漢方薬と西洋薬の有機アニオントランスポーターを介する薬物相互作用に関する研究
申 請 代 表 者
所内共同研究者

牧野手塚利明康弘

名古屋市立大学大学院薬学研究科生薬学分野
資源開発部門 化学応用分野（現 資源開発部門 天然物化学分野）

准教授
准教授

【報告セミナー要旨】【目的】現代医療の中での漢方薬の利用の拡大に伴い，西洋薬との薬物相互作用に関する医薬品情報が求められている。2007 年に報告された GFJ による有機アニオン輸送ペプチド（OATP）1A2 阻害による fexofenadine の消化管吸収抑制作用は，原因成分がフラボノイド配糖体であり，柑橘系果物を基原とする生薬，陳皮や枳実にも阻害作用を示すのに十分な量が含まれていることが明らかになっている。このことから，漢方薬においてもその機序による薬物相互作用が引き起こされることが懸念される。
これまで演者は，ラットを用いて漢方薬と fexofenadine 間の薬物相互作用の検討を試みたが，ラットでは GFJ により fexofenadine の吸収が促進されてしまい，基礎研究成果を臨床へ応用することは困難な結果であった。
そこで本研究では，ヒトの小腸に発現する OATPs のうち，すでに消化管吸収に関する薬物相互作用を起こすことが知られている OATP1A2 と OATP2B1 をとりあげ，ヒト由来細胞を用いた強制発現細胞を用いた実験系により生薬・漢方薬の OATPs に対する阻害力価を測定し，臨床へ応用するための基礎的なデータを集めることを目的としている。
【方法】市販のヒト小腸 cDNA ライブラリーから，OATP1A2 と OATP2B1 遺伝子をクローニングし，pCI-neo ベクターに組み込んだ。ヒト腎臓由来 HEK293 細胞へそれら遺伝子をリポフェクション法により導入し，OATP1A2 または OATP2B1 を一過性に発現させた。コントロールとして，空ベクターを導入した mock 細胞を利用した。OATP1A2 および OATP2B1 の基質として fexofenadine，atorvastatin，[ 3H]estronesulphate を選択し，各種漢方薬を含む培地とともに細胞を 10 分間処理し，細胞内に取りこまれた薬物量を LC/MS/MS または放射活性により測定した。
【結果】Fexofenadine の OATP1A2 を介する細胞内への輸送は，500 μg/mL の小青竜湯および小柴胡湯で有意に阻害された。一方，atorvastatin の細胞内への輸送は，mock 細胞，OATP2B1 導入細胞
ともに，500 μg/mL の防風通聖散により促進する傾向が見られた。そこで，OATP2B1 導入細胞ではestronesulphate を基質として使用したところ，500 μg/mL の防風通聖散，釣藤散，大柴胡湯により，OATP2B1 を介する estronesulphate の輸送ほぼ完全に阻害された。
【考察】今回の 500 μg/ml という濃度は，計算上ではヒトの消化管内で十分に起こりうる濃度であるが，培養細胞実験としてはかなり高い濃度であり，今後，低濃度時の阻害力価が求められる。また，今回選んだ漢方薬には陳皮や枳実を含まないことから，漢方薬に配合される生薬にはフラボノイド配糖体以外にも OATP 阻害作用をもつ化合物が含まれている可能性が示唆された。

