IL- 33デコイ受容体による皮膚炎症の制御

自治医科大学医学部生化学講座病態生化学部門

早川盛禎

Interleukin (IL)-33 is a member of the IL-1 cytokine family. Epithelial cells and vascular endothelial cells produce IL33 in the nucleus and release it by stress, injury, or necrosis. IL-33 induces the production of Th2-associated cytokines
via its receptor, ST2L on type 2 innate lymphoid cells, Th2 cells, and mast cells. Therefore, IL-33/ST2L signaling may
contribute to development of allergic diseases such as asthma and atopic dermatitis. The ST2 gene produces a soluble
secreted form, soluble ST2, in addition to a transmembrane form, ST2L, by alternative splicing. Soluble ST2 consists of
only extracellular domain of ST2L. In previous study, we found that soluble ST2 acted as an IL-33 decoy receptor. Soluble
ST2 specifically binds to free IL-33 and inhibits a binding activity of IL-33 for its receptor on target cells. To explore thefunction of soluble ST2 in vivo, we established that a transgenic mouse that constitutively express murine soluble ST2cDNA under CAG promoter (ST2-Tg mouse). Here, we show that soluble ST2 is a critical repressor for skin inflammation ina murine model of house dust mite (HDM)-induced atopic dermatitis. Skin inflammation of ST2-Tg mice exhibited a lower
development compared to that of wild-type mice. Levels of IL-13, total IgE, and HDM-specific IgE in sera were reduced
in ST2-Tg mice. Furthermore, we examined HDM-specific response of lymph node cells in vitro. Analysis of cytokines inculture supernatants revealed the reduction of IL-4, IL-5, and IL-13 productions in ST2-Tg mice. We also applied ST2-Tg
mice to hapten-induced contact hypersensitivity (CHS) model with fluorescein isothiocyanate (FITC). Migration of skindendritic cells and ear swelling developed normally in ST2-Tg mice. These results suggest that soluble ST2 contributes tosuppressions of skin inflammation and Th2-type immune response in atopic dermatitis. Therefore, soluble ST2 is a potential
therapeutic agent for allergic diseases such as atopic dermatitis.

１．緒するために、分泌型 ST2 を過剰発現するトランスジェニ

言6）

ックマウス（ST2-Tg マウス）を作製した 。

インターロイキン -33（IL-33）は、上皮細胞や血管内皮本研究では、ST2-Tg マウスを用いて、ハプテン塗布に細胞に発現するサイトカインである 。IL-33 は、自然リよる接触皮膚炎モデル、およびダニ抗原塗布によるアトンパ球、Th2 細胞、肥満細胞などを活性化し、Th2 サイ

ピー性皮膚炎モデルを作製し、皮膚炎症に対する分泌型トカインの産生誘導を介して、アレルギー疾患の病態形成

ST2 の作用を中心に検討した。

１）に関与する。アトピー性皮膚炎では、皮膚病変部において

２．実

2）

IL-33 の発現亢進が報告されている 。
IL-33 受容体（別名：ST2L）をコードする ST2 遺伝子の2. 1. マウス

遺伝子産物には、膜貫通受容体型 ST2L の他に、分泌型3, 4）

ST2 がある験

ST2 トランスジェニック（ST2-Tg）マウスは、CAG プロ。分泌型 ST2 は、IL-33 の結合部位である細モーターにマウス分泌型 ST2 cDNA を挿入したベクター胞外領域のみを持つ分子で、細胞外に分泌される。我々を用いて作製した 。本研究では、BALB/c 系統にバックは、主に in vitro による検討から、分泌型 ST2 が IL-33 の機クロスしたマウスを使用した。図中では、外因性の分泌能を抑制するデコイ受容体として働くことを発見した 。

