薬 剤 学, 81 (4), 290-295 (2021)≪若手研究者紹介≫

質量分析を基盤にしたトランスポーターの生体内基質探索

増尾友

佑*

Yusuke Masuo

金沢大学薬学系 分子薬物治療学研究室

1．はじめ系抗生物質の薬物相互作用メカニズムを解明すべにく，バルプロ酸とその代謝物のバルプロ酸グルクロ

2013 年に博士後期課程を修了して 8 年が経過しナイドの LC-MS/MS での測定系をまず立ち上げた．

た．筆者は，学生時代から現在に至るまで薬剤学とここでバルプロ酸グルクロナイドを LC-MS/MS に薬物動態学に基づいて薬物治療の最適化を目指してインジェクションした際に，バルプロ酸が検出され研究を展開しており，これらは液体クロマトグラフ

た．イオン源での熱や電圧で，抱合代謝物が開裂し，ィー-質量分析計（LC-MS）での分析に基づいてい親化合物として検出される「インソースフラグメン

る．LC-MS は，化合物の定量解析に汎用されるが，テーション」が生じていた．質量分析の経験者が頻定性解析も含めた活用を筆者の体験に基づいて本稿繁に遭遇する現象だが，当時の筆者はそのような知で紹介していきたい．

識もなく，コンタミネーションではないかと右往左

2．MS との関わり〜学生時代〜往していた．この「開裂しやすい特徴的な構造」に直面した経験は，後の筆者の構造選択的な検出，解学部 4 年の時，鈴木洋史教授が主宰する臨床薬物

析に活きてきたと思う．なお，バルプロ酸グルクロ動態学研究室（東京大学医学部附属病院薬剤部）に当該酵素の分子ナイドの脱抱合を特徴づけしつつ 1），配属された．最初はあるトランスポーターとホモロ

実体の解明のためにタンパク質精製に取り組んでいジーが高い機能未知の膜タンパク質のクローニングた矢先，当該酵素を同定した論文が公開され，研究に取り組み，幸いにしてクローニングは順調に進み，における競争の激しさを痛感した．博士後期課程 1細胞での一過性発現も確認できた．初めての研究室

年の夏であったが，あと 1～2 年ずれていたらと思セミナーの発表において，当該タンパク質の輸送基

うと背筋が凍る思いである．

質の探索手法を尋ねられた際に，安易に LC-MS/MSで同定します，と答えた．基質の候補化合物を一つずつ検証するか，スクリーニングを実施するか，全く考慮しておらず恥ずかしい限りであるが，これが3.1

トランスポーターの生体内基質同定へのメ
タボロミクスの活用

博士課程修了後，金沢大学薬学系分子薬物治療学

私の MS との関わりの最初であった．
その後，抗てんかん薬バルプロ酸とカルバペネム*2008 年 3 月東京大学薬学部卒，2013 年 3 月東京大学
大学院薬学系研究科博士後期課程修了，同年 4 月より金沢大学薬学系分子薬物治療学研究室助教，2021 年 7 月
准教授，現在に至る．2015 年 1 月～12 月米国 NIH 訪
問研究員．研究テーマ：薬物治療学，メタボロミクス．
連絡先：〒920–1192 石川県金沢市角間町
E-mail: masuo@p.kanazawa-u.ac.jp
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3．トランスポーター OCTN1 の生体内基質の同定

研究室の助教に着任し，加藤将夫教授のもとトランスポーターの機能解析に取り組んでいる．トランスポーターは，薬物のみならず，生体内基質を輸送し，生体のホメオスタシス維持にも働く．実際，トランスポーターの遺伝子変異は種々の疾患と関連し，トランスポーターの生体内基質を同定することは当該トランスポーターの生理的機能や病態原因の解明に

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つ な が る． ト ラ ン ス ポ ー タ ー OCTN1/SLC22A4（Organic Cation/Carnitine Transporter 1）は，クローン病の関連遺伝子の一つで，OCTN1 の一遺伝

OCTN1 基質候補化合物を細胞内に濃縮した．
3.3

誘導体化反応を用いた構造選択的メタボロ
ミクス

子多型の L503F を有するヒトはクローン病の罹患選択性をさらに高めるべく，サンプル調製と LC-リスクが高い．そこで，OCTN1 はクローン病の関MS/MS による検出に誘導体化反応を組み込んだ．

