特集

再生医療

応用利用に向けた
低分子化合物によるヒトiPS細胞の培養

iPS cells cultivation with small molecules for application.

京都大学 物質ー細胞統合システム拠点 研究員

池田 達彦

Tatsuhiko Ikeda, Ph.D. (Researcher)
Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University

京都大学 物質ー細胞統合システム拠点 特定拠点講師

長谷川 光一Kouichi Hasegawa, Ph.D. (Junior Associate Professor)
Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University

キ ーワード01

iPS, small molecules, cultivation

02

はじめに

ヒトES細胞/iPS細胞の培養方法

1981年にEvansらによって、はじめて多能性幹細胞である

当初ヒトES細胞の培養は牛胎仔血清を添加した培地で、
マウ

胚性幹細胞
（embryonic stem cell: ES細胞）がマウスから樹ス胎仔由来の線維芽細胞（mouse embryonic fibroblasts:

研究環境は大きく変化した。多能性幹細胞その立されて以来1)、

MEF）
をフィーダー細胞として、ES細胞とフィーダー細胞とのものに関する様々な研究が行われたのはもちろんのことであ共培養系で培養されていた。
しかしながら、牛胎仔血清や線維るが、ES細胞を用いることでキメラ胚の作製が可能となり、こ

芽細胞のロットが変わるとうまく培養できない場合がある等、れによって様々な種類のノックアウトマウスが作製されることと培養方法としては非常に不安定なものであった。そこで、フィーなった。ES細胞から作られた様々な培養細胞や病態モデルマウ

ダー細胞や血清から供給される成分の中からヒトES細胞の多ス等は今日でも多くの研究に用いられ、疾患の原因解明や治療能性の維持に寄与する成分を突き止め、安定的な培養方法を薬の開発に貢献している。さらに、1998年にはThomsonらに開発することが求められた。

よって、ヒトにおいてもES細胞が樹立され 、研究がますます加

先行するマウスES細胞の研究においては、マウスES細胞

速することとなった一方で、ES細胞の作製には生命の萌芽たるの多能性の維持にサイトカインの一種である白血病抑制因子

初期胚が必要となるとの考えから、倫理上の問題に対する議論（leukemia inhibitory factor: LIF）
が重要な役割を果たしてが持ち上がり、いくつかの国においては、ES細胞の作製が禁止いることが解明され、LIFの添加によって培養が安定することがされることとなった。そのような状況の中、2006年に山中らが明らかとなっていた。さらに近年、MAPKシグナルパスウェイがOct4, Sox2,Klf4,c-Mycの4つの遺伝子を導入することで体分化を誘導すること、wntシグナルパスウェイが多能性の維持

細胞を初期化し、誘導型多能性幹細胞（induced pluripotentに関与していることが明らかとなり、MAPK阻害剤およびwnt

stem cell: iPS細胞）を作製することに成功した3)。これによっシグナルにおいて抑制的に働いているGSK3の阻害剤を添加て、倫理上の問題に縛られることなく多様なヒト多能性幹細胞することで無血清培地での培養が確立されている4)。

2)

すなわちiPS細胞を作製・研究することが可能となり、疾患の原

一方、ヒトES細胞においては、LIFの添加は多能性の維持に因解明や治療薬の開発に加えて再生医療の分野においても研寄与しておらず、線維芽細胞増殖因子-2（fibroblast growth

究が加速することとなった。

factor-2: FGF2）やトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF

こうしてヒトiPS細胞を用いた研究が基礎研究から応用利用

β)スーパーファミリーのアクチビンなどからのシグナルによっへと発展する中で、その培養方法の研究・開発がますます重要て多能性が維持され、マウスと同様には培養できないことが分になってきている。すなわち、iPS細胞を作製・維持できることはかっていた。

