LAGUNA（汽水域研究）15，69〜76 頁（2008 年 12 月）
LAGUNA 15，p.69–76（2008）

九州に分布するイタボガキ科カキ類の DNA 鑑定
飯塚祐輔 1, 2・荒西太士 1
DNA fingerprinting for Ostreidae oysters in Kyushu
Yusuke Iidzuka1, 2, Futoshi Aranishi1

Abstract: Among several genera of the family Ostreidae, Ostrea, Crassostrea and Saccostrea
play a central role in the near shore brackish ecosystem worldwide. Although 9 species ofoysters belonging to these 3 genera had been found in Kyushu, Japan, oysters are highlyvariable in form with ecomorphological variations, and molecular methods can usefullycomplement morphological in determining the status of oyster taxa. In this study, a simple DNA
fingerprinting analysis of the mitochondrial DNA segment encoding the 16S ribosomal RNA
gene was developed for differentiation of 3 genera oysters. Of 2 Ostrea, 4 Crassostrea, and 2
Saccostrea species distributed in Kyushu, Japan, nucleotide sequences of the mitochondrial
DNA 16S ribosomal RNA gene were aligned to detect unique sites of restriction enzymes forgenus and species identifications by means of PCR-RFLP analysis. PCR amplification of anapparent 530 bp fragment of the partial 16S ribosomal RNA gene was successfully performedon all specimens collected. Direct double digestion of the PCR products using Eco130I and
HindIII enzymes enabled to discriminate Ostrea, Crassostrea, and Saccostrea genera. In
addition, double and single digestions of the PCR products using DdeI and AluI enzymes
and AluI enzyme alone enabled to identify 4 Crassostrea species and 3 Saccostrea species,
respectively.
Key word: Ostreidae oyster, PCR-RFLP, mitochondrial 16S ribosomal RNA gene

は

じ

め

およびオハグロガキ属 Saccostrea の 3 属に分類され（稲葉・鳥越，2004），かつて日本には 12 種が分布していた（Torigoe, 1981; Hedgecock et al., 1999）．特にマガキ属のカキ類は日本人に馴染みが深く，養殖生産技術が既に確立しているマガキ C. gigas は，「カ
キえもん（北海道）」，「的矢かき（三重県）」，「かき小町（広島県）」など，1994 年に島根県隠岐地域において養殖生産技術が確立したイワガキ C. nippona
は「隠岐のいわがき」としてブランド化が進んでいる（勢村ら，2001）．一方，イタボガキ属のイタボ
ガキ O. denselamellosa は，かつて食用として採集されたが，近年は分布全域で生息数が激減し，愛知県にイタボガキ科カキ類は，極圏を除く世界中に分布する代表的な二枚貝類であり（Matthiessen, 2000），
河口を含む沿岸域などに生息している（Hedgecock,1995）．イタボガキ科カキ類が，沿岸汽水域に形成するカキ礁は，他の生物が生息場所や産卵場所として利用しており，沿岸汽水環境を物理的かつ生態的に保持している（田北，2000）．世界各地に 60 種以上現生すると推測されているイタボガキ科カキ類のうち，分布域が比較的広く，水産重要種を含む 43
種以上がイタボガキ属 Ostrea，マガキ属 Crassostrea
1
2

島根大学汽水域研究センター Coastal Lagoon Research Center, Shimane University, 1060 Nishikawatsu, Matsue 690-8504, Japan.
宮崎大学大学院農学研究科 Graduate School of Agriculture, University of Miyazaki, 1-1Gakuenkibanadai-nishi, Miyazaki 889-2192, Japan.

