隔離飼育動物モデルにおけるエピジェネティックな精神神経性障害の発症機構解明と薬物（和漢薬）制御
申 請 代 表 者
所外共同研究者
所内共同研究者

矢部
荒木
松本

武士
良太
欣三

摂南大学薬学部複合薬物解析学
摂南大学薬学部複合薬物解析学
複合薬物薬理学分野

教授
助教
教授

【報告セミナー要旨】【背景・目的】統合失調症や不安障害などの精神疾患は決して稀な疾患ではないにもかかわらず、詳細な発症機序が不明であることや、既存薬では十分な治療効果が見られないことなど、依然として問題点が多数存在する。種々の精神疾患の発症には、遺伝的要因だけでなく、環境要因が関与することが示唆されており、隔離飼育マウスは幼少期の環境要因に基づく精神疾患の一部の症状を反映するものと考えられている。本研究では、隔離飼育マウスで見られる異常行動の発症機序、及び漢方薬による改善作用について、背側縫線核における GABA 神経関連遺伝子のエピジェネティクス制御に焦点をあて解析を行っている。
【方法】
隔離飼育マウスは、ddY 系雄性マウスを 3 週齢から周囲の見えないケージにて 6 週間個別飼育することで作製した。隔離飼育マウスを用いて、遺伝子発現解析、タンパク質発現解析、
DNA メチル化解析、
ヒストンアセチル化解析、行動薬理学的解析を行った。
【結果・考察】隔 離飼育マウスでは、背側縫線核において GABAB1a（GABAB 受容体サブユニットの１つ）のmRNA 発現量が有意に増加していた。一方、GABAB 受容体の他のサブユニットである GABAB1b のmRNA に発現変動は見られなかった。背側縫線核における GABAB1a の増加はタンパク質レベルでも確認された。発現増加が見られた GABAB1a のプロモーター領域では DNA メチル化の有意な減少、ヒ
ストン H3 アセチル化の有意な増加が見られた。しかしながら、ヒストン H4 のアセチル化に変動は見られなかった。一方で、発現変動が見られなかった GABAB1b のプロモーター領域においては DNA
メチル化やヒストン H3、H4 アセチル化の変動は見られなかった。GABAB1a の発現増加が見られた
背側縫線核に GABAB 受容体遮断薬 Phaclofen を 0.3 nmol 投与すると、隔離飼育マウスの多動と攻撃行動が抑制された。
本結果から、DNA メチル化の減少やヒストン H3 アセチル化の増加といったエピジェネティクス
制御の変化による、背側縫線核の GABAB 受容体の発現増加が、隔離飼育マウスの多動や攻撃行動といった異常行動に関与しているものと考えられた。
また隔離飼育マウスの異常行動に対する和漢薬の作用について検討したところ、加味温胆湯 (1g/

－ 36 －

kg/day, p.o.) の 14 日間投与が隔離飼育マウスの多動を改善することを見出した。本作用は最終投与の 24 時間後も持続していたことから、即時的な神経伝達調節作用などではなく、持続的なエピジェ
ネティクス制御変化が関与している可能性が考えられる。今後、背側縫線核における GABA B1a 発現のエピジェネティクス制御に及ぼす加味温胆湯投与の影響について解析を行う予定である。

