ＩＳＳＮ１３４６－７８４０

港湾空港技術研究所
資料
TECHNICAL NOTEOFTHE PORT AND AIRPORT RESEARCH INSTITUTE

No.1373

June 2020

環境 DNA による沿岸域魚類の網羅的な推定と多様性評価

細川 真也， 百田 恭輔， 大倉

国立研究開発法人

翔太， 小室隆

海上・港湾・航空技術研究所

National Institute of Maritime,
Port and Aviation Technology, Japan目

次・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3

1． まえがき ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4

2． 沿岸域における魚類の推定精度と注意点 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4

2.1 はじめに ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4

2.2 魚類の推定精度の検証 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

5

要

旨

2.3 検出力と同定精度―分析者間の比較―
2.4 過剰な推定の傾向
2.5 結論・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 10・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 12

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15

3． 抽出された注意点の多様性評価への影響と回避方法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15
3.1 はじめに ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15
3.2 検出力の違いに着目した比較解析への影響の考察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15
3.3 分析者の違いの影響の検証
3.4 結論・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 18

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 20

4． 多様性評価に必要な空間距離とサンプル数 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 21
4.1 はじめに ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 21
4.2 方法・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 21

4.3 結果・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 22

4.4 考察・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 22

4.5 結論・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 23

5． あとがき ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25
5.1 本論文の要約

・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25

5.2 今後の期待される展開 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25
5.3 まとめ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25
謝辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25
参考文献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 25
付録 A Sample coverage の意味， 効果， 及び限界 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 28
付録 B 目安となる sample coverage とサンプル数 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 30

—1—

Environmental DNA metabarcoding and diversity analysis
for the fish community in coastal areas
Shinya HOSOKAWA*, Kyosuke MOMOTA**, Shota OKURA***, Takashi KOMURO****

Synopsis
The analysis of environmental DNA (eDNA) enables us to estimate the presence of organisms
without direct their collection. eDNA metabarcoding for fish communities is a technique expected tobe applied for biomonitoring and ecosystem health assessment. However, in coastal areas, because
eDNA originated from other coastal areas and terrestrial areas via rivers may distribute, it is not wellknown whether environmental DNA metabarcoding is suitable or not. MiFish, which is a set of primers
for metabarcoding eDNA from fish, has been assessed to have specificity, discriminatory power, andreproducibility. This study examined the estimation accuracy of eDNA metabarcoding using MiFish incoastal areas and it applicability for coastal biomonitoring and assessment.
The estimation accuracy of eDNA metabarcoding for coastal fish communities was tested bycomparing its estimations and direct collections. These tests resulted that the estimation accuracyof eDNA metabarcoding was high. However, other analyses pointed out that detection power andidentification accuracy were dependent on the analyst, and that the eDNA of fish transported from rivers
and originated by anthropogenic activities were detected if detection power was high. Although thesecautionary notes aﬀect the analyses for species richness and composition, this study showed how we
can avoid them. Also, this study examined how distance and how many samples were suﬃcient for the
analyses for comparing species richness and compositions. The knowledge summarized in this study
would assist engineers to plan field surveys and to select analytical methods for biomonitoring andecosystem assessment using eDNA metabarcoding in coastal areas.
Key words: Environmental DNA, MiFish primers, Estimation accuracy, Species richness, Species
composition
Senior Researcher, Marine Environmental Information Group*
Ex-postdoctoral Researcher, Marine Environmental Information Group (Researcher, Marine Ecology Research Institute)***** Researcher, Marine Environmental Information Group**** Postdoctoral Researcher, Marine Environmental Information Group
3-1-1, Nagase, Yokosuka, Kanagawa 239-0826, Japan Port and Airport Research Institute
Phone : +81-46-844-5107, Fax : +81-46-844-1274
E-mail: hosokawa@p.mpat.go.jp—2—

環境 DNA による沿岸域魚類の網羅的な推定と多様性評価

細川 真也 *， 百田 恭輔 **， 大倉 翔太 ***， 小室 隆 ****

要旨

環境中に漂う DNA の検出によって生物の生息域を推定する技術 （以下， 環境 DNA 分析） の開発が進んでいる． 魚類を網羅的に推定する環境 DNA 分析は， 実務への応用が期待されるが， 他の海域との相互作用があり， かつ， 河川や人間活動の影響を強く受ける沿岸域では， 環境 DNA 分析によりどこまで生物の生息域の推定に有効なのか未知な点が多い． 本研究では， 種の識別能力と再現性が高く， 魚類を網羅的に推定でき
る MiFish プライマーセットに着目し， 沿岸域における推定精度の把握と港湾分野における魚類調査への応用の可能性の検証を行った．
沿岸域における推定精度の把握では， 直接的な方法との比較による推定能力を評価し， さらに， 注意点の抽出を行った． この結果， 環境 DNA 分析は高い精度で魚類の分布を推定できるものの， 分析者による検出力
及び同定精度に差があることと河川や人間活動に由来した環境 DNA を検出してしまう等の過剰な推定があることが注意点として挙げられた． 魚類調査への応用に関して， 環境 DNA 分析によって推定された結果から種数と種組成の比較が可能かどうか検証した結果， 抽出された注意点がこれらの比較に影響するものの， その影響は回避できることが示された． また， 種数と種組成の比較に必要となる空間距離とサンプル数についても検証した． 本研究で整理された知見は， 環境 DNA 分析技術を用いた港湾分野の魚類調査計画の立案や解析手法の選択に貢献するものと考えられる．
キーワード ： 環境 DNA， MiFish プライマー， 推定精度， 種の豊富さ， 種組成

*
**
***
****

海洋情報 ・ 津波研究領域海洋環境情報研究グループ 主任研究官
元海洋情報 ・ 津波研究領域海洋環境情報研究グループ 専任研究員 （現 （公財） 海洋生物環境研究所 研究員）
海洋情報 ・ 津波研究領域海洋環境情報研究グループ 研究官
海洋情報 ・ 津波研究領域海洋環境情報研究グループ 専任研究員〒 239-0826 神奈川県横須賀市長瀬 3-1-1 港湾空港技術研究所
E-mail: hosokawa@p.mpat.go.jp
電話 ： 046-844-5107, Fax ： 046-844-1274—3—

とする環境 DNA も多様となることから， その応用にはより高

1. まえがき度な知識や技術が必要になる可能性がある． 多くが沿岸域
生物から放出されて環境中に漂う DNA は環境 DNA と呼に立地する我が国の港湾 15) では， 環境 DNA 分析による魚

ばれ， これを分析する技術 （以下， 環境 DNA 分析） によ類の網羅的な推定が， どこまで新しい調査手法として応用でり，生物を採取しなくても生息域を把握できる可能性がある 1)．

きるか疑問が残る．

環境 DNA 分析は，生物を採取しないことから非破壊的であり，著者らは， この疑問を検証するため， およそ２年間で環場合によっては安価であることから， 現地調査への応用が注境 DNA 分析に基づいた沿岸域の魚類分布の把握に関す目されている．

るデータを積み重ね， 様々な角度から分析した （表―1.1）．

大型動物の環境 DNA 分析については， 2008 年にウシガ

本論文は， 環境 DNA 分析による網羅的な推定の港湾分野

エルを対象とした論文が発表されたのを初めとし 2)， その後，における応用の可能性を探ることを目的として， この成果を整研究対象が様々な生物に拡がっている 3)． 近年は， 生物に理したものである． 既にまとめられている環境 DNA 分析に関共通する DNA 領域を分析することで生物を網羅的に解析すする基本的な知見 1),16) に対して， 沿岸域特有の視点から補る技術が開発されている 4)–9)． この技術により， 個々の生物間する位置付けとしてまとめた．

種の分布だけでなく多様性の分布の把握も可能となることが本論文は， 主に， 第 2 章から第 4 章までの３つの章で構成期待される．

されており， 第 2 章では， まず， 環境 DNA 分析による沿岸

水中の環境 DNA は水の流れに伴って空間的に拡がるた域を対象とした魚類推定の精度を検証し， さらに， 実務で取め， 開放的な場所になるほど， 環境 DNA 分析の障壁が多くり扱う上での注意点の抽出を行った． 網羅的な推定を使ったなることが予想される． このことから， 環境 DNA 分析の検証

明確な目的がある場合，第 2 章でまとめた知見が参考になる．

の多くは， 水槽， 池， 湖のような流れの条件を単純化しやす

第 3 章と第 4 章では， 環境 DNA 分析による網羅的推定のい閉鎖的な環境で試みられている 3),4),6)–8)． 一方で， 環境応用の一つとして考えられる生物多様性の評価 17) に着目し，DNA 分析を沿岸域で使った事例もある． 日本海側に面する

その可能性を検証した． 第 3 章では， 第 2 章で抽出された

舞鶴湾では， 流動が穏やかあり， 環境中に放出された魚の注意点の多様性解析への影響の把握及びその回避方法の

DNA が数時間で検出されない濃度に薄まることから， 環境検討， 第 4 章では多様性の違いを識別できる空間距離と評DNA 分析を用いて， マアジの分布のスナップショットを捉え価のために必要となるサンプル数を検討した．

ることに成功した 10),11)．

2. 沿岸域における魚類の推定精度と注意点

しかし， 同じ沿岸域であっても， 場所によって流動特性は大きく異なり， 環境 DNA 分析だけでは生物の生息域の把握が難しくなることもある． 太平洋沿岸の英虞湾では， 環境

2.1 はじめにDNA 分析を応用したアマモ分布の推定が試みられているが，(1) 本論文で着目する MiFish プライマー

潮汐に伴う流れの影響が強く， 流動モデルを併用しなければ

環境 DNA 分析による魚類の網羅的な推定手法が 2012

その応用が困難であることが報告されている 12)–14)． 我が国

年に発表されて以降 4),5)， いくつかのプライマーが開発さの沿岸域の多くでは， 潮汐に伴う流れがあり， 河口の影響をれ て い る 7),8)． MiFish プ ラ イ マ ー セ ッ ト （ 以 下， MiFish）

受ける場所も多いことから， 環境 DNA 分析の応用は容易では， 硬骨魚類に共通する MiFish-U と軟骨魚類に最適化はないことが想像できる． さらに， 網羅的な推定では， 対象

した MiFish-E によって構成され， 水族館において 93% も表―1.1 本論文で行った調査の種類とその解析内容．

調査時期

調査場所

タイプ

第2章
2.2

2017 年度
2018 年度

2019 年度

2018 年 1 月
2018 年 9 月

東京湾周辺
広島県尾道
山口県笠戸湾2018 年 12 月 東京湾口 （フェリー）2019 年 1 月
広島県尾道
山口県笠戸湾
東京湾
2019 年 6–7 月 神奈川県久里浜湾
2019 年 7–8 月 山口県笠戸湾

沿岸域
アマモ場
アマモ場
沿岸域， 湾口
アマモ場
アマモ場
釣り場
アマモ場
沿岸域， アマモ場

—4—

第3章

2.3

2.4

*

*

3.2

第4章

3.3
*

*
*

*
*

*
*
*
*
*

*
*

*
*
*

*
*

*

*

の魚種を適中させる驚異的な実績を有している 7)． さらに，
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近年， 温帯の沿岸域に生息するアナハゼ類に最適化した

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MiFish-U2 も開発されており 1)， 推定可能な魚種は充実しつ⎔ቃ '1$ ࡟ࡼࡿ᪉ἲ

つある．
プライマーには， データベースが充実している DNA 領域
COⅠ を対象としたもの等もあり， それぞれ特徴を有しているが， MiFish は， 種の識別能力及び再現性が高く， かつ， 魚類に特化していることから推定効率にも優位性がある 18)． 魚類へ特化したプライマーとしては， 他にも teleo8) 等があるが，
MiFish であれば我が国の多くの分析専門業者が取り扱える．
本論文では， 我が国の港湾での応用方法を探ることを目的としていることから， MiFish に着目している．

図―2.1 本研究で採用する環境 DNA 分析による推定精度の評価
モデル． 未検出同士の適中は評価できないため， 点線の３つのカテゴリで評価した． 気象予報における予測精度の評価モデル 19) を応用した．

(2) 本章の目的
本章では， MiFish を用いた環境 DNA 分析による沿岸域の魚類の推定精度の把握に主眼を置き， まず， 釣り場とアマモ場において， 直接的な方法によって把握した魚種と環境
DNA 分析による推定結果を比べ， その推定精度を検証した．

東京湾内の釣り場では， 2019 年 1 月において環境 DNA

推定精度の評価においては， 気象予報の分野で用いられるの採水ポイント近くの釣り人から釣果情報を聞き取った． 釣果「適中」， 「見逃し」， 「空振り」 の３つのカテゴリ 19) を用いたは一般人から聞き取ったため， 魚種は一般名となり同定精度（図―2.1）． 閉鎖性空間における評価では， 空振りに対応すは悪い． アマモ場では，そりネットを沿岸方向（岸と平行方向）る評価方法として偽陽性が用いられるが 7)， 開放的な空間でにおよそ 50 m 程度を曳航してアマモ場内に生息する魚類をはこの用語が適切なものとは言えない． このことから， 本論文採集した． 採集した魚は， 専門家により可能な限り種レベルではこれらの評価方法を採用した．

