和漢薬の標的分子の網羅的解析および包括的作用メカニズムの解明
統括者
所内共同研究者
申 請 代 表 者
所外共同研究者

東田 千尋
久保山友晴
関谷 倫子
飯島 浩一

神経機能学分野
准教授
神経機能学分野
助教
国立長寿医療研究センター認知症先進医療開発センターアルツハイマー病研究部発症機序解析研究室 博士研究員
国立長寿医療研究センター認知症先進医療開発センターアルツハイマー病研究部発症機序解析研究室 室長【報告セミナー要旨】【関谷・飯島グループ：アルツハイマー病改善に関わる分子を網羅的に明らかにする】
独自に作製した A β 42 を神経細胞特異的に発現させたショウジョウバエを使用して、A βの毒性に対して保護的に働くと考えられる候補遺伝子のスクリーニングを行った。昨年度は，Nmnat が Aβ毒性による神経機能低下を抑制することを発見したので、今年度は Nmnat のどのような機能が Aβ毒性による神経機能低下の抑制に関与しているのかを検討した。Nmnat は、NAD の生合成を触媒する酵素であるとともに、分子シャペロンとしての機能を併せ持っている。
NAD の生合成を触媒する酵素機能部分に変異の入った Nmnat を発現するショウジョウバエでは、A β毒性による神経機能低下が抑制されなかった。一方、Nmnat は（NAD 合成酵素活性に依存しない）分子シャペロン機能を併せ持っており，タウやポリ Q といった凝集タンパクを減少させると報告されているが、Nmnat は A β量に変化を与えなかった。
以上の結果より、A βの神経毒性に対する Nmnat の神経保護作用には，Nmnat の NAD 合成酵素活性が重要であることが明らかになり、A βの神経毒性に対する保護作用の drug target としてのNAD の重要性を見出された。
【東田・久保山グループ：アルツハイマー病あるいは脊髄損傷の改善に有効な薬物の作用点を網羅的に明らかにする】
今年度の特定研究では、DARTS 法により、加味帰脾湯により直接刺激される脳内分子の同定を試
み、候補タンパク質として、cytosolic aspartate aminotransferase (cAST) を見出し、cAST の新たな機能の存在を提示した。
骨砕補に関しては、水エキス投与によって 5XFAD マウスにおける記憶障害を改善することを見出した。さらに、naringenin, naringenin-7-O-glucuronide が、骨砕補水エキス経口投与後にマウス脳内に移行する成分であることを特定し、かつ軸索修復作用を有することも確認した。それら化合物の直接の結合分子を DARTS 法にて検討し、神経細胞の軸索伸展を調節する重要な分子である CRMP2を特定した。
また、脊髄損傷作用を示した苦参水エキス中の matrine に関して、直接の結合分子を DARTS 法にて検討し、HSP90 である結果を得た。

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【成果の見通し】
今年度の取組みにより、病気を治す分子シグナリングを解明する方法の妥当性を示唆するデータが蓄積されてきた。これによって、和漢薬の薬効メカニズムを解析していく手法が構築できると思われる。また、得られた基礎データを製品開発に繋げる出口戦略においても、臨床研究の実施など着実に進展しており、次年度はさらに製品化の幅を広がられるような計画を立てている。和漢薬の標的分子の網羅的解析および包括的作用メカニズムの解明に向けて、成果があがることが見込まれる。
Publications
1) Ando K, Hearn S, Suzuki E, Maruko-Otake A, Sekiya M, Iijima K. M. Neuromethods, (2016)
in press2) Ando K, Maruko-Otake A, Ohtake Y, Hayashishita M, Sekiya M, Iijima K.M. PLoS Genetics,in revision
3) Sekiya M, Maruko-Otake A, Hearn S, Sakakibara Y, Suzuki E, Ando K, Iijima K.M.
Developmental Cell, in revision4) 関谷倫子 , 飯島浩一

ファルマシア , 52(2), 121-126, (2016).

5) Watari H, Shimada Y, Tohda C. Traditional Kampo Meidcine, (2016) in press
6) Watari H, Shigyo M, Tanabe N, Tohda M, Cho KH, Kyung PS, Jung WS, Shimada Y,Shibahara N, Kuboyama T, Tohda C. Phytother Res. 29(3):35135-35136, (2015).
7) Yang ZY, Kuboyama T, Kazuma K, Konno K, Tohda C. J Nat Prod, 78(9):2297-2300, (2015).
8) Tanabe N, Kuboyama T, Kazuma K, Konno K, Tohda C. Front Pharmacol. 2016 ;6:326,(2016).
9) Shigyo M, Kuboyama T, Sawai Y, Tada-Umezaki M, Tohda C. Sci Rep. 5:12055, (2015).

