脳・脊髄損傷後修復におけるアストロサイトの役割解明－アストロサイトを介し神経修復を促進する化合物のスクリーニングと新薬開発－
申 請 代 表 者
所外共同研究者
所外共同研究者
所内共同研究者

上山齋藤
甲田
東田健彦
尚亮
将章
千尋

神戸大学バイオシグナル総合研究センター・分子薬理研究分野

准教授

神戸大学バイオシグナル総合研究センター・分子薬理研究分野

教授

神戸大学脳神経外科助教

病態制御部門神経機能学分野

准教授（現 教授）

■背景・目的
従来、アストロサイトは、脳梗塞や脳外傷などの脳損傷時、活性化・増殖することにより病変部周囲にグリオーシス（グリア瘢痕）を形成し、このグリオーシスが損傷部の増悪や修復遅延をもたらすと考えられてきた。ところが 2006 年のマウス脊髄損傷モデルを用いた研究で、グリオーシスは、病変部を最小限に食い止めるためにアストロサイトが病変周囲部から遊走して病変部を包み込んだものであるとの報告がなされた。しかし、グリオーシスの抑制・賦活

図１
flox
GFAP-Cre マウスと Rac1 マウスの交配により作製したアストロサイト特異的に Rac1 をKO するマウスのどちらが脳・脊髄損傷病変の縮小・修復促進、ひいては、神経機能回復に繋がるかどうかの結論は、未だ出ておらず、そのメカニズムについても解っていないのが現状である。
本研究での我々の目標は、グリオーシスの抑制・賦活のどちらが中枢神経損傷後の神経機能回復促進に繋がるのか、その結果に基づき、中枢神経後修復・回復を促進する新規化合物・治療薬・治療法、を解明・開発することである。

■結果・考察１．脊髄損傷モデルを用いた脊髄損傷におけるグリオーシスおよびグリオーシス形成における Rac1 の役割解明
まず、アストロサイト特異的に Rac1 を Knockout（KO）するマウスを作製した（図１）。アストロサイト特異的Rac1-KO マウスを脊髄圧挫損傷モデルに供し、脊髄損傷後５週間、下肢・体幹運動機能を経時的に評価すると、野生型に比し Rac1 KO マウスでは著名に良好な神経機能改善を呈した（図２）。免疫組織化学的に損傷脊髄周囲のグリオーシス（GFAP 染色）を調べたところ、Rac1-KO マウ－ 36 －

図２A，脊髄損傷モデル作製後の Baso Mouse Scale(BMS) : 下 肢 機 能（0-8 点 ）、Body Support
Scale (BSS)：体幹保持機能（0-4 点）の両者が Rac1-KO マウスで著明に良好である（*P<0.05、**P <0.01、***P <0.001）。
B，Rac1-KO マウスでは、脊髄損傷５週間後の損傷部周囲の GFAP 免疫反応性（グリオーシス）が低下している（*P <0.05）。
C，Rac1-KO マウスでは、小脳・脳幹放射線損傷３週間後のスリット状損傷部周囲のGFAP 免疫反応性（グリオーシス）が低下している（**P <0.01）。

スでは野生型に比し、軽度のグリオーシス減弱を認めることを見出した（図２）。更に、Rac1-KO マウスの中枢神経損傷後のグリオーシス減弱は、大型放射光施設
SPring8 での小脳・脳幹のスリット状放射線損傷モデルでも再現できた（3 週間後に評価）（図２）。
グリオーシス形成は、アストロサイトの損傷部周囲での増殖と損傷周辺部から損傷部周囲への遊走によると考えられている。そこで、不死化アストロサイト細胞株（LN229 細胞）を用いた Rac1-Knockdown（KD）実験により、アストロサイトの増殖能・遊走能におけるRac1 の影響を調べた（図３）。まず、インキュベーター
蛍 光 顕 微 鏡 下 で Fucci (Fluorescence ubiquitinationbased cell cycle indicator) system を用いた細胞周期解析により、Rac1-KD 細胞では細胞周期の延長、特に G1期が延長することを明らかにした。次に、インキュベー
タ ー 蛍 光 顕 微 鏡 下 で の wound healing assay に よ り、

