13.神奈川県で検出されたカルバペネム耐性腸内細菌科細菌の分子疫学解析○政岡 智佳 （神奈川県衛生研究所）
鈴木 美雪 （神奈川県衛生研究所）【研究目的及び必要性】
カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(Carbapenem Resistance Enterobacteriaceae; CRE)感染症は、カルバペネム系薬剤に耐性を示す腸内細菌科の細菌による感染症で、「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律(感染症法)」に基づく 5 類全数把握疾患である。カルバペネム系薬剤は臨床において重要な治療薬の一つであり耐性菌の出現は医療上の大きな問題となっている。さらに、CRE のうちカルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌(Carbapenemase producing Enterobacteriaceae; CPE)は、カル
バペネマーゼ非産生性 CRE と比較してβ-ラクタム系薬以外の薬剤にも耐性を示す場合も多く、菌血症症例において予後が悪いとの報告もあり 1)、特に注意が必要である。
神奈川県は 2019 年の都道府県別の CRE 感染症発生報告数が東京都に次いで第 2 位となっており、全国的に見ても CRE 感染症の発生の多い地域であるといえる 2)。また、国内でもCRE による院内感染が報告されており 3)、地域で検出されている CRE 菌株について流行状況を把握することは重要であるといえる。
当所ではこれまで感染症法に基づく届出のあった CRE 菌株について、薬剤耐性遺伝子の検出やβ-ラクタム薬分解酵素の産生性確認等の検査を実施してきたが、菌株同士の比較を行うような調査は実施していなかった。そこで、本研究では、県内で検出されている CRE菌株の遺伝子型の分布状況を把握することを目的とし、当所に搬入された CRE 菌株について分子疫学解析を実施した。
【材料および方法】
2018 年度及び 2019 年度に当所に搬入された CRE 菌株のうち搬入株数の多かった

Enterobacter cloacae 37 株及び Klebsiella aerogenes 31 株について、解析を実施した。
解析にはパルスフィールドゲル電気泳動 (Pulsed-field gel electrophoresis: PFGE) 法を用いて、制限酵素 XbaⅠ及び SpeⅠを使用し、6 V/cm、パルスタイム 2.2～54.2 秒、12℃の 条 件 下 で 19 時 間 電 気 泳 動 し た 。 得 ら れ た 泳 動 パ タ ー ン に つ い て BioNumerics
Ver.6.6(Applied Maths 社)を用いてクラスター解析し、菌種ごとにデンドログラムを作成した。得られた遺伝子型と、菌株が検出された地域(8 地区(A～H))、搬入時期及び薬剤耐性遺伝子保有状況などの疫学情報を合わせて分子疫学解析を実施した。
【結果及び考察】PFGE で得られたバンドパターンについて類似度 90%で解析を実施したところ、E. cloacae
では XbaⅠ及び SpeⅠのどちらの解析でも 5 つのクラスターが確認された(クラスターⅠ～

Ⅴ)。XbaⅠを用いた解析の結果を図 1 に示した。XbaⅠで形成されたクラスターⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴは SpeⅠでも同じ菌株によってクラスターが形成されたが、クラスターⅢでは XbaⅠで 3株(No.15、No.16、No.17)含まれていたのに対し、SpeⅠでは 2 株(No.16、No.17)のみとなった。しかし、SpeⅠでクラスターに含まれなかった No.15 の菌株も No.16 及び No.17 の菌株と類似度が 88.2%と比較的高く、さらに検出された地域及び薬剤耐性遺伝子が一致しておりこれらの菌株は関連があることが疑われた。このことから、今回解析を実施した E.

cloacae では制限酵素 XbaⅠと SpeⅠによる識別能に大きな差はないと考えられた。一方、
K. aerogenes では XbaⅠによる解析ではクラスターは形成されず、SpeⅠを用いた解析では2 つのクラスターが形成された(図 2、クラスターⅥ、Ⅶ)。クラスターⅥの No.44 及び No.45
は XbaⅠでは類似度 72.2%で、薬剤耐性遺伝子はどちらの菌株も検出されず、搬入時期は 1年以上離れており、検出された地域も異なっていたため散発例だと考えられた。一方、クラスターⅦを形成した No.38 及び No.39 は XbaⅠでは類似度 86.7%で、両菌株ともに薬剤耐性遺伝子は検出されず、搬入時期は 5 ヶ月離れていたが、検出された地域は同一であり関連が疑われた。これらのことから、菌株の関連性については、遺伝子型別以外の検査結果や疫学情報も用いて総合的に判断していく必要があると考えられた。

