No.098 / 2001

■Review

糖化反応中間体3-deoxyglucosoneの特異的測定法
楠 仁美・宮田 哲■Topics on Chemistry

NOの次はH2O2?
−シグナル伝達分子としての過酸化水素−

佐々本一美

■連載

実用的蛍光誘導体化8
山口政俊・能田均

News No.98(2001)

目次
Review
糖化反応中間体 3-deoxyglucosone の特異的測定法
神戸大学医学部 楠 仁美、宮田 哲 .................................... 1
実用的蛍光誘導体化 8
福岡大学薬学部 山口 政俊、能田 均 .................................. 4

Topics on Chemistry
NO の次は H2O2?

−シグナル伝達分子としての過酸化水素− ............................ 9Commercial
Q&A
Total Glutathione Quantification Kit ............................... 6

新製品
膜電位感受性色素 DiBAC4(3) ............................................. 12
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HTS 関連試薬 ...................................................................... 14
近日発売予定DNA 抽出キット− NucleoPure − ..................................... 10

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容量、価格は下記ページをご覧ください。
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HTS 用 Cell Counting Kit ................................................... 13
HTS 関連試薬 ...................................................................... 14

Dojindo Molecular Technologies, Inc. (MolTech)付近の桜
ポトマック川岸の桜は、日米の友好の架け橋として有名ですが、弊社現地法人 MolTech のある
米国メリーランド州ゲイザースバークの地でもご覧のように桜の花が満開となり、春爛漫を告げます。

News No.98(2001)

糖化反応中間体 3-deoxyglucosone の特異的測定法(A specific assay of 3-deoxyglucosone, an intermediate of the glycation.)

楠 仁美(Hitomi Kusunoki)
神戸大学医学部第二内科[ Summary ]Nonenzymatic glycation has been proposed as one of the major mechanisms via which
hyperglycemia mediates diabetic microangiopathy. In fact, several studies
demonstrated that the formation of advanced glycation end products (AGEs) was
accelerated in diabetic patients. It is therefore important to clarify the pathway involvedin the formation of AGEs. In vitro experiments had shown that 3-deoxyglucosone (3DG) was a highly reactive intermediate and a potential precursor of AGEs detected invivo such as pyrraline and imidazolone compound. In addition, several lines of evidence
have suggested the possibility that free 3-DG per se affects cell functions in vascular
tissues. Thus, it seems important to determine 3-DG level in vivo for elucidating themechanisms underlying diabetic complications . We here report a specific assay of 3DG in blood samples. Since it was difficult to detect free 3-DG as the substance wasunstable, we attempted to convert 3-DG to a stable compound, 2-(2,3,4-trihydroxybutyl)benzo[g]quinoxaline, by reacting with 2,3-diaminonaphthalene. The derivative
had a characteristic UV absorbance and fluorescence, making it possible to use theresults of HPLC analysis at a later stage. This specific determination of 3-DG seems agood tool to investigate mechanisms of diabetic complications.

キーワード：

3-deoxyglucosone、グリケーション、糖尿病合併症、HPLC

宮田 哲(Satoshi Miyata)
神戸大学医学部第二内科

1. 緒言
糖尿病細小血管症は、持続する高血糖のために発症進展する病態
で、多くの糖尿病患者の予後を決定している。その成因の一つとして、蛋白質の糖化反応（メイラード反応）の関与が指摘され、糖化反応終末産物（AGEs: advanced glycation end products）と糖尿病性腎症などの糖尿病合併症との関連について報告がなされてきた。つまり、AGEs で修飾された組織蛋白質は、本来の構造や機能に変化をきたし、さらに AGEs修飾蛋白質が細小血管構成細胞に作用してサイトカインなどの分泌を介して組織障害を誘引することが提唱されている。この AGEs 形成に至る糖化反応後期段階では、反応性の高い中間体が生成することが知られており、3 deoxyglucosone（3-DG）はその代表的物質の一つである。この中間体が、再び蛋白質と反応することによって AGEs 形成を促進する。AGEs の中で糖尿病患者の血中濃度増加や腎組織に蓄積していることが確かめられた pyrraline1)やイミダゾロン化合物 2)は 3-DGと蛋白質の反応で形成する 3)。また、3-DG は、これらの AGEs 形
成を介して血管組織を傷害するだけではなく、free の 3-DG 自体が直接、血管壁構成細胞に作用する可能性も指摘されている。その作用機序の一つとして、細胞内の抗酸化酵素を不活性化することによって細胞内酸化ストレスを惹起することなどが示唆されている4)。
これらの研究成果を考慮すると、生体内の 3-DG を定量することが、糖尿病血管合併症の成因解析に必須と考えられたが、3-DG のようなジカルボニル化合物は非常に不安定であったことがその定量を困難にしていた。そこで、今回紹介するように 3-DG をまず安定な誘導体に変換し、それを定量する方法を導入することによって生体由来サンプルの 3-DG 特異的定量を可能にした。

CHO
I
C=O
I
CH2
I
CHOH
I
CHOH
I
CH2OH
3-DG

NH2

N

NH2

N

2,3-diaminonaphthalene

CH2OH
CHOH
CHOH
CH2

2-(2,3,4-trihydroxybutyI)benzo[g]quinoxaline

Fig.1 Derivatization of 3-DG with 2,3-diaminonaphthalene

2. 3-DG の誘導体化反応と検出原理 5)
3-DG を 2,3-diaminonaphthalene と反応させると安定な 2(2,3,4-trihydroxybutyl)benzo[g]quinoxaline（Fig.1）が形成する。この安定誘導体は特異的な吸光度特性および蛍光特性を有するので、UV 検出器あるいは蛍光検出器によって検出できる。生体由来サンプルの場合は、他の物質との分離を要するので、HPLC
や gas chromatography などを利用して定量することになる 6,7)。
以下に、我々の採用している HPLC を利用した標準的な定量法を述べる。

1

News No.98(2001)

3. 検体と2,3-diaminonaphthaleneの反応生成物の調整

3-DG-deriv.

UV absorbance
0

10

20

10

20

b

30

40

50

60

30

40

50

60

3-DG-deriv.

サンプル（血清あるいは 3-DG standard）:1 ml↓
内部標準物質添加0.005％ pentanedione 0.05 ml↓
脱蛋白
6％ perchloric acid 1 ml↓
遠心分離：3000 rpm、20 分間
↓
上清を中和

a

fluorescence

検体（血清、血漿など）1ml に内部標準として 0.005％ 2,3pentanedione 0.05 ml を加えた後、6％過塩素酸 1ml を加えて脱蛋白する。遠心（3000rpm、20 分間）によって得た上清に飽
和炭酸水素ナトリウム 2 m l を加えて中和した後 0 . 1 ％ 2 , 3 diaminonaphthalene 0.1 ml と 4℃で over night で反応させる。
それに酢酸エチル 4ml を加えて反応生成物を抽出し、蒸発乾固した後0.2mlメタノールにて再溶解したものをHPLC解析に供する（Fig.2）。

0sodium hydrogen carbonate 2 ml

Fig.3 HPLC analysis for 3-DG in rat plasma
a:UV detection, b: fluorescence detection.

