記憶や学習に関わる神経伝達物質受容体の迅速な蛍光標識に成功―記憶のメカニズム解明や神経疾患の診断への活⽤に期待―
発表のポイント

記憶の分⼦メカニズムを解明するために、神経伝達物質受容体に対して迅速に⽬印をつける⽅法が求められていた。

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記憶や学習に必須のグルタミン酸受容体にわずか数分で蛍光の⽬印をつける⽅法を開発し、グルタミン酸受容体の動きを定量的に評価することに成功した。

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この蛍光標識技術では受容体の動きを詳細に可視化できるので、グルタミン酸受容体の異常で起こる脳卒中などの神経疾患や精神疾患の原因解明、および新たな診断技術開発への応⽤が期待される。

概要
名古屋⼤学⼤学院⼯学研究科の清中 茂樹 教授、曽我 恭平 博⼠前期課程学⽣、京都⼤学⼤学院⼯学研究科の浜地 格 教授、⼩島 憲⼈ 博⼠後期課程学⽣、⽩岩 和樹 博⼠後期課程学⽣らは、記憶や学習に必須でありながら、その異常は脳卒中などの疾患の原因ともなってしまう、脳内タンパク質のグルタミン酸受容体に対して、蛍光⾊素などの⽬印を迅速につける（蛍光標識する）⼿法を開発しました。
脳内において、グルタミン酸受容体は記憶や学習に関わる重要なタンパク質で、その代表例として、AMPA受容体や NMDA 受容体が知られています。グルタミン酸受容体の神経細胞内での動きを知ることは、記憶のメカニズム解明だけでなく、神経疾患の診断⽅法などにもつながります。そのためには、神経細胞の受容体に蛍光の標識をつけて、記憶の強化や減弱に伴う受容体の発現量の変化を解析できる技術の開発が不可⽋です。
これまでに、蛍光タンパク質（2008 年下村脩 先⽣らのノーベル化学賞）を使って AMPA 受容体や NMDA 受

容体を蛍光標識する技術が開発されています。しかし、蛍光タンパク質を⽤いた⽅法では、多くの場合において新たに蛍光タンパク質を標識した受容体を遺伝⼦⼯学的に神経細胞内に強制発現させる必要があるだけでなく、蛍光タンパク質のサイズが⼤きいために受容体の本来の機能を阻害することも問題となっていました。
そのような背景のもと、本研究グループは、2017 年に AMPA 受容体に対して蛍光の標識をつけることができる⼩分⼦化合物を⾒いだしました。しかし、蛍光標識には２~４時間の時間を必要としたため、受容体の動きの定量的な観察には問題を抱えていました。もし、迅速に蛍光標識することができれば、任意のタイミングで定量的に観察することが可能となります。
今回、AMPA 受容体および NMDA 受容体に対して選択的に⽬印をつけられる新たな有機⼩分⼦化合物を開発し、２~３分と従来法に⽐べて６０分の１以下の時間で蛍光標識を実現しました。この⼿法を⽤いることで、神経細胞での AMPA 受容体および NMDA 受容体の動きの定量解析に成功し、モデル動物細胞に発現させた場合に⽐べて、受容体タンパク質の寿命が約６倍と⼤幅に⻑くなることを⾒いだしました。また、この迅速な蛍光標識技術により、神経細胞内では AMPA 受容体が効率的に細胞膜と細胞内を⾏き来（リサイクリング）することも明らかにしました。今後、この蛍光標識技術を⽤いて受容体の動きを詳細に可視化することで、記憶や学習の脳⾼次機能の解明だけでなく、神経疾患や精神疾患の原因解明や新たな診断⽅法の開発につながることが期待されます。
本研究成果は、2021 年 2 ⽉ 5 ⽇に国際学術誌「Nature Communications」のオンライン版で公開されました。
1. 背景
脳内において、グルタミン酸受容体は記憶や学習に関わる重要なタンパク質です。神経細胞間の情報伝達は、１つの神経細胞の前シナプスから神経伝達物質としてグルタミン酸が放出され、別の神経細胞の後シナプスに存在するグルタミン酸受容体がそれを受け取ることで達成されます。グルタミン酸受容体としては、脳内にAMPA 受容体や NMDA 受容体などの種類が存在します。記憶や学習時において、AMPA 受容体は細胞膜上の発現量を増加させ情報の伝達効率を上げることが重要であると知られています。NMDA 受容体も同様に記憶や学習に不可⽋なタンパク質ですが、脳卒中で起こる NMDA 受容体の異常な活性化は神経細胞死を引き起こし、予後の悪さ（脳機能障害）の主要な原因です。
AMPA 受容体および NMDA 受容体の神経細胞内での動きを知ることは、記憶のメカニズム解明だけでなく、神経疾患の診断⽅法などにもつながります。そのためには、神経細胞の受容体に蛍光の標識をつけて受容体の動きを解析できる技術の開発が不可⽋です。これまでに、蛍光タンパク質を使って AMPA 受容体や NMDA 受容体を蛍光標識する技術が開発されています。しかし、蛍光タンパク質を⽤いた⽅法では、多くの場合において新たに蛍光タンパク質を標識した受容体を遺伝⼦⼯学的に神経細胞内に強制発現させる必要があるだけでなく、蛍光タンパク質のサイズが⼤きいために受容体の本来の機能を阻害することも問題となっていました。
そのような背景のもと、本研究グループは、2017 年に AMPA 受容体に対して蛍光の標識をつけることができる⼩分⼦化合物を⾒いだしました。しかし、蛍光標識には２〜４時間の時間を必要としたため、標識された受容体は標識時間内に動いてしまい、受容体の動きの定量的な観察には問題を抱えていました。もし、迅速に蛍光標識することができれば、受容体の動きを定量的に観察することが可能となります。

