非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析
─皮膚は色を識別できるのか？─
日本薬科大学薬学部生命科学薬学分野

山本博之

The skin is the most external part of the body and is strongly influenced by light. Previous study, the effects of light on
the skin have been evaluated mainly in terms of the biological effects of UV light, which has high energy, but the mechanisms of skin tissue response to visible light are still unclear. In this study, we investigated the light response of skin, anon-visual tissue, focusing on photoreceptors. Photoreceptor expression in skin tissue and skin keratinocytes was evaluatedby RT-PCR, and multiple opsin receptor mRNA expressions were found in rat skin tissue and FRSK cells. The expressionof enzymes related to the visual cycle, which is involved in the maintenance of photoreceptor activity, was also examinedby RT-PCR. The results showed that all enzymes involved in the visual cycle were expressed in rat skin tissue. Retinal metabolites in FRSK cells after light exposure were detected by HPLC. The results showed that 11cis-retinal was converted toall trans-retinal by exposure to light. These results indicates that photoreceptors expressed on keratinocytes are modulated intheir activity by exposure to light.

1．緒

プシンタンパク質に 11-cis レチナールが結合しているこ言とが重要である。オプシンタンパク質に結合する 11 -cis

皮膚は最も外側に位置する組織であり、外界から様々なレチナールは光線の曝露によって all trans- レチナールに物理的刺激を受けている。それらの刺激の中でも光は生活変換された後、オプシンタンパク質から解離される。そのする上で避けることができないものである。生体に対するため、11 -cis レチナールを失ったオプシンタンパク質は失光の影響は、エネルギーの大きな紫外線の影響を中心に評活する。眼では解離した all trans - レチナールが再び 11 -価がされてきた。紫外線は組織において活性酸素種の増加

cis レチナールとなりオプシンタンパク質に結合する経路

や DNA 障害などを介して、色素沈着や細胞外マトリック（図 1 視サイクル）が存在し、オプシンタンパク質が活性スの分解、炎症の惹起などを引き起こす 1）。紫外線によりを持続できる環境が整っている 3）。そこで本研究では、光引き起こされるこれらの応答は、シミやしわといった皮膚線の曝露による皮膚の活性化機構についてオプシンタンパの老化現象と類似していることから光老化と呼ばれる。一ク質に着目し、初めに皮膚に発現するオプシン類の探索を方、紫外線よりも長波長の可視光線は皮膚の美容領域で利用されており、皮膚に存在する細胞は表 1 のように、浴びる光の波長によりペプチドやプロテアーゼの産生、セラミ表1波長による皮膚由来細胞の応答の違いド合成、メラニン産生などの細胞応答が起こることが報告されている。このような光線の曝露から細胞応答が起きる反応には、光線の刺激が化学シグナルに変換されて細胞応答が起こると考えられるが、皮膚における光応答の仕組みは不明な点が多い。皮膚が光を認識する機構として、光受容体として機能するオプシンタンパク質の研究が進められている 2）。オプシンタンパク質は G タンパク質共役型受容体に分類され、サブタイプの違いによって認識する波長が異なる。眼の網膜では、青、緑、赤の波長を受容するオプシンタンパク質が網膜の錐体細胞に発現しており外界からの光の色の違いを識別している。また、その活性には、オ

Activation mechanism of photoreceptors
expressed in skin tissue
Hiroyuki Yamamoto
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Nihon
Pharmaceutical University− 176 −

図1

視サイクル

非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析

─皮膚は色を識別できるのか？─

行った。また、皮膚に発現するオプシンが光を受けて活性出した。抽出液は遠心分離後、上清を回収してウエスタンを維持するために必要な視サイクルが皮膚においても存在ブロットの試料とした。ウエスタンブロットは、12 ％ アしているのかを検証した。さらに、皮膚に発現するオプシクリルアミドゲルにて試料を電気泳動し、ニトロセルローンタンパク質が光を受けて活性を調整しているのかをレチス膜に転写した。転写したニトロセルロース膜は、スキムナール代謝産物を検出することで評価した。

ミ ル ク で ブ ロ ッ キ ン グ 後、 抗 RPE 65 抗 体（3 , 000 倍、2. 方GeneTex 社）、2 次抗体として HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体

