Diosgenin の記憶改善作用に関する研究
申 請 代 表 者
所外共同研究者
所内共同研究者

後藤李
東田

幸織
英娥
千尋

McGill University Department of Psychiatry
McGill University Department of Psychiatry
民族薬物研究センター 薬効解析部（現 病態制御部門 神経機能学）

Assistant Professor
Postdoctoral Fellow
准教授【報告セミナー要旨】【背景・目的】共同研究者・東田は，これまでに，山薬の主成分である Diosgenin に着目しアルツハイマー病改善作用を研究してきており，Diosgenin を正常マウスに 3 日間投与すると物体認知記憶が亢進すること，重篤なアルツハイマー病モデルの 5XFAD マウスに 14 日間− 18 日間投与すると，空間記憶障害，物体認知記憶障害が有意に改善されることを明らかにしてきた。そこで本研究では，Diosgenin が神経可塑性を促進させることの証明，および Diosgenin の作用メカニズムの解析を行うことを目的とした。
【結果・考察】正常マウスにおける in vivo 電気生理学的解析
C57B/6 マウス ( オス，8 週齢 ) に Diosgenin (Sigma-aldrich) 10 ȝmol/kg を 21 日間腹腔内投与した。
Urethane 麻酔下で実験を行った。PFC (Prefrontal cortex)，あるいは HPC (Dorsal hippocampal
CA1) に stereotaxic に刺激電極，記録電極を刺入した。実験終了後，速やかに脳を摘出しニッスル染色により電極刺入部位の位置を確認した。
1) Diosgenin 投与による LTP の変化
Diosgenin 投与による PFC と HPC における LTP の変化は見られなかった。今回用いた Tetanic 刺
激は弱いものであり，LTP による evoked Àeld potential の増加そのものが小さいものであったことから，より強い Tetanic 刺激を用いた LTP 実験の検討が必要であると考えている。
2) Diosgenin 投与による spike ﬁring activity の変化
神経細胞の活動レベルの指標となる，自発性 spike frequency を解析した結果，PFC でも HPC でもDiosgenin 投与による spike frequency の有意的な上昇が見られた。これらの結果から Diosgenin 投
与により PFC および HPC の神経細胞が活性化したことが示唆される。錐体細胞における情報処理能力を示唆するとされている神経発火（burst）頻度を解析した結果，PFC で Diosgenin 投与による有意な増加が認められた。記憶の固定化に重要とされている PFC と HPC の同時発火頻度を検討したところ，HPC-PFC 間での神経細胞群の同時発火は Diosgenin 投与により有意に上昇した。
3) Diosgenin 投与による Local ﬁeld potential パターンの変化/RFDO¿HOGSRWHQWLDOを 0.1-1.0 Hz (slow), 1.0-4.0 Hz (delta), 4.0-10 Hz (theta), 30-50 Hz (gamma)の範囲で解析した。その結果，PFC の gamma 帯の oscillation が Diosgenin 投与により有意に増加した。近年の研究で PFC での gamma oscillation は錐体細胞と介在神経の同期活動によって生じるもので，特に PFC では認知機能に強く関わっていることが示されている。
5XFAD マウスにおける記憶障害改善と軸索変性の改善
アルツハイマー病モデルマウス 5XFAD（メス，6 – 8 か月齢）に Diosgenin（Wako）10 ȝmol/kg− 42 −

を 20 日間腹腔内投与した。Diosgenin 投与により，物体認知記憶の障害が有意に改善され，大脳皮質，海馬での Amyloid plaque に限局して見られる軸索・プレシナプスの変性も有意に改善された。また
Diosgenin 投与は神経原線維変化の増加を有意に抑制した。
Diosgenin 受容体の探索
以前の研究 ( 東田 ) より Diosgenin 受容体候補と目していた 1,25D3-MARRS について検討した。
1,25D3-MARRS の生理的リガンドである 1Į, 25-dihydroxy vitamin D3 の結合を大脳皮質神経細胞で検出し，それを Diosgenin が replace することを見出した。また，大脳皮質神経細胞で 1,25D3-MARRSをノックダウンさせると，Diosgenin による突起伸展が完全に見られなくなった。以上の結果は，Diosgenin が 1,25D3-MARRS を介してシグナル伝達することを示唆する。
【結論・今後の方針】
Diosgenin 投与により，認知機能亢進に関わる種々の神経活動が増強されることが示され，正常動物においても記憶機能を高める Diosgenin の作用が，神経生理学的知見からも支持された。5XFADマウスにおける Diosgenin 作用の電気生理学的な検討も，現在準備中である。また，Diosgenin のシグナリングの詳細をさらに検討することや，Diosgenin 受容体をより強く活性化し得る新化合物の合成も今後の課題とし，記憶障害改善作用に繋がる治療戦略の前進を目指す。

■背景・目的共同研究者・東田は，これまでに，山薬の主成分である Diosgenin に着目しアルツハイマー病改善作用を研究してきており，Diosgenin を正常マウスに 3 日間投与すると物体認知記憶が亢進すること，重篤なアルツハイマー病モデルの 5XFAD マウスに 14 日間− 18 日間投与すると，空間記憶障害，物体認知記憶障害が有意に改善されることを明らかにしてきた。そこで本研究では，Diosgenin が神経可塑性を促進させることの証明，および Diosgenin の作用メカニズムの解析を行うことを目的とした。

