実験プロトコール 201
HPLC (高速液体クロマトグラフィー) によるリガンド固定化量の定量スクリーニング (リガンド結合タンパク質のアフィニティ精製) において、ビーズへのリガンドの固定化量を定量することが必要となる場合があります。そこで、本実験プロトコールでは、プロトコール008のCOOH beads、014のNHS beadsへのNH2基を有するリガンドの固定化量の定量方法を示します。

1. 準備するもの
1.1 NHS beadsへの固定化上清A、B（プロトコール008、014参照）
・上清A (リガンド固定化時に外れたNHS含有溶液)
・上清B (マスキング時に外れたNHS含有溶液)
1.2 試薬・N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 分子量 115.09
・N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)
・酢酸アンモニウム 分子量 77.08
・酢酸 分子量 60.05
・アセトニトリル (高速液体クロマトグラフィー用)
1.3 機器等
・フィルターユニットSteritop ( MILLIPORE SCGPT05RE）
・マイクロチューブフィルターUltrafree-MC (MILLIPORE UFC30LG00)
・高速液体クロマトグラフィー装置 (HPLC) (Waters 2695, 2998)
・Symmetry カラム 5µm C18 4.6×250mm ステンレス (Waters WAT054275)
・微量高速冷却遠心分離機

1

多摩川精機株式会社
PRD001510W00

20190611

実験プロトコール 201
2. 方法
2.1 溶液調製
0.2M 酢酸アンモニウム溶液調製
1) 50 mLチューブへ酢酸0.605 gをとり、超純水で50 mLまでメスアップする。(0.2M酢酸)
2) 500 mLビーカーへ酢酸アンモニウムを7.708 gとり、超純水を加えて約400 mLまでメスアップする。
3) pHが5.70になるように0.2 M 酢酸を加え調整する。(40 mL位)
4) 500 mLメスシリンダーへ移し、超純水で500 mLまでメスアップする。
5) フィルターろ過 (フィルターユニット使用) 後、4℃保存する。
10 mM 酢酸アンモニウム溶液作製：移動相・0.2 M酢酸アンモニウム溶液を50 mLとり、メスシリンダーで1 Lまでメスアップする。
スクシンイミド (NHS) 検量線作製
100 mM：HOSuの固定化に使用した1 M品 (100 µL) + DMF (900 µL)
10 mM：100 mM (100 µL) + DMF (900 µL)
1 mM：10 mM (100 µL) + DMF (900 µL)
100 µM：1 mM (100 µL) + DMF (900 µL)
10 µM：100 µM (100 µL) + DMF (900 µL)
0M：DMFのみ※ 検量線としては10 mM以下のみを使用する。
サンプル希釈バッファー作製・グラジエントのスタート時のバッファー組成で溶液を作製する。
10 mM酢酸アンモニウム (47 mL) (全体の94%) + アセトニトリル (3ml) (全体の6%)2.2 サンプル調製
1) サンプル (検量線、上清A、B) 20 µLとサンプル希釈バッファー180 µLを混合する。
2) HPLCへのビーズの混入を防ぐためにフィルターろ過を行う。
(200 µLずつ：マイクロチューブフィルター使用、遠心分離 5000×g、1min)
3) ろ液をバイアルへ150 µLずつ入れ、フタをしてHPLCのオートサンプラーへセットする。
2.3 装置の準備とプログラムの作成
1) 装置 (本体、カラムオーブン、パソコン) の電源を入れ、流路を洗浄する。
2) カラムをセットする。
(溶媒を流しながら行う、矢印の方向に気をつける、液が出てくるのを確認する。)
3) 10mM 酢酸アンモニウム 94%、アセトニトリル 6%の条件でカラム内のバッファー置換を行う。
(圧が安定化するまで待つ：1350psi前後)4) プログラムを作成する。
↓HPLC制御ソフト (Empower) 起動↓ウィザード設定 (分析するサンプルの容量50µl、サンプル数等)↓メソッド設定 (グラジエント条件：図1、カラム40oC)
メッソド：グラジエント40min (洗浄工程含む)
時間(分)
1012202240流速(mL/min)
11111110mM酢酸アンモニウム (%)
946020209494
2

