特集

食品衛生関係国内の食品微生物試験法とISO法とのハーモナイゼーション

Japanese Methods for the Microbiological Examination ofFoods should be harmonized with ISO methods
東京農業大学 教授

五十君 靜信Shizunobu Igimi (Professor)
Tokyo University of Agriculture

キ ーワード01

微生物試験法、国際整合性、妥当性確認

はじめに

2011年10月に生食用食肉の微生物基準が施行されたこ

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食品微生物のリスクマネージメントの国際基準

まず食品のリスクマネージメントを取り巻く国際情勢であるとにより、我が国も食品の微生物基準の策定に、コーデックス

が、食品は国際的に流通しているため、各国が独自のマネージ（Codex Alimentarius Commission；CAC）の求める数的メント方法を持ち微生物基準を決めるということは避けるべき指標（Metrics）を導入した。このような方向性が決まったことかで、原則としては食品の国際標準を決めるコーデックスの基準

ら、国内の食品の微生物基準策定は、コーデックスにより2007

やガイドラインに従うことが求められている。コーデックスの年に示された微生物学的リスクマネージメント方法に関するガ示す基準に拘束力があるわけではないが、コーデックス基準にイドラインCAC/GL 63-20071）に則り、行われていくものと思従っていない場合には、非関税障壁として貿易相手国から世界われる。

貿易機関（World Trade Organization；WTO）に提訴される

我が国のこのような食品微生物のリスクマネージメント方法可能性がある。それ故、食品におけるコーデックス基準は実質の国際対応に合わせて、食品の微生物検査では現実的に最も的に拘束力のあるものとなっている。コーデックスが食品微生影響を受けると思われる試験法についても、国際整合性のあの国際基準を決めるうえで、科学的根拠を尊重するという考える試験法への移行が進められている。2015年3月に出版され方は、食品のリスクマネージメントにおいて根幹となる考え方

2）
では、試験法の妥当性た食品衛生検査指針（微生物編2015）

で、それを支えているのはリスク評価であり、その結果から数的確認（バリデーション）という考え方が大幅に取り入れられてい指標を設定しマネージメントを行うことになる。

る。また、従来の基準や通知で示されていた試験法も、ISO法と各国の事情により、コーデックス基準とは異なった微生物基のハーモナイゼーションが進められており、平成27年（2016

準の設定が必要な場合や、そもそもコーデックスに基準の無い年）には黄色ブドウ球菌やサルモネラ属菌の試験法について食品とハザードの組み合わせに、その国の食習慣に合った微生もコーデックスが採用している標準法である国際標準化機構

物基準の策定とリスクマネージメントを行う必要があることが（International Organization for Standardization ；ISO）ある。例えば、我が国が策定した生食用食肉の微生物基準のよ法と整合性のある試験法に変更されている。

うに、その国に固有と思われるような食習慣により独自の基準

一方、厚生労働省並びに農林水産省では食品の衛生に関設定が必要となる場合には、コーデックスのガイドラインであして、食品の工程管理の制度化、特にコーデックスが標準とるCAC/GL 63-2007に従い、リスク評価を基に科学的根拠のしている危害要因分析重要管理点（Hazard Analysis andある微生物基準の策定が求められるようになっている。

Critical Control Point: HACCP）の導入の検討が進められてこのような 場 合 、C A C / G L 6 3 - 2 0 0 7 では 、摂 食 時 安いる。昨年2016年12月には、９回にわたり開催された厚生労全目標値（Food Safety Objectives；FSO）、達成目標値

働省の“食品衛生管理の国際標準化に関する検討会”の最終と（Performance Objectives；PO）、達成基準（Performanceりまとめの文書が公開された。この文書では、国内のHACCPCriteria；PC）などの数的指標（Metrics）を数値として示すの制度化に向けての方向性を示している。このように、わが国ことを求めている。また、FSOは、適切な衛生健康保護水準の食品衛生をとりまく環境は、大きく変わりつつあり、食品にお（Appropriate Level of Protection ；ALOP）との関係で設ける微生物試験法にも国際整合性が強く求められている。今後定することが求められている。この様な手順を経て、微生物学食品衛生における微生物試験法にどのように対応していく必要的基準（Microbiological Criteria；MC）を決めることになる。

