薬 剤 学, 75 (5), 296‑300 (2015)≪若手研究者紹介≫

血液網膜関門におけるカチオン輸送機構の研究：
トランスポーターの道を巡って

久 保 義 行* Yoshiyuki Kubo
富山大学大学院医学薬学研究部（薬学）薬剤学研究室

薬剤耐性や薬物の体内動態に関与するトランスポー

1．は じ め にターに大変な関心を抱くようになっていた．そこで，筆者が薬剤学の分野に足を踏み入れてから 10 年

大学院進学を機会に，筆者は大阪大学産業科学研究程の歳月が経った．その始まりは，異分野でトラン所生体情報制御学研究分野（山口明人教授）に参画

スポーター研究に従事していた筆者が，金沢大学大し，遺伝子工学を利用したトランスポーターの立体

学院自然科学研究科薬学系創剤科学研究室（辻彰教

構造解明や新規 ABC トランスポーターの探索，新授）に教員として参画した時である．当時は，新し規 ABC トランスポーター遺伝子欠損マウスの作成・い研究環境に心が奮い立つとともに，出身ラボの先解析などに従事した．当時の山口研究室には，森山輩たちとは異なる道に踏み出したことに多少の不安

芳則先生（現岡山大学教授）が在籍されており，筆もあった．本稿では，筆者のこれまでの研究生活を者も抗体作成のコツなどをご指導頂いたことがあっ振り返るとともに，現在の研究について紹介させてた．研究室では，日々の研究の中で膜タンパク質の頂く．

生化学的解析手法や分子生物学的研究法の習得に熱
2．トランスポーター研究の世界へ心に努めたが，その反面，心が折れそうになったこともあった．新規トランスポーターの探索ではなか

筆者は大学院に進学してから教員となった現在まなか思うような遺伝子配列は得られず，また，遺伝で，一貫してトランスポーター研究に従事してきた．

子欠損マウス作成では胚操作方法の習得に大変な時とは言え，その第一歩は，名古屋市立大学薬学部生間を費やした．このような紆余曲折を経て，筆者は

物薬品化学研究室（奥山治美教授）で卒研生としてABCA5 を同定し，その遺伝子欠損マウスを作成し従事した脂質栄養学の研究であった．生物薬品化学

た．ABCA5 欠損マウスでは，甲状腺疾患に酷似し研究室における 1 年間に，筆者は薬学研究におけるた眼球突出や拡張型心筋症様の症状が高頻度で観察

個体解析の重要性を教わるとともに，文献紹介などされ，ABCA5 の生理的重要性が明らかとなった．

を通して分子生物学と胚操作から作成される遺伝子組織化学的解析では，ABCA5 のオートファジーへ欠損マウスの有用性を強く印象付けられた．の関与が示唆され，このことは ABCA5 のリソソー

学部 3 年生の頃から，筆者は細菌類やがん細胞のム局在からも支持された．以上の研究に筆者が従事していた当時は，ゲノム解析によって哺乳動物にお*1998 年名古屋市立大学卒業．2001 年日本学術振興会特別研究員．2003 年大阪大学大学院博後課程修了，同大産業科学研究所研究員．2004 年金沢大学助手．2007
年同大助教．2008 年米国ジョージア医科大学研究員．
2010 年東北大学特任助教．2011 年富山大学講師．2013
年同大准教授．連絡先：〒930–0194 富山市杉谷 2630
E-mail: kuboyosh@pha.u-toyama.ac.jp296ける 400 種ほどのトランスポーター遺伝子の存在が示された時期でもあった．縮重プライマーを用いた新規遺伝子探索は終焉の感があり，筆者の関心も，未知の遺伝子ではなく，機能未知のトランスポーターの発現や機能，役割に向かうようになっていた．

薬 剤 学 Vol. 75, No. 5 (2015)

3．トランスポーターの道を巡るり面白くない状況だったが，同時に，適切な判断によって研究の活性化を図ることの重要性を学んだ．

博士号取得の後，筆者は大阪大学産業科学研究所留学するまでの筆者は，特定のトランスポーター分に博士研究員として勤務した．研究遂行上のフリー子を指向して研究に取り組むことが主であったが，ハンドが増え，大学院生時代に温めていたアイディ

