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モダンメディア

61 巻 8 号 2015［臨床検査アップデート］

臨床検査アップデート 1

Up dateメラノーマにおける

V600変異の検出

Detection of BRAF V600 in melanoma
うはら宇 原

ひさし

Hisashi UHARA

久行した症例に対する治療薬の効果は限られていた。

はじめにしかし、2011 年以後、高い有効性を示す新薬が続々と登場し始め、メラノーマの治療が大きく変わって2014 年 12 月にコンパニオン診断薬「コバス BRAF®

きた。

V600 変異検出キット」が根治切除不能な悪性黒色メラノーマの最も重要な誘因は紫外線であり、前腫患者に対する検査法として承認され、本年 2 月よ

述のように白人が最もその影響を受けている。皮膚り発売された。ほぼ同時に発売された BRAF 阻害にある程度の色素をもつ黄色人種や黒人では紫外線剤ベムラフェニブは進行した悪性黒色腫に対する初によるメラノーマの発症は白人に比べて少ない。日めての分子標的薬であり、これまでの標準薬であっ本人のメラノーマの半数を占める手足指趾の発症例

たダカルバジンの 10％に対して数十％と高い奏効は外傷と関連している可能性がある。

率を示し、生存期間の延長も望める。しかし、BRAFメラノーマは予後の悪い疾患として知られている阻害剤は BRAF 変異のある患者のみに有効性を発が、早期病変であれば切除のみで完治が望める。本

揮する薬剤であるため、BRAF 変異の検出は根治切腫瘍の予後因子は原発巣の厚みと病理組織学的な潰除不能なメラノーマ患者の治療薬を決める際に必須

瘍の有無、所属リンパ節転移の状態、原発巣と所属の検査となる。本稿では、メラノーマの疫学、メラリンパ節領域の間の皮膚皮下転移の有無、遠隔転移ノーマと BRAF の関係、コバス BRAF V600 変異検の有無と血清 LDH 値である。特に原発巣の厚みと出キットの概要と検査の注意点、BRAF 阻害剤の有潰瘍の有無が予後因子として重要であり、水平方向効性について解説する 。にどれだけ大きくても薄い病変の予後は良好であり、®

1）

厚みが 1mm 以下で潰瘍がないときの 5 年生存率はⅠ. メラノーマとは96％である。逆に 1cm 大の小型の病変でも、厚みが4mm 以上で潰瘍があれば 5 年生存率は 61％に下がメラノーマはメラノサイトの悪性腫瘍である。本る 。所属リンパ節転移や in transit 転移（原発巣か邦における年間新規発症例は 10 万人あたり 1 - 2 人ら所属リンパ節までの皮膚軟部組織転移）がある場程度である。メラノーマは表皮内癌と悪性リンパ腫

合は 39 -74％、遠隔転移は 21％である。白人に比べを含めた皮膚悪性腫瘍全体の 10％と皮膚がんのなて日本人では初回診断時の進行例が多い。

2）

かでも稀少であるが、皮膚がんによる死亡者の半数

メラノーマは放射線に対する感受性が低いため、弱はメラノーマによる。白人に多い疾患であり、豪脳転移に対する定位放射線療法（ガンマナイフなど）

州のクイーンズランドでは年間 10 万人あたり数十や脊髄や骨転移による神経症状や痛みに対する緩和名の患者が発生している。また米国では年間約 6 万的な目的に限られる。また、殺細胞性抗がん剤による人の患者が発生し、約 9000 人が死亡しており、白治療については、過去数十年間さまざまなレジメンが人においては重要な位置を占めている疾患である。

試されてきた。しかし奏効率は上がっても生存期間

メラノーマは転移を起こしやすい腫瘍であるが、進はダカルバジン単剤を超えることはできなかった。

信州大学医学部 皮膚科学教室 准教授〠390 - 8621 長野県松本市旭 3 - 1 - 1

Department of Dermatology, Shinshu University School of Medicine(3-1-1 Asahi, Matsumoto, Nagano)（ 18 ）

