News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

日本ゲノム微生物学会
ニュースレター
ピロリ菌（Helicobacter pylori）の small RNA が制御する環境適応と病態発症
三室 仁美（大阪大学 微生物病研究所 / 現・大分大学 グローカル感染症研究センター）
T- リピートT- リピート伸長

small RNA HPnc4160

TTTTTT...T
hpnc4160
ピロリ菌 ゲノム DNA
ターゲット mRNA

TTTTTT...TTTTT

病原因子タンパク質（発がん因子 CagA・
外膜タンパク質群 OMP）
発現増大

RNA 分解

ピロリ菌

CagA
CagA
CagA
CagA

CagA

感染

OMP OMP
OMP
OMP

持続感染
OMP

OMP

CagA

胃粘膜上皮

hpnc4160
ターゲット mRNA

small RNA HPnc4160

OMP

small RNA HPnc4160

CagA

OMP

CagA

定着菌数増大

宿主適応

CagA

OMP
CagA

OMP

CagA

CagA

持続炎症

OMP

CagA

がん化

ピロリ菌は乳幼児期から何十年にもわたり胃粘膜に付着性の持続感染を成立させ、胃炎や胃がん等の消化器疾患を引き起こす。
しかし、細菌が胃の環境に適応するメカニズムは不明であった。我々は、ピロリ菌の non-coding small RNA HPnc4160 が、細菌の発がんタンパク質の産生だけでなく、宿主環境への病原体の適応を調節することを明らかにした。 ピロリ菌感染げっ歯類モデルの胃から分離された細菌のゲノムは、HPnc4160 コード領域の上流で連続チミジン配列（T リピート）数が増加しており、これによって HPnc4160 の発現が低下した。 RNA-seq および iTRAQ 解析によって、外膜タンパク質および発がんタンパク質 CagA をコードする遺伝子を含む HPnc4160 の 8 つのターゲットを同定した。 HPnc4160 欠損変異株は、野生型株に比べ、短期間感染マウスの胃での定着能が増大していた。しかし持続感染マウス胃内での HPnc4160 欠損変異株の定着菌数は、野生型株に比べ低下しており、胃内持続感染に HPnc4160 が重要であった。T リピートが異なる変異株解析により、T リピート長の伸長と HPnc4160 発現量はオ
シレーションを示すこと、さらに、感染前の HPnc4160 発現量に関わらず、T リピートが長いほどマウスに持続感染しやすいことがわかった。また、胃がん患者由来臨床分離株では非胃がん患者由来株よりも、T リピートは長く、HPnc4160 発現は低く、標的因子発現は高かった。したがって、small RNA HPnc4160 は、宿主環境へのピロリ菌の適応を調節し、胃の発がんを調節することが示唆された。T リピートの長い菌株は、感染中に変異が挿入されやすく、多様な T リピートと病原因子発現パターンを示す
多様な菌株集団が構築できる。それにより、環境がダイナミックに変化する胃内においても、その時その時に適した発現パターンを示すピロリ菌菌体亜集団が生き延びることができ、環境にしなやかに適応することで持続感染が可能となり、胃がんを誘導することが示唆された。
発表論文：Kinoshita-Daitoku R, Kiga K, Miyakoshi M, Otsubo R, Ogura Y, Sanada T, Bo Z, Phuoc TV, Okano T, Iida T, Yokomori R, Kuroda E,
Hirukawa S, Tanaka M, Sood A, Subsomwong P, Ashida H, Binh TT, Nguyen LT, Van KV, Ho DQD, Nakai K, Suzuki T, Yamaoka Y, Hayashi T,
Mimuro H. A bacterial small RNA regulates the adaptation of Helicobacter pylori to the host environment. Nat Commun. 2021;12(1):2085

1

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2021 年 12 月 28 日

シアノバクテリアの細胞外多糖合成系について
前田 海成
東京農業大学 生命科学部
1. はじめに

2. NDP-sugar pyrophosphorylase

シアノバクテリア ( 藍藻 ) は酸素発生型光合成をおこなう原

私が最初に取り組んだのは多糖合成の基質である NDP-sugar

核生物であり、その祖先は細胞内共生により葉緑体になったとの 合 成 酵 素 NDP-sugar pyrophospho-rylase (PPase) に 関 す る 研

考えられている。モデル種である Synechocystis sp. PCC 6803 の究である。本研究は多糖合成系そのものの研究ではないが、全ゲノムがかずさ DNA 研究所の田畑先生らによって 1996 年にNDP-sugar は多糖合成のみならず様々な代謝の基質として働く

決定されて以来 (1)、シアノバクテリアは光合成や光受容体の重要な分子であるため簡単に紹介させていただく。細胞内には研究におけるモデル生物として世界中で用いられてきた。また

UDP-glucose や ADP-glucose、GDP-Mannose などの多様な NDP-

光独立栄養バクテリアである点とモデル種の形質転換が容易で

sugar が存在し、それらは対応する NDP-sugar PPase により合成ある点から、環境負荷の少ない物質生産のホストとしても注目される。私がシアノバクテリアゲノム情報を調べたところ、基されており、応用研究が盛んである。これらに関しては国内で本的にはほとんどの種に既知のバクテリア型 NDP-sugar PPase

も多くの先生方が研究なされているため、学会員の皆様が見聞のホモログが存在したが、既知のバクテリア型 UDP-glucose

きされる機会も多いと思われる。そこで本記事では、研究者がPPase の遺伝子 galU を持つ種はごく僅かであった。その代わり

比較的少ないシアノバクテリアの細胞外多糖合成系に関する研に、シアノバクテリア特異的な新規 UDP-glucose PPase である

究について紹介させていただきたい。

CugP の遺伝子が普遍的に存在した (3)。CugP は他のバクテリア

シアノバクテリアは淡水、海水、温泉、陸上などの幅広い環の UDP-glucose PPase (GalU) よりも動物の GDP-Mannose PPase

境に生息し、微生物マット ( 図 1)、群体、ブルームなどの多様とよく似ており、後者と CugP の共通祖先酵素がシアノバクテ

な細胞集合体を形成している。シアノバクテリア細胞集合体のリア内で進化して CugP になったと考えられる。また Yersinia

代表的な構成要素は細胞外多糖 (EPS) であり、その蓄積が集合や Vibrio などのバクテリアの中の一部の種のゲノム上では、体の形成やストレス耐性などの機能において重要であると考

cugP とシアノバクテリア特異的な細胞壁セルロース合成酵素

えられている。そして、シアノバクテリアには多種多様な EPS

遺伝子群がクラスターを形成していた。この現象は、この領域が存在することが、組成分析によって明らかにされてきた (2)。

の水平伝播と、CugP により合成された UDP-glucose がセルロー

その中にはスイゼンジノリ EPS であるサクランのように、化粧ス合成の基質として利用されていることを示唆している。

品材料や医薬品としての利用を目的に研究されているものもある。一方で、シアノバクテリア EPS の合成・制御機構や、生理3. ゲノム情報から見えるシアノバクテリア EPS 合成関連遺伝子の特徴

機能に関する研究はあまり進んでいなかった。私は学生としてバクテリアの EPS 合成系に関しては主に病原菌を対象として

池内昌彦 東京大学名誉教授 ( 当時教授 ) の研究室に所属してい長年研究されており、様々な EPS 合成酵素複合体や制御機構、た頃から現在まで、シアノバクテリアのゲノム情報と形態を手

そしてそれらの遺伝子が網羅的に解明されてきた (4)。EPS 合

掛かりに、EPS 合成・制御機構の解明に取り組んできた。

成は大まかに糖鎖の合成と修飾、排出という過程からなる。それぞれの反応には１～複数個のタンパク質が関わり、それらが集まって複雑な EPS 合成酵素複合体を形成する。これらの知見をもとにシアノバクテリアゲノム情報を解析することで、シア
ノバクテリアの EPS 合成関連遺伝子の様々な特徴がわかってきた。
まず、シアノバクテリアゲノムには既知のバクテリア EPS 合成関連遺伝子と配列類似性の高い遺伝子やホモログが多く存在するが、遺伝子セットの一部を欠いている場合がある。例えば、

図１．中房温泉の微生物マットとその断面
表層には主にシアノバクテリア Thermosynechococcus が生息し、内部には主に光合成細菌が生息する。

2ある既知の EPS 合成酵素複合体の必須構成要素をコードする遺伝子のうち、一部しか存在しない場合がある。これはシアノバ

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クテリアに特異的な別の構成要素の存在を示唆しており、実際

