薬 剤 学, 71 (1), 45‑49 (2011)≪若手研究者紹介≫

魅せる DDS シクロデキストリン分子ネックレス形成を利用した
PEG 化インスリン持続放出システム

東大志*

Taishi Higashi

大正製薬株式会社 セルフメディケーション開発研究所

1．はじめ

シクロデキストリンのような温かい人情は，筆者のにどんな困難も solution（解決）に導いてくれた．本

2002 年 12 月，筆者が学部 3 年生の時，上釜兼人教授（現崇城大学教授）に憧れ，熊本大学大学院

稿では筆者のそのような研究室生活で得られた知見を概説する．

医学薬学研究部製剤設計学分野の門をたたいた．配2．背属されて与えられたテーマはモルヒネかタンパク質

景性薬物のいずれかを使用するものであったが，「東君タンパク質性薬物は微量で高活性を示し，優れたにはモルヒネは似合わないよ！」という上釜先生独医薬品として臨床で汎用されている．しかし，その特の御冗談（と信じている）により筆者のテーマは多くは①化学的・物理化学的に不安定である，②免後者に決まった．それからいくつかテーマは変更し疫原性を有する，③血中滞留性が低く，バイオアベたが，タンパク質性薬物を対象とする本テーマが生イラビリティが小さい，などの問題点を有している．

まれ，平山文俊助教授（現崇城大学教授）のご指さらに，タンパク質性薬物はその用途に応じて速効導のもと日々実験に明け暮れた．平山先生の豊かな化または持続化が望まれるものもある．これに対し，発想力，幅広い視野に筆者は魅了され，研究や科学タンパク質性薬物をポリエチレングリコールが如何に面白いかをご教示頂いた．2006 年，筆者が（PEG）で化学修飾すると上記問題点が著しく改善

博士課程に進学するとともに両先生は崇城大学へ転されることから，複数の PEG 化タンパク質製剤が任され，当時助教授であった有馬英俊先生（現教授）市販されている．例えば，ヒトインターフェロンが当研究室を受け持たれた．筆者にとって，博士課

a-2a の血中半減期は 3〜8 時間であるが，PEG 化す程の道のりは決して楽なものではなかったが，有馬

ると 72〜96 時間に延長し，週 1 回の投与が可能と先生が朝早くから夜中まで研究，事務，教育活動をなる．しかし，PEG 化タンパク質の多くは，更なる妥協することなく行われていた姿はこの上ないお手持続放出や厳密な放出制御が望まれており，これら本となった．また，筆者は先輩，同期，後輩にも恵の課題が改善されることでより多くの PEG 化タン

まれ，大変充実した研究室生活を送ることができた．

パク質が上市されるものと期待されている．

このように，熊本大学製剤設計学分野の基盤である環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリン（CyD）は分子内の疎水性空洞内に種々のゲスト分子* 鹿児島県生まれ．2004 年熊本大学薬学部卒業．2009年熊本大学大学院薬学教育部博士後期課程修了．大学
院在籍中，Evonik 社にて半年間のドイツ海外研修を修了．2009 年 4 月より大正製薬株式会社セルフメディケーション開発研究所に勤務．3 大モットー：①人と異なる発想をする．②人を尊敬し，感謝する．③大志を抱く．
連絡先：E-mail: taishi.higashi@po.rd.taisho.co.jp

を取り込んで包接複合体を形成することから，医薬品の可溶化，安定化，バイオアベイラビリティの改善などに有効利用されている 1）．最近，CyD が PEG
鎖をネックレス状に包接し，ユニークな構造を有する超分子複合体（分子ネックレス，polypseudoro-薬 剤 学 Vol. 71, No. 1 (2011)45

Fig. 1. Proposed scheme for release of PEGylated
proteins from CyDs molecular necklaces.

Fig. 2. Macroscopic photographs of precipitates of
PEGylated insulin/a-CyD and g-CyD molecular necklaces and their interaction modes.

