2022.5

No.

69

非アルコール性脂肪肝モデル SHRSP5/Dmcr ラットにおけるL- シトルリンの体重増加および肝臓内脂肪蓄積抑制効果
武庫川女子大学薬学部

東洋医薬学研究室

高明、工藤麻耶1. 背景・目的 近年の日本における食生活の欧米化進行に伴い、脂質や糖質の過剰摂取に加え、運動不足や飲酒、喫煙などによる生活習慣の乱れにより、体重増加が引き起こされる。体重が増加すると、脂質代謝異常症、高脂血症、高血圧、脂肪肝などの発症の原因となる。これらの疾患が現れた場合は薬物治療を行うが、長期間服用による人体への悪影響が懸念される。従って、天然植物を用いた、安全な治療法の確立が期待される。
SHRSP5/Dmcr ラットは、高脂肪・高コレステロール食を与えることで、短期間で非アルコール性脂肪肝を発症するモデル動物として開発された 1）, 2）。L- シトルリン（以下 L-Cit と表記）はスイカから発見された遊離アミノ酸の一種である 3）。我々は以前 L-Cit をモデル動物に投与し、摂食抑制を介した抗肥満作用に関する報告を行った 4）。本稿では SHRSP5/Dmcr ラットを用いて、L-Cit の体重増加および肝臓内脂肪蓄積抑制効果とその作用機序について検討を行ったので紹介する。
2. 研究結果・考察
対照群
L-Cit群（1）SHRSP5/Dmcr ラットにおける L-Cit 投与の効果270.5 2.19
257.6 3.37*
体重 (g)
7 週齢雄性 SHRSP5/Dmcr ラットを高脂肪・高コレス
13.0 0.21
13.9 1.17
摂餌量 (g/day)
132.2 7.87
125.5 9.68
肝臓重量 (mg/g (体重))テロール食飼育下において、0.5 g/kg/day の L-Cit を 9
11.6 0.97
11.0 0.71
脂肪重量 (mg/g (体重))週間強制経口投与したところ、有意な体重増加抑制が220.6 3.13
220.8 20.46
血中コレステロール値認められた。しかし摂餌量および肝臓・脂肪重量に変(mg/dL)
79.9 6.38*
100.8 3.26
肝臓中53.0 2.24*
45.5 2.14
血中化はなかった。また血液中のコレステロール値、中性中性脂肪値(mg/dL)
171.6 26.6*
256.2 20.8
肝臓中脂肪値、遊離脂肪酸値も L-Cit 投与による影響はなかっ
0.59 0.03
0.58 0.03
血中遊離脂肪酸値 (mEq/L)
た。しかし肝臓中のコレステロール値、中性脂肪値は
273.8
11.24*
303.36.43
血中AST値 (IU/L)
対照群と比べ、L-Cit 群で有意に減少した。さらに肝機17.03.01*
36.35.49
血中ALT値 (IU/L)*P<0.05 対照群との有意差能を示す指標である aspartate aminotransferase（AST）
表 1. SHRSP5/Dmcr ラットの L-Cit 投与開始 9 週目におけるメタボ
および alanine aminotransferase（ALT）も L-Cit 群で低リックパラメーターの比較値を示した（表 1）。
（2）L-Cit 投与による体重増加および肝臓内脂肪蓄積抑制効果の作用機序の検討① L-Cit の体重増加抑制効果の作用機序の検討
L-Cit 投与による体重増加抑制効果の作用機序を解析するため、SHRSP5/Dmcr ラットの脂肪組織における脂質代謝経路関連因子の発現量の検討を行った。脂質代謝を司り、細胞内のエネルギーセンサーである 1）AMP-activated protein kinase（AMPK）のリン酸化の割合は、対照群と比較し L-Cit 群で有意に活性化された。AMPK の下流因子について、脂肪合成に関与する因子である acetyl-CoA carboxylase（ACC）のリン酸化の割合、および fatty acid synthase（FAS）の発現量は二群間で変化はなかった。しかし脂肪分解に関L-Cit与する因子である
G proteinHSL**

0.70coupled receptor**Adenylyl cyclase

Sirt10.7

Control

L-cit

LKB1

*0Control

L-cit

PKA
1.4
Relative ratio(P-PKA/ß-actin)

1.6

P

PKAP

LKB1P

AMPK

Control

L-cit

P0HSL
Lipolysis

ControlcAMP

**

0.7

0.8
01.4
Relative ratio(P-HSL/ß-actin)

Relative ratio(P-AMPK/ß-actin)

ン 酸 化 の 比 率 は、
L-Cit 群 で 有 意 に増 加 し た。ま た、
AMPK の 上 流 に位置する因子についても検討を行 っ た。AMPKの上流因子である