まで同定した．

本章の構成は， 推定精度の評価を通じて環境 DNA 分析

そりネットによる採集は，2018 年夏季（9 月）と 2019 年冬季（1の概観をつかんだ後， 見逃しと空振りに影響する要因を整理

月） の広島県尾道と山口県笠戸湾においては 1 回のみ実施

し， 環境 DNA 分析によって得られた結果を取り扱う上でのし， 2019 年夏季の山口県笠戸湾 （7， 8 月） では 3 回， 神

注意点を抽出した．

奈川県久里浜 （6， 7 月） では 4 回実施した． なお， そりネッ
トのサイズはそれぞれの場所と年度で異なる （2018 年夏季及

2.2 魚類の推定精度の検証

び 2019 年冬季の広島県尾道・山口県笠戸湾，開口幅 1.5 m，(1) 本節の目的

網の目合い 10 mm；2019 年夏季神奈川県久里浜，開口幅 0.6

環境 DNA 分析による魚類の網羅的な解析では， 直接的m，網の目合い 3 mm；2019 年山口県笠戸湾，開口幅 0.6 m，な方法と同等もしくはそれ以上の種を推定できることが知られ網の目合い 0.8 mm)．

ている 5),8),18),20),21)． しかし， 沿岸域での応用を確かなものb） 環境 DNA 分析のための採水とするには， 推定精度に関する知見は未だに十分とは言えな環境 DNA 分析のための採水は， 釣果情報の聞き取り及びい．

そりネットによる調査と同じ日に行った （ただし， 神奈川県久

本節では， 釣り場とアマモ場において環境 DNA 分析で魚里浜においては 4 回のそりネット調査のうち 3 回のみで実施）．

種を推定し， 直接的な方法で得た魚種と比較し， 適中， 見

採水は， 海面から 0.5 m の層の海水を採取するよう行った．

逃し， 空振りの３つのカテゴリにより推定精度を評価した． 推

採水では， 事前に次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄したハイ定精度の評価を行った後， 見逃しと空振りの特徴を整理し，ロート採水器を用いた． ハイロート採水器は， 採水直前に採環境 DNA 分析による魚類の網羅的解析と直接的な方法との取する水で十分に共洗いした． 保存容器として 2 L のプラス間で不一致が生じる要因を抽出した．

チック滅菌瓶を採用した． 調査員は， 採水時の汚染を抑える(2) 方法ため， ラテックスロング滅菌手袋を装着して採水した． サンプa） 直接的な方法による魚類把握

ル中の DNA の分解を抑えるため， 採水後， 直ちに塩化ベ

環境 DNA 分析による推定精度は， 東京湾内の３つの釣り

ンザルコニウム 0.01% 溶液 （オスバン S） を 2 mL （サンプ

場 （図―2.2） と全国の３つのアマモ場 （図―2.3） を対象と

ル 1 L 当たり 1 mL） を添加した 22)． サンプルは， 採水後直して検証した．

ちに冷蔵保存し， 調査終了後に分析者へ冷蔵で輸送した．

—5—

(a)

(b)
20 km

Latitude, N

35° 30’

(c)

N

N

b

c
d

35° 00’100 m
139° 30’140° 00’

100 m

Longitude, E

(d)
N

100 m

図―2.2 環境 DNA 分析による推定精度を評価した東京湾における３つの釣り場． (a) ３つの場所の空間スケールと （b） 東京都若洲， （c） 神奈
川県本牧， （d） 神奈川県横須賀大津における採水地点と釣果情報の聞き取りを実施した場所 （点線枠内） を示している．

東京湾内の釣り場においては， それぞれの場所で護岸から

45

5 サンプルを採水した． アマモ場においては， 小型船舶でア500 km

マモ場まで行き， 船上から採水した． 2018 年夏季の広島県
Latitude, N (°)

尾道と山口県笠戸湾においては 3 サンプル， 2019 年冬季の広島県尾道と山口県笠戸湾においては 5 サンプル， 2019 年
夏季の山口県笠戸湾と神奈川県久里浜においては 24 サン
プル （1 回のそりネット調査当たり 8 サンプル） を採取した．
なお， そりネットによる調査は， アマモ場を攪乱させるため，
環境 DNA のための採水後に行った．

40

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35

ஂ㔛὾‴
➟ᡞ‴

30

c） 環境 DNA の分析方法

Pacific Ocean

MiFish を用いた環境 DNA 分析は， 環境 DNA の濃縮から130

精製まで， 精製した DNA の増幅及びタグ付け， DNA 配列

140

150

Longitude, E (°)

データの取得及び魚種の推定の流れで行われた． MiFish による推定の特徴は， 解析対象の絞り込みにこのプライマーを用いる点であり，精製した DNA に MiFish を添加してポリメラー

図―2.3 環境 DNA 分析による推定精度を評価した３つのアマモ場．
それぞれのアマモ場において， そりネットを使って魚を直接採取した．

ゼ連鎖反応 （PCR） によって 対象の DNA 領域を増幅した．

—6—

環境 DNA の濃縮におけるろ過量は， 2018 年夏季の広島b） 見逃しの特徴

県尾道以外の場所では概ね 2 L としたが， 可能な限りろ過す

見逃しが少ない一つの傾向として， 環境 DNA 分析のサンるよう努めたため 10% 程度のばらつきがある． 2018 年夏季

プル数が多いことが挙げられる． 山口県笠戸湾のアマモ場にの広島県尾道においてはサンプルに濁りがあったため， ろ過

おける 2018 年と 2019 年の夏季の環境 DNA 分析による推量は 1 L 程度とした．

定結果を比較すると， 2019 年のおいては 8 倍のサンプルで解 析 対 象 の 絞 り 込 み に お い て， 硬 骨 魚 類 に 共 通 す る2018 年よりも 20 種程度多くの魚種を推定している（図―2.4）．

MiFish-U と軟骨魚類に最適化した MiFish-E を必ず用いた．

そりネットによって採取された魚種の数も異なることから， 正確

また， 2019 年夏季の山口県笠戸湾と神奈川県久里浜のサンな比較はできないものの， サンプル数を増やすことは， 見逃

プルについては， 温帯の沿岸域に生息するアナハゼ類に最しを減らす重要なポイントであることが理解できる．

適化した MiFish-U2 も含めた３つのプライマーのセットで解析

魚種別に見逃しの特徴を見ると， アナハゼ類に最適化した

対象の絞り込みを行った．

MiFish-U2 の有無の影響が見られる． MiFish-U2 を用いた分析結果として， 推定された種ごとに読み取られた DNA の2019 年の夏季のアマモ場では Pseudoblennius （アナハゼ属）

数 （リード数） が記録される． リード数が 99 以下の魚種は，が推定されているものの （表―2.3）， 2018 年の夏季における推定精度が疑わしいと考え， 本論文では断りがない限り評価

山口県笠戸湾では見逃しとなっている （表―2.2）． 現在では対象から除外した． 解析対象として採用された魚種は検出とMiFish-U2 は広く使われていることから， この見逃しは今後問し， 検出と未検出の二値のデータとして扱った．

題にならなくなるものと考えられる．

d） 推定精度の評価方法

Sebastes （メバル属） は， 釣果情報の聞き取りとそりネット

環境 DNA 分析によって推定された魚種と直接的な方法にによる調査に係わらず， 見逃されやすい傾向にあった． また，

よって調べた魚種を比較し，それぞれの魚種について，適中，2019 年冬季の山口県笠戸湾では， Sebastes ventricosus （ク空振り， 見逃しの３つのカテゴリで評価した （図―2.1）． 環境ロメバル） が空振りとなっている一方で， Sebastes の多くの種

DNA 分析に関しては， 複数のサンプルを採取しているため，が見逃されている （表―2.2）． 2019 年の神奈川県久里浜とその推定されたサンプル数の割合 （出現頻度） も整理した．

山口県笠戸湾の比較では， 環境 DNA 分析では種の特定ま

ただし， 直接的な方法で得られた各魚種の個体数についてで至っていないものの Sebastes に属する種がそりネットによっは整理せず， １つの調査の中で 1 個体でも確認されれば検て採取されていることから， 緩い条件の下で適中として評価

出として扱った．

している （表―2.3）． 後述するとおり， Sebastes の複数の種

環境 DNA 分析による推定結果のうちの一部のデータセット

は，MiFish で解析する DNA 領域の配列が類似しているため，において， サンプル当たりの検出力とサンプル数の重要性を

環境 DNA 分析では特定に至らない傾向にある （2.3 と 3.3）．

示すため， サンプル数に対する期待種数の変化 （サンプル

Ditrema （ウミタナゴ属） と Takifugu （トラフグ属） も同様の傾数をサンプリングエフォートとした希薄化曲線 23)） を描いた．

向にあり， Takifugu に関しては， 2019 年冬季の広島県尾道また， ブートストラップ法により期待種数の 95% 信頼区間も求において見逃しとなっている Takifugu pardalis が解釈によっめた． この希薄化曲線の解析においては， 統計解析向けのては適中として評価できる （表―2.2）．

ソフトウェアのための言語である R24) の iNEXT パッケージをHippocampus （タツノオトシゴ属） と Pholis crassispina （タ使った 25)．

ケギンポ） は， 環境 DNA 分析では属のレベルでも適中した(3) 結果と考察ことがない （表―2.2 及び 2.3）． これらは， MiFish による推a） 適中， 見逃し， 空振り定が困難な魚種を反映しているか， もしくは環境 DNA が放推定精度の検証を行ったすべての場所において空振りが多出されにくい魚種である可能性もある． 今後， その原因の解

く， 環境 DNA 分析の方が直接的な方法に比べて多くの魚種明が進み， 分析精度の改善が期待される．

を推定できた （表―2.1， 表―2.2， 及び表―2.3）． 特に， 釣なお， S. ventricosus， S. cheni （シロメバル）， S. inermis （ア果情報との比較においては， 見逃しは本牧におけるアナゴとカメバル） は， 近年にようやく遺伝的に別種であることが解明

メバルのみであり，環境 DNA による適中率が高い （表―2.1）．

されたものの 26)， それまでは色の違いがある同一種として認なお， 東京都若洲の釣り人の多くは， カレイを狙った投げ釣

識されてきた経緯がある． このことから， 2019 年冬季の山口

りをしており， 釣果は確認されなかった． アマモ場における

県笠戸湾におけるこれらの見逃し及び空振りは， 直接的な方

そりネットによる調査結果との比較においてもやはり空振りの法による同定の精度に問題があった可能性も否定できない．

方が多いが， 釣果情報との比較と比べて見逃しが多く， 場所c） 空振りの特徴

によっては見逃した種数の方が適中の種数よりも多い （表―空振りとして推定された種数は多く， 環境 DNA 分析による

2.2）．

検出力の強さが理解できた． しかし， 空振りの中には生息し—7—

表―2.1 環境 DNA 分析による魚類の推定結果と釣果の聞き取り結果との比較 （2019 年 1 月）． 環境 DNA の採水はそれぞれの場所で 5 サンプルずつ採取し， それぞれの魚種が推定できた割合を示している．

評価
適中

東京都若洲

神奈川県本牧コノシロ （5/5）
カサゴ （5/5）
スズキ （3/5）
アジ （3/5）
ウミタナゴ （2/5）
ハゼ （1/5）
フグ （4/5）

見逃し神奈川県横須賀大津
カサゴ （5/5）
メバル （5/5）
クロダイ （5/5）
ウミタナゴ （5/5）
ハゼ （2/5）
フグ （4/5）

アナゴ
メバル
Seriola dumerili， カンパチ （1/5）
Salmo salar， タイセイヨウサケ （1/5）
Gadus macrocephalus， マダラ （1/5）
その他 12 種

空振り

Misgurnus anguillicaudatus，
ドジョウ （1/5）
その他 11 種

Thunnus thynnus，
タイセイヨウクロマグロ （5/5）
Salmo salar， タイセイヨウサケ （4/5）
Semicossyphus reticulatus，
コブダイ （1/5）
その他 37 種※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．
※東京都若洲では釣果情報は得られなかった．

表―2.2 アマモ場における環境 DNA 分析による魚類の推定結果とそりネットによる調査結果の比較． 広島県尾道と山口県笠戸湾の２つのアマモ場において夏季 （2018 年 9 月） と冬季 （2019 年 1 月） に実施した結果を示している． 環境 DNA の採水は，夏季においては 3 サンプル，
冬季においては 5 サンプルずつ採水し， それぞれの魚種が推定できた割合を示している． そりネットの調査は， 環境 DNA の採水と同じ日に 1 回実施した．

評価

山口県笠戸湾

広島県尾道
夏季

冬季

夏季

冬季

適中

Acentrogobius pflaumii (1/3) Acentrogobius pflaumii (3/5)
Acentrogobius sp. (4/5)
Acentrogobius sp. (2/3)
Favonigobius gymnauchen (2/5)
Takifugu niphobles (5/5)

Acentrogobius pflaumii (2/3)
Acentrogobius sp. (2/3)
Gymnogobius heptacanthus (3/3)
Rudarius ercodes (1/3)
Siganus fuscescens (1/3)
Stephanolepis cirrhifer (2/3)

Favonigobius gymnauchen (2/5)
Gymnogobius heptacanthus (4/5)
Hexagrammos agrammus (4/5)
Paracentropogon rubripinnis (3/5)

見逃しHippocampus sp.
Inimicus japonicus
Platycephalus sp.
Rudarius ercodes
Syngnathus schlegeli