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飯塚祐輔・荒西太士

や千葉県などでは絶滅危惧種に指定されている（愛知県，2002; 千葉県，2006）．また，日本ではほとん
ど食用とされていないオハグロガキ属のクロヘリガ
キ S. echinata は，タイ王国やオーストラリアなどの東南アジアやオセアニアで食用を目的として養殖生産されている（Southgate and Lee, 1998）．
このように生態学的かつ食資源学的にも重要な 3属のカキ類は，生息環境により貝殻などの形態的特徴が変化しやすいため，分類が混乱していることが多い．例えば，形態的特徴の類似によりマガ
キの地方集団であると考えられていたシカメガキ
C. sikamea（Imai and Sakai, 1961），ボンベイガキ S.
cucullata の亜種であると考えられていたオーストラ
リアガキ S. commercialis とオハグロガキ S. mordaxの 2 種（Stenzel, 1971）などがある．前者のマガキとシカメガキは，ミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子解析（Banks et al., 1993）および相互交配実験（Banks et al., 1994）により別種であるとされている．後者のオハグロガキ属 3 種は，まずオハ
グロガキは侵蝕されていない個体の貝殻形態観察（稲葉・鳥越，2004），オーストラリアガキは集団遺伝学的解析（Buroker et al., 1979）によって，それぞれボンベイガキとは別種であるとされている．また，天然海域では，同属のみならず，異属の異種間の形
態分類も困難な場合がある．例えば，マガキ属のイ
ワガキは老成したコケゴロモガキ O. circumpicta であると考えられていた（Wakiya, 1929; Hirase, 1930）．
これらの形態的特徴の多様性による分類学上の混乱
は，カキ類の天然海域における精確な生態調査を著しく困難としている .
このような状況の下，近年では，DNA を指標とした分子生物学的手法によるイタボガキ属，マガキ
属およびオハグロガキ属の天然カキの分類が最も信頼性が高いとされている．特に，細胞内のコピー数が多く解析が容易なミトコンドリア DNA の遺伝子が DNA マーカーとして精力的に開発されている．
例えば，チトクローム c 酸化還元酵素サブユニッ
ト I 遺伝子を基にポルトガルガキ C. angulata を中心としたマガキ属 6 種を比較した報告（OʼFoighil etal., 1998），同遺伝子を基に中国の香港周辺に分布す
るマガキ属を中心とした 9 種を比較した報告（Lamand Morton, 2004），同遺伝子を基に中国で分類が混乱しているマガキ属 2 種を比較した報告（Wang etal., 2004）などの報告例がある．
また別の遺伝子では，
16S リボゾーム RNA 遺伝子を基に北米とアジアに分布するマガキ属 3 種を比較した報告（OʼFoighil etal., 1995），同遺伝子を基に世界各地に分布するイタボガキ属 7 種を比較した報告（Jozefowicz and Oʼ
Foighil, 1998），同遺伝子を基に九州の有明海に分布するマガキ属 3 種を比較した報告（Hedgecock et al.,1999），同遺伝子を基に南大西洋両岸に分布するマガキ属 2 種を比較した報告（Lapegue et al., 2002），
同遺伝子を基にインド太平洋に広く分布するオハ
グロガキ属 4 種を比較した報告（Lam and Morton,
2006）等の多数の報告例がある．しかし，これらの報告例の多くは特殊な設備や多大な費用が必要な塩基配列を解読する手法であり，多検体を同定する生態調査への適用は困難である．一方，迅速性および簡易性から PCR-RFLP（制限酵素断片長多型）解析
法は多検体解析に優れた手法であり（谷口・高木，
1997），その生態調査への適用が期待されている．
そこで，本研究では，日本に分布するイタボガキ
属，マガキ属およびオハグロガキ属の 3 属 12 種にカキ類のうち，九州沿岸の汽水性潮間帯から潮下帯に分布するイタボガキ O. denselamellosa，コケゴロ
モガキ O. circumpicta，マガキ C. gigas，スミノエガ
キ C. ariakensis，イワガキ C. nippona，シカメガキ C.
sikamea，オハグロガキ S. mordax，ケガキ S. kegaki
およびクロヘリガキ S. echinata の 3 属 9 種を対象として，PCR-RFLP 解析による属および種分類技術を開発した．なお，GenBank 国際データベースに登録されているイタボガキ科カキ類の種数が多くミトコ
ンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子の部
分領域を指標とした．

