皮膚におけるアクアポリン３の発現調節
自治医科大学

石橋

賢

薬理学教室

一、中越雅

道

Water is important for skin to keep its moisture. Water transport is conducted by channel proteins namedaquaporins. Several aquaporins play pivotal roles in water metabolism in our body. AQP3 is expressed in the skinand its importance for the skin moisture is demonstrated by the study of AQP3 knockout mice which have accelerated
drying of the skin. The prevention of dry skin is important not only from the cosmetic point of view but also from theclinical point of view, i.e. it is responsible for an itch especially in aged people. This study was intended to search forthe substances which upregulate the expression of AQP3 in the skin. We used rat skins and human kerationcytes asmodels. In rat skins, vitamin A increased the AQP3 expression in a high dose (10%) but not in lower doses. However,the AQP3 expression was unaffected by vitamin A in a cell line from human keratocarcinoma. On the other hand, theexpression of AQP3 in this cell line responded to hypertonic stimulation with sorbitol suggesting that this cell line isuseful for the screening of the candidate substances which increase AQP3 expression.

１.

緒りグリセリンの輸送を介して皮膚の保湿を保っていると考言えられている３）。従って AQP3 の発現を調節することで水は生命にとって不可欠の物質であり、それを選択的に皮膚の保湿性を変える事が期待される。ヒト鼻腔上皮の通す水チャネルが発見されてこの分野の研究は急速に進展

AQP3 の発現はビタミン A では変化しないようである４）。

した。水チャネルは瞬時に大量の水を運ぶ必要がある細胞

AQP3 はケラチノサイトに発現しているがその発現がビタや浸透圧格差が小さくても水の輸送が必要とされる細胞に

ミン A で変化するかどうかは不明である。一方 AQP1 と存在している。水チャネルの実体はアクアポリン（aqua 水＋AQP5 は汗腺に分布しているが直接は皮膚の保湿性には関p o r i n 穴）と呼ばれる膜蛋白であるがヒトにおいて 13 個の与しないと考えられる。

遺伝子がみつかっている。この数は植物のシロイヌナズナのそこで今回の研究では皮膚の保湿性に重要な役割を演じ38 個にくらべるとはるかに少なく、また線虫の 11 個に比べる AQP3 の発現を調節する物質を検索し、特にその発現ても少ないように思える。一方アクアポリンは水だけを通すを増やすものをみつけることを目標とした。皮膚の保湿をのでないこともあきらかになり名前にとらわれていると他の維持する事で老人に多い乾燥性の掻痒症やアトピー性皮膚重要な機能を見落とす危険がある。水のみならずグリセリン炎の治療や皮膚の創傷の治癒の促進をはかることが可能にや尿素などの小粒子をとおす aquaglyceroporin と呼ばれるなると考えられる。また化粧品の多くが皮膚の保湿性を向サブグループも存在する（AQP3, 7, 9, 10） 。

上させる働きがあることを考えると、化粧品の成分として

１）

皮膚では角質層に適度な水分（20-30％）が含まれており皮膚の柔らかさを生み出している。一方体内にたまったも有望である。さらに加齢による皺を減らす事ができれば美容的にも重要な物質をみつける契機にもなりうる。

熱を体外に放出するために皮膚から水を蒸発させているの２.

で、角質層はそれにみあうだけの水を透過させる性質も有している。このダイナミックな水の動きに水チャネルが関

２・１

実験

材料

与していることが最近 AQP3 のノックアウトマウスが報200g の成体オス SD ラットを用いた。エーテル麻酔下告された２）。このマウスでは腎性尿崩症のほかに皮膚の異に背部の毛を剃ったあとに薬剤を塗布した。24 時間後に常な乾燥が認められた。しかしその機構は直接水の輸送皮膚を採取した。培養細胞は自治医科大学皮膚科教室でに関与しているという単純なものではなく、ノックアウト系代化したヒト皮膚癌細胞（keratocarcinoma）を用いた。

マウスの皮膚のグリセリンの含有量が減少していることよHigh glucose の DMEM（ダルベッコ変法イーグルスメジ

The regulation of AQP3 in skin andkeratinocytes.
Kenichi Ishibashi, Masamichi Nakakoshi＊Jichi Medical School, Department ofPharmacologyウム）にペニシリン（50unit/ ㎖）およびストレプトマイシン（50ug/ ㎖）と５％牛胎児血清（FCS）を添加したもので培養した。Subconfluent の状態で試薬を加え、24 時間後に細胞を採取した。試薬はシグマから購入した。