■背景・目的統合失調症、うつ病、不安障害といった精神疾患の患者数は近年増加の一途を辿っており、社会的な問題となっている。これらの疾患の発症機序に関しては不明な部分が多く残されているが、現状、
アミノ酸・モノアミン神経系を標的とした治療薬が頻用されている。しかしながらこれらの薬物に反応しない治療抵抗性患者が多数存在することや、副作用が高頻度で認められることなど、多くの問題点がある。こうした問題点を解決するには、疾患の発症機序の解明と、その発症機序に基づく新たな治療戦略の開発が必要である。近年、精神疾患の発症原因の一つとして、DNA やヒストンの化学的修飾による遺伝子発現制御機構、すなわちエピジェネティクスの関与が示唆されている。精神疾患の発症には遺伝要因に加えて環境要因、とりわけ発育期の環境が大きく寄与すると考えられており、発育期のエピジェネティックな遺伝子発現制御の変動が疾患の発症に強く関与するものと推測される。
我々はこれまでに精神疾患の発症機序の解明を目的に、発育期に他個体から隔離して飼育した長期
隔離飼育マウスの研究を行ってきた。本マウスは、過剰な攻撃行動といった異常行動を示すこと、こうした異常行動が既存の抗精神病薬、抗うつ薬、抗不安薬等により抑制されることから、発育期の環境要因により発症する精神疾患病態の分子基盤を解明する上で有用なモデルと考えられる。これまでの検討から、隔離飼育マウスでは新奇マウスとの遭遇といったエンカウンター刺激により多動反応を示すこと、この多動反応は抗精神病薬や抗不安薬より抑制されることを明らかにしている。さらに、
この多動反応に背側縫線核にセロトニン神経の興奮が関与していることを見出していることから 1)、
背側縫線核のセロトニン神経の興奮が精神疾患の分子基盤の一端である可能性が考えられる。背側縫線核のセロトニン神経は主に GABA 神経によって制御されていることが報告されていることから 2)、
我々は隔離飼育により背側縫線核の GABA 神経系の機能に変化が生じているものと推測している。
一方で近年、漢方薬の抑肝散が治療抵抗性統合失調症に対して治療効果を示し、かつ副作用が見られないことが報告されるなど 3)、精神疾患領域における新たな治療戦略の一つとして、漢方薬による治療が注目されている。しかしながら、漢方薬は長い年月に及ぶ使用経験に基づき治療法が確立されてきたものであり、西洋薬とは異なり科学的根拠に乏しい。現在では根拠に基づいた医療が求められており、治療効果における科学的根拠の蓄積が漢方薬治療を進める上での課題となっている。
上述の背景を踏まえ本研究では、エピジェネティックな精神疾患の発症機序およびそれに対する和漢薬効果の解明を目的とし、背側縫線核における GABA 神経関連遺伝子のエピジェネティクス制御の解析と異常行動に対する漢方薬の作用について解析した。

－ 37 －

■方法
隔離飼育マウスの作成
雄性の ddY 系マウス (Shimizu Laboratory Supplies Co., Ltd., Kyoto, Japan) を３週齢から６週間、集団飼育マウスは透明なケージ（24 × 17 × 12 cm）にて５匹で、隔離飼育マウスは同じサイズの周囲が灰色のケージにて１匹で飼育して実験に用いた。動物は、室温 23 ± 1℃で明期 8:00 ～ 20:00、
暗期 20:00 ～ 8:00 の 12 時間明暗サイクルで飼育した。水および飼料は自由に摂取させた。
mRNA 発現量の解析
マ ウ ス の 背 側 縫 線 核 ま た は 大 脳 皮 質 前 頭 前 野 を 採 取 し、TRIzol 試 薬（Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA）を用いて total RNA を抽出した。ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) を用いて、抽出した total RNA 1 µg から cDNA を合成した。合成した cDNA の定量は、表１のプライマー
様式１－４を用いて real-time PCR 法により行った。

表１．mRNA発現量の解析に用いたプライマー
発現量の解析に用いたプライマー
表１．mRNAmRNA

Forward primer sequence (5’ to 3’)

Reverse primer sequence (5’ to 3’)

GABAAα1

CTGCTGGACGGTTATGACAAAAACTGGTCCGAAACTGGTGGABAAβ2

TGCCAACAATGAGAAGATGC

GATGTGGCCATCTCGTTTTTGABAAγ2

GGCACCCTGCATTATTTTGT

GTTGCTGATCTGGGACGAATGABAB1a

ACGTCACCTCGGAAGGTTG

CACAGGCAGGAAATTGATGGCGCCTCTCACTCCCCTCATCTGATCTTGATGGGGTCGTTGT

様式１－４

GABAB1b

GABAB2
CAGCAAGCGTTCGGGTGTA
表１．mRNA 発現量の解析に用いたプライマー
GAD67
GCCTGAAGATCTGTGGCTTCmRNA
Forward primer sequence (5’ to 3’)
GAD65
AGAGAGGGCCAACTCTGTGACTGCTGGACGGTTATGACAAGABAAα1

GTCTTGGCGATGACCCAGATAGCAGGTTCTTGGAGGACTG
Reverse primer sequence (5’ to 3’)
CTCTGCATCAGTCCCTCCTCAAACTGGTCCGAAACTGGTGGABAAβ2
TGCCAACAATGAGAAGATGC
GATGTGGCCATCTCGTTTTT
タンパク質発現量の解析
表２．DNA メチル化の解析に用いたプライマー
マウスの背側縫線核を採取し、ウェスタンブロット法により
GABAB1a タンパク質の発現量を解析
GABA
GGCACCCTGCATTATTTTGT
GTTGCTGATCTGGGACGAAT
Aγ2
Reverse primer sequence (5’ to 3’)
CpG アイランド Forward primer sequence (5’ to 3’)
した。
GABAB1a
ACGTCACCTCGGAAGGTTG
CACAGGCAGGAAATTGATGGC
1
TTGGATTTTTGTGGAAGAAGAATAGCACCAACAACAACAACAACATCTAGABAB1b
GCCTCTCACTCCCCTCATCTGATCTTGATGGGGTCGTTGT
DNA
メチル化の解析2
AAGTTTTTTTTTTAGTTTTTTTTTTTTTAAATCTACTTCACAATCCCAAAAGABAB2
CAGCAAGCGTTCGGGTGTA
GTCTTGGCGATGACCCAGAT

