メタゲノムマイニングによる海洋無脊椎動物由来生物活性物質の探索
メタゲノムマイニングによる海洋無脊椎動物由来生物活性物質の探索
申 請 代 表 者
脇本 敏幸
申 請 代 表 者 脇本敏幸
所外共同研究者
江上 蓉子
所外共同研究者 江上蓉子
所内共同研究者
森田 洋行

所内共同研究者

森田洋行

北海道大学大学院薬学研究院天然物化学研究室
北海道大学大学院薬学研究院
北海道大学大学院薬学研究院天然物化学研究室
北海道大学大学院薬学研究院
天然物化学分野
和漢医薬学総合研究所天然物化学分野

教授
教授
助教
助教
教授
教授

【報告セミナー要旨】
【要旨】

【要旨】
海洋無脊椎動物の中でもとりわけ海綿動物は天然生物活性物質の宝庫として知られて海洋無脊椎動物の中でもとりわけ海綿動物は天然生物活性物質の宝庫として知られている。海綿動いる。海綿動物は付着性で大量の海水をろ過することで、有機物を摂取して生きており、この際に一過性に取り込む微生物とともに、多種多様な微生物が共生している。海綿動物物は付着性で大量の海水をろ過することで、有機物を摂取して生きており、この際に一過性に取り込が保有する多様な生物活性物質の多くは共生微生物によって生産されており、化学防御物む微生物とともに、多種多様な微生物が共生している。海綿動物が保有する多様な生物活性物質の多質として機能すると考えられている。それらの中には医薬品のリード化合物として有望視されるものが複数存在する。中でも、ハリコンドリン B は海綿由来の生物活性物質が抗が中には医薬品のリード化合物として有望視されるものが複数存在する。中でも、ハリコンドリン B はん剤開発に成功した例として記憶に新しい。
海綿由来の生物活性物質が抗がん剤開発に成功した例として記憶に新しい。
2000 年以降、シークエンス技術の革新的な進歩により、微生物ゲノムの解析が急速に
2000
年以降、シークエンス技術の革新的な進歩により、微生物ゲノムの解析が急速に進み、様々進み、様々な二次代謝産物の生合成遺伝子が明らかになってきた。希少医薬品資源である
海綿由来生物活性物質においても、その生合成遺伝子の取得は真の生産者の特定や異種発な二次代謝産物の生合成遺伝子が明らかになってきた。希少医薬品資源である海綿由来生物活性物質
現系の構築への礎となるため重要な研究課題である。しかし、海綿由来生物活性物質の生においても、その生合成遺伝子の取得は真の生産者の特定や異種発現系の構築への礎となるため重要
合成研究においては、共生微生物叢の複雑さや海綿メタゲノム調製の困難さが障害となっな研究課題である。しかし、海綿由来生物活性物質の生合成研究においては、共生微生物叢の複雑さてきた。
や海綿メタゲノム調製の困難さが障害となってきた。
このような背景のもと、最近我々は海綿 Discodermia calyx より単離された細胞毒性物
Discodermia calyx より単離された細胞毒性物質 calyculin
このような背景のもと、最近我々は海綿質 calyculin A の生合成遺伝子を取得し、その生産を担う共生微生物の同定に成功した。
A の生合成遺伝子を取得し、その生産を担う共生微生物の同定に成功した。本研究ではcalyculin A
本研究では calyculin A のみならず、他の生物活性物質や異種海綿動物においても同様の解析手法を適用し、生合成遺伝子の取得を試みるとともに、遺伝子情報に基づく新たな代のみならず、他の生物活性物質や異種海綿動物においても同様の解析手法を適用し、生合成遺伝子の謝産物 の特 定を 試み た。そ の結 果、 海 綿 D. calyx からは phosphocalyculin A や取得を試みるとともに、遺伝子情報に基づく新たな代謝産物の特定を試みた。その結果、海綿kasumigamide などの天然物を新たに単離することに成功した。さらに D. kiiensis から
D. calyx からは phosphocalyculin A や kasumigamide などの天然物を新たに単離することに成功した。
は lipodiscamide の生合成遺伝子クラスターを取得し、クラスター内にコードされた硫酸
さらに D. kiiensis からは lipodiscamide の生合成遺伝子クラスターを取得し、クラスター内にコード基転移酵素の存在から sulfolipodiscamide を新規化合物として同定するに至った。これらされた硫酸基転移酵素の存在からsulfolipodiscamideを新規化合物として同定するに至った。これらの化合物はいずれも海綿共生微生物
Entotheonella
によって生産されていることが明ら
Entotheonellaの化合物はいずれも海綿共生微生物によって生産されていることが明らかになった。
かになった。
これらの結果は、海綿動物由来生物活性物質の生合成遺伝子の取得が、生産菌の特定にこれらの結果は、海綿動物由来生物活性物質の生合成遺伝子の取得が、生産菌の特定につながるとつながるとともに、メタゲノムマイニングによる新規天然物の発見にも有効であることをともに、メタゲノムマイニングによる新規天然物の発見にも有効であることを示している。
示している。
くは共生微生物によって生産されており、化学防御物質として機能すると考えられている。それらの－ 94 －

