News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

日本ゲノム微生物学会
ニュースレター
遊泳する『最小の』細菌を作り出すことに成功
木山 花 1、柿澤 茂行 2、笹嶋 雄也 1、田原 悠平 1,3、宮田 真人 1,31) 大阪公大・理、2) 産総研・生物プロセス、3) 大阪公大・複合先端

らせん形状と遊泳運動の再現に成功
スピロプラズマの７つのタンパク質を合成細菌 syn3 にて発現させることで、細胞がらせん形状になり遊泳することを発見した。また 2 つの MreB のみの発現でも、らせん形状と遊泳が再現された。

スピロプラズマは、細胞壁がないことや小さなゲノムを持つことで知られるマイコプラズマに近縁な細菌で、らせん形状の細胞を形成し、らせん方向を反転して反転部より後ろ側の細胞を回転させることで遊泳する。今回、スピロプラズマが持つ 7 つの遺伝子を合成細菌 syn3 にて発現させることで、球状の細菌がらせん形状になり、回転して遊泳することを発見した。つまり、らせん形状と回転遊泳運動を再現することに成功した。加えて 7 つの遺伝子のうち、2 種類のアクチンホモログ（MreB）のみを発現させても、らせん形状と遊泳運動が再現されることが分かった。合成細菌 syn3 は、米国ベンター研究所で作られた「最少の遺伝子を持った細菌：ミニマルセル」であり、増殖以外の機能を持たないと考えられている。今回の成果は、たった 2 つの遺伝子をミニマルセルに追加することで「細胞形状と遊泳運動という高次の機能」を再現できた、驚くべき結果と考えている。
歩く、泳ぐ、飛ぶなど「運動」の起源は、細胞の運動にまで遡ることができると考えられているが、ではその「細胞運動」はどのように進化してきたのだろうか。本研究グループは、ATP 合成酵素やヘリカーゼなどの生命を維持する装置の動きが細胞の外に伝わることが細胞運動の起源であるという仮説を提唱してきた。MreB は動物の筋肉などを構成するアクチンのホモログで、多くの細菌にも存在しているが、スピロプラズマ以外の細菌ではペプチドグリカン層を正しい形に作る役割を担っている。今回の成果は、たった 2 つの遺伝子をミニマルセルに追加することで細胞全体の回転遊泳運動が生じたことを示しており、「細胞内のタンパク質が起源となった細胞運動」の実証例と言える。
発 表 論 文：Hana Kiyama, Shigeyuki Kakizawa, Yuya Sasajima, Yuhei O Tahara, Makoto Miyata. Reconstitution of a minimal motility
system based on Spiroplasma swimming by two bacterial actins in a synthetic minimal bacterium. Science Advances 8(48):eabo7490, (2022).
doi:10.1126/sciadv.abo7490

1

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2023 年 1 月 11 日

細菌代謝機構の病原性や抗菌薬感受性への関与
港 雄介
藤田医科大学医学部
１．はじめに微生物学講座受け入れてもらった。正直に言うと希望順位としては低私は 2008 年に博士号を取得した直後に渡米し、現所い研究室ではあったが、米国滞在ビザの期限が迫ってい属先に着任するまでの 11 年間、博士研究員として米国でたのと Mekalanos 先生の研究手法の一端でも学べればと過ごした。予定以上に長期の留学となってしまったが、 思い決断した。
振り返れば試行錯誤を重ねながら研究者として生涯取り

Häse 先 生 は Mekalanos 研 究 室 に 所 属 し て い た 当 時、組んでいきたいと思える研究テーマを見つけることが出ToxT の発現を制御する膜結合転写調節因子である TcpP

来た貴重な時間であった。本稿では、私が米国で現在のを発見している (1) 。 Häse 先生はさらに、Mekalanos 研

研究テーマを確立した経緯を簡単に振り返りながら、細究室でコレラ菌の toxT::lacZ レポーター株からトランスポ

菌代謝機構に注目してこれまで展開してきた私の研究に

ゾン変異株を作製し、toxT の発現が変化した株の同定し、ついて簡単に紹介させて頂く。

ナトリウム輸送性 NADH- ユビキノン酸化還元酵素（NQR）
遺伝子のトランスポゾン変異株で toxT 遺伝子の発現上昇が見られることを見出している (2)。

２．コレラ菌の代謝機構と病原遺伝子発現制御
大学院時代の私は、細菌の薬剤耐性機構について研究

NQR は、ミトコンドリア呼吸鎖では複合体 I に、大腸を行っていた。しかし良い業績を挙げることができなかっ

菌呼吸鎖では Nuo に相当する。複合体 I も Nuo も共通して、そこでしかたなく、指導教員に勧められた米国の研究室出されるが、NQR はプロトンではなくナトリウムを排出たため、希望していた研究室への留学が叶わなかった。 NADH- ユビキノン酸化還元反応と共役してプロトンが排に留学した。しかし実際に行ってみると、発表論文の元データが怪しいなど色々問題がある研究室であった。
このままここにいたら先が危ないと思った私は、これまでの研究に捉われず様々な論文を読み、新たなポスドク先を探した。ここで様々な分野の研究に触れたことはその後の研究者人生の大きな糧となった。そして多くの研究分野の中で特に、コレラ菌研究の第一人者である John Mekalanos 先生（Harvard 大学）の研究に強く興味を惹かれた。コレラ菌はヒトの腸管でコレラ毒素を産生し、激しい下痢を引き起こす。コレラ毒素遺伝子の発現は、ToxT という転写調節因子によって制御されている。コレラにおける Mekalanos 先生の大きな業績の一つは、ToxT を含むコレラ毒素遺伝子の転写を調節しする。私は NQR の存在を知り、細菌呼吸鎖にそのような大きな多様性があることに衝撃を受けた。NQR がきっか
けでコレラ菌の代謝機構に興味を持った私は、代謝機構に特に注目して解析を進め、コレラ菌の TCA 回路遺伝子
破壊株において toxT 遺伝子の発現に変化が見られることなどを見出し、代謝機構がコレラ毒素の産生制御と密接に関連していることを明らかにした (3)。一連の研究を通じて私はコレラ菌の代謝機構について専門性が高まっていったのだが、モデル生物に比べコレラ菌の代謝機構には不明な点が多くあることに気が付いた。そこで他の病
原細菌についても代謝機構に注目して文献を調べていったのだが、他の病原細菌でも同様に代謝機構に関しては未解明な点が多かった。ちょうどそのころ、総説でも病ている一連の転写因子カスケードを明らかにした事で原細菌の代謝機構について取り上げられているものが増Mekalanos 先生の研究室に行くことは叶わなかった。そこ注目した研究の将来に大きな可能性を感じ、自分の専門ある。しかしコレラ菌の研究経験もなかった私は結局、 えてきていた (4,5)。そこで私は、病原細菌の代謝機構にで私は Mekalanos 門下生のラボに片っ端から応募し、米国 Oregon State University の Claudia Häse 先生の研究室に

2

分野にしようと決めた。

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３．結核菌の代謝機構

2023 年 1 月 11 日

あり、様々な葉酸代謝拮抗薬が臨床で使われている。し病原細菌の代謝機構を自分の専門分野としようと決め

かし、結核菌はほとんどの葉酸代謝拮抗薬に対して自然た私は、結核菌を研究対象に選んだ。理由として、結核耐性を示す。PAS は結核治療に使用される唯一の葉酸代菌のユニークな代謝機構に興味を惹かれたことが大きい。 謝拮抗薬であるが (9)、PAS の結核菌に対する抗菌活性は
結核菌は自然宿主である哺乳動物以外の環境中からは、 他の抗結核薬に比べると弱く、その使用は治療薬の選択
ほとんど検出されない。結核菌は、哺乳動物との長い共が困難な多剤耐性結核の治療に限定されている。結核菌

生の歴史を通じて、哺乳動物生体内環境に適応する能力が何故多くの葉酸代謝拮抗薬に対し自然耐性を示すのかを進化させてきたと考えられている。例えば、多くの細は、未解明であった。

菌は複数の炭素源が利用可能な環境においてカーボンカ

多くの葉酸代謝拮抗薬の活性は、PABA を培地中に添

タボライト抑制（Carbon Catabolite Repression; CCR) によ

加することで阻害される事が知られていた。PABA は結り、自身が効率的に利用できる炭素源一種類を優先的に核菌の菌体内でも生合成されているので、私たちは結核

代謝し、他の炭素源代謝は抑制している (6)。この機構は、 菌の PABA 生合成を阻害し菌体内の PABA 濃度を低下さ
他の細菌種と炭素源を競合的に獲得する必要がある環境せることで、結核菌の葉酸代謝拮抗薬の効果を増強でき下における炭素源獲得に有効な機構であると考えられる。 ないかと考えた。そして予想通り、PABA 生合成に関与
これに対し結核菌は、カーボンカタボライト抑制機構をする遺伝子である pabC の遺伝子変異株は、最小発育阻止有しておらず、複数の炭素源を同時に代謝することがで濃度（MIC）で調べた場合 PAS に対して 1000 倍感受性がきる (7)。このことは、共生する他の細菌種が存在しない

増大していた (11)。さらに、結核菌に対する MIC が高い

宿主細胞内の環境において、結核菌が効率よく炭素源をため結核治療には用いられないスルファメトキサゾール

代謝するために独自の進化を遂げたと考えられている。 （SMX）やダプソン（dapson）に対しても、それぞれ 8 倍
このような高病原性細菌として特化された代謝機構に、 と 512 倍の感受性の増大が見られた。結核菌は、ペプチ
ドグリカン層の外側にアラビノガラクタン層、さらにそ

私は研究対象として強い魅力を感じた。

4．結核菌の葉酸代謝拮抗薬に対する自然耐性メカ
ニズムの解明私 は 2013 年 に Anthony Baughn 先 生（University of
Minnesota）の研究室に移り、結核菌の研究を開始した。
私が最初に取り組んだのは、結核菌の葉酸代謝経路を標的とするパラアミノサリチル酸（PAS）という抗結核薬に関する研究であった。PAS は 1940 年代に開発された非常に古い薬だが、近年までその作用機序は明らかにされていなかった。PAS は葉酸合成の前駆体であるパラアミ
ノ安息香酸 (PABA) に水酸基が結合した構造である（図１）。PAS は PABA の代わりに結核菌の葉酸代謝経路に取り込まれ、水酸化ジヒドロ葉酸に変換される。この水酸化ジヒドロ葉酸がジヒドロ葉酸還元酵素を阻害すること
でテトラヒドロ葉酸の合成を阻害するというメカニズムが近年明らかにされた (8-10)。少し話は逸れるが、PASは結核菌以外には無効な抗菌薬であり、大腸菌は PAS
図１. 葉酸代謝拮抗薬の作用機序
Abbreviations: GTP, guanosine-5-triphosphate; DHPPP,
7,8-dihydropterin pyrophosphate; PABA, Glu, glutamate; DHPte,
dihydropteroate; DHF, dihydrofolate; THF, tetrahydrofolate.