試 料 と 方 法
試料
イタボガキ属，マガキ属およびオハグロガキ属の3 属 7 種のミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム
RNA 遺伝子の部分塩基配列は，GenBank 国際デー
タベースから取得した（表 1）．また，当該データベー
スに未登録のコケゴロモガキおよびケガキの 2 属 2種のミトコンドリア DNA 16S リボゾーム RNA 遺伝
子の部分塩基配列は，本研究で解読した．
なお，部分塩基配列の解読したコケゴロモガキは
山形県，ケガキは宮崎県でそれぞれ採集された試料を使用し，形態的に種を同定した後，閉殻筋を分離して分析に供するまで−20 ℃に冷凍保存した .
DNA 調製
尿 素 -SDS-Proteinase K 法 に 従 い， 凍 結 し た 閉

九州に分布するイタボガキ科カキ類の DNA 鑑定71

表 1．イタボガキ科カキ類 9 種の日本における分布記録および GenBank 国際データベース登録番号
Table 1. Recorded distribution of 9 Ostreidae oyster species in Japan and GenBank accession number

Species
Itabogaki

㩷 Ostrea denselamellosa
Kokegoromogaki

㩷 Ostrea circumpicta

Magaki㩷 Crassostrea gigas

Suminoegaki

㩷 Crassostrea ariakensis

Iwagaki㩷 Crassostrea nippona

Shikamegaki

㩷 Crassostrea sikamea
Ohagurogaki㩷 Saccostrea mordax

Kegaki㩷 Saccostrea kegaki

Kuroherigaki

㩷 Saccostrea echinata

Distribution in JapanGenBank
accession number

southward of Boso and Noto Peninsula

AF052067

Mutu Bay 䌾 Kyushu

no data

Hokkaido 䌾 Amami

AF177226

Ariake Bay

AY632547

Mutu Bay 䌾 Kyushu

AY007426

Ariake and Yatsushiro Bay

AY632551

Kii Peninsula 䌾 Ryukyu

AF458912

Mutu Bay 䌾 Amami

no data

Kyushu 䌾 Ishigaki Island

AF463493

殻 筋 か ら ゲ ノ ム DNA を 調 製 し た（Aranishi andOkimoto, 2004; 2005; Aranishi, 2006; Aranishi and
Iidzuka, 2007）．閉殻筋約 20 mg を 200μl の TESU4抽出溶液（10 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM EDTA pH
8.0, 1％ SDS and 4 M urea, 25μg Proteinase K）に懸濁
し，55 ℃にて 60 分間攪拌加熱した．25μl の 5 M
NaCl を添加し十分に混合した後，定法に従いフェノ ー ル 溶 液（phenol : chloroform : isoamyl alcohol＝25 : 24 : 1）およびクロロホルム溶液（chloroform :isoamyl alcohol＝24 : 1）を用いて精製し，引き続きエタノールにより沈殿した．DNA 沈殿をエタノー
ルで洗浄して十分に乾燥した後，10T0.1E 溶液（10mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA pH 8.0）に再溶解した．
なお，DNA 溶液の濃度および純度は，バイオフォ
トメーター（eppendorf 社製）により測定した．
PCR 増幅
約 530 bp のミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺 伝 子 部 分 領 域 を 増 幅 す る た め 16Sar（5ʼ-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3ʼ）お よ び 16Sbr（5ʼ-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3ʼ）のプラ
イマーセットを用いた（Kessing et al., 1989）．PCR
反応は，5μl の GoTaq Green Master Mix（Promega 社
製），2μl の 2.5 mM MgCl2，各 1μl のプライマー（5pmol/μl）および 1μl の 50 倍希釈した DNA テンプ
レートの合計 10μl で反応した．サーマルサイクラー（TECHNE 社製 TC-312）を用いた PCR 反応条件は，
94 ℃で 2 分間の初期変性後，94 ℃で 10 秒間の変性/54 ℃で 20 秒間の会合/72 ℃で 40 秒間の伸長を 35
回繰り返し，72 ℃で 5 分間の最終伸長により終了
した．
塩基配列解析
GenBank 国際データベースから取得（表 1），または当研究室で解読した塩基配列長が種により異なっていたため，マガキの 16S リボゾーム RNA 遺伝子の第 203〜733 塩基に相当する塩基配列長に予め調整した後，解析に供した．塩基配列の多重整列解析
および制限酵素の認識部位探索には，ClustalW プログラム（Thompson et al., 1994）と NEBcutter プログ
ラム（Vincze et al., 2003）をそれぞれ使用した．
RFLP 解析
イタボガキ属，マガキ属およびオハグロガキ属の 3 属 の 分 類 RFLP 解 析 は，5μl の PCR 産 物，5unit の Eco130I 制限酵素（Fermentas 社製），5 unit の
HindIII 制限酵素（Roche 社製）および終濃度×1 の
制限酵素用 Tango buffer（Fermentas 社製）を含む 10
μl の反応溶液により，37 ℃で 4 時間反応した．
マガキ属マガキ，スミノエガキ，イワガキおよびシカメガキの 4 種の種分類 RFLP 解析は，5μl の
PCR 産物，2.5 unit の AluI 制限酵素（Fermentas 社製），
2.5 unit の DdeI 制限酵素（Roche 社製）および終濃飯塚祐輔・荒西太士

