Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 4, No. 2, 131–137, 2005

総

説（一般）

自然生態系における細胞外 DNA の動態と遺伝子伝播
Dynamics and Contributions to Horizontal Gene Transfer of Extracellular DNA
in Natural Ecosystems
丸山

史人，谷

佳津治，那須正夫*

FUMITO MARUYAMA, KATSUJI TANI and MASAO NASU
大阪大学大学院薬学研究科遺伝情報解析学分野（衛生化学） 〒565–0871 大阪府吹田市山田丘1–6* TEL: 06–6879–8170 FAX: 06–6879–8174* E-mail: nasu@phs.osaka-u.ac.jp
Environmental Science and Microbiology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, 1–6,
Yamada-oka, Suita, Osaka 565–0871, Japan
キーワード：細胞外 DNA，遺伝子伝播
Key words: extracellular DNA, horizontal gene transfer
（原稿受付

1.

2004年 7 月10日／原稿受理

はじめに微生物が新たな環境へ適応する上で，遺伝子の水平伝達が重要な役割を果たしている。また遺伝子伝播は微生
物 の 進 化・ 多 様 化 に お い て も そ の 一 端 を 担 っ て い
る11,29,36)。遺伝子伝播の主な様式として，細胞またはウイ
ルスの殻の外に存在する DNA である裸の DNA による形質転換，細胞どうしの接着により起こる接合，ウイルスに仲介される形質導入があり，20世紀半ばまでにその機構が明らかになっている22,39,40,71)。以来，これらは遺伝
子導入・遺伝子組換え技術に応用され，生物学の発展に大きく寄与するとともに，有用物質の生産などを通じて
我々の生活の向上に貢献している。一方，近年の遺伝情報解析技術の発展により，地理的・系統的に離れた生物
種が，同じ起源を持つ遺伝子を水平伝播により共有していること，そして細菌ゲノムの中には外来遺伝子が，大きな割合で存在していることがわかってきた11,29)。これらの知見は病原微生物の抗生物質耐性遺伝子や毒素遺伝子の獲得機構を解明する上で，また組換え生物の野外利用における生態系への影響を評価する上で，遺伝子伝播を考慮することが重要であることを示している。
これまでの実験室内での研究では，三つの遺伝子伝播様式の中で，接合が最も高い頻度で伝播することが知られている。さらに系統的に懸け離れた生物種，例えば大腸菌から酵母の間での遺伝子の接合伝達が報告されている56)。一方，形質転換や形質導入は伝播頻度が接合にく
らべると低く，さらにウイルスは宿主域が極めて限定されているため，自然環境中においても，これらの遺伝子伝播への寄与は小さいと考えられてきた48)。
これまでの研究は，実験室で十分な生理活性を持つ細菌を用いて行われてきた。しかし，自然環境中に生息す2004年11月24日）

る微生物の多くは，貧栄養な状態にあるため，実験室で培養した場合とは異なり，高い生理活性を保持していない1)。接合は細胞間での DNA の受け渡しであるため，供与菌・受容菌ともに十分な生理活性を保持している必要がある12,42)。一方，細胞またはウイルスの殻の外に浮遊している裸の DNA を受容細菌が取込む形質転換やウイル
スによって仲介される形質導入では，受容細菌のみがDNA を取込む生理活性を保持していればよい。さらに環境中には，裸の DNA やウイルスが多量に存在してい
ることがわかってきた。すなわち，環境中においてこれ
ら形質導入および形質転換が遺伝子伝播に大きく寄与している可能性が考えられる。
本総説では細胞外 DNA，すなわちウイルスおよび裸の DNA の自然環境における現存量，存在様式，由来と役割，そして遺伝子伝播への寄与についてこれまでの研究を紹介し，今後の細胞外 DNA 研究の展開について考える。
2.

細胞外 DNA の現存量と存在様式

細胞外 DNA の現存量は，河川・海洋などの水圏では0.2–88 ng/ml12,42)，海底の堆積物においては乾燥重量 1 g
あたり 1 ng–31 µg と報告され，その場に生息する全細菌の DNA 量の25倍にも達することが知られている13)。
また，その分子量・半減期についても多く報告がなされている (Table 1)。一方，電子顕微鏡を用いたウイルス計
数法が1989年に導入され，考えられていた以上に多量のウイルスが海水中に存在していることが明らかになった4)。その後，河川，湖，海洋，土壌，堆積物等の自然環
境におけるウイルスの現存量が電子顕微鏡を用いて調べられ (3×103–9.6×108 viruses/ml)，その数は細菌数の0.03

