厚生科学研究費補助金(厚生科学特別研究事業)
分担研究報告書

天然薬物シジュウムの抗HⅣ作用
HIV母児感染予防に関連して分担研究者

早川智

日本大学医学部産婦人科学教室

研究要旨 HIV感染妊婦において､ HIV垂直感染の予防法を確立することは､産科臨床的にたいへん意義の深いことである｡ HIVの経胎盤感染は比較的少なく何らかの局所的防御機構の存在が挙げられる｡さらに､胎盤械毛にはcD4が存在せず､ HIV感染機構も興味深い｡したがって､ CDl非依存的なHIV感染機構を解明することは垂直感染予防のみならず中枢神経へのHIV感染機構の解明にもつながると考えられる｡今回､ HIV感染患者胎盤の解析並びに培養械毛細胞を対象に各種検討を行なった｡さらに､我々が先に報告したThl誘導活性､ IFN‑γ産生増強活性を有する天然物
質シジュウムを用いてHIVのCD4依存性､非依存性に対する効果について検討した｡

A.研究目的i HIV母児感染の解析

近年､我が国において､不法滞在外国人の増加や異性間､同性間の接触によるHIV感染者が著しく増加している｡また､血液製剤による感染者とその配偶者が妊娠､出産を希望する事も多い｡ HIV感染妊婦において胎児新生児に対する垂直感染の予防は産科臨床的に重要な課題である｡ AIDSの垂直感染は多くの場合､産道感染によるために陣痛発来前に選択的帝王切開を施行することによって予防が可能であるが､妊娠中に成立する経胎盤感染は確実な予防が困難である｡文献的にはHIV感染妊婦より生まれた新生児の約10%に垂直感染がみられ､多くの場合10才以前に発病し死亡するとされる｡しかしながら､ HIVの経胎盤感染は比較的少なく何らかの局所的防御機構の存在する可能性が示唆される｡胎盤械毛細胞にはCD4が存在せず､ cD4を介さないHIVの感染機構の解明は垂直感染予防の確立のみならず中枢神経へのHIV感染機構の解明にもつながると考えられる｡本学ならびに国立感染症研究所エイズ研究センターにおいて1998年から1999年に収集したHIV感染患者胎盤と培養械毛癌細胞を対象として以下の検討を行った｡

II

シジュウムの抗HIV作用‑

17‑

南米インディオはシジュウムならびに関連生薬をウイルス感染症に使用しておりその臨床的有効性から､消炎作用と同時に抗ウイルス作用の存在が推定される｡

我々は先に天然物質シジュウムの細胞性免疫活性化作用としてThl細胞の誘導活性やIFN‑γ産生増強を報告した｡現在､致命的なウイルス感染症であるHⅣのCD4依存性､非依存性感染に及ぼすシジュウムの作用について検討した｡

B.研究方法I HIV母児感染の解析

HⅣ感染妊婦胎盤の病理組織学的解析
我が国においてHIV陽性が確認できた妊婦12例の胎児付属物(腰帯､卵膜､胎盤)における病理所見を検討した｡

HⅣ感染妊婦胎盤におけるHⅣの局在酵素抗体法により晴帯､卵膜､胎盤におけるHⅣp24の局在を検討した｡

胎盤におけるHⅣの感染機構
一般に胎盤繊毛細胞はcD4を発現しないとされている｡従ってHⅣ感染患者胎盤に対するHⅣの侵入機構の解析が問題になる｡そこで､樹立械毛癌細胞株JEG‑3､ JARにinvitroでHIVをチャレンジし､ 120時間後に培養上清中のHIV p 24を定量した｡この実験系においてウイルスの添加前に抗cD4抗体､抗ccR5抗体､抗cxc‑R 4を加えて検討した｡

胎盤脱落膜局所におけるケモカインによる情報伝達機構
胎盤におけるケモカインレセプターの発現と機能を解析した｡妊娠初期､中期､後期
各時期4‑8例の胎盤と繊毛癌細胞株JEG‑3においてRT‑PCR､ Flow cytometryで各種のケモカインレセプター発現を検討した｡また､械毛細胞に各種濃度のMIP‑1､ MCP‑1､MCP‑3､ RAmSを加えて繊毛細胞機能に対する影響を検討した｡

子宮内感染を来すHⅣのウイルス学的解析
胎内感染を起こしやすいウイルス株があるのかを検討した｡
膳帯血におけるm‑16の意義
近年､クローニングされたT細胞の遊走､活性化因子であるIL‑16は同時にHrvp120のCD4への結合を阻害し､ HIV感染者で高値､発病前に低下することから内因性の抗HⅣサイトカインとして注目される｡健常妊婦における血中m‑16をELISAによって測定したところ非妊婦に比較して有意に高値であり､さらに牌帯血では非妊婦の約10倍の濃度に達していた｡同一患者においても謄帯血中のIL‑16は母体末梢血よりも常に高値であり､晴帯血cD8リンパ球は構成的にIL‑16mRNAを発現していることからIL‑16が胎児リンパ球のHⅣに対する自然抵抗性に関与している可能性が示唆された｡しかし‑18‑

