News No.104(2002)

No.1042002■ Review

全身性アミロイドーシスの新たな診断法
安東由喜雄■ Topics on Chemistry

遺伝子治療用ベクターとしてのナノ粒子
佐々本一美

■ 連載

ケミストからみたポストゲノム 4
片山佳樹

ISSNO385-1516

News No.104(2002)

目次

Q&A
DNA Damage Quantification Kit-AP site counting ......... 14
Biopyrrin EIA Kit ................................................................. 15

Review
全身性アミロイドーシスの新たな診断法
熊本大学医学部臨床検査医学講座 安東由喜雄 ................... 1
ケミストからみたポストゲノム 4〜タンパク質相互作用の解析法（1）〜
九州大学大学院工学研究院 片山佳樹 ................................. 8

お知らせ
学会展示のご案内 .................................................................... 5
受託サービス・機能性材料ページオープン ............................ 7
販売中止予定のご案内 .......................................................... 14
フォーラム開催案内 .............................................................. 18

Topics on Chemistry
遺伝子治療用ベクターとしてのナノ粒子
同仁化学研究所 佐々本一美 ............................................ 13

Commercial
新製品案内
アミロイド染色用蛍光色素 .................................................. 6
近日発売予定HTS 用細胞内カルシウム測定用試薬キット ..................... 16
Total RNA 抽出キット ...................................................... 17

新製品案内
アミロイド染色用蛍光色素（1％BSB in DMSO）.................... 6

BSB solution

秋の熊本テクノリサーチパーク
同仁化学研究所の周囲では、赤、黄、緑と木々の葉が美しい色合いを見せてくれる。

News No.104(2002)

全身性アミロイドーシスの新たな診断法(Novel diagnostic methods for amyloidosis)

安東由喜雄(Yukio Ando)
熊本大学医学部臨床検査医学講座[ Summary ]Amyloidosis is a disorder of protein metabolism in which normally soluble autologous
proteins are deposited in tissues as abnormal insoluble fibrils, which cause structuraland functional disruptions. They are usually characterized by an intra- and extracellulardeposition of amyloid in various tissues and are classified as localized or systemic
amyloidoses. So far, 18 different amyloid precursor proteins have been discovered.
It has been generally considered that amyloidosis is a rare disease. However, when
we actively suspect amyloidosis in an unknown cause of a disease, more cases may
be diagnosed. To make a diagnosis as an amyloidosis, histopathologic examinationis one of the indispensable methods. Recently, (trans, trans) -1-bromo-2, 5-bis-(3hydroxycarbonyl-4-hydroxy) styrylbenzene (BSB) has been focused in the recent
attension as a useful tool for histochemical examinations. In this review, we refer tothe possibility as a inhibitory effect of BSB on amyloid formation.

キーワード：
アミロイドーシス、BSB、家族性アミロイドポリニューロパチー、Congo red、アルツハイマー病、トランスサイレチン、アミロイ
ド線維1) はじめにアミロイドーシスとは、アミロイドとよばれる線維状の難溶性蛋白質が主として種々の臓器の主に細胞外に沈着することにより機能不全を来す疾患単位である。沈着様式により全身性と局所性の 2 つに大別され、前駆蛋白の違いにより更に細かく分類されている（表 1）。最近、我々はラクトフェリンが原因となって角膜にアミロイドを形成した限局性アミロイドーシスを新たに発見し、前駆蛋白はそれをあわせると合計 18 種類となっている 1)。一般にアミロイドーシスは比較的稀な疾患と考えられがちであるが、診断不能な疾患を疑い、下記の手法で診断できるケースも少なくない。本症の診断には組織学的な検討が不可欠であるが、近年我々の研究グループと同仁化学により研究開発されている ( t r a n s ,trans ) -1-bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene (BSB)は、各種アミロイドーシスの組織診断に有用であるばかりでなく、アミロイド沈着阻止剤としても有用である可能性がある。
アミロイドーシスの診断手順
アミロイドーシス診断の最大のポイントは、臨床医が患者の臨床所見や病歴などから、まずアミロイドーシスを疑うことである。古
典的な内科学の教科書には、原因不明な疾患は、アミロイドーシスである可能性が記されている。本症を疑った場合、まず生検可能な部位から組織を採取し、Congo red 染色を行なう 2）。Congo red陽性所見が得られれば、原因蛋白を想定し、その抗体による免疫染色を行なう。しかし Congo red 染色は偏光顕微鏡下で検討しても、しばしば陽性か否かを判断しかねることがあるため、以下に述べる
BSB などの新たなアミロイド検出試薬の開発が必要となる。

1．アミロイドーシスの臨床診断
アミロイドーシスの診断においては、何と言っても臨床症状が決め手となる。全身性アミロイドーシスでは 10 年以上の透析歴を持つ患者では必ず透析アミロイドーシス（DRA）を、慢性の炎症性

全身性アミロイドーシス
免疫グロブリン性アミロイドーシス
1)AL アミロイドーシスAL
L 鎖（λ、κ）
2)AH アミロイドーシス
AH
Ig（IgGl(γ 1)）
SSA
反応性 AA アミロイドーシス AA
家族性アミロイドーシス
1)FAP ⅠATTR トランスサイレチン
2)FAP ⅡATTR トランスサイレチン
3)FAP Ⅲ
AApoAl アポ AI
4)FAP ⅣAGel
ゲルソリン
5)家族性地中海熱（FMF） AA
アポ SAA
6)Muckle-Wells 症候群
AA
アポ SAA
7)家族性腎アミロイドーシス
リゾチーム8)家族性腎アミロイドーシス
フイブリノーゲン A
透析アミロイドーシス
Aβ2m β2- ミクログロブリン
老人性アミロイドーシス
ATTR トランスサイレチン

限局性アミロイドーシス
脳アミロイドーシス
1) アルツハイマー型痴呆
Aββ 前駆蛋白2)脳血管アミロイドーシス Aββ 前駆蛋白3)遺伝性アミロイド性脳出血 Aβ
β 前駆蛋白4)遺伝性アミロイド性脳出血 ACys
シスタチン C
5)クロイツフェルト・ヤコブ病 AScr
スクレイピー前駆蛋白
内分泌アミロイドーシス
1) 甲状腺髄様癌
ACal （プロ）カルシトニン
2)Ⅱ型糖尿病 インスリノーマ
AMP アミリン
3)限局性心房性アミロイド AANP ANP
皮膚アミロイドーシス
AD
ケラチン？
L鎖
限局性結節性アミロイドーシス AL
表1

アミロイドーシスの分類（厚生省特定疾患調査研究班新分類一部改変）

1

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疾患を持つ患者に浮腫や蛋白尿、腎障害を伴った場合は二次性アミロイドーシスを疑う。特に慢性関節リウマチ症では、剖検により約半数の患者の諸臓器にアミロイド沈着が認められることから、本症の合併を強く疑う必要がある。また、発熱や全身倦怠感を強く訴える患者で、蛋白尿がみられる場合、骨髄腫の有無に関わらず常にALアミロイドーシスを鑑別診断に入れておく必要がある。ALアミ
ロイドーシスは骨髄腫を伴うタイプと、伴わない原発性アミロイ
ドーシスとに大別されるが、原発性アミロイドーシスは骨髄腫に伴うタイプの約 4 倍存在するため、骨髄腫を疑わせる所見がない場合
でも上記の症状があれば本症を疑う必要がある。
家族性アミロイド
ポリニューロパチ−(FAP)では、トランスサイレチン（TTR）の変異の種類に関わらず、常染色体優性遺伝の形式をとるため、家族歴が重要となる。しかし、弧発例も存在することから、下痢・便秘などの消化器症状、四肢末梢の感覚・運動障害、起立性低血圧、発汗障害などの自律神経障害などの症状が主症状である場合、本症を疑う。また高齢者において、正常の TTR がアミロイドの原因蛋白となり、主として心不全、心肥大などを起こす老人性アミロイドー
シス患者が存在することもわかって来ているので、原因不明の高齢者の心疾患は本症を疑ってみる必要がある 3）。
限局性アミロイドーシスにおいては組織に限局した腫瘤、結節が悪性の増殖パターンを示さず、H-E 染色などで無構造なピンク色に染まる物質が検出された場合、本症を疑い、まず Congo red 染色あるいは後に述べる BSB 染色を行う。
Congo red
NH2
N
O

