医薬品中のニトロソアミン分析

トリプル四重極 LC/MS/MS、四重極飛行時間型 LC/MS
ワークフローと消耗品ガイド

R1N
NR2RNORN

R21N
NRR21OR21N
NOO

API および医薬品中の変異原性不純物は、少量であっても健康や安全上の重大なリスクとなるため、製薬会社にとっての大きな懸念事項です。変異原性不純物は DNA を破壊する可能性があるため、突然変異やがんの誘発につながります。微量の変異原性不純物の存在に対処および制御する取り組みは、各国の規制当局の大きな関心事です。このため、米国FDAやその他の規制機関は、医薬品に含まれる変異原生不純物の問題を解決するための対策に取り組んでいます。API や医薬品に含まれる微量のニトロソアミンの検出と定量は困難であり、高度な高感度ツールを使用して規制要件を満たすことが必要な場合があります。

ニトロソアミンの測定を必要とする API および医薬品のリストは、アンギオテンシン II 容体拮抗薬（ARB）サルタン系医薬品のリストからさらに拡大し、経口糖尿病薬のメトホルミンやラニチジンなどのヒスタミン-2 受容体拮抗薬を含んでいます。これを裏付けるものとして、近年、米国食品医薬品局（FDA）、欧州医薬品品質部門（EDQM）、保健科学庁（HSA）などのさまざまな規制機関が、N-ニトロソジメチルアミン（NDMA）の存在を理由にメトホルミンのリコールを求 めました。ニトロソアミン不純物には、N-ニトロソジメチルアミン（NDMA）、N-ニトロソジエチルアミン（NDEA）、N-ニトロソジイソプロピルアミン（NDIPA）、N-ニトロソエチルイソプロピルアミン（NEIPA）、N-ニトロソジブチルアミン（NDBA）があります。これらは、おそらくヒトに対する発がん性がある物質に分類され、API の製造工程中に生じる化学反応に起因して最終製品に取り込まれたものと考えられています。

これらの不純物 は、 シングル四重極 GC/MS （GC/MSD）またはトリプル四重極 GC/MS/MS（GC/TQ）（1）、トリプル四重極 LC/MS/MS（LC/TQ）または四重極飛行時間型 LC/MS（LC/Q-TOF）（2-7）のいずれかを使用して検出できます。LC/MS/MS-ベースのメソッドは一般的に、非常に特異的で、高い感度を提供します。このため、これらの機器は、原薬およびメトホルミン、バルサルタン、ロサルタン、イルベサルタンなどの医薬品中のニトロソアミン不純物を検出し定量化するメソッドの開発のための基盤として使用されています。

図 1. 左から右へ：1260 Infinity II LC システム、6470B トリプル四重極 LC/MS、6550 iFunnel Q-TOF

LC/MS、Ultivo トリプル四重極 LC/MS¹米国食品医薬品局：www.fda.gov/media/131868/download 欧州評議会：www.edqm.eu/en/news/omcls-release-three-methods-determination-ndma-sartans

カナダ保健省：Healthycanadians.gc.ca/recall-alert-rappel-avis/hc-sc/2020/72963a-eng.php 台湾 FDA：www.fda.gov.tw/ENG/siteList.aspx?sid=10360

2

カラムの選択肢

メソッド 2 （表 1）（8）で使用される InfinityLab Poroshell 120 PFP カラムのペンタフルオロフェニル （PFP）リガンドは、C18 結合相との直交型分離メカニズムを提供します。PFP 結合相

では、構造、置換基、極性部への立体アクセスのわずかな違いをもとに化合物を分離することができます。これにより得られる位置異性体、ハロゲン化合物、および極性化合物に対する優れた選択性は、特に複雑な混合物の分析で威力を発揮します。 NDIPA と NDPA は位置異性体であるため、InfinityLab Poroshell 120 PFP は、簡単な操作でこの分離を実現する最適な推奨カラムです。

