ニワトリ PGCs の培養培地組成
基礎培地: Avian Knockout DMEM
B-27 serum free supplement
1X
100x Glutamax (35050-038)
1X
100x NEAA (11140-050)
1X
EmbryoMax® Nucleosides
1X
100x Sodium Pyruvate
0.2X
ß-mercapotethanol
100 µM
Penicillin-Streptomycin
20 U/ml
Activin A
62.5 ng/ml
bFGF
4 ng/ml
Heparin
100 µg/ml
Ovotransferrin
5 µg/ml
1. 準備
・ Avian Knockout DMEM
Invitrogen (Custom order #041966570M)
Whyte ら（Stem Cell Report 5: 1171-1182 (2015)）に基づくオーダーメイド.
(250 mOsm/kg, 12.0 mM glucose, calcium chloride free)・ B-27 serum free supplement (10 mL)
Life Technologies (17504-044)
・ 100x Glutamax (35050-038)
Life Technologies (35050-038)
・ 100x NEAA (11140-050)
Life Technologies (11140-050)
・ EmbryoMax® ES Cell Qualified Nucleosides (100X)
Millipore (ES-008-D)
・ 100x Sodium Pyruvate (11360-039)
Life Technologies (11360-039)
・ ß-mercapotethanol 50mM (20 mL)
Life Technologies (31350-010)
・ Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100mL
Thermo Fisher (15140122)
・ Recombinant Human/Murine/Rat Activin A (Insect derived) 10μg
・ Recombinant Human FGF basic (157 aa) Protein 25μg
・ Albumin from chicken egg white 1g (Ovalbumin)
・ Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa
・ Conalbumin from chicken egg white (= Ovotransferrin)

Peprotech (120-14)
R&D System (234-FSE-025)
Sigma (A5503-1G)
Sigma (H3149-250KU)
Sigma (C7786-100MG)※基礎培地は通常の KO-DMEM でも代⽤できるが、PGC が凝集しやすくなる。特に雌の PGC は樹⽴・培養共に困難になる
2. 各種ストック溶液の作成
Ovalbumin (20 %)1) 15 mL チューブ内に準備した Avian KO DMEM (1 mL) に Ovalbumin (200 mg) を加える
2) 完全に溶解するまで振とうする
3) シリンジフィルター (0.22 µm) でろ過する
4) 分注して 4℃保管
hActivin-A (25 μg / mL)1) 0.1% Ovalbumin 溶液を準備 (20% Ovalbumin 溶液 (10 μL) を 超純⽔ (2 mL) で希釈する)

2) シリンジフィルター (0.22 µm) でろ過する
3) Activin (粉末: 10 μg) のバイアルを遠沈する
4) 3) のバイアルに 0.1 % Ovalbumin 溶液 (400 μL) を加えて懸濁する
5) 分注して-80℃保管
hFGF-2 (25μg / mL) BSA 含有
1) 0.1% Ovalbumin 溶液を準備 (20% Ovalbumin 溶液 (10 μL) を 超純⽔ (2 mL) で希釈する)
2) シリンジフィルター (0.22 µm) でろ過する
3) FGF (粉末: 25 μg) のバイアルを遠沈する
4) 3) のバイアルに 0.1 % Ovalbumin 溶液 (1000 μL) を加えて懸濁する
5) 分注して-80℃保管
Heparin (50 mg / mL)1) 15 mL チューブ内に準備した Avian KO DMEM (2 mL) に heparin (100 mg) を加える
2) 完全に溶解するまで振とうする
3) シリンジフィルター (0.22 µm) でろ過する
4) 分注して 4℃保管
Ovotransferrin (10 mg / mL)1) 15 mL チューブ内に準備した Avian KO DMEM (1 mL) に ovotransferrin (10 mg) を加える
2) 完全に溶解するまで振とうする
3) シリンジフィルター (0.22 µm) でろ過する
4) 分注して 4℃保管
3. 基礎培地ストック (50 mL)・ 47 mL: Avian Knockout DMEM (Invitrogen; Custom order #041966570M)
・ 1 mL: B-27 supplement (RA および Insulin 含有)
・ 500 μL: 100x Glutamax
・ 500 μL: 100x NEAA・ 500 μL: EmbryoMax
・ 100 μL: Pyruvate・ 100 μL: β-mercaptoethanol (Invitrogen)・ 100 μL: Pen-strep (Invitrogen)4. サイトカインミックスストック (培地 100 mL 分)
・250 μL: hActivin-A
・16 μL: hFGF-2
・200 μL: Hparin・200 μL: chicken serum
・50 μL: Ovotransferrin
5. 培地の調整 (10 mL)
基礎培地 10 mL に対して 7μL のサイトカインミックスを添加 （FAcsOT medium）
6. PGC の培養継代培養
1) 浮遊培養。標準は 2 ⽇に 1 度約 2 倍に希釈
※ 24 well プレート 1 ウェルに培地 500 μL を標準とする※ 24 well プレートでは 200,000 細胞 / well まで培養可能
凍結保存
1） バイアルにマーキング（細胞名、⽇付、実験者； 蓋には細胞名を書く）
2） Cell Banker2（⾎清を含まない）で細胞ペレットを懸濁（バイアルあたり 300ul 程度）
3） 4℃に冷やしてある BICELL に⼊れ-80℃に⼊れる（ひっくり返らないように⼊れる）
4） 翌⽇細胞ストックボックスに移す※24 ウェル x2 程度をバイアル 1 本に保存。

初代培養
1) 48 well プレートに培地を 300 μL ずつ分注する
2) ニワトリ 2 ⽇胚の背側⼤動脈および周縁静脈からガラスピペットで採⾎する
3) 回収した⾎液を培地に移す (1 胚 / 1 well)4) CO2 濃度 5%、37℃の条件で培養する※ 採⾎後、胚を回収して PCR を⽤いた性判別を⾏う
培地交換
1) 2 ⽇に 1 度、培地の上清を 90 μL ずつ丁寧に除去し、新鮮な培地を 100 μL ずつ加える※ 2 週間を⽬処に培養し、選別を⾏う。PGCs が増殖していない well は廃棄する。
※ 細胞数が 50,000 を超えたら、24 well プレートで継代培養する