRNA を受精した F344 / Stm 卵母細胞にマリア機能の基礎的な解析を行った。経皮水分喪失量と皮膚イクロインジェクションした後、偽妊娠 Crlj：WI 雌ラッコンダクタンスは、FLG KO ラットで明らかに減弱していト（偽妊娠里親）の卵管に移した。8 匹の新生動物をスクリることが明らかとなった。また、共焦点ラマン分光装置をーニングすると、4 匹（50 ％）が免疫組織化学的染色により用いて角質層における天然保湿因子の含有量の評価を行っ確認されたように、FLG タンパク質発現の完全な喪失をたところ、水分保持量が FLG KO ラットで優位に減弱しもたらすフレームシフト突然変異である 7bp 〜 2622bp のていることを見出した。

欠失を含む突然変異を有していることが明らかとなった。
この FLG KO ラットでは、尾部に絞扼輪を認め背部の皮3. 2. フィラグリン遺伝子変異（FLG KO）ラットの解析

膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることがわかっ

FLG KO ラットと野生型ラットを用いてアトピー性皮膚た。また、ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染色では、炎モデルを構築した。続いてアトピー性皮膚炎モデルを

KO ラットのフィラグリン発現が完全に消失していること誘導したラットを用いて、喘息モデルの評価を行った。気を確認した。さらに、水分保持量が FLG KO ラットで優管支肺胞洗浄液中の総細胞数は、野生型ラットに比べて位に減弱していることを見出した。FLG KO ラットと野生FLG KO ラットで優位に上昇していた。さらに細胞分画を型ラットを用いてアトピー性皮膚炎モデルを構築した。続

比較したところ、好酸球が FLG KO ラットで優位に上昇いてアトピー性皮膚炎モデルを誘導したラットを用いて、していることを見出した（図 2 A，B）。

喘息モデルの評価を行った。気管支肺胞洗浄液中の総細胞4. 考数は、野生型ラットに比べて FLG KO ラットで優位に上察昇していた。さらに細胞分画を比較したところ、好酸球が今回、我々は FLG KO ラットの作成に成功した。フィラ

FLG KO ラットで優位に上昇していることを見出した。以

グリン遺伝子欠損（FLG KO）ラットを作成にあたり、Zink

上より、FLG KO ラットでは、アトピー性皮膚炎誘導に伴finger protein を用いた。ラットフィラグリン遺伝子の第い、喘息の増悪がみられることが明らかとなった。
ヒトの体全体を覆う皮膚は、面積が 1.6m2、重量は体重2 エキソンを、従来の ZFN 試薬を用いて標的化した。確図2− 65 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018の 16% を占める人体最大の臓器である。皮膚は外界とのり、今後のコスメトロジーに大きな影響を与えるものと考接触がある臓器であるため生命を維持するための様々な機える。
我々は、本研究にて FLG KO ラットの作成に成功した。

能を有している。主な機能として、水分の喪失や透過を防ぐ、体温を調整する、微生物や物理化学的な刺激から生我々はこれまで、FLG の発現をコントロールする化合物

体を守る、感覚器としての役割を果たす、などがある。皮の同定に成功し報告した 1）。具体的には、培養表皮細胞を

膚は外層から表皮、真皮、皮下組織の３層の構造を有する。

用いて約 1,200 種類の市販の化合物ライブラリーからフィ

表皮は角化細胞で構成され、外層から角層、顆粒層、有棘ラグリンの発現を亢進する化合物のスクリーニングを行っ層、基底層の４つに分類される。基底層にある基底細胞はた。この結果、JTC801 という化合物が培養表皮細胞のフ皮膚外層に向かい分裂しそれぞれの層を構成することとなィラグリン（プロフィラグリン）の発現を亢進させた。まる。最終的に核が脱落し角層になるまで約 45 日のターン

た、JTC801 は、ヒトの皮膚に近い構造を持つ 3 次元表皮オーバー時間がかかるといわれている。

培養においても、フィラグリンの発現を亢進させた。ヒト

皮膚の最外層である角層では、細胞は脱核し死んだ角化

アトピー性皮膚炎患者ではフィラグリン遺伝子のヘテロ変細胞は落ち葉を敷き詰めたように重層化する。約 10 層か異がほとんどである。そこでフィラグリン遺伝子にヘテらなる角層は表面から順に垢としてはがれ落ちる。フィラロ変異を有するマウスに JTC801 を投与させたところ、フグリンはその角層の主要な構成成分の一つである。その働ィラグリンの発現が亢進した。また、JTC801 を投与した

