薬 剤 学, 67 (5), 304―308 (2007)≪若手研究者紹介≫

癌および新生血管を標的とした
MT1-MMP ターゲットリポソームに関する研究

跡部

一

孝

Kazutaka Atobe

徳島文理大学香川薬学部

1． はじ

め

100 個の癌細胞の死につながり，効率が良い，②腫に瘍血管内皮細胞は，正常細胞なので薬剤耐性を獲得

抗癌剤を正常組織ではなく，癌細胞だけに選択的せず，治療を中止して再開しても，再度同じ血管新に送達させることで抗癌剤の治療効果を増加させ，生阻害薬が有効に使える，③腫瘍細胞は多様である

正 常 組 織 で の 副 作 用 の 軽 減 を 図 る drug delivery

ために多種類の抗癌剤の開発が必要とされるが，血system（DDS）の開発が盛んに行われている．リポ管内皮細胞は基本的に同じ性質を持つ正常細胞であソームの表面に癌細胞表面に高発現している分子にるため，1 つの有効な新生血管阻害剤があらゆる腫対する抗体やリガンドなどを結合させることで癌細瘍に有効である可能性，などがあげられる．しか胞への標的化を行ったターゲットリポソームもそのし，近年開発されている新生血管阻害薬は単独では1 つである．これらターゲットリポソームを生体内生存期間の延長など有効な治療効果を示さず，抗癌に 投 与 す る と enhanced permeability and reten-剤との併用において生存期間の延長が認められていtion 効果 1）によって癌組織に集積し，さらに標的分る 3）．このことから血管新生阻害薬は抗癌剤と併用

子に結合することで細胞内に取り込まれ，内封したすることにより高い効果がでてくると考えられてい薬物を癌細胞に選択的に送達し高い効腫瘍効果を発る．

揮する．しかしながら，癌細胞だけを標的とした場

抗癌剤は細胞の増殖を抑制することが主な作用機

合，すべての細胞を死滅さなければ生き残った細胞序である．つまり抗癌剤を選択的に増殖性の高い癌が再増殖を起こしたり，また抗癌剤に対する耐性を組織中の血管内皮細胞に送達することができれば，獲得することによってより悪性度が高い癌組織が形新生血管阻害薬と同様に血管形成を抑制することが成されると考えられる．

できると考えられる．そこで癌細胞だけでなく，癌近年の癌治療において新生血管形成を阻害するこ

新生血管内皮細胞の両方を標的とするダブルターとで，癌への栄養や供給を阻害し癌組織の維持や退ゲットリポソームを調製できれば，癌細胞，癌血管縮を期待する，新生血管阻害療法が着目され広く研内皮細胞へ一度に抗癌剤を送達することができ，癌究が行われてきている 2）．新生血管を阻害するメ細胞を標的としたターゲットリポソームとしての働リットとしては，① 1 つの腫瘍血管内皮細胞は約きと，新生血管阻害薬としての働きによる両方の効

100 個の癌細胞を養うため，1 つの内皮細胞の死は果により，これまで研究されてきたターゲットリポ

筆者紹介：2002 年 3 月徳島大学薬学部薬学科卒業，2007年 3 月徳島大学大学院薬科学教育部博士後期課程修了．
2007 年 3 月博士（薬学）を取得，2007 年 4 月より徳島文理大学香川薬学部薬物動態学分野，助教就任．研究のモットー：あきらめず，何かひとつでも見つけ出す．趣味：音楽鑑賞，読書．
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ソームよりも高い治療効果を持つことが可能になると考えられる．このダブルターゲットリポソームを実現するためには，癌細胞だけでなく，癌新生血管内皮細胞に特異的に存在する分子を標的とする必要がある．そこで癌細胞や内皮細胞の進展の際に発現薬 剤 学 Vol. 67, No. 5 (2007)

が亢進していることが知られている，マトリクスメ約 100 nm）．抗体は抗 MT1-MMP モノクローナルタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase; MMP）

抗 体 を Fab’ 化 し た も の を 用 い た．以 降，MT1-に着目した．

MMP を 標 的 と し た 本 リ ポ ソ ー ム を SIL[MT1-MMP は，発生，創傷治癒，炎症，血管新生，癌MMP(Fab’)] と記載する．また対照実験として抗体の浸潤・転移などのさまざまな生理的および病理的を結合させていないステルスリポソーム（SL）を用な生命現象に関与するタンパク質分解酵素である．

いた．

ほ乳類では，現在までに 25 種類が同定され，ドメイ

まず，SIL[MT1-MMP(Fab’)] の癌細胞へのターン構造や産生後の推移により，18 種類の分泌型と 7ゲット効果について検討を行った（Fig. 1）．その結種類の膜型の二つに分類されている．これら MMP

