News No.129(2009)2009 No.

129
CONTENTS●Review

硫酸転移酵素の持つ多様な生理機能宮崎大学農学部 榊原 陽一
東海大学農学部 安田伸
宮崎大学農学部 水光 正仁●Topics on Chemistry
チオールバイオイメージングに特化した
新規蛍光プローブ
株式会社同仁化学研究所 藤野 怜香

糸状菌とナノテクノロジーが融合した
新規血管新生阻害剤
株式会社同仁化学研究所 平島 義紀

News No.129(2009)

目次

新製品案内

Review
硫酸転移酵素の持つ多様な生理機能 ....................................... 1
宮崎大学農学部 榊原 陽一
東海大学農学部 安田 伸
宮崎大学農学部 水光 正仁

Topics on Chemistry
チオールバイオイメージングに特化した新規蛍光プローブ
株式会社同仁化学研究所 藤野 怜香 ................................ 7
糸状菌とナノテクノロジーが融合した新規血管新生阻害剤
株式会社同仁化学研究所 平島 義紀 ................................ 8

Commercial
新製品
微生物検出キット（比色）................................................ 10
試作品
微生物検出キット（蛍光）................................................ 12
お知らせ
パンフレットのお知らせ ......................................................... 6
学会展示のお知らせ ................................................................ 6
販売中止のお知らせ ................................................................ 6
フォーラム・イン・ドージン開催報告 ................................ 14

品名
容量価格( ￥)
Microbial Viability Assay Kit-WST
500 tests
20,000

メーカーコード

M439

製品案内
品名
容量
価格(￥)
-Cellstain- DAPI
1 mg
3,800
-Cellstain- DAPI solution
1 ml
4,800
-Cellstain- PI
1 mg
3,800
-Cellstain- PI solution
4,800
1 ml
-Cellstain- EB
3,800
1 mg
-Cellstain- EB solution
1 ml
4,800

2008 年 11 月 3 日より、中国北京に新しく事務所を開設いたしました。
上海事務所と共に中国における研究者支援および製品販売を幅広く行って参ります。
Dojindo Laboratories Beijing Office
北京市朝陽区徳外馬甸裕民路 12 号 元辰 大厦 E1-703 号

コード

メーカーコード

342-07431

D212

340-07971

D523

343-07461

P346

341-07881

P378

346-07451

E262

348-07891

E272

News No.129(2009)

硫酸転移酵素の持つ多様な生理機能
Functional Diversity of the Cytosolic Sulfotransferases榊原

陽一（Yoichi Sakakibara）
宮崎大学農学部応用生物科学科 准教授

安田伸（Shin Yasuda）
東海大学農学部バイオサイエンス学科 講師

水光

正仁（Masahito Suiko）
宮崎大学農学部応用生物科学科 教授

Summary:
In mammals, sulfate conjugation as mediated by the cytosolic sulfotransferases (SULTs) has been shown to be involvedin the biotransformation/excretion of xenobiotics as well as
endogenous compounds such as steroid hormones and catecholamine neurotransmitters. Based on our recent evidences, it has been clearly demonstrated that sulfation catalyzed by the cytosolic SULTs may play an important role on
the detoxification of endocrine disruptors as well as the metabolism of biologically active components, e.g (poly)phenolic
compounds, from natural foods. In this review, we summarized the available information regarding the multifunctionalrole of cytosolic SULTs. Functional implications of thesulfation of harmful oxidated/nitrated products, nitrotyrosine
and hydroxylated monoamine compounds, in the pathological settings are discussed.
要約：
生体内における硫酸化は、生体外異物や薬物の解毒代謝機構として、さらにステロイドホルモンや神経伝達物質の濃度調節機構として広く知られている。近年、解毒代謝機構としての内分泌かく
乱物質の代謝機構や、食品機能性成分の代謝機構として注目されつつある。さらに、酸化／ニトロ化ストレスの結果生じるニトロ
チロシンの硫酸化などについて、硫酸転移酵素研究に関する最近の研究動向を紹介する。

Keywords: Sulfotransferase, sulfation, endocrine disruptor,
nitrotyrosine, tyrosine nitration

1．はじめに

2．活性硫酸 PAPS の合成と硫酸化

生体内における硫酸化は、生体外異物や薬物の解毒代謝機構、そしてステロイドホルモンや神経伝達物質であるカテコールアミン類の濃度調節機構として古くから研究されてきた。この様な背景から、硫酸転移酵素は我々の生体内で不必要となった化学物質を体外に排泄する機能を担っていると考えられている 1）。近年、筆者らの研究グループをはじめ硫酸転移酵素の研究分野にも積極的に
分子生物学的手法が導入された。その結果、従来の酵素学的あるいは生化学的な研究からでは困難な知見が明らかになってきた。
分子生物学的手法を導入し、ヒト、マウスおよびゼブラフィッシュ
をモデル生物として精力的に硫酸転移酵素 cDNA のクローニングを行った。その結果、少なくともヒトにおいて 11 種類、マウスにおいて 14 種類、ゼブラフィッシュにおいては 14 種類の硫酸転移酵素遺伝子が存在することを明らかにした 2-4）。これらの研究により、同じく解毒代謝機構の酵素として知られるシトクロム P-450
酵素群と同様に硫酸転移酵素が、遺伝子スーパーファミリーを形成していることが判明した。現在までの研究により硫酸転移酵素
遺伝子スーパーファミリーは、少なくとも 5 つのファミリーから形成されることが明らかとなった5)。これらの多様な硫酸転移酵素
は、最近注目される食品機能性成分（植物性ポリフェノール）や内分泌かく乱物質の代謝にも関与する。さらに、最新の結果より、酸化／ニトロ化ストレスの結果生じるニトロチロシンの代謝へ硫酸化が関与することが明らかとなった。ここでは、筆者らのグループの成果を中心に硫酸転移酵素に関する研究を紹介する。

生体内における硫酸化に関してまずその反応を簡単に説明する。
生体内での硫酸化はまず硫酸の活性化、すなわち 1950 年代に
Lipmannらにより発見された哺乳動物に普遍的な硫酸供与体としての活性硫酸 PAPS（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate）
が ATP と無機硫酸塩から合成されることが必要である 6)。この反応では、生体内においてエネルギー源として大切な ATP を 2 分子
消費して 1 分子の活性硫酸(PAPS)を合成することからも硫酸化がいかに重要か容易に予想される。この PAPS 合成には、 ATP
sulfurylase と adenosine 5’-phosphosulfate kinase (APS kinase)の二つの酵素反応が関与することが知られている（Fig.1）。
これら二つの PAPS 合成に関与する酵素は、大腸菌、カビといった微生物や植物においては二つの異なる酵素タンパク質として存在する。しかし、哺乳動物（ヒト、マウスなど）や昆虫（ショウジョウバエなど）などにおいては二つの酵素が進化の過程で融合し二つの機能を持った PAPS 合成酵素(PAPS synthethase)とし
2-

ATP＋SO4

APS＋PPi
ATPsulfurylase

APS＋ATP

Adenosine5'-phosphosulfate
kinase

PAPS＋ADP

Fig. 1 活性硫酸 PAPS の合成
PAPS: 3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate
APS: adenosine 5’-phosphosulfate
PPi: pyrophosphate1News No.129(2009)

humSULT4A1

SULT4mouSULT4A1

SULT5mouSULT5A1
mouSULT2A1
mouSULT2A2
humSULT2A1

2A
SULT2

mouSULT2A4
humSULT2B1ahumSULT2B1bmouSULT2B1

2B

mouSULT3A1

SULT3mouSULT3A2
humSULT1A1
humSULT1A2
humSULT1A3

1A

mouSULT1A1
mouSULT1D1
humSULT1B1

Fig. 2 フェノール性化合物の硫酸化
PAPS: 3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate
P A P: 3’-phosphoadenosine 5’-phosphatemouSULT1B1

