本社︓〒5410047 大阪市中央区淡路町2丁目2番5号
TEL:(06)62316146（代） FAX:(
06)62316149
nf
o@shi
gemat
subi
o.
com
www.
shi
gemat
subi
o.
com/ iSmartEnzymes™

Nature offers a vast source of enzymes, perfected
through evolution to perform defined reactions.
At Genovis, we believe that enzymes with unique properties
can be used as biological tools to support the research anddevelopment of complex biopharmaceuticals to help bringsafe and effective medicines to patients in need.
Our task is to identify new enzymes and give them names.
We call them SmartEnzymes.

2

Table of Contents

抗体のフラグメン ト 化

糖鎖解析

IgG特異的なプロテアーゼは、バイオ医薬品の分析とその試料調製
ワークフローに最適なサブユニットを生成します。これは、バイオ医
薬品の特性評価、開発および製造に有用です。

N-およびO-結合型糖鎖タンパクの解析は、糖鎖に特異的なプ
ロテアーゼ、エンドおよびエキソグリコシダーゼを用いることにより簡便に行うことが可能となります。

FabRICATOR® (IdeS)

Immobilized PNGase F

IgGヒンジ領域直下を切断

4

FabALACTICA® (IgdE)

N-結合型糖鎖を加水分解

34

OpeRATOR®

ヒトIgG1ヒンジ領域上部を切断

12

FabRICATOR® Z (IdeZ)

O-結合型糖鎖を有するタンパクを特異的に切断

36

OglyZOR®

マウスIgGヒンジ領域直下を切断

16

FabULOUS™ (SpeB)

コア-1 O-結合型糖鎖を加水分解

38

SialEXO®

IgG1ヒンジ領域上部を切断

18

GingisKHAN® (Kgp)

シアル酸を加水分解

40

FucosEXO™

ヒトIgG1ヒンジ領域上部を切断

20

ɑ1-2,3,4結合型フコースを加水分解

42

GalactEXO™
β1-3,4結合型ガラクトースを加水分解

44

抗体の脱グリコシ ル 化
IgG特異的なエンドリコシダーゼは、高マンノース型、ハイブリッド型、複合型、バイセクト型などのネイティブ抗体上のFc領域の糖鎖構造をトリミングすることが可能です。

GalNAcEXO™
α-結合型GalNAcを加水分解

46

GlycINATOR® (EndoS2)
IgG Fc領域の糖鎖を加水分解

22

アフィニティ精製
複 雑 な 試 料 か ら O- 結 合 型 糖鎖 を 持つ タ ン パク や ペプ チドをア
フィニティ精製するツール。

IgGZERO® (EndoS2)
Fc領域の複合型糖鎖を加水分解

24

GlycOCATCH®
O-糖化タンパクを濃縮

48

抗体の修飾
抗体の部位特異的な修飾と任意の糖鎖構造を使用した糖鎖エン
ジニアリングに関するテクノロジー。

検出用抗体
多様なアッセイ系に使用可能なSmartEnzymesの検出抗体

GlyCLICK®

ネイティブなIgGを部位特異的に修飾

26

Anti-FabRICATOR®

FabRICATOR®（酵素）を検出

50

TransGLYCIT™
IgGをトランスグリコシル化

30

プロテオミクスユニーク な の 特異 性を 持つプ ロ テ ア ーゼ によ り、 プロ テ オ ミクスやMS解析に適したペプチドを生成します。

GingisREX® (RgpB)
アルギニン特異的にタンパクを切断< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

32

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

3SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

IgGヒンジ領域直下を切断

FabRICATOR（Ides）は、ヒンジ領域直下の単一アミノ酸部位で抗体を消化するIgG特異的システインプロテアーゼであり、均質なF（ab’）2およびFcフラグメントを生成することができます。この酵素は、mAb、ADC（抗体薬物複合体）、バイオシミラー、Fc融合タンパクなどの抗体ベースの治療薬の特性評価、品質管理、安定性試験、生産モニタ
リング、クローン選択に幅広く利用されています。

Human IgG1-4, IgG ofsome classes from monkey,
rat, rabbit, sheep

CPAPELLG / GPSVF

30 min reaction

No reducing agents or
co-factors needed

抗体のサブユニット化ワークフロー
Fd’

FabRICATOR®

Fd’

LC

Reduction

LC

Fc/2

酵 素 で あ る FabRICATOR は 37℃ ・ 30 分 の条件において抗体を消化し 、インタクトな F（ ab’ ） 2 お よ び Fc 部 位 を 生 じ ま す 。 こ れ には、他の最適条件は要求されず、かつ、

過 剰 な 消 化 の リ ス ク は あ り ませ ん 。 中 間 レ
ベ ル で の LC-MS 分 析 ワ ー ク フ ロ ー の 前 処
理 で は 、 サ ブ ユ ニ ッ ト を 減 ら し て 23〜25
kDaのフラグメントを生成し、質量分解能を高めて重要な品質属性を正確に決定できます。

製品フォーマット

FabRICATOR®

FragIT™

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品FabRICATOR®-HPLC

FabRICATOR® MagIC

HPLCに接続できるカラムに酵素を固定した製品

磁気ビーズに酵素を固定した製品
オートメーション向け

Thermo Scientific™ CaptureSelect™ resin from Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
Thermo Scientific and CaptureSelect are trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
4

FragIT™ kit

FragITとCaptureSelect™
（Fcフラグメント精製カラム)のセット

FabRICATOR® Validation kit
異なる3バッチの凍結乾燥品のセット
分析バリデーション向け

: OXIDATION
TE
M
NO

RING
TO

ww

w

.g

NI
O

AP
P

Antibody Digestion / FabRICATOR ®

en

FabRICATOR®を利用した重要品質特性の決定について
Fc グ リ カ ン の 相 対 的 な 存 在 量 は 、 質 量 分
解 能 を 高 め る た め に FabRICATOR 消 化 後に定量化されました。なお、類似性の評価に追加の消化やラベリングは必要ありませ
んでした。

53

non-oxidized

抗体を均質なサブユニットに消化すること
で、メチオニンの酸化など保管や製剤化中に発 生す る可能 性 のある 変化 を迅速に 監視するための中間レベルの分析が可能に(IgG1)
40

2 oxidations

な り ます 。 治 療 薬と し て 使 用 され る 抗 体 を 、強制的 に酸 化し 、FabRICATOR で領 域特異的に消化し、GlycINATORによって脱グリコシ
ル化した後、サブユニットレベルで分析を行いました 。Fc/2 フラグ メ ント の デコン ボリ ュー
ションされた質量スペクトルに示されているよ
うに、酸化に関する分析において、領域固有のデータが取得できました 。なお、分析はハイスループット形式で実行されました。

Adalimumab
LC

35
Rel. abundance [%]s.c o m /0 0

1 oxidation

FabRICATORで生成された均質なフラグメ
ントは、完全な状態の抗体では解決できな
い特性の詳細なマッピングに対して、モノア
イソトピックな側面から解決が可能です。この中間レベルで の分析ワークフローは、脱アミノ化・ピログルタミル化・グリカンプロファ
イ リ ン グ な ど を 含 む 品 質 特 性や ア ミ ノ 酸 配列の検証、酸化分析に有用です 。治療薬とし て使 用 され る 抗 体 に おい て 、 11 個 のovi

Fc/2 LC

30
25

Control

20
15
10
5

Oxidized

1
3F

1

2

4N

4F

0

4

6

8

10

24050

retention time (min)

H

6N
H

3F

1

2

1

6N

6N
H

H

3F

1
3F

3N
H

5N
H

4F

1

4

2

3N

5N
H

H

1

5N
H

4F
4N
H

H

3N

4F

1

0

Determining antibody quality attributes. Relative abun­dance ofglycans on cetuximab Fc/2 fragments, generated with FabRICATOR
and analyzed with LC-MS at the subunit level by Ayoub and colleagues(Ayoub, 2013).

24100

24150

24200

mass (Da)

Quality control of antibody oxidation. Oxidation analysis of adalimumab
showing UV (280 nm) chromatograms before (control) and after (oxidized)
incubation with 0.25% H2O2. A deconvoluted mass spectrum of the
deglycosylated Fc/2 fragments dem­onstrates the degree of oxidation.

FragIT™ Kitを利用したF(ab’)2およびFc/2サブユニット分析用調製
FragIT

FragIT kit

FragIT

FragIT kit

調製サンプル 中 に 、残留 酵素 を含まない
抗体またはFc融合タンパクの迅速かつ効
率的な消化が必要なアプリケーションでは、
FragIT ス ピ ンカラムが有 用 で す。こ れ に、はアガロースビーズにFabRICATORが固定化 さ れ て い ま す 。 ま た 、 FragIT kit で は 、CaptureSelect™アフィニティー精製カラムを使用して、均質なF（ab’）2およびFcフラ
グメントを分離することも可能です。

References
Ayoub, D. et al., 2013. Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of
intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques. mAbs, 5(5), pp.699–710.

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

5SmartEnzymes™

FabRICATOR®-HPLCを使用した中間レベル分析でのオンカラム消化高い一貫性と再現性のあるオンカラムでの
抗 体 消 化 の た め に 、 FabRICATOR-HPLCに は HPLC レ ジ ン に 固 定 化 さ れ た
FabRICATOR 酵 素 が 含 ま れ て い ま す 。
FabRICATOR-HPLC カ ラ ム は 、 標 準 の LC

Step 1: Digestion

MS ル ー チ ン 分 析 で 使 用 で き ま す が 、 2DLCセットアップなど、より高度な構成も可能です。最終的には、バイオリアクターは自動化されたオンラインな中間レベル分析のワークフローでMSに直接接続できます。

これにより、オペレーターの時間、サンプル
処理エラーが大幅に削減され、スループッ
トが向上します。

Step 2:on-column Reduction

F(ab’)2

FabRICATOR-HPLC

Abs 280nm

Fc/2
to WASTE

to RP column

Fd’

to WASTE

WASTE

Reduction

TCEP

Fc/2

LC

0

2

4

6

8

10

12

14

Mass Spectrometer

retention time
(min)

WASTE

RP-HPLCUV

Abs 280nm

Step 3: Separation
Fc/2

Fd’

LC

Signal intensity

Step 4: Analysis*

Autosampler

14

PUMP

mAb
1-2 ug0.025-2 mg/ml

16

18

20

G0F G1F

retention time
(min)

24600

Digestion

Purge

Reduction

DesaltSeparation

RP column wash

Purge

20 min10 min20 min10 min20 min30 min10 minAnalysis: 1 h 20 min

G2F

G0

0.1% FA, ACN gradient150 mM ammonium acetate, pH 7

24800

25000

25200

25400

25600

25800

m/z

Column wash: 40 min

FabRICATOR-HPLC in a middle-level workflow. Potential set-up for an automated middle-level workflow using FabRICATOR-HPLC that digests
IgG to F(ab’)2 and Fc, which is well suited for high resolution MS analysis.

6Antibody Digestion / FabRICATOR ®

堅牢性の高いパフォーマンス
2μgのトラスツズマブを4時間毎に注入し、LC-MSで 分 析した テ ス ト によ る と 、37℃ で最大14日間の連続操作という条件下にて、FabRICATOR-HPLCよるオンカラムでの消化効率は良好に維持されました 。 生成された抗体フラグメントはオンカラムで還元され、自動ワークフローを使用して分析され、14日間で95％を超える抗体消化率が得られました。

FabRICATORUV chromatogram

Fc/2

LC

FabRICATOR-HPLC
Fc/2

Fd’

5

% digestion

Fd’

*
10
15
Retention time (min)5100
Performance testing of FabRICATOR-HPLC.
Comparison between digestion with standard
in-solution FabRICATOR protocol (orange) anddigestion using the auto­mated FabRICATOR-HPLC
workflow (blue), and quan­tification of the column’s
performance over a period of 14 days (bottom).
The asterisk marks LC fragments that are notcompletely reduced with one intramoleculardisulfide bridge intact.

LC

10
15
Retention time (min)

>95%

75
50
25
0

0

2

4
6
8 10 12 14
Operation (days)

抗体Fcグリカン分析の自動化

E:
A

ED MIDDL

E-

NALYSI
EL A
S% of total

AT
OM
UT

V
LE

ww

G2F

25600

G1F

25400

G0F

25200

G0

FabRICATOR-HPLC
FabRICATOR

20

25000

25600

25400

40

0

G2F

G0

APP NOT

Fc/2 MS spectrum

G0F G1F

G2F

G0
25000

Glycan analysis using FabRICATOR-HPLC.
Deconvoluted mass spectra of trastuzumab
Fc/2 from in-solution FabRICATOR digestion(top, orange), FabRICATOR-HPLC (top, blue),and glycosyla­tion profiles of trastuzumab(bottom, orange, n=10) or (bottom, blue, n=28).

G0F G1F25200

ここでは、トラスツズマブのFcグリコシル化の分析を利用して、FabRICATOR-HPLCのカラムの性能と操作安定性を示します。
FabRICATOR-HPLCを使用した自動化された中間レベル分析では、標準的な溶液内分解に よる 分析ワ ーク フローで得 られたものと実質的に区別できない質量ス
ペクトルが得られました 。Fcグリ コシル化
プロファイルの分析結果は、すべてのグリ
コフ ォ ームの 標 準偏 差が 0.5 ％未満で 、14日間の連続操作中に安定して再現性がありました。

w.gen

ovi s.c o m /0 0

54

FabRICATOR®-HPLC
Column hardware: PEEK/biocompatible

Maximum Pressure: 100 bar

Column dimensions: 2.1 mmD × 50 mmL

Operating pH: 6.5 - 8.0

Support resin: POROS *Operating temperature: 37° C

Typical flow rate: 0.025-0.05 mL/min

Storage conditions: +4-8° C(Do not freeze!)®

Number of days ofcontinuous operation: >10 **Injections per column: >200 **Start material: Human IgG1-4,
Fc-fusion proteins* See legal and disclaimers. ** Depending on specific application< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

7SmartEnzymes™

中間レベルでの自動分析向けのFabRICATOR® MagIC
による抗体サブユニットのパラレル生成
FabRICATOR MagICは、アガロースビーズに酵素であるFabRICATORを固定した、抗体の自動処理に適した製品です。

磁気ビーズにより、中間レベルでの分析
ワークフローにおいて、複数の抗体を並行して調製・分析することが可能になっています。IgGベースの生物学的製剤のルーチン分析において、手動と自動の両方のステップで利用可能です。

FabRICATOR® MagIC
1

2
EQUILIBRATION

3

4

5

6
DIGESTION

7
ANALYSISFabRICATOR MagIC workflow on Thermo Scientific KingFisher™ Purification System. IgG, FabRICATOR MagIC beads and PBS are dispensed
into a 96-deepwell plate according to the KingFisher workflow. The beads are (1) transferred to wells containing PBS for (2) equilibration and (3) collection.
The beads are (4) added to the samples and (5) incubated with mixing for 10-20 min at 37°C, prior to (6) collection and the pure F(ab’)2 and Fc are left inthe sample wells (7). The trademark KingFisher is the property of Thermo Fisher Scientific.

