ＬＡＭＰプライマー
カスタムオリゴ(固定塩基)シリーズ
LAMP法のプライマーが簡単に注文可能！
論文で公開されているプライマーを販売サイト e Genome Order ( https://genome.e-mp.jp/ )を通じ簡単に注文できます。

ラインナップVIM
OXA-48-like

NDM
IMPKPCLAMP法とは・・・
LAMP （Loop-Mediated Isothermal Amplification ） 法は、栄研化学が独自に開発した、迅速、簡易、精確な遺伝子増幅法です。
標的遺伝子の6つの領域に対して4種類のプライマーを設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることを特徴とします。
※LAMP法の詳細についてはEiken GENOME SITE ( http://loopamp.eiken.co.jp/ ) をご参照ください。

簡易、迅速に目的遺伝子の検出が可能
サンプル、プライマー、増幅試薬を混ぜ、一定温度(60～65℃)でインキュベートするだけ。
迅速に1ステップで目的遺伝子の検出ができます。

簡易な検出が可能
増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる濁りを測定することにより、増幅の有無を確認できます。また、別売のLoopamp蛍光・目視検出試薬をあらかじめ添加しておくことで、増幅反応の蛍光を目視で確認することができます。

製品一覧
項目名VIM

NDM

KPC

製品名

製品コード

項目名

製品名

製品コード

固定塩基【VIM】（ユーロフィン）

COP120固定塩基【VIM】Ｓ（ニッポンジーン）

CNE121

固定塩基【VIM】Ｌ（ニッポンジーン）

CNE122

固定塩基【OXA】Ｌ（ニッポンジーン）

CNE152

固定塩基【NDM】（ユーロフィン）

COP130固定塩基【IMP】（ユーロフィン）

COP160固定塩基【NDM】Ｓ（ニッポンジーン）

CNE131

固定塩基【IMP】Ｓ（ニッポンジーン）

CNE161

固定塩基【NDM】Ｌ（ニッポンジーン）

CNE132

固定塩基【IMP】Ｌ（ニッポンジーン）

CNE162

固定塩基【KPC】（ユーロフィン）

COP140固定塩基【KPC】Ｓ（ニッポンジーン）

CNE141

固定塩基【KPC】Ｌ（ニッポンジーン）

CNE142OXA-48-likeIMP

固定塩基【OXA】（ユーロフィン）

COP150固定塩基【OXA】Ｓ（ニッポンジーン）

CNE151・ カスタムオリゴ（固定塩基）は栄研化学の製品ではございません。
・ 陽性コントロールは添付されておりませんので、別途ご用意ください。
・ ニッポンジーン社製の固定塩基には、保証収量の異なるSとLの2種類がございます。

関連製品（栄研化学）
製品名

包装単位

製品コード

Loopamp DNA増幅試薬D

96テスト分LMP207

Loopamp PURE DNA抽出キット

90テスト

LMP802

項目名
Loopamp 蛍光・目視検出試薬

包装単位

製品コード

96テスト分

LMP221

船島由美子,菅原和行,平田雄哉,加藤匡平,佐藤謙一,佐々木泰治,永沢善三,梅村創:
LAMP法を用いた簡易・迅速なCarbapenemase Big Five Gene分析の試み:
JARMAM Vol.28(2), p.8-14, 2018に基づき著者の了承を経て一部改変

サンプル溶液の調製

マスターミックスの調製(1テストの分量)

検体：培養したコロニー

Primer Mix.
100mM KCl

18.0µL
5.0µL

Total23.0µL

アルカリ煮沸法
またはPURE DNA 抽出キット(栄研化学)(詳細は3.DNA抽出法を参照)

反応チューブ( Dried DNA Amplification Reagent )にマスターミックスを23.0µLずつ分注

サンプル溶液を2µL添加

リアルタイム濁度測定装置に反応チューブをセット
LAMP反応 63.0℃, 60分間
単項目測定をする場合は下記条件を推奨
VIM 65℃,60分 OXA-48-like 63℃*,60分
NDM 63℃,60分 IMP
61℃, 60分
KPC 65℃,60分*著者の了承を経て 65℃ を 63℃ に改変

リアルタイム濁度測定 ・ 判定

注：本検査法は、Carbapenemase Geneを検出するためのものです。
医療行為および人、動物に対する臨床診断等の目的では使用できません。

VIM-1NDM

KPC

OXA-48-like

IMP

終濃度

1test

100test

1test

100test

1test

100test

1test

100test

1test

100testFIP(40pmol)

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

BIP(40pmol)

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

0.4μL

40μL

FL(20pmol)