1D
1B

SULT1

mouSULT1C1
humSULT1C4
humSULT1C2

1C

mouSULT1C2て存在する。このことから、生物は進化の過程でより効率よく
PAPS を合成できるようになってきたと考えられる。1998 年に
我々はヒトのPAPS合成に関与するPAPS synthethase (Bifunc-

tional ATP sulfurylase/adenosine 5'-phosphosulfate kinase)をクローニングし、大腸菌で発現させることに成功している 7)。
このように酵素的に合成された活性硫酸 P A P S を用いて、PAPS 上の硫酸基を水酸基またはアミノ基に転移する反応が硫酸化であり Fig.2 に反応の概要をまとめた。
現在、筆者らの研究室では遺伝子工学的に大腸菌で発現したヒト PAPS 合成酵素を用いて硫酸転移酵素研究に不可欠な[35S]- 放
射活性ラベルした活性硫酸 PAPS を酵素的に合成している。さらに同じく大腸菌で発現したリコンビナントヒト硫酸転移酵素を調製し、これらを用いて研究している。今後の応用の可能性として、
リコンビナント硫酸転移酵素を利用することで、有機化学的な合成では難しい様々な化学物質の硫酸体の調製が、酵素的に合成（硫酸化）可能となり様々な分野に利用できると考えている。

3．硫酸転移酵素遺伝子ファミリー
硫酸転移酵素に関する研究は 1980 年代までは臓器由来の酵素
タンパク質を扱う生化学的な研究が中心であった。1997年当時の硫酸転移酵素に関する総説においてでさえ、ヒトにおける硫酸転移酵素はフェノール硫酸転移酵素 2 種、ヒドロキシステロイド硫酸転移酵素 1 種、エストロゲン硫酸転移酵素 1 種の合計 4 種の酵素の存在が知られているにすぎなかった 8)。1990 年代後半にはヒト、マウス、ラットを始め様々な動物種において硫酸転移酵素のクローニングが盛んに行われ新規の硫酸転移酵素が多数発見された。筆者らの研究も含めて、現在までに少なくともヒトで 11 種類、マウスにおいて 14 種類、ゼブラフィッシュにおいて 14 種類の硫酸転移酵素が存在しシトクロムP-450 同様に硫酸転移酵素も遺伝
子スーパーファミリーを形成していることが判明した（Fig.3）24)。

2

mouSULT1E1
humSULT1E1

1E

Fig. 3 ヒトおよびマウス硫酸転移酵素遺伝子ファミリーの分子系統樹

現在、硫酸転移酵素の分類に関しては硫酸転移酵素ワーク
ショップにおいて提唱された分類法によりアミノ酸配列をもとに分類することが推奨されている 8）。分類法としては、硫酸転移酵素
は SULT という略号を用いて、その後にファミリーを表す数字を付ける。例えば、SULT1 はフェノール硫酸転移酵素ファミリー、
SULT2はヒドロキシステロイド硫酸転移酵素ファミリーというように分類される。さらにこれらのファミリーごとにアミノ酸配列が 60 ％以上一致するグループをサブファミリーとし、アルファ
ベットを A から順に付けていく。その結果、例えばヒトＰ型フェノール硫酸転移酵素の場合は生化学的な解析のみでは判らなかっ
た異なる遺伝子にコードされた酵素が二種存在するために
SULT1A1、SULT1A2 の二種が存在し、ヒトＭ型硫酸転移酵素の場合は SULT1A3 となる。以下はこの硫酸転移酵素分類法に基づく分類名を用いることとする。
筆者らの研究グループによる最近の研究により、マウスには
SULT3A1 と SULT3A2 の 2 種類の SULT3 ファミリー硫酸転移酵素が存在することが明らかになった 9）。この SULT3 ファミリー
硫酸転移酵素は、ナフチルアミンなど芳香族アミンのアミノ基を特異的に硫酸化するユニークな性質の硫酸転移酵素である。マウスでは 2 つの機能的な SULT3 硫酸転移酵素遺伝子を持つのに対し、ヒトゲノム上には機能的なSULT3硫酸転移酵素遺伝子が見いだせない。よって、ヒトにおいて芳香族アミンの硫酸化に関与する酵素がこれとは別に存在している可能性が考えられる。また、ヒトゲノム上には 4 つの SULT1A 硫酸転移酵素遺伝子（1A1 〜1A4）が存在するのに対し、マウスゲノムには 1 つ SULT1A1 しか存在しない。このように、硫酸転移酵素遺伝子スーパーファミリーはゲノム上で重複等によってコピー数が増加することで多様になっNews No.129(2009)

エストロゲンS

転移酵素の基質となりうることが明らかになった。この研究では、試験した 7 種のヒト硫酸転移酵素がそれぞれの環境ホルモンに対して異なった基質特異性を示した（Table 1）。これらの酵素は生体内で臓器特異的に発現調節がなされている酵素も多く、環境ホ
ルモンの種類によってはその影響を受けやすい臓器の存在が示唆された 10)。
さらに、筆者らの研究グループは内分泌かく乱物質（環境ホルモン）として知られるトリブチルスズなど有機スズが、エストロ
ゲン硫酸転移酵素SULT1E1活性を阻害することを見いだした11）。
このことは、トリブチルスズをはじめ多くの内分泌かく乱物質が持つエストロゲン様作用メカニズムの一つとしてエストロゲンの濃度調節機構としての硫酸化に影響することを示している（Fig.4
中の③）12）。

環境ホルモン

③

②

ER

S

核

①

SULT

環境ホルモン
硫酸体

DNA

S
エストロゲン
硫酸体

RNA

細胞

タンパク質

5．酸化／ニトロ化ストレスと硫酸化

Fig. 4 内分泌かく乱物質（環境ホルモン）の作用メカニズムおよびその硫酸化てきたと考えられるが、ヒトとマウスの種間では一部にそのゲノム構造に大きな違いが見られる。このことは、今後の硫酸転移酵
素研究において種間で機能的に相補している硫酸転移酵素を特定することの難しさを示唆するものである。

4．内分泌かく乱物質（環境ホルモン）と硫酸化
近年、女性ホルモンであるエストロゲン様のホルモン作用（Fig.4 中の①）あるいは男性ホルモン作用をかく乱する環境中の化学物質すなわち「内分泌かく乱物質」（環境ホルモン）の危険性が報告されている。一般に「環境ホルモン」は生体内に取り込まれると蓄積し、最終的に内分泌系の異常を誘発するといった悪いイメージが持たれている。これまでに述べてきたように硫酸化は親油性の化合物に硫酸基という親水性の高い官能基を導入することで尿中への排泄を促す解毒代謝機構である。
これらのことより、ヒドロキシル基またはアミノ基を持つ「環境ホルモン」の生体内代謝における硫酸化の関与は、ホルモン制
御に大きく影響していることが推察された。筆者らの研究グルー
プは、7 種のヒトの硫酸転移酵素によるビスフェノールＡ、アルキ
ルフェノール、ジエチルスチルベステロール(DES)そしてエチニ
ルエストラジオール等の環境ホルモン候補物質に対する硫酸化を検討し報告した（Fig.4 中の②）。
その結果より、これらの環境ホルモン候補物質は全てヒト硫酸

今から遡ること約 15 年前、筆者らの研究グループは生命現象として生体内で生じる遊離チロシン硫酸体の起源を探っていた。そして HepG2 ヒト肝腫瘍細胞などを用いて、遊離チロシンやドーパなどの硫酸化が培養細胞レベルで起こることを見いだし、またこれらモノアミン系化合物の硫酸化はヒト SULT1A3（別名：M型フェノール硫酸転移酵素、またはカテコールアミン型フェノー
ル硫酸転移酵素）によって触媒されることを世界に先駆けて明らかにした 13,14）。 SULT1A3 がチロシンとよく似た構造を有する
様々なモノアミン系化合物の活性調節を担うこともあいまって、筆者らの関心は本酵素が有する多面的な機能の解明、とくに疾病リスクに対する生体防御機構としての SULT1A3 の機能に関する研究へと次第に向かっていった。

5.1 ニトロチロシン
過度の酸化／ニトロ化ストレスにより生じた一酸化窒素由来の反応性窒素酸化物ペルオキシナイトライトは、生体内における遊離アミノ酸あるいはタンパク質アミノ酸残基としてのチロシンを容易にニトロ化することが知られている。その反応産物であるニトロチロシンは、動脈硬化症、脳卒中、肺疾患、肝炎、および慢性リウマチをはじめ様々な病態において検出されており、体内での酸化／ニトロ化ストレス状態とこれらストレスに惹起されうる疾患とのリスク関係を知る上で有効なバイオマーカーとして広く認知されている。最近の研究では、とくに遊離型のニトロチロシ
ンが DNA の酸化損傷を引き起こし、培養細胞レベルでアポトーシ
スを誘導すること、そしてマウス脳内では神経変性を引き起こして正常な神経伝達を阻害することが明らかとなっており、ニトロ

Table 1 ヒト硫酸転移酵素の内分泌かく乱物質（環境ホルモン）に対する基質特異性
Bisphenol A
4-Octylphenol
p-Nonylphenol
Diethylstilbestrol
17a-Ethynylestradiol

SULT1A1

SULT1A3

SULT1B1

SULT1C2

SULT1C4

SULT1E1

SULT2A1965 ± 206
1920 ± 152
1969 ± 117
1538 ± 233
1200 ± 79

N.D.
675 ± 8139.7 ± 1.7
19.0 ± 7.9
N.D.

