本解析の特徴

illumina社シーケンサーを用いた食性解析や植物病原菌の菌叢解析に！

応用編

DNA増幅阻害/選択的増幅技術を用いた解析※価格は税別です１．
C3 spacer修飾を用いた
食性解析
解析費用は安価ですが、宿主DNAを完全に抑制することが難しく、また種特異的なブロッキングも困難です。予備的な実験に向いています。

＜解析の具体例＞

アジの餌生物の推定(COI領域)
スーパーで購入したアジの内臓を用いて、食性解析を行いました。
右下に、検出された生物由来のリード数を棒グラフで示します。
ターゲット 動物全般
ブロック アジ

アンプリコン
シーケンス解析
中面に料金早見表があります80%

スズキ目の一種

70%

ソコイワシ

60%

ツノナシオキアミ

未精製
1stPCR産物を送る でOK！

価格（税別）

50%

ヨコエソ

120,000 円/8サンプル

96,000 円/8サンプル

72,000 円/8サンプル

40%

サガミハダカ

30%

カサゴ

20%

マダコ科の一種

納期20営業日＊115営業日＊112営業日＊1

マアジ0%
BLOCKING

NT

個体 1BLOCKING

NT

個体 2NTBLOCKING

NT

個体 3BLOCKING

作業内容

DNA抽出〜データ解析

DNAの濃度測定〜データ解析

1stPCR産物の精製〜データ解析

試料：弊社提供のチューブの半分程度

DNA：濃度0.5 ng/ul以上、液量 20 ul以上

1stPCR産物（精製前）：液量 15 ul以上

※濃度は、蛍光法を用いた2本鎖DNAの定量結果を基準としています。
260 nmの吸光度ベースで定量されている場合は、上記より高めの濃度（5 ng/ul以上）が望ましいです。

アダプター配列付きのプライマーを弊社からご提供します（1,500円 ※送料込）。
ご希望の遺伝子領域をお知らせください。

個体 4

2．
人工核酸 Locked Nucleic Acid (LNA) を用いた食性解析

必ず弊社提供の粉砕用1.5 ml
チューブをご使用ください。
試料の種類（土壌、糞便など）と数をお知らせください。送料は弊社負担でお送りします。

＜追加料金＞
LNAブロッキングプライマー設計・合成費用ご提供サンプルと送付方法

60,000円/生物種※プライマーの設計・合成は10営業日程度かかります。

＜量の目安＞湿土壌 200-500 mg程度
マウス糞便 米粒大2-3粒

冷凍便 で送付ください。

PNA(Mito./Plastid)

納品物

8

18

冷蔵便 or 冷凍便 で送付ください（保存時と同じ温度帯がベストです）。

1サンプルあたり3〜5万リードペア程度

データ量※本解析では、種子にミトコンドリア由来DNAが少なく、Anti-mitochondriaの効果は検証できていません。

1

Illumina社 MiSeqまたはNextSeq 1000を用いて、2x300 bpの条件でシーケンシングを行います（他のお客様と相乗り）。

シーケンシング条件

牧草の種子を用いて、菌叢解析を行いました。

サンプル数が多いときは、8連チューブやプレートで送付ください。
1＜解析の具体例＞

種子の菌叢解析(16S rRNA V4領域）

1stPCR産物（未精製）の濃度測定は不要です。
できれば電気泳動を行い、目的の増幅産物が得られていることをご確認ください。

濃度を0.5 ng/ulに調製していただく必要はありません。
また、基準濃度未満でも、受け入れています。

3．
ペプチド核酸 Peptide Nucleic Acid (PNA) を用いた細菌叢解析

15,000円/8サンプル

・腸内細菌相や土壌細菌相などの微生物相だけでなく、あらゆる生物相に対応。
プ
ライマー配列のご指定も可能です。

抽出DNAを送る※プライマーの設計・合成は5営業日程度かかります。

＜追加料金＞
ライブラリー調製費用

・全ての工程を国内（自社内）で行うから、短納期です。

試料を送る

90%

10%

20,000円/生物種

解析費用は高価ですが、特異的なブロッキングが可能です。
弊社では、葉緑体とミトコンドリアの増幅を阻害するPNAを用いた解析に対応しています（16S rRNA V3/V4領域またはV4領域の解析でのみ可能です）。

