BulLToyamaPre、Fish、Exp、Stn・No.3，７−１４（1992）

13℃から18℃の水槽に移したときの３倍体
サクラマスのRNA／DNA比の変化
大 津 順(1992年１月８日受理）

RNA／DNAratiointriploidmasusalmon，Ｏ"ＣＯ吻凡cﾉb妬masou，ｋｅｐｔｉｎｔｈｅｔａｎｋｆｒｏｍ１３℃ｔｏ１８℃watertemperaturechanging
ＪｕｎＯＨＴＳＵ＊

ＤＮＡａｎｄＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｍuscleintriploidanddiploidofmasu

salmon，ＯﾉzcoﾉZy〃c加ｓｍａｓｏｕ，wasdeterminedbeforeandafterchangeoftherearingtaｎｋｗｉｔｈｗａｔｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｌ３ａｎｄｌ８℃、TheDNAconcent‐rationinthetriploidwasnotdifferentfromthediploidatl3℃ofnormal

conditionTheRNA／DNAratioofthetriploidwasslightlyloweredthanthatofthediploidbutnotsignificantat１３℃、Ｔhenuclearlengthofthewhitemusclecellofthetriploidwassignificantlylongerthanthatofthediploid
After7daysofthetemperaturechange，ｔｈｅRNA／ＤＮＡｒａｔｉｏｏｆｔｈｅｄｉｐｌｏｉｄａｔ７ｄａｙｗａｓｌoweredsignificantly，however，theratioofthetriploidwasnot
significantlydifferentfrominitialratio．

Keywords：Ｏﾉzcorﾉmy"c地ｓｍａｓｏｕ，RNA／ＤＮＡratio，temperature，triploid．
Ribonucleicacid（ＲＮＡ：リボ核酸）は蛋白を合成するための鋳型として細胞内に存在するものであり，ＲＮＡ量が多いと言うことは蛋白合成が盛んであることを意味する。細胞１個あたりのDeoxyribonucleicacid（ＤＮＡ：デオキシリボ核酸）量は細胞分裂のある時期を除いて一定であり，各組織あたりのＤＮＡ量はその組織に含まれる細胞の数の指標となる。

そのため，RNA／ＤＮＡ比はｌ細胞あたりの蛋白合成活性のｌ指標とされている。さらに，RNA／ＤＮＡ比はサケ・マスを含む多くの魚種で成長率と相関が認められ，成長率の１つの指標となることが示されている（Buckleyl984，Ｂｕｌｏｗｅｔａｊ，1981,WilderandStanleyl983，WrightandMartinl985)。
３倍体魚の赤血球は核と細胞の大きさの増加とともに血液の単位容積あたりの赤血球数の減少が多くの魚種で知られており（BenfeyandSutterlinl984，BeckandBiggersl983，
Sezakietaj、1983)，同様に，網膜細胞の大きさの増加と数の減少が認められている（Aliahetaj、1990)。一方．３倍体サクラマス（Oncorﾉｉｙ凡cﾉjusmaso必）の成長は通常のサクラマスと差がないことが報告されている（宮崎1989)。しかし．３倍体サクラマスの蛋白合成＊富山県水産試験場（ToyamaPrefecturalFisheriesExperimentStation，Namerikawa，Toyama936，Japan）
富山県水産試験場業績Ａ第20号

8富山県水産試験場研究報告第 3号(1992)

能力を RNA/DNA比から調べた報告はない。
本研究は. 3倍体サクラマスの成長の特性を明らかにすることを目的とし. 3倍体サク含量と RNA含量を調べ. RNA/DNA比を比べるとともに，ラマスの筋肉組織における DNA生理的活性を変化させるために水温が 5CC高い水槽に移動した場合の RNA/DNA比の変化を経時的に調べた。