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■背景・目的
現代医療の中での漢方薬の利用の拡大に伴い，西洋薬と併用される機会が増えてきており，西洋薬との薬物相互作用に関する医薬品情報が求められている。医薬品と薬物相互作用を引き起こす代表的な天然由来素材であるグレープフルーツジュースは，含有成分のフラノクマリン類が消化管上皮細胞におけるシトクロム P450 (CYP) 3A4 や P 糖タンパク質 (MDR1) を阻害することでその基質となる多くの薬物の血中濃度を高めることが知られている。しかし，漢方薬の場合は臨床使用量では CYP3A4を阻害するだけのフラノクマリン類を含んでおらず，現代医療の場において漢方薬と西洋薬との間では，それらを介する薬物相互作用は起こらないものと推定される。
ところで，2007 年にグレープフルーツジュースが有機アニオン輸送ペプチド（OATP）1A2 を阻害することでそれを介して消化管から吸収されるフェキソフェナジンの血中濃度を低下させるという薬物相互作用が報告された。その原因成分はフラボノイド配糖体であるナリンギンとされ，その50% 阻害濃度（IC50）は 3.6 μM であった（Bailey D.G., et al., Clin Pharmacol Ther, 81, 495–502,2007）。この濃度は，陳皮や枳実などの柑橘系果物を基原とする生薬でも十分に含まれている濃度であったことから，申請代表者はラットを用いてそれらとフェキソフェナジン間の薬物相互作用について検討し，ヒト１回常用量に相当する枳実エキスとフェキソフェナジンとの併用により，フェキソフェナジンの消化管吸収が有意に抑制されたことを報告した（2009 年和漢医薬学会大会にて発表）。しかし，ラットではグレープフルーツジュースがフェキソフェナジンの吸収を抑制しないどころかむしろ促進するなど，ラットにおける OATPs の分子種や活性がヒトとは大いに異なり，臨床へ応用するためには困難な結果であった。
そこで本研究では，ヒトの小腸に発現する OATPs のうち，すでに消化管吸収に関する薬物相互作用を起こすことが知られている OATP1A2 と OATP2B1 をとりあげ，ヒト由来細胞を用いた強制発現細胞を用いた実験系により生薬・漢方薬の OATPs に対する阻害力価を測定し，臨床へ応用するための基礎的なデータを集めることを目的とした。

■方法
OATP1A2 と OATP2B1 をコードする open reading frame を，ヒト小腸 cDNA ライブラリー（タカラバイオ，大津）から DDBJ/EBI/GenBank DNA databases 番号，BC042452 および BC041095 に基づいたプライマーを用いた PCR 法により増幅させ，pCI-neo 発現ベクター（Promega，Madison，WI，USA）にサブクローニングした。
ヒ ト 腎 臓 由 来 HEK293 細 胞（American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA） は，
10% ウ シ 胎 児 血 清（FBS，Thermo ScientiÀc，Waltham，MA) ，penicillin-streptomycin mixedsolution ( ナカライテスク，京都 ) を含む Dulbecco's ModiÀed Eagle's medium (DMEM，ナカライテスク ) を用いて培養した。20 μg/ml の poly-L-lysine（Sigma Aldrich，St. Louis，MO，USA）でコーティングした 24 well プレート ( 日本ジェネティクス，東京 ) に，HEK293 細胞を 1.5 × 105 cells/wellとなるように播種し，24 時間，培養した。そこへ，OATP1A2 または OATP2B1 を含む pCI-neo ベクター
を Hilly Max 試薬（同仁化学，熊本）を用いたリポフェクション法により導入し，OATP1A2 またはOATP2B1 を一過性に発現させた。コントロールとして，空ベクターを導入した mock 細胞を利用した。
細胞を 48 時間培養後，OATP1A2 および OATP2B1 の基質である fexofenadine（LKT Laboratories，
St. Paul，MN，USA），atorvastatin（LKT Laboratories），または [3H]estrone sulphate（Waltham，− 36 −

