海生研研報，第 10号， 27‑31，2007
Rep. Mar. Eco.
lRes.1ns，.
t No.1
0，27‑
31，2007

スズキ及びマコガレイ肝臓の薬物代謝酵素 (EROD) 活性に及ぼす。‑ナフトフラボンの影響
渡 辺 剛 幸 *1 ・ 宮 庄

拓 *2 ・ 箕 輪 康 *3 ・ 堀 口 一 彦 *4 ・ 柴 崎 道 贋 *1
橋爪政男*5 ・原 猛也*1

Effects ofsn
aphthoflavoneonthehepatic EROD activ
itiesinJapaneseseabass (Lateolαbraxjaponicus) andMarbled sole (Pseudopleuronectes yokohamae)
・Takayuki Watanabe*¥ Taku Miyasyo*2，Yasushi Minowaう
本 Kazuhiko Horiguti*4，MichihiroShibazaki*¥ Masao Hashidume*5 and TakeyaHara*1
要 約 :EROD活性のモデル誘導物質である 8ーナフトフラボン(s‑NF) をスズキとマコガレイの腹腔内に注入し， 24及び48時間後に肝臓内における EROD活性を測定した。両魚種ともに s‑NF投与量と EROD活性との聞には，用量反応関係が認められた。スズキに比べてマコガレイの EROD活性が高く，スズキよりもマコガレイの薬物代謝機能が高いことが示唆された。

キーワードスズキ ，Lateolabraxjaponicus，マコガレイ ，Pseudopleuronecte
syokohamae，EROD活性，。ーナフトフラボン，肝臓

Abstr
act:s・naphthoflav
one(β‑NF)，whichwasamodelm
ater
ialt
oinduceERODactiv
ity，wasinjectedinateolabra
xjaponicu
s and Marbled sole，Pseudopleu
ronectesanabdominalcavityo
fJ
apancseseabass，L
hea
ctiv
ityo
fERODinliv
erwasmeasur
ed24and48hou
r
sa
fteri
n
jection.T
hereobservedyokohamae，andt
apositiv
edose‑res
pons
er
elations
hipbetweenthe amount ofs‑NF injected andEROD activ
ityinducedinboths
pecies.ERODa
ctiv
ityi
ndu
ce
dinMarbledsolewash
igherthant
hati
ndu
ce
dinJa
panes
es
e
abas
sbyn/
mg prote
in，which su
gg
es
ted，th
er
e
for
e，tha
tc
he
mi
calsu
bs
tanc
em
e
tabolism would beabout 40pmoVmi.
morea
ctiv
ei
ntheformerthani
nthelatter
Keywords:Lateolabraxjaponiclls，Pselldopleuronecte
syokohamae， EROD activities， s‑naphthoflavone，liver

まえがき

TCDD/F， PAHの 投 与 量 と の 有 意 な 相 闘 が 認 め ら

れ て い る (Bucheli and Fent， 1995)。 ま た ， コ プ
魚類における汚染物質の代謝には，肝臓中の薬

ラナー PCB (Co・PCB， IUPAC No.126) の 全 魚 体物 代 謝 酵 素 チ ト ク ロ ー ム P‑450が関与しており，中濃度と EROD活 性 に 相 聞 が あ る こ と は ， ニ ジ マ

そ の う ち の CYPIAlは 代 表 的 な 基 質 で あ る エ ト キス Oncorhynchus mykiss稚 魚 の 経 口 投 与 実 験 で 確

シ レ ゾ ル フ ィ ン の 7‑ethoxyresorufin‑O‑deethylase

か め ら れ て い る (Brown etal， 2002)。

(EROD) 活性で測定される(加藤・鎌滝， 2002)。

著者らは，スズ、キ Lateolabraxjaponicusとマコ

魚 類 の EROD活 性 は ， 汚 染 物 質 で あ る PCB，

ガレイ Pseu
め'Pleuronectesyokohamaeに， Co‑PCB(2006年 3月 31日受付， 2006年 4月 19fJ受理)*1 財団法人
海洋生物環境研究所 事務局 (干101‑0051 東京都千代田区神田神保町 3‑29 帝国書院ピル 5F)~ E‑
mail t‑watanabe@kaiseiken.or.jp*2 酪 農 学 園 大 学 獣 医 学 部
獣医生化学教室 (〒 069‑8501 北海道江別市文京台緑町 582)
判 財 団 法 人 海 洋 生 物 環 境 研 究 所 実証試験場 (干 945‑0017 新潟県柏崎市荒浜 4‑7‑17)
判国際協力事業団(海外渡航中)*5 全国漁業共済組合連合会(
干101‑0047 東京都千代田区内神田ト 1‑
12 コープピル)
一一 27‑

