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Proc. Arthropod. Embryol. Soc. Jpn. 52, 47–48 (2019)Ⓒ 2019 Arthropodan Embryological Society of Japan
ISSN 1341–1527

CRISPR/Cas9システムを利用したハチ目モデル昆虫のゲノム編集
畠山正統・木村澄・炭谷めぐみ・横井翔・芳山三喜雄

Masatsugu HATAKAYEMA1), Kiyoshi KIMURA2), Megumi SUMITANI3), Kakeru YOKOI1)
and Mikio YOSHIYAMA2): CRISPR/Cas9-mediated Genome Editing in Hymenopteran ModelInsects*Insect Genome Research and Engineering Unit, Division of Applied Genetics, Institute of Agrobiological Sciences, NARO, Owashi,Tsukuba, Ibaraki 305–8634, Japan2)
Animal Genetics Unit, Division of Animal Breeding and Reproduction Research, Institute of Livestock and Grassland Science,
NARO, Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japan
3)
Transgenic Silkworm Research Unit, Division of Biotechnology, Institute of Agrobiological Sciences, NARO, Owashi, Tsukuba,
Ibaraki 305–8634, Japan
E-mail: sawfly@affrc.go.jp (MH)1)

ハチ目は、祖先的な広腰亜目と派生的な細腰亜目のふたつの亜目で構成される。形態的あるいは分子系統解析から、完全変態昆虫で最も祖先的なグループに位置づけられており（Misof et al., 2014）、不完全変態から完全変態への進化を考察するうえで重要な昆虫目として認識されている。ハチ目昆虫は通常、雄産生単為生殖を行い、受精卵からは二倍体の雌を、未受精卵からは半数体の雄を生じる半数−倍数性である（Crozier, 1977）。また、植物食性のもの、寄生性のもの、社会性をもつものなど、このグループの生物学的な興味から、いくつかの種では遺伝子機能解析をめざして、全ゲノム配列が解読・公開さ れ（The Honey Bee Genome Sequencing Consortium,2006; Werren et al., 2010; i5K Consortium, 2013）、RNAi 法や遺伝子組換え技術などの遺伝子機能解析技術が確立され て い る（Hatakeyama et al., 2009; Lynch 2015; Cridge etal., 2016）。これまで昆虫に活用されてきた RNAi や遺伝子組換えは、非常に強力な遺伝子操作技術ではあるものの、同時にいくつかの制約がある。RNAi による遺伝子ノックダウンは効果が一過的で、種によっては効果がみられない場合もある。遺伝子組換えでは、ゲノム内の狙ったところに目的遺伝子を導入できるわけではない。
このような背景から、部位特異的ヌクレアーゼを利用したゲノム編集技術が注目されている。なかでも CRISPR/
Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats/CRISPR-Associated protein 9）システムは、精度、簡易性、汎用性、応用の拡張性、さらに経済性に優れ、
近 年 急 速 に 昆 虫 へ の 利 用 が 拡 大 し て き た（Gilles andAverof, 2014; Chen et al., 2016; Cui et al., 2017; Taning et al.,2017; Sun et al., 2017; Gantz and Akbari, 2018）。 こ こ で は、広腰亜目のモデル種であるカブラハバチ（Athalia rosae）と細腰亜目のモデル種であるセイヨウミツバチ（Apismellifera）を用いた CRISPR/Cas9 システムによるゲノム編集（遺伝子ノックアウト）の結果を報告する。
カブラハバチでは、眼で特異的に緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する遺伝子組換え系統（Hatakeyama etal., 2016）を用い、EGFP 遺伝子の発色団に対応する遺伝子配列を標的にして single-guide RNA（sgRNA）を作製し、DNA 切断酵素の Cas9 タンパク質をコードする mRNA とともに、成熟未受精卵に注入した。これらを単為発生させた注入当代（G0）で、EGFP がモザイク状に検出される体細胞モザイク個体が出現し、交配により EGFP ノックアウト G1 個体が得られた。これらの EGFP ノックア
ウト個体の標的配列には挿入／欠失が生じており、正常な遺伝子産物は産出されないことがわかった。セイヨウ
ミツバチでは、交尾済みの女王に産卵させた細胞性胞胚期に至るまでの初期胚に、眼色合成関連酵素のキヌレニン モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ（kynurenine 3-monooxygenase:kmo）遺伝子を標的に作製した sgRNA と Cas9 mRNA とを注入した。これらを人工的に飼養して得られた注入当代（G0）の遺伝子型判定を行ったところ、kmo 遺伝子配列にさまざまな欠失が確認できた。このようにカブラハ
バチとセイヨウミツバチで、CRISPR/Cas9 システムによる遺伝子ノックアウトが可能なことが実証された。
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