加齢に伴う皮膚 17 型コラーゲン切断動態の解析

北海道大学病院皮膚科

西 江

渉

Bullous pemphigoid (BP) is the most common autoimmune blistering disorder, which affects elderlies. IgG
autoantibodies from BP patients target the transmembrane collagen XVII (COL17), a major component of hemidesmosomes
in basal keratinocytes. Hemidesmosomes plays a vital role for keeping stable adhesion between the dermis and theepidermis, thus, autoimmunity to COL17 results in blistering phenotype. However, the pathogenesis for breaking thetolerance to COL17 is still uncertain. The major epitopes for IgG autoantibodies from BP patients are clustering within thejuxtamembranous non-collagenous (NC) 16A domain, and interestingly, extracellular domain of COL17 is physiologicallycleaved within the NC16A domain. In addition, certain autoantibodies from BP patients preferentially react with theshed ectodomain but not with the full-length form. Furthermore, cleavage of COL17 can induce neoepitopes around thecleavage-sites on the NC16A domain. These findings suggest the ectodomain shedding of COL17 is closely related withthe development of autoimmunity to COL17, and non-physiological ectopic cleavage of the molecule due to aging may berelated with the autoimmunity development. To address these issues, we tried to identify non-physiological cleavage sites
within the NC16A domain and to produce a novel cleavage site-specific antibody which can detect the non-pathologicalcleavage site. We first identified Ser508 to be N-terminal cleavage site of COL17 ectodomain which is cleaved by plasmin,a potential serine protease expressing in lesional skin as well as blister fluid of BP. Second, we generated rabbit antibodies
which specifically target pathological N-terminal cleavage site of cleaved COL17 ectodomain by immunizing short peptides
corresponding to the identified cleavage site. The antibody demonstrated that COL17 is cleaved at Ser508 in lesional skin ofsome BP patients, however, the cleavage was not observed physiological setting even aged skin.

１．緒

メイン内で切断することも報告されている 5）。従ってプラ

言

スミンによる COL 17 の切断部位が判明され、同部位に対水疱性類天疱瘡（bullous pemphigoid、BP）は、高齢者する切断部特異抗体の作成が出来ると、BP の病変部に於に好発し、自己免疫性水疱症のなかで最も頻度の高い疾患

ける COL 17 の非生理学的切断の有無が明らかになる可能である。BP 患者 IgG の多くは、表皮真皮境界部に存在す性が高い。更に、切断部が判明すると切断部を特異的に認る 17 型コラーゲン（COL 17）の細胞膜近傍の NC 16 A 領域識する抗体を作成することが可能となるため 1）、加齢に伴に強く反応する。近年、申請者らは COL 17 の NC 16 A 領

い COL 17 が非生理学的部位で切断されるかどうかについ

域内で COL 17 の細胞外領域が生理的に切断され、切断後ても解明可能となる。BP は高齢者に好発する疾患である

1）に新しい抗原エピトープが生じることを明らかにした 。

ため、BP の発症機序解明に迫る可能性がある。

従って、COL 17 の切断は、BP における自己抗体の発症に

本 研 究 の 目 的 は、COL 17 の 切 断 部 特 異 抗 体 を 用 い、大きく関与することが予想されるが、その病態生理は未だCOL 17 の切断によって生じる抗原エピトープの出現と BP十分に解明されていない。生理的な条件下では、COL 17との関連について解明することである。本研究の特徴は、は ADAM 9、10、17 によって NC 16 A ドメイン内の複数個

各種年齢の皮膚における COL 17 の切断動態を解明し、高2 , 3）

、申請者らは、BP の水疱内容液中に齢者皮膚の一部において、BP 病変部と同様に COL 17 が切含まれるセリンプロテアーゼによって生理的切断部とは異断され、切断部に新規エピトープが生じているかを明らか

所で切断されるが1）なる部位で切断を受ける可能性を示した 。しかし、実際にする点である。の BP 病変部で、生理学的切断部位と異なる部位で COL 17２．実が切断されているかは不明である。一方、BP の病変部では、プラスミンの発現が亢進していることが知られており 4）、実際に、プラスミンが COL 17 の細胞外領域を NC 16 A ド2 .1験

