福岡大学 医学部 医学科 産科婦人科学
教授 宮本新吾
2019年5月21日
1本邦における周産期死亡率および早産の背景
周産期死亡率（％）（出生千対）

早産率

妊娠22週以後の死産率

周産期死亡率
早期新生児死亡率（年）（年）
母子保健の主なる統計、2012より

2

分娩時妊娠週数毎の生存率（死産を含まない）
100%
80.9%

80%
60%
40%

p＝0.0017

58.2%

27.2%

p＝0.0053

20%
0%
2223

2425

26

2728

29

30

登録参加116施設における 51,650分娩（周産期死亡数 807）
2001年における全分娩1,170,662の4.4％
周産期死亡総数6,333の 12.5％(日産婦誌 2004）

31

（週）

3

子宮内感染の感染経路と診断法⑥臨床的絨毛膜羊膜炎⑤組織学的絨毛膜羊膜炎④胎児感染

炎症細胞 細菌感
染の浸潤

子宮内感染

③羊水感染②子宮頸管炎①細菌性腟症など
産科医療保障制度報告書より引用，一部改変• 子宮内感染は前期破水・早産など、妊娠経過に重大な影響を及ぼす• 妊娠中の診断が困難 （羊水培養検査と臨床的CAMは低感度・高特異度）• 診断の遅れは児に重大な影響を及ぼすこともあるため、的確な診断が求められる本技術に関する知的財産
発明の名称： 「絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキッ
ト、および絨毛膜羊膜炎検出方法」
出願番号：
特願2016-105177
出願人：
学校法人 福岡大学
発明者：
宮本 新吾（福岡大学）・秦 健一郎（国立研究開発法人国立成育医療研究センター）
4従来技術とその問題点
高齢妊婦の増加により早産の頻度が増加の一途をたどっている。
早産の主な原因は、子宮内感染でその診断が困難なために、新生児感染を引き起こし致死的となる疾患である。
子宮内感染の診断は、羊水の細菌培養や羊水の細菌のPCR法による検出が行われるが不正確で起炎菌が同定できず、治療方針が決定できない。
子宮内感染の診断は、宿主反応として羊水中の炎症性サイトカインなどの定量により予測するが不正確で時間がかかる。
5

目的
1. 羊水の網羅的かつ定量的な細菌組成解析を行い，子宮内感染例の羊水細菌組成を同定すること．
2. 羊水の細菌組成で絨毛膜羊膜炎を診断可能か否かを検証すること．

6

対象• 福岡大学病院で2009年12月からの5年間に，羊水検査と胎盤病理検査を施行した41例（早産38例，正期産3例）を対象とした• 絨毛膜羊膜炎の重症度分類（Balnc分類）に基づいて各群に分け，コントロール羊水として妊娠初期に得られた羊水19検体，実験ネガティブコントロールとしてDNA抽出時とライブラリー作製
時にBlank（精製水）を置いた＜絨毛膜羊膜炎の重症度分類(Blanc分類)＞
Stage III (Chorioamnionitis) ：羊膜まで炎症が波及Stage II (Chorionitis)：絨毛膜まで波及Stage I (Subchorionitis)：絨毛膜下にとどまる
Blanc WA.
Williams &Wilkins.
1981より引用

炎症性細胞の浸潤各群における胎盤の組織学的分類とコントロールの内訳
グループ名
Chorioamnionitis(CA)
Chorionitis(C)
Non-Chorionitis(Non-CA)
1st Trimester AF(1st-AF)
Blank Control(Blanｋ）

サンプル名

胎盤の組織学的診断

1-12

Stage III

13-29

Stage II

30-41

Stage <II

42-60
N1-117

方法
福岡大学病院総合周産期センターでサンプル採取
凍結保存，国立成育医療研究センター（東京）に凍結状態で輸送
溶菌（ビーズ破砕）
DNA抽出：羊水検体約1mlからDNAを抽出
次世代シークエンサー(MiSeq®)のライブラリー作製：Illumina社推奨プロトコールに従い96サンプル同時に（16Sユニバーサルプライマーを使用）

