倉田奨励金研究報告書 第 50 集｜2019 年度（第 51 回）助成■受領№1405（中間報告）

CRISPR/Cas9 技術を応用した皮膚癌における新規エピゲノム編集の開発

代表研究者

應田 涼太

北海道大学大学院医学研究院

助教

1．研究目的見 出 し た (ProcNatlAcadSciUSA.107

免疫チェックポ(31):13794-9.)。さらに、癌組織においては NLRC5イント阻害剤の登遺伝子プロモーターのメチル化が高頻度に起きて場は、癌治療に大おり、 MHC class I 抗原提示経路が機能不全となきなインパクトをることにより、癌が免疫機構から逃避することが与えて来ている。

示された(図 1)。実際、 NLRC5 の発現レベルや従来の治療法ではメチル化度は各種癌において 5 年生存率に大きく全く無効であった関わっていることが我々の研究によって明らかと進行癌にも、著明なった。以上のことから、NLRC5 遺伝子脱メチルな治療効果を示す化による癌免疫逃避の阻害が新たな癌治療戦略に例も多々報告されている。しかしながら、未だ、こうした癌免疫療法に反応する癌患者は少数派であり、多くの癌患者では治(図 1) NLRC5 を標的とした癌免疫逃避機構
癌細胞では NLRC5 プロモーター領域のメチル化が高頻度で見られ、その結果 MHC-I 遺伝子発現も抑制されている。

おいて有用であると考えるに至った。しかし、既存の脱メチル化剤は非特異的であるため強い副作用を有し、一部の癌にしか用いることができない。
そのため、特異的な DNA 脱メチル化技術の開発が⻑く望まれていた。本研究は、CRISPR/Cas9 システムを応用した新しい特異的脱メチル化技術の開発を行うことにより、新規癌治療戦略の可能性療効果が認められない。多くの原因が考えられるを明らかにすることが目的である。本研究によっが、一つは現在の癌免疫療法が、免疫系をいかにて、癌細胞における効果的な遺伝子発現制御技術賦活化させるかに重きを置いており、その相手方が開発されることが期待される。

である癌がいかに免疫系から逃れているかに対応出来ていないことが原因である。これまで我々の2．研究内容

研究グループは、21 種類の固形癌約 8000 検体、これまで我々の研究から、悪性⿊⾊腫患者の 5 年生

正常組織約 3000 検体のデータを解析した結果、存率と NLRC5 遺伝子発現量が相関し、NLRC5 遺伝

MHC class I 遺伝子群のマスター転写補因子であ子のメチル化度と逆相関することが明らかとなった。

る NLRC5 の発現および機能低下が癌の免疫逃避システムにおいて重要な役割を担っていることをそこで NLRC5 を標的遺伝子として、マウス悪性⿊⾊腫細胞株(B16F10)にてCRISPR/Cas9システムを応用した遺伝子特異的脱メチル化技術開発を行った。

倉田奨励金研究報告書 第 50 集｜2019 年度（第 51 回）助成

(図 2) CRISPR/Cas9 を応用した NLRC5 脱メチル化技術(A) NLRC5 メチル化部位に結合するように設計したガイド RNA(sgRNA)。
(B)dCas9 と脱メチル化酵素(TET1CD)がガイド RNA によってメチル化部位に結合する模式図。

2.1 NLRC5 遺伝子を標的とする脱メチル化システ

2.2 In vitro における NLRC5 遺伝子脱メチル化のムの構築

確認

我々は CRISPR/Cas9 技術を改変することにより、上記の脱メチル化誘導発現ベクターを用いて遺伝子選択的に脱メチル化酵素を標的部位へ送り込

NLRC5の発現量をqPCRによって測定し、脱メチむことを目指した。具体的には、①酵素活性能を欠損

ル化割合はバイサルファイトシークエンス法によさせた Cas9 (dCas9)と脱メチル化酵素 TET1 を融合って検討を行った。複数の発現ベクターを細胞内させた発現ベクター (dCas9-TET1) ②遺伝子特異に導入するのは非効率であると考えられることか的なガイド RNA 発現ベクター (sgRNA) ③sgRNAら、dCas9-TET1とMS2-TET1をStableに発現する特異的に結合するバクテリオファージ由来 MS2 coat細胞をレンチウイルス によって作成した。そこへ

