技術概要

Agilent 6546 LC/Q-TOF:

代謝物分析の信頼性とスループットの向上

著者

Karen E. Yannell, PhD
Agilent Technologies, Inc.
Santa Clara, CA
Christian Klein PhD
Agilent Technologies, Inc.
Santa Clara, CA
Nicola Zamboni, PhD
ETH Zurich
Zurich, Switzerland

はじめにメタボロミクスは、質量分析計 (MS) による複雑な分析の限界を常に押し広げています。大量サンプル収集の高スループットプロファイリングでは、クロマトグラフィー分離を加速させ、時間的分解能の損失を質量分解能と精度によって補う傾向があります。最も極端な形態では、クロマトグラフィーを省き、フロー注入によって 1 日あたり数千回の注入を達成しています。効果的な手法ではあるものの、複雑な生体抽出物のハイスループット分析は、生体抽出物の代謝物濃度のダイナミックレンジが広いため、困難が伴います。また、質量分析計はクロマトグラフィーの使用の有無に関係なく、質量範囲全体にわたり、同一スキャン内での広いダイナミックレンジにおいて、しかも高い採取レートで、高分解能と優れた質量精度を提供する必要があります。

この技術概要では、Agilent 6546 LC/Q-TOF の機能を解説します。Agilent 6546 の機能向上により、複雑な生物マトリックスの分析が、事前の分離なしで可能になります。大腸菌メタボロームサンプルは、グルコース最少培地で指数関数的に培養させたバクテリアのエタノール抽出によって調製しました。サ

ンプルは、リストリクションキャピラリー付き Infinity II ポンプを使用し、フロー注入 (1.5 µL) によって分析しました。6546 LC/Q-TOF をネガティブモードでチューニングし、データを 1.5 Hz、m/z 50 ～ 1,000の質量範囲で取り込みました。この結果、m/z 118 を超える成分での 30,000 超の分解能、質量精度の向上、広いスペクトルダイナミックレンジ、高い感度と同位体忠実度が示されました。最終的に、こうした機器性能の向上により、大腸菌サンプル中でより多くのフィーチャーを発見し、プロファイリングして注釈を付けることができました。

分解能と質量精度70,00076546 LC/Q-TOF は、m/z 118 を超える場合は 30,000 以上 の分解能、より大きなイオンの 場合 は 60,000 以上 の 分解能 を達成しまResolution (FWHM)

50,000す (m/z 1,521、R = 60,000)。これらの 値 は複雑な大腸菌抽出物においても、ピーク強度や取り込 みスピードに 関係 なく達成されました (図 1)。質量精度は、ピーク強度に関係な

く、質量範囲全体で概 ね 0.3 mDa 以内でし640,000
530,000log10(ion counts)

60,00020,000た (図 2)。この性能により、事前にクロマトグ

4

ラフィー 分離 をしなくても分子式 を同定でき、10,000その結果、スループットが向上します。

00200

400600Mass-to-charge (m/z)×104157.0255

9R = 36,000

875157.050641,000773.5336
R = 50,000Counts

Counts6×1052.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.41.2
1.00.80.60.40.20800

3210157.00 157.02 157.04 157.06 157.08
Mass-to-charge (m/z)

774.5370

775.5401

773.5 774.0 774.5 775.0 775.5 776.0
Mass-to-charge (m/z)

図 1. 6546 LC/Q-TOF と組み合わせたフロー注入によって大腸菌サンプルを分析し、その成分の質量範囲に対して分解能をプロットしました。イオン強度は色で示しています。挿入図は低質量および高質量イオンのピーク形状を示します。

0.870.6

60.20-0.2

5-0.4-0.6log10(ion counts)

m/z error (mDa)

0.44-0.8-1.00100200300
400500600
Mass-to-charge (m/z)

700800900

図 2. 6546 LC/Q-TOF と組み合わせたフロー注入によって大腸菌サンプルを分析し、その抽出成分の質量範囲に対して質量誤差 (mDa) をプロットしました。イオン強度は色で示しています。

2感度とイントラスキャンのダイナミックレンジ

Succinate, m/z 117.0193

Mevalonate, m/z 147.0664

1 ×107

1 ×106

大腸菌抽出物の一連の希釈は、9倍濃縮から81 倍希釈までの範囲で、水を用いて調製しました。1 倍濃縮は、前世代の Q-TOF 機器で一般的 に使用されていた濃度 に相当します。各

サンプルは、一様に 13C ラベルが付けられた同量 (1X) の 大腸菌抽出物 と組 み 合 わせて、記録された 強度内での 多様 なマトリックス効果を確認しました。注入を 3 回実行しました。

1 ×105

各成分 が 質量範囲内で抽出され、成分 の強×9度 がプロットされ、低濃度つまり希釈物における 6546 LC/Q-TOF の 感度 が 示 されました (図 3)。信号強度はより低い濃度でも安定×3×1:3:9:27:81×9ATP, m/z 505.9886

×3×1:3:9:27:81:9:27:81

Coenzyme A, m/z 766.1075

1 ×105しており、誤差が大きくなり始めたのは 81 倍希釈 あたりでした。1倍濃縮での 大腸菌抽出物の分析において、6546 LC/Q-TOF はその感 度 により、Agilent 6550 iFunnel Q-TOF

