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振動和周波検出赤外超解像顕微法を用いた毛髪内部の分子構造解析（東工大・資源研 1、花王株式会社ビューティケア研究センター2）田島朋樹 1、佐藤孝樹 1、
菊地克也 1、藤井正明 1、長瀬 忍 2、平野祐司 2、伊藤隆司 2、酒井 誠 1

Molecular structure analysis of the human hair insideby using VSFG detected IR super-resolution microscopy(Tokyo Institute of Technology1, Kao Corporation2) Tomoki Tajima1, Takaki Sato1, Katsuya Kikuchi1,
Masaaki Fujii1, Shinobu Nagase2, Yuuji Hirano2, Takashi Itou2, Makoto Sakai1【序】ヒトの毛髪の分子構造解析は、医療、化粧品業界において重要なテーマであり長年にわたって研究が行われている。毛髪の直径は 30～120 m 程度であり、外側からキューティクル、コルテックス、メデュラの３層の部位に分けられる。コルテックスは毛髪全体の 8 割以上を占め、殆どがケラチンタンパク質で構成されており、αヘリックス構造が集合した中間径フィラメント(IF)を形成して毛髪の方向に沿ってファイバー状に並んでいる[1]。近年、加齢や経年劣化によって生じた毛髪のカールや、熱圧力による形状変化、ヘアブリーチの施行による色素変化などの外観から確認できる様々な変化が、コルテックスの内部構造、特にケラチンタンパク質の二次構造あるいは IF の配向(四次構造)と関係していると推測されており、赤外分光を中心に多くの研究がされている[2]。しかしながら、赤外分光法を応用した赤外顕微鏡では空間分解能が赤外光の波長に比例した回折限界によって制限されるため 10 m 程度となり、コルテックス内部の局所的な観察は困難である。従って、コルテックス全体が均一に変化しているのか局所的に変化しているのかは明らかになっていない[3]。そこで、我々が開発した振動和周波発生（VSFG）法による赤外超解像顕微鏡を毛髪観察に適用する[4]。この方法では赤外吸収を可視の VSFG 光の発生により検出できるため、空間分解能は可視光に対する回折限界で決まり、高い空間分解能での観察が可能になる。
昨年我々は、この顕微鏡法を用いることで毛髪内部をサブマイクロメートルの空間分解能で赤外分光イメージングが可能なことを報告した[5]。本研究では、髪の色やカールの程度の異なる毛髪、ブリーチ及び熱圧力の外部処理を施工した毛髪の赤外分光イメージングを行い、外観から確認できる様々な変化がコルテックス内部のどのような構造変化と関係しているかを明らかにする。

【実験】 VSFG 法の原理図を図 1 に示す。VSFG は、赤外光と可視光を同時に入射した時、そのエネルギー和に相当する VSFG 光Visibleが発生する非線形光学過程である。測定に用いた赤外光と可視光は、再生増幅器によって増幅された Ti : Sapphire レーザーのピコν

秒パルスを波長変換することで得られた。光の波長には赤外光に2800-3600 nm 及び 7200-8500 nm、可視光に 613 nm を用いた。これらの光をビームコンバイナーで同軸に合わせ、CaF2 レンズ（f =100）を用いて毛髪試料上に照射した。発光は背面から対物レンズ

VSFG
IRS0
図1VSFG 法のエネルギーダイアグラムを用いて集め、VSFG 発光のみが透過するバンドパスフィルターを通した後に ICCD カメラ上に結像した。毛髪試料は、エポキシ樹脂に包埋した後、ミクロトームで 3 m に横断面を切り出し、カバーガラス上に載せエタノールで馴染ませることによりガラス上に半固定したものを用いた。

【結果と考察】 カールがコルテックスの内部構造にどの様な変化を与えるかを観察するために、カールの程度の異なる毛髪の超解像赤外分光イメージングを行った。図 2 で表されるカール半径が 10.0 cm（直毛）、2.1 cm、1.0 cm（カール毛）の白髪の透過像を図 3 (a)、(c)、(e)に示す。試料の毛髪横断面は、毛髪のカールの内側が右側に位置するように設定し観察した。透過像より、中央から外側にかけてメデュラ、コルテックス、キュ図 2 カール半径の模式図ーティクルがそれぞれ明瞭に観察できている。(b)、(d)、(f)は(a)、(c)、(e)に対してアミドⅢバンドの振動数(1260 cm-1)に相当する赤外光を入射したときの超解像赤外イメージである。全ての試料において、コルテックスから非常に強い発光が観測された。コルテックスはαヘリックス構造のケラチンタンパク質で占められていること、また、ケラチンタンパク質を含まないメデュラ、及びケラチンタンパク質がランダムコイル構造を取っているキューティクルが発光していないこと、さらには VSFG 法の特性により(b)、(d)、(f)においてケラチンタンパク質のαヘリックス構造を選択性高く観察出来ていると結論した（詳細は 4A19 参照）。発光の分布に着目すると、直毛である(b)においてはコルテックス全体で均一な発光が観察されるが、(d)、(f)とカール半径が小さくなるにつれてカールの内側に偏って分布している。
さらに、(b)、(d)、(f)上の様々な部位において VSFG スペクトルを測定したところ、いずれも 1260 cm-1（アミドⅢバンド）、2940 cm-1（CH 伸縮振動）、3330 cm-1（OH 伸縮振動）にバンドが観測され全く同一のスペクトルが得られた（図 3 (g)に黒点部の VSFG スペクトルのみを示す）。 カールの異なる試料でも VSFG スペクトルが類似していることから、どの試料でもケラチンタンパク質がαヘリックス構造を保っている一方、発光の分布が異なることからαヘリックス構造の配向や密度分布が変化したと推測できる。これは、コルテックスを構成している IF の配向や密度が変化するケラチンタンパク質の四次構造変化が生じたと推測できる。講演では、ブリーチや熱圧力処理した毛髪の結果も含めてコルテックス内部にどのような構造変化を与えるかを議論する。

(a)

(b)

(c)

(d)

コルテックス

(ⅱ)

(ⅰ)

20 m

20 m

キューティクル

(e)
(e)

(g)

(f)

(ⅲ)

20 m

20 m20 m
(ⅰ)
(ⅱ)
(ⅲ)

Intensity (a.u)

メデュラ

20 m
Wavenumber (cm-1)

図3(a)、(c)、(e)はカール半径が 10.0 cm、2.1 cm、1.0 cm の白髪の透過像。(b)、(d)、(f)は(a)、(c)、(e)に対するアミドⅢバンド(1260 cm-1)の超解像赤外分光イメージ。(g)は(a)、(c)、(e)における VSFG スペクトル（(b)、(d)、(f)上の黒点の部位で観測した）。試料は全て横断面で厚さ 3 m、カールの内側は右側に設定した。

【参考文献】 [1] S. Nagase et al., J. Soc. Cosmet. chem., 43, 3 (2009). [2] G. L. Carr et al., J. Soc. Cosmet.
chem., 51, 73 (2000). [3] K. L. A. Chan et al., Appl. Spectrosc., 59, 149 (2005). [4] K. Inoue et al., Appl.
Spectrosc., 64, 3 (2010). [5] 菊池克也 他, 第 5 回分子科学討論会, 4P083 (2011).