The carbohydrate tail of landomycin A is responsible for
its interaction with the repressor protein LanKThe FEBS Journal (2022)
Atsushi Tsugita, Shiro Uehara, Takashi Matsui, Takeshi Yokoyama, Iryna Ostash, Maksym Deneka, Subbarao
Yalamanchili, Clay S. Bennett, Yoshikazu Tanaka and Bohdan Ostash■Summary■LaA結合に重要な残基は、トンネル⼊り⼝付近に存在する(A)
Landomycin A (LaA) は、アングサイクリン系抗 (A)⽣物質の1つで、強い抗腫瘍活性を持つため、抗がん剤としての応⽤が期待されている。
Streptomyces cyanogenus S136は、アグリコンにデオキシ糖を順番に付加することで、最終的に (B)(B)
LaAを⽣合成する（図1(A)）。このLaA⽣合成
経路において、TetR型転写調節因⼦であるLanKは、H+トランスポーターであるLanJの転写を制御する（図1(B)）。これにより、最終⽣成物であるLaAが細胞内で⼗分に蓄積されるまで、ランドマイシンの細胞外輸送は抑制される 。3つ以上の糖鎖を持つランドマイシンは、LanKのエフェクター分⼦として機能することが分かっていたが、どのようにして、 図1 (A) ランドマイシンの化学構造。 アグリコンに6, 3, 2糖が付加された化合物がそれぞれ、landomycin A (LaA), LaE,LanKが最終⽣成物であるLaAとランドマイシン中 LaDと呼ばれる。(B) LanKによるランドマイシンの膜外輸送と間体を区別するか、正確なメカニズムは分かってい その⽣産の調節。LanKが、lanK-lanJプロモーター領域に結合することで、LanKとLanJの転写は制御される。リガンドの結合によって、LanKはDNAを放出する。
なかった。
アポ体のLanKとLanK-LaA複合体の結晶構造と、ランドマイシン中間体（LaA、LaE、LaDおよび6糖と3糖の合成糖鎖）とのゲルシフトアッセイの結果、LaAの糖鎖部分のみが、C末端ドメインのリガンド結合トンネル付近に結合し、アグリコンはリガンド認識に必須ではないことが明らかになった。また、C末端ドメインのヘリックスおよびループ領域の構造変化によって、LanK-LanJプロモーター配列からのLanKの解離を引き起こすことが⽰唆された。LanKは、糖鎖部分を認識するユニークなTetR型転写調節蛋⽩質であることが、明らかになった。
Aglycone

Sugar chain

D-olivose

LaD

LaE

L-rhodinose

Landomycin A (LaA)

lanK

cell
membrane

LanK

lanJ

basal conversion(lanK and lanJ transcriptions are down-regulated)

LanK

ing
d bind
Ligan

LaE

LaA

H+lanK

lanJ

active conversion

LanJ(lanK and lanJ transcriptions are up-regulated)LaA結合部位周辺の23残基をアラニンに置換した変異体を作製し、EMSAによりDNA結合活性を⽐較した（表1および図5）。その結果、変異体は4つのグループに分類された。グループ1（L115AとR116）は、LaA⾮存在下でも、DNA（lanKjp）に結合しない変異体で、これらの残基は、LanKが本来持っているDNA結合能に重要な役 割 を 担 っ て い る と 思 わ れ る 。 グ ル ー プ 2 の 変 異 体 （ G132A 、 Y136A 、 S149A 、L152A）は、LaA存在下でもDNAを遊離しなかった。グループ3 （M108A、N125A、I128A、F160A）は、DNA-LanK複合体の新しいバンドによって⽰されるように、LaAと不完全に結合した。グループ4 (T117A、G119A、I120A、G121A、L124A、E133A、D138A、Q145A、H156A、F157A、F161A、I165A、E166A)は、EMSAで野⽣型
LanKと同様な挙動を⽰す変異体であった。
表1. EMSAに⽤いたLanK変異体のまとめ

(B)

LaD

■LanKはランドマイシンの糖鎖の⻑さを認識する

(C)

(D)

(A)

(E)

異なるランドマイシンを⽤いたゲルシフトアッセイ（EMSA）によって、LaAとLaEはLanKのDNAへの結合を阻害するが、LaDとアグリコンは阻害しないことが分かった。
(A)(B)
図5 LanKの変異体解析によるリガンド結合に関与する残基の特定。 (A) LaA認識に関与する残基の模式図。円弧はファンデルワールス相互作⽤を、点線はリガンドとの極性的な相互作⽤をそれぞれ表す。LaAから5Å以内に位置する他の残基も⽰している。残基はEMSAにおけるLanKへの影響によって⾊分けされている（⾚︓LaA認識に重要な残基（G132, Y136, S149, L152）で、それらの変異によりLanKはLaAに結合しなくなる。
緑︓LaA認識に関わる残基（M108, N125, I128, F160）で、それらの変異はLaAによるDNA放出を完全に無効にしない。⻘︓変異がLanKによるLaA認識に影響がない残基。 (B-E) 変異体のEMSAの結果。1: 10-1 kb DNA ladder (Thermo), 2: DNA, 3: DNA + LanK, 4: DNA + LanK + LaA, 5: DNA + G132Amutant, 6: DNA + G132A mutant + LaA, 7: DNA + Y136A mutant, 8: DNA + Y136A mutant + LaA, 9: DNA + S149A mutant, 10: DNA + S149A mutant + LaA。 (C) 1: 10-1 kb
DNA ladder (Thermo), 2: DNA, 3: DNA + LanK, 4: DNA + LanK + LaA, 5: DNA + M108A mutant, 6: DNA + M108A mutant + LaA, 7: DNA + N125A mutant, 8: DNA + N125Amutant + LaA, 9: DNA + Q145A mutant, 10: DNA + Q145A mutant + LaA。 (D) 1: 10-1 kb DNA ladder (Thermo), 2: DNA, 3: DNA + I128A mutant, 4: DNA + I128A mutant +LaA, 5: DNA + F157A mutant, 6: DNA + F157A mutant + LaA, 7: DNA + F160A mutant, 8: DNA + F160A mutant + LaA, 9: DNA + F161A mutant, 10: DNA + F161A mutant +LaA。 (E) 1: 10-1 kb DNA ladder (Thermo), 2: DNA, 3: DNA + L152A mutant, 4: DNA + L152A mutant + LaA, 5: DNA + H156A mutant, 6: DNA + H156A mutant + LaA, 7:DNA + L115A mutant, 8: DNA + L115A mutant + LaA, 9: DNA + R116A mutant, 10: DNA + R116A mutant + LaA。

