皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム
岐阜大学大学院医学系研究科生命機能分子設計分野

大沢匡毅

The skin epidermis serves as a protective barrier that shelters the body from environmental insults and dehydration.
Defects in skin barrier result in various forms of skin inflammatory diseases including psoriasis and atopic dermatitis, themost common diseases in the human population. Therefore, understanding molecular basis of skin barrier formation has
important implications for establishing effective therapeutic strategies for such skin disorders.
One of the key aspects of terminal differentiation of epidermal keratinocytes is dynamic cellular remodeling, in which
various filamentous proteins and lipids are cross-linked to form rigid bundles and cell organelles including nucleus andmitochondria are eliminated to induce cell death. Although each of these processes has been extensively studied, themolecular mechanism that coordinates these events to achieve the dramatic cellular remodeling is poorly understood.
One candidate mechanism that enables such quick remodeling might be autophagy, a process that promotes cellular selfcannibalization. Autophagy is an intracellular bulk degradation system that delivers cytoplasmic organelles and proteinsto the lysosome, where they are degraded to be quickly eliminated from the cell. Accumulating evidence indicates that
autophagy has been implicated in wide range of the cellular remodeling that occurs during organogenesis, thereby enabling
cells to rapidly differentiate or change their fate in order to acquire new functions. Therefore, we hypothesize that theinduction of autophagy may play an important role in promoting epidermal terminal differentiation. In this study, we aim at
obtaining an experimental proof for the involvement of autophagy in the regulation of epidermal terminal differentiation andbarrier formation. Our study will uncover a novel role of autophagy in regulating epidermal barrier formation and provide
new insights into development of novel therapeutic strategies for skin disorders.

1．緖

アウトしたマウスを作成したところ、角化層形成が著し言く低下していることを認めた。この結果から Notch シグナ

皮膚は生体内の環境と外界とを隔てるバリアとして働く。

ルの活性化が角化層の形成に対し必須な作用を持つことがこのような皮膚上皮のバリア機能は、皮膚上皮の最上層に判明した 4）。我々は、Notch シグナル経路の下流で角化層存在する角質層によって維持されている。従来の研究によの形成を制御する分子を検索し、オートファジー制御分って、角質層の機能異常による皮膚のバリア機能の低下が子 Bnip3 に注目するに至った。遺伝子発現解析実験により

1）

さまざまな皮膚病の原因となっていることが示されている 。

Bnip3 の発現が Notch シグナルの支配下で制御されている

角質層は、細胞骨格の再編成、脱核、ミトコンドリアや細ことが確認され、また、組織学的解析により皮膚の顆粒層

胞内小器官の除去、細胞死など、上皮細胞がダイナミック

細胞に Bnip3 の発現が局在していることが示された。さら2）なリモデリングを果たすことによって形成される 。しかに、培養ケラチノサイトを用いて Bnip3 の分子機能解析をし、このような細胞のダイナミズムがどのような分子的機行い、Bnip3 がケラチノサイトのオートファジーを誘導す

構によって制御されているのかについては明らかにされてるとともに細胞分化を促進する作用を持つことを明らかにいない。近年の研究から、細胞内小器官のクリアランスにした 5）。しかし、Bnip3 ノックアウトマウスでは皮膚上皮

オートファジーが中心的な役割を果たしていることが示さの角質化が正常に起こることから、生体内のケラチノサイ

れている 3）。そこで、我々は、皮膚上皮の角質化の過程に

トでは Bnip3 の作用を補完する何らかの分子が存在してい

おいても細胞のリモデリングにオートファジーが何らかのることが考えられた。
以上の成果を踏まえ、本研究では、Bnip3 の類縁分子で役割を果たしているという仮説を考えた。
我々は、従来の研究で、皮膚上皮細胞の増殖分化の制ある Nix（Bnip3l）に注目し3）、Nix が Bnip3 と協調的に働く

御に Notch シグナルが中心的な役割を果たしていることをことによってケラチノサイトのオートファジー誘導や細胞4）示した 。Notch シグナルを皮膚上皮細胞特異的にノック分化が制御されているという仮説を立て、ケラチノサイト
に対する Nix の分子機能を明らかにすることを目標に研究を進めた。