↓
誘導体化反応0.1％ 2.3-diaminonaphthalene と反応（4℃、16h）
↓
抽出

100

285

a
80

↓
有機層を乾固↓0.2 ml メタノールにて再溶解後 HPLC にて解析

abundance

ethyl acetate 4 ml
217

60
147

306
194

40
03

Fig.2 Sample preparation

231

129

341

4. HPLC 解析 5)

じ溶出時間に単一ピークが出現した。このラット血漿由来のピー
クが本当に 3-DG 由来であるかを確認する目的でこのピークを分取し GC/MS にて解析したところ、Fig.4 に示すように 2-(2,3,4trihydroxybutyl)benzo[g]quinoxalineの構造を示唆するものであ
3-DG標準物質を誘導体化した検体から分取したパターンと一
り、
致した。

2

200

484

429
357

300

100

464

400

500

285

b
80

abundance

HPLC カラムは TSK ODS-80TM4.6 × 250 mm を使用した。
移動相として、A 液（50 mM リン酸：アセトニトリル：メタノー
ル =70：15：15）および B 液（50 mM リン酸：アセトニトリル：
メタノール =20：40：40）を作製し、30 分から 35 分にかけて溶液 B を 0％から 100％に増量させる gradient 法を用いた。流速は1.0 ml/ 分、検出波長 UV268 nm、蛍光検出では 503 nm（励起波長 271 nm）で分離した。
UVおよび蛍光のいずれの検出においてもFig.3に示すように同

100

397

261

179

0

410

319

207

20

60

20

475

231

03

320
281

175

0

306

217
194
207

147

40

100

245 265200410
371 395

461
436

300

400

500

500

Fig.4 Mass spectra of the derivatives from authentic 3-DG and rat plasma.
a:authentic 3-DG, b:rat plasma. Each derivative was isolated by
HPLC and applied to GC/MS.

News No.98(2001)

5. 検量線

参考文献

種々の既知濃度の 3-DG 標準液を作製し、上記に従って HPLCを行う。3-DG 由来誘導体のピーク高と内部標準由来のピーク高。この検量線を利の比は、元の 3-DG 濃度と正比例する（Fig.5）
用して、検体中の 3-DG 由来ピーク高と内部標準のピーク高の比から検体の 3-DG 濃度を求める。従って、検量線を得るための既知濃度 3-DG 標準液の誘導体化反応および HPLC 解析は、実験ごとに測定検体と同時に行う必要がある。

1) S. Miyata and V. Monnier, J. Clin. Invest. 89, 1102 (1992).
2) T. Niwa, T. Katsuzaki, S. Miyazaki, T. Miyazaki, Y. Ishizaki, F. Hayase,
N. Tatemichi and Y. Takei, J. Clin. Invest., 99, 1272 (1997).
3) F. Hayase, R. H. Nagaraj, S. Miyata, F. G. Njoroge and V. M. Monnier,

J. Biol. Chem., 264, 3758 (1989).
4) W. Che, M. Asahi, M. Takahashi, H. Kaneto, A. Okado, S. Higashiyama
and N. Taniguchi, J. Biol. Chem. 272, 18453 (1997).
5) H. Yamada, S. Miyata, N. Igaki, H. Yatabe, Y. Miyauchi, T. Ohara, M.
Sakai, H. Shoda, M. Oimomi, and M. Kasuga. J. Biol. Chem., 269,

0.06

Peak height ratio

20275 (1994).
0.05

6) H. Odani, T. Shinzato, Y. Matsumoto, J. Usami and K. Maeda,

Biochem. Biophys. Res. Commun., 256, 89 (1999).

0.04

7) S. Lal, F. Kappler, M. Walker, T. J. Orchard, P. J. Beisswenger, B. S.

0.03

Szwergold and T. R. Brown, Arch. Biochem. Biophys., 342, 254 (1997).
0.028) M. Takahashi, Y. B. Lu, T. Myint, J. Fujii, Y. Wada and N. Taniguchi,

Biochemistry, 34, 1433 (1995).

0.01
0
0

500

1000

1500

2000

3-DG(nM)

Fig.5 Linear relationship of 3-DG concentration vs peak height ratio(3DG-derivative/internal std.-derivative).

6. 糖尿病における 3-DG 測定意義
3-DGはグルコースと蛋白質の非酵素的糖化反応により形成される以外に、フルクトース経由の産生経路も存在する。糖尿病患者においては、血中グルコースの増加とともにポリオール経路を介したフルクトース形成も増加するため 3-DG 産生は亢進状態にあると考えられる。一方、生体内には 3-DG を非活性物質に代謝する防御機構が存在し、中でもアルデヒド還元酵素の重要性が指摘されている。これに関連して、糖尿病ラットを用いた実験で、このアルデヒド還元酵素自身が糖化を受けてその活性が低下していることが報告されている 8)。このように糖尿病では、3-DG の産生
亢進と代謝低下により組織内 3-DG 濃度は上昇することが考えられる。今回紹介した方法を用いて測定した我々の結果でも糖尿病患者の血清 3-DG 値は、コントロール群に比較して有意な上昇を。現在、糖尿病合併症の発症・進展と 3-DG 濃
認めている（Fig.6）
度の関連および 3-DG の作用についての検討を続けている。

著者紹介

氏名 楠 仁美 (Hitomi Kusunoki)
神戸大学医学部第二内科
出身大学 高知医科大学（1992 年卒）
現在の研究テーマ 糖尿病合併症の成因解明
氏名 宮田 哲 (Satoshi Miyata)
神戸大学医学部第二内科
出身大学 神戸大学医学部（1984 年卒）
現在の研究テーマ 糖尿病合併症の成因解明
連絡先〒 650-0017 神戸市中央区楠町 7-5-1

TEL(078)382-5861 FAX(078)382-2080

P<0.001

3-DG(nM)

400

300

200

100

品名

0

controlDb

Fig.6 3-DG level in human serum

容量

価格（￥）

3-Deoxyglucosone 10mg 14,000
3-Deoxyglucosone Detection ReagentsSet
18,500

メーカーコード

D535
D536

3

News No.98(2001)

9.1. ポストカラム誘導体化試薬

実用的蛍光誘導体化

8

還元糖に対する試薬として、エチレンジアミン、2- エタノール
アミン、2- シアノアセタミド、アルギニン、アリルアミジン類、メ
ソ -1,2- ジアリルエチレンジアミン 類など多数のものが使用されている。これらの試薬では、誘導体化はアルカリあるいは中性条
件下、加熱することにより進行する。これらの試薬の中で、2- シ
アノアセタミド、BA、p-MBA、p-MOED（Fig. 1）は、還元糖、アミノ糖、ウロン酸、シアル酸に対し高感度である。2- シアノア
セタミドは最も広く使用されている（検出限度、 0.1-4.2 nmol）
が、反応に際し糖の 2 位の水酸基が関与するため、2- デオキシ糖とは誘導体を与えない。BA、p-MBA、p-MOED は、還元糖と迅速に反応（100℃、3 分間）する（検出限度、2-63 pmol）。グア
ニジンは、還元糖のみならず非還元糖とも反応する。非還元糖との反応は、過ヨウ素酸ナトリウム存在下、アルカリ性で進行する。
（検出限度、5-10 pmol）

