薬 剤 学,68(4),252―257(2008)≪若手研究者紹介≫

リポソーム技術を駆使したがん治療を目指して

鈴木亮

RyoSuzuki

帝京大学薬学部生物薬剤学教室

1．はじ

め

京都薬科大学に岡田直貴助手（現大阪大学大学院薬学研究科講師）からも多くのご助言をいただきなが著者がリポソームに初めて出会ったのは，東京薬ら，生体内の環境に応じて生理活性物質を分泌する科大学薬学部 4年生のときに第一薬剤学教室（現薬機能性細胞を薬物キャリアーとして利用していくた物送達学教室）に配属されたときであった．その当めの「細胞性製剤」とも言うべき新たな製剤設計に時，土屋晴嗣教授（現日本薬科大学教授），新槇幸彦関する研究を行った．大学院生活の 5年間で様々な助教授（現東京薬科大学薬学部教授），原寿史助手

研究テーマに触れるチャンスをいただき，さらに研（現大正製薬株式会社），有馬英俊助手（現熊本大学

究室内において先生や先輩方とのディスカッション薬学部教授）からリポソームを用いたドラッグデリをさせていただいたことが，現在の著者の礎になっバリーシステム（DDS）に関する研究の面白さをおているのは間違いない．博士課程修了後，東レ株式教えいただいた．そしてリポソームについて勉強す会社にて DDSに関する研究を 3年間行い，その中でる中で，リポソームにセンダイウイルスの膜融合能大学において DDSに関する基礎研究がしたいといを付与した膜融合リポソームに興味を持つようになう思いが強くなり，現在所属している帝京大学薬学り大阪大学大学院薬学研究科薬剤学分野の修士課程部生物薬剤学教室の助手となった．現在では丸山一に進学した．眞弓忠範教授（現神戸学院大学薬学部雄教授，宇都口直樹准教授のご指導の下，薬学教育教授，大阪大学名誉教授），中川晋作助教授（現大阪とリポソームに関する研究に没頭する毎日を過ごし

大学大学院薬学研究科教授），堤康央助手（現大阪ている．今回，若手研究者紹介のコラムを執筆する

大学大学院薬学研究科教授，独立行政法人医薬基盤チャンスをいただいたので，現在進めているリポ研究所

ソーム研究について紹介させていただく．

創薬プロテオミクスプロジェクト プロ

ジェクトリーダー），微生物病研究所

博士研究員 水口裕之先生（現独立行政法人医薬基盤研究
所 遺伝子導入制御プロジェクト

2．アクティブターゲティング型リポソームを用いたがん治療戦略 1）

プロジェクトリーダー）のご指導の下，修士課程の 2年間で膜融脂質二分子膜からなるリポソームは，膜モデルや合リポソームを用いた遺伝子導入に関する研究をDDSキャリアーとして幅広い分野で注目されてき行った．この 2年間ですっかり研究の面白さに魅了た．このリポソームは生体の構成成分であるリン脂され，博士課程への進学を決めた．博士課程では，質を主成分としているため，毒性が低いことが知ら著者紹介：平成 8年東京薬科大学薬学部卒業，平成 10年大阪大学大学院薬学研究科博士前期課程修了，平成13年同博士後期課程修了，薬学博士（大阪大学）．同年
東レ株式会社入社，平成 16年帝京大学薬学部助手，平成 19年帝京大学薬学部助教，現在に至る．研究のモッ
トー：激烈に努力すること．趣味：ドライブ，旅行．
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れている．しかし一方で，生体内での不安定性や静脈内投与後の肝臓や脾臓などの細網内皮系（RES）への取り込みがリポソームの実用化における課題とされていた．この課題を解決する手段として，表面を polyethyleneglycol（PEG）で修飾したリポソー

