アプリケーションノート

臨床研究

Bond Elut Lipid Extraction とAgilent 6545 LC/Q-TOF を用いた

ヒト血漿のリピドミクス分析

著者Alex Apffel and Limian Zhao
Agilent Technologies Inc.

概要

このアプリケーションノートでは、Agilent Bond Elut Lipid Extraction の 1 mL のカートリッジを用いたヒト血漿リピドミクスサンプル前処理法の新しい固相抽出（SPE）メソッドについて説明します。タン

パク変性沈殿処理の後、血漿サンプルのホモジネートを自然落下溶出用のカートリッジに注入します。

アセトニトリル/水（90:10）で洗浄した後、脂質をジクロロメタン/メタノール （1:2）混合液で溶出しま

す。溶出したサンプルは、Agilent 6545 LC/Q-TOF で分析し、Agilent MassHunter Lipid Annotator
を用いて脂質のプロファイリングをします。ヒト血漿サンプルより、ポジティブモードメソッドで 13 分類から 347 の脂質化合物、ネガティブモードメソッドで 9 分類から 248 の脂質化合物、合計 595 の脂質化合物が検出、同定されました。メソッドの再現性は非常に高く、異なる試験での 3 回以上の繰り返し分析の RSD は 10 % 未満でした。従来の液液抽出（LLE）メソッドと比較して、Bond Elut Lipid

Extraction の SPE メソッドでは、時間と労力が削減され、溶媒の使用量が減少し、サンプルの移動回数が減少し、再現性が向上し、自動化の実現可能性が高くなりました。

はじめにます。EMR Lipid 充填剤の現在のアプリケー

溶液および標準試料

ションは、マトリックス除去に重点を置いていアセトニトリル 99 mL とメタノール 1 mL を混大規模 な研究を扱う分析生化学の分野です。

マトリックスの脂質が除去され、その後の処理

溶液（99:1, v/v）を調製しました。アセトニトと脂質、脂質とタンパク質の間の機能的相互されます。

リピドミクスは、生物系 における脂質分子 のリピドミクス研究 は、生化学系 における脂質作用について新しい知見が得られるため、過去 10 年間 で 注目度 が 高 まりました。リピド

ミクスの研究開発は、液体クロマトグラフィー（LC）、質量分析（MS）、 インフォマティクスなどの分析技術の発展により、急速に促進されました。これに対し、新しい研究の動機や分析能力の高度化により、迅速、簡便、正確、精密 なハイスループットリピドミクスサンプル 前

処理法のワークフローの需要 が高まっています。実現すれば、生物学的研究での大きな成果が期待されます。

リピドミクス 分 析 に 用 いら れてきた 従 来の サンプ ル 前 処 理 法 の ワ ー クフロ ー は、Bligh-Dyer メ ソッド 、Folch メ ソッド 、
1

2Matyash メソッド 、BUME メソッド などの34液液抽出に基づいていました。これらのメソッ

ドは、リピドミクスサンプル前処理法として広ます。EMR Lipid 充填剤との相互作用により合し、変性溶媒 アセトニトリル/ メタノール混合

または 分析のためにターゲット化合物 が分離

リル 90 mL と水 10 mL を混合し、洗浄溶媒

Bond Elut Lipid Extraction の SPE カ ート

クロロホルム 50 mL とメタノール 50 mL を混

リッジにより、EMR Lipid 充填剤をリピドミク
ス試験 のサンプル 前処理 に 使用できるように

アセトニトリル/ 水（9:1, v/v）を調製しました。

合し、溶出溶媒 クロロホルム/メタノール 混合溶液（1:1, v/v）を調製しました。n-ブタノールなります。これにより、脂質が目的の成分とし50 mL とメタノール 50 mL を混合し、再溶解溶

および単離される、新しいアプリケーション領を調製しました。

てその他のサンプルマトリックス成分から抽出域の探索ができます。従来の SPE と同様、充填剤 の「キャッチアンドリリース」機能 がこのアプリケーションに用いられています。脂質化

