V МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ: БИОТЕХНОЛОГОВ,МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВИ ВИРУСОЛОГОВ
Сборник тезисов

Новосибирск
Наукоград Кольцово
2018УДК 577.2:62.01:578+(001)ББК 28.07:30.16:28.4
М 431

М 431

V Международная конференция молодых ученых: биотехнологов,молекулярных биологов и вирусологов — 2018 : Сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2018.
— 426 с.
ISBN 978-5-4437-0821-8
Сборник тезисов составлен на основе материалов, присланных
российскими и иностранными учеными в оргкомитет Международной конференции молодых ученых биотехнологов, молекулярных
биологов и вирусологов, проходящей в рамках площадки открытых
коммуникаций OpenBio-2018.
Издание предназначено для преподавателей и научных сотрудников, аспирантов, магистрантов и студентов, интересующихся актуальными проблемами и разработками в области биотехнологии,вирусологии и молекулярной биологии.
Тезисы публикуются в авторской редакции.

УДК 577.2:62.01:578+(001)ББК 28.07:30.16:28.4

ISBN 978-5-4437-0821-8© АНО «Инновационный центр
Кольцово», 2018

c3

РАЗДЕЛ 1БИОТЕХНОЛОГИЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ YKUJ И TBI В КАЧЕСТВЕ
ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВИЧ-ИММУНОГЕНОВ *USE OF YKUJ AND TBI PROTEINS AS A PLATFORM
FOR THE DEVELOPMENT OF HIV-IMMUNOGENES
Н. Б. Андреева 1, А. П. Рудометов 1, А. Ю. Бакулина 2,
Л. И. Карпенко 1, Д. Н. Щербаков 1ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Новосибирский государственный университет
1

2

N. B. Andreeva 1, A. P. Rudometov 1,
A. Yu. Bakulina2, L. I. Karpenko 1, D. N. Shcherbakov 1
1

FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
2
Novosibirsk State University, RussiaАннотация
Активно развивающимся направлением в области разработки вакцины против
ВИЧ-1 является разработка иммуногенов, направленных на индукцию антител, способных нейтрализовать широкий спектр изолятов ВИЧ-1. Одной из консервативных
областей ВИЧ-1 с которой связываются широконейтрализующие антитела является мембрано-проксимальная наружная область, однако добиться образования нейтрализующих антител к данному региону при иммунизации удается крайне редко.
В данной работе представлены результаты использования белков YkuJ и TBI в качестве платформы для получения ряда иммуногенов (рекомбинантных белков), направленных на индукцию нейтрализующих антител к MPER региону ВИЧ-1.
© Н. Б. Андреева, А. П. Рудометов, А. Ю. Бакулина, Л. И. Карпенко, Д. Н. Щербаков, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-34-00314.

4Раздел 1

Abstract
An actively developing field in the development of the vaccine against HIV-1 is thedevelopment of immunogens aimed at inducing antibodies capable of neutralizing a wide
spectrum of HIV-1 isolates (bNAbs). One conservative region of HIV-1, to which bNAbs
bind, is the membrane-proximal external region (MPER), which includes a number of linear epitopes of broadly neutralizing antibodies 10E8, 4E10 and 2F5, but it is extremely rareto achieve such antibodies in immunization. In this paper, the use of YkuJ and TBI proteinsas a platform for the production of a number of immunogens (recombinant proteins) aimed
at inducing neutralizing antibodies to the MPER region of HIV-1 is discussed.

Одной из фундаментальных задач в области разработки вакцины против ВИЧ-инфекции является конструирование иммуногенов и разработка
схемы иммунизации, результатом которых будет наработка в организме антител, способных нейтрализовать широкое разнообразие изолятов ВИЧ-1.
Широконейтрализующие антитела (broadly neutralizing antibodies, bNAbs)
нацелены на несколько консервативных сайтов уязвимости на поверхности
гликопротеина оболочки ВИЧ-1 [1]. Одной из таких областей ВИЧ-1 является мембрано-проксимальная наружная область (membrane proximal external
region, MPER), которая состоит из 22 аминокислотных остатков, расположенных на С-конце эктодомена gp41 [2]. В данной области находится рядлинейных эпитопов, узнаваемых широконейтрализующими антителами
10Е8, 4Е10 и 2F5, однако добиться образования подобных антител при иммунизации удается крайне редко [3]. Одной из проблем в индукции нейтрализующих антител к MPER является конформационная подвижность субъединицы gp41, являющаяся следствием структурных изменений при слиянии
вирусной и клеточной мембран. Еще одной из проблем при разработке вакцины на основе MPER является необходимость избирательного воздействияна иммунную систему с целью концентрации гуморального иммунного
ответа на область MPER и выработке соответствующих нейтрализующих
антител. Для этого может быть полезна система прайм-бустерной иммунизации, когда используются разные каркасные белки, но несущие один и тотже целевой белковый антиген.
Целью данного исследования является получение и исследование
свойств ряда иммуногенов на основе белков YkuJ и TBI, направленных наиндукцию нейтрализующих антител к MPER региону ВИЧ-1.
Ранее на основе белков YkuJ и TBI были получены химерные белки
TBI_tag и YkuJ-MPER [4, 5]. При проектировании TBI_tag и YkuJ-MPERобласти, кодирующие эпитопы bNAbs, были фланкированы уникальными
сайтами рестрикции для клонирования гена в составе плазмиды и возможности замены эпитопов.

Биотехнология

5Путем последовательной встройки олигонуклеотидных дуплексов, кодирующих область MPER, на основе TBI были получены две генетические
конструкции, кодирующие один и два участка MPER ВИЧ-1. На основе последовательности, кодирующей YkuJ-MPER, были получены пять различных генетических конструкций с вариабельными эпитопами MPER. Этимодификации необходимы для создания на основе белков TBI_tag и YkuJMPER панели экспериментальных иммуногенов, способных обеспечитьпри прайм-бустерной иммунизации созревание нейтрализующих антител
к MPER региону ВИЧ-1.
Гены химерных белков были клонированы в составе плазмидного вектора рЕТ21a по сайтам рестрикции NdeI и XhoI в рамке считывания с последовательностью, кодирующей 6 а.о. гистидина. Нуклеотидная последовательность всех конструкций была подтверждена секвенированием.
Полученными плазмидами pET-YkuJ-MPER-1-5 и pET-MPERTBI-1-2 были трансформированы компетентные клетки E. coli BL21 (DE3)для наработки рекомбинантных белков. Белки YkuJ-MPER-1-5 и MPER-TBI
были очищены с помощью металл-хелатной хроматографии для анализа ихструктуры, антигенных и иммунногенных свойств. Степень очистки белков
оценивали с помощью электрофореза в 15%-м SDS-PAGE с последующей
фиксацией и окрашиванием Кумасси G250. Дополнительную очистку белков и их рефолдинг проводили с помощью диализа против буферов со снижающейся концентрацией мочевины.
Для исследования антигенных свойств белков YkuJ-MPER и MPER-TBI,
был проведен дот-блот анализ с использованием bNАbs 10E8, 4Е10, 2F5.
В качестве контроля использовали TBI_tag, который не содержит эпитопы
данных антител. Проведенный дот-блот анализ подтвердил, что YkuJ-MPER
и MPER-TBI могут специфически распознаваться bNАbs 10E8, 4Е10, 2F5.
Было установлено, что при одинаковой концентрации белка МКА эффективнее взаимодействуют с YkuJ-MPER, чем с MPER-TBI, что может свидетельствовать о более корректной презентации данных эпитопов в составе
YkuJ-MPER.
Определение вторичной структуры антигенов YkuJ-MPER и MPER-TBI
проводили с помощью метода кругового дихроизма (КД).
Для анализа иммуногенности белков была проведена иммунизация
кроликов очищенными препаратами YkuJ-MPER-1-5 и MPER-TBI-1-2.
Иммуногенность рекомбинантных белков определяли по специфической
активности полученных сывороток в ИФА. Далее был проведен перекрестный ИФА, для этого сыворотки из группы животных, иммунизированных MPER-TBI, анализировали на способность взаимодействовать
с YkuJ-MPER и наоборот.

Раздел 1

6Таким образом, в ходе работы получены генетические конструкции, кодирующие рекомбинантные белки YkuJ-MPER-1-5 и MPER-TBI-1-2, а также соответствующие продуценты рекомбинантных белков. Разработаны
протоколы очистки с помощью металл-хелатной хроматографии и протоколы диализа. Дот-блот анализ показал, что YkuJ-MPER и MPER-TBI могут
специфически распознаваться bNАbs 10E8, 4Е10, 2F5. Анализ специфической активности полученных сывороток показал, что в организме кроликов, иммунизированных как YkuJ-MPER, так и MPER-TBI, формируются
специфические антитела. Перекрестные проверки иммуногенных свойств
YkuJ-MPER и MPER-TBI показали, что обе конструкции способны вызывать анти-MPER антитела. При этом YkuJ более эффективно презентируетMPER, чем TBI.
Литература
1. Щербаков Д. Н., Бакулина А. Ю., Карпенко Л. И., Ильичев А. А. Антитела,нейтрализующие широкий спектр изолятов ВИЧ-1,-новая грань иммунной системы // Acta Naturae (русскоязычная версия). — 2015. — Т. 7. — №. 4 (27). — С. 14–25.
2. Montero M., van Houten N. E., Wang X., Scott J. K. The membrane-proximal
external region of the human immunodeficiency virus type 1 envelope: dominant siteof antibody neutralization and target for vaccine design // Microbiology and molecularbiology reviews. — 2008. — V. 72. — №. 1. — P. 54–84.
3. Molinos-Albert L. M., Clotett B., Blanco J., Carrillo J. Immunologic insights
on the Membrane Proximal external Region: A Major Human immunodeficiency virus
Type-1 vaccine Target // Frontiers in immunology. — 2017. — V. 8. — P. 1–12.
4. Андреева Н. Б., Рудомётов А. П., Бакулина А. Ю., Щербаков Д. Н. Изучение
иммуногенности химерного белка, включающего эпитопы антител, нейтрализующих широкий спектр первичных изолятов ВИЧ-1 // Международный научно-исследовательский журнал. — 2017. — № 08 (62). — Часть 2 . — С. 6—10.
5. Рудометов А. П., Андреева Н. Б., Чикаев А. Н., Щербакова Н. С., Каплина О. Н., Карпенко Л. И. Антигенные свойства искусственного полиэпитопного
ВИЧ-иммуногена // Сибирский научный медицинский журнал. — 2018. — Т. 8. —№ 4. — C. 37–43.

7Биотехнология

ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ И ПРОЛИФЕРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ
ЭНДОКАННАБИНОИДА N-АРАХИДОНОИЛДОФАМИНАНА СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЭКТОПИЧЕСКОГОИ ЭУТОПИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИЯACTION OF N-ARACHIDONOYL DOPAMINE ON THE VIABILITY
AND PROLIFERATION OF STROMAL CELLSFROM EUTOPIC AND ECTOPIC ENDOMETRIUM
А. М. Ашба 1,2, М. Н. Юшина 1,
И. А. Федорова-Гоголина 1, М. Ю. Бобров 1,2 *ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр
акушерства, гинекологии и перинатологии имени ак. В. И. Кулакова»Министерства здравоохранения Российской Федерации
2ФГБУН «Институт биоорганической химии им. ак.
М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» Российской академии наук1

A. M. Ashba 1,2, M. N. Yushina 1, I. A. Fedorova 1, M. Yu. Bobrov1,2
The National Medical Research Center of Obstetrics,
Gynecology and Perinatology
2
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic chemistry1

E-mail: alyafonya@mail.ruАннотация
Эндометриоз характеризуется формированием очагов эндометриоидной тканивне полости матки. На сегодняшний день эффективная медикаментозная терапия
эндометриоза не разработана, поэтому хирургическая резекция поражений при распространенном эндометриозе является наиболее эффективным способом лечения.
В последние годы эндоканнабиноидная система рассматривается как перспективная
мишень терапевтического воздействия на опухолевые клетки, однако ее роль в патогенезе эндометриоза остается мало изученной. В данной работе было проведено
сравнительное исследование цитотоксического действия эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина (AA-DA) на культивируемые стромальные клетки эктопического и эутопического эндометрия.
Abstract
Endometriosis is characterized by the formation of foci of endometrial tissue outside
the uterine cavity. To date, there is no effective medical therapy of endometriosis, so sur* © А. М. Ашба, М. Н. Юшина, И. А. Федорова-Гоголина, М. Ю. Бобров, 2018.

8Раздел 1

gical resection of lesions is the most effective treatment. In the last years, the endocannabinoid system is considered as a promising target of therapeutic effects on tumor cells,
but the participation of the endocannabinoid system in the pathogenesis of endometriosis
remains poorly understood. In this work, a comparative study of the cytotoxic effect of
endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (AA-DA) in cultured stromal cells of ectopic
and eutopic endometrium was conducted.

Эндометриоз — неопластическое заболевание, характеризующееся наличием эктопических участков эндометрия за пределами матки. Оно встречается у 6–10 % женщин репродуктивного возраста, причем его патофизиология остается невыясненной. Известно, что каннабиноидно-ванилоидная
система вовлечена в развитие болевого синдрома при эндометриозе, новлияние этой системы на пролиферацию клеток эндометрия практическине изучено. Цель — работы определение влияния эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина (AA-DA) — лиганда одновременно каннабиноидныхи ванилоидных рецепторов — на пролиферацию и гибель культивируемых
стромальных клеток эутопического и эктопического эндометрия.
Эксперименты проводили на культивируемых стромальных клетках эутопического (в норме выстилающего полость матки) и эктопического эндометрия, полученных от 15 пациенток под контролем Этического комитета;плотность — 50–100 тыс. клеток/см2. Цитотоксичность и пролиферацию
оценивали с помощью MTT-теста и анализа стадий клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии. Механизмы действия изучали с помощью антагонистов рецепторов CB1, CB2, TRPV1, антиоксидантов и ингиби-тора NO-синтазы, путь клеточной гибели — с помощью панкаспазного
ингибитора, флуоресцентных субстратов каспаз 3 и 9 и окраски аннексином-пропидием. АФК детектировали с помощью флуоресцентного зонда
DCFH, мембранный потенциал митохондрий — с помощью зонда TMRE.
AA-DA был цитотоксичен для клеток эутопического и эктопического эндометрия с LC50 15±1 мкМ и 2±1 мкМ, соответственно. В концентрациях
0.078–0.625 мкМ AA-DA стимулировал пролиферацию клеток эутопического эндометрия, однако не влиял на пролиферацию клеток эктопического эндометрия. Цитотоксическое действие AA-DA подавлялось блокатором CB1,
пан-каспазным ингибитором, N-ацетилцистеином и аскорбиновой кислотой,а стимуляция пролиферации — блокатором CB2. Токсичные концентрации
AA-DA вызывали активацию каспаз 3 и 9, накопление активных форм кислорода и падение мембранного потенциала митохондрий, что указывает нагибель клеток по внутреннему пути апоптоза.
Таким образом, N-арахидоноилдофамин в низких концентрациях стимулирует пролиферацию стромальных клеток эутопического эндометрия заБиотехнология

9счет активации рецептора CB2, в высоких концентрациях индуцирует апоптоз по внутреннему пути активации в стромальных клетках эктопического
эндометрия за счет активации рецептора CB1. Данное обстоятельство, наряду с отсутствием пролиферативного эффекта в низких дозах для клеток
эктопического эндометрия, позволяет рассматривать эндоканнабиноидную
систему как перспективную мишень для разработки новых фармакологических подходов для контроля за прогрессированием эндометриоидных гетеротопий.

Раздел 1

10БИОРИТМЫ И ПРИНЦИП РИТМИЧНОСТИ
БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
BIORITHMS AND THE PRINCIPLE OF RHYTHMICITY
OF BIOLOGICAL PROCESSES
П. И. Бабич, В. Н. Зарубин *ООО «Сибирский инновационный центр»P. I. Babich, V. N. Zarubin
LLC “Siberian innovation center”, Russia
E-mail: sicenter@bk.ruАннотацияС позиции хронобиологического подхода и термодинамического анализа процессов, происходящих в биологических системах, дано определение биопроцессаи его характеристики — биоритма. Сформулирован принцип ритмичности и принцип взаимной когерентности в биологических системах. Разработан метод лечения
путём ресинхронизации биоритмов организма и аппарат для его реализации.
Abstract
From the standpoint of the chronobiological approach and the thermodynamic analysisof the processes taking place in biological systems, a definition of the bioprocess and its
characteristics, biorhythm, is given. The principle of rhythm and the principle of mutual
coherence in biological systems are formulated. A method of treatment by resynchronization of body biorhythms and an apparatus for its realization have been developed.

Актуальность исследований в области хронобиологии подтверждается
созданием при РАМН проблемной комиссии «Хронобиология и хрономедицина» для решения вопросов, связанных с возникновением и лечением
десинхронозов. В начале 21-го века наблюдается значительный прогрессв направлении исследования биоритмов организма. Они обнаружены навсех уровнях организации организма: молекулярном, клеточном, тканевом, органном и организменном. В результате термодинамического анализа
процессов, происходящих в биологических системах, установлена природа
биоритмов и дано определения хронома. Хроном объединяет всю совокупность биоритмов в организме и представляет собой комплексную многоу* © П. И. Бабич, В. Н. Зарубин, 2018.

Биотехнология

11ровневую иерархическую мульти частотную синхронизированную автоколебательную систему в структуре организма, синхронизованную во времени с геофизическими ритмами [1]. В 2017г. три учёных из США получили
Нобелевскую премию в области биологии и медицины за открытие генаи белка period. Концентрация белка колеблется с периодичностью 24 часа,и представляет собой биохимический осциллятор на молекулярном уровне, который синхронизирует биоритмы организма с циркадным (суточным)ритмом.
Все биопроцессы в живых организмах представляют собой когерентные
непрерывные биохимические реакции последовательностей метаболических циклов, содержащие чередующиеся процессы анаболизма — синтеза
веществ, и катаболизма — расщепления веществ. Эти процессы синтезаи расщепления сопровождаются соответственно фазами потребления и выделения энергии, которые с точки зрения биофизики представляют собой
когерентные непрерывные термодинамические колебания. Следовательно,в клетках происходит два вида периодических когерентных колебаний: колебаний концентрации веществ и энергетических колебаний. Аналогично
происходят групповые когерентные биохимические и термодинамические
колебания на уровне ткани, органов, систем и организмов в целом.
Таким образом, биопроцесс это непрерывное чередование фаз взаимосогласованных когерентных химико-физических колебательных процессов
синтеза и расщепления веществ, протекающих в клетках. Из этого определения следует, что понятие биоритм, в этом случае, является характеристикой биопроцесса и означает чередование циклов синтез — расщепление веществ в клетках с определённой частотой.
Исходя из выше изложенного, сформулируем следующие принципы:принцип ритмичности и принцип взаимной когерентности в биологических
системах. Принцип ритмичности означает, что все биологические процессы, протекающие в живых организмах, имеют свои биоритмы (частоты),и управлять процессами можно путём воздействия на их биоритмы регулируя частоту.
Принцип взаимной когерентности означает взаимную согласованностьво времени когерентных колебательных процессов химической и физической природы, протекающих в живых организмах. В этом и заключается
механизм химико-физического взаимодействия, лежащий в основе функционирования биосистем. Из этого следует, что воздействовать на биоритмы
можно как химическими (фармакотерапия), так и физическими (физиотерапия) способами.
При заболевании в организме происходит нарушение обменных процессов, которое сопровождается отклонением их биоритмов от нормы —Раздел 112патологическим десинхронозом (ПД). В настоящее время лечение заболеваний (устранения ПД) происходит в основном методами фармакотерапии. В результате обычной медикаментозной терапии или хронотерапии
(хронобиотики) в больной ткани восстанавливаются нарушенные обменные процессы, и согласно принципу взаимной когерентности происходит
устранение ПД. Однако такой подход не гарантирует достаточную эффективность и безопасность лечения из-за побочного действия лекарственных
препаратов.
Для управления биоритмами физическим способом в компании разработан и запатентован метод ресинхронизирующей физиотерапии (РФТ)[2, 3]. Метод предназначен для лечения широкого спектра заболеваний
путем коррекции отклонений в биоритмах больного организма соответствующей частотой ЭМП. Метод реализован на базе разработанного
аппаратно-программного комплекса с функцией хронотерапии — хронокорректора биоритмов (ХКБ) организма [4]. ХКБ охватывает лечениемвсе ткани и органы, биоритмы которых попадают в диапазон его рабочих
частот. На аппарат РФТ получено регистрационное удостоверение МЗ
РФ. В настоящее время на аппарате отрабатывается технология лечения
заболеваний ЖКТ.
Литература
1. Зарубин В. Н. Управление функциональным состоянием организма путём
воздействия на его хроном // XXVI Международная мультидисциплинарная конференция «Актуальные проблемы науки ХХІ века», Направление «Биологические науки», г. Москва: Сб. статей. — М.: Международная исследовательская организация
«Cognitio», 2017. с. 6–10.
2. Зарубин В. Н. Метод ресинхронизирующей физиотерапии // IX Международная научно-практическая конференция «Фундаментальные и прикладные научные
исследования: актуальные вопросы, достижения и инновации». Секция «Медицинские науки»: Сб. статей. Ч. 1. — Пенза: МЦНС «Наука и Просвещение», 2018.
с. 166–168.
3. Зарубин В. Н. Способ терапевтического воздействия низкочастотным импульсным ЭМП. // Патент РФ на изобретение № 2616330.
4. Зарубин В. Н., Семин М. М. Магнитоимпульсный низкочастотный терапевтический аппарат. // Патент РФ на полезную модель № 120878.

Биотехнология

13ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ СР БАКТЕРИОФАГА
MS2 В РАСТИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИНА МОДЕЛИ NICOTIANA TABACUM *MS2 BACTERIOPHAGE COAT PROTEIN (CP) EXPRESSION
IN NICOTIANA TABACUM AS A MODEL OF A PLANT
EXPRESSION SYSTEM
Д. О. Байрамова 1, 2, М. А. Томилин 1, 2, И. В. Жирнов 1, Е. А. Филипенко 1,
С. В. Герасимова 1, А. В. Кочетов 1, 2
1Институт цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук, Новосибирск, Россия
2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет, Новосибирск, Россия
D. O. Bayramova1, 2*, M. A. Tomilin1, 2, I. V. Zhyrnov1,
E. A. Filipenko1, S. V. Gerasimova1, A. V. Kochetov1, 2
The Federal Research Center of Siberian Branchof the Russian Academy of Sciences Instituteof Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
1E-mail: bayramova.daria@gmail.com
Аннотация
Белок оболочки вируса, способный самопроизвольно образовывать капсид,может использоваться для создания вирусоподобной частицы (virus-like particle,
VLP), состоящей из оболочки — капсида вируса — и содержимого, представленного ДНК или РНК, белком, лекарственной молекулой, пептидом-эпитопом. Такие
химерные структуры могут использоваться для доставки биологически активных
молекул в организм, они широко применяются при создании вакцин.
Целью настоящей работы является экспрессия белка оболочки бактериофага
MS2 в растительной системе на модели Nicotiana tabacum.
Abstract
Virus coat protein, which is capable of self-assembling with formation of a capsid, canbe applied for virus-like particle (VLP) production. VLP consists of a virus capsid as an© Д. О. Байрамова, М. А. Томилин, И. В. Жирнов, Е. А. Филипенко, С. В. Герасимова, А. В. Кочетов, 2018.
*Работа поддержана бюджетным проектом 0324-2018-0018.

14Раздел 1

envelope and a molecule of DNA, RNA, a protein, a drug or an epitope peptide as a filling.
Thus, biologically active molecules, including those which induce immune response, canbe delivered to a target in an organism.
We aim to express MS2 bacteriophage coat protein in Nicotiana tabacum which is an
example of a plant expression system.

Белок оболочки (coat protein, CP) вируса E. coli MS2 обладает способностью к самопроизвольному образованию капсидоподобных частиц (Fu et al.,2015), поэтому представляет интерес как белок, из которого мог бы собраться капсид для вирусоподобной частицы. Геном MS2 обладает чрезвычайно малым размером в примерно 3500 нуклеотидов (Virus Taxonomy, 2011)(белок оболочки — 393 н.), сам вирус хорошо изучен, поэтому СР является
привлекательным объектом для исследования возможности его экспрессиив чужеродных системах.
Растения позволяют производить много продукта при небольших посравнению с другими экспрессионными системами (например, насекомые,млекопитающие, бактерии) затратах; мы выбрали в качестве модельной
системы табак обыкновенный, или виргинский. Цель настоящей работы —стабильная экспрессия белка оболочки бактериофага MS2 в растительной
экспрессионной системе на модели Nicotiana tabacum, сорт SR1.
Для осуществления цели мы установили такие этапы работы:1) создание генетических конструкций на основе бинарных плазмидных
векторов;2) получение стоков агробактерий, несущих плазмиды-конструкции;3) получение посредством агробактериальной трансформации линии N.
tabacum, SR 1, стабильно экспрессирующей целевой ген;4) анализ полученной линии N. tabacum на наличие генетической встройки, измерение уровня экспрессии целевого гена в случае положительного
результата.
Бактериофаг MS2 из коллекции ATCC (15597-B1, Великобритания) былнаработан в E. coli штамма ER2738 на чашках с двойным слоем агара. РНКфага выделили при помощи препарата Trizol и повели обратную транскрипцию, используя реактив iScript компании BIO-RAD, получив кДНК MS2.
Последовательность гена СР была наработана с кДНК MS2 методомПЦР с высокоточной полимеразой, во фланкирующие последовательности
гена были внесены сайты рестрикции, по которым последовательность генабыла перенесена в промежуточный вектор pJet1.2 (Thermo Scientific). Из
pJet1.2 последовательность СР была клонирована в промежуточный вектор
pd35S-Nos-AB-M (A. Himmelbach et al., 2007), в котором имелись двойной
промотор CaMV35S и терминатор гена нопалинсинтазы (NOS) для целевого

Биотехнология

15

гена. Из pd35S-Nos-AB-M_CP экспрессионная кассета 2x35S-CP-NOS методом рестрикции-лигирования по 3’-концам была перенесена в бинарный
вектор p6N (DNA-Cloning-Service Hamburg, Germany), имеющий селективные маркеры в виде устойчивости к антибиотикам спектиномицину/стрептомицину в E. coli и Agrobacterium tumefaciens и гигромицину в растениях.
Структура всех генетических конструкций — pJet1.2_CP, pd35S-NosAB-M_CP, p6N_CP — была по мере их получения подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.
Химически компетентные клетки A. tumefaciens штамма AGL1 (любезно
предоставлен Йохеном Кумленом, Гатерслебен, Германия) были трансформированы полученной конструкцией p6N_CP методом замораживания-оттаивания, наработаны и сохранены в виде смеси культуры с глицерином,хранящейся при -80 °C.
Листовые экспланты стерильных растений Nicotiana tabacum линии
SR1 были трансформированы конструкцией p6N_CP методом агробактериальной трансформации (Deblaere et al., 1987). Мы получили первые униполярные структуры-производные каллусов, состоящие из стебля и листьев.
Предстоит получить растения-трансформанты поколений Т0 и Т1, подтвердить наличие генетической встройки методом ПЦР. Уровень экспрессии
гена СР будет измерен с помощью RT-PCR.
Литература
1) Fu Y. et al. A novel delivery platform based on Bacteriophage MS2 virus-likeparticles // Virus Research. — 2016. — V. 211. — P. 9–16;
2) Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Report of theInternational Committee on Taxonomy of Viruses / Andrew M. Q. King et al. — Elsevier,2011;3) Himmelbach A. et al. A Set of Modular Binary Vectors for Transformation of
Cereals // Plant Physiology. — 2007. — V. 145. — P. 1192–1200;
4) Deblaere R. et al. Vectors for cloning in plant cells // Meth. Enzymol. 1987. V. 153.
P. 277–292.

Раздел 116ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ ДЕТЕКТИРУЕМОЙ СРЕДЫНА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
БИОСЕНСОРОМ НА ОСНОВЕ ПОЛЕВОГО ТРАНЗИСТОРАСО СТРУКТУРОЙ «КРЕМНИЙ НА ИЗОЛЯТОРЕ» *А. А. Бердюгин 2, Е. В. Дмитриенко 1,2
1Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
2Новосибирский государственный университет

A. A. Berdyugin 1,2, E. V. Dmitrienko 1,2Institute of chemical biology and fundamental medicine,
Siberian Division of Russian Academy of Science, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk state university, Novosibirsk, Russia
1

Е-mail: elena.dmitrienko@niboch.nsc.ruАннотация
Бурное развитие области создания биосенсоров привело к разработке большого количества различных типов устройств для обнаружения биомолекул.
Перспективным типом биосенсоров являются электрохимические биосенсоры и,в частности, микро- и нано- проволочные сенсоры на основе полевых транзисторы со структурой «кремний на изоляторе» — КНИ-транзисторов. Такие сенсоры нетребуют введения дополнительных меток в аналит, высокочувствительны и для измерения используют малое количество образца. Важной проблемой при создании
устройств такого типа является воспроизводимость результатов электрохимических
измерений. Связано это главным образом с миниатюризацией сенсорных элементови отсутствием универсальных подходов для проведения исследований. Данная работа посвящена исследованию влияния факторов среды, в которой может находиться
аналит на возможность его выявления, определению параметров детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот и оптимизации измерений с целью получения достоверных и воспроизводимых результатов.
Abstract
Rapid development of the field of biosensors has led to the development of a large
number of different types of devices for detecting biomolecules. A promising type of biosensors are electrochemical biosensors and, in particular, micro- and nanoscaled sensors© А. А. Бердюгин, Е. В. Дмитриенко, 2018.
*Работа проведена в рамках выполнения проекта КП ФНИ СО РАН II.1 (ГЗ№ 0309-2018-0017).

Биотехнология

17

based on field-effect transistors with the structure “silicon on an insulator” — SOI transistors. Such sensors do not require the introduction of additional labels in the analyte, arehighly sensitive, and a small amount of sample is used for the measurement. An important
problem in creating devices of this type is the reproducibility of the results of electrochemical measurements. This is mainly due to the miniaturization of sensory elements and thelack of universal approaches for conducting research. This work is devoted to the study ofthe influence of environmental factors in which an analyte can be found for the possibilityof detecting it, determining the parameters of detection of specific nucleic acid sequences,and optimizing measurements in order to obtain reliable and reproducible results.

Для детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислотв настоящее время разработано большое количество разнообразных подходов. Созданы биосенсоры, чья работа основана на различных принципах.
Одним из критериев, по которому можно разделить все сенсоры, является
наличие специфических меток, которые позволяют детектировать целевые
объекты, так называемые меточные и безметочные подходы. Для первых типов сенсоров необходимой стадией является введение меток для детекциив систему измерений, например, флуоресцентных, электрохимических, оптических и др.
После изобретения полевого транзистора в 1970, одним из направлений
применения этой технологии в области биотехнологий стало использование
биосенсоров такого типа для детекции различных аналитов [1]–[2]. Полевые
транзисторы относят к безметочным системам детекции, то есть позволяют
напрямую определять наличие аналита, что является их безусловным преимуществом.
Среди широкого класса различных материалов и методов изготовления нанопроволочных сенсоров одними наиболее перспективных являются нанопроволоки на нанослоях «кремний на изоляторе» (КНИ).
Кремниевые нанопроволки многообещающий чувствительный материал,привлекающий внимание исследователей из-за их высокого соотношения поверхности к объему, биосовместимости и уникальных подстраиваемых электрических, оптоэлектронных и термических свойств [3]–[4].
Эти свойства сильно улучшают такие параметры сенсора как селективность, чувствительность, временной отклик и способность осуществлять
безметочную детектцию.
Детекция нуклеиновых кислот востребована в различных областях молекулярной биологии, биомедицинской химии и медицины. Нуклеиновые кислоты могут являться биомаркерами определенных заболеваний. В качестве
биомаркеров в последнее время все более часто используются микроРНК —малые регуляторные РНК молекул, уровень которых напрямую может бытьРаздел 118связан с патологическими процессами, происходящими в организме. Таким
образом, существует необходимость создания быстрых, чувствительных,безметочных, селективных биосенсоров для детекции НК. Однако, чтобы
детектировать биомолекулы, необходимо определить параметры среды длянаилучшего отклика системы.
В ходе выполнения данной работы проведена автоматизация установки для измерений сток-затворных характеристик микропроволочных КНИтранзисторов. Созданы программные коды для блока управления с использованием платы Arduino и интерфейса измерений. Исследовано влияние
параметров среды, таких как ионная сила, рН и диэлектрическая проницаемость раствора, на сток-затворные характеристики микропроволочныхКНИ транзисторов шириной 0,2 и 3 мкм, содержащих на поверхности различные группы. Показано что:а) транзисторы шириной 0,2 мкм обладают воспроизводимыми сток-затворными характеристиками только при проведении измерений на воздухе;б) транзисторы шириной 3 мкм как с немодифицированной, так и с модифицированной APTES или GOPTS поверхностью чипов, обладают воспроизводимыми сток-затворными характеристиками при проведении измерений на воздухе и в различных растворах;в) установлено, что модификация поверхности КНИ транзисторов, ионная сила, рН и диэлектрическая проницаемость среды, в которую они помещены, влияют на сток-затворные характеристики. Определены критерии
выбора условий среды для детекции заряженных биомолекул: I) значениерН буферного раствора должно быть таким, чтобы поверхность не несла
значительного заряда; II) ионная сила раствора должна быть минимальной;III) для получения максимального отклика измерения оптимально проводить на воздухе.
Таким образом, исследовано влияние параметров детектируемой средына эффективность выявления нуклеиновых кислот биосенсором на основе полевого транзистора со структурой «кремний на изоляторе». Показана
возможность достоверной, специфической и селективной детекции РНКмишени на 3 мкм КНИ транзисторах.
Литература
1. K. Balasubramanian. Challenges in the use of 1D nanostructures for on-chipbiosensing and diagnostics: A review. // Biosens. Bioelectron. — 2010. — V. 26(4). —P. 1195–1204.
2. L. N. Cella, W. Chen, N. V. Myung, and A. Mulchandani. Single-Walled Carbon
Nanotube-Based Chemiresistive Affinity Biosensors for Small Molecules: Ultrasensitive
Glucose Detection. // J. Am. Chem. Soc. — 2010. — V. 132(14). — P. 5024–5026.

Биотехнология

19

3. K.-I. Chen, B.-R. Li, and Y.-T. Chen. Silicon nanowire field-effect transistor-based
biosensors for biomedical diagnosis and cellular recording investigation. // Nano Today. —2011. — V. 6(2). — P. 131–154.
4. R. Ahmad, T. Mahmoudi, M. S. Ahn, and Y. B. Hahn. Recent advances in nanowiresbased field-effect transistors for biological sensor applications // Elsevier B. V. — 2018. —V. 100.

Раздел 1

20ПОЛУЧЕНИЕ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВС РЕГУЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙНА ОСНОВЕ НЕЙЛОНА-6 И ЕГО КОМПОЗИТОВ1 *PREPARATION OF NEW MATERIALS WITH CONTROLLED RELEASE
OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS BASED ON NYLON-6
AND ITS COMPOSITES
Е. Н. Бобрикова 1,2, К. В. Разум 1, Е. В. Дмитриенко 1,2
1Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск Россия
E. N. Bobrikova 1,2, K. V. Razum 1, E. V. Dmitrienko 1,2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine,
Siberian Branch of Russian Academy of Science, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
1E-mail: elena.dmitrienko@niboch.nsc.ruАннотация
Таргетная доставка лекарственных средств — актуальная задача научных исследований по всему миру. Одним из возможных способов достижения адресной
доставки является конструирование сложных систем, представляющих собой «умный» контейнер, который способен транспортировать препарат и высвобождать лекарственное средство только при достижении мишени. Использование таких систем
может обеспечить контролируемое высвобождение, пролонгированное действие,а также адресность доставки за счет введения в конструкцию специфичных лигандов, обеспечивающих нацеленность на мишень. В качестве носителей для таргетной
доставки препарата обычно используют наноструктуированные частицы, такие как:нанокапсулы, наногели, наночастицы и нанотрубки. В данной работе были получены и охарактеризованы капсулированные формы цитостатика — доксорубицина наоснове нейлона-6 и его композитов. Определен размер и поверхностный потенциал
полученных частиц/капсул, а также оптимальные условия загрузки доксорубицинаи емкость полимеров. Исследована эффективность высвобождения доксорубицина
© Е. Н. Бобрикова, К. В. Разум, Е. В. Дмитриенко, 2018.
*Работа выполнена в рамках государственного задания и при поддержке программы РНФ 18-14-00357.

Биотехнология

21

из полимерного каркаса в различных условиях. Проведено исследование токсичности и эффективности полученных частиц in vitro и in vivo.
Abstract
Targeted drug delivery is very actual problem of scientific research around the world.
Designing complex systems such as smart containers is one possible way to achieve targeted delivery. They are able to transport and release the drug only when the target is reached.
The use of such systems can provide controlled release, prolonged action, as well as targeted delivery by introducing into the design specific ligands that provide attainment target.
Nanostructured particles, such as nanocapsules, nanogels, nanoparticles and nanotubes,
are commonly used as agents for target drug delivery. In present study, the encapsulated
forms of cytostatic-doxorubicin based on nylon-6 and its composites have been obtained
and characterized. The size and zeta potential of nanoparticles/capsules are determined, as
well as the optimal loading conditions for the preparation and the capacity of the polymers.
The effectiveness of the release of doxorubicin from a polymeric matrix under different
conditions has been studied. The toxicity and efficiency of particles in vitro and in vivo
also were studied.

Актуальными объектами для направленной доставки являются противораковые препараты, например, используемые в полихимиотерапии (ПХТ).
На данном этапе развития клинической и экспериментальной онкологии
ПХТ, включающая несколько цитостатиков с различным механизмом действия и токсическим профилем, является основным методом лечением онкологических заболеваний. Одним из часто используемых цитостатиков,входящих в ПХТ, является доксорубицин.
Доксорубицин (DOX) относится к семейству антрациклиновых антибиотиков. Препарат обладает широким спектром противоопухолевой активности, включая острые формы лейкемии, лимфомы Ходжкина и неходжкина,рака молочной железы, рака легких и саркому. Механизм противоопухолевой активности DOX состоит в интеркаляции ДНК и ее разрушении, ингибировании топоизомеразы II, образовании металлических комплексов с железом или медью и образовании свободных радикалов. Кроме этого, доксорубицин восстанавливается до своего нестабильного метаболита, которыйпри обратном окислении способен образовывать активные формы кислорода. Это в свою очередь может привести к разрушению клеточной мембраны,перекисному окислению липидов, окислительному стрессу, разрушениюДНК и включению апоптотических механизмов гибели клетки.
Доксорубицин оказывает сильный токсический эффект на весь организм, основной проблемой является его кардиотоксичность. Даже при коротком курсе применения препарат может вызывать сердечную недоста-22Раздел 1точность через продолжительный временной период (от 4 до 20 лет) [1].
Капсулирование цитостатика, таргетная доставка и его контролируемое
высвобождение может повысить эффективность и снизить неблагоприятные эффекты стандартной полихимиотерапии.
Таким образом, целью работы была разработка дизайна и способа получения капсулированных форм лекарственных препаратов (на примере
доксорубицина) на основе нейлона-6 и его композитов, а также изучениеи характеризация их физико-химических и биологических свойств.
Ранее в лаборатории биомедицинской химии (ЛБМХ ИХБФМ СО РАН)был предложен подход к получению частиц из нейлона-6 и композитов наего основе, проведен ряд исследований направленных на изучение способности проникновения частиц и композитных материалов в клетку. Былопоказано, что и частицы, и композитные материалы на основе нейлона-6,проникают внутрь клеток и не обладают выраженной токсичностью.
В ходе работы было апробировано три варианта получения капсулированного доксорубицина:1. частицы на основе нейлона-6 (Ny);2. частицы на основе оксида железа Fe3O4, покрытые оболочной из нейлона-6 (Fe3O4-Ny);
3. нанокапсулы на основе нейлона-6.
Все типы частиц были получены по авторской методике [2], и в дальнейшем были использованы в качестве высокоэффективного сорбента.
Получение нанокапсул подразумевает формирование полимерного нанослоя на твердом центре с последующим удалением последнего. Таким образом, формируются полые наноструктуры, способные выступать в качестве
наноконтейнеров для лекарственных препаратов. Частицы и нанокапсулы
были охарактеризованы (размер, поверхностный потенциал) методами динамического светорассеивания (Malvern, UK), оптической и просвечивающей электронной микроскопией (ПЭМ). Загрузку частиц доксорубицином
проводили, варьируя концентрацию, состав раствора препарата, pH среды.
Параметры высвобождения цитостатика исследовали в различных условиях, в том числе и в биологических жидкостях (сыворотке). Были определены
оптимальные условия для загрузки и высвобождения доксорубицина, эффективность и скорость его высвобождения, ёмкость частиц. Установлено,что высвобождение доксорубицина возрастает при снижении рН раствора,что, в перспективе, может быть использовано для специфичного высвобождения препарата в более кислых компартментах клетки, например эндосомах, а не в межклеточном пространстве.
В ходе исследования была продемонстрирована возможность модификации поверхности всех типов полученных частиц, путем введения на поверх-Биотехнология

23ность направляющего агента, например, коротких фрагментов нуклеиновых
кислот.
Для всех типов полученных конструкций исследована токсичность invitro и in vivo, поскольку одним из основных требований к компонентам
систем доставки является отсутствие таковой. Первоначально с помощью
МТТ-теста было показано, что все полученные типы частиц не цитотоксичны по отношению к клеткам линии А549. Далее был проведен ряд исследований токсичности in vivo. В ходе экспериментов было показано, что привнутрибрюшинном введении лабораторным животным частицы не оказывают видимых токсических проявлений.
Таким образом, полученные данные подтверждают перспективность новых материалов с регулируемым высвобождением биологически активных
соединений на основе нейлона-6 и его композитов. В настоящее время ведется исследование in vivo терапевтического эффекта полученных конструкций.
Литература
1. Zhu Q., Jia, L., Gao, Z. et al. A tumor environment responsive doxorubicin-loaded
nanoparticle for targeted cancer therapy //Molecular pharmaceutics. — 2014. — Т. 11. —№. 10. — С. 3269–3278.
2. Дмитриенко Е. В., Пышная И. А., Рогоза А. В., Пышный Д. В.Способ получения молекулярно-импринтированных полимеров // Патент РФ № 2385889 от
10.04.2010.

Раздел 124МОДЕЛИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ
РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ IN SILICO *MODELING OF PLANT CELL ANTIOXIDANT SYSTEM IN SILICO
А. В. Бобровских, А. В. ДорошковФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАНФГБОУ Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет
A. V. Bobrovskikh, A. V. Doroshkov
FRC Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Russia
Novosibirsk State University, Russia
E-mail: alex-bobrovskih@mail.ruАннотацияВ исследовании проведена интеграция литературных данных и экспрессионных
данных о компонентах антиоксидантной системы растительной клетки в математическую модель в среде COPASI. Получено стационарное решение для системы с подробным описанием взаимосвязей. Модель описывает поведение антиоксидантной системы растительной клетки, используя реальные кинетические механизмы реакцийи особенности функционирования системы в разных компартментах.
Abstract
This study included the integration of literature data and expression data of the components of the plant cell antioxidant system in a mathematical model in the COPASI environment. System with a detailed description of the relationships have a steady-state solution.
This model describes the behavior of the plant’s antioxidant system, using real kinetic mechanisms of reactions and features of the functioning of the system in different compartments.

Моделирование биологических систем является перспективным подходом в биологии. Метод позволяет интегрировать разного сорта данные дляописания свойств биологической системы. Целью моделирования является
добиться описания свойств системы с точностью, достаточной для получения новых знаний о ее функционировании в стационарных и измененных
состояниях. COPASI является эффективной средой для построения биологических моделей (Hoops et al., 2006).
* © А. В. Бобровских, А. В. Дорошков, 2018.

Биотехнология

25Активные формы кислорода (АФК) — одни из ключевых молекул, повреждающие растения в ходе метаболических процессов. В стрессовом состоянии (холод, засуха, засоленность и пр.) продукция АФК многократно
усиливается, что приводит к повреждению клеточных мембран, органелл,биополимеров клетки. В конечном счете, сверхпродукция АФК в ходе стрессов может привести к снижению продуктивности растений и их гибели.
Для борьбы с радикалами у растений существует антиоксидантная система (АОС). Биохимически система состоит из 7 классов антиоксидантных
ферментов (аскорбатпероксидаза, глутатионпероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионредуктаза, дегидроаскорбатредуктаза, монодегидроаскорбатредуктаза) и веществ-антиоксидантов (аскорбат, глутатион и ихокисленные формы).
Изучение особенностей регуляции и динамики АОС является перспективным как в фундаментальном плане (получение знаний о регуляции сложноорганизованной биохимической системы), так и в прикладном (увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур в районах с неблагоприятным или изменчивым климатом).
Поведение системы в разных состояниях (например, разное освещениеили стресс) недостаточно изучено. Существуют математические модели, которые описывают отдельные части АОС у растений. Например, модель, которая описывает поведение аскорбат-глутатионового цикла в хлоропластахс учетом суточной динамики и колебаний освещения (Valero et al., 2015).
Модель описывает поведение системы в зависимости от разных потоков
электронов через фотосистему. Однако, модель не описывает АОС в полном
составе и ограничена одним компартментом. Кроме того, модель не описывает регуляцию системы в стрессовых условиях.
Представляем новую модель АОС растительной клетки, разработаннуюв среде COPASI. Наше исследование включает комплексное описание динамики растительной АОС в стационарном состоянии, учитывает особенности организации данной системы в разных компартментах. Кинетические
механизмы, активность ферментов и скорости генерации радикалов быливзяты на основе литературных данных и экспрессионных баз данных. В дополнение к хлоропластам, были построены модели пероксисом и митохондрий. Были найдены стационарные состояния для описанных систем.
Литература
1. Hoops S. et al. COPASI—a complex pathway simulator // Bioinformatics. —2006. — Т. 22. — №. 24. — С. 3067–3074.
2. Valero E. et al. Modeling the ascorbate-glutathione cycle in chloroplasts under light/
dark conditions // BMC systems biology. — 2015. — Т. 10. — №. 1. — С. 11.

Раздел 126ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ НА КАЧЕСТВО
ЛИОФИЛИЗАТОВ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНЫ
FREEZING TIME EFFECT ON THE QUALITY OF LYOPHILIZATESOF LIVE TULAREMIA VACCINE *С. В. Борисова 1, Д. Н. Бибиков 1, A. B. Комиссаров 1,2,
O. A. Волох 1, С.А., Бадарин1, Н. В. Синицына 1,
Н. И. Костылева 1, А. К. Никифоров 1,2ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный
институт “Мик­роб”», 410005 Саратов, ул. Университетская, д. 46
2ФГБО УВО «Саратовский государственный аграрный университет
им. Н. И. Ва­вилова» Министерства сельского хозяйства РФ, 410012
Саратов, Театральная пл., 1
1

S. V. Borisova 1, D. N. Bibikov 1, A. V. Komissarov 1,2, O. A. Volokh 1,
S. A. Badarin 1, N. V. Sinitsyna 1, N. I. Kostyleva 1, A. K. Nikiforov 1,2
FGHI Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”,
410005, 46 Universitetskaya St., Saratov
2
N. I. Vavilov Saratov State Agrarian University of the Ministry of Agriculture of
the Russian Federation, 410012, 1 Teatral’naya Square, Saratov
1Аннотация
Изучено влияние времени замораживания на качество лиофилизатов живой туляремийной вакцины. Выявлено, что выдерживание препаратов при температуре
минус (40±5) °С в течение следующих промежутков времени: 2–3 ч, 5–6 ч, 10–11 ч,
15–16 ч, 23–24 ч оказывает одинаковое влияние на показатели лио­филизатов.
Abstract
Studied has been the effect of freezing time on the quality of lyophilizates of livetularemia vaccine. It is revealed that storing of the preparations at -40±5 °С within thefollowing time periods: 2–3 h, 5–6 h, 10–11 h, 15–16 h, 23–24 h has an equal impact on
the properties of lyophilizates.

В технологии лиофилизации препаратов первой процедурой является егозамора­живание, от правильного проведения которого зависит качество гото*© С. В. Борисова, Д. Н. Бибиков, A. B. Комиссаров, O. A. Волох, С. А. Бадарин,Н. В. Синицына, Н. И. Костылева, А. К. Никифоров, 2018.

Биотехнология

27вого продукта. По­этому представляло определенный научно-практический
интерес изучение влияния про­должительности замораживания на качество
лиофилизатов туляремийной вакцины. Фла­коны с препаратом замораживали до температуры материала минус (40 ± 5) °C на полках сублимационной сушильной установки Epsilon 2-6D (Martin Christ, Германия). При этойтемпературе материал выдерживали в течение следующих промежутков
времени: 2–3 ч, 5- 6 ч, 10–11 ч, 15–16 ч, 23–24 ч. Далее конденсатор-вымораживатель охлаждали до темпера­туры минус (65 ± 5) °C. Во флаконы
вставляли специальные пробки для лиофилизации та­ким образом, чтобы
боковые прорези в пробках не перекрывались полностью горлышком флакона. Затем создавали остаточное давление в сушильной установке (0,1 ± 0,01)
мваг. Процесс сублимации вели от температуры полок минус (40 ± 5) °C до(30 ± 2) °C со скоро­стью повышения температуры полок не более 5 °C в час.
При достижении температуры материла (25 ± 2) °C флаконы герметизировали непосредственно в камере сушильной уста­новки, используя винтовой
прижиматель пробок, являющийся конструктивным элементом сушильной
установки. После герметизации флаконов давление в установке выравнивали с атмосферным и производили выгрузку флаконов и обкатку их алюминиевыми колпачка­ми.
Оценку влияния времени замораживания на качество лиофилизатов проводили по следующим показателям, нормируемым фармакопейной статьей
предприятия на живую туляремийную вакцину: внешний вид препарата,остаточная влажность, растворимость, pH, седиментационная устойчивость
(время расслоения), жизнеспособность.
Результаты исследований представлены в таблице. По внешнему видуполученные лиофилизаты представляли собой сухую массу коричневато-белого цвета в виде хорошо сформированной таблетки. Остаточная влажностьдля препаратов была практически оди­наковой и составляла от 0,8 % до
1,1 %. Значение pH растворов, полученных после рас­творения лиофилизатов, было от 6,9 до 7,1. Полученные лиофилизаты легко растворялись в 1 млводы в течение, в среднем, 30 секунд. Расслаивание препаратов в течение
более 60 мин обнаружить не удалось. Жизнеспособность образцов послеих лиофилизации практи­чески не менялась в сравнении с жидкими препаратами. Значения всех показателей соот­ветствовали нормируемым требованиям. Полученные экспериментальные данные позво­ляют сделать вывод ободинаковом влиянии времени замораживания на показатели лио­филизатов.
В практическом плане это дает возможность варьировать временем начала
сублимационного высушивания.

Раздел 128Результаты исследований влияния времени замораживанияна качество лиофилизатов живой туляремийной вакцины

Время замораживания, ч
2–3
5–6
10–11
15–16
23–24

Остаточная
влажность,%Растворимость,секунд

I

I

н/о

II
0,8
0,8
1,1
1,0
0,9

н/о

II
30
35
25
30
30

рН
I
6,9
7,0
7,1
6,9
7,0

II
7,0
7,1
7,1
6,9
7,0

Седиментационная
устойчивость, мин
I
II

н/о

более
60

Жизнеспособность, %
I
62
58
69
54
70

II
60
55
69
53
68

Примечание. I — значение показателя жидкого препарата, II — значение
показателя лиофилизата, н/о — не определяли.

29Биотехнология

КОМБИНИРОВАННАЯ ГИДРОМЕТАЛЛУРГИЧЕСКАЯ
ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ
МЫШЬЯКСОДЕРЖАЩЕГО
МЕДНО-ЦИНКОВОГО КОНЦЕНТРАТА *COMBINED BIOHYDROMETALLURGICAL TECHNOLOGY FOR
TREATMENT OF ARSENIC-BEARING COPPER-ZINC CONCENTRATE
А. Г. Булаев 1,2, Е. А. Мельникова 2,3, Ю. А. Ёлкина 1,2, Л. А. Гавирова 1Биологический факультет Московского государственного
университета имени М. В. Ломоносова
2Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского,ФИЦ Биотехнологии РАН
3Московская государственная академия ветеринарной медицины биотехнологии — MBA имени К. И. Скрябина
1

A. G. Bulaev 1,2, E.  A. Mel’nikova 2,3, Y.  A. Elkina 1,2, L. A. Gavirova 1
Biological Faculty, Lomonosov Moscow State University
2
Winogradsky Institute of Microbiology,
Research Center of Biotechnology RAS
3
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology
n. a. K. I. Skryabin
1E-mail: bulaev.inmi@yandex.ruАннотация
Целью исследования являлась разработка гидрометаллургической технологиидля переработки мышьяксодержащего медно-цинкового концентрата, включающей
стадии биовыщелачивания и химического окисления. В предварительных экспериментах была выявлено, что оптимальная температура для биовыщелачивания медии цинка составила 50 °C. Биовыщелачивание концентрата в лабораторных реакторахв оптимальных условиях (плотность пульпы 1:10, время пребывания 7 суток, переменный температурный режим 40 °C/50 °C) позволило извлечь 29 и 78 % Cu и Zn.
Высокотемпературное доокисление твердого остатка биовыщелачивания при 90 °C
с использованием трехвалентного железа жидкой фазы пульпы и хлорида натрия
позволило увеличить степень извлечения Cu и Zn до 48 и 84 %, соответственно.
© А. Г. Булаев, Е. А. Мельникова, Ю. А. Ёлкина, Л. А. Гавирова, 2018.
*Исследование было выполнено при поддержке Гранта Президента Российской
Федерации Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых — кандидатов наук № МК-6639.2018.8.

30Раздел 1

Abstract
The goal of the present study was to develop biohydrometallurgical technology fortreatment of arsenic-bearing copper-zinc concentrate, which included stages of bioleaching and chemical oxidation. Preliminary experiments demonstrated that optimal temperature for copper and zinc bioleaching was 50 °C. Bioleaching of the concentrate under optimal conditions in reactors (pulp density 1:10, residence time 7 days, variable temperaturemode 40 °C/50 °C) made it possible to extract 29 and 78 % of Cu and Zn. High temperatureoxidation of solid bioleach residue at 90 °C using ferric iron from liquid phase of the pulp
and NaCl made it possible to extract 48 and 84 % of copper and zinc, respectively.

Цветная металлургия сталкивается с проблемой истощения запасов минерального сырья, пригодного для получения кондиционных концентратовиз медных и медно-цинковых руд. Одним из типов медных руд, использование которых затруднено из-за высоких экологических рисков, являются
руды с высоким содержанием минералов меди и мышьяка (главным образом, энаргит Cu3AsS4 и теннантит Cu12As4S13). Традиционная пирометаллургическая переработка таких руд предполагает использование специальных
систем очистки газов, что снижает рентабельность их переработки. Кроме того, многие медные и медно-цинковые руды с высоким содержанием
мышьяка, например, с ряда месторождений Южного Урала, являются труднообогатимыми по причине тонкого прорастания минералов меди и цинкас пиритом. Получение кондиционных концентратов из такого сырья является технологической проблемой. Биогидрометаллургические технологии
могут быть перспективными для переработки руд такого типа. Для переработки бедных и забалансовых медных руд в мире достаточно широко используется кучное биовыщелачивание [5]. Реакторное биоокисление может
применяться для переработки некоторых сульфидных концентратов (золотосодержащих, некондиционных концентратов цветных металлов, в томчисле, с высоким содержанием мышьяка) [8].
Целью данной работы было проведение лабораторных испытаний пореакторному биовыщелачиванию медно-цинкового концентрата с целью
определения целесообразности применения биогидрометаллургических
технологий для переработки сырья такого типа. Основными сульфидными минералами концентрата были пирит (FeS2), халькопирит CuFeS2, теннантит (Cu12As4S13), сфалерит (ZnS). Концентрат содержал 6.22 % меди,7.30 % цинка, 24.4 железа и 38.6 % серы.
Предварительные эксперименты по биовыщелачиванию халькопиритаи теннантита проводили в колбах со 100 мл жидкой питательной среды, содержащей соли азота и фосфора и 0.02 % дрожжевого экстракта, 2 г минералов с использованием смешанной культуры ацидофильных микроорганизмов на ротационном шейкере при различных температурах. Оптимальной

минералами концентрата были пирит (FeS2), халькопирит CuFeS2, теннантит
(Cu12As4S13), сфалерит (ZnS). Концентрат содержал 6.22% меди, 7.30% цинка, 24.4
железа и 38.6% серы.
Предварительные эксперименты по биовыщелачиванию халькопирита итеннантита проводили в колбах со 100 мл жидкой питательной среды,содержащей соли азота и фосфора Биотехнология
и 0.02% дрожжевого экстракта, 2 г минералов с 31использованием смешанной культуры ацидофильных микроорганизмов наротационном шейкерепри различных температурах.
Оптимальной
температурой
температуройдля биовыщелачивания
халькопиритаи теннантита
былидля биовыщелачиванияи теннантита былиинтервалы
50-55°Си 45интервалы
50–55 °C ихалькопирита
45–50 °C, соответственно
(рис.
1, А, Б).
Биовыщела50°С, соответственно (Рис. 1А и 1Б). Биовыщелачивание концентрата вчивание
концентрата в аналогичных условиях показало, что оптимальная
аналогичных условиях показало, что оптимальная температура длятемпература
длявыщелачиваниямедии (Рис.
цинкасоставила 50 °C (рис. 1, В).
выщелачивания
медии цинка составила
50°С
1В).

Рис. 1.
Рис. 1. Степень выщелачивания меди из халькопирита (А) и теннантита (Б), а
1. Степень
выщелачивания
халькопирита (А)также медиРис.
и цинкаиз концентрата(В) за 20медисутокизбиовыщелачиванияи теннантитаа также меди и цинкаиз концентрата(В) режиме
Процесс
реакторного(Б),биовыщелачивания
проводилив непрерывном
за
20
суток
биовыщелачиванияв цепи из трех лабораторных реакторах, снабженных верхнеприводными
мешалками (500 об/мин), ультратермостатами для поддержания температуры икомпрессорами для аэрации (5 л/мин). Плотность пульпы (Т:Ж) составляла 1:10. ВПроцесс реакторного биовыщелачивания проводили в непрерывном режипервый реактор цепи также осуществлялась подача CO2, что позволяет повысить
мевцепи из
трех лабораторных
реакторах,снабженных
верхнеприводными
активность
автотрофных
микроорганизмов,окисляющих
сульфидные
минералы.
мешалками
об/мин),в ультратермостатами
дляподдержания
Общее время(500пребывания
цепи из трех реакторов
составляло
7 сут,температуры
(3 сут - вреакторе идляпоаэрации
2 сут (5вол/мин).
второмПлотностьи третьем).
Было (Т:Ж)показано,чтоипервом
компрессорами
пульпы
составляла
биовыщелачиваниев реакторах
при 40°Cпозволило извлечь
26 CO
и 90%
Cuпозволяет
и Zn в
1:10.
В первый реактор
цепи также
осуществлялась
подача
,что
2раствор (Рис. 2А). При этом при 50°C степень выщелачивания металлов
былаповысить
активность автотрофных микроорганизмов, окисляющих сульфидниже, чем при 40°С (результаты не показаны). Поэтому было проведено также
ныеминералы.в Общее
времятемпературном
пребывания в режиме,цепи из гдетрехвреакторов
составлябиоокисления
переменном
первом реакторе
ло
7 сут, (3 сут— в первоми пои2 третьемсут во втором
третьем).
Былотемпература
составляла
40°С, реактореа во втором
− 50°С.и Более
низкая
температурачтов первом
реакторе обеспечивает
накоплениеи позволяет
показано,биовыщелачиваниев реакторах
при 40биомассы°C позволило
извлечь
растимикроорганизмам,подавляться
при
26
и 90автотрофным
% Cu и Zn в раствор
(рис. 2, А).ростПри которых
этом приможет
50 °C степень
выщелачи-вания металлов была ниже, чем при 40 °C (результаты не показаны). Поэтому
было проведено также биоокисления в переменном температурном режиме,где в первом реакторе температура составляла 40 °C, а во втором и третьем —50 °C. Более низкая температура в первом реакторе обеспечивает накопление
биомассы и позволяет расти автотрофным микроорганизмам, рост которых
может подавляться при высоких температурах. Переменный температурный
режим позволил извлечь в раствор 30 и 78 % Cu и Zn (рис. 2, Б).
Таким образом, переменный температурный режим обеспечил небольшое повышение извлечения меди, но привел к некоторому снижению степени извлечения цинка.
После биоокисления твердый остаток процесса биовыщелачивания концентрата подвергали высокотемпературному выщелачиванию в течение

32Раздел 1

25 часов. Для проведения процесса окисления 1 л пульпы после биоокисления помещали в титановый реактор и нагревали до 90 °C. Проведение процесса в таких условиях позволило использовать ионы Fe3+, которые накапливались в жидкой фазе пульпы в процессе биоокисления, как окислитель
Степень
извлечения меди и цинка из концентрата в ходе реакдля химического выщелачивания. Исследовали также влияние хлорид-ионащелачивания
при 40°Си вметаллов,переменном
режимена извлечение
цветныхдля чего втемпературном
пульпу перед высокотемпературным выщелачиванием вносили 0.5 и 1 M хлорида натрия, который может
аким образом,переменный
температурный
режим обеспечил некатализировать
окисление сульфидных
минералов.
Окисление безмеди,добавления
натрия кне позволило
увеличитьснижению
стеение извлечения
нохлорида
привел
некоторому
пень извлечения цветных металлов (рис. 3). Выщелачивание же в присутения цинка.
ствии
1 Мтемпературах.
позволило извлечь
48 и 84температурный
% меди и цинка,соответственно.
высоких
Переменный
режимпозволил извлечь враствор 30 и 78% Cu и Zn (Рис.
2Б).
После биоокисления
твердый
остаток процесса биовыщел
трата подвергали высокотемпературному выщелачиванию в теДля проведения процесса окисления 1 л пульпы после биооали в титановый реактор и нагревали до 90°С. Проведение процессях позволило использовать ионы Fe3+, которые накапливались впульпы в процессе биоокисления, как окислитель для химачивания. Исследовали также влияние хлорид-иона на извлечение
ов, для Рис.
чего
вРис.пульпу
передвысокотемпературным
2. Степень
медии цинка
концентратав ходе реакторноговыщелач
2.извлечения
Степень извлечения
медиизи цинкаиз концентрата
биовыщелачивания при 40°С и в переменном температурном режимев ходе реакторного
при 40 °C катализировать о
и 0.5 и 1MТаким
хлорида
натрия,биовыщелачивания
который может
образом,и впеременный
переменномтемпературный
температурном режим
режимеобеспечил небольшое
идных минералов.
повышение извлечения меди, но привел к некоторому снижению степени
извлечения цинка.
После биоокисления
твердый остаток процесса биовыщелачивания
концентрата подвергали высокотемпературному выщелачиванию в течение 25часов. Для проведения процесса окисления 1 л пульпы после биоокисления
помещали в титановый реактор и нагревали до 90°С. Проведение процесса в таких
условиях позволило использовать ионы Fe3+, которые накапливались в жидкой
фазе пульпы в процессе биоокисления, как окислитель для химического
выщелачивания. Исследовали также влияние хлорид-иона на извлечение цветных
металлов, для чего в пульпу перед высокотемпературным выщелачиванием
вносили 0.5 и 1M хлорида натрия, который может катализировать окисление
сульфидных минералов.

Рис. 3. Степень извлечения меди и цинка при химическом окислении
Степень извлечения
цинка прихимическом
окислении ((90 °C, меди25 часов)ив присутствии
хлорида
натрияв присутствии хлорида натрия
ОкислениеРис.без
добавления хлорида натрия не позволило увеличить
3. Степень извлечения меди и цинка при химическом окислении (90°С, 25Биотехнология

33Результаты, полученные в данной работе, могут позволить разработать
новую биогидрометаллургическую технологию, которая будет включать
стадию биоокисления, позволяющую наработать раствор окислителя (ионов Fe3+), и стадию высокотемпературного химического окисления, которая
позволяет повысить эффективность выщелачивания труднооокисляемых
сульфидных минералов.

Раздел 134ПОЛУЧЕНИЕ CRISPR-АССОЦИИРОВАННОГО
РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА CPF1
PRODUCTION OF CRISPR-ASSOCIATED
RECOMBINANT PROTEIN CPF1 *В. А. Васиховская
Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
V. A. Vasikhovskaya
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
E-mail: vasikhovskaya_v@mail.ruАннотация
Данная работа направлена на создание отечественного коммерческого препарата
эндонуклеазы Cpf1, входящей в бактериальную систему иммунного ответа CRISPR,для использования в генно-инженерных работах. В ходе работы ген, кодирующий
фермент Cpf1, был обнаружен в бактериальном штамме Moraxella bovis, было проведено его клонирование и экспрессия, а также проведена проверка активности полученного препарата.
Abstract
This study is focused on producing a domestic commercial Cpf1 endonuclease-based
kit from bacterial immune system known as CRISPR for genetic engineering applications.
In the course of work, the gene encoding the Cpf1 enzyme was found out in the bacterial
strain Moraxella bovis, gene cloning and expression were carried out and the enzyme
activity was examined.

По результатам публикации журналом Science ежегодного списка наиболее важных открытий в топ-10 трижды (в 2012, 2013 и 2015 году) входили
достижения в области геномного редактирования, в частности возможности
применения бактериальной системы CRISPR (сlustered regularly interspaced
short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) для редактирования геномов [1]. За прошедшие
годы эта технология заняла свое место в арсенале молекулярных биологови постепенно внедряется в клиническую практику.
* © В. А. Васиховская, 2018.

Биотехнология

35Системы CRISPR представляют собой системы иммунного ответа прокариот, принцип действия которых основан на специфическом расщеплении чужеродной ДНК. Комплекс специальных белков интегрирует небольшие фрагменты вирусной нуклеиновой кислоты (протоспейсеры) в хозяйскую ДНК в виде CRISPR-кассеты. Первичный транскрипт, образующийся
с CRISPR-кассеты, затем процессируется в направляющую РНК (gРНК),частично комплементарную геному вируса или плазмиды. При повторном заражении тем же вирусом gРНК образует комплекс с эндонуклеазойи специфически нацеливает ее, в результате чего чужеродная ДНК расщепляется. Благодаря своим свойствам эта система позволяет редактировать
геном in vivo, но кроме того может использоваться и in vitro для клонирования и гидролиза целевой ДНК в конкретном месте, что не всегда могут
сделать эндонуклеазы рестрикции, так как их сайтов в геноме может бытьочень много.
Эндонуклеаза Cpf1 является не так давно открытым функциональным
аналогом более известного белка Cas9 и имеет ряд преимуществ. gРНК,используемая Cpf1, более короткая (~ 42 н), что имеет практические преимущества перед длинной gРНК (~ 100 н) в системах на основе Cas9, поскольку более короткие рибоолигонуклеотиды значительно легче и дешевле синтезировать. Также Cpf1 разрезает двуцепочечную ДНК с образованием липких 5’‑концов, тогда как Cas9 образует тупые концы. Cpf1 узнает
небольшие T‑богатые (Cas9 — G‑богатые) последовательности около сайта-мишени, называемые PAM‑сайтами (protospacer adjacent motif — мотив, смежный с протоспейсером), и расщепляет ДНК на 18‑23 пн нижеPAM‑сайта (Cas9 разрезает в 3 пн от PAM‑сайта). Это означает, что после
восстановления нет нарушения сайта узнавания (первые 10–12 н после
PAM-сайта), и поэтому Cpf1 допускает множественные раунды расщепления ДНК. Узнавание T‑богатых PAM‑сайтов позволяет расширить диапазон ДНК‑мишеней для редактирования AT‑богатых областей генома [2].
Также есть данные о том, что использование Cas9 для геномного редактирования нецелесообразно в связи с большим количеством возникающихпри редактировании ошибок, что говорит о необходимости поиска альтернативных путей [3].
В связи с описанными выше преимуществами получение фермента
Cpf1 представляется перспективной биотехнологической задачей как с точки зрения научного, так и экономического интереса, поскольку системы
редактирования генома на основе Cpf1 производятся только зарубежными
компаниями New England Biolabs и Integrated DNA Technologies (США),а российских производителей каких‑либо CRISPR‑систем в настоящее время не существует.

36Раздел 1Исследование проводилось на бактериях рода Moraxella с тремя штаммами: Moraxella bovis, Moraxella nonliquefaciens и Moraxella species. Излитературных данных известно, что ген cpf1 обнаружен в штаммах бактерий рода Moraxella, поэтому сначала был проведен теоретический поиски выравнивание последовательностей гена cpf1 среди штаммов данных
бактерий, представленных в базе данных GenBank. Согласно полученным
данным последовательности имеют консервативные районы, что дало намоснование полагать их наличие и в геномах исследуемых бактерий и, соответственно, подбирать праймеры. Выравнивание областей, фланкирующих начало и конец гена, также показало наличие консервативных районов,поэтому теоретически было возможно амплифицировать ген полностью,однако на практике это не удалось реализовать. Поэтому были подобраны
ген-специфичные праймеры, в результате амплификации с которыми былбы получен ген без начального и конечного участков. Экспериментально
было показано наличие гена у всех трех исследуемых штаммов, полная последовательность гена была установлена для штамма Moraxella bovis с использованием методики “прогулки по хромосоме”.
Клонирование гена cpf1 проводилось по методу гомологичной рекомбинации In‑Fusion в составе экспрессирующего вектора pET15b в видедвух конструкций — содержащей и не содержащей гистидиновый олигопептид перед началом гена. Встраивание проводилось двумя способами,так как с одной стороны очистка гистидинового варианта проста в исполнении, но с другой стороны гистидиновый олигопептид может влиять нафункционирование белка, а его отщепление от полученного рекомбинантного белка экономически невыгодно.
Наработку биомассы проводили в штамме E. coli BL21 DE3 pLysS. Дляопределения оптимального времени экспрессии индукцию ИПТГ проводили в течение различного времени. Было установлено, что экспрессия происходит в обеих конструкциях и максимальный выход белка достигается приинкубации с ИПТГ свыше 5 часов. Кроме того, в обоих вариантах помимо
целевого белка (145 кДа) происходит накопление нецелевого белка массой
около 110 кДа - вероятно продуцируется укороченный вариант Cpf1.
Для проведения хроматографической очистки гистидинового варианта была подобрана следующая последовательность сорбентов: Ni-NTA —Sephacryl 200 — гидроксиапатит. Безгистидиновый вариант белка очищали последовательно на ДЕАЕ-целлюлозе и гидроксиапатите. В результате
очистки и концентрирования было получено 3 препарата — два с гистидиновым олигопептидом на N-конце, но с различной массой (110 и 150 кДа)и один безгистидиновый вариант.
Для тестирования функциональной активности полученных препаратов
была выбрана плазмида pBR322 с единственным сайтом гидролиза Cpf1.

Биотехнология

37Направляющая РНК была синтезирована химическим путем в Лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН. Гидролиз проводился в течение 1 ч при
37 °C со стадией дополнительного гидролиза EcoRI для того, чтобы судитьо степени гидролиза по получению двух бендов (состав буфера х 1(pH=7,9):50 мМ NaCl, 10 мМ Tris‑HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл BSA). В данных
условиях активность проявляет полный гистидиновый вариант белка. Длянего было изучено влияние концентрации одновалентных ионов и величины
pH на активность белка. По результатам исследований гидролиз эффективнее проходит в буфере, содержащем NaCl в концентрации 100 мМ, а значение pH в диапазоне от 7.0 до 8.5 не оказывает существенного влияния наполноту протекания гидролиза.

Гидролиз pBR322 ферментами Cpf1 и EcoRI:
A: 1 — HisCpf1_1, 2 — HisCpf1_2, 3 — Cpf1_1, 4 и 5 — исходная и линеаризованная по сайту EcoRI pBR322 соответственно;М — 50 кб маркер (СибЭнзим). Оптимизация условий гидролиза ферментом 6xHisCpf1 плазмиды pBR322:
Б: 1‑5 — буфер с C (NaCl) = 0, 50, 100, 150 и 200 мМ соответственно,6 — исходная pBR322, М — 50 кб маркер (СибЭнзим).
В: 1‑6 — буфер с pH = 7.0, 7.4, 7.6, 7.9, 8.0, 8.5 соответственно,7 — исходная pBR322, М — 50 кб маркер (СибЭнзим).

Литература
1. Travis, J. Making the cut // Science. — 2015. — V. 350 — № 6267 — P. 1456–1457.
2. Zetsche B. [и др.]. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class
2 CRISPR-Cas System // Cell. 2015. № 3 (163). C. 759–771.
3. Kosicki M., Tomberg K., Bradley A. Repair of double-strand breaks induced
by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements //Naturebiotechnology. — 2018. — Т. 36. — №. 8. — С. 765.

Раздел 138ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
УРОВНЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ПРЕПАРАТЕ
АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА
FLOW CYTOMETRY IN DETERMINING THE LEVELOF SPECIFIC ANTIBODIES IN AN RABIESIMMUNOGLOBULIN DRUG *С. В. Генералов, А. Л. Кравцов, В. А. Кожевников,Ю. А. Гаврилова, Е. Г. Абрамова
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный
институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов, Россия
S. V. Generalov, A. L. Kravtsov, V. A. Kozhevnikov,
Yu.  A. Gavrilova, E. G. Abramova
FPHI Russian Anti-Plague Research Institute «Microbe»of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protectionand Human Welfare, Saratov, RussiaАннотацияВ настоящем исследовании рассматривается разработка метода определения
уровня антирабических антител с использованием проточной цитометрии. Метод
основан на измерении уровня флуоресценции в клетках, инкубированных в питательной среде, в которую добавляют смесь разведений антирабического иммуноглобулина и вируса бешенства.
Abstract
This study examines the development of a method for determining the level of anti-rabies antibodies using flow cytometry. The method is based on measuring the level offluorescence in cells incubated in a nutrient medium to which dilutions of rabies immunoglobulin and rabies virus are added.

Вирус бешенства, относящийся к семейству Rhabdoviridae и родуLyssavirus, вызывает у человека и животных инфекционное заболевание,характеризующееся абсолютной летальностью. Размножение вируса происходит в цитоплазме клеток восприимчивого организма или тканевой культуры. Указанное свойство вируса определило особенности методов его обнаружения в культуре клеток. Для детекции вируса бешенства инфицирован* © С. В. Генералов,Е. Г. Абрамова, 2018.

А. Л. Кравцов,В. А. Кожевников,Ю. А. Гаврилова,Биотехнология

39

а

б

в

Цитограммы клеточной культуры Vero: а — интактная клеточная культурабез добавления антирабического иммуноглобулина (отрицательный
контроль); б — клеточная культура, инфицированная рабочим
разведением вируса бешенства (положительный контроль); в — клеточная
культура, инфицированная смесью, содержащей рабочее разведение
вируса бешенства и антирабический иммуноглобулин в разведении 1:500

40Раздел 1ные клетки окрашивают специфическими флуоресцирующими антителами,а результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии. Аналогично на культуре клеток в реакции нейтрализации исследуют препараты,содержащие антирабические антитела. Данный принцип является основой
таких методов обнаружения антирабических антител, как тест ингибиции
фокусов флуоресценции и метод определения вируснейтрализующих антител с использованием иммунофлуоресценции (FAVN-тест). Оба метода рекомендованы Всемирной Организацией здравоохранения в качестве замены
реакции нейтрализации вируса бешенства на белых мышах.
Тем не менее, методы исследования, связанные с использованием люминесцентной микроскопии, не позволяют провести точную количественную
оценку относительного числа клеток, инфицированных вирусом. Логичным
развитием указанных методологических подходов является использование
проточной цитометрии.
Целью настоящей работы явилась разработка метода, основанного на использовании проточной цитометрии, для определения уровня специфических
антител в препарате антирабического иммуноглобулина. Данный препарат
используется для специфической постэкспозиционной профилактики бешенства у людей. Для оценки вируснейтрализующей способности антирабических
сывороток и препарата иммуноглобулина к предварительно подготовленным
разведениям исследуемых образцов добавляли рабочее разведение вируса
бешенства штамма «Москва 3253». После нейтрализации вируса бешенства
антирабическими антителами, образцы добавляли к клеточной культуре Vero.
Клетки выращивали в CO2-инкубаторе в течение 72 ч. После завершения выращивания, клетки фиксировали, окрашивали флуоресцирующими антирабическими антителами и проводили цитометрическое исследование. Результаты
цитометрических исследований показаны на рисунке. Использование проточной цитометрии позволяет определить точное количество инфицированных
клеток в исследуемой суспензии, а также степень их инфицирования по интенсивности флуоресценции. Уровень содержания антител в исследуемых образцах учитывают по калибровочному графику, построенному на основании данных исследования стандартного образца антирабического иммуноглобулина.
Установлена высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью
предлагаемого метода в сравнении с результатами, полученных в реакции нейтрализации на белых мышах (0,95) и модифицированным методом FAVN (0,99).
Проточная цитометрия показала себя как быстрый, чувствительный и надежный метод исследования уровня антирабических антител. Получение точной информации о количестве инфицированных клеток в культуре, в дальнейшем позволит использовать проточную цитометрию на этапах контроля
производства разрабатываемых и выпускаемых антирабических препаратов.

Биотехнология

41ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХИ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ПРИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОМ
ДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА *A STUDY OF MORPHOLOGICAL AND ULTRASTUCTURALCHANGES IN TUMOR CELLS DUE TO CYTOTOXIC EFFECT
OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS
А. В. Глущенко 1, Е. В. Шекунов 2, К. С. Юрченко 1ФГБНУ «Федеральный Исследовательский Центр
Фундаментальной и Трансляционной Медицины»2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет

1

A. V. Glushchenko, FSBSI «FRC FTM», Russia
E. V. Shekunov, NSU, Russia
K. S. Yurchenko, FSBSI «FRC FTM», Russia
E-mail: xenia7yurchenko@gmail.com
Аннотация
Исследования противоопухолевых свойств вируса болезни Ньюкасла (ВБН)в экспериментальной терапии человеческих опухолей начались в середине XX века.
Однако механизм цитотоксического действия до сих пор остается предметом изучения. Большинство научных статей, в которых предлагаются возможные механизмы
вирус-опосредованной активации гибели опухолевых клеток, описывает апоптоз какосновной специфический путь для ВБН инфицированных клеток в реализации цитотоксического противоопухолевого потенциала [1]. Однако за последние годы появились работы, подтверждающие способность ВБН запускать в трансформированных
клетках аутофагию [2] и некротические изменения [3]. В данной работе, мы оценили структурные изменения опухолевых клеток под действием штамма NDV/Altai/
pigeon/770/2011 в условиях реализации ВБН-индуцированной клеточной гибели.
Abstract
The antitumor properties of Newcastle disease virus (NDV) against human tumors
in experimental therapy began in the middle of the XX century. However, at present themechanism of cytotoxic effect remains the subject of study. The wide range of scientific© А. В. Глущенко, Е. В. Шекунов, К. С. Юрченко, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-34-00139.

42Раздел 1

papers, which suggest possible mechanisms of virus-mediated tumor cell death, describe
apoptosis as the main specific pathway for NDV in infected cells in realization of cytotoxic
antitumor potential [1]. However, in recent years new studies have appeared and confirmed the ability of NDV to trigger autophagy [2] and necrotic changes [3] in transformed
cells. In this work, we evaluated structural changes of tumor cells due to NDV/Altai/pigeon/770/2011 strain in the conditions of activation of NDV-induced cell death.

Применения ВБН в качестве противоопухолевого агента изучается ужеболее 50 лет на моделях in vitro, in vivo, а также в нескольких успешных
клинических испытаниях на людях [4]. Описаны процессы попадания вируса в опухолевую клетку и его репликации в ней [5], однако единого механизма клеточной гибели при виротерпии ВБН нет по сей день. Наличие
противоречивых результатов исследований механизмов клеточной гибели
ВБН-инфицированных опухолевых клеток может объясняться специфичностью каждого конкретного штамма, которые могут использовать различные
механизмы индукции апоптоза/некроптоза/аутофагии и их комбинаций возможно даже на конкретных линиях опухолевых клеток.
Исследуемый штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011, выделенный от сизого
голубя на территории Алтайского края [6], уже показал эффективность цитотоксического действия при инфицировании опухолевых клеточных культур [7], а также появление некротических изменений в опухолевой ткани
солидного узла ксенографта немелкоклеточной карциномы легкого человека A549 после серии интратуморальной виротерапии. В то же время путиклеточной гибели, активируемые вирусом NDV/Altai/pigeon/770/2011, неописаны. Таким образом, цель настоящего исследования заключалась в изучении выбора стратегии гибели раковых клеточных линий при воздействиина них штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011. Для достижения данной целибыли поставлены следующие задачи: 1) Исследовать морфологические изменения в инфицированной культуре клеток. 2) Оценить ультраструктурные
изменения в клетках методом электронной микроскопии.
Морфологические исследования проводились методом световой микроскопии после рутинной окраски гематоксилин-эозином по истечении
24 и 72 часов после инфицирования клеток. По прошествии 24 часов ядраклеток линии HeLa становятся менее выраженным, в отличие от контрольных, что характерно для клеток, зараженных вирусом. Цитоплазма приобретает гетероморфный вид, регистрируются небольшие включения. В опухолевой клеточной линии Hep-2 отмечено более ярко выраженными изменение
цитоплазмы. Различного рода включения не регистрируются. По истечению
72 часов клетки линии Hela начинают приобретать нехарактерную измененную форму. Отмечено нарушение целостности монослоя и появление раз-Биотехнология

43ряженных участков. Растет количество погибших клеток. Ядра клеток смещаются к периферии. Аналогичная картина наблюдается в клетках Hep-2.
Для оценки механизма клеточной гибели было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток линий HeLa и Hep-2, зараженных
штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 (10 MOI), на маркеры TNF-alphaи Bcl-2 (Abcam). Положительное окрашивание на маркер апоптоза TNFalpha наблюдали уже на первые сутки после инфицирования ВБН на обеих
опухолевых линиях. Изменений при окрасе на наличие Bcl-2 выявлено не
было. Можно предположить, что на ранних этапах действия штамма NDV/
Altai/pigeon/770/2011 возможна активация внешнего пути апоптоза инфицированных клетках. Отсутствие же окраски фактора апоптоза Bcl-2 говорито том, что внутренний путь активации при этом задействован не был. Наосновании этих данных, можно сделать вывод, что на ранних этапах заражения в клеточной линии HeLa и Hep-2 активация апоптоза может происходить по внешнему пути. Однако усиление внутренних путей апоптоза и смена клеточной гибели на некроптоз остается также возможным, что требует
дальнейшего изучения.
Электронномикроскопического исследования продемонстрировало ультраструктурные изменения опухолевых клеток после заражению ВБН. Через 3 часа не было обнаружено видимых структурных изменений. На первые
сутки в клетках линии Hep-2 было отмечено увеличение размеров митохондрий, вероятно, вследствие активной репликации вируса. При исследовании
клеточной линии HeLa усиление активности синтетического аппарата также
регистрируется, но происходит преимущественно за счет увеличения объема цистерн эндоплазматического ретикулума. Данное различие, вероятно,связанно с лучшим развитием митохондрий в клеточной линии Hela в сравнении с линией Hep-2.
На третьи сутки увеличивается количество эндосом, лизосом, аутофагосом в клетках. Природа такого явления, возможно, двояка и может быть связанна с защитными функциями клетки на ранних этапах репликации вирусам. Однако, возможно, аутофагия вносит вклад в развитие апотоза, так какотмечены случаи, когда данный процесс коррелируют с ранним апоптозом
[8]. В обеих клеточных линиях наблюдается снижение в динамике запасов
гликогена в клетках. Повышенное количество глюкозы считается одним изосновных изменений метаболизма в раковых клетках [9]. Вследствие активно протекающих синтетических процессов ассоциированных с развитием
ВБН, концентрация глюкозы начинает падать, что в свою очередь может
приводить к нарушению метаболизма самой клетки.
Тем не менее, инфицированные клетки имеют отличительные черты некротической гибели, встречаются клетки с нарушениями целостности цито-Раздел 144плазматической мембраны и выходом содержимого во вне клеточную среду.
Данная картина может отражать развитие некроптоза вследствие схожих
ультраструктурных изменений с морфологией некротизированных клеток.
Регистрируется наличие клеточных образований с наличием вироплазмы.
Тем не менее, клетки в состоянии апоптоза также присутствуют при действии данного штамма.
Таким образом, наше исследование подтверждает наличие онколитического потенциала у штаммов NDV/Altai/pigeon/770/2011 и демонстрирует
развитый характер данного явления. Пути активации клеточной гибели посредством ВБН требует дальнейшего изучения.
Литература
1. Zamarin, D. et al. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: oldchallenges and new directions // Future Microbiol. — 2012. — 7 (3). — P. 347–367.
2. Meng, C. et al. Newcastle disease virus triggers autophagy in U251 glioma cells toenhance virus replication // Arch Virol. — 2012. — 157 (6). — P. 1011–1018.
3. Koks, C. et al. Newcastle disease virotherapy induces long-term survival and tumorspecific immune memory in orthotopic glioma through the induction of immunogenic cell
death // Int J Cancer. – 2015 — 136 (5). — P. E313–325.
4. NIH, U. S. Topics in integrative, alternative, and complementary therapies (PDQ®)–
health professional version [Электронный ресурс] / NIH. — 2018a.
5. Puhlmann, J. et al. Rac1 is required for oncolytic NDV replication in human cancer
cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus //Oncogene. — 2010. — 29 (15). — P. 2205–2216.
6. Yurchenko K. S. et al. Complete genome sequence of a Newcastle diseasevirus isolated from a rock dove (Columba livia) in the Russian Federation //Genome
announcements. — 2015. — Т. 3. — №. 1. — С. e01514–14.
7. Yurchenko K. S. et al. Oncolytic effect of wild-type Newcastle disease virus isolates
in cancer cell lines in vitro and in vivo on xenograft model //PloS one. — 2018. — Т.
13. — №. 4. — С. e0195425.
8. Kepp O. et al. Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer
treatment //Apoptosis. — 2009. — Т. 14. — №. 4. — С. 364–375.
9. Senft D., Ze’ev A. R. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer //Current
opinion in cell biology. — 2016. — Т. 39. — С. 43–52.

45Биотехнология

РАЗРАБОТКА МЕТОДА CИНТЕЗА КОНЪЮГАТОВ
ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО
КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРАС АЛЕНДРОНОВОЙ КИСЛОТОЙ *METHOD FOR THE SYNTHESIS OF CONJUGATESOF GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR(GM-CSF) WITH ALENDRONIC ACID
Т. И. Есина, Е. А. Волосникова, Я. С. Гогина,Л. Р. Лебедев, Е. Д. Даниленко
Институт медицинской биотехнологии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Бердск, Новосибирская область, Россия
T. I. Esina, E. A. Volosnikova, Y. S. Gogina, L. R. Lebedev, E. D. Danilenko
Institute of Medical Biotechnology FBRI SRC VB “Vector” Rospotrebnadzor,
Berdsk, Novosibirsk region, Russia
E-mail: esina_ti@vector.nsc.ruАннотацияВ работе предложен способ конъюгирования высокоочищенного белка рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора
человека с представителем класса бифосфонатов — алендроновой кислотой для создания средств доставки к костномозговому окружению.
Abstract
The work presents a method for conjugation of highly purified protein of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor with a representative ofbisphosphonates — alendronic acid for the development of delivery system to the bonemarrow environment.

Природный человеческий гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) является важным цитокином-регулятором миелопоэза и формирования клеток иммунной системы. Лекарственные
© Т. И. Есина, Е. А. Волосникова, Я. С. Гогина, Л. Р. Лебедев, Е. Д. Даниленко,2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-315-00236.

46Раздел 1средства на основе рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ (рчГМ-КСФ)активно применяют как стимуляторы кроветворения для восстановления
числа нейтрофилов и лейкоцитов у больных нейтропенией, у онкологических больных, проходящих химиотерапию и лучевую терапию, при пересадках костного мозга, органов, тканей, для лечения тяжелых инфекционных
заболеваний, в том числе ВИЧ. Однако многие исследователи отмечают наличие у рчГМ-КСФ побочных эффектов.
Одним из способов снижения дозы препарата и его токсичности, позволяющего при этом сохранить (или усилить) его терапевтический эффект,является создание адресных средств доставки рчГМ-КСФ в костный мозг.
В качестве средства направленной доставки лекарственных веществв костномозговое окружение большой интерес представляют бисфосфонаты, обладающие высоким сродством к ионам кальция и накапливающиеся в костной ткани. Одним из методических подходов является получение
конъюгатов лекарственных веществ с бифосфонатами, в частности с аминобисфосфонатом алендроновой кислотой.
В ходе исследования разработана технология очистки белка рчГМ-КСФиз рекомбинантного штамма E.coli SG20050/p280GM, полученного трансформацией штамма-реципиента плазмидой р280GM, содержащей синтетический ген ГМ-КСФ, детерминирующий конститутивный синтез полипептида со свойствами ГМ-КСФ человека (Гилева и др., 1997). Среднее
содержание мономера в готовой субстанции белка рчГМ-КСФ составляет
(98,1±0,2) %, молекулярная масса — (15100±200) Да.
Конъюгаты рчГМ-КСФ с алендроновой кислотой (АЛН) синтезировали двумя способами: в растворе и на твердом носителе — сорбенте гидроксилапатите (ГАП), с помощью сшивающих агентов: (1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида (EDC), сульфосукцинмидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата (Sulfo-SCMM) и глутарового
альдегида (GLT).
Электрофоретический анализ конъюгатов рчГМ-КСФ с АЛН, полученных при синтезе в растворе, показал, что молекулярная масса рчГМ-КСФв составе конъюгатов соответствует молекулярной массе исходного белка
(15100 ±200 Да). Синтез конъюгатов происходит с образованием мономерной формы рчГМ-КСФ, димера с молекулярной массой в области 31200 Даи тримера — 51000 Да.
При получении конъюгатов белка рчГМ-КСФ с АЛН с помощью EDC,
Sulfo-SMCC и GLT методом твердофазного синтеза, не связанный с бисфосфонатом белок элюировался с ГАП раствором фосфорнокислого калия (КФ)при концентрации 0,2 моль/л. Конъюгаты элюировались раствором КФ приконцентрации 0,8 моль/л.

Биотехнология

47Таким образом, в результате проведенного исследования получены образцы конъюгатов рчГМ-КСФ с алендроновой кислотой, которые имеют
повышенное сродство к костному матриксу и могут быть использованы приразработке средств для таргетной доставки.

Раздел 148

РАЗРАБОТКА МЕТОДА СИНТЕЗА БИОКОНЪЮГАТОВНА ОСНОВЕ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ЯМР-АНАЛИЗА *DEVELOPMENT OF SYNTHESIS METHOD OF BIOCONJUGATESBASED ON MAGNETIC NANOPARTICLES FOR SOLID-PHASE
NMR-BASED ASSAY
М. Д. Кропанева 1, П. В. Храмцов 1,2, М. С. Бочкова 1,
В. П. Тимганова 1, С. А. Заморина 1,2, М. Б. Раев 1,2Институт экологии и генетики микроорганизмов
Уральского отделения Российской Академии наук,«ИЭГМ УрО РАН», г. Пермь, Россия
2ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный
исследовательский университет, г. Пермь, Россия
1

M. D. Kropaneva 1, P. V. Khramtsov 1,2, V. P. Timganova 1,
M. S. Bochkova 1, S. A. Zamorina 1,2, M. B. Rayev 1,2
Institute of Ecology and Genetics of Microorganismsof the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm, Russia
2Perm State National Research University, Perm, Russia
1Аннотация
Данное исследование посвящено разработке стабильных суспензий магнитных
наночастиц, функционализированных моноклональными антителами и стрептавидином для твердофазного ЯМР-анализа. В ходе работы была оптимизирована процедура синтеза и продемонстрирована возможность контроля размеров магнитных наночастиц, средний диаметр которых составлял от 100 до 180 нм. Была показана применимость полученных конъюгатов в твердофазном ЯМР-анализе. В ходе месяца
хранения при температуре +4 °C структурные свойства конъюгатов не изменялись.
Abstract
This research is focused on the development of stable suspensions of magnetic nanoparticles, functionalized with monoclonal antibodies and streptavidin for solid-phase NMRbased assay. In the course of this work the procedure of synthesis has been optimized andthe possibility of magnetic nanoparticles size control has been demonstrated. The mean
© М. Д. Кропанева, П. В. Храмцов, М. С. Бочкова, В. П. Тимганова, С. А. Заморина, М. Б. Раев, 2018.
*Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного
фонда (проект №17-15-01116).

Биотехнология

49

diameter of nanoparticles was from 100 to 180 nm. The applicability of the conjugates insolid-phase NMR- based assay was shown. Structural properties of the conjugates were
not changing during the month of storage at the temperature of + 4 °C.

Введение
Конъюгат, если рассматривать это понятие в контексте in vitro диагностики, — это искусственно синтезированный комплекс, состоящий из распознающих элементов, способных к специфическому взаимодействию с мишенью и метки, поставляющей сигнал, который можно детектировать припомощи специального оборудования или визуально.
В данном исследовании в качестве метки использовались магнитные наночастицы, а сигналом являлось изменение времени спин-спиновой (поперечной) релаксации протонов (T2). Если поместить протоны в магнитное
поле и воздействовать на них радиочастотным импульсом их векторы намагниченности будут вращаться в одной фазе. Далее постепенно происходит смещение фаз вращения вектора намагниченности протонов, так, чтов конце концов векторы всех протонов будут двигаться в разных фазах. Этотпроцесс и называется спин-спиновой релаксацией, а время необходимое длядефазировки 37 % протонов — Т2. Принцип анализов, использующих данное явление, основан на том, что при наличии в среде магнитных наночастиц время Т2 будет изменяться [1]. Применительно к нашей работе данный
принцип осуществляется следующим образом. При связывании магнитных
наночастиц с мишенью они не удаляются из среды в процессе промывкии время релаксации протонов Т2 снижается.
Магнитные наночастицы могут быть широко использованы в in vivo визуализации, адресной доставке лекарственных средств, in vitro диагностике,в том числе и в анализах, основанных на ЯМР-релаксометрии. Однако дляприменения биоконъюгатов на основе наночастиц в реальной лабораторной
практике важными являются их стабильность, сроки и условия хранения
[2]. Все эти параметры в конечном итоге определяют успех применения таких биоконъюгатов, и это необходимо учитывать при их разработке.
Таким образом, цель данной работы разработать метод синтеза стабильных конъюгатов железных наночастиц, инкапсулированных углеродом
(Fe@C), с распознающими молекулами для применения в твердофазном
ЯМР-анализе.
Материалы и методыВ работе использовали аминированные железные наночастицы, покрытые углеродом (Fe@C-NH2). Аминирование осуществляли согласно методике, описанной в статье [3]. Далее полученные суспензии использовали

50Раздел 1для создания конъюгатов магнитных наночастиц с распознающими молекулами. Принцип синтеза конъюгатов заключался в следующем. На поверхность Fe@C-NH2 сорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА).
Далее наночастицы Fe@C-NH2/БСА обрабатывали раствором глутаральдегида, молекулы которого осуществляли поперечную сшивку молекулБСА на поверхности наночастиц и предоставляли свободные альдегидные
группы, к которым ковалентно пришивали распознающие молекулы: моноклональные антитела или стрептавидин. Структурные свойства (диаметр,индекс полидисперности) конъюгатов оценивали при помощи обратного
динамического светорассеяния. Функциональную активность конъюгатов
подтверждали методом твердофазного ЯМР-анализа следующим образом
(см. рисунок, А). На полоски из нитроцеллюлозной мембраны с размером
пор 8 мкм сорбировали биотинилированный БСА или белок G в различных
концентрациях. Полоски высушивали 15 мин при комнатной температуре,затем полчаса при +37 °C, после чего их помещали в пластиковые планшеты, в которых проводили все дальнейшие процедуры. Полоски трехкратно
промывали забуференным фосфатами физраствором с твином–20 (ЗФРТ),блокировали 1 % БСА в ЗФРТ в течение часа при +37 °C, затем вновь промывали и вносили в лунки суспензию Fe@C-NH2/БСА, функционализированных стрептавидином или моноклональными антителами. Спустя 60 минполоски промывали и проводили измерение времени релаксации протоновпри помощи портативного ЯМР-релаксометра.

Твердофазный ЯМР-анализ:А — схема твердофазного ЯМР-анализа;Б — Результаты измерений времени релаксации,Т2 (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3)

РезультатыВ ходе исследований была оптимизирована процедура синтеза биоконъюгатов, продемонстрирована возможность контроля размеров магнитных

Биотехнология

51железоуглеродных наночастиц путем изменения pH среды, в которой происходила сорбция молекул БСА на поверхность наночастиц; и массового
отношения БСА:магнитные наночастицы. Средний размер функционализированных распознающими молекулами наночастиц составлял от 100 до
180 нм. Была показана применимость полученных конъюгатов в твердофазном ЯМР-анализе (см. рисунок, Б). В ходе месяца хранения при температуре +4 °C структурные свойства конъюгатов не изменялись.
Заключение
Разработан метод синтеза биоконъюгатов железных наночастиц, инкапсулированных углеродом, с распознающими молекулами, который может быть успешно использован в твердофазном ЯМР-анализе.
Литература
1. Alcantara D. Iron oxide nanoparticles as magnetic relaxation switching(MRSw) sensors: Current applications in nanomedicine // Nanomedicine: NBM. 2016.
V. 12. C.1253–1262.
2. Laurentius L. B., Owens N. A., Park J, Crawford A. C. & Porter M. D. Advantages
and limitations of nanoparticle labeling for early diagnosis of infection // Expert Review
of Molecular Diagnostics. 2016. V. 16, C. 883–895.
3. Grass R. N., Athanassiou E. K., Stark W. J. Covalently Functionalized Cobalt
Nanoparticles as a Platform for Magnetic Separations in Organic Synthesis // Angewandte
Chemie — International Edition. 2007. V. 46. C. 4909–4912.

Раздел 152ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГИСТОНОВДЛЯ ДОСТАВКИ ДНК В КЛЕТКИ ОПУХОЛЕВОЙ СТРОМЫ *A DESIGN OF RECOMBINANT HISTONES FOR DNA DELIVERYTO STROMAL CELLS OF TUMOR
A. И. Кузьмич 1, О. А. Ракитина 2, Д. А. Дидыч 3ФГБУН Институт молекулярной генетики РАНФГБОУВО «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова»3ФГБУН Институт биоорганической химии РАН
1

2

A. I. Kuzmich, Institute of Molecular Genetics RAS, Russia
O. A. Rakitina, Lomonosov Moscow State University, Russia
D. A. Didych, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic
chemistry RAS, Russia
E-mail: akrubik@gmail.com
Аннотация
Одним из перспективных подходов к лечению рака является генная терапия. Длядоставки ДНК в клетки могут использоваться некоторые белки и пептиды, в частности гистоны, способные неспецифически взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Для многих невирусных систем показано усиление эффективности доставки за счет включения в их состав лигандов, способных
селективно связываться с рецепторами, представленными на поверхности целевых
клеток. Такой мишенью могут быть поверхностные белки стромальных клеток опухоли. Одним из ключевых элементов опухолевой стромы являются опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ). Эти клетки отличаются наличием на своей поверхности ряда белковых молекул, что делает их хорошей мишенью для доставки терапевтических генов невирусными носителями, содержащими лиганды специфичныек данным маркерам. Среди хорошо изученных маркеров — белки FAP и PDGFRb,
для которых найдены селективные лиганды белковой природы. Мы предполагаем,что армирование гистонов FAP- или PDGRb-связывающим доменом, способно обеспечить эффективную доставку ДНК в ОАФ. Целью данной работы было получение рекомбинантного гистона H2A человека, слитого с лигандом к белку FAP илиPDGFRb.
© A. И. Кузьмич, О. А. Ракитина, Д. А. Дидыч, 2018.
*Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-34-00852.

Биотехнология

53

Abstract
Gene therapy is one of the promising approaches to the treatment of cancer. Some
proteins and peptides may be used to deliver DNA to cells, in particular histones capableof interacting nonspecifically with a negatively charged cell membrane. The effectiveness of gene delivery system is shown to be enhanced by including in their composition
ligands that are able to selectively bind to receptors present on the surface of the target
cells. Such a target may be surface proteins of tumor stromal cells. One of the key elements of the tumor stroma are tumor-associated fibroblasts (TAF). These cells are distinguished by the presence on their surface of a number of protein molecules, which makes
them a good target for the delivery of therapeutic genes by non-viral carriers containing
ligands specific to these markers. Among the well-studied markers are the proteins FAP
and PDGFRb, for which selective ligands of protein nature have been found. We proposethat histone armed by a FAP or PDGRb binding domain is able to provide efficient DNA
delivery to the TAF. The aim of this work is production of a recombinant human histone
H2A fused to ligand for a FAP or PDGFRb protein.

Селективное связывание комплексов носитель-ДНК с какими-либо молекулами на поверхности целевых клеток, запускающее интернализацию генетического материала внутрь клеток, способно существенно увеличивать эффективность трансфекции (т. е. уровень продукции доставленного гена) целевых клеток (Durymanov et al. Microdistribution of MC1R-targeted polyplexes
in murine melanoma tumor tissue. Biomaterials. 2013 Dec;34(38):10209-16).
Мы предполагаем, что армирование гистона H2A лигандами, специфично
связывающимися с белками на поверхности ОАФ, может значительно увеличить эффективность доставки ДНК в ОАФ таким гибридным носителем.
В ходе анализа литературы мы выделили две перспективные мишени на поверхности ОАФ — белки FAP и PDGFRb.
FAP — белок активации фибробластов — сериновая протеаза, представленная на цитоплазматической мембране. Для ОАФ высоко специфична
экспрессия белка активации фибробластов (FAP). В серии экспериментовс использованием человеческих тканей, FAP был обнаружен в строме более 90 % типов злокачественных опухолей, при этом показано, что для FAPхарактерна экспрессия при эмбриональном развитии, и он практически недетектируется в большинстве нормальных тканей. На основе антител разработано несколько лигандов, селективно связывающихся с FAP и способных доставлять различные терапевтические молекулы к ОАФ: наночастицыс фактором некроза опухоли TNF, радиоизотопы, бактериальные токсины. Извсех FAP лигандов наиболее перспективным видится мини-антитело к FAP
ESC11. Данное одноцепочечное антитело было описано в работе (Fischer
et al. Radioimmunotherapy of fibroblast activation protein positive tumors by
rapidly internalizing antibodies. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6208-18).

54Раздел 1Оно было способно селективно связываться с FAP на поверхности клетокс последующей быстрой интернализацией внутрь, что может быть очень
важно для направленной доставки генных препаратов в ОАФ.
Другая мишень, белок PDGFRb, представляет собой рецептор тромбоцитарного фактора роста бета-типа. Содержание этого трансмембранного
белка часто увеличивается на поверхности опухолевых стромальных клеток
таких, как ОАФ и перициты. Известно множество лигандов, связывающихся
с PDGFRb, при этом многие из них представляют собой линейные и циклические пептиды. Такие лиганды обладают более простой структурой посравнению с мини-антителами и более просты в производстве. Данные лиганды также использовались для доставки цитотоксических белков и радиоизотопов в строму опухоли. Нами был выбран линейный пептид yG2, способный связываться с PDGFRb+ клетками и интернализовываться внутрь
(Marr et al. Peptide arrays for development of PDGFRβ Affine molecules. Mol
Imaging Biol. 2013 Aug;15(4):391-400).
Нами была получена последовательность, кодирующая гистон H2A, содержащий на N-конце мини-антитело к FAP ESC11. Также была получена
последовательность, кодирующая гистон H2A, несущий последовательность пептида yG2 на С-конце. Данные последовательности были клонированы в вектора pET для продукции рекомбинантных белков в бактериальной
системе.
Была проведена работа по подбору условий продукции белка ESC11H2A в бактериях. В ходе работы данный белок нарабатывался в цитоплазме либо в периплазматическом пространстве клеток. К сожалению,уровень продукции ESC11-H2A был крайне низким, следовые количества
целевого белка в продуцирующих клетках выявлялись только с помощью
вестерн-блота. По-видимому, бактериальная система не подходит для синтеза такого белка, что может быть связано с его значительной молекулярной массой.
Белок H2A-yG2 хорошо синтезировался в цитоплазме продуцирующихего бактерий. Нами были подобраны условия его экспрессии, при которых
клетки накапливали его в количестве, сопоставимом с немодифицированным гистоном H2A. С помощью ионообменной хроматографии удалось
получить практически чистый рекомбинантный белок H2A-yG2 (степень
чистоты не менее 80 %), при этом выход белка составил около 5 мг с литра
бактериальной культуры. Далее планируется вторая стадия очистки с помощью обращено-фазовой хроматографии, которая в случае рекомбинантного
гистона H2A позволяет получить высокочистый препарат. В случае успеха будет изучена способность белка H2A-yG2 связываться с поверхностьюPDGFRb+ клеток и обеспечивать доставку ДНК в них.

Биотехнология

55Таким образом, в ходе работы нам удалось подобрать условия продукциив бактериальной системе и последующей очистки нового рекомбинантного
гистона H2A слитого с пептидным лигандом к PDGFRb белку. В то же время
обнаружилось, что бактериальная система плохо подходит для продукции
гистона H2A слитого с мини-антителом к белку FAP.
Литература
1. Durymanov M. O., Slastnikova T. A., Kuzmich A. I., Khramtsov Y. V., Ulasov
A. V., Rosenkranz A. A., Egorov S. Y., Sverdlov E. D., Sobolev A. S. Microdistributionof MC1R-targeted polyplexes in murine melanoma tumor tissue. Biomaterials.
2013 Dec;34(38):10209-16).
2. Fischer E, Chaitanya K, Wüest T, Wadle A, Scott AM, van den Broek M, Schibli R,
Bauer S, Renner C. Radioimmunotherapy of fibroblast activation protein positive tumors
by rapidly internalizing antibodies. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6208-18.
3. Marr A, Nissen F, Maisch D, Altmann A, Rana S, Debus J, Huber PE, Haberkorn
U, Askoxylakis V. Peptide arrays for development of PDGFRβ Affine molecules. Mol
Imaging Biol. 2013 Aug;15(4):391-400.