プラスミンによるCOL17の切断部位の同定

FLAG タグを組み込んだ COL 17 A 1 cDNA を pcDNA 5 /FRT ベクター（Invitrogen）へ導入し、pOG 44 ベクターと共に Flp-In 293 細胞へコトランスフェクション後、ヒグロマイシンによって安定発現株をクローニングする。安定発

Non-physiological cleavage of collagen ⅩⅦ
in aged skin
Wataru Nishie
Department of Dermatology, Hokkaido
University Hospital

現株細胞に COL 17 が正しく発現していることを、ウェスタンブロット等にて確認後、ライセートタンパクから、FLAG に対するマウスモノクローナル抗体（M 2、Sigma）を用い、アフィニティー精製する。精製された全長のリコ− 139 −コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ンビナント COL 17 タンパクをリコンビナントプラスミン

これまで申請者が作成した生理的な COL 17 の切断部位をで消化し、SDS-PAGE を行い、COL 17 の細胞外領域に該特異的に認識する抗体を用い 1）、各種年齢の正常ヒト皮膚当する 120 kD のバンドをクマシー染色後に切り出し、トを染色し、BP の病変部と同様の病的な切断が年齢や部位リプシンで処理後、マススペクトロメトリー（nano - LC/特異的に生じているか検討する。

LC - MS）にて切断部を同定する。その際、トリプシン処理

３．結によって生じるアミノ末端断片とプラスミンによって生じた断片を鑑別する目的で、SDS - PAGE 施行直前にサンプ

3 .1

果

プラスミンによるCOL17の切断部位の同定

ル 中 の 全 タ ン パ ク の ア ミ ノ 末 端 を ア セ チ ル 化 し（Sulfo

リコンビナント COL 17 は、抗 FLAG 抗体によって極め

NHS - Acetate、Pierce）、nano - LC/LC - MS 結 果 を Mascotて高純度に精製できた。コラーゲンは３本鎖を形成するが、で解析する際、アセチル化条件でペプチド配列を算出する 1）。

精製 COL 17 は非還元状態では 540 kD（180 kD× 3 本）、還元状態では 180 kD 付近に一本鎖として確認出来た（図１）。

2 . 2 プラスミン切断部位に対する切断部特異抗体の作成

さらに精製リコンビナント COL 17 をプラスミンで処理す同定された切断部から８アミノ酸程度のペプチド（シスると、COL 17 の細胞外領域に相当する 120 kD と 97 kD のテインを C 末端に結合）を合成し、MBS を用い KLH に共断片を生じることを確認した（図１）。120 kD の切断断片有結合後、抗原として２匹の兎へ免疫する。抗原ペプチドを切り出し、マススペクトロメトリーで解析したところ、

カ ッ プ リ ン グ ア ガ ロ ー ス を 作 成 し（SulfoLink Coupling

生理的切断部位とは異なる、NC 16 A 領域内の 508 番目セResin and immobilization kit、Pierce）、得られた抗血清リン（Ser 508）のアミノ末端で切断されることが判明した。

から切断部位特異抗体をアフィニティー精製する。得られCOL 17 タンパクおよび正常ヒト皮膚を基質として用い、3 . 2 プラスミンによって生じる切断部に対する特異抗体の作製それぞれウェスタンブロットと蛍光抗体法で確認する。最Ser 508 から８アミノ酸のペプチドを合成し、２匹の野兎後に、得られた切断部特異抗体を用い、各種年齢の正常ヒへ免疫した。抗原ペプチドカップリングカラムによってアト 皮 膚 を 染 色 し、BP の 病 変 部 と 同 様 の 病 的 な 切 断 がフィニティー精製した切断部特異抗体は、プラスミンによCOL 17 に生じているかについて検討する。って消化された COL 17 断片に反応することをウェスタンた 切 断 部 特 異 抗 体 の 特 異 性 は、 プ ラ ス ミ ン 消 化 し たブロットで確認した。次に、凍結正常ヒト皮膚切片を薄切

2 . 3 各種切断部特異抗体を用いた COL17の切断動態の解明
プラスミンによって切断された切断部特異抗体に加え、切片上でプラスミンと反応させ、作成した切断部位特異抗体で染色したところ、表皮真皮間境界部に線状に沈着することを確認した（図２）。

