生物技研の環境DNA解析に解析具体例①
群馬県と神奈川県におけるブルーギルとオオクチバスの在/不在
城沼
（4/4）
（4/4）
渡良瀬遊水地（0/4）（3/4）

上段がブルーギル、下段がオオクチバスの結果で、分母が反復数、分子が検出回数を示しています。
ブルーギルはTakahara et al., (2013) 、オ
オクチバスはYamanaka et al., (2016) の方法を参照し、解析を行いました。

蛍光強度

多々良湖
（3/4）
（0/4）

ーピ
デジ 登場！
Rdigital PC

震生湖
（4/4）
（4/4）

サイクル数

LightCycler® 96 システム
（Roche）等を使用し、右上のようなデータから在・不在を判断します。

相模川
（0/4）
（0/4）

野生生物の生態調査は捕獲や観察といった直接的手法を中心として行われており、高度な専門知識と経験が必要でした。
近年、水に含まれる生物の体液や鱗、糞便由来の「環境DNA」
を解析することが可能になり注目を集めています。
生物技研では次世代シーケンサー、リアルタイムPCRおよびデジタルPCRを用いて高解像度での解析を行い、環境サンプルに含まれている生物の痕跡を見つけ出します。

解析具体例②
アユの定量解析 2つの解析方法の比較結果
抽出DNA 1 ml中のDNAコピー数
サンプル名

デジタルPCR

魚類の網羅的解析＋定量解析（オプション）注3

kushikawa-1akushikawa-1b
kushikawa-2a
kushikawa-2b
osaka-aosaka-b

0.56
0.41
0.24
0.67
2.59
1.11

2.95
1.72
0.82
0.82
9.34
5.62

外も魚類以可能！

次世代シーケンサーを用いた解析です。環境中のDNAを網羅的なプライマーセットでPCR増幅した後、シーケンシングします。得られた塩基配列をデータベースと照らし合わせ、生物相を解析します。

注3） 魚類の網羅的解析のサンプル調製時に内部標準を入れてPCRを行う
ことで、網羅的解析の結果に定量性の情報も得られる手法です。上記は、その結果の中からアユの数値を抜粋しました。

15cm

解析を弊社にご依頼いただける場合に無償で貸し出ししています。

（高さ）

11cm

◎現場でろ過するメリット
・水を送付するよりも、DNAの分解が抑えられる。

11cm

・輸送費用が安くなる。
・解析費用が、1サンプルあたり27,000円→23,000円（税別）と安くなる。
◎費用（税別) ※本体貸出は0円です
発送/返却費用 4,000円（着払い伝票を同梱）
消耗品セット（チューブやステリベクスなど） 2,000円/セット（1サンプル分）

ろ過した後、ステリべクスを生物技研へ送ればOK。

核酸保存液セット* 500円/セット（1サンプル分）▲ DIYタイプ*ろ過後すぐに冷凍できない場合は核酸保存液の添加が必要ですので、この単三電池またはACアダプターで駆動します

DNAの能！
定量も可New!
第3世代のPCR法による絶対定量③消耗品セットと核酸保存液セットの個数 ④使用日程▲ PROタイプ
バッテリーまたはACアダプターで駆動します〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹 657
TEL 042-780-8333 FAX 042-780-8334
dna@gikenbio.com