があるかについて考えてみたい。

MCは、コーデックスの別のガイドラインCAC/GL 21-19973）で、食品製品あるいはあるロットの合否を規定するもの
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THE CHEMICAL TIMES

サンプリングプラン、検査単位、試験法およびフードチェーンに04

培養による試験法の意義おいて適用される箇所の5つの要素から構成される。数的指標

これまで述べてきた試験法は、公定法として利用する目的でで示された微生物濃度などの数値を検証する目的があるため、示されている試験法である。国家基準などの評価に用いる公定検証に用いることの出来る試験法は、その性能の評価が科学法には、いわゆるフルバリデートされた培養による標準試験法

的根拠のある妥当性確認（バリデーション）されていることが必を用いる必要がある。食品の微生物基準適合性を公的に判断須である。コーデックスの基準における標準試験法は、ISO法とするような目的で使われることを想定しており、裁判などに耐え指定されており、それによらない場合は、科学的根拠のある妥得るような科学的根拠のある試験法である。従って、食品の基当性確認された試験法を採用することとされている。

準適合性を判断するような目的の検査においては、
このような食品衛生
関係れる微生物濃度と汚染頻度と定義されており、微生物（毒素）、特集で、特定の試験法とサンプリングプランの使用条件下で認めら試験法を用いることが求められる。これらの試験法は、通常培03微生物学的基準（MC）で求められる試験法養法であるが、その理由は培養法が現在のところ食品中の微生物を評価する最も信頼性の高い方法であると考えられているためである。
培養法では、検体から微生物を分離する場合、前処理方法のコーデックス基準に採用されている標準試験法はISO法であ検討が必要となる。例えば、食品や土壌などから病原微生物をり、MCの検証に用いることの出来る試験法はISO法または、科分離する場合には、食品や土壌など、検体の種類に合わせた前学的根拠のある妥当性確認された試験法である。MCでは、上処理が必要となる。微生物の菌数が少ない場合は、選択的な増述のように数的指標で示された微生物濃度などの数値を検証菌が必要で、検体の種類により対象とする微生物を選択的に増する必要があるため、用いる試験法は、あらかじめ妥当性確認殖させる適当な増菌培地を選択する。食品や環境からの分離されていることが求められている。すなわち、今後我が国が新では、損傷菌対策が重要であり、損傷菌が回復し増殖可能となたに微生物基準を設定する場合に用いることが可能な試験法

る条件設定が菌の分離に影響を与える。また、分離する菌の性は、ISO法または科学的根拠のある妥当性確認が行われた試質に合わせて、培養温度、気相（嫌気条件、微好気条件、好気条験法であることが求められることになる。ISO 16140:20034）

件や二酸化炭素分圧など）、培養時間などの条件設定を行う。には、代替試験法の妥当性確認の方法が示されているので、このガイドラインに従った妥当性確認が科学的根拠の目安となる。試験法にも数学的、統計学的なバックグラウンドを求めている。このガイドラインは、2016年に改訂され、ISO 161402:2016 として発行されており妥当性確認に関する手法が更5）に細かく整理・記載されている。
このような要求に応える試験法の整備は、国立医薬品食品衛生研究所で進められており、標準試験法検討委員会により標準試験法（National Institute of Health Sciences Japan- The Methods for the Microbiological Examinationof Foods ; NIHSJ-MMEF）
として公開されている（http://www.nihs.go.jp/fhm/mmef/index.html）。NIHSJ-MMEF
を略してNIHSJ法と呼び、NIHSJ（番号）で各試験法が示されている。NIHSJ法はISO 16140に従って、当該微生物に関するISO法を参照法として、妥当性確認が行われており、コラボ試験により妥当性確認（いわゆるフルバリデート）
された試験用いる培地の選択と、前増菌、選択的増菌、選択的分離培養などを組み合わせ菌の分離を試みるが、培地上に形成された集落から、目的の菌を選択するには検査を行う者の経験と熟練を必要とする。
培養法は、このように、検査を行う者の知識や培養経験と専門的な技術を必要とすることから、試験結果は実施者の経験や技術力に影響を受けやすい。培養法の欠点は、検査を行う者が微生物に関する情報に精通し手技に熟練を要する必要があることと、検査結果が得られるまでに時間がかかることである。経験を積んだ熟練者が行えば、検査の正確さに関しては培養法が最も優れた試験法と言える。

