実験プロトコール 008S
COOH
COOHビーズへのビーズへのリガンド（アミノ基を有する化合物リガンド（アミノ基を有する化合物リガンド（アミノ基を有する化合物）の固定化の固定化
スクリーニングにおいてスクリーニングにおいては、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリ、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、ガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、COOHビーズへのビーズへの固定化反応時のリガンド濃度を固定化反応時のリガンド濃度を固定化反応時のリガンド濃度を0, 0.1,0.1 0.3, 1 mMの44段階で固定化する場合の方法を示します。

1. 準備するもの
1.1 ビーズ、リガンド（化合物）
ビーズ、リガンド（化合物・・COOHビーズ
ビーズ (TAS8848N1140
TAS8848N1140) 4 mg (COOH量：量：約200 nmol/mg)
nmol/mg・リガンド 1 mg程度
1.2 試薬
・N,N’N,N’-ジメチルホルムアミド
ジメチルホルムアミド (DMF) 7 mL・N
N-ヒドロキシスクシンイミド
ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 分子量 115.09 40 mg
・1--エチル-3-(3--ジメチルアミノプロピル
ジメチルアミノプロピル
ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
カルボジイミド塩酸塩 (EDC・HClHCl) 分子量 191.70 40 mg
・アミノエタノール 分子量 61.08 80 µL
・トリエチルアミン 分子量 101.19 1 µL
・メタノール (MeOH
MeOH) 1.6 mL
1.3 機器・微量高速冷却遠心分離機
・マイクロチューブミキサー (TOMY社(MT
MT-360、など、など)
・超音波分散装置
超音波ホモジナイザー (カップホーン付
カップホーン付) (多摩川精機
多摩川精機TAB4905N10
TAB4905N10など)
超音波洗浄器 (多摩川精機
多摩川精機TAB4905
TAB4905など)
2. 方法
2.1 概要リガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法はリガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法は2.22.2項を参照下さい。
項を参照下さい。
1) 活性エステル化

COOHビーズ
COOH

NHSビーズNHS2) リガンド固定化

NHSビーズNHS

NH 2基リガンド固定化ビーズ

1

多摩川精機株式会社
PRD001549W00
W00 20190509
0509

実験プロトコール 008S

2.2 手順2.2.1 活性エステル化
1) NHSをDMFへ溶解し、1 M NHS溶液 200 µLを調製する。
2) 1.5 mlマイクロチューブへCOOHビーズ (TAS8848N1140) を 4 mgとる。
3) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
4) DMF 200 µLを添加し、ビーズを分散させる。
5) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
6) 4)～5)を更に2回繰り返す。(ビーズの洗浄を計3回行う)
7) 洗浄中に別の1.5 mLマイクロチューブへEDC・HCl 30.7 mg (160 µmol) を量り取る。
8) DMF洗浄後、DMFを 640 µl添加し、ビーズを分散させる。
9) 作製しておいた1 M NHS溶液を 160 µl加え、混合する。
10) 9)を7)のチューブへ全量移し、混合する。
COOHビーズ
4 mg
DMF640 µL
1M NHS
160 µLEDC・HCl30.7 mg
合計
800 µL11) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて2時間反応させる。
12) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
13) DMF 400 µLを添加し、ビーズを分散させる。
14) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
15) 13)～14)を更に4回繰り返す。(ビーズの洗浄を計5回行う)
16) DMF 80 µLに分散させる。(NHSビーズ濃度：1 mg/20 µL)
2.2.2 リガンド固定化
1) リガンド (化合物) をDMFへ溶解し、1 mM リガンド溶液を400 µL作製する。
2) アミノエタノールをDMFへ溶解し、1 M アミノエタノール溶液を1 mL調製する。
3) NHSビーズを1 mg (20 µL) ずつマイクロチューブ4本へ分注、遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
4) DMF 80 µLを加えて分散させ、遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
5) DMF、作製しておいたリガンド溶液を加え、ビーズを超音波にて分散させる。
固定化濃度00.10.3
1mM
NHSビーズ1111mg
DMF2001801400µL
1mM リガンド
02060200µL
合計
200200200200µL
注1) ビーズへ直接リガンド溶液を添加すると局所的に濃度が高くなる懸念があります。
従って、ビーズにDMFを添加した後にリガンド溶液を添加して下さい。
注2) リガンドが塩酸塩の場合は2倍モルのトリエチルアミンを添加して下さい。
その際、リガンド溶液を2 mMとし、4 mMのトリエチルアミンを調製、等量混合し、添加すると分かりやすい。
6) マイクロチューブミキサーを使用し、室温で70分間反応させる。
7) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を回収する。(上清A)
8) 残ったビーズへ1 M アミノエタノールを200 µLずつ加え、超音波にて分散させる。
9) マイクロチューブミキサーを使用し、室温で2時間反応させる。
(リガンド未結合カルボキシル基のマスキング)

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多摩川精機株式会社
PRD001549W0020190509

実験プロトコール 008S
10) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を回収する。（上清B）
11) 50% MeOH 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
12) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
13) 11)～12)を更に2回繰り返す。（ビーズの洗浄を計3回行う）
14) 50% MeOH 40 µLに分散させ、4℃にて保存する。 （リガンド固定化ビーズ濃度：0.5 mg/20 µL）
3. 補足
・ビーズの分散は超音波分散装置で容易に分散できるが、それらが無い場合は、超音波洗浄器や試験管立てを使用したガリガリ法でも分散可能。
（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

・DMFや50% MeOHに分散させたビーズは磁気分離には時間が掛かるので、遠心分離にて回収する。
・DMFはモレキュラーシーブで脱水させたもの、または低水分溶媒を使用する。水分が存在するとビーズからNHSが遊離してしまい、リガンドがうまく固定化されない場合がある。
・リガンド固定化ビーズの保存は、疎水的な化合物の固定化によるビーズの分散性低下を考慮し、50%MeOHとしているが超純水でも問題ない。
・上清A、B中のNHSをHPLCにて定量をすることで下記が調べることができる。
（方法は実験プロトコール201を参照下さい。）
A：リガンド固定化量（リガンド固定化時に遊離したNHS量）
B：リガンドが固定化されていないNHS基量（マスキング時に遊離したNHS量）
A+B：ビーズのNHS基量・リガンドが塩酸塩でない場合でも固定化量が少ない場合は、トリエチルアミンを添加すると反応性を向上させることが可能。
・リガンドがDMFに溶けづらいときはDMSOを用いることができる。ただし、プロトコール201に沿ってHPLCでNHS量を測定する場合は、NHSとDMSOのHPLCピークが重なるため、添加するDMSOの濃度を10%までとする。
以上

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20190509