材料と方法
材料は，富山県水産試験場で養成した性転換雄サクラマスから得た精液を神通川産雌サクラマスから得た卵に媒精し. 10分間吸水させた後 30C
C6分間の高温処理により第 2極 体放出を阻止して作出した 3倍体雌サクラマスを用いた。ふ化後約 9ヶ月間は 13:
t1
C
Cの地下水で飼育し. 8月中旬に実験に用いた。対照として同じ時期に通常雄と媒精し，同様に飼育したサクラマスの稚魚を用いた。
水温 13:t1
CCで飼育した供試魚(体重 7.
1‑13.
3g) と対照魚(体重 4.
8‑‑12.
6g) のそれぞれ20尾を 80oの個別の水槽に移し

水温 18:t1CCの飼育水を注入し. 1日 2回 配 合 飼 料 を13CC)及び変化後1.3.
7日目に各水槽から 5尾を給餌して 7日間飼育した。水温変化前 (80CCで保存し.核酸の測定に供した。 3倍 体 群 か ら取り上げ，背側部体側筋を採取して ‑は血液の塗抹標本を作成し，赤血球の大きさが通常魚よりも大きいことにより 3倍 体 で あることを確認した。

核酸の抽出法

核酸の抽出は S
chmit‑
Thanhauser‑Schneider法 を 一 部 改 変 し た 水 野 (1969)の方法に準じた。筋肉組織を 5倍量の冷水とともにホモジナイズし，その 1miあたり 5mi

10%トリクロロ酢酸 (TCA) を加え. 3，OOOrpmで 10分間遠心分離して沈澱を得た。沈澱に95%エタノール 5mOを加え.懸濁した後再び遠心分離した。この沈澱にメタノール・エーテル (3:1)混液 15miを加え. 90C
Cで 3分間加熱して脂質を除去した。
PCA)5mOを加え. 90C
Cで 15分 間 加 熱 し て 核 酸 を
脂質を除去した沈澱に 5%過塩素酸 (分 解 し た 。 冷 却 後 遠 心 分 離 し て 上 清 を 分 取 し さ ら に 残 撞 に 5%PCA2.5miを加えて懸濁し，遠心分離して上清を得た。この上清を前の上清とあわせて核酸分画とした。

DNAの定量 DNAの定量はジフェニルアミン法によった。核酸分画 2miに ジ フ ェ ニ ル アgを氷酢酸 100miと濃硫酸 2.
8m
Oの 混 液 に 溶 解 し た も の ) 4ミン試薬(ジフェニルアミン1.5d を加え.沸騰水中で 10分 間 加 熱 し た 後 冷 却 し . 分 光 光 度 計 ( 島 津 自 記 分 光 光 度 計 uv
‑260) を用いて室温で 695nmの吸収を測定した o サケ精巣 DNA (和光純薬製)を用いて検量線を作成し.組織 Igあたりの DNA量を計算した。
RNAの定量 RNAの定量はオルシノール法によった。核酸分画 2miに オ ル シ ノ ー ル 試 薬(オルシノール 100mgを0.
I%FeCI3濃塩酸溶液に溶解したもの) 2m
Oを 加 え て 沸 騰 水 中 で 20分間加熱し.冷却後分光光度計を用いて 660nmの吸収を測定した。同様に，サケ精巣 DNAによる発色を測定し，ジフェニルアミン法により測定した DNA量から核酸分画に含まれるDNAによるオルシノール試薬の発色を補正し，酵母 RNA (和光純薬製)を用いて作成した検量線により RNA量を計算した。
核径の測定 水温変化前の試験魚より採血し.常法により血液の塗抹標本を作成し.光学顕微鏡下で接眼マイクロメーターを用いて 40個以上の赤血球の長径と短径を測定した。ま大津 :3倍体サクラマスの RNA/DNA比の変化

