NSG Found. Mat. Sci. Eng. Rep.

金ナノ粒子 / 誘電体多層膜と極短パルスレーザを用いた生体コラーゲン SHG 顕微鏡におけるイメージ・コントラストの超増強
徳島大学

ポスト LED フォトニクス研究所

山口堅三

Ultra-enhancement of Image Contrast in Biological Collagen SHG Microscopyusing Gold Nanoparticles/dielectric Multilayer Film and Ultra-short Pulse Lasers
Institute of Post-LED Photonics, Tokushima University
Kenzo Yamaguchi
第 2 高調波発生（SHG）は、生体組織中のコラーゲンの非染色かつその場観察を可能にする。これまでに、本技術を用いたラットの真皮層のコラーゲン繊維の 2 次元可視化に成功している。一方、局在表面プラズモン（LSP）は、生体イメージの信号光を増強させることのできる技術として注目されている。本研究では、反射 SHG 顕微鏡と金ナノ粒子（AuNP）による LSP 共鳴を組み合わせ、ラットの真皮層のコラーゲン繊維からの SHG 信号光の増強を明らかにした。ここでは、Au-NP を用いることで、SHG 信号光を 4 倍増加させることに成功した。
Second harmonic generation (SHG) allows for non-staining, in situ imaging of collagen in
biological tissues. We successfully achieved two-dimensional visualization of collagen fibers
in rat dermis using this technique. A localized surface plasmon (LSP) is paid attention to oneof key techniques as enhanced SHG contrast agents for biological imaging. In this research,
we present the enhanced SHG signals from collagen fibers in rat dermis by combining areflection-mode SHG microscope with LSP resonance using gold nanoparticles (Au-NPs).
The SHG signal with Au-NPs was increased by a factor of 4 times compared to without
Au-NPs.
1．はじめに近年、超短パルスを有するレーザ光と生体の非線形相互作用を可視化する非線形光学顕微鏡が、非接触・低侵襲な生体可視化手段として注目されている。例えば、フェムト秒オーダの超短パルス光を生体組織に照射すると、光の電場とコラーゲンの分子の非線形相互作用により、入射光の一部が波長変換され、光の半波長（あるいは 2 倍の光周波数）の光が第 2 高調波発生（second-harmonic generation：以下 SHG）光として発生する。生体中の非線形光学特性では、コラーゲンが特異的な高値を示すことから生体コラーゲン SHG 顕微鏡（以下 SHG 顕微鏡）として、生体組織におけるコラーゲン線維のみを『生きたありのままの状態』で可視化できる。これは、コラーゲンの組織構造を維持する骨格のみならず、細胞の発生・分化・形態形成などを調節し、典型的な組織工学のアプローチとして目標な臓器の構造や再生医療の分野において有用である。このため、細胞から組織、器官へと高次構造化を進める上で非侵襲・非染色にコラーゲン動態を可視化する手段が望まれている。
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先述のコラーゲン特有の高い非線形光学特性は、分子の 3 重螺旋構造の非中心対称性と、分子−細線維−線維−線維束といった規則的高次構造に起因する。一方で、培養組織や再生組織中のコラーゲンは、一般組織と比べ構造的に未成熟なため、非線形光学特性が小さく、SHG 光が微弱となる。SHG 画像は、発生した SHG 光強度により画像化を行うため、本手法を再生医療分野へ展開するには、イメージ・コントラストの大幅な増強が望まれる（図 1 参照）。
コントラストの増強を達成する方法の 1 つとして、極短パルスレーザのパルスエネルギーを維持したままパルス幅のみを狭窄化する方法があり、SHG 光の発生効率は、パルス幅に反比例して向上する。しかしながら、試料への熱的ダメージは、パルスエネルギーに比例して増加する。したがって、侵襲性を低く維持したままイメージ・コントラストのみを増大することができる。このような考えに基づき、我々の研究グループでは、従来型の100 fs オーダのパルス幅を持つレーザ光源に対し、5 倍程度パルス幅が狭窄化された 19 fsのパルス光源を用い、発生効率の低い培養骨芽細胞産生コラーゲンの時系列可視化を行っている 1 。この結果、SHG 顕微鏡を用い、初めて同一個体におけるコラーゲン産生を時系列的に可視化することが可能となった。これに加え、3 および 4 週目において、細胞外に分泌された線維状のコラーゲン同士がネットワーク構造を形成する様子など、従来の染色法では可視化困難であったコラーゲン動態を捉えることに成功している。
しかしながら、1、2 週目の培養初期のコラーゲン動態を可視化するには、コントラスト増強が不十分である。
原理的には、パルス幅の更なる狭窄化によるコントラスト増強が可能であるのに対し、市販の極短パルスレーザの性能や顕微鏡光学系における極短パルスの取り扱い（群速度分散によるパルス拡がり）などを考慮すると、パルス狭窄化によるこれ以上のコントラスト増強は実現可能性に欠ける。
本研究では、ガラス基板上への金ナノ粒子を成膜することで、SHG 顕微鏡におけるイメージ・コントラストの飛躍的な向上を目的とした。ここで、100 fs のパルス幅で行った。

図 1.