合物は、最初 EMR Lipid 充填剤に保持され、その 後有機溶媒とともに溶出されます。本研

究では、Bond Elut Lipid Extraction の 1 mLのカートリッジを用 いたヒト血漿リピドミクス

分析のワークフローを実証します。

実験方法

媒 n-ブタノール/メタノール混合溶液（1:1, v/v）

実験装置と材料

本 研 究 は、Agilent Jet Stream エ レ クト

ロスプレーイオンソース 付 き Agilent 6545

LC/Q-TOF、 バイナリポンプから構成 される

Agilent 1290 Infinity II LC、サーモスタット付きマルチウェルオートサンプラ、サーモスタッ

ト付きカラムコンパートメントを用いて実施されました。

サンプル前処理の使用機器は次のとおりです。

く用いられてきたにもかかわらず、時間 がか

材料および試薬•

ピペットとリピーター（エッぺンドルフ、再現性が低いという問題点があります。

メ タ ノ ー ル （MeOH）、 ク ロ ロ ホ ル ム を•

Agilent 加圧式マニホールド SPE

SPE カートリッジを用いた新規 SPE メソッド

シガン州、マスキーゴン）から購入しました。

かり、労力が必要で、自動化が困難であり、

本 研 究 で は、Bond Elut Lipid Extraction

LC/MS グレードのアセトニトリル（ACN）、
Honeywell Research Chemicals （米国、ミ高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレード•

トリッジとプレートは、EMR Lipid 充填剤 のニウムを Sigma-Aldrich（米国、ミズーリ州、•

脂質分子 との 相互作用 を実現します。EMR

準技術研究所（NIST）が供給している標準物

用を組 み合 わせたメカニズムにより、脂質分

Sigma-Aldrich Chemical Company （米国、を、ヒト血漿のリピドミクス分析に導入しました。Bond Elut Lipid Extraction の SPE カー

使用を特徴としており、選択的かつ効率的 な

Lipid 充填剤 は、サイズ排除と疎水性相互作

子と相互作用します。大半の脂質分子の枝分

かれのない長い炭化水素鎖は、EMR Lipid 充

填剤の細孔に選択的に保持され、その他の直鎖状のアシル鎖がない分子は溶液中に留まりの n-ブタノール （n-BuOH）および酢酸アンモ
セントルイス）から購入しました。米国国立標質であるヒト血漿中 の 代謝物 SRM 1950 をミズーリ州、セントルイス）から入手しました。

•
•
•

•

•

米国ニューヨーク州）

カートリッジ 48 本用（PPM-48）（部品番号 5191–4101）

PPM-48 用 1 mL カートリッジラック（部品番号 5191–4102）

PPM-48 用廃液ラックおよび廃液ボトル（部品番号 5191–4112）

Vortexer（VWR 社、米国）

超音波洗浄器（VWR 社、米国）

Agilent Bond Elut Lipid Extraction

カートリッジ、1 mL（部品番号5610-2041）

Agilent InfinityLab Poroshell

HPH-C18、2.0 × 150 mm、2.7 µm

カラム（部品番号 693775-702）

Agilent InfinityLab Poroshell

HPH-C18、3.0 mm カラム、高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）ガード
カラム（部品番号 823750-928）

2

分析条件

LC/Q-TOF 装置の分析条件を表 1 に示します。
抽 出 さ れ た SRM 1950 標 準 血 漿 サ ンプ

表 1. リピドミクス分析に用いる LC/Q-TOF の分析メソッド条件
パラメータ

ル に よ る LC/MS/MS デ ー タ に お い て、

機器のモードウェアによる MS/MS インシリコスペクトルの

ガス温度

MassHunter Lipid Annotator ツールソフト

極性

2 Ghz、拡張ダイナミックレンジ、m/z 1,700
ポジティブおよびネガティブ

250 ° C

照合結果を用いて、特定の脂質 に対してアノ

ドライガス（窒素）密度、ベイジアンスコアリング、非負の最小二シースガス

300 ° C、12 L/分

ライブラリを検索するアルゴリズムを用いてい

ノズル電圧

500 V

ブイオンモードのデータセットが、データ解析

フラグメンタ160 V

Oct 1 RF Vpp

750 V

テーションしました。このソフトウェアは、確率乗法による最適化を組み合わせ、理論的脂質ます。ポジティブイオンモードおよびネガティ
において別々に処理されます。

35 psi

キャピラリ電圧3,500 V (+)、3,000 V (–)