もちろんであるが、より安全なiPS細胞を大量かつ安定的に供

このことから、現在もなお、ヒトES 細胞/iPS 細胞の培養給できる培養方法の開発が求められているのである。

は一般的にはフィーダー細胞としてMEFを用い、血清代替

本稿では、応用利用の観点からヒトiPS細胞の培養方法につい（KnockOut™ Serum Replacement: KSR）
およびFGF2をて概説する。

添加した培地で行われることが多い。一方で、フィーダー細胞を用いずマトリゲル等を基底膜マトリックスとして用いるフィー
7THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

ダーフリー培地も多数開発されている5)-7)。その一部を例としては解糖系がエネルギー代謝の中心となっており、酸素呼吸によ挙げると、mTeSR1やEssential8等がよく使われているほか、るエネルギー代謝は活性化していない。これは非常に興味深

国内においてはStemFit AK03Nもよく使用されているようでい現象で、発生の最初期であるnaïveでは酸素呼吸によってエある。
しかしながら、いずれも高価であるうえ、
これらにおいてネルギーを作り出しているにも関わらず、ほんのわずかに分化

もFGF2等の増殖因子が添加されており、こうしたタンパク質の進んだprimedでは発酵によってエネルギーを作り出しておの安定性が培養の安定性にも影響を与える場合があるため、り、やがて分化が進むと再び酸素呼吸によるエネルギー代謝へ応用利用のためにはより安価で安定性の高い完全合成培地のと戻っていくのである。当然のことながら、エネルギー効率の開発が望まれている。また、基底膜マトリックスはフィーダーフ

良い酸素呼吸を行っているnaïveの幹細胞はprimedよりも増リー培地で接着培養する際の細胞の足場となる重要な成分で、殖速度は速い。さらに、両者にはキメラ胚の形成能にも差があ

マトリゲル、
ビトロネクチン、ラミニン等がよく用いられているる。naïveの幹細胞はキメラ胚を形成することが可能であるが、が、継代の際には細胞と基底膜マトリックスとを解離させる必primedの幹細胞ではキメラ胚の形成は非常に困難である。

要がある。その方法としてはタンパク質分解酵素を用いる方法

通常のヒトiPS細胞はprimed状態であり、細胞の継代時にが一般的であるが、EDTAを加えたPBSを用いる方法 やカルは、単細胞に解離せずに細胞塊での継代が必要であり、継代効

シウムイオンを添加したPBSを用いる方法 8)等もあり、培地の率は作業者に依存する所も多い。ヒトiPS細胞の応用利用を考6)

種類や細胞の種類に合わせて適切な方法を選択する必要があえた場合、継代効率は非常に重要な要素であることから、
ヒトる。

におけるnaïve幹細胞の作出は近年の大きなテーマの一つで03とから、マウス等ではnaïveの幹細胞はprimedの培養条件であった。naïveから少し分化の進んだ状態がprimedであるこnaïve状態とprimed状態

さて、前項においてマウスES/iPS細胞とヒトES/iPS細胞では多能性の維持機構が異なっていることを記したが、マウスやラッ
ト等のげっ歯類由来のES/iPS細胞とその他の哺乳類由来のES/iPS細胞では様々な特性が異なっている。当初これらの違い
は種特異的な差であると思われていたが、マウスの着床直後の培養することで容易にprimedへと変化するが、ヒトiPS細胞を
primedからnaïveへと変化させることは容易ではなかった。最初に作製されたヒトnaïve ESC/iPSCはOct4とKlf4、又はKlf4とKlf2を一時的に強発現させ、MAPKの一種であるERK1/2
阻害剤、GSK3阻害剤、LIFとフォルスコリンを加えた培地で培養することで、作製・維持が可能であった13)。つまり、遺伝子導入に依存していた。
しかしその後、様々な方法・培養条件でヒト胚からもヒトES/iPS細胞様の細胞が樹立できることが報告さnaïve ESC/iPSCが作製されるようになり、現在では上記の2つ、現在では多能性幹細胞の未分化の度合いの違いによるの阻害剤に加えて、さらにいくつかの阻害剤や成長促進因子をものと考えられており、マウスやラットES細胞様のより未分化

