22．大阪府内で市販されている乳児液体ミルクのアフラトキシン M1 含有調査

○寺谷 清香 （地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所）【研究目的】
乳児用液体ミルク（調製液状乳）は、平成 30 年 8 月に規格基準が設定され、平成 31 年3 月に販売が開始された。乳中のアフラトキシン M1（AFM1）は平成 27 年に基準値が制定され、様々な乳製品で含有量調査が行われているが、調製液状乳における AFM1 含有量についての報告はない。そこで本研究では、調製液状乳の AFM1 含有量を調査することを目的としている。

【研究の必要性】
育児用の調製液状乳は、常温で一定期間保存でき、湯で溶かして冷ます必要もない。育児負担の軽減や災害時の利便性から製造・販売が望まれており、こうした背景から平成 30年の 8 月に規格基準が設定され、平成 31 年 3 月に国内での製造・販売が開始された。
一方、日本では平成 27 年 7 月 23 日付け食安発 0723 第 1 号「乳に含まれるアフラトキシン M1（AFM1）の取扱いについて」
によって乳中の AFM1 の基準値が設定され、AFM1 が 0.5 µg/kgを超えて検出する乳は、食品衛生法第 6 条第 2 号に違反するものとして取り扱うことになった。AFM1 は発がん性を有するカビ毒であるアフラトキシン B1（AFB1）の代謝産物であって、AFB1 に汚染した餌を摂食した家畜の乳に含まれる。牛乳をはじめ様々な乳製品において微量の検出事例が報告されている。しかし、調製液状乳はもとより乳児用粉ミルク（調製粉乳）
では基準値が設定されておらず、乳児では体重あたりの乳製品摂取量が多いため、摂取量には留意が必要である。
調製液状乳は平成 31 年 3 月に販売が開始されたことから、AFM1 含有量についての報告はない。そこで本研究では調製液状乳をはじめとし、大阪府内で市販されている乳幼児の摂取量の多い乳製品（調製液状乳、調製粉乳及び発酵乳・乳酸菌飲料）についての AFM1含有量の実態調査を行った。

【研究計画】
1. 試料

表 1 試料一覧

2019～2020 年に入手した調製液状乳を含めた乳製品 24 検体を用いた。
内訳は
表 1 の通りである。なお国産調製液状乳は 2 種類しかないため、それぞれロット違いを入手し、4 検体とした。

20192020

調製液状乳（ 国産）

224調製液状乳（ 輸入）

325調製粉乳

246991724

発酵乳・ 乳酸菌飲料
合計7合計

2. 検量線の作成
標準品は AFM1 標準品（富士フイルム和光純薬製）を用いて、検量線を食安発 0723 第 5号「乳に含まれる AFM1 の試験法について」に準拠した高濃度領域（1～20 ng/mL）及び汚染実態調査を行うため低濃度領域（0.02～1 ng/mL）とした。またそれぞれの領域における添加回収試験を実施した。

3. 試料溶液の調製①調製液状乳試料 20 g を採取し、イムノアフィニティカラム（堀場製作所製 Afllaking）を用いて精製を行った。
イムノアフィニティカラムに注入した後、毎秒約 1 ～ 2 滴の流速で流出し、少量の生理的食塩水（PBS）で洗浄した。さらに PBS 及び蒸留水をそれぞれ 3.5 mL で 3 回ずつ洗浄を行った。強く空気を通してカラム内の液を除いた後、アセトニトリルを 3 mL 添加し、自然落下で溶出させた。溶出液を窒素気流下で乾固させた後、アセトニトリル-水（ 1 : 4 ）混液 で溶解して試験液とした。
② 調製粉乳試料 5 g に 50～60 ℃に温めた蒸留水 30 mL を加え混合後、超音波処理を 5 分間行った。
室温まで放冷し、50 mL メスフラスコに移し蒸留水で定容した。ガラス繊維ろ紙でろ過し、ろ液 20 mL（試料 2 g 相当）を精製に用いた。
③ 発酵乳・乳酸菌飲料
試料を遠心処理（8000 ×g、10 分）した上清をガラス繊維ろ紙でろ過し、ろ液 20 g を精製に用いた。

