皮膚マトリクスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase：MMP）-9
遺伝子過剰発現マウスの作成とその解析
帝京大学医学部ちば総合医療センター皮膚科

小 林

孝 志

The skin surrounding the whole body maintains the homeostasis by the tissue metabolism both in the normal status
and in the inflammatory conditions. Among many species of matrix metalloproteinase (MMP), two kinds of gelatinase,
MMP-2 and MMP-9 are known to cleave not only denatured collagen, named as gelatin, but also other not a few matrix
components such as fibronectin, elastin, and type IV and VII collagens and pro-form of cytokines including tumor necrosis
factor (TNF)-a and transforming growth factor (TGF)-b to be activated. In comparison with MMP-2, MMP-9 is known to be
induced in the case of inflammatory stimuli and plays important roles for such tissue metabolism including tumor invasion,
blister formation, dermatitis, apoptosis by ultraviolet irradiation, and keratinization. For example, MMP-9 null micereportedly show no blister formation on the experimental model of bullous pemphigoid and they also manifest very low levelof keratinization on the squamous cell carcinoma. This study was aimed to determine the effects of overexpression of MMP9 in the skin.

１．緒

様々な基質が報告されており 7）、MMP- 2 と MMP- 9 は組織

言

代謝で重要な役割りを果たすことが示唆されるに至ってい

生体で働く組織代謝酵素には様々なものがあり、細胞る 1 −3）。

外 マ ト リ ク ス（extracellular matrix：ECM）代 謝 に 関 与

皮膚では、真皮の線維芽細胞は専ら MMP- 2 を、表皮するものも多く存在する。これらには、架橋を司る lysyl

角化細胞は MMP- 2 と MMP- 9 を分泌することが解明されoxidase など ECM 成分を合成しいわゆる同化作用を有すているが 1 −3，8）、これら両酵素により、前駆体が分解さる酵素群、一方、ECM 成分を専ら分解することに働き異れたあと、TNF-a などのサイトカインの刺激でさらに特化作用を有する酵素群、に大別される 1−3）。後者の代表的に MMP- 9 発現が亢進することが知られている 9 , 10）。実際、なものが、matrix metalloproteinase（MMP）群の酵素で皮膚の炎症疾患の代表的な湿疹・皮膚炎皮膚での MMP- 9

ある

1−3）

の発現亢進を確認している 11）。このように MMP- 9 は発現。

MMP 群の酵素は、脊椎動物では、1960 年代、おたまじ

誘導されやすい酵素であり、これは MMP- 9 遺伝子プロ

ゃくしが尻尾を自己消化して蛙になる際の尻尾から発見

モーターに MMP- 2 にはない TATA box が存在するなど、された酵素、collagenase に端を発し
類以上の酵素が報告されている

1− 4）、現在まで 20 種

1−3）

。これらはすべて別々

様々な発現調節領域が存在することによって裏付けられている 1 , 12 , 13）。

の遺伝子によりコードされたアミノ酸による蛋白質であ2）

これまで、遺伝子改変による MMP- 9 発現制御についてるが、相同性を持っている 。なかでも MMP- 2 と MMP- 9の動物モデルを用いた検討では、MMP- 9 欠失マウスを用

