脳・脊髄損傷後修復におけるアストロサイトの役割解明―アストロサイトを介し神経修復を促進する化合物のスクリーニングと新薬開発―
申 請 代 表 者
所外共同研究者
所外共同研究者
所内共同研究者

上山齋藤甲村東田健彦
尚亮
英二
千尋

神戸大学自然科学系先端融合研究環バイオシグナル研究センター分子薬理研究分野
神戸大学自然科学系先端融合研究環バイオシグナル研究センター分子薬理研究分野
神戸大学脳神経外科神経機能学分野

准教授
教授
教授
准教授

【報告セミナー要旨】【緒言】
アストロサイトが中枢神経回路網の発生・維持などに機能することは周知の事実であるが、神経損傷後の機能（特にグリア瘢痕）は複雑で、損傷部の回復促進及び阻害作用の 4 双方が報告されている。
一方、Rho ファミリー低分子量 G 蛋白質（Rho-family GTPase）である Rac 及び Cdc42 は、増殖（細胞周期）や遊走などに関与することが知られている。今回我々は、脳・脊髄損傷後修復におけるグリア瘢痕及びグリア瘢痕形成における Rho-family GTPase の役割を解明するため、アストロサイト特異的 Rac1-KO 及び Cdc42-KO マウスを作製し、圧挫による脊髄損傷及び SPring8 による微小放射線脳損傷モデルを用いて、検討を行なった。
【結果】
脊髄損傷後の運動機能評価では、野生型に比し Rac1-KO マウスは、亜急性期から有意に良好な運動機能回復を見せ、損傷後 5 週では著明に良好な改善を呈した。脊髄損傷後 5 週の組織学的検討では、Rac1-KO マウスにおいて脊髄損傷部近傍での GFAP 免疫染色性の軽度の低下が認められた。小脳内顆粒層に対する微小放射線脳損傷の検討でも、Rac1-KO マウスにおいて損傷周囲の GFAP 免疫染色性は低下していた。Rac1 ノックダウン（KD）アストロサイト細胞株を用い、細胞周期（Fuccisystem-based assay）及び遊走能（wound healing assay）を解析すると、Rac1-KD により細胞周期延長（G1 期停滞）と遊走能低下が認められた。更に、DNA マイクロアレイ解析により、Rac1-KD細胞では GSPT1（G1 to S phase transition 1）が低下することを見出し、GSPT1-KD により細胞周期が延長し、Rac1-KD による細胞周期延長が GSPT1 の導入により回復することを確認した。しかし、GSPT1 は細胞遊走能には影響を及ぼさなかった。
【結語】
アストロサイト特異的に Rac1 を KO すると、神経損傷後の機能回復が著明に促進された。その機序の１つとして、Rac1–GSPT1 シグナリングが低下し、神経損傷後の過度のグリア瘢痕形成（反応性アストロサイト増殖）が抑制されることを見出した。しかし、アストロサイト特異的 Rac1-KO マ
ウスでの脊髄損傷後の運動機能回復が野生型に比べ著明に良好なことを考えると、GSPT1 以外のRac1 ターゲット分子（下流分子）の関与が予測される。現在、その候補となる新たな分子を同定し、解析を進めている。

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■背景・目的
従来、アストロサイトは、脳梗塞や脳外傷などの脳損傷時、活性化・増殖することにより病変部周囲にグリオーシス（グリア瘢痕）を形成し、このグリオーシスが損傷部の増悪や修復遅延をもたらすと考えられてきた。ところが 2006 年のマウス脊髄損傷モデルを用いた研究で、グリオーシスは、病変部を最小限に食い止めるためにアストロサイトが病変周囲部から遊走して病変部を包み込んだものであるとの報告がなされた。しかし、グリオーシス（アストロサイト機能）の抑制・賦活のどちらが脳・脊髄損傷病変の縮小・修復促進、ひいては、神経機能回復に繋がるかどうかの結論は、未だ出ておらず、そのメカニズムについても解っていないのが現状である。
本研究での我々の目標は、グリオーシスの抑制・賦活のどちらが中枢神経損傷後の神経機能回復促進に繋がるのか、その結果に基づき中枢神経後修復・回復を促進する新規化合物・治療剤・治療法、を解明・開発することである。

