栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびに
エクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性
藤田医科大学医療科学部

若松一雅trans-Resveratrol ( 3 , 5 , 4 ’-trihydroxy-trans-stilbene, RES), a naturally occurring polyphenol, is well known for its
antioxidant, anti-platelet, anti-inflammatory, anti-aging, cardioprotective and cancer chemopreventive properties and has
recently attracted increased interest as a health-beneficial agent. However, the recent incidence of rhododendrol-induced
leukoderma highlights the risk of using compounds having p-substituted phenols because of their rapid conversion to
toxic o-quinones. Based on its p-substituted phenol structure, RES is also expected to be a substrate for tyrosinase and to
produce a toxic o-quinone metabolite. In fact, RES was found to be a good substrate for tyrosinase. The results of this study
demonstrate that the oxidation of RES by tyrosinase produces 4 -( 3 ’, 5 ’-dihydroxy-trans-styrenyl)- 1 , 2 -benzoquinone(RES-quinone), which decays rapidly to an oligomeric product (RES-oligomer). RES-quinone was identified after reduction
to its corresponding catechol, known as piceatannol. RES-quinone reacts with N-acetylcysteine, a small thiol, to form a
diadduct and a triadduct, which were identified by NMR and MS analyses. The production of a triadduct is not common
for o-quinones, suggesting a high reactivity of RES-quinone. RES-quinone also binds to bovine serum albumin throughits cysteine residue. RES-oligomer can oxidize GSH to GSSG, indicating its pro-oxidant activity. These results suggestthat RES could be cytotoxic to melanocytes due to the binding of RES-quinone to thiol proteins and the cosmetic useof RES should be considered with caution. Equol ( 7 , 4 -dihydroxy-isoflavan) is one of the end products of the intestinalbacterial biotransformation of the isoflavone daidzein which is phytoestrogen found in soy and soy-derived products, anda nonsteroidal estrogen of the isoflavone family. Equol is not a natural constituent of plants, but established as a bacterial
metabolite of daidzein. Since equol has the p-substituted phenol structure as well as RD and RES, it is expected to bea substrate for tyrosinase and to produce a toxic o-quinone metabolite. In order to examine whether equol produces theo-quinone, we performed the tyrosinase-catalyzed oxidation of equol. UV/visible spectra showed the unstable quinone
absorption at 420 nm within 15 min. Converting the o-quinones produced by tyrosinase oxidation of equol in the presenceof ascorbic acid to more stable catechols, we could obtain three compounds by preparative HPLC at UV detection. Althoughthese compounds have been known to be metabolized from equol using human liver microsomes, it is the first time that thesecompounds are formed by tyrosinase-catalyzed oxidation of equol.

1. 緒を触媒する重要な酵素であり，メラノサイト中のメラノソ

言ームと呼ばれる特殊なオルガネラ内で，メラニン色素であtrans-Resveratrol（レスベラトロール，3 , 5 , 4’ - トリヒ

るユーメラニンおよびフェオメラニンの産生をもたらす

ドロキシ -trans- スチルベン，以下 RES と略す、図 1 の（1）（Ramsden and Riley, 2014）。チロシナーゼは，天然の基は，ブドウ，ベリー，ピーナッツなどの植物中から得られ質である L- チロシンだけでなく，多数の p- 置換フェノー

る天然のポリフェノールである（Baur and Sinclair et al.,ルおよびカテコールを酸化して，オルトキノンを生成す

2006）。RES（1）は，その抗酸化，抗血小板，抗炎症，抗ることができる。o- キノンは非常に反応性の高い化合物

老化，心臓保護および癌の予防特性により，健康に有益

で，チオール酵素と結合し，活性酸素種（ROS）を生成するな薬剤として最近関心が高まっている（Baur et al., 2006 ;ことにより細胞毒性を発揮する（Bolton et al ., 2000）。まJang et al., 1997）。RES（1）は，皮膚を光保護し，光発た，o- キノンは，メラノソーム内のタンパク質と共有結がんを抑制することも示されている（Afaq and Katiyar,