丸山

132

他

Table 1. Abundance and persistence of extracellular DNA in natural environment.
Location
Fresh water
Estuarine
Offshore/oceanFreshwater sediment
Marine sedimentab

Molecular size (kbp)

DNA concentration(ng/ml or ng/ga)

Half-life (h)NDb
0.12–35.2
0.24–14.3
1.0–23.0NDb

0.5–88
6–44
0.2–5.0
1.0a5,860–31,100a

4–5.5
3.4–5.5
4.5–83NDb
140–235

DNA concentration in sedimentNot determined–76倍であることがわかった69)。近年，核酸染色剤を用いて蛍光顕微鏡下で計数を行う直接計数法がウイルスにおいても可能となり5,8)，一般的にその数は細菌数の20倍と，電子顕微鏡を用いた従来の方法と比較した場合に，より多くのウイルスが環境中に存在していることが明らかとなっている (Table 2)21,69)。このウイルスと裸の DNA を含む細胞外 DNA を超遠心により分離し31)，DNase により
裸の DNA を分解することで，細胞外 DNA におけるウ
イルス DNA の占める割合は20％（1.6–77.1％）程度であることが分かっている66)。ウイルスの大きさは 20–750 nm（多くが 60–80 nm）であり，そのゲノムサイズは一般的に 40–80 kbp である21,69)。一方，裸の DNA の長さ
は 0.15–35.2 kbp であり，遺伝子をコードするのに十分な大きさを保持している12,63,64)。さらに，粘土粒子等へ結合することで数カ月間にわたって分解されることなく裸の DNA が環境中に残存し，形質転換能を保持していることが分かっている42,51)。このように環境中には，細胞外DNA が種々の形態で豊富に存在し，その一部は遺伝子のプールとなっていると考えられる。

Table 2. Abundance of viruses in natural environment.
Location

Total number (viruses/ml)

Viruses/bacteria

Opean ocean
Coastal ocean
Estuarine
Freshwater

3×103–1.5×107
5×103–4.6×108
2.6×106–9.6×108
1.5×105–2.5×108

1.0–500.7–72
0.4–500.03–76

1.4×108

20

Average3.

細胞外 DNA の産生と役割

細胞外 DNA は，真核・原核生物，およびそれらに感染するウイルスに由来する (Fig. 1)。細菌由来の細胞外DNA の産生機構として，細菌の死，原生動物等による捕食，ウイルスによる溶菌，増殖時期の一定期間に分泌42)，低分子フェロモン物質による細胞間の quorum
sensing に誘導される分泌，自己溶解35,58)，および真核藻類との相互作用による分泌45)，が知られている。また産生される DNA の形態としては，DNase 感受性の裸のFig. 1. Dynamics and roles of extracellular DNA in natural environment.

細胞外 DNA の動態と遺伝子伝播

DNA のほか，大腸菌 O157:H7 では DNase 非感受性のDNA vesicle, Rhodobacter capsulatus では gene transfer
agent (GTA) が報告されている57,70)。一方ウイルスの産生は，宿主の溶菌を伴い，裸の DNA と共に放出される場
合と，M13 ファージに見られるような宿主の溶菌を伴わない budding に分けられる21)。このように細胞外 DNA
は種々の様式で産生されるため，環境中に存在する細胞
外 DNA を研究するためには，これらの由来となる細菌を知ることが重要な課題となっている。その手段として，裸の DNA を除去し，ウイルス殻中に存在する宿主由来の 16S rDNA の解析を行うという方法がある54)。このような裸の DNA とウイルスの分離により，細胞外DNA の由来が明らかになっていくと考えられる。
裸の DNA の役割としては，特に貧栄養条件下にある細菌にとってのリン，窒素源18,52)，変異を起こした遺伝
子 を 修 復 す る た め の 材 料， が 挙 げ ら れ る18)。 例 え ば
Bacillus subtilis においては UV 照射後に細菌の DNA 取込み能力が上がり，取り込んだ DNA との組み換えによりゲノムの変異を修復することが知られている28)。そして形質転換することにより，細菌に新しい形質を与える役割も担っている。Neisseria や Haemophillus では特定の DNA 配列を認識して，近縁種の DNA を取り込むことが報告されている18,42)。さらに Pseudomonas aeruginosa
では，裸の DNA を DNase により分解することでバイオフィルム形成が阻害されることから，バイオフィルム形成に必要な因子であることが分かっている67)。ウイル
スも裸の DNA 同様，細菌にとっての栄養源となることが報告されている21,69)。またウイルスはコートタンパク質に被われているため裸の DNA に比べると，より安定
して環境中に存在すると考えられ，裸の DNA に比べ安定な遺伝子プールとしての役割や，宿主の個体数制御，
すなわち環境中において特定の細菌種が増え過ぎないよ
うに微生物群集の多様性を維持する役割，を担ってい133

