革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発
弘前大学大学院医学研究科生体構造医科学講座

下田浩

Establishment of full-thickness human cutaneous three-dimensional ( 3 D) equivalent containing blood and/ or lymphatic
vasculature is required for drug discovery and development of chemicals and cosmetics, because microcirculatory system innature human skin plays an important role in regulating cutaneous morphogenesis and physiological function. The present
study employed our developed layer-by-layer (LbL) nanofilm coating and unique collagen gel cell-accumulation techniques
to fabricate human epidermis on dermis-like cellular and fibrous tissue with or without blood or lymphatic capillary network.
Our constructs without vascular network exhibited a well-organized epidermal tissue involving cellular differentiation of
keratinocytes and distinctive layer formation with cornification on basement membrane of dermal connective tissue and ahigh barrier function after exposure to a cytotoxic corrosive. Additional equipment of horizontal capillary network within
the dermal tissue by LbL coating method facilitates formation of every layer in epidermis, as well as dermal tissue, toincrease thickness of each tissue. Three-dimensional configuration of the vascular network introduced by collagen gel cellaccumulation procedure further accelerates maturation and thickening of both tissues. However, the lymphatic network
prepared by the current LbL coating method was somewhat different in its form from that in normal nature human skinand leave little impression on both epidermal and dermal structure in the engineered cutaneous tissue, so that improved
procedure for building lymphatic vasculature, being closely like that in nature dermis, has been currently developed. The
present results consequently demonstrate that our peculiar tissue-engineering methods afford in vitro full-thickness humancutaneous 3 D model like nature skin simply and substantial vascular network, being effective in tissue maturation, in ashorter period than that described previously. Our vascularized cutaneous tissue constructs are expected as next-generationin vitro skin models for drug and cosmetic development and as biomaterials for regenerative medicine.

１．緒

化される、再現性の高い簡便な技術の確立が不可欠である。

言

このことは化粧品などの化成品の開発のみならず、医薬品

化粧品の開発において、EU では既に動物実験が禁止さや再生医療材料の開発においてもきわめて大きな意義を有れ、本邦でも自主規制が強化されている。また、評価成績する。我々の研究グループは独自に開発した細胞集積法 9）のヒトへの応用を考慮した場合、皮膚構造が異なる実験動によりこれまで心筋 10）、腹膜 11 - 12）、動脈 13）など様々なヒ物ではなくヒトにおける研究が好ましいのは明白であるが、ト三次元組織を創製するとともに、その内部に数日で血管

このことは倫理的に困難な問題を含んでいる。これに対しやリンパ管のネットワークを自己組織化させることに成功

1）て近年、ヒト表皮細胞を分化・重層化した表皮組織 が汎している。この 3 D 組織構築技術を応用し、化粧品・医薬用されているが、最近ではよりヒト皮膚に近い構築を模倣品の開発と再生医療への応用性に優れた、高度な機能解剖する真皮様結合組織に表皮組織を積層した擬似皮膚相同体

学的特性をもつ血管・リンパ管網含有 3 D ヒト皮膚モデルの開発が報告されている

2 - 9）。しかし、その多くは体液のを確立することが本研究の目的である。

通路と生体反応の環境を提供する微小循環系（血管・リン

2. 方

パ管）
を真皮組織内に装備しておらず 1 - 6）、組織内における脈管の組織化に乏しい例 7）と脈管の構築に特殊なデバイス

2 . 1. 細胞培養

や多種多様な生理活性添加剤、加えて長い期間と多数の煩雑な工程を要する例

8）法

ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF；Lonza, NJ, USA）
、ヒト

を見るに止まっている。これらの課

臍帯静脈内皮細胞（HUVEC；Lonza）、ヒト皮膚リンパ管

題を同時に解決するには、血管やリンパ管が解剖学的正確

内皮細胞（HDLEC；PromoCell, Heidelberg, Germany）、正

性をもって配置された真皮組織と優れた機能形態を有する

常ヒト表皮角化細胞（NHEK；Kurabo, Japan）を 37 ℃、5 %表皮組織から成る三次元（3 D）構造体が短期間で自己組織

CO 2 濃度下で、それぞれの専用培地（10 % fetal bovine serum（FBS）含有 DMEM（Lonza），EGM ™ - 2 MV, NHEK 増殖添

