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生物物理 55（2），077-080（2015）
DOI: 10.2142/biophys.55.077
受理日：2015 年 2 月 6 日

総説

ドロップレット型人工細胞膜によるチャネルタンパク質計測
川野竜司 東京農工大学工学研究院生命機能科学部門

This review describes recent our studies on artificial cell membranes (lipid bilayers) and their applications using microfabrication technologies. The stable and reproducible lipid bilayer formation can be achieved by “droplet contact method” which is readily created the lipid
bilayer by contacting two lipid monolayers at the interface of the droplets. This method will be a powerful tool for the high-throughput
ion channel measurements and biomimetic sensors.
Planar lipid bilayer / Droplets / Ion channel / Nanopore sensing / Microfluidics / Single molecule detection

はじめに器官上のチャネルなど，パッチクランプ法では測定不自然物を人工的に再現する．これまで人類は生物やしイオンチャネルをはじめとする膜タンパク質の基礎環境から学び，その機能を模倣してきた．古くは空を的な研究だけでなく，近年では膜タンパク質創薬や，飛ぶ鳥に憧れ飛行機を発明し，最近では蜘蛛の糸を模嗅覚や味覚の膜受容体を利用した新規バイオセンサへ倣した強靭な糸や，魚の体表面の構造を模倣した水着の応用が期待されている．しかしながら，これまで平が作られてきている．では生物の最小構成単位である面膜形成技術の習熟が必要となること，形成した膜の細胞も一から人工的に作れないだろうか？ 細胞は主安定性が低いことが課題であった．本稿ではマイクロにタンパク質，塩基，脂質などから構成され，これら加工，マイクロ流体技術を用いた安定で再現性の高いを別々に合成し組み立てることができれば，最終的に平面膜形成法，その膜を用いた創薬，バイオセンサへ

人工の細胞を創ることも夢ではない ．また人工細胞の応用に関して筆者らの研究を中心に紹介する．

1.

可能なチャネルの測定が可能．このような利点を活か

1)を創る過程で，それぞれのパーツが持つ細胞機能を取り出し，人工的に利用する試みも行われている．その安定性・再現性の高い平面脂質膜形成法

2.

中で人工細胞膜は細胞を構成する物質と外界とのインターフェースとして研究が行われており，例えば脂質平面脂質膜形成法に関しては，1972 年に Takagi らに二分子膜で構成された球状のカプセル（リポソーム）よって報告された方法を Montal と Mueller が改良したを用いて，膜タンパク質，膜成分に関する研究や，リMontal-Mueller（MM）法 2) が報告されて以降その研究ポソーム内でのタンパク質合成を行うことができる．

が発展してきた．MM 法による膜形成実験を図 1 に示

球状膜に対し，平面脂質二分子膜と呼ばれるものもす．MM 法は脂質単分子膜貼り合わせ法とも呼ばれてある．平面膜実験系では〜 0.2 mm 程度の穴に平面状おり，水相の気液界面に脂質溶液を展開し脂質単分子の脂質膜を形成し，その両側に電極を配置しイオン膜を形成させ，水面をゆっくりと上下させることによ

チャネルのチャネル電流計測や脂質膜の膜透過，膜容り界面の脂質単分子膜を穴中で貼り合わせ二分子膜と量の計測を行う．イオンチャネルの電気生理学的性質する．他にも painting 法と呼ばれる方法があり，脂質に関してはパッチクランプ法という細胞から直接計測溶液を直接穴に塗ることにより比較的簡便に脂質二分する方法があるが，平面膜法ではパッチクランプ法に子膜を形成させることができる．これらの方法はどちは無い以下の様なメリットがある．1）精製したチャらも脂質膜を形成するのに習熟が必要になり，また形ネルの使用が可能であり脂質組成を任意に選択できる成した平面膜は機械的振動や印加電圧の切り替えなどので，構造機能相関に関する研究に有利．2）細胞小により容易に破壊される．実用的な応用を考えた場

Planar Lipid Bilayer Formation Using Droplet Contact Method and Its Applications
Ryuji KAWANOTokyo University of Agriculture and Technology077

