Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 17, No. 1, 27–33, 2017

総

説（特集）

非誘導条件下で機能する塩素化エテン類分解菌の単離と解析
Isolation and Characterization of Chlorinated Ethenes-degrading Bacterium
under Non-inducing Condition
米塚

健太 1，笠井

大輔 1*，福田雅夫 1†Kenta Yonezuka , Daisuke Kasai * and Masao Fukuda1†
1

1

1

長岡技術科学大学生物機能工学専攻 〒 940–2188 新潟県長岡市上富岡町 1603–1†
現 中部大学応用生物学部応用生物化学科* TEL & FAX: 0258–47–9427* E-mail: dkasai1@vos.nagaokaut.ac.jp
1
Department of Bioengineering, Nagaoka University of Technology, 1603–1 Kamitomioka, Nagaoka, Niigata 940–2188, Japan†
Current Address: Department of Biological Chemistry, Chubu University
キーワード：バイオレメディエーション，塩素化エテン類，multilocus sequence analysis（MLSA），average nucleotide
identity（ANI）解析，比較ゲノム解析
Key words: bioremediation, chlorinated ethenes, multilocus sequence analysis (MLSA), average nucleotide identity (ANI)
analysis, comparative genome analysis
（原稿受付

1.

2017 年 3 月 27 日／原稿受理

はじめに有機溶媒をはじめとする化学物質は，工業発展に欠かせない要素の 1 つである。しかしながら，これらの化学物質の大規模使用や環境中への漏出事故などによる環境汚染が問題となっている。今日の我が国においても，揮
発性有機化合物（VOC）や重金属類，農薬などによる汚染が報告されている。中でも VOC による土壌汚染件
数の 7 割以上を占める塩素化エテン類（塩素化エチレン類）は，揮発性が高く水に難溶性で汚染が拡散しやすい点から掘削除去や物理的封じ込めによる処理が困難である。従って，これらの浄化には曝気や吸引による物理的処理法や鉄触媒を利用した化学的処理法が採用されやすい。加えて，低濃度の汚染に対して効果的である点から，微生物の物質代謝能力を利用した生物的処理（バイオレメディエーション）も注目されている。
塩素化エテン類分解菌としては，嫌気性細菌である
Dehalococcoides 属細菌が最もよく知られており 1)，米
国では微生物製剤として浄化に使用されている。しかしながら，これらの嫌気性細菌による塩素化エテン類の分解速度は遅く，テトラクロロエテン（PCE）やトリクロ
ロエテン（TCE）の分解中間産物として，毒性の高いシス−ジクロロエテン（cDCE）や塩化ビニルモノマー（VC）が蓄積し，これらによる二次汚染がしばしば問題となっている。一方で，好気性条件下では Pseudomonas
属，Burkholderia 属，Methylosinus 属細菌など，トルエ
ンやフェノール，メタン分解菌が有している基質特異性の広い酸素添加酵素によって塩素化エテン類が迅速に分2017 年 4 月 20 日）

解される 2)。しかしながら，これらの酵素生産は上述した基質の添加による誘導を必要とするため，浄化菌として環境中で利用することは難しい。そこで現在，誘導基質を必要とせずに好気条件下で高い塩素化エテン類分解活性を有する微生物を探索するとともに，それらを浄化菌として利用するために必要な実験的知見の収集を行っている。本稿では，塩素化エテン類分解菌の探索と，取得した塩素化エテン類分解菌の解析により得た知見の一端を紹介する。
2.

