ＩＳＳＮ１３４６－７８４０

港湾空港技術研究所
資料
TECHNICAL NOTEOFTHE PORT AND AIRPORT RESEARCH INSTITUTE

No.1406

March 2023

フィルターと分析者の違いが沿岸域における魚類の環境 DNA 網羅的解析の結果にどう影響するか？

細川 真也，小室 隆，大倉

国立研究開発法人翔太，和泉 隆夫

海上・港湾・航空技術研究所

National Institute of Maritime,
Port and Aviation Technology, Japan目

次・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3

1． まえがき ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

4

1.1 網羅的解析の可能性と本論文の狙い ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4

1.2 沿岸域における環境 DNA の特徴 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

4

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5

2． 分析方法と評価指数 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

5

要

旨

1.3 本研究の目的

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

5

2.2 評価に用いる指数 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

5・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

6

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

7

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・7

3.1 はじめに ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

7

3.2 方法・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・8

3.3 結果・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 10

2.1 分析方法とリード数

2.3 種の優占度ランク曲線と指数の関係
2.4 指数の解釈方法

3． フィルターの違いが及ぼす影響

3.4 考察とまとめ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 13

4． 分析者の違いが及ぼす影響

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 14

4.1 はじめに ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 14
4.2 方法・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15

4.3 結果・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 17

4.4 考察とまとめ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 22
5． あとがき ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23
5.1 本論文のまとめ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23
5.2 今後の課題

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23

謝辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 24
参考文献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 24
付録 A 検出される種数の統計解析 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 27
付録 B 久里浜湾における塩分の空間分布 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 29

—1—How do the diﬀerences in filter and analyzer aﬀect the data quality ofenvironmental DNA metabarcoding for fish species in estuary?
Shinya HOSOKAWA*,**
Takashi KOMURO***
Shota OKURA****
Takao IZUMI*****

Synopsis
The analysis of environmental DNA (eDNA) metabarcoding is expected to reduce the labor and costof the survey and monitoring of fish communities. However, in coastal and estuarine areas, because thespatial distribution of eDNA is complex, and because there are factors that inhibit the analysis of eDNA,
challenges for practical application are remaining. The filtering water sampled and the chemical analyses
are the important processes in eDNA metabarcoding. We evaluated the eﬀects of the diﬀerences in filter
and analyzer on the results of metabarcoding analysis from three perspectives: whether the species thatare major in the read count are detected or not, whether the number of species detected is certain or not,and whether the specificity in species detection exists or not? As a result, we concluded the following:1) The detection of the species that are major in the read count was independent of filters and analyzers
compared in this study; 2) The number of species detected was greater in a filter with smaller pore size.
The diﬀerence in the chemical analyzer may aﬀect the number of species detected. However, we could
not be evaluated whether the diﬀerence was significant or not; and, 3) the pore size of the filter can bea possible factor to sort the species in coastal and estuarine areas. These conclusions indicate that filters
should be selected according to the purpose of using eDNA metabarcoding analysis. However, the exact
reasons to choose the chemical analyzer for the eDNA metabarcoding were not obtained from these
conclusions.
Key words: Environmental DNA, Metabarcoding of fish community, Estuary, Filter, Analyzer* Head of MarineEnvironmental Information Group, Marine Environment Control System Depertment** Head of Big Data Technology Group, Infrastructure Digital Transformation Engineering Depertment*** Postdoctoral Researcher, Marine Environmental Information Group, Marine Environment Control System Depertment**** Researcher, Marine Environmental Information Group, Marine Environment Control System Depertment***** Member, Marine Environmental Information Group, Marine Environment Control System Depertment
3-1-1, Nagase, Yokosuka, Kanagawa, 239-0826 Japan
Phone : +81-46-844-5107 Fax : +81-46-844-1274
e-mail: hosokawa@p.mpat.go.jp—2—

フィルターと分析者の違いが沿岸域における魚類の環境 DNA 網羅的解析の結果にどう影響するか？
細川 真也 *,** ・ 小室 隆 *** ・ 大倉 翔太 **** ・ 和泉 隆夫 *****

要旨

環境 DNA に基づく網羅的解析は， 魚類調査の低労力化 ・ 低コスト化が期待される． しかし， 沿岸域における環境 DNA の空間分布は複雑で， かつ， 分析を阻害する要因も存在することから， 実用化までには課題がある．
本研究では， 網羅的解析の要素技術のうち， フィルターと網羅的解析の分析に着目し， これらの違いが網羅的解析の結果に与える影響について， 主要な魚種を取りこぼすことなく検出できるか， 確かな種数の検出ができるか， 特定の魚種の検出に差はないか， の３つの視点で検証した． この結果， 以下の結論を得た． 1) 主要な種の検出においては， 本研究で比較したフィルターの間では差はなく， 分析者が違っても差はない． 2) 検出される種数は， 孔径が小さなフィルターほど多い． 一方， 分析者が違えば， 検出される種数に影響する可能性はあるものの， 重大な差を引き起すかどうかわからない． 3) 環境 DNA の起源が多様な沿岸域では， フィルターの孔径の違いで， 捕捉する種を生活様式別に選別できる可能性がある． これらの結論は， 網羅的解析を使う
目的に応じて， フィルターを正しく選択する必要があることを示しているが， これらの結論から， 分析者を指定す
る明確な根拠は得られなかった．
キーワード ： 環境 DNA， MiFish プライマー， 推定精度， 種の豊富さ， 種組成* 海洋環境制御システム研究領域 海洋環境情報研究グループ長** インフラ DX 研究領域 ビッグデータ研究グループ長*** 海洋環境制御システム研究領域 海洋環境情報研究グループ 専任研究員**** 海洋環境制御システム研究領域 海洋環境情報研究グループ 研究官***** 海洋環境制御システム研究領域 海洋環境情報研究グループ 技術補助員〒 239-0826 神奈川県横須賀市長瀬 3-1-1 国立研究開発法人 海上 ・ 港湾 ・ 航空技術研究所 港湾空港技術研究所
Fax ： 046-844-1274
e-mail: hosokawa@p.mpat.go.jp
電話 ： 046-844-5107—3—1. まえがき立てる者の頭を悩ませる． 例えば， 上述した既往の知見から描くことができる鉛直二次元の環境 DNA の空間分布の中で1.1 網羅的解析の可能性と本論文の狙いは （図―1.2）， 表層から採取するサンプルで， 下層の DNA

環境 DNA 分析は， コストと労力を低減させることから， 生も対象としたいと考える場合もあるであろう． この場合， 検出

物のモニタリングや保全研究のツールとしての期待が広がりの感度を上げることで下層 DNA の検出は達成できそうだが，つつある 1)–3)． 環境 DNA 分析には， 特定の種に着目した同時に， 明らかに検出したくない河川由来の DNA を検出す

種特異的解析と分類群の中の生物相を対象とする網羅的解

る可能性も高めてしてしまう． 検出感度を上げることにより偽析があり， それぞれの利点に応じて使い分けられる．

陰性を減らせる代わりに， 偽陽性の確率を上げるトレードオフ

網羅的解析は， 生物群集のモニタリングへの応用が期待さは， 既に Ficetora et al. (2015)18) によって指摘されていることれる． 魚類の網羅的解析は， 2012 年に魚類共通を対象としであり， 沿岸域はそれが起こりやすい構造であると言える．

た先駆的なプライマーが発表されて以降 4),5)， より多くの種を沿岸域は， 環境 DNA の分析に影響する因子が多く存在

包括して検出できるプライマーが開発され 6),7)， 実用化へのする場でもある． 例えば， 海藻の多糖類は， ろ過を阻害した

現実味を帯びつつある． 沿岸域は多様な魚が生息場としてり， DNA の単離の邪魔もする 19)． また， 沿岸域に広く分布利用する場であることから， これを使った調査やモニタリング

する腐食酸などが高濃度に含まれるサンプルでは， 網羅的が期待される 8)． しかし， 後述する沿岸域特有の課題はこの解析において重要となる DNA の量を増幅させるポリメラーゼ
連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction ： PCR） が阻害される

実用化の１つの障壁となっている．
網羅的解析は， 複数の専門性の強い過程によって成り立っ20),21)． 環境 DNA の分析に影響する因子及びその影響の大ており （図―1.1）， すべての過程を理解できる技術者を育成

きさについては， 他にもわかっていないことは多く， 分析するすることは容易ではない． しかし， 少なくとも， 沿岸域をフィー者の独自のノウハウにより対処されている．

ルドとして事業を統括する技術者は， 沿岸域特有の課題が網羅的解析のどの過程でどの程度結果に影響するのか理解
していなければ， 効率的な調査計画を立てられないし， 場合⥙⨶ⓗゎᯒ

によっては誤った評価を導く計画を立ててしまう恐れもある．
本論文では， 沿岸域特有の課題を示し， 網羅的解析の要ࢧࣥࣉࣜࣥࢢ

素技術がその課題にどう対処できるのか示すことで， 沿岸域

ࢁ㐣࣭DNA ᢳฟ
࣭ࣛ࢖ࣈࣛࣜㄪᩚ
࣭㓄ิㄞࡳྲྀࡾ
࣭ㄞࡳྲྀࡾ⤖ᯝࡢ☜ㄆㄪᰝ⪅をフィールドとする技術者の魚類の網羅的解析に関する理解ࢹ࣮ࢱゎᯒࢹ࣮ࢱゎᯒ⪅

ศᯒ⪅が進み， 現場での応用事例が増えて実用化へ前進する事をࣉࣟࢪ࢙ࢡࢺࡢィ⏬⪅࡞࡝

狙っている．
1.2 沿岸域における環境 DNA の特徴

図―1.1 環境 DNA の網羅的解析を使った調査から解析までの流れ． 実務
では， 複数の専門家が分業して各過程に取り組む．

環境 DNA は， 生物から排出された細胞や組織片を由来としていると考えられているものの，その実情は未だによくわかっていない 9)． しかし， 魚類の環境 DNA は， 1 μm から 10 μm

DNA of fresh and brackish fishes, and fishes from markets
Jane et al. (2015)12), Yamamoto et al. (2016)15),
Pont et al. (2018)13), Schwentner et al. (2021)14)の粒子状として存在している事は分かっており 10),11)， このサイズの粒子の動態により魚類の環境 DNA の空間分布は強く支配されるものと考えられている．
沿岸域では， 河川の上流に生息する魚類の環境 DNA がRiver water, fish market

流下したり 12)–14)， 人間活動を由来とする DNA によって汚染されやすい場でもある 15)． 実際に， 東京湾沿岸でも湾内には明らかに生息していない魚類が網羅的解析で検出されている 16)． 一方で， これらの平面的な拡がりとは逆に， 藻場に生息する魚類の環境 DNA は， 藻場からわずか 1 m 上で

DNA of marine, demersal fishes
Momota et al. (2022)17)も検出されない局所性もある 17)．
この魚類の環境 DNA の複雑な空間分布は， 調査やモニタリングのためのサンプルをどこで採ればいいのか， もしくは， 検出の感度をどこに設定すればいいのか， 調査計画を

図―1.2 沿岸域における環境 DNA の分布． 沿岸域では， 魚の生息場所が多様であり， 魚から排出される DNA の分布が空間的に複雑であることが既に知られている．

—4—

1.3 本研究の目的

粒子 10),11) を捕捉する２つの孔径が異なるフィルターを比較

魚類の網羅的解析では， ろ過した残渣を分析の対象とするすることで， フィルターの違いが網羅的解析の結果に及ぼすが， 孔径の小さなフィルターでろ過して細かい粒子まで捕捉影響を評価した． 第 4 章では， １つ１つに分解した分析ノウすることで， より多様な DNA を採取して網羅的解析の感度をハウに着目するのではなく， 分析者が有する結集したノウハ

高められる期待がある． しかし， 上述の偽陽性とのトレードオ

ウの違いが分析結果に及ぼす影響を評価した． 最後に， こフのとおり， このことが沿岸域のサンプルにおいてメリットになれらの評価結果に基づき， 沿岸域をフィールドとする技術者

るとは限らない． また， 網羅的解析の分析者が独自に有してがフィルター及び分析者を選択するための指針を導いた．

いるノウハウは， 分析に影響する因子には対処できるかもし

なお， 本論文では， 分析者による種の同定精度の違いをれないが， 標準的な手法に対して分析結果に差をもたらして着眼点の１つとしている． このことから， 断りの無い限り， 記

しまう可能性も考えられる．

載する種名は， すべて， 分析者から報告されるものとした．

本論文では， ろ過と分析者が有するノウハウに着目し， 沿岸域をフィールドとする技術者がこれらを選択する際の参考と2. 分析方法と評価指数なる指針を示すことを目的とした． このため， まず， これらの要素技術が沿岸域の特有の課題にどこまで対処できるのか，

2.1 分析方法とリード数

次の３つの視点で評価した． １つ目は， サンプルの中で相対環境 DNA の網羅的解析では， 大量の DNA 配列を読むこ的に高い DNA 濃度を有する主要な種を取りこぼすことなく検とができる次世代シーケンス技術が用いられる． 次世代シー出できるかどうかである． 主要な種を取りこぼしてしまう技術でケンス技術では， 大量の DNA 配列を読むことができるた

