課題番号 ０５Ｂ－５

研究題目

近接ビオチン標識法を基盤とした低分子化合物の標的タンパク質の同定

研究組織
研究代表者：山中 聡士（愛媛大学プロテオサイエンスセンター）
共同研究者：小迫 英尊（徳島大学先端酵素学研究所）
研究分担者：澤崎 達也（愛媛大学プロテオサイエンスセンター）
研究分担者：山田 航大（愛媛大学プロテオサイエンスセンター）【1】研究の概要[1-1]本研究の目的・概要
我々が 2020 年に開発した新規近接ビオチン化酵素 AirID (Ancestor BirA biotin identification)
は、E3 ユビキチンリガーゼに融合することでサリ ド マ イ ド 誘 導 体 や PROTAC(proteolysistargeting chimera)などのタンパク質分解薬依存的なタンパク質–タンパク質間相互作用解析が可能であることを 2022 年に報告した。本研究では、本技術を発展させ、標的タンパク質が未発見である低分子化合物を PROTAC 化することで、低分子化合物の標的タンパク質同定法の構築を目指した。

無細胞タンパク質合成系を用いた生化学的な相互作用解析および培養細胞を用いたプルダウンアッセイを行うことで、質量分析のバリデーションを行った。

【2】研究成果[2-1]本共同研究で明らかになった研究成果
サリドマイド結合ドメイン(CULT)を用いた
STA-PDA の結果、CULT を用いた方が完全長CRBN を用いるより標的タンパク質のビオチン化効率が高くなることを見出した。また、様々な リ ン カ ー 長 の GA-PROTAC を 用 い た
STA-PDA および質量分析の結果、HSP90 のビオチン化強度はリンカー長に依って異なっていた。PROTAC においてリンカー長の違いはそ[1-2]研究の方法・経過の分解活性に大きな影響を与えることが知ら
PROTAC 依存的な標的タンパク質探索の感度れており、本評価系が PROTAC の活性を評価すを上げるために、CRBN のサリドマイド結合ドる 指 標に なる こと が示唆 さ れた 。さ らに 、メイン(CULT)へ AirID を融合した AirID 融合
GA-PROTAC 依存的にビオチン化される GA のCULT を安定発現する細胞を作製した。ストレ新たな標的タンパク質候補を複数見出した。
プ ト アビ ジン ビー ズを用 い たプ ルダ ウン 法
また、CUR-PROTAC を暴露した AirID 融合(STA-PDA)によって、AirID を融合した完全長CULT 発現細胞を用いた質量分析の結果、CUR
CRBN を発現する細胞と比較した。また、抗腫の標的タンパク質候補を複数見出した。標的タ
瘍活性を示す抗生物質であるゲルダナマイシ
ンパク質候補を対象に、ビオチン化クルクミンン(GA)および抗がん作用などを示すポリフェを用いた生化学的な相互作用解析および培養ノール化合物であるクルクミン誘導体(CUR)を細胞を用いた相互作用解析を行った結果、少な対象に、サリドマイド誘導体を用いた PROTAC
くとも 6 種の CUR 標的タンパク質を見出したを有機合成した。次に、GA-PROTAC を AirID(図 1)。見出した標的タンパク質の中には、CUR融合 CULT 発現細胞へ処理し、既知標的タンパク質の HSP90 のビオチン化を解析した。そして、 の薬理作用である抗酸化作用に深く関与することが予想されるタンパク質が含まれていた。
GA-PROTAC あるいは CUR-PROTAC を処理した細胞を用いて、細胞内においてビオチン化されるタンパク質を質量分析によって探索した。 [2-2]本共同研究による波及効果及び今後の発展性見出した標的タンパク質候補を対象に、コムギ

本研究において、近接ビオチン標識法を用いることで低分子化合物の標的タンパク質が同定可能であることが示唆された。有効性を示すにも関わらず標的タンパク質が未発見である低分子化合物は数多く存在することから、今後の薬剤開発や作用メカニズムの解明に本評価系が利用されることが期待される。今後の展望として、見出した標的タンパク質を対象にした詳細な解析を進めており、GA および CUR の作用メカニズムにおける標的タンパク質の機能の解明を目指す。
【3】主な発表論文等[3-1]論文発表
1. Satoshi Yamanaka, Hirotake Furihata, Yuta
Yanagihara, Akihito Taya, Takato Nagasaka,Mai Usui, Koya Nagaoka, Yuki Shoya, Kohei
Nishino, Shuhei Yoshida, Hidetaka Kosako,Masaru Tanokura, Takuya Miyakawa, Yuuki
Imai, Norio Shibata, Tatsuya Sawasaki*.
Lenalidomide
derivatives
andproteolysis-targeting chimeras for controlling
neosubstratedegradation.
NatureCommunications 14: 4683, 2023

Nishino, Hidetaka Kosako, Masaru Tanokura,
Takuya Miyakawa, Norio Shibata, Tatsuya
Sawasaki. Thalidomide derivatives andproteolysis-targeting chimeras for controlling
neosubstrate degradation.
KEYSTONESYMPOSIA (Targeted Protein Degraddation),
アメリカ, 1 月 23 日, 2024[3-3]成果資料等
なし【4】今後の課題等
今後の課題、その他等
本研究で用いた方法は細胞内のタンパク質を対象にした評価系であり、細胞膜に局在するタンパク質に細胞外から作用する低分子化合物の評価はできない。今後の課題として、上記に様な低分子化合物を対象にした評価系の構築を目指す。

[3-2]学会発表
1. 山中 聡士. コムギ無細胞系および近位依存性ビオチン標識法を用いたタンパク質分解薬依存的な相互作用解析技術の開発と応用.第 64 回 日本生化学会 中国・四国支部
例会 シンポジウム, 愛媛, 5 月 27 日, 2023
2.

山中 聡士, 降旗 大岳, 臼井 麻衣, 長岡昂冶, 庄屋 祐希, 西野 耕平, 小迫 英尊,田之倉 優, 宮川 拓也, 柴田 哲男, 澤崎
達也. ネオ基質分解制御のためのサリドマ
イド誘導体および PROTAC の開発. 第 96回日本生化学会大会, 福岡, 11 月 1 日, 2023

3.

長岡 昂冶, 河野 将大, 庄屋 祐希, 山中聡士, 西野 耕平, 小迫 英尊, 澤崎 達也.
近位依存性ビオチン化酵素を用いた DCAF
ファミリーのインタラクトーム解析. 第 96回日本生化学会大会, 福岡, 10 月 31 日,2023

4.

澤崎達也, 山中聡士. タンパク質分解創薬における標的タンパク質同定手法. 第 40 回
メディシナルケミストリーシンポジウム,名古屋, 11 月 14 日, 2023
Satoshi Yamanaka, Hirotake Furihata, Mai
Usui, Koya Nagaoka, Yuki Shoya, Kohei

5.

図 1. 候補タンパク質を対象にした生化学的な相互作用解析の結果(左)、培養細胞を用いた相互作用解析の結果(右)