第114回学術講演会 2018年11月15日
アイスティサイエンス 技術セミナー『ホクレン法＋STQ法によるジチオカルバメート分析法の紹介』『固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC-MSシステムの紹介』
株式会社アイスティサイエンス紹介

ポスター発表最優秀賞

第41回農薬残留分析研究会, 2018年10月11~12日, 長崎市『ジチオカルバメート迅速スクリーニング法の開発』○安藤 孝1、小西賢治2、市来弥生1、佐々野僚一2、今井沙紀3、杉立久仁代4、穴沢秀峰4、坂 真智子5、関口博史3、石渡 智31(一社)食の安全分析センター、2(株)アイスティサイエンス、3ホクレン農業協同組合連合会、
4アジレント･テクノロジー(株)、5(一財)残留農薬研究所■ホクレン＋STQ-GC法
ホクレンが開発したジチオカルバメート系農薬迅速分析法1),2),3)（以下、ホクレン法）による試
料溶媒中でメチル化しQuEChERS法を基に溶媒転溶を行うことを特徴とした迅速な抽出誘導体化法と自動前処理装置によるSTQ-GC-B2法の精製を組み合わせてGC-MSMSで測定した。
【参考文献】
1) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討、第110回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2015)2) 石渡智、関口博史：農産物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討（第二報）、第111回日本食品衛生学会、講演要旨集、p.63 (2016)3) S.Ishiwata,S.Imai:Simplified Method for the Determination of Dithiocarbamates in Agricultural Products by LC-MS/MS,12th European
Pesticide Residue Workshop, Programme & Book of Abstracts,p.130-131 (2018)2

ジチオカルバメート系農薬（殺菌剤）
SS(CH3)2N-C-S

2Zn

ジラム

CH2NH-C-SZn
SS
ジネブ

S
(CH3)2N-C-S

2Ni

ニッケルビス(CH3)2N-C-S3Feフェルバム

CH2NH-C-SS
S-C-N(CH3)2チラム

S

S-C-NHCH2 -CH-HN-C-S

Zn nプロピネブ

Mn

S

SS

CH2NH-C-S Zn S-C-N(CH3)2マンネブ

CH2NH-C-S Zn S-C-N(CH3)2SS
CH2NH-C-S

S

CH3S

CH2NH-C-S

S(CH3)2N-C-S

CH2NH-C-S

CH2NH-C-S
S

S

ポリカーバメート

MnxZnyx

マンコゼブ
3

測定物質
S
(CH3)2 N-C-S-CH3ジメチル
ジチオカルバミン酸メチル

DMDC

S

S

CH2 NH-C-S-CH3

CH3-CH2 NH-C-S-CH3

CH2 NH-C-S-CH3CH2 NH-C-S-CH3S

S

エチレン
ビス ジチオカルバミン酸メチル

EBDC

プロピレン
ビス ジチオカルバミン酸メチル

PBDC

4

抽出誘導体化（ホクレン法）
試料 100g
添加 システィン-EDTA溶液 100g

S

CH2NH-C-S
CH2NH-C-S

EDTA-2Na/NaOH①

添加 6mol/L塩酸 600~900µL

S

添加 ヨウ化メチル 60µL
振とう 10分間
添加 アセトニトリル 10mL

ジネブ

S

粉砕・均一化（5,000 rpm, 30秒）
秤量 20g（試料10g 相当）

Zn

CH2NH-C-S-Na
CH2NH-C-S-Na

振とう 5分間ナトリウム塩S

NaCl（食塩）
MgSO4（無水硫酸ﾏｸﾞﾈｼｳﾑ）
激しく振とう 1分間
遠心分離（3500rpm 5分間）
アセトニトリル層を分取

CH3-I

②S

CH2NH-C-S-CH3
CH2NH-C-S-CH3
S

メチル化物
EBDC
5EDTA（エチレンジアミン四酢酸）
HOOC-CH2NCH2CH2N

HOOC-CH2

CH2-COOH
CH2-COOHEDTAはアルカリ金属を除く多くの金属イオンと非常に安定な錯塩をつくる性質がある。
そのEDTA錯塩は水によく溶ける。

EDTAは４塩基性の弱酸で白色粉末で、水、アルコールに溶けにくい。

H4Y

⇆

H3Y-

⇆ H2Y2- ＋ H＋

H2Y2- ⇆HY3-

H3Y- ＋ H＋
HY3- ＋ H＋⇆ Y4-＋ H＋EDTAのpK値
pK1
pK2
pK3
pK4

2.0
2.67
6.16
10.26

●エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物
EDTA/2Na/2H/2H2Oは白色粉末で、非潮解性、水に溶けやすい。

