Bull・ToyamaPre・Fish、Exp、Stn、Ｎｏ．４，１−９（1993）

３倍体サクラマスのリンパ球および好中球の大きさと流動パラフィン投与による循環血中の細胞数の変化
大 津 順(1993年１月25日受理）

SizeDistributionofNeutrophilesａｎｄLymphocytesinTriploidMasuSalmon，
０瓦corﾉZy"cんｕｓｍａｓｏ型，andChangesintheirNumberinCirculatingBloodafter
AdministrationofLiquidParaffin
ＪｕｎＯＨＴＳＵ＊

Sizesandnumbersofneutrophilesandlymphocytesincirculating
bloodinthetriploidmasusalmon，Ｏ"corhy"cﾉ2匹ｓｍａｓｏ座，wereinvestigated・Thenumbersofneutrophilesandlymphocytesincirculating
bloodweredeterminedandcomparedwiththosefoundindiploidfish
beforeandafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin・
Ｔｈｅｌｏｎｇａｎｄｓｈｏｒｔｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｂｏｔｈneutrophilesandlymphocytesin
triploidfishweresignificantlylargerthanthoseinthedipliods・Ｔｈｅ
ｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｓｉｎｌｍｍ３ｏfbloodofthetriploidswas
significantlylessthaninthediploids・
Ｏｎｅｔｏｌ４ｄａｙｓａｆｔｅｒｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆliquidparaffin，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ

ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｓｉｎｌｍｍ３ｏfbloodinthetriploidfishincreasedsignificantly．
Inthecontroldiploidfish，ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，significantincreases
inneutrophileswerefoundonlyafter3to7days、Lymphocytesinthe

diploidsshowedasignificantincreaseinnumberpeｒｌｍｍ３ｏｆｂｌｏｏｄａｔ７ａｎｄｌ４ｄａｙｓ，butinthetriploids，thenumberdecreasedsignificantlｙ
ａｔｄａｙｓｌａｎｄ３，andincreaｓｅｄａｔｄａｙ７，aftertheinjection．
Keywords:cellsize，immuneresponse，lymphocytes，neutrophiles，○瓦corZy凡cﾉZusmaso皿，triploid

３倍体魚は染色体が一組増加するために，赤血球の核と細胞の大きさが増加するとともに血液の単位容積あたりの赤血球数の減少が多くの魚種で知られている（BeckandBiggersl983；ＳｅｚａｋｉｅｔａＺ，1983；BenfeyandSutterlinl984)。同様な変化は網膜細胞の大きさと数にも認められており（ＡｌｉａｈｅｔａＪ、1990)，また，著者は３倍体サクラマスの筋肉細胞の核の長径が２倍体サクラマスのそれと比較して有意に大きくなることを報告した（大津1992)。しかし，３倍体サクラマスについて，生体防御に関わる白血球の大きさと，細胞性免疫の反応性について調べた報告はない。

細胞性免疫反応は魚の感染に対する防御機構の一つとして重要な役割をはたしている。
＊富山県水産試験場（ToyamaPrefecturalFisheriesExperimentStation，Namerikawa,Ｔｏｙａｍａ瞥硝鶴験場業績A第25号

富山県水産試験場研究報告第４号（1993）

多くの無脊椎動物や脊椎動物の血液や組織内には，細菌や無機物の粒子，細胞の破片などを貧食し消化する機能を持つ食細胞と呼ばれる細胞が存在し，これらは生体防御に重要な役割をはたしていると考えられている。硬骨魚類においても，哨乳類と同様に，循環血中の白血球のうち好中球と単球が食作用を持つことが知られており（Suzukil986)，感染防御にこれらの食細胞が関与していることが示唆されている。魚類の生体防御に果たす食細胞の役割は哨乳類におけるほど明らかにされていないが，哨乳類のそれと大差ないものと考えられている（Corbell975)。また，リンパ球は魚類においても免疫反応の上で抗体産生など重要な役割をもち，その反応性も魚類の感染防御機構に大きな意味を持っていると考えられている（Ellisl977，池田ら1986)。本研究は３倍体サクラマスＯ"corﾉZy"c/zus
masouの細胞性免疫の反応性の特徴を知ることを目的とし，負食能を持つとされる好中球と抗体産生に関わるリンパ球について，循環血中におけるそれらの細胞径を計測し，さらに腹腔内へ異物として流動パラフィンを投与した場合のそれらの数の変化を経時的に調べた。

