最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発
熊本大学大学院生命科学研究部老化・健康長寿学講座

三浦恭子

The naked mole-rat (NMR) is an African rodent that forms a eusocial colony in subterranean environments. The NMR
shows an extraordinary longevity with a maximum lifespan of more than 37 years, although its body mass is similar to thatof the laboratory mouse. The NMR also displays delayed aging phenotype and cancer resistance. Cellular senescence plays
an important role in the aging and carcinogenesis processes, suggesting that NMRs may have species-specific mechanisms toprevent the accumulation of senescent cells. Here we show that upon induction of cellular senescence, NMR fibroblasts progressively activate cell death including apoptosis through activation of the INK4a-Retinoblastoma protein (RB) pathway ina mechanism we termed “ INK4a-RB cell death”. We show that INK4a-RB cell death is independent of p53 activity and notobserved in mouse fibroblasts. NMR fibroblasts uniquely accumulate serotonin and are inherently vulnerable to hydrogen
peroxide (H2O2). Upon activation of the INK4a-RB pathway, NMR fibroblasts increase monoamine oxidases (MAOs) levels,
which oxidize monoamine including serotonin and produce H2O2, resulting in increased oxidative damage and activation ofcell death. The INK4a-RB cell death may potentially contribute to the suppression of senescent cell accumulation in NMRs.
Our findings provide novel insights into the mechanisms of delayed aging and cancer resistance in NMRs.

1．緒言

本研究は、最長寿かつ老化耐性を持つ齧歯類、ハダカデ
バネズミ（Naked mole-rat; NMR、図 1）における皮膚線維芽細胞の老化抑制機構の解明を目指すものである。この機構を解明することで、将来的に新規の皮膚老化予防薬の開発に繋がりうると考えられる。

図1

ハダカデバネズミは、哺乳類では極めて珍しい、昆虫の最長寿齧歯類ハダカデバネズミ

アリやハチに類似した「真社会性」と呼ばれる分業制の社会

老化耐性の特徴を持つ 2 , 3）。また、今まで自然発生腫瘍が数を形成し、エチオピア・ケニア・ソマリアのサバンナの地

例しか確認されたことがない、顕著ながん化耐性を示す 4）。

下に、トンネル状の巣を形成して集団で生息している。こ皮膚において、コラーゲン等の細胞外基質を産生する線の地下トンネルは、場所によっては酸素濃度が約 7 % とな

維芽細胞は、加齢に伴い DNA 損傷等の様々なストレスにるため、ハダカデバネズミは低酸素環境に適応しており、より、細胞老化と呼ばれる不可逆的な分裂停止を引き起こ

酸素消費量はマウスの 3 分の 2 程度と低く、ヘモグロビン

すことが知られている。細胞老化は異常な細胞がそれ以上の酸素親和性が高い。さらに最近、ハダカデバネズミ個体

分裂することを防ぐ機構であり、がん抑制機構として働くは無酸素状態に顕著な耐性があり、フルクトースを直接用ことが知られている。さらに発生過程においても細胞老化

1）いる解糖系代謝が関係することが報告されている 。ハダが形態形成に寄与すること 5）、損傷治癒過程においても老カデバネズミはマウスと同程度の大きさながら、最大寿命化細胞の出す PDGF-AA（platelet-derived growth factor

が 37 年（この 37 歳のハダカデバネズミは現在も生存）と報AA）が筋線維芽細胞への分化を引き起こすことで治癒を告されている異例の長寿動物である。驚くべきことに、ハ早めることが報告されている 6）。しかし一方で、長期にわた

ダカデバネズミでは加齢に伴う死亡率の上昇が認められなり老化細胞が組織中に存在すると、老化細胞は炎症性サイいことが報告されており、さらに生存期間の約８割の間は、トカインや活性酸素（ROS）等を分泌するSASP（ senescence-

皮膚を含む各種組織・臓器の老化や機能低下が起こらない

associated secretory phenotype）と呼ばれる現象を引き起こし、これにより周辺細胞に悪影響を及ぼす。Baker らはDevelopment of a new met hod toprevent skin aging using the longestlived and aging-resistant rodent
Kyoko Miura
Kumamoto University, Faculty of Life
Sciences, Department of Aging andLongevity Research

細胞老化マーカーでサイクリン依存性キナーゼインヒビターの１種である Ink 4 a のプロモーター下流に、薬剤投与でアポトーシスを引き起こす遺伝子を連結したトランスジェ
ニックマウスを作製した。このマウスを用いて、老化細胞をアポトーシスで排除することにより、個体の老化が減弱することを報告し、老化細胞の蓄積と個体老化に直接的な− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