は gelatinase として知られ、元々は変性コラーゲンである

い、骨髄細胞由来 MMP- 9 が水疱の形成に関わる炎症に関gelatin を分解する酵素として発見、命名された

1−3）

与するという報告 14 , 15）などがある。しかし、表皮角化細。

しかし 1980 年代後半に、基底膜に特異的に存在する IV
型コラーゲンや VII 型コラーゲンを含め、ファイブロネク

胞由来 MMP- 9 を過剰発現させた報告はなく、本研究は、その検討を行うために企画された。

チンやエラスチンなど他の複数の ECM 蛋白を分解するこ

２．実と 5，6）、 ま た 最 近 は、tumor necrosis factor（TNF）-a な
どのサイトカインの前駆体分子を分解して活性化するなど

２.１

験

遺伝子改変マウスMMP- 9 発現ベクターの取得

米国 Genecopoeia 社の EX-Mm 03900 -M 02 を使用し、また以下の 8 種の PCR primer、
ATG-F：ATGAGTCCCTGGCAGCCCCTGC
Generation and analyses of transgenic
mice for the overexpressed matrix
metalloproteinase（MMP）- 9 in the skin
Takashi Kobayashi
Department of Dermatology, Teikyo
University Chiba Medical Center− 65 −

cdna-R 1：TGTTCGAATGGCCTTTAGTG
cdna-F 1：GCTGGCAGAGGCATACTTGT
cdna-F 2：CGTCGTGATCCCCACTTACTA
cdna-F 3：GTCTTCCTGGGCAAGCAGTA
cdna-F 4：CTATACCTCCCACGGCCTAT

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

cdna-F 5：TGTGGGTGTACACAGGCAAGした。これを 2 細胞期まで Whitten's の培地中にて 37℃で

mu-PF：GGCCCAGACGTGGGTCGATT

培養し、偽妊娠の雌 ICR 系マウスの輸卵管に戻して個体をを用いて、polymerase chain reaction（PCR）法や制限酵発生させ、帝王切開により仔マウスを取り出した。得られ

素切断、ライゲーションなどの一般的な遺伝子操作法にた仔マウスは、すぐに仮親につけて離乳期まで育てた。
上記で作製したトランスジェニックマウスについて、

より、Kpn I と Not I でマウス MMP- 9 cDNA を挿入した
ベクターに、さらに開始コドンから 305 番目の塩基を T

PCR 法を用いてスクリーニングを行った。作製されたトから G に置換することから、102 番目のアミノ酸をバリン

ランスジェニックマウスは、出生後 3 週経過したところで、からグリシンに置換する遺伝子改変 MMP- 9 発現ベクター

9 個体の尾の先を切り取って、高分子 DNA 抽出法によりゲ（pCMV-cDNA（V 102 G））を得て、その塩基配列を確認した。

ノム DNA を抽出し、各 DNA 60 ng を鋳型として、プライマ

次に、遺伝子改変マウス MMP- 9 について、蛋白発現とーは、GT-hk 14 pro-F 3：CAGGTAACTAGGTTTAAGGTGC

gelatinase 活性を検討するために、培養 293 T 細胞に Roche

AG、AGT-hk 14 pA-R 1：TTATGCAACTCAGATAA

社の Fugene 6 試薬を用いて遺伝子導入を行い、培養上清TGAAGCTG、35 サイクルの条件で 3353 bp の増幅を行っを 回 収、gelatin-zymograph 法 を 用 い て 16）gelatinase 活 性た。その後、アガロースゲル電気泳動法を用いて解析、陽を持つ遺伝子改変 MMP- 9 発現を確認した。

性の 3 個体のすべて雄ファウンダーマウス（F 0 - 005，F 0 006，F 0 - 007）を得た。

２. ２ K14 プロモーターを用いた遺伝子改変 MMP-9
発現ベクターの取得

スのトランスジェニック遺伝子を定量した。分析用プロー

米 国 ATCC 株 よ り 分 譲 し て 得 た、pG 3 -K 14 cassette

ブ を 調 製 す る た め に、PCR 法 を 用 い て、 プ ラ イ マ ー は、

（pG 3 Z-K 14）を用い、上述と同様に PCR 法や制限酵素切断、GT-hk 14 pro-F 1：GATATACACACCTCC

ライゲーションなどの一般的な遺伝子操作法により、ウサ

AAAGCAGGAC、AGT-hk 14 pA-R 3：TCTGCACCTTAA

ギ b-globin second intron を挿入、さらに Bgl II で、上述

ACCTAGTTACCTG に よ り 938 bp を 増 幅 し、 得 ら れ たの遺伝子改変 MMP- 9 cDNA（V 102 G）を挿入、ヒト K 14