あれば， 群集把握の信頼性は低く， 実務での応用には値し

め， 複数のサンプルが同時に解析され， １サンプル当たりにないと考えていいだろう． 次に， 網羅的解析の結果としてよく割り当てられる情報量はその中で決まる 23)． 具体的には， １

使われる種数に着目し， 網羅的解析の分析感度を評価した．

回のランで決定する DNA 配列の数を 1500 万本に設定して最後に， 魚の生活様式に着目して検出される魚種を評価し150 サンプルを同時に解析した場合， １つのサンプル当たりた． この評価は， 環境 DNA が辿ってきた距離や物理過程に割り当てられる配列の数は平均で 10 万本となる 9)．

が違えば， 環境 DNA の存在形態が変化し 22)， 検出の感度

網羅的解析によって検出されるそれぞれの種の DNA 配列も異なるという予測に基づいたものである．

の読み取り数は， さらに， １サンプル当たりの配列読み取り数

２つ目と３つ目の評価の視点は， 網羅的解析の検出感度がの中から割り当てられる （図―2.1a）． この読み取る配列の数

重要な視点となっているが， 著者らの知る限り， この感度をについて本論文ではリード数と呼ぶとすると， 上述のとおり，

統一的に理解するための理論はない． そこで， 本論文では，

全リード数は， 分析上設定するものであり生態学的な意味は

第 2 章において， 網羅的解析の分析方法から結果が出力さないが， 種のリード数を在 ・ 不在に変換したり （図―2.1b），

れるまでの過程を整理し， 検出の感度に影響する要因を予

全リード数に対する割合 （以下， 相対リード数） に変換する

測し検証した． この検証結果を踏まえ， 第 3 章では， 少なくことで （図―2.1c）， 生態学的に意味のある情報に置き換え

とも魚類の環境 DNA の多くが存在する 1 μm から 10 μm のられる．
2.2 評価に用いる指数

0

A

B

(c)

12

6

0

(1) １つのサンプルを評価する種数と有効種数
1.0

種のリード数を在 ・ 不在に変換し， それを積み上げた数が種数 （S） であり， これは最もよく知られた多様性指数の１つ

Proportion

(b)

105

Number of species

Number of read counts

(a)

A

B

である． 相対リード数は， 明示して使われることは少ないが，種の DNA 濃度の相対量として考えられており， 第 3 章と第0.0A4 章で用いられている定量 MiSeq 法でもこの考え方が採用さB

れて種の DNA 濃度が推定される 24)．
種の多様性においては， 種数とともに種の優占の度合いを

図―2.1 環境 DNA の網羅的解析で得られる結果． 仮想のサンプル Aとサンプル B のリード数を一例として示している． （a） １回の解析で種ごとのリード数 （number of read counts） が出力され， １つのサンプルに含まれる種のリード数の合計がそのサンプルの全リード数となる． （b） リード数が得られた種を 1 としてカウントすれば種数 （number of species） が得られる． （c）種のリード数をサンプル中の全リード数で割れば，リード数に基づく種の割合 （Proportion） が得られる．

表す均等度が重要な概念であり， これらに基づいた多様性
指数がいくつか提案されている． シャノン指数とシンプソン指数は， 均等度を考慮した最も有名な多様性指数である． Hill
(1973)25) は， 種数とこれらの指数を統合した式を提示している． 例えば，シンプソン指数 （λ） は，種 i の出現確率 pi によっ—5—

て下式から求まり，λ=の相対リード数を代入できる．

S

pi2 ，
Σ
i=1

Bray-Curtis 指数に種の在 ・ 不在データを代入した結果と 1(1)から Sørensen 指数を差し引いた結果は一致する 28),29)． この

この逆数が Hill (1973)25) によって統合された式による結果のことから， これら２つの指数を比較することで， 種数と相対リー１つとなる ：

ド数の２つの観点を比較した洞察が可能となる． この洞察に

2D = λ−1

ついては， 2.4 に後述する．

(2)．

ここで， ２つの組成を比較するための解析では， 1 から類

ここに， 左辺の左肩の 2 は均等度に関するパラメータであり，似度を差し引いた非類似度が用いられることが一般的であパラメータを 1 としたものはシャノン指数の指数関数に一致す

る． すなわち， Bray-Curtis 指数は式 (4) のまま用いられるが，る． Hill (1973)25) は， 均等度に重みを付けたものをすべて

Sørensen 指数は非類似度に変換されて用いられる． しかし，有効種数と呼んでいるが， 本論文では， 有効種数と言えば，

このことを毎回説明すると冗長的になるため， 本論文では，

このシンプソン指数の逆数で定義されるものを意味することとBray-Curtis 指数と Sørensen 指数は， いずれも非類似度を意する．

味することとする．

ここに， 種 i の出現確率を相対リード数で代用すれば， 図―2.1 のサンプル A と B の有効種数は， それぞれ， 4.8 及び

2.3 種の優占度ランク曲線と指数の関係

2.4 となる． これらの値には明確な意味はないものの， 全リー(1) 種の優占度ランク曲線

ド数を占める種の数， すなわち， 主要な種の数を把握するのリード数を積み上げて棒グラフにした図―2.1a は， 横軸にに有効な数値である． なお， 有効種数は， 個体数に基づく

種， 縦軸にリード数をプロットした図として表すこともできる．

ものとサンプル数に基づくものもあり混同しやすい． 有効種数

リード数が多い順番に種を並べると種の優占度ランク曲線 （図の詳細な説明については， 細川 ・ 百田 （2019） 26) を参照―2.2） と呼ばれる生態学の分野で古くから利用されている曲

できる．

線となる 30),31)． この曲線により， 種の優占度と種数の両方を(2) ２つの組成を比較する類似度

同時に視覚的に理解できる． なお， 種 i のリード数 fi と検出

網羅的解析では魚類相を推定することから， フィルターのされた種数 S から， 全リード数 R は以下となる ：違いと分析者の違いの影響について， 種組成の観点から評S

R=価することも重要となる． 種組成を比較する方法については，
異なる群集の存在を重要と考える β 多様性の分野で発展し，

fi ．
Σ
i=1

(5)

類似度と呼ばれる多くの指数が使われており 27),28)， 網羅的

なお， 種の優占度ランク曲線が切り立った形状であるほど，解析で得られる検出種数と相対リード数についてもいくつか

先述した有効種数は小さくなる．

の類似度を適用できそうである．

(2) 検出種数を決める因子

例えば， 種の在 ・ 不在に基づく類似度である Sørensen 指種の優占度ランク曲線の形状が生態学的な条件のみによっ数がある ：て決まるとすると， 全リード数 R が変動することで， 種の優占度ランク曲線は縦軸方向に移動する． すなわち， 検出される

Sørensen index =2a2a + b + c

種数 S は， 全リード数 R が低くなるほど少なくなり， その逆も

(3)．

ここに， a は２つの組成に共通する種の数であり， b と c は，

×103
Number of read counts

それぞれ， 片方の組成に特有の種の数である． 網羅的解析で得られた種の在 ・ 不在の結果をこれに当てはめることで，２つの組成の類似性を測ることができる．
また， 個体数等の連続変数に基づいた２つの組成を比較する指数として， Bray-Curtis 指数がある ：S

Bray-Curtis index =|Xij − Xik|
Σ
i=1
S

4

2

DA=4.82

DB=2.4

SA

SB

0

．

1

(4)

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12Species rank

(Xij + Xik)Σ
i=1

図―2.2 種とリード数の関係を表す種の優占度ランク曲線． 赤と青のプロットは， それぞれ， サンプル A とサンプル B で検出された種のリード数を示している．

ここに， Xi は種 i の個体数であり， j と k は， それぞれ， 比較する場所 （もしくはサンプル） を意味している． Xi には種 i—6—きているのか， もしくは異質なのか評価できる． これと同様の

60

Number of species

解釈は， 類似度についても適用できる． 複数サンプルの比較の中で， Bray-Curtis 指数で異なるグループは， 主要な種が異なっているものと判断できる． 一方， Bray-Curtis 指数では同質で， かつ， 類似するグループが， Sørensen 指数では

30

そうでない場合， 主要ではない種に偏りがあったり， ランダムな異質性が生じていることが疑われる． 種の偏りに関しては，既に報告されている分析者の間での同定精度の差に起因することが予想されるし 16)， ランダムな異質性については， 相

0
0

×105

1.5

1.0

0.5

Number of read counts

によって， 検出されたりされなかったりすることが予想される．

D<1.5 D<3.0 D<4.5 D<6.0 D<7.5

2D<9.02D<10.52D<12.02D<13.52D

2

2

2

2

対リードの低い種が， 種の優占度ランク曲線や分析上の設定

2

3. フィルターの違いが及ぼす影響

図―2.3 全リード数と種数との関係． 横軸と縦軸は， それぞれ， MiFish-U
種に限定した全リード数と種数である． 有効種数 （ 2 D） も
MiFish-U 種に限定したリード数に基づいて算出している． 実線と点線は， それぞれ， 内部標準種， MiFish-Ev2 種，
MiFish-U2 種を含むすべてを対象とした全リード数が 10 万と100 万の場合を示している．

3.1 はじめに魚類の環境 DNA 分析では， DNA を保持した粒子を水中から取り出し， その残渣から DNA を抽出する． ろ過は，DNA を保持した粒子を取り出す重要な過程である． ろ紙の孔径， 材質， DNA 抽出までの保存方法は， 取りこぼしを防起こる． また， 種の優占度ランク曲線の裾野尾が長いほど，

ぐためには重要なポイントであり， これらの最適化を目指した

全リード数 R の変化に対して検出される種数 S は敏感に変化研究は多い 32)–38)．

する． ただし， これらは， 種の優占度ランク曲線の形状が生環境 DNA を保持する粒子を捕捉するフィルターの孔径は，態学的な条件のみによって決まる事を仮定したことによって導網羅的解析の分析感度を決める要因であることは容易に想かれる予測であって， 仮説の域を出ていない．

像できる． 実海域における環境 DNA を保持する粒子の大きこの仮説を検証するため， 本論文で出てくるデータを用い

さは， 1 μm から 10 μm の間に分布していると考えられておりて， 種数の変動が全リード数と種の優占度ランク曲線の形状

10),11)， これよりも小さな孔径のフィルターを選択すれば， 少によって説明されるかどうか検証した． 目的変数に種数 （S），

なくとも DNA 濃度の割合を占める主要な種を取りこぼすこと

説明変数に全リード数 （R） とした． また， 種の優占度ランクなく検出できそうである． さらに， より小さな粒子を捕捉するこ曲線の形状については有効種数 （2D） によって表現し， ことで， 大きな粒子には保持されていない魚の DNA の検出にれも説明変数の１つとした． 一般化線形モデル （Generalized

寄与できそうである． 実際に， Miya et al. (2016)39) は， 水族

Linear Model ： GLM） を用いて検証した結果， やはり， 種館の水槽から採取した 1 L の水サンプルを孔径 0.45 μm のメ数は全リード数と有効種数によって説明された （付録 A）． 種

ンブレンフィルターと 0.7 μm のデプスフィルターでろ過して，の優占度ランク曲線がなだらかな形状であるほど，また，全リー

メンブレンフィルターで３倍くらい多くの種を検出できる事を示

ド数が多いほど，検出される種数は多くなる事が示された （図している．

―2.3）．

さらに， 粒子の大きさによって， 網羅的解析による検出傾

この結果では， まだうまく解釈できていない点も残っており

向に差があるのであれば， フィルターの孔径の違いによって，（付録 A）， 検出種数と全リード数及び種の優占度ランク曲線

検出したい種を操作できるようになるという仮説を立てることがの形状との関係が普遍的なものとして結論づけるには早計でできる． 細粒化した粒子は，大きな粒子よりも浮遊時間が長く，ある． しかし， この結果は， 少なくとも本論文で扱うデータの表層に長く滞在できることは明らかである 40)． さらに， DNA

傾向を説明していることから， フィルターの違いと分析者の違の起源から長い距離を辿った粒子ほど細粒化していることがいが網羅的解析の結果へ及ぼす影響の考察に十分に使える

予想され 22)， 沿岸域をサンプリングポイントにする場合， フィ

ものである．

ルターの孔径を変えることで， 河川から下ってきた遠方を起源とする環境 DNA の検出傾向を調整できるかもしれない．

2.4 指数の解釈方法

サンプリングポイントを表層にする場合， 底層から浮遊した

有効種数と種数の２つ指数を使うことで， 主要な種の数とそ

環境 DNA についても同様の事が予想される． また， 植生がれ以外の種の数が比較対象の間でどれくらい同質に検出で季節的に変化する沿岸域では， フィルターの孔径の違いによ—7—

る検出傾向の違いも季節的に変化するかもしれない．

ラメ ・ カジメが優占する海藻藻場が形成されることが報告され本章では， DNA を保持した粒子を水中から取り出すフィルているが 41)， この期間の中旬以降にも藻場の形成が目視でターに着目し， 沿岸域の藻場が繁茂する環境下において，確認できた．

フィルターの孔径の違いが網羅的解析の結果に及ぼす影響(2) 調査方法を評価した． 評価は本論文の狙いである次の３つの視点で採水は，ハイロート採水器を用いて，表層から 0.2 m 程度（以行った ： 1) 孔径が 1 μm のフィルターであれば， DNA 濃度