取り込みスピード

ジョン 10.0 を用 いて 識別 されます。それら

自動 MS/MS パラメータ

ル 化 合 物 データベ ースライブラリ（PCDL）

基準補正

MassHunter Profinder ソフトウェアのバー

は、脂質アノテーターで生成されたパーソナと比較して、バッチターゲットフィーチャー 抽

11 L/min

ネブライザガス

LC/MS デ ー タ の 個 々 の 形 状 は、Agilent

設定値

デュアル Agilent Jet Stream イオン源付き Agilent 6545 LC/Q-TOF

MS のみ：3 スペクトル/秒（MS）

自動 MS/MS：3 スペクトル/秒（MS）、4 スペクトル/秒（MS/MS）

選択幅：Narrow（~1.3 amu）

コリジョンエネルギー：20 eV、35 eV

m/z 121.050873(+) と 922.009798(+) の 2 点

m/z 119.036320(–) と 980.016375(–) の 2 点

Agilent 1290 Infinity II LC

出法（BTFE）モードで 識別 されますが、質分析カラム

Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18、2.0 × 150 mm、2.7 µm

必要 とします。得られた 形状 は、 脂質 の 分

カラム温度

60 ° C

Professional バージョン 15.0 にエクスポー

オートサンプラ温度

量 とリテンションタイム（RT）両方 の 基準 を
類 および統計解析 のために、Mass Profiler

トされました。図 1 に、脂質化合物の同定および確認のためのデータ取得およびデータ処理の一般的な模式図を示します。

ガードカラム

注入量

ニードル洗浄移動相
流量

グラジエントプログラム

Agilent Poroshell HPH-C18、3.0 mm、UHPLC ガード
1 μL

5°C

洗浄ポート（1:1 メタノール/イソプロパノール）で 15 秒

A）水/メタノール（9:1, v/v）と 10 mM 酢酸アンモニウムおよび 10 µM メドロン酸
B）アセトニトリル/メタノール/IPA（2:2:6, v/v/v）と 10 mM 酢酸アンモニウム

0.6 mL/min
時間（分）

%B

0.0

55

5.0

57

25.0

100

27.0

100

28.0

55

ストップタイム

30 分

実測カラム圧力300 ～ 600 bar

ポストタイム5分

3サンプル前処理法

1. データベースの構築

タンパク変性沈殿処理（PPT）を用 いて、 その後脂質の抽出、分離、精製のために Bond

Elut Lipid Extraction SPE カートリッジで処理し、ヒト血漿を調製しました。図 2 に、リピ

ドミクス研究 のためのヒト血漿 サンプル 前処

MS/MS

理法の一般的な手順を示します。

100 µL の SRM 1950 血漿 を 2 mL のポリ

プロピレンスナップキャップバイアルに 移し

脂質アノテータ

た 後、900 µL の 氷冷したアセトニトリル/メ

タノール 混合溶液（99:1, v/v）を PPT のた
め 添加しました。チューブのキャップを固く閉め、30 秒間ボルテックスで混合し、その後 10分間氷上で超音波処理しました。氷上で超音波処理することにより、トラップされた脂質が

PCDL

PPT から遊離し、脂質抽出効率が向上します。

DB

Bond Elut Lipid Extraction 1 mL カートリッジをカートリッジの 下 に 廃液リザーバーを備えた PPM-48 の上に配置しました。各サンプ

