漢方方剤併用による抗 HTLV-I 中和モノクローナル抗体を用いた HTLV-I 感染・発症阻止効果の増強の試み
申 請 代 表 者
所内共同研究者

藤猪早川英樹芳弘

琉球大学大学院医学研究科免疫学講座
病態生化学分野准教授
准教授【報告セミナー要旨】【目的】
ヒト T 細胞白血病ウイルス I 型（human T-cell leukemia virus type-I, HTLV-I）はレトロウイル
ス科デルタレトロウイルスに属し、成人 T 細胞白血病（adult T-cell leukemia, ATL）や HTLV-I 関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy, HAM）、ぶどう膜炎などの炎症性疾患をひき起こすことが知られている。HTLV-I の感染は縄文時代に遡るといわれ、現在も我が国の HTLV-I 感染者数は１００万人以上と推定される。母子間の垂直感染が主な感染ルートであるが、麻薬乱用や性行為による大人間の水平感染も問題となっており、最近､ 大都市では感染者数の増加の傾向を示している。感染リンパ球はその後一生涯生体内で維持され、感染患者のうちの 5% 程度が ATL を発症する。しかも発症後２年以内に 100% 近くが死亡するという極めて悪性度の高い疾患である。このような状況の中で、人為的に HTLV-I 感染拡大を阻止するワクチンや医薬品を開発することは社会的に高い緊急性を持つと考えられる。HTLV-I 感染症に対する抗体医薬の開発が急がれている中で、これまでに、我々が樹立したラット抗 HTLV-I gp46 IgG 単クローン抗体（LAT-27：in vitro で感染中和及び ADCC 活性を持つ）が in vitro やヒト化した高度免疫不全マウスの体内において HTLV-I 感染を阻止することを報告してきた。
本研究では、LAT-27 抗体が持つ感染中和及び ADCC 活性を最大限引き出す効果を漢方生薬成分に見出すことを目的として検討した。
【結果と考察】120 種の生薬エキスを患者由来 ATL 細胞に添加し、LAT-27 抗体のエピトープである、ウイルスのエンベロープタンパクである gp46 の発現、および、ATL 発症の責任調節遺伝子と考えられる tax の発現をフローサイトメトリーで検討した。更にウイルス活性時に上昇することが知られている表面マーカーについても検討を行った。その結果、顕著なウイルス活性の変動が認められた生薬成分のうち、黄連（オウレン）、生姜（ショウキョウ）、丁子（チョウジ）について感染性への関与を報告する。
今後、これら生薬成分を含む漢方方剤を用いた in vivo の検討を行っていく。

