入門ガイド

Applied Biosystems StepOne™
および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems
標準曲線実験

入門ガイド

はじめにApplied Biosystems StepOne™
および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems
標準曲線実験

実験の設計

反応の準備

実験の測定

実験の解析

© Copyright 2007, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved.
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Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation.
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部品番号 4377734 Rev. C

06/2010目次
序章 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
このガイドの使用方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .vii
詳細に関する参考資料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
サポートの受け方 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .xii
本書で使われている安全に関する表記法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
装置に付いているマーク . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv装置に付いている安全上のラベル . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi
装置の安全性に関する一般的注意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii
薬品に関する安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xviii
化学廃棄物に関する安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix
電気に関する安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx

LED の安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
バイオハザードに関する安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
ワークステーションに関する安全性 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii
安全性および電磁環境適合性（EMC）規格 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii

第1章

はじめに . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734TOC.fm

DRAFT

標準曲線実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
本書の使用方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
実験例について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
実験例ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13第2章

実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
新しい実験の作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
実験プロパティの定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
方法と物品の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
ターゲットのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
スタンダードのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
サンプルのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
測定方法のセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
反応セットアップの確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
実験用物品の注文 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

iii

［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

第3章

反応の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
サンプル希釈液の調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
スタンダード希釈シリーズの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
反応ミックスの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
反応プレートの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

第4章

実験の測定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
測定の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
（オプション）通知設定の有効化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
測定の開始 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
測定の監視 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
プレートの取り出しとデータの転送 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

第5章

実験の解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
セクション 5.1：結果の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
実験の解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
標準曲線の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
ウェルテーブルの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
データのパブリッシュ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
セクション 5.2：トラブルシューティング（必要に応じて）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103［Analysis Settings］（解析設定）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104［QC Summary］（QC サマリー）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
解析からウェルを選択削除 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . 109

付録 A

代替実験ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116［QuickStart］（クイックスタート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117［Template］（テンプレート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

iv

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

DRAFT［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

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増幅プロットの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
用語集 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734TOC.fm

DRAFT

索引 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイドv

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734TOC.fm

DRAFT
vi

序章
このガイドの使用方法
システム文書についてApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems（StepOne™
および StepOnePlus™ システム）には、以下に示したガイドが付属しています。
参考： 本ガイドで使用される Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time
PCR Systems という表記は、Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System および Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR System の 2 製品を示します。

ガイド

Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Genotyping
Experiments™

Applied Biosystems StepOne and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for
Presence/Absence Experiments
Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Relative Standard
Curve and Comparative CT Experiments

目的と対象

PN

日本語版
PN

StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う方法
を解説します。各『入門ガイド』には次の 2 つの機能があります。

43767864377731437678743777224376785437774043767844377734

43767824377796437678343777904379704

4377716• Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR Software（StepOne™ ソフトウェア）で提供されている実験デー
タ例を使ったチュートリアル。
• 実際の実験のためのガイド。
StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています。

Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Standard Curve
Experiments
Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlusô Real-Time PCR Systems
Installation, Networking, and Maintenance
Guide

StepOne および StepOnePlus システムの設置とメンテナンスの方法を解説します。
StepOne または StepOnePlus システムを設置、メンテナ
ンスする実験室スタッフを対象に書かれています。

Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlusô Real-Time PCR Systems
Installation Quick Reference Card
Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlusô Real-Time PCR Systems
Reagent Guide

StepOne および StepOnePlus システムで使用する試薬に関する情報を提供し、以下のものが含まれます。
• TaqMan® および SYBR® Green 試薬に関する序論• 以下の実験タイプに対する設計ガイドラインの説明– 定量実験
– ジェノタイピング実験– 有無実験
StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

vii

序章
このガイドの使用方法

ガイド

目的と対象

PN

日本語版
PN

Applied Biosystems StepOne™ andStepOnePlusô Real-Time PCR Systems Site
Preparation Guide

StepOne および StepOnePlus システムの受け取りと設置に向けた設置場所の準備作業を解説します。

43767684378357

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR Software Help

StepOne ソフトウェアを用いて以下の事項を行う方法を解説します。

NA

NA

StepOne または StepOnePlus システムの設置前にしておくべき設置場所の準備作業をスケジュール設定、管理、実施する担当者向けに書かれています。

• StepOne および StepOnePlus システムで実験のセット
アップ、測定、解析。
• ネットワーク上の StepOne および StepOnePlus 装置の監視。
• StepOne および StepOnePlus 装置のキャリブレーション。
• RNase P 測定による StepOne および StepOnePlus 装
置の性能確認。
対象：• StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者。
• StepOne または StepOnePlus システムを設置、メンテ
ナンスする実験室スタッフ。

前提条件

本書は、次のことを前提に書かれています。

•
•
•
•
•

テキスト表記法

Microsoft Windows® XP オペレーティングシステムに精通している。
インターネットとインターネットブラウザに精通している。

DNA または RNA サンプルの取扱いおよび PCR のための調製方法に関する知識がある。
データ保存、ファイル転送、コピーと貼り付けを理解している。
既存の実験データフローへ StepOne または StepOnePlus システムを組み込む場合、ネッ
トワーク構築の経験がある。

本書では、次の表記法を採用しています。

• 太字はユーザーが行う操作を示します。次に例を示します。
0 を入力してから、残りの各フィールドで Enter を押します。
• 斜体 文字は、新規または重要な用語を示すほか、強調する際にも使われます。次に例を示します。
解析前に、必ず 新しいマトリックスを調製してください。

• 右矢印記号（）は、ドロップダウンまたはショートカットメニューからユーザーが続
けて選択すべきコマンドの区切りとして使われます。次に例を示します。
（開く）を選びます。
［File］（ファイル）［Open］

ユーザーの注意を促す語句

Applied Biosystems ユーザー文書では、ユーザーの注意を促す 2 種類の用語が使われています。各語句は、次のような注意や対応が必要なことを示します。
参考： － 必ずしも製品の使用に不可欠というわけではありませんが、製品を使用する上で役に立つ情報です。
重要！ － 装置の適切な操作、試薬キットの正しい使用、化学薬品の安全な使用にとって必要な情報を提供します。

viii

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

序章
詳細に関する参考資料

ユーザーの注意を促す用語の例を下記に示します。
参考：［Calibrate］（キャリブレーション）機能は、コントロールコンソールでも利用できます。
重要！ クライアント接続を確認するには、有効なユーザー ID が必要です。

安全上の警告語句

本書では安全上の警告語句も使用されています。詳細については、「安全上の警告語句」（xiiiページ）をご参照ください。

詳細に関する参考資料
関連文書

StepOne および StepOnePlus システム文書
下表に示した文書は、StepOne または StepOnePlus 装置に付属していません。以下の文書は、2007 年 7 月以降に入手可能となります。
文書

PN

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Installation Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Installation Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Planned
Maintenance Protocol

4376788

ジェノタイピング実験関連文書
文書

PN

Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Quick ReferenceCard4312212

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol

4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol

4334431

Ordering TaqMan® SNP Genotyping Assays Quick Reference Card

4374204

Performing a Custom TaqMan® SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick
Reference Card

4371394

Performing a TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick
Reference Card

4367636

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol

4312214

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol

4362038

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol

4332856

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイドix

序章
詳細に関する参考資料

有無実験関連文書
文書

PN

DNA Isolation from Fresh and Frozen Blood, Tissue Culture Cells, and Buccal Swabs
Protocol4343586

NucPrep® Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue
Protocol4333959

PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent Protocol

4318925

相対標準曲線および比較 CT 実験関連文書
文書

PN

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note

127AP05

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol

4375575

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide

4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression

4303859標準曲線実験関連文書
文書

x

PN

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note

127AP05

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide

4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression

4303859

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

序章
詳細に関する参考資料

試薬ガイド関連文書
文書

PN

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol

4375575

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4334429

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines

4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol

4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol

4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol

4312214

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide

4362460

SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol

4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol

4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol

4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol

4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

4351891

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

4333458

TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol

4371135

TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol

4371131

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol

4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression

4303859

Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for
Experimental Studies Application Note

127AP08

参考： その他の文書については、「サポートの受け方」（xii ページ）をご参照ください。

ソフトウェアヘルプ
情報の入手

StepOne ソフトウェアヘルプは、ユーザーインターフェースの各機能の使い方を説明します。
ソフトウェア内のヘルプにアクセスするには、下記のいずれかを行います。

• F1 を押します。
• ツールバーのをクリックします。

（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne ソフトウェアヘルプ）を選• ［Help］
択します。
ヘルプで関心トピックを見つけるには：• 目次を確認します。
• トピックを指定して検索します。
• アルファベット順の索引を検索します。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

xi

序章
サポートの受け方

コメントの送付

Applied Biosystems は、ユーザー文書を改善するために、お客様のコメントやご意見をお待
ちしています。コメントは電子メールで以下のアドレスまでお寄せください。

techpubs@appliedbiosystems.com
重要！ 上記の電子メールアドレスは、文書に関するコメントおよびご意見専用です。
文書のご注文や、PDF ファイルのダウンロード、技術上のご質問については、（サポート）リンクをクリックしてくだ
http://www.appliedbiosystems.com で［Support］
さい。（「サポートの受け方」（xii ページ）参照）。

サポートの受け方
最新のサービスおよびサポート情報については、http://www.appliedbiosystems.co.jp で［Support］（サポート）リンクをクリックしてください。
カスタマーサポートページでは次のサービスをご利用いただけます。

• Q&A の検索
• テクニカルサポートへの質問提出• Applied Biosystems ユーザー文書、MSDS、その他の関連文書の注文• PDF 文書のダウンロード• ユーザートレーニングに関する情報入手• ソフトウェアのアップデートやパッチのダウンロード
尚、技術的な質問を行うには、Applied Biosystems メンバーシップ会員として入会し、ログインしていただく必要があります。
重要！ 本書に指示のある場合や StepOne™ または StepOnePlus™ 装置のメンテナンス（年次
定 期 メ ン テ ナ ン ス や 温 度 確 認 ／ キ ャ リ ブ レ ー シ ョ ン）を ス ケ ジ ュ ー ル す る 際 は、Applied Biosystems PCR アドミにご連絡ください。PCR アドミへは、お電話 0120-203-885
までお問い合わせください。

xii

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

序章
本書で使われている安全に関する表記法

本書で使われている安全に関する表記法
安全上の警告語句

安全上の警告語句は 4 種類あり、Applied Biosystems の文書中、危険発生の可能性について
ユーザーに警告を促すべき箇所に適宜使われています。警告を促す各語句（重要、注意、警告、危険）は、次のような注意や対応の必要を示します。

定義
重要！ －装置の適切な操作、試薬キットの正しい使用、化学薬品の安全な使用にとって必要な情報を示します。

－この情報を無視すると、軽度または中程度の怪我を負う可能性のある危険な状況であることを示します。安全でない行為を警告する際に使われる場合もあります。

－この情報を無視すると、重傷を負ったり、死亡する可能性のある危険な状況であることを示します。

－すぐに対応しないと、死亡や重症を引き起こす切迫した状況であることを示します。この語句は、もっとも危険な状況にのみ使われます。

Applied Biosystems 文書中で使われている「重要」以外の安全上の警告語句は、危険マーク
を 含 む 三 角 形 の グ ラ フ ィ ッ ク と と も に 記 載 さ れ て い ま す。こ れ ら の 危 険 マ ー ク は、Applied Biosystems の装置に貼付されている危険アイコンと同じマークです（「安全上のマーク」（xv ページ）参照）。

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xiii

序章
装置に付いているマーク

例
重要！ 各 96 ウェルプレートについて、個別のサンプル入力スプレッドシートを作成する必要があります。

危険な薬品：TaqMan® Universal PCR Master Mix は、目と皮膚に炎症を引き起こす可能性があります。飲み込んだり、吸入すると、不快な症状が発生する可能性があります。MSDS をよく読み、取扱い上の指示に従ってください。使用時には、適切な保護め
がね、保護服、保護手袋を着用してください。

怪我の危険：装置の操作中、カバーやサンプルブロックは 100 °C 超にまで加熱される可能性があります。

電気に関する危険：安全に操作するには、接地回路の連続性が不可欠です。接地回路が接続されていないシステムは絶対に操作しないでください。

装置に付いているマーク
電気関連のマーク

次表に、Applied Biosystems の装置に表示されている電気関連のマークを示します。
記号

説明
主電源スイッチがオンの位置になっていることを示します。
主電源スイッチがオフの位置になっていることを示します。
装置をスタンバイ状態にするスタ
ンバイスイッチを示します。このス
イッチがスタンバイ状態の場合は、危険な電圧が存在する恐れがあります。
プッシュプッシュ主電源スイッチ
がオン／オフの位置になっている
ことを示します。

xiv

記号

説明
別の装置の信号接地基準に接続されている可能性のある端子を示します。これは、保護接地端子ではありません。
保護接地端子を示し、装置に他の電気的接続を行う前に、この端子をアース接地に接続する必要があります。
交流の電流または電圧を入力または出力できる端子を示します。
交流または直流の電流または電圧を入力または出力できる端子を示します。

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序章
装置に付いているマーク

安全上のマーク

次表に、Applied Biosystems の装置に表示されている安全上のマークを示します。これらのマークは、マーク単独で示されることもあれば、関連する危険を説明するテキストと一緒に表示される場合もあります（「装置に付いている安全上のラベル」（xvi ページ）参照）。これ
らの安全上のマークは、本書やその他の製品マニュアル中で「危険」、「警告」、「注意」の語句の隣に表示される場合もあります。
記号

説明

記号

詳細情報についてマニュアルを参照し、適切な注意を払いながら操作を進める必要があることを示します。

可動性の部品が存在するため、適切な注意を払いながら操作を進める必要があることを示します。
感電の危険があるため、適切な注意を払いながら操作を進める必要があることを示します。

表面などの高温の危険があるため、適切な注意を払いながら操作を進める必要があることを示します。

環境に関するマーク

説明

装置内でレーザーが発生するため、
適切な注意を払いながら操作を進める必要があることを示します。

下記の記号は、2005 年 8 月 13 日以降に欧州市場で販売されるすべての Applied Biosystems
電気および電子機器製品に適用します。
記号

説明
本製品は、一般廃棄物として廃棄しないでください。廃電気電子機器（WEEE）による環境への影響を低減するための、地域の廃棄物条例の適切な廃棄に関する規定に従ってください。
欧州連合のお客様：
最寄りの Applied Biosystems カスタマーサービスオフィスまで、装置の回収とリサイク
ルについてお問い合わせください。欧州連合カスタマーサービスオフィスのリストについては、http://www.appliedbiosystems.com を参照してください。

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xv

序章
装置に付いている安全上のラベル装置に付いている安全上のラベル「注意」、「警告」、「危険」で始まる下記の注意事項は、前のセクションで説明した安全上のマークとともに Applied Biosystems の装置に表示されることがあります。

警告の表示位置

xvi

英語

フランス語

CAUTION Hazardous chemicals. Read theMaterial Safety Data Sheets (MSDSs) before
handling.

ATTENTION Produits chimiques dangeureux.
Lire les fiches techniques de sûreté dematériels avant la manipulation des produits.

CAUTION Hazardous waste. Refer toMSDS(s) and local regulations for handlingand disposal.

ATTENTION Déchets dangereux. Lire lesfiches techniques de sûreté de matériels et larégulation locale associées à la manipulation
et l'élimination des déchets.

CAUTION Hot surface.

ATTENTION Surface brûlante.

DANGER High voltage.

DANGER Haute tension.

WARNING To reduce the chance of electricalshock, do not remove covers that require toolaccess. No user-serviceable parts are inside.
Refer servicing to Applied Biosystems
qualified service personnel.

AVERTISSEMENT Pour éviter les risquesd'électrocution, ne pas retirer les capots dont
l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils.
L’instrument ne contient aucune pièce
réparable par l’utilisateur. Toute intervention
doit être effectuée par le personnel de service
qualifié de Applied Biosystems.

CAUTION Moving parts.

ATTENTION Parties mobiles.

DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible
LED radiation present when open andinterlocks defeated. Avoid exposure to beam.

DANGER Rayonnement visible ou invisibled’un faisceau LED de Classe 3B (III) en cas
d’ouverture et de neutralisation desdispositifs de sécurité. Evitez toute
exposition au faisceau.

StepOne および StepOnePlus システムでは、警告は下図に示す位置にあります。

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序章
装置の安全性に関する一般的注意事項

装置の安全性に関する一般的注意事項
怪我の危険：本装置を Applied Biosystems の指示に従わないで使用すると、ユーザーが怪我を負ったり、装置が破損する可能性があります。

装置の移動と持ち上げ

怪我の危険：本装置の移動や配置は、各装置の設置場所の準備に関するガイドに指定されている担当者または販売業者のみが行ってください。一旦設置した後に装置を持ち上げたり、移動する場合は、必ず、他の人にも助けを依頼し、適切な搬送器具や正しいリフト技術をお使いください。正しい方法で持ち上げないと、背中を痛め、痛みが長く続く恐れがあります。装置の重量によりますが、装置の移動や持ち上げには、2 人以上の人員が必
要になることがあります。

コンピュータとモニタの移動と持ち上げ

一人でコンピュータやモニタを持ち上げたり、移動しようとしないでください。コンピュータやモニタの重量によりますが、移動や持ち上げには 2 人以上の人員が必要になることがあります。
コンピュータやモニタを持ち上げる前に考慮すべき項目：• 持ち上げる際に、コンピュータまたはモニタをしっかり持ちやすいようにつかんでいることを確認してください。

• 装置の現在位置から設置予定場所までの経路に障害物がないことを確認してください。
• 装置を持ち上げるのと同時に胴体をひねらないように注意してください。
• 持ち上げる際には両脚の力を利用し、背骨は良好な中間位に保ってください。
• 装置を持ち上げて運ぶ前に、それら作業に携わる人員の間で、持ち上げと移動の呼吸やタイミングを確認しあってください。

• 装置を梱包されてきた箱から出すには、装置を箱から持ち上げるのではなく、箱を注意
深く横に傾けて、一人がしっかり押さえている間に、他の人が中身を箱からスライドさせて取り出してください。

装置の操作

装置の操作者に関して次のことを確認してください。

• 一般的な実験室の安全性基準と装置固有の安全性基準に関する指導を受けたこと。
• 該当するすべての化学物質等安全性データシート（MSDS）をよく読み理解していること。「MSDS について」（xviii ページ）をご参照ください。
装置のクリーニング／除染製造元が推奨する以外のクリーニング／除染方法を使用する際は、事前に製造元に、その方法で装置が損傷しないかご確認ください。

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xvii

序章
薬品に関する安全性

薬品に関する安全性
危険な薬品に関する警告

危険な薬品：薬品を取り扱う前に、必ず、製造元の提供する化学物質等安全性
データシート（MSDS）をよく読み、関連するすべての注意事項を確認してください。

危険な薬品の保管：ガラス容器は壊れる恐れがあるため、廃棄物の収集や保管にガラス容器を使用しないでください。試薬ボトルおよび廃棄物ボトルは、ひびが入ったり、漏れる恐れがあります。各廃棄物ボトルは、低密度ポリエチレン安全容器内に保管し、カバーをしっかり閉め、ハンドルをまっすぐ立てた状態でロックします。試薬ボトルや廃棄物
ボトルを取り扱う際には、適切なめがね、保護服、手袋を着用してください。

薬品に関する安全性
ガイドライン

薬品の危険を最小限にするため：• 薬品や危険物を貯蔵し、取扱い、使用する前に、必ず、製造元の提供する化学物質等安（「MSDS について」（xviii
全性データシート（MSDS）をよく読み、理解してください。
ページ）をご参照ください。）• 薬品との接触を最小限に抑えてください。薬品の取扱い時には、適切な保護具（例、安全めがね、保護手袋、保護服）などを着用してください。その他の安全上のガイドラインについては、MSDS をご参照ください。

• 薬品の吸入を最小限に抑えてください。薬品の容器を開けたままにしないでください。
必ず適切な換気の下（例、ドラフト）でご使用ください。その他の安全上のガイドラインについては、MSDS をご参照ください。

• 薬品が漏れたり、こぼれていないかを定期的にチェックしてください。漏れたり、こぼれた場合には、MSDS で製造元の推奨する清掃手順に従ってください。
• 薬品の貯蔵、取扱い、廃棄に関する国や地方自治体の法律および規制に従ってください。

MSDS について

薬品製造元は、新しい顧客に危険な薬品を納品する時に最新の化学物質等安全性データシー
ト（MSDS）を提供します。また、MSDS を更新した後初めて危険な薬品を納品する際にも最新の MSDS を提供します。MSDS には、その薬品を安全に貯蔵し、取扱い、輸送、廃棄する際に必要な安全上の情報が記載されています。
危険な薬品とともに新しい MSDS を受け取ったときは必ず、古い MSDS と差し替えて保管してください。

MSDS の入手

Applied Biosystems が提供する薬品の MSDS は、無料で毎日 24 時間ご利用いただけます。MSDS の入手：

1. https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html を開きます。
2. ［MSDS Search］（MSDS 検索）ページの［Search］（検索）フィールドで：
a. 目的の MSDS に記載されていることが期待される、薬品名、部品番号、またはその他の情報をタイプ入力します。
b. 中央の［All languages］（全言語）をプルダウンして「Japan-Japanese」（日本‐日本語）を選びます。
c. ［Search］（検索）をクリックします。

xviii

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序章
化学廃棄物に関する安全性

3. 目的の文書を表示、ダウンロード、印刷するには：
a. 文書のタイトルを右クリックします。
b. 以下から選択します。

• Open（開く）－ 文書を表示する場合• Save Target As（対象をファイルに保存）－ 文書の PDF ファイルを希望の保存先にダウンロードする場合• Print Target（対象を印刷）－ 文書を印刷する場合

4. ［Search Results］（検索結果）ページの MSDS のコピーを FAX や電子メールで送信するには：a. 文書タイトル下の［Fax］または［Email］（電子メール）を選択します。
b. 文書リストの最後にある［RETRIEVE DOCUMENTS］（文書取得）をクリックします。
c. 必要な情報を入力します。
d. ［View/Deliver Selected Documents Now］
（選択した文書を表示／送信）をクリックします。
参考： Applied Biosystems が提供する以外の化学薬品の MSDS を入手するには、各製造元にお問い合わせください。

化学廃棄物に関する安全性
危険な化学廃棄物

危険な廃棄物：取扱いと廃棄については、化学物質等安全性データシートと地方自治体の規制に従ってください。

危険な化学廃棄物：Applied Biosystems の装置から排出される廃棄物は危険物質で、怪我、病気、死亡を引き起こす可能性があります。

危険な薬品の保管：ガラス容器は壊れる恐れがあるため、廃棄物の収集や保管にガラス容器を使用しないでください。試薬ボトルおよび廃棄物ボトルは、ひびが入ったり、漏れる恐れがあります。各廃棄物ボトルは、低密度ポリエチレン安全容器内に保管し、カバーをしっかり閉め、ハンドルをまっすぐ立てた状態でロックします。試薬ボトルや廃棄物
ボトルを取り扱う際には、適切なめがね、保護服、手袋を着用してください。

化学廃棄物に関する
安全性ガイドライン

化学廃棄物の危険を最小限にするため：• 化学廃棄物は、廃棄物容器に入っている薬品の製造元の提供する原材料安全性データ
シート（MSDS）をよく読んで理解してから貯蔵、処理、廃棄してください。
• 第一および第二廃棄物容器を用意してください。（第一廃棄物容器には廃棄物をそのまま入れます。第二廃棄物容器には、第一廃棄物容器から漏れたり、こぼれたものを入れておきます。両容器とも、廃棄物に適したもので、容器の保管に関する国や地方自治体の必要条件を満たす必要があります。）

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xix

序章
電気に関する安全性• 薬品との接触を最小限に抑えてください。薬品の取扱い時には、適切な保護具（例、安全めがね、保護手袋、保護服）などを着用してください。その他の安全上のガイドラインについては、MSDS をご参照ください。

• 薬品の吸入を最小限に抑えてください。薬品の容器を開けたままにしないでください。
必ず適切な換気の下（例、ドラフト）でご使用ください。その他の安全上のガイドラインについては、MSDS をご参照ください。

• 薬品廃棄物は、ドラフト内で取り扱ってください。
• 廃棄物容器の内容物を廃棄した後は、容器のふたをしっかり閉めてください。
• 廃棄物トレイや廃棄物ボトルの内容物は、Good Laboratory Practices（GLP）および国や地方自治体の環境・健康に関する規制に従って廃棄してください。

廃棄物の廃棄装置の操作時に危険な可能性のある廃棄物が出た場合は、次のことを実施してください。

• 実験室で使用した特定のアプリケーション、試薬、基質から発生する廃棄物を同定（必要に応じて分析）してください。

• 実験室のスタッフ全員の健康と安全を確保してください。
• 装置廃棄物が、国および地方自治体の規制に従って貯蔵、移動、輸送、廃棄されることを確認してください。
重要！ 放射性物質やバイオハザード物質は、特別な処理法が必要となり、廃棄が制限される
場合があります。

電気に関する安全性
感電の危険： 装置パネルを所定の位置にセットしないで StepOne または
StepOnePlus システムを操作すると、重度の感電が発生することがあります。装置のパネルは取り外さないでください。装置パネルを装置から取り外すと、高電圧接点が露出します。

ヒューズ

火災の危険：ヒューズや高圧電源を誤って取り付けると、装置の配線システムを破損し、火災が発生する可能性があります。装置の電源を入れる前に、ヒューズが正しく取り付けられ、装置の電圧が実験室の電源に一致していることを確認してください。

火災の危険：火災の危険を防止するため、ヒューズの交換には、必ず、装置に指定されたタイプと定格のヒューズをお使いください。

xx

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序章
LED の安全性

電源

電気に関する危険：装置を安全に操作するには、接地回路の連続性が不可欠です。接地回路が接続されていない装置は絶対に操作しないでください。

電気に関する危険：施設の電圧電源には、適切に構成された認可済みの電源
コードをお使いください。

電気に関する危険：本システムのプラグは、適切な電気容量を持つ正しく接地されたコンセントに接続してください。

過電圧定格

StepOne および StepOnePlus 装置は、設置カテゴリ（過電圧カテゴリ）II で、ポータブル機器に分類されています。

LED の安全性
安全な LED 動作のために：• 本システムは、Applied Biosystems のテクニカルサポート担当者にメンテナンスを依頼してください。

• 装置使用時は、すべての装置パネルを装置の所定の位置にセットしてください。すべてのパネルを設置すると、検出可能な放射は起こりません。LED 作動中（安全インター
ロックを無効にして整備中）にパネルを取り外すと、クラス 3B の定格を超える LED
照射被曝の恐れがあります。

• 安全性ラベルをはがしたり、安全インターロックを無効にしないでください。

バイオハザードに関する安全性
一般的なバイオハザード

バイオハザード：ヒトやその他の動物の組織、体液、感染因子、血液などの生物学的サンプルは、感染症を媒介する可能性があります。適切な国や地方自治体の規制すべてに従ってください。適切な保護具（例、保護めがね、保護面、保護衣／白衣、保護手袋）などを着用してください。すべての作業は、適切な設備の施設で、適切な安全機器（物理的封じ込め装置など）を使用して行ってください。担当者は、適切な規制および社内／組織内の必要条件に従って訓練を受けてから、感染源となりうる物質を取り扱うようにしてください。下記の適切なガイドラインや規制上の必要条件をよく読み、従ってください。

• U.S. Department of Health and Human Services guidelines published in Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories（stock no. 017-040-00547-4;
http://bmbl.od.nih.gov）• Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens（29CFR§1910.1030; http://www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/
29cfr1910a_01.html）• 感染源となりうる物質の取り扱いに関する、社内／組織内の生物学的安全性（バイオセーフティー）プログラムプロトコル。
バイオハザードのガイドラインに関する追加情報は、次のサイトからも入手できます。

http://www.cdc.gov
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

xxi

序章
ワークステーションに関する安全性

ワークステーションに関する安全性
適切な人間工学的環境が確保できるようワークステーションを構成すると、疲れ、痛み、緊張などの影響を軽減または防止できます。作業中に自然でリラックスした姿勢を取れるようにワークステーションを構成して、これらの影響を最小限または完全になくすようにしてください。
筋肉や骨に与える繰り返し動作の危険：この危険は、繰り返し動作、不適切な姿勢、無理な力、不健康な姿勢を長時間維持、接触圧、その他のワークステーション環境因子などを含む危険要因によって生じます。
筋骨格および繰り返し動作の危険を最小限にするには：• 自然な作業姿勢を維持し、キーボード、モニタ、マウスをより使いやすくするような備品を使用します。