型 ST2 cDNA が、ゲノム DNA にヘテロの状態で存在する

分泌型 ST2 は、遊離の IL-33 と特異的に結合し、複合体マウスをトランスジェニック（Tg）、外因性の分泌型 ST25）6）を形成する。この複合体は IL-33 受容体に結合できないた

cDNA がゲノム DNA に挿入されていないマウスを野生型め、標的細胞は活性化されない。生体内においても、分泌（Wt）として表記した。ST2-Tg マウスの繁殖、成長、免疫型 ST2 は IL-33 デコイ受容体として働くものと予想される。

細胞数などは、野生型マウスと比べて、差は見られなかった。

そこで、我々は生体内における分泌型 ST2 の作用を検討

2. 2. 皮膚樹状細胞の遊走能の評価
マウスの右耳介の表裏に0.5% fluorescein isothiocyanate（FITC）液を 40 ml 塗布し、左耳介の表裏に溶媒液を 40 ml
Regulation of skin inflammation with IL33 decoy receptor
Morisada Hayakawa
Department of Biochemistry, School ofMedicine, Jichi Medical University塗布した。塗布 24 時間後、右側と左側の顎下リンパ節を そ れ ぞ れ 採 取 し、 細 胞 を 単 離 し た。 細 胞 に 抗 CD16/
CD32 抗体を加えて Fc 受容体をブロックした後、7-aminoactinomycin D（7-AAD）、蛍光標識抗 CD11c 抗体、およ− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

＋び蛍光標識抗 I-A/I-E 抗体を添加した。その後、フローサ

リンパ節をそれぞれ採取し、FITC 陽性の樹状細胞（FITC

イトメーターにより、FITC 陽性の CD11c I-A/I-E 細胞CD11c I-A/I-E ）をフローサイトメーターにより検出しを検出した。

た（図 1）。野生型および ST2-Tg マウスともに、左右リン＋＋＋＋＋＋パ節中の樹状細胞（CD11c I-A/I-E ）の割合に差はなかっ＋

2. 3. 接触皮膚炎モデル＋＋た（図 1A）。FITC CD11c I-A/I-E 細胞は、FITC 塗布マウスの腹部の毛をバリカンで刈り、腹部皮膚に 0.5%した右耳介側のリンパ節にのみ検出された（図 1B）。また、

FITC 液を 200 ml 塗布して感作した。感作 6 日後、両耳のFITC CD11c I-A/I-E 細胞数は、野生型マウスに比べて、耳介の厚さを測定した後、右耳介の表裏に 0.5% FITC 液

ST2-Tg マウスの方が少なかったが、有意差はなかった（図＋＋＋を 30 ml 塗布し、左耳介の表裏に溶媒液を 30 ml 塗布した。

1C）。これらの結果から、分泌型 ST2 は、ハプテン感作

その後、経時的に両耳の耳介の厚さを測定した。

期による皮膚樹状細胞の遊走能には影響しないことが明らかになった。

2. 4. アトピー性皮膚炎モデルで処理した。背部皮膚と耳介をテープストリッピングした

3. 2. ハプテン塗布による接触皮膚炎における皮膚炎症の解析

後、50% グリセロール含有生理食塩水に溶解したコナヒョ

ハ プ テ ン に FITC を 用 い て 接 触 皮 膚 炎 モ デ ル を 作 製

ウヒダニ抽出物（HDM）を 100 ml（2.5 mg/ml）塗布した。コし、皮膚炎症に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。まントロールには、50% グリセロール含有生理食塩水 100 ml

ず、除毛した腹部皮膚に FITC を塗布して感作した。感作を反復塗布した。塗布は週に 2 回、8 週間行った。その間、6 日後、両耳の耳介の厚さを測定した後、右耳介に FITC 液、経時的に耳介の厚さを測定した。最終塗布から 24 時間後左耳介に溶媒液を塗布して炎症を惹起した。その後、経時に背部皮膚、耳介、血清、腋窩リンパ節を採取した。

