薬 剤 学, 75 (4), 221‑226 (2015)≪若手研究者紹介≫

アルブミン研究を通して感じたこと

異 島

優*

Yu Ishima

熊本大学薬学部薬剤学研究室

当時，新入りの学生は，試験管やビーカー等々の器

1．は じ め に具洗浄が朝から日が暮れるまで続いた（今の時代は2001 年当時，私は小田切優樹教授主宰の熊本大学これもパワハラに当たるのだろうか）．ビーカーやメ薬剤学研究室（現丸山徹教授）に入った．当研究室

スシリンダーなど，それぞれの器具に応じて洗い方

では，永きにわたり血清タンパク質であるアルブミが異なる．そのことを事細かに先輩から教えられ，ンや α1-酸性糖タンパク質の研究に取り組んでいた濯ぐ回数のあまりの多さに疲れを通り過ぎていたのが，そんなことは全く把握せずに，大学のサークルだろう，頭がおかしくなり，顔がニヤけ，手がフヤで準硬式野球部に所属していたという「ご縁」で，けた．それが数日間続いた．その後，先輩の実験補迷うことなくこの研究室に決めた．今思い返せば，助生活が始まった．研究室配属後に最初に指導して研究内容が好きだったのではなく，準硬式野球部の頂いた先輩は，極めて個性的な「The 体育会系」と先輩が多かったことや「体力さえあれば何とかなる」呼ぶべき M 先輩（本人に未許可であるため匿名にさという体育会系の雰囲気が好きだったのだろう．今せて頂く）であった（余談ではあるが，後にこの Mでもその感覚が抜けていないのか，飲み会での相手

先輩は，普通の Ph.D．を取得した人なら考えもしのグラスの量が半分を切ったらお酒を注ぐ癖や，注ない進路である「役者」への道に進まれ，今ではあがれる時に自分のグラスを空にする癖が直らないまの堀北真希さんとも映画共演するほどの素晴らしいまである．

役者になられている）．この M 先輩は，ものすごい実験量をこなされるため，いつも終わるのは深夜で2．研究生活のはじまりあった．だからと言って，次の日遅刻することは許物心ついた時から色々と実験（幼少の頃は「いたさなかった．この M 先輩は，実験がない日でも実験ずら」と言うべきかもしれない）が好きであった私室に立ち寄る．何かやり残した作業や出しっ放しにには，研究室という一日中実験できる環境は，まさしている器具がないか？ 器具を乾燥機に入れっぱに天国のような世界である…はずであった．研究室なしで元の棚に戻してないものがないか？…等々．に入って早々にラボの大掃除があったのだが，そのとにかく何事にも注意深く，他の実験者への配慮が行き届いていた．だからこそ，私が忙しさにかまけ*2007 年 3 月熊本大学大学院薬学教育部博士後期課程修了，博士（薬学）．同年，同大学薬学部の医薬高分子学の特任助教．2010 年，米国ピッツバーグ大学医学部・博士研究員を経て，2011 年，熊本大学薬学部・医療薬剤学・助教，2013 年より，次世代創薬研究者養成塾塾長を兼任．受賞歴は，日本 NO 学会 Young InvestigatorAward 最優秀賞（2009），日本 DDS 学会奨励賞（2014）．
研究キーワード：ドラッグデリバリーシステム，アルブミン，一酸化窒素．連絡先：〒862–0973 熊本市中央区
大江本町 5–1 E-mail: y-ishima@kumamoto-u.ac.jpて洗い物を洗わずに，洗い場に置きっぱなしにしていた時などは，よく「お説教」を頂いたものだった（未熟者の私は，あまりの M 先輩の厳しさに露骨に反抗する時期もあったと思う）．ただ，この M 先輩
は，お金がない時でもお昼ご飯に連れて行ってくれて，私に「ビックマックバーガーの L セット（コーラ付）」を買い，自分は「普通のハンバーガー 2 つ薬 剤 学 Vol. 75, No. 4 (2015)

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と水」を頼むようなお方だった（今思えば，よく後輩の分際で，私はビックマックを頼めたものだと思うが）．この M 先輩との研究生活が私の研究人生の幕開けであった．ここで，この時に取り組んだ HSA研究の紹介をさせて頂きたい．ヒト血清アルブミン（HSA）は，血清中に最も多く含まれる糖鎖を持たない単純タンパク質である．生体内において血漿膠質浸透圧の調節，脂肪酸，ビリルビン，尿毒症物質を始めとする内因性リガンド及び薬物などの外因性リガンドの輸送担体，酸化還元緩衝能，抗酸化作用及び酵素的作用（エステラーゼ様作用）など数多くの機能を有しているマルチな機能を持つタンパク質であることが知られているが，中でも，HSA の半減期が約 20 日と非常に血中滞溜性に優れている点は，
HSA をドラッグデリバリー担体として使用する利点として挙げられ，血中半減期の短い分子の滞溜性の向上にたびたび使用されている．このため，遺伝子融合技術を用いて半減期の短いタンパク質と HSA