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液滴型人工細胞膜を用いた膜タンパク質計測

合，形成する膜の安定性の向上と再現良く膜形成する方法の開発が強く望まれていた

3), 4)

100 μm の穴を有す疎水性フィルムで仕切ることで，．

膜形成面積を小さくした（図 2c）．その結果，脂質膜筆者らは液滴同士を接触することで膜形成を行う液の安定性が飛躍的に向上し，およそ 2 週間膜を保持し滴接触法を用いて，脂質膜の安定性・再現性向上を試続けることが可能であった 7)．また「∞」型のウェルみた．液滴接触法は，前述の貼り合わせ法を発展させの底部に電極を配線（図 2a，2d）することで，ペプた方法で 2006 年に Takeuchi らによって初めて報告さチドチャネルや，イオンチャネルの電流計測が可能にれ，その後 Bayley らも同様の手法による膜形成を報告なった．この液滴接触法による脂質二分子膜形成は，．この方法では図 2a に示すような「∞」再現性，安定性の面で現在最も優れた方法であると考している5), 6)型のウェルに脂質溶液，水滴を順に滴下する．この時えている．

水滴の表面には脂質の単分子膜が形成され，この 2 つの水滴が接触することで，脂質単分子膜同士が貼り合3.

わされ脂質二分子膜を形成する（図 2b）．この方法でハイスループットイオンチャネル計測

は溶液をピペットで滴下するだけで，簡単に誰でも脂創薬標的になっている遺伝子約 6,500 個の中で，イオ質二分子膜形成が可能である．しかし膜形成の再現性

ンチャネルをコードしている遺伝子は約 15% の 1,000は高かったが，形成した脂質膜の安定性に問題があっ個程度あると考えられている．しかしながら実際に用た．そこで脂質膜の面積を小さくすると膜が安定するいられている薬剤の中で，イオンチャネルを標的としと いう知見を活か し， 液 滴 が 接 触 す る 部 分 を直 径ているものはわずか 5% ほどしかない 8)．その 1 つの原因として，イオンチャネルの薬理機構の解明に必要な測定法が限られていることがあげられる．そこでイオンチャネルのハイスループット（HT）計測のため，液滴接触法を行う「∞」型のウェルを配列し脂質二分子膜アレイデバイスを作製した．脂質膜はピペット操作のみで形成可能であるため，インジェクションロボットを用い自動で脂質膜形成を行うシステムを構築した（図 3a）．このシステムを用い，人の平滑筋や神図1
一般的な平面脂質膜形成法（Montal-Mueller 法）．

図3
ハイスループット計測系．a）インジェクションロボットによる自動脂質膜形成．b）16ch アレイを用いた hBK シングルチャネル計測．c）液滴の機械的動きによる連続脂質膜形成．d）30 分間で273 個のチャネルシグナル取得に成功．（文献 7，10 から改変）

図2
液滴接触法とそのデバイス．a）デバイス写真（top view）．b）液滴接触による脂質二分子膜形成．c）液滴接触面の面積を小さくす
る．d）測定系の模式図．（文献 7 から改変）

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液滴型人工細胞膜を用いた膜タンパク質計測

経細胞に発現している Ca2+-dependent potassium channel（hBK）チャネルについて計測を行った．アレイデバ
イスは 16ch 同時計測可能なものを使用し，発現細胞から精製した hBK チャネルを平面脂質二分子膜に再構成することで hBK 再構成膜を得た．この再構成膜
アレイデバイスを用い hBK チャネルのチャネル電流を計測したところ，9 割以上のウェルからシングルチャネル応答を 2 時間で得ることができた（図 3b）．
細胞を用いたパッチクランプ法では，およそ 1 日に4 つ程度のデータしか取れないことから，HT での計測ができたといえる．またチャネル阻害剤を用いてカリウムイオン透過の阻害実験を行ったところ，50%

図4
DNA アプタマーを用いた選択的ナノポア計測．a）標的分子有無による体積差を利用しナノポアで検出．b）コカイン分子がない
とき ssDNA はナノポアを通過．c）コカイン分子存在下では複合体を形成し，ポアを塞ぐ．（文献 11 から改変）