protein と脱メチル化酵素 TET1 を融合させた発現ベ

NLRC5遺伝子を標的とするgRNAをレンチウイル

クター (MS2-TET1)を作製した(図 2)。

スによって導入し、NLRC5遺伝子脱メチル化を試(図 3) NLRC5 遺伝子標的とした gRNA による NLRC5 発現量と脱メチル化の確認
dCas9 stable B16F10 細胞に設計した NLRC5 標的 gRNA を導入し(A) qPCR によって NLRC5 の発現量(B) バイサルファイトシークエンス法によって脱メチル化を測定した。●: メチル化部位

倉田奨励金研究報告書 第 50 集｜2019 年度（第 51 回）助成みた。その結果、gRNA (#1-4)を導入することにマウスにおける癌モデルを用い、エピゲノム編

よってNLRC5発現量の上昇が見られ、NLRC5遺集を癌における遺伝子発現をコントロールする技

伝子プロモーター上に存在するメチル化領域術として応用し、将来的に新しい癌治療戦略とし(CpG1)において、脱メチル化が確認された(図3)。ての有用性を明らかにする。マウス悪性⿊⾊腫細胞株を同系のC57BL/6マウスに移植し、エピゲノ

2.3 NLRC5 遺伝子脱メチル化技術の改良

ム編集レンチウイルスを隔日ごとに腫瘍内に経皮

上記のように脱メチル化酵素(TET1)をgRNA投与し、腫瘍内CD8+T細胞数、活性度、腫瘍サイによってNLRC5遺伝子上へ送り込み、発現量の上ズ、生存曲線を求める。高い治療効果が得られない

昇と脱メチル化が観察された。しかし、NLRC5遺場合には、NLRC5同様に発現がDNAメチル化によ伝子発現量の増加が見られたにも関わらず、り抑制されている癌抑制遺伝子や免疫系遺伝子をMHC-I遺伝子の発現量に差が観られなかったこ

エピジェネティック編集標的として付け加える。とからNLRC5発現誘導が不十分であると考えら(ii) NLRC5 DNA 脱メチル化による免疫チェッれる。そこで、dCas9技術を改変し、更なるNLRC5

クポイント阻害剤の治療効果の評価発現誘導を目指した。具体的には、脱メチル化酵

現在、免疫チェックポイント阻害剤は一部の患素(TET1)にNLRC5の転写因子であるp65を付け者にのみ著効を示す。免疫チェックポイント阻害

加えた融合タンパク質(TET1-p65)を作成し(図剤の治療効果はCD8+T細胞の活性化に依存する4A)、NLRC5遺伝子を標的としたgRNAによってことから、我々の予備実験データから推測するにTET1-p65をNLRC5プロモーター領域に送り込ん

不応症例のかなりの割合がNLRC5の発現またはだ。その結果、脱メチル化酵素(TET1)単独を送り機能不全によるものである可能性がある。そこで、込んだ場合より、転写因子融合脱メチル化酵素

上記の悪性⿊⾊腫モデルマウスをエピゲノム編集(TET1-p65)を送り込むことによってNLRC5発現によってNLRC5の脱メチル化を行うと同時に免量の更なる増加が見られ、またMHC-I関連遺伝子

疫チェックポイント阻害剤で治療し、治療効果をであるLMP2の発現量の上昇も得られた(図4B)。

腫瘍内CD8+T細胞数、活性度、腫瘍サイズ、生存率によって評価する。

2.4 今後の予定(i) マウス悪性⿊⾊腫モデルにおけるin vivo でのエピジェネティック編集技術の開発

３．発表（研究成果の発表）
本研究終了後、国際雑誌に投稿予定である。

(図 4) 転写因子融合脱メチル化酵素の作成と NLRC5 誘導の確認(A) 転写因子 p65 を融合させた脱メチル化酵素が gRNA によって標的遺伝子に集積される模式図。
(B) NLRC5 遺伝子を標的とした gRNA 導入し、NLRC5, LMP2 発現量を qPCR で測定した。