体液中グルコースがトリガーとなり創傷部位を被覆・修復する新規モイストヒーリング剤の開発
大阪大学基礎工学研究科

境慎 司

Moist wound healing is an approach to wound care under moistened condition given by dressings. The approach iseffective for rapid healing with reduced scarring. The motivation of our project is to develop a novel wound dressing formoist wound healing. Our strategies to use the molecules contained in exudate as a trigger of in situ hydrogelation forcovering wounds for giving moistened condition. In this report we investigated the feasibility of a horseradish peroxidase(HRP)-catalyzed hydrogelation system for aqueous solutions of polymers using an alginate derivative bearing phenolichydroxyl moieties (Alg-Ph). We tried to supply the H2O2 necessary for the HRP-catalyzed reaction through glucose
oxidase (GOx)-catalyzed oxidation of glucose contained in serum. The possibility of the system was demonstrated by thehydrogelation of the mixture solution of Alg-Ph, HRP, GOx on the nonwoven mats containing human serum. The timerequired for gelation of the Alg-Ph solution containing HRP and GOx was variable within 1 min by changing the contentsof enzymes at 4.6 mM glucose. In addition, the resultant hydrogel had an antimicrobial property. These results indicate thegreat potential of the glucose-triggered hydrogelation system for moist wound healing.

１．緒

創傷部位を良好に被覆することは難しい。

言

このように使用時に既に成形されているドレッシング材

けがやヤケドにより生じる創傷部位が傷跡として残ると、に対して、溶液状態で創傷部位に塗布し、その後患部でゲ部位によっては常に他人の視線を気にする必要がでるなど、ルを形成させるハイドロジェル・ドレッシング材の検討・社会生活において患者は精神的負担を背負うこととなる。

開発も行われている。このタイプのドレッシング材は複雑

そのような患者を減らすために、創傷部位の傷跡を残りにな形状の創傷部位にもフィットさせることが可能であり、くくするさまざまな治療法の開発が進められている。

さらに広い面積の創傷部位にも容易に適用可能であるとい

近年、創傷部位の修復を促進し傷跡をより残りにくくすった利点を有している。これまでに、光架橋性の官能基をる治療法として、モイストヒーリングの有効性が広く認知導入したキトサン水溶液を患部に塗布した後に紫外光を照されるようになっている 。モイストヒーリングとは、傷射してゲルを形成させる方法 2）や、酸化アルギン酸水溶液

口に滲出してくる体液を乾かさずに保持して組織の再生をとゼラチン水溶液を患部に塗布する直前に混合し、患部で早める方法であり、傷跡が残りにくかったり、患部の乾燥ゲルを形成させる方法 3）などが報告されている。

1）に起因する痛みが少なかったりといった利点も有している。

本研究課題では、生体適合性の高いアルギン酸やヒアルそのための創傷被覆材としてはニチバン㈱のビューゲルやロン酸、ゼラチン、ポリビニルアルコールなどの誘導体溶

東洋化学㈱のハイドロヘルプなどがフィルム状の製品とし液を患部に塗布し、体液から供給されるグルコースをトリてすでに市販されている。また、医療現場ではハイドロガーとしてゲル化を進行させることで創傷部位を被覆する

ジェル・ドレッシング材として数種が使用されている。こハイドロジェル・ドレッシング材の開発を試みた。この反れらは創傷部位の修復に有効であることが実証されている応に必要な多糖誘導体は、フェノール性水酸基（Ph 基）を一方で、使用時にはすでに整形されているため、広範囲の導入したものであり、過酸化水素を消費して進行する西洋

傷には適用が難しいことや、複雑な形状の創傷部位では傷ワサビ由来ペルオキシダーゼ（HRP）の酵素反応により架の深い部分と接触できない部分が生じるなどの欠点がある。

橋される。グルコースをトリガーとする仕組みとして、グ

例えば、褥瘡（床ずれ）や糖尿病に由来する皮膚潰瘍のよルコースオキシダーゼ（GOx）を HRP ならびに多糖誘導体

うな比較的広範囲かつ 3 次元的にも複雑な形状をしていると同一系内に仕込むことで、グルコースから過酸化水素を発生させることを試みた（図１）。
本稿では、GOx と HRP の酵素反応を経て得られるゲル