Раздел 156ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕРОДА
В GEOBACILLUS ICIGIANUS НА ОСНОВЕ
МЕТОДА ПОТОКОВОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
GENOME-SCALE MODELING OF CARBON ASSIMILATIONIN GEOBACILLUS ICIGIANUS *М. А. Куляшов 1,2, И. Р. Акбердин 2, А. С. Розанов 1, С. Е. Пельтек 1
1Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет, Новосибирск, Россия
M. A. Kulyashov 1,2, I. R. Akberdin 2, A. S. Rozanov 1, S. E. Peltek 1
1
2

Institute of Cytology and Genet ics SB RAS, Novosibirsk, Russia
Novosibirsk National Research University, Novosibirsk, Russia
Е-mail: m.kulyashov@mail.ruАннотацияВ последнее десятилетие моделирование генома стало одним из важнейшихи полезных инструментом для исследования бактериального метаболизма на уровне
целой клетки. Для модельных видов, таких как E. Coli и B.Subtilis, существует огромное количество экспериментальных данных по различным иерархическим уровням
клеточной организации, что является основой для наиболее детальной и полной
реконструкции метаболизма организма, в то время, как прогресс в развитии высокопроизводительных методов и теоретических подходах позволяет проводить исследование внутриклеточного метаболизма для немодельных бактериальных видов.
В данной работе мы представляем недавно полученные теоретические и экспериментальные данные для Geobacillus icigianus, термофильной бактерии, изолированной в горячем источнике и геном которой был секвенирован в ИЦиГ СО РАН тригода назад.
Abstract
In the last decade, genome-scale modeling became a powerful and useful tool to investigate whole-cell microbial metabolism. For model microbes, such as E. coli, a hugeamount of experimental data on different hierarchical levels of cellular organization isa basis for the most detailed and complete metabolic reconstruction of the organism, whileadvances in high-throughput techniques and in theoretical approaches pave the way to
explore metabolic potential of the organism for non-model microbial species. Here, we* © М. А. Куляшов , И. Р. Акбердин, А. С. Розанов, С. Е. Пельтек, 2018.

57Биотехнология

represent recently obtained theoretical and experimental results for Geobacillus icigianus,a thermophilic bacterium isolated from a hot spring 3 years ago.

Материалы и методы
G. icigianus культивировали в условиях биореактора при рН = 7 с постоянной скоростью подачи воздуха равной 1 литр воздуха на 1 литр растворав минуту и в микробиологических шейкерах — инкубаторах при рН = 8.
Измерения роста культуры производились с использованием спектрофотометра PE 5400 в 1 мл пластиковой кюветы для измерения культуры изшейкера — инкубатора и 10 мл стеклянной кюветы для измерения культурыиз биореактора. Чтобы построить полногеномную модель данной бактериии проводить последующий анализ, мы использовали секвенированный геном [NZ_JPYA00000000.1] и набор программных средств: KBase и MOST.
Результаты
Нами была построена полногеномная потоковая модель на основе секвенированного генома G. icigianus, которая включает на данный момент в себя1310 генов, а также 1585 метаболита и 1547 метаболических реакции. Разработанная модель имеет наибольшее покрытие генома и включает больше
ферментативных реакций и метаболических путей, чем опубликованные ранее модели представителей рода Geobacillus (см. таблицу).
Сравнение потоковых полногеномных моделейдля рода GeobacillusОбъект
Geobacillus thermoglucosidasius(C56-YS93)
Geobacillus thermoglucosidasius(NCIMB 11955)
Geobacillus thermoglucosidasius(M10EXG)
Geobacillus icigianus (G1W1)Общееколичество
генов

Общее
количество
метаболических
реакций

Общееколичество
уникальных
метаболитов

736

1159

1163

859

1011

1050

–

1075

760

1310

1547

1585

Проведенные эксперименты in silico позволили выявить, что при культивировании на глюкозе в качестве единственного источника углерода на58Раздел 1бедной среде, основными метаболическими путями являются гликолиз,пентозофосфатный путь, ЦТК, синтез пуринов и пиримидинов, а также ряданаплеротических реакции. Также мы предсказали скорость роста на глюкозе в качестве субстрата, которая составила 0,66 ч-1.
Мы провели эксперименты по выращиванию G. icigianus на различных
субстратах и ​​в разных условиях. В результате было показано, что наиболее
эффективными для культивирования являются субстраты: глюкоза и глицерин (рис. 1), а также оптимальные условия для роста культуры: температура — 62 °C и pH = 7 (рис. 2).

Рис. 1. Определение оптимального субстрата

Рис. 2. Определение оптимальной температуры

Биотехнология

59Темп роста в экспериментах с биореактором был равен 0,5 ч-1 (рис. 3),
тогда как теоретически предсказанное значение скорости роста составляло
0,66 ч-1.

Рис. 3. Рост культуры в биореакторе

Выводы
Первоначальные результаты позволили нам определить оптимальные параметры роста, которые будут способствовать дальнейшим экспериментам, а также показали, что разработанная полногеномная модель качественно соответствует данным, наблюдаемым в экспериментах.

Раздел 1

60ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ
МИКРОБНОГО ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТАНА ДНЕ ПРИБРЕЖНОЙ ЗОНЫ ЧЕРНОГО МОРЯ *ESTIMATION OF THE APPLICATION OF A MICROBIAL FUEL CELL
AT THE BOTTOM OF THE COASTAL ZONE
OF THE BLACK SEA
А. А. Лазукин 1, Н. Н. Волченко 1, А. А. Самков 1,
Д. С. Тисленко 2, А. С. Архипова 312ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»ФГБОУ ВО «Московский политехнический университет»3ОГБУ ДО «Дворец творчества детей и молодежи»A. A. Lazukin, N. N. Volchenko, A. A. Samkov, KubSU, Russia
D. S. Tislenko, MPU, Russia
A. S. Arkhipova, GBOU DOD, Russia
E-mail: lazukin1996@mail.ru, volchenko.n@mail.ruАннотация
Показана возможность использования микробного топливного элемента на днеприбрежной зоны Черного моря в окрестностях Сочи.
Abstract
Was shown potential of using microbial fuel cell at the bottom of the Black Sea in thevicinity of Sochi.

Микробный топливный элемент (МТЭ) — биотехнологическое устройство, позволяющее преобразовывать энергию химических связей органических веществ в электрическую посредством микроорганизмов. Электрогенные микроорганизмы находятся в анодной камере, в которой поддерживаются анаэробные условия. Катод находится в катодной камере, в анаэробных условиях. Принцип работы заключается в «отрыве» микроорганизмами
электронов от субстрата питания и передачи их на анод, который выполняет
роль акцептора электронов. Электроны начинают движение от анода к ка© А. А. Лазукин, Н. Н. Волченко, А. А. Самков, Д. С. Тисленко, А. С. Архипова,2018.
*Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края (проект № 16-44-230908 р_а).

Биотехнология

61

тоду, под действием разности окислительно- восстановительного потенциала. На катоде происходит восстановление кислорода с образованием воды.
Одновременно с отрывом электронов от субстрата происходит образование
протонов водорода, которые проходят через ионно-селективную мембрануиз анодной камеры в катодную, где и соединяются с кислородом с образованием воды (Дебабов, 2008).
В настоящее время все более остро стоят вопросы о целесообразности масштабного экологического мониторинга как в городах, таки на водных объектах, с целью информационной поддержки различных
управленческих решений, охраны и оздоровления окружающей среды,интеграции полученной информации в различные ведомства (Абрамова и др., 2012). Данная концепция предусматривает использование автоматизированных систем экологического контроля, которые могли быпроизводить замеры благодаря наличию специальных измерительных
устройств и датчиков и затем передавать информацию в центр обработки информации. Однако, использование подобных систем несет определенные риски, связанные с опасностью вандализма. При этом фактором, провоцирующим интерес у вандалов, становятся солнечные элементы питания, которые демаскируют приборы. (Шубин, Тихомиров, 2003)
Становится понятно, что использование автоматизированных комплексов
экологического мониторинга ограничивается сроком работы элементов питания и малой защищенностью от воров и вандалов.
Цель работы состояла в изучении возможности использования микробных топливных элементов в водах черного моря на малой глубине (6 метров). Актуальность подобного исследования заключается в необходимости
поиска альтернативных источников энергии для автоматизированных станций экологического мониторинга. Ранее в Кубанском госуниверситете ужебыла показана возможность использования МТЭ для генерации электричества (Volchenko et. al., 2013).
Исследование было проведено в рамках проектной сметы ОЦ Сириу летом 2018 г. Для исследования были сконструированы микробные топливные
элементы бентосного типа. Данные МТЭ отличаются отсутствием протон-селективной мембраны и наличием открытого взаимодействия с окружающей
средой. Данная особенность является ключевой в вопросах выбора МТЭименно бентосного типа, так как позволяет производить генерацию энергиив непрерывном режиме, используя только диффундирующие из окружающей
среды органические вещества [Batteryless, WrielssSensor …, 2008].
В эксперименте исследовалась работа двух одинаковых МТЭ. Электроды были изготовлены из углеродного войлока марки НТМ-200М, Анодпредставлял собой плоский отрезок войлока в виде прямоугольника со сто-62Раздел 1ронами 10 на 15 см, при этом толщина войлока составляла 0,5 см. Катод былвыполнен в виде квадрата со сторонами 5 см. Оба электрода были армированы пластиковой сеткой «Protect», обычно используемой для загражденийна садовых участках. Оба электрода были расположены вертикально другнад другом. Фиксация электродов была осуществлена таким образом, чтоэлектроды были разнесены на 15 см друг от друга.
Фиксация результатов производилась посредством микроконтроллера
ArduinoUNOv3.0. Микроконтроллер измерял электрогенез МТЭ и производил запись данных на CD карту. Между электродами МТЭ был параллельно
замкнут резистор 0,25 Вт 1 КОм. Таким образом, обеспечена возможность
произвести расчеты мощности согласно формуле
W = U2/R,
где W — мощность (Вт), U — напряжение (В), R — сопротивление (Ом).
Запись напряжения производилась с периодом в 30 минут. Эксперимент
продолжался на протяжении 44 часов. Микроконтроллер оборудован 10-битным аналого-цифровым преобразователем. Опорное напряжение АЦП былоустановлено на 1,1 В, что дало возможность измерять напряжение с шагом
0,001 В.
Питание микроконтроллера производилось от литий-ионных аккумуляторов общей емкостью 6000 mAh. Микроконтроллер и аккумулятор былисобраны в специальной плавучей герметичной камере, которая располагалась в воде на расстоянии от поверхности 1 метр. Связь с МТЭ происходила
посредством электрического провода длиной 5 метров. Микробные топливные элементы были установлены на дне шельфовой зоны, на берегу пляжа,принадлежащему ОЦ Сириус. Глубина составила 6 метров, температура
воды колебалась вблизи 26 градусов. Динамика напряжения приведена нарисунке.
Исследование показало возможность генерации слабого электрического тока (см. рисунок) Напряжение под нагрузкой поднималось до 292 мВдля МТЭ 2 и до 274 мВ для МТЭ 1, что соответствует мощности 85 мкВт
и 75 мкВт соответственно. Примечательно, что МТЭ 1 в середине эксперимента вышел из строя. Вероятно, это произошло по причине механического
повреждения, вызванного подводными волнениями.
Таким образом было экспериментально подтверждена возможность генерации электрического тока посредством МТЭ в шельфовой зоне Черного
моря. Были достигнуты мощности в 85 и 75 мкВт, что может быть достаточно для обеспечения энергией маломощных процессоров в различных
«ждущих схемах» (Wang, Park, Ren, 2015). Так, напряжение может усиливаться посредством сверхнизковольтных преобразователей, запасаться в ио-Биотехнология

63График электрогенеза МТЭ 1 и МТЭ 2нистрах и по достижении определенного заряда выводить процессоры изспящего режима для совершения полезной работы. Таким образом, МТЭ является перспективным источником питания для маломощных автономных
устройств, удовлетворяющим условиям скрытности и практически неограниченной по времени генерацией электрической энергии.
Литература
1. Дебабов В. Г. Производство электричества микроорганизмами // Микробиология. 2008, Т. 7, № 2, С. 149–157
2. Системный подход к разработке концепции экологического мониторинга
промышленных городов / Абрамова А. Г., Пуготаренко Н. К., Петров В. В., Маркина А. В.// Инженерный вестник Дона. 2012. №4–2 (23). С. 1
3. Шубин И. Л., Тихомиров Л. А. Шумозащитные экраны с интегрированными
солнечными батареями // Вестник МГСУ. 2011. № 3–1. С. 103–106.
4. Volchenko N., Khudokormov A., Samkov A., Karasev S., Veselovskaya M.,
Kalashnikov A., Karaseva E. Environmental biotechnology and bio-energy studies in
Kuban State University // Всборнике: PRADEC Interdisciplinary Conference Proceedings.
2013. С. 107–111.
5. Batteryless, Wireless Sensor Powered by a Sediment Microbial Fuel Cell / Conrad
Donovan [et al.] // Environment. Science. Technology. 2008. № 42. P. 8591–8596.

Раздел 164ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИХ МАТЕРИАЛОВНА СКОРОСТЬ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ
КИСЛОТ ТЕРМОФИЛЬНЫМ МЕТАНОГЕННЫМ
СООБЩЕСТВОМ МИКРООРГАНИЗМОВ *EFFECT OF CONDUCTING MATERIALS ON THE SPEED
OF VOLATILE FATTY ACIDS DEGRADATIONBY THERMOPHILIC METHANOGENIC COMMUNITY
Ю. В. Литти 1, Ю. И. Русскова 1, Н. А. Чернова 1,
А. Н. Ножевникова 1, Э. Р. Михеева 2ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет
им. Н. И. Лобачевского»1

2

Yu. V. Litti1, Yu. I. Russkova1, N. A. Chernova 1,
A. N. Nozhevnikova,1 E. R. Mikheeva 2
Research Center of Biotechnology RAS, Russia
Lobachevsky Nizhny Novgorod State University, Russia
1

2

E-mail: litty-yuriy@mail.ruАннотация
Прямой межвидовой перенос электронов (DIET) — это недавно открытый анаэробный синтрофный процесс, в котором микроорганизмы обмениваются электронами напрямую от клетки к клетке без использования восстановленных молекул
(водород, формиат). Скорость передачи электронов с помощью DIET может бытьпочти на порядок выше, чем при других синтрофных процессах, что способствует
более быстрому и полному разложению органического вещества. В анаэробных реакторах, перерабатывающих различные органические отходы, стимулировать DIET
можно путем внесения кондуктивных материалов. В работе исследовано влияние
кондуктивных материалов: магнетита, карбоновой ткани и гранулированного угля наскорость потребления летучих жирных кислот метаногенным сообществом микроорганизмов в термофильных условиях.

© Ю. В. Литти, Ю. И. Русскова, Н. А. Чернова, А. Н. Ножевникова, Э. Р. Михеева,2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-38-00275.

Биотехнология

65

Abstract
Direct interspecies electron transport (DIET) is a newly discovered anaerobic synthrophic interaction in which microorganisms exchange electrons directly from cell to cellwithout using reduced molecules (hydrogen, formate). DIET mediated electron transport
rate can be almost an order of magnitude higher than in other syntrophic interactions,which promotes faster and more complete decomposition of organic matter. In anaerobic
reactors processing various organic waste, DIET can be stimulated by the introduction of
conductive materials. Present work studies the effect of conductive materials: magnetite,carbon cloth and granular activated carbon on the rate of consumption of volatile fatty
acids by the methanogenic microbial community under thermophilic conditions.

Деструкция органического вещества в анаэробных условиях представляет собой многостадийный процесс. На синтрофной (ацетогенной) стадии
происходит окисление летучих жирных кислот (ЛЖК) и спиртов синтрофными бактериями с образованием ацетата, водорода и углекислого газа.
В связи с низкими скоростями синтрофную стадию считают одной из двухосновных лимитирующих скорость анаэробного разложения органического
вещества стадий (вторая — стадия гидролиза). В высокопроизводительных
анаэробных реакторах велика вероятность чрезмерного накопления ЛЖК,которые при превышении определенной концентрации обладают ингибирующим воздействием на метаногенное микробное сообщество, что приводитк снижению скорости процесса метаногенеза, вплоть до его полной остановки.
На пике интереса у зарубежных исследователей метаногенеза и разработчиков анаэробных реакторов в настоящее время находятся результаты
исследований, посвященных изучению процесса прямого межвидового переноса электронов (DIET, direct interspecies electron transfer). Показано, чтодобавление разных электропроводящих материалов может ускорить считающийся «узким» местом метаногенеза межвидовой обмен электронами.
В большинстве случаев, такие исследования проводились в мезофильных
условиях, с концентрациями ЛЖК, суммарно не превышающими 1–2 г/л.
В то же время, режимы работы высокопроизводительных реакторов предполагает использование термофильных условий и накопление в сбраживаемой
среде ЛЖК до 3–4 г/л и выше. Поэтому, целью настоящей работы было исследовать влияние кондуктивных материалов (КМ) разной природы (магнетита, карбоновой ткани, гранулированного угля) на скорость разложенияЛЖК в высоких концентрациях метаногенным микробным сообществомв термофильных условиях.
В качестве источника метаногенного микробного сообщества были использованы термофильный анаэробно сброженный осадок сточных вод

66Раздел 1Курьяновских очистных сооружений (г. Москва) и эффлюент высокопроизводительных экспериментальных термофильных реакторов (V=100л),сбраживающих модельную органическую фракцию твердых бытовых отходов. Субстратом служили индивидуальные ЛЖК (ацетат, пропионат, бутират), либо их смесь. В качестве материалов, способных стимулировать
DIET, использовали гранулированный уголь, карбоновую ткань и магнетит
(FeO·Fe2O3). В качестве контролей служил инокулят с и без добавления
ЛЖК. Эксперименты проводили во флаконах объемом 120 мл, в анаэробных
условиях при 55 °С. В ходе экспериментов регулярно измеряли содержание
Н2, СН4 и СО2 в газовой фазе, а также рН и ЛЖК в жидкой фазе. Все эксперименты проводили в 3-х повторностях.
Из рис. 1 и 2 видно, что добавление даже малых количеств КМ (угляи магнетита) значительно снижало лаг-фазу и увеличивало скорость образования метана и потребления смеси летучих жирных кислот. Из. рис. 1 видно,что из добавленной смеси ЛЖК в первую очередь начиналось потребление
ацетата, прямого предшественника метана. Далее шло синтрофное разложение бутирата и только после его истощения, начиналось потребление пропионата. Это согласуется с данными о более медленном метаболизме пропионатав большинстве анаэробных реакторах, и о том, что его накопление свидетельствует о нестабильности процесса. Нами отмечено, что скорость потребления
пропионата прямо коррелировала с количеством добавленного кондуктивного материала (рис. 1). При этом разложение ЛЖК в опытах с наиболее низ-Рис. 1. Динамика разложения ЛЖК метаногенным микробным
сообществом при добавлении разных количеств гранулированного угля и магнетита

Биотехнология

67кими концентрациями КМ практически не отличалось от контроля (без КМ).
Закономерности в потреблении ЛЖК и образования метана соблюдались неполностью. Например, наибольшая скорость образования метана наблюдалась в опытах со средними концентрациями КМ, т. е. при добавлении 4,6 г/лмагнетита и 5 г/л угля. Однако при сравнении этих двух КМ можно отметить,что количество образующегося метана при добавлении магнетита в концентрации 11,6 и 4,6 г/л было на 30 % выше, чем при добавлении сопоставимых
количеств угля. Это объясняется, в том числе и тем, что содержание метанав образующемся биогазе при добавлении магнетита и угля, составляло, соответственно 80 % и 72 %, соответственно. Таким образом, при сопоставимой скорости потребления ЛЖК, использование магнетита на практике более
предпочтительно из-за более высокой энергетической ценности образующегося биогаза.

Рис. 2. Динамика образования метана из ЛЖК метаногенным
микробным сообществом при добавлении разных количеств
гранулированного угля и магнетитаВ экспериментах с добавлением индивидуальных ЛЖК (пропионат, бутират) показано, что концентрация магнетита в концентрации 1,2–11,6 г/лпропорционально влияет на увеличение скорости анаэробного разложения

68Раздел 1бутирата, в то время как добавление гранулированного угля или угольной
ткани не ведет к линейной зависимости выхода биогаза от концентрации КМданной природы. Продолжается работа по подбору концентрации магнетита для оптимального контролируемого анаэробного разложения бутирата.
Ускоренное разложение пропионата наблюдалось в присутствии магнетитас концентрацией 4,6 г/л, при отсутствии стимулирующего эффекта угольной
ткани на биодеградацию пропионата. Получены анаэробные накопительные
культуры, активно разлагающие бутират, пропионат и смесь ЛЖК в присутствии КМ, в дальнейшем планируется изучение состава данных микробных
сообществ молекулярными методами.

Биотехнология

69ОСОБЕННОСТИ ГИДРОЛИЗА ГИСТОНА Н1
И ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ
КРОВИ БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙВ ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ *FEATURES HYDROLYSIS OF H1 HYSTONE AND MYELINE BASIC
PROTEIN BY IMMUNOGLOBULINSFROM THE BLOOD OF HIV-INFECTION PATIENTSIN PATHOGENESIS OF DISEASE
Н. А. Мальцева 1,2, И. Ю. Компанеец 2, С. В. Баранова 2ФГБОУ ВО Новосибирский Государственный
Педагогический Университет
2ФБУН Институт химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
1

N. A. Maltseva, NSPU, SB RAS ICBFM, Novosibirsk, Russia
I. Y. Kompaneets, SB RAS ICBFM, Novosibirsk, Russia
S. V. Baranova, SB RAS ICBFM, Novosibirsk, RussiaАннотация
Аутоантитела с ферментативной активностью (абзимы) являются отличительной
чертой аутоиммунных и некоторых вирусных заболеваний. Сходство некоторых белков человека и вируса — это один из факторов сбоя иммунной системы. В организме
сначала нарабатываются антитела против белков вируса, а затем иммунная система перестает различать чужеродные и собственные белки. Известно, что абзимыс протеолитической активностью против разных белков обычно специфически гидролизуют только эти белки. В работе показано, что IgG крови ВИЧ-инфицированных больных против гистонов и ОБМ эффективно гидролизуют как гистон H1, таки ОБМ, но не другие контрольные белки. Используя масс-спектрометрию MALDI
TOF, найдены сайты расщепления гистона H1 и ОБМ абзимами против этих белков.
Сайты гидролиза H1 и ОБМ расположены в разных, но высоко гомологичных сайтах
этих белков. Анти-гистон и анти-ОБМ антитела крови ВИЧ-инфицированных больных являются первыми примерами абзимов, обладающих не только кросс-комплексообразованием, но и каталитической перекрестной реактивностью. Согласно литературным данным, в крови больных ВИЧ повышается концентрация гистонов, поэтому существование перекрестной реактивности абзимов против гистонов и ОБМ© Н. А. Мальцева, И. Ю. Компанеец, С. В. Баранова, 2018.
*Работа поддержана грантом РФФИ № 16-04-00604; Проектом Базового бюджетного финансирования, выполняемого в рамках Госзадания, по теме№ VI.62.1.5 (№ 0309-2016-0003).

Раздел 170представляет большую опасность для человека. Они могут атаковать ОБМ миелиновой оболочки аксонов и играть отрицательную роль в патогенезе заболевания.
Abstract
Autoantibodies with enzymatic activities (abzymes) are distinctive feature of autoimmune and viral diseases. Autoantibodies (Abs) with enzymatic activities (abzymes) are thedistinctive feature of autoimmune and some viral diseases. It is known that abzymes withproteolytic activity against different proteins usually specifically hydrolyze only these specific proteins. It was shown that IgGs against hystone and MBP effectively hydrolyze bothH1 histone and MBP but no other control proteins. Using the MALDI TOF mass spectrometry, the cleavage sites of H1 histone and MBP by abzymes against these proteins are found.
The sites of H1 and MBP hydrolysis are located in different clusters of these proteins but they
demonstrate high homology of their protein sequences. Anti-histone and anti-MBP abzymes
are the first examples of Abs possessing not only with cross-complexing but also with catalytic cross-reactivity, which may be common phenomenon for such abzymes in patients withdifferent autoimmune diseases. The existence of cross-reactivity of abzymes against histones
and MBP represent great danger to humans since in contract to MBP, histones due to cell
apoptosis constantly occurs in human blood. They can attack MBP of the myelin sheath ofaxons and play negative role in the pathogenesis of HIV-infection.

Существование каталитически активных антител (абзимов) известноуже более 20 лет. В литературе описаны антитела, способные расщеплять
нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды. Наличие абзимов, распознающих антигены хозяина, связано с аутоиммунными и некоторыми вирусными заболеваниями, которые сопровождаются аутоиммунными процессами.
Согласно сложившимся представлениям наличие в крови каталитически
активных иммуноглобулинов является четким и ранним признаком протекания этих процессов в организме человека.
ВИЧ-инфекция, сопровождается иммунным ответом не только на компоненты вирусов и бактерий, но и приводит к специфическому сбою иммунной системы, ведущему к развитию аутоиммунных реакций. Известно,что ВИЧ является не только иммунотропным, но и нейротропным вирусом,патологический процесс при ВИЧ-инфекции затрагивает практически всеорганы и системы человека, но одним из основных очагов поражения является нервная система, в том числе, и характерное для данной инфекции
прямое поражение мозга — подострый энцефалит с участками демиелинизации. Основной белок миелина (ОБМ) играет важную роль в патогенезе
рассеянного склероза. В данной работе впервые проанализировали гидролиз ОБМ антителами из сывороток ВИЧ-инфицированных больных. Показано, что способность иммуноглобулинов, гидролизовать основной белок
миелина является неотъемлемым свойством антител из крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

Биотехнология

71Гистоны — это белки, которые участвуют в упаковке нитей ДНК в ядреи регуляции ядерных процессов, таких как транскрипция, репликация и репарация. Низкая концентрация гистонов ведет к повреждению ДНК, а вбольшом количестве гистоны токсичны для клетки. Показано, что 100 %IgG из крови ВИЧ-инфицированных пациентов эффективно расщепляют отодного до пяти человеческих гистонов. Таким образом, абзимы против гистонов могут играть важную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции и, вероятно,в развитии различных аутоиммунных заболеваний.
Известно, что абзимы с протеолитической активностью против разных
белков обычно специфически гидролизуют только эти белки. Используя,последовательную хроматографию гомогенных IgG на колонках с иммобилизованными гистонами, а затем хроматографии фракции, не содержащей
антител, обладающих сродством к гистонам (элюируемому при нанесении)на ОБМ-сефарозе, получены антитела против ОБМ. Показано, что IgG против гистонов и ОБМ эффективно гидролизуют как гистон H1, так и ОБМ, ноне другие контрольные белки. Используя масс-спектрометрию MALDI, найдены сайты расщепления H1-гистона и ОБМ абзимами против этих белков.
Интересно, что гидролиз ОБМ анти-ОБМ антителами происходит в четырех
кластерах, расположенных на четырех известных антигенных детерминантах ОБМ. Анти-гистон абзимы гидролизуют ОБМ только в одном кластере.
Этот кластер частично перекрывается с одним из четырех сайтов гидролиза
ОБМ. Анти-гистон-антитела гидролизуют H1 в одном кластере белка, а анти-ОБМ IgG расщепляют этот гистон в двух кластерах. Сайты гидролиза
H1 и ОБМ расположены в разных кластерах этих белков, но они демонстрируют высокую гомологию этих белковых последовательностей.
До сих пор в литературе не было данных о кросс-гидролизе белков антителами против разных белков. Абзимы, анти-гистон и анти-ОБМ, являются
первыми примерами иммуноглобулинов, обладающих не только кросс-комплексообразованием, но и каталитической перекрестной реактивностью,что может быть обычным явлением для таких абзимов у пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями.
Существование ферментативной перекрестной реактивности абзимов
против различных белков и особенно гистонов и ОБМ представляет большую опасность для человека. Это связано с тем, что апоптоз клеток происходит постоянно даже у здоровых людей, что приводит к появлению гистонови их различных комплексов в крови. В случае каталитической перекрестной
реактивности получение абзимов против гистонов может привести к атаке
миелиновой оболочки аксонов и гидролизу ОБМ. Таким образом, гидролизОБМ как анти-ОБМ, так и анти-гистон-антителами может играть отрицательную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции.

Раздел 172ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ДНКТИРОЗИЛ-ДНК-ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 1 (TDP1)И ЕГО ПРИРОДНОГО МУТАНТА SCAN1 КАК ПРОТОТИПЫ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ *TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 (TDP1) A
ND ITS NATURAL MUTANT SCAN1 INHIBITORSAS PROTOTYPES OF DRUGS
Е. М. Мамонтова 1,2, К. С. Ковалева 2,3, А. Л. Захаренко 1, О. И. Яровая 3,
Й. Рейниссон4, О. Д. Захарова 1, Е. С. Ильина 1, О. И. Лаврик 1,2Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
2Новосибирский государственный университет
3Институт органической химии СО РАН
4Школа химических наук, университет Окленда, Новая Зеландия
1

E. Mamontova1,2, K. Kovaleva2,3, A. Zakharenko1, O. Yarovaya3, J. Reynisson4,
O. Zakharova1, E. Ilina1, O. Lavrik1,2
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS,
Novosibirsk, Russia;
2
Novosibirsk State University, Russia;
3
Institute of Organic Chemistry SB RAS, Novosibirsk, Russia;
4
School of Chemical Sciences, University of Auckland, New Zealand
1E-mail: evgeniya.mm.94@gmail.com
АннотацияБыл проведен скрининг 37 соединений — производных кумарина, β-карболинаи дегидроабиетиламина в качестве ингибиторов фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (Tdp1) и его мутантной формы SCAN1. Tdp1 является важной мишеньюдля противораковой терапии, SCAN1 связан с одноименным нейродегенеративным
заболеванием (спиноцеребеллярная атаксия с аксональной нейропатией), и также
рассматривается как мишень для лечения этого заболевания. Наиболее активные
соединения имели значения IC50 в диапазоне 0,1–1 мкМ (в отношении Tdp1). Впер© Е. М. Мамонтова, К. С. Ковалева, А. Л. Захаренко, О. И. Яровая, Й. Рейниссон,О. Д. Захарова, Е. С. Ильина, О. И. Лаврик, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ 17-04-01071,
18-33-00297.

Биотехнология

73

вые были обнаружены ингибиторы SCAN1 (IC50~3.5–10 мкМ для наиболее активных
ингибиторов). Соединения показали низкую цитотоксичность на клеточных линиях
A-549, MCF-7, T98G и WI-38. Некоторые соединения усиливают цитотоксичность
топотекана на линиях A-549 и T98G.
Abstract
In the present study we performed screening of 37 compounds — derivatives of coumarin, β-carboline and dehydroabietylamine as inhibitors of tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 1 (Tdp1) and its mutant SCAN1. Tdp1 is important target for anticancer therapy.
SCAN1 is associated with the neurodegenerative disease of the same name (spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy) and is also considered as a target for the treatment of
this disease.The most active compounds have IC50 value of 0,1–1 mkM against Tdp1. Also
the inhibitors of SCAN1 were found (IC50~3.5–10 mkM for the most active compounds).
The compounds showed low cytotoxicity against human tumor A-549, MCF-7, T98G celllines and non-tumor WI-38 cell line and the ability to increase the topotecan cytotoxicity
on A-549 and T98G lines.

The development of inhibitors of DNA repair enzymes is a promising approach in medicinal chemistry. The design of drugs based on inhibition of DNA
repair pathways can provide new specific and less toxic treatments for oncological, cardiovascular, and neurodegenerative diseases. Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (Tdp1) is a promising target for cancer and neurodegenerative
therapy.
Tdp1 plays a key role in the removal of damage caused by topoisomerase
1 inhibitors such as camptotecin and its derivatives topotecan and irinotecan [1].
Last two compounds are the antitumor drugs widely used in clinical practice [2].
It makes this enzyme a promising target to enhance anticancer treatment in conjugation with DNA damaging therapies. The hypothesis that Tdp1 is responsible fordrug resistance of some cancers is supported by a number of studies. Tdp1-/- miceand cell lines with SCAN1 mutation, that reduces in vitro catalytic activity compared to the wild type enzyme, are hypersensitive to camptotecin [3]. Otherwise,cell lines with enforced expression of Tdp1 showed fewer DNA damage caused
by camptothecin [4]. The use of Tdp1 inhibitors together with Top1 inhibitors
would prevent the path of repair and lead to the sensitization of cancer cells tochemotherapy.
Natural mutant of Tdp1 (SCAN1) with the replacement of His493 in the active center of the enzyme to Arg493 is associated with severe neurodegenerative
disease SCAN1 (spinocerebellar ataxia syndrome with axonal neuropathy) [5].
SCAN1 phenotype does not appear until the second decade of life and is not
associated with an increased risk of cancer or immunodeficiency states. Probably, the pathology is caused by the accumulation of the SCAN1-DNA covalentthe enzyme
to Arg493
is associatedneurodegenerative
centercenterof theofenzyme
to Arg493
is associatedwith withseveresevere
neurodegenerative
disea
SCAN1
(spinocerebellar
ataxiasyndrome
withaxonalneuropathy)[5].
SCAN1 (spinocerebellar ataxia syndrome with axonal neuropathy) [5]. SCAN
phenotypenot appear
the second
decadelifeisandnot associatedphenotypedoes does
not appear
until until
the second
decadeof lifeofandnotisassociatedwithincreasedrisk
ofcancerorimmunodeficiency
states.
Probably,thepathologyisincreased risk of cancer or immunodeficiency states. Probably, the pathology is causРаздел 174
the accumulation
the SCAN1-DNA
covalentcleavagecomplexes
formedby thebyaccumulationof theofSCAN1-DNA
covalentcleavagecomplexes
formedduri
the cleavage
reaction[6]. Therefore,thesuppressionof
SCAN1
activitycanimprovethethe reaction[6].complexes
Therefore,thesuppressionof
SCAN1
activitycanimprovethequalformed during the reaction [6]. Therefore, the suppression ofof SCAN1
patients
andtheofdisease.
the anddisease.
of lifeofoflife
SCAN1
patients
and preventthe progressionof theSCAN1
activitycanimprove
theprevent
qualityoflifeprogressionof SCAN1
patients
prevent
the progressionof thetested
disease.
The
compounds
testedare derivatives
the derivativesof natural
biologicallyThe
compounds
are theof natural
biologicallyacti
Thecompounds
testedarethederivativesofnaturalbiologically
activecomcompounds:
coumarins,
β-carbolinesand dehydroabietylamines.
test sy
compounds:
coumarins,
β-carbolinesand dehydroabietylamines.
As a As
testa systempounds: coumarins,
β-carbolinesand dehydroabietylamines.
Asa test systembiosencor
todetermine
the inhibitory
propertiesof compounds,
fluorescentwa
determine
the inhibitory
propertiesof compounds,
fluorescentbiosencor
was usedetermine the inhibitory properties of compounds, fluorescent biosencor was
Biosensor
is a DNAoligonucleotide
fluorophore
the 5'-endof Da
Biosensor
is a DNAoligonucleotide
with withfluorophore
FAMFAM
at theat5'-endof DNA
used. Biosensor is a DNA oligonucleotide with fluorophore FAM at the 5’-end
fluorescencequencher
BHQ1
at
the
3'-end[7].
Duringthereaction,theenzymer
fluorescencequencher
BHQ1
at
the
3'-end[7].
Duringthereaction,theenzymeremovof DNA and fluorescence quencher BHQ1 at the 3’-end [7]. During the reaction,thequencher
from
the
3
'end
of
the
DNA,
resultinginanincreaseofthefluorethe quencher
from removes
the 3 'endof the DNA,
resultingincreaseof thethe enzyme
the quencher
from the3 ‘end ofintheanDNA,
resultingin anfluorescenc(inhibitor
at wh
TheincreasesignaldetectedrealandIC50 value
ofisthefluorescence.
The time
signalIC
is50detectedin(inhibitor
real timeandIC50concentration
value (in- at which
value
concentrationt
The signal
is detected
in realin time
andhibitorconcentration
at whichthe enzyme
is. reducedhalf)present
is workcalculatenzyme
activityis reducedbyhalf)
isactivity
calculated.
. Inbythework
37 comenzymeactivityis reducedby half)
is calculated.
In thepresent
37 compou
ed.studied.
. In13the inhibitorspresent
workof37SCAN1
compoundwerewerestudied.
13 inhibitorsof SCAN1
were
13 inhibitorsof SCAN1
found
and ICtheir
IC50 values
calwere were
calculatewere werestudied.
were
found
and
their
50 values
found and their IC50 values were calculated. Among the 37 compounds studied,Among
the compounds
37 compounds
studied,30 Tdp1
inhibitors
detected.
EAmong
the 37studied,30 Tdp1
inhibitors
were weredetected.
Effecti
30 Tdp1 inhibitors were detected. Effective inhibitors of Tdp1 with an IC50 valueof 0,1-1
inhibitors
of
Tdp1
with
IC50 value
inhibitors
Tdp1
with
an
ICan
of 0,1-1
mkMmkM
were were
found.found.
50 value
ofof
0,1–1
mkM
were
found.
Using
these
compounds
togetherwithanti-cancer
drugs
such
as topotew
Using
these
compounds
togetherwithanti-cancer
such
as topotecan,
Using these compounds together with anti-cancer drugsdrugs
such astopotecan,
to receive
sensitization
to theirtheireffect,which
in canturn give:can
expectexpect
towereceive
sensitizationof theoftumor
to their
effect,which
ininturn
expecttoreceivesensitization
ofthe
the tumor
tumor
toeffect,
which
turn
can
reduction
offromside effects
from anticancer
by dosereducing
theofdrug
reductionof1)effects
side
effects
anticancer
drugs
by drugs
reducing
the dosethe drug
reduction
ofgive:side
fromanticancer
drugs
by reducing
theof the
and
dose
of
the
drug
and
2)
increasingtheeffectivenessoftherapy.
Therefore,
these
increasingtheeffectivenessoftherapy.
Therefore,
these
compounds
shouldincreasing the effectiveness of therapy. Therefore, these compounds should have halocompounds
shouldhaveenhancelowtheowncytotoxicity
cytotoxicity,butenhancethe cytotoxicity
cytotoxicity,butthecytotoxicity
of anticancer
To determt
own own
cytotoxicity,butenhanceof anticancer
drugs.drugs.
To ofdetermine
anticancer drugs. To determine the cytotoxicity, a standard MTT test was used.
cytotoxicity,a standard
test used.
was used.
All compounds
the compounds
demonstrat
cytotoxicity,a standard
MTTMTT
test was
All thedemonstratedlo
All the compounds demonstrated low cytotoxicity against A-549, WI-38, T98G
cytotoxicity
againstA-549,
WI-38,
T98G
and
MCF-7
cell
lines
(for
most
com
cytotoxicity
againstA-549,
WI-38,
T98G
and
MCF-7
cell
lines
(for
most
compounand MCF-7 cell lines (for most compounds >100 mkM), Fig.1. Moreover, somemkM),
Moreover,enhancedthecytotoxicityof to>100 >100mkM),
Fig.1.Fig.1.
Moreover,somesome
compounds
enhanced
thecompounds
enhancedthe cytotoxicity
ofcompounds
topotecan
in A-549(Fig.cytotoxicity2) andT98G of topotec
in A-549(Fig.
and T98G
cell lines(not shown).
in A-549(Fig.
2)(notand2)
T98G
cell lines(not shown).
cell
lines
shown).

40

20

80

Living A-549 cells, %60

Living WI-38 cells, %Living WI-38 cells, %80

60
40 49689

51792
52984
20 56301

49689
51792
52984
56301

0

0
0

200

4020

6040

8060

80
100

Inhibitor concentration,
mkM
Inhibitor concentration,
mkM

100

120

120

110

110

100

100

90

90

80
70
60
50
40
30

Living A-549 cells, %

100

100

80
70
60
50

49689

4051792305630120

2052984

10

10

0

0
0

20 0

49689
51792
56301
52984

40 20

60 40

80 60

10080

100

Inhibitor concentration,
mkM
Inhibitor concentration,
mkM

1. Dependence
the numberof living
cells A-549(left)and WI-38
on inhibitor
conc
Fig. 1.Fig.
Dependenceof the ofnumberof living
cells A-549(left) andWI-38(right)(right)
on inhibitor
concentrat
Fig.
1. Dependence
the –numberof living
cells A-549 (left) and WI-38 (right) on(49689,51792,
56301,
coumarine
derivatives)(49689,51792,
56301,
5298452984–ofcoumarine
derivatives)
inhibitor concentration (49689, 51792, 56301,
52984 — coumarine derivatives)

75Биотехнология
120
110

Living A-549 cells, %

100
90
80
70
60
50
40

dmso
49689
51792
52984

30
20
10
0

500

1000

1500

2000

Topotecan concentration, nM

Fig.
2. Enhancementof forcytotoxicity
topotecan
A-549 cell line
Fig. 2. Enhancement ofcytotoxicity
of topotecan
A-549 cell ofline.The
boxes forindicatecompounds
in combination
with topotecan.
used in the control
the compounds
used in usedcombination
with topotecan.
DMSO wasDMSO
used in was
the control
compounds).experiments (vehicle for compounds)

To sum up, we performed
the screeningof biologically
active compounds
To sum up,
we performed
the screeningof biologically aas inhibitors
of
Tdp1
and
SCAN1
and
calculatedtheirICvalues.their
We also50
inhibitors of Tdp1 and SCAN1 and calculated
IC50 values. W
determined cytotoxicity of compounds against the number of cell lines, includcytotoxicity of compounds against the number of cell lines, ining their self-cytotoxicity and their ability to enhance topotecan cytotoxicity.
cytotoxicity
and their
ability
to further
enhance
topotecan
cytotoxicity. T
Thus, we foundthe compounds
promisingfor thedevelopmentof bothcompounds
promisingforthefurtherdevelopmentof
both antican
anticancer drugs and drugs for the treatment of the neurodegenerative disease
SCAN1. for the treatment of the neurodegenerative disease SCAN1.
Литература

Литература

1. F. Cortes Ledesma [et al.]. A human 5’-tyrosyl DNA phosphodiesterase that repairs
1. F. DNA
CortesLedesmaal.]. —A Vol.
human
topoisomerase-mediateddamage//Nature. [et— 2009.
461. —5’-tyrosyl№ 7264. — DNA pho
repairs topoisomerase-mediated DNA damage// Nature. –P. 674–678.
2. Y. Pommier. Topoisomerase
I inhibitors:№ 7264. – P.
674-678.camptothecins and beyond// Nature
Reviews. Cancer. — 2006. — Vol. 6. — Topoisomerase I inhibitors. — № 10. —2. Y. Pommier. Topoisomerase I inhibitors: camptothecins aP. 789–802
Cancer.
– 2006.
– Vol.
6. – Topoisomerase
I in
3. S. F. El-KhamisyReviews.
[et al.]. Synergistic
decreaseof DNA
single-strand
break repair
789-802
rates in mouse neural P.
cells
lacking both Tdp1 and aprataxin // DNA repair. — 2009. —Vol. 8. — № 6. —3.P. 760–766.
S.F. El-Khamisy [et al.]. Synergistic decrease of DNA single
4. Meisenberg [et al.]. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating
rates in mouse neural cells lacking both Tdp1 and apratax
colorectal cancer response to irinotecan // Mol Cancer Ther. — 2015. — Vol. 14. —2009. – Vol. 8. – № 6. – P. 760-766.
P. 575–585.
5. H. Takashimaal.]. Mutation of
a topoisomerase
I-dependent
4. [etMeisenberg[etTDP1,al.].encoding
Clinicaland cellularroles for TD
DNA damage repair enzyme,inspinocerebellar
ataxiawithaxonalneuropathy//
Naturemodulating colorectal cancer response to irinotecan // Mol C
Genetics. — 2002. — Vol. 32. — № 2. — P. 267–272.

– Vol. 14. – P. 575-585.
5. H. Takashima [et al.]. Mutation of TDP1, encoding a topoiso
DNA damage repair enzyme, in spinocerebellar ataxia with
Nature Genetics. – 2002. – Vol. 32. – № 2. – P. 267-272.

76Раздел 1

6. H. Interthal [et al.]. SCAN1 mutant Tdp1 accumulates the enzyme--DNA
intermediate and causes camptothecin hypersensitivity // The EMBO journal. — 2005. —Vol. 24. — № 12. — P. 2224–2233.
7. A. Zakharenko [et al.]. Synthesis and biological evaluation of novel tyrosylDNA phosphodiesterase 1 inhibitors with a benzopentathiepine moiety // Bioorganic &Medicinal Chemistry. — 2015. — Vol. 23. — № 9. — P. 2044–2052.

77Биотехнология

ЗАПОЛНЕНИЕ ПРОБЕЛОВ ПРОЕКТНОГО ГЕНОМА
S. PASTORIANUS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННЫХ
СЕКВЕНИРОВАНИЯ ILLUMINA
FILLING GAPS OF S. PASTORIANUS DRAFT GENOME
USING ILLUMINA SEQUENCING DATA
А. Медина 2, А. Овалле 3, Э. Лопез 1, Дж. Розалес 5, И. Сонец 4 *    

TUHH(Technische Universität Hamburg), Germany
Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico
3
Universiad Autonoma de Nuevo Leon, Mexico
4Центральная научно-исследовательская лаборатория СибГМУ, РФ
5Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural,
Pesca y Alimentación, Mexico
1

2

A. Medina 2, A. Ovalle 3, E. Lopez 1, J. Rosales 5, I. Sonets 4Аннотация
Технологии секвенирования нового поколения позволили получить геном многих новых штаммов дрожжей, основного микроорганизма, используемого в ферментации пива. В процессе изучения мы можем найти некоторые гибридные дрожжи,такие как S. pastorianus, гибрид между S. cerevisiae и S. eubayanus. Недавно былсоздан проект гибридной последовательности генома; однако количество пробелов является значительным, поэтому задача заключается в улучшении качества засчет закрытия пробелов с использованием искусственных бактериальных хромосом(BACs), секвенированных с помощью технологии Illumina, для определения порядка скэффолдов и для выявления возможных перекрытий между ними.
Abstract
Next-generation sequencing technologies have allowed genome acquisition of many
new strains of yeast, the main microorganism used in the beer fermentation. In this processes we can found some hybrid yeasts like S. pastorianus , a hybrid between S. cerevisiae
and S. eubayanus. Recently a draft hybrid genome sequence was generated; however, thenumbers of gaps are considerable, therefore the challenge is the improvement of the quality through closing the gaps using BACs sequencing by Illumina, to determine the order ofthe remaining scaffolds and to identify potential sequences overlaps between them.

Introduction
The Saccharomyces sensu stricto complex includes some parented species:
S. cerevisiae, S. bayanus, S.kudriavzevii, S. paradoxus, etc. However, it has been* © А. Медина, А. Овалле, Э. Лопез, Дж. Розалес, И. Сонец, 2018.

78Раздел 1

observed that lager-brewing yeast is a hybrid species of two combined genomesof S. eubayanus and S. cerevisiae. This provides an important source of chromosomal rearrangements, leading to the gene number and the size of the complete
genome. With the use of next generation sequencing (NGS) technologies, such as
the Illumina Platform, many eukaryotes genomes have been reported, including
different strains of the Saccharomyces complex (Krogerus, 2017; Medina, 2016).
Recently the assembly of a new hybrid genome was made in a previous study
by Cintia Mũnoz (Dataset 1,DS1) using 454 and Illumina next generation sequencing platforms. However, the number of gaps are considerable, for that reason, the implementation of a new strategy using next generation sequencing withbacterial artificial chromosome (BACs) is a viable option for closing that gaps
and improve the equality of the sequence.
Here, we report a new draft sequence of the hybrid genome of the lager brewing yeast strain(Dataset 2, DS2) We perform 2 strategies: first, generate an assembly with Illumina BACs sequences and aligned the new scaffolds with DS1 trying to close the gaps; second, generated de novo yeast genome assembly from454 and Illumina platforms.
The DS1 assembly was obtained from a previous study by Cintia Mũnoz. For
the present study, BACs sequencing by Illumina were used (DS2). The sequencing quality data were analyzed with FastQC tool. The raw paired BAC sequenceswere filtered with bowtie2 tool , removing the vector sequence attached to the
BAC sequence, losing the 48 percent of the reads. For de novo assembly we used
3 another datasets (DS3, DS4, DS5). We obtained these data sets using 454 andIlumina sequencing platforms.
Genome assembly
We used segemehl tool (a software to map short sequencer reads to reference
genomes, capable to detect mismatches and indels) to validate the quality of theassembly DS1 aligning the reads of DS2 (without contamination).
The set sequence DS2 was assembled with SPAdes tool obtaining the necessary caffolds to perform an alignment with the DS1 assembly using BLAT tooland fill the gaps.
One de novo genome assembly was made using 454 and Illumina (Mate pairand Illumina Pair end platforms), using SPAdes tool.
Results and discussion
A preliminary genome assembly in form of a scaffold was mapped with paired
reads from sequences of a hybrid Saccharomyces previously contained in BACs.
The main objective of this mapping was the assessment of the quality of the preliminary assembly detecting gaps/splits using segemehl tool. We obtained as anБиотехнология

79

output a list of coordinates to compare with the DS1 assembly; however, we cannot graph the expected values and visualize the results.
In the first strategy, we were able to visualize with IGB the results. DS4 assembly was loaded as the reference genome and the .bam file was loaded to visualize the mapping of clean DS5 reads against the assembly. As expected, clustersof reads aligned to the ends of some scaffolds, suggesting that the assembled
sequence will be able to extend it. See Fig. 1.

Fig. 1. Clusters of read in one scaffold

DS5 assembly was loaded as a reference genome. The .bam files of the alignments against the DS5 assembly of both the reads that mapped and those that
didn’t map to DS4 assembly were loaded for visualization. In certain regions, theDS4-unmapped reads cover holes left by the DS4-mapped reads, thus suggestingthat the corresponding scaffold of the DS5 assembly fills up a gap in the DS4 assembly.
SPAdes uses Bruijn graph like
Velvet tool, but it generates thenode sequences differently. They
include the entirety of the first
k-mer in each node. With Bandage
we can visualize the nodes and theedges of our de novo genome assembly. See Fig. 2.
Conclusion
Starting from a preliminary
task in which empty fragments
were located on the chromosomal
sequence of the yeast, the hypothesis of being able to fill said gaps

Fig. 2. Graph of de novo assemblyРаздел 180

with additional data set coming from a BAC sequencing test was established.
There were also several sets of new data, with these a new assembly was made tohave a new reference to which the data of the BACs would be mapped. In our firststrategy, it was possible to visualize some reads that could fill some gaps of theoriginal assembly; however, it is necessary to validate these results.
In the second strategy, the de novo assembly obtained did not have the expected quality. Additional attempts of de novo assembling should be performed,changing the parameters, testing different assemblers and rectifying the trimmingof the raw data.
References[Kristoffer Krogerus, 2017] Kristoffer Krogerus, Frederico Magalh˜aes, V. V. B. G.
(2017). Novel brewing yeast hybrids: creation and application. Appl Microbiol Biotechnol, 1(101):65–78. Published online.
[Patricia Marcela De Le´on-Medina, 2016] Patricia Marcela De Le´on-Medina,Ramiro Elizondo, L. C. D. J. M. M. V. d. B. L. G. B. P. (2016). Genome annotation ofa saccharomyces sp. lager brewer’s yeast. Genomics Data.

Биотехнология

81ОБНАРУЖЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ЯЗВЫМЕТОДАМИ МЕТАБОЛОМИКИ *BIOMARKERS DISCOVERY OF DIABETIC ULCERBY METHABOLOMICS METHODS
А. Д. Мельников, В. В. Яньшоле
Международный томографический центр СО РАННовосибирский государственный университет
A. D. Melnikov, V. V. Yanshole
International Tomography Center SB RAS, Novosibirsk, Russia
Novosibirsk State University
E-mail: melnikov.arsenty@gmail.com
Аннотация
Анализ метаболомных данных является довольно затруднительной задачей, длярешения которой необходимо использовать специальные методы первичной обработки, а также статистические методы анализа данных. Корректная обработка данных позволяет изучать патогенез болезней и обнаруживать возможные биомаркеры.
Данная работа позволила определить возможные биомаркеры развития язв у больных сахарных диабетом. Диабетическая язва является одним из самым распространенных осложнений диабета и очень часто приводит к ампутации конечностей.
Abstract
Analysis of metabolic data is a rather difficult task, for the solution of which it is necessary to use special preprocessing methods as well as statistical methods of data analysis.
A proper data processing allows to study the pathogenesis of diseases and to discover possible biomarkers. This study determined possible biomarkers for the development of ulcers
in patients with diabetes mellitus. Diabetic ulcer is one of the most common complicationsof diabetes, which very often leads to an amputation.

Введение
Метаболомика является экспериментальной областью для изучения патогенеза различных болезней и поиска возможных биомаркеров, основанная на анализе низкомолекулярных соединений — метаболитов. Одной из© А. Д. Мельников, В. В. Яньшоле, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке российского фонда фундаментальных
исследований (гранты №17-03-00656, №18-415-543006).

82Раздел 1самых распространенных платформ для метаболомного анализа является
высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим
детектированием (ВЭЖХ-МС). ВЭЖХ-МС является высокочувствительным
методом, что позволяет детектировать большое число метаболитов, однакоэто приводит к трудностям, связанным с корректной обработкой больших
объёмов данных и правильным выявлением зависимостей между образцами.
Основной целью метаболомного анализа является поиск метаболитов, чьиконцентрации изменяются при развитии заболевания. Так в данной работе изучались изменения, вызванные развитием диабетических язв.
Диабетическая язва является одним из самых распространенных осложнений диабета. Существует два типа сахарного диабета. Первый тип является результатом нарушения работы поджелудочной железы, которая перестает производит достаточное количество инсулина. Второй тип характеризуется нарушенным взаимодействием инсулина с клетками. В результате
заболевания нарушаются энергетические процессы в клетке, увеличивается
катаболизм липидов и белков. Это очень часто приводит к развитию различных осложнений. В настоящее время проведено большое число метаболомных работ, посвященных сахарному диабету, однако лишь совсем малая ихчасть посвящена осложнениям сахарного диабета, в том числе и диабетической язве.
МетодыДля метаболомного профилирования использовались два вида высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, гидрофильная (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,
HILIC) и обращено-фазовая (ОФЖХ). HILIC хорошо удерживает полярные
соединения, в то время как ОФЖХ более эффективна для неполярных соединений. Таким образом, использование двух видов хроматографии заметно
повышает охват регистрируемых соединений, что позволяет получать более полную информацию о метаболомном составе образцов. Для обработки
данных использовались как готовые библиотеки для языков R и Python, таки подходы, разработанные в ходе данной работы.
РезультатыБыл проведен метаболомный анализ образцов сыворотки крови пациентов больных сахарным диабетом 2 типа без осложнений и пациентов больных сахарным диабетом 2 типа с диабетическими язвами. Для обработкии анализа данных был разработан специальный подход, который позволил
заметно упростить получение биологически значимых результатов.

Биотехнология

83Концентрации большинства метаболитов существенно не изменяютсяс развитием диабетической язвы. Обнаружен ряд метаболитов, уровни которых достоверно отличаются: 1,5-ангидроглюцитол (повышается в 3 раза),билирубин (уменьшается в 3 раза), и группы фосфолипидов, концентрация
которых в среднем падает в 1,5 раза (значения p-value для всех соединенийне превышают 0,05). Для оценки эффективности использования данных соединений в качестве биомаркеров были построены ROC-кривые и посчитаны площади под кривыми, метрика AUC. Данный подход является стандартным при поиске биомаркеров. Наибольшее значение AUC было получено
для 1,5-ангидроглюцитола (cм. рисунок).

ROC-кривая, построенная для 1,5-ангидроглюцитола,со значением AUC = 0,96±0.02Раздел 184ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ
С BACILLUS THURINGIENSIS
THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PHOSPHOLIPASE C
FROM BACILLUS THURINGIENSIS
Ю. А. Меркульева 1, А. А. Бондарь 2, Д. Н. Щербаков 1,3 *ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
2Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
3Алтайский государственный университет
1

Yu.A. Merkulyeva1, A. A. Bondar 2, D. N. Shcherbakov 1,3
1

FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
2
ICBFM SB RAS, Novosibirsk, Russia
3
Altai State University, Barnaul, Russia
E-mail: j.a.merkulyeva@gmail.com

АннотацияВ работе выполнен поиск вариантов гена plc, кодирующего фосфолипазу С,у бактерий Bacillus thuringiensis из коллекции штаммов ГНЦ ВБ «Вектор» и получены продуценты термостабильных рекомбинантных вариантов фермента.
Abstract
In this work the search for plc gene encoding a phospholipase C from Bacillus thuringiensis from the collection of strains of the SRC VB “Vector” has been done. Аnd the producers of thermostable recombinant variants of the enzyme were obtained.

Ферменты микробного происхождения занимают лидирующие позиции
среди промышленных ферментов, благодаря их огромному разнообразию,доступности и ценным технологическим свойствам.
Среди липолитических ферментов широкое применение получили фосфолипазы — ферменты класса гидролаз, катализирующие расщепление
фосфолипидов.
Фосфолипаза С (PLC, EC 3.1.4.3) — катализирует гидролиз фосфолипидов с образованием 1,2-диацилглицерола и фосфорного эфира соответствующего амина. Фосфолипазы используют в фундаментальных исследованиях* © Ю. А. Меркульева, А. А. Бондарь, Д. Н. Щербаков, 2018.

Биотехнология

85

и медицине, однако, наиболее перспективным является их применение в процессе рафинирования растительных масел, а так же на аналогичной стадиив процессе предварительной обработки масла при производстве биодизеля.
Неочищенное растительное масло может содержать до 3 % фосфолипидов, которые снижают качество масла при хранении и выход продукта прирафинировании. Использование PLС позволяет повысить эффективность
очистки масла и сократить потери сырья. Оптимальным ферментом для использования в промышленном рафинировании растительных масел является фосфолипаза С из бактерий рода Bacillus, поскольку фермент обладает
наиболее подходящим спектром субстратной специфичности, высокой термостабильностью и удельной активностью.
Ферментные препараты PLС B. cereus и B. anthracis уже успешно применяются в промышленности. B. thuringiensis так же входит в таксономическую группу Bacillus cereus sensu lato, что является предпосылкой для поиска новых вариантов фермента с высоким технологическим потенциалом.
Целью данной работы являлась разработка продуцента термостабильной
фосфолипазы С B. thuringiensis.
Для исследования были взяты штаммы B. thuringiensis из коллекцииГНЦ ВБ «Вектор». С помощью сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК проводили филогенетический анализ исследуемых штаммов. Так же был проведен молекулярно-генетический анализ гена plс, кодирующего фосфолипазу С B. thuringiensis.
На основе разнообразия транслируемых аминокислотных последовательностей были отобраны и клонированы 12 вариантов гена фосфолипазы С.
Для получения рекомбинантного белка на основе вектора pHT255 былисконструированы рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие продукцию
PLC в бактериальной системе Bacillus subtilis.
Скрининг активности полученных вариантов PLC проводили методом
спектрофотометрии с использованием субстрата п-нитрофенилфосфорилхолина (pNPPC). Было показано, что все полученные варианты фермента
обладают фосфолипазной активностью и выдерживают температурную обработку при 80 °C в течение 1,5 часов.
Разработанные в настоящей работе продуценты рекомбинантных вариантов фосфолипазы С ориентированы на производство ферментов, используемых в промышленности, кроме того, полученные рекомбинантные PLC
будут использованы для исследования влияния выявленных аминокислотных замен на свойства фермента.

Раздел 186ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДИ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СКОРОСТЬ
ДОСТИЖЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ВОЗРАСТА НЕПАРНЫМ
ШЕЛКОПРЯДОМ (LYMANTRIA DISPAR L)
INFLUENCE OF VARIOUS NUTRITION AND PHYSICAL FACTORSON THE SPEED OF ACHIEVING THE TARGET AGE
OF GIPSY MOTH (LYMANTRIA DISPAR L)
О. В. Охлопкова, А. А. Томилов, А. В. Дручинина, А. В. Колосов *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
O. V. Okhlopkova, A. A. Tomilov, A. V. Druchinina, A. V. Kolosov
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
E-mail: ohlopkova_ov@vector.nsc.ruАннотацияВ процессе исследования проводилось изучение влияния различных рационов
(искусственных и естественных) и физических факторов (влажность, температура)на скорость достижения целевых возрастов непарным шелкопрядом в лабораторных
условиях, а также определение чувствительности насекомых к вирусу ядерного полиэдроза.
Abstract
During the research, the influence of various rations (artificial and natural) and physical factors (humidity, temperature) on the rate of achievement of target ages of gipsy mothin laboratory conditions was studied, as well as the sensitivity of insects to the nuclear
polyhedrosis virus.

Предотвращение загрязнения окружающей среды становится одной изнаиболее актуальных проблем современности. В результате хозяйственной
деятельности человека в окружающую среду поступает огромное количество вредных соединений, которое представляет опасность как для природыв целом, так и для самого человека в частности. Одним из видов такого родахозяйственной деятельности человека является защита леса от вредителейв лесном хозяйстве. Основная нагрузка на биосферу в рамках данного видахозяйственной деятельности идет от применения химических пестицидов
*© О. В. Охлопкова, А. А. Томилов, А. В. Дручинина, А. В. Колосов, 2018.

Биотехнология

87в борьбе с насекомыми-вредителями. Для того чтобы минимизировать вредот токсичных химических пестицидов, ведется активная разработка методов биологической защиты растений. Знания в области биологии помогают
широко использовать многих естественных врагов насекомых для щадящей
защиты растений. В частности широко используются энтомопатогенные
препараты на основе семейства Baculoviridae, семейства вирусов, которыев природе поражают фитофагов из отряда Lepidoptera, одним из представителей которого является непарный шелкопряд.
Вирус ядерного полиэдроза (ВЯП) является наиболее патогенным в семействе вирусов Baculoviridae. ВЯП обладает высокой селективностью поотношению к насекомым, что позволяет ему поражать только целевых насекомых и не оказывать влияния на остальные виды животных и растений.
Это делает препараты на основе вируса ядерного полиэдроза перспективным энтомопатогенным средством.
Особенностью производства препаратов на основе бакуловирусов является то, что наработка вирусных частиц возможна только в живом организме, что ставит инсектарий на одно из важнейших мест в производственной
схеме. Кроме того, для любого производства важными являются критерии
эффективности технологии. Увеличение скорости роста насекомых в инсектарии позволит сократить затраты на их содержание. Состав искусственной
питательной среды (ИПС) является важным параметром, который не только
влияет на скорость роста насекомых, но и легко поддается изменению и контролю, также в исследовательской работе была затронута тема оптимизации
физических факторов при культивировании насекомых.
Объектами исследования были непарный шелкопряд (НШ) и вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, как наиболее актуальные для Сибирского федерального округа, который традиционно считается одним изосновных лесозаготовительных регионов страны.
Цель данной работы: установление скорости достижения целевого возраста непарным шелкопрядом при культивировании на естественных и искусственных питательных средах, изучение влияния физических факторовпри культивировании насекомых.
В эксперименте по изучению влияния естественных питательных
сред отродившихся гусениц рассаживали группами в банки объемом 500 мл,в банки помещали листья: березы повислой, рябины сибирской, липы сердцевидной, яблони сибирской, лиственницы сибирской и вяза обыкновенного и, далее таким образом насекомые культивировались до достижения
целевого возраста. Данные породы деревьев были выбраны как наиболее
характерные для Сибирского федерального округа. При культивированииНШ фиксировались личиночные стадии. Эксперимент показал, что культи-Раздел 188вирование с использованием лиственницы сибирской в качестве естественной питательной среды позволяет получать насекомых целевого возрастав среднем за 20 дней от момента активации яиц, в то время как остальные
породы дают отрицательный результат.
В ряде случаев, в частности в лабораторных экспериментах, естественная питательная среда может быть заменена на искусственную, при условии, что в ней будет оптимальное для объекта исследования соотношение
всех необходимых нутриентов. В рамках данного исследования было предложено два состава искусственных питательных сред (ИПС) с ведущим компонентом «Кукуруза» и ведущим компонентом «Чечевица» (см. таблицу).
Качественные составы ИПСКукурузная ИПСЧечевичная ИПСМука кукурузная

Чечевица

Мука соевая

Мука ржаная

Аскорбиновая кислота

Мука гречневая
Комплекс витаминов и минералов
Дрожжи кормовые

10%-й спиртовой раствор бензойной кислоты
Агар-агар
Вода дистиллированнаяВ данном эксперименте по изучению влияния искусственных питательных сред отродившихся гусениц рассаживали группами в чашки Петри с ИПС, которые различались по ключевым компонентам: 1) кукурузная
мука, 2) чечевица. При культивировании НШ фиксировались личиночные
стадии. В результате исследования было установлено, что скорость достижения III возраста у гусениц, культивируемых на ИПС с кукурузной мукой,составила 20±1 суток. Для насекомых, культивируемых на ИПС с чечевицей, данный показатель составил 16±1 суток.
Важным моментом при выращивании насекомых в лабораторных условиях является создание так называемого экологического оптимума (определенное сочетание факторов, которое характерно для каждой конкретной
популяции) экологически пессимальных и экологически оптимальных факторов. Температура тела насекомого имеет прямую зависимость от температуры окружающей среды, которая определяет поведенческие реакции,размеры тела, плодовитость, продолжительность жизни, темпы онтогенезаи интенсивность обмена веществ. Действие температуры также неотделимо

Биотехнология

89

от влажности воздуха. Вместе они оказывают прямое (гибель организма приотклонении от оптимума) и косвенное (через корм) влияние на популяцию.
Подбор наиболее благоприятных физических условий для культивирования непарного шелкопряда. Подготовка эксперимента: эксперимент
проводился в двух термостатах с различной температурой и влажностью.
В первом термостате температура 24 °C и повышенная влажность (~70 %).
Во втором термостате температура 26 °C, влажность низкая.
Для эксперимента подготовили яйца непарного шелкопряда, очистивих от грены. После яйца разделили на шесть равных частей и поместилив шесть пронумерованных чашек Петри с искусственной питательной средой. Первые три чашки поместили в первый термостат, чашки с номерами
4, 5, 6 во второй термостат. Каждый день в период проведения эксперимента
поддерживалась определенная температура и влажность в каждом термостате вне зависимости от учета показателей в этот день, в среднем экспозиция по продолжительности составляла 5–7 часов непрерывной работы
увлажнителя, температура оставалась всегда постоянной в термостатах.
Таким образом, количество суток необходимое для достижения целевых
возрастов для насекомых, которых культивировали при температуре 24 °C
и повышенной влажности (~70 %) в термостате 1, составило примерно
14 дней. Для насекомых, которых культивировали при температуре 26 °C
и пониженной влажности (~40 %) в термостате 2, данный показатель превысил 2 недели.
Для того чтобы оценить не изменилась ли чувствительность насекомыхк вирусу ядерного полиэдроза непарного шелкопряда насекомые инфицировались ВЯП НШ-10-07. На искусственную питательную среду наносили вирусную суспензию и культивировали на ней насекомых. Причину гибели гусениц устанавливали микроскопическим методом. В среднем время гибели
насекомых составило 13–15 суток, что говорит о том, что смена питания прикультивировании не сказывается на чувствительности насекомых к вирусу.
В результате проведенного исследования были выявлены определенные
тенденции при культивировании непарного шелкопряда. Наиболее благоприятной оказались такие физические условия, как повышенная влажностьи температура около 24 °C. Искусственная питательная среда на основе чечевицы оказалась эффективнее, чем среда с ведущим компонентом кукурузной мукой и естественные питательные среды. Данные вариации в культивировании не сказались отрицательно на чувствительности насекомыхк вирусу.

Раздел 190ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММОВ МИКРОВОДОРОСЛЕЙС ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЛИПИДОВ И КРАХМАЛАДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОДИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОЭНЕРГЕТИКЕ *STUDY OF PROPERTIES OF MICROALGAE STRAINSWITH HIGH CONTENT OF LIPIDS AND STARCH FOR APPLICATION
IN WASTEWATER TREATMENT AND USE IN BIOENERGY
А. В. Пилигаев 1, К. Н. Сорокина 1,2,
Ю. В. Самойлова 1, В. Н. Пармон 1,2
1ФГБУН Институт катализа им. Г. К. Борескова СО РАН
2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет

A. V. Piligaev 1, K. N. Sorokina 1,2, Y. V. Samoylova 1, V. N. Parmon 1,2
1

Boreskov Institute of Catalysis, Novosibirsk, Russia
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia

2E-mail: sorokina@catalysis.ruАннотация
Липиды и крахмал являются конечной формой запасания энергии в микроводорослях в стрессовых условиях, а их метаболизм тесно связан между собой. Выявление перспективных штаммов-продуцентов этих веществ является одним из важных
направлений исследований в биотехнологии микроводорослей. В данном исследовании проведен скрининг свойств новых штаммов микроводорослей по продукции
липидов и крахмала и изучены их метаболические особенности в процессе накопления липидов.
Abstract
Lipids and starch are the major form of energy storage in microalgae under stressful conditions and their metabolism is closely related. Isolation of promising microalgal
strains producing these substances is one of the important areas of research in microalgae
biotechnology. In this study, the properties of new microalgal strains were screened for the
production of lipids and starch and their metabolic characteristics were studied.
© А. В. Пилигаев, К. Н. Сорокина, Ю. В. Самойлова, В. Н. Пармон, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного
фонда (проект № 17-73-30032).

Биотехнология

91Получение энергии из возобновляемых источников сырья в последнее
время является общемировым трендом. Микроводоросли являются перспективным возобновляемым сырьём, в том числе для производства биотоплива
третьего поколения. Однако высокая стоимость используемых технологий
сдерживает их широкое использование в промышленности для получения
моторных топлив. Выбор подходящего штамма-продуцента для получения
целевых продуктов, а также снижение затрат при культивировании играют
решающее значение для разработки более эффективных технологий получения возобновляемого сырья.
Целью данной работы являлся поиск штаммов микроводорослей с высоким содержанием липидов и крахмала, пригодных для использования в водоочистке и получения продуктов с высокой добавленной стоимостью.
Материалы и методы
Чистые культуры микроводорослей выделяли из образцов почв и воды,отобранных в Западной Сибири, Северном Казахстане и на северо-восточном
побережье Черного моря. Таксономическую идентификацию проводили попоследовательности гена 18S рРНК (для отдельных штаммов дополнительно использовали участки ITS1, 5,8S рРНК и ITS2). Скрининг по способности
накопления липидов и крахмала в малых объемах проводили в стерилизованных сточных водах с очистных сооружений г. Новосибирска (среда MWW),а также на синтетических средах OECD [1] и BBM [2]. Исследование влияние
стрессовых условий (в том числе концентрации азота, фосфора в среде и общей солености) на продуктивность по крахмалу проводили на синтетической
среде BBM. Накопление нейтральных липидов в клетках оценивали путем
измерения интенсивности флуоресценции после окрашивания красителем
Nile Red. Анализ содержания крахмала проводили антроновым методом, какописано в [3]. Анализ состава жирных кислот и состава метаболитов микроводорослей проводили методом ГХ/МС на приборе Agilent 7000B.
РезультатыВ работе проведено исследование свойств 15 штаммов микроводорослей, из которых 8 штаммов выделены в ходе работы из природных источников, 7 штаммов получены из коллекций микроводорослей и были использованы для сопоставления их свойств со свойствами штаммов, выделеннымив ходе работы. Филогенетический анализ на основе гена 18S рРНК выявил
принадлежность выделенных штаммов к родам Chlorella, Micractinium,
Parachlorella, Desmodesmus и Scenedesmus.
Содержание крахмала в стационарной фазе роста при скрининге на используемых средах варьировалось от 2,1 до 28,6 % по сухому весу в зави-92Раздел 1симости от штамма. Штаммы рода Scenedesmus и Desmodesmus обладали
наименьшим содержанием крахмала, в то время как штаммы, идентифицированные как Parachlorella kessleri, обладали при скрининге самым высоким содержанием крахмала от 20,2 до 28,6 % от веса сухой биомассы. Изних штамм Parachlorella kessleri IC-11 был выделен в ходе работы и обладалпри культивировании в сточной воде в стационарной фазе роста содержанием крахмала 28,6±0,9 % от веса сухой биомассы. При исследовании влияния стрессовых факторов на среде BBM на уровень накопления крахмала
выявлено, что снижение содержание азота и фосфора на 50 % в исходной
среде, а также увеличение общей солености до 2 % приводило в среднемк полуторократному кратному увеличению содержания крахмала в стационарной фазе роста, и было максимальным для штамма Parachlorella kessleri
IC-11 (с 19,3±1,5 % до 28,7±1,2 %).
Флуоресцентный анализ с использованием красителя Nile Red показал,что при культивировании на используемых средах высоким содержанием
нейтральных липидов обладали штаммы C. sorokiniana IC-62, C. sorokiniana
IPPAS C-1, Micractinium sp. IC-44 и Micractinium sp. IC-76, из них максимальная продуктивность по липидам отмечена для штамма Micractinium
sp. IC-76 и составила 13,5±1,5 мг л-1 сут–1, при общем содержании липидов
36,3±0,11 % от веса сухой биомассы, при этом общее содержание насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот составило 71,9 % от суммы всехжирных кислот. Также показано, что штамм Micractinium sp. IC-76 эффективно удалял соединения азота и фосфора из среды при культивировании насточной воде. Максимальная эффективность удаления азота (N-NH4) и фосфора (P-PO4) из среды составила 96,4 и 77,8 %, соответственно.
Также в работе впервые проведено исследование метаболизма микроводорослей рода Chlorella и Micractinium и выявлены отличия между нимив процессе культивирования на сточных водах в экспоненциальной и стационарной фазах роста. По данным анализа метаболических профилей, полученных методом главных компонент (см. рисунок) у четырех штаммов, относящихся к Micractinium sp. и C. sorokiniana были выявлены значительные
отличия метаболических профилей в обеих фазах роста по первой главной
компоненте (F1). Группировка метаболических профилей в стационарной
фазе роста сопряжена с увеличением концентрации метаболитов углеводного обмена (глюкозо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, галактозо-6-фосфата,мио-инозитол-2-фосфата, галактозил глицерола), а также щавелевой и эритроновой кислоты. Для штаммов с высоким содержанием липидов отмечена
тенденция к более высокому содержанию углеводов в стационарной фазероста, в частности, у штамма Micractinium sp. IC-76 отмечено десятикратное увеличение содержания сахарозы.

соким содержанием липидов отмечена тенденция к более высоуглеводов в стационарной фазе роста, в частности, у шт
p. IC-76 отмечено десятикратное увеличение содержания сахар
93Биотехнология

8
6

F2 (17,72 %)

4
2
0
-2
-4
-6
-8
-8

-6

IPPAS C-1_exp
IC-62_exp

-4

-2

0

2

F1 (22,63 %)IPPAS C-1_st
IC-62_stIC-44_exp
IC-76_exp

468IC-44_stIC-76_stГрафик счетов в пространстве первой (F1) и второй (F2)главных компонент, полученный в результате анализа
метаболомных профилей микроводорослей методом главных компонент:exp — экспоненциальная фаза роста (4 сутки),st — стационарная фаза роста (15 сутки)рафик счетов в пространстве первой (F1) и второй (F2) главных
нт, полученный в результате анализа метаболомных профилей
ослей методом главных компонент: exp – экспоненциальная фТаким образом, в работе получен штамм Micractinium sp. IC-76, обладароста (4 ющийсутки),
st – стационарная фаза роста (15 сутки)высоким содержанием липидов (36,3 %) с высокой насыщенностью

потенциально применимый для использования в очистке муниципальных
сточныхи для получения
биодизельного
топлива, а также
штамм, облада- sp. Iобразом,в водработе
получен
штамм
Micractiniumющий высоким содержанием крахмала Parachlorella kessleri IC-11 (28,6 %),высокимпотенциально
содержанием
липидов
(36,3%)
с высокой насыщенно
применимыйдля получения
биоэтанола.

применимыйдля использования в очистке муниципальных стоЛитература
OECD Guidelines for Testingof Chemicals— Aerobic обладаю
олучения 1.биодизельного
топлива,а Simulationтакже Testsштамм,
SewageTreatment. in: Technical Report, OECD Publishing. Paris, 1996 — P. 19–142
держанием2. Stein,крахмала
kessleriIC-11 (28J. R. Handbook of Parachlorella
phycological methods culture
methods and growthmeasurements.
‒ Cambridge
University биоэтанола.
Press, 1980. 448 p.
применимый
дляполучения
3. Branyikova I., Marsalkova B., Doucha J., Branyik T., Bisova K., Zachleder V.,
Vitova M. Microalgae — novel highly efficient starch producers. Biotechnol Bioeng,2011. — V.108. — P. 766–76.

Литература
D Guidelines for Testing of Chemicals Simulation Tests - A
ent. in: Technical Report, OECD Publishing. Paris, 1996 - P. 19-142

Раздел 194ЭКЗОСОМЫ МОЛОКА: ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ,АНАЛИЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ *MILK EXOSOMES: TECHNOLOGY OF ISOLATION,ANALYSIS OF PROTEIN AND NUCLEIC ACIDS
Л. В. Пурвиньш , С. Е. Седых , Г. А. Невинский
Новосибирский государственный университет
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения РАН
L. V. Purvinsh, S. E. Sedykh, G. A. Nevinsky
Novosibirsk State University, SB RAS ICBFM, Russia
E-mail: ladapurvinsh13@gmail.com
АннотацияВ настоящее время особый интерес вызывают прикладные исследования экзосом как переносчика диагностически значимых белков и нуклеиновых кислот между клетками, а также как перспективных систем для направленной доставки лекарственных препаратов в организме. В связи с этим основной задачей является разработка эффективной технологии выделения экзосом из различных биологических
жидкостей. Важно, чтобы технология выделения позволяла получать необходимое
количество материала без примесей для анализа экзосомального содержимого. Использование сложных биологических жидкостей, как молоко, имеет смысл для создания универсального метода выделения экзосом из разных источников.
Настоящая работа включает в себя новые подходы в дополнение к стандартному протоколу выделения экзосом для получения из молока высокоочищенных
препаратов экзосом. Исследование белков показало, что использование дополнительных стадий очистки, таких как гель-фильтрация и аффинная хроматография,способствует значительному уменьшению определяемых белков в препаратах.
Анализ белкового и нуклеинового состава экзосом молока может поспособствовать созданию новых подходов для диагностики и терапии.
Abstract
The most interesting part of current studies is exosomes as a carrier of diagnosticallysignificant proteins and nucleic acids between cells and as promising systems for targeted© Л. В. Пурвиньш, С. Е. Седых, Г. А. Невинский, 2018.
*Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект
№ 18-74-10055).

Биотехнология

95

drug delivery in the body. Based on this, the main task of exosome studies is the development of effective exosome isolation technology from various biological fluids. It is important that the technology contributes to obtaining the necessary amount of material without
impurities for the exosomal content analysis. The using of complex biological fluids, likea milk, makes sense to create a universal exosome isolation method from different sources.
This work includes new modifications of the standard exosome isolation protocol to
obtain the highly purified preparation of exosomes from milk. The protein analysis showedthat the using of additional purification stages such as gel-filtration and affinity chromatography contribute to a significant decrease of determined proteins in the preparations.
Analysis of protein and nucleic composition of milk exosomes can facilitate to the creationof new approaches for diagnosis and therapy.

Небольшие размеры экзосом, а также их способность преодолевать биологические барьеры и осуществлять естественный транспорт биомолекул
между клетками делают их идеальным кандидатом для разработки новых
диагностических и терапевтических средств. Использование молока в качестве модельного объекта для создания технологии выделения экзосом позволит разработать универсальный способ выделения для разнообразных посложности и составу биологических жидкостей.
Молоко млекопитающих является уникальным источником экзосом,которые на данный момент недостаточно изучены. Выделение экзосом изданной биологической жидкости стандартным методом с использованием
только ультрафильтрации и ультрацентрифугирования не приводит к полному разделению везикулярных структур и белковых примесей. В связис этим, мы использовали дополнительные стадии очистки препаратов экзосом, такие как гель-фильтрация и аффинная хроматография. Основываясь на данных просвечивающей электронной микроскопии, разработанный
нами подход позволяет получать высокоочищенные препараты везикулярных структур из молока человека, лошади, коровы. Иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием антител к основным поверхностным
белкам экзосом: CD9, CD81, CD63 было подтверждено, что полученные везикулы являются экзосомами.
Показано, что число белков в препаратах экзосом, выделенных с помощью стандартного протокола и препаратах с дополнительной очисткой,существенно различаются. В процессе гель-фильтрации происходит отделение везикул от основных молочных белков, в частности от казеинов. Данные результаты свидетельствуют о том, что, вероятно, множество белков,определяемых ранее как экзосомальные, являются просто совыделяющимися, и при качественной очистке препаратов экзосом не выявляются.
Исследование нуклеинового состава высокоочищенных препаратов
экзосом показало, что в экзосомах присутствуют основные молочные ми-96Раздел 1кроРНК. В дальнейшем, определение уникальных РНК, присутствующих
исключительно в экзосомах, может помочь для разработки высокопроизводительного способа определения содержания экзосом в препаратах.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при правильной технологии выделения молоко служит перспективным источником
экзосом, которые могут быть использованы для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований.

Биотехнология

97ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ШТАММА CHROMOHALOBACTER SP. TC193ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ БИОСИНТЕЗА ЭКТОИНА *OPTIMIZATION OF CULTIVATION CONDITIONS FOR INCREASE
OF THE ECTOINE BIOSYNTHESIS BY STRAIN
CHROMOHALOBACTER SP. TC193
А. А. Пьянкова, Л. Н. Ананьина
Институт экологии и генетики микроорганизмов
Уральского отделения Российской академии наук —филиал ФГБУН ПФИЦ УрО РАН, Пермь, Россия
A. A. Pyankova, L. N. Anan’ina
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of
the Russian Academy of Sciences — a branch of the Federal State Budgetary
Institution of Science of the Perm Federal Research Center of the Ural Branchof the Russian Academy of Sciences, Perm, Russian FederationАннотация
Исследовано влияние температуры и разной солености среды культивированияна накопление клетками штамма Chromohalobacter sp. TC193 эктоина. Наиболее высокая внутриклеточная концентрация эктоина детектировалась в клетках исследуемого штамма, выращенных в минеральной среде с глюкозой в качестве источника
углерода и энергии в присутствии 100 г/л хлорида натрия при 28 °С.
Abstract
The influence of temperature and different salinity of the culture medium on the ectoine accumulation by Chromohalobacter sp. TC193 cells were investigated. The highest intracellular ectoine concentration was detected in the cells of the strain under study,
grown in a mineral medium with glucose as sole source of carbon and energy at the presence of 100 g / l sodium chloride at 28 °C.

Высокая совместимость с биологическими системами, отсутствие токсичности, стабилизирующие макромолекулы (ферменты, ДНК и РНК, мембраны) свойства и клеткозащитное действие делают эктоин многообещающим кандидатом для применения в различных биотехнологических целях,© А. А. Пьянкова, Л. Н. Ананьина, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Министерства
образования и науки Пермского края в рамках проекта № 17-44-590178.

98Раздел 1например, в косметической промышленности (в частности, в средствах поуходу за кожей), фармацевтической промышленности и медицине [1]. В связи с этим ведется активный поиск бактерий продуцентов эктоина. Известно,что штамм Chromohalobacter salexigens DSM3043T для выживания в условиях повышенного содержания солей поддерживает осмотический баланс засчет синтеза de novo «совместимых веществ», основным из которых является эктоин [2]. На настоящий момент нет сведений о патогенности бактерий
рода Chromohalobacter, они не требуют сложных питательных сред и условий культивирования и потому являются перспективными для примененияв биотехнологических процессах продукции эктоина.
Целью настоящей работы явилось определение оптимальных условий
биосинтеза эктоина клетками штамма Chromohalobacter sp. TC193, филогенетически близкородственного виду Ch. japonicus 43T (AB105159) и удаленного от детально изученного вида Ch. salexigens DSM3043T.
Объектом исследования служил изолят TC193 (=N3), ранее выделенный из образца соляной корки солеотвала БКПРУ-1 предприятия ПАО«Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). Проведена молекулярно-генетическая характеристика исследуемой бактериальной культуры с применением методов секвенирования гена 16S рРНК и Rep-типирования
геномов. Установлено, что исследуемая бактерия имеет наиболее высокий уровень 16S рДНК-сходства, составляющий 99.92 %, с видом Ch.
japonicus 43T (AB105159). Однако Rep-ПЦР профили изолята TC193 отличались от типового штамма вида Ch. japonicus 43T. Методом ПЦР на
ДНК-матрице исследованного штамма с применением праймеров, комплементарных ect-генам галомонад [3], получен фрагмент ожидаемой длины
около 1200 п.н. Сравнение нуклеотидных последовательностей амплифицированного фрагмента ect-оперона выделенного штамма с таковымииз базы данных GenBank выявило их сходство 99.7 % с ect-генами Ch.
japonicus CJ (CDGZ01000011.1).
Культивирование штамма проводили в 100 мл минеральной среды Раймонда [4] с глюкозой (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии в колбах объёмом 250 мл на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 при 100 об/мин при следующих условиях: в присутствии 50 г/л хлорида натрия дофазы стационарного роста при 28 °С, 37 °С и 40 °С; в присутствии 10, 100,
150 г/л хлорида натрия до фазы стационарного роста при 28 °С; а такжев присутствии 50 г/л хлорида натрия до середины фазы логарифмического роста при 28 °С. Экстракцию органических соединений из клеток и последующий анализ проводили согласно методике, описанной Schubert et al.
[5]. Идентификацию эктоина проводили по хроматографическому времени
удерживания при сравнении с коммерческим препаратом (Fluka, Германия).

Биотехнология

99Количественное содержание эктоина в экстрактах рассчитывали с помощью
пакета программ «LCsolution» (Shimadzu, Япония).
Исследование кинетики роста штамма Chromohalobacter sp. TC193 приразной солености среды выявило высокие ростовые показатели в присутствии 50–100 г/л хлорида натрия в среде культивирования. Наиболее высокое внутриклеточное количество эктоина было отмечено при выращивании
бактерии в присутствии 100 г/л NaCl и составило 1.65±0.21 мкмоль/мг сухого веса. Дальнейшее увеличение концентрации хлорида натрия до 150 г/лв среде культивирования привело к возрастанию продолжительности lag-периода, снижению скорости роста и значений максимальной оптической
плотности, но не привело к возрастанию внутриклеточной концентрации
эктоина. Однако в клеточных экстрактах был обнаружен гидроксиэктоин.
Установлено влияние температуры на рост исследуемого штамма: увеличение температуры с 28 °С до 40 °С ингибировало рост. Кроме того, уже прикультивировании исследуемого штамма при 37 °С было отмечено снижение
внутриклеточного пула эктоина с 0.905±0.007 (28 °С) до 0.61±0.03 мкмоль/мг сухого веса. Зависимости внутриклеточной концентрации эктоина отстадии роста штамма Chromohalobacter sp. TC193 не выявлено.
Таким образом, полученные результаты могут быть основой для разработки условий культивирования штамма Chromohalobacter sp. TC193 в биотехнологии промышленного получения эктоина.
Литература
1. Lentzen G., Schwarz T. Extremolytes: natural compounds from extremophiles forversatile applications. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72, № 4. P. 623–634.
2. Pastor J. M. et al. Role of central metabolism in the osmoadaptation of the
halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens.// J. Biol. Chem. 2013. V. 288, № 24.
Р. 17769–17781.
3. Ананьина Л. Н., Плотникова Е. Г. Новая система олигонуклеотидов для амплификации есt-генов бактерий семейства Halomonadaceae // Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. Т. 4, № 1. С. 17–18.
4. Plotnikova E. G. et al. Thalassospira permensis sp. nov., a new terrestrial halotolerant
bacterium isolated from a naphthalene-utilizing microbial consortium. // Mikrobiologiia.
2011. V 80, № 5. Р. 691–699.
5. Schubert T. et al. Continuous synthesis and excretion of the compatible soluteectoine by a transgenic, nonhalophilic bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73.
P. 3343–3347.

Раздел 1100ПРИМЕНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ АНЕСТЕЗИИ
ЖИВОТНЫМ-ПРОДУЦЕНТАМ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК *APPLICATION OF DIFFERENT KINDS OF ANESTHESIATO ANIMALS-PRODUCERS OF DIAGNOSTIC SERUMS
В. В. Рогожин, М. В. Овчинникова, Т. Ю. Кириллова,А. П. Семакова, В. Г. Германчук
V. V. Rogozhin, M. V. Ovchinnikova, T.Yu. Kirillova,
A. P. Semakova, V. G. GermanchukАннотация
Существующие в настоящее время методы тотального забора крови у продуцентов-кроликов, без применения какого-либо вида наркоза, не соответствуют биоэтическим нормам, которые отражены в документах организации по экономическому
сотрудничеству и развитию (OECD) и составляют основу Директив Совета Европы
98/34/ЕЭС, 67/548/ЕЭС, 86/609/ЕЭС о необходимости гуманизации экспериментовс использованием лабораторных животных.
Abstract
Existing at this moment methods of total blood sampling from rabbits-producers without application of any kind of anesthesia does not match bioethical norms, which indicatedin documents of organization economical cooperation and development (OECD) and form
the basis of Directives Europe Council about necessity of humanization of experimentswith lab animals.

ЦельИзучение возможности использования различных методов анестезиипри проведении манипуляций по тотальному забору крови у животных-продуцентов диагностических сывороток.
Материалы и методы: кроликипороды «Шиншилла» массой 2,5–3,0 кг.
Ингаляционный анестетик Изофлуран в концентрации 3,5 % в сочетании
с 0,8 % чистого кислорода, миорелаксационное средство для парентерального введения ксилазин из расчета 0,2 мл/кг, а также анестезирую смесьиз препаратов общей анестезии — золетила и ксилы. Для ингаляционного
введения использовали наркозный аппарат Moduflex (Dispomed), индукция* © В. В. Рогожин,В. Г. Германчук, 2018.

М. В. Овчинникова,Т. Ю. Кириллова,А. П. Семакова,Биотехнология

101

в наркоз составила 5–7 мин, поддержание анестезии велось на протяжении
всей процедуры тотального взятия крови; ксилазин вводили внутримышечно, время достижения миорелаксационногоэффекта составляло от 10 до
15 мин.; анестезирующую смесь вводили внутривенно в краевую вену уха,время введения животного в наркоз составляло 1–3 мин. Контроль специфической активности полученной иммунных сывороток осуществляли в развернутой реакции агглютинации.
В ходе проведения ингаляционной и парентеральной анестезии у животных ослабевали рефлексы вплоть до их полного отсутствия, незначительно
понижалась температура тела, угнетался сердечный ритм, у некоторых продуцентов снижался кровоток. Однако, внутримышечная анестезия приводила к ослаблению болевой чувствительности на непродолжительное время,которого было недостаточно для проведения процедуры кровопускания,следовательно, использование ксилазина в качестве анестетика для тотального забора крови, не рекомендуется.
Продолжительный анестезирующий эффект от внутривенного введения
смеси ксилы и золетила поддерживал кролика в состоянии полной анестезии на протяжении всей процедуры по забору крови. Специфическая активность иммунных сывороток соответствовала требованиям нормативной
документации. Таким образом, определена целесообразность применения
ингаляционного вида анестезии, а так же комбинации из препаратов ксилыи золетилапри проведении тотального забора крови у кроликов-продуцентов диагностических сывороток.

Раздел 1102КОЭКСПРЕССИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЭСТЕРАЗЫ
БАКТЕРИИ UREIBACILLUS THERMOSPHAERICUSС МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ШАПЕРОНАМИ В E. COLIИ ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ СВОЙСТВ *CO-EXPRESSION OF THERMOSTABLE ESTERASE FROM
UREIBACILLUS THERMOSPHAERICUS WITH MOLECULAR
CHAPERONES IN E. COLI AND STUDY OF ITS PROPERTIES
Ю. В. Самойлова 1, А. В. Пилигаев 1, К. Н. Сорокина 1,2, В. Н. Пармон 1,2
1ФГБУН Институт катализа им. Г. К. Борескова СО РАН
2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет

Y. V. Samoylova 1, A. V. Piligaev 1, K. N. Sorokina 1,2, V. N. Parmon 1,2
1

Boreskov Institute of Catalysis SB RAS, Russia
2
Novosibirsk State University, RussiaАннотацияВ работе была проведена разработка продуцентов новой термостабильной эстеразы estUT1 бактерии Ureibacillus thermosphaericus, получаемой ко-экспрессиейс молекулярными шаперонами E. coli и Devosia psychrophila. Коэкспрессия с шаперонами E. coli (KJE, ClpB и ELS) и триггерным фактором D. psychrophila привелак увеличению продукции эстеразы в растворимой фракции белка до 22,6 ± 1,3 ЕАи 25,2 ± 0,8 ЕА, соответственно, по сравнению с эстеразой, экспрессированной безшаперонов (15,6 ± 0,2 ЕА). На основе выделенного фермента был получен биокатализатор в виде поперечно-сшитых агрегатов белка и были исследованы его свойства.
Abstract
In this study the new thermostable esterase estUT1 from Ureibacillus thermosphaericus was co-expressed with molecular chaperones of E. coli and psychrophilic bacteria
Devosia psychrophila. Co-expression of esterase with an E. coli chaperones (KJE, ClpB,
and ELS) or with the trigger factor of D. psychrophila increased the yields of soluble protein up to 22,6 ± 1,3 U and 25,2 ± 0,8 U, respectively, as compared to esterase expressed
without chaperones (15,6 ± 0,2 U). The soluble protein fraction was used for preparationof cross-linked enzyme aggregates and used as a biocatalyst for hydrolysis of organophosphate insecticide malathion.
© Ю. В. Самойлова, А. В. Пилигаев, К. Н. Сорокина, В. Н. Пармон, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 18-38-00386 мол_а.

Биотехнология

103Биокатализаторы на основе термостабильных липолитических ферментов широко применяются в пищевой и фармацевтической промышленностидля получения модифицированных пищевых жиров, ароматических соединений и фармацевтических интермедиатов. Основным недостатком их применения является высокая стоимость получения липолитических ферментов, продуцируемых рекомбинантными штаммами микроорганизмов, которые являются активным компонентом биокатализаторов.
В данной работе для повышения продукции новой термостабильной
эстеразы estUT бактерии U. thermosphaericus в E. coli была проведена ее коэкспрессия с молекулярными шаперонами E. coli (KJE, ClpB и ELS) и с триггерным фактором (TF) психрофильной бактерии D. psychrophila в клетках
E. coli BL21(DE3). Конструкция, несущая ген TF D. psychrophila, была получена на основе плазмиды pBB540. Коэкспрессия с молекулярными шаперонами E. coli (KJE, ClpB и ELS) привела к увеличению продукции эстеразыв растворимой фракции клеточного лизата c 1 мг белка с 15,6 ± 0,2 до 22,6 ±1,3 ЕА. Коэкспрессия TF D. psychrophila с EstUT1 также привела к увеличению продукции фермента до 25,2 ± 0,8 ЕА.
Исследование свойств фермента показало, что выделенная эстераза
отличается оптимумом активности при 70–80 °C и рН 8,0, специфично
гидролизует сложные эфиры короткоцепочечных жирных кислот (С2-С8).
EstUT1 показала высокую каталитическую эффективность при гидролизе малатиона (KM = 19,5 ± 1,1 мкМ) и стереоспецифичность в отношении(S)-энантиомера кетопрофена (eep = 35,3 %). Таким образом, многообразие свойств термостабильной эстеразы EstUT1 позволяет использовать еев различных процессах, основанных на гидролизе соединений со сложноэфирной связью.
Полученный белок был использован для приготовления и исследования биокатализатора методом CLEA (cross-linked enzyme aggregates); активность полученного биокатализатора составила 29,4 ± 0,5 ЕА/мг. Былоустановлено, что в ходе иммобилизации эстеразы значительно повысилаее стабильность при рН 5–9, 50–80 °C, причем времена полуинактивации
фермента после иммобилизации при 50 и 60 °C увеличились в 1,9 и 1,5 рази стали равны 31,3 и 22,5 ч, соответственно. Исследование влияния различных веществ на фермент выявило более высокую стабильность иммобилизованной эстеразы по сравнению со свободной и в присутствии 10 мМ растворов ФМСФ, ДТТ, 2-меркаптоэтанола, а также 1 % растворов SDS и Твин20 ее активность стала больше в 1,9, 1,2, 1,2, 1,5 и 1,6 раз, соответственно.
Биокатализатор на основе эстеразы estUT1 был протестирован в реакции гидролиза малатиона (О,О-диметил-S-(1,2-дикарбэтоксиэтил)дитиофосфат),причем в последнем случае биокатализатор показал высокую операцион-104Раздел 1ную стабильность: после 25 циклов (350 ч) реакции при температуре 37 °Cстепень гидролиза малатиона составила 78,1 ± 3,1 %.
Таким образом, в работе была увеличена продукция рекомбинантной
термостабильной эстеразы бактерии U. thermosphaericus коэкспрессиейс молекулярными шаперонами и получен биокатализатор на ее основе методом CLEA. Повышенная стабильность CLEA-estUT1 в денатурирующих
условиях делает его перспективным биокатализатором для различных биотехнологических процессов на основе гидролиза соединений со сложноэфирными связями.

105Биотехнология

БИСПЕЦИФИЧНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ:СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ *BISPECIFIC ANTIBODIES: METHODS OF PRODUCTION
AND PERSPECTIVES OF USE
С. Е. Седых, Г. А. Невинский
Новосибирский государственный университет
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения РАН
S. E. Sedykh, G. A. Nevinsky
Novosibirsk State University, Russia
SB RAS ICBFM, Russia
E-mail: sedyh@niboch.nsc.ruАннотация
Биспецифичные антитела содержат два разных антигенсвязывающих центра и способны связывать два разных антигена. Журнал Nat Rev Drug Disc назвал
в 2014 году эти молекулы «антителами нового поколения» из-за перспектив их использования в качестве терапевтических агентов. Предложено более 50 различных
платформ для получения биспецифичных антител.
Abstract
Bispecific antibodies contain two different antigen-binding centers and may bind totwo distinct antigens simultaneously. Nature Reviews Drug Discovery named this molecules in 2014 — “next generation antibodies” due to their prospects for use as therapeutic
agents. There are proposed more than 50 different platforms for bispecific antibodies productions.

В настоящее время разрешены к медицинскому использованию два препарата биспецифичных терапевтических антител — блинатумомаб и катумаксомаб. Эти препараты направлены на лечение «жидких» опухолей, ракакрови (лейкемии и лимфомы). В настоящее время более 60 молекул биспецифичных антител находятся в клинических испытаниях, более 140 разрабатываются и находятся на стадии доклинических испытаний. Терапевтиче© С. Е. Седых, Г. А. Невинский, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке РФФИ 16-34-60066 мол_а_дк, Гранта
Президента РФ молодым кандидатам наук MK-410.2017.4.

106Раздел 1ские биспецифичные антитела разрабатываются для лечения аутоиммунных
(например, артриты, астма, диабет), инфекционных (например, пневмония)и других заболеваний (например, гемофилия и болезнь Альцгеймера).
Разработка новых подходов для получения биспецифичных антител позволила получить различные варианты перспективных для терапевтического использования производных иммуноглобулинов. Получаемые молекулы
отличаются от природных IgG по фармакокинетике, времени полужизнив крови, способности проникать в опухоль, по размерам, валентности и наличию Fc. Блокирование сразу нескольких биологических путей позволяет
БсАТ проявлять синергический эффект, недостижимый при введении смеси
моноспецифических молекул. Работы последних лет указывают на то, чтов перспективе будут получены молекулы, получаемые комбинациями разработанных ранее методов, направленные на лечение самых разных заболеваний, при которых ключевую роль может играть одновременное связывание
нескольких специфических антигенов.
Природные биспецифичные иммуноглобулины обнаружены в молоке,плаценте и крови здоровых доноров. Ранее нами показано, что химерные
биспецифичные молекулы IgG из этих источников представлены всеми подклассами (IgG1-IgG4), определено содержание биспецифичных IgG, а также
соотношение биспецифичных IgG к моноспецифичным.
Показано, что обнаруженные природные биспецифичные IgG, образуются в организме человека in vivo в результате обмена иммуноглобулинов
HL-фрагментами. Полученные данные указывают на то, что данный процесс в крови, молоке и плаценте человека происходит между IgG всех подклассов, а на возможную роль обмена HL-фрагментами при беременностии лактации и на перспективы использования данного процесса для получения искусственных биспецифичных антител.

Биотехнология

107ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА
ЛАССА В ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИPRODUCTION OF RECOMBINANT LASSA VIRUS ANTIGENS IN
A PROCARYOTIC EXPRESSION SYSTEM
С. С. Скрипкин 1,2, И. Р. Иматдинов 1 *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
ФГБОУ ВПО Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет
1

2

S. S. Skripkin 1,2, I. R. Imatdinov 1
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
Novosibirsk state university, Novosibirsk, Russia

2E-mail: skripkin.stan@gmail.com
Аннотация
Вирус Ласса — распространенный в странах Западной Африки РНК-содержащий вирус, представитель семейства Arenoviridae. Вирус Ласса относится к микроорганизмам I группы патогенности.
На данный момент терапия включает в себя симптоматическое лечение и применение нуклеозидного аналога рибавирина (1-p-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3carboxamide). Лицензированных вакцинных препаратов против лихорадки Лассав настоящее время не существует.
Abstract
Lassa virus is RNA virus belonging to the family of Arenaviridae, distributed in West
African countries. Lassa virus is included to the organisms of the I pathogenicity group.
Currently, therapy includes symptomatic treatment and the use of guanosine analog ribavirin (1-p-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide). So far, vaccine against Lassa fever does not exist.

В Западной Африке ежегодно инфицируются вирусом Ласса от 2 до 3 млн.
человек, из них от 5 до 10 тыс. погибает (Fichet-Calvet Е., Rogers D. J., 2009).
В 80 % случаев болезнь протекает бессимптомно. В остальных — характеризуется тяжелым течением, включающим повышение температуры тела до
40ºC, слабость, мышечную и головную боль, тошноту, рвоту и геморрагический синдром. Выявление людей, инфицированных вирусом Ласса, ослож*© С. С. Скрипкин, И. Р. Иматдинов, 2018.

108Раздел 1нено клиническими проявлениями, характерными для других вирусных геморрагических лихорадок (Эбола, Марбург, Мачупо, денге, желтая лихорадкаи другие).
Выбор прокариотической системы экспрессии на основе E. coli основанна доступности широкого спектра лабораторных штаммов, безопасности,низкой стоимости питательных сред и высоком уровне продукции целевых
белков.
Показано, что поверхностный гликопротеин, а также нуклеопротеин вируса Ласса обладают иммуногенными свойствами. Целью данной работы
являлось получение рекомбинантных антигенов вируса Ласса в прокатиотической системе E. coli.
Разработка серодиагностикумов, позволяющих дифференцировать
инфицированных (серокомплекс Ласса-лимфоцитарный хориоменингит
(группа Старого Света)) от вакцинированных кандидатными препаратами
людей, основывается на применении двух иммунодоминантных антигенов
вируса Ласса GP1 и NP.
Получены 4 конструкционных варианта экспрессионных векторов
(pQE-30/GP1; pQE-30/NP; pET32a/GP1 и pET32a/NP) с оптимизированными
нуклеотидными последовательностями, кодирующими целевые антигены,в двух штаммах E. coli (Rosetta2(DE3)pLysS и SG13009[pREP4]), отработаны условия культивирования, индукции экспрессии, лизиса, проведена
сравнительная оценка выхода химерных белков в SDS-PAGE электрофорезе. Установлено, что все рекомбинантные вектора в соответствующих
хост-штаммах обеспечивают высокий уровень синтеза целевых белков.
Последующая очистка рекомбинантных белков будет проведена с использованием Ni-хелатной аффинной хроматографии, с «полировкой» на
CHT Ceramic Hydroxyapatite.
Антигены вируса Ласса пригодны для получения гипериммунных сывороток крови, в качестве антигенов для постановки серологических реакций(ТФ ИФА, иммуноблоттинг и т. д.), в научно-исследовательских работахпри изучении антитело-зависимого усиления инфекции, перекрестного иммунного ответа и т. д.

Биотехнология

109ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯEXTRACTION AND PURIFICATION OF PROTEASESFROM DEER PANCREATIC
А. А. Стучаева, Н. В. Глазова *Санкт-Петербургский государственный
химико-фармацевтический университет
A. A. Stuchaeva, N. V. Glazova
St. Petersburg State Chemical-Pharmaceutical University
E-mail: anna.stuchaeva@pharminnotech.com
Аннотация
Данная работа посвящена подбору условий экстракции и осаждения протеазиз поджелудочной железы северного оленя, а также изучению параметров сорбции
протеаз из экстракта поджелудочной железы северного оленя.
В результате проделанной работы были подобраны условия экстракции и осаждения протеаз из поджелудочной железы северного, выбран оптимальный сорбентдля сорбции протеаз из экстракта поджелудочной железы северного оленя, оленя.
Abstract
This work is dedicated to exploration of sorption parameters of deer pancreatic, choosing of optimal sorption parameters for model chymopsin solution both in statics and dynamics, choosing of parameters for extraction and deposition from deer pancreatic.
As a result there were chosen the optimal sorbent for sorption of proteases from deerpancreatic. Alsow there were chosen parameters for extraction and deposition of proteases
from deer pancreatic.

Целью работы является разработка методики выделения и очистки протеаз из поджелудочной железы северного оленя. Протеазы из поджелудочной железы выделяли экстракционным методом. Экстракция проводилась
0,25н серной кислотой с добавлением перлита. Осадок протеаз получали
методом высаливания, сернокислым аммонием при степени насыщения 0,7.

* © А. А. Стучаева, Н. В. Глазова, 2018.

Раздел 1110

Был проведен гельхроматографический и электрофоретический анализ
экстракта, осадка и надосадочной жидкости, а так же проведено сравнение
экстракта, полученного из поджелудочной железы крупного рогатого скотаи северного оленя.
Результаты сравнения представлены в таблице.
Сравнение ферментного состава экстрактов КРСи северного оленя
Фермент
Трипсин
Химотрипсин
ДНКаза
РНКаза

Поджелудочная КРС++++Поджелудочная северного оленя++В незначительном количествеВ поджелудочной железе крупного рогатого скота протеолитические
ферменты содержатся в виде неактивных предшественников, что позволяет получить нуклеазы (ДНКазу и РНКазу). Активные протеазы в экстракте поджелудочной железы северного оленя разрушают другие ферменты.
РНКаза, за счет более низкой молекулярной массы обладает большей устойчивостью, чем ДНКаза, и в незначительном количестве сохраняется в экстракте, в то время как ДНКаза разрушается полностью.
Ранее для сорбционной очистки ферментов использовался сорбент
КУ-23[1]. В данной работе был подобран оптимальный аналог сорбента

Выходная кривая сорбции и десорбции протеазиз раствора осадка на сорбенте Purolite-C150

Биотехнология

111

КУ-23 среди сорбентов сорбентов: Purolite-C160, Purolite-C150, PuroliteC115E, PurosorbPAR910. В результате изучения процессов сорбции и десорбции протеаз из поджелудочной железы северного оленя оптимальным
сорбентом оказался Purolite-C150.
Выход на стадии десорбции составил 83 %.
Выводы
• Подобраны условия экстракции и осаждения протеаз из поджелудочной железы северного оленя.
• Получен экстракт из поджелудочной железы северного оленя, проведен
сравнительный анализ экстрактов поджелудочной железы северного оленяи поджелудочной железы крупного рогатого скота.
• Проведена сорбция протеаз из поджелудочной железы северного оленяна оптимальном сорбенте.
Литература
1. Рудометова, Н. В. Разработка сорбционно-хроматографического выделения
панкреатических ферментов: диссертация на соискание ученой степени кандидата
фармацевтических наук: / Н. В. Рудометова; СПбТИ. — СПб., 1994. — 138 с.