H2N
N

N
N

S

O

S

O

O
O

O
Chrysamine G

HO

N

N

N
N

OH
COOH

HOOC
X-34

HO

OH

HOOC

COOH
BSB
Br

HO

OH
COOH

HOOC
図1

2

2．アミロイドーシスの組織診断
アミロイドーシスの確定診断は、まず生検材料からアミロイドを病理組織学的に証明することにより始められる。一般的には、下記 A 〜 C が行なわれるが、より確実な診断を必要とする場合には
D まで行なう。
A. ヘマトキシリン・エオジン（H-E 染色）
H-E 染色では淡ピンク色の無構造な物質として認められる。
B. アミロイド特殊染色
アミロイド沈着部位はCongo red染色で赤紫色に染まり、その配向性のため偏光顕微鏡下でアップル・グリーンの複屈折を示す。Congo red染色で赤紫色に染まっても複屈折性を呈さない
場合は、通常アミロイド沈着とはみなさない。組織沈着アミロ
イド量が比較的少量であった場合、アミロイドの沈着の有無の判断がしばしば困難なことがある。最近、Congo red 誘導体である Chrysamine-G、X-34、BSB（ (trans, trans),-1-bromo2, 5- bis- (3-hydroxycarbonyl -4-hydroxy) styrylbenzene ）（図 1）といった物質を用いた in vivo の系でのアミロイド検出
法がアルツハイマー病における老人斑のアミロイドの検出などに利用され、注目されていたが、中でも BSB は後述するごと
く、脳のみならず全身性アミロイドーシスの診断薬として有用であることが明らかとなっている。
C. 免疫染色
アミロイドの存在が証明された後、そのアミロイド線維を構成する前駆蛋白に対する抗体を用いて免疫染色を行ない、
アミロ
イドーシスの病型を決定する（各抗体の適正使用濃度について
はカタログや文献等を参照のこと）。
D. 電子顕微鏡による線維状物質の確認
電子顕微鏡下では、多くのアミロイド線維は幅 8 〜 14 nm、長さ 30 〜 1000 nm の枝分かれのない周期的へリックス構造を有する細線維の集簇として認められる。
E. その他の特殊な組織診断
ABO の血液型は毛髪を試料とし、ABO の抗体を用い組織学的に血液型を診断することが出来る。我々はこの事実に着目し、異型 TTR に対する monoclonal 抗体を用いた免疫染色で、毛髪髄質の異型 TTR を同定することにより、FAP を診断することが出来ることを証明した 4）。本法は、FAP 以外にも毛髪に存在する様々な異常蛋白を検出する画期的な診断法として有用である可能性がある。
F. BSB によるアミロイドーシス診断の有用性
BSB は、Congo red 誘導体で、lipophilic であることから、invivo で投与した場合、血液脳関門を通過し、アルツハイマー病のモデルマウスに本誘導体を静注すると脳内のアミロイド組
織に集積することが知られている。
またその構造にベンジジン
構造を持たないことから、将来的にヒトに投与した場合、発癌性などの問題性が少ない可能性が高い。そこで我々は BSB を用いて、全身性アミロイド−シスにおいて in vitro および invivo での有用性を検討した。図 2 に示す如く、BSB は検討した全ての全身性アミロイド−シスの組織において、沈着アミロ
イドをCongo red染色よりもより鋭敏に検出することに成功した。in vivo での有用性を検討するため、結核死菌を用いてNews No.104(2002)

免疫染色Congo red 染色

偏光

BSB

FAP

DRA

AA

AL

familial CJD

図2

BSB

Congo red 染色

偏光下での観察図3

3

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多くのタイプのアミロイドーシスでは、血液、尿などの生化学的検査データにより診断が確定する可能性は低い。しかし、多くの場合、病態解析の重要な情報となり、いくつかのタイプのアミ
ロイドーシスでは、これらの所見が治療効果の判定や病態を把握する有用なマーカーとなる。
A. 血液生化学検査(a) AL アミロイドーシス
AL アミロイドーシスにおいては、単クローン性の免疫グロブリン産生による血清中の M 蛋白の出現がみられる。以下に示す所見
は、アミロイドーシスの確定診断になることはないが、病態把握や治療効果のマーカーとして有用である 5）。
・血清蛋白レベルA/G 比の減少を伴う蛋白の異常高値がみられた場合、まず多発性骨髄腫が疑われる。しかし、発症初期には血清、尿ともに正常所見を呈することも多く、さらに原発性 AL アミロイドーシスの場
合、蛋白の高値を認めないこともあるため注意が必要である。その場合は免疫組織診断が重要な決め手となる。
・血清蛋白分画
AL アミロイドーシスを疑った場合、電気泳動法により血清の蛋
白分画を調べる。
α2 〜 γ 領域にシャープなピークが認められた場合、
M 蛋白血症を疑う。M 蛋白の比率の減少は、病態把握や治療効果のマーカーとして有用である。血清でなく血漿を用いた場合や、高度の溶血血清では、偽 M 蛋白が現れることがあるので注意を要する。
・血清蛋白免疫学的検査
M蛋白血症が疑われた場合、特異抗血清（抗 IgG, 抗IgA, 抗IgM,
抗 κ 鎖 , 抗 λ 鎖抗体）を用いて、電気泳動免疫固定法あるいは免疫電気泳動法により、M 蛋白の構成成分である免疫グロブリン鎖の種類を同定する。
(b) FAP の診断
FAP の場合、TTR レベルの上昇は認められないが、TTR のア
ミノ酸変異型を同定する必要がある。方法としては、PCR-SSCPを用いた塩基レベルでの検出法、あるいは質量分析装置を用いた
アミノ酸レベルでの検出法があり、最終的にはシークエンスにより変異残基を同定する。
塩基変異の検出・PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) 法
塩基変異に伴う分子内高次構造の変化による泳動の違いを、RIを用いて検出する方法である。TTR は 4 つのエクソンから構成されており、その各々を切り出し、RI を加えた反応液で PCR を行なう。熱変性後、非変性条件下で電気泳動を行ない、正常と異なる泳動パターンを示すエクソンをオートラジオグラフィーにより検出し、変異があるエクソンを同定する。

4

100

Relative Intensity (%)

3．アミロイドーシスの生化学的診断

・NIRCA (non-isotopic RNase cleavage assay)法
標的 DNA が転写した RNA を野生型 RNA にハイブリダイズさせた後、RNase 処理を行うことで、変異が存在する場合、RNase
切断による RNA の小断片が検出される。本法は、RI 実験施設を用いることなく変異エクソン及び変異のおおよその位置を検出できるため、実際の臨床の場では SSCP より有用である。
・PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 法
既知の遺伝子変異の同定に用いる。たとえば F A P A T T R
Val30Met の診断の場合、Val (GTG)が Met (ATG)に変異している遺伝子が存在すれば、制限酵素 NSI1 で切断されるため、これにより診断が可能である。
アミノ酸変異の検出
近年、我々は質量分析装置を用い、簡便でかつ高感度のアミノ酸変異の検出法を開発した（図 4）6）。アミノ酸変異は質量の変化として検出され、検出限界も鋭敏である。さらにこの方法は、大量のサンプルの測定が短時間ですみ、未知のアミノ酸変異の予測も可能であることから、遺伝子変異によるアミノ酸変化を検出するスクリーニング法として優れている。また、正常、及び変異蛋
白の翻訳後修飾も検出できるため、本検査法は、病態解析に重要な情報を提供するものとしてその有用性が期待されている。

a

A

B

80
60
40
20
0
13600

100

Relative Intensity (%)

二次性アミロイド−シスを誘起したマウスにBSBを静注した
ところ、沈着アミロイドに BSB が集積することも判明した。BSB の構造の中の Br は、化学修飾が可能なことから、（図 3）
これを RI ラベルしたヨウ素などに置換すると、シンチグラ
フィーとしてアミロイド沈着の検出に有用である可能性が考えられる。

b13700 13800 13900
Molecular weight (Da)
A

B

A’

B’

14000

80
60
40
20
0
13600

13700 13800 13900
Molecular weight (Da)14000

図 4 質量分析装置を用いた TTR のアミノ酸変異の検出法（模式図）
健常人（a）の場合、未修飾の TTR（A）およびシステイン結合型 TTR（B）の 2 つの大きなピークが検出される。一方、ヘテロ接合体の FAP ATTR

Val30Met 患者の場合、正常 TTR に加え、Val（99Da）→ Met（131Da）
変異により 32Da ずつ増加した異型 TTR（A 、B ）が検出される。

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B. 尿検査AL アミロイドーシスにおいては、尿中の Bence-Jones 蛋白の証明が重要である。
・尿蛋白の検出および定量
テープ法はアルブミンに特異的であり、通常 BJP では陰性となるため、注意が必要である。必ずスルホサリチル酸法または煮沸法を用いて検出する。また、血清の場合と同様に、治療効果や病勢を把握するために必要な検査である。
・Bence Jones 蛋白の検出および同定
尿蛋白電気泳動法で、β 〜γ 領域にシャープなピークが見られた
場合、Bence Jones 蛋白を疑い、血清の場合と同様に、特異抗血清を用いた電気泳動固定法や免疫電気泳動法により、その構成成分を同定する。
C. 髄液検査アルツハイマー病において、髄液中のタウ蛋白の上昇や、Aβ 蛋
白レベルの低下を ELISA などを用いて証明することが出来るが、病態との関連は議論が分かれる。臨床診断としては、むしろ MRIで他疾患を除外した上での PET による側頭・頭頂連合野での血流量低下といった、画像診断が用いられている。また、アポリポ蛋白
E4 アイソフォームをもつ群で本症の発症率が有意に高いことや、本症患者の髄液中の TTR レベルが低下することも知られている。

100nm
TTR のみ4. BSB のアミロイド形成阻止能
上記のごとく、BSB がアミロイドに親和性を持つことから、本剤がアミロイド表面をマスクし、その形成に阻止的に働く可能性を検討した。TTR を酸性条件下でインキュベーションすると数日後にはアミロイド線維を形成するが、この系に BSB を添加すると。
有意にアミロイド形成が阻止されることが判明した（図 5）5．おわりに
以上、アミロイドーシスの診断および BSB の有用性について述べた。本症は、特異的とされる症状に乏しく、またその病型は多岐にわたるため、原因不明の疾患として取り扱われているケース
が未だに少なくない。従って有用な診断ツールを用い、速やかに確定診断を行ない、早期に治療を開始することが望まれる。FAP
では早期に診断が確定し、肝移植を行なえば症状の進行が停止す
ることが証明されている。さらに研究が進めば、他のアミロイドー
シスにおいても対症療法のみならず、根治療法の道が開けるものと期待される。そのためには、何事もまず本症を疑い、正確に診断することから始めなければならない。
参考文献
1) Ando Y, Nakamura M, Kai H et al., A novel localized amyloidosis associated with lactoferrin in the cornea. Lab. Invest., (2002).
2) 石原徳得：アミロイドーシス シンポジウム難病研究の進歩Ⅶ ,(1997).
3) 安東由喜雄、原岡克樹：アミロイドーシスの診断プロトコル . Medical
Technology 29, 794 (2001).
4) 安東由喜雄、坂下直実、田中由也、安藤正幸 , 原発性アミロイドーシスの症
状 , リウマチ科 , 第 11 巻 第 2 号 ,(1994).
5) Ando Y, Anan I, Suhr O, Holmgren G, et al., Detection of a variant
protein in the hair: A new diagnostic method in familial amyloidotic
polyneuropathy (FAP) (Met30) Br. Med. J., 316, 1500,(1998).
6) Ando Y, Ohlsson PI, Suhr O, et al., A new simple and rapid screening method for variant transthyretin (TTR) related amyloidosis.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, 480,(1996).