を PABA の代わりに葉酸生合成の先駆体として利用してしまう。
細菌葉酸生合成経路は抗菌薬の有効な標的の一つで3News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日の外側にミコール酸を主要成分とする外膜で構成された細胞壁を有しているため、結核菌の薬剤に対する自然耐性は薬剤透過性の低さに起因すると信じられている。しかし以上の結果から、結核菌の葉酸代謝拮抗薬に対する自然耐性については、PABA 生合成系が主な要因であることを明らかにすることができた。
私たちは次に、大腸菌の PABA 生合成系を阻害する抗菌化合物 MAC173979 (12) が、結核菌に対しても PABAの生合成を阻害することで抗菌活性を示すことを確認した (11)。私たちは、pabC の遺伝子変異株が葉酸代謝拮
抗薬に対し超感受性化することから、PABA 生合成系を標的とする MAC173979 は葉酸代謝拮抗薬と組み合わせることで強い相乗効果を示すと予想したが、予想は外れ
MAC173979 と PAS を組み合わせても強い相乗効果を示さなかった (11)。そこで次に私は、なぜ MAC173979 とPAS は強い相乗効果を示さなかったのかを明らかにすべく、大腸菌を用いて葉酸代謝拮抗薬の相乗効果発揮メカ
ニズムについて研究を進めた。

図２. 葉酸代謝拮抗薬の作用点と相互作用
抗 菌 薬 の 相 互 作 用 は Fractional Inhibitory Concentration Index（FICI） に よ っ て 判 定 し た。FICI = ([MIC drug A in presence ofDrug B] [MIC of drug A]-1) + ([MIC of drug B in the presence of drug
A] [MIC of drug B]-1). FICI が 0.5 以下を示した場合、薬剤の組み合わせは相乗効果を示すと判定した。

ず、SMX と TMP のように相互に作用を増強することができないと考えられる。同一の生合成経路を標的とする抗菌薬の組み合わせ、例えば細胞壁合成を標的とする抗５．細菌葉酸生合成経路と抗菌薬の相互作用
葉酸代謝拮抗薬の中で SMX とトリメトプリム（TMP）
は、組み合わせることで強い相乗効果を示す。私たちは大腸菌を用いて、PABA の生合成を阻害する MAC173979と、PAS と同じくジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する TMPの併用効果を調べたところ、結核菌における MAC173979と PAS の組み合わせと同様、この組み合わせは相乗効果を示さなかった（図 2）(13)。なぜ葉酸代謝拮抗薬は、薬剤の組み合わせによって相乗効果を示したり示さなかったりするのかと考えながら葉酸代謝経路を眺めていたところ、葉酸代謝経路はプリン生合成経路を介して下流から上流に繋がっていることに気が付いた。このことから
私は、作用点が SMX よりも葉酸代謝経路の下流に位置す
る TMP が、プリン生合成経路を介して葉酸代謝経路の上流の代謝フラックスを減弱し、SMX の効果を増強していることを突きとめた。これまでに SMX が下流への代謝フ
ラックスを減弱する事で TMP の効果を増強することは知られていたことから、SMX と TMP は互いにその効果を増強し合うことで相乗的に葉酸代謝経路のフラックスを阻害しているというメカニズムを明らかにすることができた (13)。SMX と TMP の相乗効果メカニズムから、結核 菌 に お け る MAC173979 と PAS の 併 用 に お い て は、
MAC173979 による PAS の一方的な効果増強しか起こら4

菌薬を併用した場合などにおいても、相乗効果を示す組
み合わせと示さない組み合わせがある。現在は他の生合成経路を標的とする組み合わせについても、SMX と TMPと同様に相互増強作用によって相乗効果を示しているものもあると考え、現在解析を進めている。

６．結核菌必須遺伝子のゲノムワイドな解析
三年前に米国から帰国し現所属先に着任した私は、結核菌やその類縁菌である非結核性抗酸菌を対象に、新規抗菌薬の創薬標的同定を目指した研究を主に実施している。抗菌薬の創薬標的とはすなわち細菌必須遺伝子であるため、必須遺伝子の同定とその機能解析をおこなっている。
結核菌の必須遺伝子に関する研究は、トランスポゾン
挿入変異株ライブラリーを次世代シーケンシングで網羅的に解析するトランスポゾンシーケンシング法（Tn-Seq法）が確立された事によって、飛躍的に進んだ (14)。当初は解析を独自に行わなければならず難易度が高かったが、TRANSIT というソフトウェアが公開されてからは解析も非常に簡便となった (15)。これまでは、in vitroと in vivo を含む様々な条件によって必須遺伝子群がどのように変化するかといった研究が主に行われてきたがNews Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

(14,16,17)、近年は Lineage が異なる株間での株間必須遺は、“You can’t connect the dots looking forward; you can

伝子の比較にまで研究が進んでいる (18)。

only connect them looking backward. So you have to trust

必須遺伝子の機能解析については、2016 年に Bacillus

that the dots will somehow connect in your future. You have tosubtilis を対象として CRISPRi (19) を用いた必須遺伝子のtrust in something — your gut, destiny, life, karma, whatever.

網羅的な遺伝子ノックダウン解析が行われている (20)。 This approach has never let me down, and it has made all the
そこで私も結核菌に CRISPRi を適用しようと試みたが、 difference in my life.” とメッセージを送っている（https://
広く用いられている Streptococcus pyogenes 由来の Cas9 がnews.stanford.edu/2005/06/12/youve-got-find-love-jobs-

結核菌に対して毒性を示したため、用いることが出来な

says/#:~:text=Again%2C%20you%20can't%20connect,%2C%20

かった。しかし 2017 年、現在ロックフェラー大学で研life%2C%20karma%2C%20whatever.）。このスピーチに私は究室を主宰されている Jeremy Rock 先生が、Streptococcus

強く感銘を受け、その時に一番面白いと思える研究をし、

thermophilus 由来の Cas9 が結核菌に対しての毒性が少な得られた研究結果を必ず過去の結果と併せて振り返り、い事を見出し、結核菌において本菌由来の Cas9 を用いた

過去の結果とどのように繋がるのかを考えることを実践

CRISPRi 遺伝子ノックダウン法を確立された (21)。Rockしてきた。この方法を実践してからは、将来の事をあま先生はすでに、結核菌のほぼすべての遺伝子をカバーすり悩まずに目の前の面白いことに専念できるようになっる 96,700 の sgRNAs を独自に設計し、各 sgRNA の相対量たように思うし、ネガティブなデータが得られても将来を次世代シーケンシングによって測定する方法を用いて、 の結果といつか繋がるだろうと思うので、研究者人生が結核菌必須遺伝子のゲノムワイドな機能解析を進めていより楽しくなった。

る (22)。ちなみに結核菌とその類縁菌を対象に Rock 先生がデザインした sgRNA 配列の情報と解析結果は、ウェブ上で公開されている（https://pebble.rockefeller.edu/tools/

引用文献

1) Hase CC. and Mekalanos JJ., Proc Natl Acad Sci U S A., 95:
730-734 (1998)
sgrna-design/）。これらの Tn-Seq 法や CRISPRi 法は米国で
2) Hase CC. and Mekalanos JJ., Proc Natl Acad Sci U S A., 96:
確立された手法であるが、将来的には本学会の先生方と183-3187 (1999)
共同して新しいツールを開発し、本研究分野においても
3) Minato Y. et al., Microbiology.,59: 792-802 (2013)
日本独自の革新的な研究手法を提示していきたいと思う。 4) Eisenreich W. et al., Nat Rev Microbiol., 8: 401-412 (2010)現在私たちは Tn-Seq 法や CRISPRi 法を用いながら、 5) Rohmer L. et al., Trends Microbiol., 19:341-348 (2011)
結核菌必須遺伝子の中から生存に必須な役割に加え、薬 6) Gorke B. and Stulke J., Nat Rev Microbiol., 6: 613-624(2008)
剤耐性や病原性にも関与する遺伝子の特定を進めている。
7) de Carvalho LP. et al., Chem Biol., 17: 1122-1131 (2010)
このような遺伝子を標的とすることで、他の抗菌薬との8) Chakraborty S. et al., Science., 339: 88-91 (2013)
併用時に相乗効果を示すことや、殺菌作用と病原性低下 9) Minato Y. et al., Antimicrob Agents Chemother., 59: 50975106 (2015)
作用を同時に発揮させるなど、複数機能（マルチファン
クショナル）を有する抗菌薬の開発に繋がることが期待 10) Dawadi S. et al., Org Lett., 19: 5220-5223 (2017)11) Thiede JM. et al., Sci Rep., 6: 38083 (2016)
できる。このようなマルチファンクショナル抗菌薬の標
12) Zlitni S. et al., Nat Chem Biol., 9: 796-804 (2013)
的として、代謝関連遺伝子に特に注目し研究を進めてい 13) Minato Y. et al., Nat Commun., 9: 1003 (2018)
る。
14) Griffin JE. et al., PLoS Pathog., 7: e1002251 (2011)15) DeJesus MA. et al., PLoS Comput Biol., 11: e1004401(2015)
７．終わりに
16) Zhang YJ. et al., Cell., 155: 1296-1308 (2013)
本稿で私の過去の研究について振り返る機会を頂い17) Minato Y. et al., mSystems., 4:e00070-19 (2019)
たが、改めて無計画な研究者人生を過ごしてきたと痛 18) Carey AF. et al., PLoS Pathog., 14: e1006939 (2018)
感した。しかし、これまであまり困ってこなかったの 19) Qi LS. et al., Cell., 152: 1173-1183 (2013)
は、 渡 米 後 間 も な く YouTube で 見 つ け た Steve Jobs が 20) Peters JM. et al., Cell., 165: 1493-1506 (2016)21) Rock JM. et al., Nat Microbiol., 2: 16274 (2017)2005 年にスタンフォード大学の卒業式で行ったスピー
22) Bosch B. et al., Cell., 184: 4579-4592 (2021)
チ に 影 響 を 受 け た か ら だ と 思 う。 こ の 中 で Steve Jobs

5

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2023 年 1 月 11 日

Small RNA とはどのような RNA なのか？
森田 鉄兵
慶應義塾大学

先端生命科学研究所

1. はじめにモネラを中心に研究が進められてきた small RNA（sRNA）

微生物は、環境を有効利用するために、栄養の取り込を紹介したい 1)。sRNA の多くは 100 塩基前後であり、伝因子の発現と結びつけていることが多い。つまり、微Hfq の補助を受けることで標的 mRNA と塩基対を形成し、みや使用を厳密に制御する。さらに、このような制御を、 ほとんどの場合、環境変化に起因するストレスに応答しバイオフィルムや病原性といった微生物の生理を司る遺 て発現する。そして、RNA シャペロンタンパク質である
生物生理の理解には、環境に応じた遺伝子発現制御の解明が一つの鍵となる。
今日では、小分子 RNA は、転写後段階での遺伝子発現制御を司る分子の代表格に挙げられる。RNA-Seq が普及して以来、「ある培養条件で発現する短い RNA を見つけたが、これが小分子 RNA としての機能を持つか？」といった質問を筆者は受けてきた。残念ながら、RNA 配列を見ただけでその機能を見抜けるところまで当該研究領

標的 mRNA の翻訳や安定性を変化させる（図 1A）。標的
mRNA との塩基対形成領域は 8~15 塩基程度であり、シード配列と呼ばれる（図 1B）。sRNA が標的 mRNA との間に形成する塩基対は不完全であり、この不完全さにより、
1 つの sRNA が複数の標的 mRNA を一手に制御することが可能になる。
なお、sRNA に対する Hfq のように、小分子 RNA のタンパク質パートナーとして CsrA や ProQ が知られてい域は至っていない。しかし、近年のいくつかの研究を踏る。また、枯草菌をはじめとする一部のグラム陽性菌では、一助になれば幸いである。

