ヒト腸内細菌由来プエラリン代謝酵素の単離と遺伝子クローニング

ヒト腸内細菌由来プエラリン代謝酵素の単離と遺伝子クローニング（申請代表者）（所内共同研究者）

申 請 代 表 者
所内共同研究者

中村賢一
朱 姝
中村
朱

鈴鹿医療科学大学薬学部
富山大学・和漢医薬学総合研究所賢一
姝鈴鹿医療科学大学薬学部
生薬資源科学分野

助手
助教

助手
助教

【目的】漢方薬は熱水で煎じて服用するため、その煎液には配合生薬の化学成分のうち、親水性の配糖体が多量に溶出している。一般的に配糖体は消化管から吸収されにくく、消化管【報告セミナー要旨】
下部でヒト腸内細菌による種々の代謝を受ける。腸内細菌による配糖体の代謝は、漢方薬の【目的】
薬効発現と密接に関与していると考えられている。配糖体の一群には、アグリコン部と糖部
漢方薬は熱水で煎じて服用するため、その煎液には配合生薬の化学成分のうち、親水性の配糖体がが直接 C−C結合した C−配糖体が存在する。C−配糖体は他の配糖体に比べて化学的に安定多量に溶出している。一般的に配糖体は消化管から吸収されにくく、消化管下部でヒト腸内細菌によであるが、一部のヒト腸内細菌は C−配糖体の C−C 結合を開裂し、アグリコンを生成するこる種々の代謝を受ける。腸内細菌による配糖体の代謝は、漢方薬の薬効発現と密接に関与しているととが知られている。
しかし、腸内細菌由来 C−配糖体代謝酵素はこれまで同定されていない。
考えられている。配糖体の一群には、アグリコン部と糖部が直接C－C 結合した C－配糖体が存在す
我々は、葛根に含まれるイソフラボンC−配糖体「プエラリン」に着目して腸内細菌による。C－配糖体は他の配糖体に比べて化学的に安定であるが、一部のヒト腸内細菌はる代謝研究を行い、これまでにプエラリンを代謝するヒト腸内細菌株 strain PUEC－配糖体のを単離し、CC－配糖体代－C 結合を開裂し、アグリコンを生成することが知られている。しかし、腸内細菌由来
また、本代謝反応には3 種類以上のプエラリン代謝酵素群、Mn2+ 、NAD+ 、fructose
1,6−bisphosphateが必要であることを明らかにしてきた。プエラリン代謝に必要な 2 種類謝酵素はこれまで同定されていない。の酵素を精製し、N末端アミノ酸配列をそれぞれ決定した。本研究では、ヒト腸内細菌由来C－配糖体「プエラリン」に着目して腸内細菌による代謝研
我々は、葛根に含まれるイソフラボンプエラリン代謝に関わる酵素遺伝子のクローニングを目的として実験を行った。
究を行い、これまでにプエラリンを代謝するヒト腸内細菌株 strain PUE を単離し、また、本代謝反2+【方法】プエラリン代謝酵素のN 末端アミノ酸配列の相同性検索を行い、相同性が高いと、NAD+、fructose 1,6－bisphosphate が必要であ応には 3 種類以上のプエラリン代謝酵素群、Mn推定されるタンパク質を探索した。プエラリン代謝酵素のN 末端アミノ酸配列、および推ることを明らかにしてきた。プエラリン代謝に必要な 2 種類の酵素を精製し、N末端アミノ酸配列を定タンパク質の内部アミノ酸配列を基に縮重プライマーを設計し、strain
PUE のゲノムそれぞれ決定した。本研究では、ヒト腸内細菌由来プエラリン代謝に関わる酵素遺伝子のクローニンDNA を鋳型にPCR を行った。得られた PCR 産物の塩基配列を解析した結果、Dorea
グを目的として実験を行った。
longicatenaの塩基配列と高い相同性を示した。そこで、Dorea longicatena の既知塩基配【方法】
列を基にプライマーを設計してPCR、さらにサブクローニングを繰り返して行い、プエラプエラリン代謝酵素の N 末端アミノ酸配列の相同性検索を行い、相同性が高いと推定されるタンリン代謝酵素遺伝子、および周辺領域の塩基配列を解析した。
パク質を探索した。プエラリン代謝酵素の N 末端アミノ酸配列、および推定タンパク質の内部アミ【結果・考察】Strain
PUE のゲノム DNA の解析を行い、プエラリン代謝酵素遺伝子を含ノ酸配列を基に縮重プライマーを設計し、strain PUE のゲノム DNA を鋳型に PCR を行った。得らむ約 3.7 kbpの塩基配列を決定した。本配列中には、既に精製した 2 種類のプエラリン代謝れた PCR 産物の塩基配列を解析した結果、Dorea longicatena の塩基配列と高い相同性を示した。そ酵素遺伝子が隣接してコードされており、それらのアミノ酸配列は Dorea longicatena 由来
こで、Dorea longicatena の既知塩基配列を基にプライマーを設計して PCR、さらにサブクローニンの推定タンパク質（WP_028088395.1、WP_028088396.1）と高い相同性を示した。また本グを繰り返して行い、プエラリン代謝酵素遺伝子、および周辺領域の塩基配列を解析した。
配列中には、部分アミノ酸配列を含めて 5 種類のタンパク質がコードされており、これらの【結果・考察】
OH
タンパク質がプエラリン誘導性のプエラリHOStrain PUE の ゲ ノ ム DNA の 解 析 をン代謝オペロンを形成している可能性が示
OH ヒト腸内細菌
行い、プエラリン代謝酵素遺伝子を含むHOOO唆された。今後、これらのタンパク質の大腸
strain PUE HO
約 3.7 kbp の塩基配列を決定した。本配O
菌発現系を構築し、プエラリン C−配糖体代 HO
列中には、既に精製した 2 種類のプエラOOH
謝活性を確認するとともに、C−配糖体代謝O
ダイゼイン
リン代謝酵素遺伝子が隣接してコード
OH酵素の触媒機構を解明する予定である。
されており、それらのアミノ酸配列は

