地球環境研究，Vol.22（2020）

立正大学熊谷キャンパス水路に生息する外来生物カワリヌマエビ Neocaridina spp.

―遺伝的２系統の生息とHRM解析法による簡易同定―
関

根

一

希＊

小

林

拳

大＊

山

口

力

丸＊

キーワード：甲殻類、DNA、High Resolution Melt 解析、外来生物、リアルタイムPCR

１．はじめに
国外外来のヌマエビ科カワリヌマエビ属 Neocaridina

ナミヌマエビや国外外来生物を含めた Neocaridina spp.
が複数系統認められることが報告されている（Ishiguro
et al., 2018）。

spp.は、国内各地へ侵入し、分布を拡大させている（豊本研究では、立正大学熊谷キャンパスおよびその周辺

田・関, 2014）。日本在来のカワリヌマエビ属は、西日において形態的にミナミヌマエビに類似した個体が多数本に分布するミナミヌマエビ Neocaridina denticulata

採集されており、西日本在来のミナミヌマエビ、あるい

denticulata と南西諸島に生息するイリオモテヌマエビ

は国外からのカワリヌマエビ属 Neocaridina spp. といっ

N. iriomotensis 、イシガキヌマエビ N. ishigakiensis 、コ

た外来生物が生息しているのかを明らかにするため、形ツノエビ Neocaridina sp. の３種、壱岐島の N. ikiensis

態比較および遺伝子解析を行なった。また、今後の新たのみ認められている（豊田・関, 2014；Shih et al., 2017）。

な系統の侵入や変遷に対するモニタリングができるよう

しかし、1990年代から年によっては20トンにもおよぶ大に、得られたサンプルの遺伝的特徴から、シーケンスを

量のブツエビと呼ばれる Neocaridina spp. が中国や韓経なくても、簡易的かつ安価にスクリーニングできるリ

国から釣り餌や観賞用として生きて輸入された（西野・アルタイムPCRを用いたHigh Resolution Melt（HRM）

丹羽, 2004：丹羽, 2010）ため、ブツエビの産地である解析の実験系を開発した。

中国や韓国のカワリヌマエビ属の複数種が国内に入り込んだとされる（丹羽, 2010）。これらは形態的に在来のミナミヌマエビと酷似している他、交雑の可能性もあり、分類学的問題を引き起こしている（西野, 2017）。

２．調査方法（１）カワリヌマエビ属の採集と形態比較

こ の よ う な 中、 カワリヌマエビ属の自然分 布 域 で2016年12月20、23日、2017年11月28日、12月８日およは な い 関 東 や 宮 城 県、 北 海 道 に お い て Neocaridina

び2019年11月20日の生物学実験にて、履修生が手網を用

spp. が2000年代から認められるようになってきた（金いて立正大学熊谷キャンパス内の水路にて、カワリヌマ

澤, 2015a, b； 長 谷 川 ら, 2015, 片 山 ら, 2017）。埼玉県

エビ属のエビ類を採集し、高濃度のエタノールで固定し内では、2003年からミナミヌマエビおよび国外からのた（図１）。また、2019年12月５日に埼玉県熊谷市熊谷

Neocaridina spp. が認められはじめ、2014年には埼玉県大橋より約500m下流の荒川左岸および熊谷市万吉の和内広域での生息が認められている（金澤, 2015a, b）。遺

田吉野川左岸からカワリヌマエビ属のエビ類を採集し、伝子解析や形態比較から、Neocaridina spp. の一部は中同様に固定した。

国に分布する Neocaridina davidi である可能性が挙げら

カワリヌマエビ属のエビ類には、眼窩上棘はなく、眼れており（Mitsugi et al., 2017；西野, 2017）、島根県や窩より後部の頭胸甲上に歯がある特徴が認められ、額角広島県といった在来のミナミヌマエビが分布する西日本の頭胸甲上歯数、額角上縁歯数、および額角下縁歯数とからの標本が N. davidi として扱われて分子系統解析さいった額角歯相が形態比較に用いられる（金澤, 2015b）。