マウスの背側縫線核または大脳皮質前頭前野からゲノム DNA を抽出し、バイサルファイト処理

GAD67
GCCTGAAGATCTGTGGCTTCAGCAGGTTCTTGGAGGACTGを行った。バイサルファイト処理した DNA を鋳型とし、表２のプライマーを用いて PCR 法により
表３．ヒストンアセチル化の解析に用いたプライマー
GAD65
AGAGAGGGCCAACTCTGTGACTCTGCATCAGTCCCTCCTC
CpG
アイランドを増幅しクローニングした。各サンプルにつき
8 ～ 10 クローンの塩基配列を解析し
GABAB1a 転写た。
Reverse primer sequence (5’ to 3’)
開始点からの Forward primer sequence (5’ to 3’)
距離（bp） メチル化の解析に用いたプライマー
表２．DNA
表２．DNA
メチル化の解析に用いたプライマー
GGTGTAAGCATTTGCCTGCTACCAAGGCTCTCAACCTTCA-1034～-816
Reverse primer sequence (5’ to 3’)
CpG アイランド Forward primer sequence (5’ to 3’)
GGTCTCTCGGCAGCTCTTAG
GAGGGTGCAGGGGAAGAC-161～381
TTGGATTTTTGTGGAAGAAGAATAGCACCAACAACAACAACAACATCTA
CCTGGATTCCTGTGGAAGAACTACCCCATCACTCGCCTCT
197～430
2
AAGTTTTTTTTTTAGTTTTTTTTTTTTTAAATCTACTTCACAATCCCAAAA
CCACCCTCCTTTCCTTTAGTGGCAAAGGACCAGTCCTAGAAGA
2841～3048
GTCTCTTGGCCCTAGGAAGC
4714～4838
表３．ヒストンアセチル化の解析に用いたプライマー－ 38 －CTGCCTCTTCTGCTGGTGAT
4928～5049
GABAB1a 転写
開始点からの Forward primer sequence (5’ to 3’)
距離（bp）GACACTTCTTCTGGGGAAGGTATACTGCACGCCGTTCTGA
Reverse primer sequence (5’ to 3’)

CpG アイランド

Forward primer sequence (5’ to 3’)

Reverse primer sequence (5’ to 3’)

