薬 剤 学, 76 (5), 311-316 (2016)≪若手研究者紹介≫

肝取り込みトランスポーター Organic Anion Transporting
Polypeptide 1B1（OATP1B1）を介した薬物間相互作用リスクの適正評価に向けた，
in vitro 阻害試験に用いるプローブ基質の探索

和泉沙希*Saki Izumi

エーザイ株式会社 筑波薬物動態研究室
1．はじめし，それを実際に用いて生細胞イメージングを行っにていた．

元気だけが取り柄のじゃじゃ馬がやってきた，とそれが一転，就職を機に薬物動態研究に携わるこ少なからず思われたに違いない．製薬会社に入社しととなる．「薬物動態って面白そうだなぁ，やってみ薬物動態室に配属になって早 8 年目，これまでのこるかっ」という直感と勢いだけで研究分野の壁を飛とを振り返ると顔から火が出るほど恥ずかしい出来び越え，学生感覚のまま入社してしまったのだから，事が一つや二つではない．それでもこうやって日々受け入れた会社側は大変である．この新人を育てて明るく仕事ができているのは，どんなに酷い失敗をいくのか，と愕然としたのは一人や二人ではないだ

しても諦めず指導してくださった上司や先輩方，頼ろう．私自身も学生と社会人の研究アプローチのギりになる同僚，共同研究を通じて知り合った素晴ら

ャップに少なからず苦しんだ．仕事に対する自身のしい先生方，そしていつも味方になってくれる家族

興味と業務上のニーズは必ずしも一致しないばかりや友人の支えがあったからだと思う．

か，仕事の緩急を自分ではコントロールできなかっ現在の仕事の紹介に入る前に，少し私のバックグたことから，必然的に学生時代よりもタイムライン，ランドについてお話ししたい．学生時代は薬品代謝

仕事の優先順位とスピード感を強く意識するように化学教室にて長野哲雄現名誉教授，浦野泰照現教授なった．人間関係の構築にも一苦労．製薬会社の研のご指導の下，蛍光プローブを扱う研究に携わって究所には若手からシニアまで多様な価値観を有するいた．蛍光プローブとは，例えば活性酸素などのタグローバルな人材が集っているため，高度なコミューゲット分子と選択的に反応し，その反応の前後でニケーションスキルを駆使する必要がある．また専

蛍光強度や蛍光波長が変化することでターゲット分

門分野の異なる者同士がチームを組んで仕事をする子を可視化できる機能性小分子のことである．私の場合には，自分の専門に対して責任を負わねばなら研究課題は活性酸素検出蛍光プローブの細胞内滞留ず，甘えは許されない．そのため，入社後数年間は性を向上させ高感度化するというものであり，新規理想と現実の狭間で戸惑うことが多く，会社の上司の有機蛍光プローブを論理的設計・合成により開発をはじめ多くの方々に多大なる迷惑と心配をかけた*平成 19 年 3 月東京大学薬学部薬学科卒，平成 21 年 3月東京大学大学院薬学系研究科修士課程修了，同年 4 月
エーザイ株式会社入社，現在に至る．研究分野：薬物動態研究（主にトランスポーター研究）．研究のモットー：
楽しく前向きに日々研究．趣味：旅行，ジョギング，水泳．連絡先：〒300–2635 茨城県つくば市東光台 5–1–3
E-mail: s-izumi@hhc.eisai.co.jpと思う．
そのような折に始まったのが，理化学研究所の杉山雄一先生を中心としたトランスポーターに関する共同研究であった．本研究活動を通じて会社での自分の立ち位置や強み，企業研究者としてのあり方を少しずつ見出し，また社外の人脈を広げていくこと

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ができた．今回はこの共同研究に端を発した，杉山

薬品候補化合物は臨床用量で OATP1B1 に対し阻害

雄一先生，東京大学大学院薬学系研究科の楠原洋之作用を示さないことが望ましく，in vitro OATP1B1教授，前田和哉講師をはじめとする先生方，エーザ阻害試験を創薬初期から継続的に運用し，探索合成イ株式会社の竹中理博士，小森高文博士，野崎芳胤

化合物の優先順位付けに活用することが重要であ博士とともに取り組んできた一連のトランスポータる．しかし，薬理・安全性・物性などの観点から，ー研究について紹介したい．