ながら､瞭帯血リンパ球を用いたinvitroの感染実験では､牌帯血中濃度である1,000‑2,000ngはHⅣの感染を完全に防ぐには必ずしも十分では無いため､さらにウイルス量や母児接点局所におけるm‑16の作用など今後の検討が必要である｡母体側組織である脱落膜に多く存在するcD56陽性LGLも構成的にm‑16を産生しており､局所におけるHⅣ感染防御に作用している可能性がある｡
ⅠⅠシジュウムの抗HⅣ作用

CD4依存性感染に及ぼすシジュウムの作用

健常人4名の末梢血より採取したcD4陽性Tリンパ球に国立感染症研究所において維持している日本人由来のHIV株をチャレンジし120時間後に培養上活中のHⅣp24をELISAにより定量した｡この実験系においてウイルスの添加前にシジュウム租抽出物を加えて検討した｡

m非依存性感染に及ぼすシジュウムの作用
樹立械毛癌細胞株JEG‑3に国立感染症研究所において維持している日本人由来のHIV株をチャレンジし120時間後に培養上活中のHⅣp24をELISAにより定量した｡

この実験系においてウイルスの添加前にシジュウム租抽出物を加えて検討した｡

HⅣ感染患者由来リンパ球におけるHⅣ産生に及ぼすシジウムの作用
HIV感染患者2例より同意を得て採血し､ CD4リンパ球をマグネチックビーズによって分離した｡このリンパ球をpHA5けg/mi､ IL‑2 100IU/miによって刺激し､ 120時間後に培養上清中のHⅣp24をELISAにより定量した｡この実験系にシジュウム粗抽出物を加えて検討した｡
HⅣ感染患者由来リンパ球のアポトーシスに対するシジュウムの作用
HIV感染患者2例より採血したcD4リンパ球をpHA5ug/mi､ A:2 100IU/miによって刺激し72時間後にアポトーシスをDNAladderの形成より検討した｡この実験系にシジュウム租抽出物を加えて検討した｡
C 結果および考察I HIV母児感染の解析

HⅣ感染妊婦胎盤の病理組織学的解析
胎盤では従来報告されるcholangiosis､ (械毛における胎児血管の増生) fibrinoid変性に加えて械宅間腔の小円形細胞の出現(inteⅣ此tis) ､リンパ球と械毛の接着､械毛の未熟性に加えて械毛細胞のapoptosisの増加がみられた｡ HTLVの経胎盤感染では感染械毛細胞の脱落による局所感染予防機構が報告されているが､同様の機序の存在が示唆された｡卵膜､勝帯においては特別な所見を認めなかった｡
HⅣ感染妊婦胎盤におけるHIVの局を‑19‑

12例中2例の胎盤において合胞体械毛､ syncitial trophoblast

ならびにHofbauer細胞にHIVp24の染色を認めた｡卵膜､瞭帯においては仝例とも染色性は陰性であった｡

そこで新鮮な4検体において抗原性によって分画した胎盤細胞におけるHIVmRNAの発現の有無を検討した｡胎盤を生理食塩水で十分に洗浄して付着した母体血､を除き ト
リプシン処理後､マグネチックビーズあるいは抗体プレートによってEGF‑R陽性のvillous trophoblast erbB2陽性のextravillous trophoblast､ CDl lb陽性のHofbauer細胞に分画してRT‑PCRを行った｡その結果HIV感染患者では5例中4例のvillous trophoblast､extravillous trophoblast､ Hofbauer細胞にHIVmRNAの発現を認めた｡この所見から胎盤にHIVは感染しているが大部分の胎児には感染しないという事実が明らかになった｡

胎盤におけるHIVの感染機構
JEG̲3ではウイルス量は抗ccR5抗体､抗cxc‑R4抗体で有意に減少したが抗cD4抗体では全く影響を受けなかった｡この結果､械毛癌細胞株JEG13はHIVに感受性であり､胎盤械毛へのHIVの感染はcD4非依存的であるが､ケモカインレセプターは関与するらしいという事実が明らかになった｡

胎盤脱落膜局所におけるケモカインによる情報伝達機構
妊娠初期胎盤ではcCRl,2,3,4,5

CXCR‑1,2,4､中期胎盤ではccRl,2,4､ CXCR‑2,4､妊娠後期胎盤ではccR‑2,4､ CXCR‑4の発現を認め､ JEG‑3ではccR‑3,4,5､cxcR‑1,2,4の発現が見られた｡

ケモカインとそのレセプターの脱落月割台盤局所における機能として､胎盤機能の調節､母児免疫寛容‑の関与､胎内感染の防御などの可能性があるCその結果､ 10‑100ng/miレベルでは械毛細胞の増殖を促進し､それ以上ではhCG分泌を促進する作用が明らかになった｡