２・２

RNA, タンパクの抽出

ラットの皮膚はなるべく真皮を含まないようにはぎと＊− 67 −

り、液体窒素に入れ固まった状態でクリオプレスを用いてすSDS-PAGE をおこなった。セミドライ・トランスファー装置でみやかにパウダーにした。それを R NAea sy（キアゲン）のゲルから PVDF 膜（Immobilon）にタンパクを転写した。膜

lysis buffer に入れ、protenase K 処理をおこなったあとカラは TBST（Tris-buffered saline、0.05％ Tween20）に２％ムで total RNA を抽出した。培養細胞から RNA を抽出する

スキムミルクを加えたブロッキングバッファーで４度一晩処理には培養液を PBS（リン酸緩衝生理食塩水）であらったあした。抗ラットAQP3 抗体を 500 倍に TBST で希釈し室温と lysis buffer を入れて機械的に細胞をこすりとった。それで１時間インキュベートした。TBST で洗浄後、パーオキシダを RNAeasy のカラムを通して total RNA の抽出をおこなっ

ーゼ標識抗ウサギ Ig G 抗体と室温で１時間インキュベートした。R NA は 20ug を１％アガロース R NA 用ゲルの各レーンた。TBST で洗浄後、化学発光検出キットで発光させ ECLに電気泳動した。20XSSC でナイロン膜（Hybond plus）にフィルムに感光させた。

トランスファーした。培養細胞のタンパクの抽出にはホモジ

３.

ナイザーバッファー（0.32M sucrose, 5mM Tris pH7.2, 2mMEDTA, 0.1mM PMSF, 1ug/ml pepstatin A）内で超音波破３・１結果

ラット皮膚へのビタミン A の AQP3 発現への影響砕したあと、1000g で 10 分遠心した上清を 250,000g で 30

ラット皮膚には 1.8kb のサイズの AQP3 のバンドが検分超遠心した沈澱をホモジナイザーバッファーにけん濁した。

出された（Fig. １）。ラット背部の剃毛した皮膚にビタミン A（all trans retinoic acid）を溶かすのに用いた DMSO

２・３

ノーザンブロット

単独投与しただけで AQP3 の発現が増加することがあき

ナイロン膜を 50％ for m a m ide 入りのハイブリ液で 42 度らかになった（Fig. １）。さらにビタミン A の影響をみる

16 時間ハイブリさせたあと２XSSC で室温にて 15 分洗ったために 0.1％ , 1％ , 10％のビタミン A を塗布して 24 時間

あと、２XSSC で 42 度 15 分、0.2XSSC で 58 度 15 分洗後の AQP3 の発現をノーザンブロットで調べた。10％でって増感紙といっしょにレントゲンフィルムにはさんだ。プロ増加がみられたが、0.1％ , 1％の低容量では DMSO のコーブはラットあるいはヒト AQP3 cDNA の全長をランダムプラントロールと較べて変化がみられなかった。これは５匹のイマーで 32P-dCTP でラベルした。ニックカラムで未反応のラットでおこなったが同様の結果であった。

32P-dCTP を除いた。一方 RNA のトランスファーの定量性

つぎに剃毛による傷が AQP3 の発現に影響する可能性があを検定するために、脱プローブ後ヒト GAPDH cDNA をプロるので毛のはえていない後ろ足に塗布した。やはり10％ビタミーブとしてハイブリダイゼーションを行った。GA PDH のデンンA で AQP3 の発現が誘導されることがわかった（Fig. ２）。

シトメーター値で AQP3 の値を補正して比較した。

３・２２・４ウェスタンブロット

ヒト皮膚癌培養細胞での AQP3 の発現

皮膚での AQP3 の発現はケラチノサイトに限局していサンプルバッファー（75mMTris, ２％ SDS, 15％ glycerol,る。従って AQP3 の発現をケラチノサイトで直接検討できれ3％ 2-mercaptoethanol, pH6.8）にタンパク 10ug を溶かし、ば有用性が高い。そこで当大学皮膚科に保存されているヒト95 度で５分変性させたあと 15％のポリアクリアマイドゲルで皮膚癌培養細胞に AQP3 が発現しているものがないかスクリ

123451AQP32345

AQP3GRAPDH
GRAPDH

Fig.1. AQP3 mRNA expression in rat skins
Northern blot analysis of rat skins 24 h after treatment with
1: no treatment, 2: DMSO treated, 3: 0.1% vitamin A, 4: 1%vitamin A, 5: 10% vitamin A(all trans retinoic acid).