• キーボード、マウス、モニタは、胴体や頭がリラックスできるような位置に配置してください。

安全性および電磁環境適合性（EMC）規格
米国とカナダにおける安全性規格

StepOne および StepOnePlus 装置は、以下の規格に準拠していることが試験で確認されています。

UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92,「Safety Requirements for Electrical
Equipment for Measurement, Control, and Laboratory Use, Part 1: General Requirements.」
UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010,「Particular Requirements for Laboratory
Equipment for the Heating of Materials.」
FDA「Radiation Control for Health and Safety Act of 1968 Performance Standard 21 CFR
1040.10 and 1040.11」（該当する場合）
カナダの EMC 規格

本装置は、「ICES-001, Issue 3: Industrial, Scientific, and Medical Radio Frequency Generators」に準拠していることが試験で確認されています。

ヨーロッパの安全性
および EMC 規格

安全性
本装置は安全性に関するヨーロッパの必要条件（Low Voltage Directive 73/23/EEC）を満たし て い ま す。 本 装 置 は、EN 61010-1:2001 規 格、「Safety Requirements for Electrical
Equipment for Measurement, Control and Laboratory Use, Part 1: General Requirements.」に準拠していることが試験で確認されています。

EN 61010-2-010、「Particular Requirements for Laboratory Equipment for the Heating ofMaterials」
EN 61010-2-081、「Particular Requirements for Automatic and Semi-AutomaticLaboratory Equipment for Analysis and Other Purposes」
EN 60825-1、「Radiation Safety of Laser Products, Equipment Classification,
Requirements, and User’s Guide」

xxii

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

序章
安全性および電磁環境適合性（EMC）規格

EMC
本装置は、エミッションとイミュニティに関するヨーロッパの必要条件（EMC Directive「Electrical
89/336/EEC）を満たしています。本装置は、EN 61326（Group 1, Class B）規格、
Equipment for Measurement, Control and Laboratory Use － EMC Requirements」に準拠していることが試験で確認されています。

オーストラリアの
EMC 規格本 装 置 は、AS/NZS 2064 規 格、「Limits and Methods Measurement of Electromagnetic
Disturbance Characteristics of Industrial, Scientific, and Medical (ISM) Radio-frequency
Equipment」に準拠していることが試験で確認されています。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

xxiii

序章
安全性および電磁環境適合性（EMC）規格

xxiv

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第1章

はじめに
本章の内容：■ StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
■ 使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
■ 標準曲線実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
■ 本書の使用方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
■ 実験例について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10■ 実験例ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
をクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
ルバーのSoftware ヘルプ）を選択します。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

1

第 1 章 はじめに
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて

StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて
Real-Time PCR システムには、二つのモデルがあります。
システム

特徴

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System（StepOne™ システム）• 48 ウェルプラットフォーム• 3 色システム

Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time
PCR System（StepOnePlus™ システム）• 96 ウェルプラットフォーム• 4 色システム• VeriFlex™ サンプルブロック

StepOne および StepOnePlus システムでは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）試
薬を使って、次の機能を提供します。

• リアルタイム解析を使ったターゲット核酸配列（ターゲット）の定量検出• PCR 後（エンドポイント）解析を使ったターゲットの定性検出• PCR 生成物の定性解析（PCR 後の融解曲線解析による）データ収集について

StepOne および StepOnePlus システムは、実施する測定タイプに応じて、PCR 中に様々なポイントで生の蛍光データを収集します。
測定タイプ
リアルタイム測定

標準曲線法

データ収集ポイント
装置は、PCR の各伸長ステップ後にデータを収集します。

相対標準曲線法
比較 CT（∆∆CT）

PCR 後（エンドポ
イント）測定ジェノタイピング
実験
有無実験

装置は、次のポイントでデータ収集を行います。

• PCR 前（有無実験の場合には、PCR 前のデータ収集
はオプションですが、推奨されています。）• （オプション）PCR 中。装置は、測定中（リアルタイム）にデータを収集できます。測定中のデータ収集
は、トラブルシューティングに役立ちます。
• PCR 後測定タイプに関わらず、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置によるデータ収集ポイントまたは読取 は、3 相で構成されています。

1. 励起 － 装置内にある反応プレートのすべてのウェルを照射し、各反応でフルオロフォ
アを励起します。

2. 放射 － 装置の光学系は、反応プレートのウェルから放射された残留蛍光を収集します。
装置で収集されたイメージは、放射波長の範囲に対応する光だけで構成されています。

3. 収集 － 装置は、一定時間内に収集された残留蛍光をデジタル表示します。StepOne™ ソ
フトウェアには、解析向けに生の蛍光イメージが保存されます。

ノート

2

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 1 章 はじめに
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて測定後、StepOne ソフトウェアは、キャリブレーションデータ（空間、Dye、Background）
を使って、各読取における蛍光信号の位置と強度、各蛍光信号に関与する色素、信号の重要性を特定します。

フィルタについて

StepOne および StepOnePlus システムでは、以下のフィルタを使用します。
StepOne システム
フィルタ

1

色素

FAM™ 色素StepOnePlus システム
フィルタ

1

SYBR® Green 色素
2

JOE™ 色素

ROX™ 色素FAM™ 色素SYBR® Green 色素

2

VIC® 色素3

色素JOE™ 色素
VIC® 色素3

TAMRA™ 色素
NED™ 色素4

VeriFlex™ 技術について

ROX™ 色素StepOnePlus 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、サーマルサイ
クリング条件の最適化が容易です。VeriFlex ブロックは、それぞれ異なる温度設定をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です。

詳細について詳細については：『Applied Biosystems StepOne™ Real• StepOneおよびStepOnePlusシステムについては、Time PCR Software Help』をご参照ください。
参考：［Help］（ヘルプ）にアクセスするには、StepOne ソフトウェアで［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne Software ヘルプ）を選択してください。
『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™
• ジェノタイピング実験については、
Real-Time PCR Systems ジェノタイピング実験入門ガイド』をご参照ください。
『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time• 有無実験については、
PCR Systems 有無実験入門ガイド』をご参照ください。
『Applied Biosystems StepOne™ およ• 相対標準曲線と比較 CT（∆∆CT）実験については、™
び StepOnePlus Real-Time PCR System 相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド』をご参照ください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

3

第 1 章 はじめに使用可能な消耗品

使用可能な消耗品
StepOne システム

StepOne システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、標準および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。
重要！ 標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。
消耗品

部品番号

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film

• 4375816• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip• 4358293• 4323032• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap• 4358297• MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor• MicroAmp™ 96-Well Support Base

• 4375282• 4375284• 4379590• 4375323 と4375928

D
E

F

B

B

G

#

A

H

C

C

H
C

消耗品

A

MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B

MicroAmp™ Fast 48-Well TrayC

MicroAmp™ 96-Well Support BaseD

MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E

MicroAmp™ Fast 8-Tube StripF

MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap

G

MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film

H

MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor

ノート

4Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 1 章 はじめに使用可能な消耗品

StepOnePlus
システム

StepOnePlus システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、標準
および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。
重要！ 標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。
消耗品

部品番号

• MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate with
Barcode• MicroAmp™ Optical Adhesive Film

• 4346906 と4366932• 4360954 と4311971• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip• 4358293• 4323032• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap• 4358297• MicroAmp™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks• MicroAmp™ 96-Well Support Base

• 4379983• 4379590• MicroAmp™ Adhesive Film Applicator• 4333183• 4330015• MicroAmp™ Cap Installing Tool（ハンドル）

D
G

E

F

A

C

#

B

B

C

C

消耗品

A

MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate

B

MicroAmp™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks

C

MicroAmp™ 96-Well Support BaseD

MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E

MicroAmp™ Fast 8-Tube StripF

MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap

G

MicroAmp™ Optical Adhesive Film

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

5

第 1 章 はじめに標準曲線実験について

標準曲線実験について
リアルタイムPCR 実験

標準曲線実験はリアルタイム PCR 実験です。リアルタイム PCR 実験では：• 装置は、PCR の進捗状況をリアルタイムで監視します（Kwok and Higuchi, 1989）。
• データは、PCR プロセス全体を通して収集されます。
• サイクリング中にターゲットの増幅が最初に検出された時点で、反応の特徴づけが行わ。
れます（Saiki et al., 1985）
参考： 本書では、実験 という用語は、StepOne または StepOnePlus システムでの測定実施のプロセス全体を指し、セットアップ、測定、解析を含みます。

標準曲線実験について標準曲線法を用いて、サンプルに含まれるターゲットの絶対量を特定します。標準曲線法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプルおよびスタンダード希釈シリーズ中に含まれるターゲットの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶対量を外挿します。

コンポーネント標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップするには、次のコンポーネントが必要です。

• サンプル － ターゲットの量が未知のサンプル。
• スタンダード － 既知量のスタンダードを含むサンプル。定量実験で使用して標準曲線を作成します。

• スタンダード希釈シリーズ － ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット。スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。

• 反復 － 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。
• ネガティブコントロール － サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりません。

PCR オプション

リアルタイム PCR を実施する際は、次のいずれかを選択してください。

• シングルプレックス PCR とマルチプレックス PCR（下記参照）
および• 1 ステップと 2 ステップの RT-PCR（7 ページ参照）
シングルプレックス対マルチプレックス PCR

PCR 反応は、次のいずれかで実施できます。
• シングルプレックス PCR － シングルプレックス PCR では、反応チューブまたはウェ
ルにはプライマーセットが 1 つだけ存在します。反応ごとにターゲットまたは内在性コントロールを 1 つだけ増幅できます。
または

ノート

6

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 1 章 はじめに標準曲線実験について• マルチプレックス PCR － マルチプレックス PCR では、反応チューブまたはウェルにプライマーセットが複数存在します。各セットが、特定のターゲットまたは内在性コントロールを増幅します。通常は、FAM™ 色素でラベルしたプローブは、ターゲットを検出し、VIC® 色素でラベルしたプローブは、内在性コントロールを検出します。
重要！ SYBR® Green 試薬は、マルチプレックス PCR には使用できません。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

1 ステップ RT-PCR 対 2 ステップ RT-PCR
逆転写（RT）と PCR を 1 回の反応（1 ステップ）で実施するか、別の反応（2 ステップ）で実施するかを選択できます。使用する試薬は、RT-PCR を 1 ステップまたは 2 ステップのどちらで実施するかによって異なります。

• 1 ステップ RT-PCR では、RT と PCR が同一のバッファー系で実施されるので、RT とPCR 増幅のための調製を 1 本のチューブで行えます。但し、1 ステップ RT-PCR では、
Fast PCR Master Mix やキャリーオーバー防止の酵素である AmpErase® UNG（ウラシル -N- グリコシラーゼ）を使用できません。
• 2 ステップ RT-PCR は、2 回の反応に分けて実施されます。最初に全 RNA が cDNA に逆転写され、その後で cDNA が PCR によって増幅されます。この方法は、1 つの cDNA
テンプレートから複数のトランスクリプトを検出したり、後日使用するために一部のcDNA を貯蔵しておくのに便利です。AmpErase® UNG 酵素を使ってキャリーオーバー
汚染を防ぐことができます。
参考： AmpErase® UNG については、『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems 試薬ガイド』をご参照ください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

7

第 1 章 はじめに標準曲線実験について使用できる試薬

TaqMan® 試薬と SYBR® Green 試薬
弊社では、StepOne および StepOnePlus システム用に、TaqMan® および SYBR® Green 試
薬を提供しています。下表に、両試薬のタイプを概説します。

試薬タイプ

プロセス

TaqMan® 試薬またはキット
説明

TaqMan 試薬は、蛍光プローブを使って、PCR サ
イクル中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出します。
特長• 蛍光プローブの追加による高い配列特異性。
• マルチプレックス法に対応。
• 広範なサーマルサイクリング条件に最適化した、調製済みアッセイを使用可能。
• 1 ステップおよび 2 ステップ RT-PCR 両方に利用可能。
制限
特異的な蛍光プローブを合成する必要あり。

SYBR® Green 試薬
説明

SYBR Green 試薬は、SYBR® Green I Dye（二本鎖 DNA 結合色素）を使い、PCR サイクル中に蓄積する PCR 生成物を検出します。
特長• 経済的（プローブ不要）• 融解曲線で PCR 生成物の Tm を測定可能。
• 1 ステップおよび 2 ステップ RT-PCR 両方に利用可能。
制限
すべての二本鎖 DNA シーケンスに非特異的に結合します。偽陽性信号の発生を避けるため、融解曲線またはゲル解析を使って、非特異的生成物の形成を確認してください。

重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne
システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーター
やクエンチャーとして使えます。

ノート

8

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 1 章 はじめに本書の使用方法

その他の試薬StepOne および StepOnePlus システムでは、他の蛍光ベース試薬も使用できますが、以下の事項にご注意ください。

• ［Design Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセットアッ（高度なセットアップ）により、実験を設計する必要があります。
（「［Advanced Setup］
プ）ワークフロー」（116 ページ）参照）。
• Applied Biosystems TaqMan および SYBR Green 試薬を使用すると、StepOne ソフト（反応セットアップ）画面で自動的に反応量が計算されます。
ウェアの［Reaction Setup］
詳細についてリアルタイム PCR 実験、PCR オプション、試薬については、『 Applied Biosystems StepOne™
™
および StepOnePlus Real-Time PCR Systems 試薬ガイド』をご参照ください。

本書の使用方法
本書は、チュートリアルおよび実際の実験を実施するためのガイドとして機能します。

本書をチュートリアルとして使用

StepOne ソフトウェアで提供されている実験データの例を利用すると、StepOne または
StepOnePlus システムで標準曲線実験を実施する際のチュートリアルとして本書を使用できます。第 2 章～第 5 章の手順に従ってください。
章

手順

2

（設計ウィザード）を使って実験を設
StepOne ソフトウェアの［Design Wizard］
計します。

3

第 2 章で［Design Wizard］（設計ウィザード）によって計算した試薬と容量を使って実験を準備します。

4

StepOne または StepOnePlus 装置（スタンドアロンまたはコロケーションレイアウト）で実験を実施します。

5

結果を解析します。

詳細については、「実験例について」（10 ページ）をご参照ください。

本書を実際の実験に使用

第 2 章～第 5 章のチュートリアル手順の完了後、本書に従って、実際の標準曲線実験を実施
できます。第 2 章～第 5 章の各手順には、実際の実験を実施する際のガイドラインセットが含まれています。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

9

第 1 章 はじめに実験例についてさらに、StepOne ソフトウェアで提供されている他のワークフローを使って、実際の実験を実施することもできます。下表に、StepOne ソフトウェアで利用できるすべてのワークフローの概要を示します。
ワークフローDesign Wizard（設計ウィザード）

説明参照

ソフトウェアの指示に従い、新しい実験をセットアップしま 第 2 章
す。［Design Wizard］（設計ウィザード）に従って、最適な（設計ウィザード）
実験が実施できます。［Design Wizard］
は、初めてのユーザーにお勧めします。
参考：［Design Wizard］（設計ウィザード）は、［Advanced（高度なセットアップ）と比べて、設計上のオプショ
Setup］
ンに制限があります。

Advanced Setup［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使って、新し（高度なセットアップ） い実験をセットアップします。［Advanced Setup］（高度なセットアップ）では、実際の実験を実施する際、設計に自由度が高くなります。［Advanced Setup］（高度なセットアップ）は、熟練したユーザーにお勧めです。

116 ページ

QuickStart（クイックスタート）

プレートセットアップ情報なしに新しい実験を実施します。 117 ページ
必要な場合には、測定後に設計パラメータを追加できます。

Template（テンプレート）

テンプレートからのセットアップ情報を使って新しい実験をセットアップします。

Export/Import（エクスポート／インポート）

実験セットアップ情報を含む ASCII テキストファイルから、 121 ページ
実験設計をインポートします。

119 ページ

実験例について標準曲線実験の実施方法については、本書に従って実験例を設計、準備、測定、解析するプ
ロセスを通して体験することができます。実験例は、StepOne または StepOnePlus システムに慣れるための典型的なセットアップとしてお使いください。

説明

標準曲線実験例の目的は、2 つの集団に含まれる RNase P 遺伝子の量を特定することです。
標準曲線実験例では：• サンプルは 2 つの集団から分離されたゲノム DNA です。
• ターゲットは RNase P 遺伝子です。
• 1 つの標準曲線が、RNase P 遺伝子（ターゲット）のためにセットアップされます。ス
タンダード希釈シリーズに使用するスタンダードには、既知量の RNase P 遺伝子が含まれています。対象となるターゲットが 1 つだけなので、標準曲線も 1 つしか必要ありません。
参考： 複数のターゲットを対象とする実験では、各ターゲットごとに標準曲線が必要となります。

• 統計的な有意性を確保するために、各サンプルと標準曲線の各希釈ポイントを 3 連で測
定します。

ノート

10

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 1 章 はじめに実験例について• この実験はシングルプレックス PCR のために設計されており、各ウェルには単一ター
ゲット用のプライマー／プローブセットが含まれます。

• 反応は、2 ステップ RT-PCR 用にセットアップされます。
• プライマー／プローブセットは、Applied Biosystems RNase P アッセイのものです。
参考： Human RNase P FAM™ 色素ラベル MGB プローブは、TaqMan® Gene Expression
Assay としては使用できません。Custom TaqMan® Gene Expression Assay（PN 4331348）
としてご注文ください。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

反応プレートのレイアウト

標準曲線実験例は、StepOne 装置用です。StepOne 装置の場合、ソフトウェアは、48 ウェル
反応プレートレイアウトを表示します。

StepOnePlus 装置用に実験例を作成することもできます。ただしその場合には、反応プレー
トレイアウトは本書に示す 48 ウェル反応プレートレイアウトと異なります。StepOnePlus 装
置の場合、ソフトウェアは、96 ウェル反応プレートレイアウトを表示します。

ノート

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11

第 1 章 はじめに実験例について実験例のデータについて

本書では、2 つのファイルを使用します。

• 第 2 章では、標準曲線実験例ファイルを作成しますが、このファイルには、セットアッ
プデータが含まれており、このファイルをご使用のコンピュータの実験フォルダに保存します。

< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\
Standard Curve Example.eds• 第 5 章では、標準曲線実験例ファイルにある結果を確認します。このファイルには測定データが含まれています。実験例のデータファイルは、StepOne ソフトウェアとともにインストールされます。実験例のデータファイルは、コンピュータ内の次の場所に保存されているはずです。

< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\examples\Standard Curve Example.eds
ここで、• < ドライブ > は、StepOne ソフトウェアがインストールされているコンピュータのハードドライブです。本ソフトウェアのデフォルトのインストールドライブは、D ドライブです。

• < ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。
実験例フォルダ中のデータファイル
実験例フォルダには、以下に示したいくつかのデータファイルが入っており、実際のデータを解析する際に参照できます。データファイルは、StepOneソフトウェアとともにインストー
ルされます。
参考： 本書のチュートリアル手順を実施する場合には、「Standard Curve Example.eds」を使用していることをご確認ください。「96-Well Standard Curve Example.eds」は、標準曲線実験法のもう一つの例です。

StepOne 装置

StepOnePlus 装置

Comparative CT Example.eds

96-Well Comparative CT Example.eds

Multiplex Example.eds

96-Well Multiplex Example.eds

Genotyping Example.eds

96-Well Genotyping Example.eds

Presence Absence Example.eds

96-Well Presence Absence Example.eds

Relative Standard Curve Example.eds

96-Well Relative Standard Curve Example.eds

RNase P Experiment.eds

96-Well RNase P Experiment.eds

Standard Curve Example.eds

96-Well Standard Curve Example.eds

SYBR Example.edsSYBR Example.eds

96-Well SYBR Example.eds

ノート

12

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第 1 章 はじめに実験例ワークフロー

実験例ワークフロー
13 ページの図に、標準曲線実験例のワークフローを示します。
実験開始



実験の設計（第 2 章）

1. 新しい実験を作成します。
2. 実験プロパティを定義します。
3. 方法と物品を定義します。
4. ターゲットをセットアップします。
5. スタンダードをセットアップします。
6. サンプルをセットアップします。
7. 測定方法をセットアップします。
8. 反応セットアップを確認します。
9. 実験に必要な物品を注文します。
10.［Design Wizard］（設計ウィザード）を終了します。



反応の準備（第 3 章）

1. サンプル希釈液を調製します。
2. スタンダード希釈シリーズを調製します。
3. 各ターゲットのアッセイ用に反応ミックスを調製します。
4. 反応プレートを調製します。



実験の測定（第 4 章）

1. 測定の準備をします。
2. （オプション）通知設定を有効にします。
3. 測定を開始します。
4. 測定を監視します。
5. プレートを取り出し、データを転送します。



実験の解析（第 5 章）
セクション 1、結果の確認：

1. 解析します。
2. 標準曲線を表示します。
3. 増幅プロットを表示します。
4. 結果のテーブルを表示します。
5. データを出力します。
セクション 2、トラブルシューティング（必要に応じて）：

1. 解析設定を表示し、ベースライン／閾値を調整します。
2. QC サマリーを表示します。
3. ウェルを選択削除します。
4. マルチコンポーネントプロットを表示します。
5. 生データプロットを表示します。



実験終了

ノート

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13

第 1 章 はじめに実験例ワークフローノート

14

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第2章

実験の設計
本章の内容：■ 本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
■ 新しい実験の作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
■ 実験プロパティの定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
■ 方法と物品の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
■ ターゲットのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
■ スタンダードのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
■ サンプルのセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
■ 測定方法のセットアップ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
■ 反応セットアップの確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
■ 実験用物品の注文 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
■ ［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
ルバーのをクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
Software ヘルプ）を選択します。

ノート

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15

第 2 章 実験の設計
本章の概要

本章の概要
本章では、StepOne™ ソフトウェアの［Design Wizard］（設計ウィザード）を使って、標準曲線実験例をセットアップする方法について説明します。
［Design Wizard］（設計ウィザード）に従うと、Applied Biosystems が推奨する最良の方法で実験例の設計パラメータを入力できます。

実験例ワークフロー

本書に記載されている実験例を設計するワークフローを以下に示します。
参考： StepOne ソフトウェアの［Design Wizard］（設計ウィザード）を使って実験例を設計します。実際の実験を設計する際は、代替ワークフローを選択できます（「本書の使用方法」（9 ページ）参照）。
実験開始



実験の設計（第 2 章）

1. 新しい実験を作成します。
2. 実験プロパティを定義します。
3. 方法と物品を定義します。
4. ターゲットをセットアップします。
5. スタンダードをセットアップします。
6. サンプルをセットアップします。
7. 測定方法をセットアップします。
8. 反応セットアップを確認します。
9. 実験に必要な物品を注文します。
10. ［Design Wizard］（設計ウィザード）を終了します。






反応の準備（第 3 章）
実験の測定（第 4 章）
実験の解析（第 5 章）

実験終了

ノート

16

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第 2 章 実験の設計
新しい実験の作成

新しい実験の作成
StepOne ソフトウェアの［Design Wizard］（設計ウィザード）を使って、新しい実験を作成
します。

実験の作成

1.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（スター（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］［StepOneト）［All Programs］
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. ［Home］（ホーム）画面で［Design Wizard］（設計ウィザード）をクリックして、［Design Wizard］（設計ウィザード）を開きます。

2

3. ［Design Wizard］（設計ウィザード）内のナビゲーション方法については、「ソフトウェ
アの エレメント」（18 ページ）を参照してください。

ノート

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17

第 2 章 実験の設計
新しい実験の作成

ソフトウェアのエレメント（設計ウィザード）のエレメントを以下に示します。
StepOne ソフトウェアの［Design Wizard］

1. メニューバー － ソフトウェアで利用できるメニューが表示されます。
• File（ファイル）• Edit（編集）• Instrument（装置）• Analysis（解析）• Tools（ツール）• Help（ヘルプ）
2. ツールバー － ソフトウェアで利用できるツールが表示されます。
• New Experiment（新しい実験）• Open（開く）• Close（閉じる）• Send Experiment to Instrument（実験を装置に送信）• Download Experiment from Instrument（実験を装置からダウンロード）
3. 実験ヘッダー － 開いている実験の実験名、実験タイプ、試薬が表示されます。
4. ナビゲーション欄 －［Design Wizard］（設計ウィザード）の全画面へのリンクがあります。

• Experiment Properties（実験プロパティ）• Methods & Materials（方法と物品）• Targets（ターゲット）• Standards（スタンダード）• Samples（サンプル）• Run Method（測定方法）• Reaction Setup（反応セットアップ）• Materials List（物品リスト）
参考：［Design Wizard］（設計ウィザード）は、初期設定で［Quantitation - Standard
Curve］（定量－標準曲線）実験タイプを表示します。別の実験タイプを選択すると、［Design Wizard］（設計ウィザード）画面が変わります。例えば、［Relative Quantitation
Settings］（相対定量設定）画面は、標準曲線または比較 CT（∆∆CT）実験タイプを選択すると表示されます。

5. 実験タブ － 開いている各実験のタブが表示されます。

ノート

18

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
新しい実験の作成

1
2
3

4

5

ノート

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19

第 2 章 実験の設計
実験プロパティの定義

実験プロパティの定義［Experiment Properties］（実験プロパティ）画面で、実験の識別情報を入力し、装置タイプを選択してから、設計する実験のタイプを選択します。

実験例について標準曲線実験例では：• 実験は例として識別されます。
• 実験の測定用に選択した装置は、StepOne 装置です。
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate を使用します。
• 実験タイプは定量です。
［Experiment
Properties］（実験プロパティ）
画面の入力

1. ［Experiment Name］（実験名）フィールドをクリックしてから、「Standard Curve
Example」（標準曲線例）と入力します。
参考： 入力した実験名が、実験ヘッダーに表示されます。

2. ［Barcode］（バーコード）フィールドは空欄のままにしておきます。
参考： MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate には、バーコードがありません。

3. ［User Name］（ユーザー名）フィールドをクリックしてから、「Example User」（ユーザー例）と入力します。

4. ［Comments］（コメント）フィールドをクリックしてから、「Standard Curve Getting
Started Guide Example」（標準曲線入門ガイド例）と入力します。
5. ［StepOne™ Instrument（48 Wells）］（StepOne™ 装置（48 ウェル））を選択します。
参考： この実験例は、StepOne 装置用です。StepOnePlus 装置用の実験例を作成する場
合には、反応プレートレイアウトは本書に示すレイアウトと異なります。ソフトウェアには、StepOne 装置用の 48 ウェル反応プレートレイアウトおよび StepOnePlus 装置用の 96 ウェル反応プレートレイアウトが表示されます。StepOnePlus 装置用の実験例を作成するためには、［StepOnePlus™ Instrument（96 Wells）］（StepOnePlus™ 装置（96ウェル））を選択します。

6. 実験タイプに［Quantitation］（定量）を選択します。
7. ［Next>］（次へ）をクリックします。

ノート

20

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第 2 章 実験の設計
実験プロパティの定義

1
2
3
4

5

6

設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• 実験名を入力します。
– 内容がわかるような覚えやすい名称を入力します。［Experiment Name］（実験名）
フィールドには、100 文字まで入力できます。
参考：［Experiment Name］（実験名）フィールドには、次の文字は使用できません。スラッシュ（/）、バックスラッシュ（\）、大なり記号（>）、小なり記号（<）、
アスタリスク（*）、クエスチョンマーク（?）
、引用符（"）、バー（|）
、コロン（:）、
セミコロン（;）– この実験名は、デフォルトの実験ファイル名として使用されます。
• （オプション）MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate をご使用の場合には、反応プレート上のバーコードを特定するため、バーコードを入力します。
［Barcode］（バーコード）フィールドには、100 文字まで入力できます。
参考： MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate には、バーコードがありません。

• （オプション）実験の所有者を特定するユーザー名を入力します。［User Name］（ユーザー名）フィールドには、100 文字まで入力できます。
［Comments］（コメント）フィー• （オプション）実験を説明するコメントを入力します。
ルドには、1000 文字まで入力できます。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

21

第 2 章 実験の設計
方法と物品の定義• 実験を測定するために用いる装置を選択します。
– StepOne™ 装置（48 ウェル）– StepOnePlus™ 装置（96 ウェル）
参考： StepOne ソフトウェア V2.0 以降を用いて、StepOne および StepOnePlus 装置両方での実験設計が可能です。［Experiment Properties］（実験プロパティ）画面で選択する装置によって、反応プレートレイアウトおよび物品リストが変わります。
参考： デフォルトの装置タイプを設定するには、［Tools］（ツール）［Preferences］（環境設定）を選択してから、［General］（全般）タブを選択します（デフォルト設定）。
（デフォルト装置タイプ）ドロップダウンメニューで、適切［Default Instrument Type］
な装置をを選択します。