9た.筋肉組織細胞核の観察は.水温変化前の試験魚から筋肉組織を採取し，常法によりパラフィン切片を作成して光学顕微鏡を用いて切片の方向が筋繊維と平行なものから任意に40個の核を選び.接眼マイクロメーターにより長径を測定した。
結 果
水温 13"Cで飼育した試験魚の筋肉 Ig当りの D N A量を Table‑1に示した。 3倍体サクラマスの筋肉 19あたりの DNA量 は 通 常 サ ク ラ マ ス の そ れ と 比 較 し て 有 意 な 差 は 認 め ら れなかった o

DNAとRNA含量を Table‑2に. RNA/DNA比の変化を Fig.
lに 示 し た 。 水 温 変 化 前 では 3倍体サクラマスの RNA/DNA比は1.38と低かったが.変化 1日目以後の RNA/DNA比の変化は通常サクラマスのそれと似た傾向を示した。通常サクラマスは高水温水槽への移動により RNA/DNA比が減少し. 7日目には水温変化前と比較して有意に減少した。一方.

Table‑l Mean DNA concentrationinmuscleo
fdiploidandtriploidingerlingkepti
n13"C water temperature.
masu salmon，fDiploidTriploidn

DNA (μg/g wetweight)

202
0

302.
6:
t6
9.
9
5
3
26.
6:
t7
0.
45

mean::tS.
D.

Table‑2 Mean DNA and RNA concentr
ationinmu
scleo
fdiploidan
dtriplod masu

3"
Cto18"C water temperaturec
hanging.
salmon keptint
hetankfrom 1。

Days

288.
0:
:
t6
7.
6
RNA 523.
5:
:
t8
7.
7
RNA/DNAratio1.82:
:
tO.
3
7
T
riploid
92.
0:
:
t6
3.
9
DNA 3
RNA 5
20.
0:
:
t5
9.
4
RNA/DNAratio
1.3
8:
:
t0.
40
Diploidmean:
:
tS.
D.

DNA

:
t31.0
3
33.
0:
5
12.
0:
t6
4.
1
1.54:
:
tO.
1
6
320.
0:
:
t6
2.
4
4
4
9.
0:
:
t50.
0
1.40:
t0.
1
93

7325.
5:
:
t61.4
372.
5:
t6
5.
8
:
t0.
3
11.
1
8:
34
2.
0:
:
t52.
3
380.
0:
t1
6.
3
1.1
3:
:
t0.
1
62
64.
0:
:
t2
7.
7:
t5
9.
32
97.
0:
1.1
4:
:
t0.
30
2
90.
5:
t3
6.
5
t3
6.
2
2
99.
0:
1.0
5:
:
tO.
24

富山県水産試験場研究報告第３号（1992）

１０２．０

3倍体サクラマスのＲＮＡ／ＤＮＡ比した。しかし，３倍体サクラマス
では水温変化前のＲＮＡ／ＤＮＡ比が通常サクラマスよりも小さかっＯ
１．．一一ｍ﹄くｚＱ︑くｚ塵

は水温変化後３日目より減少を示●たために変化前と後のRNA／ＤＮＡ比に有意差は認められなかった。
赤血球細胞と核の短径と長径をTable‑3に示した。３倍体サクラ
マスの赤血球細胞と核の短径と長径はともに通常サクラマスのそれ０ 一 一 戸 一 一 一
０ １ ３７らよりも有意に大きかった。
通常サクラマスと３倍体サクラ

Ｄａｙｓ

マスの筋肉組織像をFig.２，３に示
Fig.１ＣｈａｎｇｅｏｆＲＮＡ／DNAratioofdiploidandtriploid し た 。 中 央 に 核 を 見 る こ と が で きⅢｎａｓｕｓａｌｍｏｎｋｅｐｔｉｎｔｈｅｔａｎｋｆｒｏｍ13℃(Ｏdays）ｔｏる。この筋肉細胞核の長径の測定
１８℃watertemperaturechanging・
結果をTable‑4に示した。３倍体Ｏｐｅｎcircle:ｄｉｐｌｏｉｄ，
closedcircle:
triploid・Bar:standarderror，