Раздел 1112БЫСТРОЕ ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ
МУТАЦИЙ ГЕНА RPOB И KATG В КЛИНИЧЕСКИХ
ИЗОЛЯТАХ M. TUBERCULOSISС ПОМОЩЬЮ HAIN MTB/DR SL
У ДЕТЕЙ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ *С. А. Султанов 1, З. А. Сайфудинов 2Республикансий специализированный научно-практический
медицинский центр фтизиатрии и пульмонологии
2Республикансий специализированный научно-практический
медицинский центр фтизиатрии и пульмонологии
1

E-mail: sani_sultanov@mail.ruАннотация
Существует все возрастающая потребность в разработке быстрых методов
лабораторных исследований для борьбы с угрозой случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) среди детей во всем мире (ВОЗ,2018). Сегодня
многие открытия проводятся для исследования типа и частоты мутаций в генах
Mycobacterium tuberculosis (МТБ) rpoB и katG в резистентных штаммах к рифампицина (Rif) и изониазида (Inh) соответственно. По оценкам, в 2017 г. МЛУ-ТБразвился у 500 000 человек в мире. Еще 115 000 человек с ТБ, устойчивым к Rif,также отвечают установленным недавно критериям для лечения МЛУ-ТБ (ВОЗ,2017). Особую роль в росте среди детей с МЛУ-ТБ занимают дети, зараженные
ВИЧ-инфекцией (ВОЗ, 2018).

Цель исследования
Установить роль полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностики
мутаций в генах rpoB и katG.
Материалы и методы
Было проведено генотипическое тестирование восприимчивости к ЛУштамма МТБ, а именно из 50 патологических материалов (мокрота) взятыху детей с ТБ/ВИЧ. Технологии для генотипическое тестирование восприимчивости была выбрана HAIN MTB/DR SL для выявления резистентныхк ЛУ-ТБ в изолятах при низкой ресурсной настройке.

*© С. А. Султанов, З. А. Сайфудинов, 2018.

Биотехнология

113Результаты
Анализы мокроты, взятые у детей с ТБ|ВИЧ, показали следующие результаты, а именно, ЛУ к препаратам первого ряда была детектирована у 14(28 %)детей с ТБ/ВИЧ, а именно у 8(57 %) к Rif, у 6(43 %) к Inh. Мутации в генах
rpoB были обнаружена наиболее часто у кодонов 531, 526 и 516 (59,83 %,
45,29 % и 22,22 % соответственно), что свидетельствует о наличие ЛУ к Rif.
Частота мутаций в гене katG была обнаружена у кодона 315 среди 82,95 %изолятов ТБ устойчивых к Inh.
Выводы
HAIN MTB/DR SL обнаружил мутации rpoB и katG в фенотипически
устойчивых изолятах с чувствительностью 93 % и 83 %. Анализы HAIN
MTB/DR SL могут быть использованы для быстрого обнаружения МЛУ-ТБв течение 24 часов.

Раздел 1114

ИЗУЧЕНИЕ АНТИФУНГАЛЬНЫХ СВОЙСТВ
ПОЛИЕНОВОГО АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИНАВ ОТНОШЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
КАНДИДОЗНОГО ВУЛЬВОВАГИНИТАSTUDY ON ANTIFUNGAL PROPERTIES OF POLYENE ANTIBIOTIC
ROSEOFUNGIN AGAINST CLINICAL PATHOGENSOF CANDIDAL VULVOVAGINITIS
А. Ж. Султанова, А. И. Тумабаева, А. Ш. Жуатай,Н. Н. Жаксылыков, Г. Е. Тугелбай *ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии», Алматы, Казахстан
A. Zh. Sultanova, A. I. Tumabaeva, A. Sh. Zhautay,
N. N. Zhaksylykov, G. E. Tugelbay
LLP Sсientific Production Center for Microbiology
and Virology, Almaty, Kazakhstan
E-mail: imv_rk@list.ruАннотацияС целью создания новой лекарственной формы для лечения кандидозного
вульвовагинита изучена активность полиенового антибиотика розеофунгина в отношении 15 клинических штаммов грибов рода Candida: Candida albicans (9 штаммов), Candida krusei (2 штамма), Candida tropicalis (2 штамма), Candida glabrata(1 штамм), Candida parapsilosis (1 штамм). Антибиотик розеофунгин проявил высокую антифунгальную активность в отношении клинических возбудителей кандидозного вульвовагинита, минимальная подавляющая концентрация изменялась в пределах 1,66–2,5 мкг/мл.
Abstract
In order to develop a new dosage form for the treatment of candidal vulvovaginitis,the activity of the polyene antibiotic roseofungin was examined against 15 clinical fungal strains of Candida species: Candida albicans (9 strains), Candida krusei (2 strains),
Candida tropicalis (2 strains), Candida glabrata (1 strain), and Candida parapsilosis(1 strain). The antibiotic roseofungin showed a high antifungal activity against clinicalpathogens of candidal vulvovaginitis, the minimum inhibitory concentration was in therange of 1.66–2.5 μg/mL.
* © А. Ж. Султанова,Г. Е. Тугелбай, 2018.

А. И. Тумабаева,А. Ш. Жуатай,Н. Н. Жаксылыков,Биотехнология

115Кандидозный вульвовагинит относится к инфекционным заболеваниям,вызывающим воспаление слизистой оболочки вульвы и влагалища дрожжеподобными грибами рода Candida на фоне снижения иммунного статуса.
Лечение и профилактика кандидозного вульвовагинита в настоящее время
является актуальной проблемой в гинекологии. Это заболевание занимает
лидирующее положение среди вагинальных инфекций, т.к. практически каждая женщина имела хотя бы один эпизод данного заболевания в течение
жизни, а у более 70 % женщин возникали рецидивы.
В настоящее время насчитывается более 170 видов Candida, из которыхне более двух десятков видов регистрируются как возбудители инфекцийу человека. Несмотря на то, что Candida albicans является наиболее распространенной причиной вульвовагинального кандидоза, частота этого заболевания, вызванного другими видами Candida, такими как C. tropicalis,
C. glabrata и C. krusei, увеличивается, особенно у ВИЧ-инфицированных
женщин.
Полиены, азолы, эхинокандины, нуклеозидные аналоги и аллиламины
используются с различной эффективностью для лечения инфекций, возбудителями которых являются грибы рода Candida в зависимости от типа и места заражения и чувствительности видов Candida. Широкое использование
этих препаратов в качестве профилактических и терапевтических агентов
способствует появлению резистентных штаммов Candida, тем самым вызывая серьезные проблемы в успешном лечении вульвовагинита. При этомотмечается более высокий уровень резистентности, особенно к азолам,у большинства видов Candida non-albicans, многие из которых обладают
природной устойчивостью к противогрибковым препаратам.
В связи с вышеизложенным, поиск новых антифунгальных лекарственных субстанций и разработка на их основе эффективных препаратов для лечения кандидозного вульвовагинита, доступных широким слоям населения,является настоятельной необходимостью.
Целью данной работы было изучение активности противогрибкового полиенового антибиотика розеофунгина в отношении клинических возбудителей кандидозного вульвовагинита и оценка возможности его использованиядля разработки новой лекарственной формы.
Из клинического материала больных с признаками острой и хронической
кандидозной инфекции вульвы и влагалища и условно-здоровых лиц без признаков микологического заболевания, полученном в медицинских учреждениях
Алматы и Алматинской области, выделены 56 изолятов грибов рода Candida.
На их основе создана коллекция клинических возбудителей кандидоза для использования в качестве тест-организмов при разработке новой лекарственной
формы медицинского препарата с использованием в качестве лекарственной

116Раздел 1субстанции антибиотика розеофунгина. В коллекцию включены 15 штаммов
грибов рода Candida, отнесенных в результате идентификации к 5 видам:9 штаммов Candida albicans, 2 штамма Candida krusei, 2 штамма Candida
tropicalis, 1 штамм Candida glabrata, 1 штамм Candida parapsilosis. Идентификацию полученных культур дрожжеподобных грибов проводили на основе изучения морфологических признаков клеток и внешнего вида выросших колоний,а также с использованием автоматического бактериологического анализатора“MINI API” фирмы “BIO MERIEUX”.
Полиеновый антибиотик розеофунгин (регистрационный номер РКЛС-5№023224) является новой лекарственной субстанцией, разработанной учеными Казахстана, на основе которой создана лекарственная форма
противогрибкового препарата «Розеофунгин-АС, мазь 2 %» для наружного применения (регистрационный номер РК-ЛС-5№023225). Антибиотик
розеофунгин проявил высокую антифунгальную активность в отношении
клинических возбудителей вагинального кандидоза, минимальная подавляющая концентрация изменялась в пределах 1,66–2,5 мкг/мл. Наиболее
высокой активностью антибиотик розеофунгин обладал в отношении клинических штаммов вида Candida albicans, МПК — 1,66–2,0 мкг/мл. Активность в отношении штаммов Candida non-albicans была ниже: МПК для
Candida tropicalis составила 2,0 мкг/мл, для Candida krusei, Candida glabrataи Candida parapsilosis — 2,5 мкг/мл.
Наличие высокой активности у антибиотика розеофунгина в отношении
клинических возбудителей кандидоза свидетельствует о возможности разработки на его основе новых лекарственных препаратов для лечения кандидозного вульвовагинита, способных улучшить состояние больных в Казахстане и за его пределами.

Биотехнология

117ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИИЗ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК АОРТЫ ЧЕЛОВЕКАДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВ И МОДЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ *CHARACTERIZATION OF THE 3D HUMAN AORTIC SMOOTH MUSCLETISSUE CONSTRUCT FOR DRUG TESTINGAND DISEASE MODELS
А. А. Сульгин 1, В. Ю. Сидоров 2ФГБОУ ВО «Сибирский государственный
медицинский университет», Томск, Россия
2
Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, Vanderbilt
University, Nashville, TN, USA
1

A. A. Sulgin 1, V. Y. Sidorov 2
Siberian State Medical University, Tomsk, Russia
Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, Vanderbilt
University, Nashville, TN, USA
12АннотацияВ Университете Вандербильта была создана платформа «I-Wire», которая позволяет выращивать фибриллоподобную конструкцию «organ-on-a-chip» диаметром
350–450 мкм c возможностью использования различных типов клеток. Она не требует васкуляризации и достаточна по размеру для проведения количественных измерений как электрофизиологических реакций, так и пассивных и активных эластических свойств волокон при действии механических, электрических и фармакологических стимулах. В данной работе мы оптимизировали разработанную систему длякультивирования гладкомышечной ткани сосудов и оценили механо-эластические
свойства тканеинженерных конструкций.
Abstract
Scientists at Vanderbilt University have created a novel I-Wire platform that allows
growing a small-diameter, cylindrical organ-on-a-chip tissue fiber construct using different types of cells. This construct does not require vascularization and is large enough tosimplify quantitative measurements of both electrophysiological responses and the passive
and active elastic properties of the fibers under different stimulus, mechanical loading, anddrug and toxin protocols. We have optimized the developed system to culture the artificial© А. А. Сульгин, В. Ю. Сидоров, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке Zimin Foundation «SMTB Alumni
Summer Research Program Grant».

118Раздел 1smooth muscle tissue and characterized mechano-elastic properties of the smooth muscle
tissue constructs.

Введение
Недавние достижения в области тканевой инженерии дают большие
возможности для воспроизведения физиологии различных типов клеток
in vitro. Это также имеет большой потенциал для исследований в области
биомедицины, включая клинические исследования лекарств и изучение сердечно-сосудистых заболеваний [1, 4, 10]. В настоящее время в большинстве
экспериментальных подходов в тканевой инженерии используются традиционные двухмерные модели тканей, которые обеспечивают высокий контроль над типом клеток и позволяют контролировать плотность и состав
среды, но представляют собой нефизиологическую механическую среду.
Это сказывается на невозможности поддержания фенотипа первичных клеток [3] или созревания клеток, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) [2, 5, 9]. В отличие от двумерных тканевых монослоев, спроектированная трехмерная ткань лучше воспроизводит
физиологическую и механическую in vivo среду и, следовательно, более
точно воспроизводит свойства настоящей ткани.
Материалы и методы
Тканеинженерные конструкции из гладкомышечных клеток (VSMTCs)были выращены из коммерческих гладкомышечных клеток (Primary humancoronary artery smooth muscle cells, HCASMC, ThermoFisher, #C0175C) с использованием матрицы на основе фибрина при конечной плотности 106 клеток/мл. После конденсации и формирования вытянутых мышечных волокон(в среднем через 13–15 дней) были измерены пассивные механо-эластические свойства конструкций с использованием оптической установки на основе микроскопа.
Для вычисления модуля упругости и растяжимости VSMTCs был использован гибкий зонд из полиэфирэфиркетона с наружным диаметром 365 мкм,диаметром отверстия 120 мкм (Putnam Plastics, Dayville, CT, USA) и длиной
42 мм. Гибкий зонд были смонтированы при помощи фрикционного крепления к конденсору инвертированного светового микроскопа (Eclipse Ti,
Nikon, Melville, NY, USA), оснащенного цифровой камерой (Zyla sCMOS
Camera, Andor Technology, Belfast, Northern Ireland). Микроскоп оснащен
микроконтроллером (MS-2000 Flat-Top XYZ Automated Stage, ASI, Eugene,
OR, USA), который позволяет точно перемещать предметный стол по двумизмерениям. Характеристики зонда были откалиброваны и имели линейную
зависимость веса относительно перемещения манипулятора.

БиотехнологияНа рис. 1 изображена схема изменения геометрии VSMTC в ходе эксперимента проводимого для определения его эластичности. Черной точкой показан конец гибкого зонда, серой линией показана ткань VSMTC.
Черные стрелки направление сдвига
подвижной части конструкции отпервого (I) до второго (II) положенияна расстояние ds. Когда подвижная
часть приходит в движение, гибкий
зонд изгибается, положение наконечника смещается, и сила Ft прикладывается к VSMTC. Эта сила уравновешивается двумя другими силами (Fc),которые коллинеарны верхней и нижней части VSMTC. Горизонтальные
проекции двух сил Fc представляют
собой два параллельных вектора, которые обозначены двумя короткими
красными стрелками.
Вычисление модуля упругости
производили по следующей формуле:

E=

119

Рис. 1. Схематическое представление
направления действия сил.
Взято с разрешения из [8]( d s − dt )2 + a 2,
πD 2 ∆L ( d s − dt )2 Lo Ftгде a — константа, составляющая половину длины VSMTC, ds и dt —значения, получаемые при измерениях, Lo — длина VSMTC, D — диаметр VSMTC, Ft — боковая растягивающая сила, ∆L — изменение длиныVSMTC.
Для оценки пассивных механоэластических свойств VSMTCs былиподвергнуты воздействию блеббистатина и цитохалазина D. Блеббистатин является обратимым ингибитором АТФ-азной активности миозина II[6], в то время как цитохалазин D блокирует полимеризацию актина, темсамым нарушает организацию сети филаментов [7]. Для оценки способности VSMTCs отвечать на адренергическую и холинэргическую стимуляцию были использованы среды, содержащие 1 мкМоль изопреналина
и 5 мкМоль ацетилхолина.

120Раздел 1РезультатыВ ходе работы были выполнены контрольные измерения механо-эластических свойств VSMTCs через три и шесть дней после начала эксперимента (рис. 2, A, B). Для анализа различий механоэластических свойств былапостроена диаграмма деформирования (рис. 2, A), а затем линейная часть
графика была использована для вычисления модуля упругости (рис. 2, B).
Существенное удлинение VSMTCs наблюдается при приложении боковой растягивающей силы больше 0.1 мН. Все три измерения показали равномерное увеличение длины VSMTCs с увеличением боковой растягивающей силы. Была вычислена сила растяжения вдоль волокна в зависимостиот величины поперечно приложенной силы, а также рассчитано теоретическое растяжение при бесконечной упругости.
Модуль упругости не имел статистически значимых различий с течением времени (F(2,10) = 0.225, p = 0.8, n = 6). Значение модуля упругости
составило 7.4 ± 1.5 кПа в начале эксперимента, 7.9 ± 1.4 кПа после 3 днейи 7.8 ± 1.9 кПа после 6 дней, соответственно.
В ходе второго эксперимента была приложена постоянная сила Ft =0.0712 мН и в течение 15 минут были произведены контрольные измерения, после чего были последовательно внесены 30 мкМоль блеббистатина
и 50 мкМоль цитохалазина D через 15 и 50 минут после начала эксперимента (рис. 2, F). Были выполнены измерения растяжения VSMTC в контролеи после инкубации в течение 2 часов с веществами (рис. 2, E).
Инкубация с блеббистатином увеличило растяжение VSMTC с 1.2 % до
1.45 %, а последующая обработка цитохалазином D до 1.8 %, что соотносится с разницей на кривой растяжения (рис. 2, E) — увеличение растяжимости
на 0.8 % относительно контроля при Ft = 0.0712 мН.
Применение изопреналина вызывало статистически значимое уменьшение растяжимости при Ft > 0.05 мН (p < 0.05, n = 6) и статистически значимое
увеличение модуля упругости (p < 0.05, n = 6), который характеризует внутреннюю жесткость конструкции, с 7.9 ± 1,5 кПа до 10.2 ± 2,1 кПа. В то жевремя не было выявлено статистически значимых различий при применении
ацетилхолина по сравнению с контрольными измерениями (рис. 2, C, D).
Таким образом, в ходе работы были получены и охарактеризованы тканеинженерные конструкции из гладкомышечных клеток. Были рассчитаны
растяжимость и модуль упругости искусственных конструкций в контролеи при фармакологических воздействиях. В дальнейшем такая физиологичная «organ-on-a-chip» модель должна обеспечить проверку возможных механизмов развития заболеваний, таких как атеросклероз и аневризма аорты,а также может быть использована для высокопроизводительного скрининга
потенциальных терапевтических средств.

Биотехнология

121

Рис. 2. Пассивные механоэластические свойства тканеинженерных конструкцийв контроле и при фармакологических воздействиях. Данные представленыв виде x̅ ± SEM, n = 6, * p < 0.05

122Раздел 1Литература
1. Figallo E. [и др.]. Micro-bioreactor array for controlling cellular microenvironments // Lab on a Chip. 2007.
2. Fijnvandraat A. C. [и др.]. Cardiomyocytes derived from embryonic stem
cells resemble cardiomyocytes of the embryonic heart tube // Cardiovascular Research. 2003.
3. Griffith L. G., Swartz M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2006.
4. Grosberg A. [и др.]. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: Heart on a chip // Lab on a Chip. 2011.
5. Hwang H. S. [и др.]. Comparable calcium handling of human iPSC-derived
cardiomyocytes generated by multiple laboratories // Journal of Molecular andCellular Cardiology. 2015.
6. Kovács M. [и др.]. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II //Journal of Biological Chemistry. 2004. № 34 (279). C. 35557–35563.
7. Schliwa M. Action of Cytochalasin D on Cytoskeletal Networks High-voltage Electron Microscopy Cytochalasin D Applied to Intact Cells // Journal of Cell
Biology1. 1982. № 1 (92). C. 79–91.
8. Sidorov V. Y. [и др.]. I-Wire Heart-on-a-Chip I: Three-dimensional cardiac
tissue constructs for physiology and pharmacology // Acta Biomaterialia. 2017.
9. Synnergren J. [и др.]. Global transcriptional profiling reveals similarities
and differences between human stem cell-derived cardiomyocyte clusters andheart tissue. // Physiological genomics. 2012.
10. Truskey G. A. Advancing cardiovascular tissue engineering // F1000Research. 2016.

Биотехнология

123ПОВЫШЕНИЕ КОРРОЗИОННОЙ СТОЙКОСТИ СТАЛИ 12Х18Н10Т,ПОЛУЧЕННОЙ МЕТОДОМ ВНЕВАКУУМНОЙ
ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВОЙ НАПЛАВКИ
THE INCREASE IN THE CORROSION RESISTANCE OF 12Х18Н10Т
STEEL, OBTAINED BY THE METHOD OF ELECTRONVACUUM ELECTRONIC RADIATION
Е. И. Ткаченко *Новосибирский государственный технический университет,г. Новосибирск, Россия
E. I.  Tkachenko
Novosibirsk State Technical Univercity, Novosibirsk, Russia
E-mail: liza1605.98@gmail.com
АннотацияВ работе сравнивалась коррозионная стойкость нержавеющей стали после электронно-лучевой наплавки со стойкостью технической стали. Обнаружено, что скорость коррозии двух материалов практически одинакова, а её значения находятсяв пределах от 0,227 до 0,296 мм/год. Однако материал, полученный методом электронно-лучевой наплавки, обладает повышенным сопротивлением питтинговой коррозии.
Abstract
The corrosion resistance of stainless steel was compared to electron-beam surfacingwith the resistance of technical steel. It was found that the rate of corrosion of two materials is almost the same, and itranges from 0.227 to 0.296 mm per year. But the material
obtained by electron-beam surfacing has an increased resistance to pitting corrosion.

На сегодняшний день применение биоматериалов стало жизненно необходимым вследствие их особенного влияния на качество и продолжительность жизни человека. Для изготовления обширного перечня медицинских
инструментов и оборудования незаменимым материалом является сталь:благодаря своим механическим свойствам она выдерживает удары, не царапается, не вступает в химические реакции с тканями организма и межтканевыми жидкостями. Твёрдость и прочность позволяет инструменту долгоне тупиться, не гнуться и не ломаться. Благодаря высокой плотности —* © Е. И. Ткаченко, 2018.

124Раздел 1

7,8 г/см³, — в структуре стали отсутствуют микропоры, которые могут являться причиной скопления пыли, грязи, а также болезнетворных организмов [1]. Устойчивость стали к высоким и низким температурам позволяет
различными способами стерилизовать изделия.
Остатки химических реагентов на инструменте часто служат причиной образования точечной коррозии. Медицинские инструменты должны не просто
выполнять свою прямую функцию: разделять, отделять или удерживать ткани
организма, но также и не наносить дополнительных травм и повреждений.
Материалы из нержавеющей стали устойчивы к широкому диапазону
коррозионных агентов из-за высокого содержания хрома [2]: на поверхности материала образуется инертная плёнка, которая защищает изделие отнеблагоприятных воздействий. Титан, входящий в состав данной стали,уменьшает склонность к межкристаллитной коррозии.
Любые хирургические, стоматологические инструменты, оборудование,посуду, изготовленные из хромоникелевой стали, можно подвергать воздействию кислотно-щелочных сред. Однако материал не используют для внедрения в человеческий организм в качестве имплантатов, поскольку такие ионы,как Ni2+ и Cr3+, входящие в состав стали, вызывают аллергические и токсические реакции в организме.
Целью работы являлось исследование коррозионной стойкости материала, полученного методом вневакуумной электронно-лучевой наплавки, схожего по химическому составу с нержавеющей сталью 12Х18Н10Т.
Для исследования использовался материал, наплавленный методом вневакуумной электронно-лучевой наплавки с применением порошков чистых
элементов (EBC321). В качестве образца сравнения использовалась заводская нержавеющая сталь марки 12Х18Н10Т (TECH321).
Коррозионная стойкость оценивалась с использованием потенциостата-гальваностата «Elins P30-S». Испытания проводились в потенциодинамическом режиме со скоростью развёртки 2 мВ/с. В качестве биологической среды был выбран раствор Рингера-Локка [3].
Было обнаружено, что образец EBC321 более стоек к окислению, посравнению с TECH321. Согласно результатам проведённых расчётов (см. таблицу), скорости окисления (CR) TECH321 и EBC321 практически не различаются и находятся в пределах 0,227–0,296 мм/год. Однако, как следует изрисунка, потенциалы пробоя пассивирующей плёнки (Ebreakdown), характеризующие сопротивление материала питтинговой коррозии, заметно различаются. В случае TECH321 процесс питтингообразования происходит плавно,а в случае EBC321 — скачкообразно. Вероятно, данное явление связано неравномерностью химического состава материала, полученного в результате
электронно-лучевой наплавки.

125Биотехнология

Таким образом, получение никельхромовой стали методом электронно-лучевой наплавки предотвращает материал от коррозионных трещин,развивающихся благодаря зародышам питтингов. Вследствие этого при дезинфекции и стерилизации инструменты из данного материала не потеряют
своих свойств и не придут в негодность.

Потенциодинамические кривые нержавеющей стали 12X18Н10Т,полученные в растворе Рингера-Локка

Поляризационное сопротивление, плотность тока коррозии,а также скорость коррозии исследуемых в работе материаловTECH321

EBC321

Rp, мВ·см /µA

714,810697,270

jcorr, µA/см2

0,021–0,026

0,020–0,025

CR, мм/год

0,240–0,296

0,227–0,286

2Литература
1. Новиков В. Т. Оборудование и основы проектирования систем охраны
окружающей среды: Учебн. пос. // Том. политехн. ун-т. Томск, 2006. С. 7–10.
2. Комарова Е. Г. Закономерности формирования структуры и свойств
микродуговых покрытий на основе замещённых гидроксиапатитов на сплавах титана и ниобия // Томск, 2017. С. 26.
3. Tas A. C. The use of physiological solutions or media in calcium phosphatesynthesis and processing //Acta biomaterialia. — 2014. — Т. 10. — №. 5. —
С. 1771–1792.

Раздел 1

126ПРИМЕНЕНИЕ КАСКАДНОЙ ФИЛЬТРАЦИИВ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ,ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
ВАКЦИННОГО ШТАММА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА *APPLICATION OF CASCADE FILTRATION IN PREPARATION
OF THE NUTRIENT MEDIUM USED IN SUBMERGED CULTIVATIONOF TULAREMIA MICROBE VACCINE STRAIN
К. И. Холматов, М. В. Антонычева, О. А. Волох, Н. И. Вахрушина,А. Д. Белоусов, С. В. Астафьева, Н. Г. Авдеева
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт
«МИКРОБ», г. Саратов, Россия
K. I. Kholmatov, M. V. Antonycheva, O. A. Volokh, N. I. Vakhrushina,
A. D. Belousov, S. V. Astaf’eva, N. G. Avdeeva
FGHI Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”,
Saratov, Russian Federation
E-mail: rusrapi@microbe.ruАннотацияВ работе представлены результаты внедрения в технологию приготовления питательной среды, для ее очистки, метода каскадной фильтрации, который не оказывает
негативного влияния на качество и эффективность глубинного культивирования производственного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ.
Abstract
The paper presents the results of cascade filtration introduction into the technologyof nutrient medium preparation used for its purification, which does not have a negative
impact on the quality and effectiveness of submerged cultivation of the production strain,
Francisella tularensis 15 NIIEG.

© К. И. Холматов, М. В. Антонычева, О. А. Волох, Н. И. Вахрушина, А. Д. Белоусов, С. В. Астафьева, Н. Г. Авдеева, 2018.
*Работа выполнена по теме НИР 70-2-17 «Разработка и совершенствование биотехнологий промышленного выпуска иммунобиологических средств профилактикии диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы»(2017–2019 гг.).

Биотехнология

127

Штаммом-продуцентом живой туляремийной вакцины является штамм
Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Для накопления биомассы туляремийного
микроба в РосНИПЧИ «Микроб» используют жидкую питательную среду на основе концентрированного панкреатического гидролизата фибрина
(Пат. 2518282 РФ. МПК С12N1/20).
Питательную среду готовят в реакторе: под вакуумом закачивают водуочищенную методом дистилляции, с расчётом на её выкипание, добавляют
сухой ферментативный гидролизат фибрина в количестве, обеспечивающем
содержание в среде не менее 0,32 % аминного азота. Вносят глюкозу до концентрации 1 %. Всё перемешивают и устанавливают в среде pH (7,2±0,2)
при помощи 20 % раствора натрия гидроокиси. Традиционно бульон фильтруют при температуре (75±5) °C через фильтр Сальникова под давлением
(2,5±0,5) МПа. Жидкую среду из ферментативного гидролизата фибрина
стерилизуют водяным насыщенным паром при (110+2) °C в течение 30 минпри давлении (0,05+0,02) Мпа. Перед внесением инокулята посевной культуры в стерильную среду добавляют стерильный раствор пантотената кальция в концентрации 0,005 % (0,05 г/л).
Нами усовершенствована технология приготовления питательной среды. Для очистки среды от крупных не гидролизованных комплекс-протеидов крови лошади (гемоглобин, гликопротеиды, липопротеиды, иммуноглобулины и т. п.) внедрен метод каскадной фильтрации через последовательно
соединенные патронный глубинный фильтр ЭПВг.П и патронный мембранный фильтр ЭПМ. К. Фильтроэлемент ЭПМ.К в соответствии с «Правилами
организации производства и контроля качества лекарственных средств»,утв. приказом Министерства промышленности и торговли РФ от 14 июня2013 г. N 916, проверяют на целостность методом «точка пузырька» на приборе Palltronic Flowstar IV.
Влияние метода каскадной фильтрации оценено по физико-химическим показателям качества питательной среды в соответствии с МУК
4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
Физико-химические показатели качества питательной среды до и после применения внедренной технологии представлены в таблице.
Накопление биомассы F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ осуществляли методом глубинного культивирования в биореакторе с автоматическим поддержанием параметров культивирования: аэрация 0,5–0,7 л воздуха на 1 л питательной среды, скорость перемешивания 500 об/мин в течение (20±2) ч при температуре 37 °С.

Раздел 1

128Физико-химические показатели качества
питательной среды (ПС)№Показатель

1 рН среды
Прозрачность среды (пооптической плотности,2длина волны,КФК-2 λ=540; 10 мм)
3 Общий N, %4 Аминный N, %5 Глюкоза, %7,2

ПС после применения
каскадной фильтрации
(n = 7)*7,2 ± 0,04

0,38

0,25±0,008

0,592
0,32
1

0,592±0,009
0,32±0,004
1ПС до применения
каскадной фильтрации

Примечание. *— статистическая значимость по Стьюденту с 90%-й достоверностью.

В результате глубинного культивирования нативная культура F. tularensisвакцинного штамма 15 НИИЭГ имела следующие характеристики: рН(7,0±0,1), концентрация микробных клеток (36,6±0,83) млрд.м.к./мл среды(по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85-П (10 МЕ)ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд.м.кл./мл).
Туляремийный микроб имел морфологические (форма и размер клеток)и культуральные (форма колонии) свойства, характерные для возбудителя туляремии: мелкие кокковидные палочки, неподвижные, грамотрицательные. Титр агглютинации туляремийной сывороткой составил 1:3200.
Туляремийный микроб обладал следующими характеристиками: коэффициент жизнеспособности 62±0,5 %, низкая степень диссоциации (97±1) % SR(белых) иммуногенных колоний от общего количества выросших.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии негативного влияния внедренного метода фильтрации жидкой среды на её качество и нарезультат глубинного культивирования производственного штамма туляремийного микроба, что подтверждает эффективность метода.

129Биотехнология

СТРАТЕГИЯ УСИЛЕНИЯ БИОСИНТЕЗА
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ЭКДИСТЕРОИДОВВ КУЛЬТУРЕ HAIRY ROOTS ВИДОВ РОДА SILENE L. *ENHANCED PRODUCTION OF PHARMACEUTICALLY IMPORTANT
ECDYSTEROIDS FROM HAIRY ROOT CULTURES OF SPESIESOF THE GENUS SILENE L.
А. А. Эрст 1, Л. Н. Зибарева 2, Е. С. Филоненко 2ФГБУН Центральный сибирский ботанический садСибирского отделения Российской академии наук2Национальный исследовательский Томский государственный
университет1

A. A. Erst 1, L. N. Zibareva 2, E. S. Filonenko 2
1

CSBG SB RAS, Russia
2
NR TSU, Russia
E-mail: annaerst@yandex.ruАннотацияВ данном исследовании разработана эффективная стратегия получения быстрорастущих линий hairy roots для получения биологически активных экдистероидов.
Представители рода Silene являются важными источниками фитоэкдистероидовс огромной перспективой медицинского применения. Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации нами получена культура hairy roots экдистероидсодержащих видов Silene linicola, S. frivaldszkyana и S. roemeri.. ВЭЖХ анализ исследуемых образцов показал, что в заданных условиях эксперимента синтезируются
интегристерон А, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, полиподин В и редкий экдистероид — туркестерон. Показано, что внесение
элиситоров и предшественников биосинтеза экдистероидов, таких как метилжасмонат в концентрации 100 мкМ и ацетат натрия — 1,8 мМ, стимулируют биосинтез
© А. А. Эрст, Л. Н. Зибарева, Е. С. Филоненко, 2018.
*Исследование выполнено в рамках государственного задания Центрального сибирского ботанического сада СО РАН № 0312-2016-0001 по проекту «Оценка морфогенетического потенциала популяций растений Северной Азии экспериментальными
методами»; а также в рамках гранта РФФИ р_а проект № 16-44-7000634 «Исследование лекарственных растений Томской области, адаптивных возможностей интродуцентов с целью создания сырьевой базы видов, перспективных для лечения социально-значимых заболеваний».

Раздел 1

130экдистероидов и могут быть рекомендованы в качестве регуляторов биосинтеза этойгруппы веществ в культурах hairy roots.
Abstract
These studies report the development of an efficient technique for cultivation of
fast-growing hairy root culture systems for production of bioactive ecdysteroids. Representatives of the genus Silene is an important source of pharmaceutically important ecdysteriods with immense health care applications. By the method of Agrobacterium-mediatedtransformation, we have obtained hairy root culture of the ecdysteroid-containing speciesof Silene linicola, S. frivaldszkyana and S. roemeri.. HPLC analysis of the samples understudy showed that integristerone A, 2-deoxy-20-hydroxyecdysone, 20-hydroxyecdysone,
2-deoxy ecdysone, polypodin B and rare ecdysteroid, turkesterone were synthesized under the specified experimental conditions. Methyl jasmonate 100 μM and sodium acetate
1,8 mM was found to have a stimulating effect on ecdysteroid biosynthesis in this culture
and can be recommended as a promising stimulator of biosynthesis of this group of secondary metabolites in hairy roots.

Экдистероиды представляют самый распространенный и многочисленный класс cтероидных соединений в биосфере; они участвуют в жизнедеятельности практически всех классов организмов, выполняя множественные
функции. Выделены и установлены структуры более 400 экдистероидов,в том числе и из растений семейства Caryophyllaceae Juss, которые занесены в единую базу данных http://ecdybase.org/. Одним из наиболее богатыхпо количеству экдистероидсодержащих видов является род Silene L. [1, 2].
Состав и содержание экдистероидов представителей этого рода является
видоспецифичными и в значительной степени зависят от места произрастания, стадии развития и условий выращивания [3, 4]. По этой причине использование культуры клеток и органов является важным альтернативным
источником получения суммы и отдельных экдистероидов, позволяющим
избежать проблем связанных с непостоянным уровнем биосинтеза вторичных метаболитов, а также представляет собой модельную систему для изучения регуляции их биосинтеза.
Цель данной работы — получить быстрорастущие культуры hairy rootsвидов рода Silene и оценить влияние элиситоров и предшественников биосинтеза на содержание экдистероидов в данных культурах.
В результате данной работы получены культуры hairy roots экдистероидсодержащих видов Silene frivaldszkyana, S. linicola, S. roemeri. Показано, чтов процессе культивирования в выбранных условиях происходит активный
синтез как полярных, так и неполярных экдистероидов. В экстрактах hairyroots идентифицированы характерные экдистероиды для видов рода Silene:интегристерон А, 20-гидроксиэкдизон (20Е), 2-дезокси-20-гидроксиэкди-Биотехнология

131

зон, 2-дезоксиэкдизон, полиподин В и редкий экдистероид — туркестерон.
Отобраны линии hairy roots характеризующиеся высокими темпами роста
(индекс роста=25) и повышенным содержанием 20Е (0,18 %) и/или более
разнообразным составом экдистероидов (21 компонент) по сравнениюс растениями-донорами.
Нами показано, что внесение элиситоров и предшественников биосинтеза
экдистероидов, таких как метилжасмонат в концентрации 100 мкМ и ацетат
натрия — 150 мг/л, стимулируют биосинтез экдистероидов (качественныйи количественный состав) и могут быть рекомендованы в качестве регуляторов биосинтеза экдистероидов в культурах hairy roots представителей
р. Silene. Уровень биосинтеза экдистероидов линий hairy roots одно и того жевида S. linicola, полученные при трансформации различными штаммами агробактерий различается в 9 раз. В процессе работы отобрана линия hairy rootsс наибольшим уровнем биосинтеза 20Е — S. linicola K-1601, превышающим
уровень данного экдистероида в корнях растения-донора в 1,8 раза.
Таким образом, отбирая линии hairy roots и используя различные элиситоры либо предшественники биосинтеза терпеноидов можно варьировать
набор экдистероидов в культурах hairy roots представителей р. Silene и целенаправленно осуществлять их биосинтез. Проведенные нами исследования
являются основой создания новых производственных биотехнологий получения уникальных биологически активных веществ — фитоэкдистероидови лекарственных препаратов на их основе.
Литература
1. Zibareva L., Volodin V., Saatov Z., Savchenko T., Whiting P., Lafont R., Dinan L.
Distribution of phytoecdysteroids in the Caryophyllaceae // Phytochemistry. 2004. Vol. 64.
P. 499–517.
2. Зибарева Л. Н., Волкова О. В., Морозов С. В., Черняк Е. И. Фитоэкдистероиды корней Silene frivaldszkyana Hampe // Химия растительного сырья. 2017. № 1.
С. 71–75.
3. Зибарева Л. Н., Еремина В. И. Динамика содержания экдистероидов в видах
Silene // Раст. ресурсы. 1996. Т. 32, вып. 1–2. С. 106–110.
4. Зибарева Л. Н., Еремина В. И., Иванова Н. А. Новые экдистероидоносные
виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона // Раст. ресурсы. 1997.
Т. 33, вып. 3. С. 73–76.

Раздел 1132

ПРОДУКТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕС ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ БИОИНЖЕНЕРИИPRODUCTS PRODUCEDBY THE METHODS OF BIOENGINEERING
Д. Е. Юрк, В. Н. Михеев, С. П. Романенко, М. А. Лобкис *ФБУН «Новосибирский научно-исследовательский
институт гигиены» Роспотребнадзора
D. E. Yurk, V. N. Mikheev, S. P. Romanenko, M. A. Lobkis
FBUN «Novosibirsk research Institute of hygiene» of RospotrebnadzorАннотацияВ докладе основное внимание уделяется вопросу использования методов биоинженерии в производстве продуктов питания. Приводятся взгляды сторонников и противников генной инженерии и информация о возможных рисках использования методов биоинженерии.
Abstract
The report focuses on the issue of the use of bioengineering techniques in food production. Views of supporters and opponents of genetic engineering and information on
possible risks of using bioengineering methods is provided is given.

Биотехнология представляет собой новейшую отрасль науки и производства. Она основана на использовании объектов и биопроцессов длясоздания высокопродуктивных сортов растений, пород животных и дажештаммов микроорганизмов. Рассматриваемая отрасль науки реализует напрактике фундаментальные биологические знания для производства ферментов, белков, витаминов, лекарственных препаратов и ряда биологически
активных веществ. Биотехнологические методы позволяют конструировать
принципиально новые организмы, ранее не существовавшие в природе, получать целевые продукты для медицины и народного хозяйства с помощью
микроорганизмов, вирусов, внеклеточных веществ и компонентов клетки.
Биотехнология имеет глубокое прошлое, но лишь за последние несколько
десятилетий получила признание и независимость, выделившись в отдельную отрасль науки и производства [1,3].
* © Д. Е. Юрк, В. Н. Михеев, С. П. Романенко, М. А. Лобкис, 2018.

Биотехнология

133Множество исследований в области биохимии, микробиологии, генетики
организмов, включая знаменательное открытие Джеймса Уотсона и Френсиса Кирка о химической структуре и пространственной организации двойной
спирали молекулы ДНК в 1953 г., оказали огромный вклад в развитие биотехнологии, но новое ее направление — генетическая инженерия — появилось лишь к 1972 г., когда в лаборатории Поля Берга впервые была синтезирована рекомбинантная молекула ДНК. Клеточная же инженерия, возниклаеще в 50-х годах прошлого столетия, благодаря исследованиям П. Ф. Уайта(США) и Р. Готре (Франция). Методы её направлены на конструирование
клеток нового типа, которые могут быть использованы для создания жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток или для объединения различных видов клеток, с образованием новой, несущей генетический материал исходных клеток.
Генетическая и клеточная инженерия на данный момент являются основными направлениями современной биотехнологии в нашей стране и зарубежом. Методы генной инженерии направлены на конструирование новых, ранее не существовавших в природе генов и благодаря этому получать
продукты, организмы с требуемыми качествами. Наработки в этой области
используются для создания и использования генетически модифицированных растений, животных и микроорганизмов для интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.
На сегодня наиболее актуальными направлениями в рассматриваемой
области являются биотехнология пищевых продуктов, препаратов для сельского хозяйства, препаратов и продуктов для промышленного и бытового
использования, лекарственных препаратов, средств диагностики и реактивов. Первые генетически модифицированные продукты были запущеныв производство в конце 80-х годов бывшей военной компанией Монсанто
(Америка).
Несмотря на то, что открытие генетически модифицированных организмов (ГМО) является прорывом для человечества, проблема опасности
продуктов, созданных с применением этих методов, не перестает тревожитьумы людей. Нет однозначного ответа на вопрос безопасности ГМО и влияния их на организм человека ввиду малой изученности данной проблемыи новизны технологии. Противники генной инженерии приводят данные
исследований, подтверждающих негативное влияние ГМО на организм человека. В случае прямого воздействия трансгенных белков наблюдаются
подавление иммунитета, аллергии и расстройства метаболизма. Также наблюдается аккумуляция гербицидов в организме человека, нарушение усвояемости важных веществ и микроэлементов, а также появление толерантности болезнетворной микрофлоры организма человека к антибиотикам,134Раздел 1снижение поступления в организм важных элементов. Ряд исследователей
говорят об отдаленных канцерогенном и мутагенном эффектах.
Исследования И. В. Ермаковой, сотрудника Института высшей нервной
деятельности и нейрофизиологии РАН заключались в экспериментах на трехгруппах лабораторных крыс: контрольной, в корм которой ничего не добавлялось, группой; к корму которой добавлялась мука из ГМ-сои, произведенная компанией Монсанто; к корму которой добавлялась мука из традиционной сои. Соевая мука во всех случаях смешивалась с водой. В первой серии
экспериментов самки кормились, начиная за две недели до зачатия, и вплотьдо выкармливания крысят. Выжившие крысята не умирали и продолжали
питаться ГМ-кормом вместе c самками. Благодаря защите эмбриона материнским организмом критический негативный эффект не наблюдался, но
40 % крысят значительно уступают по размеру и весу контрольной группе.
В другой серии экспериментов самцы крыс кормились семенами ГМсои, устойчивой к Раундапу (Аргентина) и традиционной сои (Волгоград).
При извлечении семенников на срезе морфологически было обнаружено нарушение кровооттока и патологический митоз клеток. После одного месяца
эксперимента у группы, употреблявшей ГМ-корм, были обнаружены диффузные дистрофические изменения, перицеллюлярный отек, резкое набухание гепатоцитов и их вакуолизация [4].
Д. Е. Шуберт изучал влияние корма с добавлением плазмид с геном флуоресцентного зеленого белка на беременных мышей. Спустя 3–8 часов после кормления проводилась локализация местоположения гена. Было обнаружено, что ген флуоресцентного зеленого белка встраивается также в клетки разных органов плода, таких как мозг, кожа, печень, селезенка, почки,и сохраняется у новорожденных мышей.
Исследования долгосрочного влияния питания ГМО проводились Сералини Г. Е. в 2012 г. на крысах. По результатам работы было обнаружено,что группа крыс, питавшаяся ГМ-кукурузой, более подвержена развитию
онкологических заболеваний, нежели контрольная [5].
Сторонники генной инженерии отрицают негативное влияние ГМО наорганизм человека, в том числе многочисленные аналогичные эксперименты на лабораторных крысах, хронически употреблявших трансгенную сою,устойчивую к глифосфату, опровергают результаты противников генетически модифицированных продуктов [6–7].
Существует три категории рисков, связанных с применением генной инженерии к продуктам питания — медицинские, социально-экономическиеи экологические. Медицинские риски обусловлены повышенной аллергеноопасностью, токсичностию и опасностью ГМО для здоровья. Социальныеи экономические угрозы попадают под определение «продовольственной

Биотехнология

135безопасности», то есть способности людей обеспечить свои продовольственные потребности в здоровых, разнообразных и доступных по ценепродуктах питания. Также большой проблемой является бесплодность растений, идущих на продажу, так как это закрывает возможность последующего сбора семян [2].
Несмотря на неоспоримые плюсы генной инженерии, результаты отдельных исследований, систематически появляющиеся в научных статьяхи средствах массовой информации, вызывают серьезные опасения и настороженность при использовании ГМ-продуктов. Для решения проблемыГМО требуется систематизация наработок ученых разных стран и проведение целого ряда исследований, в том числе для оценки отдаленных последствий использования генетически модифицированных продуктов. В частности, необходимо более подробно изучить и усовершенствовать способы
встраивания генов для обеспечения безопасности человека и окружающей
среды.
Литература
1. Антипова Л. В. Прикладная биотехнология: учеб. пособие / Л. В. Антипова. — СПб.: ГИОРД, 2003. — C. 288 с.
2. Чилимбаева Г. А., Маркабаева А. Генная инженерия — веление времени // Молодой ученый. — 2014. — №8.1. — С. 31–33.
3. Касымбаева Т., Мухамбетжанов К. Общая биология / Мектеп, 2010.
4. Ermakova I. Influence of genetically modified soya on the birth-weight andsurvival of rat pups/ I. Ermakova // Proceedings «Epigenetics, Transgenic Plants
and Risk Assessment». — 2006. — С. 41–48.
5. Séralini G. E. Food Chem. Toxicol. Food Chem. Toxicol. / E. Clair, R.
Mesnage, S. Gress, N. Defarge, M. Malatesta, D. Hennequin, J.S de Vendômois //«Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant geneticallymodified maize». — 2012.
6. Key S. Genetically modified plants and human health / S. Key J. K. Ma,
P. M. Drake // J R Soc Med., 2008. — Т. 101, № 6. — С. 290–298.
7. Brake D. G. «A generational study of glyphosate-tolerant soybeans onmouse fetal, postnatal, pubertal and adult testicular development» / Brake D. G.,
Evenson D. P. — South Dakota State University, 2004.

136cРАЗДЕЛ 2ВИРУСОЛОГИЯ
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ЛИТИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА
PM135, ПОРАЖАЮЩЕГО PROTEUS MIRABILIS *MASS-SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF STRUCTURALPROTEINS OF PROTEUS MIRABILISLYTIC BACTERIOPHAGE PM135
И. К. Байков 1, Е. А. Зеленцова 2, В. В. Морозова 1, Т. А. Ушакова 1,
О. В. Боковая 1, М. В. Фофанов 1, Н. В. Тикунова 1
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук,Новосибирск, Россия
2Институт «Международный томографический центр»Сибирского отделения Российской академии наук,Новосибирск, Россия
I. K. Baykov 1, E. A. Zelentsova 2, V. V. Morozova 1, T. A. Ushakova 1,
O. V. Bokovaya 1, M. V. Fofanov 1, N. V. Tikunova 1
Institute of Сhemical Biology аnd Fundamental Medicine
SB RAS, Novosibirsk, Russia
2International Tomography Center SB RAS, Novosibirsk, Russia
1© И. К. Байков, Е. А. Зеленцова, В. В. Морозова, Т. А. Ушакова, О. В. Боковая,М. В. Фофанов, Н. В. Тикунова, 2018.
*Работа была выполнена при поддержке Фонда РФФИ, проект № 18-34-00636.
Образец бактериофага был наработан из коллекции, финансируемой по проекту ГЗ№ 0309-2016-0002.

Вирусология

137

АннотацияВ исследовании идентифицирован ряд структурных белков литического бактериофага PM135, поражающего бактерии Proteus mirabilis. Этот бактериофаг относится к семейству Siphoviridae и имеет низкий процент сходства генома с геномами
известных бактериофагов. Методом масс-спектрометрии были идентифицированы
зрелый капсидный белок, белок хвостовых нитей, белок концов хвостовых нитей,портальный белок, а также короткий белок, не имеющий сходства с известными белками и содержащий необычный мотив, состоящий из остатков пролина и глутаминовой кислоты.
Abstract
A number of structural proteins of the lytic bacteriophage PM135, which affects theProteus mirabilis bacterium, are identified in this study. This bacteriophage belongs to theSiphoviridae family and has a low percentage of genome similarity with the genomes ofknown bacteriophages. The mature capsid protein, the tail fiber protein, straight tail fibers
protein, portal protein, pore-forming tail tip protein were identified by mass spectrometry
as well as a short protein that does not have significant similarity with the known proteins
and which contains an unusual motif consisting of proline and glutamic acid residues.

Введение
Лечение инфекционных заболеваний с помощью бактериофагов в настоящее время быстро набирает популярность, что связано с повышением
доли патогенных микроорганизмов, обладающих широкой лекарственной
устойчивостью. Сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН ранее обнаружен и депонирован в «Коллекцию экстремофильных микроорганизмов и типовых культур ИХБФМ СОРАН» литический бактериофаг PM135, способных подавлять рост бактерий P. mirabilis (данные готовятся к публикации). В результате морфологического анализа и секвенирования генома этого бактериофага (GenBank:
MG030347.1) было установлено, что он относится к семейству Siphoviridae,
род T5virus, однако имеет значительное число открытых рамок трансляции(ОРТ), не имеющих гомологии с известными последовательностями. Вместе с тем, геномы бактериофагов, предполагаемых для терапевтического
использования, необходимо аннотировать достоверно и полностью. В этомслучае можно исключить наличие генов, кодирующих токсины, интегразы,способствующие интеграции фага в геном клетки-хозяина, и тем самым
гарантировать биобезопасность бактериофага при его терапевтическом использовании. В связи с этим в данной работе был масс-спектрометрически
проанализирован ряд структурных белков бактериофага PM135, а сопоставление с информацией, полученной на основе генома этого бактериофага,позволило установить функции большинства этих белков.

имеет значительное число открытых рамок трансляции (ОРТ), не имеющих
гомологии с известными последовательностями. Вместе с тем, геномы
бактериофагов,предполагаемых
длятерапевтического
использования,необходимо аннотировать достоверно и полностью. В этом случае можно
исключить
токсины,интегразы, способствующие
Раздел
2
138 наличие генов, кодирующих
интеграции фага в геном клетки-хозяина, и тем самым гарантировать
биобезопасность
бактериофагапри его терапевтическом использовании. В связи сРезультатыи обсуждение
этим в данной
работе
масс-спектрометрически
проанализированНа первом
этапебыл
работыбыл наработан препарат
бактериофага рядструктурных
белков
бактериофага
PM135,
асопоставлениес информацией,PM135 с использованием штамма P. mirabilis «КМТК 73». Дляудаления
полученной
наоснове
генома
этогобактериофага,позволило
установить
функции
клеточных белков бактериофаг был очищен с методом центрифугирования
большинства
этихбелков.
в градиенте хлористого цезия, после чего препарат был диализован против

фосфатно-солевого буферного раствора. Титр очищенного бактериофага соРезультаты и обсуждение
ставил около 2.5•1011 б.о.е/мл.
На первом
этапеработы
наработан
препарат
бактериофага
PM135 сПрепарат бактериофагабыл
PM135
был разделёнв результате
денатурируюиспользованием
штамма
P.
mirabilis
«КМТК
73».
Для
удаления
клеточных
белков
щего гель-электрофореза и окрашен серебром либо красителем “Coomassieбактериофаг
былметодом
центрифугированияв градиенте
хлористого
brilliantblueочищен
G-250” с(рис.
1). Было
обнаружено, что часть
белков образует
ковалентные
комплексы,которых отдельные
белка соединены
цезия, после
чего препарат
былвдиализован
против молекулы
фосфатно-солевого
буферного
дисульфидными
связями.
Обработкасоставил
образца около
бактериофага
б.о.е/мл.
раствора.
Титр очищенного
бактериофага
2.5•1011дитиотреитолом приводилак исчезновению
соответствующих
такимкомплексам
Препарат
бактериофага
PM135 полос,был разделёнв результате
денатурирующего
(рис. 1А, дорожка
2).
гель-электрофорезаи окрашен
серебром либо красителем “Coomassie brilliant blueБелковые
полосыс геля, окрашенного
красителем
выG-250” (рис.
1). Было
обнаружено,что часть
белковCoomassie,образует быликовалентные
резаны,после чегоотдельныебыл произведён
триптический
гидролиз белковв геле.
комплексы,в которых
молекулы
белка соединены
дисульфидными
образцы
были исследованы
MALDI
масс-спектрометриейв посвязями.Полученные
Обработка
образца
бактериофага
дитиотреитолом
приводила
кисчезновению полос, соответствующих таким комплексам (рис. 1А, дорожка 2).
А)
1
2
Б)
М
М
200 кДа
150 кДа
120 кДа
100 кДа
85 кДа
70 кДа
60 кДа
50 кДа

200 кДа
150 кДа
120 кДа
100 кДа
85 кДа
70 кДа
60 кДа
50 кДа

40 кДа

40 кДа

30 кДа

30 кДа

25 кДа

25 кДа
15 кДа
10 кДа

С9
С8
С7
С6
С5
С4
С3
С2
С1

1. Электрофореграмма препарата
бактериофага
PM135 в PM135
10 % дена- в 10%
Рис. 1. Рис.
Электрофореграмма
препарата
бактериофага
турирующем полиакриламидном геле. А) 10 мкл препарата на дорожку,денатурирующем
полиакриламидном геле. А) 10 мкл препарата на дорожку,окраска серебром, Б) 50 мкл препарата на дорожку, окраска “Coomassieокраска серебром,Б)blue50G-250”.
мкл препарата
намолекулярных
дорожку, окраска
“Coomassie
brilliantМ — маркер
масс (Thermo
scientific brilliant
blue G-250”. М#26614)– маркер молекулярных масс (Thermo scientific #26614).

Белковые полосы с геля, окрашенного красителем Coomassie, быливырезаны, после чего был произведён триптический гидролиз белков в геле.

Вирусология

139ложительном режиме. В результате все проанализированные образцы кроме
образца С8 были идентифицированы как белки бактериофага PM135 (см. таблицу).
Идентифицированные структурные белки
бактериофага PM135
Образец
С1
C1Комментарий
Hypotethical protein ATW69889.1
Putative L-shaped tail fiber assembly protein

С2

Hypotethical protein ATW69889.1 в комплексе с другим белком

С3

Capsid protein

С4Ig-like domain protein

С5Portal protein

С6Straight tail fibers protein

С7

Tail fiber

С9Pore-forming tail tip proteinСтоит отметить, что ОРТ, кодирующая капсидный белок, соответствует
белку с молекулярной массой около 50 кДа. В то же время, подвижность белкапри гель-электрофорезе, а также идентифицированные продукты триптического гидролиза свидетельствуют о том, что в вирионе этот белок присутствует в зрелом виде, не имеющем N-концевой части и характеризующимся молекулярной массой около 37 кДа. Процессинг капсидного белка описан ранеедля родственного бактериофага T5, поражающего E. coli (A. Huet et al., 2010).
Помимо белков с явной функциональной ролью, в образцах C1 и C2 былиобнаружены пептиды, соответствующие небольшой ОРТ ATW69889.1,
не имеющей значительного сходства с каким-либо из известных белков
(рис. 2). Представляет интерес мотив, состоящий из чередующихся остатков пролина и глутаминовой кислоты. Учитывая высокую представленность
данного белка в образце бактериофага PM135, а также небольшой размер
самого белка, мы предполагаем, что этот белок является декорирующим
белком, аналогом белка pb10 бактериофага T5. По-видимому, множество копий этого белка встраивается в капсид бактериофага PM135 при его созревании и выполняет маскирующую роль. Если это предположение верно, тов случае возникновения иммунного ответа у пациента при необходимости
продолжительного лечения бактериофагом PM135, незначительное изменение аминокислотной последовательности этого декорирующего белка позволит избежать нежелательных реакций организма.

предполагаем, что этот белок является декорирующим белком, аналогом белка
pb10 бактериофага T5. По-видимому, множество копий этого белка встраиваетсяв капсид бактериофага PM135 при его созревании и выполняет маскирующую
роль. Если это предположение верно, то в случае возникновения иммунного
ответа у пациента при необходимости продолжительного лечения бактериофагом
2
140
PM135, незначительное изменение Раздел
аминокислотной
последовательности этого
декорирующего белка позволит избежать нежелательных реакций организма.
MYKEIDKELISKLKEVFPAGLPDSSSLFFATEANPIKSYQELRRALGVTTAVGNRKCYKALMALLDVEDPVEPEPEPEPEPEPEPEPEPVKVTLKIIGNDTVVEGEEYSFDVRADGGAANNTVVKVNGVVNNKYKVVAELPTITIEATASNADKVTKVVTVTAKPQPEETРис. Последовательность
2. Последовательность
аминокислотных
остатков
Рис.2.
аминокислотных
остатков
белка белка
ATW69889.1
ATW69889.1
бактериофага
P. mirabilis.
Выделен участок
бактериофага
PM135
P. mirabilis.PM135
Выделен
участок чередующихся
остатков
остатков пролина и глутаминовой кислоты
пролина чередующихсяи глутаминовой кислоты.
Таким образом,образом,масс-спектрометрически
масс-спектрометрически былбыл идентифицирован
идентифицирован ряд
ряд
Таким
структурных
белков
бактериофага
PM135,
былоустановлено,
что
белок
структурных белков бактериофага PM135, было установлено, что белок
ATW69889.1 является высококопийным структурным белком и, по-видимому,ATW69889.1
является высококопийным структурным белком и, по-видимовыполняет роль декорирующего белка.

му, выполняет роль декорирующего белка.

Литература

Литература
1. Huet A, Conway JF, Letellier L, Boulanger P. In vitro assembly of the T=13

1. HuetA, Conway
JF, Letellier L,T5
Boulanger
In vitro assembly
T=132010
procapsid
procapsidof bacteriophagewith its P.
scaffolding
domain.of Jthe
Virol.
Sep;of bacteriophage
T5 with its scaffolding domain. J Virol. 2010 Sep; 84(18):9350–9358.
84(18):9350-9358.

Вирусология

141АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА
CH14D5 С ТРЕТЬИМ ДОМЕНОМ ГЛИКОПРОТЕИНА ЕРАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ ВИРУСА
КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА *ANALYSIS OF INTERACTIONS BETWEEN CHIMERIC ANTIBODY
CH14D5 AND D3 DOMAIN OF E GLYCOPROTEIN DERIVED FROMVARIOUS SUBTYPES OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS
И. К. Байков, А. Л. Матвеев, С. Е. Ткачёв,Л. А. Емельянова, Г. Б. Каверина, Н. В. Тикунова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук,Новосибирск, Россия
I. K. Baykov, A. L. Matveev, S. E. Tkachev,
L. A. Emelianova, G. B. Kaverina, N. V. Tikunova
Institute of Сhemical Biology аnd Fundamental Medicine SB RAS,
Novosibirsk, RussiaАннотация
Химерное антитело ch14D5 ранее успешно прошло доклинические испытанияи в настоящий момент рассматривается в качестве основы для создания лекарственного средства для профилактики и терапии клещевого энцфалита. В данной работе
были сконструированы домены D3 гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита
сибирского, европейского и дальневосточного подтипов. Методами вестерн-блотанализа и поверхностного плазмонного резонанса было показано, что химерное
антитело ch14D5 обладает наибольшим сродством к домену D3 вируса клещевого
энцефалита линии Софьин-Ru, принадлежащей к дальневосточному подтипу, в товремя как сродство к белкам, полученным на основе вирусов сибирского и европейского подтипов заметно снижено.
© И. К. Байков, А. Л. Матвеев, С. Е. Ткачёв, Л. А. Емельянова, Г. Б. Каверина,Н. В. Тикунова, 2018.
*Работа была выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках гранта Президента РФ, проект
№ МК-6575.2018.4. Химерное антитело ch14D5 было наработано и очищено приподдержке проекта РНФ 16-14-00083. Домен D3 вируса клещевого энцефалита
штамма Sofjin-RU был получен при поддержке проекта РНФ 17-74-10146. ВируснаяРНК и кДНК были получены в рамках проекта РФФИ № 18-44-540021.

Раздел 2

142
Abstract

Previously, the chimeric antibody ch14D5 successfully passed preclinical trials. Now
it is considered as the basis for the development of a therapeutic drug for prevention andtherapy of tick-borne encephalitis. In this paper, D3 domains of glycoprotein E of thetick-borne encephalitis virus of the Siberian, European and Far Eastern subtypes wereconstructed. It was shown by Western blot analysis and surface plasmon resonance thatchimeric antibody ch14D5 has the greatest affinity for the D3 domain of the Sofin-Ru
strain of the tick-borne encephalitis virus. At the same time, the affinity of the antibody
for D3 proteins obtained on the basis of viruses of the Siberian and European subtypes ismarkedly reduced.

Введение
Химерное антитело ch14D5 ранее успешно прошло доклинические испытания и в настоящий момент рассматривается в качестве основы длясоздания лекарственного средства для профилактики и терапии клещевого
энцфалита. Такой препарат будет существенно превосходить сывороточный
иммуноглобулин против вируса клещевого энцефалита по ряду параметров,главным образом по специфической активности и биобезопасности. Ранее
было показано, что химерное антитело ch14D5 обладает высокими протективными свойствами in vivo в отношении европейского подтипа вируса клещевого энцефалита, штамм «Абсеттаров» (Baykov I et al., 2014). Кроме того,в настоящее время идут эксперименты по изучению протективной активности in vivo с использованием вируса клещевого энцефалита сибирскогои дальневосточного подтипов. Вместе с тем, детальный механизм противовирусного действия антитела ch14D5 не исследован, равно как и эпитоп,с которым связывается антитело на поверхности вириона.
Недавно было установлено, что эпитоп расположен в домене D3 гликопротеина Е (Байков И. К. и др., 2018). Последовательность этого домена консервативна для различных штаммов вируса клещевого энцефалита,однако в некоторых позициях редко встречаются аминокислотные замены.
Поскольку точные аминокислотные остатки, входящие в узнаваемый антителом ch14D5 эпитоп, неизвестны, то не удаётся предсказать, будет ли этоантитело эффективным в отношении всех подтипов вируса клещевого энцефалита. Чтобы оценить, будет ли антитело ch14D5 обладать протективной активностью по отношению к вирусам дальневосточного и сибирского
подтипов, в данном исследовании были получены рекомбинантные домены D3 вирусов клещевого энцефалита, относящихся ко всем трем наиболее
распространённым подтипам, и было исследовано взаимодействие антитела
ch14D5 с этими белками методами поверхностного плазмонного резонансаи вестерн-блоттинга.

было исследовано взаимодействие антитела ch14D5 с этими белками методами
поверхностного плазмонного резонанса и вестерн-блоттинга.
Результаты и обсуждение
Вирусология

143

На основе
вируснойРНК штаммов «Заусаев» и «Абсеттаров», относящихся
Результатыи обсуждение
соответственно сибирскому и европейскому подтипам вируса клещевогоНа основе вирусной РНК штаммов «Заусаев» и «Абсеттаров», относяэнцефалита,были получены фрагменты ДНК, кодирующие домен D3щихся соответственно сибирскому и европейскому подтипам вируса клегликопротеинаЕ этих вирусов.
Фрагменты
были ДНК,встроеныв плазмидную
ДНКщевого энцефалита,были получены
фрагменты
кодирующие
домен
pHEN2-rED3_301,использованную
нами
ранее
для
получения
фрагмента
D3
D3 гликопротеина Е этих вирусов. Фрагменты были встроены в плазмидную
штаммаДНКSofjin-Ruисодержащую
лидерный
пептид
пектат-лиазы
B,
pHEN2-rED3_301, использованную нами ранее для получения фрагнаправляющий
синтез
белкавпериплазматическое
пространство
E.
coli(Байков
мента D3 штамма Sofjin-Ru и содержащую лидерный пептид пектат-лиазы
И.К. и B,др,2018). После
индукции
синтеза белка изпространство
клеток быливыделены
направляющий
синтез
белка в периплазматическое
E. coli(Байков
И. К. и др, 2018). После
индукции
синтеза белкаиз клеток
вы- D3_Euфракции
периплазматических
белков,содержащих
целевые
белкибыли
D3_Sof,делены
периплазматических белков, содержащих целевые белки
и D3_Zau(рис.фракции
1).
D3_Sof, D3_Eu и D3_Zau (рис. 1).

М

D3_Sof D3_Eu D3_Zau

K−50 кДа

15 кДа

рекомбинантные
домены D3

10 кДа
Рис. 1. Электрофореграмма в 15 % полиакриламидном геле периплазмати-Рис. 1. Электрофореграмма
в 15% полиакриламидном геле периплазматических
ческих фракций клеток, содержащих плазмиду pHEN2-rED3_301фракций клеток,содержащих
плазмиду
pHEN2-rED3_301(дорожка
(дорожка 2), pHEN2-D3_Eu(дорожка
3) и pHEN2-D3_Zau (дорожка
4). 2), pHEN2D3_Eu (дорожка
3) и pHEN2-D3_Zau(дорожка
4). «К−»периплазма
«К−» периплазма
клеток, не содержащих
плазмиднойДНК.
М — маркерклеток, немолекулярных масс (Thermo scientific #26614)

Далее методом вестерн-блот анализа было исследовано взаимодействие химерного антитела ch14D5 с полученными рекомбинантными
белками. Количество материала для переноса белков было выбрано так,чтобы на нитроцеллюлозной мембране оказалось равное количество целевых белков. В результате было показано, что химерное антитело проявляет
наибольшее сродство к варианту D3_Sof. Вариант D3_Zau окрашивался соДалее методом вестерн-блот анализа было исследовано взаимодейств
химерного антитела ch14D5 с полученными рекомбинантными белкам
Количество материала для переноса белков было выбрано так, чтобы
нитроцеллюлозной мембране оказалось равное количество целевых белков.
2
144
результате было показано, Разделчто химерное
антитело проявляет наибольш
сродство к варианту D3_Sof. Вариант D3_Zau окрашивался со значитель
значительно меньшей интенсивностью, а вариант D3_Eu окрасился наибоменьшей интенсивностью, а вариант D3_Eu окрасился наиболее бледно (рис. 2)
лее бледно (рис. 2).

М

15 кДа

рекомбинантные
домены D3

10 кДа

Рис. 2. Вестерн-блот анализ белков D3_Sof (полоска 2), D3_Eu (полоска 3) и D3_
Zau (полоска 4) антителом ch14D5. М — маркер молекулярных масс (ThermoРис.
2. Вестерн-блотанализ
белков
D3_Sof(полоскаSigma2), D3_Eu
scientific#26619). Белковые
комплексы
проявлены
конъюгатом
#A1543 (полоска 3)

D3_Zau (полоска 4) антителом ch14D5. М – маркер молекулярных масс (Therscientific #26619). Белковые комплексы проявлены конъюгатом Sigma #A1543.

Наконец, методом поверхностного плазмонного резонанса было определено сродство
химерного
ch14D5a к плазмонного
полученным рекомбинантным
Наконец,методомантитела
поверхностного
резонанса было определе
белкам.
Значения
равновесных
констант
диссоциации
составили
1.7±0.3 нМсродство химерного антитела ch14D5a к полученным
рекомбинантным
белк
для
белка
D3_Sof,260±30
нМ
для
белка
D3_Eu
и
25±4
нМ
для
белка
D3_Zau,Значения равновесных констант диссоциации составили 1.7±0.3
нМ для белчтохорошо
согласуетсяс качественными
полученными
D3_Sof,260±30нМ для
белка D3_Eu данными,и 25±4 нМдля белка методом
D3_Zau, что хоровестерн-блот анализа.
согласуется с качественными данными, полученными методом вестерн-блТаким образом, показано, что сродство химерного антитела ch14D5 к доанализа.
мену D3 гликопротеина Е различных подтипов вируса клещевого энцефаТаким образом, показано, что сродство химерного антитела ch14D5лита существенно различается. Наименьшее сродство антитело проявляет
домену
D3 гликопротеина Е различных подтипов вируса клещевого энцефалик белку, полученному на основе штамма «Абсеттаров», и в то же время
существенно
различается.
сродство
антитело проявляетк белизвестно, что антитело
ch14D5Наименьшее
обладает высокими
протективными
свойполученному
наоснове
штамма
«Абсеттаров»,
и
в
то
же
время
известно,чствами по отношению к штамму «Абсеттаров». Поэтому есть все основаантитело
ch14D5обладает
высокими
протективными
свойствами
поотношениюния полагать, что протективная активность этого антитела по отношению
Поэтому есть всеоснования
полагать,что протективн
кштамму
штаммам«Абсеттаров».
сибирского и дальневосточного
подтипов
будет также
высокой.

активность этого антитела по отношению кЛитература
дальневосточного
подтипов будет также высокой.

штаммам

сибирского

1. Baykov I. K., Matveev A. L., Stronin O. V., Ryzhikov A. B., Matveev L. E.,
Kasakin M. F., Richter V. A., Tikunova N. V. A
protective chimeric antibody to tick-borneЛитература
encephalitis virus. Vaccine. 2014 Jun 17;32(29):3589–3594.

1. Baykov I.K., Matveev A.L., Stronin O.V., Ryzhikov A.B., Matveev L.
Kasakin M.F., Richter V.A., Tikunova N.V. A protective chimeric antibody
tick-borne encephalitis virus. Vaccine. 2014 Jun 17;32(29):3589-3594.
2. И.К. Байков, Л.А. Емельянова, Л.М. Соколова, Е.М. Карелина, АВирусология

145

2. И. К. Байков, Л. А. Емельянова, Л. М. Соколова, Е. М. Карелина, А. Л. Матвеев, И. В. Бабкин, Я. А. Хлусевич, В. Ф. Подгорный, Н. В. Тикунова. Анализ доменной специфичности протективного химерного антитела ch14D5a против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита Вавиловский журнал генетики и селекции.
2018 ; 22(4), С. 857–864.

Раздел 2146ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА А И В СРЕДИ
НАСЕЛЕНИЯ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЕ СЕЗОНЫ 2017–2018 ГГ.
НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН *CIRCULATION OF INFLUENZA A AND B VIRUSES AMONG
THE POPULATION IN THE TERRITORY OF THE REPUBLICOF KAZAKHSTAN DURING THE 2017–2018 EPIDEMIC SEASONS
А. М. Баймухаметова 1, С. Б. Байсейіт 1, Н. С. Онгарбаева 1, 2,
М. Г. Шаменова 1, Т. И. Глебова 1ТОО «Научно-производственный центр микробиологиии вирусологии», Алматы, Республика Казахстан
2Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби
1

A. M. Baimukhametova 1, S. B. Baiseiit 1, N. S. Ongarbayeva 1, 2,
M. G. Shamenova 1, T. I. Glebova 11

LLP Sсientific Production Center for Microbiology and Virology,
Almaty, Republic of Kazakhstan
2
al-Farabi Kazakh National University
E-mail: biochem_vir@mail.ruАннотация
Результаты первичного скрининга носоглоточных смывов, собранных от людей в лечебных учреждениях различных регионов Казахстана, в РТ-ПЦР показали, что на территории Республики среди населения циркулируют вирусы гриппа
А (H1N1 и H3N2) и типа В.
Abstract
The results from the primary RT-PCR-based screening of nasopharyngeal swabs
collected from humans in healthcare facilities located in various regions of Kazakhstan
showed that influenza A (H1N1 and H3N2) and type B viruses circulate among the population in the territory of the Republic.
© А. М. Баймухаметова, С. Б. Байсейіт, Н. С. Онгарбаева, М. Г. Шаменова,Т. И. Глебова, 2018.
*Исследования выполнены в рамках грантового проекта Комитета Науки Министерства Образования и Науки Республики Казахстан «Молекулярно-биологическая характеристика и антигенные свойства эпидемически значимых штаммов вирусов гриппа, циркулирующих в Республике Казахстан».

Вирусология

147

Вирусы гриппа острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) вызывают массовые вспышки заболеваний, принимающие почти ежегодно
характер эпидемий. Грипп и ОРВИ остаются практически неконтролируемыми заболеваниями из-за высокой изменчивости антигенной структуры
циркулирующих вирусов гриппа и гетерогенности возбудителей ОРВИ.
Кроме того, вирусы гриппа и других ОРВИ способны изменять свои свойства и патогенность.
Для изучения циркуляции вирусов гриппа в лечебных учреждениях различных регионов Казахстана от людей с первичным диагнозом ОРВИ и ОРЗсобрано 205 носоглоточных смывов. В Атырауской области собрано 27 образцов, в Павлодарской — 52, в Карагандинской — 10, в Алматинской —116 биопроб. Первичный скрининг образцов в РТ-ПЦР с использованием
реагентов «АмплиСенс» (г. Москва, РФ) показал, что генетический материал вируса гриппа обнаружен в 28 смывах (13,66 % от общего числа исследованных проб). РНК вируса гриппа А — в 17 образцах (8,29 %), РНК вируса
гриппа В — в 11 пробах (5,37 %). Субтипирование образцов, положительных на грипп типа А, выявило РНК вируса гриппа А/H1N1 в девяти пробах
(4,39 %), РНК вируса А/H3N2 — в восьми образцах (3,90 %).
Таким образом, результаты первичного скрининга носоглоточных смывов в РТ-ПЦР показали, что на территории Республики среди населения
циркулируют вирусы гриппа А (H1N1 и H3N2) и типа В.

Раздел 2148АНАЛИЗ ЭПИДСИТУАЦИИ ПО ГРИППУ В 2017–2018 ГГ.
В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН *ANALYSIS OF THE EPIDEMIOLOGICAL SITUATIONFOR INFLUENZA IN THE REPUBLICOF KAZAKHSTAN IN 2017–2018
С. Б. Байсейiт, М. Қ. Қалқожаева, Г. В. Лукманова, Н. Г. КливлееваТОО «Научно-производственный центр микробиологиии вирусологии», Алматы, Республика Казахстан
S. B. Baiseiit, M. K. Kalkozhayeva, G. V. Lukmanova, N. G. Klivleyeva
LLP Scientific Production Center for Microbiology and Virology, Almaty,
Republic of Kazakhstan
E-mail: biochem_vir@mail.ruАннотацияИз клинических образцов, собранных в эпидемический период 2017–2018 гг.
в различных регионах Казахстана, выделены восемь гемагглютинирующих агентов:три — из карагандинских проб и пять — из алматинских. Идентификация восьми
полученных инфекционных агентов, проведенная в РТГА и РИНА, показала принадлежность четырех изолятов к вирусам гриппа А/Н1N1, одного — к вирусам c антигенной формулой А/Н3N2 и трех штаммов — к вирусам гриппа типа B.
Abstract
Eight hemagglutinating agents were isolated from clinical samples collected during
the 2017–2018 epidemic period in different regions of Kazakhstan: three from Karaganda
samples and five from Almaty samples. Identification of eight resulting infectious agents,
performed in the HAI assay and EIA, showed the belonging of four isolates to influenza
A/H1N1 viruses, one to viruses with the antigenic formula A/H3N2, and three strains to
influenza type B viruses.

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) и грипп являются
одной из ведущих нозологических форм инфекционных заболеваний человека, причиняющих значительный вред здоровью населения. По соци© С. Б. Байсейiт, М. Қ. Қалқожаева, Г. В. Лукманова, Н. Г. Кливлеева, 2018.
*Исследования выполнены в рамках грантового проекта Комитета Науки Министерства Образования и Науки Республики Казахстан «Генетические детерминанты
устойчивости казахстанских вирусов гриппа к химиопрепаратам».

Вирусология

149

альной значимости грипп находится на первом месте среди заболеваний.
Ежегодно во всем мире вирусы гриппа вызывают эпидемические подъемы
заболеваемости.
В результате заражения куриных эмбрионов 205 пробами, собраннымиот людей в различных регионах Казахстана, были выделены восемь гемагглютинирующих агентов: три — из карагандинских проб и пять — из алматинских.
Определение подтипа гемагглютинина в РТГА с использованием диагностических сывороток производства ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития (Россия, Санкт-Петербург) показало, что гемагглютинирующая активность четырех изолятов Алматы/04/18, Алматы/05/18, Караганда/14/18 и Караганда/15/18 подавлялась иммунными сыворотками к вирусам А/H1N1 и А/
H1N1pdm (от 1/4 до гомологичного титра), трех вирусов Алматы/06/18, Алматы/07/18 и Алматы/08/18 — сывороткой к вирусу гриппа типа B (от 1/2 догомологичного титра). Штамм А/Караганда/16/18 ингибировался сывороткой к вирусу А/H3N2 в 1/2 гомологичного титра.
Идентификация подтипа нейраминидазы, проведенная в РИНА, показала, что ферментативная активность изолятов с гемагглютинином А/H1 подавлялась поликлональной диагностической сывороткой к вирусу А/Н1N1,
с гемагглютинином А/H3 — сывороткой к вирусу А/H3N2 в титре 1:100.
Таким образом, идентификация в РТГА и РИНА, показала принадлежность двух алматинских изолятов (04/18 и 05/18) и двух карагандинских
(14/18 и 15/18) к вирусам гриппа А/Н1N1, карагандинского (16/18) — к вирусам гриппа А/Н3N2 и трех алматинских (06/18, 07/18 и 08/18) — к вирусам гриппа типа B.
Полученные данные указывают на социркуляцию в эпидемический сезон 2017–2018 гг. среди населения Алматинской и Карагандинской областях
вирусов гриппа А/Н1N1, А/Н3N2 и B.

Раздел 2150ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА
ОСПОВАКЦИНЫ IN VITRO И IN VIVOSTUDY OF THE PROPERTIES OF THE ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS
IN VITRO AND IN VIVO
Т. В. Бауэр, Т. В. Трегубчак, А. З. Максютов,И. В. Колосова, Е. В. Гаврилова, Р. А. Максютов *ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
«Вектор» Роспотребнадзора
T. V. Bauer, T. V. Tregubchak, A. Z. Maksyutov,
I. V Kolosova, E. V. Gavrilova, R. A. Maksyutov
SRC VB «Vector», Russia
E-mail: bauer_tv@vector.nsc.ruАннотация
Меланома — злокачественная опухоль, образующаяся при перерождении меланоцитов. Сейчас особое внимание уделяют методам биотерапии в борьбе с данным
онкологическим заболеванием.
Целью исследования является получение онколитического вируса осповакциныи изучение его свойств на различных культурах клеток, а также в мышиной модели
ксенографтов.
Abstract
Melanoma is a malignant tumor that occurs when melanocytes degenerate. Now special attention is paid to the methods of biotherapy in the fight against this cancer.
The aim of the study is to obtain the oncolytic vaccinia virus and to study its properties
in various cell cultures, as well as in the xenograft mouse model.

Меланома — злокачественная опухоль, образующаяся при перерождении меланоцитов. Данное онкологическое заболевание редко диагностируют на I-III стадиях развития, и первые клинические признаки, как правило,обнаруживают только на стадии с метастатическим поражением тканей организма [1].
Поскольку препараты химиотерапии являются низкоэффективнымив отношении опухолевых клеток при данном онкологическом заболевании,* © Т. В. Бауэр, Т. В. Трегубчак, А. З. Максютов, И. В. Колосова, Е. В. Гаврилова,Р. А. Максютов, 2018.

Вирусология

151

то при лечении меланомы применяют методы иммунотерапии [2]. Клинические исследования свидетельствуют о корреляции регрессии опухолейи активации опухолеспецифичных CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, которые
обнаруживают в перефирической крови и удаленных метастазах. Активация
цитотоксических Т-лифоцитов (ЦТЛ) происходит за счет гиперэкспрессии
опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) на поверхности злокачественных клеток [3].
На данный момент разрабатывают и исследуют полиэпитопные ДНК-вакцины, но такие препараты показывают низкий иммуногенный эффект из-замалой вероятности попадания ДНК-препарата в клетки. Для решения данной проблемы в качестве способа доставки в организм целевой полиэпитопной конструкции был выбран вирус осповакцины (ВОВ), онколитические
препараты на основе которого проходят клинические испытания.
В районы генов ТК и VGF методом временной доминантной селекции
произведена встройка гена, кодирующего гранулоцит-макрафагальный колониестимулирующий фактор, и искусственно синтезированного гена, кодирующего полиэпитопную конструкцию, направленную на стимуляцию
Т-клеточного ответа против опухолевых клеток, соответственно. После чегополученный рекомбинантный вирус был изучен in vitro, а также в мышиной модели ксенографтов с использованием раковой культуры клеток SKMel-28.
В статьях, посвященных разработке новых противоопухолевых препаратов, все чаще фигурирует понятие «онколитическая иммуннотерапия». Этомногообещающий подход в лечении онкологических заболеваний, и он требует дальнейших исследований.
Литература
1) Jacob Pitcovski, EhudShahar, Elina Aizenshtein, Raphael Gorodetsky. Melanoma
antigens and related immunological markers сritical reviews in oncology // Hematology.
2017. Vol. 115.
2) Boyle AP, Hong EL, Hariharan M, et al. Annotation of functional variationin personal genomes using RegulomeDB // Genome Research. 2012. Vol. 22. No. 9.
P. 1790–1797.
3) Van Der Bruggen P1, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES,
Chapiro J, Van Den Eynde BJ, Brasseur F, Boon T. Tumor-specific shared antigenic
peptides recognized by human T cells. // Immunol. Rev. 2002. No. 188. P. 51–64.

Раздел 2152ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ БАКТЕРИОФАГА KP8,СПЕЦИФИЧНОГО К БАКТЕРИИ KLEBSIELLA PNEUMONIA *GENOME ANALYSIS OF SPECIFIC TO KLEBSIELLA PNEUMONIA
BACTERIOPHAGE KP8
О. В. Боковая 1,2, Ю. Н. Козлова 1, М. Р. Клопотова 1,2, В. В. Морозова 1ФГБУН Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
2ФГАОУ ВО Новосибирский национальный
исследовательский государственный университет
1

O. V. Bokovaya 1,2, Y. N. Kozlova 1, M. R. Klopotova 1,2, V. V. Morozova 1
ICBFM SB RAS, Russia
Novosibirsk State University, Russia
1

2

E-mail: bokovaya.o.v@gmail.com
Аннотация
Klebsiella pneumonia — оппортунистический патоген, вызывающий ряд инфекционных заболеваний, и для которого характерно возникновение множественной
лекарственной устойчивости. Бактериофаг KP8, специфичный к штамму Klebsiellapneumonia КЭМТК356, был выделен и наработан. Геномная ДНК фага была выделена, и было проведено полногеномное секвенирование. Полученная последовательность была аннотирована. Размер генома составил 73679 т.н.п. и содержит 94 предполагаемых ОРТ. G+C состав генома — 44,2 %. Более половины предполагаемыхОРТ имеют неизвестные функции, в то время как 23 ОРТ имеют гомологию с генами
фагов семейства Podoviridae и родов N4virus и G7cvirus. Шесть ОРТ были отнесенык кластеру структурных генов с известной функцией. Литическая кассета состоит изэндолизина, Rz/RzI спанина и предположительно холина. Концевые повторы генома
фага составили 404 п.н. По морфологии вириона фаг также был отнесен к семейству
Podoviridae.
Abstract
Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen that causes a number of infectious
diseases and some strains of which are antibiotic resistant. Bacteriophage KP8 specific to Klebsiella pneumoniae strain CEMTC356 was isolated and propagated. The genomic phage DNA
was isolated. The phage genome was determined and annotated. The genome size is 73679 bp.
© О. В. Боковая, Ю. Н. Козлова, М. Р. Клопотова, В. В. Морозова, 2018.
*Исследование было проведено при поддержке гранта РФФИ № 18-29-08015.

Вирусология

153

The phage genome contains 94 putative ORFs. G+C content of the genome is 44.2 %. Morethan a half of the putative ORFs have unknown functions while 23 ORFs have homology withthe genes of the Podoviridae phages (N4virus and G7 cvirus genera). Six ORFs belonged toa cluster of structural genes with known function. The lytic cassette contains endolysin, Rz/
Rz spanin and putative holin. The phage genome terminal repeats have length 404 bp. Phage
KP8 was assigned to the Podoviridae family by electron microscopy methods.

Klebsiella pneumonia — это грамм-негативный оппортунистический патоген, ассоциированный с инфекционной пневмонией, инфекциями урогенитального тракта и некоторыми другими инфекциями, включая нозокомиальные. Известно, что у некоторых штаммов рода Klebsiella возникает устойчивость к антибиотикам, так, например, в 2017 году стало известно о первом
штамме, который был устойчив ко всем известным 26 антибиотикам. Коктейли бактериофагов против лекарственно-устойчивых штаммов Klebsiellapneumonia могут быть использованы как биологическое лекарство.
Бактериофаг KP8, специфичный к штамму Klebsiella pneumoniaКЭМТК356, был выделен в лаборатории молекулярной микробиологии изобразцов фекалий животных. Фаговые частицы были размножены, после
чего была выделена геномная ДНК бактериофага. Далее была наработана
библиотека нуклеотидных последовательностей, и было проведено полногеномное секвенирование бактериофага KP8.
Геномная последовательность фага KP8 была аннотирована и исследована. Размер генома составил 73679 т.н.п. и содержит 94 предполагаемых
ОРТ. G+C состав генома — 44,2 %. Из 94 ОРТ более половины гипотетические и имеют неизвестные функции, в то время как 23 ОРТ имеют гомологию с генами фагов семейства Podoviridae и родов N4virus и G7cvirus. Былиобнаружены ОРТ с функциями, отвечающими за метаболизм ДНК и РНК(репликация, транскрипция), упаковку ДНК в незрелый капсид и морфогенетические функции. Геном фага KP8 содержит три ОРТ, кодирующие ответственные за экспрессию ранних и поздних генов РНК полимеразы. Запроцесс репликации фага KP8 отвечают ДНК геликаза, ДНК полимераза
I, ДНК праймаза, белок, связывающий одноцепочечную ДНК и rIIA- andrIIB-подобные белки. Большая и малая субъединицы терминазы осуществляют упаковку ДНК в незрелую головку. Кластер структурных белков былобнаружен, но только 6 ОРТ имеют определенную известную функцию. Литическая кассета состоит из эндолизина, Rz/RzI спанина и предположительно холина. Концевые повторы генома фага составили 404 п.н.
Морфология вириона была выявлена с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила, что бактериофаг относитсяк семейству Podoviridae.

Раздел 2154ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСТРАКТА КЛУБНЕЙ ЦИКЛАМЕНА
ЕВРОПЕЙСКОГО В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА ТРИВАЛЕНТНОЙ
ГРИПОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ
ИММУНИЗАЦИИ МОРСКИХ СВИНОКINTRANASAL IMMUNIZATION OF GUINEA PIG USING TRIVALENTINFLUENZA ANTIGEN ADJUVANTEDWITH CYCLAMEN EUROPAEUM TUBERS EXTRACT
А. С. Гудымо, В. А. Евсеенко, Н. П. Колосова, C. В. Мальцев,Ю. А. Буланович, Н. И. Гончарова, Н. В. Данильченко, В. Ю. Марченко,И. М. Суслопаров, А. Б. Рыжиков *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
A. S. Gudymo, V. A. Evseenko, N. P. Kolosova, S. V. Maltsev, J. A. Bulanovich,N. I. Goncharova, N. V. Danilchenko,
V. Yu. Marchenko, I. M. Susloparov, A. B. Ryzhikov
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотация
Экстракт клубней цикламена европейского (CTE) с концентрацией обычно применяемой для лечения риносинуситов у человека был применён как муконазальный
адъювант при экспериментальной интраназальной иммунизации морских свинок
концентрированной коммерчески доступной тривалентной гриппозной вакцинойс последующим инфицированием штаммом A/California/04/2009 H1N1pdm09.
Двойная интраназальная иммунизация вакцинным препаратом, состоящим из
7,5 мкг каждого гемагглютинина и 500 мкг CTE в 50 мкл, индуцировало ответ на
21 сутки после иммунизации, детектируемый в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), средний геометрический титр (GMT (max-min)) составил 40 (5-640)против H1N1pdm; 43 (5-1280) против H3N2; 11 (5-80) против гриппа B. Только поодному животному, иммунизированному внутримышечно и интраназально, былизащищены от заражения. Эти животные имели обратные титры в РТГА на 55 деньпосле иммунизации равные 1/320 против антигена H1N1pdm полученного в развивающимся курином эмбрионе (РКЭ).
Эти данные показывают, что эффективность СТЕ как интраназального адъюванта может быть измерена стандартными методами, применяемыми для государственной сертификации инактивированных гриппозных вакцин.
*© А. С. Гудымо, В. А. Евсеенко, Н. П. Колосова, C. В. Мальцев, Ю. А. Буланович, Н. И. Гончарова, Н. В. Данильченко, В. Ю. Марченко, И. М. Суслопаров,А. Б. Рыжиков, 2018.

Вирусология

155

Abstract
Cyclamen europaeum tubers extract (CTE) with concentration commonly used for human rhinosinusitis treatment was tested as mucosal adjuvant in experimental intranasal
immunization of guinea pigs with concentrated commercially available influenza trivalentvaccine and subsequent infection with influenza strain A/California/04/2009 H1N1pdm.
Dual intranasal immunization with vaccine compound consisting of 7.5 µg of eachhemagglutinin and 500 µg of CTE in 50 µl induced reciprocal GMT (max-min) on day
21 after immunization 40 (5-640) against H1N1pdm; 43 (5-1280) against H3N2; 11 (5-80)
against influenza B. Only one animal immunized intramuscularly and intranasally, were
protected from infection. These animals had inverse titers 55 days after immunization
equal to 1/320 against the H1N1pdm-egg.
These data show that the effectiveness of CTE as an intranasal adjuvant can be measured by standard methods used for national certification of inactivated influenza vaccines.

Введение
Практически вся вакцинация сегодня проводится с использованием вакцин с парентеральным путём введения. Муконазальная вакцинация предполагает несколько преимуществ, в сравнении с парентеральными путями введения, такие как: упрощение применения, возможность самостоятельного
применения, индукция мукозального и системного иммунитета с кросс-протективным эффектом. В тоже время, муконазальные вакцины должны преодолеть несколько значимых барьеров, таких как разведение и распределение, соревнование с мириадами различных живых размножающихся бактерий, вирусов, инертных частиц пыли, ферментативное разложение и низкий
pH до достижения целевых клеток иммунной системы.
Кандидатный адъювант был найден в группе риносинуситных препаратов. Мы выбрали экстракт клубней цикламена европейского (CTE).
Целью данного исследования было идентифицировать потенциальные
свойства СТЕ как адъюванта инактивированной вакцины против гриппа дляинтраназального введения и показать его эффективность на животной модели млекопитающего.
Схема эксперимента и результатыДо начала эксперимента коммерчески доступная инактивированная расщеплённая вакцина от гриппа, содержащая антигены A/
California/07/2009 H1N1pdm-like, A/Switzerland/9715293/2013 H3N2-likeand B/Phuket/3073/2013-like полученные в РКЭ, была сконцентрирована до
300 мкг каждого гемагглютинина/мл. Концентрация CTE равная 10 мг/млбыла выбрана после превичных тестов на BALB/c мышах; эта концентрация
используется для лечения риносинусита у людей.

156

Раздел 2Иммунизация. Модельными животными для проведения эксперимента
являлись морские свинки весом 190±10 грамм. Было выделено 4 группы:Группа 1 (5 животных) для положительного контроля антигена, Группа
2 (10 животных) для интраназальной экспериментальной вакцинации, Группа 3 (5 животных) для интраназальной иммунизации антигена и Группа
4 (5 животных) для интраназального отрицательного контроля (без антигена, только СТЕ). Животным из Группы 4 вводилось по 50 мкл CTE 10 мг/мл на 4 и 1 день перед иммунизацией для подтверждения переносимости
морскими свинками рекомендованной для человека дозы. Группа 1 иммунизировалась в бедренную мышцу 15 мкг каждого антигена в объёме 50 мкл.
Группа 2 интраназально иммунизировалась 50 мкл препарата, состоящего
из 7,5 мкг каждого антигена и 500 мкг CTE, процедура выполнялась 1 млшприцем с распылителем, предназначенным для человека. Животным изГруппы 3 интраназально вводили только антиген (50 мкл, состоящего из
7,5 мкг каждого гемагглютинина). На 14 сутки после первой иммунизации
животные из Группы 2 и 3 были повторно иммунизированы идентичным
препаратом. Забор крови происходил до иммунизации и на 14, 21 и 55 сутки
после иммунизации.
Вирус и инфицирование животных. На 56 день после первой иммунизации животных подвергали инфицированию. Для инфицирования
200 мкл разведённой культуральной жидкости штамма вируса гриппа A/
California/04/2009 H1N1pdm09 с титром 4.3 log10TCID50 вводили интраназально. Назальные смывы отбирались с 3 по 7 сутки после инфицирования.
Титры в РТГА сгруппированы в таблицу 1. Степень сероконверсии
определяли как количество животных с обратным титром превакцинации
≥1:10 и по меньшей мере 4-кратным увеличением послевакцинационного
ответного титра ≥1:40. Степень серопротекции определялась как количество животных, у которых обратные HI-титры составили ≥1:40. Нижний
предел количественного определения для анализа HI составлял 1:10; образцы <1:10 считались серонегативными и получили значение 5 для расчета
среднего геометрического титра (GMT).
Все животные Группы 1, иммунизированные внутримышечно, сформировали сравнительно высокие и протективные титры (>1/40) на 14 сутки
после введения компонентов H1, H3 и В вакцины и оставались постоянными до инфицирования. Все животные Групп 3 и 4 имели титры в РТГА<1/10 в сыворотке собранной в ходе всех заборов на все компоненты вакцины. В отличие от Группы 1, на 14 сутки после иммунизации только 2 из
10 животных экспериментальной Группы 2 имели определяемые в РТГА титры и только на компоненты H3 и В. На 21 сутки после первой иммунизации
у 5 из 10 животных Группы 2, значительно увеличились обратные HI-титры

157

Вирусология

Штамм

d.p.i.

Гуморальный гемагглютинин-ингибирующий ответ.
Данные рассчитаны и представлены как обратные HI-титры
Группа 1(положительный
контроль антигена)GMT(min – max)
A California 07
2009
HINlpdm-egg
A Switzerland
9715293/2013
H3N2-egg
В Phuket 3073
2013
B-Yamagata-egg

GMT
p=0,95 CIГруппа 2(интранзальная
иммунизация
адъювант + антиген)Группа 3(интраназальная
иммунизация антигена)Группа 4(интраназальная
иммунизация
адъюванта)GMT(min – max)

GMT(min – max)GMT
р=0,95 CI

GMT(min –
max)

GMT
р=0,95 CI

5(5–5)

N.C.

5(5–5)

N.C.

N.D.

N.D.

5(5–5)

N.C.

5(5–5)

N.C.

N.D.

5(5–5)

КС.

GMT
р=0,95 CI

14

92 (80–160)

120–70

5

N.C.

21

211 (160–320)

294–151

40 (5–640)

246–6

55

242 (160–320)

338–174

29 (5–320)

122–7

14

139 (40–320)

271–71

6 (5–40)12–4

21

278 (80–640)

615–126

43 (5–1280)

302–6

55

184 (160–320)

241–140

27 (5–320)

89–8

N.D.

14

46 (40–80)

60–35

5(5–10)

6–4

5 (5–5)21

53 (20–80)

91–31

11(5–80)

28–4

55

40 (20–80)

61–26

10 (10–80)

26–4

X.D.

N.C.
X.D.

и достигли протективного уровня. На 55 сутки титры понизились, но для
5 животных они остались >1/40 к антигену A/California/07/09 H1N1pdm09,
наработанному в РКЭ.
ОТ-ПЦР анализ назальных смывов показал, что только по одному животному из Групп 1 и 2 не заразились и имели титр в РТГА равный 1/320 против антигена A/California/07/09 H1N1pdm09, полученного на РКЭ и это обеспечило протективность от заражения. Остальные животные из этих группс более низкими титрами заразились. Все животные из Группы 3 и 4 имели
вирусную РНК в назальных смывах.
Выводы
Двойная интраназальная иммунизация вакцинным препаратом, состоящим из 7,5 мкг каждого гемагглютинина и 500 мкг CTE в 50 мкл, индуцировало ответ на 21 сутки после иммунизации, детектируемый в РТГА, средний геометрический титр (max-min) составил 40 (5–640) против H1N1pdm;
43 (5–1280) против H3N2; 11 (5–80) против гриппа B.
Только одно животное иммунизированное интраназально, было полностью защищено от заражения A/California/04/2009 H1N1pdm09. Это животное имело обратные титры в РТГА равные 1/320 против антигена, полученного в РКЭ перед заражением на 55 день после иммунизации. Эти данные
показывают, что эффективность СТЕ как интраназального адъюванта может

158Раздел 2быть измерена стандартными методами, применяемыми для государственной сертификации инактивированных гриппозных вакцин.
Суммируя полученные данные, мы приходим к выводу, что экстракт
клубней цикламена европейского и его природные или синтетические аналоги могут далее рассматриваться и изучаться как сравнительно безопасный
муконазальный адъювант.

159Вирусология

ИНТЕГРАТИВНАЯ И ЭПИСОМАЛЬНАЯ ФОРМЫ ВИРУСА
ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ГЕНОТИПАВ ИЗМЕНЕННОМ ЦЕРВИКАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ *INTEGRATIVE AND EPISOMAL FORMS 16 GENOTYPESOF HUMAN PAPILLOMAVIRUS FOR CERVICAL INTRAEPITHELIALNEOPLASIA AND CERVICAL CANCER
И. В. Дерюшева 1, М. К. Ибрагимова 1,2, М. М. Цыганов 1,2
НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, РоссияНИ Томский государственный университет, Томск, Россия
1

2

E-mail: imk1805@yandex.ruАннотацияВ исследование включено 148 пациенток с предраковыми патологиями шейки
матки (цервикальная интраэпителиальная неоплазия 1-й степени (LSIL) и цервикальная интраэпителиальная неоплазия II-III степени (HSIL)) и пациентки с диагнозом рак шейки матки I-IV стадии, которые были инфицированы вирусом папилломы человека (ВПЧ), а также женщины с отстутствием патологических измененийв слизистой оболочке шейки матки. Комплексное обследование включало гинекологический осмотр, кольпоскопию, цитологическое и гистологическое исследование,обнаружение и генотипирование вируса папилломы человека высокого риска, исследование вирусной нагрузки и физического статуса ДНК ВПЧ16.
Abstract
The study involved 148 patients with precancer (cervical intraepithelial neoplasia
grade 1 (LSIL) and cervical intraepithelial neoplasia grade II-III (HSIL)) and the stage I-IV
cervical cancer patients which were infected with human papillomavirus (HPV), and women with no pathological changes in cervical mucous. The comprehensive survey included
colposcopy, cytological and histological analysis, detection and genotyping of high-risk
human papillomavirus, viral load and physical status of HPV16 DNA was evaluated incases of mono-infection.

АктуальностьВ инфицированной клетке вирус папилломы человека (ВПЧ) может существовать в эписомальной форме (вне хромосом клетки) — считается доброкачественной, интегрированной (встроенной в геном клетки) — расце© И. В. Дерюшева, М. К. Ибрагимова, М. М. Цыганов, 2018.
*Работа выполнена в рамках программы «УМНИК» фонда содействия развитию
малых форм предприятий в научно-технической сфере (договор № 11852ГУ/2017).

160Раздел 2нивается как злокачественная форма персистирования вируса и смешанной
форме (наличие свободного и встроенного в ДНК клетки-хозяина вируса).
Прогрессия от клеточных изменений, связанных с ВПЧ-инфекцией, до развития рака шейки матки (РШМ) занимает около 10–40 лет, но редко может
развиться и за 1–2 года, что, несомненно, доказывает важность своевременного мониторинга больных папилломавирусной инфекцией и проведения
вирусологических исследований для выявления групп риска развития онкологической патологии.
Целью настоящей работы явилось изучение частоты интегрированных
форм ВПЧ 16 при предопухолевых и злокачественных патологиях шейки
матки.
Материал и методы
Вирусологическое исследование было проведено 148 женщинам Томской
области в возрасте от 20 до 76 лет, проходивших осмотр (условно здоровые
женщины) и/или получавших лечение в Томском НИИ онкологии (с различными патологиями шейки матки). Все пациентки являлись носителями моноинфекции ВПЧ 16 генотипа. Материалом для исследования послужили
соскобы эпителия цервикального канала и шейки матки. В зависимости отдиагноза все пациентки были разделены на группы: 1 группа — условно
здоровые женщины (n=30, средний возраст 30,1±1,6), 2 группа — женщины с LSIL(CINI) и HSIL (CINII-III) эпителия шейки матки (n=53, средний
возраст 38,5±0,8), 3 группа — женщины с РШМ I-IV (n=65, средний возраст
44,3±1,2). Всем пациентам было проведено определение физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа. Выявление и оценка физического статуса генотипаДНК ВПЧ 16 в ДНК клетки-хозяина проводилось с использованием набора
реагентов фирмы «Amplisens®» (Москва, Россия). Значение вирусной нагрузки (ВН) рассчитывалось в геномных эквивалентах ДНК ВПЧ/105 клеток. Согласно инструкции к наборам порог клинически значимой ВН принимался равным 3 lg ДНК ВПЧ /105 клеток в соскобе. Выявление области
Е6 при отсутствии области E1/Е2 интерпретировалось как интеграция вируса в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области E1/Е2 — каксмешанная форма вируса, отсутствие области Е6 при наличии области E1/
Е2 — как эписомальная форма вируса. Для оценки статистической значимости различий в распределении частот качественных признаков между группами использовали критерий Фишера.
Результаты и обсуждениеПри сравнении частоты встречаемости клинически значимой ВН для выбранных ВПЧ16+ пациенток, было показано, что частота встречаемости вы-161Вирусология

сокой вирусной нагрузки у пациенток групп CIN II-III и всех больных РШМстатистически значимо превышает частоту встречаемости высокой вирусной нагрузки для группы здоровых женщин (р от 1,98*10–7 до 0.004). Также
было показано, что частота встречаемости высокой ВН у пациенток групп
РШМ I-II, РШМ III-IV и общей группы с диагнозом РШМ (РШМ I-IV) статистически значимо превышает частоту встречаемости клинически значимой вирусной нагрузки для группы пациенток с CIN I (р от 0.001 до 0.01).
Следующим этапом работы была оценка частоты интеграции ВПЧ
16 генотипа в ДНК на изучаемой выборке. Частота интегрированных формсоставила: в группах с патологией шейки матки (CINI-III и РШМI-IV) былав два раз выше, чем у условно здоровых (см. рисунок). Частота смешанных
форм в группе РШМI-IV была несколько выше, чем у здоровых и пациентокс дисплазией. Частота эписомальных форм ВПЧ снижалась по мере утяжеления диагноза и была равна 0 в группе РШМI-IV. Статистически значимые различия по частоте встречаемости различных форм ВПЧ 16 в группах наблюдения на уровне р<0,002 выявлены для эписомальной формы
ВПЧ 16 типа в группе больных РШМ (по сравнению с группой здоровых
лиц, OR(95CI%) = 1.2 (1.081.48), а также для группы больных РШМ посравнениюс группой больных
дисплазией
эпителия шейки
матки(р=0,02, напоказало,что распределение
частот формвируса статистически
значимо
различается
OR(95CI%)= 1.11Для смешанной и интегрированной формы
уровне
значимости
95%(1.01–1.22)).
(р=0,04).

Частота встречаемости, %

90,0%
80,0%

72,2%

70,0%

78,9%
70,0%

60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%

16,6%

11,2%

10,0%

10,0%

0,0%
Здоровые

21,1%

20,0%

Дисплазия

,

* **
0,0%

Эписомальная форма
Смешанная форма
Интегрированная форма

РШМПримечание:*- различия статистически значимы по сравнению с группой
здоровых лиц, р<0,05; ** - различия статистически значимы по сравнениюс группой больных дисплазией эпителия шейки матки, р<0,05Рис.1 ЧастотаЧастота
встречаемости
различных
форм ВПЧв группах
встречаемости
различных
форм16ВПЧ
16 наблюденияв группах наблюдения
Заключение
высок,

Несмотря на то, что риск заражения женщин ВПЧ в течение жизни достаточно
наличие эписомальной формы ВПЧ не является прогностически

162Раздел 2ВПЧ статистически значимых различий выявлено не было (см. рисунок).
Сравнение распределения частот всех трех форм (эписомальной, смешаннойи интегрированной) между больными РШМ и CIN I-III в таблице 2х3 (тестхи-квадрат) показало, что распределение частот форм вируса статистически
значимо различается на уровне значимости 95 % (р=0,04).
Заключение
Несмотря на то, что риск заражения женщин ВПЧ в течение жизни достаточно высок, наличие эписомальной формы ВПЧ не является прогностически неблагоприятным фактором, так как у большей части пациенток
происходит его элиминация. Предполагается, что интегрированная форма
вируса дольше сохраняется, благодаря чему обнаруживается в эпителиальных дисплазиях высокой степени и РШМ, вызывает пролиферативные
процессы в клетках, геномную нестабильность и формирование мутаций.
Таким образом, интеграция ДНК ВПЧ в ДНК клетки-хозяина является ключевым событием в трансформации эпителиальных клеток.

Вирусология

163ИНДУКЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА Y,ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК *INDUCTION OF IGY,
AGAINST HEMORRHAGIC FEVERS PATHOGENS
А. В. Зыбкина, О. А. Полежаева, Д. Н. Щербаков
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р. п. Кольцово
A. V. Zybkina, O. A. Polezhaeva, D. N. Scherbakov
SRC VB “Vector”, RussiaАннотация
Проведена иммунизация кур, направленная на формирование антител нейтрализующих вируса Эбола и вируса Марбург. В качестве иммуногена использованы
вирусоподобные частицы псевдотипированные поверхностными гликопротеинами
этих вирусов. При помощи псевдовирусной системы определены IC50 препаратов
нейтрализующих антител накапливающиеся в желтках иммунизированных птиц, составившие для вирусов Эбола и Марбург 1/5120 и 1/256 соответственно.
Abstract
The immunization of the hens aimed at the formation of antibodies neutralizing theEbola virus and the Marburg virus was carried out. The virus-like particles pseudotyped
with surface glycoproteins of these viruses were used as an immunogen. Using the pseudovirus system, IC50 preparations of neutralizing antibodies accumulating in the yolks ofimmunized birds were determined, which were for viruses Ebola and Marburg 1/5120 and
1/256, respectively.

Вирусы Эбола и Марбург входят в семейство Filoviridae. Оба патогена
способны вызывать геморрагическую лихорадку, с уровнем летальности
до 90 %. Начиная с середины 80-х годов ведутся поиски терапевтических
средств для борьбы с филовирусами. Несмотря на значительные усилия,одобренные препараты до сих пор отсутствуют. Для создания терапевтических препаратов предложен ряд подходов, таких как постконтактные
вакцины, миРНК, олигомеры и моноклональные антитела. Последние, попоказателям безопасности и специфичности действия, несомненно, занима© А. В. Зыбкина, О. А. Полежаева, Д. Н. Щербаков, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке РФФИ в рамках научного проекта
№18-34-00512 мол_а и научного проекта №18-04-00458 А.

