平成 29 年度 鹿児島大学大学院連合農学研究科
先進的研究推進事業報告書

鹿児島大学大学院連合農学研究科
平成 30 年 6 月 28 日

【事業一覧】
1. スサビノリに含まれるフロリドシドの高度利用に向けた研究
代表者：佐賀大学 光武進

2. 「黒麹菌・白麹菌研究拠点形成」に向けた網羅的遺伝子発現解析とネットワーク構築
代表者：琉球大学 外山 博英
3. 地すべり発生の早期検知を実現する IoT 減災クラウドシステムの構築
代表者：琉球大学 中村 真也
4. 食品機能成分におけるバイオアベイラビリティ予測のためのモデル構築
代表者：鹿児島大学(農) 坂尾 こず枝
5. 高速かつ安定的に豚糞を処理するメタン発酵種汚泥の解析と開代表者：鹿児島大学(農) 石橋 松二郎

は じ め に大学院連合農学研究科長
籾 井 和 朗鹿児島大学大学院連合農学研究科では、平成２９年度先進的研究事業を推進するために研究科長裁量経費の一部を研究支援費に充て募集を行いました。本研究事業に応募頂きました先生方に深く感謝申し上げます。
その結果、申請研究１５件の応募があり、代議委員会による慎重な審査（代議委員９名による１次審査、別の代議委員４名による２次審査）により、佐賀大学１件、琉球大学２件、及び鹿児島大学（農）２件の計５件の事業を採択しました。また、研究分野は、応用生命科学系４件、農水圏資源環境科学系１件とそれぞれの分野における先進的研究及び地域課題研究の推進に大きく貢献すると思われるものを選び、総額１，２００万円の事業となりました。
研究課題としては、・スサビノリに含まれるフロリドシドの高度利用に向けた研究
・「黒麹菌・白麹菌研究拠点形成」に向けた網羅的遺伝子発現解析とネットワーク構築
・地すべり発生の早期検知を実現するIoT減災クラウドシステムの構築
・食品機能成分におけるバイオアベイラビリティ予測のためのモデル構築
・高速かつ安定的に豚糞を処理するメタン発酵種汚泥の解析と開発であり、農水産学にとって欠かせない研究に取り組んだものになりました。
事業採択決定が９月であり、十分な研究期間の確保が難しかったと思われますが、提出された報告書を見ますとそれぞれ貴重な成果が得られており、本研究推進事業は順調に進んだと判断できます。さらに今年度は、平成30年3月28日に先進的研究推進事業成果発表会を、SINETを利用して開催し、構成大学教職員及び学生に研究成果の紹介を行うことができました。今後、これらの研究が益々発展して、連合農学研究科の基盤的研究となり外部資金の獲得に繋がっていくことや連大生の教育研究に大いに貢献することを期待しております。
連大の優れた研究成果を世界に発信するという使命を元に本研究事業を始めたわけですが、今後ともこのような先進的研究事業に支援を行い、連大の評価を高めていくことは勿論ですが、先生方の財産となるように活用して頂くことを願っております。
予算削減の中ではありますが、研究科長裁量経費として、平成３０年度も同様の支援を継続することにしています。連大構成大学間での連携した先端研究の推進、ならびに九州・沖縄地域の農水産学に関する課題解決に向けた連大教員間での共同研究の展開のため、多くの先生方からの申請を期待しております。

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研究の組織と役割分担者
氏名及び職名所属大学・専攻代表者

