アルツハイマー病の記憶障害を改善する海洋天然物の探索
アルツハイマー病の記憶障害を改善する海洋天然物の探索
申 請 代 表 者
酒井所内共同研究者
東田（申請代表者）
酒井隆一

隆一 北海道大学水産科学研究院海洋応用生命科学部門
千尋
病態制御部門神経機能学分野 教授
北海道大学水産科学研究院（所内共同研究者）東田千尋

病態制御研究部門 神経機能学分野 准教授

教授
准教授【報告セミナー要旨】【背景】アルツハイマー病は治療薬の開発が困難な最大の神経疾患といわれる。アルツハイマー病【背景】アルツハイマー病は治療薬の開発が困難な最大の神経疾患といわれる。アルツハイマー病のの発症機構は十分に解明されているとはいえないものの、いくつかの重要な仮説が存在する。その発症機構は十分に解明されているとはいえないものの，いくつかの重要な仮説が存在する。そのひとひとつにアミロイド仮説といわれるものがある。アミロイドβ（Aβ）は神経の修復や伸長に欠かせつにアミロイド仮説といわれるものがある。アミロイドβ（A β）は神経の修復や伸長に欠かせないないとされる膜タンパク質アミロイドβ前駆体蛋白質が酵素分解されて生じるペプチドで、オリゴとされる膜タンパク質アミロイドβ前駆体蛋白質が酵素分解されて生じるペプチドで，オリゴマーをマーを形成することで神経細胞に毒性を示す。この Aβ生成がアルツハイマー病の要因のひとつであ形成することで神経細胞に毒性を示す。この A β生成がアルツハイマー病の要因のひとつであると考ると考えるのがアミロイド仮説である。そこで、Aβの生成を防ぐ酵素阻害剤や、Aβのオリゴマーえるのがアミロイド仮説である。そこで，A βの生成を防ぐ酵素阻害剤や，A βのオリゴマー形成阻形成阻害等の機序に着目した創薬が進められている。しかし、現在本疾病の治療薬として利用され害等の機序に着目した創薬が進められている。しかし，現在本疾病の治療薬として利用されている薬ている薬物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤 4 種と NMDA 受容体アンタゴニスト 1 種で、その物は，アセチルコリンエステラーゼ阻害剤 4 種と NMDA 受容体アンタゴニスト 1 種で，その作用は作用は発症後の症状改善に重点を置くものであり、疾病の根本治療につながるものではない。そこ発症後の症状改善に重点を置くものであり，疾病の根本治療につながるものではない。そこで，本研

で、本研究では、Aβの作用で損傷を受けた神経細胞の修復を促す評価系を用いることで、「疾病の究では，A βの作用で損傷を受けた神経細胞の修復を促す評価系を用いることで，「疾病の治療につ治療につながる薬物の探索」をコンセプトに海洋生物の抽出物に含まれる活性物質を探索する研究ながる薬物の探索」をコンセプトに海を計画した。
洋生物の抽出物に含まれる活性物質を海洋生物からは陸上由来の生物にはない探索する研究を計画した。

ユニークな化学構造を持つ生理活性物質が海洋生物からは陸上由来の生物にはNeuroactive compounds from Sponges
H NH2H

数多く知られており、テトロドトキシンやないユニークな化学構造を持つ生理活
カイニン酸、ポリエーテル毒やコノトキシ性物質が数多く知られており，テトロ HONHOCOOH