合してネオ抗原を生成するハプテンとしても作用し，免2011）。特に多機能性色素沈着低下剤として皮膚化粧品に疫反応を引き起こすことが知られている（Westerhof et al.,

使用する目的で RES（1）を使用することへの関心が，近2011）。実際，多くのフェノール化合物が，o- キノンへの

年大幅に高まっている（Na et al., 2019）。

活性化を通じて，ヒトの皮膚に白皮症を誘発することが知チロシナーゼは，L- チロシンのドーパキノンへの酸化られている。これらのフェノールのうち，4 - メトキシフ
ェノール（Riley, 1969），モノベンゾン（4 - ベンジルオキシ

Ty rosi na se - cat a lyzed ox idat ion of
resveratrol produces a highly reactive
ortho-quinone: implications for melanocyte
toxicity
Kazumasa Wakamatsu
Department of Chemistry, Fujita Health
University School of Medical Sciences

フェノール）（Manini et al., 2009）、4 -tert- ブチルフェノール（James et al., 1977），ロドデンドロール［4 -（4 -ヒド
ロキシフェニル）- 2 - ブタノール，以下 RD と略す］
（Ito
et al., 2018; Sasaki et al., 2014）
およびラズベリーケトン［4ヒドロキシフェニル］- 2 - ブタノン］（Ito et al., 2017 a）が知られている。

− 175 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

S（-）-EQ（Equol, 6）
図 1 チオールの存在下，または非存在下における RES（1）のチロシナーゼ酸化の反応経路

図2

本研究では，RES キノン（2）をまず同定し，チオールタン

でチロシナーゼ（50 U/mL）により酸化し，吸収スペクトル

パク質であるウシ血清アルブミン（BSA）を含むチオールの変化を定期的に 60 分間追跡した。酸化は，1000 µM アス

化合物との反応を調べることを目的とした。続いて，RES

コルビン酸または 200 µM または 300 µM NAC の存在下での酸化生成物（RES オリゴマー）の pro-oxidant 活性（酸化も行った。反応を還元的に終結させるために，200 µL の

促進活性）
を調べた。

一定量を 20 µL の 10 ％ NaBH 4 と混合し，続いて 180 µL

エクオール（EQ, 7 , 4 - ジヒドロキシ - イソフラバン , 図 2の 0 . 4 M ギ酸を混合した。アスコルビン酸，CySH またはの 6））は，大豆および大豆由来製品に含まれる植物エスト

GSH の存在下での実験では，NaBH 4 の添加は省略した。

ロゲンであるイソフラボンダイゼインの腸内細菌の生体内変換の最終産物の 1 つであり，イソフラボンファミリーの非

2 . 2 . DiNAC-RES-カテコール（4）および TriNAC-

ステロイド性エストロゲンである（Lephart, 2017）。エク

RES-カテコール（5）の分離

オールは植物の天然成分ではなく，ダイゼインの細菌代謝

RES（1 , 20 . 5 mg, 0 . 09 mmol），RES- カテコール（3 , 2 . 5

産 物 で あ る こ と が 知 ら れ て い る（Setchell, and Clerici,

mg, 0 . 01 mmol），NAC（163 mg, 0 . 4 mmol）のエタノール

2010 ; Lephart, 2016）。EQ（6）
は，RD と RES と同じように，

2 mL 溶液を 98 mL 50 mM リン酸ナトリウム（pH 6 . 8）と混

p- 置換フェノール構造を持っているため，チロシナーゼ合した。混合物を 37 ℃で激しく振盪し，それに 1 mL の緩の基質となり，毒性のある o- キノン代謝物を生成し，酸