1

TTGGATTTTTGTGGAAGAAGAATAGCACCAACAACAACAACAACATCTA

2

AAGTTTTTTTTTTAGTTTTTTTTTTTTTAAATCTACTTCACAATCCCAAAA

表３．ヒストンアセチル化の解析に用いたプライマー
表３．ヒストンアセチル化の解析に用いたプライマー

GABAB1a 転写
開始点からの Forward primer sequence (5’ to 3’)
距離（bp）

Reverse primer sequence (5’ to 3’)-1034～-816

GGTGTAAGCATTTGCCTGCTACCAAGGCTCTCAACCTTCA-161～38

GGTCTCTCGGCAGCTCTTAG

GAGGGTGCAGGGGAAGAC

197～430

CCTGGATTCCTGTGGAAGAACTACCCCATCACTCGCCTCT

2841～3048

CCACCCTCCTTTCCTTTAGTGGCAAAGGACCAGTCCTAGAAGA

4714～4838

GTCTCTTGGCCCTAGGAAGCGACACTTCTTCTGGGGAAGG

4928～5049

CTGCCTCTTCTGCTGGTGATTATACTGCACGCCGTTCTGA

ヒストンアセチル化の解析
マウスの背側縫線核を採取し、DNA とタンパク質を架橋した後に DNA を断片化した。免疫沈降は抗アセチル化ヒストン H3 抗体と、抗アセチル化ヒストン H4 抗体を用いて行った。表３のプライマーを用いて real-time PCR を行い、免疫沈降 DNA とインプット DNA 中の GABAB1 遺伝子プロモーター
領域の定量を行った。
脳内への薬物投与
ガイドカニューレを背側縫線核（ブレグマから後方 4.4mm、右側 1.5 ｍｍ、26 度の角度で深さ3.8mm）に設置し、１週間の回復期間の後に行動実験を行った。マウス１匹あたり 0.2 μl の薬液を 5分間かけて投与し、10 分後に行動実験を行った。薬物はリンゲル液（147.2 mM NaCl, 4.0 mM KCl,
2.2 mM CaCl2; pH 6.0）に溶解した。
エンカウンター刺激負荷と行動解析
透明なアクリルケージ（30 × 30 × 35cm) に網目状の仕切りをし、resident として集団飼育または隔離飼育マウスを大きい区画に入れ、３時間の馴化の後、intruder として同週齢の新奇マウスを小さい区画に入れた（図１）。その後 20 分間の resident の行動を ANY-maze video tracking software(Stoelting Company, Wood Dale, IL) を用いて解析した。
新奇マウス(Intruder)

攻撃行動の解析30 cm

隔離飼育マウスと９週齢の ddY 系雄性マウ
スを測定用ケージ（24 × 17 × 12 cm）に入れ、

6 cm

20 分間行動をビデオ撮影した。隔離飼育マウ

30 cm

スが示した噛み付き行動を攻撃行動と定義し、

Mesh

攻撃行動の時間を測定した。

6 cm

集団/隔離飼育マウス(Resident)

図１．エンカウンター刺激負荷に用いるケージ
図１．エンカウンター刺激負荷に用いるケージ－ 39 －

背側縫線核

大脳皮質前頭前野

B
2.0

*

集団飼育

様式１－４

新奇マウス(Intruder)
30 cm

様式１－４
6 cm

新奇マウス(Intruder)■結果・考察

30 cm
30 cm

GABA 神経関連遺伝子の mRNA 発現量の解析

Mesh
6 cm

6 cm
我々はまず、隔離飼育マウスの背側縫線核と大脳皮質前頭前野において、GABA
神経関連遺伝子30 cm
集団/隔離飼育マウス(GABAAα1、GABAAβ2、GABAAγ2、GABA
、GABA
B1a
B1b、GABAB2、GAD67、GAD65) の mRNA 発現
Mesh量を解析した。隔離飼育マウスでは背側縫線核において、GABAB 受容体サブユニットの１つである(Resident)

図１．エンカウンター刺激負荷に用いるケージ
GABAB1a の mRNA 発現量が有意に増加していた。一方で、他のGABA 神経関連遺伝子の mRNA 発
6 cm

集団/隔離飼育マウス

現量に変化は見られなかった（図２A）。また、大脳皮質前頭前野ではいずれのGABA 神経関連遺伝(Resident)
子の mRNA 発現量にも変化は見られなかった（図２B）。

図１．エンカウンター刺激負荷に用いるケージ

背側縫線核

A

2.0
集団飼育

*

隔離飼育

背側縫線核

集団飼育

*
1.0

隔離飼育

1.5
0.5
1.0
0
α1

β2

γ2

1a

1b

大脳皮質前頭前野

B 1.5

2.0

2

67

65

mRNA 発現量mRNA 発現量

A 1.5mRNA 発現量mRNA 発現量

大脳皮質前頭前野

B

2.0

0.5

2.0
1.0
1.5
0.5
1.0
0
α1

β2

γ2

1a

1b

2

67

65

0.5
GABAB

GABAA

GAD

GABAB

GABAA

GAD

図２．背側縫線核（A）と大脳皮質前頭前野（B）におけるGABA 神経関連遺伝子の mRNA 発現量。
図２．背側縫線核（A）と大脳皮質前頭前野（B）における0
0 GABA 神経関連遺伝子の mRNA 発現量。
α1 β2 γ2*p<0.05
vs. 集団飼育。

1a

1b

2

*p<0.05 vs. GABA
集団飼育。 GABA
A

B

67

65

α1

GAD

β2

γ2

1a

1b

2

GABAB

GABAA

67

65

GAD

図２．背側縫線核（A）と大脳皮質前頭前野（B）における GABA 神経関連遺伝子の mRNA 発現量。

GABAB1a タンパク質の発現量の解析*p<0.05 vs. 集団飼育。

隔離飼育マウスの背側縫線核において GABAB1a の mRNA 発現量が増加していたことから、我々はGABAB1a タンパク質発現量
GABAB1a タンパク質発現量