2. 研究成果（１）細胞膜の AMPA 受容体だけを迅速に蛍光標識することに成功
本研究では、AMPA 受容体を迅速に蛍光標識できる新たな⽅法を開発しました。この⽅法では、初めに AMPA受容体への⽬印づけが可能な⼩分⼦化合物を細胞に振りかけます。続いて AMPA 受容体に付与した⽬印に対して迅速かつ選択的に反応する蛍光性の⼩分⼦化合物を振りかけることで AMPA 受容体への迅速な蛍光修飾が可能となります（図１A）。AMPA 受容体を発現させたモデル細胞に対して本⼿法を適⽤したところ、細胞膜上の AMPA 受容体を２〜３分以内という極めて短い時間で蛍光標識が可能であることを、顕微鏡観察により確認しました（図１B）。さらに、AMPA 受容体を天然に発現している神経細胞においても迅速な蛍光標識が可能であり、蛍光寿命顕微鏡という特殊な顕微鏡を⽤いることで、神経細胞内での AMPA 受容体の分布を定量的に解析することにも成功しました。

（２）AMPA 受容体が神経細胞内で⻑寿命であることを⾒いだした
最近の研究成果から、AMPA 受容体は細胞表層と細胞内を⾏き来（リサイクリング）すると考えられています。AMPA 受容体が存在する後シナプスは、そのサイズはわずか数百ナノメートルの微⼩空間であり、細胞内外を区別することは困難です。そこで、本⼿法を⽤いて迅速に標識し、AMPA 受容体の動きをタンパク質の解析⽅法であるウエスタンブロッティング法で解析したところ、AMPA 受容体を強制的に発現させた動物由来のモデル細胞（HEK293T 細胞）においては、AMPA 受容体は細胞膜上に発現すると細胞内に取り込まれ、数時間でほとんどが分解されてしまうことがわかりました。⼀⽅、神経細胞において同様の解析を⾏ったところ、分解されにくく数⼗時間にわたって残存することがわかり、AMPA 受容体の寿命は神経細胞で約６倍と⼤幅に⻑くなることを明らかにしました（図２）。

（３）迅速な蛍光の⽬印づけは AMPA 受容体の⻑寿命のメカニズムを明らかにした
次に、本⼿法を⽤い、神経細胞に発現する AMPA 受容体が⻑寿命であるメカニズムの解明を⾏いました。
神経細胞と HEK293T 細胞では、細胞内外の AMPA 受容体の存在⽐はあまり変わらないことがわかりました。
⼀⽅、AMPA 受容体の細胞表層と細胞内の⾏き来に関しては、神経細胞においては数⼗分の時間スケールでリサイクルされるのに対して、HEK293T 細胞ではほとんどリサイクルされないことを⾒いだしました（図３）。
すなわち、神経細胞における AMPA 受容体の⾼寿命はその効率的なリサイクルにあると考えられます。

（４）NMDA 受容体に対しても、迅速な蛍光標識を実現した
次に本⼿法の適⽤範囲を拡⼤し、新たな⼩分⼦化合物を設計、合成することで NMDA 受容体の迅速な蛍光標識にも成功しました。NMDA 受容体においても、HEK293T 細胞と⽐較し神経細胞では寿命が約５倍と幅に⻑くなっていることを⾒いだしました。また、神経細胞内においては、NMDA 受容体の寿命は AMPA 受容体よりも少し短くなっていることも明らかにしました。
3. 今後の予定および波及効果
今回の⽅法により、記憶や学習時に起こる AMPA 受容体および NMDA 受容体の動きを任意のタイミングで定量的に評価することができ、記憶の分⼦メカニズム解明に⼤きく貢献することが期待されます。本⼿法の特筆すべき点は、遺伝⼦改変などが⼀切必要なく、⼩分⼦化合物を加えるだけで解析できる点です。したがって、今後、神経疾患、精神疾患に対する新たな診断⽅法として応⽤展開できることが期待されます。特に、NMDA受容体の異常などをいち早く検出することができれば、脳卒中など重⼤な神経疾患の新たな診断⽅法につながります。

また、脳内には、グルタミン酸受容体だけでなく、他にも複数の神経伝達物質受容体が存在し、それらの活性が密に連携することで、脳の極めて複雑な機能が制御されています。本⼿法は他の神経伝達物質受容体に対しても広く適⽤できると考えられ、脳機能解明を⾰新することが期待されます。
４．研究プロジェクトについて
本研究成果は、慶應義塾⼤学 医学部 柚﨑 通介 教授との共同研究の成果であり、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業 総括実施型（ERATO）の研究領域「浜地ニューロ分⼦技術」（研究総括：浜地 格 京都⼤学 教授）の⼀環として⾏われました。
＜研究者のコメント＞
いろいろな種類の蛍光⾊素を任意のタイミングでグルタミン酸受容体に修飾できる化学的⽅法を開発しました。グルタミン酸受容体は記憶や学習などの⾼次脳機能に不可⽋なタンパク質であり、その異常は様々な疾患と直結します。今回の⽅法では、そのタンパク質の動きを精密に解析および追跡することができます。今後、未解明なことが多い脳機能の解明や疾患の診断につながればと思います（清中 教授）。

＜論⽂タイトルと著者＞
タイトル

Ligand-directed two-step labeling to quantify neuronal glutamate receptor trafficking（グルタミン酸受容体の動態の定量化を可能とするリガンド指向性２ステップラベル化法）

著

者

⼩島 憲⼈、⽩岩 和樹、曽我 恭平、堂浦 智裕、髙遠 美貴⼦、⼩松 和弘、柚﨑 通介、浜地 格、
清中 茂樹

掲

載

誌

DO

I

Nature Communications
10.1038/s41467-021-21082-x