DNA 断片をアガロースゲル電気泳動法により分離した。

次に、サザンブロット法を用いて陽性ファウンダーマウ

プロモーター、ウサギ b-globin second intron、Kozak 配

泳動後のゲルから目的のバンドを切り出し、Sephaglas

列、遺伝子改変 MMP- 9 cDNA（V 102 G）、及びヒト K 14

Band Prep Kit（Pharmacia 社製）を用いて精製して、こpolyadenylation signal を直列に連結したものを含む皮膚れをランダムプライマー法（Random Primer DNA Labeling

MMP- 9 過剰発現トランスジェニックマウス作成用ベクタ

Kit Ver. 2；宝酒造社製）により 32 P- 標識して分析用プローー（phK 14 -cDNA（V 102 G））を得た。

ブとした。調製した分析用プローブを用いて挿入 DNA の内側で一ヶ所のみ切断する制限酵素（BspHI）によりサザ

２. ３

皮膚 MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウス

ンブロットを行った。

の作製と表現型の観察得られた皮膚 MMP- 9 過剰発現トランスジェニックマウ

皮膚 MMP- 9 過剰発現トランスジェニックマウスの作製

スを同週齢の雄マウスと比較した。

採卵用の C 57 BL/ 6 系統雌マウスに卵胞刺激ホルモン（妊３．結

馬血清性性腺刺激ホルモン；PMSG）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；hCG）をそれぞれ個体

３.１

果

遺伝子改変マウス MMP-9 発現ベクターの取得あたり約 5 単位、48 時間間隔で腹腔内投与して過剰排卵

開始コドンから 305 番目の塩基を T から G に置換する

させ、C 57 BL/ 6 系統雄マウスと交配させた。膣栓確認後、ことから、102 番目のアミノ酸をバリンからグリシンに交配後 1 日目の卵管からマウス受精卵（初期胚）を採取し、置換する遺伝子改変 MMP- 9 発現ベクター（pCMV-cDNA

上記で得られた phK 14 -cDNA（V 102 G））の DNA 溶液を、 （V 102 G））を得て、その塩基配列を確認した（図１）。
該受精卵の雄性前核に 2 pl ずつマイクロインジェクション

またこの遺伝子改変マウス MMP- 9 について、gelatin-

図１ 遺伝子改変 MMP-9 発現ベクター（pCMV-cDNA（V102G））の構築を表す。矢印はサイトメガロウイルスプロモーター配列、cDNA は制限酵素 KpnI と NotI 切断部に挿入されたマウス MMP-9 の、102 番目のアミノ酸をバリンからグリシンに置換する遺伝子改変の cDNA 配列、polyA は、polyA tail 配列を示す。

− 66 −

皮膚マトリクスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase：MMP）-9 遺伝子過 剰発現マウスの作成とその解析

図３ 皮膚 MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウス作成用ベクター（phK14-c DNA（V102G）） の 構 築 を 表 す。 矢 印 は ヒ ト K14 プ ロ モ ー タ ー、RbG intron は ウ サ ギ
b-globin second intron、cDNA は制限酵素 BglII 切断部に挿入されたマウス MMP-9 の、102 番目のアミノ酸をバリンからグリシンに置換する遺伝子改変の cDNA 配列、K14
polyA は、ヒト K14 遺伝子の polyA tail 配列を示す。
図２ 遺伝子改変 MMP-9 発現ベクター（pCMV-cDNA（V102G））を用いて培養細胞に遺伝子導入した培養液のgelatin-zymograph 法 の 結 果 を 示 す。
gelatinase 活 性 を 持 つ MMP-9 の バ
ンドについて、潜在型（矢印）、活性型（矢尻）として発現を確認した。