図 1 卒業論文での最初の Figureとの融合タンパク質作製のための技術習得から始めることとなった．そこで，当研究室にて代々引き継熊本大学医学部の微生物学分野であった．その当時，がれている pichia 酵母を用いたタンパク質発現系の前田浩教授（現崇城大学 DDS 研究所特任教授）と技術を M 先輩に手取り足取り教えて頂いた．さら赤池孝章准教授（現東北大学医学部教授）の体制のに，今後 in vitro から in vivo の実験系になることに下，微生物関連から炎症・癌の領域に至るまで多岐伴い，必要なタンパク量が増加することが予想されにわたり素晴らしい業績をあげられていた．そしてたため，高収量発現系の構築を目的として，様々な私は，次の日からこの微生物学分野にお世話になる培養条件検討を同時に行った．その際私は，夜中一こととなった．どういう経緯で医学部微生物学分野

人で震盪培養機のフラスコの様子を眺めては，酵母への派遣が私になったかは未だに不明だが，この経の気持ちになって考えてみたりしていた．
『培地があ験がなければ，今の私はいなかったであろう．

まり撹拌されていないのでは？』とか，『培地の上にこの微生物学分野でまず取り組んだのは，S-二トある泡が酸素の供給を邪魔しているのでは？』と．

ロソ（SNO）化タンパク質の抗菌活性実験であった

こうした私の素人的考察に対しても，M 先輩は検討（この S-二トロソ化とは，一酸化窒素（NO）がシスしてみようと言って下さり，培養機の回転数を変えテイン残基の SH 基に付加反応した SNO 基のことたり，消泡剤を添加したり，さらには金魚用のエアである）．ここで少し，最初に取り組んだ NO 研究ーポンプを自費で買ってきては，お手製の空気注入の紹介をさせて頂くことにする．

器を火傷しながらもガラス細工で作成したりと，Mタンパク質の SNO 化体は，生体内における NO

先輩には私の知的好奇心を最大限育てて頂いたと心のリザーバーとして働くことが知られており，適材から感謝している．ちなみにその結果が，私の学士適所に NO を輸送する．中でも細菌に対しては，驚

卒業論文における思い出深い最初の Figure になっ異的な NO デリバリー効率を見せることから，まずた（図 1）．

この実験系から取り組んだ．すでに高い抗菌活性が確認されていた SNO-α1-アンチトリプシンをポジテ3．一酸化窒素との出会いィブコントロールとして，当薬剤学研究室ではなじ

修士課程の時に，小田切教授から突然「医学部にみ の 深 い タ ン パ ク 質 で あ る ヒ ト 血 清 ア ル ブミン連れて行くから」と言われ，教授と向かった先は，（HSA） の 34Cys の SNO 化 体 で あ る Mono-SNO-

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図2

内因的にも存在する Mono-SNO-HSA と多分子の NO を化学的に付加した Poly-SNO-HSAHSA の作製に着手した．その抗菌活性実験を始めた

測定した．しかし予想に反し，何度やっても Poly-

ところ，SNO-α1-アンチトリプシンには劣るものの，SNO-HSA の抗菌活性は，全く出ない．同じタンパ

Mono-SNO-HSA にも抗菌活性が存在することが分ク濃度にして試してみても，同じ NO 濃度にして試かった．その後，この研究をどう展開するか悩んだ．

してみても Poly-SNO-HSA には全く抗菌活性がな

す で に SNO-α1-ア ン チ ト リ プ シ ン と い う Mono-いのである．ちょうど時を同じくして，この Poly-SNO-HSA より優れた抗菌タンパク質があるのにSNO-HSA の抗腫瘍活性を検討するテーマが走って

Mono-SNO-HSA の抗菌活性を追求する意義はあるいたのだが，その結果は，なんと従来の Mono-SNO-のかという思いが募る一方，HSA から SNO-α1-ア

HSA とは比較にならないほど高い抗腫瘍活性が認めンチトリプシンに研究対象を乗り換えたときの罪悪られたのである．私は Poly-SNO-HSA の抗菌活性感？（HSA 研究に精を出している研究室にとってあがないという結果を踏まえ，色々と仮説を考察した．