著者紹介
氏
名：安東由喜雄（Yukio Ando）
所
属：熊本大学医学部臨床検査医学講座
出身大学：熊本大学医学部（昭和 58 年卒）
学
位：医学博士研究テーマ：アミロイド沈着機構の解析と治療
自律神経疾患の病態解析と治療
趣
味：映画鑑賞・エッセイを書くこと
連 絡 先： 〒 860-8556 熊本市本荘 1 丁目 1 番 1 号
E-mail：yukio@kaiju.medic.kumamoto-u.ac.jp

秋から冬の学会展示ご案内

100nm

下記学会において、試薬新製品の展示を行います。
皆様のご来場をお待ちいたしております。

TTR ＋ BSB

図 5 TTR を pH4.0 でインキュベーションすると上図の如くアミロイドを形成するが、BSB 存在下ではアミロイドの形成が抑制され、断片化する。

・ 日本生化学会第 75 回大会
10 月 15 日（火）〜 17 日（木）・第 25 回日本分子生物学会年会
12 月 11 日（水）〜 14 日（金）国立京都国際会館
パシフィコ横浜

5

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新製品
アミロイド染色用蛍光色素 (1% BSB in DMSO)

BSB solution〈特長〉
1. アミロイドβペプチド(Aβ)に対して高い親和性(Ki ＝ 0.4µmol/l)1)をもつ。
2. 従来の色素に比べ検出感度が高く、抗体による染色と同等の感度を有する。
3. 簡単に染色が可能である。
4. 生細胞のアミロイド染色も可能である。
5. 脂溶性物質で、脳−血液関門(blood-brain barrier)を透過する。

病理切片染色例
アルツハイマー病

A

アミロイドーシスはアミロイドが臓器や組織細胞の外に沈着してこれらの臓器や組織の働きを阻害する病気です。アミロイドーシ
スには、全身の様々な部分にアミロイド沈着が起こる「全身性アミロイドーシス」と一部の臓器のみに沈着が起こる「限局性アミロイドーシス」があります。全身性アミロイドーシスには熊本地方で患者の多い家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)と呼ばれる遺伝性のものがあり、肝臓でアミロイドを作り出し、それBが全身の臓器などに沈着して障害を起こします。発症後 10 年で死に至る難病ですが、現在はドミノ肝移植などの治療により命を落
他にも高齢で非遺伝的に発症とす危険性は少なくなっています2)。
する老人性アミロイドーシスや、透析患者の治療で使用する透析膜では除けないタンパク質が変化したアミロイドが引き起こす透析アミロイドーシス、リウマチで発現するタンパク質が切れて出来るアミロイドによる二次性アミロイドーシスなどがあります。
限局性アミロイドーシスには、アミロイドが脳に蓄積する老人斑(SP)があり、アルツハイマー病の特徴の 1 つです 3)。また、現在問題となっている狂牛病(牛海綿状脳症 , BSE)や新型クロイツフェ
ルト・ヤコブ病(vCJD)も限局性アミロイドーシスの一種です。
BSB は ア ル ツ ハ イ マ ー 病 の 研 究 に お い て 最 初 に 用 い ら れ 、Skovronsky らはアミロイド前駆体タンパク質(APP)を発現する
C
トランスジェニックマウス Tg2576 に BSB を静注し、18 時間後の脳組織の SP に色素が集積していることを確認したと報告しています 1)。
同様にアミロイドが沈着するその他のアミロイドーシスでもBSBを用いた研究が進められており、FAP、透析アミロイドーシスや二次性アミロイドーシスなどの組織染色を行なった結果、アミロイドが沈着した部分を感度よく染色していることが確認されました。また、BSE や vCJD を発症した組織でも同様の結果が得られています。
BSB は、従来の色素に比べ、親和性・検出感度共に高い蛍光色素です。Skovronsky らの結果から in vivo の系での使用も可能であ
画像はアルツハイマー病患者の脳。
(A)は Ab に対する抗体による染色で、褐色ると考えられます。従来の色素では組織染色など in vitro でしか検に染まった部分がアミロイドである。(B)は thioflavin S により、(C) は BSB に出できないものも多く、in vivo の系で沈着アミロイドを検出したより蛍光染色したもので、白く光っている部分がアミロイドである。BSB による報告はありません。今後は安定性や毒性などの研究は必要ですが、 染色の方が薄い老人斑や神経原線維変化の様子を明確に観察することができる。
(BSB 濃度：0.01%)
FAP や BSE を含めたアミロイドーシスの診断・治療などの研究（画像提供：東京大学大学院薬学系研究科臨床薬学 古和久朋先生）へのさらなる応用が期待されます。

6

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FAP

DRA（透析アミロイドーシス）

familial CJD

使用法
サンプルの固定法
エタノール固定もしくはホルマリン固定
操作方法＊本製品は 1% BSB の DMSO 溶液です。
本製品 1 本から、0.01% 濃度の染色液が 10 ml、0.0001% の染色液が 1,000 ml 調製できます。
1. BSB 染色液の調製製品に 50% EtOH を加えて希釈し、0.01 〜 0.0001% の濃度
にする。
2. 染色
・切片を BSB 染色液に 30 分間浸す。
・切片を飽和炭酸リチウム水溶液に浸した後、50% EtOH にて軽く洗う。
3. 観察：UV 光(V 励起) にて観察する。
取扱方法
保存：冷蔵保存（購入後は必要に応じて小分けして保存してください。）
参考文献
1) D. M. Skovronsky, B. Zhang, M.-P. Kung, H. F. Kung, J. Q.
Trojanowski, V. M.-Y. Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 7609
(2000).
2) 安東 由喜雄 , 臨床病理 , 48, 425 (2000).
3) 佐々本 一美 , Dojin News, 97, 11 (2001).

AL amyloydosis

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

BSB solution

100 µl

20,000B525

お知らせ

AA amyloidosis

このたび Home Page に 受託サービス（有機化合物の合成、昇華、精製）と 機能性材料（高純度機能性材料と SAM 関連
試薬）のページがオープンしました。皆様のご利用をお待ちしております。 http://www.dojindo.co.jp/

画像は各種アミロイドーシス患者の組織。左列は Congo Red により染色したもので赤褐色に染まった部分がアミロイドである。右列はBSBで染色したもので、白く光っている部分がアミロイドである。

（画像提供：熊本大学医学部臨床検査医学 安東由喜雄先生）

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ケミストからみた
ポストゲノム4〜タンパク質相互作用の解析法（1）〜
九州大学工学研究院応用化学部門

片

山

佳

樹

1．はじめにゲノム配列が明らかになり、ORF が推定され、遺伝子配列が同定されると、多くの未知遺伝子が発見されてくる。さらに、それらの中から、DNA アレイを用いた遺伝子の発現差解析により疾患などに関連した遺伝子が同定されてくると、それらを用いた創薬などの産業利用が期待される。しかし、実際にはそれら遺伝子の機能が分からなければ、産業利用は困難である。遺伝子の機能とは、それから発現してくるタンパク質の機能であるが、これを調べることは容易ではない。細胞内でのタンパク質の種類は 10 万種ともいわれるが、これらのタンパク質が様々に相互作用しあい、極めて複雑なネットワークを形成しているからである。ゲノム研究の究極の目的も、このタンパク間ネットワークの解明にあるといえる。残念ながらこれを解決する手法はまだ存在しない。しかし、2つのタンパク間あるいはタン
これを解決していく一つの糸口は、
パクとリガンド、DNA 等の相互作用を網羅的に解析していくことである。
タンパク間の相互作用を評価する手法としては、これまで免疫共沈降法 1） や光アフィニティーラベル 2）、架橋剤を用いてタンパ
ク複合体を架橋後クロマトグラフィーで単離するなどの手法があったが、少量の試料では困難であった。近年、これらをハイス
ループットで網羅的に行える手法が様々報告されている。それらは、大きく分けて以下のようなものである。
1）免疫共沈法などの概念の改良法
2）プロテインアレイを用いる手法
3）in vivo で行える手法
4）蛍光エネルギー移動を利用する手法
5）その他
これらの手法には、一長一短があるが、最近、3）に属する手法が注目され、多くの手法が開発されている。これらの手法は、Yeast
Two Hybrid System(Y2H)に代表される手法であり、対象とする