InfinityLab Poroshell HPH-C18 カラムもこの分析のメソッド 1（表 1）（8）で使用しています。
粒子の堅牢性を幅広い pH 域で高めるハイブリッド粒子技術を取り入れており、カラム寿命を長くしてカラムの交換頻度を低減できます。 しかし、このカラムを使用する場合、メソッドの長期持続性、安定性、および信頼性を確保するには、堅牢なメソッド開発プロセスが不可欠です。イオン性化合物の保持力と選択性は pH に応じて大きく変化するため、メソッド開発時には、pH を低、中、高と変えて分析を実施するのが一般的です。グラジエント条件の最適化に加えて、位置異性体の NDIPA と NDPA を分離させるために、MS/MS 機器のパラメータを最適化して感度を最大限に高める必要もあります。

LC の構成とパラメータ

表 1. UHPLC の構成と設定。メソッドの詳細については、参考文献 8 を参照してください。
パラメータ

設定値

メソッド 1

Agilent 1290 Infinity II ハイスピードポンプ

装置

サンプル希釈液

マルチサンプラの温度

注入量

Agilent 1290 Infinity II ハイスピードポンプ（G7120A）（G7120A）（G7167B）（G7167B）

サーモスタット（G7116B）

サーモスタット（G7116B）（G1315C）（G1315C）

水: メタノール （95:5）

メタノール

Agilent 1290 Infinity II マルチサンプラ
Agilent 1290 Infinity II マルチカラム

Agilent 1290 Infinity II マルチサンプラ
Agilent 1290 Infinity II マルチカラム

Agilent 1260 Infinity ダイオードアレイ検出器

ニードル洗浄メソッド 2

メタノール: 水（80:20）

Agilent 1260 Infinity ダイオードアレイ検出器

メタノール: 水（80:20）

10 ℃

10 ℃

20 µL

5 µL

Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18、Agilent InfinityLab Poroshell 120 PFP、

カラム温度

40 ℃

40 ℃

移動相 B

0.1% ギ酸メタノール溶液

0.1% ギ酸メタノール溶液

分析カラム
移動相 A流量

グラジエントストップタイム

UV 波長

4.6 × 150 mm、2.7 µm（p/n 693975-702(T)） 3.0 × 150 mm、2.7 µm（p/n 693975-308）

0.1 % ギ酸水溶液

0.1 % ギ酸水溶液

0.5 mL/min
時間0.5 mL/min
流量（min）

%A

0955

295

5740600.51025750.5111090

0.5

16.5

1090

0.5

16.6

95

50.5

20.095

50.5%B（mL/min）

0.50.5時間

流量（min）

%A

095

5395

50.5

1440600.51710900.5191090

0.5

19.1

95

50.5

2295

50.5

20 分

22 分

230 nm

230 nm%B（mL/min）

0.5

3×102
1 11 2 Total Ion Chromatogram

21 2* 5.213

20.50×102
1 1NDMA

0.50×102
1 18.818

1 2ロマトグラム（メソッドの詳細は参考文献 8 を参照）

2NDEA

0.50×102
1 19.872

1 22NEIPA

0.50×102
1 1

10.75311.210
NDPA

1 22

NDIPA

0.50×102
1 111.037

1 22
NMPA

0.50×102
1 17.169

1 22
NMBA

0.50×102
1 113.457

1 22NDBA

0.50

Counts (%)

Counts (%)

Counts (%)

Counts (%)

Counts (%)

Counts (%)

Counts (%)

1Counts (%)

Counts

図 2. メソッド 1 による、8 種類のニトロソアミン不純物（0.5 ng/mL）の代表的な MRM ク

345678910
Acquisition time (min)111213141516171819

図 3. メソッド 2 による、8 種類のニトロソアミン不×102純物（3 ng/mL）の代表的な MRM クロマトグラム

1.00.5（メソッドの詳細は参考文献 8 を参照）

0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0×102

1.0
0.5
0

1

422

3

45678910111213
Acquisition time (min)1415

161718192021

標準品、カラム、消耗品などの情報
本ガイドは、ニトロソアミン分析での使用が推奨されるアジレント製品を紹介しており、ご要望の製品をすぐに見つけることができます。
製品概要

