平成２７年度

鹿児島大学大学院連合農学研究科

先進的研究推進事業報告書

鹿児島大学大学院連合農学研究科
平成２８年６月３０日

平成 27 年度鹿児島大学大学院連合農学研究科
先進的研究推進事業報告書【事業一覧】
１．「作物の受光体勢の違いが微生物相互作用と生産性へ与える影響」(鈴木章弘)

２．
「鹿児島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」(長裕幸)

３．
「ナノ粒子化による食品機能性成分の活性増強と沖縄産食資源への応用に関する基盤研
究」(屋

宏典)

４．「先進AI（アグリインフォマテックス）による南方系農作物の生産性（土地，労働，品
質，商品，環境）の飛躍的向上に関する研究」(川満芳信)

５．
「地域ブランド食品品質保証のための近赤外迅速品質評価システムの構築」(河野６．「サツマイモ焼酎を活かした天然食材の生物活性増強への試み」(侯

澄夫)

徳興)

７．「南九州の縁辺海における亜熱帯化に対応した水産生物生産の高度化」(前田広人)

８．
「九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源のゲノム・トランスクリプトーム解析」(永野幸生)

９．
「生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解明とその効率的生産システムの構
築」(平良

東紀)

10．「水圏環境化学物質および水生生物に由来する重金属類に対するヒトおよび魚類の細胞応答」(小松

正治)

目

はじめに

次

大学院連合農学研究科長

籾井和朗 ・・・・・・・１【１】「作物の受光体勢の違いが微生物相互作用と生産性へ与える影響」 (鈴木章弘) ２

１．研究の目的と概要
２．研究の成果
小課題１：光の質の違いが根粒・菌根共生へ及ぼす影響と収量性の関係
小課題２：シカクマメの生育・収穫に及ぼす地這い栽培と支柱栽培の影響
小課題３：世界のダイズ資源を用いた子実収穫量と開花日までの日数の関係
小課題４：人工核酸(LNA)を用いたPCRクランプ技術による植物強制微生物の群集構
造解析法の開発
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．論文発表(投稿中を含む)
５．支援金額の執行内訳【２】「鹿児島連大を核としたASEAN共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」(長裕幸)・・・28

１．研究課題名
２．研究組織と役割分担
３．研究内容3-1 研究目的
3-2 研究概要
3-3 研究の成果
3-4 研究の総括と今後の課題・展望
４．支援金額の執行内訳
５．資料等【３】「ナノ粒子化による食品機能性成分の活性増強と沖縄産食資源への応用に関する基盤研究」 (屋宏典)・・・・35

１．研究の目的と概要
２．研究の成果①ボタンボウフウ(長命草)の抗肥満機能②シークヮーサー搾汁副産物からの精油抽出とその抗酸化活性機能

③選択的抗腫瘍成分ニチジンの応用利用
３．研究の総括と今後の課題・展望等
４．支援金額の執行内訳
５．資料等なし【４】「先進AI（アグリインフォマテックス）による南方系農作物の生産性（土地，労働，品質，商品，環境）の飛躍的向上に関する研究」(川満芳信)・・46

１．研究の目的と概要
２．研究の成果
1.モデルに基づいたヤトロファ生産およびバイオマス利用
2.サトウキビの成長曲線
3.UAVによる生育・環境診断の可能性
4.UAVを用いたサトウキビ圃場の情報収集に関する研究
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．論文発表５．支援金額の執行内訳【５】「地域ブランド食品品質保証のための近赤外迅速
品質評価システムの構築」(河野澄夫) ・・・・・・・・・・・77

１．研究の目的と概要
２．研究の成果
2.1 イモ塊根のスペクトル測定部位と化学分析部位との距離の糖度測定に及ぼす影響
2.2 生イモ塊根の切断面のスペクトルによる蒸しイモ糖度の迅速測定
2.3 生イモ塊根の丸のままのスペクトルによる蒸しイモ糖度の非破壊測定
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．支援金額の執行内訳
５．資料等【６】「サツマイモ焼酎を活かした天然食材の生物活性増強への試み」(侯１．研究の目的と概要
２．研究の成果①サンプルの調整②分画成分の生物活性作用機序の解明

徳興)・・・81

③機能性成分の構造解析④動物実験
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．支援金額の執行内訳
５．資料等なし【７】「南九州の縁辺海における亜熱帯化に対応した
水産生物生産の高度化」(前田広人) ・・・・・・・・・・・・88

１．研究の目的
２．研究の概要
３．研究の成果
3.1 南九州海域における魚類生態系の現状把握
3.2 南九州海域の黒潮流路および流速場の現状把握
3.3 有害・有毒微生物対策についての現状把握
４．研究の総括と今後の課題・展望
５．支援金額の執行内訳
６．資料等【８】「九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源のゲノム・トランスクリプトーム解析」(永野
１．研究の目的と概要
２．研究の成果
2.1 講習会の開催
2.2 シダ植物・リュウキュウイノモトソウのRNA-Seq解析
2.3 糸状菌Gongronella butleriのRNA-Seq解析
2.4 カンキツの交雑系統のRAD-Seq解析
2.5 ユズの遺伝的多様性に関するRAD-Seq解析
2.6 ノビル（野蒜）の遺伝的多様性に関するRAD-Seq解析
2.7 いもち病菌の遺伝的多様性に関するRAD-Seq解析
2.8 メロンの交雑系統に関するRAD-Seq解析
2.9 海苔のRNA-Seq解析
2.10 マングローブの遺伝的多様性に関するRAD-Seq解析
2.11 ウシの遺伝的多様性に関するRAD-Seq解析
３．研究の総括と今後の課題・展望幸生)・・・・・・・96

４．支援金額の執行内訳
５．資料等なし【９】「生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解明とその効率的生産システムの構築」(平良東紀) ・・・・・・・・115

１．研究の目的と概要
２．研究の成果
1) 各種生体防御関連タンパク質のカイコ発現用分子構築
2) 昆虫工場を用いた各種タンパク質の発現
3) 昆虫工場で発現された各種タンパク質の生化学的および機能性解析，並びに生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．支援金額の執行内訳
５．資料等なし【10】「水圏環境化学物質および水生生物に由来する
重金属類に対するヒトおよび魚類の細胞応答」(小松正治)・・127

１．研究の目的と概要
２．研究の成果①検討項目１：水圏毒性化合物の培養細胞に対する毒性②検討項目２：天然化合の魚卵を用いた機能評価③検討項目３：ニホンウナギの緑色蛍光タンパク質 eelGFP の機能評価
３．研究の総括と今後の課題・展望
４．支援金額の執行内訳
５．資料等

は じ め に
大学院連合農学研究科長
籾 井 和 朗鹿児島大学大学院連合農学研究科では、平成２７年度に先進的研究事業を推進するために研究科長裁量経費の一部を研究支援費に充てて募集を行いました。本研究事業に応募頂きました先生方に深く感謝申し上げます。
その結果、申請研究１９件の応募があり、慎重な審査により佐賀大学から３件、琉球大学から３件、鹿児島大学（農）から２件、鹿児島大学（水産）から２件の計１０件の事業を採択しました。また、研究分野は生物生産科学系２件、応用生命科学系５件、農水圏資源環境科学系３件とそれぞれの分野で先進的な研究事業と思われるものを選び、総額１，４００万円の事業となりました。
研究内容は「作物の受光体勢の違いが微生物相互作用と生産性へ与える影響」、「鹿児
島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」、「ナノ粒子化による食品機能性成分の活性増強と沖縄産食資源への応用に関する基盤研究」、「先進 AI（アグリインフォマテックス）による南方系農作物の生産性（土地，労働，品質，商品，環境）の飛躍的向上に関する研究」、「地域ブランド食品品質保証のための近赤外迅速品質評価システムの構築」、「サツマイモ焼酎を活かした天然食材の生物活性増強への試み」、「南九州の縁辺海における亜熱帯化に対応した水産生物生産の高度化」、「九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源のゲノム・トランスクリプトーム解析」、「生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解明とその効率的生産システムの構築」、および「水圏環境化学物質および水生生物に由来する重金属類に対するヒトおよび魚類の細胞応答」に関する研究であり、農水産学にとって欠かせない課題に取り組んだものになりました。
事業決定後から８ヶ月程の研究期間しかなく大変研究遂行が難しかったと思われま
すが、提出された報告書を見ますとそれぞれ多くの成果を上げられており、本研究推進
事業は順調に進んだと判断できます。今後、これらの研究が益々発展して、連合農学研
究科の基盤的研究となって外部資金の獲得に繋がっていくことや連大生の人材養成に大いに貢献することを期待しております。
連大の優れた研究成果を世界に発信するという使命を元に本研究事業を始めたわけ
ですが、今後ともこのような先進的研究事業に支援を行い、連大の評価を上げることは勿論ですが、先生方の財産となるように活用して頂くことを願っております。
予算削減の中、平成２８年度も同様の支援を継続することにしていますので、先生方からの多くの申請を期待しております。

1

作物の受光体勢の違いが微生物相互作用と生産性へ与える影響研究代表者

佐賀大学農学部
２０１６年３月

2鈴木章弘

研究の組織と役割分担
氏名及び職名所属大学・専攻

研究の役割分担等

代表者

鈴木章弘・教授

佐賀大学・生物生産科学

研究の総括，小課題１

分担者

川満芳信・教授

琉球大学・生物生産科学

小課題１

鬼頭誠・教授琉球大学

小課題２

・農水圏資源環境科学
境雅夫・教授

鹿児島大学

小課題４

・農水圏資源環境科学
有馬進・教授佐賀大学・生物生産科学

小課題１

鄭紹輝・教授佐賀大学・生物生産科学

小課題３

１ 研究の目的と概要① 研究の目的
本事業では，圃場の作物が受容する光の質を，栽植方法を変えることで制御し（南北植えと東西植え，地生栽培と支柱栽培など。クロロフィルは赤色
光 R を効率よく吸収するが遠赤色光 FR はほとんど吸収しない），微生物との共生効率を高め，生産性を向上させることを目指す。具体的には，根粒菌・菌根菌の両方が感染するマメ科作物を材料に，大きく緯度が異なる佐賀，沖
縄において光の質の違いが菌根菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係，光の質の違いが根粒菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係（小課題１）を調査する。
これによってダイズなどの圃場栽培における受光体勢の違いが生産性へ与える影響を評価するとともに，「栽植方法を管理して微生物との共生効率を高め収量を増加させる」という戦略が，様々な緯度の地域に適用可能か否かを調査するための研究をおこなう。さらに本事業では，シカクマメを受光体
勢が異なるように支柱仕立てまたは地這いで栽培し，受光体勢と収量性を調査する（小課題２）とともに，低緯度地域でのダイズ栽培を視野に，世界のダイズ資源を用いた子実収量と開花日までの日数の関係の調査（小課題３），3

根粒菌以外のエンドファイトを検出する技術を開発するための，PCR クラン
プ技術による植物共生微生物の群集構造解析法の開発を試みる（小課題４）。
② 研究の概要
小課題１
佐賀大学農学部圃場と琉球大学農学部圃場において畝間 60 cm，株間
20 cm の条件でダイズ品種フクユタカを栽培した。その際，図１のように

図１：フクユタカの栽培設計
東西方向または南北方向とした。その結果いずれの圃場でも植物体の成長は東西植えで旺盛な傾向にあったが，根粒数は佐賀では減少傾向にあったのに対し，沖縄では増加傾向にあった。また，菌根菌の感染率や種子生産はいずれの圃場でも有意差は見られなかった。
小課題２
本試験では琉球大学の圃場において，シカクマメの生育・収量に及ぼす地這い栽培とヒマワリおよびデントコーンとの混作によるこれら作物の茎部を支柱とした栽培の比較を行うとともに、菌根菌の利用によるシカクマメのリン栄養の改善効果を明らかにした。
小課題 3
世界のダイズ資源を用いて、佐賀大学圃場において梅雨明け後に播し、子実収量を調査したところ、開花まで日数と子実収量の間には正の相関関係がみられた。114 品種・系統のうち、北部九州の標準品種フクユタ

4

カの子実収量（24.23ｇ／個体）よりも高い品種は 14 みられた。特に収量が高かったのは烏豆、エンレイ、CHIENGMAI PALMETTO、BARI S-6などであった。
小課題 4
植物のミトコンドリア及びプラスチドに特異的な LNA オリゴヌクレオチドを細菌プライマーと競合する位置に設計し、水稲根から抽出した
DNA を用いて LNA クランプ技術の開発を試みた。その結果、ミトコン
ドリア及びプラスチドに特異的な LNA オリゴヌクレオチドを加えること
によって、これら SSU rRNA 遺伝子の PCR 増幅を抑制することができた
他、選択的に細菌遺伝子を増幅することが可能となった。また、DGGE
解析を行ったところ、LNA オリゴヌクレオチドの添加によって、従来のLNA オリゴヌクレオチドを加えていない手法では検出されなかった細菌の遺伝子も検出することが可能となった。
２ 研究の成果
小課題 1：光の質の違いが根粒・菌根共生へ及ぼす影響と収量性の関係
この小課題では，圃場の作物が受容する光の質を，栽植方法を変えることで制御し（南北植と東西植，クロロフィルは赤色光 R を効率よく吸収するが遠赤
色光 FR はほとんど吸収しない），微生物との共生効率を高め，生産性を向上させることを目指した。具体的には，根粒菌・菌根菌の両方が感染するマメ科作
物を材料に，大きく緯度が異なる佐賀，沖縄において光の質の違いが菌根菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係，光の質の違いが根粒菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係を調査した。
図１に示すダイズの栽培設計で 2015 年 7 月 21 日に佐賀大学圃場へフクユタ
カを播種した。このとき、ダイズが植えられる畝の向きが東西 または 南北の方向になるようにした。また畝の間隔が 60 cm となるように設定した。2015 年
9 月４日晴天日の午後 2 時 32 分に畝間と株間の R／FR 値を計測した。また根粒数および菌根菌感染率調査のためのサンプリングを 2015 年 10 月 7 日に行った。
さらに収量調査のためのサンプリングは 11 月 12 日とした。
図２に 2015 年 9 月４に測定したダイズ群落中の R/FR 値を示す。当初の想定

5

では南北植よりも東西植えの方が高いと予想していたが，畝間では東西植の役
1.2 に対して南北では 0.5，株間では東西植で 1.0 に対して南北では 0.6 と予想どおりいずれも東西植えの方が有意に高い値を示した。これらのことはダイズを東西に植えた場合と南北で植えた場合では，植物が受容する光の質が異なることを示している。

図２：ダイズ群落中の R/FR 値，左が畝間，右が株間グラフの色の違いは P<0.05 であることを示す。n = 20
ササゲを用いた先行研究では R/FR 値が高い東西植の方が根粒重が高い値を示していたが，今回の佐賀における試験では正反対の結果となった（図３）。

図３：東西植と南北植のダイズに形成された根粒の乾燥重量
グラフの色の違いは P<0.05 であることを示す。n = 10
次に，根をトリパンブルー染色することによって菌根菌の菌糸を可視化して感染率を調査した。その結果を図４に示す。根粒重の場合は南北植えの場合

6

図４：東西植と南北植のダイズにおける菌根菌の感染率
n = 10に有意に高い値を示していたが，菌根菌の感染率は東西植と南北植で差がなかった。
図２より R/FR 値において南北植の個体の方が高い値を示していたため，逆に
低 R/FR の光を受けていた東西植の個体は徒長するのではないかと予想された。
そこで主茎長の長さを比較した（図５）。高等植物は R/FR 値が低い光を受容す
ると

図５：東西植と南北植のダイズの主茎長の比較
グラフの色の違いは P<0.05 であることを示す。n = 10
日陰にいると判断してそこから逃げるよう茎を伸張させる陰避反応を示す。ところがこの結果も予想とは逆で，主茎長では東西植の方が有意に大きな値を示

7

した。

図６：東西植と南北植のダイズにおける個体あたりの種子数
n = 50
図６に収穫後の１個体あたりの種子数を示す。根粒形成に関しては南北植の方が促進されていたことから，この結果でも南北植が大きな値を示すことが予想されたが，意に反してほとんど差は見られなかった。
以上のように，南北植と東西植の場合を比較すると R/FR 値に関しては予想ど
おり東西植の方が高い値を示していた。根粒菌や菌根菌の共生は赤色光／遠赤
色光受容体のフィトクロムが関与する R/FR 受容反応の１つであり，日陰の状態である低 R/FR 条件では，共生菌の感染率が低下することが明らかにされている。
したがって，根粒形成や菌根形成は東西植の個体で促進されると予想された。
しかし，図３，４に示すように想定された結果とは異なった。１つの原因として東西植と南北植の圃場で水分含量が異なっていた可能性が考えられる。一般に高等植物は乾燥状態に置かれると植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）を合成して乾燥耐性を示すようになるが，ABA は根粒形成を阻害することも知られている。つまり R/FR 値が高かったけれども根粒重が小さい値を示した東西植圃場の方が，南北植と比較して土壌中の水分含量が低かったのではないかと推測される。
次に琉球大学農学部圃場において行った試験結果について述べる。琉球大学
では佐賀大学の場合と同様にダイズ品種としてフクユタカを使用した。基本的な栽培設計は図１に示した通りであり，2015 年 11 月 20 日に播種を，2016 年 28

月１１日にサンプリングをおこなった。2016 年 2 月 3 日の圃場の様子を図７に示す。

図７：琉球大学におけるダイズ栽培の様子（2016 年 2 月 13 日）

表１：琉球大学における栽培試験の結果（n = 20）
表１に見られるように，沖縄でのダイズ栽培は冬季におこなったため，個体が成長する前に開花してしまい，主茎長，地上部重，主根長，地下部重のいずれもが小さな値を示した。個体あたりの根粒数に関しては興味深いことに，東西植が 37.5 に対して南北植が 26.8 と東西植の方が有意に大きな値になっており，予想した結果と一致した。しかし，菌根菌の感染率については東西植と南
北植間で大きな差は見られなかった。今年度は沖縄においてダイズ個体が受容する光の R/FR 値を測定することができなかったが，この結果から推測すると佐賀の場合と同様に東西植の方が高い値であった可能性が考えられる。ダイズの9百粒重に関しては，東西植 21.6 グラム，南北植 23.2 グラムであり大きな差は見られなかった。
今年度はフクユタカを冬季に栽培したため，個体が十分に成長する前にサン
プリングを行わなければならなかったことから，次年度以降は播種時期と供試材料を沖縄に適した条件に変更する必要があると考える。

小課題 2：シカクマメの生育・収量に及ぼす地這い栽培と支柱栽培の影響
シカクマメは、若莢を野菜として収穫が可能な被覆作物として栽培すること
で雑草防除や土壌流亡の軽減効果が高いことは既に報告している。しかし、リン肥沃度の低い土壌では生育、収量が著しく低下することは既に明らかにしており、関連学会に論文を投稿中である。
本試験ではシカクマメの生育、収量に及ぼす地這い栽培とヒマワリおよびデントコーンとの混作によるこれら作物の茎部を支柱とした栽培の比較を行うとともに、菌根菌の利用によるシカクマメのリン栄養の改善効果を明らかにした。
シカクマメの支柱として栽培したヒマワリおよびデントコーンの収量は、シカクマメと混作をした区でこれら作物の単作区の施肥量を半減したが低下しなかった。混作によるシカクマメとの競合はヒマワリおよびデントコーンの生育速度がシカクマメの生育速度より早いためにほとんど無かったことに加えて(図８)、本試験は同一プロットで前年も同様の試験をしていたため前年のシカ
クマメ収穫残渣の肥料効果があったと考えられる。

10

図８：シカクマメ，ヒマワリ，デントコーンの混作の様子（2015 年 5 月 19 日）
一方、10 月 14 日に調査したシカクマメの生育量および 2016 年 1 月 26 日に調査した収量では，地這い栽培となる単作区に比べてデントコーンとの混作により支柱仕立て栽培になる混作区では蔓状の茎部生育量が有意に高まり、受光態勢の改善があったと思われた。同様の効果はヒマワリでも認められると思われるが、本試験では単作区と同様の生育量であった。ヒマワリの収穫後、シカク
マメ茎部が絡みつき支柱仕立て栽培となる時期の 7 月 10 日に台風

9 号の強風によりシカクマメ茎部が絡んだヒマワリが倒伏し、シカクマメの地上部に損傷があったことに加えて、倒伏後は地這い栽培状態になったため混作による支柱
仕立て栽培にはならなかったことが原因と考えられる。
シカクマメの子実収量は単作区と混作区で有意な差は無く、受光態勢の改善による増収効果は認められなかった。なお、既報によるシカクマメの収量は、地這い栽培で約 180g/m2 となっているが、本試験では非常に低下していた。本11

試験期間中の 11 月以降は例年になく降水量が多く、莢形成に影響があったこと、収穫した子実の多くが過湿による腐敗したこと、収穫時期が早かったため未熟な子実も多かったことなどが原因と思われる。混作による支柱仕立て栽培での子実収量の増大の可能性については今後試験を継続する必要がある。
シカクマメ生育量調査時の雑草発生量に関して，処理区はシカクマメを栽培していないヒマワリおよびデントコーン単作区と無作付区をシカクマメ無作付区とした。
シカクマメ無作付区に比べてシカクマメ作付区では雑草発生量は有意に低下し、特にデントコーンとの混作区では雑草の発生をほぼ完全に抑制していた。
雑草防除効果は地這い栽培の単作区では土壌に接する態勢でシカクマメ地上部が生育するためほぼ完全に被覆するために強いことは既に明らかであるが、本試験で支柱仕立て栽培とした混作区でも同程度以上の効果のあることが明らかになった。なお、ヒマワリとの混作区ではシカクマメの生育が台風の影響で十分でなく、茎部が光の当たる位置まで水平方向に伸張した後垂直方向に生長す
る特性のあるアワユキセンダングサを中心に発生し、十分な雑草防除には至らなかった。
本試験の結果から、シカクマメとヒマワリやデントコーンなどの直立型の作
物を支柱として混作することで、ヒマワリとデントコーンの収量は低下しないこと、シカクマメの受光態勢が改善され生育量が増大すること、雑草発生量は低下することが明らかになった。また、マメ科のシカクマメの栽培後の収穫残渣の施用でヒマワリとデントコーンの減肥栽培も可能であることも示された。
しかし、本試験の結果だけからシカクマメの収量への影響は明らかにできなかった。
また、本試験を行った圃場の土壌はリン肥沃度が著しく低くないこと、リン酸施肥も行っていることからシカクマメの生育量の増加に受光態勢の改善に加えて菌根菌の影響については不明である。
そのため、シカクマメの生育に及ぼす菌根菌の影響を明らかにするために、リン酸吸収係数が大きく、低リン環境を作りやすい赤玉土を用いた試験を行った。
試験は/5000a ポットに施肥をした赤玉土を充填して行った。リン酸はリン酸
吸収係数(23g/kg)の 10%相当量および 1%相当量のリン酸を施肥するリン適量区(SP 区)とリン欠乏区(DP 区)を設け、DP 区には菌根菌資材(セラキンコン)を用い

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て 43 個の胞子を接種した AM+区と無接種の AM-区を準備した。なお、窒素とカリウムは適正量を同量施肥した。
これら SP 区、DP-区および DP+区にシカクマメの前作としてヒマワリ、デント
コーン、マリーゴールド、Crotalaria juncea、C. pallida、C. brevidens、Sesbania

rostorata を栽培し、地上部の生育量とリン含有率を調査した。生育量調査後にシカクマメを無施肥で栽培し、生育量、リン含有率および菌根菌感染率を調査した。
図９に調査時の生育状況を示す。前作作物のうち S. rostorata 以外は SP 区に比べて DP-区で生育量が低下し、ヒマワリとマリーゴールドではその傾向が顕著であった。しかし、C. brevidens は低下度合が小さく、S. rostorata ではほ
とんど低下しなかった。また、S. rostorata では茎粒着生も処理間に顕著な差異が認められなかった。DP+区による生育量から菌根菌の接種効果は、DP-区で生育量の低下が小さかった C. brevidens と S. rostorata 以外、確認され、特にデントコーンとマリーゴールドでその傾向が顕著に高かった。

