薬 剤 学, 70 (6), 309‑313 (2010)≪若手研究者紹介≫

生体バリアの分子基盤を利用した創薬研究

近 藤 昌 夫*

Masuo Kondoh

大阪大学大学院薬学研究科

問を徹底的に叩き込まれた．細胞生物学に立脚した

1．は じ め に薬剤学を志向する研究生活を送る中で，同じサイト

オーストラリアの動物学者ローレンツは，動物のカインの刺激であっても細胞によって細胞内シグナ

生活史のある特定の時期に特定の物事がごく短時間

ル伝達経路が異なり，その結果として刺激に対してで覚えこまれその記憶が長期間に渡り持続する学習

相反する反応が惹起される場合もあることを知り，現象「刷り込み」を見出している．小職の研究にお細胞によって顔ばかりでなく細胞内も異なることにける刷りこみは，学部 3 回生の時に恩師の生物薬剤非常に興味を惹かれた．その当時の私の知識では，学の講義の中で聞いた「細胞製剤：細胞を敬え，細当時の薬剤学は細胞表面の議論に終始しているよう胞に学べ」という言葉である．本稿では，恩師によに思え（後に単なる勉強不足であることが分かった

る刷り込みを経て生体バリアの分子基盤を利用したが），『1）細胞内の物質輸送の様子を見る，2）細胞創薬研究に至るまでの経緯を振り返ってみたい．の時間（細胞周期）を学ぶ，3）細胞内でのシグナ

入学後テニスに明け暮れていた小職は 3 回生に進ル伝達の様子を見る』という 3 点について基礎力を学してから，少しずつ研究室配属を考え始めるよう身に付けた上で最終的に『独自の細胞製剤を開発すになっていた．小職なりに「未来の薬」について思る』という戦略を立て，博士課程在学中に理化学研案してみたものの，キックサーブやトップスピンロ究所抗生物質研究室に国内留学し，細胞周期阻害剤ブに関する知識では薬学に関するアイデアが思い浮に関する研究に従事した．その後，徳島文理大学薬かぶはずもなかった．小職なりに行き詰まりを感じ学部において，重金属や酸化的ストレスに対する生ていた矢先，恩師の生物薬剤学の講義の中で，「細胞体応答反応に関する研究に携わり分子・細胞・個体製剤」という言葉を聞き，全身から鳥肌が立つようレベルでの研究実施方法に関する基礎を多くの研究な感動を覚えた．恩師は講義の中で，「自分の置かれ者からご教示頂き，同年代の研究者と「研究のオリた「場所」と「時間」に適合しつつ恒常性を維持しジナリテイーとは？」というテーマを肴に酒席におている細胞が究極の剤形であること，この細胞からいて口泡を飛ばす議論を繰り返した．このときの議学ぶことにより必要な時に，必要な場所に，必要な論仲間は，医学部，農学部，理学部，工学部など研量だけ薬を運ぶ DDS 技術の開発が可能になること」

究文化の異なるモザイク集団であった．振り返ると，を熱く語られていた．大学院から恩師の研究室に入この議論が小職の研究哲学をある程度形づくっていり，「細胞製剤：細胞を敬い，細胞に学ぶ」という学たように思う．

*平成 10 年徳島文理大学薬学部助手，平成 14 年昭和薬科大学講師，平成 18 年大阪大学大学院薬学研究科助教授を経て平成 19 年 4 月より同大学准教授．研究テーマ：
生体バリアを利用した創薬研究．趣味：テニス，ジョギ ン グ， 散 歩． 連 絡 先：〒565–0871 吹 田 市 山 田 丘
1–6 E-mail：masuo ＠ phs.osaka-u.ac.jp

そして 2002 年 4 月に昭和薬科大学薬剤学教室に移動になったのを機に，独自の創薬研究領域の立ち上げに着手することを決意した．

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組織特異性が認められ，claudin-1 は皮膚バリア，

2．こ れ ま で

claudin-5 は血液脳関門バリアを担っている．さら独自の創薬研究領域の立ち上げを決意した時に思に，ヒトでは 12 種類の癌において発現異常が認めい浮かんだ言葉が，「細胞を敬え，細胞を学べ」といられること，粘膜免疫組織に高発現していること，う恩師の教えであった．小職がこの世界に飛び込むウイルスの感染受容体としても機能していることかきっかけとなったこの言葉を念頭に置き，まず「どら，claudin を標的とした薬物吸収促進法，癌ターの細胞から学ぶか？」ということ考え，①創薬研究