的に両耳の耳介の厚さを測定し、耳介の腫脹を算出した（図

マウスの背部の毛をバリカンで刈った後、除毛クリーム

耳介および背部皮膚のパラフィン切片を作製し、ヘマト2）。FITC 刺激による耳介の腫脹のパターンは、野生型おキシリン−エオジン染色した。腋窩リンパ節から単離した

よび ST2-Tg マウスともに、塗布 24 時間後がピークとなり、細胞に HDM を添加し、4 日間培養した後、培養上清を採その後減弱した。また、野生型と ST2-Tg マウスの耳介の取した。血清中、およびリンパ節細胞の培養上清中のサイト

腫脹は同程度であった。これらの結果から、分泌型 ST2 は、カインと免疫グロブリンの濃度を ELISA 法により測定した。

FITC による接触皮膚炎には影響しないことが示唆された。

３．結果

3. 3. アトピー性皮膚炎モデルにおける皮膚病変部の解析

3. 1. 皮膚樹状細胞の遊走能の解析

ダニ抗原によるアトピー性皮膚炎モデルを作製し、皮膚皮膚樹状細胞の遊走に対する分泌型 ST2 の関与を、炎症に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。アレルゲン

FITC を用いて検討した。右耳介に FITC 液、左耳介にはとしてコナヒョウヒダニ抽出物（HDM）を用いて、除毛し対照として溶媒液を塗布した。24 時間経過後、左右の顎下た背部皮膚と左右耳介に 8 週間反復塗布することにより炎症を誘導した。対照群には、HDM 溶媒液である 50% グリ

図１ 表皮樹状細胞の遊走能の解析（A）顎下リンパ節中の樹状細胞（CD11c ＋ I-A/I-E ＋）をフローサイトメーターにより検出した。
（B）FITC 陽性の樹状細胞（FITC ＋ CD11c ＋ I-A/I-E ＋）をフローサイトメーターにより検出した。
（C）顎下リンパ節中の FITC ＋ CD11c ＋ I-A/I-E ＋細胞数を計測した。

− 94 −

IL-33 デコイ受容体による皮膚炎症の制御

セロール含有生理食塩水を塗布した。経時的に耳介の厚さ

生型マウスの背部皮膚は、表皮、真皮、および皮下組織の測定を行い、最終塗布から 24 時間後に背部皮膚、耳介、に肥厚が認められた。ST2-Tg マウスでは、HDM 塗布に血清、腋窩リンパ節を採取した。経時的に耳介の厚さを測より肥厚は生じたが、野生型マウスに比べて減弱していた定した結果、野生型および ST2-Tg マウスともに、HDM（図 3B）。これらの結果から、ST2-Tg マウスの皮膚炎症は、塗布 1 週後から耳介の腫脹が認められたが、ST2-Tg マウ

野生型マウスよりも軽度であることが明らかになった。

スでは、野生型マウスに比べて減弱していた。HDM 塗布
5 週後以降は、野生型と ST2-Tg マウスとの差が顕著になった（図 3A）。耳介の組織像を解析したところ、ST2-Tg

3. 4. ダニ抗原塗布による血清サイトカインおよび血清IgE の増加

マウスでは、野生型マウスに比べて、表皮および皮下組サイトカインと免疫グロブリンの産生について調べるた織の肥厚が減弱していた（図 3B）。また、HDM 塗布した野め、各種サイトカイン、総 IgE、および HDM 特異的 IgE

図２ 接触皮膚炎による耳介の腫脹
FITC 液（FITC）または溶媒液（Vehicle）塗布後の耳介の厚さから、塗布前の耳介の厚さを差し引き、その差を腫脹とした。

図３ ダニ抗原反復塗布による皮膚病変部の解析（A）ダニ抗原（HDM）または溶媒液（Vehicle）塗布後の耳介の厚さから、塗布前の耳介の厚さを差し引き、その差を腫脹とした。*, p < 0.05、**, p < 0.01。
（B）耳介および背部皮膚のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色した。
（上段）
耳介、（下段）背部皮膚。Scale bar=100μm。

− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015の値を ELISA 法により測定した。HDM 塗布群の ST2-Tg

値を ELISA 法により測定した。HDM 塗布群の野生型おマウスにおける IL-13 値は、野生型マウスに比べて顕著によび ST2-Tg マウス由来リンパ節細胞は、HDM 刺激に応低かった。IL-5 は非常に低濃度であったが、IL-13 と同様じて、IL-4、IL-5、および IL-13 を産生した。しかしながの傾向を示した。また、ST2-Tg マウスにおける総 IgE 値ら、ST2-Tg マウスでは、野生型マウスに比べて、いずれおよび HDM 特異的 IgE 値も、野生型マウスに比べて低かのサイトカインも低値であった。一方、IFN-γ の産生は、った（図 4）。IL-4、IFN-γ、および IL-33 は、HDM 塗布群

HDM 塗布群の ST2-Tg マウス由来のリンパ節細胞の方が、および溶媒液塗布群のいずれにおいても、検出限界以下で野生型マウスに比べて僅かに亢進していた（図 5）。これあった。これらの結果から、ST2-Tg マウスでは、Th2 サらの結果から、ST2-Tg マウスの末梢リンパ組織におけるイトカインや IgE の産生が抑制されていることが明らかに

Th2 型免疫応答は、野生型マウスよりも低下しているこなった。とが明らかになった。

４．考3. 5. 所属リンパ節におけるサイトカイン産生察腋窩リンパ節から単離した細胞を用いて、ダニ抗原刺本研究では、2 種類の皮膚炎症モデルにより、皮膚炎症激に応じて産生されるサイトカインを調べた。リンパ節に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。FITC 塗布による細胞に HDM または生理食塩水液を添加して 4 日間培養し接触皮膚炎モデルでは、野生型と ST2-Tg マウスにおけるた後、培養上清中の IL-4、IL-5、IL-13、および IFN-γ の皮膚樹状細胞の遊走能と皮膚炎症に大きな違いは見られな

図４ 血清サイトカインおよび血清 IgE の産生
血清中の IL-13 値、総 IgE 値（Total IgE）、および HDM 特異的 IgE 値（HDM-IgE）を ELISA 法により測定した。
*, p < 0.05、**, p<0.01。

図５ 所属リンパ節由来細胞のサイトカイン産生
溶媒液塗布または HDM 塗布した野生型および ST2-Tg マウス（Wt-Veh、Tg-Veh、Wt-HDM、Tg-HDM）の腋窩リンパ節由来の細胞に生理食塩水（Saline）またはダニ抗原（HDM）を添加し、4 日間培養した後、培養上清を採取した。培養上清中の IL-4、IL-5、IL-13、および IFN-γ の値を ELISA 法により測定した。**，p < 0.01。

− 96 −

IL-33 デコイ受容体による皮膚炎症の制御かった。IL-33 欠損マウスにおける接触皮膚炎の各種症状（引用文献）

も、野生型マウスと差がないことが報告されている 。こ１）Schmitz J, Owyang A, Oldham E, Song Y, Murphyのことから、IL-33 ／ ST2L 系は、接触皮膚炎の発症に関E, McClanahan TK, Zurawski G, Moshrefi M, Qin J,与しないものと考えられ、分泌型 ST2 の有無も皮膚炎症

Li X, Gorman DM, Bazan JF, and Kastelein RA,:IL-33,に影響しないことが示唆された。

an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1

7）

HDM 反復塗布によるアトピー性皮膚炎モデルでは、

receptor-related protein ST2 and induces T helper

ST2-Tg マウスの皮膚炎症および Th2 型免疫応答は、野生type 2-associated cytokines, Immunity, 2 3, 4 7 9-4 9 0,型マウスに比べて減弱していた。このことから、分泌型

2005.

