脂質−高分子界面活性剤混合系による新規分散系“液晶エマルション”の形成
京都大学大学院

中薬学研究科野実

Aqueous dispersions of lyotropic liquid crystalline phases were prepared by high-pressure emulsification using
lipid mixtures, monoolein (MO) and oleic acid (OA), and emulsifier Pluronic F127 with changing their composition.
The size and internal structure of the prepared particles were characterized by dynamic light scattering and smallangle X-ray scattering, respectively. In MO/F127/buffer system with 8 wt % F127 to MO, particles with a diameterof ca.180 nm and including bicontinuous cubic phases (cubosomes) were formed. The lipid ratios strongly affected themorphology of the internal structure of the particles. By increasing the weight fraction of OA in the lipid mixtures,the internal structure transformed in the order of bicontinuous cubic-inverted hexagonal-inverted cubic.
13
C NMR experiments with paramagnetic shift reagent showed that the signal of carbonyl carbon of oleic-1-13Cacid mixed in the cubosomes readily shifted to a lower magnetic field by addition of europium ion (Eu3+), indicatinghigh accessibility of the ion into the water channel inside the particles.
The cubosomes were stable in buffer, but collapsed in the presence of serum albumin or plasma. Gel filtration
experiments revealed that albumin has the ability to extracts MO from cubosomes and subsequently disintegrate theparticles.

１．緒

同時に液晶構造を壊してしまうためであった。しかし、高言分子の界面活性剤はこれらの構造に対する相溶性が低いた

脂質分子の多くは水中で自己会合し、ラメラ、逆ヘキめ、このような微粒子の調製に有効であると考えられる。

サゴナル、逆キュービックなどの多様な集合構造（リオ

そこで、本研究では、高分子乳化剤 Pluronic が液晶相とトロピック液晶）を形成する。両連続キュービック、逆ヘの相溶性が低いこと、及び、液晶相の分散微粒化剤としてキサゴナル液晶などの非ラメラ液晶構造は、生体内で過渡有効であることを実証し、得られた微粒子の構造、機能性的、部分的に形成され、蛋白質の活性を制御すると考えを評価した６、７）。

２．実られており、この構造の特徴と機能についての物理化学的あるいは生化学的関心が持たれている験。特に、脂質

１- ３）monoolein（MO）は、両連続キュービック液晶相を形成す

２．１

微粒子の調製る典型的な脂質であり４、５）、非ラメラ構造研究に多く用い脂質 monoolein（MO）、oleic acid（OA）の混合物に対られている。これらの非ラメラ相は水和により形成される

し８ wt％の Pluronic F127 を混合後、脂質濃度が 10 g/わけであるが、疎水的な相であり、過剰な水の存在下ではL となるようにリン酸緩衝液（50 mM phosphate, 100 mM

水相とは相分離して存在する。

NaCl, pH7）を加え約 80℃で水和した。Vortex ミキサー

一般の疎水性液体（油）を界面活性剤によって水中に乳やホモジナイザーを用いて試料を粗分散させた後、高圧乳化できるのと同様に、この水に不溶な液晶相も分散安定化化機（Nanomizer, 吉田機械興業）により 35 MPa、60℃、できれば、粒子内部に液晶構造を有する脂質ナノパーティ

30 min の条件で分散微粒化を行った。得られた微粒子のクル（液晶エマルション）が得られると考えられる。これ

粒径は動的光散乱（DLS）（Photal LPA-3000/3100、大はエマルション（液体分散系）やサスペンション（固体分塚電子）により測定した。

散系）、あるいはリポソームなどとは異なる特性を有した、新規微粒子分散系となることが期待される。しかしなが２．２

Ｘ線小角散乱（SAXS）

ら、このような分散微粒子の調製は困難であるとされてき分散後に限外濾過により濃縮した試料、および、分散さた。それは、微粒子の分散安定化に寄与する界面活性剤が、せていない水和試料を測定用ガラスキャピラリーに封入しFormation of the Novel Dispersion System“Liquid Crystalline Emulsion” with LipidPolymer Surfactant Mixtures