添加することで、Oct4やKlf4等の一過的な強発現を伴うことなな状態はnaïve状態、
ヒトES細胞やヒトiPS細胞等のやや分化のくprimedからnaïveへの移行が可能となっている。これによっ進んだ状態はprimed状態と名付けられた11)。

て、
ヒトES/iPS細胞を高増殖で、解離継代が容易な培養が可能naïveとprimedの差を表す特徴としては、
まずコロニーの外となった。

れ9), 10)観が挙げられる。naïveの幹細胞はやや厚みのある重層的なnaïve

primed

多能性の維持LIFシグナルに依存

FGF、
アクチビンシグナルに依存

コロニー形状

ドーム状で重層的

平面的

ティックな特徴としてX染色体の不活性化が挙げられる。ヒト

単一細胞での生存性
（継代時）

高

低

を含む哺乳類のX染色体はメスの場合は分化が始まるとすぐ

X染色体の不活性化

なし

あり

低

高

起こる。これに対して、naïveの幹細胞ではX染色体の不活性

発生関連遺伝子のプロモーター領域における
H3K27me3の蓄積化は起きていない。同様に、分化とともに進むことが知られてDNAのメチル化

低高いるヒストンやDNAのメチル化修飾においても両者には違い

呼吸

酸素呼吸

発酵

増殖速度

速い

遅い

容易

困難

ドーム状のコロニーを形成するのに対して、primedの幹細胞は薄く平らなコロニーを形成する。また、継代の際にトリプ
シン処理によって細胞塊を単一細胞にまでばらしてしまうと、
primedでは生存率が大きく低下するのに対して、naïveでは高い確率で生存できることが知られている。次にエピジェネに1本が不活性化されることが知られているが、わずかに分化が進んだ状態であるprimedの幹細胞でも同様に不活性化ががある。発生に関わる遺伝子のプロモーター領域に結合しているヒストンH3の27番目のリジン残基におけるトリメチル化（H3K27me3）はnaïveではほとんど蓄積されていないのに対して、primedではH3K27me3の蓄積がみられ、全体的なDNAのメチル化についてもprimedでは促進されている12)。これらのことからも、naïveがより未分化な状態であることが改めて伺える。また、naïveとprimedではエネルギー代謝も異なっている。naïveの幹細胞ではミトコンドリアの活性が高く、TCA

8

キメラ胚の形成表1naïveとprimedの特徴

0411), 12)

培養条件による細胞の状態の変化

サイクルや酸化的リン酸化によるエネルギー代謝が活性化しヒトnaïve iPS細胞が作製されたことを先に述べたが、厳密ており、酸素の消費量も多くなっているが、primedの幹細胞でにはそれらの細胞がnaïveの状態にあるかどうかは断定できTHE CHEMICAL TIMES
面的なコロニーを形成し、継代時にトリプシンを用いて単一細キメラ胚の形成能だからである。ヒトiPS細胞においてはキメ胞にすると生存率が著しく低下する等のprimedの特徴を有し

ラ胚を作って確かめるというわけにはいかないので、前述のヒていたが、naïveにおいて多能性維持に関わる遺伝子のうちのトnaïve iPS細胞はキメラ胚形成能以外のnaïveの特徴を持一つであるTbx3の発現量が上昇していた他、他の培養条件で

iPS細胞は未だに確立

培養した場合と詳細に比較したところ、発現量に変動の見られされた技術ではなく、キメラ胚形成能といった評価法が適用でつ幹細胞ということになる。ヒトnaïve

た遺伝子のパターンがある種のnaïve ES/iPS細胞のものとよきないため、作製方法によってヒトnaïve iPS細胞には多くのく似ているという結果が得られた（図2）。