渡辺ら:EROD
活性に及ぼす 0・NFの影響
類 の 経 口 投 与 を 行 い ， 筋 肉 中 の CoPCB濃度と心分離処理し，EROD活性との関係を調べた。その結果，マコガ

102，000Xg、で 60分間の超遠心分離処理した。破砕

レイではEROD活性は増加したが，スズキでは変から超遠心分離に至る処理は，試料を約 4 Cに保化が認められなかった。水中曝露実験でも同様のち行った。生じた沈誼(ミクロゾーム画分)を結果となり，薬物代謝酵素の誘導特性に種差のあ4) 1.0mLを力日え，1.
15% KCI‑lOm M EDTA (pH7.

ることが示唆された(渡辺ら，未発表)。

超音波ホモジナイザーで 5秒間・さらに静置沈殿後の上澄みを03回の処理で均

本研究では，マコガレイ及びスズキに見られたーになるように撹枠し，これをミクロゾーム溶液EROD活性の差が確かなものであることを追試すとした。この操作は可能な限り氷水中で、冷却しなるために， ERODのモデ、/レ誘導物質として知られがら行った。ている s‑ナフトフラボン (s NF) をスズキ及びERO
D活性の測定マコガレイに投与し，両種の反応特性の違いを比μLに， 100mMエトキシレゾ、ルフィン/エタノー

較した。

ルを超純水で 10倍希釈した 10mMエトキシレゾル

幽調製したミクロゾーム溶液25

フ ィ ン 溶 液 50μL， 5.0mM NADPHlN
aHC0350μL
材料及び方法4)
及び 100mMリン酸カルシウムバッファー (pH7.

125μLを加え，よく混和した後，直ちに260Cで 15供試魚供試材料としたスズキは千葉県栽培漁業

分間反応させた。反応を停止するためにエタノーセンターから，マコガレイは(財)温水養魚開発

ル250μLを加えてよく混和し，氷中で30分間静置協会から，それぞれ種苗を購入して(財)海洋生した。次いでそれを微量冷却高速遠心機 (himac

物環境研究所(以下，海生研と略記)中央研究所

CF15R，HITACHI)で遠心分離 (6，000Xg，20分(千葉県御宿町)で、中間育成を行った。スズキで間，は体重約40g，マコガレイでは約 100gに達したもて逆相高速液体クロマトグラフィーのを選別し，海生研実証試験場(新潟県柏崎市)

series，SHIMADZU) で反応産物であるレゾ、ルフィに移送して実験に用いた。

ンを定量分離した。検出は励起波長560nm，蛍光飼育条件0.
45μm) し4 C) し，その上澄みをろ過 (0(LιVp

供試魚をそれぞれ 150L流水式水槽に

波 長 585nmで 行 っ た 。 な お ， カ ラ ム に は LUNA6個体収容し，水温20Cで飼育した。中間育成時には飼料を 1日 2回，飽食するまで与え，実験はC18(2)5μmを用い， 20mMリン酸カルシウムバッ無給餌で行った。

/v/v) (流速0.8mLlmin) で溶出した。
45:3，v0投与及び採取方法

0 NF (東京化成工業(株)・製，純度99+%) をコーン油に溶かし

5， 10，30， 50， 100mg/kg体重となるように腹腔内注射

ファー (pH6.
6)/メタノール/アセトニトリル (52:蛋白質の定量

tal.(1951) の方法に基
Lowry eづき，調製したミクロゾーム溶液中のタンパク質の定量を行った。

を行った。投与後24時間と 48時間後に各 3個体を取り上げ，直ちに頚部及び偲周辺を切開して海水。

中で放血後，体重，体長を測定，肝臓を採取した。

結果と論議‑NFを腹腔内注射したスズキ及びマコガレイ

採取した肝臓は重量測定後，液体窒素で急速冷凍し，酵素活性測定に供するまで̲
80Cで冷凍保存における EROD活性は，スズキで24及び48時間後した。

/kg
体重まで、投与量の増加に伴って増ともに50mg0ミクロゾーム溶液の調製

tal.(2000)
Hanaokae

及 びPohland Fouts(1980) に従い，加傾向を示したが， 100mg/kg体重で、はERODi
舌'性ミクロゾーがやや低下した。マコガレイでは， 24時間後でム溶液の調製及びEROD活性を測定した。スズキ

lOOmg/kg体重まで投与量の増加に伴って増加傾

1濃度区当たり 3個体向を示したが， 48時間後ではスズキと同様に 100分の肝臓試料を混合したものを 1試料とした。マmg/kg体重で、EROD活性がやや低下した (Fig.
l.
)。