福岡大学薬学部

山口政俊・能田均

9.2. プレカラム誘導体化試薬
DBD-ProCZ、ANS、2-AP、Fmoc- ヒドラジン（Fig. 1）など
が還元糖の試薬として開発されている。いずれも、試薬のアミノあるいはヒドラジノ基と糖のアルデヒドあるいはケト基との縮合。
反応に基づいている（Fig. 2）

９．糖類の蛍光誘導体化
糖類の蛍光誘導体化試薬は、大きくポストカラム用とプレカラ
ム用に分けられる。
HN
C

CN-CH 2-CONH 2

N

CH2OH
OH
O

N
O

NH2

BA
:
p-MBA :H3CO

CONHN=CH

R=H
R=OCH3OH

DBD-ProCZ

OH

N

H.OH

N

N
SO2N(CH3)2

2-Cyanoacetamide

CH2OH
OH

CONHNH2

OH

OH

O

OH

N
SO2N(CH3)2

D-Glucose

Fig.2 Fluorescence labeling reaction of carbohydrate with DBD-ProCZ

R
H

O

NH2
NH2
H

N

CONHNH2

N
N

N

N

CH3
H3CO

N

O

H3CO

N

CH2CH2

O

O

O
N

N

N

N

SO2N(CH3)2

H3CO

p-MOED

DMEQ-TAD

DBD-ProCZO

P-TAD
CH2OCONHNH2

N

N

O

O
N

N

NH2

2-AP
Fmoc-hydrazine
Fig.1 Fluorescence reagents for carbohydrates.

4

A-TAD
Fig.3 Cookson-type fluorescence labeling reagents for dienes.

News No.98(2001)

OH

OH

O

N
N

NH2CH2C

N

OCH3

O

N

OCH3

O
O

H

CH3

N
N

NH2CH2CO

DMEQ-TAD

HO

O

HO

N

OCH3

N

OCH3

CH3

25-Hydroxyvitamin D3
Fig.4 Fluorescence labeling reaction of 25-hydroxyvitamin D3 with DMEQ-TAD.

10. ジエン類の蛍光誘導体化試薬

11.2. 糖P-TAD、DMEQ-TAD、A-TAD （Fig. 3）などの Cookson 型試薬が開発されており、ビタミン D 関連物質の計測に利用されて。
いる（Fig. 4）

ヌクレオチ(シ)ド糖部の高選択的蛍光試薬として、還元糖の選択的な蛍光試薬である p-MOED（Fig. 1）が利用できる。本試薬
は過ヨウ素酸酸化したリボースに対して発蛍光し、リボヌクレオ
チ(シ)ド類のポストカラム用試薬として使われている（検出限度、4-6 pmol）。この試薬は、デオキシリボヌクレオチ(シ)ドとは反応しない。
ヌクレオチ(シ)ドの糖部 5'- 水酸基の蛍光ラベル化試薬として、
アルコールの蛍光誘導体化試薬であるOMB-COClが使用できる。
本試薬はベンゼン溶液中で少量のピリジン（反応促進剤）存在下、アルコールと反応（100℃、40 分間）して蛍光性エステルを与える。この方法はヌクレオチ( シ) ド及びモノ - からテトラヌクレオチドを高感度に計測できる。しかし、それより長いヌクレオチドについては反応收率が低くなる。反応液にアジ化ナトリウムを加えておくとラベル化が進行しやすい。

11. 核酸関連物質の蛍光誘導体化試薬
核酸はポリヌクレオチドで、それを構成するモノヌクレオチド
は核酸塩基とデオキシリボース（または、リボース）及びリン酸からなる。従って、核酸関連物質の計測には、核酸塩基、糖ある
いはリン酸をそれぞれ認識する蛍光試薬が利用されている。

11.1. リン酸

11.3. アデニンヌクレオチ( シ) ド

5'- ジメチルアミノナフタレン -1-[N-(2- アミノエチル)スルホン] DNS-EDA）が、モノ、ジ、トリグアニンヌクレオチド
アミド（
及び 2'- デオキシグアニンヌクレオチド -5'- リン酸のラベル化剤とクロロアセトアルデヒドやブロモアセトアルデヒドが、この試薬として報告されている。これらは、アデニン残基と反応し、安。反応は、弱酸性（pH4.5）の水
定な蛍光物質を与える（Fig. 6）溶液中、80-100℃、10-30 分間の加熱で行い、プレカラム誘導体化による。ブロモアセトアルデヒドはポストカラム誘導体化にも利用できる。

して報告されている。これらの核酸との反応は、グアニンヌクレ
オチドのリン酸との反応に基づいており、1- エチル -3-(3- ジメチ
ルアミノプロピル)カルボジイミド（WSC または EDAC）の存在（検出限度、5-20 pmol）。
下で行われる（Fig. 5）
H 3C

N

CH3

NH2

N

O
-

O P-OH2C

O

O-

O

Base

WSC(EDAC)DNS-EDASO2NH(CH2)2NH

P-OH2CO-NNOCl(Br)CH2CHO

Base

OH

N

N
N
R

OH

Fig.5 Fluorescence labeling reaction of 2'-deoxynucleoside 5'monophosphate with DNS-EDA

N

N

N
R

Fig.6 Fluorescence derivatization reaction of adenine - containing
compounds with chloro(bromo)acetaldehyde.

5News No.98(2001)

Q＆A
11.4. グアニンヌクレオチ( シ) ド
フェニルグリオキサール（PGO）は、グアニン及びそのヌクレ
オチ(シ)ド類に対して、マレイン酸塩緩衝液（pH3-5）中で加熱。この条件下では、アデニ
すると、蛍光性物質を与える（Fig. 7）ン、シトシン、チミン、ウラシルなどの他の核酸塩基やそれらのヌクレオチ( シ) ド類には蛍光性を与えない。 PGO のアルコキシ体である 3,4- ジメトキシフェニルグリオキサールなどが、さらに高感度なグアニンの試薬として開発されている。また、緩和で迅
速な反応条件 [リン酸緩衝液 (pH7.0) 中、37℃、5 分間] により、グアニンヌクレオチ ( シ ) ドを誘導体化できる。

OH

O O
H 2N

O
N

N

C CH

N

N

N
H

R

N

Q1 どのような原理で測定するのでしょうか。
A1 glutathioneは、下図に示した酵素リサイクリング法によって高感度に検出されます。5,5 -dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)はジスルフィドを分子内に含有し、glutathione を酸化すると同時に自身は5-mercapto-2-nitrobenzoic acidに還元されます。このチオールの吸光度(λmax=412 nm)より glutathione を定量することができます。