るまじき行為と当時私は考え込んでいた）は，計り『Poly-SNO-HSA の SNO 基は，従来の SNO-HSA知れないことも感じていた．そこで，何とかしてとは異なり，表面に露出しているため，反応性が高SNO-α1-アンチトリプシンの抗菌活性を越えるスーい．しかし，それが仇となって，細菌が出す何かにパー SNO-HSA を作製してみようという発想に辿りよって，積極的に分解されているのではないか？』

着いた，『もしかすると 1 分子の HSA に多分子の『Poly-SNO-HSA の SNO 基の導入のために化学修飾

SNO 基を導入できれば，効率的な NO の輸送を可法を用いているが，その反応において Lys 残基のア能にし，強力な抗菌活性を示すかもしれない．』とミノ基が潰されている．そのために細菌との相互作（図 2）．早速，私は HSA の Lys 残基のアミノ基に用が低下し，逆に菌体内への NO 導入が阻害されたSH 基を導入する 2-イミノチオランを用いて SH 付のではないか？』と．実際，これら仮説を裏付ける加を行い，さらに SNO 基へ変換した．その結果，ためにたくさんの予備試験をした．その結果，Poly-

この化学修飾法を用いて作製した Poly-SNO-HSA のSNO-HSA は，細菌共存下で分解を受けること，なSNO 導入効率は，6.7 mol/mol HSA であり，従来のらびに Mono-SNO-HSA の抗菌活性発現には，自身

Mono-SNO-HSA（0.3 mol/mol HSA）の 20 倍以上の Lys 残基の陽電荷が菌体膜との相互作用に極めての付加効率に成功した．この Poly-SNO-HSA は物重要であることが示唆された（図 3）．この抗菌活性

理学的安定性も高く，ワクワクしながら抗菌活性をにおける Mono-SNO-HSA と Poly-SNO-HSA の違薬 剤 学 Vol. 75, No. 4 (2015)

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図3

Poly-SNO-HSA の抗菌活性欠如の推定メカニズム

図 4 Mono-SNO-HSA と Poly-SNO-HSA の細胞内 NO 取り込み（A）50 mM SNO-HSAs（SNO 量にて換算）をマウス大腸がん細胞株 C26 細胞に暴露した際の経時的細胞内 NO 量変化．（B）PDI 阻害剤である Bacitracin 存在下での細胞内NO 量．

いを見出した知見は，これからの研究の方向性におHSA は，ヒト肝細胞に対し，へムオキシゲナーゼ-1いて非常に重要なターニングポイントになっていく．

（HO-1）といった生体防御タンパク質を誘導するこ4．Mono-SNO-HSA と Poly-SNO-HSAと，それにより肝虚血再灌流障害などを軽減することが明らかになっていった 1）．このことは，Mono-

当初は，Mono-SNO-HSA より高効率に SNO 基

SNO-HSA が，内因的な細胞保護剤として機能してを導入し，比活性を向上させる目的で Poly-SNO-いる可能性を示唆するものであった．
『では，なぜHSA を作製したにもかかわらず，Poly-SNO-HSA

Poly-SNO-HSA は Mono-SNO-HSA と異なり，癌細の抗菌活性はなくなり新たに抗腫瘍活性を獲得する胞に対してアポトーシスを引き起こせるのか？』，こという結果に，その当時はなかなか明確な答えを見の疑問が日に日に大きくなっていった．

出せずにいた．そのような中，Mono-SNO-HSA のそんな中，ヒト肝癌由来細胞などでは，Poly-SNO-

新たな生物活性の実験を進める過程で，Mono-SNO-

HSA の NO は非常に速いスピードで細胞内へ取り込

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図5

異なる細胞応答性を有する Mono-SNO-HSA と Poly-SNO-HSA のメカニズム

まれる一方，Mono-SNO-HSA ではゆっくりとした験を重ね，論文化できたときの何とも言えない喜び

細胞内 NO 輸送が起こることが判明した（図 4A）．

は，今でも忘れない．追記しておくと，今回 Poly-そして更なる阻害剤を用いた検討の結果，Poly-SNO-HSA からの細胞内 NO 輸送の大部分に関与し

SNO-HSA と Mono-SNO-HSA による NO 送達経路ている細胞表面に発現する PDI は，多くの腫瘍細胞が異なり，Poly-SNO-HSA では細胞膜上のプロテイに発現し，その PDI 発現量は悪性度と相関しているンジスルフィドイソメラーゼ（PDI）が関与するこことも知られている．また，腫瘍細胞が免疫回避のとで高効率な供給が可能になることが分かった（図手 段 の 一 つ と し て 獲 得 し て い る MHC class I4B）
．私は，この知見と NO の二面性を考え合わせchain-related gene A（MICA）の分泌に重要なタンることで，1 つの仮説を導き出した（図 5）．『Mono-パク質として PDI が着目されており，Poly-SNO-SNO-HSA は，低分子のチオール化合物への SNO