Development of progressive humancutaneous 3 D model

加剤含有 EpiLife ™（Thermo Fisher Scientific, MA, USA））
を皮膚モデルの作製に供した。

Hiroshi Shimoda
Department of Anatomical Science,N e u r o a n at o my, C e l l B i o l o g y a n d
Histology, Hirosaki University Graduate
School of Medicine

2 . 2 . LbL・細胞集積法による三次元皮膚モデルの構築
細胞表面にフィブロネクチン（Sigma-Aldrich, MO, USA）とゼラチン（Wako Pure Chemical Industries, Japan）による− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

多層性（layer-by-layer；LbL）ナノフィルムコーティング®

リンパ管網含有皮膚モデルについては、HUVEC の代わを施した NHDF を 24 -well 用 Transwell insert（Corning,

りにコーティングを施していない 0 . 5 層分の HDLEC を用

NY, USA）に 8 層となるように播種・積層化し、翌日～

いて上記と同様の操作を行うことによりリンパ管網含有皮

数 日 後 に NHDF 積 層 組 織 表 層 を Type IV collagen 溶 液

膚モデルを構築した（図 1）。

（0 . 04 mg/ml；Sigma-Aldrich）でコーティングした後、そ
翌 日 よ り 10 % FBS 含 有 DMEM と EpiLife ™ の 等 量 混 合2 . 4 . コラーゲンゲル・細胞集積法による血管網含有
三次元皮膚モデルの構築

培 地 に 25 µg/ml ア ス コ ル ビ ン 酸（Wako Pure Chemical

コラーゲンゲル溶液（3 mg/ml；collagen from human

Industries）を添加した培地を用いて air-lift による培養を

placenta；Sigma-Aldrich）に NHDF（1 × 105）と HUVEC

7 日間行い、真皮と表皮より成る皮膚モデルを構築した（図（0 . 5 × 105）を浮遊させ、遠心平衡化（1100 G, 15 分）した後、

1）。

24 -well 用 Transwell® insert に播種し，翌日より 2 . 2 . との上層に NHEK を 3 層性に播種した（図 1）。NHEK 積層

同様に NHEK の培養を 7 日間行い、血管網含有皮膚モデ

2 . 3 . LbL・細胞集積法による血管（リンパ管）網含有
三次元皮膚モデルの構築
NHDF および HUVEC の細胞表面に 2 . 2 . と同様のコールを構築した（図 2）。

2 . 5 . 光学顕微鏡的解析

ティングを行い、1 層の HUVEC を各 4 層の NHDF でサン2 . 2 . ～ 2 . 4 . において構築した各種三次元組織（各 3 体）

ドイッチ状に挟み込むように播種・積層化した（図 1）。翌

を 4 % パラホルムアルデヒド溶液で固定し、5 µm 厚のパラ

日～数日後に 2 . 2 . と同様に NHEK の培養を 7 日間行い、フィン包埋組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン

血管網含有皮膚モデルを構築した（図 1）。

（H. E.）染色ならびに下記の免疫染色に供した。また、2 . 3 .

