薬 剤 学, 72 (2), 101‑105 (2012)≪若手研究者紹介≫

生体膜リン脂質研究による疾患発症メカニズム解明
森田真也*

Shin-ya Morita

滋賀医科大学医学部附属病院薬剤部

1.

はじめいることが，近年しだいに明らかとなってきた．に

筆者は，これまで 5 つの研究室において研究に従リン脂質とは，親水性のリン酸頭部基と疎水性の事してきたが，それぞれにおいてアプローチの方法アシル鎖領域を持つ両親媒性化合物の総称であり，は違えど，一貫して「生体膜」に関わる研究を行っ細胞膜の主要構成成分である．リン脂質二分子膜でてきた．本稿では，筆者のこれまでの研究についてある細胞膜は，細胞外環境と細胞内環境を分け隔て順を追って紹介させていただく．筆者が最初に研究る働きをし，細胞内オルガネラを形成するためにも生活をスタートさせたのは，大学 4 年次に配属され必須であることから，細胞膜なくしては生命の誕生た京都大学医学部附属病院薬剤部研究室（医療薬剤もあり得なかったと考えられる．また，哺乳類の血学分野）において，乾賢一教授（現京都薬科大学学中に存在するリポタンパクでは，コレステロールや長）と矢野育子助手（現京都大学大学院薬学研究科

トリグリセライドを包み込むようにリン脂質単分子准教授）の指導のもとであった．卒業研究では，抗膜が表面を覆っている．リン脂質は，構造上，グリ癌薬シスプラチンによって惹起される腎毒性の有機セロール骨格を持つグリセロリン脂質とスフィンゴアニオントランスポーターを介した薬物腎排泄に及シン骨格を持つスフィンゴリン脂質の 2 種類に大別

ぼす影響に関する研究を行った．残念ながら 1 年間される．グリセロリン脂質は，極性頭部基の種類にの研究では，シスプラチンがトランスポーターの機よりホスファチジルコリン（PC）
・ホスファチジル能を低下させるメカニズムを解明することはできな

エタノールアミン（PE）
・ホスファチジルセリン・かったが，そのときに指導していただいた研究に対ホスファチジン酸（PA）
・ホスファチジルイノシトする姿勢や実験の組み立て方・データのまとめ方・ール・ホスファチジルグリセロールなどのクラスに論文の書き方といった研究の基礎となる部分は，現分別される．さらにこれらのリン脂質は，結合して在においても研究活動の柱となっている．

いる 2 本のアシル鎖の炭素数および二重結合数の違いにより，分子種は数千種にもなる．また，結合し2.

リポタンパク中のスフィンゴミエリンと動脈硬化の発生 1）ているアシル鎖が 1 本のみのリゾリン脂質も存在している．これらのリン脂質は，細胞膜を形成する構大学卒業後，京都大学大学院薬学研究科に進学し，造的役割に加え，さまざまな膜タンパク質の活性や製剤機能解析学分野にて半田哲郎教授（現鈴鹿医療局在を調節する働きや，受容体のリガンドとして細科学大学教授）の指導のもと，リポタンパク中のス胞内シグナル伝達において極めて重要な役割をしてフィンゴミエリン（SM）と高脂血症や動脈硬化の関係についての研究を，物理化学的手法を駆使して*2000 年 3 月京都大学薬学部卒業．2005 年 3 月京都大学大学院薬学研究科博士後期課程修了（薬学博士）．
2004 年 4 月〜2006 年 9 月日本学術振興会特別研究員．
2006 年 10 月神戸薬科大学助手．2007 年 4 月同助教．
2010 年 4 月同講師．2011 年 4 月滋賀医科大学医学部附属病院准教授．連絡先：〒520–2192 滋賀県大津市
瀬田月輪町 E-mail: smorita@belle.shiga-med.ac.jp

行った．
リポタンパクの構造として，トリグリセライドやコレステリルエステルで構成される疎水性コアを両親媒性のリン脂質や遊離コレステロールが取り囲み，その表面にさまざまなアポリポタンパクが結合薬 剤 学 Vol. 72, No. 2 (2012)

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12/02/03 15:18図 1 脂質エマルション粒子の構造
疎水性のコア脂質（トリグリセライド）を，両親媒性のリン脂質であるホスファチジルコリン（PC）とスフィンゴミエリン（SM）により形成された単分子膜が取り囲んでいる．

