麻黄含有漢方方剤の気管支ぜん息治療効果に対する免疫学的な機序解明およびその活性物質の探索〜ケモカイン受容体CCR３，CCR４，およびCCR８に対するトリプルアンタゴニストに焦点を絞って〜
申 請 代 表 者
所外共同研究者〃所内共同研究者

中山田中義江小泉隆志宏幸修桂一

近畿大学薬学部医療薬学科化学療法学研究室
岐阜薬科大学薬理学研究室
近畿大学医学部細菌学教室
臨床科学部門 漢方診断学分野

教授
准教授
教授
准教授

【報告セミナー要旨】【目的】現在，ケモカイン受容体はアレルギー性疾患を初めとする炎症性疾患の創薬標的分子として注目を集めている。我々は，平成 21 年度共同研究において，和漢薬ライブラリーを用いた網羅的探索により，マオウエキスがケモカイン受容体 CCR3，CCR4，および CCR8 に対するトリプルアンタゴニスト活性を有していることを明らかにしてきた。そこで，本研究では，(1) 麻黄含有漢方方剤のぜんそく治療に対する有用性を動物モデルにより解析する。さらに，(2) そのアンタゴニスト活性成分体の同定を行う。ことを 2 年間の研究目的とした。
【結果】(1) ぜん息動物モデルによる麻黄湯の評価：平成 22 年度共同研究において，我々はマウス気道炎症に対して，麻黄湯が有効であることを明らかにしている。そこで，本研究では卵白アルブミン (OA)および，チリダニ抗原 (Der f) をマウス気管内に反復投与する喘息モデルを用いて麻黄湯の影響を検討した。その結果，OA モデルでは感作およびその後の抗原反復曝露によりアセチルコリンに対する気道過敏性，BALF 中好酸球を中心とする炎症性細胞の浸潤ならびに血清中抗原特異的 IgE 値の上昇が認められた。これに対し，麻黄湯はほとんど影響を及ぼさなかった。一方，麻黄湯は Der f 誘発による気道過敏性ならびに BALF 中炎症性細胞の浸潤に影響を及ぼさなかった。
(2) アンタゴニスト活性成分体の同定：初めにマオウの主成分であり既に抗アレルギー作用が知られているエフェドリンについて，ケモカイン CCR3，CCR4 と CCR8 受容体に関して検討した結果，優位なアンタゴニスト活性は確認できなかった。そこで次にマオウエキスから，4 つの分画を調整した結果，酢酸エチル非可溶性分画にもとのマオウエキスより強い CCR3 と CCR4 に対するアンタゴニスト活性が確認された。
【考察と今後の展望】本研究において，麻黄湯はぜん息動物モデルに対する効果は確認出来なかった。
その理由としては，麻黄湯エキスは麻黄エキスと較べて，その CCR3 および CCR4 に対するアンタゴニスト活性が弱いことが考えられる。一方で，アンタゴニスト活性が濃縮された分画を得ることが出来た結果，マオウにはエフェドリン以外の抗アレルギー作用をもつ物質が存在することが示唆された。
今後は，定法に従って，CCR3 および CCR4 に対するアンタゴニスト成分を同定し，その成分を上記ぜん息動物モデルにて再評価する予定である。