■背景・目的
海洋無脊椎動物の中でもとりわけ海綿動物は天然生物活性物質の宝庫として知られている。海綿動
物は付着性で大量の海水をろ過することで、有機物を摂取して生きており、この際に一過性に取り込む微生物とともに、多種多様な微生物が共生している。海綿動物が保有する多様な生物活性物質の多くは共生微生物によって生産されており、化学防御物質として機能すると考えられている。それらの中には医薬品のリード化合物として有望視されるものが複数存在する。中でも、ハリコンドリン B は海綿由来の生物活性物質が抗がん剤開発に成功した例として記憶に新しい。
2000 年以降、シークエンス技術の革新的な進歩により、微生物ゲノムの解析が急速に進み、様々な二次代謝産物の生合成遺伝子が明らかになってきた。希少医薬品資源である海綿由来生物活性物質においても、その生合成遺伝子の取得は真の生産者の特定や異種発現系の構築への礎となるため重要な研究課題である。しかし、海綿由来生物活性物質の生合成研究においては、共生微生物叢の複雑さや海綿メタゲノム調製の困難さが障害となってきた。
こ の よ う な 背 景 の も と、 我 々 は 先 行 研 究 に お い て、Theonellidae 科 に 属 す る 海 綿 Theonella
swinhoei 及 び Discodermia calyx の ２ 種 お い て 二 次 代 謝 産 物 生 合 成 遺 伝 子 の 解 析 を 進 め、 遺 伝子 を コ ー ド す る 共 生 細 菌 の 同 定 に 成 功 し た。 同 定 し た 生 産 菌 は 新 門 Tectomicrobia 門 に 属 す る
Entotheonella 属難培養性細菌であり、ポリケタイドからペプチドなど多様かつ複雑な生物活性物質の生産を担う、物質生産に極めて秀でたバクテリアであった。従来、海綿動物からの二次代謝産物生合成遺伝子の取得は非常に困難とされてきたが、我々の研究によって海綿メタゲノムに基づく解析が実現可能であることを示すことができた。ひとたび生合成遺伝子が取得できれば、生産菌の特定のほか、詳細な生合成経路の解析やメタゲノムマイニングによる新規代謝産物の探索にも有用な情報が得られる。特にメタゲノムマイニングにおいては生合成産物が未同定な生合成遺伝子クラスターも同時に得られることが多く、新たな天然物の探索の重要な指標となる。そこで、本研究ではメタゲノムマ
イニングによって海綿由来二次代謝産物の生合成遺伝子の取得を試みるとともに、遺伝子情報に基づく新たな代謝産物の特定を試みた。

