固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析
就実大学薬学部

片 岡洋 行

Since the odors and emanations released from human body can include essential information about the state of healthand diseases, chemical analysis of their components is attracting attention as an objective quantitative evaluation. In thisstudy, we developed a non-invasive analytical method for the determination of 2-nonenal as a body odor component byheadspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry (SPME/ GC-MS). 2-Nonenal in skinemissions and secretions collected by gauze wiping were easily extracted onto the SPME fiber, and then analyzed sensitively
by GC-MS. Using this method, we analyzed body odor changes by use of cosmetics, food intake, cigarette smoking andstress load.

１．緒や定量性に問題がある。そこで、我々がこれまでに開発し言てきた固相マイクロ抽出（SPME）法5 − 7）を用いれば、簡近年、清潔志向が高まり、口臭や体臭、加齢臭を気にす単な器具でサンプリングと同時に抽出濃縮ができることかる体臭恐怖症（自臭症）が増加しており、消臭化粧品やデら、皮膚ガス及び皮膚滲出液中の体臭成分を生体から直接オドラント関連製品が開発されている。また、体臭は健康サンプリングして定量評価できると考えられる。

状態を示すバロメーターであり、ストレスや生活習慣病の本研究では、サンプリング ･ 前処理の重要性に着目し、サインとも言われ、心身症とも関連して社会生活の障害とファイバー SPME 法を用いて皮膚ガス ･ 皮膚滲出液中の揮なっている 。しかし、体臭は周囲の指摘が困難で判断基発成分を非侵襲的かつ簡便迅速にサンプリング、抽出濃縮準も曖昧であることから、体臭の客観的な定量評価法の開し、ガスクロマトグラフ－質量分析（GC−MS）法との連結発が望まれている。体臭にはスパイシー臭、脂肪酸臭、硫により高感度分析する方法を開発した。また、本法を用い黄臭などがあり、汗腺や皮脂腺などの分泌物が皮膚細菌にて、体臭成分の一つである 2 -Nonenal をバイオマーカーとよって分解された揮発成分や体外から摂取された化合物成した皮膚ガス ･ 滲出液サンプリング分析法を検討し、さら分に由来すると考えられている。特に、皮脂腺から分泌さに香粧品使用や食品摂取、ストレスや喫煙など内的、外的

れ る 9 -Hexadecenic acid が 酸 化 ･ 分 解 さ れ て 生 成 す る

要因による体臭への影響を解析した。初年度は不飽和アル2 -Nonenal などの不飽和アルデヒド類が加齢臭の原因の一

デ ヒ ド 類 の SPME/GC−MS 法 の 開 発、 最 終 年 度 はつとなっている（図１） 。しかし、体臭成分分析の鍵と2 -Nonenal に的を絞って体臭分析を行った。

1）

2）

なるサンプリング器材や分析手法が確立されてないため、

２．実

それらの発生の実態や動態については、十分解明されていない

1 − 4）。特に、皮膚表面から発生する“におい”は複雑

2 .1

試

験

薬で極微量であるため、官能的に感知できても分析機器で検

体臭関連の分析対象標準物質として、2 -Nonenal（ナカ出困難な場合があり、成分を分離同定 ･ 定量するためには、ライテスク製）を用い、LC-MS 用メタノールに溶かして１サンプリングや前処理を効率化した高感度分析法の開発がmg/mL とし、密栓して冷蔵（４℃）保存した。これを用時、重要な課題となっている。従来、皮膚ガスサンプリング法

LC−MS 蒸留水で希釈して用いた。

として、手のひらを PVF バッグに入れて採取する方法が報告されているが、気密性や定量性に問題がある。また、

2.2

装置及び測定条件

体臭成分の分析法として、ヘッドスペースサンプリングやGC−MS 分 析 は、島 津 QP−2010 GC−MS 装 置 を 用 い、溶媒抽出後、GC 分析する方法が報告されているが、感度

SPME/GC−MS 法 に よ り、SIM モ ー ド（2 -Nonenal：m/z= 55 , 83 , 111）で 分 析 し た。GC 分 離 は、DB−1（60 m×Development of sensitive analytical methodof body odor components using solid-phasemicroextraction, and analysis of theirchanges by use of cosmetics, food intake
and stress load
Hiroyuki Kataoka
School of Pharmacy, Shujitsu University

0 . 25 mm i.d.）キャピラリーカラムを用い、190℃（２分間保持）から 230 ℃まで５℃ /min の昇温で行った。

2.3

ファイバー SPME 操作法

SUPELCO 社製の SPME ホルダー及びファイバーアッセンブリーからなる SPME ユニットを使用した。ファイバ−9−コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ーアッセンブリーとして、次の異なる固定相を固定化したを「抽出時間」と表記する。一定時間放置後、ファイバー７種のファイバーを使用した。

