No.097 / 2001

■Review

新規のプラスミド構築及び変異、欠失導入法：
CLIP(Cross-linked Primer)法の原理
小原健志■Topics on Chemistry

In vivoでアミロイド斑を染色する蛍光色素 BSB
佐々本一美

■連載

実用的蛍光誘導体化7
山口政俊・能田 均

News No.97(2001)

目次
Review
新規のプラスミド構築及び変異、欠失導入法：
CLIP(Cross-linked Primer)法の原理
熊本大学医学部 小原 健志
実用的蛍光誘導体化 7
福岡大学薬学部 山口 政俊、能田 均

1
8

Topics on Chemistry
In vivo でアミロイド斑を染色する蛍光色素 BSB

11

Commercial

6
12
16

生物発光用発光物質

Nitrosothiol Assay Kit 改良タイプ

お知らせ
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第 11 回フォーラム・イン・ドージン開催報告

新製品案内
容量、価格は下記ページをご覧ください。
生物発光用発光物質
Nitrosothiol Assay Kit 改良タイプ
細胞染色用色素

細胞染色用色素11th フォーラム・イン・ドージン

15
18

オーガナイザーと演者の先生方

6
12
16

News No.97(2001)

新規のプラスミド構築及び変異、欠失導入法：
CLIP(Cross-linked Primer)法の原理

小原 健志(Kenshi Obaru)
熊本大学医学部第二内科

要約
現在ヒト全遺伝子の塩基配列の解析が終わり、多くの遺伝子の機能が解明されつつある。これらの情報を利用し、細胞や大腸菌などに複雑な機能を付与することが可能となってきた。しかし、これ迄の技術では、複雑な高度の機能をもつプラスミドを構築するのは不可能に近かった。複数の遺伝子を一つのプラスミドに組み換えたプラスミドの構築が必要だが、制限酵素や LoxP などの特異的塩基配列を切断し結合する構築法では、特異的塩基配列をプ
ラスミド内に一つまたは二つに限定していく必要があったため構築が困難であった。しかし、ここに紹介する新規のプラスミド構
築法では、クロスリンクしたプライマー（CLIP;Cross-linked
Primer）を用いる事により、そのような特異的塩基配列を殆ど必要とせず、自由にプラスミドを構築できるため、極めて高度で複雑なプラスミド構築が可能となってきた。また、この方法では、変異の導入、欠失が簡単に行なえるようにもなった。ここでは、この革新的 CLIP 法の原理を紹介する。

緒言
バイオテクノロジーの最も基本的な技術の一つがプラスミドの構築であり、分子生物学の発展の中でプラスミドの構築が重要であった事は、言及する迄もない。しかし、バイオテクノロジーの中でもプラスミドの構築は、手間と時間のかかるステップであり、プラスミドの構築は制限酵素切断部位の有無により制約されている。トポイソメラーゼ、ligation independent cloning (LIC)、リ
コンビネースを使う方法が開発されてきたが、特定の塩基配列に制約されてしまう。また、PCR 産物のクローニング法として多くの技術が開発された。PCR プライマーに制限酵素切断部位をいれる方法1）、
blunt-endクローニング2,3）,TAクローニング4,5) 、ligation
independent cloning (LIC)6-10)、in vivo クローニング 11,12)。これ
らの方法では、PCR 産物またはベクターの酵素処理が必要であり
1,4-7,9,10,13）、PCR プライマーが特別な塩基を含む必要があり 8,13）、
特別なベクターあるいは細菌株 3,12） が必要である。また、最近では Cre-LoxP を利用した系も開発されているが、LoxP（32bp）の特異的塩基配列が必要であり、組み換える事ができる遺伝子が一つに限定されるなど高度化されていくプラスミド構築において限[ Summary ]At present, the sequence analyses of the human genome were completed, and thefunction of a large number of the genes is being cleared. It is getting pratical to grant
the novel function to the cells using these information of the genomes. However, it
was difficult to construct the plasmid which has the multiple function. Although it isindispensable to recombine a number of the genes into a single plasmid, it is difficult
to construct the plasmid using the mehods of digestion by restriction enzymes orrecombinase and ligation, since it is required to restrict one or two restriction enzymesite or LoxP site in the plasmid. However the CLIP methods described here shows
possibility of construction the plasmid using the cross-linked primers (CLIP). Thismethod enables any construction of the plasmid DNA. Here, we describe the principleof the CLIP method.

キーワード：クローニング、PCR、クロスリンク、プライマー

界があることは、明瞭である。いずれの方法でも、ベクターを改変しオリジナルなプラスミドを作成しようとすると大変困難なものになってしまう。
そこで、酵素による切断、結合が不必要で、しかも特異的塩基配列が不必要な方法がないかを検討した。ここで一番の問題は環状化する方法である。直鎖状のプラスミドは、大腸菌をトランスフォームできないが、環状のプラスミドは、大腸菌をトランス
フォームすることができる。すなわち、プラスミドを大腸菌に導入するには環状化する必要がある。DNA を環状化するためにはラ
イゲース、トポイソメラーゼ、リコンビネース等の酵素または特殊なプライマーが使用されてきた。しかし、単純に 2 本のプライ
マーを結合して PCR をすると環状化されるはずである。このことを調べるためにクロスリンクしたプライマーを用いて PCR し、大腸菌をトランスフォームするかを検討したところ、大腸菌のコロニーを得る事ができた。また、組換え及び変異、欠失の導入も容易にできるようになった。
ここで紹介するCLIP法は、酵素等の特異的塩基配列の呪縛から逃れ自由なプラスミド構築を可能とする事により、ポストゲノム時代における増大する遺伝情報を利用した多様な機能を発現させるための高度なプラスミド構築を可能としている。

材料と方法
クロスリンクしたオリゴヌクレオチドの作成
プライマーの設計；オリゴヌクレオチドは、二本のオリゴヌクレ
オチドの 5' 末端が相補的であり、3' 末端が突出するように設計する。プソラレンでクロスリンクする場合、この相補鎖のなかに 5'TA-3' を含むようにする。この 5'-TA-3' において、二つのオリゴ
ヌクレオチドがプソラレンによりクロスリンクされる 14）。

オリゴヌクレオチドのクロスリンク；二本のオリゴヌクレオチ
ドを各々に蒸留水を加えて 100pmol/µl にする。20µl ずつ加え混
和しプソラレン飽和液（プソラレン1mg(Sigma)を140µlの100%
エタノールに溶解した。）を 1µl 加え 20µl ずつ分注する。100mMの NaCl を加え 1、2、4、8mM NaCl にする。95℃で 3 分間加熱しその後室温で 30 分以上放置し自然光（昼間）の紫外線または

1

News No.97(2001)

365nm の紫外線照射によりクロスリンクする 14)。塩濃度は式 1 より二本のオリゴヌクレオチドの相補鎖の部分のTm値を計算し、Tm
値が室温より高くなるように塩濃度を設定する。

Tm=81.5+16.6xlog10 [S]+0.41x(%GC)-500/N (式１)[S]は塩濃度(M)、%GC は相補鎖の部分の G、 C 含量(%)、N は

（1）

PCR反応
A

B

5'

3'

3'

A

A

B

5'

B

相補鎖の部分のヌクレオチド数 15)（2）

PCR；プライマー(T7pBR4287c:5'-GAATTCCCCTATAGTG
AGTCGTATTACGTCAGGTGGCACTTTTCGGG-3',T7pBR2
347:5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAATTCGGCGCTCTTCCGCTTCCTCG-3')を使い PCR を行った。PCR は、PreMix
ExTaq ( 宝酒造)を利用した。 TaKaRa PCR Thermal Cycler
Personal（宝酒造）を使用し、以下のプログラムを使用した：94℃で熱変性を 3 分間行い、94℃50 秒、53℃50 秒、72℃3 分を 30
サイクル行った後、最後に 72℃15 分間行った。
大腸菌へのトランスフォーメーション；
PCR産物をDH5αのコンピテント細胞に加え氷上で30分静置し、42℃で 40 秒加温後 LB 培地を 200µl 加え 37℃で 1 時間加温し、アンピシリン添加 LB 寒天培地に播き一晩 37℃で加温する 16）。翌日
コロニー数を計測する。

