はじめに土壌病害は難防除病害が多く、特に汚染が激しい圃場においてはクロルピクリンに代表される土壌消毒剤が防除のために利用されていますが、環境保全型農業の一層の推進を図るためにはその利用を減らす取り組みが必要です。土壌消毒剤の圃場への処理は通常栽培前に行う必要がありますが、栽培前の時点で生育期間中の発病を正確に予測できないことから、現地ではスケジュール的に地域単位等で一斉に土壌消毒を行うことがこれまで励行
されてきました。しかしながら、その結果として、本来ならば使用する必要が無い圃場にも消毒剤を用いてしまい、生産者にとっては不必要な薬剤と作業コストが生じる事態も起きています。こうした過剰な消毒剤の利用を減らすためには、予防的IPMの発想に基づいて、土壌消毒剤使用の必要性の有無を栽培前に「診断」・「評価」し、その結果に応じた「対策」を講じることが有効です。「診断」と「評価」と「対策」をセットにした病害管理は、ヒトの健康診断による病気の予防や健康管理の取り組みに通じていることから、私どもはこの管理法を「健康診断に基づく土壌病害管理」の英語表現（Health checkup
based Soil-borne Disease Management）の頭文字を取って「ヘソディム」と名付けました。ヘソディムを活用することで、圃場の診断と評価を基に、土壌病害の「発生しやすさ」の程度に応じた予防の徹底や的確な病害防除ができるようになり、土壌消毒剤の無
駄のない利用を図ることが期待できます。
こうしたヘソディムをさまざまな土壌病害対策に導入し、土壌消毒剤の無駄のない利用を推進するために、私どもは、農林水産省の農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業の支援のもと、研究課題「次世代型土壌病害診断･対策支援技術の開発（25056c）」（平成25～27年度）において、各地で問題となっている土壌病害のヘソディムの開発に取り組んできました。加えて、この研究課題の中では、ヘソディムの重要な要素である診断に関する幾つかの手法についての高度化・低コスト化にも取り組んできました。本マニュアルは、公設および民間の試験研究機関担当者を対象に、これらの手法の詳細や留意点などを解説したものとなっています。本マニュアルの活用により、各圃場における土壌病害の診断の効率化が図られ、ヘソディムの実践が円滑に行われるようになることを期待します。

2016年 2月
「次世代型土壌病害診断･対策支援技術の開発」研究代表：（研）農業環境技術研究所

吉田 重信

ヘソディム（HeSoDiM）とは？… ………………………………………… 1
ヘソディムで行うこと… ………………………………………………… 2

1. 菌媒介ウイルスの高度検出・定量法 … ………………………………… 3
2. DRC診断のための実用的手法… ………………………………………17

3. より低コストなPCR-DGGE解析手法……………………………………45

ヘソディム（HeSoDiM）とは？

−1−

1

2

ヘソディムで行うこと
ヘソディムで行うこと

2

ヘソディムは、「診断」「評価」「対策」の３つで構成された
新しい土壌病害管理システムです○診断：「全病害に共通の診断項目」と「各病害に特徴的な診断項目」から構成されています
ポイント：コストを考慮し、最小限の項目を設定します○評価：診断項目毎の基準値をもとに、畑の「発病しやすさ」を総合評価します
ポイント：レベル１（軽度）〜３（重度）の３段階で評価します○対策：「発病しやすさ」のレベルに応じて実際の対策を求めます。
ポイント：レベル 3 では効果が低くとも、1 では有効という場合があり得ます。対策の判断基準として使えます。

土壌消毒
する？

消毒は
不要です。

品種を
変えてみる？

土壌病害に
悩む生産者

抵抗性品種で対応しませんか？

もう今年はあきらめる？

指導員【最小限の調査項目による土壌診断】【最も効果的な対策の選定】《持続的・低コストな安定生産を目指す》−2−

菌媒介ウイルスの高度検出・定量法

（写真）
（写真）
左上：レタスビックベイン病
左上：レタスビックベイン病 右上：レタスビックベインミラフィオリウイルス粒子
右上：レタスビックベインミラフィオリウイルス粒子
左下：媒介菌Olpidiumvirulentus
左下：媒介菌Olpidium virulentus休眠胞子
休眠胞子 右下：チューリップ微斑モザイク病
右下：チューリップ微斑モザイク病

富山県農林水産総合技術センター園芸研究所
富山県農林水産総合技術センター園芸研究所〒939-1327〒939-1327 富山県砺波市五郎丸288
富山県砺波市五郎丸288
TEL
TEL 0763-32-2259
0763-32-2259 FAX
FAX 0763-33-2476
0763-33-2476―3―

は じ め に

1

はじめに

はじめに

手法のポイント

土壌伝染性ウイルスのうち、糸状菌媒介によって伝播されるウ
イルスには、国内に発生するものだけでも15種類存在し、日本各地で発生が確認されています。

手 法 の 詳 細留

ウイルス媒介菌の一種であるオルピディウム菌はツボカビ網に属し、耕地土壌に普遍的に生息します。一般には無害ですが、レタスやチューリップなどの園芸作物にウイルスを伝搬し、モザイ
クや、えそなどの症状を引き起こして甚大な被害を与えます。
オルピディウム菌はウイルスを保毒した状態で休眠胞子を形成し、土壌中に長期間生存します。ひとたび、圃場がウイルスで汚染されると、何も対策を講じない場合には10年以上にわたって汚染が続きます。
ウイルスによる汚染の拡大を未然に防ぐことは非常に重要であり、そのためには汚染圃場を特定する必要があります。また、圃
場の汚染程度を把握することができれば、それに応じた適切な防除対策をとることができます。