SHG イメージングの高感度化．

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2．実験方法
金ナノ粒子内の自由電子と光の相互作用による増強電場（表面プラズモン）により、粒子近傍のコラーゲンから強い SHG 光を得る（図 2 参照）。つまり、図 2 の模式図のように、生体試料上に金ナノ粒子を 2 次元的に配列させ、反射 SHG によるイメージングを行い、表面プラズモンによるコントラストの増強を狙う。

図2

金ナノ粒子を用いた SHG イメージ・コントラストの増強．

金ナノ粒子は、クエン酸還元法で、テトラクロロ金（Ⅲ）
ナトリウム二水和物とクエン酸2三ナトリウム、超純水を用い、合成した 。以下に、その合成手順を示す。
1.
2.

テトラクロロ金（Ⅲ）ナトリウム二水和物を超純水で、60 mM に調整した（種粒子）。
クエン酸三ナトリウムを超純水で、3 w/v% に調整した。

3.

80℃の超純水 100 mL に、手順 2 で調整した溶液を 3 . 5 mL 加えた後、手順 1 の種粒子
0 . 5 mL を滴下し、80℃で 3 時間撹拌した。混合直後は、無色透明な溶液であったが、3 ～ 5 分後に薄い赤色を示し、時間経過とともに徐々に濃い赤色となった。

4.

3 時間後、自然下で常温に戻した。

コラーゲン SHG を一様に増強するには、生体試料上に表面プラズモンを誘起する金ナノ粒子を均一に分散させ、着ける必要がある。そこで、金ナノ粒子の配列手法には、移流集積法による自己集積化を用いた 2 。本手法は、金ナノ粒子の単相膜を最密構造で形成できることが報告されている。ここでは、n - ヘキサンと、n - オクチルアミン、超純水、合成した金ナノ粒子分散液をそれぞれ用いた。図 3 は、移流集積法による金ナノ粒子の配列法を示す。

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図3

化学的手法による金ナノ粒子の合成と、ディップコート法による 2 次元粒子配列．

n - ヘキサン溶媒に、n - オクチルアミンを滴下し、20 mM に調整した。
超純水 42 mL に手順 1 で調整した溶液を 700 µm 滴下した。次に、手で軽く振り混ぜた後に、超音波洗浄機で 1 分以上かけ、無色透明な溶液から白濁させた（乳化）。この工程が不十分な場合、金ナノ粒子を滴下した際に粒子が分散しない。
3 . 手順 2 で調整した溶液に 14 mL の金ナノ粒子分散液を滴下し、混ぜる。このとき、元々赤色の金ナノ粒子分散液が、オクチルアミンに修飾され青色に変化したことを確認した。ここで、粒子は疎水性の膜で覆われる。
4 . ディップコーターを用いて、洗浄済みスライドガラスを手順 3 の溶液に垂直に浸す。

1.
2.

5.

6.

手順 4 に、n - ヘキサンを 6 mL を滴下し、3 時間待つ。この間に金ナノ粒子が、水（超純水）と油（n - ヘキサン）の界面に浮上する。金ナノ粒子の水層から油層への相関移動は、n - オクチルアミン以外のアルキンアミンや各種アルキンチオールでも報告されている。
ディップコーターを用い、任意の速度で基板を引き上げる。一般的な移流集積法では、粒子が溶液中に一様に分散している。これに対し、提案手法は、水と油の境界に金ナノ粒子の層を形成するため、粒子膜形成モデルが異なる。

合成した金ナノ粒子や、金ナノ粒子を成膜したラット皮膚の光学ならびに電子顕微鏡や光学特性を評価した。そして、ラット皮膚コラーゲンに対する金ナノ粒子依存反射 SHGを計測した。

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３．結果と考察
合成した金ナノ粒子は、形成した粒径と形状を電子顕微鏡で観察した（図 3 参照）。直径20 nm 程度の球形の粒子が観測できた。また、ランダムに選択した粒子 100個の粒径測定をヒストグラム化し、粒径のばらつきは正規分布に帰着すると考え、正規分布でフィッテ
ィングした結果、平均粒径は 19 . 3 nm、最頻値は 18～19 nm、標準偏差は 3 . 3 であった。
なお、正規分布の確率分布関数は次の式を用いた。

ここで、σと µ は、それぞれ標準偏差と平均である。
次に、合成した金ナノ粒子を用い、紫外可視赤外分光で吸光度を測定した（図 4 参照）。
ここで、超純水をベースラインとした。波長 648 nm で吸光度ピークとなり、ブロードな共鳴波長を示した。これは、表面プラズモン由来の共鳴波長であり、ブロードさは先の粒径のバラつきに起因すると考える。