Fig. 3. Powder X-ray diffraction patterns (upper)and schematic representation of crystal packing structures (lower) of PEGylated insulin/
CyD molecular necklaces.
a) a-CyD, b) PEGylated insulin/a-CyD physical mixture, c) PEGylated insulin/a-CyD molecular necklace, d) PEG/a-CyD molecularnecklace, e) g-CyD, f) PEGylated insulin/
g-CyD physical mixture, g) PEGylated insulin/g-CyD molecular necklace, h) PEG/g-CyD
molecular necklace.

taxane）を形成することが報告されている．空洞径の小さな a-CyD は PEG 鎖 1 本を，空洞径の大きな添加し，4˚C で 12 時間静置すると沈殿物の形成が観

g-CyD は PEG 鎖 2 本を包接し，分子ネックレスを察された．一方，b-CyD 水溶液に PEG 化インスリ形成する．これら分子ネックレスは難水溶性であるンを添加した系では沈殿物は形成されなかった．こものの，希釈されることで CyD が PEG 鎖から解離

れは，a- および g-CyD が PEG 化インスリンと分子し，溶解する．

ネックレスを形成することを示唆する．

そこで本研究では，PEG 化タンパク質を CyD 分

そこで，これら沈殿物が CyD 分子ネックレスであ子ネックレス化することにより，その溶解性を制御ることを確認するため，沈殿物の粉末 X 線回折を測し，持続性に優れるタンパク質製剤の構築を目指し定した．一般に，CyD 複合体の結晶構造は，かごた（Fig. 1）．モデルタンパク質として，インスリ型，層状および筒型構造に分類され，分子ネックレン 2〜4）およびリゾチーム 5）を用いて検討したが，今ス中の CyD は筒型構造の回折パターンを示す．Fig.

回は紙面の都合上インスリンでの検討内容を中心に3A 上段に示すように，a-CyD 系において，PEG 化

紹介する．

インスリン /a-CyD 物理的混合物は a-CyD 単独と同3．PEG 化インスリン /CyD 分子ネックレスの調製および構造解析様にかご型構造の回折パターンを示した．一方，PEG
化インスリン /a-CyD 分子ネックレスの沈殿物は，
2 q＝7.48˚，12.8˚，19.8˚ および 22.5˚ に特徴的なピCyD 分子ネックレスは，隣接する CyD 同士で水ークを与え，PEG/a-CyD 分子ネックレスの回折パ素結合を形成し，水分子と水素結合ができなくなるターンと同様に六方晶系筒型構造（Fig. 3A 下段）のため難水溶化し，沈殿物を生成する．Fig. 2 は PEG回折パターンを示した．また，g-CyD 分子ネックレ

化インスリン /CyD 分子ネックレスの調製スキーム

スは，2 q＝7.36˚，14.8˚，16.6˚ および 21.7˚ に特徴および反応終了時の溶液の写真を示す．高濃度の a-的なピークを与え（Fig. 3B 上段），PEG/g-CyD 分および g-CyD 水溶液に PEG 化インスリン水溶液を子ネックレスと同様に正方晶系筒型構造（Fig. 3B 下46

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Fig. 4. Macroscopic photographs of precipitates of PEG derivative/CyD molecularnecklaces and their interaction modes.

段）の回折パターンを示した．これらの結果は，Fig.の一定方向から入り込み，分子ネックレスの沈殿物2 の沈殿物が，PEG 化インスリン中の PEG 鎖を優を形成するものと考えられる．Fig. 4 に示すように，位に包接した筒型構造の複合体，すなわち CyD 分子

PEG 誘導体の水溶液に a-CyD 水溶液を添加してもネックレスであることを示唆した．また，ここには分子ネックレスの沈殿物は観察されなかったのに対示していないが，CyD 分子ネックレス形成の確認をし，g-CyD 水溶液を添加すると，速やかに沈殿物が1析出した．a-CyD と同様，g-CyD も嵩高い官能基を

H-NMR スペクトルや FT-IR スペクトルにおいても3）貫通するのは困難なことから，この沈殿物は分子内確認している ．
さらに，PEG 化インスリン中の PEG 鎖 1 本に対1分子ネックレスに由来するものと考えられる．これする CyD の貫通数を，PEG 鎖と CyD の H-NMR