意
点
そ
の

ここでは、土壌からレタスビックベインミラフィオリウイルス(MiLBVV)など、土壌伝染性ウイルスを検出する手法について解説します。本手法により、これら土壌伝染性ウイルス病の圃場における発病リスク診断が可能です。
本手法を活用した、「診断」・「評価」・「対策」からなる健康診断に基づく土壌病害管理「ヘソディム」が普及することを期
待します。

他

富山県農林水産総合技術センター―4―土壌試料の採取と調製（事前準備）→6ページへ（土壌試料の採取）• 1圃場あたり対角線上に５ヶ所から採取する。
（土壌試料の調製）• 土壌はふるいを通る程度に室温で乾燥させる。

Ⅱ

土壌試料からの核酸抽出（一日目）→9ページへ

意

Ⅲ

留

• 本手法では、土壌5 gから核酸を抽出する。一般的な市販キッ
トの土壌試料量0.5 gよりも反復間のばらつきが少ないことを確認している。
• 微生物細胞の破砕はビーズビーティング法で行い、抽出用緩衝
液にはタンパク質変性やRNase活性阻害剤として、グアニジ
ンチオシアン酸塩、2-メルカプトエタノールを加用する。

手 法 の 詳 細微生物細胞の破砕、土壌からの核酸抽出、核酸試料の精製の3つのステップからなる。

手法のポイントⅠ

2は じ め に手法のポイント手法のポイント

核酸試料の精製→10ページへ
点

Ⅳ

ウイルスRNAの定量（二日目）→12ページへの• 本手法では、特異性と検出感度を考慮し、TaqManリアルタ
イムPCR法を用いる。リアルタイムPCR法は専用の反応試薬
や反応と蛍光検出が一体となった機器を必要とする。操作はPCR法と同様であり、電気泳動する手間が省ける。

他

―5―

そ

• 精製には市販カラム（RNA Capture column）を用いる。
• 遠心操作とカラムによる精製により、土壌由来の腐植物質等の不純物は除去される。

は じ め に

3

土壌試料の採取と調製（事前準備）
Ⅰ Ⅰ
土壌試料の採取と調製（事前準備）

手法のポイント

1. 表層の土壌は除き、1圃場あたり対角線上に５ヶ所、合計500 g程度を採取する。

手 法 の 詳 細採取土壌試料2. 土壌はふるいを通る程度に室温で乾燥させる（土を軽くにぎると固まる程度）。
3. 乳鉢で塊を砕き、すべての土壌試料を2 mmのふるいに通し、密閉できる容器（袋）に入れる。

留意

4. 核酸抽出に用いる破砕用チューブ（次頁参照）に、土壌を5gずつ測りとる。すぐに用いない場合は、チューブのふたをしっかりと閉めてチューブごと冷蔵（4℃）保存する。

点
そ
の
乳鉢

ふるい(2 mm)他
―6―

土壌試料の保存Ⅱ

土壌試料からの核酸抽出（事前準備）

土壌試料からの核酸抽出（事前準備）

3

手 法 の 詳 細• マルチビーズショッカー（安井器械）• ボルテックス・ミキサーVORTEX-GENIE Ⅱ（MS機器）• 遠心機（50 mℓチューブ用ロータ、1.5/2.0 mℓチューブ用
ロータ）• インキュベーターまたはアルミブロック恒温槽（65℃設定が可能なもの）

手法のポイント【使用機器】は じ め にⅡ留意

ボルテックス・ミキサー

遠心機

点

マルチビーズショッカー

そ【使用器具】

他―7―の• 破 砕 用 50 mℓ チ ュ ー ブ （ 安 井 器 械 ST-5010PCR 、
WATSON1342-050S 等）• 遠心用50 mℓチューブ（WATSON1342-050S 等）• ジルコニアビーズ（直径0.5 mm、アズワン5-4060-04等）• 15 mℓチューブ• 1.5 mℓチューブ• ピペットマン、チップ

は じ め に

3

ⅡⅡ

土壌試料からの核酸抽出（事前準備）

土壌試料からの核酸抽出（事前準備）

手法のポイント【試薬】• 調製した試薬は、滅菌処理(121℃、20分)を行う。

手 法 の 詳 細留••

300 mMリン酸ナトリウム(pH 7.0)
300 mM の Na2HPO4 ・ 12H2O 溶 液 と 300 mM のNaH2PO4・2H2O溶液を作製し、pH 7.0になるように混ぜる。

••

20%SDS溶液
蒸留水に20%になるようにSDS(Wako、199-07141)を溶かす。

•

グアニジン溶液(4M グアニジンチオシアネート、10 mM
Tris-HCl (pH8.0)、1 mM EDTA)
1×TE に 4M に な る よ う に グ ア ニ ジ ン チ オ シ ア ン 酸 塩（Wako、077-02315）を溶かす。

•

意
点2-メルカプトエタノール（Wako、137-06862）•

フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)、
pH 8.0（ナカライテスク、25970-56）••

7.5M 酢酸カリウム溶液
蒸留水に7.5 Mになるように酢酸カリウム（Wako、16003175） を溶かす。

•
•
•
•
•

イソプロピルアルコール（2-プロパノール）
70%エタノール
Solution SR5(フナコシ、12866-25-5)
RNA Capture Column(フナコシ、12866-25-SF)
Solution SR6(フナコシ、12866-25-6)

