News No.102(2002)

News No.102(2002)

目次

Get pureDNA Kit ............................................................. 13

Review

試作品案内

ヒト培養細胞を用いた食品成分の機能性評価
九州大学大学院農学研究院 立花宏文 ................................ 1
ケミストからみたポストゲノム 2〜 SNP タイピングその１（蛍光法による検出）
九州大学大学院工学研究院 片山佳樹 ................................ 6

Topics on Chemistry

Self Assembled Monolayers(SAMs)研究用試薬 .......... 12
Calcium Screening Kit .................................................... 16
アミロイド染色試薬 BSB ............................................... 17
お知らせ
カスタマーサービス部からのお知らせ ................................... 4
カタログご案内 ..................................................................... 18

細胞内情報伝達におけるリスク管理〜 PKA 活性の可視化プローブ〜
同仁化学研究所 佐々本一美 ............................................ 11

Commercial
Q&A
SOD Assay Kit-WST ........................................................ 5
新製品案内

Detergent Screening Set ............................................... 12

新製品案内
容量、価格は下記ページをご覧ください。
Detergent Screening Set ...................................................... 12
Get pureDNA Kit .................................................................... 13

DOJINDO Laboratories Europe Office 開設
昨年 9 月オランダ アムステルダムに弊社ヨーロッパオフィスを開設いたしました。
日米欧に拠点をおき、これまで以上に満足いただける製品・情報・サービスを提供してまいります。

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ヒト培養細胞を用いた食品成分の機能性評価（Analysis for the biological functions of food factors using human cell lines）

立花

宏文(Hirofumi Tachibana)
九州大学大学院農学研究院[ Summary ]Many functional food-derived factors that can modulate physiological systems of ourbody (i.e., endocrine, nerve, and immunological systems) have been clarified, and thesefactors have been applied to create "functional foods". With respect to immunologicalmodulation, close attention is paid to how to suppress allergy, and the screening of
the anti- or pro-allergic factors in foodstuffs has been performed. Tea (Camelliasinensis), one of today's most popular beverages, contains various substances. A
number of studies have shown that tea has a wide range of biological effects. Therefore
we focused on tea leaves as a promising source for effective anti-allergic agents. To
search for molecules that are able to suppress IgE synthesis, degranulation and highaffinity IgE receptor expression, we examined various substances purified from tea for
their effects on these aspects. Here we describe the identification of anti-allergic
molecules found in tea leaves by using human cultured cell lines.

キーワード：
細胞培養、脱顆粒、IgE、高親和性 IgE 受容体、好塩基球、Ｂ細胞、
茶成分

1）はじめに
食品中には体調調節機能等を有する成分が存在することが明らかにされ、そうした機能性成分を活用した健康志向型の食品（機能性食品）が注目されている。著者らは現在、そうした機能性食品の創製に役立つ食品成分の検索を目的として、ヒト培養細胞株を利用した食品成分の機能性評価系の構築およびそれを利用した機能性成分の検索を行っている。ここでは、食品成分の機能性評
価の実例として、筆者らが最近取り組んでいる茶葉成分の抗アレ
ルギー性評価について紹介する。

レルギーの発症に至る。このように、I 型アレルギーの発症には多くの反応が関与しており、それぞれの段階でアレルギー応答を抑制することが可能である。
緑茶はその幅広い生理作用が注目され、抗アレルギー的に作用するか興味がもたれるが、この点に関する研究はあまり進んでいなかった。そこで、主要な反応（1.IgE 型抗体の産生、2.IgE 受容体の発現、3. 炎症物質の放出）を評価対象とし、それらに影響を与える緑茶成分をヒト培養細胞を用いて検索した。

3）ヒト B 細胞株を用いた IgE の産生を抑制する
2）アレルギーとは
われわれの体は免疫反応により体外から侵入する異物の攻撃から守られているが、時として免疫反応はわれわれの体に対して障害的に作用する。このような免疫機能に基づく障害反応はアレル
ギーと呼ばれるが、近年のアレルギー患者数の増加および症状の重篤化は重要な問題となっている。生体内で起こる免疫反応には、抗体が関与する液性免疫と抗体が関与しない細胞性免疫があり、I型から III 型アレルギー反応は前者に、IV 型アレルギー反応は後者に属する。花粉アレルギーなどの環境アレルギーは I 型アレルギーにより発症するが、食物アレルギーでは I 型アレルギーに加え、II型および IV 型アレルギーの関与が疑われている。経口的に摂取されたアレルゲンタンパク質は消化管内で分解され、アミノ酸もし
くはペプチドの形で腸管より吸収される。ここでアレルゲンが完全に分解されればアレルギーの発症には至らない。しかし、消化機能が未発達の乳幼児期などにおいては、未分解のアレルゲン物
質が腸管より吸収され、アレルギー応答を引き起こす。アレルゲ
ンが生体内に侵入すると、アレルゲン特異的抗体の産生が誘導されるが、I 型アレルギーの発症には特に IgE 型の抗体が重要な役割を果たす。B 細胞により産生された IgE は肥満細胞および好塩基球の細胞膜上に存在する高親和性 IgE 受容体に結合する。そこに、アレルゲン物質が再び侵入して肥満細胞上の IgE を架橋すると、ヒスタミンやロイコトリエン等のメディエーターが放出され、ア

茶葉成分の検索とその作用機構の解析
I型アレルギーでは特にIgE型の抗体が重要な役割を果たす。従って、IgE の産生を抑制する作用をもつ因子は抗アレルギー作用が期待できる。そこで、茶葉中における IgE 産生抑制成分の検索を行った。抗体は重鎖の違いから IgM、IgD、IgG、IgE、IgA の 5 種類が存在する。IgE は、抗体産生細胞である B 細胞がゲノム DNA 上で
抗体重鎖遺伝子の組み換え (クラススイッチ) を起こすことにより産生される。IgE へのクラススイッチはサイトカインの一種である
インターロイキン 4（ I L - 4 ）の刺激により、 I g E 重鎖胚型転写(Cε germline transcripts ; εGT) の発現が誘導されることで開始される。従って、εGT 発現を阻害することは IgE 産生の抑制につながる。そこで、このεGT 発現の抑制活性を指標として茶成分を検討した。
ヒト成熟 B 細胞株 DND39 は IL-4 の刺激により εGT を発現することが知られている 1)。そこで、DND39 細胞を IL-4 および種々の溶媒を用いて抽出した茶葉成分の存在下でそれぞれ培養し、εGT発現を検討した。その結果、カテキン画分にεGT 発現抑制活性が存在することが明らかとなった。そこでこのカテキン画分をさらに分画し、各画分の εGT 発現に及ぼす影響を検討した結果、1 つの画分に強い抑制活性が認められた。構造解析の結果、この画分中の成分はStrictinin であることが判明した(Fig. 1)。Strictinin は健常人由来の末梢血単核細胞においても IL-4 誘導性のεGT 発現を抑制した 2)。ま1

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た、アトピー患者由来末梢血単核細胞は IL-4 を新たに外から与えない状況下においてもεGTが発現していたが、こうした発現に対しても顕著に抑制した(Fig. 2)。

こうした in vitro における細胞実験の結果から、Strictinin は IgE の産生を阻害する可能性が示唆されたため、次に in vitro に対する検討を行った。アレルゲンに対する IgE 抗体は、アレルゲンを用いてマウスに免疫することで強制的に作らせることができる。そこで食物アレルギーの主要なアレルゲンである卵白アルブミンで感作すると同時に Strictinin を経口投与し、4 週間後における血清中の卵白ア
ルブミンに対する IgM, IgG, IgE 量を測定した。その結果、卵白ア
ルブミン特異的 IgM および IgG 量に対しては Strictinin 投与の影響はほとんどなかったが、Strictinin を飲ませたマウスにおける IgE 量は、飲ませなかったマウスに比べ抑制されていた(Fig. 3)。つまり、Strictininはアレルゲン特異的なIgEの産生を特異的に抑制することが示唆された。

Fig.1 Structures of anti-allergic factors in green tea.
Fig.3 Oral administration of Strictinin decreases specific IgE antibody
response in ovalbumin-immunized mice.
C57BL/6l mice injected intraperitoneally with ovalbumin wereadministrated water containing (+) or not containing (-) Strictinin every
2 days for 8 days. Two months after immunization, the amount ofovalbumin-specific IgE, IgM, and IgG in the sera was measured.
Results are expressed in OD values.

Fig.2 Strictinin inhibits IL-4-induced εGT expression in human peripheral
blood mononuclear cells.
The peripheral blood mononuclear cells from either healthy or atopic
donors were treated with IL-4 with or without Strictinin (25 µM) for
48 h, and then assessed for levels of εGT.