Development of dressings for moist
wound healing in situ gellable through thereaction triggered by plasma glucose
Shinji Sakai
Department of Materials Science andEngineering, Osaka Universityのゲル化所用時間の制御ならびに GOx の酵素反応を介さない過酸化水素を直接反応系に添加して得られるゲルとのゲル化特性の比較、得られるゲルの有する抗菌性に関する検討結果を報告する。

− 14 −

体液中グルコースがトリガーとなり創傷部位を被覆・修復する新規モイストヒーリング剤の開発

２. ４

ジチラミン結合形成の測定

Ph 基間の架橋形成反応の進行度合いを評価するために、Ph 基間の結合の形成によって生じるジチラミン結合の蛍光測定を行った（excitation 315 nm，emission 410 nm）。この測定では、1 . 5 %（w/v）の Alg-Ph を溶解するリン酸緩衝 液（pH 7 . 4）を 500 mL ず つ プ ラ ス チ ッ ク チ ュ ー ブ に 入れ、ここに 111 mL ずつの HRP と GOx 水溶液を添加した後、56 mL のグルコース水溶液を添加して反応を開始した。撹
図１ GOx と HRP の酵素反応を経るフェノール性水酸基導入
分子間の架橋形成反応模式図 .

２．実２.１

拌後すぐに、96 ウェルのブラックウェルプレートに 200 mL注ぎ、蛍光の経時変化を測定した。

２. ５

験

ゲル化所要時間の測定

Alg-Ph 溶液のゲル化所要時間は、以下に示す既報の方

Ph 基導入アルギン酸の合成

法 5）にしたがって測定した。1 . 1 %（w/v）の Alg-Ph を溶Ph 基導入アルギン酸（Alg-Ph）は、以下に示す既報の4）解するリン酸緩衝液（pH 7 . 4）を 24 ウェルプレートに各ウ

方法 によりアルギン酸ナトリウムとチラミン塩酸塩を

ェル 450 mL ずつ分注し、そこに 100 mL の HRP と GOx 混合

pH 6 . 0 の 50 mM 2 - モルホリノエタンスルホン酸緩衝液中水溶液 100 mL を添加するとともに、マグネチックスターラで、水溶性カルボジイミドと N- ヒドロキシスルホスクシーを用いて撹拌した。次いで撹拌下、50 mL のグルコースンイミドを用いて縮合させて作製した。なお、本研究で使水溶液を添加し、溶液表面が盛り上がり、明らかに溶液状用したアルギン酸誘導対中の Ph 基の含有量はアルギン酸態と異なる挙動を示した時間までをゲル化に要した時間と中のウロン酸 100 ユニットあたり 2 個であった。また同様した。の方法により Ph 基を導入したポリビニルアルコール誘導

２. ６体（PVA-Ph）も作製した。

ゲルの力学的特性測定

1 . 5 %（w/v）の Alg-Ph 水溶液を 24 ウェルプレートの各２. ２

GOxとHRP の反応を経るゲル形成の確認

ウェルに 1 . 5 mL ずつ分注した。0 . 32 mL の GOx と HRP の

図１に示した GOx と HRP の酵素反応を経るフェノール混合溶液を添加した後、0 . 16 mL のグルコース溶液を添加性水酸基の架橋によるゲル形成の可否を確認するために、して 10 秒間撹拌した。ゲル化する前に撹拌子を取り出し、0 . 75 %（w/v）の Alg-Ph 水溶液にグルコースを 4 . 6 mM と37℃の条件下で 1 時間もしくは 24 時間静置した。ゲルの圧なるようにガラス瓶に注いだ。この溶液に、GOx（0 . 8

縮−反発力の測定は卓上型材料試験装置（EZ-test，島津製）

mL/mL）と HRP（15 U/mL）を片方もしくは両方添加し、を用いて行った。

10 分後に瓶の上下を逆さまにすることでゲル化の確認を２. ７行った。

ゲルの抗菌性測定

GOx の作用によりグルコースより過酸化水素が発生す

２. ３

体液との接触によるゲル形成評価

る。このため、発生する過酸化水素の作用により形成しヒト血清中に含まれるグルコースによってゲル化可能でたゲルが抗菌性を有することが期待される。これを確かあるかを評価するために、折りたたんだ実験用不織布シー