8

Antibody Digestion / FabRICATOR ®

中間レベルでの分析ワークフロー自動化
FabRICATOR MagICはインタクトなF(ab')2
およびFcサブユニットを生成し、ジスルフィ
ド結合 は 5mM TCEP を 用いて 容易 に 還元
することができます。5 mM TCEPを用いたワンポット反応により 、簡単にジスルフィド
結合を還元することができます。生成されたFc/ 2, LC, Fd‘ フラグメントは、中間レ
ベルで の 分析ワークフ ロー で 詳細な解析やモニタリングが可能であり、インタクト

レ ベ ル の アプ ロ ー チ と 比 較 し て優 れ た 分解能を実現します。FabRICATOR MagIC
で処理 したサンプル か ら得ら れた抗体フ
ラグメ ント の逆相 LC-MS分 析 で は、完全な消化を実証されています。

Intact IgG

Intact Antibody

F(ab’)2

Fc/2

FabRICATOR MagIC

Fc/2

LC

Fd’

FabRICATOR MagIC+ Reduction
Retention time

Generation of antibody subunits with FabRICATOR MagIC. Analysis of a monoclonal antibody by RPLC-MS at the intact level (top), after
FabRICATOR MagIC digestion (middle) and after treatment with FabRICATOR MagIC and 5 mM TCEP (bottom). Data was obtained in collaboration
with Symphogen A/S (Ballerup, Denmark).

重要品質特性（CQA）の高速自動モニタリング
FabRICATOR MagICを用いた複数のモ
ノクローナル抗体の自動化された分解により、酸化などの複数のCQAを解析する
ことができます。強制的な分解を受けた6種類のモノクローナル抗体の混合物を
LC-MSでイ ンタクトまたはサブユニット レ
ベルで分析しました。この結果は、FabRICATOR MagIC を 用 い る こ と で 、モノクローナル抗体の複雑な混合物における修飾を迅速に検出し、モニタリング

できることを示しています。
また、 FabRICATOR MagIC による消化と5 mM TCEP によ る還元後の中間レベ
ル の 分 析 に よ り 、 FabRICATOR MagICに対して詳細な Fc-糖鎖プロ ファイリング
が行われました。

mAb5

Intact Antibodies

Fc/2

LC

Fd’

mAb4
mAb3

mAb2

FabRICATOR MagIC

mAb1

Frozen sample (-80°C)
Stability sample (25°C, 3 months)

Glycoform
Man5
G0
G0F
G1F
G2F

Abundance
2.5%
4.7%
47.6%
38.4%
6.8%

Retention time

Man5

G2F

G0

25000

化学品部

G0F
G1F

Oxidation studies using FabRICATOR MagIC. Six mAbs were analyzed
for tryptophan oxidation during forced degradation studies by RPLC-MS at
the intact level (top panel) and after FabRICATOR MagIC with 5 mM TCEP
(bottom panel). New peaks detectable by the subunit analysis are highlighted.
Data was obtained in collaboration with Symphogen A/S (Ballerup, Denmark).

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

Retention TimemAb5 Fd’mAb5 Fd’ +14 Da
mAb4 Fd’mAb3 Fd’mAb3 LCmAb3 LC +0 Da

mAb1 Fd’mAb2 Fd’mAb6 LCmAb2 LCmAb1 LCmAb4 LC

Fc/2

mAb5 LC -18 Da
mAb5 LCFabRICATOR MagIC+ Reduction

mAb6 Fd’mAb5 Fd’ +29 Da

mAb6

25250

25500

m/z

Glycan analysis using FabRICATOR MagIC. Analysis of Fc glycosylation by middle-level LC-MS using FabRICATOR MagIC (top) andquantification of glycoforms from a deconvoluted mass spectrum of the
Fc/2 fragment (bottom).

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

9SmartEnzymes™

FabRICATOR®
酵素の凍結乾燥品
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabRICATOR, 2000 units

Digests 2 mg IgG

A0-FR1-020

FabRICATOR, 5000 units

Digests 5 mg IgG

A0-FR1-050

FabRICATOR, 5 x 5000 units

Digests 5 × 5  mg IgG

A0-FR1-250

FabRICATOR, 96 × 100 units

Digests 96 × 100 μg IgG

A0-FR1-096

FabRICATOR, 8 × 100 units

Digests 8 × 100 μg IgG

A0-FR1-008

FabRICATOR LE (low endotoxin), 2000 units

Digests 2 mg IgG

A0-FR8-020

FabRICATOR LE (low endotoxin), 5000 units

Digests 5 mg IgG

A0-FR8-050

FabRICATOR® Validation kit
異なる3バッチの凍結乾燥品のセット, 分析バリデーション向け
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabRICATOR, 3 x 2000 units

Digests 3 × 2 mg IgG

A0-FR4-060

PRODUCTDESCRIPTIONID

FragIT, Microspin 2 × 0.5 mg

Digests 2 × 0.5 mg IgG

A0-FR6-010

FragIT, Microspin 5 × 0.5 mg

Digests 5 × 0.5 mg IgG

A0-FR6-025

FragIT, Microspin 10 × 0.5 mg

Digests 10 × 0.5 mg IgG

A0-FR6-050

FragIT, Midispin 1-10 mg

Digests 1-10 mg IgG

A0-FR6-100

FragIT, Maxispin 10-100 mg

Digests 10-100 mg IgG

A0-FR6-1000

FragIT™
スピンカラムに酵素を固定した製品

10Antibody Digestion / FabRICATOR ®

FragIT™ kit

FragITとCaptureSelect™ （Fcフラグメント精製カラム)のセット
PRODUCTDESCRIPTIONID

FragIT kit, Microspin 0.5 mg

Digests and purifies 0.5 mg IgG

A2-FR2-005

FragIT kit, Microspin 5 × 0.5 mg

Digests and purifies 5 × 0.5 mg IgG

A2-FR2-025

FragIT kit, Microspin 10 × 0.5 mg

Digests and purifies 10 × 0.5 mg IgG

A2-FR2-050

FragIT kit, Midispin 10 mg

Digests and purifies 10 mg IgG

A2-FR2-100

FragIT kit, Maxispin 100 mg

Digests and purifies 100 mg IgG

A2-FR2-1000

FabRICATOR®-HPLC
HPLCに接続できるカラムに酵素を固定した製品
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabRICATOR-HPLC

Number of injections per column: > 200

A0-FRC-050

FabRICATOR® MagIC
磁気ビーズに酵素を固定した製品, オートメーション向け
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabRICATOR MagIC, 2 ml

Digests up to 24 × 200 µg IgG

A0-FRM-024

FabRICATOR MagIC, 4 × 2 ml

Digests up to 96 × 200 µg IgG

A0-FRM-096< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

11SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

ヒトIgG1ヒンジ領域上部を切断

FabALACTICA（IgdE）は、ヒトIgG1のヒンジ上部の特定部位を消化し、インタクトかつ均質なFabおよびFc
フラグメントを生成するシステインプロテアーゼです。この酵素は、二重および多重特異性抗体の特性評
価やインタクトなFcグリコシル化の解析を促進します。また、一価の結合や高次構造、ジスルフィドスク
ランブル、ヒンジ領域が変異した抗体の研究も容易になります。

Human IgG1



KSCDKT / HTCPPC

O/N reaction

No reducing agents or
co-factors needed

抗体のサブユニット化ワークフロー

FabALACTICA®

Ig Gに 特異性 の高いプロ テア ーゼを用いる
ことで、LC-MSを用いた抗体医薬品のサブユニットプ ロ ファイリ ン グ や鍵 と なる 品質特性の研究が可能になります。酵素である

FabALACTICAは、ヒトIgG1のヒンジ領域上部の1カ所を特異的に消化します。生成されたフラグメントは、抗体の特性解析や
NMR に よ る 高 次 構 造 の 研 究 な ど 幅 広 いFabALACTICA®

Immobilized FabALACTICA®

酵素の凍結乾燥品

Reduction

用途に利用することが可能です。

スピンカラムに酵素を固定した製品

Thermo Scientific™ CaptureSelect™ resin from Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
Thermo Scientific and CaptureSelect are trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.

12

FabALACTICA® Fab kit

Immobilized FabALACTICAとCaptureSelect™
（Fcフラグメント精製カラム)のセット

Antibody Digestion / FabALACTICA®

Fabフラグメントの生成に使用される酵素の比較
FabALACTICA お よ び GingisKHAN は、 IgG
を単一の消化部位で切断し、ヒトIgG1から均質なFabおよびFcフラグメントを生成します。パパインやLys-Cのような従来の酵素もFabフラグメントの生成に使用できますが、非特異的な酵素活性のため、過消化を最小限に抑えるための慎重な最適化が必要です。

インタクトなFabおよびFcフラグメントの生成れたフラグメントをRP-HPLCで分析した
結果、フラグメントの生成は均一で、酵素の性能も高いことが確認されました。

mab ）を消化し、得られたフラグメント をRP-HPLC を 用 い て 分 析 し ま し た 。 3 種類のモノクローナル抗体を消化し、得ら

FabALACTICA の 活 性 を 実 証 す る た めに、3種類の治療用モノクローナル抗体（cetuximab、trastuzumab、adalimucetuximab

Fab

Fc

trastuzumabFabFcadalimumab

Fab
Fc

12.5

15

17.5

20

22.5

25

27.5

min

Separation of intact Fab and Fc fragments by RP-HPLC after FabALACTICA digestion. The digestion was performed O/N at 37°C.

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

13SmartEnzymes™

FabALACTICA®とLC-MS を用いたFc領域の糖鎖（ペアグリカン）の解析
医薬品の開発および製造の双方において 、
綿密なモニタリングが必要です。ここでは、トラスツズマブをFabALACTICAで消化し、得られたインタクトなFcフラグメント（約53Fc領域の糖鎖構造は、モノクローナル抗体の安定性、溶解性、薬力学的特性 、薬物動態学的特性に影響を与える重要品質特性（CQA）です。この翻訳後修飾は、抗体kDa）を用いて、2つの保存されたFc領域のグリコシル化とそのペアリングを高い質
量精度で同時に特性評価することができ
ました。
GLYCA
NA

D
RE

NA

G0F / G1F

OF MABSAPP NO
TE
:

SIS
LY

I
PA

G1F / G1F

ww

w

.g

en

ovi s.c o m /0 0

46

G0F / G0F

G1F / G2F

G0 / G0F

52800

G2F / G2F

53000

53200

53400

53600

53800

mass (Da)

Paired glycan analysis of trastuzumab Fc fragments. Trastuzumab was digested using FabALACTICA O/N at 37°C, and intact Fc andFab fragments were studied using LC-MS.

Immobilized FabALACTICA®を用いた2D-NMR分光分析
凝集や不要かつ固有の不均一性などの
重 要 品 質 特 性 （ CQA ） は 、 タ ン パ ク 質 の高次構造（HOS）を測定することによって評価することができます。二次元核磁気共鳴分光法（2D-NMR）により、IgG

ベースのバイオ医薬品のHOSを原子レベルで正確に比較することができます。ここでは、まずインフリキシマブをH2O2で処理
し 酸 化 を 誘 導 し た 後 、 Immobilized
FabALACTICAを用いて消化しました。

酸 化 さ れた サ ンプ ル の NMR スペク トル は 、FcおよびFabフラグメントの両方で酸化によるメチオニンの局所的な変性を示しましたが、高次構造はほとんど影響を受けていませんでした。
infliximab

Fab + Fc

Methionine region
2.4

2.3

2.2

2.1

2.0

1.9

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2

2.4
8

1.1
11

12

12

13

13

14

14

15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

12

12

F

20

2.0

1.9

1.8

1.7

1H (ppm)

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2

1.1

18

20

22

22

24

24

ww

2.1

FESTIVAL O16F
M
BI
O
R

POSTE
R

13C (ppm)

14

18

2.2

-0.4
8

10

16

2.3

-0.2

10

14

2.4

0.0

26
2.4

w

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

1H (ppm)

0.8

0.6

0.4

26
. g0.2-0.2-0.4
e n 0.034
ovi s.c o m /0 0

2D-NMR analysis following FabALACTICA digestion to evaluate the impact of oxidation on infliximab. 1H-13C methyl HSQC of the combined
Fab and Fc fragments of infliximab. Originator (orange) and oxidized originator sample (green). The spectra were acquired at 310 K using an 800 mHz
Bruker Avance at the Swedish NMR Center. Data was obtained in collaboration with SARomics Biostructures (Lund, Sweden).

14

ICS 2019
OGOL

11

oxidized infliximab

Antibody Digestion / FabALACTICA®

FabALACTICA® Fab Kitを利用した高純度なFabフラグメントの調製
FabALACTICA Fab kitは、抗体切断用のImmobilized FabALACTICA の ス ピ ン カ ラ
ムとFcフラグメント をアフィニテ ィー結合するためのCaptureSelect™ Fcスピンカラムから構成されています。ここでは、治療用抗 体 で あ る adalimumab 、 trastuzumab 、cetuximabをImmobilized FabALACTICA
で 消 化 し た 後 、 Fc フ ラ グ メ ン ト を Capture

adalimumab
kDa

Un

d

ste

e
dig

trastuzumab
ted

s
ige

D

Select™ Fcスピンカラムに捕捉させました。
Fabは遠心分離により容易に回収され、均質で純度の高いFabフラグメント溶液が得られました。

ed

fi
uri

P

ab

F

kDa

Un

d

ste

e
dig

ted

s
ige

D

cetuximab
ed

P

fi
uri

ab

F

kDa

260

260

260

160

160

160

110

110

80

80

110
80

60

60

60

50

50

50

40

40

40

30

30

30

20

Un

d

ste

e
dig

ted

D

s
ige

ed

P

fi
uri

b

Fa

20

20

Preparation of pure Fabs from three monoclonal antibodies using the FabALACTICA Fab kit. Adalimumab, trastuzumab and cetuximab digested
by Immobilized FabALACTICA. Pure Fab fragments were obtained in a high yield from all three mAbs using the FabALACTICA Fab kit.

FabALACTICA®
酵素の凍結乾燥品
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabALACTICA, 2000 units

Digests 2 mg human IgG1

A0-AG1-020

PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized FabALACTICA, Microspin 2 × 0.5 mg

Digests 2 × 0.5 mg human IgG1

A0-AG6-010

Immobilized FabALACTICA, Microspin 10 × 0.5 mg

Digests 10 × 0.5 mg human IgG1

A0-AG6-050

Immobilized FabALACTICA, Midispin 5-10 mg

Digests 5-10 mg human IgG1

A0-AG6-100

Immobilized FabALACTICA, Maxispin 10-100 mg

Digests 10-100 mg human IgG1

A0-AG6-1000

Immobilized FabALACTICA®
スピンカラムに酵素を固定した製品

FabALACTICA® Fab kit
Immobilized FabALACTICAとCaptureSelect™ （Fcフラグメント精製カラム)のセット
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabALACTICA Fab kit, Microspin 0.5 mg

Digests and purifies 0.5 mg human IgG1

A2-AFK-005

FabALACTICA Fab kit, Microspin 5 × 0.5 mg

Digests and purifies 5 × 0.5 mg human IgG1

A2-AFK-025

FabALACTICA Fab kit, Midispin 10 mg

Digests and purifies 10 mg human IgG1

A2-AFK-100

FabALACTICA Fab kit, Maxispin 100 mg

Digests and purifies 100 mg human IgG1

A2-AFK-1000< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

15

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

マウスIgGヒンジ領域直下を切断

FabRICATOR Z（IdeZ）は、マウスIgG2aおよびIgG3のヒンジ領域より下流の特定部位を切断し、2時間のインキュベーション後にF（ab'）2およびFcフラグメントの均質なプールを生成するシステインプロテアーゼです。

Mouse IgG2a and IgG3,
human IgG1-4, IgG of someclasses from monkey, rabbit
and sheep

CPAPNLLG / GPSVF

2 h reaction

抗体の消化ワークフロー

No need for reducing
agents or co-factors

Fc/2

Fd’

FabRICATOR® Z

Fd’
LC

LC

Reduction

Fc/2

FabRICATOR Zは、マウスIgG2aおよびIgG3をヒンジ領域下の特定の部位で切断し、インタクトなF(ab')2およびFcフラグメントを生成します。

FabRICATORが消化できない一部のマ
ウ ス IgG2a は 、 FabRICATOR Z で 容 易に消化されますが、より長いイン

キュベーション時間が必要な場合があります。なお、酵素の特異性が高いため、過消化のリスクはありません。

製品フォーマット

FabRICATOR® Z
酵素の凍結乾燥品

FragIT™ Z
スピンカラムに酵素を固定した製品

FragITとCaptureSelect™
（Fcフラグメント精製カラム)のセット

Thermo Scientific™ CaptureSelect™ resin from Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
Thermo Scientific and CaptureSelect are trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.