CLIP(Cross-linked Primer)
A
5'
3'

B

A

PCR反応
3'

5'

B
A

B

図1

CLIP(Cross-linked Primer)法の原理（1）通常の PCR 反応では、直鎖状の DNA になってしまうため、大腸菌の ori
をその DNA が持っていても大腸菌をトランスフォーメーションできない。
（2）しかし、この 2 本のプライマーを何らかの方法でクロスリンク（CLIP；
Cross-linked Primer) して PCR を行うと PCR 産物は開環状(opencircular DNA)になる。

結果と考察
CLIP（Cross-linked Primer）法の原理
プラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションするには、環状化する必要がある。通常の PCR 反応では、直鎖状の DNA になってしまうため、大腸菌の ori をその DNA が持っていても大腸菌をトランスフォーメーションできない（図 1-1）
。しかし、この 2 本のプライマーを何らかの方法でクロスリンク（CLIP ；Crosslinked Primer ）して PCR を行うと PCR 産物は開環状(opencircular DNA)になる（図 1-2）。開環状 DNA は、大腸菌をトラン
スフォーメーションできるので6）、
クロスリンクした部位が大腸菌内で修正されるならばトランスフォマントが得られるはずである。
もう少し PCR 反応を具体的に考察してみよう（図 2）。
直鎖状の DNA の A 領域、B 領域に対して相補の配列を持つ CLIP
は、熱変性後 A 領域または、B 領域にアニーリングする（ステップ 1）。次に CLIP から伸長反応が起こる（ステップ 2）。伸長反応
生成物は、熱変性後、CLIP とアニーリングする（ステップ 3）。次に CLIP から伸長反応が起こる（ステップ 4）。この伸長反応は、CLIP のクロスリンクした塩基を越える事ができない 14）。CLIP 間の PCR 反応により各々一つの CLIP 構造をもつ 2 種類の生成物が産生される（ステップ 5）。各々の CLIP 生成物は self-annealingにより伸長反応が起き self-circularization するか（ステップ 6、7）、2 分子の CLIP 生成物がアニーリングし伸長反応が起き CLIPの両側が伸長され、熱力学的に安定な self-annealing をして、環状化される（ステップ 8、9、10、11）。このように CLIP を使い
PCR を行うと開環状 DNA が得られると思われる。

2

CLIP の作成
オリゴヌクレオチドをクロスリンクする方法には、ナイトロゲン
マスタード17) 、α-bromomethylketone18)、iodoacetamidopropyl
moiety 19)、 N6,N6-ethanoadenine or N4,N4-ethanocytosine
alkylates20) ethyldisulfide or a propyl disulfide linkage 21)、
psoralen-derivatized methyl phosphonate oligonucleotides22)、

9-aminoellipticine23) 1,2-dideoxy-D-ribofuranose and butane
1,3-diol 24) などを利用する方法があるが、最も簡便にできるプソ
ラレンを用いた方法によりクロスリンクを行った。プソラレンは、
365nm で thymidine 塩基にクロスリンクされ、反対側の DNA 鎖に thymidine 塩基があると、それともクロスリンクされ、2 本のDNA 鎖がクロスリンクされる。そのため 5'-TA-3' の塩基配列があると 2 本の DNA 鎖がクロスリンクされる 14）。
オリゴヌクレオチドは、図 3 のように、二本のオリゴヌクレオ
チドの 5 末端が相補的であり、3' 末端が突出するように設計する。プソラレンでクロスリンクする場合、この相補鎖のなかに 5'TA-3' を含むようにする。この 5'-TA-3' において、二つのオリゴ
ヌクレオチドがプソラレンによりクロスリンクされる。これを 98℃3 分間加熱し 3％の低融点アガロースゲルで電気泳動するとクロスリンクしたオリゴヌクレオチド(CLIP)は、電気泳動度が遅いバンドとして検出される（図 3-2）。

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B
3'

5'
3'

5'

A

CLIP(Cross-linked Primer)
A

B
5'

3'

3'

5'

①CLIPと標的DNAとのアニーリング
B
5'

A

B

3'

5'

3'

A

B
3'

A

3'

5'

5'

A

②CLIPからの伸長反応
B

B

A

5'

3'
5'

A

B
5'
3'

5'

A

③伸長反応生成物とCLIPのアニーリング
B
3'

B
3'

5'

3'
5'

A
A

B
3'

B
3'

5'
3'

A

A

④CLIPからの伸長反応
B

B

A

5'
3'

3'
5'

A

⑤伸長反応生成物の熱変性
B

A

B

B
3'
3'

⑧伸長反応生成物同士のアニーリング

A

5'

A

⑧ 伸長反応生成物同士のアニーリング⑥Self-annealingB⑥Self-annealing

B

B

3'

A

A

A

A

B

B

3'

5'

A
3'

A

B
A

⑨CLIPからの伸長反応⑨CLIPからの伸長反応

B

B

B

3'

5'

A

3'

A

⑦Self-circularizationA⑩伸長反応生成物の熱変性

B

A

B

5'

A

A

⑦Self-circularization⑩伸長反応生成物の熱変性
B

B
5'

5'

A

A

⑪Self-annealing

図2⑪Self-annealing

CLIP による PCR の詳細な説明

直鎖状の DNA の A 領域、B 領域に対して相補の配列を持つ CLIP は、熱変性後 A 領域または、B 領域にアニーリングする（ステップ 1）。次に CLIP から伸長反応が起こる（ステップ 2）。伸長反応生成物は、熱変性後、CLIP とアニーリングする（ステップ 3）。次に CLIP から伸長反応が起こる（ステップ 4）。この伸長反。
応は、CLIP のクロスリンクした塩基を越える事ができない。CLIP 間の PCR 反応により各々一つの CLIP 構造をもつ 2 種類の生成物が産生される（ステップ 5）
各々の CLIP 生成物は self-annealing により伸長反応が起き self-circularization するか（ステップ 6、7）、2 分子の CLIP 生成物がアニーリングし伸長反応が起きCLIP の両側が伸長され、熱力学的に安定な self-annealing をして、環状化される（ステップ 8、9、10、11）。

3

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(1)

5' TA
3'

CLIP を用いた PCR

3'

AT 5'

①アニーリング
3'

5' TA
AT 5'

3'

②プソラレン添加
紫外線
3'

5' TA

AT 5' (CLIP ; Cross-linked Primer)

3'

2 本のオリゴヌクレオチドを混和した溶液に NaCl 溶液を加え
1、2、4、8mM NaCl にする。95℃で 3 分間加熱しその後室温で30 分以上放置し、プソラレン添加後、自然光（昼間）の紫外線ま
たは 365nm の紫外線照射によりクロスリンクする。pBR322 を
EcoRI で切断した直鎖状の DNA をテンプレートとして 10ng 用
い、各塩濃度でクロスリンクした C L I P と P r e M i x E x T a q(TaKaRa) を加え PCR を行う。PCR 終了後、反応液を 0.8% のアガロースで電気泳動する。1、2、4、8mM NaCl でクロスリン
クした場合、 2mM NaCl で最も良く増幅されている（図 4）
。
5'

(2)

3'
3'

3'

5'

5'

M 3' 変異（M）を持ったプライマー
5'①アニーリング
M 3'
5'②プソラレン添加紫外線
M 3'
CLIP(Cross-linked Primer)
5'③PCR反応テンプレートとのアニーリングM

CLIP④CLIPからの伸長反応
M

図3

CLIP の作成原理（1）オリゴヌクレオチドは二本のオリゴヌクレオチドの 5' 末端が相補的であり、3' 末端が突出するように設計する。プソラレンでクロスリンクする場合、こ⑤CLIPからの伸長反応が停止し、変異が導入され環状化する。

（2）クロスリンクしたオリゴヌの相補鎖のなかに 5'-TA-3' を含むようにする。

MM

クレオチド(CLIP)を 3％の低融点アガロースゲルで電気泳動する。クロスリン
クしたオリゴヌクレオチド(CLIP)は、電気泳動度が遅いバンドとして検出された。

図5

CLIP を用いた変異の導入法
CLIP 内に標的 DNA に変異（M）を導入した CLIP を作成し、PCR を行うと変異（M）を持った DNA が環状化される。