2

Strictinin は抗原特異的 IgE の産生を特異的に抑制するが、その作用は IL-4 誘導性の εGT 発現阻害であることが推定されたことから、Strictinin による εGT 発現の阻害機構について検討した。IL-4 は B
細胞膜表面上に発現する IL-4 受容体に結合し、JAK-STAT 経路を活性化する 3）。この経路により、STAT6 はリン酸化されホモ二量体を形成し、εGT 発現が誘導される。そこでまず、STAT6 のチロシ
ンリン酸化に対する影響を検討した。DND39 を IL-4 で刺激後、
STAT6 を抗 STAT6 抗体で免疫沈降により回収し、抗リン酸化チ
ロシン抗体を用いたウエスタンブロットを行った。チロシンリン酸
化 STAT6 は IL-4 刺激により誘導されるが、Strictinin は濃度依存的にこのリン酸化を阻害した(Fig. 4)。以上の結果より、Strictinin は
STAT6 のチロシンリン酸化を阻害することにより IL-4 誘導性の
εGT 発現を抑制し、IgE の産生を抑える可能性が示された。

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画分に含まれる成分の構造は NMR 解析により、 epigallo catechin 3-O-(3-O-methyl) gallate(3M-EGCg)であることが明ら
この物質は緑茶に最も多く含まれるカテキンであるかとなった7)。
EGCg のガロイル基がメチルエーテル化されたもので（Fig. 1）、
やぶきた には全く含まれない成分である。また、3M-EGCg の抑制活性は EGCg を若干上回る傾向にあった。この 3M-EGCg に関しては I 型アレルギーに対する抑制効果が、マウスの経口投与実験から確認されている 8)。

Fig.4 Strictinin inhibits tyrosine phosphorylation of STAT6.
DND39 cells were treated with strictinin (0, 25, 50, and 100 µM) in
the presence of IL-4 for 30 min as indicated. STAT6 was
immunoprecipitated, separated on a 8% SDS-PAGE, andimmunoblotted with the anti-phosphotyrosine antibody. Shown in
the lower panel are protein levels from the same filter blotted again
with the anti-STAT6 antibody.

4）抗アレルギー性評価のためのヒト好塩基球細胞株の樹立
炎症発症に関与する細胞株を用いた活性検定系は、抗アレル
ギー活性を効率的に評価するための強力なツールになる。そこで
筆者らは、炎症物質ヒスタミン産生細胞であるヒト好塩基球細胞株の樹立を試みた。ヒト白血病細胞株KU812 を種々のサイトカイ
ンで刺激後、好塩基球への分化指標である 1) 高親和性 IgE 受容体
FcεRI の発現、2)顆粒球の形成、3)ヒスタミンの産生、に基づき好塩基球への分化誘導条件について検討した。その結果、 IL-4 やハイドロコルチゾンの添加培養により FcεRI の発現増大、ヒスタミンの産生増大および顆粒形成の促進が誘導されることが明らかとなった 4、5)。また、IL-4 やハイドロコルチゾン処理により分化した KU812 は、カルシウムイオノフォア A23187 や IgE/ 抗 IgE 抗体の刺激に応答してヒスタミンを放出する。そこで IL-4 で分化誘導した好塩基球細胞株を用いて脱顆粒および高親和性 IgE 受容体
発現に対する茶成分の評価を行った。

6）ヒト好塩基球細胞株を用いた高親和性 IgE 受容体発現抑制活性の評価
食物アレルギーにおける即時型アレルギー反応では、アレルゲ
ン -IgE による好塩基球や肥満細胞表面上に存在する高親和性 IgE
受容体（FcεRI）の架橋が一連のアレルギー反応を誘導する引き金となる。そのため、これらの細胞表面上の FcεRI 発現を抑制する
ことは、IgE を介したアレルギー反応の抑制につながる。そこで、上記のように樹立した FcεRI を高発現している好塩基球様細胞株
KU812 の FcεRI 発現抑制活性を指標として、茶の主だったカテキ
ン成分の抗アレルギー活性を検討した。その結果、EGCg のみに
FcεRI の発現抑制活性が認められた 9）。また、FcεRI は α 鎖、β 鎖、γ 鎖から構成されるが、このうち α 鎖および γ 鎖の mRNA 発現量
が EGCg により低下することが認められた(Fig. 5)。これらの結果は、EGCg による KU812 細胞表面上の FcεRI の発現抑制が、α鎖およびγ鎖の mRNA 発現量低下によるものであることを示唆している。

5）ヒト好塩基球細胞株を用いた脱顆粒阻害活性の評価
アレルギーでは、ヒスタミンやロイコトリエン等の炎症物質が放出され、炎症発症が惹起される。IgE の産生抑制活性と同様、炎症物質放出シグナルの伝達阻害を含む炎症物質の産生・放出阻害活性は重要な抗アレルギー活性の指標である。
最近、国内で最も生産されている栽培種である やぶきた ではなく、紅茶系品種 べにほまれ や台湾系統の茶に、強い抗ア
レルギー作用があることがマウス肥満細胞株やマウスを用いたア
レルギー反応試験により明らかにされた 6)。そこで、上記の新たに樹立したヒト好塩基球細胞株KU812 を用い、この細胞からのヒスタミン放出抑制活性を指標に、 べにほまれ より放出抑制成分の探索を行った。べにほまれ抽出物を分画して得られた画分を検討したところ、一つの画分に強い放出抑制活性が認められた。このFig.5 Analysis of the mRNA level for FcεRI α, β and γ in KU812 cells treatedwith EGCg.
After treatment with 50 µM EGCg for 24 h, total RNA was isolated
from the cells. FcεRI α, γ and G3PDH mRNA were analyzed by RTPCR. Southern blotting using a specific probe for FcεRI α, γ and
G3PDH was performed to assess the PCR products.

7）おわりにヒト培養細胞株を利用することにより、茶葉成分であるメチル
化 EGCg および Strictinin の有する抗アレルギー活性を明らかにした過程について述べてきた。 現在、メチル化 EGCg および3

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Strictininを活用した抗アレルギー食品の開発が産学官連携で進行中である。今後、こうした評価系を用いることにより茶葉のみならず幅広い食品の中から新たな抗アレルギー成分が見出されることを期待している。今回、抗アレルギー性を評価する観点からヒ
ト培養細胞株の利用法について述べてきたが、逆に、アレルゲン性（アレルギー反応誘導活性）の評価にも活用できると考え、その実験系作りに取り組んでいる。

参考文献
1) T.Ichiki, W.Takahashi, and T.Watanabe, Int. Immunol. 4, 747 (1992).
2) H.Tachibana, T.Kubo, T.Miyase, S. Tanino, M. Yoshimoto, M. Sano,
M. Yamamoto-Maeda, and K. Yamada, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 280, 53 (2001).
3) J.Hou, U.Schindler, W.J.Henzel, T.Z.Ho, M. Brasseur, and S.L.
McKnight, Science 265, 1701 (1994).
4) T. Hara, K. Yamada, and H. Tachibana, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 247, 542 (1998).
5) T. Hara, H. Tachibana, and K. Yamada, Cytotechnology, 34, 213(2000).
6) 山本万里、佐野満昭、立花宏文 , バイオサイエンスとインダストリー , 57,
41 (1999).
7) H. Tachibana, Y. Sunada, T. Miyase, M. Sano, M. Maeda-Yamamoto,and K. Yamada, Biosci. Biotech. Biochem., 64, 452 (2000).
8) M. Sano, M. Suzuki, T. Miyase, K. Yoshino, and M. MaedaYamamoto, J. Agric. Food Chem., 47, 1906 (1999).
9) Y. Fujimura, H. Tachibana, H. and K. Yamada, J. Agric. Food Chem.,
49, 2527 (2001).

カスタマーサービス部からのお知らせ

著者紹介
氏
名：立花 宏文（Hirofumi Tachibana）
年
齢：36 才所
属：九州大学大学院農学研究院生物機能科学部門 助教授
連絡先 〒 812-8581
福岡市東区箱崎 6-10-1

TEL & FAX 092-642-3008
e-mail: tatibana@agr.kyushu-u.ac.jp
出身大学：九州大学
学位：博士（農学）
現在の研究テーマ：
1 抗アレルギー食品成分を利用したアレルギー予防食品の創製
2 植物由来ポリフェノール応答性に関わる遺伝子のクローニング
3 抗体遺伝子の発現制御とヒト型触媒抗体創製への応用
4 ガン予防に関わる食品成分の検索とその作用機構

4

弊社では、お客様ご支援のため、昨年平成 13 年 9 月よりカスタマーサービス部を新設し、お客様からの技術的お問い合
わせに対し、
これまで以上に充実した回答を図っております。
下記窓口をご利用ください。
技術お問い合わせ窓口：技術専門スタッフがご質問承ります。

(1) TEL:0120-489-548 FAX:0120-021-557(2) e-mail:info@dojindo.co.jp
価格・営業お問い合わせ窓口：マーケティング部員が承ります。

(1) TEL:096-286-1515 FAX:096-286-1525(2) e-mail:info@dojindo.co.jp
また、これまでお客様からお寄せいただきましたご質問を、近々 Web 上で FAQ として公開させていただく予定です。改めましてご案内させていただきますのでご活用ください。

