特集

分析技術

究極のHPLC用C18カラムの開発を目指して
Aiming for the development of the ultimate C18 column for HPLC

一般財団法人化学物質評価研究機構 東京事業所 クロマト技術部技術課長

内田 丈晴

Takeharu Uchida (Section chief)
Chromatography Department, CERI Tokyo, Chemicals Evaluation and Research Institute,Japan (CERI)

キ ーワード01

L-column3、シリカ系耐アルカリ性Ｃ18カラム、メタルフリーカラム

はじめにングは、トルエンなどの液相中でシリル化剤を反応させる方法がよく知られていたが、このようなエンドキャッピングでは反応効率が低く、シラノール基が残存するという問題があった。そこで、CERIでは全く新しい画期的なエンドキャッピング法である

現在、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
で最もよく用いられている分離モードは、試料と固定相との間に働く疎水性相互作用の原理を用いた逆相分配クロマトグラフィーであり、充塡

高温気相エンドキャッピング法を開発し、1990年に高温気相エンドキャッピングを施したL-column ODS を開発した。この高温気相エンドキャッピング法は、高温液相中でシリル化する方剤としてオクタデシルシリル（ODS）化シリカゲルを充塡したシ法に比べて反応効率が優れているため、より多くのシラノール

リカ系逆相C18カラムが汎用的に用いられている。また、それ基を不活性化することができる1, 2）。
また、
2007年に高温気相エンドキャッピングの反応効率を更らの充塡剤の基材には、一般的にシリカゲルを用いたものが多い。その理由として、シリカゲルは機械的強度が高い、分離効率が高い、様々な修飾基を化学修飾することができ汎用性が高い、比較的安価であるなどが挙げられる。
しかしながら、基材シに向上させた高度エンドキャッピング法を開発し、それを施した

L-column2 ODS を開発した（図1）。

金属不純物を多く含んだ基材シリカも残存シラノール基とリカは耐アルカリ性が低いため、使用できる移動相のpH範囲

同様、二次的相互作用が働き分離に悪影響を及ぼすことが知が限られるという欠点を抱えている。

られており、特に分析対象物質が配位性化合物の場合、ピーク

シリカ系逆相C18カラムは、本来疎水性相互作用のみによるのテーリング及び保持時間の遅延、最悪の場合ピークが全く比較的単純な保持機構による分離であるが、残存シラノール基検出されないこともある。そのため、金属不純物を含まない基や基材シリカ中の金属不純物による二次的相互作用が働き分材シリカを用いることも重要である3）。また、エンドキャッピン

離に悪影響を及ぼすことが広く知られている。
これらの二次的相互作用以外にも、液体クロマトグラフィー/グの表面被覆が高密度であるほど、吸着性が少なくなるといわれている。

タンデム質量分析法 (LC/MS/MS)において、クロマトグラフィー管などの金属材料と相互作用し分離に悪影響を及ぼす場合もある。
ここでは、これらの欠点を克服すべく今まで開発に取り組んできた内容について簡単に紹介する。

02

エンドキャッピング

分析対象物質が塩基性物質の場合、残存シラ

図1

シリカ系逆相C18（ODS）
カラムの分離機構（イメージ）

ノール基に吸着し易く、ピークのテーリング及び保持時間の遅延の原因となる。そのため、一般的にトリメチルシリル化による残存シラノール基を不活性化するエンドキャッピ
ングが施される。1980年代後半までは一般的にエンドキャッピ
3THE CHEMICAL TIMES