れた先行研究もある（Shih et al., 2017）。また、埼玉県

2019年に採集された標本については、先行研究の金澤

内サンプルを用いた遺伝子解析研究からは、西日本のミ（2015b）にならって、額角の頭胸甲上歯数、額角上縁＊

立正大学地球環境科学部
133立正大学熊谷キャンパス水路に生息する外来生物カワリヌマエビ Neocaridina spp.（関根・小林・山口）

なお、種名の表記はShih et al.（2017）に従った。
（３）HRM解析
High-resolution melting（HRM） 解 析 は 比 較 的 強 力(a)

なインターカレーターを用いたリアルタイムPCR、高(b)

解像度の融解曲線解析を行なうことで、一塩基レベルでの変異を検出する手法である（Wittwer et al., 2003；
Liew et al., 2004）。先行研究および本研究で決定された

Neocaridina spp. のCOI遺伝子の塩基配列のなかから、(c)

PCR産物が80 bpになるようにPrimer 3Plus（Untergasser(d)et al., 2007）を用いて、プライマーを設計した（Neo_
額角上縁⻭

頭胸甲上⻭

COI_F1: 5’-AGAGAGAGGAGTCGGCACTG-3’, Neo_
COI_R1: 5’-TCCCATATCTACTGAGGCCCC-3’
）。

額角下縁⻭

CFX96 Touch TM Real-Time PCR（Bio-Rad）を用いて、98℃（２分）、98℃（２秒）－ 60℃（１秒）×40回、

(e)

5 mm

(f)

図１ 調査地とカワリヌマエビ属 Neocaridina spp.
（ａ）立正大学熊谷キャンパス水路。
（ｂ）荒川。
（ｃ）和田吉野川。
（ｄ）採集された Neocaridina spp.。
（ｅ）実体顕微鏡下で観察された Neocaridina spp.。
（ｆ）Neocaridina spp.の額角。
歯数、および額角下縁歯数を計数し、比較した。

95℃（１分）、60℃（１分）、60℃－ 95℃（10秒、0.2℃ずつ加温）の反応条件でPCRおよび融解曲線解析を行な っ た。PCR試 薬 と し てSsoFast EvaGreen Supermix（Bio-Rad）を用いた。

３．結果および考察（１）熊谷キャンパス水路、和田吉野川および荒川に認（２）塩基配列の特定と分子系統樹推定

められた Neocaridina spp. と遺伝的２系統

エタノール固定された標本の胸脚をピンセットで取り

2019年に採集された立正大学熊谷キャンパス、和田吉

出し、HotSHOT法（Truett et al., 2000）によりDNAを

野川および荒川で採集されたカワリヌマエビ属の額角歯抽出した。抽出されたDNAを用いて、ミトコンドリア

相を表１に示す。本調査で得られた立正大学熊谷キャン

DNAのCOI遺伝子を増幅するユニバーサルプライマー

パス水路、和田吉野川、および荒川におけるカワリヌマ

LCO-HCO（Folmer et al., 1994）によって、PCR増幅しエビ属の額角歯相（頭胸甲上歯数＋額角上縁歯数／額た。PCR産物をExoSAP IT（Thermo Fisher Scientific）

角下縁歯数）はそれぞれ1-5＋14-20／3-7（各歯数を最小TM

Terminator v3.1 Cycle

数－最大数で示す）、1-4＋15-24／3-7、および2-3＋14-18

Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific） に よ っ て／4-7であった。荒川水系と利根川水系における埼玉県

シーケンス反応した後、ABI 3500 Genetic Analyzer

内全域のカワリヌマエビ属820個体の額角歯相を調べた（Thermo Fisher Scientific）を用いて塩基配列を決定し先行研究では、0-7＋8-23／2-13と報告されており（金澤,た。