また、低温による tlr0903 の転写誘導がセルロース蓄積の増強に私は複数の新規遺伝子を同定してきた。

をもたらしていた。同定された２つのタンパク質のうち、エン

次に、１つの EPS の合成に関わる遺伝子群は、一般的なバクドグルカナーゼは既知セルロース合成酵素複合体にも存在する

テリアゲノム上では１つの大きな遺伝子クラスターを形成する

ため ( 図 2 中 BcsZ)、この反応がセルロース合成に普遍的に重場合が多いが、シアノバクテリアゲノム上では散在している場

要であることを示唆している。一方で HlyD 様タンパク質の存合が少なくない。幸いにも種 A で散在している EPS 合成系遺在は既知のセルロース合成系では知られていなかった。本来の伝子群が種 B では遺伝子クラスターを形成しているケースがあHlyD は hemolysin などの分子の分泌に関わる I 型分泌装置におるため、シアノバクテリア全体のゲノム情報を調べ比較するこ

いて、細胞膜タンパク質 HlyB、外膜孔タンパク質 TolC を繋ぐとが重要である。また、１種のシアノバクテリア内には基本的通路として働くタンパク質である。T. vulcanus では HlyD 様タに複数の EPS の合成系が存在するが、EPS 合成関連遺伝子の配ンパク質 (Tlr0903) だけでなく TolC（Tlr1605）もセルロース依

列情報から「どの EPS の合成に関わるのか」を予測するのは困

存性細胞凝集に必要であったことから、１型分泌装置に似たシ難である。その判別のためには、形質転換により破壊株を作製

アノバクテリア特異的なセルロース合成酵素複合体 Xcs が存在

して表現型を調べるという古典的な手法が有効である。

すると我々は考えている ( 図 2 右 )(7)。ただし、この複合体に

最後に、ゲノム情報から多くの EPS 合成関連遺伝子を持つとついて構造生物学的な証拠はまだ得られていないため、今後の推測される種であっても、研究室環境で EPS 蓄積を示さないこ

研究が必要である。

とがある。これは、単純に EPS 合成を誘引する環境条件下にな

また、セルロース合成酵素の系統解析や遺伝子クラスターのい場合もあるが、研究室で培養されるうちに遺伝子変異が生じ情報を元に、原核生物のセルロース合成系の再分類をおこなっ

EPS 合成能が失われた場合もある。

たところ、既知のバクテリアセルロース合成系 Bcs 型、シアノ

これらの特徴から、シアノバクテリアの未知 EPS 合成系を解バクテリア細胞外セルロース合成系 Xcs 型、シアノバクテリア

明するためには、EPS 蓄積が容易に観察可能な種を研究対象に特異的な細胞壁セルロース合成系 ( 本記事では細胞壁型と呼称 )選び、ゲノム情報に基づいて予測した EPS 合成関連遺伝子の変の大きく３つに分かれた。つまり、シアノバクテリアは独自に異株を作製し、その表現型を調べることが重要となる。これは２種類のセルロース合成系を発達させたと考えられる。一方で、ごく当たり前のことだが、実際に実行可能な種は非常に限られXcs 型はごく一部のバクテリアで存在が知られている β グルカており、それがシアノバクテリア EPS 合成系研究の発展を妨げ

ン合成系と近縁であった。また、細胞壁型もごく一部のバクテてきた。

リアに見られ、シアノバクテリアから水平伝播したと考えられる。さらに、細胞壁型のセルロース合成酵素を植物セルロース
合成酵素の祖先とする説もある (8)。これらはシアノバクテリ

4. 細胞外セルロース合成系
シアノバクテリア EPS 合成系の研究として、私はまず細胞アのセルロース合成系の進化が生物全体のセルロース合成系の外セルロース合成系の解明に取り組んだ。本研究には、実験室多様化に寄与した可能性を示唆している。

で低温と青色光に応答して細胞外セルロースを蓄積し細胞凝集体を形成する好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus
vulcanus NIES-2134 ( 以 下 T. vulcanus) を 用 い た。 こ の 種 では、バクテリアに一般的なセルロース合成酵素遺伝子 bcsA のホモ
ログ tll0007 が存在しセルロース合成を担うこと (5)、複数の光受容体タンパク質により c-di-GMP の合成 / 分解反応がおき
Tll0007 の活性が調節されることがわかっていた (6)。一方で、既知のバクテリアセルロース合成酵素複合体の重要な構成要素である BcsB, BcsC, BcsZ( 図 2 左 ) などの遺伝子はゲノム上に存在しなかった。そこで我々は T. vulcanus には未知のセルロース
合成関連遺伝子が存在すると予想した。
tll0007 の近傍にはセルロース合成に関わると思われる遺伝
子が無かったため、我々はシンテニー解析をおこなった。T.
vulcanus 以外のシアノバクテリアの tll0007 ホモログの近傍に存在する遺伝子を調べたところ、いくつかの種で HlyD 様タン

図 2．セルロース合成酵素複合体モデル

パク質の遺伝子とエンドグルカナーゼの遺伝子が保存されてい左は酢酸菌などでよく知られているバクテリアに一般的なセルた。これら２つの遺伝子の T. vulcanus におけるホモログ (tlr0903

ロース合成酵素複合体。右は我々の研究により示唆されたシアと tlr1902) はゲノム上で tll0007 と離れた位置に存在したが、変異株解析の結果セルロース合成に必須であることがわかった。

3

ノバクテリア特異的なセルロース合成酵素複合体

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存在し、その多くがバイオフィルムや群体などの細胞集合体中5. 硫酸多糖シネカン合成系
シアノバクテリアには多様な EPS が存在するが、セルロースのように組成が単純で合成系の情報が豊富な EPS は稀であり、に見られる。つまり、硫酸多糖はシアノバクテリアの生態に関わるシアノバクテリア特異的な EPS である。

大多数の EPS は組成がわかったとしても合成系の遺伝子を推

私は本研究で初めて同定されたシアノバクテリア硫酸多糖合

定することは難しい。しかし、シアノバクテリア特異的な未知成制御遺伝子群を xss、Xss によって合成される硫酸多糖をシ

EPS の合成系こそ解明する意義がある。その第一歩として、私

ネカンと命名した。xss の制御関連遺伝子領域には、二成分制

は Synechocystis sp. PCC 6803( 以下 S. 6803) の細胞外硫酸多糖合

御系のセンサーヒスチジンキナーゼ遺伝子 xssS とレスポンスレ

成系について研究を進めてきた (9)。

ギュレーター遺伝子 xssR、新規転写制御因子遺伝子 xssQ が存

S. 6803 には２つの substrain 系統がある。S. 6803 GT (Glucose

在しており、この XssQ が多くの xss 遺伝子の転写を大きく上

tolerant) 株はその名の通りグルコース耐性であり、運動性がなげることでシネカン合成を増強していた。また、普段は XssS

い。この株は培地にグルコースを添加することで従属栄養的にが XssQ による xss 転写制御を抑制していることも示唆された

増殖させることが可能であるため光合成関連変異株の作製に適( 図 4 左 )。

しており、世界中で光合成研究のモデル生物として用いられてきた。一方で S. 6803 PCC 株は原種に近いとされ、グルコース感受性で運動性があり微生物学的研究に適しているが、研究材料として主流ではない。
私は S. 6803 PCC 株が粘性 EPS を介して培養液の液面付近にブルーム様の細胞集合体を形成する現象を発見した ( 図 3 左 )。
そして EPS 合成候補遺伝子の破壊株を多数作製し、細胞集合体
形成と粘性 EPS 蓄積を指標としてスクリーニングすることで、この粘性 EPS の合成制御関連遺伝子を網羅的に同定した ( 図 3右 )。この中には、バクテリアの EPS 合成系の１つである Wzx/
Wzy 型合成系の遺伝子一式と複数の制御関連遺伝子、そして２つの硫酸基転移酵素遺伝子が存在した。この硫酸基転移酵素遺伝子の存在から、私は粘性 EPS が硫酸多糖ではないかと考え組成を分析した。すると、予想通り硫酸基を含む多糖であった。
硫酸多糖 ( 硫酸化多糖ともいう ) とは硫酸基で修飾された多糖であり、動物のグリコサミノグリカン ( ヘパラン硫酸など )、図４．シネカン合成系の制御モデルと xssS 破壊株の表現型
左は S. 6803 PCC 株の XssSRQ による xss 遺伝子転写制御モデル。
中央は xssS 破壊株の培養液。右は野生株と xssS 破壊株それぞれの粘性 EPS 蓄積量。

真核藻類の細胞壁多糖 ( カラギーナンなど )、シアノバクテリ

では S. 6803 は何のためにシネカンを合成するのだろうか？ S.