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Q＆A
SOD Assay Kit-WST
サンプル毎の前処理法を教えて下さい。
下記のような方法があります。
ー培養細胞ー（1）培養した細胞を PBS で 2 回洗浄する。接着細胞の場合
は、トリプシン処理を行なった後洗浄する。
（2） PBS を除去後、細胞膜を破壊する。
例 ①− 20℃で 20 分、室温で 10 分静置。これを 2 回繰り返す。
②超音波処理（3）新たに PBS を加え、良く混合する。
。
（4） 10000 × g で 15 分間遠心する（冷蔵庫内で行なう）（5）上清を SOD Assay する。
必要に応じて、たんぱく定量も同時に行ない、全たんぱく量に対する SOD 活性を算出する。
ー赤ワイン・緑茶ー緑 茶：緑茶 10 g に沸騰水 60 ml を加え、2.5 分間静置して抽出する。これをろ紙でろ過した後、更にメンブ
ランフィルター（ポアサイズ 0.45 µm）でろ過し、測定試料とする。
ワイン：直接メンブランフィルターでろ過し、測定試料とする。緑茶や赤ワイン等はそのもの自体に着色があり
ますが、100 倍程度に希釈すると測定に対する着色の影響は回避できます。
ー植物・野菜類ー（例：人参、レタス、ポテト、キャベツ、トマト、カリフラ
ワー、ほうれん草、ブロッコリ、胡椒、玉葱など）（1）蒸留水（野菜の重量に対し 5 倍量程度）で、4℃・1 分
間ホモジナイズする。
（2）ホモジネートをろ紙でろ過し、ろ液（水での抽出物）を凍結乾燥する。
（3）凍結乾燥したものを、0.1 mol/l リン酸バッファー（pH7.4）に溶かし、これを測定試料とする。溶かしたもの
はなるべく早く使用する。
上記測定試料により得られた活性値は、水による抽出物の凍結乾燥後の重量、もしくはホモジナイズ前の野菜の重量当たりの活性値とする。
参考文献です。SOD の測り分けですが、以下の文献が参考になると思います。
亜硝酸法の文献に詳しい操作法が記載されています。
この方法はテトラゾリウム法にも対応できます。
（亜硝酸法での測定）

Q1
A11) 受田浩之・森山洋憲・川名大介・片山泰幸・中林錦一・沢村正義、日本食品科学工学会誌 , 49, 25 (2002).
2) 浅田浩二・中野稔・柿沼カツ子編 , 「活性酸素測定マニュアル」（講談社サ
イエンティフィック）, p.196
3) Pietarinen-Runtti P, Lakari E, Raivio KO, Kinnula VL, Am. J. Physiol.
Cell. Physiol., 278, C118 (2000).

1) Y. Oyanagui, Anal. Biochem., 142, 290 (1984).

（NBT 法での測定）
2) J. A. Sykes, Cancer Res., 38, 2759 (1978).
3) 谷口直之 監修，細胞工学別冊「活性酸素実験プロトコール」秀潤社 ,
P120.

Q3
A3

他の活性酸素種の・OHや一重項酸素などとも反応しますか？
還元物質との反応になります。・OH は酸化物質のため反応しないと考えられます。
他の活性酸素種に関しては、還元作用を示すものであれば反応する可能性はあります。

Q4
A4

SOD Assay Kit-WST に SOD の標品はついていますか？
キサンチンオキシダーゼは付いていますが、標品となるSODは別途ご購入ください（弊社での取扱いございません）。

Q5

A5

Mn-SODやCu,Zn-SODを分別して測れる方法はありますか？
KCN 添加（Cu,Zn-SOD 失活）により、Mn-SOD のみの活性を測定し、トータルの活性から差し引く事でCu,Zn-SODの活性が分かります。ただ、これは従来から用いられている方法で、本キットでうまくいった例があるかどうかは不明

が失活しているのでしょうか？
Enzyme solution（Xanthine Oxidase）は酵素の懸濁液になってますので、静置しておくと酵素が沈んでしまいます。
よく振ってからご使用下さい。上澄みだけを取ってしまうと superoxide は全く発生しませんので発色もしません。

Q6
A6

酵素はどのくらい安定ですか？
37℃保存で 1ヶ月、4℃保存だと 1 年以上安定であることを確認しています。

Q7
A7

前処理等の際に界面活性剤を使うと影響はありますか？
影響はあるかもしれませんが、界面活性剤の種類によっても違います。実際に使用する界面活性剤をブランクの wellに加えた場合と加えない場合とで比較、確認して下さい。

Q8

取説に載っているプレートのレイアウトの例では、blank2
は 1 つしかありませんが、sample が違えばその sample 毎に必要なのでしょうか？またその場合測定できる sample
数は減るのでしょうか？
この Kit は 450 nm の吸光度で検出しますので、着色等で450 nm に吸収のあるような sample であれば同じ sample
でも希釈倍率毎に blank2 は必要になります。また、その場合は測定できる sample 数は減ってきます。ただし 450 nmに吸収の無いような sample であればそのような必要はあ
りません。

A8
Q2
A2

superoxide と WST の反応の阻害が 0（発色が 100％）となるところが全く発色しません。酵素(Xanthine Oxidase)5News No.102(2002)

2．アレル特異的なオリゴプローブ(ASO)を用いる
SNP タイピング

ケミストからみた
ポストゲノム2

SNP を見分ける手法として最も単純に思いつくのは、通常のDNA マイクロアレイの手法を利用して SNP 部位を含むオリゴ
DNAプローブでアレル特異的な2本鎖形成反応を介してジェノタ
イピングする手法である 1,2)。この手法は、最も早くから検討された手法であるが、固定化プローブの G/C 含量や熱力学的パラメー
タなどを同程度にし、しかもクロスハイブリダイゼーションを避けられるようにする必要があるなどのため、ハイブリダイゼー
ションの条件の最適化が難しく、同時に多くのコントロールを必要とするなど、実用的観点からは多くの問題を含んでいる。

3．プライマー伸長法と蛍光法を利用する SNP タイピング〜 SNP タイピング その 1（蛍光法による検出）〜
九州大学工学研究院応用化学部門

片

山

佳

樹

プライマー伸長法は、ポリメラーゼなどの配列特異性の高い酵
素反応を用いるため、ASO を利用する手法に比べ識別能が高く、
近年、マススペクトルとの併用で多くの報告例がある。蛍光法を組み合わせた手法に関する報告はそれほど多くは無いが、幾つかの優れた手法が報告されている。それらは手法上から、均一系で行うものと、基板や担体上で行うものに分類できる。

3-1：均一法によるプライマー伸長アッセイ
プライマー伸長によるアレル特異的産物の生成を均一系で蛍光検出するには、プライマー伸長に伴い、蛍光シグナルが変化する
異なる個体間で遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なる場合、 仕組みが必要である。その様な例として、蛍光エネルギー移動
その頻度がその種全体の 1％以上である時に、これを多型、1％以 （FRET）を利用する TDI assay がある(Fig.1a) 3)。これは、SNP
部位の 1 塩基上流までの配列に相補的なフルオレセイン標識プラ
下のものを突然変異という。ある遺伝子が次世代に受け継がれる
イマーを用い、これに対し、それぞれ異なる蛍光基（ R O X と場合、その近傍にある多型部分も同時に受け継がれる場合が多い
TAMRA）で標識したジデオキシヌクレオチド 3 リン酸(ddNTP)
ため、多型は特定の遺伝子のゲノム上での位置決定に有用なマーを用いてプライマー伸長反応を行う。ジデオキシ体であるので、伸カーとなる。すなわち、ある疾患を有する群に特異的な変異を見
長は一塩基で止まるが、この時組み込まれた塩基に標識されてい
つければ、その近傍に疾患遺伝子が見つかる可能性が高い。一塩る蛍光基へフルオレセインから FRET が生じてフルオレセインの基多型（SNP）は、最も頻度の高い多型（1000 塩基に一つ）で蛍光が減弱するとともに、対応する塩基に標識された蛍光基のシあり、最も有用性が高い。そのため近年、この位置を特定するマッ
グナルが増大する。これを計測すればジェノタイピングができる
ピングにより、既に膨大な SNP データが収集されている。しかしというものである。
この手法は、条件の最適化などが簡単である半ながら、得られた SNP を用いて診断や解析を行う場合、特定の面、同一チューブ内で全ての操作ができるようにするため、PCR
SNP がどんな塩基になっているか（SNP のタイプ）を知る必要
後、過剰のプライマーや dNTP を酵素消化し、その後、その酵素がある。これを SNP タイピングという。SNP タイピングでは、いを熱失活するなど、多段階の操作が必要で、煩雑さを伴う。純粋かに正確かつ迅速、安価に行えるかがポイントとなる。
SNP タイピングを行う場合、以下の 4 つの戦略が用いられる。 なプライマー伸長法では無いが、これを改良した手法に DOL assay がある（Fig.1b）4)。この手法では、ポリメラーゼによる塩基
1) アレル特異的なオリゴプローブを用いるハイブリダイゼー
伸長の代わりに、2 つのオリゴヌクレオチドを DNA リガーゼで結ション合することを利用する。すなわち、 5’末端にフルオレセイン標識
2) プライマー伸長法：SNP 部位、あるいはそれより 1 塩基上流
したSNP部位の一塩基上流までの配列に相補的なオリゴプローブ
までのプライマーを結合させておいて、SNP特異的におこると、3’末端に蛍光標識し、SNP 部位を含み、それより下流の配列
伸長反応の生成物から判断。
に相補的なオリゴプローブを用意する。後者は、SNP 部位の相補
3) kinetic PCR ：特定の SNP 特異的な PCR を利用し、増幅過塩基の違いにより、標識する蛍光基を ROX と TAMRA と言う風
程を追跡する。
に変えておく。これらのプローブと DNA リガーゼを PCR 反応溶
4) PCR が不要な手法
液に同時に加えておくと、SNP 部位を含む PCR 産物の増幅に伴検出には、蛍光法とマススペクトルが利用される。特に最近、プラい、リガーゼにより結合したプローブが生成してくる。その際、結イマー伸長法とマススペクトルを組み合わせたものが非常に多く合されるプローブは SNP 部位に相補的なものに限られるから、フ報告されているため、これに関しては、次回改めてご紹介するこルオレセインの励起波長で励起すると、FRET の結果増加する蛍とにし、今回は蛍光法を利用した SNP タイピングを概説する。
光波長がいずれのものであるかにより SNP が判定できる。DOL