次に GABAB1a のタンパク質発現量を解析した。隔離飼育マウスの背側縫線核では mRNA 発現量の増
3

GABAB1a**加と同様に、GABAB1a のタンパク質発現量の有意な増加が確認された（図３）
。
GAPDH
集団飼育

隔離飼育
GABAB1a
GAPDH

集団飼育

隔離飼育

2

集団飼育

3

隔離飼育

1
**
2
0

集団飼育

1

隔離飼育

図３．背側縫線核における GABAB1a タンパク質発現量**p<0.01 vs. 集団飼育。

0

図３．背側縫線核における GABA
B1a タンパク質発現量
図３．背側縫線核における
GABA
B1a タンパク質発現量**p<0.01 vs. 集団飼育。

**p<0.01 vs. 集団飼育。
GABAB1 遺伝子の CpG アイランドにおける DNA メチル化の解析
これまでの検討から、隔離飼育といった環境要因により背側縫線核の GABAB1a の発現量が増加することを見出してきた。我々は、こうした環境要因による遺伝子発現の変動にエピジェネティクス制－ 40 －

御の変化が関与していると推測している。
DNA のメチル化は、CpG サイトと呼ばれるシトシンとグアニンが並んだジヌクレオチドのシトシンにおいて生じることが知られている。多くの遺伝子のプロモーター領域には CpG サイトが集中している CpG アイランドが存在しており、この CpG アイランドにおける DNA のメチル化は遺伝子の転写に影響を及ぼすものと考えられている。GABAB1 遺伝子には２つの主要なスプライシングバリア
ント GABAB1a および GABAB1b が存在するが、これらのスプライシングバリアントの転写は異なるプ
ロモーター領域を介して調節されていることが知られている 4)。GABAB1a と GABAB1b の転写開始点
周辺にはそれぞれ CpG アイランドが存在しており（図４A；以下、GABAB1a 転写開始点周辺に存在する CpG アイランドを CpG アイランド１、GABAB1b 転写開始点周辺に存在する CpG アイランドを
CpG アイランド２とする）、CpG アイランド１における DNA のメチル化は GABAB1a の転写に、CpG
アイランド２における DNA のメチル化は GABAB1b の転写に影響を及ぼすものと推測される。そこで
我々は、隔離飼育マウスの背側縫線核において CpG アイランド１と CpG アイランド２における DNAのメチル化を解析した。隔離飼育マウスでは CpG アイランド１の DNA のメチル化が有意に減少していた（図４B）。一方で、CpG アイランド２の DNA のメチル化は集団飼育マウスと隔離飼育マウスとで違いは見られなかった（図４C）。また、隔離飼育マウスの背側縫線核で見られたような CpG アイ
ランド１における DNA のメチル化の減少は、大脳皮質前頭前野においては観察されなかった（図４
様式１－４

D）。

A
GABAB1 遺伝子
GABAB1a
GABAB1b
CpGアイランド
1

2

B 背側縫線核 CpGアイランド1 C 背側縫線核CpGアイランド2 D 大脳皮質前頭前野 CpGアイランド1
30

1.0
***
0.5

3.0
メチル化DNAの割合 (%)

1.5

メチル化DNAの割合 (%)

メチル化DNAの割合 (%)

2.0

20

10

2.0

1.0

0

0

0
集団飼育 隔離飼育

集団飼育 隔離飼育

集団飼育 隔離飼育

CpG アイランドの位置（A）と、背側縫線核における CpG アイランド１（B）と図４． GABA
B1 遺伝子における図４．GABA
B1 遺伝子における CpG アイランドの位置（A）と、背側縫線核における CpG アイランド１（B）とアイランド２（C）および大脳皮質前頭前野におけるアイランド１（D）ののメチル化の割合。
CpG アイランド２（C）および大脳皮質前頭前野におけるCpG アイランド１（D）のDNAのメチル化の割合。
CpG***p<0.001 vs. 集団飼育。

CpG

DNA

***p<0.001 vs. 集団飼育。
GABA B1 遺伝子プロモーター領域におけるヒストンのアセチル化の解析
メチル化した DNA にはメチル化 DNA 結合タンパクを介してヒストン脱アセチル化酵素が結合
5-8)
。そこで
し、近傍のヒストンを脱アセチル化することにより転写を抑制することが知られている
A GABAB1遺伝子
B GABAB1遺伝子

GABAB1a
GABAB1a我々は、隔離飼育マウスの背側縫線核において、GABA
B1 遺伝子のプロモーター領域におけるヒス
GABAB1b

GABAB1b
CpGアイランド
1

16

2

*
集団飼育
12

隔離飼育

－ 41 －の割合 (%)の割合 (%)CpGアイランド

40

30

1

2

1.0
***
0.5

メチル化DNAの割合 (メチル化DNAの割合 (メチル化DNAの割合 (

1.5

20

10

2.0

1.0

トン H3 サブユニットとヒストン
H4 サブユニットのアセチル化の割合を解析した。隔離飼育マウス
集団飼育 隔離飼育
集団飼育 隔離飼育
集団飼育 隔離飼育
00

