LED 誘起蛍光法による植物葉とミドリムシの光合成活性の測定
増田健二 1・竹本裕之 1,2
1 静岡大学、技術部
2 静岡大学、グリーン科学技術研究所

我々は、植物にダメージを与えることなく光合成活性を測定できる LED 誘起蛍光法を開発した。 従来、植物の葉のクロロフィル蛍光スペクトル測定に用いられていたレーザー誘起蛍光法は、発熱により植物の光合成反応が低下し、光合成活性を正確に測定できなかった。今回開発した方法では、LED 光をホットミラーとシアンフィルターに通すことで、620nm より長い波長の遠赤色光と近赤外光はカットする。これにより、近赤外光による発熱や、730nm 付近の遠赤色光による光合成に関わるフィトクロムの不活性化を防ぐことができる。植物葉の光合成反応を低下させることなく、クロロフィル量を正確に測定できるため、光合成活性を高精度に診断することが可能である。本手法の応用例として、ミドリムシの光合成活性の測定も示す。

Key Words: absorption energy, chlorophyll content, chlorophyll fluorescence, laser-induced fluorescence method

１．はじめに応系の解析に利用されてきた 2)。
これまでの Chla 蛍光の解析手法は、レーザー誘起蛍

光合成色素は光合成に働き、光合成の細胞内器官で光 (Laser-Induced Fluorescence : LIF) 法 3)-6)により、植ある葉緑体に存在する。葉緑体は、その中にチラコイド物葉の Chla 蛍光スペクトルを測定しているものである。

膜を持っており、クロロフィルやカロテノイドの多くは、タ緑葉 で はク ロ ロ フィ ル に よ る 685nm (F685) と 740nm

ンパク質と結合してこのチラコイド膜の中に存在する。ク(F740)に蛍光のピークが見られる。Chla (P680)を誘起さ

ロロフィルは炭酸同化を行い、でんぷん類をつくり栄養とせる光の波長は 680nm 未満であり、光合成に利用されして蓄える。カロテノイドは吸収した光エネルギーをクロない余剰エネルギーのほとんどは、PSⅡからカロテノイドロフィルに渡す光捕集機能を持ち、過剰な光による傷害を防ぐ光防御機能であるキサントフィルサイクルをにない、過剰な光エネルギーを熱に変換して放散している。
図 1 に、光合成とクロロフィル蛍光の模式図を示す。
光エネルギーを吸収して誘起状態となったクロロフィル a色素が元の基底状態に移るときに、その差に相当するエネルギーを放出する。このうち、一部が蛍光という形で放出されたものをクロロフィル a（以降 Chla）蛍光という 1)。
Chla 蛍光は、光合成活性に関係し、古くから光合成反図 1 光合成とクロロフィル a 蛍光の模式図

外線で誘起すると、緑色の蛍光を発する。図 3(b)の白葉
では、米粒状の Chla 蛍光は点在しており、フラボノイドもより薄くなり楕円縞模様となっている 6)。
冷却式 CCD 分光器（Ocean Optics QE65Pro : 波長範囲 500－870nm, 波長分解能 0.1nm, 感度 16bit）を用いて分光スペクトル計測を行った。図 3 (c)に示すように、LED 光(破線)をシアンフィルタ(620～740nm カット)とホットミラー(675nm～カット)を透過させて、620nm より長波長
図 2 レーザー誘起蛍光法（従来手法）に送られ、熱に変換されて放散される。また、ごく一部が側をカットした光(青一点鎖線)で誘起すると、685nm と(a)蛍光(F685)という形で放出される。740nm にピークがある
Chla 蛍光は、光合成活性状態でチラコイド膜内に存在する光化学系Ⅰ (PSⅠ)のクロロフィルから発せられる 7)。
従来の方法には、紫外・可視レーザー光を用いたレーザー誘起蛍光法があり、植物葉のクロロフィル蛍光スペクトルを測定している。図 2 のように、レーザー光を植物葉に照射するとその熱のため、植物の光合成反応は衰退し、F740 蛍光ピーク値は小さくなっていく、このため正確な光合成活性の測定ができなかった。本研究では(b)

植物にダメージを与えることなく、光合成活性を測定できる LED 誘起蛍光法を開発した 8)。本技術では、ほとんど熱がでない（赤外線カット）LED を照射するため、植物葉の光合成活性を衰退させることなく、クロロフィル含量の定量的な測定ができ、精度が高い光合成活性の診断が可能となった。また今回、この技術をミドリムシの光合成活性の測定に応用した。

２．ポトス葉（緑葉・白葉）の Chla 蛍光(c)

植物葉として、緑色の葉に白色の斑入りのポトス葉を用いた。共焦点レーザースキャナー蛍光顕微鏡(LeicaTCS SP8)では、倍率 63 倍において表面から 100μm程度の深さまで測定ができる。本装置を用いて 740nmにピークのある Chla の蛍光画像を取得した。図 3 (a)の緑葉では深さ 30μm 程度からの棚状組織に米粒状のChla 蛍光(F740)が密集して見られた。表皮細胞部分には、厚さ 5μm 程度の高濃度のフラボノイドが存在し、有図 3 Chla 蛍光スペクトルと Chl 含量 蛍光顕微鏡画像