E. cloacae で XbaⅠを用いた解析において形成されたクラスターⅠ、Ⅱ、Ⅲ及びⅣでは、各クラスターを構成する菌株の検出地域及び薬剤耐性遺伝子の検出状況が一致していた。
クラスターⅤでは薬剤耐性遺伝子の検出状況は異なっていたが、検出地域は同じであった。
遺伝子型だけでなく検出地域や薬剤耐性遺伝子の検出状況が一致していることから、各クラスター内の菌株が同一クローンである可能性が示唆された。また、クラスターⅣを除く他のクラスターは菌株が搬入された時期が半年以上あいていた。特にクラスターⅡでは 1年以上の期間をあけて検出された菌株が含まれており、地域によっては同一クローンの菌株が半年以上にわたって維持されていることが明らかとなった。
次に、クラスターを形成した E. cloacae 11 株中 10 株が IMP 型のカルバペネマーゼ遺伝子を保有する CPE であった。カルバペネマーゼ遺伝子の多くはプラスミド上に存在することが知られており、クラスターⅤで No.21 と No.22 の薬剤耐性遺伝子の検出状況が異なっていたのは、No.22 の菌株ではカルバペネマーゼ遺伝子を含むプラスミドが脱落した可能性が考えられた。また、PFGE の遺伝子型が異なっていても、カルバペネマーゼ遺伝子を保有する同一プラスミドの水平伝達による院内感染も報告されており 4)、疫学情報で菌株の関連性が疑われる場合はプラスミドの全塩基配列解析などのさらなる解析を実施する必要があると考えられた。
今回の調査によって神奈川県内では、K. aerogenes による CRE 感染症の発生は遺伝子型が多様であり散発例が多いと考えられた一方で、E. cloacae では CRE の中でも特に注意の必要な CPE の同一クローンが、地域によっては半年以上にわたって維持されていることを明らかにすることができた。CRE 感染症のように病原体に複数の菌種が含まれている場合でも同一菌種間においては PFGE による遺伝子型別は有効であり、さらに菌株の薬剤耐性遺伝子の保有状況や他の疫学情報と合わせることで、地域における病原菌の分布状況をより正確に把握することができ感染症対策に役立てることができると考えられた。

【今後の課題】
プラスミドによる薬剤耐性遺伝子の水平伝播が起こりうる CRE 感染症では、PFGE による遺伝子型が異なっていても同一プラスミドによる院内感染等の恐れがある。さらに、プラスミドは異なる菌種にも伝播する可能性があるため、菌株の疫学情報を収集し関連が疑われる場合は PFGE による遺伝子型や菌種が異なっていても、プラスミドの全塩基配列解析などのより詳細な解析が必要であると考えられた。CRE 感染症は、国内での発生が増加しているだけでなく、海外からの持ち込みも問題となっており、今後も地域で流行している株について把握するためにも監視を続けていく必要があると考えられた。

908070605040

類似度

100

菌株
No.

薬剤耐性遺伝子地域 搬入年月

カルバペ
ネマーゼ

ESBL※

1G2019.6IMP

2G

2019.12IMP

3A

2018.74H

2018.7 IMP,NDM

5B

2020.1

6H

2019.127C

2018.7

8

C

2018.8IMP

9G

2020.1IMP

10G

2020.2

IMP

11G

2018.12IMP

12A

2019,213

B

2019.1214

B

2018.715

C

2019.6IMP

CTX-M-9 group

16C

2019.11IMP

CTX-M-9 group Ⅲ

17C

2019.12IMP

CTX-M-9 group18

G

2018.6

IMP19

H

2019.7IMP

20

H

2019.7IMP21A2019.5IMP

22A

2019.1223

B

2019.524F

2019.725G

2020.1

26

B

2019.827

H

2019.1128

H

2018.729

B

2018.730

E

2019.1131

H

2018.932

B

2018.1233

A

2019.1034B

2018.735G

2019.536

A

2018.937

H

2018.12Ⅰ

IMP

Ⅱ

IMP
TEM

※ESBL:Extended spectrum β-lactamase

図 1 制限酵素 XbaⅠを用いた E. cloacae の解析結果

ⅣⅤ

SHV

CTX-M-9 group

CTX-M-9 group

100

90

80

類似度

70

60

50

菌株
No.

耐性遺伝子
地域

搬入年月 カルバペ
ネマーゼ

53

H

2019.555

F

2018.454

H

2018.557

B

2019.448

C

2019.140

A

2018.765

F

2018.1062

E

2018.663B

2018.843G

2018.1156

F

2018.1258

H

2019.1159

E

2019.1247

F

2018.951

H

2018.961

F

2018.468

B

2018.964

B

2019.449

H

2019.650

B

2019.944H

2019.1145

E

2018.646

B

2018.666

B

2019.1

60

B

2018.1052

B

2019.1

42

B

2019.738

B

2019.639

B

2019.1141

H

2018.1167

B

2018.11

図 2 制限酵素 SpeⅠを用いた K. aerogenes の解析結果

ESBL

ⅥⅦ

CTX-M-9 group【参考文献】
1) 病原微生物検出情報．Vol.40，8-9(2019)2) 感染症発生動向調査事業年報 2019 年(令和元年)確定報告データ: 厚生労働省健康局
結核感染症課、国立感染症研究所感染症疫学センター．https://www.niid.go.jp/niid/ja/allarticles/surveillance/2270-idwr/nenpou/10115-idwr-nenpo2019.html
3) 阿部孝一ら: 郡山市保健所管内における KPC 型カルバペネム耐性腸内細菌科細菌による院内感染事例，病原微生物検出情報，Vol.40，11(2019)4) 安部朋子ら: 病原微生物検出情報，Vol.35，289-290(2014)【経費使途明細】
使途金額

消耗品費（試薬：制限酵素

XbaⅠ）

55,660 円

消耗品費（試薬：制限酵素

SpeⅠ 1500U）

26,400 円

消耗品費（試薬：ProteinaseK（PK）Solution）
事務費（振込手数料）

62,590 円
660 円

消耗品費（試薬：SpeⅠ 300U）

15,620 円

消耗品費（試薬：SeaKem Gold Agarose）

108,020 円

事務費（振込手数料）990 円

消耗品費（器材：ロングハイパーフィルターチップシステムラック）
事務費（振込手数料）

29,480 円
770 円

合計

大同生命厚生事業団助成金

300,190 円
300,000 円