MA，USA）と各種漢方薬エキスを含む Hank's バランス緩衝液（HBSS）を添加して 10 分間処理し，氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞表面を洗浄後，50% エタノールで細胞内容物を抽出し，細胞内に取りこまれた薬物量を LC/MS/MS または放射活性により測定した。また，細胞残留物は 0.2M
NaOH で 溶 解 し，HCl で 中 和 後，BCA protein assay kit（Thermo Fisher ScientiÀc，Rockford，IL，USA）でタンパク質量を測定した。細胞内への取り込み量は，以下の条件の LC/MS/MS または放射活性で定量した薬物量を，細胞のタンパク質量で補正した値により求めた。LC/MS/MS の条件は，以下の通りである：システム，Quattro Premier XE（Waters, Milford, MS, USA)；カラム，Inertsil ODS-3, 2.1 x 100 mm, 3 μm (GL サイエンス，東京 )；移動層，0.5% 酢酸 (A)：0.5% 酢酸入りアセトニトリル (B)，50% B → 95% B (0 → 4 min，フェキソフェナジン )，40% B → 96% B →96% B (0 → 2.5 → 4 min，アトロバスタチン )，0.2 ml/min；検出，ESI(+) モード，フェキソフェナ
ジン [M+H+] 502.3 → 171.0 (2.9 分），アトロバスタチン [M+H+] 559.4 → 250.11（3.7 分），フェキソフェナジンに対する内部標準としてジフェンヒドラミン（[M+H+] 255.9 → 166.8，2.8 分）を，ア
トロバスタチンに対する内部標準としてプラバスタチン（[M+H+] 447.4 → 327.3，2.8 分）を使用し，それぞれ 2 − 500 nM の濃度範囲で良好な直線の検量線を得た (r2 > 0.98)。
漢方薬の調製に使用した生薬は，大晃生薬（名古屋）から購入した。小青竜湯（麻黄 3 g・桂皮 3 g・
芍薬 3 g・甘草 3 g・半夏 6 g・乾姜 3 g・細辛 3 g・五味子 3 g），小柴胡湯（柴胡 7 g・黄䊫 3 g・芍薬
3 g・半夏 5 g・甘草 2 g・大棗 3 g・枳実 2 g・生姜 1 g・大黄 1 g），大柴胡湯（柴胡 6 g・黄䊫 3 g・人参 3 g・半夏 4 g・甘草 2 g・大棗 3 g・生姜 1 g），補中益気湯（人参 4 g・白朮 4 g・茯苓 1 g・甘草 1.5g・大棗 2 g・黄耆 4 g・陳皮 2 g・柴胡 2 g・当帰 3 g・生姜 0.5 g・升麻 1 g），麦門冬湯（麦門冬 10 g・人参 2 g・粳米 5 g・甘草 2 g・大棗 3 g・半夏 5 g），釣藤散（石膏 3 g・釣藤鈎 3 g・菊花 3 g・陳皮 3 g・麦門冬 3 g・防風 3 g・甘草 1 g・人参 3 g・半夏 3 g・茯苓 3 g・生姜 1 g）防風通聖散（麻黄 1.2 g・石膏 2 g・甘草 2 g・生姜 0.3 g・当帰 1.2 g・芍薬 1.2 g・川芎 1.2 g・大黄 1.5 g・芒硝 0.7 g・白朮 2 g・
連翹 1.2 g・桔梗 2 g・薄荷 1.2 g・黄䊫 2 g・荊芥 1.2 g・防風 1.2 g・滑石 3 g・山梔子 1.2 g）をそれぞれ調剤し，600 ml の水で 60 分間煎じることにより得た湯液を凍結乾燥し，乾燥エキスを得た。
統計処理は，一元配置分散分析（ANOVA）と Dunnet の多重比較検定を使用し，危険率 p 値が 5% 未満の時を統計学的に有意とした。

■結果・考察はじめにヒト小腸 cDNA ライブラリーからクローニングした OATP1A2，2B1 の機能の確認を行った。OATP1A2 の基質として，実際の臨床試験においてグレープフルーツジュースにより吸収の阻害が確認されているフェキソフェナジンを，OATP2B1 の基質として脂質異常症用薬であるアトロバスタチンを使用した。HEK293 細胞への遺伝子導入の方法，薬物の濃度，取り込み時間などの条件を検討した結果，フェキソフェナジンでは 25 μM，アトロバスタチンでは 5 μM の濃度で 10 分間細胞を処理することにより，空ベクターを導入した mock 細胞に対して，OATP1A2 導入細胞で有意なフェキソフェナジンの輸送と，OATP2B1 導入細胞でのアトロバスタチンの有意な輸送が確認できた（図１）。

