厚生科学研究費補助金(厚生科学特別研究事業)
分担研究報告書

マクロファージのサイトカイン産生に対するシジュウムの効果
分担研究者

研究要旨

石井里枝

斉藤頁‑

埼玉県衛生研究所

これまでの研究で,シジュウム80%アセトン抽出エキスはIFN‑γ及びLPS刺激マクロファージからのNO産生を抑制し, casuarinin等の加水分解型タンニンが活性成分の一つであることが明らかとなった.そこで,本年度はエキス及び新たに単離された化合物も含めて一酸化窒素(NO), TNF‑α, ILlβ及びIL12産生に対する影響を検討した. NO産生については新たに10種の化合物に抑制作用が認められ, 2種の化合物が産生増強作用を示した. TNF‑α産生については,エキスは増強作用を示したが,これは3種のタンニンの活性によるものと考えられた. ILlβ, Ⅰし12の産生に対しては,エキスは有意な作用を示さなかったが,単離された化合物に顕著な増強あるいは抑制作用を示す成分が確認できた.

A.研究目的培地(含10%ウシ胎児血清)で5%CO2下,これまでの研究で,シジュウム80%アセ37℃で継代培養した.シジュウム80%アセトン抽出エキスはm‑γ及びLPS刺激マク

トン抽出エキス及びエキスより得られた化合

ロファージからのNO産生を抑制することが物16種(図1)はdime血ylsulfbxide (DMSO)明らかとなっている.そして,その作用機序

で細胞培養液中1, 3, 10, 30, 100LLg/mlまはINOS誘導抑制とtNOS酵素活性阻害作用

たは〃Mとなるように調製した(DMSO濃の2つのメカニズムによるものであることや

度0.4%).細胞を1.0×105ce11S/miに調製し,casu∬inin等の加水分解型タンニンが活性成

96穴プレートに200〝1加え, 5%CO2, Sワ℃分の一つであることが明らかとなった.本年で2時間培養した.各濃度のsampleを加え,度は新たに単離された12種の化合物のNOさらに24時間培養した.培養終了後,鏡検産生に対する作用を検討するとともに,炎症による観察とMIT assayにより細胞毒性を性サイトカイン(臥‑1β及びTNF‑α)や確認した.すなわち, MTr (31 (4,5‑Tnlm2分化に関与すると報告されている

dimethylthiazoll2ly1‑2,5‑diphenyl te廿■azolium

臥‑12の産生に対する影響について検討した.

bromide)水溶液を10LLUweu添加,混和し,4時間培養した.上浦を除き, DMSOを150B.研究方法

LLl加え,反応を停止した.マイクロプレー(1)細胞培養法と細胞毒性評価

トリーダーで550 nm (ref. 630 nm)の吸光度

マクロファージはマウスマクロファージを測定した.
(2) NO産生に対する作用

株化細胞(RAW264.7細胞)を用い, Ham's F12‑23‑

細胞を8.0×105ce11S/miに調製し, 96穴プ細胞を8.0×105cells/miに調製し, 48穴プ

レートに200LLlずつ加え, 2時間培養した.

レートに250〟1ずつ添加し, 2時間培養しNO産生増強作用を検討するために.各濃度た･産生増強作用の検討に, Sampleのみをのsampleを添加し, 16時間培養した.また,添加した.また. LPS刺激マクロファージかrTCl産生抑苧作用を検討するためにsampleらの産生に対する作用を検討するために,と同p‑iにU/ml)及びSampleと同時にLPS (1 〃′g/mi)を培養液にIipopolysaccharide (LPS, Eschm‑chia coli, 055:添加した.それぞれ18時間培養後,培養上B5, 100Ilg/ml)を加え, 】6時間培養した.

清を採取した.上清中のTNF‑α及びm‑1 a

培養後,上沼を100LLl採取し. Griess法に

i Enzyme Linmed‑ ImmunoI Sorbent

より, NOの酸化体であるNO2‑量を定量した.