Ganapathy 教授の下においては，輸送機構や輸送活アを試す機会も増えた．一方，教員への道は当分険性を指向した研究に取り組む機会が増え，未知の生しく思え，「しばらく研究員をやったら，その後は海理機構を探索する面白さを知った．当時，研究室内外留学」というのが当時の考えだった．このようなで未知のペプチド輸送機構を研究していた大学院生

中，筆者は膜ベシクル取り込み輸送解析法を金沢大は，筆者の大事なディスカッション相手であった．

学大学院自然科学研究科薬学系創剤科学研究室（辻留学の後，筆者は東北大学にグローバル COE 特彰教授）においてご教示頂く機会を得た．これが思任助教として勤務する機会を頂いた．東北大学では，いがけない幸運となり，筆者は創剤科学研究室に教大学院薬学研究科薬物送達学分野（寺崎哲也教授）員として参画することとなった．筆者が金沢大学ににおいて「機能性タンパク質の定量的局在解析法の着任した 2004 年は，金沢大学薬学部が宝町から角確立」に従事し，血液脳関門（blood-brain barrier；間町に移転した年であり，完成間も無い自然科学研BBB）に発現するトランスポーターの局在性を題材究棟で筆者の教員生活がスタートした．創剤科学研として，ファーマコプロテオミクスを利用した新し究室では，辻先生のご指導の下，筆者は多様な研究

い膜タンパク質局在解析法の確立に挑んだ．この研テーマに関わる機会を頂けた．特に，在籍期間を通究の遂行には，脳毛細血管を大量に調製することがして関与した OCTN1（SLC22A4）の研究では，必須であり，筆者は食肉卸売市場から供与頂いたブOCTN1 遺伝子欠損マウスの作成などで活躍の場を

タ脳から遠心を重ね，最後は粗膜画分を 5 層の密度頂き，これが筆者にとってカチオン性薬物の体内動勾配遠心によって luminal-rich 画分などを調製し，態研究に携わる最初の機会となった．また，その欠LC/MS/MS 定量を実施した．大槻純男先生（現熊本損 マ ウ ス を 用 い た メ タ ボ ロ ー ム 解 析 に お い て，大学教授）のご指導の下，筆者は得られた定量値かOCTN1 の生理的基質として L-ergothioneine の同ら distribution ratio を算定し，BBB におけるトラ定に立ち会えたことは，欠損マウスを用いた研究にンスポーターの局在性を定量化した．特に，安定し携わってきた者として大変な喜びであった．以上のた収量の膜画分調製が可能となった時期には，筆者ような経験を通して，筆者は薬物や栄養物の体内動はやる気に満ちて LC/MS/MS 定量を計画した．残態に寄与する輸送機構やトランスポーターの研究の念なことに，本研究は，2011 年 3 月 11 日に発生し意義と面白さを知った．創剤科学研究室における 4

た東北地方太平洋沖地震によって一時中断となった年間は，筆者にとって教員や研究者としての将来をが，後年に寺崎先生からの御提案で，論文執筆の機じっくり考える期間でもあり，辻先生や加藤将夫先会を頂けたことは筆者にとって大変貴重な経験とな生（現金沢大学教授）から頂いた貴重なご指導やごった 1）．

助言は，筆者の貴重な財産となった．
2008 年の辻先生のご退任を機に，筆者は海外留学

4．組織関門研究への取り組みの途に就いた．留学先の Medical College of Georgia

筆者が富山大学大学院医学薬学研究部薬剤学研究

では，生化学 / 分子生物学講座（Vadivel Ganapathy室（細谷健一教授）に赴任したのは，東北地方太平教授）において，大腸がん細胞におけるアミノ酸取洋沖地震の発生から約 3 週間後であった．これを契り込み輸送機構などの研究に従事した．留学の当初，機に，筆者は網膜などに存在する血液組織関門の研Ganapathy 教授のアイディアの豊富さと研究が上手究に本格的に従事することとなった．筆者の今回のくいかない時の切り替えの速さには，本当に驚いた．

引越しに関しては，珍しいことに親戚から喜びの声

思わしくない研究結果が出た時は，ディスカッショが挙がった．というのも，筆者の浮沈激しい家系にンの終わりに「OK, you can forget.」という台詞がは眼科医の先祖（江戸中期）がおり，大袈裟なことボスから出てきた．部下である筆者としては，あまとは思いつつ，伯母は「巡り合わせ」と喜んだ．網