図９：前作作物栽培の様子

DP-はリン欠乏区菌根菌非接種，SP-はリン適量区

菌根菌非接種，DP＋はリン欠乏区菌根菌接種
生育量の低下が顕著で無かった C. brevidens と S. rostorata を含めて全て

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の前作作物とも SP 区に比べて DP-区ではリン含有率が有意に低下していたが、DP+区ではいずれの作物とも SP 区と同程度のリン含有率を示し、菌根菌の接種効果が認められた。また、前作作物の生育量調査時に調査した跡地土壌の菌根菌胞子数はヒマワリで有意に高まっていた。
前作の跡地に栽培したシカクマメについては，いずれの前作作物の跡地とも
シカクマメの生育量は SP 区で最も高く、DP-区で低くなり、菌根菌を接種した
DP+区では生育量の増大が認められた。特に菌根菌接種効果高い前作作物はデン
トコーン、S. rostorata、ヒマワリの順にたかくかった。ヒマワリの跡地では菌根菌胞子数が多の前作作物の跡地より有意に増加したが、デントコーンや S.

rostorata より菌根菌接種効果は低かった。
なお、前作にマメ科作物を栽培した場合の SP 区の生育量は非マメ科作物を栽培した場合に比べてやや高まる傾向があった。また、前述の試験結果や過去の試験結果から低リン耐性の強い C. brevidens、S. rostorata では前作栽培中に不可給態リン(主に Al 型リン)前の可給化の可能性もたる。また、本試験では前作作物の地上部は施用しなかったが、地下部は土壌に残存したままシカクマメを栽培した。本試験はシカクマメを無施肥で栽培したため前作作物の養分吸収による肥料成分の収奪、地下部、特に根粒を残したことによる養分供給なども影響していた可能性があり、さらに詳細な調査が必要である。
シカクマメのリン含有率に関して，DP-区ではシカクマメのリン含有率は、C.

pallida 以外、SP 区より有意に低下していたが、DP+区では非マメ科作物の跡地で有意に高まり、SP 区と同程度であった。マメ科作物では菌根菌の接種効果が明確ではなく、C. brevidens と S. rostorata で DP-区より DP+区で有意なリン含有率の上昇が示されるだけであった。
シカクマメ根部への菌根菌感染率に関しては，本試験に用いた赤玉土の菌根
菌胞子数は 0 であり、菌根勤務接種区の DP-区と PS 区には菌根菌の感染はないはずであるが、無菌的な環境での栽培試験中では無いためコンタミネーションがあったと思われる。しかしながらいずれの前作作物とも菌根勤務接種区の感染率は接種区に比べて極めて低く、本試験のシカクマメ生育量やリン含有率の結果は菌根菌の接種効果と考えられると判断している。
菌根菌を接種した DP+区の感染率は非マメ科作物のヒマワリとデントコーン
で他の前作作物より有意に高まっていた。ヒマワリの跡地では菌根菌の胞子数がデントコーンを含む他の前作作物より増大していたが、デントコーンの跡地

14

ではヒマワリと同程度の菌根菌感染率を示した。ヒマワリの跡地での菌根菌

感染率の上昇は既に報告もあるが、本試験で得られたデントコーン跡地でのシカクマメへの菌根菌感染率についてはさらに詳細な調査が必要と思われる。
以上の結果から、シカクマメの菌根菌感染率は前作作物により違いがあり、デントコーンやヒマワリの跡地では菌根菌感染率の上昇によるシカクマメのリ
ン栄養の改善、生育量の増大があったと思われる。本試験では圃場試験においてヒマワリが台風の影響で明確な結果が得られていないが、デントコーンとの混作によるシカクマメ生育量の増大に受光態勢の改善に加えて菌根菌の関与の可能性もあることが示された。
なお、台風の影響はほぼ毎年あることを考えると、ヒマワリは倒伏による被害が大きく、デントコーンとシカクマメの混作が、両作物の減肥栽培も可能になるため有望と思われる。
小課題 3：世界のダイズ資源を用いた子実収量と開花日までの日数の関係
受講体勢の違いによって微生物相互作用へ及ぼされる影響や作物の生産性への効果が理解できた暁には，そこで提案できる栽培方法を日本以外で試してみる必要が生じると思われる。そこでこの小課題では佐賀大学圃場において 114
品種・系統の世界のダイズを栽培し，開花までの日数と子実収量の関係などを調査した。
まず初めに，梅雨明け後にダイズを播種（晩播・短日条件）し、子実収量を調査したところ、開花まで日数と子実収量の間には正の相関関係がみられた（図１0）。114 品種・系統のうち、当地の標準品種フクユタカの子実収量（24.23ｇ／個体）よりも高い品種は 14 みられた。特に収量が高かったのは烏豆（台湾、39.5g／個体）、エンレイ（日本北陸、36.7ｇ／個体）、CHIENGMAI PALMETTO（タイランド、28.8g／個体）、BARI S-6（バングラデシュ、28.1ｇ／個体）などであった。

15

図１０：開花まで日数と子実収量の関係
また，子実収量は図２に見られるように地上部総乾物重と強い相関関係にあり（図１１）、また地上部総乾物重は開花まで日数にも影響されることが明らかになった（図１２）。

図１１：地上部総乾物重と子実収量の関係

16図１２：開花まで日数と地上部総乾物重の関係

小課題 4：人工核酸（LNA）を用いた PCR クランプ技術による植物共生微生物の群集構造解析法の開発
植物体に共生する細菌が、植物の生育に対して重要な働きをしていることは古くから知られている。近年の培養法に依存しない分子生物学的手法の発達により、環境中には門レベルで未分離の細菌が多数存在することが明らかにされ、難培養性細菌の機能を応用した展開が期待されている。しかし、Small Sub-Unit
Ribosomal RNA（SSU rRNA）遺伝子を標的とした分子生物学的手法による植物
根面・根内部に生息する細菌の群集構造解析では、植物オルガネ

ラ（ミトコンドリア及びプラスチド）の DNA も抽出時に混入し、PCR 反応時に細菌用プラ
イマーで過剰に増幅される重大な問題が存在する。従って、植物根面・根内部に生息する細菌の SSU rRNA 遺伝子を選択的に増幅することができれば、従来の培養法で分離されなかった細菌も検出できるようになると推測され、その結
果、植物生育に及ぼす細菌の機能に関する知見が飛躍的に進められ、食糧問題を解決する画期的な切り口となる。本研究では Locked Nucleic Acid（LNA）と呼ばれる人工核酸を含んだオリゴヌクレオチドを細菌用プライマーと競合する位置に設計し、ミトコンドリア及びプラスチドに特異的にアニーリングさせるこ

17

とで、細菌用プライマーがそれらの SSU rRNA 遺伝子に PCR 反応時にアニーリングするのを阻害し、細菌の SSU rRNA 遺伝子のみを選択的に増幅させる
LNA-PCR クランプ技術の開発を行った。
LNA-PCR クランプ技術
LNA は Locked Nucleic Acid の略称で、核酸の糖分子内に架橋構造を持つ人
工核酸である。通常の核酸は化学構造上の自由度が大きいため、DNA/DNA の二重鎖形成において熱力学的に不利になっている。一方、LNA は自由度を架橋で拘束されているため、LNA を含むオリゴは通常のオリゴに比べて、1）アニーリング時の温度（Tm 値）が上昇する、2）相補的な塩基にシビアで、LNA 塩
基にミスマッチが存在するとアニーリング時の温度（Tm 値）は大幅に低下する、
特徴を示す。
図１３に示すように、植物 SSU rRNA 遺伝子において、細菌用プライマーがアニーリングする位置と競合するように設計した LNA オリゴ（植物遺伝子に特異的で、細菌の遺伝子にはアニーリングしない）を PCR 反応液に加える。このLNA オリゴは、細菌プライマーよりも高温でアニーリングするため、PCR において、①熱変性、②LNA オリゴのアニーリング、③糸状菌プライマーのアニー
リング、④伸長、の反応を順に行うことによって、植物遺伝子の増幅を抑制することができる。他方、プライマーは、細菌の SSU rRNA 遺伝子のみにアニーリングするため（植物遺伝子は LNA オリゴによってブロックされている）、細菌の遺伝子の選択的な PCR 増幅が可能となる。

18

図１３ Principle of LNA-PCR clamping of plant organella SSUrRNA gene and selective PCR amplification of bacterial SSU rRNA gene.
供試試料の調製および DNA 抽出
本研究では水稲（コシヒカリ）を畑状態で 3 週間栽培し、実験に供試した。
水稲体 30 本から根を採取し、根表面を 0.05%-SDS 及び滅菌水で洗浄後、磨り潰して DNA を抽出した。抽出には FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals, Solon
OH, USA）を用い、付属のプロトコルに従って DNA 抽出を行った。
LNA オリゴヌクレオチドの Tm 値（アニーリング温度）の検討
LNA-PCR クランプを効率良く行うためには、94℃で熱変性後、細菌プライマーがアニーリングできない温度で LNA オリゴヌクレオチドを、ミトコンドリア
及びプラスチドの SSU rRNA 遺伝子にアニーリングさせ、次の細菌プライマーのアニーリングで、細菌プライマーがそれら SSU rRNA 遺伝子にアニーリング
するのを阻害すれば良い。その結果、細菌プライマーは細菌の SSU rRNA 遺伝
子のみにアニーリングし、選択的な細菌遺伝子の PCR 増幅が可能 となる。
事前 LNA オリゴヌクレオチドの設計できる領域をアライメントによって調べた結果、63f フォワードプライマー（5'-YRKGCYTWAYACATGCAAGTC-3'）と 1492r リバースプライマー（5´-GGYTACCTTGTTACGACTT-3´）がアニーリン
グする位置で設計可能であることが判明した。そこでアニーリング温度を 60℃〜72℃（2℃きざみ）の範囲に設定して PCR 増幅を行い、LNA オリゴヌクレオ
チドの Tm 値（アニーリング温度）を検討した。
図１４にアニーリング温度を変えて水稲根から抽出した DNA を PCR 増幅した時の結果を示す。その結果、60℃ではミトコンドリアおよびプラスチドの SSUrRNA 遺伝子の顕著な増幅が確認されたのに対し、62℃および 64℃では増幅量は減少し、66℃においてはごく僅かであった。また、68℃以上では PCR 産物は検出されなかった。従って、LNA オリゴヌクレオチドのアニーリング温度は 68℃が適当と考えられたが、68℃では電気泳動で検出されない程度で細菌プライマーがアニーリングし、ミトコンドリアおよびプラスチドの SSU rRNA 遺伝子が増幅している可能性が否めなかった。LNA オリゴヌクレオチドのアニーリング
温度は、細菌プライマーがアニーリングできない温度で、なおかつできるだけ低い温度が良いことから、本研究では LNA オリゴヌクレオチドの Tm 値は 70℃になるように設計した。

19

図１４

PCR products of extracted DNA from rice roots amplified with the PCRprimer set 63f and 1492r. The annealing temperatures ranged from 60 ºC to 72 ºC in 2
ºC increments.
LNA オリゴヌクレオチドの設計
LNA オリゴヌクレオチドは、細菌の群集構造解析に用いられているプライマーの配列をもとに、DNA Data Bank of Japan の DNA データベース（DDBJ,
http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html）に登録されている細菌および植物の SSUrRNA 遺伝子配列を用い、アライメントして設計した。細菌の SSU rRNA 遺伝
子は、系統学的な遺伝子の多様性を考慮して DNA データベースから収集した。
なお、63f フォワードプライマーと 1492r リバースプライマーをクランピング
するため、それぞれのプライマーと競合する位置に、ミトコンドリア及びプラ
スチドに特異的な LNA オリゴヌクレオチドを設計した。またこの際、前述の LNA オリゴヌクレオチドの Tm 値（アニーリング温度）の検討結果を考慮しつつ、ミトコンドリア及びプラスチドに特異的な DNA 塩基を LNA 塩基に置換した。LNA オリゴヌクレオチドの 3'末端はリン酸化し、PCR 反応サイク
ルで LNA オリゴヌクレオチドから伸長反応が生じないようにした。細菌用プラ
イマー、植物および細菌の SSU rRNA 遺伝子をアライメントした結果を図１５に示す。設計した LNA オリゴヌクレオチドも併せて示した。太文字は LNA に置換した塩基である。ミトコンドリアの SSU rRNA 遺伝子において 63f プライマーと競合する LNA オリゴヌクレオチドを LNA-Mit63、1492r プライマーと競合するそれを LNA-Mit1492 と命名した。他方、プラスチドにおいてはイネ科植物と他の植物で、LNA オリゴヌクレオチド設計領域の配列が異なっていたため、本研究ではイネ科植物に特異的な LNA オリゴヌクレオチドを設計した。63f プ
ライマーと競合する LNA オリゴヌクレオチドを LNA-Pla63、1492r プライマー

20

と競合するそれを LNA-Pla1492 と命名した。Table 1 に設計した LNA オリゴヌクレオチドの配列を示した。

図１５

Alignment of bacterial primer and LNA oligonucleotide sequences with thecorresponding region of the SSU rRNA genes of the plant organella (either
mitochondria or plastid) and bacteria. Underlined sequences were corresponded to the
LNA oligonucleotide. Bold letters were LNA bases replaced from DNA bases.

21

LNA オリゴヌクレオチドの濃度検討
LNA-PCR クランピングに効果的な LNA オリゴヌクレオチドの濃度を検討した。検討は、PCR 反応液に最終濃度が 0µM、0.5µM、1.0µM、2.0µM、3.0µM、
4.0µM になるように LNA オリゴヌクレオチドを加えて行った。PCR 反応液には
LNA オリゴヌクレオチドの他、63f フォワードプライマーと 1492r リバースプラ
イマーを加え（それぞれ 0.8µM）、Ex Taq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa, Otsu, Japan）
を用いて PCR 増幅を行った。コントロールには無菌的に栽培した水稲根および大腸菌から抽出した DNA を用い、併せて PCR 増幅を行った。次に、設計した
LNA オリゴヌクレオチドを用いて細菌 SSU rRNA 遺伝子の選択的 PCR 増幅を試みた。上述の結果より、LNA オリゴヌクレオチドの Tm 値は 70℃になるように設計したことから、PCR 増幅には次の条件を用いた；94℃3 分（プレラン）→ 94℃
1 分（熱変性）、70℃1 分（LNA オリゴヌクレオチドのアニーリング）、54℃1 分（プライマーのアニーリング）、72℃2 分（伸長反応）を 30 サイクル → 72℃10分（ポストラン）。6 段階の濃度（0µM、0.5 µM、1.0 µM、2.0 µM、3.0 µM、4.0 µM）
で PCR 増幅した時の結果を図１６に示す。その結果、0µM ではミトコンドリア
及びプラスチドの SSU rRNA 遺伝子の顕著な増幅が確認されたが、LNA オリゴ
ヌクレオチドの添加によって細菌の SSU rRNA 遺伝子が選択的に増幅されているのが分かる。他方、ミトコンドリアについては、LNA オリゴヌクレオチド濃度の増加に伴って増幅量は減少し、3.0 µM 以上では PCR 産物は認められなかった。また、プラスチドについては、0.5 µM 以上でその SSU rRNA 遺伝子の PCR
増幅を抑制することができた。以上の結果より、本研究で開発した LNA-PCR ク

22

ランプ技術は、ミトコンドリア及びプラスチド遺伝子の増幅抑制、及び細菌遺伝子の選択的増幅に有効であると判断された。

図１６

PCR products of extracted DNA from riceroots amplified by using different concentrations of LNA
oligonucleotides that ranged from 0 µM to 4.0 µM. PCR
products of Root (aseptic rice root) and E. coli were used
as controls to investigate the efficacy of LNA-PCR
clamping technique.
Denaturing Gradient Gel Electrophresis（DGGE）解析
選択的に細菌の SSU rRNA 遺伝子を PCR 増幅した PCR 産物を鋳型に、DGGE
用プライマーとして細菌の群集構造解析に一般的に使用されている 341f-GC お
よび 907r を用いて nested PCR を行った。前述と同様に、プライマーはそれぞれ最終濃度が 0.8µM になるように添加し、Ex Taq DNA ポリメラーゼを用いて PCR
増幅を行った。
PCR 増幅後、約 600ng の PCR 産物を、上から下に向けて 27.5%〜57.5%の変性剤濃度勾配を付けたアクリルアミドゲルに電気泳動（100V, 14 時間）し、サイ
バーグリーンで染色後、UV 照射下で DGGE パターンを得た。なお、100%の変性剤とは 7M の尿素と 40%のホルムアミドを含む溶液と定義されており、
DGGE 操作は池永らの論文３）を参考に行った。
図１４の 4.0 µM で増幅した PCR 産物を鋳型に、DGGE 用プライマーとして細菌の群集構造解析に一般的に使用されている 341f-GC および 907r を用いて
nested PCR を行った。約 600ng の PCR 産物を、変性剤濃度勾配を付けたアクリ
ルアミドゲルに泳動し、DGGE パターンを得た。比較対象として 0 µM で増幅し23

た PCR 産物も DGGE 用プライマーで nested PCR を行った。図１７に示したように、0 µM と 4.0 µM の DGGE パターンを比較すると、0 µM ではミトコンドリア
及びプラスチドに由来する DGGE バンドが最も主要なバンドとして検出されたのに対し、4.0 µM ではそれらに由来するバンドは検出されなかった。他方、ミトコンドリア及びプラスチド以外の細菌に由来するバンドについては、0 µM に比べ 4.0 µM で数多く検出された。4.0 µM で新たに検出されたバンドは、従来の分子生物学的手法では検出されなかった細菌の SSU rRNA 遺伝子であり、本研
究で開発した LNA-PCR クランプ技術は、新たな細菌の検出にも有効な手法であることが示唆された。
以上の結果は、従来の手法は植物体に生息する細菌の群集構造解析において、その群集構造を過小評価していたことを意味している。従って、今後 LNA-PCR
クランプ技術を活用することにより、植物の生育に有益な細菌や新種の細菌が見出されることが予想されるとともに、培養法を組み合わせてその細菌を分離することで、微生物資材として農業利用していくことも可能になると予想される。

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図１７ DGGE patterns of community structures of bacteria associated with rice roots,
which amplification products were prepared without LNA oligonucleotide (0 µM) andwith LNA oligonucleotide (4.0 µM).

３ 研究の総括と今後の課題・展望
本事業では，圃場の作物が受容する光の質を，栽植方法を変えることで制御し（南北植えと東西植え，地生栽培と支柱栽培など。クロロフィルは赤色光 Rを効率よく吸収するが遠赤色光 FR はほとんど吸収しない），微生物との共生効率を高め，生産性を向上させることを目指した。小課題１では根粒菌・菌根菌の両方が感染するマメ科作物を材料に，大きく緯度が異なる佐賀，沖縄において光の質の違いが菌根菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係，光の質の違いが根粒菌共生へ及ぼす影響と収量性の関係を調査した。佐賀における栽培では圃場
の水分含量などが比較する圃場ごとに大きく異なっていたことが予想されたた
め，次年度以降は反復数を多くして継続して行っていかなければならない。小
課題２では，シカクマメを受光体勢が異なるように支柱仕立てまたは地這いで栽培し，受光体勢と収量性を調査した。沖縄では台風の影響がほぼ毎年あることを考えると、ヒマワリは倒伏による被害が大きくなってしまうため，デント
コーンとシカクマメの混作が、両作物の減肥栽培も可能になるため推奨されるのではないかと考えられた。小課題３では低緯度地域でのダイズ栽培を視野に，世界のダイズ資源を用いた子実収量と開花日までの日数の関係の調査したが，2015 年度の結果のみであるため，来年度以降も継続して栽培試験を行う必要があることと，播種時期を変化させて栽培することを検討する必要があると考える。小課題４に関して，SSU rRNA 遺伝子を標的とした植物根面・内生細菌の群
集構造解析においては、植物オルガネラ（ミトコンドリア・プラスチド）の DNA
も抽出時に混入し、PCR 時に細菌プライマーで増幅する重大な問題が存在する。
従って、細菌の SSU rRNA 遺伝子を選択的に増幅することができれば、群集構
造解析法における大きなブレイクスルーになり得る。本研究では、植物のミト
コンドリア及びプラスチドに特異的な LNA オリゴヌクレオチドを細菌プライマーと競合する位置に設計し、水稲根から抽出した DNA を用いて LNA クランプ技術の開発を試みた。その結果、ミトコンドリア及びプラスチドに特異的な LNA

25

オリゴヌクレオチドを加えることによって、これら SSU rRNA 遺伝子の PCR 増
幅を抑制することができた他、選択的に細菌遺伝子を増幅することが可能となった。また、DGGE 解析を行ったところ、LNA オリゴヌクレオチドの添加によって、従来の LNA オリゴヌクレオチドを加えていない手法では検出されなかった細菌の遺伝子も検出することが可能となった。しかしながら、植物に共生する糸状菌（エンドファイト）の多様性解析では rRNA 遺伝子-ITS 領域をターゲットとしており、細菌の場合と同様に植物 DNA が混入することによる過小評価の問題が存在する。そのため、糸状菌エンドファイトの多様性に及ぼす環境条
件の影響を評価するためには、植物 DNA を排除可能な糸状菌多様性の解析技術を確立する必要が残されている。
４ 論文発表（投稿中を含む）
M. Nagata, N. Yamamoto, T. Shigeyama, Y. Terasawa, T. Anai, T. Sakai. S. Inada, S.
Arima, M. Hashiguchi, R. Akashi, H. Nakayama, D. Ueno, A. M. Hirsch and A.
Suzuki (2015). Red/Far Red Light Controls Arbuscular Mycorrhizal Colonization via
Jasmonic Acid and Strigolactone Signaling. Plant and Cell Physiology, 56,
2100-2109.
N. Ohkama-Ohtsu, S. Ichida, H. Yamaya, T. Ohwada, M. Itakura, Y. Hara, H. Mitsui,T. Kaneko, S. Tabataf, K. Tejima, K. Saeki, H. Omori, M. Hayashi, T. Maekawai, Y.
Murooka, S. Tajima, K. Simomura, M. Nomura, T. Uchiumi, A. Suzuki, Y. Shimoda,
M. Abe, K. Minamisawa, Y. Arima and T. Yokoyama (2015) Peribacteroid solutionof soybean root nodules partly induces Bradyrhizobium japonicum cells Soil Scienceand Plant Nutrition 61, 461-470.
M. Nagata, N. Yamamoto, T. Miyamoto, A. Shimomura, S. Arima, A. M.
Hirsch and A. Suzuki. Enhanced hyphal growth of arbuscular mycorrhiza(AM) by root exudate derived from high R/FR treated Lotus japonicus.（投稿中）鬼頭 誠
シカクマメの被覆作物としての効果と栽培技術
農業技術体系

追録第 27 号

第3巻

土壌と活用Ⅵ 16 の 56. 2016 (Mar)M. Kitou, T. Nakama, and F. Nagumo
Growth of Winged Bean in Three Soil Types in Okinawa and the Effect of26

Phosphorus Nutrition

Plant production Science (投稿中)

M. Sakai, D. Deguchi, A. Hosoda, T. Kawauchi, and M. Ikenaga, Ammoniibacillus
agariperforans gen. nov., sp. nov., a new thermophilic
agar-degrading bacterium isolated from compost, International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology, 65, 570–577, 2015
M. Ikenaga, M. Tabuchi, T. Oyama, I. Akagi and M. Sakai,
Development of LNA oligonucleotide–PCR clamping technique in investigating thecommunity structures of plant-associated bacteria, Bioscience, Biotechnology andBiochemistry, Vol. 79, No. 9, 1556–1566, 2015

５ 支援金額の執行内訳
項目

金額（円）

備品

760,000

消耗品

1,100,000

旅費

140,000

合計

2,000,000

内訳等
分光光度計 Jasco V-730

PCR 用酵素，シーケンス用試薬，ガラス器具等

日本作物学会講演会（佐賀—水戸２名）

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鹿児島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み

研究代表者 佐賀大学農学部 長 裕幸
２０１６年３月

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１． 研究課題名
鹿児島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み

２． 研究組織と役割分担
研究構成メンバー
氏名及び職名所属大学・専攻

研究の役割分担等

代表者

長裕幸・教授佐賀大学

企画と取りまとめ分担者

辻一成・准教授

佐賀大学

ASEAN 諸国における現地調査および情報の収集

３． 研究内容
３－１ 研究目的
ASEAN 共同体の創設に伴い，ASEAN 諸国内での研究者および学生の流動化の義務化が予測される。この変化を先取りし、鹿児島連大卒業生を核とした農業環境問題に関連する人材育成者養成ネットワーク構築のための人的資源の発掘と情報の収集を行う。
今後、鹿児島連大が ASEAN の研究者・学生から選ばれる大学院になるには，留学生のニーズの変化に迅速に対応できる研究体制・教育システムの検討が不可欠である。いち早く当該地域の動向に関する情報を現場において収集し、分析し、解決していくことが重要であり、鹿児島連大の有する組織力を動員して、鹿児島連大卒業生を中心としたネットワークを構築し、情報の交換をスムーズに行える環境を整えていく。