アの EPS( サクランなど ) として存在する。興味深いことに、6803 の詳しい生態は不明であるため自然界における役割を推測

硫酸多糖を合成する既知のバクテリアはシアノバクテリアのみするのは難しいが、培養液の様相から私はブルーム形成への関である。その一方で、シアノバクテリアには多様な硫酸多糖が与を考えている。ブルーム ( アオコ、水の華 ) とは異常増殖したシアノバクテリアが浮いて水面を覆い尽くす現象であり、生態系に多大な影響を与える。ブルーム形成の浮力源としてはシアノバクテリア細胞内のガス胞が知られていたが、S. 6803 はガス胞を持たない。しかし、実験室環境では、シネカンに捕らえられた気泡を浮力源として S. 6803 細胞集合体が浮上していた。この EPS と気泡による浮上はブルーム形成の新たなメカニ
ズムかもしれない (10)。また xss 遺伝子の転写量は低温条件やplanktonic 条件で大きく上昇することがドイツのグループから報告されている (11)。そのため、そのような環境刺激に応答してシネカンを合成・蓄積することが、S. 6803 の生態において重要であるのかもしれない。
本研究は S. 6803 の基礎研究として始めたが、硫酸多糖は化

図 3．シネカン合成系の制御モデルと xssS 破壊株の表現型

粧品材料や医薬品などとして注目されている高分子であるた左は S. 6803 PCC 株の XssSRQ による xss 遺伝子転写制御モデル。

め、得られた知見の応用利用も期待される。例えば、硫酸多糖

中央は xssS 破壊株の培養液。右は野生株と xssS 破壊株それぞの大量生産や組成改変などが将来的に可能になるかもしれな

れの粘性 EPS 蓄積量。

い。これまでに、シネカン合成を抑制する XssS の破壊により4

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シネカン合成量の増強 ( 約 19 倍 ) に成功した ( 図 4 右、特願 :るためには、個々の EPS の合成系の網羅的解析を継続する必要

2020-148194)。今後はシネカンの産業的有用性の解明も含めてがある。また、EPS 合成系を識別することは、それらを調節す共同研究を展開したいと考えている。

る複雑な制御系の理解にも繋がると期待できる。
一方で、モデルシアノバクテリアの研究だけでは、シアノバ
クテリア EPS の環境中における役割を正確に理解することはで

6. シネカン合成系から見えること
シネカン合成系 Xss はバクテリアの Wzx/Wzy 型 EPS 合成系

きない。幸いにも環境中には EPS を蓄積し細胞集合体を形成すに硫酸基転移酵素が組み合わさったものであった。このことかるシアノバクテリアが多く存在し、それらの単離やゲノム解析

ら、動物と同様にシアノバクテリアでも、硫酸基転移酵素によも進んできている。特に硫酸多糖は蓄積する種が多く知られてり糖鎖に硫酸基が付加されることで硫酸多糖が作られると考えおり、前述の通りゲノム情報から合成系をある程度予測可能でられる。硫酸多糖の合成に硫酸基転移酵素が必須であることは、あるため有望な研究対象である。しかし、EPS を蓄積するシア合成系を推定する上で大きな手掛かりとなる。つまり、硫酸基

ノバクテリアのほとんどは現状では形質転換できないという大転移酵素遺伝子を含む EPS 合成遺伝子クラスターが硫酸多糖合

きな問題が残っている。そのため、シアノバクテリア EPS 合成

成系 ( の一部 ) と推定できる。実際に硫酸多糖を蓄積するシア系研究のさらなる発展には、幅広いシアノバクテリア種に適用

ノバクテリアのゲノム情報を調べると、硫酸多糖合成遺伝子ク可能な新規形質転換系の構築などのブレイクスルーが必要であラスターと推測される遺伝子領域が複数見つかった。その中にる。

は、Xss 同様の Wzx/Wzy 型 EPS 合成系の他に、もう一つの代
表的なバクテリア EPS 合成系である ABC-transporter 型も存在

8. おわりにした。ABC-transporter 型は細胞表在性多糖の合成に関与するた

シアノバクテリアの EPS 合成系は他のバクテリアのものと比め、これを含むものは細胞表在性硫酸多糖の合成系なのかもし

べると遥かに未解明ではあるが、シアノバクテリアの生き方のれない。また、シアノバクテリアにおける硫酸基転移酵素の分理解という基礎研究と有用多糖の探索や利用という応用研究の布を調べたところ、海洋、塩湖、陸上といった環境に生息する両方の面から重要な研究対象であると私は考えている。同時に、シアノバクテリアに多い傾向が見られた。まだ生理学的な証拠

その研究には私が現時点で専門外である分析化学などの観点もは得られていないが、硫酸多糖は高塩や乾燥といった環境への必要不可欠であると強く感じている。本記事がシアノバクテリ

適応に必要なのかもしれない。このように硫酸多糖は他の EPS

ア EPS について様々な分野の先生方に少しでも興味を持っていよりも合成系の遺伝子を推測しやすい。また、シアノバクテリ

ただくきっかけになれば幸いである。

アの生理学上の重要性に加え、産業的な有用性も世界中で注目されている。これらの特徴から、シアノバクテリア EPS の中でも硫酸多糖の合成系研究が今後積極的に進められると考えられ
る。

9. 謝辞
私のこれまでの研究は池内 昌彦 名誉教授 ( 東京大学 )、成川礼 准教授 ( 東京都立大学 )、渡辺 智 准教授 ( 東京農業大学 ) の

シネカン合成系の転写制御因子遺伝子 xssQ のホモログはシ

ご指導、ご助言をいただきながらおこなわれました。この場をアノバクテリア特異的に広く存在した。興味深いことに、硫酸借りて深く御礼申し上げます。また、このような記事を執筆さ

多糖合成系を持つことが推測される種には、xssS, xssR, xssQ がせていただく機会をお与えくださったニュースレター幹事の先遺伝子クラスターとして保存されている傾向があった。一方で、生方にも心より感謝申し上げます。

硫酸多糖合成系を持たないシアノバクテリアの一部では xssQ
ホモログのみが保存されており、それは xssS, xssR とは異なる

引用文献

二成分制御系と遺伝子クラスターを形成していた。これはシア

1) Kaneko et al. DNA Res. 3, 109-136 (1996).

ノバクテリア EPS 合成の転写制御における XssQ の普遍性と多2) De Philippis & Vincenzini. FEMS Microbiol. Rev. 22, 151-175様性を示唆している可能性があり、今後私が取り組みたいテー(1998).

マの１つである。

3) Maeda et al. J. Bacteriol. 196, 2348-2354 (2014).
4) Schmid et al. Front. Microbiol. 6, 496 (2015).
5) Kawano et al. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).

7. シアノバクテリア EPS 合成系研究の今後
本記事で紹介したように、モデルシアノバクテリアの EPS 合

6) Enomoto et al. PNAS. 112, 8082-8087 (2015).

成系の網羅的解明はまだ始まったばかりである。例えば S. 6803

7) Maeda et al. Mol. Microbiol. 109, 121-134 (2018).

にはシネカン以外にも複数の EPS とそれらの合成系が存在し、

8) Nobles et al. Plant Physiol. 127, 529-542, (2001).

細胞の固着や運動に関わっていると推測されている。シネカン

9) Maeda et al. eLife. 10, e66538 (2021).

合成が planktonic な状態で誘導されることを考えると、固着状

10) Mullineaux & Wilde. eLife. 10, e70327 (2021).

態ではシネカン合成を抑える代わりに別の運動に関わる EPS 合11) Oeser et al. Mol. Microbiol. 3, 743-765 (2021).

成を促進しているのかもしれない。そのような可能性を検証す5

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2021 年 12 月 28 日

シングルドメイン型 (p)ppGpp 合成酵素ホモログの新機能
倉田 竜明
Dept. of Exp. Med. Sci., Lund University, Sweden
か持たない RSH は SAH (Small Alarmone Hydrolase) と呼ばれ、

1. 背景
微生物は絶えず周囲の環境に応じて自身の状態（増殖速度・RelA などのマルチドメイン型のものは long RSH と区別される

休眠状態・運動・分化など）をコントロールし、今日まで種とようになった。Long RSH はほぼ全てのバクテリアに保存され、して生存してきた。アミノ酸飢餓時におけるバクテリアの緊縮

主要な (p)ppGpp 代謝を担うと考えられる一方、SAS や SAH は

応答は古くから知られる環境応答の一つであり、中心的な役割

ゲノム中にコードされていない、もしくは逆に複数コードされを果たすシグナル分子 (p)ppGpp の発見は半世紀以上前に遡るている。すなわち、この SAS や SAH の発見は RSH による新(1)。緊縮応答時の (p)ppGpp の合成機構に関する研究は伝統的たな環境応答機構の可能性やその生理機能を問いかけるものとに大腸菌 RelA が対象とされてきたが、近年の技術・方法論のなった。

発展により、この 10 年ほどの間に再びスポットライトが当てられるようになった。

2. 細胞毒性の高い SAS の発見

その中でも最も顕著なブレイクスルーとなったのがクライオ

私は 2019 年よりスウェーデンに留学し、生化学が専門の電顕を用いた構造生物学的進展である。リボソームはクライオ

Vasili Hayryliuk とバイオインフォマティクスが専門の Gemma

電顕による構造解析の主要なターゲットの一つであり、リボ

Atkinson が共同で運営するラボで研究している。私たちは前述

ソーム上で機能する (p)ppGpp 合成酵素 RelA の構造が明らかとの SAS、SAH の発見を踏まえ、各ドメインに基づいて RSH のなった (2, 3, 4)。この構造情報を元に (p)ppGpp 合成酵素の分子系統樹を再解析した。その結果、long RSH に対して SAS また解剖と呼べる解析がなされ、近年その詳細な分子機構が明らか