λH

8mM
NaCl

4mM
NaCl

2mM
NaCl

1mM
NaCl

2mM NaCl での相補鎖の部分の Tm 値は、33℃であり、室温より8℃高い状態であった。高い塩濃度では、非特異的にアニールした
DNA が増加した事により非特異的クロスリンクが増加し PCR 反応が阻害されたと思われる。
これらの PCR 産物を DH5 α のコンピテント細胞でトランス
フォーメーションしアンピシリン添加 LB 寒天培地に播き一晩 37℃で加温し、翌日コロニー数を計測した。コロニー数は2mM NaCl
で最高となっており、PCR の結果とよく相関している（表 1）。
表1

図 4 CLIP を用いた PCR
1、2、4、8mM NaCl でクロスリンクした CLIP を用いて PCR 反応を行った
後、0.8% のアガロースで電気泳動した。矢印で PCR 産物が示されている。2mM
NaCl で最も良く増幅されている。

4

NaCl(mM)

8

4

2

1

コントロール

コロニー数

3

27

68

21

0

プライマーをクロスリンクしないで PCR を行った場合（コントロール）コロニーは得られなかった。このことは、CLIP を用いた
PCR により DNA が環状化され、大腸菌をトランスフォメーショ
ンすることが可能であることを示している。

News No.97(2001)

CLIP による変異の導入

CLIP を用いた標的 DNA のサブクローニング

CLIP を用いることにより標的 DNA を環状化することができ、大腸菌にも導入可能である事が示された。そこで、CLIP 内に標的DNA に変異（M）を導入した CLIP を作成し、PCR を行うと変異（M）を持ったDNAが環状化され、大腸菌にトランスフォーメー
ションされる（図 5）。このようにして得られたコロニーの 90％以

標的 DNA、ベクターと相補な部分とプライマー同士が相補な部分を含むクロスリンクしたプライマー（CLIP1 と CLIP2）を用いてベクターとアニーリングする（図 7）。Taq DNA ポリメラーゼを用いて CLIP1 と CLIP2 からベクター DNA を PCR で増幅する。
増幅された DNA は、標的 DNA に対して相補なプライマー部分が残されているため、標的 DNA を加えて PCR すると、ベクターから標的 DNA の伸長反応が起こり環状化される。この環状 DNA を大腸菌にトランスフォームすると、得られたコロニーの 90％以上が標的 DNA を持っていた。
このように CLIP を用いる事により、サブクローニング、変異、欠失が容易に行なえる事が明らかとなった。この原理は、既存のクローニング系のプラスミドに平易に利用可能であり、応用範囲
は、広いと思われる。

上が変異を持っていた。

CLIP による欠失
次に、欠失させる部位に近接した A 及び B 領域にそれぞれ相補鎖をもつ CLIP により PCR を行うと線状の DNA が生成され、次にCLIPの残りの一方から伸長反応が起こりABが連結された環状DNA が生成される（図 6）。大腸菌にトランスフォーメーションすると得られたコロニーの 90％以上が欠失を持っていた。

3'

A 5'

標的DNA

3'
5' B CLIP①標的DNAのA,BへのCLIPのアニーリング

CLIP2

CLIP1

A

A
B

3'

B

A

5'

5'

3'

3'

5'

5'

3'

B

ベクター

②最初のCLIPからの伸長反応
B①CLIPがベクターと標的DNAにアニーリングする

A

標的DNA

③自身のCLIPからの伸長反応
B

B

A

A

ベクター

②CLIPからの伸長反応が停止し標的DNAがベクターに組み込まれ環状化する
B④CLIPからの伸長反応が停止しAB間が欠失され環状化する
標的DNA

A

ベクター

図 6 CLIP を用いた欠失の導入法

図7

欠失させる部位に近接した A 及び B 領域にそれぞれ相補鎖をもつ CLIP により
PCR を行うと線状の DNA が生成され、次に CLIP の残りの一方から伸長反応が標的 D N A とベクターと相補な部分を含むクロスリンクしたプライマー（CLIP1 と CLIP2）を用いてベクターと標的 DNA にアニーリングする。CLIP1

起こり AB が連結された環状 DNA が生成される。

と CLIP2 からベクター DNA と標的 DNA を PCR で増幅する。増幅された DNA

CLIP を用いた標的 DNA のサブクローニング

はベクターと標的 DNA を含み環状化される。

5

News No.97(2001)

新製品
参考文献

生物発光用発光物質

1) S. J. Scharf G. T. Horn and H. A. Erlich, Science, 233, 1076 (1986).
2) S. J. Scharf in "PCR Protocols", Eds. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J.
Sninsky and T. J. White, Academic Press, New York, pp.84 (1990).

D-Luciferin K salt3) G.L. Costa, A. Grafsky and M. P. Weiner, PCR Methods Appl., 3,
338(1994).
4) T. A. Holton, and M. W. Graham, Nucleic Acids Res., 19, 1156 (1991) .

H

5) D. Marchuk, M. Drumm, A. Saulino and F. S. Collins, Nucleic Acids

Res., 19, 1154 (1991).

N

N

S

S

COOK

6) C. Aslanidis, and P. J. de Jong, Nucleic Acids Res., 20, 6069 (1990).
7) A. R. Shuldiner, L. A. Scott and J. Roth, Nucleic Acids Res., 18, 1920

HO

(1990).

C11H7N2O3S2K = 318.42

8) S. Kaluz and A. P. F. Flint, Nucleic Acids Res., 22, 4845 (1994).
9) Y.-S. Yang, W. J. Watson, P. W. Tucker and J. D. Capra, Nucleic Ac-

ids Res., 21, 1889 (1993).
10) K. Hsiao, Nucleic Acids Res., 21, 5528 (1993).
11) P. Bubeck, M. Winkler and W. Bautsch, Nucleic Acids Res., 21, 3601
(1993).

〈特長〉
・量子収率の高い発光分析試薬である。
・カリウム塩であり水溶性が高い。

12) J. D. Oliner, K. W. Kinzer, and B. Vogelstein, Nucleic Acids Res., 21,5192 (1993).
13) P. Nisson, A. Rashtchian and P. Watkins, PCR Methods Appl., 1, 120(1991).
14) D. W. Ussery, R. W. Hoepfner and R. R. Sinden, Methods in Enzy-mology , 212, 242 (1992) .
15) J. Meinkoth and G. Wahl, Anal. Biochem.,138, 267 (1984).
16) H. Inoue, H. Nojima and H. Okayama, Gene, 96, 23 (1990).
17) Grineva and Karpova, FEBS Letter, 32, 351 (1973)
18) J. Summerton and P. A. Bartlett, J. Mol. Biol., 122, 145 (1978)19) Meyer et al., J. Am. Chem. Soc., 111, 8517 (1989)20) M. D. Matteucci and T. R. Webb, Nucleic Acids Res., 14, 7661 (1986).
21) Ferentz, et al., J. Am. Chem. Soc., 113, 4000 (1991).
22) B. L. Lee, A. Murakami, K. R. Blake, S. B. Lin, and P. S. Miller, Bio-chemistry, 27, 3197 (1988).
23) J. J. Vasseur, C. Gauthier, B. Rayner, J. Paoletti and J. L. Imbach,

Biochem. Biophys. Res. Commun.,152, 56 (1988).
24) R. P. Iyer, B. Uznanski, J. Boal, C. Storm, W. Egan, M. Matsukura, S.
Broder, G. Zon, A. Wilk, M. Koziolkiewicz et al., Nucleic Acids Res.,

発光分析は、発光物質が高エネルギー状態から分解される際に、光を発生することを利用した分析方法です。
発光分析には、非酵素系の化学発光や、発光の際に触媒として酵素を必要とする生物発光が用いられています。luminolに代表される化学発光は非酵素系で行なうことができるため、操作が簡便に行なうことができるという利点があります。一方、ホタルやトビイカなど自然界に見られる生物発光では、この酸化の過程、もしくは酸化体の分解の過程に酵素が関与することにより、非常に高い量子収率で発光させるという利点があります。
D-luciferin はホタルの発光基質であり、この D-luciferin を用いた生物発光では、luciferase、ATP、マグネシウム存在下で発光量
子収率が 0.88 であり、化学発光物質として代表的な luminol の 20倍以上です。
D-luciferin の発光機構は、下に示すように luciferase によりATP と反応した後、再び luciferase を触媒として酸素分子により酸化されペルオキシドが生成し、脱炭酸分解の過程で発光するものです 1)。

18, 2855 (1990).

