倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成■受領№1298

プロテオーム解析技術の希少遺伝性疾患の原因解明への応用

代表研究者

岡 泰由

名古屋大学

環境医学研究所

発生遺伝分野1．研究目的特任助教

2．研究概要昨今の大規模ゲノム解析研究から、健常人のゲ

2.1 プロテオーム解析技術を用いた DNA 損傷応答

ノムにも数多くの機能変化を生じうる遺伝子変異機構の破綻によって発症した疾患の原因因子が多数存在することが明らかとなってきた。全エ新規検出法の確立

キソーム解析を行ったとしても、疾患原因遺伝子

DNA損傷応答機構に関連する蛋白質群は細胞変異の絞り込みが困難なため、確定診断に至るの内コピー数が少ないものが多く、定量性ならびには約30%程度といわれており、疾患原因因子の同再現性に優れた質量分析法が必要である。そのた定のための新たな探索技術の開発が喫緊の課題でめ、健常人と患者間における相対比較に優れた標ある。

識定量法を利用する。標識定量法として、安定同DNA損傷応答機構の破綻によって、ヒトでは位 体 ア ミ ノ 酸 標 識 法 (Stable Isotope Labeling

様々な病態を示す希少遺伝性疾患を発症すること

using Amino Acids in Cell Culture: SILAC)を用いが知られている。しかしながら、これらの疾患のた。検出法の確立のため、既知の遺伝子変異を持中には、いまだに遺伝的な疾患発症原因が不明なった細胞（47番目のalanineがvalineに置換したものが多く残されている。未知の疾患原因因子をMRE11 遺伝子変異が原因となり発症した毛細血同定することで、これら遺伝性疾患の病態解明へ

管拡張性運動失調症様患者由来の不死化Bリンパと繋がり、更には、これら希少疾患に対する治療球細胞）を用いた。患者由来の細胞はHeavyアミ薬/緩和剤の開発に繋がることが期待される。

ノ 酸 含 有 培 地 (13C6 L-Lysine と 13C6/15N4

本研究の目的は、次世代シーケンサーを用いてL-Arginine)を用いて培養し、健常人由来の細胞は得られたゲノム情報と精密質量分析装置を用いてLight ア ミ ノ 酸 含 有 培 地(12C6 L-Lysine と得られた蛋白質発現プロファイルとを統合するこ

12C6/14N4 L-Arginine)で6代以上培養することとで、ゲノム解析のみでは候補遺伝子を絞り込むで標識を行った。標識された健常人と患者由来のことができなかった、DNA損傷応答機構の破綻に細胞から蛋白質を回収し、定量した後に、同量をよって生じた、希少遺伝性疾患の発症原因因子を混合した。蛋白質を分画するためにSDS-PAGEゲル特定するための新規方法を開発することである。

電気泳動を行い、還元・アルキル化処理を行った後に、トリプシンを用いてゲル内消化した。ペプ
チド精製後に、質量分析測定を実施した。ナノ流量液体クロマトグラフィーと高感度質量分析計を組み合わせたプロテオーム解析によって、約8000

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個の蛋白質を同定することが可能となり、疾患発関 与 す る RNASEH2 複 合 体 の 構 成 因 子 全 て症因子 (MRE11)の発現量低下ならびに、MRE11(RNASEH2A,B,C)の発現量低下が認められた。まの相互作用蛋白質であるRAD50とNBS1蛋白質のた、RNASEH2複合体のmRNAレベルを測定した発現量低下を検出することに成功した (図1)。

結果、複合体を構成する3種の遺伝子のうち、RNASEH2B 遺伝子の発現低下が確認された。全
L o g 2 SILA C (H /L ) ra tio
f or 1 st exp erim en t

!6#!4#

!2#0#

2#

4#

エキソーム解析ではRNASEH2B遺伝子コード領6#域に変異は検出されなかったことから、非典型の6#

2#
0#

N BS1
RA D 5 0
M RE1 1

L o g 2 SILA C (H /L) ra tio
fo r 2 n d exp erim en t

4#

イントロン上の変異によるスプライシング異常が生じている可能性が考えられた。そこで、RNAシ!2#ーケンシングならびに全ゲノム解析を実施した結!4#

果、RNASEH2B遺伝子のイントロン5とエキソン6!6#の境界からおよそ1.3 kb上流に極めて頻度の低いホモ接合型変異を同定した。RNASEH2B遺伝子の図１. プロテオーム解析を用いた患者細胞での蛋

エキソン5とエキソン6にプライマーを設計し、白質複合体発現量の検出

cDNAを鋳型にPCRを行った結果、患者特異的に、予想されたDNA断⽚⻑とは異なるPCR産物が得

健 常 人 由 来 の 細 胞 を Light ア ミ ノ 酸 含 有 培 地られた。これらのDNA配列を解析した結果、患者(L)、患者由来の細胞をHeavyアミノ酸含有培地

細胞では、異所性のスプライス供与部位が挿入さ(H)で培養した。それぞれの細胞から蛋白質を抽出れていることが明らかとなった。

し、SDS-PAGE後にゲル内消化・ペプチド精製を行い、精密質量分析装置を用いて解析した。

RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2Cはアイカルディ・ゴーティエ症候群の発症関連遺伝子としてすでに報告されている。これまでの研究結果

2.2 プロテオーム解析技術を用いた DNA 損傷応答から、RNASEH2B変異により発症したアイカルデ機構の破綻によって発症した疾患の原因因子ィ・ゴーティエ症候群の症例 (104例)では、すべ新規検出法の応用てアミノ酸置換を含む複合変異であることが明ら

胎児期からの低⾝⻑、⼩頭症、大脳基底核と脳かとなっている (Crow et al., 2015)。本症例は新室周囲の石灰化を主徴とした症例の解析を実施し規の遺伝子発現異常により転写産物が激減したたた。両親がいとこ婚で、3人の子どもが全員死産でめ、既知のRNASEH2B 変異によって発症した症あったことから、劣性遺伝性疾患であることが予例には見られない重篤な症状を示していると考え想され (TORCH症候群は陰性)、当初はDNA損傷られる。

応答機構の破綻によって発症することが知られているゼッケル症候群疑いと診断されていた。患者

3．発表とその両親のトリオ全エキソーム解析を行ったが、(1) 岡泰由、中沢由華、荻朋男、マルチオミクス

既知の病的変異ならびにDNA損傷応答機構に関解析を用いた希少遺伝性疾患原因因子の新規連する遺伝子変異は見つからず、候補因子を絞り同定法の開発、第15回日本プロテオーム学会込むことはできなかった。そこで、患者由来の細2017年大会（ポスター、大阪、2017年）

胞をSILAC標識し、プロテオーム解析を実施した(2) 岡泰由、中沢由華、荻朋男、Identification of

結果、DNA:RNAハイブリッド中のRNAの分解に

pathogenic mutations in patients with rare

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diseases using multi-omics analysis、第40回日本分子生物学会年会（ポスター、神⼾、2017年）(3) Yasuyoshi Oka, Tomoo Ogi. Identification ofpathogenic mutations in patients with rarediseases using multiomics approaches.
Conference on Mass Spectrometry andProteomics 2018 (Oral, Osaka, 2018)