測定した。測定はＸ線小角散乱装置（理学電機）を用い、出力 200kV-50mA、波長 1.54Å、カメラ長 505 ㎜の条件で行った。回折パターンから非分散試料が形成する液晶相、および、分散微粒子の内部構造を同定した。

Minoru Nakano
Graduate School of PharmacetuticalSciences, Kyoto University

２．３C NMR

13

カルボニル炭素を 13C 標識した OA（13C-OA）を、MO− 28 −

脂質−高分子界 活性剤混合系による新規分散系“液晶エマルション”の形成に対し５％混合して微粒子を調製し、濃縮後 13C NMR 測

0:10 では、Fd3m の回折パターンが得られ、逆ミセルキュービ定（Varian Gemini 300）を行った。常磁性シフト試薬ック相を内部に有する微粒子の形成が確認できた。H I I およEuC l3 添加前後における標識炭素のケミカルシフトの変化

び Fd3m 構造の組成範囲では、OA の増加によりピークが広を観察し微粒子内部へのイオン透過性を評価した。

角側に移動した。またこの範囲においては F127 濃度を増加させると粒子径は減少したが、回折パターンは変化せず、内２．
４

ゲル濾過クロマトグラフィ

部構造が F127 濃度によって変化していないことが判明した。

調製微粒子をウシ血清アルブミン（BSA）あるいはラット血漿と 30min インキュベーション後、アガロースゲ
ルカラムにより微粒子画分とタンパク画分とに分離し、それぞれのタンパク量、脂質濃度を酵素法により定量した。

３．結３．
１

果

非分散試料の液晶相形成

MO/OA/F127/buffer 混合非分散試料（lipids/buffer =10g/L, F127/lipids = 0 および８wt％）は、液晶相の形成を示す明瞭な SA XS パターンを与えた。Fig ure １に MO:OAがそれぞれ 10:0、5:5、0:10 における SA XS プロファイルを示す。10:0 では、F127 が存在しない場合、６次までの回折（（110），（111），（200），（211），（220），（221/300））が観察され、P n3m 型の両連続キュービック相が形成されていることが判明した。８％ F127 の存在下では（110）（200），（211），，（310），（222），（321）の回折より Im3m 型の両連続キュービック相であることが判明した。一方、5:5 においては、F127の有無によらず同一の回折パターン（（10），（11），（20））が得られ、逆ヘキサゴナル（H I I）相の形成が確認された。また、0:10 においても、回折パターンは F127 によって変化せず、（111），（220），（311），（222），（400），（331）の回折ピークから、Fd3m 型の逆ミセルキュービック相が形成されていることが判明した。

３．
２液晶相を有する分散微粒子の調製

高圧乳化法により微粒子の調製を行い、その粒径と内部構造をそれぞれ DLS、SA XS により評価した。F127 を全脂質の８w t％とし、脂質混合比（MO:OA）を変えて微粒子

Figure 1 SAXS profiles of nondispersed MO/OA mixtures inphosphate buffered saline with different weight ratios in thepresence and absence of F127.

を調製した。その結果、粒子径は OA の割合の増加により、いったん減少し、その後増加するという傾向を示した（Figure2）。このようにして調製した微粒子の SA XS プロファイルをFigure 3 に示す。OA の無い場合（MO:OA = 10:0）、両連
続キュービック液晶相を有する微粒子、キュボソームの形成が明らかになった。この際、Pn3m の明瞭な第１，第２ピークと、より小角側に Im3m の第１ピークが出現し、２種類の両連続キュービック構造の共存が示唆された。9:1 から 6:4 においては、不明瞭ながら Im3m の回折ピークが観察された。この範囲においては、OA の増加によりピークが小角側に移動する傾向が見られた。5:5 から 2:8 においては H I I 構造を示
唆する回折パターンが得られ、逆ヘキサゴナル液晶相を有する微粒子、ヘキソソームの形成が明らかになった。1:9 およびFigure 2 Mean diameter of particles prepared in MO/OA/F127/
buffer system with 8% F127 and different MO/OA ratios.

− 29 −

Figure 3 SAXS profiles of MO/OA/F127/ buffer dispersed
system with 8% F127 and different MO/OA ratios.