3.9 ± 0.2
17.1 ± 8.7
52.7 ± 4.3
3.2 ± 0.1
1.6 ± 0.1

N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.

173 ± 121920 ± 103
268 ± 63296 ± 45
N.D.

51.9 ± 11.0475 ± 34
221 ± 18
188 ± 27
243 ± 57

19.9 ± 3.5
18.3 ± 5.8
39.9 ± 12.2
11.3 ± 7.1
26.9 ± 10.1

Specific activity refers to pmol substrate sulfated/min/mg purified enzyme
N.D.：Activity not detected.

3

News No.129(2009)

チロシンもまた疾病リスク因子であることが提唱されるようになってきた。一方、生体内での硫酸化の機能は、(i) 生体外異物の(ii) ホルモンなどの生体内内因性物質の解毒代謝としての硫酸化、濃度調節機構の 2 つがこれまで主軸として考えられてきた。そこで筆者らは、「我々の体もまたリスク因子としてのニトロチロシンを代謝変換により濃度調節あるいは除去するメカニズムが備わっているのでは？」と考え、硫酸化がその役割を担う可能性について検証することとした。

Tyrosine-nitrated proteins

L-Tyrosine

L-Nitrotyrosine

L-TyrosineS

L-NitrotyrosineS

L-Dopa5.2

ニトロチロシン硫酸体の発見と SULT1A3
まず筆者らは、遊離型ニトロチロシン存在下で HepG2 細胞および[35S]-放射活性硫酸を用いた代謝ラベル実験を行った。その結Dopamine

果、培地中に添加された遊離ニトロチロシンが培養細胞内に取り込まれ、硫酸化による代謝調節を受けて[35S]-ニトロチロシン硫酸体として培地中に放出されることが初めて明らかになった 15）。さらに、酸化／ニトロ化ストレス研究に用いられる S I N - 1 ( 3 morpholinosydnonimine)をペルオキシナイトライト供給剤として代謝ラベル実験を行ったところ、[35S] ニトロチロシン硫酸体が細胞より産生されて培地中へ放出されることが認められた 15）。興味深いことに、ニトロチロシンの硫酸化は HepG2 細胞のみでなく、他のヒト由来初代内皮培養細胞（HUVEC、HPAEC および
HLMVEC）、肺上皮細胞（H441 および BEAS-2B）、および乳腺上皮細胞（MCF-7 および MCF 10A）においても同様に観察された 16)。このことは、ニトロチロシン硫酸化が、多様な臓器由来の細胞種において一般的に起こりうること、そしてニトロチロシンが代謝変換されることを示唆するものであった。さらに[3H]- チロ
シンを用いた代謝ラベル実験を行ったところ、SIN-1 処理後に産生された多くの[3H]- ニトロチロシン（90.4-94.8%）が非抱合体として HepG2 細胞内で検出され、培地中には多くの硫酸化された[3H]- ニトロチロシン（23.2-59.2%）が時間依存的に放出されることを明らかにした 15)。これらの結果は、酸化／ニトロ化スト
レスによって生じた遊離ニトロチロシンの細胞内代謝調節には硫酸化が機能しうることを意味するものであった。しかしながら、これまで安定な最終産物またはバイオマーカーとして認識されてきた遊離ニトロチロシンがどのように抱合体として生成するのか、
さらにグルクロン酸抱合化などの他の代謝経路の存在については未だ全容解明には至っていない。

DopamineS

これまでに我々は、ヒト硫酸転移酵素について大腸菌を用いたリコンビナント酵素の大量精製を行ってきており、すでに既知の11 種類の硫酸転移酵素のコレクションを有している。そこで、これら11種類のうちニトロチロシンを硫酸化する酵素の特定を試みたところ、SULT1A3 のみで有意な活性が認められ、同濃度 100µMのチロシンを基質としたときよりも高い比活性値（2.11 nmol/
min/mg enzyme vs. 0.01 nmol/min/mg enzyme）が得られた
15）。さらにニトロチロシンは SULT1A3 による遊離チロシンの硫酸化を競争的に阻害することも判明した 15）。一方で、ヒトの体内では 95% 以上のドーパミンや 70% 程度のノルエピネフィリンといったモノアミン系化合物が硫酸抱合体として血中を循環していることが報告されており、生体内のカテコールアミン類の恒常性や生体外モノアミン類の代謝変換には SULT1A3 が重要なはたらきを担っていると考えられている。これまでの筆者らの研究結果
により、SULT1A3 がドーパミンだけでなく、遊離チロシンやその異性体、そしてドーパなどのモノアミン系化合物に対しても有4

Tyrosine-containing proteins

L-DopaS

Fig.5 ヒト SULT1A3 によるチロシンおよび関連化合物の硫酸化＊：ヒト SULT1A3 による硫酸化反応＊＊：活性酸素種によって生じるニトロ化反応※詳細は筆者らの総説を参照のこと 16）。

意に硫酸化活性を示すことが判明している 14）。今回明らかとなったニトロチロシンの硫酸化を含めると、SULT1A3 は非常に多面的な生理機能を有すること（cf. Fig. 516））、そして酸化／ニトロ化
ストレスによって生じるリスク因子としてのニトロチロシンに対して防御的に機能しうることが示唆された。遊離ニトロチロシン
硫酸体は、タンパク質中のニトロ化チロシンの分解を経由して生じることなどが考えられるが、その生成経路についての詳細な検討も必要である。今後、in vivo における遊離ニトロチロシンおよびその硫酸抱合体あるいは代謝物の体内レベルを評価することが酸化／ニトロ化ストレスを介した疾病状態を予知する上で重要であり、これらもまた有効なバイオマーカーとして利用されることが予想される。

6．神経疾患リスクと硫酸化
近年、医療技術の向上および衛生面など生活環境の改善によって我々の寿命は伸びてきており、わが国をはじめ先進国ではすでに高齢化社会を迎えつつある。それに付随して注目されてきた疾病のひとつにアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経疾患が挙げられるが、これまで原因究明と治療法の確立に関する研究に重点が置かれてきた。その発症の原因としてセロトニンやドー
パミンなどを介した神経伝達の異常や過度の酸化ストレスなどが考えられているが、これら疾病リスクに対する防御機構については明らかにはなっていない。一方で、酸化ストレス下で生じうる
7-ヒドロキシセロトニンや6-ヒドロキシドーパミンといったモノ
アミン系の酸化型神経伝達物質が神経細胞の損傷を引き起こすことが報告されており、筆者らは硫酸化の視点より SK-N-MC ヒト
神経芽腫細胞を用いてこれらの疾病リスク因子に対する防御機構について調べることとした。

6.1 7- ヒドロキシセロトニンと 6- ヒドロキシドーパミン
我々の体内では、セロトニンとドーパミンはよく知られたモノ
アミン系神経伝達物質であり、これらはセロトニンまたはドーパミン作動性レセプター特異的な神経伝達の調節を行うことにより、News No.129(2009)

