News No.123(2007)

2007 No.

123
CONTENTS●Review
人工脂質分子による核酸輸送
楠本 賢一

エイズから見た感染症研究の最前線原田 信志●Topics on Chemistry
新規アンジオテンシン変換酵素（ACE）
阻害活性測定法
野口 克也

News No.123(2007)

目次

製品案内

Review

製品価格詳細は掲載ページをご覧ください

人工脂質分子による核酸輸送
福岡県工業技術センター生物食品研究所 楠本 賢一 ...... 1
エイズから見た感染症研究の最前線
その 3 ウイルスのレセプターへの吸着と感染の機構
熊本大学大学院医学薬学研究部感染防御学分野 原田 信志 ....... 8

IC dyeSelf Assembled Monolayers 研究用試薬
分子生物学用 Good’s buffer

Topics on Chemistry
新規アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性測定法
株式会社同仁化学研究所 野口 克也 ............................. 11

タンパク質標識用キット

Commercial
新製品

IC dye .............................................................................. 12,
分子生物学用 Good s buffer ........................................... 14
IgG 精製キット ................................................................. 15
試作販売品
タンパク質標識用キット(1 mg タンパク質標識用) ........ 17
試作品
Self Assembled Monolayers 研究用試薬 ..................... 13
蛍光ラベル化キット ......................................................... 16
お知らせ
学会展示のお知らせ ............................................................. 10
フォーラム・イン・ドージン開催 ....................................... 11
九州大学 - 同仁化学組織対応型連携 ..................................... 12
販売中止 .......................................................................... 12,18

一心行の大桜
阿蘇の雲海
400
年の山桜です。
一心行の大桜は南阿蘇側のすそ野にある推定樹齢“フリーデスクトップ壁紙・熊本ふるさと百景” 提供
西原村の俵山中腹から撮影。雲海は冬と思われがちですが、条件が揃えば年中見れます。
平成 16 年の台風の被害で形は変わりましたが、大きな枝振りは健在で
撮影は 2006 年 6 月 29 日ものです。
花見の季節には多くの人で賑わいます。

News No.123(2007)

人工脂質分子による核酸輸送

Nucleic Acid Delivery with Artificially Synthesized Lipid Compounds［Abstract］

楠本賢一（Ken-ichi Kusumoto）
福岡県工業技術センター
生物食品研究所

Modifying the gene transfer process by using artificially constructed compounds is fundamental for research in the fieldof genomics, cell biology, tissue engineering, and genetherapy. However, few reports have focused on the structural characteristics using a library of artificially synthesizedamphiphiles for gene transfer in mammalian cells. In thisstudy, we have demonstrated that film-like self-assembly ofamphiphilic compound TMA-C2-DEA-C14 prepared by incubating at room temperature results in more than a 15-foldenhancement in the transfection efficiency with regard tomouse neural stem cells as compared to that of dispersion
state by ultrasonication. Electron microscopic analysis revealed that the film-like microstructures were dramaticallyaltered to liposome-like structures, including a number oftransport vesicles, on association with nucleic acids. Moreover, we have demonstrated that TMA-C2-Glu-C12 has thepotential to efficiently transfer siRNA, which has recently
emerged as a powerful tool for gene silencing in the field of
RNA interference, into mammalian cells. Our findings may
improve the development of the liposome/lipid-mediated genetransfer process and the research regarding the novel biological functions with artificial materials.

キーワード：デリバリーシステム、人工脂質分子ライブラリー、マ
ウス神経幹細胞、DNA、siRNA

1．はじめに核酸（DNA ／ RNA）は、すべての生物において遺伝情報を担う生体物質である。そのため、哺乳類細胞を標的にした核酸デリ
バリーシステムは、ゲノム解析、細胞生物学、再生医療学、臨床医療分野まで必要とされている技術である。DNA ／ RNA を単独で細胞内に輸送することは困難であることから、カチオン性脂質などを利用したリポソーム法 1, 2)、ウイルスベクター法 3)、ポリペ
特殊な装置を用いたマ
プチドのようなポリマーを用いた導入法4)、
イクロインジェクション法 5)、エレクトロポレーション法 6, 7)、遺伝子銃（パーティクルガン）法 8)など、種々のデリバリーシステムが考案されている。各方法には長所と短所がある。我々が研究対象としているリポソーム法は、インビトロジェン社のLipofectamine2000をはじめ多くの研究用試薬が開発されていることからも分かるように、簡単なプロトコールに沿って核酸を細胞内に導入できる最も利用されている手法である。リポソーム法からなる核酸デリバリーシステムでは、実質的に、脂質分子は
DNAやRNAを分解酵素や免疫応答から保護する脂質外皮となり、細胞膜を通過させる役割が知られている。本稿では、人工脂質分子の化学構造とそれらが発揮する細胞内輸送機能にフォーカスを向けて、これまでの研究を紹介したい。将来、人工脂質分子ライ
ブラリーが生み出す輸送機能に関する分子情報の蓄積が、バイオ機能を担う分子材料についてボトムアップからの構造設計を可能とし、優れた機能と安全性を兼ね備えたデリバリーシステムの発展に繋がるものと期待される（概念図）。

TMA-C2-DEA-C14(CH2)2-COO(CH2)12CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)12CH3

TMA-C2-DEA-C12(CH2)2-COO(CH2)10CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)10CH3

TMA-C2-DEA-C16(CH2)2-COO(CH2)14CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)14CH3

TMA-C4-DEA-C14(CH2)2-COO(CH2)12CH3+(CH3)3N(CH2)3CO-N(CH2)2-COO(CH2)12CH3
概念図 「人工脂質分子ライブラリーから輸送機能を発揮する分子材料の開発へ」1

News No.123(2007)

TMA-C2-DEA-C14(CH2)2-COO(CH2)12CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)12CH3

TMA-C2-DEA-C12(CH2)2-COO(CH2)10CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)10CH3

TMA-C2-DEA-C16(CH2)2-COO(CH2)14CH3+(CH3)3N(CH2)CO-N(CH2)2-COO(CH2)14CH3

TMA-C4-DEA-C14(CH2)2-COO(CH2)12CH3+(CH3)3N(CH2)3CO-N(CH2)2-COO(CH2)12CH3

Fig. 1 Chemical structures of artificially synthesized amphiphiliccompounds.
TMA-C2-DEA-C14 comprises a head region consisting oftrimethylamine (TMA) and a hydrophobic chain comprising 2
carbon atoms (C2), a connector region consisting ofdiethanolamine (DEA), and 2 tail regions consisting of ahydrophobic chain comprising 14 carbon atoms (C14).

2．人工脂質分子による DNA 輸送
リポソーム法においては、まず脂質分子の持つ正電荷を DNA の持つ負電荷と静電的相互作用を利用して複合体形成させることにより、細胞膜を通過させ核内に DNA 輸送を高めるという戦略である。リポソーム法は幅広く利用され HEK293 細胞や HeLa 細胞などの培養細胞では、ほぼ 100% に近い導入効率により遺伝子発現を可能にしている一方で、生体組織由来の初代細胞などに対しての遺伝子発現効率は、アデノウイルスベクターと比較して決して高くない。今回、我々が保有する人工脂質分子について、DNA 導入が困難とされている中枢神経系細胞に注目して、マウス胎児脳組織由来の正常神経幹細胞に対する DNA 輸送能力を評価した。

Fig. 2 Photographs of opaque emulsion and transparent solution of TMAC2-DEA-C14 prepared by different methods.
The opaque emulsion of TMA-C2-DEA-C14 was prepared byincubating in H2O for a month at room temperature. The transparent
solution was dispersed in H 2O by ultrasonication at a final
concentration of 1.3 mM for 1.0 min. Photograph: left, thetransparent solution (dispersion); right, the opaque emulsion (selfassembly).

2．2．TMA-C2-DEA-C14 溶液の調製
脂質分子を利用して遺伝子を細胞内に運ぶための手法では、

DNA との複合体形成前に、まず、どのような溶液にどのような方法で脂質分子を分散・溶解させるのか？ということを考えなければならない。脂質分子／ DNA 複合体は最終的に細胞と相互作用させるため、用いる溶媒は細胞毒性を示し難いもの、例えば、H2O、メタノール、エタノール、DMSO などが好まれる。今回、我々は、
H2O を選択し、一般的に使用されている超音波処理によりカチオ
ン性脂質 TMA-C2-DEA-C14 の分散を試みた。 TMA-C2-DEAC14 は H2O 中で 1 分間の超音波処理により完全に分散され透明の溶液になった（Fig. 2）。さらに、TMA-C2-DEA-C14 の相転移温
度が約 34℃であり、相転移温度以下で調製された脂質分子水溶液が発揮するバイオ機能を評価するために、TMA-C2-DEA-C14 を
H2O 中で 1ヶ月間、室温（25℃）にてインキュベーションし白濁溶液を得た（Fig. 2）。

