脳組織において狙った細胞の神経伝達物質受容体の活性化に成功―記憶・学習のメカニズム解明に期待―
発表のポイント

脳内の神経回路の働きを理解するために、記憶・学習を司る神経伝達物質受容体であるグルタミン酸受容体を細胞種選択的に活性化する技術が必要とされている。

本研究では、本来のグルタミン酸応答能を維持したままで、⼈⼯化合物によって活性化される変異グルタミン酸受容体を開発した。

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この変異グルタミン酸受容体をある特定の細胞種に発現させたマウスを作製し、⼈⼯化合物投与によって細胞種選択的にグルタミン酸受容体を活性化させることに成功した。

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この新技術「配位ケモジェネティクス法」により、神経回路の理解が加速すると期待される。

概要
東海国⽴⼤学機構 名古屋⼤学⼤学院⼯学研究科 清中 茂樹 教授は、京都⼤学⼤学院⼯学研究科 浜地 格教授、⼩島 憲⼈ 博⼠（2021 年度 博⼠課程卒）、慶應義塾⼤学医学部⽣理学教室 柚﨑 通介 教授、掛川 渉准教授らと共に、神経回路の役割を明らかにするために、グルタミン酸受容体を細胞種選択的に活性化できる新たな⽅法論「配位ケモジェネティクス法」を開発しました。
私たちの脳に存在する 1,000 億個もの神経細胞は、シナプスを介して互いに結合してさまざまな神経回路を形成します。シナプスにおいて主要な情報伝達を担っているのは、神経伝達物質であるグルタミン酸とその受容体（グルタミン酸受容体）です。グルタミン酸受容体は、情報伝達に加えて記憶・学習などの⾼次機能に必須の役割を果たすと考えられています。しかしグルタミン酸受容体は、さまざまな種類の神経細胞に発現しているため、どの神経回路のどのシナプスに存在する受容体が重要であるのかについては、従来の実験法では解析が困難でした。本研究では、運動機能や運動学習を⽀える⼩脳神経回路において重要な役割を果たす代謝型
グルタミン酸受容体 1 型 (mGlu1) ⽤語解説 1 に着⽬しました。まず、本研究グループは、天然リガンド（グルタ1ミン酸）との親和性を維持した mGlu1 変異体を⾒出し、その変異体を選択的に活性化できる⼈⼯化合物（Pd(bpy)および Pd(sulfo-bpy)）を開発しました。次に、ゲノム編集技術⽤語解説 2 により mGlu1 変異体を発現する遺伝⼦改変マウスを作製し、そのマウスから得られる⼩脳切⽚に Pd(sulfo-bpy)を投与することによって、mGlu1 が関わる⾼次脳機能（⼩脳⻑期抑圧⽤語解説 3）を選択的に誘起できました。さらに、アデノ随伴ウィルス
⽤語解説 4を⽤いて、マウス⼩脳内の標的とする神経細胞種に mGlu1 変異体を選択的に発現させ、細胞種選択的に mGlu1 を活性化させることにも成功しました。本⼿法（配位ケモジェネティクス法）は mGlu1 だけでなく、他のグルタミン酸受容体にも適⽤可能であり、グルタミン酸受容体が関わる神経回路の解明が⼤幅に加速すると期待されます。
本研究成果は、2022 年 6 ⽉ 16 ⽇に国際学術誌「Nature Communications」オンライン版で公開されました。
1. 背景
脳内には 1,000 億個もの神経細胞が存在し、それらが複雑につながりあって神経回路を形成しています。記憶や学習などの脳⾼次機能は神経回路によって⽣み出されるため、脳機能を理解するためには、神経回路の配線の理解が重要です。また、脳内には異なる種類の神経細胞が存在して、それらが固有の機能を有しているため、神経回路における各細胞種の機能解明が強く求められています。⼀⽅、神経細胞の種類が異なっても同じ種類の受容体を⽤いて情報のやり取りをしています。そのため、受容体に対する従来の選択的な活性化剤を⽤いる「薬理学的な⽅法」では、各神経細胞種の機能解明は⾏えない状況でした。
そのような背景の下、標的とする細胞種を選択的に活性化する⽅法の開発が進んでいます。その代表例が光で活性化されるイオンチャネルタンパク質を標的細胞に発現させて、光照射のタイミングで神経活動を誘起するオプトジェネティクス⽤語解説 5 です。この⼿法は、時間および空間分解能が⾼いという特⻑があります。しかし、その操作を動物個体で⾏うためには、光ファイバーを動物脳内に埋め込む必要がありました。これを解決するため、化合物投与のタイミングで神経活動を制御できるケモジェネティクスの開発も進んでいます。ケモジェネティクスでは、⽣体内のタンパク質には作⽤しない⼈⼯リガンドで選択的に活性化される⼈⼯受容体タンパク質を標的とする神経細胞に発現させます。それにより、この⼈⼯リガンドを動物に投与するタイミングで標的とする細胞種の神経活動を制御できます。オプトジェネティクスおよびケモジェネティクスは、標的とする神経細胞種を任意のタイミングで活性制御できるため、神経回路研究において不可⽋な⽅法になりつつあります。⼀⽅、いずれの⽅法も本来神経細胞には存在しない⼈⼯タンパク質を発現させて、神経細胞の活性を制御しているため、脳内で起こっている神経伝達とは異なってしまうという⼤きな問題点も抱えています。脳内において各種受容体の発現量や発現場所は厳密に制御されているため、神経細胞に元々存在する受容体を細胞種選択的に制御することが理想的です。しかしながら、そのような⽅法論はまだほとんど知られていません。
本研究では、運動機能や運動学習を担う⼩脳に豊富に発現するグルタミン酸受容体である mGlu1 に着⽬しました。mGlu1 は、さまざまな脳部位に発現しています。特に⼩脳において mGlu1 の⾼い発現が⾒られます
が、複数種類の神経細胞に発現しており、それぞれの細胞種の mGlu1 の機能解明が望まれています。そこで、
mGlu1 を細胞選択的に活性化する⽅法論を開発し、⼩脳における細胞種選択的な mGlu1 の活性化および機能解明を⽬指しました。