Molecular mechanisms of epidermal
cornification during skin development
Masatake Osawa
Department of Regeneration and Applied
Biomedical Sciences, Graduate School of
Medicine, Gifu University

2．実験

2. 1. マウス皮膚切片および培養ケラチノサイトの免
疫組織染色− 84 −

子宮から取り出したマウス胎児を PBS で洗浄後、氷上皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム

で冷やした 4 ％ PFA 溶液に浸し、800w の電子レンジで 1

チノサイトの懸濁液を予めコラーゲンゲルを形成させたカ

分間マイクロウエーブ処理をした後に氷上で 30 分間放置

ルチャーインサート上に添加し、CnT-PR 培地を加え細胞し固定を行った。マウスの胎児または新生児から採取したがコンフルエントになるまで培養を行った。その後、イン皮膚片についても同様な方法によって固定を行った。固定

サート内の培地を除去し，細胞を空気曝露させた。インサした胎児または皮膚片は OTC コンパウンドに包埋し液体ート外に CnT-PR-3D を添加し、CO2 インキュベーター内

窒素中で凍結させ凍結ブロックを作成した。

で 14 日間培養を行い、皮膚上皮の積層化を誘導させた。

クリオスタットにより厚さ 10µm の切片を作成した。凍
結切片を 4 ％ PFA 溶液に浸し 0 ℃で 10 分間固定を行った。

2. 3. 培養ケラチノサイトの分化誘導

固定後、切片を PBS+1% SDS 溶液に浸し室温で 10 分放置

初代培養ケラチノサイトに TryLE Express（Gibco 社）

し抗原賦活化処理を行った。その後、切片を PBS+0.05%を加え、細胞をディッシュから剥離させた後に、0.5 mM

Tween-20 によって 5 回洗浄することにより浸透化処理

CaCl2 を添加した CnT- 02 培地（CELLnTECH 社）に細胞をを行った。浸透化した切片を PBS+5% Skim milk+0.05%

懸濁し、非付着性ペトリディッシュ上に播種し浮遊細胞培

Tween-20（ブロッキング液）に浸し 4 ℃で一晩ブロッキ養を行った。分化誘導後、継時的に細胞を回収し、qRT-

ングを行った。ブロッキングを行った切片に対し、1 次抗体

PCR アッセイおよびウエスタンブロッティングによりケを含むブロッキング液を添加し室温で 1 時間反応をさせた後ラチノサイトの各種マーカー分子の発現変化を解析した。

に、Alexa 488 またはAlexa 555 をコンジュゲーとした 2 次抗体と反応させた。抗体染色を終えた切片は、PBS+0.05%

2. 4. siRNAを用いた遺伝子ノックダウン

Tween-20 によって 3 回洗浄した後、DAPIを含むAnti-fade

初代培養ケラチノサイトに対し、Lipofectamine RNAigold（In Vitrogen社）
封入剤を添加しカバーグラスで封入した。

MAX（In Vitrogen 社）を用いて siRNA のトランスフェク

封入後のサンプルはコンフォーカル顕微鏡によって観察ションを行った。トランスフェクションに用いた siRNAを行った。

は以下の通りである。
Nix-si#1: GCCATGCAGTTACATCTCTTT

2. 2. マウスケラチノサイトの初代培養および 3 次元
重層化皮膚上皮構築培養

Nix-si#2: GCCTAGACATACATGAAACTT

胎 生 15 日 目 の マ ウ ス 胎 児 か ら 皮 膚 を 採 取 し、PBS

Scrambled: GTTCGTAACCATGCCTCTATT

Nix-si#3: GTCCATCAGTGAGCTTGTACA+1mM EDTA 溶液の表面上に浮かせ 37 ℃で 1 時間イン

3．結

キュベートした。実体顕微鏡下でピンセットを用いて表果

皮と真皮を分離した後、表皮を TrypLE Express（Gibco

3. 1. マウス皮膚上皮発生期におけるNixの発現パターン社）上にのせ、37 ℃で 20 分間インキュベートした。その皮膚上皮は胎児期 14 .5 〜 15 .5 日目に基底層の細胞が積後、ペトリディッシュの底面に表皮を擦りつけ細胞を解離層化を開始することによって始まり、胎児期 18 . 5 日目頃にさせた。解離した細胞を CnT-57 培地（CELLnTECH 社）