は SAH の系統は明確に分岐していることが明らかとなったが、となってきた (5, 6) 。

驚くべきことに、SAH は long RSH と同等数の、SAS に至ってもう一方の進展は日々蓄積されるゲノム情報とその情報解析はその倍以上となる 30 種のサブファミリーが見出された (9)。

である。それまで研究されてきた RelA や SpoT、Rel といった

すなわち、半世紀にわたって研究されてきた RelA などの long

RelA/SpoT Homolog（RSH）は、ポリペプチドの N 末端側から

RSH の系統は、系統解析の視点で見ればむしろ少数派であった。

(p)ppGpp 分解ドメイン –（p）ppGpp 合成ドメイン – 活性調節

次に私たちはこれらの SAS 遺伝子の近傍に保存される遺伝子

ドメイで構成された 80 kDa 程の比較的大きなタンパク質であ群をサブファミリーごとに探索することで、各 SAS の機能がどる。一方でポストゲノム時代以降、情報解析をもとに (p)ppGppのバイオプロセスに関連するのか予想することを試みた。そのの合成、もしくは分解ドメインしか持たないタンパク質が見出

結果、5 種のサブファミリー (FaRel、FaRel2、PhRel、PhRel2、されてきた (7, 8) 。このような (p)ppGpp 合成ドメインしか持た

CapRel) に属する一部の SAS の下流に保存される隣接遺伝子群

ない RSH は SAS（Small Alarmone Synthetase）、分解ドメインしが発見された。しかし残念なことに、それらすべては機能未知

WP_062951432.1 Brachybacterium sp. sponge
WP_090034969.1 Cellulomonas marina
WP_072816088.1 Rhodococcus zopfii
WP_017831628.1 Microbacterium sp. UCD-TDU
WP_087410551.1 Collinsella sp. An2
100
WP_085022663.1 Anaerovibrio sp. JC8
WP_033170033.1 Selenomonas sp. ND2010
WP_072903260.1 Hathewaya proteolytica
67
WP_009010004.1 Coprobacillus sp. D7
YP 009202237.1 Bacteriophage Lily98
WP_088005586.1 Planomicrobium flavidum
82
WP_090558406.1 Bacillus subtilis la1a86
100 YP 764468.1 Geobacillus phage GBSV1
YP 001425595.1 Bacillus virus 1
WP_003245294.1 Bacillus subtilis
WP_070467991.1 Aerococcus sp. HMSC10H05
WP_001077683.1 Staphylococcus aureus
98 WP_005879011.1 Enterococcus durans
82
WP_002381475.1 Enterococcus faecalis
WP_062464063.1 Lysinimicrobium soli
WP_089252822.1 Rhodococcus kyotonensis
NP 391727.1 Bacillus subtilis 168
WP_000289136.1 Staphylococcus aureus
100
WP_095443596.1 Enterococcus durans
WP_083746574.1 Mycobacterium sp. AB308
95
WP_092611904.1 Raineyella antarctica
74 75
11
WP_082181164.1 Actinomyces timonensis
WP_070515524.1 Brevibacterium sp. HMSC08F02
88
WP_052745433.1 Allosalinactinospora lopnorensis
91
WP_093168291.1 Sinosporangium album
91
WP_071894002.1 Neomicrococcus aestuarii= phage
WP_062460761.1 Lysinimicrobium soli
84
tested, TA-like
WP_081590981.1 Brevibacterium caseitested, not TA-like
WP_003407164.1 Mycobacterium tuberculosis
100 YP 009304221.1 Mycobacterium phage Phrann (gp29)= 0.5 substitutions
YP 009124581.1 Mycobacterium phage Squirty
100

19

8

7

8

7

8

FaRel

+

7

8

7

ATfaRel

+

4
4
21

21

AT2faRel+

4

保存された隣接遺伝子が発見された SAS

ATfaRel2

サブファミリー (FaRel, FaRel2, PhRel2,

PhRel2

6
27

6
6

30
29 25
30
29 25

13
18

10
10

26

6

12

26

2

5

13

17
22

6

31

5

17

18

31

12

33

32

33

+

3
2

5

32

15
3

9

2

3

9

10

5

2

3

9

20

10

5

2

3

9

20

ATphRel2

RelQ

15

RelP

24

14

CapRel

1
1
1

+

1
11

1
11

24

1

ATcapRel

PhRel

16 16
23

1

19
1

14

1

23
27

22

1
28

1

+ ATphRel286

隣接保存遺伝子FaRel24
4

図 1．SAS 遺伝子の系統解析とCapRel, PhRel) に加え、(p)ppGpp 合成活性が確認されているサブファミリー (RelQ,
RelP) の遺伝子を周辺遺伝子とともに示す。黒色の矢印が SAS 遺伝子を示し、系
統樹は SAS 遺伝子に基づいている。FaRel
サブファミリーの SAS 遺伝子上流に保存された遺伝子は SAH（シングルドメイン型 (p)ppGpp 分解酵素）をコードしている。

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)であった。また、faRel 遺伝子についてはその上流にも別の遺2021 年 12 月 28 日

3. toxSAS 発現による転写 ・ 翻訳 ・ 複製への影響

伝子が保存されていたが、その遺伝子は前述した SAH（シン

それでは一体 toxSAS の毒性はどのようにしてもたらされる

グルドメイン型 (p)ppGpp 分解酵素）をコードしており、結局のであろうか。最も単純な仮説は toxSAS が高い (p)ppGpp 合成

一見したところでは SAS の多様性や新機能を予測することは活性を有するということであるが、恐らくそうではないだろう

難しかった ( 図 1) 。ただ、周辺遺伝子の保存性は SAS の隣接と私たちは考えていた。なぜなら (p)ppGpp が合成できない株

遺伝子までであり、主に bicistronic operon (FaRel サブファミリーの表現型を toxSAS は相補しなかったためである。そこで放射では tricistronic operon) を形成していることが予想された。こ性ラベルされたチミジン・ウリジン・メチオニンの細胞内のの特徴は既に SAS として同定されている RelQ、RelP が属する

生体高分子への取り込みを調べることで、toxSAS 発現の複製・サブファミリーではみられなかった。また、(p)ppGpp は DNA

転写・翻訳への影響を大まかに調べた。その結果 FaRel を大腸

複製や翻訳、代謝などを緊縮状態へ誘導するため、その過剰な菌内で発現誘導した場合、転写を第一として翻訳、複製の順で生産はバクテリアにとって潜在的に毒性を示す。以上のことか程度は弱くなるものの、すべての反応が低下することが明らか

ら、これらの SAS- 隣接遺伝子のセットはバクテリアのトキシとなった ( 図 2A)。一方で、他 4 種の FaRel2・PhRel・PhRel2・ン - アンチトキシンシステムの様に機能するのではないかとい

CapRel に関しては翻訳を特異的に阻害するということが明らうことが想起された。

かとなった ( 図 2B–E) (10)。(p)ppGpp 量の増加は速やかな転そこで私たちは各サブファミリーに属する SAS 遺伝子のコ写の低下につながることを考えると（11）、少なくとも翻訳をドンを最適化し、大腸菌内で発現誘導したところ、予想通りこ阻害する 4 種の toxSAS は (p)ppGpp 合成とは異なる機能を有しれらの SAS の過剰発現が細胞毒性を示し、さらに隣接遺伝子ているといことが示唆された。ここからは FaRel とその他のの発現誘導はその細胞毒性を中和した。このことからこれらの

toxSAS に分けて話を進めていく。

遺伝子が実際にトキシン - アンチトキシンのように機能することが示唆された。SAS 間で毒性に強弱の違いが見られ、それが4. ppApp 合成活性を有する FaRel

何に由来するかは不明だが、興味深い点として、既知の SAS (S.