きは強度や柔軟性、水分保持、皮膚の PH、生体内化合物

マウスでは経皮水分喪失量の低下が見られた。さらに、アへのバッファー作用など多岐にわたる。フィラグリン遺伝

トピー性皮膚炎モデルである NC/Nga マウスを用いた実子は角化細胞の他の最終分化に関連するタンパクと同様に

験では、JTC801 を内服させたマウス群でフィラグリンタ

クロモソーム 1q21 に存在する。フィラグリンはプロフィンパクの発現が亢進し、アトピー性皮膚炎様の症状が改善ラグリンとしてまず産生される。プロフィラグリンは分子された。以上より、皮膚でのフィラグリンの発現を上昇さ

量約 400KDa、10 ‒ 12 のフィラグリンリピート構造を有すせ、バリア機能を亢進させることにより、アトピー性皮膚る。角化細胞の最終分化に伴いプロフィラグリンは脱リ炎の発症を抑制させる可能性があることが示唆された。しン酸化し、様々なプロテアーゼの作用により 37KDa のフかしながら、JTC801 を用いたヒトを対象とした臨床治験ィラグリンへと分解される。この脱リン酸化とプロテアを行うには安全性試験など多くの課題が残されている。まーゼによる分解はカルシウム濃度、セリンプロテアーゼ

た、マウスの皮膚はヒトとは違い、表皮が薄いことが知らCAP1/Prss8、そしてプロテアーゼ阻害剤（LEKTI）によっれている。そのため、新規化合物や薬剤のヒトでの有効性て制御されていることが報告されている 13 ‒16）。モノマーにが検討可能なモデル動物の開発が必要である。本研究で開なったフィラグリンはケラチンフィラメント同士を凝集さ発した、FLG KO ラットは、ヒトの皮膚に近いラットにてせる線維間凝集物質として働く。この間フィラグリンは角アトピー性皮膚炎のモデル動物を作成できたことに大きな層での強度や柔軟性に大きく貢献する。フィラグリンがな意義がある。
今回、我々は世界初の FLG KO ラットの作成に成功した。

い状態では角層細胞ははがれやすく、経皮的な内と外との浸透性が上昇する。このことからフィラグリンがない状態

また、この KO ラットを用いたアトピー性皮膚炎モデルででは経皮水分喪失量（transepidermal water loss, TEWL）

は、喘息が増悪することが明らかとなった。今後、このモが上昇する 。角層の外層部ではフィラグリンは更に分解し、デル動物を用いてアレルギーマーチの解明のみならず、新アミノ酸、ウロカニン酸などの天然保湿因子（NMF）にな規薬剤の検討が可能となるだろう。

17）る（図 1）。NMF は角層における水分保持量を担保し、PHを維持しバッファー効果を有する。このことで表皮細胞の（引用文献）

正常分化を促し、病原性細菌の集落形成を減少させる 18）。

1） Otsuka, A., et al. Possible new therapeutic strategy

本研究は、我々の研究室で作成した世界初の FLG KO

to regulate atopic dermatitis through upregulating

ラットを用いてアレルギーマーチメカニズムの解明を目指

filaggrin expression. J. Allergy Clin. Immunol. 1 3 3,
139-146 e131-110（2014）．

した。今後喘息モデルのみならず他のアレルギーモデルを適応することでアレルギー疾患に広くアプローチができる

2） Akei, H.S., et al. Epicutaneous aeroallergen exposure

ものと考える。アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギ

induces systemic TH2 immunity that predisposes toー疾患は今後更に増加することが予想される。現在解析しallergic nasal responses. J. Allergy Clin. Immunol. 118,ているフィラグリン遺伝子異常から始まるバリア機能の破62-69（2006）．

綻とアレルギーマーチの誘導メカニズムは、皮膚の健康が

3） Spergel, J.M., et al. Epicutaneous sensitization withアレルギーの予防という新しいコンセプトを提供可能であprotein antigen induces localized allergic dermatitis− 66 −

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明

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