実験プロトコール 111S
Alkyne beadsへのリガンド
beadsへのリガンド（アジドクリックケミストリー反応を用いたクリックケミストリー反応を用いたAlkyne（アジド構造をも構造をもつ化合物）の固定化

アフィニティ精製
アフィニティ精製において、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反において、まずビーズへのリガンド固定化量の最適化が必要です。リガンド固定化量は、固定化反応時のリガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、固定化反応時のリガンド濃度を応時のリガンド濃度により変化させます。本実験プロトコールでは、固定化反応時のリガンド濃度を0,, 5, 25, 125 µMの4段階で固定化する場合の方法を示します。

1. 準備するもの
1.11 ビーズ、リガンド（化合物）
ビーズ、リガンド（化合物・・Alkyne
Alkyne beads 4 mg (1 mg/条件)
mg/※官能基
官能基量：約10000 nmol/mg
・リガンド 0.1 mg程度
1.22 試薬・・t-ブチルアルコール
ブチルアルコール (t--BuOH) 12 mL・ジメチルスルホキシド (DMSO) 3 mL・・Tris[(1-benzylbenzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amineyl)methyl]amine (TBTA)(分子量 530.63 2.7 mg
・・Copper(Ⅱ)sulfate)sulfate (CuSO
CuSO4) 分子量 159.61 16 mg
・・(+)-Sodium
Sodium L-ascorbateL(分子量198.11(198.11) 20 mg
・メタノール (MeOH)) 4 mL
1.33 機器・微量高速冷却遠心分離機
・マイクロチューブミキサー (TOMY社
社 MT-360などなど)
・超音波分散装置
超音波ホモジナイザー (カップホーン付
カップホーン付) (多摩川精機
多摩川精機TAB4905N10
TAB4905N10などなど)
超音波洗浄器 (多摩川精機
多摩川精機TAB4905
TAB4905など)
2. 方法
2.1 概要リガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法はリガンド固定化の模式図を下記に示す。詳細方法は2.3項を参照下さい。
項を参照下さい。

Alkyne beads

2.22 溶液調製
t-BuOH/DMSO
BuOH/DMSO
BuOH/DMSO溶液:
tt-BuOH 8 mLととDMSO 2 mLを混合し、mLを混合し、t-BuOH:DMSO
BuOH:DMSO = 4:1の溶液を4:1の溶液を10 mL調製する。
調製する。
※t-BuOHは凝固点が低い
は凝固点が低い (25.7oC) ので、凝固している場合は使用前に融解させるので、凝固している場合は使用前に融解させる。
。
500 µMµMリガンド溶液
リガンド溶液:リガンド (化合物化合物) をt-BuOH/DMSO
BuOH/DMSO溶液へ溶解し、溶液へ溶解し、500 µMリガンド溶液
リガンド溶液1100 µLを調製する。
を調製する。
250 µM TBTA
TBTA溶液:TBTA 2.7 mgをt-BuOH/DMSOmg
BuOH/DMSO溶液1 mL
mLへ溶解し、へ溶解し、5 mM TBTA溶液を調製す
TBTA溶液を調製する。
5 mM TBTA溶液
溶液5 µLにt-BuOH/DMSO
BuOH/DMSO
BuOH/DMSO溶液95 µLを加え、を加え、250 µM TBTA溶液を調製する。
TBTA溶液を調製する。
5 mM CuSO4溶液:
溶液
CuSO4 16 mgを超純水
を超純水1 mLへ溶解し、mLへ溶解し、100 mM CuSO4溶液を調製する。
100 mM CuSO4溶液5 µLに超純水に超純水95 µLµLを加え、5 mM CuSO4溶液を調製する。
5 mM ((+)-Sodium
Sodium L-ascorbate
L ascorbate溶液:((+)-Sodium
Sodium L-ascorbate
L
20 mgを超純水を超純水1 mLへ溶解し、へ溶解し、100 mM (+)-Sodium(L--ascorbate溶液を調溶液を調製する。
製する。100 mM (+)-Sodium
Sodium L-ascorbate
L ascorbate溶液5 µLに超純水95µL
95 µLを加え、を加え、5 mM (+)-Sodium
SodiumLL-ascorbate溶液を調製する。
溶液を調製する。

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多摩川精機株式会社
PRD002587
PRD002587W00 20190612

t-BuOH/DMSO/超純水溶液:
t-BuOH/DMSO溶液2 mLと超純水2 mLを混合し、t-BuOH/DMSO:超純水= 1:1の溶液を4 mL調製する。
2.3 手順1) Alkyne beadsを1 mgずつマイクロチューブ4本へ分注、遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
2) 各種反応溶液を下表の上から順番に加え、250 µM TBTA溶液添加後に、ビーズを超音波にて分散させる。その後、残りの試薬を加える。
固定化濃度0525125µM
Alkyne beads
1.01.01.01.0mgt-BuOH/DMSO
10096800µL
500µM リガンド
021050µL
250µM TBTA
021050µL
超純水
10096800µL
5mM CuSO4021050µL
5mM (+)-Sodium ascorbate
021050µL
合計
200200200200µL
3) マイクロチューブミキサーを使用し、室温で16～20時間反応させる。
4) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
5) t-BuOH/DMSO/超純水溶液200 µLを加えて、ビーズを超音波にて分散させる。
6) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
7) 手順5)～6)を更に2回繰り返す。
(t-BuOH/DMSO/超純水溶液によるビーズの洗浄を計3回行う。)
8) 50% MeOH 200 µLを添加し、ビーズを超音波にて分散させる。
9) 遠心分離 (15,000 rpm, r.t., 5 min) を行い、上清を廃棄する。
10) 手順8)～9)を更に2回繰り返す。 (ビーズの洗浄を計3回行う)
11) 50% MeOH 40 µLに分散させ、4oCにて保存する。
(リガンド固定化ビーズ濃度：0.5 mg/20 µL)
3. 補足
・ビーズの分散は超音波分散装置で容易に分散できるが、それらが無い場合は、超音波洗浄器や試験管立てを使用したガリガリ法でも分散可能。 (ガリガリ法では、チューブの蓋が開かないようにキャップロックを用いることが望ましい。)（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

・t-BuOH/DMSO溶液、50% MeOHに分散させたビーズは磁気分離には時間が掛かるので、遠心分離にて回収する。
・リガンド固定化ビーズの保存は、疎水的な化合物の固定化によるビーズの分散性低下を考慮し、50% MeOHとしているが、超純水でも問題無い。
以上
多摩川精機株式会社
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PRD002587W00

20190612