29

３－２ 研究概要
2015 年から本格化する ASEAN 共同体創設に伴う，研究・教育人材の広範な交流の推進にむけて，鹿児島連大卒業生を核とした将来的人材育成のための農業研究教育ネットワークの構築を目指す。
昨年度まで進めてきた、アジア環太平洋沿岸地域における，持続的農業生産のための環境修復技術開発及び農業
関連産業の振興のための人材育成に関する重要拠点形成プロジェクトにおいて，特に ASEAN 諸国における鹿児島連大卒業生を中心とした人的な交流と情報交換を行い，その成果を報告してきた。今年度は、今まで築き上げてきたこれらの成果に基づき、具体的には、ASEAN 各国の環境被害に対する、農学的な手法を駆使した各地域に適した長期的持続可能な環境修復技術を普及させるための人材育成をめざしていく。そのために，双方向の情報交換，人的な交流をスムーズに行える環境の整備を具現化し，申請者らのこれまでの経験と技術に基づき，ASEAN 諸国の農業関連研究機関で活躍している帰国留学生と連携し，鹿児島連大を核とした、農業研究教育ネットワークの構築を目指し，今後急速に進展する ASEAN 共同体の研究・教育の広範な交流を推進していくための人材供給拠点として，鹿児島連大が広く認知されるよう具体的な方法の提案を行っていく。

３－３ 研究の成果（研究の役割分担者ごとに記載）
本研究プロジェクトでは，鹿児島連大卒業生を核とした ASEAN 諸国の農業環境問題に関連する人材育成者養成
ネットワーク構築のための人的資源の発掘と情報の収集を行うために，今回は，メコン川デルタ地域における持続的農業生産のための環境修復及び人材育成を行い，地域の農業及び農業関連産業の振興を目指すため，2016 年 3月に，辻准教授をベトナムに派遣し，現地調査および情報の収集を行った。

【ASEAN 諸国における現地調査および情報の収集】（担当者：辻准教授）
2015 年プロジェクトで環境汚染調査修復グループ及び循環型農業技術開発グループが解明した新規技術の環太平洋諸国での適応可能性について，ベトナムメコンデルタ地域（アンザン省）での現地調査にもとづいて農業経営の側面から生産性や収益性を指標とする経済学的検証を行った。また，新規技術の適用・導入にあたって，現地の農業生産基盤の水準の違いよって生じると想定される技術的課題や農業者の技術習得にかかる能力的課題を明ら
かにし，それら課題を克服するための地域農業者の組織化，技術普及機関の役割や効果的な技術普及の方法について検討を行った。なお，現地調査やデータ分析は，現地の大学等の研究者と連携して実施し，加えて今回の現地調
査では，カンボジアにおける農業人材育成の現状についても併せて情報収集を実施した。

平成 27 年度の主な成果：
経済成長の著しいベトナムにおいて，特に 2000 年代以降の食料・農産物市場の変化を分析した。国内の食料安30全保障に危機感を生じ，従前の農業の多角化の推進から「米回帰」ともいえる政策に再転換を図っている。しかし，現実には，ベトナムでは米の 1 人当たり消費量が減少しつつある一方で，肉類や飲料（酒類）の消費量は急激に増加し，食料消費構造が大きく変化している。その背景には国民所得の増加や女性の社会進出に伴う食の高級化や簡便化などを消費者の嗜好の変化がある。つまり，近年こそ，自国の食料安全保障の観点から「米回帰」政策への転換がみられるが，農業の多角化の推進は長期的には不変の農業発展の方向として認識しておくべきである。
そうした農業の発展方向を前提とするとき，今後の環境変化に対応した農業の新しい主体形成（農業の担い手）のあり方も同時に検討されなければならない。実際，「米回帰」政策のもとでは，米ビジネスに携わる大企業主導による稲作農民の組織化を通じた生産の効率化と販売ルートの確保が政策的に推進されており，そこでは稲作農民の組織の運営管理を効果的にマネジメントする人材の育成が急務になっている。しかし，そればかりでなく，技術と経営スキルの向上を図り，自然的・社会的環境の変化に対応し，的確に営農条件を改善しつつ主体的に農業経営に取り組む強い意欲をもつ農業者自身の育成も課題である。そのような人材輩出を担う現地大学の研究者，実務者の能力開発に向けて，鹿児島連大の研究・教育機能がさらに発揮される余地は大きいと思われる。
最後にカンボジアでの農業人材育成の現状の一端について付け加えておくと，日系企業の旺盛な現地進出に伴い，王立カンボジア農業大学でも日本語教育コースを設置している例のあることが明らかになった。今後は，こうした大学からわが国の大学院への進学希望者が増えてくることが見込まれる。ASEAN 諸国の先導的な農業大学の動向とニーズの広がりに関して，連大として十分な情報収集の体制を整えておくべきであろう。

研究論文（下線はプロジェクト担当者）
辻�一成，2014 年
ベトナムにおける経済成長と食料・農産物市場―食料消費構造変化の分析を中心に―
農業市場研究 23：26-35.
辻�一成，2014 年
ベトナムの食料・農業
都市と農村をむすぶ 64：45-49.
辻�一成，2015 年
大企業の農業参入と大規模稲作モデルの形成‐アンザン植物防疫会社（AGPPS）の事例‐
アジ研ワールド・トレンド 21：10-13.
辻一成，2016 年 4 月
ベトナム農業のグローバル化対応－担い手政策の変化とその課題を中心に―
食農資源経済論集 67 (1)：27-36（印刷中）31３－４ 研究の総括と今後の課題・展望（代表者）

・研究の総括
今年度、「鹿児島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」というタイトルで連合農学研究科長裁量経費・先進的研究推進事業の支援を受け、限られた期間ではあったが、メンバーをベトナムとカンボジアに派遣し、本研究のタイトルにふさわしいディスカッションと情報の交換を実施することができたのは大きな成果であったと思われる。
今年度のプロジェクトに至るまでに、本研究代表者らは 2011 年から 2013 年まで、「環黄海地域におけるアグ
リビジネスと環境修復技術の開発を支える人材の育成」を佐賀大学の学長経費プロジェクトで推進し、2013 年に中国および韓国の連合農学研究科の修了生を中心にシンポジウムを開催しプロジェクト成果の発表を行った。また、2014 年には「環太平洋地域における農業環境問題とその対策」について、連合農学研究科長裁量経費プロジェク
トの支援を受け、中国、ベトナム、マレーシアより連合農学研究科の修了生を中心にしたシンポジウムを開催し、2015 年には「インドネシア及びベトナムにおける農業開発と環境保全に関する国際シンポジウム」を同じく連合
農学研究科長裁量経費プロジェクト「アジア環太平洋地域における農業生産と関連産業振興のための環境修復技術
開発及び人材の育成」の支援を受け開催し、修了生・指導教員間の交流と各国における問題点と解決法に関する情報の交換を推進してきた。これら研究の成果を背景として，2015 年度には佐賀大学農学部長を代表者とする JICA
草の根技術協力事業（新・草の根協力支援型）の採択に結びついた。同事業では，佐賀大学の連大構成メンバーが中心となり，連大の現役学生を含むベトナム側協力機関との間で，現地の農地環境修復と新規作物導入及び市場開発という実践型の共同プロジェクトを実施することになっている。このプロジェクトの進展過程では，今後，高度な農業技術の修得と研究能力の研磨を目指して，鹿児島連大への入学を志望する者が増加することも期待される。
新しく始動する ASEAN 共同体諸国においては、立地環境的に塩害や水害の自然災害のほか、過度の人口集中や経済開発による環境汚染、及び過耕作による農地の疲弊が地域の農業生産を圧迫している。また、TPP に代表されるような、近年の農業の急速なグローバル化に対応するには、ASEAN 共同体諸国における食料生産及び農業関連
産業の連携と技術協力が望まれている。現在、鹿児島大連合農学研究科で博士号を取得した修了生達の多くは、母国に戻り、農業・環境関連の職業に従事し、指導的立場で中心的な役割を演じている。今後、想定される ASEAN
共同体諸国における農業環境問題の解決にあたって、鹿児島大連合農学研究科の母校リーダーシップとしての役割は増大しており、国際的にも高く評価される立場にあると考えられる。そのためにも、修了生との定期的な意見交換の場を設け、機能的な研究者ネットワークを構築していくことは、今後の大きな目標であり、先進的な課題であると思われる。
今回のプロジェクトでは、メンバーの辻准教授にベトナム・カンボジアに渡航してもらい、現地調査に基づき、

32

農業・環境に関する諸問題に関する解決法の研究、連大修了生との交流、ネットワーク構築に向けての修了生の組織化に対して、有効な成果を得ることができたと考える。本研究プロジェクト「鹿児島連大を核とした ASEAN
共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」という大きな目標を達成するために、単年度ではあるが、着実なステップを刻むことができたと確信する。
これらの研究活動に対して、鹿児島大連合農学研究科におかれましては、多大なご支援を頂き、プロジェクトを代表して深く感謝の意を表したいと思います。

・次年度に向けての課題・計画・展望等
本プロジェクトは、2015 年度のプロジェクト「アジア環太平洋地域における農業生産と関連産業振興のための
環境修復技術開発及び人材の育成」で各グループが掲げた以下の課題：｛「環境汚染調査修復グループ」；各国の気
象条件、土壌条件に適した栽培方法、栽培条件の開発を目指すと共に、連大卒業生の研究者ネットを活用し、現地での実証栽培実験を実施し、結果の検証と実用的方法の提案及びデータベースの構築を目指す。
｝、｛「循環型農業技
術開発グループ」；土壌劣化が深刻な農業地域でモデル実験を行い、循環型農業生産システムの開発普及を図っていく。また，現地で発生する有機物を資源として活用するための技術開発に関する研究を進め，各地の状況に合致した資源循環システムの構築支援のあり方を検討する。
｝、｛「農業経営評価及び人材育成グループ」；現地の農業生
産基盤の水準の違いよって生じると想定される技術的課題や農業者の技術習得にかかる能力的課題を明らかにし，
それら課題を克服するための地域農業者の組織化，技術普及機関の役割や効果的な技術普及の方法について検討を行う。
｝、を解決するために当初企画されたものであったが、追加的配慮により予算をつけて頂き。限定された予算と期間の中で、ベトナムとカンボジアに関して現地の調査と情報の収集を行うことができた。
ただし，2015 年度からの課題については、未だ道半ばであり、今後のいっそうの展開が期待されるところである。「鹿児島連大を核とした ASEAN 共同体における農業研究教育人材ネットワーク強化の取り組み」といった、総合的、戦略的な課題は、個々の研究者が独力で解決できる問題ではなく、連合農学研究科が組織的に解決していくべきものであり、連大の存在価値を国際的に高めていく有効な手段であると思われる。今回、本プロジェクトの成果として、JICA の草の根交流推進プロジェクトへの採用を得ることができたが、これは、過去にわたる継続的な鹿児島連大の支援のおかげであると思われる。今後とも、機会あるごとに科研を初め、各プロジェクトへの挑戦を行い、継続的かつ多面的に研究を行っていく予定である。

33

４ 支援金額の執行内訳
項 目

金額（円）

機器・備品

0

内

訳

等

消耗品

300,000

プリンターカートリッジ、機器補修用品他

旅費

200,000

ベトナム旅費（辻准教授）

合計500,000

５ 資料等
５－１ JICA 草の根交流事業関連資料

34

ナノ粒子化による食品機能性成分の活性増強と沖縄産食資源への応用に関する基盤研究

研究代表者

琉球大学熱帯生物圏研究センター
２０１６年３月

35

屋宏典

研究の組織と役割分担者
氏名及び職名
代表者

屋

宏典

（教授）

所属大学・専攻

研究の役割分担等

琉球大学

・研究総括

応用生命科学・ボタンボウフウ（長命草）の抗肥満機能に関する評価

分担者

和田 浩二

琉球大学

（教授）

応用生命科学・シークヮーサー搾汁副産物
からの精油抽出法と抗酸化
機能の評価

玉城 一

琉球大学

（准教授）

応用生命科学・PLGA ナノ粒子化に適した試料調製法の検証

岩崎 公典

琉球大学

（助教）

応用生命科学・選択的抗腫瘍成分ニチジン
の応用利用

協力者

稲福 征志

琉球大学

（ポスドク研究熱 帯 生 物 圏 研 究 セ ・抗肥満機能に関する評価

員）

ンター

・PLGA ナノ粒子化に適した遺伝資源応用学分野36

試料調製法の検証

１

研究の目的と概要

１－１ 研究目的「機能性表示食品」制度の開始による健康食品ブームの再来に伴い、食品機能の安定性や生物学的利用率を増強する技術の積極的な活用が示唆される。ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）ナノ粒子は医療業界において臨床試験レベルで積極的に利用されている技術であるが、現在、食品として PLGA を利用している例はない。しなしながら、PLGA
は生分解性で最終的に水と炭酸ガスとなることから、食品分野において PLGA は有望な素材となる可能性が非常に高い。実際、PLGA ナノ粒子化することによって機能性成分の有効摂取量が１００分の１以下に減少したとの実験報告も有り、PLGA の食品分野への利活用に関する期待が高まっている。該申請研究は、PLGA ナノ粒子化技術の機能性食品開発
への利用拡大を目指し、機能性成分濃縮物の PLGA ナノ粒子化技術の有用性について検証する。同時に PLGA ナノ粒子への封入を左右する抽出物調製法の最適化を試み、機能性食品開発における PLGA ナノ粒子化技術のプラットフォームを構築する。

１－２ 研究概要
機能性食品開発における使用可能な溶剤は非常に限られている。対象物質の物性・性
状はナノ粒子への封入に大きな影響を与えることから、試料調製と PLGA ナノ粒子化技術の両方の最適化は必須である。従って本研究は「ナノ粒子作製法の最適化」と「ナノ粒子封入体の機能性評価」の二点に焦点を当てて、沖縄県産食資源を利用した機能性食品開発における PLGA ナノ粒子化技術の基礎的知見を得る。
①ボタンボウフウ（長命草）の抗肥満機能（屋 宏典、玉城 一、稲福 征志）
沖縄県産素材の一つであるボタンボウフウ（長命草）が抗メタボリックシンドローム・
抗肥満作用を有する機能性食品素材であり、我々はその機能性成分の１つがクマリン類の「プテリキシン」であることを明らかとしている。従って、本研究では長命草からプテリ
キシンを高濃度に含む抽出物（濃縮物）とその濃縮物を原料としたナノ粒子の作製を試みた。各作製法の最適化によって得られるプテリキシン封入 PLGA ナノ粒子を用いて、ナノ粒子化プテリキシンの抗肥満活性の増強を動物試験にて評価した。
②シークヮーサー搾汁副産物からの精油抽出とその抗酸化活性機能（和田 浩二）
近年、機能性食品として精油成分が注目されているが、一般的に精油の生体利用率は低いとされる。そのため、ナノ粒子への封入による精油成分の安定化や吸収率の向上が望まれる。沖縄県産素材のシークヮーサーは特有の香りを有し、その精油成分には多くの注目が集まっている。一般的にシークヮーサーは果皮ごと圧搾して果汁を回収するため、果37

皮の精油成分が果汁へ移行し、その結果として搾汁には副産物（パルプ）と共に精油層が確認される。本研究は、パルプからの精油抽出法の最適化ならびに回収した精油成分の機能性を評価して、シークヮーサー精油封入 PLGA ナノ粒子の作製の基盤構築を目指した。
③選択的抗腫瘍成分ニチジンの応用利用（岩崎 公典、玉城 一、稲福 征志）
沖縄県に自生するサルカケミカンに含まれるアルカロイドである「ニチジン」は腫瘍特異的な細胞毒性を示し、その作用は経口投与によっても認めることが出来る。ニチジンの腫瘍に対する選択性は、腫瘍細胞が積極的にニチジンを取り込むことに起因している。
従って、ニチジンの取り込みに関する分子機序は腫瘍検出技術に転換できる可能性を秘めている。本研究は、がん化学療法におけるニチジンの新たな応用利用について検証すると同時に、ニチジンの PLGA ナノ粒子への封入化における基盤技術の構築を試みた。
※①と②の研究においては、食品として利用可能な種々の調製方法（例えば水・エタノール
系や超臨界抽出系）の利用に限定して研究を遂行して、機能性食品開発における PLGA ナ
ノ粒子設計技術の基礎的知見を得た。

38

２

研究の成果

①ボタンボウフウ（長命草）の抗肥満機能（屋 宏典、玉城 一、稲福 征志）
１）長命草の機能性成分（プテリキシン）高濃縮物の調製
乾燥長命草を室温にて 50％エタノールに浸漬して、その後、低温にて静置することによって、効率的なプテリキシン粗抽出物を調製することができた。更には、その粗抽出液
を芳香族系合成吸着剤 HP20（食品に使用可）に供して、目的成分（プテリキシン）を吸着せる事によって、長命草（乾燥物）に 0.4% (v/v)程度しか含まれていないプテリキシン
を約 100 倍程度（含有率 40％）に濃縮したプテリキシン高濃縮物を作製した。
２）プテリキシン高濃縮物を用いたプテリキシン封入 PLGA ナノ粒子の作製
本研究においては、水中エマルション溶媒拡散法にて PLGA ナノ粒子化プテリキシンを調製した。調製したプテリキシン高濃縮物を原料とて、ポリマー溶液とポリビニルアル
コール水溶液を自己乳化させることで PLGA ナノ粒子懸濁液を調製した。その後、溶媒留去と粗ろ過を行い、遠心分離によりナノ粒子を回収した。その結果として、
粒子径 244nm、プテリキシン含有率 2.4％の PLGA ナノ粒子の作製に成功した。
３）PLGA ナノ粒子化によるプテリキシンの抗肥満活性増強の評価
高脂肪食誘導肥満マウスを用いて抗肥満活性の評価を行った。PLGA ナノ粒子化による活性増強を評価するために、以下の様な４つの実験群を設定した。
（実験群の設定）
１．対照群：
２．プテリキシン摂取群：プテリシキン高濃縮物混合食を摂取
３．非ナノ粒子化プテリキシン投与群（週１回の投与）
４．ナノ粒子化プテリキシン投与群（週１回の投与）
上記実験群を設定して４週間後の体重増加、脂肪組織重量、血清脂質濃度などを評価して、PLGA ナノ粒子化による抗肥満活性の増強について検証した。
②シークヮーサー搾汁副産物からの精油抽出とその抗酸化活性機能（和田 浩二）
１）パルプからの精油抽出
精油の抽出方法として遠心分離法と水蒸気蒸留法を比較した。遠心分離法においては、パルプを遠心分離して、上澄み液を脱水することで精油を回収した。水蒸気蒸留法におい39

ては、パルプを精製水と共に水蒸気蒸留して、蒸留物を脱水して精油を回収した。精油の回収率は遠心分離法が「36.4g/kg パルプ」であるのに対して、水蒸気蒸留法では「69.8g/kg
パルプ」であり、遠心分離法と比較して水蒸気蒸留法の精油回収率は約 1.92 倍であった。
２）各精油の特性＜色差とポリフェノール含量＞
L*a*b*表色系による精油の色を分析した結果を表１に示す。遠心分離法によって回収された精油（茶色）は水蒸気蒸留法によって回収した精油（透明）に比べ a*および b*値が高く、L*値が低い値を示していた。
表１ 各精油の色彩測定
精 油

L*

a*

b*

遠心分離法

39.8

33.5

25.0

水蒸気蒸留法

75.3

‒0.7

5.7
図１ 各精油のポリフェノール含量

各 精 油 中 の 総 ポ リ フ ェ ノ ー ル 含 量 は 、 遠 心 分 離 法 で 回 収 し た 精 油 は 約 311mg
GAE/100g であったのに対して、水蒸気蒸留法で回収した精油は約 49 mg GAE/100g と約7 分の 1 程度であった（図１）。
これらの結果は、遠心分離法で回収した精油には、圧搾によって果汁へと移行してパルプに付着した果皮や種子由来のポリフェノール化合物が含まれており、それらポリフェ
ノール化合物は水蒸気蒸留では精油に移行しないためであると考えられる。
＜DPPH ラジカル消去活性＞
DPPH ラジカルの消去率は、遠心分離法で回収した精油の方が高い値を示していた（図 2）。また、EC50 の値からも遠心分離法で回収した精油は水蒸気蒸留法で回収した精油よりも高いラジカル消去活性を有することが示された。
図２ 各精油の DPPH ラジカル消去能40また、両精油で組成比が 1％以上を占めた香
気成分の 6 つにおいても DPPH ラジカル消去活性を評価したところ（図３）、γ-terpinene とterpinolene で強いラジカル消去活性が認められたが、最も高い組成であった limonene のラジカ
ル消去活性は低値を示していた。
図３ 精油主成分の DPPH ラジカル消去能③選択的抗腫瘍成分ニチジンの応用利用（岩崎 公典、玉城 一、稲福 征志）
１）薬剤耐性ガン細胞に対するニチジン（NTD）の有効性
がん化学療法においては「薬剤耐性ガン細胞」の存在が重要な問題となっている。薬
剤耐性がん細胞の多くは薬剤排出に関わる ABC トランスポーターの高発現を特徴とする。
これまでに我々は、様々なガン細胞株を用いて抗腫瘍活性を評価しており、ニチジンが ABC
トランスポーターを高発現しているガン細胞株に対しても有効であることを確認している。
本研究はニチジンの応用利用を検証するために、薬剤耐性形質を有するガン細胞に対するニチジンの有効性を検証した。本研究では ABC トランスポーター遺伝子発現が高い A549
細胞（肺腺癌細胞株、wtA549）を用いており、さらには、種々の抗がん剤のリード化合物であるカンプトテシ（CPT）処理によって生存した A549 細胞を薬剤耐性形質細胞（CRC:
Camptothecin resisntant cell）として実験に供した（※CRC は ABC トランスポーター高発現とカンプトテシン耐性形質を有している、図４）。

図４ 薬剤耐性形質細胞（CRC）の特性とニチジン（NTD）の有効性

41

ニチジンは薬剤耐性形質細胞に対しても有効であるのみならず（図４）、薬剤耐性形質細胞に積極的に取り込まれることが明らかとなった（図５）。これまでの研究において、ニチジンの選択性は腫瘍細胞の積極的なニチジンの取り込みに起因することが解っている。
従って、その分子機序は新たな腫瘍検出技術、特に薬剤耐性形質を有するガン細胞の検出技術に転換できる可能性を秘めていることが明らかとなった。

図５ 薬剤耐性形質細胞（CRC）の積極的なニチジン（NTD）の取込

２）ニチジン封入 PLGA ナノ粒子の作製
従来の水中エマルション溶媒拡散法に改良を加えて、高純度のニチジン（97%）を原料としたプテリキシン封入ナノ粒子の作製を試みた。ポリマー溶液とポリビニルアルコール水溶液を自己乳化させることで PLGA ナノ粒子懸濁液を調製して、溶媒留去と粗ろ過を行い、遠心分離によりナノ粒子を回収した。結果として、粒子径 233nm、ニチジン含有率 2.1％の PLGA ナノ粒子の作製に成功している。

42

３

研究の総括と今後の課題・展望等

研究の総括
本研究によって、PLGA ナノ粒子化技術の用途拡大と機能性食品市場の活性化を考慮した機能性食品への高機能付加技術の可能性が示された。一般的にナノ粒子化技術は機能性成分の生体内での安定性、吸収効率、徐放性の向上などが望める。それらの利点は PLGA
ナノ粒子の侵襲的投与または非侵襲的（経皮）投与においても認められており、製品化へと繋がっている。経口投与における PLGA ナノ粒子化技術の有用性も実験レベルでは確認されている。しかし、それら全ては単一の機能性成分をナノ粒子に封入したものであった。
本研究は、沖縄県産食資源である①長命草のプテリキシン、②シークヮーサーの精油、③抗腫瘍成分ニチジンをモデル素材として用いて、機能性食品開発における PLGA ナノ粒子化技術の基礎的知見を得ることを目的として研究を遂行した。研究を遂行する上では、
特に食品成分としての開発に使用可能な溶剤の選択を重視した。また、対象物質の物性・性状はナノ粒子への封入に大きな影響を与えるため、試料の調製技術と PLGA ナノ粒子化
技術の相互の最適化を試みた。
長命草のプテリキシンにおいては、水中エマルション溶媒拡散法を利用して、高濃縮物を原料とした PLGA ナノ粒子への有効成分の封入に成功している。特に、単一成分を原料としたナノ粒子作製における品質基準を満たすナノ粒子を作製した意義は以上に大きく、粗抽出物を利用する機能性食品製造における機能性成分粒子化の基盤となる技術の構築に貢献できたと言えるであろう。
また、本研究の最大の論点は、高機能型食品の開発における PLGA ナノ粒子技術の有用性を検証することであるため、非ナノ粒子化試料の有効投与量の 1/100 量の PLGA ナノ
粒子化試料を経口摂取した際の機能変動（病態、血液パラメーター）についても本研究では評価している。
シークヮーサーの精油においては、搾汁生産副産物からの精油回収法の最適化および回収法の違いによる精油の機能性の差異について検証した。更にはそれら精油中の機能性成分についても議論して、機能性食品成分としての精油調製技術の基盤を構築している。
ニチジンにおいては、がん化学療法において重要な問題となっている「薬剤耐性ガン細胞」に対する有効性を見出しており、さらには薬剤耐性形質ガン細胞の検出といった新
たなニチジンの応用利用の可能性を示している。また、本研究では同様にニチジンの PLGA
ナノ粒子への封入も試みており、水中エマルション溶媒拡散法において完全に溶解しない