大腸菌とは異なる。さらに、ピロリ菌などゲノム上に hfq

まえることで、ある程度の予測が立つと筆者は考える。 hfq 遺伝子が存在するものの、RNA 結合部位の一部のア
本稿が、今まさに気になっているその RNA の機能推定の ミノ酸の違いなどが原因となって、sRNA 制御の様相が遺伝子が存在しない細菌も存在する。以上のようなケースについても個々に研究が進んでおり、総説等にまとめ

2. Small RNA
本稿では、小分子 RNA の一例として、大腸菌やサルられていることを書き留めておく。

(A)

(B)

Gene

Gene

Gene

sRNA

mRNA

Intrinsic
terminatorsRNA

transcription

mRNA

regulation

processing

seed regiontranslation

ProteinUUUUUUU-3’

5’ -

Hfq

target mRNAs
proximal faceProtein

図 1. sRNA は mRNA の翻訳や安定性を制御する(A) 遺伝子発現における sRNA の位置付けの概略図。sRNA の発現には、独自の転写単位に由来する主経路に加えて、mRNA の 3’ 非翻訳領域のプロセシングを介した経路がある。sRNA は塩基対を介して標的 mRNA と結合し、標的 mRNA の翻訳や安定性を制御する。
(B) sRNA の基本構造の概略図。sRNA は、標的 mRNA との塩基対形成領域（seed region）、Hfq との結合領域、及び転写終結領域（intrinsic
terminator）の 3 つで構成される。Hfq との結合領域は、近位面（proximal face）との結合領域に加えて内部にもう一箇所存在し、遠位面（distal face）か側面（rim）のどちらかと結合する。この違いにより、sRNA は 2 つのクラスに分類される。

6

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3. sRNA 遺伝子が転写され機能を発揮するまで
sRNA のストレスに応じた発現誘導は、主に転写開始

2023 年 1 月 11 日

sRNA genepromoterterminatorの制御により起こる。多くの sRNA は固有のプロモーター

セシングにより生じるものも存在する。この場合、sRNAUUUUUUUの転写開始は格納庫である mRNA と協調的な制御を受け

3’

Hfq

UUUUUUU

nonfunctional as an sRNA

図 2. sRNA の機能発揮において転写終結が持つ意義
Hfq は、転写終結に由来する 7 塩基以上のポリ U テールに優先的に結合する。このため、sRNA 遺伝子の転写終結産物は、
mRNA の制御機能を発揮することができる。一方、転写終結
領域を乗り越えて転写が伸長した場合、そのリードスルー産
物は Hfq と結合しないため、sRNA として機能しない。なお、大腸菌の sgrS 遺伝子では、下流に setA 遺伝子の翻訳領域が位置する。このため、リードスルー産物は setA mRNA としての機能が考えられる。

発現パターンが生じる可能性がある。3’ 非翻訳領域に由来する sRNA の成熟過程の詳細については、（宮腰，日本ゲノム微生物学ニュースレター No. 25，2022）を参照されたい。
sRNA の 5’ 末端が転写開始、あるいはプロセシング末
端のどちらかに由来する一方、どちらの場合でも、3’ 末
端は Intrinsic termination によりもたらされる 2)。Intrinsic

リードスルー産物は Hfq と結合せず、結果として sRNA

termination は、RNA ステムループ構造とそれに続く U リッとして機能しないという結果に裏打ちされる 7)（図 2）。

チテールで構成されるターミネーターにより誘起される

したがって、興味がある RNA が sRNA としての機能を持

転写終結機構であり、細菌遺伝子の大部分の転写終結を担う（以降は、Intrinsic termination を転写終結と示す）。
筆者らは、大腸菌 sRNA の 1 つである SgrS を用いた解析つかどうかを予想する際には、まずはその RNA の 3’ 末
端に目を向けることをお勧めしたい。
因みに、Hfq 6 量体には、近位面の他に 2 つ RNA 結合

により、sRNA のテールが 7 塩基以上の連続した U で構

面（遠位面、側面）が存在する。これら 3 つの RNA 結成され、さらに 7 塩基より手前での早熟な転写終結を起合面がどのように sRNA や mRNA と結合し、塩基対形成

こさないよう適した安定性のステムループ構造を必要とを促進させるかについては、（Updegrove, et al., Curr. Opin.

することを明らかにした 3-5)（図 1B）。このテールを構Microbiol., 2016）を参照されたい。

成する U は Hfq 6 量体の近位面と個々に結合し、特に末端の U は 3’ 位の OH 基で強固に Hfq と結合するため重要

4. sRNA の転写終結制御な役割を担う 6)。これは、転写終結産物が Hfq と結合し

図 2 にも図示したように、転写終結位置がその転写産

sRNA として機能する一方、転写終結領域を乗り越えた

(B)

3’

functional sRNA

る一方、プロセシングのタイミングにより sRNA 固有の・low temperature
・glucose-phosphate stress・iron-depletion stress・stationary phase5’5’

加えて、sRNA の中には、mRNA の 3’ 非翻訳領域のプロ(A)readthroughterminationを持ち、その上流に転写開始を司る制御領域が位置する。

物の運命を決定する要素であることから、sRNA の機能(C)・Slow growth
conditions?

・Rof overproduction
・Bicyclomycin
・rhoR66S mutation

CspD

promote5’

terminator

RNA polymerase

terminatorterminatorstop
transcription

Rho? attenuatetranscriptiongotranscriptiongo

図 3. 転写終結の制御(A) 低温、グルコースリン酸ストレス、鉄枯渇ストレス、及び定常期の条件では、DsrA（低温）、SgrS や RyhB（残りの 3 条件）といった sRNA の転写終結率の向上が観察されている。（B）低温ショックドメインタンパク質の 1 つである CspD は SgrS に結合し、SgrS やリードスルー産物を安定化するとともに、転写終結率を顕著に減少させる。この他にも、CspD の過剰発現により、GcvB や
CyaR といった sRNA の転写終結の抑制、及び tnaCAB オペロンや gdx Riboswitch などの転写伸長／終結の切り替え制御の破綻が確認された。（C）rof の過剰発現、Bicyclomycin の添加、及び Rho R66S 点変異は、いずれも Rho の機能を阻害する。これらの条件では、SgrS の転写終結が抑制される。

7

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2023 年 1 月 11 日

発揮を司る転写終結段階での制御が考えられた。この予が特定の環境下で機能を発揮し、sRNA の 3’ 末端となる

想は、大腸菌において、DsrA や SgrS といった sRNA の可能性が考えられるからである。事実、CspD の過剰発

転写終結率が、培養温度やストレスにより変化するとい現下における RNA-Seq 解析を行い、リボスイッチなどのう観察からも支持される 7, 8)（図 3A）。

転写伸長／終結の切り替え制御の多くが破綻することを最近になって、筆者らは、大腸菌のゲノム断片をラン明らかにした 9)。また、RNA-Seq を基盤とした解析によ

ダムに挿入したプラスミドライブラリーを用いて、SgrS

り、転写終結の位置が培養条件などにより変化することの転写終結を抑制する新規遺伝因子を同定した 9)。低温

や 10, 11)、mRNA の 5’ 非翻訳領域内で早熟な転写終結末

ショックドメインを持つ CspD はもっとも顕著な影響を

端（Rho-dependent termination を含む）が多数検出される示した遺伝因子であり、SgrS の転写終結率を大きく減少

ことがゲノムレベルで明かされている 12)。これらを踏まさせた（図 3B）。さらに、CspD の過剰発現下では、SgrS

えれば、遺伝子領域内から現れた小分子 RNA も、3’ 末端による標的 mRNA の制御が強く抑制された。これらのの配列によっては十分に sRNA の候補になり得るだろう。

結果は、CspD が転写終結の抑制を介して機能的な SgrS

5. sRNA を制御する因子

産生量を減少させ、結果として SgrS 制御系が発動しなかったことを強く示唆する。また、このスクリーニン

ここまでは、sRNA 産生の場である転写に焦点を当て

グでは、Rho の阻害因子である rof 遺伝子が単離された

sRNA の特徴を紹介してきたが、それ以外にも sRNA の（図 3C）。そして、rho 機能欠損変異や Rho 阻害剤である機能に関与する因子が報告されている。例えば、大腸菌

Bicyclomycin の影響を解析し、これらが同様に SgrS のの鉄イオン枯渇の応答制御を司る RyhB sRNA の制御因子として、N-acetyltransferase 活性を持つ YhbS や RNA 分

転写終結を抑制することを確認した。転写終結（intrinsic

解の補助的役割が想定される YicC が単離された 13)。特termination） は 別 名 Rho-independent termination と 呼 ば れに、YhbS は、RyhB 以外にも ChiX や ArcZ などいくつかることを踏まえると、これらの結果は、細菌における転写終結機構の概念を覆し得る可能性を持つ。CspD や Rhoの sRNA を抑制することが確認されており、sRNA 制御

今後の詳細な解析で明らかにしたい。

し、気になる RNA の機能を LB 培地などの一般的な実験

阻害がどのようにして転写終結を抑制するかについて、 系を一手に司る制御機構が示唆された。したがって、も室環境で検証し、その結果がネガティブだった場合でも、以上に示したように、転写終結の制御にはいくつかの経路があることが示唆された。その全体像を捉える

そこには YhbS などの sRNA 制御系を制御する因子が関sRNA が独立した転写単位や mRNA の 3’ 非翻訳領域のみ検証を試みることを勧めたい。

には至っていないものの、RNA の機能推定においては、 与している可能性があるため、培養条件を変えてさらにに存在すると思い込まないでほしい。なぜならば、オペロンや遺伝子の内部に潜んでいた不完全な転写終結領域

(A)

(B)

VcdRP

5’ -

AzuCR

U(n)-3’

VcdP
coding region

seed region

GltA

target mRNAs

5’ -

AzuC
coding region

GlpD

U(n)-3’seed region

target mRNAs

図 4. dual-function RNA(A) VcdRP は、コレラトキシンの産生を抑制する sRNA として同定された。その後の解析により、sRNA（VcdR）としての機能に加え、内部の翻訳領域から産生される small protein（VcdP）の機能が明らかにされた。（B）AzuCR は、大腸菌ゲノムの情報学的解析により
sRNA の候補に挙げられた。その後、内部の翻訳領域から産生される small protein（AzuC）の機能が明らかとなり、加えて、翻訳領
域内の変異解析により sRNA（AzuR）としての機能が明らかになった。

8

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

方の機能の発揮により他方の機能の制御が可能であれば、

6. 標的 mRNA を見つける

dual-function RNA を用いた巧妙な遺伝子発現制御ネット

標的 mRNA の同定には、sRNA の短時間の過剰発現により量的変化が生じた mRNA の抽出といった一般的な 手 法 に 加 え、RIL-Seq 法 や CLASH 法、MAPS 法 な どの RNA 相互作用に特化した解析手法が確立されている。
また、IntaRNA など RNA 相互作用を予測する Web ツー
ル が 公 開 さ れ て い る。（Miyakoshi, et al., Mol. Microbiol.,

ワークの設計など応用の可能性が広がる。

8. おわりに、思うこと
本稿を読み返してみて、意外と簡単に sRNA が見つけられるのではないかと筆者自身が錯覚してしまったが、実際には、わずか 100 塩基前後の機能性 RNA を微生物の2022）では、実際にこれらのデータセットや予測ツール

広大なゲノムの上で見つけ出すことはやはり困難である。

を利用することで大腸菌の GcvB sRNA の標的 mRNA を

しかし、RNA-Seq 解析などにより、候補となる RNA が決定しており、解析例の 1 つとして参照されたい。

リストに挙がっている状況であれば、本稿で掲示したヒ7. Small Protein

ことができるかもしれない。あるいは、学会員の方々のントをもとにそのリストの上で sRNA を浮き上がらせる

近 年、 一 部 の sRNA に お い て、 内 部 に small protein

中で、「興味はあるが、やはりまだ sRNA の探索や機能解をコードする翻訳領域が存在することが報告され始め

析に高い壁を感じる」という方は、筆者（morita-t(at)ttck.

