実験プロトコール 013
リガンド固定化ビーズを使用したスクリーニング(リガンド結合タンパク質のアフィニティ精製) ドラッグエリューション
1. 準備するもの
1.1 リガンド固定化ビーズ、タンパク質溶液
・リガンド固定化ビーズ
リガンド固定化量を変化させたビーズ各0.5 mg
リガンド固定化量以外の条件を検討する場合 (タンパク質濃度、結合・洗浄バッファー塩濃度、など) は、0.5 mg×条件検討数
・タンパク質溶液
タンパク質濃度5～15 mg/mL (調製上無理な場合はこの限りではない。)
結合・洗浄バッファーにて希釈 (通常、タンパク質濃度1 mg/mL) して使用する。
必要量は200 µL×条件
・リガンド (ドラッグエリューション用)
1.2 試薬・2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)
・水酸化ナトリウム (NaOH)
・塩化カリウム (KCl)・塩化マグネシウム (MgCl2)
・塩化カルシウム (CaCl2 )・エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) ・グリセロール (グリセリン)
・ノニデットP-40 (NP-40)
・フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)
・ジチオスレイトール (DTT)・ジメチルスルホキシド (DMSO) ・サンプルバッファー (4×dye)
・電気泳動 (SDS-PAGE) 用ゲル ・電気泳動用バッファー・銀染色試薬1.3 機器・微量高速冷却遠心分離機
・卓上遠心分離機 (スピンダウン用)・磁石スタンド(多摩川精機TAB4899N12など)
・ローテーター・ヒートブロック・スラブゲル電気泳動装置
2. 方法
2.1 試薬溶液調製
1) 2×100 mM KClバッファー (500 mL)：2.5 M KCl 40 mL、グリセロール 126 g、1 M HEPES-NaOH溶液(pH 7.9) 20 mL、1 M MgCl2溶液 1 mL、1 M CaCl2溶液 200 µL、0.5 M EDTA溶液 (pH 8.0) 400 µL、10%NP-40溶液 10 mLを混合し、超純水にて500 mLまでメスアップする。(フィルターろ過後、室温保存)
2) 100 mM KClバッファー：超純水 25 mL、2×100 mM KClバッファー25 mLを混合する。
使用前に1 M DTT溶液 50 µL、1 M PMSF溶液を10 µL添加する。
3) 1 M DTT溶液：DTTを超純水に溶かし、1 M溶液を作製する。(-20℃保存)4) 1 M PMSF溶液：PMSFをDMSOに溶かし、1 M溶液作製する。(-20℃保存)5) ドラッグエリューション用溶出液：リガンドをDMSOに溶かし、100 mM溶液、500 mM溶液を作製する。結合・洗浄バッファーでDMSO濃度が1 %となるように希釈し、0 mM、1 mM、5 mM溶液を作製する。(各30 uL使用する。)
結合・洗浄バッファー (100mM KClバッファー) の組成
20 mM HEPES-NaOH（pH7.9）, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, 0.2 mM EDTA, 10%(v/v) glycerol,0.1% NP-40, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF
4×dye溶液の組成（和光純薬工業㈱：191-13272）
0.25 M Tris-HCl（pH 6.8）, 0.02% BPB, 8% SDS, 40% glycerol, 20% 2-メルカプトエタノール

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2.2 手順
1) 100 mM KClバッファーを準備し、氷上に置く。
2) 氷上にてタンパク質溶液を100 mM KClバッファーにて目的の濃度 (1 mg/mL、3 mg/mL等) に調製する。
3) 1.5 mLマイクロチューブに分注し、遠心分離 (15,000 rpm、4℃、30分以上) を行い不溶物を除く。
(遠心分離後のタンパク質溶液の上清を別のチューブへ回収する。)
4) 上記遠心分離中に、リガンド固定化ビーズを1.5 mLマイクロチューブへ0.5 mg量りとる。
(ビーズは事前に十分に分散させておき、均一な懸濁液とする。)
5) 100 mM KClバッファーを200 µL加え、ビーズを分散させる。
6) スピンダウン後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。
7) 5)～6)を更に2回繰り返す。(バッファーによるビーズの洗浄を計3回行う)
8) 上清を廃棄したビーズの入っている1.5 mLマイクロチューブへ遠心分離後のタンパク質溶液を200µLずつ添加し、分散させる。
9) 4℃で、ローテーターにて攪拌しながら4時間結合反応を行う。
10) 4時間後、スピンダウンし、磁気分離を行い、上清を廃棄する。
11) 100 mM KClバッファーを200 µL加え、ビーズを分散させる。
12) スピンダウン後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。
13) 11)～12)を更に2回繰り返す。(バッファーによるビーズの洗浄を計3回行う)
14) 上清を廃棄したビーズへドラッグエリューション用溶出液を30 µL加え、分散させる。
(0 mM、1 mM、5 mMの3種類行う。)
15) 氷上に1時間静置 (時々軽くタッピング) にて溶出させ、スピンダウン後、磁気分離を行う。
16) 上清 (ドラッグエリューションサンプル) を別の1.5 mLマイクロチューブへ回収する。
17) 残ったビーズへ1×dye溶液を40 µL加え、分散させる。
18) ドラッグエリューションサンプルへは4×dye溶液を10 µL加え、混合する。
19) ビーズ分散液、ドラッグエリューションサンプル共に98℃にて5分間加熱を行う。
(ヒートブロックを使用する。)
20) ビーズ分散液をスピンダウンし、室温で磁気分離を行う。
21) 上清（加熱溶出サンプル）を別の1.5 mLマイクロチューブへ回収する。(ビーズは廃棄する)
22) 電気泳動 (SDS-PAGE) へ進む。(または-20℃冷凍庫にて保存する)
23) ドラッグエリューションサンプル、加熱溶出サンプルをそれぞれ電気泳動 (SDS-PAGE) する。
(例：各10 µL)24) 泳動後のゲルを銀染色し、結果を解析する。