239

国人のデータとも似ており、黄色人種における変異Ⅱ. メラノーマの遺伝子変異率と理解してよいと思われる 。黄色人種のメラノー6）

マの BRAF 変異率が白人に比べて低いのは、BRAF
さまざまな研究の中で最も注目されたのは Mitogen-

変異の多い表在拡大型（SSM）が黄色人種では少な

activated protein kinase（MAPK）経路である（図 1）。

く、BRAF 変異がまれな末端黒子型の比率が高いこ

メラノーマの 90％に MAPK 経路の活性化が起きてとによる。

おり、白人のメラノーマ数十％程度に BRAF 変異が

V600E は、年齢が若く、体幹や四肢（手掌足底を認められる 。BRAF 変異の 90％はコドン600 のバリン除く）に発症した症例に高頻度に認められる。黄色（V）がグルタミン酸（E）に変わる点突然変異（V600E）

人種においてもこの傾向は同じで、われわれの検討で、この変異によって活性化された BRAF が MAPK

でも BRAF 変異を認める症例はそうでない症例よ経路を活性化させて異常な細胞増殖を惹起する。

り中央値で 20 歳程度若く、被髪頭部、体幹下肢のBRAF 変異には V600E 以外に、
V600K , V600D, V600R発症例が多かった。一方 V600K は男性、高齢者にも認められ、同様に BRAF の活性を上げる作用を持多いと報告されている。

3）つ。BRAF の上流に位置する NRAS については、白Ⅲ. BRAF 変異の検出

人では 15 - 30％に変異があり、変異の存在部位はエクソン 1（コドン 12, 13）とエクソン 2（コドン 61）である。さらに上流にある KIT にも数％程度の変異が遺伝子検査にはさまざまな分子生物学的手法が存認められる。MAPK 経路以外では PI3K/AKT/mTOR在するが、ここでは BRAF 変異の検出を例に、ルーの経路もメラノーマの増殖にかかわっている。これ

チンに利用されているホルマリン固定パラフィン包らの分子や下流の CDK4/6 などに対して多数の薬剤埋組織（FFPE）を用いた方法について解説する。なが開発され、臨床試験が行われている。

お、ホルマリン固定から HE 染色標本の作製までは、上記の変異率に関するデータは白人のものであ通常の病理標本の作成過程と同じであり、実際は分る。われわれの検討では、日本人患者における BRAF

子標的薬の使用を検討する際に、保存してあった

変 異 率 は 25 - 30 ％（ 内 95 ％ は V600E、残 り 5 ％ がFFPE 組織を用いて遺伝子検査を行うことになる。

V600K）、NRAS の変異は 7-10％、c-KIT の変異は数％

遺伝子検査に用いる検体は、メラノーマの原発巣。この値は中または転移巣の FFPE 組織から薄切切片を作製し、であり、白人に比べて低率であった

4, 5）受容体型チロシンキナーゼ
KIT, MET

NRAS
NRAS/MAPK経路

PI3K

BRAF
MEK

PIP2

PIP3
PTEN

ERK
AKT
P16

Cyclin D
CDK4/6mTOR

RB1
G1期→S期
MDM2

P53

増殖や生存

図 1 MAPK経路とその他のシグナル伝達経路（ 19 ）

PDK1

240

スライドガラスに載せたものを用いる。ヘマトキシ

繰り返しになるが、遺伝子変異の検査に用いる検リン・エオジン（HE）染色標本を参照し、遺伝子変体は、ホルマリン固定パラフィン包理（FFPE）組織異の検出に最も適した（固定不良がなく、なるべくから切り出した標本である。したがって、将来の転壊死が少なく、腫瘍細胞の多い）ブロックを選ぶ。