HOOC-CH2
NaOOC-CH2

NCH2CH2N

CH2-COOH

HOOC-CH2

CH2-COONa-OOC-CH

2NCH2CH2N

CH2-COOH
CH2-COO-＋ 2Na+6メモS
CH2NH-C-S
CH2NH-C-SSZn＋

EDTA4/NaOH

ジネブ S
水にも有機溶媒にも溶けない。

Zn＋ CH NH-C-S

CH2NH-C-SS
水に溶ける！

EDTA2--Zn【キレート】複数の配位座を持つ配位子（多座配位子）による金属イオンへの結合
キレートとはハサミを意味するギリシャ語
金属イオンが有機試薬で包み込まれたような形になり、その状態からカニがハサミで餌を捕らえた格好に似ているため、キレート化合物と呼ぶ。

ZnのpHによる変化
pHLogK

1210864216.5
16.0
14.2
11.8
8.0
3.0-2M

安定度定数K
金属イオン LogK
Mg2+
Ni2+
Zn2+
Fe3+

8.7
18.6
16.5
25.1

【pHとの関係】
pHが低くなりH+の濃度が高くなると、EDTAと結合していた金属イオンM＋がH+によって押し出され、EDTA錯塩の解離が起こる。
溶液のpHが次第に高くなると金属イオンは水酸化物となって沈殿してくる傾向があり、pHの上昇に従って生成した水酸化物の安定度がEDTA錯塩の安定度より高くなってくると、EDTA錯塩は分解して金属の水酸化物が沈殿する。

■ EDTA錯塩が安定なのは一定のpH領域に限られており、そのpH領域は金属イオンの種類によって異なる。
参考文献：上野景平:“EDTAの使い方”,分析化学,
78巻, p207-214（1959）

L-システィン塩酸塩
O
HSOHNH2H Cl（pH調整？、安定剤？、保護剤？）8

残留農薬分析用自動前処理装置

9

なぜST-L400が必要なの？
～残留農薬分析における課題とST-L400の解決法～

簡単、セットしてボタンを押すだけ！
→ST-L400ならタッチパネルで前処理法を選択するだけ。

10

自動前処理装置によるSTQ-GC-B法

114mLバイアルにアセトニトリル抽出液

自動処理■検討１ C18ミニカラムによる保持工程

分取・負荷[通液] 抽出液0.5mL

Smart-SPE C18-50 mg：精製通液無極性夾雑除去

アセトニトリル-水（9/1)

0.4mL

流出液
混合・通液 10%塩化ナトリウム水溶液 8mL
Smart-SPE C18-50 mg：保持

極性夾雑物除去

窒素ガスで乾燥：3分間
連結

Smart-SPE GCK-20/PSA-30：精製

脂肪酸類除去フラボノイド類除去

溶出

アセトン・ヘキサン (3/7) 1mL

添加

0.1% PEG200 +1ppmフェナントレン-d体/アセトン 20µL

■検討2 GCK/PSAミニカラムによる精製工程定容（1 mL, ｱｾﾄﾝ/ﾍｷｻﾝで調製）
GC-MS/MS測定（2µL大量注入）or GC-MS測定（25µL大量注入）

12再現性について：スタンダード「ホクレン誘導体化抽出＋STQ精製＋GCMSMS測定」によるスタンダードの再現性

表 MRMによるピーク面積値
サンプル検体D BD CPBD CEB D C

1614,630

221,636

1,048,247

2616,254

226,288

1,031,410

3592,812

201,846957,213

4

631,927

220,221993,4035649,973

223,092

1,010,333

6

643,589

222,654998,897A ve.

624,864

219,290

1,006,584

R S D ,%

3.4

4.0

3.2

EBDC
DMDC

PBDC

TICによるクロマトグラム重描き（n = 6)13

添加回収試験の結果■ほうれん草（n=3, ピーク面積値）
サンプル検体DBDC

PBDCEB D CST

595,724

199,627

908,739

添加 1

680,577

188,638

902,465

添加 2598,796

182,159

877,214添加 3604,245

177,507809,690A ve.