8

2 つのタンパク間の相互作用が、あるタンパクの機能の再構成（回復）を促すことを利用し、相互作用の有無を判定する。今回は、このカテゴリーに属する手法についてご紹介する。

2．Yeast Two Hybrid System(Y2H)
Y2Hは、FieldsとSongにより初めて報告された手法である3,4）。
真核細胞において、遺伝子の転写を制御する転写制御因子は、分子内に標的遺伝子配列に結合する DNA 結合ドメイン(DBD)と転写を活性化するドメイン(AD)が機能的に独立に存在する。これを利用したのが Y2H であり、酵母の転写活性化因子である GAL4 の
DBD と AD をそれぞれ、調べたい 2 種類のタンパク（Prey と Bait）と結合したキメラタンパクを発現する遺伝子を設計し、酵母で発現する。もし、発現した 2 種類のタンパクが相互作用すれば、各々に結合した DBD と AD が再び近傍に配置され、GAL4 の転写活性化能が回復する。酵母内に、β - ガラクトシダーゼ等の遺伝子を
GAL4 プロモーター下流に組み込んだレポーター遺伝子を導入しておくと、回復した GAL4 活性により、レポーター遺伝子が発現し、その酵素活性を発色基質などで計測すると、タンパク間の相。
互作用の有無が判定できる（Fig.1a)）
この手法は、感度が高く、タンパクが精製あるいは同定できていなくとも、遺伝子さえ手に入れば評価可能であり、ゲノム研究向きである。最近、これを用いたハイスループット手法により、6000種の酵母遺伝子ライブラリを用いて相互作用のマップを作成
千種を超えるタンパク間の相互作用を網羅的に解析すするなど5）、
る試みがなされている 6）。ただし、Y2H には欠点もある。例えば、相互作用は細胞核内で、しかも転写装置の近傍で起こらねばならず、細胞質や特に細胞膜のタンパクには不向きである。タンパク
自身が転写活性を持つ場合も正確な評価ができない。また、哺乳類のタンパクを酵母内でアッセイすると、正確なタンパクの折り畳みができなかったり、翻訳後修飾がなされなかったり、他の会合に必要な因子が存在しないなどの理由で、実際には相互作用す
るにもかかわらず、酵母内では相互作用しない場合がある。調べ
たいタンパクがホモダイマーを形成する場合も、ヘテロダイマーに競合して、相互作用が同定されない可能性がある（Fig.1b)）7）。
加えて、本手法は感度が高い反面、擬陽性が極めて出易く、実際には相互作用の判定はかなり困難である。

3．Y2H の欠点を解決する種々の手法
3-1：酵母以外での Two Hybrid System
前述したように、酵母内で哺乳類タンパクを発現した場合、実際の相互作用が再現できない場合がある。また、そのタンパクが酵母にとって毒性を有する場合もある。したがって、哺乳類由来のタンパクを調べる場合は、 Two Hybrid System は、哺乳類細胞で行うことが理想的である。しかしながら、一般的には哺乳類細胞への遺伝子の導入効率は、酵母に比して低く、手間がかかる。
遺伝子が導入された細胞を選別する場合、成長促進遺伝子や細胞表面抗原を用いると、より強い相互作用の組み合わせばかりが同定されてきたりする8,9）。Shiodaらは、EBウイルス核抗原(EBNA)を発現したサルの腎臓上皮細胞株を用い、レポーター遺伝子として蛍光タンパクであるGFPを染色体内に組み込むことで安定化しNews No.104(2002)

a)

b)
Prey
Bait

Prey

AD

Bait

DBD
Binding site

c)

OriP
Bait

Prey

GAL4DBDADGAL4BE

TATA

Prey AD

Reporter genee)d)Membrane localization factor
Cellular mambrane

Adenylate cyclase
T25

T18
CAP

ATP

c AMP

Ras or hSos
cAMP/CAP dependent
promoterFig.1 Schematic outlines of Two hybrid systemsa) Yeast Two Hybrid System, b) effect of homodimer-forming in bait or prey in Y2H, c) two hybrid system in mammalian cell,d) protein recruitment system using Ras(RRS) or hSos(SRS), e) two hybrid system in bacterial cell

た系を用いている 10）。この細胞では、EBNA 存在下で遺伝子複製開始配列(OriP 配列)を有するプラスミドは、比較的低コピーで染色体外に安定に保たれ、転写できる。これを利用し、このプラス
ミドに Prey − AD 融合タンパクを組み込み、哺乳類での発現効率を保障している（Fig.1c)）。彼らはこの系の有用性を、Bait として Smad4 、 Prey としてメラノサイト特異的転写活性化因子(MSG1)を用いて検討している。Smad4 と MSG1 は、TGF-β 依
存性に相互作用するが、酵母中では相互作用しないため Y2H では陽性とならない。 Smad4 を GAL4DBD と融合した遺伝子と、
M S G 1 をコードした遺伝子を共にトランスフェクトすると、
TGF-β 依存性に、GFP の発現が認められている。
これとは別に、Ras-GEF（GTP 交換因子）である hSos が細胞膜にリクルートされて活性化することを利用したSRSシステムも報告されている(Fig.1d)) 11-13）。すなわち、Bait タンパクを Sos と結合しておき、パートナー(Prey)を v-Src ミリストイル化などの膜局在シグナルと結合しておくと、Prey と Bait が相互作用する場
合に Sos が膜にリクルートされて活性化する。このシステムを温度感受性 Cdc25 株（Cdc は、酵母の Ras-GEF）に用いると、対象タンパクが相互作用する場合に限り、Cdc25 が失活する温度で、哺乳類 hSos が活性化して生存することでモニターできる。RasGEF 欠失哺乳類細胞などを用いれば、このシステムは哺乳類細胞でも用いることができる。ただし、Sos は大きいタンパクであるた
め、結合する調べたいタンパクが小さい場合に制限がある。また、Bait の 30％が Sos と結合すると Prey が無くとも陽性を与えるな
どの欠点がある。これを解決するため、より小さいタンパクである
哺乳類 Ras を用いるシステム(RRS)も報告されている 14,15）。この

Rasの膜局在化に必要なファルネシル化部位を除いた物を用場合、い、これに Bait を結合した遺伝子を、前述の Sos の代わりに導入する。Ras 活性化の膜局在要求性は、Sos よりずっと厳密であり、擬陽性の確率は大きく低減できる。
哺乳類細胞ではなく、バクテリア（原核細胞）で Two Hybrid
System を行うと、別の意味でメリットがある。バクテリアは、増殖速度が大きく、遺伝子導入効率も高い。また、多くの分子生物学的手法は、バクテリアで最適化されている。Karimova らは、大腸菌のカルモデュリン依存性アデニル酸シクラーゼを1~224番目
までのアミノ酸配列断片(T25)と225~399番目までのアミノ酸配列断片(T18)に分け、これにそれぞれ Prey と Bait を融合し、それらが相互作用するとき、アデニル酸シクラーゼ活性が回復するようにした 16, 17）。これによりサイクリック AMP が合成されてく
ると、CAP(サイクリックAMP結合タンパク)依存性プロモーター
支配下のレポーター遺伝子（β―ガラクトシダーゼ）が発現する(Fig.1e))。これを p −ニトロフェニルリン酸などの発色基質で検出する。これは、Y2H の変法というよりは、むしろ次項で述べる
タンパク再構成アッセイ（Protein complementation assay）であるが、Y2H のバクテリア版として評価されている。レポーター遺伝子の下流に抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおくと、簡単にセレクションできる。また、タンパク間相互作用が Y2H の様に核内で起きる必要がないため、細胞内で起きる相互作用にも用いることができる。また、サイクリック AMP を仲介することで、シグナルが増幅されるメリットも考えられる。真核細胞のタンパクに可能と報告されているが、もちろん翻訳後修飾などの問題で、ある程度の制限はあると考えられる。

9

News No.104(2002)

3-2：タンパク再構成アッセイ（Protein Complementation
Assay, PCA）
これは、酵素などを 2 つの断片に分解し、各々を Prey と Bait に融合して、これらが相互作用した場合、元のタンパクが再構成され、活性が回復することを利用して相互作用を同定するものである。Y2H に比べ、ホスト特異的なプロセスや酵素が必要なく、利用できる細胞のタイプに制限が少ない。またタンパク間相互作用
が、核内で起こる必要がない。さらに、タンパクの再構成を見る
ので、Prey と Bait に結合する断片の方向が重要で、これを利用す
れば、調べたタンパク間相互作用の方向性も評価できるなどの利
点がある。

a)