■結果・考察海綿Discodermia calyx のメタゲノムマイニングによる kasumigamide の単離
我々は伊豆半島産、海綿 D. calyx から calyculin 生合成遺伝子クラスターの取得に成功している。
その過程で calyculin 生合成遺伝子クラスターとは異なる PKS-NRPS ハイブリッドな全長約 37 kbpの生合成遺伝子を見出した。その生合成産物は不明であったため、主骨格を形成すると予想される
PKS-NRPS module の解析に着手した。PKS-NRPS 生合成遺伝子はオペロンとなっており、KasA、KasB、KasC に よ っ て 構 成 さ れ て い た。KasA は NRPS module で あ り N 末 端 側 か ら A ド メ イ ン（KasA-A1）、KR ドメイン（KasA-KR）、PCP ドメインとアノテーションした。A ドメインの基質結合サイトから基質選択性の予測を試みたが、過去に報告されたどの基質結合サイトとも類似性を見出すことはできなかった。KR ドメインは PKS の構成ドメインとして知られているが、NRPS の構成ドメインとしての報告例もある。KasA-KR に着目し BLASTp 検索を試みたところ aeruginosin の生合成遺伝子である AerA の KR ドメイン（AerA-KR）と 41% の相同性を有した。AerA の構成要素はKasA と同様に N 末端側から A ドメイン（AerA-A1）、KR ドメイン（AerA-KR）、PCP ドメインである。
AerA では AerA-A1 による phenyl pyruvic acid の認識及び、Aer-KR による phenyl pyruvic acid の α－ 95 －

位のケトンのヒドロキシル基への還元によって、D-phenyl lactic acid の伸長反応を担うことが推測されている。このことから、KasA も AerA 同様に D-phenyl lactic acid の伸長反応を行うと予想した。
KasB は PKS-NRPS ハイブリッドな module であり、その構成要素は N 末端側から C ドメイン、A ドメイン（KasB-A1）、PCP ドメイン、C ドメイン、A ドメイン（KasB-A2）、PCP ドメイン、KS ドメイン（KasB-KS）、AT ドメイン、KR ドメイン、ACP ドメインであった。KasB-A1 のアミノ酸選択性の予測を試みたところ、b-Ala を認識する既知の A ドメイン（TlmIV-M1）の基質結合サイトと完全に一致したことから、KasB-MA1 は b-Ala を基質として認識すると予想した。KasB-A2 に対しても同様の予測を試みたが、KasA-MA1 同様に過去に報告されたどの基質結合サイトとも類似性を見出すことはできなかった。Module 4 の PKS はその構成要素に KS ドメイン、KR ドメインを有することから b-hydroxyacyl 基の伸長に関与していると予想した。KasC は NRPS module であり、その構成要素は N 末端側から C ドメイン、A ドメイン（KasC-A1）、PCP ドメイン、E ドメイン（KasC-E1）、C ドメイン、A ドメイン（KasC-A2）、PCP ドメイン、E ドメイン（KasC-E2）、C ドメイン（KasC-C3）とアノテーションを行った。KasC-A1 の基質結合サイトは L-Arg を認識する PvdI-MA2 と良い相関を示すことから、KasC-A1 は L-Arg を認識すると予想した。一方で KasC-A2 は L-Phe を認識する Aドメインに広く保存されている結合サイトを有していた。また、KasC に含まれる２つの E ドメイン（KasC-E1 及び KasC-E2）はそれぞれ、L-Arg 残基、L-Phe 残基の立体反転を行い、D-Arg 残基及びD-Phe への変換を担うと予想した。PKS 及び NRPS の生合成遺伝子クラスターでは伸長されたポリケタイド鎖またはポリペプチド鎖と結合したホスホパンテテイン鎖からの切り出しが必要である。この切り出しに関与する酵素は幾つか知られており、代表的なものとして TE ドメイン、reductase ドメイン（R ドメイン）、C ドメインが挙げられる。TE ドメインはペプチド鎖をカルボン酸または分子内環化体として、R ドメインはアルデヒド体としてそれぞれ放出することが知られている。C ドメインの機能はペプチドの縮合反応が知られているが、TE ドメインと同様な加水分解反応も報告されている。今回見出した PKS-NRPS 生合成遺伝子クラスターには TE ドメインを見出すことができなかった。しかしながら、その代わりに KasC の C 末端に機能未知の C ドメイン（KasC-C3）の存在が明らかになった。したがって KasC-C3 がこの PKS-NRPS 生合成遺伝子において TE ドメインの代わりとして機能していると推測した。
続いて、PKS-NRPS 生合成遺伝子の周辺酵素の機能予測を行った。KasA-C の上流には b 位のヒドロキシル化酵素 CmlA と 39% の相同性を示す KasD を見出した。CmlA はクロラムフェニコールの生合成酵素の１つでありホスホパンテテイン鎖に結合した L-p-aminophenylalanine (L-PAPA) をL-p-aminophenylserine（L-PAPS）に変換する。KasC-MA2 の基質は L-PAPA のホモログであるL-Phe と予想した。よって、KasD は L-Phe 残基の b- ヒドロキル化による L-threo-3-phenylserine への変換を担うと考えた。また、CmlA は結晶構造解析がなされており活性中心が報告されている。
この活性中心は KasD でも保存されていた。これにより、CmlA と同様の機構で b- ヒドロキシル化が行われると考察した。KasD によって生じた L-threo-3-phenylserine は KasC-ME2 によってさらに D-erythro-3-phenylserine へ変換されると予想した。以上の機能予測よりこの機能未知の PKSNRPS 生合成遺伝子クラスターによる生合成産物を kasumigamide と予測した。続いて、予想した化合物またはその類似化合物が過去に単離報告されているか否かを SciFinder により検索した。その結果、淡水性シアノバクテリア Microcystis aeruginosa NIES 87 から初めて単離報告された抗藻活性を有する kasumigamide が候補に挙がった。Kasumigamide は海綿 D.calyx より単離報告さ－ 96 －