図１ 精製 COL17 は非還元状態では 540kD（180kD×3 本）、還元状態では 180kD 付近に一本鎖として確認出来た（A、矢印）。さらに精製リコンビナント COL17 をプラスミンで処理すると、COL17 の細胞外領域に相当する 120kD と 97kD の断片を生じた（B、赤矢印）。

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加齢に伴う皮膚 17 型コラーゲン切断動態の解析

図２ 凍結正常ヒト皮膚切片を薄切切片上でプラスミンと反応させ、作成した切断部位特異抗体で染色したところ、表皮真皮間境界部に線状に沈着することを確認した。上方の配列は、プラスミンによる切断部位を図示した COL17cDNA 中の NC16A 領域のアミノ酸配列。下線：抗原ペプチド。

3 . 3 各種切断部特異抗体を用いた COL17の切断動態の解明ることが予想される。BP は高齢者に好発するため、高齢新たに作成した抗体は、COL 17 の非生理学的な切断部したが今回の研究では確認出来なかった。しかし BP は一を正しく認識することが判明した。この抗体を用い BP の部に高齢者に生じる疾患であり、一部の皮膚で COL 17 の病変部皮膚を観察した結果、15 例中４例の病変部におい非生理的切断が生じるだけで COL 17 に対する自己免疫反て非生理的な切断が生じていたことが判明した。一方、10応が誘発される可能性も想定される。今後、更なる研究に例の 80 歳以上の高齢者（正常部）皮膚において同様に検討

よって BP が高齢者に好発する機序が解明されることが期した結果、いずれの検体でも非生理的な切断は認めなかっ待される。

者皮膚において非生理的な切断が生じている可能性を検討た。

４．考（引用文献）

察１）Nishie W, Lamer S, Schlosser A, Licarete E, Franzke

BP は、IgG クラス自己抗体が自己抗原である COL 17 にC W, Hofmann S C, Jackow J, Sitaru C, Bruckner-結合し、補体活性化に伴う炎症反応の惹起により発症する

Tuderman L: Ectodomain shedding generatesと考えられているが、自己抗体が生じるメカニズムは未だ

Neoepitopes on collagen XVII, the major autoantigen

不明である。本研究により、COL 17 はプラスミンによっfor bullous pemphigoid, J Immunol. 185 ., 4938 - 4947 ,て NC 16 A ドメイン内の生理学的部位とは異なる箇所で切2010 .

断を受けることが明らかになった。同定された切断部に対２） Franzke C W, Tasanen K, Schacke H, Zhou Z,する抗体（切断部特異抗体）の作成にも成功し、実際の BP

Tryggvason K, Mauch C, Zigrino P, Sunnarborg

患者皮膚においても病変部特異的な切断が COL 17 で生じS, Lee D C, Fahrenholz F, Bruckner-Tuderman L:ていることが本研究によって解明された。BP の病変部特Transmembrane collagen XVII, an epithelial adhesion

異的な COL 17 の切断は生理的条件下では生じないため、

protein, is shed from the cell surface by ADAMs,

健常人で生じると、同切断部への自己免疫反応が惹起されEMBO J., 21 , 5026 - 5035 , 2002 .

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コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014３）Franzke C W, Bruckner-Tuderman L, Blobel C P:
Shedding of collagen XVII/BP 180 in skin depends on
both ADAM 10 and ADAM 9 , J Biol Chem., 284 , 23386 -fluid indicates plasmin generation in lesional skin, JClin Invest., 92 , 978 - 983 , 1993 .
５） Hofmann S C, Voith U, Schonau V, Sorokin L,
Bruckner-Tuderman L, Franzke C W: Plasmin plays

23396 , 2009 .
４）Kramer M D, Reinartz J: The autoimmune blistering

a role in the in vitro generation of the linear IgA

skin disease bullous pemphigoid. The presence ofdermatosis antigen LADB 97 , J Invest Dermatol., 129 ,plasmin/alpha 2 -antiplasmin complexes in skin blister1730 - 1739 , 2009 .

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