薬 剤 学, 72 (4), 226‑231 (2012)≪若手研究者紹介≫

超音波応答性マンノース修飾リポソームによる細胞選択的核酸送達システムの開発

運敬

太*Keita Un

国立医薬品食品衛生研究所

少しずつ進めていく中で，「研究」の一端が垣間見え

1．は じ め にた気がした．今思うと，大学院に進学したばかりの編集部から本コラム執筆の依頼を受けた際，これ一学生が行う研究の進捗の遅さに目をつぶり，気長までの研究内容を振り返る良い機会であると考え，に待って頂いた先生方の我慢強さに感謝したい．さ未熟ながらも筆を執らせて頂いた．て，筆者はその後博士後期課程から橋田

筆者は学部 4 回生になった際，当時木村聰城郎教充教授の主宰される京都大学薬学研究科薬品動態制御学分野授が主宰されていた岡山大学薬学部生物薬剤学教室の一員となり，川上に配属され，卒業研究のテーマとして「微粒子内封

音波刺激を利用した遺伝子・核酸医薬品の標的選択抗癌剤による抗腫瘍効果決定因子の解析に関する研的送達法に関する研究に携わることとなった．本稿

究」に関わることとなった．ドラッグデリバリーシ

では筆者がその京都大学大学院在学中に携わった

ステム（DDS）については大学の講義で耳にしてい「超音波応答性マンノース修飾リポソーム / 核酸複たが，実質的にはこれが筆者と DDS 研究との出会合体と超音波照射併用に基づく核酸導入法の開発といであり，その後も関わり続けていく「リポソーム」

疾患治療への応用に関する研究」について，その一との出会いでもある．諸先生方や先輩方からの厳し部を紹介させて頂く．

くも暖かいご指導の下，研究の楽しさ・難しさを知り，またこの研究が筆者の研究者としての第一歩で茂講師の研究グループで，超2．超音波応答性マンノース修飾リポソーム /核酸複合体の開発もあった．博士前期課程では，「P- 糖タンパク質高発現癌細胞に対する in-vivo 抗腫瘍効果に関する研

遺伝子治療は癌や嚢胞性線維症などの遺伝子変異究」に携わり，癌の薬物治療においては避けて通れに端を発する疾患治療に有望な方法であるが，効果ない「抗癌剤耐性」というテーマを頂いた．自分で的な遺伝子治療効果の達成のためには疾患に応じた考え，調べ，試すという試行錯誤を繰り返しながら標的細胞への遺伝子送達が不可欠であり，標的細胞への選択的かつ高効率な遺伝子送達を可能にする方*2006 年岡山大学薬学部総合薬学科卒業，2008 年同大学院医歯薬学総合研究科博士前期課程修了，2011 年京都大学大学院薬学研究科博士後期課程修了，博士号（薬学）取得．2010 年より日本学術振興会特別研究員を経て，2011 年 10 月より国立医薬品食品衛生研究所薬品部研究員．2011 年 7 月，日本薬剤学会第 36 回製剤セミナー Postdoctoral Presentation Award 受賞．これまで一貫して薬物送達システム（DDS）製剤の開発・評価研究に携わっている．連絡先：〒158–8501 東京都
世田谷区上用賀 1–18–1 E-mail: un@nihs.go.jp
226226-231̲09̲若手.indd 226法の開発が求められる．癌免疫療法や抗炎症療法の標的細胞である抗原提示細胞や血管内皮細胞には，その細胞膜上にマンノースやガラクトース，フコース受容体などの糖鎖認識機構が発達しており，糖修飾キャリアの標的細胞として知られている．これら糖鎖受容体介在性エンドサイトーシスに基づき，標的細胞への核酸送達を可能にする糖鎖修飾リポソー

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Fig. 1. In-vivo gene transfection method using ultrasound (US)-responsive and mannose-modifiedlipoplexes.

Fig. 2. In-vivo gene expressing characteristics by US-responsive and mannose-modified lipoplexes
and US exposure. (A) In-vivo imaging photographs of luciferase expression in mice and isolated organs at 6 hr after transfection by US-responsive and mannose-modified lipoplexes
with or without US exposure (firefly luciferase-encoding plasmid DNA: 50 mg). (B) Hepatic
cellular localization of luciferase expression at 6 hr after transfection by US-responsive
and mannose-modified lipoplexes and US exposure. **p＜0.01, compared with the corresponding group of hepatocytes. Each value represents the mean＋S.D. (n＝4).

