腎癌細胞の運動抑制効果を有する生薬エキス及び生薬含有化合物の探索
申 請 代 表 者
所外共同研究者
所内共同研究者

村田岩下横山純淳悟

秋田県立大学生物資源科学部応用生物科学科
秋田県立大学生物資源科学部応用生物科学科
病態制御部門病態生化学分野

教授
助教
助教

【報告セミナー要旨】【背景】主に腎皮質の尿細管細胞から発生する腎細胞癌は，他臓器への転移性が高く，その発生頻度については，喫煙量や動物性脂肪摂取量との間に正の相関が認められること，また人種別では欧米人に多いことなどから，生活環境，生活習慣がその発生に深く関与していると考えられている。近年，我が国では食生活を中心に生活習慣が益々欧米化していることから，今後増加が予想される癌種の一つである。
【目的】我々はこれまでに，腎機能の調節に重要な種々の神経ペプチドのうち，[Arg8]-vasopressin（AVP）が，マウス Renca 腎癌細胞の運動性を阻害するとともに，この癌細胞の細胞間接着を増強すること，その細胞間接着の増強には細胞間接着分子 E- 及び Ksp-cadherin の発現亢進が関与していること，更にその発現亢進には bHLH-LZ 型の転写因子である TFEC の発現誘導が重要であること，等を明らかとしてきた。
本研究では，癌転移阻止に重要な細胞間接着の増強に基づく細胞運動抑制に焦点を当て，マウス
Renca 腎癌細胞の運動抑制効果を有する生薬エキスを in vitro にて探索した。
【材料・方法】レポータージーンアッセイは，細胞間接着分子 E-cadherin のプロモーター配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポーターベクターを Renca 腎癌細胞へ導入した後，生薬エキス (100 mg/ml) を添加して 48 時間後のルシフェラーゼ活性を指標とした。細胞間接着は，振盪条件下で 90 分培養後の細胞凝集塊形成を指標に解析した。細胞の運動性は，Transwell chamber を用い，フィブロネクチンへの接触走化性の原理を適用した膜透過法にて解析した。細胞増殖は，WST-8 を用いた比色検定により解析した。
【結果・考察】細胞間接着分子 E-cadherin のプロモーター配列を用いたレポータージーンアッセイにて 114 種類の生薬エキスをスクリーニングした結果，カッコン，オウゴン，クジン，サイコ及びカンゾウの 5 種類に E-cadherin プロモーター活性の顕著な促進効果が認められた。これら 5 種類の生薬エキスについて，Renca 腎癌細胞の細胞間接着に及ぼす影響を解析した結果，カッコン及びオウゴンに細胞間接着増強効果が見られた。さらに，これら生薬エキスについて Renca 腎癌細胞の運動性に及ぼす影響を膜透過法にて解析したところ，カッコンでは未処置 Control の約 50%，オウゴンでは 70%にまで運動性が顕著に抑制された。なお，カッコン及びオウゴンには，Renca 腎癌細胞の増殖抑制効果は認められなかった。
以上の結果より，カッコン及びオウゴン由来エキスは，細胞間接着因子 E-cadherin の発現亢進を介して Renca 腎癌細胞の運動性を抑制し，ひいては癌転移を阻止することが示唆された。