HO

著者紹介
氏
名 小原 健志（Kenshi Obaru）
熊本大学医学部第２内科
出身大学 熊本大学医学部
学
位 医学博士専
門 内科学
連 絡 先 〒 860-0811 熊本市本荘 1-1-1

Tel: 096-373-5156, Fax: 096-363-5265
メールアドレス: obar@kaiju.medic.kumamoto-u.ac.jp

6

N

N

S

S

luciferase
ATP, Mg2+

H
COO-

HO

N

N

S

S

H
COOAMP

O O

luciferase
O2

N

N

S

S

N

N

S

S

HO

O

+ hν

O
HO

CO2

また、coenzyme A や ADP の添加等による発光の長寿命化が図られるなどして、D-luciferin—luciferase 発光はその応用が広がっています 2)。

News No.97(2001)

全ての細胞の活動はATPの代謝を基盤として成り立っていることから、ATP に依存した D-luciferin—luciferase 発光は細胞の活性を表わします。このため、細胞増殖や細胞毒性のアッセイに利用されています 3)。また、細菌の数に比例することから汚染の度合を表わす指標としても用いられています。
この、 D-luciferin—luciferase 発光を利用したアッセイ法は、
ATP 量の測定４)のみならず、ATP を産生する酵素の活性を測定す
る種々のアッセイにも応用されています。以下にその例を示します。

このように D-Luciferin K salt は D-luciferin の溶解性を高めたもので、さらに扱いやすいものです。今後、様々な測定に用いられることが期待されます。
参考文献
1) 鈴木喜隆 , 化学と生物 , 18, 169 (1980).
2) S. R. Ford, F. R. Leach, Methods Mol. Biol., 102, 3 (1998)
3) S. P. M. Crouch, R. Kozolowski, K. J. Slater, J. Fletcher, J. Immunol.

Methods, 160, 81 (1993).
4) J. J. Lemasters, C. R. Hackenbrock, Methods Enzymol., 57, 36 (1978).
5) A. Lundin, Methods Enzymol., 57, 56 (1978).
6) 辻章夫 , 前田昌子 , Dojin News, No.65, p11 (1993).

1) Creatine kinase5)
creatine kinase
ADP + creatine phosphate
ATP + creatine
luciferase + Mg2+
ATP + D-luciferin + O2
AMP + PPi + CO2 + oxyluciferin + hν7) V. T. Nguyen, M. Morange, O. Bensaude, Anal, Biochem., 171, 404(1988).
8) J. Alam, J. L. Cook, Anal. Biochem., 188, 245 (1990).

2) Pyruvate kinasepyruvate kinase
ADP + phosphoenol pyruvate
ATP + pyruvate
luciferase + Mg2+
ATP + D-luciferin + O2
AMP + PPi + CO2 + oxyluciferin + hν

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

D-Luciferin K salt

25mg

18,000

L226

N

N

S

S

3) Acetate kinase6)
ADP + acetylphosphate
ATP + D-luciferin + O2

acetate kinaseluciferase + Mg2+

ATP + acetate
AMP + PPi + CO2 + oxyluciferin + hν

関連商品

D-Luciferin

H
また、近年、遺伝子工学の分野に、D-luciferin—luciferase 発光が用いられています。例えば、組み変えた遺伝子プロモーターの発現効率を見る際に、ルシフェラーゼタンパク質を産生するベク
ターを同時に組み込むことで、発現量に応じて D-luciferin—luciferase 発光が見られます 7)。このことから、遺伝子発現効率をモニターする手法として用いられて、レポーター・ジーン・アッセ
イに利用されています 8)。
今回、弊社では水溶性を高めた D-Luciferin K salt を用意いたしました。D-luciferin フリー体は純水中にはほとんど溶解しません(1mmol/l 以下)が、これをカリウム塩とすることで約 150mmol/lの溶解性をもちます。

HO

COOH

C11H8N2O3S2 = 280.32

品名

容量

価格（￥）

メーカーコード

D-Luciferin

25mg

14,000L221

溶解性データ

D-Luciferin D-Luciferin K salt
1mmol/l 以下
約 150mmol/l
約 20mmol/l
約 150mmol/lTris Buffer (100mmol/l,pH7.8)
Tricine Buffer (100mmol/l,pH7.8) 約 20mmol/l
約 150mmol/l
純水中

7

News No.97(2001)

６．チオール類の蛍光誘導体化
チオール基を有する生体成分にはシステイン、ホモシステイン、
グルタチオン、補酵素 A などの低分子やシステインを含んだペプ
チド・タンパク質があり、それぞれ重要な機能に関与している。また、チオール基を有する薬品やチオール類を含む食品も多い。チ
オール基は反応性が比較的高いので、しばしば蛍光誘導体化の対象となる場合が多く、アミノ基と並んで他種類のチオール基用誘導体化試薬が市販されている。生体試料の分析においては、一般にアミノ基を含む化合物よりチオール基を含む化合物の方が少ないので、チオール基を誘導体化する方が選択性は高くなる。チオー
ル基は酸化されやすく、容易にジスルフィド(-S-S-)体に変化する
ので、還元剤を加えて全てチオール基とした後に定量する場合もある。また、蛍光誘導体化反応中の酸化を抑えるために酸化防止剤を加えて誘導体化することも多い。特に酸化されやすいチオー
ルを定量する場合や酸化性物質を含む試料を分析する場合には充分な注意が必要である。
チオール基の蛍光誘導体化反応は、Fig.1 に示す 7 種に分類できる。それぞれ特徴があり、チオール化合物や測定試料の性質に応じて最適な反応を用いる必要がある。詳細は総説 1） を参照されたい。

実用的蛍光誘導体化7
福岡大学薬学部

山口政俊・能田

均

O

O

A.

R

R'

N

SH

R

N

6.1. N- 置換マレイミド(Fig. １ A)

SR'

N- 置換マレイミドがチオールと容易に反応して、図のような付加物を与えることは古くから知られていた。このＲに蛍光性基（2

O

O

O
HOOC
R NH

or

R

SR'

R
R'

B.

SR'

NH2

SH

N

CHO
F (Cl)
N

N
R'

O

SH

O

N

N

R

R

E.

R

NHCOCH2l

R'

SH

R

NHCOCH2-SR'

R

R'

SH

R

H
N

N

O

O

R'

R

SH

N
R'S

Fig.1 Fluorescence derivatization of thiols

8

O
N

N
Br

SR'

O

N

F.

R

SR'

C.

D.