た。small protein は 50 アミノ酸以下のポリペプチドであkeio.ac.jp）まで連絡を頂ければと思う。

り、固有の機能を持つ。このような RNA は、sRNA 及び

small protein の翻訳領域の 2 つの機能を持つという意味で、 9. 引用文献
“dual-function RNA” と呼ばれる。一例として、コレラ菌(1) Holmqvist E. and Wagner EGH., Biochem. Soc. Trans., 45:
1203-1212 (2017)の VcdRP を 紹 介 す る 14)（ 図 4A）。VcdR は sRNA で あ(2) Chen J., Morita T. and Gottesman S., Front. Cell., Infect.
り、グルコースなどの糖取り込みに関与する遺伝子群のMicrobiol., 9: 201 (2019)
mRNA の発現を制御する。さらに、VcdR は small protein(3) Otaka H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 108: 13059である VcdP の mRNA としても機能する。VcdP は TCA
13064 (2011)
回路の代謝酵素である GltA に結合し、その活性を増加さ (4) Ishikawa H., et al., RNA., 18:1062-1074 (2012)せる。したがって、VcdRP は、sRNA 及び small protein の (5) Morita T., Nishino R. and Aiba H., RNA, 23: 1419-1431(2017)
2 つの機能を発揮することで、解答系 -TCA 回路のバラ(6) Sauer E. and Weichenrieder O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
ンスの調整役を担っていると考えられる。また、大腸菌
108: 13065-13070 (2011)
AzuCR は、sRNA と し て UDP-glucose 4-epimerase を コ ー (7) Morita T., et al., RNA., 21: 1490-1501 (2015)
ドする galE mRNA などの発現制御を司る一方、内部の翻 (8) Sledjeski DD, Gupta A and Gottesman S., EMBO J.,
15:3993-4000 (1996)
訳領域から産生された AzuC は、グリセロール -3- リン酸(9) Morita T., et al., mBio., online ahead of print (2022)
デヒドロゲナーゼである GlpD と結合しその活性を増加(10) Yan B., et al., Nat. Commun., 9: 3676 (2018)
させる 15)（図 4B）。この 2 つの機能を発揮することで、 (11) Ju X., Li D. and Liu S., Nat. Microbiol., 4: 1907-1918
AzuCR はガラクトースとグリセロールという 2 つの糖代
(2019)(12)
Adams PP., et al., eLife., 10: e62438 (2021)
sRNA
謝経路に関与する。もし、研究の中でを見つけたが、表現型の原因となる標的 mRNA が今ひとつ絞りきれない (13) Chen J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 118:
e2106964118 (2021)
場合には、改めて sRNA 内部に目を向け、小さな翻訳領(14) Venkat K., et al., EMBO J., 40: e108542 (2021)
域を探してみるのも 1 つの打開策になるかもしれない。
(15) Raina M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 119:RNA
因みに、dual-function
はまだ論文報告例が少なく、
e2117930119 (2022)
不 明 な 点 が 残 さ れ て い る。 特 に、sRNA と small proteinの 2 つの機能の切り替えについて、AzuCR では、AzuRsRNA としての機能が AzuC の翻訳を阻害するといった部分的な観察が報告されているのみである 15)。もし、一9News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

サンガーシーケンスのコツ：
簡単、確実に高品質なデータを得るために
隅田 周志

株式会社日立ハイテク、アナリティカルソリューション事業統括本部
ライフ & メディカルシステム製品本部、バイオシステム第一設計部
サンガーシーケンスは登場から 40 年以上、様々な分

ほぼ 2 倍になっています。一方、注入時間が長くなると、野で日常的に使用されています。しかし、現在でもサン

読み取り塩基長が短くなる傾向があります。これは、サプルによっては、読み取りエラーにより目的のデータがンプル注入時間、注入電圧を大きくすると、ピーク波形

得られないことがあります。ここでは当社の小型 CE シーの幅が広がるためです。信号強度を調節する際は、図 2

ケンサ日立 DS3000 を例に、読み取りエラーを減らすコを参考に、適切な読み取り塩基長が得られる条件をご検

ツを 3 つ紹介いたします。

討ください。また、より詳細な検証結果を当社ホームペー

A

25000

1. 信号強度の調節
ピーク波形の信号強度が低すぎたり、または高すぎた

20000
信号強度（RFU）

りすると、ピーク波形が正しく検出されず読み取りエラーが生じます。このような場合は、DNA をキャピラリに注入する条件（サンプル注入条件）を調節していただくと改善することがあります。DS3000 では、サンプル注入条
件の注入電圧と注入時間を変更できます。どちらの条件

サンプル注入時間
24 秒
12 秒
8秒
4秒

15000

10000

5000

もタッチパネルから簡単に変更が可能です（図 1）。
0
200

400

600
読み取り塩基長 (base)

800

1000

図 2. サンプル注入条件とデータ品質の関係
標 準 サ ン プ ル（Sequencing Standard, BigDyeTM Terminator
v3.1, Thermo Fisher Scientific）を用いて得られたデータの一例を示します。

ジで公開しています。こちらもご参照ください（1）。
次に、信号強度を調節して読み取りエラーが改善され

図 1. サンプル注入条件の設定方法
Home 画 面 か ら、”New & Edit Protocols”、”Assay”、 変 更 し た
い Assay の順に選択してください。続いて表示される画面で、Instrument Protocol の ”Edit” を選択すると上記の画面が表示されます。Injection Voltage と Injection Time にサンプル注入条件
を入力してください。

サンプル注入時間と注入電圧は、どちらも信号強度と図 3. サンプル注入時間の調節による読み取りエラーの改善

強く相関します。例として注入時間と信号強度の関係を （A, B）注入時間 4 秒および 24 秒の波形データ。（C）読み取りエ示します（図 2）。注入時間を 2 倍にすると、信号強度がラーの数。読み取りの正誤は 40-700 塩基の範囲で確認しました。

10

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

V1 V2

300

V3

塩基長（base）
600
900
V5

V4

V6

1200

V7

1500

V8

V9

1492R

27F

読み取りエラーの数B1

1

27F V1

0
1492R
1
0

1

V3

V2
V9
100

V8
200
300
塩基長（base）

V6

V7
400

500

C

3k
2k
1k
0

30

塩基長（base）

90

60

120

150

GCTAACMTGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG

信号強度（RFU）

A

2023 年 1 月 11 日

180
210
240
270
300
3k AGGGGGACCTTMGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA
2k
1k
0
360
390
330
450
420
3k CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCARCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAKGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCA
2k
1k0

図 4. 大腸菌ゲノム DNA を鋳型にしたサンガーシーケンス(A) 大腸菌 16S rRNA 遺伝子の構造。可変領域（V1-V9）とシーケンスプライマ（27F と 1492R）の位置を示します。(B) 読み取りエラーの位置。読み取りエラーの位置を黒線で、可変領域の位置を赤枠で示します。 (C) 27F プライマで得られた波形データ。読み取り
エラーを赤枠で示します。

た実例を示します（図 3）。平均信号強度が 19 RFU のサ

2. GC-rich 配列の増幅

ンプル（図 3A）では、21 個の読み取りエラーが発生しGC-rich 配列ではポリメラーゼの伸長反応が阻害さました。同じサンプルの注入時間を 6 倍（24 秒）に増やれ、PCR やサイクルシーケンス反応で目的の産物が得らすと、平均信号強度は 6.6 倍（図 3B）になり、読み取りれないことがあります。この時、PCR 反応を促進する添

エラーの数は 2 個に減少しました。以上から、読み取り

加剤（PCR 添加剤）を加えると改善する場合がありま

エラーの改善が確認できました（図 3C）。

す。代表的な PCR 添加剤には、ホルムアミド（FA）やサンプル注入条件の調節は、ゲノム DNA を直接シー

ベタインがあります（4）。ここでは GC-rich 配列を用いケンスする際にも有効です。日本ゲノム微生物学会ニュー

て、FA とベタインの濃度、および添加するタイミング

スレター（24 号）では、微生物ゲノム DNA を PCR せず

について検討しました。GC-rich 配列の例として Humanに直接シーケンスする方法が紹介されました（2）。ここ

CCAAT enhancer binding protein alpha（CEBPA）と Humanではこの記事と先述の知見を活かしながら、大腸菌ゲノ

retinoblastoma susceptibility protein（RB）を選定しました。

ム DNA を鋳型にして 16S rRNA 遺伝子をシーケンスしま
した。シーケンスプライマには、可変領域 V1 の上流にアニールする 27F と V9 の下流にアニールする 1492R を使用しました（図 4A）（3）。サイクルシーケンス反応では大腸菌ゲノム DNA を 10 μg 使用し、25 回の熱サイクルでddNTPs を付加しました。サンプル注入条件は次のように検討しました。DS3000 では注入電圧を 1-15 kV、注入時
間を 1-600 秒の範囲で変更できます。しかし、先述の通りそれぞれの値を大きくすると読み取り塩基長が短くなります。そこで、注入電圧を通常の 3 倍（3.6 kV）、注入

FA

FA

10
%

3%
ン

イ

し

タ

ベ

%

10

CEBPA

ころ、100-400 base の範囲で 2 個の読み取りエラーが認め

な

FA

3%
ン

イ
タ

し

得られたシーケンスデータを正解の配列と比較したと

FA

ベ

な

時間を通常のまま（4 秒）に設定しました。

RBられました（図 4B、C）。また、60-420 base までの領域で 図 5. PCR 添加剤の効果

PCR 反応後の溶液を Agilent D1000 ScreenTape System（アジレ

1,000 RFU を超える信号強度が得られました。以上から、ント・テクノロジー株式会社）で分析しました。青枠と黒枠

この領域では、組み換えプラスミドや外来 DNA の挿入部 部分は正しい PCR 産物の信号 を示します。CEBPA では PCR
位を確認する用途にお使いいただけることが分かりました（2）。

添 加 物 を 加 え な い サ ン プ ル（ 図 中 の “ な し ”） で、RB で はFA10% のサンプルで、正しい PCR 産物を得られませんでした。

