微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索
岐阜薬科大学

五十里彰

Human skin keratinocytes form a tight junction (TJ) in the lateral membrane between neighboring cells. The TJ restricts
the paracellular flux of water, nutrients, and solutes. The architecture of TJ is composed of claudins, transmembrane proteins,and zonula occludens, adaptor proteins. Claudins have four transmembrane domains and comprise a multi-gene family with27 members. Claudin-1 acts as a physiological barrier in the skin. Ultraviolet (UV) light may disrupt the TJ barrier, butthe pathophysiological mechanism has not been clarified well. We found that UVB causes a mislocalization of claudin-1,decrease in transepithelial electrical resistance, and increase in paracellular permeability of lucifer yellow, a hydrophilic
ﬂuorescent marker, in human keratinocyte-derived HaCaT cells. Similarly, NOC, a NO donor, and SIN-1, a peroxynitrite
donor, caused the mislocalization of claudin-1. PCR showed that opsin (OPN) 2 and 3 mRNAs are expressed in HaCaT cells.
UVB increased intracellular Ca2+, nitric oxide, and peroxynitrite concentration, which were inhibited by OPN2 siRNA. Inaddition, the elevation of Ca2+ concentration was inhibited by the siRNA of transient receptor potential vanilloid subtype
1 (TRPV1), suggesting that UVB enhances Ca2+ influx mediated through TRPV1. NOC increased the amount of tyrosine
nitration and ubiquitination of claudin-1.
Our results indicate for the first time that UVB increases intracellular Ca2+, NO, and peroxynitrite concentration, resulting
in the mislocalization of claudin-1. Peroxynitrite may elevate the amount of nitration and ubiquitination of claudin-1. The
compounds, which inhibit nitration and ubiquitination of claudin-1, may have a role in preventing the destruction of the TJ
barrier caused by UV.

１．緒が必要である。

言

クローディン - 1 は足場タンパク質の ZO- 1 とともにタイ

皮膚は体外と体内の境界をなすバリアとして働き、体外トジャンクションに分布するが、傷 害性ストレスなどの負からの病原菌や異物の侵入を防ぐとともに、体内からの水荷によりタイトジャンクションから細胞内へ 移 行する。最分子やイオンの漏出を防ぐ。皮膚にはコラーゲンなどによ

近申請者はクローディン - 1 の細胞局在制御機構を検 討し、って形成される角質層と細胞間接着分子によって形成されタイトジャンクションへの分布に 191 Thr のリン酸化が 必る顆粒層の二重のバリアが存在する。角質層にはヒアル要なこと、脱リン酸化クローディン - 1 がクラスリン依存性ロン酸、コラーゲン、セラミドが存在し、皮膚の保湿機能エンドサイトーシス機構を介して細胞内へ 取り込まれるこが維持される。一方、顆粒層バリアの形成には、タイトジとを解明した 5）。しかし、リン酸化 以外 の翻訳後修 飾のャンクションに発現するクローディンが重要な役割を担関与やその制御機構は不明である。本 研究では、微弱紫う。クローディンは 27 種類のサブタイプが同定されてお外 線 照 射によりクローディン - 1 がタイトジャンクションかり、組織選択的に各サブタイプが発現する 1 , 2）。クローデら解離することを見出したため、そのメカニズムを検 討し、

ィン - 1 ノックアウトマウスは、脱水症状によって生後まクローディン - 1 の局在異常を改善する化合物を探索した。

もなく死亡するため、顆粒層バリアの形成にクローディン

２．方- 1 が重要な役割を果たすことが明らかになった 3）。最近、クローディン - 1 の発現量がアトピー性皮膚炎の症状と逆２．
１．細胞培養相関することが報告され、皮膚疾患との関連も明らかにな
4）法

ヒト皮膚由来の不死化角化細胞株の HaCaT 細胞を、37ってきた 。敏感肌・乾燥肌の保湿ケアにおけるコスメト℃、5 % CO 2 条件下の炭酸ガスインキュベーター内で培養ロジーの観点およびアレルギー性皮膚疾患の治療補助としした。増殖培地として 5 % 熱非働化牛胎児血清、100 U/mlてのファーマコロジーの観点から、クローディン - 1 を起

penicillin-G potassium、1 0 0 µg/ml streptomycin sulfate

点とした顆粒層バリアの構築および病態メカニズムの解明を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いた。
トリプシン溶液を用いて培養皿から細胞を剥離させ、3 ～4 日ごとに継代した。

S ea rch for protect ive comp ou nds
against weak ultraviolet light-induced
dysfunction of tight junction barrier inskin

２．２．RNA 抽出とPCR

Akira Ikari

ReverTraAce を用いて逆転写反応後、ロドプシン（OPN 1、Gifu Pharmaceutical University2、3、5）および β -アクチンに対するプライマーを用い細胞を回収後、TRI reagent を用いて RNA を抽出した。