る21,26)。さらに宿主を溶菌することで，裸の DNA を含む
溶存態有機物 (dissolved organic matter, DOM) の産生にも関与している69)。
細胞外 DNA の由来や役割はまだ明らかになりはじめたばかりである。近年になって，海水試料中の全ウイル
スの DNA 配列決定から，これまでに知られていない多くの配列が見つかっている7)。これは細胞外 DNA が新規
遺伝子の宝庫であることを意味するだけではなく，未知の役割の存在を示唆していると考えられる。
4.

細胞外 DNA の遺伝子伝播への寄与

細菌の自然形質転換能は，受容細菌に物理化学的な処
理を施すことなしに指標となる遺伝子を持つ同種の細菌
ゲノムを取り込むかどうかによって調べられている。その結果，60以上の細菌種において自然形質転換能を持つ
こと16,51,62)，形質転換の頻度が細菌の増殖時期，培養に用いる培地，温度等に影響を受けることが明らかとなっている12)。さらに環境因子を最適化した条件下では，Agrobacterium, Legionella や大腸菌などのこれまで自然形質転換能を持たないとされてきた細菌種でも形質転換能を持つことがわかってきた3,15,59)。また海水から単離した細菌の10％が，プラスミドを取込む能力があり，14％が染色体を取込む能力を保持していた20)。自然形質転換能を持つ細菌種の系統樹および，その形質転換頻度をまとめた (Fig. 2)。自然形質転換能を持つ細菌種は古細菌を含め系統的に多岐にわたっており，今後も自然形質転換能を持つ細菌種は発見されていくと考えられる。
一般的にウイルスによる形質導入は伝播頻度が低いことから，遺伝子伝播への寄与は小さいとされてきた69)。
しかし，ゲノム解析により配列の決定した細菌の多くが，ゲノム内にウイルス遺伝子を保持していることが明らかとなった。例えば，Borrelia においてはゲノムの20％，Fig. 2. Natural transformable species around the microbial world. The phylogenetic tree was described based on 16S ribosomal DNA.
The value indicates transformation frequencies reported in the bacterial group.

丸山

134

他

大腸菌 O157 においてはゲノムの12％がウイルス由来であり，ゲノム中に20個ものウイルスを保持している29)。
さらに臨床由来の Salmonella typhimurium のうち少な
くとも90％以上が溶原菌であった55)。また遺伝子情報解析により，ある宿主に感染できないウイルスであっても，その宿主に感染するウイルスと共通の遺伝子を保持していることが明らかとなっている。これらのウイルス
は 1 つの宿主に同時に感染することでウイルスゲノム同士が組み換えを起こしたことを示唆している25)。さらに
大腸菌，Shigella, Pseudomonas, Sphaerotilus, Rhodospirillum など異なる属種にも感染可能な広宿主域のウイルスが見つかっている30)。また高熱細菌や数種の海洋細菌より単離したウイルスが系統的にかけ離れた大腸菌や枯草菌に高い頻度で形質導入を起こすことが明らかとなっている9,10)。今後このような複数種の宿主を用いた研究により，広宿主域のウイルスが発見されていくものと考えられる。
5.

モデル生態系における遺伝子伝播実験

これまで河川や海洋といった自然環境においても遺伝子伝播が起きていることが示されている (Table 3)。しかし自然環境においては，物理化学的および生物学的因子が複雑であることから，環境因子と遺伝子伝播の関係を明らかにすることは困難である。そこでマイクロコズム
を用いて河川や海洋の浮遊層，バイオフィルム，堆積物や土壌などの遺伝子伝播の場，伝播に影響を与える温度や栄養などの環境因子，細菌の増殖期に関する検討が行われている2,48)。実際の環境により近いマイクロコズムを作製することで自然環境での伝播を推定できることから，自然環境より採取した細菌群集を用いた研究も報告されている17)。また植物の葉の表面49)，歯垢41,65)，人のだ
液47)，牛乳等の食料品6)においても遺伝子伝播が起こっていることを示す報告もあり，さらに新たな環境因子として雷14)，抗生物質，難分解性化学物質等の影響11) も研究されている。このようにマイクロコズムを用いた研究により，自然環境中での実施が困難な実験系での遺伝子伝播や伝播に与える物理化学的因子，さらには細菌の捕食者である原生動物や生産者である微細藻類のような生物的因子の影響を明らかできると考えられる2,45,46)。
6.