忙LISA)で定義した.なお, A:1βについて

m‑γ (10Assayはさらに培養上清を除去し,滅菌蒸留水を(3) NO合成酵素(lNOS)の誘導に対す250〃l添加,凍結融解を3回繰り返すことる作用により細胞を破砕した.この液を遠心分離し,細胞を1.2×106cell如111に調製し, 35mm￠のぺトリディッシュにlml加え, 2時間培養

上清200〃1を採取した. sample, m‑γ (10U/mi)及びLPS

この細胞凍結融解液中のpr∝ursor一m‑1 β (p一(100ng/ml)を加え, 8時間培養した.培養

臥‑日月

後,細胞をセルスクレイパーで掻き採り, PBS同量の培地を加えた.

を同様にELISAで定量した.

(5) A:12 (p40)産生に対する作用細胞を8.0×105ceus/mi調整し, 48穴プレ(Mi'(‑), ca2'(‑))で2回洗浄した. Lysis Buffer

40LLlを加え, 30分後, 4℃, 10.∝X)rpmで1minートに250〃1ずつ添加し, 2時間培養した.

遠心分離し,上清を採取した.このタンパク『N‑γ (100U血1)を添加し､ 8時間培養後,抽出液のタンパク濃度をBradfbrd試薬によsampleを添加し, 16時間培養した.培養後り測定し,タンパク100〃g分をsDS‑PAGE

上浦を採取し, ELISAでm‑12 (p40)を定に供した.すなわち,タンパク抽出液をSDS量した.

サンプルバッファーで処理し, 5‑20%グラジC.研究結果

エントゲルに負荷し, 20mA/ゲルで泳動した.

ゲル上のタンパクをpvDFメンブランに転(1)細胞毒性について写し,モノクローナル抗マウスマクロファー

検討したシジュウムエキス及びエキスかジINOS抗体,ラビット抗マウスIgG抗体,ら得られた1 6種の化合物のRAW264.7細

125ⅠラベルしたプロテインAと反応させた.

胞に対する障害性は,エキスではl00LLg/mi

メンブランとⅩ線フイルムを56時間密着さで, 13‑15の加水分解型タンニンは100〝Mせ, X線フイルムの露光により, 130kDaので, 11は100LLg/hdで, 12は10LLg/mlで細INOS由来のバンドを検出した.

胞毒性が観察された.その他の化合物は100

定量はそれぞれのバンドに対応する箇所のメ

LLg/mi濃度でも毒性は認められなかった･

ンブランを切り取り,放射活性をγカウンタ

そこで以下のNO産生及びTNF‑α等のサイーで測定した.

トガイン産生に対する作用の検討にはすべて毒性の発現しない濃度で行った.

(4) TNF‑ α及びn:I /3産生に対する作用‑24‑

(2) NO産生に対する作用についてにエキス及び13‑15の加水分解型タンニンがこれまでに,シジュウム抽出エキスがm̲増強作用を示した(図4).特に, 14は顕著

γ及びLPSで刺激したマクロファージのNOな増強作用を示した.その他の化合物1‑5に産生を抑制し, 13‑15の加水分解型タンニついては有意な増強あるいは抑制作用は認めンに活性があることを明らかとしている.そられなかった.

こで,新たに単離された12種の化合物(1‑(5) 臥‑1 β産生に対する作用12)のNO産生に対する作用を検討した. NO

シジュウムエキス及び化合物1‑5, 13116

産生作用はすべての化合物で認められなかっのm‑1 /ヨ産生能に対する作用を検討した.

た.しかし, IFN‑γ及びLPSで活性化した

LPSで18時間刺激したマクロファージの培マクロファージのNO産生に対しては1, 2

養上清中にはm‑1 βはELISAの検出限界(7.8が増強作用を示し,化合物3‑12が抑制作用pg/mi)以下であった.そこで細胞中のpIL‑を示した(図2).