最終的に選出した化合物が OATP1B1 に対して阻害

2．薬物トランスポーターとは活性を示すことも少なからずある．その場合には invitro 阻害試験から得られた阻害定数（Ki）と臨床薬物トランスポーターは様々な臓器・組織に発現PK の予測値あるいは実測データをもとに，当局のしている膜蛋白質であり，生体内因子や薬物の細胞ガイダンス・ガイドラインの決定樹にしたがった薬内外への輸送に関与している．肝臓や腎臓などの消物間相互作用リスク評価が実施される．リスクあり

失臓器においてトランスポーターを介して排泄されと判定された場合には臨床薬物間相互作用試験を実る薬物が数多く報告されており，cytochrome P450施し，OATP1B1 臨床プローブ基質薬の PK に対す（CYP）などに代表される代謝酵素とともに薬物のる影響を確認することが求められている．

主要な消失経路となっている．薬物トランスポータ
ーの特徴として広い基質認識性を有することが挙げ

3．In vitro OATP1B1 阻害試験が抱えていた課題

られる．このような特性は生体にとって異物である

OATP1B1 に対する阻害活性を評価する際には，薬物を体外へ効率よく排泄する上で理にかなってい

OATP1B1 遺伝子を強制発現させた哺乳動物由来細るが，一方で複数の薬物を併用した際にトランスポ胞が広く用いられている．プローブ基質の OATP1B1ーター分子上で異なる薬物同士が競合し得るため，を介した細胞への取り込みを，被験物質存在・非存薬物間相互作用を引き起こす原因の一つとなってい在下で検討し，取り込み量の減少に基づいて被験物る．実際に臨床においてトランスポーターを介した質の阻害活性を評価する．前述のとおり，薬物間相薬物間相互作用の事例が数多く報告されている．特互作用リスク評価は in vitro 試験で算出された Ki 値に安全域の狭い薬物と併用される場合には，薬物間をもとに実施されるため，適切な試験デザインのも相互作用に起因する血中曝露量の上昇により重篤なと信頼性の高い Ki 値を求めることがリスク評価の第副作用を惹起する恐れがあるため，医薬品候補化合一歩と言える．しかしながら，OATP1B1 に対する物が薬物トランスポーターに対してどの程度の阻害Ki（あるいは IC50）値の報告値には大きなばらつき活性を有するかを医薬品開発段階で定量的に評価すがあり，その一因として研究施設間で使用するプロることが大切である．日米欧の規制当局より近年発ーブ基質の違いが考えられた．実際に，同一の阻害出された薬物相互作用に関する（ドラフト）ガイダ剤であっても，評価に用いる典型的プローブ基質のンス・ガイドラインにおいても，トランスポーター種類によって OATP1B1 に対する阻害活性が大きくを介した薬物間相互作用リスク評価の重要性が強調

異なることが報告されていた 1）．このことは，選択されている．

したプローブ基質に依存して被験物質の OATP1B1

医薬品開発上重要なトランスポーターとして，肝に対する阻害活性を過大あるいは過小評価すること臓のシヌソイド側膜に発現し，アニオン性化合物のを示唆するものであり，特に過小評価した場合には血液から肝臓への取り込みに関与する Organic Anion

薬物間相互作用リスクを見逃し，臨床安全性上の問Transporting Polypeptide（OATP）
ファミリートラン

題 に つ な が る 恐 れ が あ る． そ こ で 我 々 は， こ のスポーターが挙げられる．ヒト肝臓には OATP1B1，OATP1B1 の基質依存的な阻害を様々な基質・阻害

OATP1B3 および OATP2B1 の 3 分子種が発現して剤の組み合わせで検討し，OATP1B1 を介した薬物いるが，その中でも OATP1B1 はスタチンなどの多間相互作用リスクを適正に評価し得る最適な in