AMPK

1.4

Relative ratio(P-LKB1/ß-actin)

hormone-sensitive
lipase（HSL）のリL-cit

Body weight gain

図 1．SHRSP5/Dmcr ラットの脂肪組織における L-Cit の脂質代謝経路調節機構

FAS

ACCP

sirtuin1（Sirt1）の遺伝子発現量に影響はなかったが、別の上流因子である liver kinase B1（LKB1）および、protein kinase A（PKA）のリン酸化の割合は、L-Cit 群で顕著な増加が見られた。本結果から、L-Cit の投与により SHRSP5/Dmcr ラットの脂肪組織において、脂質代謝経路の PKA-LKB1-AMPK-HSL シグナル活性化を介して、脂肪の分解を促進することで体重増加を抑制する可能性が示された（図 1）。
② L-Cit の肝臓内脂肪蓄積抑制効果の作用機序の検討
次に L-Cit 投与による肝臓内脂肪蓄積抑制効果の作用機序を解析するため、SHRSP5/Dmcr ラットの肝臓における組織学的検討と、脂質代謝経路関連因子の発現量の検討を行った。はじめに肝臓内の脂肪滴蓄積量の検討を行うため、肝臓の組織切片を作成し、hematoxylin and eosin（HE）染色を行った
ところ、対照群と比べ L-Cit 群で脂肪滴の減少が認められた。また慢性的な脂肪肝により肝臓の線維化が惹起される 5）と考えられており、肝臓の線維化について検討を行うため AZAN 染色を行ったとこ
ろ、L-Cit 投与により線維化の進行が抑制されることが示された。さらに、L-Cit 投与による肝臓内脂肪蓄積抑制効果の作用機序を解析するため、SHRSP5/Dmcr ラットの肝臓における、脂質代謝関連因子の発現量の検討を行った。脂質代謝経路の中心的酵素である AMPK のリン酸化の割合は、L-Cit 投与により有意に増加した。AMPK の下流因子については、ACC のリン酸化の割合に差はなかったが、sterol
regulatory element-binding protein 1c（SREBP1C）および FAS の遺伝子発現量が著しく減少した。また
AMPK の上流因子について検討を行ったところ、PKA の活性化は認められなかったが、LKB1 のリン酸化率の増加ならびに Sirt1 の発現量の増加が示された。
さらに L-Cit 投与による肝臓の線維化に関連する因子の発現量についても検討を行った。肝臓の線 維 化 に 関 与 す る 主 要 因 子 で あ る transforming growth factor-β（TGF-β1）6）の 発 現 量 は、対 照 群と 比 べ L-Cit 群 で 有 意 に 減 少 し た。さ ら に TGF-β1 の 下 流 に 位 置 す る Smad2（Ser465/467）/Smad3（Ser423/425）（Smad2/3）のリン酸化の割合も、L-Cit 群で低値を示した。以上の結果より、L-Cit はSHRSP5/Dmcr ラットの肝臓において、脂質代謝経路の Sirt1-LKB1-AMPK-SREBP1C-FAS シグナル活性化を介して脂肪合成を抑制することで、肝臓内脂肪蓄積抑制効果を示し脂肪肝を改善することが明らかとなった。さらに L-Cit 投与による脂肪肝の改善により、TGF-β1-Smad2/3 経路を抑制することで、肝臓の線維化促進を抑制
Control
L-Cit
ControlL-Cit
する可能性が示唆された（図 2）。
3. 結 論 本 研 究 に お
いて SHRSP5/Dmcr ラット へ の 9 週 間 の L-Cit 投AZAN染色HE染色
与 に よ り、AMPK を 介
L-Cit
G protein-coupled receptor
Adenylyl cyclase
した体重増加抑制、肝臓TGF-β内脂肪蓄積抑制、およびTGF-βRP
PKA
Sirt1cAMP
線維化進行阻止作用を発
Smad4
P Smad2/3
PLKB1
Binding
揮することをはじめて明P Smad2/3
P AMPK
Smad4
らかにした。本研究成果
は、L-Cit が体重増加抑FAS
P Smad2/3
Smad4制および脂肪肝改善効果
Lipogenesis
に対して有用な機能性食Fibrosis
Hepatic steatosis improvement
品となり得る可能性を示
図 2. SHRSP5/Dmcr ラット肝臓における染色画像と L-Cit の脂質代謝および線維化関連経路調節機構
した。
ACC参考

1) Liu et al. Nutrients. 2018, 10. 830.
2) Yamori et al. Japanese Circulation Journal. 1981, 45. 1068-1073.
3) Rimando & Perkins-Veazie. Journal of Chromatography. 2005, 05. 009.

文P献4) Kudo et al. Biological Pharmaceutical Bulletin. 2017, 40. 524-530.
5) Yang et al, Journal of Natural Medicines. 2018, 72. 145-152.
6) Friedman et al. Gastroenterology. 2008, 134. 1655-1669.
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