め る た め に、7 %（w/w）PVA-Ph、HRP 0 . 5 U/mL HRP、ト（0 . 28 g）に 5 mL のヒト血清（Sigma 社より入手）を含ま25 U/mL GOx を含む水溶液に 4 . 6 mM となるようにグルコせ 37℃に保温した。この不織布シート上に Alg-Ph、GOx、ースを添加してゲルを作製した。このゲルを雑木林から採HRP を そ れ ぞ れ 3 %（w/v）
、100 U/mL、100 U/mL で 含取した腐葉土に水を加えて得られた上澄み液を塗布したポむ水溶液に微量のメチレンブルーを添加したものを滴下し、リペプトン、イーストエクストラクト、グルコースを含む10 分後にゲル化確認を行った。

PYG 寒天培地上に置き、25℃に保温することで抗菌性の血液と接触することによるゲル化の可否を評価するために、マウス（雄，6 週齢）の静脈を傷つけ出血させた。こ評価を行った。コントロールとして GOx を用いずに過酸化水素の添加によって得られるゲルを用いた。の患部に上記と同様の組成の Alg-Ph 溶液を滴下し、ゲル３．結化の確認を行った。なお、本実験は、大阪大学動物実験委員会の承認のもと、動物実験に関わるガイドラインを遵守３.１して実施した。

果

GOxとHRP の反応を経るゲル形成

グルコースを溶解させた Alg-Ph 水溶液に GOx と HRP の− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

いずれか一方を溶解させただけでは、溶液はゲル化するこさせた場合の、3 成分混合直後から 2 分間のジチラミン形とはなかった（図２）。一方で、GOx と HRP を両方添加し成に起因する蛍光の強度増加速度変化を示した。GOx のた場合にはゲルが形成した。この結果は、GOx の反応に濃度が 0 . 8 U/mL の条件では、HRP の濃度を 1 から 15 U/より生成した H 2 O 2 を消費する HRP の反応によりフェノーmL まで増加させてもジチラミン形成初速度に変化は無か

ル性水酸基同士の架橋とそれによるゲル化が可能であるこった。一方で、GOx の濃度を 0 . 8 から 8 . 3 U/mL へ増加さとを示している。

せるとジチラミンの結合形成速度も約 10 倍向上した。

ヒトの体液と接触することでゲルを形成可能であるかど

図６にゲル化所要時間に与える各成分濃度の影響を示しうかを評価するために、ヒトの血清（血糖値 6 . 1 mM）を含た。グルコース濃度が 4 . 6 mM よりも高い範囲では、ゲルませた不織布に Alg-Ph、GOx、HRP の混合溶液を塗布した。

化所要時間に対する HRP 濃度の明確な影響は確認されな塗布後、約 30 秒で図３に示すようにピンセットで持ち上かった。しかし、1 . 4 mM においては 1 U/mL でゲル化にげられる強度を有するゲルが形成した。さらに、血液と接約 400 秒要したのに対し、15 U/mL では約 150 秒に短縮さ触することでゲル化が可能かどうかを確認するために、マれた⒜。また、ジチラミン結合形成評価の結果と同じく、ウスの出血部位に溶液を塗布したところ、Alg-Ph 溶液単GOx の濃度の増加と共にゲル化所要時間は減少し、8 . 3 U/

独ではゲルが形成しなかったが、GOx と HRP を混合した

mL では 14 秒でゲル化した⒝。

溶液ではゲルが形成した（図４）。

３. ３ゲルの力学的特性評価

３. ２ ジチラミン結合の形成評価とゲル化所要時間の測定

成する過酸化水素を消費して得られたゲルおよび、直接

図７に 4 . 6 mM のグルコースから GOx の反応により生

図５にヒトの正常血糖値とほぼ同じとなるようにグルコ

4 . 6 mM となるように過酸化水素を添加して得られたゲルース濃度を 4 . 6 mM 一定として GOx と HRP の濃度を変化を圧縮した際の反発力を測定した結果を示した。反応開始

図２ グルコース含有 Alg-Ph 水溶液が HRP と GOx の存在下でのみ形成したゲル（右端）．

図４ マウスの出血部位で GOx と HRP の酵素反応を経て形成したゲル .