NO2

O
N

N

Total Glutathione Quantification Kit

N

N

N

or HO
N
H

R

N

S

N
R

PGO

HOOC
O2N

2GSH
S

COOH

DTNB

Fig.7 Fluorescence derivatization reaction or guanine-compounds with
PGO

HOOC

glutathione
reductase
S-

GSSG

2
O2N

5-mercapto-2-nitrobenzoic acid11.5. ピリジンヌクレオチ( シ) ド
フェナシルブロミドがシトシン含有化合物の蛍光試薬として、開発されている（Fig. 8）。

Q2 キット以外には何を準備すればいいのでしょうか？
A2 測定にはキット以外に下記の物が必要になります。
• プレートリーダー (405 nm、もしくは 415 nm フィルター)• 96 well プレート
• 20 µl と 200 µl のマルチチャンネルピペット• インキュベーター
• 5- スルホサリチル酸 (SSA)

NH2

O

N

N

C CH2Br
O

N

N
R

O

N
R

Fig.8 Fluorescence derivatization reaction of cytosine-containing
compounds with phenacyl bromide

Br-DMEQ、Br-MMC はウリジン、デオキシウリジン、チミジン。
などの活性イミノ基を有するヌクレオシドと蛍光反応する（Fig. 9）O
Br-DMEQor+ HN
Br-MMC
O N
R2

R1

N
O

N
R2

Fig.9 FIuorescence labeling reaction of pyrimidine related compoundswith Br-DMEQ or Br-MMC．

6

Q3 マルチチャンネルピペットが無い場合は使えないのですか？
A3 Substrate working solution を加えるとすぐに発色が始まりますので、well 間のタイムラグをできるだけ少なくするためにマルチチャンネルのピペットの使用をお勧めします。無い
場合には、できるだけ well 間のタイムラグの無いように添加してください。

Q4 5- スルホサリチル酸（SSA ）は何のために使うのでしょう
か？ SSA の代わりに使える試薬はありませんか？
A4 「除蛋白」と「GSH の安定化」の目的で使用します。また、除O

DMEQ or MMC
R1

λmax:412 nm

蛋白剤として通常用いられる酸（トリクロロ酢酸、過塩素酸、
メタリン酸等）では、SSA とピクリン酸が GSH の酸化を防ぐ効果が高いと言われていますので、SSA もしくはピクリン酸の使用をお勧めします。ただし測定の際には、トリエタノー
ルアミン等で pH7 程度に中和するか、酸濃度が 1% 程度以下になるように希釈してから測定して下さい。

News No.98(2001)

Q＆A
Total Glutathione Quantification Kit
Q5 測定に影響を与えるような物質はありますか？
A5 アスコルビン酸、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)のような還元物質やシステイン 、また SH 基と反応するような化合物（マレイミド等）は測定に影響があります。
これらの化合物は前処理の段階で除くようにして下さい。

Q6 測定可能な濃度範囲はどれくらいでしょうか？
A6 total glutathione 濃度が 1 〜 100 µmol/l の範囲で測定可能です。

Q7 試料にどのくらいの濃度のglutathioneが入っているかわからない場合は、どのように測定すればよろしいのでしょうか？
A7 測定試料中の total glutathione の濃度が分らない場合は、測定試料を希釈したものを数種類調製してから測定を行ってください。

Q8 試料中のglutathioneの濃度と発色時間、吸光度の関係を教えて下さい。

A8 各濃度の GSH における DTNB 発色のタイムコースを下記に
示します。

3

Absorbance at 405nm

GSH 100µmol/l
2.5

GSH 50µmol/l
GSH 25µmol/l

2

Q10 測定試料の前処理方法について教えて下さい。
A10 細胞、組織、血漿、赤血球の前処理方法について下に記します。また、測定試料中の SSA の濃度が 1% を超えると測定に影響がありますので、濃度が 0.5 〜 1% になるよう測定前に希釈して調製してください。
・細胞(付着細胞： 5x105 cells, 白血球細胞：1x106 cells)
1) 200xg で 10 分間、4℃にて遠心し、上清を捨てる。
2) 300 µl の PBS で洗浄し、再度 200xg で 10 分間、4℃にて遠心し、上清を捨てる。
3) 10 mmol/l の HCl を 80 µl 加え、凍結と溶解を 2 回繰り返し細胞膜を破壊する。
4) 5% SSA を 20 µl 加え、8000xg で 10 分間遠心する。
5) 上清を測定試料とする。
・組織 (100 mg)
1) 充分に脱血後、 5% SSA 0.5 〜 1 ml 中で組織をホモジナイズする。
2) 8000xg で 10 分間遠心する。
3) 上清を測定試料とする。
・血漿1) 抗凝固剤を加えた血液を、1000xg で 10 分間、4 ℃にて遠心する。
2) 上清を新しいチューブに移し、半量 の 5% SSA を加える。
3) 8000xg で 10 分間、4 ℃にて遠心する。
4) 上清を測定試料とする。

GSH 12.5µmol/l
1.5

GSH 6.25µmol/l
GSH 3.125µmol/l

1

GSH 1.56µmol/l
0.5
GSH 0µmol/l
0
0

5

10

15

20

25

30

Time(min)※横軸は Substrate working solution を添加してからの時間（分）・赤血球1) 抗凝固剤を加えた血液を、1000xg で 10 分間、4 ℃にて遠心する。
2) 上清を捨てる。
3) 4 倍量の 5% SSA で溶血する。
4) 8000xg で 10 分間、4 ℃にて遠心する。
5) 上清を測定試料とする。

Q11 このキットで酸化型（GSSG）、還元型（GSH）の測り分けはできますか？

Q9 溶解した Coenzyme はどのくらい使えるのでしょうか？
A9 溶解後の Coenzyme は氷浴中で保存して下さい。ただし徐々に失活しますので、Coenzyme は溶解したその日のうちにお使い下さい。Coenzymeはキットに2本入っておりますので、一度に 50well 以上測定しない場合には、1 本のみ溶解するよ
うにして下さい。

A11 2-vinylpyridine により GSH の SH 基をマスクして GSSG
のみを検出し、total glutathione（GSH+GSSG）量から差し引くことで GSH, GSSG のそれぞれを定量することができます。

Q12 GSSG の濃度測定のときに 2-vinylpyridine 処理してから測定するようにとありますが、その際に注意することはありま
すか？

7News No.98(2001)

Q＆A
Total Glutathione Quantification Kit
A12 2-vinylpyridineを高濃度で用いたり、そのままプレートに入れたりするとプレートが腐食します。下記のような方法にて測定してください。
【2-vinylpyridine を用いたマウス血清中 GSSG の測定例】
約 700 µl のマウスの全血に対し、25 µl の EDTA (500mmol/l)を加え、1.5 分遠心します。上清を取り、上清に対し半量の 10%
SSA と混合し、更に遠心します。上清から 100 µl 取り、2 µl の
2-vinylpyridine と 6 µl のトリエタノールアミン（45 µmol）を加えて混合します（トリエタノールアミンは pH 調製のため。最終 pH は 7 〜 7.5 程度）。これを測定試料として GSSG の測定を行います。