プエラリン－ 50 －

Dorea longicatena 由来の推定タンパク質（WP_028088395.1、WP_028088396.1）と高い相同性を示した。また本配列中には、部分アミノ酸配列を含めて 5 種類のタンパク質がコードされており、これらのタンパク質がプエラリン誘導性のプエラリン代謝オペロンを形成している可能性が示唆された。今後、これらのタンパク質の大腸菌発現系を構築し、プエラリン C－配糖体代謝活性を確認するとともに、C－配糖体代謝酵素の触媒機構を解明する予定である。

■背景・目的漢方薬は熱水で煎じて服用するため、その煎液には配合生薬の化学成分のうち、親水性の配糖体が多量に溶出している。一般的に配糖体は消化管から吸収されにくく、消化管下部でヒト腸内細菌による種々の代謝を受ける。腸内細菌による配糖体の代謝は漢方薬の薬効発現と密接に関わっており、例
えば、生薬「ダイオウ」に含まれる瀉下成分センノシドは、腸内細菌によりレインアンスロンへと代謝されて初めて活性体となり、瀉下作用を示すことが知られている。
配糖体の一群には、アグリコン部と糖部が直接 C － C 結合した C －配糖体が存在する。C －配糖体は O －配糖体と異なり、酸やグリコシダーゼ処理に対して安定である。一部のヒト腸内細菌は、C －配糖体の C － C 結合を開裂しアグリコンを生成することが報告されているが、腸内細菌由来 C －配糖体代謝酵素はこれまで同定されていない。
葛根湯の構成生薬である「カッコン」には、イソフラボン C －配糖体のプエラリンが含まれている。C －配糖体のプエラリンは腸内細菌による代謝を受け、アグリコンのダイゼインに変換される。
生じたダイゼインは腸内細菌によるさらなる代謝を受け、女性ホルモン様作用を示すエクオールなどに変換されることが知られている（図 1）。プエラリンはカッコンに 2% 以上含まれる主イソフラボンであることから、腸内細菌が産生するプエラリン代謝酵素は、カッコンの薬効と密接に関わっていると考えられる。我々は、C －配糖体のプエラリンをダイゼインに代謝するヒト腸内細菌株の単離を試
み、グラム陰性、偏性嫌気性菌株 strain PUE を単離し、16S rRNA 遺伝子の相同性から、本菌株をDorea 属の細菌と同定している 1)。これまでの研究から、strain PUE によるプエラリン代謝反応には、3 種類以上のプエラリン代謝酵素群が関与し、それらの酵素活性は、Mn2+、NAD+、fructose 1,6－ bisphosphate の添加により顕著に上昇することを明らかにしている 2)。プエラリン代謝に必要な複数のタンパク質のうち、2 種類のタンパク質（タンパク質 A、B）を精製し、タンパク質 A の N 末端OH
HOOH
HOHOO