関係があることを示した 7 , 8）。このように、老化細胞の増地に交換し、さらに 24 時間培養した。その後、細胞を洗加が組織の老化・機能低下やがん化に大きな役割を果たす

浄し、新鮮な培地で 21 日間、2 日ごとに培地交換をしなことが明らかとなってきた。

がら培養を行い、細胞老化を誘導した。

では、老化耐性を持つハダカデバネズミの細胞老化はどうなっているのだろうか。これまでに、ハダカデバネズミの線維芽細胞はがん遺伝子の導入、放射線照射により細胞
9）2. 3. 皮膚線維芽細胞への遺伝子導入
マウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞にレンチウイ

老化を起こすことが報告されている 。一方、ハダカデバ

ルスベクターを用いて遺伝子導入を行った。目的遺伝子発

ネズミの脳において加齢に伴う INK 4 a の発現上昇が起こ

現ベクターおよびウイルスパッケージングベクター２種を、りにくいことが示されている

10）。これらの結果から我々は、

HEK293 細胞にPEI MAX transfection regent（Polysciences）

ハダカデバネズミには老化細胞が蓄積されにくいメカニズ

を用いてトランスフェクションした。9 時間後に培地交換ムがあるのではないかと考えた。

を行い、その後 24 時間培養した培養上清を 0 . 45 µm シリ

これまでに我々は、老化耐性ハダカデバネズミの皮膚線

ンジフィルター（ザルトリウス）で濾過し、ウイルス含有

維芽細胞において、細胞老化誘導によりハダカデバネズミ

conditioned medium とした。この conditioned medium を特異的細胞死が生じることを見出した。この現象はヒトや培養培地で 2 倍希釈し、線維芽細胞へのウイルス感染に使

マウスでは全く認められない。ハダカデバネズミでは種特用した。

異的な本現象により老化細胞が除去されることで、皮膚の老化が抑制されていると考えられる。しかしこのハダカデ

2. 4. ウェスタンブロッティング

バネズミ特異的な細胞死の誘導機構はいまだ不明であり、細胞を PBS で洗浄し、2 ×サンプルバッファー（125 mM

解明することで、全く新規の皮膚老化予防薬の開発に繋がTris-HCl, pH 6 . 8 , 4 % SDS, 10 % sucrose）で溶解し、5 分

りうる。そこで本研究では、ハダカデバネズミ特異的細胞間煮沸した。BCA Protein Assay Kit（TaKaRa）を用いて死のメカニズム・誘導遺伝子を解明することを目的とし、タンパク質濃度を測定したのち、10 µg のタンパク質を用研究を行った。また研究成果は現在論文投稿中である。

い て SDS-PAGE を 行 い、Trans-Blot Turbo Transfer

2. 方System（Bio-Rad）を用いて PVDF メンブレンにトランス法ファーした。以下に示した一次抗体にて 4 ℃で over night

2. 1. 実験動物

反応させ、TBST で洗浄したのち、二次抗体を反応させた。

1 - 2 歳の成体ハダカデバネズミは熊本大学で維持し、6ECL Western Blotting Detection System または ECL Prime

週齢の成体 C 57 BL/ 6 N マウスは日本クレアから購入した。

Western Blotting Detection Reagent（Amersham）で可視

この研究は、熊本大学動物実験委員会によって承認された化した。シグナル検出には LAS- 4000 mini イメージングシ

プロトコールに従って実施した。

ステム（FUJIFILM）を、データ解析には Multi Gauge V 3 . 0

2. 2. 皮膚線維芽細胞の樹立および細胞老化誘導（CST; 9309; 1:1000 for NMR, CST; 9313; 1:1000 for mouse）、

ソフトウェア（FUJIFILM）を使用した。一次抗体には、RB
1 - 2 歳の成体ハダカデバネズミおよび 6 週齢の成体

pRB（CST; 8 5 1 6 ; 1 : 1 0 0 0）
、MAO-A（abcam; ab 1 2 6 7 5 1 ;C 57 BL/ 6 N マウスの背部皮膚を採取し、初代皮膚線維芽1 : 1 0 0 0）、MAO-B（Novus Biologicals; NBP 1 - 8 7 4 9 3 ;細胞を分離した。組織は、1 ％ペニシリン／ストレプトマ