アセトニトリル(%)
640808066曲線
66666
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グラジエント40min
10090
移動相混合割合（%）

80
70
60
5010mM酢酸アンモニウム
アセトニトリル

4030201000

5101520
時間（分）25303540

図1.
1. グラジエント40分の酢酸アンモニウム溶液混合割合の推移
グラジエント 分の酢酸アンモニウム溶液混合割合の推移
2.4 分析
1) 設定したウィザード、メッソッドを選択し、測定をスタートさせる。
設定したウィザード、メッソ ドを選択し、測定をスタートさせる。
2) 終了後、終了後、260 nmにて解析、ピークの面積から定量値へ変換する。
にて解析、ピークの面積から定量値へ変換する。
3) アセトニトリル
アセトニトリル100%にてにて1時間カラム洗浄
時間カラム洗浄 (1 mL/min/min) を行う。
2.5 データ解析
1) 上清
上清Aのサンプルのピーク面積からリガンド固定化時に遊離したのサンプルのピーク面積からリガンド固定化時に遊離したNHS量を算出する。のサンプルのピーク面積からリガンド固定化時に遊離した量を算出する。
2) 工程
工程1) からリガンド仕込み量0からリガンド仕込み量 mM ((リガンド未固定リガンド未固定) 時のNHSNHS量をバックグラウンドとして差し量をバックグラウンドとして差し引きし、実際のリガンド固定化量 (µMµM) とする。((mol/mgへ変換へ変換)
3) 上清
上清Bのサンプルピーク面積からマスキング時に遊離したのサンプルピーク面積からマスキング時に遊離したのサンプルピーク面積からマスキング時に遊離したNHSNHS量を算出する。
量を算出する。
4) 工程
工程3) からマスキングなしの上清Bサンプルのからマスキングなしの上清 サンプルのNHSNHS量をバックグラウンドとして差し引きし、リ量をバックグラウンドとして差し引きし、リガンドが固定化されなかったカルボキシル基 (またはまたはNHS基)) 量 (µM) とする。とする。(mol/mgmol/mgへ変換)
5) 工程
工程2) のリガンド固定化量 (A) と工程
工程4) のリガンドが固定化されなかったカルボキシル基 (ままたはたはNHS基)) 量 (B)を足してカルボキシルを足してカルボキシル (またはまたはNHS) ビーズの表面官能ビーズの表面 官能基量とする。
基量とする。(mol/mgmol/mgへ変換へ変換)

3. 補足（実際の測定データ：例（実際の測定データ：例 MTX）
3.1 HPLC
HPLCピーク
4. MTX 1 mM (500500 nmol)
図4.

1. バッファーのみ
図1.

上清A

図2. スクシンイミド検量線

図
図5. MTX 0 nmol

0 µM（DMFのみ）
のみ）

上清B

（マスキングなし）

3多摩川精機株式会社
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実験プロトコール 201
図3. スクシンイミド検量線nmol
図6. MTX 1 mM (500 nmol)