感情や記憶などの精神状態や物理的行動を制御すると考えられている。これら化合物もまた硫酸抱合化により代謝調節され、体内では血液、尿および脳髄液内に硫酸体として存在することが報告されている。近年の研究により、セロトニンやドーパミンに水酸基が付与された酸化型産物 7- ヒドロキシセロトニン（5,7- ジヒド
ロキシトリプタミン）および 6- ヒドロキシドーパミンが、ヒドロ
キシルラジカルを介した酸化反応により生じうること、酸化スト
レスとともにこれらが神経細胞に損傷を与えることでアルツハイ
マー病やパーキンソン病などの神経疾患を惹起することが提唱されている。そこで筆者らは、「7- ヒドロキシセロトニンや 6- ヒド
ロキシドーパミンなどの有害なモノアミン系化合物による神経疾
患リスクに対して、我々の体もまた防御機構が備わっている」と考え、前章と同様のアプローチを用いて硫酸化がその役割を担う
可能性について検証することとした。

6.2 7- ヒドロキシセロトニンおよび 6- ヒドロキシドーパミ
ンの硫酸化と SULT1A3
既知の 11 種類のヒト由来 SULTs を用いて、7- ヒドロキシセロ
トニンおよび6-ヒドロキシドーパミンを硫酸化する酵素の特定を試みた結果、SULT1A3 がこれら酸化型物質を硫酸化する主酵素であること、続いて SULT1C#2 および SULT1A1 もまた低い活性ながらこれらの基質を硫酸化しうることが明らかとなった 17）。
さらに 7- ヒドロキシセロトニンは SULT1A3 によるセロトニンの硫酸化を競争的に阻害し、6- ヒドロキシドーパミンもまたドーパ
このことより、
ミンの硫酸化を同様に阻害することも判明した17）。
これら酸化型モノアミン系化合物は硫酸化により代謝変換される
ものの、同時にセロトニンやドーパミンの硫酸化による代謝調節にも影響を与える可能性が考えられた。つぎに筆者らは、7- ヒド
ロキシセロトニンまたは6-ヒドロキシドーパミンとともにSK-NMC 細胞および放射線標識硫酸[ 35 S] を用いた代謝ラベル実験を行った。その結果、培地中に添加された 7- ヒドロキシセロトニン
は培養細胞内に取り込まれ、硫酸化による代謝調節を受けて 7- ヒ
ドロキシセロトニン[35S]硫酸体として培地中に放出されることが明らかになった 17）。興味深いことに 6- ヒドロキシドーパミンの場
合、 6- ヒドロキシドーパミン[35S]硫酸体に加えて 6- ヒドロキシドーパミン由来の[35S]硫酸体がいくつも検出された。さらに阻害剤を用いた試験により、これら 6- ヒドロキシドーパミン由来硫酸体のいくつかはカテコール O-メチル基転移酵素およびモノアミン
オキシダーゼなどの酵素による代謝変換および硫酸転移酵素による硫酸化を経て細胞外へ産出されていることがわかった 17）。この
結果は、ドーパミンが硫酸化だけでなくメチル化やモノアミン酸化など複数の酵素のはたらきによって代謝変換されうるというこれまでの報告と一致している。つぎに、これら化合物の硫酸化反応には S U L T 1 A 3 が関わっているかどうかを調べるため、
S U L T 1 A 3 特異的な s i R N A を用いて S K - N - M C 細胞内のSULT1A3 レベルを人為的に低減させる実験を行った。その結果、細胞抽出液による7-ヒドロキシセロトニンと6-ヒドロキシドーパ
ミンの硫酸化活性は有意に低下したことから、これら酸化型モノ
アミンは主に細胞内の SULT1A3 によって硫酸化されることが明らかとなった。
これらの結果より、 7- ヒドロキシセロトニンや 6- ヒドロキシドーパミンといった有害なモノアミン系化合物が神経細胞内で代謝変換され、そこでも SULT1A3 による硫酸化が積極的に機能していることが判明した。一方、6- ヒドロキシドーパミン硫酸体については他の代謝経路の存在も示唆され、疾病リスク因子となりうる化合物によっては SULT1A3 だけでなく複数酵素による防御機構が細胞内に備わっていることが窺えた。

7．おわりに以上述べてきたように、生体内における硫酸化は、単に生体外異物の解毒代謝および体内物質の濃度および活性調節を行うだけ
でなく、エストロゲン代謝阻害を介した環境中内分泌かく乱物質の活性発現メカニズムの標的となりうること、さらに疾病環境における酸化／ニトロ化ストレスの結果生じるニトロチロシンなど
有害な酸化物もしくはニトロ化物に対して生体防御的に働きうることが次々に明らかになってきた。しかしながら、我々身体の恒常性を維持するその多様な生理機能の解明にはまだまだ未開拓の余地があるのかもしれない。
筆者らのグループは、これまでにマウス由来のある種の SULTがプロスタグランジンやロイコトリエンといった炎症反応のメ
ディエーターとなるエイコサノイド類を硫酸化することが、炎症応答の沈静化にも機能しうることを見出している 18 ）。今後ヒト
SULT1A3 をはじめ各種硫酸転移酵素が有する多面的な生理機能と疾病環境における機能について明らかにされることが期待される。

謝辞
本研究を行うにあたり終始ご指導とご協力をいただき、そして現在も共同で硫酸転移酵素の機能解明に向けた研究を実施している米国トレド大学薬学部Ming-Cheh Liu博士に心よりお礼申し上げます。また、研究にご協力いただきました、宮崎大学医学部の中山建男教授と高見恭成准教授、愛媛大学農学部の菅原卓也准教
授にお礼申し上げます。
本研究は厚生労働科学研究費「萌芽的先端医療技術推進研究事
業（トキシコゲノミクス）」、文部科学研究費「基盤研究 B、若手研究 B」および科学技術振興機構の地域結集型共同研究事業の支援により遂行されています。

参考文献

1)
2)

W.B. , Jakoby, J. Biol. Chem., 1990, 265, 20715-20718 .
M. Suiko, Y. Sakakibara, M.-Y. Liu, Y.-S. Yang, , M.-C. Liu, J. Pestic.

Sci., 2005, 30, 345-353.
3)

T.A. Liu, S. Bhuiyan, R. Snow, S. Yasuda, T. Yasuda, Y.S. Yang,
F.E. Williams, M.-Y. Liu, M. Suiko, G. Carter, M.-C. Liu, Aquat.

Toxicol., 2008, 89, 94-102.
4)

T.Yasuda, S. Yasuda, F.E. Williams, M.-Y. Liu, Y. Sakakibara, S.
Bhuiyan, R. Snow, G. Carter, M.-C. Liu, Mol. Cell. Endocrinol., 2008,

294, 29-36.
5)

榊原陽一、水光正仁：生化学 , 2002, 74, 539-546.

6)

P.W.Robbins, F. Lipmann, J. Biol. Chem., 1958, 233,681-685.

7)

K. Yanagisawa, Y. Sakakibara, M. Suiko, Y. Takami, T. Nakayama,
H. Nakajima, K. Takayanagi, Y. Natori, M.-C. Liu, Biosci. Biotechnol.

Biochem,1998, 62, 1037-1040.
8)

R.M. Weinshilboum, D.M. Otterness, I.A. Aksoy, T.C. Wood, C. Her,

9)

S. Takahashi, Y. Sakakibara, E. Mishiro, H. Kouriki, R. Nobe, K.

R.B. Raftogianis, FASEB J., 1997, 11, 3-14.
Kurogi, S. Yasuda, M.-C. Liu, M. Suiko, Biochem. Biophys. Res.

5

News No.129(2009)

Commun., 2008, 375, 531-535.
10) M. Suiko, Y. Sakakibara, M.-C. Liu, Biochem. Biophys. Res.

パンフレットのお知らせ

Commun., 2000, 267, 80-84.
11) K. Ohkimoto, Y. Sakakibara, M. Suiko, H. Yoshikawa, M.-C. Liu, H.
Tamura, Pesticide Biochem. Physiol., 2005, 81, 32-38.
12) 榊原陽一、水光正仁：化学と生物 , 2000, 38, 776-778.
13) Y. Sakakibara, M. Suiko, M.-C. Liu, Eur. J. Biochem., 1994, 226,
293-301.
14) Y. Sakakibara, J. Katafuchi, Y. Takami, T. Nakayama, M. Suiko, H.