腸内細菌
strain PUE

HOO

HOOOO

ダイゼイン
O

プエラリン
図1OH

腸内細菌によるプエラリンの代謝反応

図 1 腸内細菌によるプエラリンの代謝反応－ 51 －OH

エクオールOH

アミノ酸配列 14 残基、タンパク質 B の N 末端アミノ酸配列 30 残基をそれぞれ決定している。しかし、プエラリン代謝に関わる各酵素タンパク質の全アミノ酸配列の決定には至っておらず、C －配糖体代謝反応における各酵素タンパク質の機能や役割は解明されていない。
本研究は、ヒト腸内細菌 strain PUE 由来プエラリン代謝に関わる酵素遺伝子群をクローニングし、各酵素タンパク質を同定するとともに、プエラリン C －配糖体代謝反応の反応機構を解明する目的で実験を行った。

■結果・考察（１）プエラリン代謝に関わる酵素遺伝子のクローニング
原核生物では、特定の化合物代謝に関連する一連の酵素遺伝子群がゲノム上に隣接してコードされ、遺伝子クラスター（オペロン）を形成している例が多い。例えば、ダイゼインをエクオールに代謝する腸内細菌では、ダイゼイン代謝に必要な 4 種類の酵素タンパク質が同一の遺伝子クラスターに存在することが報告されている 3)。Strain PUE によるプエラリン代謝反応には 3 種類以上の酵素タンパク質が必要であり、そのうち、精製した 2 種類の酵素タンパク質 A、B は、いずれもプエラリン誘導性のタンパク質であることを明らかにしている。これらのことから、プエラリン代謝に必要な複数の酵素タンパク質遺伝子は strain PUE のゲノム DNA 上に隣接してコードされ、プエラリン誘導性のオペロンを形成していると推測される。そこで、タンパク質 A、B をコードする遺伝子領域、およびその周辺領域について、DNAの塩基配列の解析を計画した。
OH
HO
初めに、タンパク質 A、B 遺伝子の塩基配列を解析するため、プロテインシークエンサーにより腸内細菌
OHA、B決定したタンパク質の N 末端アミノ酸配列情報を基に、それぞれ縮重プライマーを設計した。
OHOO
strain PUE HO
HO O
タンパク質 A、B の内部アミノ酸配列は未同定のため、タンパク質 A、B と相同性を示す推定タンパ
HOO
ク質の内部アミノ酸配列から、縮重プライマーを設計した。設計した各種縮重プライマーを用い、OOHOH
strain PUE のゲノム DNA を鋳型に degenerate
PCRを行った。その結果、タンパク質
A の N 末端ア
ダイゼイン
エクオール
O
ミノ酸配列と、タンパク質 Bの内部アミノ酸配列を基に設計した縮重プライマーの組み合わせにより、
OH

プエラリン

約 1.7 kbp の DNA 断片が増幅した（図 2）。得られた PCR 産物を pGEM-T Easy Vector に組み込んだ後、大腸菌 DH5α に導入し、その後、数クローンについて精製プラスミドの塩基配列を DNA シーク
エンサーで解析した。解析した塩基配列をBLAST で検索した結果、本配列は Dorea longicatena の
図 1 腸内細菌によるプエラリンの代謝反応

ゲノム DNA の塩基配列と非常に高い相同性を示した。また、本配列にはタンパク質 A、B 遺伝子が隣接してコードされていた。

図2

プエラリン代謝に関わるタンパク質 A、B 遺伝子、およびその周辺領域の塩基配列の解析

図2 PUE
プエラリン代謝に関わるタンパク質A、B 遺伝子、およびその周辺領域の塩基配列の解析
Strainのゲノム DNA を鋳型に PCR、さらにサブクローニングを繰り返して行い、プエラリン代謝酵素群（タA ～ E）をコードする約3.7kbp の塩基配列を解析した。
ンパク質PUE
Strainのゲノム DNA を鋳型にPCR、さらにサブクローニングを繰り返して行い、プエラリン代謝酵素群（タンパク質 A～E）をコードする約 3.7 kbp の塩基配列を解析した。
－ 52 －