16

FragIT™ Z kit

Antibody Digestion / FabRICATOR ® Z

FabRICATOR® Zを利用したマウスMouse IgG2aの消化
R
l
tro
on
C

IC
Fa
bR

AT
O

IC
Fa
bR

AT
O

R

Z

ここでは、FabRICATOR Z（IdeZ）とFabRICATOR（IdeS）を用いて、マウスIgG2aの消化を行いました。2時間のインキュベー
ション後、FabRICATOR Z（IdeZ）はマウス
IgG2aを容易に消化することがわかりました。
一方、FabRICATORは少量の抗体しか消化できないことがわかりました。

kDa
160
110
80
60

Digestion of mouse IgG2a using
FabRICATOR Z and FabRICATOR.
The F(ab’)2 fragment is detected at~110 kDa and the Fc fragments at ~30 kDa.
The enzyme is detected at ~37 kDa.

50
40

30

20

FragIT™ Z Kitを利用した
マウスIgG2aおよびIgG3サブユニットの調製
FragIT Z

サ ン プ ル 中 に 酵 素 が 残 存 し ない よ う に 、
迅速かつ容易にマウスIgG2aを消化する必要があるアプリケーションには、
FabRICATOR Zを ア ガ ロー ス ビーズに固定化したFragIT Zスピンカラムを使用することが可能です。FragIT Z kitを用いて、均質なF(ab')2とFcフラグメントをアフィニ
ティー精製カラムで分離し、純粋な抗体
フラグメントを調製することが可能です。

FragIT Z kit

mouse IgG2a or IgG3

Schematic overview of FragIT Z and
FragIT Z kit. Generation and purification ofF(ab’)2 and Fc fragments from mouse IgG2aand IgG3 using FragIT Z and FragIT Z kit.

FragIT Z

FragIT Z kit

mouse IgG2a or IgG3

FabRICATOR® Z
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabRICATOR Z, 2000 units

Digests 2 mg IgG

A0-FRZ-020

PRODUCTDESCRIPTIONID

FragIT Z, Microspin 2 × 0.5 mg

Digests 2 × 0.5 mg IgG

A0-FZ6-010

FragIT Z, Microspin 5 × 0.5 mg

Digests 5 × 0.5 mg IgG

A0-FZ6-025

FragIT Z, Microspin 10 × 0.5 mg

Digests 10 × 0.5 mg IgG

A0-FZ6-050

PRODUCTDESCRIPTIONID

FragIT Z kit, Microspin 0.5 mg

Digests and purifies 0.5 mg IgG

A2-FZ2-005

FragIT Z kit, Microspin 5 × 0.5 mg

Digests and purifies 5 × 0.5 mg IgG

A2-FZ2-025

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

FragIT™ Z

FragIT™ Z kit< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

17

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

IgG1ヒンジ領域上部を切断

FabULOUS (SpeB) はシステインプロテアーゼであり、様々な種やサブクラスの IgG のヒンジ領域を消化し、均一な Fab フラグメントのプールを生成します。調製されたFabフラグメントは、
アフィニティ研究、Fabグリコシル化研究、構造研究などに使用することが可能です。



Human IgG and IgGfrom mouse, rat, goat,
sheep and rabbit.

KTHT / CPPCPAP(human IgG1)

60 min reaction

Requires reducing
conditions

抗体の消化ワークフロー

FabULOUSTM

Reducing Conditions

FabULOUSはIgGを消化し、FabとFcフラグ
メントを生成します。ヒトIgG1上の主要な切断部位は、アミノ酸T225とC226の間です。
酵素であるFabULOUSは、マウス（マウス
IgG1など）、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどを含む多様な種 およびサ ブクラス のIgGを消化します。本酵素が IgGに対して活性を示すためには還元条件を必要とし、強い還元条件を用いた場合にはジスルフィド結合が還元される可能性があります。

反 応 は 中 性 pH お よ び 還 元 条 件 下 で 行 わ
れ 、 37℃ で 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る と 消化が完了します。

製品フォーマット

FabULOUS™

酵素の凍結乾燥品

FabULOUS™ Fab kit

酵素の凍結乾燥品と CaptureSelect™
LC-kappa (mur)（Fabフラグメント精製カラム）のセット

Thermo Scientific™ CaptureSelect™ resin from Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
Thermo Scientific and CaptureSelect are trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.

18

Antibody Digestion / FabULOUS™

FabULOUS™を利用したFabおよびFcフラグメントの生成
Human
FabULOUS

Ctrl

IgG1

IgG2a

FabULOUS Ctrl

FabULOUS Ctrl

FabULOUS
Ctrl

Cysteine (mM)

DTT (mM)

30

1

50

260

5

13
20

IgG2
Ctrl

ER FROM CA
ST
SS
O
P

Rat IgG2b

S

IgG1
FabULOUS

kDa

Mouse

kDa

260

160

160

110
80

110
80

60

60

50

40

.g

w

50

40

ww

酵素によるインタクトな抗体フラグメントの調 製 は 、 非 特 異的 な 酵素 活性 の た め に 、様々な動物種やサブクラスのIgGでは困難な場合があります。FabULOUS は 、マウ ス
やヒトを含む数種類の IgG からインタクトなFab フラグメントを生成することができる貴重な研究ツールです。一部の動物種のIgG
で は 、 FabULOUS は 穏 や か な 還 元 条 件 下
で活 性を発 揮し 、抗 体 の鎖 間 ジスル フ ィド結合を還元することなくインタクトなFabフラ
グメントを生成することが可能です 。また、より強い還元条件下で消化した後にバッ
ファー交換を行うと、インタクトなFabフラグ
メントを得ることができます。これにより、
Fab フ ラ グ メ ント 中 のジ スル フ ィ ド結 合 の再結合が可能となります。

30

en

ovi

s.c o m /0 0

04

30

20
15

20

10

15

Generating Fab and Fc Fragments using FabULOUS. Left: SDS-PAGE analysis of human IgG1 andIgG2 and mouse IgG1 and IgG2a digested in the hinge region using FabULOUS. The generated fragments were analyzed with SDS-PAGE under reducing conditions. Right: SDS-PAGE analysis of rat
IgG2b digested in the hinge region using FabULOUS at different reducing conditions. The generated
fragments were buffer exchanged and analyzed with SDS-PAGE under non-reducing conditions.

Fab

FabULOUS Fab kit

Fc

Generation and purification of Fab fragmentsfrom mouse IgG1. The top panel shows theintact monoclonal mouse IgG1 antibody, themiddle panel shows the analysis of the fragments
after FabULOUS digestion, and the bottom
panel shows the eluted Fab fragments fromthe CaptureSelect™ LC-Kappa (mur) column.

FabULOUS Fab kit

Fab

Elute

Spin & Collect

FabULOUS

切断用の酵素であるFabULOUS（凍結乾燥 品 ） と CaptureSelect™ LC-Kappa(mur) アフィニティースピンカラムで構成されており、マウスIgGからFabフラグメント
を 簡 便 に 精 製す る こ と が できま す 。凍 結
乾 燥 品の FabULOUS を用 いて 60 分 以内
で抗体を消化し、その後、Fabフラグメント
は アフ ィ ニ テ ィー ス ピ ン カラム に 結 合し 、
容 易 に 溶 出 可 能 で す 。 FabULOUS FabKit を 用 い て マ ウ ス IgG1 か ら 調 製 し た
Fab フラグメントをここに示します。

IntactFabULOUS™ Fab Kitを利用したマウスIgGからのFabフラグメントの生成と精製+ FabULOUS
enzyme
20

22

24

26

28

30

32

34

min

FabULOUS™
PRODUCTDESCRIPTIONID

FabULOUS, 2000 units

Digests 2 mg IgG

A0-PU1-020

PRODUCTDESCRIPTIONID

FabULOUS Fab kit, mouse

Digests and purifies 2 mg mouse IgG

A1-PFK-020

FabULOUS™ Fab kit< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

19SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

ヒトIgG1ヒンジ領域上部を切断

GingisKHAN（Kgp）は、ヒンジ領域の上流の特定の部位でヒトIgG1を切断し、インタクトで均質なFabおよびFcフラグメントを生成するシステインプロテアーゼです。 この酵素は、LC-MSを使用した抗体ベースの生物学的治療法の特性評価、Fcグリカン分析、二重特異性抗体、親和性および結合力の影響の研究および翻訳後修飾の特定に使用されます。



Human IgG1



KSCDK / THTCPPCP

60 min reaction

Requires mild
reducing conditions.
2 mM cysteine is included

抗体のサブユニット化ワークフロー

GingisKHAN®

Reducing Conditions

GingisKHAN（Kgp）は、ヒンジ領域の上流の特定の部位でヒトIgG1を切断し、インタクトで均質なFabおよびFcフラグメントを

Reduction

生成す る シ ス テ イ ンプ ロ テ アー ゼです 。
この酵素は、LC-MSを使用した抗体
ベースの生物学的治療法の特性評価、Fcグリカン分析、二重特異性抗体、親和性および結合力の影響の研究および翻訳後修飾の特定に使用されます。

製品フォーマット

GingisKHAN®

酵素の凍結乾燥品

GingisKHAN® Fab kit

酵素の凍結乾燥品と CaptureSelect™ CH1（Fabフラグメント精製カラム）のセット

Thermo Scientific™ CaptureSelect™ resin from Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.
Thermo Scientific and CaptureSelect are trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.

20Antibody Digestion / GingisKHAN ®

GingisKHAN®を利用した
モノクロナール抗体およびFc融合タンパクの消化
FabFc

trastuzumab
FabGingisKHAN

Fc融合タンパクや変異したヒンジ領域を有する抗体を、より小さなサブユニットに特異的に分解することは困難です。酵素である
GingisKHAN は 、 ヒ ト IgG1 の ヒ ン ジ 領 域 上部の露出したリジン1ヶ所を還元条件下で消化しま す。必 要な還 元条 件 は、 鎖内 お
よび鎖間のジスルフィド結合を維持するのに十分マイルドであり、その結果、インタクト
なFabおよびFcフラグメントが得られます。
ここでは、モノクローナルヒトIgG1抗体とFc
融 合 タ ン パ ク を GingisKHAN と 37℃ で 1 時
間インキュベートし、HPLCを用いて分析しました。その結果、得られたフラグメントは、
GingisKHANの効率的な消化により、トラス
ツズマブとアダリムマブからはインタクトなFabフラグメントを生成し、エタネルセプトの融合TNFRド メ イ ン か ら Fc部 分 を分離す る
ことを示しています。

Fc.

adalimumab
Fc

TNFR

etanercept
10

20

30

40

50

min

­­Specific digestion of human IgG1 using GingisKHAN. LC separation of Fab and Fc fragmentsfrom a selection of therapeutic antibodies (trastuzumab and adalimumab) and a Fc-fusion protein(etanercept) after GingisKHAN digestion.

GingisKHAN® Fab Kitを利用した高純度ヒトIgG1 Fabフラグメントの調製
Human IgG1 GingisKHAN
IntactGingisKHAN Fab kit

Digestion

Flow-throughFc

Fc

GingisKHAN Fab kit

Elution

160
110
80
60
50

Fab

Elute

SDS-PAGE analysis under non-reducing
conditions of the human IgG1 trastuzumab
digested by GingisKHAN. After digestion,
the Fab fragments were captured in the affinity
spin column and could easily be eluted.

kDa

Spin & CollectGingisKHAN Fab kitを用いる こと で、高純度かつインタクトなヒト IgG1 Fab フラグ
メントを作製・精製することができます。ここではGingisKHANの消化により、トラスツ
ズマブのFabフラグメントを作製し、このフラグメントをCaptureSelect™ human CH1
スピンカラムを用いてアフィニティ精製を行いました。フロースルーにはトラスツズマ
ブFcとともに酵素が回収され、また、pHを下げることで容易にFabを溶出可能でした。

Fab

40

+ GingisKHAN
enzyme30

20GingisKHAN®
PRODUCTDESCRIPTION

ID

GingisKHAN, 2000 units

Digests 2 mg human IgG1

B0-GKH-020

PRODUCTDESCRIPTION

ID

GingisKHAN Fab kit

Digests and purifies 2 mg human IgG1

B0-GFK-020

GingisKHAN® Fab kit< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

21SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

IgG Fc領域の糖鎖を加水分解

GlycINATOR（EndoS2）は、Fc領域のグリコシル化された部位に存在する全てのグリコフォームを加水分解するIgG特異的なエンドグリコシダーゼです。この酵素はネイティブIgGに作用し、フコースの有無を問わず、コアGlcNAcを残します。本酵素は、アフコシル化（非フコシル化）研究のために抗体ベースの治療薬の複雑さを軽減する目的に使用されています。また、当社のGlyCLICKおよびTransGLYCITプラットフォームの初期ステップおいても使用されています。

Human IgG1-4, Fc-fusion
proteins, IgG from mouse,rabbit, rat, monkey, sheep,goat, cow and horse

Hydrolyzes the β1,4-linkage
between the two innermost
GlcNAc residues

30 min reaction

Requires native IgG fold

抗体の脱グリコシル化ワークフロー

GlycINATOR®

N-結合型糖鎖をトリミングするために、酵素であるGlycINATORはFc領域のネイティブなフォールディングを必要とします。この酵素は、Fc領域の糖鎖の最も内側の2つのGlcNAc残基間のβ1,4-結合を加水分解し、Fc領域上のコア
GlcNAcをインタクトに残します。Fc領域のグリコシル化部位は多くの生物種で保存されており、GlycINATORは複数の生物種およびサブクラスの抗体を脱グリコシル化することが可能です。
高マンノース型、ハイブリッド型、複合型およびバイセクト型糖鎖を含むすべてのIgGのグリコフォームを効率的に加水分解します。

製品フォーマット

GlycINATOR®

Immobilized GlycINATOR®

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品

GlycINATOR®

22

PRODUCTDESCRIPTIONID

GlycINATOR, 2000 units

Deglycosylates 2 mg IgG

A0-GL1-020

GlycINATOR LE (low endotoxin), 2000 units

Deglycosylates 2 mg IgG

A0-GL8-020

Antibody Deglycosylation / GlycINATOR ®

LC-MS characterization of Fc glycanhydrolysis by GlycINATOR. Native and
GlycINATOR-treated trastuzumab wasdigested with FabRICATOR to generate
Fc/2 fragments before LC-MS analysis.