43

成分をナノ粒子化する技術基盤の構築に寄与している。
従って、本研究によって得られた粒子化技術と試料調製法の最適化に関する技術情報
基盤が、機能性食品製造における PLGA ナノ粒子化工程の最適化やコストダウンに繋がることが大いに期待できる。さらには、PLGA ナノ粒子化による機能性成分の質的あるいは量的な大幅な効能の向上は、安全性・安定性・使用実績と相まってナノ粒子化技術の食品分野への用途拡大の促進に繋がることが大いに期待できる。
今後の課題・展望等
本研究の今後の課題としてナノ粒子化技術の更なる最適化」と「PLGA 機能性の再現性確認」を実行することは勿論であるが、機能性食品開発分野への PLGA ナノ粒子化技術の利用拡大における次なる必須確認事項は、PLGA ナノ粒子を経口投与した際の安全性の確認」である。

その第一歩として、当該申請研究で使用した実験動物から回収した血液や臓器の組織障害等を評価して、PLGA ナノ粒子経口投与の安全性について評価する。当
該申請研究成果によって構築される機能性食品分野における PLGA ナノ粒子化システム基盤は、様々な機能性食品高度化の促進に寄与することが期待される。
沖縄県は地域特性を活かした機能性食品素材が豊富であり、開発が盛んであり、既知・未知の機能性に着目した産学官連携による生物資源開発研究がより一層求められている。
従って、種々の県産資源を利用した PLGA ナノ粒子化機能性食品の開発を発展させて、沖縄県および日本の機能性食品産業の活性化に繋げたいと考えている。

44

４

支援金額の執行内訳
項

目

機器・備品

金額（円）

内

訳

356,400 インバーター真空制御システム
184,500 卓上型冷却トラップ装置

消耗品

350,369 プラスチック消耗品
90,232 試料調製用試薬・消耗品
317,687 細胞培養試験用試薬
69,976 実験動物・送料
44,280 動物実験用消耗品
164,160 動物試験用試薬

旅費

133420 学会参加（２名分、横浜市）

その他

47,304 分光光度計修理費
178,940 遠心機修理費
62,732 共通分析機器使用料

合計

５

等

2,000,000

資料等
なし

45

先進 AI（アグリインフォマテックス）による南方系農作物の生産性（土地，労働，品質，商品，環境）の飛躍的向上に関する研究研究代表者 琉球大学農学部 川満芳信
２０１６年３月

46

研究の組織と役割分担
氏名及び職名所属大学・専攻

研究の役割分担等

代表者

川満芳信・教授

琉球大学・生物生産科学

研究の総括

分担者

上野正実・教授

琉球大学・農水圏資源環境

成長モデルと農業 AI

科学
平良英三・准教授

琉球大学・農水圏資源環境

UAV 光センシング

科学
冨永淳・特命助教

１

琉球大学・生物生産科学

Ci と光合成計測

研究の目的と概要①

研究の目的
連大卒業生の就職先として大学，研究機関の研究者に加え新たにアグリビジネ
ス分野を開拓し，６次産業化のための道筋をたてる．さらに，最新技術をもって外国人連大修了生との積極的な研究連携・支援を図り，国際貢献とともに鹿児島連大の地位向上を図る．
農業の活性化による地域振興は，国家的な重要案件となっているが，農家の高齢化などの内的問題，および，TPP など外的圧力にさらされて極めて厳しい状態に置かれている。とりわけ，鹿児島連大が位置する九州および南西諸島は
日本農業の縮図となっており，農業の活性化を図るには，当該地域で優位に栽培できる作物の生産性を飛躍的に高め，さらに，高付加価値化を推進する必要がある。

② 研究の概要
本研究では，作物生理とその環境（土壌，気象など）を光センシング・モニタ
リングや消費者情報などで得られるビッグデータを包括的・統合的に分析する手法によって，生産性の大幅増進と高品質化を推進するとともに，減農薬と適正管理（GAP）による安心安全を徹底化させる。これによって農産物の高付加価値化を図り，内外への販売戦略を確立して，地域農業の活性化に貢献する。
対象作物として，南西諸島で栽培されているサトウキビ，パインアップル，ヤトロファ，イネ，イモ，熱帯果実類などを扱う。

47

２

研究の成果

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

３

研究の総括と今後の課題・展望
鹿児島連大の位置する九州・南西諸島地域で栽培されている南方系農作物（イネ，イモ，サトウキビ，熱帯果実など）の生産性を飛躍的に向上させる技術および AI シ
ステムを開発し，地域農業の振興を図る必要がある。さらに，ここで開発した手法は，連大の修了生が活躍しているアジア・アフリカなどにおいても適用でき，修了生との研究ネットワークの構築および支援に活用できる。本研究の成果を活用して鹿児島連大を軸とした大型外部資金（科研 A・S，SATREPS，他省庁競争的資金）への申請を積極的に行う。
４

論文発表（投稿中を含む）
A)

Shun-Ichiro Kawasaki, Jun Tominaga, Shin Yabuta, Kenta Watanabe, Thanankorn
Jaiphong, Masami Ueno and Yoshinobu Kawamitsu 2015. Responses of growth,photosynthesis, and associated components to hypoxia at different light intensities in
red leaf lettuce. Scientia Horticulturae 193: 330-336. 22 Sep.

B)

河﨑俊一郎・上原直子・渡慶次安道・川満芳信・上野正実 2015. 光源高可
変並びにスライド式栽培棚を備えた栽培システムの開発. 農業食料工学会，（受理 2015 年 7 月 10 日）

C)

Jun Tominaga and Yoshinobu Kawamitsu 2015. Cuticle affects calculations of internal
CO2 in leaves closing their stomata. PCP 56(10):1900-1908
DOI:10.1093/pcp/pcv109.

D)

Jun Tominaga, Shin Yabuta, Yasunori Fukuzawa, Shun-ichiro Kawasaki, Thanankorn
Jaiphong, Ryuichi Suwa and Yoshinobu Kawamitsu 2015. Effects of vertical gradientof leaf nitrogen content on canopy photosynthesis in tall and dwarf cultivars ofsorghum. Plant Production Science 18(3):336-343.

E)

Shun-Ichiro Kawasaki, Jun Tominaga, Naoko Uehara, Masami Ueno and Yoshinobu
Kawamitsu 2015. Effects of long-term exposure to different O2 concentrations on
growth and phytochemical content in red leaf lettuce. Environmental Control in
Biology 53(3):117-122.

F)

Kenta Watanabe, Yasunori Fukuzawa, Masami Ueno and Yoshinobu Kawamitsu 2015.
Effects of potassium chloride and potassium sulfate on sucrose concentration insugarcane juice under pot conditions. Sugar Tech. DOI 10.1007/s12355-015-0392z

75

５ 支援金額の執行内訳
項目
備品

金額（円）

内訳等
0

消耗品

380,000 TDR 土壌水分センサー(8 本)，データロガー

旅費120,000 日本作物学会講演会（那覇—水戸２名）

合計

500,00076

地域ブランド食品品質保証のための
近赤外迅速品質評価システムの構築

研究代表者

鹿児島大学農学部 河野澄夫
２０１６年３月

77

研究の組織と役割分担者
氏名及び職名代表者

河野澄夫・教授

所属大学・専攻
鹿児島大学・農水圏資研究の役割分担総括・安納イモの糖度測定

源環境科学

１ 研究の目的と概要
1-1 研究の目的
鹿児島県の特産品である安納イモは、生産量が増加するにつれて、その品質（糖度）にバラツキが生じるようになり、「安納イモ」のブランドを維持するために、平成 22 年 7 月、「安納いもブランド本部」が設立され、出荷するイモの抜き取り品質検査が行われるようになった。
しかし、抜き取ったイモの糖度検査は、生イモを蒸して、蒸しイモの中心部
からほぼ一定量をサンプリングし、等量の水を加え、混濁液にして屈折糖度計で測定する、時間と労力を必要とする化学分析法で行われており、糖度検査の簡便化・合理化が重要課題である。
そこで、この課題を解決するため、化学成分の非破壊・迅速測定が可能な近赤外分光法による安納イモ糖度の非破壊・迅速測定の可能性について検討した。
1-2 研究の概要(1) イモ塊根のスペクトル測定部位と化学分析部位との距離の糖度測定に及ぼす影響
生イモ塊根の長手方向の端から 1/4 の部位を切断し、その切断面にインタラ
クタンス方式の光ファイバのヘッドを接触させてスペクトルを測定し、スペクトルを測定したイモを 90 分間蒸して、その蒸しイモの糖度（Brix 値）を分析した。糖度分析用の試料は、スペクトルを測定した断面から深さ 5mm の部位（以後、5mm 部位）、10mm の部位(10mm 部位)、及び長手方向の中央の中心（中心部）の部位からサンプリングした。得られた生イモのスペクトルと蒸しイモの Brix
値を基に、PLS 回帰により PLS 検量モデルを作製した。
(2) 生イモ塊根の切断面のスペクトルによる蒸しイモ糖度の迅速測定
生イモ塊根の長手方向のほぼ中央を切断し、その切断面にインタラクタンス
方式の光ファイバのヘッドを接触させてスペクトルを測定し、スペクトルを測定したイモを 90 分間蒸して、その蒸しイモの糖度（Brix 値）を分析した。糖度分析用の試料は、スペクトルを測定した断面から深さ 10mm の部位からサンプリングした。得られた生イモのスペクトルと蒸しイモの Brix 値を基に、PLS 回帰
により PLS 検量モデルを作製した。

78

(3) 生イモ塊根の丸のままのスペクトルによる蒸しイモ糖度の非破壊測定
丸のままの生イモ塊根のスペクトルを、生イモ塊根の長手方向の中央の赤道部にインタラクタンス方式の光ファイバのヘッドを接触させて 3 ヶ所測定し、スペクトルを測定したイモを 90 分間蒸して、蒸しイモの糖度（Brix 値）を測定した。糖度分析用の試料はスペクトルを測定した部位の中心部とした。得られた生イモのスペクトル（3 ヶ所の平均スペクトル使用）と蒸しイモの Brix 値を基に、PLS 回帰により PLS 検量モデルを作製した。
２ 研究の成果
2.1 イモ塊根のスペクトル測定部位と化学分析部位との距離の糖度測定に及ぼす影響
開発した糖度測定用 PLS 検量モデルの推定誤差の標準偏差である SECV の値は、5mm 部位、10mm 部位および中心部の順に、0.77OBrix、0.63OBrix および 0.93OBrixであった。すなわち、10mm 部位で推定誤差が最も小さく（測定精度が最も高く）なった。スペクトル測定断面に近い 5mm 部位の測定精度が高くならなかった理由として、イモを蒸す操作によりイモ塊根分析部位の化学成分の希釈が起こったためと推察された。中央部での推定精度が良くない理由として、中央部の化
学成分の情報がスペクトルに反映されていないためと考えられた。
2.2 生イモ塊根の切断面のスペクトルによる蒸しイモ糖度の迅速測定得られた生イモのスペクトルと蒸しイモの Brix 値を基に、PLS 回帰により糖度測定用の PLS 検量モデルを作製した結果、ファクター(F)10、決定係数(R2) 0.56、検量モデル作製時の標準誤差(SEC)0.81OBrix、および検量モデル評価時の標準誤差(SECV) 0.87OBrix の良好な結果を得た。
2.3 生イモ塊根の丸のままのスペクトルによる蒸しイモ糖度の非破壊測定
得られた生イモのスペクトル（3 ヶ所の平均スペクトル使用）と蒸しイモのBrix 値を基に、PLS 回帰により糖度測定用の PLS 検量モデルを作製した結果、
フ ァ ク タ ー (F)10 、 決 定 係 数 (R2) 0.65 、 検 量 モ デ ル 作 製 時 の 標 準 誤 差(SEC)0.66OBrix、および検量モデル評価時の標準誤差(SECV) 0.92OBrix の良好な結果を得た。
３ 研究の総括と今後の課題・展望
3.1 研究の総括
近赤外分光法を用いた糖度の非破壊測定は、リンゴ、温州ミカンなどの果実で既に行われているが、安納イモなどのサツマイモでは行われていない。その主な原因は、形状が歪で、表皮が泥で汚れていることから、スペクトルの測定が困難であることである。今回の実験で、インタラクタンス法により塊根の切断面でスペクトルを測定すれば、良好な測定結果が得られること。また、丸のまま測定する場合、測定部の泥を柔らかい布で取り除き、携帯型の装置で測定79すれば、非破壊的に糖度が測定可能であることを明らかにした。これらの成果
は、安納いもブランド本部における抜き取り品質検査、糖度自動選別機の開発、および安納イモの加工原料としての品質管理に活用できると期待される。
3.2 次年度に向けての課題・計画・展望等
平成 28 年 3 月末で、定年退職を迎えるが、その後も地域連携プロジェクト関係の仕事に従事する予定である。現場に普及できる技術にブラッシュアップしたい。
４

支援金額の執行内訳
項

目

金額（円）

訳

等

機器・備品

86,940 デジタル糖度計

消耗品

59,059 デンプン測定キット、試料容器など

旅費

143,520 琉球大学、北海道大学等訪問

その他

210,481 安納イモ実験補助500,000

合計

５

内

資料等

＜原著論文＞(1)松尾美紅・長谷健・宮原照昌・北原兼文・紙谷喜則・河野澄夫：プロトタイプ近赤外装置

による安納イモ糖度の迅速測定技術の開発、プロトタイプ近赤外装置の精度比較、農業食料工学会九州支部誌、64, 1-5(2015)＜学会発表＞(1)松尾美紅・長谷健・宮原照昌・北原兼文・紙谷喜則・河野澄夫:プロトタイプ近赤外装置による蒸し安納イモ糖度の迅速測定技術の開発、プロトタイプ近赤外装置の精度比較、第 69回農業食料工学会九州支部例会発表要旨集、p.88 (2015)(2) M.Matsuo, K.Nagatani, T.Miyahara, K.Kitahara, Y.Kamitani and S.Kawano, Development of
rapid measurement technique of the Brix value of steamed sweet potatoes "An-no" by the prototype
near infrared instrument, 17th International Conference on Near Infrared Spectroscpy, Foz do
Iguassu, Brazil (2015)(3)松尾美紅・山脇明佑子・長谷健・宮原照昌・北原兼文・紙谷喜則・河野澄夫:近赤外プロトタ
イプ装置による安納イモの迅速品質評価技術の確立、第 31 回近赤外フォーラム、p.92 (2015)＜修士論文＞(1)松尾美紅：近赤外分光法による蒸し安納イモ糖度の迅速測定法の開発

80

サツマイモ焼酎を活かした天然食材の生物活性増強への試み

研究代表者

鹿児島大学農学部 侯 徳興
２０１６年３月

81

研究の組織と役割分担者
氏名及び職名
代表者

侯

徳興・教授

分担者

坂尾こず枝・助教

所属大学・専攻

研究の役割分担等

鹿児島大学・応用生命科学 研究総括
鹿児島大学・応用生命科学 機能性成分の分子メカニズム
の解析

協力者

高良 健作・准教授 琉球大学・応用生命科学

機能性成分の構造解析

和田 浩二・教授

機能性成分精製のデザン・指琉球大学・応用生命科学

導永尾 晃治・教授

佐賀大学・応用生命科学

動物実験のデザイン・指導

１．研究の目的と概要
・研究の目的本事業では「サツマイモ焼酎をいかした食品機能性成分の活性化」を主な研究目的とした。
日本には果実等を蒸留酒に漬け込み、その風味を楽しむという独自の風習がある。申請者は、過去の実験において、天然食材（キノコ）を浸漬したサツ
マイモ焼酎の中に抗炎症作用、抗がん作用に対し、高い活性を有する化合物が抽出されていることを見出した。サツマイモ焼酎に浸漬した結果得られた成分に高い活性を有す成分が含まれていることは、サツマイモ焼酎に大きな付加価
値をつけるものとして期待される。しかし、活性を示す成分が複数個存在していることより、それらの内、どの成分が最も高い活性に寄与しているのかが未だに解明されていない。そこで、本研究では未だ解明されていない成分の生物活性作用機序を培養細胞から実験動物までに明らかにすると共に、構造解析を試みた。それらの結果をもとに、サツマイモ焼酎に天然食材を漬け込むことの付加価値を見出し、地域食産業の活性に繋げていくことを研究の目的とした。
・研究の概要研究では次に示す４つの内容に大別して研究を遂行した。
① サンプルの調整（琉球大学

和田、

鹿児島大学

坂尾、侯）

サンプルを得るためにサツマイモ焼酎の冬虫夏草スピリッツを作成し生物活性成分の分画を行う。主な流れとして、まず始めに冬虫夏草をサツマイモ焼
酎に 3 週間浸透させる。次に天然食材を炉別し、濃縮した後、HP 20 カラムによる分画 → Sephadex G-25 カラムによる分画 → 高速カラムクロマトブラフィー

82

（HPLC）による分画の順で成分を分離精製し、②において用いるサンプルの調整を行う。
② 分画成分の生物活性作用機序の解明（鹿児島大学

坂尾、侯）①の分画により得られた各画分のうち、機能が高い成分をサンプルとして、
ヒト大腸がん細胞 (HCT116) に対するがん細胞増殖抑制効果及びアポトーシス
誘導能を調べ、その作用機序の解明を行う。主な手法および流れとして、（１）
がん細胞増殖抑制能を MTT 測定法を用いて測定。（２）タンパク質発現の検出として Western blotting 分析法を用いる。HCT116 細胞にサンプルを添加し、回収したタンパク質を SDS-PAGE により分離、アポトーシスに関与する主要タン
パク質の抗体を用いてその発現の増減を検出する。
（３）アポトーシス誘導の指標として用いられる DNA 断片化の検出は、ELISA 法を用い、アポトーシスが起
こった細胞にあるヒストン/ DNA 断片複合体を検出すると共に、Annexin V-FITC
Apoptosis Detection kit を用いて、フルオレセインイソチオシアネート (FITC) 標
識した Annexin V および PI の二重染色によるアポトーシスの定量を行う。
③ 機能性成分の構造解析（琉球大学

高良、鹿児島大学

坂尾）②の結果より、がん細胞増殖抑制に対する生物活性が明らかになったサン
プルについて、その分子構造の化学解析を行う。その方法として、（１）NMR（核磁気共鳴）スペクトル解析（２）IR（赤外吸収）スペクトル解析（３）MS（質量分析）スペクトル解析を用いて構造の特定を行う。また、得られた構造によりサンプルが既存の化合物である可能性が明らかになった場合、標品として同化合物を購入し HPLC を用いた確認も行う。
④ 動物実験（佐賀大学

永尾、

鹿児島大学

坂尾、侯）

冬虫夏草を浸漬したサツマイモ焼酎スピリッツ、サツマイモ焼酎、コント
ロール用の一般エタノールを用いた動物実験のデザイン・構築を試みる。その結果得られた血液生化学指標および肝臓組織を解析し、機能性と安全性を実証する検討を行う。
２．研究の成果（研究の役割分担者ごとに記載）① サンプルの調整（琉球大学

和田、

鹿児島大学

坂尾、侯）

サンプルを得るためにサツマイモ焼酎の冬虫夏草スピリッツを作成し、生物活性成分の分画を行った。詳細として、まず始めに冬虫夏草をサツマイモ焼
酎に 3 週間浸透させた。次に冬虫夏草を炉別し、濃縮した後、（１）HP 20 カラ83

ムによる分画 → （２）Sephadex G-25 カラムによる分画 → （３）高速カラム
クロマトブラフィー（HPLC）による分画の順で成分を分離精製した。その結果、（１）では Fraction1~4 の 4 分画がえられ、そのうち一番機能性が高かった
Fraction1 を（２）で再分画することで、Fraction1A~1C の 3 分画が得られた。なか で も 一 番 機 能 性 が 高 か っ た Fraction1C に つ い て は （ ３ ） に お い てFraction1C-I~1C-IV として 4 つの成分として分画した。
② 分画成分の生物活性作用機序の解明（鹿児島大学

坂尾、侯）①の分画における各生成段階で得られた、Fraction1~4、Fraction1A~1C、Fraction1C-I~1C-IV の各成分について、がん細胞増殖抑制効果を測定することで、最も高い効果を示す化合物のスクリーニングを行った。その結果、Fraction1C-III
が最も高い活性を有する化合物であることが明らかになった。そこで、Fraction1C-III のヒト大腸がん細胞 (HCT116)に対するがん細胞増殖抑制効果の作用機序の解明としてアポトーシス誘導能の各種測定を行った。詳細は以下の通りである。
（１）がん細胞増殖抑制能の検証
がん細胞増殖抑制能を MTT 測定法を用いて測定した結果、Fraction1C-III
が最も高い活性を示し、濃度依存的に増殖を抑えることが明らかになった。また、冬虫夏草の生理活性主成分とされる Cordycepin と比較した結果、（２）Western blotting 分析法
アポトーシス関連タンパク質発現の検出として Western blotting 分析法を用いた。アポトーシスに関与する主要タンパク質である Caspase-3 や PARP
抗体を用いてその発現レベルを検出した結果、Caspase-3 の活性および
PARP の開裂が得られた。
（３）DNA 断片化の検出（ELISA 法）
アポトーシス誘導の指標となる DNA 断片化の検出として、ヒストン/
DNA 断 片 複 合 体 を ELISA 法 に て 検 出 し た 結 果 、 Fraction1C-III が
Cordycepin よりも高いアポトーシス誘導能を有することが明らかになった。
（４）アポトーシスの定量（Annexin V-FITC Apoptosis Detection）
Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit を用い、Annexin V および PI の二重染色による前期、後期アポトーシス誘導についての定量をおこなった
結果、Fraction1C-III が主に後期アポトーシスを誘導することが明らかに
なった。

84

③ 機能性成分の構造解析（琉球大学

高良、鹿児島大学

坂尾）②の結果より、がん細胞増殖抑制に対する高い生物活性作用機序が明らかになった Fraction1C-III について、その分子構造の化学解析を行った。その方法として、（１）NMR（核磁気共鳴）スペクトル解析（２）IR（赤外吸収）スペク
トル解析（３）MS（質量分析）スペクトル解析を用いて構造の特定を実施した。
その結果、Fraction1C-III は冬虫夏草の生理活性主成分とされる Cordycepin である可能性が示唆された。そこで Cordycepin 標品と Fraction1C-III を HPLC にて比較検証したところ、同物質である結果が得られた。しかし、②生物活性作用機序の解明における、がん細胞増殖抑制効果ならびにアポトーシス誘導能の測定の結果、Fraction1C-III は Cordycepin 標品よりも活性が高いことが明らかになったことより、Fraction1C-III は Cordycepin 類似の新規物質である可能性が示唆された。
④ 動物実験（佐賀大学

永尾、

鹿児島大学

坂尾、侯）

冬虫夏草を浸漬したサツマイモ焼酎スピリッツ、サツマイモ焼酎、コント
ロール用の一般エタノールを用いた動物実験のデザイン・構築を試みた。その結果、アルコールを含んだ液体飼料の構築に成功し、実験マウスを用いたアルコール性肝障害への影響についての検討を実施した。得られたマウスの血清については血液生化学指標として炎症および肝機能マーカーを測定し、現在解析を行っている。肝臓組織についても、凍結切片の作成ならびに免疫染色を行ったスライドの作成を試みている。