蛍光タンパク質の遺伝子伝播研究への利用

これまでの遺伝子伝播実験において，形質を獲得した細菌の検出は選択培地での増殖能にもとづいて行われてきた。培養法は，平板培地上にコロニーを形成させ分離・純培養することで，個々の形質を獲得した細菌の種類や性状を解析することが可能となる点で優れている。しかしながら，自然環境中に生息する多くの細菌は，従来の培養法では検出困難であるため，培養法を用いた場合には，遺伝子伝播頻度を過小評価している可能性がある。
また指標とする遺伝子の選択が難しく，例えば試料中に抗生物質耐性を持つ細菌が既に存在している場合は，その抗生物質耐性遺伝子を指標とすることができない。そこで通常の環境にはほとんど存在しない，水銀耐性や難分解性化学物質分解遺伝子等が利用されてきた11)。しかしながら，その場合には，重金属や有害な化学物質を用いなければならないため，利便性を欠いている。そこで細菌には存在しない遺伝子である green fluorescent protein (GFP) 遺伝子が，主に接合実験に利用されてきている19,48,49)。
GFP 遺伝子の発現は，蛍光顕微鏡下で確認できるため，これまでよりも高感度に遺伝子伝播を捉えることが可能である11,19)。例えば，環境試料を用いた接合実験において，蛍光顕微鏡下で GFP を発現している細菌，すなわち接合体を計数した場合に培養法の1000倍もの高い伝播頻度が得られている23)。また培養を伴わずにシング
ルセルレベルで検出することで，遺伝子伝播がバイオフィルム中のどの位置で起きているのかという空間情報を得ることができるようになった19)。GFP を用いた方法

Table 3. Horizontal gene transfer studies in natural environment.
Modelocationa

Transfer frequencyb

Phenotypec

Recipient

Source of DNAd

Reference No.

TFe
TF
TF
TF
TF
TF
TF
TF
TF
TDf
TD

River plankton
River biofilm
River plankton
River biofilm
River plankton
River plankton
River biofilm
River biofilm
River biofilm
Marine plankton
River plankton

1×10–2
1×10–4
1×10–72.2×10–6–1.0×10–3<1×10–4
1×10–79.6×10–5
2×10–72.1×10–7
1.6–3.7×10–8
10–4–10–5

his–
his–
Hgr
Hgr
his–
Hgr
Hgr
his–
Hgr
kan, smr
Cb, smrA. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus
A. calcoaceticus

LysateLysateLysateLysateViable cell
Viable cell
Viable cellindigenous
indigenous
phage
phage

12
12
12
68
12
12
68
12
68
32
53

indigenous
indigenous

Study location of horizontal gene transer
Transfer frequency: transformant/CFU or transductant/PFUc
Phenotype for selection of transformant or transductant
his–, histidine prototroph; Hgr, mercury resistance; kan, kanamycin resistance; sm, streptomycin resistance; Cb, carbenicillin resistancedSource of donor DNA for transformation or transductioneTransformationfTransductionab

細胞外 DNA の動態と遺伝子伝播

は，バイオフィルム中の形質転換体の検出にも用いられており24)，これまで形質転換体数を検出するには，少な
くとも 1 ng/ml のプラスミドが必要であったのに対し，
GFP を指標として用いた場合には 1 fg/ml で十分検出できることが示されている。しかし環境試料での遺伝子伝播実験をより高い精度で行うためには，検出に十分な量の GFP が発現していない細菌や GFP の遺伝子が発現せずに細胞内に安定して維持されている細菌を，どのように検出するのかという課題を解決しなくてはならな
い。
7.

