弊社のタンパク質マイクロアレイについて✔ ガラス基板を使用✔ 2 色法を採用
同一アレイ上のサンプル間比較はもとより、異なるアレイ間の比較解析も可能✔ Nature Methods (5: 1011-1017, 2008) の方法を基に開発した技術
タンパク質マイクロアレイ染色図1

スポット検出と蛍光強度について取得するデータ
・Green Intensity

レファレンス抗体由来の蛍光強度
F532 Median – B532

・スキャナーでスポットを自動認識・手動で補正

・Red Intensity

サンプル由来の蛍光強度
F635 Median – B635

・Median of Ratios

緑色と赤色の蛍光強度の比の中央値※ Median: スポット内のピクセル毎の蛍光強度の中央値
F532, F635: (Fluorescent)532, 635 nmにおける蛍光強度
B532, B635: (Background)
スポット周辺の532, 635 nmにおける蛍光強度

データを取得できないスポット
・シグナルが非常に弱く鮮明でないスポット
・スポッティング不良・バックグラウンドの蛍光が強く、Median of Ratios
が異常値となったスポット(F532 Median – B532, F635 Median – B635の異常値)

・ゴミが付着したスポット

データを取得できなかったスポットは欠損値 (0) として処理2

Median of Ratiosについて
スポット_1

スポット_2・大きいスポット

スポット_3・小さいスポット・ノイズが重なっているスポット

測定データ

Median ofRatiosを用いて解析【ピクセル毎に測定】【蛍光値の比率の分布】【蛍光値の比率の分布】【蛍光値の比率の分布】

Median of Ratios

Ratio【ピクセル毎に測定】

Ratio

ピクセル毎の蛍光値の比率を算出【ピクセル毎に測定】

Ratio

ピクセル毎の蛍光値を算出

Median of Ratios
ピクセルノイズを除く

Median of Ratios
ピクセルピクセル

3サンプルとレファレンス抗体の比
log ratio = log2= log2 (sample)

samplereference Ab

samplereference Ab

頻度＆- log2 (reference Ab)

対数比（蛍光強度）

4

解析データとデータの解説【18K抗原マイクロアレイ】 タンパク質マイクロアレイを用いた血中自己抗体プロファイリング
免疫グロブリンのクラス: ヒトIgG
データセット: 18K（18,429スポット）ヒトタンパク質

表の見方
・各行はマイクロアレイ上のスポットをあらわし、1行が1種類のヒト抗原タンパク質（遺伝子）に対応します
・列「Array 1」は、ネガティブコントロール （NC） としてサンプルを加えず、レファレンス抗体とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「Array 2」は、レファレンス抗体、各サンプル（ヒト血清）とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「2次比」の数値は、ネガティブコントロール（NC）との相対比で、各サンプル（ヒト血清）由来の反応の強さを示します

用語の説明

染色条件

Green Intensity:

レファレンス抗体とその2次抗体由来の緑色の蛍光強度

アレイフォーマット:

18K抗原マイクロアレイ（ヒトタンパク質）

Red Intensity:

サンプルとその2次抗体由来の赤色の蛍光強度

サンプル:

ヒト血清

Median of Ratios:緑色の蛍光強度と赤色の蛍光強度の比の中央値

レファレンス抗体:

Goat Reference Antibody Mixture I

Raw Data:

演算を加えていない生データ

2次抗体（Red）:

Alexa Fluor 647 anti-Human IgG antibody

Normalized Data:

アレイ間の比較のために正規化したデータ

2次抗体（Green）:

Cy3 anti-Goat IgG antibody

2次比:

アレイ間の相対比データ ※ネガティブコントロール（NC）との相対比

搭載ヒト抗原タンパク質情報
Gene ID

Gene nameMutation

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

2[A1BG]

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

3[A1CF]29974 APOBEC1 complementation factor

標準型

𝐴𝐴: レファレンス抗体（緑色）のピクセルごとの蛍光強度の中央値
4 𝑖𝑖 [A2M]
2 alpha-2-macroglobulin
標準型
5[A2ML1]144568 alpha-2-macroglobulin like 1
標準型
𝐵𝐵𝑖𝑖 : サンプル（赤色）のピクセルごとの蛍光強度の中央値