３．研究の総括と今後の課題・展望
・研究の総括本研究により得られた成果として、サツマイモ焼酎に漬け込んだ冬虫夏草の抽出成分による、ヒト大腸がん細胞の増殖抑制効果およびその作用機序の解明、さらには生物活性を有する成分の構造解明が大きく進展した。具体的な研究成果として、①サンプルの調整を通した、焼酎からの天然食材成分の分画方法の確立、②分画成分の生物活性作用機序の解明より（１）抽出成分によるがん細胞増殖抑制効果、（２）アポトーシス誘導メカニズムの解明が得られたほか、③
機能性成分の構造解析においては、Fraction1C-III が新規化合物である可能性が示唆された。また、④動物実験では、液体飼料を用いた動物実験の確立とともに、実験動物レベルでの冬虫夏草サツマイモ焼酎スピリッツの作用が実証され
つつある。

85

・次年度に向けての検討事項
本研究より得られた結果をもとに、以下に示す検討を行っていく。
検討事項① Fraction1C-III の生理活性の強さの解明② 冬虫夏草を浸漬したサツマイモ焼酎から炉別した残渣（本研究で言うならキノコのほう）を用いた、生物活性の有無についての検索③ 実験動物を用いたスピリッツの作用の解析：
現在実施しているアルコール性肝障害モデルマウス実験で得られたデータの解析および本研究で行ったアルコール性肝障害モデル実験とは異なる作用（抗炎症、抗がんなど）についての検討④ 健康的で、美味しいスピリッツの開発：
官能試験や香気成分の分析を行い、機能性が高いだけではなく嗜好性も高くなるスピリッツを開発する。
これらの研究事業を行い、連大構成教員間の連携により学際の難問をチャレンジーすることで、科学的に解明するだけではなく、最終的には地域食産業への貢献に繋げていく。

86

４

支援金額の執行内訳
鹿児島大学
項

目

機器・備品

金額（千円）

内訳

等

444 コンビニ・エバポ C1 (444)・設置場所：鹿児島大学食品分子機能学研究室
706 サツマイモ焼酎 (10)、ZICR -HILIC カラム (120)、

消耗品

ELISA キット (210)、蛍光試薬 (80×2 個)、抗体試薬(100)、培地・ディッシュ (100)、その他試薬・器具類等（6）50 機器分析機器使用代金 (50)

その他
合計

1200

琉球大学
項

目

機器・備品

金額（千円）

内訳

等

509 遠心エバポ(509)、・設置場所：琉球大学食品化学研究室

消耗品

81 NMR 試料管(11)、溶媒等(70)その他

10 機器分析使用料金(10)

合計

600

佐賀大学
項

目

金額（千円）

機器・備品

0

内

訳

等

消耗品

124 有機溶媒等試薬 (54)、ガラスピペット等器具類（70）その他

76 研究打合せ旅費 (76)

合計

200

５ 資料等
なし

87

南九州の縁辺海における亜熱帯化に対応した
水産生物生産の高度化研究代表者

鹿児島大学水産学部 前田広人
２０１６年３月

88

研究の組織と役割分担者
氏名及び職名所属大学・専攻

研究の役割分担等

代表者

前田広人･教授

分担者

野呂忠秀･教授

鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 農水圏資源環境科学専
攻
鹿児島大学･ 水産学部
鹿児島大学･ 水産学部
琉球大学･・応用生
命科学専攻
佐賀大学 ・応用生
命科学専攻（構成大学外）宮崎大学･農学部・海洋生物環境学科

分子微生物生態解析および研究総括
磯焼けおよび海藻の亜熱帯化の実態把握亜熱帯性魚類の増養殖技
術開発

門脇秀策・教授
中村啓彦・准教授
本村浩之・教授
吉川 毅･准教授
寺田竜太・准教授
奥西将之・特任准教授
國師恵美子・助教
小西照子・准教授亀井勇統・准教授

田岡洋介・准教授89

亜熱帯化の水温変化の現状把握
南九州海域魚類個体群動態の実態把握亜熱帯化赤潮の遺伝子解析
磯焼けおよび海藻の亜熱帯化の実態把握亜熱帯化水域の微生物の遺伝子解析
亜熱帯化水域の水質調査
沖縄の海草成分の分析および有効利用亜熱帯動植物の有用成分の検索

宮崎海域の亜熱帯化魚類
の有効利用

研究内容
１ 研究の目的
近年の地球温暖化に伴い、南九州の沿岸海域では亜熱帯性外来魚種（アイゴ、ボラ近縁種など）や、藻類（亜熱帯性ホンダワラ類など）、有害・有毒微細藻類種（赤潮、シガテラ毒、貝毒など）の移入が確認され、海洋生態系や水産業への影響が懸念されている。従前の温暖化対策は、現状の生態系や漁業生産性の維持に主眼が置かれてきた。しかしながら、南九州海域における水産業の持続的な振興を図るためには、むしろ亜熱帯化への積極的な対応が鍵となる。
そこで本事業では、南九州海域の漁獲対象魚種、藻類、ならびに有害・有毒
微生物個体群の現状把握から温暖化の沿岸生態系への影響を調査し、その結果から亜熱帯環境下での増養殖に適応し産業化が可能な魚種、藻類種を提言に資する研究を行う。また、亜熱帯環境下での増養殖・育種、赤潮対策、微細藻類起源の食中毒対策といった技術の確立を目指すとともに、当該増養殖の実施により生じる可能性のある生態系への影響を予測し、環境負荷の低減を図る。以
上の取り組みにより、近い将来予想される亜熱帯化で、南九州独自の収益性が高く持続可能な水産業のあり方を提言する。
２ 研究の概要
2.1 南九州海域における魚類生態系の現状把握
南九州海域に調査定点を設け、漁獲対象魚種、藻類、有害・有毒微細藻類種個体群の現状と生態をフィールド調査により把握する。過去の個体群動態との比較から、沿岸生態系におけるこれら漁獲対象種の近年の遷移を明らかにし、亜熱帯化に伴い北上、あるいは新たに移入してきた生物種を特定する。
2.2 南九州海域の黒潮流路および流速場の現状把握
南九州海域は黒潮流域に属するため、地球温暖化に対する当海域の海洋生態系の変化を予測するには、黒潮に関わる海洋環境とその上で成り立つ黒潮生態系の仕組みを理解する必要がある。そのための基礎的研究として、南九州海域の黒潮流路および流速場の変動様式と黒潮生態系の仕組みを解明する。
2.3 有害・有毒微生物対策についての現状把握
有害・有毒微細藻類の調査結果に基づき、亜熱帯性、熱帯性の魚毒性の強い
藻類ならびに食中毒原因種の移入、定着の可能性について現地調査を行う。その結果に基づき、すでに実績のある赤潮防除法の有効性も併せて検討し、予想される漁業被害の低減策を提言する。

90

３ 研究の成果（各テーマごとに記載）
3.1 南九州海域における魚類生態系の現状把握
南九州の 6 地点（甑島、笠沙、枕崎、指宿、内之浦、種子島）に水揚げされる魚類の調査を行った。種同定を正確に行うためにすべての調査標本を登録・保管した。計 3,091 標本の調査と過去の標本および地元漁師聞き取り調査によって、過去に水揚げされていない複数の魚種が近年水揚げされるようになったことが明らかになった。特に最近南九州において水揚げが確認されたのは、マテ
アジ（アジ科）、ニセタカサゴ（タカサゴ科）、グルクマ（サバ科）、ニジョウサ
バ（サバ科）、およびテングハギ（ニザダイ科）などである。2015 年 7 月にはこれまで東南アジアからのみ知られていたアジ科の一種が枕崎市沖から漁獲され、新たな和名としてサクラアジと命名された。このように多くの熱帯性魚類が近年南九州から漁獲され始めているが、それぞれの個体数は少なく、水産資源として利用する価値はまだ低い。
3.2 南九州海域の黒潮流路および流速場の現状把握
南九州海域の黒潮の変動様式として、黒潮は夏季の季節風により直進流路（陸棚斜面に沿った流路）に成りやすく、逆に、冬季の季節風により蛇行流路（陸棚斜面を横切る流路）に成りやすいことを、観測データ解析と理論・数値実験から示した。このことは、将来の南九州海域の黒潮流路状態を予測するには、北東アジアの季節風の変化を予測することが重要であることを示唆する。
さらに、トカラ海峡の黒潮における鉛直混合・栄養塩輸送と生態系の基礎構造の解明を目指して、かごしま丸の大学院洋上観測乗船実習（11 月）の一環として、物理学と生物学の学際的観測を開始した。今年度の成果として、南九州海域では，複雑な海底地形に起因して起こる非常に強い鉛直混合（外洋域の典型的な乱流強度より 10 倍以上大きい）により、海洋中層から表層へ大量の栄養塩が供給されていることがわかった（既報の栄養塩の鉛直フラックスと比較すると、フラックスが大きい海域に属する）。今後は、このような海洋環境が生態系とどのように関連しているかを突き止めていく。
3.3 有害・有毒微生物対策についての現状把握
本年度は甑島のクロマグロ養殖場における赤潮モニタリングを実施した。そこでは 10 月にコックリディニウムの赤潮を検出し、種の同定や栄養塩の動態把握を行った。その結果、原因種はこれまでの発現種と異なりコックリディニウ
ムの笠沙タイプであることがわかり、コックリディニウムポリクリコイデスとは異なった増殖条件を持っていることがわかった。また栄養塩のレベルは比較的低いものの、従来より低濃度でも赤潮発生が見られることを確認し、低濃度の栄養塩による赤潮引き金の要因を突き止める必要があることがわかった。また、赤潮対策としては複合エコ養殖の一環として、海藻による栄養塩吸収とそ

91

れらを用いたアワビ養殖の併用によって養殖場の栄養塩管理を行いうる可能性を示した。
４ 研究の総括と今後の課題・展望（代表者）
4.1 研究の総括
本研究テーマはこれまで個別のテーマで実施されてきたものをオムニバス的にまとめたものであり、亜熱帯化というキーワードで行う研究としては、緒に就いたばかりである。そのため相互の関連を結びつけるにはまだいたっていない。研究内容としてはそれぞれに先駆的な内容であり、鹿児島大学の地の利を生かした研究であると言える。今後はこれらの研究を包括的に取りまとめる
プロジェクトが必要である。
4.2 次年度に向けての課題・計画・展望等
上で述べた通り、連合農学研究科の構成大学は、我が国において地球温暖化の影響をいち早く受ける可能性のある南西諸島海域から南九州海域をフィールドとしている。また、本研究科は東南アジアをはじめとする亜熱帯・熱帯域からの留学生を多く受け入れており、彼らが母国で培った知識や技術を本事業に活用できる。すなわち、南九州海域とその亜熱帯化を対象とした本事業は、本研究科でなければなしえないものであり、当該研究分野の牽引役となることが期待される。
計画としては、上記の研究を包括的に取りまとめることにより、地球温暖化が南九州海域の沿岸生態系に与える影響が評価される。また、本事業は、現状の漁業生産性の維持にとどまらず、来たるべき亜熱帯化に対応した南九州海域
独自の水産業のあり方の提言につながる。
今後の展望としては、近年、温暖化に伴う水産資源の枯渇が危惧される中、亜熱帯環境に適応した魚種、藻類種を新たな漁業資源として利用することにより、南九州海域における水産業の安定化、振興に寄与すると期待される。
また、将来的には食糧資源にとどまらない有効活用法（有用物質生産、バイ
オマスエネルギーなど）の研究、開発を通して新たな産業の創出につながると期待される。本事業の成果を踏まえ、対象魚種、藻類種養殖の実地試験を行い、その生産性ならびに漁場環境への負荷を評価するとともに、その改善のための技術開発に取り組む必要がある。また、食糧資源にとどまらず、亜熱帯性水産資源からの有用物質の検索・生産、バイオマスエネルギー生産などへの応用可能性を検討することも必要である。これらの研究事業の実施母体として、本事業の構成メンバーを核とした研究班を形成して科学研究費、文部科学省概算要求プロジェクトなどの予算獲得に努め、長期的視野に立って研究開発を継続し、本事業の成果について実用化を目指すことが望まれる。

92

５ 支援金額の執行内訳
項 目
金額（円）
機器・備
品

669,068

内訳

等

バイオフリーザー、オートクレーブ

消耗品

1,065,090

旅費

100,000

実験試薬、実験器具、外付けハードディスク
MATLAB ソフトウェアライセンス
トナーカートリッジ
アルカリ電池コピー用紙
鹿児島-沖縄等

その他

165,842

宅急便代等

合計

2,000,000

６ 資料等
発表論文（2015 年４月から 2016 年３月まで受理分を含む）
・Tetramethylbenzidine method for monitoring the free available chlorineand microbicidal activity of chlorite-based sanitizers under organicmatter-rich environments，Letters in applied microbiology，62巻 1号 （頁47 ～ 54） ，2016年01月，H. Yamaoka, H. Nakayama-Imaohji, I. Horiuchi, H.
Yamasaki, T. Nagao, Y. Fujita, H. Maeda, H. Goda and T. Kuwahara. 研究
論文（学術雑誌）
・葉緑体ＤＮＡ遺伝子を標的とした定量ＰＣＲによる 赤潮原因藻Chattonella
marinaの定量化，日本防菌防黴学会誌，4.3巻 9号 （頁 401 ～ 406） ，2015
年09月，堀英美子, 吉川毅, 吉永拓真, 冨吉亜也子, 奥西将之, 前田広人 研究
論文（学術雑誌）
・ Tepidicaulis marinus gen. nov., sp. nov., a marine bacterium that
reduces nitrate to nitrous oxide under strictly microaerobic conditions，International journal of systematic and evolutionary microbiology，65
巻 1 号 （頁 1749 ～ 1754） ，2015 年 06 月，Mio Takeuchi, Takao Yamagishi,

93

Yoichi Kamagata, Kenshiro Oshima, Masahira Hattori, Taiki Katayama,
Satoshi Hanada, Hideyuki Tamaki, Katsumi Marumo, Hiroto Maeda, Munetomo
Nedachi, Wataru Iwasaki, Yuichi Suwa, Susumu Sakata 研究論文（学術雑誌）
・ Isolation and Characterization of a Purple Non-Sulfur Photosynthetic
Bacterium Rhodopseudomonas faecalis Strain A from Swine Sewage Wastewater,
Biocontrol Sci., 62 巻 1 号 （頁 29 ～ 36） ，2016, Wei, H. Y., Okunishi,S., Yoshikawa, T., and Maeda, H. 研究論文（学術雑誌）
・ Synergistic Effect of Photosynthetic Bacteria and Isolated Bacteriain
Their Antifungal Activities against Root Rot Fungi, Biocontrol Sci., inpress, Wei, H. Y., Okunishi, S., Yoshikawa, T., Yuto, K., MAHMOUD, A. O.
D., Sheila, M. S. S., Sharon, N. N., and Maeda, H. 研究論文（学術雑誌）
・ Seasonal cycle of volume transport through Kerama Gap revealed by a
20-year global HYbrid Coordinate Ocean Model reanalysis, Ocean Modelling,Vol. 96, pp. 203–213 ,Yu, Z., E. J. Metzger, P. Thoppil, H. E. Hurlburt,
L. Zamudio, O. M. Smedstad, H. Na, H. Nakamura, J.-H. Park, (November 2015)
研究論文（学術雑誌）
・ Local wind effect on the Kuroshio path state off the southeastern coastof Kyushu, Journal of Oceanography, Vol. 71, pp. 575-596. Nakamura H., R.
Hiranaka, A. Daisuke, and T. Saito, (October 2015)研究論文（学術雑誌）
学会発表（2015 年４月から 2016 年３月まで）
・ Application of photosynthetic bacteria, 2nd International Conference
on Fisheries and Aquatic Sciences (ICFAS2016), Sakaguchi, S., Wei, H. Y.,
Okunishi, S., Yoshikawa, T., and Maeda, H.
・ Biological control of pathogenic root rot fungus, 2nd International
Conference on Fisheries and Aquatic Sciences (ICFAS2016), Wei, H. Y.,
Okunishi, S., Yoshikawa, T., and Maeda, H.
・ Extermination of harmful phytoplankton using shredded thalli of Ulva
sp., 2nd International Conference on Fisheries and Aquatic Sciences(ICFAS2016), Okunishi, S., Seshita, K., Yoshikawa, T., Kadowaki, S., Kamei,Y., and Maeda, H.
・ 季節風が励起する台湾北東沖の黒潮小蛇行の数値実験，日本海洋学会 2016年度春季大会，2016 年 3 月，東京,平中陸・中村啓彦
・ Local wind effect on the Kuroshio path state off the southeastern coastof Kyushu, 18th Pacific-Asian Marginal Seas Meeting, 2015 年 4 月, 那覇.
Nakamura, H., R. Hiranaka, D. Ambe, and T. Saito,
・ Studies on the current system around the Okinawa Trough using Training

94

Ship Kagoshima-maru, Workshop on Typhoon-Ocean Interaction in the
Northwest Pacific, Isabu Typhoon/Ocean Program, 2016 年 2 月，ソウル
Nakamura, H.,・ 南西諸島周辺海域の海水循環，乱流混合と物質循環，水産海洋シンポジウ
ム，2016 年 3 月，東京,中村啓彦・仁科文子，
・ 西岸境界域での北太平洋中層水の変質過程，日本海洋学会 2016 年度春季大会，2016 年 3 月，東京,楊季蓮・中村啓彦・張振龍，
・ Seasonal variation of the Kuroshio and its relationship with local windstress, 日本海洋学会 2015 年度秋季大会，2015 年 9 月，松山, Zhang, Z., H.
Nakamura, D. Ambe, R. Hiranaka, and T. Saito,
・ Seasonality of the entire Kuroshio in the velocity field, 日本海洋学会 2016 年度春季大会，2016 年 3 月，東京,Zhang, Z., H. Nakamura, D. Ambe,
R. Hiranaka, and T. Saito,

95

九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源のゲノム・トランスクリプトーム解析

研究代表者

佐賀大学総合分析実験センター 永野 幸生
２０１６年３月

96

研究組織と役割分担

代表者

氏名及び職名（所属）

研究の役割分担等

永野 幸生・准教授（佐賀大学・総合分析実験センタ
ー）

研究の統括
メロンの交雑系統およびハブ
草・ホタルの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

研究分担者１（初期メンバー）
分担者

協力者

氏名及び職名（所属）

研究の役割分担等

山本 雅史・教授（鹿児島大学・農学部）

ユズの遺伝的多様性に関する
RAD-Seq 解析

平良 東紀・教授（琉球大学・農学部）

シダ植物・リュウキュウイノモト
ソウの RNA-Seq 解析

古藤田 信博・准教授（佐賀大学・農学部）

カンキツの交雑系統の
RAD-Seq 解析

穴井 豊昭・教授（佐賀大学・農学部）

研究全体への助言

大島 一里・教授（佐賀大学・農学部）

ノビル（野蒜）の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

草場 基章・准教授（佐賀大学・農学部）

いもち病菌の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

光富 勝・教授（佐賀大学・農学部）

糸状菌 Gongronella butleri のRNA-Seq 解析

福田 伸二・講師（佐賀大学・農学部）

大島一里のノビルの RAD-Seq
解析への協力者

関 清彦・講師（佐賀大学・農学部）

光富勝の糸状菌 Gongronella
butleri の RNA-Seq 解析への協力者

松本 雄一・講師（佐賀大学・農学部）

永野幸生の RAD-Seq 解析へ
の協力者

97

研究分担者２（募集により加わったメンバー）
分担者

氏名及び職名（所属

研究の役割分担等

梶田 忠・教授（琉球大学熱帯生物圏研究セン
ター）

マングローブの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

下桐 猛・准教授（鹿児島大学・農学部）

ウシの遺伝的多様性に関する
RAD-Seq 解析

濱 洋一郎・教授（佐賀大学・農学部）

海苔の RNA-Seq 解析

981

研究の目的と概要

1.1
研究の目的
連合農学研究科の構成大学は優れた遺伝資源を保有している。具体的にはカンキツとその近縁植物 300 系統以上や 100 程度の交雑系統、ダイズの変異系統 40,000
以上、ビワ 100 系統程度と交雑系統 100 程度、少なくとも日本一の規模を誇る野生ネ
ギ属植物「ノビル（野蒜）」約 500 系統、日本中のいもち病菌 1000 株以上、メロンとその近縁野生種 200 系統以上と 100 程度の交雑系統などである。また、興味深い性質の酵素を保有するが、遺伝情報の解読が進んでいないシダ植物や糸状菌 Gongronella

butleri も研究している。さらに、その他の優れた遺伝資源を、連合農学研究科の構成
大学の研究者が保有する可能性がある。研究者各々による維持・管理・収集・交雑によって保有しているものであり、「九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源」と言っても過言ではない。これら遺伝資源を最先端の次世代シークエンサーによりゲノム及びトランスク
リプトームの解析をすれば、より優れた研究成果が期待できる。しかし、これまで行ってきた研究手法と大きく異なるため、多くの研究者が、その実行に躊躇している。研究グ
ループの 永野ら には 、次世代シークエンサーを 活用した 研究（www.nature.com/srep/2014/140430/srep04853/full/srep04853.html など）で獲得した研究ノウハウがある。このノウハウを活用しつつ、次のことを行う。
1) 各構成大学において、実習を通して、研究手法を習得するための講習会を開催することで、新技術に関する啓蒙を行う。
2) 分担者がゲノム解析あるいはトランスクリプトーム解析（パイロット実験を含む）を行う。
3) 次世代シーケンサーを活用してみたい研究者を募集し、経費の一部を提供する。
以上のより、連合農学研究科における遺伝資源研究の活性化に繋げる。
1.2

研究の概要

上記の目的「1.1 の 2)」に基づいて、あらかじめ定めた研究分担者が次の研究を実施することにした。
1) シダ植物・リュウキュウイノモトソウの RNA-Seq 解析2) 糸状菌 Gongronella butleri の RNA-Seq 解析3) カンキツの交雑系統の RAD-Seq 解析4) ユズの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

99

5)
6)
7)
8)
9)

ノビル（野蒜）の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析
いもち病菌の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析
メロンの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析
ハブ草の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析
ホタルの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

また、上記の目的「1.1 の 3)」に基づいて、新たに募集した研究分担者が次の研究を実施することにした。
10) 海苔の RNA-Seq 解析11) マングローブの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析12) ウシの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析

100

2

研究の成果

2.1

講習会の開催（研究代表者・永野 幸生）

新技術に関する啓蒙を行うために、各構成大学において、実習を通して、研究手法を習得するための講習会を、次のように開催した。なお、佐賀大学で行ったものについては、本事業が採択される前に研究代表者の経費で行ったものである。
・ 6/20（土）-21（日）、佐賀大学一回目
 本事業の採択前だったので、農学部以外も対象とした。
 佐賀大学農学部から 7 名、佐賀大学医学部から 2 名、鹿児島大学医学部から 1 名の参加者があった。
・ 7/12（日）・7/26（日）、佐賀大学二回目
 上述の様に農学部以外も対象とした。
 佐賀大学農学部から 6 名、佐賀大学医学部から 1 名、佐賀県果樹試験場から 1 名の参加者があった。
・ 10/31（土）-11/1（日）、鹿児島大学（世話人：山本雅史）
 鹿児島大学農学部から 4 名の参加者があった
・ 11/28（土）-11/29（日）、琉球大学（世話人：平良東紀）
 琉球大学農学部から 6 名、琉球大学熱帯生物圏研究センターから 1 名の参加者があった。
なお、以下は、鹿児島大学及び琉球大学における講習会開催のための通知文である。
鹿児島大学大学院連合農学研究科
教員 各位
平成２７年度連合農学研究科先進的研究推進事業において採択された課題「九州・沖縄が世界に誇る遺伝資源のゲノム・トランスクリプトーム解析」代表者の佐賀大学総合分析実験センターの永野幸生と申します。
本課題におきましては、連合農学研究科構成大学の研究者が九州・沖縄地区の優れた遺伝資源を多数保有しているも関わらず、最先端の分析機器である次世代シー
クエンサーを用いてゲノム及びトランスクリプトームの解析が行われていないことを、掲げています。そこで、連合農学研究科の活性化のために、以下のことを計画しました。