塩素化エテン類分解菌のスクリーニング

分解速度が速い好気性の塩素化エテン類分解菌を取得するために，全国の様々な箇所から採取した土壌を用いて集積培養を行った。本集積培養では，トルエンやフェノールなどの誘導基質を必要としない分解菌の取得を目的としているため，炭素源として塩素化エテン類のみ（PCE，TCE，cDCE，またはトランス−ジクロロエテン［tDCE］）を供給した。集積培養により取得した分解菌候補株の塩素化エテン類分解能は，ヘッドスペースガス
クロマトグラフィー−水素炎イオン化検出器（GC-FID）
を用いて基質の減少を測定することで評価した。その結果，cDCE で集積した 6 株で cDCE の分解能が観察された（図 1）。これらの反応系にはトルエンやフェノール
等の誘導物質は添加していないため，取得した各株のcDCE 分解系は誘導基質の添加なしで発現することが示
唆された。

米塚

28

他

3.2.

図 1．cDCE 分解菌として単離した 6 株の cDCE 分解能

3.
3.1.

実際に浄化菌として利用する場合，分解活性の顕著な低下は深刻な問題となる。そこで，生育の各段階による
YKD221 株の cDCE 分解活性の違いを調べた。栄養培地
での生育曲線をもとに，対数増殖期中期（2.5 時間）および定常期（24 時間）の菌体を用いて cDCE 分解活性を比較した結果，対数増殖期中期の菌体は高い cDCE
分解能を示したのに対し，定常期での分解能は著しく低いことが示された（図 2A）。また，寒天培地で 2 日間培養した菌体の cDCE 分解は，上述の両者のほぼ中間の値を示した。これらの結果から，YKD221 株の cDCE 分
解は，菌体の生育フェーズによって大きく変化することが示唆された。これは，本株を浄化菌として使用する際に有益な情報になり得ると思われる。
3.3.

cDCE 分解菌 YKD221 株の解析

16S rRNA 遺伝子配列による分類同定

浄化菌として利用するためには，その分類学的情報が必須であるとともに，重篤な症状を引き起こす病原菌と同種ではないことを示す必要がある。そこで，取得した菌株の中で最も高い cDCE 分解能を示した YKD221 株
に関して，16S rRNA 遺伝子配列による分類同定を行った。基準株のみを対象として YKD221 株の 16S rRNA 遺伝子（1,429 bp）の相同性を検索した結果，Pseudomonas
属細菌の 13 種の基準株と 98.5％以上の相同性を示した（表 1）。一般に，16S rRNA 遺伝子配列が 98.5％以上の相同性を示していれば，比較した株が互いに同種であると 判 定 す る こ と が で き る こ と か ら，YKD221 株 は
Pseudomonas 属細菌であることが示された。基準株以外では，トルエン分解菌の P. putida F1 株（100％），有用宿主の P. putida KT2440 株（99.86％）との配列相同性が最も高く，基準株で最も近縁な P. plecoglossicida
NBRC 103162T 株（99.79％）よりも高い相同性を示した。このことから，YKD221 株は P. putida に分類される可能性が高いと考えられた。P. putida（group）細菌の分類については，全ゲノム配列を利用した系統解析について項目 4 で詳しく述べる。

生育フェーズにおける cDCE 分解活性の差異

塩素化エテン類に対する基質特異性

YKD221 株が cDCE 以外の塩素化エテン類に対しても分解能を有しているかを調べるために，PCE，TCE，tDCE の 3 種類の塩素化エテン類に対する分解活性を評価した。その結果，TCE に対しては弱い分解活性を示したものの，PCE および tDCE に対する分解活性は観察されなかった（図 2B）。これらの結果と YKD221 株がcDCE での集積培養により取得された経緯から，本株はcDCE 分解に特化した塩素化エテン分解菌であると考え
られた。
3.4.

cDCE 分解産物の検出

既存の塩素化エテン類分解菌では，分解に伴って塩化物イオンが生成することが知られている。そこで，
YKD221 株の cDCE 分解に伴う塩化物イオンの生成をイ
オンクロマトグラフィー分析により調べた。その結果，反応 24 時間後には 179.1 mol の cDCE の消失とともに，その約 2 倍にあたる 347.3 mol の塩化物イオンの生成が
観 察 さ れ た（ 図 2C）。 こ の こ と か ら，YKD221 株 の
cDCE 分解において，1 分子の cDCE に含まれる 2 つの塩素イオンの両方が放出されることが示唆された。