製品番号

ニトロソアミン標準（塩化メチレン溶液）

US-113N-1

InfinityLab Ultrapure LCMS MeOH

5191-4497

InfinityLab Ultrapure LC/MS 用超純水

5191-4498

ニトロソアミン標準と溶媒

ギ酸、5 mL

G2453-85060

15 mL 遠心分離チューブおよびキャップ、50 個

5610-2039

ニトロソアミン - サンプル前処理

Captiva エコノフィルタ、PVDF メンブレン、直径 13 mm、5190-5261

Captiva プレミアムシリンジフィルタ、PES メンブレン、直径 15 mm、5190-50961

Captiva プレミアムシリンジフィルタ、ナイロンメンブレン、直径 15mm、

5190-50882

ポアサイズ 0.2 µm、1000 個

ポアサイズ 0.2 µm、100 個（LC/MS 認証）
ポアサイズ 0.2 µm、100 個（HPLC 認証）

Captiva ディスポーザブルシリンジ、5 mL、100 個

9301-6476

Captiva ディスポーザブルシリンジ、10 mL、100 個

9301-6474

InfinityLab Poroshell 120 PFP、3.0 x 150 mm、2.7 μm

693975-308

InfinityLab Poroshell 120 PFP ガードカラム、3.0 mm、2.7 µm（推奨）823750-915

InfinityLab Poroshell HPH-C18、4.6 mm、2.7 µm、UHPLC ガードカラム、

820750-922

ニトロソアミン - LC カラム（推奨）

InfinityLab Poroshell HPH-C18、4.6 × 150 mm、2.7 μm
3個693975-702

ニトロソアミン - LC 消耗品

InfinityLab クイックコネクトアセンブリ、0.12 x 105 mm、UHPLC の5067-5957

InfinityLab クイックコネクトアセンブリ、0.17 x 105 mm、UHPLC の5067-6166InfinityLab クイックターンフィッテイング、カラム出口用

5067-5966

カラム入口接続用
カラム入口接続用

クイックターンキャピラリー、0.12 x 280 mm、カラムから検出器への5500-1191

4 ポート付きセーフティ廃液キャップ GL45 と 6 L 廃液ボトルのキット

5043-1221

InfinityLab セーフティキャップ、スターターキット

5043-1222

接続用

廃液ボトル用タイムストリップ付きチャコールフィルタ

ステンレス溶媒インレットフィルタ、ポアサイズ 10 μm

5043-1193

01018-60025

InfinityLab 溶媒フィルタアセンブリ。250 mL ガラスファネル、メンブレン

5191-67763

再生セルロースメンブレン、47 mm、0.20 μm、100 個

5191-43403

ホルダガラスベース、1 L ガラスフラスコ、アルミニウムクランプを含む

5

ニトロソアミン - バイアルおよびキャップ

バイアル、スクリュートップ、茶色、ラベル付、認定、2 mL、5182-0716

キャップ、スクリュー、緑、スリット入り PTFE/シリコンセプタム、100 個。

5183-2077

バイアルインサート、250 µL、不活性化ガラス、樹脂足付、100 個

5181-8872

100 個バイアルサイズ：12 x 32 mm（12 mm キャップ）

キャップサイズ：12 mm

ニトロソアミン - MS 用消耗品

APCI ニードル交換キット

APCI ニードル

キャピラリー、高速切り替え、0.6 mm

G1946-68704
G1960-20030
G1960-80060

1.PVDF に近い性能を得られるよう、このメンブレンはタンパク質との結合を低くしているため、タンパク質分析に最適です。小型
パックサイズ（100 個）で購入でき、LC/MS 認証されています。

2.一般ろ過のニーズに適しています。タンパク質分析には使用できません。小型パックサイズ（100 個）で購入でき、HPLC 認証されています。

3.溶媒ろ過アセンブリおよび付随するフィルタメンブレンは、InfinityLab UltraPure LC/MS 溶媒との使用を推奨していません。

参考文献
1.

2.

シングル四重極 GC/MS、トリプル四重極 GC/MS による医薬品中のニトロソアミン分析：

ワークフローと消耗品ガイド, Agilent publication (5994-2979JAJP)

Nitrosamine Impurities Application Guide – Confidently detect and quantify
mutagenic impurities in APIs and Drug Products (5994-2393EN)

3.
4.
5.
6.
7.

高分解能 Agilent 6546 LC/Q-TOF を用いた ラニチジン原薬および医薬品中の 遺伝毒性

NDMA 不純物の測定(5994-1626JAJP)

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6

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8.

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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2021
Printed in Japan, March 10, 2021
5994-2977JAJP
RA44239.5764236111