Figure 4 13C NMR spectra of MO/13C-OA/F127/buffer dispersed system with 8% F127 and 5% 13C-OA before andafter addition of shift reagent (Eu3+).

３．
３

MO がアルブミンによって引き抜かれることが判明した。

キュボソーム内部へのイオン透過性

C-OA を 5% 含むキュボソームを調製し、濃縮後 13C13NMR 測定を行った。低磁場領域に２本のピーク（176，

また、血漿とのインキュベーションによって MO は引き抜きに続いて加水分解を受けることも判明した。

179ppm）が観察され、それぞれ MO、OA カルボニル炭素４．考と帰属された（Figure 4 下）。このうち、カチオンと相互作用しうる OA カルボニルの方に注目すると、シフト試

４．１

察

非分散試料の液晶相形成と Pluronic F127 の効果薬である Eu 添加後、ピークは速やかに低磁場シフトし、脂質は水中で疎水性相互作用によって会合し、種々の液元の位置にはシグナルが観察されなかったことから、微粒晶相を形成する。その会合様式は分子の持つ親水、疎水基子内部の全ての OA が外部から添加された Eu の影響をの大きさのバランスによって決まる。例えば、レシチンは受けたことが判明した（Figure 4 中、上）。OA は微粒子曲率の無いラメラ相を形成するが、MO はやや負の自発曲内部に分布していることから、イオンは微粒子内部に容易率を有し、両連続キュービック液晶相を形成する。両連続に浸入できることが明らかになった。

キュービック相は水相、脂質相それぞれが連続相である立3+3+方晶であり、脂質二分子膜によって隔てられた水のチュー３．４

キュボソームと血清アルブミン及び血漿とのブが規則正しく三次元的に繋がった構造をしている。３相互作用）、Q229
種類の両連続キュービック相 Q224（Figure 5（a）

キュボソームを BSA あるいはラット血漿と 30min イン（Figure 5（b））
、Q230 が知られており、それぞれ Pn3m、キュベーション後、ゲル濾過クロマトグラフィにより微粒Im3m、Ia3d の回折パターンを与える２）。OA は MO と同子画分とタンパク画分とに分離した。その結果、微粒子

じアシル鎖を有するが親水基が小さいため、膜に負の曲率画分における MO 濃度の低下、およびタンパク画分の MOを誘起する８）。従って、MO に OA を添加すると両連続キ濃度の上昇が観察され、逆に、微粒子画分にはアルブミンュービックから、逆ヘキサゴナル、逆ミセルキュービックは検出されなかった。このことから、キュボソーム中のへと相が転移する（Figure 1）。Figure 5 にはこれらの相脂質−高分子界 活性剤混合系による新規分散系“液晶エマルション”の形成から、H II（ヘキソソーム）、そして Fd3m へと変化した。
これは、OA が膜に負の曲率を与えるためである。しかし、OA が低濃度（脂質の 40％以下）においては、OA の増加によりピークが小角側に移動する傾向が見られた。これは、低濃度においては OA の解離度が高く、膜に正の曲率を与えるためと考えられる。この範囲における、OA の増加による粒径の減少も、OA の解離によって親水性が高まるためと解釈できる。逆に、OA が高濃度であれば疎水性が増加し、粒径は増加する（Figure 2）。
OA が高濃度（脂質の 50% 以上）においては、F127 濃度によって微粒子の内部構造は変化しなかった。これは上述のように、F127 は H II 相および Fd3m 相に対する相溶性が非常に低いために、微粒子の分散安定性のみに寄与し、Figure 5 Schematic representation of nonlamellar liquid
crystalline phases. (a) Bicontinuous cubic phase of Pn3m,(b) Im3m, (c) inverted hexagonal phase, and (d) inverted
micellar cubic phase of Fd3m.