している．疎水性のコア脂質と両親媒性の表面膜脂質で構成される脂質エマルション粒子は，リポタンパクのモデル粒子として用いられている（図 1）．

図 2 SMase によるマクロファージ泡沫細胞化
動 脈 内 皮 下 に お い て， ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ナ ー ゼ（SMase）の作用により低密度リポタンパク（LDL）粒子中にセラミドが産生する．この変性した LDL を，マクロファージが LDL 受容体関連タンパク（LRP）とヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を介して大量に取り込むことにより，泡沫細胞へと変化する．

スフィンゴリン脂質の一種である SM は，PC とともにリポタンパク表面を形成する主要なリン脂質

SMase は，リポタンパク中の SM を加水分解し，リである．肝臓から分泌された超低密度リポタンパク

ポタンパクの凝集とマクロファージの泡沫細胞化を（VLDL）は，血中を循環しているうちにリポタンパ促進することが知られていたが，詳細なメカニズムクリパーゼにより分解され，より小さいサイズの低は分かっていなかった．そこで，エマルション粒子

密度リポタンパク（LDL）へと変化し，最終的には再を用い，SMase が J774 マクロファージによる取りび肝細胞へ取り込まれる．リポタンパク粒子表面に込みに与える影響を評価した．その結果，SMase が結合したアポリポタンパク E（apoE）
は，細胞表面の粒子中の SM を分解すると，アポリポタンパク非存

LDL 受容体や LDL 受容体関連タンパク（LRP），ヘ在下でもエマルション粒子の HSPG と LRP を介しパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）に結合し，リたマクロファージへの取り込みが促進されることがポタンパクの肝臓への取り込みを促進する．VLDL示された．また，SMase が存在していなくても，エ中の SM は，血中のリポタンパクリパーゼで分解さマルション粒子中にセラミドが含まれることでマクれないため，LDL 中で濃縮される．リポタンパク粒ロファージへの取り込みが増加した．そして，セラ子中の SM の役割を明らかにするため，SM を含むミド含有エマルションでは，apoE の結合が増加すエマルション粒子を調製し，肝癌細胞由来 HepG2ることにより，マクロファージへの取り込みはさら細胞への取り込みについて評価を行った．
その結果，に促進された．また，流動相あるいはゲル相に分布エマルション粒子表面の SM によって，apoE の結しやすい 2 種類の蛍光プローブ（BODIPY-PC，DiI-合が減少し，HSPG や LRP を介した細胞への取りC18）を含むエマルションの共焦点顕微鏡観察によ込みが低下した．SM は，スフィンゴシン骨格の水り，エマルション粒子中のセラミドは三次元のマイ素結合と飽和アシル鎖により粒子表面膜のパッキンクロドメインを形成していることが明らかになっグを強め，水和度を低下させることにより，apoE のた．これらのことから，SMase によるセラミドの産脂質粒子への結合を抑制し，細胞取り込みを減少さ

生は，リポタンパクの HSPG や LRP を介したマクせていることを明らかにした．以上のことから，リロファージの取り込みを促進し，泡沫細胞形成に関

ポタンパク粒子表面の SM は，リポタンパクの肝細わることが明らかとなった．そして，セラミドは，胞への取り込みを減少させることにより血中からの動脈硬化発生性分子として働くことを突き止めた

消失を遅らせ，高脂血症を導くと考えられる．

（図 2）．

スフィンゴミエリナーゼ（SMase）は，SM を分

これらの研究を通じて，リン脂質の物理化学的性解し，セラミドを生成させる．動脈内皮下において，質を学べたことが，現在の研究においても，細胞膜

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で起こる現象を分子レベルで感覚的にイメージする際に，大いに役立っていると自分では認識している．
3.

ABCB4 による胆汁酸依存的リン脂質排出 2）

学位取得後，日本学術振興会特別研究員（ポスドク）として京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻細胞生化学分野において植田和光教授の指導のもと，トランスポーター ABCB4 によるリン脂質排出メカニズムに関する研究に携わった．
ABC トランスポーターファミリーに属する ABCB4は，肝細胞の毛細胆管膜に発現しており，ABCB4の変異により胆汁鬱滞や胆石症が生じ，深刻な肝疾患となる．Abcb4 ノックアウトマウスでは，リン脂質を胆汁中に排出せず，門脈炎症と胆管障害が生じ，コレステロール胆石形成を進行させる．これらの肝障害は，胆汁酸の肝細胞や胆管細胞に対する毒性に