材料と方法
供試魚は，富山県水産試験場で養成した性転換雄サクラマスから得た精液を神通川産雌サクラマスから得た卵に媒精し，３０℃６分間の高温度処理で作出した３倍体雌サクラマスである。仔魚は13±１℃の地下水で飼育し，ふ化後約１年の幼魚を１月下旬に実験に用いた。対照実験には同じ時期に通常雄と媒精し，同様の条件で飼育した２倍体サクラマスの稚魚を用いた。
３倍体魚（体重24.6〜53.69）と２倍体魚（体重25.6〜78.69）の腹腔内に流動パラフィンを注射器により体重１９あたり0.2m､注入し，無給餌で飼育した。投与前及び投与後１，３，７及び14日目に尾柄部より採血を行い，赤血球数を血球算定盤で計測し，血液１㎡あたりの赤血球数を計算するとともに，常法により塗抹標本を作成した。
塗抹標本にギムザ染色を施し，投与前の３倍体魚と２倍体魚のリンパ球と好中球の短径と長径を光学顕微鏡により接眼マイクロメーターを用いて測定した。また，光学顕微鏡により投与前後の３倍体魚と２倍体魚の栓球以外の白血球系細胞と赤血球の数を無作為に２５視野以上計測し，赤血球1,000個あたりの白血球系細胞数を計算した。計測中，リンパ球と好中球以外の白血球系細胞はまれにしか認められなかったため，計測から除外した。さらにリンパ球，好中球の数を合計200個以上計数してリンパ球と好中球の比を求め，赤血球１，０００個あたりの白血球系細胞数にリンパ球と好中球の比を乗じて赤血球1,000個あたりのリンパ球 好中球の数とした。また，血液１㎡あたりの赤血球数と赤血球1,000個あたりのリンパ球，好中球の数から血液１miあたりのそれぞれの数を求めた。３倍体魚は，赤血球の長径が通常魚より大きいことにより，それぞれの個体が３倍体であることを確認した。

有意差検定は，独立２試料のｔ検定を行い，有意水準５％未満を有意とした。

大津：３倍体サクラマスの白血球細胞

結果

Ｔａｂｌｅｌに３倍体魚のリンパ球と好中球のそれぞれの短径と長径を示した。３倍体魚のリンパ球と好中球の短径と長径を２倍体魚のそれらと比較すると，３倍体魚のリンパ球及び好中球の短径，長径ともに有意に大きかった。
流動パラフィンを腹腔内に注射した場合の３倍体魚と２倍体魚の好中球数の血液１mjあたりおよび赤血球1,000個あたりの経時的変化をそれぞれFig.１とFig.２に示した。流動パラフィン投与前の赤血球1,000個あたりの好中球の数は，３倍体魚と２倍体魚との間で有意な差はなかった。また，３倍体魚の血液１㎡あたりの好中球の数は２倍体魚のそれと比較して有意に少なかった。
３倍体魚の好中球数は，流動パラフィン投与前と比較すると，赤血球1,000個あたりと血液１miあたりのいずれも投与後１日目から有意に増加し，７日目まで増加して14日目では７日目よりも減少したものの，投与前と比較すれば有意に多かった。２倍体魚の好中球の数は赤血球1,000個あたりと血液１㎡あたりとも３，７日目のみ投与前より有意に多かった。好中球数を３倍体魚と２倍体魚との間で比較すると，血液１㎡あたりでは投与後３日目に３倍体魚が有意に少なく，１，７，１４日目には有意な差を示さなかった。赤血球1,000個あたりの好中球数は投与後７日目には３倍体魚が有意に多かった。
流動パラフィンを腹腔内に注射した場合の３倍体魚と２倍体魚のリンパ球数の血液１mｉあたりおよび赤血球1,000個あたりの経時的変化をそれぞれFig.３とFig.４に示した。流
動パラフィン投与前の赤血球1,000個あたりのリンパ球数は，３倍体魚と２倍体魚との間では有意な差はなかった。また，３倍体魚の血液１mjあたりのリンパ球数は２倍体魚のそれと比較して有意差がなかった。
３倍体魚のリンパ球数は，流動パラフィン投与前と比較すると，赤血球1,000個あたりと血液１㎡あたりとも投与後１，３日目で有意に減少し，７日目には有意に増加し，１４日目には投与前とほぼ同じとなって有意な差を示さなくなった。２倍体魚のリンパ球数は，投与前と比較すると赤血球1,000個あたりと血液１ｍあたりとも投与後７日目ではじめて有意な差を示し，１４日目でも有意に多かった。リンパ球数を３倍体魚と２倍体魚との間で比較すると，血液１miあたりでは１日目と14日目で３倍体魚が有意に少なかったが，３，Table１．Shortandlongdiametersoflymphocytesandneutrophilesin
circulatingbloodoftriploidanddiploidmasｕｓａｌｍｏｎ
lymphocyte
ShortDiploid
Triploid