－ 25 －■背景・目的
これまでの様々な試みにもかかわらず，癌は依然として我が国における死因の第一位を占めている。
癌により死に至る最大の要因は，癌細胞に極めて特徴的な転移という現象が存在するからである。癌が転移を形成する過程で，癌細胞の運動性は特に重要であり，転移性の高い癌細胞ほど運動性が高いことが知られている。更に，その癌細胞の運動性が高い要因の一つとして，癌細胞同士の結合性（細胞間接着）の低下による細胞の自由度の増加が考えられる。したがって，癌細胞間の接着性を増加させることにより癌細胞の運動性を抑制できれば癌転移は抑制されると考えられる。
主に腎皮質の尿細管細胞から発生する腎細胞癌は，他臓器への転移性が高く，その発生頻度については，喫煙量や動物性脂肪摂取量との間に正の相関が認められること，また人種別では欧米人に多いことなどから，生活環境，生活習慣がその発生に深く関与していると考えられている。近年，我が国
では食生活を中心に生活習慣が益々欧米化していることから，今後増加が予想される癌種の一つである。
これまでに我々は，腎機能の調節に重要な種々の神経ペプチドのうち，腎臓で抗利尿作用を有する神経ペプチドの AVP([Arg8]-vasopressin) が，①マウス腎癌細胞株：Renca の運動性を顕著に抑制すること，②その運動抑制は細胞間接着の増強に基づくものであること，③その接着増強には細胞間接着タンパク質である E-cadherin 及び Ksp-cadherin の発現亢進が関与していること，④ E- 及び Kspcadherin の発現亢進には b-HLH-lz 型転写因子で MITF/TFE ファミリーである TFEC の発現誘導が重要であること，などを明らかとしてきた。さらに最近，Renca 腎癌細胞を用いたマウスの実験的肺転移モデル実験において，AVP が腎癌細胞の肺転移を著明に抑制すること，遺伝子工学的に作製したTFEC 過剰発現 Renca 腎癌株の肺転移能が顕著に低下すること等を見出した。
本研究では，癌転移阻止に重要な細胞間接着の増強に基づく細胞運動抑制に焦点を当て，マウス
Renca 腎癌細胞の運動抑制効果を有する生薬エキスを in vitro にて探索した。

■結果・考察マウス細胞間接着分子 E-cadherin のプロモーター配列を用いたレポータージーンアッセイにて114 種類の生薬エキス ( 濃度：100 mg/ml) をスクリーニングした結果，カッコン，オウゴン，クジン，サイコ及びカンゾウの 5 種類に E-cadherin プロモーター活性の顕著な促進効果が認められた ( 図 1)。
これら 5 種類の生薬エキスについて，マウス Renca 腎癌細胞の細胞間接着に及ぼす影響を振盪条件下
で 90 分培養後の細胞凝集塊形成を指標に解析した結果，カッコン及びオウゴンに Aggregation indexの顕著な低下 ( 図 2) 即ち，細胞間接着増強効果が見られた ( 図 3)。さらに，これら生薬エキスについて Renca 腎癌細胞の運動性に及ぼす影響を，Transwell chamber を用いてフィブロネクチンへの接触走化性の原理を適用した膜透過法にて解析したところ，カッコンでは未処置 Control の約 50%，オウゴンでは 70% にまで運動性が顕著に抑制された ( 図 4)。なお，カッコン及びオウゴンには，Renca
腎癌細胞の増殖抑制効果は認められなかった ( 図 5)。

－ 26 －様式１－４

Transfection

Kampo
Extracts

Transfection

Kampo
Extracts

Luc assay

Relative Relative
CDH1 promoter
activity activity
CDH1 promoter/Luc(Log2 (LucKampo
CNTL)/LucCNTL)(Log
2 (LucKampo

2.0
1.5
2.0
1.0
1.5
0.5
1.0
0
0.5
-0.5
0
-1.0
-0.5
-1.5
-1.0
-2.0
-1.50

Luc assay
48 hr

048 hr

Renca

Renca

251007550

1. カッコン
2. オウゴン
3. クジン
1.
4. カッコンサイコ
2.
5. オウゴン
カンゾウ
3. クジン
4. サイコ
5.
125 カンゾウ

No. of Extracts
251007550125
No. of Extracts

図1．E-cadherin promoterに及ぼす生薬エキスの影響 (Luc活性の測定)-2.0
図1．E-cadherin promoterに及ぼす生薬エキスの影響 (Luc活性の測定)

図 1．E-cadherin promoter に及ぼす生薬エキスの影響 (Luc 活性の測定 )Aggregationindex index
Aggregation