連化合物を基質とするのではないかとの仮説を立OCTN1 は，生理的な pH で正電荷を帯びた化合物て，OCTN1 の生体内基質の同定を試みた．

を基質として認識しやすく，基質の多くはアミノ基メタボロミクスは化合物の濃度変化を網羅的に検を有している．この特徴を利用して，アミノ基を有出できるため，トランスポーターの輸送機能が異なする化合物のみを選択的に検出する誘導体化メタボ

るサンプル間を比較することで，生体内基質の同定ロミクスを構築して，偽陽性の軽減を目指した．アに有用である．トランスポーターの機能変化で生じミノ酸の質量分析用の誘導体化試薬 3-aminopyr-た血漿や組織，細胞内の化合物濃度変化は，イオン

idyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate（APDS）のシグナル強度変化として網羅的に検出される．本は，アミノ基と水中で反応し，誘導体化反応物は手法は，トランスポーターの輸送機能を直接捉えら

APDS 由来の fragment イオンを共通に有する．それるため，オミクス解析から見出した差異が機能にこ で， 細 胞 抽 出 液 を APDS と 反 応 後，APDS の直結する．メタボロミクスは，バイオマーカー探索

fragment イオンを対象にした precursor イオンスキを目指して差異のあるイオンに着目する方法と，測ャンを LC-MS/MS で行うことで，APDS と反応し定結果を代謝マップに投影してパスウェイ解析を行た化合物，すなわちアミノ基を有した化合物を選択う方法に大きく二分される．筆者は主に前者を対象的かつ網羅的に検出できる（図 1A）．また，水溶性として，測定対象化合物を限定しないアンターゲッが高く，汎用の逆相カラムに保持しづらい化合物は，トメタボロミクスによる基質探索を，高分解能で測APDS による誘導体化後は，脂溶性が増してカラム定可能な，液体クロマトグラフィー–飛行時間型質に保持されやすくなる．つまり，APDS による誘導量分析計（LC-TOFMS）を併用して取り組んでい体化と，APDS 由来の fragment イオンを対象にしる．

た precursor イオンスキャンを融合することで，測3.2

トランスポーターの機能が異なる実験系の定対象の化合物を拡大しつつも，選択的な検出がで構築

きる．筆者は，他にも誘導体反応を活用することで，トランスポーターの機能が異なる群として，野生腎機能の異なる患者血漿中の 6-hydroxyindole を，型と遺伝子欠損マウス，vehicle と阻害剤投与群，位置異性体を分離した上で LC-MS/MS で定量し，mock とトランスポーター発現系細胞といった比較

腎機能の低下に伴って 6-hydroxyindole の血漿中濃群がある．このうち，野生型とノックアウトマウス．
度が増加することを示した 2）の血漿や組織をメタボロミクスで比較するアプロー

アンターゲットメタボロミクスの取得データは，チは，in vivo での機能変化を的確に捉えられるもの

m/z（イオンの精密質量を電荷で除した値），リテンの，炎症とは無関係の基質化合物や，炎症で副次的ションタイム（カラムからの溶出時間），イオン強度に変動した基質以外の化合物も含む可能性がある．の 3 次元データで構成され，最初にピークの抽出工

そこで in vivo よりも，in vitro のトランスポーター程（ピークピッキング）が必要となる．ピークピッ発現系のほうが，トランスポーターの機能変化によキングは，ソフトウェアのパラメーターや抽出アルる副次的な影響が少ないのではないかと考えた．一ゴリズムに強く依存し，厳しいパラメーター設定で方で，in vitro 実験系の培地中に目的の基質が存在は検出される総ピーク数が少なく，緩い設定ではノするかは不明であったことから，デキストラン硫酸イズ由来のシグナルが多数を占め，最適化に苦労しナトリウムで誘発した炎症性腸疾患マウスから消化た．ソフトウェアよりも，ヒトの目で画像を比較し管ホモジネートを抽出し，基質源に供した．OCTN1た方が精度よく抽出できるのではないかと考え，そ発現細胞またはコントロール細胞を，基質源を含有れぞれの検出イオンを，横軸をリテンションタイム，するバッファーと一定時間インキュベーションし，縦軸を m/z でプロットし，イオンのシグナル強度を薬 剤 学 Vol. 81, No. 4 (2021)