rapamycin

FKBP

FRB

Fragment of a protein Reconstitution of
the protein(DHFR or β-Gal)b)
X

3-2-1：Prey と Bait の相互作用で直接タンパクを再構成するタイプ（Fig.2a)）
これは、最もシンプルな系で、Prey と Bait の相互作用により、各々と結合したタンパク断片が接近して元のタンパクを再構成するものである。タンパクとしては、ジヒドロ葉酸レセプター(DHFR) 18）やβ―ガラクトシダーゼ(β-Gal) 19）を用いる例がある。
DHFR を用いる例では、107 番目のアミノ酸で切断した 2 つの断片 F[1,2]と F[3]に分けて用いる。これに結合する Prey と Bait
としては、2 量化するロイシンジッパーや、p21Ras と Raf の Ras
結合ドメイン、FK506 結合タンパク(FKBP)と酵母ラパマイシン
標的タンパク(TOR2)のラパマイシン依存性結合、Epo レセプター
タンパクなどが報告されている 20）。検出としては、DHFR 欠損株
での細胞の生存（タンパクが相互作用して DHFR が再構成されないと細胞は死滅）やフルオレセイン標識メトトレキセート(fMTX)の DHFR への結合を利用した蛍光法が用いられる 20）。細胞の生存で見る場合、バクテリアでアッセイすれば、DHFR を欠損させな
くても、これを阻害するトリメトロプリムで処理するとよい。哺乳類の DHFR は、この薬剤に対し 1200 分の 1 の親和力しかないため、影響を受けずにアッセイできる。また fMTX を用いる場合、
THFR に結合しない場合、細胞から迅速に排除され、また、結合したものは蛍光量子収率が 4.5 倍向上するので、感度良く DHFR の再構成がモニターできる。この手法の利点は、蛍光強度から結合した MTX を定量できるので、タンパク間相互作用の Kd 値や、それに影響する薬剤の能力を定量的に評価できる点である。
β-Gal を用いる手法では、11~41 番目のアミノ酸を欠損させた
Δαと始めの 788 アミノ酸部分であるΔωの 2 つの断片を用いる。
この 2 つの断片自身の会合能力は低く、各々に結合した Prey とBait の相互作用に依存している。FKBP12 とラパマイシン依存性に FKBP と結合する FRAP を用いた例がある 19）。
これらの手法は、対象とするタンパクや用いる細胞に制限が少なく、相互作用を直接評価できるのが利点だが、擬陽性が多いとも言われている。

3-2-2：タンパクの再構成と共にレポータータンパクの切断を介在させる方法
単純に、対象タンパクの相互作用が、それらに結合するレポー
タータンパクの再構成を促すのではなく、相互作用に伴いレポー
タータンパクが切断されてくるタイプもある。まず、Johnsson らは、ユビキチンを用いた系を報告している(Fig.2b)) 21）。ユビキチ
ンは 76 アミノ酸からなる小さなタンパクで、プロテアソームを介

10Y

Reconstitution ofubiquitin
Cleavagewith UBPc)XYLuciferase or EGFP
splicing
Reconstitution of intein

Fig.2 Schematic outline of protein-fragment complementation assaya) Original protein-fragment complementation assayb) Split ubiquitin assayc) Split enzyme reconstitution based on protein splicing

する不要タンパクの分解に関係する。真核細胞では、ユビキチン
がタンパクに結合すると、ユビキチン結合タンパク(UBP)により、迅速にユビキチン−タンパク結合部位で切断される活性がある。
ただし、このためにはユビキチンが正確にフォールディングされている必要がある 22）。そこで、ユビキチンを N 末端 1~37 残基(Nub)と C 末端 36~76 残基(Cub)に分割し、Nub の C 末端と NubのN末端にそれぞれ対象とするタンパクをリンカー介して結合し、さらに Cub の C 末端には DHFR などのレポータータンパクを結合する。もし、対象タンパクが相互作用すると、互いに接近する
ユビキチンが正しい折り畳みを起こし、UBP により結合している
レポータータンパクが切断される。この切断を電気泳動などで確認する。この手法では、Cub に結合しておくレポータータンパクの種類をいくつか用意しておくと、これにそれぞれ異なるタンパ
クを結合させることにより、どのタンパクがどのくらい切断されてくるかで、Nub に結合したタンパクとの相互作用の強さを比較することもできる。ただし、切断前後でレポータータンパクの機能が変化するわけではないので、切断は電気泳動などでアッセイせねばならず煩雑さが伴う。
これに対し、Umezawa らは、タンパクスプライシングを利用した手法を報告している 23, 24）。これは酵母の発生期の翻訳産物かNews No.104(2002)

ら内部のタンパク(Intein) が正確に切り出され、その両側（外側の）2 つのタンパク断片（Extein）がライゲーションされる現象を利用したものである。すなわち、この Intein を 2 つに分割し、それぞれに Extein を結合し、他方の末端に Prey と Bait を結合すると、それらが相互作用した場合、2 つの Intein 由来の断片が接近し、元の形にフォールディングされることにより、スプライシン
グ活性が回復し、 Extein がライゲートされ切り出される。このExtein にレポータータンパクの断片を用いると、これによりレポータータンパクが再構成され、その回復した酵素活性などの機能によりタンパク間相互作用が評価できる(Fig.2(c)) 。彼らはまず、120kDa の VMA1 翻訳産物の Intein である 50kDa エンドヌ
クレアーゼ(VDE)を 128 番目のアミノ酸で 2 つの断片に分けたものに、蛍光タンパクである EGFP を 2 つに分割した断片を Extein
として結合し、反対側に調べたいタンパクをそれぞれ結合した23）。
モデル系としてカルモデュリンとそれに結合するM13ペプチドを結合したところ、大腸菌内でのその相互作用に基づき EGFP 由来の蛍光の増大が見られる。この手法は、酵素基質などが要らないなどの利点があるが、哺乳類細胞では感度が足りなかった。そこ
で、Intein として酵母の DnaE タンパクを用い、レポーターとしてルシフェラーゼを用いて同様のシステムを構成することで、この問題を解決している24）。モデル系として、インスリンレセプター
基質 1(IRS-1)とそのターゲットである PI-3 キナーゼの SH2 ドメ
インを用い、そのインスリン依存性の結合を CHO-HIR 細胞内で評価し、その有用性を報告している。ただし、実際にインスリン刺激により IRS-1 がリン酸化されていると考えられる時間より、
本アッセイでIRS-1とSH2ドメインの相互作用が確認できるには長い時間が必要で、また、他のインスリン非依存性リン酸化によるバックグラウンド増加などいくつかの改善されるべき問題もあるが、薬物やアゴニストのスクリーニングなどにも使える可能性があり、興味深い。

4．タンパク間相互作用以外への応用
これまでの手法は、いずれも Prey と Bait の相互作用が、別のタンパクの何らかの機能の変化を引き起こすものであるが、これを応用すると、タンパク間の相互作用以外のアッセイにも適用できる。

4 - 1 ：D N A −タンパク相互作用評価法（ O n e H y b r i d
System）(Fig.3a))
標的 DNA 配列に結合するタンパクを、ライブラリーから探索したり、逆にあるタンパクが結合する DNA 配列を探したりする場
合、対象タンパクに転写活性化ドメイン(AD) を結合し、レポーター遺伝子の上流に調べたい DNA 配列を結合しておくと、これが対象タンパクと結合した場合のみ、レポーター遺伝子の発現が起こり、容易にアッセイできる 25, 26）。Wang らは、このシステムを用い、嗅覚細胞特異的な遺伝子の発現スイッチに関係する転写活性化因子 Olf-1 を発見している 26）。また、Pabo らは、バクテリア
で DNA 結合性 Zn フィンガータンパクのターゲット DNA 結合配列をこのシステムを利用してデザインしている 25）。

4-2 ：タンパクー小分子相互作用評価法（ Three Hybrid
System）（Fig.3b)）

a)
AD
DBD
Binding site

Reporter gene

Receptor for
ligand A

Receptor for ligand B

b)

A

B

AD

DBD
Binding sitec)

Reporter gene

RNA
A

B

AD

DBD
Binding site

Reporter geneFig.3 Schematic outlines of one- and three-hybrid assaya) One hybrid assay for detecting DNA-protein interactionb) Three hybrid assay for detecting protein-ligand interactionc) Three hybrid assay for detecting protein-RNA interaction

前述の β-Gal や DHFR 再構成を利用する PAC 法では、ラパマ
イシン依存性の FKBP と FRAP の結合が用いられたし、タンパク
スプライシングを用いる方法では、インスリン依存性の IRS-1 とSH2 ドメインの結合がアッセイされている。これらは見方を変えれば、ラパマイシンやインスリン類似物質やアゴニストの標的タ
ンパク結合のアッセイにも用いることができる。この考え方をさらに発展させたのが、Three Hybrid System である 27-32）。このシ
ステムでは、レポーター遺伝子の上流の配列に結合する DNA 結合
ドメイン(DBD)とリガンド A のレセプターを結合した Hook、リガンド B のレセプターを転写活性化ドメイン ( A D ) と結合した
Fish、リガンド A と B を化学的に結合した人工リガンド(Bait)を用いる。Hook と Fish をコードする遺伝子を細胞に導入し、人工リガンドを細胞内に投与すると、リガンドとそれぞれのレセプ
ターの結合により、DBD と AD が近傍に固定され、レポーター遺伝子の発現が起こる。ここで、例えばリガンド A と Hook 内のレセプターは既知の強力に結合するものを用いると、人工リガンドの B に相当する部分をコンビケムなどで種々合成して、Fish 内のレセプター B に結合するリガンド分子を探索できる。逆に、リガ
ンド A にリンクしたリガンド B に結合するタンパクをライブラ
リーからスクリーニングすることも可能である。このシステムは、

11News No.104(2002)