Acanthopagrus latus
Repomucenus curvicornis
Rudarius ercodes
Syngnathus schlegeli
Takifugu pardalisParacentropogon rubripinnis
Pholis crassispina
Pseudoblennius sp.
Sebastes cheni
Sebastes inermis
Sebastes schlegelii
Syngnathus schlegeli

Sebastes cheni
Sebastes inermis
Sebastes oblongus
Sebastes schlegelii

空振り

16 種

18 種

Carassius auratus，
キンギョ (1/3)
Katsuwonus pelamis，
カツオ (1/3)
Nipponocypris temminckii，
カワムツ (1/3)
Odontobutis obscura，
ドンコ (1/3)
Tribolodon hakonensis，
ウグイ (1/3)
Zacco platypus， オイカワ (1/3)
その他 21 種

31 種※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

—8—

表―2.3 アマモ場における環境 DNA 分析による魚類の推定結果とそりネットによる調査結果との比較． 神奈川県横須賀市久里浜 （2019 年 6 月， 7 月） と山口県笠戸湾 （2019 年 7 月， 8 月） で実施した結果． 環境 DNA の採水は， 24 サ
ンプルずつ採水し， それぞれの魚種が推定できた割合を示している． 環境 DNA の採水は合計で 3 回実施した （1回当たり 8 サンプルの採水）．そりネットの調査結果は，それぞれの場所環境 DNA の採水と同じ日に 1 回ずつ実施し，久里浜湾においてはさらに 1 回追加した．

評価
適中

神奈川県久里浜湾

山口県笠戸湾

Acentrogobius pflaumii (21/24)
Aulichthys japonicus (1/24)
Ditrema viride (24/24)
Favonigobius gymnauchen (10/24)
Gobiidae (24/24)
Heteromycteris japonica (1/24)
Paracentropogon rubripinnis (22/24)
Plotosus japonicus (2/24)
Pseudoblennius cottoides (7/24)
Pseudoblennius percoides (7/24)
Pterogobius (5/24)
Rudarius ercodes (14/24)
Sebastes cheni (19/24)
Sebastes inermis (19/24)
Syngnathus schlegeli (1/24)
Takifugu pardalis (23/24)

Acentrogobius pflaumii (13/24)
Paracentropogon rubripinnis (1/24)
Pseudoblennius cottoides (3/24)
Rudarius ercodes (9/24)
Sebastes cheni (15/24)
Sebastes inermis (15/24)
Syngnathus schlegeli (1/24)

見逃しApogonichthyoides niger
Hippocampus coronatus
Pholis crassispina

Hippocampus coronatus

空振り

Carassius cuvieri， ゲンゴロウブナ (1/24)
Cyprinus carpio， コイ (21/24)
Oncorhynchus sp.， タイヘイヨウサケ属の一種 (1/24)
Paramisgurnus， ドジョウ属 (1/24)
その他 58 種

Carassius spp.， フナの種 (3/24)
Lepomis macrochirus， ブルーギル (1/24)
その他 44 種※プライマーは， MiFish-U， MiFish-U2， 及び MiFish-E を用いた．
※ Ditrema viride， Sebastes の 2 種， Takifugu pardalis については， それぞれ， 環境 DNA で Ditrema sp.， Sebastes sp.，
Takifugu sp. として推定されたものを適中として評価している．
※ Pseudoblennius cottoides は， 環境 DNA 分析で推定されていたものの近縁種であることから Pseudoblennius percoides に含めて整理されていた． このことから， ここでは， 環境 DNA 分析で Pseudoblennius percoides として推定されたものを適中として評価している．

No. of species

60

40

20

0
1

5

10

15

20

24

No. of samples
図―2.4 環境 DNA 分析によって推定された魚類の種数に関するサンプルベースの希薄化曲線の比較．山口県笠戸湾における夏季の 2018 年（青色，
全 3 サンプル；MiFish-U 及び MiFish-E） と 2019 年 （赤色，全 24 サンプル；MiFish-U，MiFish-U2，及び MiFish-E） の結果を示している．
ハッチは 95% 信頼区間を示している．

—9—

ているはずがないと考えられる種も推定された． 例えば， 横

７つの場所 （図―2.5 に示す Site1 から 7） で採水した． サン

須賀大津で検出されたクロマグロ （表―2.1）， 横須賀大津，

プルは， Site6 以外の６つの場所においては， 陸上から海へ

若洲， 横須賀久里浜で検出されたタイセイヨウサケ （表―2.1

アクセスして 1 L のプラスチック滅菌瓶を用いて手で採水する

及び 2.3），笠戸大島で検出されたキンギョやブルーギル等（表か， 次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄済みのバケツで採水し―2.2 及び 2.3） は， その場にいるとは考えにくい．

た． バケツによって採水したサンプルは， 1 L のプラスチック

舞鶴湾においてマアジを対象とした環境 DNA 分析では卸

滅菌瓶へ移し替えた． それぞれの方法では， ラテックスロン

売市場周辺で高い DNA 濃度が検出されており， 人間活動

グ滅菌手袋を装着して採水したが， 手によって採水する場合による影響を強く受けた結果が示されている 10)． 横須賀大津においては， 手が海水に浸らないよう注意した． Site6 におの調査地点付近にも魚市場があり， 出現頻度が高かったクロ

いては， 港湾空港技術研究所が東京湾フェリーのかなや丸

マグロとタイセイヨウサケは， その影響を受けた可能性がある．

に設置している水質測定装置から海水を分取した． 採水後，また， ブルーギルは自然由来であったとしても， 調査対象と直ちに冷蔵保存し， 調査終了後に２つのサンプルを別々のした海に生息していたとは考えにくく， 陸域からの影響を受け分析者 （A 社と B 社） に送付した．

たものと推測される． このような過剰な推定は， 沿岸域だけで分析の過程については，2.2 で記述したとおりである． また，なく閉鎖性空間でも見られ 6),7)， 環境 DNA 分析における重両社ともに， ろ過量は 1 L 程度とし， アナハゼ類に最適化し要な注意点と言える． 過剰な推定の要因については 2.4 でた MiFish-U2 を用いていない． しかし， それぞれの分析過

詳細に検討する．

程の中で用いられる試薬や細部の処理方法については， 分(4) まとめ析者のノウハウが用いられている．

本節では， 釣り場とアマモ場において MiFish を用いた環

A 社は， リード数等から推定結果の妥当性を検証した後の境 DNA 分析による魚類の推定精度の把握を行った． この結検出 ・ 未検出の二値の結果を報告した． B 社は推定された果， 釣果情報や網による直接的な手法に比べてより多くの魚種のリストをリード数の結果と共に報告した．

種を推定できることを確認した．

b） 解析方法

しかし， 見逃しのケースもあった． 見逃しを減らすためには，二社の検出力を比較するため， それぞれから報告された

採水 ・ ろ過量を増やしてサンプル当たりの検出力を高めるか，サンプルの数を多く取ることが重要である． 近年新しく開発された MiFish-U2 はアナハゼ類の推定精度を改善させたが，

Site3

MiFish による特定が困難な種もいた．この困難さについては，

Site4

今後の技術開発による解決が期待される．
また，その場には生息していないと考えられる種の推定 （過剰な推定） があることも示した． 過剰な推定については， 人

35° 30’間活動や他の場所に由来した環境 DNA が影響している可Latitude, N

能性があり， 2.4 において詳細に検討する．
2.3 検出力と同定精度―分析者間の比較―(1) 本節の目的

Site5

Site2

Site7

MiFish を用いた環境 DNA の分析方法は， 標準的な方法が確立されており 1)， 分析者によって大きく異なることはない．

Site6

しかし， 分析過程の中の個別の処理方法については， 分析
35° 00’者のノウハウが活かされており， このノウハウの違いによって

Site1

推定結果に差が生じる可能性が考えられる．
本節では， 同じ場所で同時に採水した環境 DNA サンプルを２つに分けて異なる分析者によって推定した結果を比較し，139° 30’

分析者の違いによる検出力及び同定精度の差を検証した．

140° 00’

Longitude, E(2) 方法a） 調査及び分析方法

図―2.5 東京湾周辺において環境 DNA のサンプルを採取した場所．
中抜きの丸は A 社のみ， Site1–7 は A 社と B 社の二社が分析した地点を示している．

異なる分析者による検出力と同定精度を比較するため，
2018 年 1 月に茅ケ崎から房総半島先端までの東京湾周辺の— 10 —

この影響の除去は環境 DNA 分析において重要な要素となる

表―2.4 環境 DNA 分析による魚類種数の推定結果の分析者間の比較． サンプルは同じ場所 （図―2.5 参照） で同時 （2018年 1 月） に採水したものであり， 分析までの過程は同じである． B 社においてはリード数が 99 以下のものを棄却した
結果 （100 以上の種を採用） とすべての結果の両方を併記している．

場所

Site1
Site2
Site3
Site4
Site5
Site6
Site7

B社

24
18
17
24
29
36
28

リード数 ≥100
13
24
6
10
8
4
0

た可能性が考えられる．
検出力は， 分析上の影響に限らず， 採取する底泥の量 28)
や水のろ過量 29) 等のサンプルサイズの影響も受ける． この

共通種数

出現種数
A社

1),21)． この影響の除去が分析者の間の検出力に差をもたらしように多重の要因が影響する検出力を標準化することはおそ
すべて
14
33
9
12
11
4
0

らく困難であり， 環境 DNA 分析によって推定された種数を単純に比較することに生態学上の意味はないと言える．

6
4
1
5
6
3
0

b） 二社で検出された種の傾向
二社の比較をした場所のうち， B 社が推定できなかった
Site7 を除き， すべての場所で共通する種が存在した （表―2.4）． Site4 における共通の種は 5 種であり，翌年 （2019 年）に実施した環境 DNA 分析において 3/5 以上の頻度で推定さ※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．
※共通種数については，B 社のいずれの結果と比較しても同じである．

れた 8 種のうちの 4 種がこの共通種であった （表―2.5）． この 4 種の Acanthopagrus sp. （クロダイ属の一種）， Konosirus
punctatus （ コ ノ シ ロ ）， Lateolabrax japonicus （ ス ズ キ ），

種数をウィルコクソンの符号順位検定 （Wilcoxon signed-rank

Mugil cephalus （ボラ） は， 若洲周辺に生息している一般的test） を用いて比較した． B 社の推定結果については， 本論

な魚種である． 翌年に 3/5 以上の頻度で推定された残りの 4文で採用している棄却ルール （リード数が 99 以下は棄却）

種の内訳は， A 社のみで推定された種が 2 種， B 社のみでに則って推定した場合に加え， そのルールを適用せずにリス推定された種が 1 種， どちらの社でも推定されなかった種がトされた種すべてを推定した場合の２つを対象として， 棄却

1 種である． 2019 年の環境 DNA 分析で 3/5 以上の頻度でルールの感度解析を行った．

推定された 8 種に限定して見れば， 分析者の間の検出力に

本節で比較した７つの場所のうち Site4 は， 釣果情報との比大きな差はない．

較 （2.2） を行った東京都若洲である． 本節における二社のc） 同定精度の差推定結果と併せて東京都若洲の結果を比較することで， 二同定精度においても分析者の違いによる差が見られた．

社の間で結果が異なった原因を検証した． なお， 東京都若Acanthopagrus schlegelii （ ク ロ ダ イ ）， Ditrema temminckii

洲の採水はおよそ１年のずれがある． その分析については，

temminckii （ウミタナゴ）， Hexagrammos agrammus （クジメ），

比較対象の二社のうちの一社が請け負った．

Sardinops melanostictus （マイワシ）， Sebastes ventricosus （ク(3) 結果と考察ロメバル）， Takifugu niphobles （クサフグ） に関して， 一方のa） 検出力の差

分析者は属の一種として同定していた． これらは， MiFish に東京湾周辺の７つの場所における環境 DNA 分析による推よって特定しにくい魚種であり （2.2）， 一方の社が慎重に検定結果は，A 社で 17 から 36 種，B 社で 0 から 24 種であった（表討して属の一種までの同定に留めた可能性がある．

―2.4）． その内訳は６つの場所で A 社の推定種数の方が多(4) まとめく， 検出力は A 社の方が有意に高かった （Wilcoxon signed-

本節では， 同じサンプルであっても分析者の違いによってrank test; W+ = 27, p = 0.034 < 0.05）． しかし， 棄却ルールを

分析上の検出力に差があることを示した． また， 検出力は，採用しない B 社の種数と比較すると， 二社の間で有意な差分析者の違いの他にも多重な要因が影響することから， 標準は得られなかった （W+ = 24, p = 0.109）．

化することは困難であり， サンプル当たりの種数に生態学上これらの比較は， 分析上の検出力の差は， 結果の取り扱の意味を持たせることはできない． ただし，検出力に差はあっいに依存するものの実際にあった可能性を示している． 環境ても， 出現頻度が高い種は推定されやすい傾向にあった． こ

DNA 分析の検出力は， ろ過量やフィルタの孔径等の DNAのことは， 検出力に差が多様性比較において問題とならない抽出過程や PCR サイクルや温度等の分析条件の影響を強く可能性を示唆している （3.2）．

受けることが知られており 16),27)， 分析過程の中の分析者のノまた， 分析者が違えば同定精度も異なる可能性を示した．

ウハウの違いが検出力の差の要因になったものと考えられる．

環境 DNA 分析の技術やデータベースは日々進歩しているこB 社が検出できなかった Site7 のサンプルは， 海岸の波打とから， 同じ分析者であっても分析手法の改善に伴って同定