今後の展開

ここまで述べたように，自然環境中において細胞外DNA は細胞内 DNA よりも多量に存在している。裸のDNA は遺伝子をコードするのに十分な大きさで存在
し，遺伝子としての機能を保持している。さらに形質転換が起こる細菌種は多岐に渡っており16,51,62)，環境中においても形質転換が起きることが明らかとなっている。またゲノム解析からウイルスが遺伝子伝播において重要な役割を果たしており，ウイルスの中には極めて広い宿主域を持つものが存在することが分かってきている9,10)。このため，環境中での遺伝子伝播を研究するにあたっては細胞のみならず，細胞外に存在する DNA も同時に研究していくことが重要である。そのためには遺伝子の流れそのものを考慮して研究していく必要がある。
GFP の利用により遺伝子伝播研究は新しい局面を迎えた。今後，細胞内の発現していない遺伝子を標的として in situ PCR37,38,60,61), in situ LAMP43), SEM-ISH33), in
situ RCA44), CPRINS34) 法等のシングルセルレベルでの検出法を用いることにより，遺伝子伝播の頻度をより高精度に把握し，遺伝子伝播の場や伝播に影響を与える環
境因子がより明らかになると期待される。また細胞外DNA をウイルス，裸の DNA に分離した後に，定量的PCR を合わせて用いることで細胞内，細胞外の遺伝子の流れを定性的，かつ定量的に理解していくことができるものと考えられる。
8.

おわりに

近年になって，gene ecology という遺伝子を総合的に扱う学問分野が提唱されている。gene ecology とは，既知の遺伝子がゲノム・生理状態・外部環境との相互関係の中で，どのように機能し，変化（変異・組換え）するのかとともに，その動態（移動・伝播）を解明し，遺伝子改変技術の評価や創薬を行う学問領域である27)。組換
え生物の指標遺伝子や抗生物質耐性遺伝子に加え，その遺伝子を持つ生物の環境中での消長を明らかにすることも，gene ecology における主要なテーマのひとつとなっている。これまでに裸の DNA がバイオフィルム形成に必須な因子であり67)，Neisseria や Haemophillus では，
特定の短い塩基配列が細胞外の DNA を取り込むためのシグナルであることが報告されている18,42)。また海水試料の全ウイルスの塩基配列のうち65％が，新規の塩基配列であることが明らかになっている7)。すなわち環境中における遺伝子・核酸の流れを明らかにし，生態学的側面

135

から考察するにあたっては，gene ecology で対象となっている遺伝因子として明らかな核酸のみならず，未知の遺伝子および機能を有する物質としての両面を考慮する必要がある。
本総説においては細胞外に存在する DNA を中心に述べてきたが，自然環境中においては細胞外 RNA も細胞
外 DNA と同様に多量に存在している13,63,66)。また既知の遺伝子を持つ核酸だけを捉えるのではなく，核酸そのものを研究することで生態系における新たな核酸の役割を発見する可能性もある。すなわち，gene ecology の概念に加え，栄養としての核酸18,21,52,69)，生理活性の指標としての RNA50)，そして機能が明らかにされていない核酸配列も考慮する学問分野が必要となる。今後，環境中での遺伝子，核酸の流れを理解するにあたっては，より包括的に核酸を対象とする生態学の発展が期待される。
文

献1) Amann, R.I., W. Ludwig, and K.-H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual
microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:
143–169.
2) Ashelford, K.E., J.C. Fry, M.J. Day, K.E. Hill, M.A.
Learner, J.R. Marchesi, C.D. Perkins, and A.J. Weightman.
1997. Using microcosms to study gene transfer in aquatic
habitats. FEMS Microbiol. Ecol. 23: 81–94.
3) Baur, B., K. Hanselmann, W. Schlimme, and B. Jenni.
1996. Genetic transformation in freshwater: Escherichia coli
is able to develop natural competence. Appl. Environ.
Microbiol. 62: 3673–3678.
4) Bergh, Ø., K.Y. Børsheim, G. Bratbak, and M. Heldal.
1989. High abundance of viruses found in aquatic environments. Nature 340: 467–468.
5) Bettarel, Y., T.S-. Ngando, C. Amblard, and H. Laveran.
2000. A comparison of methods for counting viruses inaquatic systems. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2283–2289.
6) Bräutigam, M., C. Hertel, and W.P. Hammes. 1997. Evidence for natural transformation of Bacillus subtilis infoodstuffs. FEMS Microbiol. Lett. 155: 93–98.
7) Breitbart, M., P. Salamon, B. Andresen, J.M. Mahaffy,
A.M. Segall, D. Mead, F. Azam, and F. Rohwer. 2002.
Genomic analysis of uncultured marine viral communities.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 14250–14255.
8) Chen, F., J.-R. Lu, B.J. Binder, Y.-C. Liu, and R.E.
Hodson. 2001. Application of digital image analysis andflow cytometry to enumerate marine viruses stained withSYBR gold. Appl. Environ. Microbiol. 67: 539–545.
9) Chiura, X.H. 1997. Generalized gene transfer by virus-likeparticles from marine bacteria. Aquat. Microb. Ecol. 13:
75–83.
10) Chiura, X.H. 2002. Broad host range xenotrophic genetransfer by virus-like particles from a hot spring. Microbes
Environ. 17: 53–58.
11) Davison, J. 1999. Genetic exchange between bacteria in theenvironment. Plasmid. 42: 73–91.
12) Day, M. 2002. Transformation in aquatic environment, pp.
63–80. In M. Syvanen and C.I. Kado (ed.), Horizontal
Gene Transfer, Academic Press, London.
13) Dell’anno, A., M. Faviano, M.L. Mei, and R. Danovaro.
1999. Pelagic-benthic coupling of nucleic acids in an abyssal
location of the northeastern Atlantic Ocean. Appl. Environ.
Microbiol. 65: 4451–4457.
14) Demanéche, S., F. Bertolla, F. Buret, R. Nalin, A. Sailland,
P. Auriol, T. M. Vogel, and P. Simonet. 2001. Laboratoryscale evidence for lightning-mediated gene transfer in soil.