1．はじめに6

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Fig.1 Endogenious SNPs typing using FRETa) TDI assay, b) DOL assay

assay では、全ての反応が 1 つのチューブ内で一度に行え、非常に簡単であるが、多検体処理には向かない欠点もある。

3-2：基板や担体上でのプライマー伸長アッセイ
蛍光検出の場合、プライマー伸長を基板上で行うと、蛍光標識の種類が最低 1 種類あればよいことと、多くのコントロールが必
要ないことから高密度のアレイは必要なく、さらにプライマーを1塩基伸長を用いる
合成してからアレイを作成できる利点がある。
ものとしては、Affymetrix のオリゴヌクレオチドタグアレイを利用した方法や、Pastinen らの方法がある。
Affymetrix の手法は、従来のマイクロアレイが初めから決められた目的にしか使えないという欠点を克服するために、プローブではなく、特定の配列を認識するためのタグ配列を固定化してアレ
イとしたものを用いる手法である（Fig.2a）5)。この場合、標的のSNP に対するプローブをタグに結合したプライマーを合成し、タグアレイ上に固定化し、SNP 部位を含む PCR 産物をテンプレー
トとして、蛍光標識 ddNTP を用いて 1 塩基伸長反応を行う。この手法は、30 × 30 µm の基板上に 32000 種づつのパーフェクト
マッチとミスマッチのプローブを固定できるが、タグの設計にはASO でのプローブ設計同様の最適化の困難さを伴う。これに対し、 Pastinen らは表面をイソチオシアネート処理したガラスプ
レートに末端アミノ化オリゴDNA型プライマーを固定したプライ
マーアレイを調製している。これと PCR 産物を 2 本鎖形成後、蛍光標識 ddNTP で一塩基伸長すると加えた標識塩基に対応する
SNP のスポットのみが蛍光を発することになる（Fig.2b）6)。彼らはこの手法を一塩基伸長だけではなく、さらに多くの塩基配列を伸長させる手法にも応用している（Fig.2c）7)。この場合には、PCR 産物から T7RNA ポリメラーゼで RNA として 2000 倍程度増幅し、プライマーアレイと逆転写酵素によって伸長反応を行う。

そうすることで、PCR の際に、1％程度なら複数の副産物が生成しても影響が無いようにしている。この手法では、PCR に 4 時間、検出までに 1 時間、検出に 10 分という時間で、40 の変異に対し8000 以上のジェノタイピングが可能であるという。
基板ではなく、蛍光ビーズ担体上にプライマー伸長産物を捕捉し、フローサイトメトリー分析を用いることで多検体処理を可能にした方法として Luminex assay がある（Fig.2d）8,9)。この手法では、各プライマーは、5’端にそれぞれ異なる ZipCode と呼ばれる配列を付加してある。このプライマーを用いて SNP 部位を含む PCR 産物をテンプレートとして、蛍光標識 ddNTP を用いて一塩基伸長反応を行う。こうして得られる蛍光性伸長産物を蛍光性
ビーズで捕捉するが、各ビーズ表面には、それぞれ別の ZipCodeと相補的な cZipCode 配列が修飾してあるため、ビーズごとに同種のプライマーを捕捉する。その後、ビーズの蛍光と伸長した塩基にし標識された蛍光の種類をセルソーターで分析して55種類の
SNP に関し 181 のジェノタイピングを一度に行っている。最近では、異なる波長の蛍光ビーズを多く用いることにより、さらに多検体の処理も可能であるとされている。

4．Kinetic PCR (Real time PCR)を利用する
SNP タイピング
Kinetic PCR は、PCR 産物の生成過程を蛍光法などでモニターする手法である。この時、PCR 産物がアレル特異的に生成すれば、SNP タイピングに利用できる。 TaqManPCR 法は、代表的な
Kinetic PCR の手法である(Fig.3a) 10-12)。この場合、SNP 部位を含む配列に相補的な PCR プライマーと分子内に FRET を起こす２種類の蛍光基を標識し、２つの PCR プライマーにはさまれた領域のどこかに相補的なプローブを用いる。ここで用いる

TaqDNA ポリメラーゼは、5’→ 3’エンドヌクレアーゼ活性を持っ7

News No.102(2002)

Fig.2 SNPs typing using primer extention on a chip or microspherea)Oligo-Tag array, b) Primer array with single-base extentionc)Primer array with multi-base extention, d) Luminex assayているので、テンプレート上に相補鎖が合成されていく過程で、その途中に結合している蛍光オリゴプローブは分解される。そのため、2 種の標識蛍光基間の FRET が解消され、蛍光波長が変化する。両者の蛍光波長の強度変化をリアルタイムにモニタリングすることで PCR 産物の生成過程が追跡できる。PCR は、用いるプライマーが結合できるアレルでのみ起こるから、PCR 産物生成か
ら SNP の判定ができる。同様に FRET を利用するものに、分子ビーコンを用いる手法がある（Fig.3b）13,14)。分子ビーコンは両末端に蛍光基と消光基を標識した一本鎖 DNA で、分子内で相補的配列を有し 2 本鎖を形成すると、2 つの色素が近接して蛍光が消光す

8る。しかし、中央の配列に相補的な配列にハイブリダイズすると、2 つの色素間距離の増大に伴って蛍光が回復する。そこで、SNP
部位の塩基と、それに対応して標識された蛍光基がそれぞれ異なる４種の分子ビーコンを用いると、標的部位の PCR による増幅に伴って回復する蛍光波長を測定することでSNPタイピングが均一系で可能となる。この手法は、スマートな方法であるが、PCR 増
幅条件が難しく、ゲノム DNA で実際に行うと条件設定に難がある。分子ビーコンは、これとは別に後述する Sniper assay で威力を発揮する。
TaqMan PCR 法と同じアレル特異的 PCR 反応を利用し、蛍光News No.102(2002)

Fig.3 SNPs typing using kinetic –PCR strategya) Taq-Man PCR, b) Allele-specific molecular beacon

ではなく、PCR 反応の進行に伴い dNTP が消費される際に生成する副産物であるピロリン酸を、アデノシン 5’- ホスホサルフェートと ATP スルフリラーゼを用いて ATP に変換して化学発光分析する Pyrosequncing も報告されているが、実用性の程は定かでは無い 15)。また、各アレルに対応する PCR プライマーをアダマンタン
や DANSYL 等の異なるハプテンで修飾し、これを用いて PCR を行い、抗体標識ビーズで PCR 産物を捕捉して、酵素標識抗体で検出する LCx assay 等も報告されている。単純にアレル特異的 PCRを行って、生成する 2 本鎖 DNA の増加を 2 本鎖特異的蛍光プロー
ブである PicoGreen で追跡する簡易法も報告例がある 16)。
アレル特異的 Kinetic PCR 法は簡便さが長所であるが、プライマーの結合が完全にアレル特異的とはならないため、別のアレルでも遅いながら PCR が進行する等、条件設定と正確性に難がある。また、多検体処理に適さない。

