アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

東京医科歯科大学生体材料工学研究所

秋吉

一成

Synopsis: Stimuli-responsive molecular assembly systems have attracted considerable attention in the fieldsof biotechnology and drug delivery systems. Typically, the external stimulus is heat, pH, light or the addition ofmolecules, such as glucose or cyclodextrin. Enzymes are also used to trigger the response of a system. We report
here new enzyme-responsive micellar systems in which an enzymatic reaction controls the amphiphilicity of thesurfactants. The surfactants in our study consist of a short alkyl chain and a maltooligomer as a primer which canbe synthesized enzymatically. In the presence of phosphorylase and α-D-glucose-1-phosphate (G1P), the elongation
reaction of the saccharide chain proceeds from the non-reducing 4-OH terminus of the (α1→4)-glucan chain. Thus,
we first prepared amylose-primer surfactants (C8MP, C12MP, C16MP) where an alkyl group (C8, C12, C16) is linked
to the reduced terminus of maltopentaose (MP, number of glucose units (GU) = 5). The surfactants form micelles inwater, which are dissociated upon the enzymatic elongation reaction of the sugar moiety. The association of amylose
primer surfactants was controlled by changing the amphiphilicity with a chain-elongation reaction triggered by
the addition of phosphorylase. We demonstrate here that by using this property the micelle-to-vesicle transitionof mixed lipid/ primer systems can be controlled, and this presents a new method for the reconstitution of transmembrane protein to liposome.

１．緒よる会合構造の制御、およびそのバイオテクノロジー応用

言について検討した。

生分解性を有するアミロースは水溶液中において螺旋構

２．実造を形成し、その中に疎水性の低分子を包接しえる興味あ験基 5 つからなるマルトペンタオースをプライマーとして、ホ2. 1 アルキル置換アミロースプライマーの合成とキャラクタリゼーションスホリラーゼを用いた酵素触媒重合により合成できる [1, 2]。

マルトペンタオースの還元末端を既存の方法によりラクる高分子ホストである。アミロースはまた、グルコース残

この反応は非還元末端から進行することから還元末端の修トン化し、マルトペンタオースラクトンを得た（図１）
。

[3-6]

その後、マルトペンタオースラクトン / エチレングリ

我々はこれまでにポリエチレンオキシド（PEO）修飾コール溶液にアルキルアミン / エチレングリコール溶液プライマーを合成し、酵素重合法により両親媒性の PEO-を滴下し、窒素雰囲気化にて 70℃で 6 時間攪拌することで、アミロースブロックコポリマーを合成した。この PEO- ア

ア ル キ ル 鎖 長 が 8、12、16 の C8-MP、C12-MP、C16-MP

ミロースがクロロホルム中にてアミロース部位を内核としを得た。

飾により、様々なアミロース誘導体の合成が可能である。

た会合体を形成し、特異な包接挙動を示すことを明らかと構造解析は 1H-NMR、FT-IR、MS より行った。次に表した [6]。食品やドラッグデリバリー分野ではすでに利用さ面張力測定により各アルキル置換プライマーの臨界ミセルれ安全性も高いアミロースの自己組織化制御による機能発濃度（CMC）を決定した。また C12-MP、C16-MP の水溶

現、ナノバイオマテリアル創製はより広範な利用の途が開

液中における会合挙動を多角度光散乱測定（MALS）測定かれるものと期待される。

により評価した。

本研究ではマルトペンタオースにアルキル鎖（アルキルプ ラ イ マ ー（C8-MP、C12-MP、C16-MP） を 合 成 し、 そ2. 2 アルキル置換プライマーを用いた筋肉ホスホリラーゼによる酵素重合の水中での会合挙動、ホスホリラーゼを用いた酵素重合に合成した各プライマーを用いて筋肉ホスホリラーゼによ

鎖長 =8、12、16）を化学置換した両親媒性アルキル置換る酵素重合を行った（図２）。
Amylose engineering: Design of nanogel
particles with molecular recognition
Kazunari Akiyoshi
Institute of Biomateria ls andBioengineering, Tokyo Medical andDental University

各 プ ラ イ マ ー ま た は マ ル ト ペ ン タ オ ー ス（1.0mM）、
G-1-P（100mM）、AMP（10mM）、筋肉ホスホリラーゼ（0.26μM）となるように pH6.2 の 100mM Bis-Tris buffer に溶解し、40℃にて重合を開始した。所定の時間における反応液を用いて遊離リン酸の定量を行い、重合度を求めた。

− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

2. 3 アルキル置換プライマーの酵素重合による動的構造変化

μm のフィルターを通した後、動的光散乱 (DLS) 測定を行い粒径を評価した。TEM 観察は 0.5% の酢酸ウランにより染色後、100kV で行った。

酵素重合による C12-MP ミセルの崩壊挙動を重合条件下における表面張力変化および重合度より評価した。

３．結果および考察

2. 4 アルキル置換プライマーの酵素重合によるリポソームの再構成

3. 11

合成をそれぞれ確認した。

DPPC（1mM）および C12-MP（1mM）を G-1-P（100mM）、合成の結果、それぞれ収率 50％、39％、20％で C8-MP、AMP（10mM）、 筋 肉 ホ ス ホ リ ラ ー ゼ（1.3μM） を 含 む

C12-MP、C16-MP を得た（表１）。

pH6.2 の 100mM Bis-Tris buffer（1mL） に 溶 解 し、40 ℃

両親媒性プライマーは表面張力測定からミセルを形にて重合を開始した。各時間における溶液を採取し、0.80

CH2OH

CH2OH

CH2OH

OO

O
OO

OH

OH

OH

OH
OH

3ROH

O
OHOHOH70℃, 6h, Ethyleneglycol

O

OH

OH

O

OH
OH

CH2 OH

OH

O+NH

3

OPO3 K 2OH

α-glucose-1-phosphate
CH2 OHCH2 OHO

CH2 OHO

OH

Muscle phosphorylase b
AMP

OH
OH

OH

C12-MP primer

40℃, pH6.2

O

nO

O
OH

アルキル化アミロースプライマーの合成

OH

O-(CH2)11CH3[C12-MP]-(CH2)15CH3[C16-MP]

CH2 OHOH

R: -(CH2)7CH3[C8-MP]

OH

3Primer
図１

HN R

O

O

OH

OH

OH

CH2OH

CH2OH

O

CH2 OH

3

Maltopentaoselactone
CH2OH

CH2 OH

O

O
OH

OH

Maltopentaose
H2N

OH

OH
O

OH

OO

O
OH

(ii) Ion exchange

CH2OH

CH2OHCH2OH(i) I 2 , KOH

OHOH

OH

プライマーの合成とキャラクタリゼーション

H-NMR、MS スペクトルより、アルキルプライマーのOH

OH

OHO

OHOHOHNHO

On+ 3OH

C12-amylose
図２C12-MP プライマーの酵素重合− 14 −+ n K 2 HPO4

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成 し て い る こ と が 示 唆 さ れ、CMC は、 そ れ ぞ れ C8-速された。これは、ミセル表面で基質の濃縮効果によるもMP=10mM、C12-MP=0.5mM、C16-MP=0.05mM であるこのと思われる。一方、C16-MP では CMC よりも高い濃度とが明らかとなった。静的光散乱測定による求められた会

では重合反応はむしろ抑制された。本酵素反応の律速は、合体の分子量から、C12-MP では会合数が約 68 分子のミミセルから基質プライマーが引き抜かれ、酵素活性点へ取セルを C16-MP では 138 分子からなるミセルをそれぞれ形り込まれる段階であると考えられる。疎水性が高く最も安成していることが示された。

定なミセルを形成する C16-MP 系では、ミセルへの引き抜きが抑制され結果的に反応が抑制されたものと考えられた。

3. 2

プライマーの酵素重合プライマーの会合状態により、酵素反応が制御しえること

図３より 1mM の各プライマー存在下にて筋肉ホスホリが明らかになった。

ラーゼを用いた酵素重合では C12-MP において酵素重合がまた、ホスホリラーゼ b は AMP が存在することで活性マルトペンタオースに比べ、約 4 倍早く進行した。リン定型となり重合を開始することから、AMP 分子応答性のミ1量により求められた重合度の値は H-NMR より計算されセルともいえる。

た重合度とほぼ一致することが確かめられた。また、糖鎖の伸長はマススペクトル（MS）より確認され、分子量分3. 3

布も狭いことが分かった。

酵素重合によるミセル構造の動的変化

C12-MP ミセル（1mM）系での酵素重合反応の時間変

いずれの系でも CMC より低い濃度、すなわちモノマー化を詳細に観測したところ、重合および表面張力は時間ととして存在する濃度では、重合速度は、アルキル鎖を導入ともに、初期の早い反応過程とその後ある時間経過後の遅していない未修飾のマルトペンタオース（MP）とほぼ等い反応の二段階で進行することが明らかになった（図４）。

しかった。一方、C8-MP と C12-MP を CMC よりも高い

これは糖鎖の伸長により親水性が増大し、ミセル臨界濃濃度で重合させた場合には、未修飾 MP よりも反応が加度が増加し、最終的には C12-MP ミセルが崩壊したものと

表１

アルキル置換アミロースプライマーの合成およびキャラクタリゼーション

Abb.