角化層形成が起こり皮膚上皮の発生が完了する。皮膚上皮に懸濁し、遠心分離によって細胞を回収した。細胞を 4×発生過程における Nix の発現パターンを調べるために、胎4210 個 /cm になるように播種し培養を行った。ケラチノ

児期 15 .5 日目以降の皮膚切片を作成し、抗 Nix 抗体を用

サイトの 3 次元重層化培養は、3D Keratinocyte Starter

いて免疫組織染色を行った。その結果、皮膚上皮におけるKit（CELLnTECH 社）のプロトコールを改変して行った。

Nix の発現は胎児期 16 .5 日目以降から認められるように

Millipore カルチャーインサートの培養膜上に 1 型コラーなり、その発現は顆粒細胞層に限局していることが判明し6

ゲンを加えゲルを形成させた。1×10 個 /mL の培養ケラた（図 1）。顆粒層は角化層へと最終分化を起こす過程にあ

図 1 マウス胎児皮膚上皮における Nix の発現パターン
胎生 15.5 日目、16.5 日目、および 17.5 日目から採取した皮膚切片を抗 Nix 抗体および抗ケラチン 15抗体を用いて免疫組織蛍光色染色を行い、コンフォーカル顕微鏡によって観察した。Nix の発現は胎生
16.5 日目より認められるようになり、その発現は皮膚上皮の顆粒層に局在していることがわかった。

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コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

る細胞であることから、Nix が最終分化に何らかの作用を対しては Nix の方がより鋭敏に反応することを示している。
従来の報告から、Nix はオートファジー（ミトファジー）

果たしていることが考えられた。

を誘導することで細胞からミトコンドリアを除去する働き

3. 2. 培養ケラチノサイトを用いたNixの分子機能解析を持つことが示されている 7）。このことから、浮遊培養に

ケラチノサイトをカルシウムイオン存在下で浮遊培養をよって誘導される Nix の発現上昇がケラチノサイトにおけ行うと、ケラチノサイトは速やかに最終分化を起こし、脱るミトコンドリア除去に関与している可能性が考えられた。

6）

核まで至る 。このようなケラチノサイトの分化誘導培養

このような可能性を調べるために、浮遊培養による分化誘系を用いて、Nix の分子機能解析を行った。

導刺激によりケラチノサイトにおいてオートファジーが起はじめに、ケラチノサイトの分化と Nix との発現の関連

こるかどうか検討を行った。浮遊培養 12 時間後のケラチ性を調べるために、浮遊培養開始前のケラチノサイトとノサイトをサイトスピンによって回収し、抗 LC3 抗体と

24 時間の浮遊培養を行ったケラチノサイトをそれぞれ回収

抗 Nix 抗体を用いて細胞免疫染色を行った。その結果、浮し、ケラチノサイトの分化マーカーであるKrt1 と Krt10 の遊培養後のケラチノサイトにおいて Nix の発現が認められ遺伝子発現量および Nix の遺伝子発現量を qRT-PCR 法にるとともに、細胞質に LC3 陽性の顆粒が観察され、オーよって比較定量を行った。その結果、Krt1と Krt10 同様

トファゴソーム形成が起こっていることが示唆された。また、に、Nix の遺伝子発現量が細胞分化誘導刺激により著明に浮遊培養後のケラチノサイトを経時的に回収し、抗 LC3 抗

上昇することを認めた（図 2）。一方、Nix の類縁分子であ体を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、オる Bnip3 については分化誘導刺激の前後においてその発現

ートファゴソーム形成を示す LC3B-II のバンドが時間経過量に有意な差が認められなかった。我々は、従来の報告でとともに増強することが明らかになり、ケラチノサイトに