G0F

G1F

G2F

G0

GlycINATOR

治療用抗体に対するGlycINATORの活性を
特 徴 付 け る た め に 、 GlycINATOR を ト ラ ス ツ
ズマブと 37℃で 30 分間インキュベートしま し た 。 次 に 、 こ の 抗 体 を FabRICATOR(IdeS) で 消 化 し 、 LC-MS 分 析 に 適 し たF(ab')2 および Fc/2 フラグメントを生成しました。抗体がGlycINATORとインキュベート
された際、フコースの有無を問わず、コア
GlcNAc以降のグリコフォームが加水分解されていることを結果は実証しています。

Native trastuzumab

GlycINATOR®を利用したFc領域の糖鎖の加水分解

24000

24500

25000

25500

m/z

GlycINATOR®によって脱グリコシル化された抗体はADCCを誘発しない
TER FROM

Relative Light Units

www

Relative Light Units

18
20

S
AI
IgGにおけるN-結合型糖鎖の脱グリコシル
PO
S
化は受容体への結合、ひいては抗体依存
500000性細胞傷害活性（ADCC）に影響を及ぼす
可 能 性 が あ り ま す 。 細 胞 ベ ー ス の iLite®
trastuzumab
500000ADCC アッセイを用いて 、ネイティブ およびtrastuzumab + GlycINATOR
300000脱グリコシル化トラスツズマブのADCC誘導
trastuzumab.gtrastuzumab + GlycINATOR
300000能を解析しました。ネイティブな抗体は、添en10000033
ovi
s.c o m /0 0
加量を増やすと予想通りシグナルが増加し100000
0.1
1
10
100
1000
ました。しかし、GlycINATORで脱グリコシル
ng/ml trastuzumab
化された抗体は、より多くの量を投与しても
0.1
1
10
100
1000
シ グナルを示さず 、 GlycINATOR 処理後にStudyng/ml
of ADCCby native and deglycosylated trastuzumab. The effect of trastuzumab was analyzed
trastuzumab
ADCC 活 性が 消 失し たこ とが 示唆 さ れましusing iLite ADCC Effector (V) Assay Ready Cells (BM4001) and iLite ADCC Target HER2 (+) Assay
Ready Cells (BM4011). Effector and Target cells were diluted and mixed with the antibody solutions.
た。
Incubation was performed at 37°C and 5% CO2. Luminescence reading was performed after 6 h.

Immobilized GlycINATOR®
PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized GlycINATOR, Microspin 2 × 0.5 mg

Deglycosylates 2 × 0.5 mg IgG

A0-GL6-010

Immobilized GlycINATOR, Microspin 5 × 0.5 mg

Deglycosylates 5 × 0.5 mg IgG

A0-GL6-025

Immobilized GlycINATOR, Microspin 10 × 0.5 mg

Deglycosylates 10 × 0.5 mg IgG

A0-GL6-050

Immobilized GlycINATOR, Midispin 1-10 mg

Deglycosylates 1-10 mg IgG

A0-GL6-100

Immobilized GlycINATOR, Maxispin 10-100 mg

Deglycosylates 10-100 mg IgG

A0-GL6-1000< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

23SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

Fc領域の複合型N-結合型糖鎖を加水分解

IgGZERO（EndoS）は、Fc領域のグリコシル化部位の複合型N-結合型糖鎖を加水分解するIgG特異的なエンドグリコシダーゼです。この酵素は、コアGlcNAc以降のIgGを脱グリコシル化し、高マン
ノース型およびハイブリッド型糖鎖には限られた活性しか示しません 。本酵素は、サンプルの複雑さを迅速に軽減し、イムノアッセイにおけるFc領域を介したエフェクター機能を不活性化し 、Fc領域の相互作用を低減することでイメージングを向上させるツールとして使用されています

Human IgG1-4, Fc-fusion
proteins, IgG from mouse,rabbit, rat, monkey, sheep,goat, cow and horse

Hydrolyzes the β1,4-linkage
between the two innermost
GlcNAc residues

30 min reaction

Requires native IgG fold

抗体の脱グリコシル化ワークフロー

IgGZERO®

酵素であるIgGZEROはIgGのFc領域のグリ
コ シ ル 化 部 位 の N- 結 合 型 糖 鎖 を 特 異 的に加水分解します。GlycINATORとは対照的に、IgGZERO は高マンノース型およびハ
イブリッド型糖鎖に対する活性は限定的です。複合型の加水分解は高速で、本酵素の活性にはネイティブなIgGフォールディン
グが必要なため、ネイティブな生理的条件下で行われます。

製品フォーマット

IgGZERO®

deGlycIT™

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品

IgGZERO®

24

PRODUCTDESCRIPTIONID

IgGZERO, 1000 units

Deglycosylates 1 mg IgG

A0-IZ1-010

IgGZERO, 5000 units

Deglycosylates 5 mg IgG

A0-IZ1-050

IgGZERO LE (low endotoxin), 2000 units

Deglycosylates 2 mg IgG

A0-IZ8-020

Antibody Deglycosylation / IgGZERO ®

N-結合型糖鎖を分解するグリコシダーゼの比較
GlycINATOR 、IgGZERO 、EndoHはN-結合型糖鎖のコアGlcNAc間に作用するエ
ンドグリコシダーゼであり、PNGase Fはコ
アGlcNAcとペプチド鎖の結合に作用する

一般的な アミダーゼ です 。 GlycINATOR とIgGZEROはIgGのFc領域の糖鎖に特異的であり 、EndoHは高マンノース型糖鎖に対する一般的なエンドグリコシダーゼです。

GLYCINATOR

Digestion site

IGGZERO

Asn

Works on native IgG

PNGase Fはすべての哺乳類のN-結合型
糖 鎖 に 広 く 作 用 し ま す が 、 コ ア GalNac が
ɑ1-3フコシル化された糖鎖は加水分解できません。

PNGASE F

Asn

ENDO H

Asn

Asn

Yes

Yes

Yes

Yes/NopH optimum

7.4

7.4

7.5

5-6

Reaction time

30 min30 min15 min +1-16 hIgG specific

Yes*

Yes

No

No

All Fc glycoforms

Complex Fc glycoforms,
limited activity on
high-mannose andhybrid-type glycans

All glycoforms except
core ɑ1,3 fucosylation

High-mannose and somehybrid-type glycans

Glycoform specificity* GlycINATOR has one more known substrate, ɑ-1-acid glycoprotein.

IgGZERO®を利用したクローン選択におけるフコシル化の度合いの利用
治療用抗体のFc 領域のN-結合型糖鎖上にコアGlcNAcにフコースが存在しないことは、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）の増加と関連しており 、多くの治療用抗体にとって望ましい特性です。
IgGZERO は 、 不 均 質 な Fc 糖 鎖 を 除 去し、フコシル化された最内の GlcNAc残基のみを残すことにより、サンプルの複雑さを迅速に軽減するので、MSデータの解釈が大幅に簡素化されます。
IgGZEROを用いたフコシル化の度合いを調べる技術が 、 Institute Pasteur とLFB Biotechnologies の研究 者によって開発されました。簡単に説明すると、フコシル化レベルを容易に決定し、クローン選択を迅速化することができました（Henninot et.al., 2015）。

細 胞 上 清 を 濃 縮 し 、 FabRICATOR とIgGZEROで処理し還元した後、LC-MSで分析を行います。これにより、抗体のGlcNAc + Fuc(86.7%)

GlcNAc(13.3%)

23600

23700

23800

23900

24000

24100

24200

24300

24400

24500

24600

mass (Da)

Determination of fucosylation levels using IgGZERO.
References
Henninot, A. et al. Characterization of monoclonal antibodies by a fast and easy LC- MS ToF analysis on culture supernatant. Anal Biochem 1–8 (2015).

deGlyIT™
PRODUCTDESCRIPTIONID

deGlycIT, Microspin 2 × 0.5 mg

Deglycosylates 2 × 0.5 mg IgG

A0-IZ6-010

deGlycIT, Microspin 5 × 0.5 mg

Deglycosylates 5 × 0.5 mg IgG

A0-IZ6-025

deGlycIT, Microspin 10 × 0.5 mg

Deglycosylates 10 × 0.5 mg IgG

A0-IZ6-050

deGlycIT, Midispin 1-10 mg

Deglycosylates 1-10 mg IgG

A0-IZ6-100

deGlycIT, Maxispin 10-100 mg

Deglycosylates 10-100 mg IgG

A0-IZ6-1000< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

25SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

ネイティブなIgGを部位特異的に修飾

GlyCLICKは、3ステップによるFc領域特異的かつ定量的なIgG抗体の修飾テクノロジーであり、複数の動物種・サブクラスに対応しています。Fc領域のグリカンを特異的に加水分解することにより 、クリックケミストリーを利用してコアとなるGlcNAcに対して修飾が可能となります。その結果、標識度（DOL）または抗体-薬物比（DAR）は2.0になります。信頼性の高いパフォーマンスにより、高感度が要求されるアプリケーションにおいて、定量的な修飾と免疫反応性が保証されます。このテクノロ
ジーはさまざまなキット形式で利用することが可能となっています。

Human IgG1-4, IgG frommouse, rabbit, rat, monkey,
sheep, goat, cow and horseConjugation occurs at
the Fc N-glycan sites

1. Deglycosylation

脱グリコシル化：複数の動物種・サブクラスのIgG に対して、Fc領域に特異的に作用するエンドグリコシダーゼであるGlycINATOR®
（EndoS2）は、最も内側のGlcNAcにつながるFc領域のグリカンを加水分解します。この
酵素は、ハイマンノース型、ハイブリッド型、
バイセクト型、複合型のグリカンを除去しま
す。





2-3 day protocol

2. Azide Activation

3. Click Reaction

アジド導入による活性化：β-1,4-ガラ
ク ト シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ （ Y289L ） 1 と
UDP-GalNAzを使用して、露出したGlcNAcに酵素的にGalNAzが結合し、活性のあるアジド基を 有す る 抗 体を生 成 し ます 。 こ れ は
sDIBO や DBCO と い っ た 反 応 性 を 持 っ た 機
能的なシクロオクチン合物と反応します。

Alexa Fluor ®, biotin,
DFO, MMAE, PNU,
Azide activation++

クリック反応：活性のあるアジド基を有する抗体は、生体直交型反応を利用して機能性のあるラベルで修飾することが可能です。これは歪み促進型アジドア ル キ ン 付 加 環 化 (Strain-promoted
alkyne-azide cycloaddition, SPAAC)
を経由して、安定なトリアゾール環の形
成を介しています。

製品フォーマット

GlyCLICK® Fluorophore

Alexa Fluor® （ 488, 555, 647）修飾用キット

GlyCLICK® ADC

GlyCLICK® Affinity
ビオチン修飾用キット

MMAE または PNU2 修飾用キット

26

GlyCLICK® Chelator

DFO (desferrioxamine)修飾用キット

GlyCLICK® Azide Activation
アジド修飾用キット
アルキンによるクリック反応向け

Antibody Conjugation / GlyCLICK®

GlyCLICK ® を利用した次世代の抗体修飾について
従来の抗体修飾 はランダム性 の高い方法を使用しています。具体的には、リシン残基にあるアクセスが容易なアミンまたは溶媒に
よってアクセス可能になる鎖間のシステインに修飾・ラベルを行います。そのような方法においては、用途は広いですが、標識度（DOL）やサイト占有率のコントロールが制限
Lysine Conjugation
Conjugation
Cysteine Conjugation
Conjugation
GlyCLICK Conjugation
LysineCysteine
GlyCLICK
Conjugation
されます。したがって、それらが最終製品の安定性、免疫反応性および再現性に影響
Schematic representation of IgG and different conjugation technologies with degree of labeling.
Lysine-based conjugation, DOL = varied; cysteine-based conjugation, DOL = 0-8; and GlyCLICKする傾向があります。部位特異的な修飾方
conjugation, DOL = 2.0.
法 は、 こ ういった 制限 を打 開 するた め の 魅
力的なオプションですが、プロセスを制御・安定化するためのエンジニアリングを要することも多いです。 GlyCLICKによるFcグリカン部位での結合は、部位特異的であるだけでなく、 Fc
部位のグリカンを修飾することにより、免疫細胞にあるFc受容体（FcYR）との結合を阻害し、オフターゲット効果も減少させます。

DC

ROM WORL
D
RF
A
TE

9
201

Fc/2
Nativeww

酵素によるリモデリングと銅フリークリックケミ
ス ト リ ー （ SPAAC ） の 組 み 合 わ せ に よ り 、
sDIBOやDBCOラベルなどの任意のシクロオ
クチンラベルを使用することが可能になります。これにより、GlyCLICKは、抗体に対して部位特異的に修飾を行うことができます 。
GlyCLICKを 使用 して得 られた 均質性を実証するため に 、 パニツムマブに 対して様々なラベルで修飾を行い、F（ab´）2およびFc/ 2サブユニットレベルでRP-HPLCにより分析しました。ネイティブなコントロールと比較した場合、結果として得られたピークは、ラベルされたFc / 2サブユニットのもののみ検出されたことを示しています 。つまり 、使用されているラベルのタイプとは関係なく 、
GlyCLICKがFc-グリカン部位で特異的に修飾できることを示しています。

POS

GlyCLICK ® を利用した多様な目的に使用できる抗体ラベル化

w

Fc/2
Fc/2
Alexa Fluor Biotin

Fc/2
DFO

.g

en

ovi s.c o m /0 043

F(ab’)2
NativeFc/2
MMAE

Analysis of Fc glycan conjugation using
GlyCLICK. RP-HPLC analysis of unmodified
panitumumab and panitumumab conjugatedwith desferrioxamine (DFO), Alexa Flour ® 488,
biotin or monomethyl auristatin E (MMAE) afterdigestion with FabRICATOR.

4.5

5

5.5

6

F(ab’)2
Conjugates

6.5

7

7.5

min

1. SiteClick™ is provided under an intellectual property license from Life Technologies Corporation.
The trademark SiteClick™ is the property of Life Technologies Corporation.
2. Linker-toxin Payloads included in GlyCLICK® are provided under an intellectual property license from Glykos Finland ltd.

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

27

SmartEnzymes™

信頼性の高い抗原検出
ランダムにラベルされた抗体を使用した免疫染色が、その結果イメージの品質に影響する可能性があります 。これは、抗原が結合するFab領域での、過剰なラベルまたは
ラベルによる免疫反応性の障害に起因す
る、不十分なシグナルや非特異的結合によるものです。

Control
Trastuzumab

GlyCLICK
Alexa Fluor 488

60
40
20

0

200

400

600

800

80

Response Units (RU)

Response Units (RU)

Response Units (RU)

Random
DyLight 488

80

80

0

表面プラズモン共鳴（SPR）応答曲線は、
ランダムにラベルされたものでは 、20％のみの結合能力を保持していたのに対し、
GlyCLICK で修飾した抗体で は 、高感度か
つ信頼性の高い完全な免疫反応性を保持していることが示されました。

ラベル化した抗体の免疫反応性を評価するために、トラスツズマブを部位特異的に
GlyCLICK によってAlexaFluor®488でラベル、またはNHS-activated DyLight® 488
によってリシン残基にランダムにラベルを行
いました。

60
40
20

0

0

200

400

600

800

60
40
20
0

Time (seconds)

Time (seconds)

200

400

Time (seconds)

600

800

Affinity analysis of native and conjugated trastuzumab. Anti-human IgG (Fc) was used as the capturing molecule for trastuzumab. Native (control),Alexa Fluor ® 488 (GlyCLICK, DOL=2), DyLight ® 488 (random, DOL=10). HER2 was injected in a range to ensure sufficient curvature. All data were fitted
against a 1:1 mathematical model.