ち際で得られたものであり， 砂等の夾雑物の混入が避けられ精度が変化することも十分に考えられる． 同定精度の差は，なかった． 夾雑物は PCR における阻害要因になることもあり，多様性比較の解析に影響を及ぼすため （3.3）， 十分な注意— 11 —

表―2.5 環境 DNA 分析によって推定された魚種の分析者間の比較． サンプルは， 東京都若洲 （図―2.5 におけるSite 4） で同時 （2018 年 1 月） に採水したものであり， B 社においてはリード数が 99 以下のものを棄却した
結果を示している． また， ほぼ同じ場所 （図―2.2b） で１年後 （2019 年 1 月） に採水して推定した結果を示している． 2019 年 1 月については， 5 サンプル採水しており， その推定割合を示している．

カテゴリ

2018 年 1 月
魚種名

A 社分析

B 社分析
検出
検出
検出
検出
検出

共通検出種

Acanthopagrus sp.
Konosirus punctatus
Lateolabrax japonicus
Mugil cephalus
Rhynchopelates oxyrhynchus

検出
検出
検出
検出
検出

一社のみの検出種

Acanthogobius flavimanus
Carassius auratus langsdorfii
Chasmichthys dolichognathus
Chasmichthys gulosus
Cololabis saira
Dictyosoma burgeri
Engraulis japonicus
Lepomis macrochirus
Misgurnus anguillicaudatus
Omobranchus punctatus
Parapristipoma trilineatum
Plecoglossus altivelis
Repomucenus sp.
Rhinogobius sp.
Rhodeus ocellatus ocellatus
Salmonidae
Sebastes sp.
Sebastiscus marmoratus
Theragra chalcogramma
Tribolodon brandtii
Tridentiger obscurus
Tridentiger trigonocephalus
Tripterygion etheostoma
Zacco platypus

検出
検出
検出
検出
検出
検出
検出
検出
検出

未検出種

Dasyatis akajei
Gadus macrocephalus， マダラ
Pagrus major
Parablennius yatabei
Sardinella zunasi
Seriola dumerili， カンパチ
Seriola quinqueradiata2019 年 1 月
（B 社）
4/5
5/5
3/5
5/5

4/5

4/5

検出
検出
検出
検出
検出
検出
検出

(1/5)
検出
検出

検出
検出

3/5

検出
検出
検出
検出
(2/5)
(1/5)
(1/5)
3/5
(2/5)
(1/5)
(1/5)

※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

が必要である．

おける検証で偽陽性 （空振り） が生じた種の傾向として， 他のサンプルとの同時分析による混入， 他の水槽からの混入，

2.4 過剰な推定の傾向

及び水槽で撒かれた餌を由来としたもの等を挙げている． す(1) 本節の狙い

なわち， このことを現地調査に当てはめて考えると， 過剰な空振りは環境 DNA 分析の大きな強みだが， 人間活動に推定は， 分析上のもの， 調査方法によるもの， 調査場所に由来したり， 自然由来であったとしても遠くから運ばれた環境

よるもの等の多様な要因に起因しているものと推測できる．

DNA を検出したものと考えられる空振りもあった （2.2）． この

本節では， 過剰な推定における調査者の立場からの原因

ような過剰な推定は， 沿岸域だけでなく閉鎖性空間でも見らを検証することを目的とし， まず， 調査方法に起因する汚染れ 6),7)， 環境 DNA 分析における推定結果を取り扱う上で重の程度を検討するため， フィールドブランクを用いたネガティ

要な注意点である． Miya et al. (2015)7) は， 水族館の水槽にブコントロールを行った． 次に， 調査場所に起因する汚染の— 12 —

表―2.6 ネガティブコントロールで検出された例． 計 15 サンプルのブランクサンプルのうち， 3 サンプルで検出された． カッコ内の数字はリード数を表している．

程度を検討するため， 東京湾周辺の沿岸域において， 対象場所に生息する生物以外を由来とする環境 DNA 分布の把握を試みた．
(2) 方法

サンプル名
サンプル１

検出された魚種とリード数
Mugil cephalus，ボラ （4）サンプル２Barbatula barbatula，フクドジョウ （72559）
Mugil cephalus，ボラ （4）サンプル３Acanthopagrus schlegelii， クロダイ （1016）
Cyprinus carpio， コイ （619），
Scomber australasicus， ゴマサバ （258）a） ネガティブコントロール
ネガティブコントロールとは対照実験の一つであり， 陰性（MiFish で検出されないこと） が分かっているブランクサンプ
ルを同時に分析することで， 見ようとするサンプルの正味の効
果を見るものである．
ネガティブコントロールは 2019 年夏季の神奈川県久里浜と※プライマーは， MiFish-U， MiFish-U2， 及び MiFish-E を用いた．

山口県笠戸湾の調査において実施した．ブランクサンプルは，調査前に滅菌済み容器に超純水 （Milli-Q） を入れて封をし， それ以外は環境 DNA サンプルと同様に取り扱った （図―2.6）． 環境 DNA サンプル 4 本に 1 本の割合 （郵送単位）でブランクサンプルを入れ， 分析者に輸送して分析した． 分析したブランクサンプルは計 15 本であった．
b） 過剰な推定の種の分布の把握
過剰な推定の種の空間分布を把握するため， 茅ケ崎から房総半島先端までの東京湾周辺の 30 地点において採水を行った （図―2.5）． 調査は， 2018 年 1 月に 4 班により１日のうち㉸⣧Ỉに実施した． その他の方法については 2.3 における方法と同じであり， A 社が分析した．

Ვໟ(3) 結果と考察⁛⳦῭ࡳᐜჾ

a） ネガティブコントロール
ブランクサンプルにおいて， 15 本のうち 3 本から 5 種の魚㍺㏦㸪ศᯒが検出された （表―2.6）． 2 本のブランクサンプルで検出さࢧࣥࣉࣝ᥇Ỉ

れた M. cephalus はリード数が一桁であることから， 本研究においては排除される対象であり結果に影響することはない．

図―2.6 ネガティブコントロールの説明． 超純水を入れたブランクサ
ンプルを容易し， サンプル採水以外の過程を現地サンプルと同様に扱い分析した．

しかし， その他の 4 種は高いリード数で検出された．
ブランクサンプルで検出される理由の一つとして， 分析中Carassius auratus langsdorfii

Lepomis macrochirus

Misgurnus anguillicaudatus

Salmonidae
Zacco platypus

139° 30’

139° 30’

139° 30’

139° 30’

Latitude, N

35° 30’35° 00’140° 00’

140° 00’

140° 00’

140° 00’

Longitude, E
図―2.7 東京湾周辺において生息しないと考えられるものの環境 DNA 分析によって推定された魚種の分布 （A 社による分析結果）． 例として，
4 パターン （5 種） の推定結果を示している． プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

— 13 —

表―2.7 東京湾周辺において環境 DNA 分析によって推定されたものの生息しないものと考えられるもののうち， 多くの地点で推定された魚種 （A社による推定結果）． サンプルを採水した全 30 地点及び分析した二社の比較をした 6 地点の中で出現した地点数を示している．

魚種名
Anguilla japonica， ニホンウナギ
Carassius auratus langsdorfii， ギンブナ
Cololabis saira， サンマ
Misgurnus anguillicaudatus， ドジョウ
Plecoglossus altivelis， アユ
Rhinogobius sp.， ヨシノボリ属の一種
Salmonidae， サケ科
Silurus asotus， ナマズ
Theragra chalcogramma， スケトウダラ
Zacco platypus， オイカワ

出現地点数30 地点中 6 地点中
17
3
29
6
30
6
29
6
21
4
27
6
30
6
22
4
30
6
30
6

※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

された． 淡水魚の L. macrochirus （ブルーギル） も 2地点のみであるが推定された． Salmonidae （サケ科）
は全ての地点で推定された．
淡水魚の環境 DNA は河川を由来したものと考えられるが， 大きな河川から離れている湾口付近においても推定されていることから， DNA は海水中でも分解されずに流れに伴って湾内に拡がったものと考えられる． Salmonidae （サケ科） は， 東京湾に生息している可能性もあるものの， 広く定着しているとは考えにくい．
人間活動に伴って東京湾内に流入した後に残存した
環境 DNA や洋上養殖を由来とした環境 DNA が検出された可能性が考えられる．
これら 5 種の他にも， 広い範囲で推定されたものの生息が疑わしい魚種は多い （表―2.7）． 魚類の環境
DNA は， 自然に近い環境下では 1 日の内に半減期を迎え， 数日程度で検出できなくなるが （表―2.8），の汚染は広く認識されている 1),7)． 特に， 増幅された後の河川のような流れが速い場所では 240 m 下流側でも検出さ

DNA 濃度は濃くなっていることから， 他のサンプルの汚染のれる 34)． また，底質に吸着する環境 DNA は，量が多く，かつ，

原因となりやすい． また， 例え実験室で扱っていたとしても共長く保持されるため 35)， 河川由来の環境 DNA が， 底質に用で使う Milli-Q 水は汚染の原因となりやすい． 本研究で見吸着した状態で沿岸域に流下した可能性は十分にある． 分られた汚染がどの過程で生じたのか定かではないが， 本結析感度が高ければ， たとえその量がわずかでも検出されるも果は， ブランクサンプルを活用して， 一連の調査の精度を監のと考えられる．
環境 DNA の劣化の速度は， 水質 30) や水温 31) によって視することの重要性を示している．
b） 過剰な推定の種の分布の把握

変動することから， 季節的にも変動することが予想される． ま

東京湾周辺の広い範囲においては， 生息しないと考えられた， 環境 DNA の放出量は魚種 33) やそれぞれの魚の生活る多くの種が推定された（図―2.7）． C. auratus langsdorfii（ギ史 32) によっても変化する． 本論文で示した東京湾周辺でのンブナ）， M. anguillicaudatus （ドジョウ）， Z. platypus （オイ

過剰な推定のスナップショットは冬季のものであるが， 他の季カワ） は淡水魚であるにも係わらず， ほぼ全ての地点で推定

節では環境 DNA の放出や劣化の要因が変化し， 異なった表―2.8 環境 DNA の劣化実験に関する既往の研究． 半減期に関して， 報告されている論文についてはそのまま記載し， 指数関数の係数のみを報告している論文については，その係数に基づいて本論文で算出した． <DL は，DNA が検出限界よりも下回るまでの日数を意味している．

半減期
(hrs)

<DL
(days)

淡水魚
Cyprinus carpio， コイ
Cyprinus carpio， コイ
Cyprinus carpio， コイ
Cyprinus carpio， コイ
Lepomis macrochirus， ブルーギル （稚魚）Lepomis macrochirus， ブルーギル （成魚）
Plecoglossus altivelis altivelis， アユ
Plecoglossus altivelis altivelis， アユ
Plecoglossus altivelis altivelis， アユ

6.6
20.5
4.9
2.8
5.3–6.0
4.4–13.6
19.6
4.9
2.8

4.2

海水魚
Platichthys flesus， ヨーロッパヌマガレイ
Gasterosteus aculeatus， イトヨ
Engraulis mordax， カタクチイワシ
Sardinops sagax， カリフォルニアイワシ
Scomber japonicas， マサバ

51.7
23.7
6.9
10.2–12.2
9.9–12.6

6.7
0.9

実験対象

実験条件
光

水槽

25.0° C
10.0° C
20.0° C
30.0° C自然光

4 L 水槽30)

4 L 水槽31)

3.4–64.8 L の
循環水槽

32)

10.0° C
20.0° C
30.0° C

4 L 水槽31)

15.0° C 12 時間日夜ｻｲｸﾙ

54 L の循環水槽

5)22.0° C
18.7° C
18.7° C

5200 L の循環水槽

33)20.0° C 12 時間日夜ｻｲｸﾙ— 14 —

出典

水温分布になる可能性もある．

3.2 検出力の違いに着目した比較解析への影響の考察(4) まとめ(1) 本節の目的

過剰な推定の原因となる調査に起因する汚染の程度を検討

本節では， 種数比較における検出力の差の問題を回避でし， 東京湾周辺に生息しないと考えられる種の抽出を試みた．

きる可能性のある指数を採用し， その機能について説明した．

この結果， 調査に起因する汚染は， 頻度は低かったものの

種組成の比較については， 比較に重要となる種の特徴を整

過剰な推定の要因となり得ることを示した． その原因の特定

理し， 第 2 章で抽出された注意点が解析に影響するメカニズ

は難しいものの， 環境 DNA 分析のための調査では， 一連ムを考察した．

の作業の決まり事として組み入れて， 調査・分析の質のチェッ(2) 方法クに使うことが推奨される 1)． また， 対象場所には生息しないa） データセット

ものの河川や人間活動に由来する環境 DNA が東京湾内に例題として， アマモ場における環境 DNA 分析によって得ら

広く分布し， 環境 DNA 分析で検出されてしまうことが明らかれた， それぞれ， 12 サンプルを含む４つのデータセットを用となった． このような過剰な推定は， 多様性の解析を行う上いて考察した． 期待種数は， 赤色の２つのデータセットにおで大きく影響することから取り扱いに十分な注意が必要である