図 3 ABCB4 によるリン脂質排出メカニズム
モノマーの胆汁酸が，ABCB4 の基質結合部位へ拡散し，PC と結合する．ATP が加水分解され，PC は，胆汁酸と相互作用しながら，毛細胆管側へ移動する．胆汁酸 /PC 混合ミセルが形成され，毛細胆管内へと排出される．胆汁酸により，ABCB4 の基質結合部位から毛細胆管内への PC の移動に必要な活性化エネルギーが減少する．

よるものである．リン脂質は，胆汁酸と混合ミセルを形成することで，胆汁酸の界面活性作用から胆管あることが示された．ABCB1 の基質であるベラパ上皮を保護し，過剰なコレステロールを可溶化する．

ミルが，ABCB4 によるタウロコール酸依存的なリ

また，ABCB4 は，多剤耐性トランスポーターであン脂質の排出を完全に阻害したことから，ABCB1る ABCB1（P 糖タンパク）と非常に高いアミノ酸と ABCB4 の基質結合ドメインは，類似していると配列類似性（86%）を示すが，ABCB1 とは異なり，考えられた．また，質量分析により，タウロコール

ABCB4 の発現では多剤耐性は生じない．また，酸存在下で ABCB4 は，SM よりも PC を優先的にABCB1 も ABCB4 の機能を代替できない．しかし，排出していることが判明した．以上の知見から，図細胞レベルでの ABCB4 に関する研究は，非常に少3 に示した ABCB4 によるリン脂質排出モデルを構なく，ABCB4 によるリン脂質排出機構に関しては築した．これらのことから，ABCB4 は，胆汁酸存不明な点が多く残されていた．

在下で，肝細胞から毛細胆管中へのリン脂質の排出

そこで，筆者は，ABCB4 あるいは ABCB1 を安を行っており，胆汁形成ならびに脂質恒常性維持に定 発 現 す る HEK293 細 胞（HEK/ABCB4，HEK/おいて重要な役割を果たしていることを明らかにしABCB1）を遺伝子導入により樹立し，ABCB4 によた．

るリン脂質排出について検討を行った．その結果，

ポスドクとして研究に従事していた期間は，1 年

培地中へのリン脂質の排出は，HEK/ABCB4 細胞と半であり，長くはなかった．しかし，この間，分子HEK293 細胞や HEK/ABCB1 細胞との差はなかっ生物学を基礎からみっちりと学ぶことができ，中身た．しかし，0.5 mM（臨界ミセル濃度以下）のタウの濃い充実したものであった．

ロコール酸により，HEK/ABCB4 細胞からのリン脂質の排出が大きく増加した．一方，HEK293 細胞と4.

PEMT による細胞膜胆汁酸耐性の獲得 3, 4）

HEK/ABCB1 細胞では，このようなタウロコール酸

2006 年 10 月に，北河修治教授が主宰する神戸薬依存的なリン脂質の排出は見られなかった．他の胆科大学製剤学研究室に助手として着任した．ここで汁酸に関しても調べたところ，HEK/ABCB4 細胞かは，引き続き ABCB4 の脂質排出メカニズムの解明

らのリン脂質排出は，タウロコール酸＞グリココーに取り組むとともに，ホスファチジルエタノールアル酸＞コール酸の順であった．また，ABCB4 の ATPミンメチル基転移酵素（PEMT）の機能に関する研結合ドメインの変異体を用いた実験より，ABCB4究にも取りかかり始めた．

によるリン脂質の排出には，ATP 加水分解が必要でPC と PE は，哺乳類の細胞膜を構成する主要なリ薬 剤 学 Vol. 72, No. 2 (2012)

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ン脂質であり，PC は総リン脂質の 40〜50%，PE は20〜50% を占めている．PC 分子はシリンダー型であり，二分子膜の形成を促進する．一方，PE 分子は頭部基が小さなコーン型をしており，非二分子膜（ヘキサゴナル構造）の形成を促すことが知られている．全ての真核細胞において，PC は CDP-コリン経路により生合成される．哺乳類肝臓では，PC は，PEMT によっても合成される．PEMT は，肝細胞の小胞体に局在し，アデノシルメチオニンからメチル基を PE へ付加させ，PC を産生する．Pemt ノック
アウトマウスは，コリン欠乏食により肝不全へと導かれるが，Abcb4/Pemt ダブルノックアウトマウス
では，肝不全を逃れることが報告されている．正常