移に備え、遺伝子変異の検索に適した DNA を抽出

これは、腫瘍以外の組織や細胞が多く混入すると、することを前提に手術検体の適切な固定や保管が極目的とする変異遺伝子が正常の遺伝子（野生型）にめて重要である。特に組織の固定時に脱灰操作を行よって薄められ感度が下がってしまうためである。

うと DNA が劣化し、変異の検出ができなくなる。脱HE 染色標本を見ながら薄切無染色標本の腫瘍部分灰する可能性が高い爪のメラノーマは日本人に多いにマーキングしておき、マーキングに沿って腫瘍部病型であるため、とくに注意が必要である。骨を含分を徒手的に削り取る。

む手術検体は、軟部組織と骨を離して別々に処理し体細胞遺伝子変異の検索方法としては、主にダイなければならない。今後、多くの分子標的薬が使えレクトシークエンス法と real-time PCR 法などが用るようになれば、アジュバント療法や再発時の薬剤いられている。
ダイレクトシークエンス法（サンガー選択に際し、BRAF に限らず複数の遺伝子検査が必法など）は目的のエクソン部分を PCR で増幅し、須となる可能性がある。したがって初回の手術検体

PCR 増幅産物について直接塩基配列を明らかにし、は適切に固定し、大切に保管されなければならない。

得られた解析波形チャートから専用のソフトウエア

Ⅳ. BRAF 変異がある患者に対する治療薬で変異を検出する。サンガー法による変異の検出感度は 10 - 25％以上である。real-time PCR 法は目的遺伝子の変異部位をデザインしたプライマーと蛍光BRAF V600 に変異があれば BRAF 阻害剤（ベムプローブを用いて解析する。特定の変異を高感度かラフェニブ）と MEK 阻害剤（本邦未承認、臨床試

つ迅速に検出することが可能で、さまざまな方法が験中）の効果が期待できる。米国で最初に認可され実用化されている。変異の検出感度は前述のサンガー

たのがベムラフェニブである。2011 年に報告され法より高い。real-time PCR 法を用いた V600E の検たダカルバジンとの比較試験で、奏効率 48％対 5％、査キット［cobas 4800 BRAFV600 Mutation kit（ベム無増悪生存期間（PFS）中央値 5.3 カ月対 1.6 カ月だっラフェニブ用）、The THxID -BRAF test（dabrafenib7）た 。免疫チェックポイント阻害剤の ipilimumab に用））が対応する BRAF 阻害剤の承認に合わせて米続いて、ダカルバジンを上回る生存期間の延長効果®

国 FDA に認可され、本邦でも本年 2 月にコバスが確認された試験結果であった。V600E と V600K

BRAF V600 変異検出キットが承認された。データに分けた解析も行われており、臨床効果に差がな

シートによれば本検出キットの検出感度は 5％以上かったと報告されている 。また、効果発現までにであり、サンガー法よりも高感度であり、V600E 以かかる期間の中央値はベムラフェニブ群で 1.4 カ月、外の V600K, V600D も検出できる。

ダカルバジンで効果が得られずベムラフェニブに®

®

8）ある薬剤の使用に際して、最も効果が期待できる

cross over した群では 3 カ月と報告されている。つ

患者を選択するための検査を「コンパニオン診断」

まり BRAF 阻害剤の効果の発現は早い。2 番手としという。BRAF 阻害剤のベムラフェニブに対してはて登場した dabrafenib もダカルバジンとの比較試験

V600E の変異を確認するためのコンパニオン診断（BREAK-3）
で、PFS 中央値が dabrafenib 5.1カ月、ダ薬としてコバス BRAF V600 変異検出キットが開発

カルバジン 2.7 カ月と有意差を認めた 。Dabrafenib

され、ベムラフェニブと対で承認された。このよう10）は、脳転移にも効果があることが報告されている 。に、最近では臨床試験の段階から、コンパニオン診また 3 番手の BRAF 阻害剤である encorafenib（LGX断薬を準備して対象患者を選別する傾向がある。前818）については日本を含む世界同時治験が進行中