ルを再び 10 秒間ボルテックスで混合し、ホモ

2. プロファイリングと同定

ジネートをすべて口径が大きいピペットチップ

を用いてピペットでカートリッジに移しました。

サンプルのホモジネートをすべて移すことは、タンパク質沈殿物との一時的 な結合による脂MS 1

質のロスを防ぐために必須です。

Profinder

MPP

図 1. リピドミクス分析のための Agilent 6450 LC/Q-TOF によるデータ取得およびデータ処理

除タンパク処理

除タンパク処理のためアセトニト
リル/メタノール（99:1）を 9:1 の比率で加える

サンプル洗浄サンプルロード
ホモジネートをすべてBond Elut Lipid カート
リッジまたはプレート
に移す

ヒト血漿

アセトニトリル/
水（9:1）で洗浄する

溶出液を捨てる

脂質溶出
クロロホルム/メタノール混合液（1:1）で溶出する

溶出液を捨てる
溶出液を回収する

図 2. Agilent Bond Elut Lipid Extraction 1 mL カートリッジを用いたリピドミクス研究のためのヒト血漿サンプル前処理法のワークフロー

4により、3 ～ 5 秒/ドロップの 流量 で 徐々に

カートリッジ回収試験における総リン脂質（PL）

トロールとして用いました。総 PL ピーク面積

により、 脂 質 化 合 物 と 充 填 剤 の 十 分 な 相

ムで表 2 のメソッドでモニタリングしました。

血漿 と PPT 後 Bond Elut Lipid Extraction

その 後、自然落下 または 低圧（2 ～ 4 psi）
ゆっくりと 溶 出 しました。一 定 の 溶 出 流 量

互 作 用 の 時 間 ができ、 脂 質 は 充 填 剤 に 効
率 よく保 持 され ます。カ ートリッジ 内 に 液

体 が 残ってい な いことを 確 認 し、1 mL のアセトニトリル/水（9:1, v/v）を用 いて 2 ～4 psi の圧力で 2 回の洗浄ステップを実施しました（1 mL を 2 回）。最終的に、高圧（6～ 9 psi）によりカートリッジを 完全 に 乾燥しました。廃液ラックを除去し、 カートリッジの下 に、収集ラックにガラス製遠心分離管を立 てて 置 きました。その 後、必要 に 応じて、

1 mL のクロロホルム/メタノール 混合溶液

は、リテンションの全範囲のデータを手動で統合することにより得られました。PPT のみの総 PL の結果を、Agilent LC/MS/MS システ

SPE で処理をした血漿との間の総 PL ピーク

PPT 後 の 血 漿 サンプル を 遠 心 分 離 し、 上面積を比較し、迅速なカートリッジでの回収に

澄 み を 移 して、 乾 燥 した 後、100 µL の n-

ついて評価しました。

ブタノール/メタノール （1:1, v/v）に 再溶解しました。この サンプル を Bond Elut Lipid

Extraction 処理後のサンプルと比較するコン

表 2. 総リン脂質の結果のメソッドパラメータ
LC セクション

機器

Agilent 1290 Infinity II LC

移動相 A

10 mM ギ酸アンモニウムバッファ + 0.125 % ギ酸

（1:1, v/v）を用 いて自然落下 または 低圧（1カラム

Agilent InfinityLab Poroshell 120、HILIC-Z、2.1 × 150 mm、2.7 µm（部品番号 683775-924）

終的に、高圧（6 ～ 9 psi）により充填剤を完

移動相 B

アセトニトリル/10 mM ギ酸アンモニウム（95:5）+ 0.125 % ギ酸

～ 3 psi）により脂質溶出を 2 回しました。最

全に乾燥しました。溶出液をすべて 30 ° C にて N2 で乾燥させました。

乾燥残渣を 100 µL の n-ブタノール/メタノール（1:1, v/v）に 再 溶 解 しました。サンプル は、
室温で 2 分間 ボルテックスで混合し、さらに10 分間超音波処理しました。上記 の 再溶解

手順は、乾燥脂質残渣を完全かつ均等に再溶解するために重要です。装置に注入するため、ガラスのインサートを取り付けた 2 mL サンプ

グラジエント

時間（分）

0

MPA

MPB

5

95

流量（mL/分）

0.3

1

5

95

0.3

12

60

40

0.3

15

停止

停止

停止

MS セクション

機器

Agilent 6490 トリプル四重極 LC/MS/MS

スキャンセグメント

プロダクトイオン 184 m/z、CE 20 V のポジティブプリカーサイオンスキャン

イオン源

Agilent Jet Stream エレクトロスプレーイオンソース

ルバイアルにサンプルを移しました。また、乾燥させたサンプルを冷凍庫で保存し、後日装置を用いて分析することも可能です。

5

結果と考察効率 を改善しました。メタノールを低 い割合とクロロホルムまたはジクロロメタンの 混合

プし、ホモジネートを移す時にピペットチップ

ることが充填剤から脂質 を遊離させるために物凝固物の生成を防ぎました。ローディングの用することによりさまざまなプラスチックの溶（1 ～ 5 %）で添加することで、脂質 をトラッ