衝液中のチロシナーゼ（20 , 000 U）を加えた。酸化の 30 分化促進作用を示すことが推測される。天然の EQ
（6）
は，S-

後，2 mL の 6 M HCl を添加して酸化を停止し，混合物を（-）- 体と R（+）- 体の二種類のエナンチオマーが存在する。

100 mL の 1 - ブタノールで 2 回抽出した。減圧下で 1 - ブ

そこで，エクオールが o- キノン体を生成するかどうかを

タノールを蒸発させた後，残渣を HPLC 溶出緩衝液に溶調べるために，今回は，S（-）-EQ（6）のチロシナーゼ触媒

解し，分取 HPLC にかけた。分取した画分の凍結乾燥によ酸化反応を行い，次に酸化促進活性も同様に調べた。

り，DiNAC-RES- カテコール（4，HPLC 純度 97 ％）として

2. 方

13 . 6 mg（22 ％収率），および TriNAC-RES- カテコール（5，法

HPLC 純度 99 ％）として 18 . 3 mg（24 ％）が得られた。

2 . 1. L-アスコルビン酸または N-アセチルシステイン

100 µM RES（1）
または RES- カテコール（3）の溶液（2 mL）

2 . 3 . 2 , 5 - ジ -S-［（N-アセ チル）システ イニ ル］- 3 , 4 , 3’ , 5’ - テトラヒドロキシトランススチルベン（DiNAC-RES-カテコール, 4）を 50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6 . 8 または 5 . 3）中，37 ℃

DiNAC-RES- カテコール（4）は，1 H NMR スペクトルと（NAC）の非存在下または存在下でのチロシナーゼによるRES（1）または RES-カテコール（3）の酸化− 176 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

13

C NMR スペクトルおよび高解像度 LC-MS より構造を確

RES- カ テ コ ー ル B（1 . 7 mg，31 ％）， お よ び MonoGSRES- カテコール A（それぞれ 1 . 0 mg, 18 ％）を得た。GSH認した。

置換の数は，高解像度 LC-MS 分析によって確認した。

2 . 4 . 2 , 5 ,6 -Tri-S-［（N-アセチル）システイニル］- 3 , 4 , 3 ′, 5 ′- テトラヒドロキシトランススチレン（TriNAC-RES-カテコール, 5）

13

2 . 6 . RES 酸化生成物，RES- オリゴマーの酸化促
進活性

TriNAC-RES-catechol（5）は，1 H NMR スペクトルと

過去に報告したように（Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Ito,

C NMRスペクトル，
高解像度LC-MSより構造を確認した。

Okura et al., 2017），RES オリゴマーと RD オリゴマーは，前駆体 RES（1 . 1 mM）および RD（1 mM）から 50 mM ナト

2 . 5 . RES キノン（2）とシステイン（CySH）およびグ
ルタチオン（GSH）との付加反応リウムリン酸緩衝液（pH 7 . 4）中で調製した。チロシナー
ゼ（200 U）を各前駆体溶液 2 mL に加え，反応混合物を 37

RES カテコール（3，2 . 5 mg，0 . 01 mmol）および CySH

℃で 120 分間インキュベートした。対照としてチロシナー（4 . 9 mg, 0 . 04 mmol）の 10 mL 50 mM リン酸ナトリウムバ

ゼのみ（100 U/mL）も使用した。メラニン溶液（2 , 000 µL）

ッファー（pH 6 . 8）溶液を 37 ℃で激しく振盪した。その中を 10 mM GSH（200 µL、1 mol 当量）と混合し、37 ℃でイに 1 mL のバッファーに溶かしたチロシナーゼ（2 , 000 U）

ンキュベートした。0，30 および 60 分の反応時間で，反を加えた。10 分の酸化後，0 . 2 mL の 6 M ギ酸を添加して応混合物を 100 µL 取り出し，0 . 4 M HClO 4（800 µL）と酸化を停止し , 混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残渣を混合して酸化を停止した。酸化反応物中の GSH と GSSG

HPLC で使用する緩衝液に溶解し，分取用 HPLC カラムでは，我々の HPLC 法を使用して分析した（Imai et al., 1987 ;分取した。最も早く溶出した画分，次に溶出した画分，最Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Ito, Okura et al., 2017）。酸化