では GABA0の転写開始点周辺においてヒストン H ３のアセチル化が有意に増加していた。一方で

B1a
図４． GABAB1 遺伝子におけるCpG アイランドの位置（A）と、背側縫線核における CpG アイランド１（B）と

GABAB1b の転写開始点周辺におけるヒストン H3 のアセチル化に関しては有意な差は認めれなかった

CpG アイランド２（C）および大脳皮質前頭前野における CpG アイランド１（D）の DNA のメチル化の割合。
（図５A）。またヒストン H4 のアセチル化は、GABAB1a、GABAB1b の両方の転写開始点周辺において***p<0.001
vs. 集団飼育。
変化は見られなかった（図５B）。こうした結果から、GABA

B1aの転写開始点周辺において、DNA メ

チル化が減少することによりヒストン H3 のアセチル化が増加し、GABAB1a の転写が亢進する可能性が考えられた。

A GABAB1遺伝子

B GABAB1遺伝子

GABAB1a

GABAB1a

GABAB1b

GABAB1b
CpGアイランド1162

アセチル化ヒストンH4の割合 (%)

アセチル化ヒストンH3の割合 (%)

CpGアイランド

*
集団飼育
隔離飼育

12

8

*
4

0
-2000

0

2000

4000

6000

GABAB1aの転写開始点からの距離(bp)

1

40

2

30

20

10

0
-2000

0

2000

4000

6000

GABAB1aの転写開始点からの距離(bp)図５．背側縫線核におけるヒストンのアセチル化（A）とヒストンのアセチル化（B）の割合。
H3 のアセチル化（A）とヒストン
H4H4
図５．背側縫線核におけるヒストンH3のアセチル化（B）の割合。
集団飼育。
*p<0.05 vs. 集団飼育。
*p<0.05 vs.

異常行動発現における背側縫線核の GABAB 受容体機能の関与の解析
これまでの検討から、隔離飼育マウスでは環境要因によるエピジェネティクス制御の変化を介して、背側縫線核の GABAB1a の発現量が増加すると考えられる。この GABAB1a の増加により背側縫線核における GABAB 受容体の機能に変化が生じることで、異常行動が発現すると推測される。そこで我々
は、背側縫線核の GABAB 受容体機能と異常行動との関連性を明らかにするために、GABAB 受容体
リガンドの背側縫線核内投与が隔離飼育マウスの異常行動に与える影響について解析した。GABAB
受容体アゴニスト baclofen(0.06 nmol) の背側縫線核内投与は、隔離飼育マウスが示すエンカウンター刺激による多動反応を増悪させた。一方で、GABAB 受容体アンタゴニスト phaclofen(0.3 nmol) の背側縫線核内投与は、多動反応を抑制した（図６）。また、phaclofen(0.3 nmol) の背側縫線核内投与は隔離飼育マウスの攻撃行動も有意に抑制した（図７）。これらの結果は、背側縫線核の GABAB 受容体の機能が、エンカウンター刺激による多動反応や攻撃行動といった隔離飼育マウスの異常行動に関与する可能性を示唆するものと考えられる。

－ 42 －

様式１－４

集団飼育

様式１－４

隔離飼育

集団飼育

VehicleVehicleBaclofen (0.06) Phaclofen (0.3)

VehicleVehicleBaclofen (0.06) Phaclofen (0.3)

隔離飼育

120
†
運動時間
運動時間
(秒)
(秒)

120
†

80

*
80
40

†

*

†
40

0
0.06
Baclofen*p<0.05 vs. 集団飼育
Phaclofen
0.3†p< 0.05 vs. vehicle(nmol) 0
Baclofen 集団飼育
0.06
- 隔離飼育*p<0.05 vs. 集団飼育
Phaclofen
0.3†p< 0.05 vs. vehicle(nmol)
図６．エンカウンター刺激による多動反応に対する GABAB 受容体リガンドの背側縫線核内投与の影響。
集団飼育
隔離飼育
*p<0.05 vs. 集団飼育。†p<0.05 vs. vehicle。
受容体リガンドの背側縫線核内投与の影響。
図６．エンカウンター刺激による多動反応に対するGABABB受容体リガンドの背側縫線核内投与の影響。
図６．エンカウンター刺激による多動反応に対するGABA*p<0.05 vs. 集団飼育。
p<0.05 vs. vehicle。
*p<0.05
vs. 集団飼育。†p<0.05 vs. vehicle。
†