図 1 LbL・細胞集積法による血管（リンパ管）網含有 3 D 皮膚モデルの構築。主にフィブロネクチンとゼラチンによる多層化（Layer-byLayer；LbL）ナノフィルムコーティングを行ったヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）またはヒト皮膚リンパ管内皮細胞（HDLEC）を積層化した後、上層に正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を播種し、air-lift の状態で分化・誘導する。

図 2 コラーゲンゲル・細胞集積法による血管網含有 3 D 皮膚モデルの構築。コラーゲンゲル溶液にヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と浮遊・遠心し、積層化した後、上層に正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を播種し、air-lift の状態で分化・誘導する。

− 88 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発～ 2 . 4 . において構築した血管網含有皮膚モデル各 2 体をデヒド溶液で固定した後、常法に従い超薄切片を作製し、4 % パラホルムアルデヒド溶液で固定後、whole-mount 標

JEM 1250（JEOL, Tokyo）で観察した。また、SEM 解析に本として下記の免疫染色に供した。

ついては、上述のパラフィン包埋組織より組織切片を作製した残りの組織を 1 % オスミウム酸溶液で導電染色した後、

2 . 6 . 免疫染色

凍結乾燥と白金コーティングを行い、JSM- 6510 LV（JEOL,

2 . 2 . で構築した皮膚モデルの組織切片をクエン酸緩Tokyo）で観察した。

衝液（0 . 01 M, pH 6 . 0）で煮沸した（121 ℃，15 分）後、antioccludin IgG（abcam, Cambridge, UK）、anti-desmoglein

2 . 8 . 皮膚刺激性評価試験

IgG（Heiderberg, Germany）、anti-laminin IgG（Sigma-

三次元皮膚モデルのバリア機能を評価するために、2 . 2 .

Aldrich）を一次抗体として、各一次抗体の動物種に特異的で構築した三次元皮膚モデルならびに NHDF のみで構成さな IgG に蛍光物質（fluorescein isothiocyanate, Cy 3 , Cy 5）

れた三次元真皮モデルに対して生理食塩水ならびにドデシルを結合させた二次抗体を用いてレーザー共焦点顕微鏡で各

硫酸ナトリウム（SDS）溶液（1 , 2 , 4 , 10 , 50 mg/ml）を組織表

タンパクの局在を可視化した。

面に暴露し，18 時間後 に洗浄した後，常法通りにMTT（3 -2 . 3 . ～ 2 . 4 . の whole-mount 標 本 に つ い て は、anti-［4 , 5 -dimethylthiazol- 2 -yl］- 2 , 5 -diphenyltetrazolium

CD 31 IgG（DAKO, Glostrup, Denmark）
を一次抗体として、

bromide）アッセイを行い、得られた測定値から細胞生存度（各Cy 3 を結合させた特異的二次抗体を用いてレーザー共焦

濃度の SDS 溶液暴露後の検体の吸光度 /生理食塩水暴露後

点顕微鏡で血管網を可視化した。

の検体の吸光度×100（%））
を算出した。

2 . 4 . で構築したリンパ管網含有皮膚モデルの組織切片

3. 結をクエン酸緩衝液で煮沸した後、anti-LYVE- 1 IgG（R&D
Systems, MN, USA）を 1 次抗体として、peroxidase を結果

3 . 1. 三次元皮膚モデルの構造合させた特異的二次抗体を用いて 3 . 3’-diaminobenzidine

本研究で用いた細胞集積法は 10 日以内に真皮様結合組を免疫反応産物として LYVE- 1 の局在を光学顕微鏡で可織と表皮様組織から成る 3 D ヒト皮膚モデルを構築する視化した。

ことができた。24 -well insert 内に構築された 3 D 組織は
1 cm の径をもち、多数の線維芽細胞と細胞外マトリクス

2 . 7. 電子顕微鏡的解析から成る 80 ～ 100 µm 厚の真皮様組織とその上に形成さ2 . 2 . で構築した皮膚モデル各２体を透過型電子顕微鏡れた基底層から角質層の各層が識別される 50 ～ 70 µm 厚（TEM）および走査型電子顕微鏡（SEM）による解析に供の表皮組織で構成されていた（図 3 A, B）。表皮組織においした。TEM 解析については、検体を 2 . 5 % グルタルアルて基底層と有棘層は明瞭であったが、顆粒層はやや乏しく、