そ

•

の
他

―8―

3

手法のポイント
手 法 の 詳 細
留
意
点
そ
の

1. 土を入れた破砕用50 mℓチューブにジルコニアビーズを
10 g入れる。
2. さらに、リン酸ナトリウムを9 mℓ、20%SDS溶液を500 μℓ、グアニジン溶液を500 μℓ、2-メルカプトエ
タノールを2.5 μℓ加える。
3. マルチビーズショッカーで3,000 rpm、60秒間、3回破砕する（または15分間ボルテックス・ミキサーにかける）。
4. 12,000×g、10分間、遠心する。
5. 50 mℓチューブに上清を回収する。
6. フ ェ ノ ー ル / ク ロ ロ ホ ル ム / イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル(25:24:1) 注）を等量(7.5 mℓ)添加する。注）使用前に室温に戻しておく。
7. 10秒間、ボルテックス・ミキサーにかける。
8. 12,000×g、10分間、4℃で遠心する。
9. 50 mℓチューブに上清を回収する。
10. 酢酸カリウム溶液を1/4量(2.5 mℓ)添加する。
11. 10回転倒混和する。
12. 5分間静置する。
13. 12,000×g、10分間、遠心する。
14. 50 mℓチューブに上清を回収する。
15. イソプロピルアルコールを等量(10 mℓ)添加し、転倒混和
後、-20℃で30分間静置する。
16. 12,000×g、20分間、4℃で遠心し、沈殿を得る。
17. 70%エタノールを5 mℓ加え、12,000×g、5分間、4℃で遠心し、沈殿（核酸試料）を得る。

は じ め に

Ⅱ 土壌試料からの核酸抽出（一日目）
Ⅱ
土壌試料からの核酸抽出（一日目）

他―9―

は じ め に

3

Ⅲ

Ⅲ

核酸試験の精製

核酸試料の精製手法のポイント
手 法 の 詳 細留意

1. 核酸試料にSolution SR5を1 mℓ添加し、すべてを1.5mℓチューブに移す。
2. ボルテックス・ミキサーにかける。
3. 65℃、10分間静置し、核酸試料をよく懸濁する。
4. この間にRNA Capture Columnを15 mℓチューブに設置
し（下図）、Solution SR5を2 mℓ添加する。
5. 核酸試料を20,000×g、1分間、4℃で遠心する。
6. RNA Capture Columnに遠心後の上清（核酸試料）のみを添加する。
7. さらに、Solution SR5を1 mℓ添加する。
8. RNA Capture Columnを新しい15 mℓチューブに設置し、Solution SR6を1 mℓ添加する。
9. 溶出した核酸試料を2 mℓチューブに移す。
10. 前頁15-17と同様にイソプロピルアルコール沈殿を行う。
11. 沈殿（核酸試料）に100 μℓのRNaseフリー水を添加後、65℃で10分間静置し、完全に溶解する。すぐに用いない場
合は、-20℃で保存する。
12. このうち5μℓを用いて、リアルタイムPCRを行う。

点
その他
RNA Capture Column― 10 ―

Ⅳ

ウイルスＲＮＡの定量（事前準備）

ウイルスRNAの定量（事前準備）

3

手法のポイント【使用機器】•

StepOne Plus Real-Time PCR System（アプライドバイオシステムズ）• プレート用遠心機• リアルタイムPCR用8連チューブまたは96穴プレート• 使い捨てのゴム手袋• ピペットマン、チップ

留

【試薬】

手 法 の 詳 細StepOne Plus Real-Time
PCR System【使用器具】は じ め にⅣ他

― 11 ―の• 以下のサイト↓から注文が可能
http://www.appliedbiosystems.jp/website/jp/product/m
odelpage.jsp?BUCD=131&PLCD=19716&MODELCD=1
9811&MODELPGCD=70276

そプライマー、プローブ名
塩基配列
MiLBVV-167F
5'-AATTTCTYTWGGTCTCATGACAA-3'
MiLBVV-238R
5'-TTTGCAGATGCYACCATGG-3'
MiLBVV-205T
5'-FAM-ACAGGCTTCTCTTC-MGB-3'

点

表 リアルタイムPCR用プライマー、TaqMan MGBプローブ（FAMラベル）の塩基配列(MiLBVV検出用）

意• TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix （アプライドバイ
オシステムズ）• プライマーおよびTaqManプローブ• 検量線用プラスミド

は じ め に

3

ⅣⅣ

ウイルスＲＮＡの定量（二日目）

ウイルスRNAの定量（二日目）

手法のポイント【試薬の調製】

手 法 の 詳 細RNaseフリー水
各プライマー 終濃度250nM
TaqMan MGBプローブ 終濃度900nM
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix 5μℓ
核酸試料またはプラスミド 5μℓ
合計 20μℓ

留

1. 使い捨てのゴム手袋をはめる。
2. RNase フ リ ー 水 、 プ ラ イ マ ー （ 2 種 類 ） 、 プ ロ ー ブ 、Master Mixの順に検定数＋1の混合溶液を作製し、8連
チューブまたは96穴プレートに分注する。
3. 最後に核酸試料またはプラスミドを5μℓずつ分注する。
4. 遠心し、反応液すべてをチューブの底に落とす。
5. ふたまたはシールをする。