次世代シークエンサー(MiSeq®)でシークエンス
Fastqファイルのマージ
クオリティコントロール
アダプター配列の除去
ランダムに3000リードを選出
16S rRNA遺伝子解析（網羅的かつ定量的）：UniFrac距離に基づく主座標分析(PCoA)やOTU(Operational Taxonomic Units)解析など

服部正平，実験医学Vol.32 (2014) より引用 8

菌叢の類似性を検証• 定量性を考慮したWeighted UniFrac距離に基づいて，主座標分析(PCoA)を行った• 各点が各検体（赤：CA群，オレンジ：C群，青：Non-C群，黄：1st.AF群，紫：Blank群）を示し，点の近さは菌叢組成が類似していることを示す

PCoA based UniFrac distances (Weighted)• 胎盤に重度の炎症を伴う症例の多く（CA群全12例とC群の6/17例，Sample 1-18）は，再現性よく同一クラスター（クラスター1 ）を形成した• 一方，その他の検体はシークエンスごとにクラスター形成し，コンタミネーションによるアーチファクトが考えられた（1回目：クラスター2, 2回目：クラスター3）9

菌の組成解析
羊水60検体と実験ネガコン11検体で，OTU(Operational Taxonomic Units)解析した細菌組成 （門レベル）• OTU解析では，PCoAでクラスター1を形成した18検体(CA群全12例とC群の6/17例，Sample1-18)は，明らかに他と異なった細菌組成が観察された10• 同18検体を，羊水感染群と命名した

羊水感染群と非羊水感染群の比較
羊水感染
(18)

非羊水感染
(23)

P-value

8 (44 %)
4( 22 %)
2/12 (17 %)2.7±0.5

7 (30%)
1 (4 %)
0/5 (0 %)1.3±0.7

0.515
0.150
1.000
0.000

羊水検体1μLあたりの16S rDNAコピー数(copy/μl, Median)

1.2x103

4.1

0.000

分娩までの入院日数(日, Mean±SD)

4.3±3.5

18.4±15.8

0.005

13/17 (76 %)2/18 (11 %)0.000

前期破水 (n, %)臨床的絨毛膜羊膜炎 (n, %)羊水培養検査 (n/N, %)Blanc's stage (Mean±SD)

新生児感染症治療 (n/N, %)※有意差検定にはMan-Witney U testとFisher’s exact testを使用• 羊水感染群は，羊水培養や臨床的絨毛膜羊膜炎では有意差がなかったが，胎盤の炎症度と羊水中の細菌量では有意差を認めた• 羊水感染群は，母児ともに比較的予後不良である可能性も示唆された
11

絨毛膜羊膜炎(Stage III)の予測精度Stage IIIStage ≤II計

羊水感染 羊水感染(+)(-)
1206231823

計122941

感度： 100% (12/12)

特異度： 79% (23/29)

陽性的中率： 67% (12/18)

陰性的中率： 100% (23/23)

従来法※との比較
グラム染色
羊水中白血球数
羊水中糖IL-6
本研究のメタ16S解析

感度
24 %
57 %
57 %
81 %
100 %

特異度
99 %
78 %
74 %
75 %
79 %

※Romero R, et al.
Am J Obstet Gynecol
1993;169(4):839–51.

• 網羅的かつ定量的解析により，高い精度で重度の絨毛膜羊膜炎（Blanc III）を予測できる可能性が示唆された• 羊水感染群でdominantに検出される菌種をマーカーとして，簡便に検出することの有益性が示唆された
12

羊水感染群に特異的に検出される菌の絞り込み【目的】 羊水感染群で特徴的な細菌組成を引き起こした菌種の同定【方法】 羊水感染群で10%(300リード)以上，コントロール群（Non-C群，1st.AF群，Blank群）で0.5%（15リード）未満のOTU（菌種に相当）を同定した
11608
1390
0000000022997
00000000032997
00000010042994
00000000052992
000000000600
2980
000010070002555
372
000008100002250
614
85
0092929000000100

10
1000000
2894
00

11
0000
00002487
0121967
00
000
0000

13
2000000
2987
00141144
00000000182815
2970
00000000016946
2010
00000000172873
000000000182499
000000100