HNH3CNOン等に代表される特異な作用点を持つ化合
ドトキシンやカイニン酸，ポリエーテ

H
NHCH3物の宝庫である。我々の研究室ではこれまル毒やコノトキシン等に代表される特1OCOOHONNCH3 CH32

でにマウスや海馬ニューロンを用いた評価異な作用点を持つ化合物の宝庫であ系で海綿から新規のグルタミン酸受容体のアゴニストであるダイシハーベイン（１）やGABA 受容体る。我々の研究室ではこれまでにマウスや海馬ニューロンを用いた評価系で海綿から新規のグルタミのモジュレーター活性を持つ新規プリン（２）等を見出してきた。今回は、これまでの研究で蓄積ン酸受容体のアゴニストであるダイシハーベイン（１）や GABA 受容体のモジュレーター活性を持つ新規プリン（２）等を見出してきた。今回は，これまでの研究で蓄積した抽出物を材料にスクリーした抽出物を材料にスクリーニングを行った。
ニングを行った。
【結果】パラオ共和国で採集した海綿を始めとする海洋生物
129 種の水抽出物について損傷した【結果】パラオ共和国で採集した海綿を始めとする海洋生物
129 種の水抽出物について損傷した神経神経細胞の修復を軸策の伸長を指標に評価したところ、9種の抽出物に活性が確認された。活性を細胞の修復を軸策の伸長を指標に評価したところ，9種の抽出物に活性が確認された。活性を示した
示した腔腸動物の一種であるヤギPal663 と同種の試料と思われ、すでに分離が進んでいた
Pal459腔腸動物の一種であるヤギ Pal663 と同種の試料と思われ，すでに分離が進んでいた Pal459 についてについて検討した。抽出物は、透析により分画し、低分子画分とタンパク質画分に分離、低分子画検討した。抽出物は，透析により分画し，低分子画分とタンパク質画分に分離，低分子画分はさらに分はさらにSephadexLH-20 で分画、さらにそれぞれの画分を HPLC により分画した。それぞれのSephadexLH-20 で分画，さらにそれぞれの画分をHPLCにより分画した。それぞれの画分について画分について活性を評価した結果、HPLC精製画分である
CKX1-46-4に有意な活性が確認された。
活性を評価した結果，HPLC 精製画分である CKX1-46-4 に有意な活性が確認された。
【考察と展望】海洋生物の抽出物は、非常に複雑な混合物であるにもかかわらず、今回の探索法【考察と展望】海洋生物の抽出物は，非常に複雑な混合物であるにもかかわらず，今回の探索法で候で候補抽出物を絞り込むことができた。今後、得られた活性成分は極微量であったのでより多くの補抽出物を絞り込むことができた。今後，得られた活性成分は極微量であったのでより多くの活性物活性物質の単離を行う。またその構造を検討するとともに、他のサンプルについても分離･精製を行ってゆく予定である。
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質の単離を行う。またその構造を検討するとともに，他のサンプルについても分離 ･ 精製を行ってゆく予定である。

■背景 ･ 目的
海綿を始めとする海洋無脊椎動物に含まれる生理活性物質は，その新規性，多様性から創薬シーズとして注目されてきた。申請者はこれまでにマウスやゼブラフィッシュを用いた in vivo 検定と培養
神経細胞や発現受容体を用いた in vitro 検定を組み合わせたスクリーニングを用い，海洋生物から新規の興奮性アミノ酸ダイシハーベイン，GABA 受容体調節作用を持つプリン誘導体，新規神経毒ペプチドアーキュレイン等を見出し，その構造と生理活性を明らかにしてきた 1-3。これら化合物はいずれもこれまでに類を見ない構造と生理活性を持つもので，海洋天然物が神経科学の分野においても有望な活性物質探索源であることを立証したといえる。すなわち，もし生物検定を工夫することで海洋生物抽出物ライブラリーの潜在性をさらに引き出すことができれば，新規の医薬資源となる化合物の発見につながることが期待できる。これまでに海洋生物の抽出物は，細胞毒性や酵素阻害作用，抗菌・抗カビ作用等主に阻害剤の探索源として注目され 20000 種を超える化合物が報告されてきた。それらには申請者が過去に携わったエクテナシディンや最近上市されたハリコンドリンの誘導体エリブリンように抗がん剤として利用されているものもある。しかし，アルツハイマー病の治療を目指して探索研究が行われた例は少ない。そこで本研究では和漢医薬総合研究所の東田准教授が構築したアルツハイマー病などの難治性神経疾患モデルを用い，海洋生物由来成分の探索を行う。東田の検定法は，神経細胞やマウスを用いた神経損傷や認知障害を改善する効果を調べるもので，既存の関連酵素阻害作用を調べる検定法とは根本的に異なり，アルツハイマー病の中核症状である認知障害を改善する活性成分を見出そうとするものである。本研究では申請者の研究室で培ってきた海洋天然物の採集，分離精製，構造決定と東田の持つ神経科学の蓄積を融合し，アルツハイマー病の治療・診断薬の開発や発症機構の解明に資する化合物を海洋生物から見出すことを目的とする。

図1

スクリーニングにおける軸策伸長および樹状突起形成活性の比較

図 1 スクリーニングにおける軸策伸長および樹状突起形成活性の比較－ 62 －

図 1 スクリーニングにおける軸策伸長および樹状突起形成活性の比較

図2

スクリーニングで軸策伸長を示したサンプル（ID は試料のフィールド名）

図 2 スクリーニングで軸策伸長を示したサンプル（ID は試料のフィールド名）

図３ 活性を示したサンプルの写真
図３．活性を示したサンプルの写真■結果・考察パラオ産の海洋生物を中心に水抽出物を調製し，軸索の伸長 ( 軸策伸長活性とする ) および樹状突起の形成に対するアミロイドペプチドの毒性阻害を指標にスクリーニングを行った。試験を行った－ 63 －