意
点
そ
の

【機器の設定】他••使用するリアルタイムPCR反応試薬(Master Mix)に順ずる。
ここでは以下の反応条件に設定する。
50℃、5分→95℃、20秒→[95℃、15秒→60℃、1分]×40サイクル― 12 ―

解析方法（例）•

PCR増幅産物がある一定の蛍光強度(Threshold)に達するまでのサイクル数(Ct値)で評価する。Ct値が小さい程、目的のウイルスRNAの量が多いと判断する。
毎回、濃度既知の標準試料を一緒に検出することにより、異なる反応間での定量が可能である。本手法では、標準試料として、MiLBVVのCP領域をクローニングしたプラスミドを用いた。

プラスミドの希釈系列
10-1 10-2 10-3 10-4

意Threshold

留

100

圃場A
圃場B

手 法 の 詳 細（解析結果画面）手法のポイント•3

は じ め に解決方法（例）点他― 13 ―の1. プラスミドの希釈系列（赤線）を基にThresholdを決定する（例えば、毎回10-3のCt値が24サイクル付近になるように設定する）。
2. プラスミドの希釈系列をstandardに設定し、値を代入すれば、測定試
料の濃度（またはコピー数）の計算が可能となる。
3. Analysisボタンを押すと、Ct値（およびプラスミド換算の濃度（コピー数））が自動計算される。
4. Ct値（またはプラスミドの濃度（コピー数）でも同様)が35サイクルで発病リスクを分けた場合、圃場Aは発病リスクレベル３、圃場Bは発病リスクレベル２となる。

そ

発病リスク
レベル3 レベル2

は じ め に

4

留意点
留意点

手法のポイント【土壌試料の採取と調製】• 複数圃場の比較を行う場合は、出来るだけ同一時期の採取、保存条件の土壌試料を用いて検出することが望ましい。

【土壌試料からの核酸抽出】

意【ウイルスRNAの定量】

点• プラスミドを用いた絶対定量のほか、毎回同じ試料を一緒に検出する相対定量も可能である。
• 本手法による圃場の発病リスク診断は、事前にウイルス検出値と発病リスクレベルの関係を評価する必要がある（参考資料参照）。
• 本マニュアルとは異なる機種・メーカーのリアルタイムPCRの使用も可能である。
• 本手法により抽出した核酸試料を用いて、LAMP法で検出することも可能である。

そ留

手 法 の 詳 細• 土壌の種類によっては、精製度が不足し、ウイルスの検出が困難となる場合がある。
• ボルテックス・ミキサーの使用は、マルチビーズショッカーよりも検出感度が劣る。
• 本手法により抽出した核酸試料を用いてDNAを検出する場合には、別途DNA Elution Accessory Kit, RNA PowerSoil（フナコシ12867-25）が必要である。

の他― 14 ―

参考資料

手法のポイントy = 2214.3x - 781.65
R² = 0.8803

200000150000100000
50000
0
0

5

10

15

20

25

30

発病株率(%)

図）現地レタス圃場における発病株率と土壌からのウイルス定
量結果の比較(Momonoi et al., 2015を改変）

留

現地圃場における収穫期のレタスビックベイン病発病株率(品種 シスコビバ）と一作後の土壌中のMiLBVV RNA量を比較した。土壌中のウイル
ス量と発病株率は相関が高く、土壌中のウイルス量のレベル分けを指標に圃場の発病リスクレベルを推定できる。

手 法 の 詳 細pGEM-MiLBVV(コピー)/ 生土(g)300000250000は じ め に

5

参考資料

意

/土(g)
0.4

(%)
微斑モザイクウイルス
条斑ウイルス

微斑モザイクウイルス
条斑ウイルス

0.2
0.1
I

レベル3

レベル2

レベル2
0

A B C D E F G H圃場I

現地植付け前土壌中のチューリップ微斑モザイクウイルス、条斑ウイル
ス RNA量とTBIAによるチューリップ開花期の両ウイルス感染割合を比較した。土壌中のウイルス量のレベル分けを指標に圃場の発病リスクレベ
ルを推定できる。

― 15 ―

他図）圃場ごとの植付け前のウイルス量（左図）とチューリップ
のウイルス感染割合（右図）の関係のA B C D E F G H
圃場

レベル3 20

そ

40

0.3

0

60

点

0.5

は じ め に

5

参考文献

参考文献

手法のポイント

1. Momonoi K., Mori M., Matsuura K., Moriwaki J. andMorikawa T. (2015) Quantification of Mirafiori lettuce
big-vein virus and its vector, Olpidium virulentus,
from soil using real-time PCR. Plant Pathology, 64(4),825-830.

手 法 の 詳 細2. 桃井 千巳、森 充隆、松浦 克成、森脇 丈治、守川 俊
幸 (2016) レタスビックベインミラフィオリウイルスとその媒介菌 Olpidium virulentus の土壌からの検出定量方法
植物防疫、70(1)、23-29.