136

丸山

Appl. Environ. Microbiol. 67: 3440–3444.
15) Demanéche, S., E. Kay, F. Gourbiére, and P. Simonet.
2001. Natural transformation of Pseudomonas fluorescens
and Agrobacterium tumefaciens in soil. Appl Environ.
Microbiol. 67: 2617–2621.
16) de Vries, J., P. Meier, and W. Wackernagel. 2001. The
natural transformation of the soil bacteria Pseudomonas
stutzeri and Acinetobacter sp. by transgenic plant DNA
strictly depends on homologous sequences in the recipient
cells. FEMS Microbiol. Lett. 195: 211–215.
17) DiGiovanni, G.D., J.W. Neilson, I.L. Pepper, and N.A.
Sinclair. 1996. Gene transfer of Alcaligenes eutrophus
JMP134 plasmid pJP4 to indigenous soil recipients. Appl.
Environ. Microbiol. 62: 2521–2526.
18) Dubnau, D. 1999. DNA uptake in bacteria. Annu. Rev.
Microbiol. 53: 217–244.
19) Errampalli, D., K. Leung, M.B. Cassidy, M. Kostrzynska, M.
Blears, H. Lee, and J.T. Trevors. 1999. Applications of thegreen fluorescent protein as a molecular marker in environmental microorganisms. J. Microbiol. Methods. 35: 187–
199.
20) Frischer, M.E., G.J. Stewart, and J.H. Paul. 1994. Plasmidtransfer to indigenous marine bacterial populations by natural transformation. FEMS Microbiol. Ecol. 15: 127–136.
21) Fuhrman, J.A. 1999. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature 399: 541–548.
22) Griffith, F. 1928. The significance of pneumococcal types. J.
Hyg. 27: 113–159.
23) Hausner, M., and S. Wuertz. 1999. High rates of conjugation in bacterial biofilms as determined by quantitative insitu analysis. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3710–3713.
24) Hendrickx, L., M. Hausner, and S. Wuertz. 2003. Natural
genetic transformation in monoculture Acinetobacter sp.
strain BD413 biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1721–
1727.
25) Hendrix, R.W., M.C.M. Smith, R.N. Burns, M.E. Ford,and G.F. Hatfull. 2002. Evolutionary relationships among
diverse bacteriophages and prophages: all the world’s aphage, pp. 133–140. In M. Syvanen and C.I. Kado (ed.),Horizontal Gene Transfer, Academic Press, London.
26) Hennes, K.P., C.A. Suttle, and A.M. Chan. 1995. Fluorescently labeled virus probes show that natural virus populations can control the structure of marine microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3623–3627.
27) Ho, M-.H., T. Traavik, O. Olsvik, B. Tappeser, C.V.
Howard, C. von Weizsacker, and G.C. MaGavin. 1998.
Gene technology and gene ecology of infectious diseases.
Microb. Ecol. Health Dis. 10: 33–59.
28) Hoelzer, M.A., and R.E. Michod. 1991. DNA repair andthe evolution of transformation in Bacillus subtilis. III. Sex
with damaged DNA. Genetics. 128: 215–223.
29) Jain, R., M.C. Rivera, J.E. Moore, and J.A. Lake. 2002.
Horizontal gene transfer in microbial genome evolution.
Theor. Popul. Biol. 61: 489–495.
30) Jensen, E.C., H.S. Schrader, B. Rieland, T.L. Thompson,
K.W. Lee, K.W. Nickerson, and T.A. Kokjohn. 1998.
Prevalence of broad-host-range lytic bacteriophages of
Sphaerotilus natans, Escherichia coli, and Pseudomonas
aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol. 64: 575–580.
31) Jiang, S.C., and J.H. Paul. 1995. Viral contribution todissolved DNA in the marine environment as determinedby differential centrifugation and kingdom probing. Appl.
Environ. Microbiol. 61: 317–325.
32) Jiang, S.C., and J.H. Paul. 1998. Gene transfer by transduction in the marine environment. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2780–2787.
33) 見坂武彦，石徹白愛，山口進康，谷佳津治，那須正夫．
2003．走査型電子顕微鏡を用いた菌体内遺伝子の検出．第19回日本微生物生態学会講演要旨集．p. 89.
34) 見坂武彦，山口進康，谷佳津治，那須正夫．2004．抗生物