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2. 研究成果（１）mGlu1 を選択的に活性化させるための変異導⼊および⼈⼯リガンド（Pd(bpy)）の開発
mGlu1 は、7 回膜貫通構造と細胞外に⼤きなグルタミン酸結合部位を有する G タンパク質共役型受容体の⼀種です。細胞外においてグルタミン酸が結合すると、⾙の⼝が閉じるかのようにグルタミン酸結合部位の構造が変化し、その構造変化が膜貫通領域に伝播して G タンパク質が結合することにより細胞内に情報が伝達されます（図 1a）。本研究では、グルタミン酸結合部位の⼊り⼝の上下に⾦属配位性のアミノ酸であるヒスチジンの変異導⼊を⾏い、⾦属錯体を加えるタイミングで mGlu1 を活性化させる⽅法を考案し、配位ケモジェネティクス法と名付けました（図 1b）。この⽅法では、グルタミン酸の結合位置には変異導⼊を⾏いませんので、従来のケモジェネティクス法とは異なり、受容体本来の機能は維持されることを期待しました。実際に、候補となる変異体と⾦属錯体の組み合わせを探索したところ、複数の mGlu1 変異体とパラジウムビピリジル錯体（Pd(bpy)（図 2））の組み合わせを⾒出しました。最適化した mGlu1 変異体においては、ｍGlu1 に元々存在する上部 55 番⽬のヒスチジン残基をそのまま⽤いるため、アミノ酸変異導⼊は、下部に存在する 264 番⽬のアスパラギン残基に対してのヒスチジンへの１アミノ酸変異（N264H）で⼗分でした。期待したとおり、この変異体 mGlu1（N264H）は、グルタミン酸に対する応答に影響を与えることなく、1〜3 μM の Pd(bpy)により活性化されました（図 1c）。