果，SIL[MT1-MMP(Fab’)] はリポソーム濃度依存的の中で癌の成長や血管新生に関与している分子としては，分泌型の MMP-2，MMP-9，膜結合型の membrane type 1-MMP （MT1-MMP; MMP-14）が 特に他の MMP の活性化し重要な働きを果たすと考えられている．MT1-MMP は，前駆体として分泌される MMP-2 （pro-MMP-2）などの他の MMP の活性化因子であるのみならず，コラーゲン I，II 型，フィブロネクチン，ラミニン，ビトロネクチン，フィブリン，プロテオグリカンなどの幅広い細胞外マトリクス（extracellular matrix; ECM）を基質とする．
また，MT1-MMP は細胞表層の因子を制御することで，特に細胞運動性の亢進に関与する可能性が報告されている 4 〜 6）．癌細胞および血管内皮細胞へ効率よく薬物を送達するためには，標的とする分子が細胞膜表面に存在していることが必須である．そのため MT1-MMP を標的としたリポソームを調製することで，理想とするダブルターゲットリポソームを実現できると考えられる．
そこで MT1-MMP を標的としたターゲットリポソームの有用性について，in vitro および in vivo でのターゲット効果の検討を行った．
2． 研

究

成

果

2.1 ヒト線維肉腫 HT-1080 細胞へのターゲット効果の検討
癌細胞のモデルとして，MT1-MMP を恒常的に発現しており，MT1-MMP の研究に広く用いられているヒト線維肉腫細胞 HT-1080 細胞を用いた．リポ
ソ ー ム の 脂 質 組 成 は モ ル 比 で HSPC: Chol:
PEG2000-DSPE ＝ 1.49:1:0.059 と し，薄 膜 振 盪 法（Bangham 法）により調製した．また in vivo での血中滞留性を増加させるための PEG 表面修飾は，コンベンショナルリポソームを形成後，PEG 修飾を行うポストインサーション法により行った（粒子径Fig. 1. Binding/Uptake of Fluoresence (DiI) -Labeled
Liposomes by HT-1080 Cells.
(A) Lipid concentrations, (B) Competition
experiment, (C) Time period. ●: SIL[MT1MMP(Fab’)], ○: SL.

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に細胞に取り込まれることが明らかとなった（Fig.

HT-1080 細胞に比べると少ないものであった．こ1-A）．SIL[MT1-MMP(Fab’)] が MT1-MMP を介しれは細胞での MT1-MMP の発現量や，細胞活性にて結合していることを示すため，抗 MT1-MMP モよる違いであると考えられる．これらの結果からノクローナル抗体と SIL[MT1-MMP(Fab’)] の競合

SIL[MT1-MMP(Fab’)] は癌細胞だけでなく，血管内実験を行ったところ，SIL[MT1-MMP(Fab’)] の結合皮細胞においても高いターゲット効果を持つことがが抑制された（Fig. 1-B）．このことから SIL[MT1-明らかとなった．

MMP(Fab’)] は MT1-MMP に結合することで取り込

また，HT-1080 細胞および HUVEC 両細胞においまれることが明らかとなった．次に時間依存的な取て，SIL[MT1-MMP(Fab’)] は細胞内に内在化後ライり込みについて検討を行ったところ，12 時間まで時ソゾームに集積していることを観察している（data間に依存した取り込みが認められた（Fig. 1-C）．一not shown）．このことから SIL[MT-MMP(Fab’)] は方，SL は細胞に取り込まれているものの，その取り細胞内に内在化後，ライソゾームで分解されること込み量は SIL[MT1-MMP(Fab’)] に比べ少ないことで内封する薬物を放出し殺細胞効果を発揮すると考が わ か っ た．こ れ ら の 結 果 か ら SIL[MT1-えられる．

MMP(Fab’)] は MT1-MMP を発現している癌細胞に対して高いターゲット効果を持つことが明らかと

2.3 ドキソルビシン封入リポソームによる殺細胞効果の検討
これまでの結果から，SIL[MT1-MMP(Fab’)] は癌なった．
2.2 ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞 HUVEC へ の タ ー
ゲット効果の検討

細胞および血管内皮細胞の両方を標的とすることができることが明らかとなった．そこで実際にリポ

次にもう 1 つの標的細胞である血管内皮細胞へのソームにドキソルビシンを封入し，それぞれの細胞ターゲット効果について，新生血管や MT1-MMPにおける殺細胞効果について検討を行った．その結の研究で広く用いられているヒト臍帯静脈内皮細胞

果を Table 1 に示している．SIL[MT1-MMP(Fab’)]

HUVEC をモデルとして実験を行った．その結果は Free ドキソルビシンには及ばないものの，SL にHUVEC においても HT-1080 細胞と同様に時間依比べ高い殺細胞効果を持つことが明らかとなった．

存的な取り込みが認められた（Fig. 2）．HUVEC で

これは SL にくらべ SIL[MT1-MMP(Fab’)] の方が多認 め ら れ た SIL[MT-MMP(Fab’)] の 取 り 込 み は，くの薬物を細胞内に効率的に運ぶことができるためであると思われる．しかし癌細胞 HT-1080 細胞に比べ血管内皮細胞 HUVEC への効果は，低いことも明らかとなった．この効果の違いは Free ドキソルビシンでも観察された．これはドキソルビシンが細胞増殖を阻害することで殺細胞効果を発揮する薬物であるため，癌細胞に比べ細胞増殖速度の遅い HUVEC では効果が減弱したと考えられる．以上の結果から，SIL[MT1-MMP(Fab’)] は SL に比べ高い殺細胞効果をもつことが明らかとなった．

