27. 大阪府内で分離された腸管出血性大腸菌主要 3 血清群の薬剤感受性と耐性遺伝子の探索○西嶋 駿弥 （地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所）【研究目的】
腸管出血性大腸菌 (Enterohemorrhagic Escherichia coli ; EHEC) 感染症は感染症法で三類感染症に位置付けられており、接触者の検査や患者の就業制限などの行政対応が必要となる場合がある。
2021 年に地方衛生研究所から報告された EHEC の全検出数における O157、O26、O111 血清群の割合は、それぞれ、47.1％、18.2％、9.3％で合計 70％を超えており、この主要 3 血清群への対応が EHEC 感染症を制御する上で重要になる。EHEC 感染症治療における抗菌薬の使用について、国際的な統一見解は得られていないものの、我が国ではしばしば抗菌薬が用いられる。特に小児に対しては、重症化を予防する目的で発症早期にホスホマイシン (FOM) を投与することが、国内の感染症治療のガイドラインに示されている[1]。近年、国内で分離される EHEC において、FOM に対して耐性あるいは低感受性を示す株が報告され、重症化や治療の長期化を招くことが懸念されている [2、3]。FOM 耐性の機序は、これまでに輸送系 (UhpT 系; グルコース 6 リン酸 [Gulcose-6-phosphate; G6P] などを輸送する糖リン酸輸送系、GlpT 系; sn-グリセロール-3-リン酸輸送系) の変異、標的酵素 (UDP-GlcNAc enolpyruvyl transferase) の変異または過剰産生および FOM 不活化酵素によるものが報告されている [4]。特に、FOM 不活化酵素をコードしている FOM 耐性遺伝子は、伝達性プラスミド上にコードされているものが多く、水平伝播による拡大が懸念されている。
本研究では、2019 年から 2021 年に大阪府内で分離された EHEC 主要 3 血清群の薬剤耐性状況を明らかとするため、FOM を含む様々な薬剤に対する感受性を調査した。さらに、FOMの感受性が低下した株については、FOM 耐性遺伝子の保有と UhpT 系の機能を調べた。
【研究の必要性】
近年、様々な薬剤耐性菌の出現が世界的な問題となっている。また、国内で分離された
EHEC について、FOM 耐性菌が散見されるが、それらの耐性機構や遺伝学的関連性については不明な点が多い。そこで、大阪府で分離された EHEC の薬剤耐性の状況、特に FOM 耐性菌の実態を調査する必要があると考えられた。
【研究計画】
1. 研究対象の菌株2019 年 5 月から 2021 年 12 月までに分離された EHEC O157 (118 株)、O26 (35 株)、O111(4 株)のうち、反復配列多型解析 (Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis;MLVA) の結果から、MLVA 型が異なる 96 株を供試株とした。MLVA は Izumiya らの方法に基づいて実施し [5]、O157 は 81 種類、O26 は 12 種類、O111 は 3 種類に型別された。
2. 薬剤感受性試験
供試株について、米国臨床検査標準協会 (CLSI) に準拠した Kirby-Bauer 法 (KB 法、ディスク拡散法) で薬剤感受性試験を実施した。供試薬剤は、アンピシリン（ABPC）、セフォ
タキシム（CTX）、ゲンタマイシン（GM）、カナマイシン（KM）、イミぺネム（IPM）、ノルフロキサシン（NFLX）、シプロフロキサシン（CPFX）、ナリジクス酸（NA）、ST 合剤（SXT）、
メロぺネム（MEPM）、セフタジジム（CAZ）、ホスホマイシン (FOM)、クロラムフェニコール（CP）、セフォキシチン（CFX）、アミカシン（AMK）、ストレプトマイシン（SM）、テトラサイクリン（TC）、セフタジジム/クラブラン酸 (CAZ/CLA) の 18 薬剤を使用した。ただし FOMについては、
日本 BD から市販されている FOM を 50 µg 含有したディスクを使用した。また、
FOM に対する感受性、中間、耐性の判定は製品に添付の判定基準に従った。
FOM の最小発育阻止濃度 (MIC) は、CLSI に準拠した寒天平板希釈法で測定した。CLSIの FOM のブレイクポイントは、尿路感染症由来の大腸菌のみを対象に定められているため、本研究では MIC 値で感受性、中間、耐性の判定を実施しなかった。
3. FOM 耐性遺伝子の検出
FOM の MIC が 16 µg/mL 以上の菌株について、fosA、fosA3、fosC2 を PCR 法により検出した。PCR のプライマーは Hou らの方法に従った [6]。
4. UhpT 系の機能の評価