5) Standard GSH solution、もしくは測定試料20 µlを添加し、30℃で 10 分間インキュベートする。
6) Substrate working solution を 20 µl 添加し、室温で 10 分
間インキュベートする。

7) プレートリーダーで吸光度（405 nm もしくは 415 nm）を測定する。

Q16 total glutathione 濃度の求め方を教えて下さい。
A16 得られた吸光度より、total glutathione濃度は下に示すendpoint methodでもkinetic methodのどちらの計算式でも求めることができます。

Q13 N-ethylmaleimide を用いて酸化型（GSSG）のみを測定す

Pseudo-endpoint method:
Total glutathione (GSH+GSSG)= (O.D.sample - O.D.blank) / 検量線の傾きることは可能ですか？
A13 基本的に2-vinylpyridineと同様に用いることは可能ですが、あまりお勧めはできません。N-ethylmaleimide は、還元型の glutathione との反応は非常に早いのですが、ある一定の濃度を超えると、その後の glutathione reductase を用いた
酵素サイクリングの反応を阻害するとの報告例があります。
［M. E. Anderson, Methods in Enzymol., 113, 548 (1985).］。

Kinetic method:
Total glutathione (GSH+GSSG)= (傾き sample - 傾き blank) / 検量線の傾き

Q14 他社のキットとはどのように違うのですか？
A14 O 社のキット（￥59,000/100 tests）は 1 アッセイ当たりのボリュームが大きく 96 穴のプレートでの測定ができないた
め、同時に多検体の測定を行う場合には向いていません。また、C 社のキット（￥29,800/96 well）は 96 穴のプレートでの測定は可能ですが、測定範囲が 0 〜 16 µmol/l と狭く、測定試料が限られたり前処理の操作が増えることが考えられます。
本キットは測定範囲が 1 〜 100 µmol/l と広く、また 96 穴プ
レートでの測定が可能で操作もインキュベートの時間を含めても 40 分〜 1 時間程度で終了するため、同時に多検体を短時間で測定することができます。

Q15 実際の操作を教えて下さい。
A151) Substrate（DTNB）に 1.2 ml、Coenzyme に 7 ml Buffer
solution を加えて溶解する（Substrate working solution,
Coenzyme working solution）。
2) Standard GSH に測定サンプルと同じ酸性溶液（例：0.5 〜
1% 5-sulfosalicylic acid:SSA）を 2 ml 加えて溶解し、順。
次希釈する（Standard GSH solution）
3) Enzyme solution を Buffer solution で 200 倍希釈する。
（Enzyme working solution）
4) Coenzyme working solution を 140 µl、Enzyme working
solution を 20 µl 各 well に添加し、30℃で 5 分間インキュベートする。

8*これらの計算式によって求められた値は、調製した測定試料
溶液中の glutathione の総量 になります。細胞や組織中の正確な glutathione の濃度を求めるには、除蛋白剤の量や測定試料の希釈倍率等を考慮して更に計算が必要となります。

品名

容量

価格
（￥）

Total Glutathione Quantification Kit
100tests
25,000

メーカーコード

T419

お知らせ

春の学会展示ご案内
下記学会において、試薬新製品の展示を行います。
皆様のご来場をお待ちいたしております。
・第 74 回日本薬理学会
3 月 2 1 日 ( 水 ) 〜 2 3 日 ( 金 ) パシフィコ横浜（横浜）・第 1 回日本 NO 学会学術集会
5 月 2 6 日 ( 土 ) 〜 2 7 日 ( 日 ) ア ク ロ ス 福岡（福岡）News No.98(2001)

Topics on Chemistry
NO の次は H2O2?−シグナル伝達分子としての過酸化水素−（株）同仁化学研究所

血管は弛緩と収縮とのバランスによって、その緊張性を調節・維持している。 血管内皮から産生される血管弛緩因子（EDRF）の存在と、その本体が一酸化窒素（NO）であることを突き止めた功績に対して、1998 年のノーベル医学生理学賞が Drs. Furchgott,
Ignarro, Murad の３人に与えられたことは記憶に新しい。 血管
は、内側を裏打ちしている内皮細胞にある NO 合成酵素（eNOS）
によって常に NO を産生している。 NO は外側を取りまく血管
平滑筋細胞に拡散し、cyclic GMP 合成酵素（sGC）のヘム部分に結合し、この酵素を活性化する。 血管の弛緩は、cyclic GMP
濃度の上昇によって引き起こされる。

佐々本 一美れるが、反応場としては heterogeneous である細胞内の局所では O2-. が NO による捕捉を免れ、SOD によって H2O2 に還元されると考えられる。

実はこれ以外にも細胞膜の過分極による血管平滑筋の弛緩メカニ
ズムが知られており、内皮細胞由来の過分極因子（endotheliumderived hyperpolarizing factor = EDHF）の存在が提唱されてきた。 特に、細い血管になるほど血管弛緩における EDHF の寄与が大きくなると言われている。 例えば、以前からニトロ剤が大きな冠状動脈にしか作用せず、細い冠状動脈には作用しにくいことが知られており、NO 以外の弛緩因子（メカニズム）の存在が疑われていたが、用いる血管の種類や種によっても結果が異なるため、
EDHF の本体はこれまで謎につつまれていた。

EDHF は NO と同様、Ca2+/Calmodulin 依存的に血管内皮で産生・遊離され、血管平滑筋のカリウムチャネルを開口させることによって弛緩を引き起こすと言われている。 NO は NOS に
よってアルギニンから産生されるが、アルギニンや NOS の補酵
EDHF が NO に代わって血管弛緩を起素が存在しない状態では、
EDHF と NO は補完的に作用し合ってこすことが知られており、いると考えられている。 1980 年代後半には EDRF イコールNO であることが実証され、その後も飛躍的に NO に関する研究が進展したのと対照的に、EDHF は同時期にその存在が提唱されたにもかかわらず、これまで同定されずにきた 1)。

図 1．過酸化水素を介する血管弛緩メカニズム（文献 6 より改変）

活性酸素の一種である過酸化水素は NO と同様、シグナル伝達分子としての機能が注目されつつあるが、ここでも内皮 -血管平滑筋間の細胞間シグナル伝達分子として機能していることが示された。 NO と H2O2 とは血管弛緩に関しては補完的に作用し合っており、全体像の解明にはこれらに特異的な可視化プローブ分子の開発が欠かせない。
参考文献
1) この分野の第一人者は、フランスの P. M. Vanhoutte である。 以下の彼

幾つかの EDHF 候補分子が報告されており、例えば Busse らのグループはアラキドン酸カスケード中の cytochrome P450
monooxygenase によって産生される epoxyeicosatrienoic acids （EETs）が EDHF の本体であると主張している 2)。 また、
Edwards らはラットの肝動脈ではカリウムイオンがその本体であると結論している 3)。 さらには、そのような内皮細胞由来の因子が存在するのではなく、内皮と血管平滑筋との gap junction を介
して過分極が伝播するという説もある 4)。
このような中、最近になって下川らのグループにより EDRF の本体が過酸化水素であるという論文が出され注目されている 5),6)。
彼らは eNOS ノックアウトマウスの腸管膜動脈を用いる実験で、
eNOS が superoxide anion（O2-.）を産生すること、さらにそれが SOD によって還元され H2O2 を発生し、血管平滑筋に移行してカリウムチャネルを開口させ、弛緩を惹起することを実証した。 eNOS は NO と同時に O2-. を産生しているが、これら（図 1）は互いに反応して peroxynitrite （ONOO-）を産生する。 NO／ O2-. の産生のバランスは、血管の種類や状態によっても左右さの文献が参考になる。

Vanhoutte, P.M., editor. 1998. Endothelium-

derived hyperpolarizing factor . Harwood Academic Publishers.
Amsterdam, The Netherlands. 335 pp; Vanhoutte, P.M., editor. 1999.