• 実験タイプとして［Quantitation］（定量）を選択します。
詳細について詳細については：（実験プロパティ）画面の入力については、 をクリックする• ［Experiment Properties］
か、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

• 消耗品については、「使用可能な消耗品」（4 ページ）をご参照ください。
『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time• 定量実験については、
PCR Systems 試薬ガイド』をご参照ください。

方法と物品の定義［Methods & Materials］（方法と物品）画面で、実験に使用する定量方法、試薬、ランプ速
度、PCR テンプレートを選択します。

実験例について標準曲線実験例では：• 標準曲線定量法を使用します。
• TaqMan® 試薬を使用します。
• 装置測定には標準ランプ速度を使用します。
• テンプレートのタイプは、精製済み gDNA（2 つの集団から分離）です。gDNA テンプ
レートを使用する前に、まず組織やサンプルから gDNA を抽出する必要があります。
［Methods &Materials］（方法と物品）
画面の入力

1. 定量方法として［Standard Curve］（標準曲線）を選択します。
2. 試薬に、［TaqMan® Reagents］（TaqMan® 試薬）を選択します。
3. ランプ速度に［Standard（~2 hours to complete a run）］（標準（測定完了まで 2 時間以下））を選択します。

4. テンプレートタイプに［gDNA（genomic DNA）］（gDNA（ゲノム DNA））を選択します。
5. ［Next>］（次へ）をクリックします。

ノート

22

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
方法と物品の定義

1

2

3

4

設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• 定量方法として［Standard Curve］（標準曲線）を選択します。 標準曲線法を用いて、サンプルに含まれるターゲットの絶対量を特定します。反応プレートをセットアップする際、標準曲線法では、ターゲット、スタンダード、サンプルが必要です。

• 使用する試薬を選択します。
– TaqMan 試薬を使ってサンプル中のターゲットの増幅を検出し、定量する場合は、［TaqMan® Reagents］（TaqMan® 試薬）を選択します。TaqMan 試薬は、2 つのプライマーと 1 つの TaqMan® プローブで構成されています。プライマーは、ターゲッ
トを増幅するよう設計されています。TaqMan プローブは、ターゲットにハイブリダ
イゼーションし、ターゲットが増幅されたときに蛍光信号を生成するよう設計されています。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ シス
テムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

23

第 2 章 実験の設計
方法と物品の定義– SYBR Green 試薬を使ってサンプル中のターゲットの増幅を検出し、定量する場合
は、［SYBR® Green Reagents］（SYBR® Green 試薬）を選択します。SYBR Green
試薬は、2 つのプライマーと 1 つの SYBR Green 色素で構成されています。プライ
マーは、ターゲットを増幅するよう設計されています。SYBR Green 色素は、二本鎖 DNA に結合すると蛍光信号を生成します。SYBR Green 色素は、反応に添加される SYBR Green Master Mix に含まれています。SYBR Green 色素を使用する場合：（融解曲線を含む）チェックボックスを選択して、増幅され［Include Melt Curve］
たターゲットの融解曲線解析を実施するようにします。
ランプ速度として、［Standard］（標準）を選択します。弊社では、SYBR Green 試
薬の Fast Master Mix は提供していません。
参考： StepOne および StepOnePlus システムで他の蛍光ベースの試薬を使うこともできますが、その場合は、［Design Wizard］（設計ウィザード）でなく、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使って、実験を設計する必要があります。

• 装置での測定に適切なランプ速度を選択します。
［Fast（~40 minutes to complete a run）］
– PCR 反応に Fast 試薬を使っている場合は、）を選択します。
（高速（測定完了まで 40 分以下）
［Standard（~2 hours to complete a run）］
– PCR 反応に標準試薬を使っている場合は、（標準（測定完了まで 2 時間以下））を選択します。

• 適切な PCR 法テンプレートを選択します。
– 2 ステップ RT-PCR を実施中で、すでに逆転写を実施して RNA を cDNA に転写し］（cDNA（相補 DNA）
）を選択します。
た場合は、［cDNA（complementary DNA）
PCR 反応に相補 DNA が追加されます。
［RNA］を選択します。PCR 反応に総 RNA– 1 ステップ RT-PCR を実施中の場合は、
または mRNA が追加されます。
参考：［Fast］（高速）ランプ速度で RNA テンプレートを使用する場合には、［Design
Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワー
クフローにより、実験を設計する必要があります。
［gDNA（genomic DNA）］
– 組織またはサンプルからすでに gDNA を抽出した場合は、（gDNA（ゲノム DNA）
）を選択します。PCR 反応に精製済みゲノム DNA が追加されます。

詳細について詳細については：• ［Methods & Materials］（方法と物品）画面の入力については、 をクリックするか、
F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
（高度なセットアップ）の使用については、「［Advanced Setup］（高• ［Advanced Setup］
度なセットアップ）ワークフロー」（116 ページ）をご参照ください。
『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™
• 他の定量方法の使用については、
Real-Time PCR Systems 相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド』をご参照ください。

• TaqMan および SYBR Green 試薬については、『Applied Biosystems StepOne™ および
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド』をご参照ください。
• シングルプレックス PCR 対マルチプレックス PCR および 1 ステップ RT-PCR 対 2 ス
テ ッ プ RT-PCR を 含 め た PCR に つ い て は、『Applied Biosystems StepOne™ お よび
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド』をご参照ください。
ノート

24

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
ターゲットのセットアップ

ターゲットのセットアップ［Targets］（ターゲット）画面で、PCR 反応プレートで定量したいターゲット数を入力してから、各ターゲットのアッセイをセットアップします。

実験例について標準曲線実験例では：• 反応プレートごとに 1 つのターゲットを定量します。
• ［Set Up Standards］（スタンダードのセットアップ）チェックボックスを選択します。
（ターゲット）画面
このチェックボックスが選択されていると、ユーザーが［Targets］
を入力し終わった後、ソフトウェアが自動的に［Standards］（スタンダード）画面を表（スタンダード）画面では、ターゲットアッセイ用の標準曲線示します。［Standards］
をセットアップできます（「スタンダードのセットアップ」（27 ページ）参照）。
• Target 1 アッセイは、試験中のターゲットのためにセットアップします。実験例では、
これは RNase P 遺伝子です。
［Targets］（ターゲット）
画面の入力

1. ［How many targets do you want to quantify in the reaction plate?］（この反応プレートで定量したいターゲット数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、「1」を入力します。
参考： ターゲットアッセイ表の行数が、入力した数でアップデートされます。

2. ［Set Up Standards］（スタンダードのセットアップ）チェックボックスを選択して、ターゲットアッセイのスタンダードをセットアップします。
参考：［Set Up Standards］（スタンダードのセットアップ）チェックボックスは、デフォルトで選択されています。

3. Target 1 アッセイをセットアップします。
a. ［Enter Target Name］（ターゲット名の入力）セルをクリックしてから、「RNase P」
を入力します。
b. ［Reporter］（レポーター）ドロップダウンメニューで［FAM］を選択します（デフォルト設定）。
c. ［Quencher］（クエンチャー）ドロップダウンメニューで［NFQ-MGB］を選択します（デフォルト設定）。
d. ［Color］（カラー）フィールドは、デフォルト設定のままにします。

4. ［Next>］（次へ）をクリックします。
参考：［（Optional）Enter Gene Name］（（オプション）遺伝子名の入力）フィールドは空欄のままにします。物品を注文するときは、遺伝子／アッセイ ID で検索できます（「実験用物品の注文」（38 ページ）参照）。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

25

第 2 章 実験の設計
ターゲットのセットアップ

1

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設計ガイドライン

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3d

標準曲線実験を設計する場合：• ［Set Up Standards］（スタンダードのセットアップ）チェックボックスを選択します。
弊社では、反応プレートの各ターゲットアッセイに対して標準曲線をセットアップする
ようお勧めします。

• 各ターゲットアッセイに一意の名前とカラーを指定します。［Target Name］（ターゲット名）フィールドには、100 文字まで入力できます。
• ターゲットアッセイで使用するレポーター色素を選択します。以下の試薬を選択した場（方法と物品）画面で、次の操作を合には、22 ページにある［Methods & Materials］
行います。

– TaqMan® 試薬を選択した場合には、TaqMan プローブの 5′ 末端に結合する色素を選択します。

– SYBR® Green 試薬を選択した場合には、「SYBR」を選択します。
• ターゲットアッセイで使用するクエンチャーを選択します。以下の試薬を選択した場合には、22 ページにある［Methods & Materials］（方法と物品）画面で、次の操作を行います。

– TaqMan® 試薬を選択した場合には、TaqMan プローブの 3′ 末端に結合するクエン
チャーを選択します。

– SYBR® Green 試薬を選択した場合には、「None」（なし）を選択します。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

（ターゲット）画面の入力については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne
詳細について ［Targets］
ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

26

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
スタンダードのセットアップ

スタンダードのセットアップ［Standards］（スタンダード）画面で、反応プレートのすべての標準曲線についてポイントと反復の数を入力します。各標準曲線について、開始量を入力し、シリアル係数を選択します。

実験例について標準曲線実験例では：• 1 つの標準曲線が、ターゲット（RNase P）のためにセットアップされます。スタンダー
ド希釈シリーズに使用するスタンダードには、既知量の RNase P 遺伝子が含まれています。対象となる遺伝子が 1 つだけなので、標準曲線も 1 つしか必要ありません。
• 5 ポイントを使用します。
• 各ポイントに 3 つの反復を使用します。反復とは、同じ反応コンポーネントと容量を含む同一の反応です。

• 開始量は 10,000 コピーで、シリアル係数は 1:2 です。
［Standards］（スタンダード）
画面の入力

1. ［How many points do you need for each standard curve?］（各標準曲線に必要なポイント数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、「5」を入力します。
2. ［How many replicates do you need for each point? ］（各ポイントに必要な反復数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、「3」を入力します。
3. RNase P アッセイのスタンダード量の範囲を指定します。
a. ［Enter Starting Quantity］（開始量の入力）フィールドをクリックしてから、「10000」を入力します。
b. ［Select Serial Factor］（シリアル係数の選択）ドロップダウンメニューで［1:2］を選択します。

4. ［Standard Curve Preview］（標準曲線プレビュー）欄を確認します。標準曲線には次のポイント、10000、5000、2500、1250、625 が含まれています。
5. ［Next>］（次へ）をクリックします。

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ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

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第 2 章 実験の設計
スタンダードのセットアップ

設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• 反応プレートの各ターゲットに対して標準曲線をセットアップします。ターゲットは、（ターゲット）画面ですでに定義されています（「ターゲットのセットアップ」［Targets］（25 ページ））。
• 反応プレートの各標準曲線について、ポイント数を入力します。弊社では、各標準曲線について少なくとも 5 つの希釈ポイントを取ることをお勧めします。
• 標準曲線の各ポイントについて、反復（同一反応）の数を入力します。弊社では、各ポ
イントについて少なくとも 3 回の反復をお勧めします。
• スタンダード量の範囲は増幅効率の計算に影響するため、アッセイのスタンダード量は、適切な範囲を注意深く選択してください。

– 増幅効率をより正確に測定するには、スタンダード量に 5 ～ 6 log の広範囲を使用してください。広範なスタンダード量を指定するには、cDNA クローンなど、PCR 産物または高濃縮テンプレートを使用する必要があります。

– cDNA テンプレートの量が限られている場合、ターゲットがコピー数の小さい転写産物の場合、一定の範囲内に収まることが分かっている場合などは、スタンダード量を狭い範囲に設定することが必要となります。

• シリアル係数は、標準曲線のすべてのポイントの量を計算する際に使用されます。開始
量が大きな値の場合は、1:2、1:3 などの希釈係数を選択します。開始量が小さな値の場
合は、2✕、3✕ などの濃縮係数を選択します。
詳細について詳細については：• ［Standards］（スタンダード）画面の入力については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
• 増幅効率については、『Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays
Application Note』をご参照ください。

ノート

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Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
サンプルのセットアップ

サンプルのセットアップ［Samples］（サンプル）画面で、反応プレートに含めるサンプル、反復、ネガティブコント
ロールの数を入力し、サンプル名を入力してから、サンプル／ターゲット反応を選択してセットアップします。

実験例について標準曲線実験例では：• 2 つのサンプル、すなわち 2 つの集団からのゲノム DNA を使用します。サンプルには、未知量のターゲット（RNase P）が含まれています。
• 3 つの反復を使用します。反復とは、同じ反応コンポーネントと容量を含む同一の反応です。

• 3 つのネガティブコントロールを使用します。ネガティブコントロール反応には、サン
プルの代わりに蒸留水が含まれており、増幅しません。

［Samples］（サンプル）
画面の入力

1. ［How many samples do you want to test in the reaction plate?］（この反応プレートで試験したいサンプル数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、
「2」を入
力します。
参考： サンプル表の行数が、入力した数でアップデートされます。

2. ［How many replicates do you need?］（必要な反復数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、「3」を入力します。
3. ［How many negative controls do you need for each target assay?］（各ターゲット
アッセイに必要なネガティブコントロール数はいくつですか？）フィールドをクリックしてから、「3」を入力します。

4. サンプル 1 のセットアップ：
a. ［Enter Sample Name］（サンプル名の入力）フィールドをクリックしてから、「pop1」（population 1 の場合）を入力します。
b. ［Color］（カラー）フィールドはデフォルト設定のままにします。

5. サンプル 2 のセットアップ：
a. ［Enter Sample Name］（サンプル名の入力）フィールドをクリックしてから、「pop2」（population 2 の場合）を入力します。
b. ［Color］（カラー）フィールドはデフォルト設定のままにします。

6. ［All Sample/Target Reactions］（すべてのサンプル／ターゲット反応）を選択して、すべてのサンプル中のすべてのターゲットを試験します。

7. ［Well Count］（ウェル数）欄で次のことを確認します。
• 未知のウェルが 6 個であること。
• スタンダードウェルが 15 個であること。
• ネガティブコントロールウェルが 3 個であること。
• 空のウェルが 24 個であること。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

29

第 2 章 実験の設計
サンプルのセットアップ

8. ［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブで：a. ［Arrange Plate by］（プレートの配置方法）ドロップダウンメニューで［Rows］（行）
を選択します（デフォルト設定）。
b. ［Place Negative Controls in］（ネガティブコントロールの配置）ドロップダウンメ
ニューで［Upper Left］（左上）を選択します（デフォルト設定）。

9. ［Next >］（次へ）をクリックします。

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設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：［Sample Name］（サンプル名）フィー• 各サンプルに一意の名前とカラーを指定します。
ルドには、100 文字まで入力できます。

• セットアップする反復（同一反応）数を入力します。弊社では、各反応について少なく
とも 3 つの反復をお勧めします。
• セットアップするネガティブコントロール反応数を入力します。弊社では、各ターゲッ
トアッセイについて少なくとも 3 つのネガティブコントロール反応をお勧めします。
• サンプル中のどのターゲットを試験するかを選択します。
– ［All Sample/Target Reactions］（すべてのサンプル／ターゲット反応）を選択すると、すべてのサンプル中のすべてのターゲットを試験できます。

– ［Specify Sample/Target Reactions］（サンプル／ターゲット反応を指定）を選択す
ると、各サンプル中で試験するターゲットを指定できます。
参考：［Design Wizard］（設計ウィザード）を用いて標準曲線実験をセットアップする
場合には、シングルプレックス反応（ウェル当たり 1 ターゲットの増幅と検出）のみ
セットアップできます。標準曲線実験でマルチプレックス反応（ウェル当たり 2 以上のターゲットの増幅と検出）をセットアップするには、［Design Wizard］（設計ウィザード）ではなく［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使って実験を設計してくだ
さい。

ノート

30

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
測定方法のセットアップ［Run Method］（測定方法）（31 ページ）を• StepOnePlus 装置で実験を測定するときに、編集して各 VeriFlex ブロックを異なる温度に設定するには、次のことが必要です。

a. ［Design Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を用いて、実験を設計します。
b. ［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面で、［Assign Targets and Samples］（ターゲットとサンプルの割り当て）タブを選び、［View Plate Layout］（プレー（VeriFlex™ ブ
トレイアウトの表示）タブを選んだ後、［Enable VeriFlex™ Block］
ロックの有効化）チェックボックスを選択します。
重要！［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面の［Enable VeriFlex™ Block］™
（VeriFlex ブロックの有効化）チェックボックスを選択しておかないと、［Run Method］（測定方法）画面（31 ページ）で各 VeriFlex ブロックを異なる温度に設定できません。

詳細について詳細については：• ［Samples］（サンプル）画面の入力については、 をクリックするか、F1 を押して、
StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
（高度なセットアップ）の使用については、「［Advanced Setup］（高• ［Advanced Setup］
度なセットアップ）ワークフロー」（116 ページ）をご参照ください。

測定方法のセットアップ［Run Method］（測定方法）画面で、デフォルトの測定方法の反応量とサーマルプロファイ
ルを確認します。必要に応じて、デフォルトの測定方法を編集したり、Run Method ライブ
ラリから選択することもできます。

実験例について標準曲線実験例では、デフォルトの測定方法を 1 箇所だけ変更して使用します。ウェルあたりの反応量を 20 µL から 25 µL に変更します。

［Run Method］（測定方法）
画面の確認

1. ［Graphical View］（グラフィック表示）タブ（デフォルト設定）をクリックするか、［Tabular View］（テーブル表示）タブをクリックします。
2. ［Reaction Volume Per Well］（ウェルあたりの反応量）フィールドをクリックしてから、25 µL を入力します。
3. サーマルプロファイルに、以下のように［Holding Stage］（ホールディングステージ）（サイクリングステージ）が表示されていることを確認します。
と［Cycling Stage］
4. ［Next >］（次へ）をクリックします。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

31

第 2 章 実験の設計
測定方法のセットアップ

1
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設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• 反応量／ウェルに 10 ～ 30 の値を入力します。StepOne および StepOnePlus システム
では、10 ～ 30 µL の反応量がサポートされています。
• サーマルプロファイルを確認します。
– サーマルプロファイルが試薬に適していることを確認します。
– 1 ステップ RT-PCR を実施中の場合は、逆転写ステップを含めます。
実験に別のサーマルプロファイルが必要な場合は、サーマルプロファイルを編集する
か、Run Method ライブラリから測定方法を選択することもできます。Run Method ラ
イブラリは、StepOne ソフトウェアに含まれています。

• StepOnePlus 装置で実験を測定するときに、各 VeriFlex ブロックを異なる温度に設定するには、次のことが必要です。

a. ［Design Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を用いて実験を設計します。
b. ［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面（31 ページ）で、［Assign Targets
and Samples］（ターゲットとサンプルの割り当て）タブを選び、［View Plate
Layout］（プ レ ー ト レ イ ア ウ ト の 表 示）タ ブ を 選 ん だ 後、［Enable VeriFlex™
Block］（VeriFlex™ ブロックの有効化）チェックボックスを選択します。
重 要！［Plate Setup］（プ レ ー ト の セ ッ ト ア ッ プ）画 面 の［Enable VeriFlex™
Block］（VeriFlex™ ブロックの有効化）チェックボックスを選択しておかないと、［Run Method］（測定方法）画面で各 VeriFlex ブロックを異なる温度に設定できません。

c. ［Run Method］（測定方法）画面で、［Graphical View］（グラフィック表示）タ
ブを選択します。

ノート

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Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
反応セットアップの確認

d. 変更したい各 VeriFlex™ ブロックについて、温度をクリックしてから希望の値を入力します。
参考： VeriFlex ブロックはそれぞれ異なる温度設定をすることも、すべての VeriFlex ブ
ロックを同じ温度にすることも可能です。隣り合う VeriFlex ブロックを同じ温度に設定しない場合は、設定温度の差を 0.1 ～ 5.0 ° C にする必要があります。最高温度は 99.9 ° Cです。

詳細について詳細については：• Run Method ライブラリや［Run Method］（測定方法）画面入力の詳細については、をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

• VeriFlex ブロックの温度設定の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、
StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスします。
（高度なセットアップ）の使用については、「［Advanced Setup］（高• ［Advanced Setup］
度なセットアップ）ワークフロー」（116 ページ）をご参照ください。

反応セットアップの確認［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面で、アッセイタイプを選択してから、PCR 反応、
スタンダード希釈シリーズ、サンプル希釈液の調製のための容量計算値を確認します（TaqMan 試薬を使用する場合）。必要に応じて、反応容量、過剰反応容量、コンポーネント
濃度、スタンダード濃度、希釈サンプル濃度は編集できます。
重要！ 反応プレートの各ターゲットアッセイに対して、これらのステップを実施します。

実験例について標準曲線実験例では：• Applied Biosystems RNase P アッセイを使用します。
• ウェルあたりの反応容量は、25 µL です。
• 過剰反応容量は 10% です。
• 反応コンポーネントは：– TaqMan® Universal PCR Master Mix（2✕）または TaqMan® 2✕ Universal PCR
Master Mix, No AmpErase® UNG– RNase P Assay Mix（20✕）– サンプルまたはスタンダード– 蒸留水• ストック中のスタンダード濃度は 20,000 コピー／ µL です。
• 希釈サンプル濃度は、6.6 ng/µL です。
• サンプルストック濃度は、100 ng/µL です。

ノート

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33

第 2 章 実験の設計
反応セットアップの確認［Reaction Setup］ ［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブの入力（反応セットアップ）
1. ［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブを選択します（デフォルト設定）。
画面の入力
2. ［Select Target］（ターゲットの選択）欄で［RNase P］を選択します（デフォルト）。

3. ［Assay Type］（アッセイタイプ）ドロップダウンメニューで、［Inventoried/Made toOrder］（在庫／注文生産）を選択します。
4. ［Reaction Volume Per Well］（ウェルあたりの反応量）フィールドに「25 µL」と表示されていることを確認します。

5. ［Excess Reaction Volume］（過剰反応量）フィールドに「10%」と表示されていることを確認します。

6. ［Reactions for RNase P］（RNase P の反応）欄で：a. ［Master Mix Concentration］（Master Mix 濃度）フィールドに「2.0✕」と表示されていることを確認します。
b. ［Assay Mix Concentration］（Assay Mix 濃度）フィールドに「20.0✕」と表示されていることを確認します。
c. PCR 反応のコンポーネントと容量計算値を確認します。
コンポーネント

1 反応あたりの容量（µL）

Master Mix（2.0✕）

12.5

Assay Mix（20.0✕）

1.3

サンプル（10✕）またはスタンダード

2.5‡

H2O

8.8

総容量

25.0

‡ サンプルまたはスタンダードの容量は、上限が反応総容量の 10% です。

3

4

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1
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ノート

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Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
反応セットアップの確認

7. ［Standard Dilution Series for RNase P］（RNase P のスタンダード希釈シリーズ）欄で：a. ［Standard Concentration in Stock］（ストック中のスタンダード濃度）フィール
ドをクリックしてから、「20000」を入力します。
b. 単位フィールドをクリックしてから、「copies」（コピー）per µL を入力します。
c. スタンダード希釈シリーズの調製のための容量計算値を確認します。
原液

原液容量
（µL）

希釈液容量
（µL）

総容量
（µL）

スタンダード濃度（コピー／ µL）

1 (10,000)

ストック

3.6

14.5

18.2

4000.02 (5,000)

希釈液 1

9.1

9.1

18.2

2000.03 (2,500)

希釈液 2

9.1

9.1

18.2

1000.04 (1,250)

希釈液 3

9.1

9.1

18.2

500.0

5 (625)

希釈液 4

9.1

9.1

18.2

250.0

希釈ポイント7a7b

7c［Sample Dilution Calculations］（サンプル希釈計算）タブの入力

1. ［Sample Dilution Calculations］（サンプル希釈計算）タブを選択します。
2. ［Diluted Sample Concentration（105 for Reaction Mix）］（希釈サンプル濃度（反応ミックスの 10✕））フィールドをクリックしてから、「6.6」を入力します。
3. 単位ドロップダウンメニューで［ng/µL］を選択します（デフォルト設定）。

ノート

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35

第 2 章 実験の設計
反応セットアップの確認

4. サンプル希釈のための容量計算値を確認します。
ストック濃度（ng/µL）

サンプル容量
（µL）

希釈液容量
（µL）

希釈サンプルの総容量（µL）

pop1

100.0

1.0

14.2

15.2

pop2

100.0

1.0

14.2

15.2

サンプル名

1
2
3
4

反応セットアップ手順の印刷
詳細な反応セットアップ手順を印刷してから、第 3 章「反応の準備」用に手順を保存します。

1. ［Print Reaction Setup］（反応セットアップの印刷）をクリックします。

1

2. ダイアログボックスで以下を選択します。
• ［Detailed Reaction Setup Instructions］（詳細な反応セットアップ手順）• ［Include Plate Layout］（プレートレイアウトを含める）• ［Use sample color］（サンプルカラーを使う）
3. ［Print］（印刷）をクリックして、反応セットアップ手順をプリンタに送信します。

ノート

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第 2 章 実験の設計
反応セットアップの確認

2

3

4. ［Next >］（次へ）をクリックします。
設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• TaqMan 試薬を使っている場合は、使用しているアッセイタイプを選択します。
– Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays（Inventoried または Madeto Order）または Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression Assays を（在庫／注文生産）を選択します。
使っている場合は、［Inventoried/Made to Order］– Primer Express® ソフトウェアでアッセイを設計している場合は、［Custom］（カスタム）を選択します。

• 反応量／ウェルに 10 ～ 30 の値を入力します。StepOne および StepOnePlus システム
では、10 ～ 30 µL の反応量がサポートされています。
• 試薬分注の際に発生するロスを考慮して、反応容量を多めにしてください。弊社では、過剰反応容量を少なくとも 10% とすることをお勧めします。
• 各ターゲットの反応ミックス濃度を確認します。必要に応じて：– TaqMan 試薬については、Master Mix と Assay Mix の濃度を編集します。
– SYBR Green 試薬については、Master Mix、フォワードプライマー、リバースプラ
イマーの濃度を編集します。

– 1 ステップ RT-PCR については、逆転写酵素の濃度を編集します。
• 各ターゲットの反応ミックスコンポーネントを確認します。
– 高速 PCR 反応を実施している場合は、PCR 反応に Fast Master Mix を使用していることを確認します。

– 標準 PCR 反応を実施している場合は、PCR 反応に標準 Master Mix を使用していることを確認します。

– 1 ステップ RT-PCR については、PCR 反応に逆転写酵素を含むこと、特定のバッファーを使用していることを確認してください。

• 各ターゲットのスタンダード希釈シリーズの計算値を確認します。必要に応じて、ス
トック中のスタンダード濃度を編集します（単位を含む）。
参考：［Standard Concentration in Stock］（ストック中のスタンダード濃度）の単位
フィールドには、ドロップダウンメニューから［ng］か［µg］を選択するか、あるいはフィールドに別の単位（「copies」、「IU（International Units：国際単位）」、「nmol」、「pg」など）を入力することもできます。入力した内容に応じてテーブルがアップデー
トされます。

ノート

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第 2 章 実験の設計
実験用物品の注文• 各サンプルのサンプル希釈計算値を確認します。必要に応じて、希釈サンプル濃度（単位を含む）とストック濃度を編集します。

詳細について詳細については：• ［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面の入力については、 をクリックするか、
F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
• Applied Biosystems アッセイについては、以下をご参照ください。
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

実験用物品の注文［Materials List］（物品リスト）画面で、PCR 反応プレートの準備に推奨されている物品リストを確認します。オプションで、物品リストを印刷し、ショッピングリストを作成し、Applied Biosystems Store から推奨物品を注文することもできます。
参考： Applied Biosystems Store にアクセスするには、自由にインターネットに接続ができる環境が必要です。製品の在庫状況や価格は、お住まいの地域や国により変動します。全ての国から、Applied Biosystems Store にオンラインで注文可能とは限りません。不明な点は、弊社セールス担当者までお問い合わせください。
参考： StepOne ソフトウェアは、実験設計に基づいて注文する物品を推奨します。ソフトウェ
アは、ユーザーが、実験を設計し、物品を注文し、物品到着時に反応プレートを準備（第 3 章）、
測定（第 4 章）するものと仮定します。

実験例について標準曲線実験例では、次の物品が推奨されます。

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film
• MicroAmp™ 96-Well Support Base
• TaqMan® Universal PCR Master Mix（2✕）または TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix, No AmpErase® UNG

ノート

38

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
実験用物品の注文• Applied Biosystems RNase P assay
参考： Human RNase P FAM™ 色素ラベル MGB プローブは、TaqMan® Gene Expression
Assay としては使用できません。Custom TaqMan® Gene Expression Assay（PN 4331348）
としてご注文ください。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考： この実験例は、StepOne 装置用です。［Experiment Properties］（実験プロパティ）画
面（20 ページ）で StepOnePlus 装置を選択した場合、96 ウェル用消耗品（MicroAmp™ Fast
Optical 96-Well Reaction Plate など）が 48 ウェル用消耗品の代わりに表示されます。