Neutrophile（似）Ｌｏｎｇい）

Short（Ju）

Ｌｏｎｇ）

9.2±0.4

9.8±0.4

11.5±0.6

12.0±0.6

10.2±0.4＊

10.9±0.4＊

13.1±0.7＊

14.1±0.7＊*significantlydifferentatP＜0.01(mean±S、Ｅ､）

富山県水産試験場研究報告第４号（1993）

４０８１

ｍ①﹃﹃二︒︒﹄

６４０︵耐昌︑ハヨ×︶

２．①匡唱︒﹄①口匡コヱ

０１３ＤａｙｓＦｉｇ．１

７1４

ａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Changesinnumberofneutrophilesinlnmicirculatingbloodinjuvenilemasusalmonafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin，Ｏｐｅｎcircle：diploidfish，closedcircle：triploidfish、Bar：standarddeviation・

a：significantlydifferentfromOday（p＜0.05)；
b：significantlydifferentfromdiploidfish（p＜0.05)．

０１︵○国崖祁つ﹇８６４２０﹄①ユ︶め①﹇﹃ニユ︒﹄二コ①こ﹈︒﹄①卓屋︒琴

０１ＤａｙｓFig.
２７３ａｆｔｅｒ

１４ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Changesintheratioofneutrophilestoredbloodcellsinjuvenilemasu
salmonafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin、Ｏｐｅｎcircle：diploidfish，closedcircle：triploidfish・Bar：standarddeviation．

a：significantlydifferentfromOday（ｐ＜０．０５)；
b：significantlydifferentfromdiploidfish（ｐ＜0.05）

大津：３倍体サクラマスの白血球系細胞

５︵︑自︑︑白×︶＄呉：乞員﹃﹄︒﹄①︒昌毒

３０

２０

1００ １ ３ ７

１４

Ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Ｆｉｇ．
３

Changesinnumberoflymphocytesinlmjcirculatingbloodinjuvenilemasusalmonafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin、Ｏｐｅｎcircle：diploidfish，closedcircle：triploidfish・Bar：standarddeviation・

a：significantlydifferentfromOday（p＜005)；
b：significantlydifferentfromdiploidfish（p＜0.05)．
︵口重匡恥つ﹇﹄①︒︶ぬ①響謁○○二Ｑ匡謁﹇﹄︒﹄①匡匡コヱ

３０２０

1０

００１

３

Ｄａｙｓ

Fig.
４

７

ａｆｔｅｒ

１４

ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Changesintheratiooflymphocytestoredbloodcellsinjuvenilemasu
salmonafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin・Ｏｐｅｎ
Circle：diploidfish，
closedcircle:
tri
ploidfish・Ｂａｒ：standarddeviation．

a：significantlydifferentfromOday（ｐ＜0.05)；
b：significantlydifferentfromdiploidfish（ｐ＜0.05）

的⑩型易︒◎二︒白話﹇◎響い①﹃﹃ニユ︒﹄

６

富山県水産試験場研究報告第４号（1993）

1.0

団回−１（う０．
５︒①匡雫︒︒﹃響︑壁００１

３

７

１

４

Ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Ｆｉｇ．５

Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈeratioofneutrophilestolymphocytesincirculatingblood
injuvenilemasusalmonafteranintraperitonealinjectionofliquidparaffin・
Ｏｐｅｎcircle：diploidfish，closedcircle：triploidfish・Bar：standarddeviation，a：significantlydifferentfromOday（p＜005)；b：significantlydifferentfromdiploidfish
（p＜0.
05)
．
７日目には有意な差を示さなかった。赤血球1,000個あたりのリンパ球数は１日目に３倍体魚が有意に少なく，７日目には３倍体魚が有意に多かった。