法（10 , 000 倍、SeraCare 社）で反応させたのち、RPE 65 タン

2. 1. 実験動物と培養細胞パク質をイムノスターゼータ（和光純薬）で検出した。

実験には、Sprague-Dawley ラット（SDR）および弘前小眼球ラット（Hirosaki Small Eye Rat； HiSER）を用いた。

2. 4. レチナール代謝産物の検出
10 cm シャーレに 1 × 107 細胞となるように播種した。

HiSER ラットは、SDR より自然突然変異により発生したラットであり、常染色体劣性遺伝性かつ進行性の水晶体の24 時間培養後、細胞を 350 nm- 850 nm の波長を含む LED白濁や退縮、網膜の剥離などの異常を示すラットである 4）。

光で 15 分間、曝露した。曝露後、10 分および 30 分の細ラットの飼育は、室温 23 ± 1 ℃、湿度 50 ％、明暗を 12 時

胞からレチナール代謝産物およびレチノール代謝産物を抽間サイクルに維持された飼育室にて、摂餌・飲水は自由に出した。また、LED 光で曝露していないものを非照射細摂取できる環境で飼育した。本実験は日本薬科大学動物実胞として用いた。レチナール代謝産物は、ホルムアルデヒ

験倫理委員会によって承認を受けて実施した。

ド法 5）、レチノール代謝産物はヘキサン 6）により抽出した。

また、実験に用いたラット胎児角化細胞（FRSK）は、すなわち、レチナール代謝産物は、PBS で洗浄後、6 M ホJCRB 細胞バンク（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄ルムアルデヒドで固定した後、レチナール代謝産物をジク養研究所）より分譲されたものを用いた。FRSK 細胞は、ロロメタン /n- ヘキサンで分配抽出した。抽出物は遠心エ10 ％ FCS を 添 加 し た ダ ル ベ ッ コ 改 変 イ ー グ ル 培 地

バポレーターにて乾固させた。また、レチノール代謝産物（DMEM）で、CO 2 インキュベーターを用いて 5 ％ CO 2、は、PBS で洗浄後、エタノールで除タンパク質した後、ジ37 ℃の条件で培養した。

クロロメタン /n- ヘキサン溶液によりレチノールを抽出した。抽出物は遠心エバポレーターにて乾固させた。抽出し2. 2. ラット胎児角化細胞に発現する光受容体および視サイクル関連酵素mRNA発現の検討
7たレチナール代謝産物とレチノール代謝産物はメタノール／ リ ン 酸 緩 衝 液 で 溶 解 後、 逆 相 カ ラ ム（ コ ス モ シ ー ル

FRSK 細胞を 10 cm シャーレに 1 × 10 細胞となるように

Cholester カラム、ナカライテスク）を用いた高速液体クロ播種した。24 時間後、培地を除去した後、RNA 抽出用試マトグラフィーにより分離し、溶出時間からレチノールお薬 Isogen を用いて total RNA を抽出した。抽出した total

よびレチナール代謝産物の分子型を評価した。

RNA は、逆転写酵素（ReverTra Ace、東洋紡）を用いて3. 結cDNA を合成した。また、SDR および HiSER より背部皮膚と眼組織を採取し、FRSK 細胞と同様に cDNA を調製した。調製した cDNA を用いて、光受容体および視サイクル関連酵素遺伝子の発現を PCR 法により検討した。光受果

3. 1. 角化細胞および皮膚組織に発現する光受容体の探索
皮膚組織に発現する光受容体の探索を行った。その結果、容体は、OPN 1 -SW、OPN 1 -MW/LW、OPN 2、OPN 3、

ラット背部の皮膚組織には OPN 1 -SW、OPN 3、OPN 4 おOPN 4 および OPN 5 mRNA の発現を PCR 法により検討しよび OPN 5 mRNA の発現が認められた（図 2 -A）。ラット

た。また、視サイクル関連酵素はレチノールデヒドロゲナの皮膚に発現する光受容体の波長と活性の関連を図 2 -Bーゼ（RDH）8、RDH 12、RDH 11、レシチン - レチノールに示す。このことから、皮膚組織には UV-A に相当するアシルトランスフェラーゼ（LRAT）およびレチノイドイソ

380 nm 付近から緑色の 550 nm 付近の波長に応答する光受メロヒドロラーゼ（RPE）65 mRNA の発現を PCR 法により容体が発現することが示された。紫外線や青色光などの短評価した。

波長の光は組織への透過力が弱く表皮や真皮にまでしか到達しない。そこで、皮膚で最も外部に位置する表皮の主な2. 3. ラット胎児角化細胞に発現するRPE65タンパ細胞である角化細胞に与える影響が大きいと考え、角化細ク質の検出胞に発現する光受容体を RT-PCR 法にて解析した。そのFRSK 細胞を 10 cm シャーレに 1 × 107 細胞となるように結果、FRSK細胞にはOPN1-SW、OPN2、OPN3 およびOPN 5播種した。24 時間後、培地を除去した後、PBS で細胞をmRNA の発現が認められた（図 2 -A）。FRSK 細胞に発現