れた例は無いことから、今回見出した未知の PKS-NRPS 生合性遺伝子クラスターの生合成産物をkasumigamide またはその類縁体と予想し、海綿 D. calyx から新規化合物の探索を試みた。海綿 D.
calyx からの kasumigamide 及びその類縁体の探索を行った結果、2 kg の凍結海綿 D. calyx から 2.3mg の kasumigamide を単離した。この結果は、新規 PKS-NRPS 生合成遺伝子クラスター kasA-K がkasumigamide の生産に関与することを強く示唆するものであった。
海綿Discodermia kiiensis のメタゲノムマイニングによる sulfolipodiscamide 類の単離伊豆半島や紀伊半島に生息する Discodermia kiiensis には環状デプシペプチドである discodermin類が主要な二次代謝産物として含まれていることが知られている。また、よりマイナーな成分として紀伊半島産 D. kiiensis より discokiolide 類が報告されている。我々は 2014 年に伊豆半島産 D.
kiiensis より新規リポペプチド lipodiscamide 類を単離、構造決定した。環状構造内に２つのエステル結合を有し、シトルリン、ウレイドアラニン、デヒドロノルバリンなどの異常アミノ酸を含む特異な環状デプシペプチドであった。
日本産 D. kiiensis からは上記３つの特異な環状デプシペプチドが見出されている。しかし、それらの生合成遺伝子や生産菌の報告例はこれまで皆無であった。そこで、これら代謝産物の生合成遺伝子を取得し、その生産を担う共生微生物の同定を試みた。D. kiiensis の組織を人工海水に懸濁し、光学顕微鏡によって観察した結果、フィラメント状の特徴的な形態を有するバクテリア細胞が多数認められた。この形態は海綿共生細菌 Entotheonella 属の特徴でもあることから、それらを密度勾配遠心法によって分画し、エンリッチした画分からゲノムを抽出し、次世代シークエンサーによって解析した。その結果、discodermin 及び lipodiscamide の生合成遺伝子クラスターの取得に成功した。Discodermin に関しては NRPS の A domain の基質特異性を検討した結果、構成アミノ酸と良い一致を示した。Lipodiscamide に関してはクラスター内に予想外の硫酸基転移酵素がコードされていたため、硫酸化 lipodiscamide の存在が示唆された。そこで実際に海綿抽出液中の探索を行った。硫酸化体は比較的極性が高いことが予想されたため、海綿抽出液を液液分配して得られたブタノール層を Spehadex LH-20 カラムクロマトグラフィーによって分画し、網羅的な解析を進めた。その結果、lipodiscamide よりも分子量が 80 大きい化合物を検出した。80 マスユニットは硫酸基１個分に相当する。
Lipodiscamide の構造には水酸基は一つもないことから、硫酸化される部位として考えられる官能基は分子内に２つ存在するウレア残基のみであった。しかし、これまでに硫酸化ウレア構造を持つ天然物の報告例は皆無であったため、実際にそのような官能基が天然物として存在するかどうかは不明であった。そこで、各種２次元 NMR スペクトルの詳細な解析を行い、sulfolipodiscamide のシトルリン残基のケミカルシフトが lipodiscamide と大きく異なっていることが判明した。したがって硫酸基はシトルリンのウレア基に結合していることが分かった。マウス白血病細胞 P388 に対する細胞毒性試験の結果、新規化合物 sulfolipodiscamide の IC50 値は lipodiscamide より約 2 倍程度低濃度であった。以上の結果より D. kiiensis 由来の discodermin 類、lipodiscamide 類はいずれも海綿共生微生物
Entotheonella によって生産されていることが明らかになった。