2015b）、本調査結果で得られたほとんどの個体の歯数によって精製し、BigDye

決定された塩基配列658 bpを用いて、MEGA 7（Kumar

は最小値－最大値の範囲内に含まれた。和田吉野川からet al., 2016）のソフトウェアでKimura-2 parameterによ

額角上縁歯数が24と先行研究（金澤, 2015b）より多い

る近隣結合樹を作成した。また、各ノードの支持率を

歯数が１個体からのみ認められた。金澤（2015b）では、評価するため、ブートストラップ確率を算出した。今西日本の在来ミナミヌマエビの額角歯相が1-4＋7-16／

回特定された塩基配列の他、ミナミヌマエビ近縁種と0-9であり、埼玉県内のカワリヌマエビ属のなかには頭の 比 較 を す る た め、 先 行 研 究Shih et al.（2017） で 用

胸甲上歯数、額角上縁歯数および額角下縁歯数の多い個いられている塩基配列を含め、N. saccam を外群とし体がいることが指摘されている。本調査で得られた標本

た（GenBank Accession No. AB300177, AB300178,

からは、西日本在来ミナミヌマエビと比べて額角下縁歯AB300183, AB300185- AB300187, LC324764- LC324769）。

数について多いものはなかったが、頭胸甲上歯数が５と134

地球環境研究，Vol.22（2020）

表１

熊谷キャンパスおよびその周辺で採集されたカワリヌマエビ属の額角歯相と金澤（2015b）との比較
額角歯相
採集地

採集日

遺伝子系統

（頭胸甲上歯数＋額角上縁歯数／額角下縁歯数）

調査
個体数

最小－最大値

平均値

1-5＋14-20／3-7

2.61＋16.11／4.50

18

埼玉県熊谷市万吉、立正大学熊谷2019年11月20日
NdtおよびNdv
キャンパス水路（遺伝子系統別にしたもの）
Ndt
万吉、和田吉野川

1-5＋14-20／3-7

2.55＋16.38／4.54

13

Ndv

1-4＋14-18／3-6

2.20＋15.40／4.40

5

2019年12月５日

NdtおよびNdv

1-4＋15-24／3-7

2.50＋17.38／5.00

8（遺伝子系統別にしたもの）

Ndt

2-4＋15-24／3-7

2.80＋17.00／5.00

5Ndv

1-3＋17-19／4-6

2.00＋18.00／5.00

32-3＋14-18／4-7

2.67＋15.33／6.00

3

熊谷大橋より約500m
2019年12月５日
NdtおよびNdv
下流、荒川（遺伝子系統別にしたもの）
Ndt
久下、荒川
（金澤, 2015b）
埼玉県全域（金澤, 2015b）

2-3＋14-18／7

2.50＋16.00／7.00

2

Ndv

3＋14／43＋14／41

2014年11月16日－

1-4＋13-17／3-9

2.50＋14.80／5.40

10

2014年－2015年－

0-7＋8-23／2-13－820

多いものが水路で１個体、額角上縁歯数が17-24と多いて認められた。埼玉県の利根川水系および荒川水系のカ

ものが水路で５個体、和田吉野川で４個体、荒川で１個

ワリヌマエビ属を調べたIshiguro et al.（2018）では塩基体認められた。したがって、先行研究（金澤, 2015b）同

配列の公開はされていないため、本研究で得られた塩基様、本調査で得られたサンプルは形態的に西日本在来ミ

配列データと直接比較することはできない。ただし、分ナミヌマエビに類似しているものの、やや異なる特徴を子系統解析からの樹形から判断する限り、複数の系統が持ったカワリヌマエビ属であると考えられる。

認められており、本研究で認められた N. davidi とミナ

2016年、2017年、2019年の熊谷キャンパス水路から採ミヌマエビの２つの単系統群に加えて、両系統の姉妹群

集された33個体、和田吉野川８個体、荒川４個体を用いとなるような単系統群が認められている。本調査地と同た分子系統解析からは、強く支持されたクレードが２つ

じ熊谷市内の荒川本川で採集されたサンプルは、いずれ認められ、一つは N. davidi との単系統群（Ndv）であり、も本調査結果と同様のもので２つの単系統群に含まれるもう一方はミナミヌマエビ N. denticulata （Ndt）とで（Ishiguro et al., 2018）。一方、荒川水系の支川である入構成された（図２）。したがって、遺伝的なデータから