阻害濃度（IC50）を短時間で決定することができた．
人工膜の利点として細胞内側・外側に対する実験が容易に可能であることがあげられる．アルツハイマー病
モデルマウスにおいて，神経細胞の hBK チャネルが不活性化していることが最近報告されたが，アミロイ
ド β がチャネルを直接阻害しているのか，また細胞のチャネルを通過する分子を電気的に検出するナノポア内・外どちらから阻害が起こっているのかなど詳細な計測も新しい計測法として着目されている．ナノポアメカニズムは不明であった ．そこで本システムを用計測では，主に直径 1.4 nm のナノポアを作る αHL といて阻害実験を行ったところ，このアミロイド β がいう toxin チャネルが用いられている．この 1.4 nm とhBK チャネル自身を細胞の内 ･ 外どちら側からも直接いう孔の大きさが single-stranded DNA（ssDNA）の直阻害することを実験的に確認できた ．

径〜 1 nm と近いことから，ssDNA の検出，シーケン

9)7)

HT 計測は，前述のように測定要素（ウェル）を並スに向けて研究が広く展開している．しかしながら，列化する以外にも，繰り返し計測を行うことでも可能

これまでのナノポア計測では基質選択性が低く，孔をであると考えた．そこで液滴を機械的に動かすことに通過する分子を見分けることは難しかった．

より，脂質膜を形成させるシステムの開発を試みた．

そこで筆者らは DNA アプタマーを用いることで，液滴接触法では，液滴表面の脂質単分子膜同士が接触ナノポアによる選択的一分子計測法を考案した 11)．実して二分子膜になり，液滴同士が離れると元の単分子

験ではコカインを標的とする DNA アプタマーを用い，膜に戻る．ローター部分に滴下した 4 つの液滴を回転

標的分子非存在下では ssDNA が αHL ポアを通過，標させ（図 3c），外側の液滴と接触・分離を繰り返すこ的分子存在下ではアプタマー複合体を形成し αHL ポとで脂質二分子膜形成，単分子膜分離するデバイスをアを通過できずブロックする，という複合体形成前後構築した．実際にデバイスのローター部分を回転さにおける体積差を利用して一分子の選択的検出を行っせ，4 つのウェルから後述する α ヘモリシン（αHL）のた（図 4a）．図 4b，4c に複合体形成前，形成後の電チャネル電流計測を行ったところ，30 分間で 273 回の流―時間のグラフを示す．コカイン非存在下で DNAチャネルシグナルの計測に成功した（図 3d）．このよは複合体形成を行わず ssDNA の状態であり，ssDNAうな動的な機構と，接触法での安定性の高い膜形成機が αHL ポアを高速で通過するスパイク状の阻害電流構を組み合わせることで，HT 計測が実現できた ．

が観測される（図 4b）．一方，コカイン分子存在下で10)は，DNA とコカイン分子で複合体を形成し，αHL ポ

バイオセンサへの応用

アを塞ぐことで長時間の阻害電流を示す（図 4c）．こ膜タンパク質の中には受容体など，外界物質を感知用いコカイン検出を行ったところ，300 ng/mL（検出するセンサの役割を担うものが数多く存在する．この下限推奨値）のコカイン分子をおよそ一分で検出でき受容体を人工細胞膜に埋め込むことで，例えば昆虫のた．原理的には体積差を利用するので，アプタマー以フェロモンを感知するセンサができるかもしれない．

外にも抗体を用いた選択的一分子検出が可能であるとまたチャネルを形成する膜タンパク質を用い，その考える．

4.のシグナルの違いを利用し，マイクロ流路デバイスを079

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液滴型人工細胞膜を用いた膜タンパク質計測

センサに関しては実用的な使用を考えた場合，確立されたプロトコルが必要になる．今後創薬やバイオセン
サ以外にも，人工細胞膜システムを様々な分野に展開することが期待される．最近筆者らは脂質膜液滴ネッ
トワークを用いた DNA 演算システムの構築を試みている．
最後に，本研究の大部分は筆者の前所属である公益法人神奈川科学技術アカデミー竹内プロジェクト及び東京大学生産技術研究所の竹内昌治研究室での仕事で