ST2 は、アトピー性皮膚炎の皮膚炎症を軽減させる作用

２）Pushparaj PN, Tay HK, H’ng SC, Pitman N, Xu D,を持つ可能性が示唆された。ST2-Tg マウスにおける分泌

McKenzie A, Liew FY, Melendez AJ,: The cytokine

型 ST2 は、恒常的に様々な組織で発現しているだけでなく、interleukin-33 mediates anaphylactic shock, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 106, 9773-9778, 2009.

血流を通しても全身に循環している。このため、IL-33の機能が分泌型 ST2 により抑制されるものと考えられた。

３）Yanagisawa K, Takagi T, Tsukamoto T, Tetsuka

しかしながら、ELISA 法では、HDM 刺激した野生型マウT, and Tominaga S,: Presence of a novel primaryスにおいても血清 IL-33 を検出できなかった。今後、このresponse gene ST2L, encoding a product highly similar

モデルマウスの皮膚病変部における IL-33 の発現を調べる

to the interleukin 1 receptor type 1, FEBS Lett., 3 1 8,予定である。

83-87, 1993.

アトピー性皮膚炎患者では、皮膚病変部に IL-33 の発４）Tominaga S,: A putative protein of a growth specific2）

現亢進が認められる 。また、IL-33 トランスジェニック

cDNA from BALB/c-3T3 cells is highly similar to the（IL-33-Tg）マウスを用いた解析において、IL-33 の発現亢

extracellular portion of mouse interleukin 1 receptor,

進により皮膚炎症が誘導されることが示された 。このFEBS Lett., 258, 301-304, 1989.

8）

IL-33-Tg マウスは、表皮特異的に IL-33 を過剰発現してお５）Hayakawa H, Hayakawa M, Kume A, and Tominaga

り、アトピー性皮膚炎と似た皮膚炎症を自然発症する。まS,: Soluble ST2 blocks interleukin-3 3 signaling in

た、Th2 サイトカイン産生能力を持つ２型自然リンパ球

allergic airway inflammation, J. Biol. Chem., 282, 26369-が皮膚炎症の発症に関与することも示唆された。しかしな26380, 2007.

がら、IL-33 がどのような機序で細胞外に産生されるのか

６）Ohto-Ozaki H, Kuroiwa K, Mato N, Matsuyamaは分かっていない。IL-33 は、上皮細胞などで発現するが、Y, Hayakawa M, Tamemoto H, Tominaga S,:

その細胞内局在は核である。そのため、アトピー性皮膚炎

Characterization of ST2 transgenic mice with resistanceの患者やモデルマウスでは、搔破行動により表皮細胞が傷

to IL-33, Eur. J. Immunol., 40, 2632-2642, 2010.

つき、細胞外に IL-33 が放出されるものと考えられている。

７）Oboki K, Ohno T, Kajiwara N, Arae K, Morita H,

このように、アトピー性皮膚炎の発症機序にはまだ不明な

Ishii A, Nambu A, Abe T, Kiyonari H, Matsumoto

点は多いが、その発症に IL-33 が関与する可能性は強く示K, Sudo K, Okumura K, Saito H, Nakae S,: IL-3 3 is唆されている。

a crucial amplifier of innate rather than acquired

５．総immunity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1 0 7, 1 8 5 8 1-括18586, 2010.

本研究は、ST2-Tg マウスを用いて、分泌型 ST2 がアト８）Imai Y, Yasuda K, Sakaguchi Y, Haneda T, Mizutani

ピー性皮膚炎に見られる皮膚炎症および Th2 型免疫応答

H, Yoshimoto T, Nakanishi K, Yamanishi K,: Skin-を抑制することを明らかにした。今後、アトピー性皮膚炎

specific expression of IL-3 3 activates group 2 innateの発症機序の解明や治療薬の開発に、分泌型 ST2、すなわ

lymphoid cells and elicits atopic dermatitis-likeち IL-33 デコイ受容体が寄与することが期待される。

inflammation in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110,13921-13926, 2013.

− 97 −