第 65 回質量分析総合討論会, 1P-25
2107 年 5 月 17-19 日, つくば市

固相誘導体化を用いた低濃度のアミノ酸および有機酸と高濃度の糖類を含む試料の一斉分析法の開発（株式会社アイスティサイエンス 1・和歌山県工業技術センター2・阪大院工 先端生命工学専攻 3）
さ さ の りょういち

おおさきしゅうすけ

ふ る の まさひろ

ふくさきえいいちろう〇佐々野 僚 一 1・大崎 秀 介2・古野正浩3・福崎英一郎3

Development of simultaneous analysis with in-SPE derivatization method for low
concentrated amino acid and organic acid and high concentrated sugar.
(AISTI Science Co.1, Wakayama prefecture 2, Dept Biotech, Grad Sch Eng, Osaka Univ.3)〇R.Sasano1, S.Osaki2, M.Furuno3, E.Fukusaki3Short Abstract: When the peak of high concentrated sugar is appeared in the chromatogram, it is alsodifficult to measure both low concentrated amino acids and organic acids. Therefore, by using in-SPE
derivatization method technology. At the first sample load, we kept the amino acid and organic acid in SPE
cartridge, and the second sample load, less than 1/20 sample amount load into the same SPE cartridge enable tocatch the sugar with in the same dynamic range. Thus, we have achieved to analyze for amino acid, organic acidand sugar in simultaneously.
Keywords: Amino acid, Organic acid, Sugar, In-SPE derivatization
緒言：一般的な GCMS 測定対象のメタボロミクスにおいては、アミノ酸、有機酸、糖類を一斉に分析する必要がある。一方、ヒトなどの生体由来のサンプルや食品由来のサンプルなどには多数の成分が様々な濃度範囲で含有している。しかし、高濃度の糖類が存在すると、そのピークのリテンションタイムに近接する低濃度のアミノ酸や有機酸の測定が困難になるという問題が生じている。また、高濃度の糖類が大量に GCMS に導入されると、分離カラムの液相の保持可能な量を超え、目的成分も含めてリテンションタイムが大きくずれることがあり、解析が困難になることがある。さらに、高濃度の糖類が MS に導入されることにより、MS が汚れやすくなり、感度低下につながる。このように低濃度の成分と高濃度の成分が混在するサンプルの一斉分析が難しい要因となっている。
実験：固相抽出の技術を応用し、第１回目の試料負荷では糖類は固相に保持させず、アミノ酸と有機酸を固相に保持させておき、第 2 回目の試料負荷では先の試料量の 1/20 以下にして先の固相に糖類を保持させ、アセトニトリルで洗浄することで脱水を行い、アミノ酸と有機酸と糖質が固相に保持された状態で誘導体化試薬を固相に添加含浸させて誘導体化し、その後、一斉にヘキサンで溶出して、大量注入法で 10µL 注入し、質量分析装置で SCAN にて測定した。

結果と考察：２段階に分けて試料量および溶媒を調製して固相に負荷することで、低濃度のアミノ酸および有機酸を多く固相に保持させ、高濃度の糖類を同じ固相に少なく保持させることができた。その結果、得られたクロマトグラムは同じダイナミックレンジ内でそれぞれのピーク強度を得ることができた。これにより、GCMS に負荷を与えることなく、低濃度のアミノ酸および有機酸と高濃度の糖類を含む試料の一斉分析が可能になることがわかった。

第65回質量分析総合討論会, ポスター発表
2017年5月17-19日（つくば市）

固相誘導体化を⽤いた低濃度のアミノ酸および有機酸と⾼濃度の糖類を含む試料の⼀⻫分析法の開発〇佐々野僚⼀1・大崎秀介2・古野正浩3・福崎英⼀郎3
アイスティサイエンス1・和歌山県工業技術センター2・阪大院工3