初めに FK506 ダイマーをリガンドとして報告された27）が、Licitraと Liu は、Hook 側のレセプター A にグルココルチコイドレセプ
ターのリガンド結合ドメイン、Fish 側のレセプター B に FK506
結合タンパク(FKBP12)を用い、人工リガンドとしてデキサメタ
ゾンと FK506 を化学的に結合した分子を合成して、この系の有用性を示し、既知薬物の細胞内ターゲットの同定に使えると主張している 28）。実際、Jurkat T 細胞ライブラリーで FK506 に結合するタンパクの同定を行い、ヒト FKBP12 の 2 種類のバリアントを
3 週間で見出している。既存の手法では、1 年以上かかるという。
ただし、元からある FKBP の競合により、会合能力の強いものしか見つからない問題もある。また、人工リガンドは、この例のよ
うに疎水性のものはよいが、親水性のリガンドでは酵母の細胞内に透過しないという問題もある。それでも、同様の系を用いて
FK506 合成アナログの性能評価やデキサメタゾンとメトトレキ
セートを結合したリガンドを用いたシステム、ラパマイシンとFK506結合リガンドを用いて、Fish に結合したラパマイシン会合
タンパクに種々の変異を導入してのラパマイシンに高選択的なミュータントのスクリーニングの試みなどが報告されている 29）。

4-3 ：RNA- タンパク相互作用の評価法 (Three Hybrid
System)(Fig.3c))
RNA- タンパク間相互作用の評価は、RNA- タンパク融合体がin vivo で合成できないので、 Y2H の直接の応用は難しいが、Three Hybrid System を利用することで解決できる 33）。すなわ
ち、前述の系で人工リガンドの部分に RNA分子を用いる。その際、RNA の半分は、既知タンパクに結合する配列を用い、もう半分に調べたい配列を結合する。すると、その部分が Fish のタンパクと結合した場合にだけ、レポーター遺伝子の発現が見られる。例えばこの系を利用して、線虫の 3’-fem-3 遺伝子の非翻訳領域に結合して精子/卵子のスイッチを仲介するタンパクの探索などが行われている 34）。

5．おわりに以上、遺伝子を用いて細胞内(in vivo)でタンパク間やタンパク−リガンドなどの相互作用を評価できる手法について概説した。
これらの手法は、いずれもタンパクが同定されなくても遺伝子さえ取得できれば評価に供することができ、迅速性、感度、ハイス
ループット化などの点で、既存の手法よりも優れている。しかし、系によって、擬陽性の出易さ、利用できる細胞のタイプ、利用できるタンパクのタイプなどに制限があるなど、それぞれ長所と短所がある。にもかかわらず、これらの使い分けをして、ハイスルー
プットの網羅的解析系にもっていけば、今後、タンパク機能の解明、未知タンパクや未知リガンド、新薬や遺伝子配列の探索に大きな力を発揮するものと期待できる。次回は、これらの手法以外のタンパク相互作用の評価法についてご紹介する。

12

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News No.104(2002)

Topics on Chemistry
遺伝子治療用ベクターとしてのナノ粒子（株）同仁化学研究所

佐々本

一美

細胞に遺伝子を導入するにはベクターと呼ばれる運び屋を用い
Hood ら は、インテグリンのアンタゴニストを表面に有するカ。αvβ3 を認識するアるのが一般的だが、これにはウィルスを用いる方法と、そうでな
チオン性のナノ粒子をベクターとした（図 2）
ンタゴニスト部分はタウリンより７ステップで合成できる。 こ
い方法の 2 通りがある。前者はウィルスの扱いに慣れてないとできないし、病原性の問題も依然として課題である。それに比べ非のアンタゴニストを 3 個結合したジアセチレン含有脂質と、フォ
スファチジルコリン骨格を有するジアセチレン含有脂質、およびウィルス法は導入効率は劣るが、安全かつ操作が簡便であるとい
カチオン性脂質の３者を混合し、得られたベシクルを光照射にう利点を持っている。近年、脂質系リポソームや合成ペプチドによって高分子化すると 40 nm 前後の粒径のカチオン性ナノ粒子
代表される非ウィルス系遺伝子導入試薬が各社から市販されるよ
うになり、種々の培養細胞への導入効率も飛躍的に向上している。 （α vβ 3 -NP ）が得られる。導入する遺伝子はシグナル伝達経路のµRaf に注目し、この変異体（ATP -Raf）の cDNA を選択した。
遺伝子を核まで効率よく運ぶには、細胞表面への取りつき、細胞
Raf の働きを抑えることで血管新生を抑制することができる。実内でのエンドソームから細胞質への移行、ベクターからの離脱、細際、この αvβ3-NP と DNA の複合体（αvβ3-NP/Raf(-)）を坦癌マ
胞質から核への移行など、ちょっと考えただけでも多くの障害をウスに静注したところ、大腸癌（CT-26）の肺および肝転移巣の乗り越えなければならない。さらに治療に用いる場合、体内の特顕著な退縮が見られた。
定の細胞だけを狙ったターゲティングが重要になる。核にたどり着くには気が遠くなりそうな生物学的な距離だが、鍵を握るのはIntegrin Antagonist(=R)
やはりベクターの選択である。
1)

O

ここに紹介するのは、転移性癌の遺伝子治療にむけたベクターの開発である。癌は依然として人類に対して大きな脅威だが、転移さえしなければその脅威もさほどでもない。転移した癌に対する確立した治療法がない現在、遺伝子治療は多くの期待を集めている。そもそも癌の転移は、原発巣から離脱し、細胞外マトリッ
クスと呼ばれる周辺組織に浸潤し、血管（血行性）もしくはリン
パ管（リンパ行性）に進入、さらに遠隔組織に接着し、再び増殖するといった長い旅の結果である。癌細胞はその増殖を支えるた
めに、VEGF, bFGF といった血管新生因子を産生し、盛んに血管新生を促している。これらの因子に刺激された血管の内皮細胞は血管外に移動し、新たに血管を形成する。したがってこの過程をブロックすると、癌への栄養や酸素供給が絶たれ、いわゆる兵糧攻めの状態となる。血管新生の際には、血管内皮細胞の表面に癌細胞からの刺激を受けるための特殊なタンパク質が高発現しているが、代表的なものがインテグリン・ファミリーの一つ αvβ3 であ。
る（図 1）
血管新生因子DNA(Raf-1 mutant )（VEGF, bFGF）

ανβ3-NP/Raf(-)

インテグリン（ανβ3）

細胞外マトリックス

NH

NHR

CO2H

N

O
HN SO2

HN

O

HN
O

N
H
N
H

N
N

O

H
N

O

H
N

O

O

O
N

RHN

O

O

N
H

O

N
H
O

O
O P O
O-

O
+

(CH3)3N

x

O
O
O

O
+

O

(CH3)3N
O
O

図2

z

n

ανβ3-NP の構造

遺伝子治療において遺伝子を in vivo に導入する場合、特定の細胞だけに導入する細胞ターゲティングの技術が必須である。そのため、既存の DNA ベクターを糖などで修飾し、レセプターを介して導入する試みも盛んに行われている。今回ベクターとして用いたナノ粒子は、粒子サイズが 40 nm 前後と比較的小さく、表面荷電も多いため（ゼータ電位 35 mV）、 DNA との結合性も高いと思われる。多価のインテグリン・アンタゴニストにより効率的なターゲティングが達成され、さらに αvβ3 レセプターとの結合によって internalization が促進されている。このナノ粒子は抗原性も低く、転移性癌の治療法としての臨床応用が期待される。

血管内皮細胞(internalization)
Ras

DNA

ATPµ-Raf

Raf
（抑制）

参考文献
1) J. D. Hood, M. Bednarski, R. Frausto, S. Guccione, R. A. Reisfeld,
R. Xiang and D. A. Cheresh, Science, 296, 2404 (2002).

MEK
ERK
血管新生

図1

ανβ3-NP/Raf(-)の血管新生抑制機構

13News No.104(2002)

Q＆A
DNA の塩基損傷部位検出キット
修飾後の AP 部位は安定ですので、抽出後の速やかな ARP
処理をおすすめします。

-Nucleostain-

DNA Damage Quantification Kit –AP Site CountingDNA は紫外線や化学物質、生体内の活性酸素などにより損傷を受ける。この損傷が正しく修復されないと突然変異を誘発し、癌や老化の原因ともなる。DNA 損傷の修復機構の一つに塩基除去修復があり、この時 AP site と呼ばれる塩基除去部位が出現する。この AP site の検出は DNA の損傷部位を測定し得る有効な方法である。
このキットは AP site と特異的に結合する ARP によるビオチン化を行ない、検体 DNA 中の AP site を簡便に定量できる。

Q6
A6

洗浄用 PBST の保存方法が室温になっていますが、安定性はどの程度でしょうか？
室温で半年以上持ち、かなり安定です。長期保存すると白い濁りが出てくる場合がありますが、測定には影響はありません。冷蔵保存の場合は沈殿が出てくる可能性があります。

Q1

DNA Damage Quantification Kit に含まれる ARP 溶液のA1

濃度はどれくらいですか？
ARP solution： ARP 5 mg/1.5 ml H2O になっています。

標準 DNA の長さはどのくらいですか？
キットに用いている標準 DNA はウシ胸腺 DNA を精製したもので、長さは大体 20 kbp 程度です。
文献に従い AP buffer(pH 5.0 のクエン酸バッファー）中で一定時間熱処理を行って生じさせています。

Q2

DNA 固定用にアミノプレートとして ELISA 用プレートア

Detection of Abasic Sites in DNA, Biochemistry, 32, 8276 (1993).

Q7
A7

H.Ide,et.al.,Synthesis and Damage Specificity of Novel Probe for

A2

ミノを用意したのですが、使用出来るでしょうか？
基本的には大丈夫です。実際にアミノプレートを用いて AP
サイトの検出を行っている例があります。ただし、BSA 等
によるブロッキングが必要になってくるかもしれません

Q8
A8

A.Kanazawa et al., Cancer Letters, 156, 51 (2000).
K.Kubo et al., Biochemistry, 31, 3703 (1992).