11

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

A

120

160

塩基長（base）

読み取り塩基長が短くなりました（図 6B）。同様の傾向

200は RB でも確認されました（データ未記載）。サイクルシー

CGCGCTCAA GG GGCT GGGCGCCGCGCACCCC G ACCT CCGCGCG AG TGGCG GCAGCGGCG CG GGCAAGG CCAAG AAGTCGGTGG ACAAG AACAG CAACG AG TA

1800 PCR添加剤：なし

ケンス反応では、ベタイン、FA を加えないことをお勧め

信号強度（RFU）

1200
600
0

120

160

します。

200

CGCGCTCAA GG GGCT G GGCGCCGCGCACCCC G ACCT CCG CG CGAG TGGCGGCAG CG G CG CG GGCAAGG CCAAG AAGTCG GTGG ACAAG AACA GCAACG AGT

1800 PCR添加剤：FA

3. 読み始めの領域の品質改善

1200
600
0

120

160

サンガーシーケンスでは、読み始めの領域で読み取り

200

CG CG C TCAAGG GG CTG G G CG CCGYK CWWCCCCG ACCTCCGCG CG AG TGG CG GCAGCGGCGC GGGCAAG GCCAAG AA GTC GGTG G ACAAG AACA GCAACG AG

エラーが発生することがあります。これは、キャピラリ

1800 PCR添加剤：ベタイン
1200に充填された電気泳動媒体（ポリマ ー）が、短い DNA

600

をうまく分離できないことがあるためです。短い DNA

0

正解配列との一致率（%）

B

2023 年 1 月 11 日

1.00
0.75
0.50
1.00
0.75
0.50
1.00
0.75
0.50

CEBPA PCR 添加剤なしの分離性能は、泳動電圧を調節することで改善します。
DS3000 で得られた実例を、解像度（R）を用いて説明します。解像度（R）は隣り合うピーク間の距離を、ピーク

CEBPA FA

幅と塩基長差で割った値です（図 7A）（5）。解像度が大きいほどベースコールの精度が向上します。解像度は電CEBPA ベタイン

20

100

200

気泳動で設定する電圧（泳動電圧）と、塩基長により変
300

400

塩基長（base）

化します。DS3000 では泳動電圧が異なる 2 種類のアッセ

500

イをご用意しています。それぞれのアッセイにおける塩図 6. サイクルシーケンス反応時の PCR 添加剤の効果(A) CEBPA を鋳型として得られたピーク波形。赤枠は読み取りエラーが発生している領域を示します。(B) 正解配列との一致率。各条件で 8 回ずつシーケンスを実施し、得られた塩基が正解と一致する割合を 20 塩基ごとにまとめて表示しています。
塩基長はシーケンスプライマーの 3’ 末端と隣接する塩基を 1 としてカウントしています。

基長と解像度の関係を、図 7B に示します。読み始めの領域の品質を重視する場合は、fast sequencing（泳動電圧14 kV）をお勧めします。逆に、できるだけ長い DNA 分子を分析したい場合は standard sequencing（泳動電圧 7.5

ピーク間隔（∆X）

A

解像度（Ｒ）GC 含有率はそれぞれ 71% と 72% です。
始めに PCR 反応時の PCR 添加剤の効果を確認しましR = ∆X / (∆N・Wh)

た。CEBPA では PCR 添加剤を加えると目的の PCR 産物が得られました（図 5）。RB では PCR 添加剤を加えなくても目的の PCR 産物が得られました。しかし、ベタイン

塩基長差（∆N）

B

1.0
0.8

得られました。一方で、FA を終濃度 10% で添加すると0.6

PCR 添加剤の量は塩基配列やポリメラーゼによって異なります。PCR 添加剤を加えても目的の PCR 産物が得られない場合は、添加量をご検討ください。

解像度

や FA（終濃度 3%）を加えると、より多くの PCR 産物が目的の PCR 産物が得られませんでした（図 5）。適切な

0.4
0.2
0

続いて、サイクルシーケンス反応における PCR 添加剤の効果を確認しました。サイクルシーケンス反応に PCR
添加剤を加えると、信号強度が低下することが示されました（図 6A）。特に、ベタインを添加すると信号強度が1/10 程度に低下し、ノイズと区別することが難しくなります。このノイズにより、読み取りエラーが発生しました（図 6A、赤枠部分）。さらに、ベタインを添加すると

12

ピーク幅
（Wh）

std (7.5 kV)

fast (14 kV)

200 400 600 800 1000 1200
塩基長 (base)

図 7. 解像度と泳動電圧の関係(A) 解像度の定義。(B) DS3000 における相対的な解像度。(A)の定義で得られる解像度を元に、最大値に対する比率をプロットしました。DS3000 では、解析の目的に応じて 2 種類のアッセイを使い分けることが可能です。fast sequencing（fast）は短時間でできるだけ長い読み取り塩基長を得たい場合に使用し、standard sequencing（std）は fast よりも長い読み取り塩基長を得たい場合に適しています。
図は、解像度 0.5 の領域を中心に色分けしてあります。図中に、各領域で得られるピーク波形の模式図を示します。

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

プライマー

3’

B
5’
3’

5’

3’

鋳型DNA

5’

テイル
プライマー
3’

鋳型DNA

5’

3k
2k
1k
0

信号強度（RFU）

A

20

塩基長（base）
40

参考文献

60

WKSCARMRGCWKCTKGCGCAGGAWCCTAGGCCTGAAGMTTGTCCGTTTGATTACCGGTC

1) DS3000 Compact CE Sequencer におけるサンプル注入条
件と泳動性能の検証
https://biz.hitachi-hightech.com/sinavi/asi_applicationdetail?cat

4k GAGAGCTCCTGCAGGCTAGCTTGCGCAAGGATCCTAGGCCTGAAGCTTGTCCGTTTGATTACCGGTC

2k
02023 年 1 月 11 日

2040
塩基長（base）

egory=a122x000000Z02gAAC%2Ca1228000001ZQqLAAW&freeword=%2Cfalse&kijiId=AP100514&viewLanguage=ja

60

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図 8. テイル付きシーケンスプライマーの効果(A) テイルの無いシーケンスプライマーで得られた波形デー
タ。読み始めの領域でピーク波形が乱れてしまい、読み取り
エラー（赤枠部分）が発生しています。(B) テイル付きシー
ケンスプライマーで得られた波形データ。(A) のプライマーに 40 塩基のテイルを付加しました。読み始めからピークが分離できているため、読み取りエラーが認められません。

2) 大坪嘉行 日本ゲノム微生物学会ニュースレター 24:14(2021)
3) Lillo et al. Oral Microbiol. Immunol., 21:61-68 (2006)
4) Henke et al. Nucl. Acids Res., 25:3957-3958 (1997)
5) Heller. Electrophoresis., 22:629-643 (2001)
6) Binladen et al. BioTechniques., 42:174-176 (2007)kV）をご利用ください。
読み始めのデータ品質は、シーケンスプライマーにテイルを付加することでさらに改善します（6）。テイルはシーケンスプライマーの 5’ 側に付加する任意の塩基配列です。テイルにより反応産物が長くなるため、電気泳動で分離できるようになります。ここでは 40 塩基のテイルを付加した例を示します（図 8）。テイルの無いプライマー
では読み始めの領域でピーク波形が乱れているため、読み取りエラーが発生しています（図 8A、赤枠部分）。対
照的に、40 塩基のテイルを付加したプライマーでは読み始めから正しい塩基が同定されています（図 8B）。読み
始めの領域で、読み取りエラーを避けたい場合はプライ
マーにテイルを付加してください。

4. まとめサンガーシーケンスで読み取りエラーが発生したり、目的の産物が得られない場合は、下記のコツをお試しください。
1. ピーク波形の信号強度が低すぎる、または高すぎる場
合は、サンプル注入条件を変更して信号強度を調節する。
2. 解析したい領域が GC-rich 配列を含む場合は、PCR 反
応時に PCR 添加剤を加える。
3. 読み始めの領域の読み取りエラーを減らしたい場合は、
fast sequencing を用いて電気泳動するか、シーケンスプ
ライマーにテイルを付加する。

137) 図のピーク波形は sangerseqR を用いて描画しました。
Hill et al. Developmental Dynamics., 243: 1632-1636 (2014)

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

原核生物の命名について、現在、国際的な動きがあることを受けて、25 号に引き続き 26 号においても誌面を借りて日本ゲノム微生物学会の会員の皆様に基礎的な情報提供をさせていただきます。本件、会員の方々の中にも様々な理解度、多方面からのご意見があることが推測されたため、Slack を用いた Q&A 方式にて、複数の会員の方々に基礎的な内容につきましてご回答をいただきました。また、関連論文ならびにサイト URL についてもご紹介させていただきます。ご協力いただきました会員の皆様に厚くお礼申し上げます。
今回の Q&A は、回答者の現段階での個人的理解によるものです。従いまして、新しい動向による変更等がありえますことをご了承ください。会員の皆様からのさらなるご教示がございましたらお寄せいただければ、ありがたく存じます。今後の議論の足がかりになります事を願っております。なお、回答者と回答内容は、順不同であり、イラスト（顔写真）と回答内容は関係がありません。
（ご協力いただいた方々、市川夏子、伊藤隆、岩崎渉、玉木秀幸、布浦拓郎、ニュースレター編集委員）

Q ８：微生物の命名法の議論の今後のスケジュールについて、わかっていることがありますか？

A ８：ICNP の改訂は 2022 年の夏までに行う予定でしたが、スケジュールは遅れているかもしれません。
加えて、2023 年 1 月に未培養微生物を含むゲノムシーケンスに基づく分類体系を担う The Committee on the
Systematics of Prokaryotes Described from Sequence Data( 略称 the SeqCode Committee) という委員会が立ち上がります。SeqCode Executive Board の面々が International Society for Microbial Ecology (ISME) におけるいくつかのタスクグループの役割を担うとされています。the SeqCode Committee には、the SeqCode Community というコミュニテイもあり、こちらは微生物に関わるお仕事をしている ISME メンバーであれば参加できるようです。

Q ９：日本ゲノム微生物学会員が着目しておくと良い、と思われる事がありますか？

A ９：ICNP は（あくまでも培養が可能な）原核生物の命名規約であり、一方で分類はそうした規約による縛りはなく、研究者が自由に考えていけば良いものと思います( もちろんコミュニティの中で認められることは必要でしょうが）。培養できているもの
はほんの一部でしかないので、原核生物全体の分類体系を見ていく上では今後も GTDB（Genome Taxonomy Database）や NCBI などのデータベースは有用な情報源になると思い
ま す。 さ ら に LPSN（List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, https://www.
bacterio.net）は承認されている学名を調べるためには優れたソースです。
A ９の２：少し違うかもしれませんが、現在、学名の変更が頻繁に起こっていることは認識しておいていただいた方がよいと思います。
例 え ば、 ゲ ノ ム 配 列 を INSDC に 登 録 す る 際 に エ ン ト リ の Definition を 付 け ま す し、
BioSample や BioProject も登録することになっています .
学名の変更があった場合、RefSeq だと新しい学名に更新されていますが、オリジナルのゲノム配列の登録エントリでは旧名の Definition が残っていたり、BioSample のタイトルが更新されていなかったりします。
（学名が更新されるケースとされないケースがあるようです）。結果として旧名の Definition がついたエントリと新学名のエントリが混在しているためわかりにくいのではと思います。

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

A ９ の ３： コ メ ン ト は、Nat Rev Microbiol （https://doi.org/10.1038/s41579-02200706-z ）にも記載されています。とは言え、未培養系統群の名称等は、データベースも構築者の趣味が反映されることがしばしばであり、改訂も頻繁であって、かな
り安定性に欠けるのが実情です