特 集03

様々なアプローチで改善を目指している。ただし、残存シラノー

メタルフリーカラム

ル基についてはエンドキャッピングの反応率をいかに上げるかという比較的シンプルな方法論での対処が可能であったが、化分 析 技 術学的耐久性については、充塡剤のほとんどを占める基材自体の液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (LC/MS/MS)による生体試料の微量分析が広く行われている。
しかし、一部侵食を防ぐ必要があるため、この課題は非常に複雑で解決困難なテーマであるといえる。の化合物、特にペプチドや低分子のリン酸化合物の分析では、しかし、CERIでは独自に開発した化学的耐久性の非常に高配管やバルブなどの金属材料と相互作用し、それらのピークがいPCSシリカ（Perfect Chemical Stable Sillica）と耐久型高大きくテーリングする。一般的に、カラムは充塡剤とステンレス度エンドキャッピングにより、これらの難題の克服に成功した
L-column3 を2017年9月より供給を開始した。L-column3

製のクロマトグラフィー管、フリットと呼ばれるフィルターなどから構成されているが、これらとも相互作用し、ピークがテーリングする原因となっている。そこで、試料との相互作用が起こりにとpH 12まで使用可能な他社製カラムとの耐アルカリ性を評価するため、これらのカラムに対してトリエチルアミン（pHくいガラスライニングステンレス管とポリマー系のフリットを組12.2）及びリン酸緩衝液（pH 11.5）による通液劣化試験を行っみ合わせたメタルフリーカラムを2014年に開発した4）。

た。その結果を図3に示す。
トリエチルアミンの通液において、このカラムは金属配位性化合物のLC/MS/MS分析においBrand D及びBrand Eは200時間前後で理論段数の著しい低て、ピーク形状や感度の改善、キャリーオーバーの低減、定量範下が認められた。一方、250時間以上安定していたBrand B及（図2）。
囲の拡大 、不確かさの低減 など有効性が確認されたびBrand Cも、リン酸緩衝液の通液では150時間以内に著しい

また、メタボロミクスやリピドミクスなどの分野でも使用されつ低下が認められた。これはカラムがアルカリ性移動相の種類に5）6）つある。

21

いずれのアルカリ性移動相の通液条件においても安定していることから、非常に耐アルカリ性が高いことがわかる。つまり、
理論段数（ナフタレン）の維持率（％）

ステンレスカラム

L-column3 はも大きく影響を受けるということを示している。

メタルフリーカラム1充塡剤
カラムサイズ
溶離液

0100

通液時間
（h）

200

250

L-column3

L-column3

通液劣化試験条件
Brand A50
移動相54 mMトリエチルアミン（pH12.2）/メタノール（90/10）Brand B

Brand C
0.2 mL/min、：50℃
50Brand カラム温度
D
Brand E
ナフタレン測定条件
Brand A
Brand B （40/60）
0移動相
水/アセトニトリル
0Brand C 100
流速0.2mL/min、
カラム温度
：40℃
通液時間
（h）
00100

流速

（左）
ステンレスカラム、（右）
メタルフリーカラム

L-column3

200

250

200

通液時間
（h）

100

図2 カラム材質の違いによるリン酸化ペプチドの分析結果

04

0100
充塡剤
C18 5 μm
カラムサイズ 100
2.0 or 2.1×150 mm

理論段数（ナフタレン）の維持率
（％）

流速
カラム温度
試料
試料濃度
注入量
検出

L-column2 ODS, 3 μm
メタルフリーカラム2.0 mm I.D. or ステンレスカラム2.1mm I.D., 150 mm L.
A：0.1% ギ酸; B：アセトニトリル A/B：95/5-50/50 (0-10min)
0.2 mL/min
40℃
リン酸化ペプチド（1：NVPL-pY-K、2：HLADL-pS-K）
500 fmol/μL
3 μL
ESI-MS/MS(+)