Fig.2. AQP3 mRNA expression in rat hind feet.
Northern blot analysis of rat hind foot skins 24 h after treatment with 1 and 2: DMSO, 3and 4: 10% vitamin A.

− 68 −

皮膚におけるアクアポリン３の発現調節ーニングしたところ kishi となづけられた細胞に AQP3 が発AQP3 がソルビトールで増加し尿素ではかわらないという上現していることが明らかになった。まずこの細胞の AQP3 の記の結果が確認された（Fig. ４）。以上の結果からこの細胞発現が浸透圧の変化に応じて変化するかどうか調べた。細

は AQP3 の発現が正常のケラチノサイトと同様の変化をする５）胞に取り込まれない浸透圧物質であるソルビトールによる浸ので AQP3 の発現を調節する物質の検索に使えると考えられ透圧の刺激に反応して AQP3 の発現が増加することがわかる。まずラットで用いたビタミン A の影響を調べてみた。こった（Fig. ３）。一方、細胞にとりこまれて浸透圧格差の生じの細胞では 10-6M のビタミン A でも AQP3 のノーザンブロッない尿素では浸透圧に対する反応がみられなかった（Fig.3）。

トでの変化はみられなかった（Fig. ５）。

これらの結果はウェスタンブロットでは 30k Da のハンドと同じく、dexamethasone(10-6, 10-7, 10-8 M), dibutyl-40k Da 付近の幅の広いバンドが見られたが後者は糖鎖のつcAMP(10-5, 10-6, 10-7M), dibutyl-cGMP (10-5, 10-6, 10-いた AQP3 と考えられる。ノーザンブロットと同様の結果が7M ) でも 24 時間後の AQP3 の発現のノーザンブロットでのウェスタンブロットでも見られ、タンパクレベルの発現でも変化はみられなかった。

1234567AQP3

GRAPDHFig.3. AQP3 mRNA expression in a human keratocarcinoma with hypertonic medium.
Northern blot analysis of a human keratocarcinoma cell line 24 h after
treatment with 1: 200 mM urea, 2: 100 mM urea, 3: 50 mM urea, 4:control, 5: 100 mM sorbitol, 6: 200 mM sorbitol, 7: 300 mM sorbitol.

1kD

1

2234

350AQP337-GRAPDH

25-Fig.4. AQP3 protein expression in a human keratocarcinoma
cell line.
Western blot analysis of a human keratocarcinoma cell line
24 h after treatment with 1: control, 2: 200 mM sorbitol, 3:200 mM urea.

Fig.5. AQP3 mRNA expression in a human keratocarcinoma
cell with vitamin A.
Northern blot analysis of a human keratocarcinoma cell line
24 h after treatment with 1. vehecle(DMSO), 2: 10-8M vitamin A, 3: : 10-7M vitamin A, 4: : 10-6M vitamin A.

− 69 −

４

考膚の AQP3 発現への影響は二次的な可能性があり、ビタ察

ミン A により誘導される未知の物質が AQP3 の誘導をし皮膚の保湿に重要な水チャネルである AQP3 の発現のていると考えられる。今後この機構の解明が必要である。

変化を調節する物質を検索するために２つの実験モデルをヒト皮膚癌培養細胞はスクリーニングとして有用なので用いた。１つはラットの皮膚であり、もう１つはヒト皮膚癌よく用いられる誘導物質であるデキサメサゾン（ステロイ培養細胞である。ラットの皮膚では DMSO の塗布だけでもドホルモン）、サイクリック AMP、サイクリック GMP にAQP3 の発現がふえたことから剃毛により皮膚が傷付き炎症ついて検討してみたが AQP3 は誘導されなかった。これなどの影響や DMSO による浸透圧の変化が原因として考え

は AQP3 がヒト気管培養細胞 (A549 cells) においてデキサられる。よりヒトに近い毛のはえていない足の裏の皮膚を用メサゾンで誘導されるというこれまでの報告６） と違っていても、ビタミン A による AQP3 の発現誘導がみられたのでいるが、細胞の違いや実験条件の違いを考慮にいれる必要ヒトの皮膚でも同様の結果が期待される。ただ皮膚の R NAがある。今後この細胞を用いて AQP3 を誘導するものがを足の裏の皮膚から十分な量をこわさないでとることは困難