Раздел 2164

ют лидирующие позиции. Ключевым этапом создания эффективных моноклональных антител является получение разнообразия антител, способных
нейтрализовать патоген. Достичь этой цели можно разными путями, в томчисле с использованием различных схем иммунизаций лабораторных животных.
В работе, для индукции IgY антител, способных нейтрализовать филовирусы, было апробировано несколько вариантов иммунизации. В качестве
иммуногенов использовали псевдовирусные частицы двух типов, лентивирусные и рабдовирусные. Для «сборки» лентивирсных частиц проводили
ко-трансфекцию клеток HEK293Т двумя плазмидами, pSG3Δenv и плазмидой, содержащей последовательность поверхностного гликопротеина GPЭбола. Для получения частиц на основе «ядра» вируса везикулярного стоматита (ВВС), сначала проводили трансфекцию клеток HEK293Т плазмидой,содержащей последовательность поверхностного гликопротеина GP Эбола
(или Марбург), спустя сутки добавляли псевдовирусы ВВС.
Для иммунизации было сформировано пять групп кур — две для вируса Марбург и три для вируса Эбола. Промежуток между иммунизациями
составлял 3 недели. Вводимые разным группам иммуногены представленыв таблице.
Состав использованных иммуногенов
Номергруппы

Количество
животных

1

2

2

2

3

2

4

3

5

3

Иммуноген
Вирус Эбола
Лентивирусные частицы, экспонирующие на своей
поверхности GP вируса Эбола
Рабдовирусные частицы, экспонирующие на своей
поверхности GP вируса Эбола
Смесь рабдовирусных и лентивирусных частицв соотношении 50/50Вирус Марбург
Рабдовирусные частицы, экспонирующие на своей
поверхности GP вируса Марбург
Рабдовирусные частицы, экспонирующие на своей
поверхности GP вируса Марбург в комплексе с НАФПрепараты IgY антител выделяли из желтка при помощи метода изоэлектрического осаждения. Оценку вируснейтрализующих антител проводилипри помощи псевдовирусов ВВС псевдотипированных поверхностным гликопротеином вируса Эбола (Марбург).

Вирусология

165

В группах 1, 2 и 3 (Эбола) было проведено шесть иммунизаций. Нейтрализующие антитела детектировались уже после первой иммунизации,спустя 10 дней. Наибольший уровень нейтрализации (1/5120) был зафиксирован в группе 3 после шестой иммунизации.
В группах 4 и 5 (Марбург), нейтрализующие антитела накапливались
значительно медленнее, поэтому было принято решение провести буст-иммунизацию. После шести иммунизаций, провели две дополнительные иммунизации с использованием в качестве иммуногена смеси псевдовирусов,состоящей на 50 % из рабдовирусных частиц, несущих на своей поверхности GP штамма Popp с делецией муциноподобного домена и на 50 % излентивирусных частиц, несущих на своей поверхности GP штамма DRC
с делецией муциноподобного домена. В результате были получены препараты антител, нейтрализующие псевдовирусы Марбург в разведении 1/256.
Необходимо так же отметить что наибольший уровень нейтрализации былзарегистрирован для антитела, полученных от птиц, иммунизированной посхеме с добавлением неполного адъюванта Фрейнда (5 группа).

Раздел 2166БЕЗРЕЦИДИВНАЯ И ОБЩАЯ ВЫЖИВАЕМОСТЬ
БОЛЬНЫХ ВПЧ-АССОЦИИРОВАННЫМИ ВПЧ-НЕГАТИВНЫМ РАКОМ ШЕЙКИ МАТКИ *DISEASE-FREE AND OVERALL SURVIVAL OF PATIENTS DIAGNOSEDWITH HPV-ASSOCIATED OR HPV-NEGATIVE CERVICAL CANCER
М. К. Ибрагимова 1,2, И. В. Дерюшева 1,
Ю. А. Небова 1,2, М. М. Цыганов 1,2
НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, РоссияНИ Томский государственный университет, Томск, Россия
1

2

E-mail: imk1805@yandex.ruАннотация
Методом ПЦР в режиме реального времени исследованы соскобы эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки 116 больных первичным РШМ
I-IV стадий в возрасте от 24 до 79 лет. У 84 (72,4 %) больных установлено наличие
вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР), у 32 больных (27,6 %) наличие вируса в опухоли не было выявлено. Показано достоверное
снижение выживаемости, а также преобладание худшего прогноза для больных
ВПЧ-негативным раком шейки матки.
Abstract
The real-time PCR method is used to study scrapings of cervical epithelium and outerportion of the cervix in 116 patients aged 24–79 years with stage I–IV primary cervicalcancer. The comprehensive survey included colposcopy, cytological and histological analysis, detection and genotyping of high-risk human papillomavirus. In 84 patients (72.4 %)the presence of human papillomavirus (HPV) of high carcinogenic risk (HCR) is found, in
32 patients (27.6 %) the presence of the virus has not been inspected in the tumor. A significant decrease in the survival rate as well as the prevalence of the worst prognosis forpatients with HPV-negative cervical cancer are shown.

ВведениеВ настоящее время ВПЧ является основным этиологическим факторомв развитии рака шейки матки (РШМ). По данным различных исследований
до 80–90 % больных РШМ являются носителями ВПЧ ВКР, соответственно,в до 20 % ДНК опухоли шейки матки не содержит вируса. Это дает основание предполагать, что незначительное число опухолей могут возникать без© М. К. Ибрагимова, И. В. Дерюшева, Ю. А. Небова, М. М. Цыганов, 2018.
*Работа поддержана грантом РФФИ 18-44-703004 «Физический статус вируса
папилломы человека и прогрессия цервикальной интраэпителиальной неоплазии».

Вирусология

167

участия данной группы вирусов (или вирус элиминируется в процессе канцерогенеза), т. е. являются ВПЧ-негативными. Есть мнение, что обнаружение
данного подтипа РШМ, не ассоциированного с наличием вируса, возможно
лишь при наличии погрешностей при проведении лабораторных исследований. Есть и другой взгляд на данный феномен — ВПЧ-негативные опухоли нетолько возникают наряду с ВПЧ-ассоциированным РШМ, но и принадлежатк более агрессивной группе и их канцерогенез существенно отличается от механизма развития ВПЧ-положительных опухолей.
Цель работы: оценка безрецидивной и общей выживаемости ВПЧ- позитивных и ВПЧ-негативных больных первичным РШМ.
Материалы и методыВ исследование было включено 116 пациенток в возрасте от 24 до 79 летс первичным РШМ I-IV стадий. Диагноз верифицирован гистологически,опухоли были охарактеризованы в соответствии с классификацией FIGO
(классификация Международной федерации акушеров и гинекологов). Комплексное обследование включало гинекологический осмотр, кольпоскопию,цитологическое и гистологическое исследование, что позволило верифицировать диагноз. Материалом для исследования служили соскобы эпителия
цервикального канала и наружной части шейки матки.
Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ проводили методом PCR в режиме реального времени на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research»,Австралия) с использованием комплектов реагентов фирмы «Amplisens®»(Москва, Россия). Значение вирусной нагрузки рассчитывалось в геномных
эквивалентах ДНК ВПЧ/105 клеток, порог релевантного количества вируса принимался равным 3 lg ДНК ВПЧ /105 клеток в соскобе. Для оценки
статистической значимости различий в распределении частот качественных
признаков между группами использовали критерий Фишера. Оценку выживаемости проводили по методу Каплана-Майера.
Результаты и обсуждение
Наличие ВПЧ+ РШМ, ассоциированного с одним или одновременнос несколькими типами ВПЧ, были обнаружены у 84 пациенток (72,4 %) и у
32 больных (27,6 %) ВПЧ в опухоли не был выявлен.
В зависимости от инфицированности ВПЧ, женщины были разделены
на 2 группы наблюдения: группа 1 — ВПЧ-позитивные женщины (n=84),средний возраст 42,1±1,7 лет; группа 2 — ВПЧ-негативные женщины
(n=32), средний возраст 45,5±1,6 лет. Группы не различались по основным
клинико-патологическим показателям: размеру опухолей, лимфогенному
метастазированию и гистотипу (данные не представлены).

168Раздел 2Генотипирование ВПЧ-позитивных образцов выявило, что 16 генотипВПЧ встречается в 67,8 % случаев. Это согласуется с литературными данными и полученными ранее результатами. Второе и третье ранговое место
занимают ВПЧ 33 и 31 типов (22,6 % и 20,2 % соответственно). В то времякак согласно литературным данным, во многих регионах мира ВПЧ18 типазанимает по распространению второе место. При определении вирусной нагрузки (концентрации ДНК вируса) в исследуемых образцах было показано,что количество пациенток с показателем низкой вирусной нагрузки (< 3 lgДНК ВПЧ/105 клеток), для которой показана слабая связь с риском развития РШМ [10], в группе обследуемых женщин составило 22,6 %, при этом,показатель высокой (клинически значимой вирусной нагрузки >3 lg ДНКВПЧ/105 клеток), для которого показан высокий уровень корреляции с риском возникновения РШМ, составил 77,4 %.
При исследовании выживаемости в группах было обнаружено снижениекак общей, так и безрецидивной выживаемости больных РШМ в группе
ВПЧ-отрицательных пациенток. На рис. 1 и 2 представлена безрецидивнаяи общая выживаемость больных РШМ: сроки наблюдения безрецидивной
выживаемости для групп ВПЧ-положительных и ВПЧ-отрицательных пациенток оставили 102 и 68 месяцев, общей — 52 и 83 месяца, соответственно. 2-летняя безрецидивная выживаемость в данных группах составила
92,0 % и 73,0 %, общая — 86,0 % и 65,0 %. Можно полагать, что преоблада-Рис. 1. Безрецидивная выживаемость больных РШМВирусология

169

ние среди ВПЧ-отрицательных РШМ более агрессивных форм неслучайнои снижение выживаемости таких пациенток может быть обусловлена иными механизмами канцерогенеза РШМ, что может объяснять причину различий в исходе заболевания. В работе Harima и соавторов было показано, чтоВПЧ-негативные раки — отдельная группа и именно этот подтип наиболее
плохо поддается действию лучевой терапии. Еще в 2006 году появилось сообщение, где была исследована вирусная нагрузка ВПЧ в соскобах эпителиальных клеток шейки матки больных РШМ до лечения. Было показано,что по степени тяжести прогноза заболевания РШМ находятся в следующей
иерархии: ВПЧ-положительные опухоли с высокой вирусной нагрузкой,ВПЧ-положительные опухоли с низкой вирусной нагрузкой и наиболее плохой прогноз у ВПЧ-негативных опухолей.

Рис. 2. Общая выживаемость больных РШМЗаключение
ВПЧ-негативные опухоли шейки матки встречаются в два с половиной
раза реже, чем ВПЧ-позитивные, но имеют значительно худший прогноз.
Наличие/отсутствие ДНК ВПЧ в опухоли может стать новым, независимым
прогностическим фактором для РШМ Патогенез РШМ, не связанного с наличием ВПЧ изучен слабо и необходимо его более детального исследование.

Раздел 2170СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНА ГРИПП ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕЙВ КОСТАНАЙСКОЙ ОБЛАСТИ КАЗАХСТАНА В 2018 Г. *SEROLOGICAL STUDIES FOR INFLUENZAAMONG SWINE POPULATION IN KOSTANAI OBLAST
OF KAZAKHSTAN IN 2018
М. Қ. Қалқожаева, Н. Т. Сактаганов,А. М. Баймухаметова, Н. Г. КливлееваТОО «Научно-производственный центр микробиологиии вирусологии», Алматы, Республика Казахстан
M. K. Kalkozhayeva, N. T. Saktaganov,A. M. Baimukhametova, N. G. Klivleyeva
LLP Sсientific Production Center for Microbiology and Virology,
Almaty, Republic of Kazakhstan
E-mail: biochem_vir@mail.ruАннотацияВ животноводческих хозяйствах Костанайской области от свиней 4–5-месячного
возраста для серологических исследований собрано 39 сывороток крови. Результаты
серологических исследований в РТГА и ИФА, указывают на социркуляцию вирусов
гриппа A/H1N1 и A/H3N2 среди свиней в Костанайской области.
Abstract
39 blood serums were collected from swine aged 4–5 months for serological studies
in the cattle-breeding farms of Kostanai oblast. The results from serological studies in the
HAI assay and EIA indicate the co-circulation of influenza A/H1N1 and A/H3N2 viruses
among swine in Kostanai oblast.

Вирус гриппа является как в мире, так и в Казахстане широко распространенным и значимым возбудителем респираторного заболевания у свиней. Эпизоотии среди животных имеют большое социальное значение в свя© М. Қ. Қалқожаева, Н. Т. Сактаганов, А. М. Баймухаметов, Н. Г. Кливлеева,2018.
*Исследования выполнены в рамках грантового проекта Комитета Науки Министерства Образования и Науки Республики Казахстан «Молекулярно-генетическая изменчивость вирусов гриппа свиней в Казахстане».

Вирусология

171

зи со способностью вируса к реассортации и возникновению штаммов высокопатогенных для людей [Кливлеева Н. Г., 2017; Сактаганов Н. Т., 2017].
Серологическое исследование сывороток крови на наличие антителк вирусам гриппа в РТГА проводили с использованием диагностикумов
производства ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития (Россия, Санкт-Петербург), в ИФА — тест-систем производства ООО «ППДП» (Россия,Санкт-Петербург).
В животноводческих хозяйствах Костанайской области от свиней
4–5-месячного возраста для серологических исследований собрано 39 сывороток крови.
Результаты серологических исследований сывороток крови в РТГА показали, что наибольшее количество положительных образцов выявленок вирусу гриппа A/H3N2 — в 23,08 % (девять образцов) от общего числа исследованных сывороток, к A/H1N1 — в 7,69 % (три образца), к A/
Hsw1N1 в 2,56 % случаев (одна проба). Титры антител составили 1:20–1:40.
Серологический анализ сывороток крови свиней в ИФА позволил выявить антитела только к вирусу гриппа A/H3N2 в 15,38 % (6 образцов).
Таким образом, результаты серологических исследований сывороток
крови собранных в 2018 г. в Костанайской области указывают на социркуляцию среди свиней вирусов гриппа A/H1N1 и A/H3N2.

Раздел 2172ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ ВИРУСА БОЛЕЗНИ
НЬЮКАСЛА, ИЗОЛИРОВАННОГО ОТ СИЗОГО ГОЛУБЯВ ЮЖНОМ КАЗАХСТАНЕ В 2015 ГОДУFULL GENOM ANALYSIS OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS
ISOLATED FROM ROCK DOVE
IN SOUTHERN KAZAKHSTAN IN 2015
Е. Т. Касымбеков, К. О. Карамендин, А. И. Кыдырманов,М. Х. Саятов, К. Д. Даулбаева, Е. Я. Хан, С. А. Сулейменова *ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии», г. Алматы,Богенбай батыра 105, Республика Казахстан
Ye. T. Kassymbekov, K. O. Karamendin, A. I. Kydyrmanov,
M. H. Sayatov, K. D. Daulbaeva, E. Ye. Khan, S. A. SuleimenovaАннотация
Приводятся результаты выделения шести (6434/15, 6438/15, 6440/15, 6444/15,
6446/15, 6451/15) изолятов парамиксовируса птиц серотипа-1 в Южном Казахстане.
По данным филогенетических исследований штамм ПМВ-1/сизый голубь/Чокпак/6444/15 проявлял близкое родство с европейскими вариантами и по генубелка слияния отнесен в кластер уникальных вирусов в пределах класса 1.
Abstract
The results of isolation of six isolates (6434/15, 6438/15, 6440/15, 6444/15, 6446/15,
6451/15) of avian serotype 1 paramyxovirus in South Kazakhstan are presented.
The strain APMV-1/Rock dove/Chokpak/6444/15 in phylogenetic assay of the fusion
protein gene showed a close relationship to the European like variants and was prescribedto the cluster of unique viruses within the class 1.

Болезнь Ньюкасла представляет собой серьезную угрозу для птицеводстваво всем мире [1]. Возбудитель болезни относится к птичьему серотипу парамиксовирусов-1 (ПМВ-1) из семейства Paramyxoviridae, рода Avulavirus [3].
Установлено, что вирусы болезни Ньюкасла (ВБН) различных линий,представляющие разные географические регионы, одновременно подвергаются эволюционным изменениям, что значительно затрудняет контрольи диагностику болезни [4, 5]. Молекулярно-генетические исследования выявили неоднородность популяций ВБН, циркулирующих в мире. В настоящее
*© Е. Т. Касымбеков, К. О. Карамендин, А. И. Кыдырманов,К. Д. Даулбаева, Е. Я. Хан, С. А. Сулейменова, 2018.

М. Х. Саятов,Вирусология

173время имеется несколько филогенетических классификаций ПМВ-1 с разделением на линии или генотипы.
Согласно классификации все изоляты ВБН разделяются на класс I икласс II [6]. Молекулярно-генетический анализ показал, что внутри генотипа 1 существует три субгруппы 1а, 1в и 1с.
Вирусы II группы отличаются значительной дивергентностью, филогенетический анализ выявил в ее составе десять ранее описанных генотипов
и 5 новых (X, XII, XIII, XIV и XV) [7].
С середины 2000-х гг. исследования по вариабельности современных
штаммов ВБН в Казахстане не проводились, в то время как ситуация по данной инфекции продолжает оставаться напряженной и представляет большой научный интерес для работников ветеринарной службы Республики.
В связи с вышеуказанным, мониторинг популяций диких птиц необходим для изучения ареала распространения и спектра известных серотипов
ПМВ, выявления заносов возбудителей и их новых разновидностей, определения видового состава инфицируемых птиц.
В 2014 г. в Алматинской, Атырауской, Акмолинской и Жамбылской областях Казахстана собраны 797 биологические пробы от 604 особей, относящихся к 43 видам 19 семейств 10 различных отрядов диких птиц (изописанных в Казахстане 62 семейств и 21 отряда орнитофауны) в виде клоакальных, трахеальных смывов, кусочков органов и помета.
В ходе первичного заражения 10–11 дневных развивающих куриных эмбрионов и двух последовательных пассажей из материалов, собранных отдиких птиц в Жамбылской области (Чокпак) выделены шесть гемагглютинирующих агента (6434/15, 6438/15, 6440/15, 6444/15, 6446/15, 6451/15).
В ОТ-ПЦР проведен скрининг пулов биологических проб, собранных отдиких птиц во время весеннего и осеннего перелетов, с праймерами к фрагментам консервативной последовательности L генов ПМВ, которые охватывают участки геномов в 132 и 700 п.о., соответственно. В результате реакции
образцы из Западного и Центрального Казахстана показали отрицательные
результаты на наличие ВБН.
В то же время скрининг в ПЦР биологических проб, собранных от беркута, сизых голубей, черноголовых хохотунов, майны и больших баклановв Жамбылской области (орнитологическая станция «Чокпак»), позволил выявить 8 положительных проб, относящихся к семейству ПМВ-1.
Секвенированы полные нуклеотидные последовательности генов внутренних (L, Р, М, NP) и поверхностных (HN, F) белков изолята ПМВ-1/сизый голубь/Чокпак/6444/15.
Установлено, что его геном состоит из 15203 п.о. Аналогично другим
ПМВ-1, этот вирус содержит шесть генов в следующей последовательно-174Раздел 2

сти: NP, P, M, F, HN и L. Ген нуклеопротидного белка (NP) представлен
1470 п.о., фосфопротеидного (Р) — 1200 п.о., матриксного (М) — 1095 п.о.,полимеразного (L) — 6615 п.о. Гены белков F и HN состоят из 1662 п.о.,и 1758 п.о., соответствено. Процентное содержание G+С вирусного генома
равно 47,98 %. Концевые последовательности 5’ и 3’ состоят из 114 и 55 нуклеотидов соответственно. Структура стартового гена (GS) аналогична таковым других ПМВ-1 и содержит последовательность UGCCCAUCUU, которая оказывает влияние на эффективность транскрипции всех генов.
Нуклеотидная структура концевого гена (GЕ) содержит последовательность U/A)A(U/A)UCUUUUUU, с которой связаны процессы терминациии инициации синтеза.
Геном вируса ПМВ-1/сизый голубь/Чокпак/6444/15, проявивший наибольшее сходство (98 %) с таковым штамма NDV08-046, выделенным
в 2008 г. от утки в Китае, вошел в кластер уникальных вирусов, состоящих,в основном, из низко- или апатогенных ПМВ.
Для анализа аминокислотного состава нуклеотидной последовательности поверхностных HN и F белков казахстанских вирусов использован изолят ПМВ-1/сизый голубь/Чокпак/6444/15 от дикой птицы из Жамбылской
области.
У штамма ПМВ-1, выделенного от сизого голубя на перевале Чокпакв Жамбылской области, отсутствуют множественные основные аминокислоты в сайте расщепления F-белка (ERQER), что свидетельствует о его низкой патогенности для птиц (см. рисунок).

Сайт расщепления белка слияния казахстанского изолята ПМВ-1/сизый голубь/Чокпак/6444/2015 (полевой № -APMV-1/dove/Chokpak/46/2015)По результатам филогенетических исследований штамм ПМВ-1/сизый
голубь/Чокпак/6444/15 проявлял близкое родство с европейскими вариантами и по гену белка слияния отнесен в кластер уникальных вирусов в пределах класса 1.

Вирусология

175Литература
1. Alexander D.J, Aldous E.W, Chad M. F. The long view:A selected review of 40 years ofNewcastle disease research. Avian Pathol. 2012; 41: 329–335.
2. Cattoli G, Susta L, Terregino C, Brown C. Newcastle disease:A Shahid and Liaquat
366 review of field recognition and current methods of laboratory detection. J. Vet. Diagn.
Invest. 2011; 23: 637–656.
3. Miller P., Decanini E., Afonso C. Newcastle disease: evolution of genotypes andthe related diagnostic challenges // Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary
Genetics of Infectious Diseases. — 2010. — Vol. 10. — P. 26–35.
4. Cattoli G., Fusaro A., Monne I., Molia S, Le Menach A., Maregeya B., Nchare A.,
Bangana I., Maina A., Koffi J., Thiam H., Bezeid O., Salviato A., Nisi R., Terregino C.,
Capua I. Emergence of a new genetic lineage of Newcastle disease virus in West and Central
Africa-implications for diagnosis and control // Veterinary Microbiology. 2010. Vol. 142.
P. 168–176.
5. Diel D., da Silva L., Liu H., Wang Z., Miller P., Afonso C. Genetic diversity of avian
paramyxovirus type 1: Proposal for a unified nomenclature and classification system ofNewcastle disease virus genotypes // Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary
Genetics of Infectious Diseases. — 2012. — Vol. 12. — P. 1770–1779.
6. Miller P., Estevez C., Yu Q., Suarez D., King D. Comparison of viral shedding following vaccination with in activated and live Newcastle disease vaccines formulated withwild-type and recombinant viruses // Avian Diseases. — 2009. — Vol. 53(1). — P. 39–49.

Раздел 2176РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫСВИНЕЙ С ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНА EP402R *RECOMBINANT VIRUS OF AFRICAN SWINE FEVER
WITH EP402R GENE
Г. С. Кольцова, И. А. Титов, А. С. Малоголовкин
ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологиии микробиологии» (ФГБНУ ФИЦВиМ)G. S. Koltsova, I. A. Titov, A. S. Malogolovkin
Federal research center for virology and microbiology
E-mail: Lila5757@yandex.ruАннотация
Африканская чума свиней является одним из наиболее опасных вирусных заболеваний домашних свиней. Вакцины против АЧС отсутствуют, а их разработку
осложняет недостаток данных об антигенах, обуславливающих сероиммунотиповую
принадлежность вируса. Ранее нами было показано, что два белка вируса АЧС, CD2v
(EP402R) и C-type Lectin like protein (EP153R), являются необходимыми и достаточными для опосредования серологической специфичности в РЗГА (Malogolovkin etal., 2015). В данной работе представлены результаты изучения рекомбинантного вируса АЧС с делецией гена EP402R, включая характеристику иммуногенных свойств
данного вируса. Продемонстрировано, что белок CD2v представляет собой важный
протективный антиген вируса АЧС.
Abstract
African swine fever is an emerging disease threat for the swine industry worldwide.
No ASF vaccine is available and progress is hindered by lack of knowledge concerning
the viral antigens conferring type-specific protective immunity in pigs. Recently, we haveshown that two ASFV proteins, CD2v (EP402R) and C-type lectin (EP153R), are necessary and sufficient for mediating HAI serological specificity (Malogolovkin et al., 2015).
Here, we present the results of studying the recombinant ASFV with the EP402R genedeletion, including the data of vaccination/challenge experiments in pigs. We demonstratethat serotype-specific CD2v protein is important for protection against homologous ASFV
infection.
© Г. С. Кольцова, И. А. Титов, А. С. Малоголовкин, 2018.
*Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект
№ 16-16-00090).

Вирусология

177Африканская чума свиней (АЧС) является одним из наиболее опасных
вирусных заболеваний домашних свиней. Возбудитель болезни, вирус африканской чумы свиней — большой, оболочечный и сложноорганизованный
ДНК-содержащий вирус из рода Asfivirus семейства Asfarviridae (Dixon L.,
et al., 2000).
Начиная с 2007 года, во многих субъектах Российской Федерации отмечается неблагополучная эпизоотологическая обстановка по АЧС. Вспышки АЧС были зарегистрированы и в других европейских странах (Польша,Эстония, Латвия, Литва, Чехия, Румыния, Болгария), в том числе в популяциях диких кабанов. Отсутствие вакцин затрудняет контроль распространения болезни. Инактивированные вакцины неэффективны, и только иммунизация живыми аттенуированными вирусами позволяет защитить животное от гибели после заражения гомологичными вирулентными штаммами.
Однако использование вакцин на основе аттенуированных штаммов может
быть опасно из-за возможной длительной персистенции вируса в организмеи развития хронической формы болезни. Кроме того, многие исследователи
отмечали низкий уровень или отсутствие перекрестной защиты. По результатам предыдущих многолетних исследований, проведенным в ФГБНУ ФИЦВиМ, на основании результатов реакции задержки гемадсорбции установлено наличие восьми серогрупп вируса АЧС (Середа А. Д. и Балышев В. М.,2011). Филогенетический анализ более чем 70 штаммов вируса АЧС показал
корреляцию между генетическими кластерами на основе нуклеотидных последовательностей генов СD2v и C-type Lectin like protein, и выявленными
ранее сероиммунотипагруппами (Malogolovkin A., et al., 2015). А изменение
данных генов в геноме приводит к изменению серотиповой принадлежности штамма, что было показано в экспериментах in vivo и in vitro (Burmakina
G., et al., 2016). Таким образом, было продемонстрировано, что поверхностный гликопротеин CD2v, наряду с белком C-type Lectin like protein, вероятно
играет важную роль в модуляции механизмов иммунного ответа.
Целью данной работы являлось создание рекомбинантного штамма вируса АЧС с удаленным геном EP402R (ΔCongoCD2v) и изучением его биологических свойств.
Штамм ΔCongoCD2v получен из аттенуированного штамма КК-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная кассета представляет собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP153R и EP364R (плечи рекомбинации), штамма КК-262 вируса АЧС, а также репортерный ген
EGFP под контролем промотера гена р72 вируса АЧС. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток СOS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее вирусом АЧС178Раздел 2штамм КК-262. Для дальнейшего скрининга клонов использовали реакцию
бляшкообразования и метод предельных разведений (7 последовательных
пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных
вариантов вируса по репортерной флюоресценции гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинантного вируса была подтверждена в ПЦР соспецифическими праймерами, фланкирующими фрагмент генов EP152R
и EP364R вируса АЧС, а также в ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, комплиментарных
фрагментам гена EP402R (CD2v). Отсутствие нуклеотидных замен в сайте
рекомбинации определяли нуклеотидным секвенированием фрагментов генома вируса.
Было продемонстрировано, что рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v
утратил гемадсорбирующую активность и, в отличие от исходного штамма
КК-262, не взаимодействовал с эритроцитами свиньи после инфицирования
культуры клеток макрофагов свиней. Это согласуется с данными других исследователей, согласно которым именно белок CD2v обуславливает феномен гемадсобции вируса АЧС (Borca M., et al., 1994).
Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v вируса АЧС размножается в первичной культуре клеток макрофагов свиней, а также в перевиваемой культуре клеток COS-1. Кинетика репликации рекомбинантного штамма идентична исходному штамму КК-262. Репродукция вируса в культуре клеток
макрофагов свиней сопровождается развитием цитопатического эффекта(ЦПЭ). Накопление вируса, как в первичной, так и перевиваемой культуре
клеток составляет 6,0–7,0 lg TCD 50/см3.
Штамм ΔCongoCD2v вируса АЧС не является патогенным для свинейпри внутримышечном заражении в дозе 6,0 lg TCD 50/см3. Иммунизация
рекомбинантным штаммом не позволяет защитить животных от заражения
вирулентным штаммом К49 вируса АЧС. Таким образом, иммуногенные
свойства рекомбинантного штамма существенно отличаются от исходного
штамма КК-262, иммунизация которым приводит к развитию протективного иммунного ответа против гомологичного штамма К49.
Таким образом, в ходе проведенных исследований был получен и охарактеризован рекомбинантный штамм вируса АЧС с делецией гена EP402R(CD2v). Дальнейшее его изучение позволит получить новую информациюо роли белка CD2v во взаимодействии вируса АЧС и хозяина.

Вирусология

179

ПОИСК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
4 И 5 ГЕНОТИПОВ В КЛЕЩАХ, СНЯТЫХ С ЛЮДЕЙВ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ В 2017 ГОДУSEARCHING FOR THE 4TH AND THE 5TH GENOTYPESOF THE TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ISOLATED FROM TICKS
WHICH WERE TAKEN OFF FROM PEOPLE
IN NOVOSIBIRSK REGION IN 2017
Е. И. Кривошеина 1,2, А. И. Кузнецов 1,2, М. Ю. Карташов 1,
Т. П. Микрюкова1, А. С. Акимова 1,3 *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Новосибирский государственный университет
3ФГБОУ ВО «Новосибирский ГАУ»1

2

E. I. Krivosheina1,2, A. I. Kuznetsov 1,2, M. Yu. Kartashov 1,
T. P. Mikryukova 1, A. S. Akimova 1,3
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
2
Novosibirsk State University, Russia
3
FSBEI HE «Novosibirsk SAU»

1АннотацияВ связи с недавним появлением публикаций о выявлении изолятов, предположительно соответствующих ранее не известным 4-му и 5-му генотипам вируса клещевого энцефалита, было проведено исследование генетического материала вируса,полученного от клещей, снятых с людей в Новосибирской области, с целью филогенетического анализа и сравнения с новыми штаммами. В исследование было взято
272 клеща, уровень инфицированности которых составил 12,5 %. Филогенетический
анализ показал, что ни один положительный образец не был отнесен ни к 4 ни к 5 ник Европейскому генотипам. Дальневосточный генотип был обнаружен у 12,9 %,а Сибирский у 87,1 % положительных проб.
Abstract
A study of ticks’ infection with different genotypes of tick-born encephalitis virus inorder to search supposed recently revealed the 4th and the 5th genotypes. 272 ticks were taken off from people and included to the current study. 12,5 % were infected with tick-borne
encephalitis virus. None of them was related to the 4th or to the 5th genotypes and also none
to the European genotype. 12,9 % of positive were related to the Far-Eastern and 87,1 % to
the Siberian genotypes.
* © Е. И. Кривошеина, А. И. Кузнецов, М. Ю. Карташов, Т. П. Микрюкова,А. С. Акимова, 2018.

180Раздел 2Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является эпидемиологически значимым в РФ, он вызывает заболевание, которое затрагивает центральную
нервную систему, а также может переходить в хронические формы. ВКЭпредставлен несколькими генотипами каждый из которых, при попаданиив организм человека может вызывать заболевания разной степени тяжести.
Принято считать, что штаммы ВКЭ делятся на три основных генотипа — Дальневосточный, Сибирский и Европейский. С развитием молекулярно-генетических методов были определены полные нуклеотидные последовательности ВКЭ, которые показали, что ВКЭ очень разнообразени возможно обнаружение новых генотипов вируса. Так в Восточной Сибири
были выявлены штамм 178–79 и штаммы группы 886, которые были описаны как 4 генотип и 5 генотип, соответственно. Поиск новых генетических
вариантов ВКЭ является важной задачей для современной науки, потомучто на основании таких исследований становится возможной разработка более совершенных методов диагностики инфекции и вакцинации населения.
Целью работы являлся поиск возбудителей клещевого энцефалита
4 и 5 генотипов в клещах, снятых с людей в Новосибирской области.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: создание
коллекции ДНК/кДНК клещей; детекция генетического материала ВКЭметодом ПЦР; определение нуклеотидной последовательности фрагмента
гена E выявленных изолятов; сравнение выявленных изолятов с штаммами
4 и 5 генотипов при помощи филогенетического анализа.
Материалы и методы
Всего в исследование было взято 272 клеща родов Ixodes (85 шт.)
и Dermacentor (187 шт.), которые были сняты с людей в летний период в Новосибирской области в 2017 году.
Гомогенизация клещей осуществлялась с использованием лабораторного гомогенизатора Tissue Lyser (Qiagen, Германия) в 300 мкл стерильного
физраствора. Выделение нуклеиновых кислот осуществлялось сорбционным методом коммерческим набором по инструкции производителя («ИнтерЛабСервис», Россия) Реакция обратной транскрипции проводилась
набором «Реверта-100» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Скрининг клещей на наличие генетического материала ВКЭ проводили с помощью метода ПЦР с использованием праймеров на фрагмент гена E генома
ВКЭ. Cеквенирование продуктов амплификации проводили по обеим цепям
методом Сэнгера на основе капиллярного электрофореза с помощью автоматического секвенатора 3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems»,
США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводилис использованием программ Unipro UGENE v.1.30 и MEGA X.

Вирусология

181

Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей гена E вируса
клещевого энцефалита. Зеленым цветом обозначены последовательности,относящиеся к Дальневосточному генотипу, а красным цветом — к Сибирскому. Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены последовательности, полученные в данном исследовании, курсивом выделены прототипные последовательности

182Раздел 2Результаты и их обсуждение
Методом ПЦР был выявлен генетический материал ВКЭ в 34 пробах.
Таким образом уровень инфицированности составил 12,5±2 %. Инфицированность ВКЭ клещей рода Ixodes составила 11,8±3,5 %, а клещей родаDermacentor — 12,8±2,4 %.
Для выявленных изолятов ВКЭ были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена E, кодирующего основной антигенный белок.
На основании полученных данных было построено филогенетическое дерево (см. рисунок), в структуру которого были также включены прототипные
последовательности некоторых штаммов и изолятов ВКЭ из международной
базы данных GenBank NCBI с целью отнесения полученных в исследовании
последовательностей к соответствующим ветвям дендрограммы. Прототипная
последовательность, соответствующая вирусу Омской геморрагической лихорадки представлена для сравнения в качестве близкородственного вируса.
К Дальневосточному генотипу было отнесено 12,9±6 %, а к Сибирскому — 87,1±6 % положительных проб. Гомология выявленных изолятов соштаммом 178–79 была на уровне 83–87 %, а со штаммами группы 886–84 —86–91 %. Следовательно, ни один из выявленных нами изолятов не относится к предполагаемым 4 и 5 генотипам. Также не было обнаружено сходстваи с Европейским генотипом ВКЭ.
Бóльшая часть образцов, отнесенных к Сибирскому генотипу, былаблизка к штамму Enisey-2 — 63 %, меньше к изоляту Ekaterinburg-992-09 —29,6 % и по одному образцу к штамму Zausaev и изоляту TBEV-2922 — по
3,7 %. Разделение 4 образцов в Дальневосточной ветви произошло поровну
между штаммами Tomsk-PT12 и Khekhtzir 17-13.
Заключение
Исследование клещей, снятых с людей в Новосибирской области
в 2017 году, не выявило ни одного образца, содержащего генетический материал ВКЭ, соответствующего штаммам 178-79 и 886-84, выделеннымв Восточной Сибири. Возможно, предложенные генотипы на самом деле существуют, но не встречаются или очень редко встречаются на территории Западной Сибири. Подавляющее большинство инфицированных клещей ВКЭв Западной Сибири являются переносчиками Сибирского генотипа (87,1 %).
В целях повышения эффективности в области эпидемиологического контроля
природно-очаговых инфекций, необходимо продолжать исследование клещейна предмет нетипичных вариантов ВКЭ в Новосибирской области.

183Вирусология

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ВИЧ-1В КРАСНОЯРСКОМ КРАЕ: ГОРЯЧАЯ ТЕРРИТОРИЯ
РЕКОМБИНАЦИИ ВИРУСА *GENETIC DIVERSITY HIV-1 IN KRASNOYARSK REGION:
A HOT AREA OF VIRAL RECOMBINATION
Л. В. Максименко 1, А. В. Тотменин 1, С. Е. Скударнов 2,
С. В. Ященко 2, Н. М. Гашникова 1Федеральное бюджетное учреждение науки
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»Роспотребнадзора, пос. Кольцово,Новосибирская область
2Краевое государственное автономное учреждение
здравоохранения «Красноярский краевой Центр профилактикии борьбы со СПИД», г. Красноярск
1

L. V. Maksimenko 1, A. V. Totmenin 1, M. P. Gashnikova 1,
S. E. Skudarnov 2, S. V. Yaschenko 2, N. M. Gashnikova 1
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
Krasnoyarsk Regional Center for Prevention and Control of AIDS,
Krasnoyarsk, Russia
1

2

E-mail: locet@inbox.ruАннотация
Клинические образцы крови 157 жителей Красноярского края с диагностированной в период 2002-2017 гг ВИЧ-инфекцией, были собраны с конца 2017 до февраля
2018 г. Для каждого образца были получены и расшифрованы гены pol и env ВИЧ-1,с применением филогенетического и рекомбинационного анализов выполнено генотипирование ВИЧ-1. Первичная резистентность ВИЧ-1 была найдена у 4,5 % пациентов,не получавших антиретровирусную терапию (АРВТ). Как показал филогенетический
анализ, основными генетическими циркулирующими вариантами ВИЧ являлись субтип А (56,2 %) и CRF63_02A1 (13,7 %). В 30,1 % были выявлены впервые описанные
уникальные рекомбинантные формы (URFs), включающие рекомбинантные вирусы
© Л. В. Максименко, А. В. Тотменин, С. Е. Скударнов, С. В. Ященко, Н. М. Гашникова, 2018.
*Исследование разнообразия ВИЧ-1 выполнено в рамках ГЗ-2/16, анализ генетической гетерогенности и первичной резистентности области интегразы ВИЧ-1 проведен при поддержке проекта РНФ № 16-15-10238.

Раздел 2

184

URF63_02A1/A6 (25,3 %), URF03_AB/A (4,1 %) и URF03_AB/A/63_02A1 (0,7 %). Интересно, что уникальные генотипы ВИЧ-1 впервые были выявлены нами в Красноярском крае после 2012 (в 2012 в 10 % случаев, в 2015 — в 52,6 %, в 2017 — в 46,2 %).
Abstract
Blood samples from a total of 157 HIV-1 persons in Krasnoyarsk region, who werediagnosed between 2002 and 2017, were collected in 2017–2018. HIV-1 pol, env genes
were amplified and sequenced from plasma followed by genotype determination using
phylogenetic and recombination analyses. Transmitted antiretroviral resistance mutations were observed among 4,5 % individuals, who were antiretroviral therapy (ART)naïve. Major circulating HIV-1 genotypes determined by neighbour-joining phylogenetic inference included subtype A6 (56,2 %) and CRF63_02A1 (13,7 %). At 30.1 %were newly-described unique recombinant forms (URFs) including recombinant viruses
URF63_02A1/A6 (25,3 %), URF03AB/A (4,1 %) and URF03AB/A/63_02A1 (0,7 %).
Interestingly, unique HIV-1 genotypes were detected for the first time in Krasnoyarsk
region after 2012 (in 2012 at 10 % of cases, in 2015 — 52,6 %, in 2017 — 46,2 %).

В отличие от территорий Центральной России и Урала, где доминирует распространение специфического российского субтипа А (А6)ВИЧ-1, в Новосибирской, Томской, Кемеровской областях, в Алтайском
крае более 85 % из количества новых выявляемых случаев ВИЧ-инфекции после 2013–14 гг вызвано циркулирующей рекомбинантной
формой (CRF) 63_02A1 ВИЧ-1 или рекомбинантными ВИЧ на основе
CRF63_02A1 ВИЧ-1. В Красноярском крае до 2008 года регистрировалось
распространение ВИЧ-1 субтипа А [1].
Учитывая недавнее возникновение CRF63_02A1 ВИЧ-1, её растущую
распространенность в ряде регионов Сибирского федерального округа,представляло интерес исследование современной молекулярно-эпидемиологической ситуации в Красноярском крае.
Общее число ВИЧ-инфицированных лиц, зарегистрированных на территории Красноярского края на 01.06.2018 г. достигло 35779, показатель
пораженности составил 734,6 на 100 тысяч населения. Среди территорийСФО по уровню распространенности ВИЧ-инфекции Красноярский крайзанимает 5 место после Кемеровской, Иркутской, Новосибирской областейи Алтайского края. За период эпидемии в крае были зарегистрированы тривспышки распространения ВИЧ-инфекции: в 2000–2002, 2007–2008 и в
2013–2014 годах. Данные эпидемиологического анализа указывают на то,что активизация ВИЧ-инфекции была связана с распространением ВИЧв среде потребителей наркотиков (ПИН), а последняя — с вовлечениемв распространение ВИЧ-1 потребителей синтетических наркотических препаратов.

Вирусология

185

Клинические образцы были собраны от 157 ВИЧ-инфицированных жителей Красноярского края в конце 2017 — начале 2018 гг. В исследование
было вовлечено 51 % женщин и 49 % мужчин, средний возраст пациентов
составил 38 лет (18–58). Из плазмы крови выделяли РНК ВИЧ-1 и определяли нуклеотидные последовательности генов pol и env, кодирующие белки
обратной транскриптазы, протеазы, интегразы и основного белка оболочки
вируса. Для расшифрованных последовательностей с применением специализированных программных ресурсов выполняли филогенетический, мутационный и рекомбинантный анализы.
Установлено, что у 18 пациентов со сроком постановки диагноза
2002–2008 гг в 100 % случаев был выявлен ВИЧ-1 субтипа А. Среди 20 человек с выявленной ВИЧ-инфекцией с 2009 по 2012 гг в 80 % был выделен
ВИЧ-1 субтипа А, по 10 % пришлось на ВИЧ-1 CRF63_02A1 и URF63_02A1/A.
В выборке лиц (18), диагностированных в 2013, URF ВИЧ-1 выявлялись
в 30,8 %, в 2014 — выявлено 42 % URF ВИЧ-1 (8 из 19). Среди 76 пациентов,диагностированных в 2015–2017 годах, URF ВИЧ-1 были найдены в 42,1 %,субтип А вируса был выделен в 43,4 % случаев, CRF63_02A1 — в 14,5 %.
Среди всех уникальных описанных в работе URF ВИЧ-1 78,9 % являлись результатом повторного инфицирования людей вирусами субтипа А и
CRF63_02A1 (URFA/63_02A1), в одном случае был описан URF ВИЧ-1,образованный при рекомбинации вирусов среднеазиатского CRF02_AG
ВИЧ-1 и субтипа А (URF02_AG/A). Особый интерес вызвали семь вариантов ВИЧ-1, являющихся продуктом рекомбинации CRF03_AB и субтипа
А (URF03_AB/A). Шесть из этих вирусов формировали на филогенетическом дереве отдельную ветвь с коэффициентом поддержки 99, что указывает на высокий процент их генетической идентичности и вероятность
возникновения новой CRF. Седьмой вариант URF03_AB/A, выделенный отпотребителя инъекционных наркотических препаратов, после углубленного
исследования оказался «тройным» рекомбинантом ВИЧ-1 — URF03_AB/
A/63_02А1. Анализ эпидемиологических данных позволил определить, что
URF03_AB/A ВИЧ-1 выявляется в Красноярске и близлежащих населенных
пунктах с 2014 года среди ПИН (3 случая) и среди лиц, инфицированныхпри гетеросексуальных контактах (4).
Среди лиц, вовлеченных в исследование, 134 человека не имели опыта
приема антиретровирусных препаратов (АРВП), никто из лиц, получавших
антиретровирусную терапию (АРВТ), не принимал ингибиторы интегразы
вируса. Поэтому для исследованной выборки ВИЧ-1 мы смогли оценить
распространенность первичной резистентности ВИЧ-1.
Резистентность ВИЧ-1 была найдена у 4,5 % (6 из 134) пациентов, неполучавших АРВТ. Четверо из них являлись ПИН, при этом у 2-х лиц, инфи-Раздел 2186цированных при гетеросексуальных контактах, была выявлена резистентность более высокого уровня. Анализ генетической гетерогенности ВИЧ-1,выделенных от жителей Красноярского края, не позволил подтвердить частоту встречаемости субтип-специфичных мутаций (M50I и L74I), описанных нами для CRF63_02A1 и субтипа А ВИЧ-1 при исследовании гетерогенности вирусов на других территориях СФО. Вероятно, данный факт можно
объяснить большим количеством рекомбинационных событий, регистрируемых в области генома, кодирующей интегразу вируса.
Определение сродства выделенных ВИЧ-1 к клеточным рецепторам
CCR5 и CXCR4, выполненное путем анализа аминокислотной последовательности области, кодирующей основной белок оболочки вируса, указывает на то, что среди ВИЧ-1 субтипа А CXCR4-тропные ВИЧ были найдены
в 7,8 % случаев в большей части у лиц, имеющих более длительный период
болезни, по сравнению с лицами, инфицированными СXCR4-тропными вирусами CRF63_02A1. Среди вирусов CRF63_02A1 тропность к СXCR4-корецептору регистрировалась в два раза чаще (15,8 %), что является плохим
прогностическим признаком для развития болезни.
Исследование современной ситуации по распространению ВИЧ-1 в Красноярском крае позволило выявить негативные изменения в эпидемическом
процессе. В крае впервые зарегистрирована циркуляция генетически отличающихся ВИЧ-1, что создает условия для рекомбинационной изменчивости
вируса. Впервые в России описана территория с таким уникально высоким
процентом выявления возникающих новых рекомбинантных ВИЧ-1. Очевидно, что к возникновению URF ВИЧ-1 приводит практика рискованного
поведения жителей края. Тем не менее, на данном этапе работ не представляется возможным объяснить высокий процент выявления возникающих
новых URF ВИЧ-1 на территории Красноярского края, практически в 2 разапревышающий распространенность URF ВИЧ-1 в Кемеровской области, гдепораженность населения ВИЧ намного выше.
Литература
1. Rumyantseva О. А. et. al. Epidemiological Networks and Drug Resistance of
HIV Type 1 in Krasnoyarsk Region, Russia // AIDS Research and Human Retroviruses.
2009. — V. 25. — Р. 931–936.

Вирусология

187ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
ВЫСОКОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА H5NX,ВЫДЕЛЕННЫХ В РОССИИISOLATION AND CHARACTERIZATION OF H5NX HIGHLY
PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUSES
OF CLADE 2.3.4.4 IN RUSSIA
В. Ю. Марченко, Н. П. Колосова, Н. И. Гончарова,И. М. Суслопаров, А. С. Гудымо, С. В. Святченко,Е. В. Гаврилова, Р. А. Максютов, А. Б. Рыжиков *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
V. Marchenko, N. Kolosova, N. Goncharova, I. Susloparov, A. Gudymo,
S. Svyatchenko, E. Gavrilova, R. Maksyutov, A. Ryzhikov
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотацияЗа последние два года в России складывалась неблагополучная ситуация погриппу птиц. Это было связано с распространением высокопатогенных вирусов клады 2.3.4.4, которые вызвали множественные вспышки среди диких и домашних птицв Европейской части России. Также, некоторые вирусы гриппа клады 2.3.4.4 выделялись в ходе мониторинга вируса гриппа в других регионах России. Так, осенью
2016 года в ходе мониторинга вируса гриппа птиц на территории Камчатского краябыл выделен вирус гриппа субтипа А(H5N5). Затем, в течение 2016–2017 года регистрировались вспышки среди диких и домашних птиц, вызванные вирусом гриппа
субтипа А(H5N8). В конце 2017 года в Костромской области была зарегистрирована вспышка среди сельскохозяйственных птиц, вызванная вирусом гриппа субтипа
А(H5N2). Нами проведен сравненительный вирусологический и молекулярно-биологический анализ новых и ранее выделенных штаммов вируса гриппа птиц субтипов А(H5Nx).
Abstract
For the last two years there has been challenging situation regarding avian influenza
in Russia. This was due to the spread of highly pathogenic avian influenza viruses of clade
2.3.4.4, which caused multiple outbreaks among wild birds and poultry in European partof Russia. Also several viruses of clade 2.3.4.4 were isolated during avian influenza virus
surveillance in other regions of Russia. In the autumn of 2016, during the avian influenza* © В. Ю. Марченко, Н. П. Колосова, Н. И. Гончарова,И. М. Суслопаров,А. С. Гудымо, С. В. Святченко, Е. В. Гаврилова, Р. А. Максютов, А. Б. Рыжиков, 2018.

188Раздел 2

virus surveillance in the territory of the Kamchatka region of Russia the HPAI A(H5N5)
influenza virus was isolated. Then, during 2016–2017, multiple outbreaks among wild
birds and poultry caused by HPAI A(H5N8) avian influenza virus were recorded in European part of Russia. At the end of 2017, an outbreak among poultry caused by HPAIA(H5N2) influenza virus was recorded in the Kostroma region. We have selected some ofthese strains for the investigation and comparison of genetic and biological properties of
newly and previously isolated avian influenza viruses A(H5Nx).

РезультатыПри культивировании на 9-дневных развивающихся куриных эмбрионахвсе изученные вирусы показали высокую степень вирулентности для куриных эмбрионов, приводя к их гибели в течение 48 часов после заражения.
Инфекционный титр вируса в аллантоисной жидкости составил от 7,6 до
9.0 log ЭИД50/ml. Показатели инфекционности вновь выделенных штаммов
А(H5N8), А(H5N5) и А(H5N2) оказались сопоставимы с показателями штамма A/great crested grebe/Tyva/34/2016 (H5N8), выделенного в мае 2016 года доначала масштабной эпизоотии в России, и были выше показателей инфекционности штамма A/wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8), циркулировавшего ранее. Длявсех штаммов было определено наличие аминокислотной последовательностиREKRRKR*GL в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина, чтохарактерно для высокопатогенных штаммов вируса гриппа. Также, изученные
штаммы показали высокую степень вирулентности для мышей. При интраназальном заражении мышей Balb/c показатель инфекционной дозы (ИД50)находился в диапазоне 1,6–2,8 logЭИД50. Также, для штаммов были определены значения летальной дозы (ЛД50), которые составили 1,8–4,4 logЭИД50.
При этом, показатели вирулентности для изученных штаммов различалисьв зависимости от субтипа выделенного вируса. При этом, наибольшую вирулентность для мышей показал штамм A/chicken/Kostroma/1718/2017 (H5N2).
Результаты исследования антигенных свойств показали, что все изученные
штаммы А(H5Nx), включая штамм A/environment/Kamchatka/18/2016 (H5N5)
и A/chicken/Kostroma/1718/2017 (H5N2) имеют высокую степень антигенного родства со штаммами вируса гриппа H5N8, циркулировавшими ранеев России, а также рекомендованными в 2016–2017 кандидатными вакцинными штаммами клады 2.3.4.4. Филогенетический анализ гена HA вновь выделенных в России штаммов А(H5Nx) также определил их высокую степень
идентичности и принадлежность к кладе 2.3.4.4. Однако, в отличие от кандидатных вакцинных штаммов клады 2.3.4.4 2016–2017, и штамма A/wigeon/
Sakha/1/2014 (H5N8), выделенного ранее, все они относятся к группе B вирусов гриппа клады 2.3.4.4. Изученные штаммы показывают высокую степень
идентичности с кандидатными вакцинными штаммами клады 2.3.4.4, предложенными ВОЗ в 2018 году. При исследовании нуклеотидных последова-Вирусология

189

тельностей геномов выделенных штаммов с использованием Genetic Changes
Inventory и FluSurver был выявлен ряд мутаций, влияющих на антигенные
свойства вирусов и его вирулентность. Анализ выделенных штаммов выявил
наличие генетических маркеров (94S, 133A, 156A, 192K) в гене HA, обуславливающих потенцию для рецепторного взаимодействия с α2-6 остатками
сиаловых кислот. Также, в генах NS(142S, 103F, 106M), PB2 (L89V, G309D,
T339K, R477G, I495V, K627E, A676T) и M30 (30D and 215A) всех выделенных штаммах выявлены маркеры, обуславливающие высокую вирулентность
вирусов гриппа для мышей. В гене NS1 (205S, T47A) выделенных штаммов
выявлены маркеры, обуславливающие устойчивость к противовирусным
препаратам. При этом, по результатам дополнительного исследования нейраминидазной активности, все штаммы оказались чувствительны к антивирусным препаратам занамивир и озельтамивир. В гене NA штамма A/chicken/
Kostroma/1718/2017 (H5N2) было выявлено наличие делеции в 24 аминокислотных остатка в области «ножки» нейраминидазы.
ЗаключениеС момента первого случая выделения высокопатогенного вируса гриппа
клады 2.3.4.4 в России, данный вирус продолжает циркулировать в природе,приобретая в ходе эволюции новые свойства. Это было показано проведением
вирусологических и молекулярно-генетических исследований вирусов гриппа A(H5Nx), выделенных нами в различных регионах России. Результаты изучения антигенных свойств и филогенетический анализ Российских штаммов
A(H5Nx) показали высокое родство с рекоммендованным ВОЗ в 2018 годукандидатным вакцинным штаммом A/Fujian-Sanyuan/21099/2017-like (H5N6),
что подтверждает целесообразность создания вакцины на основе данного
штамма. Молекулярно-генетический анализ выделенных штаммов выявилряд мутаций, отвечающих за их высокую вирулентность для мышей. При этом,повышенная вирулентность штамма A/chicken/Kostroma/1718/2017 (H5N2)
может быть обусловлена комбинацией выявленных генетических маркеров
вирулентности в генах HA, NS1, PB2, PB2-F2, а также наличием делециив гене NA. Делеция в этом районе похожа на делецию в нейраминидазах
высокопатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N1), вызывающих гибель людей, и как показано экспериментально, увеличивающая вирулентность длямышей. Продолжающаяся циркуляция новых вирусов H5, включая вирусы
A(H5N8) и A(H5N2) с высокопатогенным генотипом и фенотипом для птици млекопитающих, представляют серьезную угрозу для сельского хозяйстваи общественного здравоохранения и подчеркивают важность постоянного
мониторинга вируса гриппа и изучения его биологических характеристик дляоценка риска распространения вирусов гриппа А(H5Nx).

Раздел 2190РЕКОМБИНАЦИОННАЯ КАССЕТА ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙС ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНОВ MGF110 *RECOMBINATION CASSETTE FOR OBTAINING AFRICAN SWINE
FEVER VIRUS WITH DELETION OF MGF110 GENES
К. А. Мима, Г. С. Кольцова, С. А. Каторкин, А. С. Малоголовкин
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр
вирусологии и микробиологии
K. A. Mima, G. S. Kolcova, S. A. Katorkin, A. S. Malogolovkin
FRCVM, Russia
E-mail: mima89@ya.ruАннотация
Получена рекомбинационная кассета pGEM/EGFP/MGF110 для делеции мультигенного семейства MGF110 вируса африканской чумы свиней. Кассета включаетв себя гомологичные нуклеотидные последовательности для рекомбинации и последовательность маркерного белка EGFP с p72 промотором.
Abstract
Recombinant cassette pGEM/GFP/MGF110 was obtained for deletion of the multigenic family 110 (MGF110) from the African swine fever virus. The cassette includes homologous nucleotide sequences for recombination and a sequence of EGFP marker proteinwith a p72 promoter.

Африканская чума свиней (AЧС) является одной из самых опаснейших
инфекционных заболеваний, влияющих на свиноводческую промышленность. Вирус АЧС может вызывать до 100 % летальности у домашних свиней.
AЧС эндемична в большинстве стран Африки к югу от Сахары и на острове Сардиния. С 2007 года AЧС распространилась из Грузии в Российскую
Федерацию и Восточную Европу, включая страны ЕС. Отсутствие вакцины
от AЧС ограничивает контроль данного заболевания. Возбудителем AЧС является сложный двухцепочечный ДНК вирус, геном которого содержит до
167 генов (L. Dixon et. аl., 2013). Интригующим аспектом является наличие
© К. А. Мима, Г. С. Кольцова, С. А. Каторкин, А. С. Малоголовкин, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-016-00216.

Вирусология

191

в геноме вируса АЧС пяти мультигенных семейств (MGF), расположенныхв левых и правых вариабельных областях генома. Они называются MGF100,-110, -300, -360 и -505/530 (С. Netherton et. аl., 2004). Ряд генов, экспрессируемых в локусах MGF360 и MGF530, определяет диапазон хозяина и вирулентность (J.Neilan et. аl., 2002), а белки семейства MGF110 теряются приадаптации вируса к перевиваемым клеточным линиям (S. Pires et. аl., 1997).
Предполагается, что MGF могут иметь значение при распространении AЧС
среди клещей. Клеточные функции большинства белков MGF в значительной степени неизвестны и трудно предсказуемы, поскольку белки демонстрируют ограниченную гомологию с белками хозяина. Так же может существовать аналогичная связь между экспрессией генов членов семейства
MGF110, диапазоном хозяев и вирулентностью вируса АЧС. Однако, в настоящее время нет данных о прямой корреляции между количеством копий
генов MGF110 и диапазоном восприимчивых хозяев или вирулентностью.
С целью изучения функций членов MGF110 было решено сконструировать
рекомбинатную кассеты и получить делеционный мутант вируса АЧС. В основе получения рекомбинатного вируса АЧС лежит гомологичная рекомбинация.
Для конструирования рекомбинантной плазмиды pGEM/GFP/
MGF110 были подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры кодирующие сайты рестрикции для клонирования в вектор pGEM-T
Easy (Promega, США). В качестве матрицы для ПЦР использовали штамм
«Волгоград 0110». Для наработки ПЦР-продуктов использовали высокоточную полимеразу с эндонуклеазной активностью Q5 High-Fidelity DNA
Polymerase (NEB, США). Далее ПЦР продукты очищали и обрабатывали
специфическими рестриктазами, после чего повторно очищали методом
этанольной преципитации и использовали для клонирования в вектор.
Дополнительно для облегчения скринирования рекомбинантного вирусана место удаленного мультигенного семейства в конструкцию так же былвведен маркерный ген ЕGFP с р72 промотором. Использование маркерного гена ЕGFP позволит проводить скрининг и селекцию мутантного вируса
АЧС Volgograd∆MGF110 от вируса дикого типа по средством флуоресцентной микроскопии. Правильность сборки рекомбинационной кассеты подтверждалась нуклеотидным секвинированием.
В дальнейшем планируется использовать полученную рекомбинационную кассету для одновременной инфекции и трансфекции с целью проведения гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация, скрининги селекция рекомбинантного вируса будут проводиться на перевиваемой
линии клеток COS-1.
Таким образом, получена рекомбинаная кассета для создания рекомбинатного вируса АЧС с делецией генов MGF110 и изучения их свойств.

Раздел 2192

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ВИРУСА
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ *HETEROGENEITY OF THE AFRICAN SWINE VIRUS
Д. Ю. Морозова, А. Р. Иматдинов, А. Д. Середа
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр
вирусологии и микробиологии
D. Y. Morozova, A. R. Imatdinov, A. D. Sereda
Federal Research Center of Virology and Microbiology, RussiaАннотация
Представлен краткий анализ данных о гетерогенности вируса АЧС, которая проявляется в различиях между изолятами и штаммами по патотиповой вариабельности
вирулентности, количественной гемадсорбции, сероиммунотиповому плюралитету,генотипическому многообразию. Сформулированы предложения по разработке единой системы классификации изолятов и штаммов вируса АЧС, и проведению исследований с кандидатными полисероиммунотипоспецифичными рекомбинантнымии ДНК-вакцинами.
Abstract
A brief analysis of the data on the heterogeneity of the ASF virus is presented, which
manifests itself in the differences between isolates and strains according to the pathogenicity variability of virulence, quantitative hemadsorption, seroimmunotype pluralty,
genotypic diversity. Proposals have been formulated to develop a unified system for theclassification of isolates and strains of the ASF virus, and to conduct studies with candidate
polyseroimmunotype-based specification recombinant and DNA vaccines.

Африканская чума свиней (АЧС) — вирусная, контагиозная, септическая
болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью. Вакцины против АЧСотсутствуют. Вирус АЧС отличает чрезвычайная гетерогенность, которая
проявляется в различиях между изолятами и штаммами по патотиповой вариабельности вирулентности, количественной гемадсорбции, сероиммунотиповому плюралитету, генотипическому многообразию [1].
Патотиповая вариабельность вирулентности проявляется в том, что в зависимости от свойств изолятов и штаммов вируса АЧС, способа и дозы за© Д. Ю. Морозова, А. Р. Иматдинов, А. Д. Середа, 2018.
*Исследования выполнены в рамках гранта РФФИ №18-316-00061.

Вирусология

193

ражения болезнь может протекать сверхостро, остро, подостро, хроническии бессимптомно.
Сравнительное исследование феномена гемадсорбции, проведенное с использованием различных штаммов вируса АЧС, показало их существенные
отличия по признакам количественной гемадсорбции и структуре вирусных
популяций в коррелятивной связи с вирулентностью. Установлено, что состав популяции каждого штамма гетерогенный, т. е. при микроскопическом
наблюдении в зараженной ими культуре клеток лейкоцитов свиней встречаются «плотная», «промежуточная», «рыхлая» гемадсорбция, причем,в различных их пропорциях. На основании исследования штаммов вирусаАЧС с различными биологическими характеристиками был сформирован
своеобразный «градиент» по степени вирулентности и гемадсорбирующей
активности. Аттенуированные (авирулентные) штаммы вируса АЧС характеризовались присутствием только субпопуляций, имеющих «рыхлый»и «промежуточный» типы гемадсорбции. Вирулентные — содержали только субпопуляции вируса с «промежуточным» и «плотным» типами гемадсорбции. Таким образом, количественная характеристика гемадсорбирующей
активности может рассматриваться как важный фенотипический признак
изолятов, штаммов, вариантов вируса АЧС [1].
Используя реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) и иммунологическую пробу на животных, Malmquist W. (1963) доказал существование семииммунологических и серологических типов изолятов, выделенных в Африке
[2]. Отечественные исследователи подтвердили, что результаты иммунологической типизации вируса АЧС заражением свиней, предварительно «вакцинированных» аттенуированными штаммами (биопроба), как правило, совпадают с их серотиповой характеристикой в РЗГАд. Около 100 «африканских»,«европейских», «южноамериканских» штаммов и изолятов вируса АЧС поданным сероиммунотипизации были разделены на 12 групп [3].
Обоснованность сероиммунотипой классификации вируса АЧС подтверждена идентификацией серотипоспецифического мажорного гликопротеина gp110-140 вируса АЧС [4]. Испанскими исследователями в ходе изучения генома вируса АЧС идентифицирована открытая рамка считывания(ОRF) ER402R, которая кодирует полипептид CD2v из 402 оснований, гомологичный адгезивному рецептору Т-клеток CD2. Делеция EP402R не влиялана скорость вирусного размножения in vitro, но лишала вирус способности
индуцировать адсорбцию свиных эритроцитов на поверхности инфицированных клеток. Экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом продукт
гена EP402R вызывал адсорбцию свиных эритроцитов в зараженных имклетках насекомых. Эти результаты свидетельствуют, что белок, кодируемый геном EP402R, прямо вовлечен в феномен гемадсорбции при инфици-194Раздел 2ровании чувствительных клеток вирусом АЧС. На основании совпадения
физико-химических свойств gp110-140 и CD2v сделан вывод, что испанскиеи российские исследователи имели дело с одним и тем же гликопротеином.
Действующая и широко признанная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС основана на методе генотипирования по секвенированию
478-нуклеотидного фрагмента из С-терминальной части гена B646L, кодирующего структурный белок р72 [5]. Проанализировав полученные в разное время десятки изолятов, отличных по географическому происхождениюи организму-хозяину, удалось выделить 23 основных генотипа вируса АЧС.
Самый крупный генотип включал изоляты, выделенные во время вспышек
болезни в Европе, Южной Америке, Западной Африке, странах Карибского
бассейна. Позднее были проведены исследования, которые позволили дополнительно дифференцировать изоляты внутри одного генотипа вируса
АЧС. Был предложен центральный вариабельный участок внутри открытой
рамки считывания гена 9RL. Например, внутри I генотипа было выявлено
12 различных вариантов длины амплифицированных фрагментов центрального вариабельного участка, четыре из которых соответствовали изолятам изЗападной Африки, а восемь — изолятам из тех стран, где заболевание являлось экзотическим, т. е. Южной Америки, Европы, Карибского бассейна. Наоснове анализа нуклеотидной последовательности фрагмента другого гена,B602L, 66 изолятов, относящихся к I генотипу, были разделены на 19 подгрупп [6]. Изоляты вируса АЧС, выделенные с 2007 г. по настоящее времяв Европе и Азии, отнесены ко II генотипу. Сравнение нуклеотидной последовательности генома изолята Georgia 2007/1 с другими изолятами вирусаАЧС показало, что он наиболее близок с африканским изолятом Mkuzi 1979,выделенным от клещей в Зулулэнде (ЮАР). Однако, филогенетический
анализ конкатенированных белковых последовательностей из 125 консервативных ORF приводит к кластеризации изолятов Georgia 2007/1 и Mkuzi
1979 с изолятами генотипа I. Таким образом, анализ филогении отдельных
белков не всегда соответствует кластеризации, наблюдаемой при сравнении
конкатенированных консервативных ORF. Полный анализ последовательности геномов дает более точную оценку филогенетических отношений посравнению с анализом по одной ORF, такой как B646L [6].
Ранее упоминалось, что белок gp 110-140 (он же CD2v) обладает свойством серотиповой специфичности. Malogolovkin et al. (2014) установили, чтофилогенетическое древо, построенное на основании анализа генов белков вируса АЧС CD2v и лектина C-типа, соответствует дифференциации изолятови штаммов по сероиммунотипам [7].
Исходя из вышеизложенного, предлагается разработать единую систему
классификации изолятов и штаммов вируса АЧС на основе его антигенных

Вирусология

195свойств, что потребует международной кооперации в определении референс-штаммов и стандартизации методик сероиммунотипизации. Представляется целесообразным экспериментально подтвердить возможность
определения сероиммунотипов изолятов вируса АЧС по гену CD2v-белка,и начать исследования по созданию экспериментальных полисероиммунотипоспецифичных рекомбинантных и ДНК-вакцин против вируса АЧС.
В данный момент нами проводится работа по изучению роли белка CD2v
(gp 110-140) в формировании иммунной защиты против АЧС, предполагающая конструирование рекомбинантного вируса АЧС, в составе генома
которого будут введены нуклеотидные последовательности этого белка отразличающихся по сероиммунотиповой специфичности аттенуированных
штаммов МК-200 и ФК-32/135 (III и IV сероиммунотип, соответственно).
Получены активные в РЗГАд антисыворотки свиней к вирусу АЧС III и IVсероиммунотипов. В качестве локуса гомологичной рекомбинации предложен ген вирусной тимидинкиназы (K196R). В результате анализа имеющихся в GenBank полногеномных последовательностей вируса АЧС IV сероиммунотипа и последовательностей гена EP402R подобраны олигонуклеотидные праймеры с введением искусственных сайтов эндонуклеаз рестрикциидля сборки кассеты интеграции.
Литература
1. Макаров В. В. Иммунологическая концепция африканской чумы свиней (некоторые итоги исследований). Ветеринарная практика, 2013, 62(3): 7–22.
2. Malmquist W. A. Serologic and immunologic studies with African swine fever
virus. Am. J. Vet. Res., 1963, 24: 450–459.
3. Середа А.Д, Балышев В. М. Антигенное разнообразие вируса АЧС. Вопросы
вирусологии, 2011, 4: 38–42.
4. Середа А. Д., Казакова А. С., Иматдинов А. Р., Колбасов Д. В. Гуморальныеи клеточно-опосредованные механизмы иммунитета при африканской чуме свиней.
Сельскохозяйственная биология, 2015, 50(6): 709–718.
5. Bastos A. D.S., Penrith M.-L., Crucière C., Edrich J. L., Hutchings G., Roger F.,
Couacy-Hymann E., Thomson G. R. Genotyping field strains of African swine fever virus
by partial p72 gene characterization. Arch. Virol., 2003, 148: 693–706.
6. Chapman D. A.G., Darby A. C., Da Silva M., Upton C., Radford A. D., Dixon
L. K. Genomic analysis of highly virulent isolate of African swine fever virus. Emerg.
Infect. Dis., 2011, 17(4): 599–605.
7. Malogolovkin А., Burmakina G., Titov I., Sereda A., Gogin A., Baryshnikova E.,
Kolbasov D. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups.
Emerg. Infect. Dis., 2015, 21(2): 312–315.

Раздел 2196ПРОИЗВОДНЫЕ 2-ТИОУРАЦИЛА — ИНГИБИТОРЫ
РЕПЛИКАЦИИ АДЕНОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА *2-THIOURACIL DERIVATIVES DOWNREGULATE HUMAN
ADENOVIRUS REPLICATION
Н. А. Никитенко 1, А. Н. Гейсман 2, В. Е. Мельникова 1, К. Н. Лысенко 2,
А. И. Тухватулин 1, А. А. Озеров 2, М. С. Новиков 2, Д. Ю. Логунов 1
1ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи
2ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный
медицинский университет»N. A. Nikitenko 1, A. N. Geisman 2, V. E. Melnikova 1, K. N. Lysenko 2,
A. I. Tukhvatulin1, A. A. Ozerov 2, M. S. Novikov 2, D. Y. Logunov 1
1

Gamaleya National Research Center for Epidemiology
and Microbiology, Russia
2
Volgograd State Medical University, Russia
E-mail: nanthalia@gmail.com

Аннотация
Аденовирусы человека вызывают инфекционные заболевания дыхательных путей, глаз, желудочно-кишечного тракта, мочевой и нервной систем. В настоящее
время методы лечения аденовирусных инфекций ограничены симптоматическойи поддерживающей терапией. Целью данной работы являлось исследование ингибиторной активности синтезированных нами новых производных 2-тиоурацилав отношении аденовирусов человека. Было показано, что производные 2-тиоурацила
ингибируют репликацию аденовирусов в микромолярном диапазоне концентраций,что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных средствдля лечения заболеваний, вызываемых аденовирусами.
Abstract
Human adenoviruses are a group of viruses that can cause the infections of the respiratory tract, eyes, intestines, urinary tract, and nervous system. Currently, specific therapy for© Н. А. Никитенко, А. Н. Гейсман, В. Е. Мельникова, К. Н. Лысенко, А. И. Тухватулин, А. А. Озеров, М. С. Новиков, Д. Ю. Логунов, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых — кандидатов
наук (МК-1746.2017.7).

Вирусология

197

adenovirus infection, other than supportive and symptomatic treatment, is not available.
Therefore, we propose here to assess the anti-adenoviral activity of newly synthesizedthiouracil derivatives. We have shown that 2-thiouracil derivatives inhibit adenoviral replication in the low micromolar range and thus can be considered for the development ofdrug candidate to treat adenovirus infections.

Аденовирусы человека (HAdV) — безоболочечные вирусы, геном которых представлен линейной несегментированной двухцепочечной ДНК.
Для аденовирусных инфекций характерен широкий спектр распространения и высокая контагиозность. Заболеваемости ими подвержены люди всехвозрастных групп. Аденовирусы человека чаще всего поражают различные
участки слизистой, включая ткани глаз, дыхательные и мочеполовые пути,а также желудочно-кишечный тракт. Особую опасность аденовирусные инфекции представляют для пациентов с нарушениями иммунной системы:в этих случаях аденовирусы могут вызывать развитие острых инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу. Существующие подходы к лечению заболеваний, вызываемых аденовирусами, ограничены симптоматической и поддерживающей терапией.
Таким образом, целью настоящего исследования является разработка,синтез новых 2-тио производных урацила и исследование их противоаденовирусной активности.
На первом этапе работы был осуществлен синтез библиотеки 2-тио производных урацила. Было выявлено, что часть полученных соединений обладает ингибиторной активностью в отношении HAdV. В результате изучения
закономерностей структура-противовирусная активность была определена
стратегия оптимизации структуры соединений, а также методы их синтеза.
На втором этапе скрининга была исследована активность оптимизированных производных 2-тиоурацила.
Ингибиторное действие соединений оценивали по определению количества копий генома HAdV5. Вначале клетки линии НЕК293 заражали
HAdV5 с множественностью инфекции 1 БОЕ/клетку. Через 3 ч после заражения к клеткам добавляли соединения в концентрациях 0,5, 2,5, 5, 10,15 и 25 мкМ. ПЦР для определения количества копий генома HAdV 5 проводили через 24ч. Цитотоксичность оценивали с помощью метода прижизненного окрашивания данных клеток бромидом 3-[4,5-диметилтиазолил-2]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) через 48 ч после внесения веществ.
В результате были определены два соединения-лидера z556 и z557, обладающих выраженным противовирусным действием и не оказывающим
токсического действия на клетки линии НЕК293. Концентрация полумаксимального ингибирования составляла 0,06 мкМ и 0,33 мкМ для z556 и z557 со-198Раздел 2ответственно. Полумаксимальная цитотоксическая концентрация составляла 405,7 мкМ и 172,7 мкМ, а индекс селективности 6761,7 и 523,3 для
z556 и z557 соответственно.
Таким образом, были выявлены ингибиторы репликации HAdV, являющиеся потенциальными лекарственными средствами для борьбы с аденовирусными инфекциями.

Вирусология

199

РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ
ГРИППА А/H3N2 И А/H9N2, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ
В 2017–2018 ГГ. В РОССИИ
RECEPTOR SPECIFICITY OF INFLUENZA VIRUSES
A/H3N2 AND A/H9N2 CIRCULATED IN 2017–2018 IN RUSSIA
Г. С. Онхонова, В. Ю. Марченко, С. В. Святченко, А. Б. Рыжиков *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
G. S. Onkhonova, V.Yu. Marchenko, S. V. Svyatchenko, A. B. Ryzhikov
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
E-mail: onhonova_gs@vector.nsc.ruАннотация
Целью данного исследования являлась оценка рецепторной специфичности изолятов вирусов гриппа типа А, выделенных и охарактеризованных в 2017–2018 гг.
в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В работе представлены результаты измерений констант диссоциации с помощью кинетического метода ИФА для двух актуальных штаммов — A/chicken/Primorsky Krai/03/2018 и A/swine/Irkutsk/155/2017.
В работе также приведены некоторые результаты, полученные с помощью поверхностного плазмонного резонанса, позволяющие оценить возможность применения
метода для оценки рецепторной специфичности вирусов гриппа.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the receptor specificity of influenza A viruses isolated and characterized in 2017–2018 at SRC VB “Vector” Rospotrebnadzor. The resultsof dissociation constants measurements using the kinetic ELISA method for the two actual
strains — A/chicken/Primorsky Krai/03/2018 and A/swine/Irkutsk/155/2017 are presented. The results of research using the surface plasmon resonance enabling to evaluate theopportunity of application of this method to analyze the influenza virus receptor specificity
are also presented.

Подтип A/H3N2 вируса свиного гриппа циркулирует по всему миру среди
домашних свиней, однако может инфицировать птиц, людей и другие виды.
В большинстве случаев заболевания у людей процесс инфицирования происходит в непосредственной близости от зараженных свиней или при посещении мест, где они находятся. Штамм вируса гриппа A/H9N2 относится к птичьим подтипам и является наиболее распространенным подтипом вируса* © Г. С. Онхонова, В. Ю. Марченко, С. В. Святченко, А. Б. Рыжиков, 2018.

200Раздел 2гриппа у птиц в Китае, следовательно, приводит к большим экономическим
потерям для птицеводческой отрасли. Зарегистрированы единичные случаи
заражения людей данным подтипом при контакте с инфицированной птицей.
Для оценки специфичности с аналогами рецепторов на поверхности чувствительных клеток, и, как следствие, рисков инфицирования человека выбранными штаммами вируса гриппа, были проведены измерения с помощью
кинетического метода ИФА. Известно, что птичьи штаммы вируса гриппав качестве рецепторов используют сиаловые кислоты со связью α2-3. Такого
рода рецепторы содержатся на эпителии желудочно-кишечного тракта птиц.
Человеческие штаммы вируса гриппа предпочтительнее связываются с рецепторами со связью α2-6, которые находятся на клетках эпителия верхних
дыхательных путей человека. На эпителии трахеи свиньи присутствуют обатипа рецепторов, поэтому помимо свиного гриппа, они могут быть инфицированы как штаммами птичьего гриппа, так и человеческого. Так как эпителий нижних дыхательных путей человека содержит также некоторое количество α2-3 связанных сиаловых кислот, существует риск заражения человека
птичьими и свиными штаммами. Как правило, это сопровождается различного рода осложнениями, вплоть до летального исхода. Поэтому очень важно
своевременно выявлять потенциально опасные для человека штаммы.
Образцы вируса гриппа были наработаны на растущих куриных эмбрионах и инактивированы β-пропиолактоном. Для эксперимента вирус очищали путем центрифугирования и гель-фильтрации. В качестве клеточных рецепторов были выбраны сиалозиды 3’-Sialyl-N-acetyllactosamine и 6’-SialylN-acetyllactosamine, содержащие необходимые сиаловые кислоты.
Параметром, характеризующим рецепторную специфичность, является
равновесная константа диссоциации, которая рассчитывалась по следующей формуле:k
Kd = − ,(1)k+где k– и k+ определяются как коэффициенты уравнения прямой:k = k+ [L0] + k–(2)полученной из выражения для равновесной концентрации комплекса лиганд-рецептор:[ R] [ L]=(3)[ LR ] K 0+ L 0 (1 − e−t (k+ L0 + k− ) ),d [ ]0где [LR] — концентрация комплексов лиганд-рецептор, [R]0 — общая концентрация рецепторов, [L]0 — общая концентрация лигандов, k+ — констан-201Вирусологията скорости прямой реакции, k– — константа скорости обратной реакции,t — время.
По результатам измерений выбранные штаммы вируса гриппа А показали более высокое связывание с аналогами рецепторов «птичьего» типа (см.
таблицу). Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют предполагать, что выделенные изоляты вирусов гриппа, циркулирующих в России
в 2017–2018 гг., не приобрели способности к устойчивой передаче от птици свиней человеку.
Равновесные константы диссоциации (Kd) для штаммов вируса
гриппа A/chicken/Primorsky Krai/03/2018, A/swine/Irkutsk/155/2017, (μM)Вирус
A/chicken/Primorsky Krai/03/2018
A/swine/Irkutsk/155/2017

3’SLN
1,6±1,137,2±19,06’SLN
17,5±9,6>300

Отдельной частью исследования был анализ рецепторной специфичности с помощью SPR-диагностики. Этот метод основан на явлении поверхностного плазмонного резонанса, которое происходит, когда свет под определенным углом отражается от тонкой металлической пленки в условиях
полного внутреннего отражения (ПВО). Свет возбуждает поверхностные
плазмоны в металле под определенным углом падения. Поле ПВО генерирует затухающую волну, которая распространяется по всей среде. Возбужденные плазмоны очень чувствительны к изменениям показателя преломления на поверхности тонкой металлической пленки, на которой происходит
связывание аналита и лиганда. Процесс можно наблюдать в реальном времени по так называемой сенсограмме. Измерения проводились на приборе
ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories).
На рис. 1 представлены кинетические кривые процесса комплексообразования вирионов гриппа A/Anhui/01/2013 (H7N9) c белком фетуином, содержащим оба типа рецепторов. Как видно из графика уровень сигнала
ниже, чем у буферного раствора.
В качестве другой модели лиганд-рецепторного связывания использовали
сплит-вакцину Ваксигрип, которая не содержит вирусных частиц, а состоитиз очищенных молекул гемагглютинина трех штаммов вируса гриппа. В этомслучае кинетические кривые связывания гемагглютинина с белком фетуином
адекватно описывают процессы ассоциации и диссоциации (рис. 2). Равновесная константа диссоциации в данном случае Kd = 1,5 ± 0,2 нМ.
Проведенные исследования показали, что для изучения лиганд-рецепторного взаимодействия новых вирусов гриппа необходимо проводить дополни-202Раздел 2тельную подготовку образцов вируса гриппа для выделения и очистки молекул гемагглютинина, несущих рецепторсвязывающий участок. Использование
цельных вирионов при измерении лиганд-рецепторного взаимодействия возможно при изучении кинетики процесса методом ИФА, но не с помощью SPR.
Полученные результаты по измерению равновесных констант диссоциации сиалозидов 3’SLN и 6’SLN и вирионов вируса гриппа птиц A/
chicken/PrimorskyKrai/03/2018 (H9N2) и вируса гриппа свиней A/swine/
Irkutsk/155/2017 (H3N2) позволяют сделать вывод о доминирующей специфичности этих вирусов гриппа животных по отношению к «птичьему» типусиаловых рецепторов 3’SLN.

Рис. 1. Кинетические кривые процессов ассоциациии диссоциации вируса гриппа с аналогами рецепторов

Рис. 2. Кинетические кривые процессов ассоциациии диссоциации Ваксигрипа с аналогами рецепторов

Вирусология

203ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ
ВИРУСОВ ГРИППА А(H3N2), ЦИРКУЛИРОВАВШИХВ РОССИИ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ СЕЗОН 2017–2018 ГГ. *ANTIGENIC AND ISOLATING PROPERTIES OF THE RECENT HUMAN
INFLUENZA A(H3N2) VIRUSES IN RUSSIAN FEDERATION
IN THE EPIDEMIC SEASON 2017–2018
П. А. Петрова, Н. И. Коновалова, Д. М. Даниленко,А. Д. Васильева, М. Ю. Еропкин
ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России
E-mail: suddenkovapolina@gmail.com
Аннотация
Вирусы гриппа в настоящее время остаются одними из самых распространенныхи неуправляемыми инфекциями. Вирусы гриппа А(H3N2) человека имеют наибольшую скорость эволюционной изменчивости. Антигенный анализ вирусов гриппа
данного подтипа позволяет выбрать вакцинный компонент на предстоящий эпидемический сезон.
Abstract
Influenza viruses nowadays are still of great economic and social threat. Influenza
A(H3N2) viruses has the highest rate of evolutionary variability. Antigenic analysis of influenza virus use for selection of candidate vaccine viruses for the production of influenza
vaccine for the upcoming epidemic season.

Вирусы гриппа А(H3N2) ежегодно являются одними из основных инфекционных агентов сезонных эпидемий гриппа и приводят к тяжелым случаям
заболевания с развитием большого количества осложнений у лиц, относящихся к группам высокого риска. Несмотря на значительные успехи в разработке
противовирусных химиопрепаратов, основным инструментом контроля надгриппозными эпидемиями остается вакцинация. Вирусы гриппа А(H3N2) отличаются самым высоким уровнем антигенной изменчивости, и демонстрируют высокую гетерогенность циркулирующих штаммов. Своевременное
выявление антигенно новых вариантов является важной и актуальной задачейв надзоре за гриппозной инфекцией. За последнее время у представителей
© П. А. Петрова, Н. И. Коновалова, Д. М. Даниленко, А. Д. Васильева,М. Ю. Еропкин, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке стипендии Президента Российской
Федерации молодым ученым и аспирантам (Конкурс СП-2018).

Раздел 2204данного подтипа вирусов гриппа человека произошли изменения рецепторных
свойств, что осложнило выделение и дальнейший антигенный и генетический
анализы. Многие исследователи отмечают, что вирусы, выделенные на клетках MDCK, несут аминокислотные замены в 148 или 151 положении в поверхностном белке нейраминидазе, что может оказывать влияние на их антигенные
свойства. Для объективной оценки изменчивости этих вирусов ВОЗ рекомендует осуществить
переходс клеточнойMDCKна MDCK-Siat1
Для оценки
антигенных
свойств культуры
вирусов гриппа
А(H3N2)производили в лапараллельное
выделение штаммов
назофарингиальных
мазков наклеточных
культурахКлетбораторном
использовании
приизисследовании
вирусов
гриппа
А(H3N2).
MDCK и MDCK-Siat1(полученнойповышенноеиз СЦ ВОЗ в количество
Лондоне, Великобритания).
Далее чтоки MDCK-Siat1экспрессируют
α2,6-рецепторов,проводили идентификацию вирусов гриппа и их антигенный анализ в реакции
теоретически
существенно
повысить
эффективность антисывороток,выделения вируторможения должно
гемагглютинации
спанелью
диагностическихВОЗ подтипа.
для идентификации
вирусов
гриппа
человекакультурыи панелью крысиных
совпредоставляемых
гриппа данного
Однако,ведение
даннойна практике
антисывороток, полученных к широкому спектру современных вирусов гриппа человека
оказывается
существенно
болеедорогостоящим,
чем
MDCK,
из-за
необходиА(H3N2). Перед проведением антигенного анализа в РТГА ставили реакцию
гемагглютинациив присутствии
20 нМ озельтамивира
карбоксилата,в результате
мостииспользования
селективного
антибиотика
Генитицина.
Такжечего
многие
производили
отбор штаммов,имеющих
подходящийлинии,титр дляне
проведения
РТГА.
Штаммы,вирусы,выделенные
наданной
клеточной
имеютгемагглютинирукоторые имели пониженный титр гемагглютинации анализировали с помощью реакции
ющеготитра, но вызывают значительный цитопатический эффект. Свойства
микронейтрализации.
В эпидемическом
сезоне 2017-2018для выделения вирусов
гриппа
данного
данных изолятов
невозможно
оценить гг.
стандартными
методамии дляних исподтипа было взято 75 проб. На клеточной культуре MDCK было выделено 54 изолята, напользуется
болеетрудоемкий
метод—реакция
микронейтрализации.
MDCK-Siat1 60 изолятов.
При последующей
постановкев присутствиинМ озельтамивираДля оценки
антигенных
свойствРГА
вирусов
гриппа 20
А(H3N2)производили
карбоксилата выделение
было показано,что у 55,4%
штаммов 2017-2018 гг. мазков
выделения
параллельное
штаммов
изназофарингиальных
натитр
клеточоставался без изменений, в то время как в 2016-2017 эпидемическом сезоне таким титром
ныхобладали
культурахи MDCK-Siat1(полученнойиз СЦ эпидемическогоВОЗ в Лондоне,толькоMDCK
31,4% штаммов.
Большинство
штаммов 2016-2017сезона – 88,6%, не Далее
сохраняли
свой титр в идентификацию
присутствии ингибитора
нейраминидазы
Великобритания).
проводили
вирусов
гриппа– и ихозельтамивира в буфере. В прошедшем эпидемическом сезоне титр уменьшался у 44,6%
антигенный
анализв реакции
торможенияс панелью
штаммов. Падение
титранаблюдаласькак у штаммов,гемагглютинации
выделенных на клеточной
культуре диMDCK-Siat1, так у вирусов, выделенных и пассированных на MDCK.
в 64 раза
в 32 раза
в 16 раз
в 8 раз
в 4 раза
в 2 разабез изменений
0%

10%

20%

2017-2018

30%

40%

50%

60%

2016-2017

Рис. 1 Зависимость
падения гемагглютинирующего
титра
в РГА
вирусов А(H3N2)
Зависимость
падения гемагглютинирующего
титра
в РГА
вирусов
А(H3N2)от присутствия 20 нМ озельтамивира карбоксилатаот присутствия 20 нМ озельтамивира карбоксилата

Таким образом, можно сделать вывод, что антигенный анализ большинства
выделенных штаммов стандартными методами затруднен.
Вирусы, выделенные на разных клеточных культурах, показали сходные
результаты в РТГА и микронейтрализации. По результатам антигенного анализа, вирусов
А(H3N2) эпидемического сезона 2017-2018 гг. было выявлено, что большинство штаммов

Вирусология

205агностических антисывороток, предоставляемых ВОЗ для идентификации
вирусов гриппа человека и панелью крысиных антисывороток, полученныхк широкому спектру современных вирусов гриппа человека А(H3N2). Перед
проведением антигенного анализа в РТГА ставили реакцию гемагглютинации в присутствии 20 нМ озельтамивира карбоксилата, в результате чегопроизводили отбор штаммов, имеющих подходящий титр для проведения
РТГА. Штаммы, которые имели пониженный титр гемагглютинации анализировали с помощью реакции микронейтрализации.
В эпидемическом сезоне 2017–2018 гг. для выделения вирусов гриппа
данного подтипа было взято 75 проб. На клеточной культуре MDCK быловыделено 54 изолята, на MDCK-Siat1 60 изолятов.
При последующей постановке РГА в присутствии 20 нМ озельтамивира
карбоксилата было показано, что у 55,4 % штаммов 2017–2018 гг. выделения титр оставался без изменений, в то время как в 2016–2017 эпидемическом сезоне таким титром обладали только 31,4 % штаммов. Большинство
штаммов 2016–2017 эпидемического сезона — 88,6 %, не сохраняли свойтитр в присутствии ингибитора нейраминидазы — озельтамивира в буфере.
В прошедшем эпидемическом сезоне титр уменьшался у 44,6 % штаммов.
Падение титра наблюдалась как у штаммов, выделенных на клеточной культуре MDCK-Siat1, так у вирусов, выделенных и пассированных на MDCK.
Таким образом, можно сделать вывод, что антигенный анализ большинства выделенных штаммов стандартными методами затруднен.
Вирусы, выделенные на разных клеточных культурах, показали сходные
результаты в РТГА и микронейтрализации. По результатам антигенного анализа, вирусов А(H3N2) эпидемического сезона 2017–2018 гг. было выявлено, что большинство штаммов относятся к антигенной группе современного референс-штамма А/Сингапур/INFIMH-16-0019/16, реагируя с антисывороткой к данному вирусу до 1-1/2 гомологичного титра. Также изоляты
взаимодействуют до 1-1/4 с антисывороткой к штамму, рекомендованномудля вхождения в состав противогриппозных вакцин — А/Гонконг/4801/14.
Однако, в настоящее время антигенно различить штаммы, входящие в различные подгруппы генетического клайда 3с.2а практически невозможно.
Подводя итог, хочется отметить, что антигенный анализ позволяет подробно и четко охарактеризовать свойства и эволюционную изменчивость
вирусов гриппа. Эти данные помогают наглядно оценить антигенное соответствие циркулирующих в популяции штаммов с вирусами-кандидатами, включенными в состав противогриппозных вакцин на эпидемический
сезон. Более полное и детальное исследование свойств вирусов А(H3N2)
позволит повысить качество отбора штаммов-кандидатов для противогриппозных вакцин.

Раздел 2206РАЗРАБОТКА СПЕЦИФИЧНЫХ РЕАЛ-ТАЙМ ПЦРТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СЕРОТИПА
ВИРУСА ЯЩУРА ASIA1
DEVELOPMENT OF TAILORED SPECIFIC REAL-TIME PCR ASSAYSFOR DETECTION OF FMDV SEROTYPE ASIA1
М. А. Садуакасова 1, А. А. Султанов 1, К. Б. Банковска 2 *1

ТОО «Казахский научно-исследовательский
ветеринарный институт»2Пирбрайт Институт

M. A. Saduakassova, A. A. Sultanov, “KazSRVI” LLP, Kazakhstan
K. B. Bankowska, The Pirbright Institute, United Kingdom
E-mail: sadumeru_87@mail.ruАннотация
Ящур эндемичен на большей части Азии и Западной Евразии, где вспышки
очага из-за циркулирующего серотипа Asia 1 регулярно сообщаются у домашнего
скота. Из них в Казахстане ранее были обнаружены серотипы O (линии ME-SA/PanAsia и ME-SA/PanAsia-2) и A (линии ASIA/Iran-05 и ASIA/Sea-97). Тем не менее,все еще есть пробелы в понимании передвижении вируса ящура. Вирус ящура
является эндемичным заболеванием во многих странах близлежащих с Казахстаном,которые известны своей быстрой и непредсказуемой экспансией в новые
географические регионы. Поэтому в дополнение к штаммам вируса ящура, ранее
описанным в Казахстане, Asia1/ASIA/Sindh-08 генетическую линию также следует
рассматривать как угрозу для сельскохозяйственной отрасли Казахстана. С целью
облегчения идентификации генетической линии Sindh-08 разработана ОT-ПЦР тестсистема, определяющая специфичную генетическую линию Asia1.
Abstract
FMD is endemic across much of Asia and West Eurasia where field outbreaks due toco-circulating serotypes O, A and Asia 1 are regularly reported in domesticated livestock.
Of these, serotypes O (ME-SA/PanAsia and ME-SA/PanAsia-2 lineages) and A (ASIA/
Iran-05 and ASIA/Sea-97 lineages) have been previously detected in Kazakhstan. However, there are still gaps in the understanding of virus movements. The FMD viruses currently
circulating in countries in the neighbourhood of Kazakhstan are known for their rapid andunpredictable expansion into new geographical areas. Therefore, in addition to the FMDV
strains previously reported in Kazakhstan the Asia1/ASIA/Sindh-08 additional viral lin* © М. А. Садуакасова, А. А. Султанов, К. Б. Банковска, 2018.

Вирусология

207

eage should be considered as a threat to Kazakhstan’s agricultural industry. To facilitate
identification of Sindh-08 lineage a real-time RT-PCR assay detecting a specific FMDV
lineage of Asia1 was designed and validated.

The causative agent of foot and mouth disease belongs to the genus Aphthovirus, family Picornaviridae in the taxonomy of viruses. It has 7 typicalvariants: A, O, Asia-1, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3. Animals, infected by one serotype of foot-and-mouth disease virus, can be affected again with anothertype variant of the virus. Therefore, each serotype of foot-and-mouth diseasemust be considered as a separate noso unit and take appropriate preventive
and combat measures. In addition, for each serotype of foot and mouth diseasevirus, during the circulation in nature (reproduction in the body of various
species of animals and animals with different specific and nonspecific immune
status), lineage appears that differ significantly and insignificantly in antigenic
and genetic relationship.
VP1 sequence data, including historical and current strains of FMDV, werealigned, analysed and conserved regions were identified as targets for individual
lineage-specific assay. Multiple primers and probes for each of the assays were
designed according to TaqMan specification and tested for diagnostic sensitivity
and performance. Best assay candidates were selected and validated with a panelof field samples at the Pirbright Institute, UK and the Kazakh Scientific-ResearchInstitute, Kazakhstan.
Sindh-08 lineage-specific RT-PCR assay for detection of FMDV strains circulating in Asia were designed; to detect FMDV the Asia1/ASIA/Sindh-08 lineage. This assay was shown to correctly identify FMDV lineage in a panel offield and tissue cultured samples originated from Asia. Mixed serotype samples
could also be identified using the system. In addition, FMDV positive samples
which could not be propagated in tissue culture were investigated and, in manycases, the serotype of the samples could be determined. The assay developed
have been shown to be of a similar efficiency to the “gold standard” 3D assay(Callahan at al., 2002).
Real-time RT-PCR assay was developed able to determine the serotype
Asia1/ASIA/Sindh-08 of FMD viruse circulating in Asia. This assay can aid
molecular epidemiology of FMDV and help to inform FMDV control policyin the region. The system could be also adapted to field diagnostic platforms
aiding transfer of technology and use in the countries concerned.
Accurate and timely diagnosis of FMD using laboratory tests provides vital
support to surveillance and disease control programmes. Molecular assays suchas real-time RT-PCR are now established as front-line tests, and are widely used
for routine diagnosis in most Reference Laboratories.

Раздел 2208ПОЯВЛЕНИЕ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, ОПОСРЕДОВАННОЙ
НЕЙРАМИНИДАЗОЙ, ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
СЕЗОННЫХ ШТАММОВ A(H3N2)
В КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ MDCKNEURAMINIDASE-MEDIATED HEMAGGLUTINATION, ARISINGDURING SEASONAL INFLUENZA A(H3N2) VIRUSES PROPAGATIONIN MDCK CELLS
С. В. Святченко, А. Г. Дурыманов, Н. П. Колосова, А. Н. Швалов,Н. И. Гончарова, И. М. Суслопаров, А. С. Гудымо, В. Ю. Марченко,Т. В. Трегубчак, А. Б. Рыжиков, Т. Н. Ильичева *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
S. V. Svyatchenko, A. G. Durymanov, N. P. Kolosova, A. N. Shvalov,
N. I. Goncharova, I. M. Susloparov, A. S. Gudуmo, V. Y. Marchenko,
T. V. Tregubchak, A. B. Ryzhikov, T. N. Ilyicheva
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотация
Пассирование сезонных вирусов гриппа A(H3N2) в культуре клеток MDCK может приводить к появлению аминокислотных замен D151G и D151N в нейраминидазе и возникновению у нейраминидазы способности к гемагглютинации.
Abstract
Seasonal influenza A(H3N2) viruses propagation in MDCK cells can result in D151G
and D151N mutations in neuraminidase, which are associated with neuraminidase-mediated hemagglutination.

На протяжении последних 20 лет наблюдается сужение спектра видового
разнообразия эритроцитов, которые сезонный вирус гриппа A(H3N2) способен агглютинировать. Если ранее в спектр входили эритроциты петуха,индейки, морской свинки, то с 2001 года вирусами A(H3N2) была утеряна
способность к гемагглютинин-опосредованной агглютинации эритроцитов
петуха, с 2005 года — индейки, а значительная доля циркулирующих в настоящее время штаммов из клады 3С.2а не способна агглютинировать даже* © С. В. Святченко, А. Г. Дурыманов, Н. П. Колосова, А. Н. Швалов, Н. И. Гончарова, И. М. Суслопаров, А. С. Гудымо, В. Ю. Марченко, Т. В. Трегубчак, А. Б. Рыжиков, Т. Н. Ильичева, 2018.

Вирусология

209эритроциты морской свинки. Тем не менее, проведение нескольких пассажей вирусов A(H3N2) в культуре клеток MDCK позволяет получать вирусные препараты, у которых появляется способность к агглютинации, которая
пропадает при добавлении ингибитора нейраминидазы осельтамивира. Данный феномен ассоциируют с появлением при культивировании в нейраминидазе аминокислотных замен D151G или D151N, отсутствующих в вирусеиз первичного материала. Было показано, что наблюдаемая в данном случае
осельтамивир-чувствительная агглютинация обусловлена не гемагглютинином, а нейраминидазой. Данные аминокислотные замены приводят к тому,что в непосредственной близости от каталитического центра нейраминидазы возникает дополнительный сайт связывания сиаловых кислот, в котором
происходит связывание сиаловых кислот, устойчивых к гидролитической
активности фермента. При этом ферментативная активность нейраминидазы не страдает: она по-прежнему остается способной отщеплять терминальные сиаловые кислоты, являющиеся рецепторами для гемагглютинина,обеспечивая тем самым выход вирионов из инфицированной клетки. В связи с тем, что возникающий сайт связывания находится вблизи от активного
центра фермента, добавление конкурентных ингибиторов нейраминидазы,блокирующих каталитический центр, приводит к ингибированию не только
гидролитической активности фермента, но и агглютинации, опосредованной нейраминидазой [1].
Селекцию вирусной субпопуляции, имеющей в нейраминидазе аминокислотные замены D151G и D151N, связывают с пассированием вирусав культуре клеток MDCK. Было показано, что на протяжении последних нескольких лет сродство гемагглютинина вирусов A(H3N2) к α2,6-связанным
сиаловым кислотам, рассматривающимся в качестве основных рецепторовдля сезонных штаммов вируса гриппа А в верхних дыхательных путях человека, постепенно снижается [1]. Концентрация целевых α2,6-связанных
рецепторов на поверхности клеток MDCK считается относительно невысокой, что связано с присутствием на их поверхности еще и α2,3-связанных сиаловых кислот. При выделении вирусов A(H3N2) в условиях, когда
концентрация рецепторов недостаточна, а сродство к ним снижено, штаммы, способные связываться с клеткой не только через гемагглютинин, нои через нейраминидазу, получают преимущество в репродукции. Данный
феномен затрудняет проведение антигенной характеристики гемагглютинина выделенных в системе MDCK вирусов с помощью реакции торможения
гемагглютинации, являющейся ключевым методом сопоставления антигенных свойств циркулирующих штаммов со штаммами входящими в вакцину,по результатам которого может быть принято решение по смене штаммовв составе вакцины. Факт наличия торможения гемагглютинации таких пас-

210Раздел 2сажей референсной сывороткой будет характеризовать антигенные свойстване гемагглютинина, а нейраминидазы. По существующим на сегодняшний
день представлениям, именно наличие антител к гемагглютинину считается
наиболее значимым протективным фактором, поэтому при выборе вакцинного штамма в первую очередь рассматриваются характеристики гемагглютинина. В связи с этим, в Сотрудничающих центрах ВОЗ по гриппу на протяжении последних нескольких лет стало внедряться рутинное добавление
20 nM осельтамивира при постановке РТГА с вирусами A(H3N2), позволяющее ингибировать агглютинацию, опосредованную нейраминидазой, сохраняя гемагглютинин-зависимую гемагглютинацию.
Начиная с эпидемического сезона 2016–2017 в отделе зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора также стало
проводиться сравнение способности выделенных нами штаммов A(H3N2)
агглютинировать эритроциты морской свинки в присутствии осельтамивираи без него. В эпидемическом сезоне 2016–2017 гг. в культуре клеток MDCKнами было выделено 76 изолятов вируса гриппа A(H3N2). При этом на первом пассаже подавляющее большинство из них не агглютинировало эритроциты морской свинки, агглютинация появлялась лишь на втором или третьем пассаже. Для 18 штаммов была определена полногеномная нуклеотидная
последовательность с использованием секвенирования нового поколения наплатформе MiSeq, Illumina. Все 18 штаммов были отнесены к генетической
кладе 3C.2a. Был проведен анализ полиморфизмов в гене нейраминидазы.
У пяти штаммов было выявлено наличие субпопуляции с аминокислотной
заменой D151N. Еще у двух штаммов были представлены субпопуляции,имеющие в положении 151 три различных аминокислоты: D (аспартат),N (аспарагин) и G (глицин). Для штаммов были определены гемагглютинационные титры с эритроцитами морской свинки с добавлением 20 нМосельтамивира и без него. Снижение титра в присутствии осельтамивира
наблюдалось именно среди штаммов, имеющих полиморфизм в положении
151 (см. таблицу).
Таким образом, было показано, что изоляты циркулирующих на территории Российской Федерации вирусов A(H3N2), выделенные в культуре клеток MDCK, могут содержать аминокислотные замены D151G и D151N, ассоциируемые с возникновением гемагглютинации, опосредованной нейраминидазой. Пренебрежение данным фактом может приводить к ошибочным
заключениям при проведении антигенной характеристики штаммов в РТГА.
В связи с этим важным является добавление осельтамивира при постановке
РТГА со штаммами A(H3N2). Следует также внедрять иные способы антигенной характеристики, такие как микронейтрализация. Кроме того, возникновение при культивировании на MDCK аминокислотных замен в активном

211Вирусология

Соотношение субпопуляций вирусов A(H3N2),
имеющих разные аминокислотыв позиции 151 нейраминидазы (MiSeq, Illumina)№Штамм A(H3N2)

Доля популяции c дан�ной аминокислотой в по- Снижение гемагглютиложении 151 нейрамини- национного титра придобавлении осельтадазы (%)мивира (20 нM)
D
N
G

1

A/Samara/640/2016

73,6

26,3

–

есть

2

A/Samara/711/2016

98,2

1,8

–

нет

3

A/Stavropol/3/2017

46,6

53,2

–

есть

4

A/Stavropol/4/2017

98,5

–

1,4

нет

5

A/Voronezh/1/2017

99,2

–

–

нет

6

A/Noyabrsk/7/2016

99,6

–

–

нет

7

A/Kurgan/24/2016

99,7

–

–

нет

8

A/NovyUrengoy/1329/2016

99,3

–

–

нет

9

A/Ekaterinburg/3/2017

35,1

40,1

24,5

есть

10

A/Novosibirsk/01/2017

79,3

20,6

–

Не агглютинирует

11

A/Novosibirsk/04/2017

71,1

2,3

26,5

есть

12

A/Novosibirsk/D1/2016

95,2

4,7

–

есть

13

A/Omsk/4150/2016

97,2

2,6

–

нет

14

A/Krasnoyarsk/22/2017

99,8

–

–

нет

15

A/Krasnoyarsk/1430/2017

89,2

10,8

–

есть

16

A/Krasnoyarsk/1807/2017

99,5

–

–

Не агглютинирует

17

A/Surgut/73/2017

99,7

–

–

нет

18

A/Chita/927/2017

99,5

–

–

нет

сайте нейраминидазы, к которому относится положение 151, может приводить к возникновению резистентности к антинейраминидазным препаратам
[2]. В связи с этим, Сотрудничающими центрами ВОЗ рекомендуется длявыделения вирусов H3N2 использование клеточной линии MDCK-SIAT, по-Раздел 2212лученной генно-инженерным методом и характеризующейся повышенным
содержанием на поверхности клеток α2,6-связанных сиаловых кислот, культивирование на которой не приводит к селекции популяций вирусов с описанными аминокислотными заменами.
Литература
1. Y. P. Lina, X. Xionga, S. A. Whartona et al. Evolution of the receptor binding
properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin // PNAS. 2012. Vol. 109, N 52.
P. 21474–21479.
2. Mishin V. P., Sleeman K., Levine M. Et al. The effect of the MDCK cell selected neuraminidase D151G mutation on the drug susceptibility assessment of influenza A(H3N2) viruses // Antiviral Res. 2014. N 101. P. 93–96.

Вирусология

213ФИЛОГЕНЕЗ ГЕНОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНАИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ШТАММА
ВИРУСА ГРИППА А (Н5N1), ВЫДЕЛЕННОГООТ ЧАЙКИ В КАЗАХСТАНЕ В 2015 Г.
PHYLOGENESIS OF HEMAGGLYUTININ AND NEURAMINIDASESGENES OF HIGHLY PATHOGENIC INFLUENZA A (H5N1) VIRUS,
ISOLATED FROM GULL
IN KAZAKHSTAN IN 2015
С. А. Сулейменова, К. Х. Жуматов, А. И. Кыдырманов,К. О. Карамендин, Е. Я. Хан, Е. Т. Касымбеков,К. Д. Даулбаева, М. Х. Саятов *ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии», г. АлматыS. A. Suleymenova, K. Kh. Zhumatov, A. I. Kydyrmanov, K. O. Karamendin,
E. Ya. Khan, E. T. Kasymbekov, K. D. Daulbayeva, M. Kh. Sayatov
LLP “SPC of Microbiology and Virology”, AlmatyАннотацияВ статье представлены результаты филогенетического анализа генов поверхностных белков — гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А подтипа H5N1,
изолированного от чайки на территории Республики Казахстан в 2015 г. Делается
вывод о необходимости постоянного мониторинга орнитофауны Казахстана с целью
изоляции текущих вариантов возбудителей.
Abstract
The article presents the results of phylogenetic analysis of surface protein hemagglutinin
and neuraminidase genes of influenza A virus of H5N1 subtype isolated from gull in the
territory of the Republic of Kazakhstan in 2015. It is concluded that it is necessary to continuously monitor the avifauna of Kazakhstan in order to isolate current variants of pathogens.