図３ ヒト血清を染みこませた不織布上で GOx と HRP の酵素反応を経て形成したゲル .

図５ GOx と HRP の濃度とジチラミンの形成初速度（IFIR）の相関．グルコース濃度 : 4.6 mM に固定 .

− 16 −

体液中グルコースがトリガーとなり創傷部位を被覆・修復する新規モイストヒーリング剤の開発

1 時間後においては、ゲル間に顕著な差はなかった。24 時

３. ４ゲルの抗菌性評価

間後には GOx の反応により過酸化水素を供給して得られ

図８に腐葉土と混ぜた水の上澄みを塗布した寒天培地のたゲルの 2 mm 圧縮時の応力が 1 時間後に測定した値の約経時変化の様子を示す。PVA-Ph ゲルを形成させていない10 倍に達した。これに対して、過酸化水素を直接添加し寒天培地は菌体・微生物の増殖により全体的に白くなった。て得られたゲルは 24 時間後も 1 時間後とほぼ同じ挙動を示

一方で、GOx とグルコースから過酸化水素を発生させてした。

得られたゲルの表面には白くならない領域が 115 時間経過後も存在していた。これに対して、GOx によらず直接過酸化水素を添加してゲルを形成させたものでは、培養開始
16 時間後までは GOx を含むゲルと同じ程度の白くならない領域が存在したものの、その大きさは時間経過と共に減少し、40 時間後にはなくなった。

４．考察

本研究課題では、体液と接触すると患部でヒドロゲルを形成し、さらに創傷治癒を促進する新しいモイストヒーリ

図６ ⒜グルコース，⒜ HRP と⒝ GOx 濃度とゲル化所要時間の相関 .

図 ７ GOx と HRP の 酵 素 反 応 を 経 て 得 ら れ た ゲ ル お よ び
H2O2 を直接添加して得られたゲルの圧縮−反発力特性の経時変化 .

図８ PYG 寒天培地上に腐葉土抽出水溶液を塗布し、過酸化水素の直接添加および GOx の反応によりグルコースより過酸化水素を生成させて形成させたゲルを留置した後の経時変化．

− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

ング剤の開発を目的としている。これまで著者らが取りて徐々に過酸化水素を生成しているためだと考えられる。

組んできたのは、フェノール性水酸基を導入した高分子

創傷面に適用した場合にも、細菌の感染を防がなくてはなの水溶液に HRP を溶解させ、そこに過酸化水素を直接添らない創面から体液が滲出している状況では、体液中のグ加することでゲルを形成させるものであった。これに対しルコースを消費しながら持続的に過酸化水素を生成し、抗て、本研究においてグルコースから過酸化水素を生成す菌機能を発揮することが期待される。なお、抗菌性のみでる GOx の酵素反応を用いると、体液中に存在するグルコなく過酸化水素の細胞毒性により、治癒が遅れるのではなースをトリガーとしてヒドロゲルを形成させることが可いかとの懸念がされるところであるが、これまでにラット能であることが明らかになった（図３，４）。また、GOx やを用いて市販のモイストヒーリング材と全層・分層欠損創

HRP の濃度を制御することによってゲル化に要する時間

傷治癒に要する期間を比較したところ、ほぼ同じ期間で治を制御することができ、数十秒でゲル化できるような条件癒することを確認しており（データ未掲載）、その影響はを見出すこともできた。