［Ordering Materials］（物品の注文）画面の入力

1. 実験例については、［Find Assay］（アッセイの検索）欄を空欄のままにします。
Human RNase P FAM 色素ラベル MGB プローブは、TaqMan Gene Expression Assay
としては使用できないので、［Order Materials List］（注文物品リスト）画面から注文できません。必要な場合には、Custom TaqMan Gene Expression Assay（PN 4331348）
としてご注文できます。『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』を参照
してください。
参考： 標準曲線実験を設計する場合、［Find Assay］（アッセイの検索）欄の入力の仕方については、「設計ガイドライン」（41 ページ）をご覧ください。

2. ［Display］（表示）ドロップダウンメニューで［All Items］（すべてのアイテム）を選択してから（デフォルト設定）、推奨物品を確認します。必要に応じて、右側のスクロー
ルバーを使って、すべてのアイテムを確認します。
参考： 特定のアイテムに関する詳細については、部品番号リンクをクリックしてください。Applied Biosystems Store の製品情報ページに接続します。Applied Biosystems
Store にアクセスするには、自由にインターネットに接続ができる環境が必要です。

3. （オプション）［Print Materials List］（物品リストの印刷）をクリックして、物品リス
トをプリンタに送信します。

4. （オプション）ショッピングリストを作成します。
a. 以下の各アイテムの横にあるチェックボックスを選択します。

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film
• MicroAmp™ 96-Well Support Base
• TaqMan® Universal PCR Master Mix（2✕）または TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix, No AmpErase® UNG
b. ［Add Selected Items to Shopping List］（選択したアイテムをショッピングリス
トに追加）をクリックします。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

39

第 2 章 実験の設計
実験用物品の注文

5. （オプション）Applied Biosystems Store にショッピングバスケットを作成します。
参考： Applied Biosystems Store にアクセスするには、自由にインターネットに接続ができる環境が必要です。製品の在庫状況や価格は、お住まいの地域や国により変動します。全ての国から、Applied Biosystems Store にオンラインで注文可能とは限りません。
不明な点は、弊社セールス担当者までお問い合わせください。

a. ［Experiment Shopping List］（実験ショッピングリスト）に希望の物品が含まれていること、数量が正しいことを確認してから、［Order Materials in List］（リストの物品の注文）をクリックします。

2
3

4b

4a

5a

b. ［Order Materials - Log In］（物 品 の 注 文 － ロ グ イ ン）ダ イ ア ロ グ ボ ッ ク ス で、Applied Biosystems Store 用のユーザー名とパスワードを入力してから、［Loginand Submit］（ログインと送信）をクリックします。
参考： Applied Biosystems Store のアカウントをお持ちでない場合は、［RegisterNow］（今すぐ登録）をクリックして、アカウントを作成してください。（直接アメリカのインターネットオーダーシステムにご登録いただいても、日本国内のお客様はご利用いただけません。詳細は、03（5566）6700 までお問い合わせください。）

5b

ノート

40

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計
実験用物品の注文

c. Applied Biosystems Store に接続した後は、注文を完了するまで指示に従ってください。

6. 「［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了」（42 ページ）に進みます。
設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• 実験に必要な物品をすべて選択し、ショッピングリストに追加します。
• Applied Biosystems Store にアクセスするためには、– コンピュータが、インターネットに接続できることを確認します。
– Applied Biosystems のウェブサイトをご利用になる際は、以下のバージョンのブラ
ウザと Adobe® Acrobat® Reader を使うようお勧めします。
デスクトップ
オペレーティング
システム

Netscape®
Navigator

Microsoft®
Internet
Explorer

Macintosh®
Safari

Adobe®
Acrobat®
ReaderWindows®
2000/NT/XP/Vista

v6.x 以降

v6.x 以降該当なし

v4.0 以降

Macintosh® OS 9以降

利用できません

利用できません

v2.0.4 以降

v4.0 以降

参考： ウェブサイトが正しく機能するため、cookie と Java Script がオンになっていることを確認してください。
［Find Assay］（アッセイの検索）• Applied Biosystems Store でアッセイを検索するには、欄にもれなく入力します。

a. ［Enter Gene Name］（遺伝子名の入力）フィールドをクリックし、遺伝子名を入力した後「Find Assay」（アッセイの検索）をクリックします。
b. ［Find Assay Results］（アッセイの検索結果）ダイアログボックスでアッセイを選択します。
c. ［Apply Assay Selection］（アッセイ選択の適用）をクリックします。

詳細について ［Materials List］（物品リスト）画面の入力に関する詳細については、 をクリックするか、
F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

41

第 2 章 実験の設計［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了［Design Wizard］（設計ウィザード）を終了するには、プレートレイアウトを確認してから、終了オプションを選択してください。

実験例についてStepOne ソフトウェアは、反応プレート中のウェルの位置を自動的に選択します。標準曲線
実験例では：• ウェルは、以下に示すように配置されます。

参考： この実験例は、StepOne 装置用です。
［Experiment Properties］（実験プロパティ）
画面（20 ページ）で StepOnePlus 装置を選択した場合には、反応プレートレイアウト
は上記のレイアウトと異なります。ソフトウェアは、StepOnePlus 装置には、96 ウェル
反応プレートレイアウトを表示します。96 ウェル反応プレートレイアウトの例については、11 ページをご参照ください。

• 実験をそのまま保存し、閉じます。
参考： 実験例では、この時点で測定を実施しないでください。

［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了

1. StepOne ソフトウェア画面の下にある［Finish Designing Experiment］（実験設計の完了）をクリックします。

2. ［Review Plate Layout for Experiment］（実験のプレートレイアウトの確認）ウィンド
ウで、プレートレイアウトを確認します。以下の確認を行ってください。

•
•
•
•

未知のウェルが 6 個であること。
スタンダードウェルが 15 個であること。
ネガティブコントロールウェルが 3 個であること。
空のウェルが 24 個であること。

参考： プレートレイアウトが誤っている場合は、［Return to the Wizard］（ウィザードに戻る）をクリックして、入力されている値を確認してください。
ノート

42

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 2 章 実験の設計［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了

3. ［Save Experiment］（実験の保存）をクリックします。

32

4. ［Save Experiment］（実験の保存）ダイアログボックスで、［Save］（保存）をクリック
して、デフォルトのファイル名と保存場所をそのまま使用します。実験例を保存してから閉じ、［Home］（ホーム）画面に戻ります。
参考： デフォルト設定の場合、実験例は、< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフト
ウェア名 >\experiments フォルダに保存されます。

4

ノート

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43

第 2 章 実験の設計［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了

設計ガイドライン

標準曲線実験を設計する場合：• ［Review Plate Layout for Experiment］（実験のプレートレイアウトの確認）ウィンド
ウで、適切な終了オプションを選択します。
クリック

行いたい操作［Save Experiment］（実験の保存）変更も測定開始もせずに実験を保存し、終了します。

［Start Run for This Experiment］（この実験の測定を開始）

実験を保存し、測定を開始します。反応プレートが装置にロードされていることを確認します。

［Edit Plate Layout］（プレートレイアウトの編集）• ［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を用いてプレートレイアウトを変更します。
• （StepOnePlus 装置のみ）各 VeriFlex ブロックに異なる温度を設定するには、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使います。

［Create Another Experiment Using
the Design Wizard］（設計ウィザード
を用いて他の実験を作成する）

現在の実験を保存終了した後、［Design Wizard］（設計ウィザード）を用いて他の実験を作成します。

［Return to the Wizard］（ウィザードに戻る）

実験に戻り、［Design Wizard］（設定ウィザード）を用いて変更を行います。

• デフォルト設定の場合、実験は、< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments フォルダに保存されます。変更する場合：– 特定の実験の保存場所を変更するには、［Save Experiment］（実験の保存）ダイアロ
グボックスを使って希望の保存場所に進みます。

– デフォルトの保存場所を変更するには、［Tools］（ツール）［Preferences］（環境設定）を選択してから、［General］（全般）タブ（デフォルト設定）を選択します。
（デフォルトデータフォルダ）フィールドで、希望の保存場所［Default Data Folder］
を参照します。

詳細について ［ Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフローの詳細については、「［Advanced
Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー」（116 ページ）をご参照ください。

ノート

44

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第3章

反応の準備
本章の内容：■ 本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
■ サンプル希釈液の調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
■ スタンダード希釈シリーズの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
■ 反応ミックスの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
■ 反応プレートの調製 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
をクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
ルバーのヘルプ）を選択します。
Software

ノート

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45

第 3 章 反応の準備
本章の概要

本章の概要
本章では、標準曲線実験例の PCR 反応を準備する方法について説明し、実際の標準曲線実験の PCR 反応を準備する際のガイドラインを提供します。

実験例ワークフロー

本書に記載されている実験例用 PCR 反応を準備するワークフローを、以下に示します。
実験開始




実験の設計（第 2 章）
反応の準備（第 3 章）

1. サンプル希釈液を調製します。
2. スタンダード希釈シリーズを調製します。
3. 各ターゲットのアッセイ用に反応ミックスを調製します。
4. 反応プレートを調製します。



実験の測定（第 4 章）
実験の解析（第 5 章）

実験終了

ノート

46

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第 3 章 反応の準備
サンプル希釈液の調製

サンプル希釈液の調製
サンプルを最終反応ミックスに添加するまえに、サンプル希釈を行います。サンプルは、（サ
StepOne™ ソフトウェアで計算した容量で希釈します（「［Sample Dilution Calculations］）。
ンプル希釈計算）タブの入力」（35 ページ）

実験例について標準曲線実験例では：• StepOne ソフトウェアでは、サンプルの容量は反応総容量の 10% に限られているため、サンプルの希釈が必要です。反応総容量は 25 µL ／反応なので、サンプル量は 2.5 µL／反応となります。
［Sample Dilutions Calculations］（サンプル希釈計算）• ストック濃度は 100 ng/µL です。
表に従ってサンプルを希釈すると、サンプル濃度は、6.6 ng/µL となります。これは、容量が 25 µL の最終反応ミックスに、2.5 µL の容量で加えた場合、10✕ の濃度となります。最終反応液中の濃度は、1✕ です。

• ソフトウェアで計算した容量は、以下のようになります。
ストック濃度（ng/µL）

サンプル容量
（µL）

希釈液容量
（µL）

希釈サンプルの総容量（µL）

pop1

100.0

1.0

14.2

15.2

pop2

100.0

1.0

14.2

15.2

サンプル名

必要な物品

• サンプル希釈用蒸留水• マイクロ遠心管• ピペッター• ピペットチップ• サンプルストック• ボルテックスミキサー• 遠心機

サンプル希釈液の調製

1. 各希釈サンプル用遠心管にラベリングします。
• 集団 1• 集団 2
2. 必要量の蒸留水（希釈液）を空の遠心管にそれぞれ加えます。
遠心管

サンプル名

希釈液容量（µL）

1

集団 1

14.2

2

集団 2

14.2

ノート

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47

第 3 章 反応の準備
サンプル希釈液の調製

3. 必要量のサンプルストックを各遠心管にそれぞれ加えます。
遠心管

サンプル名

サンプル容量（µL）

1

集団 1

1.0

2

集団 2

1.0

4. 各希釈サンプルを 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。
5. 反応プレートの準備ができるまで、希釈サンプルを氷冷します。
準備ガイドライン

標準曲線実験を準備する場合：• StepOne ソフトウェアではサンプル容量が反応総容量の 10% までと定められているため、サンプル希釈が必要です。サンプルを最終反応ミックスに添加するまえに、サンプ
ル希釈を行います。

• TaqMan® Gene Expression Assay や Custom TaqMan® Gene Expression Assay の性能を最大限に活用するためには、20 µL 反応液当たり 10 から 100 ng の cDNA テンプレー
トを使用してください。高速試薬の場合には、10 ng とすることをお勧めします。
• TE 緩衝液または蒸留水でサンプルを希釈します。
詳細についてApplied Biosystems アッセイの詳細については、以下をご参照ください。
• TaqMan® Gene Expression Assays Protocol• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

ノート

48

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第 3 章 反応の準備
スタンダード希釈シリーズの調製

スタンダード希釈シリーズの調製
ス タ ン ダ ー ド 希 釈 シ リ ー ズ を、StepOne ソ フ ト ウ ェ ア で 計 算 し た 容 量 で 調 製 し ま す（「［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブの入力」（34 ページ））。

実験例について標準曲線実験例では：• ストック中のスタンダード濃度は 20,000 コピー／ µL です。
• ソフトウェアで計算した容量は、以下のようになります。
原液

原液容量
（µL）

希釈液容量
（µL）

総容量
（µL）

スタンダード濃度（コピー／ µL）

1 (10,000)

ストック

3.6

14.5

18.2

4000.02 (5,000)

希釈液 1

9.1

9.1

18.2

2000.03 (2,500)

希釈液 2

9.1

9.1

18.2

1000.04 (1,250)

希釈液 3

9.1

9.1

18.2

500.0

5 (625)

希釈液 4

9.1

9.1

18.2

250.0

希釈ポイント

必要な物品• スタンダード希釈用蒸留水• マイクロ遠心管• ピペッター• ピペットチップ• サンプルストック• ボルテックスミキサー• 遠心機

RNase P アッセイのスタンダード希釈シリーズの調製

1. 各スタンダード用遠心管に、次のようにラベリングをします。
• RNase P Std. 1• RNase P Std. 2• RNase P Std. 3• RNase P Std. 4• RNase P Std. 5
2. 必要量の蒸留水（希釈液）を空の遠心管にそれぞれ加えます。
遠心管

スタンダード名添加する希釈液容量（µL）

1

RNase P Std. 1

14.5

2

RNase P Std. 2

9.1

3

RNase P Std. 3

9.1

4

RNase P Std. 4

9.1

5

RNase P Std. 5

9.1

ノート

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49

第 3 章 反応の準備
スタンダード希釈シリーズの調製

3. RNase P Std 1 遠心管に希釈液 1 を調製します。
a. ストックを 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、遠心管を短時間遠心機にかけます。
b. 新しいピペットチップを使って、3.6 µL のストックを RNase P Std 1 遠心管に添加します。
c. Std 1 遠心管を 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。

4. RNase P Std 2 遠心管に希釈液 2 を調製します。
a. 新しいピペットチップを使って、9.1 µL の希釈液 1 を RNase P Std 2遠心管に添加します。
b. Std 2 遠心管を 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。

5. RNase P Std 3 遠心管に希釈液 3 を調製します。
a. 新しいピペットチップを使って、9.1 µL の希釈液 2 を RNase P Std 3遠心管に添加します。
b. Std 3 遠心管を 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。

6. RNase P Std 4 遠心管に希釈液 4 を調製します。
a. 新しいピペットチップを使って、9.1 µL の希釈液 3 を RNase P Std 4遠心管に添加します。
b. Std 4 遠心管を 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。

7. RNase P Std 5 遠心管に希釈液 5 を調製します。
a. 新しいピペットチップを使って、9.1 µL の希釈液 4 を RNase P Std 5遠心管に添加します。
b. Std 5 遠心管を 3 ～ 5 秒間ボルテックスにかけた後、短時間遠心機にかけます。

8. 反応プレートの準備ができるまで、スタンダードを氷冷します。
準備ガイドライン

標準曲線実験を準備する場合：• 測定データの正確な分析には、スタンダードが重要です。
• 希釈液を準備する際に誤ったり不正確であると、結果に直接影響が出ます。
• ピペッターやピペットチップの品質の他、希釈液の計量や混合の際に注意を怠ると、精度に影響が出ます。

• スタンダードの希釈には、TE 緩衝液または蒸留水を用います。

ノート

50

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第 3 章 反応の準備
反応ミックスの調製

反応ミックスの調製
反応ミックスを、StepOne ソフトウェアで計算したコンポーネントと容量で調製します（「［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブの入力」（34 ページ））。
参考： ソフトウェアが PCR 反応の全コンポーネントの容量を計算します。しかし、本章に従って反応ミックスを調製する場合には、マスターミックス、アッセイミックスおよび蒸留水のみとしてください。反応プレートの準備をする際に、サンプルまたはスタンダードを加えてください（「反応プレートの調製」（53 ページ）参照）。

実験例について標準曲線実験例では：• 反応ミックスコンポーネントには、次のものが含まれます。
– TaqMan® Universal PCR Master Mix（2✕）または TaqMan® 2✕ Universal PCR
Master Mix, No AmpErase® UNG– RNase P Assay Mix（20✕）– 蒸留水• ソフトウェアが計算した容量は：コンポーネント

1 反応あたりの容量（µL）

Master Mix（2.0✕）

12.5

Assay Mix（20.0✕）

1.3

H2O

8.8

総容量

22.6

参考： この時点では、サンプルやスタンダードは加えません。

必要な物品• マイクロ遠心管• ピペッター• ピペットチップ• 反応ミックスコンポーネント（上掲）
• 遠心機

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

51

第 3 章 反応の準備
反応ミックスの調製

反応ミックスの調製

危険な薬品：TaqMan® Universal PCR Master Mix（2✕）は、目と皮膚に炎症を引き起こす可能性があります。飲み込んだり、吸入すると、不快な症状が発生する可能性があります。MSDS をよく読み、取扱い上の指示に従ってください。使用時には、適切な保護めがね、保護服、保護手袋を着用してください。

危 険 な 薬 品： TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG は、目と皮膚に炎症を引き起こす可能性があります。飲み込んだり、吸入すると、不快な症状が発生する可能性があります。MSDS をよく読み、取扱い上の指示に従ってください。使用時には、適切な保護めがね、保護服、保護手袋を着用してください。

1. 反応ミックスに適したサイズの遠心管に下記のラベルを付けます。
RNase P Reaction Mix
2. RNase P アッセイでは、各コンポーネントの必要量を遠心管に添加します。
1 反応あたりの容量（µL）

24 反応あたりの容量（µL）（過剰容量を 10% 含む）

TaqMan® Universal PCR Master
Mix（2✕）または TaqMan® 2✕
Universal PCR Master Mix, No
AmpErase® UNG

12.5

330.0

RNase P Assay Mix（20✕）

1.3

34.3

蒸留水

8.8

232.3

総反応ミックス容量

22.6

596.6

コンポーネント

3. 上下にそっとピペットして反応ミックスを混合してから、遠心管にキャップをします。
4. 遠心管を遠心機にかけて、気泡を除きます。
5. 反応ミックスは、反応プレートを調製し終わるまで氷上に置きます。
準備ガイドライン

標準曲線実験を準備する場合：• 実験にターゲットアッセイが複数含まれる場合には、各ターゲットアッセイ用の反応
ミックスは、別々に調製してください。

• 試薬分注の際に発生するロスを考慮して多めの容量を準備するため、容量計算の際には、過剰分を含めてください。弊社では、過剰容量を少なくとも 10% とすることをお勧めします。

• 必要なコンポーネントをすべて添加します。
• 製造メーカーの指示に従って、試薬を調製してください。
• アッセイミックスは、使う準備が整うまで、遮光して冷凍庫で保存します光に過度にさらすと、蛍光プローブに影響が生じる場合があります。

• 使用前には：– マスターミックス容器を十分に振って、よく撹拌してください。
– ボルテックスミキサーでアッセイミックスを懸濁分散させた後に、遠心管を短時間遠心機にかけてください。
ノート

52

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製– 冷凍サンプルは、氷の上で解凍します。解凍後に、ボルテックスミキサーでサンプルを懸濁分散させた後に、遠心管を短時間遠心機にかけてください。

詳細について反応ミックス調製方法の詳細については、PCR 反応に使用している試薬が該当する次のプロ
トコルをご参照ください。

• TaqMan® Gene Expression Assays Protocol• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

反応プレートの調製
各反復グループ用の反応液を調製した後、反応プレートに移します。StepOne ソフトウェア
で表示されるプレートレイアウトを使います。

実験例について標準曲線実験例では：• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate を使用します。
• ウェルあたりの反応容量は、25 µL です。
• 反応プレートには次の内容が含まれています。
– 未知のウェルが 6 個。
– スタンダードウェルが 15 個。
– ネガティブコントロールウェルが 3 個。
– 空のウェルが 24 個。
• StepOne ソフトウェアで自動的に表示されるプレートレイアウトを使います。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

53

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製

参考： この実験例は、StepOne 装置用です。
［Experiment Properties］（実験プロパティ）
画面で StepOnePlus 装置を選択した場合には（20 ページ）
、反応プレートレイアウトは
上記のレイアウトと異なります。ソフトウェアは、StepOnePlus 装置には、96 ウェル反応プレートレイアウトを表示します。96 ウェル反応プレートレイアウトの例について
は、11 ページをご参照ください。

必要な物品• マイクロ遠心管• ピペッター• ピペットチップ• RNase P 反応ミックス（52 ページから）• 蒸留水• スタンダード（49 ページから）• サンプル（47 ページより）• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film
• 遠心機

反応プレートの調製

1. ターゲットに対してネガティブコントロール反応を調製します。
a. 適当なサイズの遠心管に、以下に示す容量の反応ミックスおよび蒸留水を加えます。
遠心管

反応ミックス

1

RNase P Reaction
Mix

反応ミックス容量
（µL）

蒸留水容量
（µL）

74.6

8.3

b. 丁寧なピペット操作によって、各遠心管に反応液を加えた後、遠心管にキャップを
します。
ノート

54

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製

c. 遠心管を遠心機にかけて、気泡を除きます。
d. 反応プレートの適当なウェルに、ネガティブコントロール反応液を 25 µL 加えます。

2. 各反復グループ用に、スタンダード反応液を調製します。
a. 適当なサイズの遠心管に、以下に示す容量の反応ミックスおよびスタンダードを加
えます。
遠心管

スタンダード反応

反応ミックス

反応ミックス
容量（µL）

スタンダードスタンダード容量（µL）

1

RNase P
Std 1

RNase P
Reaction
Mix

74.6

RNase P
Std 1

8.3

2

RNase P
Std 2

RNase P
Reaction
Mix

74.6

RNase P
Std 2

8.3

3

RNase P
Std 3

RNase P
Reaction
Mix

74.6

RNase P
Std 3

8.3

4

RNase P
Std 4

RNase P
Reaction
Mix

74.6

RNase P
Std 4

8.3

5

RNase P
Std 5

RNase P
Reaction
Mix

74.6

RNase P
Std 5

8.3

b. 丁寧なピペット操作によって反応液を加えた後、遠心管にキャップをします。
c. 遠心管を短時間遠心機にかけて、気泡を除きます。
d. 反応プレートの適当なウェルに、スタンダード反応液を 25 µL 加えます。

3. 各反復グループについて、未知サンプルの反応を調製します。
a. 適当なサイズの遠心管に、以下に示す容量の反応ミックスおよびサンプルを加えます。
遠心管

反応ミックス
容量（µL）

サンプル
容量（µL）

未知の反応

反応ミックス

1

RNase P
pop1

RNase P
Reaction
Mix

74.6

pop1

8.3

2

RNase P
pop2

RNase P
Reaction
Mix

74.6

pop2

8.3

サンプル

b. 丁寧なピペット操作によって反応液を加えた後、遠心管にキャップをします。
c. 遠心管を短時間遠心機にかけて、気泡を除きます。
d. 反応プレートの適当なウェルに、未知の（サンプル）反応液を 25 µL 加えます。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド55

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製

4. 反応プレートを光学接着フィルムでシールします。
5. 遠心管を短時間遠心機にかけて、気泡を除きます。
6. 液が反応プレートの各ウェルの底にたまっていることを確認します。ウェルの底まで達していないものがあれば、反応プレートをより高速で長時間遠心機にかけます。
重要！ 反応プレートの底を汚さないように注意してください。反応プレートの底に液体や他の汚染物がつくと、サンプルブロックを汚染し、異常に高いバックグラウンド信号が検出されてしまう可能性があります。

正液がウェルの底にたまっている。

誤• 遠心力が不充分、または• 遠心時間が不充分

7. 測定の準備ができるまで、反応プレートを冷暗所で氷冷します。
準備ガイドライン

標準曲線実験を準備する場合：• 使用する消耗品が適切であることを確認します。
• PCR 反応の配置が StepOne ソフトウェアで表示されるプレートレイアウトに合致していることを確認してください。次のいずれかが可能です。

– ソフトウェアが自動的に作成するプレートレイアウトを使います。
または– ［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使って、ソフトウェアでプレートレイ
アウトを変更します。

• 光学接着フィルムを用いて反応プレートをシールする場合には、各反応プレートを以下のようにシールしてください。
具体例
操作

StepOne™ システム

StepOnePlus™ システム

1. 反応プレートを 96 ウェルベースの中央部に置きます。反応プレートが 96 ウェルベースの上部面とぴったり重なることを確認します。
2. 必要に応じて反応プレートを装填します。
3. ボックスから光学接着フィルム（フィルム）を 1 枚取り出します。
• StepOne システム反応プレートの場合には、両端を上向きに折り曲げます。フィルムの保護面を上側に向けます。
• StepOnePlus システム反応プレートの場合には、片側の端を折り返します。フィルムの保護面を上側に向けます。

ノート

56

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製

具体例
操作

StepOne™ システム

StepOnePlus™ システム

4. 白色の保護フィルムをすばやくシール面から剥します。シール面には触れないでください。
重要！ 光学接着フィルムがきちんと密着していないと、ウェルがくっきりと見えませんが、結果に影響はありません。装置のヒートカバー
がフィルムと接触すると、ぴったりくっつきます。

5. フィルムの両端を持ち、フィルムを反応プレートの方に向けて降ろします（接着面が反応プレートに面するように）。フィルムが反応プレート中の全ウェルを完全に覆っていることを確認します。

6. 上から圧力をかけながらアプリケータを縦横にゆっくり動かして、反応プレート全体とフィルムが密着するようにします。

7. アプリケータを使ってフィルムの端を正しい位置で押さえている
間に、他方の端を持って、すばやく引っ張ってください。反対側についても同じようにします。

8. 蒸発が生じないよう完全に密着させるためには：
a. ステップ 6 を繰り返します。
b. アプリケータの端をフィルムの外側の縁に沿ってしっかり圧力をかけながら動かします。
参考： 光学接着フィルムは、接触しただけで密着するものではなく、蒸発が生じないよう完全に密着させるためには、圧力をかけることが必要です。

9. 反応プレートを点検し、ウェルがすべて密閉されているかどうか確認します。フィルム表面上に全ウェルの縁がはっきりと映っていなければなりません。

詳細について詳細については：• 反応プレート調製方法の詳細については、PCR 反応に使用している試薬が該当する次のプロトコルをご参照ください。

– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol• 消耗品については、「使用可能な消耗品」（4 ページ）をご参照ください。
• ［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を用いてプレートレイアウトを変更するには、「［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー」（116 ページ）をご参照
ください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

57

第 3 章 反応の準備
反応プレートの調製

ノート

58

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第4章

実験の測定
本章の内容：■ 本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
■ 測定の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
■ （オプション）通知設定の有効化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
■ 測定の開始 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
■ 測定の監視 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
■ プレートの取り出しとデータの転送 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
をクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
ルバーのSoftware ヘルプ）を選択します。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

59

第 4 章 実験の測定
本章の概要

本章の概要
本章では、Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems において測定を実施する方法について説明します。

実験例ワークフロー

本書に記載されている実験例の測定を実施するワークフローを以下に示します。
実験開始





実験の設計（第 2 章）
実験の準備（第 3 章）

実験の測定（第 4 章）

1. 測定の準備をします。
2. （オプション）通知設定を有効にします。
3. 測定を開始します。
4. 測定を監視します。
5. プレートを取り出し、データを転送します。



実験の解析（第 5 章）

実験終了

ノート

60

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の準備

測定の準備
第 2 章で作成した実験例ファイルを開き、密閉した反応プレートを StepOne™ または
StepOnePlus™ 装置にロードして、測定の準備をします。

実験例ファイルを開く

1.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（スター（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］［StepOneト）［All Programs］
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. ［Home］（ホーム）画面で、［Open］（開く）をクリックします。
3. ［Open］（開く）ダイアログボックスで、［experiments］（実験）フォルダを選択します（デフォルト設定）。

< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments

4. ［Standard Curve Example］（標準曲線例）をダブルクリックして、第 2 章で作成した
実験例ファイルを開きます。
2

3
4

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

61

第 4 章 実験の測定
測定の準備

反応プレートを装置にロード

怪我の危険：装置の操作中、サンプルブロック温度は 100 °C を超える可能性があります。装置使用後は、サンプルブロックが室温に戻るまで手を触れないでください。
重要！ 反応プレートを取り扱う際は、パウダーフリーの手袋を着用してください。