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■背景・目的ケモカインは白血球やリンパ球等の免疫担当細胞遊走を誘導するサイトカインの一群であり，その受容体は創薬の代表的な標的分子である 7 回膜貫通 G タンパク共役型受容体 (GPCR) であり，19種類が確認されている。これらケモカインおよびその受容体はアレルギー疾患等に重要な役割を担っている。種々疾患のキーファクターとなるケモカインならびにその受容体が解明され，それら分子の相互作用を阻害することにより，アレルギー疾患を初めとした異常免疫応答に有効な治療効果を発揮できることから，現在，ケモカイン受容体のアンタゴニスト探索が精力的に展開されている。
これまでに我々（近畿大学・中山，義江ら）は世界に先駆けて多くのケモカインならびにその受容体のクローニングに成功し，さらに生理的および病的な役割を詳細に明らかにすることで本研究領域を世界的にリードしてきた。さらに，19 種類全てのケモカイン受容体に対して，各々一受容体のみを遺伝子工学的に過剰発現させた免疫担当細胞株のラインナップ（細胞パネル）を作製し，これら細胞のケモカインへの遊走阻害を指標に，ケモカイン受容体のアンタゴニストの探索を網羅的に遂行できるシステムの構築してきた。既に，平成 21 年度共同研究において，本パネルシステムに標準和漢薬ライブラリーを供したところ，麻黄エキスが，ケモカイン受容体 CCR3，CCR4，およびCCR8 に対するトリプルアンタゴニスト活性を有していることが確認できた。これら 3 つは，好酸球，および好塩基球等のアレルギー反応惹起担当細胞に発現している受容体であり，特に，これらのトリプルアンタゴニストは，気管支ぜん息治療の有望な候補薬剤となり得るために，その探索が精力的に行われている。そこで，本研究では，上記トリプルアンタゴニスト活性の結果を基盤として，既に，気管支ぜん息治療で汎用されている麻黄含有漢方方剤の効果機序を，世界的なぜんそく治療薬トラニラストの創薬開発に貢献した動物モデル（岐阜薬科大学・田中）により，解析する。さらに，そのトリプルアンタゴニスト活性成分本体の同定を，漢方方剤の薬効を免疫学的に解析し，かつトランスレーショナルリサーチを意欲的に推進している和漢研担当共同研究教員（小泉）が担当する。
従って，本研究の目的は，各研究領域で実績を有する 3 グループの研究者が，平成 21 年度の共同データをもとに連関を取ることで，ケモカイン受容体 CCR3，CCR4，および CCR8 に焦点を絞って，麻黄含有漢方方剤の気管支ぜん息治療効果に対する免疫学的な機序解明およびその活性成分の探索を遂行することにある。