リード量

Ureaplasma parvum
Mycoplasma hominis
Haemophilus influenzae
Bacteroides fragilis
Fusobacterium sp. 11_3_2
Sneathia sanguinegens
Capnocytophaga sputigena
Gardnerella vaginalis
Lactobacillus jensenii
Streptococcus agalactiae

サンプル番号

羊水感染群でdominantだった10 OTUのリード量

羊水感染群でdominant（優勢）であった10 OTUを特定し，9菌種を同定した 13

羊水感染群に特異的な菌種の特異的プライマーセットを作製【目的】 羊水感染群を簡便に検出する【方法】 16S全長配列と同属の配列，20-30配列をダウンロードし，各菌種に特異的なプライマーを作製し，PCR実験(in-silico & in-vivo)で確認した
100bp
ladderTargetspecies

U_p

M_p

G_p

L_p

H_p

Sn_p

C_p

U NC1 DW

M NC1 DW

G NC1 DW

L NC1 DW

H NC1 DW

SnC NC1 DW

SnC

PCR実験 Sample
検体名 number

Primer Amplicon In-siliconame size(bp) PCR

Ureaplasma
parvum

U_p

Mycoplasma
hominisM_p543(+)

Gardnerellavaginalis

G_p464(+)

Lactobacillus
jensenii

L_p331

ND

Haemophilus
influenzae

H_p662(+)

Sneathia
sanguinegens

Sn_p308

ND652

(+)

Capnocytophaga
C_psputigena

441

ND

Bacteroides
fragilis

B_p382(+)

Streptococcus
agalactiae

St_p275(+)

U3M

16G13L

11H

6SnC8B

7St

14NC141

NC240

DW

精製水

上段: プライマー名
下段：サンプル名
100bp
ladder

C_p

B_p

St_p

NC2 DW

B NC2 DW

St NC2 DW

16S universal primer (internal positive control)
UM

GL

H

SnC

B

St

NC1 NC2 DW

全種類のプライマーで，感染羊水でのみ，想定されるサイズの増幅産物が確認された 14

発明品の内容表1.

9菌種, 18種類のPCRプライマーセット

Target Species

PrimerName

Forward PrimerSize
Reverse Primer(mer)Size Amplicon(mer) Size(bp)Ureaplasma parvum

U_p

ATGTAGAAAGTCGCTCTTTGTG

22GGCCGACATTTAATGATGATCG

22652

Mycoplasma hominis

M_p

TTGGAATACCCATTGGAAACAA

22

CTCTATCTAACTCTAGTTTGCT

22543

Gardnerella vaginalis

G_p

CTTGGAAACGGGTGGTAATGCT22AGACGCGACGAACCGCCTACAA

22464

Lactobacillus jensenii

L_p

TAATACCGGATAAAAGCTACTT22GTCAAATAAAGGCCAGTTACTA

22331

Haemophilus influenzae

H_p

GCATTTCAGACTGGGTAACTA

21TGAGATTCGCTCCACCTCGCA

21662

Sneathia sanguinegens

Sn_p

AGGGGACTGAGATACGGCCCTT 22GAGCCACAGGTTTTCACCTTC

21308

Capnocytophaga sputigena

C_pGAGCGGCATCGTTTTTATATT

20AGGCAGTTGCTTAGTTGAGCTA

22441

Bacteroides fragilis

B_p

TATCCAACCTGCCCTTTACTCG

22

AATACATACAAAACAGTATACA

22382

Streptococcus agalactiae

St_p

AGAAGTGACAGGTGGTGCATGG 22

AATCCGAACTGAGATTGGCTTTA 23275
15新技術の特徴・従来技術との比較
細菌混合感染である子宮内感染の起炎菌を全て同定できる。
子宮内感染の程度を推測でき、分娩帰結を含めた臨床的診断を正確にできる。
診断までの時間が、短時間で臨床的に有用である。
16