2．3．マウス正常神経幹細胞の樹立
2．1．人工脂質分子
Kunitake T.らは、人工脂質分子の構造と集合形態の相関について詳細に検討を行い、人為的に H2O 中で安定なリポソームを形成させることに成功している 9–11)。我々は、これまでに合成・構築してきた人工脂質分子ライブラリーの中から、医療用タンパク質の生産を担う有用な細胞株である CHO 細胞に対して DNA を効率よく細胞内に導入・発現することのできるカチオン性脂質分子
ditetradecyl-acetyldiethanolamine-trimethylammonium（TMA-C2-DEA-C14）を報告した 12)。TMA-C2-DEA-C14 の化学構造は、ジエタノールアミン（DEA）をコネクターとして、ヘッド領域に正電荷のトリメチルアミン（TMA）とカーボン数 2 を持
つ炭化水素鎖（C2）、テイル領域にカーボン数 14 を持つ 2 つの炭化水素鎖（C14）を有する（Fig. 1）。

2

神経幹細胞は胚期や成人期の中枢神経系に存在し、未成熟で運命付けられていない自己再生型の組織性幹細胞である 13, 14)。神経幹細胞が神経疾患への細胞治療／再生治療や脳組織発生における機能解明のために不可欠とされるため、神経幹細胞への核酸デリ
バリーシステムの確立は重要である。我々は、Barnes D.W. らが提唱する神経幹細胞の無血清培養法 15)に則って、マウス胎生 14 日
目の脳組織から神経幹細胞の樹立を試みた。神経幹細胞のための増殖因子として知られている EGF と FGF2 存在下で培養・増殖した細胞集団は、神経幹細胞マーカーである Nestin を発現しており（Fig. 3）、さらに、樹立されたマウス正常神経幹細胞は、増殖因子を除いた培養液にて神経分化因子の刺激により神経細胞（βTub.III-positive）ならびにグリア細胞（GFAP-positive）への分化能を有していた。

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2．4．TMA-C2-DEA-C14 による神経幹細胞への DNA 導入

Fig. 3 Immunocytochemistry of mouse embryonic neural stem cells.
Neural stem cells were cultured for 24 h in the DMEM/F12 medium
with insulin, transferrin, chemically defined lipid concentrate,
selenium, EGF, and FGF-basic in a fibronectin-coated 24-well plate.
The cells were fixed with 2.0% paraformaldehyde solution andstained with anti-nestin antibody and Alexa Fluor 488-conjugatedsecondary antibody. Fluorescence images of nestin-positive neuralcells: left, phase contrast image (×400); right, fluorescence image( × 400).

A

GFP-expressed ceIIs(%)

50
40
30

人工脂質分子による神経幹細胞へのDNA導入能力を評価するた
めに、 cytomegalovirus 由来のプロモーター + エンハンサー（CMV-IE）制御下に蛍光タンパク質（GFP）を連結したプラスミ
ド DNA（pCMV-IE-GFP）を作製し、TMA-C2-DEA-C14 溶液と pCMV-IE-GFP の複合体を形成させ、poly-L-lysine でコート
した plate にて前培養した神経幹細胞に対して複合体を作用させ、GFP 発現した細胞を蛍光顕微鏡下で測定し、DNA 導入効率として評価した。超音波処理で調製した TMA-C2-DEA-C14 溶液を用いた DNA 導入効率は 2.3% ± 2.0% であり（Fig. 4）、水溶液中で十分に分散させたTMA-C2-DEA-C14から生み出された脂質／
DNA 複合体では、低い DNA 輸送能力であった。一方、室温にてインキュベーションを行い調製したTMA-C2-DEA-C14白濁溶液
による DNA 導入効率は 34.0% ± 2.4% であり、超音波処理により水溶液中に分散させたものと比較して、およそ 15 倍の導入能力を示した（Fig. 4）。興味深いことに、白濁溶液中にみられるような人工脂質分子TMA-C2-DEA-C14を自己集合体としてマクロ形
成させることにより、マウス正常神経幹細胞への DNA 輸送能力を大きく伸ばすことができた。人工脂質分子が発揮するバイオ機能を抽出する際に、脂質分子を組織化させることも新たな機能を生み出すために必要な要素なのかもしれない。

2．5．TMA-C2-DEA-C14 自己集合体の光学顕微鏡観察20100dispersion

seIf-assembIy
TMA-C2-DEA-C14

B

Fig. 4 Transfection efficiencies of TMA-C2-DEA-C14 solutions preparedby using different methods for neural stem cells.
A) Neural stem cells were precultured in 24-well plates andtransfected for 3.0 h with the DNA/TMA-C2-DEA-C14 mixture (1.5µg/5.0 µl). At 24 h post-transfection, fluorescent cells were counted
under a fluorescence microscope in more than 3 different views (aminimum of 300 cells/view). All the data points are averages
obtained from 2 replications performed on different days andexpressed as the mean ± standard deviation. B) Fluorescence
images of GFP-expressed cells transfected DNA with the TMA-C2DEA-C14 emulsion (1.5 µg/5.0 µl) for 3.0 h and cultured for 24 h:
left, phase contrast image (× 100); right, fluorescence image (×100).

TMA-C2-DEA-C14 は、室温にて自己集合化（白濁溶液状）させることで、超音波処理により分散化させたものと比較して、神経幹細胞への高い DNA 導入能力を発揮できるようになった。我々は、この白濁溶液を成している TMA-C2-DEA-C14 自己集合体がどのような脂質形状なのか？また、DNA と結合する際にどのような複合体形状であるのか？光学顕微鏡ならびに透過型電子顕微鏡のもとで観察した。はじめに、最終的な電子顕微鏡観察で注意しなければならないことは、サンプル作製時の染色処理による標的
構造物の形状が崩れることである。本来の TMA-C2-DEA-C14 自己集合体の形状を電子顕微鏡下で観察するために、まず光学顕微
鏡を用いて無処理の TMA-C2-DEA-C14 自己集合体を観察した。
TMA-C2-DEA-C14白濁溶液をスライドグラスに滴下し 1,000倍
にて観察を行うと、その自己集合体はフラットなフィルム様の構造物であり、それら多くは丸いエッジを持った多角体形状であった（Fig. 5A）。さらに、 TMA-C2-DEA-C14 自己集合体に DNAを相互作用させた場合には、フラットなフィルム様構造物は、丸みを帯びた構造に変化し、そこから突出した繊維状の構造物がいくつも観察された（Fig. 5B）。一方、超音波処理により十分に分散させた TMA-C2-DEA-C14 溶液では、フラットなフィルム様構
造物は観察されず、また、DNA と相互作用させた際に生じた丸みを帯びた構造も観察されなかった（Fig. 5C）。このように、光学顕微鏡下で観察された TMA-C2-DEA-C14 白濁溶液は、フラットなフィルム様構造物として特定の形状で組織化された自己集合体
であり、超音波処理により分散化させたものとは全く異なる形状であった。このことから、TMA-C2-DEA-C14 からなるフィルム
様自己集合体がマウス神経幹細胞への高いDNA輸送能力を発揮しているものと考えられる。

3

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Fig. 5 Optical images of TMA-C2-DEA-C14 self-assembly.
A) TMA-C2-DEA-C14 self-assembly. B) DNA/TMA-C2-DEA-C14
self-assembly complex. C) DNA/TMA-C2-DEA-C14 dispersion
complexes. Each solution was applied on a micro slide glass andobserved under an Axiovert optical microscope (× 1,000).

2．6．TMA-C2-DEA-C14 自己集合体の電子顕微鏡観察
光学顕微鏡下で観察されたTMA-C2-DEA-C14自己集合体の形
状を更に詳細に観察するために、白濁溶液をカーボングリッドに滴下し電顕用染色処理を行わずに透過型電子顕微鏡を用いて観察した。電子顕微鏡下で観察されたフィルム様自己集合体は、 0.5µm ~ 6.5 µm の範囲で平均 2.7 µm ± 1.5 µm の脂質分子から組織化された構造物であった（Fig. 6A）。また、一般的に使用されている Negative 染色処理を介した自己集合体の観察では、光学顕微鏡下でみられたフィルム様多角形状を壊す結果となり、今回の試験では無染色により全て観察した。次に、TMA-C2-DEA-C14
自己集合体に DNA を相互作用させた場合には、脂質分子からなる幹のような繊維形状とそこから分岐した細い脂質繊維も観察され、それらが集まってリポソーム様の小胞を多く生み出していた（Fig.
6B）。一方、超音波処理により分散した TMA-C2-DEA-C14 とDNA の複合体の形態は、全く異なるものであり、リポソーム様小胞も僅かに観察されるだけであった（Fig. 6C）。以上の結果から、
TMA-C2-DEA-C14 によるフィルム様自己集合体は、DNA と結合する際に多くのリポソーム様小胞を生み出し、神経幹細胞へのDNA 輸送能力を格段に上昇させていると考えられる。TMA-C2DEA-C14 脂質分子は、一般的な超音波処理により分散させた分子形態を出発点として DNA 複合体を形成させるよりも、組織化したフィルム様の脂質構造体からDNA複合体を形成させることにより、多くのリポソーム様小胞を生み出し、結果としてマウス神経幹細胞への DNA 輸送能力を高めることができた。興味深いことに、人の手によって作られた TMA-C2-DEA-C14 のフィルム様脂質構造物は、 DNA との相互作用によりその形状を劇的に変化させ、リポソーム様小胞を形成するというユニークな特徴を持っていた。

4

Fig. 6 Transmission electron images of TMA-C2-DEA-C14-RT selfassembly.
A) TMA-C2-DEA-C14 self-assembly: left image, × 3,000; rightimage, × 15,000. B) DNA/TMA-C2-DEA-C14 self-assemblycomplexes (× 15,000). C) DNA/TMA-C2-DEA-C14 dispersion
complexes (× 15,000). Each solution was applied on a carboncoated grid and observed under an electron microscope (Hitachi
H-7100, 75 kV).