洗浄後、RIPA 緩衝液で細胞を可溶化してタンパク質を抽する光受容体と活性化される波長の関係から、皮膚組織と− 177 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図2

ラット皮膚および皮膚角化細胞における光受容体遺伝子の発現検討

A： RT-PCR法によるラット皮膚およびラット角化細胞に発現する光受容体mRNAの検討
B： 皮膚組織および角化細胞に発現する光受容体と応答する波長の関係

図3

ラット皮膚および皮膚角化細胞での視サイクル関連酵素の発現検討

A： RT-PCR法によるラット皮膚および眼組織に発現する視サイクル関連酵素発現の検討
B： 皮膚に発現する視サイクル関連酵素発現の系統の違いに関する検討
C： ウエスタンブロットによるRPE 65タンパク質発現の検討

同様に FRSK 細胞は 380 nm から 550 nm 付近の光線を認識

trans - レチナールが all trans - レチノール、11 cis- レチナする光受容体が発現していることが示唆された（図 2 -B）。

ールを介して 11 cis - レチノールに変換されるのに必要なすべての酵素が発現していることを示している。また、視サ

3. 2. 皮膚組織に発現する視サイクル関連酵素の探索

イクルに関わる酵素の発現が週齢やラットの系統により違

ラットの皮膚組織や表皮角化細胞に複数の光受容体が発いがあるのかについても検討を行った（図 3 -B）。その結果、現していることが示唆された。そこで、光受容体が活性をSDR および HiSER ラットのいずれの系統においても、視サ維持するために必要な視サイクルに関わる酵素が皮膚組織イクルに関わる酵素の発現が認められた。また、酵素の発に発現しているかを確認するために、RT-PCR 法にて検現は 1 週齢から 4 週齢にかけて大きな変化は認められなか討した。その結果、図 3 -A に示すように眼組織と同等にった。さらに、all trans - レチノールを 11 cis - レチナール

皮膚組織においても視サイクルに関わる RDH 8、RDH 12、に変換する RPE 65 タンパク質の発現をウエスタンブロット

RDH 11、LRAT および RPE 65 mRNA の発現が認められた。

法にて検出した。その結果、ラット皮膚においても眼組織

こ の 結 果 は 光 の 曝 露 に よ り 光 受 容 体 か ら 遊 離 し た allと同様に RPE 65 が発現していることが示された（図 3 -C）。

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非視覚組織に発現する光受容体の機能の解析

図4

─皮膚は色を識別できるのか？─

光線曝露後の角化細胞内のレチノールおよびレチナール代謝産物の検出

A： 標準物質の溶出位置、B： 光線非曝露細胞、C： 光線曝露10分後、D： 光線曝露30分後

3. 3. 角化細胞における光線曝露後のレチナール代謝
ラットの皮膚組織や表皮角化細胞に光受容体が発現してな る と、all trans- レ チ ナ ー ル の ピ ー ク は 減 少 し、alltrans- レチノールの割合が大きくなった（図 4 -D）。

おり、その活性の維持に関わる視サイクルが存在している

４. 考ことが示唆された。そこで、FRSK 細胞が光線の曝露を受察けたときに、細胞に発現する光受容体が活性化されている

以上より皮膚組織においても眼と同様に光受容体であるのか、また、光受容体の活性を維持するためにレチノールオプシンタンパク質の発現が認められ、可視光線を感受すおよびレチナール関連分子が代謝を受けているのかを明らることが示唆された。皮膚組織に発現する光受容体の応答かにすることを目的に光線曝露後のレチナール代謝産物の波長をまとめると皮膚は紫外光から緑色光にわたり、広い経時変化を解析した。図 4 -A に視サイクルで生成される範囲の波長で光を受容することが可能であると考えられた。

レチナールおよびレチノール代謝産物の標準物質のクロマ

これまでに、角化細胞や毛乳頭細胞において青色光によりト グ ラ ム を 示 す。 本 実 験 条 件 で は 11 cis -レ チ ナ ー ル、活性化される OPN 3 の発現が報告されており、角化細胞