図5ポータブルチャネル電流計測システム．a）富士山山頂での計測風景．b）富士山山頂でのヘモリシンチャネル電流計測結果．（文献10 から改変）ある．本研究は，竹内昌治教授をはじめ，研究室の方々との共同成果でありここに謝意を記す．また科研費を始めとする研究助成により，これらの研究を推進できたことに深く感謝する．

実用的なバイオセンサに応用するため，液滴接触法で形成した高い安定性を持つ脂質膜を利用し，持ち運

文

献び可能なチャネル計測デバイスを開発した．共同研究

1)

Deamer, D. (2005) Trends Biotechnol. 23, 336-338. DOI:
10.1016/j.tibtech.2005.05.008.

先の Tecella 社が開発した小型アンプに，液滴接触法デ2)バイスを組み込み，ノート PC と接続することで持ち運

DOI: 10.1073/pnas.69.12.3561.

び可能なチャネル計測システムを構築した（図 5a）12)．

3)

この計測システムを用いて富士山の山頂でのチャネル

Ide, T. et al. (2008) Anal. Chem. 80, 7792-7795. DOI: 10.1021/ac801224a.

4)計測を試みた．これはシステムの有用性を示すとともHirano-Iwata, A. et al. (2010) Langmuir 26, 1949-1952. DOI:
10.1021/la902522j.に，一般の人へ膜タンパク質に関する興味を喚起でき

5)ればと行った．学生を含む 4 名で本システムと試薬，

Funakoshi, K. et al. (2006) Anal. Chem. 78, 8169-8174. DOI:
10.1021/ac0613479.

ピペットを持って登山，八合目にて山小屋泊した後登

6)Bayley, H. et al. (2008) Mol. BioSyst. 4, 1191-1208. DOI: 10.1039/
b808893d.

頂した．実際に 3,620 m 付近において実験を行ったと

7)

ころ，αHL のチャネル電流の計測に成功した（図 5b）．

Kawano, R. et al. (2013) Scientific Reports 3. DOI: 10.1038/
srep01995.

屋外での計測はノイズ源となる電源がないので，予想8)以上に低ノイズで計測ができたが，風の影響でデバイ

Terstappen, G. C. et al. (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 23-26.
DOI: 10.1016/s0165-6147(00)01584-4.

スが揺れ振動ノイズとなるため，風よけを設置するな

9)

Yamamoto, K. et al. (2011) J. Neurosci. 31, 11100-11109. DOI:
10.1523/jneurosci.6752-10.2011.

ど実験条件の調整が必要であった．チャネル電流に関10)しては大量のデータを得ることができなかったため，Tsuji, Y. et al. (2013) Anal. Chem. 85, 10913-10919. DOI:
10.1021/ac402299z.

地上のデータと統計的な比較はできないが，得られた

11)

データにおいてコンダクタンスやポア形成の様子に特Kawano, R. et al. (2011) J. Am. Chem. Soc. 133, 8474-8477. DOI:
10.1021/ja2026085.

12)に違いはみられなかった．

5.

Montal, M. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3561-3566.

Kawano, R. et al. (2014) PLoS ONE 9. DOI: 10.1371/journal.
pone.0102427.

おわりにマイクロ加工，マイクロ流体技術を用いた液滴接触法により，再現性・安定性の高い脂質二分子膜形成ができるようになった．しかしまだ課題も多い．イオンチャネル創薬に展開する場合，標的となるタンパク質をいかに効率よく人工膜に再構成できるかが今後の課

川野竜司

題である．また得られたデータが膨大な量になるので，データの自動解析技術の発展も望まれる．バイオ

川野竜司（かわの りゅうじ）
東京農工大学工学研究院生命機能科学部門テニュアトラック准教授
2005 年横浜国立大学工学研究科博士課程修了，博士（工学）．学振海外特別研究員（ユタ大学），
KAST 竹内プロジェクト研究員を経て 14 年から東京農工大学工学研究院テニュアトラック准教授．
研究内容：ナノ空間化学，マイクロ加工
連絡先：〒 184-8588 東京都小金井市中町 2-24-16
E-mail: rjkawano@cc.tuat.ac.jp
URL: http://www.tuat.ac.jp/~rjkawano/

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