まず、FaRel 発現株の細胞内ヌクレオチド量を HPLC によっaureus relP と E. faecalis relQ) を同様に過剰発現した場合にはそて解析したところ、発現誘導後 (p)ppGpp 量の増加が確認されほど細胞毒性が認められなかった。したがって、隣接する調れた ( 図 3A)。同時に GTP・GDP 量が減少したが、(p)ppGpp

節遺伝子を持つこれらの SAS は潜在的に他の SAS よりも毒性がグアニンヌクレオチドの de novo 合成経路を負に制御するが強いことが考えられ、私たちはこれらの SAS を toxSAS (toxic

ことを踏まえると妥当であり、実際に大腸菌の緊縮応答時にSAS) と名付けた。
Incorporation, %A 100

一般的に見られる結果である (12)。一方でアデニンヌクレオ

C. marina FaRel

チド量に関して不自然とも思える ATP・ADP 量の明確な減少80が確認された ( 図 3B)。当初この原因は不明であったがちょ

S methionine

60

35

40

3

H uridine20

3

H thymidine

うどその頃に、SAS と相同なドメインを持つ分泌タンパク質が分泌先の細菌内で (p)ppGpp の代わりに (pp)pApp を合成し、

00B. subtilis la1a PhRel2

Incorporation, %Incorporation, %0

Incorporation, %

120

C 140
120
100
80
60
40
20
0

120
100
80
60
40
20
0

D 160

ATP・ADP 量を低下させることによって毒性を発揮するとい

16

4
8 12
Time, min16

Mycobacterium phage
Phrann PhRel

80
40
0

う報告がされた (13)。そこで注意深く HPLC の結果を見てみCoprobacillus sp. D7
FaRel2

ると、ppApp に相当するピークを発見し、それが FaRel 誘導に依存して蓄積することが明らかとなった ( 図 3B)。さらに、低毒性型の FaRel 変異体 (Y175A) タンパク質の精製には成功していたので、それを用いて生化学的解析を行ったところ、

0

E 160
Incorporation, %

B 140

4
8 12
Time, min

4
8 12Time, min

確かに ppApp 合成活性が確認された。FaRel 誘導時に増加し

16た細胞内 ppGpp は FaRel と内在性の RelA のどちらによって

M. tuberculosis
AB308 CapRel120

合成されたのは不明であるが、少なくとも FaRel は ppApp を合成し、細胞毒性を示すと考えられる。

80
40

5. tRNA のピロリン酸化により翻訳を阻害する toxSAS

0
0

4
8 12
Time, min

16

0

4
8 12
Time, min

一方で、他の toxSAS の機能については依然として不明なまま

16であり、これらの toxSAS を発現誘導しても当然ながら ppApp

図 2．toxSAS 誘導時の転写、翻訳及び複製の活性の蓄積は確認されなかった。そんな中、部分的ではあるがtoxSAS 誘導 (time 0) 後、継時的に放射性同位体の生体高分子へ

FaRel2 と PhRel2 タンパク質を精製することができたので、この取り込み量を測定した。(9, 10) より抜粋し編集

れらを再構成型無細胞翻訳系 (PUREsystem) に加えたところ、

7

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)
B

0.59

400

0.57
0.56

200

0.55

100

0.54

0

0.53
0

2

4

6

8

Time, min

Guanosine:

0.58

800

0.57

600

0.56

400

0.55

200

0.54

0

0.53
0

10

2

4

6

8

C. marina FaRel

0.58
0.57
0.56

400

0.55
200

0.54
0.53

0
0

UTP and CTP:

AMP
ADP
ATP
pApp
ppApp
pppApp

0.59

600

10

Time, minAdenosine:

GMP/IMP
GDP
GTP
ppGpp

C 800

0.59

OD600

300

C. marina FaRel
1000

OD600

pmol / (OD600 x mL)

0.58pmol / (OD600 x mL)

C. marina FaRel

OD600

pmol / (OD600 x mL)

A 500

2021 年 12 月 28 日

2

4

6

Time, min8

10GrowthCTP
UTP

図 3．FaRel 誘導時の細胞内ヌクレオチド量
FaRel 誘導 (time 0) 後、継時的に細胞内ヌクレオチド量を HPLC により測定した。(10) より抜粋し編集
翻訳阻害活性を有することを確認することができた ( 図 4A, B)。

てくる。これまで RSH によるピロリン酸化の標的はリボヌク

そこで RSH の酵素活性にもう一度振り返った。まず基本とレオチドであったが、tRNA の 3’ 末端はアデニン残基であり、して、(p)ppGpp は ATP を供与体としてグアニンヌクレオチド

FaRel の基質と共通している。またアデニン残基の 3’ 位はアミの 3’ 位の水酸基をピロリン酸に置換することによって合成さノアシル化反応によりアミノ酸が付加される位置であり、そのれる。この時 GDP がピロリン酸化すると ppGpp ができ、GTP

位置のピロリン酸化は潜在的にその反応と競合しうる。tRNAの 場 合 は pppGpp が 合 成 さ れ る。 こ こ ま で 頻 出 し て き た (p)のアミノアシル化が阻害されれば必然的に翻訳反応もまた阻害

ppGpp という表記はこれらをまとめたものであり、前半の p はされる。

5’ 位の、後半の p は 3’ 位のリン酸基の数を示している。一方で、

32
この仮説を検証するため、精製 tRNA と FaRel2 を P で標識

ppApp の場合は GDP の代わりに ADP の 3’ 位がピロリン酸化

された ATP 存在下で反応させ、変性 PAGE により tRNA を分されることによって合成される。つまり RSH の活性に共通す

離した後、オートラジオグラフィによりリン酸機の転移を検出ることは、ATP を供与体としてリボヌクレオチドの 3’ 位をピした。その結果、開始 tRNA (tRNAifMet) とフェニルアラニン

ロリン酸化するということである。

tRNA (tRNAPhe) が FaRel2 に依存してリン酸化された ( 図 4C)。

ここで PUREsystem を構成する物質を見てみると、toxSAS の

また、このリン酸基転移は PhRel2 を用いた場合でも確認され活性と翻訳阻害を結びつける因子として tRNA が浮かび上がっC

PhRel2Marker

Y128A

B
D90G

Markerwt FaRel2

Aた ( 図 4D)。

+

+

−

+

26 kDa26 kDatRNA-PP
DHFR

DHFR
17 kDa17 kDaE+tRNA-PPtRNAiMettRNAPhetRNAiMet

F
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

100

+ FaRel2

74%

CACCA-PPm/z 834.595 (z=-2)

CACCA>Pm/z 785.607 (z=-2)
CACCA-OH
22%
m/z 754.629 (z=-2)
4%
16

18

20

22

24

26

28

Time, min

30

32

80

tRNAPhetRNAPhe
74%

73%

60
40
20

34

8%

0

mock

−

120 minaminoacylation, %PhRel2+

Relative abundance

−

0 min

FaRel2120 minD

FaRel2−

図 4. tRNA のピロリン酸化を介した toxSAS による翻訳阻害(A, B) FaRel2、PhRel2 による再構成翻訳系の阻害。DHFR が目的の翻訳産物。(C, D) tRNA に対する FaRel2、PhRel2 によるリン32
酸機の転移反応。γ 位リン酸機が P で標識された ATP を使用した。(E) tRNA の 3’ 末端のピロリン酸化。FaRel2 により修飾された tRNAPhe の質量分析の結果とそのイオンクロマトグラム。(F) 3’ 末端のピロリン酸化による tRNA アミノアシル化の阻害。
tRNAPhe と FaRel2 を ATP 存在下で反応し、その後 PheRS ( フェニルアラニン tRNA 合成酵素 ) と 3H 標識されたフェニルアラニン
を加えさらに反応した。反応後酸不溶画分に含まれるフェニルアラニンを液体シンチレーションカウンターにより測定した。(10)より抜粋し編集

8

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

ただ、この時点では tRNA の「どの位置」に「いくつ」リン

の生理的機能については、本来の生物を用いていないため、あ酸基が転移したかという、修飾反応の詳細までは不明であっまりアプローチできていないのが実情である。ただし、phRel

た。そこで東大の鈴木勉先生のグループに質量分析を用いた解として解析された gp29 はマイコバクテリウム属細菌に感染す析を依頼し、その結果、確かに 3’ 末端のアデニン残基がピロる溶原性ファアージ由来で、他のファージによる感染を抑制す

リン酸化されていることが明らかとなった ( 図 4E)。さらに、ることが報告されている (14)。したがって、他の toxSAS もそ

FaRel2 による 3’ 末端のピロリン酸化は tRNAPhe のアミノアシのような何らかのバクテリア - ファージ間の生理機能に関連しル化を阻害した ( 図 4F)。これらのことから、前述の仮説の通ていることを想定し現在新たな実験系を構築している段階であり、FaRel2 が tRNA の 3’ 末端のピロリン酸化をすることによっる。

て翻訳を阻害することが示唆された。

本稿ではあまり触れなかったが、toxSAS に隣接して保存された遺伝子もまた興味深い。faRel の上流に保存される SAH 遺伝
子は、cognate な toxSAS である FaRel (ppApp 合成 ) だけでなく、

6. まとめ今回は、スウェーデンでの私の研究について、toxSAS に焦点

他の toxSAS の毒性も中和する (9)。このような SAH は他にもいをあてて掻い摘んで報告してきた。詳細に関しては直近に報告

くつか (PaSpo や PbcSpo) 見つかっており、その緩い基質特異性

した 2 報の論文を参照していただけると幸いである (9, 10)。結は進化の過程における SAS 機能の多様化に何らかの形で関与し果として、バイオインフォマティクスを用いた解析に端を発し、ているかもしれない。また、これらの SAH の存在は私たちにとっいくつかの SAS から RSH の新機能を見出すことができた ( 図ては幸運でもあり、SAH の共発現による毒性の中和がなければ、