酸化ストレス研究関連試薬のパンフレットを作成いたしました。
疾患と活性酸素(由来)フリーラジカルの関わりを示すとともに、生体内の代謝とその機構解析のための製品を紹介しています。ご請求は、小社マーケティング部まで。

Nakajima, M.-C. Liu, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1355, 102-106.
15) S. Yasuda, S. Idell, M.-C. Liu, Biochem. J., 2007, 401, 497-503.
16) M.-C. Liu, S. Yasuda, S. Idell, IUBMB Life, 2007, 59, 622-627.
17) S. Yasuda, M.-Y. Liu, M. Suiko, Y. Sakakibara, M.-C. Liu, J.

Neurochem., 2007, 103, 2679-2689.
18) M.-C. Liu, Y. Sakakibara, C.-C. Liu, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 1999, 254, 65-69.

著者紹介
榊原 陽一（Yoichi Sakakibara）
宮崎大学農学部応用生物科学科 准教授〒 889-2192 宮崎市学園木花台西 1-1
電話：0985-58-7211 Fax：0985-58-7211
e-mail：ysakaki@cc.miyazaki-u.ac.jp
出身大学：宮崎大学農学部農業化学科
学位：博士（農学）鹿児島大学
現在の研究テーマ：翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の機能解
明、プロテオーム解析による食品機能性評価
安田 伸（Shin Yasuda）
東海大学農学部バイオサイエンス学科 講師〒 869-1404 熊本県阿蘇郡南阿蘇村河陽 東海大学農学部
電話：0967-67-3946 Fax：0967-67-3960
e-mail：shin.yasuda@agri.u-tokai.ac.jp
出身大学：九州大学大学院生物資源環境科学府
生物機能科学専攻食糧科学
学位：博士（農学）
現在の研究テーマ：食品素材の機能性に関する研究
生理活性物質の機能性と代謝調節に関する研究
水光 正仁（Masahito Suiko）
宮崎大学農学部応用生物科学科 教授〒 889-2192 宮崎市学園木花台西 1-1
電話：0985-58-7215 Fax：0985-58-7215
e-mail：msuiko@cc.miyazaki-u.ac.jp
出身大学：九州大学農学部農芸化学科
学位：農学博士 九州大学
現在の研究テーマ：細胞質硫酸転移酵素の網羅的機能解析、翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の機能解明、ハイスループット食品機能性評価法の開発

学会展示のお知らせ

日本農芸化学会 2009 年度大会

附設展示会

日時：2009 年 3 月 28 日 ( 土 ) 〜 29 日 ( 日 )会場：マリンメッセ福岡
福岡市博多区沖浜町 7-1＊ランチョンセミナーも開催予定です。

販売中止のお知らせ

下記製品を販売中止とさせていただきます。
これまでのご愛顧有り難うございました。

Arsenazo-III
メーカーコード：A013

1 g（コード：349-00143）
5 g（コード：347-00144）

6

News No.129(2009)

Topics on Chemistry
チオールバイオイメージングに特化した新規蛍光プローブ
株式会社同仁化学研究所
古くからチオールは生命科学分野において盛んに研究されてきた。グルタチオン、システイン、ホモシステインなどに代表される生体チオールは、生体酸化還元ホメオスタシスを維持し、代謝をつかさどる重要物質のひとつである。例えば、グルタチオンは酸化ストレスと密接に関係していることがわかっており、ホモシ
ステインなどの特定チオールは多くの疾患に関連していることが報告されている。
これらチオール研究に欠かせないのが光学的検出法である。チオールプローブとしてよく知られているDTNB（エルマンズ試薬）
は、紫外 - 可視吸収スペクトルでチオールの検出・定量を可能にする(Fig.1)。その他、求電子基を有することでチオール選択性を持たせた多くの色素が存在しているが、それらは on/off シグナル比が低く、また、洗浄・単離を必要とするため迅速な定量は難しいという欠点がある。

Fig. 1 Reaction of DTNB with Thiol

現在、チオール検出色素は蛍光 turn-on プローブが開発された
ことにより目覚しい進歩を遂げている。これらの色素は、チオールとの反応により分子内の PET 効果(Photoinduced ElectronTransfer Effect)が遮断され、元々消光分子であった物質が蛍光分子に変換されることで蛍光を発するようになる。しかし、これらの多くは水溶性が低いために共溶媒として有機溶媒の使用を余儀なくされる。また、チオール以外の求核攻撃や加水分解を受けやすく、副反応による感度・選択性の低下が認められる。
最近、これら欠点を克服し、赤色発光するチオールプローブがBouffard らによって報告されたので 1)、ここに紹介する。現在一般的に用いられている蛍光プローブは、紫外 - 緑色励起で発光するものがほとんどであるが、長波長プローブは光散乱を抑え、光透過性を増し、自家蛍光を減らし、細胞の光安定性を増大させることから、バイオイメージングに最適なプローブであると言える。
チオール高選択性を兼ね備えたプローブ 1 はドナー - アクセプ
ター型の骨格で構成されている。電子吸引性のスルホニル基はチオールと反応して脱離し、吸収・発光スペクトルで大きく長波長シフトした色素 2 を生成する(Fig.2)。

藤野 怜香

電子吸引基は今までアレーンスルホナートを用いるのが主流であったが、アレーンスルホンアミドに変換したことで、酸素・窒
素の求核攻撃に対して耐性が増し、同時にチオール選択性も向上している。また、エチレングリコール鎖の効果で高い水溶性も備わっている。
プローブ 1 のチオール選択性は非常に高く、系中にチオールが共存するときのみしか蛍光反応を示さない。さらに蛍光シグナル
はブランクと比較して 60-120 倍強度を増すことが確認されている。またブランクの上昇は、アミン類、活性酸素種、還元剤が存在しても観測されることはない。加えて、加水分解に対する耐性も非常に高いことがわかっている。
水溶液中では、プローブ 1 は極大吸収波長 405 nm で、蛍光を発生しない(λex = 560 nm, ΦF = 0.0008)。これは、スルホンア
ミド保護された状態では電荷移動の性質がなく、電子吸引基に効
果的なドナー励起 PET 効果があることに起因している。脱保護により生成する色素 2 は極大吸収波長 563 nm と赤色域に長波長シ
フトすることから、push-pull型の発色団に効果的に非局在化が起こっていることがわかる。
色素 2 の蛍光量子収量は 0.01(λem = 623 nm)と元々はほんのわずかである。しかし、蛍光量子収量は培地に依存して変化が見られる。生体高分子存在下では、細胞表面での相互作用または吸着作用により、色素 2 の蛍光量子収量は大きく増加する。一方、プローブ 1 は発光しないままである。この培地依存性はバイオイ
メージングにおいて大変都合がよい。
生細胞内チオールモニタリングでは、プローブ 1 は細胞透過性を示し、蛍光顕微鏡で強い蛍光が見られる。遊離のチオールがな
い細胞では蛍光シグナルはまったく観測されていない。このこと
は、生細胞における他の検体においてもプローブ 1 のチオール選択性が保持されることを意味する。
以上のように、プローブ 1 は高い on/off 比を持つチオール選択
的 turn-on 蛍光プローブである。従来のチオールプローブの欠点をなくし、生体高分子の存在下でプローブとしてのより良い効果を発揮することから、今後 in vivo での小動物イメージングへの応用が期待される。また、この合成法を利用することで、スルホニ
ル基、側鎖、π- 共役ブリッジ、電子受容体それぞれのコンポーネントを多様に組み合わせることが可能になる。近赤外発光チオー
ルプローブや、その他さまざまな新規プローブの合成への応用も期待される。
参考文献

1)

J. Bouffard, Y. Kim, T. M. Swager, R. Weissleder, S. A. Hilderbrand,

Org. Lett., 2008, 10 (1), 37-40.