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図 1 （A）LC-MS/MS による APDS 誘導体化反応物の Precursor イオンスキャン．
（B）m/z 683.4 の MS/MS スペクトル．

色の濃淡で示したヒートマップを，タンパク質の二しかし，データベースは全化合物を網羅していない次元電気泳動のように描画した．OHP フィルムに印上に，同一の m/z でも異なる組成式や異性体の候補刷して重ねて見比べるという，アナログな荒業も挑化合物が存在する．他のオミクス解析として次世代戦したが，全く役立たなかった．そんな中，アメリシークエンスやプロテオミクスは，構成される要素

カ国立衛生研究所の Dr. Frank Gonzalez の研究室にが核酸塩基またはアミノ酸に限定され，さらにゲノ留学する機会を頂き，アンターゲットメタボロミク

ム情報に基づいて塩基またはアミノ酸配列情報と照スの技術基盤を習得した．助教に着任して 2 年も経合できることから，帰属が比較的容易である．筆者っていない中，快く送り出してくださった加藤教授，もプロテオミクスでタンパク質の一斉定量に携わっ研究室員の方々には感謝しつくせない．

たが，タンパク質に自動で帰属できることに感銘を

帰国後，測定と解析に取り組み，OCTN1 発現系．一方，メタボロミクスで検出対象とする化受けた 3）細胞で mock よりもイオン強度が明確に高いピーク

合物は，ヒトが一生のうちに暴露されるだけでも数が抽出されたが，化合物に帰属できないでいた．ア

万種類存在し，その代謝物までも考慮すると，全てンターゲットメタボロミクスでは，m/z とリテンシ

を 網 羅 し た デ ー タ ベ ー ス の 構 築 は 困 難 で あ る．

ョンタイムの情報で構成されるイオンを，化合物にOCTN1 生体内基質候補として抽出された m/z 342.1帰属するのが困難なことが多い．リテンションタイを APDS の誘導体化による増加分を引いた上で，デムは LC システムやカラムに依存し，化合物の帰属ータベースで検索しても妥当な化合物がヒットしなには活用しづらい．一般的には，m/z を化合物デーかった．化合物がデータベースに存在しない場合をタベースで検索し，候補化合物の妥当性を検証する．

考慮し，m/z を満たす炭素，水素，窒素，硫黄の原292

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子数を計算し，2 週間ほど構造推定をする日々が続害でこれらの血漿中濃度が変動するかは不明であっいていた．

た．そこで，薬物相互作用のポテンシャル予測に適ある日，候補イオン m/z 342.1 の MS スペクトル用可能な BCRP の生体内基質探索を目的とし，野生の同位体イオンとの差が 0.5 であり，候補イオンは型マウスに BCRP 阻害剤を投与後，血漿中濃度が上2 価であったことにようやく気付いた．炭素原子の昇する化合物をメタボロミクスで網羅的に探索した．

12C と 13 C の安定同位体比はおよそ 100：1 であり，4.2

マウスの食餌成分の基質源としての重要性

炭素を含む化合物の MS スペクトルは 13 C を含む同バイオマーカーへの活用を目指した化合物を実験

位体ピークが観測され，その間隔の逆数が価数にな動物で探索するにあたり，実験動物とヒト間での食る．1 価では m/z は 683.4 であり，既知の OCTN1餌成分の違いに着目した．マウスが通常摂取する基質よりも分子量が大きいことが懸念されたが，MS/chow diet は，穀物と添加された必須栄養素で構成

MS 解析でこの杞憂は解消された．コリジョン電圧され，ヒトの食餌のような化合物のバリエーションを高めていくと，m/z 683.4 の fragment イオンは，が少ない．そこで，マウスの餌をヒトの食事に模倣120 ずつ 4 回減り，この差分は開裂しやすいアミドすることで，基質源中の化合物の多様性が高まり，結合でつながった APDS に由来する（図 1B）．つまバイオマーカーを発見しやすくなると考えた．しかり，化合物には APDS が 4 分子反応し，アミノ基をし，混餌できる食材はマウスへの感染対策から限定4 つ有することが推測された．データベース検索のされ，少なくとも乾燥食品が望ましい．最初の候補