留
意
点
そ
の
他
― 16 ―

DRC診断のための実用的手法
DRC診断のための実用的手法

農研機構近畿中国四国農業研究センター
農研機構近畿中国四国農業研究センター〒７２０－８５１４〒７２０－８５１４
広島県福山市西深津町６－１２－１
広島県福山市西深津町６－１２－１
ＴＥＬ：０８４－９２３－４１００
ＴＥＬ：０８４－９２３－４１００− 17 −

は じ め に

1

はじめに
はじめに

手法のポイント

DRC(Dose-response curve)診断法は、「土壌と作物と菌」の組み合わせに大きく影響される「畑の発病のしやすさ」
をポット試験で比較的簡単に求めることができ、発病ポテン
シャルを大まかに推定するのに有効な方法です。DRC診断の詳細については、ヘソディム指導者向マニュアルに記載されて手 法 の 詳 細おりますが、民間企業等でDRC診断法を実施し、生産現場における圃場管理に活用していくためには、従前のマニュアルに記載した手法では作業性や必要な設備等が大きくなり実用的ではなく、より簡素化した手順による診断が求められています。
また、今後、診断を事業化するためには、対象病害の範囲を拡大することが必要と考えられます。

留

本項では、民間企業や農業生産法人等において本診断法を実施するために、作業性、コスト等を考慮した手法の改善策、ま意

た、新しい作物種、病害を対象としたDRC診断法の開発の取り組みについて紹介します。

点
そ近畿中国四国農業研究センターの他― 18 ―

手法のポイント2

コマツナ、ビート、ルッコラ等のベビーリーフを栽培している圃場で発生した立枯性病害を対象病害として、現地圃場より採取した罹病植物体から Rhizoctonia solani という病原菌を
本病害の軽減のために、分離した病原菌を用いたDRC作成法を新たに考案しました。栽培品目が多く、栽培期間、作間の期間が短いベビーリーフの診断では迅速な診断が求められますが、考案した手法では、３種類の植物種（コマツナ、ビート、
ルッコラ）のDRCを作成することが可能です。

手 法 の 詳 細分離しました（参考文献）。

手法のポイント

リゾクトニア菌によるベビーリーフの立枯性病
害のためのDRC診断法

は じ め に手法のポイント留意

アブラナ科野菜根こぶ病のためのDRC診断法
アブラナ科根こぶ病のDRC診断では、使用するポットが大点

きく、診断に要する設備や土壌の量が大きくなるという問題点がありました。改善した手法では、診断用のポットの小型化に

そより、従前の手法と比べて省スペースで、かつ、少ない土壌の量でDRC診断が可能となりました。また、診断に用いた汚染の土壌の廃棄量も少なく済むようになりました。

他― 19 ―

は じ め に

3 DRC作成方法

ＤＲＣ作成方法～ベビーリーフ～～ベビーリーフ～

手法のポイント【用意するもの】

手 法 の 詳 細・土壌サンプル・セルトレイ（5cm×5cm穴）1条件あたり3穴×5条件×反復数
5条件（無接種、汚染レベル４条件）3反復が望ましい
・セルトレイの底に敷くネット（三角コーナー用ネットなど）
・菌培養物（病原菌のオオムギ粒培養物を粉砕したもの）
・はかり
・ビニール袋（規格袋No.12程度のもの）
・バット（使い捨ての弁当箱等でもよい）・ピンセット

【ポット作成前準備】

留・土壌サンプルは5mm（もしくは2mm）篩でふるったものを用いる。
・セルトレイ１穴に何グラムの土が入るか確認する。
・篩にかけた土（セルトレイ3穴分）をビニールに小分け（5袋分）にする（写真１）。
・セルトレイの底穴を塞ぐようにネットを切って置く（写真２）。

意
点
そ
の

写真２ セルトレイにネットを敷く他

写真１ 土の量に対して、余裕のあるビニール袋を使用― 20 ―

DRC作成方法～ベビーリーフ～

3

１．病原菌接種源の計量
病原菌の接種濃度ごとに菌培養物をはかりとる。接種濃度は土壌の重さに対し、0%～1%の範囲で5条件とする。
（例） 0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%

手 法 の 詳 細２．汚染土壌の調製
菌体培養物を土に加え（写真1）十分に混和する。袋内に空気を入れるように袋を軽くねじり（写真2、3）、菌培養物が均一に土と混ざるように袋を振る。

手法のポイント【ポット作成から栽培まで】

は じ め にＤＲＣ作成方法～ベビーリーフ～

留
意

写真1

写真2

写真3

点
そ

３．ポットの土つめ
各条件ごとに混和した土壌をセルトレイの各穴にほぼ均等になるよ
うに入れ（写真4）、土表面を平らにならす。これを５条件分用意する（写真は２条件分）。

の
他

写真4

― 21 ―

は じ め に

3

DRC作成方法～ベビーリーフ～
ＤＲＣ作成方法～ベビーリーフ～

手法のポイント

４．播種
種子をあらかじめ、種袋から皿などに出しておき、それぞれセルト
レイ穴（1穴5粒ずつ）にピンセットを用いて播種する（図1、写真
5）

図1 播種位置イメージ（赤点＝種）

手 法 の 詳 細※菌の感染・移動などを防ぐため、菌培養物の少ない土から順番に播種する。
残った種子は廃棄する。

写真5

留
意

５．栽培
受け皿に水を入れ、上から不織布などで覆い（写真6、7）、6日間栽培を行う。温度は28度、明暗期12時間で管理が望ましい。
※給水は底面給水で適宜行う

点
そ
の
他
写真7

写真6

― 22 ―

3は じ め にＤＲＣ作成方法～ベビーリーフ～
DRC作成方法～ベビーリーフ～

手法のポイント【発芽数・発病株数の観察計数】

ルッコラ

写真8 播種後6日目のポットの状態

意
点

発芽数：播種後3日目までに発芽した芽の数を計数する。
発病株数：播種後6日までに発病している株数を計数する。
（発病株は胚軸のくびれ、褐変、立枯症状を示したものすべて）
発病株率=発病株率/発芽数