2．7．TMA-C2-DEA-C14 化学構造と DNA 輸送機能の相関
本稿で人工脂質分子 TMA-C2-DEA-C14 が発揮するバイオ機
能；DNA 輸送能力を紹介してきた。TMA-C2-DEA-C14 は、室
温中にてインキュベーションを行うことで、フィルム様の多角構
造体として自己組織化され、DNA と相互作用する際には分散形態ではみられない多くのリポソーム様小胞を生み出すことができた。
では、TMA-C2-DEA-C14 の化学構造とフィルム様自己集合体を介したDNA輸送機能にはどのような相関があるのだろうか？そこで、我々が保有する人工脂質分子ライブラリーの中から、 TMAC2-DEA-C14 の類似化合物（Fig. 1；炭化水素鎖の長さが異なる
脂質分子 TMA-C2-DEA-C12、TMA-C2-DEA-C16、TMA-C4DEA-C14）を選抜し、TMA-C2-DEA-C14 と同様な試験を行った。その結果、TMA-C2-DEA-C12、TMA-C2-DEA-C16、TMAC4-DEA-C14 による DNA 導入効率は、 TMA-C2-DEA-C14 と比較して非常に低いものであった（Fig. 7）。TMA-C4-DEA-C14の炭化水素鎖の長さを変化させるだけで、 DNA 輸送能力は失わNews No.123(2007)3．人工脂質分子による小さな RNA の輸送

GFP-positive ceIIs(%)

10

近年、遺伝情報を持たないジャンク RNA とされていた noncoding RNA（ncRNA）の新しい機能が次々と明らかになりつつある。Fire A. と Mello C.C. らによる RNA 干渉（RNAi）の発見
は、二本鎖 RNA をベースとする新たな遺伝子発現の制御メカニズ
ムに関する研究の礎を成した 21)。近い将来、 RNAi が安全かつ有

8
6
4
2
0
TMA-C2-DEA-C12

TMA-C2-DEA-C16

TMA-C4-DEA-C14

Fig. 7 Transfection efficiencies of amphiphilic compounds similar to TMAC2-DEA-C14.
The cells were transfected for 3.0 h with mixtures of DNA/similaramphiphile (1.5µg/5.0µl). At 24 h post-transfection, fluorescent cells
were counted under a fluorescence microscope in more than 3
different views (a minimum of 300 cells/view). All data points areaverages obtained from 2 replications performed on different days
and expressed as the mean ± standard deviation.

れ、TMA-C4-DEA-C14 の持つ炭化水素鎖のバランスは DNA 輸
送機能に大きな影響を与えた。TMA-C2-DEA-C14 は、フィルム
様自己集合体の形成、DNA との相互作用で生み出されるリポソー
ム様小胞、神経幹細胞への DNA 輸送能というポテンシャルを発揮
する化学構造を持った人工脂質分子である。
近年、開発されてきたリポソーム法は、汎用されている
HEK293 細胞や HeLa 細胞などの培養細胞に対して高効率に遺伝子を導入・発現させることができる。しかしながら一方で、神経幹細胞のような生体組織に存在する正常細胞などに対しては、アデノウイルスベクターと比較して、その遺伝子発現効率は決して高くない 16–18)。その理由として、①細胞膜の通過効率、②細胞核への移行効率、③発現遺伝子の転写効率などウイルスベクターの持つ能力と比較して人工ベクターが劣っていることにあると考えられる。これは、人の手によって短期間で発展させてきた人工脂質ベクターと長い進化の過程で獲得してきたウイルスベクターの能力との大きな差であり、ウイルスが獲得してきた機能は洗練されているということである。本稿で述べた TMA-C2-DEA-C14 自己集合体による DNA 導入技術についても、汎用されているリポソーム法と同様に、マウス正常神経幹細胞への導入効率は最大でも約 4 0 % であり、ウイルスベクターと比較すると決して高い
DNA 輸送能力ではない。今後、どのような技術により人工ベク
ターが発展していけるのか、我々は、人工脂質分子の化学構造が持つバイオ機能に関する情報を蓄積することにより、将来、神経幹細胞のような組織性幹細胞をはじめ導入が困難とされている細胞種（多くの分野で遺伝子導入が必要とされている細胞種）に対して高い DNA 輸送能力を発揮する新しい脂質分子の発見やリポソーム法の発展への貢献を行っていきたいと考えており、ウイル
スベクターで懸念されている腫瘍活性などの副作用19, 20)を生じない優れた人工ベクターの創出に繋がれば幸いである。

効に遺伝子発現を制御する手法となりつつあり、低分子化合物とタンパク質に続く第三の標的薬剤としてRNA分子に熱い視線が注がれている。ncRNA を細胞内で機能させるためには、DNA と同様に ncRNA を単独で外部から細胞内に輸送することは難しいた
め、効率の良い細胞内輸送についての手段が必要になる。これまでに我々は、核酸デリバリーシステムのために人工脂質分子ライ
ブラリーの構築を進めてきた。そこで本稿では、我々が保有する
分子ライブラリーを用いて ncRNA 輸送を発揮する脂質分子の化
学構造について紹介したい。

3．1．人工脂質分子ライブラリー
第 1 項で述べてきたように分子ライブラリーは、我々に「核酸の細胞内輸送」を行うために必要な構造的情報を与えてくれる。第2 項では、我々が保有する人工脂質分子を用いて、ncRNA として注目を集めている small interfering RNA（siRNA）を輸送するために必要な脂質分子の化学構造について紹介する。人工脂質分
子ライブラリーは、glutamate（Glu）をコネクターとして、ヘッド領域にトリメチルアミン（TMA）、テイル領域に 2 つの炭化水素
鎖（C）を有する化学構造からなり（Fig. 8）、それぞれ炭化水素
鎖のカーボン数が異なる脂質化合物からなる。
TMA-C2-GIu-C12+(CH3)3N(CH2)CO-NH-CH-COO-(CH2)11CH3(CH2)2-COO-(CH2)11CH3

TMA-C2-GIu-C14+(CH3)3N(CH2)CO-NH-CH-COO-(CH2)13CH3(CH2)2-COO-(CH2)13CH3

TMA-C2-Asp-C12+(CH3)3N(CH2)CO-NH-CH-COO-(CH2)11CH3(CH2)-COO-(CH2)11CH3
Fig. 8 Chemical structures of artificially synthesized amphiphiliccompounds.
TMA-C2-Glu-C12 is represented by a structure made up of a headregion consisting of trimethylamine (TMA) and a hydrophobic chain
comprising 2 carbon atoms (C2), a connector region consistingof glutamic acid (Glu), and 2 tail regions consisting of ahydrophobic chain comprising 12 carbon atoms (C12).

5

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A
ReaIative EGFP-suppression effeciency(%)

A

B

100

80

60

40

20

0

Mock
(siRNA)

TMA-C2- TMA-C4- TMA-C6- TMA-C11GIu-C12 GIu-C12 GIu-C12 GIu-C12

3．2．人工脂質分子による siRNA 導入
人工脂質分子による siRNA の輸送効率を簡便に評価するために、我々は蛍光タンパク質（EGFP）を恒常的に発現する CHOEGFP 細胞を作製した（Fig. 9）。次いで、脂質分子の細胞内輸送
効率は anti-EGFP siRNA duplex （Wako ；target site,
CGAAGCTGAAGTTCA）を用いて細胞内 EGFP の発現低下を観察することにより評価した。人工脂質分子は超音波処理により
H2O 中で分散・溶解させた。まず、didodecyl-acetylglutamatetrimethylammonium（TMA-C2-Glu-C12）をベースに、ヘッド領域の炭化水素鎖のカーボン数を増加させた脂質分子（C2 → C4
→ C6 → C11）による siRNA 導入効率を比較検討した。その結果、炭化水素鎖の長さが伸びるほど siRNA による EGFP の発現阻害効果が減少していた（Fig. 10A）。次に、TMA-C2-Glu-C12 のテ
イル領域にある 2 つの炭化水素鎖のカーボン数を 14 とした脂質分
子 TMA-C2-Glu-C14 について siRNA 導入試験を検討した場合では、TMA-C2-Glu-C12 と比較して低い siRNA 導入効率であった（Fig. 10B）。また、TMA-C2-Glu-C12 の結果と同様に、 TMAC2-Glu-C14 のヘッド領域の炭化水素鎖のカーボン数を増加させた場合（C2 → C6）でも、siRNA の導入能は向上しなかった（Fig.
10B）。このように、TMA-C2-Glu-C12 の化学構造は、siRNA を細胞内に輸送するために適した炭化水素鎖の長さを持ち、炭化水
素鎖の長さのバランスを変えるだけでsiRNA輸送能力に大きな影響を与えた。さらに、我々は、コネクター領域をグルタミン酸（Glu）からアスパラギン酸（Asp）に交換した脂質分子 TMA-C2Asp-C12 の持つ siRNA 導入能力についても評価した結果、TMAC2-Glu-C12 とほぼ同等の能力であった（Fig. 10C）。以上の結果

6

100

80

60

40

20

0

Mock
(siRNA)

TMA-C2GIu-C14

TMA-C4GIu-C14

TMA-C6GIu-C14

C
ReaIative EGFP-suppression effeciency(%)

Fig. 9 Characterization of CHO-EGFP cell line.
A) Fluorescence images of CHO-EGFP cells; left, phase contrast
image (×400); right, fluorescence image (×400). CHO cells weretransfected with pCMV-IE EGFP and established by a cloning assay
using a 96-well plate. The constant expression of the EGFP genein the CHO-EGFP cells was analyzed under a fluorescencemicroscope. B) Flow cytometry analysis of CHO-EGFP cells. The
cells were gently harvested using 0.2% trypsin-EDTA solution and
EGFP expression was analyzed on a flow cytometer (5.0 × 104
events, 488-nm excitation laser wavelength, 500 V).