坂尾こず枝・助教

鹿児島大学・応用生命科学

協力者

侯

鹿児島大学・応用生命科学

分担者

高良健作・准教授

琉球大学・応用生命科学

協力者

和田浩二・教授

琉球大学・応用生命科学

協力者

小松正治・教授

鹿児島大学・応用生命科学

協力者

永尾晃治・教授

佐賀大学・応用生命科学

徳興・教授

３

目次

3-1

研究の目的と概要①

研究の目的
本研究の主な目的は、食品の機能性成分におけるバイオアベイラビリティ予測のための、より簡便で、ヒト介入実験と相関性の高い評価モデルの構築を行うことである。
近年における日本人の食生活は、飽食・グルメ志向から健康志向へと広がりをみせつつある。その背景には、食や生活様式の多様化に起因する生活習慣病の増加、高度高齢社会の進行にともなう健康寿命への関心の高まりと共に予防医療の重要性が注目され始めたことが挙げられる。それらに付随し、体調調節作用や疾病予防を目的とした食品成分に関する研究が広く行われるようになり、さまざまな機能性食品が開発されてきている。しかし、このような機能性食品成分は、食品であるがゆえに詳細な体内動態解析が行われていないものが多く、適正な摂取量範囲や、効率的な摂取法などにおける科学的根拠は十分とは言い難い。そこで、本研究事業では、機能性食品成分の体内動態の解析を代謝産物の解析を通して行い、科学的根拠に基づいた適正な機能性成分の摂取量を提示する基盤を構築することに着目した。
食品成分のように、経口で摂取されたものは、消化・吸収され、循環血流に乗って体内に分布する。「バイオアベイラビリティ（bioavailability、生物学的利用能）」は、服用した薬物がどれだけ全身循環血中に到達し作用するかの指標であり、ここ数年において機能性食品成分における bioavailability についての報告も見られるようになった。
食品の機能成分を真に我々の健康維持に役立たせるためには、それぞれの機能成分の循環血中最小有効濃度、循環血中最小毒性発現濃度、および bioavailability 指標を知る必要がある。しかし、これらの実験にはヒトを対象とした試験研究が必要であり、容易に得られるデータではない。また、食品のように経口摂取される成分のbioavailability を考えるとき、水溶性のものと脂溶性のものとでは、その代謝経路が大きく異なることも念頭に置く必要がある。これらを踏まえ、本研究事業では、親水性ポリフェノールならびにヒドロキシル基をアセチル修飾した疎水性ポリフェノール誘導体を用い、ヒト由来培養細胞を用いた生理活性評価ならびに分化細胞を用いた腸管モデル代謝、ヒトのミクロソームを用いた代謝、実験モデルマウスを用いた in vivo 代謝
実験から総合的にポリフェノールの体内動態を評価し、食品成分のバイオアベイラビリティの予測を行うための評価モデルの構築を行うことを目的とした。
②

研究の概要
本研究事業では、各試験で得られる結果と比較検討を行うために、ヒトにおける代謝産物まで報告されているポリフェノールである、ケルセチンをサンプルとして用いた。
また、研究の基盤として、Fernandez-Garcıa らが示す Bioavailability (生態利用能) =Bioaccessibility ( 生 態 可 給 性 ) + Bioactivity ( 生 理 活 性 お よ び 代 謝 ) の 式(Fernandez-Garcıa et al., Nutrition Research, 29, 2009)を採用し、この式を満たす各実験手法の確立を試みた。また、経口摂取経路の bioavailability において重要となる消化管吸収は、その成分の水相や有機相への溶解性や解離度、極性などの影響により制御されていることが明らかになりつつあることより、化学的手法を用いて親水性の高いケルセチンをアセチル化することで、疎水性の高いケルセチン誘導体を合成し、水溶性および脂溶性の機能性成分における生態可給性や生理活性、代謝機構の違いのシミュレーションも行うことで、機能性成分から最大限の効果を得る方法も模索した。そこで、第一にケルセチンよりも疎水性の高いアセチル化ケルセチンを合成した後、それらを用いて、bioaccessibility 試験に当てはまる、人工胃腸液内での安定性の評価試験を行った。次に、bioactivity 試験として、ケルセチンならびにアセチル化ケルセチンのヒト由来培養細胞における生理活性をアポトーシス誘導能を測定することで評価した。同時に、腸管上皮モデルを用いた in vitro 膜透過性評価を行い、続いてヒト介入実験の代わりとしての、ヒト小腸ならびにヒト肝ミクロソーム（組織の破砕溶液から得られる物質）を用いた代謝実験、実験モデルマウスを用いた血清中の代謝産物の動態測定を行った。
本研究では、試験管実験から細胞実験、さらには実験動物試験の手法を駆使し、代謝産物の作製、精製、構造解析ならびにその代謝機構の解析まで、多岐に渡る専門知識と技術、経験を有するメンバーが連携し事業を展開した。
３‐２研究の成果（研究の役割分担者ごとに記載）