表 1．16S rRNA 遺伝子レベルで YKD221 株と 98.5％以上の配列相同性を示した基準株
種
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

菌株名
Pseudomonas plecoglossicida NBRC 103162
Pseudomonas monteilii CIP 104883T
Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751T
Pseudomonas entomophila L48T
Pseudomonas putida ICMP 2758T
Pseudomonas mosselii CFML 90-83T
Pseudomonas parafulva AJ 2129T
Pseudomonas oryzihabitans L-1T
Pseudomonas cremoricolorata NBRC 16634T
Pseudomonas soli F-279,208T
Pseudomonas guariconensis PCAVU11T
Pseudomonas flavescens NBRC 103044T
Pseudomonas japonica NBRC 103040T

T

配列相同性（一致 / 全塩基数）

アクセッション番号99.79%（1445/1448）
99.65%（1440/1445）
99.65%（1438/1443）
99.59%（1442/1448）
99.48%（1342/1349）
99.31%（1435/1445）
99.17%（1436/1448）
99.17%（1436/1448）
99.03%（1434/1448）
98.94%（1404/1419）
98.76%（1433/1451）
98.69%（1429/1448）
98.62%（1428/1448）

NR_114226.1
NR_024910.1
NR_116172.1
NR_102854.1
NR_114794.1
NR_024924.1
NR_040859.1
NR_025881.1
NR_113855.1
NR_134794.1
NR_135703.1
NR_114195.1
NR_114192.1

塩素化エテン類分解菌の単離と解析

29

ナーゼ成分をコードする todC1 を破壊したところ，トル
エンでの生育能（図 3A）と cDCE および TCE の分解活性を完全に失った（図 3C）。このことから，YKD221 株の cDCE および TCE 分解においてもトルエンジオキシ
ゲナーゼが関与することが示唆された。
3.6.

YKD221 株と F1 株のゲノム比較

YKD221 株と F1 株のゲノムサイズは約 5.9 Mb，G+C
含量は 61.9％であり，ゲノム全体の相同性は 99.24％であった。両者のゲノム配列を比較した結果，YKD221 株にのみ存在する遺伝子（coding DNA sequence, CDS）は
96 個あることが示された。これらの中に塩素化エテン類の初発分解を担うと考えられる酸素添加酵素は認められなかったが，フェレドキシンやフェレドキシンレダク
ターゼなどの電子伝達コンポーネント，ギ酸レダクター
ゼやグルタチオン依存型のチオールレダクターゼなど下流分解に関与する酵素，複数の転写制御因子など，塩素化エテン類分解との関連が想像される CDS が含まれていた。YKD221 株は F1 株とは異なり，cDCE に特化した分解活性を示したことから，これらの遺伝子の存在が両株の活性の差異に関係しているかもしれない。さらに一塩基多型や挿入・欠失領域も複数見られたことから，
YKD221 株と F1 株はゲノム配列レベルで相同性は高い
ものの，それらは同一ではないことが示された。
4.

図 2．YKD221 株の塩素化エテン類分解能

3.5.

塩素化エテン分解へのトルエン分解系の関与

YKD221 株と最も近縁なトルエン分解菌 P. putida F1
株では，トルエンの初発分解反応を担うトルエンジオキ
シゲナーゼが TCE の分解に関与する 3)。YKD221 株のトルエン生育能を調べた結果，本株もトルエンを単一炭素源として旺盛に生育することが示された（図 3A）。さらに，トルエンで生育した菌体を用いて cDCE およびTCE 分解能を調査したところ，栄養培地で生育した菌体と比べて高い分解活性を示すことが明らかとなった（図 3B）。特に cDCE の分解活性の向上は著しく，反応3 時間で 500 nmol の cDCE をほぼ完全に分解した。このことから，YKD221 株は，誘導なしでも cDCE を分解できるものの，トルエンによりその分解系が活性化されることが示唆された。
YKD221 株の全ゲノム解析を行った結果，本株は F1
株のトルエン分解酵素遺伝子群（tod 遺伝子群）と同一の遺伝子群を持つことが明らかとなった。さらに，本遺伝子群に含まれるトルエンジオキシゲナーゼのオキシゲ