1 : 1000）および β-Actin（CST; 4970 ; 1 : 2000）を使用した。

イシン（富士フイルム和光）およびアンフォテリシン B（富二次抗体は、HRP 標識抗ウサギ（CST; 7074 ; 1 : 1000）また士フイルム和光）を含む氷冷した PBS（ナカライテスク）では抗マウス（CST; 7076 ; 1 : 1000）IgG 抗体を使用した。

洗浄後、細断した。組織片を 15％ウシ胎児血清
（FBS）
（NMR
線維芽細胞用）または 10 ％ FBS（マウス線維芽細胞用）を

2. 5. RNA-sequencingとMetabolome analysis

含む DMEM 培地に懸濁し、ゼラチンコートした 10 cm 細細胞老化誘導時にハダカデバネズミ特異的に発現変動す

胞培養皿（IWAKI）に播種、32 ℃、5 ％ CO 2、5 ％ O 2 条件

る候補遺伝子群を抽出するために、ハダカデバネズミおよで培養した。遊走してきた線維芽細胞を回収し、初代線維びマウス皮膚線維芽細胞に細胞老化誘導（INK 4 a を過剰発芽細胞として使用した。線維芽細胞は 5 回継代以内で使用現）を行った後 TRIzol reagent（Invitrogen）に溶解した。

し、培地は 2 日おきに交換した。

RNA 抽出後ライブラリーを調製、Novaseq 6000 にて RNA-

サブコンフルエントになったマウスおよびハダカデバネ

sequencing を実 施（Novogene Bioinformatics Institute）し、ズミ線維芽細胞に、DNA 傷害剤であるドキソルビシン

変動遺伝子について種間比較を行った。また、一般的に老（DXR；富士フイルム和光）を 100 nM の濃度で含む培地を化細胞では代謝状態が大きく変動するが、老化ハダカデバ

添加した。24 時間後、培地を新しく調製した DXR 含有培

ネズミ細胞における代謝状態を解析するために、ハダカデ− 152 −

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発

バネズミおよびマウス皮膚線維芽細胞に細胞老化誘導し、液体窒素で凍結後氷冷メタノールで回収し、メタボローム
解析を行った。

3. 2. INK4aの発現上昇はハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こす
INK 4 a の発現上昇がハダカデバネズミ線維芽細胞に細3. 結胞死を引き起こすのかを調べるために、レンチウイルスベ

果

クターを用いてマウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞

3. 1. 細胞老化誘導時のハダカデバネズミ細胞の挙動に INK 4 a を過剰発現した。DXR 老化誘導時と同様にマウ

マウスおよびハダカデバネズミ線維芽細胞に低濃度

スおよびハダカデバネズミ細胞で、SA-β-Gal 陽性細胞の（100 nM）のドキソルビシン（DXR）を添加し、細胞老化を増加、BrdU 取り込みの低下が認められた。INK 4 a はサイ

誘導してその後の挙動を経時的に 3 日おき、21 日まで解クリン依存性キナーゼである CDK 4 / 6 を阻害することに析した。その結果、ハダカデバネズミ、マウスともに細胞より、RB の脱リン酸化（活性化）を起こし、細胞周期停止

老化マーカーである SA-β-Gal 陽性細胞の増加、細胞増殖を引き起こす。ウェスタンブロッティングにより解析を行の停止を示す BrdU 取り込みの低下、細胞老化マーカー遺ったところ、マウスおよびハダカデバネズミ細胞で RB の伝子である INK 4 a および p 21 の発現上昇が認められた。

脱リン酸化が見られた。このように両種の細胞で細胞老化

興味深いことに、マウスでは細胞死の上昇は見られないのの特徴を示す一方、ハダカデバネズミ細胞のみで細胞死がに対し、ハダカデバネズミでは DXR 処理後 12 日目以降に上昇した（図 3）。これらの結果から、INK 4 a の発現上昇が細胞死が有意に上昇した（図 2 A, B）。また、細胞死の上昇

ハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こすことがと INK 4 a の発現上昇が同時期に起こっていた。さらにハ

明らかとなった。

ダカデバネズミ線維芽細胞でINK 4 aをノックダウンすると、DXR処理して 21 日後の細胞死が有意に減少した。これらの結果から、ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK 4 a の発現上
昇が細胞死の増加に寄与していると考えられた。

3. 3. ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK4aの発現上昇はp53とは無関係にRBを介して細胞死を引き起こす一般的に細胞へのダメージが大きい場合は細胞死が、小図2