■結果・考察（１）実験材料および方法
A．ぜん息動物モデルによる麻黄湯の評価
本研究では先ず古典的かつ汎用されている卵白アルブミン (OA) によるマウス喘息モデルを用いて麻黄湯の影響を検討した。次いで，臨床において重要な抗原であるチリダニ抗原 (Der f) をマウス気管内に反復投与する喘息モデルを用いて麻黄湯の影響を検討した。すなわち，マウスを OA およびアラムにて 2 回腹腔内注射することにより能動的に感作し，その後，OA 生理食塩水溶液を 4 日おきに計 3 回吸入曝露した。麻黄湯は初回抗原曝露前日から 10 日間経口投与した。一方，ダニ抗原モデルは吸入麻酔下，マウス気管内に Der f を計 8 回投与した。麻黄湯は 5 回目の抗原投与前から 10 日間連日経口投与した。OA モデルの場合は最終抗原曝露 24 時間後に，Der f モデルの場合は最終抗原曝露48 時間後に，麻酔下人工呼吸下にてアセチルコリンに対する気道収縮を測定し，直後に左気管支は結紮後，気管支肺胞洗浄を行い，気管支肺胞洗浄液 (BALF) を得た。その後，BALF 中の炎症性細胞−2−数を計数すると共に，サイトカイン（IL-13・IFN-J）・ケモカイン (eotaxin) の定量，組織学的解析，血清中抗原特異的 IgE 値などの定量を行った。
B．アンタゴニスト活性成分体の同定
細胞遊走は CHEMOTX ケモタキシスチャンバー（Pore size 5P m）を用いて行った。L1.2 細胞の CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5 および CCR8 安定発現細胞は細胞遊走バッファー（0.5%BSA，20 mM HEPES pH7.4，RPMI-1640 without phenol red）で洗浄を 2 回行った後，8 × 106 個/ml となるように懸濁した。ケモカインを細胞遊走バッファーで希釈して下部ウェルに 29P l 加え，8× 106 個 /ml に調整した細胞を上部ウェルに 25P（2l × 105 個）加えた。チャンバーは 5％ CO2 インキュベーター中で 37℃，2 時間放置した。下部ウェルに遊走した細胞を溶解溶液（0.1% triton-X100，10mM Tris pH8.0）で溶解し，同時に PicoGreen 2 本鎖 DNA 定量試薬（Molecular Probes，Eugene，OR）を用いてラベルした。蛍光強度を励起光 485 nm/ 測定光 535 nm で測定し，細胞数を定量した。
細胞遊走は上部ウェルにインプットした細胞の％として標記した。麻黄湯，エフェドリン，麻黄エキ
ス，麻黄分画のケモカイン依存的な細胞遊走に与える影響を検討するために，これらを下部のケモカイン溶液に加えて細胞遊走解析を行い，阻害活性を測定した。細胞はカルシウム濃度上昇反応解析バッ
ファー（1% BSA，10 mM HEPES pH7.4，HBSS）で洗浄を 2 回行った後，1 × 106 個 /ml となるように懸濁した。細胞懸濁液 1ml あたり fura2-AM (1 mM DMSO 溶液（Molecular)
Probes）を 3P l 加え，37℃で 1 時間，暗所に放置した。洗浄を 2 回行った後，細胞を 5 × 106 個 /ml となるように懸濁した。
100P l の細胞懸濁液を石英セルに入れて，蛍光分光光度計 Fluorescence Spectrophotometer F-2500（Hitachi，Tokyo，Japan）に配置した。ケモカイン刺激による蛍光強度の増強は励起光 485 nm/ 測
定光 535 nm で測定した。麻黄由来の酢酸エチル非可溶性分画のケモカイン依存的な細胞内カルシウム濃度上昇反応に与える影響を検討するために，酢酸エチル非可溶性分画をケモカイン刺激の 30 秒前に前投与して解析を行った。
（２）結果
A．ぜん息動物モデルによる麻黄湯の評価
平成 22 年度共同研究において，我々はマウス気道炎症に対して，麻黄湯が有効であることを明らかにしている。そこで，本研究では卵白アルブミン (OA) および，チリダニ抗原 (Derf) をマウス気管内に反復投与する喘息モデルを用いて麻黄湯の影響を検討した。その結果，OA モデルでは感作およびその後の抗原反復曝露によりアセチルコリンに対する気道過敏性，BALF 中好酸球を中心とする炎症性細胞の浸潤ならびに血清中抗原特異的 IgE 値の上昇が認められた。これに対し，麻黄湯はほとんど影響を及ぼさなかった（Fig.1）。一方，麻黄湯は Derf 誘発による気道過敏性ならびに BALF 中炎症性細胞の浸潤に影響を及ぼさなかった（Fig.2）。

