アプリケーションノート
アカデミア

イオンペア dMRM LC/QQQ による腸内微生物叢由来のインドール代謝物の定量

著者

Jiye Cheng , Carolina B. Livi ,1,23and Siddarth Venkatesh1,21 Edison Family Center for
Genome Sciences andSystems Biology
2 Center for Gut Microbiome
and Nutrition Research,
Washington University in
St. Louis, St. Louis, MO
63108 USA
3 Agilent Technologies, Inc.
Santa Clara, 95051 USA

概要

健康・疾病研究においてヒト腸内微生物叢の役割への関心が急激に高まったことで、多様な化合物群からなる微生物叢由来の代謝物の定量が必要とされるようになりました。こういった状況を受け、アジレントは、200 種類を超える中心炭素代謝物を効率的に分離する、再現性と堅牢性に優れたイオンペア逆相 (IP-RP) ダイナミックマルチプルリアクションモニタリング (dMRM) メソッドを開発しました。このアプリケーションノートでは、宿主の代謝経路と免疫経路との相関性が認められたトリプトファン代謝物およびインドール代謝物の測定を目的とした、この IP-RP dMRM メソッドの拡張について取り上げます。拡張 IP-RP dMRM メソッドでは、関連する生体サンプル中に存在するこれらの化合物を広いダイナミックレンジにわたって高感度検出することができます。

はじめに

一部のインドール代謝物 は、アリール炭化水

腸内微生物叢 は、生物 の 3 つのドメインすべてに属する、細菌のメンバーを主とした何十兆もの微生物で構成され、宿主の生態に幅素受容体 (AhR) の内因性リガンドであり、上皮内 γδ T 細胞、調節性 T 細胞、および IL-22などのサイトカイン産生に作用することで、抗炎症効果および抗菌効果を誘導します9、10。ミ

広い影響をおよぼす多数の代謝物群を産生しクログリア細胞 はその代表例であり、Ahr 依

インドール異化産物は、宿主の生理機能に有酸を使用し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の症

ます1 ～ 4。必須アミノ酸であるトリプトファンの益 な 効果 を与える代表的 な 微生物代謝物群

存的にトリプトファン由来のインドキシル-3-硫状を改善します11。近年の研究により、ラクトです。

バチルスロイテリが、AhR を活性化し、CD4+複数のステップを経ます。

ミングを引き起こすインドール-3-乳酸 の 産生

食物由来のトリプトファンは、摂取後に以下の••ペプチドおよびタンパク質に取り込まれる

宿主の異化作用により、律速酵素である菌であることが示されました12。興味深いことに、クローン病および潰瘍性大腸炎の患者でも、糞便中のトリプトファンおよびインドール

インドール-3-アセトアミド、 インドール-3-酢酸、インドール-3-酪酸、インドール-3-カルボアルデヒド、 インドール-3-カルボン酸、 イン

ドール-3-乳酸、 インドール-3-プロピオン酸、インドール-3-ピルビン酸、インドキシル硫酸、トリプトホール、キヌレン酸、キヌレニン、キノリン酸、キサンツレン酸、および 5-ヒドロキシトリプトファンを Sigma-Aldrich 社 から購入し、それぞれ濃度 1 mg/mL のメタノール溶液を調製しました。これらの標準物質を組 み合わせて 3 種類の混合液を調製しました。その 際、各混合液 に含まれる化合物相互 の 分-3-酢酸のレベルの低下およびキヌレニンのレ動を通して、それぞれキヌレニンとセロトリプタミンは、上皮 GPCR 5-HT4 受容体を活

腸内微生物叢 のメンバー により、トリクスを増加させます15。

装置構成れつつありますが、多様 な化合物群からなる•

Agilent 1290 Infinity II LC•

Agilent 6470A トリプル四重極 LC/MS

ニンになる

プタミン、インドール-3-酢酸、インドー

ル-3-プロピオン酸、インドール-3-乳酸、インドールなど、さまざまな異化産物に変換される5、6ベルの増加が認められています13、14。また、ト性化し、cAMP 依存的に結腸のアニオンフラッ