くの薬物の肝取り込みに関与していること，臨床にvitro プローブ基質を提案すべく，以下の検討を行っ

おいて OATP1B1 を介した薬物間相互作用が報告さた．

れていることから重要視されている．したがって医312

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図 1 ［3H］
E2G，［3H］
E1S および［3H］
BSP をプローブ基質として用いて得られた OATP1B1 に対する Ki 値の比較
13 化合物（1, E1S；2, CsA；3, BSP；4, ritonavir；5, rifampin；6, tacrolimus；7, erythromycin；
8, E2G；9, ketoconazole；10, taurocholate；11, verapamil；12, gemfibrozil；13, probenecid）の［3H］
E2G，［3H］
E1S および［3H］
BSP）
OATP1B1 に対する Ki 値を，RI 標識された 3 つのプローブ基質（
33［ H］E2G と［ H］E1S の比較，B）［3H］E2G とに対して算出し，Ki 値を基質間で比較した．A）
BSP の比較，および C）［3H］
E1S と［3H］BSP の比較．文献 2）より引用．
［3H］

4．放射性同位体（RI）標識プローブ基質を用いた
基質依存的な OATP1B1 阻害の検討
In vitro トランスポーター阻害試験においては RI値をリスク評価に使用することで，薬物間相互作用リスクを見逃す可能性が低減できると考えられた．
5．臨床基質薬を用いた基質依存的なOATP1B1 阻害の検討標識されたプローブ基質が好んで使用されてきた．
RI 標識体を用いた評価は高感度であり，また定量分先の検討から E2G が OATP1B1 を介した薬物間相析法が簡便であることから，特に当局への申請を目互作用のリスク評価に適した in vitro プローブ基質的とした試験に適していると言える．そこで我々は，であることが示唆されたが，E2G は生体内物質であOATP1B1 の典型的プローブ基質として古くから使り薬物ではない．当然，薬物間相互作用のリスク評用されてきた［ H］estradiol-17β-glucuronide（E2G），価は，臨床で併用が予想される OATP 基質薬に対しestrone-3-sulfate（E1S）および［ H］sulfobro［ H］て行うことが望まれる．仮に E2G と OATP 基質薬

mophthalein（BSP）の 3 基質を用いて 13 化合物の間に大きな Ki 値の乖離が認められ，特に E2G をの OATP1B1 阻害活性を検討し，得られた Ki 値をプローブ基質として使用した際に薬物間相互作用リ基質間で比較した ．その結果，同一の阻害剤であスクが過小評価されてしまう場合には，E2G を阻害っても用いる基質によって OATP1B1 に対する Ki 値試験のプローブ基質として用いることは不適であが大きく乖離し，特に阻害剤 ritonavir，gemfibrozil，る．そこでスタチンを含む 15 の OATP 基質薬のerythromycin の Ki 値はそれぞれ 117 倍，14 倍，13OATP1B1 発現細胞への取り込みを検討し，それぞ倍 も 異 な る こ と が 判 明 し た． ま た 臨 床 に お い てれの取り込みに対する 3 種類の典型的阻害剤（CsA，OATP 阻害剤として使用される rifampin や cyclo-rifampin お よ び gemfibrozil） の Ki 値 を 評 価し，sporine A（CsA）の Ki 値もそれぞれ 12 倍，6 倍のE2G の結果と比較した 3）．

3332）乖離を示した．

その結果，OATP 基質薬を in vitro プローブ基質

さらに，得られた Ki 値を基質間で比較したとことして用いた際にも基質依存的な阻害が観察され，ろ， 全 て の 阻 害 剤 の OATP1B1 に 対 す る Ki 値 はCsA，rifampin および gemfibrozil の OATP1B1 にE2G を用いた場合に最も低い値を示すことが［ H］

対する Ki 値はぞれぞれ 6.3 倍，3.4 倍および 26 倍の明らかとなった（図 1）．即ちこれら 3 基質の中では乖離を示した．だが，OATP 基質薬を用いて得られE2G が最も被験物質の OATP1B1 阻害活性を［ H］［3H］E2Gた 3 阻害剤の Ki 値は，一部の例外を除き，強く検出することができ，これを用いて得られる Kiをプローブ基質として得られた Ki 値の 3 倍の範囲内