ム / 核酸複合体が開発されているが，臨床において製剤と超音波照射を併用するソノポレーション法で優れた治療効果を得るためには，細胞選択的かつよは，最適強度の超音波照射によって誘導される製剤り効率的な核酸送達を達成し得る方法論の開発が望崩壊と共に発生するキャビテーションエネルギーにまれる．

より細胞膜上に一過性の小孔が生じ，それを介して近年，細胞内への遺伝子・薬物導入効率を増強さ多量の核酸医薬品を細胞質内に直接導入可能であるせる方法として，電気刺激，物理的圧力，高水圧やことが報告されている．さらにマイクロバブル製剤

超音波照射などの外部刺激の利用が積極的に試みら

は血管造影剤として，また超音波照射機器は超音波れている．特に超音波造影剤であるマイクロバブル検査や結石治療などの分野で既に利用されているた薬 剤 学 Vol. 72, No. 4 (2012)

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め，臨床応用の可能性が高い遺伝子導入法としてもでは，超音波照射によるマイクロバブル製剤の崩壊注目されている．その一方，核酸医薬品とマイクロに起因して細胞膜上に生じる一過性の小孔を介してバブル製剤を別個投与する従来のソノポレーション

多量の核酸医薬品が細胞質内に導入される 2）．従っ

法では，標的臓器・標的細胞選択的に高い遺伝子発て，超音波照射に伴う肝臓および脾臓への核酸移行現効率を得ることは難しい．

量の増大は，核酸医薬品の細胞質内導入の促進に起こうした背景の下，筆者らはソノポレーションを因するものであると推察され，超音波照射時に多量利用した効率的核酸導入と糖鎖認識機構に基づく細の核酸医薬品を肝臓および脾臓内に送達し得る製剤

胞選択的核酸送達の融合を図り，単一製剤に超音波を利用した場合に，核酸医薬品の効率的組織内移行応答性と標的細胞指向性を付与した超音波応答性マが認められると考えられる．

ンノース修飾リポソーム / 核酸複合体の開発研究を一方で，各種物理刺激により転写過程が活性化さ行った（Fig. 1）．まずマンノース受容体認識機構とれ，それに伴い遺伝子発現が増強するという知見が超音波照射に伴う細胞穿孔誘導機構を単一製剤内に報告されているため，超音波応答性マンノース修飾組み込むことを考え，超音波応答性と標的細胞指向リポソーム / 核酸複合体と超音波照射を利用した遺性を併せ持つ超音波応答性マンノース修飾リポソー

伝子発現増強に及ぼす転写活性化の関与についても

ム / 核酸複合体を開発した 1）．本製剤と超音波照射評価した．その結果，遺伝子発現制御プロモーターを利用した遺伝子導入による in-vivo 遺伝子発現特における特定の転写因子結合部位の有無が遺伝子発性を評価した結果，マウス肝臓および脾臓において現の増強に影響することが示された 3）．さらに超音顕著に高い遺伝子発現が示され，その遺伝子発現は波照射に伴い，上記特定の転写因子の活性化が誘導

マンノース受容体発現細胞である肝非実質細胞や脾されることも示され，他の物理刺激に起因した転写

臓の樹状細胞において選択的に認められることを見活性化機構と同様，本方法においても超音波照射を1）出した（Fig. 2） ．一方，肺や腎臓，心臓において付与した細胞において同様の生理的変化が誘導されは超音波照射に伴う遺伝子発現増強は認められず，ていることが明らかとなった 3）．

本方法に基づく遺伝子導入は，標的細胞選択的に高以上，超音波応答性マンノース修飾リポソーム /い遺伝子発現を達成し得る方法であると言える．

核酸複合体と超音波照射に伴う in-vivo 遺伝子発現

3．遺伝子発現増強機構の解明

増強には，1）マンノース修飾による核酸医薬品の標的細胞への移行性増大，2）超音波照射に起因し超音波応答性マンノース修飾リポソーム / 核酸複た製剤崩壊に伴う細胞質内への核酸送達の増強，な合体と超音波照射を利用した in-vivo 遺伝子導入法

らびに 3）超音波照射に伴う転写活性化，という三では，従来のリポフェクション法と異なる機構で遺因子の複合的関与が示唆された．

伝子発現が誘導されていると推察され，このメカニ

4．疾患治療への応用

ズム解析は，遺伝子発現効率の改善や疾患治療への応用を考える上で不可欠である．そこで，in-vivo 遺4.1 癌に対する DNA ワクチンへの応用

伝子発現に関与する核酸化合物の体内動態挙動，細癌抗原により付与される癌特異免疫を利用した癌

胞内導入機構，ならびに遺伝子導入に伴う転写活性免疫療法は，標的癌細胞特異的な抗腫瘍効果が得ら化に着目し，超音波応答性マンノース修飾リポソーれると共に，治療に伴う毒性が低いという特徴を有ム / 核酸複合体と超音波照射を用いた遺伝子導入機することから，癌患者の転移・再発予防法として期構とその支配因子について評価した．