1. 装置のドロアーを開きます。

StepOne 装置サンプル
ブロック

StepOnePlus 装置のVeriFlex™ サンプルブロック

2. サンプルブロックに反応物を入れます。
• 反応プレートを使用する場合は、A1 ウェルが左奥になるようにサンプルブロックに反応プレートを入れます。

• 反応チューブストリップを使用する場合は、チューブストリップを入れたトレイをサンプルブロックに入れます。

• 反応チューブを使用する場合は、チューブを入れたトレイをサンプルブロックに入
れます。

ノート

62

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定（オプション）通知設定の有効化

重要！ 一部分しかロードしない場合に性能を最大限に発揮するためには、

StepOnePlus 装置 － 少なくとも 16 本のチューブをロードし、次のように配列してください。

• 隣接する各列に 8 本のチューブを入れ、A から H までの行を使用します。例えば、第 1 列（A 行から H 行まで）と第 2 列（A 行から H 行まで）を使います。
または• 隣接する各行に 8 本のチューブを入れ、3 から 10 までの列を使用します。例えば、
A 行（第 3 列から第 10 列まで）と B 行（第 3 列から第 10 列まで）を使います。
StepOne 装置 － 少なくとも 4 本のチューブをサンプルブロックにロードします。

3. 装置ドロアーを慎重に閉じます。

（オプション）通知設定の有効化
通知設定を有効にすると、StepOne または StepOnePlus 装置が実験を開始、終了した際に、あるいは測定中にエラーが生じた場合に、StepOne ソフトウェアが電子メールにより通知します。通知設定は、オプションであり、StepOne™ および StepOnePlus™ システムの機能や測定時間には影響しません。
重要！ 通知設定は、使用するコンピュータが StepOne または StepOnePlus 装置を制御し、かつイーサネットネットワークに接続している場合にのみ有効にできます。
参考： 通知設定は、コンピュータによる StepOne または StepOnePlus 装置の遠隔監視を行っている場合も有効にできます。詳細については、「遠隔監視」（73 ページ）をご参照ください。

実験例について実験例では、• StepOne または StepOnePlus システムが測定を終了し、稼働中にエラーが生じた場合に、3 名のユーザー（ドメイン名が「mycompany.com」で、アドレスが「scientist」、「supervisor」および「technician」）に対して StepOne ソフトウェアにより通知が行われるように設定されます。

• 実験例の SMTP サーバー（www.mycompany.com）は、SSL 暗号化プロトコルを用いてセットアップされており、使用には認証が必要となります。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

63第 4 章 実験の測定（オプション）通知設定の有効化

通知設定のセットアップ

1. StepOne ソフトウェアのナビゲーション欄で
2.

［Run］
（測定）をクリックします。

［Notification Settings］（通知設定）をクリックします。

3. ［Enable Notifications］（通知の有効化）で［Yes］（はい）を選択します。
4. 通知するイベントを選択します。
a. ［Instrument Error］（装置エラー）を選択します。
b. ［Run Completed］（測定完了）を選択します。

5. ［Enter e-mail addresses for notifications］（通知する電子メールアドレスの入力）フィー
ルドに、次のアドレスを入力します。

scientist@mycompany.com、supervisor@mycompany.com、
technician@mycompany.com

6. ［Outgoing Mail Server（SMTP）］（送信メールサーバー（SMTP））フィールドに「smtp.mycompany.com」と入力します。
7. 認証に関する設定を行います。
a. ［Server requires authentication］（サーバーに認証が必要ですか）には、［Yes］（はい）を選択します。
b. ［User Name］（ユーザー名）フィールドに「Example User」（ユーザー例）と入力します。
c. ［Password］（パスワード）フィールドに「password」と入力します。

3

4
5
6
7a
7b
7c

測定ガイドライン

自動通知を StepOne または StepOnePlus システムでセットアップする場合：• システムがネットワークに接続されていることが必要です。『Applied Biosystems StepOne™
および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 設置・ネットワーク・メンテナンスガイ
ド』をご参照ください。

ノート

64

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の開始• 電子メールによる通知を希望するイベントを選びます。
– Instrument Error（装置エラー）－ 装置のエラーが、各測定ごとに電子メールで受信者に通知されます。

– Run Started（測定開始）－ 装置が測定を開始するごとに電子メールで受信者に通知されます。

– Run Completed（測定完了）－ 装置が測定を完了するごとに電子メールで信者に通知されます。

• 通知を受ける電子メールアドレスを入手します。
重要！ アドレスは、コンマ（ , ）で区切ります。

• 必要に応じ、次の情報について、システム管理者か情報技術部門に問い合わせます。
– 通知を受けるユーザーの電子メールアドレス– LAN 上の送信（SMTP）サーバーのネットワークアドレス– ユーザー名とパスワード（サーバーのアクセスに必要な場合）– サーバーの SSL 暗号化プロトコルの設定（有効か無効か）測定の開始
StepOne または StepOnePlus システムのレイアウトに従って、測定を開始してください。

コロケーション
スタートアップ

レイアウト

説明

参照

コロケーション

コンピュータと装置が黄色いケーブルで接続されている。

下記「コロケーション
スタートアップ」

スタンドアロン• コンピュータと装置が接続されていない、または• コンピュータと装置が同じネットワークに接続されている。

「スタンドアロン
スタートアップ」（66 ページ）

コンピュータが黄色いケーブルで StepOne または StepOnePlus 装置に直接接続されている場合には、この手順に従います。

1. StepOne ソフトウェアのナビゲーション欄で［Run］（測定）をクリックします。

2. ［START RUN］（測定開始） をクリックします。
2

1

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

65

第 4 章 実験の測定
測定の開始

スタンドアロン
スタートアップ

コンピュータと StepOne または StepOnePlus 装置が、黄色いケーブルで直接接続されていない場合には、この手順に従います。実験を開始します。

• コンピュータと装置が同じネットワークに接続されている場合には、「ネットワーク経由で実験を装置に送信」（66 ページ）に従います。
または「装置に USB ド• コンピュータと装置が同じネットワークに接続されていない場合には、ライブを用いて実験を転送」（66 ページ）に従います。

ネットワーク経由で実験を装置に送信

1. StepOne ソフトウェアで、 ［Send Experiment to Instrument］（実験を装置に送信）をクリックします。

2. ［Send Experiment to Instrument］（実験を装置に送信）ダイアログボックスで、
a. ［Browse］（参照）をクリックして、実験例ファイルを開き、［Open］（開く）をクリックします。
b. 実験ファイルを受信する装置を選択します。
参考： リストに装置が表示されない場合には、『Applied Biosystems StepOne™ お

よび StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 設置・ネットワーク構築・メンテナ
ンスガイド』の説明に従って、装置が監視されるようにセットアップしてください。
c. ［Send Experiment］（実験の送信）をクリックして、実験をネットワーク上の装置に送信します。

2a2b2c

3. 確認の表示がでたら、［OK］をクリックしてウィンドウを閉じます。
4. 「タッチスクリーンを使用した装置測定の開始」（67 ページ）に進みます。
装置に USB ドライブを用いて実験を転送

1. USB ドライブをコンピュータの USB ポートの 1 つに接続します。
2. StepOne ソフトウェアで、 ［Save］（保存）［Save As］（名前を付けて保存）を選択します。

3. ［Save］（保存）ダイアログボックスで USB ドライブを選び、［Save］（保存）をクリッ
クします。

ノート

66

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の開始

4. USB ドライブをコンピュータから取り外し、StepOne または StepOnePlus 装置の USB
ポートに接続します。

5. 下記の「タッチスクリーンを使用した装置測定の開始」に進みます。
タッチスクリーンを使用した装置測定の開始

1. StepOne または StepOnePlus 装置のタッチスクリーンに触れて、休止を解除します。
参考： タッチスクリーンに［Main Menu］（メインメニュー）画面が表示されない場合には、 に触れます。

2. タッチスクリーンに USB のマークが表示されるまで待ちます。
3. ［Main Menu］（メインメニュー）画面で、［Browse/New Experiments］（実験の参照／新しい実験）に触れます。

4. ［Browse］（参照）画面で［Folders］（フォルダ）に触れます。

5. ［Choose an Experiment Folder］（実験フォルダの選択）画面で：• USB ドライブから実験を転送した場合には、［USB］に触れます。
［Default］（デフォルト）に触れます。
• ネットワーク経由で実験を転送した場合には、
6. 測定を開始する前に、実験例を装置に保存します。
a. ［Browse］（参照）画面で実験例名に触れ、［Copy］（コピー）に触れます。
b. ［Save Experiment］（実験の保存）画面で保存先フォルダを選択し、［Save & Exit］（保存して終了）をクリックします。

7. ［Browse］（参照）画面で実験例名に触れ、 ［Start Run］
（測定の開始）に触れます。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

67

第 4 章 実験の測定
測定の開始

4

6a

7

8. ［Run Parameters］（測定パラメータ）画面で：a. ［Reaction Volume］（反応容量）フィールドに触れ、キーパッドで実験例の反応（完了）に触れます。
容量を入力した後、［Done］
b. ［Start Run Now］（すぐに測定開始）に触れます。

8a

8b

ノート

68

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の監視

測定の監視
StepOne または StepOnePlus システムのレイアウトに従って、測定を監視します。
レイアウト

説明

参照

コロケーション

黄色いケーブルで、コンピュータと装置が接続されている。

下記「コロケーション監視」

スタンドアロン コンピュータと装置が同じネットワークに接続さ（ネットワーク） れている。
スタンドアロン（ベーシック）コロケーション監視コンピュータと装置が接続されていない。

「遠隔監視」（73 ページ）「スタンドアロン監視」（75 ページ）

コンピュータが黄色いケーブルで StepOne または StepOnePlus 装置に直接接続されている場合には、次に示すように、測定の進行をリアルタイムで表示することができます。測定中、StepOne ソフトウェア上で示される 3 種類のプロットを定期的にチェックして、問題がないかどうか確認してください。
#
A

目的
測定の停止

操作
［STOP RUN］
（測定停止）をクリッ
1. StepOne ソフトウェアで、クします。

2. ［Stop Run］（測定停止）ダイアログで次のいずれかをクリックします。
– 測定を即座に停止する場合には、［Stop Immediately］（すぐに停止）をクリックします。
– 今のサイクル／ホールド終了後に測定を停止する場合には、（現在のサイクル／ホー［Stop after Current Cycle/Hold］
ルド後に停止）をクリックします。
［Cancel］（キャンセル）をクリッ– 測定を継続する場合には、
クします。
B

C

増幅データをリアル
タイムで表示測定の温度データをリアルタイムで表示

D ［Run Method］（測定方法）画面に測定の進行状況を表示E

通知設定を有効化／無効化［Amplification Plot］（増幅プロット）を選択します。
「［Amplification Plot］（増幅プロット）画面について」（70 ページ）をご参照ください。
［Temperature Plot］（温度プロット）を選択します。
「［Temperature Plot］（温度プロット）画面について」（71 ページ）をご参照ください。
［Run Method］（測定方法）を選択します。
「［Run Method］（測定方法）画面について」（72 ページ）をご参照ください。
［Enable Notifications］（通知の有効化）を選択または選択解除します。
「（オプション）通知設定の有効化」（63 ページ）をご参照ください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

69

第 4 章 実験の測定
測定の監視

A
E

B
C
D

［Amplification Plot］（増幅プロット）画面について［Amplification Plot］（増幅プロット）画面には、装置が測定中に収集する蛍光データをもとに、サンプルの増幅を表示できます。リアルタイムデータを収集するように測定方法が設定されている場合、［Amplification Plot］（増幅プロット）画面には、［View Plate Layout］（プ
レートレイアウトの表示）タブで選んだウェルのデータが表示されます。このプロットは、
ノーマライズ色素蛍光（∆Rn）対サイクル数の関数として表示されます。下図は、実験例による［Amplification Plot］（増幅プロット）画面の様子を示します。
［Amplification Plot］（増幅プロット）画面のデータを表示するには、［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブで、表示したいウェルを選択します。

［Amplification Plot］（増幅プロット）画面は、増幅異常を発見したり、調べるのに有益です。増幅異常には、次の場合があります。

• ネガティブコントロールウェルの蛍光が増加する。

ノート

70

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の監視• サイクルで想定される蛍光（以前に同一条件下で同じ試薬を使用して行った実験の測定結果から判断）が検知されない。
増幅異常が発見されたり、信号が全く検知されない場合には、StepOne ソフトウェアのヘルプ（ツールバーのをクリックするか、［F1］を押します）で、問題のトラブルシューティ
ングを行ってください。

［Temperature Plot］（温度プロット）画面について［Temperature Plot］（温度プロット）画面は、測定中、サンプルブロック、加熱カバーおよびサンプル（計算値）の温度をリアルタイムで表示します。下図は、実験例による［Temperature
Plot］（温度プロット）画面の様子を示します。
目的

操作

A

温度プロットを追加／削除［Cover］（カバー）または［Sample（サンプルブロック）を選択しBlock］て、プロットに表示するデータを切り
替えます。

B

プロットに表示される時間を変更［View］（表示）ドロップダウンメニュー
から、プロットに表示する時間を選択します。

C

装置測定中、固定時間ウィンドウを表示（固定表示）を選択しま［Fixed View］
す。

全プロットが画面に入りきらない場合、測定の進行に伴う画面の更新は行われません。例えば、［View］（表示）ドロップダウンメニューで 10 分を選択すると、プロットには 10 分間分のデータしか表示されません。測定が 10 分間以上継続する場合、（固定表示）の選択を解除すると、測• ［Fixed View］
定の進行に伴うプロットが更新されます。
（固定表示）を選択されていると、測• ［Fixed View］
定の進行に伴うプロットの更新は行われません。

A

B
C（温度プロット）画面は、装置の故障を発見するのに有益です。
［Temperature Plot］［Temperature Plot］（温度プロット）画面を監視する際には、［Sample］（サンプル）および［Block］（ブロック）のプロットに異常な挙動がないかどうかを確認します。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

71

第 4 章 実験の測定
測定の監視• 通常、サンプルプロットとブロックプロットは、ほぼ同じように動きます。プロットが大きく食い違う場合には、問題が起こっている可能性があります。

• ［Cover］（カバー）プロットは、方法で指定した温度を一定に保つはずです。 一定の温度を保持できない場合には、問題が起こっている可能性があります。
温度プロットに異常が発見された場合には、StepOne ソフトウェアのヘルプ（をクリックするか、［F1］を押します）で、問題のトラブルシューティングを行ってください。
参考：［Current Temperatures］（現在の温度）グループに表示されるサンプル温度は推定値です。

［Run Method］（測定方法）画面について［Run Method］（測定方法）画面には、進行中の測定に関して選択した測定方法が表示されます。測定中は、ソフトウェアにより、［Run Status］（測定ステータス）が更新されます。下図は、実験例による［Run Method］（測定方法）画面の様子を示します。
目的

操作

A

サイクル数の変更［Adjust # of Cycles］（サイクル数の調整）フィールドで、［Cycling Stage］（サイクリングステージ）に適用するサ
イクル数を入力します。

B

融解曲線を測定の最後に追加［Add Melt Curve Stage to End］
（最後に融解曲線を追加）を選択します。

C ［Hold］（ホールド）ステージを測 ［Add Holding Stage to End］
（最後にホールディングス
定の最後に追加
テージを追加）を選択します。
D

変更の確定

［Send to Instrument］（装置に送信）をクリックします。

A
B
C
D

警告が表示された場合は、エラーをクリックして詳細を表示し、StepOne ソフトウェアのヘをクリックするか、［F1］を押します）に従って問題をトラブルシュー
ルプ（ツールバーのティングしてください。

ノート

72

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の監視

遠隔監視

StepOne または StepOnePlus 装置がネットワークに接続されている場合、StepOne ソフト
ウェアの［Remote Monitor］（遠隔監視）を用いて、ネットワーク上の任意のコンピュータ
上に測定の進行状況をリアルタイムで表示することができます。
重要！ ネットワーク上のコンピュータでは、StepOne または StepOnePlus 装置の制御はできません。監視のみ可能です。

装置を遠隔監視するには：

1. StepOne ソフトウェアで、［Instrument］（装置）［Remote Monitor］（遠隔監視）を選択します。

2. ナビゲーション欄で、装置を選択します。
ナビゲーション欄に装置が表示されない場合には：

a. ［Add Instrument］（装置の追加）をクリックします。
b. ［Remote Monitor］（遠隔監視）内にある装置プロファイル名を入力します。
参考：装置を特定できるようなプロファイル名を入力してください。入力するプロ
ファイル名は、実験を送信したり、実験をダウンロードしたり、装置を監視するときに、［Remote Monitor］（遠隔監視）および装置ドロップダウンメニューに表示されます。

c. ［Instrument Name］（装置名）、［Host Name］（ホスト名）、［IP Address］（IP アドレス）フィールドに：• ホスト名が分かっている場合は、ホスト名を入力します。
• ホスト名が分からない場合は、装置名か IP アドレスを入力します。
参考： 装置名やIPアドレスは、装置のタッチスクリーンに表示されます。
［Settings（設定メニュー）［Admin Menu］（管理メニュー）［Set Instrument
Menu］
Name］（装置名の設定）または［Set IP Address］（IP アドレスの設定）に進みます。ホスト名については、システム管理者または情報技術部門に問い合わせてください。

d. ［Save & Exit］（保存して終了）をクリックします。

2b
2c
2d

参考： StepOne または StepOnePlus 装置のネットワーク使用や［Remote Monitor］（遠隔監視）機能の設定の詳細については、『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems 設置・ネットワーク構築・メンテナンスガイド』をご参照ください。
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド73

第 4 章 実験の測定
測定の監視

3. 該当する装置の［Start monitoring the instrument］（装置の監視開始）をクリックします。装置が情報をコンピュータに送信するのに数分かかる場合があります。

1

2
3

4. 以下の手順に従ってデータを確認します。
#
A

B

目的
増幅データをリアル
タイムで表示測定の温度データをリアルタイムで表示

C ［Run Method］（測定方法）画面に測定の進行状況を表示D

通知設定を有効化／無効化操作［Amplification Plot］（増幅プロット）をクリックします。
「［Amplification Plot］（増幅プロット）画面について」（70 ページ）をご参照ください。
［Temperature Plot］（温度プロット）をクリックします。
（温度プロット）画面について」（71 ページ）「［Temperature Plot］
をご参照ください。
［Run Method］（測定方法）を選択します。
「［Run Method］（測定方法）画面について」（72 ページ）をご参照ください。
［Enable Notifications］（通知の有効化）を選択または選択解除します。
「（オプション）通知設定の有効化」（63 ページ）をご参照ください。

ノート

74

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
測定の監視

D

A

スタンドアロン監視

B

C

StepOne または StepOnePlus 装置から測定を開始した場合には、タッチスクリーンで測定の（測定方法）画面には、実験の方法が表示され、装進行状況を表示できます。
［Run Method］
置が実行中のサーマルプロファイルのステップがハイライト表示されます。
#

目的

操作

A

融解曲線ステージを測定に追加［Add Melt Curve］（融解曲線の追加）に触れた後、
［OK］に
触れます。

B

測定の残り時間を表示［Display Experiment Time］（実験時間の表示）に触れてから、 に触れて［Run Method］（測定方法）画面に戻ります。

C

測定の停止

［STOP］（停止）に触れた後、次のいずれかに触れます。

• 今のサイクルまたはホールド完了後に、装置による測定を停止するには、［Stop］（停止）に触れます。
• 測定を即座に停止するには、［Abort］（中止）に触れます。
• 変更を加えずに測定を継続するには、 に触れます。
D

実験情報を表示［View Experiment Information］（実験情報の表示）に触れ（測定方法）画面に戻ります。
てから、 に触れて［Run Method］

E

エラーログを表示

ステータスバーに触れて、エラーログを表示します。

D

B

A

C

E

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド75

第 4 章 実験の測定
プレートの取り出しとデータの転送

プレートの取り出しとデータの転送
StepOne または StepOnePlus 装置に［Main Menu］（メインメニュー）画面が表示されているときに、反応プレートを装置から取り出し、実験データをコンピュータに転送して、解析を行います。

反応プレートの取り出し

怪我の危険：装置の操作中、サンプルブロック温度は 100 °C を超える可能性があります。サンプルブロックが室温に戻るまで触れないでください。
参考： StepOne または StepOnePlus 装置が測定を完了すると、システムは、測定の詳細を測
定履歴に保存しますが、当該情報は、次の測定が完了するまでシステムに残ります。

1. ［Run Report］（測定報告）画面が StepOne または StepOnePlus 装置タッチスクリーンに表示されたら、に触れます。

2. 装置のドロアーを開きます。
3. サンプルブロックから反応プレートを取り出します。
4. 装置ドロアーを静かに閉じます。

データ転送方法の選択

StepOne または StepOnePlus システムのレイアウトに従って、実験をコンピュータに転送
し、解析を行います。
レイアウト

説明

参照

コロケーション

黄色いケーブルで、コンピュータと装置が接続さ
れている。

下記
「コロケーションでのデータ転送」

スタンドアロン コンピュータと装置が同じネットワークに接続（ネットワーク） されている。

「遠隔データ転送」（77 ページ）

スタンドアロン（ベーシック）「スタンドアロンでのデータ転送」（78 ページ）

コンピュータと装置が接続されていない。

ノート

76

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
プレートの取り出しとデータの転送

コロケーションでのデータ転送

コンピュータが黄色いケーブルで StepOne または StepOnePlus 装置に直接接続されている場合には、操作は不要です。StepOne ソフトウェアは、測定後、自動的に装置からコンピュー
タに実験データを転送します。
参考： コロケーションレイアウトでは、コンピュータまたは装置のタッチスクリーンから測定が開始できます。しかし、StepOne ソフトウェアが自動的に実験データを転送するのは、（65 ペー
測定をコンピュータから開始した場合のみです（「コロケーション スタートアップ」
ジ）参照）。

遠隔データ転送コンピュータと StepOne または StepOnePlus 装置が同じイーサネットネットワークに接続されている場合には、ネットワーク経由で装置から実験をダウンロードします。

1. StepOne ソフトウェアで、 ［Download Experiment from Instrument］（実験を装置（実験
からダウンロード）をクリックして、［Download Experiment from Instrument］
を装置からダウンロード）ダイアログボックスを開きます。

2. ［Select Instrument］（装置の選択）ドロップダウンメニューで装置を選択します。
3. ［Experiment］（実験）ドロップダウンメニューで実験例ファイルを選択します。
4. ［Download File To］（ファイルのダウンロード先）フィールドで：a. ［Browse］（参照）をクリックします。
b. 以下の場所に進みます。

< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\
ここで、< ドライブ > は、StepOne ソフトウェアがインストールされているコンピュータのハードドライブです。本ソフトウェアのデフォルトのインストールドライブは、D ドライブです。
< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。
c. ［Select］（選択）をクリックします。

5. ［Download Experiment］（実験のダウンロード）をクリックして、ネットワーク経由
で装置から実験ファイルをコンピュータにダウンロードします。

2
4

3

5

6. 確認の表示がでたら、［OK］をクリックしてウィンドウを閉じます。

6

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

77

第 4 章 実験の測定
プレートの取り出しとデータの転送

スタンドアロンでのデータ転送

コンピュータが StepOne または StepOnePlus 装置に接続されていない場合には、USB ドラ
イブを用いて、実験を装置からコンピュータに転送します。

1. USB ドライブが装置に接続されていない場合には、USB ドライブを USB ポートに接続します。

o2. StepOne または StepOnePlus 装置のタッチスクリーンに触れて、休止を解除します。
参考： タッチスクリーンに［Main Menu］（メインメニュー）画面が表示されない場合には、に触れます。

3. タッチスクリーンに USB のマークが表示されるまで待ちます。
4. ［Main Menu］（メインメニュー）で［Collect Results］（結果の収集）に触れ、データを USB ドライブに保存します。
参考： 装置が USB ドライブを検出できない場合には、一度 USB ドライブを取り外し、やり直します。それでも USB ドライブが検出されない場合には、USB ドライブを交換してください。

5. データ転送の成功が表示されたら、［OK］に触れます。

6. USB ドライブを装置から取り外し、コンピュータの USB ポートに接続します。
7. コンピュータ画面上で、Windows Explorer を用いて USB ドライブを開きます。

ノート

78

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 4 章 実験の測定
プレートの取り出しとデータの転送

8. 実験例を次の場所にコピーします。
< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\
ここで、• < ドライブ > は、StepOne ソフトウェアがインストールされているコンピュータのハードドライブです。本ソフトウェアのデフォルトのインストールドライブは、D ドライブです。
• < ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

79

第 4 章 実験の測定
プレートの取り出しとデータの転送

ノート

80

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第5章

実験の解析
本章の内容：■ 本章の概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
■ セクション 5.1 結果の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
■ セクション 5.2 トラブルシューティング（必要に応じて）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
ルバーのをクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
Software ヘルプ）を選択します。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

81

第 5 章 実験の解析
本章の概要

本章の概要
StepOne™ ソフトウェアは、標準曲線定量法を用いてデータの解析を行います。本書のセク
ション 1 では、いくつかの解析画面を用いて解析データを確認する方法およびデータのパブ
リッシュ方法について、説明します。問題のある結果が得られた場合には、本章のセクショ
ン 2 で説明するトラブルシューティング手順の実行方法を参照してください。

実験例ワークフロー

本書に記載されている実験例を解析するワークフローについて、以下に示します。
実験開始






実験の設計（第 2 章）
反応の準備（第 3 章）
実験の測定（第 4 章）
実験の解析（第 5 章）
セクション 1、結果の確認：

1. 解析します。
2. 標準曲線を表示します。
3. 増幅プロットを表示します。
4. 結果をテーブル表示します。
5. データをパブリッシュします。
セクション 2、トラブルシューティング（必要に応じて）：

1. 解析設定を表示、ベースライン／閾値を調整します。
2. QC サマリーを表示します。
3. ウェルを選択削除します。
4. マルチコンポーネントプロットを表示します。
5. 生データプロットを表示します。



実験終了

ノート

82

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
セクション 5.1 結果の確認

セクション 5.1 結果の確認
本セクションの内容：■ 実験の解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
■ 標準曲線の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
■ 増幅プロットの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
■ ウェルテーブルの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
■ データのパブリッシュ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

83

第 5 章 実験の解析
実験の解析

実験の解析
StepOne ソフトウェアでは、実験を解析し、解析画面に結果を表示します（［Amplification
Plot］（増幅プロット）画面、［QC Summary］（QC サマリー）画面等）。
実験例について標準曲線実験例では、StepOne ソフトウェアとともにインストールされるデータファイルを使用します。データファイルは、第 2 章で提示した設計パラメータを使って作成されており、
StepOne™ 装置で測定され、解析されています。実験例のデータファイルは、コンピュータ
内の次の場所に保存されています。

< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\examples\Standard
Curve Example.eds
ここで、• < ドライブ > は、StepOne ソフトウェアがインストールされているコンピュータのハードドライブです。本ソフトウェアのデフォルトのインストールドライブは、D ドライブです。

• < ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。
実験例の解析

1.