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ム（PEG-リポソーム）が開発され，RES回避可能

海外において優れた治療成績が報告されており，な画期的なリポソームとして脚光を浴びている．こ

2005年に本邦でも「エルプラット」として薬価収載の PEG-リポソームは，リポソーム表面の PEGによされた抗がん剤であるオキサリプラチン（lOHP）り補体系たん白質の吸着が抑えられるため RESにを TF修飾 PEGリポソームに封入することとした．

捕捉されにくくなり，血中での安定性および滞留性

この l
OHPはホリナートおよびフルオロウラシルに優れている．一方，腫瘍組織では一般に血管透過との併用療法（FOLFOX4法）として使用した場合性が亢進しているため，全身投与された PEG-リポの有用性が報告されているが，単剤投与による有用ソームは腫瘍組織に集積しやすい．この現象は En-性は確立されていない．これは，lOHPのがん細胞

hancedPermeabilityandRetention（EPR）効 果へのデリバリー効率が低いことに起因していると考によるもので，PEGリポソームのパッシブターゲえられる．そのため，上述の TF修飾リポソームにティングメカニズムとして知られている．2007年

lOHPを封入し，がん細胞に積極的にデリバリーでには EPR効果を期待したドキソルビシン封入 PEGリポソーム製剤（Doxil）が本邦でも認可された．この Doxilは，副作用を軽減し，がん細胞に対する抗がん作用を増強しうる有望な治療戦略とされている．しかし一方で，皮膚，特に圧迫部位への Doxilの集積が認められ，手掌・足底発赤知覚不全症候群などの予期せぬ副作用が報告されている．したがって，腫瘍組織へのパッシブターゲティングだけでは抗がん剤の副作用を完全に拭い去ることが困難であると考えられている．それゆえ，PEGリポソームの有用性を最大限に引き出すためには，目的細胞のみに薬物送達できるアクティブターゲティング能をも付与した次世代型リポソーム製剤の開発が望まれている．
がん細胞に対するアクティブターゲティング型リポソームを開発するためには，リポソーム表面にがん細胞を特異的に認識する抗体やリガンドなどのターゲティング分子を修飾する必要がある．これまでにがん細胞において特異的に発現もしくは発現亢進する分子について多数の報告がなされている．その中で著者らは，正常細胞に比べ多種類のがん細胞で発現が亢進しているトランスフェリンレセプターに着目した．このレセプターは細胞内への鉄の取り込みに関与するレセプターであり，レセプター介在型エンドサイトーシスによりトランスフェリン（TF）を細胞内に取り込む機能を有している．したがって，TFを PEGリポソーム表面に修飾した TF
修飾 PEGリポソームを利用すれば，トランスフェリンレセプターを過剰発現するがん細胞へのアクティブターゲティングが可能になると考えられる．
そこで，TF修飾 PEGポソームの抗がん剤デリバリーにおける有用性を評価した．今回の検討では，

図1 l
OHP封入 TFPEGリポソーム投与後の腫瘍内 l
OHP量および抗腫瘍効果（a）l
OHP投 与 後 の 腫 瘍 内 l
OHP濃 度 推 移：Co
lon26細胞を皮内移植した担がんモデルマウスにl
OHP量として 5mg/kgとなるように単回尾静脈内投与し，任意の時間で腫瘍組織を採取後，
l
OHP量を測定した．
（b）l
OHP投与後の抗腫瘍効果：Co
lon26細胞を皮内移植した担がんモデルマウスに l
OHP量として 5mg/kgとなるように腫瘍移植後 9日目と12日目に尾静脈内投与し，その後の腫瘍体積を測定し腫瘍移植後 9日目の腫瘍体積に対する腫瘍体積増加比を算出した．

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きれば，l
OHP単剤でも抗腫瘍効果が得られるように な る と 期 待 さ れ る．そ こ で TF修 飾 PEGリポ