Fig. 2 Formation of Fluorochrome from Thiol Probe

7

News No.129(2009)

Topics on Chemistry
糸状菌とナノテクノロジーが融合した新規血管新生阻害剤
株式会社同仁化学研究所
癌とは正常細胞が変異により異常増殖能を獲得する疾患であり、その由来が自己の細胞であることから、異生物侵入により引き起
こされる感染症などに比べ薬物治療による効果を見出すことが困難である。
現在使用されている抗癌剤の多くがこの癌細胞の異常増殖性を選択性としているため、生体内で増殖の盛んな骨髄細胞・粘膜細胞などの正常細胞も障害を受け免疫低下・消化管障害などの重篤な副作用を伴うことが問題となっている。そこで、新たな作用機構を持った抗癌剤が望まれている。また、近年、癌の拡大が血管新生に依存しているという新しい概念が提唱され、この血管新生を標的とした抗癌剤の探索および開発が非常に盛んになってきている。
ここでは、血管新生とその阻害物質について概説するとともに、さらに現在最も注目されている血管新生因子である血管内皮細胞
増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)に対する阻害物質について極めて強力な経口の血管新生阻害剤である
Lodamin（ロダミン）によるモデル実験の研究結果 1) も合わせて
紹介する。

平島 義紀

O
HOOC

4

O
OCH3
O
H
O
CH3

Fig. 1 Fumagillin（フマギリン）

不明だが、血管内皮細胞の CDKs（サイクリン依存性キナーゼ）活性阻害による細胞周期の停止と、メチオニンアミノペプチダーゼ
阻害活性が報告されている。その血中半減期は 5 〜 10 分と極めて短い。
血管新生阻害剤によって癌治療を行った場合、その作用の特徴
1. 血管新生とはとして、①多くの抗癌剤治療の場合に併発する骨髄毒性などの重篤な副作用は起こらないものと考えられる。②遺伝子変化が起こ
りにくいと考えられる血管内皮細胞を標的とするため、癌細胞を通常の生理的状態では、血管新生はその促進因子と抑制因子に標的とした今までの抗癌剤のような獲得薬剤耐性という問題は無よって高度に制御された現象である。しかし、癌（腫瘍）細胞でいと考えられる。③腫瘍血管は、癌の血行性転移にも関与しておは制御不能の血管新生が見られる。
り、血管新生阻害は転移阻害にも有効であると考えられる。
腫瘍に誘発される血管新生は既存の血管を囲む基底膜が溶解す
このように、抗癌剤が癌細胞に直接的（cytotoxic）に作用するることから始まる。本プロセスは腫瘍細胞や周辺支持組織によりのに対して、血管新生阻害剤は、「兵糧攻め」による間接的作られるマトリクスメタロプロテアーゼ（MMPs）により促進される。続いて血管芽細胞が崩壊した組織細胞外マトリックスを通 （cytostatic）な作用であることが大きく異なっている点である。
そのため血管新生阻害剤は、既存抗癌剤のように、癌を退縮・消じて腫瘍細胞へ向けて移動する。そして、細胞外マトリックスの失させることが困難である。従って、血管新生阻害剤による癌治崩壊により血管新生因子の放出が容易になり MMP 活性の増加に療においては、癌の退縮を期待するのではなく、癌の増殖を抑え、より腫瘍細胞の転移、血管新生能力が増加する。
現在、腫瘍細胞から産生され、内皮細胞に対する特異性が高く、 休眠（dormancy）の状態に保つことを期待する治療法として特徴
消化器癌の進展に最も関与しているとされるのが VEGF である。 付けられる。血管新生阻害剤は既存抗癌剤と比べて利点が多く、既にアメリカでは数種類の血管新生阻害剤の臨床試験が開始されて種々の悪性腫瘍において、VEGF が悪性細胞から直接産生されるいる。
VEGF
ことが報告されており、この事は癌治療の標的因子として、が利用できることを示唆している。

82. 血管新生阻害剤による癌治療

3. Lodamin（ロダミン）〜 Folkman らによる抗血管新生の新経口阻害剤〜

血管新生阻害剤は、その標的が血管内皮細胞であり、抗癌剤の様な腫瘍細胞による薬剤感受性の差が無く、また、耐性が獲得される可能性も少ないために固形癌の新しい治療戦略として有望である。
血管新生阻害剤は、特異的に血管新生因子を阻害するものと、非特異的に血管内皮細胞の増殖、浸潤、管腔形成を阻害するものとに大別される。前者の代表が VEGF 中和抗体であり、後者の代表が日本で開発された TNP-470 を挙げることが出来る。
TNP-470 は、血管内皮細胞の培養中に混入した糸状菌（Aspergillus fumigatus fresenius）が内皮細胞の増殖を阻害したことから偶然発見された低分子物質 フマギリン（Fig. 1）を基にして、後述の Folkman と武田薬品工業がその毒性軽減を目的
として、共同開発した合成誘導体である 2)。TNP-470 は血管内皮細胞の増殖を強く阻害するが、癌細胞に対しては、より高い濃度
でないと作用しないという欠点を持っている。作用機構の詳細は

前述のフマギリン類似化合物である TNP-470 は、 血液供給増加のための血管新生を妨げることによって腫瘍を飢えさせる というFolkmanの血管新生阻害療法のアイデアによって開発された極めて強力で広域の血管新生阻害剤である。しかし、この薬は脳に作用し、うつやめまいなどの副作用を引きおこした。また、経口での利用能が低く半減期が短いという大きな臨床的制約があり、高頻度で連続的な非経口投与が必要となる。そこで、Folkman ら
はその問題解決に取り組み、カプロスタチンの改良薬でナノテクノロジーを合わせ持った初の合成抗血管新生剤である Lodamin（ロダミン）を開発した。
まず、水に溶けにくいTNP-470をモノメトキシポリエチレング
リコール−ポリ乳酸ジブロック共重合体に結合させ、この共重合体をナノポリマーミセルに自己組織化させることで、この経口製剤 Lodamin を合成した(Fig. 2 , Fig. 3)。なお、このポリマーは
すでに商業的にも汎用されているものであり、胃酸環境でも保護News No.129(2009)

O

O

O
H3CO

m

O

O
H3CO

m

CI

O

H
N

O
O

N
H

n
O

O

O

O
N
H

O
OCH3
O

O
N
H

NH2
N
H

n
m

NH2

H 2N

O

O

OH

n

O
O

H3CO

O
O

H
O
CH3

O
OCH3
O

O

H
CH3

Fig. 2 Synthesis of Lodamin

されるため、経口投与可能なものである。
さらに、肝臓に高転移性のマウスメラノーマ細胞(B16/F10)をそこで、Lodaminがマウスで腫瘍の増殖を顕著に阻害することを 接種したところ、ロダミンは毒性なく蓄積した。また、マウスの実証するために、培養細胞および腫瘍異種移植片において蛍光色素 皮下に転移したルイス肺癌細胞とマウス黒色腫細胞の増殖を顕著でラベル化したナノポリマーミセルがエンドサイトーシスによって に阻害し、脾臓に注入したマウス黒色腫細胞の肝転移を有意に抑内皮細胞に取り込まれることを明らかにした。また、血管新生因子 制して生存期間を延長したことは特筆すべき点であり、同時に、マである塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor： ウスでは特に癌の致命的合併症で適切な治療がない肝転移予防に
bFGF）や VEGF を含有させたペレットをマウス角膜のマイクロポ 有効であることを示唆している。他にも目の黄斑に異常が起きてケットに移植して(マイクロポケット法) 3）、輪部血管から生じた新 視野の中央が暗く見える、よく見えない、線がゆがむといった症
生血管がナノポリマーミセルを処理することによって抑制されるか 状を有する加齢黄斑変性症の異常血管成長による疾患にも有効でどうかを検討したところ、血管新生を抑制することを認めた。
あると考えられる。
そして、遊離型の TNP-470 が血液脳関門（blood-brain barrier） 今後は、薬剤耐性癌細胞の発生にロダミン単独で対処可能なのを通過するのに対して、ロダミンは脳に浸透しないことから、ロダ か、もしくは別の抗血管新生剤との併用が必要なのかを見極める
ミンは、TNP-470 の効力を保持しているものの、TNP-470 が有す ために、さらに実験を積み重ねる必要があると感じる。
る神経毒性を示さないこと、ロダミンは半減期が長く、経口投与す
ると腸で吸収され、最初に肝臓に到達し、選択的に肝臓と腫瘍組織
このように、経口での利用能が低いという大きな臨床的制約をに蓄積して血管新生を阻害することが明らかとなった。
克服するために、不溶性のTNP-470をナノポリマーミセルに自己組織化させ、経口投与可能な薬剤とする発想は、汎用性が高く非常に興味深い。医薬品分野のみならず、その応用性は更に広がっていき、様々な分野で利用されることが期待される。

参考文献

1)

O. Benny, O. Fainaru, A. Adini, F. Cassiola, L. Bazinet, I. Adini, E.
Pravda, Y. Nahmias, S. Koirala, G. Corfas, R. J D’Amato and J.
Folkman., “An orally delivered small-molecule formulation withantiangiogenic and anticancer activity”, Nature Biotechnology, 2008,

26, 799.
2)

D. Ingber, T. Fujita, S. Kishimoto, K. Sudo, T. Kanamaru,
H. Brem and J. Folkman, “Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumour growth”, Nature, 1990, 348,

Headline: New Oral Angiogenesis Inhibitor Offers Potential Nontoxic
Therapy for a Wide Range of Cancers
Link: http://www.sciencedaily.com/releases/2008/06/080630114209.htm
Source: Science Daily / University of Toronto

555.
3)

M. Rogers, A. Birsner and R. D’Amato, “The mouse cornea
micropocket angiogenesis assay”, Nature Protocols, 2007, 2, 2545.