627,873

182,768

863,123R S D ,%

7.3

3.1

5.6

回収率, %1059295・スタンダード・添加１・添加２・添加３・未知試料

TICによるクロマトグラム重描き■オレンジ（n=1, ピーク面積値）
サンプル検体DBDC

PBDCEB D CST595,724

199,627

908,739

添加 1646,826

213,771939,190

回収率, %

109107103・スタンダード
・添加１・未知試料

TICによるクロマトグラム重描き

14固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC-MSシステムについて

株式会社アイスティサイエンス

メタボロミクスの現状

16

固相誘導体化法
STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

試料負荷＆保持洗浄

脱水／１分

誘導体化／２分

溶出

アミノ酸と有機酸をイオン交換相互作用により固相に保持

水-ACNで固相に残存している非イオン性化合物を除去

ACN で 固 相 に 残 存 している水分を除去

誘導体化試薬を固相に含侵させて、目的成分を固相中で誘導体化

試料水-ACN

ACN

MSTFA

-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R-SO3 ⊝-SO3 ⊝-N ⊕アミノ基⊕NH3-R
カルボキシル基-N⊕⊝OOC-R(CH3)3(CH3)3-N ⊕-N⊕
(CH3)3(CH3)3⊝ OOC-R

非イオン性化合物-N ⊕-N⊕(CH3)3(CH3)3
H2O⊝ OOC-R-N ⊕ヘキサン

TMS-NH-R-N⊕(CH3)3
TMS-OOC-R(CH3)3-SO3 ⊝-N ⊕-N⊕(CH3)3(CH3)3
R-NH-TMS
R-COO-TMS

特許登録：（株）アイスティサイエンス

17従来法と本法の前処理比較
 従来法

 本法
血清 50µL

血清 50µL

添加：H2O/ACN 1000µL

添加：MeOH/H2O/CHCl3 1000µL振とう抽出（37℃, 30分）

振とう抽出（37℃, 30分）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

１ 時間

分取：上澄み 600µL

添加：超純水 250µL

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

精製

バイアル
装置にセットしてスタートボタンを押すだけ！

0.5 時間オンライン固相誘導体化SPE-GC-MS

減圧濃縮遠心分離（1600rcf, 4℃）

脱水

凍結：液体窒素
凍結乾燥（一晩：16時間）

１ 時間

分取：上澄み 250µL

添加：超純水 300µL

分取：上澄み 400µL（MeOH/水の混液）

抽出

遠心分離（1600rpm, 4℃, 3分）

自動前処理時間

10～15 分SGI-M10017 時間

誘導体化試薬添加
メトキシアミン/ピリジン溶液 100µL
誘導体化反応（30℃, 90分）

誘導体化反応（37℃, 30分）

誘導体化

遠心分離（1600 rcf, 4℃, 3分）

3 時間

誘導体化試薬添加：MSTFA 50µL

分取：上澄み 100µL→バイアル

測定：GC/MS：注入1µL（スプリット 25:1)

40µL

精製
脱水

誘導体化

LVI-S250
Spiral Insert
スプリット 50:1

GC-MS

18

SPE-GC-MS system19

本法による標準溶液のSCANトータルイオンクロマトグラム

Fig. 3. The SCAN total ion chromatogram of standard solution using SPE-GCMS system with automated SPE-based derivatization method.
＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL20

本法による標準溶液の再現性
Table 1. Reproducibility of peak area with standard solution using SPE-GC-MS system.
N o. C om pound
1 A lanine-2TM S
2 V aline-2TM S
3 P hosphate (3:1)-3TM S
4 N orleucine-2TM S
5 Isoleucine-2TM S
6 P roline-2TM S
7 G lycine-3TM S
8 Succinic acid-2TM S
9 Fum aric acid-2TM S
10 Serine-3TM S
11 Threonine-3TM S
12 M alic acid-3TM S
13 A spartic acid-3TM S
14 M ethionine-2TM S
15 P roline-oxo-2TM S
16 C ytosine-2TM S
17 A m inobutyric acid-3TM S
18 K etoglutaric acid-3TM S
19 G lutam ic acid-3TM S
20 P henylalanine-2TM S
21 A sparagine-3TM S
22 P utrescine-4TM S
23 A conitic acid-3TM S
24 C itric acid-4TM S
25 O rnithine-4TM S
26 A denine-2TM S
27 Lysine-4TM S
28 Tyrosine-3TM S
29 G uanine-3TM S