Endothelium-dependent hyperpolarizations. Harwood Academic Publishers. Amsterdam, The Netherlands. 433 pp.
2) Fisslthaler, B. Popp. R., Kiss, L., Potente, Harder, D. R., Fleming, I.,
and Busse, R., Nature, 401, 493-497 (1999); Fleming, I., Michaelis,
U. R., Bredenkotter D., Fisslthaler, B., Dehghani, F., Brandes, R. P.,
and Busse, R., Circ. Res., 88, 44 - 51 (2001).
3) Edwards, G., Dora, K. A., Gardener, M. J., Garland, C. J., and Weston,A. H., Nature, 396, 269-272 (1998).
4) Yamamoto, Y., Fukuta, H., Nakahira, Y., and Suzuki, H., J. Physiol.,
511, 501-508 (1998); Edwards, G. Thollon, M., Gardener, M. J.,
Feletou, M., Vilaine, J. -P., and Vanhoutte, P. M., Br. J. Pharmacol.,129, 1145-1154 (2000).
5) Matoba, T., Shimokawa, H., Nakashima, M., Hirakawa, Y., Mukai, Y.,
Hirano, K., Kanaide, H., and Takeshita, A., J. Clin. Invest., 106, 1521
- 1530 (2000).
6) Vanhoutte, P.M., J. Clin. Invest., 107, 23 - 25 (2001).

9

News No.98(2001)

近日発売予定DNA 抽出キット (-NucleoPure-)
DNA Extraction Kit (for Agarose Gels)

0.8

O.D.

〈特長〉
・高純度 DNA を高回収率で得ることができる。
・遠心フィルターや担体を使用しないので、各種のスケールに対応することができる。
・各種の DNA 溶液を調製することが可能である。
・各アガロース濃度のゲルに使用することができる。
・各断片長の DNA の精製が可能である。

1.0

0.6

Kit C

特定の DNA 断片を単離精製するために、アガロースゲル電気泳動を用いた DNA の分離回収は広く行われており、簡便な操作で、高回収率、高純度の DNA が得られる方法が望まれています。
本キットはゲルを溶解させるための Gel Solubilizer と Precipitation Solution の 2 種類の溶液によって構成されており、この２種の溶液によって簡単にゲルを溶解し、効率的に目的 DNA を回収できます。DNA 回収ステップを以下に簡単に示します。

0.4
Kit Q
Kit B
0.2
Dojindo

0.0
200

220

1) アガロースゲルを用いて電気泳動させた後、目的の DNA フ

240

260

280

300

Wavelength(nm)ラグメントを含んだ部分を切り出す（ゲルスライス）。

2) Gel Solubilizer をゲルスライスに加え、加温し溶解させる。
3) Precipitation Solution を加え DNA 以外の物質を沈殿させ

Fig.1 Spectra of DNA after extraction using various kits.

る。

4) 遠心分離により上澄みを取る。
5) エタノール沈殿によって上澄みから DNA を回収する。
一方、従来のアガロースゲルからの DNA の回収は、透析膜を用いた電気泳動濃縮法、低融点アガロースを用いた方法、またアガラーゼ等の分解酵素を用いた方法、およびシリカベースの担体への DNA の吸着を利用した方法が用いられています。中でも、シリカベースの担体を用いたキットが多数市販されています。この方法の概要を以下に示します。

1) アガロースゲルを用いて電気泳動させた後、目的 DNA フラグメントを含んだ部分を切り出す（ゲルスライス）。

2) 高濃度 NaI 水溶液を加え、加温しながらゲルスライスを溶解させる。

3) シリカベースの担体を加え吸着させる。
4) 遠心フィルター等を用いてDNAを吸着した担体を分離する。
5) 担体に吸着させたまま、バッファーで洗浄する。
6) 溶解バッファーで DNA を担体から溶かし出す。

1

2

3

4

Fig.2 Recovery of Calf thymus DNA using various Kits
1: Kit C, 2: Kit Q, 3: Dojindo, 4: Standard DNA (0.5 ug DNA)

10

News No.98(2001)

シリカゲルベースのキットは吸着担体の懸濁液、分離用フィル
ター、各種バッファーをセットにしたもの、あるいは、シリカベー
スのメンブランフィルターを組み込んだ遠心チューブと各種バッ
ファーをセットにしたものです。しかしながらいずれも担体を分離するためのフィルターを利用するため、一度に精製できる量が制限されてしまいます。
本キットで実際に抽出したDNAと上市されている他社キットを用いて抽出した DNA の吸光スペクトルの比較を Fig.1 に、また、各キットで分離精製したDNAをアガロースゲル電気泳動しエチジ
ウムブロマイドで染色した結果を Fig.2 に示します。
精製された純度の高い DNA フラグメントであれば、260 nm 付
近に極大吸収を持つスペクトルとなりますが、Fig.1のスペクトルデータから、他社キットを用いた場合は 260 nm 付近に明瞭な極大吸収がなく、アガロース由来の多量の不純物を含んでいる事がわかります。また、Fig.2 に示すように吸着担体を使ったキットで回収した DNA フラグメントの蛍光量は回収前の DNA フラグメン
トや本キットで回収した DNA フラグメントに比べ弱く、回収率が低い事がわかります。
以上のことから、シリカゲルベースの担体を用いたキットでは、実際にその製品のマニュアルに述べられている純度や回収率を達成することは難しいといえます。
その他の DNA フラグメント単離精製方法として、特殊なフィル
ターを用いてゲルと DNA を分離させる方法や、透析膜の付いたカ
プセルに切り出したゲルを入れ、短時間で電気泳動させ、カプセ
ルの透析膜側に DNA を濃縮する方法があります。しかし、これらの方法も純度や収量がばらつき、アガロースゲルからの DNA 回収
キットとして高い信頼性を持っているとは言えません。

DNA マーカーとして用いられています λDNA / Hind Ⅲの各フラグメントを本キットを用いて分離し、再び電気泳動した結果をFig.3 に示します。この図から、それぞれの長さの DNA フラグメ
ントがきれいに分離回収されていることがわかります。
なお、λDNA / Hind Ⅲ の 23 Kbp のフラグメントと 4.4 Kbpの DNA フラグメントが一部ハイブリダイズするため、回収した
23 Kbp DNAフラグメントを泳動したレーンでは２本のバンドが見られます。

0.6%
1.0%

1.5%

200

220

240

260

280

300

Wavelength(nm)Fig.4 Comparing of the spectra of extracted DNA with various gelconcentrations.