特集 再 生 医 療

ない。なぜなら、naïveであることを示す重要な要素の一つがバリエーションが存在する。作製方法としては、当初作製されたように2種類の阻害剤とLIFを培地に加えるとともに、Oct4
やKlf4等の一過的な強発現によってnaïveへと移行させる方
法や、ERK1/2阻害剤、GSK3阻害剤にさらに骨形成タンパク質(BMP)シグナル阻害剤を加えLIFを添加した培地でOct4やKlf4等の一過的な強発現を伴わずにnaïveへと移行させる方
法、さらにこれらを発展させて、複数のMAPK阻害剤を加える方法等がある。もちろん、いずれのnaïve iPS細胞においてもドーム状のコロニー形成やLIFシグナル依存的な多能性維持等のnaïveであることを示す特徴は持っているが、遺伝子の発現量を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析等の高分解能を有する解析方法を用いると非常に多くのバリエーションが存在することがわかる。
実際にいくつかのRNA-seqデータ 14)-19)を用いてトランス
クリプトーム解析を行うと、naïve ES/iPS細胞の中にもややprimedに近い遺伝子発現パターンを持つものと大きく異なる遺伝子発現パターンを持つものが存在している。筆者も公開されているRNA-seqデータを用いて解析を行ったところ、Theunissenらの作製したnaïve ES細胞とTakashimaらの作製したnaïve ES細胞が特にprimedと異なる遺伝子発現パ
ターンを有していることが確認できた
（図1）
。

図2

様々なnaïve、rs幹細胞およびAKIT培養ES細胞の発現変動遺伝子のヒートマップ primedの細胞と比較して発現変動のあった遺伝子について、その変動パターンをヒートマップを用いて比較した。緑の点線で囲んだ遺伝子群がnaïveに特異的な遺伝子群であると思われる。また、AKIT
培養ES細胞の発現変動パターンはnaive3と似ていることが確認できる。

このことと、培養条件を変えることで遺伝子の一過的な強発現を伴わずにprimedからnaïveへと移行させることができる
ことを併せて考えると、naïveとprimedの間にはある程度の可逆的な連続性があるのかもしれない。
さらに、従来のprimedやnaïveとは異なる特徴を有する新しい状態が見つかってきている。その一つが領域選択型多能性幹細胞（region-selective pluripotent stem cell: rsPSC）
である19)。この多能性幹細胞はマウスのエピブラストをFGF2とwnt阻害剤であるIWR1を添加した培地で培養することで得られた。このrsPSCは基本的にはprimedの特徴を有していたが、単一細胞での継代に対する耐性や、やや早い増殖速度を示した
他、特殊なキメラ胚形成能を有していた。すなわち、
マウスエピ
ブラストの後極側に移植した場合にのみ生着し、キメラ胚を形
図1様 々 な n a ï v e 、p r i m e d 、r s 幹 細 胞 の 主 成 分 分 析
AKITは筆者らのグループが作製した新しい培地で培養したES細胞。左側にnaïveのクラスターが、右側にprimedのクラスターが形成されている。rsはprimedの一部であることが確認できる。

成したのである。同様に、FGF2とIWR1を添加した培地でヒト
ES細胞を培養したところヒトrsPSCが得られ、これをマウスエピ
ブラストの後極側に移植したところ生着し、三胚葉のいずれにも寄与していたことから、rsPSCには異種間キメラ形成能があることが示された。

同様の結果は他の論文でも報告されており20)、現時点では彼

このように、
ヒト多能性幹細胞の未分化状態には様々な状態

ら2グループのnaïve ESCがよりnaïveらしい状態にあるのだが存在し、細胞の遺伝的背景や組織的背景、樹立時の遺伝子改

ろうと思われる。

変だけではなく、培養方法によって大きく特徴が変化すること逆に、primedに属する細胞でありながら、naïveに近い遺伝が示されてきた。このことは目的にあわせて最適な培養方法を

子発現パターンを持つものも見出された。筆者らのグループ

選択、あるいは開発する必要があることを示している。例えば、が作製したFGF2等の増殖因子を含まない新しい培地で培養し遺伝子改変を行うのであれば、単一細胞から効率よく増殖する

