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サイトカイン測定の意義とその留意点
大阪ラボラトリー

白井雅子・川口美和・大岡香織・曽根原

和彦

サイトカインは造血系や免疫系への機能を持つ分泌型糖タンパク質であり，最新の分類では 6 つのファミリーに分類される。サイトカインそのもの，またはサイトカイン受容体を標的とする医薬品が上市されているほか，臨床検査，免疫療法における副作用指標に利用されるなど，生体試料中のサイトカイン測定の意義が高まっている。Multiplex を含む
ligand binding assay での測定が汎用されているが，測定バリデーションに関する規制，測定結果に影響を与える種々の要因に注意を払う必要がある。当社はお客様の求める分析仕様を第一に考え，サービス提供してまいります。

シグナルを伝達する因子類，ケモカイン，および JAK / STAT

1 はじめにサイトカインについては，
1950 年代における IFN（interferon）（Janus kinase/ signal transduction and activator of‑αの発見から半世紀超を経て，関係するリガンド・受容体の構造transcription）経路を介するサイトカイン類に分類される 2）。

や，細胞内伝達形式の知見が集まり，その機能・分類の整理が

TNF および TNF 受容体（TNFR）スーパーファミリーは，進んだ。30 種類に迫る治療応用も実現し，アンメット・メディ

19 のリガンドと 29 の受容体を含む。TNF‑ αとの配列相同性

カル・ニーズすなわち，それまでに有効な治療方法がないとさに基づいて，LT‑ β（lymphotoxin‑beta），CD27L，CD30L，れていた疾患に対する医療ニーズの，充足の一翼を担って来た。

CD40L，FasL，4‒1BBL，OX40L，RANKL，APRIL，

また，一昨年からの SARS‑CoV‑2 の感染症（COVID‑19）の

EDA‑A1，EDA‑A2，LIGHT，BAFF，TRAIL，TWEAK，TL1A，

報道により，サイトカインストームという言葉も広く認知される

GITRL などのメンバーが同定された 4）。

ようになった。本稿では生体試料中のサイトカイン測定の意義と分析における留意点について述べる。

IL‑1 および IL‑1 受容体（IL‑1R）スーパーファミリーは，11 種のサイトカイン（IL‑1，IL‑18，IL‑33，IL‑37，IL‑38 等）と10 種の受容体より構成され，自然免疫と呼ばれる炎症性および宿主防御特性を担い，非特異性を特徴とする 5）6）。

2 サイトカイン

TGF‑ βファミリータンパク質は 33 の遺伝子にコードされ，

2.1 サイトカインとは
サイトカインは造血系および免疫系にて炎症反応を制御する細胞間メッセンジャーとして機能する分泌型糖タンパク質でTGF‑ βアイソフォーム，inhibin β，BMP/GDF ファミリーを含むとされる 7）。

ある。
「cytokine」という用語は，ギリシャ語の「細胞と運動」

M‑CSF と IL‑34 の受容体である CSF1R は，受容体チロシンを語源とし，免疫細胞を感染と炎症の部位に動員する能力を意味キナーゼの Type Ⅲ（PDGF ファミリー）に位置づけられる 8）。

する 1）。サイトカインの一種である interleukin（IL）は，特異的IL‑8 類，MCP（monocyte chemoattractant protein）類な受容体に結合し，白血球間の情報伝達を担うタンパク質の意味を含み，50 種以上が同定されているケモカイン類の受容体は，2）で名付けられている 。ケモカインは，化学誘因性サイトカイン

ヒト 7 回膜貫通 G タンパク質共役型構造を持つ。サイトカイン類（chemoattractant cytokines）のファミリーで，血液・組織間（ILs の名前を冠するものを除く）が機能に基づき定義されているの小静脈を介した細胞移動，および化学物質に応答した細胞運動のと対照的に，ケモカイン類は一次構造で定義される。ほとんど

3）の誘導に重要な役割を果たす 。

が 70 〜 80 アミノ酸より成り，N 末端システインの数と間隔に2.2 サイトカインの分類

CX3CL）9）。

応じて 4 つに細分して名付けられている（CXCL，CCL，XCL，

サイトカインは，配列の相同性，受容体鎖の類似性または50 種を 超 える JAK/STAT 関連 のサイトカインは，IL‑2，機能特性に基づいて各ファミリーに分類される。サイトカインのIL‑3，IL‑6 のファミリーを含む Class Ⅰサイトカインと，IFN