他
質耐性遺伝子をもつ細菌のシングルセルレベルでの検出．
日本薬学会第124年会．29[P1]II-199.
35) Kloos, D.K., M. Strätz, A. Güttler, R.J. Steffan, and K.N.
Timmis. 1994. Inducible cell lysis system for the study ofnatural transformation and environmental fate of DNA
released by cell death. J. Bacteriol. 176: 7352–7361.
36) Koonin, E.V., K.S. Makarova, and L. Aravind. 2001. Horizontal gene transfer in prokaryotes: quantification and classification. Annu. Rev. Microbiol. 55: 709–742.
37) Kurokawa, K., K. Tani, and M. Nasu. 1997. Direct in situ
PCR method for the detection of verotoxin-producing
Escherichia coli. Jpn. J. Bacteriol. 52: 513–518.
38) Kurokawa, K., K. Tani, M. Ogawa, and M. Nasu. 1999.
Abundance and distribution of bacteria carrying sltll genein natural river water. Lett. Appl. Microbiol. 61: 405–410.
39) Lederberg, J. 1987. Genetic recombination in bacteria: a
discovery account. Annu. Rev. Genet. 21: 23-46.
40) Lederberg, J., and E.L. Tatum. 1946. Gene recombinationin Escherichia coli. Nature 158: 558.
41) Li, Y., P.C.Y. Lau, J.H. Lee, R.P. Ellen, and D.G.
Cvitkovitch. 2001. Natural genetic transformation ofStreptococcus mutans growing in biofilms. J. Bacteriol.
183: 897–908.
42) Lorenz, M.G., and W. Wackernagel. 1994. Bacterial genetransfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev. 58: 563–602.
43) Maruyama, F., T. Kenzaka, N. Yamaguchi, K. Tani, and M.
Nasu. 2003. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by insitu loop-mediated isothermal amplification. Appl. Environ.
Microbiol. 69: 5023–5028.
44) 丸山史人，見坂武彦，山口進康，谷佳津治，那須正夫．
2003．In situ RCA 法による特定遺伝子を持つ細菌の検出．
第19回日本微生物生態学会講演要旨集．p. 90.
45) Matsui, K., N. Ishii, and Z. Kawabata. 2003. Release of
extracellular transformable plasmid DNA from Escherichia
coli cocultivated with algae. Appl. Environ. Microbiol. 69:
2399–2404.
46) Matsui, K., N. Ishii, and Z. Kawabata. 2003. Microbialinteractions affecting the natural transformation of Bacillus
subtilis in a model aquatic ecosystem. FEMS Microbiol.
Ecol. 45: 211–218.
47) Mercer, D.K., K.P. Scott, C.M. Melville, L.A. Glover, and
H.J. Flint. 2001. Transformation of an oral bacterium via
chromosomal integration of free DNA in the presence ofhuman saliva. FEMS Microbiol. Lett. 200: 163–167.
48) Molin, S., and T.-T. Nielsen. 2003. Gene transfer occurs
with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced
stabilisation of the biofilm structure. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 255–261.
49) Normander, B., B.B. Christensen, S. Molin, and N. Kroer.
1998. Effect of bacterial distribution and activity on conjugal gene transfer on the phylloplane of the bush bean
(Phaseolus vulgaris). Appl. Environ. Microbiol. 64: 1902–
1909.
50) Ostle, N., A.S. Whiteley, M.J. Bailey, D. Sleep, P. Ineson,and M. Manefield. 2003. Active microbial RNA turnover ina grassland soil estimated using a 13CO2 spike. Soil Biol.
Biochem. 35: 877–885.
51) Paget, E., and P. Simonet. 1994. On the track of naturaltransformation in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 15: 109–117.
52) Redfield, R.J., M.R. Schrag, and A.M. Dean. 1997. The
evolution of bacterial transformation: sex with poor relations. Genetics 146: 27–38.
53) Ripp, S., O.A. Ogunseitan, and R.V. Miller. 1994. Transduction of a freshwater microbial community by a new
Pseudomonas aeruginosa generalized transducing phage,
UT1. Mol. Ecol. 3: 121–126.
54) Sander, M., and H. Schmieger. 2001. Method for hostindependent detection of generalized transducing bacteriophages in natural habitats. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1490