たES/iPS細胞である。この培地で培養されたES/iPS細胞は平naïveやrsが適しているし、短期間で多量の細胞を必要とする
9

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療のであれば、naïveやrsの増殖速度の速さも魅力的だろう。その一方で、naïveやrsを作製・維持するための培地は高価であり、長期培養下でのゲノムの安定性が低いことも報告されている21)。また、前述のStemFitやE8では、細胞はnaïveと同等の増殖も可能である。このため、現在まで、特別な理由がなければ従来のprimedの培養方法を選択することが無難である。

05

応用利用に向けた培養方法の開発

では、応用利用に適した培養方法とはどのようなものだろう
なければならない。高品質であるということは、分化した細胞や死細胞がほとんど含まれていないことはもちろんだが、ロット間の差がなく、同一の処理に対して同一の応答性が維持されている必要がある。安定供給を行うためには発酵工学でいう回分培養や流加培養あるいは連続培養のような大容量での培養が必要となる。これらを満たし、市場に広く供給するためには培地
成分に高価なものを使用しない等のコストカットも必要となる。
まず高品質を実現するためには、現在の培養方法に存在する不安定性の原因を取り除く必要がある。ヒトiPS細胞の培養における不安定性の最大の要因は生物由来の成分である。フィーダー細胞を用いる培養方法ではフィーダー細胞の状態がヒト
iPS細胞の状態に影響を与えるし、フィーダーフリー培地においても添加されているシグナルタンパク質の安定性の影響を受けることになる。さらに、再生医療への活用においては、安全性の観点から動物由来成分を含まない（Xenoフリー）培地であることも要求される。そこで重要な役割を果たすのが生理活性をもつ低分子化合物である。naïveやrsPSCの作製・維持にもERK1/2阻害剤やGSK3阻害剤、wnt阻害剤といった低分子化合物が用いられているが（表2）、
このような低分子化合物は細胞内のシグナル分子や細胞表面のレセプターに結合すること
で、シグナルを遮断したり強化したりする作用がある。これら低分子化合物を組み合わせることで、培地中から不安定なタンパ
ク質を取り除き、安定的な培地を作製することができると期待される。実際に、筆者らのグループにおいて低分子化合物を組み合わせることでFGF2等の増殖因子を含まない、全く新しいフィーダーフリー・Xenoフリー培地の作製に成功しており、今培養方法・培地

上に、培地交換にも多くのコストがかかる。そこで大容量のタンがらヒトiPS細胞の培養には細胞間接着によるシグナル伝達も重要であるため、単一細胞ではなく一定の大きさの細胞塊を維持しながら培養液中を浮遊させる（浮遊培養）
必要がある。こうした条件を満たすためには、浮遊培養に適した完全合成培地を調製しなければならない。この点についても、筆者らのグルー
プは、2種類のポリマーを利用することで、
ヒトiPS細胞にストレスを与えることのない全く新しい浮遊培養系を開発している。
現在はこの浮遊培養系と、完全合成培地の開発を通して、新たな安価な培養系の開発に着手している。
また、再生医療への応用を考える場合には、これらの安価で安定した培養法に加えて、培養方法によるエピジェネティックな変化やゲノム不安定性にも注意が必要となる。iPS細胞においてはその初期化の過程においてエピジェネティックな状態は完全には初期化されていないことが知られているが、このことが分化後の組織を生体へ移植した際にどのような影響を及ぼすのかは不明である。さらに、他の培養細胞同様、iPS細胞を長く継代していると遺伝子が損傷を受け突然変異が生じたり、エピジェネティックな変化が生じることがある。こうした変化が生じた細胞を再生医療に用いることは出来ないので、こうした変化が起こりにくい培養条件についての検討が今後の大きな課題の一つである。
ここまではヒトiPS細胞を高品質で安価に安定供給する場合に必要となる培養条件を示した。
しかし、培養されたiPS細胞をどのように利用するかによって、その後の要求される培養条件は異なってくる（図3）。例えば、角膜等に分化させ患者に移植を行うことを目的とする場合であれば、大量培養の必要性は低くなり高い安全性が求められることから、均質性の高い浮遊培養よりも小スケールで個別に管理できる従来のプレート上での接着培養や特殊なメンブレン上での培養の方が適していると思われる。この場合においては、
ヒトiPS細胞を播種する基底膜
マトリックスに何を用いるかも重要な選択となる。前述のように
増殖因子