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様式１－４【背景・目的】■背景・目的HTLV-Iは世界で初めてヒトの疾患との関連が見いだされたレトロウイルスでありは世界で初めてヒトの疾患との関連が見いだされたレトロウイルスであり, HTLV-I 関連髄膜症（HAM）および成人
T
HTLV-I, HTLV-I 関連髄膜症（HAM）および成人
T 細胞白血病(ATL) の原因ウイルスである. 我が国には, 先進国で最多の細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである.
我が国には,先進国で最多の 110 万人ものHTLV-I感染者が存在しており, 特に ATL110 万人もの HTLV-I 感染者が存在しており , 特に ATL においては , 発症後の予後は極めて悪く , 発においては, 発症後の予後は極めて悪く, 発症 1 年以内の死亡率が極めて高い深刻な現実がある. 我が国での ATL での死亡者数症 1 年以内の死亡率が極めて高い深刻な現実がある . 我が国での ATL での死亡者数は年間で 1000 人
は年間で 1000 人を超える. しかしながら, 今日 HTLV-I 関連疾患の有効な治療法はもとより, 主な感染ルートである母子感染やを超える . しかしながら , 今日 HTLV-I 関連疾患の有効な治療法はもとより , 主な感染ルートである母大都市で見られる水平感染を防御するワクチンの開発もなされていない.
子感染や大都市で見られる水平感染を防御するワクチンの開発もなされていない .
我々はinin vitro
HTLV-I
感染を阻害する抗HTLV-I 中和モノクローナル抗体(LAT-27:rat anti-gp46, IgG1)をvitroにおいて細胞間の我々はにおいて細胞間のHTLV-I
感染を阻害する抗HTLV-I 中和モノクローナル抗体(LAT-27:rat anti-gp46,IgG1) を樹立しており , 本抗体の投与により中和活性を介したウイルス感染樹立しており,
本抗体の投与により中和活性を介したウイルス感染の体内伝播の阻止,並びに抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)の体内伝播の阻止 , 並びに抗体依存性細胞傷害活性 (ADCC) を介したウイルス感染細胞の排除するこを介したウイルス感染細胞の排除することを目指している.とを目指している .
HTLV-I 感染キャリア患者, 及び ATL/HAM 発症患者のいずれの血液中にも抗 HTLV-I 抗体は確認されるが, しかしながら,そHTLV-I 感染キャリア患者 , 及び ATL/HAM 発症患者のいずれの血液中にも抗 HTLV-I 抗体は確の防御効果は十分でないと考えられており,その原因の一つとして, HTLV-I 感染細胞上で抗体が認識するHTLV-I抗原の発現が認されるが, しかしながら , その防御効果は十分でないと考えられており, その原因の一つとして,減弱していることが知られている.
HTLV-I
感染細胞上で抗体が認識する HTLV-I 抗原の発現が減弱していることが知られている .

本研究では抗体が持つ感染中和及びADCC 活性を最大限引き本研究では,, この点を改善する目的で、LAT-27
この点を改善する目的で、LAT-27 抗体が持つ感染中和及びADCC 活性を最大限引き出す効果を漢方生薬成分に見出す効果を漢方生薬成分に見出すことを目的として検討した .
出すことを目的として検討した.

■結果・考察【結果・考察】ATL 細胞を IL-2(20U/ml), 10%FCS 添加の RPMI1640 培地で 37 度 , 5% CO2 環境下で 3 日間培養を

ATL. 細胞をIL-2(20U/ml), 10%FCS 添加の RPMI1640 培地で 37 度,CO2 環境下で 3 日間培養を行った.
行った
その際に和漢医薬総合研究所所有の生薬ライブラリー1205%種類を添加して評価を行った. モ その際に和漢医ノクローナル抗体
LAT-27 の抗原であるエンベロープタンパクであるgp46 の細胞表面発現を, さら
薬総合研究所所有の生薬ライブラリー120種類を添加して評価を行った. モノクローナル抗体
LAT-27 の抗原であるエンベロープに , gp46 をはじめとするウイルス遺伝子の発現を促進する HTLV-I のがん蛋白 Tax の発現の細胞内染タンパクである gp46 の細胞表面発現を, さらに, gp46 をはじめとするウイルス遺伝子の発現を促進する HTLV-I のがん蛋白 Tax
色を行い , フローサイトメトリーで発現量を測定した ( 図 1). 生薬サンプルは最終濃度 5mg/ml で細胞の発現の細胞内染色を行い,フローサイトメトリーで発現量を測定した(図 1). 生薬サンプルは最終濃度 5μg/ml で細胞増殖に影響増殖に影響の出なかったもの , かつ 2 種類の由来の異なる ATL 細胞株で同じ傾向が得られたものを評の出なかったもの,
かつ 2 種類の由来の異なるATL ,細胞株で同じ傾向が得られたものを評価対象とした（結果省略）.
その結果,価対象とした（結果省略）. その結果 , 生姜 , 丁子
大黄に gp46, Tax の発現抑制作用が得られた . 一方 ,生姜, 丁子,大黄にgp46, Tax の発現抑制作用が得られた. 一方, .黄連にはgp46, Tax に対する強い発現増強効果が認められた.
黄連にはgp46,Tax に対する強い発現増強効果が認められた
これらのことは、これら生薬サンプ

ルがATL 細胞内の HTLV-I プロウイルスの活性化を直接制御していることを示唆している.
これらのことは、これら生薬サンプルがATL 細胞内の HTLV-I プロウイルスの活性化を直接制御していることを示唆している.