33薬 剤 学 Vol. 76, No. 5 (2016)313

図 2 ［3H］
E2G，［3H］
E1S,［3H］
BSP および OATP 基質薬をプローブ基質として使用した時に得られた，CsA，rifampin および gemfibrozil の OATP1B1 に対する Ki 値の比較A）CsA，B）rifampin， お よ び C）gemfibrozil の OATP1B1 に 対 す る Ki 値 を，15 種 類 のプローブ基質（1, E2G；2, E1S；3, BSP；4, pitavastatin；5, atorvastatin；6, fluvastatin；7,rosuvastatin；8, pravastatin；9, repaglinide；10, nateglinide；11, glibenclamide；12, bosentan；13, valsartan；14, torasemide；15, fexofenadine）を使用して算出し，Ki 値を基質間で比較した．文献 3）より一部改変し引用．におさまっていた．一方で，［3H］
E1S および［3H］
BSP初期の多検体スクリーニングには適さない．そこでをプローブ基質として用いて得られた Ki 値は，高感度かつ高スループット性を両立し得る蛍光法にOATP 基質薬を用いて得られる値よりも大きな Ki 値着目し，特に創薬初期段階で有用な OATP1B1 阻害を示した（図 2）．

試験系の樹立を試みた 4）．

さらに，得られた Ki 値をもとに，阻害剤 CsA,

これまでに OATP1B1 の蛍光基質はいくつか報告

rifampin および gemfibrozil の OATP1B1 阻害リス

さ れ て い た．Chenodeoxycholyl-(Nε-nitrobenz-2-ク評価を当局の薬物相互作用ガイダンス・ガイドラ

oxa-1,3-diazole)-lysine（CDCA-NBD），cholyl-gly-インにしたがって実施したところ，E2G は OATP 基

cylamido-fluorescein（CGamF），および cholyl-L-lysyl-質薬を用いた時と同等のリスク評価結果を与えるこ

fluorescein（CLF）は胆汁酸を NBD や fluoresceinとが確認された．以上の結果から，E2G は OATP 基などの蛍光団で修飾したものであるが，いずれも市質薬の代替基質として使用可能であり，かつ保守的販されておらず使用前に合成する必要がある．また，な Ki 値算出を通じて薬物間相互作用リスクの過小

fluorescein や，fluorescein を蛍光団とした fluores-

評価の危険性を最小限に抑えることができることがcein methotrexate（FMTX）や 8-fluorescein-cAMP確認でき，E2G は OATP1B1 阻害試験に適した in（8-FcA）は一般試薬として購入可能だが，OATP1B1vitro プローブ基質であると結論づけられた．

を介した十分な取り込み活性が見えない，あるいは

6．新規蛍光プローブ基質を用いた
OATP1B1 阻害評価系の樹立

試薬が高価でランニングコストが高くなるなどの点で必ずしも探索活用におけるニーズを十分に満たしていなかった．そこで我々は，pH 7.4 で負電荷を帯E2G は in vitro OATP1B1 阻害試験において理想び，かつ強い蛍光を有する fluorescein 誘導体に着目的なプローブ基質と言えるが，RI 標識体として使用し，新規 OATP1B1 蛍光プローブ基質の探索を試みされるため安全性の面から取り扱いに注意を要し，た．その結果，Oregon green，2 ,7 -dichrolofluores-

さらにサンプル処理や測定に時間を要するためスルcein（DCF），および 4 ,5 -dibromofluorescein の 3ープット性に課題が残されている．このような点は，化合物を新規 OATP1B1 蛍光プローブ基質として見ある程度限られた数の被験物質に対して実施される出し，これら新規蛍光プローブ基質の OATP1B1 を

当局申請用試験では大きな問題とならないが，創薬介した取り込み活性は，既知プローブ基質（fluo-314

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図3

Fluorescein および fluorescein 誘導体の OATP1B1，OATP1B3，OATP2B1 発現細胞および control 細胞への 5 分間の取り込み
A）fluorescein（FL）, B）oregon green（OG）, C）2 ,7 -dichlorofluorescein（DCF）, D）4 ,5 -dibromofluorescein（DBF）, E）5-carboxyfluorescein（5-CF）, F）6-carboxyfluorescein（6-CF）, G）5-（and 6）-carboxy-2 ,7 -dichlorofluorescein（CDCF）, H）2 , 7 -bis
（2-carboxyethyl）- 5（and6）-carboxyfluorescein（BCECF）, I）calcein,J）fluo-3, K）8-fluorescein-cAMP（8-FcA）．文献 4）より引用．