攻撃行動時間
攻撃行動時間
(秒)
(秒)

40
30
40
20
30
10
***
20
0
10 リンゲル液 Phaclofen***(0.3 nmol)
0Phaclofen
リンゲル液
隔離飼育
(0.3 nmol)

図７．隔離飼育マウスの攻撃行動に対する GABA 受容体アンタゴニストの背側縫線核内投与の影響。
隔離飼育***p<0.001 vs. リンゲル液。

B
図７．隔離飼育マウスの攻撃行動に対する GABA
B 受容体アンタゴニストの背側縫線核内投与の影響。

***p<0.001 vs. リンゲル液。
図７．隔離飼育マウスの攻撃行動に対するGABAB 受容体アンタゴニストの背側縫線核内投与の影響。
***p<0.001 vs. リンゲル液。

隔離飼育マウスが示すエンカウンター刺激による多動反応に対する抑肝散の作用
本研究では、これまでに見出した隔離飼育マウスの行動異常とエピジェネティクス制御変化に対すAB
週齢る漢方薬の作用について解析している。まず我々は、抑肝散の作用について解析を行った。抑肝散は
100
9

11

120

運動時間
運動時間
(秒)
(秒)

3

* 3)
80
臨床研究において、治療抵抗性統合失調症に対して改善作用を示すことや、アルツハイマー病の周120
39 隔離飼育
11
週齢

A

B

9)
100
辺症状に対して有効であることが報告されている。また基礎研究においても、隔離飼育マウスの攻
抑肝散
40
*

(0.3
g/kg/day, p.o.)
隔離飼育

60
80

20
撃行動を抑制することなどが報告されており 10-14)、精神機能障害に対して有用な処方であると考えら
60
抑肝散

40
最終投与の24時間後に行動試験(0.3 g/kg/day, p.o.)れる。しかしながら、隔離飼育マウスが示すエンカウンター刺激による多動反応に対して、
抑肝散 (0.3- + - +
抑肝散
020g/kg/day, p.o.) の２週間投与（投与スケジュール：図８A）は改善作用を示さなかった（図８B）。
0 集団飼育 隔離飼育
最終投与の24時間後に行動試験- + - +抑肝散

図８．抑肝散の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する抑肝散の影響（B）。
集団飼育 隔離飼育*p<0.05 vs. 集団飼育。
図８．抑肝散の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する抑肝散の影響（B）。
*p<0.05 vs. 集団飼育。

－ 43 －

図７．隔離飼育マウスの攻撃行動に対する GABAB 受容体アンタゴニストの背側縫線核内投与の影響。
***p<0.001 vs. リンゲル液。

A
9

週齢

11

B
運動時間 (秒)

3

隔離飼育

120
100
80

60
40
20
0
抑肝散

抑肝散
(0.3 g/kg/day, p.o.)

最終投与の24時間後に行動試験

*

-

+

-

+

集団飼育 隔離飼育図８．抑肝散の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する抑肝散の影響（B）。
*p<0.05 vs. 集団飼育。

図８．抑肝散の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する抑肝散の影響（B）。
様式１－４*p<0.05 vs. 集団飼育。

A
9

週齢

11

B
100
*
運動時間 (秒)

3

隔離飼育
加味温胆湯
(1 g/kg/day, p.o.)

最終投与の24時間後に行動試験

80
60
†
40
20

0
加味温胆湯

-

+

-

+

集団飼育 隔離飼育図９．加味温胆湯の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する加味温胆湯の影響（B）。
*p<0.05 vs. 集団飼育。†p<0.05 vs. vehicle。

図９．加味温胆湯の投与スケジュール（A）とエンカウンター刺激による多動反応に対する加味温胆湯の影響（B）。
*p<0.05 vs. 集団飼育。†p<0.05 vs. vehicle。

隔離飼育マウスが示すエンカウンター刺激による多動反応に対する加味温胆当の作用
我々は次に、基礎研究においてうつ様行動を改善することが報告されている加味温胆湯の作用について解析を行った 15)。隔離飼育マウスの多動反応に対して、加味温胆湯 (1 g/kg/day, p.o.) の２週間投与（投与スケジュール：図９A）は有意な改善作用を示した（図９B）。

■結論
本研究では、隔離飼育といった発育期の環境要因により、エピジェネティクス制御変化を介した背側縫線核の GABAB1a の増加が生じることを明らかにした。また、こうした背側縫線核の GABAB1a の増加がエンカウンター刺激による多動反応や攻撃行動に関与するものと考えられた。
漢方薬の加味温胆湯は、隔離飼育マウスが示すエンカウンター刺激による多動反応を有意に改善した。この改善作用にエピジェネティクス制御変化が関与する可能性が考えられることから、今後は、加味温胆湯の改善作用にエピジェネティクス制御変化が関与しているかを解析する予定である。

■引用文献
1. Ago Y., Araki R., Tanaka T., Sasaga A., Nishiyama S., Takuma K., Matsuda T. Role of social
encounter-induced activation of prefrontal serotonergic systems in the abnormal behaviors of
isolation-reared mice. Neuropsychopharmacology 2013; 38: 1535-1547.
2. Tao R., Auerbach SB. Regulation of serotonin release by GABA and excitatory amino acids.