100
1 µM

上清B

[HPLC 分析：サンプル20μl+バッファー180μl][HPLC分析：サンプル180μl]
図1. サンプル=バッファー
図バッファー
10mM 酢酸アンモニウム：アセトニトリル = 94：6 で混合したバッファーのみを分析
図2. サンプル=スクシンイミド検量線
図
スクシンイミド検量線 0μM
MTX固定化時、マスキング時に遊離するスクシンイミドは固定化時、マスキング時に遊離するスクシンイミドはDMFへ溶けているために検量線も固定化時、マスキング時に遊離するスクシンイミドはDMFへ溶けているために検量線もDMFで作製する。
で作製する。
スクシンイミド
スクシンイミド0μMははDMFのみとなる。DMF
DMFのみを分析。3分以前はピークが無い。
分以前はピークが無い。
図3.サンプル=スクシンイミド検量線
図
スクシンイミド検量線 100μM
スクシンイミド100μM100μMを分析。2.519分にスクシンイミドのピークが見られる。
分にスクシンイミドのピークが見られる。
図4.サンプル== MTX 1mM 上清A
図
MTX-NH2仕込み量1mM時の上清。スクシンイミドのピークが仕込み量時の上清。スクシンイミドのピークが時の上清。スクシンイミドのピークが2.514分に見られる。
分に見られる。6.5分付近のピー
クはクはMTXのもの。スクシンイミドのピーク面積よりのもの。スクシンイミドのピーク面積よりのもの。スクシンイミドのピーク面積よりMTX-NH2固定化量を算出する。
図5.サンプル== MTX 0mM 上清B（マスキングなし）
図（マスキングなし）
MTX-NH2仕込み量0mM時かつマスキングをしない（アミノエタノールの代わりに仕込み量時かつマスキングをしない（アミノエタノールの代わりに時かつマスキングをしない（アミノエタノールの代わりにDMF）場合の上清（）場合の上清（B）。バックグラウンドのスクシンイミドのピークが2.514分に見られる。
グラウンドのスクシンイミドのピークが2.514
図6.サンプル== MTX 1mM 上清B
図MTX-NH2仕込み量1mMでマスキング時の上清（仕込み量でマスキング時の上清（B）。2.335分にスクシンイミドのピークが見られる。検量線、上清分にスクシンイミドのピークが見られる。検量線、上清A
A、上清B（マスキングなし）のスクシンイミドのピークに比べ、ピーク位置が少し前にシフトしている。
（マスキングなし）のスクシンイミドのピークに比べ、ピーク位置が少し前にシフトしている。
原因は、マスキング剤として使用しているアミノエタノールによるものである。このピークの面積をスクシンイミドの検量線へ当てはめ、マスキング時に遊離したスクシンイミド量を算出する。

HPLC定量値
3.2 HPLC

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実験プロトコール 201

Con c. ofch emical
co m poun d at
imm o bili zation(mM )259NH S
Sup A

259NH SSup B

M TX -NH2(n m ol/5 00ul)

N HS s up
qu antit ative
co nc. withHPLC (uM )Succinim id evalu e o f 2 00u l(nmol)

Bac kgro un drem oval(nm ol)Im mobilized
M TX -NH2 at
1mg of beads(nmo l/mg)

COOH o r
NHS valu e(nmo l/mg)

Average(nm ol /m g)

211.7

00

79

15.9

0.0

0.0

201.5

0.1

5083

16.6

0.8

0.8

216.8

0.3

15099

19.9

4.0

4.0

212.7

1500

136

27.2

11.3

11.3215.901 008

2 01.50.1

1 080

2 16.00.3

1 044

2 08.7

11 023

2 04.6200ul = 1mg of beads

3.3 MTX固定化ビーズによるアフィニティ精製
Salt Elution

Boil Elution

KDa

KD a

M 0 0 .1 0. 3 1200116
9766
45

2 00116
9766
45

31

31

21.5

21 .5

14. 4

14 .4

M 0 0.1 0 .3 1

M TX immo bilization
co nc. (mM )DHFR

Condition
Beads
Amount of be ads
Binding, Washing buffer
Elution buffer
Protein extract
Protein Conc.
Reaction time

: COOH be ads(S259PSSNENCOOH): 0.5mg: 150 mM KCl（200μl）: 1M KCl（30μl）: He La cytoplasmi c compartment: 3mg/ml（200μl）: 2h

4. 注意事項
・マイクロチューブフィルターは有機溶媒耐性がありませんので必ずバッファーに希釈してから使用してください。
・上清A+Bの値がCOOH beads (またはNHS beads) の全体のCOOH (NHS) 量を表しています。この値が200 nmol/mgを大幅に下回るようですとマスキングがうまくできていないか、水分のコンタミによるNHSの遊離が考えられます。この場合は新しいCOOH beads (またはNHS beads) を使用して再度固定化を行ってください。

以上

5

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