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結果および考察び 73 bp に切断された RFLP 産物が生成された（図3）．オハグロガキ属の場合，種判別を行う制限酵素
AluI によって，オハグロガキは 243 bp，170 bp，67
bp および 50 bp に切断され，ケガキは 170 bp，160
bp，83 bp，53 bp，50 bp および 14 bp に切断された
RFLP 産物が生成された（図 4）．図 2，図 3 および
図 4 では，40 bp 程度の切断片差を判別するのは難しく，また 100 bp 以下の切断片も同様に判別し難い．しかし，それぞれの属および種で特異的な電気泳動結果が得られたため，イタボガキ属，マガキ属
およびオハグロガキ属の 3 属の属分類と，マガキ属
4 種の種分類，オハグロガキ属 3 種の種判別が可能

GenBank 国際データベースから取得した 3 属 7 種のミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子領域の部分塩基配列のうち，イワガキは，277
bp の部分塩基配列しか登録されておらず，制限酵
素認識部位の探索には不足していた．そのため，宮崎県産イワガキから当該領域の塩基配列を解読した．
ミ ト コ ン ド リ ア DNA の 16S リ ボ ゾ ー ム RNA
遺 伝 子 部 分 領 域 約 530 bp を 多 重 整 列 解 析 し，NEBcutter プログラムを用いて制限酵素認識部位を探索した．その結果，3 属の属特異的な制限酵素認
識部位および 2 属 6 種の種特異的な制限酵素認識部
位を特定した．制限酵素 Eco130I および HindIII に
よって 3 属の属分類，制限酵素 AluI および DdeI に
よってマガキ属 4 種の種分類，制限酵素 AluI によってオハグロガキ属 2 種の種分類が可能と推測された（図 1）．また，オハグロガキ属は属分類 RFLP 反応
によって，オハグロガキとケガキの 2 種が含まれる
ハプロタイプと，クロヘリガキの 1 種のハプロタイ
プに別けられた．
属分類の場合，制限酵素 Eco130I および HindIII
によって，イタボガキ属は RFLP 反応後の鎖長が468 bp および 59 bp に切断され，マガキ属は 530 bpで切断されず，オハグロガキ属のオハグロガキ , お
よ び ケ ガ キ の 2 種 は 196 bp，173 bp，100 bp お よび 59 bp に切断され，クロヘリガキは 232 bp，196
bp および 100 bp に切断された RFLP 産物が生成された（図 2）．マガキ属 4 種の種分類の場合，制限酵素 AluI および DdeI によって，マガキは 357 bp，100 bp および 73 bp に切断され，スミノエガキは
305 bp，100 bp，73 bp および 52 bp に切断され，イ
ワガキは 199 bp，171 bp，125 bp および 35 bp に切断され，シカメガキは 216 bp，141 bp，100 bp およとなった．
イタボガキ科 3 属のカキ類は世界に広く分布しており，カキ殻構造物による魚礁効果や摂餌行動による水質浄化作用など，沿岸汽水生態系の重要な役割を担っている．さらに，沿岸の潮間帯から潮下帯に生息し，採集が容易なため，食用としての需要も高い．その一方で DNA 解析などの研究は増加傾向にあるものの，その知見は未だ十分とは言えない．カ
キ類は生息環境などによって形態的変異が起こりやすく，従来の形態学的手法では貝殻や軟体部などの形態で判別するが，カキ類は生息環境によって貝殻や軟体部の色などの形態的特徴が変化しやす
いため，カキ類を正確に分類することは困難である．近年，イタボガキ科カキ類については，バージ
ニアガキ C. virginica・マガキ・スミノエガキの 3 種（O'Foighil et al., 1995），シカメガキ・マガキ・スミ
ノエガキの 3 種（Hedgecock et al., 1999）などの限定されたカキ類を対象にミトコンドリア DNA の 16S