下， 表層） と 1.5 m 程度 （以下， 底層） の深さの２層で実の割合を占める主要な種を取りこぼすことなく検出できるか，2)

施した （図―3.1b）． 表層のサンプリングポイントは期間中をより孔径の小さなフィルターほど多くの種を検出できるか， 3)

通して藻場よりも上に位置していたが， 底層のサンプリングポ

フィルターの孔径により起源が異なる魚種を選別できるか．

イントは藻場が繁茂した時には藻場の中に位置していた． 採
水は， ハイロート採水器にセットした 2 L の滅菌ポリエチレン

3.2 方法瓶により行った． １回の採水では， 表層と底層から１つのサン(1) 調査の場所及び時期

プル （1 反復） を採取した．

１つのサンプルを異なるフィルターでろ過することで比較検

サンプルは， 採水後に速やかに港湾空港技術研究所内の証した． サンプルの採水は， 平作川の下流に位置する久里実験室へ持ち帰ってろ過した． １つのサンプルを２つの 1 L

浜湾において， 港湾空港技術研究所の敷地内で実施したサンプルに分けた後， それぞれを材質がガラス繊維， 粒子（図―3.1a）． 塩分は， 平作川の表層付近で 20 PSU 近くまで保持能が 0.7 μm のデプスフィルター （GF/F，Whatman 社製）

低くなる鉛直構造が形成されているが， 久里浜湾内全域及と材質がポリフッ化ビニリデン， フィルター孔径が 0.22 μm のび採水場所付近では鉛直方向にほぼ一様である （付録 B）．

メンブレンフィルター （Sterivex-GV， Merck Millipore 社製）

採水は，2021 年 11 月 24 日から 2022 年 1 月 26 日までの間に，を使い吸引ろ過した （図―3.1c）． ろ過後のフィルターは， しおよそ 1 週間の間隔で計 10 回実施した． 別の日のサンプル

ばらくの間冷凍保存し， 後日， まとめて分析業者へ送付した．

で比較する理由は， 特定の種組成による検出傾向の偏りの(3) DNA 分析

影響を排除するためである． 採水場所付近では， 冬季にア

環境 DNA の網羅的解析は， 主に， フィルターからの DNA

(a)

(b)
Tokyo Bay

Hirasaku River

35.5° N35.24° N
sampling location

35.0° Nsurface

Kurihama Bay

35.22° N

20 km

Pacific Ocean
139.5° E

140.0° E

bottom

2 km
139.70° E

139.72° E(d)(c)
surface sample

bottom sample

purified water

sample DNA

standard DNA

reagent
Sterivex-GV
GF/F
aspirator

PCR

図―3.1 フィルター比較のための調査方法の概要． （a） 久里浜湾と平作川及び採水場所． （b） サンプルはハイロート採水器を用い， 表層と底層から採水した． （c） １つのサンプルは， ２つに分けて， 異なるフィルターでろ過した． （d） サンプルから抽出した DNA 溶液に内部標準 DNA
溶液を加えた試薬について， ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR） を実施した．

—8—

表―3.1 解析対象のカテゴリ， 採水場所 （久里浜湾） から見たその意味， 及びカテゴリに当てはまる種の FishBase43) からの検索条件．
FishBase による区分

採水場所から見たカテゴリの意味

カテゴリ

タイプ

生活場所

淡水魚 ・ 汽水魚

明らかに上流を起源とする環境
DNA“Fresh” のみの種
“Fresh” と “Brack” のいずれも含む種

底生魚

久里浜湾内の底層を起源とした環境 DNA である可能性“Saltwater” のみの種
“Saltwater” と “Brack” のいずれも含む種 “demersal”“Saltwater”， “Brack”， 及 び “Fresh” のいずれも含む種

岩礁魚

久里浜湾内の浅場や護岸近傍を起源とした環境 DNA である可能性

同 上“reef-associated”

遊泳魚

久里浜湾内を起源とした環境 DNA
である可能性同 上“pelagic-neritic”

指定なし

抽出， 抽出した DNA の増幅及びその増幅産物の精製と濃の生活様式でカテゴライズした （表―3.1）． Bray-Curtis 指数

縮， サンプルごとのタグ付け， DNA 配列の読み取り， 読みと Sørensen 指数によりサンプル間の種組成を比較した （第 2取り結果の確認の過程に分けられる． この中で， 抽出した章）． これら指数に基づく種組成の変動に対する時間 （採水DNA の増幅とサンプルごとのタグ付けの２つの工程で PCR日）， 層， フィルター， 時間と層の交互作用， 時間とフィルを行うことから， それぞれ， 1st PCR 及び 2nd PCR と呼び分

ターの交互作用の効果について Permutational Multivariate

けられている． なお， サンプルごとのタグ付けは， DNA 配列

Analysis of Variance （PERMANOVA） により検定した． 有の解読を１回のランで複数のサンプルから同時に行うことから意な効果が認められた変数を用い， 距離に基づく冗長性分（2.1）， サンプルの識別のために必要となる．

析 （distance-based Redundancy Analysis ： db-RDA） を 行 っフィルターからの DNA 抽出方法については， 第 4 章のて主要な変動を二次元で視覚化した．

A 社のとおりである． また， 1st PCR 及び増幅産物の精製と種組成を解析した後， フィルターの間での結果の違いを検濃縮の方法については第 4 章の D 社のとおりである． 網羅証した． まず， いずれのフィルターでも検出された種とどちら的解析の精度を左右するプライマーについては， MiFish のか片方のフィルターで検出された種について， 定量 MiSeq

プライマーセット （硬骨魚類全般に適用可能な MiFish-U6)，

法によって推定した DNA 濃度の分布を求めた． 次に， 種数

温帯の沿岸域で一般的なアナハゼ類に最適化したのフィルター間での差について， 対比較による Wilcoxon のMiFish-U22),3)， サメ ・ エイ類に最適化した MiFish-Ev22),3)

順位和検定により検定した． この検定は， 全種数と生活様式の複数のプライマーによって構成されるセット） を用いた．

のカテゴリ別に実施した．

網羅的解析では， 濃度が分かっているサンプル中に存在し種数の変動を引き起こす要因を明らかにするため， サンプ

ない魚種の DNA （内部標準 DNA） を添加することで， サン

ル中の MiFish-U 種を対象として， その種数を目的変数とし，プル中の魚種の DNA 濃度を定量できる定量 MiSeq 法 24) を

全リード数， 有効種数， フィルターの違い， 層の違いを説用いた． このため， 1st PCR の前に内部標準 DNA を混ぜて

明変数とした GLM を構築した． つまり， 構築したモデルは，試薬を調製した （図―3.1d）． なお， 内部標準については，

第 2 章で解析したデータのうち，本章のデータに限定しつつ，内部基準と記述している例もあるが 9)， 本論文では内部標準

さらにフィルターと層の効果を加えたものである． 目的変数でとして用語を統一する．

ある種数は， 正の値を取る離散型の変数であるため， 誤差

DNA 配列の解読については次世代シーケンサー （Miseq

分布としてポアソン分布を適用した． 最適モデルは， ステッ

Reagent Kit V2 × 150PE / × 250 PE， Illumina 社） を用いた．

プワイズ法により選択した． 説明変数間の効果量を比較でき解読した DNA 配列については， 解析パッケージを用いて，るよう， 説明変数を標準化して解析した．

結合，プライマー配列除去，トリミング，クオリティフィルタリング，

解析はすべて R44) を用いて実施した． 魚種のカテゴライ

デノイズ， キメラ配列を除去を経て実施した 42)． その後， 種ズは rfishbase 4.0.045) で実施した． PERMANOVA は， パッ

名の割り当てと種リストを作成した．

ケージ vegan 2.6-446) にある adonis2 関数を用いて実施した．

(4) データ解析

db-RDA は， 同パッケージの capscale 関数を用いて解析し検出した魚種の傾向をみるため， FishBase43) と照合し， そた． ステップワイズ法には step 関数を用いた． 対比較による—9—

表―3.3 環境 DNA の網羅的解析で推定された魚類相の非類似度のばらつきの検定結果 （PERMANOVA）． 調査日 （time），
層 （layer）， フィルター （filter）， 調査日と層及びフィルターの交互作用を説明変数として考慮している．

表―3.2 全種数に対するカテゴリに属する種数の割合． 値は， パー
センタイル値で示している． 冗長的になるため， ここではデプスフィルターの結果のみを示している．
種数の割合

カテゴリ

表層
2.6 ±
58.5 ±
18.1 ±
8.0 ±

淡水魚 ・ 汽水魚
底生魚
岩礁魚
遊泳魚

Explanatory
variables

底層
4.6
5.0
5.2
4.7

2.4 ±
61.3 ±
18.4 ±
7.5 ±

3.3
5.8
2.8
3.2

df

Sum ofsquaresr2

pseudo-F

p

9
1
1
9
9
10
39

2.92
0.03
0.16
0.44
0.90
0.41
4.85

0.60
0.01
0.03
0.09
0.19
0.08

8.00
0.67
3.95
1.20
2.48

<0.001
0.771
<0.01
0.185
<0.001

1.55
0.01
0.11
0.60
0.55
0.54
3.36

0.46
0.00
0.03
0.18
0.16
0.16

3.20
0.23
2.09
1.24
1.13

<0.001
0.997
<0.05
0.101
0.236

Bray-Curtis index
Time
FilterLayer
Time×filter
Time×layer
Residual
Total

Wilcoxon の順位和検定， フィルター間の分散の検定， GLM
は，それぞれ，R のデフォルトの wilcox.test 関数，var.test 関数，

Sørensen index (dissimilarity)

glm 関数を用いた． GLM の多重共線性のチェックに使う分

9
1
1
9
9
10
39

Time
FilterLayer
Time×filter
Time×layer
Residual
Total

散拡大係数 （VIF） は，パッケージ car47) の vif 関数を用いた．
3.3 結果(1) 網羅的解析結果の要約
網 羅 的 解 析 に よ っ て 検 出 さ れ た 全 種 数 は， 表 層 で31.8±6.3， 底層で 36.3±8.4 であった． 全種数のうちの 60%近くが底生魚で最も優占し， 次に岩礁魚が多く 20% 近くを占めていた （表―3.2）． 淡水魚 ・ 汽水魚も全体の 2.5% くらいの種の相対リード数の時間変化が Bray-Curtis 指数による種占めていた．

組成の時間変動を支配されていたことが理解できる． 12 月

種組成は， Bray-Curtis 指数でも Sørensen 指数でも時間で22 日の種組成は， 他の日の種組成と縦軸方向に離れる特徴

有意に変動していた （表―3.3）． さらに， 時間の r2 は， いを有していた． この方向に分布する魚は， 回遊性のマサバ

ずれの指数においても他の説明変数に比べて倍以上大きく，（Scomber japonicus） であった． Sørensen 指数を対象とした

種組成の変動は時間変化に強く支配されていることが理解

db-RDA の二次元プロットでは （図―3.2b）， Bray-Curtis 指できる． Bray-Curtis 指数を対象とした db-RDA の二次元プ数よりも同じ色の中でのばらつきが大きいことから， 相対リーロットからも， 層間やフィルター間の変動よりも， 時間変動がド数の低い種の時間的な特徴が弱かったものと解釈される

支配的であることが分かる （図―3.2a）． また， メバルの一種（2.4）．

（Sebastes sp.） とアオタナゴ （Ditrema viride） が，横軸方向 （主種組成の層間変動は有意であったが， その r2 はいずれの要な変動方向を意味する方向） に分布しており， 主にこれら指数でも 0.03 であり種組成の変動の説明力は小さい （表―%RWWRP
Sebastes sp.