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（２）⼈⼯リガンド（Pd(bpy)）の低毒性化
Pd(bpy)により mGlu1（N264H）の活性化に成功しましたが、Pd(bpy)は疎⽔的であり、その化学的な特性は抗癌剤として知られるシスプラチンに類似するため、細胞内に⼊ると DNA に結合して細胞増殖を阻害するなどの副作⽤が懸念されました。実際に、神経のモデル細胞株として⽤いられるラット由来 PC12 細胞を⽤いて Pd(bpy)の細胞毒性を評価したところ、神経突起伸⻑には影響を与えないものの、細胞増殖を抑制してしまいました。そこで、細胞膜の透過性低下が期待できる親⽔的な Pd 錯体を複数合成して毒性を評価したところ、Pd(sulfo-bpy)は細胞増殖、神経突起伸⻑に影響を与えることなく、Pd(bpy)と同様に mGlu1(N264H)を活性化できることが確認されました（図 2）。よって、脳組織を⽤いた実験では、低毒性 Pd(sulfo-bpy)を⽤いることにしました。
（３）Pd(sulfo-bpy)による脳組織内の mGlu1 の活性化神経モデル細胞株に対して低毒性な Pd(sulfo-bpy)が得られたので、次にマウス脳組織に発現する mGlu1 の⼈為的な活性制御について検討しました。変異導⼊は、ゲノム編集（CRISPR/Cas9 システム）を⽤いてmGlu1(N264H)の 1 アミノ酸変異導⼊がされたノックインマウスを作製しました。mGlu1 は、⼩脳においてプルキンエ細胞⽤語解説６の樹状突起に多く発現して運動機能や運動学習に重要な役割を果たし、mGlu1 の機能を損失させたマウスは重篤な運動失調を⽰すことが知られております（図 3a）。まず、その変異導⼊マウスを詳細に解析して、mGlu1 に N264H の変異導⼊を加えても mGlu1 の発現や機能に影響が及ぼされず、マウスの運動機能も正常であることを確認しました（図 3b）。次に、mGlu1(N264H)ノックインマウスから調製した⼩脳急性スライスを⽤いて Pd(sulfo-bpy)の効果を検討したところ、mGlu1 の活性化に伴って引き起こされる⾼次脳機能である⼩脳⻑期抑圧（シナプス電流応答(EPSC)の持続的な減弱）が確認されました（図 3c）。Pd(sulfobpy)の効果は野⽣型マウスでは⾒られないことから、脳組織レベルにおいても変異 mGlu1 の活性化およびPd(sulfo-bpy)による⾼次脳機能の制御を実現できたと⾔えます。

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（４）脳内における細胞種選択的な mGlu1 変異体の発現および Pd(sulfo-bpy)による活性化
⼩脳において、mGlu1 は複数種類の神経細胞に発現することが知られています。上記のとおり、mGlu1 はプルキンエ細胞に豊富に発現しますが、プルキンエ細胞の機能を調節する役割を担う顆粒細胞および分⼦層介在神経（MLI）⽤語解説７にも mGlu1 が発現することが知られています（図 4a）。MLI においては、mGlu1 の活性化剤である DHPG を⼩脳急性スライスに投与した際に MLI の神経活動が亢進することが報告されていました。しかし、これまではどの神経細胞（顆粒細胞、MLI、プルキンエ細胞）の mGlu1 活性化が MLI の活動亢進に重要かを確認する術がありませんでした。そこで、アデノ随伴ウィルスと細胞種選択的な遺伝⼦発現プロモーターを駆使して、マウス脳内のプルキンエ細胞および MLI に対して、それぞれ mGlu1(N264H)を選択的に発現させました（図 4b）。これらのマウス由来の⼩脳急性スライスに対して Pd(sulfo-bpy)を投与したとこ
ろ、MLI に mGlu1(N264H)を発現させた⼩脳スライスにおいては、MLI の神経活動の亢進が確認されたのに対して、プルキンエ細胞に mGlu1(N264H)を発現させた標本では、そのような変化は⾒られませんでした（図4c）。すなわち、これらの結果は、MLI の活動亢進が MLI ⾃⾝に発現する mGlu1 の活性化によって引き起こされていることを⽰唆しており、MLI に発現する mGlu1 の重要性を、本⼿法を⽤いることではじめて明確に⽰すことができました。図 3a に記載した通り、神経細胞内において mGlu1 の発現場所は厳密に決められています。従来の⼈⼯受容体を⽤いた⽅法では、その発現場所を制御することは困難で、かつその⼈⼯受容体を活性化させているので、mGlu1 の機能とは⾔えません。⼀⽅、本⼿法では mGlu1 ⾃体を本来の機能を保ったま5まで⼈為的な制御が可能であるため、mGlu1 の細胞選択的な機能解明が可能となったと⾔えます。