5．PCR が不要な手法
PCR は、サンプル量が限られるゲノム DNA を用いて SNP 判定をする際に、シグナルを増幅するために非常に有効であるが、副生成物が生じる危険性と共に、時間がかかると言う欠点がある。もし、PCR を用いることなくシグナルが増幅できれば、非常に操作性のよい多検体処理に適した手法が開発できると考えられる。その様な可能性を有する手法としてInvader assayとSniper assayがある。
Invader assay は、2 つのアレルに特異的なレポータープロー
ブ、Invasive プローブと Flap エンドヌクレアーゼによる切断反応を利用する手法である（Fig.4a）17-19)。レポータープローブは、テンプレート DNA に対し SNP 部位から 3’末端側に相補的な配列を有し、さらにプローブの 5’側にフラップと呼ばれる配列が存在する。Invasive プローブは、テンプレートの SNP 部位に対し 5’側に相補的な配列を有し、SNP 部位にあたる部分の塩基は任意のものでよい。この 2 つのプローブをテンプレート DNA と混ぜて 2 本鎖形成反応を行うと、レポータープローブとテンプレートで形成される 2 本鎖の SNP 部位に Invasive プローブが一塩基侵入することになる。Flap エンドヌクレアーゼは、この構造を認識してレポータープローブの 2 本鎖を形成していないフラップ配列部分を切断する。溶液内には、Fig.4a の様に 2 種のレポータープローブのフラップ配列に相補的な一本鎖部分を有する FRET プローブが入っており、切断されたフラップは相当する FRET プローブに結合する。FRET プローブは、その他は分子内で 2 本鎖を形成する構造をもち、蛍光基と消光基で標識されており、分子内で消光している。ところが、フラップが結合すると、ここに先ほどと同様の構造が生じ、蛍光基を標識した一本鎖部分が切断され、 FRETが解除されて蛍光が増大する。増大する蛍光波長から、どちらのアレルであるかが判定できるわけである。ただし、フラップ部位は切断されなくてもFRETプローブに結合する可能性があるため、弱いながら切断反応は進行する。したがって、2 種の蛍光増大のタ
イムコースを追跡して、その差からアレルを判定する。この手法
では、蛍光標識プローブは共通のものを使用でき、また一定温度で行え、PCR も不要であることからコストが抑えられる利点がある。ただし、サンプル DNA が他の手法に比べ大量に必要となる欠点もある。
PCR 不要の手法として、前述の分子ビーコンを用いる Sniper

9News No.102(2002)

Fig.4 SNP typing without PCRa) Invader assay b) Sniper assay

assay と言う手法も報告されている(Fig.4b) 20,21)。この手法では、両端にサンプル SNP 部位を含む領域に相補的な配列を含み、一方の末端1 塩基が各アレルの SNP 部位に相当するように設計した一本鎖プローブを用いる。このプローブとテンプレート DNA をハイブリダイズすると、SNP 部位が相補的であったプローブのみがリガーゼで環状 DNA に変換される。プローブの残りの部分には、分

4) X. Chen, K.J. Livak, P-Y. Kwok, Genome Res., 8, 549 (1998).
5) J-B. Fan, X. Chen, M.K. Halushka, A. Berno, X. Huang, T. Ryder,
R.J. Liphutz, D.J. Lockhart, A. Chakravarti, Genome Res., 10,853 (2000).
6) T. Pastinen, A. Kurg, A. Metspalu, L. Peltonen, A-C. Syvanen, Ge-nome Res., 7, 606 (1997).
7) T. Pastinen, M. Raitio, K. Lindroos, P. Tainola, L. Peltonen, A-C.

子ビーコンと相補的な配列が組み込まれており、環状になったものはここで用いる特殊なポリメラーゼにより連続して相補鎖が合成され、次々に分子ビーコンが結合するため、蛍光が大きく変化する。この手法は、迅速にジェノタイピングできる可能性を有している。

9) M.A. Iannone, J.D. Taylor, J. Chen, M.S. Li, P. Rivers, K.A. Slentz-

6．おわりに

10) T. Morris, B. Robertson, M. Gallagher, J. Clin. Microbiol., 34, 2933

以上、蛍光を用いる SNP 判定法を述べた。どの手法にも一長一短はあるが、今後、多検体処理の面から考えると、Pastinen らのアレイ法や Luminex assay、迅速性からは DOL assay、Invader
assay、Sniper assay などが有望である。ただし、いずれの手法
も、より少量のサンプルで行えるようにすることや、S/N 比をあげる、自動化の工夫など、今後更に改良が必要であろう。
次回はマススペクトルを用いるSNPタイピングについてご紹介する。

Syvanen, Genome Res., 10, 1031 (2000).
8) J. Chen, M.A. Iannone, M-S. Li, J.D. Taylor, P. Rivers, A.J. Nelsen,
K.A. Slentz-Kesler, A. Roses, M.P. Weiner, Genome Res., 10, 549(2000).
Kesler, M.P. Weiner, Cytometry, 39, 131 (2000).
(1996).
11) M.A. Doll, D.W. Hein, Anal. Biochem., 288, 106 (2001).
12) K.J. Livak, J. Marmaro, J.A. Todd, Nature Genet., 9, 341 (1995).
13) S. Tyagi, D.P. Bratu, F.R. Kramer, Nature Biotech., 16, 49 (1998).
14) A.S. Piatek, S. Tyagi, A.C. Pol, A. Telenti, L.P. Miller, F.R. Kramer,
D. Allamd, Nature Biotech., 16, 359 (1998).
15) A. Alderborn, A. Kristofferson, U. Hammerling, Genome Res., 10,1249 (2000).
16) S. Germer, M.J. Holland, R. Higuchi, Genome Res., 10, 258 (2000).
17) V. Lyamichev, A.L. Mast, J.G. Hall, J.R. Prudent, M.W. Kaiser, T.

参考文献
1) J.G. Hacia, B. Sun, N. Hunt, K. Edgemon, D. Mosbrook, C. Robbins,
S.P.A. Fodor, D.A. Tagle, F.S. Collins, Genome Res., 8, 1245 (1998).
2) D.G. Wang, J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky, G.

Neri, M.A.D. Brow, Nature Biotech., 17, 292 (1999).
18) V. Lyamichev, M.A.D. Brow, V.E. Varvel, .E. Dahlberg, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 96, 6143 (1999).

Ghandour, N. Perkins,E. Winchester, J. Spencer, L. Kruglyak, L. Stein,19) C.A. Mein, B.J. Barratt, M.G. Dunn, T. Siegmund, A.N. Smith L.

L. Hsie, T. Topaloglou, E. Hubbell, E. Robinson, M. Mittmann, M.S.

Esposito, S. Natland, H.E. Stevens, A.J. Wilson, M.S. Phillips, N.

Morris, N. Shen, D. Kilburn, J. Rioux, C. Nusbaum, S. Rozen, T.J.

Jarvis, S. Law, M.de Arruda, J.A. Todd, Genome Res., 10, 330 (2000).

Hudson, R. Lipshutz, M. Chee, E.S. Lander, Science, 280, 1077

20) P.M. Lizardi, X. Huang, Z. Zhu, P. Bray-Ward, D.C. Thomas, D.C.

(1998).
3) X. Chen, B. Zehnbauer, A. Gnirke, P-Y. Kwok, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 94, 10756 (1997).

10

Takova, R.W. Kwiatkowski, T.J. Sander, M.de Aruda, D.A. Arco, B.P.

Ward, Nature Genet., 19, 225 (1998).
21) A.S. Piatek, S. Tyagi, A.C. Pol, A. Telenti, L.P. Milller, F.R. Kramer,
D. Alland, Nature Biotech., 16, 359 (1998).

News No.102(2002)

Topics on Chemistry
細胞内情報伝達におけるリスク管理〜 PKA 活性の可視化プローブ〜（株）同仁化学研究所

細胞はそれ自体独立して生きているわけではなく、細胞社会を構成するメンバーとして常に外部からの情報を受けている。 情報というと、聞き流してもよさそうないい加減なイメージだが、増殖や分化や細胞死といった生死を決定する重要な情報も含まれている。 むしろ一個一個の細胞は、何のために生きるかという目的すら、外からの情報に依存してるといった方がいいのかも知れない。
絶え間なく入ってくる数多くの情報を同時に処理し、しかも情報ごとに異なった応答をしなければいけない。 聞き流してもいいような情報と、生死を分けるような重要な情報とが混線しない
ように適切に処理されるには、どんな情報処理の仕組みが必要なのだろうか。 細胞内は無数のタンパク質が高濃度に存在する混
沌とした世界だが、そこにある秩序を見いだすべく、それらの相互作用の全体像を解明する試みも盛んに行われている。

佐々本

一美

ある。 生物学的にももちろん重要なパスウェイであるが、前述の 2 通りの伝達機構の交差点にも位置し、技術的な困難さも予想される。 最近になって、工藤ら 1)による蛍光標識された合成基
質ペプチドによる PKA の可視化技術や、萩原ら 2)や梅澤ら 3)による遺伝子工学的なアプローチによる PKA プローブも相次いで報告されている。 また Tsien ら 4)も同様の手法で、 PKA によってリン酸化される基質部分に良く知られた Kemptide のアナログ、そしてそのリン酸化認識ドメインとして 14-3-3τ
（LRRASLP）
を用い、さらにそれらの両端を、それぞれ変異 GFP（YFP, CFP）
で挟んだキメラタンパク質によるイメージングを報告している。