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迅速法の意義法である。すなわち国家レベルの公定法として利用することを培養法は正しく行われるならば最も信頼性のある結果が得想定し検討された試験法である。2017年1月現在、既に30のられるが、前述のような熟練を要求し手技が煩雑であることや、試験法が検討され、17の試験法については検討が終了し、標検査結果を得るまでに時間がかかるといった欠点を考えると、準試験法としてwebで公開されている。生食用食肉の基準に検査の目的によっては他の試験法を選択する方がよいことがあ採用された腸内細菌科菌群試験法（NIHSJ-15）、リステリアのる。培養法の欠点を克服する方法として、さまざまな迅速法ある基準に採用されたリステリアの定性法（NIHSJ-08）、及び定量

いは簡易法と呼ばれる方法が開発されている。
ここでは、
このよ法
（NIHSJ-09）、食品、添加物等の規格基準のサルモネラ属菌

うな迅速法や簡易法を含めて、迅速法と呼ぶことにする。

試験法（NIHSJ-01）、黄色ブドウ球菌試験法（NIHSJ-03）、サー培地等による培養法が確立されていない微生物では、培養ベイランスのためのカンピロバクター試験法（NIHSJ-02）など法を利用することができない。この場合は、微生物の特徴が明が、公定法として活用されている。

らかになれば、その性質を利用して当該微生物の存在を示すことになり、その方法が当該菌を特異的に検出可能であれば、試験法として利用可能となる。これらには、資化性、形態、代謝物、特徴的な構造、酵素、毒素などが利用可能である。
遺伝子配列を利用した方法は、現在最も有用な方法として多11

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特集

くの微生物の検査に利用されている迅速法である。遺伝子配まだ国内には、試験法の妥当性確認を行う評価機関（第三者

食品衛生関係列を利用した方法は、培養のできない微生物を評価することも機関）はないが、ヨーロッパでは、ISO法を参照法として代替法できる。PCRなどの技術により理論値で1個の微生物の検出がの妥当性確認を行う第三者機関が機能している。フランスの可能である。多数の微生物が共存していても検出することが可

AFNOR、オランダのMicroVal、ノルウェーのNordValといっ能であり、リアルタイムPCRを用いれば定量的な評価が可能でた第三者機関は、ISO法を参照法として代替試験法を評価してある。遺伝子配列を利用した方法では、微生物が生きているかおり、その評価を受けた試験法は、信頼できる方法として広くを判断することは難しいとされていたが、RNAを標的とする、
あ活用されている。アメリカでは、既にISO法との整合性に力を入るいは微生物の膜の健全性と組み合わせる手法など新しい技れているが、AOAC INTERNATIONALという第三者機関によ術の開発によりこの欠点を克服しつつある。メタゲノム解析なり、公定法であるFDA-BAM法やAOAC-OMAといった標準試どでは、菌の集団を網羅的に評価することが可能である。

験法との妥当性確認が行われている。

抗原性を標的とした免疫学的方法も迅速法としてしばしば利微生物試験法では、化学物質の試験法のように適切な標準用されている。抗体を利用した方法は、一般的に安価に迅速な物質を設定することが難しく、ガイドラインなどに基づき誰もが検査をすることができ、その利用価値は高いと評価できる。免