FOM の輸送系の 1 つである UhpT は、G6P の存在下で誘導・産生され、G6P を細胞質内へ能動輸送する。MIC が 16 µg/mL 以上の菌株について、UhpT 系の機能を評価するために、
Takahata らの方法に準じて、0.2%の G6P を含む M9 最小培地での発育性を確認した [7]。
【実施内容・結果】
1. KB 法の結果と寒天平板希釈法による FOM の MIC 分布
表 1 に O 血清群ごとの薬剤耐性パターンを示した。O157 (81 株) では、1 剤以上に耐性を示した株は 16 株で、うち 2 剤以上に耐性を示した株は 13 株であった。O111 (3 株) では、供試株のすべてが 1 剤以上に耐性を示し、うち 2 株は 4 剤以上に耐性を示した。O26 (12株) では 1 剤以上に耐性もしくは中間を示した株は 5 株で、うち 2 剤以上に耐性を示した株は 2 株であった。O26 では他の O 血清群と異なり、FOM に対して耐性もしくは中間を示す株が合計 3 株確認された。O157、O111、O26 のいずれもニューキノロン系、およびセフェム系薬剤に耐性を示さなかった。
図 1 に各 O 血清群における FOM の MIC 分布を示した。O157、O111 ではすべての株の MICが 4 µg/mL 以下になった。一方で、O26 では 6 株で 16 µg/mL 以上を示し、O157、O111 と比較して、MIC 値が高い株が多かった。MIC が 512 あるいは 512 µg/mL 以上を示した 2 株は、KB 法で耐性と判定された。また、32 µg/mL を示した 1 株は、KB 法で中間と判定された。
図 3 に O26 の MLVA 結果と各菌株の薬剤耐性パターンを Minimum Spanning Tree (MST) で示した。EHEC の MLVA では、2 遺伝子座違いまでであれば遺伝学的関連性が高いと考えられるが、FOM の MIC が 16 µg/mL 以上の 6 株はすべて、4 遺伝子座以上異なり、関連性はないと考えられた。
2. FOM 耐性遺伝子の検出と UhpT の機能の評価
PCR により、FOM の MIC が 512 µg/mL 以上を示した 2021H010 から fosA3 が検出された。
また、本菌株は 0.2%の G6P を含む M9 培地に発育が確認された。その他の 5 株は、fosA、fosA3、fosC2 をいずれも保有しなかったが、0.2%の G6P を含む M9 培地に発育しなかったことから、G6P の取り込みが阻害されていると考えられた (表 2)。
【考察と今後の課題】
2015 年から 2021 年に国内で分離されたヒト由来 EHEC の薬剤耐性率は、20～30％程度で推移している [8]。2019 年から 2021 年に大阪府で分離された EHEC 主要 3 血清の薬剤耐性率は 26%であり、国内の状況と相違はなかった。また、O 血清群ごとの FOM の MIC 分布から、O157、O111 と比較して、O26 は FOM に対する感受性が低下しやすい可能性が示された。これまでも、O26 は FOM の MIC 値が他の EHEC と比較して高い傾向にあるという報告があり、本研究でも同様の結果となった [2、3]。また、MLVA の結果から、FOM の MIC が 16 µg/mL以上の株について、それぞれ遺伝的関連性は低いと考えられた。今後は、耐性機構の調査やより詳細な分子系統解析を実施することで、O26 で FOM 耐性株や感受性の低下した株が出現する原因を明らかにする必要がある。
本研究で、FOM 耐性遺伝子である fosA3 を保有する株が確認された。fosA3 は、fosAsubtypes の中で最も頻繁に検出される。fosA3 を保有する大腸菌は、尿路感染症患者やペット、家畜、食肉から分離されているが [9]、これまで国内で fosA3 を保有する EHEC は、我々が知る限り報告されていない。既報では、fosA3 は伝達性プラスミド上にコードされていることが知られており、他の EHEC に水平伝播することが懸念される [9]。今後は、今回検出された fosA3 がプラスミド上にコードされているかを確認した上で、プラスミドの構造解析および他の菌株への接合伝達能を確認する必要がある。また、耐性遺伝子非保有株が 0.2%G6P を含む M9 最小培地に発育しなかったことから、UhpT 系になんらかの障害があり、FOM の菌体への取り込みが阻害されている可能性が示唆された。今後、G6P の能動輸送系をコードする遺伝子 (uhpT) の発現量が低下しているかを確認する必要があると考えられた。また、GlpT 系の変異や標的酵素の変異、過剰発現の有無を解析することで、EHEC
O26 における FOM の耐性化や低感受性化の要因を究明する予定である。

