鳥取県産業技術センター研究報告 No.25 (2022)

液体クロマトグラフ質量分析計を用いた葉酸分析法の確立
Establishment of Folic Acid Analysis Method Using Liquid Chromatograph Mass Spectrometer

梅林志浩
Yukihiro Umebayashi

食品開発研究所 農産食品・菓子グループ

健康維持成分として一般に認知されつつある葉酸であるが、栄養機能食品等の開発を目指す際に既存の分析法では操作が煩雑で時間が掛かるため多検体の分析には適さない。本研究では、近年注目される LC-MS を使用した葉酸分析法について基本分析条件を検討した結果、複数の葉酸類の同時検出が可能となった。

1. はじめにによるブロッコリーの葉酸分析を試みたが、目的成分葉酸は様々な農水産物に含まれており、県内産品での検出に至らなかった。この点に関してはサンプル処は特にブロッコリーに多く（生鮮 100g 中 210µg）、他理の方法等検証課題を残した。多くの食材において葉にネギ（同 100µg）、エリンギ（同 65µg）などが挙げら酸は訴求成分として有用であることから、引き続きれる。食品表示法に基づいて基準値以上の葉酸を含む

LC-MSによる葉酸分析法の確立及びノウハウの蓄積を農産物やその加工品には「栄養機能食品」の表記が可目指して検討した。

能であることから、他県ではそのような取り組みが進められており、商品差別化の有効な手段となっている。

2. 実験方法

また、厚生労働省の「日本人の食事摂取基準」におい

2.1 試料調製法及び LC-MS 測定条件て、成人の１日摂取推奨量 240µg、妊婦では 480µg とブロッコリーからの葉酸抽出に関しては Luo ら 2)及されるなど葉酸は人の健康維持に必須の成分であり、び Shohag ら 3)の方法を一部改変して行った。則ち、市一般にも認知されつつある。

販の生鮮ブロッコリーを抽出バッファ（1%アスコルビ

しかし、栄養機能食品や機能性表示食品の開発を目ン酸、2%メルカプトエタノール含）中で加熱・粉砕し指す際、対象成分の検体毎のばらつきが大きいため多定容後、酵素処理（アミラーゼ、プロテアーゼ）を行い、検体を分析する必要があるが、既存の分析法（微生物続いて加熱によるプロテアーゼ不活化処理の後コンジ法）は操作が煩雑あるとともに結果が判明するまでにュガーゼ処理（37℃、2 時間）を行った。

最短でも２日を要するため多検体分析には適さない。

得られた酵素処理液を固相抽出（Sep-Pak）により精代替法として近年注目されている分析法が「質量分析製したものを LC-MS 分析サンプルとした。LC-MS は法」である。微生物法に比べ高価な分析装置を必要とWaters 社製 Xevo G2-S Q-TOF を用いた。表１に LC-MS

する点はデメリットであるが微生物を利用しないため分析条件を示す。

ハイスループット分析が可能である。更に、検出感度が高いことや様々な分子構造をとる葉酸群を個別に分

表１ LC-MS 分析条件

カラム

BEH C18, 2.1×75mm, 1.7µm

移動相A:0.1%ギ酸溶液, B:アセトニトリル[A;90%(0min)→20%(8min)→90%(9min)→90%(15min)]

イオンモードキャピラリー電圧

ポジティブ
1.0 kV析できるなど、微生物法に比べ多くのメリットがある。
令和元年度に実施した実用化促進研究「ブロッコリ
ーの健康成分を保持するための冷凍加工条件の最適化1)」においても液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）3. 結果と考察した。
図 2 はグルタミン酸 4 量体が付加した葉酸（PteGlu4）

3.1 LC-MS による葉酸測定
図１に葉酸標準試薬を用いた LC-MS 分析結果を示す。本測定により、葉酸(PteGlu1)、メチル化テトラヒド
ロ キ シ 葉 酸 (CH3-H4PteGlun) 及 び ホ ル ミ ル 化 葉 酸(CHO-PteGlu1)が検出された。