図 3 3 D皮膚モデルの構造。A. LbL・細胞集積法で構築された三次元皮膚モデルの組織切片の全体像。
B. A. の一部の拡大像。線維芽細胞と細胞外マトリクスから成る真皮様組織上に細胞分化と角質化を伴う表皮組織が見られる。C. ヒト表皮角化細胞のみで分化誘導した表皮様組織。細胞分化による層形成が乏しく、重層化されない。A. − C. H.E. 染色− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

角化層には扁平な細胞核をもつ錯角化を示す細胞も散見さの特性を有する細胞がデスモゾームを備えた細胞間橋を無れた（図 3 B）。真皮様組織を構築せずに NHEK のみで作製数に発達させて基底層と有棘層を構築し、基底膜の形成した構造体は表皮としての分化傾向を呈したが、組織化さに伴いヘミデスモゾームをもつ基底細胞が散見された（図れなかった（図 3 C）。

4 A）。顆粒細胞内ではトノフィラメントの間に大小のケ

LbL・細胞集積法により構築された皮膚モデルの表皮組

ラトヒアリン顆粒が散在し、その上層には扁平な細胞が屋

織では、トノフィラメントをはじめとするケラチノサイト

根瓦様に堆積する角質層が形成されていた（図 4 A, B）。ま

図 4 3 D 皮膚モデルの TEM 像（A）、SEM 像（B）
、desmoglein（赤）・occludin（緑）・laminin（青）に対する免疫染色像（C）、皮膚刺激性試験（D）．A- 1 . 表皮から真皮にかけての全体像。 A- 2 . A- 1 . の表皮角質層から顆粒層の拡大像。A- 3 . A- 1 . の表皮顆粒層の拡大像。A- 4 . A- 1 . の表皮有棘層の拡大像。A- 5 . A- 1 . の表皮有棘層か
ら基底層の拡大像。A- 6 . A- 1 . の表皮基底層から真皮にかけての拡大像。矢頭は基底膜とヘミデスモゾーム様構
造を指す。B. 角質層の表層は扁平な細胞の屋根瓦状の堆積から成る。C. desmoglein、occludin、laminin はそれ
ぞれ表皮全体、表皮表層、表皮と真皮の境界層および真皮全体に局在が見られる。D. 青曲線と赤曲線はそれぞれ真皮様結合組織と 3 D皮膚モデルに対するSDS各濃度溶液（横軸）
暴露後のMTTアッセイ後の吸光度
（縦軸）
を示す。

− 90 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発た、基底層から有棘層の細胞間でデスモゾームが発達する

3 . 3 . 血管網含有三次元皮膚モデルの構造のに対し、顆粒層から角質層では desmoglein などのデス

LbL またはコラーゲンゲルを用いたいずれの細胞集積手

モゾーム構成タンパクに加えて occludin を含む閉鎖結合構法においても毛細血管網を有する全層性の 3 D 皮膚モデル

成タンパクが密に分布していた（図 4 C）
。一方、真皮様結を 10 日以内に構築することができた（図 5）。LbL 法によ合組織では表皮組織との境界面に laminin を含む基底膜がる皮膚モデルの真皮様組織では、二次元的に広がる毛細血形成されたが、laminin は結合組織深層にも散在性に分布

管網が中層部に形成され、その厚さは血管網を有しないしていた（図 4 A, C）。

モデルの真皮様組織より約 1 . 5 倍に増加していた（100 ～150 µm；図 5 A, B）。同モデルの表皮組織は、明瞭な顆粒

3 . 2 . 三次元皮膚モデルのバリア機能の評価層を形成する細胞分化を呈し、血管網をもたない皮膚モ

SDS 溶液と MTT アッセイを用いた 3 D 皮膚モデルのバデルに比べて約 1 . 5 倍に肥厚していた（約 100 µm；図 5 A）。

リア機能評価において、NHDF のみで構築した 3 D 結合組

また、角質層は細胞核をもたない扁平な細胞の堆積のみで織では暴露される SDS 溶液の濃度上昇に伴い急激に細胞構成され、その上層はしばしば脱落していた（図 5 A）。