リンパ球数に対する好中球数の比の経時的変化をFig.５に示した。流動パラフィン投与
前には３倍体魚のリンパ球数に対する好中球数の比は，２倍体魚よりも有意に小さかった。
流動パラフィン投与後には，この比が３倍体魚では投与前と比較して１日目から７日目まで有意に増加したのに対し，２倍体魚では３日目と７日目に有意な増加が認められた。３倍体魚と２倍体魚の問では，投与前と投与後１日目のみで有意差が認められた。

考察

３倍体魚は２倍体よりもリンパ球，好中球ともに細胞の大きさが有意に大きくなっていたｏまた，赤血球1,000個あたりではリンパ球数，好中球数ともに３倍体魚と２倍体魚との間で差がなかったが，血液１mjあたりの好中球数は３倍体魚が２倍体魚よりも有意に少なく，リンパ球数も小さい傾向を示していた。このことは，３倍体魚のリンパ球や好中球においても，赤血球や筋肉細胞，３倍体アユにおける網膜細胞などの場合と同様に（AliahetaZ、1990；大津1991,1992)，細胞の大きさの増加とそれにともなう細胞数の減少がおこっていることを示している。異物を貧食するという細胞性免疫機構の生体内での意
味を考えると，血液１miあたりの貧食能を持つ細胞の数が重要である。魚類においては好中球と単球一マクロファージが食作用を持つことが知られており（Suzukil986)，異物大津: 3倍体サクラマスの白血球系細胞7の侵入に対する感染防御や炎症応答にこれらの細胞が関与していると考えられている。 3倍体魚において異物の侵入以前に好中球が少ないことは， 3倍体魚が異物の侵入に対する防御をおこなう上で不利であると考えられる。
nndあたりの好中球数は 2倍体魚と比較して有流動パラフィン投与前の 3倍体魚の血液 1意に少なかったが.流動パラフィン投与によって， 3倍体魚， 2倍体魚ともリンパ球数，好中球数のいずれも異物に反応して増加し，投与後 7日目では血液 1nmlあたりではほぼ同程度になった。このことは， 3倍体魚は細胞性免疫機構に関して 2倍体魚と同様の反応性を持つことを示している。また、 3倍体魚では，投与後 1日目にリンパ球数に対する好中球数の比が 2倍体魚のそれよりも有意に大きくなったが， 3日目以降はその比は 3倍体魚と 2倍体魚との問で有意差を示さなかった。このことは好中球とリンパ球の数の変化は 3倍体魚と 2倍体魚とでほぼ同様であるが.異物の侵入初期の応答性に差があることを示し
nmlあたりのリンパ球数と好中球数が増ている。さらに.流動パラフィン投与により血液 1加する一方，赤血球 1，000個あたりでは投与 7日目で 3倍体魚のリンパ球数と好中球数がともに 2倍体魚よりも有意に多くなったのは， 3倍体魚が 2倍体魚よりも赤血球数が少ないことによると考えられる。
3倍体魚の血液 1mrHあたりの好中球数の流動パラフィン投与後の増加は 2倍体魚よりも顕著で、あった。 3倍体魚と 2倍体魚の問で赤血球 1，000個あたりの好中球数に有意差がみ
nndあたりのられたのは投与後 7日目のみであったことから， 3倍体魚では投与前の血液 1好中球数が少ないために異物に反応しての好中球数の増加がより顕著にあらわれたものと考えられる。
3倍体魚のリンパ球数は流動パラフィン投与後 1， 3日目に血液 1nmlあたりと赤血球1，000個あたりの両方とも有意な減少を示した。これは造血器官からの供給が行われるよりも先に循環血から異物の侵入した腹腔内へのリンパ球の移行が起こったためと考えられnmlあたりのリンパ球数は 2倍体魚のそれとほぼ同る。投与後 7日目での 3倍体魚の血液 14日目では， 2倍体魚のリンパ球数は赤血球 1，000個あたりと血液様となったが，投与後 11nmlあたりの両方とも投与前より有意に増加したままであったのに対して， 3倍体魚のリンパ球数はいずれも減少して投与前と差がなかった。循環血中の白血球の数は造血器官(魚類では牌臓と頭腎)からの新しい細胞の移入による増加と細胞の死及び組織への移行による減少のバランスによって決まると考えられる。 3倍体魚のリンパ球数の減少が 2倍体魚のそれよりも顕著な原因は明らかではないが，染色体量が多いために造血器官における産生量が少ない可能性が考えられる。また. リンパ球は免疫反応の上で重要な役割をもっているために，その数が感染症やその他のストレスなどに対して大きく変動するとされて986)。本研究でみられた 3倍体魚のリンパ球数の変化の特徴についてはいる(池田ら 1さらに検討の必要があろう。
3倍体魚では 2倍体魚より好中球の数が有意に減少している一方で好中球とリンパ球の大きさが有意に大きい。好中球は異物をその侵入の場で貧食することによって生体を防御する働きを持っており，その防御機能は数だけではなく遊走能，貧食能，殺菌・消化能などの能力によって大きく左右されると考えられる。今回は腹腔内への白血球系細胞の浸出と白血球の貧食能の観察を行っていないが，好中球の大きさが，貧食能にどのように影響しているかは今後の検討課題である。