ゲティング法，粘膜ワクチン，抗ウイルス薬の開発において重要な細胞であること，②創薬研究領域になど，新たな創薬研究領域創成の可能性が強く示唆

おいて未開拓の分野が残されていること，③活用すされた．しかしながら，claudin は抗原性が低い上る細胞生物学的知見が国産であること，④温故知新に立体構造が解析されておらず，抗体を含めて clau-という基本方針を設定した上で，細胞生物学の教科

din binder の創製は著しく立ち遅れており，claudin

書を紐解き，上皮細胞に注目することにした．

を利用した創薬研究は皆無に等しいのが現状であっ周知のように上皮細胞は生体内外・組織内外を隔た．

てるバリアとして機能していること，悪性腫瘍のウエルシュ菌下痢毒素（CPE）はヒトの食中毒を90% が上皮由来であること，多くの病原性微生物の引き起こすことから細菌学の分野で詳細な解析が進侵入門戸となっていることから，上皮細胞は薬物吸められており，97 年に CPE 受容体が同定されてい収，癌治療や感染症治療・予防における創薬ターゲたものの，本受容体の生理的役割についての解析はットとして有用な性質を有している．上皮細胞を標遅々として進展していなかった．99 年月田グループ的とした創薬研究としては，80 年代より吸収促進剤により，CPE 受容体が claudin-4 であること，CPEが研究開発されているものの，実用化された吸収促の受容体結合領域断片（C-CPE）が細胞傷害性を伴

進剤はカプリン酸ナトリウムのみであり，非特異的うことなく claudin-4 に結合し claudin-4 バリア機な物質の流入に起因する安全性確保が困難であるこ能を阻害することが報告され，claudin が TJ バリアとから paracellular route を介した薬物吸収促進法機能を担っていることが実験的に初めて証明されての限界が指摘されている部分もあった．上皮細胞生いた．小職は，徳島文理大在職中にウエルシュ菌研

物学の分野では，既に 60 年代には tight junction

究の世界的権威である櫻井純先生から，細菌毒素の（TJ）によって paracellular route がシールされて持つ特異性について薫陶を受けていたこともあり，いることが知られていたが，TJ 分子基盤の解明は遅この月田グループの報告を読んだ時に C-CPE を利れており，ようやく 98 年になって TJ シールが膜蛋用することで claudin を標的とした創薬研究を展開白質によって構成されていることが証明された．こできると直感した．さらに，C-CPE はポリペプチドのことは，従来の吸収促進剤の限界は paracellularであり将来的な遺伝子工学的手法を用いた改変が容route を利用した創薬研究の限界を示しているので易（C-CPE を prototype として用いた新規 claudinはなく，上皮細胞生物学の遅延により TJ の分子基binder の創製が可能）であることから，C-CPE を盤に立脚した創薬戦略が取られてこなかったことにclaudin binder のモデル分子として利用し，claudin起因していることを意味していた．そこで小職のグを利用した創薬研究に着手することにした．

ループでは，TJ の分子基盤に立脚した創薬研究領域

2002 年 7 月に，C-CPE の遺伝子を持っている阪の開拓を広義の目標として設定し，TJ シールの機能

大微研堀口先生に手紙を差し上げ，C-CPE cDNA を本体でありシール機能に組織特異性を有する分子と譲渡して頂き，試行錯誤しながら C-CPE 蛋白質をいう条件により標的分子の絞り込みを試み，京大月作製した．そして，当時修士 1 年生であった浅野長田グループにより同定されていた claudin に注目し祥君にお願いし，モデル薬物として分子量 4000 のた．

デキストラン（FD-4）を用いてラット腸管ループ法

Claudin は分子量〜23 kDa の 4 回膜貫通蛋白質

により粘膜吸収促進活性を解析してもらった．するであり，24 種類の分子からなるファミリーを形成しと，わずか 0.2 mg/ml の処理で劇的な FD-4 の吸収ている．興味深いことに発現およびバリア機能には促進活性が観察され，このとき粘膜傷害性は観察さ310

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れなかった．当時小職は天然物由来の生理活性物質設定し，claudin を利用した創薬研究に本格的にアの機能解析および胎盤における亜鉛代謝に関する研タックすることにした．2002 年 12 月のことである．

