実験プロトコール 005S
NH2ビーズへのHOSuを使用すビーズへのリガンド（カルボキシル基をリガンド（カルボキシル基をリガンド（カルボキシル基を有する有する化合物化合物）の固定化の固定化① HOSuを使用する方法
スクリーニングにおいてスクリーニングにおいては、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリガ、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、NH2ビーズへの固定化反応時のリガンド濃度をビーズへの固定化反応時のリガンド濃度を固定化反応時のリガンド濃度を0, 0.4, 2, 10 mMの4段階で固mM 段階で固定化する場合の方法を示します。

1. 準備するもの
1.1 ビーズ、リガンド（化合物）
ビーズ、リガンド（化合物・・NH2ビーズ (TAS8848N1130
TAS8848N1130)4 mg (NHNH2量：約200200 nmol/mg)
・リガンド 2mg
mg程度
1.2 試薬
・N,N
N,N’-ジメチルホルムアミド
ジメチルホルムアミド (DMF)： 脱水品 10 mL・N
N-ヒドロキシスクシンイミド
ヒドロキシスクシンイミド (HOSu) 分子量 115.09 2 mg
・1--エチル-3-(3--ジメチルアミノプロピルジメチルアミノプロピル
ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
カルボジイミド (EDC))
分子量 155.24 2 mg (ペプチド研究所社
ペプチド研究所社 1020など)
・無水酢酸 分子量 102.09 160 µL
・メタノール (MeOH
MeOH) 2 mL
1.3 機器・微量高速冷却・微量高速冷却遠心分離機
遠心分離機
・マイクロチューブミキサー
マイクロチューブミキサー (TOMY
TOMY社 MT--360、など)
・超音波分散装置
超音波ホモジナイザー (カップホーン付
カップホーン付) (多摩川精機
多摩川精機TAB4905N10
TAB4905N10など)
超音波洗浄器 (多摩川精機多摩川精機TAB4905
TAB4905など)
2. 方法
2.1 概要リガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法はリガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法は2.22.2項を参照下さい。
項を参照下さい。

活性化リガンドNH2ビーズCOOHリガンド固定化ビーズ
リガンド固定化ビーズ

2.2 手順1) リガンド (化合物化合物) をDMF
DMFへ溶解し、4 µmol/200 µL
L (20 mM) 溶液を調製する (反応時に反応時に10 mMになになるようにするるようにする)。
2) スクシンイミドをスクシンイミドをDMFへ溶解し、へ溶解し、2000 mM スクシンイミド溶液40スクシンイミド溶液 µLを調製する。
を調製する。

多摩川精機株式会社

1

PRD001547
001547W00 20190509

実験プロトコール 005S
3) EDCをDMFへ溶解し、200 mM EDC溶液 40 µLを調製する。
4) 20 mM リガンド溶液 200 µLへDMF 160 µL、200 mM スクシンイミド溶液 20 µL、200 mM EDC溶液 20 µLを混合し、マイクロチューブミキサーにて室温で2時間反応させる（等モルずつ反応させる）。

20 mM リガンド（化合物） 200 µL (4 µmol)
200 mM スクシンイミド20 µL (4 µmol)

200 mM EDC

20 µL (4 µmol)

DMF

160 µL

反応液量400µL

5) 1.5 mLマイクロチューブ4本へNH2ビーズ (TAS8848N1130) を1 mgずつとる。
6) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
7) DMF 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
8) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
9) 7)～8)を更に2回繰り返す。（ビーズの洗浄を計3回行う）
10) リガンド固定化濃度に応じてDMFを加える。
11) 作製しておいた活性化10 mM リガンド溶液を加え、ビーズを超音波にて分散させる。
12) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて一晩（16～20時間）反応させる。
固定化濃度00.4210mM

NH2ビーズ1111mg

DMF

200

1921600µL

活性化10mM リガンド

0840200µL

合計

200200200200µL注) ビーズへ直接リガンド溶液を添加すると局所的に濃度が高くなる懸念があります。
従って、ビーズにDMFを添加した後にリガンド溶液を添加して下さい。
13) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
14) DMF 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
15) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
16) 14)～15)を更に2回繰り返す。（ビーズの洗浄を計3回行う）
17) DMF 160 µLへ超音波にて分散させる。
18) 無水酢酸 40 µLを加える。（20％無水酢酸）19) マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて2時間反応させる。
(リガンド未結合アミノ基のマスキング)
20) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
21) DMF 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
22) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
23) 21)～22)を更に2回繰り返す。（ビーズの洗浄を計3回行う）
OH基のような無水酢酸にてアセチル化されてしまう官能基を有する場合はマスキング後、0.1 M
水酸化ナトリウム溶液 200 µLを加えて分散、マイクロチューブミキサーを使用し、室温にて30分反応させることで脱アセチル化を行う。その後、遠心分離、超音波によるビーズの分散を繰り返し、超純水 200 µLによる洗浄を3回行う。
多摩川精機株式会社

2PRD001547W00 20190509

実験プロトコール 005S
24) 50% MeOH 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
25) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
26) 24)～25)を更に2回繰り返す。（ビーズの洗浄を計3回行う）
27) 50% MeOH 40 µLに分散させ、4℃にて保存する。(リガンド固定化ビーズ濃度：0.5 mg/20 µL)
3. 補足
・ビーズの分散は超音波ホモジナイザーまた超音波分散装置で容易に分散できるが、それらが無い場合は、超音波洗浄器や試験管立てを使用したガリガリ法でも分散可能。(ガリガリ法では、チューブの蓋が開かないようにキャップロックを用いることが望ましい。)（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

・DMFや50% MeOHに分散させたビーズは磁気分離には時間が掛かるので、遠心分離にて回収する。
・DMFはモレキュラーシーブで脱水させたもの、または低水分溶媒品を使用すること。
・リガンド固定化ビーズの保存は、疎水的な化合物の固定化によるビーズの分散性低下を考慮し、50%MeOHとしているが、超純水でも問題無い。
・リガンド未結合アミノ基のマスキングは、20％無水酢酸で室温にて2時間撹拌するか、あるいは1％無水酢酸で室温にて一晩撹拌することでマスキングできる。
以上

多摩川精機株式会社

3

PRD001547W00 20190509