Q3
A3

Filtration tube の分画分子量はどのくらいですか？
キットの中に入っているチューブの分画分子量は30Kです。

Q4

DNA の精製度が 1.8 以上を推奨されていますが、1.5 程度

A4でも測定は可能ですか？
1.5 では確認していませんので、保証は出来ません。1.6 〜
1.7 の DNA で測定した結果、大きなバラツキは見られてませんでした。推奨として 1.8 としています。
精製度が低いということは、タンパクの混入が考えられると思います。タンパクはブロッキング作用を持ち、DNA がプレートに吸着するのを妨げる可能性があります。

品名40 AP sites/100,000 以上の standard solution を作成することが出来ますか？
弊社では 50 AP sites/100,000 までの ARP-DNA を調製したことはありますが、それ以上はありません。キットのスタ
ンダード DNA は 0 〜 40 AP sites/100,000 です。
理論的にはそれ以上のARP-DNAを調製することは可能です
が、検量線の直線性がどこまで保持されるか保証できません。
高いレベルの塩基傷害を検出するには、サンプル DNA を同じ濃度の傷害のない DNA、つまり 0 ARP-DNA でキットの測定レンジに希釈してアッセイを行い、その後に実際の AP数を換算して求める方法がよいのではないかと思います。
容量

価格（￥）

和光コード

メーカーコード-Nucleostain-

DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting5 samples
21,000
DK02
ARP
10 mg
18,000340-07611
A305
販売中止予定のご案内

Q5
A5

14

抽出したDNAをARP化せずに保存することは可能ですか？
溶液状態での保存はAP siteが増えてくるので注意が必要です（冷蔵、冷凍の両方）。
エタノール沈殿を行い、ペレット状にして冷凍保存して下さい。
A P 部位は確かに切断が起こりやすい部位です。ただcaralist freeの状態で保存されていれば、3' 側に切断があっても ARP の検出には支障ありません。むしろ抽出 DNA が凍結状態以外の環境下で保存されていた場合、自然に起こる脱塩基によって形成されたAP部位の問題の方が重要になります。この場合、サンプルに同一条件下で保存されていた
標準 DNA が含まれる場合は補正が可能になります。ARP

2002 年 12 月 20 日をもちまして、下記商品の販売を勝手ながら中止させていただきます。
このたび本製品に原料として用いております非イオン性界面活性剤が、環境ホルモン物質に指定されました。それに伴い、購入メーカーより販売中止の連絡を受けたのが販売中止の理由です。
ご不明な点、詳細につきましては小社マーケティング部まで
お問い合わせください。
品名
容量
和光コード
メーカーコード
Scintisol 500
Scintisol EX-H

500 ml
3.8 L

344-03915
348-04013

SC08
SC09

News No.104(2002)

Q＆A
酸化ストレスマーカー - 尿中 Biopyrrins 測定キット
原抗体反応を示す」ということを示しています。
従って、抗体に対するビリルビンの反応性と Biopyrrin の反応性に差があれば、当然その分だけ実際の 1 µmol/l からはずれると考えられます。その差がどの程度のものであるか
は今のところ分かっていません。また、Biopyrrins は、ビ
リルビン分解物の混合物であり、それぞれの物質について
反応性の差はあると思われますが、確認はされていません。

Biopyrrin EIA Kit
Biopyrrins の尿中排泄量は、生体内の酸化的状態を反映すると考えられ、ストレスマーカーとしても報告されています。
inhibition
このキットは抗ビリルビンモノクローナル抗体を使用し、
ELISA により尿中 Biopyrrins を簡便に測定できます。

Q1

A1

Q2
A2

Biopyrrin EIA Kit は尿をサンプルとして測定しますが、尿の種類（早朝尿、2 番尿、蓄尿など）はどれを使用するのがよいのでしょうか？
一般論としては「早朝第一尿」を用いるのが普通です。しかし、実際のところ早朝第一尿の採取は困難なため、随時尿を用いている例が多く見られます。
蓄尿も出来れば良いのですが「サンプリング後すぐに遮光凍結」することが難しいので用いられません。
尿採取にあたって添加剤（抗酸化剤等）は必要でしょうか？
抗酸化物の添加は行わず、「採取後、すぐに遮光凍結する」よ
うにして下さい。Biopyrrins は 1 種類の物質ではなく、ビリルビンの分解物の物質群です。そこに含まれる物質には安定なものと不安定なものがあると考えられています。特に高値の検体で不安定な場合が多く、経時的に値の低下のみられる場合があります。しかし、抗酸化物を添加するだけ
では、その分解を止めることは難しいと考えます。

本キットで測定されるものから、ビリルビンのみを除外できますか？
ビリルビンだけ除外する方法は、いまのところ確立されていません。サンプル中にビリルビンがあれば、反応し、正誤差を生じてしまいます。

Q5
A5

第 2 反応停止液を加えなくても問題無いでしょうか？
これを入れないと反応が進行しますので、データのばらつ
きが生じます。データのばらつきを押さえる意味でも各
ウェルの反応時間を正確にあわせて入れて下さい。

Q6
A6

参考文献
1) Yamaguchi T., et al., Bilirubin oxidation provoked by endotoxin treatment is suppressed by feeding ascorbic acid in a rat mutant unable
to synthesize ascorbic acid, Eur. J. Biochem., 245, 233 (1997).
2) 山口登喜夫、杉本昭子、酸化ストレスと生体防御機構一バイオピリンを含

Q3

A3

Q4
A4

マウスやラットなどの血中の Biopyrrins の測定は可能でしょうか？また細胞培養上清中の Biopyrrins は出来ますか？
本キットはヒトの尿中 Biopyrrins を測定する事を前提として開発されていますので、動物での応用が可能かどうかの検討はされておりません。
血清サンプルにおいては、ビリルビンとも反応します。
Biopyrrin EIA Kitの原形ともいえる方法では、数報の論文が出されていますが、キットを使用して培養上清の測定を検討した際に、定量性に不具合がみられることもありました。
ヒト尿サンプル以外での測定を検討される際は、お問い合
わせください。
本キットで測定したBiopyrrin量を濃度表示で表すことは可能でしょうか？（例えば µmol/l のような表記法）
厳密な意味では、µmol/l のような濃度表記で表すことはできません。ただし、本キットの試薬の設定は、原法の 1µmol/l のものが 1 u/l になるようにしてありますので、u/lを µmol/l と記載している論文もあります。
しかし、ここでいう 1 µmol/l は、Biopyrrins がサンプル中にそのモル数含まれているということを必ずしも示しているのではなく、試薬に使われている抗体に対して、サンプル
中の Biopyrrins が「1µmol/l のビリルビンと同じ強さの抗めて、臨床検査、45, 237 (2001).

3) Yamaguchi T., et al., psychological stress increases bilirubin metabolites in human urine, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293, 517(2002).

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

Biopyrrin EIA Kit
1set
100,000
Anti-Bilirubin Antibody(24G7)
200 µg/200 µl
50,0001 mg/ml
200,000

B433
A420
A420

（メーカー：株式会社シノテスト）

15

News No.104(2002)

近日発売予定HTS 用細胞内カルシウムイオン測定用試薬キット
間インキュベートする。

Calcium Screening Kit II
Calcium Custom Screening Kit

6． FDSS にて、薬剤刺激による蛍光強度変化を測定する。

＜特長＞
・ 測定系に応じた最適条件が設定可能である。
・ 細胞洗浄の必要がなく、ウェルに直接試薬溶液を添加できる。
・ 96well, 384well の両方のマイクロプレートに対応。
・ シャープなシグナル応答が得られる。
＜キット内容＞
Calcium Screening Kit II (Fura 2, type A)・ Fura 2-AM
・ DMSO・ Hanks’ HEPES Buffer
・ Quenching Buffer A
・ Probenecid
・ Pluronic F-127
・ Cremophor EL

1 mg × 1 本
2 ml × 1 本
1本
2本
1本
1本
1本

* Fluo 3タイプのキットには、Fura 2-AMの代わりにFluo 3-AM
1 mg × 1 本が含まれます。
* type Bのキットには、Quenching Buffer Aの代わりにQuenching Buffer B が含まれます。
* 発売時までに、仕様が一部変更になる可能性がございます。
本キットは、細胞内カルシウムイオン測定試薬である Fluo 3AM または Fura 2-AM と、その測定に必要なバッファー等を組み込んだ High-Throughput Screening (HTS)用キットで、先に発売された Calcium Screening Kit の改良タイプです。細胞種や添加する薬剤などに応じて、Pluronic F-127 またはCremophor EL（Fluo 3-AM または Fura 2-AM の溶解補助剤）、Probenecid（陰イオントランスポーターの阻害剤）の各濃度を任意に設定することが可能となりました。
1 キットで 2,000 アッセイ（96 穴プレート 20 枚分）の測定が可能です。
＜使用法＞ （96 穴マイクロプレート 10 枚を処理する場合）
1．マイクロプレートで細胞を培養する（培地 100 µl/well）。
2． Fluo 3-AM または Fura 2-AM 1 mg を添付の DMSO 1ml で溶解する。