ReaIative EGFP-suppression effeciency(%)

B

100

80

60

40

20

0

Mock(siRNA)

TMA-C2-GIu-C12 TMA-C2-Asp-C12

Fig. 10 Transfection efficiencies of siRNA by amphiphilic compounds withdifferent structures.
A) Transfection efficiencies of siRNA by TMA-C2-Glu-C12, TMAC4-Glu-C12, TMA-C6-Glu-C12, or TMA-C11-Glu-C12. CHOEGFP cells were precultured in 24-well plates and transfected for3.0 h with a mixture of EGFP siRNA and amphiphile (50 pmol/5.0µl); transfection efficiencies were estimated as a decreased rangeof EGFP expression on a flow cytometry histogram at 24 h posttransfection. All data points are averaged from 2 replications on
different days and expressed as the mean ± standard deviation.
B) Transfection efficiencies of siRNA by TMA-C2-Glu-C14, TMAC4-Glu-C14, or TMA-C6-Glu-C14. C) Transfection efficiencies ofsiRNA by TMA-C2-Asp-C12.

から、siRNA 輸送のための脂質分子の化学構造は、ヘッド領域のテイル領域の炭化水素鎖のカー
炭化水素鎖の長さがカーボン数2、ボン数 12 であり、コネクターとしての Glu ／ Asp は重要な要素ではなかった。今後、分子ライブラリーにより示された構造的情報をもとに、細胞内 ncRNA 輸送のために優れた人工脂質分子ベクターの開発を行っていきたい。

News No.123(2007)

4．おわりに参考文献

本稿で、我々が保有する人工脂質分子ライブラリーによる DNAとsiRNAの細胞内輸送というバイオ機能を脂質分子の化学構造にフォーカスを向けて紹介してきた。ユニークなフィルム様自己集
合体や siRNA 輸送のための炭化水素鎖の長さのバランスなど、人工脂質分子が発揮するバイオ機能を明らかにしてきた。我々が人
工脂質分子材料に興味を持つ理由は、「化学構造とバイオ機能」の相関からアプローチを行いながら、どのように設計すれば脂質分子に発揮させたいバイオ機能を付加できるようになるのか？大袈裟に言えば、如何にして分子の持つ記憶を見出しながら優れた分子材料を創り出すのか？という面白さである。今後、人工脂質分子が発揮するバイオ機能についての情報を蓄積することにより、脂質分子材料を用いたデリバリーシステムの発展に繋げていけるのではないだろうか。例えば、輸送したい分子を核酸だけでなく低分子化合物やタンパク質に対しても可能とする人工脂質分子を創り出すことも大いに興味深い。実際、我々が保有する約 120 種
類の人工脂質分子の中には、医療分野でも注目を集めている IgG
抗体を高効率に細胞内へ輸送可能な脂質分子も存在しており、細胞内にあるシグナルタンパク質などを生きた細胞の状態で染色することも可能であろう。このように、核酸をはじめ単独では導入し難い分子をボトムアップ技術により人為的に輸送することができれば大きな意義になるのではないだろうか。
また現在、優れた分子材料が創りだされている一方で、人為的に生み出されたナノ材料（我々が保有する人工脂質分子も含まれる）による人への安全性が問われている。本稿で紹介してきた人
工脂質分子は、直接的に細胞を死滅させるような効果を有していないが、人工脂質分子材料の一部には、細胞に直接作用し細胞膜障害を介してアポトーシス／ネクローシス様の細胞死が誘導されることを確認している。ある特定の化学構造を持つ脂質分子を介して細胞死が誘導されるという情報は、今後、人工脂質分子材料の安全性を考える上で重要となるだろう。
以上、これまでの研究について、我々の保有する人工脂質分子が発揮するバイオ機能を紹介してきた。今後、人工脂質分子の研究開発には克服すべき課題も多く発展途上の段階ではあるが、将来のデリバリーシステムの確立のために、分子材料の開発をより安全にかつ高い能力を発揮させるための情報と議論が積み上げられ、優れた人工分子材料が開発されることを期待したい。

1)

謝辞
本研究では、神経幹細胞の樹立・培養方法について、The Mount
Desert Island Biological Laboratory の David W. Barnes 教授
からご教示していただいた。現在の「人工脂質分子ライブラリーの構築とバイオ機能」ならびに「 同仁化学研究所・遺伝子導入
試薬 HilyMax の開発」について、京都大学工学研究科の浜地格教授、 同仁化学研究所の方々からのご支援をいただいた。また、本研究を進めるにあたり、福岡県生物食品研究所の研究員（石川智之、山下聡子、赤尾哲之、水城英一）をはじめ多くの方々のサポートに深く感謝します。

2)

3)
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6)
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8)
9)
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11)
12)
13)

14)
15)
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17)
18)
19)
20)
21)

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著者プロフィール
氏名：楠本 賢一（Ken-ichi Kusumoto）
年齢：36 歳
所属：福岡県工業技術センター 生物食品研究所 生物資源課
研究員
連絡先：〒 839-0861 福岡県久留米市合川町 1465-5
TEL（0942）30-6644 FAX（0942）30-7244

kkusumoto@fitc.pref.fukuoka.jp
出身大学：九州大学大学院農学研究科 遺伝子資源工学専攻
細胞制御工学講座
学位：農学博士
現在の研究テーマ：
・人工脂質分子材料とバイオ機能・セラミックス材料と三次元細胞培養
・脳神経細胞への抗ストレス因子

7

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エイズから見た感染症研究の最前線
その 3

ウイルスのレセプターへの吸着と感染の機構

する三量体のウイルス糖蛋白スパイクと細胞膜上のレセプター分子が結合し、その結合物が複数集合(multiple-site binding)する
ことにより fusion pore を形成するためとされている。HIV-1 でもこのような過程が感染成立に要求されるのか、fusion pore形成に必要な要素は何か、この要素を阻害することにより HIV-1 の感染を抑制できるか、など調べた。

multiple-site binding
熊本大学大学院医学薬学研究部感染防御学分野

原田信志

1. はじめにウイルスは細胞への感染なしには増殖できない。ウイルスが細胞へ感染するためには、まず、ウイルス表面の蛋白リガンドの細胞表面に存在するレセプターへの附着が必要である。この現象を「吸着」と呼んでいる。ウイルス学的には、その後、ウイルスコアの細胞への「侵入」と「脱殻」という過程を経て初期の感染が進行する。ウイルスにもいろいろな種類があり、いろいろな分類法が使われるが、そのひとつにエンベロープを持つものと持たないウイルスに大別する方法がある。エンベロープを持たないポリオ
ウイルスは、吸着後、単なる translocation で侵入・脱殻が行われると思われる。エンベロープを持つインフルエンザウイルスでは
endocytosis、エイズのウイルスである HIV-1 では direct fusion
で感染が成立すると言われる。しかし、それらの詳細な吸着後の機序にはまだ分からない点が多い。
個々のウイルスでレセプターの同定は盛んに行われる。インフ
ルエンザウイルスの sialic acid、HIV-1 の CD4 とケモカインレセ
プター（CXCR4 か CCR5）などである。これらのレセプターの同定は、ウイルスの感染をその最初のステップで抑えるという意
味で、抗ウイルス剤開発の有効な手段となりえる。しかしながら、
ウイルス特有の酵素を阻害する他の抗ウイルス剤やワクチンにも共通していることだが、このようなウイルス感染症治療薬の最大の欠点は、極めて狭いウイルス株にしか有効でないことである（そのためウイルス感染症の治療では、もし有効な抗ウイルス剤があれば、どのウイルスに感染しているかの診断が極めて重要になる）。もうひとつの大きな問題点は、ウイルスの変異による耐性株
が 1、2、3)、ほとんどのウイルスで簡単に出現することである。
これらの問題点を克服することは、ウイルス感染症で可能であろうか？広範囲のウイルスに効く抗ウイルス剤；どんなウイルスの変異にも対応できる抗ウイルス剤の開発の可能性は？それらの可能な方策は、多くのウイルスの感染成立に共通して重要な役割を担っている宿主細胞側の因子をつきとめることである。そして、その因子を抑制することで、可能であれば、それらの感染を制御することであろう。