生存率が減少し、1 mg/ml 溶液で 50 ％未満になるのに対一方、コラーゲンゲル法で構築した 3 D 皮膚モデルは、し、真皮様組織上に表皮構造が形成された 3 D 皮膚モデル

真皮様組織内に三次元的に広がる毛細血管網が形成され、は SDS 溶液濃度の上昇に対してより緩やかな細胞生存率

LbL・細胞集積法による毛管網含有皮膚モデルよりさらの減少を示し、細胞生存率が 50 ％に低下する溶液濃度はに真皮様組織の厚み（約 150 µm）が増していた（図５C, D）。

4 ～ 7 mg/ml であった
（図 4 D）。

また、本モデルの表皮組織は LbL 法による皮膚モデルと同様に明確な細胞分化と角化を呈し、その厚さは 120 ～150 µm に達していた（図 5 C）。

図 5 血管網含有 3 D 皮膚モデルの構造．A. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織中層に管腔を形成する血管が見られる。H.E. 染色 B. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの真皮様組織内で２次元的に広がる血管網。Whole-mount 標本における
CD 31 に対する免疫染色 C. コラーゲンゲル・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織の浅層から深層にわたり管腔を形成する血管が見られる。H.E. 染色 D. コラーゲン
ゲル・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの真皮様組織内で三次元的に広がる血管網。
Whole-mount 標本におけるCD 31 に対する免疫染色− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

3 . 4 . リンパ管網含有三次元皮膚モデルの構造

膚モデルの結合組織内に血管網の付与を行った。我々のLbL 法によりリンパ管網を含有する全層性の 3 D 皮膚モ

LbL・細胞集積法は立体組織内に血管・リンパ管網を組織

デルを 10 日以内に形成することができた（図 6）。真皮様化することに優れ、これまで微小循環系を内蔵する様々な組織の中層部を中心に、リンパ管内皮マーカーの一つであ

3 D 組織を創製している 10 - 13）。先行研究の脈管網含有皮膚るLYVE-1 陽性の拡張した毛細リンパ管網が二次元的に発相同体がその作製に煩雑な操作と 28 日以上の長い期間を達していたが、真皮様組織の厚さは 80 ～ 100µmと血管・リ要する 9） のに対して、LbL・細胞集積法は 10 日以内に真ンパ管網をもたない皮膚モデルとほぼ同等であった（図 6A,

皮様組織内に 2 次元的に広がる毛細血管網を有する皮膚モ

B）。その表皮組織では紡錘状の細胞への分化傾向と角質層デルを作製し、さらに新たに開発したコラーゲンゲル・細（20µm）の形成が明瞭であったが、その厚さは約 70µmで血胞集積法は同期間内に真皮全層に広がる 3 次元的毛細血管

管網を有する皮膚モデルより薄い傾向を示した（図 6A）。

網を構築した。コラーゲンゲル法による 3 D 皮膚モデルは

4. 考

LbL 法に比べて線維芽細胞の密度を抑えて細胞外マトリク察スの増加と分散配置を図ることにより、より生体真皮に近我々の研究グループが独自に開発した細胞外マトリクス

い組織を構築することが可能であり、このことが血管網は、真の 3 次元化に働いていると推測される。結合組織内に血管皮様結合組織上でケラチノサイトが生体と同様の分化・成網が構築されたことにより皮膚モデルの真皮様組織が厚く熟と角質形成を呈する全層性の皮膚組織を構築した。本構なるとともに、表皮組織が明確な細胞分化による肥厚を示

造体は、特殊なデバイスや多種多様の添加剤を用いることしたことは、血管網の形成と配置が真皮組織だけでなく表なく、細胞自身が自己組織化することにより形成され、ヒ

皮組織の機能形態形成にも深く関与することを示唆していト生体皮膚に類似する組織学的特性を有していた。加えて、る。コラーゲンゲル法による 3 D 皮膚モデルではさらに真の LbL・コーティング技術を用いた細胞集積法