課題と目的
低濃度の成分と⾼濃度の成分が混在する
サンプルの⼀⻫分析の課題•

⾼濃度の糖類により、低濃度のアミノ酸や有機酸の測定が困難になる。

•

⾼濃度の糖類が大量にGCMSに導入されると、分離カラムの液相の保持可能な量を超え、正確な測定が困難になる。

•【研究目的】
⾼濃度の糖類を低濃度のアミノ酸や有機酸の測定値と同じダイナミックレンジ内にすることを目的として、２段階に分けて試料を分取し、それぞれを同じ固相に⾼濃度の糖類がMSに導入されることによ保持させる２段階試料分取

り、MSが汚れやすくなり、感度低下につ法を開発した。

ながる。

試料負荷時の⽔濃度と固相への保持について

☞ポイント
第⼀溶媒

20%水-アセトニトリル溶液では糖類を除去して、アミノ酸と有機酸を保持することが可能。

第二溶媒

1%水-アセトニトリル溶液ではアミノ酸と有機酸と糖類を保持することが可能。

２段階試料分取法：構想
試料抽出液
20%⽔-ACN

2回目採取

試料抽出液
5μL

１回目採取
試料抽出液
100μL

希釈液添加
ACN 100μL

試料抽出液
20%⽔-ACN

洗浄液
20%⽔-ACN

1. 試料負荷

2. 洗浄CX-

アミノ酸
–NH3+

AX+ 有機酸–COO-

糖類 -OH

CX-

洗浄液
ACN

3. 脱⽔

アミノ酸–NH3+

AX+ 有機酸–COO-

残存糖類 -OH

アミノ酸をと有機酸を固相に保持。
糖類はスルーさせ、除去。

CX-

アミノ酸
–NH3+

AX+ 有機酸

–COO-

残存⽔

希釈試料抽出液
１%⽔-ACN

洗浄液
ACN

誘導体化試薬 [含浸]MTA、MSTFA

溶出液
ヘキサン

4. 希釈試料負荷

5. 脱⽔

6. 固相誘導体化

7. 溶出

CX-

アミノ酸
–NH3+
有機酸

AX+ –COO糖類–OHCX-

アミノ酸
–NH3+
有機酸

AX+ –COO残存⽔糖類–OH

少量の試料をアセトニトリルで希釈して少量の糖類を固相に保持。

CX-

アミノ酸

–NH-TMSAX+ 有機酸–COO-TMSCXAX+糖類–O-TMS

アミノ酸–NH-TMS
有機酸–COO-TMS
糖類–O-TMS

第１回目の試料負荷では糖類は固相に保持させず、アミノ酸と有機酸を固相に保持させておき、第２回目の試料負荷では先の試料量の1/20以下にして先の固相に糖類を保持させ、アセトニトリルで洗浄することで脱水を行い、アミノ酸と有機酸と糖質が固相に保持された状態で誘導体化試薬を固相に添加含浸させて誘導体化し、その後、一斉にヘキサンで溶出した。

前処理フロー
野菜ジュース

試料 10µL（10mg）

１回目分取

添加：水 190µL

Presh-SPE AOS-3mg

添加：ACN 800µL（アミノ酸と有機酸を保持）

洗浄：20%水-ACN 50µL（糖類を洗浄）

インキュベーション（37℃, 30min）
遠⼼分離（14000rpm, 5min）

試料抽出液分取 100µL （20%⽔-アセトニトリル）

2回目分取洗浄：ACN 100µL（脱⽔効果）
試料抽出液分取 5µL（１%⽔-アセトニトリル）

希釈：ACN 100µL（糖の保持効果）
試料抽出液（20%⽔-アセトニトリル）

Presh-SPE AOS-3mg（アミノ酸と有機酸を保持した状態）（糖類を保持）洗浄：ACN 100µL（脱⽔効果）
誘導体化試薬を含浸 メトキシアミン/ピリジン 5µL
固相誘導体化反応 3min
誘導体化試薬を含浸 MSTFA 25µL

※適宜希釈
※NaOH水溶液を添加してpH７になるように調整

固相誘導体化反応 1min
溶出：ヘキサン 100µL
添加：ヘキサン 400µL
検液 GC/MS：大量注入10µL

操作写真

測定条件
PTV Injector
Insert Type
Injector Temp.