Птицы водного и околоводного комплексов играют основную роль в сохранении вирусов гриппа A в биосфере. От них изолированы все известныедля науки разновидности патогенов, вызвавших пандемии и эпизоотии, ониявляются резервуаром и источником возникновения новых вариантов возбудителей [1, 2, 3].
* © С. А. Сулейменова, К. Х. Жуматов, А. И. Кыдырманов, К. О. Карамендин,Е. Я. Хан, Е. Т. Касымбеков, К. Д. Даулбаева, М. Х. Саятов, 2018.

214Раздел 2Классификация вирусов гриппа А базируется на антигенных различияхНА и NА, выявляемых в серологических реакциях с помощью иммунных
сывороток, а также в ПЦР с использованием специфических праймеров;к настоящему времени идентифицированы 18 подтипов НА и 11 — NА.
Вирусы гриппа А подтипа Н5 занимают особое место в современной
эпидемиологии. Ранее считалось, что возбудители гриппа птиц, как правило, не распространяются среди людей. События, произошедшие на рубеже XXI века в странах Юго-Восточной Азии и на европейском континенте,опровергли это представление. На эпидемическую арену вышел «птичий»грипп H5N1, по данным ВОЗ с мая 1997 г. по 2 марта 2018 г. из 860 случаевс официально подтвержденным диагнозом гриппа А (H5N1) у людей 454 завершились летальным исходом [4].
В РК в 2014–2016 гг. от диких птиц выделены 8 изолятов вируса гриппа
А/Н5 [5]. Целью настоящего исследования явилось определение таксономической принадлежности казахстанского изолята вируса гриппа А (Н5N1),
выделенного от дикой птицы в Западном Казахстане.
Вирус гриппа А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1), выделенный от чайки в Западном Казахстане, клонировали и пассировали методом предельных разведений на 10–11-дневных развивающихся куриных
эмбрионах по общепринятой методике.
Экстракцию РНК проводили с использованием набора QIAamp Viral
RNA Mini kit (Qiagen GmbH, Hilden) в соответствии с рекомендациями производителя.
Комплементарные ДНК из РНК получали методом обратной транскрипции при помощи универсального праймера uni-12 для вирусов гриппа А изнабора First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas) согласно наставлений
производителя.
ДНК секвенировали в ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии» с использованием терминирующих дидеоксинуклеотидов на автоматическом
8-капиллярном секвенаторе ABI 3500 DNA analyzer (Applied Biosystems).
Выравнивание последовательностей генома вируса гриппа А с полными нуклеотидными последовательностями таковых из международной базыданных проводили с помощью компьютерной программы BioEdit.
Филогенетический анализ и построение древ осуществлено с помощью
программ BioEdit и MEGA версий 4–6 методом «присоединения соседей» созначениями Bootstrap на основе 1000 повторов [6].
После секвенирования ДНК-копий фрагментов генов НА и NA казахстанского изолята, проведено их выравнивание с соответствующими нуклеотидными последовательностями вирусов этого подтипа из международного банка
GenBank. Размеры сегментов генов НА и NA вируса гриппа А/черноголовый
хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1) составляют 700 и 649 пар оснований, номера
депонентов в GenBank — GU953249 и GU953250, соответственно.

Вирусология

215

На рис. 1 показана токсаномическая принадлежность гена НА вируса
А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1) и других представителей
этого подтипа из GenBank.
Как видно из рис. 1, вирус А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1) по гену НА наиболее близок к вирусу из Индии A/
duck/India/11CA08/2014 (H5N1) и двум штаммам из Нигерии и Кот-д’Ивуара — A/chicken/Nigeria/15VIR339-1/2015 (H5N1) и A/duck/Ivory_
Coast/15VIR2742-2/2015 (H5N1), с которыми он входит в клайд 2.3.2.1С.
На рис. 2 представлены филогенетические взаимоотношения между генами NА вируса А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1) и вирусов подтипа Н5 из GenBank.

Рис. 1. Филогенетические взаимоотношения между генами НАвируса А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1)
и вирусов этого подтипа из GenBankРис. 2. Филогенетические взаимоотношения между генами NАвируса А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1)
и вирусов подтипа Н5 из GenBankРаздел 2216

Как следует из рис. 2, казахстанский изолят А/черноголовый хохотун/Атырау/6491/15 (Н5N1) наибольшее родство проявляет с вирусами из Нигера и Индии, выделенными от домашних птиц -А/chicken/
Niger/15VIR2060-8/2015 (Н5N1), A/duck/India/12ТР04/2014 (H5N1). Вместес шестью другими вирусами из Ливана, Китая и Вьетнама они по гену НАотносятся к генотипам G, V, Z. Интересно отметить, что один из них — A/
tiger/Jiangsu/01/2013 (Н5N1) выделен от кошачьих.
В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в дикой орнитофауне Казахстана циркулируют актуальные, высокопатогенные вирусы
гриппа. Обитание на территории республики огромного количества перелетных птиц и их видовое разнообразие объясняют необходимость постоянного эколого-вирусологического мониторинга с целью изоляции текущих
современных вариантов возбудителей.
Литература
1. Кilbourne E. D. Influenza pandemics of the 20th century Emerging Infect. Dis.
2006. Vol. 12 (1). P. 9–14.
2. Taubenberger J., Johan V., David M. Discovery and characterization of the1918 pandemic influenza virus in historical context//Antivir. Ther. (Lond.) 2007. Vol. 12.
P. 581–591. PMID: 17944266 PMCID: PMC2391305
3. Chen Ji-M., Sun Yi-X., Chen J-W., Liu Sh., Yu J-M., Shen Ch-J., Sun X-D., Peng D.
Panorama phylogenetic diversity and distribution of type A influenza viruses based on their
six internal gene sequences//Virol. J.–2009. 6:137.-doi:10.1186/1743-422X-6-137. PMID:
19737421 PMCID: PMC2746212
4. WHO. Cumulative number of confirmed human cases of avian influenza A(H5N1)
reported to WHO. http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_
cumulative_table_ archives/en/
5. Саятов М. Х., Жуматов К. Х., Кыдырманов А. И., Карамендин К. О., Даулбаева К. Д., Асанова С. Е., Касымбеков Е. Т., Хан Е. Я., Сулейменова С. А. Мониторинг
вирусов гриппа А в дикой орнитофауне Казахстана // Доклады НАН РК. — 2017.
№ 2. С. 130–136.
6. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4. Molecular evolutionary genetics
analysis (MEGA) software version 4.0//Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24. P. 1596–1599.
PMID: 17488738 DOI: 10.1093/molbev/msm092

217Вирусология

МЕХАНИЗМЫ СЕЛЕКЦИИ ВИРУСА ECHO11
ПРИ АДАПТАЦИИ К КУЛЬТУРАМ КЛЕТОК RD И Л-41 КД/84
ECHOVIRUS 11 SELECTION MECHANISMS DURING ADAPTATIONTO RD AND L-41KD/84 CELL LINES
П. С. Усольцева, А. В. Резайкин, А. В. Новоселов *ФБУН «Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных
инфекций» Роспотребнадзора, Екатеринбург, Россия
P. S. Usoltseva, A. V. Rezaikin, A. V. Novoselov
FBIS “Yekaterinburg Scientific Research Institute of Viral Infections”
of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and
Human Well-Being, Yekaterinburg, Russian Federation
E-mail: savina_polina@mail.ruАннотация
Целью данного исследования являлось выяснение механизмов селекции вариантов вируса ECHO11 с различной рецепторной специфичностью при репродукциина клеточных культурах RD и Л-41 КД/84. Изучена динамика численности вирусной
популяции в одиночном цикле репродукции у двух близкородственных клонов вируса: daf+ клона, использующего первичный клеточный рецептор DAF, и daf– клона,не использующего данный рецептор. Негативная селекция daf– клона на клетках RDсвязана с пониженной интенсивностью депротеинизации и с меньшей эффективностью синтеза новых вирионов по сравнению с daf+ клоном. Негативная селекция
daf+ клона на клетках Л-41 КД/84 связана с более низким уровнем адсорбции вирусана поверхности клеток, низкой интенсивностью депротеинизации и задержкой синтеза новых вирионов по сравнению с daf– клоном.
Abstract
The aim of this study was to elucidate the selection mechanisms affecting reproductionof echovirus 11 variants with different receptor specificity in RD and L-41KD/84 cell lines.
Single cycle growth curves were obtained for two closely related clones of the virus: thedaf+ clone using DAF as a primary cell receptor and the daf– clone that does not use thisreceptor. Negative selection of the daf– clone in RD cells was associated with decreased
intensity of uncoating and lower efficiency of synthesis of new virions as compared tothe daf+ clone. Negative selection of the daf+ clone in L-41KD/84 cells was associatedwith a lower level of virus adsorption on the cell surface, low intensity of uncoating, anddelayed synthesis of new virions as compared to the daf– clone.
* © П. С. Усольцева, А. В. Резайкин, А. В. Новоселов, 2018.

218Раздел 2В большинстве случаев инфицирование энтеровирусами приводит к развитию инаппарантной инфекции с кратковременным вирусоносительством,однако могут развиваться и манифестные формы, клинические проявления
которых крайне разнообразны и обусловлены поражением практически любых органов и систем человека, включая ЦНС [1]. Мультитропность энтеровирусов подразумевает способность к репродукции в различных тканяхи органах за счёт использования различных клеточных рецепторов и соответствующих им путей интернализации вирусов в клетку. Изучение процессов интернализации энтеровирусов, депротеинизации вирусной РНК и еётранслокации в цитозоль обеспечивает понимание молекулярных механизмов энтеровирусной инфекции на субклеточном уровне, что является однойиз важнейших задач фундаментальной вирусологии.
Ранее было показано, что репродукция вируса ECHO11 (E-11) в течение
нескольких пассажей на культуре клеток RD обеспечивала постепенную позитивную селекцию Daf+ вариантов, а пассажи вируса на культуре клеток
Л-41 KД/84 обеспечивали постепенную позитивную селекцию Daf– вариантов [2, 3]. Рецептор DAF, как и другой (неидентифицированный) клеточный рецептор, экспрессируются на обеих культурах клеток, поэтому целью
данного исследования было выяснение механизмов селекции, связанныхс параметрами репродукции клонов вируса E-11, использующих разные
первичные рецепторы на двух видах клеток. Анализ динамики численности вирусных популяций в опытах с одиночным циклом репродукции (ОЦР)позволил сравнить клоны по следующим параметрам: уровень адсорбциина монослойной культуре клеток, интенсивность депротеинизации и эффективность синтеза новых вирионов.
В работе использовали перевиваемые линии клеток RD и Л-41 КД/84. Дваблизкородственных (daf+ и daf–) клона вируса E-11 были получены и охарактеризованы ранее [4]. Клон 431-1 (daf+), использующий DAF в качестве
первичного клеточного рецептора, и клон 431-6 (daf–), использующий другой (неидентифицированный) клеточный рецептор, отличались единственной аминокислотной заменой T165A в капсидном белке VP2 в области сайта
связывания с рецептором DAF. Для синхронизации начала ОЦР, плотный
монослой соответствующей культуры клеток в пластиковых флаконах, после замены среды роста на среду поддержания, охлаждали 20 минут притемпературе 4 °C. Затем, после удаления среды поддержания, во флаконы
вносили по 400 мкл инокулята из расчета множественности заражения
10 БОЕ на клетку. Флаконы инкубировали на платформе покачивателя при
4 °C 45 минут, тщательно удаляли инокулят и 3-кратно отмывали монослой от несвязавшегося вируса охлажденной до 4 °C средой поддержания.
Далее в каждый флакон добавляли по 5 мл среды поддержания комнатной

Вирусология

219

температуры и нагревали в термостате до 37 °C. Через заданные интервалы времени инфекционный цикл останавливали, замораживая флаконы при–70 °C. Инфекционную активность вируссодержащих жидкостей оценивали
методом конечных разведений (в ТЦД50). Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами вариационной статистики.
Динамика численности вирусных популяций в опыте ОЦР клонов
431-1 и 431-6 вируса Е-11 в культурах клеток RD и Л-41 КД/84 представлена на рис. 1.
В культуре клеток RD при одинаковой заражающей дозе у двух клоновне наблюдалось различия в остаточной инфекционной активности после отмывания монослоя (точка 0 минут), что указывало на отсутствие различийв уровне адсорбции на клетках. Интенсивность депротеинизации daf+ клона 431-1 была выше, чем у daf– клона 431-6, о чем свидетельствовало более
быстрое снижение инфекционной активности в точках 30, 60 и 120 минут.
Восходящий участок графика инфекционной активности в ОЦР отражал
эффективность синтеза новых вирионов в единицу времени, которая былавыше у клона 431-1 по сравнению с клоном 431-6.
При одинаковой заражающей дозе, уровень остаточной инфекционной
активности после отмывания монослоя клеток Л-41 КД/84 у daf– клона
431-6 более чем на два порядка величины превышал таковой у daf+ клона
431-1. Максимальная интенсивность депротеинизации daf– клона 431-6 наблюдалась через 180 и 210 минут после начала ОЦР, в то время как у daf+ клона 431-1 роста интенсивности депротеинизации не наблюдалось. Сравнение
восходящих участков графиков ОЦР в культуре клеток Л-41 КД/84 показало
меньшую эффективность синтеза новых вирионов у daf+ клона 431-1, так какрост инфекционной активности запаздывал по сравнению с клоном 431-6.

Результаты определения инфекционной активности в одиночном цикле
репродукции клонов 431-1 и 431-6 вируса Е-11на культурах клеток RD и Л-41 КД/84

220Раздел 2Таким образом, механизмы негативной селекции daf– клона 431-6 в культуре клеток RD связаны с пониженной интенсивностью депротеинизациии с меньшей эффективностью синтеза новых вирионов по сравнению с daf+клоном 431-1. Механизмы негативной селекции daf+ клона 431-1 в культуре
клеток Л-41 КД/84 связаны с пониженным уровнем адсорбции вируса наклетках, низкой интенсивностью депротеинизации и отсроченным началом
синтеза новых вирионов.
Выявленные существенные различия интенсивности депротеинизации
daf+ и daf– клона вируса E-11 в культуре клеток RD согласуются с установленным ранее различием путей интернализации и внутриклеточного трафика daf+ и daf– клонов E-11 в клетках RD [5].
Литература
1. Канаева О. И. Энтеровирусная инфекция: многообразие возбудителей и клинических форм // Инфекция и иммунитет. 2014. 4(1): 27–36.
2. Новоселов А. В. Генетический анализ гемагглютинирующих свойств энтеровирусов (на модели вируса ЕСНО 11): автореферат дисс. … канд. мед. наук: 03.00.06:
защищена 10.06.1994 // Новоселов Алексей Владимирович; Институт полиомиелитаи вирусных энцефалитов РАМН — М., 1994. — 23 с.
3. Фадеев Ф. А. Изменчивость рецепторной специфичности вируса ECHO11: автореферат дисс. канд. биол. наук: 03.00.06: защищена 27.10.2008 // Фадеев Федор
Алексеевич; Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. — M., 2008. — 24 с.
4. Novoselov A. V., Rezaykin A. V., Sergeev A. G., Fadeyev F. A., Grigoryeva J. V.,
Sokolova Z. I. A single amino acid substitution controls DAF-dependent phenotype ofechovirus 11 in rhabdomyosarcoma cells. Virus Res. 2012; 166(1–2): 87–96; doi:10.1016/j.
virusres.2012.03.007.
5. Stuart A. D., Eustace H. E., McKee T. A., Brown T. D. K. A novel cell entry pathway
for a DAF-using human enterovirus is dependent on lipid rafts. J. Virol. 2002; 76 (18):9307–9322; doi: 10.1128/JVI.76.18.9307–9322.2002.

221Вирусология

АНАЛИЗ ГЕНОМОВ БАКТЕРИОФАГОВ,ИНФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИИ РОДА KLEBSIELLA *THE ANALYSIS OF THE GENOMESOF THE BACTERIOPHAGES INFECTING BACTERIAOF THE KLEBSIELLA GENUS
М. В. Фофанов 1,2, М. Р. Клопотова 1,2, Ю. Н. Козлова 1,
А. Ю. Тикунов 1, В. В. Морозова 1
1Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, лаборатория молекулярной микробиологии
(ИХБФМ СО РАН, ЛММБ)2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет
M. V. Fofanov 1,2, M. R. Klopotova 1,2, Y. N. Kozlova 1,
A. Y. Tikunov 1, V. V. Morozova 1
ICBFM SB RAS, Russia
Novosibirsk State University, Russia
1

2

E-mail: MVFofanov@mail.ruАннотацияВ ходе данной работы была охарактеризована группа клебсиельных бактериофагов, принадлежащих к семействам Podoviridae (КР192, KP194, KP 195, KP 196)
и Myoviridae (КР179) и проанализированы их геномы. Было выявлено, что геномы
исследуемых бактериофагов имеют кластерное строение, среди них кластер генов
метаболизма нуклеиновых кислот (ДНК/РНК полимеразы, лигазы и эндонуклеазы),кластер структурных генов, кодирующих составные части капсида, и кластер генов
литической кассеты (лизоцим, холин и т. д.). В геноме бактериофага КР179 выделяется также кластер генов, кодирующих различные тРНК, и некоторые другие гены,кодирующие, например, анти-сигма фактор и ферменты, ингибирующие хозяйскую
систему рестрикции-модификации. Все исследованные геномы также содержат
большое количество генов, кодирующих гипотетические белки. В результате бактериофаги KP192-KP196 были отнесены к роду KP32-virus семейства Podoviridae,a KP179 — к роду Jd18-virus семейства Myoviridae.
© М. В. Фофанов, М. Р. Клопотова, Ю. Н. Козлова, А. Ю. Тикунов, В. В. Морозова, 2018.
*Исследование проведено при поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований, проект № 18-29-08015.

Раздел 2

222
Abstract

In this study, some genomes of Klebsiella bacteriophages belonging to the Podoviridae(КР192, КР194, КР195, КР196) and Myoviridae (КР179) families were analyzed. It was
shown these genomes have cluster structure, which consist of metabolism genes of nucleic acids (DNA/RNA polymerases, ligases and endonucleases), cluster of structure genes
encoded lytic cassette (lysozyme, holin, etc). KP179 has some particular genes encoded
different tRNAs and some other genes such as anti-sigma factor and enzymes inhibiting
the host’s restriction-modification system. These annotated genomes have also many genes
encoded hypothetical proteins. As a result, bacteriophages KP192-KP196 belongs to the
KP32-virus genus of the Podoviridae family and KP179 — to the genus Jd18-virus of the
Myoviridae family.

В лаборатории молекулярной микробиологии ИХБФМ СО РАН ранее были выделены из клинических образцов 5 штаммов бактериофагов
(KP192, KP194, KP195, KP196, KP179), специфичных к бактериям родаKlebsiella. Бактериофаги были охарактеризованы по спектру бактериальных
штаммов-хозяев (см. таблицу) и по биологическим свойствам. Геномы бактериофагов были секвенированы с использованием методов высокопроизводительного секвенирования на приборе MiSeq (Illumina, CША).
Бактериофаги, специфичные к штаммам рода Klebsiellaи спектры их бактериальных штаммов-хозяев

№Бактериофаг

Бактерия, к которой специфичен
бактериофаг

1
2
3
4
5

KP192
KP194
KP195
KP196
KP179

K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. oxytoca
K. pneumoniaeШтамм-хозяин изколлекции ЭМТК,с использованием
которого выделен
бактериофаг
2274
2291
2337
2487
2544

Идентификационные
номера чувствительных штаммов изКЭМТК ИХБФМ СОРАН*2291, 2548, 2574
2274, 2548, 2574
1755, 1756, 1922, 2148,
2545, 2827Примечание. * КЭМТК — Коллекция экстремофильных микроорганизмови типовых культур ИХБФМ СО РАН.

В ходе анализа геномных последовательностей с использованием программного обеспечения Vector NTI Advance 11.5.1, в геномах бактериофагов
KP192-КР196 было выявлено около 40–47 предполагаемых открытых рамок
считывания (ОРТ), а в геноме KP179 — 261 ОРТ при помощи программы

Вирусология

223

для автоматической аннотации геномов RAST (http://rast.nmpdr.org/). Выявленные ОРТ идентифицировали с использованием базы данных GenBank
Database, алгоритмом blastx.
В результате проведённого нами анализа были составлены геномные
карты для всех исследованных бактериофагов.
Было выявлено, что геномы исследуемых бактериофагов имеют кластерное строение, т. е. гены определенной функциональной принадлежности сгруппированы в опероны. Таким образом, в геномах бактериофагов
KP192-196 можно выявить три кластера, в первый из них входят гены метаболизма нуклеиновых кислот (ДНК/РНК полимеразы, лигазы и эндонуклеазы), далее идет кластер структурных генов, кодирующих составные части
капсида, и кластер генов литической кассеты (лизоцим, холин и т. д.), который обеспечивает лизис бактериальных клеток и выход из них фагового потомства. Также надо отметить, что 25–32 % генов этих бактериофагов кодирует гипотетические белки с неизвестными свойствами, которые не имеют
сходства с аминокислотными последовательностями в GenBank Database.
Геном бактериофага KP179 также кодирует 41 % (108/261) гипотетических
белков с неизвестными свойствами
Таксономическую идентификацию исследуемых бактериофагов проводили с использованием наиболее близких геномных последовательностей
бактериофагов из базы данных GenBank Database. Для этого был проведен
филогенетический анализ этих последовательностей (рис. 1), по результа-Рис. 1. Филогенетический анализ геномов бактериофагов KP192-KP196.
При построении был использован метод
ближайших соседей онлайн-сервиса MAFFT v.5.0

224Раздел 2там которого было выявлено, что фаги KP192, KP194, KP195, KP196 являются родственными и относятся к роду KP32-virus семейства Podoviridae,
прототипным представителем которого является клебсиельный бактериофаг KP32 (GQ413937). В результате филогенетического анализа было также
выявлено, что фаг KP192 и фаги KP194, KP195, KP196 относятся к разным
кладам внутри данного рода.
С использованием программы BankIt аннотированные геномные последовательности бактериофагов KP192, KP194, KP195, KP196 были депонированы в GeneBank Database, где им были присвоены соответствующие идентификационные номера MH172261, MH172262, MH172263 и MH172264,
соответственно. Геномная последовательность бактериофага KP179 также
была депонирована с использованием данной программы.
В результате филогенетического анализа бактериофаг KP179 был отнесён к роду Jd18-virus семейства Myoviridae (рис. 2).

Рис. 2. Филогенетический анализ геномов бактериофага KP179.
При построении был использован метод максимального правдоподобия
программы MEGA X

225Вирусология

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНАИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВИРУСА ГРИППА
A/ФАЗАН/БАЛХАШ/6218/14 (H1N1)
Е. Я. Хан, А. И. Кыдырманов, К. О. Карамендин, К. Д. Даулбаева,С. Е. Асанова, Е. Т. Касымбеков, А. Б. Сейдалина,С. А. Сулейменова, К. Х. Жуматов, М. Х. Саятов *ТОО «Научно-производственный центр
микробиологии и вирусологии»Ye. Ya. Khan, A. I. Kydyrmanov, K. O. Karamendin, K. D. Daulbaeva,
S. E. Asanova, Ye. T. Kasymbekov, A. B. Seydalina, S. A. Suleymenova,
K. Kh. Zhumatov, M. Kh. Sayatov«Scientific and Production Centre for Microbiology and Virology» LLP
E-mail: Lizaveta4ka@list.ruАннотацияВ работе представлены результаты молекулярно-генетического изучения генов
гемагглютинина и нейраниминидазы вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1).
Abstract
The results of molecular genetic researches of the hemagglutinin and neurranimidase
genes of the influenza virus A/Pheasant/Balkhash/6218/14 (H1N1) are presented.

РНК-содержащие вирусы гриппа A семейства Orthomyxoviridae инфицируют человека, млекопитающих животных и птиц, и способны наносить громадный экономический и социальный урон. Они классифицируются на основе антигенных различий поверхностных гликопротеидов — гемагглютинина
(HA) и нейраминидазы (NA), к настоящему времени известны 18 подтиповНА и 11 — NА [1, 2, 3]. Вирусы гриппа A имеют сегментированный геноми способны к реассортации в процессе смешанной инфекции [4].
В 1918 году зарегистрирована пандемия гриппа А(H1N1), вызванная вирусом птичьего происхождения [5].
В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического исследования вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1).
* © Е. Я. Хан, А. И. Кыдырманов, К. О. Карамендин, К. Д. Даулбаева, С. Е. Асанова, Е. Т. Касымбеков, А. Б. Сейдалина, С. А. Сулейменова, К. Х. Жуматов, М. Х. Саятов, 2018.

226Раздел 2Изоляцию вируса проводили общепринятым методом в развивающихся
куриных эмбрионах. Антигенную формулу определяли в реакциях торможения гемагглютинации и ингибиции нейраминидазной активности (РТГАи РИНА). Для секвенирования кДНК использовали метод дидеоксисеквенирования по Сенгеру, выравнивание секвенированных последовательностей
генов вирусов гриппа А с соответствующими нуклеотидными последовательностями из GenBank проводили по компьютерной программе BioEdit.
Филогенетический анализ и построение древ выполняли с помощью программы и MEGA версии 4 методом «присоединения соседей» со значениями
Bootstrap на основе 1000 повторов.
На рис. 1 представлены результаты BLAST анализа гена HA вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) с аналогичными последовательностямииз базы данных GenBank.
Как видно из рисунка 1 ген НА вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) на 99 % сходен с таковыми пяти вирусов: А/mallard/
Republic of Georgia/4/2012 (H1N1), А/mallard/Sweden/816/2014 (H1N1), А/
duck/Hainan/Q47/2012 (H1N2), А/northern pintail/Egypt/EMC-2/2012 (H1N1),
А/northern pintail/Egypt/EMC-3/2012 (H1N1). С шестью вирусами из
GenBank отмечено 95 % родство, с 12 вирусами — 94 % сходство, пять вирусов оказались близкими на 93 %.
Следующим объектом изучения явился ген NA казахстанского изолятаи других представителей этого подтипа.

Рис. 1. Результаты BLAST анализа гена гемагглютинина
вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) с последовательностямииз базы данных GenBankВирусология

227

Как видно из рис. 2, выявлено 97 % сходство гена нейраминидазы вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) с тремя вирусами из Бангладеш,подобными А/duck/Bangladesh/24705/2015 (H7N1). С остальными 24 вирусами c NA N1 отмечена близость на 96 %.

Рис. 2. Результаты BLAST анализа гена нейраминидазы
вируса гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) с последовательностямииз базы данных GenBankВ дальнейшем проведен анализ аминокислотных последовательностей
функционально активных сайтов расщепления НА казахстанского изолята.
Установлено, что вирус гриппа A/фазан/Балхаш/6218/14 (H1N1) имел последовательность GLRNIPSQSR↓GLF и не содержал вблизи сайта протеолитического расщепления НА основных аминокислот, характерных для высокопатогенных вариантов.
Литература
1. Webster R., Govorkova E. Continuing challenges in influenza // Ann. N. Y. Acad.
Sci. 2014. Vol. 1323. P. 115–139.
2. Fouchier R. A., Munster V., Wallensten A., Bestebroer TM., Herfst S., Smith D.,
Rimmelzwaan G. F., Olsen B., Osterhaus A. D. Characterization of a novel influenza
A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls // J Virol Vol. 79.
P. 2814–2822
3. McKimm-Breschkin J. L. Influenza neuraminidase inhibitors: antiviral action andmechanisms of resistance // Influenza neuraminidase inhibitors: Antiviral action andmechanisms of resistance. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2012. P. 25–36.
4. Steinhauer D. A., Holland J. J. Rapid evolution of RNA viruses // Annu Rev
Microbiol. Vol. 41. P. 409–433
5. Kilbourne ED Influenza pandemics of the 20th century // Emerg. Infect. Dis. 2006.
Vol. 12. P. 9–14.

Раздел 2228ИССЛЕДОВАНИЕ ВИЧ-1 СРЕДИ ЛИЦ, ЖИВУЩИХС ВИЧ В РЕСПУБЛИКЕ КЫРГЫЗСТАН, ВЫЯВИЛО
ЗНАЧИМЫЕ ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЕ ОТЛИЧИЯ *HIV-1 STUDY AMONG PEOPLE LIVING WITH HIV
IN THE REPUBLIC OF KYRGYZSTAN REVEALEDSIGNIFICANT TERRITORIAL DIFFERENCES
В. В. Хомколова 1, А. Ю. Аникина 1, А. В. Тотменин 1,
А. А. Бекболотов 2, У. К. Кадырбеков 2, Н.М Гашникова11Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный
центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»Роспотребнадзора, пос. Кольцово, Новосибирская область
2Республиканский Центр СПИД МЗ Кыргызской Республики,г. Бишкек, Кыргызская Республика
V. V. Khomkolova 1, A. Y. Anikina 1, А. V. Тоtmenin 1,
А. А. Bekbolotov 2, U. К. Kadyrbekov 2, N. M. Gashnikova 1
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
National Center for the Prevention and Control of HIV/AIDS,
Ministry of Health and Social Protection of the Republic of Kyrgyzstan
1

2

E-mail: vera-usib@mail.ruАннотацияДля изучения молекулярной эпидемиологии ВИЧ-1 в Кыргызстане были получены последовательности гена pol ВИЧ-1 для ВИЧ-инфицированных лиц, проживающих в двух географически отдаленных районах: Джалал-Абадской и Чуйской областях республики. В Чуйской области доминировали субтип А (55,6 %) и CRF02_AG(40,7 %) ВИЧ-1. Только 3,7 % ВИЧ-1 не были классифицированы как чистый субтипили циркулирующая рекомбинантная форма (CRF). В Джалал-Абадской области
была обнаружена генетически гетерогенная популяция ВИЧ-1. Филогенетический
анализ показал, что уникальные рекомбинантные формы (URF) ВИЧ-1 являются основным генетическим вариантом (38,5 %), за которым следуют субтип A (30,8 %),CRF02_AG (25,6 %) и CRF63_02A1 (5,1 %). Различия в распределении генотипов
© В. В. Хомколова, А. Ю. Аникина, А. В. Тотменин, А. А. Бекболотов,У. К. Кадырбеков, Н. М. Гашников, 2018.
*Исследование выполнено в рамках комплексной российской программы по оказанию помощи странам Восточной Европы и Центральной Азии в области профилактики и надзора за ВИЧ/СПИД (РП РФ от 14.11.2015 № 2314-р).

Вирусология

229

ВИЧ-1 не были связаны с путями передачи ВИЧ, с полом или возрастом пациентов.
Примечательно, что пациенты из Джалал-Абада, принимающие АРВТ, имели более
высокие показатели эффективности терапии.
Abstract
To study the molecular epidemiology of HIV-1 in Kyrgyzstan, we obtained HIV-1 pol
sequences from HIV-infected individuals living in two geographically remote region:
Jalal-Abad and Chui Oblast of the Republic. In Chui Oblast, subtype A (55,6 %) andCRF02_AG (40,7 %) HIV-1 were dominant. Only 3,7 % HIV-1 were not classified in any
pure subtype or circulating recombinant form (CRF). A heterogeneous genetic HIV-1 poolhas been found in Jalal-Abad Oblast. Phylogenetic analyses indicated unique recombinant
forms (URF) HIV-1 as the main genetic variant (38,5 %), followed by subtype A (30,8 %),CRF02_AG (25,6 %) and CRF63_02A1 (5,1 %). The differences in HIV-1 genotype distribution were not associated with transmission routes, sex or age of patients. Remarkably,
patients of Jalal-Abad, who are taking ARVT, had higher efficacy rates of therapy.

В Кыргызской Республике (КР) за последние 10 лет количество людей,живущих с ВИЧ, увеличилось в восемь раз. На 01.06.2018 г в Республике
зарегистрировано всего 8323 человек с ВИЧ-инфекцией, в том числе детей
до 14 лет — 633. Большая часть людей, живущих с ВИЧ (ЛЖВ), выявленав Чуйской (3711) и Ошской (2489) областях. В последние годы активизация распространения ВИЧ-1 регистрируется и в географически отдаленных
регионах страны с меньшей пораженностью населения ВИЧ — Джалал-Абадская (951), Баткенская (203) области, где до настоящего времени исследования циркулирующих ВИЧ-1 и резистентности вируса не проводилось.
Целью настоящей работы являлось изучение циркулирующих в Кыргызской Республике генетических вариантов ВИЧ-1 и анализ распространения
мутаций ВИЧ-1, связанных с развитием резистентности вируса к антиретровирусной терапии (АРВТ).
В исследование в 2017–2018 гг было вовлечено 144 человека с диагнозом ВИЧ-инфекция, проживающих в Чуйской (80) и Джалал-Абадской (56)областях КР. На текущее время для 80 % клинических образцов, связанныхс клинико-демографическими данными пациентов, были получены и расшифрованы фрагменты генома ВИЧ-1, кодирующие протеазу и ревертазу
вируса. Филогенетический анализ выявил, что в Чуйской области доминируют субтип А (55,6 %) и CRF02_AG (40,7 %) ВИЧ-1. Варианты субтипа А (А6) близки к аналогичным ВИЧ-1, циркулирующим в РФ. Вирусы
СRF02_AG принадлежат к специфическому среднеазиатскому кластеру
ВИЧ-1 — CRF02_AGСА. Формирование на филогенетическом дереве обособленных генетически близких кластеров CRF02_AG, реже — субтипа А ВИЧ-1 позволяет предположить, что распространение CRF02_AG230Раздел 2в КР преимущественно происходит по внутренним эпидемическим сетям.
В 5,7 % случаев были выявлены отличающиеся уникальные рекомбинантные формы — URF02_A1 ВИЧ-1, образованные в результате рекомбинации
ВИЧ-1 субтипа А и CRF02_AG.
Так как все пациенты, вовлеченные в исследование, находились наАРВТ, проводилось исследование резистентности ВИЧ-1 и анализ вирусологической эффективности терапии. Для пациентов Чуйской области вирусологическая эффективность терапии составила 25,9 %, в 27 % случаев
были выявлены мутации ВИЧ-1, связанные с развитием резистентности,в 37 % — регистрировалась высокая концентрация РНК ВИЧ-1 в крови пациентов при отсутствии мутаций ВИЧ-1, что может указывать на низкую
приверженность/отказ ВИЧ-инфицированных лиц от АРВТ.
Абсолютно уникальной оказалась ситуация в Джалал-Абадской области.
По результатам филогенетического и рекомбинационного исследования
только одной области генома ВИЧ-1, кодирующей протеазу-ревертазу вируса, показано, что уникальные рекомбинантные формы (URF) ВИЧ-1 на данной территории являются преобладающими — такие вновь возникшие вирусы, не имеющие близких референсных штаммов, были описаны в 38,5 %.
В 30,8 % был найден ВИЧ-1 субтипа A, в 27 % — CRF02_AGСА. В 3,7 %были описаны ВИЧ-1, частично кластеризующиеся с сибирским вариантом
CRF63_02A1. Для этих вариантов необходимо расшифровать более протяженные участки для корректности генотипирования, исключить возможность вторичной рекомбинации ВИЧ-1.
Трудно объяснимым является тот факт, что примерно одинаково выявлялись URF ВИЧ-1 среди лиц разного возраста (в том числе и среди детей), пола, инфицированных ВИЧ разными путями. При этом практическине было найдено эпидемиологических цепочек, генетически близких URF,формирующих отдельные филогенетические кластеры. В исследованной
выборке пациентов все женщины были заражены при гетеросексуальных
контактах, среди мужчин было примерно равное количество лиц, инфицированных половым путем и при потреблении инъекционных наркотиков(ПИН).
Примечательно, что пациенты из Джалал-Абада, принимающие АРВТ,имели более высокие показатели вирусологической эффективности терапии — 59 %. Резистентность ВИЧ-1 была обнаружена в 15,4 %, отказ отАРВТ/низкая приверженность — в 17,9 %.
Заключение
Выявлено, что увеличение генетического разнообразия циркулирующих в Кыргызской Республике ВИЧ-1 происходит за счет возникновения

Вирусология

231новых рекомбинантных ВИЧ-1. Показано, что для Кыргызской Республики характерна территориальная специфика развивающихся процессов пораспространению ВИЧ-инфекции. Впервые описана крайне высокая распространенность вновь возникающих уникальных рекомбинантных формВИЧ-1 в Кыргызстане. Появление и распространение новых генетических
вариантов ВИЧ-1 может негативно сказаться на диагностике ВИЧ-инфекции. Слишком высокий показатель частоты рекомбинационных событий
ВИЧ-1 может быть частично объяснен тем, что ВИЧ на данной территории
распространяется не среди всего населения, а в основном среди определенных групп лиц, практикующих рискованное поведение, где циркулируют
разные геноварианты вируса. Ситуация требует более глубокого молекулярно-эпидемиологического изучения. Джалал-Абад граничит с Узбекистаноми Ошской областью. Как показывают результаты наших текущих исследований ВИЧ-1, в Ошской области ситуация близка к Чуйской области. Данныхпо территориям Узбекистана нет.

232cРАЗДЕЛ 3МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
МИКРОВЕЗИКУЛЫ В ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИУ ЖЕНЩИН В ПРОГРАММЕ ЭКО
MICROVESICLES IN FOLLICULAR FLUID
WITH WOMEN IN IVF PROGRAM
Е. А. Андреева 1, Н. А. Хонина 1,2, Е. В. Баторов 1,
Н. М. Пасман 2, Е. Р. Черных 1 *1ФБГНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальнойи клинической иммунологии», Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
E. A. Andreeva 1, N. A. Khonina 1,2, E. V. Batorov 1,
N. M. Pasman 2, E. R. Chernykh 1

1

Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
E-mail: evga_91@mail.ru, nkhonina@mail.ru

AннотацияВ последние годы особое внимание уделяется микровезикулам, которые выявляются во всех биологических жидкостях и имеют высокую диагностическую значимость при ряде заболеваний, в том числе при патологии репродукции. В данной
работе показано, что повышенный уровень микровезикул в фолликулярной жидкости женщин ассоциирован с возрастом, формой бесплодия, с продолжительностью
бесплодия и низким уровнем АМГ.
*© Е. А. Андреева, Н. А. Хонина, Е. В. Баторов, Н. М. Пасман, Е. Р. Черных, 2018.

Молекулярная биология

233

Abstract
In recent years, special attention is given to microvesicles. Microvesicles can be foundin almost all biological fluids and has a significant potential as a new diagnostic and prognostic biomarker including reproductive pathologies. In this paper shown that an elevatedlevel of microvesicles in women’s follicular fluid is associated with the age, the form
infertility, the duration of infertility and a low AMH levels.

Микровезикулы (МВ) представляют собой мембранные структуры,отделяющиеся от цитоплазматической мембраны клеток, окруженные
фосфолипидной мембраной. Образование внутриклеточных везикул происходит в условиях in vivo и in vitro. Это физиологический процесс, однако, при активации клеток, воздействии стресса или в процессе апоптоза
продуцируется их повышенное количество. МВ секретируются из различных типов клеток, таких как: лимфоциты, моноциты, макрофаги, дендритные и эпителиальные клетки. Поверхностная экспрессия МВ имеет
маркеры «материнской» клетки. Наибольший интерес представляет МВ,отделившиеся в процессе апоптоза (характерный маркер AnnexinV). Другой антиген опосредованно участвующий в процессе апоптоза — трансмембранная тирозинфосфатаза (СD45), передает сигнал внутрь клеткис Т и В-клеточного рецепторов. Также активируются NК-клетки, запускается синтез протеолитических ферментов, в результате экспрессируется
маркер CD107a, характеризующий цитотоксический потенциал NК. Возникшие апоптопические тельца фагоцитируются окруженными макрофагами, посредством скавенджер-рецепторов (рецепторов-«мусорщиков»):СD206 связывает сульфированные и несульфированнные полисахариды,а также структуры с высоким содержанием манноз; CD14 -рецептор комплекса липополисахаридсвязывающего протеина с липополисахаридом.
Появление МВ в биологических жидкостях организма отражает физиологический процесс развития и старения клеток, однако, повышенное ихсодержание ассоциировано с рядом патологических состояний (воспалительные, онко- и аутоиммунные процессы). Согласно данным литературы
микровезикулы ФЖ участвуют в фолликулогенезе, мейозе ооцитов, стероидогенезе и профилактике полиспермии после оплодотворения. Можно
предположить, что МВ играют роль в регуляции роста фолликула, посредством взаимообмена сигналами с клетками иммунной системы
Цель исследования
Исследовать уровень и фенотип МВ в ФЖ, и их потенциальную связьс клиническими характеристиками пациенток в цикле ЭКО.

Раздел 3234Материалы и методыВ исследование было включено 32 женщины с бесплодием, проходивших лечение методом ЭКО и 5 фертильных женщин — доноров ооцитов.
Всем женщинам проводилось комплексное обследованное в соответствиис приказом №107н от 30.08.2012г. Исследование проводилось после получения письменного информированного добровольного согласия. Возраст женщин с бесплодием варьировал от 20 до 42 лет (медиана 33,0), длительность
бесплодия — от 1 года до 18 лет (медиана 5,5). Первичное бесплодие былодиагностировано у 59,4 %, вторичное — у 40,6 % женщин. Причиной бесплодия в 15,6 % случаев был мужской фактор, в 84,4 % случаев — женское
бесплодие; из них 59,4 % женщин выявлен трубно-перитонеальный фактор,у 21,8 % — эндокринный фактор, у 3,2 % женщин регистрировалось сочетанное бесплодие. Процедура ЭКО была проведена у 32,4 % женщин, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) — у 67,6 %. Сбор образцовФЖ осуществляли во время трансвагинальной пункции яичников. Проводили
пробоподготовку образцов ФЖ и криоконсервировали при -80 °C. Фенотипическую характеристику МВ проводили методом проточной цитометри в соответствии с протоколом производителя (BD Biosciences). Статистическую
обработку данных проводили при помощи программы Statistica 6.0.
Результаты и обсуждения
Исследование содержания МВ в ФЖ показало, что значимых отличийв группе пациенток и доноров, а так же пациенток с разной причиной бесплодия, не получено. На основании этого данные группы были объединеныпри последующем анализе. Анализ образцов ФЖ женщин <35 лет и ≥35 летвыявил достоверные различия в уровне популяций МВ: у женщин ≥35 летуровень AnnV+ и AnnV+CD107a+ был в 1,7 и 1,3 раза соответственно выше,чем у женщин <35 лет (табл. 1).
Таблица 1Содержание микровезикул в фолликулярной жидкостиу женщин разных возрастных групп
ПараметрыМВ (мкл)1
AnnVAnnV+Возраст женщины (лет)<35 (n=26)≥35 (n=11)2
3
193,7±17,3
223,3±39,8
185,9 (145,1–217,9)
179,7 (127,4–270,7)
24,6±3,4
41,6±8,5
20,6(11,8–30,7)
34,9 (22,8–51,4)

pu
4
0,43
0,03

235

Молекулярная биология

Окончание табл. 1
1
AnnV-CD45+
AnnV-CD107a+
AnnV-CD206+
AnnV-CD14+
AnnV+CD45+
AnnV+CD107a+
AnnV+CD206+
AnnV+CD14+287,1±8,5
80,7 (63,4–105,9)49,4±5,2
42,7 (33,4–61,7)
102,1±10,8
95,3 (68,0–120,7)
164,7±15,9153,2 (117,4–200,3)
12,1±1,7
9,3 (6,4–15,3)
13,7±1,7
11,7 (6,9–18,6)
11,7±1,7
9,5 (6,2–11,7)
19,6±2,915,7 (9,3–25,6)

3
101,3±21,9
81,9 (50,3–138,1)
62,1±14,7
49,2 (26,7–86,5)
116,3±23,1
93,6 (61,9–159,7)
187,2±35,3
157,2 (98,7–230,1)
16,8±3,8
14,7 (8,0–23,3)
23,6±6,2
15,6 (12,5–28,7)18,0±4,4
14,3 (9,1–21,7)
29,9±7,3
24,2 (14,1–32,2)

4
0,46
0,31
0,53
0,50
0,19
0,04
0,10
0,12

Примечание. Данные представлены в виде M± S.E., медианы, квартильного
диапазона (LQ-UQ).; рu — U-критерий Манна — Уитни.

Исследование содержания МВ у женщин с разной формой бесплодия выявило, что в группе с вторичным бесплодием уровень AnnV-CD107a+ в ФЖбыл в 1,4 раза достоверно выше, чем при первичном бесплодии (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют о повышенной активации NK-клетоку женщин с невынашиванием беременности в анамнезе .
Таблица 2Содержание микровезикул в фолликулярной жидкостиу женщин с разной формой бесплодия
Параметры

Форма бесплодияМВ (мкл)Первичное (n=19)Вторичное (n=13)

pu

1

2

3

4

AnnVAnnV+

181,3±14,4
185,1 (141,7–233,9)
27,7±3,9
23,2 (12,8–39,4)

243,5±40,0
188,9 (155,3–270,7)
28,5±7,7
18,7 (11,8–30,7)

0,11
0,92

Раздел 3236Окончание табл. 2
1

AnnV-CD45+
AnnV-CD107a+
AnnV-CD206+
AnnV-CD14+
AnnV+CD45+
AnnV+CD107a+
AnnV+CD206+
AnnV+CD14+278,4±7,1
79,4 (57,2–95,8)
43,8±3,7
42,3 (33,9–52,3)
91,3±8,0
89,5 (61,9–105,8)
154,6±13,4
156,3 (107,7–206,4)
12,5±1,7
12,6 (7,4–15,5)
13,9±1,7
12,5 (9,7–18,8)
12,4±1,7
10,6 (8,8–15,9)
21,6±3,2
19,4 (11,1–32,2)

3

113,9±20,7
94,3 (63,7–138,1)
69,4±13,9
57,5 (33,4–86,5)
132,7±24,1
109,7 (68,5–159,7)
205,6±36,2
157,2 (119,0–230,1)
13,8±3,6
10,0 (6,4–14,8)
18,2±5,3
12,2 (6,9–15,1)
14,0±3,99,4 (6,2–11,7)
23,4±6,6
16,1 (9,3-25,6)

4

0,07
0,05
0,07
0,14
0,72
0,38
0,67
0,79

Примечание. Данные представлены в виде M± S.E., медианы, квартильного
диапазона (LQ-UQ); рu — U-критерий Манна — Уитни.

В то же время статистически достоверные различия в содержании МВбыли выявлены в группах с различной продолжительностью бесплодия. Такв ФЖ женщин с бесплодием > 6 лет регистрировалось более высокое содержание МВ (табл. 3): AnnV+ (в 2,4 раза), AnnV+CD45+ (в 2,2 раза), AnnV+CD206+(в 1,6 раза), AnnV+CD14+ (в 2,2 раза) по сравнению с группой с бесплодием
3–6 лет. Данная связь, вероятно, обусловлена усилением апоптотических процессов на фоне длительного воспаления и гормональных дисфункций.
Далее, учитывая факт снижение фолликулярного резерва с возрастом,исследовали содержание МВ в группах женщин с различным уровнем антимюллерового гормона (АМГ): с низким (<1,0 нг/мл; группа 1), средним
(1,0–6,0 нг/мл; группа 2) и высоким (> 6,0 нг/мл; группа 3) уровнем гормона
(табл. 4).
Анализ данных показал, что содержание AnnV-, AnnV-CD206+, AnnVCD14+ в ФЖ у женщин с наиболее низким уровнем АМГ было в 1,7 раздостоверное выше, чем в группе с высоким уровнем гормона. Вероятно, макрофаги с супрессорной активностью, локализующиеся в клетках теки растущих фолликулов, способны оказывать на них модулирующее действие.

237

Молекулярная биология

Содержание микровезикул в фолликулярной жидкости у женщин сТаблица
разной 3продолжительностью
Содержание микровезикул в фолликулярной
жидкости бесплодияу женщинс разной продолжительностью бесплодия
Параметры

Длительность бесплодия (лет)
<3
(n=7)

3-6
( n=11)>6( n=14)

AnnV-

159,3±22,9
150,9 (116,9-188,9)

180,8±22,3
184,2 (144,9-236,4)

255,8±36,8
215,7 (179,7-264,5)AnnV+

25,9±3,7
30,7 (17,9-32,3)

16,5±3,2
12,8 (8,3-22,9)38,3±7,5
31,3 (15,7-53,1)

66,3±12,957,2 (49,7-73,7)

86,6±12,3
92,2 (62,1-125,2)

113,6±19,1
84,6 (78,1-120,8)

43,9±7,7
39,2 (26,7-64,2)

44,5±6,9
34,8 (25,5-54,5)

68,9±13,2
84,6 (78,1-120,8)

76,5±14,6
62,4 (58,9-82,9)95,9±12,5
95,3 (68,5-120,7)

136,8±22,3
109,6 (85,4-141,9)

127,5±20,2
123,7 (97,1-150,4)

151,7±19,0
153,2 (117,4-206,4)

222,7±33,0200,3 (157,2-230,1)

11,5±1,9
12,8 (6,4-14,7)

8,2±1,96,3 (3,2-10,5)

17,6±3,1
13,7 (9,2-27,4)

AnnV+CD107a+

13,6±2,5
12,5 (8,7-16,5)

10,3±2,4
8,7 (4,7-15,2)

21,0±4,6
14,2 (9,2-27,4)

AnnV+CD206+

11,6±2,59,5 (7,9-14,3)

8,2±1,48,6 (4,2-10,9)18,0±3,8
13,9 (9,7-21,7)

AnnV+CD14+20,1±3,2
23,0 (12,3-25,6)

12,9±2,5
11,1 (6,4-17,5)30,9±6,3
24,6 (14,1-38,1)

МВ (мкл)-AnnV CD45+

AnnV-CD107a+-

AnnV CD206+

AnnV-CD14++

AnnV CD45+pu
1-2=0,52
1-3=0,08
2-3=0,11
1-2=0,07
1-3=0,27
2-3=0,02
1-2=0,29
1-3=0,102-3=0,26
1-2=0,96
1-3=0,20
2-3=0,13
1-2=0,33
1-3=0,08
2-3=0,14
1-2=0,41
1-3=0,06
2-3=0,09
1-2=0,27
1-3=0,212-3=0,02
1-2=0,36
1-3=0,29
2-3=0,07
1-2=0,22
1-3=0,26
2-3=0,03
1-2=0,09
1-3=0,26

2-3=0,02Примечание: данные представлены в виде M± S.E., медианы, квартильного диапазона (LQ-UQ).;Примечание. Данные представлены в виде M± S.E., медианы, квартильнорu- U-критерий Манна-Уитни.

го диапазона (LQ-UQ); рu — U-критерий Манна — Уитни.

Далее, учитывая факт снижение фолликулярного резерва с возрастом,исследовали содержание МВ в группах женщин с различным уровнем
Выводы
антимюллерового гормона (АМГ): с низким (<1,0 нг/мл; группа 1), средним (1,0 +++Обнаружено
повышение
уровня
AnnVгруппа
и AnnV
CD107aу женщин
стар6,0 нг/мл; группа
2) и высоким
(> 6,0 нг/мл;3) уровнем
гормона.
(Таблица
4).
шей возрастной группы; а также повышение содержания AnnV-CD107a+Таблица 4.
у женщин при вторичном бесплодии. В то же время большая
длительСодержание микровезикул в фолликулярной жидкости у женщин с разным +ность бесплодия ассоциировалась
сболеевысоким
уровнем
МВ:AnnV ,
уровнем АМГ

AnnV+CD45+, AnnV+CD206+, AnnV+CD14+. При сниженном овариальном
резерве регистрировалось более высокое содержание: AnnV-, AnnV-CD206+
и AnnV-CD14+.

Раздел 3238Таблица 4Содержание микровезикул в фолликулярной жидкости у женщинс разным уровнем АМГУровень АМГ (нг/мл)ПараметрыМВ (мкл)

< 1,0
(n=6)

1-6
(n=24)

AnnV-

239,3±28,5
265,6 (185,9-270,8)

206,8±23,3
181,9 (145,0-235,2)

149,9±19,7
159,5 (101,5-186,9)AnnV+

34,0±6,8
38,5 (17,9-39,4)

28,5±5,1
21,9 (11,8-31,8)

24,6±3,9
21,0 (18,6-34,6)

111,0±17,5
118,5 (78,1-138,1)

90,8±11,977,2 (57,9-95,1)74,1±15,1
72,0 (37,6-105,9)

AnnV-CD107a+

63,5±9,9
69,1 (42,7-86,5)54,0±8,0
42,3 (33,2-62,6)

40,5±6,7
43,9 (23,8-52,3)

AnnV-CD206+

138,9±15,5150,8 (132,0-159,7)

104,8±14,1
83,3 (62,2-115,2)80,4±11,0
89,1 (53,8-95,8)

AnnV-CD14+

201,9±24,1
220,6 (172,9-232,7)

176,1±21,1
153,8 (116,9-207,0)

123,6±17,4
130,8 (8,2-153,2)

AnnV+CD45+

16,9±3,5
17,3 (8,3-23,3)

12,6±2,2
10,1 (6,0-14,7)

13,6±3,39,4 (7,3-23,3)

22,3±4,9
23,2 (9,7-28,7)

14,5±2,9
12,0 (5,9-15,0)

16,4±3,2
13,3 (9,6-25,6)

AnnV+CD206+

18,6±3,5
20,4 (8,8-25,1)

12,5±2,59,5 (5,6-13,9)

13,2±2,9
10,9 (8,9-18,3)

AnnV+CD14+27,1±5,530,3 (12,3-32,5)

22,3±4,4
16,6 (7,7-24,9)

20,4±3,7
17,7 (13,9-27,8)-

AnnV CD45++

AnnV CD107a

+

>6,0
(n=7)

pu
1-2=0,51

1-3 = 0,02
2-3=0,24
1-2=0,62

1-3 = 0,24
2-3=0,69
1-2=0,43

1-3 = 0,14
2-3=0,51
1-2=0,58

1-3 = 0,08
2-3=0,42
1-2=0,25

1-3 = 0,01
2-3=0,40
1-2=0,56

1-3 = 0,02
2-3=0,23
1-2=0,37
1-3=0,50
2-3=0,82
1-2=0,24
1-3=0,32
2-3=0,74
1-2=0,25
1-3=0,25
2-3=0,88
1-2=0,60
1-3=0,32

2-3=0,82Примечание:данные
представлены
в
виде
M±
S.E.,
медианы,квартильного
диапазона
(LQ-UQ).;Примечание. Данные представлены в виде M± S.E., медианы, квартильного
рu- U-критерий Манна-Уитни.

диапазона (LQ-UQ); рu — U-критерий Манна — Уитни.

Анализ данных показал, что содержание AnnV-, AnnV-CD206+, AnnVCD14 в ФЖ у женщин с наиболее низким уровнем АМГ было в 1,7 раздостоверное выше, чем в группе с высоким уровнем гормона. Вероятно,макрофаги с супрессорной активностью, локализующиеся в клетках текирастущих фолликулов, способны оказывать на них модулирующее действие.
Выводы: Обнаружено повышение уровня AnnV+ и AnnV+CD107a+ уженщин старшей возрастной группы; а также повышение содержания AnnVCD107a+ у женщин при вторичном бесплодии. В то же время большая
длительность бесплодия ассоциировалась с более высоким уровнем МВ: AnnV+,
AnnV+CD45+, AnnV+CD206+, AnnV+CD14+. При сниженном овариальном резерве
регистрировалось более высокое содержание: AnnV-, AnnV-CD206+ и AnnVCD14+.
+

239

Молекулярная биология

ИММУНИЗАЦИЯ РАЗЛИЧНЫМИ АНТИГЕНАМИИ ОБРАЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
АУТОИММУННОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ МЫШЕЙ *IMMUNIZATION WITH DIFFERENT ANTIGENS AND AUTOBODYPRODUCTION IN MICE WITH EXPERIMENTALAUTOIMMUNE ENCEPHALOMYELITIS
К. С. Аулова, Г. А. Невинский
Новосибирский государственный университет
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
K. S. Aulova, G. A. Nevinsky
NSU, Russia
ICBFM SB RAS, Russia
E-mail: k.aulova@g.nsu.ruАннотация
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, модель рассеянного склероза человека, имеет различные особенности в зависимости от используемой линии
мышей и введенного антигена. При иммунизации мышей линии C57BL/6 такими
антигенами, как пептид миелин-олигодендроцитарного протеина, комплекс ДНКи гистонов, комплекс ДНК и метилированного сывороточного альбумина наблюдается различный эффект на протеинурию, уровень антител в крови к ДНК, гистонами белкам миелина, каталитическую активность антител при гидролизе данных субстратов, уровень пролиферации и апоптоза лимфоцитов в различных органах, а также профиль дифференцировки и пролиферации гематопоэтических клеток костного
мозга.
Abstract
Experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for human multiple sclerosis,
has different characteristics depending on a used strain of mice and an injected antigen. In
cases of immunization C57BL/6 mice with antigens, such a peptide of myelin oligodendrocyte glycoprotein, a complex of DNA and histones, a complex of DNA and methylated serum albumin, we have observed different effect on proteinuria, level of antibodies© К. С. Аулова, Г. А. Невинский, 2018.
*Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект
№ 16-15-10103).

240Раздел 3

against DNA, histones and myelin proteins, catalytic activity of antibodies in hydrolysis ofthese substrates, level of lymphocyte proliferation and apoptosis in different organs, anddifferentiation and proliferation profiles of hematopoietic cells in bone marrow.

Рассеянный склероз (РС) — воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, которое характеризуется гетерогенным проявлением. Различные аспекты РС изучают с помощью различных моделей на животных. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) мышей является традиционно используемой моделью
заболевания человека, поскольку имеет аналогичные признаки, такие каквоспаление, демиелиницазия и нейродегенерация в ЦНС. Также, как приЭАЭ в крови мышей, так и при РС в крови пациентов обнаруживают антитела к ДНК и основному белку миелина (ОБМ). Кроме того, IgG из плазмы
мышей с ЭАЭ и больных РС гидролизуют как отдельные белки миелина,так и ДНК. Антитела с каталитической активностью присутствуют в крови больных и другими аутоиммунными заболеваниями. Наличие детектируемого уровня IgG с ДНКазной активностью является одним из ранних
признаков протекания аутоиммунных процессов. Также было показано, чтопри развитии ЭАЭ изменяется профиль дифференцировки и уровень пролиферации гематопоэтических клеток костного мозга, что в сочетании с образованием каталитически активных антител указывает на реорганизацию
иммунной системы.
В данной работе рассмотрены три варианта иммунизации мышей линии
C57BL/6 для инициации ЭАЭ: с помощью пептида миелин-олигодендроцитарного протеина (МОГ35–55), комплекса ДНК и метилированного бычьего
сывороточного альбумина (ДНК-метБСА), а также комплекса ДНК с гистонами. Иммунизация мышей с помощью МОГ35–55 приводит к образованиюв острую фазу ЭАЭ (7–20 дней) каталитически активных антител, эффективно гидролизующих основной белок миелина, МОГ и ДНК, параллельно со снижением активности IgG, гидролизующих гистоны. По сравнениюс МОГ, иммунизация с помощью комплекса ДНК и гистонов приводитк снижению протеинурии, значительному повышению титров антител против ДНК, МОГ и ОБМ, а также каталитических активностей гидролиза данных антигенов. В отличие от МОГ, комплексы ДНК-гистоны и ДНК-метБСА
стимулируют образование гидролизующих ДНК антител с длительной задержкой (15–20 дней). Исходя из полученных данных, иммунизация мышейс помощью комплексов ДНК с метБСА и ДНК с гистонами имеет противоположный по сравнению с МОГ эффект. Иммунизация с помощью комплекса ДНК-гистоны приводит к появлению в острую фазу ЭАЭ каталитических
антител, гидролизуюших гистоны, в то время как ДНКазную активность IgGМолекулярная биология

241обнаруживают значительно позже. Показано, что иммунизация с помощью
МОГ, комплексов ДНК-метБСА и ДНК-гистоны также оказывает различный
эффект на уровни апоптоза лимфоцитов в различных органах, профиль дифференцировки и пролиферации стволовых клеток костного мозга.

Раздел 3242ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ
ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ,НЕСУЩИХ ЦИАНО-ЕНОНОВЫЙ ФАРМАКОФОР *IMMUNOMODULATING EFFECT OF SEMISYNTHETIC DERIVATIVESOF GLYCYRRHETIC ACID BEARINGA CYANO-ENON PHARMACOPHORE
В. О. Бабич, А. В. Марков, О. В. Саломатина,Н. Ф. Салахутдинов, М. А. Зенкова, Е. Б. Логашенко
Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск
V. O. Babich, A. V. Markov, O. V. Salomatina,
N. F. Salakhutdinov, M. A. Zenkova, E. B. Logashenko
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine
SB RAS, NovosibirskАннотация
Исследована иммуномодулирующая активность циано-енон-содержащих тритерпеноидов СМ и СГ-199 in vitro. Показано, что тритерпеноиды при концентрации
0.5 μМ эффективно подавляют фагоцитарную активность и подвижность мышиных макрофагов, увеличивают экспрессию провоспалительных цитокинов (ИЛ-6,ФНО-α, ИЛ-1β); а также обладают антиоксидантной активностью, повышая экспрессию HO-1 и уровень GSH и подавляя экспрессию iNOS и продукцию ROS.
Abstract
Immunomodulating activity of cyano-enone-containing triterpenoids SM and
SG-199 in vitro was studied. It has been shown that triterpenoids at a concentration of
0.5 μM effectively inhibit phagocytic activity and mobility of murine macrophages, increase the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1β); have antioxidant activity, leading to an increase in expression of HO-1 and GSH level, as well asa decrease in the expression of iNOS and ROS production.

В настоящее время большие усилия исследователей направлены на создание химических производных растительных метаболитов. Одним из©
В. О. Бабич,А. В. Марков,О. В. Саломатина,Н. Ф. Салахутдинов,М. А. Зенкова, Е. Б. Логашенко, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РНФ № 17-75-20120.

243Молекулярная биология

наиболее перспективных направлений в данной области является введение
циано-еноновой группировки в тритерпеноидный скаффолд. Показано, чтоданная модификация приводит к значительному увеличению биологической
активности тритерпеноидов [1].
Ранее нами было синтезировано два новых производных глицирретовой
кислоты (Рис.1), содержащих в кольце А циано-еноновую функциональную
группу. На примере СМ было показано, что данное производное характеризуется широким спектром биологической активности — ингибирует пролиферацию опухолевых клеточных линий [2], подавляет рост мышиной карциномы Кребс-2 [3], обладает противовоспалительной активностью на модели
грипп-индуцированной пневмонии у мышей [4] и подавляет репликацию
вируса гриппа А in vitro и in vivo.
Целью данного исследования являлась оценка иммуномодулирующего
действия циано-енон-содержащих производных глицирретовой кислотыСМ и СГ-199 (рис. 1) in vitro на модели мышиных макрофагов.
СМ

СГ-199Рис. 1. Структуры производных глицирретовой кислоты
Рис. 1. Структуры производных глицирретовой кислотыНа первом
этапе исследований нами был определен диапазон нетконцентраций исследуемых производных глицирретовой кислоты. Дпервом этапе исследований
намивбыл
определен диапазон
нетоксичклетки Наинкубировалив среде
присутствии
исследуемых
соедных концентраций исследуемых
-5-9 производных глицирретовой кислоты. Для
до
10
М
в
течение
24часов.
Послечегоэффект
иконцентрации
от
10этого клетки инкубировали в среде в присутствии исследуемых соединений
соединенийна жизнеспособность
мышиных
макрофагов
св концентрации
от 10–5 до 10–9 М в течение
24 часов. После
чего эффектоценивали
изуМТТ-теста.
Было установлено,чтомышиных
концентрации
дочаемых соединенийна жизнеспособность
макрофагов соединений
оценивали
RAWдоспомощью
МТТ-теста.
Былоустановлено,чтоконцентрации
соединений
=2 мкМ, Iоказывают токсический эффект на клетки (СГ-199: IC
50
RAW токсический эффект
J774
не оказываютна клетки (СГ-199: IC50RAW=2 мкМ,
=3.5
мкМ,
IC
=2.2
мкМ).
Для
дальнейших
исс
мкМ;1 µМ
СМ:
IC
50
50
IC50J774=1.9 мкМ;СМ: IC50RAW=3.5 мкМ,IC50J774=2.2 мкМ). Для дальнейших
намиисследований
была выбрана
концентрация
исследуемых
соединений
– 0.
намирабочая
была выбрана
рабочая концентрация
исследуемых
соеМы исследовали
эффект тритерпеноидов на функциональную адинений
— 0.5 µМ.
Мы исследовали
эффектна
тритерпеноидовна функциональную
макрофагов,в частности
фагоцитарную
активность активностьи подвижность клмакрофагов,вчастности
нафагоцитарную
активность
иподвижность
клеток.
оценки влияния на фагоцитарную активность производных
глицкислоты, клетки RAW264.7 инкубировали в присутствии соеди
концентрации 0.5 мкМ в течение 24 часов. Фагоцитарную активность опо способности макрофагов поглощать FITC-dextran с помощью п

244Раздел 3Для оценки влияния на фагоцитарную активность производных глицирретовой
кислоты, клетки RAW264.7 инкубировали в присутствии соединений в концентрации 0.5 мкМ в течение 24 часов. Фагоцитарную активность оценивали поспособности макрофагов поглощать FITC-dextran с помощью проточной цитофлуориметрии. Исследование показало, что соединение СМ в концентрации
0.5 мкМ снижает фагоцитарную активность макрофагов до 47,6 %.
Влияние соединений СМ и СГ-199 на подвижность клеток J774 оценивали in vitro методом зарастания царапины («Scratch assay»). Целостность
сформированного клетками монослоя нарушали нанесением царапиныи отслеживали скорость заполнения царапины макрофагальными клеткамив отсутствие соединений (контроль) и в присутствии исследуемых соединений в концентрации 0.1 и 0.5 мкМ. Было показано, что соединения СМи СГ-199 в концентрации 0.5 мкМ эффективно подавляют миграционную
активность клеток J774 (рис. 2).
Влияние на экспрессию цитокинов было исследовано с помощью ПЦРв режиме реального времени. В ходе исследования было показано, что тритерпеноиды оказывают иммуномодулирующий эффект, приводящий к повышению экспрессии провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-1β),IP-10, COX-2, участвующей в синтезе простогландина Е2, а также к снижению противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Было также установлено,Рис. 2. Оценка влияния производных ГЛК на миграционную
активность клеток J774. Клетки J774 инкубировали в присутствии соединений СМ и СГ-199 в концентрации 0,5 мкМ в течение
72 часов. В качестве контроля использовали интактные клетки,инкубированные в отсутствии соединений

Молекулярная биология

245

что исследуемые производные снижают уровень экспрессии iNOS, что коррелирует со способностью СМ подавлять синтез NO, показанной нами ранее [5]. Выявлено, что исследуемые соединения обладают антиоксидантным
эффектом, повышая уровень HO-1, не влияя при этом на уровень экспрессии
Nrf2, а также повышая уровень GSH, что взаимосвязано со способностью
соединений подавлять выработку ROS мышиными макрофагами.
Таким образом нами было показано, что новые производные глицирретовой кислоты, содержащие дополнительную циано-еноновую группировкув кольце А, ингибируют фагоцитарную активность и подвижность мышиных макрофагов, обладают антиоксидантной активностью, а также снижают экспрессию противовоспалительных и повышают экспрессию провоспалительных цитокинов.
Литература
1. Markov, A., Zenkova, M., Logashenko, E. Modulation of Tumour-Related Signaling
Pathways by Natural Pentacyclic Triterpenoids and their Semisynthetic Derivatives //Current Medicinal Chemistry. 2017. Vol. 24. P. 1277–1320.
2. Popadyuk, I., Markov, A., Babich, V., Salomatina, O., Logashenko, E., Zenkova,
M., Salakhutdinov, N. Novel derivatives of deoxycholic acid bearing aliphatic or cyclic
diamine moieties at the C-3 position: Synthesis and evaluation of anti-proliferative
activity // Bioorg Med Chem Lett. 2017. Vol. 27. P.3755–3759.
3.. Markov, A., Sen’kova, A., Zenkova, M., Logashenko, E. Novel Glycyrrhetinic Acid
Derivative Soloxolone Methyl Inhibits the Inflammatory Response and Tumor Growth invivo // 2018. Molekulyarnaya Biologiya. Vol. 52, No. 2. P. 306–313.
4. Markov, A., Sen’kova, A., Warszycki, D., Salomatina, O., Salakhutdinov, N.,
Zenkova, M., Logashenko, E. Soloxolone methyl inhibits influenza virus replication andreduces virus-induced lung inflammation // Scientific Reports. 2017. Vol. 7.
5. Salomatina, O., Markov, A., Logashenko, E., Korchagina, D., Zenkova, M.,
Salakhutdinov, N., Vlasov, V., Tolstikov, G. Synthesis of novel 2-cyano substituted
glycyrrhetinic acid derivatives as inhibitors of cancer cells growth and NO production in
LPS-activated J-774 cells // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2014. Vol. 22. P. 585–593.

Раздел 3246ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ОТВЕТ БУРОГО ЖИРАНА ОЖИРЕНИЕ, ИНДУЦИРОВАННОЕ ДИЕТОЙ,У САМЦОВ И САМОК МЫШЕЙ *TRANSCRIPTIONAL RESPONSE OF BROWN FATTO DIET-INDUCED OBESITY IN MALE AND FEMALE MICE
Н. Ю. Балыбина 1, Т. В. Яковлева 2, Е. Н. Макарова 2, Н. М. Бажан 1,2Новосибирский национальный исследовательский государственный
университет, Новосибирск, Россия
2Институт цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук, Новосибирск, Россия

1

N. Yu. Balybina 1, T. V. Iakovleva 2, E. N. Makarova 2, N. M. Bazhan 1,2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Institute of Cуtology and Genetics, The Siberian Branch of the Russian
Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
1

2

E-mail: n.balybina@g.nsu.ruАннотация
Ожирение — одно из наиболее распространенных заболеваний в развитых странах, оно повышает риск развития многих патологий. До сих про нет эффективных
средств для быстрого и безопасного снижения веса.
Ожирение возникает, когда поступление энергии превышает ее расход. Поступление энергии зависит от потребления пищи, а расход, от многих факторов и, в частности, от термогенеза в бурой жировой ткани. Поэтому одним из способов увеличения
расхода энергии является активация термогенеза в буром жире. Известно, что в буром
жире фактор роста фибробластов 21 (FGF21) активирует термогенез и повышает экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию термогенеза и углеводно-жирового обмена [1, 2]. Однако до сих пор не изучены половые различия в изменении экспрессии
FGF21 в буром жире при ожирении. В нашем исследовании мы обнаружили признаки
резистентности к FGF21 при ожирении у самцов, но не у самок.
Abstract
Obesity is one of the most common diseases in developed countries; it increases therisk of many diseases. Until now, there are no effective approaches for rapid and safe
weight loss.
© Н. Ю. Балыбина, Т. В. Яковлева, Е. Н. Макарова, Н. М. Бажан, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке РНФ (проект 17-15-01036).

Молекулярная биология

247

Obesity occurs when the energy intake exceeds its expenditure. Energy intake depends
on food intake; energy expenditure depends on many factors and, in particular, on thermogenesis in brown adipose tissue. Therefore, activation of thermogenesis in brown fat
is one of the way to increase energy consumption. Fibroblasts growth factor 21 (FGF21)
is known to activate thermogenesis and increases the expression of genes involved in theregulation of thermogenesis and carbohydrate-fat metabolism in brown fat [1,2]. However,sex differences in the change in the expression of FGF21 in brown fat in obesity have notyet been studied. In our study, we found signs of resistance to FGF21 for obesity in males,
but not in females.

Ожирение — одна из наиболее значимых проблем в развитых странах,оно повышает риск развития сахарного диабета второго типа, болезней сердечно-сосудистой системы и опорно-двигательного аппарата, безалкогольной жировой болезни печени и др. До сих пор не разработано эффективных
методов лечения данного расстройства, способствующих быстрому, эффективному, а главное безопасному снижению веса.
При ожирении нарушается баланс между поступлением и расходом
энергии. Поступление энергии зависит от потребления пищи, а расход, отмногих факторов и, в частности, от термогенеза в бурой жировой ткани.
Поэтому одним из потенциально возможных способов эффективно и безопасно избавиться от лишнего веса является повышение активности бурой
жировой ткани, что позволит увеличить расход энергии и снизить запасы
питательных веществ. Известно, что в буром жире фактор роста фибробластов 21 (FGF21) активирует термогенез и повышает экспрессию генов,вовлеченных в регуляцию термогенеза и углеводно-жирового обмена [1,2].
Показано, что интенсивность термогенеза зависит от пола. Однако до сихпор не изучены половые различия в изменении экспрессии FGF21 в буром
жире при ожирении. Исходя из вышесказанного целью нашей работы былоисследовать влияние ожирения на экспрессию генов бурого жира, участвующих в регуляции термогенеза и углеводно-жирового обмена, у особей разного пола.
В эксперименте были использованы мыши С57Bl с 10-ти недельного
возраста. Мыши контрольной группы получали стандартный корм, животных в группах с диет-индуцированным ожирением (ДИО) перевели на сладко-жирную диету, содержащую помимо стандартного корма, сдобное печенье, семена подсолнечника и свежее свиное сало (10 недель). Методом ПЦРв реальном времени мы исследовали следующие гены: FGF21 — активация
термогенеза; рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами
(Pparg) и ко-рецептор рецептора FGF21 (Klb) — передача сигнала FGF21;
переносчик глюкозы 1(Glut1) — метаболизм глюкозы; карнитин-пальмето-248

Раздел 3Уровень мРНК генов в буром жире у контрольных мышей
(белый столбик) и мышей с диет-индуцированным ожирением
(серый столбик). *P<0,05: сравнение с контролем; $P < 0,05:сравнение с самцами по Fisher Post-hoc testил трансфераза 1b (Cpt1b) и гормон-чувствительная липаза (Hsl) — метаболизм липидов; рассопрягающий белок 1 (Ucp1) и дейодиназа 2 (Dio2) —термогенез.
У самцов в большей степени, чем у самок повышался уровень
в FGF21 крови и экспрессия его гена в буром жире. При этом у самцов,но не у самок, наблюдались признаки снижения чувствительности к действию FGF21 на бурую жировую ткань: снижение уровня экспрессии генов
Pparg и Klb. Также мы обнаружили у ДИО самцов снижение, относительно
контроля, экспрессии гена-мишени FGF21 — Glut1, экспрессию которого

Молекулярная биология

249

в норме он стимулирует [3]. У самцов при ожирении, несмотря на повышенный уровень экспрессии гена FGF21, мы не наблюдали увеличение уровня
экспрессии генов, Cpt1b, Hsl, Ucp1 и Dio2, однако известно, что в норме
FGF21 стимулирует их экспрессию (рис. 1.) [4,5]. Эти факты свидетельствуют о снижении чувствительности к FGF21 в буром жире при ожиренииу самцов.
В отличии от самцов, у самок не было обнаружено признаков снижения
чувствительности к FGF21 на уровне экспрессии генов в буром жире приожирении, у них достоверно не изменялся уровень экспрессии ни одного изисследованных нами генов.
В настоящее время активно ведутся исследования по применению
FGF21 для коррекции ожирения у лабораторных животных. На основании
полученных нами результатов мы можем предположить, что самцы будут
менее чувствительны, чем самки к лечению ожирения с помощью введения
экзогенного FGF21.
Литература
1. Liu X., Wang Y., Hou L., Xiong Y., Zhao S. Fibroblast Growth Factor 21 (FGF21)
Promotes Formation of Aerobic Myofibers via the FGF21-SIRT1-AMPK-PGC1α
Pathway // Journal of cellular physiology. — 2017. — Vol. 232. — №. 7. — P. 1893–1906.
2. Chen M. Z., Chang J. C., Zavala-Solorio J., Kates L., Thai M., et al. FGF21 mimetic
antibody stimulates UCP1-independent brown fat thermogenesis via FGFR1/βKlotho
complex in non-adipocytes // Molecular metabolism. — 2017. — Vol. 6. — №. 11. —P. 1454–1467.
3. Fisher F. M., Maratos-Flier E. Understanding the Physiology of FGF21 // Annual
review of physiology. — 2016. — Vol. 78. — P. 223–241.
4. Douris, N., Desai, B. N., Cisu, T., Fowler, A. J., Zarebidaki, E., et al. Beta-adrenergic
Receptors are Critical for Weight Loss but not for other Metabolic Adaptations to theConsumption of a Ketogenic Diet in Male Mice // Molecular Metabolism. — 2017. —Vol. 6. — №. 8. — P. 854–862.
5. Chau M. D., Gao J., Yang Q., Wu Z., Gromada J., et al. Fibroblast growth factor
21 regulates energy metabolism by activating the AMPK–SIRT1–PGC-1α pathway //Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2010. — Vol. 107. — №. 28. —P. 12553–12558.

Раздел 3250ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СЕРОТОНИНОВОЙ СИСТЕМЫ
МОЗГА ВЗРОСЛЫХ КРЫС ПОСЛЕ НЕОНАТАЛЬНОГО
ВВЕДЕНИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И ДЕЙСТВИЯ
ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА *SEROTONERGIC GENES EXPRESSION
IN THE ADULT RAT BRAIN AFTER NEONATAL
GLUCOCORTICOIDS AND CHRONIC STRESS*
К. В. Балык 1,2, Е. В. Сухарева 1,2,
Д. А. Ланшаков 1, Т. С. Калинина 1,2Федеральный исследовательский центр
Институт цитологии и генетики СО РАН
2Новосибирский государственный
научно-исследовательский университет
1

K. V. Balyk 1,2, E. V. Sukhareva 1,2, D. A. Lanshakov 1, T. S. Kalinina 1,2
1

Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, RussiaАннотация
Однократное введение дексаметазона и гидрокортизона на 3 день жизни снижает
активность серотонинергической системы мозга взрослых животных, понижая в среднем мозге экспрессию гена ключевого фермента синтеза медиатора — нейрональной
триптофангидроксилазы (tph2) в покое и при действии хронического стресса.
Abstract
A single injection of dexamethasone or hydrocortisone to 3-day-old rats significantly
decreased TpH2 mRNA levels, the key enzyme of the serotonin synthesis, in the midbrainof adult rats at rest and after chronic unpredictable stress.

Серотонинергическая система мозга, как свидетельствуют экспериментальные и клинические данные, вовлечена в проявление депрессивных
состояний, склонность к которым многократно возрастает в результате неблагоприятных условий протекания раннего онтогенеза. Даже такие слабые
стрессорные воздействия, как разлучение с матерью на различные временные интервалы или ухудшение степени материнской заботы в первые дни© К. В. Балык, Е. В. Сухарева, Д. А. Ланшаков, Т. С. Калинина, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ 16-04-01222.

Молекулярная биология

251жизни, способно привести к развитию аффективных расстройств в дальнейшем. Кроме того, известно, что развитие психопатологий может быть спровоцировано длительным действием стресса уже во взрослой жизни. Какие
изменения при этом происходят в экспрессии генов, белковые продукты которых обеспечивают синтез, обратный захват и рецепцию серотонина, остается не ясным.
Исследование уровней экспрессии основных генов серотониновой системы в отделах мозга взрослых животных после неонатального воздействия глюкокортикоидами и действия хронического непредсказуемого
стресса явилось целью настоящего исследования.
Для достижения поставленной цели на 3-й день жизни крысятам мужского пола линии Вистар однократно вводили один из двух глюкокортикоидных гормонов — дексаметазон (0,2 мг/кг) или гидрокортизон (5 мг/кг). В качестве контрольных групп выступали однопометные интактные животныеи животные с введением физиологического раствора. По достижению половозрелого возраста (45 дней) животных подвергали процедуре хронического непредсказуемого стресса на протяжении 15 дней, предъявляя случайную
последовательность таких воздействий, как обдув теплым воздухом, наклон
клетки, круглосуточный свет, ограничение подвижности, суточное голодание, плавание. Образцы ткани мозга были взяты через 2 ч. и 24 ч. после
окончания действия стресса. Уровень экспрессии генов, регулирующих активность серотонинергической системы — ключевого фермента синтеза медиатора — нейрональной триптофангидроксилазы (tph2), серотонинового
транспортера (Scl6a4) и ауторецептора 5-НТ1А подтипа (5ht1a) определялис помощью метода ПЦР в реальном времени с использованием технологии
Taq-man и рассчитывали по методу ∆∆Ст относительно экспрессии гена домашнего хозяйства — бета-актина.
Неонатальное введение глюкокортикоидов привело к долговременному изменению активности серотонинергической системы — понижению
экспрессии гена нейрональной триптофангидроксилазы (tph2) в среднем
мозге — области основного скопления перикарионов серотонинергических
нейронов. Пониженный уровень мРНК гена tph2 у животных с неонатальным введением гормона сохранялся на фоне хронического непредсказуемого стресса, повышающего уровень мРНК фермента: на уровне тенденции
через 2 ч. после стресса, достигая достоверности через 24 ч. после стресса по сравнению с контрольными группами. Профиль изменений экспрессии гена серотонинового транспортера (Scl6a4) в стволе мозга у животныхс неонатальным введением глюкокортикоидов в целом повторял динамику
изменений уровня мРНК tph2 на протяжении всех экспериментальных процедур. Экспрессия гена основного ауторецептора — 5ht1a не зависела от252Раздел 3неонатальных гормональных воздействий и повышалась исключительно через 2 ч. после стресса, как в стволе, так и в префронтальной коре головного
мозга, через сутки возвращаясь к исходному уровню экспрессии.
В целом в работе впервые установлено долговременное изменение экспрессии генов серотонинергической системы мозга взрослых животных
после однократного введения глюкокортикоидов в чувствительный период
раннего онтогенеза. Выявленные изменения экспрессии генов серотонинергической системы могут являться причиной отклонений в психоэмоциональном статусе животных после неонатального гормонального воздействия.

Молекулярная биология

253

ОТСТАВЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ НЕОНАТАЛЬНОГО
ВВЕДЕНИЯ ДЕКСАМЕТАЗОНА: НАРУШЕНИЕ
КОГНИТИВНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ВЗРОСЛЫХ САМЦОВ
МЫШЕЙ И ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВВ ГИППОКАМПЕ *THE LONG-TERM EFFECTS OF NEONATAL DEXAMETHASONE
TREATMENT: DISTURBANCE COGNITIVE ABILITIESOF ADULT MALE MICE AND CHANGESIN GENE EXPRESSION IN THE HIPPOCAMPUS
У. И. Батлук 1,2, К. В. Бурдеева 3, А. С. Шулюпова 3, Н. П. Бондарь 1,2
1Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
3Новосибирский государственный медицинский университет,Новосибирск, Россия
U. I. Batluk 1, 2, K. V. Burdeeva 3, A. S. Shulyupova 3, N. P. Bondar 1, 2
1Institute of Cytology and Genetics of SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3
Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, RussiaАннотация
Дексаметазон является синтетическим аналогом глюкокортикоидов (ГК), вырабатываемых организмом в ответ на стресс. Действие стресса или применение таких
ГК, как дексаметазон, в ранний период жизни может негативно сказываться на постнатальном развитии мозга: приводит к нарушениям в формировании и сохранении
пространственной памяти. Исследование изменения экспрессии генов на уровне
всего генома у взрослых животных с неонатальным введением дексаметазона может
объяснить механизмы таких отставленных эффектов как нарушение когнитивных
способностей.
Abstract
Dexamethasone is a synthetic analogue of glucocorticoids (GC), produced by the bodyin response to stress. The effect of stress or the use of such GCs, like dexamethasone, inthe early period of life can adversely affect postnatal brain development. In our experi© У. И. Батлук, К. В. Бурдеева, А. С. Шулюпова, Н. П. Бондарь, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке проектом Российского научного фонда 16-15-10131.

254Раздел 3ment, it was shown, that neonatal dexamethasone administration leads to disturbances in
the learning abilities and spatial memory. A study of changes in gene expression on wholegenome level in adult animals with neonatal dexamethasone treatment may explain themechanisms of such delayed effects as cognitive impairment.

Методы
Введение дексаметазона проводили в течение первых трех дней после
родов один раз в день с уменьшением дозы (0,5, 0,3, 0,1 мг / кг соответственно). Нами было исследовано влияние дексаметазона как в раннем периоде
жизни — на неонатальные рефлексы особей, так во взрослом возрасте — наповедение и экспрессию генов в гиппокампе. Экспрессия генов была оценена с помощью РНК-seq.
Результаты
Введение дексаметазона в ранний период жизни приводит к задержке
нейромоторного развития, характеризующегося сохранением незрелых двигательных паттернов, а также к задержке проявления некоторых физиологических параметров — появления шерсти и открытия глаз. Кроме того, введение дексаметазона вызывает задержку в приросте веса животных. Взрослые
самцы мышей с введением дексаметазона показали снижение тревожности,а также нарушение пространственной памяти и обучения в водном лабиринте Морриса. Анализ изменений транскриптома взрослых животных с иcторией введения дексаметазона в раннем возрасте выявил изменение экспрессии 12-ти генов. Среди них были выявлены гены, участвующие в процессах
сплайсинга (Cpsf6, Srsf2), вовлеченные в процессы метаболизма глюкозыи гликогена (Gck, Amy1), 5 некодирующих РНК, функция которых не изучена, ген, участвующий в процессах расщепления глицина (Amt), и ген, вовлеченный в процесс в регуляции транскрипции (Ankzf1). Особый интерес
представляет гена Arc, экспрессия которого была увеличена у мышей с введением дексаметазона. Функция этого гена тесно связана с образованием
долговременной памяти, а также с регуляцией синаптической пластичности, и нарушение его экспрессии может вызывать наблюдаемые изменения
когнитивных функций.
Заключение
Наше исследование показало, что неонатальное введение дексаметазона
оказывает неблагоприятное воздействие на когнитивные способности взрослых самцов мышей. Однако анализ изменений транскриптома гиппокампа
этих животных выявил лишь слабые изменения отдельных генов, возможно
задействованных в реализации отставленных эффектов дексаметазона.

Молекулярная биология

255ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ
ЭНТЕРОАГРЕГАТИВНЫХ E. COLI ПО ДАННЫМ
ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯSTUDY OF THE PROPERTIES OF ISOLATES OF ENTEROAGGREGATIVE
E. COLI BY THE COMPLETE GENOMIC SEQUENCE DATA
Д. С. Болдырева 1,2, А. А. Кечин 1,2, М. А. Макарова 3,
Л. А. Кафтырева 3, С. Г. Щербак 4,5, С. В. Апалько 5, М. Л. Филипенко 1,2,
А. М. Сарана 4,5, М. А. Чурина 5,61Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук2Новосибирский государственный университет
3Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологиии микробиологии им. Пастера
4Санкт-Петербургский государственный университет
5СПб ГБУЗ «Городская больница № 40Курортного административного района»6СПб ГБУЗ «Клиническая инфекционная больница
им. С. П. Боткина»D. S. Boldyreva 1,2, A. A. Kechin 1,2, M. A. Makarova 3, L. A. Kaftyreva 3,
S. G. Scherbak 4,5, S. V. Apalko 5, M. L. Filipenko 1,2, A. M. Sarana 4,5,
M. A. Churina 5,6 *Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicineof the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
2
Novosibirsk State University
3
Saint-Petersburg Pasteur Institute4Saint-Petersburg State University
5
St. Petersburg State Medical Academy «City Hospital
No. 40 of the Resort Administrative District»
6
St. Petersburg Clinical Infectious Diseases Hospital
named after S. P. Botkin1Аннотация
Целью работы стало исследование свойств 8-ми изолятов энтероагрегативных E.
coli (EAggEC), выделенных от детей с дисбиозом кишечника, с использованием дан* © Д. С. Болдырева, А. А. Кечин, М. А. Макарова, Л. А. Кафтырева, С. Г. Щербак, С. В. Апалько, М. Л. Филипенко, А. М. Сарана, М. А. Чурина, 2018.

256Раздел 3ных полногеномного секвенирования. В среднем, все изоляты несли по 12 генов, кодирующих факторы вирулентности. Генов, кодирующих шига-тоскины, найдено не
было. По отношению к стандартным культуральным и фенотипическим методам характеризации полногеномное секвенирование показало высокую информативностьдля поиска детерминант резистентности к лекарственным препаратам, а также дляпрогноза вирулентности по наличию соответствующих генов.
Abstract
The aim of the work was to study the properties of 8 isolates of enteroaggregative E.
coli (EAggEC) extracted from children with intestinal dysbiosis using full genome sequencing data. On average, all isolates carried 12 genes encoding virulence factors. There
were no genes encoding shiga-toskins. With respect to standard culture and phenotypiccharacterization methods, full genome sequencing has shown high information value forthe search for drug resistance determinants, as well as for prognosis of virulence by thepresence of appropriate genes.

Энтероагрегативные E. coli (EAggEC) являются возбудителями таких
кишечных заболеваний, как острая и хроническая диарея, воспаление кишечника у детей и взрослых, дефицит роста у детей. EAggEC являются
одними из наиболее частых возбудителей внутрибольничных инфекций,часто приводя к гибели пациентов в детских инфекционных и акушерских
отделениях. Изоляты EAggEC характеризуются наличием широкого спектра
факторов вирулентности и резистентностью к стандартному спектру антибиотиков.
Целью нашей работы стало определение свойств изолятов EAggEC, выделенных от детей с диагнозом «дисбиоз» кишечника на основе данных
полногеномного секвенирования.
Нами были исследованы 8 штаммов E. coli, выделенных от детей в возрасте до 2 лет с диагнозом «дисбиоз кишечника». Штаммы были идентифицированы как EAggEС, имели различия по ферментации лактозы и сахарозы, подвижности и гемолитической активности.
Определение последовательностей геномов изолятов было проведенос помощью высокопроизводительного секвенирования (NGS) на приборе
MiSeq (Illumina) с использованием реагентов MiSeq reagent kit v2 (500 циклов). Библиотеки были приготовлены путём фрагментации геномной ДНКи отбора фрагментов со средней длиной около 500–600 п.о. с последующим
присоединением адаптеров с помощью лигирования.
Фенотипическую резистентность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом. Выявление генов лекарственной резистентности в полученных геномных последовательностях осуществляли программой ResFinder.

Молекулярная биология

257

Факторы вирулентности были определены путём выявления генов вирулентности EAggEC (aaf, aggR, pet и др.) с помощью ПЦР в мультиплексном формате с последующей электрофоретической детекцией, а также программным обеспечением VirulenceFinder, проводящим поиск соответствующих последовательностей в геномных последовательностях.
Наиболее часто изоляты были устойчивы к β-лактамам (6 изолятов),аминогликозидам (6 изолятов) и сульфаниламидам (5 изолятов). В большинстве случаев (29 из 34), результаты, полученные анализом данных полногеномного секвенирования, совпадали с результатами диско-диффузионного
теста, даже в случае низкого среднего покрытия референсного генома, чтоговорит о применимости NGS для исследования бактериальных изолятов наустойчивость к антибактериальным препаратам.
Программой VirulenceFinder в среднем было найдено 12 (от 5 до 18)факторов вирулентности для каждого изолята. Наиболее часто встречались
гены, кодирующие факторы вирулентности, такие как aap (кодирует дисперсин, 7 изолятов) и ORF4 (6 изолятов). Гены, кодирующие токсины, astA и sat,встретились в геномах трёх и двух изолятов, соответственно. Гены, кодирующие шига-токсины найдены не были. При сравнении с данными ПЦРрезультаты совпадали в 88 % случаев (35 из 40).
Таким образом, среди восьми исследуемых изолятов, не было выявлено
особо опасных, несущих гены шига-токсинов, однако были найдены изоляты с другими токсинами (первоначально не анализировавшиеся с помощью
классического ПЦР), а также изоляты с широким спектром устойчивостик антибиотикам.

Раздел 3258АКТИВАЦИЯ МИКРОГЛИИ КОРЫ НА ФОНЕИНФИЦИРОВАНИЯ НЕ НЕЙТРОПНЫМ
ВИРУСОМ ГРИППА А(H1N1) A/ TOMSK/13/2010 *CEREBRAL CORTEX MICROGLIA ACTIVATION DURING
INFECTION WITH THE NON-NEUROTROPIC
A/TOMSK/13/2010 H1N1 INFLUENZA VIRUS
П. И. Гайнутдинов, А. В. Слепнева,О. Г. Курская, П. М. Кожин, А. В. Ковнер
ФГБНУ Научно-исследовательский институт экспериментальнойи клинической медицины структурное подразделение ФИЦ ФТМ
P. I. Gainutdinov, A. V. Slepneva, O. G. Kurskaya, P. M. Kozhin, A. V. Kovner
RIECM, Russia
E-mail: pg@centercem.ruАннотация
Помимо повреждения респираторного тракта, острая вирусная инфекция в организме человека может обусловить развитие повреждения центральной нервной системы в виде менингита, энцефалита, менингоэнцефалита (Fuchigami T. etal., 2012)с развитием неврологической симптоматики в виде прогрессирующей энцефалопатии сочетающейся выраженной цефалгией, а так же комы на фоне нарастающего
отека мозга, вплоть до летального исхода (Ekstrand J. J., 2012). Эти симптомы характерны для вирусного инфекционного процесса обусловленного разными штаммами
вируса гриппа А/H1N1 (Idehara R., 2012). Механизмы индукции повреждения различных структур головного мозга являются спорными: с одной стороны они могут
быть связаны с первичной реакцией клеток в ответ на присутствие вируса в ткани
ЦНС, а с другой, являться результатом системного иммунного ответа, вторичного, поотношению к инфекционному агенту (Mukherjee A. et al., 2011). Таким образом, приинфицировании сезонным вирусом гриппа А/H1N1 A/Tomsk/13/2010, не имеющим
детектированного нейротропного характера, будут комплексно изучены и уточнены механизмы повреждения коры головного мозга, в том числе степень реализации иммунного ответа клетками ЦНС моноцитарного происхождения (иммунными
резидентными клетками). Учитывая, тот факт, что реализация воспаления в тканях
© П. И. Гайнутдинов, А. В. Слепнева, О. Г. Курская, П. М. Кожин, А. В. Ковнер,2018.
*Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-315-00257.

Молекулярная биология

259

ЦНС является основой генерации и прогрессирования ряда нейродегенеративных
нарушений, эти результаты подчеркивают значимость способности вирусов гриппа
инициировать и пролонгировать воспаление в структурах головного мозга.
Abstract
In addition to respiratory damage, acute viral infection in the human body can lead tothe development of central nervous system damage in the form of meningitis, encephalitis, meningoencephalitis (Fuchigami T. et al., 2012) with the development of neurologic
symptoms in the form of progressive encephalopathy combined with severe cephalgia, as
well as coma against the backdrop of increasing brain edema, up to a lethal outcome (Ekstrand J. J., 2012). These symptoms are typical for the viral infectious process caused bydifferent strains of the influenza A/H1N1 virus (Idehara R., 2012). Mechanisms of various
structures of the brain damage induction are controversial: on the one hand, they can beassociated with the primary response of cells due to the presence of the virus in the CNS
tissue, and on the other, result from a systemic immune response secondary to the infectious pathogen (Mukherjee A. et al., 2011). Thus, infection with the seasonal influenza A/
H1N1 A/Tomsk/13/2010 virus, which does not have a detectable neurotropic character,will comprehensively study and refine the mechanisms of cerebral cortex damage, including the degree of realization of the immune response by CNS cells of monocytic origin(immune resident cells). Considering the fact that the realization of inflammation in the
CNS tissues is the basis for the generation and progression of a number of neurodegenerative disorders, these results emphasize the importance of the ability of influenza viruses toinitiate and prolong inflammation in the structures of the brain.

Вирус гриппа принадлежит к семейству Orthomyxoviridae (Wang G. etal, 2016) и подразделяется на три типа (А, В и С), из которых А и В являются клинически наиболее значимыми. Поражение ЦНС во время гриппозной инфекции включает в себя множество синдромов, описываемых каку детей, так и у взрослых (Nicholson K. G., 1998). Основными клиническими проявлениями являются энцефалиты или энцефалопатии. Воспаление
является основополагающим компонентом разнообразного ряда нейродегенеративных заболеваний и связанных с ними невропатологий. Оценка состояния тканей фронтальной и соматосенсорной коры при инфицировании
сезонным вирусом гриппа А/H1N1 позволит составить картину общего состояния нервной ткани и оценить вероятные последствия их повреждения
(Locuratolo N. et al., 2012; Raha S., Udani V., 2012). На данный момент существует все больше доказательств того, что микроглия является ключевым
фактором нейровоспаления (Block M. L. et al., 2007). Активация микроглии
присутствует при различных нейродегенеративных заболеваниях, и тесно
связана с патологией. Активация микроглии может одновременно инициировать дополнительную активацию апоптотических стимулов в нейронахи усиливать постоянное повреждение нейронов, указывая, что микроглия

260Раздел 3может иметь решающее значение для этиологии и прогрессивного характера нейродегенеративных заболеваний (Baburamani A. A. et al., 2014; López
González I. et al., 2016; Sasaki A., 2017). Sadasivan с коллегами показали, чтопри интраназальном инфицировании неадаптированным не нейротропным
штаммом A(H1N1) A/California/09 (Sadasivan S. et al., 2015) инфильтрация
Т-клетками отсутствовала, следовательно, увеличение количества микроглии было связано с внутренними нейротоксическими факторами и увеличением количества циркулирующих цитокинов (Chen X. X. et al., 2014).
Целью данной работы явилось изучение активации микроглии коры мышей
линии BALB/c при инфицировании сезонным вирусом гриппа А/H1N1 A/
Tomsk/13/2010 без документированного нейтропного характера.
Исследование было проведено на 75 6–8 недельных мышах самцах линии BALB/c. 60 животных были интраназально инфицированы штаммом
А/H1N1 A/Tomsk/13/2010 дозой 1МЛД50, 10 животных составили контрольную группу. Образцы легких и головного мозга животных забирались на
1, 3, 6, 10, 14, 21 и 30 сутки после инфицирования (35 — гистологический
анализ, 35 — титрование вируса и постановка рт-ПЦР). Для общего патоморфологического анализа использовалась стандартная гистологическая
пробоподготовка (Kovner A. V. et al., 20XX), для проведения ИГХ анализа
использовался кит SpringBioScience kit HRP-125 с применением специфических первичных антител на антиген вируса гриппаА (abcam, 1:300), Iba1 (abcam, 1:200), TNF-α (Sony, 1:300), iNOS (SBS,
1:100), TGFβ (SBS, 1:100), Arg1 (sigma. 1:200). Окрашивание проводили согласно мануалу производителя. Инфекционный титр вируса для культуры
клеток MDCK из гомогенатов легких и коры головного мозга рассчитывалипо методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lgTCID50/мл(Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962). Для оценки уровня экспрессии ключевых генов активации микроглии проводили рт-ПЦР (Rusanov A. L. et al.,2014). С использованием первичных праймеров TGFB1, TNFA, AIF1, NOS2,
ARG2 с нормировкой на ген GAPDH (Биосинтез, Россия).
В результате проведенной работы нами было впервые продемонстрировано отсутствие нейротропности для выбранного сезонного штамма вируса
гриппа А/H1N1 A/Tomsk/13/2010, что подтверждалось как при титровании
вируса на клетки MDCK (см. таблицу), так и при ИГХ-анализе.
Основным патоморфологическим признаком вовлечения центральной
нервной системы при сезонном не нейротропном гриппе А/H1N1 являлся
деструктивно–отечный синдром, связанный с ранними гемоциркуляторными нарушениями. Данные нарушения сопровождались увеличением численности, активированных Iba1 позитивных клеток микроглии. При морфометрическом анализе гистологических образцов не было детектировано

Численная плотность

праймеров TGFB1, TNFA, AIF1, NOS2, ARG2 с нормировкой на ген GAPDH(Биосинтез, Россия).
В результате проведенной работы нами было впервые продемонстрировано
отсутствие нейротропности для выбранного сезонного штамма вируса гриппа
биология
А/H1N1 A/Tomsk/13/2010, Молекулярнаячто подтверждалоськак при титровании вируса 261
наклетки MDCK (табл. 1), так и при ИГХ-анализе.
Таблица 1. Титрвируса гриппа
A/Tomsk/13/2010на культуре клеток
переключения
фенотипа
клетокA/H1N1
микроглиис провоспалительногона репаMDCK(lgTCID50/мл).
ративный, что свидетельствуето пролонгированном
воспалительном ответе
День после инфицирования
(см.
рисунок).
Орган
(n=5)
1
3
6
10
легкие
4,4 ± 0,89
5,2 ± 0,36
5,6 ± 0,11
4,3 ± 0,26гриппа A/H1N1
A/Tomsk/13/2010головной мозг Титр вируса
0
0
0
0
на
культуре
клетокMDCK(lgTCID/мл)Основным патоморфологическим признаком вовлечения
центральной
50нервной системы при сезонном не нейротропном гриппе А/H1N1 являлся
деструктивно–отечный синдром, связанныйс инфицирования
ранними гемоциркуляторными
День после
Орган (n=5)Данные нарушения сопровождались увеличением численности,нарушениями.
1
3
6
10
активированных Iba1 позитивных клеток микроглии. При морфометрическом
легкие
4,4 ± 0,89
5,2 ± 0,36
5,6 ± 0,11
4,3 ± 0,26анализе гистологических образцов не было детектировано переключения
головнойклеток
мозг микроглии
000 на репаративный,0фенотипас провоспалительного
чтосвидетельствует о пролонгированном воспалительном ответе (рис. 1).
70
60
50
40
30
20
10
0
сутки после инфицирования
Iba1

TNFα

iNOS

TGFβ

ArginaseПри анализе экспрессии
ключевых
геновмикроглии
активации клеток микроглии,Профиль активации
клеток
были выявлены повышенные уровни как провоспалительных, так ипротивоспалительных генов в отличии от работы на другом не нейтропном
штамме
A(H1N1)ключевых
(Sadasivan генов
S. et al.,активации
2015).
При A/CA/04/2009анализе экспрессии
клеток микроглии,Входеанализа
результатов
былоподтверждено
развитие таквоспаления
были выявлены повышенные уровни как провоспалительных,и проти-вкоре головного мозга в ответ на первую волну токсинов, выделяемых клетками
воспалительных
геноворганов.
в отличииот работына другом непроцессы
нейтропном
штамме
других висцеральных
Приэтом, репаративные
начинаются
A/CA/04/2009
A(H1N1)(Sadasivan
S.
et
al.,
2015).
одновременно с продолжающимся повреждением структур коры головного мозга,ходе анализа
результатов
развитиеНавоспаления
чтоВговоритоб отсутствии
четкойбыло
сменыподтверждено
фенотипа микроглии.
последние
периодно в данной
всутки
коре инфицирования
головного мозгадолженв ответнаступатьна первую
волнуреконвалесценции,токсинов, выделяемых
клетработене наблюдали,ни восстановления
структурпроцессы
коры головного
камидругих
висцеральных
органов. Приразрушенных
этом, репаративные
начимозга, ниснижения количества
провоспалительных
маркеров. структур коры гонаются
одновременнос продолжающимся
повреждением

ловногоi мозга, что говорит об отсутствии четкой смены фенотипа микроглии.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ в рамках
Напоследние
суткиинфицирования должен наступать период реконвалеснаучного
проекта
№ 18-315-00257.
ценции, но в данной работе не наблюдали, ни восстановления разрушенных
структур коры головного мозга, ни снижения количества провоспалительных
маркеров.

Раздел 3262ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ
ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТАК РАЗЛИЧНЫМ ВИДАМ ХОЗЯЕВSTUDY OF THE MECHANISMS OF ADAPTATIONOF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS
TO DIFFERENT TYPES OF HOSTS
А. В. Гладышева 1,2, В. А. Терновой 1, Е. П. Пономарева 1,
Т. П. Микрюкова 1, Е. В. Протопопова 1, А. Н. Швалов 1,
С. Н. Коновалова 1, Е. В. Чаусов 1, В. Б. Локтев 1 *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
Новосибирский Государственный Университет, Россия
1

2

A. V. Gladysheva 1, 2, V. A. Ternovoi 1, E. P. Ponomareva 1,
T. P. Mikryukova 1, E. V. Protopopova 1, A. N. Shvalov 1,
S. N. Konovalova 1, E. V. Chausov 1, V. B. Loktev 1
1

FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
2
Novosibirsk State University, Russia
E-mail: gladysheva_av@vector.nsc.ruАннотацияИз головного мозга человека был выделен штамм С11-13 вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), который был пассирован на культурах клеток почек эмбриона свиньи
(PEK), человека (293) и нейроклетках мыши (Neuro-2a). Анализ полного генома полученных вариантов ВКЭ показал, что адаптированный к клеткам ВКЭ приобретает множественные аминокислотные замены, по сравнению с первичным вариантом
ВКЭ. Также было обнаружено, что длина 3’ UTR изменяется с пассажной историей.
Происходит удлинение вариабельной части 3’ UTR (V3’ UTR) со 107 до 144 нуклеотидов. Было произведено сравнение структуры 3’ UTR штамма С11-13 с другими,ранее полученными нами 22 штаммами ВКЭ. Установлено, что за вариабельность
длины главным образом отвечает существенная модификация У-структуры в V3’
UTR. Полученные результаты позволяют высказать предположение, что изменение
длины V3’ UTR принципиально важно для эффективной репликации TBEV в клетках различных хозяев.

* © А. В. Гладышева, В. А. Терновой, Е. П. Пономарева, Т. П. Микрюкова,Е. В. Протопопова, А. Н. Швалов, С. Н. Коновалова, Е. В. Чаусов, В. Б. Локтев, 2018.

Молекулярная биология

263

Abstract
The C11-13 strain from the Siberian subtype of tick-borne encephalitis virus (TBEV)
was isolated from human brain using pig embryo kidney (PEK), 293, and Neuro-2a cells.
Analysis of the complete viral genome of the C11-13 variants during six passages in thesecells revealed that the cell-adapted C11-13 variants had multiple amino acid substitutions
as compared to TBEV from human brain. In addition, it was found that the length 3’ UTR
changes during passages. It was detected that the length of the V3’ UTRs are increasedon 107 to 144 nucleotides and whole genomes too. A comparison was made of the structure of 3’ UTR strain C11-13 with other previously obtained 22 strains of TBEV. It wasestablished that the length variability there corresponds an essential modification of theY-structure in V3 ‘UTR. Thus, the obtained results were proposing that the mechanism
change of 3’ UTR is fundamentally important for effective TBEV replication into cells ofdifferent hosts.