究を進めており，claudin を利用した研究はエフォ

まず，C-CPE の粘膜吸収促進活性が claudin-4 をートの 10% 程度を割いているに過ぎない状況であっ介して生じていることを確認するために，C-CPE のた．実際，生理活性物質の機能解析については論文claudin-4 結合ドメインの同定を試み，C-CPE の1 報がアクセプトされ，複数の論文を投稿準備中とclaudin-4 結合領域欠損体を創出し，本欠損体を用いう状況であり，両研究とも順調に推移していた．

いて claudin を利用した粘膜吸収促進法の有用性をそこで，主に下級生を中心にテーマの選択と集中に

1）明らかにした（図 1）．さらに，C-CPE 変異体を用関して忌憚の無いデスカッションを行い，両研究テ

いて claudin を利用したペプチド医薬の経肺・経鼻ーマを切り上げ claudin を利用した創薬研究にチー吸収促進法を開発した 2）．また，C-CPE と緑膿菌エムを挙げて取り組むことを決意した．そして，
C-CPE

キソトキシン由来の蛋白合成阻害因子（PSIF）とのが唯一の claudin binder であることを踏まえ，①

融合蛋白質 C-CPE-PSIF を作製し，claudin-4 発現

C-CPE を claudin binder のモデル分子として利用

癌細胞に対する抗腫瘍活性を解析し，C-CPE-PSIF

し，claudin を利用した創薬研究の可能性を検証すが claudin-4 指向性分子であること，C-CPE-PSIFること，② C-CPE を prototype として用いた clau-が in vitro および in vivo で抗腫瘍活性を有すること

din binder 創製系を構築すること，③新たな claudinを見出し，C-CPE を用いた癌ターゲテイング法を確制御分子の探索を試みることをメインテーマとして3, 4）立した（図 2）
．さらに，2003 年に東大医科研の清野グループにより，粘膜免疫組織に claudin-4 が高発現していることが見出され，claudin-4 を標的とした粘膜免疫組織への抗原デリバリーの可能性が示唆されていた．そこで，C-CPE とモデル抗原の融合蛋白質を作製し，claudin-4 を標的とした粘膜ワクチン創製の可否を検証し，C-CPE とモデル抗原との混合液投与では抗原特異的な免疫応答が観察され

図 1 C-CPE の腸管吸収促進活性
FITC ラベルした分子量 4000 のデキストラン（FD-4）をモデル薬物として用いて，ラット腸管ループ法により C-CPE の吸収促進活性を解析（文献 1 を一部改変）．

図 2 Claudin-4 指向性分子
Pseudomonas aeruginosa exotoxin の蛋白質合成阻害ドメイン（PSIF）と C-CPE との融合体（A）を作製し，各種 claudin 発現細胞に各濃度 24 時間処理後にWST アッセイにより細胞毒性を解析（B）．

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図 3 Claudin binder を利用した粘膜ワクチンモデル抗原（卵白アルブミン：OVA）と C-CPE との融合体（A）を作製し，マウスに経鼻投与し，血中（B），鼻粘膜洗浄液（C），糞便抽出液（D）に含まれる OVA 特異的抗体価を解析．

した粘膜吸収促進法，癌ターゲテイング法，粘膜ワクチン技術を創製し，claudin を利用した創薬の可能性を先駆けて報告してきた．さらに，C-CPE に比して優れた粘膜バリア制御活性を有する新規 claudin binder の創製，および claudin binder 創製系の構築にも成功している．
3．こ れ か ら
上述したように，現在までに claudin が創薬ター
図4

生体バリアを利用した創薬研究ゲットとして多くの可能性を秘めていることを見出してきた．Claudin は 24 種類の分子が多種多様なないこと，融合蛋白質投与によって投与粘膜面のみ組み合わせによって様々な性質を有する TJ シール

ならず遠隔粘膜面での抗原特異的 IgA 産生が起きるを構成し，生体内の多種多様な内部環境を維持してこと，claudin-4 結合性が消失した C-CPE 変異体といることから，この内部環境維持機構を自由自在にの融合蛋白質では抗体価の上昇が観察されないこと制御することができれば，新たな drug deliveryを見出し，claudin-4 を標的とした粘膜ワクチン技

system（DDS）の開発に繋がる可能性がある．今後

5）

術を初めて確立した（図 3） ．さらに，C-CPE をは，独自の claudin binder 創製技術を駆使して，多prototype として用いた claudin binder 創製を図る