101１）あらかじめ定めた研究分担者による上記研究の実施
２）研究者のゲノムリテラシー向上のための講習会の開催
３）優れた遺伝資源を有する研究者の掘り起こし（次世代シーケンサーを活用してみたい研究者を募集し、経費の一部を提供する）
このうち、２）と３）については、研究分担者以外も対象となることから、先生方にメールを差し上げる次第です。
まず、２）につきましては、本年度、佐賀大学において既に実施した実習コース「次世代シーケンサーで得られたデータの解析の実践」を改良したものを、鹿児島大学と琉球大学で開催します。ノートパソコン（64 ビット）を持参していただ
き、次世代シーケンサーで得られたデータの解析を体験して頂きます。対象は、連合農学研究科の学生や教員となります。日程は、10/31（土）-11/1（日）、鹿児島大学（世話人：山本雅史）
11/28（土）-11/29（日）、琉球大学（世話人：平良東紀）です。各日とも 1-5 限目、計 10 限の開催となります。受講希望者の方は、10/23（金）までに佐賀大学の永野幸生（nagano@cc.saga-u.ac.jp）までご連絡ください。場所や準備事項については、追って、受講者に連絡いたします。
次に３）については、これからゲノム・トランスクリプトーム解析を実施したい方を主な対象として、以下の研究を募ります。
①RNA-seq
これまでゲノム・トランスクリプトーム解析が行われていなかった生物を対象として、新たにトランスクリプトームを決める研究を対象とします。トランスクリ
プトームを知ることで、その後の様々な研究に役立てることを目的とします。発現の差異を調べる研究は対象外です。各研究者に RNA を準備して頂くことになります。
②RAD-seq
ゲノムの 1%くらいを決定して、連鎖解析や集団構造の解析を行う研究手法です。
今後、この手法で連鎖解析等が実施可能かどうかを検証するパイロット実験の実施を目的とします。これもあまり解析が進んでいない生物を対象とします。各研102

究者に多検体の DNA を準備して頂くことになります。
これらにつきましては、行いたい研究の概要を説明した文書（A4 一枚以内）を、
10/31（土）までに佐賀大学の永野幸生（nagano@cc.saga-u.ac.jp）までお送りください。できる限り多くの方に、新しい研究手法を試していただけるように調整しますが、希望に添えない場合や、規模の縮小をお願いする場合があります。
既に解析が進んでいる遺伝資源を用いた研究や、大規模な研究は、対象にならない可能性があります。どれを実施するかについては、あらかじめ定めた研究分担者と相談して、判断することになります。
以上、質問等がございましたら、永野（nagano@cc.saga-u.ac.jp 0952-28-8898）
までご連絡ください。
佐賀大学総合分析実験センター
永野幸生
2.2

シダ植物・リュウキュウイノモトソウの RNA-Seq 解析（研究分担者・平良 東紀）

現在，生物進化解明や未知の有用遺伝子探索のために，様々な進化段階にある
生物種のゲノム配列が読まれ，その比較ゲノム解析が行われている。陸上植物においては，これまでに種子植物でモデル生物となっているシロイヌナズナのゲノムが 2000
年に，次ぎにイネを始めとした主要作物が，2007 年にはコケ植物であるヒメツリガネゴ
ケのゲノムが読まれている。
（参考：http://www.nibb.ac.jp/press/071212/071212_open.html）
2011 年にコケ植物と種子植物の間に位置する「シダゲノムの解読」がなされた。
（
参考：
http://www.jst.go.jp/pr/announce/20110506/index.html?utm_medium=twitter）
しかしながら，近年の系統解析により「シダゲノム」で解析されたイヌカタヒバは「小葉類」と呼ばれるもので，いわゆる「シダ（類）」とは進化系統的に大きく離れていることが分かっている。現在ではコケ植物→小葉類→シダ類→種子植物の順番に分岐したことが分かっている。
（参考：http://www.nibb.ac.jp/evodevo/tree/02_02_land%20plants.html）
我々の研究グループでは，シダ類で琉球列島に自生するリュウキュウイノモトソウ（Pteris ryukyuensis）より，新奇のドメイン構成を持つキチン分解酵素 PrChiA のタンパ
ク質および遺伝子を単離した。PrChiA は lysin motif（LysM）と呼ばれるドメインを有しており，本ドメインを持つ事により強い抗真菌活性を示す。本ドメインを有する植物由103

来キチン分解酵素はこれが唯一の報告であり（2008 年），ゲノム解析の終了した他の植物種には存在しない。最近，シダ類に属するスギナ（Equisetum arvense）より単離したキチン分解酵素 EaChiA にも LysM ドメインが含まれていることが分かった（2015）。これらのことから，LysM ドメインを持つキチン分解酵素はシダ類にのみ分布し，シダ類が独自に獲得したことが推察される。
このように，シダ類には独自に獲得した遺伝子が含まれ，その中には未知の有用遺伝子がある可能性がある。本研究ではシダ類 P. ryukyuensis の RNA-seq を行い，カタログ化すると供に有用遺伝子の探索を行うものである。本研究の遂行により，未知の有用遺伝子利用が可能になるとともに，陸上植物の進化における重要な知見を与えることが期待される。
そこで、シダ類リュウキュウイノモトソウの栄養葉および胞子葉から全 RNA を抽出した。
対象としてスギナも解析に供したかったが、磁気的に入手することができなかった。得られた RNA については、研究協力者の関清彦が佐賀大学総合分析実験センターに設置のバイオアナライザーにより、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、この全 RNA をマクロジェン・ジャパンに供して、RNA-Seq 解析を委託したところ、下記のデータ量の結果が得られた。今後のコンピュータ解析を行うのに十分なデータ量であった。
Total read bases (bp)

Total reads

栄養葉5,809,923,596

57,523,996

胞子葉7,261,422,068

71,895,268

データがダウンロード可能になったのは、3 月 18 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。
2.3

糸状菌 Gongronella butleri の RNA-Seq 解析（研究分担者・光富 勝、研究協
力者・関 清彦）

近年、様々な生理活性をもったオリゴ糖の活用が注目を集めている。これらオリゴ糖を調製する方法として、酵素法は有用な手段を与える。酵素法に用いる糖質加水分
解酵素は種々の生物から得られているが、近年糸状菌の有する酵素に注目が集まっている。ゲノム解析から糸状菌は多くの有用酵素および機能未知の推定糖質加水分
解酵素遺伝子を有するものが多い。糸状菌の一つ Gongronella butleri においては、
当研究室で初めて、キトビオハイドロラーゼ（キトサン（部分的に N-アセチル化された
キトサンを含む）を非還元末端から、２糖単位で加水分解する酵素）を精製し、機能を104

明らかにした。しかし、構造解析（一次構造の解析）には至っていない。 Gongronella
butleri キトオリゴ糖で処理し、その前後の RNA-Seq 解析を行う。そのことにより、
1) キトオリゴ糖誘導的に生産する糖質加水分解酵素を網羅的に明らかにする。つまり、有用酵素のスクリーニングを行う。
2) また、得られたデータを活用して、キトビオハイドロラーゼの構造解析を行う。
を明らかにする。
そこで、キトオリゴ糖処理前後の Gongronella butleri から全 RNA を抽出した。得られた RNA については、佐賀大学総合分析実験センターに設置のバイオアナライザーにより、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、この全 RNA をマク
ロジェン・ジャパンに供して、RNA-Seq 解析を委託したところ、下記のデータ量の結果が得られた。今後のコンピュータ解析を行うのに十分なデータ量であった。
Total read bases (bp)

Total reads

誘導前5,875,058,294

58,168,894

誘導後6,953,315,710

68,844,710

データがダウンロード可能になったのは、3 月 18 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほ
とんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。
2.4

カンキツの交雑系統の RAD-Seq 解析（研究分担者・古藤田 信博）

カンキツ類の中でも「シークワシャー」や「ポンカン」など一部のマンダリンに、抗癌作用や記憶減退抑制効果のあるポリメトキシフラボンが蓄積することが知られている。特に、ノビレチンおよびタンゲレチンは、これらの種に高蓄積する。しかし、その生合成経路や蓄積のメカニズムはよくわかっていない。そのため、ポリメトキシフラボンの蓄積に関与する遺伝子座を明らかにすることを目的としてノビレチン低含有品種と「シークワシャー」を掛けあわせた後代実生群を育成した。
そこで、これら交雑系統およびその親から DNA を抽出し、計 63 サンプルを RAD-Seq
解析に供することにした。RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分析実験センターにて、古藤田が指導する大学院生・野田 孝幸が行った。得られたライブラリについては、佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq
による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。

105

Total read bases (bp)

Total reads

9,386,186,370

184,042,870

データがダウンロード可能になったのは、3 月 3 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。

2.5

ユズの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究分担者・山本 雅史）

本研究は、研究分担者・山本 雅史が、研究代表者・永野 幸生、研究分担者・古藤
田 信博、および、お茶の水女子大学の福留奈美らと共同で行いたいと考えている共同研究のパイロット実験である。本研究では「遺伝情報に基づくユズの分類と分布図を作り、食文化研究の分野で定説となっているユズの来歴と伝播の系譜を科学的手法から検証する。さらに、この検証に基づいて、国産ユズのブランド化戦略を検討する。
そのために、第一に、次世代シーケンサーによる新しいゲノム解析の手法を用い、日本全国のできるだけ広範囲のユズ・ゲノムデータベースの構築をする。第二に、得られた遺伝情報の類似性と相違性をもとに科学的根拠に基づくユズの分類を行い、果実の形質分析と成分分析を合わせることで、食材として活用するための情報を整理する。」を謳っている。
そこで、これらユズおよびその比較対象から DNA を抽出し、計 63 サンプルを
RAD-Seq 解析に供することにした。RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分
析実験センターにて、研究代表者・永野 幸生が指導する研究支援推進員・坂井 明子が行った。得られたライブラリについては、佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。
Total read bases (bp)

Total reads

8,637,058,692

169,354,092

データがダウンロード可能になったのは、3 月 3 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことは、難しい。しかし、ある程度、データ解析を行うことが出来た。種間の遺伝的差異、たとえば、メキシカンライムがシトロンとパペダの交雑であることは、得られたデータから解明でき106た。一方、種内の遺伝的、つまり、ユズ間の遺伝的分化については、明確にわからなかった。過去には、山本雅史と永野幸生はメキシカンライムの種内分化を明らかにしている。この過去の経験と比較して考察してみたところ、今回の研究では、サンプルあたりのリード数が少なかったために、欠側値が多く、種内分化の研究に本データが向かなかったと考えた。
今後、さらなる詳細なデータ解析で、興味深い結果が得られることを期待する。
2.6

ノビル（野蒜）の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究分担者・大島 一
里、研究協力者・福田 伸二）

研究協力者の福田 伸二らは RAD-Seq 法 (Restriction Site Associated DNA
Sequence)によるゲノム情報の解析を精力的に取り組んでいる。これは次世代シーケンサーを活用して制限酵素認識サイト近隣領域の DNA 配列を全ゲノムにわたって繰り返し解読する方法であり、現在、ビワ（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.)において、個体間で数万か所の DNA の相違を同定することができた。本研究においてはこの手法を活用し、佐賀大学が保有する北は北海道、南は沖縄までのノビルコレクションの遺伝的分化と多様性の解明を行うことを目的とする。これらコレクションは、研究分担
者・大島 一里らが精力的に収集したものである。得られた配列情報については、各系
統中の葉や球根中の機能性成分の定量結果とリンクさせ、関係性を明らかにする。また、今後のノビルの品種登録を想定して本試験において得られたビッグデータを基に、ノビル由来の SNPs マーカーを開発し、品種判別できる体制を構築する。
ノビルは半数体ゲノムサイズが 10Gb を越えるため、多数のサンプルを解析することに向かない可能性がある。そこで、この研究においては、この事業の他の研究で用いられている一般的 RAD-Seq ではなく、ddRAD-Seq と呼ばれる、ゲノムサイズが大きい
場合に適した方法を採用することにした。また、パイロット実験であることも考慮し、少なめのサンプル数である 50 サンプルのみを解析に供することにした。ノビルから DNAを抽出し、DNA をクロックミクスに供して、ddRAD-Seq 解析を委託したところ、下記のデータ量の結果が得られた。今後のコンピュータ解析を行うのに十分なデータ量であった。
Total read bases (bp)

Total reads

6,516,268,470

127,769,970

データがダウンロード可能になったのは、3 月 1 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。

107

2.7

いもち病菌の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究分担者・草場 基章）

イネいもち病菌はイネ栽培に甚大な被害を及ぼす重要病原菌として知られる。また、本菌と同一種の Pyricularia oryzae はイネ以外にも多様なイネ科植物に発生し、これら宿主植物には各種栽培植物やそれらに近縁な野生植物も含まれる。これまで、 P.
oryzae の生態学的研究はその宿主の経済的な重要性からイネいもち病菌を中心とした栽培植物の菌について行われてきた。一方、野生植物のいもち病菌については防除の必要性が無いことから、その生態に関しては研究がほとんど着手されていない。しかしながら、野生植物のいもち病菌を対象とした研究は自然状態におけるいもち病菌の本来の姿を映し出すものとなり、得られる知見は新規観点から栽培植物のいもち菌の防除に方法論を提供するものと成り得る。このような背景の下、本研究では野生Setaria 属植物であるエノコログサおよびアキノエノコログサのいもち病菌を対象とし、その集団構造を RAD-seq 法を用いた解析により調査する。イネいもち病菌では新規抵抗性イネ品種の導入による淘汰、その後の菌の病原性変異による適応といったボト
ルネックを何回も通過したため、極めて集団が遺伝的に均一化されたことが明らかになっている。一方、野生植物の菌の集団ではこのようなボトルネック効果は働かなかったと考えられ、集団が遺伝的に多様であることが予想される。本研究では野生 Setaria
属植物の菌の集団とイネいもち病菌の集団の遺伝的多様度を比較し、この作業仮説の検証を行う。また、これら野生 Setaria 属植物の菌における分集団化構造を地理および宿主の違いから検討し、適応進化の実態解明を試みる。
そこで、Pyricularia oryzae から DNA を抽出し、計 63 サンプルを RAD-Seq 解析に供することにした。RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分析実験センターにて、草場が指導する大学院生・赤瀬 公亮が行った。得られたライブラリについては、
佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。
Total read bases (bp)

Total reads

9,407,442,048

184,459,648

データがダウンロード可能になったのは、2 月 25 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことは、難しい。しかし、予備的なデータ解析を行うことが出来、宿主の違いにより群分け出来そうである。
今後、さらなる詳細なデータ解析で、興味深い結果が得られることを期待する。

108

2.8

メロンの交雑系統に関する RAD-Seq 解析（研究代表者・永野 幸生、研究協
力者・松本 雄一）、ハブ草の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究代
表者・永野 幸生）、ホタルの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究代
表者・永野 幸生）

いずれもパイロット実験である。
メロンの交雑系統に関する RAD-Seq 解析に関しては、研究協力者・松本 雄一が応募した科学研究費・若手研究（B）「次世代シークエンサーを利用したメロン生殖隔離
緩和遺伝子 pia の解析と育種利用」のためのパイロット実験である。科研費の応募では、「メロン種間交雑において認められる生殖隔離を回避し、種間雑種の作出を図るため、
近年申請者らにより見い出された生殖隔離緩和遺伝子 pia について解析し、高密度連
鎖地図の作成を通じた選抜マーカーの開発を行う。さらに、開発マーカーを利用した
他種への pia 遺伝子の導入による生殖隔離の回避について検証する。」を謳った。
ハブ草の遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析に関しては、研究代表者・永野幸生
が、お茶の水女子大学の福留奈美らと共同で行いたいと考えている共同研究のパイ
ロット実験である。ハブ草は、ハブ茶の原料であり、高知県の特産の健康茶である。ハブ草とよく似た「えびす草」との混同が問題となることから、両者の識別法に繋げるための予備的検討を行うことに目的とした。
ホタルの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析に関しては、研究代表者・永野幸生
が、鹿児島大学・理学部の加藤 太一郎らと共同で行いたいと考えている共同研究のパイロット実験である。鹿児島を初めとする南日本には、多様なホタルがいるためその遺伝的多様性を明らかにしたい。
そこで、サンプルから DNA を抽出し、混在した計 63 サンプルを RAD-Seq 解析に供することにした。RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分析実験センターにて、研究代表者・永野 幸生が指導する研究支援推進員・坂井 明子が行った。得られたライブラリについては、佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。
Total read bases (bp)

Total reads

7,681,180,380

150,611,380

データがダウンロード可能になったのは、3 月 3 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。

109なお、2016 年度のことになるが、研究協力者・松本 雄一の科学研究費・若手研究（B）は採択された。
2.9

海苔の RNA-Seq 解析（研究分担者・濱 洋一郎）

九州・有明地区は日本有数の海苔生産地で、中でも佐賀県の乾海苔生産量、販売額は、ともに日本一を継続している。海苔養殖に用いられる主要品種はスサビノリだが、海水温の上昇、低栄養、疾病を引き起こす微生物の増殖、などの環境変化により、海苔養殖業は例年被害を被っており、安定的な生産を困難なものにしている。そこで、様々な環境に対応できるよう、新たな形質を備えたスサビノリライブラリーの構築を目指し、スサビノリ突然変異株の育種を行っている。本実験では、代表的なスサビノリ株
である U-51 と S-5-0 を試料に用い、環境応答前の基礎データの取得と、個体間、株間での発現量の変動状況を把握することを目的としている。
そこで、計 6 サンプルから全 RNA を抽出した。得られた RNA については、が佐賀大学総合分析実験センターに設置のバイオアナライザーにより、品質をチェックしたとこ
ろ、十分な品質のものであった。そこで、この全 RNA をマクロジェン・ジャパンに供して、
RNA-Seq 解析を委託したところ、下記のデータ量の結果が得られた。今後のコンピュータ解析を行うのに十分なデータ量であった。なお、各試料について、3 点の反復を行った。
Total read bases (bp)

Total reads

U-15-1

7,173,177,156

71,021,556

U-15-26,811,694,116

67,442,516

U-15-3

6,139,387,010

60,786,010

S-5-1

7,415,638,362

73,422,162

S-5-2

6,322,799,172

62,601,972

S-5-3

6,193,089,922

61,317,722

データがダウンロード可能になったのは、3 月 18 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。
2.10

マングローブの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究分担者・梶田忠）

マングローブ林は人類にとって極めて重要な生態系であるが、急激に破壊されつつ110ある。また、マングローブ林は極めて分布域の広い少数の樹種から構成されるユニー
クな特性を持っており、近年の急速な集団の断片化が、種内の遺伝的多様性の維持にどのような影響を与えているのかは、十分に分かっていない。そこで、本研究では、
新大陸から東太平洋域まで極めて広く分布するヒルギ科オオバヒルギ属の Rhizophora
mangle とその近縁種に注目し、RAD-seq 解析を用いることで、集団間の遺伝的分化を解析することを目指した。RAD-seq 法ではゲノムワイドに数百から数千の多型遺伝子座が得られることが見こまれる。また、アウトライアー解析を行うことにより、中立遺伝子と適応遺伝子のそれぞれで、集団構造の比較を行うことも可能になる。本推進事業では 1 セット 63 サンプルの RAD-seq 解析についての補助を受け、さらに、自前で２セット追加で解析することで、合計 189 サンプルについてデータを得ることができた。現在、共同研究者と共に解析中である。今回用いたサンプルについては、、従来のマイクロサテライト解析や、次世代シーケンシングを用いる MIG-seq 法でもデータが得られており、３つの異なる方法で得られた結果を比較することもできる。また、RAD-seq 解析
では、最も多くの遺伝子座についてのデータが得られることが期待されるので、中立遺伝子を用いた保全ユニットの策定や、適応遺伝子（候補）に注目したで ESU（進化的重要単位）の認識も目指している。質の良いデータが得られれば、適応遺伝子の分布モデルを作成し、気候変動に対する将来予測結果を用いて、優先的に保全すべき区域の推定を目指している。本研究の成果は、マングローブ植物の保全における、科学的指針を与えるものとして、活用されることが期待できる。
そこで、サンプルから DNA を抽出し、計 62 サンプルを RAD-Seq 解析に供することにした。RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分析実験センターにて、研究代表者・永野 幸生が指導する研究支援推進員・坂井 明子が行った。得られたライ
ブラリについては、佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたとこ
ろ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。
Total read bases (bp)

Total reads

9,578,128,644

187,806,444

データがダウンロード可能になったのは、3 月 3 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。
2.11

ウシの遺伝的多様性に関する RAD-Seq 解析（研究分担者・下桐 猛）

鹿児島県にも薩摩鶏・インギー鶏・口之島野生化牛などの在来の家畜がいるように、

111

アジア各地に様々な在来家畜がいる。これらの遺伝的多様性の解析に今回お話を伺った RAD-seq の導入を検討したい。これまで、アジア在来家畜の遺伝的多様性解析
は、ミトコンドリア d-loop 等の配列比較、STR や SNP 等の既存の多型座位を使った手法が主であり、多数に対して GBS を使ったものはない。研究室で所有するアジア在来
鶏等の DNA サンプル（1 集団あたり最大 30 サンプル）を使って、新規の SNP 等の獲得と多様性の評価を予備的に行う。将来的には、連大生の研究に取り入れたり、科研費等の申請に利用して、祖先種であるヤケイとの遺伝的な関係、他の家畜種（在来牛・和牛）での利用等に発展させたいと考えている。
そこで、サンプルから DNA を抽出し、計 31 サンプルを RAD-Seq 解析に供することにした。半数体ゲノムサイズが 3Gb であることを考慮して、扱うサンプル数を少なくした。
RAD-Seq 用のライブラリ調製は、佐賀大学総合分析実験センターにて、研究代表者・
永野 幸生が指導する研究支援推進員・坂井 明子が行った。得られたライブラリについては、佐賀大学農学部に設置の MultiNA により、品質をチェックしたところ、十分な品質のものであった。そこで、このライブラリをマクロジェン・ジャパンに供して、HiSeq
による解析に供したところ、下記のデータ量の結果が得られた。他の RAD-Seq 解析よりデータ量が少ない理由は不明である。
Total read bases (bp)

Total reads

5,070,369,663

99,419,013

データがダウンロード可能になったのは、3 月 3 日であった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、2015 年度内にデータ解析を行うことがほとんど行うことが出来なかった。今後、興味深い結果が得られることを期待する。

112

３

研究の総括と今後の課題・展望（研究代表者・永野 幸生）

事業に採択された時期が遅かったため、次世代シーケンサーによる解読結果を得た
ところで、年度末になってしまった。通常、コンピュータによるデータ解析には数ヶ月必要であるため、本格的に研究成果が出始めるのは、2016 年の夏頃になるであろう。しかし、予備的ではあるが、いもち病菌の研究で既に極めて興味深い成果が得られている。今後のデータ解析の進展に期待したい。
しかし、少し触れたけれども、RAD-Seq において、欠測値の問題が発生しており、いくつか実験手法の改善が今後必要かもしれない。しかし、具体的な方策については、
内容が高度になりすぎるため、触れない。
この書類は、2016 年 3 月の報告書であるが、実際に、執筆しているのは、2016 年 4月です。つまり、既に、科学研究の採択状況が発表されているが、本事業のパイロット
実験が研究協力者・松本 雄一の科学研究費取得に繋がった。
研究代表者としての永野 幸生にとって、喜ばしいことは、共同研究の拡がりである。
募集により加わったメンバーである梶田 忠と下桐 猛とはこれまで面識がなかった。しかし、今回の事業により、共同研究を開始し、また、両名が指導する連大生の副指導教員に永野が着任した。このような形で共同研究が拡がった点でも本事業は意義があるものである。
2016 年度も、連合農学研究科からの援助がなくとも、本事業で築いた研究協力体制を維持し、連合農学研究科における研究の活性化に邁進したい。