SR'

HOOC

O

CHO

NH

R

−フェニルベンゾイミダゾール）を導入すると、試薬自身は無蛍
光性となり、チオールと反応して生成した誘導体は蛍光性となることが見いだされ、それ以降様々な蛍光性基を導入した試薬が開発された。本反応は緩和な条件（室温、pH5 〜 9）で数分以内に進行するので、熱に弱いチオール（ペプチドやタンパク質）の蛍光誘導体化に汎用される。ただし、蛍光誘導体はさらに加水分解を受けるので（図の括弧内の反応）、プレカラム誘導体化 HPLC において複数のピークを与えることがある。反応温度を高くしたり、時間を延長して加水分解反応を完結させた後に分析すると一本のピークとなることが多い。低分子のチオール類に適用される市販
試薬 N - [ 4 - ( 6 - d i m e t h y l a m i n o - 2 - b e n z o f u r a n y l )phenyl]maleimide を用いた応用例が DOJINDO のカタログ（http://www.dojindo.co.jp/ wwwroot/productsj/info2/07/
dbpm.html）にある。
高分子（ペプチド、タンパク質）用の試薬としては、フルオレッ
セイン、各種ローダミン、シアニン色素等を蛍光性基として導入したマレイミド試薬が市販されており、蛍光標識高分子の調製に用いられる。これらの試薬はそれ自身も蛍光性を有するものが多く、緩和な条件で蛍光誘導体化したのちにゲル濾過等で試薬と標識高分子を分離する必要がある。一例としてシアニン色素−マレイミドを IgG の蛍光標識に利用した例が DOJINDO のカタログ（http://www. dojindo.co.jp/wwwroot/productsj/info2/07/ic3m.html）にあるので参照されたい。これらの試薬は励起波長が長いので、レーザー光源を使った高感度化が可能である。

6.2. オルトフタルアルデヒド(OPA)と第一アミン(Fig.１ B)

News No.97(2001)

OPAはアミン及びアミノ酸の誘導体化試薬として汎用されるが（本連載 2.1. 参照）、図に示すように OPA と第一アミンを試薬として用いることにより、チオールの蛍光誘導体化が可能となる。本
誘導体化反応は緩和な条件で 1 分程度で完了するので、プレカラ
ム誘導体化のみならずポストカラム誘導体化にも用いることが出来る。生成する誘導体はやや不安定であるので、ポストカラム誘導体化の方が高い精度を得やすいが、感度は低くなる。高感度と高精度を同時に達成するために、プレカラム誘導体化を自動化した測定法 2） も報告されている。

O
R

COCI

+

R'

OH

R C O R'

R

COCN

+

R'

OH

R C O R'

R

CON3

R

N=C=O

O

O
+

R'

OH

R

N C O R'H

6.3. ベンゾフラザン（ベンゾオキサジアゾール）誘導体 (Fig. １ C)
R としては、-NO2、-SO3- NH4+、-SO2NH2 及び -SO2N(CH3)2がある。このうち反応速度が大きく、蛍光誘導体が最も安定な 4フルオロ -7- スルファモイルベンゾフラザン(ABD-F) が有用で、HPLC におけるプレラベル誘導体化試薬として汎用されている。
反応は、50℃で 5 分間以内に完結する（応用例：DOJINDO のカ
タログ、http://www.dojindo.co.jp/wwwroot/productsj/info2/ 07/
abd-f.html）。ABD-F を用いてホモシステイン等をプレカラム誘導体化し、キャピラリー電気泳動 - レーザー誘起蛍光検出により、

COCI or CON3
CH3O

O

O

O

COCI

O

O

O

N

COCN
COCN
NCO

試料の微量化と高感度化が達成されている。

3）(CH3)2NO

O

6.4. ヨードアセトアミド (Fig.1 D)
緩和な条件下(室温、中性 ~ 弱アルカリ性)で、長時間(1~12 時
間)かけて反応させる場合が多い。R としては、クマリン色素、ピレン、フルオレッセイン及びローダミン色素類が用いられ、主に高分子の蛍光標識に用いられる。マレイミド試薬に比べて反応は遅いが、生成した誘導体は安定である。

6.5. アジリジン (Fig.1 E)

CH3

Et2N

O

CON3

CH3O

N

O

O

CH3O

N

CON3 or COCIDMEQ-CON3 or DMEQ-COCI

Fig.2 Fluorescence derivatization of alcohols

市販試薬にダンシルアジリジンがある。反応は弱アルカリ性(pH8.2)下、60℃で 1 時間の加熱を要する。反応はマレイミド試薬と同様に選択性が高く、生成した誘導体は安定で、かつ 200nmに及ぶ長いストークスシフトを特徴とする(励起波長 338nm、発光波長 540nm)。

6.6. モノブロモビマン (Fig.1 F)
この試薬は、比較的緩和な条件下(室温、中性 ~ 弱アルカリ性)で数分間で反応が完結する。試薬自身は無蛍光性であるが分解しやすく、その分解物はHPLCにおいて複数のピークを与えるので、それらが定量を妨害する場合がある。

7. アルコールアルコール性水酸基を有する化合物は生体や食品中に多いが、この官能基は極めて反応性に乏しい。従って、蛍光誘導体化試薬には高い反応性が要求され、一般にカルボン酸クロライドあるいはその類縁物質が用いられる(Fig.2)。反応は一般に高温(80-120℃) で長時間(30-60 分) 加熱する必要がある。試薬はいずれもその高い反応性故にアミン、チオール、水などとも反応し、蛍光性物質(分解物)を与えるので、試料の前処理や試薬溶液等の調製時には留意する必要がある。試薬およびその分解物はアルコールの蛍光誘導体と同様の蛍光特性をもつ場合が多いので、蛍光誘導体化は専らプレラベル反応に用いられる。

7.1. ヒト皮表脂質中 7- デヒドロコレステロール(7-DHC)の定量 4)
7-DHC は皮膚表面に存在し、光化学的にビタミン D3 に変換される。加齢とビタミン D3 生合成能の関連を研究するため、皮表中
7-DHC が測定される。しかし、その濃度は極めて低いので、従来は切除した皮膚組織を有機溶媒抽出し、その抽出液を試料とする必要があった。より被験者の負担が軽いヒト皮表脂質(皮膚を切除することなく、皮表から直接脂質を抽出)を試料として分析することが望ましい。
本法は、皮表脂質を特殊な抽出装置(Fig.3)を用いて抽出し、これに含まれる 7-DHC を DMEQ-CON3 を用いて蛍光誘導体化し、HPLC 検出する。本法により初めて皮表脂質中 7-DHC の定量が可能となり、加齢とともに同7-DHC 濃度が低下することを実証した。

9

News No.97(2001)

Chart 1 Procedure for the determination of 7-dehydrocholesterol in human skin surface
Human skin surface (2.25 cm2)
Extract with n-hexane-ethanol (1:1, v/v)(30ml) by an extraction device
Extract
Evaporate under N2 gas
Reconstitute with acetone
mix
Evaporate under N2 gas
2.0 mmol/l DMEQ-CON3
0.2ml
Heat at 120℃ for 60 min
Dilute with methanol
1.8ml
mix
Apply onto HPLC (10µl)

8. フェノール
フェノール性水酸基を有する化合物は生体中ではカテコールアミ
ン、セロトニン、チラミン、チロシンとがあるが、いずれもその水酸基を誘導体化のターゲットとすることは少ない。しかし、近年、環境中の内分泌撹乱物質としていくつかのフェノール類が注目されており、フェノール性水酸基用の蛍光誘導体化反応に関する研究も盛んになっている。フェノール性水酸基は比較的反応性が高く、アミノ基用の蛍光誘導体化試薬により誘導体化できる場合が多いが、その中でも反応性の高い酸クロリド類が有用である。反応条件は、
アミンの場合と比べると、高温（50 〜 60℃）で長時間（30 〜 60分）を要する。また反応中における試薬の加水分解を抑えるために、反応液には出来るだけ水が入らないように前処理及び試薬溶液の調製を行う。

HPLC conditions
Column:TSK gel ODS-120T(250 × 4.6mm i.d.;5µm)(50℃)
Mobile phase: aqueous 90％(v/v) acetonitrile
Flow rate: 1.0 ml/min
Fluorescence detection: Ex.360nm Em.440nm

E

B
D

A

B

Fig.3 Diagram and use of the lipid extraction device. A, inlet (solvent); B,
outlet (collector); C, Filter paper; D, teflon cell; E, aspirator.

(A)

(B)

Detector response

1

1

0

20

40

Retention time/min

60

0

20

40

60

Retention time/min

参考文献
Fig.4 Chromatograms obtained with (A) a standard solution and (B) an
extract of human skin (abdomen) surface. Peaks and concentrations: 1=7DHC [A, 80.0 pmol (30.7ng); 13.8pmol (5.29ng)cm -2 skin surface];others=A, the reagent blank; B, the reagent blank and endogenous
substances in human skin surface. The shaded areas disappeared uponoxidation and two peaks (in broken line) appeared.