図 1 生薬は ATL 細胞の HTLV-I gp46 と Tax の発現を制御する

図 1 生薬はATL 細胞の5µg/ml
HTLV-Igp46と Tax の発現を制御する
生薬抽出液を最終濃度で ATL細胞の培養に添加し、３日後に細胞表面のgp46 と細胞内の Tax の発現をフローサイトメトリーにて解析した。
生薬抽出液を最終濃度 5mg/ml で ATL 細胞の培養に添加し、３日後に細胞表面の gp46 と細胞内の Tax の発現をフローサイトメトリーにて解析した。

生薬サンプルが ATL 細胞内の HTLV-I プロウイルスの活性化を直接制御していることを示唆していることから、ウイルス粒子－ 91 －産生の指標となるウイルス gag タンパクである p24 の培養上清中への放出を ELISA にて確認を行った（図 2）. その結果, 生姜,

様式１－４

丁子は濃度依存的にp24の培養上清中への放出を抑制した. 一方, 黄連は増強傾向を示した. 黄連の最終濃度5生薬サンプルが ATL 細胞内の HTLV-I プロウイルスの活性化を直接制御していることを示唆して制は、強い細胞増殖抑制効果によるものと考えられる（結果省略）.
いることから、ウイルス粒子産生の指標となるウイルス gag タンパクである p24 の培養上清中への放出を ELISA にて確認を行った（図2）. その結果 , 生姜 , 丁子は濃度依存的に p24 の培養上清中への放様式１－４出を抑制した . 一方 ,丁子は濃度依存的にp24の培養上清中への放出を抑制した.
黄連は増強傾向を示した . 黄連の最終濃度 50mg/ml での産生抑制は、強い細胞増一方, 黄連は増強傾向を示した. 黄連の最終濃殖抑制効果によるものと考えられる（結果省略）.
制は、強い細胞増殖抑制効果によるものと考えられる（結果省略）.

図 2 生薬は ATL 細胞の HTLV-I プロウイルス活性化を制御する生薬抽出液を最終濃度 5µg/ml で ATL 細胞の培養に添加し、2 日後の培養上清中の p24 の濃度を ELISA にて測定した. 平均±標準誤差 (n=***; p＜0.001(対照).

HTLV-I の感染様式は通常のウイルス感染とは異なり, フリーのウイルス粒子が直接正常細胞へ感染するので
図 2 生薬は ATL 細胞の HTLV-I プロウイルス活性化を制御する

図 2 生薬は ATL 細胞のHTLV-I プロウイルス活性化を制御すると非感染細胞同士の接触によると考えられている.
その際に使われる表面分子の一つがgp46 であるため,生薬生薬抽出液を最終濃度 5µg/ml で ATL 細胞の培養に添加し、2日後の培養上清中の p24 の濃度を ELISA にて測定した.
平均±標準誤差
生薬抽出液を最終濃度 5mg/ml で ATL 細胞の培養に添加し、2 日後の培養上清中の p24 の濃度を ELISA にて測定***; p＜0.001(対照).
した . 平均±標準誤差(n=3).
現が制御されることからATL 細胞の感染性にも影響が及んでいるかを検討した. ATL 細胞株と非感染 T 細胞株***; p ＜ 0.001( 対照 ).

比で 1HTLV-I
日混合培養し合胞体を形成させ,その形成に対する効果を評価した（図３）.
その結果, 図１において gの感染様式は通常のウイルス感染とは異なり,フリーのウイルス粒子が直接正常細胞へ感染するみられた黄連では、おびただしい数の合法体形成が見られた.
一方, gp46 の発現抑制がみられた生姜,
丁子でHTLV-I の感染様式は通常のウイルス感染とは異なり, フリーのウイルス粒子が直接正常細胞へ感と非感染細胞同士の接触によると考えられている.
その際に使われる表面分子の一つがgp46 であるため,染するのでは無く, 感染細胞と非感染細胞同士の接触によると考えられている . その際に使われる表とんど確認されなかった.
現が制御されることから ATL 細胞の感染性にも影響が及んでいるかを検討した. ATL 細胞株と非感染 T 細比で 1 日混合培養し合胞体を形成させ, その形成に対する効果を評価した（図３）. その結果, 図１においみられた黄連では、おびただしい数の合法体形成が見られた. 一方, gp46 の発現抑制がみられた生姜, 丁
とんど確認されなかった.