KSR + MEF

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

FGF2およびMEF細胞発現物質

TeSR15)

ラミニン

XenoフリーFGF2、TGFβ 他

ビトロネクチン

XenoフリーFGF2、TGFβ

ラミニン

XenoフリーFGF2

2iL13)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIFおよびMEF細胞発現物質

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、フォルスコリンt2iL+Gö17)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIF、FGF2およびMEF細胞発現物質

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、PKC阻害剤

5i/L/A18)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIF、FGF2、アクチビン

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、ROCK阻害剤、
BRAF阻害剤、SRC阻害剤

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質
又はマトリゲル

含む

FGF2

IWR1

StemFit AK03N

7)

rs19)

10

レート上での平面的な培養では空間当たりの培養効率が悪い

動物由来成分Essential8

表2完全合成培地の開発は、均質で安定供給可能な大容量の培養を行うためにも重要である。現在一般的に行われているプ

基質

6)

naïve

完全合成培地の開発を目指したい。

ク質で3次元的に培養することが求められるが、当然のことなか。それはまず高品質で安価に安定供給が可能な培養方法でprimed後さらなる改良を進めることで、タンパク質を全く添加しない

主な培養方法・培地とその特徴

低分子化合物

他

THE CHEMICAL TIMES

6) Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD,
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図3 応用利用と培養条件 iPS細胞を応用利用する場合には、その目的にあわせて培養方法を開発・選択する必要がある。再生医療への応用を目的とする
場合には
（上段）
、高い安全性が要求される。創薬研究や病理研究などへの応用を目的とする場合には（下段）、コストの低さや、安定供給体制がより重要となる。いずれの場合においても生理活性を持つ低分子化合物を用いることで培地から高価で不安定なタンパク質を取り除き、安全で安価な培養方法が開発できる他、シグナルのコントロールによるnaïveやrsPSCの作製・維持および分化誘導などにおいても重要であり、今後様々な生理活性を持つ低分子化合物が開発されることで、多くの問題が解決できるものと期待される。

基底膜マトリックスの種類によっては増殖速度や継代の効率、分化効率が変化するほか、生体に移植した際に残留していると激しい免疫応答（拒絶反応）を起こす場合もあることにも注意が必要である。一方で、創薬における候補化合物のスクリーニ
ングや薬効・毒性評価への応用を目的とする場合には、Xenoフリー培地であることは必須ではなくなり、コストの低さや安定供給体制といった要素がより重要となる。また、病態モデルの作製や病理研究に利用する場合には遺伝子改変が必要になる場合もあり、
このような場合には遺伝子改変効率が高いと思われるnaïveやrsPSCを作製・維持する培地を選択することも考慮
しなければならない。

06

おわりに

ヒトES/iPS細胞の様々な特徴とその特徴を引き出す、あるいは変化させる培養条件について概説した。
しかしながら、ヒト
ES/iPS細胞においてその状態を維持するためのシグナル経路
については完全には明らかになっておらず、また、既知である領域においてもそのシグナルを遮断又は増幅することができる生理活性を持つ低分子化合物が網羅されているわけではな
い。今後、
ヒトiPS細胞の基礎的研究の進展と並行して、新たに生理活性を持つ低分子化合物が発見・合成されることでより応用利用に適した培養方法が開発されていくものと期待したい。

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