LVI-S250(AiSTI Science)
Spiral Insert
70℃(0.1min)-120℃/min-240℃-50℃/min-300℃(12min)

Auto Samplar
SyringInjection Volume

Agilent 7693
50µL
10µL

GC
Inlet ModeVent
Splite Parge Flow
Flow Mode

Agilent 7890B
Solvent Vent Mode
150mL/min, 70kPa, 0.06min
50mL/min, 3minConstant Flow, 1.2ml/min

ColumnDB-5ms, 0.25mm i.d. X 30m, df;0.25µm
Oven Temp.
60℃(2.5min)-20℃/min-310℃(1min)
Trans. Line Temp. 280℃
MS
Ion Souce Temp.
MS Method

Agilent 5977B
230℃
SCAN, m/z;70-500試料負荷時の抽出液のpHと保持について
180

アミノ酸
Alanine-2TMS
Valine-2TMS
Leucine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Proline-2TMS
Glycine-3TMS
Serine-3TMS
Threonine-3TMS
Aspartic acid-3TMS
Methionine-2TMS
Glutamic acid-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Lysine-4TMS
Histidine-3TMS
Tyrosine-3TMS

160

Relative Peak Area

140
120
100
80
60
40
200

pH3.5

pH4.0

pH5.5

pH7.0

pH8.5

試料負荷時の抽出液のpHと保持について
140

有機酸
Succinic acid-2TMS
Fumaric acid-2TMS

Relative Peak Area

120

Malic acid-3TMS
100

Ketoglutaric acid-MO-2TMS
Tartaric acid-4TMS

80

Citric acid-4TMS
6040

結果：

20

抽出液のpHが低いと保持され有機酸においては試料負荷時のないことがわかった。よって、試料を負荷する時の抽出液は0pH3.5

pH4.0pH5.5

pH7.0

pH8.5

pH７になるように調整することとした。

本法による標準溶液を⽤いた再現性
N o.

アミノ酸および有機酸 0.05nm ol/uL 50uL

化合物名

1 P yruvic acid-M O -TM S
2 O xalic acid-2TM S
3 M aleic acid-2TM SST-1

ST -2

ST -3

326,078

272,621

255,639

228,791

247,419

238,435

2,101,596 2,201,338 2,189,384

4 Su ccinic acid -2TM S

1,545,773 1,811,758 1,531,092

5 Fu m aric acid -2TM S

1,736,037 1,888,235 1,729,101

6 M alic acid-3T M S652,172

715,041

633,750

7 K etoglu taric acid-M -2T M S 1,743,632 1,766,843 1,692,053
8 Tartaric acid-4TM S

1,373,960 1,441,944 1,313,024

9 C itric acid-4T M S

1,230,029 1,294,887 1,202,971

10 A lanine-2TM S

8,640,462 9,028,803 9,243,813

11 V aline-2TM S

1,643,565 1,598,273 1,795,816

12 Leucine-2TM S

524,794

517,891

555,474

13 Isoleucine-2T M S

2,145,613 2,184,722 2,256,030

14 P roline-2TM S

5,966,070 5,815,625 6,337,728

15 G lycine-3TM S

465,546464,208

486,616

16 Serine-3TM S

6,733,940 6,765,371 7,090,181

17 Th reonine-3T M S

1,638,309 1,692,383 1,725,648

18 A spartic acid -3TM S

7,876,615 7,698,440 8,112,766

19 M ethion ine-2TM S

401,614403,554

416,804

20 G lu tam ic acid -3TM S

1,775,455 1,595,572 1,826,798

21 P h enylalanin e-2TM S

6,911,026 6,847,395 7,029,301

22 Tyrosine-2TM S

5,707,831 5,797,850 5,428,516

23 Lysine-4TM S

1,480,711 1,440,106 1,686,430

24 H istidin e-3TM S

138,428

132,212

152,731

25 Tyrosine-3TM S

371,747

362,896416,279

S T-4

A ve

289,516
229,875 236,130
2,277,568 2,192,472
1,741,508 1,657,533
1,903,735 1,814,277
696,375 674,335
1,836,823 1,759,838
1,419,340 1,387,067
1,273,394 1,250,320
9,480,040 9,098,280
1,983,400 1,755,264
589,075 546,809
2,403,115 2,247,370
6,947,649 6,266,768
491,786 477,039
7,561,905 7,037,849
1,806,406 1,715,687
8,337,593 8,006,354
439,198 415,293
1,865,958 1,765,946
7,367,841 7,038,891
6,026,842 5,740,260
1,684,583 1,572,958
157,374 145,186
423,004 393,482
303,726

N o.