StepOne ソフトウェア（ショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（ス（すべてのプログラム）
［Applied Biosystems］［StepOneタート）［All Programs］
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. ［Home］（ホーム）画面で、［Open］（開く）をクリックします。
3. ［Open］（開く）ダイアログボックスで、［examples］（実験例）フォルダを選択します。
< ドライブ >:\Applied Biosystems\< ソフトウェア名 >\experiments\examples

4. Standard Curve Example（標準曲線例）をダブルクリックして、実験例データファイ
ルを開きます。
参考： 実験例フォルダには、データファイルがいくつか入っているので、「Standard
Curve Example」（標準曲線例）を選択したことを確認します。その他のデータファイ
ルの詳細については、「実験例フォルダ中のデータファイル」（12 ページ）をご参照く
ださい。

ノート

84

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
実験の解析

2

3

4

5. ［Analyze］（解析）をクリックします。ソフトウェアは、デフォルトの解析設定を使ってデータを解析します。

5

6. 解析画面のナビゲーション方法については、下記の「ソフトウェアの エレメント」および「ナビゲーションの ヒント」
（88 ページ）を参照します。
ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合：• 測定終了後すぐに、StepOne ソフトウェアは、デフォルト解析設定により自動的にデー
タ解析を行い、コンピュータ上に［Amplification Plot］（増幅プロット）画面を表示します。

• データの再解析を行うには、プレートレイアウトですべてのウェルを選び、［Analyze］（解析）をクリックします。

ソフトウェアのエレメント

StepOne ソフトウェアの解析画面のエレメントについて、以下に示します。

1. メニューバー － ソフトウェアで利用できるメニューが表示されます。
• File（ファイル）• Edit（編集）• Instrument（装置）• Analysis（解析）• Tools（ツール）• Help（ヘルプ）ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド85

第 5 章 実験の解析
実験の解析

2. ツールバー － ソフトウェアで利用できるツールが表示されます。
• New Experiment（新しい実験）• Open（開く）• Save（保存する）• Close（閉じる）• Send Experiment to Instrument（実験を装置に送信）• Download Experiment from Instrument（実験を装置からダウンロード）• Export（エクスポート）• Print Report（レポートの印刷）
3. 実験ヘッダー － 開いている実験の実験名、実験タイプ、試薬が表示されます。
4. 実験メニュー欄 － 以下のソフトウェア画面へのリンクがあります。
• ［Setup］（セットアップ）画面• ［Run］（測定）画面• ［Analysis］（解析）画面• Amplification Plot（増幅プロット）• Standard Curve（標準曲線）• Multicomponent Plot（マルチコンポーネントプロット）• Raw Data Plot（生データプロット）• QC Summary（QC サマリー）• Multiple Plots View（複数プロット表示）
5. プロット欄 － 開いている実験に対して選択した解析画面を表示します。
6. 表示タブ － 開いている実験のプレートレイアウトや［Well Table］（ウェルテーブル）を表示します。

7. 実験タブ － 開いている各実験のタブが表示されます。

ノート

86

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
実験の解析

1
2
3
6

4

7
5

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

87

第 5 章 実験の解析
実験の解析

ナビゲーションのヒント

ウェルの選択方法
解析画面で特定のウェルを表示するには、以下の方法に従って、［View Plate Layout］（プ
レートレイアウトの表示）タブで、表示したいウェルを選択します。

1. 特定のタイプのウェルを選択するには、［Select Wells With］（ウェルの選択条件）ド（サンプル）、［Target］（ターゲット）、
ロップダウンメニューを使用します。
［Sample］［Task］（タスク）のいずれかを選択してから、サンプル、ターゲット、タスク名を選択します。

2. 単一のウェルを選択するには、プレートレイアウトで該当するウェルをクリックします。

3. 複数のウェルを選択するには、プレートレイアウトをクリックし、該当するウェル上でマウスをドラッグしてから、Ctrl を押しながらクリックするか、Shift を押しながらクリックします。

4. 48 ウェルをすべて選択するには、プレートレイアウトの左上隅をクリックします。
1

4

ノート

88

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第 5 章 実験の解析
実験の解析

複数プロットの表示方法
複数プロット画面を使うと、最高 4 種類のプロットを同時に表示できます。
［Multiple Plots］（複数プロット）画面内を移動するには：

1. Experiment Menu（実験メニュー）欄から、［Analysis］（解析）
View］（複数プロット表示）を選択します。

［Multiple Plots

2. プロットを 4 つ表示するには、 ［Show plots in a 2 ✕ 2 matrix］（2 ✕ 2 マトリックス
でプロット表示）をクリックします。

3. プロットを横に表示するには、 ［Show plots in two rows］（2 つを横に並べてプロット表示）をクリックします。

4. プロットを縦に表示するには、 ［Show plots in two columns］（2 つを縦に並べてプ
ロット表示）をクリックします。

5. 特定のプロットを表示するには、各プロット表示の上にあるドロップダウンメニューから、プロットを選択します。
5

2 3
4

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

89

第 5 章 実験の解析
標準曲線の表示標準曲線の表示［Standard Curve］（標準曲線）画面には、スタンダードとして指定されたサンプルの標準曲線が表示されます。StepOne ソフトウェアは、この標準曲線から未知のターゲットの量を計算します。

実験例について標準曲線実験例で、次の回帰係数値について［Standard Curve］（標準曲線）画面で確認します。

• 傾き／増幅効率• R2 値（相関係数）• CT 値
標準曲線の表示

1. Experiment Menu（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）

［Standard Curve］（標準曲線）を選択します。
参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブでプレートレイアウトの左上隅をクリックして、［Standard Curve］（標準曲線）画面に 48 ウェルをすべて表示します。
3. ［Target］（ターゲット）ドロップダウンメニューで、［All］（すべて）を選択します。
4. ［Plot Color］（プロットカラー）ドロップダウンメニューで、［Default］（デフォルト）を選択します。

5.

［Show a legend for the plot］（プロットの凡例を表示）をクリックします（デフォルト）。
参考： これはトグルボタンになっていて、凡例が表示されているとき、ボタンは、［Hidethe plot legend］（プロットの凡例を非表示）に変わります。

6. 標準曲線の下に表示される値を確認します。実験例では、ターゲット（RNase P）の値
は、許容範囲内に収まっています。

– 傾きは –3.477。
– R2 値は 0.999。
– 増幅効率（EFF%）は 93.912%。

7. すべてのサンプルが標準曲線内にあることを確認します。実験例では、すべてのサンプ
ル（青い点）が、標準曲線（赤い点）内にあります。

ノート

90

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
標準曲線の表示

3

4

5

7

6

8. CT 値を確認します。
a. ［View Well Table］（ウェルテーブルの表示）タブをクリックします。
b. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューで、［Replicate］（反復）を選択します。
c. CT 欄の値を確認します。実験例では、CT 値は、期待範囲（>8 かつ <35）内にあり
ます。
8a

8b
8c

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

91

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

解析ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合は、次のことに注意してください。

• 傾き／増幅効率値 － 増幅効率は、標準曲線内の回帰直線の傾きを使って計算します。傾
きが –3.3 に近いとき、最適な 100% PCR 増幅効率を示します。増幅効率に影響する要因には、次のものがあります。

– スタンダード量の範囲 － より精密•正確な効率測定を行うには、広範囲のスタンダー
ド量、すなわち、5 ～ 6 log（105 ～ 106 倍）をご使用ください。
– スタンダードの反復数 － より正確な効率測定を行うには、反復を含めることで不正確な分注の影響を低減できます。

– PCR 阻害剤 － 反応中の PCR 阻害剤により、増幅効率が低下する可能性があります。
• R2 値（相関係数）－ R2 値は、回帰直線と、スタンダード反応の各 CT データポイントとの適合度を示します。値が 1.00 なら、回帰直線とデータポイントとの完全フィットを示します。R2 値は >0.99 が理想的です。
• CT 値 － threshold cycle（CT）は、蛍光レベルが閾値と一致する PCR サイクル数です。
CT 値は、>8 かつ <35 が理想的です。CT 値 <8 は、反応中のテンプレートが多すぎることを示します。CT 値 >35 は、反応中のターゲット量が低すぎることを意味します。CT
値 >35 の場合には、標準偏差が大きくなることが想定されます。
実験が上記のガイドラインを満たさない場合は、以下に従ってトラブルシューティングを実施してください。

• ウェルの選択削除（「解析からウェルを選択削除」（108 ページ）参照）。
または、• 実験の再測定。
詳細について詳細については：• ［Standards Curve］（標準曲線）画面については、 をクリックするか、F1 を押して、
StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
• 増幅効率については、『Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays
Application Note』をご参照ください。

増幅プロットの表示［Amplification Plot］（増幅プロット）画面には、選択したウェル内のすべてのサンプルの増幅が表示されます。3 種類のプロットを表示できます。

• ∆Rn vs Cycle（∆Rn 対サイクル）－ ∆Rn は、PCR 増幅の各サイクルでレポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。このプロットには、∆Rn がサイクル数の関数として表示されます。このプロットを使うと、不規則な増幅を特定、調査できるほか、測定の閾値とベースラインの値を表示できます。

• Rn vs Cycle（Rn 対サイクル）－ Rn は、パッシブリファレンスの蛍光信号にノーマライズした、レポーター色素からの蛍光信号。このプロットには、Rn がサイクル数の関数として表示されます。このプロットを使うと、不規則な増幅を特定、調査できます。

ノート

92

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示• CT vs Well（CT 対ウェル）－ CT は、蛍光レベルが増幅プロットの閾値と一致する PCR
サイクル数です。このプロットには、CT がウェル位置の関数として表示されます。このプロットを使うと、異常な増幅（域外値）を特定できます。
各プロットは、リニアまたは log10 のグラフタイプで表示できます。

実験例について標準曲線実験例で、次の項目について［Amplification Plot］（増幅プロット）画面でターゲッ
トを確認します。

• ベースラインと閾値が正しいこと• 域外値

Amplification Plot
（増幅プロット）の表示

1. Experiment Menu（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）

［Amplification Plot］（増幅プロット）を選択します。
参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Amplification Plot］（増幅プロット）画面に、RNase P ウェルを表示します。
a. ［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブをクリックします。
b. ［Select Wells With］（ウェルの選択条件）ドロップダウンメニューで、［Target］（ターゲット）、［RNase P］を選択します。
2a2b3. ［Amplification Plot］（増幅プロット）画面で：a. ［Plot Type］（プロットタイプ）ドロップダウンメニューから、［∆Rn vs Cycle］（∆Rn 対サイクル）を選択します（デフォルト）。
b. ［Plot Color］（プロットカラー）ドロップダウンメニューで、［Well］（ウェル）を選択します（デフォルト）。

ノート

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93

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

c.

［Show a legend for the plot］（プロットの凡例を表示）をクリックします（デフォルト）。
参考： これはトグルボタンになっていて、凡例が表示されているとき、ボタンは、［Hide the plot legend］（プロットの凡例を非表示）に変わります。

4. ベースライン値を表示します。
a. ［Graph Type］（グラフタイプ）ドロップダウンメニューで、［Linear］（リニア）を選択します。
b. ［Baseline］（ベースライン）チェックボックスを選択して、開始サイクルと終了サ
イクルを表示します。
c. ベースラインが正しく設定されていることを確認します。すなわち、終了サイクル
は、蛍光信号の検出されるサイクル数よりも数サイクル前に設定されていなければなりません。実験例では、ベースラインは、正しく設定されています。
3a

4a

3b

3c

4b

5. 閾値を表示します。
a. ［Graph Type］（グラフタイプ）ドロップダウンメニューで、［Log］（ログ）を選択します。
b. ［Target］（ターゲット）ドロップダウンメニューで、［RNase P］を選択します。
c. ［Threshold］（閾値）チェックボックスを選択して、閾値を表示します。
d. 閾値が正しく設定されていることを確認します。実験例では、閾値は、指数増幅領域にあります。

ノート

94

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

5a

5b
5c

6. 域外値を特定します。
a. ［Plot Type］（プロットタイプ）ドロップダウンメニューで、［CT vs Well］（CT 対ウェル）を選択します。
b. 増幅プロットで域外値を探します。実験例では、RNase P の域外値はありません。
6a

ノート

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95

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

解析ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合は、次のことに注意してください。

• 域外値• 典型的な増幅プロット － StepOne ソフトウェアは、データが典型的な増幅プロットを示していると仮定して、ベースラインと閾値を自動的に計算します。典型的な増幅プ
ロットには、四つの特異的なセクションがあります。

a. プラトー領域
b. 直線領域c. 指数関数的（幾何学的領域）
d. ベースライン

a
b
閾値

c

∆Rn

サイクル

d

重要！ 実験エラー（汚染や分注エラーなど）により、非典型的な増幅曲線が作成され、StepOne ソフトウェアが計算するベースラインと閾値に誤りが発生する可能性があります。したがって、Applied Biosystems は、解析が完了したら、［Amplification Plot］（増幅プロット）画面を調べ、各ウェルに割り当てられたベースラインと閾値を確認す
るようお勧めします。

• 正しいベースラインおよび閾値 閾値の例については 97 ページを、ベースラインの例については 98 ページをご覧ください。

ノート

96

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

正しく設定された Threshold（閾値）Threshold（閾値）は、増幅曲線の指数関数的増幅領域内に設定されています。

Threshold が最適値を上回ったり下回って設定されると、反復グループの標準偏差が増加します。

低すぎる Threshold

Threshold は、増幅曲線の指数関数的増幅領域より低い領域に設定されています。この場合、Threshold が正しく設定された場合のプロットよりも、はるかに大きい標準偏差が発生します。Threshold バーを曲線の指数関数的増幅領域内に引き上げてください。

高すぎる Threshold

Threshold は、増幅曲線の指数関数的増幅領域より高い領域に設定されています。この場合、Threshold が正しく設定された場合のプロットよりも、はるかに大きい標準偏差が発生します。Threshold バーを曲線の指数関数的増幅領域内に下げてください。

ノート

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97

第 5 章 実験の解析
増幅プロットの表示

正しく設定されたベースライン
増幅曲線が最大のベースラインを越えてから始まっています。

低すぎるベースライン
最大のベースラインを右に大幅に越えてから増幅曲線が始まっているので、「End Cycle」（終了サイクル）値を増やす必要があります。

高すぎるベースライン
増幅曲線がベースラインの最大以前に始まっているので、「End Cycle」（終了サイクル）値を減らす必要があります。

実験が上記のガイドラインを満たさない場合は、以下に従ってトラブルシューティングを実施してください。

• ウェルの選択削除（「解析からウェルを選択削除」（108 ページ）参照）。
または• ベースラインと閾値の手動調整（「［Analysis Settings］（解析設定）の表示」（104 ページ）参照）。

詳細について ［Amplification Plot］（増幅プロット）画面の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

98

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第 5 章 実験の解析
ウェルテーブルの表示

ウェルテーブルの表示
ウェルテーブルには、反応プレート内の各ウェルに関して次のようなデータが表示されます。

• サンプル名、ターゲット名、タスク、色素• Threshold cycle（CT）計算値、ノーマライズ済み蛍光（Rn）、量• コメント• フラッグ
実験例について標準曲線実験例では、［Well Table］（ウェルテーブル）で次の項目を確認します。

• 量• フラッグ• CT 値（CT 標準偏差を含む）
ウェルテーブルの表示

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）を選択してから、［View
Well Table］（ウェルテーブルの表示）タブを選択します。
参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューを使って、特定のカテゴリでウェルをグループ分けします。実験例では、Replicate（反復）、Flag（フラッグ）、CT 値でグループ分けします。
参考： カテゴリは、一度に 1 つしか選択できません。

a. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューで、［Replicate］（反復）を選択します。ソフトウェアが、反復ウェルをネガティブコントロール、スタンダー
ド、サンプルにグループ分けします。実験例で、各反復グループ内の Quantity（量）が同じであることに注意してください。
参考： 実験例では、Quantity（量）、Quantity Mean（量平均）、Quantity SD（量標準偏差）欄が、デフォルトの位置から［Well Table］（ウェルテーブル）の始めに移動されています。欄を移動するには、欄見出しをクリックし、ドラッグしてく
ださい。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

99

第 5 章 実験の解析
ウェルテーブルの表示

2ab. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューで、［Flag］（フラッグ）を選択します。ソフトウェアが、フラッグの付いたウェルと付いていないウェルをグ
ループ分けします。実験例では、フラッグの付いたウェルはありません。

2b

ノート

100

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
ウェルテーブルの表示

c. Group By（グループ別）ドロップダウンメニューで、［CT］を選択します。ソフ
トウェアが、CT 値の Low（低）、Medium（中）、High（高）、Undetermined（未決定）にウェルをグループ分けします。実験例では、CT 値は、期待範囲（>8 と<35）内にあります。

2c

解析ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合は、次の項目別にウェルをグループ分けします。

• Replicate（反復）－ ソフトウェアが、反復によってウェルを、ネガティブコントロー
ル、スタンダード、サンプルにグループ分けします。
［Quantity］（量）欄で、各反復グ
ループ内の量が同じであることを確認してください。これは高い精度を意味します。

• Flag（フラッグ）－ ソフトウェアが、フラッグの付いたウェルと付いていないウェルをグループ分けします。フラッグは、ソフトウェアが、フラッグの付いているウェルにエラーを検出したことを意味します。StepOne ソフトウェアのフラッグについては、「［QC
Summary］（QC サマリー）の表示」（106 ページ）をご参照ください。

• CT － threshold cycle（CT）は、蛍光レベルが閾値と一致する PCR サイクル数です。
CT 値は、>8 かつ <35 が理想的です。CT 値 <8 は、反応中のテンプレートが多すぎることを示します。CT 値 >35 は、反応中のターゲット量が低すぎることを意味します。CT
値 >35 の場合には、標準偏差が大きくなることが想定されます。
詳細についてWell Table（ウェルテーブル）の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、
StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

101

第 5 章 実験の解析
データのパブリッシュ

データのパブリッシュ
実験データは、いくつかの方法でパブリッシュできます。

• プロットをイメージファイルとして保存する。
• プロットを印刷する。
• プレートレイアウトを印刷する。
• スライドを作成する。
• レポートを印刷する。
• データをエクスポートする。
これらの手順の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェ
アのヘルプにアクセスしてください。

ノート

102

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析
セクション 5.2 トラブルシューティング（必要に応じて）セクション 5.2 トラブルシューティング（必要に応じて）
本セクションの内容：■ ［Analysis Settings］（解析設定）の表示. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104■ ［QC Summary］（QC サマリー）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106■ 解析からウェルを選択削除 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108■ ［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示 . . . . . . . . . . . . 109■ ［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

ノート

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103

第 5 章 実験の解析［Analysis Settings］（解析設定）の表示［Analysis Settings］（解析設定）の表示［Analysis Settings］（解析設定）ダイアログボックスには、threshold cycle（CT）、フラッグ、
詳細オプションなどの解析設定が表示されます。StepOne ソフトウェアのデフォルトの解析（解析設定）ダイアログボックスで設設定が、実験に適さない場合は、［Analysis Settings］
定を変更してから、実験を再解析できます。

実験例について標準曲線実験例では、デフォルトの解析設定を変更せずに使用します。

［Analysis Settings］（解析設定）の表示

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）を選択します。
2. ［Analysis Settings］（解析設定）をクリックして、［Analysis Settings］（解析設定）ダ
イアログボックスを開きます。

3. 実験例では、各タブのデフォルトの解析設定を使用します。
• CT Settings（CT 設定）• Flag Settings（フラッグ設定）• Advanced Settings（詳細設定）

ノート

104

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析［Analysis Settings］（解析設定）の表示

解析ガイドライン

実験の最適設定を特定できていない場合は、StepOne ソフトウェアのデフォルトの解析設定を使用してください。デフォルト設定が実験に適していない場合は、次の設定を変更できます。

• CT Settings（CT 設定）－ このタブを使うと、閾値とベースラインを手動で設定できます。閾値とベースラインを手動で設定する場合は、Applied Biosystems は次のことをお勧めします。
設定推奨閾値

閾値が次を満たすように値を入力してください。

• バックグラウンドより上。
• 増幅曲線のプラトー領域と直線領域より下。
• 増幅曲線の指数関数的増幅領域内。
ベースライン（開始サイクル）と［End Cycle］（終了サイクル）は、蛍［Start Cycle］
光信号が検知される前にベースラインが終了するよう選択してください。

• Flag Settings（フラッグ設定）－ このタブを使うと、– 感度を調整して、フラッグを付けるウェルを増やしたり、減らしたりできます。
– StepOne ソフトウェアが適用するフラッグを変更できます。
• Advanced Settings（詳細設定）－ このタブを使うと、ベースライン設定をウェルごとに変更できます。

詳細について

解析設定の詳細については、［Analysis Settings］（解析設定）ダイアログボックスが開いているときに、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

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105

第 5 章 実験の解析［QC Summary］（QC サマリー）の表示［QC Summary］（QC サマリー）の表示［QC Summary］（QC サマリー）画面には、開いている実験のフラッグの頻度や場所などを含む、StepOne ソフトウェアのフラッグのリストが表示されます。

実験例について標準 曲線 実験 例で、実験 デー タに よっ て付 けら れた すべ ての フラ ッグ につ いて、［QC
Summary］（QC サマリー）画面で確認します。実験例では、フラッグは付いていません。

［QC Summary］（QC サマリー）の表示

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）
（QC サマリー）を選択します。

［QC Summary］

参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Flags Summary］（フラッグサマリー）を確認します。実験例では、フラッグの付いた
ウェルはありません。

3. ［Flag Details］（フラッグの詳細）テーブルで、［Frequency］（頻度）欄と［Wells］（ウェル）欄を確認して、実験に付けられたフラッグを特定します。実験例では、［Frequency］（頻度）欄には、すべてのフラッグに 0 が表示されています。
参考：［Frequency］（頻度）欄に表示された 0 は、この実験にはフラッグが付いていな
いことを示します。

4. （オプション）フラッグの各行をクリックすると、そのフラッグに関する詳細情報が表示されます。

2
3
4

ノート

106

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析［QC Summary］（QC サマリー）の表示考えられるフラッグ

標準曲線実験では、実験データに応じて次に挙げるフラッグが付けられる可能性があります。
フラッグが実験で現れない場合、頻度は 0 です。頻度が >0 の場合、実験のどこかにフラッ（ウェル）欄にあります。
グが表示されています。ウェルの位置は、［Wells］
フラッグ

説明

AMPNC

ネガティブコントロールで増幅

BADROX

異常なパッシブリファレンス信号

BLFAIL

ベースラインアルゴリズムに失敗

CTFAILCT 値アルゴリズムに失敗

EXPFAIL

指数増幅アルゴリズムに失敗

HIGHSD

反復グループで高標準偏差

MTP

複数の Tm ピーク
参考： このフラッグは、実験に融解曲線が含まれる場
合にのみ表示されます。

解析ガイドライン

NOAMP

増幅なし

NOISE

プレート内の他よりノイズが高い

NOSIGNAL

ウェルに信号なし

OFFSCALE

蛍光がオフスケールOUTLIERRG

反復グループに域外値

SPIKE

ノイズスパイク

THOLDFAIL

閾値アルゴリズムに失敗

標準曲線実験を解析する場合：（フラッグの詳細）テーブルで、頻度が >0 の各フラッグをクリックする• ［Flag Details］と、そのフラッグに関する詳細が表示されます。必要に応じて、トラブルシューティン
グリンクをクリックして、フラッグの修正に関する情報を表示します。

• フラッグの設定は変更できます。
– 感度を調整して、フラッグを付けるウェルを増やしたり、減らしたりできます。
– StepOne ソフトウェアが適用するフラッグを変更できます。
詳細について ［QC Summary］（QC サマリー）画面またはフラッグ設定の詳細については、 をクリック
するか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

107

第 5 章 実験の解析
解析からウェルを選択削除

解析からウェルを選択削除
実験中のエラーにより、充分に増幅されなかったり、または全く増幅されないウェルが発生する可能性があります。通常これらのウェルからは、対応する反復ウェルの平均値から大幅に逸脱する CT 値が生成されます。これらの域外値を計算に含めると、測定結果に誤りが生じる可能性があるため、精度を高めるために解析からこれらの域外値を選択削除してください。

実験例についてウェルの選択削除

標準曲線実験例では、域外値は存在しないため、解析からウェルを削除する必要はありません。

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）
Plot］（増幅プロット）を選択します。

［Amplification

参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Amplification Plot］（増幅プロット）画面で、［Plot Type］（プロットタイプ）ドロッ
プダウンメニューから［CT vs Well］（CT 対ウェル）を選択します。
3. ［View Well Table］（ウェルテーブルの表示）タブを選択します。
4. ［Well Table］（ウェルテーブル）で：a. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューで、［Replicate］（反復）を選択します。
b. 反復グループに域外値がないか確認します（フラッグが付いているはずです）。実験例では、域外値はありません。
3

4a

ノート

108

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示

解析ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合は、域外値がないか反復グループを注意深く表示します。必要に応じて、ウェルテーブルを使って域外値を手動で削除します。

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）
Plot］（増幅プロット）を選択します。

［Amplification

参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Amplification Plot］（増幅プロット）画面で、［Plot Type］（プロットタイプ）ドロッ
プダウンメニューから［CT vs Well］（CT 対ウェル）を選択します。
3. ［View Well Table］（ウェルテーブルの表示）タブを選択します。
4. ［Well Table］（ウェルテーブル）で：a. ［Group By］（グループ別）ドロップダウンメニューで、［Replicate］（反復）を選択します。
b. 反復グループに域外値がないか確認します（フラッグが付いているはずです）。
c. 異常なウェルの横にある［Omit］（選択削除）チェックボックスを選択します。

5. ［Analyze］（解析）をクリックして、解析から異常なウェルを削除した状態で実験データを再解析します。

詳細について解析からのウェルの選択削除の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、
StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。ヘルプ内で、ウェルの選択削除に関するトピックを検索してください。

1. ［Search］（検索）タブをクリックします。
2. ［omit well］（ウェルの選択削除）を入力します。
3. ［List Topics］（トピックをリスト）をクリックします。
4. 確認したいトピックをダブルクリックします。

［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面には、PCR 測定中を通して、選択したウェル内の各色素の全スペクトル構成が表示されます。

実験例について標準曲線実験例では、［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面で次の項目を確認します。

• ROX™ 色素（パッシブリファレンス）• FAM™ 色素（レポーター）• スパイク、ディップ、突然の変化• ネガティブコントロールウェルでの増幅
ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

109

第 5 章 実験の解析［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示

Multicomponent Plot
（マルチコンポーネント
プロット）の表示

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）
Plot］（マルチコンポーネントプロット）を選択します。

［Multicomponent

参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面で未知およびスタンダー
ドウェルを一度に 1 つだけ表示します。
a. ［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブをクリックします。
b. プレートレイアウトでウェルを選択すると、そのウェルが［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面に表示されます。
参考： 複数のウェルを選択すると、［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネン
トプロット）画面に、選択したすべてのウェルのデータが同時に表示されます。

3. ［Plot Color］（プロットカラー）ドロップダウンメニューで、［Dye］（色素）を選択します。
4.

［Show a legend for the plot］（プロットの凡例を表示）をクリックします（デフォルト）。
参考： これはトグルボタンになっていて、凡例が表示されているとき、ボタンは、［Hidethe plot legend］（プロットの凡例を非表示）に変わります。

5. ROX 色素信号を確認します。実験例は、ROX 色素の信号が PCR プロセスの間中一定値を示すという典型的なデータです。

6. FAM 色素信号を確認します。実験例は、FAM 色素信号が PCR プロセスの間増加するという、正常な増幅を示しています。
3

5
6

4

2a

2b

ノート

110

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）の表示

7. ネガティブコントロールウェルを一度に 1 つずつ選択して、増幅を確認します。実験例
では、ネガティブコントロールウェルに増幅はありません。

7

解析ガイドライン

標準曲線実験を解析する場合は、次のことに注意してください。

• パッシブリファレンス － パッシブリファレンス色素の蛍光レベルは、PCR プロセス中
比較的一定です。

• レポーター色素 － レポーター色素の蛍光レベルは、ベースラインに対応する平らな領域に続いて、増幅が進むにつれて蛍光レベルが急激に上昇します。

• 信号に異常がないこと － 蛍光信号に、スパイク、ディップ、突然の変化はないはずです。
• ネガティブコントロールウェル － ネガティブコントロールウェルに増幅はないはずです。

詳細について ［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

111

第 5 章 実験の解析［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示［Raw Data Plot］（生データプロット）画面には、リアルタイム PCR の各サイクル中、選択したウェルの各光学フィルタの生蛍光信号（ノーマライズされていない）が表示されます。

実験例について標準曲線実験例では、［Raw Data Plot］（生データプロット）画面で、適切なフィルタからの信号の安定した増加（突然の変化やディップなし）を確認します。

［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示

1. ［Experiment Menu］（実験メニュー）欄で、［Analysis］（解析）

［Raw Data Plot］（生データプロット）を選択します。
参考： データが表示されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。

2. ［View Plate Layout］（プレートレイアウトの表示）タブでプレートレイアウトの左上隅（生データプロット）画面に 48 ウェルをすべて表示をクリックして、［Raw Data Plot］
します。

3.