コンパクトでいいねぇ

15,000円/サンプル（税別）
デジタルPCR解析によるDNAコピー数の絶対定量

15,000円/サンプル（税別）
ちらしは別途ご用意しています。

次世代シーケンサーを用いた解析です。同じ生物種内で遺伝的に異なる集団（ハプロタイプ）を解析します。

どのハプロタイプかな？

①本体タイプ（DIYタイプ or PROタイプ） ②本体台数

環境中のDNAを種特異的なプライマーセットでPCR増幅しながら、特定生物の在・不在やDNAのコピー数を解析します。

遺伝的多様性解析◎ご依頼方法
メール等で以下の内容をお知らせください。

種特異的解析
リアルタイムPCR解析による在・不在

この生物はいるかな？

セットもご購入いただくか、ご自身でそれをご用意ください。

使い方など
詳細は弊社HPで27,000円/サンプル（税別）

どんな生物がいるかな？

環境DNA用ポータブルチューブポンプの貸出しサービス⑤送付先 ⑥無償の練習用キット同梱の必要の有無

網羅的解析

環境ＤＮＡ用ポータブルブル
チューブポンプを貸出ししています。

4反復の場合42,000円/サンプル（税別）

詳しくは裏表紙をご覧ください。

環境DNA

環境DNA

網羅的解析（メタバーコーディング解析）

どんな生物がいるかな

リアルタイムPCR解析
デジタルPCR解析（種特異的解析

この生物はいるかな？

）※価格は税別です価格

内訳

27,000円/サンプル
底生動物の解析は32,000円/サンプル[

リアルタイムPCR解析

動物 (COI)、魚類 (cMiFish)※1、哺乳類 (MiMammal)※2、節足動物 (gInsect)※3、鳥類 (gBird)※3･4、二枚貝 (gClam) 、※3※3※3※3
巻貝（gSnail） 、有尾目<イモリ類とサンショウウオ類> (gSalamander) 、無尾目（gFrog） 、環形動物（gWorm） 、※3※3※3※3※3
線虫 (Ecdysozoa) 、陸上植物 (rbcL) 、光合成生物 (psbA) 、褐藻(gKasso) 、紅藻(gKoso) 、真核生物 (18S rRNA)、※3・5( )は使用するプライマーセット名または解析対象領域の名称です。上記以外の生物種についてはご相談ください。
底生動物（gBenthos）※3価格[・ろ過4,000円/サンプル
・DNA抽出3,000円/サンプル
・リアルタイムPCR解析 8,000円/サンプル・ろ過・DNA抽出・デジタルPCR解析

4,000円/サンプル
3,000円/サンプル
8,000円/サンプル

ブルーギル、オオクチバス、コクチバス、アユ、アユモドキ、オオサンショウウオ、チュウゴクサンショウウオ、ハクバサンショウウオ、ニホンウナギ、イワナ、ヤマメ、イシドジョウ、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ニホンザリガニ、ウチダザリガニなど
記載のないの生物種についてはご相談ください。

解析系がある生物種

cMiFishに円口類（スナヤツメやヌタウナギなど）プライマーを追加するオプションです。

15,000円/サンプル
内訳

解析系がある生物種※ダウンロード形式で納品します。

MiFish定量解析 +10,000円/サンプル（納期も+5営業日）

内訳

20営業日

プライマー追加 + 2,000円/依頼[解析New!
第3世代のPCR法による絶対定量

デジタルPCR解析

15,000円/サンプル（底生動物の解析は25,000円/サンプル）

納期オプション

※価格は税別です・ろ過
4,000円/サンプル
3,000円/サンプル
・DNA抽出・メタバーコーディング解析 20,000円/サンプル

プライマーやプローブは、in silicoで設計するため、対象生物種のみを検出できる保証はできません。
対象生物やその近縁種の個体やDNAをお送り頂ければ、特異性の検証を行うことも可能です（3サンプルまで）。

DNAコピー数を算出するオプションです。

※1 2020年5月よりプライマーセットの名称・混合内容が変わりました。
旧）
淡水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R (Miya et al., 2015)を1:1で混合

納期海水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R (unpublished primer)を2:1:1で混合

5営業日新）
cMiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R 、MiFish-Ayu&Wakasagi(unpublished primer)を4:2:2:1で混合※2 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。

2サンプルまで：+10,000円/サンプル
3〜20サンプル：+30,000円/依頼・生物種

定量解析※3 自社で開発したプライマーセットでの解析です。

（DNAコピー数の算出）

オプション※4 鳥類は環境DNAへの移行が少なく、検出が困難な傾向にあります。
※5 節足動物、環形動物、貝(二枚貝・巻貝)、十脚甲殻類が解析対象です。
プライマー配列やPCR条件は開示していませんので、あらかじめご了承ください。

解析の反復

解析の流れ
（お客様）サンプルの送付

水サンプル ( 1 L ) を冷蔵便で送付下さい。
※冷蔵での送付が難しい場合は、下記Q2の回答下コラムを参考にして下さい。

ろ過フィルターを用いて、ろ過を行います（水の濁度が高いなど、弊社標準フィルターだけではろ過が難しい場合は、プレフィルターも用いてろ過を行います）。

DNA抽出注1)

フィルターに捕集された物質からDNAを抽出します。抽出DNAからPCR阻害物質を除去した後、DNA濃度を測定します。

ライブラリー作製(PCR)

弊社標準フィルター
ステリべクス-GP 0.22μm

12S rRNAやCOI領域などを対象として、2-step tailed PCRを行い、ライブラリーを作製します。
その後、ライブラリーの濃度と品質を確認します。

DADA2法を用いて、得られたリードをamplicon sequence variant (ASV)にまとめます。
ASVとリード数をまとめた表をご提供します。
また、データベースの配列と97%以上の相同性があるASVは、種名を併記します。

サンプルの送付

水サンプル(1L)を冷蔵便で送付下さい。
※冷蔵での送付が難しい場合は、下記Q2の回答下コラムを参考にして下さい。

フィルターろ過フィルターを用いて、ろ過を行います（水の濁度が高いなど、弊社標準フィルターだけではろ過が難しい場合は、プレフィルターも用いてろ過を行います）。

DNA抽出注2)