糖類 0.2nm ol/u L 5uL

化合物名
ST-1

R S D (% )

ST-2

ST -3

S T-4

A ve

R S D (% )1,829,954 1,697,406 1,884,760 1,854,972 1,816,773

4.6

27 A rab inose-M O -4TM S

2,058,363 1,927,036 2,180,936 2,151,136 2,079,368

5.5

28 R ham nose-M O -4TM S

1,133,837 1,058,002 1,208,867 1,172,861 1,143,392

5.7

10.9

26 X ylose-M O -4TM S

3.7
3.3
8.5

29 Fucose-M O -4T M S

5.2

30 Fructose1-M O -5TM S

5.6
3.4

909,615

4.9

2,097,758 2,064,597 2,148,115 2,143,372 2,113,461

1.9

31 Fructose2-M O -5TM S

1,643,276 1,635,447 1,695,825 1,747,072 1,680,405

3.1

32 M ann ose-M O -5TM S

4,836,740 4,851,336 4,937,350 5,090,237 4,928,916

2.4

4.1

33 G alactose-M O -5TM S

3,865,132 3,869,771 3,920,023 3,996,825 3,912,938

1.6

3.3

34 G lucose-M O -5TM S

3,379,203 3,121,917 3,190,987 3,180,244 3,218,088

3.5

3.9

35 G lucopyranose-5TM S

9.6

9.9

36 Sucrose-8TM S

2,622,777 2,662,113 2,631,348

6.0

37 Lactose1-M O -8TM S

3,725,973 3,468,644 3,464,426

5.0

38 Lactose2-8TM S

4,602,143 5,581,471 5,268,097

8.0

39 M altose1-M O -8TM S

4,552,684 4,072,476 4,110,055

3.0

40 M altose2-8TM S

3,659,795 4,138,740 3,773,779

630,818
2,696,903 2,653,285
3,533,066 3,548,027
5,638,305 5,272,504
4,065,236 4,200,113
4,336,212 3,977,132

5.5
4.1
3.5
4.2
6.8
3.3
4.3
8.3
8.1
7.8

915,640

548,010846,252

654,027

950,447

630,117926,120

691,119

1.3
3.5
9.0
5.6
7.9

本法による野菜ジュースのSCANトータルイオンクロマトグラム[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

TIC : 38568480 - 0

1. Alanine-2TMS
2. Malic acid-3TMS
3. Asparatic acid-3TMS
4. Pyroglutamic acid-2TMS
5. GAVA-3TMS
6. Glutamic acid-3TMS
7. Citric acid-4TMS
8. Fructose1-MO-5TMS
9. Fluctose2-MO-5TMS
10.Glucose-MO-5TMS
11.Glucopyronose-5TMS
12.Sucrose-8TMS

7
3.0E+07212

2.0E+07

8,9,1063,4,5

1.0E+0711

10.0E+00
R.T-->

08:00

09:00

10:00

11:00

12:00

13:00

14:00

15:00

TIC : 1242248 - 95763

1.2E+0678

1.0E+0668.0E+051

9112,3,4,5

6.0E+05

4.0E+05

2.0E+051拡大[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

07:00

R.T-->

07:30

08:00

08:30

09:00

09:30

10:00

10:30

10

1. Valine-2TMS
2. Isoleucine-2TMS
3. Proline-2TMS
4. Glycine-3TMS5. Succinic acid-2TMS
6. Fumaric acid-2TMS
7. Serine-3TMS
8. Threonine-3TMS
9. Asparatic acid-3TMS
10.Tartaric acid-4TMS
11.Phenylalanine-2TMS

本法による野菜ジュースを⽤いた再現性
N o.