YKD221 株の系統学的分類

現在は 16S rRNA 遺伝子配列の相同性を利用した細菌の分類が主流であるが，3.1. で示したように YKD221 株
は 13 種の Pseudomonas 属細菌と同種となり，種レベルまで同定できなかった。Pseudomonas 属のように，同属内で配列相同性が極めて高いものは 16S rRNA 遺伝子配列では正確に分類できない。2000 年代からのコンピュータの発展およびシークエンス技術の向上により，現在では細菌など比較的小規模の生物のゲノムシークエンスが容易に行えるようになった。これを受けて，ゲノム配列を利用した精緻な系統分類技術が誕生し，上記の問題が克服されつつある。中でも複数のハウスキーピング遺伝
子配列を連結した配列を用いた multilocus sequence analysis（MLSA）や全ゲノム配列を用いた average nucleotide identity（ANI）は，細菌の分類解析法として数多くの研究者が利用し始めている。またこれらは，従来の種分類同定法である DNA-DNA ハイブリダイゼーション法との相関も明らかにされており，ANI では 95％が種分類の閾値となっている 4,5)。
本研究においても，YKD221 株を含めた合計 59 株の P.
putida group 細菌を用いて，MLSA および ANI 解析を実施し，分解菌として取得した YKD221 株の正確な分類を試みた。MLSA と ANI の解析結果は非常に高い相関性を示したため，本稿では ANI の結果を取り上げて説明する。ANI 解析結果をもとに作成した系統樹を図 4に示した。また種分類の閾値である 95％を樹形内に図示
し，互いに同種であると判定できた 9 つのクラスターを
I〜IX で番号付けした。解析の結果，59 株の P. putida
group 細菌を 9 種類のクラスターを含む合計 26 種に分類することができた。YKD221 株はクラスター I 内の他

30

米塚

他

図 3．YKD221 株の塩素化エテン類分解へのトルエン分解系の関与の 15 株と同種であると判定できた。これらの中には，
F1 株や DOT-T1E 株といったトルエン分解菌が含まれていた。また安全な宿主として利用されている KT2440
株とも同種であったため，YKD221 株も浄化菌として使用するために十分な安全性を有していると考えられた。
一方で，P. putida の基準株である NBRC 14164T 株はクラスター I 内ではなく，クラスター III に隣接する独立種として位置付けられた。そのため，P. putida の名を冠する他の株では，分類結果と種名が一致していない場
合があり，P. putida group では，今後正確な分類に基づいた種名の変更が望まれる株も存在することが示された。

5.

比較ゲノム解析による臨床株との差別化

MLSA および ANI 解析では合計 59 株の P. putida group
細菌を使用したが，これらの中には，病院などの医療現場から単離された 26 株の臨床株が含まれていた。臨床株は病原菌のような重篤な症状を引き起こすものではな
いため，現行では浄化菌として使用する際に問題にならないが，日和見感染性を持ち得ると考えられる。そこで，
臨床株と YKD221 株のような臨床現場以外の環境中から単離された株（非臨床株または環境株）に着目して，両者を差別化できないか検討した。
先に示した ANI 系統樹からも明らかなように（図 4），