Fig. 2. Binding/Uptake of DiI-Labeled Liposomes byHUVEC.
●: SIL[MT1-MMP(Fab’)], ○: SL.
Table 1. Comparison of the Cytotoxicity of Various Liposomal Formulations
with DXR in HT-1080 Cells and HUVECs.
Formulations
Free DXRDXR-SL
DXR-SIL[anti-MT1-MMP(Fab’)]
306IC50 (DXR µM)
HT-1080 cells
2.6±1.237.5±3.1＞300

薬 剤 学 Vol. 67, No. 5 (2007)

HUVEC
4.48±1.578.8±6.4＞300

2.4 新生血管誘導モデルを用いた新生血管ターゲットに関する検討布していることが確認された（Fig. 3-C）．また血管への集積度をリポソームの蛍光強度を指標として計In vitro において SIL[MT1-MMP(Fab’)] は，癌細測すると，SIL[MT1-MMP(Fab’)] は SL に比べ最大胞および血管内皮細胞に対して高いターゲット効果で 2 倍のリポソームが集積していることが確認されを示し，またドキソルビシンを封入することによった．て高い殺細胞を持つことが明らかとなった．そこで次にドキソルビシンを封入したリポソームを用い

次に in vivo での新生血管ターゲット効果について，て，新生血管阻害効果について検討を行った（Fig.

dorsal air sac model によって新生血管を誘導した4）．SL 投与群ではコントロール群と同様の血管形

マ ウ ス を 用 い て 検 討 を 行 っ た．そ の 結 果，成が認められ，新生血管形成は阻害されなかった

SIL[MT1-MMP(Fab’)] は新生血管血管壁に選択的が，SIL[MT1-MMP(Fab’)] はコントロール群，SLに集積していることが確認された（Fig. 3-A，B）．

群に比べ新生血管形成数は明らかに少なく，形成さ一方，SL は新生血管とは関係なく全体的に広く分れた新生血管もコントロール群，SL 群と比較して，細く未熟なものであった．これらの結果から SL に比べ SIL[MT1-MMP(Fab’)] は in vivo においても高いターゲット効果を示し，ドキソルビシンを封入す

Fig. 3. Accumulation of Liposomes in Neo-Vasculature.
(A) SIL[MT1-MMP(Fab’)], (B) SL, (C) Penetration of liposomes. ― : SIL[MT1-MMP(Fab’)], …: SL. Bar 200 µm.

Fig. 4. Inhibition of Angiogenesis by Liposomes.
(A) Control, (B) SL, (C) SIL[MT1-MMP(Fab’)].

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ることで高い新生血管阻害効果を有することが明ら

浩一研究員，小幡賢一研究員，青木隆則研究員，第かとなった．

一ファインケミカル株式会社・安田純子研究員に深こ れ ら の こ と か ら，MT1-MMP を 標 的 と し た

く感謝いたします．

SIL[MT1-MMP(Fab’)] は癌細胞および新生血管を引標的とできるダブルターゲットリポソームとして有用であることが明らかとなった．
3． 最後に博士課程 3 年間の間に，癌細胞および血管内皮細胞を標的とするダブルターゲットリポソームの有用性について検討を行うことができた．今後は，これらの研究により学んだ知識，経験等を生かし，より高い治療効果を発揮できる DDS キャリアーの開発を設計していきたい．
本研究に際して始終御指導御鞭撻頂いた徳島大学・際田弘志教授，石田竜弘准教授に深甚なる謝意を表します．また，本研究に際し，有益なる御助言をいただきました，北海道大学・原島秀吉教授，秋田英万博士，静岡県立大学・奥直人教授，浅井知浩博士に心より感謝いたします．数々の貴重な御助言と御協力をいただきました，エーザイ株式会社・菊池寛博士，第一三共株式会社・小林英夫博士，橋本308

用文献1) Y. Matsumura, H. Maeda, A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy:
Mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs, Cancer
Res., 46, 6387–6392 (1986).
2) J. Folkman, Tumor angiogenesis: Therapeutic implications, N. Engl. J. Med., 285, 182–186 (1971).
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4) M. Kajita, Y. Itoh, T. Chiba, et al., Membranetype 1 matrix metalloproteinase cleaves CD44
and promotes cell migration, J. Cell Biol., 153,893–904 (2001).
5) N. Koshikawa, G. Giannelli, V. Cirulli, K. Miyazaki, V. Quaranta, Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration overlaminin-5, J. Cell Biol., 148, 615–624 (2000).
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Rozanov, A.Y. Strongin, Processing of integrinalpha(v) subunit by membrane type 1 matrix metalloproteinase stimulates migration of breast carcinoma cells on vitronectin and enhances tyrosine
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薬 剤 学 Vol. 67, No. 5 (2007)