後に溶出した画分を凍結乾燥して，それぞれ，DiCyS-

反応物（20 µL）中の過酸化水素を pH 7 . 4 緩衝液（180 µL）で

RES- カテコール（0 . 8 mg，17 ％収率）
，MonoCyS-RES-

希釈した後，分光測光法で分析した。希釈した混合物を

catechol-B（1 . 3 mg，36 ％）， お よ び MonoCyS-RES- カ

Ampliflu ™ Red 試薬（200 µL）と反応させ、568 nm の吸収

テコール -A（0 . 6 mg，17 ％）を得た。CySH 置換の数は，極大を持つ赤色色素を生成させた（Zhou et al., 1997）。

高解像度 LC-MS 分析によって確認した。

3. 結

RES- カテコール（3，2 . 5 mg，0 . 01 mmol）と GSH の溶

果

カラムで分取した。最も早く溶出した画分，次に溶出し3 . 1. RES（1）の チロシ ナー ゼ 触 媒による酸 化 は
RES- キノン（2）を生成する

た画分，最後に溶出した画分を凍結乾燥して，それぞれ，

チロシナーゼ（50 U/mL）による RES（1 , 100 µM）の酸化

DiGS-RES- カテコール（2 . 8 mg，33 ％収率）
，MonoGS-

は、pH 6 . 8 の 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液中、37 ℃で液（12 . 4 mg，0 . 04 mmol）を同様に処理し、分取用 HPLC

図3 RES（1）およびRES-カテコール（3）のチロシナーゼ酸化反応と生成物のHPLC分析− 177 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020実施した。UV/ 可視スペクトルの変化を 60 分間追跡したにより酸化された時，酸化は 5 分以内に急速に進み，450

ところ，単調な吸収を持つオリゴマーの迅速な生成が示さnm 付近に最大吸収波長を持つ o- キノン色素が生成したれ（図 3 a），o- キノン酸化生成物の非常に速い二次反応が（図 5 a）。これはかなり驚くべきことである。なぜなら，2示されたので，pH 5 . 3 で酸化を行うことで反応を遅くした。

mol 当量のチオールの存在下でのフェノール（およびカテ

図 3 b に示すように，実際に反応は遅くなった。UV/ 可視コール）のチロシナーゼ酸化は，通常、主な生成物としスペクトルの変化が複雑に現れたので，次に，pH 5 . 3 でて無色のモノチオール付加物を生成するからである（Ito,の酸化を 310 nm での UV 検出器を使用して HPLC で追跡

Hinoshita et al., 2017 ; Ito and Prota, 1975）。したがって、した。図 3 c に示すように，RES（1）は，15 分以内に消費NAC 濃度を 3 mol 当量（300 µM）に増やしたところ，450

され，HPLC での保持時間 5 . 5 分（RES は 6 . 9 分に現れた）

nm での吸収は 3 分の 1 に減少し，2 mol 当量の NAC を使を持つ新しい化合物が現れた。その構造は RES- カテコー

用した場合よりも 318 および 282 nm での 2 つの吸収極大

ル（ピセアタンノール，3）と推定された。RES- カテコール

はより明確になった（図 5 b）。2 当量の NAC を使用した場（3）の構造は，HPLC による市販のピセアタンノールとの合，5 分間の反応時間での HPLC 分析により，3 付加体と同時注入により確認された。この RES- カテコール（3）の2 付加体の保持時間がそれぞれ 4 . 8 分と 9 . 6 分である 2 つ

同定により，4 -（3’ , 5’ - ジヒドロキシ - トランス - スチレの主要な化合物の生成が示された（RES（1）は 11 . 7 分に出ニル）- 1 , 2 - ベンゾキノン（RES キノン，2）として 485 nm現した（図 5 c）
。しかし，ほとんどの生成物は，キノン型へので吸収極大を示す直後の生成物の構造が確認された。図