らの結果は，g-CyD が PEG と分子内分子ネックレス ペ ク ト ル の 積 分 値 の 比 か ら 算 出 し た と こ ろ，スを形成することを示唆する．

a-CyD 数 は 約 20，g-CyD は 約 10 と g-CyD 数 が以上の結果より，a-CyD は PEG 化インスリンのa-CyD 数の約半分となった ．この結果は，a-CyD

PEG 鎖 1 本を，g-CyD は PEG 鎖 2 本を包接し，そが PEG 化インスリンの PEG 鎖 1 本と分子ネックレ

れぞれ六方晶系および正方晶系筒型構造の分子ネッスを形成するのに対し，g-CyD は PEG 鎖 2 本と分クレスを形成することが示唆された．さらに，g-CyD子ネックレスを形成することを示唆している（Fig.

は，分子間のみならず，分子内分子ネックレスも形

2）．

成可能なことが示唆された．

3）

Fig. 2 に示すように，g-CyD は 2 分子の PEG 鎖を包接した分子間分子ネックレスと，1 分子の折れ曲がった PEG 鎖を包接した分子内分子ネックレス

4．PEG 化インスリン /CyD 分子ネックレスの持続性製剤としての有用性の評価を形成することが予想される．しかし，これまで分

Fig. 5 はリン酸緩衝液中における CyD 分子ネック

子内分子ネックレスの形成を示唆する検討はほとん

レスからの PEG 化インスリンの放出挙動を示す．

ど報告されていない．そこで，PEG 鎖の両末端に嵩PEG 化インスリン単独はリン酸緩衝液に速やかに高い官能基を導入した PEG 誘導体を調製し，g-CyD溶解したが，CyD 分子ネックレスからの PEG 化イとの分子ネックレス形成の可否を確認した．すなわ

ンスリンの放出は著しく抑制された．さらに，そのち，CyDs は PEG 誘導体に貫通できず分子ネックレ

放出速度は CyDs の種類により異なり，g-CyD 分子スを形成できないのに対し，g-CyD が分子内分子ネネックレス＞a-CyD 分子ネックレスの順に遅延しックレスを形成可能であれば，折れ曲がった PEG 鎖た．これは，PEG 鎖と g-CyD との相互作用が a-CyD

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に比べて弱いことや，正方晶系筒型複合体の溶解速を選択し，検討を行った．また，CyD 分子ネックレ度が六方晶系筒型複合体に比べて速いことに起因す

スの沈殿物をリン酸緩衝液のみで希釈すると，PEG5）るものと考えられる ．また，PEG 化インスリンの化インスリンと CyD に解離するため，その希釈溶媒放出速度は，溶出溶媒量の減少や溶媒中の遊離 CyDsとして g-CyD（232 mg/mL）含有溶液を用いた．

濃度の増大により遅延した 3）．これは，CyD 分子ネ

Fig. 6A に示すように，インスリンや PEG 化インスックレスの解離が抑制されたことによるものと考えリン単独を皮下投与すると，血漿中インスリン濃度られる．以上の結果から，CyD 分子ネックレスはは 15 分〜30 分以内に最高血漿中濃度（Cmax）に達PEG 化インスリンの放出を抑制し，その放出速度はし，その後速やかに低下した．一方，g-CyD 分子ネ

CyDs の種類により制御可能なことが示唆された．

ックレスは投与後約 78 分で Cmax を示し，その後もFig. 6 は，PEG 化インスリン /CyD 分子ネックレ

有意に高い血漿中インスリン濃度を維持した．また，ス（3.7 U/kg）をラット背部皮下に投与後の血漿中Fig. 6 B に示すように，g-CyD 分子ネックレスは，インスリン濃度および血糖降下作用を示す．なお，

インスリンや PEG 化インスリン単独に比べ，著しインスリンは長期投与される製剤であるため，a-CyD

く血糖降下作用を持続させ，血糖値 時間曲線下面積に比べ生体適合性に優れる g-CyD の分子ネックレス（AUCG）も増大させた．PEG 化インスリンの吸収性や効果が増大した理由として，g-CyD 分子ネックレス化による皮下組織での酵素安定性の向上が考えられた 4）．
さらに，PEG 化インスリン /g-CyD 分子ネックレ
スは，①市販の持続性インスリン製剤に比べ，有意に血糖降下作用を持続すること，②皮下投与する際の希釈溶媒中の g-CyD 濃度を調節することにより，その解離速度（放出速度）を制御可能なことが確かめられたため 3），制御放出可能な持続性製剤として有用であると考えられる．

Fig. 5.