塩素化エテン類分解菌の単離と解析

31

図 4．ANI 解析に基づいた YKD221 株の系統学的分類

P. putida group 細菌の臨床株および非臨床株は，一部で片方のみから構成されるクラスターがいくつか見られたが（クラスター VI，VIII，IX の全体，クラスター I，IV，
V の一部分），大部分は系統樹内に混在していた。そのため MLSA や ANI といった系統解析法では，塩基配列の類似度を比べているため，特定の異なる部分の違いが解析結果に大きく反映されないと考えられた。
臨床株および非臨床株の差異を見出すために，全ゲノ
ム配列から取得した CDS をもとに比較ゲノム解析を実施した。CDS の分布およびその数をベン図として図 5にまとめた。臨床株の全 CDS 数は 4,910 〜 6,357 個の間で，平均値は 5,527 個であった。一方，非臨床株の全CDS 数は 4,108 〜 6,153 個の間で，平均値は 5,297 個であった。全 CDS 数は最小値，最大値，平均値のいずれにおいても臨床株の方が非臨床株よりも僅かに多い傾向を示した。さらに，臨床株と非臨床株のそれぞれで普遍的に存在する CDS（コアゲノム CDS）を調べた。普遍性の判定は，アミノ酸配列の相同性が 20％以上かつクエリカバー 60％以上の CDS を基準とした。その結果，
臨床株および非臨床株のコアゲノム CDS 数はそれぞれ
2,087 個および 1,847 個であった。またこれらのうち，
1,332 個の CDS は臨床株，非臨床株問わず，解析に使

米塚

32

他

図 5．臨床株および非臨床株の CDS 数の内訳

表 2．臨床株および非臨床株特異的コアゲノム CDS の COG 機能別分類
COG major function
Cellular processes
and signaling

Information storage
and processing

Metabolism

Poorly characterized

コアゲノム CDS 数
臨床株特異的 非臨床株特異的
Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning
6
5
Cell wall/membrane/envelope biogenesis
30
23
Cell motility
19
17
Post-translational modiﬁcation, protein turnover, and chaperones
19
23
Signal transduction mechanisms
38
26
Intracellular traﬃcking, secretion, and vesicular transport
9
6
Defense mechanisms
14
7
Extracellular structures
20
Nuclear structure00
Cytoskeleton
00
RNA processing and modiﬁcation
00Chromatin structure and dynamics
00Translation, ribosomal structure and biogenesis
49
21
Transcription
32
18
Replication, recombination and repair
25
16
Energy production and conversion
40
34
Amino acid transport and metabolism
61
60
Nucleotide transport and metabolism
15
11
Carbohydrate transport and metabolism
18
26
Coenzyme transport and metabolism
41
22
Lipid transport and metabolism
18
19
Inorganic ion transport and metabolism
33
17
Secondary metabolites biosynthesis, transport, and catabolism
11
12
General function prediction only
42
36
Function unknown
22
9
COG detailed function

Total

用した全ての株で共通して見られた。これらのデータの差分から，臨床株および非臨床株で特異的なコアゲノム
CDS 数は，それぞれ 755 個および 515 個であり，コア
ゲノム CDS 数も臨床株の方が 240 個多いという結果が得られた。これらの CDS 数の傾向は，臨床株では生体内で生存するためにより多くの機能性遺伝子を必要とすることに起因すると考えることもできるが，株毎の個体差が大きいことから今回の解析では各機能と関連付けることはできなかった。これは，インフルエンザ菌や緑膿菌，黄色ブドウ球菌などにおいて，ゲノムサイズや全CDS 数と病原性の間に必ずしも相関があるわけではない
ことからも明らかである 6,7)。
臨床株および非臨床株で特異的なコアゲノム CDS の

544

408

割合 (C-N)/C
0.2
0.2
0.1
-0.2
0.3
0.3
0.5
1.0
̶
̶
̶
̶
0.6
0.4
0.4
0.2
0.0
0.3
-0.4
0.5
-0.1
0.5
-0.1
0.1
0.6
0.3