図 4 PEMT の構造
ホスファチジルエタノールアミンメチル基転移酵素（PEMT）は，小胞体膜に局在する 3 回膜貫通タンパクである．小胞体管腔内に存在し，高マンノース型糖鎖が付加している N 末端部位により，酵素活性と基質アシル鎖特異性が調節されている．

な肝臓では，ABCB4 により減少する PC を PEMTが補うことで細胞膜整合性を保っていることが予想

PK1 細胞を用いた．まず，細胞膜の脂質組成についされるため，筆者が PEMT に着目するに至った．て調べたところ，LLC-PK1/PEMT 細胞の細胞表面

筆者は，まず，PEMT のロングアイソフォーム

膜において PE と SM の割合が低下していることが（PEMT-L） あ る い は シ ョ ー ト ア イ ソ フ ォ ー ム

確認された．また，走査型電子顕微鏡観察により，（PEMT-S）を安定発現する HEK293 細胞を遺伝子

PEMT 発現により細胞表面の微絨毛が太くなってい導入により樹立し，PEMT の構造と機能に関する検ることが明らかとなった．そして，PEMT が細胞膜討を行った．PEMT-L は，PEMT-S と比べて，N 末の胆汁酸耐性に与える影響について調べたところ，端側が 37 アミノ酸残基長い．エンドグリコシダー

LLC-PK1/PEMT 細胞では，非抱合型胆汁酸（コーゼ H 処理により，PEMT-L の N 末端部位は，高マル酸，デオキシコール酸，ケノデオキシコール酸）

ンノース型糖鎖が付加し，小胞体管腔内に位置してに対する耐性は低下したが，抱合型胆汁酸（タウロいることが明らかとなった．また，PEMT-S は，コール酸，グリココール酸，タウロデオキシコール

PEMT-L よりも高い酵素活性を示した．次に，細胞酸，グリコデオキシコール酸，タウロケノデオキシ

内の PC と PE 量を調べたところ，
HEK/PEMT-L おコール酸，グリコケノデオキシコール酸）に対するよび HEK/PEMT-S 細胞で細胞内 PC 量は大きく増耐性は上昇した．この原因として，PEMT 発現によ加した．一方，細胞内 PE 量は，HEK/PEMT-L 細り，細胞表面のリン脂質組成ならびに微絨毛構造が胞では変化せず，HEK/PEMT-S 細胞でわずかに減変化したことが挙げられる．毛細胆管中の大半の胆少しただけであった．さらに，質量分析を用いるこ汁酸が抱合型として存在しているため，PEMT は，とにより，PEMT-S は長鎖多価不飽和 PC とエーテ

肝細胞の胆汁酸耐性獲得において重要な働きをしてル結合型 PC をより多く増加させ，PEMT-L は短鎖いると考えられる．

エーテル結合型 PC をより多く増加させていること

現在のところ，まだ，ABCB4 と PEMT の機能をが示された．これらの結果より，小胞体管腔内に局直接的に結びつける結果は得られていない．今後，在する PEMT の N 末端部位によって，酵素活性と肝細胞の胆汁酸耐性メカニズムを追究していくに基質アシル鎖特異性が調節されていることが示唆さは，ABCB4 と PEMT の両方が発現している細胞実れた（図 4）．

験系を構築することが必要である．

次に，ヒト肝臓で発現量が多い PEMT-S を安定発現する LLC-PK1 細胞（LLC-PK1/PEMT）を遺伝

5.

リン脂質酵素蛍光定量法の開発 3, 5）

子導入により樹立し，細胞の胆汁酸耐性に対する筆者は，リン脂質と疾患の関係性についての研究

PEMT 発現の影響を調べた．胆汁酸耐性には，頂側を行ってきていたが，これらの研究を遂行する際に，膜における微絨毛形成が重要であることから，LLC-適切なリン脂質定量法が無いことを常に不便に感じ

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の進歩につながると予想される．
6.
図 5 PA 酵素蛍光定量法の原理（1）ホスファチジン酸（PA）のリパーゼによるグリセロール 3-リン酸と脂肪酸への分解．（2）グリセロー
ル 3-リン酸酸化酵素による過酸化水素の発生．（3）アンプレックスレッドと過酸化水素の反応によるレゾルフィンの産生．最終的に産生したレゾルフィンの蛍光強度測定により，PA の濃度を求めることができる．