3．リポソーム技術のがん免疫療法への応用 2）

ソームの有用性を評価する目的で，担がんモデルマ

近年のがん免疫に関する研究の進展に伴い，がんウスへの l
OHP封入 TF修飾 PEGリポソーム投与

免疫療法が現実的なものとなりつつある．このがんによる腫瘍への l
OHPの集積性および抗腫瘍効果免疫療法を有効な治療法として確立していくためにについて検討した．まず腫瘍内 l
OHP量を測定しは，がん細胞に対する細胞傷害性 T細胞（CTL）をたところ，l
OHP単独投与群や l
OHP封入リポソー活性化することが重要である．そのためには，T細ム（PEG未修飾）に比べ，lOHP封入 PEGリポソー胞への強力な抗原提示細胞として知られている樹状ムや l
OHP封入 TF修飾 PEG-リポソーム投与群に細胞（DC）の MHCクラス I分子上にがん関連抗原おいて高い腫瘍内 lOHP量が観察された．これはを提示させる必要がある．しかし，通常外来性抗原

PEGリポソームの EPR効果によるパッシブターゲ

は MHCクラス IIにのみ提示されることが知られてティングで腫瘍に lOHPが集積したためであるとおり，がん免疫療法の成功の鍵は，外来性抗原を考えられた．さらに興味深いことに，l
OHP封入

MHCクラス Iに抗原提示を誘導可能な抗原送達

PEGリポソーム投与群において投与 72時間後に腫キャリアー開発にあると考えられている．これまで

瘍内 l
OHP量の低下が認められたものの，lOHP封に，DC上の Fcgレセプターを介して抗原を DCに取入 TF修 飾 PEGリポソーム投与群では腫瘍内 l-り込ませることで，外来性抗原が MHCクラス IにOHP量が維持されていた（図 1a）．これは，lOHP

クロスプレゼンテーションされることが確認されて

封入 TF修飾 PEG-リポソームがパッシブターゲいる．この原理を利用して抗原抗体複合体によるクティングにより腫瘍組織に集積後，がん細胞表面上ロスプレゼンテーション誘導が試みられるようにのトランスフェリンレセプターに認識され細胞内になった．しかし，この方法では抗原に対して抗体を取り込まれたためであると考えられた．次に抗腫瘍それぞれ用意する必要があるため，汎用性の点で問効果について検討したところ，l
OHP封入 PEGリ題がある．この問題を解決するため著者らは，DC

ポソーム投与群より l
OHP封入 TF修飾 PEGリポ上の Fc
gレセプターを介して積極的に抗原をデリバソーム投与群において高い抗腫瘍効果が認められたリー可能なリポソーム開発に着手した．前項で述べ（図 1b）．このことから，パッシブターゲティングとたようにリポソーム表面には標的指向性分子を修飾アクティブターゲティング能を併せ持った TF修飾することができる．そこで，リポソーム表面に IgG

PEGリポソームはがん治療における次世代型薬物分子を修飾したリポソーム（IgGリポソーム）を抗デリバリーキャリアーになるものと期待される．

原送達キャリアーとして利用することを考えた（図2）．実際にこの I
gGリポソームは invitroにおいて

図2 I
gGリポソームを用いた DCへの抗原デリバリー戦略
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DC Fcgレセプターを介したエンドサイトーシスにツールになることが示唆された．このようにリポより内在化され，内封抗原を DCに効率よく送達可

ソーム技術はがん免疫療法における抗原デリバリー能であった．また，この送達された抗原が DCのシステムへの応用も期待される．

MHCクラス I上にクロスプレゼンテーションされ，この DCをマウスに免疫することで抗原特異的 CTLが誘導できることが明らかとなった．そこで，IgG

4．リポソーム技術と超音波技術の融合による新たな遺伝子導入システムの構築 3，4）

リポソームを用いた抗原送達システムの樹状細胞が遺伝子治療は，先天性の遺伝子疾患やがんの新しん免疫療法（exvivo法）における有用性を評価した．

い治療法として期待されている．これまでに行われモデル抗原としてニワトリ卵白アルブミン（OVA）てきた遺伝子治療では，遺伝子導入効率の観点かを封入した I
gGリポソームまたは IgG未修飾リポ