を収納して針を抜き、GC − MS の試料気化室に導入し、＜吸収型＞抽出された化合物を加熱により脱離する（図２）。SPME① PDMS（Polydimethylsiloxane、膜厚 100 mm）

による抽出条件は本研究により最適化した。

② Polyacrylate（膜厚 85 mm）

2.4＜吸着型＞③ Stable Flex PDMS/DVB（PDMS/divinylbenzene、 膜厚 65 mm）

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング方法として、図３に示す４つの方法を比較検討した。皮膚を石鹸で洗浄し④ CAR/PDMS（Carboxen/PDMS、膜厚 75 mm）て３時間後にサンプリングを行った。

⑤ Stable Flex CAR/PDMS（膜厚 85 mm）

2.5⑥ CW/DVB（Carbowax/DVB、膜厚 65 mm）⑦ DVB/CAR/PDMS（膜厚 50 / 30 mm）

拭き取り法または貼り付け法による体臭分析

本学研究倫理安全委員会の承認のもと、20 歳代から 50＜操作手順＞

歳代の男女４名の被験者に対して、実験の趣旨を説明し、試料溶液をホットプレートスターラーに乗せ、試料を加同意を得て皮膚ガス ･ 皮膚滲出液をサンプリングした。図熱する。この時の加熱温度を「抽出温度」と表記する。次３の③または④の方法に従い、0 . 1ｇの乾燥ガーゼを用いにバイアルのセプタムに SPME 針を貫通させ、続いてフて、額、腕、耳裏、腋は拭き取り法、胸部、背中からは貼ァイバーをヘッドスペース（HS）中に露出し、加熱によりり 付 け 法 に よ り サ ン プ リ ン グ し、2 -Nonenal を HS−気化した物質を吸着させる。この時のファイバー露出時間

SPME/GC −MS 分析した。

図１

脂質過酸化反応による 2-Nonenal の推定生成機構 2）（A）ヘッドスペース ー SPME による抽出

図２（B）GC 気化室での熱脱離ヘッドスペースファイバー SPME/GC − MS 法の概要

− 10 −

固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析

また、香粧品の使用、食品摂取、喫煙やストレスなどにたが、特徴的なフラグメントイオンとして、m/z= 55、83、よる体臭変化を解析するために、これらの事前 ･ 事後にお111 が検出されたことから、これらを選択して SIM モード

ける皮膚ガス ･ 皮膚滲出液を上記の方法によりサンプリンで測定を行うこととした。また、図５に示すように同濃度グし、2 -Nonenal を HS−SPME/GC−MS 分析した。の溶液をヘッドスペース法による直接注入（MeOH 溶液 ,３．結3 .1１mL）と、ファイバー SPME 法を用いて比較したところ、

果SPME 法により効率よく濃縮できることがわかった。

GC− MS 分析法の確立

ス キ ャ ン モ ー ド（m/z：30−150）GC−MS 法 に よ り、

3.2

HS−SPME 条件の最適化

2 -Nonenal（分子量 140）標準溶液のマススペクトルを分析

SPME 法は分配係数に従った化合物の移動による抽出法

した結果、図４に示すように分子イオンは検出されなかっであるため、迅速かつ高い抽出率をあげるためには化合物

①③、④②

図３

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法①ガラス容器に蒸留水２mL を入れ、水が手のひらの皮膚に接するよう５分間片方の手で押さえ、皮膚
滲出液を蒸留水中に抽出し、この溶液をバイアルに入れて HS−SPME 抽出する。
②吸引カップを用いて、セプタムを通して SPME ファイバーを手のひらの上部に挿入し、直接 HS −SPME 法で５分間抽出する。
③脱脂綿またはガーゼ 0.1ｇで手のひら２cm 角の範囲を１分間拭き取り、バイアルに入れて、直接 HS−SPME 抽出する。
（拭き取り法）④脱脂綿またはガーゼ 0.1ｇを手のひらにテープで貼り付け、３時間後にバイアルに入れて、直接 HS−SPME 抽出する。
（貼り付け法）図４

図５2-Nonenal 標準溶液のマススペクトル

ヘッドスペース法と SPME 法により得られたクロマトグラム− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014のファイバー固定相への分配率を上げることが重要である。の回収量を測定した。図７に示すように、脱脂綿では回収

