マルチモーダル超解像イメージング

渡辺 梢 、藤田克昌 * 、永井健治 、小松崎民樹
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大阪大学大学院 工学研究科 精密科学・応用物理学専攻、
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大阪大学 産業科学研究所、 北海道大学 電子科学研究所*fujita@ap.eng.osaka-u.ac.jp, *http://bit.ly/kfujita_j
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ライブセル環境下で、一つ一つの細胞個性を分子レベルで解析する技術を開発する。
細胞をマルチモーダルに超解像観察する光学顕微鏡を開発、細胞内分子を多角的に計測・分析し、細胞の個性を検出、定量化する。
細胞内の特定の分子の詳細な分布の測定と、分子振動検出による網羅的な細胞内分子検出、および得られる膨大なデータの解析を組み合わせることで、細胞の振る舞いを決定している分子レベルの「要素」を探る。

藤田グループ（阪大・工）

高解像度の蛍光顕微鏡、ラマン顕微鏡を開発し、細胞内構造の形態や特定の分子の分布、また分子の分光情報とその空間分布を取得する顕微鏡装置開発
ラマン／蛍光マルチモーダル
超解像顕微鏡プローブ開発‡励起 / 発光特性がライブセル超解像観察に適した蛍光プローブを開発

データ解析

永井グループ（阪大・産研）

小松崎グループ（北大・電子研）

高解像度かつマルチモーダル（多重染色および細胞内分子の振動分光スペクトルなど）の膨大なデータを解析し、個々の細胞個性を定量的に評価できるパラメータを抽出する

High resolution and large field of view multi-modal imaging by SLI microscopy
SLILIi

1086420y5 µmxiii

SLI2848 cm-12884 cm-1
2930 cm-1

We have succeded in high-resolution Raman/ fluorescence imagingof biological samples by developed SLI microscope.

Raman intensity profile

Structured line illumination (SLI) Microscopy Setup
grating

Virtualstateωω-Ω}Ω

Groundstate

Resolution improvement by SLI Microscopy
We implemented structured illumination microscopy (SIM) [2] to line illumination(LI) microscope for the realization of multi-modal high-resolution imaging [3].
ObjectOTF

Observed image
k0
k0

k0
k0
Reconstruction}

Final obtainedimage

D(r) = {SI(r) × O(r)} PSF(r)D(k) = {SI(k) O(k)} × OTF(k)I(r) = I0{1 + cos(k0r + ø)}D(k) = I0{O(k) + 0.5O(k+k0)e-iø+ 0.5O(k-k0)e-iø}OTF(k)The mixing between SI and Raman scattering from the object allow access to thenormally inaccessible high spatial frequency information.

objective lensgalvanometer L2L3
mirrorbeamstop
CL1CL2 CL3

top view

L4yzx

samplecooledCCD camera

spectrophotometerside view

LIx

L1edge filter

Raman spectrum

Raman
scattering
ω-ΩObserved image

5 µmyLI
SLI

contains rich chemical information - distribution, concentration, temperature,and environment of the molecule [1].

Spatial frequency ofSIx2700 2800 2900 3000
Raman shift [cm-1]

Line-illuimination Raman/ fluorescence microscopyRaman scattering

Molecular vibration ΩLI

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10y [µm]1682 cm-1 (amide-I); 2848 cm-1 (CH2 stretching)

Incidentlight ωHigh resolution fluorescence microscopy of fixed HeLa cellstained with ATTO532 phalloidin

2848 2884 2930

Raman intensity [a.u.]ii

Raman intensity [a.u.]High resolution Raman micro-spectroscopy of mouse brain tissue

φ1, φ2, φ3Laser
intensity
at focusyy

The spatial frequencies of LI and SLI Raman
images of φ330 nm polystyrene particles

kykx
λSLI

1000 1400 1800 2200 2600 3000Raman shift [cm-1]

The improvement of spatial resolution
was confirmed for the all the detected
Raman bands from the sample.
Slit-confocal: x) 320 nm; y) 380 nm
SIM: x) 320 nm; y) 190 nm

References:[1] Almar F Palonpon et al., “Raman and SERS microscopy for molecular imaging oflive cells” , Nature Protocols 8, 677-692 (2013)[2] M. G. L. Gustafsson, “Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using
structured illumination microscopy” , Journal of Microscopy 198, 82-87 (2000)[3] Watanabe et al., “Structured line illumination Raman microscopy” Nat. Commun.
6:10095 doi: 10.1038/ncomms10095 (2015)‡ F. Yand et al., “The molecular structure of green fluorescent protein” Nature
Biotechnology 14, 1246-1251 (1996)