− 62 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索て PCR を行った。PCR 産物をアガロースゲルに泳動し、- 1 の細胞局在を調べたところ、コントロール状態でクロOPN の発現を確認した。

ーディン - 1 は細胞隣接部位（タイトジャンクション）に分布していた。5 mJ/cm 2 の微弱紫外線（UVB）照射により、

2+２．３．細胞内 Ca 、一酸化窒素、パーオキシナイト
ライト濃度の測定

細胞傷害率はほとんど変化しなかったが、クローディン細胞を 96 ウェルプレートに播種し、72 時間培養した。

ャンクションから消失することにより、細胞間バリア機能

2+- 1 は主に細胞質に分布した。クローディン - 1 がタイトジ細胞内 Ca 、NO、パーオキシナイトライト濃度を測定すが低下することが示唆されるため 6）、UVB 照射によるクるため、細胞に Fluo- 8、DAF- 2 または NiSPY を負荷した。

ローディン - 1 の局在異常メカニズムを検討することにし各指示薬の蛍光強度を、Infinite F 200 PRO（テカン社）をた。

用いて測定した。

３．２．クローディン -1 の細胞局在に対するROS の効果２．
４．免疫沈降とウエスタンブロット細胞を回収後、lysis buffer を用いて細胞膜を溶解した。

HaCaT 細胞に紫外線を照射すると、一酸化窒素の産生遠心操作によって核画分を除去し、細胞抽出画分を調製し量が増加する 7）。そこで、クローディン - 1 の細胞局在にた。免疫沈降の際には、細胞抽出画分、プロテイン-G セ対する一酸化窒素の影響を検討した。HaCaT 細胞を一酸ファロースビーズ、抗クローディン- 1 抗体を混合し、4 ℃で化窒素産生剤の NOC で処理したところ、タイトジャンク16 時間インキュベートした。サンプルを SDS- ポリアクリルションに分布するクローディン - 1 量が低下した（Fig. 1）。

アミドゲルで電気泳動後、トランスブロットセル （バイオラ同様に、パーオキシナイトライト産生剤の SIN- 1 処理にッド社）を用いて PVDF 膜に転写した。PVDF 膜を抗クロより、タイトジャンクションからクローディン - 1 が消失

ーディン- 1 抗体、抗ニトロ化チロシン抗体、抗ユビキチンした。細胞内の一酸化窒素量を DAF- 2 で測定したところ、抗体でブロットした。EzWestLumi Plus（アトー社）で発NOC 処理により増加が観察された（Fig. 2）。一酸化窒素は光後、C-DiGit（スクラム社）を用いてバンドを検出した。

スーパーオキシドと反応し、パーオキシナイトライトを産生する。パーオキシナイトライト量を NiSPY で測定した

２．
５．蛍光免疫染色と蛍光観察
カバーガラスを入れた 35 mm 培養皿上に細胞を播種し、96 時間培養した。UVB の照射直前または照射してから 3 時間後、細胞を冷メタノールで固定した。0 . 2 % Triton X- 100 による細胞膜の透過処理と 4 % Block Ace によるブロッキング後、抗クローディン - 1 抗体を 4 ℃で 16 時間処理した。その後、DyLight 555 標識二次抗体を室温で 1 時間処理した。LSM 700 共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss 社）を用いて、クローディン - 1 タンパク質の細胞局在を解析した。

Fig. 1 Effects of NO and peroxynitrite donors on the localization ofclaudin-1２．
６．細胞間透過性の評価
細 胞 を ト ラ ン ス ウ ェ ル に 播 種 し、96 時 間 培養した。Volt ohm meter（Millipore 社）を用いて、上皮膜間電気抵抗値（TER）を測定した。また、トランスウェルの上層から下層への luciferyellow（LY、水溶性蛍光マーカー）の移行量を指標として、細胞間低分子透過性を評価した。

３．結果と考察３．１．クロ ー ディン -1 の 細 胞 局 在 に 対 する
UVB の効果
共焦点レーザー顕微鏡を用いてクローディン

Fig. 2 Measurement of intracellular concentration of NO andperoxynitrite− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

ところ、NOC で増加傾向が、SIN- 1 で有意な増加が観察知されることが報告されている 8）。PCR 法で OPN 1、2、3、された。以上の結果から、クローディン - 1 の局在異常に、5 の発現を調べたところ、HaCaT 細胞に OPN 2、3 の発現一酸化窒素とパーオキシナイトライト濃度の増加が関与すが確認された（Fig. 4）。細胞に 5 mJ/cm 2 UVB を照射したることが示唆された。