主要なファミリーは次の 6 つ，すなわち TNF（tumor necrosis

類及び IL‑10 ファミリー等を含む Class Ⅱサイトカインに分類

factor）類，IL‑1 ファミリーメンバー，
TGF‑ β（transformingされる 2）。

growth factor‑ β）類，受容体チロシンキナーゼを介して
17 住化分析センター SCAS NEWS 2021 ‑Ⅱ分 析 技 術 最 前 線

3 サイトカイン測定の意義

4 サイトカイン測定の実際

3.1 医薬品とその分子標的としてのサイトカイン

4.1 測定方法

サイトカインそのもの，あるいはサイトカイン受容体等を分子4.1.1 汎用測定法

標的とする医薬品が多数上市されている（表 1）。サイトカインの血清または血漿などの生体試料中のサイトカイン類の測定に遺伝子組換えタンパク質自体が医薬品であるものは，その薬物は，抗原 ‑ 抗体の特異的結合を利用した LBA（ligand binding

動態特性の確認の目的で濃度測定が行われる。また，サイトassay）法が実用的に用いられている。特異的な 2 種の抗体でカインあるいはその受容体に対する抗体が医薬品である場合は，analyte を検出するサンドイッチイムノアッセイの市販キットのその抗体医薬品の効果や濃度測定に与える影響の有無評価のため活用が可能である。単一 analyte を分析する ELISA（enzyme‑測定されることがある。

linked immuno sorbent assay）kit の 他， 多 項 目 同 時 測 定

3.2 臨床検査におけるサイトカイン

Diagnostics, LLC），Luminex（Luminex Corp.），Ella TMが可能な ECL（electro chemiluminescence，Meso Scale

非ホジキンリンパ腫，成人T 細胞性白血病（ATL），急性リンパ球性白血病（ALL）における sIL‑2R，アトピー性皮膚炎における（Protein Simple）等の kit が，対応 analyte，検体種，感度等を勘案の上，選択される。

TARC，COVID‑19 の 重 症 化 リ ス ク に 対 す る
IFN‑ γ 3，全身性炎症反応症候群，多臓器障害，敗 血 症における IL‑6 は，各 疾 患 の指 標として

表1 サイトカインに関係の医薬品

臨床検査の保険項目に収載されている。これらは CLEIA（chemiluminescent enzyme

分類

適応症

IFN‑ α（Interferon alfa）

C 型慢性肝炎，胃癌他

IFN‑ β（Interferon beta）

C 型慢性肝炎，芽腫，多発性硬化症等

immunoassay）などの方法にて測定されている。

3.3 副作用指標としてのサイトカイン
免 疫 チ ェ ッ ク ポ イ ン ト 阻 害 薬，Bispeciﬁc

サイトカイン・ホルモン

T‑cell Engager（BiTE）法，Car‑T 療法などの強力な免疫療法の臨床応用に伴い，潜在的に致命的な副作用，特にサイトカイン放出症候群（CRS）の認識が高まっている。
CRS のグレーディングは CTCAE（有害事象共通用語規準）において，軽度より Grade 1（全身症状の有無は問わない発熱），Grade 2（輸液反応性低血圧，（40% 未満の）低濃度酸素投与反応性の低酸素症），Grade 3（昇圧剤反応性低血圧，（40% 以上の）要高濃度酸素投与の低酸素症），
Grade 4（生命を脅かす結果，人工呼吸器等の要緊急処置）と規定されている10）。