図３．活性を示したサンプルの写真

4 Pal663 と 459の水中写真とNMR スペクトル
図 4 Pal663 と 459図の水中写真とNMR
スペクトル

129 サンプルの 2 つの活性についてその相関を調べたところ相関係数は 0.24 となり，それぞれ異なった試料が活性を示す傾向となっていた( 図 1)。アルツハイマー病の治療により重要な要素と考えられる軸策伸長活性に絞り込むと 9 サンプルに活性を示すものが見られた ( 図 2)。このヒット率は約 7%で，他の海洋天然物アルツハイマー治療薬スクリーニングの結果と比較しても遜色はなく（www.
kagakucafe.org/yoshikuni120218.pdf），この検定法が海洋生物の新しい活性物質の探索に有用であることが示唆された。得られた 9 サンプルの内訳は海綿６種，腔腸動物 2 種，そして藍藻 1 種であった。
それらの写真を図 3 に示す。それぞれの NMR を測定し，そのプロファイルを調べた。多くの試料は粗抽出物に共通の複雑な混合物を示唆するスペクトルパターンを示したが，形態から Antipathes
sp. と考えられる腔腸動物ヤギ Pal663 には粗抽出物にもかかわらず単一化合物由来と思われる興味深いスペクトルを与えた。そこでまずこの試料の分離を行うこととした。本試料と形状が類似していた
Pal459 はすでに抽出・分離が進行中であったので，抽出物の NMR を比較したところ，Pal663 と良く一致した ( 図４)。そこで，Pal459 の分離をさらに進めることとした。まず，水抽出物を透析し低分子と高分子画分に分画した。低分子画分はさらに SephadexLH-20 カラムを用いて分離し，全６画分を得た。最も量が多かった画分 3 をさらに逆相 HPLC を用いて分離し，ほぼ純粋な分画物 3 種を含め全 10 種の分画物を得た ( 図 5)。得られた分画物の活性を調べた結果いくつかの分画物に軸索伸長活性が確認された（図 5）。精製の進んだ CHX1-48-3, CHX1-55-3, CHX1-46-4 および Sephadex 分画物の CHX1-9-7 に活性傾向が見られた。この中で有意な活性を示したものは CHX1-46-4 のみであった( 図 6)。この試料は HPLC による精製後の化合物なので純度は高いと考えられる。HPLC の UV チャー
トから本化合物は 260nm 付近に吸収を持つ芳香族化合物である可能性が高い。しかし，0.2mg 程度のサンプルを用いて１HNMR の測定を行ったところシグナルは全く得られなかった ( 図 7)。したがってこの化合物の構造決定にはさらに量を得る必要がある。また，UV データから本化合物がプリン類－ 64 －

図5Pal 459 の分離

黄色囲み：活性傾向 ( 有意差無し )，赤：有意差在図 5 Pal 459 の分離 黄色囲み：活性傾向(有意差無し)、赤：有意差在

図6分画物の活性データ ( 上グラフ ) と活性画分 CKX1-46-4 による軸策伸長 ( 下写真 )図 6 分画物の活性データ(上グラフ)と活性画分 CKX1-46-4 による軸策伸長(下写真)－ 65 －

図７ CKX1-46-1 の NMR と質量分析データ
図７
CKX1-46-1 のの NMR
NMR と質量分析データと質量分析データ
図７ CKX1-46-1

図
図 8 CKX1-55-3 の NMR と推定構造
図88 CKX1-55-3
CKX1-55-3 のの NMR
NMR と推定構造と推定構造である可能性も示唆されるが，その置換基によっては全くプロトンが観察されない可能性も考えられる。今後はこれらの点も留意し構造研究を行う予定である。弱いながらも活性傾向を示した CHX155-3（1）は純度が高かったので ( 図 8)，その構造決定を行った。13CNMR において 1 は 1 つのカルボニル基を含む 7 つの炭素原子が観測された。また，HSQC データより 2 つの N-CH3, ( δ 54.1，59.1)，
2 つの CH2（δ 79.6，41.4），２つの CHX（δ 81.3，71.9）の存在が示された。高分解能質量分析の－ 66 －