ケモカインを産生源となる細胞をRT‑PCRで検索した｡械毛細胞自体はケモカインを産生せず､脱落膜リンパ球､特に未熟なNKT細胞を含むcD56陽性額粒リンパ球がIL̲2の存在下にMIP‑1､ MCPll､ MCP‑3､ RJWTESを産生することが明らかになった｡

この事実より脱落膜(母体側)と胎盤(胎児側)の間にケモカインを介した情報伝達が行われている事実が明らかになった｡

子宮内感染を来すHIVのウイルス学的解析
我々は､先に我が国においてHIV垂直感染の成立した8例のうち6例はV3ループの29例がDがNに置換していることを報告した｡個々の症例内でも母親血中には複数のクローンが存在しても感染した児のHIVはほぼ単独クローンであることから母体に感染したHIVは変異を繰り返しそのごく一部が胎児･新生児に感染すると考えられた｡この現象がウイルスの性状に相違によるものかそれとも単に感染機会が少ない事の反映かを検証するためHIV胎盤から分離したHⅠVのシークエンシングを行っているが､現時点では確定的な結論を得られていない｡

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膳帯血におけるm‑16の意義
近年､クローニングされたT細胞の遊走､活性化因子であるm‑16は同時に.fIIVp120のCD4への結合を阻害し､ HIV感染者で高値､発病前に低下することから内因性の抗HIVサイトカイ■ンとして注目される｡健常妊婦における血中m‑16をELISAによって測定したところ非妊婦に比較して有意に高値であり､さらに晴帯血では非妊婦の約10倍の濃度に達していた｡同一患者においても陪帯血中のIL‑16は母体末梢血よりも常に高値であり､膳帯血cD8リンパ球は構成的にm‑16IllRNAを発現していることからm‑16が胎児リンパ球のHIVに対する自然抵抗性に関与している可能性が示唆された｡しかしながら､隣帯血リンパ球を用いたinvitroの感染実験では､瞭帯血中濃度である1,000‑2,00OngはHIVの感染を完全に防ぐには必ずしも十分では無いため､さらにウイルス量や母児接点局所におけるm‑16の作用など今後の検討が必要である｡母体側組織である脱落膜に多く存在するCD56陽性LGLも構成的にm‑16を産生しており､局所におけるHIV感染防御に作用している可能性がある｡
ⅠⅠシジュウムの抗HIV作用

cD4依存性感染に及ぼすシジュウムの作用
cD4陽性Tリンパ球ではウイルス量はシジュウム添加により100ng/mi以上の濃度で濃度依存的に減少した｡
cD4非依存性感染に及ぼすシジュウムの作用
cD4陽性Tリンパ球ではウイルス量はシジュウム添加により100ng/mi以上の濃度で濃度依存的に減少した｡
HⅣ感染患者由来リンパ球におけるHIV産生に及ぼすシジウムの作用
HIV感染者cD4陽性Tリンパ球ではウイルス量はシジュウム添加により1000ng/血以上の濃度で減少した｡
HⅣ感染患者由来リンパ球のアポトーシスに村するシジュウムの作用
HⅣ感染者cD4陽性Tリンパ球のアポトーシスはシジュウム添加により100mg/血以上の濃度で抑制された｡
D.結論
I HIV母児感染の解析について

1 HⅣ感染妊婦胎盤に特異的な所見はないがHⅣp24が染色される症例がある｡
2

抗原性によって分離した械毛細胞､ Hofbauer細胞にHⅣmRNAが存在する｡

3

HIVはcD4非依存的に械毛癌細胞に感染するがケモカインレセプターは関与する｡

4

械毛細胞と脱落膜リンパ球の間にケモカインを介した情報伝達が行われている05胎児に感染するHIVは母体に感染したHIVのごく一部である｡

6

健常新生児腰帯血には健常成人の約10倍濃度のm‑16が存在する｡

‑21‑

7

新生児勝帯血リンパ球は構成的にm‑16mRNAを発現する｡

8m‑16は膳帯血cD4リンパ球に対するHⅣ感染を濃度依存性に抑制する｡

9

脱落膜リンパ球はm‑16を産生しており局所におけるHIV感染防御に作用している可能性がある｡
ⅠⅠシジュウムの抗HIV作用について

1シジュウム租抽出物は100ng仙1以上の濃度でCD4陽性Tリンパ球におけるHIVHⅣp24産生を濃度依存性に抑制した｡
2

シジュウム租抽出物は1000ng巾11以上の濃度で械毛癌におけるHIVp24産生を濃度依存性に抑制した｡
3

シジュウム粗抽出物は1000ng/hll以上の濃度でHIV感染患者cmリンパ球におけるHⅣ産生を抑制した｡
4

シジュウム租抽出物は1000ng/hll以上の濃度でHIV感染患者cD4リンパ球におけるアポトーシスを抑制した｡‑22‑