5)。とりわけ、tRNA のピロリン酸化については目新しいもの

ToxSAS タンパク質の精製など到底不可能であった。

であり、(p)ppGpp などのアラーモン分子の合成とは異なること

phRel2 の下流に保存される遺伝子 (aTphRel2) と C. crescentus のから、FaRel2 や PhRel2 はこれまで考えられていた SAS (Small

SocA アンチトキシンは互いに DUF-4065 ドメインを持つのホモ

Alarmone Synthetase) という括りをもはや逸脱しているようにログであった。SocA が中和するトキシン SocB は DNA ジャイも見える。本研究では非モデル生物を含めたゲノム情報を用いレースの阻害因子であり、toxSAS とは異なる。したかってアて遺伝子を探索し、大腸菌などのモデル生物を用いて簡単な in

ンチトキシン側からの観点では、DUF-4065 は多様なトキシン

vivo の実験と、そのタンパク質の生化学的解析を行うというスを中和する、一種のコアドメインとなっている可能性がる。

キームで、興味深い成果を得られた。一方で、これらの toxSAS

A

housekeeping
long RSH and SAS

GTP/GDP
OH
HO

P

OH
O

O

P

O

O

P

O

O

OH

P
O

OH

NH2

P

O P O
O OH O

toxSAS

Toxic RSH effectors ofsecretion systems
or toxin-antitoxin modules

ATP/ADP/AMP
OH
HO

P
O

OH
O

P
O

P
O

O
OH

OH
P

O

OH

Toxic RSH effectors of
toxin-antitoxin modules

P

N

O
O
O

O

P

NH2

FaRel

N

Tas1

OH

ATP

CC O

P
O

O

O

HO

O
OH

tRNA

OH
HO

P
O

O

P O P OO OH O

P

O

P

N

OH
O

P

O

O

O

O

OH
HO

P

N

O
O

P

OH

AMP

O

N
N

NH2
N

OH

O

HO

P

O
O

N

N

N

OH

AMP

NH2
CC O

NH2

OH

N

OH
OH

N

OH

N

O

O

N

N

NH2

OH

P

O

O

OH

O

OH

N

OH

P

O

N

N

NH2
N

OH

NH2
N

OH

NH2

OH

HO

N

NH
N

OH
OH

(pp)pApp

N

O

O

OH

OH

N

P O P OO OH O

P
O

HO

O

OH

SASs

C

ATP

O

O

N

OH

O

OH

P
O

RSH

N

N

O

N

OH

majority ofNH2Olong RSHs

HO

N

N

OH
O

N

N

O

P

O

OH

O

N

OH

B

HO

NH2

N

OH
O

OH

NH

N

O

OH
HO

(p)ppGpp

O
N

OH

N

N

N

OH

ATP

FaRel2majority of
toxSAS (?)

O

OH
HO

P
O

N

O
O

P
O

N
N

OH
OH

NH2
N

OH
HO

P
O

O
O
OH

N

N

N

OH

AMP

図 5. RSH の (p)ppGpp 合成ドメインの多様性
赤背景の図は SAS ドメインに基づいた RSH の系統樹を模式したもの。Tas1 は ppApp の合成活性を有する分泌タンパク質。
(10) より抜粋

9News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日とにより、ラボのメンバー入れ替わりが一時的に出ていく一方

7. 最後に本研究を共に行った Vasili/Gemma 研のメンバー及び、鈴木勉の状態になった。このような経緯で実験系ラボの移動とセット

教授、坂口裕理子氏をはじめとする共同研究者の方々に深く感アップをほぼ Vasili と二人で行うこととなり、それは現在進行謝する。また、このような機会をくださったニュースレター幹中である。大学によって文化やルールが異なり、ラボのセット

事の皆様にも深く御礼申し上げる。

アップに苦労する日々だが、この経験もまた貴重なものであり、いただいたご依頼に海外での研究活動に関する内容も含まれやがて彼との語り草になるであろうと思う今日この頃である。

ていたので、最後にその点について記す。前述の通り私は 2019年よりスウェーデン・ウメオ大学で研究を行なっているが、引用文献

Vasili/Gemma の移動に伴い今年 9 月から、同じくスウェーデン

1) Cashel et al. Nature 221: 838–841 (1969)のルンド大学に移った。ウメオでの体験に関する記事を先日寄

2) Brown et al. Nature 534: 277–280 (2016)

稿したのでそちらも参照していただけると幸いである (15)。こ3) Arenz et al. Nucleic Acids Res. 44: 6471–6481 (2016)

こルンドは歴史的な街並みが美しい所で、ルンド大を中心とし4) Loveland et al. elife 5: 1–23 (2016)

た学園都市である。市内の至る所に大学施設が点在する一方、

5) Roghanian et al. Mol. Cell 81: 3310–3322.e6 (2021)

郊外には大学に関連するベンチャー企業が並んでいる。地理的

6) Takada et al. Nucleic Acids Res. 49: 444–457 (2021)にはスウェーデンの南部に位置し、デンマークの首都コペン

7) Nanamiya et al. Mol. Microbiol. 67: 291–304 (2008)

ハーゲンにアクセスが良い。ウメオはオーロラも見えるような

8) Murdeshwar et al. J. Bacteriol. 194: 4003–4014 (2012)スウェーデンの北部に位置するため、大分ヨーロッパの中心に

9) Jimmy et al. PNAS 117: 10500–10510 (2020)

近づいてきた印象である。実際にヨーロッパ各国の研究者との10) Kurata et al. Mol. Cell 81: 3160–3170.e9 (2021)

コラボレーションも活発化しており、ヨーロッパに来てから感11) Winslow et al. J. Biol. Chem. 244:3387-92 (1969)

じた、時差すら煩わしい研究のスピード感を改めて実感してい

12) Varik et al. Sci. Rep. 7:11022 (2017)

る。

13) Ahmad et al. Nature 575: 674–678 (2019)

Vasili/Gemma 研は現在ちょうど過渡期にあり、ラボ移動の決定後、新メンバーの受け入れをルンドへの移動後にずらしたこ

14) Dedrick et al. Nat. Microbiol. 2:16251 (2017)15) 倉田 竜明 日本 RNA 学会会報 https://www.rnaj.org/newsletters/

図 6. ウメオのクライオ電顕（左）およびルンドの新しいラボ（右）現在も一部のメンバーはウメオに残り、リボソームと関連因子の構造解析を行っている（左）。ウメオのファシリティは北欧地域の拠点となっている。実験台は黒い方が個人的に好みだが、こちらはなぜか白い（右）。ここでも放射性同位体を用いた実験ができるのがありがたい。

10

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

レイクアウトルームを使用し、口頭発表終了後に発表者と直接議論できます。また、年会組織委員会の企画として、シンポジ
ウム「様々な環境の微生物とその利用」を開催します。ポスター

第 16 回日本ゲノム微生物学会年会

発表では、LINC Biz に年会開催中だけでなく、年会の数日前
から数日後までポスターを掲示して頂きます。Zoom でのポスのお知らせ（2）

ターセッションの発表に加えて、LINC Biz のチャット機能などを通して、深い議論ができるようにします。

塩見
立教大学

オンライン学会では、参加者同士のコミュニケーションを取

大輔

理学部

ることが難しく、対面での学会のような「立ち話」ができません。このような状況では、とくに学生・ポスドクを含めた若い

生命理学科参加者にとっては、新たな人的ネットワークの構築が困難となっています。そこで、学会参加者のコミュニケーションを促

第 16 回日本ゲノム微生物学会年会を 2022 年 3 月 2 日（水）進するために、oVice (https://ovice.in/ja/) のサイトを年会開催中から 4 日（金）の 3 日間完全オンラインで開催致します。対面および年会の前後数日もアクセス可能にしますので、議論やコ開催とオンライン開催のいずれの可能性についても考えた準備

ミュニケーションにご自由にお使い下さい。また、年会 2 日目をしておりましたが、2021 年 7 月の段階では新型コロナウィには oVice 上でオンライン懇親会を開催する予定です。できる

ルス感染症の状況が全く不透明であり、完全オンラインでの開だけ、参加者の間で対面のような感覚でコミュニケーションが催が決定されました。原稿執筆時点（2021 年 11 月 10 日）では、取れるような年会にしたいと考えています。

陽性者数が全国的に減少しておりますが、依然として今後の感参加登録は Google form を用いて、要旨の提出はメールで行

染状況の動向は楽観視できない状況です。会員の皆様には対面います。年会の詳細は年会ホームページ (https://www2.rikkyo.