9 - 13）に比べて、簡便に 10 日以内で構築で皮、表皮ともにその厚みを増していたことから、血管網のきることも大きな特徴である。本法では線維芽細胞が分布

三次元化は栄養素やガスの各組織への供給を迅速に有効化

する真皮様組織上においてのみ表皮が形成されることから、することで皮膚組織の分化・成熟を促進すると思われる。

従来の皮膚相同体

2 - 8）

本構造体はケラチノサイトの表皮形成に真皮との接触・相

生体の皮膚には血管系だけでなく、細胞の代謝物、異物

互作用を必要とする生体皮膚 14）と同様の微小環境を提供などを含む組織液の排導や高分子物質と細胞の輸送に関わすることでヒト表皮と相同の細胞・組織構造と分子発現をるリンパ管が配備され、近年では皮膚の恒常性の維持や再現していると思われる。このことが、細胞毒性基準物質

免疫の機能調節に密接に関与することが知られている 16）。

より高いバリア機

これより、3 D 皮膚モデルの結合組織内にリンパ管網を構能を発揮することに寄与していると考えられる。しかし、築し、皮膚組織の形態形成について解析を行ったが、血管表皮の分化と角質形成は未だ十分とは言えず、真皮様組織

網の場合と異なり、脈管を有さない皮膚モデルとの間に明においても微小循環系をはじめとする組織構築が不足してらかな差は見られなかった。このことは脈管本来の機能的おり、生体皮膚に代わる評価系の確立にはこれを解決する

差異によるものかもしれないが、今回構築されたリンパ管必要があると思われる。

網は拡張した管腔による平面的な洞様構造を呈し、生体皮に対して本構造体がヒト表皮モデル

15）

上記の課題に応えるために、本研究ではさらに全層性皮膚のリンパ管網の機能形態と乖離していることがその結果

図 6 リンパ管網含有 3 D 皮膚モデルの構造。A. LbL・細胞集積法により構築された 3 D 皮膚モデルの組織切片像。真皮様組織中層を中心に洞様に拡張したリンパ管が見られる。H.E. 染色 B. Aの隣接切片におけるLYVE- 1 に対する免疫染色像。LYVE- 1 陽性の内皮細胞が管腔を形成する。

− 92 −

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発に影響している可能性が否定できないことから、より解剖

3D skin models. Adv Healthcare Mater 7, 1701405, 2018

学的に正確なリンパ管網含有 3 D 皮膚モデルを構築すべく

6） Groeber F, Holeiter M, Hampel M, Hinderer S, SchenkeLayland K: Skin tissue engineering – in vivo and in vitro

現在その技術改善を行っている。

5. 総

applications. Adv Drug Deliv Rev 128 : 352-366, 2011

括7） Black AF, Berthod F, Heureux NL, Germain

本研究成果は独自に開発した立体組織構築技術がヒト生

L, Auger FA: In vitro reconstruction of a human

体皮膚に類似した in vitro 3 D 皮膚モデルを簡便に短期間

capillary-like network in a tissue-engineered skinで構築できることを示している。加えて、解剖学的に高い

equivalent. FASEB J 12: 1331-1340, 1998

相同性をもつ毛細血管網を本構造体の真皮内に装備するこ8） Bourland J, Fradette J, Auger FA: Tissue-engineeredとにより真皮組織だけでなく、表皮組織の分化・成熟と機

3D melanoma model with blood and lymphatic capillaries

能性を亢進させることが明らかになり、微小循環系を内蔵

for drug development. Sci Rep 8 : 13191, 2018する本皮膚相同体は in vitro における薬剤や化粧品・化成

9） Matsusaki M, Fujimoto K, Shirakata y, Hirakawa S,

品の開発に高い有用性をもつ実験動物代替ヒト皮膚モデル

Hashimoto K, Akashi M: Development of full-thickness

として、さらには再生医療材料としての応用が期待される。

human skin equivalents with blood and lymphlike capillary networks by cell coating technology. J