サクラマスの筋肉細胞核の長径はastarisk:significantlydifferentfromOday．

通常サクラマスよりも有意に大きかった。

Table‑3Meannuclearandcellsizeoferythrocytesindiploｉｄａｎｄｔｒｉｐｌｏｉｄｍａｓｕｓａｌｍｏｎｋｅｐｔｉｎｌ3℃watertemperaturecondition．
Nuclear

Erythrocyte

Width

LengthWidth

Length

( 、）

(,α、）

( 、）

（jum）

3.33*＊±０．０６

10.65*＊

Ｂ／Ａ

１．
０８１．
１５＊：mean±ＳＥ．＊＊：significant（Ｐ＜0.01）

12.19

9.25*＊±０．０６

21.0*＊

１．
１９１．
７２＋一十一Triploid(B）7.75±0.05

６１
７０００

9.30＋一十一

3.09±0.05＊

５７００００Diploid(A）大津：３倍体サクラマスのＲＸＡ／ＤＮＡ比の変化

別１L画

■

竜一Ｉ

一一一一一一.
１
１０卜
11ｍ

絢騨職

Ｆｉｇ．２NuclearｏｆｍｕｓｃｌｃｃｃｌｌｏｆｄｉｐｌｏｉｄｍａｓｕＦｉ９．３Nuclearofmusclecelloftriploidｍａｓｕ
ｓａｌｍｏｎ，Ｏ"ＣＯＦﾉzync/ｌｕｓｍａｓｏｕ．ｓａｌｍｏｎ，Ｏﾉzcorﾉiy瓦cA"ｓｍａｓｏｕ．

Table‑4MeannuclearlengthofwhiLemuscleindiploｉｄａｎｄｔｒｉｐｌｏｉｄｍａｓｕ
ｓａｌｍｏｎｋｅｐｔｉｎｌ3℃watertemperaLurecondition．
Nuclearlength

Diploid（A）

10.36±Triploid⑧．
２３11.51＊*± ０Ｂ／Ａ0.
25＊

１．
１
１＊：mean±ＳＥ．＊＊：significanL（Ｐ＜０．０１）

考察

通常サクラマスと３倍体雌サクラマスの筋肉組織１９あたりのＤＮＡ量に有意差は認められなかった。

一方，３倍体雌サクラマスの筋肉細胞核の長径は通常サクラマスと比較して有意に大きく，その比は1.11で，３乗すると1.37となる。また，３倍体サクラマスの赤血球核の長径も有意に大きく，その比は1.15で，３乗すると1.52である。これらのことから．３倍体サクラマスの筋肉及び赤血球の核の容積は通常サクラマスの1.4〜1.5倍と推定され，他の魚種の場合とほとんど同様である（Swarupl959）ことが判明した。
筋肉細胞の核に含まれるＤＮＡ量が３倍体サクラマスでは通常サクラマスよりも多いと考えられるにもかかわらず，組織の単位重量あたりのDNA量に有意差が認められなかったことは，３倍体サクラマスにおいては核が大きくなると同時に核１個あたりの細胞の容積が増加していることを示している。３倍体魚の赤血球の核と細胞の容積が増加するが．一方