0
Ditrema viride

6XUIDFHí
Scomber japonicus

í
í

0



&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

E&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

D1RY
'HF
'HF
'HF
'HF
'HF-DQ-DQ-DQ-DQ%RWWRP0í
6XUIDFH

í

í

0



&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

6XUIDFH*))%RWWRP*))6XUIDFH679%RWWRP679

図―3.2 環境 DNA の網羅的解析で推定された種組成についての距離に基づく冗長性分析 （db-RDA） の二次元プロット． （a） Bray-Curtis 指数と（b） Sørensen 指数を対象とした結果を示している． 中塗りのプロットは各時間 （調査日） もしくは層の重心を表し， 点線の矢印は時間変化を示している． Bray-Curtis 指数の冗長性分析では時間と層の交互作用も有意であったため， 同じ調査日の中でも表層と底層の違いが分
かるよう底層を点線の枠で囲んでいる．

— 10 —

表―3.4 フィルター間と層間の種数の差． GF/F と STV は， それぞれ， デプスフィルターとメンブレンフィルターを意味している．
フィルター間比較 （STV − GF/F）

層間比較 （底層−表層）

カテゴリ

GF/F
4.5 ±
0.1 ±
3.5 ±
0.9 ±
0.3 ±

全種
淡水魚 ・ 汽水魚
底生魚
岩礁魚
遊泳魚

STV

4.7 (*)
0.9
3.3 (*)
1.8
2.1−8.7 ±−0.4 ±−5.6 ±
0.1 ±−1.8 ±

表層
7.1 ±
0.9 ±
4.4 ±
0.4 ±
1.4 ±

5.9 (**)
1.2
3.6 (**)
1.4
2.3 (*)底層
6.9 (*)
0.6 (**)
4.3 (*)
1.6
1.4 (*)−6.1 ±
0.4 ±−4.7 ±−0.4 ±−0.7 ±

9.3
1.4
6.2
1.7 (*)
2.4

Wilcoxon rank sum test; *, p < 0.05; **, p < 0.01: ***, p < 0.001

心は， 座標の中心付近に分布しており， 時間変動に比べて目立たない （図―3.2）． 一方， BrayCurtis 指数では時間と層の交互作用も有意で， かつ， その r2 は 0.19 であり種組成変動を説明する
寄与率は大きい （表―3.3）． これらの結果は， 層の違いによる種組成の違いは一意的ではなく， 相

(b)

140

'1$FRQFHQWUDWLRQ FRSLHVȝ/í)の db-RDA の二次元プロットでも表層と底層の重(a)'1$FRQFHQWUDWLRQ FRSLHVȝ/í)3.3）． Bray-Curtis 指数と Sørensen 指数のいずれ

120
100
80
60
40
20

140
120
100

0

80

Pseudolabrus sieboldi
Ditrema viride

60

Zoarchias glaber

40
20
0

対リード数に基づく種組成の時間変化のパターン
Bothが層間で異なっていたことを意味している．
種数は，全種と底生魚，及びメンブレンフィルターの遊泳魚において，層間で差があった （表―3.4）．
全種と底生魚の層間の種数の差の傾向は， フィル
ター間で逆であった．
(a)60

Surface

30

0

0

15

Surface105024 Nov

26 JanSampling dateNo. of read counts

Surface105

No. of effective species

No. of read counts
No. of effective species

Both

GF/F

STV

Bottom

30

0

(b)

(c)

STV

図―3.3 検出された種の DNA 濃度のフィルター間比較． （a） 表層と （b） 底層のそれ
ぞれにおいて， いずれのフィルター （Both）， デプスフィルターのみ （GF/F），
メンブレンフィルターのみ （STV） で検出された種の DNA 濃度を示している．
パネル b で示した Pseudolabrus sieboldi（ホシササノハベラ），Ditrema viride（アオタナゴ）， Zoarchias glaber （トビイトギンポ） は， 1 月 26 日に比較的濃度が高いにもかかわらずデプスフィルターのみで検出された種である．

No. of species

No. of species

60

GF/F

Bottom105

015

Bottom10
50
24 Nov

26 JanSampling date

図―3.4 網羅的解析による （a） 種数，（b） リード数，（c） 有効種数 （2D） の時系列． 青色と赤色は，それぞれ，デプスフィルターとメンブレンフィルターの結果を示している． 実線は， サンプル中の MiFish-U の種のみを対象とした有効種数 （ 2D sMFS ） を示し， 点線は， 内部標準の種，
MiFish-Ev2 の種， MiFish-U2 の種も含む全リード数とそれに基づく有効種数 （2Dall） を示している． 破線は， 図―3.5 において種の優占度ランク曲線を詳細に見た日である．

— 11 —

表―3.5 種数の一般化線形モデル （GLM） の要約． ステップワイズ法により選択されたモデルと比較検討のモデルの説明変数と AIC を示している．
説明変数の数字は， 効果量 （平均±標準誤差） を表している． 目的変数である種数はサンプル中の MiFish-U 種のみを対象としており，
RsMFU 及び 2DsMFU は， それぞれ， サンプル中の MiFish-U 種の全リード数と有効種数である． Rall と 2Dall は， それぞれ， 全ての種を対象とした全リード数と有効種数を示している．
Rall

RsMFU

2D

2D

all

sMFU

Filter

Layer

AIC

ΔAIC

VIF

Selected model
Model1Model2Model3Model40.143 ± 0.035 0.121 ± 0.034
0.143 ± 0.035 0.121 ± 0.034
0.017 ± 0.055
0.143 ± 0.037 0.121 ± 0.035
0.002 ± 0.058
0.227 ± 0.030
0.095 ± 0.029
0.104 ± 0.029
0.077 ± 0.030

240.4
242.3
242.4
242.8
290.1

1.9
2.0
2.5
49.8

1.38
1.39
1.55
1.04
1.11

Null model
Full model

0.015 ± 0.041 0.142 ± 0.068 0.109 ± 0.068 0.022 ± 0.056 0.012 ± 0.056 0.017 ± 0.064

301.8
247.9

61.4
7.5

5.68

1.5

0
1

0
3

0

50

1

19 Jan20140Species rank

15 DecNo. of read counts

0

4

0

4

0

1

40

Species rank

08 Dec

0
2

0

1

40

Species rank

No. of read counts

No. of read counts

×104

No. of read counts

No. of read counts
No. of read counts

GF/F
STV

×104
2

40

×104
2

Species rank

Species rank(b)

15 DecNo. of read counts

0

×104
3

No. of read counts

27 DecNo. of read counts

×104
1.5

No. of read counts

No. of read counts
No. of read counts

STV

GF/F

(a)

×104
3

26 Jan

0
3

0

1

40

Species rank

図―3.5 種の優占度ランク曲線． （a） 表層及び （b） 底層のデプスフィルターとメンブレンフィルターにおける種の優占度ランク曲線を示している．
赤色と青色は， それぞれ， 内部標準の種と MiFish-Ev2 もしくは MiFish-U2 の種の結果を示しており， それ以外はすべてサンプル中のMiFish-U の種の結果である． それぞれのパネルにおいて， 種の優占度ランク曲線にフィルター間で比較的差がない日を左側， 大きく異なる日を右側に示している．

— 12 —

(2) 検出される種と種数のフィルター間比較

良モデルが含む有効種数 （2DsMFU） と異なった． しかし，

DNA 濃度が高い種はいずれのフィルターでも検出された本章で選択されたモデルが含む有効種数 （2Dall） をその有（図―3.3）． 一方， どちらかのフィルターでしか検出されてい効種数 （2DsMFU） に置き換えた model3 の ΔAIC は 2.46 でない種の DNA 濃度は，高くても 20 copies μL−1 程度であった．

あり （表―3.5）， 2DsMFU もある程度の説明力はある． 一方，底層のデプスフィルターでは， DNA 濃度がやや高い種が見サンプル中の MiFish-U のみの全リード数 （RsMFU） を全てられているが，これらはすべて 1 月 26 日の検出結果であった．

の種の全リード数 （Rall） に置き換えた model4 の ΔAIC は

全種数は表層ではメンブレンフィルターで有意に多く， 淡

10 を超えており， この説明力はほとんどないと判断できる 48)．

水魚 ・ 汽水魚， 底生魚， 遊泳魚においても同様の傾向が見(4) サンプル中の MiFish-U の種の優占度ランク曲線

られた （表―3.4）． しかし， 種組成の 20% 近くを占める岩礁

表層と底層のそれぞれから， 全ての種のリード数に基づく有魚の種数はフィルター間で有意な差はなかった． 底層の種数

効種数 （2Dall） が特徴的な３日分を選定して，２つのフィルターは， 底生魚を除き， フィルター間で有意な差はなかった． 底における種の優占度ランク曲線を示す （図―3.5）． MiFish-

生魚の種数は， 表層のパターンとは逆にデプスフィルターでEv2 種及び MiFish-U2 種のリード数は非常に小さく， 全リー

有意に多かった．

ド数に対してあまり寄与していない．

(3) 検出種数を説明する変数

表層の種の優占度ランク曲線は， フィルターの違いによる

検 出 さ れ た MiFish-Ev2 の 種 は， ア カ エ イ （Hemitrygon

極端な差はない． また， 底層における 1 月 19 日の種の優akajei），

ホ シ ザ メ （Mustelus manazo），

ト ビ エ イ

占度ランク曲線もフィルターの違いによる極端な差は見られな（Myliobatis tobijei） で あ り， MiFish-U2 の 種 は ア サ ヒ ア

い． しかし， 12 月 15 日と 1 月 26 日における底層のメンブレ

ナ ハ ゼ （Pseudoblennius cottoides） 及 び ア ヤ ア ナ ハ ゼ

ンフィルターでは， 内部標準として用いた種のリード数が極端（Pseudoblennius marmoratus） であった． これら以外はすべに大きくなり， これが全リード数に対して大きく占めていた． こて MiFish-U の種であった．

れらの日は， 全ての種のリード数に基づく有効種数 （2Dall）

サンプル中の MiFish-U 種の種数は時間的に変動していたと種数が， デプスフィルターに対してメンブレンフィルターで（図―3.4a）． 底層の 1 月 26 日におけるメンブレンフィルター小さくなっていた日である （図―3.4）．

の種数は， 同じ日のデプスフィルターと比べて低くかった． この日は， デプスフィルターで比較的高い濃度であったにもか

3.4 考察とまとめ

かわらず， メンブレンフィルターで検出されなかった３種がい沿岸域での網羅的解析において， ２つのフィルターによるた日である （図―3.3）． 全ての種を含む全リード数は， 概ねろ過がその結果に与える影響を検証した結果， 1) DNA 濃度

10 万リードを上限として変動し， サンプル中の MiFish-U のが高い種はいずれのフィルターでも検出され， どちらかのフィ種の全リード数は時間的に変動していた （図―3.4b）．

ルターで検出される種の DNA 濃度は低いこと， 2) 検出でサンプル中の MiFish-U の種の有効種数 （2DsMFU） は，きる種数はフィルター間で差があるものの， 表層と底層でそ

表層ではフィルター間で同じ変動をしていた （図―3.4c）． しの傾向が異なることを示した． さらに， 3) 種数の変動を説明

かし， 底層でのフィルター間のばらつきは大きく， それは表する要因として， フィルターによる直接的な効果は示されず，層よりも有意に大きなばらつきであった （F test; F9 = 5.34, p <第 2 章の結果と同様に全リード数と有効種数が選択された．

0.05）． メンブレンフィルターの 2Dall が，2DsMFU から小さくなっ以上の結果は， フィルターの選択は， DNA 濃度が高い主要ている時があった．

な種の検出には影響しないものの， 検出される種数において種数の GLM は， サンプル中の MiFish-U の種の全リード

は， リード数や有効種数の変化に影響を与えた可能性を示し

数 （RsMFU） と全ての種に基づく有効種数 （2Dall） を説明変ている．

数とするモデルが選択された （表―3.5）． このモデルにフィ

いずれのフィルターでも DNA 濃度が高い種が検出された

ルターの違いを説明変数として追加したモデル （model1） と結果は， 今回用いたデプスフィルターでも主要な種の DNA層の違いを説明変数として追加したモデル （model2） のそを捕捉するのに十分であったことを示している． このことは，れぞれの効果量は， RsMFU と 2Dall の効果量に比べて 1/10

環境 DNA を保持している多くの粒子の大きさが 1 μm 以上

程度以下であった．また，これらのモデルの ΔAIC は 2 に近く，

10),11) と考えられているこれまでの知見を支持していると考え変数が１つ増えることによって加えられるペナルティ （付録 A）ていいだろう． 本章の結果だけでは， いずれのフィルターでとほぼ一致している． このことから， 種数はフィルター間と層も DNA 濃度が高い種をとりこぼしている可能性も否定できな間で違いがあったものの （表―3.4）， これらが直接影響した

いが， 用いた MiFish プライマーセットのカバー率は他のプラ

わけではないことを意味している．

イマーに比べても高く 49)， また， 今のところ沿岸域でよく出

本章で選択されたモデルが含む有効種数は， 第 2 章の最現する種の取りこぼしは報告されていないことから， おそらく

— 13 —

問題はないと考えてよさそうである．

Miya et al. (2016)39) は， 水族館の水槽で， 本章で用いたも種数のフィルター間での差の傾向が表層と底層で異なったのよりも孔径が少し大きい 0.45 μm のメンブレンフィルターと本ことは， フィルターが検出結果に与えた影響のメカニズムの解章で用いたデプスフィルターを比較し， メンブレンフィルター

釈を難しくさせる． しかし， 1) デプスフィルターによって検出で３倍くらい検出種数が多かったことを報告している． これは，された表層と底層の間での種数の傾向がこれまでの知見 17)

我々の結果と比較するとかなり多い． この差は， 実海域と水と一致すること， 2) 表層ではメンブレンフィルターの方がデ槽との間で， DNA が存在する形態の違いに起因したサイズ

プスフィルターよりも多くの種を検出できるというこれまでの知の違いによって生まれたのかもしれない． 同様に， 久里浜湾

見 39) とも一致することから， 底層のメンブレンフィルターの結の表層のメンブレンフィルターで種数が生活様式によって異果が特異的であった可能性を疑わせる． 底層においてデプなるパターンが見られたことは， サンプリングポイントである表

スフィルターで比較的高い DNA 濃度の魚もメンブレンフィル

層では， 生活様式によって DNA を保持する粒子のサイズにターで取りこぼした 1 月 26 日は， その影響が強く現れたのか違いがあった可能性を示唆する．

もしれない．

沿岸域では多様な起源の DNA が空間的に複雑に分布す

孔径が小さいフィルターでは， ろ過に時間がかかったり， 目

ることは既に分かっている （図―1.2）． 今回のサンプリングポ

詰まりが起こることはよく知られているものの 32),33),38)， 今回

イントは， 平作川河口からおよそ 500 m ほど離れており （図のすべてのサンプル及びフィルターで明らかな目詰まりは見―3.1a）， サンプリングポイントに到達するまでに少なくともこられなかった． メンブレンフィルターで特異な傾向が起きた理の距離を移動する必要があった淡水 ・ 汽水魚の DNA を含由としては， 今回用いたカートリッジ式の複雑な形状が DNA