留

１．発芽数と発病株数の観察記録
播種した日を0日とし、播種後6日目まで発芽数、発病株数を記録し、発病株率を算出する（写真８）。発芽後、発病した株（写真９）は腐敗してしまうため、毎日確認する。

手 法 の 詳 細

コマツナ

そ

健全株

発病株

健全株

発病株

の
他

コマツナ

ルッコラ

写真9 発病株の例― 23 ―

は じ め に

3

ＤＲＣ作成方法～ベビーリーフ～
DRC作成方法～ベビーリーフ～

手法のポイント【DRCの作成】反復数3の場合の例
1．発芽数
病原菌の各接種濃度における発芽数の平均値を求める。

反復3（3+3+3）/3＝3

反復1（2/3+2/4+3/4）/3＝0.6

意（4+4+3）/3＝3.7

反復2

留（3+4+4）/3＝3.7

手 法 の 詳 細

反復1

反復2

（3/4+2/4+1/3）/3＝0.5

反復3（1/3+2/3+2/3）/3＝0.6

平均発芽数
3.5

2．発病株率
病原菌の各接種濃度における（発病数/発芽数）の平均値を求める。
黒点＝健全、赤点＝発病とする

平均発病率
0.6

点
そ

３．プロット
病原菌の各接種濃度における（発病数/発芽数）発病率をプロットするとDRC曲線が得られる。

の

1

他

発
病
株 0.5
率

0

0

0.1 0.2 0.5 1.0
病原菌接種濃度図 作成したDRCの例― 24 ―

～アブラナ科根こぶ病～～アブラナ科根こぶ病～

3

対象病害：アブラナ科根こぶ病

実際の作業性診断のためのポットが大きい φ11.5㎝×10㎝
たくさんの土壌が必要 800g/ポット
栽培期間 5週間

手 法 の 詳 細DRC診断法としては先行しており、具体的な手法については29ページ以降の付録「アブラナ科野菜根こぶ病
におけるDRC（病原菌密度－発病度曲線）作成マニュアル」を参照。

手法のポイント【DRC診断法の改良】

は じ め に

ＤＲＣ診断法の改善
DRC診断法の改善

留意

実際の診断に支障点

改良のポイントの

被検土壌の量、使用済み土壌の量、スペース、
労力の軽減

そ

使用するポットの小型化

他

診断所要期間の短縮
現場への試験結果の迅速な反映、対策実施までの時間的ゆとり― 25 ―

は じ め に

3

ＤＲＣ診断法の改善
DRC診断法の改善～アブラナ科根こぶ病～～アブラナ科根こぶ病～

手法のポイント

改良した内容ポットの⼩型化
直径11.5cm、⾼さ10cm→ 直径8.5cm、⾼さ8cm
必要⼟壌量 800g → 300g ＝ 約60%減量

手 法 の 詳 細栽培期間短縮5週間 → 4週間（インキュベーター使⽤）＝1週間短縮「アブラナ科野菜根こぶ病におけるDRC（病原菌密度－発病度曲線）作成マニュ
アル」における「４．植物の栽培：発病検定試験」部分を改良【具体的データ】
使用したポットの大きさ
大：改良前 ； 小：改良後

留
意
点
そ
の

図

ポットの大きさと栽培条件の違いがハクサイ根こぶ病のDRCに及ぼす影響
Inc：人工気象室（23℃、16時間照明）、4週間栽培
GH：ガラス室、5週間栽培

他
ポットが小さい場合、ほぼ同様のDRC― 26 ―

留意点

4

用意するもの・必要な土壌の量は土の種類によって異なります。開始前にあらかじめ1
ポットに入る土の量を確認しておき、必要量を確保してください。例えば1ポットに60g入る場合は1作物種あたり60g×15ポット×3反復分となります。

その・本結果は茨城県筑西市の生産者にご協力頂き得られた結果の一部です。
各土壌ごとに求めたDRCと現場における実際の発病程度の関係については十分に検証がされていません。また、各地土壌での適用性についても検討が必要です。

点

DRCの作成・本マニュアル作成時点では、現段階では新たに作付けを行う圃場の適正診断や、同一の圃場において、連作等による障害発生の予測、有機物施用の圃場管理による病害低減効果の検定等への活用を想定しています。

意・適用可能な作物は、本マニュアル作成時点でコマツナ、ルッコラ、ビート（テンサイ）です。この他の作物については今後の検討となります。

留

ポット作成から栽培まで・使用した器具（スプーンなど）は病原菌の汚染源となるため、絶対に圃場へ持ち込まないでください。再利用する際は、使用後熱湯もしくはハ
イターに漬け滅菌してください。

手 法 の 詳 細・菌培養物の培養状態、保存状態により菌株の生育量や活性が異なる可能性があります。本マニュアルでは、接種濃度を土壌に対する％で記載していますが、CFU等で調製することで安定した診断が行えるよう改良中です。また、作成に関しては、専用の機器等の設備が必要となりますので、担当者にご相談ください。

手法のポイント【DRC作成方法～ベビーリーフ～】は じ め に留意点他

― 27 ―

は じ め に

5

その他
その他

手法のポイント

参考文献
Sekiguchi H, Toda T, Sato E, Tomioka K, Murakami H, Amemiya R,
Hirako N, Nakata M, Hyakumachi M, Tsushima S (2016)
Rhizoctonia blight of turnip green caused by Rhizoctonia
solani AG-4 HG-III. J Gen Plant Pathol. 81:454-456