酸化により15 分以内に消失した。3 当量のNAC が使用された

3 c に示すように，RES キノン（2）は非常に反応性の高い化

場合，
これら 2 つの生成物は，安定した状態であった（図 5 d）。

合物であると思われ，RES キノンから可能なオリゴマー

これらの付加物の構造を同定するために，4 mol 当量の生成物を分離する試みはうまくいかなかった。図 3 d に示

NAC（4 mM）の存在下，RES（1，1 mM）の酸化を行った

すように，その酸化により，2 分以内に 485 nm に吸収ピが，十分速く進行しなかったので，生成物を取り出すこークを持つ化合物が急速に生成した。

とはできなかったので，RES- カテコール（3，0 . 1 mM）を

チロシナーゼ酸化中，RES カテコール（3）の生成は，pH触媒として添加した。その後，急速に反応は進行して 2 つ

5 . 3 での 10 mol当量のアスコルビン酸（1 , 000 µM）
存在下で，の主生成物を生成し，それらを分取 HPLC で分離した。こ100 µM RES（1）を酸化することによりさらに確認された。

れらの化合物の構造は，1 H-NMR，2 D-NMR，13 C-NMR，

図 4 a に示すように，RES（1）の UV スペクトルは，2 〜 5

高分解能 MS 分析により同定した。これらにより，この分で RES-catechol（3）の UV スペクトルに置き換えられた。

TriNAC 付加物の構造（7）を同定した。

反応混合物の HPLC 分析により，RES カテコール（3）が 5
分間で高収率（80 ％）に急速に生成し，RES カテコールは，
RES キノン（2）に酸化された。その後，アスコルビン酸はす
べて RES キノンとの酸化還元交換により消費された（図 4 b）。

3 . 3 . RES- キノン（2）とBSAを含む他のチオールとの反応
次に，CySH または GSH との反応性を調べた。3 mol 当量の CySH または GSH の存在下，RES（1）（100 µM）の反応

3 . 2 . RES キノン（2）とNACとの反応は，二付加体

は，フェノールの酸化におけるチオールの阻害作用によりと三付加体を生成する

非常にゆっくりと進行することがわかった（Naish-Byfield

次に、RES キノン（2）がチオール化合物と結合するかど

et al., 1994）。RES カテコール（3）（100 µM）は，pH 5 . 3 でうかを調べた。RES（1）（100 µM）が，pH 5 . 3 で 2 mol 当

3 mol 当量（300 µM）のチオール存在下で，チロシナーゼ

量の NAC（200 µM）の存在下で，チロシナーゼ（50 U/mL）（50 U/mL）により酸化した。図 6 a, b に示すように，CySH

図 4 アスコルビン酸存在下，RES（1）のチロシナーゼ酸化反応と HPLC 分析− 178 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

図 5 NAC 存在下，RES（1）のチロシナーゼ酸化反応と反応生成物の HPLC 分析

図 6 チオール存在下，RES- カテコール（3）のチロシナーゼ酸化反応と HPLC 分析− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 7 ウシ血清アルブミン（BSA）
存在下，RES- カテコール（3）のチロシナーゼ酸化と GSH は急速に反応して無色で比較的安定なチオール付化された RD オリゴマー（または RD ユーメラニン）が，合加物を生成した。HPLC分析は，3 つの主生成物の生成を示し

成フェオメラニンと同じくらい強力な酸化促進活性を持った。その収率は，60 分の酸化中ほぼ一定であった（図 6 c, d）。

ていることを示した（Ito, Hinoshita et al., 2017）。したがCys- 付加物とGSH- 付加物のHPLC 分析は，
3 つのピークをって、RES（1）のオリゴマー酸化生成物である RES オリ

示し，
それらは質量分析により構造決定した（図 6 e, f）。

ゴマーが酸化促進活性を有するかどうかを調べた。 RES

次に，BSA と RES キノン（2）の反応性を調べた。BSA

オリゴマーと RD オリゴマー（陽性対照として使用）は，には，17 個のシスチン残基に加えて 1 個のシステイン残それぞれ 1 mM RES（1）または RD を pH 7 . 4 で 120 分間，基が含まれている。BSA は，そのシステイン残基の反応

チロシナーゼ（100 U/mL）で酸化することにより調製した。

性が広く研究されており，o- キノンの反応に敏感である

各オリゴマーは，1 mol 当量の GSH と 60 分間反応し，ことが判明したため，代表的なチオールタンパク質としGSH と酸化型グルタチオン（GSSG）の残量は，GSH 量をて使用した（Ito, Hinoshita et al., 2017 ; Manini et al., 2009）。