図3A, shRac1 plasmid の導入により、LN229 細胞での Rac1-KD を確認。
B, Fucci (Fluorescence ubiquitination-basedcell cycle indicator) system とインキュベー
ター蛍光顕微鏡を用いた細胞周期解析により、
Rac1-KD 細胞では細胞周期の延長、特に G1期が延長する（*P <0.05、**P <0.01）。
C, イ ン キ ュ ベ ー タ ー 蛍 光 顕 微 鏡 下 で の woundhealing assay により、Rac1-KD 細胞では細胞遊走能が低下する（48 時間観察：**P <0.01）。

Rac1-KD 細胞では細胞遊走能が低下することを突きとめた。
上記の Rac1 低下による細胞周期延長及び細胞遊走能の低下は、Rac1 を KD した初代培養アストロサイトでも、Rac1-KO マウスから得られた初代培養アストロサ
イトでも確認することが出来た（図４）。
２．アストロサイトの増殖・遊走に関わる Rac1 の下流ターゲット分子の同定
次に、アストロサイトの増殖・遊走に関わる Rac1 シ
グナルの詳細、すなわち、Rac1 の下流ターゲット分子を同定のため、Rac1-KD LN229 細胞を用いた DNA マイクロアレイによるスクリーニングを行った。コント
ロール LN229 細胞に比し Rac1-KD 細胞で２倍以上に低下もしくは増加する分子に着目した結果、Rac1-KO によりグリオーシス形成を抑制する Rac1 の下流ターゲッ
ト分子候補として GSPT1（G1 to S phase transition 1）を見出した。

図4
A, Rac1-siRNA（20nM をリポフェクション）による Rac1-KD マウス初代培養アストロサイト
及び Rac1-KO マウスからの初代培養アストロ
サイトで、GSPT1 低下を認める。
B, Rac1-KD 及び Rac1-KO マウス初代培養アスト
ロサイトで細胞周期の延長を認める（インキュベーター蛍光顕微鏡下：**P <0.01）。
C, Rac1-KD 及 び Rac1-KO マ ウ ス 初 代 培 養 ア ス
トロサイトで遊走能低下を認める（インキュベ ー タ ー 蛍 光 顕 微 鏡 下 で の wound healing
assay：**P <0.01）。
D, Rac1-KD 及び Rac1-KO マウス初代培養アス
トロサイトで遊走能低下を認める（CytoSelectcell migration assay kit を用いる：**P <0.01）。

Rac1 KD/KO に よ る GSPT1 低 下 は、 ２ 種 の Rac1siRNA による Rac1-KD LN229 細胞、Rac1-KO マウスからの初代培養アストロサイトで確認した。
また、GSPT1 の発現が炎症惹起物質である LPS により上昇し、その上昇が Rac1-KD により抑制されることを明らかにした。更に、LPS により上昇する GSPT1 の発現が、JNK の阻害剤である JNK-－ 37 －

IN-8、ERK の阻害剤である U0126、NFKB の阻害剤である
BAY11-7085 により抑制された。これらの結果は、脊髄を含む中枢神経系の損傷急性期（活性化されたマイクログリ
アや浸潤してきた白血球・リンパ球により惹起される炎症状態）において、Rac1 の下流シグナルとして機能した
JNK・ERK・NFKB 経路を介して GSPT1 の発現が上昇することを示唆するものであった（図５）。
GSPT1 が Rac1 シグナルの下流ターゲット分子であることは、我々が見出した新事実であったが、GSPT1 は細胞周期のみならず細胞遊走にも関与するとの報告があった。実際、GSPT1 の細胞周期に関与することは、インキュベーター蛍光顕微鏡下での GSPT1-KD HeLa 細胞の細胞周期解析により明らかにした。更に、Rac1 シグナルの下流で GSPT1 が細胞周期を制御（促進）していることを、
Rac1-KD による細胞周期延長が GSPT1 の過剰発現により回復することにより確認した。加えて、初代培養アストロサイトにおいて GSPT1 を KD することでも、細胞周期の延長が認められることを確かめた（図６）。

図５A, ２種の Rac1-siRNA（2.5 nM をリポフェクション）による Rac1-KD（LN229 細胞）及び Rac1-KO マウスからの初代培養アストロサイトで、GSPT1 低下を認める。
B, GSPT1 の発現が炎症惹起物質である LPS により上昇し、その上昇が Rac1-KD（2.5 nMsiRNA）により抑制される。
C, LPS により上昇する GSPT1 の発現が、JNKの 阻 害 剤 で あ る JNK-IN-8、ERK の 阻 害剤 で あ る U0126、NFKB の 阻 害 剤 で あ る
BAY11-7085 に よ り 抑 制 さ れ る が、p38
MAPK の阻害剤である SB203580 では抑制されない。