タンパク質 A、B 遺伝子の部分塩基配列が Dorea longicatena の塩基配列と相同性を示したため、タンパク質 A、B 遺伝子の周辺領域の塩基配列も Dorea longicatena の塩基配列と類似していると予測された。Dorea longicatena は、全ゲノム配列が解析された微生物種である。そこで、Dorea
longicatena の既知塩基配列からプライマーを設計し、strain PUE のゲノム DNA を鋳型に PCR、さらにサブクローニングを繰り返して行うことにより、約 3.7 kbp の塩基配列を解析した（図 2）。本配列中には、タンパク質 A、B 遺伝子の全長を含む 5 種類のタンパク質（タンパク質 A ～ E）がコードされると推測された。
得られた塩基配列に基づき、タンパク質 A ～ E のアミノ酸配列を各々推定した。タンパク質 A 遺伝子は 348 のアミノ酸をコードしており、精製タンパク質 A の N 末端アミノ酸配列 14 残基が、その配列と完全に一致した。タンパク質 A の推定分子量は 39074 であり、精製タンパク質 A の SDSPAGE 分析結果、約 38kDa と一致した。タンパク質 A の推定アミノ酸配列は Dorea longicatena 由来の推定タンパク質（WP_028088396.1）と 99％一致しており、そのアミノ酸配列を BLAST 検索した結果、本タンパク質は Gfo/Idh/MocA ファミリー酸化還元酵素と高い相同性を示した。
タンパク質 B 遺伝子は 367 のアミノ酸をコードしており、そのアミノ酸配列は Dorea longicatena由来の推定タンパク質（WP_028088395.1）と 99％一致していた。タンパク質 B の推定分子量は40329 であり、精製タンパク質 B の SDS-PAGE 分析結果、約 40kDa とよく一致した。タンパク質 Bの推定アミノ酸配列を BLAST 検索した結果、本タンパク質も Gfo/Idh/MocA ファミリー酸化還元酵素と推定された。しかし、タンパク質 B の推定アミノ酸配列と精製タンパク質 B の N 末端アミノ酸配列 30 残基の間に、一部不一致が認められた。不一致の原因は不明であるが、今後、より詳細な検討を行う予定である。
タンパク質 A、B 遺伝子の周辺領域には、タンパク質 C ～ E がコードされていた。タンパク質 C の部分推定アミノ酸配列は、Dorea longicatena 由来の推定タンパク質（WP_028088397.1）と非常に高い相同性を示した。そこで、WP_028088397.1 について BLAST 検索を行った結果、本タンパク質は AP-endonuclease と 86%、sugar phosphate isomerase/epimerase と 78% の相同性を示した。タンパク質 D 遺伝子は 143 のアミノ酸をコードしており、その推定アミノ酸配列は Dorea longicatena由来の推定タンパク質（WP_028088394.1）と 99％一致した。タンパク質 D の推定アミノ酸配列をBLAST 検索した結果、機能既知のタンパク質とは相同性を示さなかった。タンパク質 E の部分推定アミノ酸配列は、Dorea longicatena 由来の推定タンパク質（WP_028088393.1）と非常に高い相同性を示した。そこで、WP_028088393.1 について BLAST 検索を行った結果、本タンパク質は xylose
isomerase と 31% の相同性を示した。
以上の結果より、タンパク質 A ～ E をコードする遺伝子を含む本 DNA 領域がプエラリン代謝酵素群をコードするオペロンである可能性が示唆された。今後、タンパク質 A ～ E の大腸菌発現系を構築し、プエラリン C －配糖体代謝活性を確認する予定である。
（２）プエラリン代謝反応における酵素反応中間体の構造決定
Strain PUE によるプエラリンからダイゼインへの代謝反応には、複数の酵素タンパク質が関与している。このため、本代謝反応は 1 段階の酵素反応ではなく、酵素反応中間体を経由する多段階の酵素反応であると予測される。そこで、プエラリン代謝反応における酵素反応中間体を同定する目的で、研究を行った。