11 cis - レチノール、all trans-レチナールおよび all trans-では分化を抑制することにより表皮を厚くすることで皮膚レ チ ノ ー ル は そ れ ぞ れ、9 . 1 分、8 . 1 分、11 . 0 分 お よ びの保護作用を亢進すること 7）や毛乳頭細胞では毛髪の成長10 . 0 分付近に溶出された。LED 光で細胞を曝露する前に速度を促進すること 8）が報告されている。紫外光や青色光は、11 cis - レチナールの存在割合が大きく、11 cis - レチノは短波長の光線に分類され、皮膚の透過性は小さく、組織ール、all trans -レチナールおよび all trans- レチノールはに与える影響が大きい波長である。そのため、これらの応検出されるものの存在割合は小さかった（図 4 -B）。次に、答は光線曝露からの生体の防御応答と考えられた。一方、LED 光線曝露 10 分後では、11 cis-レチナールはほとんど赤色光の長波長を認識する光受容体は検出されておらず、検出されなくなり、all trans-レチナールの存在割合が最オプシンタンパク質以外に光を認識する仕組みの存在が予も高くなった（図 4 -C）。さらに、LED 光線曝露後 30 分に想された。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

皮膚組織においてオプシンタンパク質の活性維持に必要

2017, 39, 1-5.

な酵素の発現も認められ、皮膚に発現するオプシンタンパ

2） Suh S, Choi EH, Atanaskova Mesinkovska N. The

ク質が機能していることが強く示唆された。また、皮膚角expression of opsins in the human skin and its化細胞に光線を曝露すると一過性に all trans-レチナール

implications for photobiomodulation: A Systematicが増加し、その後 all trans-レチノールの増加が見られた

Review. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2020,

ことから、皮膚角化細胞においても視サイクルと同様の代36, 329-338.

謝が行われていることが示された。さらに、光線の曝露に

3） Choi EH, Daruwalla A, Suh S, Leinonen H, Palczewski

よって all trans -レチナールが増加したことは、皮膚角化

K. Retinoids in the visual cycle: role of the retinal G細胞に発現するオプシン受容体が曝露された光線に応答しprotein-coupled receptor. J Lipid Res. 2021, 62, 100040.ていることを示している。本研究では、350 から 850 nm

4） Yamada T, Nanashima N, Shimizu T, Nakazawa Y,の波長を示す LED 光を用いているため、いずれの波長がNakazawa M, Tsuchida S. Establishment of a recessive

オプシン受容体の活性調節に関わっているかまでは明らか

mutant small-eye rat with lens involution and retinalにできていない。今後は、単一波長の LED 光で曝露した

detachment associated with partial deletion and時のレチナール代謝産物を検出することにより、細胞が認

rearrangement of the Cryba1 gene. Biochem J. 2 0 1 5,

識する波長の同定に取り組む予定である。

471（2）, 293-305.

5. 総5） Suzuki T, Fujita Y, Noda Y, Miyata S. A simple

括procedure for the extraction of the native chromophore

近年は、光を利用した病気の治療や美容分野での応用が進んでいる。これらの治療には、局所に高いエネルギーをof visual pigments: the formaldehyde method. VisionRes. 1986, 26（3），425-9.

照射できる紫外光や生体の深部まで到達可能な近赤外光が6） Kane MA, Folias AE, Napoli JL. HPLC/UV quantitation

利用されているが、その作用発現の機序は不明な点が多く

of retinal, retinol, and retinyl esters in serum and残っている。本研究を進めることにより、効果的で安全な

tissues. Anal Biochem. 2008, 378（1）, 71-9.
7） Buscone S, Mardaryev AN, Raafs B, Bikker JW,

光の利用を可能にできるものと考えている。

Sticht C, Gretz N, Farjo N, Uzunbajakava NE,
謝

辞Botchkareva NV. A new path in defining light

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス

parameters for hair growth: Discovery and modulation

メトロジー研究財団のご支援をいただきましたことに心よof photoreceptors in human hair follicle. Lasers Surg

り感謝申し上げます。また、ここで報告した研究は、当研

Med. 2017, 49（7）, 705-718.

究室のメンバーの協力による成果です。メンバー各位に御8） Castellano-Pellicena I, Uzunbajakava NE, Mignon C,Raafs B, Botchkarev VA, Thornton MJ. Does blue light

礼申し上げます。

restore human epidermal barrier function via（引用文献）

activation of Opsin during cutaneous wound healing?

1） Moriwaki S. Light-emitting diodes as a new medical

Lasers Surg Med. 2019, 51（4）, 370-382.

tool in aesthetic dermatology. Photomed. Photobiol.

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