GlyCLICK ® により修飾された抗体の In Vivoにおけるパフォーマンス
GlyCLICKを使用して部位特異的に放射性ラベルされた抗体とリシン残基にランダムにラベルした抗体をPET / CTイメージングで使用してin vivoでの性能を評価しました。
そのトレーサーは、担ガンマウスに対し注射により投与される前に、一度キレート化され、標準的な放射性同位元素であるジルコニウ
ム-89（89Zr）で標識されました。

投与されたマウスの分析は、トレーサーの生体内分布と腫瘍取り込みを測定するために、
PET / CTイメージングを使用して実施されました。結果は、ランダムにラベルされたトレーサーと比 較して、 GlyCLICKによ り部位
特異的なラベルトレーサーの優れた腫瘍取り込みと有意に長い循環時間を示しています。

Tumor uptake

Biodistribution ex vivo

RandomZr-trastuzumab

Zr-trastuzumab

POS
GlyCLICK 89Zr-trastuzumab

25%ID/g (mean)

89

10

8
201

GlyCLICK

Random 89Zr-trastuzumab

20

ww%ID/g (mean)

30
89

ROM WORL
D
RF
A
TE

DC

20

15

GlyCLICKキット（DOL = 2）を使用して抗体ごとに結合するラベルの数が一定であると、
in vivoでのパフォーマンスが向上するだけ
でなく、PETイメージング実験での定量化の可能性も高まります。

w

15

.g

en

ovi s.c o m /0 0

25

10

5
5

168 h

d

120

oo

70

H

24

ea
r
Lu t
n
Pa gs
nc
re
a
Sp s
le
en
Li
St ver
om
a
In ch
te
st
in
e
Ki
dn
ey
M s
us
cl
e
Bo
ne
Br
ai
n
Tu
m
or

0
4

Bl

0

Analysis of PET/CT imaging of SK-OV-3 tumor-bearing mice. Mean tumor uptake (left panel) over a time interval of 0 -168 hours post injection, and exvivo biodistribution of 89Zr-DFO-trastuzumab in major organs (right panel). Data was obtained in collaboration with Minerva Imaging (Copenhagen, Denmark).

28

Antibody Conjugation / GlyCLICK®

GlyCLICK®ADCキットを利用した非常に強力なADCの生成
GlyCLICK テ ク ノ ロ ジ ー に よ り 、 DAR=2.0
で抗体にリンカー・ペイロードを組み込んだ万全な修飾がもたらされます。このキットは、細胞内で薬物放出するために2段階で切断可能なリンカー・ペイロードを備えた均質なADC、かつ、pMレンジで細胞毒性効果を示すコンジュゲートを生み出
し 、 こ れ は 機 能 的 で 非 常 に 強 力 な ADC であることが示されています。

Panitumumab Native

WOR
L

D

A

1
202

ww

w

RO
RF
TE

DC

PO
S

MMAEまた はPNU の ど ち ら かを 運ぶ 、 2段
階に切断可能なリンカー・ペイロードと任意のネイティブな抗体を結合させることができるようにGlyCLICK ADCキットはデザイ
ンされています。

.genovi s.c o m /0 0

48

120

Trastuzumab-glycolinker-PNU

Cell viability, %GlyCLICK ADC kit PNU

100

DAR=2.0 IC50=75pM

80
60
40
20

25000

25500

26000

m/z

0
-12

-11

-10

-9

-8

-7

Log 10 of molar concentration

ADC generation using GlyCLICK. LC/MS analysis of panitumumab conjugated with the PNU linker-payload using GlyCLICK (left). The antibody was
analyzed after FabRICATOR digestion to determine the native Fc/2 glycan profile and site-specific labeling after conjugation using GlyCLICK ADC kit PNU.
In vitro cytotoxicity analysis of trastuzumab conjugated with the PNU linker-payload using GlyCLICK ADC kit PNU (right). HER2+ SK-BR-3 cells wereincubated with the ADC and cell viability was measured using PrestoBlue after 5-6 days. Curves represent the average result from three replicates.
Data was obtained in collaboration with Glykos Finland Oy (Helsinki, Finland).

GlyCLICK® Fluorophore
PRODUCT

GlyCLICK® Chelator

DESCRIPTIONID

GlyCLICK Alexa Fluor 488

Conjugates 250 μg IgG

GlyCLICK Alexa Fluor ® 488

Conjugates 1 × 2 mg IgG

GlyCLICK Alexa Fluor ® 555

Conjugates 250 μg IgG

L1-F02-025

GlyCLICK Alexa Fluor 555

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-F02-200

GlyCLICK Alexa Fluor 647

Conjugates 250 μg IgG

L1-F03-025

GlyCLICK Alexa Fluor 647

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-F03-200

®

®

®
®

PRODUCTDESCRIPTIONID

L1-F01-025

GlyCLICK DFO

Conjugates 250 μg IgG

L1-C01-025

L1-F01-200

GlyCLICK DFO

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-C01-200

PRODUCTDESCRIPTIONID

GlyCLICK ADC kit, MMAE

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-T02-200

GlyCLICK ADC kit, PNU

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-T01-200

GlyCLICK® Affinity
PRODUCTDESCRIPTIONID

GlyCLICK Biotin

Conjugates 250 μg IgG

L1-A01-025

GlyCLICK Biotin

Conjugates 1 × 2 mg IgG

L1-A01-200< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

GlyCLICK® ADC

GlyCLICK® Azide Activation
PRODUCTDESCRIPTIONID

GlyCLICK Azide Activation

Activates 250 μg IgG

L1-AZ1-025

GlyCLICK Azide Activation

Activates 1 × 2 mg IgG

L1-AZ1-200

GlyCLICK Azide Activation

Activates 1 × 10 mg IgG

L1-AZ1-100

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

29

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

IgGをトランスグリコシル化

TransGLYCITは、ネイティブなヒトIgGを3時間以内に効率的にトランスグリコシル化するためのプ
ラットフォーム技術です。酵素的リモデリングを用いて抗体のFc領域 N-結合型糖鎖をトランスグ
リコシル化する堅牢なワークフローにより、特定のグリコフォームを有する抗体調製物を得ることができます。この技術は、G0、G1、G2またはG2S2糖鎖プロファイル（±フコース）を有する抗体を 作 製 す る た め の キ ッ ト 形 式 で 提 供 さ れ て お り 、 TransGLYCIT Afucosylated kit を 使 用 し て コ ア
GlcNAcのフコースを除去するオプションも用意されています。

Human IgG1, IgG2 and IgG4Transglycosylation occurs
at the Fc N-glycan sites

3 hour workflow

Glycoform included,
optional defucosylation
using the Afucosylated kit

トランスグリコシル化ワークフロー
G0

G1

1. Deglycosylation

2. Transglycosylation

Optional Defucosylation

Oxazoline Glycoform

脱グリコシル化： Fc領域のN-結合型糖鎖
は 、 IgG 特 異 的 な 酵 素 で あ る Immobilized
GlycINATOR (EndoS2) に よ っ て 、 コ ア
GlcNAc に ト リ ミ ン グ さ れ ま す 。こ の 酵 素 はハイマンノース型、ハイブリッド型、バイセク
ト型および複合型を含むすべてのFc領域のグリコフォームを加水分解します 。アフ
コ シル化（ 脱 フコ シ ル化） した 糖鎖を得 る
た め に 、 Immobilized FucosEXO（ TransGLYCIT Afucosylated に 含 ま れる）はα1-6結合したコアフコースを加水分解します。

+

+

G2

G2S2

+

+

+

+

トランスグリコシル化：人工設計されたグリ
コ シ ン タ ー ゼ で あ る TransINATOR は オ キ
サ ゾ リ ン 反 応 性 の G0 、 G1 、 G2 ま た は
G2S2 グ リ コ フ ォ ー ム と コ ア GlcNAc と の 間のトランスグリコシル化反応を触媒します。

製品フォーマットTransGLYCIT™

TransGLYCIT™ Afucosylated

ヒトIgGの糖鎖リモデリング（G0, G1, G2, G2S2）キット

ヒトIgGの糖鎖リモデリング（G0, G1, G2, G2S2+脱フコシル化）キット

TransGLYCIT™

30

PRODUCTDESCRIPTION

ID

TransGLYCIT G0, 1 mg

Generates 1 mg human IgG with the G0 glycoform

T1-G0F-010

TransGLYCIT G1, 1 mg

Generates 1 mg human IgG with the G1 glycoform

T1-G1F-010

TransGLYCIT G2, 1 mg

Generates 1 mg human IgG with the G2 glycoform

T1-G2F-010

TransGLYCIT G2S2, 1 mg

Generates 1 mg human IgG with the G2S2 glycoform

T1-S2F-010

Antibody Conjugation / TransGLYCIT ™

TransGLYCIT™利用したFc領域のアガラクトシル化（脱ガラクトシル化）、
ガラクトシル化およびシアル酸化グリコフォームの生成
ADCC活性が増大した抗体が得られます。これにより、フコース化抗体とアフコース化抗体を直接比較することが可能です。

プロファイルと、TransGLYCITを用いてG0、G1、
G2またはG2S2を付加し、抗体を完全にトラン
スグリコシル化した後のマススペクトルのシフトを示しています。また、均一なアフコシル化糖
鎖プロファイルはTransGLYCIT Afucosylated
kitを使用して生成されました。

ここでは、治療用抗体であるトラスツズマブの糖鎖プロファイルをリモデリングし、フコシル
化またはアフコシル化したG0、G1、G2または
G2S2グリコフォームのいずれかを付加することに成功しました。得られたマススペクトルは、ネイティブなトラスツズマブの不均一な糖鎖

ROM GLYC
RF
ON
TE

G0

TransGLYCIT

G2S2F

w

.g

en

ovi s.c o m /0 052

G0Afucosylated

G2F

G2F

Man5

G1

Afucosylated

TransGLYCIT

G1F
G1TransGLYCIT

G1F
G0

G2

Afucosylated

TransGLYCIT

G0F
G0

G2

G0F

Afucosylated

G2F

Man5

Native Trastuzumab

G1F

ww

Native Trastuzumab

G0F

1
202

PO

ET

S

IgGの糖鎖プロファイルのエンジニアリングは、エフェクター機能を強化または抑制した次世
代治療用抗体の開発に重要です。
TransGLYCITは、アガラクトシル化（G0）、ガラ
クトシル化（G1、G2）、シアル化（G2S2）グリコ
フォームを有する抗体作製に使用されます。
また、TransGLYCIT Afucosylated kitを用いてコアGlcNAcのフコースを欠くグリコフォームを作製すると 、FcγI I Ia 受容体への結合と

G2S2

G2S2

23500

24000

24500

25000

25500

26000

26500 23500

24000

24500

mass (Da)

25000

25500

26000

26500

mass (Da)Transglycosylation using TransGLYCIT. Deconvoluted mass spectra of the Fc/2 fragment of native trastuzumab (top) and after transglycosylation withTransGLYCIT (left panel) or TransGLYCIT Afucosylated (right panel). The mAb was digested with FabRICATOR and the subunits were analyzed by reversedphase LC-MS on a Waters™ BioAccord™ system equipped with a Waters™ BioResolve™ RP mAb column (2.1 × 50 mm).

TransGLYCIT™ Afucosylated
PRODUCTDESCRIPTION

ID

TransGLYCIT G0 Afucosylated, 1 mg

Generates 1 mg afucosylated human IgG with the G0 glycoform

T1-G0A-010

TransGLYCIT G1 Afucosylated, 1 mg

Generates 1 mg afucosylated human IgG with the G1 glycoform

T1-G1A-010

TransGLYCIT G2 Afucosylated, 1 mg

Generates 1 mg afucosylated human IgG with the G2 glycoform

T1-G2A-010

TransGLYCIT G2S2 Afucosylated, 1 mg

Generates 1 mg afucosylated human IgG with the G2S2 glycoform

T1-S2A-010< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

31SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

アルギニン特異的にタンパクを切断(N)-S-T-R E-G-(C)GingisREX（RgpB）はアルギニン残基のC末端でタンパクを切断するアルギニン特異的なプロテアーゼです。なお、他の酵素では切断が難しいアルギニン-プロリン配列も切断可能です。この酵素は、ペプチドマッピング、de novoペプチドシーケンシング、および翻訳後修飾の分析に有
用です。



Digests any peptide orprotein containing Arg.
Specific for Arg-X motifs

Digests C-terminally of
Arg residues

60 min reaction

Active in 6 M urea
and 0.1% SDS

タンパク切断ワークフロー
Arg- X

Arg- X

GingisREX は、アルギニン残基の C 末端にあるペプチド結合を特異的に切断するシステインプロテアーゼで、隣接するアミノ酸が プ ロリ ン の 場 合 も 切断 し ます 。 トリ プ シ ン
による切断に比べ、長いペプチドが生成され、高 分解能 MS で分 離・ 同 定する ことがGingisREX®

可能です。これにより、ボトムアップアプ
ロ ー チ のた め の サ ン プ ル調 製に 関 す る 選択肢が増え、分解プロファイルやシーケン
スカバレッジを向上させることができます。

GingisREX には、Arg-Cにおいて一般的にみられるようなリシンへの活性はありません。
本酵素は5.0 - 9.0の広いpH範囲で活性を示し、シス テインを必要と しますが 、塩酸グアニジンにより阻害されます。

製品フォーマット

GingisREX®

酵素の凍結乾燥品

GingisREX®

32

PRODUCTDESCRIPTION

ID

GingisREX, 5 μg enzyme

Enzyme:Protein ratio: 1:20 - 1:200

B0-GRX-005

Proteomics / GingisREX®

S

ER FROM CA
ST
SS
O
P

16
20

ww

w

.g

GingisREX®を利用したアルギニン特異的な切断
ボトムアップ質量分析データの解釈は、多くの場合、サンプルの消化に使用されたプロテアーゼの特異性に関する特定の仮定に基づいて行われます。
特 異 性 の な い 活 性 は 、デ ータ の 解 釈 を困難にする不確実性をもたらし、分析時間と誤認識のリスクの両方を増大させます。
そこで、酸化インスリンβ鎖を非常に単純なモデル基質として、GingisREX と ArgC の活 性 を 比 較 し ま し た 。 酸 化 イ ン ス リ ン
β鎖は、アルギニンとリシンを 1つずつしか含まないため、アルギニン特異的なプロテアーゼ によって1箇所し か 消化 されないはずです。GingisREX と Arg-C により生成されたペプチドを RP-HPLC および MS により解析したところ、GingisREX はアルギ

en

ov is

.

m /0 010

ニン残基を特異的に消化し 、リシン残基には活性を示さず、酵素/基質比を 1:5 として一晩中インキュベートしても他の非特異的活性は認められませんでした。一方、
Arg-C は アルギ ニ ン残 基 で主 要な活 性を示したが、リシン残基や他の多くのマイナーな部位での切断も観察されました。

Digestion of oxidized β-chain of insulin with GingisREX and Arg-C.
The digestion was performed O/N at 37°C, with an enzyme to substrate
ratio of 1:20 (w/w), 20 mM cysteine in buffers at pH 7.4 (GingisREX) andpH 7.6 (Arg-C). The peptides were separated on RP-HPLC.

GingisREXPEPTIDE NO.

AMINO ACID SEQUENCE

Intact protein

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

1

GFFYTPKA

2

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER

3GFFYTPK

4

FVNQHLCGSH

5

LVEALYLVCGER + Na

Sequences of oxidized insulin β-chain digested by GingisREX or Arg-C.
Green indicates arginine residues and red indicates lysine residues.