zymograph 法を用いて gelatinase 活性を持つ遺伝子改変
MMP- 9 発現について、非活性型と、活性型のバンドを確認した（図２）。

３. ２ K14 プロモーターを用いた遺伝子改変 MMP-9
発現ベクターの取得
ヒト K 14 プロモーター、ウサギ b-globin second intron、
Kozak 配列、遺伝子改変 MMP- 9 cDNA（V 102 G）、及びヒト K 14 polyadenylation signal を直列に連結したものを含む皮膚 MMP- 9 過剰発現トランスジェニックマウス作成
用ベクター（phK 14 -cDNA（V 102 G））を得た（図３）。

３. ３

皮膚 MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウスの作製と表現型の観察
マ ウ ス 受 精 卵（ 初 期 胚 ）297 個 に、 上 記 で 得 ら れ た
phK 14 -cDNA（V 102 G））の DNA 溶液を、該受精卵の雄性前核に 2 pl ずつマイクロインジェクションした。うち生存 246 個について 9 体のレシピエントを使用し、7 体に妊

図４ 受精卵にマイクロインジェクションを行った後、生まれたマウスについてのトランスジェニック遺伝子発現を解析した（A）PCR 法、（B）サザンブロット法の結果を示す。（A）
Lane 1 から 9 は各々、順に F0-001 から F0-009 までのマウス由来 genome DNA を表し、lane 10、11、12 は各々、
野生型 genome 1mg に加えてトランスジェニック遺伝子を100pg、100fg、0g を加えたコントロールを表す。矢印に増幅された陽性バンドを示す。F0-005，
006，
007 の 3 種のファ
ウンダーマウスを得た。
（B）Lane 1 は、野生型 genome、lane 2 は、F0-006、lane 3 は F0-005、lane 4 は F0-007を示す。3 種類のファウンダーマウスのうち、F0-006 に強い遺伝子導入を認めた。

娠あり、帝王切開により仔マウスを取り出した。産仔の出４．考

生数は 15 体であったが、その後の生存数の関係で 9 個体

察の尻尾を PCR 法を用いて解析、陽性の 3 個体のすべて雄

最近の遺伝子改変動物を用いた研究から、様々な蛋白質

ファウンダーマウス（F 0 - 005，F 0 - 006，F 0 - 007）を得たについて各々の生体内での実際の機能が解明されてきた。

（図４A）。またサザンブロット法を行った結果、F 0 - 005、

皮膚科領域で MMP- 9 に関するものでは、欠失マウスの解F 0 - 006、F 0 - 007 で band を確認し、特に F 0 - 006 で強いト

析から、特に多型核白血球由来の MMP- 9 が、水疱症の水ランスジェニック遺伝子の発現を認めた（図４B）。

疱形成 14，15）、炎症を伴った癌の浸潤と転移 17 ､ 18）に関わる得られた皮膚 MMP- 9 過剰発現トランスジェニックマウ

ことが解析されている。

スを同週齢の雄マウス と比較した結果、高発現のトラン

しかしながら MMP- 9 は、皮膚の表皮角化細胞が分泌す

スジェニック遺伝子を確認した F 0 - 006 マウスで、生後 3ることが示されている 1 - 3，6，8 - 10，12，13，16）。今回の研究は表

週頃より、炎症時一般に伴う異常角化を尻尾や耳に、脱毛

皮角化細胞由来 MMP- 9 過剰発現動物モデルを作成するこを背部に認めた（図５）。

とでその働きを解明することを主たる目的に企画された。
マウス MMP- 9 は、ヒト MMP- 9 と同様に N- 末端側のア− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

A

B

C

図５ 野生型と F0-006 の皮膚 MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウス（MMP-9TG）との表現型の比較を表す。（A）生後 10 週間で、野生型（上）と比較して F0-006（下）では炎症一般に伴う異常角化を尻尾や耳（白矢尻）に、脱毛を背部（白矢印）に認めた。（B）F0-006 の耳の拡大、（C）F0-006 の尻尾の拡大をそれぞれ示す。