いて同程度でサンプリングエフォートの増加に伴った変化を（3.3）． 今後， 環境 DNA 分析の沿岸域における応用を高度示し， 青色の２つのデータセットの期待種数はそれらよりも低化するためには， これらの過剰な推定の知見を積み重ねてい （図―3.1）． しかし， データセット間でサンプル当たりの検いくことが重要である．

出力が違えば， 種の多様性を比較したことにはならず， これらの差が生態学的な差によるものかどうか， この比較から判

2.5 結論断することはできない．

沿岸域を対象として， MiFish を用いた環境 DNA 分析によb） 種数比較―検出力の違いの回避―

る魚類の推定精度を把握した結果， 環境 DNA 分析による推Chao & Jost (2012)36) は， サンプリングエフォートを標準化

定は， 直接的な方法と比べてより多くの魚種を推定できること

した 0 から 1 の値を取る sample coverage と呼ばれる指標を導を確認した．採水によって魚類推定する環境 DNA 分析では，入し， これが種数の比較において標準化の指標になることを現場での作業量も直接的な手法に比べると格段に少なく， 現主張している． Sample coverage は， 検出力の差から独立し地調査の有効な手段になると考えられる．

た指標であることから， この指標を基準にすることで種数を公

ただし， 環境 DNA 分析による推定に特有の注意点も見出平に比較できる可能性がある （付録 A）． ここでは， sample

された． 一つは， 検出力と同定精度が分析者に強く依存すcoverage に着目し， ４つのデータセット間の種数の比較を検る点であり， 異なる分析者によって推定された結果に基づい討した． サンプルベースの希薄化曲線と sample coverage のて種数や種組成を比較する際に問題になることが予想され算出ついては， R24) の iNEXT パッケージ 25) を使った．

る． もう一つの注意点は過剰な推定であり， 誤った魚類分布c） 種組成解析―検出力の違いの影響の検証―の推定を導く恐れがある． これらの注意点については， 応用

魚類の種組成は様々な角度から見て理解する必要がある

方法ごとに具体的な影響を分析し， その回避方法に関するが， 最もシンプルでかつ重要な見方として， 視覚的に見るこ知見を積み重ねていく必要がある．
80

3.1 はじめに
環境 DNA 分析による網羅的な推定の応用方法の一つとして， ２つ以上の推定結果を比較した多様性の評価が想定される． 前章で示したとおり， 環境 DNA 分析による検出力を

No. of species

3． 抽出された注意点の多様性評価への影響と回避方法

40

標準化することは難しく， 同定精度についても分析者に依存0

する可能性があることから， これらが種数や種組成の比較に1

影響することが予想される． また， 過剰な推定についても，

612No. of samples

当然， その比較における懸念となる． 本章では， 多様性評
価に焦点を合わせ， 第 2 章で抽出された注意点が種数と種組成の比較の解析にどのような問題を生じさせるのか考察し，その回避方法を示した．

図―3.1 多様性比較の例題として用いた４つのデータセットの希薄化曲線． それぞれのデータセットは 12 サンプルで構成されている．
ハッチは 95% 信頼区間を示している．

— 15 —

と （視覚化） がある． 種組成は， 通常， それを構成する種法であり， 類似度をそのままの形で視覚化するよりも頑健での数の次元を持つ複雑な構造を有するが， ２つの場所の魚

あ る 39)–41)． nMDS に よ る 二 次 元 化 の 適 切 さ に つ い て は，類の塊が明確に違えば， その違いは直観的に理解できる．

STRESS と呼ばれる指標で評価した． STRESS は 0.2 以下でこの違いを分かり易くするための技法として， 視覚化が使わあれば問題は生じていないとされ， 0.05 以下であれば非常にれる．

よい結果とされている 40),41)． PERMANOVA と nMDS は， R

サンプル間の種組成の類似性を表現するため， 類似度等の vegan パッケージ 42) を用いて解析した．

の距離が提案されている． この距離として， いろいろな尺度

種組成の違いの視覚化に対して貢献する種を検証するたに基づいたものが提案されているが， 本論文で対象とする環

め， ３つの異なる出現頻度のグループに分け， 各グループ

境 DNA 分析では検出 ・ 未検出 （在 ・ 不在） の二値を扱うの下で nMDS 解析を実施した． 出現頻度については， 12ことから， これらに基づいた Sørensen （0 から 1 までの値の指サンプル中， 9 から 12 サンプルに出現した高頻出な種のグ数） によりサンプル間の類似性を表現した 37)． なお， 在 ・ループ， 1 から 4 サンプルにしか出現しなかった低頻出な種

不在に基づいた類似度として， 他にも Jaccard があるが， このグループ， それら以外の中頻出な種のグループの３つにれらの類似度の間に大きな違いはない． データセット間で分けた．

の 類 似 度 の 違 い は Permutational Multivariate Analysis of(3) 結果と考察

Variance （PERMANOVA） 38) で検定した．

a） 出現確率の推定

次に， ４つのデータセットの種組成を視覚化するため， 非

複数のサンプルがあれば， あるサンプル数だけ出現した種

計 量 多 次 元 尺 度 法 （Nonmetric multidimensional scaling ：の数を示す頻度分布を描くことができ （図―3.2a）， この分布

nMDS） を用いて二次元化した． nMDS は， 類似度の大きより， 多くのサンプルで出現した種 （出現確率が高い種） とさに従って順位付けをしたものを低次元化する多変量解析

少ないサンプルで出現した種 （出現確率が低い種） の数を

(a)

(b)

0

1

6

12

No. of species

300Sample coverage

30

1.0

0.8

0.6

0.4
1

6

1

12

6

12

No. of samples

30

(c)
80
1

6

12

30

0

1

6
12
No. of samples

No. of species

0

40

0
0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Sample coverage
図―3.2 ４つのデータセットの構成と種数比較の例． （a） 種が出現したサンプル数とその種数の関係， 及びそれぞれのデータセットにおける（b） サンプル数の増加に伴う sample coverage の変化と （c） sample coverage に対する種数の変化． 種数については， 95% 信頼区間も示している． Sample coverage についても 95% 信頼区間を描くこともできるが， 煩雑になるためここでは示していない．

— 16 —

把握できる． 出現頻度とその種の数より， 確率論に基づいたの青色のデータセットの種数の間に生態学的な差はないもの

様々な予測が可能となる． その予測の中で最も重要となるもの， 青色下三角は検出力が高いことからサンプル当たりの種のが未出現種数の推定である 43)–45)． この推定により， 調査数が多く， そこに差があったように見えただけであると解釈で対象場所における sample coverage の把握が可能となる （付

きる．

録 A）．

c） 検出力の違いの影響の検証b） 種数比較における検出力の違いの回避

種 組 成 は デ ー タ セ ッ ト 間 で 異 な り （PERMANOVA ；Sample coverage を４つのデータセットに適用すると， すべ

pseudo-F3,44 = 15.1， p < 0.001）， nMDS でも青色と赤色の違てのデータセットにおいて， １つのサンプルで 0.6 から 0.7 程

いと青色の中でも上三角と下三角との間で違いを視覚化でき度の充足率で種を観測できており， その指数は２つ目のサンた （図―3.3）． 異なる出現頻度別の nMDS を見ると， 明らか

プルになると 0.1 程度増加している （図―3.2b）． しかし， さに高頻出な種 （12 サンプル中， 9 から 12 サンプルに出現すらにサンプルを増やしても sample coverage は上がりにくく，る種） の種組成がデータセット間で異なっており （図―3.4），

12 サンプルを採ったとしても 0.8 から 0.9 程度に留まっている．

出現頻度の高い種が全体の視覚化に貢献していることが理

２つの青色のデータセットの種数は， サンプリング数に対す解できる．

る期待種数の変化 （希薄化曲線） で比較すると差があるよう二次元化の STRESS に関しては高頻出な種のグループのに見えたものの （図―3.1）， sample coverage に基づいて比ものが， 非常によい結果とされる 0.0540),41) を下回っている．

較すると差はなくなった （図―3.2c）． これらの結果は， ２つ

このことは， 高頻出な種の組成の差は低次元的であることを意味しており， その差があれば， 環境 DNA 分析の結果が表で出力されていたとしても， その違いは直感的にイメージしやすくなる． また， 分析上の検出力に差があったとしても出STRESS = 0.15

現頻度が高い種は推定されやすいことから （2.3），このことは，分析上の検出力の差は， 種組成の比較において， さほど重要にならない可能性を示唆している．
(4) まとめ
本節では， 環境 DNA 分析の検出力の差が種数と種組成の比較に及ぼす影響を考察し， 種数に関してはその回避方法を提示した． 本節の１つ目の成果は，Chao & Jost (2012)36)によって提案された sample coverage の採用であり， これに基づけば， 検出力に差があったとしても種数を公平に比較できる可能性があることが示された． また， 分析上の検出力の違いに限らず， 調査時のサンプルサイズの影響 28),29) や抽出

図―3.3 ４つのデータセットを対象とした種組成比較． 非計量多次元尺度法 （nMDS） による種組成の視覚化の結果を示している．

までの環境 DNA の劣化 22) の影響も標準化できる可能性が

1-4 samples

5-8 samples

9-12 samples

675(66§ QRWFRQYHUJHGSTRESS = 0.10

STRESS = 0.04

図―3.4 ４つのデータセットを対象とした種組成比較の分析． それぞれのデータセットの中で 1 から 4 サンプルのみで出現した種， 5 から 8 サンプルのみで出現した種，9 から 12 サンプルのみで出現した種の３つのグループに分割し，それぞれのグループごとに非計量多次元尺度法（nMDS）
を用いて二次元による種組成の見え方を比較している． 9 から 12 サンプルのみで出現した種のグループでは， 複数のサンプルが重なっているためサンプル数が 12 未満に見える．

— 17 —

ある． ただし， この指標にも限界があることに注意する必要が採水したもので 5 サンプルによって構成されている． いずれ

ある （付録 A）． ２つ目の成果は， 検出力の違いは種組成比

もアマモの上層で採水されており， C 社が環境 DNA 分析を

較においてさほど影響しない可能性を示した点である． ただ行った． ３つ目のデータセットは 2019 年夏季に採水したもの

し， この期待は， 検出力の強さが引き起こす過剰な推定によであり， D 社が環境 DNA 分析を行った． 既出では 24 サン

る別の問題が顕在化により打ち消される可能性がある． そのプルを対象として解析したが， 12 サンプルは， アマモの草体

詳細については 3.3 で説明する．

の中で採水されたものであり， 条件が異なることから比較対象から外し， アマモの上層で採水した残りの 12 サンプルを比較

3.3 分析者の違いの影響の検証対象とした．

(1) 本節の目的

Sample coverage の機能を把握するため， サンプルベース

本節では， 異なる分析者による推定結果の比較解析を通の希薄化曲線と sample coverage の下で種数を比較した． サじ， sample coverage の種数比較における機能を説明しつつ，ンプル数が少ない 2018 年夏季と 2019 年冬季については外同定精度の差が種組成の比較に及ぼす影響を検証した． さ

挿による方法 46) を適用し， 可能な限り比較範囲を広げた．

らに， 前節で示した検出力の差が種組成比較にさほど影響し

ただし， 定量比較を目的としていることから， 外挿の範囲はない可能性について， 実際の現地データに基づいて検証しサンプル数の 2 倍に留めた 36),46)．
２つの分析者の間では同定精度に差が見られたことから，た．
(2) 方法

たとえ同じ種の環境 DNA を検出していたとしても， 推定結果

a） 同定精度の違いの影響の検証のリスト上には異なる種として記載された可能性がある． すな

既出の山口県笠戸湾のアマモ場の３つのデータセット （2.2）

わち，データ間の共通種数や固有種数の計数が影響を受け，を用い， 分析者の違いによる同定精度の違いの影響を検証

Sørensen の指数も影響を受けた可能性がある． この種組成した． データセットのうちの１つは 2018 年夏季に採水したも比較における影響の程度を検証するため， 異なる精度で同ので 3 サンプルによって構成され， もう１つは 2019 年冬季に定された種について， 異なる種として扱った場合と同定精度

(b)

60

No. of species

No. of species

(a)

30

0

60

30

0
1

6

12

0.5

No. of samples

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Sample coverage

2018 ᖺኟᏘ (C)2019 ᖺ෤Ꮨ (C)(c)
Sample coverage

1.0

2019 ᖺኟᏘ (D)

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1

6
No. of samples

12

図―3.5 異なる分析者による種数の推定結果の比較． （a） サンプル数に対する種数の変化 （希薄化曲線）， （b） sample coverage に対する種数の変化， （c） サンプル数に対する sample coverage の変化を示している． 種数と sample coverage の中抜きと点線は， 外挿による推定結果を示しており， ハッチは 95% 信頼区間を示している． C 社は2018 年夏季及び 2019 年冬季のサンプル （MiFish-U 及び MiFish-E）
を分析し， D 社は 2019 年夏季のサンプル （MiFish-U， MiFish-U2，
及び MiFish-E） を分析した．

— 18 —

を統一した場合の解析結果の比較を行った． ２つの種組成な差はないことを示している． ただし， この比較では， 検出比較においては， PERMANOVA によりデータセット間の類