待されている．特に癌特異抗原発現遺伝子を利用す

まず超音波応答性マンノース修飾リポソーム / 核

る DNA ワクチンは，液性免疫，ならびに細胞性免酸複合体と超音波照射による遺伝子導入時の核酸医疫を付与できると共に，強い殺細胞活性を示す標的薬品の体内動態挙動について評価した．その結果，癌細胞特異的な細胞傷害性 T 細胞（CTLs）を効率製剤のマンノース修飾，ならびに超音波照射により，的に誘導可能である．しかしながら，DNA ワクチ

肝臓および脾臓への核酸送達量が増大することが示

ンにより優れた治療効果を得るためには，癌特異免された 1）．またソノポレーションを利用した本方法

疫誘導において重要な役割を果たす抗原提示細胞に

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Fig. 3. Cancer vaccine effects against solid tumors (A) and pulmonary metastatic tumors (B) by
DNA vaccination using US-responsive and mannose-modified lipoplexes and US exposure(melanoma-related antigen encoding plasmid DNA: 50 mg). N.T., no treatment. Each value
represents the mean±S.D. (n＝10).

対して選択的かつ高効率に癌抗原発現遺伝子を導入

患者の予後が極めて悪い．その一方，様々な特異抗することが不可欠である．一方，組織内に分布する原の同定が進んでいる癌種であるため，転移・再発

抗原提示細胞数は極めて少なく，in-vivo において抗予防法としての DNA ワクチンの有効性が期待され原提示細胞選択的かつ高い遺伝子導入を達成するこている．従って超音波応答性マンノース修飾リポソとは難しい．

ーム / 核酸複合体と超音波照射を利用した DNA ワ

超音波応答性マンノース修飾リポソーム / 核酸複合体を用いた遺伝子導入では，樹状細胞への選択的かつ高効率な遺伝子導入が可能となるため，
DNA ワ
クチンへの応用が期待される．そこで，癌特異抗原クチンが，メラノーマの転移・再発に対する予防・治療法への発展が期待される．
4.2

細胞間接着分子の発現抑制に基づく抗炎症治療への応用

発現プラスミドを用いて作製した超音波応答性マン

薬剤性肝炎や虚血再灌流性肝傷害は，臨床におけノース修飾リポソーム / 核酸複合体による DNA ワ

る薬物治療や生体肝移植などの外科手術時におけるクチン効果を評価した．メラノーマ関連抗原を発現有害事象として認識され，様々な薬物投与に伴うするプラスミドを用いて超音波応答性マンノース修

NF-kB 活性化や活性酸素誘導，およびそれに起因し飾リポソーム / 核酸複合体作製して評価した．そのた炎症性サイトカイン産生によって惹起される．こ結果，製剤の静脈内投与と超音波照射併用により免れらの炎症反応発生初期には，血管細胞接着分子や疫誘導を施したマウス脾臓において，主要組織適合細胞間接着分子（ICAM）が肝臓の血管内皮細胞上遺伝子複合体クラス I 分子上への抗原提示が認めらに発現誘導され，好中球などの血管内皮細胞との接れ，それに伴い，メラノーマ特異的な CTL 活性の着，回転，ならびに組織内浸潤に関与することが報4）誘導が認められた ．さらにメラノーマ特異的に高告されている．特に ICAM-1 は，炎症反応の重症化

い腫瘍増殖抑制効果，ならびに生存日数の延長効果に繋がる好中球などの組織内浸潤に強く関与する分が固形腫瘍や転移性肺腫瘍に対して認められた（Fig.

子であり，アンチセンス DNA による ICAM-1 発現3）4）．メラノーマは高転移・再発特性を有するため，抑制や抗 ICAM-1 抗体による ICAM-1 と好中球との薬 剤 学 Vol. 72, No. 4 (2012)

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Fig. 4. Anti-inflammatory effects by US-responsive and mannose-modified lipoplexes complexedwith ICAM-1 siRNA and US exposure. (A) The level of ICAM-1 expression obtained bysiRNA delivery (10 mg siRNA) using various types of methods in hepatic endothelial cells
at 3 hr following LPS/D-galactosamine stimulation. (B) The level of ALT activities followedby siRNA delivery (10 mg siRNA) using various types of methods following LPS/D-galactosamine stimulation. *p＜0.05; **p＜0.01, compared with N.T.. N.T., no treatment. Eachvalue represents the mean±S.D. (n＝5).