3． Quenching Buffer 1 本（50 ml）に、10x Hanks HEPES
Buffer 5 mlまた測定条件に応じて任意の量のPluronic F-127
またはCremophor EL, Probenecidを添加して純水で全量を100 ml とする。
4. これに Fluo 3-AM または Fura2-AM の DMSO 溶液を半量(500 µl)添加して、Loading Buffer とする。(DMSO 溶液 1 ml
から 500 µl × 2 を分取することが困難な場合、予め添加する
DMSO を 50 µl 程度過剰に加えて溶解して下さい）。
5．培地に 100 µl/well の Loading Buffer を添加し、37℃で 1 時

16［trial version のご案内］
測定条件に応じて最適なQuenching Bufferを選んでいただける
ように、Calcium Screening Kit II (Fluo 3, trial version) と Calcium Screening Kit II (Fura 2, trial version) をご用意致しました。これらのキットには、2 種類の Quenching Buffer が組み込まれております。Quenching Buffer には、細胞外に存在する Fluo
3またはFura 2の蛍光を消去するための試薬が入っております。細
胞種や添加する薬剤などの測定条件によっては、「レスポンスが低い」「リガンドとの相互作用がある」などの問題が生じる可能性がありますので、各々の Quenching Buffer でアッセイを行ない、2種類のうちから、最適な結果が得られる Quenching Bufferをお選
びください。各 Quenching Buffer 1 本で 100 アッセイ（96 穴プ
レート 1 枚分）が測定可能です。
［Calcium Custom Screening Kit のご案内］
Calcium Screening Kit II を用いて条件検討を行ない、最適なスクリーニング条件を見つけられた上で、 Calcium Custom
Screening Kit をご検討されてはいかがでしょうか？
既に設定した条件にて大量にスクリーニングを行なおうとする場
合、各補助剤を別包装にした Calcium Screening Kit II は、キット購入毎に試薬を混合する必要があり操作が煩雑になります。
Calcium Custom Screening Kit は、弊社にてお客様が予め設定した条件に組み上げたキットです。例えば、Calcium Screening Kit II (Fluo 3, type B)にて条件検討し、Quenching Buffer Bに Cremophor EL を 0.01 %、Probenecid を 10 mmol/l 添加した場合に最も良く Ca シグナルを捉えることができたとします。この条件を弊社にお伝えいただきましたら、弊社にて予め、上記の条件でQuenching Buffer Bに必要量の溶解補助剤やProbenecidを添加してご提供させていただきます。
スクリーニング条件が決まりましたら、こちらのキットをご用命ください。価格等、詳細につきましては弊社マーケティング部までお問い合わせください。
品名
容量
価格（￥）
メーカーコード

Calcium Screening Kit II (Fura 2, trial version)
1 set
販売中止
Calcium Screening Kit II (Fura 2, typeA)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit II (Fura 2, typeB)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit II (Fluo 3, trial version)
1 set
販売中止
Calcium Screening Kit II (Fluo 3, typeA)
2,000 assays
販売中止
Calcium Screening Kit II (Fluo 3, typeB)
2,000 assays
販売中止

CS10
CS11
CS12
CS13
CS14
CS15

News No.104(2002)

近日発売予定Total RNA 抽出キット
Get pureRNA Kit

1

2

3

4

＜特長＞
・ フェノール、クロロホルム等有害な有機溶媒は使用しない。
・ 高純度、高収率で Total RNA が得られる。
・ 細胞、動物組織および血液から Total RNA が得られる。
・ 大量サンプルから抽出も可能。
・ RT-PCR、ノーザンブロット等にそのまま使用できる。

図 . 抽出 Total RNA をテンプレートとした RT-PCR 産物の電気泳動写真Lane1: Marker(φx174/Hinc II)

Lane2: positive control (353 bp)
Lane3: 回収 HeLa RNA（Run1）
Lane4: 回収 HeLa RNA（Run2）
Primer: Human β-actin
1.2% Agarose gel＜キット内容＞
・Lysis buffer
・Precipitation solution I
・Precipitation solution II
・DNase・DNase dilution buffer1

遺伝子解析の一つであるノーザンブロット解析、cDNA ライブ
ラリーの構築などのアプリケーションには組織や細胞から抽出した RNA が必要となります。また研究手段として増幅技術の使用が広がるにつれ高品質の RNA をゲノム DNA の混入なく迅速に取り出す方法が必要とされています。
従来、Total RNA 抽出には酸性フェノール法が用いられてきましたが、精製した Total RNA の純度に影響を及ぼすことが知られています。フェノールの混入は RT-PCR、シークエンシング等の反応を阻害したり効率を低減させたりしてきました。
Get pureRNA Kit は、溶解液、タンパク除去液および DNase 溶液により構成されています。フェノール、クロロホルム等の有害な有機溶媒を一切使用せず 40 分程度で高純度な Total RNA を抽出することができます。また、スピンカラムやフィルターチュー
ブを用いるキットに比べ、サンプル量の制限が無く大量のサンプ
ルからでも一度に高純度な RNA を抽出可能です。

2

3

4

＜操作方法＞
例) 細胞からの Total RNA 抽出
細胞サンプル（1×107cells）
500 µ I Lysis buffer
5 µ I β -Mercaptoethanol（別途準備）
100 µ I Precipitation solution I
室温で遠心分離（13,000xg以上、5分間）
上澄み
上澄みと同量のエタノール添加
室温で遠心分離（13,000xg、2分間）
沈殿
1 ml 70%エタノール
室温で遠心分離（13,000xg、2分間）
沈殿
200 µ I DNase working solution
インキュベート（37℃、15分間）
50 µ I Precipitation solution I

表.

Total RNA回収量とその純度
回収量（µg）
HeLa(1 x 107 cells)
90 - 150
90 - 150
Balb3T3(1 x 107 cells)
30 - 60
HL60(1 x 107 cells)
Mouse liver(20 mg)60 - 75
Mouse brain(30 mg)15 - 25
Mouse kidney(30 mg)40 - 55
Mouse heart(30 mg)
7 - 15
Mouse liver(1.0 g)
3800-4400
Mouse brain(1.0 g)700-1000

OD260/280
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2
2.0-2.2

50 µ I Precipitation solution II
室温で遠心分離（13,000xg以上、5分間）＊上澄みに沈殿物が混入している際は再度遠心分離し上澄みのみを回収してください＊
上澄み

上澄みと同量のエタノール添加
室温で遠心分離（13,000xg、2分間）
沈殿
1ml 70%エタノール
室温で遠心分離（13,000xg、2分間）

Total RNA pellet

17

News No.104(2002)

13th フォーラム・イン・ドージン

生命機能と病の中の蛋白質フォールディング
日 時／平成 14 年 11 月 29 日（金）10:15 〜 18:20（開場 10:00）
場 所／鶴屋ホール（テトリア熊本 7 階 熊本市手取本町 6‐1）
代表世話人／前田 浩（熊本大学医学部 微生物学講座）
当番世話人／山本 哲郎（熊本大学大学院医学研究科 分子病理学講座）
主 催：株式会社 同仁化学研究所
後 援：株式会社 ケミカル同仁
セッション１

10:30-11:15
11:15-12:00
12:00-12:45
セッション２

13:45-14:30

14:30-15:15
15:15-16:00
セッション３

16:15-17:00
17:00-17:35
17:35-18:10

参加費／無料
定員／ 300 名＜座長：三浦 洌 （熊本大学医学部 生化学第一講座）＞
星野 大 （大阪大学蛋白質研究所 溶液学部門）「蛋白質のフォールディングにおける α → β 構造転移」
永田 和宏 （京都大学再生医学研究所 細胞機能調節学分野）「小胞体品質管理機構と分子シャペロン」
田中 啓二 （東京都臨床医学総合研究所 分子腫瘍学研究部門）「蛋白質分解と品質管理」＜座長：棚瀬 純男 （熊本大学医学部 生化学第二講座）＞
森 正敬 （熊本大学医学部 分子遺伝学講座）「タンパク質のミトコンドリア輸送・フォールディング
・アポトーシスと分子シャペロン」
小椋 光 （熊本大学発生医学研究センター 細胞複製分野）「AAA ＋ファミリー ATPase と分子シャペロン」
吉田 賢右 （東京工業大学資源化学研究所 生物資源部門）「分子シャペロンとタンパク質の変性凝集」＜座長：前田 浩（熊本大学医学部 微生物学講座）＞
西道 隆臣 （理化学研究所 脳科学総合研究センター）「アルツハイマー病とアミロイド β タンパク質代謝」
安東 由喜雄 （熊本大学医学部 臨床検査医学講座）「家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)のアミロイド沈着機構の解析と治療」
堂浦 克美 （九州大学大学院医学研究院 脳神経病研究施設病理部門）「タンパク質フォールディングとプリオン病」

問い合わせ・参加申し込み先：フォーラム・イン・ドージン事務局（担当：蒲野・堀口）〒 861-2202 熊本県上益城郡益城町田原 2025-5 株式会社 同仁化学研究所 内
Tel:0120-489548, Fax: 0120-021557，E-mail: komine@dojindo.co.jp◎講演終了後、ミキサーを同会場で予定しております。(20:00 終了予定、無料)◎参加ご希望の方は、所属・氏名・連絡先（住所、TEL、FAX、E-mail）
・ミキサー参加の有無をご記入の上、E-mail または FAX でお申し込みください。
◎駐車場は有料となりますので、出来るだけ公共の交通機関をご使用ください。

ホームページアドレス
URL : http:// www. dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.104

News No.104
180120-021557
0120-489548

平成14年10月2日発行

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 石田和彦 編集責任者 斉藤素子

年４回発行

許可なくコピーを禁ず