細胞外 DNA の動態と遺伝子伝播–1493.
55) Schicklmaier, P., and H. Schmieger. 1995. Frequency ofgeneralized transducing phages in natural isolates of the
Salmonella typhimurium complex. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1637–1640.
56) Sikorski, R.S., W. Michaud, H.L. Levin, J.D. Boeke, and
P. Hieter. 1990. Trans-kingdom promiscuity. Nature 345:
581–582.
57) Solioz, M., H.-C. Yen, and B. Marrs. 1975. Release anduptake of gene transfer agent by Rhodopseudomonas
capsulata. J. Bacteriol. 123: 651–657.
58) Steinmoen, H., E. Knutsen, and L.S. Håvarstein. 2002. Induction of natural competence in Streptococcus pneumoniae
triggers lysis and DNA release from a subfraction of the cell
population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 7681–7686.
59) Stone, B.J., and Y.A. Kwaik. 1999. Natural competence for
DNA transformation by Legionella pneumophila and its
association with expression of type IV pili. J. Bacteriol.
181: 1395–1402.
60) Tani, K., K. Kurokawa, and M. Nasu. 1998. Developmentof a direct in situ PCR method for detection of specificbacteria in natural environments. Appl. Environ. Microbiol.
64: 1536–1540.
61) Tani, K., M. Muneta, K. Nakamura, K. Shibuya, and M.
Nasu. 2002. Monitoring of Ralstonia eutropha KT1 ingroundwater in an experimental bioaugmentation field byin situ PCR. Appl. Environ. Microbiol. 68: 412–416.
62) Tønjum, T., K. Bøvre, and E. Juni. 1995. Fastidious gramnegative bacteria: meeting the diagnostic challenge with
nucleic acid analysis. APMIS. 103: 609–627.

13763) Trevors, J.T. 1996. Nucleic acids in the environment. Curr.
Opin. Biotechnol. 7: 331–336.
64) Turner, A.K., and R. Sellwood. 1997. Extracellular DNA
from Serpulina hyodysenteriae consists of 6.5 kbp random
fragments of chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Lett.
150: 75–80.
65) Wang, B.Y., B. Chi, and H.K. Kuramitsu. 2002. Genetic
exchange between Treponema denticola and Streptococcus
gordonii in biofilms. Oral Microbiol. Immunol. 17: 108–112.
66) Weinbauer, M.G., and P. Peduzzi. 1996. Comments on thedetermination of nucleic acids in natural waters by the
CTAB-DABA-orcinol method. Sci. Total Environ. 177: 97–
103.
67) Whitchurch, C.B., T.-T. Nielsen, P.C. Ragas, and J.S.
Mattick. 2002. Extracellular DNA required for bacterial
biofilm formation. Science. 295: 1487.
68) Williams, H.G., M.J. Day, J.C. Fry, and G.J. Stewart. 1996.
Natural transformation in river epilithon. Appl. Environ.
Microbiol. 62: 2994–2998.
69) Wommack, K.E., and R.R. Colwell. 2000. Virioplankton:
viruses in aquatic ecosystems. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
64: 69–114.
70) Yaron, S., G.L. Kolling, L. Simon, and K.R. Matthews.
2000. Vesicle-mediated transfer of virulence genes from
Escherichia coli O157:H7 to other enteric bacteria. Appl.
Environ. Microbiol. 66: 4414–4420.
71) Zinder, N.D., and J. Lederberg. 1952. Genetic exchange in
Salmonella. J. Bacteriol. 64: 679–699.