GingisREX® を用いた治療用抗体のペプチドマッピング
治療用抗体のような大きく複雑なサンプル
では、アルギニン残基で切断することにより、より大き なペプ チドが 得 ら れ 、 ペプチドマ ッ
プのピークが少なくなります。ここでは、トラス ツ ズ マ ブ の GingisREX お よ び Arg-Cの消化プロファイルを紹介します。

GingisREX

GingisREXによるアルギニン部位での切断
では、ピーク数が少なく、ペプチドマップも複雑でなく、マスフィンガープリント解析における デ ータ の 相 互 参照 に 有 利な特 徴 を持 っています。

Peptide maps of trastuzumab after digestion using GingisREX or Arg-C.

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

33

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

Immobilized PNGase F
N-結合型糖鎖を加水分解

Immobilized PNGase Fは、酵素であるPNGase F(Peptide N-glycosidase F)がスピンカラム形式でアガロー
スビーズに共有結合しており、抗体、融合タンパク質、その他のN-グリコシル化タンパク質上のN-グリカンを簡単に除去できる製品です。この酵素は、MS分析におけるサンプル調製（タンパク質の不均一性を低減し、放出された糖鎖分析を可能にします）、およびN-グリカンの機能的役割の研究に幅広く利用されています。

N-linked glycans on
glycoproteinsHydrolyzes the glycosidic
bond between N-glycans
and Asn

15+ min denaturing or
1+ h native reaction



RapiGest™ included in
the Denaturing kit

脱グリコシル化ワークフロー

Immobilized PNGase F

PNGase F (Peptide N-glycosidase F)
はPNGase Fは、「ポリペプチドのアスパラギン」と「オリゴサッカライドの最も内側のGlcNAc」との間のアミド結合を加水分解するグリコアミダーゼです 。これは、すべての哺乳類のアスパラギンに結合する

複合型・ハイブリッド型・高マンノース型のオリゴサッカライドに対して作用します。
反応中、グリカンが除去されたアスパラギン残基は脱アミド化されてアスパラギン酸になります。 サンプルである糖タンパクを、
スピンカラム内でImmobilized PNGase Fとともに通常反応条件で 1時間から一晩、ま た は 変 性 反 応 条 件 （ RapiGest™ SF
Surfactantを利用）で15〜60分間インキュ
ベートします。その後、脱グリコシル化された糖タンパクは、遠心分離によって容易に収集可能です。

製品フォーマットImmobilized PNGase F Denaturing

Immobilized PNGase F

スピンカラムに酵素を固定した製品

Immobilized PNGase FとRapiGest™ SF Surfactantのセット

Immobilized PNGase F

34

PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized PNGase F, Microspin 5 × 0.2 mg

Deglycosylates 5 × 0.2 mg glycoproteinsG1-PF6-010

Immobilized PNGase F, Microspin 10 × 0.2 mg

Deglycosylates 10 × 0.2 mg glycoproteinsG1-PF6-020

PNGase F
Immobilized PNGase F

Glycan Profiling / Immobilized PNGase F

Immobilized PNGase Fを使用した通常反応条件でのN-結合型糖鎖の除去
1 h,native

2

4

6

8

10

retention time (min)ネイティブな反応条件で、PNGaseFを使用
してFc領域のN- グリカンを除去すると、遊離N-結合型 糖鎖 およ び脱 グリ コシ ル化抗体の構造・特性評価が可能になります。ネ
イティブな反応条件でのPNGaseFによるグリカンの効率的な除去を実証するため、トラ
スツズマブを利用しました。質量のシフト は、溶液中のPNGase Fで処理されたサンプルと比較して、分析に干渉する酵素を残さずにFc領域のN-グリカンの除去に成功したことを示しています。

Fc/2

LC

Fd’

G0F

PNGase F

Control

Control

G1F

Man5

G2F

PNGase F
Immobilized PNGase F

PNGase F
Immobilized PNGase F

G0

1 h,
native
2

4

6

10

8

1 h,
native
23500

24000

retention time (min)

24500

25000

25500

mass (Da)Removal of N-glycans under native conditions. TIC chromatogram (left) and deconvoluted mass spectra (right) of the Fc/2 fragment of
intact trastuzumab (top panel) and trastuzumab treated with Immobilized PNGase F (bottom panel) or PNGase F in solution (middle panel).
The antibody samples were analyzed after digestion with FabRICATOR.
G0F

Control

G1F

G0
G2F

PNGase F

Man5

Immobilized PNGase F

Immobilized PNGase F Denaturingを使用した迅速なN-結合型糖鎖の除去

ある糖タンパクでのImmobilized PNGase Fの脱グリコシル化能がこちらに示されています。例として一般的に使用される糖タンパク質である
1 h,nativeRNase Bは、Immobilized PNGase F Denaturingを使用して15分で完全に脱グリコシル化されました。
23500

24000

24500

25000

25500

mass (Da)ABATACEPTRNASE BCETUXIMAB

Fusion protein

Glycoprotein

IgG1

Number of N-glycans

6

1

4

Number of O-glycans

8

-

-

Reaction conditions

Native, 18 h or denaturing, 30 min

Denaturing and reducing, 15 min

Native, 1 h or denaturing, 15 min

Preparation ofsamples for analysis

ReducedN/A

FabRICATOR digested







Protein type

Undigested

Intact Immobilized
PNGase F

IntactImmobilized
PNGase F
native denaturing

F(ab’)2

Immobilized PNGase F

1x

Denaturing
30 min2x** **minor O-glycoforms
Fc

Native
18h
38000

*
40000

* *
42000

44000

46000

48000

mass (Da)Key characteristics and deconvoluted mass spectra or SDS-PAGE assay of a selection of glycoproteins treated with Immobilized PNGase F.
Abatacept was analyzed by reversed-phase LC-MS and RNase B and cetuximab were analyzed on SDS-PAGE. The mass shifts in the deconvoluted
mass spectra or on the gels show the successful removal of N-glycans from the various glycoprotein substrates.

Immobilized PNGase F Denaturing

PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized PNGase F Denaturing, Microspin 5 × 0.2 mg

Deglycosylates 5 × 0.2 mg glycoprotein. 5 × 1 mg RapiGest SF is included

G2-PDK-010

Immobilized PNGase F Denaturing, Microspin 10 × 0.2 mg

Deglycosylates 10 × 0.2 mg glycoprotein. 10 × 1 mg RapiGest SF is included

G2-PDK-020™

™

RapiGest™ SF Surfactant is included in Immobilized PNGase F Denaturing. RapiGest™ SF Surfactant is a trademark of Waters Corporation.

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35

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

O-結合型糖鎖を有するタンパクを特異的に切断
OpeRATOR は、ムチン型O-結合型糖鎖を持つタンパクの糖鎖残基である Ser と Thr の N 末端を切断する O-結合型糖鎖に特異的プロテアーゼです。O-結合型糖鎖を持つ糖ペプチドが生成され、本酵素によりO-結合型糖鎖プロファイリング、ペプチドのマッピング、部位占有率の決定、さらにMS解析による中間レベルのアプローチも可能になります。

Native proteins with mucintype O-glycosylation



Digests N-terminally ofO-glycosylated Ser and
Thr residues

2 h to O/N (16-18 h) reactionDesialylation using
SialEXO (included)
increases performance

O-糖化タンパク切断ワークフロー

OpeRATOR®
SialEXO®

OpeRATOR は 高 い 特 異 性 で 、 ム チ ン 型
O-糖化タンパクおよびペプチドと O-結合型糖鎖を有するセリンまたはスレオニン残
基 の N 末 端 で 切 断 し ま す 。 N- 結 合 型 糖
鎖部位の糖タンパクを消化することはありません。
この酵素はアシアル（脱シアル）化された
コア1 O- 結合型 糖鎖 に対 し て最も活性が高いです。シアル化コア1およびコア3も切断するが、その程度はかなり低くなって

い ま す 。 OpeRATOR は SialEXO （ 複 数 のシ アリ ダ ー ゼ の 混 合物 ）と 共 に 使 用 可 能
で 、 購 入 時 に SialEXO は 同 梱 さ れ て い います。

製品フォーマット

OpeRATOR®

酵素の凍結乾燥品

OpeRATOR®

36

PRODUCTDESCRIPTIONID

OpeRATOR, 2000 units

Digests 2 mg O-glycoprotein

G2-OP1-020< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

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Glycan Profiling / OpeRATOR ®

OpeRATOR®を利用したO-グリコシル化部位に特異的な切断
ER FROM CA
ST
SS
O
P

S

UV trace

19
20

1

APPRLI...SPPDAA 125

30

20

126

25

SAAPLR...ACRTGD

30

35

.g

w

エリスロポエチン（EPO）は、単一のO-グリコシル 10
化 部 位 を 持 つ 約 30 kDa の 糖 タ ン パ ク で す 。
0
PNGaseFによるN-結合型糖鎖の除去とSialEXO
による脱シアル酸化の後、ネイティブなタンパクを、
OpeRATORを用いてO-結合型糖鎖を有するアミノ酸のN-末端を切断しました。得られたタンパク
8
断片は逆相LC-MSで分析されました。

ww

OpeRATORは、中間レベルのO-グリコシル化部
位のマッピングに用いることが可能です。実際、1個または数個のO-結合型糖鎖しか持たないタン
パクでは、OpeRATORによる切断部位の特定からO-グリコシル化部位を直接決定することが可
能です。

40

45

50

55

en

ovi s

.c o m /0 0

42

60

QTOF MS1APPRLI…..SPPDAA 125

1.0

126

SAAPLR….ACRTGD 165
0.8

Specific digestion N-terminally of the Oglycosylation site. The reduced fragments wereseparated on a reversed-phase C4 column
followed by ESI-QTOF MS detection. The EPO
protein carrying one core 1 O-glycan washydrolyzed at a single specific site N-terminallyof the O-glycosylated serine using OpeRATOR.

6
0.6
4
0.4

126

2

4000

SAAPLR….ACRTGD

5000
mass (Da)

1

165

0.2

Undigested EPO

1000

6000

APPRLI…..SPPDAASAAPLR….. ACRTGD 165

2000
3000
mass (Da)

4000

5000

OpeRATOR®によるエタネルセプトのO-グリコシル化部位の完全なマッピング

OpeRATOR
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Retention time (min)

*

22

24

26

28

30

32

1

L

P

A

Q

V

A

F

T

P

Y

A

P

E

P

181

T

S

P

T

R

S

M

A

P

G

A

V

H

L

P

Q

P

V

S

T

R

S

Q

H

T

Q

P

T

P

E

P

S

T

A

P

S

T

221

L

P

M

G

P

P

P

A

E

G

S

T

G

D

E

P

K

S

C

D

K

T

H

T

C

P

P

C

P

A

P

E

L

L

G

256

S

F

220

L

*
S

FabRICATOR

Glycopeptides
BPC
XIC(204.087)
2

4

6

8

10

12

14

16

18

Retention time (min)

20

22

24

26

28

DE

ww

w

.g

30

32

RMINATIONTE
OF
YCAN SITESGLAPP NOTE:

0O-

In-depth analysis of the O-glycosylationsites of etanercept originator. HILIC-MS
analysis (top panel) of etanercept peptides
generated by digestion with OpeRATOR.
The middle panel shows the peptide map of the
O-glycosylation sites of etanercept based on the
results from the OpeRATOR-based workflow.
The identified O-glycosylation sites are marked
in yellow. Two sites (marked with an asterisk)
could only be inferred from the OpeRATOR
digestion pattern without direct identificationof a peptide containing the glycosylatedamino acid. The bottom panel shows a RP-MS
analysis of etanercept digested with trypsin.
Data was obtained in collaboration with
Thermo Fisher Scientific (UK).

BPC
XIC(204.087)

OpeRATOR

比較のために、同じ材料の標準的なトリプシ
ン消化物（下図）を見ると、解析が困難なご
く少数の非常に大きな糖ペプチドのみが示されています。

O-glycopeptides

TrypsinO- グ リ コ シ ル 化 され たヒ ン ジ領 域 を持 つため、従来のアッセイでは分析が困難でした。
ここでは、このタンパクを OpeRATOR とイン
キ ュ ベ ー ト し 、 得 ら れ た 糖 ペ プ チ ド を LCMS/MS で分析しました（上図）。タンパクのO- 結 合 型 糖 鎖 パ タ ー ン の 不 均 一 性 とOpeRATORのO-結合型糖鎖構造に対する特異性のために、オーバーラップしたペプチ
ド が 形 成 さ れ 、 O- 結 合 型 糖 鎖 を 有 す る 部
位の完全なマップを得ることができました（中央のパネル）。

enovis.c o m /0 055

37SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

コア-1 O-結合型糖鎖を加水分解

OglyZORは、ネイティブな糖タンパク上のコア1 O-結合型糖鎖2つを特異的に加水分解するエンドグ
リコシダーゼ（O-グリコシダーゼ）です。OglyZORは、糖鎖分析のためのO-結合型糖鎖の除去、O結合型糖鎖の存在確認、サンプルの不均一性の低減に使用されています。

O-glycans on glycoproteinsHydrolyzes Core 1
disaccharides

2-4 h reaction

Requires removal of
terminal sialic acids(SialEXO included)

O-糖化タンパクの脱グリコシル化ワークフロー

OglyZOR®
SialEXO®

OglyZORは、ネイティブな糖タンパク上のコ
ア1 (Gal-β1-3-GalNAc) および限定的にコア3 (GlcNAc-β1-3-GalNAc)の O結合型糖鎖2つを加水分解するエンドグリ

コシダーゼ（エンド-α- N-アセチルガラク
トサミニダーゼ）です。この酵素は通常、基質 の 変 性 を 必 要 と し ま せ ん 。 OglyZOR の活性のためには、O-結合型糖鎖の末端

シアル酸を除去する必要があるので 、複数のシアリダーゼの混合物であるSialEXOが同梱されています。最適な活性は、
pH6.5から7.5、37℃で得られます。

製品フォーマット

OglyZOR®

酵素の凍結乾燥品

OglyZOR®

38

PRODUCTDESCRIPTIONID

OglyZOR, 2000 units

Deglycosylates 2 mg glycoprotein

G2-OG1-020

Glycan Profiling / OglyZOR ®

OglyZOR®を利用したバイオ医薬品の脱グリコシル化

Schematical Workflow

エタネルセプトは高度にグリコシル化されたリコンビナントFc融合タンパクであり、そのインタクトな状態での解析は非常に困難です 。
FabRICATOR (IdeS) による消化により、 2
つのサブユニット (TNFR と Fc/2) をミドル

O-glycans

ア ッ プ LC-MS ア プ ロ ー チ で 別 々 に 分 析することができます。未処理のTNFR ドメ
インは複雑すぎて解析不可能でしたが、PNGase Fで処理するとO-結合型糖鎖の組成を分解して比較することができました。また、完全な糖鎖除去により、
TNFR部分の一次構造の情報を得ることができました。

N-glycans

SialEXO
OglyZORPNGase F

8C1S1
7C1S1
2C1S2 7C1S1
2C1S2
6C1S1
3C1S2
3C1S2
6C1S1
4C1S2

1-256

Analytical Workflow

8C1S1
1C1S2
6C1S1
7C1S1 2C1S2
1C1S2

2-256
3-256

Originator

Biosimilar 1

2-256

Biosimilar 2
36000

37000

38000

39000

40000

32000

41000

33000

34000

mass

35000

36000

37000

26000

26500

27000

mass

27500

28000

28500

mass

FROM
PE
G
S

ER
ST
PO

19
20

ww

Deglycosylation of the TNFR subunit of etanercept from three commercially available preparations.
Deconvoluted mass spectra. Left panel: The TNFR subunit carrying both N- and O-glycans is too complex for all
variants to be resolved. Middle panel: Treatment with PNGase F for removal of N-glycans enabled assessment of
the O-glycan composition. C1S1 = core 1 monosialylated, C1S2 = core 1 disialylated. Right panel: Complete glycan
removal (using OglyZOR, SialEXO, PNGase F) provided information of the primary structure of the TNFR part.
N-terminal truncation, –L (2-256) and –LP (3-256) are visualized. A fraction of the deglycosylated subunits
revealed mass shifts of +203 Da (HexNAc), indicating presence of incomplete core 1, not removed by OglyZOR.

w

.g

en

ov is

.c o m / 0 0

41

OglyZOR®活性のベンチマーク
こ こ で は 、 OglyZOR と SialEXO の 酵 素 活 性を他の市販のエンドグリコシダーゼやシアリ
ダーゼと比較しました。シアル酸を除去した
場合、酵素であるOglyZORはTNFRとイン

タクトなエタネルセプト 分子か らO-結合型
糖鎖を効率よく加水分解しました。
OglyZORは、ネイティブな糖タンパク上のコ
ア1の2糖を効率よく加水分解するので、Intact+ SialEXO
OglyZOR

Other

Intact+ SialEXO
OglyZOR

他の翻訳後修飾 の同定やアミ ノ酸配列の
確 認 の た め の LC-MS 分 析 前 の 試 料 調 製に適した酵素です。

Other

160
110
80

60

50
40

TNFR

Etanercept

Comparison of the enzymatic activities of OglyZOR and SialEXO to commercially available endoglycosidases and sialidases.
All incubations (4 h) were performed according to the manufacturer’s instructions, and the samples were analyzed by SDS-PAGE.