3. HIV-1 における multiple-site binding
HIV-1 の感染効率はウイルス 1 個当たりの gp120 の量が多い
か、あるいは細胞表面のウイルスレセプターの発現量が多いと上昇する。また、CD4 と CXCR4 の colocalization が起こると、CD4と CXCR4 をレセプターとする X4 タイプの HIV-1 の感染価が増強する 8)。これらの現象は 1 分子の gp120（実際は三量体）と 1
セットのレセプターとの結合が感染成立に充分であると仮定すると、説明できない。また sCD4 を利用した HIV-1 感染抑制のデー
タからも、HIV-1 は複数の gp120 とレセプターの結合 complex、
つまり multiple-site binding が必要であると報告されている9)。この multiple-site binding はウイルスエンベロープと細胞膜（両者とも脂質二重膜）の流動性に依存して形成されると考えられている。膜流動性は温度依存的であると考えられるが、HIV-1 の吸着を 25、37、40℃で行うと、感染価は吸着時の温度に依存して増加する。

4. 細胞膜とエンベロープの流動性の測定
細胞膜とエンベロープの流動性を 5-doxyl stearic acid を用いた電子スピン共鳴法（ESR）で測定した（図１）。細胞膜の流動性
order parameter は 0.582~0.598 であった。一方、ウイルスエン
ベロープの order parameter は 0.685~0.738 で、細胞膜より流動性の低い硬い膜であった。

2. エンベロープウイルスの侵入機構
エンベロープを持つウイルスでは、 endocytosis か direct fusion でウイルスは細胞内へ侵入する。この時、エンベロープと細胞膜との融合 fusion が起こることは、両者に共通している。この過程はrabies4)、baculovirus5)、influenza virus6)、Semliki Forest
virus7)などでかなり詳細に報告されている。エンベロープに存在

8

図1

ESR を用いた細胞膜とウイルスエンベロープの流動性
A; Free の 5-doxyl stearic acid。B; MOLT/C-2 細胞で order parameter は0.611。C; HIV-1 C-2 ウイルスで 0.729。D; CD45-depleted C-2 ウイルスで0.776。E; MT-2で0.585。F; C-2(MT-2)ウイルスで0.704。G; CD45-depletedC-2(MT-2)で 0.721。

News No.123(2007)

Infectivty ratio

このように細胞膜あるいはエンベロープの僅かな流動性の変化
は、HIV-1 の感染成立に大きく反映されることがわかった。細胞膜流動性を抑制する物質は、少なくとも HIV-1 の感染を阻害するものとして使えることも示唆されている。

図 2 膜流動性と HIV-1 の感染性との関連
図の左から、40℃処理、 0.2% xylocaine、 0.05% Tween 20、200 µg/ml

細胞に室温で HIV-1 を吸着させ洗浄後、40℃あるいはキシロカ
イン（37℃）で 1 時間処理すると、感染価の増加が認められる。この吸着後感染増強は、高温あるいはキシロカイン処理時にCXCR4 のアンタゴニストである T140 を加えると完全に抑制される 10)。このことは、高温やキシロカインによる膜流動性の亢進が、室温下で細胞にゆるやかに吸着したウイルスのエンベロープの流動性をも亢進させ、multiple-site binding を促進させたと思われる。また、T140 で感染増強が阻止されることから、multiplesite binding が起こっていると考えた。

DPPC、10 µg/ml DPPC、anti-HLA-II、25℃処理を示している。

6. HIV-1 gp120 の不均一性
ウイルスのエンベロープでは細胞膜よりコレステロールの含量が高く、このことが膜の流動性を低くしていると考えられた。また、HIV-1 はコレステロール含量の高い膜部分 raft から選択的に出芽していることを示している。細胞膜およびエンベロープの流動性は温度依存的であり、低温では低く、高温では高かった。ESRを用いることにより、正確に生細胞の膜とウイルス粒子エンベ
ロープの流動性を測定できた。

5. 流動性と感染性との関連
細胞膜の流動性に影響をあたえる因子であるキシロカイン、 dα-phosphatidylcholine dipalmitoyl (DPPC)などを作用させ、細胞膜と HIV-1 感染性との関連を求めた。細胞膜の流動性が亢進す
ると、対数的に感染性は増加した。流動性が 5% 増加すると感染価は 2.4 倍、5% 低下すると HIV-1 感染は 56% 抑制された（図２）。

図3

室温、37℃、40℃で吸着し感染可能なウイルスは、ある特定のウイルス群が選択されているのか、あるいは偶然の確率で感染価が増加していくのか検討した。ウイルスを中和抗体あるいは細胞を T140 で処理し、その後、室温、37℃、40℃で吸着を行い、それぞれのウイルスの抗体や T140 に対する感受性が同じか、異なるかで gp120 の不均一性が証明できるか試みた 11)。室温吸着で感染可能なウイルスは、中和抗体や T140 に対して感受性が低かった。このことは、通常のウイルスサンプルは必ずしも均一ではな
く、吸着時の温度の条件である一定の性質を持ったグループが選択されると考えられた。つまり、低温吸着の条件では膜流動性が低く、感染に充分な multiple-site binding を形成するためには、ウイルスが多くの gp120 あるいは多くの functional gp120 を持っている方が感染成立のためには有利である。このような多くの gp120 を持った HIV-1 は、また、中和抗体や T140 に耐性である。

HIV-1 感染成立のための muItipIe-site binding の伝説

9News No.123(2007)

また、 X 4 株のウイルスにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ
NL43-luc と R5 株である JR-FL-luc では、JR-FL-luc が 80 倍も感染性が高い。しかも、JR-FL-luc では gp120/p24 が NL43-lucより高く、多くの gp120 が JR-FL-luc では存在していると考えられる。このような JR-FL-luc は NL43-luc より、その感染性が温度非依存的であった。これらのデータは multiple-site binding が感染に重要であり、それを左右する因子として膜の流動性とウイ
ルスの gp120 の量が考えられた（図３）。

7. おわりに ー 膜流動性制御と感染抑制の可能性
Fusion pore の形成に multiple-site binding が必要だという概念は、ほとんどのエンベロープを有するウイルスに適用できると思われる。そうであれば、細胞膜あるいはエンベロープの流動性を制御して、エンベロープを有する多くのウイルスの感染をコ
ントロールすることが可能であろう。コレステロールの脂質二重膜内での存在は膜の流動性を liquid ordered、つまり低下させる
ことが良く知られている。コレステロールそのものは、直接ウイルスに作用させても感染性に影響を与えないという報告もあるが、コレステロール類似の構造を持った分子で、多くのエンベロープ
ウイルスに抗ウイルス作用を持つものをスクリーニングして、その作用機序を解明すべきであろう。

copy and crystallography. Cell 114: 573-583.
8)

Song, W., S. Yahara, Y. Maeda, K. Yusa, Y. Tanaka, and S. Harada.
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9)

Layne, S.P., M.J. Merges, M. Dembo, J.L. Spouge, and P.L. Nara.
1990. HIV requires multiple gp120 molecules for CD4-mediated infection. Nature 346: 277-279.

10) Harada, S., T. Akaike, K. Yusa, and Y. Maeda. 2004. Adsorption
and infectivity of human immunodeficiency virus type 1 are modified
by the fluidity of the plasma membrane for multiple-site binding.

Microbiol. Immunol. 48: 347-355.
11) Harada, S., K. Yusa, and Y. Maeda. 2004. Heterogeneity of envelope molecules shown by different sensitivities to anti-V3 neutralizing antibody and CXCR4 antagonist regulates the formation of multiple-site binding of HIV-1. Microbiol. Immunol. 48: 357-365.

筆者紹介

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2)

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氏名：原田信志
所属：熊本大学大学院医学薬学研究部 感染防御
住所：熊本市本荘 1-1-1

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4)

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5)

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135: 1831-1839.
6)

学会展示のお知らせ

Plonsky, I., and J. Zimmerberg. 1996. The initial fusion pore in-Markovic, I., E. Leikina, M. Zhukovsky, J. Zimmerberg, and L.V.
Chernomordik. 2001. Synchronized activation and refolding of in-

日本食品科学工学会 第 54 回大会
期日：2007 年 9 月 6 日（木）〜 8 日（土）会場：中村学園大学（福岡市城南区別府 5-7-1）

fluenza hemagglutinin in multimeric fusion machines. J. Cell Biol. 155:
833-844.
7)

Gibbons, D.L., I. Erk, B. Reilly, J. Navaza, M. Kielian, F.A. Rey,and J. Lepault. 2003. Visualization of the target-membrane-inserted
fusion protein of Semliki Forest virus by combined electron micros-

10

・展示 9 月 6 日〜 8 日・ランチョンセミナー 9 月 8 日
皆様のお越しをお待ちしております。

News No.123(2007)