間川や高麗川、都幾川、越辺川では、別系統のカワリヌも本調査で得られた熊谷キャンパス内の水路や和田吉野

マエビ属が主に認められている。この別系統のカワリヌ

川、荒川におけるサンプルはカワリヌマエビ属であるこ

マエビ属は熊谷市内の熊谷キャンパス水路や和田吉野川、とが支持された。また、国外外来の N. davidi および国

荒川ではまだ確認されておらず、河川域によって異なる

内在来のミナミヌマエビといった複数種と同種、あるい系統が生息しているものと考えられる。しかし、今後、は近縁である可能性が高いと考えられる。

カワリヌマエビ属の同一水系内や別水系からの侵入・分Neocaridina davidi の単系統群内では、Shih et al.
（2017）で報告されている塩基配列と同一のものが本調

布拡大によって、各系統の分布に変化が生じていく可能性があると考えられる。

査の標本から認められたが（ハプロタイプNdv-6）、今回

今回調査した熊谷キャンパス水路、和田吉野川および初めて認められたハプロタイプNdv-aもあった。ミナミ

荒川のいずれからも、N. davidi の系統（Ndv）とミナ

ヌマエビとの単系統群では、広島県や、岡山県、兵庫

ミヌマエビの系統（Ndt）の両系統が認められた。埼玉

県、岐阜県の西日本で認められたハプロタイプNdt-1と県では2003年ごろから県西部において、在来のミナミヌ

Ndt-2との単系統内に入るNdt-cと、これらのクレードとマエビと国外外来の Neocaridina spp. が生息していた姉妹群をつくるNdt-aとNdt-bが新しいハプロタイプとし可能性について報告されている（金澤, 2015a, b）。しか135

立正大学熊谷キャンパス水路に生息する外来生物カワリヌマエビ Neocaridina spp.（関根・小林・山口）

91 Ndv-2 AB300185 N. davidi
9093

Ndv-3 AB300186 N. davidi
Ndv-1 AB300183 N. davidi

Ndv

Ndv-4 AB300187 N. davidi
95

Ndv-5 LC324766 N. davidi
Ndv-6: LC324767 N. davidi, ⽔路 2017年 (2),荒川 (1), 和田吉野川 (1)8896

Ndv-a: ⽔路 2017年 (3), 2019年 (5), 和田吉野川 (2)Ndt-a: ⽔路 2016年 (3), 2017年 (7), 2019年 (11),荒川 (3), 和田吉野川 (3)95

Ndt-b: ⽔路 2019年 (1), 和田吉野川 (1)100

Ndt 2 LC324765 N. denticulata

100

Ndt

Ndt-c: ⽔路 2019年 (1)
Ndt 1 LC324764 N. denticulata
LC324768 N. heteropoda koreana
LC324769 N. palmata
AB300178 N. saccam
0.01

AB300177 N. saccam

外群

図２ COI（658 bp）に基づく近隣結合樹
ノード上の数値はブートストラップ確率を示し、85以下については表記を省略した。括弧内の数値は個体数を示す。

し、カワリヌマエビ属では、観賞用として交雑等品種改

間での変異はない（表２）。一方で、Ndv-Ndt系統間で良されてきたこともあり、交雑個体の子孫がミナミヌマ

は１～３塩基の変異があり、本研究で明らかになった

エビのハプロタイプを保持しているとも考えられる。形

Ndt-a、Ndt-b、およびNdt-cはShih et al.（2017）で特定態データである額角歯相についても、NdvとNdtの系統されているNdt-1、Ndt-2とは１～２塩基異なる。

別に見たとしても、系統間で明瞭な違いがあるとは言え2019年に採集され、シーケンス解析により塩基配列がず（表１）、また、西日本の在来ミナミヌマエビの額角決定している熊谷キャンパス水路の16個体（Ndv系統：