害な紫外線を吸収する働きをしている。フラボノイドは紫(a)緑葉 (b)白葉 (c)LED 光誘起 Chla 蛍光740nm にピークのある緑葉の Chla 蛍光スペクトル(緑線)

図 4 (a)のように、① 深緑(SPAD 値：62.6)＞② 緑が検出できる。白葉(赤点線)では、740nm のピークはほ(44.0)＞③ 黄緑(29.3)＞④ 黄(15.5)＞⑤ 赤(3.0)の順

とんどなくなり、685nm のピークも小さくなっている。

で SPAD 値が大きくなった。
図 3 (c)の青一点鎖線のような 620nm より長波長側を３. 葉色別の SPAD と Chla 蛍光スペクトルの比較カットした LED 光で誘起すると 685nm と 740nm にピークのある Chla 蛍光が検出できる（図 4 (b)）。光化学系 II

植物葉の光合成反応の活性化の診断のために考案（PSII）の Chla に集められた励起エネルギーは、光合成され たの が 葉 緑素 計 (SPAD: Soil and Plant Analyzerに利用されない場合、ほとんどが熱として放散され、ごくDevelopment ） で あ る 。 ク ロ ロ フ ィ ル が 吸 収 す る 赤 色

一部が F685 蛍光として PSII から放射される。740nm に(650nm)と吸収のない近赤外(940nm)の LED 光を交互ピークを持つ Chla 蛍光は、活発な光合成の際にチラコに照射すると、光が葉を透過して受光素子に導かれてイド膜に存在する PSI の Chl から放出される。

光電変換される。これら２つの光学濃度を測定し、差をLED により光合成有効放射強度（Photosynthetically

元に SPAD 値を求めている(光学濃度差方式)。SPAD 値

Active Radiation, PAR）が 350molm-2s-1 程度の適切なによりクロロフィル濃度の推定も可能となっている 9)-12)。

強度光を照射すると、光合成反応が起こる。①深緑葉はSPAD 値はクロロフィル含量と相関があり、作物の窒素光合成が活性化し、F740 蛍光強度値が最も大きくなり、吸収が多いと、葉中色素のうち光合成に必要なクロロフ光合成に使われないで放出される F685 蛍光の強度値ィル含量が高まり、葉色が濃くなる。水稲では葉身の窒が最も小さくなっている。反対に、⑤黄葉は、F740 蛍光素含有量が高まるにつれてクロロフィル含量が直線的に強度値は小さくなり、F685 の余剰エネルギーの蛍光強増加する。水稲の窒素栄養状態の測定では、葉色より度値が大きくなっている。

精度が高い診断が可能である13)。

４．SPAD 値と Chla 蛍光ピーク、植生指数の比較(a)

SPAD 値が同じくらいの値に偏らないように 40 枚の葉を選び、SPAD 値と Chla 蛍光を測定した。図 5 は、横軸正規化植生指数(Normalized Difference Vegetation Index)R R RedNDVI  NIR
NIR : 850nm, Red : 680nm
R NIR  R Red(b)図 4 葉色と SPAD 値とクロロフィル a 蛍光の比較(a) サンプル葉 (b) Chla 蛍光スペクトル

図 5 SPAD 値と Chla 蛍光ピーク値、NDVI の比較

に SPAD 値、主軸に F740 (739.5-740.4nm) と F685 の蛍して垂直に、ミドリムシを入れた凹スライドグラスの中心か光ピーク値、２軸に正規化植生指数（NDVI）を示したグラら 20mm の位置に設置し、凹部分の全面（直径 15mm）

フである。SPAD 値と F740 peak (●)の相関係数が 0.926の光を集光する（図 6）。と高い相関を示した。SPAD 値と NDVI(▲)もよい相関

LED 誘導蛍光法の光源（青線）は、LED 光（破線）を(R=0.843)を示す。このことから、光合成活性は Chla のホットミラー（675nm～NIR カット）とシアンフィルター（620相対含量に由来し、PSⅠから発する F740 蛍光強度値か～725nm カット）に通すことで赤外線をカットしている。ユら判断が可能であることが分かる。また、光合成に使用さーグレナの Chlb 蛍光のピークは 685 nm の赤い点線でれずに PSⅡから放出される F685peak(◆)には SPAD 値ある（図 7）。との間に相関関係が見られない。

5. 植物葉とミドリムシの蛍光スペクトルの比較
ミドリムシ（ユーグレナ）は、葉緑体内の Chlb に二酸化炭素を取り込んで酸素に変換する炭酸同化作用を行い、多糖類のパラミロンを生成して栄養として蓄える。藻類には、ミドリムシのように光合成を行うものがよく知られている。例えば緑藻には、Chlb とカルテノイドが存在する 14)。
LED を用いたミドリムシの蛍光スペクトル測定には、冷図7LED 誘起蛍光法によるミドリムシの蛍光測定