rescein，8-FcA）と同等以上であることを明らかとした（図 3）．
中でも OATP1B1 に対して最も大きな取り込み活性を示し，かつ，検出感度の点でも最も優れた DCFに着目し，DCF が果たして OATP1B1 阻害評価にE2G の代替として用いおいて OATP 基質薬や［3H］ることが可能か否か検討した．その結果 DCF を基質として用いて得られる各阻害剤の Ki 値と［3H］E2Gを基質として用いて得られる Ki 値の間には非常に良好な 1：1 の相関があることが確認された（図 4）．
さらに DCF と E2G は互いに競合阻害することから，いずれも OATP1B1 の同一の結合部位を介して取り込まれることが示唆された．以上より新規蛍光プロ
E2G や臨床基質薬の代替とーブ基質 DCF は，［3H］して多検体評価に応用可能であることが示され，本阻害試験方法を用いることで薬物間相互作用リスクの低いより安全な医薬品の創出に，創薬初期から貢図 4 ［3H］E2G, DCF をプローブ基質として用いて得られた OATP1B1 に対する Ki 値の比較
13 化合物（1, E1S；2, CsA；3, BSP；4, ritonavir；5,rifampin；6, tacrolimus；7, erythromycin；8, E2G；9,ketoconazole；10, TCA；11, verapamil；12, gemfibrozil；13, probenecid）の OATP1B1 に対する Ki 値を，2つのプローブ基質（RI 標識体［3H］E2G，および蛍光プローブ基質 DCF）に対して算出し，Ki 値を基質間で比較した．文献 4）より引用．

献できるものと期待される．

薬 剤 学 Vol. 76, No. 5 (2016)3157．おわりに引

これら一連の研究を開始した頃は，自分の興味の赴くまま夢中に実験を行っていた．最近は自分の興味は勿論，創薬現場における顕在的または潜在的なニーズを満たす研究を行いたいと考えている．例えば前臨床で薬物間相互作用リスク評価を実施する際には，医薬候補品のヒト体内動態予測が必要である．
ヒト体内動態予測は薬物間相互作用だけでなく，臨床薬効量推定や安全域の議論にも関係するため非常に重要である．特にトランスポーター基質のヒト体内動態予測は難度が高いが，大いにやりがいのある研究だと感じ，現在意欲的に取り組んでいる．
また私には企業研究者として社業に貢献するだけでなく，科学の発展に貢献する責任があると感じている．私の発信できる情報は限られているかもしれないが，継続的に情報を発信し，薬物動態分野の発展の一助となりたいと考えている．

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用文献1) J. Noé, R. Portmann, ME. Brun, C. Funk, Substrate-dependent drug-drug interactions between
gemfibrozil, fluvastatin and other organic anion-transporting peptide (OATP) substrates on
OATP1B1, OATP2B1, and OATP1B3, Drug Metab.
Dispos., 35, 1308–1314 (2007).
2) S. Izumi, Y. Nozaki, T. Komori, K. Maeda, O. Takenaka, K. Kusano, T. Yoshimura, H. Kusuhara, Y.
Sugiyama, Substrate-dependent inhibition of organic anion transporting polypeptide 1B1: comparative analysis with prototypical probe substrates
estradiol-17β-glucuronide, estrone-3-sulfate, andsulfobromophthalein, Drug Metab. Dispos., 41 ,1859–1866 (2013).
3) S. Izumi, Y. Nozaki, K. Maeda, T. Komori, O. Takenaka, H. Kusuhara, Y. Sugiyama, Investigation of
the impact of substrate selection on in vitro organic anion transporting polypeptide 1B1 inhibition
profiles for the prediction of drug-drug interactions,
Drug Metab. Dispos., 43, 235–247 (2015).
4) S. Izumi, Y. Nozaki, T. Komori, O. Takenaka, K.
Maeda, H. Kusuhara, Y. Sugiyama, Investigationof fluorescein derivatives as substrates of organic
anion transporting polypeptide (OATP) 1B1 to develop sensitive fluorescence-based OATP1B1 inhibition assays, Mol. Pharmaceutics, 13, 438–448(2016).

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