LC/MS と同等の複数の代謝物を検出できました (図 4)。

1 ×104
1 ×104×9×3×1:3:9:27:81×9×3×1:3

図 3. 4 種類の抽出成分のイオン強度を大腸菌サンプルの希釈に対してプロットしました。

誤差バーは n = 3 での標準偏差を表しています。グレーで強調表示されたサンプル (1X) は、前世代の Q-TOF で使用されていた大腸菌サンプルの標準濃度です。

3

6546

6550

図 4. 6546 LC/Q-TOF と 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS で分析した場合の 1X 大腸菌サンプル内のフィーチャーを示す代謝物マップ。色を付けた円は、サンプル内で検出されたフィーチャー (つまり代謝物) を表しています。

6546 LC/Q-TOF は、複数の異なる代謝物類内のフィーチャー (赤色の四角形) を、6550 Q-TOF LC/MS よりも多く同定できました。

4

さらに、6546 LC/Q-TOF は 5 桁のスペクトル×108
3.5内ダイナミックレンジを実現します。この範囲

は 純粋 な大腸菌を使用して調査する場合よりも広いため、サンプルに 13C2-コハク酸をスパ3.0

イクしました。6546 LC/Q-TOF の 新しい 10

GHz のアナログ/デジタル (ADC) 取り込みシ

2.5

たる複雑 な強度のサンプルでも、ピークを正確 に検出できます (図 5)。そのため、複雑 な2.0

代謝物 の 定量 と同定 が 可能です。この 点 は、Intensity

ステムにより、同一スキャン内で 4 桁近くにわ抽出物 のダイナミックレンジ 全体 に存在する

119.0262[13C2] Succinate

複雑 なマトリックスの 高スループット測定で、1.5

とんど実施しない場合 に、特 に重要となりまサンプル前処理やクロマトグラフィー分離をほ1.0す。こうしたサンプルの分析対象成分には、強度 が低 いものも高 いものもあるためです。つ0.5

まり、6546 LC/Q-TOF では、分解能、精度、感度、スキャンスピードを損なうことなく、イン0トラスキャンのダイナミックレンジ全体を常に118.0224[13C] Succinate

117.0利用できます。

117.5118.0
Mass-to-charge (m/z)

118.5

117.03117.04Mass-to-charge (m/z)

117.05119.0

10,000x Magnification
×1049117.0191
Succinate87Intensity

65432117.0102[13C2] Fumarate

10
117.00117.01117.02117.06117.07

図 5. 6546 LC/Q-TOF のイントラスキャンのダイナミックレンジ。1 つの 1X 13C 濃縮大腸菌抽出物にC2-コハク酸をスパイクしました。3 つのテクニカルレプリケートを重ね表示しました。強度の違いが大きい(104 ～ 108 カウント) にもかかわらず、精度と分解能が保持され、同一スペクトル内の存在量の多いピークと13希少なピークの両方を正確に決定できます。

5

×106

さらにテストして、6546 Q-TOF LC/MS の同16て、正確な同位体比分析は、スペクトル分解

14ロマトグラフィー分離 がない場合でも、654612域内の大半の 13C および 2H 同位体種を明確10位体ラベリング性能を評価しました。原則とし能と直線ダイナミックレンジに依存します。クに分離することができました。図 6 は、最小分解能 (m/z 100) の 質量範囲 における分離 を示しています。質量とアバンダンスの全範囲にIntensity

LC/Q-TOF の高分解能により、混み合った領

119.0262
13
C2C2H5O4-119.0809
C3C2H10NO2-

13119.0513
C5H8O2•F-

8119.0909
CC4H12NO2-

わたり誤差が 0.3 mDa ppm 未満という質量精度により、高い信頼性での分子式の予測が6可能になります。数十種類もの代表的 な代謝物について、相対的同位体精度の誤差 (RIAE)

4て、RIAE は 20 % 未満 でした (つまり、トリ220 % 以上の誤差は、強度が 104 近くのモノア0119.00を計算しました。大半 のフィーチャーにおいプル四重極検出器で実現できる範囲内です)。
イソトピックピークを持つ成分でのみ観察されました。これらの成分は 103 以下の同位体があり、そのためにベースライン内にあります。

6546 LC/Q-TOF は、定量において高精度を

13119.0344
C4H7O4119.0398
C2C4H6NaO-

119.0135

119.01119.0703
C3H9N3O2-

13119.02

119.03119.0605
C7H7N2-119.04119.05119.06Mass-to-charge (m/z)

119.07119.08119.09図 6. 6546 LC/Q-TOF でフロー注入を使用して測定した濃縮大腸菌抽出物の低 m/z 範囲に含まれる隣接した
13C および 2H ピークのスペクル分解能。

維持することによって、安定した高い分解能と50同位体忠実度を実現します。

7Relative isotopic accuracy error (RIAE)

4030
62010log10(ion counts)

同位体の分解能と忠実度

50-104ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2019
Printed in Japan, February 21, 20195994-0724JAJP-200100

200

300
400500Mass-to-charge (m/z)

600

700800

図 7. 同位体測定の精度。RIAE は理論上の M+1/M+0 と測定した M+1/M+0 の比をパーセント誤差として示します。RIAE 値が 20 未満の場合、優秀と判断されます。10 回のスキャンにおけるイオン強度の合計の記録が色で示されています。RIAE 値の悪化は、低強度のピークイオンでのみ観察されました。

モノアイソトピックピークの約 5 ～ 10 % の M+1 のイオンカウントで、ベースラインの範囲となりました。