4. 装置及び測定条件
装置及び測定条件は表 2 の通り行った。

表 2 装置及び測定条件
装置
LC : Agilen t 1290

蛍光検出器 : G7121B

測定条件
カ ラ ム : L-colu m n 2 ODS（ 2.1 m m ×100 m m 、 3 µm ）移動相 : A : 水 / B : ア セト ニト リ ル

流速: 0.2m L/m in

カ ラ ム温度: 40℃

注入量: 50μL

A/B : 90/10 (0 m in )→50/50 (10m in )→50/50 (20m in )励起波長 : 365 n m , 蛍光波長 : 435n m【実施内容・結果】① 妥当性評価
妥当性確認のため 2 つの濃度領域について添加回収試験を実施し、結果を表 3 に示した。
真度及び精度ともに良好であり、総アフラトキシンの試験法で示されている妥当性評価基準を満たしており、本調査で行った試験法は妥当であると考えられた。

表 3 妥当性評価
添加濃度（ μg/kg)

試行数（ n ×回数）

回収率平均（ % ）調製液状乳（ 低濃度）

0.0025

5×4

84.4

6.6

調製液状乳（ 高濃度）

0.1

5×4

94.5

1.78.8

調製粉乳（ 低濃度）

0.05

5×3

109.4

6.1

12.2
9.1

調製粉乳（ 高濃度）

併行再現精度（ % ）室内再現精度（ % ）
11.6

2

5×3

95.5

6.0

発酵乳・ 乳酸菌飲料（ 低濃度）

0.0025

5×1

93.8

5.2-

発酵乳・ 乳酸菌飲料（ 高濃度）

0.1

5×1

84.5

2.0-

② 調製液状乳
調製液状乳を含めた乳製品 24 検体のうち定量下限を超えた試料について結果を図 1に示した。汚染実態調査は低濃度領域の検量線を用いて定量した。また定量下限は検量線の最低濃度より、0.001 μg/kg とした。調製液状乳 9 試料中 AFM1 が検出された試料は 3試料（国産 1 試料、輸入 2 試料）であり、0.002 ～ 0.005 μg/kg であった。
③ 調製粉乳6 試料のうち 1 試料から AFM1 が検出され、その含有量は粉末として 0.01 μg/kg であった（定量下限 0.01 μg/kg）。また当該試料を表示に従い調乳した場合、その液状乳中の濃度は 0.001 μg/mL となった。
④ 発酵乳・乳酸菌飲料
9 試料中 2 試料から AFM1 が検出され、その含有量は 0.001 μg/kg であった（定量下限 0.001 μg/kg）
。