3. 今後の予定および波及効果
本研究（配位ケモジェネティクス法）により、mGlu1 の細胞種選択的な活性制御法を実現しました。本⼿法
では、mGlu1 の機能を失うことなく低毒性な Pd(sulfo-bpy)による活性制御ができるため、⼩脳に限らずさまざまな脳部位の神経細胞種選択的な mGlu1 の活性化および機能解明が実現できると期待されます。本研究においては、標的タンパク質として mGlu1 に焦点をあてましたが、本⼿法は他のグルタミン酸受容体に対しても適⽤可能と考えられます。今後、神経回路における各種グルタミン酸受容体機能の細胞別分類に応⽤でき、グルタミン酸受容体が関わる記憶や学習などの⾼次脳機能の解明が加速すると期待されます。
４．研究プロジェクトについて
本研究成果は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業 総括実施型（ERATO）の研究領域「浜地ニューロ分⼦技術」（研究総括：浜地 格 京都⼤学 教授）の⼀環として⾏われました。

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＜論⽂タイトルと著者＞
タイトル

Coordination chemogenetics for activation of GPCR-type glutamate receptors in brain tissue（脳組織内において GPCR 型グルタミン酸の活性化を実現する配位ケモジェネティクス法）

著者

⼩島 憲⼈、掛川 渉、⼭崎 世和、三浦 裕太、伊藤 政之、道籏 友紀⼦、窪⽥ 亮、堂浦 智裕、
三浦 会⾥⼦、野中 洋、⽔野 聖哉、⾼橋 智、柚﨑 通介、浜地 格、清中 茂樹

掲

載

誌

Nature Communications

DOI

10.1038/s41467-022-30828-0

URLhttps://www.nature.com/articles/s41467-022-30828-0＜⽤語解説＞
1. 代謝型グルタミン酸受容体 1 型（mGlu1）：7 回膜貫通構造と細胞外に⼤きなグルタミン酸結合部位を有す
る G タンパク質共役型受容体の⼀種。主に Gq タンパク質と結合することが知られ、細胞内でホスホリパーゼ C 経路を活性化する。mGlu1 は、脳内において、主に、⼩脳、海⾺、嗅球、視床などにも発現する。
2. ゲノム編集技術：ゲノム編集とは、⽣物が持つゲノム DNA 上の特定の塩基配列を狙って変化させる技術の総称。その代表例として CRISPR/Cas9 システムが挙げられる（2020 年ノーベル化学賞の受賞研究）。
3. ⼩脳⻑期抑圧：神経活動に依存して神経細胞間の情報伝達効率が変化するシナプス可塑性の⼀種。⼩脳の⻑期抑圧は、平⾏線維とプルキンエ細胞間のシナプスの伝達効率が⻑期に渡って低下する現象。
4. アデノ随伴ウィルス：アデノ随伴ウィルスはヒトや霊⻑類の動物に感染する⼩型ウィルス。複数種類の⾎清型が同定されており、その違いにより導⼊される組織の種類が変わる。⾮常に弱い免疫反応しか引き起こさないため、遺伝⼦治療⽤のウィルスベクターとして臨床応⽤されはじめている。
5. オプトジェネティクス：光によって活性化されるタンパクを特定の細胞に発現させて、その機能を光で操作する技術。その代表例として、光で活性化されるイオンチャネルであるチャネルロドプシンが挙げられ、神経活動の光制御に広く⽤いられる。
6. プルキンエ細胞：プルキンエ細胞は γ-アミノ酪酸 (GABA) 作動性の抑制性神経細胞であり、⾮常によく発達した樹状突起を有する。プルキンエ細胞は、⼩脳顆粒層と分⼦層の間に規則正しく並び、プルキンエ細胞層と呼ばれる領域を形成している。
7. 分⼦層介在神経細胞(MLI)：介在神経細胞とは、⽐較的短い軸索を持ち、近傍の神経細胞のみと情報交換を⾏う神経細胞。MLI は、⼩脳分⼦層に存在する介在神経細胞であり、プルキンエ細胞に対して抑制性の出⼒を⾏う。

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