・データ解析まで含まれたパッケージサービスです。

100%＜追加料金＞
C3 spacer修飾ブロッキングプライマー
設計・合成費用

解析費用は高価ですが、種特異的なブロッキングが可能です。

・1サンプルでもご注文可能です。

・報告書・シーケンス生データ（fastq形式）
・系統解析結果
・DDBJのデータベース登録に必要なデータダウンロード形式での納品となります。

Plastid

ターゲット 細菌

データ量が4 GBを超える場合は記録媒体での納品に変更させていただきます（目安は96サンプル超）。

ブロック ミトコンドリア由来DNA

葉緑体由来DNA

ご依頼の流れ*1 納期は初回のPCRで良好な増幅が確認された場合です。
再調製が必要な場合は追加日数をいただきます。

4．
LNA を用いた植物内生細菌叢・植物内生糸状菌叢の解析

他のシーケンサーを用いるアンプリコンシーケンス解析もあります＜解析の具体例＞

植物サンプルの真菌叢解析(ITS領域）

5営業日

短いアンプリコンでリード数が多くほしい

長いアンプリコンを解析したい

種子（ネギ）種子（イネ）ＬＮＡ処理＜追加納期＞

本チラシはこれ

根

ITS1からITS2領域をPCR法で増幅後、gITS7とITS4を用いてITS2領域のみを再度増幅して菌叢解析を行いました。

＜追加料金＞
ライブラリー調製費用

20,000円/8サンプル

植物由来のリード（黒い部分）

無処理

鹿児島大学農学部の池永先生・境先生が開発した、特許第5846496および特願2016-051621の遺伝子増幅方法を使用します。植物内生細菌選択的増幅プライマ
ーは16S rRNA V3/V4領域またはV4領域の解析のみ、植物内糸状菌選択的増幅プライマーはgITS-ITS4の解析のみ可能です。

まずは、お見積りをご依頼ください。弊社HPにお見積り依頼フォームをご用意しています。

根種子（ネギ）ターゲット 真菌種子（イネ）ブロック 植物由来DNA

存在割合（％）

シーケンサー

illumina社 MiSeq・NextSeq1000

MGI社 DNBSEQ T7・G400

PacBio社 Revio・Sequel lle

取得リード数3〜5万リードペア

100万リードペア

3万リード

解析長〜500 bp

150〜250 bp〜数 kb

解析費用（税別）

このチラシの通り

このチラシと同じ40,000円~/サンプル*2

納期（DNA送付の場合）

15営業日

25営業日

30営業日

*2 プライマー合成費用が別途20,000円/プライマーセット（税別）かかる場合があります1. 解析の流れ

2. 料金早見表

ライブラリー作製

PCR反応と精製を2回行い(2-step tailed PCR）、ライブラリーを作製します。その後、ライブラリーの濃度と品質を確認します。

シーケンシング解析

MiSeqまたはNextSeq 1000 (Illumina)を用いて、2x300 bpの条件でシーケンシングを行います（他のお客様と相乗り）。
菌叢解析用パイプラインQiimeを用いて解析を行い、「菌相組成の棒グラフ」や「ヒートマップ」などの形でデータの可視化まで行います。
一部の遺伝子領域(12S rRNAやCOIなど)は、「エクセルデータ」のみを提供いたします。
Qiime2.0（DADA2モデル）が標準です。
Qiime1での解析をご希望の方はお知らせください（追加料金は発生しません）。

16S rRNAやITS領域、18S rRNAの場合可視化データを納品
OTU htheatmap

菌相組成の棒グラフ

サンバ
ストチャ トサンバーストチャート

サンプル数

（税別）

抽出DNAを送る

1サンプルあたり

120,000円@20,000円

15,000円

1stPCR産物を送る

1サンプルあたり精製前でOK！

@15,000円

15,000円*4@15,000円*4120,000円

96,000円

72,000円

16240,000円

192,000円

144,000円*4

24360,000円

32

480,000円

40540,000円@13,500円

420,000円@10,500円

360,000円*448576,000円@12,000円

432,000円@9,000円

384,000円*4@8,000円*4288,000円@12,000円

216,000円*4@9,000円

616,000円@11,000円

448,000円@8,000円

392,000円@7,000円

64672,000円@10,500円

480,000円@7,500円

416,000円*4@6,500円

72720,000円@10,000円@10,000円*4504,000円@7,000円@7,000円

432,000円

＠6,000円*4@6,000円*4 1stPCR用のプライマー送付料金 1,500円/依頼が別途かかります。

12S rRNAやCOIの場合エクセルデータを納品

各ASVに対して、検出されたリード数と対応する生物種を示した「エクセルデータ」を提供致します。

3396

5673〜

132288,000円*4384,000円

サンプル数

2ndPCR産物（精製後・混合不要）を送る

1サンプルあたり

8@15,000円

（税別）

〜

データ解析

試料を送る

〜

DNA抽出*3

弊社は、糞便や土壌、水など様々なサンプルからの抽出実績があり、それぞれのサンプルに最適な抽出方法で行います。
その後、DNA濃度を測定します。

サンプル数が８の倍数でないときも、上記1サンプルあたりの単価で対応します。
例）
試料を18サンプル送る場合
16サンプルの場合の単価は@15,000円ですので、15,000円×18サンプル＝270,000円（税別）となります。