SPE メソッド開発および考察が詰まる可能性がある大型のタンパク質沈殿

Bond Elut Lipid Extraction SPE 手順は、3つの段階から構成されています。それは、充填

出性物質を抽出してしまうのを防ぐために、溶その他のマトリックス共溶出 など、望ましくな

ド」、望ましくないマトリックス成分をよりきれ

出液 の 回収 にはガラスのチューブを使用する

いマトリックス共溶出 が SPE カートリッジをいに除去する「洗浄」、トラップされた脂質をことが重要です。

通過しました。充填剤 は 選択的に脂質を結合回収する「溶出」です。脂質抽出 およびタンするため、高濃度（最大 90 %）の有機溶媒

パク質除去のため、最初にタンパク変性沈殿を含んだ洗浄試薬を使用することによって、よ処理をしました。アセトニトリル/血漿を高比率り効率的に洗浄しマトリックス干渉を除去する（9:1）にすることにより、脂質化合物 の 抽出ことが可能となります。溶出溶媒はメタノール

×107
3

アバンダンス（任意の単位）

重要です。プラスチックを溶出する充填剤を使ステップで、塩や直鎖状のアルキル鎖のない剤に脂質をリテンションさせる「サンプルロー

SRM 1950 血漿LC/MS ポジティブイオン

SM
PC

2
TG, CE

LPC, LPE
1

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

×106
2.0
アバンダンス（任意の単位）

物であり、50 % 以上のメタノールを含んでい

11

12

13

14

リテンションタイム（分）

15

16

17

18

19

20

22

23

1.5

25

Cer
PG,PE,PI

0.5

0

SM

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

リテンションタイム（分）

15

16

17

18

19

20

21

22

23

図 3. Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE メソッドによるヒト血漿中の 11 分類の脂質化合物のポジティブおよびネガティブ抽出イオンクロマトグラム

624

SRM 1950 血漿LC/MS ネガティブイオン

FA, FAHFA

1.0

21

24

25

ヒト血漿リピドミクス分析

図 3 に、ヒト血漿中の主要な分類の脂質化合物を同定するポジティブモードおよびネガティ

LC/MS ポジティブモード

ブモードでの抽出イオンクロマトグラム（EIC）

Cer
5%

を示します。図 4 に、総ピーク強度から同定された 脂質化合物 の 分布 を脂質 の 分類 に 基

づき示します。ポジティブモードおよびネガティ

ブモードの結果 は、繰り返し分析のために調

PE
4%

CE
2%

SM
11%
PC
41%

製した 3 サンプルそれぞれについて、LC/MS

での繰り返し分析を 3 回実施し、同定された脂質化合物 の 分布 に 基 づいた 結果 の 平均です。同定された脂質化合物には、次のような分類の脂質がありました。