113

４

支援金額の執行内訳
項 目
機器・備品
消耗品
旅費
その他
合計

５
なし

金額（円）

内

訳

等

0
0
88,800 佐賀大学から鹿児島大学・琉球大学
1,911,200 委託費（次世代シークエンサー）
2,000,000

資料等

114

生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解明とその効率的生産システムの構築

研究代表者

琉球大学農学部
２０１６年３月

115

平良東紀

研究の組織と役割分担者
氏名及び職名
代表者

平良東紀

准教授

研究の役割分担等

研究総括および研究分担（琉球大学・応用生命科学専攻）

植物由来生体防御タンパク質の抗真菌作用機構の解析

分担者

イブラヒム

ヒッシャム

ラドワン教授研究分担：マラリア抗原タンパク質の（鹿児島大学・応用生命科学専攻）

構造予測解析

光富 勝

研究分担：真菌由来生体防御関連タン教授（佐賀大学・応用生命科学専攻）

パク質による希少オリゴ糖の生産シス
テムの開発

宮田 健

協力者

准教授

研究分担：マラリア抗原タンパク質の（鹿児島大学・応用生命科学専攻）

発現、精製とその免疫原性解杉元康志

研究協力：生体防御タンパク質（特に教授（鹿児島大学・応用生命科学専攻）

ワクチン抗原）免疫学的解析の研究協
力

関

清彦

講師

研究協力：植物由来抗菌ペプチドの作（佐賀大学・農学部）用機構の解析の研究協力

日下部宜宏

研究協力：カイコ発現系による生体防

外部研究者
教授

（九州大学農学院・資源生物科学部門）

御タンパク質およびペプチド生産シス
テムの開発

116

１
①

研究の目的と概要研究の目的

本事業では，抗細菌・抗真菌性の生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析，抗原虫のためのワクチン分子の構築，真菌由来生体防御タンパク質を利用した希少オリゴ糖の生産システムの構築，並びにカイコ-バキュロウイ
ルス発現系によるその効率的生産システムの構築を試みることを目的とした。
我々は，各拠点で，それぞれ異なる真核生物が保有する生体防御関連タンパ
ク質およびペプチドを研究材料としてそれらの有用機能について見いだしているが，それらの多くは作用機構の解明にまでは至っていない。作用機構の解明には，各拠点が持つ解析技術や分子構築技術を結集する必要があった。琉球大学では高感度な抗真菌活性測定系を持ち，鹿児島大学では感染症に対するワクチン抗原のデザイン、精製および免疫原性解析といった一連の評価システムを有し，佐賀大学では人工細胞膜を用いた抗菌作用メカニズムに関するアッセイ
系を開発している。また，琉球大学はタンパク質の精製技術、鹿児島大学はタンパク質分子デザイン技術，佐賀大学ではペプチドの合成および酵素反応の詳細な解析を得意としている。さらに，九州大学ではカイコを用いたタンパク質の効率的生産系を有している。これら各拠点および研究協力者間の技術交流，解析の相互依頼，密な情報交換・議論を行い，生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の詳細な解明を目指すと共に，その応用に向けて，これらの大量発現系の構築を試みた。
②

研究の概要

各研究拠点における生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析を行
いつつ，これらの昆虫工場による大量生産の技術基盤を確立した。詳細を以下に示す。
1）各種生体防御関連タンパク質のカイコ発現用分子構築（琉球大学 平良，鹿児島大学 宮田，佐賀大学 関）
カイコで目的タンパク質や機能性ペプチドを発現させるための組換えバキュ
ロウイルスベクターの作製を進める。具体的には発現させる長さ（全長発現もしくは機能性ドメインだけ）についての検討，シグナルペプチドの有無または種類（カイコ由来もしくは目的タンパク質オリジナル）の検討，精製タグの有無および導入位置（生理活性の阻害となる可能性があるならば，内部にタグを導入するなど）について検討する。これらのコンストラクトはカイコで発現させるためのエントリーベクターにクローニングを完了させた時点で九州大学での実験に供する。

117

2）昆虫工場を用いた各種タンパク質の発現（九州大学 日下部）
各拠点で構築されたエントリーベクターを相同組換え機構およびトランスポ
ゾン機構を利用して，目的タンパク質発現用バクミドへと変換する。このバク
ミドをカイコ由来細胞へ感染させることで組換えバキュロウイルスが増幅される。この増幅時にカイコ由来細胞での目的物質の発現が確認できるので，必要に応じて，タンパク質や機能性ペプチドの発現レベル検証やウエスタンブロット等による抗原性の確認を実施する。
（このカイコ由来細胞での発現レベルをひとつの目安として，感染させるカイコの量（使用頭数）についても検討する。）
次に，増幅したバキュロウイルスをカイコに感染させ，感染期間をモニタリン
グすることで最適な目的タンパク質回収時期を決定し，分泌タンパク質ならばカイコ血清，蓄積タンパク質ならばカイコ脂肪体を回収し，目的タンパク質を含む画分を回収する。
3）各拠点における生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析（琉球大学 平良，鹿児島大学 杉元・ヒッシャム・宮田，佐賀大学 光富・関）各拠点で対象とする主な生体防御タンパク質およびペプチド分子は以下に示す。それぞれの標的分子の作用機構の解析を大学間で連携して行う。
植物由来キチナーゼおよびその他抗真菌タンパク質の抗真菌機能性評価を行い，構造-機能相関について調べる（琉球大学 平良）
寄生虫感染症に対する感染防御機能抗原の作出、生化学的解析、抗原の免疫原性について調べる（鹿児島大学 杉元・ヒッシャム・宮田）
植物由来抗真菌ペプチドの抗真菌機能性評価および真菌由来キチナーゼを用いた稀少オリゴ糖生成を試みる（佐賀大学 光富・関）2. 研究の成果（研究の役割分担者ごとに記載）
1) 各種生体防御関連タンパク質のカイコ発現用分子構築（琉球大学 平良，鹿児島大学 宮田）
これまでに琉球大学拠点（平良）では生体防御関連タンパク質のひとつとして，植物由来キチン分解酵素（キチナーゼ）の解析を行って来た。平成 26 年度の先進的研究推進事業支援において、ヒメツリガネゴケ由来キチナーゼ（Physcomitrella patens chitinase: PpChi）の 3 種，PpChi-Ib, -IIa, IIc についてカイコ発現用分子構築を実施した。上記 3 種のキチナーゼは大腸菌，枯草菌，酵母の発現系では可溶化したタンパク質として発現しないが，PpChi 由来のシグナル配列をカイコ用シグナル配列に置換した系において，カイコでは血清中に可溶性タンパク質として発現した。PpChi-Ib ではキチン分解活性は検出されたが，抗真菌活性は検出されなかった。PpChi-IIa および IIc ではキチン分
解活性・抗真菌活性の何れも検出されなかった。カイコ血清中に発現したこれら 3 種のキチナーゼには糖鎖が付加していることが分かった。糖鎖付加が活性118

に影響を与えている可能性が示唆されたために，シグナル配列を除いたコンス
トラクトを新たに作成し，小胞体・ゴルジ体に移行させずに糖鎖が付加しない
タンパク質の発現を試みた。また，これまでに強い抗真菌活性を発揮することが知られているガジュマル乳液由来キチナーゼ（GlxChi-B）のカイコ発現系による発現を試みた。GlxChi-B には糖鎖付加のためのコンセンサス配列が見られなかったので，分泌シグナルを付加したコンストラクトを作成し，カイコ血清中への発現を試みた。
これまでに鹿児島大学拠点（杉元・ヒッシャム・宮田）では生体防御関連タ
ンパク質のひとつとして、感染症に対するワクチン抗原の発現に着手している。
既に、平成 26 年度の先進的研究推進事業支援において、マラリアワクチンの候補抗原である三日熱マラリア原虫表層抗原(Pvs25)発現カイコの分子構築（二種類のコンストラクト）およびカイコ由来細胞での発現予備検証を完了させた。
その結果、Pvs25 はいずれのコンストラクトも分泌発現することが分かった。さらに、タンパク質構造シミュレーションソフト MOE により、精製タグの付加位置をモデリングにより予測した結果、N および C 末端いずれに付加しても効率的な精製ができると予測された。これらの予備的検証および予測解析結果を総合的に判断して、そのデザインをカイコ発現コンストラクトにも採用した。詳細な Pvs25 コンストラクトデザインとしては、大腸菌発現系では発現できないこと、Pichia pastoris 酵母発現系では膜貫通領域を除外し、酵母のシグナルペプ
チドを利用して分泌することが分かっているので、カイコでは同様に膜貫通領域を除外し、分泌シグナルにカイコ用シグナル配列を付加し、精製タグを N 末端または C 末端に導入した。
2) 昆虫工場を用いた各種タンパク質の発現（九州大学 日下部）
各種拠点大学で構築されたエントリーベクターを相同組換え機構およびトラ
ンスポゾン機構を利用して，目的タンパク質発現用バクミドへと変換し、カイ
コ感染用バキュロウイルスを構築した。このバキュロウイルスをカイコ由来細胞へ感染させることで組換えバキュロウイルスが増幅される。この増幅時にカイコ由来細胞での目的タンパク質発現が確認できるので、SDS-PAGE/CBB 染色やウエスタンブロットによる各候補分子のタンパク質の発現検証を実施した。さらにカイコ由来細胞で発現が確認できた候補に関してはカイコに感染し、カイ
コにおけるタンパク質生産の検証を実施した。
琉球大学拠点（平良）で構築したヒメツリガネゴケ由来の 3 種のキチナーゼ
PpChi-Ib, -IIa, IIc に関しては、分泌シグナルを削除したにも関わらず，カイコ由来細胞において分泌タンパク質として検出され，カイコ幼虫でも血清中に検出された。このことから，本タンパク質には N 末端以外の内部配列に小胞体
移行シグナルがあることが示唆された。また，ガジュマル乳液由来キチナーゼ

119

GlxChi-B は，カイコ幼虫の血清中に大量に発現していることが分かった（1.4mg/幼虫）。
鹿児島大学拠点で構築した Pvs25 はカイコ由来細胞の結果と同様にカイコ幼虫においても、N 末端タグタイプおよび C 末端タグタイプ、いずれのコンストラ
クトにおいても分泌発現が確認された。さらに、カイコ幼虫だけでなく、カイ
コさなぎも用いて発現検証を実施した。さなぎでの発現についてもカイコ幼虫と同様に顕著な分泌発現をすることが分かった。発現レベルも既存の酵母発現系に比べて、単純な比較はできないが、ある一定の絶対量の確保という観点でコストパフォーマンス（精製効率も含む）を考えると優位性があることが分かった。具体的な発現レベルの数値は以下の表に示す。
表１ Pvs25 の各種発現系での発現レベル
発現系
発現量
Pichia pastoris（C 末端タグタイプ） 10 mg/L of medium
カイコ幼虫（N 末端タグタイプ）
0.6 mg/幼虫
カイコ幼虫（C 末端タグタイプ）
1.6 mg/さなぎ
カイコさなぎ（N 末端タグタイプ）
0.5 mg/幼虫
カイコさなぎ（C 末端タグタイプ）
0.8 mg/さなぎ

3) 昆虫工場で発現された各種タンパク質の生化学的および機能性解析，並びに生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析（各研究拠点）
琉球大学拠点（平良）では分泌シグナルを付加せずにカイコ血清中に発現したヒメツリガネゴケ由来の 3 種のキチナーゼ PpChi-Ib, -IIa, IIc の酵素活性を測定したが，検出されなかった。分泌シグナルを付加してカイコ血清中に発現させた PpChi-Ib は，酵素活性を示すが，抗真菌活性は全く示さない。一部の糖鎖の切断およびタグの切断を行っても，抗真菌活性はほとんど検出されなかった。一方，同様にしてカイコで発現させた GlxChi-B は，酵素活性および強い抗真菌活性を示した。これらの結果から，PpChi-Ib の弱い抗真菌活性の原因は，付加された糖鎖やタグでは無く，その性質そのものにあると考えられた。ほとんど抗真菌活性を持たない PpChi-Ib と強い抗真菌活性を示す GlxChi-B の酵素
化学的諸性質について比較した。PpChi-Ib は，最適 pH が 8 付近であり，長鎖基質であるグリコールキチンに対する比活性が，GlxChi-B と比較して 6 分の 1 以
下であることが分かった。しかしながら，PpChi-Ib は短鎖基質である N-アセチ
ルグルコサミン 4 糖を速やかに分解したが，同条件では GlxChi-B は 4 糖を全く分解できなかった。これらの性質と構造に関係があるかどうかを検討するため

120

に，PpChi-Ib と GlxChi-B の立体構造モデルを，鹿児島大学拠点のタンパク質構
造シミュレーションソフト MOE を用いて構築した。その結果，PpChi-Ib には
GlxChi-B の触媒ドメインの N 末端側から 2 番目のループ構造が欠損していることが分かった。先行研究により，このループは基質結合クレフトを形成しており，より長鎖の基質の結合に関与していることが示唆されていた。PpChi-Ib はループ構造の欠損により長鎖基質に対する比活性が低いため，抗真菌活性が弱いことが示唆された。同時に本生体防御タンパク質の抗真菌活性の発揮には本ループ構造が極めて重要であることが示された。
鹿児島大学拠点（杉元・ヒッシャム・宮田）ではカイコ幼虫およびさなぎ（昆虫工場）で血清中に分泌発現した Pvs25 の精製および生化学的解析を実施した。
精製に関しては、導入した Hisx8 および Strep タグにおけるアフィニティーク
ロマトグラフィーによって、ほぼ単一な精製バンドを得ることができた。今回、導入した精製タグは構造予測解析によって精製効率には大きな影響を受けないというモノであったが、実際には C 末端タグタイプの方が発現効率（または精製効率）がよいことが分かった。これは精製タグ自身ではなく、融合タンパク質として N 末端よりも C 末端融合タンパク質とした方が、Pvs25 にとっては望ましい構造を取ることができるのではないかと推測している。Pvs25 はこれまでの研究によって疎水クロマトグラフィーによって精製することが分かっているので、将来的にはタグを除去したより天然の構造に近いコンストラクトデザインを実施することも考えている。各種カイコ発現 Pvs25 を酵母発現 Pvs25 と比較した結果、酵母で発現させた際に生じるフォールディングが異なる isoform が発現総量の 6 割を占めているのが、カイコ発現の場合だと、まったく isoform
が存在しないことが分かった。このカイコ発現 Pvs25 を還元、熱、熱および還元という条件で変性させた SDS-PAGE すると、酵母で適切なフォールディングをとっている Pvs25 A フォームと同様のバンドパターンを示したことからも、カイ コ で は適切な A フォームのみを発現 することが確認でき た。 Pvs25 はEGF-like-domain を有し、Cys が 22 残基存在し、ジスルフィド結合によって、その適切な構造と抗原エピトープを保持している。カイコ発現 Pvs25 が酵母発
現 Pvs25 と比較して、どの程度ジスルフィド結合がどれくらい形成されているかを将来的に検証する必要がある。
次に、カイコ発現 Pvs25 のワクチン抗原としての免疫原性について、マウスを用いて検証した。比較として酵母発現 Pvs25 も同様に検証し、その抗原特異的抗体産生応答を免疫マウス血清を用いて ELISA にて解析した。その結果、酵母発現 Pvs25 と同程度もしくはそれ以上の抗体産生応答があることがわかり、カイコ発現 Pvs25 の抗原性についても確認ができた。この ELISA では酵母発現
Pvs25 をコート抗原として用いており、それに対する抗体産生応答が認められることから、酵母発現 Pvs25 とカイコ発現 Pvs25 のエピトープは同じフォールデ

121ィングからなると推測できる。また酵母発現 Pvs25 で誘導した抗血清は、これまでの研究で、三日熱マラリア原虫に対する伝搬阻止効果（ワクチン効果）が十二分にあることが分かっているので、今回発現させたカイコ発現 Pvs25 にも少なくとも同程度のワクチン効果があることが推定できる。将来的に、三日熱
マラリア原虫を用いた感染防御試験を実施し、ワクチン効果を調べる予定である。
佐賀大学拠点（光富・関）では，GH19キチナーゼによる有用キトオリゴ糖の調製法の開発およびキチン結合ペプチドの抗真菌作用機序の解析を行った。
キトヘテロオリゴ糖は、Vibrio 属細菌に対し遊走因子として働くなど、様々な生理機能をもつ可能性を有しているが、特定の配列のヘテロオリゴ糖を量産することが困難で、研究が進んでいない現状にある。そこで酵素法を用いた、
GlcNAc-GlcN などの還元末端が脱アセチル化されたキトヘテロオリゴ糖のより効率の良い調製法を検討した。基質として市販の部分N -アセチルキトサンを使用した場合、不均一系でブロック状に脱アセチル化しているため、酸にしか溶
解せず、ヘテロオリゴ糖ができにくい。そこで、均一系で脱アセチル化された
水溶性キチンを使用し、さらに部分脱アセチル化キチンの脱アセチル化度を変えることにより、分解後のヘテロオリゴ糖生成量の向上を図った。結果、低分子のキトヘテロオリゴ糖において2倍以上に収率が向上した。ヘテロオリゴ糖調
製の効率を上げるためには、酵素の切断特異性と、基質の脱アセチル化度および調製法が重要であることを明らかにした。今後は、真菌由来のキトサナーゼ
およびキチナーゼをカイコで発現させ、キトオリゴ糖に適した酵素の生産を目指す。真菌由来のキトサナーゼのエントリーベクターを構築したので、九州大学にて、カイコで発現させる予定である。
アマランサス（Amaranthus caudatus）由来キチン結合ペプチド（Ac-AMP）の抗真菌作用は、芳香族アミノ酸を介したキチン結合に加え、C端領域の塩基性アミノ酸も抗真菌作用に関与していることを示唆する結果が得られていた。そこ
で、C端領域の塩基性アミノ酸を電荷のないアミノ酸に置換した組換えAc-AMPを作成し、抗真菌作用に及ぼす影響を調べたところ顕著な抗真菌活性の低下が認められた。Ac-AMPは、グラム陽性細菌に対し塩基性アミノ酸を介した細胞膜障
害を起こすことが示されており、このことから抗真菌作用は真菌細胞壁成分のキチンへの作用とともに細胞膜に対する障害性が関与していることが示唆された。
キチン結合性に関与する芳香族アミノ酸を、キチン結合に適した位置に配置するように置換変異したペプチドおよび塩基性アミノ酸の増加を図った置換変異ペプチドを、大腸菌を用いて生産した。これら変異ペプチドの抗真菌活性を測定した結果、抗真菌活性の増強が示された。
今後の課題は、大腸菌を用いた発現では生産量が低いこと。また植物由来の122

キチン結合性抗真菌ペプチドは、分子内に 3 組以上のジスルフィド結合を有しており、適切な立体構造をとらせることにより活性の増強が図れることである。
カイコ発現系を用いることにより、これらの課題が解決できると期待される。
すでに変異ペプチドのカイコ発現系構築のためのエントリーベクターを構築しており、今後九州大学にてバクミド構築後、カイコで発現させる予定である。
３ 研究の総括と今後の課題・展望
・研究の総括
本事業において，抗細菌・抗真菌性の生体防御タンパク質およびペプチドの作用機構の解析，抗原虫のためのワクチン分子の構築，真菌由来生体防御タン
パク質を利用した希少オリゴ糖の生産システムの構築，並びにカイコ-バキュロ
ウイルス発現系によるその効率的生産システムの構築を試み，一定の成果を得た。以下に詳細を示す。
植物の生体防御関連タンパク質のひとつであり，その抗真菌活性が期待された 3 種キチナーゼは N 末端にカイコ用シグナル配列を付加した場合，カイコ血
清中に可溶性タンパク質として発現するが，抗真菌活性は示さなかった。糖鎖付加が活性に影響を与えている可能性が示唆されたために，シグナル配列を除いたコンストラクトを新たに作成し，糖鎖付加のないタンパク質の発現を試みた。しかしながら，分泌タンパク質として検出されたことから，本タンパク質には N 末端以外の内部配列に小胞体移行シグナルがあることが示唆された。また，これまでに強い抗真菌活性を発揮することが知られているガジュマル乳液
由来キチナーゼ（GlxChi-B）のカイコ発現系による発現を試みた結果，カイコ
幼虫 1 匹あたり 1.4 mg と大量に発現することが分かった。カイコ血清中に発現させた PpChi-Ib は，酵素活性を示すが，抗真菌活性は全く示さない。一方，同様にしてカイコで発現させた GlxChi-B は，酵素活性および強い抗真菌活性を示した。これらの酵素化学的諸性質について比較した結果，長鎖基質に対する比活性は GlxChi-B の方が 6 倍以上高く，短鎖基質に対する比活性は PpChi-Ib
が圧倒的に高かった。PpChi-Ib と GlxChi-B の立体構造モデルを構築した結果，
PpChi-Ib には GlxChi-B の触媒ドメインの N 末端側から 2 番目のループ構造が欠損していることが分かった。PpChi-Ib はループ構造の欠損により長鎖基質に対する比活性が低く，抗真菌活性が弱いことが示唆された。これの研究により，生体防御タンパク質の１つであるキチナーゼの構造と抗真菌活性の相関の一部が解明された。
マラリアワクチンの候補抗原である三日熱マラリア原虫表層抗原(Pvs25)発
現カイコの分子デザイン（膜貫通領域を除外し、分泌シグナルにカイコ用シグ
ナル配列を付加し、精製タグを N 末端または C 末端に導入）を行い，カイコ-バ
キュロウイルス系による発現を試みた。その結果，カイコ幼虫およびさなぎに123

おいて、N 末端タグタイプおよび C 末端タグタイプ、いずれのコンストラクトにおいても十分な分泌発現が確認された。血清中に分泌発現した Pvs25 の精製および生化学的解析を実施した。精製に関しては、導入した Hisx8 および Strep
タグにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって、ほぼ単一な精製バンドを得ることができた。各種カイコ発現 Pvs25 は，酵母で発現させた際に生じるフォールディングが異なる isoform が発現総量の 6 割を占めているのが、カイコ発現の場合だと、まったく isoform が存在せず，適切な A フォームのみを発現することが確認できた。次に、カイコ発現 Pvs25 のワクチン抗原としての免疫原性について、マウスを用いて検証した。その結果、酵母発現 Pvs25 と同程度もしくはそれ以上の抗体産生応答があることがわかり、カイコ発現 Pvs25の抗原性についても確認ができた。
様々な生理機能をもつキトヘテロオリゴ糖の量産化のために，酵素法を用いた効率の良い調製法を検討した。基質として市販の部分N -アセチルキトサンを使用すると、不均一系であるためにヘテロオリゴ糖ができにくいことが分かった。均一系で脱アセチル化された水溶性キチンを使用し、さらに部分脱アセチ
ル化キチンの脱アセチル化度を変えることにより、分解後のヘテロオリゴ糖生成量の向上を図った結果、低分子のキトヘテロオリゴ糖において2倍以上に収率が向上した。ヘテロオリゴ糖調製の効率を上げるためには、酵素の切断特異性と、基質の脱アセチル化度および調製法が重要であることを明らかにした。
植物由来抗菌ペプチドAc-AMPにおいて，C端領域の塩基性アミノ酸を電荷のないアミノ酸に置換した組換えAc-AMPは顕著な抗真菌活性の低下が認められた。
Ac-AMPのキチン結合性に関与する芳香族アミノ酸を、キチン結合に適した位置に配置するように置換変異したペプチドおよび塩基性アミノ酸の増加を図った
組換えAc-AMPでは抗真菌活性の増強が示された。Ac-AMPはグラム陽性細菌に対し塩基性アミノ酸を介した細胞膜障害を起こすことが示されており、このことから抗真菌作用は真菌細胞壁成分のキチンへの作用とともに細胞膜に対する障害性が関与していることが示唆された。
・次年度に向けての課題・計画・展望等
本事業において，生体防御関連タンパク質・ペプチドの作用機構の一端が解明され，より強い作用を持つ分子の開発の指針ができた。今後，更なる解析によって，よりスペクトルの広い，またはより特異的な機能性分子の構築を目指す。
真菌由来生体防御タンパク質を利用して，有用なキチン含有希少オリゴ糖の生産システムの構築にも成功した。キチンは真菌や昆虫などの構造多糖の一部であり，その修飾オリゴ糖は抗真菌性および殺虫性を有する可能性があり，これらの生理活性を調べていく予定である。
また，強い抗真菌活性を持つ植物由来キチナーゼおよび十分な免疫原性を有124

しているワクチン抗原タンパク質が，カイコ-バキュロウイルス発現系により，正確なフォールディングした形で，かつ大量に生産されることが分かった。強い抗真菌活性を持つ植物由来キチナーゼ GlxChi-B においては，応用利用のために，複数の機能ドメインの融合タンパク質などをデザインし，更なる活性および安定性の増強を目指す。十分な免疫原性を有しているワクチン抗原タンパク質 Pvs25 のおいては，酵母発現 Pvs25 で誘導した抗血清同様の伝搬阻止効果（ワクチン効果）が期待されるので，三日熱マラリア原虫を用いた感染防御試験を実施し、ワクチン効果を調べる予定である。
生体防御関連タンパク質およびペプチドは，感染症治療において有望なツールとなると期待される。感染症においては治療と予防が重要であり，カイコ-バ
キュロウイルス発現系を用いて生体防御関連タンパク質・ペプチドおよびワク
チン抗原タンパク質の更なる大量生産系の構築を目指す。また，今回用いた植物由来キチナーゼと抗菌ペプチドおよび市販されている抗真菌薬は，その作用点および作用機構が異なっており，併用による相乗効果が期待されるので，混合系の抗菌効果を調べる予定である。
本研究の成果に基づき，生体防御関連タンパク質・ペプチドの作用機構の解明と大量発現系構築により，以下のような医薬・研究用および産業用タンパク質としての利用が期待される。
 医薬・研究用タンパク質として，単独または抗生物質との併用による病原性
細菌・真菌の増殖抑制剤や，真菌の遺伝子操作に必須なプロトプラスト化酵素剤としての利用
 ワクチン抗原タンパク質の大量生産技術により，より安全で有効なワクチンを低コストで供給する。
 産業用酵素として，キチン質を含む食品および飼料の加工用酵素剤，細菌・真菌の増殖抑制剤として洗剤用酵素への利用
 様々な生理活性を有するグルコサミンおよび N-アセチルグルコサミンを含む希少糖の大量生産への利用
本研究事業終了後は、本研究の遂行により得られた技術・協力体制および成果をもとに、応用利用を目指したプロジェクト研究を行う。