［Show a legend for the plot］（プロットの凡例を表示）をクリックします（デフォルト）。
参考： これはトグルボタンになっていて、凡例が表示されているとき、ボタンは、［Hidethe plot legend］（プロットの凡例を非表示）に変わります。
参考： 凡例には、反応プレートの各行のカラーコードが表示されます。下に示す例では、
A 行が赤、B 行が黄緑、C 行が緑のようになっています。

4. ［Show Cycle］（サイクル表示）ポインターをクリックし、サイクル 1 ～サイクル 40 まで
ドラッグします。実験例では、FAM™ 色素フィルタに対応するフィルタ 1 からの信号に安定した増加が認められます。

ノート

112

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

第 5 章 実験の解析［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示

34

フィルタは：
StepOne システム
フィルタ

1

色素

FAM™ 色素StepOnePlus システム
フィルタ

1

SYBR® Green 色素
2

JOE™ 色素

ROX™ 色素FAM™ 色素SYBR® Green 色素

2

VIC® 色素3

色素JOE™ 色素
VIC® 色素3

TAMRA™ 色素
NED™ 色素4

解析ガイドライン

ROX™ 色素

標準曲線実験を解析する場合は、各フィルタについて次のことに注意してください。

• 特徴的な信号増加• 突然の変化やディップがないこと
詳細について ［Raw Data Plot］（生データプロット）画面の詳細については、 をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

113

第 5 章 実験の解析［Raw Data Plot］（生データプロット）の表示

ノート

114

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

付録 A

代替実験ワークフロー
本付録の内容：■ ［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116■ ［QuickStart］（クイックスタート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117■ ［Template］（テンプレート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119■ ［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . 121
参考： 本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、ツー
ルバーのをクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne
Software ヘルプ）を選択します。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

115

付録 A 代替実験ワークフロー［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフロー（高度なセットアップ）を使って実験を作成す
StepOne™ ソフトウェアの［Advanced Setup］
ると、各自の設計に応じて実験をセットアップできます。

1.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（スタート）［All Programs］（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］［StepOne
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. ［Home］（ホーム）画面で、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）をクリックします。
参考：［Advanced Setup］（高度なセットアップ）のアイコンが見つからない場合には、（設計ウィザード）アイコンの下にある矢印をクリックして、［Set Up］［Design Wizard］（セットアップ）メニューを全画面します。

3. セットアップ画面の入力を完了して、新しい実験をセットアップします。
a.
b.

［Experiment Properties］（実験プロパティ）（デフォルト）をクリックしてから、実験名を入力した後、実験例のプロパティを選択します。
［Plate Setup］（プレートセットアップ）をクリックします。
実験タイプ

操作

ジェノタイピング実験

SNP アッセイを定義した後、反応プレートの各ウェルに割り当てます。

その他の実験

ターゲットを定義した後、反応プレートの各ウェルに割り当
てます。

c.

［Run Method］（測定方法）をクリックしてから、反応容量とサーマルプロ
ファイルを確認し、必要に応じて変更します。

d.

［Reaction Setup］（反応セットアップ）をクリックし、PCR 反応のコンポー
ネントと容量計算値を確認し、必要に応じて変更します。

e. （オプション） ［Materials List］（物品リスト）をクリックして物品リストを確認し、反応プレートの準備に必要な物品を注文します。

4. PCR 反応を調製します。
実験タイプ

相対標準曲線法
標準曲線法

操作

a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. スタンダード希釈シリーズを調製します。
d. 反応ミックスを調製します。
e. 反応プレートを調製します。

ノート

116

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

付録 A 代替実験ワークフロー［QuickStart］（クイックスタート）ワークフロー

実験タイプ

比較 CT 法ジェノタイピング実験
有無実験

操作

a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. 反応ミックスを調製します。
d. 反応プレートを調製します。

5. 実験を測定します。
a. 反応プレートを装置にロードします。
b. 測定を開始します。
c. （オプション）測定を監視します。
d. 装置から反応プレートを取り出します。

6. データを解析します。
a. StepOne ソフトウェアで実験を開きます。
b. ［Experiment Menu］（実験メニュー）で、［Analysis］（解析）を選択します。
c. データが解析されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。
d. ナビゲーション欄で解析画面を選択し、データを表示します（例えば、［QC Summary］（QC サマリー）を選択して、データクオリティーに関する要約を表示します）。

［QuickStart］（クイックスタート）ワークフロー［QuickStart］（クイックスタート）を使って実験を作成すると、反応プレートセットアップ
情報なしに装置による反応の測定が可能になります。

1. PCR 反応を調製します。
実験タイプ

相対標準曲線法
標準曲線法

比較 CT 法ジェノタイピング実験
有無実験

操作

a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. スタンダード希釈シリーズを調製します。
d. 反応ミックスを調製します。
e. 反応プレートを調製します。
a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. 反応ミックスを調製します。
d. 反応プレートを調製します。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド117

付録 A 代替実験ワークフロー［QuickStart］（クイックスタート）ワークフロー

2. 実験をクイックスタートします。
a.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］（スタート）［All Programs］
［StepOne Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

b. ［Home］（ホーム）画面で、 ［QuickStart］（クイックスタート）をクリックします。
c. ［Experiment Properties］（実験プロパティ）タブ（デフォルト）をクリックしてから、実験名を入力した後、実験プロパティを選択します。
d. ［Run Method］（測定方法）タブをクリックしてから、反応容量とサーマルプロ
ファイルを確認し、必要に応じて変更します。

3. 実験を測定します。
a. 反応プレートを装置にロードします。
b. 測定を開始します。
c. （オプション）測定を監視します。
d. 装置から反応プレートを取り出します。

4. StepOne ソフトウェアでプレートセットアップを入力します。
実験タイプ

操作

ジェノタイピング実験（SNP アッセイとa. ［Define SNP Assays and Samples］
サンプルの定義）タブを選択し、入力します。
b.［Assign SNP Assays and Samples］（SNP アッセイとサンプルの割り当て）タブを選択し、入力します。

その他の実験

a. ［Define Targets and Samples］（ターゲットとサンプ
ルの定義）タブを選択し、入力します。
b.［Assign Targets and Samples］（ターゲットとサンプ
ルの割り当て）タブを選択し、入力します。

5. データを解析します。
a. StepOne ソフトウェアで実験を開きます。
b. ［Experiment Menu］（実験メニュー）で、［Analysis］（解析）を選択します。
c. データが解析されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。
d. ナビゲーション欄で解析画面を選択し、データを表示します（例えば、［QC Summary］（QC サマリー）を選択して、データクオリティーに関する要約を表示します）。

ノート

118

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

付録 A 代替実験ワークフロー［Template］（テンプレート）ワークフロー［Template］（テンプレート）ワークフロー
テンプレートを使用して新しい実験を作成することができます。同じセットアップ情報により実験を多く作成する場合に、テンプレートは便利です。

テンプレートの作成

1.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（スター（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］［StepOneト）［All Programs］
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. 既存の実験を開くか、新しい実験を作成します。
参考：［Design Wizard］（設計ウィザード）（第 2 章参照）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）（116 ページ参照）を使うと、新しい実験を作成できます。

3. ［File］（ファイル）［Save As Template］（テンプレートとして保存）を選択します。
4. ファイル名を入力し、テンプレートの場所を選択してから、［Save］（保存）をクリックします。

5.
テンプレートを使った実験の作成［Close］（閉じる）をクリックします。

1. ［Home］（ホーム）画面で、［Template］（テンプレート）をクリックします。

参考：［Template］（テンプレート）のアイコンが見つからない場合には、［Design
Wizard］（設計ウィザード）アイコンの下にある矢印をクリックして、［Set Up］（セットアップ）メニューを全画面します。

2. ステップ d で作成したテンプレートを指定して選択し、［Open］（開く）をクリックします。テンプレートからのセットアップ情報を使って新しい実験が作成されます。

• 実験プロパティ• プレートセットアップ• 測定方法• 反応セットアップ

3. （オプション）実験を変更したい場合には、［Advanced Setup］（高度なセットアップ）
を使用します（116 ページ参照）。
4.

［Save］（保存）をクリックし、ファイル名を入力してから、［Save］（保存）をクリックして実験を保存します。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

119

付録 A 代替実験ワークフロー［Template］（テンプレート）ワークフロー

5. PCR 反応を調製します。
実験タイプ

相対標準曲線法
標準曲線法

比較 CT 法ジェノタイピング実験
有無実験

操作

a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. スタンダード希釈シリーズを調製します。
d. 反応ミックスを調製します。
e. 反応プレートを調製します。
a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. 反応ミックスを調製します。
d. 反応プレートを調製します。

6. 実験を測定します。
a. 反応プレートを装置にロードします。
b. 測定を開始します。
c. （オプション）測定を監視します。
d. 装置から反応プレートを取り出します。

7. データを解析します。
a. StepOne ソフトウェアで実験を開きます。
b. ［Experiment Menu］（実験メニュー）で、［Analysis］（解析）を選択します。
c. データが解析されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。
d. ナビゲーション欄で解析画面を選択し、データを表示します（例えば、［QC Summary］（QC サマリー）を選択して、データクオリティーに関する要約を表示します）。

ノート

120

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

付録 A 代替実験ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフローを用いると、他の実験からエク
スポートしたセットアップデータを使って、新しい実験をセットアップできます。反応プ
レートのセットアップデータのみが、インポート／エクスポートの対象となります。
参考： StepOne ソフトウェア v1.0 によりエクスポートした実験のセットアップデータは、
v2.0 以降のバージョンの StepOne ソフトウェアで実験にインポート可能です。しかし、
StepOne ソフトウェア v2.0 以降によりエクスポートした実験のセットアップデータは、
StepOne ソフトウェア v1.0 では実験にインポートできません。

セットアップデータのエクスポート1.

（StepOne ソフトウェアショートカット）をダブルクリックするか、［Start］（スタート）［All Programs］（すべてのプログラム）［Applied Biosystems］［StepOne
Software］ < ソフトウェア名 > を選択します。
ここで、< ソフトウェア名 > は、StepOne ソフトウェアの最新バージョンです。

2. 既存の実験を開くか、新しい実験を作成します。
参考：［Design Wizard］（設計ウィザード）（第 2 章参照）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）（116 ページ参照）を使うと、新しい実験を作成できます。

3. ［File］（ファイル）［Export］（エクスポート）を選択します。
4. ［Export Properties］（エクスポートプロパティ）タブ（デフォルト）を選択した後、a. ［Setup］（セットアップ）を選択します。
b. ドロップダウンメニューから［One File］（1 ファイル）を選択します。
c. ファイル名を入力した後、エクスポートファイルの場所を選択します。
d. ［File Type］（ファイルタイプ）ドロップダウンメニューからます。

（*.txt）を選択し重要！ *.xml ファイルは、エクスポートできません。

5. （オプション）［Customize Export］（エクスポートのカスマタイズ）タブをクリックし、適切なオプションを選択します。

6. ［Start Export］（エクスポート開始）をクリックします。
7. 確認の表示がでたら、［Close Export Tool］（エクスポートツールを閉じる）をクリックします。

エクスポートした
テキストファイルを使った実験の作成

エクスポートしたテキストファイル（*.txt）からプレートセットアップデータをインポート
して、実験用の反応プレートセットアップデータを作成できます。
重要！ 選択したエクスポートテキストファイルには反応プレートセットアップデータのみが含まれており、実験タイプが合致することを確認してください。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

121

付録 A 代替実験ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー

1. エクスポートしたテキストファイルから、反応プレートセットアップデータをインポートします。

a. 表計算ソフト（Microsoft® Excel など）を使って、エクスポートしたテキストファ
イルを開きます。
b. 必要に応じて、テキストファイルのパラメータを変更します。終わったら、タブ区
切りテキストファイルとしてファイルを保存します。
c. ［Home］（ホーム）画面で、クリックします。

［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を

参考：［Advanced Setup］（高度なセットアップ）のアイコンが見つからない場合（設計ウィザード）アイコンの下にある矢印をクリックしには、［Design Wizard］て、［Set Up］（セットアップ）メニューを全画面します。

d. 新しい実験を作成するか、または既存の実験を開きます。
e. ［File］（ファイル）［Import］（インポート）を選択します。
f. ［Browse］（参照）をクリックし、テキストファイル（*.txt）を指定し、選択した
後、［Select］（選択）をクリックします。
g. ［Start Import］（インポートの開始）をクリックします。エクスポートしたテキス
トファイルのセットアップデータを、開いている実験にインポートします。
参考： 実験にプレートセットアップ情報があらかじめ入っている場合には、ソフト
ウェアは、テキストファイルからのデータによりプレートセットアップを書き換えるかどうかを尋ねます。［Yes］（はい）をクリックして、プレートセットアップ情報を書き換えます。

2. ［Advanced Setup］（高度なセットアップ）を使用して、実験のセットアップを終了しま。
す（116 ページ参照）
3. PCR 反応を調製します。
実験タイプ

相対標準曲線法
標準曲線法

比較 CT 法ジェノタイピング実験
有無実験

操作

a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. スタンダード希釈シリーズを調製します。
d. 反応ミックスを調製します。
e. 反応プレートを調製します。
a. テンプレートを調製します。
b. サンプル希釈液を調製します。
c. 反応ミックスを調製します。
d. 反応プレートを調製します。

ノート

122

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

付録 A 代替実験ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー

4. 実験を測定します。
a. 反応プレートを装置にロードします。
b. 測定を開始します。
c. （オプション）測定を監視します。
d. 装置から反応プレートを取り出します。

5. データを解析します。
a. StepOne ソフトウェアで実験を開きます。
b. ［Experiment Menu］（実験メニュー）で、［Analysis］（解析）を選択します。
c. データが解析されない場合は、［Analyze］（解析）をクリックしてください。
d. ナビゲーション欄で解析画面を選択し、データを表示します（例えば、［QC Summary］（QC サマリー）を選択して、データクオリティーに関する要約を表示します）。

ノート

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

123

付録 A 代替実験ワークフロー［Export/Import］（エクスポート／インポート）ワークフロー

ノート

124

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

参考文献
Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

125

参考文献

126

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集
StepOne™ ソフトウェアの機能で、実験を自分の実験設計に従ってセットアップできます。
（高度なセットアップ） Advanced Setup（高度なセットアップ）により、実験の設計やセットアップが自由に行えまAdvanced Setup

す。

AIF

アッセイ情報ファイル（AIF）をご参照ください。

Assay ID

Applied BiosystemsがTaqMan® Gene Expression AssayやTaqMan® SNP Genotyping Assay（アッセイ ID）に割り当てる識別名。

AutoDelta

サイクリングステージ内のその後の各サイクルでステップの温度や時間を増減する測定方法の設定。AutoDelta がサイクリングステージで有効の場合、設定はサーマルプロファイル
内のアイコンで示されます。

（オートデルタ）• AutoDelta オン：• AutoDelta オフ：
CT

Threshold cycle（CT）をご参照ください。

delta Rn（∆Rn）

ベースライン修正したノーマライズ済み レポーター（∆Rn）をご参照ください。

Design Wizard

実験のセットアップを補助する StepOne™ ソフトウェアの機能で、希望の実験設計を入力す
ると、最良の実施法を表示します。

（設計ウィザード）

Diluted Sample［Reaction Setup］（反応セッ
StepOne™ ソフトウェアでは、このソフトウェアフィールドは、Concentrationトアップ）画面の［Sample Dilution Calculations］（サンプル希釈計算）タブに表示されま（10✕ for Reaction Mix） す。このフィールドに、すべての実験サンプルについて、反応ミックスに添加するサンプル（希釈サンプル濃度（反応 の濃度を入力します。“10✕ for Reaction Mix”（反応ミックスでは 10 倍）は、反応ミック
スのサンプルまたはスタンダード成分が10✕濃度であるとソフトウェアが仮定することを示
ミックスでは 10 倍））します。例えば、希釈サンプル濃度 50.0 ng/µL（10✕）の場合、反応の最終サンプル濃度は5 ng/µL（1✕）です。
EFF%

増幅効率（EFF%）をご参照ください。

Inventoried アッセイ

過去に製造され、品質管理仕様に合格し、在庫保管される TaqMan® Gene Expression Assays
および TaqMan® SNP Genotyping Assays。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

127

用語集

IPC

有無実験における内在性ポジティブコントロール（IPC）の略語。StepOne™ ソフトウェアでは、IPC を含むが IPC 遮断剤を含まないウェル内の IPC ターゲットのタスク。内在性ポジ
ティブ コントロール（Internal positive control：IPC）をご参照ください。

IPC+

ネガティブコントロール IPC ウェルをご参照ください。

IPC 遮断剤

PCR 反応に添加して内在性ポジティブコントロール（IPC）の増幅をブロックする試薬。

Made-to-order

注文後に製造する TaqMan® Gene Expression Assay または TaqMan® SNP Genotyping
Assay。製造品質管理仕様に合格したアッセイのみ出荷されます。

アッセイ

PCR 後の読み取り

ジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅後に行われます。
ジェノタイピング実験では、PCR 後の読み取り時に収集した蛍光データをアレル識別プロットに表示し、アレルコールに使用します。有無実験では、PCR 後の読み取り時に収集した蛍光データを有無プロットに表示し、検出コールに使用します。別称「エンドポイント読み取り」。

PCR 前の読み取り

ジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅前に行われます。
PCR 前の読み取りは、オプションですが、選択することをお勧めします。PCR 前の読み取りで収集した蛍光データを使用して、PCR 後の読み取りで収集した蛍光データをノーマライ
ズすることができます。

Pure Dye

カスタム色素およびシステム色素参照。

QuickStart

StepOne™ および StepOnePlus™ システムの機能で、プレートセットアップ情報を入力しなくても実験を実施できます。QuickStart には、装置の電源がオンであり、装置コンピュータ間（クイックスタート）の接続を変更していないコロケーションレイアウトが必要となります。

R2 値

回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。R2 値は、標準曲線回帰直線と、スタン
ダード反応の各 CT データポイントとのフィットの近似を示します。値が 1.00 なら、回帰直線とデータポイントとの完全フィットを示します。

refSNP ID

リファレンス SNP（refSNP）クラスタ ID を識別する数字。国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）にあるヌクレオチド配列変異の一塩基多型データベース（dbSNP）により
作 成 さ れ ま す。refSNP ID は、Applied Biosystems Store で Applied Biosystems SNP
Genotyping Assay の検索に使用できます。別称「rs 番号」。

Remote Monitor

StepOne™ ソフトウェアの機能で、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置を監視できます。遠（遠隔監視）

隔監視により、装置のステータスを監視したり、実験を装置に転送したり、リアルタイムで増幅プロットや温度プロットを監視したり、結果をコンピュータにダウンロードできます。
［Remote Monitor］（遠隔監視）では操作できません。
StepOne または StepOnePlus 装置は、

128

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

Rn

ノーマライズ済み レポーター（Rn）をご参照ください。

ROX™ 色素

Applied Biosystems が製造し、StepOne™ および StepOnePlus™ システムで事前キャリブ
レーションされている色素。ROX 色素は、パッシブリファレンスとして使用されます。

rs 番号

refSNP ID をご参照ください。

Sample Library

StepOne™ ソフトウェアでのサンプルのコレクション。サンプルライブラリには、サンプル（サンプルライブラリ）

名とサンプルの色が含まれます。

Sample or Standard
StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、［Reaction Setup］（反応セット（反応ミックス計算）タブに表示されます。本（10✕）（サンプルまたは アップ）画面の［Reaction Mix Calculations］
スタンダード（10 倍）） ソフトウェアは、反応ミックスへ添加するサンプルまたはスタンダードが 10✕ 濃度であると仮定します。例えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプルまたはスタンダード量は2 µL です。
SNP「一塩基多型」の略語。SNP は、一塩基の違いや一塩基の挿入や欠失などです。

SNP Assay Library（SNP アッセイライ

StepOne™ ソフトウェアで、ジェノタイピング実験に追加する SNP アッセイのコレクション。
ライブラリの SNP アッセイには、SNP アッセイ名や SNP アッセイカラーの他、各アレルにブラリ）

対してアレル名や塩基、レポーター、クエンチャーおよびアレルカラーが含まれます。ライ
ブラリ中の SNP アッセイには、アッセイ ID や SNP アッセイに関するコメントを追加することができます。

SNP アッセイ

ジェノタイピング実験で使用する、SNP 増幅用プライマーと、異なるアレルの検出用の 2 プ
ローブを含む PCR 反応。

SYBR® Green 試薬

ターゲット増幅用の 2 つのプライマーと、二本鎖 DNA 検出用 SYBR® Green 色素からなる
PCR 反応コンポーネント。

TaqMan® 試薬

ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブからなる PCR 反応コンポーネント。

Target Library

StepOne™ ソフトウェアで、実験に追加するターゲットのコレクション。ライブラリのター（ターゲットライブラリ） ゲットには、ターゲット名、レポーター、クエンチャーとサンプルの色が含まれます。ライ
ブラリのターゲットには、さらにターゲットに関するコメントを追加することができます。

Threshold cycle（CT） 蛍光レベルが増幅プロットの閾値と一致する PCR サイクル数。
Tm

融解温度（Tm）をご参照ください。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

129

用語集

VeriFlex™ 技術

StepOnePlus™ 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、96 サンプル
ウェルに対して温度の異なる 6 つのゾーンを設定できます。StepOne™ ソフトウェアでVeriFlex ブロックを有効にすると、各 VeriFlex ブロックに異なる温度を設定できるように
なります。

y 切片

標準曲線で、回帰直線が y 軸と交わる点。y 切片は、量が 1 のサンプルに対する期待 Thresholdcycle（CT）を示します。

アッセイ

StepOne™ および StepOnePlus™ システムにおいて、ターゲット増幅用プライマーと、増幅したターゲットを検出する試薬を含む PCR 反応ミックス。

アッセイミックス

Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assay や TaqMan® SNP Genotyping Assayに含まれる PCR 反応コンポーネント。アッセイミックスには、ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブが含まれます。

アッセイ情報ファイル（AIF）

各アッセイのご注文ごとに CD で発送されるデータファイル。ファイル名には、プレート上のバーコード番号が含まれます。AIF 内の情報は、タブ区切りフォーマットで提供されます。

アレルあるターゲットで、集団内に見られる異なる複数のシーケンス。

アレル識別プロット

PCR 後の読み取りで収集したデータの表示。アレル識別プロットはアレル 1 プローブからのノーマライズ済みレポーター信号を、アレル 2 プローブからのノーマライズ済みレポーター
信号に対してプロットしたグラフです。

アンプリコン

PCR で増幅する DNA セグメント。

域外値あるデータセットで、その他より有意に小さいか大きいデータポイント。

ウェル拒絶

ソフトウェアが解析時に実行し、特定フラッグがウェルに適用された場合に、それらのウェルを以後の解析から除外する操作。拒絶したウェルは、拒絶の時点までの結果を示します。

ウェル削除

再解析前に、1 つ以上のウェルを解析から削除する操作。削除したウェルにはアルゴリズムが適用されないので、削除したウェルの結果は出ません。

エンドポイント
読み取り

PCR 後の読み取りをご参照ください。

温度プロットStepOne™ ソフトウェアによる、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置測定時のサンプル、装置カバー、装置ブロックの温度表示。

回帰係数

標準曲線での回帰直線からの計算値。R2 値、傾き、y 切片があります。回帰係数を使用し、スタンダードからの結果品質を評価できます。「標準曲線」も参照。

130

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

回帰直線

標準曲線および相対標準曲線実験で、標準曲線の最も良くフィットするライン。回帰直線の計算式：

CT = m [log (Qty)] + b
m は傾き、b は y 切片、Qty はスタンダード量です。
回帰係数をご参照ください。

開始量

StepOne™ ソフトウェアで標準曲線を設定する際の、最大または最小の量に相当します。

解離曲線

融解曲線をご参照ください。

カスタム色素提供元が Applied Biosystems でない色素。StepOne™ および StepOnePlus™ システムでは、カスタム色素を実験に使用できます。カスタム色素を使用する場合には、そのカスタム色素を Dye Library に追加し、カスタム Dye キャリブレーションを行う必要があります。

重 要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色 素 を レ ポ ー タ ー や ク エ ン チ ャ ー と し て
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
傾き回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。傾きは、アッセイの PCR 増幅効率を示します。傾きが −3.32 の場合、100% の増幅効率を示します。増幅効率（EFF%）および回
帰直線をご参照ください。

希釈液

サンプルやスタンダードを PCR 反応に添加する前の希釈に使用する試薬。希釈液には、水やバッファーが使われます。

希釈係数

シリアル係数をご参照ください。

逆転写酵素

RNA を cDNA に変換する酵素。逆転写酵素の PCR 反応への添加により、1 ステップ RTPCR を実施できます。

キャリブレータ

リファレンスサンプルをご参照ください。

空間キャリブレーション

StepOne™ および StepOnePlus™ システムのキャリブレーションの 1 タイプで、システムがサンプルブロック中のウェル位置をマッピングします。空間キャリブレーションのデータによって、ソフトウェアは測定中に、蛍光の増加を反応プレートの特定ウェルに関連付けできます。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

131

用語集

TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。これにより、レポーターの蛍光信号放射は、プローブがインタクトな時は阻止されます。TaqMan® 試薬には、非蛍光クエンチャー - マイ
ナーグルーブバインダー（NFQ-MGB）をクエンチャーとして使用できます。SYBR®Green

クエンチャー

試薬には、クエンチャーは使用しません。

重 要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色 素 を レ ポ ー タ ー や ク エ ン チ ャ ー と し て
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ システム
でレポーターやクエンチャーとして使えます。
ケミストリ

試薬をご参照ください。

コロケーション
レイアウト

このシステムレイアウトでは、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置を黄色いケーブルで、近接するコンピュータに直接接続します。このレイアウトでは、近接するコンピュータや装置のタッチスクリーンから StepOne™ ソフトウェアによる装置のコントロールができます。

サーマルプロファイル

StepOne™ または StepOnePlus™ 装置測定のすべてのステップおよびステージにおける温度、時間、ランプ、データ収集ポイントを指定する測定方法の一部。

サイクリングステージ

サーマルプロファイル内で繰り返されるステージ。増幅ステージとも呼ばれます。サイクリ
ングステージでは、AutoDelta 設定が可能です。増幅ステージをご参照ください。

サイクル閾値

Threshold cycle（CT）をご参照ください。

サンプル

テストするテンプレート。

サンプル DNA（10✕）

StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面の［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブに表示されます。本
ソフトウェアは、反応ミックスへの添加サンプル DNA が 10✕ 濃度であると仮定します。例
えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプル量は 2 µL です。

サンプル／ SNP
アッセイ反応ジェノタイピング実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッセイの組み合わせ。各 PCR 反応には、サンプルと SNP の各 1 アッセイのみ含めることができます。

サンプル／ターゲット
反応

定量実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッセイの組み合わせ。
［Design Wizard］（設計ウィザード）で、1 回の PCR 反応には、1 つのターゲットのみ
検出と定量ができます。［Advanced Setup］（高度なセットアップ）により、1 回の PCR 反応において、複数のターゲットの検出と定量ができます。

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Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

閾値

1. 増幅プロットでベースラインよりも高く、指数増幅領域内の蛍光レベル。閾値は、自動で（自動 CT 参照）、また手動で（手動 CT 参照）設定できます。
2. 有無実験で、StepOne™ ソフトウェアが検出コールを発信する蛍光レベル。

システム色素Applied Biosystems が製造し、StepOne™ または StepOnePlus™ システムで事前キャリブレー
ションされている色素。実験にシステム色素を使用する前に、［Instrument MaintenanceManager］（装置メンテナンスマネージャ）でシステム Dye キャリブレーションが最新であることを確認してください。

StepOne システム用システム色素：• FAM™ 色素• JOE™ 色素• ROX™ 色素• SYBR® Green 色素• VIC® 色素
StepOnePlus システム用システム色素：
•
•
•
•
•
•
•

FAM™ 色素
JOE™ 色素
NED™ 色素
ROX™ 色素SYBR® Green 色素
TAMRA™ 色素
VIC® 色素重 要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色 素 を レ ポ ー タ ー や ク エ ン チ ャ ー と し て
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
実験

StepOne™ または StepOnePlus™ システムでの測定実施のプロセス全体を指し、セットアッ
プ、測定、解析を含みます。StepOne and StepOnePlus システムを用いて実施できる実験の
タイプ：

•
•
•
•
•
•

定量 - 標準曲線
定量 - 相対標準曲線
定量 - 比較 CT（∆∆CT）
融解曲線
ジェノタイピング実験
有無実験

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

133

用語集

実験タイプ

StepOne™ または StepOnePlus™ システムを用いて実施できる実験のタイプ：
•
•
•
•
•
•

標準曲線法
比較 CT（∆∆CT）
相対標準曲線法
融解曲線（［Design Wizard］（設計ウィザード）では使用できません）
ジェノタイピング実験
有無実験

実験タイプの選択は、セットアップ、測定、解析の画面に影響します。

実験名

実験セットアップ時に入力する名前で、実験の識別に使用します。実験名は 100 文字以内とし、下記の文字は使用できません。スラッシュ（/）、バックスラッシュ（\）、大なり記号（>）、小なり記号（<）、アスタリスク（*）
、クエスチョンマーク（?）
、引用符（"）、バー（|）、
コロン（:）、セミコロン（;）

自動 CT

この解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値や閾値を計算します。ソフトウェアは、ベースラインと閾値を使用して Threshold cycle（CT）を計算します。Threshold cycle（CT）をご参照ください。

自動ベースライン

この解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値を計算します。反応プレート中の特定のウェルに対して自動ベースライン設定を行えます。ベー
スラインをご参照ください。

試薬

ターゲット増幅と増幅検出に使用する PCR 反応コンポーネント。
StepOne™ および StepOnePlus™
システムで使用する試薬のタイプ：• TaqMan® 試薬• SYBR® Green 試薬• その他の試薬
手動 CT