腸内微生物叢由来 の 代謝物 は 徐々に 解明さ
代謝物 を正確 に 定量するためのアッセイは、まだ広く利用できる状況にありません。この度

インドール代謝物は、最終的なクリアランスをアジレントは、 あらゆる生物の中心炭素代謝ンドキシル硫酸になります。

スの 200 種類以上の代謝物を効率的に分離

高 めるために、肝臓でさらに硫酸化されてイインドール代謝物 は、多様 な活動機構を通して宿主の生態を調節します。例えば、クロスト

リジウムスポロゲネスは、トリプトファンを代謝してインドール-3-プロピオン酸 を産生します。この化合物は、
プレグナン X 受容体 (PXR)の内因性リガンドであり、オクルディン、ゾヌリ

ン-1、E-カドヘリン、クローディン-7 などのタイトジャンクション構成タンパク質の発現を誘発して腸バリア完全性を改善します 。同様に、
7いくつかのペプトストレプトコッカス種によって産生されるインドールアクリル 酸 には 抗炎症効果 があり、この化合物 を使用したヒト末梢血単核球 の 治療 は、LPS 刺激 に対する IL-6および IL-1 の分泌の低下につながります 。
82

サンプル前処理

トリプトファン 2,3-ジオキシゲナーゼおよびトリプトファンヒドロキシラーゼの活•上皮リンパ球から CD8aα 細胞へのリプログラ

実験方法に関 わるものを主とした、幅広い化合物クラできる IP-RP dMRM メソッドを開発しました。

このアプリケーションノートでは、微生物由来の 代謝物 のサブセットを含 む、一般的 なインドール 代謝物群 にも対応できるようにすることを目的とした、IP-RP dMRM メソッドの 拡張ステップについて説明します。

子量差が 2 ダルトン以下にならないようにしました。混合液中の各標準物質の最終濃度は100 µg/mL としました。

MS パラメータ、 クロマトグラフィー、 およびグラジエントの 分析条件 は、メタボロミク

ス dMRM メソッド (アジレントのクイックス
タートガイド「MassHunter Metabolomics

Dynamic MRM Database and Method」、
G6412-90006 Revision A、5991-6467ENを参照) を使用しました。

アジレントのメタボロミクス dMRM
メソッドへの新しい化合物の追加

アジレントのダイナミックマルチプルリアクショ

ンモニタリング (dMRM) では、MRM トランジションをリテンションタイムでスケジュールすることで、データ品質を損なうことなく、より多くの代謝物 を 1 回で分析できます。そのため、このメタボロミクス dMRM メソッドに新しい化合物を追加するには、まず新しい化合物のリテンションタイムを特定する必要 があり、それをもとに各化合物 の取り込 みパラメータを最適化することができます。

•ステップ 1. dMRM メソッドに追加する

新しいインドール代謝物のリテンションタイムを特定するために、この dMRM メ•

ソッドをスキャンメソッドに変更しました。
ス テ ッ プ 2. Agilent MassHunter

Optimizer を使用して、インドール代謝物の MRM トランジション、フラグメンタ
電圧、 およびコリジョンエネルギーパラメータを最適化しました。新しいすべての化合物には、Optimizer の注入モード•を使用しました。

ステップ 3. Optimizer による MRM 取結果と考察

現性 (3 回 の 測定で RSD < 5 %) を示しました。このことは、調査対象 のすべての代謝物

この 改良 IP-RP dMRM メソッドを使用して、で 100 nM を下回っていた定量下限において調査対象の微生物叢由来のインドール代謝物も同様でした。

を分離しました (図 1)。リテンションタイムとピーク面積レスポンスは、 どちらも優 れた再表 1. dMRM メソッドに追加したトリプトファン化合物とインドール化合物化合物