結果，spermine が候補としてヒットした．実際に，はペットフードであり，成分表を確認して，なるべ

spermine は分子内にアミノ基を 4 個有していたこ

く多様な原料で構成された製品をマウスに摂餌させとから，未知分子の構造推定において MS/MS frag-たものの，有望な候補イオンは発見できなかった．

ment 情報の有用性を実感した．その後，spermine

その後，BCRP は isoﬂavone 類とその代謝物を基質

は OCTN1 内因性基質として同定された．L503F 変とし，ヒトは大豆由来食品を日常的に摂取すること異を有するヒトは，腸管マクロファージ等に sper-に着目し，粉末で混餌投与が容易な「きな粉」を摂

mine が多く取り込まれ，spermine の活性代謝物が餌したマウスでバイオマーカー探索を開始した．

炎症を増悪させる因子の一部になることを示唆でき

4．トランスポーター BCRP の生体内基質の同定
4.1

4.3

All Ion Fragmentation による構造情報の絞り込み

た ．
4）アンターゲットメタボロミクス解析において「m/z と溶出時間から化合物に帰属する」プロセスは，トランスポーターの生体内基質の機能バイ

前述のように困難が多く，バイオマーカーの候補イオマーカーへの活用

オンでも化合物が同定できないことにも遭遇した．

トランスポーターの輸送機能は，遺伝子変異，発打開策を模索していたところ，precursor イオンに現量，阻害作用等の複数の要因で変化し，その機能付随して，fragment イオンを一度の測定で網羅的に変化は基質薬の薬効や副作用に影響する．トランス取得できる All Ion Fragmentation（AIF）という測ポーターの生体内基質は，トランスポーターの機能定解析技術の導入に至った（図 2）．コリジョン電圧変化に応じて血漿や尿中濃度が変化しうるため，そのオフ，オンを切替えながら測定すると，precursorの血漿または尿中濃度が，in vivo でのトランスポーイオンと fragment イオンを交互に取得できるが，ター機能を反映したバイオマーカーに活用できる．

fragment イオンがどの precursor イオンに由来する

トランスポーター BCRP（Breast Cancer Resis-かは不明であった．そこで，precursor とその frag-tant Protein/ABCG2）は，小腸管腔側，肝臓胆管

ment イオン間のリテンションタイムが等しい，膜，血液脳関門の基底膜側の細胞膜に発現し，基質

precursor とその fragment のイオン強度比は全ての化合物を細胞外へ排出する．BCRP は，抗がん薬をサンプルで等しい，という両方の条件を満たす pre-含む多くの薬物を排出輸送し，これらの薬物の体内cursor と fragment イオン間で対応づけることがイ動態の規定因子の一つである．BCRP の生体内基質．AIF はンフォマティクス解析で可能になった 5）は複数同定されていたが，併用薬による BCRP の阻fragment イオンを一度の測定で取得するため，

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BCRP の生体内基質を効率的に選択した．硫酸抱合体は，BCRP の基質となりやすく，その fragmentイオンは開裂しやすい硫酸基が外れて検出される．
AIF で生成させた precursor と fragment イオンの対応づけ情報から，precursor と fragment の m/z の差分が硫酸基に対応している precursor のみを選択することで，硫酸抱合体を抽出できる．複数の硫酸抱合体が同定され，BCRP の生体内基質を効率的に同定することに成功した．同様な手法は neutral loss
scan でも特定の構造を有した代謝物の網羅解析で利用されるが，AIF では取得済みの MS データの再解析から可能な面で，汎用性が高く今後の活用が期
図2

All Ion Fragmentation によるデータ取得．Precursor イオン（A, B, C）と Fragment イオン（α,β, γ）は，インフォマティクス処理で対応づける．