В 2013 году из мозга погибшей от энцефалита женщины был выделен
штамм С11-13 ВКЭ. Адаптация к клеткам производилась путем серии пассажей на культурах почек эмбриона свиньи (PEK), человека (293) и нейроклеткам мыши (Neuro-2а). После каждого пассажа производилось секве-Схема полноразмерного выравнивания нуклеотидных
последовательностей 3’UTR ВКЭ

264Раздел 3нирование. Анализ полного генома полученных вариантов С11-13 показал,что адаптированный к клеткам штамм С11-13 приобретает множественные
аминокислотные замены (8 аминокислотных и 25 нуклеотидных замен), посравнению с первичным вариантом ВКЭ, а также, было обнаружено увеличение длины вариабельного региона 3’ UTR (V3’ UTR). С пассажной историей размер V3’ UTR изменяется от 107 до 144 нуклеотидов. Нами былопроизведено полноразмерное выравнивание нуклеотидных последовательностей 3’UTR и построены вторичные структуры 3’ UTR РНК. Установлено,что Y-3 структура у штамма С11-13 сформировалась в процессе многократного пассирования на клетках, хотя изначально это была гантелеобразная(DB) структура. Форма Y-3 в целом сохраняется для различных вариантови штаммов внутри сибирского генотипа, приобретая лишь дополнительные
стеблевые петли (SL). Например, у штамма Kolarovo-2008 имеется пятьшпилек, вместо двух.
Также, нами было проведено моделирование 3’ UTR РНК ВКЭ 22 последовательностей различных штаммов ВКЭ, относящихся к трем основным
генотипам. Которое позволило установить, что основную роль в варьировании размеров вирусного генома играет значительная гетерогенность вариабельной области 3’ UTR (V3’ UTR) ВКЭ, размер которой колеблется от 67 до
446 нуклеотидов. Наиболее разнообразная структура V3’ UTR характернадля европейского генотипа ВКЭ. Она представлена двойными Y-образными
структурами и 2–4 стеблевыми петлями.
Исключение составил штамм Tomsk-PT122, у которого был обнаруженне выравненный регион (NAR). Из-за дополнительной вставки размер V3’
UTR увеличивается до 413 нуклеотидов. NAR в V3’ UTR у штамма TomskPT122 полностью сформирован нуклеотидными вставками из кодирующих
областей вирусного белка E и NS4a. Предполагаемая схема размещения
NAR для 3 гомологичных фрагментов с идентичностью уровня, которая составляет более 70 % от фрагментов гена белка E и NS4a (24–26 нуклеотидов), показана на рис. 1.
Таким образом, наличие найденных делеций и дупликаций в V3’ UTR
позволяет предположить существование некоторого механизма редактирования 3’ UTR ВКЭ. Механизм изменения длины 3’ UTR принципиально
важен при адаптации ВКЭ к различным видам хозяев и различным природно-климатическим условиям.

265Молекулярная биология

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
RPN4-ПОДОБНОГО БЕЛКА ИЗ CANDIDA GLABRATA *STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS
OF RPN4-LIKE PROTEIN FROM CANDIDA GLABRATA
Е. Н. Гринева, Д. С. Спасская, Д. С. Карпов
ФГБУН Институт молекулярной биологии
имени В. А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
E. Grineva, D. Spasskaya, D. Karpov
Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS, Moscow, Russia
E-mail: drspssk@gmail.com
Аннотация
Белок Rpn4 был впервые идентифицирован в пекарских дрожжах Saccharomyces
cerevisiae как фактор транскрипции, отвечающий за координированную регуляцию
генов убиквитин-протеасомной системы (1). В ходе биоинформатического анализа
было установлено, что гены, кодирующие Rpn4-подобные белки, обнаруживаются
только у дрожжей класса Saccharomycetes (2). В том числе, ортолог гена RPN4 былнайден у условно-патогенного микроорганизма Candida glabrata, родственного пекарским дрожжам. Мы клонировали ген CGRPN4 из Candida glabrata, и показали,что белок CgRpn4 функционально комплементирует делецию собственного генаRPN4 у S. cerevisiae. Кроме того, мы провели делеционный анализ N-концевой области CgRpn4 и показали, что, в отличие от белка S. cerevisiae, для его трансактиваторной активности необходимы первые 57 аминокислот, включающие в себя глутамин-богатый участок.
Abstract
Rpn4 protein was first identified in the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae as
a transcription factor required for the coordinated regulation of the ubiquitin-proteasome
system genes. Genes encoding Rpn4-like proteins were found only in Saccharomycetes
yeast. Opportunistic yeast pathogen Candida glabrata also has gene encoding Rpn4like protein. We cloned the CGRPN4 gene from Candida glabrata, and showed that the
CgRpn4 protein functionally restores the RPN4 gene deletion in S. cerevisiae. In addition,
we performed a deletion analysis of the N-terminal region of CgRpn4 and showed that, incontrast to S. cerevisiae protein, its transactivator activity requires the first 57 amino acids,
containing the glutamine-rich region.
© Е. Н. Гринева, Д. С. Спасская, Д. С. Карпов, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке
№18-34-00704 мол_а.

гранта

РФФИ

266Раздел 3В ходе биоинформатического анализа установлено, что уровень общего
сходства между последовательностями белков CgRpn4 (XP_448300.1, кодируемый геном CAGL0K01727g) и ScRpn4 составляет 48 %. Наибольшее локальное сходство между белками обнаруживается в C-концевой области, гдесодержится ДНК-связывающий домен типа «цинковые пальцы».
N-концевая область CgRpn4 не имеет значимого сходства с N-концевой
областью ScRpn4, содержащей сильный трансактиваторный домен (3).
При этом в N-концевой области CgRpn4 обнаруживается участок, обогащенный остатками глутамина (QRR), который, возможно, входит в состав
потенциального глутамин-богатого трансактиваторного домена.
Участок гена CAGL0K01727g, кодирующий предполагаемый ортолог
ScRpn4, амплифицировали с геномной ДНК C. glabrata штамма HTL (4)и клонировали в дрожжевой низкокопийный вектор Ycp36 под контролем
промотора SCRPN4. В аналогичный вектор клонировали делеционные формы
гена, кодирующие белки с делециями 57, 100 и 177 N-концевых аминокислот.
Активность белков проверяли в штамме S. cerevisiae с делецией собственного гена SCRPN4 по способности восстанавливать сниженную экспрессию гена PRE1, кодирующего субъединицу корового комплекса протеасомы — основного протеазного комплекса эукариотических клеток.
Обнаружено, что синтез полноразмерного белка CgRpn4 в мутантном
штамме полностью восстанавливает уровень мРНК гена PRE1 до уровня
дикого типа как в нормальных условиях, так и при индукции 4-нитрохинолин-1-оксидом (4-NQO) (рис. 1).

Рис. 1. Делеция гена RPN4 приводит к снижению экспрессии гена PRE1,в то время как синтез с низкокопийной плазмиды как собственного белка
S.cerevisiae (ScRpn4), так и белка из C.glabrata (CgRpn4), восстанавливает
уровень мРНК PRE1 до уровня дикого типаМолекулярная биология

267

Путем делеционного анализа белка из S. cerevisiae ранее было установлено, что трансактиваторную активность ScRpn4 существенно снижает удаление первых 150 N-концевых аминокислот, в то время как удаление
56 и 109 аминокислот незначительно снижает его способность активировать
экспрессию мишеней. В то же время для белка из C. glabrata обнаружено,что делеция первых 57 аминокислот с N-конца уже значимо снижает экспрессию гена PRE1 в условиях индукции 4-NQO. Наиболее сильно трансактиваторную активность белка снижает делеция 177 N-концевых аминокислот (рис. 2).

Рис. 2. Делеция первых 57 аминокислот с N-конца CgRpn4значимо снижает трансактиваторную способность белкаПо всей видимости, несмотря на отсутствие значимого сходства
в N-концевой области с белком ScRpn4, эта область CgRpn4 также содержит сильный трансактиваторный домен. В трансактиваторную активность
CgRpn4 значимый вклад вносят первые 57 аминокислот, содержащие обогащенный остатками глутамина участок. Способность белка CgRpn4 восстанавливать экспрессию протеасомных генов в S. cerevisiae говорит о том, чтов клетках условно-патогенных дрожжей C. glabrata ортолог выполняет туже функцию, что и у пекарских дрожжей.
Литература
1. Mannhaupt G., Schnall R., Karpov V., Vetter I., Feldmann H. (1999) Rpn4 acts
as a transcription factor by binding to PACE, a nonamer box found upstream of 26S
proteasomal and other genes in yeast. FEBS Lett. 450, 27–34.

268Раздел 3

2. Mannhaupt G., Feldmann H. (2007) Genomic evolution of the proteasome systemamong hemiascomycetous yeasts. J. Mol. Evol. 65, 529–540.
3. Karpov D. S., Tutyaeva V. V., Karpov V. L. (2008) Mapping of yeast Rpn4ptransactivation domains. FEBS Letters. 582, 3459–3464.
4. Schwarzmuller T., Ma B., Hiller E., Istel F., Tscherner M., Brunke S., Ames L., Firon
A., Green B., Cabral V., Marcet-Houben M., Jacobsen I. D., Quintin J., Seider K., Frohner
I., Glaser W., Jungwirth H., Bachellier-Bassi S., Chauvel M., Zeidler U., Ferrandon D.,
Gabaldon T., Hube B., d’Enfert C., Rupp S., Cormack B., Haynes K., Kuchler K. (2014)
Systematic phenotyping of a large-scale Candida glabrata deletion collection reveals
novel antifungal tolerance genes. PLoS Pathog. 10, e1004211.

Молекулярная биология

269

ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ НЕКОДИРУЮЩИХ РНКВ РАЗВИТИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХС ЛОМКОЙ Х-ХРОМОСОМОЙ *STUDY OF NONCODING RNA INVOLVEMENT
IN THE FRAGILE X ASSOCIATED DISORDERS
А. А. Дольский
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
A. A. Dolskiy
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
E-mail: dolskiy_aa@vector.nsc.ruАннотация
Данная работа посвящена исследованию участия некодирующих РНК в регуляции экспрессии гена FMR1 у пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы, синдромом атаксии/тремора, а также синдромом первичной овариальной недостаточности,ассоциированных с ломкой Х-хромосомой.
Abstract
This work is devoted to research the role of noncoding RNA involvement in Fragile
X-associated premature ovarian insufficiency, Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome and Fragile X syndrome development.

К заболеваниям, ассоциированным с ломкой Х-хромосомой относятся
синдромы FXTAS и FXPOI, а также синдром ломкой Х-хромосомы, обусловленные экспансией ЦГГ-повтора в 5’-UTR гена FMR1, отвечающего за синтез белка FMRP, который принимает непосредственное участиев развитии и правильном функционировании нейронов. При экспансииЦГГ повтора в количестве от 55 до 200 триплетов аллель гена FMR1 считается премутацией и встречается крайне часто (1:200 — 1:300 у женщин
и 1:250 — 1:450 у мужчин). При этом экспрессия мРНК может увеличиваться, однако количество белка, как правило, снижается или остается науровне нормы. В данном случае развиваются синдромы FXTAS и FXPOI.
В случае дальнейшей экспансии ЦГГ повтора больше 200 единиц, а также
© А. А. Дольский, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке РНФ, проект № 18-15-00099.

270Раздел 3метилирования промоторной области гена FMR1 развивается синдром ломкой Х-хромосомы. Стоит отметить, что проявления симптомов у пациентовс аллелями полной мутации и премутации отличаются, что указывает наразные механизмы патогенеза в обоих случаях. В первом случае — это отсутствие белка FMRP, тогда как механизмы патогенеза синдромов FXTASи FXPOI остаются неясными. Следует отметить, что характер изменения
экспрессии гена FMR1 при экспансии повторов указывает на участие малых
регуляторных некодирующих РНК и механизмов РНК-интерференции в развитии патологии. Возможность участия микроРНК в регуляции экспрессии
FMR1 подтверждается тем, что у носителей премутации только в определенном проценте случаев наблюдаются симптомы, тяжесть которых варьирует от человека к человеку, что может быть связано с балансом мРНК генаFMR1 и белка FMRP, синтез которого регулируется РНК интерференцией.
Также предполагают, что антисенс транскрипт ASFMR1, охватывающий область гена FMR1 и обладающий ГЦЦ повтором является источником микроРНК, комплементарных мРНК гена FMR1, что может приводить к подавлению синтеза белка FMRP.
В результате данного исследования не выявлено корреляции между
отношением транскрипта ASFMR1 к уровню мРНК гена FMR1 и уровнем
белка FMRP, что говорит об отсутствии потенциального прямого влияния
микроРНК, содержащих ГЦЦ повтор, на активность гена FMR1. Проанализирована экспрессия 8 микроРНК и ее корреляция с отношением значений
экспрессии мРНК гена FMR1 и количеством белка FMRP. В результате мыпоказали, что для одной микроРНК в клеточных линиях с полной мутациейи отсутствием экспрессии гена FMR1 уровень экспрессии увеличен относительно контрольной группы. Для других микроРНК не выявлена корреляция
между их уровнями экспрессии и отношением значений экспрессии мРНКгена FMR1 и количеством белка FMRP, что вероятно указывает на отсутствие участия данных микроРНК в развитии заболеваний, ассоциированныхс ломкой Х-хромосомой.

Молекулярная биология

271

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА РАННЕГО ОТВЕТА С-FOSВ НЕЙРОНАХ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ ЯДЕР СРЕДНЕГО МОЗГА
ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ СУБАНАСТЕТИЧЕСКОЙ ДОЗЫКЕТАМИНА В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО СТРЕССА *EXPRESSION OF C-FOS IN THE NEURONS OF THE PREFRONTALCORTEX AND SEROTONINERGIC NUCLEI OF THE FOREBRAIN
AFTER INFUSION OF SUB-ANESTHETIC DOSE OF KETAMINE
IN THE ACUTE STRESS CONDITIONS
У. С. Дрозд 1,2, Д. А. Ланшаков 1 , Н. Н. Дыгало 1.2
1

ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАННовосибирский государственный университет

2

U. S. Drozd 1,2 ,D. A. Lanshakov 1 , N. N. Dygalo 1.2
1

FRC Institute of Cytology and Genetics, Siberian Divisionof Russian Academy of Science, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk state university, Novosibirsk, RussiaАннотация
Кетамин, антагонист NMDA рецепторов, в субанастетических дозах оказывает быстрое и стойкое антидепрессантное действие у устойчивых к классическим
антидепрессантам пациентов. Однако механизм этого эффекта остается не ясным.
В работе исследовано влияние низкой дозы кетамина на активность глутаматергических, ГАМК-ергических и серотонинергических нейронов, оцененной по экспрессии c-Fos, в префронтальной коре, дорсальном и медиальном ядрах шва в условиях
острого стресса.
Abstract
Ketamine, an NMDA receptor antagonist, exhibits a rapid and persistent antidepressant activity, at sub-anesthetic doses in treatment-resistant depressed patients and in preclinical studies in rodents. The precise mechanisms underlying this activity remain unclear.
In this study, the effect of sub-anesthetic dose of ketamine on c-Fos expression in the neurons of the prefrontal cortex, dorsal and medial raphe nuclei has been investigated in theacute stress conditions. Furthermore, it was established whether glutamatergic pyramidal,
serotonergic neurons and GABA-ergic interneurons are involved in this response.
© У. С. Дрозд, Д. А. Ланшаков, Н. Н. Дыгало, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ №18-315-00114 мол_аи РНФ № 14-15-00115-П.

272Раздел 3Примерно треть пациентов с депрессивными расстройствами не реагирует на существующие антидепрессанты. Поэтому ведется поиск быстродействующих и более эффективных препаратов. Кетамин — антагонист NMDAрецепторов глутамата в низких субанастетических дозах в течении нескольких часов ослабляет симптомы депрессии как у людей, так и у животных.
Однако механизмы эффектов остаются во многом неясными. Установлено,что префронтальная кора (PFC), в которой экспрессируются NMDA рецепторы, вовлечена в ответ на кетамина. Этот препарат увеличивает высвобождение серотонина в PFC крыс, а проекции PFC в дорзальное ядро (DRN),так же, как и нейроны медиального ядра (MRN) шва, в которых находятся
тела серотонинергических нейронов, участвуют в поведенческих ответахна стрессоры, которые, как известно, способны провоцировать формирование депрессивно-подобного состояния. Однако эффекты кетамина на активность серотонинергических нейронов при стрессе остаются неясными.
Поэтому в работе исследовали эффекты субанастетической дозы кетаминана активность нейронов, индикатором которой является экспрессия белка
раннего ответа c-Fos, в PFC, DRN и MRN при остром стрессе.
Методы
Взрослым самцам крыс линии Wistar внутрибрюшинно вводили кетамин (15 мг/кг) или физиологического раствор (контроль). Через час после

Рис. 1. Изменение общего количества нейронов, экспрессирующих
белок c-Fos в префронтальной коре и серотонинергических ядрах
среднего мозга после введения субанастетической дозы кетаминаи воздействия острым стрессом

Молекулярная биология

273

введения половину животных каждой группы стрессировали 6 минутным
подвешиванием за хвост. Через 2 ч после этого у животных всех групп пообщепринятой методике извлекали головной мозг и приготавливали криостатные срезы (16 мкм). Нейроны PFC, DRN и MRN, экспрессирующие анализируемые белки: c-Fos; кальретинин (CR) — маркер ГАМК-ергических
интернейронов, Satb2 — маркер пирамидных проекционных нейронов,а в серотонинергических ядрах также их специфический маркер — фермент синтеза этого нейротрансмиттера триптофангидроксилазу 2 (TPH2),выявляли иммуногистохимически. Количество c-Fos- и TPH2-позитивных
нейронов, а также нейронов соэкспрессирующих c-Fos и Satb2, c-Fos и CR
и c-Fos и TPH2 нормировали на 1 мм2 среза. Статистический анализ полученных данных проводили при помощи двухфаркторного дисперсионного
анализа и критерия Фишера и считали достоверным при p < 0,05.
Результаты
Иммуногистохимическое выявление белка c-Fos показало, что введение
субанастетической дозы кетамина вызывает увеличение числа нейронов,экспрессирующих этот белок, в условиях острого стресса. Такая картина
наблюдается как в префронтальной коре, так и в дорсальном и медиальных
ядрах шва, где расположены тела серотонинергических нейронов. Однаков PFC наблюдается увеличение количества c-Fos-позитивных нейронов по-

Рис. 2. Изменение количества нейронов, соэкспрессирующих
белки c-Fos и Satb2, c-Fos и CR в префронтальной корепосле введения субанастетической дозы кетаминаи воздействия острым стрессом

274

Раздел 3сле воздействия острым стрессом, однако введение кетамина значительно
усиливает это реакцию. В отличие от префронтальной коры, в DRN и MRN
только совместное воздействие стрессом и кетамином вызывало такой ответ.
В префронтальной коре наблюдалось увеличение количества проекционных нейронов, соэкспрессирующих c-Fos и Satb2 как после воздействия
острым стрессом, так и после введения кетамина. С другой стороны, введение субанастетической дозы кетамина не оказало эффекта на уровень экспрессии белка c-Fos в интернейронах, экспрессирующих кальретинин CR,тогда как острый стресс вызывал увеличение белка — маркера активностив этих нейронах.
В медиальном ядре шва воздействие стрессом вызывало увеличение
числа нейронов, экспрессирующих TPH2, но введение кетамина предотвращало развитие этой реакции. В дорсальном ядре шва таких изменений ненаблюдалось.
В исследованных ядрах шва не наблюдалось никаких изменений в количестве нейронов соэкспрессирующих как с-Fos и СR, так и c-Fos и TPH2,
что, возможно, говорит о том, что в наблюдаемое увеличение экспрессии
с-Fos в этих областях вовлечены какие-то другие типы нейронов.
ВыводыВ совокупности полученные результаты говорят о том, что субанастетическая доза кетамина вызывает увеличение экспрессии белка раннего ответа c-Fos в префронтальной коре и дорсальном и медиальном ядрах швав условиях острого стресса. Причем в префронтальной коре в этот ответ
вовлечены глутаматергические пирамидные нейроны, но не ГАМК-ергические интернейроны, а в изученных ядрах шва ни серотонинергические нейроны, ни ГАМК-ергические интернейроны не вовлекаются в эту реакцию.
Кроме того, субанастетическая доза кетамина предотвращает повышение
экспрессии TPH2 в медиальном ядре шва, которая вызывается воздействием
острым стрессом.

Молекулярная биология

275

ИССЛЕДОВАНИЕ Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ,ИММУНИЗИРОВАННЫХ ДНК-ВАКЦИННЫМИ
КОНСТРУКЦИЯМИ, КОДИРУЮЩИМИ ИСКУССТВЕННЫЕ ПОЛИЭПИТОПНЫЕ ИММУННОГЕНЫ ВИРУСА ЭБОЛА *STUDY OF T-CELL RESPONSE IN MICE IMMUNIZEDWITH DNA-VACCINE CONSTRUCTS ENCODING ARTIFICIALPOLYEPITOPE IMMUNOGENES EBOLA VIRUS
С. Г. Дудко, Д. В. Антонец, Л. И. Карпенко, С. И. Бажан
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
S. G. Dudko, D. V. Antonets, L. I. Karpenko, S. I. Bazhan
State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo,
Novosibirsk region, Russia
е-mail: s.g.dudko@gmail.com
АннотацияНа сегодняшний день не существует в достаточной степени эффективной и безопасной вакцины против вируса Эбола. Работа посвящена оценки Т-клеточного
иммунного ответа на ДНК-вакцинные конструкции, кодирующие хелперные и цитотоксические полиэпитопные иммуногены, спроектированные на основе белков
вируса Эбола. С помощью метода ICS показано, что иммунизация мышей комбинацией ДНК-вакцин приводит к формированию вирус-специфических CD4+ и CD8+
T-лимфоцитов.
Abstract
Today there is no sufficiently effective and safe vaccine against the Ebola virus. Study
is devoted to the evaluation of the T-cell immune response to DNA vaccines constructs encoding helper and cytotoxic polyepitope immunogens, designed from Ebola virus proteins
Using the ICS method, it has been shown that immunization of mice with a combinationof DNA vaccines leads to the formation of virus-specific CD4+ and CD8+ T lymphocytes.

На сегодняшний день геморрагическая лихорадка Эбола остается одним из самых опасных инфекционных заболеваний. Возбудителем является РНК-геномный вирус Эбола (Ebolavirus), семейство Filoviridae, род© С. Г. Дудко, Д. В. Антонец, Л. И. Карпенко, С. И. Бажан, 2018.
*Исследования выполнены в рамках выполнения государственного задания
ГЗ-25/16.

276Раздел 3

Ebolavirus. Род Ebolavirus разделяют на пять видов: Reston ebolavirus, Sudan
ebolavirus, Tai Forest ebolavirus, Bundibugyo ebolavirus.
В последние годы наблюдаются некоторые успехи в области разработки
профилактических препаратов против вируса Эбола. Описано несколько вакцин потенциально эффективных в борьбе с вирусом в том числе rVSV-ZEBOV,
Ad5-ZEBOV, GamEvac-Combi [1–3]. В частности, rVSV-ZEBOV (разработка
компании Мерк) с одобрения Всемирной Организацией Здравоохранения использовалась при вспышке 2018 года в Демократической Республики Конго.
К сожалению, большинство разрабатываемых вакцин сконструировано на основе генетически модифицированных вирусов, что может явиться причиной
нежелательного иммунного ответа на их введение пациенту.
Одним из перспективных направлений является конструирование искусственных полиэпитопных иммуногенов, представляющих собой комбинацию
эпитопов, собранных в единую структуру [4]. В теоретическом отделе ФБУНГНЦ ВБ «Вектор» на основе оригинального программного обеспечения
TEpredict [5] и PolyCTLDesigner [6] были сконструированы две рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие искусственные полиэпитопные
цитотоксические и хелперный Т-клеточные иммуногены, соответственно.
Целью данной работы являлось исследование Т-клеточного ответа у мышей иммунизированных полученными ДНК-вакцинными конструкциями
против вируса Эбола. Оценка Т-клеточного иммунного ответа на исследуемые вакцины проводилась с использованием метода внутриклеточного
окрашивания цитокинов (ICS).
Экспрессия спроектированных генов в составе плазмид оценивали посинтезу специфической мРНК и с помощью иммуноокрашивания трансфицированных клеток. Из клеток линии 293T, трансфицированных исследуемыми плазмидами, выделяли суммарную РНК и с помощью ОТ-ПЦРполучали кДНК с использованием которой, в дальнейшем, проводили
ПЦР. Амплифицированные фрагменты соответствовали теоретически рассчитанным. Фрагменты ПЦР, полученные при проведении положительного контроля с использованием в качестве матрицы исследуемых плазмид,оказались аналогичными. Это свидетельствует о наличии специфических
мРНК в выделенной из клеток суммарной РНК. Параллельно, клетки, трансфицированные целевыми плазмидами, подвергались иммуногистохимическому окрашиванию. Оценка окрашивания проводилась с помощью антител
МАТ 29F2/30A6 к маркерному эпитопу, входящему в состав исследуемых
конструкций. Таким образом, было подтверждено, что экспрессия целевых
генов идет как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции.
Для оценки иммуногенности вакцинных конструкций использовалась инбредная мышиная линия BALB/c, которые были разделены на три группы:Молекулярная биология

277

1. Мыши, иммунизированные вакциной стимулирующей цитотоксический иммунный ответ (pE-CTL);
2. Мыши, иммунизированные комбинацией из двух вакцин (pE-CTL +pE-Th);
3. Контрольная группа мышей, которым вводился физраствор.
Иммуногенность целевых ДНК-вакцинных конструкций оценивали поих способности индуцировать Т-клеточный ответа у мышей BALB/c через
14 дней после третьей иммунизации.
Выделенные у животных спленоциты стимулировали смесью пептидов
(20 мкг/мл каждого пептида), входящих в состав целевых антигенов, после
чего проводили их окрашивание флуоресцентными маркерами и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (производства BD).
Величину Т-клеточного иммунного ответа оценивался по продукции цитокинов IFN-γ CD8+ и CD4+ T-лимфоцитами.
Полученные с помощью ICS экспериментальные данные были проанализированы с помощью статистического анализа. Достоверность различий
между группами была определена с помощью парного теста Уилкоксона.
Полученные результаты показали, что статистически значимые отличия отконтроля показали IFNγ-продуцирующие CD8+ Т-лимфоциты в группе животных, иммунизированных ДНК-вакциной pE-CTL, а также IFNγ-продуцирующие CD4+ Т-хелперы в группе животных, иммунизированных комбинацией вакцинных конструкций (pE-CTL+pE-Th). Максимальные ответы
IFNγ-продуцирующих CD8+ Т-лимфоцитов (p = 0.063) и CD4+ T-клеток
(p = 0.024), были выявлены в группе животных, иммунизированных комбинацией вакцинных конструкций. Возможно данный эффект обусловлен
синергетическим действием CD8+ и CD4+ T-лимфоцитов.
Таким образом, было показано, что иммунизация мышей комбинацией
ДНК-вакцинных конструкций, кодирующих хелперные и цитотоксические
полиэпитопные иммуногены, приводит к формированию вирус-специфических CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов. Следовательно, полученные вакцинные
конструкции являются перспективными кандидатами для дальнейших исследований их способности индуцировать цитотоксический и протективный ответы.
Литература
1. Henao-Restrepo A. M., Camacho A., Longini I. M. et al. Efficacy and effectivenessof an rVSV-vectored vaccine in preventing Ebola virus disease: final results from the
Guinea ring vaccination, open-label, cluster-randomised trial (Ebola Ça Suffit!). Lancet.
2017, 389 (10068), 505–518. doi: 10.1016/S0140–6736(16)32621–6.

278Раздел 3

2. Wu L., Zhang Z., Gao H. et al. Open-label phase I clinical trial of Ad5EBOV in Africans in China. Hum Vaccin Immunother. 2017, 13 (9), 2078–2085. doi:
10.1080/21645515.2017.1342021
3. Dolzhikova I. V., Zubkova O. V., Tukhvatulin A. I. et al. Safety and immunogenicity
of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-vectored Ebola vaccine: An open phase
I/II trial in healthy adults in Russia. Hum Vaccin Immunother. 2017, 13 (3), 613–620. doi:
10.1080/21645515.2016.1238535
4. Karpenko L. I. et al. Novel approaches in polyepitope T-cell vaccine development
against HIV-1 // Expert Rev Vaccines. 2014. Vol. 13, № 1. P. 155–173.
5. Antonets D. V., Maksiutov A. Z. [TEpredict: software for T-cell epitope prediction]// Mol. Biol. (Mosk.). 2010. Vol. 44, № 1. P. 130–139.
6. Antonets D. V., Bazhan S. I. PolyCTLDesigner: a computational tool for constructing
polyepitope T-cell antigens // BMC Res Notes. 2013. Vol. 6. P. 407.

Молекулярная биология

279

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ADIPOQВ ОБРАЗЦАХ ЖИРОВОЙ ТКАНИ РАЗЛИЧНОЙ
ЛОКАЛИЗАЦИИ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВС ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА *EXPRESSION OF ADIPOQ GENE IN DIFFERENT ADIPOSE DEPOTSIN CORONARY ARTERY DISEASE PATIENTS
Ю. А. Дылева 1, М. Ю. Синицкий 1,2Научно-исследовательский институт комплексных проблем
сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия
2Федеральный исследовательский центр угля и углехимии СО РАН,Кемерово, Россия
1

Y. A. Dyleva 1, M. Y. Sinitsky 1,2
1

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases,
Kemerovo, Russia
2
The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry,
Kemerovo, Russia
E-mail: max-sinitsky@rambler.ruАннотацияВ данной работе изучена экспрессия мРНК адипонектина (ADIPOQ) в адипоцитах, изолированных из образцов подкожной, эпикардиальной и периваскулярной
жировой ткани 25 пациентов с ишемической болезнью сердца, подвергнутых процедуре аортокоронарного шунтирования. Установлено, что экспрессия гена ADIPOQв адипоцитах варьирует в зависимости от локализации жировой ткани, а также отвремени культивирования адипоцитов in vitro. Кроме того, показана возможность
модификации уровня генной экспрессии адипонектина с помощью розувастатина.
Abstract
The expression of adiponectin (ADIPOQ) mRNA in adipocytes isolated from subcutaneous, epicardial and perivascular adipose tissue obtained from 25 patients with ischemic heartdisease undergoing coronary artery bypass surgery was studied in this study. It was foundthat expression of ADIPOQ gene changes depending on the localization of adipose tissue, as
well as on the time of cultivation of adipocytes in vitro. In addition, the possibility of modifying the level of gene expression of adiponectin with rosuvastatin has been demonstrated.
© Ю. А. Дылева, М. Ю. Синицкий, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант
№ 17-75-20026).

280Раздел 3Накопление сведений о секреторной и эндокринной функции адипоцитов ведет к признанию роли жировой ткани (ЖТ) в регуляции функционирования сердечно-сосудистой системы. Взаимодействие ЖТ с другими тканями и органами осуществляется посредством биологически активных белков — адипокинов. Профиль адипокинов, секретируемых в различных депоЖТ, существенно различается. Так, висцеральная и подкожная ЖТ (ПЖТ)характеризуются уникальными профилями адипокинов. Особого внимания
заслуживает висцеральная ЖТ, конкретные участки которой, расположенные вокруг кровеносных сосудов и сердца (периваскулярная [ПВЖТ] и эпикардиальная [ЭЖТ] ЖТ), могут влиять на сердечно-сосудистую функцию
миокарда. Секретируемые компоненты данной ЖТ могут непосредственно
воздействовать на основную сосудистую сеть и вызывать патологические
изменения, такие как утолщение стенок сосудов и образования жировых
прослоек, и способствовать образованию атеросклеротических бляшек.
Присутствие воспалительных медиаторов в тканях, окружающих эпикардиальные коронарные артерии, может приводить к активации сосудистого
воспаления, индукции фибротического изменения миокарда, нестабильности атероматозных бляшек и манифестации острых коронарных событий.
Таким образом, изучение молекулярно-генетических основ функционирования ЖТ различной локализации может способствовать более глубокому
пониманию этиопатогенетических механизмов формирования сердечно-сосудистых патологий и роли ЖТ в их формировании.
Целью данной работы явилось изучение особенностей экспрессии генаADIPOQ, кодирующего один из наиболее распространенных адипокинов —адипонектин — в адипоцитах, изолированных из образцов жировой ткани
различной локализации, а также возможности коррекции его экспрессиис помощью ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (статинов).
Материалом исследования послужили адипоциты, изолированные из образцов ПЖТ, ЭЖТ и ПВЖТ, полученных от 25 пациентов НИИ комплексных
проблем сердечно-сосудистых заболеваний с ишемической болезнью сердца (ИБС) в ходе операций аортокоронарного шунтирования.
Изоляция адипоцитов выполнялась по стандартному протоколу, предложенному K. A. Carswell, после чего флотирующая клеточная фракция переносиласьв отдельную пробирку с культуральной средой. РНК выделяли с помощью наборов RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) на нескольких этапах: непосредственно после изоляции адипоцитов (первичное выделение), по истечению 1-х
и 2-х суток культивирования в базовой среде, а также после суток культивирования в присутствии розувастатина в двух концентрациях (1 мкг и 5 мкг).
РНК хранилась до следующего этапа эксперимента при температуре –70 °C.
На основе выделенной РНК синтезировали молекулу кДНК с использованием

Молекулярная биология

281

наборов для обратной транскрипции High-Capacity cDNA Reverse Transcription
Kit (Applied Biosystems). Экспрессию гена ADIPOQ оценивали с помощью количественной ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени с использованием TaqMan зондов. Нормирование результатов проводили по тремреференсным генам HPRT1, GAPDH и B2M в соответствии с общепринятымина настоящий момент рекомендациями. Экспрессию изучаемого гена рассчитывали по Pfaffl-методу и выражали на логарифмической (log10) шкале в видекратного изменения относительно контрольных образцов.
Адипонектин является одним из наиболее изученных адипокинов в контексте его роли в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Известно, чтоданный адипокин обладает противовоспалительным и антиатерогенным
эффектом, его концентрация в крови снижается у пациентов с инфарктом
миокарда, ИБС и атеросклерозом коронарных артерий на фоне увеличения
концентрации лептина, которое, в свою очередь, ассоциировано с повышением уровня маркеров воспаления. Отмечено, что продукция адипонектинав различных жировых депо существенно различается. На рис. 1 представлены результаты изучения особенностей генной экспрессии адипонектинав образцах жировой ткани различной локализации, полученных от пациентов с ИБС, а также динамика его экспрессии в зависимости от времени
культивирования адипоцитов в базовой среде. За контроль в данном эксперименте была принята экспрессия гена ADIPOQ в образцах ПЖТ. В целом
экспрессия адипонектина в образцах висцеральной ЖТ была снижена относительно ПЖТ (за исключением суточных культур ЭЖТ, в которых было показано незначительное увеличение экспрессии). Полученные нами результаты по снижению экспрессии адипонектина полностью соответствуют литературным данным и согласуются с ранее полученными нами результатами
иммуноферментного анализа, свидетельствующими о снижении секреции
данного адипокина в висцеральной ЖТ. Установлено также, что увеличение
времени культивирования адипоцитов оказывает влияние на уровень экспрессии адипонектина, приводя к более выраженному его снижению.

Рис. 1. Экспрессии гена ADIPOQ в адипоцитах висцеральной ЖТ

282Раздел 3Отдельный интерес представляет проблема коррекции уровня адипокинов с помощью лекарственных препаратов, например, ингибиторов
ГМГ-КоА редуктазы (статинов), широко использующихся в терапии ИБСи атеросклероза. Несмотря на то, что ЖТ не является таргетной тканью длястатинов, известно большое количество плейотропных эффектов данных
препаратов, не связанных напрямую с их клиническим эффектом. В нашем
эксперимента мы оценили способность розувастатина (одного из наиболее
часто используемых в клинической практике статинов) модифицировать
уровень экспрессии гена ADIPOQ адипоцитами, изолированных из ЖТ различной локализации (рис. 2). Установлено, что низкие концентрации данного препарата вызывают более выраженное увеличение экспрессии адипонектина в образцах висцеральной ЖТ, чем высокие концентрации. Данные
результаты носят не только фундаментальное, но и прикладное значение,так как адипонектин обладает протективным эффектом в контексте развития сердечно-сосудистых патологий.

Рис. 2. Экспрессии гена ADIPOQ в адипоцитах,культивируемых в присутствии розувастатинаВ результате выполненной работы были изучены молекулярно-генетические особенности ЖТ различной локализации, показаны закономерности изменения генной экспрессии адипонектина в зависимости от жирового депо, времени культивирования адипоцитов, а также возможность
коррекции ее коррекции с помощью розувастатина.

Молекулярная биология

283

АНАЛИЗ УРОВНЯ РНК ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХС БИОСИНТЕЗОМ ОКСИДА АЗОТА, У КРЫСС НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНДУЦИРОВАННОЙ СТРЕССОМ
АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ (НИСАГ)ANALYSIS OF THE RNA RNA OF THE GENES ASSOCIATED
WITH BIOSYNTHESIS OF NITRIC OXIDE IN RATS
WITH INHERITED STRESS-INDUCEDARTERIAL HYPERTENSION (ISIAH)
М. А. Журавина 1,2, Л. О. Климов 1.2, А. Л. Маркель 2 *Федерального государственного автономного образовательного
учреждения высшего образования «Новосибирский национальный
исследовательский государственный университет»2ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологиии генетики Сибирского отделения
Российской академии наук» (ФИЦ ИЦиГ СО РАН)1

M.A. Zhuravina1,2, L.O. Klimov 1,2, A.L. Markel 2
NSU
FRC «Institute of Cytology and Genetics» SB RAS
1

2

E-mail: Zhuravina.Mashaa@yandex.ru.
Аннотация
Гипертоническая болезнь широко распространена в современном обществе. Онаможет быть причиной таких осложнений, как инфаркт миокарда и инсульт. Первичная или эссенциальная гипертония рассматривается как многофакторным заболеванием. В то же время, накоплены данные о том, что эндотелиальная дисфункция
часто сопровождает артериальную гипертонию. Нарушение эндокринной функции
эндотелия может происходить из-за уменьшения биосинтеза NO или окислительного стресса.
Abstract
Hypertensive disease is widespread in modern society. It can be the cause of complications such as myocardial infarction and stroke. Primary or essential hypertension is considered as a multifactorial disease. At the same time, evidences were collected that endothelial
dysfunction often accompanies arterial hypertension. Endocrine dysfunction of the endothelium can occur because of the decrease biosynthesis of nitric oxide and oxidative stress.
* © М. А. Журавина, Л. О. Климов, А. Л. Маркель, 2018.

284Раздел 3Введение
Гипертоническая болезнь широко распространена в современном обществе. Она может быть причиной таких осложнений, как инфаркт миокарда,инсульт, сердечная и почечная недостаточность. Первичная или эссенциальная гипертония рассматривается как многофакторное заболевание. Однимиз факторов развития гипертонии является хронический эмоциональный
стресс. Линия крыс НИСАГ была получена в ИЦиГ СО РАН и является генетической моделью стресс-зависимой артериальной гипертонии.
Уменьшение биосинтеза оксида азота (NO) в эндотелиальных клетках —это одна из основных причин возникновения эндотелиальной дисфункции.
Нарушение функционирования эндотелия в свою очередь может быть одним из возможных механизмов возникновения и развития эссенциальной
гипертонии. У крыс линии НИСАГ обнаружена отрицательная корреляция
систолического артериального давления (АД) и концентрации NО в плазме
крови. В основе этого явления могут лежать механизмы, осуществляющие
биосинтез NO.
Оксид азота оказывает вазодилататорный эффект и таким образом участвует в регуляции почечной гемодинамики. Сосудорасширяющий эффект
NO также способствует нормализации общего сосудистого тонуса. У крыслинии НИСАГ ранее было показано уменьшение кровотока в ткани почек.
У них значительно снижается уровень АД при внутрибрюшинном введении
нитроглицерина — донора оксида азота. Важным параметром, говорящимоб уменьшении биодоступности NO, является концентрация этой активной
молекулы в плазме крови. У крыс НИСАГ снижено содержание NO в плазме
крови. Уменьшение биодоступрости NO может быть связано с уменьшением его биосинтеза или с окислительным стрессом. Таким образом, целью
нашего исследования является анализ уровня мРНК генов, связанных с биосинтезом NO, у крыс НИСАГ. Для достижения поставленной цели былисформулированы следующие задачи:1. Проанализировать данные транскриптомов мозгового и коркового
вещества почек крыс линии НИСАГ с целью выявления дифференциально экспрессирующихся генов, связанных с биосинтезом NO. Верифицировать полученные данные с помощью метода ПЦР в режиме реального
времени.
2. В стенке артерии мышечного типа крыс линии НИСАГ определить
уровень мРНК генов, связанных с биосинтезом NO, методом ПЦР в режиме
реального времени и сравнить с этими же показателями у крыс контрольной
линии Wistar Albino Glaxo (WAG).

Молекулярная биология

285

Материалы и методы
Исследования проводились на трехмесячных крысах линий НИСАГ
и WAG в качестве нормотензивного контроля. Каждая экспериментальная
группа состояла из семи животных. Животные содержались в условиях вивария ИЦиГ СО РАН с неограниченным доступом к корму и воде и двенадцатичасовым световым циклом день/ночь.
В ходе выполнения работы были использованы следующие методы:1. Выделение тотальной РНК из хвостовой артерии и мозгового вещества почек с помощью трирегента (TRIzol™ reagent) на основе рекомендаций производителя — Ambion, США.
2. ДНКазная обработка с помощью RNase-Free DNase I согласно рекомендациям производителя — Promega.
3. Обратная транскрипция с исспользованием ревертазы Momlv и рандомизированных олигонуклеотидов N9.
4. Для определения уровня мРНК исследуемых генов проводили полуколичественный анализ с помощью ПЦР в режиме реального времени наамплификаторе iCycler (Bio Rad laboratories).
Результаты и обсуждение
Биосинтез NO осуществляется NO-синтазой. Она представлена в организме млекопитающих тремя изоформами: нейрональной, индуцибельной и эндотелиальной. Эндотелиальная NO-синтаза (ген Nos3) локализована в эндотелии артерий и эпителии почечных канальцев. В нашем исследовании показан
сниженный уровень мРНК гена Nos3 в хвостовой артерии крыс НИСАГ относительно крыс контрольной линии WAG (р<0.008). Также нами был верифицирован сниженный уровень мРНК гена Nos3 в мозговом веществе почек
этих животных (p<0.035). Ранее в лаборатории эволюционной генетики былпроведен полный анализ транскриптома мозгового и коркового вещества почек крыс НИСАГ. Изменение уровня транскрипции гена Nos3 может лежатьв основе ранее описанных у крыс линии НИСАГ физиологических нарушений. Хвостовая артерия относится к артериям мышечного типа, обеспечивающим общее периферическое сопротивление сосудов. В мозговом веществе
почек локализованы почечные канальцы, в которых осуществляется реабсорбция ионов натрия. Нарушение этих механизмов быть одним из факторов ведущих к повышению уровня базального АД у крыс НИСАГ.
Окислительный стресс также способствует уменьшению биодоступности NO. Дело в том, что активные формы кислорода (ROS) влияют на каталитическую активность NO-синтазы. Под их действием NO-синтаза вместо
NO начинает активно синтезировать супероксид-анион. Восстановлению

286

Раздел 3физиологической функции NO-синтазы способствует дигидрофолат-редуктаза (ген Dhfr). Нами был верифицирован сниженный уровень мРНК генаDhfr в мозговом веществе почек крыс НИСАГ (р ˂0.0017). Таким образом,возможно изменение каталитической активности эндотелиальной NO-синтазы в почках этих животных. Кроме того, супероксид-анион взаимодействует с NO с образованием пероксинитрита.
Признаки окислительного стресса были ранее обнаружены у крыс НИСАГ. Хроническое пероральное введение темпола — миметика супероксид-дисмутазы, крысам линии НИСАГ в молодом возрасте значительно
снижает уровень АД у взрослых животных. Также у этих животных снижена концентрация восстановленных тиолов в плазме крови, используемыхв качестве маркера окислительного стресса.
В нашем исследовании был обнаружен повышенный уровень мРНК генов, кодирующих антиоксидантные ферменты в хвостовой артерии крысНИСАГ. Повышен уровень мРНК гена Sod3, кодирующего третью изоформу супероксид-дисмутазы, (р˂0.0027) и гена Cat, кодирующего каталазу, (р˂0.04). Нами был верифицирован повышенный уровень мРНК генаSod3 (р˂0.004) и гена Gpx2, кодирующего вторую ихоформу глутатион-пероксидазы, (р ˂0.0017) в мозговом веществе почек этих животных. Повышенный уровень мРНК генов, кодирующих антиоксидантные ферменты,в тканях крыс НИСАГ может быть компенсаторным. В то же время, чтобы
говорить об окислительном стрессе у этих животных нужно провести анализ не косвенных, а прямых показателей. Главным маркером окислительного стресса является концентрация самих активных форм кислорода.
Выводы
1. Был верифицирован повышенный уровень мРНК генов Sod3
и Gpx2 и сниженный — Nos3 и Dhfr в мозговом слое почек крыс НИСАГ.
2. В ткани артерии мышечного типа крыс линии НИСАГ обнаружен пониженный уровень мРНК гена Nos3 и повышенный уровень мРНК генов
Sod3 и Cat относительно крыс контрольной линии WAG. Полученные данные могут свидетельствовать о связи уменьшения биосинтеза оксида азотав почках и артериях с развитием гипертензивного статуса у крыс НИСАГ.

Молекулярная биология

287

ПОЛНОТРАНСКРИПТОМНОЕ И ПРОТЕОМНОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ МАЛЫХ
ЯДРЫШКОВЫХ РНК В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА *WHOLE-TRANSCRIPTOME AND PROTEOMIC STUDYOF FUNCTIONING OF MODIFIED SMALL NUCLEOLAR RNA
ANALOGUES IN HUMAN CELLS
Е. С. Журавлев 1, В. О. Шендер 2, К. С. Ануфриева 3,
Д. В. Семенов 1, В. А. Рихтер 1, Г. А. Степанов 1,41Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск
2Федеральный научно-клинический центр физико-химической
медицины, Москва
3Институт биоорганической химии им. академиков
М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
4Новосибирский государственный университет, Новосибирск
E. S. Zhuravlev 1, V. O. Shender 2, K. S. Anufrieva 3,
D. V. Semenov 1, V. A.Richter 1, G. A. Stepanov 1,4
1

ICBFM SB RAS, Russia
2
FRCC PCM, Russia
3
IBCH RAS, Russia
4
NSU, Russia
E-mail: evgenijur@gmail.com

Аннотация
Малые ядрышковые РНК (мяоРНК), наряду с основной ролью в пост-транскрипционной модификации нуклеотидов рибосомных РНК, нередко участвуют в других
процессах регуляции экспрессии генов. Более того, некоторые мяоРНК вовлеченыв патогенез наследственных и онкологических заболеваний и обнаружены среди
форм, циркулирующих в физиологических жидкостях человека. В данной работе припомощи модифицированных аналогов мяоРНК удалось выявить функциональные
группы генов, а также специфические кластеры белок-белковых взаимодействий,© Е. С. Журавлев, В. О. Шендер, К. С. Ануфриева, Д. В. Семенов, В. А. Рихтер,Г. А. Степанов, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке РФФИ 16-04-01414, 16-34-60136.

288Раздел 3на которые могут влиять мяоРНК в результате проникновения в клетки человека.
Полученные данные позволили предложить молекулярные пути функционирования
аналогов мяоРНК в клетках человека.
Abstract
Small nucleolar RNAs (snoRNAs), along with the main role in the post-transcriptional
modification of nucleotides of ribosomal RNAs, are often involved in other processes ofregulation of gene expression. Moreover, certain snoRNAs are involved in pathogenesisof hereditary and oncological diseases and are found among forms circulating in humanphysiological fluids. In the current work, using the modified analogues of snoRNA, functional groups of genes, as well as specific clusters of protein-protein interactions, whichmight undergo the influence of snoRNA in consequence of penetration into human cells,
were determined. The obtained data allowed to suggest molecular pathways of functioningof snoRNA analogues in human cells.

Малые ядрышковые РНК (мяоРНК) представляют одну из наиболее
многочисленных и хорошо изученных групп некодирующих РНК (нкРНК). В составе рибонуклеопротеидных комплексов мяоРНК регулируют
созревание предшественников рибосомных РНК, осуществляя две наиболее распространенные модификации нуклеотидов: представители семейства C/D-бокс-мяоРНК направляют 2’-O-метилирование, а представители
семейства H/ACA-бокс-мяоРНК — псевдоуридилирование. Благодаря развитию высокопроизводительных подходов получения и анализа данных,был выявлен ряд неканонических функций мяоРНК, среди которых регуляция альтернативного сплайсинга и трансляции, а также подавление экспрессии генов по механизму подобному действию микроРНК [1]. Более
того, изменения в экспрессии и/или локализации определенных мяоРНК
наблюдаются при патогенезе некоторых наследственных и онкологических заболеваний [2].
Центральной задачей в рамках данной работы является исследование
особенностей функционирования в клетках человека следующих мяоРНК: SNORD25, SNORD35a, SNORD74 — для которых выявлено участиев патологических процессах. В качестве основного подхода был выбран
синтез аналогов этих мяоРНК и последующая их трансфекция в клетки
человека с регистрацией возникающих изменений при помощи различных
методов.
Ранее было установлено, что в клетках MCF-7, трансфицированных немодифицированными аналогами мяоРНК, происходит повышение уровня
транскрипции группы генов интерферонового ответа и генов апоптотического каскада, которое характеризует неспецифический иммуностимулирующий
эффект РНК [3]. Более того, выявлено, что наличие в структуре аналогов

Молекулярная биология

289

5’-трифосфата значительно усиливает индукцию врожденного иммунного ответа в клетках человека.
С другой стороны, в настоящее время широко известно, что зрелые формы многих классов нкРНК содержат помимо канонических мономеров модифицированные нуклеотиды. Наиболее распространенными являются нуАБРис. 1. А. Кривые роста клеток MCF-7, трансфицированных аналогами
SNORD35a мяоРНК. Представлено среднее значение клеточного индексас указанием стандартного отклонения, рассчитанного по данным трех независимых экспериментов. Звездочкой (*) обозначены аналоги, содержащие
структуру кэпа на 5’-конце. Б. Сравнение наборов генов с повышенной экспрессией через 24 ч после трансфекции аналогов SNORD25 мяоРНК в клетки MCF-7. Представлены диаграммы сравнения (диаграмма Венна) наборов генов, уровень мРНК которых достоверно отличается в контрольныхи трансфицированных клетках (Diff pValue < 0.05) по результатам анализа
данных дифференциальной экспрессии. “НМ” — немодифицированный
аналог мяоРНК; “100%Ψ”, “100%m5C”, “50%m6A” — аналоги, синтезированные в транскрипционных смесях с полной заменой UTP на ΨTP, CTP на
m5CTP и с заменой половины ATP на m6ATP, соответственно; “Контроль” —клетки, обработанные только трансфицирующим агентом

290Раздел 3клеотиды, метилированные по остатку рибозы или основания, и псевдоуридины (Ψ). Предполагается, что модификации нуклеотидов в совокупности
стабилизируют вторичную структуру молекулы РНК, а также контролируют прочность межмолекулярных взаимодействий с другими РНК и белкамив сложных надмолекулярных комплексах.
Исходя из вышесказанного, в данной работе для подавления неспецифического иммунного ответа была выбрана стратегия включения модифицированных нуклеотидов в состав аналогов мяоРНК. На первом этапе с помощью транскрипции in vitro были получены РНК-конструкции с последовательностями природных SNORD25, SNORD35a, SNORD74 С/D-бокс-мяоРНК, содержащие m6A, m5C и Ψ.
В ходе трансфекции аналогов мяоРНК в клетки человека MCF-7 былоустановлено, что введение псевдоуридина в структуру коротких нкРНК
существенно снижает как иммуностимулирующее, так и цитотоксическое
действие РНК-конструкций (рис. 1).
На следующем этапе для выявления специфичных путей функционирования каждой мяоРНК по результатам скрининга клеточных линий былавыбрана культура клеток аденокарциномы яичников SK-OV-3, как культурас минимальной активацией системы врожденного иммунного ответа. Трансфицированные Ψ-модифицированными аналогами мяоРНК клетки былипроанализированы с помощью двух подходов: метода глубокого секвенирования транскриптома на платформе Illumina NextSeq и метода тандемной
масс-спектрометрии, совмещенной с обращенно-фазовой жидкостной хро-Рис. 2. Гипотетическая схема действия аналога SNORD74 мяоРНКна клетки SK-OV-3 по результатам функционального анализа
дифференциальной экспрессии генови дифференциальной представленности белков

Молекулярная биология

291

матографией на приборе Q Exactive HF Thermo Fisher Scientific. Анализ совокупности полученных данных позволил предположить возможные молекулярные пути функционирования аналогов каждой из выбранных мяоРНКв клетках человека (рис. 2).
Литература
1. Bratkovič T., Rogelj B. The many faces of small nucleolar RNAs //Biochimica etBiophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. — 2014. — Т. 1839. — №. 6. —
С. 438-443.
2. Su J. et al. Analysis of small nucleolar RNAs in sputum for lung cancer diagnosis //Oncotarget. — 2016. — Т. 7. — №. 5. — С. 5131.
3. Stepanov G. A. et al. Artificial Analogues of Circulating Box C/D RNAs Induce
Strong Innate Immune Response and MicroRNA Activation in Human Adenocarcinoma
Cells //Circulating Nucleic Acids in Serum and Plasma–CNAPS IX. — Springer
International Publishing, 2016. — С. 121-125.

Раздел 3292ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ АНТИОКСИДАНТОВПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОПИСТОРХОЗЕ *HEPOATOPROTECTIVE EFFECT OF ANTIOXIDANTS
IN THE EXPERIMENTAL OPISTHORCHIASIS
О. Г. Запарина 1, A. В. Kовнер 1, A. Ш. Рахметова 2,
M. Ю. Пахарукова 1,2, В. A. Mордвинов 1
1Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
O. Zaparina1, A. Kovner1, A. Rakhmetova2,
M. Pakharukova1, 2, V. Mordvinov1
1

Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
E-mail: zp.oksana.93@gmail.com

Аннотация
Opisthorchis felineus (кошачья двуустка) широко распространенная на территории Европы и Азии трематода семейства Opisthorchiidae, который паразитируетв гепатобилиарной системе рыбоядных млекопитающих, в том числе и человека,вызывая описторхоз.
Abstract
Opisthorchis felineus (liver fluke) is endemic to the territories of Europe and Asia
the trematode of the family Opisthorchiidae, which infests the hepatobiliary system offish-eating mammals including humans, causing opisthorchiasis.

Opisthorchis felineus (кошачья двуустка) является одним из эпидемиологически значимых представителей трематод семейства Opisthorchiidae, который паразитирует в гепатобилиарной системе рыбоядных млекопитающих,в том числе и человека, вызывая описторхоз. Ареал О. felineus охватывает
территории Европы и Азии, однако, основной очаг находится на территории
Западной Сибири. Описторхоз сопровождается структурно-функциональ© О. Г. Запарина, A. В. Kовнер, A. Ш. Рахметова, M. Ю. Пахарукова, В. A. Mордвинов, 2018.
*Работа поддержана грантом РНФ №18-15-00098.

Молекулярная биология

293ными нарушениями печени, в результате чего возникают холестаз и холецистит, формируются очаги хронического воспаления, вплоть до возникновения предраковых изменений эпителия желчных протоков. Механизмы
этих изменений при описторхозе до конца не изучены. Однако, существует
гипотеза о возможной роли окислительного стресса в этом процессе. Предполагается, что секреторно-экскреторный продукт O.felineus, содержащий
белки и низкомолекулярные метаболиты, обладает генотоксичными и прооксидативными свойствами, за счет чего может вызывать повреждения ДНКи привести к возникновению предраковых изменений клеток.
Цель: исследовать влияние природного антиоксиданта ресвератрола и митохондриально-направленного антиоксиданта SKQ1 (10-(6’-Plastoquinonyl)
decyltriphenylphosphonium) на печень и оценить возможную роль оксидативного стресса при экспериментальном описторхозе.
С помощью полуколичественного анализа гистологических препаратов,были выявлены структурные изменения в печени, включая воспаление, дисплазию, метаплазию, пролиферацию эпителия желчных протоков, перидуктальный фиброз, холангиофиброз и т. д. Оценены биохимические показатели сыворотки крови, а также оценен уровень экспрессии генов, отвечающихза воспаление и фиброгенез и генов антиоксидантной защиты организмас помощью ПЦР анализа с детекцией в режиме реального времени.
При воздействии антиоксидантов наблюдалось улучшение биохимических показателей печени, снижение степени дисплазии эпителия желчных
протоков и снижение маркеров воспаления на фоне экспериментального
описторхоза.
Таким образом оксидативный стресс играет важную роль в патогенезе
описторхоза, по-видимому, опосредуя процессы воспаления и дисплазии
желчных протоков.

Раздел 3294ПОЛУЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ КЛОНОВ CRF63_02A1 ВИЧ-1С ТРОПИЗМОМ К CCR5 И CXCR4 КОРЕЦЕПТОРАМ *CONSTRUCTION OF INFECTIOUS MOLECULAR CLONESCRF63_02A1 HIV-1 USING CCR5 AND CXCR4 CO-RECEPTORS
Д. П. Зырянова, А. В. Тотменин, Н. В. Богачева, Н. М. Гашникова
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
D. P. Zyryanova, A. V. Totmenin, N. V. Bogacheva, N. M. Gashnikova
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотацияВ настоящее время на значительной части Сибирского федерального округа(СФО) преобладающим генетическим вариантом среди ВИЧ-инфицированных лицявляется форма CRF63_02A1 ВИЧ-1. R5- и X4-тропные инфекционные молекулярные клоны (ИМК) CRF63_02A1 ВИЧ-1 являются перспективной моделью для решения фундаментальных и прикладных задач.
Abstract
In a significant part of the Siberian Federal District, the predominant genetic variant
among HIV-infected persons is CRF63_02A1 HIV-1. R5- and X4-tropic infectious molecular clones CRF63_02A1 HIV-1 can be widely used in basic and applied HIV research.

ИМК ВИЧ-1 представляют собой плазмидный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность ВИЧ-1, кодирующую все структурные и функциональные вирусные белки, а также регуляторные области, необходимыедля образования патогенных вирусных частиц в культуре эукариотических
клеток. Вирусные частицы генетически однородны, их нуклеотидная последовательность известна, что повышает уровень стандартизации и воспроизводимости исследований. Возможность создания целевых модификаций геномаИМК расширяет спектр применения данной модели. В настоящее время актуально получение ИМК на основе генетических вариантов, определяющих
эпидемию ВИЧ-1 в России. Одним из таких вариантов является CRF63_02A1,
распространенный на территории СФО [2]. ВИЧ-1 изоляты классифицируются на основе их способности использовать CCR5 (варианты R5), CXCR4 (ва© Д. П. Зырянова, А. В. Тотменин, Н. В. Богачева, Н. М. Гашникова, 2018.
*Данная работа проводится в рамках проекта РНФ, № 16-15-10238.

Молекулярная биология

295

рианты X4) или оба корецептора (варианты R5X4) для слияния с клеткой. Типтропизма ВИЧ-1 является важной характеристикой, поскольку определяет
свойства белка gp120 и, как следствие, особенности патогенеза [3]. При культивировании X4-тропных ВИЧ-1 наблюдается характерный цитопатический
эффект в виде синцитиеобразования, тогда как R5-тропные ВИЧ-1 синцитиевне образуют. Целью настоящего исследования было получение Х4-тропного
и R5-тропного ИМК CRF63_02A1 ВИЧ-1.
Для получения ИМК из коллекции изолятов ВИЧ-1 отдела ретровирусов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора выбраны образцы
CRF63_02A1 ВИЧ-1 MtBs и T11 с тропизмом к CXCR4 и CCR5 корецепторам
соответственно. Тропизм определялся генотипическим методом с использованием базы данных geno-2-feno. Схема получения ИМК Т11 описана ранее [1]. ИМК
MtBs получен по альтернативной схеме. Проведено выделение провирусной ДНК
MtBs из клеток. Методом полимеразной цепной реакции получено два перекрывающих геном фрагмента размерами 6160 и 4224 пар нуклеотидов. Фрагменты
генома клонированы в векторах pCR-XL-TOPO Invitrogen. Проведено секвенирование вставок, отобраны варианты наиболее близкие к консенсусной последовательности. Сборка полного генома MtBs проводилась в плазмиде Bluescriptпо уникальным сайтам рестрикции EcoRI, NotI, NcoI. Выполнена трансфекцияИМК Т11 и MtBs в культуру HEK293T с использованием реагента Lipofectamine
2000. На 3 сутки культуральная среда отобрана, проведена через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм. Проведено измерение концентрации вирус-специфического
белка p24 в культуральной среде каждого из образцов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Выполнено инфицирование клеточных линий мононуклеаров периферической крови (МПК) и МТ-4 полученными вирусными стокамиИМК Т11 и MtBs. Отбор культуральной среды для определения прироста концентрации p24 проводился каждые 3 суток культивирования. Визуально примикроскопии проводилась оценка цитопатического действия вируса. Выявлен
значительный прирост концентрации белка p24 в культуральной среде МПК прикультивировании ИМК Т11 и MtBs, что свидетельствует о получении репликационно компетентных вирусов. В культуре MT-4 прирост концентрации p24 наблюдался только при культивировании MtBs. Эти данные подтверждают результат
генотипического исследования тропизма изолятов Т11 и MtBs. При микроскопииМПК и MT-4, инфицированных ИМК MtBs отмечалось образование синцитиев,характерных для X4-тропных ВИЧ-1.
Выводы. Впервые получены ИМК CRF63_02A1 ВИЧ-1 с тропизмомк CCR5 и CXCR4 клеточным рецепторам. ИМК могут быть использованыдля решения фундаментальных и прикладных задач, таких как изучение
биологических свойств вируса, оценка эффективности лекарственных препаратов, вакцин, диагностических систем.

296

Раздел 3Данная работа проводится в рамках проекта РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований
отдельными научными группами «Создание новых препаратов, ингибирующих интеграцию ВИЧ-1, на основе ген-направленных и антисмысловых
олигонуклеотидов»», № 16-15-10238.
Литература
1. Зырянова Д. П., Тотменин А. В., Богачева Н. В., Гашникова Н. М. Получение и возможность использования инфекционных молекулярных клонов
CRF63_02A1 ВИЧ-1 // Журнал инфектологии. Материалы V конгресса Евро-азиатского общества по инфекционным болезням. Новосибирск. П. 1. Т. 10 №2, 2018.
С. 48–49.
2. Baryshev PB, Bogachev VV, Gashnikova NM (2014) HIV-1 genetic diversity in
Russia: CRF63_02A1, a new HIV type 1 genetic variant spreading in Siberia. AIDS Res
Human Retrovir 30(6):592–597.
3. Schuitemaker H, van’t Wout AB, Lusso P. Clinical significance of HIV-1 coreceptor
usage. J. Transl. Med. 2011; 9(Suppl. 1):S5. [PubMed: 21284904].

297Молекулярная биология

ПОИСК БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА TRIM14 *SEARCH FOR PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONSOF HUMAN PROTEIN TRIM14
Г. В. Ковалева
ФГБУН Институт молекулярной генетики
Российской академии наукG. V. Kovaleva
Institute of Molecular Genetics RAS, Russia
E-mail: winter888@bk.ruАннотация
TRIM (TRIpartite Motif) 14 — активный участник процессов врожденного иммунитета, играет важную роль в онкогенезе. Однако механизмы его функционированияв клетках до конца не выяснены. Мы поставили своей целью обнаружение ранее
неизвестных взаимодействий данного белка с другими белками с помощью метода
двухшаговой аффинной очистки (GS-TAP, tandem affinity purification) с последующей масс-спектрометрией. В результате проведенной работы были выявлены несколько белков, взаимодействующих с TRIM14, среди которых кератин 10, кератин
1 и транскрипционный фактор PAX-5.
Abstract
TRIM (TRIpartite Motif) 14 is an active participant in the processes of innate immunity, plays an important role in oncogenesis. However, the mechanisms of its functioningin cells are not fully understood. We aimed to detect previously unknown interactions of
this protein with other proteins using the two-step affinity purification (GS-TAP, tandem
affinity purification) method followed by mass spectrometry. As a result of the work, several proteins interacting with TRIM14 were detected, among them keratin 10, keratin 1 andtranscription factor PAX-5.

Семейство белков TRIM — одно из наиболее исследуемых семейств насегодняшний день, так как эти белки активно участвуют во множестве важных процессов в клетках, и, в первую очередь, во врожденном иммунном ответе. TRIM14, как и другие члены TRIM семейства, участвует в противови© Г. В. Ковалева, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ (18-34-00484).

298Раздел 3русном и противобактериальном иммунном ответе (Zhou et al., PNAS USA,2014, 111, E245–254; Nenasheva et al., Immunol Res, 2015, 62, 255–262; Wang
S. Sci Rep, 2016, 6, 32336, Perelman et al. PLoS Pathog, 2016, 12, e1006102).
Cуществуют данные, указывающие на его влияние на апоптоз и аутофагию
(Nenasheva et al., Mol Biol Rep, 2018, 10.1007/s11033–018–4365–7; Chen etal., Mol Cell, 2016, 64(1), 105–119) и на участие в процессах онкогенеза (Zhu
et al., Sci. Rep., 2016, 6, 19070; Su et al., Oncotarget, 2016, 7, 9939–9950; Xu etal., Sci. Rep., 2017, 7, 42411).
Было показано, что мышиный гомолог TRIM14 (PUB) взаимодействует с транскрипционным фактором PU.1, который участвует в дифференцировке и пролиферации клеток лимфоидного и миелоидного ряда. При этомподавляется активность PU.1, что приводит к снижению количества зрелых
макрофагов, нейтрофилов, Т- и В-клеток (Hirose et al., Biochem Biophys Res
Commun, 2003, 311, 351–360). Также, недавно было показано, что активация
макрофагов через toll-рецепторы приводит к повышенной регуляции большинства белков TRIM семейства, в том числе и TRIM14 (Jiang MX, Hong X,
Sci Rep, 2017, 7, 42781).
TRIM14 располагается на внешней поверхности митохондрий, где онсвязывается с белком MAVS и при индукции вирусными РНК выступает
посредником между транскрипционным фактором NF-κB и MAVS, что способствует антивирусному иммунному ответу (Zhou et al., PNAS USA, 2014,
111, E245-254).
Особое место TRIM14 занимает в хронических процессах при аутоиммунных заболеваниях. Аутоиммунные заболевания могут возникнуть, когда
иммунная система особенно остро реагирует на раздражитель, что приводит к выбросу провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа. Повышенная экспрессия интерферонов I типа наблюдается при аутоиммунных
заболеваниях, таких как системная красная волчанка и синдром Шегрена.
Шведские ученые идентифицировали гены семейства TRIM, индуцируемые
интерфероном, при синдроме Шегрена, в том числе и TRIM14 (Sjostrand
et al., Ann Rheum Dis, 2012, 71, A81). Также, повышенная экспрессия
TRIM14 была обнаружена и при изучении псориаза (Roberson et al., J Invest
Dermatol, 2012, 132, 583–592).
Для изучения молекулярных механизмов участия TRIM14 в этих процессах нами был осуществлен поиск белок-белковых взаимодействий этого белка с помощью метода аффинной очистки белка, совмещенной с масс-спектрометрией (AP-MS). Двухшаговая аффинная очистка (TAP, tandem affinity
purification) представляет собой поэтапное получение белковых комплексов
(байтов) с использованием антител к первому тегу. Наиболее совершенный
вариант данной системы для клеток млекопитающих был предложен ав-Молекулярная биология

299

стрийскими учеными (GS-TAP). В качестве первого тега они использовалидва иммуноглобулина G, а второго — стрептавидин-связывающий белок
(Bürckstümmer T, Bennett KL, Nature Methods, 2006, 3, 1013–1019). Затем
байты были разделены с помощью 1D SDS-PAGE и визуализированы окрашиванием серебром. Для идентификации обнаруженных белков далее проводился масс-спектрометрический анализ, который включал: отмывку геляот красителя; трипсинолизис белков; нанесение пептидов на мишень для
MALDI масс-спектрометрии.
Мы проводили поиск белков, взаимодействующих с TRIM14 человека,в двух типах клеток HEK293 и HL-60. Была сконструирована плазмида для
GS-TAP, содержащая последовательность кДНК TRIM14. В случае клеток
HEK293 были получены клоны, стабильно экспрессирующие эту плазмиду, в культуре клеток HL-60 была использована транзиентная экспрессия.
В качестве контроля использовали трансфекцию плазмидой, не содержащей
кДНК TRIM14. Полученные в результате GS-TAP белки были разделеныс помощью 1D SDS-PAGE и визуализированы окрашиванием серебром.
Белковые полосы были вырезаны из геля и проанализированы с помощью
метода масс-спектрометрии.
Согласно результатам масс-спектрометрии наиболее достоверно в качестве партнеров TRIM14 в обоих случаях (HEK293 и HL-60) были идентифицированы три белка: кератин (KRT)1, KRT10 и PAX-5. В контроле ни одиниз этих белков не обнаруживался.
Транскрипционный фактор PAX-5 привлекает в последнее время большое внимание исследователей, что связано, в первую очередь, с его рольюв иммунологических процессах (Busslinger M, Annu Rev Immunol, 2004,
22, 55–79). Было также показано, что нарушение его экспрессии связанос возникновением разного типа опухолей (Souabni et al., Blood, 2007, 109,281–289). Кроме участия в злокачественном перерождении клеток, имеются
основания предполагать, что PAX-5 играет роль в развитии других патологических процессов, например, в патогенезе бронхиальной астмы (Минеев и др., Мед Иммунол, 2011, 13, 569–580). Возможное его взаимодействие
с TRIM14 открывает новое направление в изучении механизмов его работы.
Кератин второго типа KRT1 и его партнер-гетеродимер первого типа
KRT10 образуют основной цитоскелет в кератиноцитах. Их повышенная
экспрессия способствует увеличению количества филаггрина и появлению
гипервоспаления, как при экземе (Brown SJ, McLean WH., J Invest Dermatol.,
2012, 132, 751–762).
Также для других белков семейства кератинов было показано участиев процессах иммунной защиты клеток. Например, цитокератин 6А участвуетв антибактериальной защите (Chan et al., J Cell Biol, 2018, 217, 731–744), а ке-

300Раздел 3ратин 8 уменьшает воспалительный процесс, подавляя активность пути TLR/
NF-κВ (Dong et al., Sci Rep, 2016, 6, 32710).
Таким образом, кератины участвуют в регуляции кожного воспалительного процесса и иммунного ответа на секрецию цитокинов. Причем нарушение этой регуляции приводит к дерматозам, псориазу, злокачественным
заболеваниям кожи и другим последствиям.
Взаимодействие кератина 10 и TRIM14 было предварительно подтверждено иммуноокрашиванием и вестерн-блот гибридизацией на разных стадиях GS-TAP.
Таким образом, по нашим данным, TRIM14 взаимодействует с кератином 10. Мы предполагаем, что это один из возможных механизмов участия
TRIM14 в иммунном и воспалительном ответе клеток.

Молекулярная биология

301

ВОЗМОЖНОСТИ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ
НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ПАТОЛОГИИ
СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В СОХРАНЕНИИ КАЧЕСТВА
ЗДОРОВЬЯ И ПРОФИЛАКТИКЕ
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ *MAINTAINING HEALTH-RELATED QUALITY OF LIFE
AND PREVENTING CARDIOVASCULAR DISEASES BY MEANSOF EARLY DIAGNOSIS OF CONNECTIVE TISSUE DYSPLASIA
З. А. Колхидова, Г. С. Кокаев, Р. А. Хестанова
ФГБОУ ВО «Северо-Осетинская Государственная
Медицинская Академия» Минздрава РФ
Z. A. Kolkhidova, G. S. Kokaev, R. A. Khestanova
North Ossetian State Medical Academy
E-mail:Levak9010@gmail.com, faaroo@mail.ruАннотацияВ работе приведены результаты изучения распространённости и степени выраженности признаков недифференцированной патологии соединительной ткани
(нДСТ) у 200 студентов-медиков. У респондентов с высокими баллами проведен
анализ вегетативного статуса и микроциркуляции с использованием современных
подходов, разрабатываются алгоритмы диагностики и профилактики осложненийс помощью фитоадаптогенов.
Abstract
The study presents the results of prevalence and severity of indications for undifferentiated pathology of connective tissue in 200 medical students.
Analysis of vegetative status and microcirculation was conducted on respondents withhighest scores. Algorithms for diagnosing and preventing complications were developedwith modern approachs including the one using phyto-adaptogens.

Цель и задачи исследования
Изучение особенностей проявлений нДСТ у студентов-добровольцев
СОГМА, детей и подростков, обучающихся в муниципальных государственных учреждениях г.Владикавказа, профилактика ранних механизмов
© З. А. Колхидова, Г. С. Кокаев, Р. А. Хестанова, 2018.
*Научный руководитель — д-р мед. наук Ф. С. Датиева.

302Раздел 3возникновения проявлений патологии соединительной ткани, определение
критериев и разработка методов прогнозирования осложнений, разработка
рекомендаций для индивидуальной профилактики.
Изучить характер проявлений нДСТ, нарушений микроциркуляциив структуре здоровья студентов-медиков Северо-Осетинской государственной медицинской академии.
Изучить профилактическое и лечебное влияние комплексных фитоадаптогенов, витаминотерапии, режимов ЛФК и питания на состояние здоровья и степень проявления нДСТ.
Основная частьВ исследовании участвовали 200 здоровых студентов-добровольцев
СОГМА в возрасте от 17 до 22 лет. Распространенность признаков нДСТоценивали с использованием анкеты, разработанной на основе оценочной
таблицы Т. И. Кадуриной и Л. Н. Абакумовой (2010), В. В. Чемоданова
(2015), Национальных рекомендаций (2016), состоящей из 50 вопросов.
В анкету было включено информированное согласие на обработку и анализ
представленных данных. Обработка анкетных данных проводилась в оценочной таблице MS Excel. В результате, по сумме баллов сформированы тристепени выраженности клинических признаков нДСТ: 0–12 баллов — лёгкая степень (вариант нормы); 13–23 балла — средняя степень; более 23 —высокая степень. На втором этапе путем объективного осмотра с помощью оценочной таблицы, разработанной В. Г. Арсентьевым,сформировали
2 группы по 30человек: с легкой степенью (вариант нормы) и выраженной
степенью.
На третьем этапе обеим группам исследовали микроциркуляцию, оценили вегетативный статус и уровень тревоги и депрессии.
Обработка анкетных данных проводилась в SPSS 20.0, а затем данные
переносили в оценочную таблицу MS Excel. Определение степени выраженности ДСТ проводилась по сумме баллов по фенотипическим признакам:при первой степени тяжести (вариант нормы) сумма баллов не превышает
12, умеренной — 23, а при выраженной она составляет 24 и более баллов.
Анализ показателей микроциркуляции и вегетативного статуса проводили
в MS Excel.
РезультатыУ респондентов диагностирован высокий уровень выявляемых признаков нДСТ: у 12,5 % признаки лёгкой степени тяжести (вариант нормы),у 24,5 % — умеренной, у 63 % — выраженной степени. Гендерный анализ
показал, что средняя степень выраженности у девушек встречается в 3 разаМолекулярная биология

303чаще и относительно здоровых респондентов среди них в 1,5 раза меньше.
У 54 % обследуемых отягощенный семейный анамнез, что при ассоциациис ДСТ является предиктором для развития острых гемодинамических осложнений.[2] У близких родственников 27 % анкетируемых диагностированы болезни крови и/или онкологические заболевания. В нашем исследовании доклинические признаки синдрома дисплазии соединительной
ткани сердца (частые кардиалгии, чувство «нехватки» воздуха) отмечалось
у 1/3 респондентов.
Сравнительный анализ показателей микроциркуляции показал достоверное снижение перфузии у респондентов с выраженной степенью проявления нДСТ.
Оценка вегетативного статуса исследуемых проводилась по таблице
Вейна. Из группы с нДСТ у 85 % исследуемых была диагностирована дисфункция вегетативной нервной системы.
Уровень тревожности и депрессии оценивались по «Госпитальной шкале
тревоги и депрессии» с соответствующей оценкой в баллах. В результате
более чем у половины лиц с нДСТ выявились субклинически и клинически
выраженные тревога и депрессия.
Формирующийся при нДСТ спектр доклинических нарушений здоровьяпри отсутствии коррекции всегда сопровождается формированием целого
ряда осложнений, в том числе и со стороны сердечно-сосудистой системы
(схема 1).
НДСТ индуцирована точечными полигенными мутациями, которые
нарушают нормальный метаболизм и формообразование-структуру соеди-Схема 1. Патогенез развития осложнений при нДСТ304

Раздел 3нительной ткани. Это ведёт к расстройствам гомеостаза: в первую очередь
нарушается вегетативная регуляция, которая ведёт к снижению перфузии,развитию хронической гипоксии и воспаления. Нарушение баланса элементов — микроэлементоз влечёт следующие нарушения: например, при дефиците магния возрастает активность металлопротеиназ, которые вызывают
ремоделирование коллагеновых волокон, ведущее к деградации СТ, также
замедляется синтез всех структурных компонентов СТ, ухудшаются механические свойства соединительной ткани, снижается мышечный тонус, развивается астенизация и остеопения хроническое воспаление.
На данный патологический фундамент накладывается воздействие
внешних факторов, таких как: нерациональное питание, дефицит макрои микроэлементов, гиповитаминозы, белково-энергетическая недостаточность; несбалансированные физические нагрузки, в том числе неправильный режим труда и отдыха; стресс, загрязнение окружающей среды.
На этом фоне в ранние сроки происходит манифест клинических проявлений практически во всех системах: сколиоз, плоскостопие, гипермобильность суставов, деформация грудной клетки, патология органа зрения,нарушение регуляции, снижение психической устойчивости, пролапс митрального клапана, дополнительная хорда, дефект межпредсердной перегородки, несостоятельность как артериальной так и венозной сосудистой
стенки, недостаточность либо отсутствие венозный клапанов, аномалии
развития мочеполовых органов, ослабление фагоцитарного и Т-клеточного
иммунитета, нарушение гемостаза, повышенная растяжимость кожи, тра-Схема 2. Возможные пути замедления прогрессиии предотвращения развития осложнений при нДСТМолекулярная биология

305хеобронхиальная дискинезия, деформация, дискинезия желчевыводящих
путей, висцероптоз и т. д.
Влияние внешних фактов на данные проявления усугубляет их течениеи ведёт к развитию осложнений: аритмии, разрыв аневризмы, тромбофлебит, тромбозы, кровотечения, вторичная артериальной гипертония, бесплодие, вторичный остеоартроз, почечная, дыхательная, сердечная недостаточность, внезапная смерть.
В условиях экологического неблагополучия распространенность фенотипических признаков нДСТ встречается чаще, что обусловлено напряжением адаптационно-приспособительных механизмов организма под влиянием внешних факторов, что требует дальнейший скрининг населения напредмет ранней диагностики и распространение методов профилактики
(схема 2). Профилактические методы должны включать средства, повышающие адаптационные резервы организма (фитоадаптогены), рациональную
диетотерапию, метаболическую терапию, адаптированную физическую нагрузку.

Раздел 3306ИЗУЧЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО КОМПОНЕНТАИ ОРГАНИЧЕСКОГО МАТРИКСА ЭМАЛИ ЗУБОВ
ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИSTUDY OF THE MINERAL COMPONENT AND ORGANIC MATRIXOF THE ENAMEL OF TEETH OF HUMAN BY THE METHODOF ATOMIC-POWER MICROSCOPY
А. С. Коршунов, В. П. Конев *ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет»Минздрава России
A. S. Korshunov, V. P. Konev
Omsk State Medical University, Russia
E-mail: Andrey_K_180588@mail.ruАннотацияВ работе впервые представлены результаты исследования неорганического компонента и структуры органического матрикса эмали ретинированных 38-х зубовв возрастных группах 15–20, 21–30, 31–40 лет методом атомно-силовой микроскопии. В указанных группах наблюдаются различные темпы роста и созревания неорганического компонента, изменение которого связано с уменьшением пика органического матрикса. Наибольшая упорядоченность неорганического компонента наблюдается в группе 31–40 лет, где кристаллы имеют аркообразную форму, большие
размеры, плотную упаковку, при уменьшении количества органического матриксаи размеров призматической оболочки. Изменение указанных параметров доказывает
выраженную изменчивость и вариабельность эмали зубов, которая происходит в течение длительного периода жизни и развития человека.
Abstract
The results of the study of the inorganic component and the structure of the organic
matrix of the enamel of retinished 38 teeth in the age groups 15–20, 21–30, 31–40 years by
the method of atomic force microscopy are presented for the first time. In these groups, different rates of growth and maturation of the inorganic component are observed, the changeof which is associated with a decrease in the peak of the organic matrix. The highest orderof the inorganic component is observed in the group of 31–40 years, where the crystals
have an arcuate shape, large dimensions, dense packing, with a decrease in the amount of* © А. С. Коршунов, В. П. Конев, 2018.

Молекулярная биология

307

organic matrix and the dimensions of the prismatic shell. The change in these parametersproves the pronounced variability and variability of tooth enamel, which occurs during
a long period of life and development of a person.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, эмаль, органический матрикс, минеральный компонент, вариабельность.
Цель исследования — изучить строение минерального компонента и органического матрикса эмали ретинированных 38-х зубов в возрастных группах 15–20, 21–30, 31–40 лет методом атомно-силовой микроскопии.
Введение
Многие авторы утверждают, что созревание эмали происходит в течение всей жизни человека, и его рассматривают как защитный физиологический процесс (G. Daculsi, В. Kerebel, 1978). Однако на сегодняшний деньэтот вопрос вызывает много дискуссий. Ряд отечественных и зарубежных
ученых считают, что минерализация и созревание эмали заканчивается
к 1–3 годах после прорезывания зуба (А. Nanci, 2003). Некоторые авторы утверждают о полном созревании эмали зубов еще до прорезывания
зуба (F. J. Cuisinier, 1991; T. G. Diekwisch, 1995). Наиболее убедительной
считается точка зрения, которая говорит об индивидуальных сроках созревания эмали, которое зависит от состава органических и минеральных
субстанций и после прорезывания зуба определяющееся составом смешанной слюны (G. Daculsi, В. Kerebel, 1978; А. С. Коршунов, В. П. Конев,2017). Таким образом, к сегодняшнему дню установлено, что в процессе
созревания эмали повышается содержание минеральных веществ и изменяется структура минеральных призм, которые становятся более компактными (A. G. Fincham, J. Moradian-Oldak, 1999; А. С. Коршунов, В. П. Конев, 2017, 2018). При этом формируется тенденция об изменении эмалив течение дальнейшей жизни человека.
Несмотря на большое количество публикаций о развитии и созревании
эмалевых кристаллов в постнатальном онтогенезе, отсутствуют убедительные данные о темпах роста эмалевых кристаллах, и влияние органического
компонента на рост эмалевых кристаллов в разных возрастных периодах
человека с использованием современных методов морфологического исследования, в частности атомно-силовая микроскопия.
Материалы и методыВ исследовании приняли участие 140 человек мужского пола, которые
были разделены на возрастные группы 15–20, 21–30, 31–40 лет. У каждого
обследованного удаляли по одному ретинированному 38 зубу по ортодонти-308

Раздел 3ческим показаниям, с полностью сформированными корнями и не имеющего
контакта с ротовой жидкостью. Полученные образцы эмали зубов подготавливали с использованием полировально — шлифовального станка Нейрис,шлифовальных кругов hermes с разной степенью зернистости, и полировальных кругов с алмазной суспензией Akasel, разного количества микрон.
Исследование образцов осуществлялось на оптическом микроскопе марки
Olympus jx 41, с увеличением 1000крат, с дальнейшим АСМ-микроскопированием в АСМ-микроскопе SolverPro (NT-MRT, Россия). Анализ образцов
АСМ-изображения осуществлялся с помощью программного модуля обработки изображения Image Analysis NT-VDT (патент РФ № 2458675). В результате были получены цифровые снимки зубов у обследованных лиц, покоторым анализировали степень упаковки, форму, размер эмалевых призм,размер оболочки эмалевых призм. Математическая обработка данных проводилась с помощью статистического пакета STATISTICA 10.0 (StatSoftInc.
USA).
Результаты
Анализируя данные атомно-силовой микроскопии, важно отметить, чтоформа эмалевых призм во всех возрастных группах правильно упорядоченав виде шестигранной или семигранной фигуры. Наиболее постоянные ориентиры эмалевые призмы имеют в 31–40 лет, где доминируют эмалевые призмы в виде семигранной фигуры с очень плотной упаковкой (6,02±0,25 ед.).
В возрастных группах 15–20 (5,68±0,13 ед.), 21–30 лет (5,79±0,11 ед.) онитакже представлены семигранной, однако в большом количестве встречаются шестигранные с более хаотичным и менее плотных расположением другк другу эмалевые призмы. Плотность призм является важным показателем,которая определяется упаковкой коллагена, и указывает на зрелость эмалевой ткани, увеличиваясь с возрастом.
Наблюдается изменение не только формы и ориентации, но и размеров
эмалевых призм при увеличении возрастного периода (Р < 0,05). Необходимо обратить внимание на малые размеры в группе 15–20 лет (4,68±0,51 микрон), их увеличение в 21–30 лет (5,59±0,47 ед.), а наибольшие размеры
наблюдаются в 31–40 лет (6,13±0,38 ед.). Важным аспектом ультраструктурного строения эмали являются неровности и выступы на поверхности
эмалевых призм, наличие которых ярко выражено в возрастных группах
15–20 (рис. 1) и 21–30 лет, в 31–40 лет (рис. 2) шероховатости и неровностине наблюдались. Следует отметить, что в 31–40 лет эмалевые призмы отличаются меньшей рельефностью. Во всех сравниваемых возрастных группахмы не обнаружили разветвлений на множественные кристаллы и их слияние
(рис. 1, 2).

Молекулярная биология

309

Различная плотность упаковки кристаллов указывает нанедостаточную зрелость эмали
зубов в возрастных группах
15–20 и 21–30 лет, в сравнениис аналогичными количественными и качественными показателями в группе 31–40 лет, однако наблюдается увеличение
темпа созревания эмалевых
призм в указанных группах.
Наличие призматической
оболочки мы наблюдали вовсехсравниваемых
группах, наибольшие ее размеРис. 1. Рельефность эмалевых призмры встречаются в группахпо данным АСМ в группе 15–20 лет(3Д-изображение) Ув.×50 000
15–20(0,36±0,05микрон)и 21–30 лет (0,25±0,04 микрон), в группе 31–40 лет онапрактически не визуализируется и прерывается на некоторых
участках (0,07±0,01 микрон)(Р < 0,05).
Наибольший пик количества минерального компонента приходится на группу
31–40 лет, минимальный пикколичества минерального компонента приходится на группу 15–20 лет (Р < 0,05). НаиРис. 2. Рельефность эмалевых призмпо данным АСМ в группе 31–40 летменьший пик органического
(3Д-изображение) Ув.×50 000матрикса приходится на группу 31–40 лет (Р < 0,05). Данное строение в группе 31–40 лет обеспечивает большую жесткость эмалии трудную растворимость, риск поражения патологическим процессом которой увеличивается после прорезывания зуба в полость рта.
Выводы. По результатам исследования размера, формы, упаковки эмалевых призм методом атомно-силовой микроскопии в различные возрастные
периоды можно утверждать о высоких темпах их роста и развития. В группах 15–20, 21–30 лет эмалевые призмы напоминают аркообразную форму,310Раздел 3менее плотно упакованы, имеют различные размеры, что характерно длянезрелых призм. Однако, несмотря на выраженную вариабельность неорганического компонента в группах 15–20 и 21–30 лет отмечается активный
рост и уплотнение эмалевых призм с возрастом. Метод атомно-силовой микроскопии позволяет детально изучить внутренние структуры эмали зубов,при этом определяя их конкретное содержание и индивидуальные принципы формообразования, путем количественной оценки минерального компонента и органического матрикса.

Молекулярная биология

311

РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ
ОПУХОЛЕВОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВС РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR ANALYSIS
OF EXTRACELLULAR TUMOR DNA
IN COLORECTAL CANCER PATIENTS BLOOD PLASMA
А. Е. Кулешова 1,2, У. А. Боярских 2 *Новосибирский государственный университет, Россия
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения РАН, Россия
1

2

A. E. Kuleshova 1,2, U. A. Boyarskikh 2
1

Novosibirsk State University,Russia
2
SB RAS ICBFM, Russia
E-mail: aekuleshova25@gmail.com

Аннотация
Анализ внеклеточной опухолевой ДНК в плазме крови является перспективны
методом диагностки рака толстой кишки, в виду своей неинвазивности и возможности регулярного взятия образцов. Однако в плазме присутствует ДНК из других
источников, и доля опухолевой ДНК крайне мала, поэтому необходимо работатьс большими объемами образца и отличать опухолевую ДНК от ДНК из других источников. Существующие на данный момент методы анализа не имеют общей согласованности, и в полной мере не выполняют поставленных задач. В рамках данной
работы разрабатывается оптимальный метод анализа внеклеточной опухолевой ДНКиз плазмы крови пациентов с РТК.
Abstract
Analysis of extracellular tumor DNA in blood plasma is promising as a diagnostic toolfor colorectal cancer, in view of its non-invasiveness and the possibility of regular sampling. However, DNA is present in the plasma from other sources, and the proportion oftumor DNA is extremely small, so it is necessary to work with large volumes of the sample
and distinguish between tumor DNA and DNA from other sources. Existing methods ofanalysis do not have general consistency, and do not fully fulfill the tasks set. Within thiswork, an optimal method for the analysis of extracellular tumor DNA from the plasma of
patients with CRC is being developed.
* © А. Е. Кулешова, У. А. Боярских, 2018.

312Раздел 3Рак толстой кишки (РТК) является третьим по распространенности онкологическим заболеванием, ежегодно регистрируется более 1 млн. новых
случаев.
Успех в лечении данного заболевания зависит, в частности, от своевременного и правильного подбора терапии. Поэтому, среди всех приложений
диагностики РТК, большое значение имеет определение молекулярного
типа опухоли, который, в свою очередь, становится решающим факторомпри подборе т.н. «таргетной» терапии.
Для молекулярной диагностики РТК используются разные типы биологического материала. Среди них, внеклеточная опухолевая ДНК из плазмы
крови пациентов является одним из перспективных материалов, поскольку
взятие образцов плазмы не требует хирургического вмешательства и может
производиться многократно.
Однако в плазме крови присутствует внеклеточная ДНК из других источников, и доля опухолевой составляет всего от 0,05 до 5 %, в связи с чемнеобходимо отличать опухолевую ДНК от ДНК из других источников. Поэтому разработка высокоспецифичного и чувствительного метода детекции
опухолевой ДНК в плазме крови пациентов с РТК стала основной целью
данного исследования.
В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:• Сформировать выборку пар образцов плазма-опухоль, полученных отпациентов с РТК;• Разработать метод выделения внеклеточной ДНК из плазмы крови,сравнить его с референсным методом;• На основе общедоступных баз данных выбрать локусы, с наиболее часто встречающимися мутациями при РТК;• Разработать метод приготовления библиотек для дальнейшего секвенирования;• Секвенировать библиотеки на платформе MiSeq (Illumina);• Определить соматические мутации в образцах плазмы крови пациентов с РТК;• Определить чувствительность, специфичность и конкордантность разработанного метода.
Для дальнейшего анализа, нами была сформирована выборка, состоящая из 43 пар образцов плазма-опухоль, среди которых 12 образцов былополучено от мужчин, 31 — от женщин, средний возраст которых составил
67,4 года. Также было получено 66 образцов плазмы без парного образца
опухоли, которые тоже были задействованы в исследовании.
Для выделения внеклеточной ДНК из плазмы крови, нами был разработан метод, в котором ДНК в плазме концентрировалась 20 % раствором

Молекулярная биология

313

полиэтиленгликоля, инкубировалась в модифицированном лизирующем буфере и осаждалась при помощи изопропанола.
Для оценки эффективности разработанного нами метода, было проведено его сравнение со стандартным протоколом Qiagen (QIAmp Mini Kit).
После выделения внеклеточной ДНК с помощью разработанного и референсного методов, была оценена концентрация ДНК в образцах. Среднее
значение концентрации ДНК в образцах, выделенных разработанным методом, составила 0,2767 нг/мкл (ст. отклон. — 0,1562), референсным методом — 0,2769 (ст. отклон. — 0,1685). Таким образом, разработанный намиметод не продемонстрировал существенных различий со стандартным протоколом Qiagen.
Далее, для оценки уровня внеклеточной опухолевой ДНК в плазме,а также определения молекулярного субтипа опухоли, нами были отобраны
локусы с наиболее часто встречающимися мутациями при РТК. Для этого
нами использовались базы данных COSMIC, в которой выбирались опухоли
толстой кишки всех гистологических типов и локализаций, а также отбирались данные только полногеномного секвенирования.
В результате данного отбора, нами были выбраны 349 соматических мутаций, наиболее часто встречающихся при РТК. Наиболее частые из нихвстречались в генах ТР53, KRAS, PIK3CA, FBXW7, APC, BRAF.
Таким образом, на данном этапе нами был разработан метод выделенияДНК из плазмы крови, а также отобраны локусы с наиболее частыми мутациями при РТК. В дальнейшем планируется выполнение последующих
задач, заявленных ранее.

Раздел 3314ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ
ДЕНАТУРАЦИИ ДНК/ДНК-КОМПЛЕКСОВ МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ СПЕКТРОСКОПИИ *INVESTIGATION OF THE ENERGY PROFILE OF DNA DUPLEX
DENATURATION BY MEANS OF ATOMIC FORCE SPECTROSCOPY
Н. Н. Курусь 1, Ф. Н. Дульцев 1,2, А. А. Ломзов 2,3,
Г. Ю. Шевелёв 2,3, Е. С. Дюдеева 3, Д. В. Пышный 3ФГБУН Институт физики полупроводников
им. А. В. Ржанова СО РАН
2Новосибирский государственный университет
3ФГБУН Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
1

N. N. Kurus 1, F. N. Dultsev 1,2, A. A. Lomzov 2,3,
G. Yu. Shevelev 2,3, E. S. Dyudeeva 3, D. V. Pyshnyi 3
Institute of semiconductor physics SB RAS
2
Novosibirsk State University
3
Institute of chemical biology and fundamental medicine SB RAS
1Аннотация
Исследование энергетического профиля разрыва коротких ДНК/ДНК-комплексов открывает возможности для более детального изучения механизмов образованияи денатурации двойной спирали ДНК. Метод атомно-силовой спектроскопии (АСС)является эффективным инструментом, позволяющим определить количество и положения потенциальных барьеров вдоль координаты реакции, а также кинетические
параметры денатурации двойной спирали. В данной работе методом АСС исследовали энергетические профили механической денатурации модельных ДНК-дуплексов
длиной 20 пар оснований с A/T- и G/C-богатыми концами. Экспериментально установлено наличие двух потенциальных барьеров на пути денатурации. Показано, каквнедрение однонуклеотидного несоответствия в G/C- богатом конце влияет на прочность ДНК/ДНК-комплекса и параметры энергетического профиля его диссоциации.
Abstract
Investigation of the energy profile of the short DNA duplexes rupture opens the possibility for a more detailed study of the mechanisms of formation and denaturation of a DNA© Н. Н. Курусь, Ф. Н. Дульцев, А. А. Ломзов, Г. Ю. Шевелёв, Е. С. Дюдеева,Д. В. Пышный, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-34-00320.

Молекулярная биология

315

double helix. The atomic force spectroscopy (AFS) method is an effective tool for determining the number and positions of potential barriers along the reaction coordinate, as wellas the kinetic parameters of denaturation. In this study, the energy profiles of mechanicaldenaturation of model 20 base pairs length DNA/DNA complexes with A/T- and G/C-richends were studied by the AFS method. The presence of two potential barriers on the path ofdenaturation was experimentally established. It is shown how the introduction of a single
nucleotide mismatch in the GC-rich end affects the strength of the DNA/DNA complex
and the parameters of the energy profile of its dissociation.

ДНК является ключевой биомолекулой, выполняющей роль хранения ипередачи генетической информации. Ряд процессов, происходящих в организме с её участием, сопровождаются образованием и распадом двойной спирали. Формирование наиболее общих представлений о внутренних механизмах протекания этих реакций до сих пор остается актуальной
фундаментальной задачей. Один из основных подходов к её решению заключается в исследовании энергетического профиля денатурации двойной
спирали ДНК.
Диссоциация биомолекулярного комплекса, в том числе и двойной
спирали ДНК, может быть представлена как химическая реакция, протекающая с преодолением одного или нескольких потенциальных барьеров. Воздействие на комплекс внешней силы вдоль координаты реакции
приводит к снижению потенциальных барьеров, уменьшению времениего жизни и увеличению вероятности перехода в несвязанное состояние.
При некоторой величине силы, приложенной к молекулам комплекса, преодоление барьеров приводит к его разрыву. Изучение зависимости силыразрыва биомолекулярного комплекса от скорости его нагружения составляет основу метода динамической силовой спектроскопии и позволяет
установить количество и расположение потенциальных барьеров, а также
равновесные значения константы скорости диссоциации и времени жизни
комплекса [1].
Метод атомно-силовой спектроскопии (АСС) обладает высокой чувствительностью и широким динамическим диапазоном (скорости нагружения
~0,1÷100 нН/с). В данной работе методом АСС исследовали параметры
энергетических профилей денатурации двойных спиралей ДНК длиной
20 пар оснований. ДНК/ДНК-комплексы ON1/ON2 и ON1/ON3, формируемые модельными олигонуклеотидами (Таблица 1), содержат A/T- и G/C-богатые концы длиной 5 пар оснований и среднюю часть смешанного состава
длиной 10 пар оснований. При этом комплекс ON1/ON3 содержит однонуклеотидное несоответствие в G/C-богатом конце.

Раздел 3316Таблица 1Последовательности модельных олигонуклеотидов ДНКОлигонуклеотид
ON1
ON2
ON3

Последовательность 5´-3´
AAT TAC TCG AAG CTA CGG CC-NH2
GGC CGT AGC TTC GAG TAA TT- NH2
GGA CGT AGC TTC GAG TAA TT-NH2

Олигонуклеотид ON1 ковалентно иммобилизовали на покрытой золотом
подложке, а один из олигонуклеотидов ON2 или ON3 — на острие зондадля АСС. При сближении зонда с подложкой происходило формирование
двухцепочечого комплекса, а при последующем отводе зонда — его разрывв сдвиговом режиме, при котором внешняя сила направлена вдоль оси спирали. Силу разрыва комплекса определяли по высоте характерных пиков,наблюдаемых на силовых кривых (см. рисунок, А, Б). Измерения проводилив диапазоне скоростей нагружения от 0,4 до 20 нН/с., варьируя скорость отвода зонда от 100 до 3000 нм/с.

Типичные силовые кривые, наблюдаемые при разрыве комплексов ON1/
ON2 (А) и ON1/ON3 (Б); Зависимость силы разрыва комплексов от скорости нагружения, построенная в полулогарифмическом масштабе (В):растяжение двойной спирали комплекса ON1/ON2 (0,47÷3,7 нН/с), разрыв
комплекса ON1/ON2 (3,7÷18,3 нН/с), растяжение двойной спирали комплекса ON1/ON3 (0,51÷3 нН/с), разрыв комплекса ON1/ON3 (3÷17,6 нН/с)317Молекулярная биологияНа полученных зависимостях сил разрыва от скорости нагружения в обоих случаях наблюдаются два прямолинейных участка с разными углами наклона, что указывает на присутствие двух потенциальных барьеров на путиденатурации модельных ДНК-дуплексов ON1-ON2 и ON1-ON3 (см. рисунок, В). Положения барьеров вдоль координаты реакции (Δx), рассчитанныена основе данных зависимостей, позволяют предположить, что первый изних связан с растяжением двойной спирали, а второй — с разрывом водородных связей между цепями. При этом внедрение в последовательность
однонуклеотидного несоответствия на положениях барьеров не отразилось.
Как и ожидалось, прочность комплекса ON1/ON3, содержащего однонуклеотидное несоответствие, меньше прочности комплекса ON1/ON2 вовсем диапазоне скоростей нагружения. Расчеты (табл. 2), выполненные наоснове экспериментальных данных, показывают, что наличие однонуклеотидного несоответствия приводит к практически двукратному увеличению
константы скорости диссоциации (Kdiss), связанной с разрывом водородных
связей (т. е. с преодолением второго барьера), и не влияет на константу скорости диссоциации, связанную с растяжением двойной спирали (преодоление первого барьера).
Таблица 2Кинетические параметры механической денатурации
дуплексов ДНККомплекс
ON1/ON2
ON1/ON3

Область1 (0,47÷3,7 нН/с)Область2 (3,7÷18,3 нН/с)Область1 (0,51÷3 нН/с)Область2 (3÷17,6 нН/с)Δx, нм

Kdiss, 1/cτdiss, c

0.14
0.32
0.15
0.32

10.8
0.89
10.8
1.6

0.09
1.12
0.09
0.63

Как правило, в подобных экспериментах наблюдают линейную зависимость силы разрыва дуплексов ДНК в широком диапазоне скоростей нагружения [2, 3]. При этом полученные в данной работе значения кинетических
констант согласуются с литературными данными.
Литература
1. E. Evans. Biophysical chemistry, 1999, 82, 83–97.
2. T. Strunz et al Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96,11277–11282.
3. L. H. Pope et al. European Biophysics Journal, 2001, 30, 153–62.

Раздел 3318МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ
ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ
ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКОГО ТРИТЕРПЕНОИДА СМ,НЕСУЩЕГО ЦИАНО-ЕНОНОВЫЙ ФАРМАКОФОР:IN SILICO АНАЛИЗ *MOLECULAR DETERMINANTS OF THE ANTITUMOR EFFECTS
OF SEMISYNTHETIC TRITERPENOID SM, BEARINGCYANO-ENONE PHARMACOPHORE:
AN IN SILICO APPROACH
А. В. Марков 1, А. Э. Кель 1,2, О. В. Саломатина 3,
Н. Ф. Салахутдинов 3, М. А. Зенкова 1, Е. Б. Логашенко 1
1Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, Россия
2
geneXplain GmbH, Вольфенбюттель, Германия
3Новосибирский институт органической химии
им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск, Россия

A. V. Markov 1, A. E. Kel 1,2, O. V. Salomatina 3, N. F. Salakhutdinov 3,
M. A. Zenkova 1, E. B. Logashenko 1
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine
SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
geneXplain GmbH, Wolfenbüttel, Germany
3
N. N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry
SB RAS, Novosibirsk, Russia
1E-mail: andmrkv@gmail.com
Аннотация
Проведен анализ влияния полусинтетического тритерпеноида солоксолон метила (СМ) на транскриптом клеток рака шейки матки человека КВ-3-1. Установлено,что СМ вызывает гибель опухолевых клеток путем запуска стресса эндоплазматического ретикулума с последующей индукцией апоптоза. Выявлены потенциальные
первичные мишени СМ (SERCA и Grp94) и мастер-регуляторы процессов, запускаемых данным тритерпеноидом (ATF4, DDIT3, CEBP и XBP1).
© А. В. Марков, А. Э. Кель, О. В. Саломатина, Н. Ф. Салахутдинов, М. А. Зенкова, Е. Б. Логашенко, 2018.
*Исследование было поддержано Российским научным фондом (грант
№ 17-75-20120).

Молекулярная биология

319

Abstract
The effect of semisynthetic triterpenoid soloxolone methyl (SM) on transcriptome ofhuman cervical carcinoma cells KB-3-1 was analyzed. It was found that SM induced endoplasmic reticulum stress with subsequent activation of apoptosis. Probable primary targetsof SM (SERCA and Grp94) and master regulators of the processes triggered into tumor
cells by triterpenoid (ATF4, DDIT3, CEBP и XBP1) were identified.

Пентациклические тритерпеноиды благодаря наличию широкого спектра биологической активности, высокому химическому разнообразию, относительно низкой токсичности и способности воздействовать на множественные мишени в организме являются перспективным источником новых
фармакологических агентов. В настоящий момент ведется большой объем
работ по увеличению уровня биоактивности и селективности действия
данных соединений путем химической трансформации их структуры [1].
Наибольшей успех в данной области связан с открытием циано-еноновой
фармакофорной группировки, введение которой в структуру тритерпеноидов приводит к значительному усилению их противоопухолевого и противовоспалительного потенциала [1].
Ранее нами был синтезирован солоксолон метил (далее СМ, метил
2-циано-3,12-диоксо-18βH-олеан-1(2),11(9)-диен-30-оат) — производное
глицирретовой кислоты, содержащее в кольце А циано-еноновую группировку. Было показано, что СМ подавляет пролиферацию опухолевых
клеток различного происхождения in vitro (IC50 = 0,3–5,0 мкМ), приводитк остановке клеточного цикла на фазе G2/M, активирует митохондриальный каспазо-зависимый путь апоптоза [2], эффективно ингибирует ростмышиной карциномы Кребс-2 in vivo [3].
Целью данного исследования являлось определение детального механизма действия СМ и его возможные первичные мишени в опухолевых клетках
человека. Для этого клетки рака шейки матки человека KB-3-1 инкубировали в присутствии СМ (1 мкМ) в течение 1, 2, 3, 4, 6 и 10 ч и проводили полнотранскриптомный анализ экспрессии генов на кДНК-микрочипах
HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, США). Затем с помощью платформы
geneXplain (geneXplain GmbH, Германия) полученные сырые данные (rawdata) были нормализованы, с помощью гипергеометрического анализа былирассчитаны относительные изменения уровней экспрессии генов в опыте посравнению с контролем (клетки, инкубированные в отсутствие СМ). Всего
было выявлено 1245 дифференциально экспрессирующихся генов (далее
ДЭГ, кратность изменения уровня экспрессии ≥1,5, p<0,001). Функциональный анализ ДЭГ, выявленных на ранних этапах воздействия СМ (1–4 ч)(базы данных Gene Ontology, KEGG, REACTOME, WikiPathways), свиде-320Раздел 3тельствует о способности тритерпеноида вызывать в опухолевых клетках
дисрегуляцию гомеостаза эндоплазматического ретикулума (ЭПР), приводящую к запуску стресса ЭПР (4 ч). Эффект СМ сопровождается также
активацией ряда компенсаторных механизмов, являющихся, однако, недостаточными для полной цитопротекции — к 6–10 ч воздействия СМ наблюдается высокий уровень обогащения ДЭГ по терминам, ассоциированнымс клеточной гибелью. В силу того, что стресс ЭПР является известным индуктором цитопротекторных сигнальных путей и апоптоза [4], именно ЭПРрассматривается нами в качестве потенциальной первичной мишени СМв опухолевых клетках.
Анализ промоторных участков ДЭГ с последующей идентификацией
транскрипционных факторов, способных связываться с ними (базы данных:Transfac, Jaspar, Encode, Swissregulon, Homer), подтвердил ЭПР-направленное действие СМ. В результате анализа было установлено, что ATF4,
DDIT3, CEBP и XBP1 могут рассматриваться в качестве мастер-регуляторов процессов, запускаемых СМ. Согласно базе данных Genecards, данные
транскрипционные факторы являются мастер-регуляторами стресса ЭПР.
С целью поиска потенциальных первичных белковых мишеней СМ былапроанализирована модуляция транскриптома опухолевых клеток, вызванная СМ и библиотекой низкомолекулярных соединений с известным механизмом действия, с использованием базы данных Connectivity Map. Установлено, что эффект СМ на транскриптом опухолевых клеток с высокой
долей вероятности сходен с действием известных индукторов стресса ЭПРтапсигаргина (p = 3,978E-95) и гельданамицина (p = 1,747E-58) — ингибиторов Ca2+-АТФазы сарко/эндоплазматического ретикулума SERCA и белка
теплового шока Grp94, соответственно. С помощью молекулярного докинга
установлено, что SERCA и Grp94 могут рассматриваться в качестве белковых мишеней СМ — СМ может связываться с SERCA (∆G=-9.2 kcal/mol)и Grp94 (∆G=-7.2 kcal/mol), формируя водородные и гидрофобные связи,аналогичные связям в кристаллических комплексах данных белков с тапсигаргином и гельданамицином, соответственно.
Литература
1. Markov A. V., Zenkova M. A., Logashenko E. B. Modulation of tumour-related signaling pathways by natural pentacyclic triterpenoids and their semisynthetic derivatives //Current medicinal chemistry. — 2017. — Т. 24. — №. 13. — С. 1277–1320.
2. Logashenko E. B., Salomatina O. V., Markov A. V., Korchagina D. V., Salakhutdinov N. F., Tolstikov G. A., Vlassov V. V., Zenkova M. A. Synthesis and pro‐apoptotic activity of novel glycyrrhetinic acid derivatives //ChemBioChem. — 2011. — Т. 12. — №.
5. — С. 784–794.