での開催を期待されていた方もおられることと思いますが、完

ac.jp/web/sgmj2022-rikkyo/) でお知らせ致します。

全オンラインでの開催になることに、ご理解いただきますよう

年会開催にあたって会員の皆様のご理解とご協力を頂けました

お願い致します。

ら幸いです。そして、できるだけ多くの会員の皆様にご参加頂

発 表 形 式 は、 前 回 の 年 会 と 同 様 に、 口 頭 発 表 を zoom

けますよう、心から願っております。

(https://zoom.us) で、ポスター発表を Zoom と LINC Biz (https://（年会長：塩見大輔、組織委員：関根靖彦、末次正幸、笠井大司、

getlincbiz.jp) のシステムを用いて行う予定です。Zoom ではブ

鈴木祥太、野崎晋五、向井崇人）

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

Relationship between the microbiome and indoor

Mining RNA-seq data reveals the massive regulon of GcvB

temperature/humidity in a traditional Japanese house withsmall RNA and its physiological significance in maintaining

a thatched roof in Kyoto, Japan

amino acid homeostasis in Escherichia coli

小久保 舞香 1、藤吉 奏 2、小椋 大輔 1、中嶋 麻起子 3、宮腰 昌利 1、丘山 春奈 2、Maxence Lejars1、神田 健 1、
田中 佑樹 2、板谷 佳織 2、奥野 未来 2 †、伊藤 武彦 2、

藤枝 絢子 4、能田 淳 5、丸山史人 2
1

岩井 伯隆 2、和地 正明 2

京都大 , 2 広島大 , 3 広島工業大 ,41

京都精華大 , 5 酪農学園大

筑波大 , 2 東京工業大、†久留米大（現所属）

Mol. Microbiol. in press (2021)

Diversity 13 (10):475 (2021)

Miyakoshi  et  al.,  2021

https://doi.org/10.3390/d13100475 (Open access)Figure  7

https://doi.org/10.1111/mmi.14814 (Open access)Cystine

Cys

CycA
LivJ
LivK
BrnQ

SstT
ArgT
MetQ
NlpA

HisQ

SstT

TcyJ

Ser

3PG

SerA

Thr
Lys
Met

IlvC
IlvD
IlvE
ThrA
Asd
PanD
-­Ala

His
Phe

Gly
Ala
Leu
Val
Ile

AroP

PEP

AroC

Tyr

chorismate

TrpE

Trp

Pyruvate

IlvB
IlvM

Acetyl-­CoAAsp
Oxaloacetate
AsnA
AsnB
Asn Malate

Acs

AcetateCitrateIsocitrate

Pro

Icd
Fumarate

DppA
Dipeptide
YdeE

2-­oxoglutarate

Succinate

GdhA

Glu

Gln
Arg

Succinyl-­CoA

SucC
KgtP

GltI
GltP

ArgT

GcvB は大腸菌などの腸内細菌科を含む γ- プロテオバクテリ
住環境には多様な微生物が生息しており人と生活を共にしアに広く保存されている small RNA である。大腸菌で 3 種類ている。住環境の中で微生物が人や構造物に与える潜在的な影の RNA-seq 法 (RIL-seq、CLASH、MAPS) によって報告されて響を明らかにするため、我々はさまざまな住まい方、性能を持いたデータを精査することにより、GcvB との塩基対形成を介

つ家屋を対象として微生物群集について調査を進めている。本して発現が制御される遺伝子を同定した。まず 3 種類の RNA-

論文では、我が国の伝統的家屋の代表である茅葺古民家の壁・

seq データ全てに共通するものとして 47 遺伝子が抽出された。

床面の微生物量と温湿度の関係を調べた。その結果、茅には未

さらに GcvB の２つのシード配列 R1 と R3 のいずれか、もし培養の稲分解菌と近縁の細菌が、土間には土間作製時に混ぜる

くは両方と塩基対を形成して発現が転写後レベルで制御され“ にがり ” が原因と思われる Halococcus が群集中に高い割合をるものとして、21 遺伝子を明らかにした。これにより大腸菌占めていた。微生物群集は屋外と屋内、あるいは各部屋で類の GcvB 標的遺伝子は合計で 54 遺伝子となった。GcvB はほぼ似しており、気密性の高い現代住宅とは全く異なる結果であっ全てのアミノ酸の輸送系・生合成経路を制御するだけでなく、た。これらは、夏場に窓や間仕切りを開けるなどの居住者の行

核酸合成、細胞膜合成や翻訳制御に関与する遺伝子も調節する

動や、自然素材を用いて建造する古民家ならではの住環境が反ことが明らかになった。また、大腸菌ぺプチダーゼ欠損株の映されていると考えられる。一方、生物量の指標となる DNA示すジペプチド Ala-Gln 感受性に、GcvB によって制御される

濃度は、年間最低湿度あるいは年間の相対湿度の変動幅と強いDpp ジペプチド取り込み系と YdeE ジペプチド排出担体が関与

相関（R =0.99）を示した。これらのことから、茅葺のようなしていることが示された。

2

伝統的家屋の方が、温湿度管理が進んだ現代家屋よりも、自然環境中の微生物群集を維持可能な環境であると言える。

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

Metabolic potential of the imperfect denitrifier Candidatus

Genome sequencing of the NIES Cyanobacteria collection

Desulfobacillus denitrificans in an anammox bioreactor

with a focus on the heterocyst-forming clade

大久保 卓 1、髙見英人 1

広瀬 侑 、大坪 嘉行 、三澤 直美 、米川 千夏 、長尾 信義

1

1

1

海洋研究開発機構

2

1

1、志村 遥平 、藤澤 貴智 、兼崎 友 、加藤 浩 、片山 光徳 、
3

4

5

6

7

MicrobiologyOpen 10 (4) e1227 (2021)

山口 晴代 、吉川 博文 、池内 昌彦 、https://doi.org/10.1002/mbo3.1227 (Open access)浴 俊彦 、中村 保一 、河地 正伸

3

8

1

1

9

4

3

豊橋技科大， 東北大， 国立環境研， 国立遺伝研， 静岡大， 三重
2

4

3

5

6

大， 日本大， 東京農業大， 東京大78

9

DNA Res. 28(6):dsab024 (2021)
https://doi.org/10.1093/dnares/dsab024 (Open access)
ヘテロシストを形成しないグループ（Section I-III）

ゲノム解析３１株
Leptolyngbya boryana NIES-2135
Stanieria sp. NIES-3757
Pleurocapsa sp. NIES-4102

Calothrix sp. NIES-3974
Calothrix sp. NIES-4101
Calothrix sp. NIES-4071
Calothrix parasitica NIES-267
Scytonema sp. NIES-4073
Scytonema sp. NIES-2130

ヘテロシストを形成し、枝分かれするグループ（Section V）

Fischerella sp. NIES-4106

Tolypothrix sp. NIES-4075
Nostoc sp. NIES-2109
Anabaenopsis circularis NIES-21
Nostoc sp. NIES-2111
Trichormus variabilis NIES-23
Calothrix brevissima NIES-22
Calothrix sp. NIES-2100
Calothrix sp. NIES-2098
Microchaete diplosiphon NIES-3275
Nostoc carneum NIES-2107
Tolypothrix tenuis NIES-37
Aulosira laxa NIES-50
Nostoc sp. NIES-4103
Nodularia sp. NIES-3585
Nostoc linckia NIES-25

Ca. D. denitrificans の窒素代謝能 . ( ) 内は ribosomal protein との RPKM 比 . 点線の矢印は欠損反応 . 不完全脱窒菌の副産物(NO, NH2OH, NH4+) が anammox バクテリア (Ca. B. pituitae) にNostoc commune NIES-4070

供給されていると考えられる。

Cylindrospermum sp. NIES-4074

一酸化窒素 (NO) 還元酵素を欠く不完全脱窒菌である Ca. D.

Dolichospermum compactum NIES-806

denitrificans は、嫌気的アンモニア酸化 (anammox) アクターにAnabaena cylindrica NIES-19

頻出する。本論文ではゲノム、トランスクリプトミクスを通Sphaerospermopsis kisseleviana NIES-73

して Ca. D. denitrificans の代謝能を評価し、anammox 細菌 (Ca.
B. pituitae) との関係性を推定した。Ca. D. denitrificans は不完全脱窒の副産物である NO を Ca. B. pituitae に供給すると思われるが、本菌は NH4OH の NO への酸化とその逆反応をするヒド
ロキシルアミン酸化還元酵素も有していた。Ca. D. denitrificans
は芳香族化合物、グルコース、硫黄化合物、水素など様々な電子供与体を脱窒反応に利用可能だが、メタトランスクリプトー
ム解析の結果、電子供与体は、主に anammox 反応を阻害する
芳香族化合物であることが示唆された。この芳香族化合物を介した相互作用が、両細菌の個体群バランスを支配していると考えられる。また、Ca. D. denitrificans は、不規則なカルビンサ
イクルを介した CO2 固定能も有しており、これら多様な代謝能が本菌の anammox アクターでの定着性に貢献していることが示唆された。

