睡眠の質および断片化を改善する漢方方剤の検討
申 請 代 表 者
所内共同研究者

佐藤亜希子
東田 千尋

ワシントン大学医学部発生生物学部門
神経機能学分野

Staff Scientist
准教授【報告セミナー要旨】【要旨】
睡眠の質は、老化またはアルツハイマー病の神経変性疾患の初期段階で低下する。従って、睡眠の質を指標とする創薬研究は、老化関連疾患特にアルツハイマー病の早期治療に繋がることが期待される。脳電図により脳波を解析することは、脳の活動状態を知るための客観的指標として有用であり、睡眠の解析にも古くから用いられている。睡眠の質は、ノンレム睡眠時の相対的なデルタ波の検出頻度より定量的に評価される。しかしながら、睡眠の質が老化とともに低下する分子作用機序および神経回路については、完全には明らかにされていない。本研究は、老化に伴うノンレム睡眠時のデルタ波の検出頻度の低下が、視床下部、特に腹内側核 (Dorsomedial hypothalamus, DMH) による睡眠恒常性維持機能が低下することに起因していることを見出した。さらに我々は、その制御に関与している DMH に特異的な分子シグナルおよびその上流因子も同定しつつある。これらの研究成果は、DMH 特異的分子シグナルを維持することが、老化に伴う睡眠の質低下に拮抗する手段として有効である可能性を示唆している。今後は、生薬や漢方方剤の中から老化関連疾患や睡眠異常を標的とした創薬スクリーニング実現に向けた細胞アッセイ法の確立を目指したい。

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■背景・目的
日本における高齢者の総人口に占める割合は、2013 年では 25％、2055 年には 33.4％にまで増加することが予測されている。このような高齢者人口が著しく増加している社会的背景から、健康寿命を延ばし、健やかな老後をより長く維持していくことが重要である。これにより高額な老人医療費の負担が削減されることも期待される。また、老化関連疾患として知られるアルツハイマー病の患者数も年々増加傾向を示し、2015 年現在のアルツハイマー病患者数は 262 万人、2035 年には 337 万人までに増加することが予測されている。アルツハイマー病は、記憶や思考能力が次第に障害されていく進行性の脳疾患である。その病巣においてアミロイド β の過剰な蓄積が引き金となり不可逆的な神経細胞の死滅がおこることから、根本的な治療が非常に難しい疾患である。アルツハイマー研究は、これまでの根本的治療を目指した研究の他に、近年では、発症までにアミロイドβの蓄積が数十年という長期的にかけて蓄積される点に着目し、その早期発見・早期治療を目指した研究も盛んに行なわれている。例えば、アルツハイマー病が発症する徴候として、入眠障害や睡眠時間の減少などによる睡眠の質の低下が認められる。さらに、このような睡眠の質の低下がアルツハイマー病を進展させる要因の一つとなっていることが報告されている。そのため、睡眠の質を発症の初期段階で改善させることができれば、アルツハイマー病の発症・進展を抑えることができるのではないかと考えられている。
申請者はこれまでに、哺乳類の老化・寿命制御機構の解明を目指し研究を行なってきた。近年の研究成果により、脳の視床下部 DMH(dorsomedial hypothalamus) が、哺乳類の老化・寿命を制御する上で中枢的役割をもつことを明らかにした。脳特異的に Sirt1 を高発現させたトランスジェニックマウス（BRASTO マウス）では、寿命の有意な延長が認められる。特に Sirt1/Nkx2-1 シグナルが、視床下部 DMH に特異的に発現している PR domain containing protein 13 (Prdm13) を標的遺伝子として睡眠の質の低下や睡眠の断片化を制御していることを見出した。視床下部における Prdm13 の発現量は、老化過程で低下するが、カロリー制限時に増加する。これらの研究結果は、加齢とともに低下する Sirt1/Nkx2-1/Prdm13 シグナルを維持することが老化を抑制的に制御するために重要な役割を担っていることを示している。本研究は、DMH に直接作用して睡眠の質の低下や睡眠断片化を抑制する漢方方剤を探索するためのスクリーニングシステムの確立を目指し、DMH に特異的な Sirt1/Nkx2-1/Prdm13 シグナルの生理学的重要性をさらに明らかにすることを目的として遂行された。

■結果・考察はじめに、視床下部の Sirt1/Nkx2-1 シグナルの下流遺伝子である Prdm13 を DMH で特異的にPrdm13 をノックダウンしたマウスモデル（DMH-Prdm13-KD）を作製した。DMH-Prdm13-KD
マウスおよびその対照群（DMH-fLuc-KD）は、Prdm13-shRNA または ﬁreﬂy Luciferase-shRNAを導入したレンチウイルスを 4 ヶ月齢マウスの DMH に直接注入することにより作製された。これ
らのマウスの DMH における Prdm13 のノックダウン効率は、それぞれのマウスの DMH をレーザーマイクロダイセクションにより採取し精製した RNA サンプルから qRT-PCR により Prdm13 発現量を定量した。その結果、80-90％であることが明らかになった。これにより、我々が作製した DMHPrdm13-KD マウスが Loss-of-function モデルとして Prdm13 の機能解析をする上で十分であると判断し、以下の解析に移行した。
このモデルマウスを用いて脳波解析による睡眠解析を行なった。 DMH-Prdm13-KD マウスは対照群（DMH-fLuc-KD マウス）と比較して、NREM 睡眠量に有意差は認められなかった。また、覚醒－ 40 －