謝辞Biomed Mater Res A 103A, 3386 - 3396, 2015

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援を賜りました公

10）Narita H, Shima F, Yokoyama J, Miyagawa S,

益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝

Tsukamoto Y, Takamura Y, Hiura A, Fukumoto K,

申し上げます。

Chiba T, Watanabe S, Sawa Y, Akashi M, Shimoda H:

また、本研究は当教室の高橋一人氏と成田大一氏の尽力

Engraftment of vascularized human iPS cell-derived

によるものであり、研究の遂行にあたり明石満教授（大阪

3 D-cardiomyocyte tissue after xenotransplantation.

大学生命機能研究科）と松崎典弥教授（大阪大学工学研究

Sci Rep 7 : 13708 , 2017

科）に温かいご指導を頂きました。この場をお借りいたし

11）Asano Y, Odagiri T, Oikiri H, Matsusaki M, Akashi
M, Shimoda H: Construction of artificial human

まして厚く御礼申し上げます。

peritoneal tissue by cell-accumulation technique and（引用文献）

its application for visualizing morphological dynamics
of cancer peritoneal metastasis. Biochem Biophys Res

1） Alépée N, Grandidier MH, Cotovio J: sub-categorizationof skin corrosive chemicals by the EpiSkin

TM

Commun 494 : 213 - 219 , 2017reconstructed human epidermis corrosion test method

12）Oikiri H, Asano Y, Matsusaki M, Akashi M, Shimoda

according to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline

H, Yokoyama Y: Inhibitory effect of carbonyl reductase

431. Toxicology in Vitro 28: 131-145, 2014

1 against peritoneal progression of ovarian cancer:
evaluation by ex vivo 3 D-human peritoneal model.

2） Black AT, Hayden PJ, Casillas RP, Heck DE, Gerecke ER,

Mol Biol Rep 46 : 4685 - 4697 , 2019

Sinko PJ, Laskin DL, Laskin JD: Expression of proliferative
ans inflammatory markers in a full-thickness human13）Shima F, Narita H, Hiura A, Shimoda H, Akashi M:skin equivalent following exposure to the model sulfur

Construction and histological analysis of a 3 D humanmustard vesicant, 2-chloroethyl ethyl sulfide. Toxicol

arterial wall model containing vasa vasorum using

Appl Pharmacol 249: 178-187, 2010a layer-by-layer technique. J Biomed Mater Res A.
105 : 814 - 823 , 20173） Thakoersing VS, vanSmeden J, Mulder AA, Vreeken
RJ, El Ghalbzouri A, Bouwstra JA: Increased presence of14）Liu N, Matsumura H, Kato T, Ichinose S, Takada

monounsaturated fatty acid in the stratum corneum of

A, Namiki T, Asakawa K, Morinaga H, Mohri y,human skin equivalents. J Invest Dermatol 133: 59 - 67, 2013

De Arcangelis A, Georges-Labouesse E, Nanba D,4） Falanga V, Isaacs C, Paquette D, Downing G, Kouttab

Nishimura EK: Stem cell competition orchestrates skinhomeostasis and aging. Nature 68 , 344 - 350

N, Butmarc J, Badiavas E, Hardin-Young J: Wounding of
bioengineered skin: cellular and molecular aspects after

15）化学物質の試験に関する OECD ガイドライン 439 invitro 皮膚刺激性：再構築ヒト表皮試験法

injury. J Invest Dermatol 119: 653-660, 2002
5） Pupovac A, Senturk B, Griffoni C, Maniura-Weber K,16）下田Rottmar M, McArthur AL: Toward immunocompetent− 93 −

浩：リンパ管の解剖学と老化．アンチエイジン

グ医学 14：191 - 196，2018