手 法 の 詳 細
留
意
点
そ
の
他
― 28 ―

「アブラナ科野菜根こぶ病におけるDRC」（病原菌密度-発病度曲線）作成マニュアル」

DRC（病原菌密度－発病度曲線）作成マニュアル

手法のポイント

アブラナ科野菜根こぶ病における

5は じ め に付録

ver 1.4

手 法 の 詳 細
留
意
点
そ
の
他

独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構

近畿中国四国農業研究センター― 29 ―

は じ め に

5

手法のポイント目次

手 法 の 詳 細

はじめに

・・・

１

０．必要資材・器具

・・・

２

１．試料の収集・保存

・・・

４

・・・

５

・・・

８

・・・

９

・・・

１０

・・・

１２

（１）土壌
（２）病原菌２．根こぶ病菌休眠胞子懸濁液の調製（１）休眠胞子懸濁液の調製（２）調製懸濁液の休眠胞子密度の測定
３．根こぶ病菌汚染土壌の調製

留（１）接種休眠胞子懸濁液の調製（２）休眠胞子懸濁液の接種

意

４．植物の栽培：発病検定試験（１）栽培環境の準備（２）栽培方法点

５．発病調査そ（１）生育状況（２）発病程度の調査（３）発病度の算出の（４）留意点
６．DRC の作成

他

（１）DRC の作成（２）DRC に影響する要因（３）DRC の利用法：DRC 診断（執筆担当：前 環境保全型野菜研究領域― 30 ―村上弘治）

根こぶ病は、ハクサイ、キャベツ、ブロッコリー、ナバナ、コマツナなどアブラナ科植物に広く発病がみられる土壌病害である。植物体は感染すると根にこぶができて維管束が圧迫され、やがて地上部の萎れや生育停滞を示すようになり、ひどい場合には枯死に至る。
こ の 病 原 菌 で あ る 根 こ ぶ 病菌 （ Plasmodiophorabrassicae） は 絶 対 寄生 菌 で 、 土壌 中 で は手法のポイント

はじめには じ め に

5

耐久体である休眠胞子として通常は存在しており、宿主となりうる植物の根が近傍にくるに位置づけられている。
根こぶ病の総合防除に際しては、圃場ごとに発病程度を予測し、適切な防除を行うことが必要であるが、根こぶ病の発生は、「土壌条件」、「作物の種類や品種」、「病原菌の病原性」に影響されるため、圃場の病原菌密度（休眠胞子密度）を測定しただけでは発病程度の予測や防除効果の推定は困難である。
て対象作物を栽培し、幼植物による生物検定試験により土壌中の病原菌密度と発病度の関留

そのため対象土壌に対象病原菌を接種して調製した病原菌密度の異なる汚染土壌におい手 法 の 詳 細と、発芽して遊走子となり、根毛に感染する。このことから、本菌は分類学上は原生動物係を示す Dose Response Curve(DRC)を求めて DRC 診断を行うことが有用である。

意

本マニュアルでは、誰でも容易にこの DRC データを得られるよう、DRC 作成に関わる手順をなるべく詳細に記載した。ただし、根こぶ病菌は絶対寄生菌であることから、培地

点上では培養や計数などができないため、取り扱いには本菌独自の方法が用いられており、高度な科学機器が必要な手順も含まれている。

そなお、ここでは「病原菌＝休眠胞子」として記載している。

の他― 31 ―-1-

は じ め に

5

手法のポイント

０．必要資材・器具
重複しているものは割愛し、原則、初出時になるべく網羅的に記載した。
（１）試料の収集
・スコップ、ポリ袋（70L 程度、厚さ 0.04mm）、大型コンテナーなど（ボックスコンテ
ナー 60L 程度）、油性マジック、軍手・ステンレスふるい（目合い 5mm 程度、直径 200mm 以上）、シリコン栓（上径 50mm程度）、移植ごて、手袋

手 法 の 詳 細・冷凍庫（-20 ℃以下）、ポリ袋（No.15 程度、厚さ 0.03mm）、キムタオル（２）根こぶ病菌休眠胞子懸濁液の調製
・ステンレス包丁、まな板、磨砕器（ブレンダー）、蒸留水、洗浄ビン
・ ガ ラス ビ ー カ ー（ 500ml 容 程度 以 上 ）、 大型 ガラス ロート （直径 100mm 程度）、市 販
ガーゼ、使い捨て手袋（クリーンノール手袋など）、ペーパータオル、キムワイプ
・遠沈管（50ml 容コニカルチューブなど）、（冷却）遠心分離器、ガラス棒（直径 5mm程度）、冷蔵庫（4 ℃）

留・次亜塩素酸ナトリウム液（市販漂白剤）
・蛍光試薬（カルコフルオールホワイト M2R）、電子天秤（最小表示 0.01g）、薬包紙、マグネチックスターラー、撹拌子、ろ紙（Advantec TOYO No.6、直径 125mm 程度）、意

ガラスロート（直径 70mm 程度）、クライオバイアル（2ml 容程度）
・マイクロピペット（200 ～ 5000 μ l）、マイクロテストチューブ（1.5ml 容程度）、タッ
チミキサー、トーマ血球計算盤、蛍光顕微鏡、数取り器