図 3 生薬は ATL 細胞の感染性を制御する

図 3 生薬は ATL 細胞の感染性を制御する
生薬抽出液を最終濃度 5µg/ml で添加し, ATL 細胞株と非感染 T 細胞株Jurkat を 1:1 の比で 1 日混合培養し合胞体を形成させた.
生薬抽出液を最終濃度 5mg/ml で添加し , ATL 細胞株と非感染 T 細胞株 Jurkat を 1:1 の比で 1 日混合培養し合胞体を形成させた .

以上の結果から、生薬抽出液のうち生姜, 丁子, 大黄（結果省略）に HTLV-I の活性化抑制効果が得られるこ
図 3 生薬は ATL 細胞の感染性を制御する－ 92 －には強い活性増強効果が得られることが明らかとなった.

生薬抽出液を最終濃度 5µg/ml で添加し, ATL 細胞株と非感染 T 細胞株Jurkat を 1:1 の比で 1 日混合培養し合胞体を形成させた.

HIV-1 潜伏感染細胞である U1 細胞に麻黄湯、補中益気湯、十全大補湯、人参養栄湯で、p24面分子の一つが gp46 であるため , 生薬によって gp46 発現が制御されることから ATL 細胞の感染性にも影響が及んでいるかを検討した . ATL 細胞株と非感染 T 細胞株 Jurkat を 1:1 の比で 1 日混合培養し合胞体を形成させ , その形成に対する効果を評価した（図３）. その結果 , 図１において gp46 の発現増強がみられた黄連では、おびただしい数の合法体形成が見られた . 一方 , gp46 の発現抑制がみられた
生姜 , 丁子では合胞体形成はほとんど確認されなかった .
以上の結果から、生薬抽出液のうち生姜 , 丁子 , 大黄（結果省略）に HTLV-I の活性化抑制効果が得られること、対照的に黄連には強い活性増強効果が得られることが明らかとなった .
HIV-1 潜伏感染細胞である U1 細胞に麻黄湯、補中益気湯、十全大補湯、人参養栄湯で、p24 発現細胞の増加が認められたという報告（Murakami T et.al. Biol Pharm Bull. 2008 Dec;31(12):23347.）もあり , レトロウイルスである HTLV-I への生薬成分の直接作用も多岐にわたると考えられる .
HTLV-I Tax の発現制御には NF-kB が関わっているとの知見（未発表）もあり , Murakami らの報告とも一致する . HTLV-I キャリアにはプロウイルス活性化抑制効果の高い生薬成分が有効と考えられるが , 治療を視野にいれる場合 , HTLV-I 感染細胞の抗原性を上げる黄連は , LAT-27 抗体の投与による抗体療法や細胞傷害活性に基づく免疫療法を行う際にはむしろ有効な手段となる可能性も秘めている.

■結論
これまで , HTLV-I 感染細胞に生薬成分が直接作用する報告は殆ど無かった . 今回 , 生姜 , 丁子 , 大黄 , 黄連といった生薬に強い HTLV-I のプロウイルス活性を制御する作用が明らかとなった .

今後はこれらの生薬成分がどのようにして HTLV-I プロウイルスの活性化を制御しているかの分子メカニズ
ムを明らかにすることによって , 今後の漢方方剤選択における基盤が形成されるものと考えられる .
今回の結果から , これらの生薬成分 , または生薬成分を含む漢方方剤の in vivo での解析をすることに大きな可能性が得られた .

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