■結果・考察
正常マウスにおける in vivo 電気生理学的解析
C57B/6 マウス（オス，8 週齢）に Diosgenin（Sigma-aldrich）10 ȝmol/kg を 21 日間腹腔内投与した。
Urethane 麻酔下で実験を行った。PFC（Prefrontal cortex），あるいは HPC（Dorsal hippocampalCA1）に stereotaxic に刺激電極，記録電極を刺入した。実験終了後，速やかに脳を摘出しニッスル染色により電極刺入部位の位置を確認した。PFC（Prelimbic cortex）の場合は Anterior Posterior（AP）: +1.5mm, Lateral（L）: +0.4mm, Ventral（V）: -2.8mm に，HPC（Dorsal CA1）の場合はAP: -2.3mm, L: +1.7mm, V: -1.5mm 近辺からの記録とした。
Single/multi unit 記録はスパイク : ノイズの比が 3:1 以上のものを 5 分間記録した。また single/multi unit 記録の後，Local Àeld potential（0.1 – 100 Hz）を 5 分間記録した。
LTP 誘起に用いた Tetanic 刺激は，PFC の場合，30 秒の interval で 10set （1set=10trains@10Hz,1train=5pulses@100Hz, 1pulse=200ȝsec），HPCの場合には30秒のintervalで10set （1set=10trains@5Hz,1train=5pulses@100Hz, 1pulse=200ȝsec）のバースト刺激を用いた。刺激電極は PFC の場合は記録電極近傍（およそ 500 um はなれた場所），HPC の場合は Perforant Path（CA3 から CA1 への投射 :AP: -1.8mm, L: +1.0mm, V: +1.6mm）に設定した。20 分間のベースライン記録の後，Tetanic 刺激をし，その後 60 分間記録をした。

− 43 −

データ解析は ClampÀt 10.2 と Neuro Exploer 4 用い行った。
1）Diosgenin 投与による LTP の変化
Diosgenin 投与による PFC と HPC における LTP の変化は見られなかった。今回用いた Tetanic 刺
激は弱いものであり，LTP による evoked Àeld potential の増加そのものが小さいものであったことから，より強い Tetanic 刺激を用いた LTP 実験の検討が必要であると考えている。
2）Diosgenin 投与による spike ﬁring activity の変化
神経細胞の活動レベルの指標となる，自発性 spike frequency を解析した結果，PFC でも HPC でもDiosgenin 投与による spike frequency の有意的な上昇が見られた。これらの結果から Diosgenin 投
与により PFC および HPC の神経細胞が活性化したことが示唆される。錐体細胞における情報処理能力を示唆するとされている神経発火（burst）頻度を解析した結果，PFC で Diosgenin 投与による有意な増加が認められた。記憶の固定化に重要とされている PFC と HPC の同時発火頻度を検討したところ，HPC-PFC 間での神経細胞群の同時発火は Diosgenin 投与により有意に上昇した。
3）Diosgenin 投与による Local ﬁeld potential パターンの変化/RFDO¿HOGSRWHQWLDO を 0.1-1.0 Hz（slow），1.0-4.0 Hz（delta），4.0-10 Hz（theta），30-50 Hz（gamma）の範囲で解析した。その結果，PFC の gamma 帯の oscillation が Diosgenin 投与により有意に増加した。近年の研究で PFC での gamma oscillation は錐体細胞と介在神経の同期活動によって生じるもので，特に PFC では認知機能に強く関わっていることが示されている。
5XFAD マウスにおける記憶障害改善と軸索変性の改善
アルツハイマー病モデルマウス 5XFAD（メス，6 – 8 か月齢）に Diosgenin（Wako）10 ȝmol/kgを 20 日間腹腔内投与した。Diosgenin 投与により，物体認知記憶の障害が有意に改善され，大脳皮質，海馬での Amyloid plaque に限局して見られる軸索・プレシナプスの変性も有意に改善された。また
Diosgenin 投与は神経原線維変化の増加を有意に抑制した。
Diosgenin 受容体の探索
以前の研究（東田）より Diosgenin 受容体候補と目していた 1,25D3-MARRS について検討した。
1,25D3-MARRS の生理的リガンドである 1Į,25-dihydroxy vitamin D3 の結合を大脳皮質神経細胞で検出し，それを Diosgenin が replace することを見出した。また，大脳皮質神経細胞で 1,25D3-MARRSをノックダウンさせると，Diosgenin による突起伸展が完全に見られなくなった。以上の結果は，Diosgenin が 1,25D3-MARRS を介してシグナル伝達することを示唆する。

■結論
Diosgenin 投与により，認知機能亢進に関わる種々の神経活動が増強されることが示され，正常動物においても記憶機能を高める Diosgenin の作用が，神経生理学的知見からも支持された。5XFADマウスにおける Diosgenin 作用の電気生理学的な検討も，現在準備中である。また，Diosgenin のシグナリングの詳細をさらに検討することや，Diosgenin 受容体をより強く活性化し得る新化合物の合成も今後の課題とし，記憶障害改善作用に繋がる治療戦略の前進を目指す。

− 44 −

図1図2

図3

C57B/6 マウスの物体認知記憶に対する Diosgenin の促進作用

C57B/6 マウスの前頭皮質および海馬における長期増強反応に対する Diosgenin の作用

C57B/6 マウスの前頭皮質および海馬における自発性発火頻度に対する Diosgenin の促進作用− 45 −

図4

C57B/6 マウスの前頭皮質と海馬間の自発性発火の同期性に対する Diosgenin の促進作用

図5

C57B/6 マウスの前頭皮質および海馬における集合電位に対する Diosgenin の促進作用

図65XFAD マウスの物体認知記憶障害に対する Diosgenin の改善作用と Memantine の無効性

− 46 −

図75XFAD の大脳皮質と海馬における Amyloid plaque 内に限局した変性軸索の増加に対する Diosgenin の抑制作用と Memantin の無効性

図8

本研究で示唆された Diosgenin のシグナリング− 47 −