標準品をブタ腎臓コンジュガーゼ処理した際のLC-MS
イオンクロマトグラムである。
本実験での酵素処理によって PteGlu4（m/z 829.27）が減少し、PteGlu3（m/z 700.22）及び PteGlu2（m/z 571.19）

Ringling ら 4) は、ブロッコリー中に最も多く含まれが増加することが確認された。

る葉酸はメチル化テトラヒドロキシ葉酸（約 80%）であり、次いでホルミル化テトラヒドロキシ葉酸(CHOH4PteGlun)（約 10%）と報告しているが、本試験ではホルミル化テトラヒドロキシ葉酸は検出されなかった。
本試験ではホルミル化葉酸が検出されていることから、ホルミル化テトラヒドロキシ葉酸が今回のサンプル中に元々少なかったという可能性は低く、処理中にホルミル化葉酸が酸化型に変化した可能性が高いと考えられた。

PteGlu1
CH3-H4 PteGlu1

CH3-H4 PteGlu2
CH3-H4 PteGlu3
CHO-PteGlu1
図１ LC-MS による葉酸類の分析例

図２ 標準品に対するコンジュガーゼ処理の効果検証

標準品において酵素処理の効果が認められたことか
ら、次にブロッコリー抽出液を用いてターゲットをメチル化テトラヒドロキシ葉酸トリグルタミン酸付加体

3.2 酵素処理効果の検証
続いて、コンジュガーゼ処理の効果を検証した。植(CH3-H4PteGlu3)として同様の試験を行った。ただし酵素処理は 14 時間行った。

物中の葉酸はグルタミン酸が複数結合した状態で存在

LC-MS 分析の結果を図 3 に示す。CH3-H4PteGlu3 のし、Munyaka ら 5)はブロッコリー中の葉酸のグルタミ減少及び CH3-H4PteGlu2 の増加を確認できたがモノグン酸付加数は 1~7 であると報告している。

ルタミン酸付加体の増加は見られなかった。

本研究においてブロッコリー中の葉酸を定量する場

本試験では標準品での試験結果と同様の傾向が見ら

合、グルタミン酸付加数が異なる全ての標準品を入手れたことから、ブロッコリー中の妨害物質の影響の可することは実用的でないため、酵素処理によりモノグ能性は低く、本試験で用いたコンジュガーゼの影響でルタミン酸付加体（PteGlu1 等）の形で検出可能か検証ある可能性が高いことが示唆された。

文 献1)

鳥取県産業技術センター研究報告 No.24 (2021).

2)

Luo, S. et al.; Quantification of Total Folate, Folate Species and Polyglutamyl Folate Distribution in Winged
Beans (Psophocarus tetragonolobus (L) DC)from Different Cultivars and Growth Stages by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, J Nutr Sci Vitaminol, 63 (1), p.69-80 (2017).

3)

Shohag M.J.I. et al.; A rapid method for sensitive pro-filing of folates from plant leaf by ultra-performanceliquid chromatography coupled to tandem quadrupole
mass spectrometer, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1040, p.169-179 (2017).
4)

Ringling, C. et al.; Origins of the difference between

food folate analysis results obtained by LC-MS/MS
and microbiological assays, Anal Bioanal Chem, 409(7):p1815-1825 (2017).
図３ ブロッコリー抽出液に対するコンジュガーゼ処理の効果検証

4. おわりに本研究ではブロッコリーの抽出液を濃縮することにより高価な葉酸標準試薬を用いることなく複数の葉酸類を LC-MS にて検出することが可能となった。
これにより加熱処理等を行ったブロッコリー中の各種葉酸（メチル化葉酸、ホルミル化葉酸等）の残存率等を相対的に比較することが可能となった。
更に葉酸の定量評価を実現するため酵素処理条件を検討した結果、ブタコンジュガーゼによる葉酸付加グ
ルタミン酸の脱離を LC-MS により評価可能であることが確認された。

5)

Munyaka, A. W. et al.; Influence of thermal processing
on hydrolysis and stability of folate poly-gamma-glutamates in broccoli (Brassica oleracea var. italica), carrot(Daucus carota) and tomato (Lycopersicon esculentum),
J Agric Food Chem, 58 (7), p4230-40 (2010).