アルキルアミン 1）(mmol)

エチレングリコール
(mL)

収率(%)

CMC 2）(mM)

C8-MP6.0

185010C12-MP6.018390.5C16-MP

6.021200.05C8-MP
C12-MPC16-MP
マルトペンタオース

987

表面張力 (dyn/cm)

重合度（グルコース単位）

1065437020601550

1040530021003060901200200300400

重合時間（分）重合時間（分）図３100

各プライマーの酵素重合

図４− 15 −C12-MP の酵素重合による表面張力変化

重合度（グルコース単位）

1）マルトペンタオースの仕込量：1.2mmol2）表面張力測定による

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

いえる。今回行った表面張力測定では 40 分後から 160 分

４．

後に急激な変化が見られたことから、その中間点である

総括

100 分後の重合度（DP ＝ 9）あたりからミセルの崩壊が以上のように、糖鎖界面活性剤は、水中、中性 pH とい始まり、180 分後の重合度（DP ＝ 17）でミセルは完全にう穏和な条件下でホスホリラーゼ酵素による糖鎖伸長反応崩壊していると考えられた。

により分子の親水性 - 疎水性を変化させ、その集合特性、界面特性を制御しえることが明らかになった。これら界面

3. 4 ミセルーベシクル転移の酵素反応制御 : 新規リ
ポソーム合成法

活性の制御は、材料表面へのコーティング、物質可溶化、エマルション作成はもとより近年のマイクロ計測におけるリン脂質 - 界面活性剤系における酵素応答性ミセルーベ

流れやぬれの制御などにおいて重要であろう。この新規酵シクル転移についても検討した。リン脂質と C12-MP を混素応答性界面活性剤を持ちうることで、コロイド化学のみ合すると動的光散乱測定より粒径 21.1nm の混合ミセルがならず、タンパク質再生や膜タンパク質再構成などのバイ形成することがわかった。この溶液に酵素処理を行うと、オテクノロジー分野での幅広い応用が期待できる。

時間とともに会合体の粒径が増加し、重合時間が 2 時間を経過すると（重合度 14）比較的サイズの揃った約 100 nm（参考文献）のリポソームが形成した。C12-MP の糖鎖の伸長に伴って、

１）Whelan WJ, Bailey JM, : The action pattern of potato
phosphorylase, Biochem. J. 58, 560-9, 1954.

その親水性が増加して界面活性剤としての性質が失われ、会合体から除去され結果的にリン脂質のみからなるリポソ

２）Ziegast G, Pfannemueller B,: Linear and star-shaped
hybrid polymers.4. Phosphorolyric synthesis with di-ームへと転移したものと考えられる。

functional, oligo-functional and multifunctional primers,

この重合条件における混合ミセルの重合速度は MP のCarbohydr. Res., 160, 185-204, 1987.

1.5 倍であった。電子顕微鏡観察からもサイズの揃ったリポソーム形成が確認された。これは、リポソーム形成法と３）Kobayashi K, Kamiya S,:Amylose-carrying styrene
Macromonomer and its homo- and copolymers:

して従来にない新しい手法である。
C12-MP ミセルは、バクテリオロドプシン（BR）を可Synthesis via enzyme-catalyzed polymerization and溶化した。この BR を含むミセル溶液に C12-MP- リン脂

complex formation with iodine, Macromolecules 29,質（DPPC）混合ミセルを加えた。この溶液に対して、グ

8670-8676,1996.

ルコース - １- リン酸および筋肉ホスホリラーゼ存在下酵４）Loos K, Stadler R,: Synthesis of Amylose-block-

素重合を 2 時間行ったところ、約 150nm のロドプシン再polystyrene rod-coil block copolymers, Macromolecules

構成リポソームが調製しえた。この再構成されたロドプシ

30, 7641-7643, 1997.

ンは、プロトンポンプ活性を有しており、本システムが、

５）Enomoto N, Furukawa S, Ogasawara Y, Akano H,

新規な膜タンパク質再構成リポソーム調製法として有効でKawamura Y, Yashima E, Okamoto Y,: Preparation ofあることが明らかになった。

silica gel-bonded amylose through enzyme-catalyzed

散乱強度 (%)

2015C12-MP/DPPC
混合ミセル

DPPCリポソーム

10501101001000

粒径 (nm)
図５C12-MP/DPPC 混合ミセルの酵素重合によるベシクル転移− 16 −

200 nm
図６ C12-MP/DPPC 混合ミセルの酵素重合により得られた DPPC リポソームの電子顕微鏡像

アミロース工学による分子認識性ナノゲル微粒子の設計と応用

polymerization and chiral recognition ability of itsrecognition site: Induction of a novel binding

phenylcarbamate derivative in HPLC, Anal. Chem., 68,characteristic of amylose by self-assembly of2798-2804, 1996.

poly(ethylene oxide)-block-amylose in chloroform,６）Akiyoshi K, Maruichi N, Kohara M, Kitamura

Biomacromolecules, 3, 280-3, 2002.

S,: Amphiphilic block copolymer with a molecular− 17 −