•

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

アシルカルニチン（Acar）

LPE
18%

グリセロホスホコリン（PC）

グリセロホスホエタノールアミン（PE）

TG
19%

グリセロホスホイノシトール （PI）
グリセロホスホセリン（PS）

グリセロホスホグリシン（PG）

リゾグリセロホスホコリン（LPC）

LC/MS ネガティブモード

リゾホスホエタノールアミン（LPE）

SM
5.9%

スフィンゴミエリン（SM）
セラミド（Cer）

コレステロールエステル （CE）
ジアシルグリセライド（DG）

トリアシルグリセライド（TG）

PE
6.1%

PI
3.0%

PS
2.3%

FAHFA
0.01%

LPC
6.8%

Cer
36.0%

脂肪酸（FA）

ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（FAHFA）

遊離コレステロールを除き、同定された脂質

FA
13.0%

化合物の分類の分布 は、SRM 1950 の標準的 な分布と同等でした5。コレステロールなどの遊離ステロールは、長い直鎖状のアルキル

PC
26.9%

鎖がないため、EMR Lipid 充填剤に効率的に保持されません。

図 4. 総ピーク強度に基づいた脂質の分類により同定された脂質化合物の
分布の概要

7

表 3 に、同定された血漿中の脂質化合物の数

位間統計検定を用いて少量しか存在しない化のポジティブモードおよびネガティブモードで分位数 – 1.5 × 四分位範囲、>第 3 四分位数と、Bond Elut Lipid Extraction SPE メソッドの 各分類 の 平均総 ピーク面積 を示しました。

ヒト血漿サンプルより、ポジティブモードで 13

合物 および異常値 を削除しました（<第 1 四+ 1.5 × 四分位範囲）。同定された残りの脂質化合物の総ピーク強度の %RSD を計算しまし分類から 合計 347 の脂質化合物、ネガティ

た。装置に注入する繰り返し分析の RSD% は、同定されました。総ピーク面積強度 は、 ポジ

4.3E+07 でした。

ブモードで 9 分類から 248 の脂質化合物 がティブモードで 1.1E+09、ネガティブモードでさらに、装置への 3 回の注入用にそれぞれ調製されたサンプルを用いて 3 回の繰り返し分析を実施することによって、メソッドの再現性を評価しました。同定された 脂質化合物 の 数とピーク面積を評価に用いました。同定されたすべての脂質化合物をフィルタリングし、四分装置のメソッドの再現性を示しており、サンプ

表 3. Agilent Bond Elut Lipid Extraction SPE

メソッドによるヒト血漿中の同定された脂質化合物とピーク強度の概要
モード

分類

脂質の数

総ピーク面積4.5E+08

PC

93

ル前処理法の繰り返し分析の RSD% は、ワー

TG72

2.1E+08

LPC

44

2.0E+08のメソッドの再現性は 6.4 % であり、ワークフ

SM50

1.2E+08

Cer

18

5.8E+07

クフロー 全体 の 再現性 を示しています。装置

ロー全体の再現性は 9.4 % でした。この結果

により、Bond Elut Lipid Extraction メソッド
は、ワークフローの大幅 な変動がない、整合性 において優秀 なサンプル 前処理法であるこポジティブとが示されました。

PE

6

4.5E+07CE

19

2.4E+07

DG

20

1.4E+06ACar

17

8.0E+05LPE

2

3.2E+05

PI

3

4.4E+04PS2

2.1E+041

9.9E+03

PG
合計

ネガティブ

合計

8

同定された

347

1.1E+09

Cer

47

1.5E+07PC

89

1.2E+07FA

5

5.6E+06LPC

7

2.9E+06PE

52

2.6E+06SM

26

2.5E+06

PI

16

1.3E+06PS

5

9.9E+05FAHFA

1

5.3E+03248

4.3E+07

カートリッジでの総リン脂質回収

図 5 に、PPT および SPE メソッドにより調製比較して、高いアバンダンスを示しました。こリン脂質は、血漿など生体のマトリックスにおされたサンプル中の総 PL のクロマトグラフののことは、ホモジネートサンプルをすべて SPEのため血漿中の PL はリピドミクスの一部分とンプルクロマトグラムの 結果比較 においてわラップされた特定 の脂質 が 回収されたことをロダクトイオン 184 のプリカーサイオンスキャが示されました。リテンションタイム（RT） 0

総ピーク面積によると、総 PL 回収率は 143

結果比較を示しました。全体として、2 つのサ

ける重要な脂質のグループの 1 つであり、そずかな違いが認 められるものの、高い類似性して重要です。血漿抽出物からの総 PL は、プ～ 3.5 分の範囲内でのピーク強度では、SPEンにより簡単にモニタリングすることができま

抽出したことにより、タンパク質沈殿物中にト示しています。この RT 範囲内で統合された% でした。Bond Elut Lipid Extraction SPE

す。したがって、本メソッドは、カートリッジでメソッドは、PPT のみのメソッドと比較して、メソッドと PPT のみのメソッドの 統合した 総として使用されました。さらに、本試験の目的