Fig. 3 Polymer Micelle Formation of Lodamin

9

News No.129(2009)

新製品
微生物検出キット（比色）

Microbial Viability Assay Kit-WST
福岡県工業技術センターとの共同開発により微生物の比色検出キットを開発、10 月 30 日より発売を開始致しました。本製品は、水溶性テトラゾリウムである WST-8（特許 2757348）を発色試
薬として用いた微生物の比色検出キットです。
＜特長＞• 寒天培地法や微量液体希釈法に比べ、短時間での検出が可能(Fig. 2-5 ,Table 1)。
• マイクロプレートを使った多検体処理が可能。
• 培地成分による影響を受けにくい(Fig. 6)。

＜原理＞
微生物はエネルギー代謝活動により細胞内に NAD(P)H を生成します。
WST-8 は電子メディエーターを介する事で、この NAD(P)H により還元され、水溶性 formazan（オレンジ色）を生成します(Fig.
1)。formazanの生成量は微生物のエネルギー代謝活性に比例する
ため、オレンジ色への呈色を見ることで、その微生物の生存率や活性度合を確認できます。

＜キット内容＞ 500 tests/ 1 kit（96 well プレート 5 枚分）• WST solution 1 ml × 5 tubes• Electron mediator reagent 0.5 ml × 1 tube

＜本キット以外に必要なもの＞• マイクロプレートリーダー（測定波長：450 〜 490 nm）• 96 穴マイクロプレート• マイクロピペット及びチップ• 1.5ml チューブ
• インキュベーター

細胞増殖Assay(E.coli)

1×107
1×106
1×105
1×104

2

1×103
1×102

1

1×10
1

time (hr)

1×1083lncubation

Absorbance (460nm)

検出感度（OD460 0.5に達する時間）

細胞密度
CUF/ml4

Fig.1 発色原理

8
7
6
5
4
3
2
1
0

R2＝0.9993

1X102

1

1X104

1X106

1X108

0
0

2

4

6

8

10

細胞密度（CFU/ml）

Time(hr)Fig.3 E.coli の菌体密度と発色時間

Fig.2 E.coli の発色曲線

検出感度（OD460 0.5に達する時間）

細胞密度
CUF/ml

3

1×107
1×105

2

1×104
1×103

1

1×102

time (hr)

1×106

1×10

12

6

R2＝0.9995

10
8

4
2
0
1

0
0

2

4

6

8

10

12

14

1X102

1X104

1X106

1X108

16

Time(hr)Fig.4 S.aureus の発色曲線

10

14

1×108

lncubation

Absorbance (460nm)

細胞増殖Assay(S.aureus)4

細胞密度（CFU/ml）

Fig.5 S.aureus の菌体密度と発色時間＜微生物増殖試験＞
細菌（E.coli, S.aureus）懸濁培地を 10 倍希釈
系列で 96 well マイクロプレートに播種した。
各 well に発色試薬を添加し、37°C でインキュベー
トしながら一定時間ごとの吸光度（460 nm）をマ。
イクロプレートリーダーにて測定した（Fig. 2, 4）
それぞれの菌体密度において OD 460 が 0.5 に達した時間を求めると、菌体密度と OD 460 =0.5 到達時
間との間に高い直線関係が得られた（Fig. 3, 5）。

News No.129(2009)＜薬剤感受性試験＞
各細菌を抗生物質を含む Mueller-Hinton 培地中で 6 時間（35°C）インキュベートした後、発色試薬を添加し 2 時間（35°C）反応させた。各薬剤濃度において、発色が確認されなかった濃度を同キットにおける Minimum Inhibitory Concentration(MIC) とした。
Microdilution method（日本化学療法学会標準法）では 22 時間のインキュベーション後に目視で MIC を求めるが、本キットを用いた場合、 8 時間で Microdilution method と同等の MIC(µg/ml)を得ることができた。
Table 1 Microbial Viability Assay Kit-WST と Microdilution method での MIC 値の比較

Microbial Viability Assay Kit-WST

Microdilution method

Microbial Viability Assay Kit-WST

Microbilution method

Ampicillin

2

2-4

0.125

0.125-0.25

Cefotaximine

0.062-0.125

0.031-0.125

44Chloramphenicol

8

16

8

8

Gentamicin

0.5-1

1

0.031

0.031-0.062

Ciprofloxacin

0.062

0.031-0.062

1

0.25

薬剤感受性試験の手順
1) 微生物を最適な培地で培養する。
2) 培養した菌懸濁液を滅菌生理食塩水で OD 550 が約 0.125（0.5 McFarland 相当）となるように希釈し、さらに滅菌生
理食塩水で 10 倍希釈し接種用菌液とする（約 10 7 CFU/ml）。
3) 抗生物質などの被検物質を Ca 及び Mg イオン濃度調整済み
Muller-Hinton broth を用いて 2 倍希釈系列に調製する。
（例
えば、64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.12, 0.06 µg/ml）
4) 96well プレートへ抗生物質含有 Muller-Hinton broth 180µl/well を分注する。
5) 各 well へ接種用菌液 10 µl を分注する（約 104 CFU/well）。
6) 微生物に適した温度で 6 時間インキュベーションする。
7) WST solution と Electron mediator reagent を 9 ： 1 で混合し、検出試薬とする。
8) 6 時間 インキュベーションしたマイクロプレートに、手順7)で作成した検出試薬を 10 µl/well 添加し、更に、2 時間イ
ンキュベーションする。
9) マイクロプレートリーダーにて 450 〜 490 nm の吸光度を測定する。
＊グラム陽性菌や真菌を検体とされる場合は、 Electron mediator reagent を滅菌水もしくは DMSO にて 8 倍希釈したもので、検出試薬の調製を行って下さい。
＊必ずブランクを測定して下さい（菌を含まない抗生物質含有培地）。

＜培地成分の影響を受けにくい＞
微生物の培養には各種培地が使用され、その成分も様々です。
よって、これら培地成分による非特異的な発色（還元反応）が起
こりにくいという事が検出試薬にとって重要なポイントです。
Microbial Viability Assay Kit-WST で採用している WST-8 は、培地成分による還元を殆ど受けませんので、より比色検出に適したテトラゾリウム化合物です。

Fig. 6 培地成分によるバックグランドへの影響
培地成分を含む PBS（pH 7.0）に検出試薬を加え、37°C にて 24 時間イン
キュベートし吸光度を測定した。
〈測定波長〉WST-8 formazan 460 nm

品名
容量
価格(￥)
Microbial Viability Assay Kit-WST
500 tests
20,000

メーカーコード

M439

11

News No.129(2009)

試作品
微生物検出キット（蛍光）-Bacstain- CTC Rapid Staining Kit
for Flow cytometry, for Microscopy《特長》• スピーディーで高感度な生菌の CTC 染色が可能です。
• 少量小分け品ですので使いやすくなっております。