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図１ OATP1A2 および 2B1 を導入した HEK293 細胞に対するフェキソフェナジンとアトロバスタチンの輸送ࡈࠚࠠ࠰ࡈࠚ࠽ࠫࡦߪ -‫ ߪࡦ࠴࠲ࠬࡃࡠ࠻ࠕޔ‬- ߩỚᐲߢ‫⚦ޔ‬⢩ߦኻߒߡಽ㑆૞↪ߐߖߚ‫ޕ‬࠺࡯࠲ߪᐔဋ୯ r ᮡḰ⺋Ꮕ n  ߢ␜ߒߚ‫ޕ‬P  P  +(#%!'%*&,*$$)(#*") &"t)()‫ޕ‬

図２OATP1A2 を介するフェキソフェナジン輸送に対する小青竜湯の作用ࡈࠚࠠ࠰ࡈࠚ࠽ࠫࡦߪ - ߩỚᐲߢ‫ޔ‬ዊ㕍┥ḡࠛࠠࠬߪ  - #" ߩỚᐲߢ⚦⢩ߦኻߒߡಽ㑆૞↪ߐߖߚ‫ߪ࠲࡯࠺ޕ‬ᐔဋ୯ r ᮡḰ⺋Ꮕ n  ߢ␜ߒߚ‫ ޕ‬P  +(#%!'%*&,*$$)(#*") &"t)()‫ޕ‬

次に，OATP1A2 を介するフェキソフェナジンの輸送に対する漢方薬の作用について検討した。フェ
キソフェナジンは抗アレルギー薬であり，花粉症によく使用されるため，併用される機会の多い漢方薬として小青竜湯を選択した。小青竜湯エキスは，OATP1A2 を介するフェキソフェナジンの輸送を，500 μg/ml の濃度でほぼ完全に阻害してした（図２）。小青竜湯には，既知の OATP1A2 阻害活性を持つフラボノイド配糖体を多く含んでいる陳皮や枳実などなどの生薬を含まないため，小青竜湯にはOATP1A2 阻害作用をもつ未知の化合物を含有する生薬が配合されていることが予想された。小青竜− 38 −

湯１回量の煎液の濃度は約 10 mg/ml であり，本実験で採用した 500 μg/ml という濃度はそれを 20 倍に希釈した濃度である。ヒトが薬物を摂取する時には，消化管内液で 10 倍程度に希釈されるといわれていることから，本実験における濃度は，実際のヒト消化管内でも起こりうる濃度と考えられる。
このことから，小青竜湯とフェキソフェナジンは，臨床において OATP1A2 を介する薬物相互作用が起こる可能性が示唆された。
同様に，他の漢方処方の OATP1A2 に対する作用について検討した。小柴胡湯，補中益気湯，麦門冬湯各エキスをそれぞれ 500 μg/ml の濃度で作用させたところ，小柴胡湯で有意な OATP1A2阻害作用が確認され，補中益気湯，麦門冬湯では有意な抑制は認められなかった（図３）。一方，
OATP1A2 の遺伝子を導入していない mock 細胞において，有意差はないものの，フェキソフェナジンの細胞内への移行を補中益気湯が促進する傾向が見られた。フェキソフェナジンは，細胞の内側から外へと薬物を排出するトランスポーターである P 糖タンパク質の基質でもあることが知られており，そのような排出型のトランスポーターを補中益気湯が阻害する可能性が示唆された。



図３

OATP1A2 を介するフェキソフェナジン輸送に対する漢方薬の作用ࡈࠚࠠ࠰ࡈࠚ࠽ࠫࡦߪ - ߩỚᐲߢ‫ޔ‬ฦṽᣇ⮎ࠛࠠࠬߪ  - #" ߩỚᐲߢ⚦⢩ߦኻߒߡಽ㑆૞↪ߐߖߚ‫ߪ࠲࡯࠺ޕ‬ᐔဋ୯ r ᮡḰ⺋Ꮕ n  ߢ␜ߒߚ‫ޕ‬P  P  +(#%!'%*&,
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次に，OATP2B1 に対する漢方薬の作用について検討した。OATP2B1 の代表的な基質であるア
トロバスタチンやグリベンクラミドは，脂質異常症や糖尿病に使用される薬物であることから，防風通聖散をまずはじめに選択した。防風通聖散エキスを 500 μg/ml の濃度で作用させたところ，OATP2B1 を導入していない mock 細胞において，防風通聖散エキスはアトロバスタチンの細胞への取り込みを増加させる傾向が認められ，OATP2B1 遺伝子導入細胞においては，防風通聖散エキスは有意にアトロバスタチンの細胞への取り込みを増加させた（図４）。アトロバスタチンの場合は，フェキソフェナジンよりも排出系トランスポーターの基質として認識されやすく，漢方薬の排出系トランスポーター阻害作用の影響を受けやすい可能性が推測された。以上のことから，OATP1A2 やOATP2B1 を介する西洋薬と漢方薬の薬物相互作用を検討するためには，P 糖タンパク質などの排出型のトランスポーターの基質にならない物質を用いて実験を行うなどの改善が必要であると考えられた。