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図2

図1

In vivo-in vitro 相関解析．RUI と parallel artificial membrane permeability assay（PAMPA）で得られた Papp をプロットした．P-gp の基質である
digoxin や vincristine が予測値（実線）よりも低い RUI 値を示す一方，verapamil は高い RUI 値を示した（文献 2）より転載）．

血液網膜関門を介した［3H］verapamil 輸送の解析．
（A）Integration plot による網膜への［3H］
verapamil 透過性解析，および（B）TR-iBRB2細胞を用いた［3H］verapamil 取り込み輸送解析（文献 3）より転載）．

なった（図 1）．筆者らは in vivo 解析をラットにおいて実施し，網膜への［3H］verapamil 取り込みクリアランスが細胞間隙輸送マーカーに比して約 980

膜は視覚を司る神経組織であり，糖尿病網膜症や加倍高い値を示すこと，また，網膜への［3H］verapam-

齢性黄斑変性症などの網膜疾患は失明に繋がること

il 取り込みがカチオン性薬物である pyrilamine によから，患者の quality of life を低下させる原因となって阻害されることを明らかとした．これに対し，る．一方，現在の網膜疾患薬物療法はその安全性や脳への［3H］verapamil 取り込みは pyrilamine によ

効率性の点において不十分な状況であり，薬剤学研って促進される傾向にあった．以上から，BRB にお究室では「循環血液中から網膜への薬物送達」を提ける verapamil 取り込み輸送の存在が示されるとと唱し，これに血液網膜関門（blood-retinal barrier；もに，BRB と BBB がカチオン性薬物に対して異なBRB）に発現するトランスポーターの利用を考えてる関門特性を示すことが示唆された．さらに，筆者

きた．BRB は，網膜毛細血管内皮細胞を細胞実体とらは inner BRB におけるカチオン性薬物取り込み輸する内側血液網膜関門（inner BRB）と網膜色素上送機構を in vitro レベルで解析し，inner BRB を介皮細胞を細胞実体とする外側血液網膜関門（outerした verapamil や pyrilamine，propranolol などのBRB）から構成されており，研究室では，inner BRB3,4）．
輸送が担体介在輸送であることを示唆した（図 2）に発現するアミノ酸やビタミンを基質とするトラン

Inner BRB において，カチオン性薬物輸送機構のスポーター群の生理的役割が明らかとされてきた．

存在が明らかとなったことから，筆者の関心はその当時，研究室内では BRB のカチオン性薬物輸送分子的実体や医療への応用に向かうこととなった．

機構が考え始められていた．BRB を介した化合物のIn vitro 阻害解析において，筆者らが報告したカチ網膜移行性の評価には，in vivo 解析である retinal

オ ン 性 薬 物 輸 送 機 構 は，p-aminohippuric aciduptake index（RUI）法の利用が考えられてきたが，（PAH）などのアニオン性化合物によっては阻害さその創薬応用には，より簡便で迅速な in vitro 評価れず，その分子実体として有機カチオントランスポ法の確立が必須であった．筆者は進行中であった inーターが想定された．しかし，既知の有機カチオン

vitro-in vivo 相関解析に加わり，化合物の BRB 透過トランスポーターである OCTs や OCTNs，MATE1，性の予測において inner BRB モデル細胞株である条PMAT などの阻害剤である tetraethylammonium

件的不死化ラット網膜毛細血管内皮細胞株（TR-（TEA）や 1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP＋），iBRB2 細胞）を利用した in vitro 輸送解析の有用性

decynium-22，choline，cimetidine などは阻害効果2）を報告した ．この検証過程において，P-gp（ABCB1/を示さず，inner BRB のカチオン性薬物取り込み輸

MDR1）の基質である verapamil が予測値に比して送機構は未知のトランスポーター分子によって担わ高い RUI 値を示したことから，BRB における ver-れることが示唆された 2〜4）．カチオン性薬物に関し

apamil 取り込み輸送機構の存在が考えられるようにては，これまでの神経科学研究において desipramine298

薬 剤 学 Vol. 75, No. 5 (2015)図 3 ［3H］
Clonidine 輸送の in vitro 阻害解析．TR-iBRB2 細胞による［3H］clonidine
輸送は，（A）に示されるようなカチオン性化合物によって阻害される一方，（B）に示されるような典型的な有機カチオンや有機アニオンによって阻害されない．