101) K. Shimada, K. Mitamura, J. Chromatogr. B, 659, 227 (1994).
2) S. K. Park, R. B. Boulton, A. C. Noble, Food Chem., 68, 475 (2000).
3) S. H. Kang, W. Wei, E. S. Yeung, J. Chromatogr. B, 744, 149 (2000).
4) T. Iwata, H. Hanazono, M. Ymamaguchi, M. Nakamura, Y. Ohkura

Anal. Sci., 5, 671(1989).

News No.97(2001)

Topics on Chemistry
In vivo でアミロイド斑を染色する蛍光色素 BSB（株）同仁化学研究所

アルツハイマー病は中年後期に発症し、記憶障害、見当識障害などを呈する進行性の精神障害で、米国では約 400万人が罹患し、その社会的なコストは年間 600 億ドル以上と言われている。病理学
的には脳（特に前頭葉，後頭葉，側頭葉）の萎縮、組織学的にはアミロイドの芯をもつ顆粒状または線維状の塊からなる老人斑（senile plaques, SP）と細胞内神経線維の変形（neurofibrillarytangle, NFT）とを特徴とする。この SP は、アミロイド β ペプ
チド（Aβ）とよばれる 40 または 42 個の比較的小さなペプチドからなっており、前駆体タンパク質（APP）から secretase によって切り出された後、β シート構造からなる凝集体を形成する。
この凝集体形成のきっかけとなるのは、Aβのコンホメーション
が α ヘリックス構造から β シート構造に変化するためであり、狂牛病などとともに最近ではタンパク質の誤った折りたたみによって引き起こされるフォールディング病という概念に分類される。

佐々本 一美しかしながら、これまでは死後の患者の脳組織を特殊な色素や抗体で染色する病理学的な方法しかなかった。良く用いられる色
素としては、アゾ色素の Congo red や蛍光性の Thioflavin-S であるが、これらはもちろん生きた患者の SP を検出することはできない。
このため、Klunk らは脂溶性を増して血液−脳関門を通りやす
くした Congo red 誘導体である Chrysamine-G2-4 や X-345,6 を開発しているが、実際の in vivo の系で SP を検出した報告はない。

NH2

H 2N
N

N

N

N

HO3S

HO
SO3H

OH

HO2C

Congo red

CO2H

X-34

Br
1

40/42

N

99

N

N

HO

APP

N
N

CO2H

HO2C

α-secretase
1

16

17

β-secretase

Aβ

Chrysamine-G

1

99

+

99

C83

sAPPβ

γ-secretase

1

99

+
Aβ

C57/59APP から Aβ の生成

16 17

35

42

tv....

AEFRHDSGYEVHHGKLVFFEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAα
図2

BSB7 は Skovronky らによって最近報告された蛍光色素で、Aβに対して高い親和性（Ki = 0.4 µmol/l）をもっており、SP や NFT
を選択的に染色する。彼らは APP を発現するように遺伝子改変されたマウス Tg2576 に BSB を静注し、18 時間後の脳組織の SPに色素が集積していることを確かめた。これは、in vivo でアミロ
イド斑を染色した最初の例であり、今後、生体内での安定性や毒性などさらに研究が必要ではあるが、アルツハイマー病の早期診断・治療につながる大きな一歩である。

Aβ1-42

β

BSB

40/42

C57/59

図1

1

OH
CO2H

C99

+

....km

HO2C

γ-secretase

40/42

p3

HO

図3

+

sAPPα

17

OH

C

γ

γ

Aβ の構造と secretase 切断部位

参考文献
1) A. Rauk, D. A. Armstrong, D. P. Fairlie, J. Am. Chem. Soc., 122,
9761(2000).
2) W. E. Klunk, M. L. Debnath, J. W. Pettegrew, Neurobiol. Aging, 15,アミロイド形成の過程で活性酸素ラジカルが産生され、それがAβの神経毒性の原因であると考えられているが、その詳細な機構
は十分分かっていない。しかしながら、Aβ のフラグメントである
Aβ31-35 も同様の神経毒性を有することなどから、35番目のメチオニン（Met35）が疑われている。Cu2+ や Fe3+ といった金属存在
下、Met35 が酸化されて生じる S −カチオンラジカルは、種々のラジカル反応の引き金になり、凝集や神経毒性を引き起こすと考えられる。したがって早期のアルツハイマー病の診断には、このAβ が凝集してできた SP（約 10µm の大きさ）の検出が非常に重要になってくる。

691 (1994).
3) W. E. Klunk, M. L. Debnath, J. W. Pettegrew, ibid., 16, 541 (1995).
4) W. E. Klunk, M. L. Debnath, A. M. Koros, J. W. Pettegrew, Life Sci.,
63, 1807 (1998).
5) S. D. Styren, R. L. Hamilton, G. C. Styren, W. E. Klunk, J. Histochem.

Cytochem., 48, 1223 (2000).
6) W. E. Klunk, R. L. Hamilton, S. D. Styren, G. Styren, M. L. Debath,C.
A. Mathis, A. Mahmood, K. K. Hsiao, Soc. Neurosci. Abstr ., 23,1638(1997).
7) D. M. Skovronsky, B. Zhang, M.-P. Kung, H. F. Kung, J. Q.
Trojanowski, V. M.-Y. Lee, Proc. Natl. Acad. Soc., 97, 7609 (2000).

11

News No.97(2001)

Nitrosothiol Assay Kit
Nitrosothiol Assay Kit 改良タイプ発売のご案内〈キット内容〉
1) 緩衝溶液
2) 標準液3) 前処理剤
ニトロソチオール(R-SNO)は、寿命の長い NO 供給体であり、
4) 亜硝酸イオン消去剤
生体内では g l u t a t h i o n e や L - c y s t e i n e から誘導された S 5) HCl 溶液
nitrosoglutathione(GSNO)やS-nitroso -L-cysteine(CysNO)等
6) Tris 溶液
といった形で存在し、生体内での・NO ドナー、あるいは生理活性
7) 反応試薬 A
物質として働いていると言われています。
8) 反応試薬 B
本キットは、R-SNO の S-N 結合を切断し、放出される NO を、
9) Griess 試薬 A
酸化されて生じる NO2- として検出します。元々試料中に存在する
10) Griess 試薬 B
バックグランドの NO2- は、亜硝酸イオン消去剤により消去される
本キットは従来冷凍保存品でしたが、改良を加え安定性を向上させたため、冷蔵での保存が可能となりました。

1本
1本
1本
1本
1本
1本
1本
1本
1本
1本

ので、R-SNO由来のNO2- のみを検出することが出来ます（下図）。
亜硝酸イオン消去剤

反応試薬

発色試薬

measurement
消去

sample: R-SNO図: NO2

azo dye
570nm

Nitrosothiol Assay Kit の測定原理〈特長〉
1. 従来品に改良を加えて安定性が向上し、冷蔵保存可能である。
2. 水銀フリーで安全である。
3. バックグラウンドの NO2- は完全に消去されるので、一回の測定で R-SNO のみを検出できる。
4. 1 キットで 28 サンプル（n ＝ 3 として）測定できる。
5. 1µmol/l 以上の濃度の R-SNO を検出することができる。

12

NO
+
RSSR
-

参考文献
1) P. R. Myers, R. L. Minor Jr., R. Guerra Jr., J. N. Bates, D. G. Harrison,

Nature, 345, 161 (1990).
2)Robert K. Goldman, Angelo A. Vlessis, Donald D. Trunkey, Anal.

Biochem., 259, 98 (1998).
3) J. A. Cook, S. Y. Kim, D. Teague, M. Murali, C. Krishna, R. Pacelli, A.
M. Miles, M. B. Grisham, D. A. Wink, Anal. Biochem., 238, 150 (1996).