インドール-3-アセトアミド

リテンションタイム

フラグメンタ電圧

110173.1 -> 130.0

16.8

70

174.1 -> 130.0

517.9

140

202.1 -> 158.1

1712.1

インドール-3-酢酸
インドール-3-酪酸

MRM

コリジョンエネルギー (V)17

り込みパラメータの最適化後、リテンショ

インドール-3-カルボアルデヒド

14.9

140

144.0 -> 115.033

メンタ電圧、およびコリジョンエネルギー

インドール-3-乳酸

15.3

100

160.0 -> 116.0

1716.5140

204.1 -> 158.0

1716.7130188.1 -> 59.1

1317.390202.1 -> 174.0

516.4

100

212.0 -> 80.0

25

15.9

80

160.1 -> 116.0

1715.580

188.0 -> 144.0

13

ンタイム、MRM トランジション、フラグ
パラメータを元のメタボロミクス dMRM

メソッドにインポートし、新しいファイル名で保存しました。

インドール-3-カルボン酸

インドール-3-プロピオン酸
インドール-3-ピルビン酸
インドキシル硫酸

トリプトホール
キヌレン酸

×104
2.0

インドール-3-カルボアルデヒド

インドール-3-アセトアミド

1.8

インドール-3-カルボン酸

1.6

Counts1.4
インドール-3-酢酸

1.2

インドール-3-プロピオン酸

1.0

インドール-3-乳酸

0.8

インドキシル
硫酸0.6

インドール-3-ピルビン酸
インドール-3-酪酸

0.4
トリプトホール

0.2010111213141516171819

図 1. 微生物叢由来のインドール代謝物の合成 dMRM クロマトグラム

3このアプリケーションノートでは、重要な微生物代謝物群 をより幅広く検出し、測定することを目的とした、既存のメタボロミクス IP-RP

dMRM メソッドの拡張による改良について取り上 げました。改良したアジレントの IP-RP

dMRM メソッドを使用することで、追加したトケーションに適していることがわかりました。

このメソッドは、先頃発表された次の研究において、生体サンプル中のインドール代謝物レベルの測定に使用されています。

Gehrig, J. L. et al. Effects ofMicrobiota-Directed Foods in GnotobioticAnimals and Undernourished Children.
Science 2019, 365, eaau4732.

42,000 4,000 6,000 8,000Concentration (ng/mL)

10500

2,000
4,000
6,000
8,000
Concentration (ng/mL)

×103
18 インドール-3-プロピオン酸
16 y = 1.9236x + 273.64
14 R2 = 0.9998
1210864200
2,000
4,000
6,000
8,000
Concentration (ng/mL)

Response

ナミックレンジから、このメソッドが生体サン

プルの微生物叢 (マイクロバイオーム) アプリ

0×103
インドキシル硫酸
20 y = 2.0275x + 226.37
R2 = 0.999
15

高い信頼性で定量することができました。トリ測定における分析感度、直線性、およびダイ

1000

リプトファン代謝物およびインドール代謝物をプトファン代謝物 およびインドール 代謝物 の200

図 2. 特定化合物の検量線

Response

結論300×103 インドール-3-乳酸
14 y = 1.4821x + 192.03
212 R = 0.9996
10864
20
10,000
0
2,000
4,000
6,000
8,000
Concentration (ng/mL)

Response

6 種類の代表的代謝物の検量線を示します。

×103 キヌレン酸
500 y = 53.532x – 5905.8
R2 = 0.9968
400

10,00010,000×103
25 インドール-3-酪酸
y = 2.7781x + 272.26
20
R2 = 115105
0

0

2,000
4,000
6,0008,000
Concentration (ng/mL)

×103
8 トリプトホール
7 y = 0.4824x – 77.271
6 R2 = 0.9997
5432
10
10,00005,00010,00015,000Concentration (ng/mL)

10,000

Responseの検量線が得られました。図 2 に、例として、

Response(R2 > 0.999) 広いダイナミックレンジ (3 桁超)

Response

すべての標準物質について、直線性に優 れた

20,000

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