Topics on Chemistry
新規アンジオテンシン変換酵素(ACE) 阻害活性測定法
株式会社同仁化学研究所
昔から日本人には高血圧の人が多く、現在、30 歳以上の男性の約 50%、女性の約 40% が高血圧である。高血圧は自覚症状が少ないため、放置する人が多いが、高血圧の状態が長年続くと、血管を徐々に痛めていき、動脈硬化を引き起こし、最終的に心筋梗
塞や脳卒中などを発症してしまう。血圧を調節するメカニズムは人体に数々備わっており、その中で重要なものの一つとしてレニ
ン - アンジオテンシン系が挙げられる。
レニン - アンジオテンシン系において、アンジオテンシン 変換酵素(ACE)は昇圧ペプチドであるアンジオテンシン の生成を触媒する。アンジオテンシン の生成を抑制すれば、血圧上昇を防ぐことができるため、高血圧の患者には ACE 阻害薬が処方されている。しかし、ACE 阻害薬は副作用として味覚障害、発疹およびアレルギーなどを生じることもある。これらの理由から、安全で安価なACEの阻害活性をもつ天然の基質は研究者たちに注目されている。 ACE の阻害活性を持つイワシ由来のジペプチド(ValTyr)、発酵乳由来のトリペプチド(Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro)などが発見され、それらを含む食品は機能性食品と言われている。また、ACE 阻害活性をもつ機能性食品は、厚生労働省が認可する特定保健用食品として売り出され、消費者の関心を集めており、
ACE 阻害活性を測定することは非常に重要である。
現在、主に利用されている ACE 阻害活性測定法は、合成基質
Hippuryl-His-Leu(HHL)から切り出されてくる馬尿酸を酢酸エチ
ルで溶媒抽出後、濃縮乾固し、それを再溶解して紫外吸収(228nm)を測定するという煩雑な方法である。これらの点を克服する
ため、新規合成基質である 3-Hydroxybutyrylglycyl-glycylglycine(3HB-GGG)と市販の酵素分析キット(F-kit)を用い、受田らと小社が共同開発した迅速・簡便な ACE 阻害活性測定法を紹介
する 1)。

野口克也

図 ACE 阻害活性測定法の原理

た迅速・簡便であるため、操作ミスが減り、再現性のよい結果が得られる。さらに、煩雑な操作が少なくなるため、本法は試料を分析する時間を従来法と比べ 1/3 に抑える事ができる。
新規合成基質 3HB-GGG と F-kit を用いた迅速・簡便・再現性の高い ACE 阻害活性測定法は ACE 阻害物質のスクリーニング分野への応用の可能性がある。それにより、新たな ACE 阻害薬の開発や機能性食品の探索が期待される。
参考文献

1)

Le Hoang Lam, Tomoko Shimamura, Ken Sakaguchi, Katsuya
Noguchi, Munetaka Ishiyama, Yume Fujimura and Hiroyuki Ukeda,

Anal. Biochem., 2007, 104.

この測定法の原理を図に示す。合成基質 3HB-GGG と ACE を反応させると、ペプチドの C 末端側をジペプチド単位で切断し、3Hydroxybutyrylglycine と Glycyl-glycine が生成する。そこにAminoacylase を作用させることで 3-Hydroxybutyric acid とGlycine が生成する。生成した 3-Hydroxybutyric acid を F-kit で定量し、試料の ACE 阻害活性を測定する。
実 際に 3HB-GGG と ACE との反応により、3-Hydroxybutyrylglycine と Glycyl-glycine が生成することを TNBS 法及びNBD-F 法により確認した。また、 Aminoacylase によって 3Hydroxybutyrylglycine から Glycine が生成されることを NBDF 法によって確かめた。そして、迅速・高感度という観点から ACE
濃度、Aminoacylase 濃度の最適化を行い、30 分で反応できるようにした。
代表的なACE阻害薬であるカプトプリルについて従来法と本法を比較した結果、IC50 値は従来法で 0.086 µmoI/I、本法で 0.081µmoI/I とほぼ同じ値であった。また、ACE 阻害活性をもつ食品についても比較した結果、従来法と本法の相関係数は 0.872 であり、よい相関性を示した。
従来法では酢酸エチルでの抽出操作や濃縮乾固の操作(120℃で30 分)が必要であり、残存した酢酸エチルはアッセイの結果に影響を与える。それに対し、本法は酢酸エチルの残存を気にせず、ま第 18 回フォーラム・イン・ドージンのご案内
今年も下記の日程にてフォーラム・イン・ドージンを開催いたします。
多数のご参加をお待ちしております。
タイトル：感染症をめぐる宿主の応答と微生物の戦略
日時：2007 年 11 月 30 日（金）9：30 〜 17：00
場所：鶴屋ホール（熊本市）
演者 ( 順不同敬省略 )中西義信（金沢大学医学系研究科）
鎮西康雄（三重大学医学系研究科）
黒川健児（東京大学薬学系研究科）
嘉糠洋陸（帯広畜産大学原虫病研究センター）
Bok-Luel Lee（釜山国立大学薬学部）
福井宣規（九州大学生体防御医学研究所）
佐々木雄彦（秋田大学医学部）
住本英樹（九州大学生体防御医学研究所）
白土明子（金沢大学医学系研究科）

11

News No.123(2007)

九州大学 - 同仁化学組織対応型連携に関するお知らせ
九州大学と小社は、九州大学での優れた研究成果を迅速に実用化することを目的に組織対応型(包括的)連携契約を締結致しております。下記の技術に関して現在実用化を検討しております。こ
れらにご興味がございましたら小社までお問い合わせ下さい。

IC Dye 販売再開のお知らせ
昨年、12 月に販売を中止いたしておりました IC3-OSu, IC5OSu に関して、販売を再開して欲しいとの強いご要望を受け、包装容量を改め販売を開始することといたしました。
また改めてのご愛顧をよろしくお願いいたします。

No.007 Protein kinase C eta (-)の特異的基質ペプチド
セリン / スレオニンキナーゼである Protein kinase C (PKC)には 12 種類のサブファミリーが存在しており、各サブファミリーによる細胞内作用は異なる。Protein kinase C eta は最近グリオー
マ（脳腫瘍）のターゲットシグナルとして注目されているが、リン酸化研究に利用可能な基質ペプチドは開発されていない。
九州大学では、10 種類の Protein kinase C (alpha, beta ,, gamma, delta, theta, epsilon, iota, lambda および zeta)にはリン酸化されず、Protein kinase C eta にのみリン酸化される
基質ペプチドの開発に成功した（Protein kinase C eta 10 ng/µl
濃度で 90％以上リン酸化）。今後、診断および治療用基質ペプチドとして、また、各種研究用基質ペプチドとしての利用が期待される。

IC3-OSu λ ex〜 550 nm、λ em〜 570 nm

No.008 Rho-kinase に特異的リン酸化される基質ペプチド
セリン / スレオニンキナーゼである PKA 、 PKC および Rhokinase は RXS/T または RXXS/T という同じリン酸化基質モチー
フを有するので、細胞内リン酸化研究のためには特異性を持つ基質ペプチドの開発は必要不可欠なことである。
九州大学では、血管疾病に深く関与している Rho-kinase に特異的にリン酸化される 2 種類の基質ペプチドを開発した。 Rhokinase に対する基質ペプチドの Km (mM)と kcat(min-1)は A 基質の場合 0.29 と 6.48、B 基質の場合 0.38 と 20.9 であった。

No.010 PKCα 特異的阻害剤ペプチド
従来、ペプチドをはじめ、種々の PKC 阻害剤が有るが、PKCαに特異的なもの存在しなかった。PKCα はガンなどにおいて他のPKC と全く異なる挙動を取り、発ガンに極めて重要なシグナルであることが分かってきている。したがって、PKCα 特異的な阻害剤は非常に有用な物質であると考えられる。
九州大学では、種々の PKC サブタイプに特異的な基質ペプチドを開発する中で、これまでに存在しなかった PKCα に特異的な阻害ペプチドを見いだした。この阻害剤ペプチドは、 PKCα、あるいはそれが深く関与するガンの研究に有用であると考えられる。
販売中止のお知らせ
下記製品を販売中止とさせていただきます。
これまでのご愛顧ありがとうございました。在庫に関しては、お近くの代理店まで、お問い合わせ下さい。
Drynap500 g 包装(コード：342-01135)
Chromotropic acid25 g 包装(コード：347-00661)
5 g 包装(コード：345-00662)
Sucrose monocholate 1 g 包装(コード：344-07751)
5 g 包装(コード：340-07753)

12

IC5-OSu λ ex= 640 nm、λ em= 660 nm

インドシアンニン化合物は、分子中のメチン炭素数によって色調が変化します。長波長域の強い蛍光を利用することにより、試料の自家蛍光を避け、高感度に検出することが可能です。励起光源として HeNe レーザー(543 nm または 633 nm)を利用できることから、共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いた免疫組織染色
や、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いた一分子イメージング等への応用が期待されます。アミノ酸やペプチドなどのアミノ基を選択的に標識することができます。

品名

容量

IC3-OSu special packaging
20 µg × 3
IC5-OSu special packaging
20 µg × 3

価格 ( ￥ )メーカーコード

38,000I271

38,000

I272

News No.123(2007)