品名

容量価格（￥） メーカーコード

Nitrosothiol Assay Kit

set

32,000NK06

News No.97(2001)

販売中止のご案内 1

品名

弊社都合により下記製品の販売を中止いたしましたのでご連絡申し上げます。
品名
容量
コード
メーカーコード
5-Nitro-2-PDS
Ba(II)-CHBA,(AS)
Ba(II)-EDTA
Benzene,(Pr)BHBTBNBAC5 Sulfo-OSu
Caged cGMP
Caged fluorescein-OSu
Cr(Ill)-AA
cyclo(D-Asn(Oct)2 - Pro-AIa)2
DBPM
Dimethoxyethane,(Sc)DPS-CIFe(Ill) - CHBA,(AS)H(fod)
iso-Octane,(Pr)L-NIO
Maleimido-C5-benzyl-EDTA
Methyl alcohol,(Pr)MethyI-EDTA
MMTr-Cl
Mn(ll)-AA
Mn-TBAP
Ni(Il)-CHBA,(AS)NIR-1
Pr-PTA
Quene 1-AM solution
Quin 2-AM solution
ScintisoI AM-1
SPQTAA
TTMAPP

1g
1g
25g
250ml
10mg
5mg
5mg
5mg
25g
RequestRequest
250ml
100mg
1g
5g
250mI
10mg
10mg
250ml
5g
5g
5g
10mg
1g
Request
1g
1mI
1mI
500ml
50mg
5g
100mg

340-03451
341-03241
348-00152
342-0023l
349-06721
347-06261
347-05921
346-05751
348-00772
RequestRequest346-00991
Request349-03161
349-01341
343-02101
349-07181
342-06071
347-01641
342-01711
343-06621
340-01751
348-07771
343-03181
Request346-02331
342-05851
340-05391
347-02425
344-05671
348-02531
346-0477l

N023
A018
E006
PR01
B328
B295
CC04
C304
A047
C305
D259
SC05
D399
A024
H005
PR05
N409
M032
PR04
M006
NX02
A039
M373
A028
N368
P020
Q006
Q003
SC03
S017
T005
T004

販売中止のご案内 2
弊社都合により下記製品の販売を 6 月 1 日より中止いたしますのでご連絡申し上げます。
ただし在庫がなくなり次第、5月末まででも中止とさせていただく
場合もございますのでご了承ください。
また 6 月以降も在庫あれば対応できますので、弊社および販売店
までお問い合わせください。
品名
容量
コード
メーカーコード
2-Aminoperimidine HCl
2-Hydroxy-4-dodecyloxy-4'carboxysalicylideneaniline

RequestRequest

A009

RequestRequestH208

346-07331
RequestRequest342-07291

I012
L001
D042
B350

RequestD202

Request

O201

RequestO202

2-Iminopiperidine
100mg
2Li(EDTA・2Li)
Request3,5-DiBr-PADAP
Request3-Br-7-Nitroindazole
25mg
4-Dodecyloxy-4'(3-carboxytrimethyleneoxy)
azobenzene
Request4-Octyl-4'(3-carboxytrimethyleneoxy)
azobenzene
Request4-Octyl-4'(5-carboxypentamethyleneoxy)
azobenzene
Request

容量

コード

メーカーコード

4TF
6TF
7-Nitroindazole
8-AcetoxyquinolineAA
Acridinium-I
ACVJ
ALOS
Anisidine BlueBBD
BDC-OH
BG
BPR
BPR
BT Standard
Caged cAMP
Caged fluorescein
Caged fluorescein Sulfo-OSu
Calmagite
Calmagite
Carboxyarsenazo
CCVJ
Ce(III)-EDTA
Chloranilic acid
Chromazurol B
Co(II)-CHBA,(AS)Co(III)-AA
Cr(III)-AA,(AS)DABITCDABITC
DAHP
DBMC
DBPH
Dibenzyl-bis (12-crown-4)
Didodecyl-bis (12-crown-4)
DIDS
DIDS
Dimethyl CFSE
Diphenyleneiodonium chloride
D-NMMA
Docosylpyridinium TCNQ salt
DPMDS
DPTBA
Dy(III)-EDTA
EDTPO
EGS
Eu-DPM
FNPA
FTA
HABT
Hexanes,(Lu)Ins(1,3,4,5)P4(synthetic)

100mg
100mg
50mg
5g
25g
10mg
25mg
RequestRequest
1g
1g
5g
1g
5g
1g
5mg
5mg
5mg
1g
5g
1g
25mg
Request
10g
1g
1g
25g
25g
100mg
1g
1g
100mg
Request
100mg
100mg
100mg
500mg
25mg
10mg
10mg
RequestRequest1g
RequestRequestRequest
1g
100mg
5g
25g
250ml
100µg

340-04811
347-04821
343-07221
347-00063
344-00012
347-06521
342-07051
RequestRequest340-03711
340-03691
343-00283
349-00361
345-00363
349-00383
340-05891
348-06311
345-06321
348-00473
346-00474
349-00523
349-07061
Request341-00561
340-04051
342-03151
344-00752
348-00772
345-05101
341-05103
345-07301
340-06991
Request341-06301
348-06291
340-05271
346-05273
341-06781
342-07171
342-07791
RequestRequest344-05213
RequestRequestRequest345-01201
341-05321
347-01261
341-01362
344-01411
349-05861

T017
T018
N408
A002
A001
A060
A313
OC03
A010
B022
B024
B007
B013
B013
B016
CC03
C299
C261
C004
C004
C006
C340
C224
C009
C011
A020
A036
A021
D004
D004
D462
D398
D373
D349
D210
D032
D032
D352
D449
N430
D204
D221
D036
D240
E030
E028
E019
F013
F003
H002
LU11
I008

iso-Propyl alcohol,(Lu)L-NNA
Lumogallion
MAPS
MBD
MBPM
Methyl-EDTA
Mg(II)-CHBA,(AS)MMTr-Cl
Mn(II)-CHBA,(AS)MoO2(II)-AA
Na(I)-CHBA,(AS)Naphthalene
Naphthol AS-MX

250ml
1g
1g
Request
500mg
10mg
25g
1g
25g
1g
5g
1g
100g

349-02321
346-07211
345-01603
Request343-03723
341-06281
340-01712
346-03171
341-06622
340-04671
348-01791
343-03201
344-01891

LU16
N410
L003
OC12
M017
M274
M006
A025
NX02
A026
A040
A027
N044

15

News No.97(2001)

新製品
品名

容量

phosphoric acid
100mg
Naphthol AS-MX
phosphoric acid1g
Neocuproine
RequestNi(II)-EDTA
25g
NIR-2
RequestNitr 5
5mg
NOR 2
10mg
NOR 2
50mg
NPDE
1g
NTP
Requesto,o'-Dihydroxyazobenzene
1g
ODQ
10mg
PACH
RequestPentacosa-10,12-diynoic acid
RequestPhenylarsonic acid25g
Phosphododecyl-14-crown-4
50mg
PMAC
Request
PPKO
1g
PPKO
10g
Pr-FOD1g
p-Terphenyl
100g
PV
1g
PV
5g
Rh(III)-AA
RequestSABF
Request
SAPH
1g
SAPH
10g
Scintilamine-OH
RequestS-Ethyl-ITU
1g
Sm(3)-EDTA
RequestS-Methyl-ITU
1g
S-Nitroso-L-cysteine 溶液
1ml × 5SPADNS
RequestSr(II)-CHBA,(AS)1g
Stilbazo
RequestStilbenefluoblue-S
1g
STTA
1g
Thorin1g
Thorin5g
TMA-PTIO
10mg
TMA-PTIO
100mg
TPP
1g
TTMAPP
1g
Variamine Blue B, hydrochloride
5g
XB-II
1g
Zr(IV)-AA5g
硬度滴定液（A）
500ml
複合滴定液（A）
500ml

コード

メーカーコード

344-01911

N004

340-01913
Request345-02002
Request349-05741
348-06931
344-06933
346-06731
Request348-00951
345-07781
RequestRequest344-02212
341-05681
Request348-02271
342-02274
345-02301
341-02641
340-02351
346-02353
RequestRequest341-02381
345-02384
Request341-07261
Request344-07251
340-07351
Request347-03221
Request343-02503
342-03031
343-02721
349-02723
342-07311
348-07313
342-03891
342-04773
347-02903
348-02933
345-03021
340-01555
346-01275

N004
N034
E015
N369
N051
N389
N389
N267
N017
D009
O277
P024
LB22
P008
P031
P214
P011
P011
P019
T016
P014
P014
A042
S001
S002
S002
SC10
E259
S241
M358
N414
S005
A030
S006
S007
S008
T020
T020
A375
A375
T002
T004
V001
X002
A046
K005
F004

細胞染色用色素（-Cellstain-）
生細胞染色用蛍光色素-Cellstain- CytoRed solution

N
O
O

O

O

CH3

O

CH3
C17H15NO5 = 313.31〈特長〉
・生細胞の細胞質を染色する。
・使いやすい DMSO 溶液(1mmol/l)なので、試薬を量り取ったり溶解する手間が不要である。
・蛍光特性 λem / λex=590/535nm

CytoRedは生細胞内に取り込まれた後細胞内のエステラーゼによって加水分解され、蛍光性の resorufin となります。よって、生細胞を染色することができます。同様の生細胞染色色素としてCalcein-AM( λ em / λ ex =515nm/490nm) が知られていますが、
CytoRed はより長波長域に比較的広い範囲での蛍光を持つため、蛍光顕微鏡下で G 励起（赤色蛍光）もしくは B 励起（緑色蛍光）での観察が可能です。（推奨 G 励起）また、 Cell viability assay
への応用例も報告されています 1) 。
参考文献
1) K Sasamoto, et al. , Anal. Sci., 15, 1025 (1999).