1２

富山県水産試験場研究報告第３号（1992）

で赤血球数が減少することは，大西洋サケ（BenfeyandSutterlinl984)，ギンブナ（SezakietaJ、1983）などでよく知られている。平均赤血球容積は大きくなるが赤血球数が減少することはサクラマスにおいても同様である（大津1991)。細胞の大きさの増加と細胞数の減少は，３倍体のアユ（PZecOgjossusajtjue"s）の網膜や腎臓の細胞においても報告されている（Ａｌｉａｈｅｔａｊ．1990)。核の容積が増加する一方で組織１９あたりのＤＮＡ含量が変化しないことは，筋肉組織は多核であるために，正確には細胞数の減少を意味するものではな
いが，赤血球においてみられたと同様に，核と細胞の容積の増加及び細胞数の減少が３倍体サクラマスの筋肉組織においても起こっていると考えられる。
３倍体サクラマスでは核１個あたりのDNA量が多いと考えられるが、組織あたりのＤＮＡ量に差がないことから，ＤＮＡに対する細胞質の量は通常サクラマスと等しいと考えられる。
RNA／ＤＮＡ比は細胞あたりの蛋白合成活性，ひいては成長率の指標とされているが，細胞質あたりのDNA量に差がないならば，RNA／ＤＮＡ比により３倍体サクラマスと通常サクラマスの成長を比較することができるものと考えられる。通常の飼育条件である水温１３℃においてはRNA／ＤＮＡ比が通常サクラマスよりも３倍体サクラマスの方が小さいことは，３倍体サクラマスにおいては蛋白合成活性が小さい傾向にあることを示唆するものと思われる。一方で，高水温水槽（18℃）に移動した場合，３倍体サクラマスと通常サクラマスのRNA／DNA比に差がないことは，３倍体サクラマスの基本的な蛋白合成能力が通常魚と違いがないことを示していると思われる。３倍体サクラマスの成長は，通常魚と混養した場合には通常魚よりも劣るものの，分養した場合には差がないと報告されている（宮崎1989)。また，３倍体ニジマスの飼料効率は通常のニジマスと差がないと報告されている(Oliva‑TelesandKaushikl990)。しかし，３倍体アユでは刺激に対する反応が通常のアユよりも鈍いと報告されており（Ａｌｉａｈｅｔａｊ、1990)，今回の実験において通常飼育状態における３倍体サクラマスのRNA／ＤＮＡ比が低い傾向を示したことは，３倍体サクラマスの摂餌活性が低い可能性もあるように考えられる。

RNA／DNA比は重金属などの影響により減少することが報告されており（Kearnsand
Atchinsonl979)，また，高水温などのストレスによっても減少することが知られている(SpigaraelliandSmithl976)。今回の実験において通常サクラマスでは７日目までＲＮＡ／ＤＮＡ比が減少している。サクラマスにとっては18℃という水温は適水温の上限であり，１３℃の適水温から１８℃の水温に移した場合にはストレスを受けてＲＮＡ／ＤＮＡ比，すなわ

ち蛋白合成活性が減少し，７日目では回復していない。３倍体サクラマスも、通常サクラマスと同様に別水槽への移動と高水温によりストレスを受け，環境変化後少なくとも７日目までRNA／DNA比が減少する傾向が認められた。３倍体サクラマスのRNA／ＤＮＡ比が通常サクラマスと異なり，７日目においても環境変化前と有意な差が認められないのは，水温13℃の条件下でのRNA／DNA比が通常魚のそれよりもやや小さいためであるが，３倍体サクラマスも，通常サクラマスと同様にストレスを受けて蛋白合成活性が減少していることは明らかである。ただし．３倍体サクラマスのRNA／ＤＮＡ比が水温13℃の条件下で低いのは３倍体サクラマスの適水温が通常サクラマスと異なっている可能性も考えられる。
本実験より，３倍体サクラマスの成長能力はRNA／DNA比からみた場合には，通常サクラマスと大差ないことが明らかとなった。今後は，高水温や別水槽への移動によるストレスだけではなく，成長に影響を与える他の要素について検討するとともに，ストレスから大津：３倍体サクラマスのＲＮＡ／ＤＮＡ比の変化

1３の回復についても研究を進める必要があろう。

謝辞

本研究の遂行に当たり様含な御協力，御支援をいただいた富山県水産試験場の研究員，職員の皆様に厚く御礼申し上げる。また，本論文をまとめるに当たり，御助言，御校閲をいただいた養殖研究所栄養代謝部長新井茂博士と当水産試験場長正木康昭博士に深謝の意を表する。