相互作用の阻害による炎症反応の抑制に関する研究

同様，超音波照射に伴う超音波応答性リポソーム崩が近年進められている．

壊に起因して細胞膜上に一過性に生じる小孔を介しこの肝血管内皮細胞には，マンノース受容体に基て siRNA が細胞質内に直接導入される．
ここで細胞づく糖鎖認識機構が発達しており，マンノース修飾質内は siRNA の機能発現部位であるため，本方法はキャリアの標的細胞となり得る．そのため，超音波siRNA 送達法として適していると言える．また，こ応答性マンノース修飾リポソーム / 核酸複合体を用の抗炎症効果は四塩化炭素やジメチルニトロソアミ

いた遺伝子導入法は，肝血管内皮細胞への選択的かン，虚血再灌流処理に基づく急性肝炎に対しても認つ高効率な遺伝子導入を可能にすると考えられる．

められた 5）．従って，超音波応答性マンノース修飾

そこで本方法を ICAM-1 に対する siRNA 送達に応

リポソーム / 核酸複合体と超音波照射を利用した

用し，肝血管内皮細胞内に ICAM-1 siRNA を効率的

ICAM-1 siRNA 送達による抗炎症治療では，様々なに送達することによる抗炎症効果を評価した．超音

急性肝炎および肝傷害に対して高い効果が期待され

波応答性マンノース修飾リポソーム / 核酸複合体とる．

超音波照射を利用した ICAM-1 siRNA 送達では，

5．お わ り にICAM-1 発現を惹起するリポ多糖（LPS）誘導急性肝炎モデルマウスにおいて，細胞内 icam-1 mRNA

筆者らは超音波応答性マンノース修飾リポソー発現量，ならびに細胞膜上の ICAM-1 発現量共に顕ム / 核酸複合体の静脈内投与と体外からの超音波照5）著に抑制されることが明らかとなった（Fig. 4） ．

射という極めて簡便な方法で，標的細胞選択的かつさらに本方法を用いた ICAM-1 siRNA 送達による飛躍的に高い遺伝子導入を達成可能であり，さらにICAM-1 発現抑制に伴い，好中球の組織内浸潤，なは疾患治療の応用することで優れた治療効果が得ら

らびに炎症性サイトカイン産生が抑制され，その結れることを示した．この方法論は，in-vivo 核酸送達

果 LPS 誘導急性肝炎モデルマウスの炎症反応も顕の障壁である「標的細胞への選択的核酸送達」と「細著に抑制された（Fig. 4）5）．この方法では，前述と胞質内への効率的核酸導入」
を解決可能であるため，

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これらの知見は新規遺伝子導入法開発に有用な情報

引 用 文 献を提供し得ると考えられる．また，マンノース分子を様々なリガンドに置換することで，多様な標的細胞に対して応用可能な汎用性の高いシステムである
ため，癌や急性炎症のみならず慢性疾患や先天性疾患治療などの幅広い疾患への応用を今後期待したい．筆者は現在，国立医薬品食品衛生研究所薬品部において，奥田晴宏部長，加藤くみ子室長のご指導の下，DDS 製剤の品質評価に関する研究に携わっている．まだまだ微力ではあるが，これまでの経験を活かしながら，DDS 製剤開発の促進に貢献できればと願っている．
最後に本研究を遂行するにあたり，ご指導を賜りました京都大学大学院薬学研究科・橋田山下富義准教授，川上充教授，茂講師に深謝致します．併

せて共同研究者としてご助言を賜りました帝京大学
薬学部・丸山一雄教授，鈴木亮講師に感謝致します．
さらに，研究にご協力頂きました大学院生の方々に心より感謝の意を表します．また，この度コラム執筆の機会を与えて頂いた「薬剤学」編集委員の先生方に深く感謝致します．

1) K. Un, S. Kawakami, R. Suzuki, K. Maruyama, F.
Yamashita, M. Hashida, Development of an ultrasound-responsive and mannose-modified genecarrier for DNA vaccine therapy, Biomaterials,
31, 7813–7826 (2010).
2) K. Un, S. Kawakami, M. Yoshida, Y. Higuchi, R.
Suzuki, K. Maruyama, F. Yamashita, M. Hashida,
The elucidation of gene transferring mechanism
by ultrasound-responsive unmodified and mannose-modified lipoplexes, Biomaterials, 32, 4659–4669 (2011).
3) K. Un, S. Kawakami, Y. Higuchi, R. Suzuki, K.
Maruyama, F. Yamashita, M. Hashida, Involvement of activated transcriptional process in efficient gene transfection using unmodified andmannose-modified bubble lipoplexes with ultrasound exposure, J. Control. Release, 156, 355–363(2011).
4) K. Un, S. Kawakami, R. Suzuki, K. Maruyama, F.
Yamashita, M. Hashida, Suppression of melanoma growth and metastasis by DNA vaccination
using an ultrasound-responsive and mannosemodified gene carrier, Mol. Pharm., 8, 543–554(2011).
5) K. Un, S. Kawakami, M. Yoshida, Y. Higuchi, R.
Suzuki, K. Maruyama, F. Yamashita, M. Hashida,
Efficient suppression of murine ICAM-1 using ultrasound-responsive and mannose-modified lipoplexes inhibits acute hepatic inflammation, Hepatology, (2012) in press.

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