妥当性確認を行うという状況ではない。そこで、微生物試験法

疫学的方法には、対象を微生物やその産生物を抗原とし特異的の妥当性確認は、上述のような第三者機関による妥当性確認をな抗体を利用する方法と、病原体に対する抗体を標的として評活用する必要がある。図1に、標準試験法（NIHSJ法）を介した価する方法があり、後者は臨床診断に用いられることが多い。

国内の公定法、ISO法、アメリカのFDA-BAM法との関係についATP測定法は、微生物を評価するというよりも汚れを含めててまとめた。このようなネットワークにより、第三者機関により清浄度を評価するというコンセプトの全く異なる検査方法で、妥当性確認された試験法が評価可能であることが理解できる培養法とは単純に比較のできない方法であるが、薬品や食品ものと思う。の製造工程の洗浄度を評価する目的で有用な試験法として広BAMく利用されている迅速法である。その他、いろいろな原理で開発された迅速法が存在し、研究段階の方法を含めて、多様な迅ISO

速試験法の開発が試みられている。

06(NIHSJ

試験法の妥当性確認を行う第三者機関)

基準適合性の評価には公定法を用いるべきであるが、それ以外の微生物検査では、その検査の目的に合わせて十分な信頼性がある試験法であれば用いることが可能である。特に今後

図1

HACCPが制度化され、その検証として用いる試験法は公定法

標準試験法と主な試験法との連携などの培養法を採用するよりもむしろ信頼性のある迅速法を用いる方が現実的である。多種・多様な試験法からどの試験法を選んだら良いか判断する場合、その試験法が妥当性確認されているかどうかによって選ぶことが良い。試験法の妥当性確認に関して総合的にまとめてある書籍は、サイエンスフォーラ
ム社から発行されている“最新版

食品分析法の妥当性確認

2011年に導入された生食肉の微生物基準の腸内細菌科菌が推薦できる。食品の評価に用いるためには、妥
ハンドブック ”

群試験法は、いわゆる国際スタンダードであるISOの試験法

当性確認済みの試験法であるかは最低限考慮されるべきであをそのまま導入したものである。これまで国内での使用実績

6）る。
“十分な信頼性”を判断するときに参考となるのが、妥当性の全くない試験法である腸内細菌科菌群試験法はなぜ、採用確認である。従って、信頼性のある試験法を開発するためにはされたのか？実は、コーデックスのガイドラインCAC/GL 63-

妥当性確認に関して知識がないと、“十分な信頼性”のある試験

2007 1）に従ってMCを設定しようとすると、その検証としての法を開発できない。どのレベルで妥当性確認が行われているか試験法はISO法を採用する必要があった。使用する培地が異なによって、対象となる試験法がどの程度の信頼性を持っているる衛生指標菌試験法をISO 16140に従い該当すると思われるかを評価することが可能である。

ISO法と妥当性確認することは難しいため、
コーデックスの標準

現在国内の公定法は国際的な標準法であるISO法と整合性

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腸内細菌科菌群試験法が登場したのは必然法とされているISO法をそのまま導入することになった。

を重視して置き換えられている。その主な理由は国際整合性を腸内細菌科菌群試験法は、ヨーロッパでは広く使われているもたせることであるが、海外の第三者機関による妥当性確認を衛生指標である。国内の公定法が採用しているDESO培地を活用できるようになるということも重要である。国内の公定法用いた大腸菌群試験法を使っている国は現在ほとんどなく、国がISO法と妥当性確認されていると、今後はISO法を参照法と際整合性の立場から基準値を評価する試験法として採用するして妥当性確認により評価されている試験法の性能を判断すことは困難であった。衛生指標は、多種・多様な菌が混在していることが可能となる。妥当性確認されている方法であれば、代るため、妥当性確認により性能評価することは容易ではない。