この解析設定では、ユーザーが閾値を入力し、自動ベースラインまたは手動ベースライン値のどちらかを選択します。ソフトウェアは、ベースラインと閾値を使用して Threshold cycle（CT）を計算します。

手動ベースライン

この解析設定では、ユーザーが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値を入力します。反応プレート中の特定のウェルに対して手動ベースライン設定を行えます。

シリーズ

スタンダード 希釈シリーズをご参照ください。

シリアル係数

StepOne™ ソフトウェアで、標準曲線における量のシーケンスを設定する数値。シリアル係
数と開始量から、標準曲線の各ポイントのスタンダード量が計算されます。例えば、標準曲線の定義シリアル係数が 1：10 か 10✕ のときは、曲線での隣接 2 ポイント間の差は 10 倍です。

134

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

スタンダード既知の標準量を含むサンプル。スタンダード反応は、定量実験で使用して標準曲線を作成します。標準曲線およびスタンダード 希釈シリーズをご参照ください。

スタンダード
希釈シリーズ

標準曲線および相対標準曲線実験で、ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。例えば、スタン
ダード原液から第一希釈ポイントを調製し、第一希釈ポイントから第二希釈ポイントを調製します。スタンダード希釈シリーズの調製に必要な量は、StepOne™ ソフトウェアによって、希釈ポイント数、スタンダードの反復数、開始量、シリアル係数、スタンダード原液濃度から計算されます。標準曲線をご参照ください。

スタンドアロンレイアウト

このシステムレイアウトでは、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置は、
黄色いケーブルでコンピュータに接続されません 。このレイアウトの場合、装置のコントロールは、装置のタッチスクリーンのみ可能です。USB ドライブやネットワーク接続により装置とコンピュータ
間のデータ転送を行います。

ステージ

サーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。3 種類のステージがあります。ホールディングステージ（PCR 前の読み取りおよび PCR 後の読み取りを含む）、サ
イクリングステージ（増幅ステージとも呼ばれる）および融解曲線ステージです。

ステップ

サーマルプロファイルのコンポーネント。サーマルプロファイル中の各ステップでは、ランプ速度（融解曲線ステップのランプ増分）、ホールド温度、ホールド時間（時間幅）の設定ができ、ステップのランプまたはホールド部分に関しデータ収集をオンまたはオフに設定できます。サイクリングステージのステップは AutoDelta ステータスによっても定義されます。
StepOnePlus™ システムには、VeriFlex™ ブロックが含まれており、各ステップで 6 種類の温度（各 VeriFlex ブロックに一つ）を設定できます。

生データプロット

各光学フィルタの（ノーマライズしていない）生の蛍光シグナルによるプロット。

ゾーン

StepOnePlus™ 装置での測定中、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックに設定できる、96
ウェル内の最高 6 つのサンプル温度領域の一つ。VeriFlex ブロックはそれぞれ異なる温度設
定をすることも、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です。
参考： 溶解曲線ステップでは、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度に設定する必要があります。

ゾーン境界線

個別に熱制御可能な 6 つの VeriFlex™ ブロックによって形成されるサンプルのゾーンの境界。
ゾーン境界線は、StepOne™ ソフトウェアのプレートレイアウトに濃赤色で表示されます。

相対標準曲線法

サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。相対標準曲線法では、StepOne™ ソフトウェ
アにより、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールによりノーマラ
イズされます。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します。ソフトウェア
は、標準曲線を用いて、サンプルおよびリファレンスサンプル中のターゲット量を外挿します。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のターゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量を決定します。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

135

用語集

増幅

装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。定量実験では、増幅時に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用します。ジェノタイピン
グ実験や有無実験では、増幅時に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用することができます。

増幅効率（EFF%）

PCR 増幅の効率計算。増幅効率は、標準曲線での回帰直線の傾きを使って計算します。傾きが −3.32 に近いとき、最適な 100% PCR 増幅効率を示します。増幅効率に影響する要因には、次のものがあります。

• 標準量の範囲 – より精密度 • 正確度の高い効率測定を行うには、広範囲の標準量すなわ
ち 5 ～ 6 log（105 ～ 106）をご使用ください。
• スタンダードの反復数 – 不正確な分注の影響を低減し、より正確な効率測定を行うためには、反復を行います。

• PCR 阻害剤 – 反応中の PCR 阻害剤により、増幅効率が低下し、効率測定に影響が生じる可能性があります。

増幅しないコントロール 「ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル」参照。
（NAC：No amplification
control）
増幅ステージ装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。増幅ステージは、サーマル
プロファイルのサイクリングステージとも呼ばれ、変性、プライマーのアニーリング、重合反応の各ステップを繰り返します。
定量実験では、増幅ステージで収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用します。ジェノタイピング実験や有無実験では、増幅ステージで収集した蛍光デー
タを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用することができます。サイクリングス
テージをご参照ください。

増幅プロットPCR 増幅のサイクリングステージで収集したデータの表示。以下の形で表示できます。
• ベースライン修正したノーマライズ済みレポーター（∆Rn）対サイクル• ノーマライズ済みレポーター（Rn）対サイクル• Threshold cycle（CT）対ウェル

測定方法

StepOne™ または StepOnePlus™ 装置が実行する反応量とサーマルプロファイルの定義。

ターゲット増幅および検出の対象となる核酸配列。

ターゲットカラー

StepOne™ システムで、ターゲットに割り当て、ターゲットをプレートレイアウトや解析プ
ロットで同定する色。

136

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

タスク

StepOne™ ソフトウェアで、ターゲット／ SNP アッセイのウェルで実施する反応のタイプ。
実施可能なタスク：

•
•
•
•
•
•
タッチスクリーン

未知のサンプル
ネガティブコントロール
スタンダード（標準曲線および相対標準曲線実験）
ポジティブコントロール（ジェノタイピング実験）

IPC（有無実験）
ブロック IPC（有無実験）

StepOne™ または StepOnePlus™ 装置をコントロールするためにタッチする装置のディスプ
レイ。

定量方法

定 量実 験で、サ ンプ ル に含 ま れる タ ーゲ ット の 量を 特 定す る 方法。StepOne™ お よ び
StepOnePlus™ システムでは、3 種類の定量方法が可能です。標準曲線法、相対標準曲線法および比較 CT（∆∆CT）法。

テンプレートStepOne™ ソ フ ト ウ ェ ア の［Design Wizard］（設 定 ウ ィ ザ ー ド）（お よ び 定 量 実 験 の［QuickStart］（クイックスタート））で、PCR 反応に追加する核酸の種類。推奨テンプレー
トは、実験タイプにより異なります。

• 定量実験（標準曲線法、相対標準曲線および比較 CT 法）－ cDNA（相補 DNA）、RNA、
gDNA（ゲノム DNA）。
定量実験では、テンプレートの選択により、測定方法、反応セットアップ、物品リスト
が変わります。

• ジェノタイピング実験 － 湿潤 DNA（gDNA もしくは cDNA）または乾燥 DNA（gDNA
もしくは cDNA）。
ジェノタイピング実験では、テンプレートの選択により、反応セットアップが変わります。

• 有無実験 － DNA
Applied Biosystems は、有無実験で、DNA テンプレートを PCR 反応に添加することをお勧めします。

テンプレートを含まない ネガティブコントロール（NC）をご参照ください。
コントロール（NTC：
No template control）
データ収集

装置のコンポーネントが、反応プレートの各ウェルからの蛍光データを検出する装置の測定プロセス。装置が信号を電子データに変換し、データは実験ファイルに保存されます。
StepOne™ システムでは、データ収集ポイントは、サーマルプロファイル内のアイコンで示されます。

• データ収集がオン：• データ収集がオフ：

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

137

用語集

実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現すべきターゲットまたは遺伝子。相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験では、内在性コントロールを用いて定量中のター
ゲットの蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コント
ロールとして使用できます。ハウスキーピング 遺伝子をご参照ください。

内在性コントロール

有無実験で、PCR 反応に添加する短い合成 DNA テンプレート。IPC を使用して、真の陰性
内在性ポジティブ
コントロール（Internal 結果（すなわち、サンプル中にターゲットが存在しない）と、PCR 阻害剤や不適切なアッセ
positive control：IPC） イセットアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。

ネガティブコントロール
IPC ウェル

有無実験で、IPC テンプレートおよびバッファーまたは水をサンプルの代わりに含むウェル。
ネガティブコントロール IPC ウェルでは、IPC テンプレートのみが増幅します。反応にサンプルが含まれないからです。別称「IPC+」。

ネガティブコントロール（NC）

StepOne™ ソフトウェアで、サンプルの代わりに水やバッファーを含むウェル内のターゲッ
トや SNP アッセイに割り当てられるタスク。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロー
ルウェルでは起こりません。別称、「テンプレートを含まないコントロール（NTC：No
template control）」。

ネガティブコントロール
ブロック済み IPC ウェル有無実験で、PCR 反応のサンプルの代わりに IPC 遮断剤を含むウェル。増幅はネガティブ
コントロールブロック済み IPC ウェルでは起きません。反応にサンプルが含まれず、IPC の増幅が遮断されるからです。別称「増幅しないコントロール（NAC：No amplification
control）」。

ノーマライズ済み
レポーター（Rn）

パッシブリファレンスの蛍光信号にノーマライズした、レポーター色素からの蛍光信号。

ノーマライズ量ターゲット量を内在性コントロールの量で除したもの。

ハウスキーピング
遺伝子

細胞の基本的な機能に関与し構成的に発現する遺伝子。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コントロールとして使用できます。内在性コントロールをご参照ください。

パッシブリファレンス

蛍光シグナルを生成する色素。パッシブリファレンス信号はすべてのウェルで一定なので、レポーター色素信号をノーマライズし、わずかなウェル間の濃度や量の違いによる PCR に関連しない蛍光変動を補正するために使用されます。パッシブリファレンス信号への正規化
により、データ精度が高まります。

反応ミックステンプレート（サンプル、スタンダード、またはコントロール）以外のすべての PCR 反応
測定コンポーネントを含む溶液。

反復グループ

実験での同一反応のセット。

反復数

同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。

138

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

比較 CT（∆∆CT）法

サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。比較 CT（∆∆CT）法では、StepOne™ ソフ
トウェアにより、サンプルやリファレンスサンプル中のターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールによりノーマライズされます。ソフト
ウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のノーマライズ済みター
ゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量を決定します。

非蛍光クエンチャー マイナーグループバインダー（NFQ-MGB）

TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。プローブがインタクトな時は、非蛍光クエン
チャー（NFQ）は、レポーター色素からの蛍光信号の放射を阻止します。NFQ は蛍光を出

微分レポーター（−Rn′ ）PCR 増幅でレポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナル強度の負の一次微分。微分レポーター（–Rn′ ）vs 温度融解曲線では、ノーマライズした、微分レポーターシグナルは
y 軸に表示されます。

標準曲線

標準曲線および相対標準曲線実験で：さないので、生成されるバックグラウンド信号は低く、その結果、定量精度が向上します。
マイナーグループバインダー（MGB）は融解温度（Tm）を上げますが、プローブ長は増えません。また、短いプローブも設計できます。

• 標準量に対してプロットしたスタンダード反応からの CT 値のプロットで最も良くフィッ
トするライン。「回帰直線」も参照。

• ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。標準曲線反応からのデータを使用して標準曲線を作成します。標準曲線は、希釈シリーズのポイント数、スタンダードの反復数、開始量、シリアル係数で定義されます。「スタンダード希釈シリーズ」も参照。

標準曲線法

サンプル中ターゲットの絶対量を決定する方法。標準曲線法では、StepOne™ ソフトウェア
により、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるターゲットの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します。ソフトウェ
アは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶対量を外挿します。スタンダードおよび標準曲線をご参照ください。

標準量

PCR 反応での既知量。
• 標準曲線実験では、スタンダードにおけるターゲット量。StepOne™ ソフトウェアでは、標準量の単位は、質量、コピー数、ウイルス量、その他のターゲット量などの測定単位です。

• 相対標準曲線実験では、スタンダードにおける既知量。例えば、標準量は、cDNA 量やPCR 反応中の標準原液量などです。単位は相対標準曲線実験では無関係で、計算では無効です。

フォワードプライマー

アンプリコンの 5′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライマーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。

ブロックされた IPC

有無実験で、IPC 遮断剤（内在性ポジティブコントロール、IPC の増幅を遮断する）を含む反応。StepOne™ ソフトウェアでは、IPC 遮断剤を含むウェル内の IPC ターゲットのタスク。
ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェルをご参照ください。

プライマー／プローブ
ミックス

ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブからなる PCR 反応コンポーネント。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

139

用語集

プライマーミックス

ターゲットを増幅するよう設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーを含む
PCR 反応コンポーネント。

プレートレイアウト

反応プレートのグリッドの各ウェルと、割り当てられた内容物の図。StepOne™ システムの場合、グリッドは 6 行 8 列です。StepOnePlus™ システムの場合、グリッドは 8 行 12 列です。

StepOne™ ソフトウェアでは、プレートレイアウトを選択ツールとして使用し、ウェル内容
物を割り当てたり、ウェル割り当ての表示や結果の表示ができます。プレートレイアウトは、印刷、レポートへの表示、エクスポートや、プレゼンテーション用のスライドとしての保存ができます。

ベースライン

増幅プロットにおいて、蛍光シグナルの変化が小さい PCR 初期サイクル中の蛍光レベルに該当するライン。

ベースライン修正した
ノーマライズ済み
レポーター（∆Rn）

レポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。

1. リアルタイム PCR データを含む実験では、PCR 増幅の各サイクルでレポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。∆Rn vs. Cycle 増幅プロットでは、各サイ
クルの ∆Rn は次式により計算されます。
∆Rn（サイクル）= Rn（サイクル）− Rn（ベースライン）で、Rn = ノーマライズ済み
レポーター。

2. ジェノタイピング実験や有無実験では、ノーマライズしたレポーター蛍光シグナル値の、PCR 前読み取りと PCR 後読み取り間の差。アレル識別プロット（ジェノタイピン
グ実験）や有無プロット（有無実験）では、∆Rn は、次式で計算します。
∆Rn = Rn（PCR 後読み取り）− Rn（PCR 前読み取り）で、Rn = ノーマライズ済みレポーター。
ノーマライズ済み レポーター（Rn）をご参照ください。

ホールディングステージ

サーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。ホールディングステージ
は、酵素の活性化や不活性化、反応物の培養のためサーマルプロファイルに追加できます。

ポイント

標準曲線内の 1 つのスタンダード。標準曲線の各ポイントのスタンダード量は、開始量とシリアル係数に基づいて計算されます。

ポジティブコントロール

ジェノタイピング実験で、ジェノタイプが既知であるホモ接合性またはヘテロ接合性の DNA
サンプル。StepOne™ ソフトウェアで、既知ジェノタイプのサンプルを含むウェル内の SNP
アッセイに割り当てたタスク。

マルチコンポーネント
プロット

指定したウェル内の各色素の全スペクトル構成を PCR 測定中表示するプロット。

未知－ IPC ウェル有無実験で、未知のサンプルと内在性ポジティブコントロール（IPC）を含むウェル。

140

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

用語集

未知の

StepOne™ ソフトウェアで、テストするサンプルを含むウェル内のターゲットまたは SNP
アッセイに割り当てたタスク。

• 定量実験では、ターゲット量不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用のタスク。
• ジェノタイピング実験では、ジェノタイプが不明のサンプルを含むウェル内の SNP アッ
セイ用のタスク。

• 有無実験では、ターゲットの有無不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用のタス
ク。

融解温度（Tm）

融解曲線実験で、DNA の 50% が二本鎖であり、50% が一本鎖に解離する温度。Tm は溶解曲線に表示されます。

融解曲線

融解曲線ステージで収集したデータのプロット。融解曲線のピークはターゲットの融解温度（Tm）を示す場合があり、非特異的 PCR 増幅を特定できる場合もあります。StepOne™ ソフ
トウェアでは、融解曲線は、ノーマライズ済みレポーター（Rn）対温度か、微分レポーター（−Rn′ ）対温度で表示できます。別称「解離曲線」。

融解曲線ステージ

サーマルプロファイル内で、温度を段階的に上げて融解曲線を作成するステージ。

ランプ

装置実行時の温度変更レート。融解曲線ステップ以外では、ランプはパーセントで定義します。融解曲線ステップでは、ランプは温度増分で定義します。サーマルプロファイルのグラ
フィック表示では、ランプは対角線で示されます。

ランプ速度

装置実行中に発生する温度ランプの速度。使用できるランプ速度は Fast（高速）とスタン
ダードです。

• Fast ランプ速度により最適な結果を得るために、Applied Biosystems は、TaqMan®
Fast 試薬を PCR 反応に使用することをお勧めします。
• 標準ランプ速度で最適な結果を得るためには、Applied Biosystems は、標準試薬を PCR反応に使用することをお勧めします。

重要！ ジェノタイピングまたは有無実験では、TaqMan Fast 試薬は使用できません。
リアルタイム PCRPCR 時の蛍光データの収集プロセス。リアルタイム PCR データは、定量実験の結果計算や、ジェノタイピング／有無実験結果のトラブルシューティングに使用します。

リバースプライマー

アンプリコンの 3′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライマーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。

リファレンスサンプル

相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験で、相対定量結果の基礎とするサンプル。別称「キャリブレータ」。

量

定量実験でサンプルに含まれるターゲットの量。絶対量には、コピー数、質量、モル濃度、またはウイルス量があります。相対量は、サンプル中ノーマライズ済みターゲット量と、リファレンスサンプル中ノーマライズ済みターゲット量との発現差です。

レポーター

増幅を検出する蛍光色素。TaqMan® 試薬では、レポーター色素は 5′ 末端に結合します。
SYBR® Green 試薬では、レポーター色素は SYBR® Green 色素です。

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

141

用語集

142

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

索引
数字

I

1 ステップ RT-PCR 7, 24, 32, 37
2 ステップ RT-PCR 7, 11, 24

Inventoried アッセイ 37

M

A
Advanced Setup（高度なセットアップ） 9, 10, 24, 30, 56,
116［Advanced Setup］（高度なセットアップ） 24［Amplification Plot］（増幅プロット）画面
測定後の表示 92
測定中の監視 70
AMPNC フラッグ 107
Applied Biosystems
テクニカルサポート xii
文書に関するユーザーのフィードバック
問い合わせ xii

xii

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734IX.fm

説明 xviii
入手 xviii
MSDS、入手 xii
MTP フラッグ 107［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）
画面 109［Multiple Plots］（複数プロット）画面 89

N

B

NOAMP フラッグ 107
NOISE フラッグ 107
NOSIGNAL フラッグ 107

O

C

OFFSCALE フラッグ 107
OUTLIERRG フラッグ 107

CT 101CTFAIL フラッグ 107
Custom assays 37

Q

D
Design Wizard（設計ウィザード）［Experiment Properties］（実験プロパティ）画面 20［Materials List］（物品リスト）画面 38［Methods & Materials］（方法と物品）画面 22［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面 33［Run Method］（測定方法）画面 31［Samples］（サンプル）画面 29［Standards］（スタンダード）画面 27［Targets］（ターゲット）画面 25
終了 42
ソフトウェアのエレメント 18

E
EMC 規格 xxii
［Experiment Properties］（実験プロパティ）画面 20
EXPFAIL フラッグ 107
Export/Import（エクスポート／インポート） 10, 121H
HIGHSD フラッグ 107

22

MSDS

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System「StepOne システム」参照。

BADROX フラッグ 107
BLFAIL フラッグ 107

DRAFT

Made to Order アッセイ 37［Materials List］（物品リスト）画面 38［Methods & Materials］（方法と物品）画面［QC Summary］（QC サマリー）画面 106
QuickStart（クイックスタート） 117, 10

R［Raw Data Plot］（生データプロット）画面 112［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面 33［Run Method］（測定方法）画面 31
測定中の監視 72
Run Method ライブラリ 32

S［Samples］（サンプル）画面 29
SPIKE フラッグ 107［Standards］（スタンダード）画面 27
StepOne システム
試薬 8
消耗品 4
データ収集 2フィルタ 3, 113
レイアウト 65, 69, 76
SYBR Green 試薬 3, 8, 24, 26, 37, 113T
TaqMan 試薬 3, 8, 23, 24, 26, 37, 113

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

143

［Targets］（ターゲット）画面 25［Temperature Plot］（温度プロット）画面
Template（テンプレート） 119
THOLDFAIL フラッグ 107

解析設定

CT 105
閾値 105
詳細 105
表示 10471

W
Well Table（ウェルテーブル） 99

あ
安全上のマーク、装置 xv
安全上のラベル、装置 xvi
安全性
移動／持ち上げ xvii
ガイドライン xviii, xix, xx
化学廃棄物 xix
規格 xxii
繰り返し動作 xxii
装置の移動と持ち上げ xvii
装置の操作 xvii
装置の操作前 xvii
電気 xx
人間工学 xxii
バイオハザード xxi
表記法 xiii
薬品 xviii
ワークステーション xxii
安全性規格 xxii

フラッグ 105
ベースライン 105
ガイドライン
解析 85, 92, 96, 101, 105, 107, 109, 111, 113
化学廃棄物に関する安全性 xix
化学廃棄物の廃棄 xix
準備 48, 50, 52, 56
設計 21, 23, 26, 28, 30, 32, 37, 41, 44
測定 64
薬品に関する安全性 xviii
化学廃棄物に関する安全性 xix
過電圧カテゴリ（定格） xxi

き規格

EMC xxii
安全性 xxii「危険アイコン」の「安全上のマーク」参照。
危険。「安全性」参照。
危険、説明 xiii
危険マーク。「安全上のマーク、装置」の「危険アイコン」
参照。

く
繰り返し動作、安全性

け
警告、説明
結果、解釈

う

xxii

xiii
83

ウェル
削除 108スタンダード 29, 42, 53
選択 88
ネガティブコントロール 29, 42, 53
未知の 29, 42, 53
ウェル削除 108
ウェルの選択 88

こ

お

サンプル
希釈液 47
サンプル反応液（未知） 55
設計ガイドライン 30
セットアップ 29
サンプル希釈液
準備 47
容量計算値 36, 47

オンラインヘルプ。「ヘルプシステム」参照。

か解析画面［Amplification Plot］（増幅プロット）画面 92［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面 109［Multiple Plots］（複数プロット）画面 89［QC Summary］（QC サマリー）画面 106［Raw Data Plot］（生データプロット）画面 112［Standard Curve］（標準曲線）画面 90
Well Table（ウェルテーブル） 99
ソフトウェアのエレメント 85
ナビゲーションのヒント 88

144

コロケーションレイアウト
監視 69
スタートアップ 65
データの転送 77

さし閾値
手動で調整 105
正しい数値 96
例 97
実験の解析
［Amplification Plot］（増幅プロット）画面 92［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面 109

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734IX.fm

域外値。「ウェルの選択削除」参照。
一般的な xxi
移動と持ち上げ、安全性 xvii

DRAFT

い

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734IX.fm

DRAFT［Multiple Plots］（複数プロット）画面の表示 89［QC Summary］（QC サマリー）画面の表示 106［Raw Data Plot］（生データプロット）画面の表示 112［Standard Curve］（標準曲線）画面の表示 90［Well Table］（ウェルテーブル）の表示 99
ウェル削除 108
解析 84
解析設定の表示 104
ガイドライン 85, 92, 96, 101, 105, 107, 109, 111, 113
詳細について 92, 98, 101, 105, 107, 109, 111, 113
データのパブリッシュ 102
ワークフロー 82
実験の準備
ガイドライン 48, 50, 52, 56
サンプル希釈液 47
詳細について 48, 53, 57
スタンダード希釈シリーズ 49
反応プレート 53
反応ミックス
準備 51
ワークフロー 46
実験の設計［Design Wizard］（設計ウィザード）の終了 42
ガイドライン 21, 23, 26, 28, 30, 32, 37, 41, 44
サンプルのセットアップ 29
実験プロパティの定義 20
詳細について 22, 24, 26, 28, 31, 33, 38, 41, 44
新規作成 17
スタンダードのセットアップ 27
測定方法のセットアップ 31
ソフトウェアのエレメント 18
ターゲットのセットアップ 25
反応セットアップの確認 33
物品の注文 38
方法と物品の定義 22
ワークフロー 16
実験の測定
開始 65
ガイドライン 64
監視 69
警告 72
詳細について 63, 72, 73
通知設定の有効化 63
データの転送 76
実験例
解析 82
準備 46
設計 16
説明 10
測定 60
データ 12
データの場所 12
名称 20
ワークフロー 13
試薬

SYBR Green 8
TaqMan 8
その他の蛍光ベース 9
消耗品
使用可能な 4
「必要な物品」も参照。 4
新規実験の作成 17
シングルプレックス PCR 6, 24

すスタンダード［Set Up Standards］（スタンダードのセットアップ）
チェックボックス 25, 26
希釈 49
実験のコンポーネント 6
スタンダード反応 55
設計ガイドライン 28
セットアップ 27
スタンダード希釈シリーズ
実験のコンポーネント 6
準備 49
容量計算値 35
スタンドアロンレイアウト
Remote Monitor（遠隔監視） 73
遠隔データ転送 77
監視 75
スタートアップ 66
データの転送 78

せ設置カテゴリxxi

そ装置の操作、安全性 xvii
増幅効率 28, 92
増幅プロット、典型的 96
測定の開始
コロケーションレイアウト 65
スタンドアロンレイアウト 66
測定の監視［Amplification Plot］（増幅プロット）画面 70［Run Method］（測定方法）画面 72［Temperature Plot］（温度プロット）画面 71
コロケーションレイアウト 69
スタンドアロンレイアウト 75
スタンドアロンレイアウト（リモート） 73
測定の実施
準備 61
ワークフロー 60
測定の準備 61
その他の蛍光ベース試薬 9
ソフトウェアのエレメント
Design Wizard（設計ウィザード） 18
解析画面 85

た
ターゲット
設計ガイドライン 26
セットアップ 25
代替実験ワークフロー。「ワークフロー」参照。

ち
注意、説明

xiii

つ
通知設定

63

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

145

て

ふ

データ
実験例 9, 84
データ収集について 2
転送 76
パブリッシュ 102
データの転送 76
データのパブリッシュ 102
テキスト表記法 viii
テクニカルサポート、問い合わせ xii
電気に関する安全性 xx
電磁環境適合性規格。「EMC 規格」参照。
テンプレート 10
テンプレート。「サンプル」参照。

物品の注文 38
フラッグ 101
解析設定 105
標準曲線実験で 107
プレートの取り出し 76
文書、関連 ixへ
ベースライン
手動で調整 105
正しい数値 96
例 98
ヘルプシステム、アクセス
偏差、標準 97とトラブルシューティング［Multicomponent Plot］（マルチコンポーネントプロット）画面の表示 109［QC Summary］（QC サマリー）画面の表示 106［Raw Data Plot］（生データプロット）画面の表示 112
ウェル削除 108
解析設定の表示 104
閾値の調整 105
フラッグ 107
ベースラインの調整 105
トレーニング、情報 xii

ほ放射性廃棄物、取扱い xx
本ガイドを使用する際の前提 viii
本書で使用する表記法 viii
本書の使用
実際の実験に 9
チュートリアルとして 9まマーク、安全上の xv
マルチプレックス PCR 6, 24

なナビゲーションのヒント
ウェルの選択 88
複数プロット表示 89

や

に

ゆ

薬品に関する安全性xviii

ね
ネガティブコントロール、実験のコンポーネント

6

ら
ライブラリ
ランプ速度

は
バイオハザード廃棄物、取扱い xx
廃棄物の廃棄、ガイドライン xx
廃棄物プロファイル、説明 xx
反応セットアップ手順の印刷 36
反応プレート
準備 53装置からの取り出し 76
レイアウト 42ロード 62
反応プレートのロード 62
反応ミックス
容量 51
容量計算値 34
反復、実験のコンポーネント 6

32
22, 24わワークステーションに関する安全性 xxii
ワークフローAdvanced Setup（高度なセットアップ） 116
Export/Import（エクスポート／インポート） 10, 121
QuickStart（クイックスタート） 117, 10
Template（テンプレート） 119
実験例 13
テンプレート 10

ひ必要な物品 47, 49, 51, 54標準曲線実験
説明 6
標準偏差、Threshold の影響

146

97

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 標準曲線実験入門ガイド

September 28, 2007 12:02 pm, 4377734IX.fm

ユーザーの注意を促す語句、説明 viii
ユーザーのフィードバック、Applied Biosystems の文書に関する xii

xxii

DRAFT

人間工学、安全性

xi

Worldwide Sales and Support
Applied Biosystems vast distribution andservice network, composed of highly trained
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