0.8

0.8
0.6

0.6
0.4
*
*
0.40.2***0.20
Control

AVP

カッコン

*
オウゴン

クジン

サイコ

クジン

*; p < 0.001
サイコ
カンゾウ

生薬エキス

0Control

AVP

カッコン

オウゴン

カンゾウ

Aggregation index生薬エキス= N90/N0*; p < 0.001
N0 = 最初に播種した細胞の個数；(4 x 105)
N90 = 90分間振蕩後の単個細胞及び細胞塊の個数
Aggregation index = N90/N0N0 = 最初に播種した細胞の個数；(4 x 105)
図2．細胞間接着に及ぼす生薬エキスの影響（凝集度の測定）
N90 = 90分間振蕩後の単個細胞及び細胞塊の個数

図 2．細胞間接着に及ぼす生薬エキスの影響（凝集度の測定）

図2．細胞間接着に及ぼす生薬エキスの影響（凝集度の測定）－ 27 －

様式１－４
様式１－４Control

カッコン

オウゴン

(x200)

Control

カッコン
Renca

オウゴン

(x200)

Renca
生薬エキスによる細胞間接着の増強（凝集塊形成）
図図3.
3. 生薬エキスによる細胞間接着の増強（凝集塊形成）
図3. 生薬エキスによる細胞間接着の増強（凝集塊形成）

of migrated
cells/field
No. No.
of migrated
cells/field

10010080806060404020******2000 Control
Control

クジンAVP

カッコン

AVP

カッコン 生薬エキス
オウゴン クジン

オウゴン

サイコ

カンゾウ

サイコ*; p カンゾウ
< 0.001

生薬エキス
図4. 細胞運動に及ぼす生薬エキスの影響*; p < 0.001

図図4.
4. 細胞運動に及ぼす生薬エキスの影響
細胞運動に及ぼす生薬エキスの影響

11
AbsorbanceAbsorbance(450(450nm)nm)

0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
00

Control

AVP

カッコン

クジン

サイコ

カンゾウ

Control

AVP

オウゴン クジン
カッコン 生薬エキス

サイコ

カンゾウ

オウゴン
生薬エキス

図 5.
細胞増殖に及ぼす生薬エキスの影響
図5.
細胞増殖に及ぼす生薬エキスの影響

図5. 細胞増殖に及ぼす生薬エキスの影響－ 28 －

従来，腎細胞癌の転移治療において，化学療法並びに放射線療法はほとんど効果が無く，IL-2 やInterferon-a を用いた免疫療法が主流であったが，その奏効率はわずかに 15% 程度であった。一方，最近では分子標的療法が台頭し，チロシンキナーゼ阻害剤（ソラフェニブ）による血管新生阻害，或いは mTOR 阻害剤（エベロリムス）による癌細胞増殖・血管新生阻害により腎癌の転移治療は飛躍的に進歩した。しかしながら，一定期間持続的に投与すると効果が失われるケースがしばしば報告されており，更に効果的な治療法の検討が必要である。
今回の結果より，カッコン及びオウゴンエキスに細胞間接着分子である E-cadherin のプロモーター促進活性が認められたことから，これらエキス中に転写因子 TFEC の発現誘導効果を有する生理活性物質の存在が示唆された。我々のこれまでの研究より，神経ペプチド AVP は転写因子 TFECの発現促進活性を有するが，血管平滑筋細胞に対して血圧上昇作用を有するため，腎癌の転移治療薬として高用量で持続的に投与することは困難である。カッコン及びオウゴンの両エキスに含まれる活性成分が同一物質か否かは不明であるが，これらエキスの分画をすすめることで目的物質を単離・精製し，これを用いて AVP で想定されるような副作用のない転移治療が期待される。
in vitro でカッコンまたはオウゴンエキス（或いはそれらに含まれる TFEC 発現促進活性成分）
今後，で前処置した Renca 腎癌のマウス尾静脈への接種による実験的肺転移系において，その転移抑制効果を AVP との比較から解析したい。更に，最近当研究室で確立した Renca 腎癌の同所性（腎皮膜下）移植による自然肺転移系において，カッコンまたはオウゴンエキス（或いはそれらに含まれる TFEC発現促進活性成分）投与による治療効果についても併せて検討したい。

■結論
以上の結果より，カッコン及びオウゴン由来エキスは，細胞間接着因子 E-cadherin の発現亢進を介して Renca 腎癌細胞の運動性を抑制し，ひいては癌転移を阻止することが示唆された。

－ 29 －