見つかれば、皮膚においても誘導できるかどうか、またそであり、クリオプレスという凍った皮膚をパウダーにする装置れによって皮膚の保湿性が高まるかどうか、また毒性がなと protenaseK 処理を行う事でやっと可能になった。これはいかどうかを検討していく必要がある。

表皮では細胞間結合が強固なため、細胞内に R Na se の活５．総性を抑える lysis buffer が入りにくく、RNA の崩壊を防ぐの括がむつかしいためと考えられる。クリオプレスで機械的にバ皮膚の保湿性に重要な役割を演じる AQP3 の発現をラバラにするだけでなく、proteinase K で化学的にも個々の調節する物質の検索をおこなった。ラット皮膚ではビタミ細胞に分ける事で壊れていない R NA を十分量うることがでン A による AQP3 の発現増加がみられたが、ヒト皮膚癌きると思われる。真皮部分の細胞成分は少ないので RNA は細胞ではビタミン A の AQP3 への影響は認められなかっ

表皮それもケラチノサイトの R NA を反映していると考えられた。この培養細胞はソルビトールによる浸透圧の上昇に応る。従ってより簡便なスクリーニングのシステムが望まれるの

じて AQP3 の発現が増加し、AQP3 の発現を調節する物

で、ヒト皮膚癌培養細胞で AQP3 の発現を調べたところ１つ質のスクリーニングに有用であると考えられる。の cell line で AQP3 が発現しているのを見つけた。この細胞は浸透圧の変化に応じて AQP3 の mRNA だけでなくタン（引用文献）パクも変化させることがあきらかになり、正常のケラチノサイ１） 石橋賢一：水チャネルの構造と機能。医学のあゆみ 201,1077-1082, 2002.

トに近い性質をもっていると考えられる。しかし癌細胞であるので性質が変わっている可能性もあり、結果の解釈に注意

２） Ma T, Hara M, Sougrat R, et al.: Impaired stratumが必要である。とくに薬物に対するレセプターの発現や細胞

corneum hydration in mice lacking epidermal water channel

内シグナリングが変わっていると適切な反応が期待できない。

aquaporin-3. J Biol Chem. 277, 17147-17153, 2002.

それでも AQP3 を増加させる物質のスクリーニングの手始め

３） Hara M, Ma T, Verkman AS.: Selectively reducedとしては簡便であり、タンパクや RNA の抽出が容易でありき

glycerol in skin of aquaporin-3-deficient mice may account

れいな結果がえられるので有用と考えられる。

for impaired skin hydration, elasticity, and barrier
recovery. J Biol Chem. 277, 46616-46621, 2002.

ビタミン A はヒトにおいて皺をへらすことが美容的にも利用されている。従って AQP3 の発現が変化するかど

４） Jun ES, Kim YS, Yoo MA, et al.: Changes in expression

うかは興味あるところである。今回は２４時間という短いof ion channels and aquaporins mRNA during differentiation

時間にもかかわらずビタミン A によって AQP3 の発現がin normal human nasal epithelial cells. Life Sciences 68,827-840, 2001.

増加することがあきらかになった。10％という高用量で変化がみられたのであるが長期にわたれば低用量でも効果が５） Sugiyama Y, Ota Y, Hara M et al.: Osmotic stress up-期待できる。しかし一方で長期になるとビタミン A 直接

regulates aquaporin-3 gene expression in cultured humanの作用だけでなく組織の変化に伴う二次的な影響をみる可

keratinocytes. Bichemica et Biophysica Acta 1522, 82-88,
2001.

能性もあるので解釈はむつかしい。一方培養細胞ではビタミン A の効果が認められなかった。これは癌細胞によっ

６） Tanaka M, Inase N, Fushimi K. et al.: Induction ofて形質が変化しているためでないことは primary culture

aquaporin 3 by corticosteroid in human airway epithelialのケラチノサイトでビタミン A の AQP3 への影響を調べ

cell line. Am J Physiol 273, L1090-L1095, 1997.てみる必要がある。もしケラチノサイトでもビタミン Aの AQP3 への影響が見られないならば、ビタミン A の皮− 70 −