図3

細胞老化誘導時のハダカデバネズミ細胞の挙動

INK 4 aの発現上昇はハダカデバネズミ線維芽細胞に細胞死を引き起こす− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

さい場合は細胞老化が引き起こされ 11）、図 4 A に示すように、

ハダカデバネズミおよびマウス皮膚線維芽細胞に INK 4 a

がん抑制遺伝子であるp 53 はアポトーシスの誘導に大きく寄過剰発現による細胞老化誘導を行い、mRNA-seq を実施与している。本研究で見られたハダカデバネズミ特異的細胞した。ハダカデバネズミの老化細胞で発現上昇していた遺死が p 53 に依存するのかを調べるために、ウイルス由来の伝子群について gene ontology（GO）解析を行ったところ、

SV 40 Large T antigen（LT）タンパクとその変異体を使用

老化および細胞死を反映していると考えられる GO term；

した。野生型 LT は p 53 とRB の両方を阻害し、その変異体“SASP” や“aging”、“positive regulation of cell death” ととLTΔ 434 ‒ 444（LTΔ）
は RB のみを、LTK 1 変異体（LTK 1）

もに、“hydrogen peroxide metabolic process” に関わる遺は p 53 のみを阻害する。これらとINK 4 aをハダカデバネズミ

伝子群が濃縮されていた（図 5）。ハダカデバネズミはこれま

線維芽細胞に過剰発現させ、細胞死を解析した。その結果、

でに hydrogen peroxide（H 2 O 2）に対して顕著な脆弱性 12）

LTとLTΔ は顕著に細胞死を抑制し、LTK 1 は細胞死を抑を持つことが報告されている。我々はハダカデバネズミ線

制しなかった（図 4 B）。また、DXR 処理ハダカデバネズミ細維芽細胞がマウス線維芽細胞と比べて、これまでの報告通胞においても同様の結果が得られた。これらの結果から、り、顕著に H 2 O 2 に対して脆弱であることを見出した。こハダカデバネズミの細 胞 老 化 誘 導 時の細 胞 死は p 5 3 非 依のことから、我々はハダカデバネズミの INK 4 a-RB cell

存的、RB 依存的に起こっていることが明らかとなった。そdeath には、酸化ストレスの亢進が関与しているのではな

こで我々はこの細胞死をINK 4 a-RB cell deathと命名した。

いかと考えられた。実際、INK 4 a-RB cell death を起こして い る ハ ダ カ デ バ ネ ズ ミ 細 胞 に お い て、2 ', 7 '- dihydro3. 4. ハダカデバネズミ線維芽細胞において、固有のH2O2への脆弱性がINK4a-RB cell deathに寄与している
INK 4 a-RB cell death のメカニズムを解析するために、

図4

dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA）を用いて活性酸
素種（ROS）が増加しているかを解析したところ、ROS レ
ベルの上昇が認められた。

ハダカデバネズミ線維芽細胞において、INK 4 aの発現上昇はp 53とは無関係にRBを介して細胞死を引き起こす

図5

INK 4 a過剰発現ハダカデバネズミ線維芽細胞のgene ontology（GO）解析− 154 −

最長寿・老化耐性齧歯類を利用した新たな皮膚の老化予防方法の開発

次にメタボローム解析を行ったところ、興味深いことに、老化していないハダカデバネズミ線維芽細胞では種特異的

phenotype” を持っており、今後研究を進めることで、真に安全な“senolytic drug”の開発に寄与する可能性がある。

に serotonin が顕著に蓄積しており、老化したハダカデバ
ネズミ細胞ではその代謝産物である5-hydroxyindoleacetic（引用文献）

acid（5 -HIAA）が 有 意 に 増 加 し て い た。Serotonin か ら

1） Park, T. J. et al. Fructose-driven glycolysis supports

5 -HIAA への代謝経路は大量の H 2 O 2 を産生することが知anoxia resistance in the naked mole-rat. Science 3 5 6,られており、
その代謝経路には monoamine oxidase（MAO）

307‒311（2017）．

が寄与している。上述の mRNA-sequencing の結果におい

2） Edrey, Y. H., Hanes, M., Pinto, M., Mele, J. &ても“hydrogen peroxide metabolic process” には MAO-B

Buffenstein, R. Successful aging and sustained goodが含まれていた。さらに INK 4 a を過剰発現させたハダカ

health in the naked mole rat: A long-lived mammalian

デバネズミ線維芽細胞では MAO-A および MAO-B タンパ

model for biogerontology and biomedical research.