抗体

Grade 1，2 では，T 細胞の活性化や免疫細胞の溶解により，IFN‑ γや TNF‑ αの放出が誘導

IFN‑ γ（Interferon gamma 1a）

腎癌

EPO（Epoetin）

腎性貧血

G‑CSF（Filgrastim）

各種好中球減少症

IL‑2（Celmoleukin，Teceleukin）

血管肉腫

bFGF（Trafermin）

褥瘡，皮膚潰瘍

GH（Somatropin，Somapacitan）

下垂体性小人症他

Leptin（Metreleptin）

脂肪萎縮症

抗 TNF‑ α抗体（Inﬂiximab，Adalimumab，Golimumab）

関節リウマチ他

抗 IL‑6R 抗体（Tocilizumab）

関節リウマチ他

抗 IL‑12/IL23‑p40 抗体（Ustekinumab）

尋常性乾癬他

抗 IL‑1 β抗体（Canakinumab）

クリオピリン関連
周期性症候群他

抗 CCR4 抗体（Mogamulizumab）

T 細胞リンパ腫他

抗 IL‑17A 抗体（Secukinumab）

尋常性乾癬

抗 IL‑5 抗体（Mepolizumab）

気管支喘息他

抗 IL‑17 抗体（Ixekizumab）

尋常性乾癬他

抗 IL‑17R 抗体（Brodalumab）

尋常性乾癬他

抗 IL‑6R αサブユニット抗体（Sarilumab）

関節リウマチ

抗 IL‑4R αサブユニット抗体（Dupilumab）

アトピー性皮膚炎他される。それに続き，マクロファージ，樹状細胞，

抗 IL‑5R αサブユニット抗体（Benralizumab） 気管支喘息

その他の免疫細胞，内皮細胞が活性化され，炎症抗 IL‑23 抗体（Guselkumab）

尋常性乾癬他性サイトカインが放出される。Grade 3，
4 では，

抗 IL‑23 α（p19）サブユニット抗体（Risankizumab）

尋常性乾癬他

pH 依存的結合性抗 IL‑6R 抗体（Satralizumab）

視神経脊髄炎スペク
トラム障害

可溶性 TNFR‑Fc 融合タンパク質（Etanercept）

関節リウマチTPO（Fc‑TPOR アゴニストペプチド融合タンパク質）（Romiplostim）

血小板減少

CCR5 阻害剤（Maraviroc）

HIV 感染症治療薬

CXCR4 拮抗薬（Plerixafor）

末梢血中への動員促進薬

特にマクロファージと内皮細胞は大量の IL‑6 を産生し，正のフィードバックループにて T 細胞や他の免疫細胞を活性化しサイトカインストームを引き起こす 11）。

融合タンパク質

開発段階でのサイトカイン放出プロファイルの確認が，免疫療法の潜在的リスクの推定や，有害事象発生時の処置準備の手助けとなる。

低分子住化分析センター SCAS NEWS 2021 ‑Ⅱ 18

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場合，multi‑subtype 検出のキットを選択する必要がある。多数

4.1.2 超高感度測定法
サイトカイン類は一般にその血中濃度が数十 pg/mL 以下との分子種のあるその他のサイトカインについても同様である。

低いことから，市販の汎用キットではしばしば検出限界以下となる。S‑PLEX（Meso Scale Diagnostics, LLC.），Simoa（Quanterix），SMCxPro（Merck KGaA），Immuno‑PCR

4.2.3 翻訳後修飾
サイトカインの市販のキットに内包の calibrator は，ヒト（RayBiotech, Inc.）などの測定プラットフォームでは，一部の細胞あるいはヒト生体試料由来のもの以外に，大腸菌，CHO

サイトカインの Single‑plex でサブ pg/mL 以下の超高感度（Chinese hamster ovary）または昆虫細胞から製造されたもの測定が可能であり，その性能が期待される。

がある。後者の場合，ペプチド骨格のリン酸化やグリコシル化など翻訳後修飾の様相がヒト由来のものと異なることにより，タンパク質の安定性，タンパク質間相互作用，タンパク質の折り4.1.3 サイトカインの LC‑MS での測定
サイトカイン類は，血漿プロテオーム中での存在量が数十畳み及び抗原性に影響を与える可能性がある。

pg/mL 以 下 と 低 く，albumin や IgG な ど の HAP（ 高 濃 度タンパク質）の除去や，aﬃnity 精製等による前処理を介した
12）

4.2.4 サイトカイン試料の安定性。上位 14

一部のサイトカインについて，採血管の種類，‑80℃凍結保存

HAPs（albumin，IgG，transferrin，haptoglobin，alpha期間，凍結融解回数がその測定結果に大きな影響を及ぼすとの1‑antitrypsin，IgA，fibrinogen，alpha2 macroglobulin，報告がある 16）。

多次元 MS を経ても実用的な解析が困難である

alpha1 acid‑glycoprotein，IgM，apolipoprotein AI，apolipoprotein AII，complement C3 及 び transthyretin） の4.2.5 サイトカインの可溶性受容体

multiple affinity removal system（MARS‑14）immuno‑

サイトカインの受容体は，免疫細胞の表面受容体として存在depletion column（Agilent Technologies, Inc.）での除去など，する他，多くのサイトカインで可溶性受容体の存在が報告され13）ている。それらは受容体をコードする遺伝子から自然に生成さ種々の除去法が試みられている。

れるもの，あるいは膜受容体の派生物などである。それらの大多数は受容体阻害的に機能するが，受容体のダウンレギュレー

4.1.4 In vitro サイトカイン誘導アッセイ
臨床でのモノクローナル抗体医薬品の重篤なインフュージョンションを起こすもの，受容体アゴニスト活性を示すもの，サイトリアクションや，治療用オリゴヌクレオチドに対する全身性のカイン結合タンパク質として機能するものもある 17）。疾患やサイトカイン反応の予測の手段として，In vitro 全血アッセイ

モデル実験での可溶性受容体 sIL‑6R の IL‑6 作用の増強の報告（WBA：whole blood assay）の有用性が提案されている

14）15）。

もある 18）。サイトカインの可溶性受容体は，サイトカインの機能や測定値だけでなく，疾患状態にも影響することを考慮する必要

4.2 サイトカイン測定の留意点がある。

4.2.1 Multiplex 測定の留意点
サイトカイン等の multiplex 測定では，単一 well 内で複数の4.2.6 サイトカインと自己抗体LBA を実施するため，測定試料の希釈倍率は均一な 1 条件で全身性エリテマトーデス（SLE）患者，癌患者のみならず，実施せざるを得ず，一部の項目にて希釈超過による感度不足や，健常人血清中に，Ⅰ，Ⅱ型 IFN 類（IFN‑ α，IFN‑ β，IFN‑ γ等）