ところ、細胞内 Ca 2 +、一酸化窒素、パーオキシナイトライト濃度が増加した。これらの効果は、OPN 2 siRNA の３．
３．細胞間バリアに対する一酸化窒素の影響導入によって阻害されたが、OPN 3 siRNA は阻害効果を細 胞をトランスウェルに 培 養し、TER と LY 透 過 性を指 標として 細 胞 間 バリア 機 能を評 価した。NOC または示さなかった。以上の結果から、OPN 2 が UVB のセンサーとして働くことが示唆された。

SIN- 1 で処理したところ、コントロールに比べて有意にTERが低下し、LY透過性が増加した（Fig. 3）。
そのため、一酸化 窒素とパーオキシナイトライトは、クローディン- 1 の局在異常を介して細胞間バリアを減弱させることが示唆された。一酸化窒素とパーオキシナイトライトの産生を抑制することにより、細胞間バリアの維持に繋がると考えられるため、そのメカニズムを検討することにした。

３．４．UVB による一酸化窒素の産生におけるOPN の関与
紫外線などの光は、オプシン受容体によって感Fig. 4

Fig. 3

Effects of NO and peroxynitrite donors on tight junction barrier

Expression of OPN in HaCaT cells− 64 −

微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索

３．５．UVB による一酸化窒素の産生におけるTRPV
チャネルの関与

ゴニストの olvanil は、UVB と同様に細胞内 Ca 2 +、一酸化OPN 受容体の活性化による Ca 2 + 濃度の上昇機序を解明

結果から、UVB 照射によって TRPV 1 を介した Ca 2 + 流入するため、一過性受容器電位チャネルである TRPV チャネが増加し、それによって一酸化窒素とパーオキシナイトラルの関与を検討した。皮膚には TRPV 1 と TRPV 4 の発現イトの濃度が増加することが示唆された。

窒素、パーオキシナイトライト濃度を増加させた。以上のが報告されているため 9）、それぞれの選択的阻害剤である
AMG 9810 と RN 1734 の効果を調べた。UVB 照射による2+細胞内 Ca 、一酸化窒素、パーオキシナイトライト濃度の３．６．UVB による一酸化窒素の産生における NOSの関与増加は、AMG 9810 処理によって阻害されたが、RN 1734

一酸化窒素は恒常的に発現する NOS 1、NOS 3 または誘は阻害効果を示さなかった（Fig. 5）。また、Ca 2 + キレート

導型の NOS 2 によってアルギニンから産生される 10）。ウ剤の EGTA も、UVB による細胞内 Ca 2 +、一酸化窒素、パエスタンブロット法で NOS タンパク質の発現量を調べた

ーオキシナイトライト濃度の増加を阻害した。TRPV 1 ア

ところ、NOS 1 は検出限界以下であった（Fig. 6）。NOS 2発現量は UVB や AMG 9810 処理によって変化しなかった。
一方、UVB 照射によって NOS 3 発現量が増加し、この効果は AMG 9810 共処理によって阻害された。また、olvanil処理によって NOS 3 発現量が増加した。次に、クローディン - 1 の細胞局在に対する効果を検討した。UVB 照射により、タイトジャンクションにおけるクローディン - 1 の分布量が低下した、この効果は AMG 9810 共処理によって阻害された。また、olvanil 処理によって、UVB と同様にタイトジャンクションからクローディン - 1 が消失した。
以上の結果から、UVB 照射によるクローディン - 1 の局在異常に、NOS 3 の発現増加が関与すると示唆された。これまでに最小紅斑量の UVB 照射により、NOS 1 mRNA 量が増加することが報告されているが 11）、我々の結果ではNOS 1 の増加が観察されなかった。UVBの照射量によって、NOS は異なる応答性を示す可能性がある。

Fig. 5 Inhibition of UVB-induced elevation of intracellular
Ca 2+, NO, and peroxynitrite concentration by AMG9810− 65 −

Fig. 6

Effects of UVB on NOS expression

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

Fig. 7 Effects of UVB on nitration and ubiquitination of claudin-1

３．７．クローディン -1 の局在異常における翻訳後修飾の影響

局在異常が関与する可能性がある。UVB 照射によるクロUVB 照射により、クローディン - 1 のニトロ化チロシによって阻害されたため、これらを皮膚に塗布することにン量が増加した（Fig. 7）。同様に、NOC 処理により、クより、紫外線による保湿機能の低下が抑制されることが期

ローディン - 1 のニトロ化チロシン量が増加した。クロー

待される。

ーディン - 1 のニトロ化は、数種類のフラボノイドの処理

ディン - 1 の細胞局在はユビキチン化酵素によって制御されるため 12）、ユビキチン化の関与を検討した。その結果、 （引用文献）
NOC 処理により、クローディン - 1 のユビキチン化量が増