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■背景および目的（関谷・飯島）脳神経細胞においてアミロイドβ（A β）を発現するショウジョウバエの遺伝子発現解析の結果から得られた情報をもとに、A βの毒性に対して保護的に働くと考えられる候補遺伝子を選定し、スクリーニングを行った。その結果、Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase（NMNAT）の強制発現により、A β毒性による神経機能低下を抑制できることを見いだした。NMNAT は、軸索損傷による神経変性を遅延させる効果が報告されており、また A βを発現するショウジョウバエにおいても発現が上昇していることから、A βによる神経障害に対して保護的に働く可能性が考えられる。
NMNAT は、NAD の生合成を触媒する酵素であるとともに、分子シャペロンとしての機能を併せ持っている。本年度は、A β毒性による神経機能低下を抑制する薬物の作用点を見つけるために、ス
クリーニングで得られた NMNAT の効果が NAD 合成酵素活性によるものか、それ以外の機能によるものかを明らかにする。
（東田・久保山）
我々は以前より、“神経回路網修復によるアルツハイマー病改善の概念の実証”を目指してきた。
神経回路網修復が AD の記憶障害改善にとって決定的に重要であると考えて、A βによって誘発される神経回路網破綻に対して、それを修復する活性物質を生薬から探索し、また活性を示した生薬中から、軸索を再伸展させる成分を種々同定してきた。
また、漢方方剤では加味帰脾湯に着目し、早期から重篤な AD 病変を示すトランスジェニックマウ
ス 5XFAD への加味帰脾湯の経口投与により、物体認識記憶障害が有意に改善されること、アミロイドプラーク近傍に限局した軸索とシナプス前部位の変性を顕著に改善されるという新しい知見を得た。さらに加味帰脾湯による軸索変性解除の機序の一つとして、タウ過剰リン酸化の持続的抑制によること、それにはタウの脱リン酸化酵素 PP2A の活性化が関与することを明らかにした。
この、“神経回路網修復によるアルツハイマー病改善”の研究の集大成として、diosgenin の抗AD 作用とその分子メカニズムの解明に取り組み、重篤期に入ったアルツハイマー病モデルマウス
5XFAD への diosgenin 投与によって、物体認識記憶、空間記憶障害の有意な改善、アミロイドプラークや神経原線維変化の減少、アミロイドプラーク近傍に限局した軸索とシナプス前部位の変性の顕著な改善をもたらすことを見出した。
さらに、diosgenin の直接の結合タンパク質を drug afﬁnity responsive target stability（DARTS）
法により検討し、種々の検証を重ね、1,25D3-MARRS が diosgenin の受容体であることを突き止めた。1,25D3-MARRS の神経系での機能についてはこれまで報告がなかった。我々は、in vivo での神経活動電位の測定や、脳室内への 1,25D3-MARRS 中和抗体投与下での記憶試験等の検討を行い、1,25D3-MARRS が確かに diosgenin の受容体であり、その刺激により軸索伸展や神経細胞の興奮が起こり記憶亢進に至ることを証明した。
アルツハイマー病モデル動物である 5XFAD マウスを用いた。変性軸索を正常化させる作用を示した生薬として着目した骨砕補水エキスに関して 5XFAD マウスに経口投与し、物体認知記憶、物体場所記憶、エピソード記憶のそれぞれに対する改善効果を検討した。
本年度は、昨年度までの取り組みで 5XFAD マウスに対する記憶改善作用が示されている、骨砕補水エキス、加味帰脾湯に関して、それらの作用機序の最上流分子を網羅的に同定することを目的とした。

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■結果および考察（関谷・飯島）A β毒性による神経機能低下を抑制する薬物の作用点を見つけるために、スクリーニングで得られた Nmnat の効果が NAD 合成酵素活性によるものか、それ以外の機能（シャペロン機能）によるものかを検討した。2 種類の変異ショウジョウバエを作製した。Nmnat H30A は Nmnat の catalytic
motif に，Nmnat WR は NMN binding motif と ATP binding motif の両方に変異が入っている。
まず NAD 合成酵素活性の関与について調べるため、NAD の生合成を触媒する酵素機能部分に変異の入った Nmnat が A β毒性による神経機能低下を抑制するかどうか，ショウジョウバエで検討した。
Nmnat H30A も Nmnat WR も、A β毒性による神経機能低下を抑制しなかったため、Nmnat の A
β毒性に対する神経保護作用には，NAD 合成酵素活性が必要であることが示唆された。
次に分子シャペロン機能の関与について調べた。Nmnat は、NAD 合成酵素活性に依存しない分子シャペロン機能を併せ持っており，タウやポリ Q といった凝集タンパクを減少させると報告されている。脳に Nmnat を過剰発現したショウジョウバエにおいて、脳内の A β量を定量したところ、コントロール群との差は見られなかった。
以上の結果より、A βの神経毒性に対する Nmnat の神経保護作用には，Nmnat のシャペロン機能よりも NAD 合成酵素活性が重要であることが明らかになり、A βの神経毒性に対する保護作用にNAD が重要な働きをしていることが示唆された。
（東田・久保山）
今年度の特定研究では、DARTS 法により、加味帰脾湯により直接刺激される脳内分子の同定を試み、候補タンパク質として、cytosolic aspartate aminotransferase（cAST）を見出し、cAST の新たな機能の存在を提示した。
骨砕補に関しては、水エキス投与によって 5XFAD マウスにおける記憶障害を改善することを見出した。さらに、naringenin, naringenin-7-O-glucuronide が、骨砕補水エキス経口投与後にマウス脳内に移行する成分であることを特定し、かつ軸索修復作用を有することも確認した。それら化合物の直接の結合分子を DARTS 法にて検討し、神経細胞の軸索伸展を調節する重要な分子である CRMP2を特定した。

■結論（関谷・飯島）A βの神経毒性に対する保護作用に NAD が重要な働きをしていることが示唆され、NAD が drug
screen のターゲットの 1 つになるのではないかと考えられる。
（東田・久保山）
今年度の取組みにより、病気を治す分子シグナリングを解明する方法論が徐々に固まってきており、その方法で示される結果が妥当であること示唆するデータも蓄積されてきた。これによって、和漢薬の薬効メカニズムを、先入観なしにシグナリングの起点から下流へ順に解析していく手法、が構築できると思われる。また、得られた基礎データを製品として実用化する出口に向けても、今年度の取組－4－

み（学長裁量経費戦略的経費の使用も含む）により既に、臨床研究の実施や開発担当企業の確定など、着実に進展しており、次年度はさらに製品化の幅を広がられるような計画を立てている。和漢薬の標的分子の網羅的解析および包括的作用メカニズムの解明に向けて、成果があがることが見込まれる。

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