個々の情報に対して個別の伝達経路をもつのは非効率であり、PKA プローブの原理
大変なコストがかかるだろう。 したがって、この部分はかなり
統合化・共通化されているが、同時に情報伝達の混線のリスクが基質部分のセリン残基が PKA によってリン酸化されると、今常につきまとうことになる。 細胞内での情報の受け渡し方には
度はその部分が 14-3-3τ によって認識される。 14-3-3τ の正に
基本的に 2 通り存在する。 一つは、リン酸化カスケードのように相手を認識した 1：1 のリレー形式である。 情報の送り手と受荷電した Arg/Lys リッチな認識部位と、負に荷電したリン酸化セ
け手とは、酵素（キナーゼ）と基質との特異的な関係であり、情リン部位とが接近することで、蛋白質の高次構造のダイナミック
報はタンパク質の形（活性）として担われる。 一方、セカンドな変化が引き起こされる。 それによって、蛍光性の YFP と
CFP とが接近し、CFP から YFP への蛍光共鳴エネルギー移動
メッセンジャーを介するものは、情報がいったん低分子（あるいはイオン）の濃度に置き換わる。 濃度の違いによって情報の受 （FRET）が観測される。 実際、HeLa その他の生きた細胞を刺激したとき、刺激が伝わる様子がうまく捕らえられているが、論け手が異なるもので、いわば不特定多数に向けて情報発信を行う
文にもあるように、キナーゼと表裏一体をなすフォスファターゼ
ようなものである。 多くの情報がここでは 1 種類のセカンドメッセンジャーに姿を変えるわけで、情報の流れの結節点とも考による脱リン酸化の部分はまったく不明である。 効率的な情報
えられ混線のリスクが大きいと思われる。 前者のケースでも、素伝達を行うため、PKA は細胞内の特定の足場にアンカーリングプ
こロテインを介して係留されていることが最近分かってきたが5)、早くパートナーを見つけださなければならず、どのように混線をれらのプローブを用いて情報伝達のリスク管理の機構が少しずつ回避しているのか不思議である。 正確に情報を伝えるという点解明されていくと思われる。
では、一見危うい機構にも思えるが、何か生物学的な合理性があるに違いない。
そうした疑問を解く一つの鍵は、伝達分子の局在化である。
送り手と受け手とが近接した位置関係にあれば、情報はよりス
ムーズに流れる筈である。 したがって、伝達分子の細胞内での空間的な位置情報を得ることが重要になってくる。 これまで、代表的なセカンドメッセンジャーである Ca(II) に対しては、プロー
ブと呼ばれる蛍光性の試薬が数多く開発されてきた。 それによって、細胞内での Ca(II) 濃度の変化が蛍光強度の変化として可視化され、Ca(II) を介した細胞機能の発現機構の解明に大きく貢献してきた。 ところが、cAMP を始めとするその他のセカンドメッセンジャーについては、Ca(II) に対するキレート剤のような認識素子がないため、化学的なアプローチは困難である。 さらにもう一方の伝達機構であるリン酸化カスケードにいたっては、
これまで直接情報の流れを見ることはまったく不可能だった。
特に、 Ca(II) 以降関心を集めてきたのは、セカンドメッセン
ジャー cAMP から A キナーゼ（PKA）へと向かう情報の流れで

参考文献
1) H. Higashi, K. Sato, A. Ohtake, A. Omori, S. Yoshida, Y. Kudo,

FEBS Lett., 414, 55 (1997).
2) Y. Nagai, M. Miyazaki, R. Aoki, T. Zama, S. Inouye, K. Hirose, M.
Iino, M. Hagiwara, Nature Biotech., 18, 313 (2000).
3) 日本分析化学第 50 年会講演予稿集（2001）p205.
4) J. Zhang, Y. Ma, S. S. Taylor, R. Y. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.,
98,14997 (2001).
5) S. Edwards, J. D. Scott, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 217 (2000).

関連商品
品名
AR Ⅱ
DR Ⅱ

容量

価格（￥）

メーカーコード

500 µg500 µg29,00029,000

A407
D510

11

News No.102(2002)

新製品

試作品
自己組織化単分子膜 (SAMs)研究用試薬

Detergent Screening Set
Detergent Screening Set (first choice)
よく使われている代表的なDetergent 5種類を組み合わせたタイプ。
〈セット内容〉
CHAPS, n-Dodecyl-β-D-maltoside, n-Octyl-β-D-glucoside,

Dithiobis(C2-NTA)

Sodium cholate(purified), Sucrose monolaurate
以上 5 種類の各 200 mg 包装

Detergent Screening Set (for crystalization)
タンパク質の構造解析のための結晶化に用いられた実績のある 5
種類の Detergent を組み合わせたタイプ。
〈セット内容〉
n-Decyl-β-D-maltoside, n-Dodecyl-β-D-maltoside, n-Octyl-βD-glucoside, n-Octyl-β-D-maltoside, MEGA-10
以上 5 種類の各 200 mg 包装〈結晶化への応用例〉
n-Decyl-β-D-maltoside
ウシ心臓：cytochrome c oxidase1)
グラム陰性菌：tetracyclin cation/proton antiporter2)
n-Dodecyl-β-D-maltoside
ウシ心臓ミトコンドリア：ATP synthase3)
n-Octyl-β-D-glucoside
Trypanosoma cruzi：Trypanothione reductase4)
Rhodobacter sphaeroids：reaction center5)
Thermus thermophilus HB8：DNA excision repair enzyme

UvrB6)
ヒト：17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD1)7)
MEGA-10
ウシ心臓ミトコンドリア：ubiquinol-cytochrome c reductase8)

参考文献
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

T. Tsukihara, et al., Science, 269, 1069 (1995).
C. Yin, et al., Molecular Microbiology, 38, 482 (2000).
R. Lutter, et al., Biochem. J., 295, 799 (1993).
R. L. Krauth-Siegel, et al., FEBS Lett., 317, 105 (1993).
J. P. Allen, Proteins, 20, 283 (1994).
A. Shibata, et al., Acta Cryst., D55, 704 (1999).
S. Lin, et al., J. Endocrinol., 150, S13 (1996).

8) W. Yue et al., Biochemistry, 30, 2303 (1991).

品名

容量

価格（￥）

Detergent Screening Set (first choice)
1 set
14,000
Detergent Screening Set (for crystalization)
1 set
18,00012

メーカーコード

DS04
DS05

〈特長〉
• NTA 末端を持つ自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayers : SAMs)を作製することができる。
• His-tag 技術により、特定の配向を維持したまま蛋白質を結合できる。
近年、 His-tag 技術により、複雑な高次構造を持つ蛋白質を、その活性を損なわずに固体表面に化学的に結合させることが可能になっています。その基本原理は、NTA 誘導体を官能基（通常、活性エステル、チオール、エポキシなどの反応性基）で修飾した
固体表面と反応させ固定化した後、 Ni(II) を加えて錯形成させます。その時、Ni(II)の配位座は完全には満たされず、空いた部分には水が配位しています。この状態で 6 個のヒスチジンを末端に発現させた融合蛋白質を加えると、ヒスチジン部分が Ni(II)に配位す
るため、特異的かつ一定方向に固体表面に結合されます（この結合は強固ですが、フリーのヒスチジンやイミダゾール、EDTA 等のキレート剤によって可逆的に解離します）。この His-tag 技
術は、人工蛋白質の精製や表面プラズモン共鳴(SPR)等に使用されています。
今回、NTA 末端を持つジスルフィド、Dithiobis(C2-NTA)を御用意いたしました。アルキルジスルフィド化合物は、アルカンチ
オールと同様に、金表面と反応して Au-S 結合すると共に、アルキル鎖同士の相互作用によって高い配向性を持つ単分子膜を形成することが報告されています。 Dithiobis(C2-NTA)も、他のアルキ
ルジスルフィドと同様に SAMs を形成することをサイクリックボ
ルタンメトリー(CV)で確認しております（データ未掲載）。
この Dithiobis(C2-NTA)は、金表面上に SAMs を形成させた後、His-tag”技術を用いることで、特定の配向を維持したまま蛋白質を結合できる可能性があります、各種センサー等への応用が期待されます。

News No.102(2002)