内部構造に影響を与えないことを表している。

４．３

キュボソーム内部へのイオン透過性

リン脂質リポソームの場合、イオンの膜透過性は非常に低いことが知られており、このことは 31P NMR においての模式図を示した。逆ミセルキュービック相は両連続キュシフト試薬の添加によってピークのスプリットが観察されービック相とは異なり、不連続（discrete）型のキュービることから確認できる。これは、リポソーム外葉のリン脂ック相であり、大小２種類の球状逆ミセルが配列し面心立質のみがカチオンであるシフト試薬と相互作用しケミカル。脂質の種類やシフトの変化が生じるのに対し、内葉のリン脂質はシフト方晶を形成していると考えられている

９-11）

混合組成を変えることで膜の曲率を変化させ、これらの非試薬の影響を受けないためである 13-15）。

ラメラ相を形成させることが出来る。

キュボソームにも同様の手法を適用し、イオンの粒子内F127 の添加により、両連続キュービック相の場合のみ部への透過性を評価した。この際、微粒子の構成脂質であ相変化が生じた。これらのことから、F127 は Pn3m 相にる M O は電荷を持たず、シフト試薬によるケミカルシフトの対しては混合して Im3m 相へと変化させるが、H II 相およ変化が起こらないので、５％の 13 C - OA を導入し、OA カル

び Fd3m 相に対してはほとんど相互作用しないことが明ら

ボニルピークの変化を観察した。その結果、ピークは完全かとなった。このことはこれらの液晶相の分散を行う上でにシフトしたことから、シフト試薬が容易に粒子内部に浸透重要な知見を与える。水に溶解しないこれらの液晶相を分したことが判明した。イオンは微粒子表面の F127 の層を散させるためには、用いる分散剤（乳化剤）として、比透過した後、内部キュービック相の水のチャネルを自由に移較的親水性の高い界面活性剤が要求される。しかしそれら動するものと考えられる。このことから、水溶性物質を微は高い正の自発曲率を持っているため、液晶相とよく混ざ粒子に封入するのは困難であることが示唆された。

り合うならば膜の曲率を大きく変化させてしまう。低分子の界面活性剤ではその傾向が強いのに対し、高分子界面４．４

キュボソームと血清アルブミン及び血漿との活性剤では脂質との相溶性が低いため 12）、分散剤として相互作用有効であると考えられる。実際に、F127 は、HII 相および微粒子の DDS への応用を考える上で、血漿タンパク質とFd3m 相に対する相溶性は非常に低く、また Pn3m 相に対の相互作用を明らかにする必要がある。その中でも血清アルしてはある程度の相溶性はあるものの別の両連続キュービ

ブミンは MO や OA と結合することが知られており 16、17）、こック構造（Im3m）を保っているため、分散に用いることの微粒子の代謝挙動を左右する可能性がある。実際、微が出来ると結論づけられた。

粒子中の MO は血清アルブミンや血漿により速やかに微粒子外へ引き抜かれることがゲル濾過クロマトグラフィに４．
２液晶相を有する分散微粒子の調製より明らかとなった。このことはこの微粒子が血中においF127 を用いて高圧乳化法を行った結果、MO/OA 混合て急速に崩壊することを示しており、微粒子からの薬物の物が形成する液晶相を保持した微粒子（液晶エマルション）

sustained release を想定するとこの特性は不利であると考が得られることが判明した。OA の割合の増加により、微えられる。しかしながら、調製、保存時においては安定で粒子内部の構造が、両連続キュービック（キュボソーム）ありながら、血中投与後速やかに薬物が放出されるという− 31 −

メカニズムは、場合によっては一つの投与形態として有効であると考えられる。

７） N a k a n o M , T e s h i g a w a r a T , S u g i t a A e t a l . :Dispersions of liquid crystalline phases of the

今後、キュボソーム、ヘキソソームの液晶担持微粒子としての特性を最大限に生かすためには、血漿タンパク質にmonoolein/oleic acid/Pluronic F127 system, Langmuir,
18, in press, 2002.

よる構成脂質の引き抜きという微粒子崩壊メカニズムを回８） Borne J, Nylander T, Khan A: Phase Behavior and

避させなければならない。そのためには、微粒子の構成脂Aggregate Formation for the Aqueous Monoolein System

質を変える必要がある。脂肪酸やモノグリセリドはアルブ

Mixed with Sodium Oleate and Oleic Acid, Langmuir,

ミンに対して高い親和性を有するが、二本鎖の脂質は結合

17, 7742-7751, 2001.

