実験プロトコール 016
COOH beadsへのリガンド (OH基を有する化合物) の固定化
リガンド結合タンパク質のアフィニティ精製(スクリーニング)においては、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、COOHビーズへの固定化反応時のリガンド濃度を0 , 3, 10, 30 mMの4段階で固定化する場合の方法を示します。

1. 準備するもの
1.1 ビーズ、リガンド（化合物）
・COOH beads (TAS8848N1140) 10 mg (COOH基量：約200 nmol/mg)
・リガンド 20 mg程度
1.2 試薬・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)： 脱水品 30 mL・フルオロ-N,N,N’,N’-テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロフォスファート(TFFH)
分子量264.12 4.0 mg
・N,N-ジイソプロピルエチルアミン(i-Pr2NEt) 分子量129.24 8.8 μL・oxyma pure 分子量142.11 2.1 mg
・2-アミノエタノール 分子量 61.08 126 μL
・N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 分子量115.09 51.8 mg
・1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl) 分子量191.70 76.8 mg
1.3 機器・微量高速冷却遠心分離機
・マイクロチューブミキサー (TOMY社 MT-360など)
・超音波分散装置
超音波ホモジナイザー(カップホーン付) (多摩川精機TAB4905N10など)
超音波洗浄器 (多摩川精機TAB4905など)
2. 方法
2.1 概要リガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法は2.2項を参照のこと。

COOH beads

OH基リガンド固定化ビーズ

2.2 手順
リガンド固定化
1) リガンド (化合物) をDMFへ溶解し、100 mM リガンド溶液を 250 μL調製する。
2) i-Pr2NEt (8.8 uL)をDMF (41.2 uL)へ混合し、1M i-Pr2NEt を50 uL調製する。1M i-Pr2NEtを希釈して100mM i-Pr2NEtを120 uL調製する。
3) TFFH (4.0 mg)をDMF (150 uL)へ溶解し、100 mM TFFH溶液を150 uL調製する。
4) oxyma pure (2.1 mg)をDMF (1.5 mL)へ溶解し、10 mM oxyma pure溶液を1.5 mL調製する。
5) 1.5 mLマイクロチューブ4本へCOOH beads (TAS8848N1140) を2.5 mgずつとる。
6) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
7) DMF 500 μLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。

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実験プロトコール 016
8) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
9) 手順7)～8)を更に2回繰り返す。(ビーズの洗浄を計3回行う)
10) 手順1)～4)で作製した溶液を以下の表の通りに加え、ビーズを超音波にて分散させる。
固定化濃度031030mM

COOHビーズ

2.52.52.52.5mg

DMF
100 mM i-Pr2NEt
or 1M i-Pr2NEt

500
044025(100 mM)

31575(100 mM)

14723(1M)μL

100 mM TFFH

0103090μL

100 mM リガンド

01550150μL

10 mM oxyma pure0103090μL

合計

500500500

500μLμL11) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて一晩（16～20時間）反応させる。
12) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
13) DMF 500 μLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
14) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
15) 手順13)～14)を更に2回繰り返す。(ビーズの洗浄を計3回行う)
マスキング16) NHS (51.8 mg)をDMF (450 uL)へ溶解し、1M NHS溶液を450 μL調製する。
17) アミノエタノール (126 uL)とDMF (1974 uL)を混合し、1M アミノエタノール溶液を2.1 mL調製する。
18) 別の1.5 mLマイクロチューブへEDC・HCl 19.2 mg (100 μmol)を4本量り取る。
19) 手順15)で洗浄したビーズへDMF 400 μLを添加し、ビーズを分散させる。
20) 1M NHS溶液をそれぞれ100 μL加え、混合する。
21) 手順20)を手順18)のチューブへ全量移し、混合する。
反応後ビーズ2.5mgDMF400μL

1M NHS

100μL

EDC・HCl19.2mg

合計500μL22) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて2時間反応させる。
23) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
24) DMF 500 μLを添加し、ビーズを分散させる。
25) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
26) 手順24)～25)を更に2回繰り返す。(ビーズの洗浄を計3回行う)
27) 上清を廃棄したビーズへ1Mアミノエタノール500 μL (4本) を添加し、ビーズを分散させる。
28) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて2時間反応させる。
29) 2時間後、遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
30) 超純水 500 μLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
31) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。

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実験プロトコール 01632) 手順30)～31)を更に2回繰り返す。(ビーズの洗浄を計3回行う)
33) 超純水 100 μLに分散させ、4℃にて保存する。 (リガンド固定化ビーズ濃度：0.5 mg/20 μL)

3. 補足
・ビーズの分散は超音波分散装置で容易に分散できるが、それらが無い場合は、超音波洗浄器や試験管立てを使用したガリガリ法でも分散可能。 (ガリガリ法では、チューブの蓋が開かないようにキャップロックを用いることが望ましい。)（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

・DMFや超純水に分散させたビーズは磁気分離には時間が掛かるので、遠心分離にて回収する。
・DMFはモレキュラーシーブで脱水させたもの、または低水分溶媒品を使用すること。

4. 注意事項
・TFFH、EDC・HClは吸湿しやすいので水分のコンタミにご注意下さい。
・TFFH溶液は活性が長く持ちませんので、なるべく使用直前に調製して下さい。
・TFFH使用後は、試薬瓶に不活性ガスを封入して保存して下さい。空気中の水分で試薬の活性が低下しますので、開封して時間が経過したTFFHは使用しないようにして下さい。
・このリガンド固定化ビーズは、リガンドとビーズ結合部分がエステル結合のため、加水分解が起こりやすいので長期保存はできません。固定化後はできるだけ早くご使用下さい。
・フェノール性OH基を持つリガンドをビーズへ固定化する場合は、プロトコール003「リンカービーズへのリガンド(フェノール性OH基またはアミノ基を有する化合物)の固定化」をご参照ください。

以上

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