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

BL(20pmol)

0.2μL

20μL

――

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

0.2μL

20μL

F3(5pmol)

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL

5μL

B3(5pmol)

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL5μL

0.05μL

5μL

Distilled Water

16.7μL

1670μL

16.9μL

1690μL

16.7μL

1670μL

16.7μL

1670μL

16.7μL

1670μL

Total volume

18.0μL

1800μL

18.0μL

1800μL

18.0μL

1800μL

18.0μL

1800μL

18.0μL

1800μL(1) マスターミックス調製用滅菌チューブに各試薬を必要なテスト数分、下表の割合（1 テストあたり）で分注します。

※ 蛍光目視検出試薬を使用する場合は、Fluorescent Detection Reagent 1µL/テストを用い、1テスト当たりのPrimer Mix量を1µL減らしてください(Primer Mix作成時のDistilled Water量を減らして調整してください)。

(2) 分注後、チューブを軽く数回叩いて混合（タッピング）するか、又は転倒混和あるいはボルテックスミキサー(1秒間×3回)での攪拌により十分混合した後、微量簡易遠心機でスピンダウンし、これをマスターミックスとします。
なお、調製したマスターミックスはすぐに使用してください。

Multiplex Real-Time PCR Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) and New Delhi metallo-β-lactamase (NDM-1)
Background (https://www.cdc.gov/hai/pdfs/labsettings/KPC-NDM-protocol-2011.pdf) に準拠

トリプチケースソイ5％ヒツジ血液寒天培地にて増菌培養した後のコロニーを検体として使用

操作手順
１．1.5mL遠心チューブに滅菌精製水を25µL加え1µL白金耳で採取した菌を懸濁する
２．各サンプルに0.1N NaOHを25µL加え、転倒混和
３．95～99℃で10分間加熱
４．氷上で3～5分間冷却し、0.5M Tris-HCl（pH8.0）を18µL加え中和
５．各チューブに冷却した滅菌精製水を400µL加え、転倒混和しタッピングする
６．16.1 RCF*で3分間遠心した後、上清（約400µL）を新しいチューブに移し、サンプル溶液**とする（-20～30℃で保存）* 16.1 RCF（16.1×g）は、微量簡易遠心機（ローター径：約4cm）で約600rpm、微量高速遠心機（ローター径：約7cm）で約450rpmに相当します。
** DNA以外の夾雑物混入の高い抽出液はTE液で10倍希釈したサンプル溶液を推奨します。

操作手順
１．増菌培養後のコロニーを10µL白金耳を用い釣菌し1mLの滅菌精製水に懸濁する
２．懸濁液60µLをPURE DNA抽出キットの説明書に従い抽出し、サンプル溶液とする(1) DNA増幅試薬の中から、反応チューブ( Dried DNA Amplification Reagent )を必要本数分用意します。
(2) 反応チューブに、マスターミックスを 23µLずつ分注します。（氷冷）(3) サンプル溶液 2µLを添加し全量を 25µLとします。（氷冷）(4) 蓋を閉めた後、反応チューブを転倒して溶液を蓋に移し、転倒状態のまま2 分間静置します。（氷冷）(5) 反応チューブを5 回転倒混和後、8 連マイクロチューブ用簡易遠心機でスピンダウンします。

※ LAMP反応は、Loopampリアルタイム濁度測定装置（LoopampEXIA、 LA-320C : 販売終了、 RT-160C :販売終了）をご使用ください。

(1) Loopamp リアルタイム濁度測定装置の反応条件は、以下の通りです。
<LAMP反応条件>
63.0℃、60分<酵素失活条件>
80℃, 5分間又は95℃, 2分間(2) Loopamp反応チューブの蓋が確実に閉まっていることを確認した後、装置にセットし、反応を開始します。
(3) LAMP反応終了後、80℃, 5分間又は、 95℃, 2分間の酵素失活を行い反応を停止させます。
（Loopampリアルタイム濁度測定装置の場合は、自動的に移行します。）(4) 判定は、自動的に行われます。
※ 蛍光目視による検出の場合、紫外線照射装置（波長240~260nm、又は350~370nm）を用いて反応チューブ底面より紫外線を照射して反応チューブの側面より観察し、陽性対照と同様に緑色の強い蛍光を発すれば陽性、陰性対照と同様に蛍光を発しなければ陰性と判定します。

※ 注意事項反応後のチューブはキャップを開けずに、焼却処理又は密閉できるビニール袋を二重に施し、廃棄の基準に従って処理してください。増幅産物の飛散防止のため、廃棄の際にオートクレーブ処理は行わないでください。