む粒子は， 輸送の過程を経て， サンプリングポイントにおいの抽出効率に影響を及ぼした可能性も考えられるが 50)， そては細粒化して存在していた可能性が考えられる． また， 底

れだけが原因であれば， 表層のメンブレンフィルターでも特層を起源とする底生魚の DNA は， 水中に長く滞留できる小異な傾向が起きなければならない． すなわち， 底層のサンプ

さな粒子 40) として存在していたのかもしれない． これに対し，

ルをメンブレンフィルターでろ過した組み合わせが特異な傾岩礁魚は， 鉛直方向に一様な護岸を生活場としていることか向の原因となった可能性がある．

ら， DNA を保持する粒子の多くが表層に存在していたため，

全リード数と有効種数を含むモデルが種数を説明するモデ

フィルター間で差が出なかったのかもしれない． メンブレンフィ

ルとして選択されたことは， 第 2 章の結果とほぼ同じであり，ルターのみが捕捉する 0.22 μm から 0.7 μm までの間で生活

本章のデータでも， やはり， 分析の設定と種の優占度ランク

様式によるパターンの違いは， 起源からサンプリングポイン

曲線が検出種数の変動要因であったと言えるであろう． このトまでの輸送による粒子の細粒化の過程とフィルターの径に解析結果から考えると， 内部標準として用いた種のリード数

よって異なる生活様式の魚種を選択できる可能性を示していが極端に大きく， サンプル中の MiFish-U 種のリード数が少る．

なくなっていたことと種数が少なくなったことは （図―3.5）， 直

本章の研究による結論は以下の通りである ： 1） DNA 濃度

接的な関係があったと言えそうである． 内部標準はどのサンが濃い種なら， デプスフィルターでもメンブレンフィルターでもプルでも同じ濃度で添加していることから， この場合において検出できる． 2） ２つのフィルターの間で， 検出される種数には， サンプル中の MiFish-U 種の DNA の増幅が十分ではな

２割程度の違いがあった． この差は， DNA を保持する粒子

かったことが可能性として考えられる．

の形態によって異なる可能性がある． 沿岸域では， 3） フィ

DNA を増幅する PCR を阻害する要因は分かっていること

ルターの選択により， 検出する種を生活様式によって選別でもあるものの 20),21)， 分かっていないことも多くある． 底層できる可能性がある一方で， 4） 孔径の小さなフィルターでは，採取されるサンプルの特徴としては， 一般的には底質の巻き

PCR を阻害する要因の影響を受けやすくなる可能性がある．

上がりの影響を受けていることがあると言われている． 今回の4. 分析者の違いが及ぼす影響

採取場所は， さらに， 海藻の中であったことも特徴であり， こ
れらを原因とする何かがメンブレンフィルターのみに作用し，DNA 抽出や PCR の阻害を引き起こしたのかもしれない． し

4.1 はじめにかし， 今回の研究ではこれ以上の事は分からない．

ろ過後の分析過程は， フィルターからの DNA 抽出， 抽出

表層においてメンブレンフィルターの方が多くの種を検出した DNA の増幅 （1st PCR）， 及びその増幅産物の精製とできた理由が， フィルターの孔径の差によるものであったと

濃縮， 2nd PCR， DNA 配列の読み取り， 読み取り結果のすると， 0.22 μm から 0.7 μm までのサイズの粒子が２割程度確認である． それぞれの過程の中の手順については， 環境（7.1/31.8， 全種数については本文中で記述し， 差について

DNA 学会から出されているマニュアル 2),3) 等を参照できる．

は表―3.4 に示している）の種数の増加に貢献したことになる．

しかし， 現時点でも細部の技術の改良は重ねられており， 分— 14 —

析業者によっては， 知見を収集して独自のノウハウを構築し冷凍で輸送した．

ている． このように， 必ずしも手順が統一されているとは言えDNA 増 幅 及 び 配 列 読 み 取 り 者 の 比 較 の た め の 採 水 はない中で， 事業を統括する技術者は， 分析者の違いが分析

2021 年 1 月に実施した． なお， この採水は DNA 抽出者の結果のクオリティにどのように作用し， 調査の目的が要求する比較のためのサンプリングの前年に実施している． 採水方法

クオリティに収まっているかどうか把握した上で， 分析者を選は， DNA 抽出者比較における方法と同じであり， 2 L のサン

択する必要がある．

プルを採水した． この時は， ろ過も DNA 抽出者に依頼した

本章では， ろ過後の分析過程について， DNA 抽出とそれため， 長時間海水サンプルの状態で保存する必要があった．

以降の過程 （以下， DNA 増幅及び配列読み取り） に分け，

このため， DNA の分解を遅らせることを目的として， 採水後，それぞれの過程の中での分析者の違いが網羅的解析の結果

直ちに塩化ベンザルコニウム 0.01% 溶液 （オスバン S） を 2に及ぼす影響を検証した． 影響については第 3 章と同様に，

mL 添加した 52)． 以上の操作が終了した後， 直ちにサンプ

いずれの分析者であっても主要な種を検出できるか， 検出のルを冷蔵保存し， 調査終了後に分析者へ冷蔵で輸送した．

感度が変わるか評価した． さらに，読み取り結果の確認では，(3) DNA 分析

分析者の違いによって種の同定に差が生じることが既に知らDNA 抽出者比較においては， A 社と B 社がフィルターをれていることから 16)， 本章では， DNA 増幅及び配列読み取受け取った後， 環境 DNA マニュアル 2),3) の方法に従って，りの分析者比較において，この影響についても再び検証した．

Proteinase K を添加してタンパク質の分解処理を行い， Bloodand Tissue Kit を用いて DNA を精製した． ただし， A 社は，4.2 方法DNA 抽出の前に， 余分な水分と塩化ベンザルコニウムを取(1) 調査場所

り除くことを目的とした遠心 53) を実施した． ただし， 上述のと分析者の比較のためのサンプルは， 種組成によって分析

おり， DNA 抽出者比較のためのサンプルには塩化ベンザル

者の間で差が出にくかったり， もしくはその逆の可能性もある

コニウムを添加していないため， この遠心の効果は余分な水ため， ２つの異なる海域で各海域の中から２つの場所を選定

分の除去に留まる．

して， 計４つの場所から採取した． １つの海域は瀬戸内海に抽 出 し た DNA は， 冷 凍 保 存 で A 社 に 集 約 し， A 社 が位置する山口県周南市の沿岸であり， 大島半島を挟んで生DNA 増幅及び配列読み取りを実施した． DNA 増幅及び配物環境は大きく異なる徳山港と笠戸湾の２つの場所を選定し列読み取りについては， 後述する D 社の方法に従いつつ，た （図―4.1a）． 徳山港では港に隣接する晴海親水公園内

加えて， AmpureXP による阻害物質除去を 1st PCR の前と後の潮だまりで採水し， 笠戸湾においては護岸で採水した．

に 2 回実施した． A 社が抽出した DNA 溶液については， さ

もう１つの海域は東京湾の湾口に位置する神奈川県横須賀らに 4 倍に濃縮されたが， B 社が抽出した DNA 溶液につい市の沿岸であり， 東京湾内だけでなく外洋の環境の影響も強ては濃縮作業は行われなかった． この相違は， 著者らと A

く受ける海域である 51)． この中で， 東京湾スケールで湾口の社との間の伝達ミスによるものである．

環境に近い場所である燈明堂と防波堤で囲まれて湾口の環DNA 増幅及び配列読み取り者の比較においては， 海水サ

境からやや隔離され， かつ， 小さな河川の下流に位置する

ンプルを受け取った C 社が孔径 0.45 μm のメンブレンフィル

久里浜湾を採水場所として選定した （図―4.1b）． 久里浜湾

ター （Sterivex-HV， Merck Millipore 社製） を用いてサンプの採水場所は， 第 3 章の採水場所と同じである．

ルをろ過した後， 環境 DNA マニュアル 2),3) の方法に従って(2) 調査時期及び方法

DNA を抽出した． 抽出した DNA のうち， １つは C 社が冷凍

比較は， DNA 抽出者の違い （図―4.1c） と DNA 増幅及保存し，もう１つは D 社へ冷凍で輸送した． それぞれの者が，び配列読み取り者の違い （図―4.1d） について行い， これら

表―4.1 に示す方法で DNA 増幅及び配列読み取りを実施し以外の条件はすべて同じとした．

た． 手順についてはいずれの者も環境 DNA マニュアルを踏DNA 抽出者の比較のための採水は 2022 年 1 月に実施し襲しているものの， 試薬の組成に違いがある． なお， どちら

た． 上述のそれぞれの場所において， 2 L の滅菌ポリエチレの者でも定量 MiSeq 法 24) を実施したので， この手順は環境

ン瓶を用いて手袋をつけた手により表層水から５つのサンプ

DNA マニュアルとは違う． 例えば， C 社の内部標準 DNA

ルを採水した． 採水後， 現場において直ちにろ過した． １つの濃度が濃い （表―4.1）．

のサンプルを２つの 1 L サンプルに分け， 粒子保持能が 0.7(4) データ解析

μm のガラス繊維のデプスフィルター （GF/F，Whatman 社製）

いずれの比較においても， 検出した魚種の傾向をみるたでろ過した． すなわち， １つの場所で 1 L ろ過した５つのフィめ， FishBase43) と照合して， 生活様式でカテゴライズした

ルターを２セット準備した． フィルターは， ろ過後に直ちに冷（表―3.1）． DNA 分析によって出力された種リストの中には，蔵保存し， 調査終了後， それぞれのセットを異なる分析者へ

FishBase に一致しない種がいたため，これらの種については，— 15 —

表―4.1 DNA 増幅及び配列の読み取り方法の比較表
DNA 学会マニュアル 2),3)

項 目

C 社 （△）

D 社 （〇）

1st PCR

8 replicates

8 replicates

プライマー

5μM に希釈し，E-v2:U:U2= 1:2:1 10μM に 希 釈 し， E-v2:U:U2= 10μM に 希 釈 し， E-v2:U:U2=
1:2:1 で混合
1:2:1 で混合で混合試薬の組成 （標準 DNA 以外）

K A PA H i F i H S R e a d y M i x(6.0μL)， プ ラ イ マ ー ミ ッ ク ス(2.8μL)， ミリ Q 水 (1.2μL)， DNA
溶液 (2.0μL)

内部標準 DNA の濃度

95 度の DNA 変性 3 分間
以下 35 サイクル・ 98 度 DNA 変性 20 秒
・ 65 度アニーリング 15 秒
・ 72 度伸長反応 15 秒
さらに， 75 度の伸長反応 5 分間

サーマルサイクラー

その他

(a)

8 replicates

K A PA H i F i H S R e a d y M i x(7.5μL)， プ ラ イ マ ー ミ ッ クス (1.5μL)， 脱 イ オ ン 蒸 留 水(4.0μL)， DNA 溶液 (2.0μL)

K A PA H i F i H S R e a d y M i x(10.0μL)， プ ラ イ マ ー ミ ッ ク ス(2.33μL)， ミ リ Q 水 (1.67μL)，
DNA 溶液 (4.0μL)

10 copies μL−1
50 copies μL−1
100 copies μL−1

10 copies (2μL)−1
50 copies (2μL)−1
100 copies (2μL)−1

95 度の DNA 変性 3 分間
以下 35 サイクル・ 98 度 DNA 変性 20 秒
・ 65 度アニーリング 15 秒
・ 72 度伸長反応 15 秒
さらに， 75 度の伸長反応 5 分間

95 度の DNA 変性 3 分間
以下 35 サイクル・ 98 度 DNA 変性 20 秒
・ 65 度アニーリング 15 秒
・ 72 度伸長反応 15 秒
さらに， 75 度の伸長反応 5 分間

96 穴プレートを使用

8 連チューブを使用(b)35.24° N

2 km

Tokuyama Port

34.05° N

2 km

35.23° N

Kurihama Bay

TomyodoKasado Bay

34.00° N

35.22° N
33.95° N

Seto Inland Sea
131.75° E

131.80° E(c)
DNA extraction
sampling,
filtering

The mouth ofTokyo Bay

35.21° N
131.85° E

131.90° E

library preparation,
sequencing

139.71° E 139.72° E 139.73° E 139.74° E(d)filtering,
DNA extraction

139.75° E

library preparation,
sequencing

sampling

図―4.1 分析者比較の場所と方法． （a） 山口県周南市から徳山港 （緑， Tokuyama Port） と笠戸湾 （紫， Kasado Bay）， （b） 神奈川県横須賀市から久里浜湾 （青， Kurihama Bay） と燈明堂 （赤， Tomyodo） を選定し， サンプルを採取した． 比較する分析過程については， DNA
抽出と DNA 増幅以降 （DNA 増幅及び配列の読み取り） の２つの過程に分け， それぞれを比較するデザインとした （c 及び d）．