要

約３倍体サクラマスと通常サクラマスの筋肉組織のDNA量とRNA量を測定し，単位組織重逓あたりのDNA量とRNA／ＤＮＡ比を計算した。また，筋肉組織の核の長径を測定した。

その結果，筋肉組織lgあたりのDNA量に差がなかった。また，ＲＮＡ／ＤＮＡ比は３倍体サ
クラマスの方が通常サクラマスよりも低い傾向を示したが，有意差は認められなかった。
筋肉細胞の核の長径は通常サクラマスのそれと比較して３倍体サクラマスの方が有意に大きかった。

試験魚を13℃から１８℃の水温の水槽に移してＲＮＡ／ＤＮＡ比を経時的に調べたところ，通常サクラマスは移動後７日目で，移動前と比較して，有意にＲＮＡ／ＤＮＡ比が減少した。
一方，３倍体サクラマスのRNA／ＤＮＡ比は減少する傾向を示したが，移動前と比較して有意差は認められなかった。

文

献ＡｌｉａｈＲ．Ｓ､，Ｋ・Yamaoka，Ｙ・Inada，andNTaniguchil990・Effectsoftriploidyontissue
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BenfeyT．』・ａｎｄＡ，MSutterlinl984・ThehaematologyoftriploidlandlockedAtlantic
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1４富山県水産試験場研究報告第３号（1992）

宮崎統五1989．昭和63年度地域バイオテクノロジー研究開発促進事業報告書染色体操

作によるサクラマスの不稔３倍体大量生産技術開発研究l8pp・富山県水産試験場．
水野重樹1969．核酸の一般的分離・定量法，16‑111．東京大学出版会，東京．
大津順1991．平成２年度地域バイオテクノロジー研究開発促進事業報告書染色体操

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Oliva‑TelesA.，ａｎｄＳ．』・Kaushikl990・GrowthandnutrientutilizationbyＯ＋ａｎｄｌ＋triploidrainbowtrout，ＯＩｚｃｏＦﾉby"chusmyhjss．』・FishBio1.,37,125‑133．

SezakiK.，Ｓ・ＷａｔａｂｅａｎｄＫＫａｓｉｍｏｔｏｌ９８３・Acomparisonofchemicalcomposotion
betweendiploidandtriploidof Ginbuna Cbmss虹ｓ 、t"ｓｊα昭sdo板．Bull・Japan・
ＳＯＣ・Sci・Fish.，４９，９７−１０１．

SpigaraelliS，ＡａｎｄＤ．Ｗ、Ｓｍｉｔｈ１９７６．GrowthofsalmonidfishesfromheatedandunheatedareasofLakeMichiganmeasuredbyRNA‑DNAratios・InThermalEcology（ＧＷ、ＥｓｃｈａｎｄＲ．Ｗ，McFarland，eds)，VoLII,ｐｐ､100‑105.ERDASymposiumSeries（Conf，750425)．Augusta，Georgia，Ｕ､S・A
SwarupH1959、Effectoftriploidyonthesize，generalorganizationandcellularstructure
inGasterosteusaculeatus(Ｌ)．Ｊ・Genet.，56,143‑155．

Wilderl．Ｂ，ａｎｄＪ．Ｇ・Stanleyl983・ＲＮＡ−ＤＮＡｒａｔｉｏａｓａｎｉｎｄｅｘｔｏｇｒｏｗｔｈｉnsalmonid
fishesinthelaboratoryandinstreamscontaminatedbycarbary１．Ｊ・FishBio1.,
22,165‑172．

WrightD．Ａ，ａｎｄＦ．Ｄ・Martin1985．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔａｒｖａｔｉｏｎｏｎＲＮＡ:ＤＮＡｒａｔｉｏｓａｎｄ

ｇｒｏｗｔｈｏｆｌａｒｖａｌｓｔｒｉpedbass，Moro"ｅｓａｘａｔα"s・ibid.，27,479‑485.