クの発現が上昇していた。これらの結果から、ハダカデバ

ILAR J. 52, 41‒53（2011）．

ネズミの INK 4 a-RB cell death には MAO による H 2 O 2 の3） Ruby, J. G., Smith, M. & Buffenstein, R. Naked mole-

産生が寄与している可能性が考えられた。H 2 O 2 を含む

rat mortality rates defy gompertzian laws by not

ROS の 増 加 が ハ ダ カ デ バ ネ ズ ミ 細 胞 に INK 4 a-RB cellincreasing with age. Elife 7, 1‒18（2018）．

death を引き起こしているのかを明らかにするために、

4） Buffenstein, R. Negligible senescence in the longest

INK 4 a-RB cell death を誘導したハダカデバネズミ細胞に

living rodent, the naked mole-rat: insights from a

抗酸化剤である NAC、Trolox、Tempol を投与した。そのsuccessfully aging species. J. Comp. Physiol. B. 1 7 8,

結果、INK 4 a-RB cell death は有意に減弱した。これらの439 ‒ 45（2008）．

ことから、ハダカデバネズミ細胞が持つ生来の H 2 O 2 への

5） Storer, M. et al. Senescence is a developmental

脆弱性と、細胞老化時に H 2 O 2 を大量に産生するような代

mechanism that contributes to embryonic growth and

謝状態への変化によって、INK 4 a-RB cell death が起きて

patterning. Cell 155, 1119（2013）．
6） Demaria, M. et al. An essential role for senescentいると考えられた。

cells in optimal wound healing through secretion of

4 . 考察とまとめ

PDGF-AA. Dev. Cell 31, 722‒733（2014）．

酸化ストレス仮説は個体老化のメカニズムの１つとして

7） Baker, D. J. et al. Clearance of p1 6Ink4a-positive

よく知られている。酸化ストレス仮説とは、ROS による

senescent cells delays ageing-associated disorders.

酸化的ダメージが加齢とともに蓄積し、それに起因する細Nature 479, 232‒236（2011）．

胞障害が個体の機能低下をもたらすという考え方である。

8） Baker, D. J. et al. Naturally occurring p1 6Ink4a-

ハダカデバネズミは老化耐性動物であることから、酸化ス

positive cells shorten healthy lifespan. Nature 5 3 0,

トレス仮説に基づいた検証が積極的に行われてきたが、184‒189（2016）．

ROS に対して抵抗性を持っているとする報告や ROS に対

9） Zhao, Y. et al. Naked mole rats can undergo

する防御機構の低さを示す報告といった相反する結果が報

developmental, oncogene-induced and DNA damage-

告されており、これまで一定の見解は得られていない。本

induced cellular senescence. Proc. Natl. Acad. Sci. 115,

研究は、ハダカデバネズミ線維芽細胞において INK 4 a-

1801‒1806（2018）．

RB 経路が活性化し、H 2 O 2 産生代謝経路が活性化するこ

10）Lee, B. P., Smith, M., Buffenstein, R. & Harries, L. W.

とと、ハダカデバネズミ線維芽細胞が生来持つ ROS の１

Negligible senescence in naked mole rats may be a

種である H 2 O 2 に対する脆弱性が協調して INK 4 a-RB cellconsequence of well-maintained splicing regulation.

deathを引き起こしていることを明らかにした。この機構により、

GeroScience 42, 633‒651（2020）．

ハダカデバネズミにおいて老化細胞が除去され、皮膚をはじめとする個体の老化耐性に寄与しているのではないかと考えられる。

11）Childs, B. G. et al. Senescence and apoptosis: duelingor complementary cell fates? EMBO Rep. 15, 1‒15（2014）．

本研究は、ハダカデバネズミにおけるH 2 O 2 に対する脆弱性と

12）Salmon, A. B., Akha, A. A. S., Buffenstein, R. &老化耐性を結びつけた初めての報告である。近年、老化防止

Miller, R. A. Fibroblasts from naked mole-rats are

薬として老化細胞を除去する“senolytic drug” の開発が進んでresistant to multiple forms of cell injury, but sensitive

いるが、老化細胞は個体にとって有益な側面も持っており、老to peroxide, ultraviolet light, and endoplasmic化細胞の除去が本当に安全なのかは議論の余地がある。ハダ

reticulum stress. Journals Gerontol. Ser. A Biol. Sci.

カデバネズミは進化の過程で獲得した “naturally senolytic

Med. Sci. 63, 232‒241（2008）．

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