リボゾーム RNA 遺伝子領域の PCR-RFLP 解析による分類法が開発されている．本研究では，ミトコ
ンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子領域の PCR-RFLP 解析により，九州で採集されるイタ
ボガキ科カキ類 3 属 9 種を網羅的に分類でき，かつ生態調査に応用できる技術の開発を目指した．制限酵素 Eco130I および HindIII によって 3 属の属分類，
制限酵素 AluI および DdeI によって Crassostrea 属 4種の種分類，制限酵素 AluI によって Saccostrea 属 3種の種分類ができることが判明した．
今後，九州沿岸汽水域の調査で採集されるイタボ
ガキ科カキ類 3 属 9 種の迅速かつ安価な同定が可能になり，天然海域におけるカキ類の分布生態に関する情報が得られる事が期待される．一方，九州以外の日本国内の海域では 3 属のカキ類は本研究で取り扱った 9 種以外にヒヅメガキ S. malabonensis，

度×1 の制限酵素用 B buffer（Roche 社製）を含む 10
μl の反応溶液により，37 ℃で 2 時間反応した .
オハグロガキ属オハグロガキおよびケガキの 2 種の種判別 RFLP 解析は，5μl の PCR 産物，5 unit のAluI 制限酵素（Fermentas 社製）および終濃度× 1 の制限酵素用 Tango buffer（Fermentas 社製）を含む 10
μl の反応溶液により，37 ℃で 2 時間反応した .
なお，PCR 産物および RFLP 産物は，臭化エチ
ジウムで染色した後，EDAS 290 Gel Documentation
System（invitrogen 社製）により紫外線下で観察した．

九州に分布するイタボガキ科カキ類の DNA 鑑定73
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図 1．イタボガキ科 3 属 9 種のミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子部分領域の相同性解析．下線の塩
基配列は 3 属の属分類における制限酵素 Eco130I（5ʼ-CCWWGG-3ʼ）および HindIII（5ʼ-AAGCTT-3ʼ）の認識部位，二重下線の塩基配列はマガキ属 4 種およびオハグロガキ属 2 種の種分類における制限酵素 AluI（5ʼ-AGCT-3ʼ）および DdeI
（5ʼ-CTNAG-3ʼ）の認識部位をそれぞれ示す．
Fig. 1. Alignment of sequences of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene in 9 Ostreidae oyster species. Dots indicate sequence
identity with O. denselamellosa. Numerous endonuclease restriction site differences are apparent among the 3 oyster genera andrestriction sites for Eco130I（5ʼ-CCWWGG-3ʼ）and for HindIII（5ʼ-AAGCTT-3ʼ）which differentiate the 3 oyster genera, areunderlined. Numerous endonuclease restriction site differences are apparent among the 4 Crassostrea species and the 2 Saccostrea
species restriction sites for AluI（5ʼ-AGCT-3ʼ）and for DdeI（5ʼ-CTNAG-3ʼ）which differentiate the 4 Crassostrea species and the2 Saccostrea species, are double-underlined.