測定するための DBBQ を使用する我々の特別な HPLC 法

BSA 付加物は 314 nm で大きな吸収極大を持つが，300 nm

によって分析された（Imai et al., 1987 ; Ito, Okura et al.,

未満の BSA による大きな吸収は，小さなチオールからの2017）。図 8 a に示すように、GSH 量は時間依存的に，そ吸収よりも明確ではなかった（図 7 a）
。314 nm での吸収は，して，RES オリゴマーおよび RD オリゴマーとの 60 分間

BSA のシステイン残基を経由して生成した付加物と帰結のインキュベーションで，それぞれ約 50 ％および 90 ％まできる。それは，モノチオール付加物のスペクトルとの類で減少した。GSH の減少の大部分は，GSSG への酸化に起似性に基づいている（図 6 e、f）
。400 nm 付近に生成した弱因するが，減少の一部は，GSH の酸化生成物とキノンとい吸収は，おそらくキノン型に起因するものと推測される。

の結合を経由して進行しているように見える。次に，これ

RES キノン（2）への結合にシステイン残基が関与しているらのオリゴマーにより GSH の酸化中に過酸化水素が生成可能性を確認するために，システイン残基を N- エチルマ

されるかどうかを調べた。図 8 b に示すように，26 µM 過レイミド（NEM）で修飾した BSA と RES キノン（2）を反応

酸化水素が GSH との 30 分間の反応中に RD オリゴマーかさせたところ（図 7 b）
，RES キノン（2）の 390 nm での 0 . 60

ら生成したが，RES オリゴマーからはわずか 6 µM 過酸化の吸光度は，天然の BSA（400 nm で 0 . 20）の吸光度と比水素（コントロールと同じ量）が生成した。ただし、このべて約 3 倍大きかった。NEM 修飾 BSA からのこの大きな

RES オリゴマーからの過酸化水素の生成の減少が、過酸

吸収は，NEM-BSA と RES- キノン（2）のアミノ基間のキ化水素を生成できないことによるのか，RES オリゴマー自ノイド発色団の生成に起因する可能性がある。これらの結体による過酸化水素の除去によるのかは，現在不明である。

果から，RES キノン（2）の大部分がシステイン残基を介し

3 . 5 . EQ（6）のチロシナーゼ酸化て BSA に結合することを示している。

EQ（6）のチロシナーゼ酸化を追跡したところ，UV/ 可

3 . 4 . RES オリゴマーは GSH を GSSG に酸化し，

視スペクトルで 15 分以内に 420 nm での不安定なキノン

pro-oxidant 活性（酸化促進活性）を有する

吸収が現れた。アスコルビン酸の存在下，還元して o- キ

合成フェオメラニンと同様に天然のフェオメラニンは，

ノンをより安定したカテコールに変換後，HPLC 分取に

強力な酸化促進活性を持つことが知られている（Panzellaよ っ て 6 -hydroxy-EQ（12 %），3’ -hydroxy-EQ（25 %），et al., 2014）。我々は，以前，RD のチロシナーゼ触媒で酸

6 , 3’ -dihydroxy-EQ（25 %）のカテコール体が得られた（図− 180 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性

図 8 RES オリゴマーと RD オリゴマーによる GSH の酸化

図 9 EQ（6）のチロシナーゼ酸化物

図 10 EQ（6）および 3’ -hydroxy-EQ の NAC および GSH 共存下のチロシナーゼ酸化物９）。生成物の構造は，1 H-NMR，13 C-NMR および高分解
能 ESI-TOF 質量スペクトルにより同定した。これらの化