力の差が分析者間の検出力の差によるものか， 環境 DNA

似度の差を検定した．

の濃度の差によるものか判断できない． なお， ３つのデータb） 検出力の違いの影響の検証

セットの sample coverage の信頼区間は狭く （図―3.5c）， こ

検出力の違いが種組成比較にさほど影響しない可能性をれらの解釈は妥当なものと判断される．

検証するため， 東京湾周辺における二社 （A 社と B 社） の種 組 成 は 時 期 に よ る 違 い が あ り （PERMANOVA ；推定結果を比較したデータセット （2.3） を用いた． ただし，

pseudo-F2,17 = 12.3， p < 0.001）， C 社が分析した 2018 年夏

Site7 については B 社が未検出であったことから （表―2.4），

季と 2019 年冬季の間でも差は見られたが， D 社の結果はよ

二社が共に検出できた６つの場所を比較対象とした． ここでり離れていた （図―3.6a）． C 社が分析した 2018 年夏季とは， 検出力に差があっても種組成の比較解析は影響を受け2019 年冬季の間の非類似度 （1−Sørensen 類似度） は 0.52

にくい可能性の検証を主目的としているが， 一方で， A 社に

（0.39 から 0.60） であり， D 社の結果に対する C 社の非類似よる多くの過剰な推定 （2.4） も種組成の比較に影響する可度は， 2018 年夏季の種組成に対して 0.69 （0.50 から 0.90），

能性がある． この影響も検証するため，生息が疑わしく，かつ，

2019 年冬季の種組成に対して 0.74（0.56 から 0.86）であった．

広い範囲で推定された 10 種 （表―2.7） を含めたデータセッ

同 定 精 度 の 違 い に つ い て は， Acanthopagrus schlegelii

トとこれらを除外したデータセットの２つについて解析し， その（ ク ロ ダ イ ）， Ditrema temminckii temminckii （ ウ ミ タ ナ ゴ ），結果を比較した． 種組成の比較においては， PERMANOVA

Sebastes ventricosus （ ク ロ メ バ ル ）， Takifugu niphobles （ クによりデータセット間の類似度の差を検定し， さらに， 類似度サフグ） について見られ， 一方の分析者は属までの特定でのばらつきについて， Permutational analysis of multivariateあった． これら 4 分類の同定精度を属のレベルに統一して

dispersions （PERMDISP） により検定した． それぞれの解析

解析した結果， 依然として種組成に違いがみられるもののでは， R の vegan パッケージを使った．
(3) 結果と考察
表―3.1 分析者間で異なる同定精度で推定されたと考えられる魚種とその出現頻度 （山口県笠戸湾のアマモ場）． 一方の分析者は種名を特定し， もう一方の分析者は種名の特定には至っていなかった．

a） 同定精度の違いの影響の検証
山口県笠戸湾のアマモ場における種数は， 希薄化曲線で比較した場合， 2019 年夏季が他の時期のよりも半分程度低

C社

魚種名

い （図―3.5a）． Sample coverage を基準にした場合， sample

2018 年夏季

coverage がおよそ 0.8 以下までであればやはり 2019 年夏季

Acanthopagrus sp.
Ditrema sp.
Sebastes sp.
Takifugu sp.

が低いが， sample coverage が 0.9 付近まで到達すれば信頼区間は重なり， 差は目立たなくなった （図―3.5b）． これ
らの結果は， C 社と D 社の間に検出力の差があるものの，

3/3
3/3
0/3
1/3

D社

2019 年冬季 2019 年夏季

5/5
5/5
5/5
5/5

12/12
4/12
3/12
9/12

※二社ともに MiFish-U 及び MiFish-E のプライマーを用い， 加えて，
D 社は MiFish-U2 も用いた．

sample coverage を基準にすれば， ３つの時期に種数の明確

(a)

(b)

STRESS = 0.10

2018 ᖺኟᏘ (C)2019 ᖺ෤Ꮨ (C)2019 ᖺኟᏘ (D)STRESS = 0.15

図―3.6 異なる分析者による同定精度の違いが種組成比較に与える影響 （非計量多次元尺度法， nMDS）． (a) C 社 （2018 年夏季及び 2019 年冬季 ； MiFish-U 及び MiFish-E）と D 社 （2019 年夏季 ； MiFish-U， MiFish-U2， 及び MiFish-E） から報告された結果に基づき解析した場合と (b)C 社と D 社の間で同定精度が異なった 4 種の種名を統一（表―3.1 参照） して解析した場合．

— 19 —

（PERMANOVA ； pseudo-F2,17 = 6.39， p < 0.001）， D 社 の者間の違いは依然として有意であるものの （PERMANOVA ；結果は他の２つに近くなった （図―3.6b）． D 社の結果に対

pseudo-F1,10 = 2.95， p = 0.007 < 0.01）， nMDS では 1 つのする 2018 年夏季及び 2019 年冬季の非類似度は，それぞれ，ペアを除いて， それぞれのペアが混在することはなくなった

0.56 （0.40 から 0.76） 及び 0.57 （0.33 から 0.79） となり， C（図―3.7b）．

社内の非類似度とほとんど差がなくなった． これらの同定精これらの結果は， A 社に多くいた過剰に推定された種が A

度に差が見られた 4 種は， 各時期で高い頻度で出現してい社内の類似度を高くし， 種組成比較に影響したことを意味しる種であることから （表―3.1）， この 4 種の精度の違いだけている． この A 社の過剰な推定の多さは， A 社の検出力ので種組成の比較が影響を受けたことになる．

高さに起因しているものと考えられ， 検出力の高さが種組成b） 検出力の違いの影響の検証の比較解析の難易度を高くしたものと言える

東京湾周辺の種組成は， 分析者間の差の方が場所間の(4) まとめ

差よりも大きく （図―3.7a）， 分析者間の差は有意であった異なる分析者による環境 DNA 分析の推定結果の比較を通（PERMANOVA ； pseudo-F1,10 = 6.59， p < 0.01）． また， 二じ， sample coverage を使うことで種数比較の解釈の幅が広が社の種組成の間の均質性には差が見られた （PERMDISP ；ることを示した． また， 分析者間の同定精度と検出力の差がpseudo-F1,10 = 37.8， p < 0.001）． 生息が疑わしい 10 種を解種組成の比較に影響することを示した．同定精度に関しては，

析対象から除外すると A 社の推定種数は B 社に近づき （表解析前にデータセット間の差を確認し， 必要に応じて統一す―3.2）， 二社間の種組成の均質性の差はみられなくなった

る必要があり， 検出力の差に関しては， 過剰な推定があった（PERMDISP ； pseudo-F1,10 = 1.59， p = 0.229）． 種組成の二場合に種組成の比較に影響することに注意しなければならないことを示した．
前節の検討も踏まえると， データ間で共通する種が種組成

表―3.2 東京湾周辺において環境 DNA 分析によって推定されたものの生息しないものと考えられる魚種 （表―2.7） を含む場
合 （調整前） と含まない場合 （調整後） の A 社による推定種数と B 社による推定種数の比較．

場所

Site1
Site2
Site3
Site4
Site5
Site6

調整前
24
18
17
24
29
36

調整後
14
8
6
15
18
24

度が高い種を検出するよう努めることと， 過剰な推定に陥らない程度に検出力を抑えること， もしくは， そのような種を適切

共通種数

種数
A社

の比較において重要であり， たとえ検出力が弱くても出現頻に除去する方法を準備しておくことが環境 DNA 分析に基づ

B社
13
24
6
10
8
4

いた種組成比較の鍵を握ると言える．
6
4
1
5
6
3

3.4 結論本章では， 多様性の評価に焦点を合わせ， 環境 DNA 分
析の検出力と同定精度の違いが種数と種組成の比較解析に及ぼす影響を把握し， その回避方法を示した． 種数については， 検出力が標準化できないことからサンプル当た※プライマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

(a)

(b)

STRESS = 0.11

STRESS = 0.19

図―3.7 検出力の違いが種組成比較 （非計量多次元尺度法， nMDS） に与える影響． 環境 DNA 分析によって推定されたものの生息しないと考えられる魚種 （表―3.2 参照） を (a) 含めて解析した場合と (b) 含めずに解析した場合． 中抜きの丸は A 社による分析結果， マゼンタは B
社による分析結果を示し， 線でつながれた２つのデータは同じ場所 （図―2.5 の Site1–6） を示している． それぞれ， 同定精度の違いを調整した後に解析した． プライマーは， 二社ともに MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

— 20 —

りの比較に生態学的な意味が与えられないものの， sample

様性を把握するための空間解像度について検証した．さらに，

coverage を使えば公平な比較ができる可能性を示した． 種組

サンプル数に関して， 種数の差を見いだすための考え方とそ成の比較に関しては， データセット間の同定精度の差や検出のための目安を検討した．

力の高さに起因する過剰な推定が影響することから， これら
は解析の前に排除しなければならないことを示した．

4.2 方法(1) 空間解像度の検証方法
空間解像度の検証は， 数十 km 程度と数 km 程度の２つの4. 多様性評価に必要な空間距離とサンプル数

空間スケールの下で得られた海水サンプルの環境 DNA 分
4.1 はじめに析結果を比較することにより実施した． 数十 km 程度の空間比較する場所の間の統計的な差を見出せる限界について，

スケールの検証は，既出の東京湾内の３つの釣り場（図―2.2）

あらかじめ把握しておけば， その知見は調査計画の立案にの結果を用いた． この調査で採用したサンプル数は 5 つで活かすことができる．

あった．

その重要な知見の一つは空間解像度である． 環境 DNA

数 km 程度の空間スケールの検証は， 東京湾口と山口県

は， 体から放出された後に流動に伴って空間的に分布する

笠戸湾において実施した． 東京湾口における検証は， 久里が， その過程の中で劣化すれば 5),30)–33)， 拡がる範囲には

浜港内， 湾口久里浜側， 湾口金谷側の３つの場所で実施し限界が生じる． 一方， 環境 DNA は， 底質に吸着した場合，た （図―4.1a）． 東京湾フェリー株式会社が運航する 「かな比較的長期間保持されることから 35)， 底質の移動に伴ってや丸」 の航路上のそれぞれの場所において， 2018 年 12 月

分布することが予想される． 流動が比較的穏やかな舞鶴湾でにサンプルを採取した． サンプルは， 港湾空港技術研究所

は， 800 m 程度離れれば環境 DNA 分析で推定した魚類のが 「かなや丸」 に設置している水質測定装置から分取して種組成に相関がなくなることが示されているが 20)， 東京湾で採取した． 「かなや丸」 は， 一日の間に久里浜港と金谷港をは， 河川や人間活動を由来とした環境 DNA が広く分布して6 もしくは 7 往復することから， １つの経度上で一日の中で均いることは既に示したとおりである （2.4）． 空間解像度に関す等に 4 サンプルを採水できるよう時間を調整した． しかし， 久

る知見を把握しておけば， 調査場所の配置計画に活かされ

里浜港内においては， １つのサンプルの DNA が分析においる 47)．

て増幅しなかったため， 計 3 サンプルとして解析した． なお，

もう一つの重要な知見はサンプル数である． サンプル数は，

航路は緯度方向に変動することから， 採水場所は経度で定統計的な確からしさを得るためには多い方がいいが， その反めた．

面， 費用が高くなる． 確かさを得られるサンプル数を把握し山口県笠戸湾においては， アマモ場， 笠戸湾内の２つのておくことで， 費用の抑制につながる．

場所， 笠戸湾外の計４つの場所で採水した （図―4.1b）． 笠

本節では， 調査計画の立案のための知見を整理することを戸湾内と笠戸湾外の採水は， 2019 年 8 月 2 日において，目的とし， まず， 環境 DNA 分析を用いて沿岸域の魚類多小型船舶及び中国地方整備局の港湾業務艇 「おおつ」 にஂ㔛὾

Latitude, N

35° 14’

(b)

ෆ

࢔࣐ࣔሙ
ஂ㔛὾ഃ

34° 00’35° 12’35° 10’Latitude, N

(a)

㔠㇂ഃ

3 km
139° 44’

3 km
139° 46’

139° 48’131° 50’

Longitude, E

Longitude, E

図―4.1 数 km スケールの魚類多様性の違いを把握することを目的としてサンプル採取した場所． (a) 東京湾フェリーの航跡及び採水した３つの経度と （b） 山口県笠戸湾周辺における４つの採水地点．

— 21 —

より海面から 0.5 m の層にハイロート採水器を垂下させて実施の sample coverage が小さくなっている （図―4.3c）．

し， 計 3 サンプルを採取した． アマモ場のデータは， 2.2 で(3) 数 km スケールの比較―笠戸湾―

既出の 24 サンプルのうちのアマモ場の草体の中で採水した

笠戸湾の種組成は， 地点間で異なり （PERMANOVA ；12 サンプルを解析対象とした． 笠戸湾内と笠戸湾外におけ

pseudo-F3,17 = 6.83， p < 0.001）， かつ， そのばらつきにも差る採水は同日のほぼ同じタイミングで実施したが， アマモ場があった（PERMDISP；pseudo-F3,17 = 6.95，p = 0.004 < 0.01）．

における採水はそれらとは数日前後した異なる 3 日間で実施

アマモ場内の種組成の均質さが特徴的である （図―4.4a）．

した．

アマモ場に近い笠戸湾内も比較的均質であるが， 笠戸湾外

(2) 解析方法

の種組成が大きくばらついている．
Sample coverage が 0.8 付近で比較すると， アマモ場内の比較の前に， 同定精度と過剰な推定について対処した．
同一分析者の比較であっても， DNA 配列の一致の程度に注