𝐶𝐶𝑖𝑖 : ピクセルごとに緑と赤の比率を算出した後の比率の中央値※

Array 1Array 2

Array 1NCSample1

NC237

Raw

Normalized

2次比

Array 2

Array 1Array 2

Array 1Array 2 Array 2/1

Sample1NC

Sample1NC

Sample1 Sample1

0.77-0.31

3.92

4.23-0.24

2.64

2.91

0.27-0.31

1.80

2.84

1.04

5.37

0.05

8.52

8.47

408
587
416
194
0.01
-1.65
5.01
1.50
※ Medianof Ratios(𝐶𝐶𝑖𝑖 )は、𝐵𝐵
𝑖𝑖 を𝐴𝐴𝑖𝑖 で割った値ではない-3.5154

𝐴𝐴𝑖𝑖 81320228Median of Ratios (Log2)

951092944381

177

𝐵𝐵𝑖𝑖 39-812263

𝐵𝐵𝑖𝑖𝐶𝐶𝑖𝑖 ≠ log 2 ( )𝐴𝐴𝑖𝑖-5.31=[A1BG]

F635 Median- B635=

Gene symbol

1Red Intensity

F532 Median- B532=

#Green Intensity-2.36

𝐶𝐶-3.20𝑖𝑖-4.95

例) −5.31 ≠ log 2 (4)237

5正規化について・振れ幅の大きい上下各16%を除いた中央68%の値から平均値を算出
・各タンパク質の値と前述の平均値の差を算出
全体の形を整えた上でサンプル間比較′

𝑋𝑋 = 𝑋𝑋 − 𝜇𝜇

𝑋𝑋: 変数𝜇𝜇: 平均値

平均をひく

𝑋𝑋 − 𝜇𝜇※ 標準偏差で補正するZ-score (𝑍𝑍 =)では検体間のばらつきが大きくなる傾向があります。
𝜎𝜎
このため、弊社では平均値を使用したGlobal normalization (𝑋𝑋 ′ = 𝑋𝑋 − 𝜇𝜇)を採用しています。

6Global normalizationとZ-Score【正規化】
Global normalization

Z-score各スポットの値と平均値の差各スポットの値と平均値の差を標準偏差で割る

𝑋𝑋 ′= 𝑋𝑋 − 𝜇𝜇

𝑋𝑋: 変数𝜇𝜇: 平均値

𝑋𝑋 − 𝜇𝜇
𝑍𝑍 =𝜎𝜎𝑋𝑋: 変数𝜇𝜇: 平均値
𝜎𝜎: 標準偏差

正規化には様々な方法があり、目的にあった方法を選択する必要がある。
弊社の正規化方法
弊社では下記の理由からGlobal normalizationを採用しています。
・ 抗体の反応がなくとも各スポットの値にはマイクロアレイ間でばらつきがある。
・ 標準偏差で補正（Z-score）をかけた場合、上記のばらつきが大きくなる傾向にある。
⇒ 結果的にマイクロアレイ間（検体間）のばらつきも大きくなる。
・ Z-scoreを使用することで陽性判定のための閾値が検体によってばらつく。
⇒ 検体間の比較解析が難しくなる。

7

解析データとデータの解説【18K抗原マイクロアレイ】 タンパク質マイクロアレイを用いた血中自己抗体プロファイリング
免疫グロブリンのクラス: ヒトIgG
データセット: 18K（18,429スポット）ヒトタンパク質

表の見方
・各行はマイクロアレイ上のスポットをあらわし、1行が1種類のヒト抗原タンパク質（遺伝子）に対応します
・列「Array 1」は、ネガティブコントロール （NC） としてサンプルを加えず、レファレンス抗体とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「Array 2」は、レファレンス抗体、各サンプル（ヒト血清）とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「2次比」の数値は、ネガティブコントロール（NC）との相対比で、各サンプル（ヒト血清）由来の反応の強さを示します

用語の説明

染色条件

Green Intensity:

レファレンス抗体とその2次抗体由来の緑色の蛍光強度

アレイフォーマット:

18K抗原マイクロアレイ（ヒトタンパク質）

Red Intensity:

サンプルとその2次抗体由来の赤色の蛍光強度

サンプル:

ヒト血清

Median of Ratios:

緑色の蛍光強度と赤色の蛍光強度の比の中央値

レファレンス抗体:

Goat Reference Antibody Mixture I

Raw Data:

演算を加えていない生データ

2次抗体（Red）:

Alexa Fluor 647 anti-Human IgG antibody

Normalized Data:

アレイ間の比較のために正規化したデータ

2次抗体（Green）:

Cy3 anti-Goat IgG antibody

2次比:

アレイ間の相対比データ ※ネガティブコントロール（NC）との相対比

搭載ヒト抗原タンパク質情報
Gene ID

Gene nameMutation

Green Intensity

Red Intensity

F532 Median- B532F635 Median- B635Array 1Array 2

Array 1NC

Sample1

NC

Median of Ratios (Log2)
Raw

Normalized

2次比

Array 2

Array 1Array 2

Array 1Array 2 Array 2/1

Sample1NC

Sample1NCSample1 Sample1[A1BG]

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

237

228

4381-5.31

0.77-0.31

3.92

4.23

2

[A1BG]

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

5495

177-2.36-0.24

2.64

2.91

0.27

3

[A1CF]

標準型

81109

2.84

1.04

4

[A2M]

標準型

320294

0.05

8.52

8.47

5

[A2ML1]144568 alpha-2-macroglobulin like 1
標準型
アレイごとにスポットの値と平均値の偏差を算出

408

587

5.01

1.50

-3.51

29974 APOBEC1 complementation factor

Normalizeddata
2 alpha-2-macroglobulin例） -0.31 = -5.31 – (-5.00)-8912263416194𝑋𝑋-3.20
𝑖𝑖-4.95…

𝑋𝑋𝑋𝑖𝑖 = 𝑋𝑋𝑖𝑖 − 𝜇𝜇

平均値 𝜇𝜇30.01-0.31
5.37-1.65=

Gene symbol

1=#𝑋𝑋𝑋1.80
𝑖𝑖8解析データとデータの解説【18K抗原マイクロアレイ】 タンパク質マイクロアレイを用いた血中自己抗体プロファイリング
免疫グロブリンのクラス: ヒトIgG
データセット: 18K（18,429スポット）ヒトタンパク質

表の見方
・各行はマイクロアレイ上のスポットをあらわし、1行が1種類のヒト抗原タンパク質（遺伝子）に対応します
・列「Array 1」は、ネガティブコントロール （NC） としてサンプルを加えず、レファレンス抗体とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「Array 2」は、レファレンス抗体、各サンプル（ヒト血清）とそれぞれの2次抗体を使って染色して得られたデータです
・列「2次比」の数値は、ネガティブコントロール（NC）との相対比で、各サンプル（ヒト血清）由来の反応の強さを示します

用語の説明

染色条件Green Intensity:

レファレンス抗体とその2次抗体由来の緑色の蛍光強度

アレイフォーマット:

18K抗原マイクロアレイ（ヒトタンパク質）

Red Intensity:

サンプルとその2次抗体由来の赤色の蛍光強度

サンプル:

ヒト血清

Median of Ratios:

緑色の蛍光強度と赤色の蛍光強度の比の中央値

レファレンス抗体:

Goat Reference Antibody Mixture I

Raw Data:

演算を加えていない生データ

2次抗体（Red）:

Alexa Fluor 647 anti-Human IgG antibody

Normalized Data:

アレイ間の比較のために正規化したデータ

2次抗体（Green）:

Cy3 anti-Goat IgG antibody

2次比:

アレイ間の相対比データ ※ネガティブコントロール（NC）との相対比

搭載ヒト抗原タンパク質情報
Gene ID

Gene nameMutation

Green Intensity

Red Intensity

F532 Median- B532

F635 Median- B635

Array 1Array 2

Array 1NC

Sample1

NCMedian of Ratios (Log2)
Raw

Normalized

Array 2

Array 1Array 2

Array 1Array 2 Array 2/1

Sample1NC

Sample1NC

Sample1 Sample1

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

237

228

4381-5.310.77

2[A1BG]

1 alpha-1-B glycoprotein

標準型

5495

177-2.36-0.24

3[A1CF]

標準型

81

109

3-8-3.20-0.31

4

[A2M]

2 alpha-2-macroglobulin

標準型

320294912263

-4.95

5.37

5

[A2ML1]144568 alpha-2-macroglobulin like 1408

587416

194

0.01-1.65

二次比

標準型
SampleとNCの差を算出

𝐶𝐶𝑖𝑖 = 𝐵𝐵𝑖𝑖 − 𝐴𝐴𝑖𝑖例） 4.23 = 3.92 – (-0.31)