3 . 6 . EQ（6）のチロシナーゼ酸化によるNAC およびGSHとの反応

合物は，すでにヒト肝ミクロソームを使用した EQ（6）か

触媒 量の 3’ -hydroxy-EQ（0 . 01 mmol）存 在下，EQ（6，らの代謝により生成することが知られているが，EQ（6）0 . 09 mol）とチロシナーゼを触媒として，NAC（0 . 4 mmol）のチロシナーゼ触媒酸化によって生成することがわかったと反 応させ， 生 成 物の 構造を 1 H-NMR および 高 分 解能のは最初の実験結果である。以上の結果は，p- 置換フェLC-MS 質量スペクトルにより同定した。5’ -mono-NAC-3’

ノール体である EQ（6）が酸化により，細胞毒性を示す o--hydroxy-EQ（12 %） と 5 , 5’ -diNAC- 6 , 3’ -dihydroxy-EQ

キノンを生成することを示している。

（5 %）が得られた（図 10）。一方，エクオール（6）とGSHと− 181 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 11 EQ オリゴマーによる GSH の酸化と過酸化水素量の変化の反応は，3’ -hydroxy-EQ（0 . 01 mmol）に 4 等量の GSHを有意に抑制したことを発見した。Lei ら（2017）は，RES

存在下，チロシナーゼ酸化したところ，モノGSH 付加体が（1）が HT- 144 ヒトメラノーマ細胞の増殖を 5 〜 10 µM の59 %，ジ GSH 付加体が 3 ％の収率で得られた。これらのIC 50 で強く阻害したことを発見した。同様に，Okura ら

1

構造は，NAC 体との比較で H-NMR， C-NMR および高（2015）は，RES（1）が B 16 F 1 マウスメラノーマ細胞およ

分解能 ESI-TOF 質量スペクトルから構造決定した。

び NHEMb ヒト表皮メラニン細胞の増殖をそれぞれ 27 . 1

13および 38 . 2 µM で阻害した。その値は，ハイドロキノン

3 . 7. EQ（6）の酸化促進活性（28 . 3 および 9 . 4 µM）に匹敵する値である。一方，RES

EQ（6）の酸化促進活性を測定した（図 11）。図 8 と比較
して，酸化促進活性が，RES オリゴマーと RD オリゴマー（1）の細胞毒性はかなり弱いことがわかり，別の研究ではIC 50 は≫ 100 µM であった（Lee et al., 2014）。

の中間的な結果が得られた。一方，過酸化水素の産生にRES（1）の局所適用は，一般に，皮膚に有害というよ

ついては RD オリゴマーとほぼ同様な結果が得られた（図りも有益であると考えられている（Na et al., 2019）。しか11 b）。この結果は，EQ（6）オリゴマーが，RA オリゴマー，

し，我々の研究では，チロシナーゼが効果的に RES（1）RES オリゴマーと同様に酸化促進活性を有することがわ

を酸化し，反応性の高い RES キノン（2）を生成できることかった。

を示している。高い反応性は，その急速な減衰（図 3）と，
DiNAC-RES-catechol（4）および TriNAC-RES-catechol

４. 考察と総括（5）の定量的収率での生成によって示される。ジ付加体のRES（1）は，一般に基質よりもむしろチロシナーゼの生成も CySH と GSH に対して確認された。これらの結果は，優れた阻害剤と考えられている（Na et al., 2019）。例えば、RES（1）が RES キノン（2）のチオールタンパク質への結合

Park ら（2014）は，RES（1）は，マッシュルームチロシナ

によりメラニン細胞に対して細胞毒性を示す可能性があるーゼを 1 . 8 µM の IC 50 で強く阻害することを示した。しかことを示唆している。RD オリゴマーほど強力ではないが，し，本研究は，RES（1）がマッシュルームチロシナーゼの

RES オリゴマーの酸化促進活性は細胞毒性に寄与する可優れた基質であり，反応性 o- キノンである RES キノン（2）能性がある。

を生成することを示している。ヒトを含むさまざまなもの

EQ（6）は，チロシナーゼの基質となり，o- キノンを産に存在するチロシナーゼは，さまざまな p- 置換フェノー

生しカテコール体を生成することが今回の実験からわかっ

ルを酸化して o- キノンを形成することができる（Ito et al.,た。このことは，EQ（6）がメラニン細胞に対して，細胞2014 ; Ramsden and Riley, 2014）。