野菜ジュース 10u L/1m L 4倍希釈

化合物名
P J-１

12345678910111213
1415161718192021222324

Su ccinic acid -2TM S
53,618
Fu m aric acid -2TM S
13,489M alic acid -3TM S
794,415
K etoglu taric acid-M O -2T M S 10,287
Tartaric acid -4T M S
9,313
C itric acid -4TM S
1,966,814
A lanine-2TM S
2,845,774
V alin e-2T M S
101,107
Leucine-2TM S
15,321Isoleucine-2TM S
63,155
P rolin e-2T M S
458,672
G lycine-3T M S
21,668Serin e-3T M S
476,122
Th reonine-3TM S
78,341
A spartic acid -3TM S
4,686,933
G lutam ic acid-3T M S
4,736,619
P h en ylalanin e-2T M S
257,196
Tyrosin e-2TM S
31,487
Fru ctose1-M O -5T M S
2,062,980
Fru ctose2-M O -5T M S
1,711,374
M ann ose-M O -5T M S
51,091
G lucose-M O -5TM S
2,535,728
G lucopyranose-5T M S
742,148
Su crose-8TM S
1,847,061

１回目100uL

２回目5u L

P J-２

P J-３

P J-４

P J-５

P J-６

P J-７

48,21911,865
724,4119,840
8,245
1,935,224
2,768,258
88,755
14,91650,295393,806
22,811
443,964
78,1394,643,713
4,882,719
257,661
35,662
1,994,412
1,647,589
49,2982,186,072
786,844
1,746,771

53,185
12,732
793,269
10,4158,340
1,934,789
2,657,313
87,413
12,93653,582425,565
20,153407,985
72,696
4,436,285
4,744,648
234,500
32,902
2,042,655
1,673,083
51,4292,194,972
801,596
1,728,064

55,224
12,848803,023
10,414
8,706
1,938,684
2,774,700
92,007
14,241
58,315442,178
23,835449,604
78,255
4,519,353
4,812,985
255,148
37,777
1,997,072
1,650,628
49,616
2,152,255
816,807
1,720,861

50,265
11,804
722,560
9,592
7,902
1,909,637
2,662,174
74,19912,27947,137347,122
22,879381,791
70,1694,386,816
4,716,805
244,192
33,5182,008,716
1,653,13449,484
2,144,596
827,676
1,710,034

53,96512,087
788,610
10,145
8,655
1,948,231
2,694,419
87,422
14,52049,470412,539
21,285429,997
74,5584,574,875
4,689,354
261,769
39,8442,003,833
1,638,625
49,3352,346,947
759,322
1,725,824

51,095
13,646
791,110
10,393
8,584
1,949,949
2,777,270
102,797
14,842
57,837434,530
20,946474,545
77,714
4,786,882
4,954,272
278,415
43,1092,146,394
1,689,720
50,9892,809,710
625,699
1,789,754

A ve52,224
12,639773,914
10,1558,535
1,940,475
2,739,987
90,52914,151
54,256416,345
21,940437,71575,696
4,576,408
4,791,057
255,554
36,3282,036,580
1,666,308
50,1772,338,611
765,727
1,752,624

R S D (% )
4.7
5.9
4.5
3.2
5.2
0.9
2.6
1 0.6
7.9
1 0.6
8.9
5.9
7.8
4.3
3.1
2.0
5.4
1 1.5
2.7
1.6
1.9
1 0.7
9.0
2.8

フルーツジュースを⽤いた各法によるSCANトータルイオンクロマトグラム比較

まとめ
２段階に分けて試料量および溶媒を調製して固相に負荷することで、低濃度のアミノ酸および有機酸を多く固相に保持させ、⾼濃度の糖類を同じ固相に少なく保持させることができた。
２段階試料分取法にて得られたクロマトグラムは同じダイナミックレンジ内でそれぞれのピーク強度を得ることができた。
GCMSに負荷を与えることなく、低濃度のアミノ酸および有機酸と⾼濃度の糖類を含む試料の⼀⻫分析が可能になることがわかった。