ミノ酸が分解されることにより活性化を受けて生体内で働

白 が poly（ADP-ribose）polymerase- 1（PARP- 1）で あ り、

くことが知られている 19 , 20）。他の MMP に関してもこの活

この PARP- 1 が、炎症やアポトーシスに関わるカスペース性化を受けるアミノ酸配列は相同性が高く保持されており、の働きで分解されることで両者の発現が亢進することを検活性化を受けるアミノ酸の置換が別の MMP に関しての同証した 27）。もともと分化刺激は炎症時の過角化を含めた角様の研究でも行われていることから 19 , 20）、今回の研究でも、化、表皮角化細胞に運命づけられたプログラムされた細胞

この活性化が起こりやすいように活性化に関わるアミノ酸

死の刺激であり、一種のアポトーシスと考えられる 1）。まに変異を加え、その変化を発現ベクターの細胞へのトラン

た炎症惹起もアポトーシスを起こす刺激として捉えること

スフェクションによる培養上清の分子量で確認した。

ができる 1）。今後、交配をしながらさらに表現型を検討す

ヒト K 14 のプロモーターは表皮基底層の角化細胞に特る必要があるが、今回の皮膚の変化はこれらアポトーシス

異的に蛋白を発現させるための遺伝子領域として知られてに関わる MMP- 9 の役割を裏付けるものと考えられる。加おり

19 , 21 , 22）、今回もこれを用いた。他に同様の局在発現さえて MMP は老化において過剰発現することも示唆されて

20）

おり 1）、今回の結果は、皮膚の老化と MMP- 9 との関わりせる K 5 のプロモーターを用いる方法が報告されており、また分化した角化細胞のみに発現する K 1 や K 10 などを使も想定され興味深い。

用することも今後試みられる余地がある。

別に、本マウスを用いることで、皮膚、特に表皮での今回、特に MMP- 9 過剰発現が認められたマウスで、野MMP- 9 過剰発現モデルとして、新たな、あるいは既存の生型と比較して脱毛、耳や尻尾の過角化を認めた。これ

抗炎症薬や保湿薬の効果を検証するのに有用であると思わらは、MMP- 9 発現亢進を確認した皮膚の代表的な炎症疾

れる。

11）

患である湿疹・皮膚炎で認められる所見であるが 、別また、毒ガスとして知られるサルファマスタードやナイに、本研究者のこれまでの検討結果により、MMP- 9 はヒ

トロジェンマスタードへの暴露により、MMP- 9 発現が亢トの皮膚組織で、悪性や良性の異常角化組織、過角化組

進することが知られており 28）、これらの化学兵器への暴露

織での発現を認めている 23−25）。また培養表皮角化細胞で動物モデルとしての利用も期待される。

は、 高 カ ル シ ウ ム の 濃 度 や transforming growth factor

さらに、K 14 プロモーターに成長ホルモンを発現する（TGF）-b を添加した分化刺激、ultraviolet（UV）B 照射や過剰発現マウスではマウスの成長そのものに影響を与える

TNF-a および interleukin（IL）- 1 a 添加による炎症惹起刺ことも判明しており 22）、今後、ホモマウス作成などの際に激で、MMP- 2 と比較して MMP- 9 が選択的に発現亢進す

MMP- 9 過剰による全身他臓器の表現型検討も必要と考えることを解明している

1 , 8 −10 , 26）。さらに最近、本研究者にられる。

より、この際に起こる MMP- 9 発現亢進を司る MMP- 9 プ

なお本研究は、上述したような観点から前職で防衛省のロモーターと分化のマーカーとして知られるインボルクリ

職務発明として認定され、特許出願することとなった（特願：2013 - 041950）。

ンのプロモーターとに共通に結合して発現量を抑制する蛋− 68 −

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