－ 44 －

Journal of psychopharmacology 2000; 14: 100-113.
3. Miyaoka T., Furuya M., Horiguchi J., Wake R., Hashioka S., Tohyama M., Mori N., Minabe Y.,
Iyo M., Ueno S., Ezoe S., Murotani K., Hoshino S., Seno H. Efﬁcacy and safety of yokukansanin treatment-resistant schizophrenia: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial (aPositive and Negative Syndrome Scale, ﬁve-factor analysis). Psychopharmacology 2015; 232:
155-164.
4. Steiger JL., Bandyopadhyay S., Farb DH., Russek SJ. cAMP response element-binding
protein, activating transcription factor-4, and upstream stimulatory factor differentiallycontrol hippocampal GABABR1a and GABABR1b subunit gene expression through alternative
promoters. The Journal of neuroscience 2004; 24: 6115-6126.
5. Grunstein M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 1997; 389:
349-352.
6. Nan X., Ng HH., Johnson CA., Laherty CD., Turner BM., Eisenman RN., Bird A.
Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone
deacetylase complex. Nature 1998; 393: 386-389.
7. Ng HH., Zhang Y., Hendrich B., Johnson CA., Turner BM., Erdjument-Bromage H., Tempst
P., Reinberg D., Bird A. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCP1 histone
deacetylase complex. Nature genetics 1999; 23: 58-61.
8. Wade PA., Gegonne A., Jones PL., Ballestar E., Aubry F., Wolffe AP. Mi-2 complex couples
DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. Nature genetics 1999;
23: 62-66.
9. Hayashi Y., Ishida Y., Inoue T., Udagawa M., Takeuchi K., Yoshimuta H., Kiue K., Ninomiya
Y., Kawano J., Sameshima T., Kawahara T., Goto I., Shudo K., Kurayama S., Nakamura J.,
Okahara K., Mitsuyama Y. Treatment of behavioral and psychological symptoms of Alzheimertype dementia with Yokukansan in clinical practice. Prog Neuropsychopharmacol Biol
Psychiatry 2010; 34: 541-545.
10. Uchida N., Egashira N., Iwasaki K., Ishibashi A., Tashiro R., Nogami A., Manome N., Abe
M., Takasaki K., Mishima K., Takata J., Oishi R., Nishimura R., Fujiwara M. Yokukansan
inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion
in rodents. Biol Pharm Bull. 2009; 32: 372-375.
11. Kanno H., Sekiguchi K., Yamaguchi T., Terawaki K., Yuzurihara M., Kase Y., Ikarashi Y.
Effect of yokukansan, a traditional Japanese medicine, on social and aggressive behaviour ofpara-chloroamphetamine-injected rats. J Pharm Pharmacol. 2009; 61: 1249-1256.
12. Sekiguchi K., Yamaguchi T., Tabuchi M., Ikarashi Y., Kase Y. Effects of yokukansan, a
traditional Japanese medicine, on aggressiveness induced by intracerebroventricular
injection of amyloid beta protein into mice. Phytother Res. 2009; 23: 1175-1181.
13. Tamano H., Kan F., Oku N., Takeda A. Ameliorative effect of Yokukansan on social isolationinduced aggressive behavior of zinc-deﬁcient young mice. Brain Res Bull. 2010; 83: 351-355.
14. Takeda A., Iwaki H., Ide K., Tamano H., Oku N. Therapeutic effect of Yokukansan on social－ 45 －

isolation-induced aggressive behavior of zinc-deficient and pair-fed mice. Brain Res Bull.
2012; 87: 551-555.
15. Nakagawasai O., Yamadera F., Iwasaki K., Asao T., Tan-No K., Niijima F., Arai H., Tadano T.
Preventive effect of kami-untan-to on performance in the forced swimming test in thiaminedeficient mice: relationship to functions of catecholaminergic neurons. Behav Brain Res.
2007; 177: 315-321.

－ 46 －