3. 捕足・ビーズの分散は、ガリガリ法にて行うと容易に分散できる。
(この際、チューブの蓋が開かないようにキャップロックを用いることが望ましい。)（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

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・磁気分離は、氷上に・磁気分離は、氷上に磁石スタンドを置いてスタンドを置いてスタンドを置いて5分以上行行う。

磁気分離前

磁石スタンド

磁気分離後・タンパク質溶液はタンパク質溶液はタンパク質溶液はDignam法にて調製した細胞質画分（または核画分法にて調製した細胞質画分（または核画分、膜画分）を使用することを法にて調製した細胞質画分（または核画分）を使用することを推奨）を使用することを推奨するする。(参考文献：
参考文献：J.D.Dignam,
J.D.Dignam, R.M.Lebovitz, and R.G.Roeder, Nucleic Acids Res
Res. 11, 1475 (19831983))
但し、
但し、Dignam法は細胞数が非常に多く法は細胞数が非常に多く（法は細胞数が非常に多く（>109 Cells））必要となる。
。小スケールで実施の場合は、小スケールで実施の場合は、NP-40
小スケールで実施の場合は、 40
lysis
lysis法、市販の細胞抽出液調製試薬も法、市販の細胞抽出液調製試薬も使用可能
法、市販の細胞抽出液調製試薬も使用可能。
・ドラッグエリューション時のリガンド濃度
ドラッグエリューション時のリガンド濃度
ドラッグエリューション時のリガンド濃度1 mM、55 mM (リガンド量リガンド量3030 nmolnmol、150 nmol)) は、ビーズへ固定化されている推定のリガンド量（へ固定化されている推定のリガンド量（33 nmol/0.5 mg）の10倍からmg倍から50倍程度となるように設定してい倍程度となるように設定している。
る。(通常、リガンドの固定化量はビーズ
通常、リガンドの固定化量はビーズ
通常、リガンドの固定化量はビーズ1 mg当たり、当たり、1～10 nmol程度が最適です。
nmol程度が最適です。)
推定固定化リガンド量の推定固定化リガンド量の2倍程度倍程度 (0.20.2 mMmM) でも結合タンパク質が溶出される場合もある。
・結合タンパク質の溶出が確認できない場合は、リガンド濃度を増加させる。
結合タンパク質の溶出が確認できない場合は、リガンド濃度を増加させる。
リガンドがリガンドがDMSODMSOに溶け難いためリガンド濃度を増加できない場合は、バッファー希釈時のに溶け難いためリガンド濃度を増加できない場合は、バッファー希釈時のに溶け難いためリガンド濃度を増加できない場合は、バッファー希釈時のDMSO濃濃度を度を5%まで上げてリガンド量を多くする。
まで上げてリガンド量を多くする。

4. 注意事項
・ビーズへ混合する前の細胞抽出液の遠心分離は必ず行
・ビーズへ混合する前の細胞抽出液の遠心分離は必ず行う。遠心分離を行わないと、凍結融解等により。遠心分離を行わないと、凍結融解等により生じた不溶性画分が生じた不溶性画分が系中に残存残存し、バックグラウンドの原因とし、バックグラウンドの原因となるし、バックグラウンドの原因となる。
・ビーズは遠心分離でなく、磁気分離で回収・ビーズは遠心分離でなく、磁気分離で回収する。遠心分離を行うと、反応中に生じたタンパク質の不。遠心分離を行うと、反応中に生じたタンパク質の不溶性画分も溶性画分もビーズとビーズと一緒に回収し一緒に回収してしまいてしまい、バックグラウンドの原因となる、バックグラウンドの原因となる、バックグラウンドの原因となる。
・洗浄、溶出等で洗浄、溶出等でビーズを分散させる際は塊が無いことを確認
ビーズを分散させる際は塊が無いことを確認
ビーズを分散させる際は塊が無いことを確認するする。確実に分散していないと。確実に分散していないと洗浄が不。確実に分散していないと洗浄が不十分となり、十分となり、非特異的なバンドが非特異的なバンドが出現しやすくな非特異的なバンドが出現しやすくなる。
。
・ケラチンのコンタミ・ケラチンのコンタミを防ぐため、手袋を着用して実験を行を防ぐため、手袋を着用して実験を行を防ぐため、手袋を着用して実験を行う。
以上

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