Raphidiopsis curvata NIES-932

ヘテロシストを形成し、枝分かれしないグループ（Section IV）

地球上には多様なシアノバクテリアが存在し，光合成反応の分子メカニズム、バイオマス生産、生態系における物質循環等、幅広い研究分野で注目されている。シアノバクテリアの中でも、ヘテロシストと呼ばれる異型の細胞をつくるグループはゲ
ノムサイズが大きく、精度の良いゲノム情報の整備が遅れていた。本研究では、国立環境研究所（NIES）が保管する 28 株のヘテロシスト形成株と３株の非形成株，合わせて 31 株のシアノバクテリアのゲノム解析を行った。ゲノム解析株およびゲノム情報は全世界の研究者に公開され、シアノバクテリアの多様性の理解と、それを活用した基礎・応用研究の進展に貢献できる。今後は、糸状性のヘテロ形成能を持たない株のシークエンスや、データベースの分類情報の精査が重要である。

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News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

で DNA を切ると良く読めるような気がしますが、未確認です。
(3) 以下の組成を参考にしてください。BigDye premix が高いわ

ゲノム DNA を鋳型にしたけですが、これくらいは許容範囲かと思います ( なお PCR 産

サンガーシーケンシング

BigDye premix は 0.075 µl /sample です )。

大坪 嘉行

物のシーケンシングの場合、筆者は 3 µl スケールで反応を行い、

東北大

表１, 反応組成「細菌のゲノム DNA を鋳型にしてシーケンス読めますよ」と言うと、「ゲノムを鋳型に PCR で増やしてから、PCR 産物を

5x sequencing buffer

1 µl

鋳型にして読むってことでしょう？」と聞き返されますが違い

1.6 pmol primer

1 µl

す (BigDye kit を使用 )。実際のところ、あまり長くは読めませ水 + DNA

6 µl

んが、100 塩基でも読めれば良いという場合に有用です。筆者

BigDye terminator premix

2 µl

total

10 µl

ます。ゲノム DNA と primer を混ぜて、シーケンス反応をしまは以前、ICE (integrative and conjugative element; いわばゲノムに潜り込んだプラスミド ) がゲノム中のどこに潜り込んだかを調べるのに、ゲノム鋳型シーケンスを実施したり (1)、ゲノムに
integrate させたプラスミドの integration 位置の決定を多数行うなどしています (2)。

(4) 70 から 100 サイクルに増やします。一方、伸長時間を 1 分程度に下げます。あまり増やしすぎると T のピークが小さくなる、ということがあるような気がします。

現在、筆者が考えるポイントは以下の通りです ( 最適化はしていません ....)。

(5) 精製キット ( 例えば BigDye XTerminator™ Purification Kit) では反応産物濃度が薄くなってしまうのでエタノール沈殿で精製します。

(1) 特異性が高い primer を用いる。
(2) 鋳型 DNA を十分に精製し、十分量用いる。

(6) シーケンサーの解析条件のうち injection 時間を通常 6 秒の(3) シーケンス反応溶液で kit をケチらない。

ところを 90 秒程度まで伸ばします。injection 時間と得られる(4) サイクル数を増やす。

シグナル強度はおおよそ比例するようです。injection 時間を長(5) エタノール沈殿で精製。

くするとピーク解像度が劣化しますが、長く読むわけではない(6) インジェクション時間を伸ばす。

場合にはそれほど影響がありません。なお、最近、株式会社日立ハイテクより新型のシーケンサー DS3000 が発売されました。

各ポイントについて具体的には以下の通りです。

こちらの機器でも injection 時間の変更ができるようです。

(1) primer の 3’ の特異性に注意して primer をデザインします。
弊ソフト「GenomeMatcher」の PrimerFinder は、複数指定した
配列中の一配列の指定位置からユニークな k 塩基 ( 例えば 11
塩基 ) を探し出し、これに基づいて primer 候補を出力する機能です。例えば 1 kb のトランスポゾン DNA をゲノムに飛ばし、その近隣配列を読み取りたい場合では、ゲノム配列 + トランス
ポゾンの配列を入力し、トランスポゾンの末端部分 ( 例えば配列中 50 から 150 塩基の部分 ) を指定します。PrimerFinder は指定部分にしかない 11 塩基を探し出して、これを起点にして 5’
方向に、別に指定した Tm 値を超えるまで配列を伸ばして行き、
primer 候補配列として出力します。
(2) kit を用いてゲノム DNA を調製している場合には、追加でPCI 抽出とエタノール沈殿を行い、100 〜 1000 ng を反応に用います。kit の説明書に、調製後そのまま以後の反応に用いることができると書いてあっても信じないようにします。超音波

14

通常、1 kb の PCR 産物を鋳型にして、鋳型を 1 ng 程度、サイ
クル数 25、精製キットを使用 ( 最終的に 70 µl)、injection 6 秒といった条件だと思います。5,000 kb のゲノムが鋳型だとしても、鋳型量を 100 倍、サイクル数を 3 倍、精製方法をエタ沈 ( 最終的に 10 µl) にして濃度を 7 倍、injection 時間を 15 倍にすれば、十分読める、ということかと思います。まずはお試しを。
引用文献
1) Ohtsubo et al. J. Bacteriol. 194:4237–4248 (2012)
2) NIshiyama et al. Env. Microbiol. 12:2539–2558 (2010)

News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

ここのところ相変わらずあまり遠出ができませんので、もっぱら神戸市近郊の山や公園などで花の写真を撮影しています。
ただし、かねてより実物を見たかったトウヤクリンドウだけは高山から乗鞍にバスで登って撮ってきました。また、知人の紹介で訪れたあいな里山公園というところはなかなかいいところで、いろいろな里山の植物がありました。また春に行ってみようと計画しています。
（磯野克己）

ウド（ウコギ科）
Aralia cordata Thunb., 2021.10.20 神戸市

トウヤクリンドウ（リンドウ科）
Gentiana algida Pall., 2021.8.31 乗鞍岳

セージ（シソ科）
Salvia guranitica A.St.-Hil. ex Benth2021.9.10 神戸市布引ハーブ園

ゲンノショウコ（フウロソウ科）
Geranium thunbergii Sieb. ex Lindl. et Paxton
2021.9.29 神戸市← イヌコウジュ（シソ科）
Mosla scabra C.Y.Wu et H.W.Li
2021.9.22 神戸市

キンエノコロ（イネ科）→
Setaria pumila Roem. et Schult.
2021.9.29 神戸市

15News Letter of the Society of Genome Microbiology, Japan (No. 24)

2021 年 12 月 28 日

柿の実が赤く色づき、干し柿づくりの季節がやってきました。

２０２１年度日本ゲノム微生物学会役員

紅葉の沼にコハクチョウも舞い降りる季節、ジョウビタキのヒーッと澄んだ声が碧い空に響き渡ります。青と赤コントラス

会長：黒川 顕トのイソヒヨドリは美しい声で囀っています。24 号の編集も大庶務幹事・会計幹事：大島 拓、渡辺 智

坪、佐々木、佐藤、相馬、広瀬で行ってまいりました。

集会幹事：河野 暢明、森 宙史

ところで、2 年後に大阪で開催予定の国際学会について御紹広報幹事：矢原 耕史、大島 拓

介させてください。マイコプラズマというゲノムが小型の細菌

ニュースレター幹事：

達（分類は Mollicutes 綱）に特化した学会です。この細菌達は、

佐藤 勉、相馬 亜希子、大坪 嘉行、佐々木 裕子、広瀬 侑

植物、昆虫、甲殻類、魚類、鳥類、ほ乳類が地球上に現れるの男女共同参画幹事：相馬 亜希子に共進化し寄生したのではないかと仮説が立てられる程に、宿評議員 ( 会長推薦を含む ): 朝井 計、跡見 晴幸、飯田 哲也、

主特異性があります。おまけに産業植物、産業動物、人間に病岩崎 渉、大西 康夫、永田 裕二、仁木 宏典、布浦 拓郎、

気を引き起こす種も多くあり、国際マイコプラズマ学会 (IOM)

野尻 秀昭、林 哲也、本郷 裕一、南澤 究、市川 夏子、は、異なる分野の発表が集まる学際的な会議です。小型ゲノム

大林 龍胆、神沼 英里、島田 友裕の特性を活かした世界初の合成生物としても有名で、昨今では

会計監査：阿部 貴志、伊藤 武彦

合成生物の応用もされはじめています。進化、微生物生態、感染症の疫学や疾病病態、ワクチン開発など日本ゲノム微生物学

会員の動向

会の方々が興味をいだかれることでしょう。

一般会員 343 名、学生会員 134 名、名誉会員 3 名

国際マイコプラズマ学会 (IOM) 2023 大阪の詳細は、下記の賛助会員 12 名、機関会員 1 名（計 493 名）

URL からご覧になれます。HP から Twitter に入ることができます。2023 年 7 月 16-20 日は、大阪市中央公会堂（国指定重要文
化財）に集いましょう。下記に学会サイトを記します。
https://www.iom2023-osaka.org/

Phylogenic tree of mycoplasma and related mollicutes
Mycoplasmatota

Phylogenetic tree: Manilof J. “Phylogeny and evolution” in Molecular biology and pathogenicity of
mycoplasma, by Razin S and Herrmann R (edits) Kluwer academic/ Plenum publishers
Yuko Sasaki, 「Mebio」29 (10): 16-23, 2012 より引用

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