富山県水産試験場研究報告第４号（1993）

要

約３倍体サクラマス１歳魚のリンパ球と好中球のそれぞれの長径，短径，出現頻度を調べ，２倍体魚のそれと比較した。また，腹腔内に流動パラフィンを投与し，リンパ球数と好中球数の経時的変化を調べた。その結果，３倍体魚のリンパ球と好中球のそれぞれの短径と長径は２倍体魚のそれと比較して有意に大きかった。また，流動パラフィン投与前の３倍体魚の血液１mjあたりの好中球数は２倍体魚のそれより有意に少なかった。流動パラフィン投与によって３倍体魚の好中球数は，赤血球１，０００個あたり，血液１miあたりとも２倍体魚と同様の変化を示したが，３倍体魚の好中球数は流動パラフィン投与後１日目から１４日目まで有意な増加を示したのに対し，２倍体魚のそれは３日目と７日目に有意な増加を示したにとどまった。リンパ球数も，３倍体魚は赤血球1,000個あたりと血液１miあたりとも２倍体魚のそれと同様の変化を示したが，投与後14日目には２倍体魚が投与前よりも有意に多かったのに対して，３倍体魚では有意差がみられなかった。

謝辞

本研究の遂行に当たり様全な御協力，御支援をいただいた富山県水産試験場の研究員，職員の皆様に厚く御礼申し上げる。また，本論文をまとめるに当たり，御助言，御校閲をいただいた山田寿郎博士と当水産試験場長正木康昭博士に深謝の意を表する。
文

献ＡｌｉａｈＲ．Ｓ､，Ｋ・Yamaoka，Ｙ・Inada，ａｎｄＮ・Taniguchil990・Effectsoftriploidy
ontissuestruｃｔｕｒｅｏｆｓｏｍｅｏｒｇａｎｓｉｎＡｙｕ・NipponSuisanGakkaishi，56,
569‑
575．

ＢｅｃｋＭＬ・ａｎｄＣ．』・Biggersl983・Erythrocytemeasurementsofdiploidand
triploidae"
Opﾉ
zaroy
7zgodo〃jde"
α×Ｈ
ｊ｛pOpﾉ
Z
tﾉ
Z
α姉
jc
ﾉ
2tﾉ
Zys
凡o6jZ
jshybrid．
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BenfeyT．Ｊ・ａｎｄＡ・MSutterlinl984・Thehaematologyoftriploidlandlocked
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大津：３倍体サクラマスの白血球系細胞

９SuzukｉiＫK、１
１９９８８６６．
．M
Moorrpphhoollooggiiccaallaannddpphhaaggooccyyttiicccchhaarraacctteerriissttiiccssooff
peritoneal
exudatecellsintilapia，OreocﾉZromお刀"otj ｓ（Trew誠as)，andcarp，
QXpr加邸Ｓｃα城ＯＬ.Ｊ・FishBio1.,29,349‑364.

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