■結論
海綿 D. calyx のメタゲノムマイニングによって kasumidemide を新たに見出した。D. kiiensis から－ 97 －

Lipodiscamide の構造には水酸基は一つもないことから、硫酸化される部位として考えられる官能基は分子内に２つ存在するウレア残基のみであった。しかし、これまでに硫酸化ウレア構造を持つ天然物の報告例は皆無であったため、実際にそのような官能基が天然物として存在するかどうかは不明であった。そこで、各種２次元 NMR スペクトルの詳細な解析を行い、sulfolipodiscamide のシトルリン残基のケミカルシフトが lipodiscamide と大きく異なっていることが判明した。したがって硫酸基はシトルリンのウレア基に結合していることが分かった。マウス白血病細胞 P388 に対する細胞毒性試験の結果、新規化合物 sulfolipodiscamide の IC50 値は lipodiscamide より約 2 倍程度低濃度であった。以上の結果より D. kiiensis 由来のdiscodermin 類、lipodiscamide 類はいずれも海綿共生微生物 Entotheonella によって生産されていることが明らかになった。

は lipodiscamide の生合成遺伝子クラスターを取得し、クラスター内にコードされた硫酸基転移酵素結論の存在から sulfolipodiscamide を新規化合物として同定するに至った。これらの化合物はいずれも海海綿 D. calyx のメタゲノムマイニングによって kasumidemide を新たに見出した。D. kiiensis からは lipodiscamide の生合成
綿共生微生物 Entotheonella によって生産されていることが明らかになった。これらの結果は、海綿遺伝子クラスターを取得し、クラスター内にコードされた硫酸基転移酵素の存在から sulfolipodiscamide を新規化合物として動物由来生物活性物質の生合成遺伝子の取得が、生産菌の特定につながるとともに、メタゲノムマイ同定するに至った。
これらの化合物はいずれも海綿共生微生物Entotheonellaによって生産されていることが明らかになった。
これらの結果は、海綿動物由来生物活性物質の生合成遺伝子の取得が、生産菌の特定につながるとともに、メタゲノムマイニ
ニングによる新規天然物の発見にも有効であることを示している。
ングによる新規天然物の発見にも有効であることを示している。

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