おわりに筆者は，研究を始めてからこれまでに，薬剤系・物理化学系・生化学系と異なる分野の研究室に身を置いてきた．短期的な視点で見ると，研究室が変わる際には，前の研究室ではやり残した研究があり，新しい研究室では慣れるのに時間が必要なため，データが出ない時期が少なからずとも生じてしまう．ていた．そこで，リン脂質クラスごとに高感度・高しかし，異なる分野を経験することで，実験手法を精度かつハイスループットに定量できる方法を構築習得できただけでなく，問題解決に対する考え方がすれば，脂質研究分野が飛躍的に発展するのではな

柔軟となり，研究テーマ設定の幅が広がったことが，いかと考え，リン脂質クラスの酵素蛍光定量法の網今後の活動における大きな利点となることを期待し羅的開発に着手した．酵素蛍光定量法とは，複数のている．そして，2011 年 4 月より，滋賀医科大学医

酵素反応を組み合わせることで，特定の分子から特学部附属病院薬剤部において寺田智祐教授のもと，異的に蛍光物質を生成させ，蛍光強度測定により定准教授として薬剤業務・教育・研究に取り組んでい量を行う方法である．近年，生体組織内に存在するる．基礎系研究室から臨床現場の近くで研究できる脂質分子を網羅的に分析するリピドミクスと称するようになったことを活かして，これまでのリン脂質研究分野が世界中で急速に広がっている．そのリピ研究を臨床に応用できるような形で研究を進めていドミクスの主流は質量分析によるもので，微量成分きたい．の検出や分子種の定性的解析には非常に有効である

本稿において紹介させていただきました研究は，が，すべてのアシル鎖を区別してしまうため，測定多くの関係者の皆様のご指導・ご協力のもとの成果ごとに膨大なデータが生じ，リン脂質クラスごとのであり，この場をお借りして深謝申し上げます．

定量には不向きである．一方，酵素蛍光法は，アシ引ル鎖の違いを検出することはできないが，各リン脂質クラスを定量するのに適している．酵素蛍光法と質量分析を組み合わせることで，リン脂質に関する完全な情報が得られることとなる．
これまでに，筆者は，さまざまな酵素活性を調節するシグナル伝達物質である PA およびリゾホスファチジン酸の酵素蛍光定量法の開発に成功し（図5），癌細胞の増殖に関わる PA 合成酵素ジアシルグリセロールキナーゼに対する阻害剤の探索に利用できることを実証した．次に，PC と PE の酵素蛍光法による定量を可能にしたことで，PEMT や ABCB4の機能に関する研究が大きく進展した．これらの酵
素蛍光法は，従来の方法と比べて非常に高感度（検出限界 10〜50 pmol）であり，必要な操作は，ピペットによる試料と反応液のマイクロプレートへの分注が主で，非常に簡便であり，定量に要する時間は短時間で，ハイスループット定量が可能である．現段階でとどまらず，酵素蛍光定量法でリン脂質クラ用

文献1) S. Y. Morita, M. Kawabe, A. Sakurai, K. Okuhira,A. Vertut-Doï, M. Nakano, T. Handa, Ceramide inlipid particles enhances heparan sulfate proteoglycan and low density lipoprotein receptor-related protein-mediated uptake by macrophages, J.
Biol. Chem., 279, 24355–24361 (2004).
2) S. Y. Morita, A. Kobayashi, Y. Takanezawa, N. Kioka, T. Handa, H. Arai, M. Matsuo, K. Ueda, Bilesalt-dependent efflux of cellular phospholipids
mediated by ATP binding cassette protein B4,Hepatology, 46, 188–199 (2007).
3) S. Y. Morita, A. Takeuchi, S. Kitagawa, Functional analysis of two isoforms of phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, Biochem. J., 432,387–398 (2010).
4) S. Y. Morita, N. Ikeda, M. Horikami, K. Soda, K.
Ishihara, R. Teraoka, T. Terada, S. Kitagawa, Effects of phosphatidylethanolamine N-methyltransferase on phospholipid composition, microvillus formation and bile salt resistance in LLCPK1 cells, FEBS J., 278, 4768–4781 (2011).
5) S. Y. Morita, K. Ueda, S. Kitagawa, Enzymatic
measurement of phosphatidic acid in cultured
cells, J. Lipid Res., 50, 1945–1952 (2009).

スの網羅的解析を可能にすることが，脂質研究分野
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