Brand A
Brand B
Brand C
Brand D
Brand E50

理論段理数（タナレフンタ）の率（論ナ段フ数（レ維ン持）の維％持）
率（％）

分析条件

L-column3100

2L-column350

0Brand A
Brand B
Brand C

0100200

通液時間（h）

HPLC分析においてカラムは常に移動相に晒され続ける。このことはシリカ系逆相C18カラムなどの充塡剤表面が常に加水分解のリスクに晒されているということを意味する。シリカ系
逆相C18カラムは、シリカゲル表面をアルキル基で高密度に修飾しているため、中性移動相での耐久性は十分に維持される。
しかし、アルカリ性移動相となると基材シリカは簡単に侵食されはじめ、やがてカラム先端に隙間が生じカラム性能は著しく低下する。シリカ系カラムにおけるアルカリ性の耐久性の向上について、残存シラノール基の問題と同様に各カラムメーカーも4充塡剤
カラムサイズ

C18 5 μm
2.0 or 2.1×150 mm

通液劣化試験条件
移動相
流 速

10 mMリン酸緩衝液（pH11.5）/メタノール（90/10）0.2 mL/min、カラム温度：40℃

ナフタレン測定条件
移動相
流 速水/アセトニトリル（40/60）0.2 mL/min、カラム温度：40℃

図3 アルカリ性移動相の通液劣化試験
上）54 mMトリエチルアミン（pH12.2）/メタノール（90/10）下）
10 mMリン酸緩衝液（pH11.5）/メタノール（90/10）THE CHEMICAL TIMES
9.5である。pH 2の移動相では構造中のピペリジノ基のほとんどが解離し、カルボキシル基は解離が抑えられた状態となり、しており、塩基性物質、配位性化合物及び酸性物質の全てに対られた状態で、カルボキシル基がほとんど解離している。また、してシャープなピークを示す。図4に、塩基性物質である抗うpH 7の移動相では、構造中のピペリジノ基及びカルボキシル

L-column3 は極限まで残存シラノール基を不活性化
また、pH 11の移動相では逆に構造中のピペリジノ基は解離が抑え基の両方がほとんど解離しているため、保持時間が最も小さく

L-column3 と同等の耐アルカリ性をピークが得られた。一方、

L-column3 を用いれば、なる。このような両性物質に対しても、

L-column3 は多岐の物質にわたりオールラウンド果であった。

目的に応じた分析条件を選択することができる。

示したBrand Aは、吸着性に関してはL-column3 より劣る結分 析 技 術

L-column3 は左右対称なシャープなつ剤の分析結果を示す。

特 集L-column3 は非常に幅広いpH領域（pH 1～pH 12）でメソッド設計が可能なカラムといえる。

広範囲な移動相条件から移動相のpHに制約されることなく、に最高レベルの低吸着性を発揮するカラムといえる。
12a) pH11

3T.f.(3) =1.69

Brand A

T.f.(3) =3.76

Brand BT.f.(3) =1.60

Brand C

T.f.(3) =1.29

L-column2

T.f. (3 ) =1.30

L-column3

0510Time (min)

分析条件
充塡剤
カラムサイズ
移動相流 速試 料
注入量15b) pH720c) pH2

C18 5 μm
4.6×150 mm
アセトニトリル/25 mMリン酸緩衝液（pH7）（35/65）
1 mL/min、
カラム温度：40℃
1. パロキセチン
2. シタロプラム
3. フルオキセチン
1 μL

図4低吸着性（塩基性物質）

CH3
H3COCOOH

FF05N

2. イブプロフェン

OHH3C

CH3HOF

L-column3 で広がるアプリケーション

OHCH3O
N

O

CH3

NH2

7. フルボキサミン

5. フェキソフェナジン

分析条件

L-column3 は非常に幅広いpH領域（pH 1～12）
でメソッド

カラム
移動相

L-column3 C18 5 μm, 2.1×150 mm
A: アセトニトリル; B:25 mM リン酸緩衝液（pH2,7,11）

能を十分に発揮することができる。それは、イオン性化合物の流速
試料A/B: 20/80-70/30 (0-20 min)
0.3 mL/min、カラム温度：40℃
1. ケトプロフェン（酸性）設計が可能なことから、イオン性化合物の分析に対してその性解離状態が移動相のpHによって変化し、保持が大きく変化する