替法として迅速法の性能を評価することができる。

衛生指標については国際標準法をそのまま採用していくことTHE CHEMICAL TIMESのような方向性を持つISO法を採用することにより、今後食品おわりに検証の信頼性を確保するためには、信頼性の高い試験法をの検査も遺伝子診断などが主流となっていくであろうというこ採用していく必要がある。公定法で検討された妥当性確認はあとも考慮されていると言える。

くまでも法的根拠のある体系であり、国家基準の適合性判断に食品衛生関係あるという考え方がISO法で定着しつつある。今回の選択は、こ09特集が重要であると思われる。特定の培地による菌の集団をとらえるという考え方から、分類学的な集団を衛生指標とするべきで用いられる試験法は公定法である。一方、今後は食品の微生物

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制御は、工程管理すなわちHACCPの制度化に向かっている。

目的に合わせた試験法の選択

食品の工程管理の検証には、必ずしも公定法を用いる必要はな
く、信頼できる必要とする性能を持った迅速簡便法を利用するなど、目的にあった十分な性能が担保できる試験法を上手く使図1に示したネットワークを活用すると、第三者機関などで評うことが求められる。微生物の試験法の妥当性確認は、欧米で価された多くの代替法が利用可能となってくる。つまり、目的には第三者機関により行われている。特にヨーロッパには三か所合わせて試験法を選択する幅が広がると言うことになる。検査の第三者機関が機能しており、ISO法を参照法として妥当性確の目的によって採用する微生物試験法は異なる。例えば、サー認された試験法のリストを示している。アメリカではAOACイベイランス、問題の程度、実態を把握するための調査に使う試ンターナショナルによる妥当性確認が行われており、このよう験法は、公定法ほどのスペックは要求されない。工程の管理のな第三者機関の評価を受けている代替試験法を用いていくこモニタリングの試験法についても同様である。つまり、微生物とが大切であるといえる。

試験法はその目的によって、十分な性能が期待できる試験法であればそれを採用すれば良く、選択肢は様々である。性能はあ参考文献

る程度担保しながら、目的に最も適合した試験法を選択するこ

1) P R I N C I P L E S A N D G U I D E L I N E S F O R T H E C O N D U C T O F
MICROBIOLOGICAL RISK MANAGEMENT (MRM) (Codex AlimentariusCommission, CAC/GL 63-2007).とが重要である。どのレベルで検査を行うことが出来るかがわ
かる試験法を選ぶことが重要で、自分の目的に合っている性能

2) 食品衛生検査指針 微生物編2015 (日本食品衛生協会, 東京, 2015).

かを判断する根拠とできるのが、その試験法がどのレベルで妥

3) PRINCIPLES AND GUIDELINES FOR THE ESTABLISHMENT ANDAPPLICATION OF MICROBIOLOGICAL CRITERIA RELATED TO FOODS(Codex Alimentarius Commission, CAC/GL 21-1997).

当性確認をされているかによって判断すればよい。
微生物試験の選択肢を増やすために、現在我々は標準試験法の整備を進めており、他の代替試験法を評価するための尺度に使えるような標準試験法となることを期待している。標準試
験法を尺度としてほかの試験法を妥当性確認により評価し、当該の代替法はどの目的なら使えるという判断ができるようになることを期待している。国内にはまだ、海外で機能しているような第三者機関は存在しないため、当面はISO法を参照法として評価している海外の第三者機関の評価を参考とすることにな

4) Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Protocol for thevalidation of alternative methods (International Organization forStandardization, ISO 16140, 2003).
5) Microbiology of the food chain -- Method validation -- Part 2 : Protocol
for the validation of alternative（proprietary ）metnods against areference method (International Organization for Standardization, ISO16140-2, 2016).
6) 最新版 食品分析法の妥当性確認ハンドブック, 安井明美, 五十君静信, 後藤哲久, 丹野憲二, 湯川剛一郎編. (サイエンスフォーラム, 千葉,2010).

る。代替法である“迅速簡便法”などが試験法としてどの程度の性能なのかを明確にできるような考え方も整備することが必要である。

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