Q １０：今後、各種の国際 DB や標準マニュアル等の門名は切り替わっていくのか、切り替わるとすればいつ頃になるのか、どのような見通しでしょうか？

A １0：LPSN では今回の門名が既に登録されています。
例：（https://lpsn.dsmz.de/phylum/pseudomonadota）
また、今回の経緯が掲載されています。
（https://lpsn.dsmz.de/text/names-of-phyla）
NCBI Taxonomy は 2021 年の論文を Reference にして門名がエントリとして追加されているものもあり、また既存の門については現在のところ「heterotypic synonym」として門名が登録されています。
早さは DB それぞれの事情に応じてになると思いますが、ICNP で新しい分類名が承認されれば従っていく流れではないかと思います。
一方で旧名で菌株を探す方もいることから、旧名を Synonym などで残したりする対応は行われています。

Q １1：門の名称と関連がある他階層の分類群名称（綱など）については、今後ど
うなる見通しでしょうか？

A １１：ICNP では綱以下の学名の取り扱いは変わっていません。しかし、ゲノム情報が増えてきたことと相まって幾つかの分類群が再編成されています（例えば Lactobacillus など）。こうした動きはしばらくは続くのではないかと思います。一方、アーキアでは上門（superphylum）などを使うケースもありますが、このレベルの分類群が ICNP の対象になることは当面はなさそうです。

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

A １１の２：superphylum は完全に研究者の趣味ですね。門等、高次分類のゲノ
ムベースの整理が進むにつれて、superphylum が門レベルとして認識されてくる等の事象が生じています。設問１の３：Thaumarchaeota 等は、このレベルの整理で門ではない、ということになりつつある情況があります。

A １１の３：Alphaproteobacteria などの class 名は ICNP のもとで承認名（正名）として扱われてきました。一方、2015 年に Rule 8 が改正されたことで（ICSP での承認は 2008年だそうで、2015 年に施行という意味になるかと思います）、class・subclass 名の命名法が明確化しました。すなわち、class 名は命名基準である Type order の Type genus の名前に基づき、これに語尾として -ia ( または -iia) をつけて造語するという命名法です。その方 法 に 従 い、Alphaproteobacteria に つ い て は 2006 年 に Type order を Caulobacterales と して Caulobacteria の class 名が承認されています。Betaproteobacteria, Gammmaproteobacteria,
Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria ついては、Burkholderiia, Pseudomonadia, Myxococcia,
Campylobacteria が承認されています。
さ ら に、Alphaproteobacteria な ど の 名 前 を ど う 扱 う か に つ い て request for an opinion「 意 見 募 集 」(Oren A et.al, Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 66: 4296-4298 (2016) doi 10.1099/ijsem.0.001319) が 提 出 さ れ、Alphaproteobacteria を Caulobacteriaに変えようか、変えないままにしようかの議論を公開したのが 2016 年の論文です。その結論が出ていない現時点
で は Alphaproteobacteria は 正 名 と 見 な す べ き で す。 も し Caulobacteria に す る と い う 決 定 が 出 さ れ た 場 合、 そ の 時 はAlphaproteobacteria は廃棄名となる可能性があります。
Request for an opinion は通例数年間の意見募集が行われ、それをもとに裁定委員会が判断し、ICSP が了承する形になると思います。今まで本件に関わる裁定委員会の報告を目にしたことがないと思っていましたが、最近の IJSEM 誌にはこの件はまだ検討中であるとのことでした。
尚、Class 名の変更は Phylum の決定とは直接的な関わりはありません。
Type order も無く、同じ誌面には Mollicutes 綱は、規則にのっとっていない名前であると記載があります。
綱についても今後、注視していく必要があります。

本文に紹介した以外の関連する情報の紹介
International Committee on Systematics of Prokaryotes: ICSP 関連
https://www.the-icsp.org/reports
Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Prokaryotes: Minutes of the Meeting on 3 March 2022
https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijsem.0.005395?emailalert=true
Bergey’s International Society for Microbial Systematics: BISMis 関連
https://www.youtube.com/channel/UCScYG-RicXucp6x9vHTja_Q
SepCode 関連文献とサイト
https://www.isme-microbes.org/seqcode-news( リストされる文献を含む )https://www.isme-microbes.org/seqcode-initiative
https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijsem.0.005754
https://www.nature.com/articles/s41564-020-0733-x

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

ゲノム微生物学会若手の会報告
国立遺伝学研究所
特任研究員

情報研究系

黒川 真臣

2022 年 9 月 20 日〜 21 日に、第 14 回目となる日本ゲノム微生物学会若手の会研究会がホテルラフォーレ修善寺にて開催されました。本年度は応用微生物学ルネサン
スセンターさんと共同で「総合微生物学研究会」として開催しました。日本ゲノム微生物学会若 手の会としては、筆者を世話人代表として、河野暢明さん（慶應大）、大林
龍胆さん（静岡大）、森宙史さん（遺伝研）、新たに加わってくださった前田海成さん（東工大）の 5 名で世話人を務めさせていただきました。参加者 38 名のうち約半数は学生で、企業からの参加もあり多様な立場の人が交流で第一回総合微生物学研究会（修善寺の会）を終えて信州大学大学院 生命医工・
応用微生物学ルネサンスセンター
センター長

片岡 正和

信州大学応用微生物学ルネサンスセンターと日本ゲノムきる会となりました。全員に発表もしくはショートトー

微生物学会若手の会の共催で、2022 年 9 月 20 日から伊クを行ってもらうことで、初対面でも話しやすい環境を

豆のラフォーレ修善寺で一泊二日の第一回総合微生物研作ることができました。2019 年以来 3 年ぶりに現地宿泊究会を開催しました。なんでこんな研究会をやっている型の研究会として開催でき、時間を気にせず夜遅くまでかというと、、、信州大学では 21 年度後半に次世代の研究

研究の議論や生活の情報交換をしたりして非常に密度のクラスターとして応用微生物学ルネサンスセンター（以濃い時間を作ることができました。学生や大人が混じっ

下ルネサンス）を採択し、片岡がセンター長を務めていて友人同士のように活発に話し合いをしている様子は世ます（といっても給料とかほとんどかわらんのですが）。

話人としては非常に嬉しく、オンラインセミナーによるこのルネサンスの真の目的は信州大学の生き残り！（こ知識の伝達のみでなく、面と向かって話ができる機会のれは大学の考え）というよりも微生物周辺の研究者の意

意義を改めて感じました。
本若手の会は結成当初より「微生物学研究の次世代を担う若手研究者の交流と情報交換」を目的として掲げています。この目的を達成するために、自由闊達な議論が行える場であること、他の組織や若手の会とも交流し多様な知識や視点に触れられる場であることを大切にして今後も若手の会としての意義を模索していく所存です。
本年度の研究会の開催にあたり日本ゲノム微生物学会から支援を賜り、学生会員や会員の紹介した学生は参加費を実質無料にすることができました。コロナ禍でこのような研究会の経験がなかった学生に対しても参加のハードルを下げることができました。この場をお借りして御礼申し上げます。会員の皆様には今後とも若手の会の活動を温かく見守っていただけますと幸いです。

思疎通を太くして各人の研究を加速させるのが（片岡の）真の目的です。9/20 の 13 時より北は北海道、西は広島、果ては中国広東省からの学生も含む 38 名の老若男女の参
加者全員が多角的な研究紹介、あるいは自己紹介のトー
クで盛り上がりました。夜は，これが皆様待望のイベントだったのですが、ラフォーレの大サービスで素晴らしい材料のバーベキュー、そしてコテージでの研究討論会と続きました。特に研究討論会では午前 4 時まで熱い議
論を中国から飛来した 70 歳手前の先生までガンガンやると。この熱い議論、しばらくは公開していなかったのですが、終了後もコロナ感染者はゼロで主催者としては心置きなく公開、宣伝しまくることになりました。
研究会そのものもレベルも高く、学生さんの発表もよく訓練されており、多分だめだったのは私的にはありがちの主催者の遅刻とか、時間をルーズにしてやや遅延し

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日たくらいです。ゲノム微生物若手の会の方も遺伝研の黒ています。自分の研究に関するアドバイスやフィードバッ

川さんがしっかりと進めていただき，いいメンバーが揃っクをいただきたい、また自身の所属している研究室のみて楽しんでいました。やっぱ基礎研究はおもろないとあならず、広いコミュニティで様々な研究者の方々とディきませんね〜。

スカッションをしたいと考え、第 14 回日本ゲノム微生物

最後に今回の開催をスムースに進めていただきました

学会若手の会に参加しました。本若手の会は静岡県伊豆ラフォーレのスタッフの皆様、その計画段階からお骨折

市ホテルラフォーレ修善寺にて、応用微生物学ルネサン

りいただいた森トラストの豊島さんと様々な研究会主催

スセンターとの共同開催となりました。総勢約 40 名の方における盟友の近畿大学の藤原先生にお礼申し上げます。 が参加され、多くの方々と研究に関する議論や趣味の話
そして何より、参加いただきめっちゃ楽しんでいただいをすることが出来ました。本稿が少しでも若手の会へのた参加者の皆様に深くお礼申し上げます。あまり文字を参加に興味を持っている方々の参考になれば幸いです。

書くとアホばれるので、会の様子の写真をあげておきま

第 14 回若手の会は 2 日間での開催となり、1 日目にす。特に高級肉が火事になってる図に着目！

口頭発表と交流会、フリークロストーク、2 日目に口頭発表とフリークロストークが行われました。口頭発表をしない方は自己紹介を数分程度していただき、参加される方全員に話す機会が設けられていました。1 日目の口頭発表は 3 つのセッションで構成されており、有識者の方々の発表から始まりました。次に若者セッション
として、学生の口頭発表が行われました。質疑応答も活発に行われ、自分の研究のモチベーションをさらに高める事が出来ました。また、参加された学生の皆さんの発表に関してどれも興味深く、ディスカッションするには設けられた発表時間では物足りなく感じました。これに関しては交流会やフリークロストークで十分ディスカッ
ションする事ができたので満足です。交流会では「BBQ
GARDEN」でバーベキューを行いながら、研究の話やプライベートの趣味の話で他大学の学生さん、及び有識者の方々と交流する事ができました。研究内容に関するディスカッションのみならず、発表に関するアドバイス等を有識者の方々から頂いていた学生の方も見受けられました。バーベキューインストラクターと呼ばれる資格を持っ

ゲノム微生物学会若手の会に参加して信州大学大学院総合理工学研究科 修士課程２年

猪又 俊輔

たスタッフの方々が美味しい焼き方をアドバイスしてく
ださり、楽しい時間を過ごすことが出来ました。夕食後も名酒をいただきながらクロストークができる時間が設
けられており、気が付いたら朝の 3 時まで話し込んでし
まいました。2 日目は朝から昼すぎまで、有識者の方々

私は接合伝達と呼ばれる遺伝子水平伝播現象についての発表が行われました。自分の専門分野とは異なってい研究しています。特に RP4 と呼ばれるプラスミドの伝達ましたが、薬剤耐性に関する研究やメタゲノム、ミニマ