細菌検出用の蛍光試薬として、EB, DAPI, SYBR Green などのような生・死全菌染色剤、Invitrogen 社の LIVE/DEAD®BacLightTM 《キット内容》 ※各 100 assay 用
Bacterial Viability Kit（以下、BacLight）に代表されるような、
生・死二重染色キットが汎用されています 1-3）。BacLight は細胞
for Flow cytometry と for Microscopy の 2 種類をご用意して膜透過性の異なる 2 つの核染色試薬（SYTO 9 及び PI）により同おりますので、検出系にあったキットをお選び頂けます。
時染色することで、生細胞（膜損傷なし）及び死細胞（膜損傷あり）を見分けます。このように膜損傷の有・無で細菌の生・死判for Flow cytometry
定を行います。
• CTC
10 mg × 3 tubes
一方、CTC は呼吸活性による電子伝達系により還元され、蛍光性の formazan を生成するという特性をもちます。この菌の代謝に応じ蛍光を発する点で注目され、生菌に選択的な蛍光試薬として汎用されてきましたが、染色性が悪いという問題を抱えておりました。
この度、小社で開発しました -Bacstain- CTC Rapid Staining
Kit は、CTC 染色時に enhancer を加えることで、CTC での染色をより迅速・高感度にできるキットです。CTC 単独では染色されなかった乳酸菌や真菌おいても、同キットにて染色されることが確認できました。

• enhancing reagent A （DMSO solution）

0.1 mlfor Microscopy• CTC
10 mg × 3 tubes• enhancing reagent B （aqueous solution） 0.5 ml《本キット以外に必要なもの》• マイクロピペット• インキュベーター（25 〜 37℃）
• マイクロチューブ• 遠心機（マイクロチューブ用）

Microscopy

Flow cytometry
CTC Rapid Staining Kit (for Flow cytometry)と I 社キットとの染色能比較※細胞密度，CTC 終濃度，インキュベート時間及び温度はすべて同一条件※ 488 nm 励起、検出波長 670 〜 735 nm

培養した細菌懸濁液を遠心分離し上清（培地）除去後、PBS(-)に再懸濁した。
CTC のみ又は CTC + enhancing reagent B を添加した。
37°C で 1 時間インキュベートした後、プレパラートを作成し蛍光観察（B 励起）した。
Staphyrococcus aureus subsp. Aureus （× 400）
CTC だけでの染色
CTC + enhancing reagent B での染色

未染色の細胞（自家蛍光）CTC Rapid Staining Kit
で染色した細胞Klebsiella peneumoniae （× 400）
CTC だけでの染色
CTC + enhancing reagent B での染色

I 社 CTC 染色キットで染色した細胞福岡県工業技術センター生物食品研究所のご指導、ご協力のもと染色実験を行
いました。

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News No.129(2009)

関連製品
＜染色例＞
CTC による菌の染色例を下記に示します。
対比染色として、SYBR® Green I を用いております。

その他、核染色剤として使用される製品をご紹介いたします。

-Cellstain- DAPI-Cellstain- DAPI solution
DAPI は蛍光顕微鏡下、酵母のミトコンドリア、葉緑素、ウイル
ス、マイコプラズマ、染色体中のDNA 検出に使用されている。460
nm に青色の蛍光を持ち（励起波長 360 nm）、DNA の AT 配列に特異的な minor grove binder である。

50%live B.cereus CTC-SYBR® Green I B 励起(400 倍)

S.aureus DAPI(終濃度 1µg/ml)UG 励起、4％ホルマリン固定-Cellstain- PI-Cellstain- PI solution
Propidium iodide（PI）は DNA の二重らせん構造に intercalate することにより特有の赤色蛍光が増強される核酸染色色素である。一部は二本鎖構造の RNA とも結合するため、正確な DNA
染色を行うには、二本鎖構造の RNA の除去が必要である。一般に生細胞の細胞膜は透過せず、死細胞にのみ入り込み核内の DNA にintercalate し赤色蛍光を発する。したがって死細胞染色色素として利用され、フローサイトメトリー への応用例も数多い。

-Cellstain- EB-Cellstain- EB solution
PIと同じくphenanthridium 系染料に分類されるカチオン性の蛍光色素である。DNA の二重らせん構造に intercalate すること
Staphyrococcus aureus CTC-SYBR® Green I B 励起(400 倍)
参考文献

1)

染谷 孝， 蛍光染色による土壌微生物の検出法 ，月刊 海洋 培養不能細菌-VNC 研究の現状と課題 -，2003, 33, 14．
2)

平石 明，吉田 奈央子， 活性汚泥における培養不能な細菌の検出 ，月刊
海洋 培養不能細菌 -VNC 研究の現状と課題 -，2003, 33, 48．

3)M. Kawai，N. Yamaguchi and M. Nasu, J．Appl．Microbio．，1999，

86，496．

により特有の赤色蛍光が増強される核酸染色色素である。
品名
容量
価格(￥)
-Cellstain- DAPI
1 mg
3,800
-Cellstain- DAPI solution
1 ml
4,800
-Cellstain- PI
1 mg
3,800
-Cellstain- PI solution
4,800
1 ml
-Cellstain- EB
3,800
1 mg
-Cellstain- EB solution
1 ml
4,800

コード

メーカーコード

342-07431

D212

340-07971

D523

343-07461

P346

341-07881

P378

346-07451

E262

348-07891

E272

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News No.129(2009)19th フォーラム・イン・ドージン開催報告

細胞膜脂質のダイナミクス
19 回目を迎える今年のフォーラム・イン・ドージンが「細胞膜脂質のダイナミクス」と題して、さる 11 月 28 日、熊本市の鶴屋ホールで開催された。この時期、市内は黄色く色づいた街路樹の銀杏が美しい。当日は前日までの雨もあがり、爽やかな初冬の一日、会場では熱気に溢れた討論が行われた。参加者は延 140 人程度とほぼ例年並だったが、東京などの遠方からの参加者もあり、徐々にこのフォーラムの存在も知られるようになってきたのではないかと思う。今年から小社の三浦 洌顧問（熊本大学名誉教授）
も世話人として参加し、さらに充実した内容になった。
脂質はいうまでもなく細胞膜を形づくる基本分子だが、核酸やタンパク質、あるいは糖鎖が担う高度な機能や情報と比べて、何となく魅力に欠ける気がしていた。しかし、生命を司る反応の多
くは、われわれが親しんでいる均一な溶液中で起こる化学反応とは異なり、高度に組織化された場のうえで起こる全く別の世界である。生体膜はまさにそのような反応場であり、それを構成する脂質の働きを理解することは、生命現象の深い理解に欠かせないものだ。今回のフォーラムでは、脂質がもつ多彩な機能について
最新の研究成果が紹介され、非常に魅力的な研究分野であることを再認識させられた。生命は一個の細胞に宿っており、その生命を包み込む細胞膜は単なる包装紙ではなく、生命活動の場そのものである。
講演内容は、「1 分子で見る、細胞膜がはたらく仕組み」と題して、楠見先生（京都大再生研）がラフトでのシグナルの授受を 1 分子イメージングによって「見る」研究を紹介された。理研の小林先生は、細胞膜の動態を脂質蛍光プローブを用いて可視化する試
み、国立感染症研究所の花田先生が、脂質セラミドの小胞体からゴルジ体膜への選択的な輸送について話された。

ホームページアドレス
URL : http://www.dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

午後のセッションでは、応用に主眼をおいた４件の講演が行われた。熊本大（薬）の佐藤先生は生体内で発生する脂質ラジカル
を、スピントラップ剤と有機溶媒への抽出とを組み合わせ、ESRで測定する手法を紹介された。続いて、野口先生（同志社大生命
医科学部）は脂質酸化生成物や shear stress に対する遺伝子発現
応答について、また東城先生（大阪大医）が脂質代謝と病態について、最後に有馬先生（熊本大薬）がシクロデキストリンのラフトへの作用について講演された。いずれも、フロアからの質問は同じ分野の専門的なものが多く、真剣な議論が交わされた。

来年はこのフォーラムも 20 周年を迎える。小社が現在の場所に移転したのをきっかけに、ヨチヨチ歩きから始めたこのフォーラ
ムも、ようやく成人になるのを記念して、何か特別な企画を検討したいと考えている。
これからもよりいっそう充実した内容のフォーラムを目指していきたいと思いますので、ご意見、アドバイスなどお寄せいただ
ければ幸いです。また、講演予稿集をご希望の方は、小社カスタ
マーサービス部（info@dojindo.co.jp ／ free dial: 0120-489548）までご連絡下さい（佐々本 一美）。

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.129

News No.129
140120-021557
0120-489548

平成21年1月1日発行

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 吉田睦男 編集責任者 蒲野志保 年４回発行 許可なくコピーを禁ず