－ 53 －

プエラリン

0 min

1ダイゼイン15 min230 min

120 min

HPLC 分析
図
図3 3 部分精製酵素によるプエラリン代謝反応の経時的部分精製酵素によるプエラリン代謝反応の経時的HPLC 分析
2++mM）を加部分精製したプエラリン代謝酵素にプエラリン（0.5 mM）、Mn （1 mM）、NAD （1 mM）、FBP（5部分精製したプエラリン代謝酵素にプエラリン（0.5 mM）、Mn2+（1 mM）、NAD+（1 mM）、FBP
えて 37°C でインキュベートし、経時的に HPLC で分析した。
（5 mM）を加えて37°C でインキュベートし、経時的にHPLCで分析した。
HPLC
C18, 3 mm, 4.6×150 mm、溶媒 : 12%
0.05% TFA（0 ～ 30 分）、
条件 カラム : InertSustain
アセトニトリル
HPLC
条件
カラム:InertSustain
C18,3mm,4.6×150mm、溶媒:12%
アセトニトリル
30%0.05%TFA（32600.8mL/min、検出波長256nm。
アセトニトリル～ 分）、流速 ::0.05% TFA（0～30 分）、30% アセトニトリル 0.05% TFA（32～60 分）、流速 : 0.8 mL/min、検出波長 : 256 nm。
初めに、部分精製したプエラリン代謝酵素にプエラリン（0.5 mM）、Mn2+（1 mM）、NAD+（1mM）、FBP（5 mM）を加えて 37°C でインキュベートし、経時的に HPLC で分析した（図 3）。その結果、反応開始 15 分後に酵素反応中間体と予測される 2 つの新規ピーク（1, 2）が検出された。反応溶液から 1 を分取し、1H-NMR を測定したところ、その構造はプエラリン糖部分 3 位が酸化された3″-oxo-puerarin と推定された。そこで、パラジウム錯体 [(neocuproine)-PdOAc]2OTf2 を用いた糖 3位選択的酸化法 4) により、プエラリンから 3″-oxo-puerarin を合成し、1H-NMR スペクトルを比較することにより、1 を 3″-oxo-puerarin と同定した（図 4）。部分精製酵素に各種補因子を添加し、プエラリンまたは 1 を基質に酵素反応を行った。その結果、1 はプエラリンよりも数倍速くダイゼインに代謝された。これらの結果より、1 がプエラリン代謝反応における酵素反応中間体であることが示唆された。
次に、中間体 2 の構造を決定するため、酵素反応溶液から 2 を分取し、1H-NMR を測定した。しかし、分取した 2 の量が少なく、構造決定には至らなかった。各種検討した結果、1 の水溶液に fructose 1,6－ bisphosphate を添加し、室温で 20 分間インキュベーションすることにより、1 と 2 の混合物を生－ 54 －じることを見出した。生じた 2 を分取し、二次元 NMR 等の機器分析により構造を解析した結果、2は 2″-oxo-puerarin（2a）、および、その分子内環化物（2b）の互変異性体の混合物であった（図 4）。
プエラリン代謝に関わるタンパク質 A、B はいずれも Gfo/Idh/MocA ファミリー酸化還元酵素と相同性を示した。本研究により単離、構造決定した中間体はプエラリン糖部分が酸化された化合物であったことから、これらの酵素タンパク質が、プエラリンから中間体への酸化反応を触媒している可能性が示唆された。今後、プエラリンから中間体、中間体からダイゼインへの代謝を触媒する各酵素タンパク質を同定する予定である。

OH

OH
HOOH

O

OH
HO

HO
OH

OH

OH

OH
HOO
H

HO
HO

HO
HO

O

O
H

O
HO

O

O

O

O

O
H

O

O

O
OH

OH

プエラリンO
H

1O
OH

2aOH

2b1、2（2a、2b）の構造
図4 図
プエラリン代謝反応における酵素反応中間体
4 プエラリン代謝反応における酵素反応中間体
1、2（2a、2b）の構造
プエラリン代謝反応溶液中に検出された中間体 1、2 の構造を決定した。中間体 2 は 2a と 2b の互変異性体の混合
プエラリン代謝反応溶液中に検出された中間体 1、2 の構造を決定した。中間体 2 は 2a と 2b の互物であった。

変異性体の混合物であった。

■結論
プエラリンをダイゼインに代謝する腸内細菌 strain PUE の DNA の解析を行い、プエラリン代謝に関わるタンパク質 A、B 遺伝子、およびその周辺領域の塩基配列を解析した。得られた約 3.7 kbpの塩基配列にはタンパク質 A、B 遺伝子を含む 5 種類のタンパク質 A ～ E がコードされており、本DNA 領域がプエラリン代謝酵素群をコードするオペロンである可能性が示唆された。
プエラリン代謝反応における酵素反応中間体の探索を行い、中間体 1 と 2（2a、2b の互変異性体）の構造を決定した。今後、タンパク質 A ～ E の大腸菌での発現系を構築し、発現タンパク質のプエラリン代謝活性等を検討する予定である。

【参考文献】
1）Jin J.S. et al., Biol. Pharm. Bull., 31, 1621-1625（2008）
2）Nakamura K. et al., Biol. Pharm. Bull., 36, 635-640（2013）3）Shimada Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 78, 4902-4907（2012）
4）Jäger M. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 52, 7809-7812（2013）－ 55 －