“遺伝子診断でイチゴの病害を予防”

イチゴ栽培における主要土壌病原菌・萎黄病菌の簡易検出技術の開発
生命科学総合研究支援センター

准教授

須賀晴久

アピールポイント

国内外のイチゴ栽培では、予防が困難な萎黄病が発生して問題となっている。予防が困難な理由は病原菌の検出が困難かつ、時間がかかることにある。そこで、ここではDNA増幅法による簡易かつ迅速な病原菌の検出技術を開発した。
研究内容
苗に病原菌は着いてないかな？
栽培地に病原菌は居ないかな？
大丈夫かどうか教えて！
調べてみましょう

萎黄病菌？

イチゴ栽培開始
イチゴ萎黄病の発生が報告されている国

新たな経過
栽培期間

従来の経過

菌の分離数時間

DNA抽出・迅速診断
この技術を開発
萎黄病菌を検出対策
菌の性状調査1ヶ月

萎黄病で壊滅収穫

イチゴへの接種試験
対策

もう遅いよ・・・

売れたよ・・・

萎黄病菌を検出

本件に関する詳しい
お問合せはこちら ＞＞〒501-1193 岐阜市柳戸1-1

国立大学法人 岐阜大学 産官学連携推進本部
Tel：058-293-2025/Fax：058-293-2022
E-mail：sangaku@gifu-u.ac.jp

“遺伝子診断でイチゴの病害を予防”

イチゴ栽培における主要土壌病原菌・萎黄病菌の簡易検出技術の開発
生命科学総合研究支援センター

准教授

須賀晴久

イチゴ萎黄病菌検出用PCR法・LAMP法の開発☞ イチゴの栽培や苗販売ではここが問題

土壌には、Fusarium oxysporum というカビが多数生息しているが、イチゴに病気を起こすものはその中で特にf. sp. fragariaeと呼ばれる集団だけである。病原菌の特定には、分離されたF. oxysporumをいちいちイチゴに接種して発病するのかを見るしかなく、時間や特殊設備・知識が必要となっている。

病原菌

イチゴ萎黄病
これまでの病原菌検出の問題をDNA増幅技術で改善

PCRによるイチゴ萎黄病菌の検出のながれ

苗に病原菌は着いてないかな？
土壌に病原菌はいないかな？
大丈夫かどうか教えて！

調べてみましょう萎黄病菌？
イチゴ栽培開始
従来の経過

栽培期間

菌の分離
分離菌は植物に接種して発病するまで観察しないと病原菌かどうかを判定できない

新たな経過

対策

1ヶ月

DNA増幅による迅速診断

半日
萎黄病菌が見つかりました

菌の性状調査（イチゴ炭疽病・萎黄病・疫病 感染苗検査マニュアル）
萎黄病で壊滅イチゴへの接種試験

対策

収穫

千葉県のウェブサイトwww.pref.chiba.lg.jp/lab-nourin/nourin/koukaishiryou/manual.html

土壌からPCRで病原菌を検出できるのか？
よりダウンロード可能
添加試験: 土壌にイチゴ萎黄病菌の胞子を1×102～105胞子/g(土壌)で添加

売れたよ

もう遅いよ

萎黄病菌が見つかりました

イチゴ萎黄病菌(F. oxysporum f. sp. fragariae)特異的プライマーの設計とF. oxysporum特異的プライマーとのマルチプレックスPCR
bp

Fusarium 属(80種以上)
F. acuminatum
・・

F. oxysporum

非病原性

F. oxysporum 特異的プライマー(Edel et al 2000)
PFO318S rDNA

5.8S rDNA

28S rDNAPFO270bp

病原性(100以上の分化型)
f. sp. fragariae(イチゴ萎黄病菌)
f. sp. melonis(メロンつる割病菌)
f. sp. radicis lycopersici(トマト根腐萎凋病菌)
f. sp. spinaciae(ホウレンソウ萎凋病菌)・・・イチゴ萎黄病菌(F. oxysporum f. sp. fragariae)特異的プライマー
FofraF
Han