図2 (A) 本研究で⽤いたランドマイシン（誘導体）の構造。
(B) EMSAの結果。1: 10-1 kb DNA ladder (Thermo), 2: DNA, 3: DNA +LanK, 4: DNA + LanK + 50 pM LaA, 5: DNA + LanK + 100 pM LaE, 6: DNA+ LanK + 100 pM LaD, 7: DNA + LanK + 100 pM aglycon, 8: DNA + 100pM LaA, 9: LanK.

■LanKの結晶構造解析
分解能2.4Åで決定されたアポ体のLanKの結晶構造は、TetR型転写調節因⼦に典型的なΩ型の⼆量体であった（図3(A)）。また、LanK-LaA複合体の結晶構造によって、LaAは⻑い糖鎖部分がリガンド結合トンネルに深く挿⼊して結合し（図2(B)）、アグリコンはLanKとの直接的な相互作⽤に関与しないことが明らかになった。
(A)

(B)

図3 (A) LanK-apo⼆量体のリボン図（⾚: molCのN末端ドメイン（NTD）、⻘: molDのNTD、グレー: molCのC末端ドメイン（CTD）、ライトグ
レー: molDのCTD、緑: molCとmolDのループL6-7, オレンジ: molCとmolDのヘリックスα6）。 (B) LanKとLaAとの複合体の結晶構造。

さらに、LaAの結合とヘリックスα6のループへの構造変化と連動して、α6に隣接するα4が、直線状に⼤きく構造変化することを⾒いだした（図3）。これにより、両プロトマーのNTDに存在する、DNA結合HLHモチーフが外側に移動することがわかった。
(A)

(B)

■LanKのランドマイシン認識による転写制御機構の全体モデル(A) リガンドフリーな状態では、LanKのα6（オレンジ）とL6-7（緑）はそれぞれヘリックス、ループ構造をしている。α6はα4（⽔⾊）と疎⽔的な相互作⽤を形成し、NTDと結合しているα4は曲がった構造を形成している。(B) 1分⼦のLaAの結合により、L6-7とα6の1つが構造変化する。α4は曲がったままであり、NTDは低LaA濃度では外側に開いていない。(C） 細胞内のLaA濃度が⼗分になると、LanKは2つのLaAと結合する。このとき、2つのLaAに沿って、L6-7はヘリックス構造に変化し、α6が完全にディスオーダーする。その結果、α4はα6との疎⽔的相互作⽤を⼀部失い、直線的な構造に変化し、NTDのHLHモチーフは外側に開き、LanK⼆量体はDNAを放出する。
(D) LaE の 糖 鎖 の1→2→3モチーフはLaAの4→5→6と同じであるため、その結合様式はLaAと類似すると予想される。そのため、アロステリックな構造変化により、LanKはDNAを放出すると考えられる。
(E）アグリコンはリガンド認識に必要ではないため、
Hexa は 、 LaA と 同 様 にDNAを放出するように働
図6 本研究によって提唱された、LanKのランドマイシン認識機構と転写調節くと推察される。

■謝辞〜ウクライナ リヴィウ国⽴⼤学との⼆国間共同研究〜(C)

図4 LaAによるLanKのアロステリックな構造変化。 (A) アポ体では、α6（紫とオレンジ）とL6-7（緑）は、それぞれヘリックスとループ構造をとっている。α6とその周囲のヘリックスは疎⽔性コアを形成し、α4（グレーとベージュ）と相互作⽤している。α4は短いループでHLHと結合しており、屈曲した構造を形成している。 (B）1分⼦のLaA結合により、L6-7がヘリックスを形成し、α6の1つがループ構造に変化する。
α4は依然として屈曲しており、HLHは外側に開いていない。 (C）2つのLaAが結合すると、LaAに沿うようにL6-7がヘリックス構造へと変化し、α6が完全にディスオーダーする。その結果、α4はα6との疎⽔的な相互作⽤を⼀部失い、直線的な構造をとるようになる。これにより、HLHが外側に開き（右）、LanK⼆量体はDNAを放出する。

本研究は、JSPS⼆国間交流事業の⽀援のもと、ウクライナ リヴィウ国⽴⼤学
Bohdan Ostash教授グループ、⽶国 タフツ⼤学 Clay S. Bennett教授との共同研究として⾏われました。
(A)(B)
EMSAアッセイを⾏っていただいたOstash教授、糖鎖の有機合成を⾏っていただいたBennett准教授をはじめとする、本研究に携わった全ての⽅々に⼼より感謝を申し上げます。
図7 ウクライナ リヴィウ国⽴⼤学への2度の訪問。
Ostash研究室と⽥中研究室の集合写真（(A) 2018年6⽉、(B) 2019年9⽉）。