述のように遺伝子変異の検出法にはさまざまな手法である。

®

9）があり、検出感度にも差が存在する。このため現在

BRAF の下流（図 1）に存在する MEK を阻害するは薬剤とセットになったコンパニオン診断薬による薬剤としては、trametinib が 2013 年、米国 FDA に認変異検出が薬剤の使用条件になっている。

可された。trametinib 単剤での奏効率は 20％程度で、（ 20 ）

241

表 1 メラノーマに対する BRAF 阻害剤と MEK 阻害剤の併用試験
薬剤

症例数

無増悪
生存期間（月）

奏効率（％）

Dabrafenib + trametinib対 dabrafenib
2012
Dabrafenib + trametinib
Dabrafenib
2014
Dabrafenib + trametinibDabrafenib

5454

75.9
53.7

9.4
5.8

211
212

6751

9.3
8.8

Vemurafenib + Cobimetinib対Vemurafenib
Vemurafenib + Cobimetinib
Vemurafenib

247
248

68
（CR : 10）45
（CR : 4）9.9
6.2

Dabrafenib + trametinib対 vemurafenib
Dabrafenib + trametinib
Vemurafenib

352
352

6451

11.4
7.3

Vemurafenib + Cobimetinib（phase 1）
Vemrafenibで悪化した症例
未治療例

6663

1587

2.8
13.7

Dabrafenib + trametinib
Dabrafenib 単剤で進行した症例

45133.6

BRAF 阻害剤に比べて低く、また、BRAF 阻害剤にBRAF 変異がある場合はベムラフェニブかニボルマ。したがっブか殺細胞性抗がん剤となる（イピリムマブは発売て、単剤としての利用価値は乏しい。しかし BRAF前）。いずれにしろ、何らかの全身療法が必要になっ阻害剤と併用すると奏効率が上がり、BRAF 阻害剤た場合は BRAF 変異の有無を確認することが必須での副作用である皮膚腫瘍の発生が減る。BRAF 阻害ある。

耐性となった症例に対する効果は低い

11）剤 dabrafenib に MEK 阻害剤の trametinib を併用しおわりにた臨床試験が行われ、奏効率は単剤の 50％から併用で 70％に上がり、奏効期間も延長した。ベムラ

11）フェニブと cobimetinib の併用についても、ベムラ

世界的には 2011 年から、本邦でも 2014 年より進

フェニブ単剤に対して奏効率と PFS 中央値共に併行したメラノーマ患者に対する新薬が続々と登場し。ただし、dabraf-てきた。薬剤の選択の際には標的分子の遺伝子情報

enib/trametinib、ベムラフェニブ /cobimetinib の両を調べる必要がある。メラノーマ治療にもやっと個別方ともまだ全生存期間についてのデータが出ていな化医療の時代が来たことになる。今後は効果を予測い。なお、BRAF 阻害剤単剤での治療に耐性を示しする検査や薬剤の選択法を確立していく必要がある。

用効果が確認されている8, 12 ～ 14）た患者に対するセカンドラインとして BRAF 阻害剤に MEK 阻害剤を併用した場合の効果は低い

15 ～ 17）（表 1）。
BRAF 変異の有無にかかわらず有効性が確認されている薬剤は腫瘍免疫を作動させる抗体薬であり、イムノチェックポイント阻害剤と呼ばれている、本邦では 2014 年 7 月に抗 PD-1 抗体であるニボルマ
ブと 2015 年 7 月に抗 CTLA - 4 抗体であるイピリムマブが承認された。これらの抗体薬は BRAF 阻害剤にくらべて奏効率は低いが、効果持続期間が長いという特徴をもっている。BRAF 変異がない場合に本邦で使用できる治療薬（2015 年 8 月現在）はダカルバジンなどの殺細胞性抗がん剤かニボルマブで、（ 21 ）

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（ 22 ）