1 ）ケルセチン誘導体の合成（坂尾）ケルセチンの疎水性を高めるために、ピリジン存在下、無水酢酸とケルセチンを反応させ、ケルセチンのヒドロキシル基をアセチル化した誘導体（4Ac-Q）を合成した。
構造決定は NMR および FT-IR 解析により行った。
2 ）ケルセチンおよび 4Ac-Q の人工胃・腸液における安定性の評価（坂尾・和田）
ケルセチンおよび 4Ac-Q に日本薬局方 16 改正溶出試験第１液（模擬胃液)およびBiorelevant 社の空腹時小腸環境液を連続的にそれぞれ 2 時間処理し、遠心した後、その上澄みのケルセチンおよび 4AC-Q の残存量を HPLC を用いて測定した結果、ケルセチンおよび 4Ac-Q ともに一部が分解する可能性が示唆された。
3 ) ケルセチンならびに 4Ac-Q の生理活性試験(坂尾・小松・侯)
ヒト結腸腺癌由来細胞株である HCT116 細胞ならびにヒト肝癌由来細胞株であるHepG2 細胞を用い、ケルセチンならびに 4Ac-Q の生理活性試験を行った。その結果として、細胞増殖抑制試験では、ケルセチン、4Ac-Q ともに濃度依存的に細胞抑制効果を示した。また、Annexin & PI のダブル染色法によりアポトーシス誘導能をフローサイトメトリーを用いて測定した結果、両細胞に対し、いずれのサンプルも強いアポトーシス誘導能を示した。また、アポトーシスの中心的な制御因子であるカスパーゼの活性化ならびにカスパーゼの最終ターゲットであるポリ(ADP)リボースポリメラーゼ (PARP)の分解がウェスタンブロッティング実験により確認されたことより、ケルセチンならびに4Ac-Q が誘導するアポトーシスの一部はカスパーゼカスケードに依存して誘導されていることが確認された。
4 ）腸管上皮モデルを用いた in vitro 膜透過性評価（高良・坂尾）
並行人工膜透過性試験 (parallel artificial membrane permeability assay) お
よび小腸上皮モデル系 Caco-2 細胞透過性試験を行い、その相関性を比較検討した。その結果、PAMPA および小腸上皮モデル系 Caco-2 細胞透過性試験において、 異なる透過性が見られたが、 Quercetin ならびに 4Ac-Q 間の透過性の相関は一致した。
5 ）モデルマウスにおける in vivo 代謝試験（坂尾・永尾）
経口摂取後の循環血中における濃度と時間を算出するために、雄の DDY マウスを用
い、0.5 % のケルセチンおよび 4Ac-Q を 25 日間、自由給餌、自由給水させた。飼育最終日に各サンプル 50 mg/kg B.W.を PBS 200 µL で懸濁したものを経口投与し、1, 2, 6h 後に血液採取を行った。これらの血液から血清を回収し、それぞれの血清におけるケルセチンならびに 4Ac-Q の量を HPLC にて測定した。1 匹分の血清では検出限界以下であったことより、4 匹分のマウス血清をプールし測定した結果、ケルセチン、4Ac-Q ともに経口投与 3 時間後に最大吸収量を示した。
6 ）ヒト小腸およびヒト肝ミクロソームを用いた in vitro 代謝試験（高良・坂尾）
まず、小腸ミクロソームを用いたケルセチンンの硫酸抱合代謝試験を行った。反応液(1mL) の調整として Quercetinmg/mL、10 mmol/L
PAPS を 0.02

Na-リン酸緩衝液mmol/L

濃度 0.2 μmol/L に小腸 S9 タンパク濃度 0.1(pH7.4) を加え、37℃ で 5 分間加温した後、となるように添加。さらに 37℃で 0，10, 20 分間加温した後，IS を含む 0.1%ギ酸-アセトニトリル溶液 0.1mLと混合して反応停止させた。サンプルを 4℃，16,000 g で 5 分間遠心し、上清回収したのち、AB Sciex 3200 Q TRAP MS
にて測定を行った。結果として、すべての時間において、ケルセチンならびに硫酸抱合体の濃度が検出限界以下となり、いずれのピークも確認されなかった。