機構を用いて、大腸菌から様々な細菌に DNA 導入を行っ

ルセルなど、興味惹かれる内容ばかりで、他分野の方とています。今現在は RP4 の接合伝達の開始に重要な役割の交流はとても勉強になると改めて感じました。

を果たしている伝達開始起点 (oriT) に着目し、伝達の開

今回の若手の会を通して、自身の研究のモチベーショ始に必要な最小 oriT 領域の特定を目的として研究を行っ

ンの向上、及び専門分野のみならず他分野の方との交流

18News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)
が自身の研究を進めていく上でも重要であることを感じました。また、オンサイトでの学会は自身の研究に関する議論も多く行えるうえに様々な知識を得る事ができる機会だと改めて思いました。コロナ過で数多くの学会がオンラインとなってきたこの 3 年間ですが、これからは徐々にオンサイトでの学会が多く行われていくのかと思われます。
「若手の会」も対面で活発な議論ができる場な

2023 年 1 月 11 日

いません。これまでの私達の研究室の研究より、シアノ
バクテリアの細胞の大きさとゲノムコピー数が正の相関を示すことや、細胞当たりのタンパク質濃度がゲノムコ

ピー数に関わらず一定であることを明らかにしてきました。私は、シアノバクテリアがゲノムを複数持つ理由を解明するために、まずはシアノバクテリア１細胞あたりの転写または翻訳産物蓄積量を計測し、この実験データに基づいて転写または翻訳活性を定量しています。転写ので興味ある方は参加されることを強くお勧めします。 活性と翻訳活性を定量し細胞サイズとそれぞれの活性の最後に黒川さんを始め、若手の会を運営して頂いた皆様、 関係性を明らかにすることで、細胞の大きさとゲノムコ
ルネサンスセンター長である片岡先生、会場や美味しい

食事を提供してくださったホテルラフォーレ修善寺のス
タッフの皆様、並びに本会に参加した皆様に感謝申し上げます。

ピー数の相関関係の解明が可能になります。また、種間比較することでシアノバクテリアに共通するゲノム倍数性の解明に繋がります。

本会の研究発表は、一人あたり 15 分間（学生は 10 分間）の口頭発表から始まりました。研究発表の質疑応答
ではあらゆる観点で議論し合い、とても有意義な時間を過ごすことができました。私の発表の際にも相手に伝わりやすいグラフの作成方法などのフィードバックを頂くことができ、学生ではなく研究者としての作法を教えていただきました。頂いた意見を活かして今後の研究に取り組んでいきたいと思います。夜の食事は屋外でのバー

ゲノム微生物学会
静岡大学

理学部

若手の会

ベキュー形式でした。本会に参加した全員が所属関係な

生物科学科 4 年

してとても盛り上がりました。最初は馴染めるか不安でく、研究について話したり、プライベートの話をしたり奥本 麗奈

したが、隣の席にご一緒した本会主催の片岡正和先生がこの度私は、静岡県のラフォーレ倶楽部修善寺にて開ぐれました。本会に参加することで、日本各地で研究を催された日本ゲノム微生物学会若手の会に参加しました。
本若手の会はコロナ禍で開催できない状況が続いていましたが、今年は久しぶりの開催となり、参加できたことを心より嬉しく思います。私は今年の春に研究室に所属

し研究を始めたため、これまで学会に参加したことはあ

気さくに声をかけてくださったおかげで緊張が一気にほ行っている方たちと研究について意見交換を行うことで、繋がりを持つことができました。今までより広い視野で研究を進めることができると思いました。若手の会に少しでも興味のある方は是非、参加していただきたいと思りませんでした。本会で初めて学外の研究者と意見交換います。最後になりましたが、今回の若手の会を企画・若手の会に参加して感じたことや学んだことをご紹介しより感謝を申し上げます。

をすることができ、とても勉強になりました。本稿では、 運営してくださったスタッフの方々、関係者の皆様に心ます。

私は現在、静岡大学理学部の大林龍胆研究室でシアノバクテリアが持つゲノム倍数性の意義について研究を行っています。多くの原核生物、真核生物においてゲノ
ムの倍数化がみられます。これまで植物での進化可能性

やバクテリアでの UV 耐性向上など倍数体のメリットは報告されています。しかし、本質的な細胞機能としてのゲノム倍数性の意義は不明な点が多く、生育条件下での複数ゲノムコピーを持つことによるメリットや細胞サイ
ズとゲノムコピー数の関係性はほとんど明らかになって19

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

Zooplankton act as cruise ships promoting the survival
and pathogenicity of pathogenic bacteria
Ishara U. Perera1,2，So Fujiyoshi1,2, Yukiko Nishiuchi1, Toshihiro
Nakai3, Fumito Maruyama1,2
1
Hiroshima University・IDEC institute・Center for the Planetary
Health and Innovation Science，2Hiroshima University・Centerfor Holobiome and Built Environment (CHOBE), 3Hiroshima
University・Graduate School of Integrated Science for Life・
Takehara Marine Science Station.

Microbiol Immunol. 1-15 (2022)

Machine learning-assisted discovery of growthdecision elements by relating bacterial population
dynamics to environmental diversity
會田穂乃香，橋詰崇雅 , 芦野一葉 , 應蓓文
筑波大・生命環境

eLife 11:e76846, (2022)
https://doi.org/10.7554/eLife.76846

生命の最も基本的なプロセスである細胞増殖は温度や栄養源といった環境因子に影響を受ける。これらの環境
環境ゲノム科学においてメタゲノム解析が多く用いら 因子は自然界に無数に存在するが、細胞増殖への定量的れるようになり、アンプリコン解析だけでは見えないウ な寄与度がほとんど評価されていない。環境因子が細胞
イルス、細菌、真菌を同時に捉えることができるように 増殖に与える影響を理解するために、本研究は、膨大ななってきた。本稿では、さらにサイズの大きな動物プラ 計測実験に機械学習分析を組み合わせることで、微生物
ンクトンと細菌の関係に着目している。動物プランクト 細胞の増殖と代表的な環境因子である培地成分の関係をンと病原性細菌の相互作用は古くから研究されているが、 初めて定量的にかつ網羅的に調査した。
本研究では、様々な微生物培地の構成成分中に最も代これらの相互作用が非病原性細菌を含めた環境中の細菌
44 種類の化合物を様々な濃
表的な化学成分を絞って、計群集に与える影響については十分な注意が払われていな
い。本総説では、動物プランクトンを細菌の「クルーズ船」 度で混合し、計 966 種類の合成培地を用意した。これらの培地で大腸菌を増殖させ、その経時的変化を測定し、に例えている。クルーズ船では、細菌は増殖に必要な栄12,989 個の増殖曲線を取得した。これらを紐づけること
養を安定的に供給され、ストレス条件からも保護される。
で化学成分 - 増殖ビッグデータを構築し、機械学習分析
さらに、他の細菌種と相互作用することで病原性遺伝子を適用した（図１A）。どの化学成分が大腸菌の増殖にどの水平移動が促進されることから、動物プランクトンはのような影響を与えているのかを推定した。その結果、病原体の格好の輸送船となる。病原性・非病原性にかか
大腸菌増殖における「ラグタイム」、「最大増殖速度」、「最わらず、動物プランクトンに付着する細菌はフリーリビ
大菌体量」の３つの指標の変化にはそれぞれセリン、硫ングの細菌と比較して、より高密度に長い期間存在する 酸イオン、グルコースが優位に寄与していることが明らことが知られている。また動物プランクトンとの相互作 かとなった（図１B）。集団増殖のシミュレーションでは、
用により、細菌は水処理プロセスにも耐え生存・増殖す ３つの増殖指標が同一化学成分で決定される場合に比べ、ることができるため、人間の健康への潜在的なリスクを 異なる成分で決定された時の生存確率が高いことが検証
生み出す可能性がある。このことから、これまで動物プ された。微生物の各増殖期の運命を決める環境因子が異ランクトンと Vibrio spp. の相互作用にばかり注目されて なることが集団全滅のリスクを減らすことを示唆していきたが、ホロビオームの概念を取入れ、病原細菌と他の る。
環境中に生息する生物全体の相互作用を明らかにするこ
これらの研究結果は、リスク分散といった微生物の生とが、リスク管理には重要である。
存戦略への理解に繋ぐものであり、細胞増殖の普遍的モ

https://doi.org/10.1111/1348-0421.13029

デルの構築に膨大なデータとシンプルな法則を提供することにもなる。

動物プランクトンは、病原性細菌のクルーズ船として、環境ス
トレスから細菌を保護し、局所的および世界的な拡散を促進する。動物プランクトンに付着した細菌は、水処理において健康へのリスク要因となる可能性がある。

20

図 1. 研究概要 A 微生物実験とビッグデータ構築の概要。B推定された増殖決定因子。Ser、SO42-、Glc はそれぞれセリン、
硫酸イオン、グルコースを表す。

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

1

History-dependent physiological adaptation to lethal
genetic modification under antibiotic exposure
小金澤優太 1, 梅谷実樹 1-3, 佐藤守俊 1-4, 若本祐一 1-3

東大院総合文化・広域科学，2 東大・複雑系センター，
3

東大・生物普遍性，4KISTEC

2023 年 1 月 11 日

The OceanDNA MAG catalog contains over 50,000
prokaryotic genomes originated from various marine
environments1

西村陽介 1，吉澤晋 1,2

東京大・大気海洋研，2 東京大・院・新領域

elife 11:e74486 (2022)

Sci. Data 9, 305 (2022)

https://doi.org/10.7554/eLife.74486

https://doi.org/10.1038/s41597-022-01392-5

遺伝子型 - 表現型対応を理解するため、遺伝学的解析では遺伝子型変化の発生から充分に時間が経過した後の表現型を観察する。しかし、遺伝子型変化が起きた直後からその影響が表現型変化へ波及していく過程の理解はこれまで進んでいなかった。我々は遺伝子型変化の発生後の表現型のダイナミクスを観察するため、遺伝子欠失を青色光照射により任意のタイミングで誘導可能な Photoactivatable Cre（PA-Cre）システムと、細胞動態を 1 細胞レベルで長期間観察できるマイクロ流体デバイスを組み合わせた。抗生物質クロラムフェニコール (Cp) 耐性遺伝
子を染色体上に持つ大腸菌をモデルに用い、マイクロ流体デバイスに導入した。そして本来、耐性遺伝子なしでは細胞が増殖できないと考えられる濃度の Cp 環境下で培養し、青色光を照射して耐性遺伝子を除去した。その結果、
約 40％の細胞が一時的に成長をほとんど停止した後、徐々に回復し安定した分裂を示した。耐性遺伝子欠失に適応した細胞で、その他の遺伝子変異は確認されなかったた
め、この適応は表現型レベルの変化で実現したと考えられる。さらに遺伝子欠失から Cp 投与までの時間を段階的に変化させた。その結果、遺伝子欠失から Cp 投与までの時間が 3 時間以内では適応細胞の割合はほとんど変化しなかったが、それ以上時間が経過するとその割合は減少
し、10 時間以上では適応細胞が出現しなかった。以上の結果は、大腸菌細胞は外的ストレスに限らず、遺伝子型変化という内的ストレスに対しても履歴依存的に適応できることを示しており、薬剤耐性菌の出現、進化、拡散を考えるうえで重要な知見であると考える。