Bnip3 がケラチノサイトの分化に重要な働きをしているこ

おいてオートファジーが誘導されていることが判明したとを示したが、この結果より、浮遊培養による分化刺激に（図 3）。また、浮遊培養後のケラチノサイトを、抗 LC3 抗体および抗ミトコンドリア抗体（Tomm 20）を用いて免疫染色を行ったところ、LC3 陽性のオートファゴソームとミトコンドリアが共局在していることが観察され、浮遊培養後のケラチノサイト中でミトファジーが起こっていることが示唆された。また、より長期間の浮遊培養を行ったケラ
チノサイトの中には、脱核を完了しミトコンドリアを失っ

図 2 ケラチノサイトの分化誘導開始前後における各種遺伝子の発現変化および Nix 遺伝子ノックダウンが分化に及ぼす影
響
浮遊培養による分化誘導前のケラチノサイトと、24 時間分化
誘 導を行ったケラチノサイトから RNA を回 収した後、qRTPCR 法によってそれぞれの遺伝子発現量を比較定量した。Nixに対する siRNA をトランスフェクションしたケラチノサイトについても同様な定量を行った。

図 3 ケラチノサイトの分化刺激によって起こる Nix の発現誘導とオートファゴソーム形成
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った。その後ケラチノサイトを回収し、抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、
抗 Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。

− 86 −

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズムた細胞が認められ、これらは Nix を強く発現していることられた。そこで、皮膚上皮形成の過程をより忠実に再現でがわかった（図 4）。これらの結果から、ケラチノサイトのきる皮膚 3 次元培養系を用いて、ケラチノサイトに対する分化誘導に伴い、Nix の発現、ミトファジーの誘導、およNix の分子機能について再検討を行った。
培養ケラチノサイトをコラーゲンゲルの上に播種し空気びミトコンドリアの排除がシークエンシャルに起こることに暴露し積層化を誘導した。培養 9 日目には積層化が完了が明らかになった。
ケラチノサイトにおけるNix の機能を調べるために、siRNAし、顆粒層および角化層が認められ、組織学的所見上は生を用いて Nix 遺伝子のノックダウンを行い、ケラチノサイ

体の皮膚上皮と同等な構造が観察された。このようにしてトの分化やオーファジー誘導に対する影響を調べた。Nix

作成した 3 次元構成皮膚の切片を、抗 LC3 抗体、抗ミトに対する 3 つの異なる siRNA を設計し、ノックダウン効

コンドリア抗体、および抗 Nix 抗体を用いて免疫染色を行率が 90% 以上であることを確認した。Nix に対する siRNAった。その結果、3 次元構成皮膚においても、顆粒層およをトランスフェクションした培養ケラチノサイトに対して

び角化層からミトコンドリアが消失していることが観察さ

浮遊培養によって分化刺激を与えた後、分化マーカー遺伝

れるとともに Nix の発現とオートファゴソームの形成が認子の発現量を qRT-PCR 法によって比較定量するとともに、められ、生体の皮膚上皮と同様な現象が起こっていること

抗 LC3 抗体を用いてウエスタンブロッティング法によりがわかった（図 6）。そこで、Nix の分子機能を調べるために、

オートファゴソーム形成に対する影響を解析した。その結

予め Nix に対する siRNA をトランスフェクションした培養

果、Nix のノックダウンにより、浮遊培養刺激誘導性のケ

ケラチノサイトを用いて皮膚 3 次元培養を行った。その結ラチノサイトの分化に遅延が起こるとともに、オートファ

果、Nix に対する siRNA によって処理を行ったケラチノサ

ゴソーム形成が低下することが認められた。これらの結果

イトを用いた場合には、積層化が著しく阻害され、明瞭なから、Nix がケラチノサイトの分化やオートファジーの誘皮膚上皮が形成されなかった（図 6）。この結果より、Nix

導に重要な役割を果たしていることが示唆された（図 5）。

はケラチノサイトの分化や積層化構造の構築に必要な役割を果たしていることが示唆された。

3. 3. 皮膚 3 次元培養系を用いた Nixの分子機能解析

4．考

以上の研究では、ケラチノサイトの浮遊培養系を研究

察ツールとして用いて Nix の分子機能解析を行った。しかし、本研究では、ケラチノサイトの分化や角化細胞形成に対このような培養系は人為的であり、それによって得られたする Nix の役割について検討を行った。これまでに、皮膚知見についても生理的現象を反映していない可能性が考え上皮における Nix の発現について解析された例はない。そ図 4 ケラチノサイトの分化刺激によって起こるミトファジーとミトコンドリアの消失
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った後、ケラチノサイトを回収し、抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、抗Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。
左写真：ミトコンドリアとオートファゴソームの共局在が認められることよりミトファジーが起こっていることがわかる。右写真：
分化誘導刺激 24 時間後には脱核しミトコンドリアを失った細胞が認められた。