1 βについて検討した.エキス及び化合物はいずれも単独でpJL‑1 βを誘導する作用を示(3) lNOS誘導に対する作用

m‑γ及びLPS刺激によるNO産生に対さなかった. LPSで刺激したマクロファージ

し,増強作用の認められた1, 2及び抑制作のpJL1 /3産生に対してもエキスは顕著な抑用の認められた3‑5の化合物のINOS酵素誘制あるいは増強作用を示さなかった.一方,導に対する作用を検討した.図3に各化合物化合物については3, 4, 5, 16が抑制作用100fLg/miでの増強･抑制効果を示した. m‑を, 13‑15が増強作用を示した(図5).

γ及びLPS刺激コントロール細胞中のINOS(6) 臥‑12 (p40)産生作用

タンパク量をlCOとした場合の相対量で示し

シジュウムエキス及び1‑5, 13, 16の化合た. NO産生増強作用の認められた1物m‑12 (p40)の産生に対する作用を検討(107.9%)及び2 (110.8%)はコントロー

した.まず, m‑γでの前培養の有無,前ルと比較し, iNOSタンパク量の増加がそれ培養時間とml12( p40)の産生量について検ぞれ100.3%, 1(姫.2%認められた.また, NO討した. IFN‑T (1∝) U/mi)で0‑16時間あ産生抑制作用の認められた3,5の化合物につらかじめ前培養した後, LPSで16時間刺激

いては同様の傾向でINOSタンパク量も減少した場合,あるいは, LPS単独で16時間刺していた.

激した場合の上清中のm‑12 (p40)を定量(4) TNF‑ α産生に対する作用した.その結果,図6に示すようにLPS単

シジュウムエキス,化合物1‑5, 13‑16の独の刺激ではELISAの検出限界とする濃度

TNF‑α産生に対する作用を検討した.無刺(7.8 pg/mi)以下であった.また. FN‑γの激コントロール(TNF‑α産生9.3pg/mi)に前培養時間については8時間培養した時が最対しシジュウム抽出エキス(30LLg/mi), 13もm‑12産生能が高かった.そこで, m‑(30LLM), 14 (30LLM), 15 (30〟M).はγ (100U/mi)で8時間培養後, Sampleを添26.7, 135.9, 265.3, 178.9pg/miと単独でTNF‑価, 16時間培養することとした.エキスはα産生増強作用を示した.また, LPSで刺有意な作用を示さなかったが,化合物1‑5に激した場合のTNF‑α産生に対しては,同様産生増強作用が認められた.特に1, 5はコ‑25‑

ントロールのそれぞれ5.2倍, 3.5倍の産生く増強させた. 13‑15はLPS刺激マクロファ量を示した.また, 13, 16は抑制作用を示

ージのNO産生を抑制することから,同じ活した(図7).

性化のシグナルに対して相反する作用を示す結果であった.このことは,これら化合物はD.考察(1)

LPSによる活性化のシグナル伝達, mRNAへの転写に対し,促進的に作用するものの,NO産生に対する作用

新たに検討した12種(1‑12)の化合物のLNOS酵素誘導に対してはpost ‑旭ISCriptional

うち1, 2が産生増強作用を, 3‑12が抑制作levelで抑制的に作用しているものと考えら用を示した.特に5, 6, 7が強い抑制作用れた.
(3)を示した(IC5.値: 143.6, 163.8, 165.8FLM).

m‑12(p40)に対する作用

5, 6, 7のアグリコンである12 (quercetin)

T細胞クローンのタイプは2つに分類され,はすでにNO産生抑制作用が報告されている

Thl型ヘルパー細胞はn:2, 『N‑ γを産生し,が,本研究においても10〃M濃度で40.4%

Th2型ヘルパー細胞はアトピーの病態に重要の抑制効果が認められた. 3‑5はNO産生抑なm‑4, 臥‑5を分泌するとされている. 臥‑12

制効果と同様の傾向で細胞中のtNOSタンパはマクロファージから分泌され,ナイーブTク量も減少させた.また, 1, 2はNO産生細胞のml細胞への分化を促すサイトカイ増強作用を示したが,細胞中のINOSタンパンである.シジュウムはアトピー性皮膚炎をク量も同様に増加しており, lNOS酵素誘導はじめとする各種アレルギー疾患に効果を示に対し,促進的に作用しているものと考えらすことから, RI12 (p40)産生に対する影れる.これまでの研究で,シジュウム抽出エ響を検討した.シジュウムエキスはm‑12産

キスはマクロファージのNO産生抑制するこ生に対し,顕著な作用を示さなかったが,エとが明らかとなっているが,その構成成分をキスから得られた1‑5がm‑12 (p40)産生検討すると,促進的にあるいは抑制的に働く増強作用を示した.このことは,これら化合両方の成分が存在していることがわかった.