HSA の抗腫瘍効果と MICA に何らかの関係性が推転移反応を介して L-アミノ酸トランスポーター（L-察されるため，今後明らかにしていく必要があるとAT）により細胞内へ NO を供給する．この NO 輸考えている．

送効率は極めてゆっくりとしたものであり，細胞内5．お わ り にの NO 濃度が高濃度に達することはない（NO 輸送過程が律速）．一方で，Poly-SNO-HSA は，PDI に私の研究人生の始まりから，ターニングポイント

よって極めて高効率かつ 1 段階で細胞内へ NO を供になった研究内容に至るまで徒然なるままに書かせ給するため，短時間で細胞内 NO は高値を示す（Po-て頂いた．今回，執筆の機会を与えて頂き，日頃あ2, 3）

ly-SNO-HSA 暴露濃度が律速） ．つまり，こういまり振り返らない過去を思い起こしてみる非常に良った律速過程の違いが細胞内 NO 濃度をそれぞれ低い機会を与えて頂いたことをまずは感謝したい．起値と高値に調節制御し，異なった細胞内シグナルこるすべてのことが研究や人としての糧になってい（HO-1 とカスパーゼ-3 の誘導）を引き起こした結き，経験するすべてのことが繋がっていくことを改果，細胞保護あるいは細胞障害に働いているというめて感じ，自分はそれに『ただ乗っかっているだけ』ことではないか』と．実際このことを立証し，レビであることを再認識させられた．私は自分でも頭がュアーに罵声を浴びせられながらも，様々な追加実良くないし，物覚えが悪いと感じている（これは謙薬 剤 学 Vol. 75, No. 4 (2015)225遜でもなんでもない．最近特に感じている）．学会等ったとしても，研究や実験がきついということを本に行かせて頂くと，スマートな方は本当に大勢いら当に聞いたことがない．こういった素晴らしい研究っしゃる．だからこそ，他の人が考えないことを考者の方々の背中を見てきたからこそ，「自然と」研究えるように，研究が好きだという気持ちだけは負けが好きであり続けられているのかと，ふと感じた．

ないようにと努力してきた．例えば，ゼミや学会のまだまだ研究者の道は先が長いが，私もそういう素時の質問は他の人がやってからすること（質問がか晴らしい研究者になりたいと強く思うと同時に，いぶったらすぐ別の質問を考える）とか，論文を読んつまでも研究の楽しさを伝えられる人になりたいとで，その研究者達が今後やろうとすることをしない心から願っている．

こと等々．後は，どんな領域の研究でも自分の研究との関連がありそうなことはないかとアンテナを張り続けることを心がけている．こういうことを今書いていることすらも，これまでに出会った先輩方や先生方から頂いた，非常に的を射た言葉が心の奥底に突き刺さっているからだと思う．幸い単刀直入に言って下さる方々が周りに多かったおかげである．
ただ，研究が好きな気持ちは，どうやって維持できているのか自分でも分からない．生まれつき好きだと言えばそうなのかもしれないが，今回こうして改めて振り返ってみると，私の周りには薬を作りたいとか科学の進歩のためになどという巨大な使命感に押しつぶされそうになりながらも，研究を楽しんでやっている先輩方や先生方ばかりであった．いくら朝方まで実験が続いたとしても，休みの日が無くな226

引 用 文 献1) Y. Ishima, F. Yoshida, U. Kragh-Hansen, K. Watanabe, N. Katayama, K. Nakajou, T. Akaike, T. Kai,T. Maruyama, M. Otagiri, Cellular uptake mechanisms and responses to NO transferred from mono-and poly-S-nitrosated human serum albumin,Free Radic. Res., 45 (10), 1196–1206 (2011).
2) Y. Ishima, M. Hara, U. Kragh-Hansen, A. Inoue, A.
Suenaga, T. Kai, H. Watanabe, M. Otagiri, T.
Maruyama, Elucidation of the therapeutic enhancer mechanism of poly-S-nitrosated humanserum albumin against multidrug-resistant tumor
in animal models, J. Controlled Release, 164 (1),
1–7 (2012).
3) Y. Ishima, U. Kragh-Hansen, T. Maruyama, M. Otagiri, Poly-s-nitrosated albumin as a safe and effective multifunctional antitumor agent: characterization, biochemistry and possible future therapeutic applications, Biomed. Res. Int., 2013, 353892(2013).

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