種数は笠戸湾内の２つの場所に比べて大きい （図―4.4b）．

意し， Sebastes （メバル属） と Takifugu （トラフグ属） につい

笠戸湾外の sample coverage は 0.8 に到達しておらず比較がては属までの同定に抑えてこれらに属する種を一つにまとめ難しいが， 平均値で比較するとアマモ場と同等の種数であた． 過剰な推定については， 東京湾の３つの釣り場についてる． ただし， 笠戸湾内と外の sample coverage の信頼区間はは表―2.1， 山口県笠戸湾については表―2.3 の空振りの欄

広く （図―4.4c）， 上述の種数の比較は確かではない． このに魚種名を記載した種を過剰な推定として解析対象から除外

sample coverage の信頼区間の広さは， サンプル数の少なさした． 東京湾口については， Carassius auratus （キンギョ），に起因している． また， 東京湾口の金谷側と同様， 笠戸湾

Cobitis sp. （シマドジョウ属の一種），Zacco platypus （オイカワ）

外のサンプル間の種組成は異質であり， サンプルが１つの場

を解析対象から除外した．

合の sample coverage も非常に小さい．

種数と種組成の比較解析については， 3.3 と同様の方法を採用し， サンプル数が少ないものについては， その 2 倍もし

4.4 考察環境 DNA 分析によって推定された魚類の種数及び種組成

くは比較対象のサンプル数と同じ数まで外挿した．

は， 東京湾内で数十 km の距離が離れた場所であれば明確
4.3 結果な違いが見出された． 東京湾口における数 km スケールの比(1) 数十 km スケールの比較

較においても種組成の違いが見いだされ， 環境 DNA 分析

東京湾内の３つの釣り場における魚類の種組成は有意にによる多様性の空間分解能が数 km 程度あることが示された．

異 な っ て い た （PERMANOVA ； pseudo-F2,12 = 10.5， p <しかし， 東京湾口の種数の差は明確ではなかった． これは，0.001；図―4.2a）． 場所ごとのばらつきは小さく （PERMDISP；

１つの場所の採水時間に差があったことが影響している可能

pseudo-F2,12 = 0.17， p = 0.83）， 場所間で明確に異なる種組性がある．

成が推定されていた． 横須賀大津の種数は最も多く， 本牧

湾口金谷側において sample coverage が非常に小さく， かに比べて倍程度であった （図―4.2b）． 若洲における種数は，つ， 種数が少なかった結果は， 金谷側の海水に含まれる環

sample coverage に対する増加が小さく，sample coverage が 0.8

境 DNA の量が少なかったことを示している可能性がある． 東程度で比較すると横須賀大津の 1/4 程度であった． Sample

京湾口においては， 湾内の海水が久里浜側から流出し， 外coverage の大きさは３つの場所で同程度であり， その信頼区

洋水が金谷側から流入する流動構造が形成されることが知ら間は大きくないことから （図―4.2c）， 種数の比較には確かられている 48)． 一般的に有機物濃度は外洋水よりも閉鎖性内しさがある．

湾の水の方が高いことを踏まえれば， この解釈は既往の知見(2) 数 km スケールの比較―東京湾口―と一致する．

東京湾口のフェリー航路上の３つの場所の種組成は， 場所

笠戸湾周辺の比較においては， アマモ場内の種組成が明間で有意な差があったものの （PERMANOVA ； pseudo-F2,8

らかに他の場所の種組成よりも均質であり， 1 km 以内しか離= 1.61， p = 0.030 < 0.05）， 場所内のサンプルは大きくばられていない地点の種組成とも異なっていた． さらに， アマモ

ついていた （図―4.3a）． ３つの場所の sample coverage が重場の中とアマモから 1 m 程度上層で比較しても異なる種組成

なる範囲は 0.5 付近のわずかであり， この辺りの種数は久里が推定される結果も得られている （Momota et al., 未発表）．

浜港内で大きいものの， 明確な違いが見られなかった （図―このことは， 環境 DNA 分析による種組成の識別においては，

4.3b）． ただし， 湾口の２つの場所の sample coverage の信頼

局所的な水塊の差でさえも影響したものと考えられる． すな

区間は広いことから， この比較は確かなものとは言えない （図わち， 調査場所を決める際には， 環境 DNA の挙動を予測―4.3c）． なお， 湾口金谷側においては， サンプル間の種することが重要であると考えられる．

組成が異質であるため （図―4.3a）， サンプルが１つの場合サンプルの数については， 3 個あれば統計解析が可能とな— 22 —(a)(a)

STRESS = 0.12

STRESS = 0.11

(b)

(b)
No. of species

No. of species

60

30

0
0.5

ஂ㔛὾ ෆ
‴ཱྀஂ㔛὾ഃ
‴ཱྀ㔠㇂ഃ

60

30

0
0.0

1.0

1.0
Sample coverage

Sample coverage(c)Sample coverage

Sample coverage

(c)
1.0

ᶓ㡲㈡኱ὠ
ᮏ∾
ⱝὪ

0.0

0.0
4

1

5

1

1.0

No. of samples

No. of samples
図―4.3 東京湾口における３つの場所 （久里浜港内， 湾口中央，
湾口金谷側） の魚類多様性の比較 （数 km スケールの比較の例）． （a） 非計量多次元尺度法 （nMDS） による種組成
比較， （b） sample coverage に対する種数の比較， （c）
サンプル数に対する sample coverage を示している． 種数とsample coverage の中抜きと点線は， 外挿による推定結果を示しており， ハッチは 95% 信頼区間を示している． プラ
イマーは， MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

図―4.2 東京湾における３つの釣り場の魚類多様性の比較 （数十 km
スケールの比較の例）． （a） 非計量多次元尺度法 （nMDS）
による種組成比較， （b） sample coverage に対する種数の比較， （c） サンプル数に対する sample coverage を示している． ハッチは 95% 信頼区間を示している． プライマーは，
MiFish-U 及び MiFish-E を用いた．

るが， サンプル数が 3 個もしくは 4 個あった東京湾口と笠戸

4.5 結論湾では， sample coverage の信頼区間が広すぎることで， 種

本節では， 環境 DNA 分析に基づく魚類の多様性評価の数の差に関して確かな解釈を導くことができなかった． 必要ための調査計画に資する知見の整理を目的とし， その空間となるサンプル数を議論するためには， 種数を比較するため分解能と統計的な確からしさを得るためのサンプル数についの妥当な sample coverage を定めることが重要であり， 少なくて検討した． 空間分解能の検討の結果， 東京湾内であればとも 5 個なければ， 確かな解釈は難しくなると考えられる （付数十 km あれば多様性の違いを見出せ， 東京湾口と笠戸湾

録 B）．

周辺では数 km の空間スケールであっても， 異なる水塊や異なる場の下であれば多様性の違いを見出せる可能性を示し— 23 —(a)࢔࣐ࣔሙෆ➟ᡞ‴ෆ㸦࢔࣐ࣔሙ௜㏆㸧➟ᡞ‴ෆ㸦୰ኸ㸧➟ᡞ‴እ

STRESS = 0.09(b)

No. of species

60

40

20

0
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Sample coverage

1.0

1.0

0.8

0.8

Sample coverage

Sample coverage

(c)

0.6
0.4
0.2

0.6
0.4
0.2
0.0

0.0
1

6

12

No. of samples

1

6

12

No. of samples

図―4.4 山口県笠戸湾周辺の魚類多様性の比較 （数 km スケールの比較の例）． （a） 非計量多次元尺度法 （nMDS） による種組成比較，（b）sample coverage に対する種数の比較，（c）サンプル数に対する sample coverage を示している．種数と sample coverage の中抜きと点線は，外挿による推定結果を示しており， ハッチは 95% 信頼区間を示している． プライマーは， MiFish-U， MiFish-U2， 及び MiFish-E を用いた．

— 24 —

た． その差は， 環境 DNA の挙動を支配する水塊の違いに

謝辞 ： 本研究は， 国土交通省関東地方整備局横浜港湾空強く依存している可能性があり， 調査場所を決める際には，港技術調査事務所及び中国地方整備局広島港湾空港技術

環境 DNA の挙動を予測しておく重要がある． また， sample

調査事務所からの受託研究 （それぞれ， 平成 29 年度から

coverage を用いて種数を比較する場合， サンプル数は 5 個

令和元年度までの３年間と平成 30 年度及び令和元年度の２あることが望ましい．

年間） の一部として実施した． これらの受託研究の関係者には多大なるご支援をいただいた． 横須賀市東部漁業協同組
合， 浦島漁業協同組合， 尾道漁業協同組合， 吉和漁業協

5. あとがき

同組合，山口県漁業協同組合周南統括支店のみなさまには，
5.1 本論文の要約

本研究の重要性をご理解いただきつつ， 現地調査にご協力

魚類の網羅的な推定が可能な環境 DNA 分析は， 沿岸域

いただいた． 環境 DNA の分析及び調査については， 株式でも高い推定能力を発揮することから， 港湾分野でも有効な

会社環境総合リサーチ， 三洋テクノマリン株式会社， 株式会

調査手法となる可能性が示された． しかし， いくつかの注意

社 CTI アウラ， 株式会社生物技研， 株式会社東京久栄， 復点も抽出され， それが多様性評価に影響することが示された．

建調査設計株式会社， 株式会社プライア ・ コンサルタントに

多様性評価のための解析においては本論文で提示した影響

請け負って頂いた． また， 調査の一部に関しては， 井上徹の回避方法を参考にしつつ，注意深く結論を導く必要がある．

教海洋環境情報研究グループ長及び松﨑義孝主任研究官

最後に， 環境 DNA 分析によって推定される魚類に基づいたにお手伝い頂いた． 部内討議では， 新型コロナウィルスの影

多様性評価が可能となる空間距離とその解析に必要となるサ

響がある中でオンラインを使う等の苦労をしながらも， みなさ

ンプル数の目安を示した．

まからは活発に貴重な意見を頂いた． 本論文を査読していた
だいた宮井真一郎特別研究主幹から有益なコメントをいただ
いた． みなさまに対して， ここに感謝の意を表す．

5.2 今後の期待される展開
本論文では， 魚類の多様性比較の観点から環境 DNA 分
析の応用の可能性を検討したが， 近年はエビやカニ類を参考文献

網羅的に推定できるプライマーも開発されている 9)． 今後，

1)

MiFish とこのプライマーを併用することで， 食物連鎖の構造2)の解明等へ展開することが期待される．
また， 本研究で示した応用は比較的厳密なものであり， １
つの場所で複数のサンプルを要することから費用も高くなる．

3)

今後は， 厳密さを緩和しつつ， サンプルを空間的に広く配置することで， 有用魚種の分布の把握に応用したり， 過剰な推定の分布の把握により環境 DNA 分析のデータの質の監視

4)への応用も期待される． そのためには， 環境 DNA の放出量や劣化率， 及び底質への吸着に関する知見の蓄積や空間構造を考慮した統計モデリング 49) や流動や底質の輸送に関5)するシミュレーション等の技術開発が期待される．
5.3 まとめ

6)

環境 DNA 分析は， 魚類把握のための有力な推定方法であり， 現地調査に係る労力と費用の軽減に貢献する可能性がある． 港湾分野に携わる管理者や技術者が環境 DNA 分

7)

析を活用した調査計画の立案や評価のための解析方法を検討する際， 本論文が参考となることを期待する． なお， 環境
DNA 分析の応用は本論文で示したものに限らない． 今後は，基礎研究や技術開発を平行して進めていくことで， 実務への応用の幅が広がることが期待される．

8)（2020 年 6 月 5 日受付）

— 25 —

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現確率の大きさ及びバランスがケース間で異なることを想定している．

付録 A Sample coverage の意味， 効果， 及び限界
個体サンプルに基づいた sample coverage は Chao & Jost
(2012)1) によって提案され， 採取面積や体積等のサンプル
単位に基づいた sample coverage （サンプルベースの sample

Case 1coverage） については Chao et al. (2014)2) で記述されている．
その詳細については， これらの原著論文を読めば理解できるが， ここでは著者らの解釈を踏まえ， sample coverage が種数を公平に比較するための指標となる理由を説明する．
(1) サンプルベースの sample coverage の解釈
群集を構成する種は， 大きく， 観測された種と未出現の種

Case 2

Case 3

出現確率
0.4
0.3
0.2
0.1

種数
8
7
8
7

出現確率
0.9
0.7
0.5

種数
10
10
10

計

30

計

30

出現確率
0.9
0.4
0.3
0.2
0.1
計

種数
5
7
6
6
6
30

に分けられる． 未出現種の数については， 確率論に基づいた手法によって推定され 3)–5)， 条件が整えばこの信頼性は高くなる 6)． しかし， その推定精度にも限界はあることから，る魚類分布を異なる３つの条件でサンプリングすることを想定

手法を開発した Chao らはこの推定値を使った直接的な比較

した （表―A.1）． Case 1 は， 0.1 から 0.4 までの出現確率のを避けている． このため， Chao & Jost (2012)1) は， 種数を比

サンプリングであり， 出現確率に対する種数の分布はほぼ均較するための基準が必要と考え，sample coverage を提案した．

等であるのに対して， Case 2 の出現確率は Case 1 よりも倍程

サンプルベースの sample coverage は， その場に存在する度大きく， その相対的な大きさはやや歪んでいる． これらの延べの種数に対するあるサンプルサイズの下で観測された延違いは， 検出力や DNA 濃度の違いに伴う出現確率の非線