ミトコンドリア染色用蛍光色素-Cellstain- MitoRed

CH3

H 3C
H3C

N

N

O

+

O

CH3

CI

O

O
O

CH3

C38H37CIN2O5 =637.17

16

News No.97(2001)〈特長〉
・ミトコンドリアを特異的に赤色に染色できる。
・50µg × 8 本 , DMSO 1ml の使いやすいセット品、試薬を量り取る手間が不要である。

(a)

MitoRed は rhodamine を基本骨格とする色素で細胞に取り込
まれた後ミトコンドリアに集積する特徴があり、ミトコンドリアを特異的に染色します。20 〜 200nmol/l と非常に低濃度でかつ高感度に染色でき、
ミトコンドリア選択性に優れた蛍光プローブ
です。MitoRed は λem/ λex=580nm/560nm の蛍光特性を持ち、蛍光顕微鏡 G 励起下で細胞内のミトコンドリアが赤色に染色されている様子が観察できます。
染色プロトコール
下記に HeLa 細胞を用いた例を示す。
（細胞の種類、観察条件、固定の有無によって試薬濃度、染色条件等の検討が必要ですのでご注意下さい。）〔試薬〕
・MitoRed
・DMSO

(b)

〔ストック溶液の調製〕
MitoRed 50µg（1 本分）を DMSO 78µl で溶解し、ストック
溶液を作成する( 1mmol/l )。ストック溶液は冷蔵で保存する。
〔染色〕
1. チャンバースライドに適当な細胞密度になるように細胞を培養する。（ 1x105 〜 1x106 cells/ml ）2. 培地を除き、軽く洗浄する。（培地、PBS、Hank’s 溶液等）
3. 1mmol/l MitoRed ストック溶液を、培地を用いて最終濃度が20 〜 200nmol/l になるように希釈する。
（細胞に加える前に、
あらかじめ 37℃に保温しておいたほうが良い。）ウェルに希釈した MitoRed 溶液を加え、培養条件下で 30 分〜 1 時間イン
キュベートする。
4. MitoRed 溶液を除き、培地を加える。
5. 蛍光顕微鏡 G 励起下で観察する。
（MitoRed; λem/ λex=580/ 560nm）
細胞の固定を行う場合は、3. に続いて以下の操作を行う。
4. MitoRed 溶液を除き、洗浄する。
（serum free の培地、PBS、Hank’s 溶液等）
5. 10％中性ホルマリン緩衝液で 15 〜 20min 固定する。
6. PBS で洗浄する。
7. 蛍光顕微鏡下で観察する。

図 1 CytoRed による生細胞染色(a) HeLa 細胞 , G 励起 (b) HeLa 細胞 , B 励起

図 2 MitoRed によるミトコンドリア染色
HeLa 細胞 , G 励起
品名-Cellstain- CytoRed Solution-Cellstain- MitoRed

容量1ml50µg × 8

価格（￥） メーカーコード

9,800
11,000C410
R237(DMSO(1ml)添付)17

News No.97(2001)

第 11 回フォーラム・イン・ドージン開催報告「自然免疫の分子基盤」
フォーラム・イン・ドージンも回を重ね、今年で 11 回目を迎え 11
月 24 日、秋晴れのなか、熊本県立劇場で開催することができました。 今年は岩永 貞昭先生（九州大学名誉教授）のご指導により、「自然免疫の分子基盤」というテーマで、この分野の第一線で活躍されている先生方に講演いただきました。 オーガナイザーは岩永先生の他、先生のお弟子さんにあたる川畑 俊一郎先生（九大院・、それに第一回目からお世話い理）、牟田 達史先生（九大院・医）ただいている山本 哲朗先生（熊本大院・医）の 4 名の先生方で、演者構成も例年になく若手中心になりました。 その分、討論も非
常に活発で、レベルの高いシンポジウムになったのではないかと自負しています。 この分野は日本が世界をリードしており、自然免疫の仕組みがどこまで分かっているか、また、どのような分子がそれを担っているかといった点について、本フォーラムでは明らかにできました。 これも岩永先生をはじめとするオーガナ
イザーの先生方の意向が強く反映された結果だと思います。

おける補体レクチン経路の重要性についてで、ヒトのフィコリン
が補体レクチン経路を活性化していることを示されました。 さらに野中先生（東大院・理）の講演も補体系に関するものでしたが、マボヤ補体系を例に、分子進化の面からの考察をされました。
つづくセッションは哺乳類の自然免疫にフォーカスをあて、まず最初に改正先生（阪大微生物研）が、自然免疫の病原体認識に関与する膜タンパクファミリーである Toll-like receptors（TLR）
について講演されました。 TLR は最近注目を集めていますが、その機能についてはまだまだ不明なところも多いようです。 赤司先生（佐賀医科大）は TLR と会合する MD タンパク質によるエンドトキシン認識機構について最近の知見を紹介されました。
最後に泥谷先生（大分医科大）によって、LPS の上流に位置す
るタンパク質 CD14 の機能についての紹介がありました。
自然免疫は、下等生物から哺乳動物まで生物が基本的に備えている免疫システムで、その重要性がストレスや疾病との関連で最近注目されつつあります。 そこで働く分子も、ほぼ役者が出そろった感があります。 本フォーラムは、それらについて現時点
でどこまで解明されたかについて第一線からの報告と集中的な議論の場となり大変有意義だったと思います。 なお、講演要旨集の残部が若干ございますのでご希望の方は、小社マーケティング部・斉藤までご連絡下さい。
（佐々本 一美）

講演はまず最初に、倉田先生（東北大院・薬）が主にショウジョ
ウバエの抗菌ペプチドの発現誘導を例に、自然免疫を制御するシグナル伝達カスケードについて述べられました。 広く生物界において自然免疫が非常に有効な生体防御システムであることが良
く理解できた講演でした。 次に、オーガナイザーでもある川畑
先生は、カブトガニの生体防御レクチンによる異物認識について講演されました。 講演ではタキレクチン -2 とタキサイチンの糖鎖認識機構を中心に紹介されました。 前田先生（熊本大・医）は、
セリンプロテアーゼインヒビターの一種であるα1プロテアーゼイ
ンヒビターの生体防御における役割について、特に NO によるニトロソ化との関連で講演されました。 このタンパク質は炎症初期に多く血中に出現し、同時に発生する NO によってニトロソ化をうけ、多彩な生理作用を持つようになるといった興味深い内容でした。 次の藤田先生（福島県立医大）の講演は、生体防御に

ホームページアドレス
URL : http:// www. dojindo.co.jp/
E-mail : info@dojindo.co.jp

フリーファックス
フリーダイヤル

0120-021557
0120-489548

ドージンニュース No.97 平成13年1月28日発行

News No.97
18

株式会社同仁化学研究所

DOJINDO LABORATORIES

熊本県上益城郡益城町田原2025-5 〒861-2202
発行責任者 石田和彦 編集責任者 斉藤素子

年４回発行

許可なくコピーを禁ず