500
400
300
200
100

F. oxysporum
特異的PCR産物(70bp)
PCＲ産物のアガロースゲル電気泳動

500
300
100

Suga et al 2013

PCＲ産物のアガロースゲル電気泳動

LAMP用プライマーの開発

FofraRF. oxysporum

240bp

F. oxysporum

イチゴ萎黄病
菌特異的PCR
産物 (240bp)

1000

SkippyInter-Retrotransposon Sequence-Characterized
Amplified Polymorphism(IRAP)-PCR法と呼ばれるトランスポゾン間を増幅させる (Pasquali et al 2007)により、イチゴ萎黄病菌特異的DNA配列を取得してPCR用プライマー(FofraFとFofraR)を設計

bp

胞子を添加した土壌0.2gにFo-G2培地40μlを加えて、25℃、4日間前培養してからDNAを抽出してPCRを行った。
1×102胞子/g(土壌)以上で病原菌の検出が可能であった。
(注: 前培養なしの場合は1×103胞子/g(土壌)以上)
イチゴ萎黄病菌
特異的PCR産物 (240bp)

イチゴ萎黄病菌特異的DNA配列にLAMP用のプライマーセット(FIP: HS735、F3: HS736、BIP: HS739、B3: HS741)を設計

FofraFとFofraRプライマーによるPCR増幅の特異性確認 aF. oxysporum
分離地調査株 陰性株数 陽性株数非病原菌
国内3県以上 11b110f. sp. fragariae (イチゴ萎黄病菌)
国内4県以上 34b034f. sp. melonis (メロンつる割病菌)
不明
110f. sp. radicis lycopersici (トマト根腐萎凋病菌)不明
110f. sp. spinaciae (ホウレンソウ萎凋病菌)不明
110f. sp. lagenariae (ユウガオつる割病菌)
不明
110f. sp. cucumerinum (キュウリつる割病菌)不明
110
計501634

非病原菌

菌株

MAFF727519
FOF13
FOF25
FOF55
FOF113
FOF121
NRF09145
NRF09146
NRF0839
NRF0841
09SFo-8
f. sp. fragariae (イチゴ萎黄病菌)
MAFF305557
MAFF305558
MAFF727510MAFF744009
FOF10
UKA1
NRF0501
SI09063-1
09SFo-1
f. sp. melonis (メロンつる割病菌)
GUS76
f. sp. lagenariae (ユウガオつる割病菌)
GUS80
f. sp. cucumerinum (キュウリつる割病菌) GUS77

分離地
静岡県
栃木県
栃木県
栃木県
栃木県
栃木県
奈良県
奈良県
奈良県
奈良県
佐賀県
不明
不明
奈良県
福岡県
栃木県
栃木県
奈良県
北海道
佐賀県
不明
不明
不明

LAMP法による反応液の白濁化(2-2.5時間後)
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
ありありありありありありありありありなし
なし
なし

アガロースゲル電気泳動
イチゴ萎黄病菌ゲノムDNAをもとにLAMPで増幅した産物

a 240bpのDNAが増幅されたものが陽性、DNAの増幅がなかったものが陰性
b イチゴへの接種試験で病原性の有無を確認したもの

なお、 F. oxysporumによる作物病害はイチゴ萎黄病の他にシクラメン萎凋病、チューリップ球根腐敗病、バナナパナマ病など100種類以上ある。ここで病原菌検出技術の開発に利用した方法は、他のF. oxysporum病害の病原菌の検出技術開発にも適用できるものである。
関連文献 : Suga et al 2013 Development of PCR primers to identify Fusarium oxysporum f. sp. fragariae. Plant Disease 97: 619-625.
Pasquali et al 2007 Identification of race 1 of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae on lettuce by inter-retrotransposon sequence-characterized amplified region technique. Phytopathology 97: 987-996.

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