-0.31
2.64

𝐴𝐴1.80
𝑖𝑖
0.05
5.01

3.92
2.91

𝐵𝐵2.84𝑖𝑖

4.23=[A1BG]=

Gene symbol

1=#29974 APOBEC1 complementation factor

2次比

0.27

𝐶𝐶𝑖𝑖1.04

8.52

8.47

1.50

-3.51

9

正規化データと二次比データについて二次比データのヒストグラム

被験サンプルが結合したスポット

2,000

Frequency

Median of ratios (Log2) in AB

正規化データの散布図

被験サンプルが結合したスポット
1,000

回帰直線
0-8

Median of ratios (Log2) in NC

NC: ネガティブコントロール（レファレンス抗体のみで染色）
AB: 被験サンプル

大部分のスポットが回帰直線近傍に分布
Y軸の+側に移行したスポットが被験サンプルが結合しているスポット-4048Median of ratios (Log2)

二次比データ:Median of ratios (Log2) in AB - Median of ratios (Log2) in NC

大部分のスポットが0付近に分布+側に大きく移動したスポットが被験サンプルが結合しているスポット

10

データ解析のまとめ
スポットの検出

正規化

2次比

解析

解析

解析

・スキャナーでスポットを自動認識
・手動で補正・Median of Ratiosをスポットの値として解析

・振れ幅の大きい上下各16%を除いた
中央68%の値から平均値を算出
・各タンパク質の値と前述の平均値の差を算出

・各スポットについてサンプルの測定値(AB)とネガティブコントロール(NC)の測定値の差を算出（底2の対数に変換し、以降の解析に使用）

𝑋𝑋 ′ = 𝑋𝑋 − 𝜇𝜇

𝑋𝑋: 変数𝜇𝜇: 平均値（対数値なので割り算）

Median of ratios (Log2) in AB- Median of ratios (Log2) in NC

解析対象

解析対象

・スキャナーで認識されたスポット（スポットの検出と同一）

・サンプル、ネガティブコントロールともに検出できたスポット

欠損値

欠損値

欠損値

・スキャナーで認識されなかったスポット
・バックグラウンドの蛍光が強く、Medianof Ratiosが異常値となったスポット（スポットの検出から増減なし）

・サンプル、またはネガティブコントロールのいずれかが検出できなかったスポット（対数値で0となったスポットは欠損値と分けて解析）

欠損値 (0) として取扱い

解析対象

欠損値 (0) として取扱い
11

解析例
抗体の評価

体液中の抗体プロファイリング

・抗体の抗原への結合・交差反応を検証

・全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、涙液、乳汁、精液などに含まれる抗体のプロファイルを取得

・抗原未知の抗体の抗原探索・疾患に特異的な抗体（疾患マーカー）の探索

交差性評価

抗体検査

・抗体の交差反応性を評価【実施例】
市販抗体の結合性、並びに交差反応性評価
標的タンパク質

抗体プロファイリング

・任意の値以上のスコアのタンパク質を抽出

・サンプル間や群間で差が大きいタンパク質を抽出

・標的タンパク質に対する抗体の有無を評価

・クラスタ分析（階層的クラスタリング）や多群比較など【実施例】
新型コロナウイルス感染症回復者の血中抗体評価

目的に合わせ様々な解析が可能【クラスタ分析】・ サンプル間のユークリッド距離を算出

d(a,b) = (a1−b1)2+(a2−b2)2+…+(an−bn)2
・ クラスター間の距離を群平均法で算出
クラスター (𝑋𝑋, 𝑌𝑌) の中から、データを一つずつ選択 (𝑋𝑋𝑖𝑖 , 𝑌𝑌𝑗𝑗 )距離 {d(𝑋𝑋𝑖𝑖 , 𝑌𝑌𝑗𝑗 )} の平均値をクラスター間の距離として採用

d(X,Y) =𝑛𝑛𝑚𝑚

1
� � 𝑑𝑑(𝑋𝑋𝑖𝑖 , 𝑌𝑌𝑗𝑗 )𝑛𝑛𝑛𝑛
𝑖𝑖=1 𝑗𝑗=1

サンプル、クラスター間の距離により階層化【多群比較】
・ コントロール群で変動が小さく、解析対象群で変動が大きいタンパク質を抽出
・Turkey法により群間の違いを解析

12