リッジでのわずかなロスがあることが 示され

総 PL 回収率は 102 % でした。この迅速な比短い LC システムグラジエントを用いたカラム

ク面積によると、総 PL 回収率 は 90 % でしを最小限に抑えるために、HILIC クロマトグラ

では、SPE メソッドは、PPT のみのメソッドとわずかに 下回るアバンダンスを示し、 カートの総リン脂質回収の迅速かつ簡便な評価方法

ました。
この RT の範囲内で統合された総ピーにおいて PL 分離 は 重要ではなかったため、た。RT 3.5 ～ 15 分の範囲内でのピーク強度

での高速溶出と、カラムでのキャリーオーバー
フィーを用いました。

A ×102

Counts (%)

1.0

ピーク面積 の 比較 によると、RT 全範囲での較により、SPE プロセスにおいてわずかな PLのロスがあること、そして SPE の手順によりタンパク質沈殿物によりトラップされた脂質の一部を回収できることが明らかとなりました。

* 2.1531148480639

1

1

0.8
0.6
0.4
0.2
0

B ×102

Counts (%)

1.0* 1.6991096104566

1

1

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5

Acquisition time (min)図 5. プロダクトイオン 184 のプリカーサイオンスキャンを用いた総リン脂質の結果比較。
（A）PPT により調製され、Bond Elut Lipid Extraction SPE メソッドで処理された
血漿サンプル。
（B）PPT のみにより調製された血漿サンプル

9

ワークフローおよびマトリックス
クリーンアップの簡素化

リピドミクスサンプル 前処理法 に 用 いられる

従来 の 液液抽出メソッドと比較して、Bond

Elut Lipid Extraction SPE メソッドは 大 幅にワークフロー全体を簡素化し、時間および労力を節約できます。液液抽出メソッドでは、
脂質抽出効率を改善し、塩などの望ましくないサンプルマトリックス共溶出 を除去するため、通常繰り返し抽出します。この 手順 は、

相分離、有機層の移動、サンプルの乾燥などの複数のステップから成り、時間と手間 がかかります。また、 エラーや成分ロスの可能性

Bond Elut LE による抽出後のサンプルの乾燥残渣

図 6. Bond Elut Lipid Extraction メソッドおよび PPT 抽出のみで調製されたサンプルのが 高 まります。Bond Elut Lipid Extraction

サンプル乾燥残渣の状態

アセトニトリル/水（90:10）などの 相対的 に化合物 との 選択的相互作用 が 生じるため、結論

ディングおよび洗浄 のステップにおける、 サ

いた簡単、かつ信頼性の高い SPE メソッ
堅牢、

メソッドで は、EMR Lipid 充 填 剤 に 脂 質

強 い洗浄液 を使用することになります。ロー

Bond Elut Lipid Extraction カートリッジを用

ンプルマトリックスでは 特 に 望 ましくない 塩

ドがヒト血漿リピドミクス分析のために確立さが効率的かつ簡便に洗浄されます。図 6 に、ノンターゲットリピドミクス分析のために、同PPT 抽出のみで調製したサンプルのサンプルにおいて驚異的 な脂質同定 ができることが実や長 い脂肪族鎖 を持 たないその 他 の 夾雑物

Bond Elut Lipid Extraction メソッドおよび乾燥残渣 を示します。SPE メソッドは、PPT

抽出後、大幅なマトリックスクリーンアップを可能にすることが示されました。

PPT のみによる抽出後のサンプルの乾燥残渣

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れました。SPE メソッドにより、ヒト血漿中の定された脂質化合物の数とピーク強度の両方証されました。また、総リン脂質回収の迅速な評価により、カートリッジでのわずかなリン脂質のロスがあることが明らかとなりました。従来の液液抽出メソッドと比較して、SPE メソッ

ドにより、大幅な時間と労力の節約ができ、さらに再現性も向上しました。また、本メソッド
により、96 ウェルプレートを用いたハイスルー

プットのサンプル前処理法の開発の可能性 が示されました。

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