は魚体が小さかったため

コガレイは個体別に約 1gを 1試料(1濃度区当両種とも，/kg体重の範囲では ， s5'"'‑'50mg・たり 3試料)とした。肝臓試料を1.15% KCト

NF濃度の対数 (x) と24時間後 EROD活 性 (y)10mM EDTA (pH7.
4) 5.0mLとともに，テフロンとの聞には，以下に示すとおりの有意な関係が認中 mで 15秒間の処理を製ホモジナイザーで， 5，000められた (P<0.05)。

3回繰り返し破砕した後， 9，000Xg、で45分間の遠一一28一一スズキ

y=1
7.
7x+
29.
1

渡辺ら :EROD
活性に及ぼす 0・NFの影響

150150日120120‑EL.
tl90〈百90eoM。
E 60rv:、、、4hr.
一一一・←
一
一 28hr.
一ーベ〉
一一 4

60QE

μQ

30E30、・~。
。1020 30 40 50 6070 80 90100 。
。1020 30 40 50 60 70 80 90100
s‑naphthoflav
on(mg/kg‑BW)0・naphthoflav
on(mg/kg‑BW)

ct
iv
itie
si
nhe
pati
cmi
crosomes仕omJ
apaneseseabass(Ieft)andMarbledsole(right)pre‑Fig.1ERODaaphthoflavon.
treatedw
ithasingleintraper
itonealin
jectionofvariousdoseso
f s・n

y=35.
4x+
35.
8

マコガレイ

も50mg/kg体重までは濃度依存的に増加したが，24時間後と 48時間後のEROD活性を比較すると，それ以上の濃度については濃度依存性は認められ/kg体 重 を 投 与 し た 場 合 を 除
マコガレイに 100mgなかった。

いて， 48時間後のEROD活性が 24時間後に比べて程度の異なる二つの河川から採取したマミチヨグ。

Meyer etal. (2002) は，汚染の(Fundulusheteroclitus) に s‑NFの 腹 腔 内 注 射 をおおむね高い値を示した。
‑NFを50mg/kg体重腹腔内注射した場合，ス行い2日後のEROD活性を調べている。それにズキとマコガレイのEROD活性は， 24及 び48時間

よると，同一魚種においても供試魚の採取地等の後にそれぞれ598
1 pmol/minlmgp
rotein， 101‑124

履歴によって EROD活性が異なることを示していpmol/minlmgp
roteinを示し，マコガレイで高く，る。いずれもスズキ，マコガレイの活性値に比べその差は約 40 pmol/minlmg proteinで あ っ た 。 著て，極めて高い値で、あった。

・者らが別に実施した Co‑PCBs曝露実験におけるス
ズキとマコガレイの EROD活性は以上の結果から，種によって薬物代謝機能が異8週後にそれなるものと考えられる。また，同一種においてもぞれ 20， 50 pmol/minlmg protein増 加 し ， マ コ ガ

その生息環境によってEROD活性が異なる可能性

レイで高くその差は 30 pmo1/minlmg proteinで、あがあることが示されていることから，今後，スズり(渡辺ら，未発表)，曝露方法や測定時期は異キ，マコガレイについてもさらに詳細な検討が必なるが，本実験における両魚種の差とほぼ同程度要であると考える。

であった。このことから，スズキよりもマコガレ

謝E宇イの薬物代謝機能が高いことが示唆された。
本実験で得られた結果を ， sNFを腹腔内注射

本研究の端緒となった有益な示唆を頂いた海生・により投与した他魚種の EROD活性の値と比較し研中央研究所伊藤康男総括研究員に深謝します。

Table1)。スズキとマコガレイでは 24時間後た (また，ご指導を頂いた元海生研研究専門家里見至より 48時間後のEROD活性が増加する傾向を示し

弘博士及び海生研の木下秀明博士，道津光生博士，

たが， riverinecatfish(Ritarita) で は 3 日後と御園生淳総括研究員，ご校閲頂いた東京大学名誉1
0日後の活性は変化がないこと， marine mudfish

教授平野礼次郎博士，東京大学名誉教授清水誠博(Apocryptesbato)では 10日後には大幅に減少する士，元海生研顧問会津安志博士に感謝の意を捧げことが示されている。 gilthead seabream (Sparusます。

aurata)(p印刷 etal.，2001) では，投与量 10mg/kg

なお，本研究は水産庁委託「ダイオキシン類等

10

漁業影響調査一魚介類中のコプラナー PCB削減方mg/kg体重と 50mg/kg体 重 で は そ の 値 は 変 化 し て策検討解明事業」の一部である。併せて謝意を表いない。本実験においてもスズキ，マコガレイとします。