12,780,202
3,231,804
1,980,261
3,860,754
3,166,213
3,326,569
2,170,649
3,020,526
1,768,634
2,012,774
1,040,407
485,209527,945
1,317,135
1,972,283
1,164,055
1,903,218
179,954
486,088
1,553,897
264,587
1,097,163
1,068,411
2,509,279
948,801
1,791,455
438,332
2,290,304
1,276,608

2
2,814,678
3,290,271
1,945,488
3,995,800
3,281,486
3,445,278
2,352,541
3,101,538
1,813,725
2,110,285
1,085,291
496,725
521,172
1,376,552
2,178,513
1,199,619
2,080,359
187,293482,193
1,642,952
293,568
1,143,662
1,095,208
2,585,329
1,074,181
1,859,990
487,673
2,415,910
1,325,553

32,805,838
3,270,689
1,842,146
3,961,145
3,263,756
3,452,215
2,219,378
3,047,906
1,790,816
2,078,505
1,075,400
505,695
605,941
1,320,877
2,188,232
1,211,399
1,832,270
167,292
528,880
1,616,874
269,785
1,022,892
1,085,018
2,551,370
928,962
1,930,628
411,966
2,339,399
1,372,469

42,570,446
2,966,049
1,762,489
3,572,341
2,942,720
3,055,493
2,118,024
2,891,328
1,626,601
1,857,176
963,085
464,603439,870
1,165,099
2,213,001
1,081,564
1,718,333
138,034
375,004
1,422,103
215,342
1,069,833
973,865
2,326,885
889,675
1,670,688
389,2632,070,195
1,201,496

5
2,663,543
3,107,653
1,746,163
3,750,253
3,112,611
3,264,503
2,229,077
2,874,284
1,697,384
1,969,420
1,019,290
471,484
548,152
1,233,662
2,171,464
1,154,429
1,911,954
169,160
494,429
1,528,499
260,091
1,140,680
1,026,875
2,437,909
963,445
1,831,552
423,849
2,220,032
1,273,918

6
2,676,876
3,132,760
1,658,840
3,798,730
3,105,804
3,272,235
2,288,729
2,677,718
1,608,388
1,978,512
1,028,004
446,942
689,805
1,299,449
2,218,260
1,179,900
1,983,878
156,600
585,775
1,564,042
264,791
1,218,672
1,009,638
2,410,546
1,025,487
1,839,583
469,2632,300,204
1,292,009

72,632,581
3,054,963
1,585,771
3,712,869
3,057,182
3,230,054
2,328,562
2,840,826
1,635,905
1,918,379
988,509451,563
622,430
1,267,142
2,414,150
1,130,354
1,952,195
151,045
510,207
1,507,985
258,735
1,113,605
1,007,640
2,372,287
1,049,537
1,690,694
485,851
2,231,995
1,214,782

8
2,692,127
3,085,131
1,679,471
3,729,371
3,062,330
3,247,932
2,291,359
2,917,558
1,710,549
1,950,455
997,181459,884
590,812
1,274,606
2,348,929
1,140,346
1,884,295
147,256
483,426
1,508,373
249,746
1,075,243
1,025,144
2,395,838
1,005,050
1,722,793
449,843
2,184,577
1,217,067

A ve.
92,718,118 2,706,045
3,160,769 3,144,454
1,991,253 1,799,098
3,834,508 3,801,752
3,129,208 3,124,590
3,297,886 3,288,018
2,432,007 2,270,036
3,180,044 2,950,192
1,825,272 1,719,697
1,968,792 1,982,700
1,024,209 1,024,597
497,251475,484
358,848544,997
1,279,034 1,281,506
2,386,591 2,232,380
1,191,227 1,161,433
2,036,145 1,922,516
178,112
163,861
320,272
474,030
1,520,941 1,540,630
263,337
259,998
1,130,409 1,112,462
1,085,668 1,041,941
2,470,814 2,451,140
1,047,923
992,562
1,876,276 1,801,518
475,516
447,951
2,239,834 2,254,717
1,316,201 1,276,678