べ種数の割合として解釈できる． １つのサンプルで観測され形性を想定している． Case 3 は， 出現確率が高い種が 5 種

た１種を１つの玉として例えると， 最も出現しにくい種の玉を１存在し， その他の出現確率は Case 1 と同じである． これは，つとして， その出現確率との比率に応じて， その他の種の玉環境 DNA 分析における検出力の種特異性を想定している．

の数を用意し， すべての玉の集合を袋に入れた中からランダb） シミュレーションの一例

ムな抽出によって得られた玉の数の割合 （全体に対する努力

仮想サンプリングの条件 （表―A.1） の下で 5 つのサンプ

量の割合） がサンプルベースの sample coverage のイメージ

ルの採取をシミュレーションした （図―A.1）． 出現確率の違である．

いによって， 出現サンプル数と種数との関係も異なっている

Sample coverage が “あるサンプルサイズの下” での割合と（図―A.1a）． なお， 出現したサンプル数を 5 で除した値がしているのは， 同じ種数から構成される群集を観測するとして出現確率の推定値となる．

も， サンプルサイズが異なればそれぞれの在 ・ 不在の確率

この結果を希薄化曲線で表すと， ケース間に種数の差は無の種間のバランスも異なるためである 6)． すなわち， sample

いにも係わらず， Case 2 のサンプル当たりの期待種数が他よcoverage は， 調査側の都合によって変わる指標でもある． そり多いことが見て取れる （図―A.1b）． しかし， 環境 DNA 分

れでは， 何故， このような回りくどい指標が種数の公平な比析による推定においては， 調査 ・ 分析の手法がサンプル当

較に用いられるのか疑問となる．

たりの検出力に強く影響することから （本文 2.3）， この比較

群集全体の種数を観測で把握することはほとんど不可能に生態学的な意味がないことは明確である．

である中で， 観測の努力量は， 観測した種数の程度に見一 方， sample coverage を 基 準 と す れ ば， 同 じ sample

当を付ける指標と言え， その努力量を標準化した sample

coverage の下の種数はほぼ一致した （図―A.1c）． Sample

coverage は， 種数の比較の土台となり得る有力な指標と言えcoverage は， “あるサンプルサイズの下” での割合であり，る． また， sample coverage は推定精度の面でも優位性があ

検出力の影響を間接的に受けている． しかし， ここで示した

る． Sample coverage の算出にあたっては， 未出現種の数の種数の概ねの一致は， 努力量に比べて， sample coverage推定が重要な役割を担っている． 上述のとおり， この推定精がその影響を緩和した指標となっていることを意味している．

度には限界があるものの， sample coverage の算出にあたっ

Sample coverage は， 完璧な公平な比較を可能とするものでては分母の一部として扱われるだけなので， その推定精度のはないものの， ここでの検証は， 少なくとも， 希薄化曲線より限界は sample coverage の精度にあまり影響しないことが期待も妥当性があることを示している．

されている 1)．

(3) Sample coverage の限界(2) 仮想のサンプリング

Sample coverage の算出において重要な役割を担う未出現a） 仮想の魚類分布とその出現確率

種の数の推定は， 種の出現確率の連続性を前提とした理論

Sample coverage の機能を理解するため， 30 種で構成されに基づいている 7),8)． サンプル数が少なく， この連続性を— 28 —

4)

担保できなくなれば， 推定される未出現種数の妥当性が低下する 6)． すなわち， 不十分なサンプル数の下では sample
coverage の指標としての妥当性がなくなる． この詳細につい5)ては， 付録 B において検証する．

6)

参考文献
1) Chao A, Jost L: Coverage-based rarefaction andextrapolation: Standardizing samples by completenessrather than size. Ecology 93: 2533–2547, 2012.
2) Chao A, Gotelli NJ, Hsieh TC, Sander EL, Ma KH,
Colwell RK, Ellison AM: Rarefaction and extrapolation
with Hill numbers: A framework for sampling andestimation in species diversity studies. Ecol Monogr 84:
45‒67, 2014.
3) Chao A: Nonparametric estimation of the number ofclasses in a population. Scand J Stat 11: 265‒270, 1984.

7)

8)

Chao A: Estimating the population size for capture Recapture data with unequal catchability. Biometrics 43:783‒791, 1987.
Chao A: Estimating population size for sparse data in
capture-recapture experiments. Biometrics 45: 427‒438,
1989.
細川真也， 百田恭輔 ： 港湾における小型無脊椎動物の種の多様性指数―２つのサンプリングエフォートの考え方の比較―, 港湾空港技術研究所資料， No.1361，
pp30， 2019． URL https://www.pari.go.jp/report_search/detail.php?id=20191205143541
Good IJ: The population frequencies of species and theestimation of population parameters. Biometrika 40:
237–264, 1953.
Harris B: Determining bounds on integrals withapplications to cataloging problems. The Annals of
Mathematical Statistics 30: 521–548, 1959.

No. of species

(a)
15

15

Case 1

0

1

2

3

4

0

5

Case 2

1

No. of samples

2

3

0

5

No. of samples(b)

Case 3

1

2

3

4

5

No. of samples

(c)
40

40

No. of species

No. of species

4

15

20

0

20

0
1

2

3

4

5

0.2

No. of samples

0.4

0.6

0.8

1.0

Sample coverage

図―A.1 仮想サンプリングのシミュレーションの一例． 表―A.1 の条件の下で 5 個のサンプルを採取した結果であり， （a） 出現したサンプル数とその種数との関係， （b） サンプル数に対する種数の変化 （希薄化曲線）， （c） sample coverage に対する種数の変化を示している． パネル c
における中抜きと点線は， 外挿による推定結果を示しており， パネル b と c におけるハッチは 95% 信頼区間を示している．

— 29 —

く， 種数の推定幅は 10 程度に収まっていた （図―B.1）． 一

付録 B 目安となる sample coverage とサンプル数
ここでは， シミュレーションと本文の結果を通じて， 環境

方， Case 1 においては sample coverage と種数の両方が大きDNA 分析のサンプル数が種数と sample coverage の推定にくばらついた． このことは， Case 1 の条件で観測したとしても与える影響を理解し， 種数の比較において必要となるサンプ

全く信用できない結果が得られる可能性を示している．

ル数を考察した．

b） 推定結果がばらつく要因(1) 仮想のサンプリング

サンプル数が小さい場合， 推定結果 （期待値） がばらつa） 理論値とシミュレーションの比較

くことはよく知られた事実であるが， sample coverage の推定と付録 A で示した仮想サンプリングの条件 （表―A.1） に基

種数の外挿においては， この影響に加えて， 未出現種の数

づき， シミュレーションを行った． この条件の下で， サンプルの推定精度も強く影響する．

数を 3， 5， 10 としたランダムサンプリングによるシミュレーショ

ここで採用している未出現種の数の推定方法は， 1 つのサンをそれぞれ 100 回実施し， その結果に基づいて sample

ンプルにしか出現しなかった種の数 （Q1） と 2 つのサンプル

coverage に対する種数の関係を求め， サンプル数の 2 倍のに出現した種の数 （Q2） のみを必要としている 2)–4)． すなわ

範囲まで外挿した． また， この関係の理論値を求め 1)， シミュち， Q1 と Q2 がその推定のための確かな代表値となっている

レーションの結果と比較した．

かどうかが， sample coverage の推定と種数の外挿の精度の鍵を握っている 5)．

この結果， 出現確率が高い Case 2 のシミュレーションは，

サンプル数を T とすると，， 1 つのサンプルに出現した頻度

サンプル数が 3 個であっても理論値から大きく外れることはな(a) T=3
Case 1

No. of species

40

Case 2

40

20

20

20

0

0

0
0.0

1.0

Case 340

0.0

Sample coverage

1.0

0.0

Sample coverage

1.0
Sample coverage(b) T=5Case 1

No. of species

40

Case 2

40

20

20

20

0

0

0
0.0

1.0

Case 340

0.0

Sample coverage

1.0

0.0

Sample coverage

1.0
Sample coverage(c) T=10
Case 1

No. of species

40

Case 2

40

20

20

20

0

0

0
0.0

1.0
Sample coverage

Case 3

40

0.0

1.0
Sample coverage

0.0

1.0
Sample coverage

図―B.1 サンプル数と推定精度との関係． 30 種で構成される魚類分布を表―A.1 の条件の下で， （a） 3 個のサンプル， （b） 5 個のサンプル，（c） 10 個のサンプルを採取した場合の理論値 （色線） とシミュレーション結果 （灰色の線） を示している．

— 30 —

と 2 つのサンプルに出現した頻度は， それぞれ， 1/T と 2/T(3) 目安となるサンプル数となり， この頻度が出現確率の推定値となる． すなわち， 出

サンプル数の一つの目安は， この境界に到達するサンプル

現確率の推定値の解像度が T に強く依存する． サンプル数数となる． 上述のデータセットでは， 0.8 の sample coverageが 10 個であれば， それらの推定値は 0.1 と 0.2 となるが， サを達成するサンプル数は 3 個から 6 個であり （図―3.2b），ンプル数が 3 個であれば， Q2 の出現割合は 0.667 （= 2/3）

東京湾内 （図―4.2c）， 神奈川県久里浜湾 （図―4.3c）， 笠

であり半分の 0.5 を超えた大きな値となる．

戸湾内とアマモ場 （図―4.4c） でも同様に 6 個のサンプル数

Case 2 のすべての種の出現確率は大きく， サンプル数が 3で 0.8 の sample coverage を達成しているか， もしくは， 外挿個であっても多くの種が観測され， 未出現種の数の推定へによりその見込みがあると判断される． たとえ 3 個のサンプルの依存の程度が低くなる． このことから， sample coverage の数で 0.8 の sample coverage を満たせたとしても， 推定結果

推定と種数の外挿の精度は高くなったものと考えられる． しかがばらつく可能性を踏まえると， 確かな解釈のためには 5 かし， Case 1 と Case 3 の種の出現確率は高くなく， 3 個のサン

ら 6 個のサンプルが望ましい．

プルでは観測できない種が多くいる． すなわち，これらのケー

一 方， 笠 戸 湾 外 で は サ ン プ ル 数 が 6 個 で も sample

スの sample coverage の推定と種数の外挿は， 未出現種の数

coverage は 0.8 に到達しておらず （図―4.4c）， 東京湾口のの推定に強く依存し， ばらつきが大きくなる．

２つの場所でも 0.8 に到達する見込みはない （図―4.3c）．

Case 3 のばらつきは，Case 1 に比べて安定している．これは，これらの場所は， 海水交換が高いことが共通しており， 環境

Case 3 では， 既に観測された種が多く， 未出現種数の推定

DNA 濃度の低さが sample coverage が上がりにくい原因となっ値への依存の程度が低いためであると考えられる．

た可能性が考えられる． このような場所では出現確率を上げ(2) 目安となる sample coverage

るよう （つまり， 表―A.1 において Case 1 から Case 2 の条件

種数の比較においては， 全体の種数の把握に努めるのでに移行するよう）， ろ過量を増やすか分析上の検出力を上げはなく， そのための妥当な sample coverage を見極めることがる等の工夫が必要となる．

重要となる．
本文 3.2 で用いた４つのデータセットは， １つのデータセッ

参考文献

ト当たりに 12 個のサンプルが含まれた規模の大きなデータ

1)セットであり， 出現割合の解像度は比較的高く， 目安となる sample coverage を見極めるのに適している． この４つのデ ー タ セ ッ ト の sample coverage に 対 す る 種 数 は， sample
coverage が 0.8 から 0.9 までの辺りで緩やかな上昇を示すが，2)

それ以降は急な上昇を示している （図―3.2c）． この変化は，
3)

sample coverage が 0.8 から 0.9 までで多くの種が観測され，それ以降に出現しにくい種が観測されていることを示している． すなわち， この辺りまでの努力量で観測できる種とそれ4)以上の努力を必要としてようやく観測できる種に境界があると言える． 全種数を把握することはほとんど不可能であることを5)

思い起こせば （付録 A）， この境界が種数を比較するための一つの目安と考えることができる．

— 31 —

Chao A, Gotelli NJ, Hsieh TC, Sander EL, Ma KH,
Colwell RK, Ellison AM: Rarefaction and extrapolation
with Hill numbers: A framework for sampling andestimation in species diversity studies. Ecol Monogr 84:
45‒67, 2014.
Chao A: Nonparametric estimation of the number ofclasses in a population. Scand J Stat 11: 265‒270, 1984.
Chao A: Estimating the population size for capture Recapture data with unequal catchability. Biometrics 43:783‒791, 1987.
Chao A: Estimating population size for sparse data in
capture-recapture experiments. Biometrics 45: 427‒438,
1989.
細川真也， 百田恭輔 ： 港湾における小型無脊椎動物の種の多様性指数―２つのサンプリングエフォートの考え方の比較―, 港湾空港技術研究所資料， No.1361，
pp30， 2019． URL https://www.pari.go.jp/report_search/detail.php?id=20191205143541

港湾空港技術研究所資料

No.1373

２０２０．６

編集兼発行人

国立研究開発法人海上・港湾・航空技術研究所

発

港 湾 空 港 技 術 研 究 所

行

所

横 須 賀 市 長 瀬 ３ 丁 目 １ 番 １ 号
TEL. 046(844)5040 URL. http://www.pari.go.jp/

C （2020）by MPAT
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