— 16 —

表―4.2 DNA 増幅及び配列の読み取り比較において調整した種のリスト
Species recorded

Species changed

Acentrogobius virgatulus
Carassius sp. 'Ginbuna'
Chelidonichthys cuculus
Diaphus kuroshio
Ditrema temminckii
Hexagrammos agrammus
Lagocephalus spadiceus/Lagocephalus wheeleri
Luciogobius guttatus
Platycephalus indicus
Pseudopleuronectes yokohamae
Rhinogobius brunneus
Scomber japonicus
Sebastes aleutianus
Takifugu alboplumbeus
Takifugu porphyreus
Takifugu snyderi
Trachurus japonicus
Tridentiger brevispinis
Vinciguerria nimbaria
Amblychaeturichthys sciistius
Carassius spp.
Diaphus perspicillatus
Dictyosoma burgeri Form a
Favonigobius gymnauchen / Acanthogobius lactipes
Plecoglossus altivelis altivelis

Acentrogobius pflaumii
Carassius sp.
Chelidonichthys sp.
Diaphus sp.
Ditrema sp.
Hexagrammos sp.
Lagocephalus sp.
Luciogobius sp.
Platycephalus sp. MAGOCHI
Pseudopleuronectes / Pleuronectes / Hippoglossoides
Rhinogobius sp.
Scomber sp.
Sebastes sp.
Takifugu sp.1
Takifugu sp.2
Takifugu sp.3
Trachurus sp.
Tridentiger sp.
Vinciguerria / Woodsia
Amblychaeturichthys hexanema
Carassius sp.
Diaphus sp.
Dictyosoma burgeri
Favonigobius gymnauchen
Plecoglossus altivelis

生活様式に差がないと思われる種に置き換えてカテゴライズ

種数の変動に影響すると考えられる全リード数及び有効種

した．

数についても分析者の違いを検証した． 全リード数につい

種組成の分析者間比較をするため， Bray-Curtis 指数とては， 全ての種を含む全リード数とサンプル中の MiFish-U

Sørensen 指数を算出し， これら指数の変動に対する分析者，

種のみの全リード数に分けた． 有効種数は， サンプル中の場所， 分析者と場所の交互作用の効果を PERMANOVAMiFish-U 種のリード数に基づく有効種数とした． これらの平により検定した． 有意な効果が認められた変数を用い， db-

均と標準偏差を求め， 等分散を仮定しないウェルチの t 検定

RDA を行って主要な変動を二次元で視覚化した． これらのにより分析者間の差の有意性を検定した．

種組成の解析により， いずれの分析者でも主要な種を検出

魚 種 の カ テ ゴ ラ イ ズ， 種 組 成 の 違 い を 検 定 す る

できているか， 相対リード数の低い種の検出傾向が異なるか

PERMANOVA， 主な変動を二次元化する db-RDA は， す検証した． ただし， この解析で用いる種リストは， 次のとおり

べて第 3 章と同じ方法で解析した． サンプル数の変化に対とした． 1) DNA 抽出者比較においては， 種リストを精査する

する期待種数の曲線については iNEXT3.0.0 パッケージ 56)

者が同一であるため， その者から報告された種リストをそのまの iNEXT 関数を用いた． ウェルチの t 検定は， R のデフォま用いて種組成を解析した． 2) DNA 増幅及び配列読み取り

ルトにある t.test 関数を用いて実施した．

者の比較では， まず， 著者らによって， ２者の同定精度の違いによって異なる名称を付されているものの同じ種と判断され4.3 結果たものに限定して， 同じ種となるよう種リストを調整した後に種(1) 概要組成を解析した （表―4.2）． さらに， ２者から報告された種リ

DNA 抽出者比較で検出できた全種数は， 場所間で最大ストのままで種組成を解析した．

3 倍の差があり， DNA 増幅及び配列読み取り者比較で検出

種数については， １サンプル当たりの種数だけでなく， 複できた種数の場所間の差は最大で 2 倍であった （表―4.3）．

数サンプルによる検出感度も検証した． この検証のため， サ

いずれの年もいずれの場所でも， 第 3 章と同様に， 底生魚

ンプル数に対する期待種数の変化を内挿と外挿により求めたの割合が高く， 岩礁魚と遊泳魚の割合は， 場所の間でも調

54),55)． 期待種数の 95% 信頼区間はブートストラップ法により査年の間でも変動があった． 淡水魚 ・ 汽水魚は， DNA 抽

求めた．

出者比較では久里浜における 2.0±1.0 種が最大であった一— 17 —

表―4.3 比較検証に用いたサンプル中の生活様式の構成． 検出された種数の平均及び標準偏差を示している． また， カッコ内の数値は， 全種数に対するカテゴリの種数の割合を示している． DNA 抽出者比較では A 社の結果， DNA 増幅及び配列読み取り者比較については C 社の結果を示している． DNA 増幅及び配列読み取り者比較の結果は， 異なる種リストで解析しているため， 図―4.3 の結果と一致するとは限らない．
DNA 抽出者比較 （2022 年 1 月）

カテゴリ

DNA 増幅及び配列読み取り者比較 （2021 年 1 月）

徳山港

笠戸湾

燈明堂

久里浜湾

徳山港

笠戸湾

燈明堂

久里浜湾

全種

20.8 ± 2.5

11.6 ± 2.9

25.4 ± 3.0

33.8 ± 8.1

21.4 ± 4.2

19.6 ± 4.2

30.6 ± 5.9

39.0 ± 5.3

淡水魚 ・ 汽水魚

0.8 ± 0.4
(3.8)

0.0 ± 0.0
(0.0)

1.0 ± 0.0
(3.9)

2.0 ± 1.0
(5.9)

2.4 ± 0.9
(11.2)

2.4 ± 0.9
(12.2)

2.2 ± 0.8
(7.2)

4.6 ± 1.1
(11.8)

底生魚

12.2 ± 1.3(58.7)

6.8 ± 2.4
(58.6)

16.4 ± 2.6(64.5)

19.4 ± 6.3(57.4)

11.4 ± 3.2(53.3)

11.2 ± 2.5(57.1)

16.4 ± 3.0(53.6)

20.4 ± 2.6(52.3)

岩礁魚

1.2 ± 1.1
(5.8)

1.4 ± 0.9
(12.1)

5.8 ± 1.8
(22.8)

5.8 ± 1.1
(17.2)

2.0 ± 0.7
(9.3)

1.6 ± 0.9(8.2)

4.2 ± 2.7
(13.7)

5.6 ± 1.1
(14.4)

遊泳魚

4.2 ± 1.3
(20.2)

1.6 ± 0.9
(13.8)

1.2 ± 0.8
(4.7)

2.6 ± 1.1
(7.7)

4.2 ± 0.8
(19.6)

2.2 ± 1.1
(11.2)

3.2 ± 1.8
(10.5)

5.8 ± 1.1
(14.9)

表―4.5 DNA 増幅及び配列読み取り者比較における種組成の違いの検定結果 （PERMANOVA）． 種の同定精度の調整を行った場合． 説明変数の説明は表―4.4 と同じ．

表―4.4 D N A 抽 出 者 比 較 に お け る 種 組 成 の 違 い の 検 定 結 果（PERMANOVA）． 場所 （location）， 抽出者 （extractor），
場所と抽出者の交互作用を説明変数として考慮している．
Explanatory
variablesdf

Sum ofsquaresr2

pseudo-F

Explanatory
variables

p

3
1
3
32
39

7.58
0.33
0.34
4.26
12.52

0.61
0.03
0.03
0.34

19.0
2.51
0.86

<0.001
<0.05
0.603

3.80
0.74
0.73
4.39
9.66

0.39
0.08
0.08
0.45

9.24
5.37
1.77

<0.001<0.001<0.05

Location
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

r2

pseudo-F

p

3
1
3
32
39

6.70
0.32
0.25
1.88
9.14

0.73
0.04
0.03
0.21

37.0
5.48
1.40

<0.001
<0.01
0.174

3.45
0.75
0.15
1.83
6.17

0.56
0.12
0.02
0.30

20.2
13.2
0.86

<0.001<0.0010.630

Sørensen index (dissimilarity)

Sørensen index (dissimilarity)
Location
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

Sum ofsquaresBray-Curtis index

Bray-Curtis index
Location
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

df

3
1
3
32
39

Location
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

3
1
3
32
39

方で， DNA 増幅及び配列読み取り者比較では， 少なくともまた， 縦軸方向には複数の種が分布しており， これらによっ

燈明堂で 2.2±0.8 種が検出されており， 後者の方が全種数て他の３つの場所が特徴づけられている．

に対する割合も高かった． 第 3 章の結果から， フィルターのいずれの指数においても， 種組成は DNA 抽出者間で有影響が反映されているのかもしれないが， ここではこれ以上意な変動があったが，その r2 は 0.03 及び 0.08 と小さかった（表の検証はしない．

―4.4）． Bray-Curtis 指数における説明力は場所間に比べる(2) DNA 抽出者の比較とでは 20 倍小さく， Bray-Curtis 指数の db-RDA の二次元プ

種組成は， Bray-Curtis 指数と Sørensen 指数のいずれにおロットでは， 場所の違いに比べて DNA 抽出者の違いでの差

いても， 場所間で有意な変動があった （表―4.4）． 場所のは目立たない （図―4.2a）． 一方， Sørensen 指数における抽効果の r2 は， Bray-Curtis 指数では 0.61 であるのに対して出者の説明力は， 場所に比べて 4 倍程度であり， db-RDA

Sørensen 指数では 0.39 程度であり， 相対リード数が高い主の二次元プロットでは， DNA 抽出者の違いが Bray-Curtis 指

要な種の方が場所差を特徴づけていた． Bray-Curtis 指数の数に比べて相対的に大きくなっている （図―4.2b）． Sørensen

db-RDA の二次元プロットでは， サッパ （Sardinella zunasi）

指数では， さらに， 場所と DNA 抽出者の交互作用が種組が横軸方向の片側にプロットされており， これが徳山港と他の成の有意な変動要因があったが （表―4.4）， この結果は３つの場所の違いを大きく特徴づけた種である （図―4.2a）．

Sørensen 指数における DNA 抽出者の影響の程度が場所に— 18 —

(b)PCoA2 (9.4% of total variation)&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ(a)2
Sebastiscus marmoratus



A

0

Sardinella zunasi

Bí
Takifugu sp.

í

2
A



0

B

í

í
4



í

&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ



**

0

A

sample
50

0


(e)

5

No. of samples

(f)

5

No. of samples

î5


0

A



0


5

No. of samples

î5


**

0

A

B

*

0

**
0

A

**

0

A

0

A



0

A

B

B

sample MiFish-U


0

B

sample MiFish-U
î5

**

B

sample MiFish-U

Bsample MiFish-U
î5


B
All

No. of read counts

No. of species

sample

BA

No. of read counts



î5


B
All

No. of read counts

No. of species

0A

sample MiFish-U

sample MiFish-U

0

A

***

0

All
î5
2

sample


î5
2

B

No. of read counts

No. of species

(d)

5

No. of samples2



sample MiFish-U
No. of read counts

0

No. of read counts



All
î5
2

No. of read counts

No. of species

sampleNo. of read counts

(c)

0

í

&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

No. of effective species

2

No. of effective species

No. of effective species

0

A

B

sample MiFish-U
No. of effective species

í



0

A

B

図―4.2 DNA 抽出者の違いによる網羅的解析結果の比較． A 社 （▲） と B 社 （●） による DNA 抽出の違いによる結果を比較している． パネル
a と b は， それぞれ， 検出された種組成の Bray-Curtis 指数と Sørensen 指数を対象とした距離に基づく冗長性分析 （db-RDA） による
二次元プロットを示している． 十字 （✛） は魚のプロットを表し， ×印はそれぞれの場所とそれぞれの DNA 抽出者の重心を表している．
パネル c，d，e 及び f は，徳山港，笠戸湾，久里浜湾及び燈明堂の結果であり，左からサンプルベースの種数，全ての種を含む全リード数，
サンプル中の MiFish-U 種の全リード数， サンプル中の MiFish-U 種のリード数に基づく有効種数を示している． サンプルベースの種数については，中塗が内挿，中抜きは外挿の結果を示している． 棒グラフの比較は，ウェルチの t 検定による検定結果を示している （*, p < 0.05;**, p < 0.01: ***, p < 0.001）．

— 19 —

E
Engraulis japonicus

C0
Takifugu sp.1

í
D

í
í

0



0

2

0

C



H

0

C



I

5

1RRIVDPSOHV

î5


***

0

C



0


5

1RRIVDPSOHV

î5


0

0

C

0

C

0

D

0

C



0

C

D

D

VDPSOH0L)LVK8


***
0

D

VDPSOH0L)LVK8
î
5

D

VDPSOH0L)LVK8D

VDPSOH0L)LVK8
î5


D

***

C



D

*

C

$OO
1RRIUHDGFRXQWV

1RRIVSHFLHVVDPSOH

î


D

$OO
1RRIUHDGFRXQWV

1RRIVSHFLHV

0C

VDPSOH0L)LVK8

VDPSOH0L)LVK8***

VDPSOH

D

1RRIUHDGFRXQWV

5
1RRIVDPSOHV

î5


*

0

$OO
1RRIUHDGFRXQWV

1RRIVSHFLHV

0

î


1RRIUHDGFRXQWV***VDPSOH

VDPSOH0L)LVK8

1RRIUHDGFRXQWV

G5
1RRIVDPSOHVî5

1RRIUHDGFRXQWV$OO
1RRIUHDGFRXQWV

1RRIVSHFLHV

0

&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

VDPSOH0í&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

F

D

í

1RRIHIIHFWLYHVSHFLHVí

C

1RRIHIIHFWLYHVSHFLHVí

1RRIHIIHFWLYHVSHFLHV

Lateolabrax japonicus

C

D

VDPSOH0L)LVK8
1RRIHIIHFWLYHVSHFLHV

2&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

D



0

C

D

図―4.3 DNA 増幅及び配列の読み取り者の違いによる網羅的解析結果の比較． C 社 （▲） と D 社 （●） による DNA 抽出の違いによる結果を比較している． 詳細は図―4.2 と同じである． ただし，黒色と灰色の十字（✛）は，それぞれ，同定精度の調整をした種としなかった種を表している．