待される．
5．おわりに多くのトランスポーターは複数臓器に発現しておconventional な MS/MS のように precursor イオン

り，生体内基質の血漿中濃度がいずれの臓器での機ごとに fragment イオンを取得する必要がなくなり，能を反映するか，生体内基質の合成，消失を考慮し解析が効率化できる．さらに，未知イオンの化合物た薬物動態の観点に基づいた探索がバイオマーカーへの帰属において，対象とするイオンと類似したの有用性を示す上で今後必要である．一方で，MSfragment パターンを有するイオンをグループ化するの感度や分解が進展しつつも，MS での取得データことで，グループ内の既知イオンの化合物情報から，を十分に活かしきれていないことがある．Fragment未知イオンの構造推定が可能である．AIF がイオンパターンやイオン強度のクラスター解析は，対象化から化合物の帰属を飛躍的に発展することが期待さ合物の前駆体や代謝物同定につながる可能性があれるため，筆者は LC-TOFMS での全測定に AIF をり，データ駆動型サイエンスでの活用が期待される．

導入している．

筆者は，これまで培った薬剤学の研究基盤に基づき，AIF を活用して，BCRP の阻害剤を投与したマウ

本分野で貢献していきたいと考えている．最後に，

スで血漿中濃度が変動する BCRP の生体内基質を効本研究を遂行するに当たり，ご指導・ご協力を頂き率的に同定した例を紹介する．マウスに阻害剤を投ました先生方に深謝するとともに，研究に一緒に携与した群と非投与群の血漿サンプルをメタボロミクわってくれました学生の方々にも感謝いたします．

スで比較すると，阻害剤投与群の血漿では，目的のBCRP 生体内基質に加えて，阻害剤に由来する化合物も濃度が増加する．阻害剤は代謝で複数化合物を生じ，さらに各化合物のインソースフラグメンテーションや多価イオンが存在して，阻害剤に由来するイオンが複数存在することが示唆された．用いた阻害剤は，分子内に塩素原子を含み，塩素原子は 35 Clと 37 Cl の同位体比が約 3：1 と高く，阻害剤に由来するイオンは特徴的な MS スペクトルを示す．しかし，塩素原子を失う代謝物や fragment イオンも存在することから，precursor イオンの MS スペクト
ル情報のみでは，阻害剤に由来する全イオンは抽出できない．そこで，構造選択的なメタボロミクスで294

引用文献1) Y. Masuo, K. Ito, T. Yamamoto, A. Hisaka, M. Honma, H. Suzuki, Characterization of inhibitory effectof carbapenem antibiotics on the deconjugation ofvalproic acid glucuronide, Drug Metab. Dispos., 38,1828–1835 (2010).
2) Y. Masuo, K. Fujita, K. Mishiro, N. Seba, T. Kogi, H.
Okumura, N. Matsumoto, M. Kunishima, Y. Kato,
6 -Hydroxyindole is an endogenous long-lasting
OATP1B1 inhibitor elevated in renal failure patients, Drug Metab. Pharmacokinet., 35, 555–562(2020).
3) Y. Masuo, S. Nagamori, A. Hasegawa, K. Hayashi,
N. Isozumi, N. Nakamichi, Y. Kanai, Y. Kato, Utilization of liver microsomes to estimate hepatic intrinsic clearance of monoamine oxidase substrate
drugs in humans, Pharm. Res., 34 , 1233 –1243

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(2017).
4) Y. Masuo, Y. Ohba, K. Yamada, A. H. Al-Shammari,N. Seba, N. Nakamichi, T. Ogihara, M. Kunishima,
Y. Kato, Combination metabolomics approach foridentifying endogenous substrates of carnitine/organic cation transporter OCTN1, Pharm. Res., 35,224 (2018).

5) H. Tsugawa, R. Nakabayashi, T. Mori, Y. Yamada,M. Takahashi, A. Rai, R. Sugiyama, H. Yamamoto,
T. Nakaya, M. Yamazaki, R. Kooke, JA. Bac-Molenaar, N. Oztolan-Erol, JJB. Keurentjes JJB, M.
Arita, K. Saito K, A cheminformatics approach tocharacterize metabolomes in stable-isotope-labeledorganisms, Nat. Methods, 16, 295–298 (2019).

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