3

研究の総括と今後の課題・展望（代表者）

・研究の総括本研究事業では、食品の機能性成分におけるバイオアベイラビリティ予測のための、より簡便で、ヒト介入実験と相関性の高い評価モデルの構築を行うために、以下に示す①～⑥の試験を実施・検討し、Fernandez-Garcıa らが提示した Bioavailability =Bioaccessibility + Bioactivity と言う式の Bioaccessibility (生態可給性)またはBioactivity ( 生 理 活 性 お よ び 代 謝 ) に あ て は め る こ と で 、 間 接 的 か つ 総 合 的 にBioavailability (生態利用能)の予測を行うことが可能になるかの検討を行った。
まず、各試験の結果として、①でアセチル化ケルセチンを合成したことで、ケルセチンと疎水性を高めた 4Ac-Q の代謝動態の違いから、胃腸液で起こす構造変化の予測ならびに吸収改善に寄与する構造を予測することが可能となり、②の胃腸消化モデル試験では、ケルセチン、4Ac-Q 共に一部が分解することが示唆された。③におけるケルセチンなら
びに 4Ac-Q の生理活性試験では、いずれのサンプルもヒト由来がん細胞に対しアポトーシス誘導能を有し、その一部はカスパーゼカスケードに依存していることが確認された。
④腸管上皮モデルを用いた in vitro 膜透過性評価では、ケルセチンならびに 4Ac-Q のヒトの腸管吸収率の予測が可能であること、また疎水性を上げるだけでは膜透過性は向上しないことが示唆された。⑤でのモデルマウスにおける経口摂取後の循環血中の濃度ならびに最大吸収時間の算出については、ヒトにおける最大吸収時間とは異なるものの、データベースは構築可能であると考えられた。最後に⑥でのヒト小腸ミクロソームならびにヒト肝ミクロソームを用いた代謝試験に関しては、本実験ではデータを得られていないが、ヒト介入実験を行うことなく、食品成分の体内動態予測を行う上ではかなり重要な情報源となるため、質量分析を可能にするためにイオン化の検討などを改善していく必要性があると考えている。
上記①～⑥をそれぞれ、Bioavailability (生態利用能) = Bioaccessibility (生態可給性) + Bioactivity (生理活性および代謝)の式にあてはめると、Bioavailability(生態利用能) = Bioaccessibility (①, ②) + Bioactivity (③～⑥)となり、ヒト介入試験なしに、ある程度の Bioavailability を予測できるモデルを確立しうる可能性を見出した。今後は、残された課題を確立すると共に、他の食品機能成分に対しる汎用性の検討も視野にいれた試験を行う。
・次年度に向けての課題・計画・展望等
本研究を通し、次に挙げる３つの課題が提示された。
（1）胃腸消化モデル試験にて産出された未知化合物の同定(2)PAMPA ならびに腸管モデル代謝の相違についての検討(3) ヒトミクロソームを用いた代謝産物の測定方法の確立。これらについては、今後、未知化合物の同定ならびに、プロトコルの改善を行っていく。また、次年度以降の展望として、機能性食品、健康食品、薬、サプリメント、化粧品などのバイオアベイラビリ

ティは、エマルジョン、リポソーム、ミセルのような画期的な技術によって上昇すると言う報告があり、今後は経口摂取された機能性食品成分がその作用を効率良く発揮するための、根拠に基づく吸収改善理論の構築ならびに技術の開発・評価（①～③）を行う。
そのために、まず、本事業で得られたケルセチンの誘導体のうち、親水性および疎水性の異なる誘導体の代謝動態の差異のデータから、バイオアベイラビリティの上昇の要因を見出し、① 吸収効率が最も高くなる構造のケルセチン誘導体の作製を試みる。さらに、② 食品成分のナノ化や水溶性、脂溶性成分の融合化などによる吸収改善を試みる。
同時に、バイオアベイラビリティの向上が実際に機能性の発揮に繋がるのかについて、③培養細胞もしくはモデルマウスを用いた評価実験を随時行っていく。
・科研費等の競争的外部資金への応募計画
本研究ならびに次年度以降の研究結果より見出した方針を元に、科研費の獲得を目指す。
４

支援金額の執行内訳項

目金

機器・備品消耗品

額

内訳・備品の設置場所
40 エバポレーター(鹿児島大学農学部

食品分子0 機能学研究室に設置)、ヒト小2050 人工胃・腸液、腸管上皮モデル（PAMPA）
腸ミクロソーム 5 種類、ヒト肝ミクロソーム 7 種類、ヒト代謝実験試薬、ヒト結腸癌細胞 Caco-2、小腸吸収評価用細胞アッセイキット POCA® 小腸吸収(CACO-2)、トランスチャンバー、 HPLC カラム、NMR 測定溶媒、実験マウス、マウス飼育試料、タンパク質抗体

旅そ費の他

0250 機器分析機器（核磁気共鳴、赤外吸収、質量分析、LC-MS/MS）使用代金

合計金額
５

資料等

2,700

該当なし