2. イブプロフェン（酸性）
3. インドメタシン（酸性）からである。そのため、移動相のpH変化が分離改善に大きく寄4. イソブチルパラベン（弱酸性）

L-column3 を用いてイオン性化合物を分析し与する。図5に、

5. フェキソフェナジン（両性）たものを示す。移動相のpHを2、7、11に変更することで、イオン性化合物の保持時間を変化させることができる。

酸性物質であるイブプロフェンのpKa は4.5であることから、

pH 2の移動相では解離が抑えられた状態となるので、保持時間は最も長くなる。一方、pH 7及びpH 11の移動相ではほとんど解離しているので、保持時間は短くなる。
塩基性物質では、酸性物質と逆の傾向となる。塩基性物質であるフルボキサミンのpKa は9.2であることから、pH 2及びpH

6. トリプロリジン（アルカリ性）
注入量

7. フルボキサミン（アルカリ性）1 μL

図5 L-column3 を用いた移動相のpHによるイオン性化合物の分離パターン変化

現在、医薬品の開発において原薬中の不純物に関するガイドラインが発行されており、新規医薬品の申請時に、不純物や医薬品の保存中に生成する分解生成物等についての分析法、7の移動相ではほとんど解離しているので保持時間が短くな構造決定及び安全性評価をしたものを添付する必要がある。

るが、pH 11の移動相では解離が抑えられた状態になることか

図6に、塩基性医薬品であるホモクロルシクリジンの分解生成ら、保持時間が最も長くなる。この挙動は他の塩基性物質及び物を分析した例を示す。それぞれのクロマトグラムを比較する酸性物質でも同様の傾向が見られた。と、pH 11の移動相が一番多くピークを検出することができ一方、両性物質であるフェキソフェナジンのpKa は4.3及びた。また、移動相のpHによりピーク数が異なることから、pHを
5

THE CHEMICAL TIMES

特 集
分 析 技 術高くすることで今までは分離することができなかった不純物のら購入したものを用いた。その結果を図8に示す。上側のクロピークを分離する可能性が示唆され、pH 11でも分析可能なマトグラムが移動相にアンモニア水を使用して分析したもの、れた。また、移動相のpHが高くなるほど負荷量によるピーク形を使用した公定法で分析したものである。これらを比較すると、

L-column3 が、医薬品の不純物分析に有効であることが示さ下側のクロマトグラムが移動相にギ酸アンモニウム及びギ酸状の変化が小さくなり、pH 11の移動相では高負荷量の試料アンモニア水を使用することで、公定法と比較して三成分ともを注入してもシャープなピークとして検出することができた。

感度を向上し、OAとDTX-2間の分離も改善することができた。

このことから、塩基性物質を大量に負荷させる分取精製においこのことから、アルカリ性移動相を用いたオカダ酸群の分析にL-column3 が有効であることが確認された。

L-column3 が有効であることが示された。て、

1a) 検討法（アルカリ性移動相）

131：OA2：DTX-2

13：DTX-112c) pH1151b) pH744a) pH245017.5Time (min)

分析条件

35カラム
移動相

L-column3 C18 5 μm, 2.1×150 mm
A: アセトニトリル; B:25 mM リン酸緩衝液（pH2,7,11）

流 速試 料
注入量

A/B: 5/95-75/25-75/25 (0-30-40 min)
0.2 mL/min、カラム温度：40℃
10 g/L ホモクロルシクリジンの分解生成物
5 μL

図6OH

No.
123HOOO103b) 公定法

12O
OR1H0OHHO

R1-H-H-H

分析条件

OOHR2-CH3-H-CH3R3R3-H-H-CH3R4R4-H-CH3-H

ディノフィシストキシン-1：関東化学株式会社製（製品番号49915-06、CAS.
No 81720-10-7）
ディノフィシストキシン-2：関東化学株式会社製（製品番号49915-07、CAS.
No 139933-46-3）