— 20 —

よって違いがあったことを意味している． さらに， Sørensen 指表―4.6 DNA 増幅及び配列読み取り者比較における種組成の違いの検定結果 （PERMANOVA）． 種の同定精度の調整を行わなかった場合． 説明変数の説明は表―4.4 と同じ．

数を対象とした db-RDA では， B 社のプロットのばらつきが目立つ （図―4.2b）． このことから， 相対リード数が低い種は，Explanatory
variables

A 社ではサンプル間で同質性が強かったのに対し， B 社ではばらつきが強かったものと解釈される （2.4）．

df

Sum ofsquaresr2

pseudo-F

p

3
1
3
32
39

6.54
0.98
0.41
1.88
9.80

0.67
0.10
0.04
0.19

37.1
16.6
2.30

<0.001<0.001
<0.05

3.33
2.45
0.26
1.85
7.89

0.42
0.31
0.03
0.23

19.2
42.5
1.52

<0.001<0.001
0.09

Bray-Curtis index

種数は， DNA 抽出者の間に明らかな差があり， その差はLocation
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

すべての場所でサンプル数が小さいほど顕著であった （図―4.2c から f まで）． その差は， 徳山港と久里浜湾では全サ
ンプル数の下でも明確な差があった． 笠戸湾と燈明堂では，サンプル数が 1 の場合に種数に明確な差があったものの，

Sørensen index (dissimilarity)
Location
Extractor
Location×extractor
Residual
Total

サンプル数が大きくなるに従って， その差は不明瞭になった．
サンプル中の MiFish-U 種のみの全リード数は， すべての場所において， A 社で有意に高く， 倍程度以上の差があった． さらに， 徳山港と久里浜湾では， 全ての種を含む全リー

3
1
3
32
39

ド数も A 社で有意に高かった． 有効種数は， サッパによって強く特徴づけられた徳山港で他の場所に比べて小さくなっていた． 有効種数の場所間の差は， 徳山港のみで有意であっ

DNA 増幅及び配列読み取り者の重心は座標の中心にあったものの， 他の場所では有意ではなかった．

た （図―4.3a）． Sørensen 指数の db-RDA の二次元プロット(3) DNA 増幅及び配列読み取り者の比較でもその差は小さいものであったが （図―4.3b）， r2 （= 0.12）

種組成は， Bray-Curtis 指数と Sørensen 指数のいずれには Bray-Curtis 指数や DNA 抽出者の効果に比べて大きかっ

おいても， 場所間に有意な変動があった （表―4.5）． Bray-

た． 場所と分析者の交互作用は DNA 抽出者比較では有意Curtis 指数を対象とした db-RDA の二次元プロットでは， 特であった， この比較では有意ではなかった （表―4.5）．

定の種 （スズキ， Lateolabrax japonicus） が横軸の片側にプ種数の曲線は， すべての場所において， DNA 増幅及びロットされ， 燈明堂と他の３つの場所との違いを特徴づけてい配列読み取り者の間でほぼ一致していた （図―4.3c から f また （図―4.3a）． 縦軸方向では， 瀬戸内海の２つの場所の方で）． また， 全ての種を含む全リード数は， すべての場所で向にカタクチイワシ （Engraulis japonicus） が分布し， 久里

C 社が有意に高かった． サンプル中の MiFish-U 種のみの

浜湾は瀬戸内海に対して反対方向に分布していた．

全リード数は，徳山港と笠戸湾では D 社の方が有意に高かっDNA 増幅及び配列読み取り者の間の種組成の変動は， いたものの， 燈明堂と久里浜湾では有意な差はなかった． 有

ずれの指数においても有意であった （表―4.5）． Bray-Curtis

効種数は， スズキによって強く特徴づけられた燈明堂で他の指 数 の r2 は 0.04 と 小 さ く， db-RDA の 二 次 元 プ ロ ッ ト で も場所に比べて小さかった． また， 有効種数の差は， 燈明堂(b)
2

Engraulis japonicus
Lateolabrax japonicus

C0

Takifugu alboplumbeus
Takifugu sp.1

í

Acanthopagrus sp.

DSebastiscus marmoratus

í
í

í

í

0



2

CAP2 (20.5% of total variation)&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ(a)Tokuyama Port



0

D

í

C

TomyodoKurihama Bayí&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

Kasado Bay0&$3 RIWRWDOYDULDWLRQ

図―4.4 DNA 増幅及び配列読み取り者の違いの間の同定精度の調整を行わない種組成の距離に基づく冗長性分析（db-RDA）による二次元プロット．
（a） Bray-Curtis 指数と （b） Sørensen 指数を対象とした db-RDA の二次元プロットを示している． C 社 （▲） と D 社 （●） による DNA 抽出の違いによる結果を比較している． ただし， 黒色と灰色の十字 （✛） は， それぞれ， 図―4.3 において同定精度の調整をした種としなかった種を表している．

— 21 —

のみで有意があったものの， 他の場所では有意ではなかっ

同様に， 種間でミトコンドリア DNA の違いが極端に小さいメ

た．

バル属 （Sebastes） やトラフグ属 （Takifugu） も解像度が低(4) 同定精度の違いの影響

いことは分かっている 42)． 他にも種の解像度が低い分類もい

同定精度の差の調整を行った Bray-Curtis 指数を対象としくつか存在したり， また， 出力された結果を最新の学名に修た db-RDA の二次元プロットに対して （図―4.3a）， 調整を行正する必要も生じたりすることから， 同定においては， 読み

わない分析者から報告された種リストに基づく Bray-Curtis 指取り結果の確認の中で人為的な操作が入りやすい． これらの数を対象とした db-RDA の二次元プロットの構造に大きな変ことが， 同定精度に差が生じやくなる理由である．

化はなかった （図―4.4a）． これに対して， 同定精度の調整

メバル属やトラフグ属は， 沿岸域でよく検出される魚種であ前の Sørensen 指数を対象とした db-RDA の二次元プロットはり， 同定精度の影響を必ず受けると言っていいであろう． 本（図―4.4b）， 同定精度の差を調整した場合 （図―4.3b） と論文の比較では， 主要な種の同定精度に差がなかったもの

比べると大きく変化した． 特に， 横軸方向に分析者の違いがの， 別の場所や別の季節においては， この影響がモニタリン

明確に現れた点が大きな変化であり， 分析者の違いによる r2

グ評価等において致命的な誤りを誘導する可能性は十分にも調整した場合に比べ （表―4.5）， 調整しない場合では大き考えられる．環境 DNA の網羅的解析の実用化へあたっては，い （表―4.6）．

複数年にまたがるモニタリングの可能性も視野にいれなけれまた， 同定精度の調整をした種だけでなく， しなかった種もばならず， 複数の分析者が請け負う可能性を考えれば， この

横軸方向に広く分布しており （図―4.4b）， 表―4.2 の調整が影響は重要な課題となりそうである．

不十分であったことを示している． 実際， 上述のとおり， 同DNA 抽出者の違いで検出された種数だけでなく， サンプ

定精度の差を調整した場合において， 種組成に対する分析

ル中の MiFish-U 種の全リード数も A 社の方が高かったこと

者の効果は比較的大きいものであり， その効果は場所に依は， 分析の設定の差が検出種数の差をもたらした可能性を存しない （場所と分析者の交互作用がない） ものであった （表示している （第 2 章参照）． しかし， 分析の設定は， DNA―4.5）． すなわち，DNA 増幅及び配列読み取り者比較では，増幅及び配列読み取りを担当した A 社の一者によって実施

検出種の差が場所に係わらない特定の種への依存があったされたものであり， 何故， 抽出者の違いがこれらの差を生じさことが示されている．

せたのか疑問が残る．

これらの結果は， 配列読み取りの技術者の違いは同定精度

いずれの抽出者も環境 DNA マニュアルに則った手順を実に影響することを改めて示している． また， 事後解析で同定行していたが， A 社が抽出した DNA 溶液のみ 4 倍に濃縮さ精度を調整することは， 可能であるものの容易ではないことをれていた．この違いがサンプル中の MiFish-U 種のみの全リー示している．

ド数に差を生じさせる要因となっていたとすれば， 濃縮作業の差が検出される種数に差を生じさせる直接的な原因であっ

4.4 考察とまとめたと言えるであろう． つまり， 今回の比較で生じた種数の差

網羅的解析の分析者について， DNA 抽出者と DNA 増幅

は， DNA 抽出技術の技量の問題ではなく， DNA 抽出者か

及び配列読み取り者の２つの過程に分け， それぞれの過程

ら DNA 増幅及び配列読み取り者への指示の伝達が正しく行における分析者の違いが結果に及ぼす影響を検証した． こ

われていなかったことの問題と言える．

の結果， いずれの過程の分析者が違っても， 場所を特徴づ

DNA 増幅及び配列読み取り者の比較において， サンプル

ける種は検出された． しかし， DNA 抽出者が違えば， 検出

中の MiFish-U 種の全リード数が分析者間で差がない， もしできる種数に差があったこと， DNA 増幅及び配列読み取り

くは全リード数ほどの差がなかったにもかかわらず， C 社の全者が違った場合， 種数の差はなかったものの同定精度に差リード数が極端に大きかったことは， 内部標準 DNA の濃度があり， その影響の修正は容易ではなかったことを示した． こが濃かったためであろう （表―4.1）． この差は， 定量 MiSeq

れらの結果は， 分析者の違いは網羅的解析の結果に差をも法の技術がまだ標準化されていないために生じたものと考えたらす可能性があることを示している．

られる． もし， サンプル中の MiFish-U 種の全リード数が分析

いずれの過程の分析者が違っても場所を特徴づける種を検者間で大きな差があれば， 検出種数にも差が生まれていた

出できたことは， 網羅的解析を依頼する上で一先ず安心でき可能性は十分に考えられる．

る点と言える． しかし， 同定精度の面では細川ら （2020） 16)

本章の結論は以下の通りである ： 1） DNA 抽出者が違っての懸念が再確認され， その修正は容易なものではなかった．

も， DNA 増幅及び配列読み取り者が違っても， 場所を特徴

本章で用いた MiFish プライマーでは， 解析領域の塩基配列づける種は検出できる． 2） DNA 抽出者が違った場合， 検の変動が小さいマグロ属 （Thunnus） とウナギ属 （Anguilla），

出される種数に差はあったものの， これは次の分析過程を請

いくつかのサケ類に関しては種レベルまでの解像度が低く，け負う者へのサンプル情報の伝達が不足していた可能性が— 22 —

表―5.1 フィルターと分析者の選択に関する指針．分析者の選択に関しては，マニュアル等を正しく再現できる技量を有していることを前提としている．
項目 （調査目的）

指針

主要な魚種 （DNA 濃度が相対的に濃い魚種） の検出・ 孔径が 1 μm 以下のフィルターであれば， いずれでも差は出ない． ただし， 分析阻害が起これば検出漏れする可能性がある．
・ 分析者 （技術者） の技量に依存した種の同定精度の差に注意しなければならない．

種数 （検出感度）・ 孔径が小さなフィルターは， 多くの種を検出できるが， デメリットも増す． 検出種数が不確かなことも踏まえて， 種数を評価値とする事の理由を明確にし， 適切に選択する必要がある．
・ 分析者を指定する明確な根拠はない．

特定の魚種の検出・ 孔径が大きなフィルターを選ぶことで， 沿岸域特有の遠方を由来とする DNA の検出（偽陽性） を避けられる可能性がある．
・ 分析者を指定する明確な根拠はない．

あり， DNA 抽出の技量の問題によるものとは言えない． 3）によって検出できる種数は， 第 2 章でも示したとおり分析上

DNA 増幅及び配列読み取り者が違った場合， 種の同定精の設定に依存する可能性が高く不確かである． これらの事実度に差が生じ， 場合によってはこれがデータの解釈においてと， 孔径が小さなフィルターでは， ろ過に時間がかかったり分

致命的な誤りの原因となる可能性がある． また， 検出される析阻害の確率が高まるかもしれないデメリットを考慮した上で，種数に差はなかったものの， 安心できる結果とは言えない．

目的にあった適切なフィルターを選択する必要がある．
本論文では分析過程によって分析者を分離し， それぞれの5. あとがき過程の分析者の違いの影響を検証したが， むしろ， この分
離が， 分析結果の不確実さを増し結果に影響した可能性が5.1 本論文のまとめ強く疑われた． 分析過程を分離することで， 専業して効率的(1) 結論にサンプル数を処理できたり， 複数社に事業への参加機会