受け入れ可能ですが、価格は「1stPCR産物を送る」と同じです。
パッケージではなく、下記項目を足し合せた価格になります。

・シーケンシング解析
・データ解析
・プライマー送付

300,000円/式
サン
500円/プル
10,000円/回◆ シーケンシング解析の条件
MiSeq または NextSeq1000を用いて2×300 bpの条件で解析します。
◆データ量
トータル300-400万リードペア程度です。
◆納期
12営業日
（但し、他のお客様とのインデックスの重複がある場合、5営業日程度追加になります）◆ご提供サンプルと送付方法
濃度と液量は、10 ng/ul以上、20 ul 以上でお願いします。
精製済サンプルをプレート（または8連チューブ）に入れて冷蔵便 or 冷凍便で送付してください。

解析に用いるデータベース
遺伝子領域
細菌 16S rRNA
真菌 ITS
18S rRNAcMiFishその他

データベースGreengene・SILVA・Human Oral Microbiome Database より選べます。特にご指定がない場合はGreengeneを用いて解析します。EzBioCloud 16S Database を用いる場合は +10,000円/解析かかります。
UNITE
SILVA
魚類ミトコンドリアゲノムデータベースMitoFish とMiFish用参照配列
NCBI

3. オプション料金表価格

液体サンプルのフィルターろ過

4,000円/サンプル

PCR阻害物質の除去（ビーズ精製）

10,000円/8サンプル

1stPCR 4反復

16,000円/8サンプル

オプション

多様性解析の詳細はＨＰをご覧ください

機能予測解析
※細菌16Sのみ対応

機能予測解析の残サンプルの返却 ※送料込

2,500円/回

EzBioCloud 16S database使用 ※細菌16Sのみ対応

10,000円/解析

群間比較解析 ※細菌16S/真菌ITS/18Sのみ対応※グループ分けのパターンが複数ある場合は、追加1パターンごと10,000円

多様性解析

10,000円/解析

真核生物

18S rRNA：1422f-1642r┗ 多様性解析の統計解析

20,000円/解析

動物

COI：IntF-HCOmR

魚類*712S rRNA(cMiFish)

哺乳類*812S rRNA(MiMammal)

30,000円/解析

節足動物*916S rRNA(gInsect)※グループ分けのパターンが複数ある場合は、追加1パターンごと10,000円

鳥類*9 *1016S rRNA(gBird)

二枚貝*918S rRNA(gClam）

巻貝*918S rRNA(gSnail）

有尾目（イモリ類とサンショウウオ類）*912S rRNA(gSalamander)*3

Qiime2のdiversityプラグインを用いて、レアファクション解析(chao1やshannonなど)と主座標分析 (PCoA)を行います。
サンプルのグループ分けをご指示いただくことで、グループ単位での比較が可能です。
ベータ多様性はPERMANOVAで検定し、アルファ多様性はKruskal-Wallisで検定します。

┗ 機能予測解析の統計解析
PICRUSt2を用いて、菌叢解析結果を特定の機能(酵素・KEGG ID・代謝パスウェイ）へと紐づける予測を行います。サンプルのグループ分けをご指示いただくことで、グループ単位での比較が可能です。

コピー数の取得※細菌16Sのみ対応

機能予測解析と群間比較解析セット割引

30,000円/解析

各3割引
・リアルタイムPCR解析

コピー数の取得ます。
この観点から弊社におけるDNA抽出ノウハウに乏しいサンプルについてはお断りさせていただく場合がございます。

(gITSほど真菌類を広くカバーしていないが、植物由来DNAは増幅しにくい)

無尾目*916S rRNA(gFrog）

環形動物*916S rRNA(gWorm）

・リアルタイムPCR解析

線虫*9 *1118S rRNA(Ecdysozoa)

陸上植物*9rbcL(gPlant)

光合成生物（主に単細胞生物）*9psbA：psbA̲597f-psbA̲927r

褐藻*9rbcL(gKasso)

紅藻*9rbcL(gKoso)

カスタム

任意の領域 ※120 bp〜500 bp

リアルタイムPCR解析

8,000円/サンプル
・検量線作成20,000円（20サンプルごと）

ネットワーク解析

50,000円/解析

生息環境の推測 ※細菌16Sのみ対応

20,000円/解析*5 送付いただいたライブラリーが精製不足の場合、弊社で再精製を行います。
*6 アンプリコンシーケンス解析と同時にご依頼いただいた場合の価格です。
リアルタイムPCR解析と検量線作成の両方が必要です。