図710OO

化学物質
オカダ酸（OA）
ディノフィシストキシン-2（DTX-2）
ディノフィシストキシン-1（DTX-1）

5Time (min)R2オカダ酸：関東化学株式会社製（製品番号49915-09、CAS.No 78111-17-8）

オカダ酸群の化学構造

次に、L-column3を用いて下痢性貝毒であるオカダ酸群を分析した例を紹介する。オカダ酸（OA）や異性体であるディノフィシストキシン（DTX）
は、構造中にカルボキシル基を有する毒素である（図7）。公定法では、移動相にギ酸アンモニウムやギ酸を加えて酸性にすることで、カルボキシル基の解離が抑制された状態で分析をしている。
しかし、マトリックス効果により感度が不安定であるという問題がある。
最近では、LC/MS/MS分析にアルカリ性移動相を用いている例も報告されている7）。これは、移動相をアルカリ性にすることでカルボキシル基が解離状態となるため、イオン化効率が改善されて感度を向上することができるからである。我々も、移動相にアンモニア水を用いたアルカリ性移動相でオカダ酸群を分析した。分析に用いたオカダ酸群は、関東化学株式会社か65Time (min)ホモクロルシクリジンの分解生成物の分析

OH0カラム
溶離液

L-column3 C18 3 μm, 2.1×150 mma) A：5 mM アンモニア水（pH10.5）; B：アセトニトリル/5 mM
アンモニア水（pH10.5）（95/5）b) A：2 mM ギ酸アンモニウム及び50 mM ギ酸; B：アセトニトリ
ル/2 mM ギ酸アンモニウム及び50 mM ギ酸（95/5）

流速
試料濃度

A/B：60/40-60/40-100/0-100/0 (0-2.5-7.5-12.5 min)
0.2 mL/min、カラム温度：40℃
380 μg/L（ OA）、840 μg/L（ DTX-2）、850 μg/L（ DTX-1）、注検出

入量：5 μL
ESI-MS/MS(-)

図8

L-column3 を用いたオカダ酸群の分析a）
検討法、b）
公定法

THE CHEMICAL TIMES
参考文献

特 集06

おわりに1) Y. Sudo, J. Chromatogr. A 737(2), 139-147 (1996).
2) Y. Sudo, J. Chromatogr. A 757(1-2), 21-28 (1997).
3) Y. Sudo, T. Wada, J. Chromatogr. A 813(2), 239-246 (1998).

について紹介してきた。いずれのカラムも様々な試行錯誤の中で開発できたものである。
しかし、その中でも耐アルカリ性カラムの開発は、基材シリカ自体が持つ化学的特徴に関わることであるため、最もハードルの高いものであった。そのような中、近年の耐アルカリ性カラムの登場は、先に紹介したように今後の

4) H. Sakamaki, T. Uchida, L. W. Lim, T. Takeuchi, J. Chromatogr. A 1381,125–131 (2015).

分 析 技 術

本稿では、これまでCERIで開発したシリカ系逆相C18カラム

5) H. Sakamaki, T. Uchida, L. W. Lim, T. Takeuchi, Anal. Sci. 31(2), 91–97(2015).
6) S. Shibayama, H. Sakamaki, T. Yamazaki, A. Takatsu, J. Chromatogr. A1406, 210–214 (2015).
7) A. Gerssen, P. P. J. Mulder, M. A. McElhinney, J. de Boer, J. Chromatogr.
A 1216(9), 1421-1430 (2009).

HPLC分析、LC/MS/MS分析等において広がりを持たせることができる重要なツールの一つとして期待できる。
しかしながら、シリカ系逆相C18カラムが登場して以来、耐アルカリ性が低いということが周知の事実として広く認知されていたため、アルカリ性移動相を使用したアプリケーションデータは酸性及び中性移動相と比べて遥かに少ないのが実情であり今後の課題である。

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