2023.2

No.

71

SHRSP/Izm における Nox2 欠損による骨修復異常
島根大学

医学部

病理学講座

病態病理学

藤川晃一、並河徹

1）背景、目的SHRSP/Izm は高血圧モデルとして広く使用されており、その高血圧の原因の一つとして活性酸素による酸化ストレスの亢進があげられる（1, 2）。我々は、活性酸素を能動的に作り出す酵素である NADPHOxidase（Nox）に着目して、研究を行ってきた。Nox ファミリーは Nox1 から Nox5 までの 5 種類が存在しており、p22phox などと複合体を形成することで機能し、NADPH 由来の電子が細胞の内側から表面側に輸送されて、最終的に酸素分子と反応することで活性酸素であるスーパーオキシドアニオンが産生される。Nox1、2 および 4 はユビキタスに、Nox3 は内耳などに発現しており、Nox5 はげっ歯類には発現していない。Nox1 と 2 は Rac、p47phox などのコファクターによって活性が調節され、短期的に大量の O2- を産生するのに対し、Nox4 は恒常的に活性化しており、比較的少量の H2O2 を産生している（3）。

Nox2 と Nox4 は心血管系に発現が多く、高血圧に特に重要であると考えられる（4）ことから、Crispr/Cas9
シ ス テ ム を 使 用 し て、Nox2 あ る い は Nox4 を 欠 損 す る SHRSP/Izm（Nox2 KO SHRSP、Nox4 KOSHRSP）を作出し、高血圧の進展への影響を評価した。この検討によって、Nox2 欠損で血圧の上昇が有意に抑制され、Nox4 欠損で血圧の上昇が促進されるという結果が得られた。
一方で、これらのラットを飼育していく中で、Nox2 KO SHRSP 個体において尾骨や下肢骨端が肥大化している個体が散見されたため、この症状の原因を検討した。本稿では、この結果について紹介する。
2）方法、結果骨肥大が生じている箇所を詳細に観察するために、レントゲン撮影を行ったところ、下肢骨の骨端や尾骨にお正常個体

骨肥大個体いて、骨の形成が過剰になっている様子が観察された（図 1）。骨端や尾骨は通常飼育下で負荷のかかりやすい箇所であり、すべての Nox2 KO SHRSP で骨肥大が起こるわけではないということから、骨組織に損傷を受けた際に骨修復に異常が生じ、骨肥大になるのではないかと考えた。そこで、WKY/Izm、SHRSP/Izm、すべてのNox を 欠 損 す る SHRSP（Nox KO SHRSP）、Nox2 KO
SHRSP、Nox4 KO SHRSP の五系統を用いて、骨損傷モデルを作成し詳細に検討した。

2 か月齢の時点で、左脛骨に傷を付ける手術を行い、その 1 か月後および 2 か月後にレントゲン撮影と左右の脛骨の回収を行った。レントゲン撮影の結果、術後 1 ヵ
月 の 時 点 で は WKY や SHRSP、Nox4 KO SHRSP の 3系統と比べて、Nox KO SHRSP と Nox2 KO SHRSP で骨の肥大化が見られ始めていた（図 2）。さらに、術後 2か 月 の 時 点 で は、WKY や SHRSP、Nox4 KO SHRSPの骨は少し太くなっているものの修復が進んでいるのが

図 1. Nox2 KO SH RSP で偶発的に見られる骨肥大分かるのに対し、Nox KO SHRSP と Nox2 KO SHRSP では骨が異常に肥大化していることが観察された（図 2）。
これらの骨組織を脱灰し、パラフィン切片を作成し、HE 染色を行うことで骨組織の観察を行った。術後 1 ヵ月の時点では、5 系統すべての骨損傷サンプル（左脛骨）で、活性化した立体的な骨芽細胞や多核の破骨細胞が観察された

WKYSHRSP

Nox KO

Nox2 KO

Nox4 KO。コントロールサンプ（図 3）ル（右 脛 骨）で は、非 活 性な扁平な骨芽細胞が観察され、破骨細胞はほとんど見ら術後1 ヵ月れなかった。術後 2 か月の時
点 で は、WKY、SHRSP、

Nox4 KO SHRSP では、立体的な活性型の骨芽細胞や破骨細胞がほとんど見られなくなっており、骨修復反応が術後2 ヵ月終焉に向かっていることが観察された。一方、Nox KO

SHRSP、Nox2 KO SHRSP
では、立体的な活性型の骨図 2. 骨損傷モデルのレントゲン写真

芽細胞や破骨細胞が未だ多術後1 ヵ月

く残っており、骨修復反応

SHRSPが継続していることが観察された。

術後2 ヵ月Nox KO SHRSPSHRSPNox KO SHRSP

コントロール（右腟骨）3）考察
本研究結果では、Nox2 を欠 損 す る Nox KO SHRSP

骨損傷サンプル（左腟骨）および Nox2 KO SHRSP で、骨を損傷した際の修復過程において、異常な骨修復が図 3. 骨損傷モデルの HE 染色画像生じた結果、過剰な骨肥大が起こる可能性を示した。その詳細としては、活性型骨芽細胞と破骨細胞の残存が観察されたことから、Nox2 欠損によって骨修復過程を終了するシグナルが入らなくなり、骨芽細胞の過剰な増殖と活性化が引き起こされたことに起因すると考えられた。Nox2 は骨芽細胞の分化過程においては機械的刺激によって発現上昇し、分化を抑制する方向に働く一方で、破骨細胞の分化過程で発現上昇し、分化を促進すると報告されている（5, 6, 7）。この報告からも、Nox2 欠損によって骨芽細胞への分化が促進された可能性が支持され、この過剰な骨芽細胞に対応するために破骨細胞も維持されたと考えることができる。
一方で、骨修復過程での Nox2 欠損による影響についての報告はなされておらず、Nox2 KO マウスで骨が肥大化したという報告もなされていない。本研究にみられた骨肥大は、高血圧モデルラット

SHRSP においてのみ見られた現象である可能性があり、SHRSP は老人性骨粗鬆症のモデルとしても知られている（8）ことから、SHRSP では酸化ストレスをはじめとした様々な要因によって、骨微小環境のバランスにも影響が生じていると推察される。今後、SHRSP を用いた骨環境と高血圧の連関に関する研究が進むことで、高血圧患者における骨病態への影響が示されることを期待する。
参1) Kishi T, et al. Circulation. 2004 May 18;109(19):2357-62
2) Noguchi K, et al. Eur J Pharmacol. 2010 Apr 10;631(1-3):28-35
3) Karen Bedard, et al. Physiol Rev. 2007; 87(1):245-313
4) Ago T, et al. Circ J. 2011;75(8):1791-800

考文献5) James S Lyons, et al. Sci Signal. 2017 Nov 21;10(506)6) Nakanishi A, et al. Int J Mol Med. 2013 Apr;31(4):874-80
7) Jin-Ran Chen, et al. J Biol Chem. 2015 Jun 5;290(23):14692-704
8) Yamori Y, et al. Clin Exp Hypertens A. 1991;13(5):755-62
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