しかしながら、GSPT1-KD（２種の GSPT1-siRNA を用いる）による細胞遊走能の低下は、LN229 細胞でも A431
細胞でも確認出来なかった。更に、GSPT1 を KD した初代培養アストロサイトにおいても、細胞遊走への関与は証明できなかった（図７）。
以 上、Rac1 シ グ ナ ル の 下 流 タ ー ゲ ッ ト 分 子 と し てGSPT1 を新規に同定した。Rac1-GSPT1 シグナルが関与する機能としては、アストロサイトの細胞周期におけるG1 期から S 期への移行促進を介してのグリオーシス形成促進が考えられる。一方で、従来の報告にある GSPT1 の細胞遊走促進作用については、我々の研究では、否定的結論であった（支持する結果は得られなかった）。このように、
Rac1 シグナル（特に GSPT1）の抑制が、神経損傷後の過度のグリオーシス形成（グリア瘢痕）を抑制し、損傷後機能回復を促進させる治療ターゲットの１つであることが分かった。

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図６
A, ２種の GSPT1-siRNA（5, 10 nM をリポフェクション）による GSPT1-KD HeLa 細胞で、細胞周期の延長を認める（10 nM、インキュベーター蛍光顕微鏡下：**P <0.01）。
B, Rac1-KD HeLa 細胞（2.5, 5 nM siRNA）でGSPT1 低下を認め、Rac1-KD により延長した細胞周期は、GFP-GSPT1 の過剰発現により回復する（**P <0.01）。
C, GSPT1-siRNA（10, 20 nM をエレクトロポレーション）による GSPT1-KD マウス初代
培養アストロサイトで、細胞周期の延長を認める（20 nM：**P <0.01）。

■結論❶アストロサイト特異的 Rac1-KO マウスを作製した。
❷ Rac1 シグナルの抑制が、神経損傷後の過度のグリオーシス（増殖・遊走）を抑制した。
❸ Rac1-KO による過度のグリオーシス抑制（アストロサイトの細胞周期延長）の原因として、Rac1-GSPT1シグナルが関与することを明らかにした。
図7
A, ２種の GSPT1-siRNA（5, 10 nM をリポフェクション）による GSPT1-KD LN229 細胞で、 細 胞 遊 走 能 低 下 を 認 め な い（10 nM、インキュベーター蛍光顕微鏡下での woundhealing assay）。
B, GSPT1-siRNA（20 nM をエレクトロポレーション）による GSPT1-KD マウス初代培養
アストロサイトで、細胞遊走能低下を認めない（CytoSelect cell migration assay kitを用いる）。

❹ Rac1 シ グ ナ ル（ 特 に GSPT1） の 抑 制 が、 神 経 損
傷後の過度のグリア瘢痕を抑制し、損傷後機能回復を促進させる治療ターゲットの１つであることが分かった。
一方で、アストロサイト特異的 Rac1-KO マウスにおける脊髄損傷後の著名な神経機能回復を、Rac1-GSPT1 シグナル低下のみで説明するのは難しいのも事実である。引き続き、グリオーシス減弱により中枢神経損傷後の機能回復を促進する Rac1 シグナル（Rac1 シグナルの下流ターゲット分子）の検索・同定が必要と考えられた。
我々の最終目標は、Rac1 シグナルを抑制する生薬・化合物を見出し、脊髄損傷はもとより脳損傷を含めた中枢神経損傷の修復を促す新規治療薬・治療法を開発することであり、更なる研究の発展が必要である。

以上の研究成果は、下記に報告及び報告予定である。
1) Ishii T, Ueyama T, Shigyo M, Kohta M, Kondoh T, Kuboyama T, Uebi T, Hamada T, Gutmann
DH, Aiba A, Kohmura E, Tohda C, Saito N: A novel Rac1-GSPT1 signaling pathway controls
astrogliosis following central nervous system injury. J Biol Chem, 2017, 292, 1240-1250
2) Sakamoto I, Ueyama T, Hayashibe M, Shigyo M, Tohda C, Saito N: Roles of Cdc42 and Rac inBergmann glia during cerebellar corticogenesis. Manuscript in preparation－ 39 －