体重までは濃度依存的に活性は増加するが，一 29一渡辺ら:EROD
活性に及ぼす s‑NFの影響

T
able 1ERODactiv
itiesinhepati
cmicrosomesfromfisheswithasingleinjectionofv
ariousdosesapht
hoflavoneo
fs・ns・napht
hoflavone

fish(mglkg‑BW)

Marbledsole(Pelldoplellronectesyokohamae)giltheadseahream(Sparusallrata)

0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 00
一 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 00
一 0030000
1 3 5101
11a1
31
5 0一 1 3 5 0 1 i 3 5 0 5 1 1 1 5 5Japanesese
abass(Lateolabraxjaponiclls)

daysa
ftersinglem
jection
(day)

2
222
2

50AUAUAUAU︑ ︑︐︑戸 ︑Jr dmarinemudfish

Jr driv
erinecatfish(Ritarita)

7.
942.
844.
7
556.
59.
032.
7
4.
742.
668.
8

thi
sstu
dy

64.
081.
4

63.
3
thi
sstu
dy
2
8.
9:
1:12.
1
士 7.
0
5
9.
0.2
76.
1土21
12.
8
80.
1土3
:
1
:1
5.
8
1
00.
7
:
1
:1
8.
6
1
24.
9
2
8.
2
36.
1土3
2
土1
5.
8
1
13.
5
6.
2
1
0
3.4:1:1
2
土 5.
9
1
2
6.
4
2
士15.
6
1
24.
0
2.4
土 3.
0
1
01
2
P
re
t
ti，C.etal(2001)
79.
252971077507150752075202tal(2002)
800Meyere(SedimentPAHconcentr
ation;
above1000ppm)
22002(SedimentPAHconcentr
ation;
3ppm):
1:1
1.0AI‑Ar
abietal(2002)
.
3
58.
2
103.
7士2.
0357士28AIArabietal(2002).
1058
土24(FlIndlllllsheteroclitt日)(Apocη'ptesbato)

refferences2

且killifishERODactiv
ity(pmoVminlmg)

・

引用文献

cytochrome P450 as a biomarker forenvironmental，i S. A. M. and Goksoeyr，A. (2002).
AI‑
Arabcontammationmaquaticecosystems. Crit.Rev.Env
iron. Sci.Technol.

Cytochrome P
4501A responsesintwot
ropical01‑
268.
25，2iverinecatfish(Ritarita) andfishs
pecies，ratarazako，N.，Jinno，h.，Arizono，K.
Hanaoka，N.，Tmanne mApocryptes ato)
. Comp.
udfish (and Ando， M. (2000). Determination of

3
1，61‑
71.
Biochem.Physiol. C，1cytochrome P450 lA activ
itiesin mammalianBrown，S.Fisk，A.T.，Brown，M.，Villella，M.，Muir，liver microsomes by high‑performanceliquidD.C.G.，Evans，R.E Lockhart，W.L.
，Metner，.
chromatographyw
ithfluorescenc
edetection.JD.A. and Cooley，H. M. (2002). DietaryChromatogr. B 744，399‑
406.

吋accumulation and biochemical responses of

加藤隆一・鎌滝哲也 (2002).薬物代謝学. 第 2Oncorhynchusmykiss)juv
enilerainbowt
rout(to3，3'，4，4¥
5‑
pentachlorobi
phenyl (PCB126).

版，東京化学同人，東京， ppふ 52.

.H.，Rosebrough，M.，.
1 Fa民A.L.andLowry，OAquat.Toxicol. 59，139‑
152.

Randdall，R.J.(
1951).Protein measurement.D.andFent，K.(
I995).Induction on
Bucheli，T‑30一.Boil. Chem.
witht
heFolinphenolreagent.J渡辺ら:EROD
活性に及ぼす 0・NFの影響

193，265‑275.

ethoxyresorufin by microsomal subcellu
larMeyer，1.N.，Nacci，D.E.andGiulio，R.T.D.

fractions.Anal.Biochem.，107，150‑
155.

(2002). Cytochrome P4501A (CYPIA) inPretti， C.， Salv
etti， A.
， Longo， V.， Giorgi，恥1.

killi
fish(Fundulusheteroclitus):
heritabilityofand Gervasi，P. G. (2001).E
ffectsofル

alter
edexpression and relationshi
ptosurv
iv
alnaphthof1avone on the cytochrome P450c.
i68，incontaminatedsedi
ments.Tox
icol.S

system，and phase I
I enzymes ing
ilthead69‑81.

seabream (Sparusaurata). Comp. B
iochem.

Pohl，R.1.andFouts，1.R. (1980).A rapidmethod forassayingthemetabolismo
f7‑

一一3
1一一.1
30，133‑
144.
Physiol.C