飯塚祐輔・荒西太士

74

M

Od Oc Cg Cn Sk Se

1,000 bp
500 bpM

Ca Cs Cn Cg

1,000 bp
500 bp100 bp100 bp
図 2．イタボガキ（Od），コケゴロモガキ（Oc），マガキ（Cg），イワガキ（Cn），ケガキ（Sk）およびクロヘリガ
キ（Se）のミトコンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA
遺伝子部分領域の制限酵素 Eco130I および HindIII を用いた PCR-RFLP 解析．M は 100 bp DNA マーカーを示す．
Fig. 2. PCR-RFLP analysis of the partial 16S ribosomal
RNA gene using Eco130I and HindIII restriction enzymes
for standard oyster specimens of O. denselamellosa（Od），
O. circumpicta（Oc），C. gigas（Cg），C. nippona（Cn），
S. kegaki（Sk）and S. echinata（Se）．
Lane M, 100 bp DNA
ladders.

M Sm Sm Sk Sk

1,000 bp
500 bp100 bp
図 4．オハグロガキ（Sm）およびケガキ（Sk）のミト
コンドリア DNA の 16S リボゾーム RNA 遺伝子部分
領域の制限酵素 AluI を用いた PCR-RFLP 解析．M は
100 bp DNA マーカーを示す．
Fig. 4. PCR-RFLP analysis of the partial 16S ribosomal
RNA gene using AluI restriction enzymes for standard
oyster specimens of S. mordax（Sm）and S. kegaki（Sk）．
Lane M, 100 bp DNA ladders.

ニュージランドガキ S. glomerata およびクロヒメガ
キ O. futamiensis の 3 種が生息するため（稲葉・鳥越，2004），他の海域に今回開発した分類技術を適用するにはこの 3 種についても検討する必要があ
る．具体的には，まず，クロヒメガキの 16S リボゾー

図 3．マガキ（Cg），スミノエガキ（Ca），イワガキ（Cn）
およびシカメガキ（Cs）のミトコンドリア DNA の 16S
リボゾーム RNA 遺伝子部分領域の制限酵素 AluI および DdeI を用いた PCR-RFLP 解析．M は 100 bp DNA
マーカーを示す．
Fig. 3. PCR-RFLP analysis of the partial 16S ribosomal
RNA gene using AluI and DdeI restriction enzymes forstandard oyster specimens of C. gigas（Cg），C. ariakensis（Ca），C. nippona（Cn）and C. sikamea（Cs）．Lane M,
100 bp DNA ladders.

ム RNA 遺伝子領域の塩基配列は未だ解読されていないため，この塩基配列を解読する必要がある．次に，本研究と同じ手順で特異的な制限酵素を特定することによって日本沿岸を対象とした 3 属 12 種の属および種判別技術の開発が可能であると考えられる．クロヘリガキ，ヒヅメガキおよびニュージーラ
ンドガキは主に熱帯地域に分布する南方系カキ種であり，特にクロヘリガキについては近年の環境変動による分布域の北進が報告されている（荒西・飯塚，
2007）．この南方系カキ種の北進を調査する上でも本研究の技術および更なる分子分類技術の深化が必要であると考えられる．また，イタボガキなど各県の絶滅危惧種に指定されているカキ種についての分
布調査にも本研究は応用でき，イタボガキの種の保全についても貢献できると考えられる．
本研究の属および種判別法は，ほぼ実用化の段階に達したと考えられる．ただし，本研究で用いた試料は国内の限られた地域から採集した試料であるため，今後より多くの検体を解析し，解析結果に影響を及ぼすような変異の有無を調べる必要がある．

謝辞

カキ試料を提供して下さった瀬戸内海区水産研究九州に分布するイタボガキ科カキ類の DNA 鑑定所の浜口昌巳博士にお礼申し上げる．また，カキ類の DNA を提供して下さった Rutgers University の沖本宜音博士にお礼申し上げる．

引

用

文

献

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