125

４

支援金額の執行内訳

琉球大学
項

目

金額（円）

内

訳

等

機器・備品

421,200 ゲル撮影装置セット

消耗品

128,736 遺伝子工学・蛋白質実験用試薬，その他器具類

旅費50,000 沖縄-福岡（会議）合計

599,936

鹿児島大学
項

目

金額（円）

内

訳

等

機器・備品

294,192 タンパク質構造解析用 PC

消耗品

431,206 遺伝子工学・蛋白質実験用試薬，その他器具類

旅費

71,200 鹿児島-福岡（会議）二名分

合計

796,598

佐賀大学
項

目

機器・備品

金額（円）

内

訳

等

180,630 冷却水循環装置一式
98,820 顕微鏡一式

消耗品
合計

５

320,546 遺伝子工学・蛋白質実験用試薬，その他器具類
599,996

資料等
なし

126

水圏環境化学物質および水生生物に由来する
重金属類に対するヒトおよび魚類の細胞応答研究代表者 鹿児島大学水産学部 小松正治
２０１６年３月

127

研究の組織と役割分担者
代表者

小松正治 准教授

鹿児島大学水産学部・研究統括、応用生命科学専攻

重金属や毒性化合物曝露に対するヒト培養細胞の応
答解析、培養細胞におけるレドックス解析分担者

板倉隆夫 教授

鹿児島大学水産学部・

ウナギ GFP の機能解析

応用生命科学専攻
上西由翁 教授

鹿児島大学水産学部・

ウナギ GFP 発現培養細胞

応用生命科学専攻の重金属耐性の獲得機序の解析

石川学 准教授

鹿児島大学水産学部・

小型魚類の飼育・産卵実

農水圏資源環境科学専 験攻塩崎一弘 准教授

鹿児島大学水産学部・

ヒト培養細胞および魚類の応用生命科学専攻

糖鎖解析とレドックス解析

128

１． 研究の目的と概要① 研究の目的
本研究プロジェクトは，昨年度の採択課題を引き続き実施したものである。
ヒトや魚類を含めて生物は，環境中に存在する生体外異物に曝されて棲息している。
生物はこれらの生体外異物に対する生体防御機構を発達させて進化してきた。また，
我々人間において，生体外異物の摂取経路は食品を介する経口経路によるものが多く存在する。そこで食品のなかでも魚介類を介してヒト体内に摂取される生体外異物に着目し，魚介類における生体外異物の代謝機構，そしてヒトがこのような魚介類を摂取した際の細胞応答について解析する。また，魚類への酸化ストレス曝露時の応答についても解析する。すなわち，生理活性を示す生体外異物について以下の点について解析する。
すなわち，魚介類に含まれる既知および未知を問わず化合物のヒトに対する新規な機能性の発見をめざし、魚類養殖の発展，環境保全，ならびに人々の健康の保持・増進に繋がる礎となることを期待し，目的とする。
② 研究の概要
ヒトや魚類を含めて生物は，環境中に存在する生体外異物に曝されて棲息している。
生物はこれらの生体外異物に対する生体防御機構を発達させて進化してきた。
昨年度の本研究推進事業において，アオコ毒マイクロシスチン LR の新機能としてアノイ
キス抵抗性の誘導能を発見した（Toxicology, 2014）。そこで，本年度は，マイクロシスチン LR のアノイキス抵抗性の誘導条件の詳細な検討，がんの悪性化に関与する
NF-κB 等の炎症性転写因子やシアリダーゼ等の糖鎖分解酵素のアノイキス抵抗性獲得における関与について解析する。また，マイクロシスチン LR の細胞毒性発現の責任分子である OATP1B1 または OATP1B3 の輸送基質として輸送されずに，マイクロシスチン
LR の細胞毒性を抑制し得る化合物の探索を試み，副作用の少ない化学予防および対処策を構築する礎を築く。その他に，ヒ素等の重金属毒性について，コレステロール代謝系との関わりについて解析する。また，重金属由来の酸化ストレスに対する細胞応答を，
ビリルビン結合能を有すウナギ GFP（eelGFP）発現細胞を用いて解析する。
以上のケミカルバイオロジー解析により，魚類養殖の発展に寄与するとともに人々の健康の保持・増進と環境保全に貢献する。

129

２．

研究の成果

① 検討項目１：水圏毒性化合物の培養細胞に対する毒性
マイクロシスチン LR が誘導するアノイキス抵抗性の誘導の分子機序の解明に着手した。
HEK293 細胞に OATP1B1 の遺伝子 SLCO1B1 を導入し，安定に強制発現させた
HEK293-OATP1B1 細胞（親株）を実験に供した。この親株に 50nM のマイクロシス
チ ン LR を 24 時 間 曝 露 し ， 浮 遊 し た 細 胞 と 接 着 を 維 持 し た 細 胞（HEK293-OATP1B1-AD 細胞(AD 細胞)）を MC-LR-free の新鮮培地で培養し、浮遊細胞由来の再接着・増殖した細胞（HEK293-OATP1B1-FL 細胞(FL 細胞)）と AD 細胞のマイクロシスチン LR に対する感受性を MTT 法により解析した。また，マイク
ロシスチン LR と類似した毒性発現機序を有す 10nM オカダ酸を 24 時間曝露して ADおよび FL 細胞の作製を試みた。解析の結果、昨年度報告した HEK293-OATP1B3 と同様に HEK293-OATP1B1 を用いた解析においても，マイクロシスチン LR 曝露によるAD および FL 細胞が得られた。また，親株に比べ AD 細胞では IC50 値で約 3 倍、FL細胞では約 2 倍マイクロシスチン LR に対して耐性を示した。一方，オカダ酸曝露によるアノイキス抵抗性細胞は出現せず，アノイキス抵抗性の獲得はマイクロシスチン LR 特有の性質であることが示唆された。
つづいて，水圏毒性化合物としてマイクロシスチン LR およびオカダ酸を使用して，毒性評価を試みた。マイクロシスチン LR はアオコを形成する藍藻類の一部の種が産生する毒性化合物である。肝臓に選択的な毒性を示し，肝不全を引き起こすことが知られている。青酸カリの数十倍ほどの毒の強さがあり，野生動物や家畜，さらにはヒトが死亡する事故まで報告されている。一方，オカダ酸は，渦鞭毛藻の一部が産生する毒性化合物である。渦
鞭毛藻を捕食する二枚貝に蓄積し，それを食べた動物に対し下痢や嘔吐などの症状を引き起こす。人に対しての死亡事故は報告されていないものの，過去には集団食中毒の原因となった。また，マイクロシスチン LR とオカダ酸はともに発がんを促進する機能を有すことが知られており，さらに活性酸素種を産生することも報告されていることから遺伝子変異を誘発して発がんの直接の原因となる可能性も考えられる。しかし，オカダ酸の細胞内外への輸送機構については報告が少なく，不明な点が多く残されている。さらにオカダ酸中毒への対処法は現在のところ確立されていない状況にある。そこで，本研究では，マイクロシスチ
ン LR と同様，オカダ酸の細胞内輸送機序の分子基盤を解明し，マイクロシスチン LR またはオカダ酸が引き起こす中毒への対処法の確立を目的とした。
オカダ酸は， OATP1B1（HEK293-OATP1B1）または OATP1B3 の発現細胞

130

（HEK293-OATP1B3）において，対照細胞(HEK293-CV)に比べてより強い細胞毒性を発現した。また，両トランスポーターの既知の輸送基質をオカダ酸と共に複合曝露した
結果，OATP1B1 または OATP1B3 発現細胞において細胞毒性が有意に抑制された。
オカダ酸曝露により，マイクロシスチン LR およびオカダ酸の標的分子である細胞内タンパク
質脱リン酸化酵素の活性は，対照細胞と比較して OATP1B1 または OATP1B3 の発現細胞で有意な活性低下が認められ，オカダ酸が OATP1B1 および OATP1B3 を介して細胞内へ輸送される可能性が示唆された。さらに，オカダ酸は OATP1B3 を介したマイクロシ
スチン LR の輸送を競合的に阻害し，その阻害定数 Ki 値は 0.89μM であった。以上の結果より，オカダ酸が肝細胞に比較的選択的に毒性を発現することが強く示唆された。
昨年度の研究で，柑橘類由来のフラボノイドナリンゲニンおよびその配糖体ナリンジンが抗酸化能とは無関係にマイクロシスチン LR の細胞毒性を抑制し，そのメカニズムの一部は
OATP1B1 および OATP1B3 を介したマイクロシスチン LR の細胞内取り込みの抑制能であることを明らかにした。今年度はマイクロシスチン LR およびオカダ酸を使用して同様の解析
を 行 っ た 結 果 ， ナ リ ン ジ ン お よ び ナ リ ン ゲ ニ ン は HEK293-OATP1B1 ，
HEK293-OATP1B3 細胞におけるマイクロシスチン LR およびオカダ酸の毒性抑制効果を示した。また，HEK293-OATP1B3 細胞におけるマイクロシスチン LR の細胞内取り込み量は，ナリンゲニンの濃度依存的に減少した。以上の結果から ，OATP1B1 およびOATP1B3 が毒性発現に関与する水圏毒性化合物の毒性が，各種の化合物により抑制可能であることが示唆された。
② 検討項目 2：天然化合の魚卵を用いた機能評価
ゼブラフィッシュおよびニホンメダカなどの小型魚類は，ヒトの病態研究，創薬，機能性食品の開発，ならびに環境汚染評価等におけるモデル生物として生命科学領域研究に利用されている。本研究では，孵化速度が比較的速い利点をもつことから受精卵を用いた解析に適したゼブラフィッシュ受精卵を用いて，天然化合物の機能評価を試みた。
96穴プレートの各穴に１個ずつ播種したゼブラフィッシュ受精卵に過酸化水素および柑橘類由来のフラバノン配糖体のナリンジンまたはそのアグリコンのナリンゲニンを複合曝露し，これらの天然化合物の酸化ストレス抑制能をゼブラフィッシュ受精卵の孵化率と半数孵化
所要時間を指標に用いて解析した。
解析の結果、ゼブラフィッシュ受精卵の孵化率は65.6±25.9％，半数孵化所要時間は48.1±1.9hであった。孵化率は変動が大きいことから，その後の解析は半数孵化所要時間を用いた。ゼブラフィッシュ受精卵に過酸化水素を単独曝露した結果，その最大無毒性濃度は200µMであった。最小毒性発現濃度の800µM過酸化水素と無毒性濃度

131

（10µM）のナリンジンを複合曝露した結果，過酸化水素単独曝露条件における半数孵化所要時間は78.4±12.4hであったのに対し，ナリンジンとの複合曝露条件下では半数孵化所要時間が75.9±7.9hとなり，約2.5h短縮した。 すなわち，ナリンジンは過酸
化水素曝露により遅延した半数孵化所要時間を早め，抗酸化的に機能した。一方，無毒性濃度（10µM）のナリンゲニンは，過酸化水素曝露により遅延した半数孵化所要時間(82.3±9.5h)をさらに約3.3h遅らせる(85.8±12.1h)ことが明らかになった。以上の結果から，ナリンジンおよびナリンゲニンの構造上の相違点である糖部分が，半数孵化
所要時間の短縮または遅延に関与する直接的または間接的本体であると推測された。
③ 検討項目３：ニホンウナギの緑色蛍光タンパク質 eelGFP の機能評価
ニホンウナギの筋肉切片に過酸化水素による酸化ストレスを与えると，昨年度の研究成果報告書に報告した培養細胞で検出された現象と同じく，筋肉切片を用いた解析においても酸化ストレス曝露により eelGFP に由来する蛍光の消失が確認された。

132

３． 研究の総括と今後の課題・展望
研究の総括① 昨年度に引き続き，培養細胞およびゼブラフィッシュ受精卵を用いた天然化合物の機能評価を行った。
有毒シアノバクテリアが産生する肝臓毒マイクロシスチン LR が肝細胞のみに特異的に発現している有機陰イオン輸送体タンパク質 OATP1B1 および OATP1B3 を介して細胞内に取り込まれて，その後，タンパク質脱リン酸化酵素 PP1 および PP2A を特異的かつほぼ不可逆的に阻害することにより，細胞内にリン酸化タンパク質が過剰蓄積し，通常のタンパク
質のリン酸化と脱リン酸化を巧みに制御してなされる細胞の営みが崩壊し，細胞毒性が引き起こされる。マイクロシスチン LR と同様に PP1 および PP2A 阻害活性を有すものの細胞
膜透過性が比較的高いことから臓器特異性を示さないと考えられてきたオカダ酸が，少なく
とも OATP1B3 の輸送基質として（おそらく OATP1B1 にも認識される）肝臓毒性を発揮することを試験管レベルで明らかにした。
さらに，昨年度の研究で，柑橘類由来のフラボノイドナリンゲニンおよびその配糖体ナリン
ジンが抗酸化能とは無関係にマイクロシスチン LR の細胞毒性を抑制し，そのメカニズムの
一部は OATP1B1 および OATP1B3 を介したマイクロシスチン LR の細胞内取り込みの抑制能であることを明らかにした。今回は，オカダ酸をナリンジンまたはナリンゲニンと複合曝露した結果，OATP1B1 または OATP1B3 発現細胞でのみオカダ酸の細胞毒性が抑制され，オカダ酸が肝細胞に比較的選択的な毒性を発揮するという上述の仮説を強く支持する結果となった。
② また，ナリンゲニンおよびナリンジンの抗酸化能および両 OATP の輸送活性阻害以外の機能性について解析するために，ゼブラフィッシュ受精卵へ過酸化水素による酸化ストレス曝露に対するナリンゲニンおよびナリンジンの複合曝露実験を行った。ナリンジンには弱い抗酸化能が検出されたが，ナリンゲニンには認められず、両フラボノイドとも多くの条件においてむ
しろ魚卵毒性を誘発した。
③ 昨年度研究で，eelGFP を強制発現させた培養細胞に過酸化水素を用いて酸化ストレスを曝露すると eelGFP に由来する傾向が減弱した。この現象は，eelGFP の蛍光発現に必須のリガンドであるビリルビンが酸化されてビリベルジンに代謝され，eelGFP から遊離した133

ことが推察される。そこで，本年度は二ホンウナギの筋肉切片を調製し，過酸化水素を用いて酸化ストレスを曝露する実験を行った。実験の結果，筋肉切片の蛍光強度が減弱した。従って，二ホンウナギ筋肉切片においても酸化ストレス曝露によりビリルビンが酸化されビリベルジンに変換され、eelGFP から遊離したものを推察された。

134

次年度に向けての課題・計画・展望等
本研究プロジェクトに参画しているメンバー全員が鹿児島大学水産学部の教員であり，情報交換やディスカッションを比較的スムーズに行うことができる。従って，平成 28 年度以降においても本年度の研究成果をさらに発展的に継続し，水産業・養殖業への貢献に留まらず，環境保全ならびに人々の健康の保持・増進に大きく貢献できることが期待される。以下に研究計画を記す。
マイクロシスチン LR の細胞毒性を抑制し得る水生生物由来の天然化合物のスクリーニングを行う。



今年度は実施しなかったが，昨年度の結果を踏まえて，がん細胞のシスプラチン耐性を克服し得る水生生物由来の天然化合物のスクリーニングを継続して実施する。また，銅の細胞内取り込みトランスポーターCtr1 がシスプラチンを輸送することが明らかになっているため、
ATP7A または ATP7B 発現培養細胞に Ctr1 を共発現させ，シスプラチンの細胞内ベクトル輸送解析系を作製し，同様にシスプラチン耐性克服剤の開発を目指す。また，肝細胞から血中へのコレステロール分泌を担う ABCA1 の発現と輸送活性に与える重金属類の影響を解析する。



蛍光強度が不安定な eel GFP の蛍光発現におけるスイッチングの分子機序を解析し，明らかにする。また，ビリルビン結合型 GFP の発現の生物間における普遍性と分子進化についても検討する。

マイクロシスチン LR のアノイキス抵抗性の誘導条件の詳細な検討において，がんの悪性化に関与する NF-κB 等の炎症性転写因子やシアリダーゼ等の糖鎖分解酵素のアノイキス抵抗性獲得における関与についての解析は不十分であった。これらの点についても検討する。

135

４．支援金額の執行内訳
項目
機器・備品

消耗品

金額（円）

内訳等
0

500,000 分子細胞生物学実験用試薬
魚類飼育費 他

旅費0

合計

500,000136

５．資料等
原著論文
F Moinuddin , Yoshinari Shinsato , Masaharu Komatsu , Ryoichi Mitsuo , Kentaro
Minami , Masatatsu Yamamoto , Kohichi Kawahara , Hirofumi Hirano , Kazunori Arita,
Tatsuhiko Furukawa
ATP7B expression confers multidrug resistance through drug sequestration.
Oncotarget, in press.

Kazuhiro Shiozaki, Yusuke Harasaki, Midori Fukuda, Ayana Yoshinaga, Sena Ryuzono,
Petros Kingstone Chigwechokha, Masaharu Komatsu and Taeko Miyagi.
Positive regulation of myoblast differentiation by medaka Neu3b sialidase throughganglioside desialylation.
Biochimie, 123, 65-72, 2016.

Aki Funahashi, Masaharu Komatsu, Tatsuhiko Furukawa, Yuki Yoshizono, Hikari
Yoshizono, Yasuhiro Orikawa, Shota Takumi, Kazuhiro Shiozaki, Seiichi Hayashi,
Yoshio Kaminishi, Takao Itakura.
Eel green fluorescent protein is associated with resistance to oxidative stress.
Comparative Biochemistry and Physiology-part C, 181-182, 35-39, 2016.

Ryuzono, S., Takase, R., Oishi, K., Ikeda, A., Chigwechokha, P., Funahashi, A.,
Komatsu, M., Miyagi, T., Shiozaki, K.,
Lysosomal localization of Japanese medaka (Oryzias latipes) Neu1 sialidase and its
highly conserved enzymatic profiles with human.
Gene, 575, 513-523, 2016.

Chigwechokha, P., Tabata, M., Shinyoshi, S., Oishi, K., Araki, K., Komatsu, M., Itakura,T., Shiozaki, K.,
Recombinant sialidase NanA (rNanA) cleaves alpha 2-3-linked sialic acid of host cellsurface N-linked glycoprotein to promote Edwardsiella tarda infection.
Fish Shellfish and Immunology, 47, 34-45, 2015.

137

Satoshi Ikema, Shota Takumi, Yuta maeda, Takashi Kurimoto, Shinya Bohda, Petros
Kingstone Chigwechokha, Yasumasa Sugiyama, Kazuhiro Shiozaki, Tatsuhiko
Furukawa, and Masaharu Komatsu
Okadaic acid is taken-up into the cells mediated by human hepatocytes transporter
OATP1B3.
Food and Chemical Toxicology, 83, 229-236, 2015.

Asami Ikeda, Hayato Ichino, Kiguchiya, S., Chigwechokha, P., Masaharu Komatsu,
Kazuhiro Shiozaki.
Evaluation and identification of potent angiotensin-I converting enzyme inhibitory
peptide derived from dwarf gulper shark (Centrophorus atromarginatus).
Journal of Food Processing and Preservation, 39, 107-115, 2015.

Takumi, S., Ikema, S., Hanyu, T., Shima, Y., Kurimoto, T., Shiozaki, K., Sugiyama, Y.,
Park, H., Ando, S., Furukawa, T., Komatsu, M.
Naringin attenuates the cytotoxicty of hepatotoxin microcystin-LR by the curious
mechanisms to OATP1B1- and OATP1B3-expressing cells.
Environ Toxicol Pharmacol, 39, 974-981, 2015.

Shiozaki, K., Takahashi, K., Hosono, M., Yamaguchi, K., Hata, K., Shiozaki, M., Bassi,R., Prinetti, A., Sonnino, S., Nitta, K., Miyagi, T.
Phosphatidic acid-mediated activation and translocation to the cell surface of
sialidase NEU3, promoting signaling for cell migration.
FASEB J. 2015 in press

Yamamoto, K., Takahashi, K., Shiozaki, K., Yamaguchi, K., Moriya, S., Hosono, M.,
Shima, H., Miyagi, T.,
Potentiation of epidermal growth factor -mediated oncogenic transformation by
sialidase NEU3 leading to Src activation.
PLoS One 2015, in press

138

Hata, K., Tochigi, T., Sato, I., Kawamura, S., Shiozaki, K., Wada, T., Takahashi, K.,
Moriya, S., Yamaguchi, K., Hosono, M., Miyagi, T.
Increased sialidase activity in serum of cancer patients: identification of sialidase
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学会発表

古川龍彦，FM Moinuddin，新里能成，小松正治，南謙太郎，山本雅達，河原康一，
上條陽平，藤本啓汰，堀口史人，川畑拓斗，白石岳大，有田和徳
ATP7B の発現はドキソルビシンの核から後期エンドソームへの再局在と抗がん剤耐性に関与する
第 38 回日本分子生物学会年会 第 88 回日本生化学会大会 合同大会 2015 年 12 月（神戸）池間智，内匠正太，塩崎一弘，古川龍彦，小松正治
水圏毒性化合物の臓器選択毒性の発現メカニズム
第５回リン化合物討論会 2015 年 11 月（京都）

小松正治
DNA・遺伝子から水生生物をみよう
かごしま県民大学連携講座「やさしい DNA・遺伝子の講座」2015 年 10 月（鹿児島）龍薗せな、高瀬諒、大石一樹、小松正治、宮城妙子、塩崎一弘
メダカリソソームシアリダーゼの胚発生における意義
第 34 回日本糖質学会年会 2015 年 7 月（東京）塩﨑一弘、龍薗せな、大石一樹、高瀬諒、吉永綾奈、小松正治、宮城妙子
ニホンメダカにおける脱シアリル化機構の解明
第 34 回日本糖質学会年会 2015 年 7 月（東京）140

Petros Chigwechokha、新吉沙弥香、本田晃伸、大木麗菜、荒木亨介、小松正治、宮城妙子、
塩崎一弘
Edwardsiella tarda 感染による脱シアリル化機構とその意義
第 34 回日本糖質学会年会 2015 年 7 月（東京）堀田夕貴、高野博之、池間 智、内匠正太、杉山靖正、 塩崎一弘、古川龍彦、小松正治
肝臓毒マイクロシスチン LR は OATP1B3 発現細胞にアノイキス抵抗性を誘導する
第８回トランスポーター研究会九州部会 2015 年 7 月（鹿児島）

池間 智、内匠正太、Petros Kingstone Chigwechokha、杉山靖正、 塩崎一弘、古川龍彦、
小松正治
下痢性貝毒オカダ酸は OATP1B1 および OATP1B3 の輸送基質として細胞毒性を発現する
第８回トランスポーター研究会九州部会 2015 年 7 月（鹿児島）

池間 智、内匠正太、塩崎一弘、杉山靖正、古川龍彦、小松正治
ナリンジンは肝臓毒マイクロシスチン LR の OATP1B1 および OATP1B3 を介した毒性発現を様々なメカニズムで抑制する
第８回トランスポーター研究会九州部会 2015 年 7 月（鹿児島）橋本海理、池間 智、内匠正太、青木俊二、池田龍二、杉山靖正、 塩崎一弘、古川龍彦、
小松正治
生薬を用いたマイクロシスチン LR およびオカダ酸中毒の発現抑制
８回トランスポーター研究会九州部会 2015 年 7 月（鹿児島）

塩崎一弘：シアル酸分解阻害を介したカンキツ由来フラバノンの機能性．第 2 回鹿児島の黒膳 機能性食と健康シンポジウム, 奄美, 2016.1

塩崎一弘：水棲生物を利用した健康機能性研究. 第 3 回日本統合医療学会鹿児島支部学術大会, 鹿児島, 2015.8

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