調製粉乳

調製液状乳（輸入）

図 1 乳製品の AFM1 濃度
定量下限 調製液状乳及び発酵乳・乳酸菌飲料：

調製液状乳（国産）

発酵乳・乳酸菌飲料

0.001μg/kg
調製粉乳：0.01μg/kg【考察と今後の課題】
市場に流通する調製液状乳を含む乳製品についてAFM1 の汚染実態調査を行った。検出されたAFM1 は調製液状乳及び発酵乳・乳酸菌飲料において、0.001 ～ 0.005 μg/kgであった。これは、2016～2017 年に行われた生乳・牛乳及び加工乳の実態調査1) において報告された 0.001～0.006 μg/kgと同程度の結果である。調製粉乳において粉末でのAFM1 含有量
は 0.01 μg/kg であるが、調乳とした場合の濃度に換算すると 0.001 μg/mL であった。
これは平成 25 年に報告された「乳中のアフラトキシン M1 及び飼料中のアフラトキシン」と比較すると極微量であった2)。これは、調製液状乳及び調製粉乳に原材料として含まれる乳成分の割合が乳そのものと比較して低いため、そのAFM1 含有量は極微量となり、その結果汚染濃度は低くなったと考えられた。
さらに調査対象である乳製品を摂取した場合の乳幼児における一日あたりのAFM1 摂取量について推定を行った。
生
後 0 ～ 5 か月の乳児の栄養はすべて乳汁に依存しており、「日本人の食事摂取基準（2020 年版 ）」3) によると、この時期の哺乳量は 0.78 L/日（780ｇ/日）である。また平成 30 年の国民栄養調査4） では、幼児（1 ～ 6 歳）は牛乳及び発酵乳・乳酸菌飲料以外に、チーズ等の乳製品を摂取しているが、その 90％を牛乳及び発酵乳・乳酸菌飲料が占める。このことから、幼児（1 ～ 6 歳）における一日あたりのAFM1 摂取量は、2016～2017 年に行われた実態調査1) 及び本調査で得られた各乳製品のAFM1 含有量の最大値から推定した（表 4）。さらに生後 0 ～ 5 か月の乳児の平均体重 6.1 kgとし、幼児の平均体重 16.5 kgとして、それぞれ体重 1 kgあたりのAFM1 摂取量を算出した。これは20 歳以上の体重 1 kgあたりの乳製品における 最大 AFM1 摂取量 0.04 （ng/kgBW/day）と比べ、乳児のAFM1 摂取量は多くなっているが2)、乳児の栄養は全て乳汁に依存しているため摂取量が高く見積もられたと考えた。しかし、AFM1 はAFB1 と比べ、その発がん作用は 10 分の 1 と推定されており、AFM1 の暴露における発がんリスクは十分に低いと考えた。
調製液状乳及び調製粉乳については基準値が設定されておらず、また乳幼児の乳製品に対する栄養摂取源としての依存度を考慮すると、今後も継続して調査が必要であると考えている。

表 4 乳製品における AFM1 摂取量
AFM 1含有量

乳製品

一日摂取量（ g）

摂取量あたり の体重1kgあたり のAFM 1含有量

AFM 1摂取量（ n g/g）(n g/d ay）
0～5か月

調整液状乳（ 国産）
調整液状乳（ 輸入）
調製粉乳

0.002

※10.005※10.001

※1牛乳

―

チーズ

―

発酵乳・ 乳酸菌飲料
その他の乳製品

―
―

―
―
―
0.006

※2―

0～5か月

1～6歳

0～5か月

1～6歳

780

※3―

1.2―

0.2―

780

※3―

3.7―

0.6―

780

※3―

1.2―

0.2―

―

0.001
―

―
―

※4―

0.7―

0.04

※4――

―

―

42.1

※4―

0.06

―

0.003

19.8

※4―

―

―

―

122.6―※1（ n g/kgBW /d ay）

1～6歳

3.4

※1 本調査結果で得られた各乳製品の最大 AFM1 含有量※2 2016～2017 年に行われた生乳・牛乳及び加工乳の実態調査結果より牛乳の最大 AFM1 含有量※3 「日本人の食事摂取基準（2020 年版）」の報告書より乳児の乳汁摂取量※4 平成 30 年 国民栄養調査より各乳製品摂取量【参考文献】
1) 紀雅美、工藤鮎子、村上太郎、昌山敦、山口之彦、山野哲夫、第 55 回全国衛生化学技術協議会年会講演集、102-103、(2018）2) 食品安全委員会、かび毒・自然毒等専門調査会、乳中のアフラトキシン M1 及び飼料中のアフラトキシン B1、47-52、(2013)3) 厚生労働省、「日本人の食事摂取基準（2020 年版）」策定検討会報告書、389-392
4) 厚生労働省、平成 30 年「国民健康・栄養調査」、72【経費使途明細】
使途金

額

調製液状乳等試料購入

27,349 円

HPLC 用カラム

49,390 円

アフラトキシン用イムノアフィニティカラム

168,300 円

アフラトキシン M1 標準品

41,338 円

試薬（有機溶媒）

13,662 円

合計

大同生命厚生事業団助成金

300,039 円
300,000 円