In vitro release profiles of PEGylated insulin
from CyD molecular necklaces1) in phosphatebuffer (pH 7.4,1.0 mL) at 37˚C.
○: a-CyD molecular necklace, ●: g-CyD molecular necklace, △: PEGylated insulin alone.
Each point represents the mean±S.E. of 3
experiments.
1) The amount of PEGylated insulin was 0.1mmol.

5．おわりにCyD 分子ネックレスが大阪大学の原田らによって報告されて以来，多分野に渡り，その応用に関する研究が行われている．本研究で示した分子ネックレスによる PEG 化タンパク質の持続放出

Fig. 6. Plasma levels of insulin (A) and glucose (B) after subcutaneous administrations of insulin 2 U/kg (◇), PEGylated insulin 3.7 U/kg (△) and its
g-CyD molecular necklace1) 3.7 U/kg (●) to rats.
Each point represents the mean±S.E. of 4–10 experiments. *, p＜0.05
versus insulin. , p＜0.05 versus PEGylated insulin. 1) g-CyD molecularnecklace was diluted with 232 mg/mLg-CyD solution.
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明教授

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システムは，①調製が簡便であり，高収率である，を表します．また，本稿を執筆するにあたり，ご協②有機溶媒を用いないため，安全性や製造適性に優力を賜りました大正製薬株式会社の明戸孝夫氏，恒れる，③ CyDs の安全性は確立されており，臨床使成嘉伸氏，大橋隆文氏に深く感謝の意を表します．

用例も多い，④ CyDs は比較的安価である，⑤理論

最後に，私の学生生活を温かく見守って頂いた家族上全ての PEG 化化合物（低分子薬物，DDS 担体なに感謝致します．

ど）に適用可能である，などの理由から極めて実用引性に富む DDS 技術であると考えられる．また，今回は紙面の都合上割愛したが，筆者らは，g-CyD が難水溶性薬物のコエンザイム Q10 と分子ネックレス様超分子複合体を形成し，経口投与による吸収性や親水軟膏からの放出性を改善することを報告している．さらに，熊本大学製剤設計学研究室や崇城大学製剤学研究室では，分子ネックレスの DDS への応用を更に拡大・発展させるとともに，新たな有効利用方法を展開している．このように，CyD 分子ネックレスは，そのユニークな構造のみならず，機能性の面においても， 魅せるDDS 技術として今後の発展が期待される．
本研究を行うに際して，終始御懇篤なる御指導と御鞭撻を賜りました有馬英俊教授，上釜兼人教授，平山文俊教授に深甚なる感謝の意を表すとともに，有益なる御助言と御協力を賜りました熊本大学の先生方，先輩方，後輩方，同期の皆様に深く感謝の意

用文献1) 東 大志, 有馬英俊, シクロデキストリンを用いた難水溶性薬物の溶解性改善に関する最近の話題, ファルマシア, 42, 1005–1010 (2006).
2) T. Higashi, F. Hirayama, H. Arima, K. Uekama,
Polypseudorotaxanes of pegylated insulin withcyclodextrins: Application to sustained releasesystem, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17, 1871–1874(2007).
3) T. Higashi, F. Hirayama, S. Misumi, H. Arima, K.
Uekama, Design and evaluation of polypseudorotaxanes of pegylated insulin with cyclodextrins
as sustained release system, Biomaterials, 29,3866–3871 (2008).
4) T. Higashi, F. Hirayama, S. Misumi, K. Motoyama,
H. Arima, K. Uekama, Polypseudorotaxane formation of randomly-pegylated insulin with cyclodextrins: Slow release and resistance to enzymatic degradation, Chem. Pharm. Bull., 57, 541–544(2009).
5) T. Higashi, F. Hirayama, S. Yamashita, S. Misumi,
H. Arima, K. Uekama, Slow-release system of pegylated lysozyme utilizing formation of polypseudorotaxanes with cyclodextrins, Int. J. Pharm.,
374, 26–32 (2009).

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