図 5 ケラチノサイトの分化刺激によって起こるオートファジ
ー誘導
ケラチノサイトの浮遊培養を行い分化誘導刺激を行った後、経時的にケラチノサイトを回収し、抗 LC3 抗体を用いてウ
エスタンブロッティング法によりオートファゴソーム形成に対する影響を解析した。オートファゴソーム形成が起こるとLC3 の C 末がリン脂質と共有結合を起こし、LC3-BII の割合が増加する。

− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

図 6 A、B：皮膚 3 次元培養において認められるオートファジー誘導とミトコンドリアの除去、C：
Nix のノックダウンが皮膚 3 次元培養に及ぼす影響
A、B：ケラチノサイトの 3 次元培養によって作成された皮膚片を抗ミトコンドリア抗体（Tomm20）、
抗 Nix 抗体、および抗 LC3 抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。白矢印で挟んだ領域では Nixの発現およびオートファジーが認められミトコンドリアが存在しない。C：Nix のノックダウンしたケ
ラチノサイトを用いた場合は積層化が起こらない。

こで、本研究では、まず、免疫組織染色法を用いて皮膚与していることが示唆された。また、我々は、従来の研究

上皮発生過程における Nix の発現パターンを詳細に解析しにおいて、Bnip3 の分子機能解析を行い、Nix と同様にた。その結果、Nix が皮膚上皮の顆粒層に限局して発現し

Bnip3 についてもケラチノサイトの分化やオートファジーていることが明らかになった。我々は従来の研究において、制御に関与していることを報告している 5）。これらの研究

Nix の類縁分子である Bnip3 も顆粒層に発現していること

結果より、Nix と Bnip3 が相加的もしくは相乗的に作用すを報告している。これらの結果から、皮膚上皮顆粒層のることにより、ケラチノサイトが制御されている可能性が細胞には Nix と Bnip3 が共に発現していることが示された。

考えられる。実際に、Nix と Bnip3 については、ともにオ

今後、これらの分子についてより詳細な機能解析を行うたートファゴソームの膜上に存在する LC3/GABARAP タン

めには、遺伝子ノックアウトマウスを作成し、皮膚上皮にパク質と結合することによりミトコンドリアを選択的にオおける表現型について詳細に解析を行う必要がある。Nix

ートファゴソームへとリクルートする機能を持つことが示と Bnip3 は互いに重複する機能を持ち、それぞれを補完しされており3）、ミトファジーを誘導するという点においてこ

あうことができる。皮膚上皮に Nix と Bnip3 が共発現してれらの分子は同様な機能を有している。本研究において、いるという結果から、遺伝子ノックアウトマウスを作成し我々は、皮膚上皮の顆粒層ではオートファジーが誘導され分子機能解析を行う際には、これらの分子の補完作用を避ているとともにミトコンドリアが消失していることを見出けるために、双方の遺伝子を同時にノックアウトしたマウした。これらのことから、ケラチノサイトにおいても、スを作成する必要性が考えられる。我々は、すでに双方のNix と Bnip3 が協調的に働くことによりミトコンドリアの遺伝子を皮膚上皮特異的にノックアウトしたマウスの作成

クリアランスを行い、最終分化に伴うダイナミックな細胞に着手している。

のリモデリングを可能にしていることが考えられる。

本研究では、培養ケラチノサイトを用いて Nix の発現解一方で、本研究では、Nix と Bnip3 の発現制御機構や分析および分子機能解析を行った。その結果、ケラチノサイ