【参考文献】[1] 大西健児ら 日本化学療法学会雑誌 64 (1) 31-65 2015[2] 白鳥浩美ら 愛知衛所報 72 11-17 2022
[3] Midori Hiroi et al. Jpn. J. Infect. Dis. 65 198-202 2012[4] Vincent Cattoir et al. Future Microbiol. 13 (16) 1693-1696 2018[5] Hidemasa Izumiya et al. Microbiol. Immunol. 54 (10) 569–577 2010[6] Jianxia Hou et al. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (4) 2135–2138 2012[7] Sho Takahata et al. Int. J. Antimicrob. Agents 35 (4) 333-337 2010[8] 厚労科研 (食品の安全確保推進研究事業) 令和３年度分担研究報告書 ワンヘルスに基づく食品由来薬剤耐性菌のサーベイランス体制強化のための研究[9] Tsung-Ying Yanget al. J. Microbiol. Immunol. Infect. 52 (1) 9-21 2019

【経費使途明細】
使途金額

薬剤感受性試験用の試薬類107,837 円

PCR 試薬74,624 円

プラスチック製品

44,730 円

その他の試薬69,905 円

振込手数料2,904 円
合計300,000 円

大同生命厚生事業団助成金

300,000 円

表 1. KB 法による主要 3 血清群における薬剤耐性パターン
薬剤耐性パターン
ABPC, KM, NA, SM, TC
ABPC, SXT, CP, SM, TC
ABPC, CP, SM, TC
ABPC, SXT, SM, TC
SXT, CP, SM, TC
ABPC, SM, TC
ABPC, SXT, SM
CP, SM, TC
ABPC, SM
FOM, CPSM
TC
FOM
CPO157

合計() は中間の株数を示す。

16O26

12O11111

合計1131611111311 (1)1323 (1)11611111311 (1)4 (1)40O157

株数30O26O111

20100MIC (µg/mL)

図 1. 主要 3 血清群における FOM の MIC 分布

図 2. 血清群 O26 の MLVA に基づく MST

表 2. FOM の MIC が 16 µg/mL 以上を示した菌株の O 血清群および薬剤耐性パターン、FOM の MIC、
0.2%G6P 含有 M9 培地への発育性、FOM 耐性遺伝子 (fosA、fosA3、fosC2) の保有状況

菌株番号O 血清群

薬剤耐性パターン(KB 法)

FOM の MIC(µg/mL)

0.2%G6P 含有
M9 培地での発育

FOM 耐性遺伝子の保有2019H004

O26

TC16--

2019H020

O26

すべて感受性16--

2020H036

O26

FOM512--2021H010

O26

FOM、CP>512++ (fosA3)

2021H024

O26

FOM (I)

32--

2021H081

O26

すべて感受性16--

NT: Not Tested (I): 中間