希釈不足によるマトリックス効果で希釈直線性を得られないことの IgG 及び IgM タイプの自己抗体の存在報告があり 19），IFN 類がある。正確な定量値取得のため，該当項目について別途アッの機能や，定量値への影響を考慮する必要があるかもしれない。

セイを設定する必要がある。また，サイトカイン等の multiplex

サイトカインの multiplex 測定における NIBSC/WHO standards

測定の市販キットに内包の calibrator の中には，analyte がと定量値の解離の改善策として，Ig（免疫グロブリン）結合タンカクテルになっているものもある。calibrator を用いて QC 試料

パク質である Protein L による前処理が奏功との報告もある 16）。

を調製する際の濃度は，複数の analyte について，感度，レンジ，内因性濃度を考慮の上決定する必要がある。

4.3 サイトカイン測定のバリデーションに関する規制サイトカインを含む狭義のバイオマーカー（流体ベースの4.2.2 アイソフォーム
IFN‑ αは，ヒトにおいて 23 のアイソフォーム（異分子種）
1）

バイオマーカーすなわち血漿，尿，唾液などに可溶なタンパク質，ペプチド，脂質またはその他の化学物質）の医薬品等の申請が報告されている 。特定の分子種（医薬品の IFN‑ α 2）の資料への活用のための測定のバリデーションに関して Lee et al.

pharmacokinetics，toxicokinetics 測 定 など の目的で なく，（2006）20），FDA（2018）21），Piccoli et al.（2019）22）のバイオマーカーとしての広範なⅠ型 IFN 類の測定を目的とする報告は重要である。その骨子として，context of use（利用19 住化分析センター SCAS NEWS 2021 ‑Ⅱ分 析 技 術 最 前 線状況）を勘案の上，ﬁt for purpose（目的に合致）にて，バリデーションの実施が求められる。また，生体試料中の薬物濃度測定

17）M. L. Heaney, D. W. Golde：Journal of Leukocyte Biology , 64,135 （1998）.
18）T. Tamura et al.：Proc. Natl. Acad. Sci. U S A , 90, 11924 （1993）.との相違点として，内因性濃度，平行性，キットのロット間差

19）C. Ross, M. B. Hansen, T. Schyberg, K. Berg：Clin. exp. Immunol. ,について特に留意が必要となる。

82, （1）, 57 （1990）.
20）J W Lee et al.：Pharmaceutical Research , 23, （2）, 312 （2006）.
21）FDA,： Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation ,4.4 サイトカイン測定結果の統計評価
測定法の感度不足や，減少方向への作用にて定量値が定量下限未満（BLQ）となった場合，区間打ち切りデータとしての BLQ に，あ る 値 を 代 入 す ること（deterministic imputation）に より
平均値，SD，CV などの算出・評価が可能となる。BLQ の取扱（0，LLOQ（定量下限），LLOQ/2，除外）による統計値に与えるバイアスの大きさや方向を把握し，事前に取り決めておく必要がある 23）。

（2018）, available from＜https://www.fda.gov/files/drugs/
published/Bioanalytical‑Method‑Validation‑Guidance‑for‑Industry.pdf＞, （accessed 2021‑5‑28）.
22）S. P. Piccoli, J. M. Sauer, Biomarker Assay Collaborative Evidentiary
Considerations Writing Group, Critical Path Institute： Points toConsider Document : Scientiﬁc and Regulatory Considerations for
the Analytical Validation of Assays Used in the Qualiﬁcation ofBiomarkers in Biological Matrices , （2019）, available from＜https://c‑path.org/wp‑content/uploads/2019/06/evidconsid‑
whitepaper‑analyticalsectionv2019.pdf＞, （accessed 2021‑5‑28）.
23）橋本敏夫, 山田雅之, 笠井英史：計量生物学, 36, S19 （2015）.

5 おわりに
現在もサイトカイン類を分子標的とする新規治療の開発候補は少なくない。また創薬ニューモダリティの拡大に伴い，サイトカインに関係するバイオマーカーの評価法も多様化している。
当社では，最新の技術・知識と豊富な経験を活かし，お客様の多様な分析ニーズに応え，問題解決に助力することにより，新規治療の開発に貢献していく。

白井 雅子

文献（しらい まさこ）
大阪ラボラトリー

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Margolis：BMC Immunol , 10, （52）, （2009）.

川口 美和（かわぐち みわ）
大阪ラボラトリー

大岡 香織（おおおか かおり）
大阪ラボラトリー

曽根原 和彦（そねはら かずひこ）
大阪ラボラトリー

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