1：0.6Kbp
2：2.0Kbp
3：2.3Kbp
4：4.4Kbp
5：6.6Kbp
6：9.4Kbp
7：2.3Kbp(4.4Kbp)
8: λDNA/HindⅢ
1

2

3

4

5

6

7

8

Fig.3 Recovery of different size DNA fragments of λDNA/Hind III

Fig.4 には各アガロース濃度のゲルから抽出した DNA のスペクトルを示します。アガロース由来の成分の混入を示す短波長域の吸収も無く、高純度の DNA が抽出されていることがわかります。
本キットを用いてアガロースゲルからDNAフラグメントを回収するのに要する時間は約 40 分程度で、吸着担体を使用する他のキットに比べ時間を要しますが、コンスタントに高純度の DNA フ
ラグメントを分離回収する事ができます。また、DNA をペレットとして得ることができるために、長期保存も可能で、各種バッ
ファー溶液や高濃度の DNA 溶液を調製することが可能です。加えて、スケールアップが容易なため、大量に DNA フラグメントをア
ガロースゲルから回収する事が必要な場合にも有効なキットとな
ります。

11

News No.98(2001)

新製品

新製品

膜電位感受性色素

HTS 用 Cell Counting Kit
Cell Counting Kit-WR (for HTS)
Cell Counting Kit-HS (for HTS)DiBAC4(3)
O-Na+

O

N

N

N

N

O

O
O

O

C27H39N4NaO6=538.61< 特長 >• Ar レーザー(488 nm)を励起光源として利用可能である。
• 膜電位変化に対し、高感度な蛍光変化を示す。
• 蛍光特性(メタノール中) λex = 493 nm, λem ＝ 516 nm
DiBAC4(3)は、Bis-oxonol 型のアニオン性膜電位感受性色素です。細胞外液に添加してインキュベートすると、膜電位に応じた
細胞内外の分布を示します。刺激によって細胞膜が脱分極すると、その電位変化を受け、細胞中の存在率が高くなります。細胞質中では、細胞内タンパク質や細胞内膜に結合し、その蛍光が増強します 1)。このような機構により、蛍光強度変化から、膜電位の変化を検出することができます。
DiBAC 4(3) は、 DiBAC 4 (5) や DiSBAC 2 (3) などの他の Biso x o n o l 型や、スチリル系の d i - 4 - A N N E P S 、シアニン系のDiOC6(3)などの膜電位感受性色素に比べ、高い電位応答性を持っています 2)。Br uner らは、BICR/M1R-k 細胞（ラット乳癌細胞）において、-25 〜 -90 mV の膜電位範囲で約 1%/mV の蛍光強度変化が得られることを報告しています 2)。電位変化に伴う応答は 1 次の速度式に従い、その速度定数は 0.1 〜 0.8 /min と報告されています 2)。カルシウムイオン濃度と膜電位の相関解析 3)、抗生物質に対する細胞の生存率の分析 4)、ATP 感受性カリウムイオンチャネ
ルの活性評価 5)などの研究に応用されています。
Ar レーザー(488 nm)で励起可能なことから、フローサイトメ
トリー 4)、共焦点レーザー顕微鏡観察 6)などで利用可能です。最近
では、High-Throughput Screening(HTS)での細胞応答検出に最も頻繁に使用されている膜電位感受性色素です 7)。

〈特長〉
・High-Throughput Screening (HTS)用に調製した細胞増殖アッセイキットである。
・希釈の必要がなく、直接 384 ウェルプレートへ添加できるので操作が簡単である。
・1 液系なので HTS 用測定機器への組み込みが容易である。
・高水溶性なので、 MTT アッセイと違い溶解操作が不要である。
・Wide Range 用（ WR ）と High Sensitivity 用（ HS ）で測定系に合わせて使い分けできる。
Wide Range 用 ：0 〜 25,000 cells/wellHigh Sensitivity 用：0 〜 5,000 cells/well
弊社では細胞増殖試験あるいは細胞毒性感受性試験において生細胞数を測定するキットとして、これまで Cell Counting Kit 、
Cell Counting Kit-8など市販しており多くの研究者に使用され好評を得ております。
弊社の市販する Cell Counting Kit-8 は、高感度水溶性ホルマザ
ンを生成するテトラゾリウム塩、WST-8を発色基質として採用しており、ホルマザンを溶解する操作を必要することなく、簡便に生細胞数の高感度測定が可能です。WST-8 は、Fig.1 に示すように細胞内脱水素酵素によりメディエーターである 1-methoxyPMSを介して還元され450 nmに吸収を持つ水溶性のホルマザンに変換されるので、その吸光度の変化量を測定することにより直接生細胞数を計測することが可能です。

脱水素酵素
+

基質

NAD

酸化体

NADH

1-methoxy PMS（還元体）

1-methoxy PMS

WST-8

WST-8ホルマザン
8

参考文献
1) D. E. Epps, M. L. Wolfe, V. Groppi, Chem. Phys. Lipids, 69, 137 (1994).
2) T. Br uner, D. F. Hulser, R. J. Strasser, Biochim. Biophys. Acta, 771, 208 (1984).
3) T. T. Rohn, A. Sauvadet, C. Pavoine, F. Pecker, Am. J. Physiol., 273, C909 (1997).
4) D. J. Mason, R. Allman, J. M. Stark, D. Lloyd, J. Microsc., 176, 8 (1994).
5) U. Langheinrich, J. Daut, J. Physiol., 502, 397 (1997).
6) V. Dall Asta, R. Gatti, G. Orlandini, P. A. Rossi, B. M. Rotoli, R. Sala, O. Bussolati,
G. C. Gazzola, Exp. Cell Res., 231, 260 (1997).
7) K. S. Schroeder, B. D. Neagle, J. Biomol. Screening, 1, 75 (1996).