フィルターに捕集された物質からDNAを抽出します。抽出DNAからPCR阻害物質を除去した後、DNA濃度を測定します。

リアルタイムPCR解析

リアルタイムPCR：LightCycler® 96 システム（Roche）等を用いて解析を行います。

または

デジタルPCR：QX200 Droplet Digital PCR（BIO-RAD）を用いて解析を行います。

注2）抽出されたDNAは、別の種の種特異的解析（追加料金：8,000円/サンプル・生物種）やメタバーコーディング解析(追加料金: 20,000円/サンプル)にも使用することが可能です。

第3世代のPCR「デジタルPCR」とは？

相模川における動物相
各サンプリング地点におけるASVごとのリード数と種名を示しています。
動物（COI）プライマー(Lerayet al., 2013)を使用しました。

<容器>再利用する場合は10倍希釈した漂白剤（ブリーチ）に3時間以上浸漬した後、水道水と純水や超純水でよく流してからお使いください。
新品の場合はこの作業は必要ないと考えていますが、慎重を期す場合は行って下さい。
<採水>必ず手袋をして下さい。
<保存>採水後はできる限り早く冷蔵して下さい。

4反復 +4,000円/サンプル
より正確なデータを得るため、標準の2反復から4反復へ増やすオプションです。

デジタルPCR解析

解析具体例

Q1.採水時の注意点は？

8反復 +4,000円/サンプル
より正確なデータを得るため、標準の4反復から8反復へ増やすオプションです。

（お客様）

注1）抽出されたDNAは、メタバーコーディング解析だけでなく種特異的解析にも使用することが可能です(追加料金: 8,000円/サンプル・生物種)。

よくあるご質問

デジタルPCRは定量が基本です。

解析の流れ

メタバーコーディング シーケンシング解析 MiSeqシステムとMiSeq Reagent Kit v3 (Illumina)を用いて、2x300 bpの条件でシーケンシングを行います。
解析
データ解析

※プライマーの設計・合成が必要な場合は、プライマー合成完了後5営業日です。
※ダウンロード形式で納品します。

Q2.サンプル送付時の注意点はありますか？
必ず平日着・冷蔵便で、弊社（右記住所）へ送付して下さい。
※冷凍は推奨しません。
凍結融解に伴い細胞が破壊され、解析対象であるDNAが溶液中に放出され、フィルターを通り抜けてしまうためです。
冷蔵での保存・送付が難しい場合「オスバン消毒液」を、水1 Lに対して1 ml添加すると10日程度の保存が可能となるようです。参照論文など詳しくは弊社HPをご覧下さい。

MiSeqを使用し、左のようなデータ解析結果を納品します。

Q3.ろ過量はどのくらい？
送付いただいたサンプル全量をろ過することを基本としていますが、フィルターが目詰まりを起こした時は、その時点でろ過終了となります。複数のフィルターを使用してろ過量を多くしたい場合は、2,500円/フィルター（税別）の追加料金が発生します。

Q4.フィルターの種類やろ過方法は？
弊社標準は、ステリべクス-GP 0.22μm(メルクミリポア)で加圧ろ過になります。
プレフィルターは、
ガラス繊維ろ紙GF/A（Whatman）で減圧ろ過になります。

デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べてはるかに高精度、高感度に定量を行う新しい技術です。 定性のみの通常PCR、検量線による相対定量のリアルタイムPCRに対して、絶対定量を行う
デジタルPCRは第3世代のPCRと言われています。

デジタルPCRは、1分画あたり1コピー以下に抽出DNAを希釈してPCR解析をします。希釈の過程で、PCR阻害物質も希釈されるため、阻害を受けにくくなります。
その点でも、環境DNAの解析に適した手法と言えます。

鋳型DNAが存在した分画で蛍光が検出されます

7コピー

お見積り例
＜網羅的解析と種特異的解析の両方を行う＞＜網羅的解析＞
例：１サンプルについて魚類相と動物相を解析・ろ過とDNA抽出7,000円・メタバーコーディング解析 20,000円×2=40,000円
合計 47,000円

例：１サンプルについて魚類相の網羅的解析と2コピー

お問合せ・見積依頼
サンプル送付先

アユの種特異的解析
・ろ過とDNA抽出

7,000円・メタバーコーディング解析

20,000円

・リアルタイムPCR解析

8,000円
合計 35,000円

株式会社生物技研〒252-0154
神奈川県相模原市緑区長竹657
tel: 042-780-8333
Email: dna@gikenbio.com