却 CCD 分光器（Ocean Optics QE65Pro）を用いた。光源には高輝度 LED 懐中電灯（KENSUN）を使用し、自作ホルダーに取り付けた。ホルダーの前面にはホットミラー(a)を，背面にはシアンフィルターを取り付けた。ホットミラーとシアンフィルターとの距離は 10mm である。LED フラッシュライト（8000 lm）の照射距離は 20mm、赤外線カット
LED の光合成有効放射量（PAR）は、約 350 molm-2s-1である。
ミドリムシの測定装置は、水面に対して 45°の角度でLED 光を照射します。光ファイバーの先端は、水面に対(b)

図6

LED 誘起蛍光法によるミドリムシの測定装置

図 8 緑葉とミドリムシの蛍光スペクトル比較(a) ミドリムシの蛍光取得法 (b) 紫外線誘起蛍光UV（350－400nm）ライトを用いた蛍光スペクトル測定とができる。Chla 量と F740 蛍光強度値には高い相関がには、CCD 分光器（Ocean Optics USB2000: 波長範囲あった。このことから、光合成活性は Chla 量に由来し、180－880nm, 波長分解能 0.4nm, 感度 14bit）を使用しPSI から放出される F740 蛍光強度値から判断することがた（図 8）。

できることがわかった。

図 8 (a) に UV ライト(Alonefire XHP99)を誘起光源にユーグレナは光合成色素としてクロロフィル b (Chlb)を用いたミドリムシの蛍光検出方法を示す。凹スライドガラ持ち、電子輸送に 1 種類の光化学系のみを用いている。

スに 80   のミドリムシの培養液を入れ、UV ライト光を照光合成反応を行い、二酸化炭素を還元し、ユーグレナ射して、ミドリムシの反射光（赤線）を取得した。ミドリムシ特有の多糖類であるパラミロンと、細胞内貯蔵物質であ（赤線）から水（黒線）の反射光を差分したのが蛍光強度る脂肪を生産している。ユーグレナの濃度が高くなると、スペクトル（緑線）である。ミドリムシの Chlb は、赤色の波赤色吸収率（吸収したエネルギー量）が増加し、同じ割長の光を吸収して、光合成反応に伴う F685 蛍光を発す合で蛍光強度値も増加しました。このことから、ユーグレる。また、カルテノイドは、青色の光を吸収して F500 蛍光ナの光合成活性は、Chlb が吸収した励起エネルギー量を発する。緑葉とミドリムシにおけるカルテノイドの F500に由来し、F685 の蛍光強度値から判断することができる

蛍光とクロロフィルの F685 蛍光は類似している。ミドリム

ことがわかった。本研究の方法は、非破壊・非接触でミドシは、緑葉のような光化学系Ⅰ (PSⅠ)からの F740 蛍光はリムシの光合成活性を測定でき、緑の反射率による増殖見られなかった。の評価や Chlb 蛍光強度を用いた光合成活性の診断を行う技術としてのシステム開発への応用が期待できる。

６． おわりに謝辞開発した LED 誘導蛍光法は、植物葉の光合成反応

本研究を実施するにあたりミドリムシを提供して頂きまを低下させることなくクロロフィル量を正確に測定できるした、静岡市立高校の曲田澄子先生、科学探究科 2022

ため、光合成活性を高精度に診断することが可能です。

年度課題研究ミドリムシ班の生徒の皆様に感謝申し上

本法の応用例として、ユーグレナの蛍光・吸収スペクトルげます。

を測定し、光合成活性の診断を行いました。
植物の葉は、光合成色素としてクロロフィル a（Chl a）を含み、光化学系 I（PSI）と光化学系 II（PSII）の直列か

参考文献1)

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600 mol m s ）応答において、Chla の光形態形成に関

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わるフィトクロムは、赤色光（600-670 nm）の吸収により活2)性化される。F740 蛍光は、光合成によって活性化されたチラコイド膜の PSI に含まれる Chla が、吸収したエネル

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ギーを励起状態から基底状態に戻す際に放出する蛍光fluorescence of green plants. 1: A technique for theである。光合成に使われなかった励起エネルギーの大remote detection of plant stress and species

部分はカロテノイドに移動し、熱として放散される。また、

differentiation. Appl. Opt., 23 134-138 (1984)

少量は PSII から蛍光（F685）として放出される。Chla 含4) H. K. Lichtenthaler et al. Detection of vegetation

量は、光合成反応時に PSI から放出される F740 蛍光とstress via a new high resolution fluorescence imaging

光合成に利用されない PSII から放出される F685 蛍光

system. J. Plant Physiol., 148 599-612 (1996)の 2 つのピーク波長の強度比（F740/F685）から求めるこ

5)

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