種多様な結合域を有する claudin binder を創製し，ために 5 年余りの歳月をかけて，C-CPE の claudin

組織特異性および透過物質特異性を併せ持つ新規薬結合残基を網羅的に解析，claudin binder のスクリ物吸収促進法の開発，新規癌ターゲテイング法，ウーニングシステムを構築し，最近新規 claudin bind-イルス感染阻害剤の開発などの創薬研究を展開してer の取得に成功した（Unpublished data）．

いきたい（図 4）．

以上，現在までの検討により，claudin を標的と312

三つ子の魂百までというように，「細胞を敬え，細薬 剤 学 Vol. 70, No. 6 (2010)

胞に学べ」という刷り込みに支配され，上皮細胞おられたものでございます．この場をお借りして相互よび claudin の可能性に魅せられ，現在まで歩んで作用頂いた学生の皆様に改めてお礼申し上げます．

きた．引き続き小職らのグループでは，本邦独自の当該研究成果の一部は，文部科学省科研費，文部細胞生物学研究土壌に育まれた本邦独自の創薬領域

科学省知的クラスター創成事業，厚生労働省科研費，の開拓，およびその成果の実用化を目指し，激烈に武田科学振興財団からのサポートにより実施されたチャレンジを続けていく予定である．

ものでございます．グラントサポートを賜りました
関係者の皆様方に深謝申し上げます．

本稿を執筆する機会を与えて頂いた出口芳春先生

最後に，「細胞製剤」という学問を授けていただいを始めとした編集委員の先生方に深謝申し上げまた恩師眞弓忠範先生に衷心よりお礼を申し上げ，拙す．また，本稿でご紹介した研究成果は，大阪大学稿の結びとさせていただきます．

大学院薬学研究科生体機能分子化学分野八木清仁先

引 用 文 献生，昭和薬科大学薬剤学研究室渡邉善照先生，藤井まき子先生，アスビオファーマ株式会社内田博司先
生をはじめとした多くの先生方のご指導ご鞭撻の所産であり，相互作用頂いた全ての方々に衷心よりお礼申し上げます．
また，実際の研究は多くの優秀な学生によって進められております．Claudin を利用した粘膜吸収促
進に関する研究は増山茜さん，原田東樹君，高橋梓さん，古宮栄利子さんを中心としたグループ，claudin を利用したバイオ医薬の非侵襲性投与法の開発は山浦利章君，高橋梓さん，松久幸司君，松下恭平君，各務洋平君を中心とした研究グループ，claudinを利用した癌ターゲティング法の開発は海老原千晶さん，佐伯理恵さん，角谷秀樹君を中心とした研究グループ，claudin を利用した粘膜ワクチンの開発
は角谷秀樹君，深坂昌弘君，鈴木英彦君を中心とした研究グループ，新規 claudin binder の創製は高橋梓さん，山浦利章君，斎藤郁美子さん，松下恭平君，

1) M. Kondoh, A. Masuyama, A. Takahashi, N. Asano, H. Mizuguchi, N. Koizumi, M. Fujii, T. Hayakawa, Y. Horiguchi, A. Watanbe, A novel strategy
for the enhancement of drug absorption using aclaudin modulator, Mol. Pharmacol., 67, 749–756(2005).
2) H. Uchida, M. Kondoh, T. Hanada, A. Takahashi,
T. Hamakubo, K. Yagi, A claudin-4 modulator enhances the mucosal absorption of a biologicallyactive peptide, Biochem. Pharmacol., 79, 1437–1444 (2010).
3) R. Saeki, M. Kondoh, H. Kakutani, S. Tsunoda, Y.
Mochizuki, T. Hamakubo, Y. Tsutsumi, Y. Horiguchi, K. Yagi, A novel tumor-targeting using aclaudin-4-targeting molecule, Mol. Pharmacol.,76, 918–926 (2009).
4) R. Saeki, M. Kondoh, H. Kakutani, K. Matsuhisa,
A. Takahashi, H. Suzuki, Y. Kakamu, A. Watari,
K. Yagi, A claudin-targeting molecule as an inhibitor of tumor metastasis, J. Pharmacol. Exp.
Ther., 334, 576–582 (2010).
5) H. Kakutani, M. Kondoh, M. Fukasaka, H. Suzuki, T. Hamakubo, K. Yagi, Mucosal vaccination
using claudin-4 targeting, Biomaterials, 31,5463–5471 (2010).

各務洋平君を中心とした研究グループによって進め

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