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39

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

シアル酸を加水分解酵素であるSialEXOは、シアル酸の除去・分析に有用なシアルダーゼです。
本酵素は、ネイティブな糖タンパクに存在するN-およびO-結合型糖鎖と遊離糖鎖の両方に活性を示します。SialEXOは、OpeRATORやOglyZORで消化する前のO-グリコシル化タンパクの処理に使用されます。その他の用途としては、サンプルの複雑さの軽減、チャージバリアント
解析、エキソグリコシダーゼアレイなどがあります。



Sialic acids on N- andO-linked glycans



α2-3, α2-6 and α2-8linked sialic acids

30 min – 2 h reaction

Requires no co-factors

脱シアル酸化ワークフロー

SialEXO®

シアル酸が持つ固有の負電荷は、分析
ワークフローを複雑にし、他の重要な修飾をマスキングしてしまう可能性がありま す 。そ の た め 、 シ ア ル 酸を 除去 す る
ことで、タンパクに内在するバリアントの研究が容易になります。SialEXOはネイティブな条件下で糖タンパクを加水分解し、6.5から9の幅広いpH領域で高い活性を示します。

製品フォーマット

SialEXO®
複数の酵素の凍結乾燥品

SialEXO® 23

ɑ2-3結合に特異的な酵素の凍結乾燥品

Immobilized SialEXO®

スピンカラムに酵素を固定した製品

SialEXO®
PRODUCTDESCRIPTIONID

SialEXO, 2000 units

Desialylates 2 mg glycoprotein

G1-SM1-020

PRODUCTDESCRIPTIONID

SialEXO 23, 500 units

Desialylates 0.5 mg glycoprotein

G1-SD2-005

SialEXO® 23

40

Glycan Profiling / SialEXO ®

SialEXO®およびSialEXO® 23を利用した遊離糖鎖の分析
バイオ医薬品に含まれるシアル酸は、主に
ɑ2-3 またはɑ2-6で結合しています。複数のシアリダーゼを含み、幅広い活性を示す
SialEXOはɑ2-3、 ɑ2-6および ɑ2-8を含む全てのシアル酸の結合を加水分解します。な
お、SialEXO 23はɑ2-3結合のシアル酸に対して高い特異性を示す酵素です。ここでは、
親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC) を用いて、2つの糖鎖ライブラリを解析しました。一方はɑ2-3結合のシアル酸を含む
遊離糖鎖、他方はɑ2-6結合のシアル酸を含むライブラリです。SialEXO 23はɑ2-3結合、SialEXOはɑ2-6結合のシアル酸をそれぞれの糖鎖から遊離していることが、保持時間の変化から明確に示されています。
Analysis of released sialic acids. HILIC
analysis of released glycans with α2-3-linked (left)
or α2-6-linked (right) sialic acids after incubation
with SialEXO 23 or SialEXO respectively.
Sialylated glycan structures are shaded in purple.

α2-3-linked sialic acids

α2-6-linked sialic acids

Control

SialEXO 23

SialEXO
5

10

15

20

Retention time (min)

5

10

15

20

Retention time (min)25

Immobilized SialEXO®を利用したチャージバリアント分析
Untreated

19
20

25,000R FROM
STE
AE
PO
T

20,00015,00010,0005,000

pI Marker 8.4

pI Marker 4.05

0Fluorescence

30,00025,000.g

w

エタネルセプト の チャージバリ ア ントを調べるために、ここではImmobilized SialEXOを用いてタンパクを脱シアル酸化し、ProteinSimple社のMauriceを用いてイメー
ジングキャピラリー等電点電気泳動（icIEF）で分析しました。脱シアル酸化により、シアル酸に由来する電荷の不均一性が取り除かれ、タンパク質のチャージバリアン
トの分析が可能になりました。

30,000ww

キ ャ ピ ラ リ ー 等 電 点 電 気 泳 動（ cIEF ） は 生
物学的製剤の特性評価や品質管理において、チャージバリアントを決定するために一般的に使用されています。エタネルセプト
は高度にシアル酸化されたFc融合タンパクであるため、そのチャージバリアント の解析は困難です。

20,00015,000SialEXO

10,0005,000

SialEXOenovi

s.c o m /0 036

030,00025,00020,00015,00010,0005,000

Immobilized SialEXO

0

4

5

6

pI

7

8

9

Unmasking charge variants. The analytical workflow improved the separation and enabled charge
variant analysis of glycoproteins. Etanercept is difficult to analyze without first removing the sialic
acids, but using Immobilized SialEXO, separated peaks were obtained. Data was obtained incollaboration with ProteinSimple (San Jose, CA, USA).

Immobilized SialEXO®
PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized SialEXO, Microspin 2 × 0.5 mg

Desialylates 2 × 0.5 mg glycoprotein

G1-SM6-010

Immobilized SialEXO, Microspin 5 × 0.5 mg

Desialylates 5 × 0.5 mg glycoprotein

G1-SM6-025

Immobilized SialEXO, Microspin 10 × 0.5 mg

Desialylates 10 × 0.5 mg glycoprotein

G1-SM6-050< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

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41

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

ɑ1-2,3,4結合型フコースを加水分解

FucosEXOはα-フコシダーゼの混合物であり、N-およびO-糖化タンパクまたはフリーなオリゴ糖からα1-2、α1-3およびα1-4結合型フコースを効率的に除去します。
これは、N-およびO-糖化タンパクのグリカン構造解析、およびオリゴサッカライドのエキ
ソグリコシダーゼアレイにおける有用なツールです。



Fucose on N- andO-glycosylated proteinsHydrolyzes ɑ1-2,3,4linked fucose



1-2 h reaction

No need for co-factors

脱フコシル化ワークフロー

FucosEXOTM

FucosEXO は 、 糖 タ ン パ ク 上 の フ コ ー ス をネイティブな条件下で加水分解し、pH6～
8で高い活性を示します。酵素活性は補酵素や添加物に依存しないため、LC-MS

分析を含むほとんどの分析サンプル調製に適応可能です。基質の性質にもよりますが 、FucosEXOは1～2時間で糖タンパク上のフコースを加水分解します。しかし、非常に複雑なサンプルではより長いインキュ
ベーションが必要な場合もあります。

製品フォーマット

Immobilized FucosEXO™

FucosEXO™

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品

FucosEXO™

42

PRODUCTDESCRIPTION

ID

FucosEXO, 2000 units

Defucosylates 2 mg glycoprotein

G1-FM1-020

Glycan Profiling / FucosEXO™

FucosEXO™の基質特異性
フコース残基はN-型結合糖鎖とO-型結合
糖鎖の両方に異なる形で結合しています。
一 般 的 に α1-2 、 α1-3 お よ び α1-4 結合型フコースはO-型結合糖鎖で最もよく見ら れ 、 ま た N- 型 結 合 糖 鎖 の ア ン テ ナ 型 フ
コースとして見られます。一方、コアα1-6結合型フコースはN-型結合糖鎖の修飾として見つかっています。FucosEXOとのイン
キュ ベート した後 の フ コ ー ス の 遊離を測 定するために、ここでは様々な結合を示すオ
リゴサッカライド基質のパネルを使用しました 。 FucosEXO は 、 α1-2 、 α1-3 お よ び
α1-4-結合型フコースを効率的に遊離す
る こ と が わ か り ま し た が 、 α1-6 結 合 型 フ
コースでは活性は観察されませんでした。

Amount released fucose (µg)

6
5
4
3
2
1
0

α1-2

α1-3

α1-4

α1-6

FucosEXO substrate specificity. The substrate specificity of FucosEXO was analyzed on equal molar amounts of synthetic oligosaccharides; α1-2(2’-fucosyllactose), α1-3 (3-fucosyllactose), α1-4 (Lewis a) and α1-6 (α1-6 fucosylated chitobiose). Substrates were incubated with FucosEXO for
30 min at 37°C and the amount of released fucose was measured spectrophotometrically using an L-Fucose Assay Kit (Megazyme).

Immobilized FucosEXO™を使用したネイティブな糖タンパクの脱フコシル化
O- 型 結 合 糖 鎖 の フ コ ー ス は 、 血 液 型 抗原やルイス抗原など、機能的に重要な糖
鎖エピトープの合成に関与しています。このような複雑な 糖鎖 で修飾 さ れた糖タン
パクの分析は困難な場合があり 、特定の効率的な酵素ツールが必要です。ここでは 、 α1-2 お よ び α1-3 結 合 型 フ コ ー ス
で修飾された最大11個のO-型結合糖鎖を 有 す る TNFR タ ン パ ク を Immobilized
FucosEXO で 処 理 し 、 そ の 活 性 を 市 販 のα-フコシダーゼと比較しました。1時間以内に、FucosEXOを使用してフコースの完全な除去が達成されましたが、市販のα-フコ シダーゼ によ る処理 は フコー ス にわずかな影響しか与えませんでした。

Defucosylation using Immobilized FucosEXO.
Glycoengineered TNFR with core 1 and core 2
O-glycans decorated with both α1-2 and α1-3fucose was incubated with bovine kidney
fucosidase (1 h, 37°C) or Immobilized FucosEXO(1 h, RT). The processed protein was analyzed byreversed-phase LC-MS on a Waters™ BioAccord™
system equipped with a Waters™ BioResolve™ RP
mAb column (2.1 × 50 mm).

α1-2Glycoengineered TNFR

α1-2

α1-2
α1-3

(PNGase F treated)fucosylated
O-glycans

Undigested

Bovine kidney
α1-2,3,4,6 fucosidase (BKF)

4x
5x

5x

4x

5x

6x

5x

5x
6x

4x

Immobilized FucosEXO
32000

33000

mass (Da)

34000

35000

Immobilized FucosEXO™
PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized FucosEXO, Microspin 5 × 0.5 mg

Defucosylates 5 × 0.5 mg glycoprotein

G1-FM6-025

Immobilized FucosEXO, Microspin 10 × 0.5 mg

Defucosylates 10 × 0.5 mg glycoprotein

G1-FM6-050< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

43SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

β1-3,4結合型ガラクトースを加水分解

GalactEXOは、N-およびO-グリコシル化タンパクのβ1-3,4結合した末端ガラクトースを加水分解するβ-ガラクトシダーゼの混合物です。本酵素は、エキソグリコシダーゼアレイにおける遊離糖鎖構造上のガラクトースのトリミングや、均質なG0/G0F糖鎖プロファイルを有する抗体の作製に有用です。

Galactose on N- andO-glycosylated proteinsHydrolyzes β1-3 andβ1-4-linked galactose

2 h reaction



No co-factors needed

脱ガラクトシル化ワークフロー

GalactEXOTM

GalactEXO は 、β- ガラク ト シ ダーゼの 混合物で、糖タンパク上のβ1-3,4結合型
ガラクトースの加水分解を効率的に促進します。

酵素であるGalactEXOは、N-およびO-グリコシル化構造の両方に作用し、2時間以内に末端ガラクトースの完全な加水分解を行います。

本酵素は、インタクトな糖タンパクと遊離糖鎖の両方に使用でき 、糖鎖配列決定や抗体Fc領域の糖鎖のトリミングに利用可能です。

製品フォーマット

Immobilized GalactEXO™

GalactEXO™

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品

GalactEXO™

44

PRODUCTDESCRIPTIONID

GalactEXO, 2000 units

Degalactosylates 2 mg glycoprotein

G1-GM1-020

Glycan Profiling / GalactEXO™

GalactEXO™ を利用した遊離糖鎖の分析
エキソグリコシダーゼを用いた遊離型糖鎖
解析では、データの解釈におけるエラーを最小限に抑えるために、特異的かつ完全な加水分解が必要となります。標識された
G0/G0F glycoforms

N-結合型 糖鎖ラ イ ブラリを シ アリダー ゼであるSialEXOおよびGalactEXOと1時間イン
キュベートし、UHPLCで分析を行いました。
HILIC-FLD 分 離 で は 、 シ ア ル 酸 化 お よ び

ガラクトシル化構造が完全に除去され、残ったピークはG0、G0F、あるいはG0Fとして容易に同定できることが示されました。

galactosylated glycoforms

galactosylated glycoforms

sialylated glycoforms
5

2

1

2

3

4/4’

5/5’

6/6’

7

9

11

9

5’

4

7

Undigested

sialylated glycoforms

4’

3

1

6
6’

10’
8

12

10
8’

11

13 14

16

17
18

15

9
5

2

8/8’

10/10’

12

13

14

15

16

17

18

SialEXO

7

5’

4
4’

3

1

6

11

6’

2

Released glycan analysis. HILIC-FLD UHPLC chromatograms of a 2-AB labeled glycan library analyzed undigested(top), after treatment with SialEXO (middle) or SialEXO
and GalactEXO (bottom). Analyzed on Thermo Scientific
Vanquish Duo UHPLC system equipped with Thermo ScientificAccurcore 150 Amide HILIC column (2.1 × 150 mm).

1

SialEXO
GalactEXO
4

3

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Retention time (min)Immobilized GalactEXO™ と抗体糖鎖（G0）抗体におけるガラクトースの存在はエフェクター
機能に影響を与えます。この作用機序を研究するためには、ガラクトース残基を明確に除去することが必要な可能性があります。トラスツズ
マ ブ に 対 し て 、 FabRICATOR を用 い た サ ブ ユニットへの消化の前に30分間インキュベートし、
LC-MS に よ る 分 析 を す る こ と で Immobilized
GalactEXOのβ1-4ガラクトシダーゼ活性は、
実 証 さ れ ま し た 。 UV ク ロ マ ト グ ラ ム は 、Immobilized GalactEXOで処理したサンプルには、酵素であるGalactEXOが存在しないことを明確に示しています（黄色の網掛け）。G0Fグリ
コフォームへのシフトは、マススペクトルで確認できました。

Fc/2
Undigested

enzymeenzymeGalactEXO

Immobilized GalactEXO

G0F

Degalactosylation of trastuzumab. Deconvoluted mass
spectra of the Fc/2 fragment of trastuzumab treated withimmobilized GalactEXO (bottom panel). The mAb wasdigested with FabRICATOR, separated by RP-HPLC(Waters™ BioResolve™ RP mAb (2.1 × 50 mm) andanalyzed by ESI-Q-TOF MS (Bruker Impact II).