1） Mineta, K., Yamamoto, Y., Yamazaki, Y., Tanaka, H.,加した。以上より、一酸化窒素濃度の増加により、クロー

Tada, Y., Saito, K., Tamura, A., Igarashi, M., Endo, T.,ディン - 1 のニトロ化とユビキチン化修飾量が増加し、エTakeuchi, K., Tsukita, S., Predicted expansion of the

ンドサイトーシスが促進されると示唆された。今後、クロclaudin multigene family, FEBS Letters, 585, 606-612

ーディン - 1 のニトロ化およびユビキチン化部位を同定し、（2011）．

両者の関係を解明する必要がある。

2） Turksen, K., Troy, T.C., Barriers built on claudins, J
Cell Sci, 117, 2435-2447（2004）．

３．８．クローディン -1 のニトロ化修飾に対する抑制因子の探索

3） Sugawara, T., Iwamoto, N., Akashi, M., Kojima, T.,UVB 照射によるクローディン - 1 のエンドサイトーシス

dysfunction in the stratum granulosum leads toに、ニトロ化修飾の関与が示唆されたため、その阻害効果

aberrant stratum corneum barrier function in claudin-Hisatsune, J., Sugai, M., Furuse, M., Tight junctionを有する食品成分を探索した。フラボノイドの効果を検討

1-deficient mice, J Dermatol Sci, 70, 12-18（2013）．

したところ、数種類のフラボノイドにニトロ化修飾の阻害

4） Gruber, R., Bornchen, C., Rose, K., Daubmann, A.,

効果が観察された（特許申請に関わるため化合物名は非公

Volksdorf, T., Wladykowski, E., Vidal, Y.S.S., Peters,開）。

E.M., Danso, M., Bouwstra, J.A., Hennies, H.C., Moll,

４．総I., Schmuth, M., Brandner, J.M., Diverse regulation

括of claudin-1 and claudin-4 in atopic dermatitis, Am JPathol, 185, 2777-2789（2015）．

本研究において、強い細胞傷害を誘発しない UVB 処理により、クローディン - 1 のタイトジャンクション局在量

5） Marunaka, K., Kobayashi, M., Shu, S., Matsunaga, T.,が低下することを見出した。これまでに我々は、クローデ

Ikari, A., Brazilian Green Propolis Rescues Oxidativeィン - 1 の細胞局在の調節にリン酸化が関与することを報Stress-Induced Mislocalization of Claudin-1 in Human
Keratinocyte-Derived HaCaT Cells, Int J Mol Sci, 2 0,5）

告したが 、他の翻訳後修飾の関与は不明であった。UVB
照射により、OPN 2 を介した TRPV 1 の活性化、Ca 流入、（2019）．

一酸化窒素産生、パーオキシナイトライト産生といったシ

6） Morita, K., Miyachi, Y., Furuse, M., Tight junctions

グナル伝達経路が活性化されることが示唆された。さらに、

in epidermis: from barrier to keratinization, Eur J

2+

Dermatol, 21, 12-17（2011）．

クローディン - 1 のニトロ化修飾やタイトジャンクションからの解離が観察されたため、これらが細胞間バリア機能

7） Liu, W., Wu, S., Differential roles of nitric oxideの低下を誘発すると示唆された。紫外線による皮膚の保湿synthases in regulation of ultraviolet B light-induced

機能の低下に、細胞傷害だけでなく、クローディン - 1 のapoptosis, Nitric Oxide, 23, 199-205（2010）．

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微弱紫外線による皮膚タイトジャンクションバリアの破壊機構の解明と保護化合物の探索

8） Haltaufderhyde, K., Ozdeslik, R.N., Wicks, N.L.,11）Kuhn, A., Fehsel, K., Lehmann, P., Krutmann, J.,

Najera, J.A., Oancea, E., Opsin expression in human

Ruzicka, T., Kolb-Bachofen, V., Aberrant timing inepidermal skin, Photochem Photobiol, 9 1, 1 1 7-1 2 3

epidermal expression of inducible nitric oxide synthase（2015）．

after UV irradiation in cutaneous lupus erythematosus,
J Invest Dermatol, 111 , 149 - 153（1998）．

9） Ho, J.C., Lee, C.H., TRP channels in skin: fromphysiological implications to clinical significances,

12）Takahashi, S., Iwamoto, N., Sasaki, H., Ohashi, M.,Oda, Y., Tsukita, S., Furuse, M., The E 3 ubiquitin

Biophysics, 11, 17-24（2015）．
10）Mattila, J.T., Thomas, A.C., Nitric oxide synthase:ligase LNX 1 p 8 0 promotes the removal of claudins

non-canonical expression patterns, Front Immunol, 5 ,from tight junctions in MDCK cells, J Cell Sci, 1 2 2 ,478（2014）．

985 - 994（2009）．

− 67 −