上縁歯数より多いものは両系統で認められる。ハプロタ

５個体、Ndt系統：11個体）、和田吉野川８個体（Ndv：

イプNdt-cを持つ個体さえも額角歯相は1＋20／5と、額３個体、Ndt：５個体）、および荒川４個体（Ndv：１

角上縁歯数が多い。したがって、飼育実験や核DNAか個体、Ndt：３個体）のDNAサンプルを用いてリアル

らの解析といった詳細な調査も必要となるが、熊谷市をタイムPCRおよびHRM解析を実施した結果を図３に示はじめとする埼玉県内のカワリヌマエビ属は在来のミナ

す。ノーマライズされた融解曲線（図３ｃ）および差分

ミヌマエビと国外外来の Neocaridina spp. 間の交雑個曲線（図３ｄ）において、明瞭な分離が認められ、Ndv

体、あるいはその子孫である可能性が高いと思われる。

系統とNdt系統の融解曲線がそれぞれまとまった。また、
Ndt-aとNdt-b、c間についても、やや明瞭さに欠けては（２）HRM解析を用いた２系統の検出
本調査で得られたハプロタイプはNdv-6、Ndv-a、Ndt-a、

いたものの、１塩基の変異（A/C）による融解曲線の違いが認められた。

Ndt-b、およびNdt-cの５種類であった。HRM解析用にしたがって、シーケンス解析をしなくとも、本研究で作成されたプライマーでの増幅領域について、N. davidi

開発したプライマーでのHRM解析で、Ndv系統とNdt系

系 統 のNdv-6とNdv-a、 お よ び、Shih et al.（2017） で統のどちらの系統かを検出することは可能となった。ま

決定づけられているNdv-1～ Ndv-5といったNdv系統のた、比較的信頼性は低くなるものの、系統内での多型

136

地球環境研究，Vol.22（2020）

表２

HRM解析用のPCR増幅配列において認められる変異
増幅塩基配列位置*

ハプロタイプ名
Ndv-1

22

25

31

37

40

43

55

58

64

C

A

T

C

A

A

T

C

A

Ndv-2

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndv-3

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndv-4

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndv-5

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndv-6

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndv-a

・

・

・

・

・

・

・

・

・

Ndt-1

・

・

・

・

G

・

・

・

・

Ndt-2

・

・

・

・

G

・

・

T

・

Ndt-a

・

G

・

A

G

・

・

・

・

Ndt-b

・

G

・

・

G

・

・

・

・

Ndt-c

・

G

・

・

G

・

・

・

・

Neocaridina heteropoda koreana

・

・

・

・

・

・

・

・

G

Neocaridina palmata

・

・

・

・

・

G

C

・

・

Neocaridina saccam AB300178

T

・

C

・

・

・

・

・

・

Neocaridina saccam AB300177

T

・

C

・

・

・

・

・

・

*プライマー Neo_COI_F1の塩基配列数20 bpもカウント.
同じ塩基配列は省略されている.

(a)

(b)

(RFU)

(RFU)

蛍光強度

蛍光強度

温度 (℃)

温度 (℃)(c)
Ndt‐a (14)G..AG
Ndt‐b (2), Ndt‐c (1)
G..CG

Ndv‐6 (2),
Ndv‐a (7)A..CA

温度 (℃)

相対蛍光強度

蛍光強度(Normalized)(d)Ndt‐b (2),Ndt‐c (1)
G..CG

Ndt‐a (14)G..AG

Ndv‐6 (2),
Ndv‐a (7)A..CA

温度 (℃)

図３ HRM解析（ａ）融解曲線のRaw data。
（ｂ）79℃－87℃間を示した融解曲線。
（ｃ）ノーマライズされた融解曲線。（ｄ）蛍光強度の差分曲線。

137

立正大学熊谷キャンパス水路に生息する外来生物カワリヌマエビ Neocaridina spp.（関根・小林・山口）

を検出する上でも利用できると考えられる。本研究で片山敦・佐藤僚介・吉川朋子（2017）：東日本鶴見川水系には、カワリヌマエビ属の近縁種、例えば N. heteropoda

おけるカワリヌマエビ属とヌカエビの急激な分布の変化．

koreana や N. palmata については、PCR増幅配列内に変異があることを確認してはいるが、実際にHRM解析したわけではなく、融解曲線が明らかではない。したがって、別種や別系統が生息する地点や、新たに入り込んだ

自然環境科学研究，30，5-12.
Kumar, S., Stecher, G. and K. Tamura（2016）: MEGA7:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0
for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution , 33,
1870-1874.