ら，アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルソーム（Bareリポソーム）を作用させたマウス骨髄スベクターが利用されてきた．しかし，ウイルスベ由来 DCを 1週間隔で 2回マウスに免疫した．最終クターに関して安全性の面で危惧する報告がなされ免疫から 1週間後にモデル腫瘍として OVA発現リており，安全性が高く，容易に利用できる非ウイルンパ腫（E.
G7OVA細胞）を皮内移植し，その腫瘍スベクターが注目を集めている．一方で，非ウイル

体積を指標に抗腫瘍効果を検討した（図 3）．その結スベクターの遺伝子導入効率は一般的に低いため，果，DCのみを免疫した群，OVAのみを作用させた

この問題を解決可能な新規遺伝子導入ツールの開発

DCを免疫した群では，顕著な抗腫瘍効果は認めらが望まれている．さらに，いずれのベクターにおいれなかった．一方，OVA封入 Bar
eリポソームを作ても遺伝子導入部位を簡易的にコントロールするこ用させた DCを免疫した群において若干の抗腫瘍効とは困難であるとされている．したがって，有効性果が認められた．さらに，OVA封入 gGリポソームが高く，副作用の少ない遺伝子治療を行っていくたを作用させた DCを免疫した群では，全例においてめには，目的部位特異的に安全かつ効率よく遺伝子腫瘍の生着が完全に阻害された．なお，OVA未封導入可能なシステムの構築が求められている．そこ入I
gGリポソームを作用させた DCを免疫しても抗で著者らは，超音波造影剤である微小気泡（マイク腫瘍効果がほとんど認められなかったことより，ロバブル）を利用した超音波遺伝子導入法に着目しOVA封入 I
gGリポソームを用いた際の抗腫瘍効果た．この遺伝子導入法はマイクロバブルへの超音波は内封した OVAに対する抗原特異的 CTL誘導に起照射により誘導されるバブルの崩壊（キャビテー因するものと考えられた．以上の結果から，IgG リション）を細胞への遺伝子導入の駆動力にしている．

ポソームががん免疫療法における有用な抗原送達

すなわち，キャビテーション時に生じるジェット流

図3 I
gGリポソームを用いた DCへの抗原デリバリーによる抗腫瘍効果
各形態の OVA（15mg/mL）をパルスしたマウス骨髄由来 DCを 1週間隔で2回免疫し，最終免疫から 1週間後にモデル腫瘍である E.
G7OVA細胞をマウス皮内に移植した．その後，腫瘍体積を指標に抗腫瘍効果を評価した．
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が細胞に一過性の小孔を開け細胞膜の透過性を向上

DDSキャリアーとしての可能性・安全性・汎用性のさせることで細胞外の遺伝子が細胞内に導入され点で有用であると考えられるリポソームに着目し，る．最近では，この方法が体外からの超音波照射にリポソームを新たなバブル素材として利用するためより目的組織にのみ薬物・遺伝子デリバリーを可能の研究を始めた．そして，超音波造影ガスを封入しとする新たな DDSとして期待されている．しかし，た新規リポソーム（バブルリポソーム）を開発する

既存のマイクロバブルは直径 2～ 3mm であり形状ことができた（図 4）．このバブルリポソームの粒子的に大きく，遺伝子治療の臨床で要求される組織深径は 400～ 950nm であり，既存のマイクロバブル部に到達することは困難であると考えられる．まより小さいことが判明した．またこのバブルリポ