R S D ,%
3.0
3.4
8.3
3.4
3.4
3.6
4.3
5.2
4.9
3.9
3.8
4.5
18.3
4.6
6.1
3.5
5.6
10.1
16.8
4.2
7.9
5.0
4.1
3.5
6.3
5.0
7.8
4.4
4.5

＊標準溶液バイアル中濃度：0.01nmol/μL
21

２段階試料分取法：構想
試料抽出液
20%水-ACN

2回目採取
１回目採取

試料抽出液
5μL

試料抽出液
100μL

希釈液添加
ACN 100μL

試料抽出液
20%水-ACN

洗浄液
20%水-ACN

1. 試料負荷

2. 洗浄

CX-

アミノ酸
–NH3+

AX+ 有機酸–COO-

糖類 -OH

CX-

洗浄液
ACN

3. 脱水

アミノ酸
–NH3+

AX+ 有機酸–COO-

残存糖類 -OH

アミノ酸をと有機酸を固相に保持。
糖類はスルーさせ、除去。

CX-

アミノ酸
–NH3+

AX+ 有機酸

–COO-

残存水

希釈試料抽出液
１%水-ACN

洗浄液
ACN

誘導体化試薬 [含浸]MTA、MSTFA

溶出液
ヘキサン

4. 希釈試料負荷

5. 脱水

6. 固相誘導体化

7. 溶出

CX-

アミノ酸
–NH3+
有機酸

AX+ –COO糖類–OH

CX-

アミノ酸–NH3+有機酸

AX+ –COO糖類
–OH

残存水

少量の試料をアセトニトリルで希釈して少量の糖類を固相に保持。

CX-

アミノ酸
–NH-TMSAX+ 有機酸–COO-TMSCXAX+糖類–O-TMS

アミノ酸–NH-TMS
有機酸–COO-TMS
糖類–O-TMS

第１回目の試料負荷では糖類は固相に保持させず、アミノ酸と有機酸を固相に保持させておき、第２回目の試料負荷では先の試料量の1/20以下にして先の固相に糖類を保持させ、アセトニトリルで洗浄することで脱水を行い、アミノ酸と有機酸と糖質が固相に保持された状態で誘導体化試薬を固相に添加含浸させて誘導体化し、その後、一斉にヘキサンで溶出した。

22

混合標準溶液によるトータルイオンクロマトグラム

23野菜ジュースのトータルイオンクロマトグラム

24

本法によるスタンダードのSCANトータルイオンクロマトグラム
有機酸系（短鎖脂肪酸、ジカルボン酸類）誘導体化試薬：MTBSTFA

617953421315

検出器OFF8

1. Methanoic acid-tBDMS
2. Ethanoic acid-tBDMS
3. Propanoic acid-tBDMS
4. Butanoic acid-tBDMS
5. Pentanoic acid-tBDMS
6. Hexanoic acid-tBDMS

1110 121614

7. Heptanoic acid-tBDMS
8. Lactic acid-2tBDMS
9. Octanoic acid-tBDMS
10. Maleic acid-2tBDMS
11. Succinic acid-2tBDMS
12. Fumaric acid-2tBDMS

13. Malic acid-3tBDMS
14. a-Ketoglutaric acid-3tBDMS
15. Tartaric acid-4tBDMS
16. Citric acid-4tBDMS

25

ブルーチーズ3種のSCANトータルイオンクロマトグラム比較
有機酸系（短鎖脂肪酸、ジカルボン酸類）誘導体化試薬：MTBSTFA
試料：ブルーチーズ３種C

12345789112122242526272829B

A

Methanoic acid-tBDMS
Ethanoic acid-tBDMS
Propanoic acid-tBDMS
Butanoic acid-tBDMS
Pentanoic acid-tBDMS
Heptanoic acid-tBDMS
Lactic acid-2tBDMS
Octanoic acid-tBDMS
Succinic acid-2tBDMS
Decanoic acid-tBDMS
Dodecanic acid-tBDMS
Tetradecanoic acid-tBDMS
Aspartic acid-3tBDMS
Glutamic acid-3tBDMS
Hexadecanoic acid-tBDMS
cis-9-Octadecenoic acid
Stearic acid-tBDMS

26