毒性を示す可能性があることを示している。EQ オリゴマ

p- 置換フェノールのメラノサイトへの細胞毒性の可能

ーの酸化促進活性は，RES オリゴマーと RD オリゴマーの性にもかかわらず，多くの研究が RES（1）の色素沈着低

中間的であり，一方，過酸化水素の産生については，RD

下効果を報告している。たとえば, Leeら（2014）
は，
RES（1）

オリゴマーとほぼ同様な結果が得られた。EQ（6）は，大がメラノーマ細胞におけるメラニン形成関連タンパク質の豆食品を食べた時に大豆イソフラボン（ダイゼイン）
が，お発現を低下させ，RES（1）の局所適用は，in vivo におけなかの中で腸内の EQ 産生菌によって代謝され生成する

る紫外線 B で刺激されたモルモットの皮膚の色素沈着過剰ことが知られている（Setchell and Clerici, 2010 ; Lephart,− 182 −

栄養補助食品として使用されるレスベラトロールならびにエクオールのチロシナーゼ酸化物による pro-oxidant 活性2016）。EQ（6）は女性ホルモン（エストロゲン）と構造

8） Ito, S., Yamashita, T., Ojika, M., & Wakamatsu,が似ているため，体内で女性ホルモンと似た働きをする。

K.（2 0 1 4a）．Tyrosinase-catalyzed oxidation of

EQ（6）の効果は，①骨粗鬆症予防，②血管内皮作用，④rhododendrol produces 2-methylchromane-6,7-dione,

更年期症状の改善，③目尻のシワが改善するなど，皮膚老the putative ultimate toxic metabolite: implications

化予防，美肌効果，④抗酸化作用などが知られているが，

for melanocyte toxicity. Pigment Cell and Melanoma

上記に述べたように，RES（1）と EQ（6）の構造は酸化さResearch, 27, 744-753.

れやすいフェノール骨格を持ち，チロシナーゼ酸化で細胞

9） Ito, S., Hinoshita, M., Suzuki, E., Ojika, M., &毒性を示す o- キノン体を生成し，RES（1）および EQ（6）Wakamatsu, K.（2017a）．Tyrosinase-catalyzed oxidationのチロシナーゼ酸化により生成したオリゴマーが強い酸化of the leukoderma-inducing agent raspberry ketone

促進活性を示すことがわかった。以上の観点から，RES（1）produces（E）-4-（3-oxo-1-butenyl）-1,2-benzoquinone:

および EQ（6）を美白剤として皮膚に塗布した場合，これImplications for melanocyte toxicity. Chemical

らの化合物がチロシナーゼの基質になり，毒性代謝物を産Research in Toxicology, 30, 859-868.

生する可能性を示唆できた。RES（1）および EQ（6）を皮10）Ito, S., Okura, M., Wakamatsu, K., & Yamashita,

膚へ塗布する危険性について注意を喚起する必要がある。

T.（ 2 0 1 7 b）．The potent pro-oxidant activity ofrhododendrol-eumelanin induces cysteine depletion

謝辞in B 1 6 melanoma cells. Pigment Cell and Melanoma

本研究を推進する上で，藤田医科大学伊藤祥輔名誉教授，
岐阜医療科学大学田中ひとみ助教，化学教室卒論生の藤木Research, 30 , 63 - 67 .
11）Ito, S., Agata, M., Okochi, K., & Wakamatsu, K.（2018）．

C-NMR おThe potent pro-oxidant activity of rhododendrol-

よび高分解能 ESI-TOF 質量スペクトルを測定して頂いた

eumelanin is enhanced by ultraviolet A radiation.

名古屋大学大学院生命農学研究科小鹿一教授に重ねて深謝

Pigment Cell and Melanoma Research, 31 , 523 - 528 .

1

優衣氏に感謝申し上げます。また， H-NMR,

1312）James, O., Mayes, R. W., & Stevenson, C. J.（1977）．

申し上げます。

Occupational vitiligo induced by p-tert-butylphenol: a（引用文献）

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− 184 −