まとめ• 羊水で，網羅的かつ定量的に細菌叢解析を行った• 絨毛膜羊膜炎群全例と絨毛膜炎群の一部（羊水感染群：18検体）で特徴的なOTUのpopulationが観察され，主座標分析でもコントロール群と明らかに異なって集簇した• 羊水感染群では，妊娠延長期間が有意に短く，新生児感染症の罹患率が有意に高かった• 羊水感染群を検査陽性とした場合，高い精度（感度100%, 特異度79%)で絨毛膜羊膜炎を予測可能であることが示唆された• 羊水感染群の検体で高頻度に検出された9菌種を，羊水感染群のマーカーとして絞り込んだ• これらの菌種に特異的プライマーを作製し，PCR実験(in-silico & in-vivo)で検出した• 絨毛膜羊膜炎を，羊水で出生前に予測可能であることが示唆された
17

子宮内感染の感染経路と診断法⑥臨床的絨毛膜羊膜炎⑤組織学的絨毛膜羊膜炎④胎児感染

炎症細胞 細菌感
染の浸潤

子宮内感染

③羊水感染
②子宮頸管炎①細菌性腟症など
産科医療保障制度報告書より引用，一部改変• 子宮内感染は前期破水・早産など、妊娠経過に重大な影響を及ぼす• 妊娠中の診断が困難 （羊水培養検査と臨床的CAMは低感度・高特異度）• 診断の遅れは児に重大な影響を及ぼすこともあるため、的確な診断が求められる本技術に関する知的財産
発明の名称： 「絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキッ
ト、および絨毛膜羊膜炎検出方法」
出願番号：
特願2016-105177
出願人：
学校法人 福岡大学
発明者：
宮本 新吾（福岡大学）・秦 健一郎（国立研究開発法人国立成育医療研究センター）18

腟フローラの次世代シークエンス解析による子宮内感染の予測

切迫早産例の腟フローラ解析
本技術に関する知的財産

106 A.A. 糖タンパク質
腸内フローラの改善

特定臨床研究Primary Endpoint：＃１ 妊娠期間の延長＃２ 胎盤病理の炎症所見の消失（Blanc分類）
Secondary Endpoint：＃１ 腟細菌叢の変化＃２ ラクトフェリンの服用による有害事象

免疫能の亢進抗酸化作用

診断キットの実用化
19

社会的効

果早産の予防少 子 化 対 策

社会進出促進未熟児関連疾患撲滅

20想定される用途
診断困難な子宮内感染を迅速に診断することともに、全ての起炎菌の同定が可能となる。
起炎菌の定量的な同定から、経母体的な抗生物質投与の治療選択が可能となる。
起炎菌の定量的な同定から、分娩後の新生児感染に対する抗生物質投与の治療選択が可能となる。
起炎菌の定量的な同定から、分娩時期の決定が可能となる。
21

実用化に向けた課題
腸内細菌叢や腟細菌叢の乱れからくる子宮内感染は、早産、切迫早産、常位胎盤早期剥離という事態を誘起する可能性がある。
切迫早産例において腟細菌叢を解析することで、子宮内感染を予測できる検査法の確立を目指している（特許申請準備中）。
常位胎盤早期剥離を発症した症例の腟細菌叢の乱れについては、現在、解析中である。
ラクトフェリンあるいはビフィズス菌の投与により腸内細菌叢や腟細菌叢の乱れの改善が、切迫早産、早産、常位胎盤早期剥離症例を減少させるという臨床研究を実施する必要がある。
22

企業への期待
ラクトフェリンあるいはビフィズス菌を発売している会社とヒト切迫早産妊婦に対する臨床研究（AMEDなどの公的資金も視野に入れて）を実施して、検査薬の有用性を実証して検査キットとして発売する。
次世代シークエンス法やデジタルPCR法による検査キットを保有する会社と共同開発する。
少子化対策や女性ヘルスケアに興味を有する企業との共同開発を期待する。
23

本技術に関する知的財産権
発明の名称 ：「絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法」
出願番号 ：特願2016-105177
出願人 ：1学校法人 福岡大学、2国立研究開発
法人国立成育医療研究センター
発明者 ：宮本 新吾1 、秦 健一郎224

お問い合わせ先
福岡大学 研究推進部 産学官連携センター
担当コーディネーター
芳賀 慶一郎ＴＥＬ 092－871 － 6631（内線2809）
ＦＡＸ 092－866 － 2308
e-mail sanchi＠adm.fukuoka-u.ac.jp

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