新製品
Get pureDNA Kit-Agarose
Get pureDNA Kit-Agarose〈特長〉• 70％以上の回収率で高純度の DNA が得られる。
• 広範なサイズの DNA(0.05 〜 50 kbp)の回収が可能。
• DNA をペレットで回収でき、目的濃度の DNA 水溶液を容易に調製できる。
• 短時間で回収できる。
• TAE および TBE buffer で泳動したゲルの使用が可能。
• 低融点・高強度タイプのアガロースからも回収可能。
• 1 sample あたり￥75 と低コスト。
アガロース電気泳動後の目的 DNA の回収には、透析膜を用いた電気泳動濃縮法、アガラーゼのようなゲル分解酵素を用いた方法、シリカ担体を用いた方法等が汎用されています。中でもシリカ担体を用いた方法はキットとして市販されてますが、1)処理するゲルの使用量に制限がある、2)高分子量の DNA では回収量が低い、という問題を抱えていました。
Get pure DNA Kit-Agarose はゲル溶解剤、ゲル除去剤およびDNA 共沈剤で構成され、目的 DNA を簡便に高回収率で得ることができます。DNA はペレットで回収されますので、バッファーで目的濃度の水溶液に調製でき、PCR、ライゲーション等にそのままご使用頂けます。
〈キット内容〉
65 ml x 1
・Gel lysis buffer
・Precipitation solution
65 ml x 1
・Co-precipitation solution(20 mg/ml glycogen) 0.5 ml x 1〈保存方法〉
本キットは冷蔵（0 〜 5℃）で保存して下さい。
〈操作方法〉〈Q ＆ A〉
Q1 このキットで使用可能なアガロースゲルの濃度は？
A1 ゲル濃度 3% 以内でご使用下さい。それ以上の濃度ゲルから回収する際、Gel lysis buffer にゲルが溶解しにくい場合があるので加温時間を延長し完全に溶解して下さい。またTAE 及び TBE buffer で泳動したゲルがご使用頂けます。
Q2 このキットで処理可能なゲル量はどれくらいですか？
A2 余分なゲルを含まないように切り出し、ゲル断片 200 mg 以
内でご使用ください。それ以上のゲル重量を取り扱う場合、試薬量を比例倍に増やしてご使用ください。またその際 1.5
ml チューブは使えませんのでご注意下さい。
Q3 回収したDNAフラグメントはどのようなアプリケーションに使用できますか？
A3 ライゲーション、制限酵素消化反応、PCR 増幅などにそのまま使用できます。
Q4 Co-precipitation solution(20 mg/ml glycogen)を使用しても回収後のアプリケーションに影響しませんか？
A4 A3 のアプリケーションにも問題なくご使用頂けます。Coprecipitation solution なしでも DNA は回収できますがペレットとして確認できないことがありますので上澄み除去の際には DNA ペレットを吸い取らないようご注意ください。
Q5 シリカパウダーや遠心フィルターを用いた方法との違いは何ですか？
A5 汎用されているシリカパウダーや遠心フィルターを用いた場
合、(1) スピンカラムを用いるため処理できるゲル量に制限がありました。(2)一旦 DNA をシリカ担体に吸着させた後、指定の buffer にて溶出しますが、その際高分子量の DNA 回
収率が低いという問題がありました。一方、本キットでは(1) ゲル量に合わせてスケールアップが可能です。(2)DNAを担体に吸着させることなくエタノール沈殿で回収するので、回収量も DNA サイズにほとんど影響しません。さらには (3)DNA をペレットとして回収できるため目的濃度のDNA 水溶液を調製できるという点が異なります。

1 2

3

4

5 6

7

Lane 1
Lane 2
Lane 3
Lane 4Lane 5
Lane 6
Lane 723.0 kbp
9.42 kbp
6.56 kbp
4.36 kbp
2.32 kbp
2.02 kbp
回収前

0.8% Agarose, 100V, 60 min

λDNA/Hind III
λDNA/Hind III の各フラグメントの回収

13

News No.102(2002)

新製品
Get pureDNA Kit-Blood, Get pureDNA Kit-Cell, Tissue
Get pureDNA Kit-Blood
Get pureDNA Kit-Cell, Tissue＜操作方法＞

Get pureDNA Kit-Blood〈特長〉• 高純度な DNA を高い回収率で得られる。
• フェノール、クロロホルムなど有害な有機溶媒は使用しない。
• スピンカラムを使わないため各種スケールに対応でき、大量のサンプルを一度に処理できる。
• 回収したゲノム DNA の A260/A280 値は 1.7 〜 1.9 となり、様々なアプリケーションにそのまま使用可能。
• 1 sample あたり￥143 と低コスト。
• キットには酵素類が含まれており別途準備する必要がない。

〈はじめに〉
ゲノム解析法の一つであるサザンブロット法、ゲノムライブラ
リーの作製、および PCR には、高純度のゲノム DNA を簡便かつ短時間に抽出することが求められます。本キットは、①サンプルを溶解する、②溶解液から RNA およびタンパク質を除く、③エタ
ノール沈殿により DNA を回収する、という 3 ステップで、高純度のゲノム DNA を簡便に抽出できます。本キットは、フェノール /クロロホルムを必要としませんので抽出した DNA は制限酵素反応、PCR 反応等にそのまま使用できます。
＜キット内容＞

Get pureDNA Kit-Cell, Tissue〈保存方法〉
本キットは冷蔵(0 〜 5 ℃) で保存して下さい。
〈キット以外に必要な試薬・機器類〉
・エタノール・70% エタノール
・1.5 ml 遠心チューブ・マイクロピペット及びチップ・遠心分離器・ボルテックスミキサー
・65℃恒温槽

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News No.102(2002)＜ Q&A ＞
〈試作品の評価にご協力頂いた先生方の感想〉
Q1 「Get pureDNA Kit-Cell, Tissue」で抽出できるサンプル量 ・「小型の淡水魚の PCR フィンガープリンティングを行うため、Get pureDNA Kit-Cell, Tissue を使って、ゲノム DNA を抽出しと回数は？
A1 培養細胞 3x106 〜 1x107 cells、動物組織 25 〜 30 mg (肝・ ました。全てのサンプルから 2 kb の PCR 産物を得ることができ( 香川大学 池田 滋 先生)
腎・心臓等)、マウス尾 0.5 〜 1.0 cm からの抽出は 1 キッました。
」
ト 200 回分です。また培養細胞 1x106 〜 3x106 cells からの・「操作が簡便で実験時間の短縮になりました。動物の胃からの抽出は 400 回分です。
DNA 抽出を行いました。サンプルの破砕はホモジナイザーを使わ
Q2 ゲノム DNA の純度と回収量はどのくらいですか？
ないで完全に溶解できました。他社のキットでは表示時間内の溶A2 どのサンプルも A260/A280 は 1.7 〜 1.9 になります。回収量
解ができないものが多く、また不溶物が残ってしまう場合があり
はサンプルの種類によっても異なりますので下表をご参照くますが、今回はそういったこともなく純度・回収率共に良かったださい。
(獨教医科大学 片岡 しのぶ 先生)です。
」

Table 各試料から得られるゲノム DNA 量
SampleRecovery(µg)
A260/A280
HeLa cell(1x107 cells)
80 〜120
1.7 〜 1.9
HL60 cell(1x107 cells)
40 〜 60
1.7 〜 1.9
Mouse liver(25 〜 30 mg)
40 〜100
1.7 〜 1.9
Mouse brain(25 〜 30 mg)
20 〜 40
1.7 〜 1.9
Mouse tail(0.5 〜 1 cm)
40 〜 60
1.7 〜 1.9
Whole blood(200 µl)
3 〜 10
1.7 〜 1.9

・
「サンマ、ノコギリガザミ、クルマエビから DNA を抽出しました。サンマは少し抽出量が少ないようですが他は充分量抽出されていました。スメアリングが極めて少なく DNA の切断や RNA のコンタミが少ないと思いました。操作は私どもが常法にしている
フェノクロ法より簡単で時間もかかりません。この抽出で重要なのは組織を最初によくホモジェナイズしておくことだと思いました。( 中略) フェノール、ジエチルエーテルなど怪しげなものを使わないので、廃棄に気を付ける必要がないのはよい点です。」( 東海大学 沼知 健一 先生)

Q3 「Get pure DNA Kit-Cell, Tissue 」を使って全血からのDNA 抽出はできますか？
A3 可能です。但し、使用前に一旦 PBS(-)にて血球層を洗浄し・「ブタの耳刻片、ニワトリの肝臓、脳、腎臓からゲノム DNA を
取り出しました。高分子の DNA を抽出する際は vortex やピペッ
ティング操作の多用が懸念されます。しかし抽出されたゲノム
DNA は通常のサザン解析や PCR 解析には十分に適用できるもの( 九州東海大学 山下 秀治 先生)と思います。
」てからご使用ください。

1 2 3 4 5 6 7 8 9Lane 1 : λDNA/Hind III
Lane 2 〜 5 : mouse heart DNA
Lane 6 〜 9:mouse kidney DNA
Lane 2, 6: undigested
Lane 3, 7: BamH I-digested
Lane 4, 8: EcoR I-digested
Lane 5, 9: Pst I-digested

・「ハブ毒腺からゲノム DNA を抽出しました。電気泳動では従来のフェノール / クロロホルム抽出に比べ、より高分子領域に濃いバンドが確認できたことから、かなり長いままのゲノム DNA を大量に抽出できたと考えられます。」 ( 崇城大学 千々岩 崇仁 先生)
平成 13 年 10 〜 12 月 モニター調べ
試作品評価にご協力頂きましたことを厚くお礼申し上げます。

0.8% Agarose, 100V, 60 min
マウス組織からの抽出 DNA とその制限酵素消化反応

品名

容量Get pureDNA Kit-Agarose
200 samples
Get pureDNA Kit-Blood
200 samples
Get pureDNA Kit-Cell,Tissue
200 samples