試作品
Self Assembled Monolayer 研究用

Amino-EG6-undecanethioI,hydrochIoride

関連商品

HCI

< 特長 >• 非特異的吸着の少ない SAM を形成できる。
• 蛋白質、DNA など、様々な物質を SAM 上に固定化できる。

固体表面に種々の分子を配向・集積させる方法の一つである自己組織化法は、簡便に高密度・高配向な自己組織化単分子膜（SelfAssembled Monolayers：SAMs）を構築することができるため、研究・応用が活発に行われています。
SAMs の性質は、そのアルキル鎖長や末端の官能基、主鎖の親水性などにより変化し、多彩な機能を固体表面に導入することが可能であり、表面プラズモン共鳴(SPR)や水晶振動子マイクロバ
ランス(QCM)など、金属板を利用するセンサーに広く用いられております。
SPR や QCM を用いた測定においては、特異的吸着と非特異的吸着を区別することが困難であるため、非特異吸着を抑制することが重要となります。
近年、蛋白質等の表面固定化にオリゴエチレングリコールを導入した SAMs 試薬が頻繁に用いられています。オリゴエチレング
リコールには蛋白質や細胞の吸着を抑制する効果があることが、Whitesides らにより実証されております 1)。
上記の Amino-EG6-undecanethiol はエチレングリコール部位と末端にアミノ基を有しており、カルボキシル基を持つタンパク ,ペプチド , その他分子認識サイトを導入する際に有用です。
Hodenland らは、 Amino-EG3-undecanethiol と HydroxyEG3-undecanethiol を混合した SAM を作製し、Calmodulin を固定化してCalcineurinとの相互作用をSPRにて測定しています2) 。
また、Bamdad らは、Amino-EG3-undecanethiol を基に Duplex DNA を基板上に結合させ、ハイブリッド形成の様子を SPRにて観測しております 3)。
小社では、他にもエチレングリコール部位を有した右記の SAM
試薬を取り扱っております。他社品と比較して高純度であり、単分子膜形成を阻害する可能性が有る不純物をほとんど含んでおりません。

＜参考文献＞

1)

C. Pale-Grosdemange, E. S. Simon, K. L. Prime, and G. M.

2)

C. D. Hodneland, Young-Sam Lee, D. Min, and M. Mrksich, Proc.

3)

C. Bamdad, Biophysical Journal., 1998, 75, 1997-2003.

Whitesides, Anal. Chem., 1999, 71, 777-790.

Nat. Acad. Sci., 2002, 99, 5048-5052.

品名
容量
価格( ￥)
メーカーコード
Carboxy-EG6-undecanethiol
10 mg
24,000C445
100 mg60,000
C445
Hydroxy-EG3-undecanethiol
10 mg
14,400H354
100 mg36,000
H354
Hydroxy-EG6-undecanethiol
10 mg
18,000H355
100 mg38,800H355
11-Amino-1-undecanethiol, hydrochloride
A423
8 -Amino-1-undecanethiol, hydrochloride
A424
6 -Amino-1-undecanethiol, hydrochloride
A425
各 10 mg
13,200100 mg39,40010-Carboxy-1-decanethiol
C385
7-Carboxy-1-heptanethiol
C386
5-Carboxy-1-pentanethiol
C387
各 10 mg
11,400100 mg31,00010-Carboxydecyl disulfide
C404
10 mg
11,400100 mg33,0007-Carboxyheptyl disulfide
C405
5-Carboxypentyl disulfide
C406
各 10 mg
11,40011-Hydroxy-1-undecanethiol
H337
8-Hydroxy-1-octanethiol
H338
6-Hydroxy-1-hexanethiol
H339
各 10 mg
12,000100 mg35,00011-Ferrocenyl-1-undecanethiol
F246
10 mg
16,000100 mg48,0008-Ferrocenyl-1-octanethiol
F247
6-Ferrocenyl-1-hexanethiol
F269
各 10 mg
15,000100 mg45,000N-Fmoc-Aminoundecanethiol
F287
N-Fmoc-Aminooctanethiol
F288
N-Fmoc-Aminohexanethiol
F289
各 10 mg14,80050 mg
45,00013

News No.123(2007)

分子生物学用 Good’s buffer

関連商品

分子生物学用グレードの HEPES, MOPS, PIPES を発売致しました。
ご要望の多い、分子生物学用 Good’s Buffer 3 種(HEPES,
MOPS, PIPES)に、エンドトキシン試験（試験適合）、DNase,
RNase 試験（不検出）を行い、かつ純度を従来の 99.0% 以上か
ら HEPES, PIPES：99.7% 以上、MOPS：99.5% 以上の超高純度品となっております。

HEPES 分子生物学用< 試験規格 >純度(滴定): 99.7％以上、DNase, RNase: 不検出、エンドトキ
シン: 試験適合
白色結晶性粉末、水溶状: 試験適合 0.025 以下(320 nm)、乾燥減
量: 0.20% 以下、強熱残分( 硫酸塩): 0.10% 以下、重金属（Pbとして）: 0.0005% 以下、鉄(Fe): 0.0005% 以下
MOPS 分子生物学用< 試験規格 >純度(滴定): 99.5％以上、DNase, RNase: 不検出、エンドトキ
シン: 試験適合
白色結晶性粉末、水溶状: 試験適合 0.020 以下(300 nm)、乾燥減
量: 0.30% 以下、強熱残分( 硫酸塩): 0.10% 以下、重金属（Pbとして）: 0.0005% 以下、鉄(Fe): 0.0005% 以下
PIPES 分子生物学用< 試験規格 >純度(滴定): 99.7％以上、 DNase, RNase: 不検出
白色結晶性粉末、アルカリ溶状: 試験適合 0.030 以下(300 nm)、
乾燥減量: 0.50% 以下、強熱残分(硫酸塩): 0.10% 以下、重金属（Pb として）: 0.0005% 以下、鉄(Fe): 0.0005% 以下
品名

容量

HEPES 分子生物学用
100 g
500 g
MOPS 分子生物学用
100 g
500 g
PIPES 分子生物学用
100 g
500 g

価格(￥)

コード

メーカーコード

9,600
34,400344-08231
346-08235

GB70
GB70

9,600
34,800341-08241
343-08245

GB71
GB71

9,400
34,000348-08251
340-08255

GB72
GB72

347-07481
344-07491
344-07511
344-07555
340-07535
347-07545
348-07575

MB01
MB02
MB04
MB08
MB06
MB07
MB10

関連商品：分子生物学用 buffer

0.5M EDTA
10 × MESA
10 × TBE
10 × TE
20 × SSC
20 × SSPE
1M Tris-HCl

14

1L
1L
1L
500 ml500 ml500 ml500 ml

10,00012,00010,000
8,200
8,800
8,800
8,200

Good’s Buffer（一般規格品）
品名

ACES

容量

25 g
100 g
ADA
25 g
100 g
BES
25 g
100 g
500 g
Bicine
25 g
100 g
Bis-Tris
25 g
100 g
CAPS
25 g
100 g
CHES
25 g
EPPS
25 g
HEPES
25 g
100 g
250 g
500 g
1 kg
HEPPSO
25 g
MES
25 g
100 g
250 g
500 g
1 kg
MOPS
25 g
100 g
250 g
500 g
1 kg
MOPSO
25 g
PlPES
25 g
100 g
500 g
PIPES sesquisodium 25 g
POPSO
25 g
TAPS
25 g
100 g
TAPSO
25 g
TES
25 g
100 g
500 g
Tricine
25 g
100 g
HEPES buffer solution 100 ml
MOPS buffer solution 100 ml

価格(￥)
8,000
24,600
3,400
8,200
2,800
8,000
31,600
2,800
7,000
4,800
14,0004,000
10,800
3,800
5,800
2,400
6,400
14,00023,00044,200
6,200
2,600
6,400
14,00026,00047,0002,800
6,400
15,60024,00043,000
3,800
3,200
7,800
28,400
3,800
5,200
3,200
9,400
4,800
5,200
12,80053,4002,800
7,800
11,00011,000コード

メーカーコード

347-04882
349-04881
346-04732
348-04731
341-00262
347-00264
345-00265
347-03282
343-03284
343-04742
345-04741
347-00482
343-00484
342-04692
348-03192
348-01372
346-01373
340-01371
342-01375
340-01376
340-04132
341-01622
349-01623
343-01621
345-01625
343-01626
349-01802
345-01804
341-01801
343-01805
341-01806
341-04162
341-02222
347-02224
345-02225
340-08032
344-04152
344-02572
340-02574
348-04172
346-02652
344-02653
340-02655
341-02842
347-02844
345-06681
342-06691

GB01
GB02
GB03

GB04
GB05
GB06
GB07
GB09
GB10

GB11
GB12

GB13

GB14
GB15

GB25
GB16
GB17
GB20
GB18

GB19
GB60
GB61

上記以外の包装容量も承ります。小社マーケティング部までお問合わせください。

News No.123(2007)