Молекулярная биология

321

3. Markov A. V., Sen’kova A. V., Zenkova M. A., Logashenko E. B. Novel Glycyrrhetinic Acid Derivative Soloxolone Methyl Inhibits the Inflammatory Response andTumor Growth in vivo //Molecular Biology. — 2018. — Т. 52. — №. 2. — С. 262–268.
4. Sano R., Reed J. C. ER stress-induced cell death mechanisms //Biochimica etBiophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. — 2013. — Т. 1833. — №. 12. —С. 3460–3470.

Раздел 3322РЕГУЛЯЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
АКТИВНОСТИ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНКС ПРИМЕНЕНИЕМ СИСТЕМЫ СRISPR/CAS9 *CRISPR/CAS9-MEDIATED REGULATION AND FUNCTIONALANALYSIS OF SMALL NUCLEOLAR RNAS ACTIVITY
А. М. Матвеева 1,2, Ю. А. Филиппова 1, Е. С. Журавлев 1, Е. А. Балахонова 1,
М. М. Тимофеева 1, Д. В. Семенов 1, Г. А. Степанов 1,2
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины,Сибирское отделение Российской Академии наук2Новосибирский государственный университет

A. M. Matveeva 1, 2, J. A. Filippova 1, E. S. Zhuravlev 1, E. A. Balakhonova 1,
M. M. Timofeeva 1, D. V. Semenov1, G. A. Stepanov 1,2
1

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine,
Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
2
Novosibirsk State UniversityАннотацияВ рамках данной работы описана стратегия для CRISPR/Cas9-опосредованного
редактирования генов C/D-бокс- малых ядрышковых РНК (мяоРНК), относящихсяк одному из подклассов малых некодирующих РНК (нкРНК). Были получены плазмидные конструкции, экспрессирующие компоненты системы редактирования, направленные на внесение разрывов в участки гена GAS5 (Growth Arrest Specific 5),кодирующие мяоРНК-мишени. Для моноклонов на основе линии 293FT были определены виды мутаций, проведен как анализ экспрессии генов целевых мяоРНК,так и массовое параллельное секвенирование транскриптома. Для характеризации
функциональных изменений с использованием разработанной ранее в нашей лаборатории методики была проведена оценка уровня целевого 2’-O-метилирования рибосомной РНК.
Abstract
The current study presents a novel strategy for CRISPR/Cas9-mediated box C/D small
nucleolar RNA (snoRNA) genes editing in human cells. Box C/D snoRNAs present oneof the subclasses of small non-coding RNAs (ncRNAs). We obtained plasmid constructs
expressing CRISPR/Cas9 components guiding double-strand breaks into GAS5 (Growth© А. М. Матвеева, Ю. А. Филиппова, Е. С. Журавлев, Е. А. Балахонова,М. М. Тимофеева, Д. В. Семенов, Г. А. Степанов, 2018.
*Исследование проведено при поддержке гранта РФФИ 18-29-07073.

Молекулярная биология

323

Arrest Specific 5) gene regions encoding target snoRNAs. Types of mutations were characterized for 293FT-derived single cell clones; target gene expression analysis was carriedout. Transcriptome was analysed using RNA-Seq method. The 2’-O-methylation level oftarget nucleotide in ribosomal RNA was evaluated by the method that had been developed
earlier in our laboratory, and functional changes were characterized in the mutant cells.

Малые ядрышковые РНК принимают участие в пост-транскрипционной модификации рибосомной РНК (рРНК) в эукариотических клетках.
C/D-бокс-мяоРНК являются одним из подклассов мяоРНК и отвечают занаправленное 2’-O-метилирование нуклеотидов рРНК. Функционирование
обеспечивается наличием в структуре консервативных С- и D-боксов и направляющей последовательности, специфично комплементарной определенной области рРНК.
Различные техники геномного редактирования, широко используемыедля направленного нокаута или мутагенеза генов, являются эффективным
инструментом не только для изменения уровня экспрессии гена-мишени,но и для изменения конечной структуры и функции его продукта. Система CRISPR/Cas9 является наиболее распространенным, хорошо изученными простым в использовании методом геномного редактирования.
Целью работы являлось получение клеточных линий, мутантных по генам мяоРНК.
Основным результатом работы является разработанная стратегия геномного редактирования малых ядрышковых РНК с помощью системы CRISPR/
Cas9. Стратегия, в первую очередь, включала в себя рациональный выбор
мяоРНК-мишеней с направлением вносимых разрывов в функциональные
элементы на основании имеющихся в структурах мяоРНК мотивов PAM.
Полученные данные позволяют заключить, что наиболее оптимальной мишенью в структуре C/D-бокс-мяоРНК являются D- и D’-боксы, однако, выбор должен осуществляться для каждой мяоРНК индивидуально в соответствии с имеющимися PAM.
В качестве объекта исследований было выбрано множество закодированных в интронах гена GAS5 C/D-бокс-мяоРНК, а именно: U74,
U75, U77 и U80. Они осуществляют 2’-O-метилирование C3820, C4032,
A1521 и G1612 нуклеотидов 28S рРНК человека, соответственно. Интересно, что U80 мяоРНК имеет две мишени 2’-O-метилирования, одна из которых совпадает с мишенью U77 мяоРНК (А1521). Выбор был обусловлен
наличием мотивов PAM вблизи консервативных последовательностей (D-,D’-, С- и D-бокса, соответственно).
Были получены ДНК-конструкции на основе вектора pSpCas9(BB)-2AGFP, с помощью которых была проведена дальнейшая трансфекция клеток

324

Раздел 3линии 293FT. Были отобраны GFP-положительные клетки и получены моноклоны. Для анализа изменений экспрессии мяоРНК-мишеней методом
ОТ-ПЦР в режиме реального времени были подобраны праймеры и референсные гены. Было проведено массовое параллельное секвенирование
транскриптома мутантных клеток и дифференциальный анализ экспрессии
генов. Кроме того, была разработана методика оценки изменений в уровне
2’-O-метилирования.
Общая эффективность проведенного редактирования была оценена с помощью обработки секвенограмм в ПО «TIDE» и составила 34,4 % и 45,6 %для U75 и U77 мяоРНК, соответственно. Линии клеток, мутантные по U74,показали низкую скорость роста и жизнеспособность. На данный момент
удалось получить моноклоны, мутантные по U75 или по U77 мяоРНК.
Секвенирование по Сэнгеру участка генома для моноклона, полученного действием конструкции, направленной на редактирование U75 мяоРНК,выявило две делеции в каждом из аллелей, 9 и 10 нт, при этом в область
делеции попал D’-бокс и часть области узнавания рРНК-мишени 2’-O-метилирования. Для моноклона, полученного действием конструкции, направленной на редактирование U77 мяоРНК, была выявлена инсерция 1 нти делеция 11 нт в целевом участке — консервативном C-боксе, при этоммутации не изменили структуру С-бокса.
Анализ изменений в экспрессии мяоРНК-мишеней методом ОТ-ПЦР выявил снижение уровня диких форм, вплоть до полного, что подтвердилосьпри дифференциальном анализе экспрессии генов. При этом были обнаружены зрелые формы мяоРНК с измененной структурой — форма с делецией 9 нт для моноклона, мутантного по гену U75 мяоРНК и обе мутантные
формы для моноклона, мутантного по гену U77 мяоРНК. Интересно, чтоданные массового параллельного секвенирования также показали для обеих
мутантных линий повышение экспрессии генов, ассоциированных с процессами внутреннего иммунного ответа.
Для оценки изменений глубины 2’-O-метилирования был разработан
протокол терминации обратной транскрипции с последующей ПЦР в режиме реального времени. Было показано снижение глубины модификаций длямоноклона с мутациями в гене U75 мяоРНК, что свидетельствует о подавлении ее активности. При этом не наблюдалось изменений в профиле 2’-O-метилирования для моноклона с мутациями в гене U77 мяоРНК.
Разработанная стратегия позволит проводить функциональный анализ
мяоРНК, перенаправлять их активность и получать клеточные линии с новыми свойствами.

Молекулярная биология

325

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
ХИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ (CAR),СПЕЦИФИЧНЫХ К БЕЛКАМ PSMA И PSCA *FUNCTIONAL ANALYSIS OF PSMA- AND PSCA-SPECIFICCHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CAR)
Д. А. Матвиенко
Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАННовосибирский государственный университет
D. A. Matvienko
Institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS
Novosibirsk State University, Russia
E-mail: dacikmatvienko@gmail.com
Аннотация
Одним из современных методов иммунотерапии различных типов онкологических заболеваний является терапия с использованием Т- или NK-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR). Однако, эффективность этого подхода для терапии солидных типов рака, таких как рак предстательной железы, поканевысока. Мы предполагаем, что оптимизация структуры CAR позволит повыситьих эффективность в борьбе с солидными типами рака. Данная работа направлена на
in vitro сравнение цитотокcической активности CAR, имеющих различное строение
шарнирного участка рецептора. В ходе работы нами было получено шесть NK-клеточных линий, экспрессирующих CAR специфичные к двум основным маркерам
рака предстательной железы ─ белкам PSMA и PSCA, с шарнирными районами,заимствованными от молекул IgG1 или CD8a, либо без шарнирного района. Былопоказано, что все полученные клеточные линии экспрессируют CAR на поверхности
клеток. Анализ цитотоксической активности выявил, что для PSMA-специфичных
CAR структура шарнирного района ощутимо влияет на уровень цитотоксической активности клеток-эффекторов in vitro, хотя для PSCA-специфичных CAR подобного
эффекта замечено не было.
AbstractT- and NK-cells armed with chimeric antigen receptors (CARs), are novel and promising instruments for cancer treatment, however, its efficiency in solid cancers, such as© Д. А. Матвиенко, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 16-14-10237.

326Раздел 3

prostate cancer (PC), still remains low. It is possible that optimizing the structure of the
CAR will improve their efficiency in the context of solid cancers. Our work is aimed atcomparing the in vitro performance of CARs of various designs of hinge regions, recognizing two PC surface markers: PSMA and PSCA. As a result we obtained six NK-cells lines
CARs (with hinge region of IgG, CD8 and one is hingeless). Our obtained cells express
CAR on the cell surface. It was found that for PSMA-specific CAR the structure of hinge
region affects the level of cytotoxic activity in vitro, although for PSCA-specific CAR
these effects have not been identified.

На сегодняшний день рак предстательной железы ─ это одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний среди мужчин. Согласно данным общемировой статистики рак простаты является третьей почастоте причиной смерти от злокачественных опухолей мужчин старшего
возраста. К сожалению, примерно 90 % случаев рака предстательной железы выявляются на поздних стадиях заболевания, что приводит к летальному
исходу у более, чем половины больных и продолжает оставаться серьезной
проблемой во всем мире. В связи с этим, развитие новых подходов для лечения раковых заболеваний является крайне востребованной задачей.
В последнее время активный интерес проявляется к одному из современных методов адоптивной клеточной иммунотерапии с использованием
клеток иммунной системы, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR). Данный тип иммунотерапии основан на ex vivo траснгенезе аутологичных Т-лимфоцитов пациента, с последующим введениемих обратно в организм больного. Пролиферируя в организме продолжительное время, CAR-клетки способны находить и направленно уничтожать
опухолевые клетки, экспонирующие распознаваемый CAR антиген [1]. Насегодняшний день наиболее впечатляющие показатели данная терапия демонстрирует в отношении онкогематологических заболеваний В-клеточной
природы. Вследствие такого взрывного успеха подхода в отношении гематологических заболеваний, растет интерес к использованию CAR-клеток длялечения солидных злокачественных новообразований, к которым относится
карцинома предстательной железы. Однако распространение этой технологии применительно к солидным видам рака сталкивается с рядом трудностей. Последние исследования в этой области свидетельствуют о том, чтофункциональность CAR Т-клеток в значительной мере зависит от природыи структуры шарнирного района CAR [2,3], что делает интересным поиск
наиболее оптимальной и эффективной структуры этого района CAR.
Данная работа направлена на исследование влияния шарнирного района рецептора на функционирование PSCA-, PSMA- специфичных CAR
в контексте NK-клеточной линии YT. В ходе работы мы воспользовались

Молекулярная биология

327

разработанной нами ранее платформой лентивирусных векторов для сравнения различных вариантов дизайна CAR в унифицированном формате.
С помощью данной платформы были наработаны псевдовирусные частицы и получено шесть NK-клеточных линий, экспрессирующих PSMAи PSCA-специфичные CAR, с шарнирным районом, заимствованным отмолекул IgG1 или CD8a, либо без шарнирного района. С помощью метода проточной цитометрии было показано, что все полученные клеточные
линии экспрессируют CAR на поверхности клеток (уровень экспрессии
превышал 97 %). Анализ цитотоксической активности проводили путем
инкубации эффекторных клеток (CAR NK-клеток) с клетками-мишенями
(клетки рака простаты человека) с последующим анализом FACS и RTCA.
Было обнаружено, что для PSMA-специфичных CAR структура шарнирного района ощутимо влияет на уровень цитотоксической активности клеток-эффекторов in vitro ─ наибольший цитотоксический эффект оказывают CAR-клетки без шарнирного района. Для PSCA-специфичных CAR подобного эффекта замечено не было, что может указывать, на тот факт, что
CAR со специфичностью к небольшим белкам (в данном случае PSCA)
обладают меньшей требовательностью к шарнирному участку. В настоящее время нами проводятся работы по получению первичных T-клеток,экспрессирующих CAR против PSMA.
Полученные данные помогут нам выявить наиболее выгодную структуру
шарнирного района CAR и в перспективе могут быть полезны для создания
клинически-эффективных вариантов CAR для лечения рака предстательной
железы.
Литература
1. Gianpietro Dotti, Stephen Gottschalk, Barbara Savoldo. Design and Developmentof Therapies using Chimeric Antigen. Immunol Rev ; 257(1). 2014;580:6269–74.
2. Nishio N, Diaconu I, Liu H, Cerullo V, Caruana I, Hoyos V, et al. Armed oncolytic
virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid
tumors. Cancer Res. 2014;74:5195–205.
3. Кулемзин С. В., Кузнецова В. В., Мамонкин М., Таранин А. В., Горчаков
А. А. Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae. 2017;1:6–15.

Раздел 3

328

N-МЕЗИЛ ФОСФОРАМИДНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ
ЭФФЕКТИВНО ИНАКТИВИРУЮТ ОНКОГЕННУЮ
МИКРОРНК-21 IN VITRO И IN VIVO И ЯВЛЯЮТСЯ
ДОСТОЙНОЙ АЛЬТЕРНАТИВОЙ
ФОСФОТИОАТНЫМ АНАЛОГАМ *N-MESYL PHOSPHORAMIDATE OLIGONUCLEOTIDESEFFECTIVELY INACTIVATE ONCOGENIC MIRNA-21
IN VITRO AND IN VIVO AND REPRESENT A WORTHY ALTERNATIVETO PHOSPHOTHIOATE ANALOGS
С. К. Мирошниченко, О. А. Патутина, Е. А. Буракова, А. В. Сенькова,Б. П. Челобанов, Д. А. Стеценко, В. В. Власов, М. А. Зенкова
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН
S. K. Miroshnichenko, O. A. Patutina, E. A. Burakova, A. V. Sen’kova,
B. P. Chelobanov, D. A. Stetsenko, V. V. Vlassov, M. A. Zenkova
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS
E-mail: sveta-mira@yandex.ruАннотацияВ данной работе впервые были представлены и всесторонне исследованы анти-микроРНК-21 олигонуклеотиды, содержащие в своём составе новую N-мезил
фосфорамидную модификацию межнуклеотидных связей, и было проведено сравнение их биологических свойств с характеристиками широко применяемой фосфотиоатной модификации. Было выявлено, что мезильные олигонуклеотиды более
эффективно подавляют ключевые события канцерогенеза in vitro и опухолевый ростin vivo по сравнению с фосфотиоатными аналогами.
Abstract
For the first time anti-miRNA-21 oligonucleotides that possess novel N-mesyl phosphoramidate modification of internucleotidic bonds were presented and thoroughly investigated and comparison of their biological properties with widely used phosphorothioate
modification was carried out. It was evaluated that mesyl oligonucleotides inhibit key© С. К. Мирошниченко, О. А. Патутина, Е. А. Буракова, А. В. Сенькова, Б. П. Челобанов, Д. А. Стеценко, В. В. Власов, М. А. Зенкова, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта Российского Научного фонда
№ 14-44-00068.

Молекулярная биология

329

events of tumorigenesis in vitro and tumor growth in vivo more effectively in contrast tophosphorothioate analogs.

Поиск эффективных способов борьбы с онкологическими заболеваниями остаётся важнейшей задачей в настоящее время. На текущий момент
одной из наиболее перспективных мишеней противораковой терапии являются короткие некодирующие молекулы — микроРНК. Поскольку ониконтролируют множество белковых мишеней, обеспечивающих протекание
ключевых клеточных процессов, подавление активности микроРНК оказывает комплексное действие на многие события канцерогенеза. Для эффективного ингибирования функций микроРНК исследователи применяют синтетические антисмысловые олигонуклеотиды. Данные соединения комплементарно связываются и блокируют действие микроРНК, связанных с развитием заболеваний. Для увеличения продолжительности и эффективности
действия антисмысловых олигонуклеотидов, исследователи вводят в состав
соединений химические модификации оснований и межнуклеотидных связей. На данный момент в области разработки химических модификаций ужедостигнуты значительные успехи, однако создание новых модифицированных соединений, обеспечивающих эффективное связывание и необратимую
инактивацию терапевтической мишени всё ещё остаётся актуальной задачей в наши дни.
В данной работе были созданы и всесторонне исследованы олигонуклеотиды, содержащие в своём составе новую N-мезил-фосфорамидную модификацию межнуклеотидных связей. Биологические свойства разработанных олигонуклеотидов были сопоставлены с характеристиками олигонуклеотидов, содержащих широко используемую фосфотиоатную модификацию
межнуклеотидных связей. В качестве терапевтической мишени была выбрана онкогенная микроРНК-21, являющаяся общепризнанным онкогеном, экспрессия которой нарушена во многих типах онкопатологий. Было выявлено,что мезильные олигонуклеотиды сочетают в себе такие характеристики каквысокая аффинность к мишени, значительная стабильность в сыворотке,а также способность активировать фермент РНКазу Н, катализирующую необратимую деградацию микроРНК в гетеродуплексах с олигонуклеотидами.
Стоит отметить, что по всем перечисленным характеристикам мезильные
олигонуклеотиды значительно превосходят фосфотиоатные аналоги.
Исследование биологической активности разработанных соединенийв культуре клеток показало, что мезильные олигонуклеотиды снижают уровень микроРНК-21 в клетках меланомы В16 в 1.5 раза эффективнее, чемфосфотиоатные аналоги, оказывая более чем в 2 раза длительное ингибирование мишени. Эффективное подавление микроРНК-21 под действием ме-330Раздел 3зильных олигонуклеотидов отражается в специфической активации апоптоза, а также в снижении пролиферативного и миграционного потенциалов
раковых клеток, которое в случае фосфотиоатных олигонуклеотидов в основном обеспечивается общей токсичностью данного типа модификации.
В эксперименте in vivo было показано, что созданные мезильные олигонуклеотиды способствуют значительному торможению роста опухоли, и ихэффект примерно в 5 раз превосходит ингибирующее действие фосфотиоатных олигонуклеотидов. Это даёт основание полагать, что мезильные олигонуклеотиды являются достойной альтернативой фосфотиоатно модифицированным олигонуклеотидам и могут в дальнейшем стать эффективным
инструментом в терапии онкопатологий.

Молекулярная биология

331

293FT — МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ
МЕХАНИЗМОВ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А *293FT — A MODEL FOR STUDYING THE MOLECULARMECHANISMS OF INFLUENZA A VIRUS INFECTIONЕ. В. Можаева 1,2, Г. А. Степанов 1,2, Е. С. Журавлев 1, Д. В. Семенов 2,
Е. А. Балахонова 1, М. Ф. Касакин 1, Р. Шах Махмуд3, С. Ю. Маланин 3,
Т. Ю. Григорьева 3, М. В. Сергеева 1,4, А. Б. Комиссаров 1,41Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
3Казанский (Приволжский) федеральный университет,Казань, Россия
4Научно-исследовательский институт гриппа
Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

E. V. Mozhaeva 1,2, G. A. Stepanov 1,2, E. S. Juravlev 1, D. V. Semenov 1,
E. A. Balakhonova 1, M. F. Kasakin 1, R. Shah Mahmud3, S. J. Malanin 3,
T. V. Grigoreva 3, M. V. Sergeeva 1,4, A. B. Komissarov 1,4
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine
SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3
Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
4
Research Institute of Influenza, Ministry of Healthcare of Russian Federation,
Saint-Petersburg, Russia
1E-mail: mozhaevaalena@gmail.com,
stepanovga@niboch.nsc.ruАннотация
Вирус гриппа A является респираторным патогеном и периодически вызывает
эпидемии у людей, а также свиней, птиц и других животных. Отличительной чертой
© Е. В. Можаева, Г. А. Степанов, Е. С. Журавлев, Д. В. Семенов, Е. А. Балахонова, М. Ф. Касакин, Р. Шах Махмуд, С. Ю. Маланин, Т. Ю. Григорьева, М. В. Сергеева,А. Б. Комиссаров, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда
(проект №18-75-10069).

332Раздел 3данного вируса является его изменчивость как в антигенности, так и в патогенности. В настоящее время во всем мире для защиты населения от инфекции вирусом
гриппа используют инактивированные и субъединичные формы вакцин, полученныес использованием куриных эмбрионов. Применение культур клеток в производстве
вакцин позволит устранить ряд недостатков стандартной технологии, а также сделать производство более экономичным. В качестве модели для исследования молекулярных механизмов инфекции вируса гриппа была выбрана клеточная линия 293FT.
Были проведены этапы анализа дифференциальной экспрессии генов в клетках в условиях заражения вирусом гриппа А, кроме того выявлены изменения в уровне рядамикроРНК, а также в представленности модифицированных компонентов в составе
основных классов РНК. Далее была предложена стратегия направленного нокаута
генов-мишеней для создания клеточных линий, пермиссивных к различным штаммам вируса гриппа.
Abstract
Influenza A virus (IAV) is a respiratory pathogen, which periodically causes epidemics
in humans, and also pigs, birds and other animals. Variability in antigenicity and pathogenicity is a distinctive feature of IAV. Currently, in the whole world inactivated and subunit
forms of vaccines obtained by using chicken embryos are used to protect the populationfrom infection caused by the IAV. Application of cell cultures for vaccines production will
eliminate a number of problems of standard technologies, and will make production more
economical. The 293FT cell line was chosen as a model for studying the molecular mechanisms of influenza infections. An analyze of the differential expression of genes in cells
under conditions of IAV infection were made, in addition, changes in the level of a numberof microRNAs were revealed, as well as in the representation of modified nucleosides asa part of the main RNA classes. Further, a strategy of directed knock-out of target genes
was proposed to create cell lines permissive to various strains of the IAV.

Вирус гриппа А относится к семейству Orthomyxoviridae и включаетв себя множество штаммов с различными патогенными профилями. Поскольку получение вакцин путем накопления вирионов в развивающихся
куриных эмбрионов весьма трудоемок, а сами вакцины нуждаются в ежегодной корректировке из-за антигенного дрейфа поверхностных гликопротеинов вируса, существует потребность в разработке более современных подходов для производства вакцин. Применение культуры клеток в производстве вакцины позволит существенно упростить технологию производства,а использование бессывороточной питательной среды полностью исключитне только аллергические реакции вакцинированных на белки куриных яиц,но также возможное заражение посторонними вирусами, микоплазмамии прионами, содержащимися в продуктах животных. Актуальность работы
состоит в изучении молекулярных путей развития вируса гриппа в клетках
человека. Таким образом, целью данной работы являлось определение из-Молекулярная биология

333менений в путях регуляции экспрессии генов в клетках человека 293FT приинфицировании вирусом гриппа А.
Для оценки изменений в путях регуляции экспрессии генов в клетках
человека в условиях заражения вирусом гриппа был проведен анализ дифференциальной экспрессии генов методом массового параллельного секвенирования на платформе Illumina NextSeq. Было установлено, что через
12 часов после заражения вирусом гриппа происходит достоверное изменение уровня экспрессии 42 генов (Adj. p-value < 0.05). Далее было проведено обогащение по GO-терминам, результаты которого свидетельствуютоб участии данной группы генов в активации иммунного ответа и каскадов
апоптоза в условиях развития инфекции.
Массовое параллельное секвенирование фракции коротких форм РНКчерез 8 часов после заражения выявило изменения в уровне 57 форм (Adj.
p-value < 0.05). Было показано, что 21 форма относится к группе микроРНК, и 21 форма — к группе малых ядрышковых РНК (мяоРНК), которые
были сгруппированы в функциональные блоки, отвечающие за регуляцию
клеточного цикла, а также активацию апоптоза. Полученный результат
указывает на участие систем пост-транскрипционной регуляции созревания рРНК и трансляции мРНК в контроле вирусной инфекции в клетках
человека.
Отдельным фундаментальным вопросом является регуляция механизмов модификации РНК в клетках человека в условиях вирусной инфекции.
Для оценки изменения в уровне представленности модифицированных
компонентов в составе суммарной РНК были определены условия исчерпывающего ферментативного гидролиза и последующего ВЭЖХ-МС/МСанализа. Был подготовлен ряд образцов клеток 293FT через 2–24 часа после заражения и проведена оценка вклада модифицированных нуклеотидов в составе основных классов РНК. Было установлено, что в клетках
после заражения вирусом происходит резкое увеличение инозина через
6 часов после инфицирования, что хорошо согласуется с литературными
данными. В тоже время было обнаружено, что происходит снижение уровня метилированной формы аденозина по N6-положению (m6A) в период
0–6 часов с последующим восстановлением уровня до исходного через
24 часа. Схожий эффект был обнаружен нами на клеточной линии карциномы легких человека A549.
Для создания клеточных линий человеческого происхождения для наработки вакцинных штаммов вируса гриппа была предложена стратегия
рационального выбора гена для последующего CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута. Дальнейшие этапы включали конструирование специфичных
протоспейсеров, нокаут гена-мишени путем внесения точечных разрывов

334

Раздел 3в гене, получение ДНК-конструкций для трансфекции с последующим отбором моноклонов, характеризация мутаций методом Сэнгера и отбор клонов, содержащих мутации, обеспечивающий сдвиг рамки считывания. Подтверждение изменений в уровне экспрессии генов-мишеней в полученных
модифицированных линиях проводили методом вестерн-блота. Таким образом были получены клеточные линии с охарактеризованными мутациями
генов-мишеней и продемонстрирована возможность повышения продуктивности таких линий по отношению к вирусу гриппа.

Молекулярная биология

335

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ CRE/LOXPДЛЯ ИНДУКЦИИ МНОЖЕСТВЕННЫХ ХРОМОСОМНЫХ
ПЕРЕСТРОЕК В ГЕНОМЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКАAPPLICATION OF CRE/LOXP SYSTEM FOR INDUCTION
OF MULTIPLE CHROMOSOMAL ABERRATIONSIN THE HUMAN GENOME
Р. В. Мунгалов 1,2, В. С. Фишман 2, А. А. Хабарова 2 *1Новосибирский государственный университет, НГУ
2Федеральный исследовательский центр
Институт цитологии и генетики СО РАН
R. V. Mungalov 1,2, V. S. Fishman 2, A. A. Khabarova 2
1

Novosibirsk State University, NSU
2
ICG RB RAS

Аннотация
Человеческий геном на 99 % состоит из некодирующих элементов и лишь 1 %кодирует белки. И если роль генов по большей мере известна, то функции некодирующей части генома до сих пор остаётся неизвестной. Существующих методов молекулярной и эволюционной биологии оказывается недостаточно для понимания роливсей ДНК. В данном проекте мы разработали две принципиально разные стратегии
поиска функциональных элементов человеческого генома. В основе каждой из нихлежит принцип действия Cre/LoxP-системы.
Abstract
The human genome consist of noncoding elements on 99 %, while protein-coding partof the human genome is only about 1 %. Suppose, that we know role of genes, but the function of protein-noncoding part of the genome is unknown for us. There are some methodsof molecular and evolutionary biology, but it’s not enough to answer the question about
functionality of all these elements. In this project we have developed two different strategies for identification of functional elements in human genome. At the core of each one
lays operating principle of Cre/LoxP-system.

В данной работе нами проведены первые шаги к созданию новой скрининговой системы для выявления функциональных элементов в геноме человека. Метод основан на введении в геном множественных LoxP-сайтов* © Р. В. Мунгалов, В. С. Фишман, А. А. Хабарова, 2018.

достигаться за счёт разнообразия малого числа делеций, индуцированных вомножестве
клеток.
Раздел 3336
Для идентификации делеций нами был разработан молекулярный метод,с последующей индукцией хромосомных перестроек при помощи Cre/LoxPкоторый заключается в следующем. После событий рекомбинаций в геноме
системыи далее,за счёт искусственной
селекции, обогащении
геномов
клеток
человека,индуцируемых
Cre/LoxP-системой,из клеток выделяется
клеток
функциональными
элементами.
Интеграция
LoxP-сайтовв геном
геномная ДНК и гидролизуется короткошепящей эндонуклеазой рестрикции
(сайтосуществляется
сиспользованием
лентивирусных
векторов.
Схемаэкспеотсутствует в конструкции, несущей LoxP-сайт). Далее полученные фрагменты
«Минимальный
представленана рис. к1.появлению кольцевых
ДНКримента
лигируютсяв условиях геном»разбавления,что приведёт
Оценки
эффективности
встройки
вируса
вгеном, проведенныес помолекул (фрагменты лигируются сами на себя). Конструкции
с LoxP-сайтами
количественной
ПЦР, позволили
оценить
количество интеграций
несутмощьюпо одномуиз двух вариантов
уникальных
олигонуклеотидов,каждый из
LoxP-сайтав среднемна сторону
клетку, чтосоставило ~50событийв масштабах
которых
находитсяпо одну
от LoxP-сайта.
Такимобразом,после актавсего генома.
Мы такжечто конструкции
концентрирование
вирусов позволяет
рекомбинации
участки
ДНК,показали,содержащие
с LoxP-сайтамии разными
значительно увеличить
провирусных
интеграций.
олигонуклеотидами
будут количество
сближаться
и, используя
последние в качествеВ качестве
системыдля направленной
селекции
клеток насеквенирования
уменьшение
праймеровдля ПЦР,а также
после массового
параллельного
можноопределять
участки
генома, гдепроизошли рекомбинации.
Следовательно,контентаДНК мы
использовали
прижизненный
краситель Vybrant
DyeCycle,маловероятно,что данные
участкиДНК
несутважную
функциональную
ролькоторый позволяет
окрашивать
клетоки отсортировыватьту часть
по-для
обеспечения
Таким Однако
образом,в данном
эксперименте
пуляции, жизнедеятельностиу которой геном былклетки.
редуцирован.
тестовые
экспериментынас интересует
отрицательный
результат, тодетектировать
есть те участки
ДНК,которые мы нес красителем
показали его способность
лишьсущественную
наблюдаем,азначит
клетки,вкоторых
онибылиделетированы,погибли
разницу в количестве ДНК, соизмеримую с плоидностью клеток, ноне хро- наначальном
этапеэксперимента.
Данные
участки
генома
подлежат
болеемосомные делеции. На данный момент мы разрабатываем альтернативную
целенаправленному
изучению.
Схемаэксперимента
«Смысловые
кольца»стратегию поиска функциональных элементов генома. Принципиальным отпроиллюстрированана рисунке
2.
личием новой стратегииот первоначальной
является масштаб планируемых
Делеция
нефункционального
участка

Делеция
функционального
участка
Делеция

СелекцияНет рекомбинации

Другая рекомбинация

Клоныс минимальным
геномом

Рис. 1. Схема эксперимента «Минимальный геном»Рис. 1. Схема эксперимента «Минимальный геном»337

Молекулярная биология

делеций, а именно получение как можно большего разнообразия делецийв большой популяции клеток. Тогда как первая стратегия предполагала максимально возможное уменьшение генома до момента получения нескольких
клонов, геномы которых будут сильно редуцированы и обогащены функциональными элементами. При этом не обязательно вносить огромное число
случайных делеций в один и тот же геном, достаточно нескольких событийв каждой клетке. Информативность метода будет достигаться за счёт разнообразия малого числа делеций, индуцированных во множестве клеток.
Для идентификации делеций нами был разработан молекулярный метод,который заключается в следующем. После событий рекомбинаций в геноме
клеток человека, индуцируемых Cre/LoxP-системой, из клеток выделяется
геномная ДНК и гидролизуется короткошепящей эндонуклеазой рестрикции
(сайт отсутствует в конструкции, несущей LoxP-сайт). Далее полученные
фрагменты ДНК лигируются в условиях разбавления, что приведёт к появлению кольцевых молекул (фрагменты лигируются сами на себя). Конструкции
с LoxP-сайтами несут по одному из двух вариантов уникальных олигонуклеотидов, каждый из которых находится по одну сторону от LoxP-сайта. Таким
образом, после акта рекомбинации участки ДНК, содержащие конструкции
с LoxP-сайтами и разными олигонуклеотидами будут сближаться и, используя последние в качестве праймеров для ПЦР, а также после массового параллельного секвенирования можно определять участки генома, где произошли
рекомбинации. Следовательно, маловероятно, что данные участки несут важную функциональную роль для обеспечения жизнедеятельности клетки. Таким образом, в данном эксперименте нас интересует отрицательный результат, то есть те участки ДНК, которые мы не наблюдаем, а значит клетки, в которых они были делетированы, погибли на начальном этапе эксперимента.
Данные участки генома подлежат более целенаправленному изучению. Схема
эксперимента «Смысловые кольца» проиллюстрирована на рис. 2.

Гидролизи лигирование
ПЦРи секвенирование

Делеция
нефункционального
участка

Выводо функциональности

Рис. 2. Схема
эксперимента
«Смысловые кольца»Рис. 2. Схема эксперимента
«Смысловые
кольца»Источники и литература

338

Раздел 3Литература
1. Kellis, M. et al. Deﬁning functional DNA elements in the human genome //Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014, №111 (17). p. 6131–6138
2. Sauer, B., and N. Henderson. Site-speciﬁc DNA recombination in mammalian cellsby the Cre recombinase of bacteriophage P1 // Proceedings of the National Academy of
Sciences. 1988, №85 (14). p. 5166–70
3. https://www.addgene.org/cre-lox (Некоммерческое хранилище плазмид
Addgene.org)

Молекулярная биология

339

АПОЛИПОПРОТЕИН А-1 В МАКРОФАГАХ ЧЕЛОВЕКА
УЧАСТВУЕТ В ЗАХВАТЕ АЦЕТИЛИРОВАННЫХ
ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ
MACROPHAGE APOLIPOPROTEIN A-I PARTICIPATESIN ACETYLATED LOW DENSITY LIPOPROTEIN UPTAKEBY HUMAN MACROPHAGES
Е. В. Некрасова, А. А. Никитин, В. С. Шавва, С. В. Орлов *ФГБНУ Институт экспериментальной медицины,отдел биохимии
Санкт-Петербургский государственный университет,кафедра эмбриологии
E. V. Nekrasova, A. A. Nikitin, V. S. Shavva, S. V. Orlov
1

Department of Biochemistry, Institute of Experimental Medicine, Russian
Academy of Medical Sciences, St. Petersburg, Russia
2
Department of Embryology, St. Petersburg State University,
St. Petersburg, Russia
E-mail: katherina.nekrasova@gmail.com

Аннотация
Аполипопротеин А-I человека является главным белком липопротеинов высокой
плотности и обладает атеропротекторными свойствами. Ранее нами было показано,что ген АпоА-I экспрессируется в человеческих макрофагах.
Abstract
Human Apolipoprotein A-I is a core component of high density lipoprotein (HDL)
particles that harbors anti-atherosclerotic functions. Earlier we have shown that apoA-I
gene is expressed in human macrophages.

Objective
Given the importance of apoA-I for protection against the development of
atherosclerosis and metabolic syndrome we have studied the potential functionsof apoA-I expressed in human macrophages.
Methods
Real Time RT-PCR, FACS, isolation of primary human monocytes.
* © Е. В. Некрасова, А. А. Никитин, В. С. Шавва, С. В. Орлов, 2018.

340Раздел 3

Results
Earlier we have shown that human macrophage population is divided in
apoA-I-rich and apoA-I poor subgroups. FACS analysis revealed that apoA-Irich macrophages take up significantly more acetylated LDL (acLDL) then apoAI-poor macrophages. Treatment of human PBMC with siRNA against apoA-I or
ABCA1 revealed that apoA-I or ABCA1 knock down leads to the decrease of
surface LOX-1 scavenger receptor and LOX-1 mRNA level, yet had no effect on
surface concentration of CD36 or SR-A. Administration of recombinant apoA-I
or human HDL to PBMC treated with siRNA against apoA-I or ABCA1 rescued
LOX-1 surface level. To probe the signaling pathways known to be activatedby apoA-I/ABCA1 that can be involved in the apoA-I-dependent regulationof LOX-1 expression, we treated THP-1-derived macrophages with activators
or inhibitors of different signaling pathways. PKA activator Forskolin and
PKC activator PMA increased LOX-1 gene expression, while JNK inhibitor
SP600125 downregulated LOX-1 gene activity. In contrast, MEK1/2 inhibitor
U0126 and NF-κB inhibitor QNZ displayed no effect.
Conclusion
Macrophage apoA-I and ABCA1 play a role in acLDL uptake through theregulation of LOX-1 expression.

Молекулярная биология

341

ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ К САМОАССОЦИАЦИИ
ДОДЕЦИЛ-СОДЕРЖАЩИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ *ANALYSIS OF THE SELF-ASSEMBLY
OF THE OLIGONUCLEOTIDES WITH DODECYL GROUPS
А. С. Павлова, М. С. Купрюшкин
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия
A. S. Pavlova, M. S. Kupryushkin
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS,
Novosibirsk, Russian FederationАннотация
Интерес к введению в нуклеиновые кислоты (НК) функциональных группировок
остатков алифатических углеводородов, липидов или жирных кислот с недавнего времени возрос ввиду способности данных групп увеличивать проникновение в клетки
соответствующих НК и оказываемый ими антисенс эффект. В данной работе былиисследованы свойства самосборки синтезированных додецил-содержащих олигонуклеотидных конъюгатов (ДОК) с помощью методов гель-электрофореза, анализа интенсивности флюоресценции, атомно-силовой микроскопии (АСМ) и динамического
рассеяния света (ДРС). Показано, что такие амфифильные ДОК способны формировать мицеллоподобные частицы размером от 30 до 100 нм и обладают более высоким
сродством к бычьему сывороточному альбумину по сравнению с олигонуклеотидом,не содержащим данных функциональных группировок. Продемонстрирован потенциал ДОК для использования в качестве средства доставки лекарственных препаратов.
Abstract
Interest in functionalizing nucleic acids (NAs) with aliphatic groups, lipid or fatty
acids chains has recently grown due to the ability of these groups to improve cellular
uptake and antisense effect of the corresponding NAs. In this report we investigated theself-assembly properties of synthesized dodecyl-oligonucleotide conjugates (DOCs) bymeans of gel electrophoresis, fluorescence techniques, atomic force microscopy (AFM)
and dynamic light scattering (DLS). Experimental results showed that these amphiphilic
DOCs can form micellar particles with small size of 30 to 100 nm and have a higher affinity for association with bovine serum albumin in comparison with non functionalizing
oligonucleotide, which point to their potential for the use as the drug delivery vehicles.
© А. С. Павлова, М. С. Купрюшкин, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 16-15-10238.

342Раздел 3В настоящее время использование синтетических олигонуклеотидов,содержащих остатки алифатических углеводородов, липидов или жирных
кислот является одним из способов улучшения доставки функционально
значимых НК [1]. Липофильная группировка служит так называемым «якорем» для закрепления таких конъюгатов на липидном бислое клеточных
мембран, что позволяет рассматривать данные соединения как средства
доставки, например, НК-аптамеров на поверхность клеток [2]. Кроме того,как амфифильные соединения такие конъюгаты способны к самоассоциации в водных и солевых растворах с образованием мицелл, как правило,не превышающих 100 нм [1]. Благодаря небольшому размеру, хорошей
биологической совместимости и способности к удержанию и транспортировке внутри своего гиброфобного кора различных низкомолекулярных
плохо растворимых соединений, к числу которых принадлежат некоторые
лекарственные препараты, такие мицеллоподобные структуры особенно
интересуют ученых всего мира.
Ранее в нашей лаборатории была разработана методика синтеза додецил-содержащих олигонуклеотидных конъюгатов (ДОК) [3].
Целью данной работы было исследование свойств некоторых ДОК и ихдуплексов с комплементарными олигонуклеотидами к самоассоциации.
Было показано, что ДОК способны формировать мицеллоподобные частицы размером от 30 до 100 нм и их размер зависит от длины олигонуклеотидной части конъюгата. ДОК обладают более высоким сродством к бычьему сывороточному альбумину по сравнению с олигонуклеотидом, не содержащим данных функциональных группировок. Также продемонстрировано
тушение флюоресценции остатка 6-FAM при его расположении на одном
конце с додецильными группировками в условиях образования мицелл, тоесть можно предположить, что гидрофобное ядро располагается внутри,а гидрофильная олигонуклеотидная часть — снаружи формируемых частиц. Данные результаты позволяют рассматривать ДОК как перспективную
платформу для создания средств доставки лекарственных препаратов.
Литература
1. Juliano R. L. The Delivery of Therapeutic Oligonucleotides // Nucleic Acids
Research. 2016. V. 44(14). P. 6518–6548.
2. Liu H. et al. DNA Based Micelles: Synthesis, Micellar Properties and Size-dependent
Cell Permeability // Chemistry. 2010. V. 16(12). P. 3791–3797.
3. Kupryushkin M. S. et al. Efficient Functionalization of Oligonucleotides by New
Achiral Nonnucleosidic Monomers // Organic Letters. 2014. V. 16(11). P. 2842–2845.

343Молекулярная биология

ЭКСПРЕССИЯ МРНК ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМЫ
КАТЕХОЛАМИНОВ, УРОВЕНЬ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВВ ПОЛОСАТОМ ТЕЛЕ, СРЕДНЕМ И ПРОДОЛГОВАТОМ
МОЗГЕ И РЕАКЦИЯ ПРЕСТИМУЛЬНОГО ТОРМОЖЕНИЯУ КРЫС С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАТАТОНИЕЙ *GENES EXPRESSION OF CATECHOLAMINE SYSTEM ENZYMES,THE LEVEL OF NEUROTRANSMITTERS
IN THE STRIATUM, MIDBRAIN AND MEDULLA OBLONGATA
AND THE REACTION OF PREPULSE INHIBITION
IN RATS WITH GENETIC CATATONIA
В. С. Плеканчук 1,2, Т. В. Латышева 3, О. И. Прокудина 1,
Т. А. Алехина 1, М. А. Рязанова 1,2ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр
Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия
2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
3Научно-исследовательский институт физиологиии фундаментальной медицины, Новосибирск, Россия
1

V. Plekanchuk 1,2, T. Latysheva 3, O.Prokudina 1,
T. Alekhina 1, M. Ryazanova 1,2
1

Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia
2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3
Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine,
Novosibirsk, Russia
E-mail: lada9604@mail.ruАннотация
Крысы линии ГК (аббревиатура от слов «генетическая» и «кататония») предрасположены к реакциям кататонического застывания. Данный тип кататонических
реакций характерен для людей с шизофренией, что дало основание предполагать,что крысы линии ГК, по крайней мере частично воспроизводят психопатологию человека. В связи с этим актуально исследование престимульного торможения (PPI)© В. С. Плеканчук, Т. В. Латышева, О. И. Прокудина, Т. А. Алехина, М. А. Рязанова, 2018.
*Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект №16-04-01325).

344

Раздел 3у крыс ГК, как показателя фильтрации сенсомоторной информации, который нарушен в большей степени при шизофрении, а также при некоторых других психиатрических заболеваниях [1], [2]. Известно также, что дофаминергическая система
мозга играет важную роль в проявлении кататонии и её влияние комплексное. Норадренергическая система может модулировать работу дофаминергической, а также
непосредственно влиять на двигательную активность и эмоциональное состояние.
Исследовали PPI у крыс ГК, экспрессию генов тирозингидроксилазы (Тh), катехол-O-метилтрансферазы (Comt) и гена моноаминоксидазы А (Maoa), а также оценивали содержание норадреналина, дофамина и ДОФУК в структурах мозга интактных крыс инбредной линии крыс ГК. Достоверно более низкий уровень престимульного торможения был показан как при силе престимула 75 дБ (р<0.001), так и при
85 дБ (р<0.001). Выявлена достоверно низкая экспрессия гена моноаминоксидазыА (Maoa) в полосатом теле у крыс ГК. Кроме того, показан высокий уровень норадреналина в полосатом теле и среднем мозге по сравнению с контрольной линией
крыс WAG. Изменения в уровне норадреналина в мозге могут вносить вклад в высокую возбудимость и «нервность», которые были показаны ранее у крыс ГК [3],как и реакции «застывания». Выявленное снижение PPI у крыс ГК свидетельствуетв пользу функционального сходства линии ГК, как генетической модели психопатологии, с прототипом.
Abstract
The GC rats strain (an abbreviation from words «genetic» and «catatonia») are predisposed to catatonic freezing reactions. This type of catatonic reactions is observedin schizophrenia, which give the reason to assume that GC rats reproduce human psychopathology at least partially. In connection with this, it is important to study the prepulse inhibition (PPI) in GC rats as an indicator of sensorimotor information filtration,
which is disrupted in schizophrenia, as well as in some other psychiatric diseases [1],[2]. It is also known that the brain dopaminergic system plays an important role in the
manifestation of catatonia and its effect is a complex. Noradrenergic system can modulate the dopaminergic function, and also directly affect on motor activity and emotional
state. PPI was studied in GC rats. Expression of tyrosine hydroxylase (Th), catecholamine-O-methyltransferase (Comt) and of monoamine oxidase A (Maoa) genes, as well
as norepinephrine, dopamine and DOPAC levels was study in striatum, midbrain andmedulla oblongata of intact rats GC rats. A significantly lower level of PPI was shownwith a prepulse power of 75 dB (p <0.001), and at 85 dB (p <0.001). The low expressionof mRNA Maoa was observed in striatum of GC rats. In addition, a high level of norepinephrine in striatum and midbrain of GC rats was shown compared with the control
WAG rats. The revealed changes in the level of norepinephrine in the brain can contribute to the high excitability and «nervousity» of GC rats, which was shown before [3]as well as «freezing» reactions. The revealed reduced level of PPI of GC rats count infavor of functional similarity of GC line (as a genetic model of psychopathology) withthe prototype (psychopathology itself).

Молекулярная биология

345

Целью работы было исследование реакции престимульного торможения, а также оценка экспрессии мРНК генов синтеза (Тh) и деградации катехоламинов (Comt, Маоа), и определение содержания катехоламинов и ДОФУК в полосатом теле, продолговатом и среднем мозге у крыс линии ГК.
Методы
Исследование престимульного торможения (prepulse inhibition, PPI)у крыс ГК и WAG проводили в установке TSE StartleResponseSystem(Germany), количество мРНК исследуемых генов в структурах мозга крыс(полосатое тело, средний и продолговатый мозг) определяли методом ПЦРв реальном времени, количество катехоламинов измеряли с использованием
высокоэффективной жидкостной хроматографии, статистическая обработка
результатов проведена с помощью пакета программ «Statistica 6.0».
Результаты
Престимульное торможение (prepulse inhibition, PPI) — это снижение моторной реакции организма рефлекса вздрагивания в ответ на сильный резкий
стимул, обычно звуковой (импульс), при наличии слабого предварительного
подпорогового звукового стимула (преимпульс). PPI является важным показателем способности нервной системы к сенсомоторной фильтрации. Дефицит
PPI наблюдается у пациентов с шизофренией и другими психическими расстройствами [4]. Выраженность реакции PPI связана в том числе и с дофаминергической системой мозга, в частности с уровнем экспрессии гена Comt
[5]. Норадренергическая система мозга может модулировать работу дофаминергической, а также непосредственно влиять на двигательную активностьи эмоциональное состояние. Основным центром синтеза норадреналина является Голубое пятно ствола мозга, тем самым регулируя уровень возбуждения, тревожности, страха и двигательные реакции. Полосатое тело является
важной базальной структурой, дофаминовая функция которой оказывает влияние на патогенез шизофрении [6], депрессии и каталепсии [7].
Выявлено снижение уровня PPI у крыс инбредной линии ГК по сравнению с крысами линии WAG. Достоверно более низкий уровень престимульного торможения показан как при силе престимула 75 дБ (по Манн-Уитни: U=24.0, р<0.001), так и при 85 дБ (по Манн-Уитни: U=25.0, р<0.001).
В полосатом теле показано снижение экспрессии мРНК гена Maoa у крысс генетической кататонией (p<0,05). Выявленное изменения в экспрессии
Maoa в полосатом теле могут указывать на недостаточную скорость утилизации катехоламинов в полосатом теле, что согласуется с полученными
данными о повышенном содержании норадреналина у крыс ГК в данной
структуре (p<0,05).Повышенное содержание норадреналина также показа-346

Раздел 3но для среднего мозга у крыс ГК(p<0,01), однако экспрессия исследуемых
генов в этой структуре не отличалась у крыс ГК и WAG.Возможно, у крысс генетической кататонией наблюдаемое нарушение баланса нейромедиаторов в среднем мозге ассоциировано не с количеством мРНК генов Th, Comt,
Maoa, а с изменением других параметров, например с изменением активности этих ферментов. Высокоэффективная жидкостная хроматография невыявила различий в содержании дофамина и ДОФУК в исследуемых структурах мозга крыс ГК по сравнению с контролем.
Выводы
Высокий уровень норадреналина в полосатом теле крыс ГК может бытьобусловлен низкой экспрессия мРНК Maoa в этой структуре, однако, увеличение уровня норадреналина в среднем мозге не связано с изменениямив экспрессии мРНК исследованных генов. Выявленные изменения уровня
норадреналина в мозге могут способствовать увеличению возбудимостии «нервозности» крыс ГК, которые были показаны ранее [3] наряду с акинетическими реакциями «торможения». Сниженная реакция престимульного
торможения свидетельствуют в пользу функционального сходства линии
ГК, как генетической модели психопатологии, с прототипом.
Литература
1. J. P. Vargas et al, Animal Models of Maladaptive Traits: Disorders in Sensorimotor
Gating and Attentional Quantifiable Responses as Possible Endophenotypes, Front.
Psychol., vol. 7, p. 206, 2016.
2. N. R. Swerdlow et al, Realistic expectations of prepulse inhibition in translationalmodels for schizophrenia research, Psychopharmacology (Berl)., vol. 199, no. 3, pp.
331–388, 2008.
3. М. А. Рязанова и др., Увеличение доли ‘нервных’ животных в ходе селекции накататонию: участие в кататонических реакциях центральных адренорецепторов, Генетика. 2012. Т. 48. № 11. С. 1–8, 2012.
4. I Martinez-Gras et al., The relationship between prepulse inhibition and general
psychopathology in patients with schizophrenia treated with long-acting risperidone,
Schizophr. Res., vol. 115, no. 2–3, pp. 215–221, 2009.
5. N. R. Swerdlow et al, Opposite effects of tolcapone on amphetamine-disrupted
startle gating in low vs. high COMT-expressing rat strains, Pharmacol. Biochem. Behav.,vol. 106, pp. 128–131, 2013.
6. S. M. Stahl, Beyond the dopamine hypothesis of schizophrenia to three neuralnetworks of psychosis: dopamine, serotonin, and glutamate, CNS Spectr., vol. 23, no. 03,
pp. 187–191, 2018.
7. R. Vajdi-Hokmabad et al, Modafinil Improves Catalepsy in a Rat 6-Hydroxydopamine
Model of Parkinson’s Disease; Possible Involvement of Dopaminergic Neurotransmission,
Adv. Pharm. Bull., vol. 7, no. 3, pp. 359–365, 2017.

Молекулярная биология

347

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КЛАССА Y,НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ ВИРУС МАРБУРГ *MARBURG VIRUS-NEUTRALIZING IGYS
О. А. Полежаева, Д. Н. Щербаков, А. В. Зыбкина
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, РоссияO. A. Polezhaeva, D. N. Scherbakov, A. V. Zybkina
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотация
Была проведена работа по получению иммуноглобулинов класса Y, нейтрализующих вирус Марбург. В результате нами были получены препараты антител способные нейтрализовать псевдовирусные частицы вируса Марбург при разведении 1/256.
Abstract
Our study aimed at developing chicken immunization schedule to produce MARV-neutralizing IgYs. Resulting IgYs were isolated and tested in virus neutralization assay with
VLPs. We selected IgYs that neutralize VLPs in 1/256 dilution.

Согласно международной классификации, вирус Марбург относитсяк семейству филовирусов отряд Mononegavirales. Вирус Марбург вызывает
тяжелую геморрагическую лихорадку у людей. Уровень смертности в очагах лихорадки Марбург варьируется от 24 до 88 %. Начиная с середины 80-хгодов ведутся поиски терапевтических средств для борьбы с филовирусами. Предложен ряд подходов, таких как постконтактные вакцины, миРНК,олигомеры и моноклональные антитела. Последние, по показателям безопасности и специфичности действия, несомненно занимают лидирующие
позиции.
Первым этапом получения моноклональных антител является получение разнообразия специфических иммуноглобулинов в организме животного. Наша работа направлена на разработку эффективной схемы иммунизации кур, для получения разнообразия IgY антител, нейтрализующего вирус
Марбург. На первом этапе на основе рабдовирусной системы нами былиполучены функциональные вирусоподобные частицы (ВПЧ), псевдотипи© О. А. Полежаева, Д. Н. Щербаков, А. В. Зыбкина, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке РФФИ в рамках научного проекта
№18-34-00512 мол_а.

348Раздел 3

Рис. 1. Схема иммунизации

Рис. 2. Динамика накопления нейтрализующих антител.
Пунктиром отмечены сроки иммунизации. М3, М4, М5, первая группа птиц,иммунизация препаратом псевдовирусов. М6, М7, М8 вторая
группа, псевдовирусы в комплексе с неполным адъювантом Фрейнда

Молекулярная биология

349

рованные поверхностным гликопротеином (GP) вируса Марбург. Функциональную активность ВПЧ определяли на клетках HEK293Т. Сигнал свечения прямо пропорционален количеству зараженных клеток и определяетсяв относительных люциферазных единицах (RLU).
Для иммунизации было сформировано две группы кур — первой группе
вводились очищенные ВПЧ в концентрации 1,4×107 RLU внутримышечно,второй группе вводилось то же количество ВПЧ с неполным адъювантом
Фрейнда. Промежуток между иммунизациями составляет 3 недели. После
шести иммунизаций проводили бустирующую иммунизацию обеих групп
смесью ВПЧ. Использовали смесь, состоящая на 50 % из рабдовирусных
частиц, несущих на своей поверхности GP штамма Popp с делецией муциноподобного домена и на 50 % из лентивирусных частиц, несущих на своей
поверхности GP штамма DRC с делецией муциноподобного домена. Схема
иммунизации представлена на рис. 1.
IgY выделялись методом изоэлектрического осаждения. Проверку вируснейтрализации проводили с помощью псевдовирусной системы (рис. 2).
Появление нейтрализующих антител было зафиксировано после первой
иммунизации. Наибольший уровень нейтрализации (1/256) был достигнут
после третьей иммунизации.
В результате были получены препараты антител, нейтрализующие ВПЧв разведении 1/256. Более высокие титры нейтрализующих антител накапливались в желтках птиц, иммунизированных по схеме с добавлением неполного адъюванта Фрейнда.

Раздел 3350ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ
СТРОМА-АССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВВ АЛЛОГРАФТНЫХ МОДЕЛЯХ ОПУХОЛЕЙ МЫШИ *THE STUDY OF THE EXPRESSION OF STROMA-ASSOCIATED GENESIN MOUSE ALLOGRAFT TUMOR MODELS
А. В. Полуконова, Д. А. Дидыч, Е. Д. Свердлов
ФГБУН Институт биоорганической химии
им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова
Российской академии наукA. V. Polukonova, D. A. Didych, E. D. Sverdlov
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistryof the Russian Academy of Sciences
E-mail: polukonova.av@gmail.com
Аннотация
Данная работа посвящена анализу экспрессии ряда строма-ассоциированных
генов в трех аллографтных моделях опухолей мыши. Особое внимание в работе
уделено потенциальным маркерам опухоль-ассоциированных фибробластов (ОАФ).
Полученные нами результаты подтверждают высокую специфичность экспрессии
большинства исследуемых генов в клетках опухолевой стромы. Сравнение экспрессии строма-ассоциированных генов в опухолях разных моделей указывает на разную
степень развития в них стромального компонента. В дальнейшем анализ экспрессии исследованных в работе генов планируется использовать для характеристики
отдельных популяций ОАФ, выделяемых из опухолей.
Abstract
This work is devoted to the study of the expression of potential stromal markers inthree mouse allograft tumor models. Especially, our attention was focused on the potential markers of cancer-associated fibroblasts (CAFs). Our results confirm that most of thestudied genes have the high specificity of expression in tumor stroma cells. Comparison of
the expression of stroma-associated genes in different tumor models indicates a different
degree of stromal component development. In the future, the gene expression analysis
performed in this work is planned to be used to characterize the individual populations of
CAFs isolated from tumors.
© А. В. Полуконова, Д. А. Дидыч, Е. Д. Свердлов, 2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 17-00-00190.

Молекулярная биология

351

В большинстве солидных опухолей основным компонентом стромы
являются опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ), взаимодействия
которых с раковыми клетками и клетками иммунной системы, обеспечивают опухолевую прогрессию, инвазию, метастазирование, ангиогенези уклонение опухоли от иммунного надзора. Благодаря различному происхождению, высокой пластичности и чувствительности к внешним сигналам, ОАФ характеризуются высокой меж- и внутриопухолевой гетерогенностью. Поэтому поиск специфичных генов и их сочетаний, позволяющих
идентифицировать разные популяции ОАФ, представляется важной прикладной задачей.
В данной работе на основе литературных данных мы составили список
потенциальных ОАФ-специфичных генов и провели анализ их экспрессиив трех аллографтных моделях опухолей мыши.
Для исследования были выбраны как известные стандартные гены-маркеры ОАФ, (Pdgfrb, Acta2, Fsp1/S100a4, Cspg4, Faр) так и выбранные
нами на основе литературных данных (Saa3, Wnt2, Dpp4, S100a8, Kcnj15,
Gjb2 и Csf3). В качестве дополнительных были исследованы и другие строма-ассоциированные гены, связанные с иммуномодуляторными активностями (Il6, Il11, Ccl2, Cxcl12, Ox40, Ox40L, Nt5e, Cd276, Pdl2 и Foxp3). Дляанализа использовали образцы тотальной РНК, выделенные из подкожно
привитых опухолей мыши, полученных с использованием раковых линий:CT26 (карцинома толстой кишки), С26 (карцинома толстой кишки) и Pan02/
Panc02 (протоковая аденокарцинома поджелудочной железы). В качестве
контрольных образцов использовали РНК, выделенные из клеток соответствующих раковых линий, культивируемых in vitro. Из обработанных ДНКазой I образцов РНК с применением метода рассеянной затравки былиполучены образцы кДНК, которые использовали для анализа экспрессии
исследуемых генов методами «обычной» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в «реальном
времени». В качестве референсных генов использовали гены домашнего хозяйства Psmb2 и Psmb7.
В результате работы нами были получены данные об относительном содержании мРНК строма-ассоциированных генов в образцах РНК, выделенных из клеток трех раковых линий, культивируемых in vitro, и из соответствующих им подкожно привитых мышиных опухолей. Мы показали, чтов образцах из клеток, культивируемых in vitro, мРНК большинства исследованных генов либо не детектируются, либо их содержание незначительнопо сравнению с образцами из опухолей. Эти данные свидетельствуют о возможной высокой специфичности их экспрессии в клетках стромы. Однако,мы допускаем, что после инокуляции раковых клеток под кожу в процессе
формирования опухоли под воздействием сигналов микроокружения в ра-

352Раздел 3ковых клетках может происходить и активация некоторых молчащих генов,и усиление уже активных генов.

Анализ экспрессии Fap в подкожно прививаемых
мышиных опухолях, полученных с использованием культур
раковых клеток CT26, C26 и Pan02

Сравнение между собой опухолей разных моделей по содержанию мРНКстрома-ассоциированных генов указывает на разную степень развития стромального компонента в опухолях. Интерпретируя полученные результатына примере Fap, который известен как высокоспецифичный ген, активныйв популяциях Fap-позитивных опухоль-ассоциированных фибробластах
(см. рисунок), можно ожидать, что, в опухолях Pan02 количество Fap-позитивных клеток значительно больше, чем в опухолях CT26. Похожая картина
наблюдается и для таких генов как Wnt2, Dpp4, Acta2, Saa3 и S100a8.
В дальнейшем анализ экспрессии исследованных в работе генов планируется использовать для характеристики отдельных популяций ОАФ, выделяемых из опухолей.

Молекулярная биология

353

СОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МОДЕЛИ (ЦГГ)N ПОВТОРАИ ЕЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИ АКТИВНОЙ ТРАНСКРИПЦИИВ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ *(CGG)N REPEAT MOLECULAR MODEL DEVELOPMENT AND STUDYIN EUCARIOTIC CELLS DURING ACTIVE TRANSCRIPTION
Я. В. Пурвиньш, И. В. Грищенко
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
Y. V. Purvinsh, I. V. Grishchenko
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
E-mail: yana.purvinsh@gmail.com
Аннотация
Синдром ломкой Х-хромосомы является экспансионным заболеванием, которое
развивается в результате экспансии (ЦГГ)n повторов в 5’- UTR гена FMR1. Это приводит к гиперметилированию промотора и прекращению экспрессии данного гена.
Вероятно, в механизм возникновения экспансии вовлечена репарация, ассоциированная с транскрипцией. Проведено исследование влияния активной транскрипциина экспансию в молекулярной модели (ЦГГ)n повтора.
Abstract
The Fragile X syndrome is repeat expansion disorders that develops as a result of the
expansion (CGG)n repeats in the 5’-UTR of the FMR1 gene. It leads to hypermethylationof the promoter and termination of the expression of this gene. Probably, the transcription-coupled repair is involved in the mechanism of expansion. Study of active transcription influence to expansion have been carried out on molecular model.

Одной из причин нестабильности генома является экспансия тринуклеотидных повторов. Данная мутация является причиной ряда нейродегенеративных заболеваний человека, таких как синдром ломкой Х-хромосомы,болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз и др. Она заключается в резком увеличении числа копий внутригенных последовательностей ДНК. Заболевания, связанные с экспансией повторов на сегодняшний
день остаются неизлечимыми, а механизм возникновения — неизвестным.
Синдром ломкой Х-хромосомы является одним из распространенных экс© Я. В. Пурвиньш, И. В. Грищенко, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ 18-34-00336.

354Раздел 3пансионных заболеваний. Его развитие обуславливается увеличением повторов (ЦГГ)n в 5’- UTR гена FMR1,что в свою очередь приводит к гиперметилированию промотора и как следствия прекращению экспрессии генаFMR1 и резкому сокращению продукции белка FMRP. Данный белок является ответственным за нормальную дифференцировку и функционирование
нейронов. Существует множество гипотез возникновения экспансии повторов, одна из них рассматривает репарацию ДНК, как основную причину.
Для аллелей гена FMR1 было показано, что уровень транскрипции значительно выше в аллелях с увеличенным повтором, что указывает на то, чторепарация, ассоциированная с транскрипцией (TCR), вероятно, является одной из причин экспансии. Данные повторы способны формировать альтернативные вторичные структуры ДНК, которые затрудняют транскрипциюи репликацию. Образование таких структур приводит к остановке движения РНК-полимеразы II, что включает механизм TCR. При этом причиной
экспансии повторов может являться проскальзывание ДНК-полимеразыв месте образования вторичных структур при TCR. Так как (ЦГГ)n-повтор
присутствует как в клетках пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы,так и в клетках здоровых людей, однако его увеличение происходит толькоу пациентов, можно предположить, что экспансия повторов обусловлена вероятными нарушениями работы системы репарации именно у пациентов.
Целью нашей работы являлось создание молекулярной модели повтора(ЦГГ)n длины, характерной для нормального аллеля гена FMR1, и исследование его экспансии при активной транскрипции в иммортализованных
В-лимфоцитах пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы с помощью
вектора, несущего соответствующую конструкцию. В ходе работы былсконструирован ДНК-вектор, содержащий встройку ЦГГ-повторов, былапроверена его работоспособность и проведена трансфекция клеточных линий иммортализованных В-лимфоцитов пациентов с синдромом ломкой
Х-хромосомы и здорового контроля, а также исследовано изменение длины
ЦГГ-повтора в векторе при активной транскрипции с течением времени.

Молекулярная биология

355

НОВЫЙ ПОДХОД К ПОИСКУ РАДИОПРОТЕКТОРОВ *A NEW APPROACH IN SEARCHING FOR RADIOPROTECTORS
Г. С. Риттер 1,2, В. П. Николин 1, Н. А. Попова 1,2,
П. Э. Кисаретова 1,2, Е. В. Долгова 1, А. С. Проскурина 1,
Е. А. Поттер 1, С. С. Кирикович 1, С. И. Байбородин 1,
О. С. Таранов 3, Я. Р. Ефремов 1,2, Н. А. Колчанов 1, С. С. Богачев 1ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр
Институт цитологии и генетики СО РАН»2ФГБОУВПО «Новосибирский национальный
исследовательский государственный университет»3ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
1

G. S. Ritter, V. P. Nikolin, N. A. Popova, P. E. Kisaretova, E. V. Dolgova,
A. S. Proskurina, E. A. Potter, S. S. Kirikovich, S. I. Bayborodin,
O. S. Taranov, Y. R. Efremov, N. A. Kolchanov, S. S. Bogachev
E-mail: labmolbiol@mail.ruАннотация
Поиск новых средств профилактики острых радиационных поражений остается
одной из актуальных научных задач современной радиобиологии. Это особенно актуально для решения проблемы защиты организма от сверхвысоких доз ионизирующего облучения. В данной работе представлен препарат с абсолютно новым механизмом радиозащитного действия, связанным с интернализацией экстраклеточных
фрагментов РНК во внутренние компартменты стволовой гемопоэтической клеткии с последующим их участием в восстановительном репарационном процессе.
Abstract
The search for new means of prevention of acute radiation injuries remains one of
the urgent scientific problems of modern radiobiology. This is especially true to solve theproblem of protecting the body from ultra-high doses of ionizing radiation. This study
presents a drug with a completely new mechanism of radioprotective action associatedwith the internalization of extracellular RNA fragments in the internal compartments of thestem hematopoietic cell and their participation in the restorative repair process.

© Г. С. Риттер, В. П. Николин, Н. А. Попова, П. Э. Кисаретова, Е. В. Долгова,А. С. Проскурина, Е. А. Поттер, С. С. Кирикович, С. И. Байбородин, О. С. Таранов,Я. Р. Ефремов, Н. А. Колчанов, С. С. Богачев, 2018.
*Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00205\18.

356Раздел 3В предварительных тестах коммерчески доступный препарат дрожжевой
РНК, показал на мышах линии CBA 100 % радиозащитный эффект при облучении летальной дозой в 9.4 Гр. Так же обнаружилось, что препарат дрожжевой РНК обладает пролонгированным радиопротекторным действием.
Так биологические тесты показали, что при облучении, проводимом через
1 час и на 4 сутки после введения препарата РНК, к 70-ым суткам наблюдения выживает 100 %, а при облучении на 8 и 12 сутки до 60 % животных.
Однако эффект не является прямолинейным, поскольку оказался неожиданным факт практически полной гибели экспериментальной группы мышей,облученных через сутки после введения препарата РНК (рис. 1).

Рис. 1. Характеристика пролонгированного радиопротекторного действия
препарата РНК, выделенной из дрожжей Saccharomyces сerevisiae, приоблучении в абсолютно летальной дозе 9.4 Гр. A) Схема экспериментаи диаграмма выживания мышей. Достоверность подсчитана с помощью
критерия хи-квадрат в программе Statistica 10 относительно контрольной
группы, * p < 0,05 ** p < 0,01. B) График выживания экспериментальных
групп. C) Животные, облученные на 4 сутки после введения
радиопротектора РНК дрожжей, через 90 суток после облучения

Молекулярная биология

357

В ходе аналитических исследований препарата суммарной РНК дрожжей обнаружилось, что в препарате суммарной РНК присутствует две четко
разграниченные фракции, одна из которых элюируется с ГАП (гидроксиапатит) как одноцепочечная РНК при элюции 0.15 М PBS. Вторая фракция элюируется в условиях, характерных для двуцепочечных нуклеиновых кислот,при 0.25 М PBS. Дальнейшие исследования этой фракции показали, что еюявляется двуцепочечная РНК (дцРНК).
Проведенные эксперименты по оценке радиопротекторного действия обеих фракций свидетельствовали, что радиопротекторные свойства характерны только для фракции, элюирующейся в 0.25 М PBS. При этом количество
вводимого препарата, необходимое для радиопротекторного действия, многократно сокращалось. Если для достижения 80–100%-го радиозащитного
эффекта на одну мышь требуется 7–10 мг препарата суммарной РНК, то дляполной защиты животного при абсолютно летальных дозах γ-облучения, хватает 160 мкг дцРНК.
Известно, что CD34+ клетки костного мозга (ККМ) представляют собой
плюри/мультпотентные стволовые гемопоэтические предшественники. Цитологическое исследование, с использованием антител к мембранному белку CD34 и меченого флюурохромом двуцепочечного РНК-зонда, подтвердило присутствие двуцепочечной РНК в этих клетках (рис. 2.). Количество
клеток, захвативших РНК-зонд оценивается в 0.01–0.025 % от общего числа

Рис. 2. Совместная локализация 36-FAM двуцепочечной РНК (FITC)и Су5 CD34 антител (Cy5) в ККМ в системе ex vivo

358Раздел 3ККМ, т. е. — порядка 5000 клеток. Несмотря на незначительный процент
таких клеток, экспериментально определенное их количество, вполне достаточно для заселения паренхимы селезенки, где в различных экспериментахпо радиопротекции детектируется до 40 селезеночных колоний (Likhacheva
et al., 2007, настоящее исследование). Было установлено, что меченый РНКзонд уже через 30 минут полностью насыщает клетку, и при этом может
находится в клетке как минимум до 7 часов. Оценка доставки в разных системах свидетельствует, что в стволовые клетки крови интернализуются недеграданты молекулы РНК, а именно молекула исходного субстрата.
Мы предполагаем, что именно спасенные стволовые гемопоэтические
клетки, мигрируя на периферию и достигнув селезенки и других лимфоидных органов, дают новый пул клеток, которые формируют новую кроветворную и иммунную систему, разрушенную в результате облучения.
Литература
1. Долгова Е. В., Николин В. П., Попова Н. А., Проскурина А. С. и др.
Интернализация экзогенной ДНК во внутренние компартменты клеток
костного мозга мышей // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2012,том 16. № 2. C. 397–414.
2. Dolgova E. V., Efremov Y. R., Orishchenko K. E., Andrushkevich O. M. et
al. Delivery and processing of exogenous double-stranded DNA in mouse CD34+
hematopoietic progenitor cells and their cell cycle changes upon combined treatment with cyclophosphamide and double-stranded DNA // Gene, 2013, vol. 528.
№ 2. P. 74–83.
3. Dolgova E. V., Potter E. A., Proskurina A. S., Minkevich A. M. et al.
Properties of internalization factors contributing to the uptake of extracellular
DNA into tumor-initiating stem cells of mouse Krebs-2 cell line // Stem cellresearch & therapy, 2016, vol. 7. № 1. P. 76.
4. Likhacheva A. S., Nikolin V. P., Popova N. A. et al. Integration of human
DNA fragments into the cell genomes of certain tissues from adult mice treatedwith cytostatic cyclophosphamide in combination with human DNA // Gene Ther
Mol Biol, 2007, vol. 11. P. 185–202.

Молекулярная биология

359

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ИММУНОГЕНОВ,НЕСУЩИХ ЭПИТОПЫ, УЗНАВАЕМЫЕ
ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ ВИЧ-1 АНТИТЕЛАМИ *INVESTIGATION OF THE ANTIGENIC PROPERTIESOF IMMUNOGENES CARRIED WITH EPITHOPES RECOGNIZEDBY BROADLY NEUTRALING HIV-1 ANTIBODIES
А. П. Рудометов 1, Н. Б. Андреева 1, Д. Н. Щербаков 1, А. Ю. Бакулина 2,
А. Н. Чикаев 3, О. Н. Каплина 1, Л. И. Карпенко 1ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
2Новосибирский государственный университет
3Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН
1

A. P. Rudometov 1, N. B. Andreeva 1, D. N. Shcherbakov 1,
A. Yu. Bakulina1, A. N. Chikaev 3, O. N. Kaplina 1, L. I. Karpenko 1
1

FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, Russia
2
Novosibirsk State University, Russia
3
IMCB SB RAS, RussiaАннотация
Несмотря на то, что вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является одним из наиболее хорошо изученных вирусов, пока не удалось разработать
эффективную вакцину против ВИЧ-1. В настоящее время доминирующим направлением является разработка иммуногенов, направленных на индукцию антител,способных нейтрализовать широкий спектр изолятов ВИЧ-1 (broadly neutralizing
antibodies, bNAbs). В данной работе представлены результаты исследований по конструированию и изучению антигенных и иммуногенных свойств ВИЧ-иммуногенов,несущих эпитопы, узнаваемые bNAbs 2F5, 4E10, 10Е8 и VRC01. Иммуногены былиполучены на основе 3-х белков-носителей: искусственного полиэпитопного белка
TBI, корового белка вируса гепатита В (НВсАg) и белка YkuJ Bacillus subtilis.
Abstract
In spite of the fact that the human immunodeficiency virus type I (HIV-1) is one of
the most well-studied viruses, it has not yet been possible to develop an effective vaccine© А. П. Рудометов, Н. Б. Андреева, Д. Н. Щербаков, А. Ю. Бакулина, А. Н. Чикаев,О. Н. Каплина, Л. И. Карпенко, 2018.
*Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и Субъекта РФНовосибирской области в рамках научного проекта № 18-44-543017 и при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-34-00314.

360Раздел 3

against HIV-1. Currently, the dominant trend is the development of immunogens aimed
at inducing antibodies capable of neutralizing a wide spectrum of HIV-1 isolates (broadly
neutralizing antibodies, bNAbs). This paper presents the results of studies on the designand study of the antigenic and immunogenic properties of HIV-immunogens carrying epitopes recognized by bNAbs 2F5, 4E10, 10E8 and VRC01. Immunogens were obtainedon the basis of 3 carrier proteins: an artificial polyepitope protein TBI, a hepatitis B coreprotein (HBcAg), and a YkuJ protein Bacillus subtilis.

Решением проблемы распространения ВИЧ-инфекции может стать применение эффективной профилактической вакцины. К сожалению, в результате высокой генетической и, как следствие, антигенной вариабельности
ВИЧ-1, до сих пор не удалось создать иммуноген, способный индуцировать
формирование протективного иммунного ответа против широкого разнообразия генетических вариантов вируса. Надежду на появление эффективной вакцины дало открытие антител, обладающих вируснейтрализующей
активностью, в отношение широкого разнообразия изолятов ВИЧ-1. Их особенность заключается в том, что они взаимодействуют с консервативными
участками, что обеспечивает им способность связывать и нейтрализовать
большое количество разнообразных штаммов вируса. Однако создать иммуноген способный индуцировать такие антитела пока не удалось. Сейчасвсе больше исследователей приходит к выводу о том, что вакцина должна
состоять из нескольких различных иммуногенов. Собственно, вакцина RV
144, показавшая частичную эффективность в клинических испытаниях, также содержит несколько иммуногенов. Вполне вероятно, что эффективной
вакциной окажется комбинация иммуногенов, основанных на разных стратегиях их дизайна.
Целью данной работы является конструирование и изучение свойств
ВИЧ-иммуногенов, несущих эпитопы, узнаваемые широконейтрализующими ВИЧ-1 антителами, с использованием в качестве носителей белков TBI,
НВсАg и YkuJ.
В данной работе были выбраны два наиболее важных и хорошо охарактеризованных региона ВИЧ-1: регион gp41 мембранно-проксимальной наружной области (MPER, от англ. membrane-proximal external region) которая
играет важную роль в процессе слияния вируса с клеткой-мишенью и содержит линейные эпитопы широконейтрализующих антител, таких как 2F5,
4E10 и 10Е8; и сайт связывания вируса с клеточным рецептором CD4 гликопротеина gp120 ВИЧ-1 (CD4bs), несущий конформационный эпитоп, узнаваемый bNAbs VRC01. В качестве белков-носителей (скаффолдов) эпитопов, узнаваемых bNAbs, были выбраны три молекулы: белок TBI, НВсАgи белок YkuJ.

Молекулярная биология

361

Сконструирован иммуноген nTBI, содержащий линейные эпитопы, узнаваемые bNAbs 10E8, 4E10, 2F5, а также линейный миметик конформационного эпитопа bNAb VRC01. Показано, что, находясь в составе белка
nTBI, линейные эпитопы 4Е10, 10E8 и 2F5 сохраняют свои антигенные
свойства. Установлено, что имитатор конформационного эпитопа антитела
VRC01 при переносе из белка PIII бактериофага М13 теряет антигенные
свойства в составе белка nTBI. При иммунизации кроликов nTBI индуцирует образование антител, способных нейтрализовать ряд псевдотипированных штаммов ВИЧ-1.
Также получен химерный белок НВсAg-mimicVRC01, экспонирующий
линейный пептид-имитатор конформационного эпитопа, узнаваемого bNAb
VRC01. Показано, что химерный белок НВсAg-mimicVRC01 образует частицы подобные нативному коровому белку. Установлено, что сыворотки
иммунизированных животных обладают вируснейтрализующей активностью в отношении рекомбинантного ВИЧ-1 92BR025.
Получен искусственный белок MPER-TBI. Установлено, что участки региона MPER ВИЧ-1 в составе химерного белка MPER-TBI, сохраняют альфа спиральную структуру и узнаются МКА к эпитопам входящим в данный
регион.
Обосновано и практически реализовано использование белка B. subtilis
YkuJ в качестве носителя региона MPER ВИЧ-1. Показано что химерный
белок YkuJ-MPER обеспечивает в организме лабораторных животных выработку специфичных антител к соответствующему региону ВИЧ-1.
В заключении следует отметить, что все полученные в результате проделанной работы иммуногены обладают специфической антигенностьюи иммуногенностью в отношении ВИЧ-1. Полученные данные могут способствовать усовершенствованию методов дизайна искусственных полиэпитопных иммуногенов для индукции ВИЧ-специфического В-клеточного
ответа, а также могут быть использованы в стратегиях иммунизаций направленных на индукцию bNAbs.

Раздел 3362ВЛИЯНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МЕМБРАННЫХ ЧАСТИЦ КРОВИ
ЧЕЛОВЕКА — ЭКЗСОМ И МИКРОВЕЗИКУЛНА КЛЕТКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ А549 *THE INFLUENCE OF HUMAN BLOOD PLASMA MEMBRANE-COVEREDVESICLES — EXOSOMES AND MICROPARTICLESON LUNG ADENOCARCINOMA CELLS A549
Ю. И. Савиновская , А. В. Савельева, А. А. Нуштаева,В. В. Морозова, Е. В. Кулигина, В. А. Рихтер, Д. В. Семенов
Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Россия, г. Новосибирск
E-mail: yulya_savinovskaya@mail.ru
Y. I. Savinovskaya, A. V. Savelyeva, A. A. Nushtaeva, V. V. Morozovа,E. V. Kuligina, V. A. Richter, D. V. Semenov
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branchof Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, RussiaАннотация
Получены препараты мембранных частиц крови здоровых доноров. Методом
высокоэффективного секвенирования РНК на платформе Illumina HiSeq 1500 исследовано изменение экспрессии генов в клетках аденокарциномы легких А549 поддействием мембранных частиц крови человека.
Abstract
Purified preparations of membrane particles of healthy human blood were obtained.
By method of high-throughput RNA sequencing on the Illumina HiSeq 1500 platform wasstudy the alterations in gene expression of human lungs adenocarcinoma A549 cells under
the influence of human blood membrane particles.

В настоящее время в крови человека, а также в других биологических
жидкостях человека выявлено несколько типов внеклеточных везикул, основными из которых являются экзосомы, микровезикулы и апоптотиче© Ю. И. Савиновская, А. В. Савельева, А. А. Нуштаева, В. В. Морозов, Е. В. Кулигина, В. А. Рихтер, Д. В. Семенов, 2018.
*Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 16-04-01457.

Молекулярная биология

363

ские тельца. Экзосомы и микровезикулы — мембранные везикулы диаметром 30–100 нм (экзосомы) и 50–2000 нм (микровезикулы), секретируемыев межклеточное пространство жизнеспособными клетками тканей и органов. Внеклеточные везикулы содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты — РНК, ДНК. Мембранные частицы являются не только трофическими
факторами, но и активными переносчиками сигналов межклеточной коммуникации и участвуют в регуляции процессов иммунного ответа, секреции
белков. Разнообразие структурных компонентов и содержимого циркулирующих мембранных частиц отражает специфичные признаки отдельных
клеток, процессов и состояний. Анализ изменений состава и свойств циркулирующих частиц крови является одним из самых активно-развивающихся
направлений поиска новых диагностических и прогностических маркеров
онкологических, инфекционных, сосудистых и других патологий человека.
Предложен целый ряд стратегий использования потенциала мембранных
частиц для доставки терапевтических соединений, в том числе и синтетических аналогов микроРНК, в клетки-мишени для разработки новых средств
терапии заболеваний человека.
Целью данной работы является анализ влияния мембранных микро- и наночастиц крови здоровых доноров на жизнеспособность и пролиферацию
клеток аденокарциномы легких человека линии А549.
Для выделения и очистки мембранных микро- и наночастиц крови человека мы использовали метод последовательного центрифугирования при
1 200g, 16 000g и 3 этапа ультрацентрифугирования при160 000 g. Былоустановлено, что препараты мембранных частиц крови здоровых доноров не вызывают апоптотических изменений в клетках A549 и повышают
жизнеспособность клеток и клеточную метаболическую активность (МТТтест). Методом проточной цитофлуориметрии установлено, что мембранные частицы крови не вызывают апоптотических изменений мембран клеток А549 и не оказывают существенного влияния на пролиферацию.
С использованием метода высокоэффективного секвенирования проведен детальный анализ изменений транскриптома клеток аденокарциномы
А549 под действием мембранных частиц крови человека. Для этого проводили выделение polyA РНК из контрольных клеток и клеток, инкубированных в среде с мембранными частицами крови, конструировали кДНК-библиотеки и секвенировали ДНК на станции Illumina HiSeq 1500.
При дифференциальном анализе экспрессии генов в клетках A549 былоустановлено, что мембранные частицы крови здоровых доноров приводят в течение 6 часов к изменению экспрессии генов из групп сигнальных
каскадов цитокинов, а также генов, контролируемых транскрипционным
фактором NF-kappa-B. Инкубация клеток А549 с мембранными частицами

364

Раздел 3в течение 12 и 24 ч приводит к изменениям экспрессии тех же групп генов,которые выявлены для 6 ч инкубации, а также генов регуляции апототического каскада, метаболических процессов, генов белков эндоплазматического ретикулума, мембран эндосом и внеклеточных везикул.
Полученные данные позволяют заключить, что мембранные частицы
крови взаимодействуя с клетками A549 на начальном этапе (6 ч), активируют NF-kappa-B сигнальные каскады, которые в дальнейшем вызывают масштабные изменения экспрессии генов контроля апототических процессови генов формирования секреторных мембранных везикул.
Результаты могут быть использованы для создания новых средств диагностики и терапии заболеваний с использованием мембранных структур —экзосом и микровезикул крови человека.

Молекулярная биология

365ПРОТЕАЗЫ ЭКЗОСОМ КРОВИ ПРИ РАКЕМОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ *EXOSOMAL PROTEASES IN BREAST CANCER
А. К. Сомов 1, Е. А. Тугутова 2,3, К. В. Проскура 1,4, С. Н. Тамкович 1,4,
Н. В. Юнусова 2,3, М. Н. Стахеева 2, П. П. Лактионов 1,6Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН2НИИ онкологии ТНИМЦ РАН,3Сибирский государственный медицинский университет,4Новосибирский областной онкологический диспансер,5Новосибирский государственный университет,6Новосибирский научно-исследовательский институт патологии
кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина
1Аннотация
Показано, что экзосомы опухолевого происхождения участвуют в формировании
приметастатической ниши, увеличивают инвазивный потенциал клеток, усиливают
ангиогенез и экспрессию клетками проангиогенных факторов. Целью исследования
было оценка уровня тетраспанин-ассоциированных (ADAM-10) и тетраспанин-неассоциированных (20S протеасом) протеаз в экзосомах в крови при развитии ракамолочной железы. Экзосомы были выделены и охарактеризованы в соответствиис рекомендациями Сообщества Внеклеточных Везикул (Extracellular Vesicle Society).
Уровень экспрессии 20S протеасом и ADAM-10 в экзосомах определяли методами
вестерн-блот анализа и проточной цитофлуориметрии, соответственно. Уровень экспрессии ADAM-10 в субпопуляции CD9-позитивных экзосом и уровень 20S протеасом достоверно повышены в экзосомах из культуральной среды MCF-7 и плазме
крови онкологических больных по сравнению с экзосомами из культуральной среды
HUVEC и экзосомами из плазмы крови здоровых женщин. Полученные данные подтверждают роль экзосомальных протеаз в прогрессировании опухоли.
Abstract
As is known, exosomes play an important role in promoting progression of cancers
by increasing its invasive potential. The aim of this study was to evaluate the levels of
tetraspanine-associated (ADAM-10) and tetraspanine-nonassociated proteases (20S proteasomes) in exosomes in the blood in the breast cancer development. Exosomes were
© А. К. Сомов, Е. А. Тугутова, К. В. Проскура, С. Н. Тамкович, Н. В. Юнусова,М. Н. Стахеева, П. П. Лактионов, 2018.
*Исследование выполнено при поддержке РФФИ и Правительства Новосибирской области в рамках научного проекта №18-415-540012.

366

Раздел 3

isolated and characterized in accordance with the recommendations of the Extracellular
Vesicles Society. The expression level of 20S proteasomes and ADAM-10 in exosomes
determined methods of Western blot analysis and flow cytometry, respectively. The levelof expression of ADAM-10 in the subpopulation of CD9-positive exosomes and the 20Slevel of proteasomes are significantly increased in exosomes from MCF-7 culture medium
and blood plasma of cancer patients compared to exosomes from HUVEC medium andblood plasma exosomes of healthy women. Obtained data confirm role of exosomal proteases in tumor progression.

Актуальность
Несмотря на активное распространение маммографии, доля первично
выявленных больных раком молочной железы (РМЖ) на поздней стадии
заболевания остается высокой (1). Для повышения эффективности ранней
диагностики онкологических заболеваний и выявления новых терапевтических стратегий, актуальной задачей является изучение механизмов метастазирования опухолей.
Экзосомы секретируемые раковыми клетками влияют как на развитие
первичной опухоли, так и на развитие удалённых метастазов путем горизонтального переноса РНК и белков (2, 3). Известно, что в состав экзосом входят протеазы. Ранее ADAM-10 и 20S-протеасомы были обнаружены в составе экзосом из мезенхимальных стволовых клеток (4) и эндотелиальных
клетках (5). Однако уровень этих ферментов в экзосомах биологических
жидкостей онкологических больных остается неясным.
Материалы и методыВ исследование были включены препараты экзосом из культуральной
среды MCF-7 и плазмы крови здоровых женщин (n=30), больных мастопатией (n=28) и больных РМЖ (n=32) путем ультрафильтрации с последующим ультрацентрифугированием (6). Экзосомальную природу везикул
подтверждали проточной цитофлуориметрией на латексных частицах с использованием антител против CD9, CD24, CD63 и CD81 (BD Biosciences).
Для количественного белкового анализа использовали коммерческий набор NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen). Уровень экспрессии
ADAM-10 и 20S протеасом в экзосомах определяли методами проточной
цитофлуориметрии и вестерн-блот анализа соответственно.
Результаты
Субпопуляционная представленность экзосом в образцах из среды культуры карциномы молочной железы MCF-7, плазмы крови здоровых женщин и плазмы крови больных РМЖ оказалась сходной: CD24/CD9 > CD9/
CD81 > CD24/CD63 > CD9/CD63. Медианы концентраций экзосомальных

367

Молекулярная биология

белков в плазме крови у здоровых доноров, больных мастопатией и больных РМЖ составили 14.5, 12.2, 14.2 мкг/мл соответственно. Методом проточной цитофлуориметрии в препаратах экзосом плазмы больных РМЖи экзосомах культуральной среды клеток MCF-7 показано достоверное повышение уровня экспрессии поверхностной формы ADAM-10 в CD-9 позитивной субпопуляции экзосом по сравнению с образцами экзосом изплазмы здоровых доноров (в 1,8 и 1,9 раз, соответственно) (см. таблицу).
Оценка представленности CD9, CD24 и CD81на поверхности ADAM-10 позитивных экзосомиз культуральной среды MCF-7 и плазмы крови
здоровых доноров и онкологических больных
Источник экзосом
Здоровые женщины
Плазма
Больные мастопатией
Плазма
Больные РМЖПлазма
MCF-7
Среда

CD9+
844±99–1531±162*1607±128*CD24+884±1241031±155926±94887±67CD81+621±84–696±68597±48Примечание.* — значимые отклонения по сравнению с здоровыми донорами.
Представлен уровень интенсивности медианы флуорисценции (MFI) ± SEM.

Уровень 20S протеасом в составе экзосом из культуральной среды
клеток MCF-7 (А) и из плазмы пациентов с РМЖи мастопатией по сравнению со здоровыми женщинами (Б)

368Раздел 3С помощью вестерн-блот анализа было показано, что уровень экспрессии 20S протеасом достоверно повышен в экзосомах из культуральной среды MCF-7 и в экзосомах из плазмы крови больных мастопатией и РМЖ(1,25±0,08, 1,81±0,34 и 2,28±0,46 усл ед, соответственно) по сравнениюс препаратами экзосом из культуры клеток HUVEC, а так же плазмы здоровых доноров.
Выводы
Cубпопуляционный состав экзосом из культуральной среды и плазмы
крови здоровых женщин и больных с мастопатией и больных РМЖ сходен,однако содержание в них тетраспанин-ассоциированных и тетраспанин-неассоциированных протеаз различно. Выявленное перераспределение экзосомальных протеаз в субпопуляциях экзосом в норме и при заболеваниях
молочной железы может указывать на различные механизмы сортировки
биологически активных молекул в везикулы, большинство из которых неясны. Ожидается, что понимание роли различных субпопуляций экзосомв опухолевом микроокружении и формировании метастатических ниш приведет к развитию опухолеспецифической терапии.
Литература
1. Witten M, Parker CC (2018). Screening Mammography: Recommendations andControversies. Surg Clin North Am, 98(4), 667–75.
2. Bryzgunova OE, Zaripov MM, Skvortsova TE, et al (2016). Comparative study of
extracellular vesicles from the urine of healthy individuals and prostate cancer patients,
PLoS One, 11, e0157566.
3. Li W, Li C, Zhou T, et al (2017). Role of exosomal proteins in cancer diagnosis. Mol
Cancer, 16(1), 145.
4. Lai RC, Tan SS, Teh BJ, et al (2012). Proteolytic potential of the MSC exosome
proteome: implications for an exosome-mediated delivery of therapeutic proteasome.
J Proteomics, 12, 971907.
5. Dieudé M, Bell C, Turgeon J, et al (2015). The 20S proteasome core, active
within apoptotic exosome-like vesicles, induces autoantibody production and accelerates
rejection. Sci Transl Med, 7(318), 318ra200.
6. Grigor’eva AE, Dyrkheeva NS, Bryzgunova OE, et al (2017). Contamination of
exosome preparations, isolated from biological fluids. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B,
11, 265.

Молекулярная биология

369

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ДНК-ВАКЦИННЫХ КОНСТРУКЦИЙ, КОДИРУЮЩИХ
КОНСЕРВАТИВНЫЕ ФРАГМЕНТЫ СТЕБЛЯ
ГЕМАГГЛЮТИНИНА И БЕЛОК М2 ВИРУСА ГРИППАSTUDY THE SPECIFIC ACTIVITY OF DNA VACCINE CONSTRUCTS
ENCODING THE CONSERVATIVE FRAGMENTS OF HEMAGGLUTININ
AND M2 PROTEIN FROM INFLUENZA VIRUS
Е. В. Старостина, С. А. Федотова, С. Г. Дудко, Д. В. Антонец,О. Н. Каплина, Л. И. Карпенко, С. И. Бажан *ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия
E. V. Starostina, S. A. Fedotova, S. G. Dudko, D. V. Antonets,
O. N. Kaplina, L. I. Karpenko, S. I. Bazhan
FBRI SRC VB «Vector», Rospotrebnadzor, RussiaАннотацияВ данной работе представлены результаты исследования Т-клеточного иммунного ответа у мышей, иммунизированных ДНК-вакцинными конструкциями спроектированных с использованием консервативных фрагментов стебля гемагглютининаи белка М2 вируса гриппа. Показано, что ДНК-вакцинные конструкции при совместной иммунизации животных, обладают способностью индуцировать Т-клеточный
иммунный ответ, специфичный в отношении вируса гриппа.
Abstract
This paper presents the results of the study of T-cell immune response in mice immunized with DNA vaccines, containing conservative fragments of hemagglutinin andM2 protein from influenza virus. It has been shown that DNA vaccine constructs encoding artificial influenza virus antigens induced specific T-cell immune response to the
influenza virus.

Грипп — одно из самых распространенных заболеваний верхних дыхательных путей, возбудитель которого — вирус гриппа. Ежегодно во время
эпидемий от данного заболевания погибают от 250 до 500 тыс. человек. Наданный момент для профилактики гриппа используется следующий подход:на основе эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа создаются
*© Е. В. Старостина, С. А. Федотова, С. Г. Дудко, Д. В. Антонец, О. Н. Каплина,Л. И. Карпенко, С. И. Бажан, 2018.

370Раздел 3вакцины, которые могут содержать аттенуированный или же инактивированный возбудитель заболевания. Проблемой этого метода является высокая изменчивость вируса гриппа, вследствие чего возникают трудностив предсказании актуальных штаммов. Создание универсальной гриппозной
вакцины – сложная научная проблема, требующая новых решений. Однимиз подходов, нацеленных на решение этой проблемы, является создание
вакцин, кодирующих консервативные антигены вируса гриппа. Во ФБУНГНЦ ВБ «Вектор» были созданы кандидатные универсальные ДНК-вакцины, кодирующие консервативные антигены. Два из них сконструированные,AgH1 и AgH3, спроектированы на основе консервативных фрагментов стебля гемагглютинина разных субтипов вируса гриппа (H1N1 и H3N2, соответственно), а третий иммуноген AgM2 — на основе консервативного вирусного белка М2.
Цель данной работы — оценка Т-клеточного иммунного ответа у животных, иммунизированных ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими
спроектированные антигены вируса гриппа. Для иммунизации использовались мыши BALB/c, самки весом 16–18 г. Все животные были разбиты натри группы: (1) мыши, иммунизированные смесью трех ДНК-вакцин (AgH1,
AgH3 и AgM2); (2) мыши, иммунизированные плазмидным вектором pcDNA
3.1, не несущим целевых генов (отрицательный контроль) и (3) мыши, иммунизированные вирусом гриппа (штамм A/California/4/2009 (H1N1pdm09) —положительный контроль). Иммунизация проводилась внутримышечно
трёхкратно с интервалом две недели (доза 100 мкг ДНК на мышь). Для оценки иммунного ответа использовали два метода: внутриклеточное окрашивание цитокинов и IFN-γ ELISpot, которые позволяют оценивать количество
CD4+ и cD8+Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ. От иммунизированных
мышей забирали селезёнки, из которых выделяли спленоциты и стимулировали их синтетическими пептидами, соответствующих эпитопам, входящихв состав спроектированных иммуногенов. Число клеток, секретирующих
IFN-γ на 106 клеток селезенки, регистрировали после того, как клетки селезенки были проинкубированы в присутствии пептидов или же в отсутствие пептидов (спонтанный выброс цитокинов). Достоверным результатом
считали соотношение количества цитокинов после стимуляции пептидамик количеству цитокинов, не стимулированных пептидами, равное и более
2. Данные полученные с помощью метода ELISpot показали, что в группе,иммунизированной суммарными ДНК-вакцинами, наблюдался достоверно
значимый иммунный ответ. Измерение процента клеток, синтезирующих
цитокины IFN-γ и IL-2, проводилось с использованием проточного цитофлуориметра FACSCalibur.

Молекулярная биология

371

Полученные результаты показали, что спроектированные вакцинные
конструкции индуцируют ответ CD8+ Т-лимфоцитов, продуцирующих как
IFN-γ, так и IL-2. Количество Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ, измеренное с помощью метода ELISpot коррелирует с результатами измерений
процента цитотоксических T-лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ, полученными с помощью метода внутриклеточного окрашивания цитокинов.
Таким образом, полученные результаты показами, что ДНК-вакцинные
конструкции, кодирующие искусственные антигены вируса гриппа, обладают способностью индуцировать Т-клеточный иммунный ответ, специфичный в отношении вируса гриппа.

Раздел 3372ПОИСК МУТАЦИЙ В ГЕНАХ LEP И MC4R
У ПАЦИЕНТОВ С МОРБИДНЫМ ОЖИРЕНИЕМ *SEARCH OF MUTATIONS IN THE GENES LEP AND MC4R
IN PATIENTS WITH MORBID OBESITY
К. В. Субботина
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАННовосибирский государственный университет
K. V. Subbotina
Institute of chemical biology and fundamental medicine
Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
Novosibirsk State UniversityАннотация
Ожирение является глобальной проблемой. Официальная статистика ВОЗ насчитывает около 1,9 млрд. человек в мире с избыточным весом. Нами было проведено
исследование по поиску мутаций в генах, ответственных за появление избыточной
массы тела (LEP, LEPR, POMC, PCSK1 и MC4R), у пациентов, страдающих ожирением в Новосибирской области, (НСО) с помощью современных молекулярно-генетических методов.
Abstract
Obesity is a global problem. According to official statistics about 1,9 billion people in
the world are overweight. We conducted a study to search for mutations in genes responsible for the emergence of overweight (LEP, LEPR, POMC, PCSK1 and MC4R) in patients
suffering from obesity in the Novosibirsk region with the help of modern molecular-genetic methods.

Введение
Ожирением называют хроническое заболевание, которое характеризуется увеличением массы тела и связано с нарушением обмена веществ. Генетика играет фундаментальную роль в развитии ожирения. Гены лептин-меланокортиновой системы (LEP, LEPR, POMC, PCSK1 и MC4R), участвующей в контроле аппетита, являются одним из ключевых звеньев регуляции
© К. В. Субботина, 2018.
*Научный руководитель — канд. биол. наук, доцент Е. Н. Воронина.

373

Молекулярная биология

обмена веществ. Целью нашей работы является анализ данных о наличии
мутаций в вышеуказанных генах, а также дальнейший поиск мутаций в генах LEP и MC4R у жителей НСО с индексом массы тела (ИМТ) выше нормы
(т. е. выше 18.5–25).
Материалы и методыВ источнике NCBI были найдены и изучены более 35 научных публикаций о ранее обнаруженных мутациях в таких генах, как LEP, MC4R, РОМС,PSCK1, LEPR.
С помощью ПЦР и дальнейшего секвенирования были исследованы
ДНК 50 людей. Среднее значение ИМТ пациентов равнялось 48. Были отобраны пациенты, имеющие высокую степень ожирения с ИМТ в пределах
45–60. Среди пациентов соотношение полов было следующим: 38 женщин
и 12 мужчин. Также нами было проведено сравнение полученных данныхс контрольными ДНК 50 людей, которые не страдают ожирением.
РезультатыВ ходе проведённого анализа были собраны данные о количестве найденных мутаций на основании изученных нами статей (см. таблицу).
Число мутаций в генах ожирения
Ген
LEP
MC4R

РОМС
PSCK1
LEPR

Мутации,кол-во
1
1
4
3
2
1
1
1
3

Число
Контрольное
пациентов число пациентов
35
475
77
268
77
250
126
105
535

100
–*
177
–*
–*
225
75
55
–*

Страна

ГодАвторстатьи

КитайПакистан
Италия
Словакия
Испания
Пакистан
Франция
Франция
Франция

2014
2016
2016
2015
2012
2015
2014
2015
2015

Yue ZhaoShabana
B. Paolin
Stanikova
S.Granell
Shabana
Philippe J
Philippe J
H. HuvenneПримечание. * В некоторых статьях отсутствовала информация о контролях.

Как видно из таблицы, число найденных мутаций в генах слишком мало(до 5.19 % от числа пациентов, которые участвовали в исследованиях). ГеныLEP и MC4R были выбраны нами для работы из-за частой встречаемостив них мутаций по сравнению с генами РОМС, PSCK1, LEPR.

374Раздел 3В результате практической части работы нами не было обнаружено мутаций в генах LEP и MC4R. Результат может быть связан с тем, что либоу данных людей к развитию ожирения привели мутации в других генах
(LEPR, POMC, PCSK1), либо основными причинами являются факторы
окружающей среды (такие как отсутствие физических нагрузок и несбалансированное высококалорийное питание).
В процессе анализа было обнаружено, что некоторые гены отвечают и задругие заболевания (мутация в гене PCSK1 приводит не только к ожирению,но и к значительной абсорбционной дисфункции тонкой кишки, а мутациив генах LEP и LEPR могут привести к плоскоклеточному раку пищевода).
Поэтому, мы также планируем провести исследование по поиску мутаций,ответственных за другие, отличные от ожирения, заболевания.

Молекулярная биология

375

ГИБЕЛЬ КЛЕТОК В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕИ СЕТЧАТКЕ КРЫС OXYS НА СТАДИИ,ПРЕДШЕCТВУЮЩЕЙ
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫМ ИЗМЕНЕНИЯМ *CELL DEATH IN PREFRONTAL CORTEX AND RETINAOF OXYS RATS IN THE PRECEDING STAGE
OF NEURODEGENERATION
Г. К. Суворов, О. С. Кожевникова, Д. В. ТелегинаФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
G. K. Suvorov, O. S. Kozhevnikova, D. V. Telegina
Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, Novosibirsk, RussiaАннотацияВ работе исследованы общие молекулярные механизмы апоптоза и аутофагии наранней доклинической стадии развития болезни Альцгеймера (БА) и возрастной макулярной дегенерации (ВМД) — неизлечимых нейродегенеративных заболеваний,сходство патогенеза которых в последнее время активно обсуждается. Исследование
проведено на линии преждевременно стареющих крыс OXYS, у которых развиваются признаки болезни Альцгеймера и ретинопатия, аналогичная ВМД у людей. Показано, что на доклинической стадии болезни (возраст 20 дней) проявлениям признаков БА и ВМД у крыс OXYS предшествует уси­ление апоптоза.
Abstract
The research studied the common molecular mechanisms of apoptosis and autophagy
during early preclinical stages of Alzheimer disease and age-related macular degeneration(AMD) — incurable neurodegenerative diseases, whose similarity of pathogenesis currently being actively discussed. In this study, we used a senescence-accelerated OXYS rat
which develop the clinical signs of Alzheimer disease and AMD-like retinopathy. We havefound that OXYS rats characterized by increasing of apoptosis at preclinical stages of thediseases (age of 20 days).

Возраст является общим фактором риска для болезни Альцгеймера (БА)и возрастной макулярной дегенерации (ВМД), заболеваемость которыми
растет по мере увеличения продолжительности жизни населения развитых
стран. Эффективных способов профилактики и лечения БА — самой рас© Г. К. Суворов, О. С. Кожевникова, Д. В. Телегина, 2018.
*Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 18-315-00216.

376Раздел 3пространенной прогрессирующей сенильной деменции, и ВМД, которая
становится основной причиной потери зрения людьми старше 60 лет, нет.
Популяционные исследования выявили высокую частоту когнитивных нарушений у больных ВМД, и, напротив, патологические изменения глазногодна у большинства больных БА (Nolan et al., 2014; Keenan et al., 2014; Frostet al., 2016). Перекрываются факторы риска (курение, гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз, ожирение, неправильное питание) и механизмы патогенеза БА и ВМД, среди которых усиленный окислительный
стресс, воспаление, нарушения протеосомной, лизосомальных и митохондриальных функций, нарушение агрегации белков и накопление амилоида
бета в аномальных внеклеточных отложениях — сенильных бляшках в мозге у пациентов с БА, и в друзах больных ВМД приводят к усиленной гибели
нейронов (Sivak, 2013). Тем не менее, молекулярные механизмы гибели клеток как при БА, так и при ВМД, особенно на ранних, доклинических этапах
развития болезней, остаются неясными, что затрудняет поиск эффективной
лекарственной терапии. В последнее время накапливаются данные о том,что при развитии БА и ВМД решающее значение может иметь нарушение
процессов апоптоза и аутофагии, приводящих к нарушению процесса деградации нефункционирующих органелл и преждевременной гибель нейронов.
В работе использована линию крыс OXYS (ИЦиГ СО РАН) — уникальная модель преждевременного старения, проявлением которого становится развитие аналогичной ВМД ретинопатии и ускоренного старения мозгас характерными для болезни Альцгеймера признаками (Stefanova et al., 2014;
Kolosova et al., 2014). Нейродегенеративные процессы в сетчатке и мозге
развиваются у крыс OXYS параллельно, сопряжены с усиленным накоплением бета амилоида, что предполагает общие механизмы их развития. Цельнастоящего исследования — выявление общих молекулярных механизмов
гибели клеток на этапе предшествующему развитию нейродегенеративных
изменений в мозге и сетчатке крыс OXYS. В работе использовали крысВистар (контроль) и OXYS в возрасте 20 дней — доклинический период
развития признаков БА и ретинопатии.
Исследование активности процессов апоптоза в префронтальной кореи сетчатке крыс Вистар и OXYS проводили с помощью TUNEL окрашивания,используя DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega) согласно предложенному протоколу. В префронтальной коре крыс оценивали общее количество апоптозных клеток (TUNEL+ клетки) и количество апоптозных нейронов (колокализованные TUNEL+ и NeuN+ клетки) в поле зрения (рис. 1).
Принципиально важно, что в возрасте 20 дней — период окончания
созревания мозга, как в сетчатке, так и префронтальной коре крыс OXYSколичество TUNEL+ клеток на 30 % выше, чем у крыс Вистар. При этомМолекулярная биология

377

в префронтальной коре количество апоптозных нейронов у крыс OXYS также достоверно выше, чем у крыс Вистар (F1, 22=5,92, p<0,05).