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Fig.1OA モデルにおける麻黄湯の効果

Fig.2

Der f モデルにおける麻黄湯の効果

B．アンタゴニスト活性成分体の同定
初めに麻黄湯に関して，ケモカイン CCR3，CCR4 と CCR8 受容体に関するアンタゴニスト活性を評価した。その結果，麻黄エキスと比べて麻黄湯の CCR3 と CCR4 に対するアンタゴニスト活性が弱いこと，および CCR8 に対してはその活性は有しないことが確認された。次に，マオウの主成分であり既に抗アレルギー作用が知られているエフェドリンについて，ケモカイン CCR3，CCR4 と CCR8受容体に関して検討した結果，これら 3 種類の受容体に対して，優位なアンタゴニスト活性は確認できなかった。そこでマオウエキスから，酢酸エチル可溶性分画，酢酸エチル非可溶性分画，クロロホルム可溶性分画，および水溶性分画の 4 つの分画を調整した結果，酢酸エチル非可溶性分画にもとのマオウエキスより強い CCR3 と CCR4 に対するアンタゴニスト活性が確認された（Fig.3）。次に，麻−4−黄由来の酢酸エチル非可溶性分画による細胞遊走阻害活性のケモカイン受容体特異性を検討した。既知の全てのケモカイン受容体の系統樹解析を行った結果，CCR3 と CCR4 は CCR1，CCR2，CCR5および CCR8 に対して構造的類似性が高いことが示された。さらに CCR1 〜 5 および CCR8 の L1.2
安定発現細胞株を用いた細胞遊走解析により，酢酸エチル不溶性分画のアンタゴニスト活性を解析した。CCR1 の細胞遊走は CCL5/RANTES，CCR2 は CCL2/MCP-1，CCR3 は CCL11/eotaxin，CCR4は CCL22/TARC，CCR5 は CCL5/RANTES そして CCR8 は CCL1/I-309 を用いた結果，酢酸エチル非可溶性分画は，CCR1 に対しても弱いアンタゴニスト活性を示し，比較的 CCR3 と CCR4 に特異的なアンタゴニスト活性を示すことが確認された（Fig.4）。一方，CCR3 と CCR4 にはそれぞれ複数のリガンドが存在しており，CCR3 のリガンドとしては，CCL11/eotaxin，CCL24/eotaxin-2，CCL26/eotaxin-3，CCL13/MCP-4，CCL5/RANTES， ま た，CCR4 の リ ガ ン ド と し て は CCL22/MDC とCCL17/TARC が知られている。そこで次にこれらのリガンドによる CCR3 と CCR4 を介した細胞遊走への酢酸エチル不溶性分画の影響を検討した。酢酸エチル非可溶性分画は，これら全てのリガンドによる CCR3 と CCR4 を介した細胞遊走が阻害した。これらのケモカインのアミノ酸レベルでの相同性は 30％程度であることから，酢酸エチル非可溶性分画によるアンタゴニスト活性は，リガンド側ではなく受容体側への直接作用によると考えられた（Fig.5）。また，ケモカイン受容体を介したシグナルは，三量体 G 蛋白質を介して伝達されるが，細部遊走活性には G D サブユニットが重要な役割を果たすことが知られている。一方で，E J サブユニットは，PLC E の活性化を介して細胞内小胞体からのカルシウム放出を誘導し，この放出されたカルシウムは細胞遊走活性以外の，遺伝子発現誘導，細胞増殖活性，抗アポトーシス活性，血管新生作用などにおいて重要な役割を果たすと考えらえている。そこで，次に酢酸エチル非可溶性分画のケモカイン刺激によって誘導される細胞内カルシウム濃度上昇反応における影響を検討した。CCL11/eotaxin と CCL22/MDC は，それぞれ CCR3 と CCR4の L1.2 安定発現細胞株において，強い細胞内カルシウム濃度上昇反応を誘導した。これらの反応は，酢酸エチル非可溶性分画の前投与により，有意に抑制されることが確認された。この結果から，酢酸エチル非可溶性分画が細胞遊走活性以外のケモカイン機能も阻害する可能性が示唆された。
（３）考察
本研究において，麻黄湯はぜん息動物モデルに対する効果は確認出来なかった。その理由としては，麻黄湯エキスはマオウエキスと較べて，その CCR3 および CCR4 に対するアンタゴニスト活性が弱いことが考えられる。一方で，アンタゴニスト活性が濃縮された分画を得ることが出来た結果，マオウにはエフェドリン以外の抗アレルギー作用をもつ物質が存在することが示唆された。今後は，定法に従って，CCR3 および CCR4 に対するアンタゴニスト成分を同定し，その成分を上記ぜん息動物モデルにて再評価する予定である。

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Fig.3

Fig.4

Fig.5

マオウエキスより調整された 4 分画のアンタゴニスト活性の評価

マオウエキス由来の酢酸エチル非可溶性分画による細胞遊走阻害活性の受容体特異性

マオウエキス由来の酢酸エチル非可溶性分画の CCR3 と CCR4 リガンドによる細胞遊走への影響−6−