MonoFas® バクテリアゲノムDNA抽出キットⅦ トラブルシューティング
トラブル

DNA回収量が少ない
（ない）

予想原因

対処法

①

サンプル中の細胞濃度が低い、菌体の量多すぎる加えたBuffer A7、AP7の量が足りない菌体に加えたBuffer A7、AP7の量を確認
培養液中の細胞濃度ODを測定、グラム陰性菌250 µL、グラム陽性菌600 µL培養液に対してBuffer A7、AP7は200 µL②

サンプルとBuffer A7、AP7との混和が不十分なために細胞溶解が不完全

細胞ペレットにBuffer A7、AP7に添加後、ボルテックスで完全に溶解させる③ 100%エタノールの代わりに低い濃度のエタノールを使用した100%エタノールを用いる④ プロティナーゼ活性の低下により、細胞溶解が不完全

新たなProteinase K溶液で再度DNA精製を行なう
酵素溶液は室温仕様１年間です
Proteinase KをBuffer A7、AP7に直接添加しない⑤

インキュベーション時間が不十分なためにBuffer A7、AP7
中での細胞溶解、タンパク質変性が不完全

サンプルの溶解を確認し、インキュベーション時間を延長する目にみえる白い沈殿物がないか確認する⑥

カラムにロードする前にライセートにエタノ－ルを添加していない

エタノ－ルを添加したかを確認する
メタノールやメチルエチルケトンのような物質を含んだ変性アルコールは使用しない⑦ DNAの溶出が不十分⑧ 溶出BufferのpHが適正でない（酸性）⑨ Buffer C7とD7の順番を間違えて使用⑩ 多量のBuffer E7 で溶出

１00 µL以下で溶出を行なう場合は、溶出液中のDNA濃度は増加するが、トータルのDNA収量が多少低下する
微量DNAを含むサンプルには20 µLのBuffer E7あるいは精製水での溶出を推奨する⑪ 溶出用Buffer E7がモノリス表面に拡散していないモノリス表面の中央部分にBuffer E7を添加して全体が馴染むようにする①
抽出・精製した核酸のA260/A280比率が高い

溶出効率を高めるため、カラムにBuffer E7あるいは精製水をピペットで添加後、遠心操作前に室温でカラムを1分間インキュベートする
DNAは10 mMのTris-HCl, pH 8.5～9.0或いは精製水のみで溶出させる
溶出効率はpHに依存し、pH 7.0～8.5で効率が最も高い
低いpHはDNA収量を低下させることがある
精製水で溶出したい場合はpHが7.0以下でないことを確認するか、Buffer C6を溶出に使用する
Buffer C7とD7をプロトコールの順序に従って使用したか確認する

サンプルとBuffer A7、AP7との混和が不十分なために細胞溶解が不完全② Proteinase K活性の低下により細胞溶解が不完全③

インキュベーション時間が不十分なためにBuffer A7、AP7
中での細胞溶解、タンパク質変性が不完全

細胞ペレットとBuffer A7、AP7をボルテックスで完全に溶解させる
新たなProteinase K溶液で再度DNA精製を行なう
酵素溶液は室温仕様１年間です
Proteinase KをBuffer A7、AP7に直接添加しない
サンプルの溶解を確認し、インキュベーション時間を延長する目にみえる白い沈殿物がないか確認する

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トラブル

予想原因
④

カラムにロードする前にライセートにエタノ－ルを添加していない⑤ Buffer C7とD7の順番を間違えて使用した⑥
抽出・精製した核酸のA260/A280比率が高い

Buffer B7が残っている、またはBuffer C7、D7による洗浄が不十分

Buffer A7、AP7,中の白色沈澱物

エタノールを添加したか確認する
Buffer C7とD7をプロトコールの順序に従って使用したか確認する
抽出・精製ＤＮＡをエタノール沈澱して回収する⑦ 溶出液中にエタノールが残留、不純物が混入溶出の前に洗浄ステップを行ったことを確認する
グラム陽性菌から精製した際に洗浄工程の追加又はDNA吸着後、カラムにBuffer D7 300 µLを添加して、５分間室温でインキュベートしてから、遠心する⑧ RNAの残留量が多い

完全に残留RNAをなくす場合は、精製後のDNA溶液をRNase Aで調製行なう⑨ Buffer A7、AP7添加前にBuffer B7をサンプルに添加した

Buffer A7、AP7添加後必ずボルテックスし、細胞溶解確認後、Buffer B7を添加ボルテックス
する① 溶出液中のDNA量が不十分

溶出液中にDNAが少ない場合は、反応に添加する溶出液量を増やす
必要に応じて、DNAを真空濃縮するか、細胞数が少ない場合は、サンプル量を増やして、再度精製を行なう
もしくは、溶出量を50 µLにするなど液量を減らす
溶出量を減らすとトータルDNA量はわずかに低下するが、溶出液中の核酸濃度は増加する
カラム上にDNAが残っている場合があるので、溶出ステップ後に、同一溶出液を再度カラムにアプライする
溶出ステップを繰り返して回収すると回収量があがる場合がある

抽出・精製したDNAが酵素反応効 ② 調製中の阻害物質率が低い+H25:L34

溶出液中にRNAが存在

対処法

可能性のある原因をトラブル及び対処法の「精製した核酸のA260/A280比率が低い」の項をチェックする③ 溶出液中にBuffer D7が残留

プロトコールにおける洗浄工程２の後に乾燥ステップを行なう（エタノールを完全にとばす）溶出の前に、カラムに廃液が付着していないことを確認する④ Buffer C7とD7の順番を間違えて使用

Buffer C7とD7をプロトコールの順序に従って使用したか確認する⑤ RNAの残留量が多少ある

完全に残留RNAをなくす場合は、精製後のDNA溶液をRNase Aで調製行う⑥ PCR増幅反応の効率が悪い

PCR増幅反応にテンプレートとして添加する溶出液の量を調節する
添加された溶出液量を調節して増幅システムを再度至適化する

RNAが分解している

RNase A処理行う
Buffer A7、AP7添加後ボルテックス、RNase A(20mg/mL)4.0 µL 添加し、ボルテックス後、40℃で15分間反応、その後Buffer B4を添加、ボルテックス混合して、プロトコール通りの順序に従って精製行う

白色沈澱物は低温での保存あるいは長期保存により形成する

Buffer A7、AP7中のほとんどの沈澱物は56℃でのインキュベーションにより溶解される
沈澱物がDNA精製に影響を与えることはない
沈殿物を高温で溶解しても、精製される核酸の収量あるいは品質に影響を及ぼさない

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トラブル

予想原因

対処法

Buffer A7、AP7にBuffer B7を入れると白色沈澱物

細胞が完全に溶解していない

通常、白色沈澱物が形成されないが、多少あるとしても、エタノ－ル添加攪拌の際に白色沈澱物がほとんど溶解される
この沈澱物はDNA精製、あるいは続いて行なう実験にも影響を及ぼさない

ライセートがカラムを完全に通過しない細胞濃度が高く、完全に溶解されてない

プロトコール通りの使用の場合：最高速度で1分間あるいは全ライセートがモノリスを通過するまで遠心分離する
細胞濃度ODが0.6以上であった場合、サンプルを水で希釈し、精製を行う

株式会社アニモス Tel：048-606-2892 E-Mail：monofas@animos.co.jp
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