12

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

DiBAC4(3)25mg

27,000

D545

Fig.1 測定原理

最近では短時間に多くのサンプルを測定する技術、 H i g h Throughput Screening (HTS)を導入した生化学あるいは分子生物学的研究が盛んに行なわれていますが、その一つとして細胞増殖試験、細胞毒性感受性試験などにおいても HTS の手法を用いた研究が進められております。

News No.98(2001)

新製品
HTS 用 Cell Counting Kit〈キット内容〉
WST-8、1-methoxy PMS 混合水溶液 ......................... 400ml（384 ウェルプレート 26 枚分）〈操作方法〉
1 細胞増殖試験
1) 対数増殖期にある細胞懸濁溶液を384-wellマイクロプレートに 35 µl ずつ播種する。
2) プレートを CO2 インキュベーター内で 2-3 時間インキュベー
ションする。
3) 凍結している Cell Counting Kit-HS（または WR）を融解させる(37 ℃以下の温水を使用してもよい) 。
4) Cell Counting Kit-HS（または WR） 35 µl を各 well に添加する。
5) プレートを CO2 インキュベーター内で 1-4 時間インキュベー
ションする。
6) マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を測定する。

Absorbance at 450 nm

1.5

Cell Counting Kit-HS(for HTS)

1

0.5

0

2.5

1

2

3

4

5

6

7

Cell Counting Kit-WR(for HTS)

2
Absorbance at 450 nm

弊社では、HTS 用細胞増殖試験、細胞毒性感受性試験用の Cell
Counting Kit として、Cell Counting Kit-WR (for HTS)、および Cell Counting Kit-HS (for HTS)を用意いたしました。 Cell
Counting Kit-WR (for HTS)は Wide Range 用として、 0 から
25,000 cells/well の細胞数測定に、また Cell Counting Kit-HS(for HTS)は高感度用として、0 から 5,000cells/well の細胞数測定に適しております。それぞれ測定系に合わせてお使い分け下さ
い。

1.5
1
0.5
0

Hela
HL60
10

15

20

25

Number of Cells (x1000 cells/well)

2 細胞毒性試験
1) 細胞懸濁溶液(1000-2000 cells/well)を 384-well マイクロプ
レートに 35 µl ずつ播種する。
2) プレートを CO2 インキュベーター内で 24-48 時間インキュ

Fig.2 Cell proliferation assay using Cell Counting Kit ( for HTS )Staining: 37℃, 5% CO2, 1h (Hela)
37℃, 5% CO2, 4h (HL60)
Detection: 450 nm

ベーションする。

3) 試料の薬剤溶液 5 µl を各 well に添加し、 CO2 インキュベー
ター内で 24-48 時間インキュベーションする。
4) Cell Counting Kit-HS（または WR）35 µl を各 well に添加する。

5) プレートを CO2 インキュベーター内で 1-4 時間インキュベー
ションする。

6) マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を測定する。
〈取扱い上の注意〉
本キット溶液は -20℃で保存して下さい。
解凍は室温に放置するか、37℃以下の温水で行って下さい。
解凍後頻繁に使用する場合は、遮光して 4℃で保存し、なるべく早くお使い下さい。
凍結融解操作はなるべく行なわないようにして下さい。

品名

容量

価格（￥）

Cell Counting Kit-WR ( for HTS )10000 回用
46,000Cell Counting Kit-HS ( for HTS )10000 回用
46,000

メーカーコード

CK07
CK08

13

News No.98(2001)

新製品
Reagents for High-Throughput Screening(HTS)
今回発売しました DiBAC4(3), Cell Counting Kit (for HTS)以外に、HTS に用いられる製品を多数揃えております。記載されている容量以外の包装も承りますのでお気軽にお問い合わせください。
1. 細胞内カルシウムイオン測定用試薬

Fura 21)励起波長がシフトし(362nm → 335nm) ratiometry が可能。
2) ratiometry により、プローブ濃度等の影響を避けられる。
Fluo 31) 可視光励起であるため、細胞損傷の影響が少ない。
2) Ar レーザー(488nm)を励起光源として利用可能。
Rhod 2
1) 可視光励起であるため、細胞損傷の影響が少ない。
2) Kr 、He-Ne レーザーを励起光源として利用可能。
Fura 2-AM, Fluo 3-AM, Rhod 2-AM
1) AM 化することにより、脂溶性が向上している。
2) 細胞外液に添加するだけで細胞内に導入可能。
Coelenterazine-WS
1) 細胞内のカルシウム濃度を発光で測定可能。
2) 包接化合物の添加による、中性領域での高い水溶性。
2. 細胞内塩化物イオン測定用蛍光試薬
MQAE1) λex=355nm、λem=458nm。
2) 塩化物イオンの上昇により蛍光強度が減少。
3) 高い水溶性と膜透過性を有し、細胞に容易に導入できる。
3. 細胞内 pH 測定用蛍光試薬
BCECF, BCECF-AM
1) pH6.4 〜 8.0 で、pH と蛍光強度の間に良好な直線関係。
2) 440nm に等吸収点を持ち、励起二波長測光が可能。
4. 生物発光試薬
D-Luciferin, D-Luciferin K salt
1) 530nm 〜 635nm の光を発する。
2) 発光素子収率は 88% と高く、 Luminol の 20 倍以上。
5. 細胞増殖／細胞毒性測定用試薬
Cell Counting Kit-8
1) 高水溶性であり、ホルマザンの溶解操作が不要。
2) 他の水溶性テトラゾリウム塩（XTT、MTS）より高感度。
3) 1 ボトル溶液タイプであるため、試薬の調整が不要。
MTT
1) λmax=565nm、ε =2 × 104
Calcein-AM
1) 細胞膜を容易に透過し、蛍光性の Calcein を生じる。
2) 細胞からの漏出および細胞毒性が少ない。

ホームページアドレス
URL : http:// www. dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

Fluo 3

Fura 2（FDSS6000 を用い 384 プレートにて細胞内 Ca を測定した例。浜松ホトニクス株式会社より提供）

品名

容量Fura 21mg
Fura 2-AM
1mg
Fura 2-AM special packaging
50µg × 8
50µg × 40
Fura 2-AM solution
1 ml
Fura 2-AM solution
10 ml
Fluo 31mg
Fluo 3-AM
1mg
Fluo 3-AM
10mg
Fluo 3-AM special packaging
50µg × 8
Fluo 3-AM special packaging
50µg × 40
Rhod 2
1mg
Rhod 2-AM
1mg
Rhod 2-AM
10mg
Coelenterazine-WS
1mg
Coelenterazine-WS
10mg
MQAE
50mg
BCECF
5mg
BCECF-AM
10mg
BCECF-AM solution
1ml
D-Luciferin
25mg
D-Luciferin K salt
25mg
Cell Counting Kit-8
500 回用Cell Counting Kit-8 2500 回用Cell Counting Kit-8 10000 回用
MTT
1g
MTT
5g
Calcein-AM
1mg

14

コード

27,000
Request347-05421

F014
F015

16,800
Request36,200
Request23,500
RequestRequest348-05831

F025
F025
F016
F016
F019
F023
F023

22,000
Request25,00041,000
Request9,000
Request12,0008,500
Request30,00014,00018,00012,50031,000
Request12,50044,00010,000

フリーファックス
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ドージンニュース No.98

News No.98

価格（￥）

343-05401
345-05721

349-06961
344-05811
341-05821

348-06051
345-05184
344-05431
347-07621
343-07623
341-01823
349-01824
349-07201

メーカーコード

F026
F026
R001
R002
R002
C397
C397
M024
B031
B262
B034
L221
L226
CK04
CK04
CK04
M009
M009
C326

0120-021557
0120-489548

平成13年3月16日発行

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 石田和彦 編集責任者 斉藤素子

年４回発行

許可なくコピーを禁ず