■結果・考察１．脊髄損傷モデルを用いた脊髄損傷におけるグリオーシスおよびグリオーシス形成における Rac1の役割解明
まず、アストロサイト特異的に Rac1 を Knockout（KO）するマウスを作製した（図１）。アストロサイト特異的 Rac1-KO マウスを脊髄圧挫損傷モデルに供し、脊髄損傷後５週間、下肢・体幹運動機能を経時的に評価すると、野生型に比し Rac1 KO マウスでは著名に良好な神経機能改善を呈した（図２）。免疫組織化学的に損傷脊髄周囲のグリオーシス（GFAP 染色）を調べたところ、Rac1-KOマウスでは野生型に比し、軽度のグリオーシス減弱を認めることを見出した（図２）。更に、Rac1KO マウスの中枢神経損傷後のグリオーシス減弱は、大型放射光施設 SPring8 を用いた小脳のスリット状放射線損傷モデルでも再現できた。
グリオーシス形成は、アストロサイトの損傷部周囲での増殖と損傷周辺部から損傷部周囲への遊走によると考えられている。そこで、不死化アストロサイト細胞株（LN229 細胞）を用いた Rac1Knockdown（KD）実験により、アストロサイトの増殖能・遊走能における Rac1 の影響を調べた（図図１

GFAP-Cre マウスと Rac1flox マウスの交配により作製したアストロサイト特異的に

図１

GFAP-Cre マウスと Rac1flox マウスの交配により作製したアストロサイト特異的に Rac1 を KO するマウス

Rac1 を KO するマウス

図２－ 34 －GFAP-Cre マウスと Rac1flox マウスの交配により作製したアストロサイト特異的にRac1 を KO するマウス
図２

図２

A, 脊髄損傷モデル作製後の Baso Mouse Scale (BMS) : 下肢機能（0-8 点）、Body Support Scale (BSS)：体幹保持機能（0-4 点）の両者が Rac1-KO マウスで著明に良好である（*P <0.01）。
A, 脊髄損傷モデル作製後のBaso Mouse Scale (BMS) :下肢機能（0-8 点）、 Body
B, Rac1-KO マ ウ ス で は、 脊 髄 損 傷 周 囲 の GFAP 免 疫 反 応 性（ グ リ オ ー シ ス ） が 低 下 し て い る（*PSupportScale<0.05）。 (BSS)：体幹保持機能（0-4 点）の両者が Rac1-KO マウスで著明に図３良好である（*P <0.01）。
B, Rac1-KO マウスでは、脊髄損傷周囲の GFAP 免疫反応性（グリオーシス）が低下している（*P <0.05）。

A, shRac1
plasmidの導入により、LN229細胞でのRac1-KDを確認。
図３
A, shRac1
plasmidの導入により、LN229 細胞でのRac1-KDを確認。
B,Fucci(Fluorescenceubiquitination-basedcellcycleindicator)
systemを用いた細胞周期解析により、system を用いた細B, Fucci (Fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator)
Rac1-KD 細胞では細胞周期の延長、特に G1 期が延長する。
胞周期解析により、Rac1-KD細胞では細胞周期の延長、特にG1 期が延長する。
C, インキュベーター蛍光顕微鏡下でのwound healing assay により、Rac1-KD細胞では細胞遊走能が低下する（48時間観察）。
C,インキュベーター蛍光顕微鏡下での wound healing assay により、Rac1-KD 細胞では細胞遊走能が低下する（48 時間観察）。

３）。まず、インキュベーター蛍光顕微鏡下で Fucci (Fluorescence ubiquitination-based cell cycleindicator) system を用いた細胞周期解析により、Rac1-KD 細胞では細胞周期の延長、特に G1 期が延長することを明らかにした。次に、インキュベーター蛍光顕微鏡下での wound healing assay により、

図４

Rac1-KD 細胞では細胞遊走能が低下することを突きとめた。

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２．アストロサイトの増殖・遊走に関わる Rac1 シグナルの下流分子の同定

次に、アストロサイトの増殖・遊走に関わる Rac1 シグナルの詳細、すなわち、Rac1 の下流分子を同定のため、Rac1-KD LN229 細胞を用いた DNA マイクロアレイによるスクリーニングを行った。
コントロール LN229 細胞に比し Rac1-KD 細胞で２倍以上に低下もしくは増加している分子に着目した結果、Rac1-KO によりグリオーシス形成を抑制する Rac1 の下流分子候補として GSPT1（G1 to Sphase transition 1） を見出した。