Man5

Undigested

G1F
G2F

G0

G0F
+ glycation

Immobilized GalactEXO
24800

24900

25000

25100

25200

25300

25400

25500

mass (Da)Immobilized GalactEXO™
PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized GalactEXO, Microspin 5 × 0.5 mg

Degalactosylates 5 × 0.5 mg glycoprotein

G1-GM6-025

Immobilized GalactEXO, Microspin 10 × 0.5 mg

Degalactosylates 10 × 0.5 mg glycoprotein

G1-GM6-050< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

45

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

α-結合型GalNAcの加水分解酵素であるGalNAcEXOは、糖タンパク上の末端GalNAcを効率的に加水分解するα-N-アセチルガ
ラ ク ト サ ミ ニ ダ ー ゼ で す 。 Tn 抗 原 と 呼 ば れ る セ リ ン や ス レ オ ニ ン が 結 合 し た GalNAc は 、GalNAcEXOによって迅速かつ効率的に加水分解され、α1-3結合型のGalNAcに対しても活性を示します。本酵素は、α結合型GalNAcを、伸長が途中で停止した糖鎖のコア1として持つ複雑なOグリコシル化タンパクの分析において、試料の不均一性を低減する貴重なツールとなります。

ɑ-linked GalNAc residues
on O-glycoproteinsTn antigen and ɑ1-3linked terminal GalNAcs

4 h reaction

No need for co-factors

GalNAcを除去
GalNAcEXOTM

GalNAcEXO は 、 糖 タ ン パ ク 上 の GalNAc を
ネ イ ティ ブな条件 下 で加水分 解し 、pH6.0
から7.6の範囲で活性を示します。補因子や特別なバッファーは必要ありません 。基質の性質にもよりますが、糖タンパク上の
GalNAcEXO の 反応 は 2時 間 で 完了しま す。

し か し、 複 雑なサ ンプ ル で は 一晩 の イ ン
キュベーションが必要な場合もあります。

製品フォーマット

Immobilized GalNAcEXO™

GalNAcEXO™

酵素の凍結乾燥品

スピンカラムに酵素を固定した製品

GalNAcEXO™

46

PRODUCTDESCRIPTIONID

GalNAcEXO, 2000 units

Hydrolyzes GalNAcs from 2 mg glycoprotein

G1-NA1-020

Glycan Profiling / GalNAcEXO™

複雑な基質におけるGalNAcEXO™のパフォーマンス
エタネルセプトは13か所のO-結合型糖鎖部位を持つ複雑なバイオ医薬品であり 、そのうちの平均9〜10か所が占有されています。PNGase FによるN-結合型糖鎖除去、SialEXO と GalactEXO に よ る O- 結 合 型 糖鎖のトリミングの後、マススペクトルによってGalNAc関連のピークを確認しました （図中の上）。GalNAcEXOとのインキュベーション
後、残りのα結合型GalNAc の95%以上が除去されていました。（図中の下）。

10xEtanercept

9x8x+ PNGase F+ SialEXO+ GalactEXO

11x

7x

TNFR

GalNAcEXO

GalNAcEXO activity on etanercept withtruncated O-glycans. Deconvoluted mass
spectra of partially deglycosylated etanercept(top) and after treatment with GalNAcEXO (O/N
at 37°C, bottom). Samples were FabRICATORdigested, separated by RP-HPLC (Waters™
BioResolve™ RP mAb, 2.7 μm, 2.1 × 100 mm) andanalyzed by ESI-Q-TOF MS (Bruker Impact II).

+ FabRICATOR
26000

28000

27500

29000

28500

29500

mass

GalNAcEXO™利用したC1インヒビターの脱グリコシル化
O- グ リ コ シ ル 化 さ れ た バ イ オ 医 薬 品 の 製
造中における、コアGalNAc残基の不完全な処理の結果として、製品にTn抗原が出
現 す る こ と が あ り ま す 。 こ れ は HexNAc（203 Da）単位の規則的な差を伴う反復的な質量シフトとして現れます。高度（ 26 ヶ 所 ） に O- グ リ コ シ ル 化 さ れ た C1

インヒビター上のTn抗原の存在を確認するために、以下のワークフローを適用しました。
まず、PNGase Fを用いてN-結合型糖鎖を除去し、OglyZORとSialEXOを用いてコア1
O- 結 合 型 糖 鎖除 を除 去 しまし た 。そ の 結果、マススペクトルに反復的なピークのパターンが観察されました。

Tn Antigen

1-478

2x

70000

75000

80000

85000

90000

95000

52500 52750 53000

mass

53250 53500

5x

6x 7x
8x 9x

53750 54000 54250 54500 54750

2-478
3-478
52500 52750 53000

mass

.g

w

65000

FESTIVAL O
F
OM
R
F

3x
4x

60000

POST
ER

1x
1-478

ww

Analytical Workflow

GalNAcEXO™

CS 2020
OGI
OL
BI

Schematic Workflow

PNGaseF
SialEXO
OglyZOR

55000

残 っ た GalNAc は GalNAcEXO を 用 い て 完
全に除去され、1つのピークが残りました。
このワークフローは、コアGalNAcの数を定量化し 、残存す る不 均一性を 減少させ 、イ ンタクト な GalNAc の 質量 の 確認を 容易にしました。

53250 53500

53750 54000

54250 54500

mass

54500

en

ov is

.c o m / 0 0

47

Total deglycosylation of the recombinant C1 inhibitor. The C1 inhibitor was analyzed by LC (Waters™ ACQUITY UPLC Protein BEH C4 column, 1.7 μm,
2.1 × 100 mm) and ESI-Q-TOF mass spectrometry (Bruker Impact II). In its intact form (left), the protein is highly complex, and deconvolution of the mass
spectra only yielded noise. After removal of N- and core 1 O-glycans, the Tn antigens remained (middle) and could efficiently be removed by incubation
with GalNAcEXO (O/N at 37°C, right).

Immobilized GalNAcEXO™
PRODUCTDESCRIPTION

ID

Immobilized GalNAcEXO, Microspin 5 × 0.5 mg

Hydrolyzes GalNAcs from 5 × 0.5 mg glycoprotein

G1-NA6-025

Immobilized GalNAcEXO, Microspin 10 × 0.5 mg

Hydrolyzes GalNAcs from 10 × 0.5 mg glycoprotein

G1-NA6-050< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

47

SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

O-糖化タンパクの濃縮

GlycOCATCHは、ムチン型O-糖化タンパク・ペプチドを精製するためのアフィニティーレジンです。
このアフィニティーレジンは、O-糖化タンパク・ペプチドと高い親和性で結合するように設計された不活性なOpeRATOR（酵素）をベースにしています。GlycOCATCHの用途は、O-糖化タンパク・ペプチドの特異的な濃縮や除去、グリコミクス、複雑なサンプルの研究、バイオ医薬品の特性評価
などです。



Mucin-type O-glycosylated
proteins and peptides

Binds to glycoproteinsand peptides carrying
mucin-type O-glycans.



2 h workflowDesialylation using
SialEXO (included)
increases the binding

アフィニティ精製ワークフロー

GlycOCATCH®
SialEXO®

GlycOCATCH は 、ムチ ン型O- 糖化タン パ
クの 濃縮 を簡 便 に 行う た め に 、 ス ピ ンカラ
ム形式で提供されています。
GlycOCATCHタンパクはO-糖化タンパクと強い相互作用により高い親和性で結合し 、8M尿素を用いて溶出を行うことができます。
また、同梱されているOpeRATOR（酵素）を
用 い て 、結 合 し た O- 糖 化タ ンパ ク の O- 結合型糖鎖部位のN末端を切断することで溶出を行うことも可能です。

この場合、ペプチドはネイティブな状態で回収されます。シアル酸化されていないO-結合型糖鎖はこのレジンに効率よく結合する
ため、シアリダーゼ混合物であるSialEXOも同梱されています。

製品フォーマット

GlycOCATCH®

O-糖化タンパクの濃縮用キット

GlycOCATCH®

48

PRODUCTDESCRIPTIONID

GlycOCATCH

Enrichment of 0.2 mg O-glycoprotein

G3-OC6-002

Affinity Purification / GlycOCATCH ®

GlycOCATCH®を利用したO-糖化ペプチドの選択的精製
H8390

ER
ST
PO

H2686

FROM
AS
M
18
20

SialEXO

Load

.g

w

Affinity purification using GlycOCATCH.
Selective purification of an O-glycosylated peptide (glycodrosocin) carrying a core 1 O-glycan.

IOB

H4062

Glycodrosocinww

精 製 後 、 分 離 し 、 RP-LC-MS で 分 析 を 行
い ま し た 。 こ の デ ー タ か ら 、 コ ア 1 O- 結 合型 糖 鎖 を 持 つ glycodrosocin が 選 択 的 に精製されることが示されました。

TICS

こ こ で は 、 GlycOCATCH の O- 結 合 型 糖 鎖への特 異性をペプチドレベ ル で検討 しました 。 O- 糖 化 ペ プ チ ド で あ る glycodrosocin
を非糖化ペプチド混合物にスパイクしてGlycOCATCH に ロ ー デ ィ ン グ し 、 洗 浄 し た
後、結合しているペプチドを8M尿素で溶出させました。

Flowthrough

en

ovi s

.c o m /0 0

32

GlycOCATCH®
Eluate
10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

Time (min)GlycOCATCH®を利用したO-糖化タンパクのアフィニティー精製
GlycOCATCH は、MS 分析 に先 立ち 、 O糖化タンパク・ペプチドを特異的に濃縮するために使用することができます。
020

ここでは、ヒト血清のような複雑なマトリックスからO-糖化タンパクを濃縮するためにGlycOCATCHの強い結合力が有効に
40

60

80

利用されています。

100

120

140

Ig alpha-1 chain C region
Apolipoprotein B-100
Kininogen-1

Complement C4-B
Complement C4-A

Complement C3Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4
Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2
Plasminogen

Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1

Serum albumin# of peptides, O-glycosylated proteins

Alpha-2-macroglobulin

Fibronectin# of peptides, other proteins

Complement C1s subcomponent

N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase

Plasma protease C1 inhibitor

Prothrombin

C4b-binding protein alpha chain
Coagulation factor XII

Complement C1r subcomponent

Ig delta chain C region
Apolipoprotein F

Complement component C7

18
20

Histidine-rich glycoprotein

FROM
AS
M
S

ER
ST
PO

Ig mu chain C region

Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3

Complement component C9Alpha-2-HS-glycoprotein
Protein AMBP

Ig gamma-1 chain C region
Alpha-1-antitrypsin

Plasma kallikrein

ww

Vitronectin.gw

Apolipoprotein A-I

Vitamin K-dependent protein S

Serotransferrin

Apolipoprotein E

en

ovi s

.c o m /0 0

32

von Willebrand factor

Proteoglycan 4

Enrichment of O-glycoproteins from human serum. Human serum was treated with SialEXO and incubated with the GlycOCATCH resin. The eluted
proteins were denatured, reduced, alkylated and trypsin digested. Peptides were analyzed using RP-LC-MS/MS, and searched against the Swiss Prot
database. Identified O-glycosylated proteins and other proteins with > 12 matching peptides and a MASCOT score > 200 are listed.

< お問い合わせ > 重松貿易株式会社

化学品部

TEL :(06）6231-6146

Mail : info@shigematsu-bio.com

49SmartEnzymes™™
SmartEnzymes

FabRICATOR®（酵素）の検出

Anti-FabRICATOR (Anti-IdeS) は、酵素であるFabRICATOR (IdeS) を検出するヤギポリクローナル
抗体で、アフィニティー精製品、ビオチン結合・アフィニティー精製品、プロテインG精製品の3つの タ イ プ か ら 選 択 いた だけ ま す 。 Anti-FabRICATOR は 、 ウ ェ ス タ ン ブロ ッ トや ELISAアッ セ イ でIdeSを検出するために使用することが可能です。

Anti-FabRICATOR®
Affinity PurifiedConcentrations ranging
from 0.5 mg/ml to 4 mg/ml

Polyclonal

Anti-FabRICATOR®
Affinity Purified Biotin ConjugatedAnti-FabRICATOR®
Protein G Purified

Anti-FabRICATOR® Affinity Purifiedのパフォーマンス

1.8
Affinity / Affinity

1.6

1.2
1
0.8
0.6
0.4

8

16

31

63

125

0

250

0.2

500

ま た 、 biotinylated Anti-FabRICATOR
Affinity Purified は 二 次 抗 体 と し て 使 用され、HRP標識 スト レプトアビジン によって検出されました。

1.4

1000

CATORを結合させる前にプレートをAntiFabRICATOR Protein G Purified またはAnti-FabRICATOR Affinity Purified でコートティングする方法で行われました。

ELISA OD

Anti-FabRICATORシリーズは、酵素である
FabRICATOR (IdeS)の検出に鋭敏な試薬で す 。 Anti-FabRICATOR Protein G
Purified と 比 較 し て 、 Anti-FabRICATOR
Affinity Purified は 分 析 対 象 で あ る
FabRICATOR に 対 し て 高 い 親 和 性 を 示 す
ことが 確認 されま した 。こ れ は サンド イ ッチ
ELISA に よ っ て 証 明 さ れ 、 そ れ は FabRI

Protein G / Affinity

1

Source: goat2

Detects the FabRICATOR(IdeS) enzyme

4

ng/ml FabRICATOR

Performance of Anti-FabRICATOR Affinity Purified. To display the difference in performance between the Anti-FabRICATOR Protein G Purified andthe Anti-FabRICATOR Affinity Purified, wells were coated with either Anti-FabRICATOR Protein G Purified or Anti-FabRICATOR Affinity Purified at 2 µg/ml.
The FabRICATOR enzyme was added in dilutions from 1 µg/ml to 1 ng/ml. Anti-FabRICATOR Affinity Purified Biotin Conjugated was then added at 1 µg/ml.
HRP-Streptavidin was added in a 1:2000 dilution, followed by visualization using ABTS.

Anti-FabRICATOR®

50

PRODUCTDESCRIPTION

ID

Anti-FabRICATOR Affinity Purified

Frozen solution of 0.1 ml, concentration 1 mg/ml

A3-AF2-010

Anti-FabRICATOR Affinity Purified, Biotin Conjugated

Frozen solution of 0.1 ml, concentration 0.5 mg/ml

A3-AF3-005

Anti-FabRICATOR Protein G Purified

Frozen solution of 0.1 ml, concentration 4 mg/ml

A3-AF1-010

Legal and Disclaimers

Legal and Disclaimers

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FabRICATOR ®
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Patent No US 7,666,582 and granted European
Patent No 1458861. The license encompasses
IdeS from Streptococcus pyogenes forbiotechnical industrial applications which areneither therapeutic nor diagnostic, other than
the following exception which is included
within the license: digesting IgG in vitro inclinical samples for diagnostic purposes.
POROS ® included in FabRICATOR ® HPLCThis product is provided under an intellectual
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FabRICATOR ® MagIC
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Scientific Inc. and its subsidiaries.

as described above, contact Life Technologies
Corporation, 5781 Van Allen Way, Carlsbad, CA
92008 USA or outlicensing@thermofisher.com.
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Technologies Corporation.
Linker-toxin Payloads included in GlyCLICK®
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property license from Glykos Finland ltd.
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SiteClick™ included in GlyCLICK®
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property license from Life Technologies
Corporation. The transfer of this product isconditioned on the buyer using the purchased
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