うち，Clusters of Orthologus Groups（COG）による機能別分類が可能であったものを対象として，これらの内 訳 を 表 2 に ま と め た。 臨 床 株 特 異 的 な コ ア ゲ ノ ム
CDS が多いもの（表 2，ratio 0.5 以上）は，細胞外因子（Extracellular structures, 1.0），翻訳・リボソーム因子・発生（Translation, ribosomal structure and biogenesis, 0.6），
防御機構（Defense mechanisms, 0.5），補酵素輸送・代謝（Coenzyme transport and metabolism, 0.5），無機イオン
輸送・代謝（Inorganic ion transport and metabolism, 0.5）であった。これらの機能別分類とともに病原性に関わる因子を調べたところ，臨床株と非臨床株を識別するための指標となり得るいくつかの CDS を見出した。
（1）細胞外因子に関わる CDS：IV 型線毛と II 型分泌塩素化エテン類分解菌の単離と解析系が見出された。IV 型線毛は感染時の定着に重要なバ
イオフィルム形成に関わる湿固相表面の移動能を提供する病原因子であり，II 型分泌系は IV 型線毛の形成に関与することが，Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）を含む細菌で報告されている 8)。
（2）防御機構に関わる CDS：チオールペルオキシ
ダーゼおよびカタラーゼ（ヒドロキシペルオキシダーゼ
I，HPI）が含まれる。これらの酵素は生体内の異物殺菌作用に寄与する活性酸素種の 1 つである過酸化水素を無毒化する酵素として知られている 9)。一方で，活性酸素種の 1 つであるスーパーオキシドアニオンの無毒化に関わるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）10) は，臨床株だけでなく非臨床株にも存在していたことから，指標遺伝子としては適さないと考えられた。
（3） 無 機 イ オ ン 輸 送・ 代 謝 に 関 わ る CDS： シ デ ロ
フォアレセプター（トランスポーター）が含まれる。生
体内ではほとんどの鉄イオンが固定化され遊離の鉄イオンが欠乏しているため，鉄イオンを獲得するためにシデロフォアが感染に関与することが知られている 11,12)。シデロフォアそのものは臨床株特異的ではないが，シデロ
フォアレセプター（トランスポーター）が臨床株のシデロフォア分泌量を増加させる役割を担っている可能性が考えられた。
（4）抗生物質分解に関わる CDS：β-ラクタマーゼおよびペニシリンアミダーゼ（アシラーゼ）が含まれる。
これらの酵素は，β-ラクタム系抗生物質を不活化し抗生物質耐性に関与する。特に β-ラクタマーゼは，病原性菌に広く分布していることが知られている 13,14)。
以上の中から，P. putida group 細菌の臨床株および非臨床株を正確に区別できる指標となり得る遺伝子を特定し，それらを利用した分類法が確立できれば，両者を容易に判別することが可能になると期待される。
6.

おわりに

これまでに，cDCE 分解能を持つ YKD221 株の取得と，その塩素化エテン類分解能や分解遺伝子などバイオレメ
ディエーションでの利用に有益な情報の収集が行われて33きた。また分解菌の比較ゲノム解析から，臨床株と非臨床株の区別に利用できる遺伝子の候補が限定され，微生物の安全性を評価するための指標確立に向けた基礎的知見が得られている。YKD221 株は，公的菌株保存機関である NITE Biological Resource Center（NBRC）に寄託されており，浄化事業者への分譲体制も整備されている。
本研究によって得られた成果を利用すれば，浄化菌の利用申請が比較的容易になると考えられ，今後，YKD221
株が浄化菌として利用されることでバイオレメディエー
ション普及の一助となることを期待したい。そして，臨
床株と非臨床株を区別可能な遺伝子を用いた菌株の安全性評価基準が確立されることも期待される。
謝

辞

以上の研究成果は，経済産業省受託事業「土壌汚染対策のための技術開発」の研究助成によって得られたものである。ここに感謝の意を表する。
文

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