A, shRac1 plasmid の導入により、LN229 細胞での Rac1-KD を確認。

B, Fucci (Fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator) system を用いた細Rac1 KD/KO に よ る GSPT1 低 下 は、 ２ 種 の Rac1-siRNA に よ る Rac1-KD LN229 細 胞、Rac1-胞周期解析により、Rac1-KD 細胞では細胞周期の延長、特に G1 期が延長する。

shRNA による Rac1-KD HEK293 細胞、Rac1-KO マウスからの初代培養アストロサイトで確認した。

C,インキュベーター蛍光顕微鏡下での wound healing assay により、Rac1-KD 細胞で更に、GSPT1 の発現が炎症惹起物質である LPS により上昇し、その上昇が Rac1-KD により抑制さは細胞遊走能が低下する（48 時間観察）。

れることを明らかにした。この事は、脊髄損傷により惹起される炎症反応状態でも、GSPT1 が Rac1の下流分子として機能していることを示唆するものであった（図４）。

図４

図４A, ２種の Rac1-siRNA（2.5 nM）による Rac1-KD（LN229 細胞）、Rac1-shRNA による Rac1-KD（HEK293

A, ２種のRac1-siRNA（2.5nM）による Rac1-KD（LN229 細胞）、Rac1-shRNAに細胞）、Rac1-KO マウスからの初代培養アストロサイトで、GSPT1低下を認める。

B, GSPT1 の発現が炎症惹起物質である
LPS により上昇し、その上昇がRac1-KD（2.5 nM siRNA）によよる Rac1-KD（HEK293 細胞）、Rac1-KO
マウスからの初代培養アストロサイトで、り抑制される。

GSPT1 低下を認める。
B, GSPT1 の発現が炎症惹起物質である LPS により上昇し、その上昇が Rac1-KD（2.5nM siRNA）により抑制される。

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GSPT1 が Rac1 シグナルの下流分子であることは、我々が見出した新事実であったが、GSPT1 が細胞周期のみならず遊走にも関与するとの報告はあった。実際、GSPT1 の細胞周期に関与している
かは、インキュベーター蛍光顕微鏡下で Fucci system を用いた GSPT1-KD HeLa 細胞の細胞周期解析により確認した。更に、Rac1 シグナルの下流で GSPT1 が細胞周期を制御（促進）していることは、
Rac1-KD による細胞周期延長が GSPT1 の過剰発現により回復することを明らかにした（図５）。しかしながら、GSPT1-KD による細胞遊走能の低下は、Rac1-KD LN229 細胞でも Rac1-KD A431 細胞でも認められなかった。

図５

図５A, ２種の GSPT1-siRNA（5, 10 nM）による Rac1-KD 細胞（HeLa 細胞）で、細胞周期の延長を認める。
B,5 nM siRNA, 10HeLa細胞）では、GSPT1の低下と細胞周期の延長を認める。GFPA, Rac1-KD２種の細胞（2.5,GSPT1-siRNA（5,nM）によるRac1-KD細胞（HeLa 細胞）で、細胞周GSPT1 の過剰発現により、Rac1-KD により延長した細胞周期が短縮される。

期の延長を認める。

B, Rac1-KD 細胞（2.5, 5 nM siRNA, HeLa 細胞）では、GSPT1 の低下と細胞周期の延長を認める。GFP-GSPT1の過剰発現により、Rac1-KDにより延長した細胞周期が以上より、Rac1シグナルの下流分子としてGSPT1 を新規に同定した。Rac1-GSPT1シグナルが関短縮される。
与している機能としては、細胞周期におけるG1 期から S 期への移行の促進作用を同定したが、細胞遊走能については否定的な結果であった。この事から、Rac1-KO によるグリオーシス低下の一因として、Rac1-GSPT1 シグナルが関与することを明らかにしたが、遊走に関する Rac1 シグナルの下流分子の新規同定には至らなかった。

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■結論①アストロサイト特異的 Rac1-KO マウスを作製した。
② Rac1 シグナルの抑制が、神経損傷後の過度のグリオーシス（増殖・遊走）を抑制し、神経機能回復を促進させる治療ターゲットの１つである。
③ Rac1-KO による増殖能低下（細胞周期延長）原因の１つとして、Rac1-GSPT1 シグナルが関与することを明らかにした。
④②で見出したアストロサイト特異的 Rac1-KO マウスにおける脊髄損傷後の著名な神経機能回復をRac1-GSPT1 シグナルの低下のみでは説明し難いのも事実である。現在引き続き、グリオーシス減弱により中枢神経損傷後の機能回復を促進する Rac1 シグナル（Rac1 の下流シグナル分子）の検索・同定を行っている。
①～④後の我々の最終目標は、Rac1 シグナルを抑制する生薬・化合物を見出し、脊髄損傷はもとより脳損傷を含めた中枢神経損傷の修復を促す新規治療法・治療薬の開発に繋がるリード化合物を見出し、新規治療法を開発することである。

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