新製品

開発元

IgG 精製キット
IgG Purification Kit – A
IgG Purification Kit – G
本製品は『試作販売品』として 2006 年 3 月に発売を開始いたしました。その間、ユーザーの皆様のご意見・ご要望を取り入れ、『製品』として作り上げました。
今後もこのような『試作販売品』という形で皆様のご意見を取り入れた製品作りを目指していきたいと考えております。
各種動物への免疫後に得られる腹水や血清などにはイムノグロ
ブリン G（IgG）の他に、アルブミンなどのタンパク質が多く含まれており、一般的に硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマ
ト法、あるいはプロテイン A/G クロマト法などにより IgG 分画へと精製されます。
IgG Purification Kit – A 及び IgG Purification Kit – G は、各種動物の IgG を単離、精製するためのキットです。キットにはプロテイン A またはプロテイン G 固定化ゲル、および各種緩衝液が含まれており、わずか 30 分で IgG を高純度、高回収率で精製することができます。プロテイン A/G 固定化の担体としてはシリカゲルを採用しています。遠心後のプロテイン A/G 固定化ゲル上の残液量はごく少量であり、プロテイン A/G への抗体結合後のゲル洗浄操作によって、プロテイン A/G 未結合の物質を完全に除去することができます。また、プロテイン A/G へ結合した IgG は溶出時の酸性条件下に長時間さらすことなく素早い溶出操作を行うこと
で、IgG の活性低下を最小限に抑えることができます。
本キットは 1 回の精製につき 50 µl の腹水や血清、200 µg 程度の IgG の精製が可能です。なお、プロテイン A 及びプロテイン G
に対する IgG の親和性は動物種により異なりますので、表 1 を参考にご選択ください。
表 .1 血清 50 µl からの IgG 回収量（280 nm の吸光度から算出）＜特長＞• 精製操作は約 30 分で完了
• 高純度・高回収率• 1 回につき 50 µl の血清や腹水、200 µg の抗体精製が可能• プロテイン A/G 固定化ゲルは約 10 回の繰り返し使用が可能＜キット内容＞• Protein A Cartridge tube（または Protein G Cartridge tube）
×1• Washing Buffer
10 ml × 1
• Elution Buffer
1.6 ml × 1• Catching Buffer
1 ml × 1
5 tubes × 2• 1.5 ml Microtube＜本キット以外に必要なもの＞• 200 µl マイクロピペッター• マイクロチューブ• 遠心機（マイクロチューブ用） • ボルテックスミキサー＜操作法＞例）IgG Purification Kit - A の場合

IgG を含む試料溶液と Washing
Bufferの混合溶液をプロテインA 固
定化ゲルに加え、プロテイン A へ
IgG を吸着させる。

遠心によりプロテイン A 未結合物質を除去する。

Multi-color Labeling Kit（仮称） 試作品モニター募集
Washing Buffer を加え、遠心し、プ
ロテイン A 未結合物質を完全に洗浄除去する。

Elution Buffer を加えた後、遠心により IgG を溶出させる。

品名

容量

IgG Purification Kit - A
1 set
IgG Purification Kit - G
1 set

本体価格（￥）

メーカーコード

21,000AP01

21,000AP0215

News No.123(2007)

試作品

開発元

蛍光ラベル化キット

HiLyte FluorTM 750 Labeling Kit – NH2
HiLyte FluorTM 750 Labeling Kit – NH2 は、抗体など分子量50,000以上で反応性のアミノ基を有する少量のタンパク質を蛍光標識するためのキットです（図 1）。本キットは、簡便な操作性、高い回収率、高い再現性などの特長を持っています。現在小社で販売しております 488 nm 励起の Fluorescein、より長波長の 550
nm、650 nm 付近で励起可能な HiLyte FluorTM 色素と比較して、更に長波長の近赤外光で励起されるため、免疫染色などのアッセイにおいて低バックグラウンドでの観察が可能となります。
標識タンパク質量は 1 サンプルあたり 50-200 µg です。わずか2 時間で HiLyte FluorTM 750 標識タンパク質を得ることができ、得られた標識体はそのまま免疫染色などの様々な用途に利用することができます。

HiLyte FluorTM 色素は AnaSpec 社が開発した蛍光色素であり、HiLyte FluorTM 750 標識抗体は λex = 760 nm、λem = 780 nm という蛍光特性を示します（図 2）。

図 1.

図 2.

16

＜特長 >
・約 2 時間で標識体が調製できる。
・Filtration Tube を用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。
・付属の保存溶液で標識体の長期保存ができる。

< キット内容 >NH2-Reactive HiLyte FluorTM 750
WS Buffer
Reaction Buffer
Filtration Tube
< 本キット以外に必要なもの >• 10 µl, 200 µl マイクロピペッター• インキュベーター（37℃）• マイクロチューブ （標識体保存用）• 遠心機（マイクロチューブ用）• DMSO

HiLyte FluorTM750 標識 IgG の調製法

FIuorescein 及び各 HiLyte FluorTM 色素の励起・蛍光スペクトル

1.5 ml200 µl

X1
X1
X1
X1

News No.123(2007)

試作販売品

開発元

タンパク質標識用キット（1 mg タンパク質標識用）
Biotin Labeling Kit – NH2 ( for 1 mg)
本製品は、アミノ基を有するタンパク質、特に抗体へビオチンを標識するためのキットです。従来の 0.1 mg タンパク質標識用キットと同様に、NH2-Reactive Biotin と標的分子を混合するだけで簡単にビオチン標識体を得ることができます。
NH2-Reactive Biotin は、その分子内に活性エステル基を有しているため、アミノ基を有する標的分子と安定な共有結合を形成します。標識反応を阻害するような低分子化合物（トリスやグリシンなど）や未反応の NH2-Reactive Biotin は付属の Filtration
Tube を用いて容易に除去することができます。本キットには、
DMSOを除く標識に必要なすべての試薬と作製したビオチン標識体を保存するための溶液が含まれています。
＜特長＞
・1 mg のタンパク質を標識可能である。
・3 時間以内にビオチン標識体が調製できる。
・ Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。
＜キット内容＞
・NH2- Reactive Biotin
・WS Buffer
・Reaction Buffer
・Filtration Tube *1
・15 ml Tube (for counterbalance)

13 ml
1.2 ml

X1
X1
X1
X1
X1

* Filtration Tube を使用する際は、15 ml 容量の遠沈管に対応する遠心機が必要です。Filtration Tube の外径と遠心機ローターが一致しない機種がありますので、事前に Filtration Tube および遠心機ローターのサイズをご確認ください（Filtration Tube: 外径17.3 mm、全長 124 mm）。また、7,000 xg での遠心を推奨しますが、1,500 xg の場合でも遠心時間を 20-30 分間延長すること1で対応可能です。
＊他にも下記の大容量タイプを試作販売品としてご用意いたして
おります。

品名

容量

価格(￥)

メーカーコード

Biotin Labeling Kit -NH2 (for 1 mg)
1 sampIe
25,000
LK55
Alkaline Phosphatase Labeling Kit -NH2 (for 1 mg)
1 sampIe
36,000
LK59
Alkaline Phosphatase Labeling Kit -SH (for 1 mg)
1 sampIe
36,000
LK61
Peroxidase Labeling Kit -SH (for 1 mg)
1 sampIe
30,000
LK53

関連製品
今回ご紹介しております試作販売品、試作品以外にもタンパク質標識キットシリーズとして、下記の製品を販売いたしております。用途にあわせてご使用ください。
品名

容量

価格(￥)

Biotin Labeling Kit - NH2
3 samples
12,000
Biotin Labeling Kit - SH
3 samples
12,000Peroxidase Labeling Kit - NH2
3 samples
17,000Peroxidase Labeling Kit - SH
3 samples
17,000Peroxidase Labeling Kit - NH2 (for 1mg)
1 sample
30,000
Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH2
3 samples
21,000
Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH
3 samples
21,000
Fluorescein Labeling Kit - NH2
1 sample
10,0003 samples
21,000
HiLyte FluorTM 555 Labeling Kit - NH2
1 sample
10,0003 samples
21,000
HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2
1 sample
10,0003 samples
21,000Allophycocyanin Labeling Kit - NH2
1 sample
17,0003 samples
43,000
B-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2
3 samples
43,000R-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2
1 sample
17,0003 samples
43,000Allophycocyanin Labeling Kit – SH
3 samples
38,000
B-Phycoerythrin Labeling Kit - SH
3 samples
38,000R-Phycoerythrin Labeling Kit - SH
3 samples
38,000

メーカーコード

LK03
LK10
LK11
LK09
LK51
LK12
LK13
LK01
LK01
LK14
LK14
LK15
LK15
LK21
LK21
LK22
LK23
LK23
LK24
LK25
LK26

17

News No.123(2007)

遺伝子導入試薬
HiIyMax(ハイリーマックス）＜特長＞
・多岐にわたる細胞へ DNA を高効率に導入
・血清を含む培地での導入が可能
・導入遺伝子の細胞内シグナル応答が良好
・コストパフォーマンスに優れた純国産導入試薬

品名

容量

HiIyMax

1 mI

価格(￥)
20,000

メーカーコード

H357

発売開始より好評を得ております。
ご要望の多かった細胞種毎プロトコールも現在、ホームページにて 17 種掲載しております。是非お試しください。

http://www.dojindo.co.jp/whatsnewsj/newpro/hiIymax/hiIymax.htmI
これまでお試しいただいたユーザーより「より導入できる」「低価格」とのご意見をいただいております。

導入実績細胞種ー多岐にわたる細胞への導入実績ー

販売中止のお知らせ
遺伝子導入試薬 -Dofect-GT1 を販売中止とさせていただきます。
これまでのご愛顧誠にありがとうございました。
今後は HiIyMax をご使用ください。

ホームページアドレス
URL : http://www.dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.123

News No.123
180120-021557
0120-489548

平成１９年６月２１日発行

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 吉田睦男 編集責任者 蒲野志保 年４回発行 許可なくコピーを禁ず