た，市販のマイクロバブルに対し標的指向性を付与

ソームに超音波を照射したところバブルリポソームするのも容易ではない．残念ながら多くの研究での崩壊が誘導され，様々な種類の培養細胞に遺伝子は，遺伝子送達に最適化されたバブルがないために導入できることを確認している．本方法は超音波を仕方なく市販のマイクロバブルを使用しているのが照射したときのみ遺伝子導入が誘導されるため，in現状である．したがって，これからは核酸医薬へのvivo遺伝子導入において超音波照射部位をコント応用をも見据えた新たなバブル製剤の開発が望まれロールすることで超音波照射部位特異的な遺伝子導る．そ こ で 著 者 ら は，前 項 ま で に 述 べ た よ う な

入が可能になると考えられる．そこで，バブルリポソームと超音波の併用による低侵襲的かつ組織特異的な遺伝子導入システムの確立を試みた．バブルリポソームとルシフェラーゼ発現プラスミド DNAを尾静脈から全身投与後，直ちに肝臓に向けて体外から経皮的に超音波照射した．その 1日後にマウスから各臓器を回収し，ルシフェラーゼ活性を測定した．その結果，超音波照射した部位である肝臓において高いルシフェラーゼ発現が認められた（図 5）．
このようにバブルリポソームとプラスミド DNAが図 4 バブルリポソームを用いた遺伝子デリバリーメ
カニズム（a）バブルリポソームの模式図．
（b）バブルリポソームと超音波の併用による細胞へのプラスミド DNA導入メカニズム．

血流を介して流れていたにも関わらず肝臓に遺伝子導入できたのは，バブルリポソームが超音波照射部位である肝臓部位で崩壊し瞬時に遺伝子を肝臓に導入したためであると考えられた．今回は示していな

図 5 バブルリポソームと超音波の併用による肝臓への遺伝子導入（a） バブルリポソームと超音波を利用したマウス肝臓への遺伝子導入方法．
バブルリポソーム（500mg）とルシフェラーゼ発現プラスミド DNA（100mg）を ddYマウスに尾静脈内投与し，投与後速やかに体外から肝臓に向けて超音波照射 （1MHz，1W/cm2，1分間） した．超音波照射 2日後にマウスから各臓器を回収し，ルシフェラーゼ活性測定を行った．
（b） バブルリポソームと超音波の併用により遺伝子導入したマウスにおける各組織での遺伝子発現．
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いが，著者らは同様の方法を用い超音波照射部位を目指し研究を進めている．

変更することで脾臓や脳へも遺伝子導入できることを確認している．今回示した方法は，超音波照射部

最後に本研究の遂行にご指導賜りました帝京大学

位を変更するだけで様々な組織や部位に低侵襲的か薬学部・丸山一雄先生，宇都口直樹先生，東京大学

つ特異的に遺伝子導入できる可能性を有しており，大学院工学系研究科・柳衛宏宣先生，京都大学大学

他の遺伝子導入ベクターにはない非常に簡便でユ院医学研究科・門脇則光先生，大阪大学大学院薬学

ニークな特性をもつ方法であると言える．最近で研究科・岡田直貴先生，東京薬科大学薬学部・根岸

は，超音波照射部位を数 mm オーダーでコントロー洋一先生に深謝するとともに，研究にご協力いただルできる集束超音波技術が開発されている．それゆいた学生諸子に感謝いたします．

え，将来的には上述したようなリポソーム技術と超引音波技術をうまく組み合わせることで低侵襲的かつがん組織特異的な遺伝子導入が可能となり，副作用の少ないがん遺伝子治療が確立できるものと期待される．
5．おわりに以上，最近の著者らのリポソームに関する研究について紹介した．近年，リポソーム製剤が本邦においても認可されはじめ，DDSキャリアー開発におけるリポソーム技術が注目されている．本稿で示したようにリポソームは，薬物・抗原デリバリーキャリアーとしてばかりではなく，超音波との併用による遺伝子デリバリーツールとしても利用可能であることが明らかとなった．このように，リポソーム技術を駆使することで新たなコンセプトに基づいたDDS戦略を構築できるものと考えられる．そこで
現在著者は，このリポソーム技術を利用し，有効性が高く副作用の少ない最適ながん治療戦略の構築を

用

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