子機能に相違点があることも認められた。Nix mRNA のトの分化に伴い Nix の発現が著明に上昇するとともにオー

発現はケラチノサイトの浮遊培養刺激により速やかに上昇

トファゴソームの形成が誘導されることを見出した。また、することが認められたが、Bnip3 の発現量は分化誘導刺激

Nix 遺伝子の発現を siRNA によってノックダウンしたとこの前後で変化することがなく一定に保たれていた。また、ろ、ケラチノサイトの分化とオートファゴソーム形成が遅Nix をノックダウンしたケラチノサイトを用いて皮膚の 3延することが認められた。これらの結果より、Nix がケラ次元培養を行った場合は積層化が著しく阻害されたが、チノサイトの分化や分化に伴うオートファジーの誘導に関

Bnip3 をノックダウンしたケラチノサイトを用いた場合は− 88 −

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子メカニズム

30 (3) :277-279.

このような著明な異常は観察されなかった。これらの結果から、両者の遺伝子の発現が異なる仕組みにより制御され2） Candi E, Schmidt R, & Melino G (2005) The cornifiedている可能性が考えられ、また、両者の分子機能やその作

envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev

用の仕方にも違いがあることが示唆される。実際に、Nix

Mol Cell Biol 6 (4) : 328-340.

はミトコンドリア膜の脱分極を誘導することにより活性化

3） Ney PA (2 0 1 5) Mitochondrial autophagy: Origins,

酸素の産生を上昇させオートファジーを誘導する作用を持

significance, and role of BNIP3 and NIX. Biochim

8）

Biophys Acta 1853 (10 Pt B) : 2775-2783.

つことが示されているが 、Bnip3 は活性化酸素非依存性
9）にオートファジーを誘導することが報告されており 、両4） Moriyama M, et al. (2 0 0 8) Multiple roles of Notch

者はオートファジー誘導能を持つという点においては同様

signaling in the regulation of epidermal development.

な機能を持つが、その作用メカニズムは異なることが推測

Dev Cell 14(4):594-604.

される。近年、ケラチノサイトの分化を誘導するためには

5） Moriyama M, et al. (2014) BNIP3 plays crucial roles

ミトコンドリアから産生される活性化酸素が必須な役割をin the differentiation and maintenance of epidermal

もつことが報告された。本研究では、Nix がケラチノサイ

keratinocytes. J Invest Dermatol 134 (6) : 1627-1635.

トの分化誘導に重要な役割を果たしていることが示された

6） Li L, Tennenbaum T, & Yuspa SH (1996) Suspension-

が、このような分化誘導は Nix によるミトコンドリアから

induced murine keratinocyte differentiation is mediatedby calcium. J Invest Dermatol 106 (2) : 254-260.

の活性化酸素の産生制御を介して行われている可能性が考7） Sandoval H, et al. (2 0 0 8) Essential role for Nix in

えられる。

autophagic maturation of erythroid cells. Nature

本研究によって、皮膚上皮の角質化の過程にオートファ

454(7201):232-235.

ジーが関与していることが示唆された。一般的に、ストレスにより肌の調子が悪くなるということが広く信じられて

8） Ding WX, et al. (2010) Nix is critical to two distinct

いる。オートファジーはさまざまなストレスの影響を受け

phases of mitophagy, reactive oxygen species-、ストレスによってオートファジー活性がmediated autophagy induction and Parkin-ubiquitin-

変化することを介して角化層の機能が変化する可能性が考

p62-mediated mitochondrial priming. J Biol Chem 285

えられる。本研究のさらなる発展によって、皮膚のオート(36) : 27879-27890.

ることから

10）

ファジー制御機構の分子的詳細が明らかにされれば、皮膚

9） Quinsay MN, Thomas RL, Lee Y, & Gustafssonの健康を維持するための方策として、オートファジー制御

AB (2010) Bnip3-mediated mitochondrial autophagy

を標的にした新たなアプローチ法を開拓できる可能性があis independent of the mitochondrial permeability

る。

transition pore. Autophagy 6 (7) : 855-862.
10）Huang Z, Zhou L, Chen Z, Nice EC, & Huang C（引用文献）(2016) Stress Management by Autophagy: Implications

1） Ramos-e-Silva M & Jacques C (2 0 1 2) Epidermal
barrier function and systemic diseases. Clin Dermatol− 89 −

for Chemoresistance. Int J Cancer.