Пример окрашивания срезов мозга крыс OXYS методом TUNEL(зеленый), и его колокализация с маркером зрелых нейронов NeuN(красный), ядра окрашены DAPI (синий). Бар 20 мкмОценка изменений с возрастом содержания белков, участвующих в регуляции аутофагии (Atg7, связанной формы Atg12, LC3 A/B) в префронтальной
коре и сетчатке 20-дневных крыс OXYS и Вистар была выполнена методом
Вестерн-блот анализа и иммуногистохимии. Как показал ANOVA-анализ,в префронтальной коре уровень Atg7 и Atg12 не зависел от генотипа. Сравнение групповых средних выявило достоверные межлинейные различия в префронтальной коре только в базальном уровне LC3 A/B — его снижение у крысOXYS (p<0.01), свидетельствующее об снижении у них уровня аутофагии.
Иммуногистохимическое исследование показало, что в префронтальной корекрыс обеих линий в возрасте 20 дней сигнал белка LC3 A/B детектируетсяв основном в глиальных клетках, были выявлялись только отдельные нейроны, содержащие LC3, не более 5 % от общего числа нейронов.
Иммуноокрашивание антителами к белку-маркеру аутофагосом
LC3A/B криосрезов сетчатки показало слабое диффузное окрашиваниево всех слоях сетчатки 20–дневных крыс обеих линий. Анализ результатов иммуногистохимического окрашивания криосрезов сетчатки показал,что сигнал Atg7 детектируется преимущественно во внутреннем сетчатоми ганглионарном слоях сетчатки крыс обеих линий. Сигналы Atg12 локализовались преимущественно в слое фоторецепторных нейронов и на уровне наружных сегментов фоторецепторов. В других слоях интенсивность
свечения Atg12 была слабее. Межлинейных различий по интенсивности
сигналов Atg7 и Atg12 в возрасте 20 дней не обнаружено. Вестерн-блотанализ также не выявил достоверных межлинейных различий в уровне
белков Atg7 и Atg12 в сетчатке крыс Вистар и OXYS (p<0.05).
Таким образом, проявлениям признаков БА и ВМД у крыс OXYS предшествует усиление апоптоза. К возрасту 20 дней завершается период постна­тального развития головного мозга крысы, связанный с коррекцией ошибок

378

Раздел 3и необходимым для оптимизации нейронных сетей устранением «переходных» клеточных популяций путем апоптоза. Возможно, повышенная посравнению с крысами Вистар активность процессов апоптоза у крыс OXYSсвязана с нарушением созревания мозга и отставанием формирования синаптической пластичности в период раннего постнатального онтогенеза.
Литература
1. Frost S. et al. Alzheimer’s disease and the early signs of age-related maculardegeneration //Current Alzheimer Research. — 2016. — Т. 13. — №. 11. — С. 1259–1266.
2. Nolan J. M. et al. Macular pigment, visual function, and macular disease among
subjects with Alzheimer’s disease: an exploratory study // Journal of Alzheimer’s
Disease. — 2014. — Т. 42. — №. 4. — С. 1191–1202.
3. Keenan T. D. L., Goldacre R., Goldacre M. J. Associations between age-related
macular degeneration, Alzheimer disease, and dementia: record linkage study of hospital
admissions //JAMA ophthalmology. — 2014. — Т. 132. — №. 1. — С. 63–68.
4. Sivak J. M. The aging eye: common degenerative mechanisms between the
Alzheimer’s brain and retinal disease //Investigative ophthalmology & visual science. —2013. — Т. 54. — №. 1. — С. 871–880.
5. Stefanova N. et al. Senescence-accelerated OXYS rats: a model of age-related
cognitive decline with relevance to abnormalities in Alzheimer disease //Cell cycle. —2014. — Т. 13. — №. 6. — С. 898–909.
6. Kolosova N. G. et al. Senescence-accelerated OXYS rats: A genetic model ofpremature aging and age-related diseases //Advances in Gerontology. — 2014. — Т. 4. —№. 4. — С. 294–298.

Молекулярная биология

379

РОЛЬ БЕЛКОВ АР-1 КОМПЛЕКСАВ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ *THE ROLE OF AP-1 PROTEINS IN THE GLUCOCORTICOIDREGULATION OF TYROSINE HYDROXYLASE EXPRESSION
Е. В. Сухарева 1, 2, Д. А. Ланшаков 1, Т. С. Калинина 1, 2,
В. В. Булыгина 1, Н. Н. Дыгало 1, 2ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук» (ФИЦ ИЦиГ СО РАН)2Федерального государственного автономного образовательного
учреждения высшего образования «Новосибирский
национальный исследовательский государственный университет»1

E. V. Sukhareva 1, 2, D. A. Lanshakov 1, T. S. Kalinina 1, 2,
V. V. Bulygina 1, N. N. Dygalo 1, 2
Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia
Novosibirsk National Research State University, Novosibirsk, Russia
1

2

E-mail: evsukhareva@mail.ruАннотация
Индукция глюкокортикоидами экспрессии гена тирозингидроксилазы мозга,ключевого фермента синтеза катехоламинов, определяется взаимодействием рецептора гормона с транскрипционным фактором АР-1 на консенсусном участке промотора гена фермента. Активация неканонического механизма действия глюкокортикоидов в раннем онтогенезе обуславливает чувствительность к гормону животных
разного возраста.
Abstract
Glucocorticoid induction of the brain tyrosine hydroxylase gene expression, a key enzyme for the synthesis of catecholamines, is determined by the interaction of the hormone
receptor with the transcription factor AP-1 in the consensus region of the enzyme gene promoter. Activation of the non-canonical mechanism of glucocorticoids in early ontogenesis
defines sensitivity to the hormone of different ages animals.
© Е. В. Сухарева, Д. А. Ланшаков, Т. С. Калинина, В. В. Булыгина, Н. Н. Дыгало,2018.
*Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 18-315-00118.

380Раздел 3Глюкокортикоиды — гормоны стресса осуществляют свое действие через изменение экспрессии гормон-зависимых генов. Механизмы действия
гормонов осуществляются через собственные рецепторы (GR), которые являясь транскрипционными факторами, взаимодействуют как со специфическими гормон-отвечающими элементами (GRE) генома (канонический механизм), так и с другими транскрипционными факторами (неканонический
механизм). Одним из таких факторов является АР-1 комплекс, который образуется взаимодействием гомодимеров белков Jun или гетеродимеров Jun/Fos с гептамерной консенсусной последовательностью промоторов многих
генов. Неканонический механизм расширяет список генов, регулируемых
глюкокортикоидами, но не имеющих в своих промоторах гормон-зависимых
элементов. Одним из таких генов может быть ген ключевого фермента синтеза катехоламинов — тирозингидроксилаза (ТГ), глюкокортикоидная индукция экспрессии которого зависит от возраста. Промотор гена ТГ содержитдва АР-1 элемента, один из которых вовлечен в гормональную индукцию
гена в культуре феохромоцитомы. Известно, что при взаимодействии GR
с гомодимером Jun/Jun АР-1 комплекса глюкокортикоиды активируют, а привзаимодействии с гетеродимером Jun/Fos, напротив, подавляют транскрипцию генов. Следовательно, направление изменения транскрипции гена ТГможет определяться соотношением экспрессии белков Jun и Fos в разные
сроки онтогенеза.
Для выявления роли белков транскрипционного комплекса АР-1 в регуляции глюкокортикоидами экспрессии ключевого фермента синтеза катехоламинов — тирозингидроксилазы (ТГ) в головном мозге крыс в раннем
онтогенезе определяли уровни мРНК c-jun, junB, junD, c-fos, fosB (ОТ-ПЦРв реальном времени) и белков JunB, c-Fos (иммуногистохимический анализ)в стволе мозга 3- и 8-дневных крысят. Соотношение уровней мРНК c-jun,
junB, junD к c-fos или fosB и белков JunB/c-Fos значительно выше в стволе
мозга 3-дневных животных по сравнению с 8-дневными, что способствует
объяснению достоверного повышения регуляции уровней мРНК и белка TГчерез 4–6 часов после воздействия дексаметазона (0,2 мг/кг) у 3-дневных
крысят без каких-либо эффектов у 8-дневных. Кроме того, методом иммунопреципитации хроматина (CHIP-qPCR) было показано значительно большее связывание белков JunB с дистальным AP-1-элементом промотора TГчерез 6 часов после гормонального воздействия в стволе головного мозгав период выявленной глюкокортикоидной индукции гена ТГ на 3-й деньжизни, чем в период нечувствительности экспрессии гена фермента к гормону у 8-дневных животных. Таким образом, зависимая от возраста индукция глюкокортикоидами ТГ в перинатальном головном мозге ассоциирована

Молекулярная биология

381

с преобладанием количества транскриптов и белков Jun над Fos, а также
большей степенью взаимодействия белка JunВ с АР-1 элементом промотора
гена ТГ, являющимися компонентами неканонического механизма действия
гормона, активирующего экспрессию генов.

Раздел 3382ПРИЛОЖЕНИЕ МЕТОДА MALDI-TOF
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ
ОЦЕНКИ МАРКЕРОВ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯИ СЕПСИСА В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
AN APPLICATION OF MALDI-TOF MASS SPECTROMETRYFOR QUANTITATIVE EVALUATION OF MARKERSOF SYSTEMIC INFLAMMATION AND SEPSIS IN HUMAN SERUM
А. С. Тараскин, А. В. Протасов, С. А. Клотченко, О. А. Миргородская
ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России,Санкт-Петербург, Россия

*A. S. Taraskin, A. V. Protasov, S. A. Klotchenko, O. A. Mirgorodskaya
Smorodintsev Research Institute of Influenza,
Ministry of Health of the Russian Federation
E-mail: taraskin_07@bk.ruАннотация
Основной целью данного исследования являлась разработка и верификация метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для одновременной количественной оценки
сразу нескольких маркеров воспаления: альфа-2-макроглобулин, альфа-2-HS-гликопротеин (фетуин А), сывороточный альбумин, сывороточный амилоид А и фибринопептид А, в сыворотках крови человека для диагностики системной воспалительной реакции и сепсиса с применением изотопно-меченого внутреннего стандарта.
На выборке из 27 образцов, полученных от пациентов с гнойно-воспалительными
заболеваниями мягких тканей в СПб ГБУЗ «Городская больница № 14», было показано, что в группе больных с клиническим диагнозом «сепсис» наблюдалось значительное отклонение от референсных значений уровней всех измеренных маркеровв сыворотке крови.
Abstract
The aim of this work was to develop a method for simultaneous quantification of several inflammatory markers such as alpha-2-macroglobulin, alpha-2-HS-glycoprotein (fetuin A), serum albumin, serum amyloid A and fibrinopeptide A in human blood serum by
MALDI mass spectrometry for the diagnosis of systemic inflammatory response syndrome
and sepsis using isotopomers, peptides that contain stable isotopes of oxygen. In a sample
of 27 serum specimens, obtained from patients of the St. Petersburg City Clinical Hospital* © А. С. Тараскин, А. В. Протасов, С. А. Клотченко, О. А. Миргородская, 2018.

Молекулярная биология

383№ 14 with pyo-inflammatory soft tissue diseases, there was a significant deviation fromthe reference values levels of all measured markers in serum of patients with a clinicaldiagnosis of «sepsis».

Системная воспалительная реакция организма (СВР) — это типовой патологический процесс, развивающийся при системном повреждении, какправило, протекающий при участии медиаторов воспаления с вовлечением практически всех систем организма. Изначально воспалительная реакция развивается преимущественно местно — в очаге воспаления. Развитие
местного патофизиологического процесса осуществляется путём поддержания баланса между противо- и провоспалительными медиаторами воспаления. При несостоятельности противовоспалительных факторов, в кровотоке
происходит генерализация факторов повреждения, способных индуцировать «воспалительный» клеточный стресс на системном уровне. Основным
инициирующим механизмом для развития системной воспалительной реакции является поступление в системный кровоток из очага воспаления отдельных цитокинов и некоторых других медиаторов [1].
Согласно современным представлениям, сепсис — это патологический
процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного воспаления на инфекцию различной природы в сочетании с остро
возникшими признаками органной дисфункции и/или доказательствами
микробной диссеминации. Сепсис описывается комплексным клиническим
синдромом системной воспалительной реакции (ССВР) организма при инфицировании бактериями, грибами, вирусами и паразитами [2]. Чаще всего
сепсис вызывают бактерии S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, E. coli,
Salmonella spp. и N. meningitidis. Сепсис также может являться смертельным следствием инфицирования вирусами сезонного, птичьего и свиного
гриппа, вирусами лихорадки Денге и желтой лихорадки, коронавирусами,вирусами Эбола [3]. Без своевременного лечения сепсис может привестик развитию полиорганной недостаточности и смерти [4]. Ключевым фактором в положительном исходе заболевания является своевременная и точная диагностика. Однако в настоящее время число используемых в клинической практике молекулярных маркеров для диагностики сепсиса крайне
мало и ограничивается, в основном, прокальцитонином (procalcitonin, PCT),
С-реактивным белком (C-reactive protein, CRP) и эндотоксином, а также относительно новым маркером пресепсином.
В настоящий момент существует порядка двухсот биомаркеров, потенциально представляющих интерес при диагностике системного воспаленияи сепсиса[5]. Однако ни один из предлагаемых в качестве маркера воспалений белковый фактор не обладает необходимой надёжностью, чтобы исполь-384

Раздел 3зовать его в качестве единого критерия молекулярной диагностики. Именно
поэтому основной задачей предлагаемого исследования являлась разработка
диагностической тест-системы, позволяющей одновременно и быстро проводить детекцию в биологических жидкостях (в сыворотке крови) нескольких
биомаркеров с использованием малых объёмов реагентов и образцов.
Возможность одновременно детектировать несколько факторов воспаления позволит получить более полную картину состояния конкретного больного, а также обеспечит дифференциальный мониторинг патологии. Такой
подход позволит не только детерминировать воспаления инфекционногои неинфекционного генеза, но и проводить пациент-ориентированную диагностику и лечение, в том числе основанное на использовании рациональных принципов антибиотикотерапии [6, 7].
В качестве измеряемых маркеров в данном исследовании выступали:альфа-2-макроглобулин, альфа-2-HS-гликопротеин (фетуин А), сывороточный альбумин, сывороточный амилоид А и фибринопептид А.
Aльфа-2-макроглобулин (а2-MG) действует как антипротеаза и способен
инактивировать огромное количество протеиназ. Действует как ингибитор
фибринолиза, ингибируя плазмин и калликреин. Действует как ингибитор
коагуляции, ингибируя тромбин [8].
Альфа-2-HS-гликопротеин (Фетуин А) участвует в нескольких функциях, таких как эндоцитоз, развитие мозга и образование костной ткани.
Фетуины — это белки-носители, такие как альбумин. Фетуин-А образует
растворимые комплексы с кальцием и фосфатом и, таким образом, является
носителем нерастворимого в других условиях фосфата кальция [9].
Альбумин является основным белком плазмы крови человека. Он связывает воду, катионы (такие как Ca2 +, Na+ и K+), жирные кислоты, гормоны,билирубин, тироксин и фармацевтические препараты (включая барбитураты). Основная функция заключается в регулировании онкотического давления крови [10].
Сывороточный амилоид А (Serum amyloid A, SAA) является быстрои сильно реагирующим маркером острой фазы. Подобно C-реактивному
белку (CRP), уровень SAA увеличивается в течение нескольких часов после
воспалительного стимула, и увеличение может быть большим, чем у СRP.
Относительно простые воспалительные стимулы могут приводить к ответуSAA [11].
Фибринопептид А (ФПА) — пептид, отщепляемый тромбином от альфа-цепи фибриногена, при превращении фибриногена в фибрин. Количество ФПА указывает на активность свертывающей системы крови [12].
Основной целью данного исследования являлась разработка и верификация метода MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization — TimeМолекулярная биология

385

Of Flight) масс-спектрометрии для одновременной количественной оценки
таких маркеров воспаления, как альфа-2-макроглобулин, альфа-2-HS-гликопротеин (фетуин А), сывороточный альбумин, сывороточный амилоид А ифибринопептид А, в сыворотках крови человека для диагностики системной воспалительной реакции и сепсиса с применением изотопно-меченого
внутреннего стандарта согласно методике [13].
Для верификации метода в образцах контрольной группы пациентов
были измерены уровни альфа-2-макроглобулина спектрофотометрически
[14] и с помощью разработанной методики. Предварительная апробация метода на выборке из 27 образцов от пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей, полученных в СПб ГБУЗ «Городская больница
№ 14», показала, что в группе больных с клиническим диагнозом «сепсис»наблюдалось отклонение от референсных значений уровней всех измеренных маркеров в сыворотке крови.
В процессе выполнения работы была получена и применена новая потенциальная методика диагностики СВР и сепсиса на основе количественной
масс-спектрометрии с применением изотопно-меченых стандартов. Разработанная тест-система позволяет одновременно выявлять в сыворотке крови пациентов несколько молекулярных маркеров, характеризующих процесс
протекания заболевания. Данная система диагностики показала удовлетворительные результаты в процессе предварительной апробации на сыворотках
пациентов. В дальнейшем планируется провести клиническую апробациюкак выбранных молекулярных маркеров, так и самой тест-системы.
Литература
1. Singer M. et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic
shock (sepsis-3) // Jama. — 2016. — Т. 315. — №. 8. — С. 801–810.
2. Гельфанд Б. Р. и др. Сепсис: классификация, клинико-диагностическая концепция и лечение. / Под ред. акад. РАН Б. Р. Гельфанда — 4-е изд., доп. и перераб. —Москва : ООО «Медицинское информационное агенство», 2017.
3. Совершенствование профилактики, диагностики и клинического ведения
сепсиса. 140 сессия Исполнительного комитета ВОЗ. 2017; EB140/12.
4. Sivak K. V. et al. Adenosine A2A receptor as a drug target for treatment of sepsis //Molecular Biology. — 2016. — Т. 50. — №. 2. — С. 200–212.
5. Sepsis. //Diagnostic Methods and Protocols. — 2015. — C. 460.
6. Kelly B. J. et al. Combined biomarkers discriminate a low likelihood of bacterial
infection among surgical intensive care unit patients with suspected sepsis // Diagnostic
microbiology and infectious disease. — 2016. — Т. 85. — №. 1. — С. 109–115.
7. Han J. H. et al. Use of a combination biomarker algorithm to identify medical
intensive care unit patients with suspected sepsis at very low likelihood of bacterial
infection // Antimicrobial agents and chemotherapy. — 2015. — С. AAC. 00958–15.

386Раздел 3

8. Rehman A. A., Ahsan H., Khan F. H. alpha‐2‐Macroglobulin: a physiologicalguardian // Journal of cellular physiology. — 2013. — Т. 228. — №. 8. — С. 1665–1675.
9. Vashist S. K. et al. Emerging human fetuin a assays for biomedical diagnostics //Trends in biotechnology. — 2017. — Т. 35. — №. 5. — С. 407–421.
10. Chien S. C. et al. Critical appraisal of the role of serum albumin in cardiovasculardisease // Biomarker research. — 2017. — Т. 5. — №. 1. — С. 31.
11. Schrödl W. et al. Acute phase proteins as promising biomarkers: Perspectives andlimitations for human and veterinary medicine //PROTEOMICS–Clinical Applications. —2016. — Т. 10. — №. 11. — С. 1077–1092.
12. Mosesson M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions // Journal ofThrombosis and Haemostasis. — 2005. — Т. 3. — №. 8. — С. 1894–1904.
13. Козьмин Ю. П. и др. Прямое введение изотопов О-18 в пептиды и белки дляколичественного анализа методом масс-спектрометрии //Биоорганическая химия. —2011. — Т. 37. — №. 6. — С. 793–806.
14. Веремеенко К. Н., Голобородько О. П., Кизим А. И. Протеолиз в норме и припатологии // К.: Здоровья. — 1988. — Т. 198.

Молекулярная биология

387

ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ РНК ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА *PHOTOSENSITIVE RNA FOR REGULATIONOF GENE EXPRESSION AND GENOME EDITTING
Е. А. Хабардина 1, Д. С. Новопашина 1,2, И. П. Вохтанцев 1,
Д. О. Жарков 1,2, А. Г. Веньяминова 2Новосибирский государственный университет,Новосибирск, Россия
2Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, Россия
1

E. A. Khabardina 1, D. S. Novopashina 1,2, I. P. Vokhtantsev 1,
D. O. Zharkov 1,2, A. G. Venyaminova 2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Institute of Chemical Biology and Fundamental Science SB RAS,
Novosibirsk, Russia
1

2

E-mail: liza.khabardina@mail.ruАннотация
Разработаны и оптимизированы два подхода к фоторегулируемой экспрессии генов и фотоконтролируемому редактированию генома. Первый подход связан с активацией siРНК, содержащей блокирующую липофильную группировку, введенную через
фоторасщепляемый линкер. Второй подход основан на инактивации направляющей
РНК, входящей в состав системы CRISPR/Cas9 и содержащей в своей структуре одинили два фотолабильных линкера. Активация или инактивация таких олигонуклеотидных конструкций осуществляется воздействием ультрафиолетового облучения.
Abstract
Two approaches to photoregulated gene expression and photocontrolled gene editing
were developed and improved. The first approach is related with activation of siRNA, con© Е. А. Хабардина, Д. С. Новопашина, И. П. Вохтанцев, Д. О. Жарков, А. Г. Веньяминова, 2018.
*Работа выполнена в рамках базовых проектов ПФНИ ГАН на 2017–2020 гг.
(VI.62.1.4, 0309-2016-0004) «Интеллектуальные материалы для биомедицины» и ПФНИГАН на 2017–2020 гг. (VI.62.1.5, 0309-2016-0003) «Синтетическая биология: разработка средств манипуляции генетическим материалом и создание перспективных препаратов для терапии и диагностики».

388

Раздел 3

taining blocking lipophilic group attached by means of photocleavable linker. The second
approach is based on deactivation of guide RNA for CRISPR/Cas9 system containing one
or two photolabile linkers in the structure. Activation or inactivation of these oligonucleotide constructions are caused by ultraviolet radiation.

Актуальной задачей современной молекулярной и синтетической биологии является создание НК-конструкций, действие которых можно регулировать. Одним из способов контроля активности олигонуклеотидных
конструкций в клетках во времени и пространстве является использование
фотоактивируемых структур в составе олигонуклеотидов [1–3], например,фоторасщепляемых линкеров. Наличие фоторасщепляемого линкера между олигонуклеотидом и группировкой (липофильной, репортерной и др.)позволяет удалять ее путем УФ-облучения в определенный момент времени, например, после проникновения олигонуклеотида в клетку. При этомвысвобождается функциональная НК-конструкция (антисенс-олигонуклеотид, siРНК и др.), «свободная» от дополнительных группировок:R — липофильная блокирующая группа; ON — олигорибонуклеотидили олигодезоксирибонуклеотид
Другой подход основан на использовании олигонуклеотидных конструкций, содержащих фоторасщепляемый линкер внутри цепи. В результате
УФ-облучения такая конструкция разрушается с образованием двух коротких олигонуклеотидов и происходит потеря ее функциональной активности:ON1 и ON2 — фрагменты олигорибонуклеотида
Таким образом УФ-облучение может быть использовано как для контролируемой активации, так и для инактивации олигонуклеотидных конструкций в клетке. Используемый для облучения диапазон длин волн (> 360 нм)Молекулярная биология

389

находится далеко за пределами полосы УФ-спектра, повреждающей биологические молекулы, и практически не вызывает мутаций [4], что в свою очередь не повышает риск онкогенной трансформации клеток при облучении.
Целью данной работы являлась разработка подхода к получению конъюгатов олигонуклеотидов, содержащих на 5’-конце остатки липофильных
молекул (холестерин, токоферол и др.), введенных через фоторасщепляемый линкер, а также получение направляющих РНК для системы CRISPR/
Cas9 (sgРНК, crРНК/tracrРНК), содержащих фотолинкер внутри цепи, и исследование расщепления группировок под действием ультрафиолетового
излучения в составе олигонуклеотидов и конъюгатов.
С использованием специально синтезированного амидофосфитного
синтона на основе 1-(2-нитрофенил)-1,2-этандиола получены полимерсвязанные олигодезоксирибо- и олигорибонуклеотиды, содержащие фоторасщепляемый линкер на 5’-конце. На их основе путем активации дисукцинимидилкарбонатом свободной гидроксильной группы линкера с последующим взаимодействием с аминосодержащими липофильными производнымив твердофазном варианте получены 5’-липофильные производные олигонуклеотидов. Продемонстрирована возможность расщепления фотолинкерапод действием УФ-света и высвобождения целевого олигонуклеотида.
Возможность получения протяженных направляющих РНК, в том числе и sgРНК, путем химического синтеза открывает широкие возможности
введения модификаций в состав таких РНК с целью увеличения устойчивости РНК конструкции к действию нуклеаз, усиления ее способности связываться с мембраной клетки и проникать внутрь, а также изменения сродствак ДНК-мишени и/или белку Cas9 [5]. Фосфитамидным методом в оптимизированных условиях нами были получены как химерные направляющие
sgРНК (102 нуклеотида), так и пары crРНК (36 и 42 нуклеотида) и tracrРНК
(67 и 74 нуклеотида) и их аналоги, содержащие одну или две фоторасщепляемые вставки в участках, комплементарных модельной ДНК-мишени, и/или в участках взаимодействия с белком Cas9 (см. рисунок). Показана воз-Использованные в работе фотолабильные sgРНК (а)и crРНК (б) в составе системы CRISPR/Cas9390Раздел 3можность их расщепления под действием УФ-света; продемонстрирована
высокая эффективность белка Cas9 расщеплять плазмидную ДНК-мишень
in vitro в их присутствии до облучения и значительное снижение эффективности расщепления после облучения фоточувствительных направляющих РНК как в комплексе с белком Cas9, так и индивидуально в растворе.
Продемонстрирована возможность контролируемой остановки действияCRISPR-системы в определенный момент времени.
В данной работе разработаны и оптимизированы подходы к контролируемой регуляции экспрессии генов и редактированию генома с использованием фотолабильных РНК-конструкций.
Литература
1. Nguyen Q. N., Chavli R. V., Marques J. T. et al. Light controllable siRNAs regulate
gene suppression and phenotypes in cells. Biochim. Biophys. Acta. 2006, V. 1758. N. 3.
P. 394–403.
2. Mikat V., Heckel A. Light-dependent RNA interference with nucleobase-caged
siRNAs. RNA 2007, V. 13. N. 12. P. 2341–2347.
3. Ankenbruck N., Courtney T., Naro Y., Deiters A. Optochemical control of biologicalprocesses in cells and animals. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, V.57. N. 11. P. 2768–2798.
4. Setlow R. B. Shedding light on proteins, nucleic acids, cells, humans and fish.
Mutat. Res. 2002, V.511. N.1. P.1–14.
5. Hendel A., Bak R. O., Clark J. T. et al. Chemically modified guide RNAs enhance
CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol. 2015, V. 33. N. 9.
P. 985–989.

Молекулярная биология

391

РАЗРАБОТКА ИНГИБИТОРОВ TDP1,
ОСНОВАННЫХ НА ПРИРОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЯХ *DEVELOPMENT OF TDP1 INHIBITORS BASED ON NATURAL
BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS
А. А. Чепанова 1,, А. Л. Захаренко 1, О. Д. Захарова 1,
Е. С. Ильина 1, Т. М. Хоменко 2, Е. С. Можайцев 2,
Е. В. Суслов 2, Н. С. Ли-Жуланов 2, А. С. Филимонов 2,
О. А. Лузина 2, К. П. Волчо 2, Н. Ф. Салахутдинов 1, О. И. Лаврик 1
1
Novosibirsk Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SBRAS,
630090, Russian Federation, Novosibirsk,
Akademika Lavrentieva Ave., 8
2
N. N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry,
SBRAS, 630090, Russian Federation, Novosibirsk,
Akademika Lavrentieva Ave., 9
E-mail: arinachepanova@mail.ruАннотация
Ингибирование ферментов системы репарации относится к перспективным методам по созданию эффективной противораковой терапии, особенно для лекарственно-устойчивых опухолей. Tdp1 является многообещающей мишенью противораковой терапии, поскольку может восстанавливать повреждения ДНК, вызванные ингибиторами Top1, что приводит к резистентности к лекарственным средствам. Четыре
класса веществ, основанных на природных биологически активных соединениях
(производные кумарина, монотерпенов, хромена и усниновой кислоты), тестировались in vitro для выявления ингибирующей активности в отношении Tdp1 с использованием флуоресцентного анализа. Было показано, что все изученные соединения
обладают ингибирующим эффектом. Влияние выбранных соединений на пролиферацию линий опухолевых клеток и оценку гибели клеток изучали с использованием
MTT теста. Среди разработанных ингибиторов имеются как умеренно токсичные,так и нетоксичные соединения.
Abstract
Developing inhibitors of DNA repair enzymes is a promising approach to improveanticancer therapy, particularly for drug-resistant tumors. Tdp1 is a promising target for© А. А. Чепанова, А. Л. Захаренко, О. Д. Захарова, Е. С. Ильина, Т. М. Хоменко,Е. С. Можайцев, Е. В. Суслов, Н. С. Ли-Жуланов, А. С. Филимонов, О. А. Лузина,К. П. Волчо, Н. Ф. Салахутдинов, О. И. Лаврик, 2018.
*
This work was supported by Russian Science Foundation (grant 16-13-10074).

392Раздел 3

anticancer therapy, since it can repair DNA lesions caused by Top1 inhibitors leading todrug resistance. Four classes of inhibitors based on natural compounds (derivatives of
coumarin, monoterpenoids, chromen and usnic acid) were tested in vitro Tdp1 inhibitory
activity using a fluorescent-based assay. It was shown that all studied compounds havea pronounced inhibitory effect. The effect of the selected compounds on the proliferationof transplanted tumor cell lines and the evaluation of cell death were studied using the
MTT test. Among the developed inhibitors, there are both moderately toxic and non-toxic
compounds.

Synthetic transformation of natural biologically active metabolites to designnovel drugs is a successful strategy in medicinal chemistry. During the period
between the 1940s and 2014, 49 % of anticancer pharmaceuticals introduced toclinical practice were either natural compounds or their derivatives [1].
Monoterpenoids, the plant secondary metabolites, are known to possess activity against certain cancer cell lines. Compounds carrying the adamantane moiety
exhibit a broad range of biological activities. Some of them are active against different types of cancer. We have synthesized a series of compounds with both thediaza-adamantane and monoterpenoid moieties and tested their inhibitory activity
against purified recombinant DNA repair enzyme Tdp1. Compound synthesizedfrom 1-aminoadamantane and myrtenal, and compound produced from 2-aminoadamantane and citronellal were found to be most potent as they inhibited
Tdp1 with IC50 values of 6 and 3.5 µМ, respectively. These compounds proved
to have low cytotoxicity in HCT-116 cells (IC50 > 50 µМ) [2].
Octahydro-2H-chromene is an oxygen-containing heterocycle with tetrahydropyran moiety occurring in many important natural products and biologically
active molecules The novel amide and adamantane derivatives of octahydro-2Hchromen-4-ol were synthesized from the monoterpenoid (-)-isopulegol. Adamantane derivatives are widely used in medicinal chemistry and clinical practice.
The introduction of an adamantyl moiety into biologically active molecules often
decreases toxicity and improves therapeutic effect [2,3]. Therefore, combining
these two molecular scaffolds is a promising approach to develop potent anticancer agents. The series of chiral heterocyclic compounds with the octahydro-2H-chromene scaffold, containing amide substituents, was synthesized in thethree-step reaction for the first time. All derivatives were tested and IC50 values
were determined. It was found that the octahydro-2H-chromen-4-ol derivativewith 1-adamantane moiety appeared to be an effective inhibitor of Tdp1 with
IC50 value of 1.24 µM.
Coumarin (chromen-2-OH) and its derivatives are widely distributed in nature,mainly in plants. It is known that coumarins possess different types of biologicalactivity and are used in medical chemistry [4]. In 2016, out team had published theМолекулярная биология

393

article in which it was shown that the 7-hydroxycoumarin derivatives with monoterpene pinene moiety are effective inhibitors of Tdp 1 [5]. This compound had low
cytotoxicity enhanced the cytotoxicity of camptothecin, an established topoisomerase 1 poison, was demonstrated. We continued the work with compounds of thisclass. New modifications of compounds have been proposed. All new derivatives
were tested and resulting in IC50 values in the of 0.41–4.3 μM range.
One of the compounds was tested in mice. The inhibitor was injected intraperitoneally into the Krebs ascite carcinoma. The coumarin derivative sufficiently improved effect of topotecan and the coumarin derivative suppressed tumor
growth at mice as shown (see figure).

The influence different concentration of inhibitor in presence of topotecan (tpc)
on average ascite weight. 1 — control, 2 — tpc 0.5 mg/kg, 3 — tpc 0.5 mg/kg + inh
80 mg/kg, 4 — tpc 0.5 mg/kg + inh 40 mg/kg, 5 — tpc 0.5 mg/kg + inh 20 mg/kg,
6 — inh 80 mg/kg. inh — means Tdp1 inhibitor

Usnic acid is a secondary metabolite commonly found in various types oflichens, which has a broad range of biological activities: antitumor, antiviral, antibiotic, analgesic, antimycotic and insecticide [6,7]. It has been previously foundthat usnic acid derivatives are effective Tdp1 inhibitors with significant synergistic effect on the viability of the MCF-7 breast cancer cell line [5]. The derivativesof usnic acid were evaluated for their Tdp1 inhibitory activity in vitro. Overall,most of the tested (het)arylidenfuranone derivatives of usnic acid demonstrated potent anti-Tdp1 activity in submicromolar, or even nanomolar, concentration [8]. To study cytotoxicity on A-549 and HEK-293 cells, the most effective
Tdp1 inhibitors were selected. The cells were incubated in the presence of theinhibitors at concentrations ranging from 1 to 100 μM. The compounds proved tobe moderately toxic for the cells (CC50 values in the range from 4.6 to 20 μM)
except for compound 6s, for which CC50 value could not be determined for bothcell lines (> 50 μM) [8].

394Раздел 3

Conclusion
All studied compounds have a pronounced inhibitory effect and they improvethe effect of tpc. The dependence of the inhibitory activity on the structure of thecompounds was revealed. Among the developed inhibitors, there are both moderately toxic and non-toxic compounds. The most effective compounds are very
perspective and will be studied further.
Literature
1. Newman D. J., Cragg G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from1981 to 2014 // Journal of Natural Products. 2016. Vol. 79, № 3. P. 629–661.
2. Ponomarev K. Y. et al. Aminoadamantanes containing monoterpene-derived fragments as potent tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 inhibitors // Bioorg. Chem. Academic
Press, 2018. Vol. 76. P. 392–399.
3. Yasumoto T., Murata M. Marine toxins // Chem. Rev. American Chemical Society,1993. Vol. 93, № 5. P. 1897–1909.
4. Xu L. et al. The Study on Biological and Pharmacological Activity of Coumarins //Proceedings of the 2015 Asia-Pacific Energy Equipment Engineering Research Conference. Paris, France: Atlantis Press, 2015.
5. Khomenko T. et al. New inhibitors of tyrosyl-DNA phosphodiesterase I (Tdp 1)
combining 7-hydroxycoumarin and monoterpenoid moieties // Bioorg. Med. Chem. 2016.
Vol. 24, № 21. P. 5573–5581.
6. Luzina O. A., Salakhutdinov N. F. Biological activity of usnic acid and its derivatives: Part 1. Activity against unicellular organisms // Russ. J. Bioorganic Chem. Pleiades
Publishing, 2016. Vol. 42, № 2. P. 115–132.
7. Luzina O. A., Salakhutdinov N. F. Biological activity of usnic acid and its derivatives: Part 2. effects on higher organisms. Molecular and physicochemical aspects // Russ.
J. Bioorganic Chem. Pleiades Publishing, 2016. Vol. 42, № 3. P. 249–268.
8. Zakharova O. et al. Synthesis and evaluation of aryliden- and hetarylidenfuranone
derivatives of usnic acid as highly potent Tdp1 inhibitors // Bioorganic Med. Chem. Elsevier, 2018. Vol. 26, № 15. P. 4470–4480.

Молекулярная биология

395

ВВЕДЕНИЕ ГЕТАРИЛЬНЫХ ЗАМЕСТИТЕЛЕЙВ СТРУКТУРУ ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ
УСИЛИВАЕТ ЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ *INTRODUCTION OF HETARYL SUBSTITUENTS INTOGLYCYRRHETINIC ACID SCAFFOLD INCREASES ITS ANTITUMOR
AND ANTI-INFLAMMATORY POTENTIAL
С. Чэн1,2, А. В. Марков 2, О. В. Саломатина 3,
Н. Ф. Салахутдинов 3, М. А. Зенкова 2, Е. Б. Логашенко 2Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет, Новосибирск, Россия
2Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, Россия
3Новосибирский институт органической химии
им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск, Россия
1

X. Chen1,2, A. V. Markov 2, O. V. Salomatina 3, N. F. Salakhutdinov 3,
M. A. Zenkova 2, E. B. Logashenko 2
Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine
SB RAS, Novosibirsk, Russia
3
N. N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry
SB RAS, Novosibirsk, Russia
12Аннотация
Проведен скрининг цитотоксичности 10 новых производных глицирретовой
кислоты (ГЛК) в отношении 5 опухолевых клеточных линий. Установлено, чтоприсоединение гетарильных заместителей к карбоксильной группе ГЛК приводитк значительному усилению ее антипролиферативного действия in vitro. Выявлены
производные sg-623 и spo-13, эффективно подавляющие синтез провоспалительных
медиаторов NO и TNF-α мышиными макрофагами, активированными IFN-γ.

© С. Чэн, А. В. Марков, О. В. Саломатина, Н. Ф. Салахутдинов, М. А. Зенкова,Е. Б. Логашенко, 2018.
*Исследование было поддержано Российским научным фондом (грант
№ 17-75-20120.

396

Раздел 3

Abstract
Screening of cytotoxicity of 10 novel chemical derivatives of glycyrrhetinic acid
(GLA) in a panel of 5 tumor cell lines was performed. It was found that introduction ofhetaryl substituents into carboxyl group of GLA highly increased its anti-proliferative activity in vitro. Compounds sg-623 and spo-13 were shown to effectively suppress synthesisof pro-inflammatory mediators NO and TNF-α by murine macrophage activated by IFN-γ.

Одним из важных способов поиска и разработки новых эффективных
лекарственных препаратов является синтетическая трансформация молекул природных биологически активных соединений, характеризующихся
огромным разнообразием молекулярных структур и широким спектром действия. Многие годы природные соединения занимают центральное местов области разработки фармакологических агентов. Одним из примеров природных метаболитов, использующихся в качестве платформы для создания
новых лекарственных средств, являются растительные тритерпеноиды. Глицирретовая кислота (ГЛК) представляет собой один из самых распространенных тритерпеноидов олеанолового ряда. Данное соединение содержитсяв больших количествах в корне солодки. Широкий ареал распространения
солодки на территории Российской Федерации, легких способ выделенияГЛК из растительного сырья, широкий спектр ее фармакологических активностей делают данный тритерпеноид перспективным в качестве стартовой
молекулы для химической трансформации.
Нами было синтезировано 10 новых производных ГЛК, несущих различные гетарильные заместители в положении С30. Целью данного исследования являлась оценка уровня цитотоксичности синтезированных производныхна панели опухолевых клеток и их противовоспалительный потенциал in vitro.
Скрининг цитотоксичности производных ГЛК проводили in vitro наклетках карциномы шейки матки человека KB-3-1 и HeLa, аденокарциномы
прямой кишки HuTu-80 и легких A-549 человека и меланомы мыши B16 методом МТТ-теста. Клетки инкубировали в среде DMEM в присутствии исследуемых соединений (10–9–10–5 М) в течение 24 ч, после чего определяли
долю живых клеток по отношению к контролю — клеткам, инкубированныхв отсутствие производных. Для каждого производного определяли значение
IC50 — концентрацию вещества, при которой наблюдается гибель 50 % клеток. Полученные данные представлены в таблице.
Было показано, что введение гетероциклических заместителей в структуру ГЛК может значительно усиливать цитотоксичность — присоединение
бензимидамидного (sg-610), трет-бутил оксидиазольного (sg-625), никотинимидамидного (sg-608) и пиколинимидамидного (sg-612) заместителейк карбоксильной группе С30 ГЛК привела к заметному увеличению цитоток-397

Молекулярная биология

сичности производных в отношении клеток рака шейки матки KB-3-1 (IC50 =22,3–32,7 мкМ против IC50 (ГЛК) = 50,8 мкМ) и HeLa (IC50 = 3,7–11,6 мкМпротив IC50 (ГЛК) = 42,3 мкМ), причем клетки линии HeLa оказались значительно более чувствительными к действию данных соединений. Интересно, что среди отмеченных выше производных sg-625 и sg-608, несущие
трет-бутил оксидиазольный и никотинимидамидный заместители, обладали
более широким спектром действия, эффективно ингибируя пролиферацию
клеток меланомы B16 (IC50 = 11,2 и 18,9 мкМ, соотв.). Выявленные группировки, приводящие к увеличению антипролиферативной активности, могут
рассматриваться в качестве перспективных заместителей для синтеза новых
высокоактивных противоопухолевых агентов на основе тритерпеноидов.
Цитотоксичность новых производных ГЛКПроизводные
sg-610sg-623sg-625sg-608sg-612
sg-613sg-609sg-617
sg-562
spo-13ГЛКЗначение IC50, мкМ
KB-3-127,2±2,9> 100
22,3±3,7
24,8±2,7
32,7±2,8> 100
61±15,1> 100
38,5±4,2> 100
50,8±1,5HeLa
8,6±1,8> 100
3,7±0,911,6±1,9
4,5±0,3> 100
84±9,1
> 100
Н.д.
Н.д.
42,3±2,2B1684,3±7,8> 100
11,25±1,918,9±5,2
> 100
> 100
> 100
83±7,9Н.д.
Н.д.
35±2,0

HuTu-8012,3±1,2
87±8,18,8±1,1
5,9±2,38,7±3,4> 100
91±8,434±5,1
Н.д.
Н.д.
>50

A-549
21,8±7,1> 100
23,5±6,3
21,9±3,9
54±6,7> 100> 100
54±6,2
> 100
> 100
>50

Примечание. Н. д. — нет данных; ГЛК — глицирретовая кислота.

Оценку противовоспалительного потенциала новых производных ГЛКпроводили в два этапа. На первом этапе был проведен отбор наиболее перспективных молекул путем in silico скрининга наличия у исследуемых соединений потенциальной анти-NO (NO — важный провоспалительный
медиатор) и противовоспалительной активности с помощью ресурса PASS
Online (Институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича, Москва). Результаты данного скрининга вынесены в таблицу, представленную на рисунке. Для дальнейших работ по оценке способности новых производных
подавлять синтез провоспалительных медиаторов NO и TNF-α, были выбраны производные sg-623, spo-13 и sg-562, обладающие наивысшими показателями PA (вероятности наличия активности у соединения по данным

398

Раздел 3Оценка противовоспалительного потенциала производных ГЛК, несущих
гетарильные заместители. А) Скрининг in silico способности исследуемых
производных проявлять противовоспалительную (Anti-INF) и анти-NO(Anti-NO) активность. Анализ с помощью PASS Online. В таблице представлены значения PA — вероятности наличия у соединений искомой
активности. Во всех проанализированных случаях PA >> Pi (вероятности
отсутствия активности). Зелеными точками отмечены производные, взятые нами на второй раунд противовоспалительного скрининга — оценку
анти-NO активности. B) Эффект производных ГЛК на синтез NO макрофагами мыши RAW264.7, активированными IFN-γ. Концентрацию нитритав надклеточной среде определяли с помощью набора реагентов Griess
Reagent System (Promega, США). C) Эффект производных ГЛК на экспрессию TNF-α макрофагами мыши RAW264.7, активированными IFN-γ.
Уровень экспрессии провоспалительного цитокина определяли с помощью
набора Mouse TNFα ELISA Kit (Thermo Scientific, США)PASS). Макрофагальные клетки мыши RAW264.7 активировали рекомбинантным мышиным IFN-γ (20 нг/мл) и инкубировали в присутствии нетоксических концентраций указанных соединений в течение 24 часов, после
чего определяли концентрацию нитрита (являющегося основным продуктом окисления NO) и TNF-α в надклеточной среде с помощью Griess Reagent
System (Promega, США) и Mouse TNFα ELISA Kit (Thermo Scientific, США),соответственно.
Показано, что производные sg-623 и spo-13 достоверно снижали синтез
NO — значения их IC50(NO) оказалось равным 18,6±1,1 и 23,4±1,3 мкМ, соответственно (см. рисунок), в то время как sg-562 практически не обладал
анти-NO активностью. Кроме этого, sg-623 и spo-13 эффективно подавляли
экспрессию TNF-α активированными макрофагами до базального уровня.

399

Молекулярная биология

ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА ЭКСПРЕССИЮ
НЕЙРОТРОФИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВВ ОБЛАСТЯХ НЕОНАТАЛЬНОГО ГОЛОВНОГО МОЗГАС МОНОАМИНЕРГИЧЕСКОЙ ИННЕРВАЦИЕЙ *EFFECTS OF GLUCOCORTICOIDS ON THE EXPRESSION OF
NEUROTROPHINS AND THEIR RECEPTORS IN AREAS OF THE
NEONATAL BRAIN WITH MONOAMINERGIC INNERVATION
Е. В. Шабурова 1,2, Д. А. Ланшаков 2, Т. С. Калинина 1,2, Н. Н. Дыгало 1,2ФГБОУ ВПО «Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет», Россия
2ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия
1

E. V. Shaburova 1,2, D. A. Lanshakov 2, T. S. Kalinina 1,2, N. N. Dygalo 1,2
NSU, Russia
ICG SB RAS, Russia
12АннотацияУ неонатальных крысят исследовали эффекты дексаметазона на уровни мРНК9 генов: нейротрофинов и их рецепторов в стволе головного мозга, в котором локализованы клеточные тела моноаминергических нейронов, а также в префронтальной
коре, содержащей проекции этих нейронов. В течение первого часа после введения
гормона наблюдалось повышение уровней мРНК рецепторов зрелых форм нейротрофинов (TrkB, TrkC, SorCS1), а к 4–6 часу снижалась экспрессия мРНК рецепторов их проапоптозных форм (p75, SorCS3). Уровни мРНК самих нейротрофинов
начинали повышаться в первые часы после гормонального воздействия, а некоторые
оставались повышенными через 24–120 часов. Следовательно, глюкокортикоиды
влияют на нейротрофические процессы в областях тел и отростков моноаминергических нейронов формирующегося головного мозга.
Abstract
This study is devoted to research the effects of dexamethasone treatment on the mRNAlevels of 9 genes, included neurotrophins and their receptors. Measurements were carriedout in the brain stem, in which the cellular bodies of monoaminergic neurons are localized,
and in the prefrontal cortex, which contains the projections of these neurons. During thefirst hour after hormone administration, the mRNA levels of the receptors for mature forms© Е. В. Шабурова, Д. А. Ланшаков, Т. С. Калинина, Н. Н. Дыгало, 2018.
*Работа
выполнена
прифинансовой
поддержке
РФФИ
18-315-00114 (мол_а), 16-34-60103.

гранты

400Раздел 3of neurotrophins (TrkB, TrkC) were increased, and mRNA expression of receptors for theirproapoptotic forms (p75, SorCS3) decreased between 4–6 hours. The mRNA levels of theneurotrophins began to rise since first hour after treatment, and some of them remained
elevated after 24–120 hours. Consequently, glucocorticoids affect neurotrophic processes
in the areas of monoaminergic neurons bodies and projections in the developing brain.

Терапия глюкокортикоидами используется для предупреждения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных при угрозе преждевременных родов. Метод давно и прочно вошел в медицину, однако накопилось
большое количество свидетельств негативного влияния глюкокортикоидовна развитие плода и, в частности, на формирование его нервной системы.
При этом, точные молекулярные и клеточные мишени действия глюкокортикоидов в развивающемся мозге до сих пор остаются невыясненными.
Важнейшими регуляторами развития головного мозга являются нейротрофины — регуляторные белки нервной ткани. Известно, что развитие
нервной системы сопровождается сложными последовательными изменениями чувствительности к нейротрофинам (стимулирующим пролиферацию,дифференцировку и выживаемость нейронов и увеличивающим количествоих проекций) и их проформам (запускающими программу апоптоза) в определенных популяциях клеток нервной ткани. Это осуществляется не только изменением экспрессии самих нейротрофинов и пронейротрофинов, нои рецепторов к ним. Таким образом, проанализировав паттерны экспрессии
белков нейротрофической системы в какой-либо области головного мозга,можно предугадать ее дальнейшее развитие. Моноаминергические (серотониновые, дофаминовые, норадренергические и т. д.) нейроны, тела которых
локализованы в стволе головного мозга, а их отростки проецируются практически во все отделы, включая кору, здесь представляют наибольший интерес в связи с интенсивными перестройками, происходящими в этих нейронах в неонатальный период (на основе анализа данных с сайта Allen Brain).
Например, при трехкратном введении дексаметазона, дофаминергические
нейроны ствола начинают активно пролиферировать, увеличивая количество своих проекций в разные области мозга [Virdee, Mcarthur, 2014].
Целью данной работы является исследование влияния однократного введения синтетического глюкокортикоида дексаметазона неонатальным крысятам на уровни мРНК 9 генов нейротрофинов и их рецепторов, определяющих рост и пролиферацию нейронов всех типов, в том числе и моноаминергических нейронов, тела которых локализованы в стволе головного мозга.
Так, на третий день жизни неонатальным крысятам подкожно была введена терапевтическая доза дексаметазона (0,2 мг/кг). Образцы ткани стволовой части головного мозга и префронтальной коры собирались через 0,5 —Молекулярная биология

401

120 часов после гормонального воздействия. Экспрессию нейротрофинов
(NT3, NGF, BDNF), рецепторов к нейротрофинам (TrkB, TrkC, SorCS1) и ихпроформам (p75, SorCS2, SorCS3) определяли при помощи ПЦР в реальном
времени. Результаты анализировали однофакторным дисперсионным анализом, достоверными считались различия с p < 0,05 по критерию Фишера.
Введение дексаметазона приводило к временному повышению через
6 часов уровней мРНК NT3 [F(8,54)=5.21 p<0.05] и NGF [F(8,58)=9,69, p<0.05]
рис.1А, в 1,5 и 2 раза, соответственно, а также к выраженному — в 3 раза —и продолжавшемуся на протяжении 5 дней повышенному уровню мРНКBDNF [F(10,76)=7.24, p<0.05] рис.1А. Одновременно с повышением экспрессии нейротрофинов происходило снижение уровня мРНК рецептора их проформ p75 [F(8,45)=4.15, p<0.05] рис.1C. Уровни мРНК рецепторак проформам SorCS2 [F(7, 45)=0.87, p=0.5] не изменялась, но снижалась мРНКSorCS3 [F(7, 54)=2.0837, p<0.05] рис.1С. Рецепторы к зрелым формам нейротрофинов SorCS1, Trk C и Trk B показали одинаковый паттерн экспрессии, достигая пика через 0,5 часов после введения дексаметазона [F(8, 87) = 6,0595, p <0.05] рис.1B, и также быстро понижая свою экспрессию, что может объясняться активацией нейронов в первые часы после введения глюкокортикоидов, как было показано нами ранее [Lanshakov и др., 2016].
Следовательно, глюкокортикоиды действительно влияют на нейротрофические процессы в областях тел и отростков моноаминергических нейронов формирующегося головного мозга.

Экспрессия мРНК нейротрофинов (1А — BDNF, NGF, NT3) в префронтальной коре, рецепторов к нейротрофинам (1C — SorCS1, Trk C, Trk B)
и их проформам (1B — p75, SorCS3, SorCS2) в стволе головного мозга,относительно бета-актина. * — p < 0,05, по сравнению с экспрессией
мРНК в интактном контроле (пунктирная линия)402

Раздел 3Литература
1. Allen Brain Atlas: www.brain-map.org
2. Virdee K., Mcarthur S. Antenatal Glucocorticoid Treatment Induces Adaptationsin Adult Midbrain Dopamine Neurons, which Underpin Sexually Dimorphic Behavioral
Resilience // Neuropsychogpharmacology 2014. P. 339–350.
3. Lanshakov D. A. et all. Neurobiology of Disease Dexamethasone-induced acuteexcitotoxic cell death in the developing brain // Neurobiol. Dis. 2016. Vol. 91. P. 1–9.

Молекулярная биология

403

ИНСУЛИН ПОДАВЛЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА С3
В ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЛИНИИ HEPG2ЧЕРЕЗ АКТИВАЦИЮ PPARΓ *INSULIN DOWNREGULATES C3 GENE EXPRESSION IN HUMAN
HEPG2 CELLS THROUGH ACTIVATION OF PPARΓ
В. С. Шавва, Е. В. Некрасова, С. В. Орлов
ФГБНУ Институт экспериментальной медицины,отдел биохимии
Санкт-Петербургский государственный университет,кафедра эмбриологии
V. S. Shavva, E. V. Nekrasova, S. V. Orlov
Department of Biochemistry, Institute of Experimental Medicine,
Russian Academy of Medical Sciences, St. Petersburg, Russia
Department of Embryology, St. Petersburg State University,
St. Petersburg, Russia
E-mail: katherina.nekrasova@gmail.com
Аннотация
Инсулин относится к метаболическим гормонам. Дисфункция инсулинового сигналинга является причиной диабета второго типа и способствует развитию метаболического синдрома. Воспаление, как известно, ингибирует инсулиновый сигналинг. С3 — белок острой фазы воспаления. Повышенный уровень плазматического
С3 коррелирует с повышенным уровнем инсулина, с инсулинорезистентностью и,
по-видимому, является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и атеросклероза. Инсулин регулирует экспрессию провоспалительных генов.
Abstract
Metabolic hormone insulin is a crucial regulator of metabolism. Malfunctions of insulin signaling are the causes of type two diabetes and are known to contribute to the development of the metabolic syndrome. Inflammation was shown to suppress insulin signaling.
C3 is an acute phase protein. Elevated level of plasma C3 was shown to correlate withheightened fasting insulin levels and insulin resistance and appears to be a risk factor forthe cardiovascular disease and atherosclerosis. Insulin regulates the expression of proinflammatory genes.
© В. С. Шавва, Е. В. Некрасова, С. В. Орлов, 2018.
*
This work was supported by Russian Science Foundation (Grant № 17-15-01326).

404Раздел 3

Objective
As complement component C3 was shown to be associated with the development of metabolic syndrome, we asked if insulin was capable of regulating
C3 production in the main source of plasma C3 — hepatocytes.
Methods
Real Time RT-PCR, ELISA, Western blotting, Chromatin immunoprecipitation, DNA-affinity precipitation.
Results
Insulin downregulates C3 gene expression in human HepG2 cells throughactivation of PI3K, mTORC1, p38 and MEK1/2 signaling pathways. Inhibition of PI3K, JNK, mTORC1 and MEK1/2 prevented insulin-induced decreaseof C3 protein secretion. Transcription factors PPARα, PPARγ, HNF4α and NFκB are important for this process. Insulin activates PPARγ through PI3K/Akt/mTORC1 pathway, resulting in PPARγ binding to DR4 and DR0 elements within
the C3 promoter and subsequent displacement of HNF4α and PPARα from thesesites. As a result PPARα/NF-κB complex, which exists on C3 promoter, is broken
down and C3 gene expression is downregulated. The promoter of murine C3 genedoes not contain DR4 element and the murine C3 gene is upregulated by insulin
in a PPARγ-independent manner.
Conclusion
Insulin and PPARγ ligand GW1929 downregulate C3 gene expression andprotein secretion in human HepG2 cells. Given the proinflammatory role ofC3 and its association with metabolic syndrome, this effect likely represents theanti-inflammatory function of insulin.

c405УКАЗАТЕЛЬ АВТОРОВ
Абрамова Е. Г.........................................38Авдеева Н. Г.........................................126Акбердин И. Р........................................56Акимова А. С.......................................179Алехина Т. А........................................343
Ананьина Л. Н.......................................97Андреева Е. А......................................232Андреева Н. Б..................................3, 359
Аникина А. Ю.....................................228Антонец Д. В...............................275, 369
Антонычева М. В................................126Ануфриева К. С...................................287
Апалько С. В........................................255
Архипова А. С.......................................60Асанова С. Е........................................225Астафьева С. В....................................126Аулова К. С..........................................239
Ашба А. М...............................................7Бабич В. О............................................242
Бабич П. И.............................................10Бадарин С. А..........................................26Бажан Н. М..........................................246
Бажан С. И...................................275, 369
Байбородин С. И.................................355
Байков И. К..................................136, 141Баймухаметова А. М...................146, 170Байрамова Д. О......................................13Байсейiт С. Б................................146, 148Бакулина А. Ю.................................3, 359
Балахонова Е. А...........................322, 331Балыбина Н. Ю....................................246
Балык К. В...........................................250Банковска К. Б.....................................206

Баранова С. В.........................................69Батлук У. И...........................................253Баторов Е. В.........................................232Бауэр Т. В.............................................150Бекболотов А. А..................................228Белоусов А. Д......................................126Бердюгин А. А.......................................16Бибиков Д. Н..........................................26Бобрикова Е. Н......................................20Бобров М. Ю............................................7Бобровских А. В....................................24Богачев С. С.........................................355
Богачева Н. В.......................................294Боковая О. В................................136, 152Болдырева Д. С....................................255
Бондарь А. А..........................................84Бондарь Н. П........................................253Борисова С. В........................................26Бочкова М. С..........................................48
Боярских У. А.......................................311
Булаев А. Г.............................................29Буланович Ю. А...................................154Булыгина В. В......................................379
Буракова Е. А.......................................328
Бурдеева К. В.......................................253Васильева А. Д....................................203
Васиховская В. А...................................34Вахрушина Н. И..................................126Веньяминова А. Г................................387
Власов В. В..........................................328
Волосникова Е. А..................................45Волох O. A.....................................26, 126Волченко Н. Н.......................................60406Волчо К. П...........................................391
Вохтанцев И. П....................................387
Гавирова Л. А........................................29Гаврилова Е. В.............................150, 187
Гаврилова Ю. А.....................................38Гайнутдинов П. И................................258
Гашников Н. М....................................228Гашникова Н. М..........................183, 294Гейсман А. Н........................................196Генералов С. В.......................................38Герасимова С. В.....................................13Германчук В. Г.....................................100Гладышева А. В...................................262
Глазова Н. В.........................................109
Глебова Т. И.........................................146
Глущенко А. В.......................................41Гогина Я. С.............................................45Гончарова Н. И....................154, 187, 208Григорьева Т. Ю..................................331Гринева Е. Н........................................265Грищенко И. В.....................................353
Гудымо А. С.........................154, 187, 208Даниленко Д. М...................................203
Даниленко Е. Д......................................45Данильченко Н. В................................154Даулбаева К. Д.....................172, 213, 225Дерюшева И. В............................159, 166Дидыч Д. А....................................52, 350
Дмитриенко Е. В.............................16, 20
Долгова Е. В.........................................355
Дольский А. А.....................................269
Дорошков А. В.......................................24Дрозд У. С............................................271
Дручинина А. В.....................................86Дудко С. Г.....................................275, 369
Дульцев Ф. Н.......................................314Дурыманов А. Г...................................208Дыгало Н. Н.........................271, 379, 399
Дылева Ю. А........................................279
Дюдеева Е. С........................................314Евсеенко В. А......................................154Ёлкина Ю. А..........................................29Емельянова Л. А..................................141Еропкин М. Ю.....................................203

Есина Т. И..............................................45Ефремов Я. Р........................................355
Жаксылыков Н. Н................................114
Жарков Д. О.........................................387
Жирнов И. В..........................................13Жуатай А. Ш........................................114
Жуматов К. Х...............................213, 225Журавина М. А....................................283
Журавлев Е. С......................287, 322, 331Заморина С. А........................................48
Запарина О. Г.......................................292
Зарубин В. Н..........................................10Захаренко А. Л...............................72, 391
Захарова О. Д.................................72, 391
Зеленцова Е. А.....................................136Зенкова М. А................242, 318, 328, 395
Зибарева Л. Н.......................................129Зыбкина А. В...............................163, 347
Зырянова Д. П......................................294Ибрагимова М. К.........................159, 166Ильина Е. С....................................72, 391
Ильичева Т. Н......................................208Иматдинов А. Р....................................192Иматдинов И. Р....................................107Каверина Г. Б.......................................141Кадырбеков У. К..................................228Калинина Т. С......................250, 379, 399
Каплина О. Н...............................359, 369
Карамендин К. О.................172, 213, 225Карпенко Л. И..................3, 275, 359, 369
Карпов Д. С..........................................265Карташов М. Ю...................................179Касакин М. Ф.......................................331Касымбеков Е. Т..................172, 213, 225Каторкин С. А......................................190Кафтырева Л. А...................................255
Кель А. Э..............................................318
Кечин А. А...........................................255
Кирикович С. С...................................355
Кириллова Т. Ю...................................100Кисаретова П. Э..................................355
Кливлеева Н. Г.............................148, 170Климов Л. О.........................................283
Клопотова М. Р............................152, 221

Указатель авторов
Клотченко С. А....................................382
Ковалева Г. В.......................................297
Ковалева К. С.........................................72Ковнер A. В..................................258, 292
Кожевников В. А...................................38Кожевникова О. С................................375
Кожин П. М..........................................258
Козлова Ю. Н...............................152, 221Кокаев Г. С...........................................301
Колосов А. В..........................................86Колосова И. В......................................150Колосова Н. П......................154, 187, 208Колхидова З. А....................................301
Колчанов Н. А.....................................355
Кольцова Г. С...............................176, 190
Комиссаров A. B....................................26Комиссаров А. Б..................................331Компанеец И. Ю....................................69Конев В. П............................................306
Коновалова Н. И..................................203
Коновалова С. Н..................................262
Коршунов А. С....................................306
Костылева Н. И......................................26Кочетов А. В..........................................13Кравцов А. Л..........................................38Кривошеина Е. И.................................179Кропанева М. Д.....................................48
Кузнецов А. И................................52, 179
Кулешова А. Е......................................311
Кулигина Е. В......................................362
Куляшов М. А. ......................................56Купрюшкин М. С................................341
Курская О. Г.........................................258
Курусь Н. Н..........................................314Кыдырманов А. И...............172, 213, 225Қалқожаева М. Қ.........................148, 170Лаврик О. И...................................72, 391
Лазукин А. А..........................................60Лактионов П. П...................................365Ланшаков Д. А.............250, 271, 379, 399
Латышева Т. В......................................343
Лебедев Л. Р...........................................45
Ли-Жуланов Н. С.................................391
Литти Ю. В............................................64407

Лобкис М. А.........................................132Логашенко Е. Б....................242, 318, 395
Логунов Д. Ю......................................196Локтев В. Б...........................................262
Ломзов А. А.........................................314Лопез Э...................................................77Лузина О. А.........................................391
Лукманова Г. В....................................148Лысенко К. Н.......................................196Макарова Е. Н......................................246
Макарова М. А....................................255
Максименко Л. В.................................183
Максютов А. З.....................................150Максютов Р. А.............................150, 187
Маланин С. Ю.....................................331Малоголовкин А. С.....................176, 190
Мальцев C. В.......................................154Мальцева Н. А.......................................69Мамонтова Е. М....................................72Маркель А. Л.......................................283
Марков А. В.........................242, 318, 395
Марченко В. Ю............154, 187, 199, 208Матвеев А. Л........................................141Матвеева А. М.....................................322
Матвиенко Д. А...................................325Медина А...............................................77Мельников А. Д.....................................81Мельникова В. Е..................................196Мельникова Е. А...................................29Меркульева Ю. А..................................84Микрюкова Т. П...........................179, 262
Мима К. А............................................190Миргородская О. А.............................382
Мирошниченко С. К...........................328
Михеев В. Н.........................................132Михеева Э. Р..........................................64Можаева Е. В.......................................331Можайцев Е. С.....................................391
Мордвинов В. A...................................292
Морозова В. В..............136, 152, 221, 362
Морозова Д. Ю....................................192Мунгалов Р. В......................................335
Небова Ю. А........................................166Невинский Г. А......................94, 105, 239

408Некрасова Е. В.............................339, 403
Никитенко Н. А...................................196Никитин А. А.......................................339
Никифоров А. К.....................................26Николин В. П.......................................355
Новиков М. С.......................................196Новопашина Д. С................................387
Новоселов А. В....................................217Ножевникова А. Н.................................64Нуштаева А. А.....................................362
Овалле А................................................77Овчинникова М. В...............................100Озеров А. А..........................................196Онгарбаева Н. С..................................146
Онхонова Г. С......................................199
Орлов С. В...................................339, 403
Охлопкова О. В......................................86Павлова А. С........................................341
Пармон В. Н...................................90, 102Пасман Н. М........................................232Патутина О. А......................................328
Пахарукова M. Ю................................292
Пельтек С. Е...........................................56Петрова П. А........................................203
Пилигаев А. В................................90, 102Плеканчук В. С....................................343
Полежаева О. А...........................163, 347
Полуконова А. В..................................350Пономарева Е. П..................................262
Попова Н. А.........................................355
Поттер Е. А..........................................355
Прокудина О. И...................................343
Проскура К. В......................................365Проскурина А. С.................................355
Протасов А. В......................................382
Протопопова Е. В................................262
Пурвиньш Л. В......................................94Пурвиньш Я. В....................................353
Пышный Д. В......................................314Пьянкова А. А........................................97Раев М. Б................................................48
Разум К. В..............................................20Ракитина О. А........................................52Рахметова A. Ш...................................292

Резайкин А. В......................................217Рейниссон Й...........................................72Риттер Г. С...........................................355
Рихтер В. А..................................287, 362
Рогожин В. В........................................100Розалес Дж.............................................77Розанов А. С..........................................56Романенко С. П....................................132Рудометов А. П................................3, 359
Русскова Ю. И.......................................64Рыжиков А. Б.......................................154Рыжиков А. Б.......................187, 199, 208Рязанова М. А......................................343
Савельева А. В.....................................362
Савиновская Ю. И...............................362
Садуакасова М. А................................206
Сайфудинов З. А..................................112Сактаганов Н. Т...................................170Салахутдинов Н. Ф.....242, 318, 391, 395
Саломатина О. В..................242, 318, 395
Самков А. А...........................................60Самойлова Ю. В............................90, 102Сарана А. М.........................................255
Саятов М. Х.........................172, 213, 225Свердлов Е. Д......................................350Святченко С. В....................187, 199, 208Седых С. Е.....................................94, 105Сейдалина А. Б....................................225Семакова А. П......................................100Семенов Д. В...............287, 322, 331, 362
Сенькова А. В......................................328
Сергеева М. В......................................331Середа А. Д..........................................192Сидоров В. Ю......................................117Синицкий М. Ю..................................279
Синицына Н. В......................................26Скрипкин С. С.....................................107Скударнов С. Е....................................183
Слепнева А. В......................................258
Сомов А. К...........................................365Сонец И..................................................77Сорокина К. Н...............................90, 102Спасская Д. С......................................265Старостина Е. В...................................369

Указатель авторов
Стахеева М. Н......................................365Степанов Г. А...............287, 322, 331, 328
Стучаева А. А......................................109
Субботина К. В....................................372
Суворов Г. К.........................................375
Сулейменова С. А................172, 213, 225Султанов А. А......................................206
Султанов С. А......................................112Султанова А. Ж...................................114
Сульгин А. А........................................117Суслов Е. В..........................................391
Суслопаров И. М.................154, 187, 208Сухарева Е. В...............................250, 379
Тамкович С. Н......................................365Таранов О. С........................................355
Тараскин А. С......................................382
Телегина Д. В.......................................375
Терновой В. А......................................262
Тикунов А. Ю......................................221Тикунова Н. В..............................136, 141Тимганова В. П......................................48
Тимофеева М. М..................................322
Тисленко Д. С........................................60Титов И. А............................................176Ткачёв С. Е...........................................141Ткаченко Е. И.......................................123Томилин М. А........................................13Томилов А. А.........................................86Тотменин А. В.....................183, 228, 294Трегубчак Т. В..............................150, 208Тугелбай Г. Е........................................114
Тугутова Е. А.......................................365Тумабаева А. И....................................114
Тухватулин А. И..................................196Усольцева П. С.....................................217Ушакова Т. А........................................136Федорова-Гоголина И. А........................7Федотова С. А......................................369
Филимонов А. С..................................391
Филипенко Е. А.....................................13Филипенко М. Л..................................255
Филиппова Ю. А.................................322
Филоненко Е. С...................................129409

Фишман В. С.......................................335
Фофанов М. В..............................136, 221Хабардина Е. А....................................387
Хабарова А. А......................................335
Хан Е. Я................................172, 213, 225Хестанова Р. А.....................................301
Холматов К. И......................................126Хоменко Т. М.......................................391
Хомколова В. В....................................228Хонина Н. А.........................................232Храмцов П. В.........................................48
Цыганов М. М.............................159, 166Чаусов Е. В...........................................262
Челобанов Б. П....................................328
Чепанова А. А......................................391
Чернова Н. А..........................................64Черных Е. Р..........................................232Чикаев А. Н..........................................359
Чурина М. А........................................255Чэн С....................................................395Шабурова Е. В.....................................399
Шавва В. С...................................339, 403
Шаменова М. Г....................................146
Шах Махмуд Р. ...................................331Швалов А. Н................................208, 262
Шевелёв Г. Ю......................................314Шекунов Е. В.........................................41Шендер В. О........................................287
Шулюпова А. С...................................253Щербак С. Г.........................................255
Щербаков Д. Н...........3, 84, 163, 347, 359
Эрст А. А..............................................129Юнусова Н. В......................................365
Юрк Д. Е..............................................132Юрченко К. С........................................41Юшина М. Н............................................7Яковлева Т. В.......................................246
Яньшоле В. В.........................................81Яровая О. И............................................72Ященко С. В.........................................183

410cОГЛАВЛЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1БИОТЕХНОЛОГИЯ
Андреева Н. Б., Рудометов А. П., Бакулина А. Ю., Карпенко Л. И.,Щербаков Д. Н. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ YKUJ И TBI
В КАЧЕСТВЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ВИЧ-ИММУНОГЕНОВ..................................................................................... 3Ашба А. М., Юшина М. Н., Федорова-Гоголина И. А., Бобров М. Ю.
ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ И ПРОЛИФЕРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ
ЭНДОКАННАБИНОИДА N-АРАХИДОНОИЛДОФАМИНАНА СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЭКТОПИЧЕСКОГОИ ЭУТОПИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИЯ........................................................... 7Бабич П. И., Зарубин В. Н. БИОРИТМЫ И ПРИНЦИП
РИТМИЧНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ................................. 10Байрамова Д. О., Томилин М. А., Жирнов И. В., Филипенко Е. А.,Герасимова С. В., Кочетов А. В. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА ОБОЛОЧКИСР БАКТЕРИОФАГА MS2 В РАСТИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ
ЭКСПРЕССИИ НА МОДЕЛИ NICOTIANA TABACUM................................ 13Бердюгин А. А., Дмитриенко Е. В. ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ
ДЕТЕКТИРУЕМОЙ СРЕДЫ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ БИОСЕНСОРОМ НА ОСНОВЕ
ПОЛЕВОГО ТРАНЗИСТОРА СО СТРУКТУРОЙ «КРЕМНИЙНА ИЗОЛЯТОРЕ»............................................................................................. 16Оглавление

411

Бобрикова Е. Н., Разум К. В., Дмитриенко Е. В. ПОЛУЧЕНИЕ
НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ С РЕГУЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ
НЕЙЛОНА-6 И ЕГО КОМПОЗИТОВ............................................................. 20Бобровских А. В., Дорошков А. В. МОДЕЛИРОВАНИЕ
АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
IN SILICO........................................................................................................... 24Борисова С. В., Бибиков Д. Н., Комиссаров A. B., Волох O. A.,Бадарин С. А., Синицына Н. В., Костылева Н. И., Никифоров А. К.
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ НА КАЧЕСТВО
ЛИОФИЛИЗАТОВ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНЫ..................... 26Булаев А. Г., Мельникова Е. А., Ёлкина Ю. А., Гавирова Л. А.
КОМБИНИРОВАННАЯ ГИДРОМЕТАЛЛУРГИЧЕСКАЯ
ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ МЫШЬЯКСОДЕРЖАЩЕГО
МЕДНО-ЦИНКОВОГО КОНЦЕНТРАТА...................................................... 29Васиховская В. А. ПОЛУЧЕНИЕ CRISPR-АССОЦИИРОВАННОГО
РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА CPF1............................................................ 34Генералов С. В., Кравцов А. Л., Кожевников В. А., Гаврилова Ю. А.,Абрамова Е. Г. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
УРОВНЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ПРЕПАРАТЕ
АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА.......................................... 38Глущенко А. В., Шекунов Е. В., Юрченко К. С. ИССЛЕДОВАНИЕ
МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ПРИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОМ
ДЕЙСТВИИ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА........................................... 41Есина Т. И., Волосникова Е. А., Гогина Я. С., Лебедев Л. Р.,Даниленко Е. Д. РАЗРАБОТКА МЕТОДА CИНТЕЗА
КОНЪЮГАТОВ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАГАЛЬНОГО
КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА С АЛЕНДРОНОВОЙ
КИСЛОТОЙ....................................................................................................... 45Кропанева М. Д., Храмцов П. В., Бочкова М. С., Тимганова В. П.,Заморина С. А., Раев М. Б. РАЗРАБОТКА МЕТОДА СИНТЕЗА
БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ЯМР-АНАЛИЗА.................................................... 48

412Кузьмич A. И., Ракитина О. А., Дидыч Д. А. ПОЛУЧЕНИЕ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ГИСТОНОВ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДНКВ КЛЕТКИ ОПУХОЛЕВОЙ СТРОМЫ.......................................................... 52Куляшов М. А. , Акбердин И. Р., Розанов А. С., Пельтек С. Е.
ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕРОДА В GEOBACILLUS
ICIGIANUS НА ОСНОВЕ МЕТОДА ПОТОКОВОГО
МОДЕЛИРОВАНИЯ......................................................................................... 56Лазукин А. А., Волченко Н. Н., Самков А. А., Тисленко Д. С.,Архипова А. С. ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОБНОГО
ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА ДНЕ ПРИБРЕЖНОЙ ЗОНЫЧЕРНОГО МОРЯ.............................................................................................. 60Литти Ю. В., Русскова Ю. И., Чернова Н. А., Ножевникова А. Н.,Михеева Э. Р. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИХ МАТЕРИАЛОВНА СКОРОСТЬ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЛЕТУЧИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
ТЕРМОФИЛЬНЫМ МЕТАНОГЕННЫМ СООБЩЕСТВОМ
МИКРООРГАНИЗМОВ................................................................................... 64Мальцева Н. А., Компанеец И. Ю., Баранова С. В. ОСОБЕННОСТИ
ГИДРОЛИЗА ГИСТОНА Н1 И ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА
ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙВ ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ.......................................................................... 69Мамонтова Е. М., Ковалева К. С., Захаренко А. Л., Яровая О. И.,Рейниссон Й., Захарова О. Д., Ильина Е. С., Лаврик О. И.
ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ДНК ТИРОЗИЛ-ДНКФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 1 (TDP1) И ЕГО ПРИРОДНОГО МУТАНТА
SCAN1 КАК ПРОТОТИПЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ.............. 72Медина А., Овалле А., Лопез Э., Розалес Дж., Сонец И.
ЗАПОЛНЕНИЕ ПРОБЕЛОВ ПРОЕКТНОГО ГЕНОМА
S. PASTORIANUS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННЫХ
СЕКВЕНИРОВАНИЯ ILLUMINA.................................................................. 77Мельников А. Д., Яньшоле В. В. ОБНАРУЖЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ
ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ЯЗВЫ МЕТОДАМИ МЕТАБОЛОМИКИ................... 81Меркульева Ю. А., Бондарь А. А., Щербаков Д. Н. ПОЛУЧЕНИЕ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ
С BACILLUS THURINGIENSIS........................................................................ 84Оглавление

413

Охлопкова О. В., Томилов А. А., Дручинина А. В., Колосов А. В.
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ФИЗИЧЕСКИХ
ФАКТОРОВ НА СКОРОСТЬ ДОСТИЖЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО
ВОЗРАСТА НЕПАРНЫМ ШЕЛКОПРЯДОМ
(LYMANTRIA DISPAR L)................................................................................ 86Пилигаев А. В., Сорокина К. Н., Самойлова Ю. В., Пармон В. Н.
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММОВ МИКРОВОДОРОСЛЕЙС ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЛИПИДОВ И КРАХМАЛАДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОДИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОЭНЕРГЕТИКЕ................................................ 90Пурвиньш Л. В., Седых С. Е., Невинский Г. А. ЭКЗОСОМЫ
МОЛОКА: ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, АНАЛИЗ БЕЛКОВИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ........................................................................ 94Пьянкова А. А., Ананьина Л. Н. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА CHROMOHALOBACTER
SP. TC193 ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ БИОСИНТЕЗА ЭКТОИНА....................... 97Рогожин В. В., Овчинникова М. В., Кириллова Т. Ю.,Семакова А. П., Германчук В. Г. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ
ВИДОВ АНЕСТЕЗИИ ЖИВОТНЫМ-ПРОДУЦЕНТАМ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК........................................................ 100
Самойлова Ю. В., Пилигаев А. В., Сорокина К. Н., Пармон В. Н.
КОЭКСПРЕССИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЭСТЕРАЗЫ БАКТЕРИИ
UREIBACILLUS THERMOSPHAERICUS С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ
ШАПЕРОНАМИ В E. COLI И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕ СВОЙСТВ............ 102
Седых С. Е., Невинский Г. А. БИСПЕЦИФИЧНЫЕ
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ: СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯИ ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ..................................................... 105
Скрипкин С. С., Иматдинов И. Р. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ
АНТИГЕНОВ ВИРУСА ЛАССА В ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ
СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ............................................................................ 107
Стучаева А. А., Глазова Н. В. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ................................................................... 109

414Султанов С. А., Сайфудинов З. А. БЫСТРОЕ ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ
ОБНАРУЖЕНИЕ МУТАЦИЙ ГЕНА RPOB И KATG
В КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТАХ M. TUBERCULOSISС ПОМОЩЬЮ HAIN MTB/DR SL У ДЕТЕЙС ТУБЕРКУЛЕЗОМ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ.................................................... 112
Султанова А. Ж., Тумабаева А. И., Жуатай А. Ш.,Жаксылыков Н. Н., Тугелбай Г. Е. ИЗУЧЕНИЕ АНТИФУНГАЛЬНЫХ
СВОЙСТВ ПОЛИЕНОВОГО АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИНАВ ОТНОШЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
КАНДИДОЗНОГО ВУЛЬВОВАГИНИТА.................................................... 114
Сульгин А. А., Сидоров В. Ю. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ИЗ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ
КЛЕТОК АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВИ МОДЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ..................................................................... 117
Ткаченко Е. И. ПОВЫШЕНИЕ КОРРОЗИОННОЙ СТОЙКОСТИ
СТАЛИ 12Х18Н10Т, ПОЛУЧЕННОЙ МЕТОДОМ
ВНЕВАКУУМНОЙ ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВОЙ НАПЛАВКИ................. 123
Холматов К. И., Антонычева М. В., Волох О. А., Вахрушина Н. И.,Белоусов А. Д., Астафьева С. В., Авдеева Н. Г. ПРИМЕНЕНИЕ
КАСКАДНОЙ ФИЛЬТРАЦИИ В ПРИГОТОВЛЕНИИ
ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ПРИ ГЛУБИННОМ
КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВАКЦИННОГО ШТАММА
ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА................................................................... 126
Эрст А. А., Зибарева Л. Н., Филоненко Е. С. СТРАТЕГИЯ
УСИЛЕНИЯ БИОСИНТЕЗА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ
ЭКДИСТЕРОИДОВ В КУЛЬТУРЕ HAIRY ROOTS ВИДОВ
РОДА SILENE L............................................................................................... 129
Юрк Д. Е., Михеев В. Н., Романенко С. П., Лобкис М. А.
ПРОДУКТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ
БИОИНЖЕНЕРИИ......................................................................................... 132

Оглавление

415

РАЗДЕЛ 2ВИРУСОЛОГИЯ
Байков И. К., Зеленцова Е. А., Морозова В. В., Ушакова Т. А.,Боковая О. В., Фофанов М. В., Тикунова Н. В. МАСССПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ СТРУКТУРНЫХ
БЕЛКОВ ЛИТИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА PM135,
ПОРАЖАЮЩЕГО PROTEUS MIRABILIS.................................................. 136
Байков И. К., Матвеев А. Л., Ткачёв С. Е., Емельянова Л. А.,Каверина Г. Б., Тикунова Н. В. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА CH14D5 С ТРЕТЬИМ ДОМЕНОМ
ГЛИКОПРОТЕИНА Е РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ ВИРУСА
КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА..................................................................... 141
Баймухаметова А. М., Байсейіт С. Б., Онгарбаева Н. С.,Шаменова М. Г., Глебова Т. И. ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА АИ В СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЕ СЕЗОНЫ
2017–2018 ГГ. НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН............. 146
Байсейiт С. Б., Қалқожаева М. Қ., Лукманова Г. В., Кливлеева Н. Г.
АНАЛИЗ ЭПИДСИТУАЦИИ ПО ГРИППУ
В 2017–2018 ГГ. В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН....................................... 148
Бауэр Т. В., Трегубчак Т. В., Максютов А. З., Колосова И. В.,Гаврилова Е. В., Максютов Р. А. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ
ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ
IN VITRO И IN VIVO ...................................................................................... 150
Боковая О. В., Козлова Ю. Н., Клопотова М. Р., Морозова В. В.
ПОЛНОГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ БАКТЕРИОФАГА KP8,СПЕЦИФИЧНОГО К БАКТЕРИИ KLEBSIELLA PNEUMONIA................ 152
Гудымо А. С., Евсеенко В. А., Колосова Н. П., Мальцев C. В.,Буланович Ю. А., Гончарова Н. И., Данильченко Н. В.,Марченко В. Ю., Суслопаров И. М., Рыжиков А. Б.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСТРАКТА КЛУБНЕЙ ЦИКЛАМЕНА
ЕВРОПЕЙСКОГО В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТА
ТРИВАЛЕНТНОЙ ГРИПОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ
ИММУНИЗАЦИИ МОРСКИХ СВИНОК.................................................... 154

416Дерюшева И. В., Ибрагимова М. К., Цыганов М. М. ИНТЕГРАТИВНАЯИ ЭПИСОМАЛЬНАЯ ФОРМЫ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА
16 ГЕНОТИПА В ИЗМЕНЕННОМ ЦЕРВИКАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ...... 159
Зыбкина А. В., Полежаева О. А., Щербаков Д. Н. ИНДУКЦИЯ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА Y, ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК.......................................................... 163
Ибрагимова М. К., Дерюшева И. В., Небова Ю. А., Цыганов М. М.
БЕЗРЕЦИДИВНАЯ И ОБЩАЯ ВЫЖИВАЕМОСТЬ БОЛЬНЫХ
ВПЧ-АССОЦИИРОВАННЫМ И ВПЧ-НЕГАТИВНЫМ РАКОМ
ШЕЙКИ МАТКИ............................................................................................ 166
Қалқожаева М. Қ., Сактаганов Н. Т., Баймухаметов А. М.,Кливлеева Н. Г. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНА ГРИПП ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕЙ В КОСТАНАЙСКОЙ
ОБЛАСТИ КАЗАХСТАНА В 2018 Г............................................................. 170
Касымбеков Е. Т., Карамендин К. О., Кыдырманов А. И., Саятов М. Х.,Даулбаева К. Д., Хан Е. Я., Сулейменова С. А. ПОЛНОГЕНОМНЫЙ
АНАЛИЗ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА, ИЗОЛИРОВАННОГООТ СИЗОГО ГОЛУБЯ В ЮЖНОМ КАЗАХСТАНЕ В 2015 ГОДУ............ 172
Кольцова Г. С., Титов И. А., Малоголовкин А. С.
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙС ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНА EP402R........................................................................ 176
Кривошеина Е. И., Кузнецов А. И., Карташов М. Ю.,Микрюкова Т. П., Акимова А. С. ПОИСК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 4 И 5 ГЕНОТИПОВ В КЛЕЩАХ,СНЯТЫХ С ЛЮДЕЙ В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ В 2017 ГОДУ......179Максименко Л. В., Тотменин А. В., Скударнов С. Е., Ященко С. В.,Гашникова Н. М. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ
ВИЧ-1 В КРАСНОЯРСКОМ КРАЕ: ГОРЯЧАЯ ТЕРРИТОРИЯ
РЕКОМБИНАЦИИ ВИРУСА........................................................................ 183
Марченко В. Ю., Колосова Н. П., Гончарова Н. И.,Суслопаров И. М., Гудымо А. С., Святченко С. В., Гаврилова Е. В.,Максютов Р. А., Рыжиков А. Б. ВЫДЕЛЕНИЕИ ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ВЫСОКОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА
H5NX, ВЫДЕЛЕННЫХ В РОССИИ............................................................ 187

Оглавление

417

Мима К. А., Кольцова Г. С., Каторкин С. А., Малоголовкин А. С.
РЕКОМБИНАЦИОННАЯ КАССЕТА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВИРУСА
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙС ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНОВ MGF110.................................................................... 190
Морозова Д. Ю., Иматдинов А. Р., Середа А. Д. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ
ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ............................................ 192
Никитенко Н. А., Гейсман А. Н., Мельникова В. Е., Лысенко К. Н.,Тухватулин А. И., Озеров А. А., Новиков М. С., Логунов Д. Ю.
ПРОИЗВОДНЫЕ 2-ТИОУРАЦИЛА — ИНГИБИТОРЫ
РЕПЛИКАЦИИ АДЕНОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА....................................... 196
Онхонова Г. С., Марченко В. Ю., Святченко С. В., Рыжиков А. Б.
РЕЦЕПТОРНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА
А/H3N2 И А/H9N2, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ
В 2017–2018 ГГ. В РОССИИ.......................................................................... 199
Петрова П. А., Коновалова Н. И., Даниленко Д. М., Васильева А. Д.,Еропкин М. Ю. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНТИГЕННЫХ
СВОЙСТВ ВИРУСОВ ГРИППА А(H3N2), ЦИРКУЛИРОВАВШИХВ РОССИИ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ СЕЗОН 2017–2018 ГГ........................ 203
Садуакасова М. А., Султанов А. А., Банковска К. Б. РАЗРАБОТКА
СПЕЦИФИЧНЫХ РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯОБНАРУЖЕНИЯ СЕРОТИПА ВИРУСА ЯЩУРА ASIA1 ........................ 206
Святченко С. В., Дурыманов А. Г., Колосова Н. П., Швалов А. Н.,Гончарова Н. И., Суслопаров И. М., Гудымо А. С., Марченко В. Ю.,Трегубчак Т. В., Рыжиков А. Б., Ильичева Т. Н. ПОЯВЛЕНИЕ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, ОПОСРЕДОВАННОЙ
НЕЙРАМИНИДАЗОЙ, ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ СЕЗОННЫХ
ШТАММОВ A(H3N2) В КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ MDCK........................... 208
Сулейменова С. А., Жуматов К. Х., Кыдырманов А. И.,Карамендин К. О.,Хан Е. Я., Касымбеков Е. Т., Даулбаева К. Д.,Саятов М. Х. ФИЛОГЕНЕЗ ГЕНОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНАИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ШТАММА
ВИРУСА ГРИППА А (Н5N1), ВЫДЕЛЕННОГООТ ЧАЙКИ В КАЗАХСТАНЕ В 2015 Г........................................................ 213

418

Усольцева П. С., Резайкин А. В., Новоселов А. В. МЕХАНИЗМЫ
СЕЛЕКЦИИ ВИРУСА ECHO11 ПРИ АДАПТАЦИИ К КУЛЬТУРАМ
КЛЕТОК RD И Л-41 КД/84............................................................................ 217
Фофанов М. В., Клопотова М. Р., Козлова Ю. Н., Тикунов А. Ю.,Морозова В. В. АНАЛИЗ ГЕНОМОВ БАКТЕРИОФАГОВ,ИНФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИИ РОДА KLEBSIELLA............................. 221
Хан Е. Я., Кыдырманов А. И., Карамендин К. О., Даулбаева К. Д.,Асанова С. Е., Касымбеков Е. Т., Сейдалина А. Б.,Сулейменова С. А., Жуматов К. Х., Саятов М. Х. ХАРАКТЕРИСТИКА
ГЕНОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И НЕЙРАМИНИДАЗЫ
ВИРУСА ГРИППА A/ФАЗАН/БАЛХАШ/6218/14 (H1N1)......................... 225
Хомколова В. В., Аникина А. Ю., Тотменин А. В., Бекболотов А. А.,Кадырбеков У. К., Гашников Н. М. ИССЛЕДОВАНИЕ ВИЧ-1СРЕДИ ЛИЦ, ЖИВУЩИХ С ВИЧ В РЕСПУБЛИКЕ КЫРГЫЗСТАН,ВЫЯВИЛО ЗНАЧИМЫЕ ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЕ ОТЛИЧИЯ................... 228

РАЗДЕЛ 3МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
Андреева Е. А., Хонина Н. А., Баторов Е. В., Пасман Н. М.,Черных Е. Р. МИКРОВЕЗИКУЛЫ В ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ
ЖИДКОСТИ У ЖЕНЩИН В ПРОГРАММЕ ЭКО...................................... 232
Аулова К. С., Невинский Г. А. ИММУНИЗАЦИЯ РАЗЛИЧНЫМИ
АНТИГЕНАМИ И ОБРАЗОВАНИЕ АНТИТЕЛПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АУТОИММУННОМ
ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ МЫШЕЙ................................................................ 239
Бабич В. О., Марков А. В., Саломатина О. В., Салахутдинов Н. Ф.,Зенкова М. А., Логашенко Е. Б. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ
ДЕЙСТВИЕ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ, НЕСУЩИХ ЦИАНО-ЕНОНОВЫЙ
ФАРМАКОФОР.............................................................................................. 242
Балыбина Н. Ю., Яковлева Т. В., Макарова Е. Н., Бажан Н. М.
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ОТВЕТ БУРОГО ЖИРА НА ОЖИРЕНИЕ,ИНДУЦИРОВАННОЕ ДИЕТОЙ, У САМЦОВ И САМОК МЫШЕЙ....... 246

Оглавление

419

Балык К. В., Сухарева Е. В., Ланшаков Д. А., Калинина Т. С.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СЕРОТОНИНОВОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА
ВЗРОСЛЫХ КРЫС ПОСЛЕ НЕОНАТАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ
ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И ДЕЙСТВИЯ
ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА........................................................................ 250
Батлук У. И., Бурдеева К. В., Шулюпова А. С., Бондарь Н. П.
ОТСТАВЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ НЕОНАТАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ
ДЕКСАМЕТАЗОНА: НАРУШЕНИЕ КОГНИТИВНЫХ
СПОСОБНОСТЕЙ ВЗРОСЛЫХ САМЦОВ МЫШЕЙИ ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГИППОКАМПЕ................... 253
Болдырева Д. С., Кечин А. А., Макарова М. А., Кафтырева Л. А.,Щербак С. Г., Апалько С. В., Филипенко М. Л., Сарана А. М.,Чурина М. А. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ
ЭНТЕРОАГРЕГАТИВНЫХ E. COLI ПО ДАННЫМ
ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ............................................. 255
Гайнутдинов П. И., Слепнева А. В., Курская О. Г., Кожин П. М.,Ковнер А. В. АКТИВАЦИЯ МИКРОГЛИИ КОРЫ НА ФОНЕИНФИЦИРОВАНИЯ НЕ НЕЙТРОПНЫМ ВИРУСОМ
ГРИППА А(H1N1) A/ TOMSK/13/2010........................................................ 258
Гладышева А. В., Терновой В. А., Пономарева Е. П.,Микрюкова Т. П., Протопопова Е. В., Швалов А. Н.,Коновалова С. Н., Чаусов Е. В., Локтев В. Б. ИЗУЧЕНИЕ
МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО
ЭНЦЕФАЛИТА К РАЗЛИЧНЫМ ВИДАМ ХОЗЯЕВ.................................. 262
Гринева Е. Н., Спасская Д. С., Карпов Д. С. СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ RPN4-ПОДОБНОГО БЕЛКА
ИЗ CANDIDA GLABRATA............................................................................... 265
Дольский А. А. ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ НЕКОДИРУЮЩИХРНК В РАЗВИТИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХС ЛОМКОЙ Х-ХРОМОСОМОЙ................................................................... 269
Дрозд У. С., Ланшаков Д. А. , Дыгало Н. Н. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА
РАННЕГО ОТВЕТА С-FOS В НЕЙРОНАХ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ
КОРЫ И СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ ЯДЕР СРЕДНЕГО МОЗГА
ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ СУБАНАСТЕТИЧЕСКОЙ ДОЗЫ КЕТАМИНАВ УСЛОВИЯХ ОСТРОГО СТРЕССА........................................................... 271

420Дудко С. Г., Антонец Д. В., Карпенко Л. И., Бажан С. И.
ИССЛЕДОВАНИЕ Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ,ИММУНИЗИРОВАННЫХ ДНК-ВАКЦИННЫМИ КОНСТРУКЦИЯМИ,КОДИРУЮЩИМИ ИСКУССТВЕННЫЕ ПОЛИЭПИТОПНЫЕ
ИММУННОГЕНЫ ВИРУСА ЭБОЛА........................................................... 275
Дылева Ю. А., Синицкий М. Ю. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ
ГЕНА ADIPOQ В ОБРАЗЦАХ ЖИРОВОЙ ТКАНИ РАЗЛИЧНОЙ
ЛОКАЛИЗАЦИИ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВС ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА................................................ 279
Журавина М. А., Климов Л. О., Маркель А. Л. АНАЛИЗ УРОВНЯРНК ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С БИОСИНТЕЗОМ ОКСИДА АЗОТА,У КРЫС С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНДУЦИРОВАННОЙ
СТРЕССОМ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ (НИСАГ)..................... 283
Журавлев Е. С., Шендер В. О., Ануфриева К. С., Семенов Д. В.,Рихтер В. А., Степанов Г. А. ПОЛНОТРАНСКРИПТОМНОЕИ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХРНК В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА..................................................................... 287
Запарина О. Г., Kовнер A. В., Рахметова A. Ш., Пахарукова M. Ю.,
Mордвинов В. A. ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ
АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ОПИСТОРХОЗЕ.............................................................................................. 292
Зырянова Д. П., Тотменин А. В., Богачева Н. В.,Гашникова Н. М. ПОЛУЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ КЛОНОВ CRF63_02A1 ВИЧ-1 С ТРОПИЗМОМК CCR5 И CXCR4 КОРЕЦЕПТОРАМ.......................................................... 294
Ковалева Г. В. ПОИСК БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА TRIM14........................................................................ 297
Колхидова З. А., Кокаев Г. С., Хестанова Р. А. ВОЗМОЖНОСТИ
РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ
ПАТОЛОГИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В СОХРАНЕНИИ
КАЧЕСТВА ЗДОРОВЬЯ И ПРОФИЛАКТИКЕ
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ................................................ 301

Оглавление

421

Коршунов А. С., Конев В. П. ИЗУЧЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО
КОМПОНЕНТА И ОРГАНИЧЕСКОГО МАТРИКСА ЭМАЛИ
ЗУБОВ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ
МИКРОСКОПИИ........................................................................................... 306
Кулешова А. Е., Боярских У. А. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА
ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ
ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ............................................ 311
Курусь Н. Н., Дульцев Ф. Н., Ломзов А. А., Шевелёв Г. Ю.,Дюдеева Е. С., Пышный Д. В. ИССЛЕДОВАНИЕ
ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ ДЕНАТУРАЦИИ
ДНК/ДНК-КОМПЛЕКСОВ МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ СПЕКТРОСКОПИИ................................................ 314
Марков А. В., Кель А. Э., Саломатина О. В., Салахутдинов Н. Ф.,Зенкова М. А., Логашенко Е. Б. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ
ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКОГО
ТРИТЕРПЕНОИДА СМ, НЕСУЩЕГО ЦИАНО-ЕНОНОВЫЙ
ФАРМАКОФОР: IN SILICO АНАЛИЗ......................................................... 318
Матвеева А. М., Филиппова Ю. А., Журавлев Е. С., Балахонова Е. А.,Тимофеева М. М., Семенов Д. В., Степанов Г. А. РЕГУЛЯЦИЯИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ МАЛЫХ
ЯДРЫШКОВЫХ РНК С ПРИМЕНЕНИЕМ СИСТЕМЫ СRISPR/CAS9....322
Матвиенко Д. А. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ХИМЕРНЫХ
АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ (CAR), СПЕЦИФИЧНЫХК БЕЛКАМ PSMA И PSCA............................................................................ 325
Мирошниченко С. К., Патутина О. А., Буракова Е. А., Сенькова А. В.,Челобанов Б. П., Стеценко Д. А., Власов В. В., Зенкова М. А.
N-МЕЗИЛ ФОСФОРАМИДНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ
ЭФФЕКТИВНО ИНАКТИВИРУЮТ ОНКОГЕННУЮ МИКРОРНК-21
IN VITRO И IN VIVO И ЯВЛЯЮТСЯ ДОСТОЙНОЙ
АЛЬТЕРНАТИВОЙ ФОСФОТИОАТНЫМ АНАЛОГАМ.......................... 328
Можаева Е. В., Степанов Г. А., Журавлев Е. С., Семенов Д. В.,Балахонова Е. А., Касакин М. Ф., Р. Шах Махмуд, Маланин С. Ю.,Григорьева Т. Ю., Сергеева М. В., Комиссаров А. Б. 293FT —МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ
ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А.............................................................. 331

422Мунгалов Р. В., Фишман В. С., Хабарова А. А. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
СИСТЕМЫ CRE/LOXP ДЛЯ ИНДУКЦИИ МНОЖЕСТВЕННЫХ
ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК В ГЕНОМЕ
КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.................................................................................... 335
Некрасова Е. В., Никитин А. А., Шавва В. С.,Орлов С. В.
АПОЛИПОПРОТЕИН А-1 В МАКРОФАГАХ ЧЕЛОВЕКА
УЧАСТВУЕТ В ЗАХВАТЕ АЦЕТИЛИРОВАННЫХ
ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ............................................ 339
Павлова А. С., Купрюшкин М. С. ИССЛЕДОВАНИЕ
СПОСОБНОСТИ К САМОАССОЦИАЦИИ
ДОДЕЦИЛ-СОДЕРЖАЩИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ............................. 341
Плеканчук В. С., Латышева Т. В., Прокудина О. И., Алехина Т. А.,Рязанова М. А. ЭКСПРЕССИЯ МРНК ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ
СИСТЕМЫ КАТЕХОЛАМИНОВ, УРОВЕНЬ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВВ ПОЛОСАТОМ ТЕЛЕ, СРЕДНЕМ И ПРОДОЛГОВАТОМ МОЗГЕИ РЕАКЦИЯ ПРЕСТИМУЛЬНОГО ТОРМОЖЕНИЯ У КРЫСС ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАТАТОНИЕЙ............................................................ 343
Полежаева О. А., Щербаков Д. Н., Зыбкина А. В.
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КЛАССА Y, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ
ВИРУС МАРБУРГ.......................................................................................... 347
Полуконова А. В., Дидыч Д. А., Свердлов Е. Д. ИССЛЕДОВАНИЕ
ЭКСПРЕССИИ СТРОМА-АССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВВ АЛЛОГРАФТНЫХ МОДЕЛЯХ ОПУХОЛЕЙ МЫШИ............................ 350
Пурвиньш Я. В., Грищенко И. В. СОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ
МОДЕЛИ (ЦГГ)N ПОВТОРА И ЕЕ ИССЛЕДОВАНИЕПРИ АКТИВНОЙ ТРАНСКРИПЦИИВ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ........................................................... 353
Риттер Г. С., Николин В. П., Попова Н. А., Кисаретова П. Э.,Долгова Е. В., Проскурина А. С., Поттер Е. А., Кирикович С. С.,Байбородин С. И., Таранов О. С., Ефремов Я. Р.,Колчанов Н. А., Богачев С. С. НОВЫЙ ПОДХОД К ПОИСКУ
РАДИОПРОТЕКТОРОВ................................................................................. 355

Оглавление

423

Рудометов А. П., Андреева Н. Б., Щербаков Д. Н., Бакулина А. Ю., Чикаев А. Н., Каплина О. Н., Карпенко Л. И.
ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ИММУНОГЕНОВ,НЕСУЩИХ ЭПИТОПЫ, УЗНАВАЕМЫЕ
ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ ВИЧ-1 АНТИТЕЛАМИ.................... 359
Савиновская Ю. И., Савельева А. В., Нуштаева А. А.,Морозов В. В., Кулигина Е. В., Рихтер В. А., Семенов Д. В.
ВЛИЯНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МЕМБРАННЫХ ЧАСТИЦ
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА — ЭКЗСОМ И МИКРОВЕЗИКУЛНА КЛЕТКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ А549................................................. 362
Сомов А. К., Тугутова Е. А., Проскура К. В., Тамкович С. Н.,Юнусова Н. В., Стахеева М. Н., Лактионов П. П. ПРОТЕАЗЫ
ЭКЗОСОМ КРОВИ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ........................... 365
Старостина Е. В., Федотова С. А., Дудко С. Г., Антонец Д. В.,Каплина О. Н., Карпенко Л. И., Бажан С. И. ИССЛЕДОВАНИЕ
СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДНК-ВАКЦИННЫХ
КОНСТРУКЦИЙ, КОДИРУЮЩИХ КОНСЕРВАТИВНЫЕ
ФРАГМЕНТЫ СТЕБЛЯ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И БЕЛОК М2ВИРУСА ГРИППА.......................................................................................... 369
Субботина К. В. ПОИСК МУТАЦИЙ В ГЕНАХ LEP И MC4R
У ПАЦИЕНТОВ С МОРБИДНЫМ ОЖИРЕНИЕМ.................................... 372
Суворов Г. К., Кожевникова О. С., Телегина Д. В. ГИБЕЛЬ
КЛЕТОК В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ И СЕТЧАТКЕ КРЫС OXYSНА СТАДИИ, ПРЕДШЕCТВУЮЩЕЙ
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫМ ИЗМЕНЕНИЯМ........................................... 375
Сухарева Е. В., Ланшаков Д. А., Калинина Т. С., Булыгина В. В.,Дыгало Н. Н. РОЛЬ БЕЛКОВ АР-1 КОМПЛЕКСАВ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ
ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ........................................................................ 379
Тараскин А. С., Протасов А. В., Клотченко С. А.,Миргородская О. А. ПРИЛОЖЕНИЕ МЕТОДА MALDI-TOF
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ
МАРКЕРОВ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ И СЕПСИСАВ СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА...................................................... 382

424

Хабардина Е. А., Новопашина Д. С., Вохтанцев И. П.,Жарков Д. О., Веньяминова А. Г. ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕРНК ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА............................................................... 387
Чепанова А. А., Захаренко А. Л., Захарова О. Д., Ильина Е. С.,Хоменко Т. М., Можайцев Е. С., Суслов Е. В., Ли-Жуланов Н. С.,Филимонов А. С., Лузина О. А., Волчо К. П., Салахутдинов Н. Ф.,Лаврик О. И. РАЗРАБОТКА ИНГИБИТОРОВ TDP1,
ОСНОВАННЫХ НА ПРИРОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЯХ.................................................................... 391
Чэн С., Марков А. В., Саломатина О. В., Салахутдинов Н. Ф.,Зенкова М. А., Логашенко Е. Б. ВВЕДЕНИЕ ГЕТАРИЛЬНЫХ
ЗАМЕСТИТЕЛЕЙ В СТРУКТУРУ ГЛИЦИРРЕТОВОЙ
КИСЛОТЫ УСИЛИВАЕТ ЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ................................... 395
Шабурова Е. В., Ланшаков Д. А., Калинина Т. С., Дыгало Н. Н.
ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА ЭКСПРЕССИЮ
НЕЙРОТРОФИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В ОБЛАСТЯХ
НЕОНАТАЛЬНОГО ГОЛОВНОГО МОЗГАС МОНОАМИНЕРГИЧЕСКОЙ ИННЕРВАЦИЕЙ...................................... 399
Шавва В. С., Некрасова Е. В., Орлов С. В. ИНСУЛИН
ПОДАВЛЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА С3 В ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ
КЛЕТКАХ ЛИНИИ HEPG2 ЧЕРЕЗ АКТИВАЦИЮ PPARΓ...................... 403

Научное издание

V МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ: БИОТЕХНОЛОГОВ,МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВИ ВИРУСОЛОГОВ
Сборник тезисов

Верстка А. С. Терешкиной

Подписано в печать 08.10.2018 г.
Формат 60 × 84 1/16. Уч.-изд. л. 26,6. Усл. печ. л. 24,7.
Тираж 150 экз. Заказ № 228.
Издательско-полиграфический центр НГУ
630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2.

Expertise in Pharmaceutical IndustryРешение дляБиоинженерии

ФокусБиотехнологии, биофармацевтика

Область применения

Антитела, рекомбинированные белки, вакцины, биологические продукты и продукты наоснове плазмы крови

Продукты

Культивация:> Ферментер
> Биореактор
Очистка:> Тангенциальная фильтрация потока
Вспомогательные системы:> Подготовка и хранение сред> Подготовка и хранение буферов
> Технологические сосуды

Сервис:> Интегрированные решения

> Хроматографические системы

> Колонны

> Системы непрерывной деактивации отходов
> In-line разбавление
> Разработка биотехнологических процессов

Помимо проведения собственных научных исследования, Tofflon привлекает глобальные
ресурсы для обеспечения заказчиков оптимизированными системными решениями.
Tofflon поставляет готовые решения, включая биотехнологическое оборудование исистемы начиная от подготовки питательных сред, культивации и сбора
микроорганизмов, очистки и приготовления буферов до финального розлива.

www.tofflon.com