物によってmlnn2バランスが¶11側に誘(2)導される可能性を示すものである.

TNF‑α及びm‑1βに対する作用

TNFα及びm‑1βは炎症性サイトカインとして,炎症性疾患の病巣等で過剰産生されD.結論

症状の増悪に関与していると報告されている.

･ IFN‑7,及びLPS刺激マクロファージのNO

しかし,一方で,外来の異物(病原微生物,産生に対して10種の化合物が抑制作用を, 2ウイルス等)から生体を守る防御反応や腫癌種の化合物が産生増強作用を示した.

細胞に対する障害性等,生体にとって有益な･シジュウム抽出エキスはTNF‑α産生に対面もあり,そのバランスが重要である. 3‑5

しては促進的に, Ⅰト1β及びIL‑12に対してはNO産生抑制効果と同様にp一m‑1 β産生は顕著な影響を示さなかった.

に対しても抑制作用を示した.一万, 13‑15･単離された化合物について化合物13‑15はのタンニンは無刺激あるいはLPS刺激マク

m‑α及びml1 β産生に対し促進的に,化ロファージのTNF‑α及びn:1 β産生を著し

合物3‑5はm‑1β産生に対し抑制的に,化合‑26‑

物1‑5はm‑12産生に対し促進的に作用した.

‑27‑

H"07が…
OH O03R=H4

R=CH30H5

R=6‑galloyトβ‑arabinofuranosy16R=β‑arabinofuranosy17

R=β‑arabinopyranosy18

R=β‑xytopyranosy19

R=P‑garactopyranosy110R=β一g山Copyranosy1ll R=αイhamnopyranosyI

12R=H

13C0‑‑0coo;邑怠〆｡HHOHO追14OHHOOH

HOHO"Hy coocH316

図1検討した化合物の構造式
‑28‑

OHOH

15OH

◆

1N∽ ‑

0

10Reagent cone. ( FL a/mr)

100

10100

Reagent cone. ( FL g/ml)

図2シジュウムから単離された化合物のNO産生抑制作用

110Reagent conc. ( LJ a/ml)

100

‑

OC‑

iNOSレベル(%)
oUVTローJL

図3 で･1r)卜蕃江L♯A苧6瀬鷲仰ぎT;熟串0)iNOS湖単苫萱皆瀬冒

(l∈Pu)T胡雌D‑jNト(lEPu)T胡磯DIjNト
80 60 40

6400ト 脂i1 ‑110100R8agent Con°. (〃g/ml or〃M)

図4110Reagent cone. (Fl居/ml orFLM)

シジュウム及び単離成分のTNF‑α産生に対する作用100

肘軸94轄=J事翠g卜11(βlV,静=j叫幸碓青.O甘7(JTC･JT･ S囲(MTlool) (MTloc) (HTloc) (HTloc) (luJPT7001)
9L

引‑lCL;(luJ/7 TIOOt帆′y TlooL ) (IuJ/甘TIOOL )(luJ/y T700L ) (lLL･.7 170C)

1(一口1く⊂ウCil7(,･tI:./1トロ1′て⊂0I NC ‑00 00 00 00EL⊥e恥粋jL(pg＼ml)｣7 8 '6 9

H H一Jy CE) rO C)

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9LZL

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640

642 0 0 00

卜 澗PI ‑

20コントロール
コントロールシジュウム

12

図74513

163(30FL g/mL) (100LLB/ml) (100LLg/mt) (100LL a/ml)(100FLdmll100LL〆TTll) (30LLM) (100LJM)

シジュウム及び単離された成分のIL12(p40)産生に対する作用