Q2.解析を依頼したい｡まず何をすればよい？

Q4.推奨のDNA抽出キットは？

ダウンロード形式で納品します。
＜データ内容＞
・報告書
・シーケンスデータ（fastq形式）
・データ解析結果
エクセルファイルと可視化データ、またはエクセルファイルのみ（遺伝子領域による）
・DDBJのデータベース登録に必要なデータ

特に推奨はございませんが、DNA精製工程が含まれているキットをお使いください。
精製されていないクルードサンプルを送付いただいた場合は、それに対応したPCR用酵素を用いる必要がございます。

納品デモデータは弊社HPからダウンロードできます

ITS2領域：fITS7 ‒ ITS4

20,000円（80サンプルごと）

まずは見積をご依頼ください。
弊社HPに見積り依頼フォームがあります。
すぐにチューブやプライマーが必要な方は、その旨もお知らせください。

DNAの返却は、2,500円（送料込・税別）で対応しています。
弊社では、解析完了後3カ月経過すると、サンプルを処分しますので、返却希望の場合はお早目にご連絡ください。
なお、試料やPCR産物の返却はできません。

(真菌類を広くカバーしているが、植物由来DNAが増幅する)・検量線作成Q1.納品物の内容は？

Q3.残サンプルの返却は可能？

ITS2領域：gITS7 ‒ ITS4

1反復

16S rRNA遺伝子配列と微生物の生息環境を網羅的に結びつけるデータベース「ProkAtlas」
を用いて、生息環境を推測します。

DNA 抽出は、対象生物やサンプルの状況によって抽出方法を最適化する必要がございます。
より良いデータを得るための非常に重要なステップであると位置づけており

真菌類

5,000円/サンプル

4反復

弊社からご提供させていただく専用チューブに入れて発送いただきます。サンプルの形状等により弊社で追加の作業が必要と判断した場合は別途料金をいただきます。

（植物由来DNAは増幅しにくい）

リアルタイムPCR解析*6

SpiecEasi（MB法）
を使用して、ネットワーク解析を行います。

また、サンプルの内容（例えば感染性の有無）によりお断りする場合がございます。

生物技研のアンプリコン
シーケンス解析についてのギモン・シツモン

ごめんね！
値上げ

30,000円/解析

LEfSeを用いて、比較する群間の違いと相関を示す微生物群の抽出やある現象の原因微生物の探索を行います。

リアルタイムPCR解析を行い、サンプル中の対象遺伝子のコピー数を測定します。
アンプリコンシーケンス解析の結果を相対値から絶対値に変換したデータをお返しします。

※細菌16Sのみ対応

16S rRNA V3/V4領域：341f-805r
ITS1領域：ITS1F̲KYO1 ‒ ITS2̲KYO2

・カスタム多型解析：取得した配列データをカスタム多型解析で解析すると、各アレルのリード数が得られます。

STAMPを用いて、比較するグループ間で機能予測解析結果に有意な差がみられるかを検定します。

生息環境の推測

16S rRNA V4領域：515F-806R
16S rRNA V4領域：515F-806RB
16S rRNA V1/V2領域：27Fmod-338R

・CRISPResso2を用いた解析：CRISPR-Cas9 によるゲノム編集後の配列・変異率が確認できます。

┗ 統計解析

ネットワーク解析細菌）はプライマーセット名

5,000円/8サンプル

機能予測解析 ※細菌16Sのみ対応┗ 統計解析

細菌と古細菌

対象領域 （ライブラリーのビーズ精製※細菌16S/真菌 ITS/18Sのみ対応

多様性解析

4. 対象遺伝子領域
ターゲット生物種

ゲノム編集結果の確認や多型を知りたい方には、以下の解析方法がオススメです。

*5

いずれも追加料金はかかりません。
お見積り時にどちらかご希望をお知らせください。
デモデータは弊社HPにご用意しています。

群間比較解析

（税別）

項目

Q5.データ解析のみを依頼できる？
可能です。
他社で取得されたデータでも対応しています。
弊社に解析いただいたデータであれば、納品後1ヵ月以内は、上記料金で追加解析も対応しています。
1ヵ月を過ぎると一部再解析手数料が発生します。

*7

MiFish-UとMiFish-E、MiFish-U2、MiFish-Ayu&Wakasagiを混合したプライマーセットとなり、名称変更しました。
*8 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
*9 自社で開発したプライマーでの解析です。
*10 鳥類は環境DNAへの移行が少なく、環境サンプルでは検出が困難な傾向にあります。
*11 植物由来DNAも増幅されます。

お問合せ・見積依頼・サンプル送付先
株式会社生物技研〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹657
tel: 042-780-8333 Email: dna@gikenbio.com