そこで、７種のファイバーを検討したところ、65 mm Stableにばらつきが見られ、ガーゼを使用することにより安定しFlex PDMS/DVB ファイバーを用いるとき、2 -Nonenal をて回収できることから、拭き取り法及び貼り付け法ではガ効率よく抽出できることから、以後の実験ではこのファイーゼを使用することにした。
ガーゼを用いた拭き取り法による 2 -Nonenal の回収率をバーを用いることにした。
また、ガーゼ 0 . 1ｇに５ng の 2 -Nonenal を染みこませて、求めるために、５ng の 2 -Nonenal をシャーレにとり、ガ40 mL バイアル中で 65 mm Stable Flex PDMS/DVB ファ

ーゼ 0 . 1ｇで拭き取ってバイアルに入れ、HS−SPME/GC−イバーを用いて HS−SPME 抽出条件を最適化したところ、

MS 分析した。直接５ng の 2 -Nonenal をバイアルに入れて抽出温度 50℃で 45 分間ファイバーをヘッドスペース中に測定した場合と比較して、約 60％の 2 -Nonenal が回収でき曝露することにより、効率よく抽出濃縮できることがわかることがわかった。
また、ガーゼでサンプリングした皮膚ガス ･ 皮膚滲出液った。

中の 2 -Nonenal の安定性を調べるために、2 -Nonenal １

3.3

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法の検討

mg/mL 標準溶液を 40 mL バイアルに入れて、密栓して室

図３の①～④の方法に従い、0 . 1ｇの脱脂綿またはガー温、冷蔵、冷凍で保存し、24 時間後に 2 -Nonenal の抽出、ゼを用いて、手のひらから皮膚ガス ･ 皮膚滲出液をサンプ測定を行った。図８に示すように、冷凍保存することによリングし、HS−SPME/GC−MS 分析したところ、図６にり 2 -Nonenal の減少率は低かったことから、ガーゼでサン示すように、拭き取り法が最も効率よく 2 -Nonenal を回収プリングした後、直ちにセプタム付バイアル瓶に入れて凍できることがわかった。そこで、拭き取りに用いる脱脂綿結保存すれば、2 -Nonenal の分解を防ぎ安定した結果が得とガーゼからの 2 -Nonenal の回収を比較するために、脱脂られることがわかった。

綿またはガーゼ 0 . 1ｇをバイアル瓶に入れ、2 -Nonenal をそこで、ガーゼを用いた拭き取り法による 2 -Nonenal の５ng 添加して、経時的にこれらの素材からの 2 -Nonenal

検量線、検出限界及び再現性について検討した。ガーゼ

図６

皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法の比較

図８

図７

サンプリング素材の比較

サンプリング後のガーゼの保存条件の検討− 12 −

固相マイクロ抽出法に基づく体臭成分の高感度分析法の開発と香粧品・食品摂取やストレスによる体臭変化の解析

0 . 1ｇに 1 ～ 50 ng の 2 -Nonenal を滴下し、HS−SPME/GCに、脂肪酸と過酸化脂質の反応によって生成すると言われ−MS 分析した結果、表１に示すように、相関係数は 0 . 991ており、脂肪や脂肪酸を多く含む食品の摂取や、脂質過酸と良好な直線性を示し、検出限界は 171 pg（S/N= 3）と高化に関与する活性酸素の発生が大きな要因となっている。

感度に検出できることがわかった。また、日内及び日差変

従って、飲酒や喫煙、ストレスなども体臭変化に影響する

動 に お け る 相 対 標 準 偏 差 RSD は、 そ れ ぞ れ 9 . 6 % 及 びと考えられる。また、化粧や体臭を消すと言われている消3 . 6 % と再現性良く定量できることがわかった。

臭石鹸の使用も体臭変化に影響すると考えられる。そこで、本研究で開発した方法を用い、2 -Nonenal をバイオマーカ

3.4

体の各部位からの 2 -Nonenal 分泌量と日内変化ーとして香粧品使用や食品摂取、ストレスや喫煙など内的、被験者３名（A：20 代女性 , B：20 代男性 , C：30 代男性）外的要因による体臭への影響を解析した。

について、体を石鹸で洗浄後、６時間の通常の生活におい表２に示すように、低脂肪食（肉を含まない）と高脂肪て分泌される 2 -Nonenal を、額、腕、耳裏、腋からガーゼ食（牛焼肉 500ｇ）の後、12 時間後にガーゼ拭き取り法に拭き取り法（0 . 1ｇ）により採取し、また、胸部、背中、枕より額からサンプリングし、HS−SPME/GC−MS 分析したか ら は ガ ー ゼ 貼 り 付 け 法（0 . 1ｇ）に よ り 採 取 し、HS −ところ、高脂肪食で有意に 2 -Nonenal が増加することがわ