しないので、ジグリセリドやリン脂質などを加えることで

９） L u z z a t i V , V a r g a s R , G u l i k A e t a l . : L i p i d

この崩壊メカニズムを軽減あるいは回避できると考えられpolymorphism: a correction. The structure of the cubicる。液晶構造を維持したまま脂質組成をどこまで変化させphase of extinction symbol Fd-- consists of two types

られるかがこれからの課題である。

of disjointed reverse micelles embedded in a three-５．総括

dimensional hydrocarbon matrix, Biochemistry, 31, 279285, 1992.

高分子界面活性剤を用いることで、液晶エマルションの

10） Luzzati V, Vargas R, Mariani P et al.: Cubic phases

調製、すなわち液晶構造を維持したまま安定に分散微粒子

of lipid-containing systems. Elements of a theory and化することが可能となった。微粒子の薬物キャリアとしてbiological connotations, J. Mol. Biol., 229, 540-551,の性能を考えると、水溶性物質に関してはその保持は困難

1993.

であることが示唆されたが、疎水性あるいは膜結合性のあ11） Cribier S, Gulik A, Fellmann P: Cubic phases of

る物質は、微粒子内部の広大な脂質−水界面を利用してト

lipid-containing systems. A translational diffusion study

ラップすることができると考えられる。血中での微粒子のby fluorescence recovery after photobleaching, J. Mol.

早い崩壊挙動を改善すれば、液晶としての性質を生かしたBiol. 229, 517-525, 1993.

新規 DDS の構築が可能であると考えられる。

12） Kunieda H, Uddin MH, Furukawa, H et al.: Phase
behavior of a mixture of poly（oxyethylene）-Poly

References（dimethylsiloxane）copolymer and nonionic surfactant in

１） Mariani P, Luzzati V, Delacroix H: Cubic phases ofwater, Macromolecules, 34, 9093-9099, 2001.

lipid-containing systems, J. Mol. Biol., 204, 165-189,
1988.

13） Barsukov LI, Victorov AV, Vasilenko IA et al.:Investigation of the inside-outside distribution,２） Lindblom G, Rilfors L: Cubic phases and isotropicintermembrane exchange and transbilayer movement

structures formed by membrane lipids - possibleof phospholipids in sonicated vesicles by shift reagent

biological relevance, Biochim. Biophys. Acta, 988, 221256, 1989.

NMR, Biochim. Biophys. Acta., 598, 153-168, 1980.
14） Ivanov NN, Rykov SV, Isakova OL et al.: Estimation

３） Seddon JM: Structure of the inverted hexagonal（HII）phase, and non-lamellar phase transitions of lipids,Biochim. Biophys. Acta, 1031, 1-69, 1990.

of liposome integrity by 1H-NMR spectroscopy, Anal.
Biochem., 147, 280-284, 1985.
15） Saito H, Nishiwaki K, Handa T et al.: Comparative

４） Hyde ST, Andersson S, Ericsson B et al.: A cubic

study of fluorescene anisotropy in surface monolayers ofstrucure consisting of a lipid bilayer forming an infinite

emulsions and bilayers of vesicles, Langmuir, 11, 3742-

periodic minimum surface of the gyroid type in theglyceromonooleate-water system, Z. Kristallogr., 168,213-219, 1984.

3747, 1995.
16） Hamilton JA, Era S, Bhamidipati SP et al.: Locationsof the three primary binding sites for long-chain fatty５） Q i u H , C a f f r e y M : T h e p a h s e d i a g r a m o f t h emonoolein/water system: metastability and equilibrium
aspects, Biomaterials, 21, 223-234, 2000.

acids on bovine serum albumin, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, 2051-2054, 1991.
17） T h u m s e r A E A , B u c k l a n d A G , W i l t o n D C ,６） Nakano M, Sugita A, Matsuoka H et al.: Small-angle

Monoacylglycerol binding to human serum albumin:

C NMR investigation on theEvidence that monooleoylglycerol binds at theinternal structure of "cubosomes", Langmuir, 17, 3917-

dansylsarcosine site, J. Lipid Res., 39, 1033-1038, 1998.

X-ray scattering and3922, 2001.

13