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図４

OATP2B1 を介するアトロバスタチン輸送に対する防風通聖散の作用ࠕ࠻ࡠࡃࠬ࠲࠴ࡦߪ  - ߩỚᐲߢ‫ޔ‬㒐㘑ㅢ⡛ᢔࠛࠠࠬߪ   - #" ߩỚᐲߢ⚦⢩ߦኻߒߡಽ㑆૞↪ߐߖߚ‫ߪ࠲࡯࠺ޕ‬ᐔဋ୯ r ᮡḰ⺋Ꮕ n  ߢ␜ߒߚ‫ޕ‬P  P  +(#%!'%*&,
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図５

OATP2B1 を介するエストロン硫酸輸送に対する漢方薬の作用ಽ㑆૞↪ߐࠛࠬ࠻ࡠࡦ⎫㉄ߪ  - ߩỚᐲߢ‫ޔ‬ฦṽᣇ⮎ࠛࠠࠬߪ   - #" ߩỚᐲߢ⚦⢩ߦኻߒߡߖߚ‫ߪ࠲࡯࠺ޕ‬ᐔဋ୯ r ᮡḰ⺋Ꮕ n   ߢ␜ߒߚ‫ޕ‬P    +( #%! '%*& , *$$)(#*") &"t)()‫ޕ‬

そこで，OATP2B1 を導入した細胞において，有機アニオントランスポーターで輸送される典型的な基質であるエストロン硫酸を用いて，同様の実験を行った。漢方薬として防風通聖散のほか，高血圧に適応をもつ釣藤散と大柴胡湯を選択した。その結果，防風通聖散，釣藤散，大柴胡湯，各エキスとも 500 μg/ml の濃度で，完全に OATP2B1 の機能を阻害した（図５）。従って，それらの処方はOATP2B1 を介して消化管から吸収される薬物と相互作用を示す可能性が示唆された。
本実験では，消化管上皮細胞を用いること，対象としたトランスポーターは細胞膜上に発現しているものであり消化管内で漢方薬中の成分が直接的に培養細胞に触れることから，和漢薬研究における− 40 −

「ふりかけ実験」に対する批判には該当しない。今回の 500 μg/ml という濃度は，計算上ではヒトの消化管内で十分に起こりうる濃度であるが，培養細胞実験としてはかなり高い濃度である。本研究では濃度依存性についての検討ができていないが，今後，低濃度時の阻害力価を求め，50% 阻害濃度などで，臨床において実際に薬物相互作用が報告されているグレープフルーツジュースと比較することなどにより，実際に薬物相互作用を示す可能性について慎重に検討する必要がある。また，今回選んだ漢方薬には陳皮や枳実を含まないことから，漢方薬に配合される生薬にはフラボノイド配糖体以外にも OATP 阻害作用をもつ化合物が含まれている可能性が示唆された。

■結論
本研究では，OATP1A2 および 2B1 の機能に対する漢方薬の影響を評価する実験系を確立した。その結果，OATP1A2 では小青竜湯，小柴胡湯において，OATP2B1 では防風通聖散，釣藤散，大柴胡湯において，500 μg/ml の濃度で有意な阻害作用を認めた。今後，それらの IC50 値を求め，グレープフルーツジュースと比較することで，臨床において薬物相互作用が起こりうる可能性を推定していきたい。

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