SPME/GC − MS 分析した。図９に示すように、個人差はかった。また、化粧水使用の有無や喫煙の前後においては、あるものの、2 -Nonenal は額、腕、耳裏から比較的多く分若干の 2 -Nonenal の増加が認められたが有意な差ではなか泌されていることがわかった。

った。ストレス負荷として、会議の前後（精神的ストレス）

そこで、洗浄した額（２cm×２cm 四方）の４箇所につや 運 動 前 後（ 肉 体 的 ス ト レ ス ）に お い て は、 有 意 にいて、３時間毎にガーゼ拭き取り法（0 . 1ｇ）により皮膚ガ2 -Nonenal が増加し、特に運動後は大量の 2 -Nonenal が発ス ･ 皮膚滲出液を採取し、HS−SPME/GC−MS 分析した生していることがわかった。これは、運動による発汗で皮ところ、2 -Nonenal は 13 ～ 16 時の午後の時間帯に比較的脂腺から脂肪酸や過酸化脂質の分泌が増加し、体表中の常多く分泌されていることがわかった。

在細菌によって 2 -Nonenal への酸化分解が促進されたものと思われる。

3. 5 香粧品使用、食品摂取、ストレスや喫煙などによる体臭への影響

石鹸による消臭効果を 50 歳代男性で調べた。普通の石け体臭成分の一つである 2 -Nonenal は、緒言に述べたようん水（無添加）及び柿渋石鹸（柿タンニン配合）でそれぞれ

表１

一方、最近デオドラント製品として市販されている柿渋

ガーゼ拭き取り法によるファイバー SPME/GC− MS 法のバリデーション

図９

体表の各部位における 2-Nonenal 検出量の比較− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

表２

様々な生活習慣による体臭変化の解析

体を洗浄後、ガーゼ貼り付け法により、胸部及び首にガー（引用文献）

ゼを貼り、一晩睡眠後、起床時にガーゼを回収し、HS −１）Kataoka H., Saito K., Kato H., Masuda K., Non-

SPME/GC−MS 分析したところ、柿渋石鹸使用により、

invasive analysis of volatile biomarkers in human

2 -Nonenal の発生がほとんど認められなかった。これは、

emanations for health and early disease diagnosis.

柿渋エキスによる殺菌効果によるものと思われる。

（Review）Bioanalysis, 5（11），1443 − 1459 , 2013 .

４．考２）Haze S., Gozu Y., Nakamura S., Kohno Y., Sawano察K., Ohta H., Yamazaki K., 2 -Nonenal newly found in
human body odor tends to increase with aging. J.

本研究により、体臭成分の一つである 2 -Nonenal を HS

Invest. Dermatol., 116 , 520 − 524 , 2001 .

−SPME/GC−MS により簡便かつ高感度に分析できることがわかった。皮膚ガス及び皮膚滲出液のサンプリング法

３ ）P a n d e y S . K . , K i m K . - H . , H u m a n b o d y - o d o r

については、ガーゼ拭き取り法が効果的ではあるが、拭き

components and their determination. Trends Anal.

取り方を一定にする必要があり、回収率や定量性に関してChem., 30 , 784 − 796 , 2011 .

もまだ検討の余地がある。また、体臭は複合臭であり、

４）Jiang R., Cudjoe E., Bojko B., Abaffy T., Pawliszyn

2 -Nonenal だけでなく他の体臭成分との相互作用や、前駆J., A non-invasive method for in vivo skin volatile

物質である 9 -Hexadecenic acid の動態についても解析する

compounds sampling. Anal. Chim. Acta, 804 , 113 − 119 ,2013 .

必要がある。今後、さらに効率的かつ簡便なサンプリング手法に改良し、2 -Nonenal や他の体臭成分の生成及び分解

５）Kataoka H, Recent developments and applicationsのメカニズムを明らかにして、食習慣や生活習慣の改善にof microextraction techniques in drug analysis. Anal.

よる効果的な体臭対策法を検討していく予定である。

Bioanal. Chem. 396 , 339 − 364 , 2010 .
６）Kataoka H, Saito K. Recent advances in SPME

（謝辞）

techniques in biomedical analysis. J. Pharm. Biomed.
Anal. 54 , 926 − 950 , 2011 .

本研究を行うにあたり、多大なるご援助を賜りました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたし

７）Kataoka H., Solid-phase Microextraction: BiomedicalApplications. in Chemistry, Molecular Sciences andます。

Chemical Engineering. Edited by Jan Reedijk（Elsevier,Academic Press: Oxford, UK），2014 , in press.

− 14 −