ないものと考えられる。おそらく、発生している過酸化水

図５に示したジチラミン結合の形成に関する検討におい素の量が微量であることと、生体組織側に放出された過酸て、グルコース濃度 4 . 6 mM、GOx 濃度 0 . 8 U/mL の場合に、化水素は、生体に存在するカタラーゼの作用により迅速にHRP 濃度を変化させても結合形成初速度に差が生じなか分解されているためと考えられる。
本検討で得られた結果は、溶液状態で患部に塗布すると、った結果は、図１に示した反応経路において GOx の反応が律速段階になっていたことを示している。ゲル化時間を患部に存在する体液と反応してゲル化し、創面を覆うこと測定した図６に示した結果において、4 . 6 mM 以上のグルで創傷治癒を促進する新しいモイストヒーリング剤ができコース濃度では HRP 濃度が 1 U/mL と 15 U/mL の場合にる可能性を示している。今後、より詳細に実験動物を用いおいてゲル化時間に差が生なく一方で、グルコース濃度た治癒に関する検討を行い、新しいモイストヒーリング剤

1 . 4 mM の場合には HRP 濃度 15 U/mL の条件で明らかにゲとしての実用化の可能性を評価していきたい。

ル化所要時間が短かった結果も、GOx 反応が律速であっ（引用文献）たことを示している。
ゲルの力学的特性評価において、GOx の反応を介して１）Sibbald RG, Goodman L, Woo KY, Krasner DL, Smart

過酸化水素を供給した系で反応開始 1 時間目から 24 時間目

H, Tariq G, Ayello EA, Burrell RE, Keast DH, Mayerまでに圧縮に対する反発力が大きく向上した理由は、1 時

D, Norton L, Salcido RS,: Special considerations in

間経過時点でもまだ未反応のグルコースが存在し、その後

wound bed preparation 2011 : an update, Adv. Skin

も徐々に過酸化水素が生成した結果、徐々に HRP による

Wound Care, 24 , 415 - 436 , 2011 .

フェノール性水酸基同士の架橋が進行していったためと考２）Lu G, Ling K, Zhao P, Xu Z, Deng C, Zheng H,

えられる。なお、GOx の反応において 1 分子のグルコース

Huang J, Chen J,: A novel in situ-formed hydrogelから 1 分子の過酸化水素が生成するため、系内のグルコー

wound dressing by the photocross-linking of a chitosan

スが完全に過酸化水素に変換された場合には、4 . 6 mM のderivative. Wound Repair Regen., 18 , 70 - 79 , 2010 .

過酸化水素が発生する。これと同量の過酸化水素を同じ

３）Balakrishnan B, Mohanty M, Umashankar PR,

HRP 濃度下で添加したにも関わらず GOx を用いて得られJayakrishnan A,: Evaluation of an in situ forming

たゲルの反発力が過酸化水素を直接添加して得られたゲルhydrogel wound dressing based on oxidized alginate

よりも著しく大きな値を示した理由は、ゆっくりと反応

and gelatin. Biomaterials 26 , 6335 - 6342 , 2005 .

が進行したために、ゲル内の分子構造がより均質なもの

４）Sakai S, Kawakami K,: Synthesis and characterizationとなったためと考えられる。ゲル化機構は異なるものの、

of both ionically and enzymatically crosslinkable

Viela らは大豆蛋白抽出物とジェランガムの混合溶液をカalginate. Acta Biomater., 3 , 495 - 501 , 2007 .

ルシウムイオンでゲル化させたところ、ゲル化が早いほど

５）Sakai S, Hirose K, Taguchi K, Ogushi Y, Kawakami
K,: An injectable, in situ enzymatically gellable, gelatin

不均質なゲルが形成したことを報告している 。
6）derivative for drug delivery and tissue engineering.

ゲルの抗菌性評価において、過酸化水素を直接添加してBiomaterials 30 , 3371 - 3377 , 2009 .

得られたゲルの周囲では作製後しばらくしか周囲での菌体・微生物の増殖が抑制されなかった。一方で GOx を用

６）Viela JAP, Cavallieri ÂLF, Cunha RL,: The influence

いてゲル化させたゲルの周囲ではより長期間にわたり増殖of gelation rate on the physical properties/structureが抑制された（図８）。この違いは、ゲル形成後も GOx がof salt-induced gels of soy protein isolate-gellan gum.

活性を有しており寒天培地に含まれるグルコースを消費しFood. Hydrocolloid, 25 , 1710 - 1708 , 2011 .

− 18 −