図 4 血液網膜関門を介した網膜への clonidine 輸送．BRB に存在するカチオン性薬物輸送機構は，神経保護薬の網膜への送達に有用と期待される．

や memantine などの薬物が神経保護作用を示すこ在が示唆された．加えて，筆者らが実施した in vitroとが明らかとされており，将来の神経疾患治療にお解析においては，inner BRB における clonidine 取けるこれら薬物の有用性が考えられてきた．In vitro

り込み輸送機構が pH 依存性を有する担体介在輸送阻害解析において，inner BRB におけるカチオン性であること，また，種々のカチオン性神経保護薬に薬物の輸送機構が desipramine などによって阻害さ5），よって阻害されることなどが示されており（図 3）れることから，これら輸送機構が網膜への神経保護以上から，網膜への神経保護薬の輸送におけるカチ薬の送達に有用であることが考えられた．筆者らはオン性薬物輸送機構の有用性が示唆された（図 4）．

アドレナリン α2 受容体アゴニストである clonidine

5．お わ り にを用いて，このことを検証してきた．Clonidine の神経保護作用としては，塩基性繊維芽細胞成長因子

大学院生であった頃，恩師から「難しいテーマだ（bFGF）の発現を上昇させて虚血や興奮毒性によるけど，とにかくやってみろ． 瓢箪から駒 ってこと障害から網膜神経を保護することが知られていた．

もある．骨は拾ってやる．」とよく言われた．当初の筆者らによる解析の結果，ラットにおける網膜への見通しと異なる結果や展開となった研究は少なくな

3［ H］clonidine 取り込みクリアランスは細胞間隙輸く，瓢箪から出てきた駒送マーカーに比して約 730 倍高い値を示すとともた．そして，トランスポーターの道を巡りながら，に，この輸送は pyrilamine などによって阻害されバリエーション豊かな研究に従事できたことは本当たことから，BRB を介した clonidine 輸送機構の存に幸運なことだったと思う．現在取り組んでいる

薬 剤 学 Vol. 75, No. 5 (2015)を捕まえようと努めてき

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BRB の輸送機構研究に関しては，神経疾患治療の飛躍的向上が期待されるとともに，新たな生理機構の発掘や詳細解明に繋がるものと予想される．今後とも，分子実体同定を含めた研究展開に精励したい．
最後に，筆者に研究の機会を与えて頂くとともに厚いご指導を賜った先生方，また，貴重なご助力を賜った学生の皆様に，心より御礼申し上げます．また，本稿の執筆に絶え間ないご助力を賜りました富山大学細谷健一教授ならびに赤沼伸乙助教に深謝するとともに，執筆の機会を与えて下さいました「薬剤学」編集委員の先生方に感謝申し上げます．
引 用 文 献1) Y. Kubo, S. Ohtsuki, Y. Uchida, T. Terasaki, Quantitative determination of luminal and abluminal
membrane distributions of transporters in porcine
brain capillaries by plasma membrane fraction-300

ation and quantitative targeted proteomics, J.
Pharm. Sci., doi: 10.1002/jps.24398 (2015).
2) Y. Kubo, E. Fukui, S. Akanuma, M. Tachikawa, K.
Hosoya, Application of membrane permeability
evaluated in in vitro analyses to estimate bloodretinal barrier permeability, J. Pharm. Sci., 101,2596–2605 (2012).
3) Y. Kubo, Y. Kusagawa, M. Tachikawa, S. Akanuma,
K. Hosoya, Involvement of a novel organic cationtransporter in verapamil transport across the inner
blood-retinal barrier, Pharm. Res., 30, 847–856(2013).
4) Y. Kubo, Y. Shimizu, Y. Kusagawa, S. Akanuma, K.
Hosoya, Propranolol transport across the inner
blood-retinal barrier: potential involvement of anovel organic cation transporter, J. Pharm. Sci.,
102, 3332–3342 (2013).
5) Y. Kubo, A. Tsuchiyama, Y. Shimizu, S. Akanuma,
K. Hosoya, Involvement of carrier-mediated transport in the retinal uptake of clonidine at the inner
blood-retinal barrier, Mol. Pharm., 11, 3747–3753(2014).

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