本論文では， フィルターの違いと分析者の違いが沿岸域にを与えるメリットがあったりするかもしれないが， 特段の事情がおける環境 DNA の魚類網羅的解析に与える影響を評価しなければ， 不確実さを抑えるためにも同じ分析者が一貫してた． この結果， 以下の結論を得た ： 1) 粒径が 1 μm よりも小分析する方がいいかもしれない．

さな孔径のフィルターであれば，フィルターの孔径に関係なく，
DNA 濃度の濃い種を検出できそうである． また， フィルター

5.2 今後の課題の孔径を小さくすることで検出できる種数を多くできるメリットが本論文では， 網羅的解析で検出される種数の全リード数及ある． しかし， フィルターの孔径を小さくすれば， 逆に， 沿び種の優占度ランク曲線への依存の普遍性 （第 2 章）， 底

岸域特有の遠方を由来とする DNA の検出確率を高めたり，層におけるメンブレンフィルターでの分析阻害の可能性とそ

分析阻害の確率を高める可能性がある． 2) 分析者の違いは，のメカニズム （第 3 章），分析者のノウハウの具体的な効果 （第フィルターの違いと同様に， 主要な種の検出に大きな影響を4 章） について， 疑問を残したままである． これらの疑問は，及ぼさない． しかし， 分析者のノウハウの影響により検出種検出される種数の生態学的な意味を不確かなものにする要数を変動させる可能性があり， 技術者の技量の差による種の因でもある． 種数は， 多様性の基本的な概念である種の豊同定精度の差は確実にある．

富さを示す指数であることから， これらの疑問は， 今後， 明(2) フィルターと分析者の選択に関する指針

らかにされていくことが望まれる．

本論文によって得られた結論より， 網羅的解析を応用する３

公共性が高く， かつ， 継続的に続ける必要がある調査やモつの目的に対して， 表―5.1 の指針を提示することができる．

ニタリングでは， 同一の分析者を選択し続けることが難く， 種

孔径が小さなフィルターを選択するメリットは， 多くの種を検の同定精度の差は必ず課題となるであろう． 将来的には， 本出できることくらいであり， 調査の目的がどこまで種数を重視

論文で用いた MiFish のプライマーセットよりも網羅性が高く，しているのかが選択の分かれ目となる． 孔径を小さくすること

種の解像度も高いプライマーが開発されれば， 種の同定精

でどれくらい多くの種を検出できるかについては， 本論文の度の分析者の技量への依存度が低くなる事が期待される． し結果 （２割程度） と水族館の水槽の結果 （３倍程度） との間

かし，MiFish のプライマーセットは，現状では，他のプライマーでも大きな差があり明確な事は言えない． また， 網羅的解析

よりも網羅性が高く 49)， 多くのユーザーに使われていることか— 23 —

5)ら， この問題はしばらく続きそうである． 少なくともその間の同定精度の差を取り除くためにも， 標準化等による解決は課題として残るであろう．
最後に， 沿岸域における魚類相の把握において網羅的解6)

析を確かな技術とするためには， その再現性の限界を明らかにするとともに， 環境 DNA が空間的に複雑に分布する中でサンプルの空間代表性について理解を深めていく必要がある． 今後は， 本論文で対象としたような要素技術の評価だけでなく， 調査 ・ モニタリングの目的に応じたサンプリングデザ

7)

インの最適化を支援する技術開発が必要になるであろう．
（2023 年 2 月 6 日受付）
謝辞
本研究は， 国土交通省関東地方整備局横浜港湾空港技術調査事務所からの受託研究及び中国地方整備局広島港湾

8)

空港技術調査事務所からの受託研究の一部として実施した．
これらの受託研究の関係者には多大なるご支援をいただいた． 環境 DNA の分析については， いであ株式会社， 株式
会社環境総合リサーチ， 中外テクノス株式会社に請け負って頂いた． 特に， 株式会社環境総合リサーチの元職員である
芝田直樹氏からは， 網羅的解析の手順についての詳細な情9)報を提供して頂いた． 本研究の理論的なアイデア及び解析に関して， ビッグデータ研究グループの本間翔太研究官及10)び百田恭輔客員研究員 （公益財団法人海洋生物環境研究
所研究員） から貴重な意見を頂いた． また， 中川康之特別研究主幹からは， 本論文の査読を通じて有益なコメントを頂

11)

いた． みなさまに対して， ここに感謝の意を表す． なお， 本
論文で扱ったデータは， ビッグデータ研究グループによって試験的に運用されているオープンデータプラットフォーム（https://pari.mpat.go.jp/bdhome/） から取得できる．

12)

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2)
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16)

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— 26 —

付録 A 検出される種数の統計解析

断することはできず， 経験に頼らざるを得ない 2)． ここでは，(1) 概要著者らの経験として， VIF が 2 を超えていれば， 多重共線性

本論文で用いた MiFish を使った定量 MiSeq 法は， 複数が疑わしいモデルとして判断することとした．

のプライマーを用い， かつ， サンプル以外の DNA （内部標

GLM の評価は， 以下の式で算出される赤池情報量基準

準 DNA） も同時に分析する方法である． MiFish-U と呼ば（AIC） 3) に基づいて実施した ：れるプライマー以外のプライマーに反応する魚種は少ないこ

AIC = −2lnL + 2Kとから， サンプル中の検出種数のほとんどは， サンプル中の

(A.1)

．

MiFish-U に反応する魚種である． このことから， 検出種数を

L は最大尤度であり lnL は最大対数尤度である． K は説明変支配する全リード数と種の優占度ランク曲線は， MiFish-U に数の数である． この式が示すとおり， 説明変数が１つ増える

反応する魚種のものに限定されそうである （図―A.1）．

と AIC は 2 だけ増える． 科学哲学では， 事象の説明には必要以上に多くの要因を仮定するべきではないと言われており，

本 文 で は， 網 羅 的 解 析 で 検 出 さ れ る 種 数 （S） は， 全
リード数 （R）と有効種数 （2D）の２つによって説明できる

この加算は， 説明変数を加えることによるペナルティとしてもという仮説を立てた． 上述のことを踏まえると， この仮説は，解釈できる．

MiFish-U に限定した中で成り立つ． しかし， ここでは， 網羅

モデルの選択は， AIC が低いものを選ぶ事が基本とされて的解析の手順を考え， 他の要因も含めて検討した．

いるが， データの構造に偏りがあったり， データ量が不十分(2) 方法であったりすれば， 必ずしも最も AIC が低いモデルが最良と

サンプル中の MiFish-U の種数を説明する変数として， 対は言えないこともある． ここでは， AIC の低さだけでなく VIF

象とする全ての種の全リード数 （Rall） とそれに基づく有効種も見ながら， 妥当な最良モデルを選択しつつ， その AIC と数 （2Dの差 （ΔAIC） も見ながら， 他のモデルの良否の可能性も検all）， それから， サンプル中の MiFish-U の種の全リー） とそれに基づく有効種数 （2DsMFU） を考慮した．

討した． ΔAIC は， 確実ではないが重要な定量性を有しておこれら４つの説明変数によるすべての組み合わせの候補モデり， これが 10 以上あるモデルは情報量の観点から価値はな

ルを構築し， モデル選択により尤もらしいモデルを探索した．

いと判断される 4)．

解析には一般化線形モデル （GLM） を用いた． 目的変数

(3) 結果と考察である種数は， 正の値を取る離散型の変数であるため， 誤すべての変数を含んだモデル （Full model） は， AIC がド数 （RsMFU差分布としてポアソン分布を適用した． 説明変数間の独立を最も低いモデルであったものの VIF が 3.6 と高く多重共線

仮定している GLM では， 説明変数間の相関による多重共線性が疑われることから， 検討から除外した． この結果， Rall，性により， 説明変数の効果を正しく説明できなくなる． このことから， 一般化した分散拡大係数 （VIF） 1) を用いて， 説明
変数間の相関をチェックした． VIF は， 説明変数間の相関が全くないモデルで 1 を取り， 相関が強くなるに従って大きくなる． しかし， VIF の大きさから多重共線性の有無を一概に判Species of MiFish-Ev2 and -U2, and standard DNA

105

No. of read counts

Number of read counts

Rank-read counts diagram

0

for all species
Sallfor the species of MiFish-U
in sample (solid lines)
SsMFS

MiFish-U species in sample

図―A.1 本論文で採用した網羅的解析の手法による種の優占度ランク曲線と検出種数の関係のイメージ． サンプル中の MiFish-U
種 （sMFU） の種数は， その全リード数と種の優占度ランク曲線によって支配されていると予想される．

表―A.1 検出種数を説明する一般化線形モデル （GLM） の結果． アスタ
リスク（*）は，モデルがその説明変数を含んでいる事を示している．
それぞれのモデルには赤池情報量規準 （AIC） と最も大きな
一般化分散拡大係数 （maxVIF） を示している． ベストモデル（model12） 以外については ΔAIC も示している．

Model12Model14Model9Model11
Model13Model6
Model10Model8Model3Model7
Model4Model2Model5Model1
Null model
Full model— 27 —

Rall

RsMFU

*

*
*
*
*

*
*
*

*

2D

all

*
*
*
*
*
*
*

*

*
*

*

2D

sMFU

*
*
*
*
*

*
*
*
*

*

*

*

AIC

ΔAIC

1036.41038.41042.41050.41064.81076.01127.21134.71170.31171.71173.81326.61328.11393.3

2.0
6.0
14.0
28.4
39.6
90.8
98.3
133.9
135.3
137.4
290.2
291.7

1391.81006.9

355.4
−29.5

maxVIF
1.11
2.14
1.09
1.55
2.91
1.52
1.72
1.02
1.01

1.00

3.61

RsMFU， 2DsMFU を説明変数としたモデル （model12） が選要で予想したメカニズムからは， Rall がどのように検出種数に択された （表―A.1）．

影響しているのか定かではない． このことから， model12 の２番目に選択されたモデル（model14）の ΔAIC は 2.0 であり，

説明変数が網羅的解析の検出種数を説明する普遍的な要因

2D

all も Rall と同程度に検出種数を説明している可能性もあるであると判断することは早計と言えそうである． しかし， このモ

が， VIF は 2 を超えており， 多重共線性が疑わしい． このモデルの結果は， 少なくとも本論文で扱うデータの傾向を説明

デルに対し， ３番目のモデル （model9） は， 2Dしていると言っていいであろう．

all を除外しているものの ΔAIC は 6.0 （model14 との差は 4.0） であり，同等の説明力があると判断できる． この model9 の 2DsMFU を

参考文献

2D

1)

all に置き換えたモデル （model8）

いことを考えると， 2Dの ΔAIC がかなり大きall の説明力は低いと判断してよいであろ2)う． そうすると， やはり， model14 は， 2DsMFU と 2Dall との間の多重共線性の結果， 説明力が高くなったモデルであること

3)を疑った方がよさそうである．
１ 番 目 の model12 か ら Rall を 除 外 し た ３ 番 目 の モ デ ル

4)（model9） の ΔAIC は 6.0 であり， Rall も劇的に検出種数の説明力を上げるものではない． また， 何よりも， 本付録の概— 28 —Fox J, Monette G: Generalized collinearity diagnostics. J
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付録 B 久里浜湾における塩分の空間分布

(a)

(b)
2 km

RA
35.24° N

S4

RE
RB

S6

S3

RC

35.225° N

RD

S2

S5
S7

35.22° N
S1

S8
139.70° E

139.72° E

200 m
139.72° E

(c)

(PSU)

Depth (m)

0
1

32.5
30.0

5

27.5
25.0

10

Low, Nov 2020

High, Nov 2020

Low, Jan 2021

RA RC RE S1 S4 S6 S8
RB RD S3 S2 S5 S7

RA RC RE S1 S4 S6 S8
RB RD S3 S2 S5 S7

RA RC RE S1 S4 S6 S8
RB RD S3 S2 S5 S7High, Jan 2021
RA RC RE S1 S4 S6 S8
RB RD S3 S2 S5 S7

22.5
20.0

図―B.1 久里浜湾における塩分の空間分布． （a） 久里浜湾周辺の外観と （b） 久里浜湾の詳細． 2020 年 11 月と 2021 年 1 月の満潮時と干潮時において， 計 13 か所で塩分の鉛直分布を測定した結果を示している． 塩分は， 垂下式多項目水質計 （Rinko Profiler; JFE アドバンテック社）
を用いて， 表層から深さ 0.1 m ごとに測定した． 塩分の単位は実用塩分 （Practical Salinity Unit ： PSU） である． 図中の S4 は， 第 3 章及び第 4 章における久里浜湾のサンプリングポイントに近い場所である．

— 29 —

港湾空港技術研究所資料

No.1406

２０２３．３

編集兼発行人

国立研究開発法人海上・港湾・航空技術研究所

発

港 湾 空 港 技 術 研 究 所

行

所

横 須 賀 市 長 瀬 ３ 丁 目 １ 番 １ 号
TEL. 046(844)5040 URL. https://www.pari.go.jp/

C （2023）by MPAT
Copyright ○All rights reserved. No part of this book must be reproduced by any means without the written
permission of the President of MPAT
この資料は、海上・港湾・航空技術研究所理事長の承認を得て刊行したものである。したがって、
本報告書の全部または一部の転載、複写は海上・港湾・航空技術研究所理事長の文書による承認を得ずしてこれを行ってはならない。