場合に見落とされる可能性もあるので、注意する必要がLiew, M., Pryor, R., Palais, R., Meadows, C., Erali, M., Lyon,

ある。しかしながら、HRM解析はPCRまでの作業で塩E. and C. Wittwer（2004）: Genotyping of single-nucleotide基配列の変異を検出することができるため、精製やシー

polymorphisms by high-resolution melting of small

ケンス解析といった手順や時間、試薬の使用が大幅に削減される。状況に合わせて、シーケンスとHRM解析を使い分けることで、より効率的なモニタリング調査などが可能になると考えられる。

amplicons. Clinical chemistry , 50, 1156-1164.
Mitsugi, M., Hisamoto, Y. and H. Suzuki（2017）: An invasive
freshwater shrimp of the genus Neocaridina Kubo,
1938（Decapoda: Caridea: Atyidae）collected from Boso
Peninsula, Tateyama City, Chiba Prefecture, easternJapan. Crustacean Research , 46, 83-94.

謝辞
本研究は2019年度立正大学研究推進・地域連携セン
ター支援費第２種による支援を頂いた。また、熊谷キャンパス内でのサンプル採集には、2016年－2019年度生物学実験の履修生にご協力いただいた。心から感謝申し上げます。

西 野 麻 知 子（2017）：日本への外来カワリヌマエビ属（Neocaridina spp.）の侵入とその分類学的課題（特集 シンポジウム「在来種を脅かす近縁外来種の侵入：水域の生物を中心に」）．地域自然史と保全，39，21-28.
西野麻知子・丹羽信彰（2004）：新たに琵琶湖へ侵入したシナ
ヌマエビ？．オウミア（琵琶湖研究所ニュース），80，３.
丹羽信彰（2010）：外来輸入エビ，カワリヌマエビ属エビ
（Neocaridina spp.）および Palaemonidae spp. の輸入実態

引用文献
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cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan
invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology ,３, 294-299.
長谷川政智・池田実・藤本泰文（2015）：宮城県に侵入した
淡水エビ：カワリヌマエビ属 Neocaridina spp. の分布拡大とヌカエビ Paratya compressa improvisa への影響．伊豆沼・内沼研究報告，９，47-60.
Ishiguro, N., Tamura, N., and M. Ohkashiwa（2018）: Habitatof a native freshwater shrimp Paratya improvisa in
Iruma River syextem in Saitama Prefecture and theinvasion status of alien species, Neocaridina spp. DNA鑑定, 10, 51-57.
金澤光（2015a）：外来甲殻類が及ぼす水域の生態系サービスへの影響（特集 外来生物がもたらす水環境問題）．水環境学会誌，38，51-55.
金澤光（2015b）：埼玉県に侵入した外来甲殻類ヌマエビ科カワリヌマエビ属の現状について．埼玉県環境科学国際セン
ター報，15，152-156.

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ガイドブック．誠文堂新光社．255p.
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地球環境研究，Vol.22（2020）

Invasive freshwater shrimps, Neocaridina spp. inhabiting theirrigation canal in Kumagaya Campus Rissho University―genetic two lineages and identification by HRM analysis―
SEKINÉ Kazuki＊ , KOBAYASHI Kenta＊ and YAMAGUCHI Rikimaru＊＊

Faculty of Geo-Environmental Science, Rissho University

Key words: crustacean, DNA, High Resolution Melt Analysis, invasive species, Real-time PCR

139