青色光照射により遺伝子除去を誘導する PA-Cre システムと、
マイクロ流体デバイス内の大腸菌細胞

21

海洋環境には「微生物ダークマター」と呼称される、未知の微生物が数多く残されています。これらの微生物がどのような生態を持ち、どういった進化を遂げてきたのかについては、謎に包まれてきました。本研究では、
メタゲノムデータを用いて、個々の微生物ゲノム（一般に、「MAG」と呼ばれる）を解読する手法を開発しました。特に、ゲノム断片配列の様々な特性を解析すること
で、ゲノムに誤って含まれた断片配列を検出・除去するためのソフトウェア MAGRE を開発し、GitHub で公開しています。この手法を用いて、公共データベースから入手可能な、様々な海洋環境に由来する計 29 兆塩基対からなる大規模メタゲノムデータを解析しました。その結果、59 門 8,466 種にまたがる 52,325 個の高品質な原核生物ゲノムの解読に成功し、得られたゲノムの情報を整備
して、世界最大の海洋生物ゲノムカタログ「OceanDNA
MAG カタログ」として公開しました。本ゲノムカタロ
グは約 15,000 ゲノムを収載する海洋微生物ゲノムデータ
ベース MarDB などの既存のゲノムリソースの規模を大幅に上回っています。
本研究は、「微生物ダークマター」に相当するゲノム配列を多数解読することで、海洋原核生物ゲノムの多様性に関する知識を大幅に拡充しました。また、OceanDNA
MAG カタログは、海洋微生物の生態や進化の過程の解明に貢献するとともに、地球環境保全に取り組むための重
要な知識基盤となることが期待されます。

OceanDNA MAG カタログの概要

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

ドの IPTG を終濃度 1 mM になるように３本ずつのフラス
コに加え、同条件で培養を行いました。培養開始から 30

IPTG は安いグレードでも大丈夫？
豊橋技術科学大学

大学院工学研究科

分ごとに細胞の OD600 を測定しました。培養開始から 5h後に細胞を遠心分離で回収し、3.0 mL の緩衝液に細胞を懸濁し、細胞を破砕し、変性・還元処理後、SDS-PAGE

によってタンパク質の発現量を評価しました。（腕が衰え応用化学・生命工学系 准教授

ないよう、私自身の手で実験を行いました。）

広瀬 侑細胞の増殖曲線を調べてみると ( 図 1)、99.0% グレー

タンパク質の発現・精製実験は、分子生物学実験において最もよく行われる実験の一つです。特定の生物種の持つタンパク質を大腸菌に発現させ、精製することができれば、そのタンパク質の性質を詳細に調べることができます。また、大量に調製することができれば、NMR

や X 線結晶構造解析などの手法によって、構造解析も可能となります。大腸菌におけるタンパク質の発現・精製 で は、 内 在 の lac プ ロ モ ー タ の 活 性 を Isopropyl-β-D-

thiogalactopyranoside（IPTG）の添加によって誘導し、それを利用して強力な T7 プロモーターの活性を誘導する
pET システムがよく使われています。

分子生物学実験でよく使われる IPTG は、純度 99.0%の HPLC 精製のグレードで、国内試薬メーカーから 10g で定価 3 万円ほどで販売されています。私はこれま

ドと、97% グレードのどちらの IPTG を添加した場合でも大腸菌の増殖曲線に大きな差は見られませんでした。
IPTG 精製時に混入する不純物が大腸菌の増殖を阻害していることはなさそうです。続いて、SDS-PAGE によるタンパク質のバンドの強度を比較しました ( 図 2)。どちらの条件においてもタンパク質の発現量に明確な違いは見られませんでした。これらの結果は、97% グレードの
IPTG を用いても、99.0% グレードの IPTG を用いた場合と同等の発現誘導を行うことができる可能性を示しています。タンパク質の発現系の評価は、目的とするタンパ
ク質によって最適化する必要があるため、どのタンパク質においても 97% グレードの試薬で十分かどうかはわかりませんが、皆さんの研究室でも検討してみてはいかがでしょうか？

でこのグレードの IPTG を購入してきました。ある日、

細胞回収

4

IPTG の在庫が無くなったので、オンラインで価格の安

99.0% IPTG

い IPTG を検索していたところ、97% グレードの IPTG 試

97% IPTG

3

薬が 100g で定価 5.4 万円で販売されていました。これは99.0% グレードの試薬と比べて 1/6 〜 1/7 の価格です。説

明書をよく見てみると、99.0% グレードの試薬には、抽OD 600出時に使用する有機溶媒ジオキサンが含まれていないと

2
IPTG添加書いてあるのですが、97% グレードの試薬にはそのよう

1な記載がありませんので、ジオキサンや他の混入物があるのかもしれません。しかし、大腸菌培養に使用する 1Lの LB 液体培養液（乾燥重量 20 g）に添加する IPTG は 1

0mM（238 mg）であり、その 3% 程度（7 mg 程度）混入

替えることができれば、研究費の節約につながります。
M

Ctrl

実験手順は以下の通りです。タンパク質発現系として、用しました。100 mL 三角フラスコ 6 本のそれぞれに 50

ml の LB 液体培地と抗生物質を加え、前培養液を移し、37℃で 180 rpm の速度で震盪培養を行いました。培養開始から 2.5 時間経過後に 99.0% グレードと、97% グレー

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3

4

5

99.0% IPTG

97% IPTG

1

4

2

3

5

6
発現タンパク質

シアノバクテリアの光受容体タンパク質 RcaE の発現系を使用しました（1）。大腸菌ホストとしては C41(DE3) を使

2

図 1. 大腸菌の増殖曲線 (n=3, エラーバー : 標準誤差 )はないかと考えました。もし、97% グレード試薬に切り現実験を行ってみました。

1

培養時間（h)物があったとしても、タンパク質発現は誘導されるのでそこで、グレードの異なる IPTG を用いてタンパク質発0

図 2. SDS-PAGE によるタンパク質発現量の比較

参考文献

1) Hirose Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110: 4974- 4979
(2013)

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

今年の８月から９月にかけて二週間ほどドイツのコンスタンツに滞在したのですが、その間コンスタンツから見えるスイスア
ルプスの Säntis という山の麓まで行く機会がありました。そこで出会ったたくさんの花のうちの 2 種をお目にかけます（表示してある名前は正式な和名ではありません）。その他の花も皆さんがあまり見たことがないと思われる秋の花です。フヨウカタ
バミは南アフリカ原産の帰化植物です。
（磯野克己）

クズ ( マメ科）：Pueraria lobata Ohwi, 2020.9.13 神戸市

アキノノゲシ（キク科）：Lactuca indica L., 2022.9.29 神戸市

チャボアザミ（キク科）：Carlina aculis L.,
2022.8.26 スイスアルプス

ツルソバ（タデ科）：Persicaria chinensis H.Gross,2022.10.23 富津市（千葉県）

アイブライト（ゴマノハグサ科・コゴメグサに近縁）：

フヨウカタバミ（カタバミ科）：Oxalis purpurea L.,

Euphrasia rostkoviana Hayne, 2022.8.26 スイスアルプス

2021.12.12 神戸市

23News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 26)

2023 年 1 月 11 日

ゲノム微生物学会ニュースレターは今回で 26 号目となります。学会ホームページのニュースレターのコーナーにこれまで発行した号がアーカイブされています。また、ここに編集委員がリストされていますが、初代の委員は磯野克己先生でかずさ DNA 研究所

田畑す。編集委員は代替りしましたが、磯野先生の編集方針は継承されています。編集委員会は春と秋に Zoom で開催して、年哲之

会での話題や最新のトピックスについて、議論しながらコン

日本ゲノム微生物学会第 17 回年会を、2023 年 3 月 8

テンツを考えています。25 号は特別企画として原核生物の命名規約法を取り上げご好評いただきました。26 号ではその企日（水）〜 10 日（金）の 3 日間、かずさアカデミアホー

画に加えサンガーシーケンスのコツについての記事を掲載し夏以降、他学会の年会はオンサイト開催を基本として毎回閑話休題として野山に咲く花々のお写真をいただいていル（千葉県木更津市）にて開催いたします。

開催されており、一般的な感染対策を講じた上で、ほぼ通常通りのプログラムで実施されているようです。感染状況は相変わらず落ち着きませんが、総合的に考えれば3 月の本学会年会もオンサイト開催の可能性が極めて高いと思われます。多くのセッションをオンライン配信する予定で準備が進んでいますが、ご都合がつくようであております。一方、季節を感じるコーナーとして磯野先生より、ます。ホッとするコーナーとして楽しみにしていただいている方も多いのではないでしょうか。ご執筆いただきました方々に感謝申し上げます。今後ともニュースレターをご愛読いただけますと幸いに存じます。

ところで、微生物の研究をしているとラボのフリーザーにはレポーター導入株など構築した株がどんどん貯まっていき

ればぜひ木更津までお越しください。

ます。フリーザーには先代からの菌株もストックされています。なかには 500 株もの菌株を作製する大学院生もいますの

ショートトーク付きポスター発表、さらにシンポジウム

が経つにつれ、苦労して作製した菌株が無事に次の代に継承

加でお願いします。感染状況にもよりますが、会場でのの保存と分譲事業（NBRP）が進められています。ご存じの方も多いと思いますが、NBRP の HP には、多くの微生物事業が発 表 形 式 は、 コ ロ ナ 前 の 年 会 と 同 じ く 口 頭 発 表 とで、毎年リストと照合し、整理をしています。しかし、年数も検討されています。発表者は原則としてオンサイト参されるのか不安になります。2002 年から作製した細胞・菌株

簡単なミキサーは開催、全体での懇親会は開催せず、木
更津駅付近の飲食店で小規模に歓談をお楽しみいただくことになりそうです。年会の詳細や宿泊情報は随時年会

HP を通じて提供されますので、こまめにご確認いただきますようお願いします。

すでにアナウンスしていますように、今回の年会は「原掲載されています。例えば、大腸菌・枯草菌の NBRP 事業など。
分譲株のリストは分かり易く、魅力的な菌株がラインナップ

されています。研究室のフリーザーに眠っている菌株を積極的に NBRP に寄託すると、それらの分譲・利用を通じて微生物研究のコミュニティーの輪が広がります。NBRP 事業の HPの URL を記します。是非とも積極的に利用ください。（佐藤）点に戻って」がメインテーマです。社会の状況、研究環境、 https://nbrp.jp
微生物科学の現状について、この機会に一度立ち止まって「原点に戻って」考え、新たな一歩に向かって意見を交換する楽しい時間を提供できれば幸いです。かずさア

カデミアホールで皆さんにお会いできることを心から楽しみにしています。

２０２２年度日本ゲノム微生物学会役員
会長：黒川 顕庶務幹事・会計幹事：大島 拓、渡辺 智
集会幹事：河野 暢明、森 宙史
広報幹事：矢原 耕史、大島 拓
ニュースレター幹事：

佐藤 勉、相馬 亜希子、大坪 嘉行、佐々木 裕子、広瀬 侑
男女共同参画幹事：相馬 亜希子

評議員 ( 会長推薦を含む ): 朝井 計、跡見 晴幸、飯田 哲也、
岩崎 渉、大西 康夫、永田 裕二、仁木 宏典、布浦 拓郎、
野尻 秀昭、林 哲也、本郷 裕一、南澤 究、市川 夏子、
大林 龍胆、神沼 英里、島田 友裕
会計監査：阿部 貴志、伊藤 武彦

会員の動向
一般会員 345 名、学生会員 142 名、名誉会員 3 名賛助会員 9 名、機関会員 1 名（計 500 名）

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