価格（￥）

メーカーコード

15,000GK01

28,500GK02

28,500GK03

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News No.102(2002)

試作品（3 月 29 日発売予定）
FDSS 専用 Calcium Screening Kit
Calcium Screening Kit〈特長〉• 高感度のシグナル検出が可能である。
• 細胞洗浄の必要がなく、操作が簡便。
• 96well, 384well の両方のマイクロプレートに対応。
• trail version でより最適な Assay Buffer の選択ができる。

性がございます。
各々の Assay Buffer でアッセイを行ない、2 〜 3 種類のうちから、より最適な結果が得られる Assay Buffer をお選びください。
各 Assay Buffer 1 本で 100 assays（96 穴プレート 1 枚分）が可能です。最適な Assay Buffer が決まりましたら、同一の Assay
Buffer を含む 2000 assays キットをご使用ください。

〈キット内容〉

ACalcium Screening Kit (Fura 2, type A)・Fura 2-AM
・DMSO
・Assay Buffer A

1 mg × 1 本
1 ml × 1 本
2本＊ Fluo 3 タイプのキットには、Fura 2-AM の代わりに Fluo 3-AM 1mg × 1 本が含まれます。
＊ type B のキットには、 Assay Buffer A の代わりに Assay Buffer B が含まれます。

B
本キットは、細胞内 Ca 測定試薬である Fluo 3-AM またはFura 2-AM と、その測定に必要な Buffer 等を全て組み込んだキットです。近年、High-Throughput Screening（HTS）に使用されている FDSS（浜松ホトニクス株式会社）での測定に、最適な構2+成としています。
操作は、 Fluo 3-AM または Fura 2-AM を Assay Buffer に溶かして、細胞を培養したマイクロプレートに添加するだけと簡便です。従来必要とされていた細胞の洗浄をせずに測定できるので、短時間で多くのサンプルを処理することが可能となりました。
1 キットで 2,000 assays（96 穴プレート 20 枚分）の測定が可
能です。
〈使用法〉
（マイクロプレート 20 枚を処理する場合）
1．マイクロプレート中で細胞を培養する（培地 100 µl/well）。
2．Fluo 3-AM または Fura 2-AM 1 mg を添付の DMSO 1ml で溶解する。
3．Assay Buffer を 200 ml の純水で溶解し、Fluo 3-AM または Fura 2-AM のDMSO 溶液 1 ml を添加した Loarding Buffer を作成する。
4．培地に 100 µl/well の Loarding Buffer を添加し、37℃で 1 時間インキュベー
トする。

5．そのまま薬剤添加による蛍光強度変化を FDSS にて測定する。

【trial version のご案内】
弊社では、測定条件に応じてより最適な Assay Buffer を選んでいただけるように、 Calcium Screening Kit （Fluo 3, trial
version） と Calcium Screening Kit（Fura 2, trial version）をご用意しております。
これらのキットには、2 〜 3 種類全ての Assay Buffer が組み込まれております。(Fluo 3 では typeA,B,C,Fura 2 では typeA,B)
Assay Buffer には、細胞外に存在する Fluo 3 または Fura 2 の蛍光を消去するためにそれぞれ異なった試薬が入っております。
細胞種や添加する薬剤などの測定条件によっては、「レスポンスが低い」「リガンドとの相互作用がある」などの問題が生じる可能

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orexin receptor を発現させた CHO 細胞（15,000 cells/well）を使用し、100
nmol/l orexin で刺激した際の蛍光強度変化。
FDSS 6000 で測定：Sens.ID
A)は最終濃度 2.5 µmol/l の Fura 2-AM で染色後、細胞洗浄したもの。
B)は Calcium Screening Kit(Fura 2, typeB)で染色（洗浄過程なし）したもの。

＊発売時までに仕様が一部変更になる可能性がございますのでご了承下さい。

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

Calcium Screening Kit(Fluo 3, trial version)
1set
RequestCalcium Screening Kit(Fluo 3, typeA)
2,000assays Request
Calcium Screening Kit(Fluo 3, typeB)
2,000assays Request
Calcium Screening Kit(Fluo 3, typeC)
2,000assays Request
Calcium Screening Kit(Fura 2, trial version)
1set
RequestCalcium Screening Kit(Fura 2, typeA)
2,000assays Request
Calcium Screening Kit(Fura 2, typeB)
2,000assays Request

CS05
CS06
CS07
CS08
CS02
CS03
CS04

News No.102(2002)

試作品
アミロイド染色試薬

BSB

れています。

化学名 1-Bromo-2,5-bis(3-carboxy-4-hydroxystyryl)benzene

BSB は、従来の色素に比べ、親和性・検出感度共に高い蛍光色素です。Skovronky らの結果から in vivo の系での使用も可能であると考えられます。従来の色素では組織染色など in vitro でしか検出できないものも多く、in vivo の系で沈着アミロイドを検出した報告はありません。BSB は安定性や毒性などの研究は必要です
が、FAP や BSE を含めたアミロイドーシスの診断・治療などの研究へのさらなる応用が期待されます。

〈特長〉• アミロイド β ペプチド( A β )に対して高い親和性 ( Ki ＝ 0.4µmol/l)1)をもつ。
• 従来の色素に比べ検出感度が高い蛍光色素である。
• 脂溶性物質で、脳−血液関門を透過する。

参考文献
1) D. M. Skovronsky, B. Zhang, M.-P. Kung, H. F. Kung, J. Q.
Trojanowski, V. M.-Y. Lee, Proc. Natl. Acad. Soc.U.S.A., 97, 7609
(2000).
2) 安東 由喜雄 , 臨床病理 , 48, 425 (2000).

アミロイドーシスはアミロイドが臓器や組織細胞の外に沈着し
3) 佐々本 一美 , Dojin News, 97, 11 (2001).
てこれらの臓器や組織の働きを阻害する病気です。アミロイドー
シスには、全身の様々な部分にアミロイド沈着が起こる「全身性アミロイドーシス」と一部の臓器のみに沈着が起こる「限局性ア
ミロイドーシス」があります。全身性アミロイドーシスには熊本
地方で患者の多い家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)と呼ばれる遺伝性のものがあり、肝臓でアミロイドを作り出し、それが全身の臓器などに沈着して障害を起こします。発症後約 10 年で死に至る難病ですが、現在はドミノ肝移植などの治療により命
他にも高齢で非遺伝的にを落とす危険性は少なくなっています2)。
発症する老人性アミロイドーシスや、透析患者の治療で使用する透析膜では除けないタンパク質が変化したアミロイドが引き起こ
す透析アミロイドーシス、リウマチで発現するタンパク質が切れて出来るアミロイドによる二次性アミロイドーシスなどがあります。限局性アミロイドーシスには、アミロイドが脳に蓄積する老人斑(SP) があり、アルツハイマー病の特徴の 1 つです 3)。また、
現在問題となっている狂牛病(牛海綿状脳症 , BSE)や新型クロイ
ツフェルト・ヤコブ病(vCJD)も限局性アミロイドーシスの一種です。
B S B はアルツハイマー病の研究において最初に用いられ、Skovronkyらはアミロイド前駆体タンパク質(APP)を発現するトランスジェニックマウス Tg2576 に BSB を静注し、18 時間後の脳組織の SP に色素が集積していることを確認したと報告しています 1)。
同様にアミロイドが沈着するその他のアミロイドーシスでもBSBを用いた研究が進められており FAP、透析アミロイドーシス
FAP 患者の小腸スライス切片の染色像。粘膜下層部分にアミロイドの沈着が見られる。
や二次性アミロイドーシスなどの組織染色を行なった結果、アミ
A：Congo Red 染色で、赤褐色に染まった部分がアミロイド。
ロイドが沈着した部分を感度よく染色していることが確認されま
B：BSB で染色したもので、白く光っている部分がアミロイド。
した。また、BSE や vCJD を発症した組織でも同様の結果が得ら （画像提供：熊本大学医学部臨床検査医学 安東由喜先生）

17News No.102(2002)

カタログご案内Web 版カタログが新しくなりました
今までの Web 版カタログは、 検索ができない 、 見つけにくい など使い勝手が悪いというご意見をいただいておりました。
お客様のご要望にお応えして変更を加え、このたびリニューアルいたしました。

1）全文検索が可能になりました。（* * により曖昧検索も可能です。"and" "or" による複合検索も可能です。）
2）商品名一覧の横には、目的・特徴がわかるように説明を加えました。
3）商品名順、化学名順、カテゴリ別、分析対象別にわかりやすくまとめました。
4）今まで通り、商品の説明はできるだけ詳しく表示しております。
本カタログはデスクトップタイプによく使われている 800 × 600 ピクセルのモニターを対象に設計しております。
サイズの大きなモニターをお使いの方は若干操作しづらいかもしれませんがご了承ください。

▲

総合カタログ第 23 版(2002

本カタログご希望の方は、弊社マーケティング部までご依頼ください。

182003)が完成しました