図 9 活性傾向を示した成分の
図 9 活性傾向を示した成分のNMR データの比較NMR データの比較

結果からの分子式は C7H13NO3 と推定された。さらに詳細な 2 次元 NMR データの解析の結果，本化合物は N,N- ジメチル -3- ヒドロキシプロリンであると推定された ( 図８)。CHX1-48-3 にもその NMRより主成分として１が含まれていることがわかった ( 図 9)。本化合物は柑橘類等の適合溶質として知られており 4，果実の凍結等から細胞を保護する作用があると考えられている。今回得られた結果は，本化合物の細胞保護作用によりアミロイドの毒性が軽減された可能性を示唆する。今後は合成化合物で構造と活性の確認を行う予定である。

■結論
今回，東田が開発したアミロイドにより阻害された軸策伸長の回復を図る検定系を用い初めて海洋生物の抽出物の評価を行った。海洋生物にはテトロドトキシンを始めとした強力かつ選択的な神経毒が多く知られている。また最近の研究ではテトロドトキシンが強力な鎮痛作用を示すことががん患者で立証されるなど，「毒から薬へ」と応用を図る研究も進んでいる。その例として，猛毒を持つイモガイの毒コノトキシンがある。コノトキシンは N- 型カルシウムチャンネルの強力なブロッカーであるが，同時に強力な鎮痛作用を示すため米国などで承認され臨床応用されている。このような背景の中，決定的な治療薬がない最大の脅威アルツハイマー病の治療に資する化合物の探索にも海洋生物が脚光を浴びている。しかし，アミロイド仮説を始めとするいくつかの仮説に基づく研究が最近になって報告されてはいるが，有望な活性物質を見出した例はまだ少ない 5-7。今回の結果は，海洋生物に含まれるベタインなどの低分子化合物にも何らかの作用が期待されること，また多岐にわたる活性化合物が含まれている可能性を示唆した。今回は活性を示した 9 種の試料のうち 1 種のもの分離を行うにとどまったが，今後これらの試料の分離精製をさらに進めることで，海洋天然物の特徴である意外性のある構造を持つ活性物質が見出されるものと期待している。

－ 67 －■文献
1. Matsunaga, S.; Jimbo, M.; Gill, M. B.; Wyhe, L. L.; Murata, M.; Nonomura, K.; Swanson, G.
T.; Sakai, R., Isolation, amino acid sequence and biological activities of novel long-chain polyamine-associated peptide toxins from the sponge Axinyssa aculeata. Chembiochem 2011, 12,(14), 2191-200.
2. Sakurada, T.; Gill, M. B.; Frausto, S.; Copits, B.; Noguchi, K.; Shimamoto, K.; Swanson, G. T.;
Sakai, R., Novel N-methylated 8-oxoisoguanines from Pacific sponges with diverse neuroactivities. J Med Chem 2010, 53, (16), 6089-99.
3. Sakai, R.; Swanson, G. T.; Shimamoto, K.; Green, T.; Contractor, A.; Ghetti, A.; Tamura-Horikawa, Y.; Oiwa, C.; Kamiya, H., Pharmacological properties of the potent epileptogenic aminoacid dysiherbaine, a novel glutamate receptor agonist isolated from the marine sponge Dysidea
herbacea. J Pharmacol Exp Ther 2001, 296, (2), 650-8.
4. Nolte, K. D.; Hanson, A. D.; Gage, D. A., Proline accumulation and methylation to proline betaine in Citrus: Implications for genetic engineering of stress resistance. Journal of the American
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5. Alonso, E.; Vale, C.; Vieytes, M. R.; Laferla, F. M.; Gimenez-Llort, L.; Botana, L. M., The cholinergic antagonist gymnodimine improves Abeta and tau neuropathology in an in vitro modelof Alzheimer disease. Cell Physiol Biochem 2011, 27, (6), 783-94.
6. Williams, P.; Sorribas, A.; Liang, Z., New methods to explore marine resources for Alzheimer'stherapeutics. Curr Alzheimer Res 2010, 7, (3), 210-3.
7. Alonso, E.; Fuwa, H.; Vale, C.; Suga, Y.; Goto, T.; Konno, Y.; Sasaki, M.; LaFerla, F. M.;
Vieytes, M. R.; Gimenez-Llort, L.; Botana, L. M., Design and synthesis of skeletal analogues ofgambierol: attenuation of amyloid-beta and tau pathology with voltage-gated potassium channel and N-methyl-D-aspartate receptor implications. J Am Chem Soc 2012, 134, (17), 7467-79.

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