図4

金ナノ粒子の電子顕微鏡像と吸光度特性− 219 −

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ラット皮膚上への金ナノ粒子配列前後での明視野顕微鏡像を図 5 に示す。ここで、赤枠部分と同一箇所での高倍率な顕微鏡像を取得した。金ナノ粒子を配列した結果、全体的に金属光沢な輝きが見られることから、金ナノ粒子がラット皮膚上を覆っていると考える。
しかしながら、色が変わっていない部分もあったことから、不均一に金ナノ粒子が着いていると考える。

図5

金ナノ粒子有無／ラット皮膚の明視野顕微鏡像．

金ナノ粒子により増強されたコラーゲン由来の SHG 増強度を求めるには、先にコラーゲン単体の SHG 像を取得しなければならない。真皮層は、表皮側と皮下組織側で異なる組成をとるが、組織組成学において表皮側の真皮層での議論が多い。本実験では、表皮側でコラーゲンが密集する部分を測定箇所とした。図 6 は、金ナノ粒子配列前後における入射光波長 1250 nm における SHG 像を示す。なお、画像は、256 × 256 px の一辺 246 µm で、グレースケールは、光電子増倍管の光強度（count/px）を表す。金ナノ粒子配列前の SHG像から、白く見える部分で線維形状を確認した。このことから、SHG によってコラーゲンの可視化ができたと判断した。ただし、先にも説明したように、SHG 光強度がかなり弱い。一方、金ナノ粒子配列後の SHG 像では、コラーゲン特有の線維形状が僅かに確認できる程度であったが、SHG 光強度が非常に強く現れた。また、同様な計測を他波長810 nm と 1040 nm でも検討したが、入射光波長 1250 nm の SHG 像が最も強く表れた。

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図6

金ナノ粒子による SHG イメージ・コントラストの増強@λin 1250 nm．

金ナノ粒子有無／ラット皮膚に生じる入射光強度依存 SHG 光強度特性を図 7 に示す。
ここで、ラット皮膚単体と金ナノ粒子 / ラット皮膚を測定した。測定データは、最小二乗法で 1 次関数フィッティングを行い、傾き a を算出した。傾きが 2 に近いことから、SHG 光を取得できたと判断した。また、金ナノ粒子有無での SHG 光のコントラスト増大を確認した。

図7

金ナノ粒子有無／ラット皮膚の入射光強度依存 SHG 光強度特性．

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４．結論
ディップコート法によるガラス基板上への金ナノ粒子を成膜することで、SHG 顕微鏡における生体組織のイメージ・コントラストの飛躍的な向上を実現した。本研究では、コラーゲンの非染色かつその場観察に加え、従来の 4 倍となる SHG 信号光増強を観測した。
ここでは、SP 共鳴の中心波長 648 nm@ 直径 20 nm の金ナノ粒子が、入射波長 1250 nm のSHG 波長 625 nm を網羅した。たただし、本結果が計測する上での最適な条件ではなく、金ナノ粒子の粒径つまり、共鳴波長の制御やパルス幅の狭窄化を検討することで、さらなるイメージ・コントラストの向上と、医用画像への応用を展開する。
５．引用文献1 . Eiji Hase, Oki Matsubara, Takeo Minamikawa, Katsuya Sato, and Takeshi Yasui,“In situ
time-series monitoring of collagen fibers produced by standing-cultured osteoblasts
using a second-harmonic-generation microscope”, Appl. Opt. 55 , 3261 ( 2016 ).
2.

Nobuyuki Takeyasu, Kenzo Yamaguchi, Ryusuke Kagawa, Takashi Kaneta, Felix Benz,
Masamitsu Fujii, and Jeremy J Baumberg,“Blocking Hot Electron Emission by SiO 2
Coating Plasmonic Nanostructures”, J. Phys. Chem. C. 121 ( 34 ), 18795 ( 2017 ).
3 . 山口堅三、長谷栄治、金村洋平、髙成広起、岡本敏弘、原口雅宣、安井武史、『金ナノ粒子を用いたバイオイメージングにおけるコントラストの増強』、
生体医工学シンポジウム 2019 、2 A- 30 、2019 年 9 月 .
4 . Kenzo Yamaguchi, Eiji Hase, Toshihiro Okamoto, Masanobu Haraguchi and Takeshi Yasui,“Gold nanoparticles as enhanced SHG contrast agents for biological imaging”,
Photonics West 2020 : BiOS 2020 , 11257 - 39 , Feb. 2020
5 . 関洋伸、山口堅三、長谷栄治、安井武史、岡本敏弘、原口雅宣、『金微粒子を用いた生体コラーゲン第 2 次高調波増強』、
第 69 回応用物理学会春季学術講演会、23 p-E 303 - 6 、2022 年 3 月
6 . 関洋伸、山口堅三、長谷栄治、安井武史、岡本敏弘、原口雅宣、『金微粒子を用いた生体コラーゲン第 2 次高調波増強の定量特性』、
第 69 回応用物理学会春季学術講演会、22 p-P 01 - 13 、2022 年 3 月− 222 −