および REM 睡眠量には 12% 程度の統計的に有意な差が認められたが、この量的変化が非常に小さい
ことから、DMH 特異的に Prdm13 を欠損させても、睡眠および覚醒量には大きな影響を与えないことが示された。一方、睡眠の質は睡眠の深度を指標として、計測される脳波に対する相対的なノンレム睡眠時のデルタ波の検出頻度（NREM delta power 値）により定量的に評価されている。DMHPrdm13-KD マウスの NREM delta power 値は、対照群と比較して有意に低下していた。NREM
delta power 値は加齢やアルツハイマー病の神経変性疾患の初期段階で低下することが知られている。
また、Prdm13 の発現量は加齢により低下することから、DMH の Prdm13 が加齢過程で睡眠の質を維持する上で重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、先述した通り僅か（12%）ではあるが、覚醒量に差が認められることから、この差がその後の睡眠深度、つまり NREM delta power値に影響を及ぼしているのか、この可能性についても将来的に検討する必要がある。さらに我々は、
DMH-Prdm13-KD マウスに睡眠の断片化が認められることを明らかにした。特に、覚醒期と NREM睡眠期との間のトランジッションの回数が対照群と比較して DMH-Prdm13-KD マウスで著しく増加していた。興味深いことに、同様の変化が 4 ヶ月齢マウスと比較したとき 20 ヶ月齢マウスでも認められた。加えて、先述した長寿 BRASTO マウスでは、老化に伴う睡眠の断片化が認められなかった。BRASTO マウスの DMH では Prdm13 の発現量が対照群と比較して有意に高く保たれていることを考えると、BRASTO マウスが老化過程において Prdm13 の機能を維持することにより睡眠の質を維持している可能性が示唆された。この可能性については、DMH で Prdm13 を欠損させた老齢BRASTO マウスの解析を通して検証することが可能であると考えられる。
さらに、Prdm13 の睡眠制御機構を明らかにするため、既知のメカニズムとして知られている概日周期制御と睡眠恒常性制御機序に着目した。睡眠覚醒周期は、大きく分けてこの２つの制御因子により調節されていることが知られている。DMH-Prdm13-KD マウスと DMH-fLuc-KD マウスの間に、Circadian period の有為な差は認められなかった。これにより、DMH の Prdm13 は概日周期制御には影響が無いことが示された。そこで次に、Sleep deprivation への反応性を検討した。対照群では、睡眠を剥奪されるとそれを補充し恒常性を維持するために、より深度の高い睡眠が導入される。具体的には、対照群では定常状態と比較すると、Sleep deprivation 後には著しく NREM delta power 値が上昇した。一方、DMH-Prdm13-KD マウスでは、Sleep deprivation 後に定常状態と比較して著しい NREM delta power 値の上昇は認められなかった。これにより、DMH-Prdm13-KD マウスは、睡眠恒常性制御機構の機能低下により NREM delta power 値の低下、つまり睡眠の質の低下がもたらされていることが明らかになった。
Prdm13 の 発 現 調 節 の メ カ ニ ズ ム と し て、 転 写 制 御 に 着 目 し て 検 討 を 行 っ た。 既 に 我 々 は、Prdm13 の転写領域の上流に Nkx2-1 の結合配列が存在し、Nkx2-1 が Prdm13 の転写活性を調節していることを明らかにしている。今後はさらに、１）Nkx2-1 が Prdm13 転写領域に直接結合しているのか、２）Prdm13 転写活性は Sirt1 依存的に制御されているのか、などを明らかにすることによりこの３つの分子の相互作用を明らかにする予定である。

■結論
本研究により、DMH 特異的に発現している Prdm13 は、睡眠の質を維持する上で重要な役割を果たしており、老化に伴う Prdm13 発現量低下が睡眠の断片化を引き起こし、睡眠の質的低下に繋がることが示された。また、Prdm13 は概日周期には影響を与えずに睡眠恒常性制御機序を介して睡眠の－ 41 －質を調節していることが明らかになった。これらの結果は、Sirt1/Nkx2-1/Prdm13 シグナルが、老化現象・疾患を対象とした創薬スクリーニングの標的として有用な可能性を示唆している。加えて、睡眠恒常性制御に特異的に作用する漢方方剤やその関連化合物の探索に役立つことが予想される。今後、Sirt1/Nkx2-1/Prdm13 シグナルを指標とした培養細胞系スクリーニングシステムを確立することにより、漢方方剤の有効性をより確立していくことが期待される。

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