点（３）根こぶ病菌汚染土壌の調製

そ・ガラスメスシリンダー（25ml ～ 1L 容）、ガラスビーカー（50 ～ 200ml 容）、霧吹き（500ml
容、ダイヤスプレーなど）、・コンテナー（600 × 400mm、高さ 100 ～ 150mm など）の（４）植物の栽培
・硬質ポリ鉢（4 号または 3 号ポット）、寒冷紗（目合い 1mm 程度）、ゴールドラベル

他（10.5cm 程度）、バット（330 × 330mm、高さ 100mm など）、保温マット（ファーマットなど）、テーブルタップ、サーモスタット（農電サーモなど）、農ビ（梨地、幅 185cm、厚さ 0.1mm）、大型コンテナー（プラ舟 220L など）
・温室、ガラス室、ビニールハウス、照明付きインキュベーターなど
・ステンレス製ピンセット（125mm）、プラスチックシャーレ（直径 90mm 程度）
・じょうろなど・液肥、ステンレスビーカー（2L 容程度）

― 32 ―-2-

・大型バット（ボックスコンテナー 60L、110L 程度など）
・クリップボード、調査用紙
・オートクレーブ、ステンレスバケツ

手法のポイント（５）発病調査は じ め に5

手 法 の 詳 細
留
意
点
そ
の
他

― 33 ―-3-

は じ め に

5

手法のポイント

１．試料の収集・保存診断対象とする土壌、病原菌を用いることが原則であることから、供試材料を収集する必要がある。
（１）土壌①.対象圃場より土壌を採取する。この際、表層 2 ～ 3cm の乾いた部分を避け、その下からスコップ等により作土を採取する。
この際に、汚染土壌の可能性もあることから、コンテナー等の容器に直接土壌を入れ

手 法 の 詳 細るのではなく、大きなポリ袋に入れた方が良い。
ただし、後述するように、病原菌の汚染程度が著しい場合は、目的とする DRC が得られないことがあるので、高汚染が想定される場合は、同一種類や類似管理の土壌での代替を検討する必要がある。
また、土壌水分が高いと、ふるいかけや休眠胞子懸濁液の接種の際に作業性が低下するので留意する。
②必要土壌量は、土壌の種類、試験区の構成、使用するポリ鉢の容量、ふるいかけ時の歩留まりなどにより変動するため、事前に大まかに概算しておく。

留③使用にあたり土壌は 5mm 目合いのふるいを通す。土壌団粒などはシリコン栓でつぶして目合いを通す。汚染土壌の可能性がある場合は、使用する手袋は使い捨てのものが良い。

意④供試するまで風通しの良い日陰などで保存する。
⑤根こぶ病発病圃場の土壌の場合は、長靴やスコップなどの使用器具の洗浄、消毒に留意する。

点（２）病原菌そ①根こぶ病菌は培養できないため、圃場から栽培植物の根こぶ病罹病根（根こぶ）を事前に収集する必要がある。
②.対象とする圃場から複数の根こぶ病罹病根を採取する。

のその際に、白くて硬い根こぶは発病しにくく、黒くて腐敗気味の根こぶの方が発病しやすいことに留意し、分別して採取するとよい。
③周囲に付いている余分な土壌は水洗して極力取り除く。

他

この際、水洗に用いた汚染水の廃棄に留意する。
④洗浄した根こぶは、余分な水分をキムタオルなどで取り除き、ポリ袋に入れて、冷凍保存（-20 ℃；-80 ℃の方がより良い）する。

― 34 ―-4-採取した根こぶから土壌に接種するための菌液（休眠胞子懸濁液）を調製する。
（１）休眠胞子懸濁液の調製①接種に必要な休眠胞子懸濁液量（必要量の算出法は P6 参照）に応じて、根こぶの量を算出する。
根こぶ一握りで、約 1 × 109 個休眠胞子／ ml の菌液 50ml 程度が得られる。

手法のポイント

２．根こぶ病菌休眠胞子懸濁液の調製は じ め に

5
②凍結保存しておいた根こぶを室温で若干解凍する（約 30 ～ 60 分）。
③包丁で 1 ～ 2cm 角に細断して磨砕器に入れ、（滅菌）蒸留水を 200ml 程度加えて 1 分
間程度粉砕する。
添加する水量は根こぶが浸る位で、根こぶの量に応じて調整する（写真：下左）。
④大型ロート（直径 10cm）に 20cm 角程度に切断したガーゼ 4 枚をのせてろ過し、ろ液をビーカー（500ml 容程度）で受ける（写真：下中）。
⑤塊が残っていた場合は、再度粉砕する。

手 法 の 詳 細全解凍すると磨砕しにくくなるので、半解凍とする。

⑥洗浄ビンを用いて、全量を蒸留水とともにガーゼ上に流し入れる。
⑧ 50ml 容遠沈管数本に均等に分注し、必要に応じて蒸留水を添加して 40ml 程度にする。

留⑦手袋をして、ガーゼごと搾汁する。
⑨冷却（4 ℃）しつつ 2500 回転で 5 分間遠心分離する（写真：下右）。
⑪ガラス棒を用いて遠沈管下部に残ったペレットを少量の蒸留水に塊が残らないように意⑩上澄み液を上記のろ液を受けたビーカーに慎重に捨てる。
懸濁する。

点

⑫ 2 ～ 3 本分の再懸濁液を 1 本にまとめて、蒸留水を加えて 40ml 程度とし、よく撹拌して再び遠心分離する。
度繰り返す。

そ⑬この洗浄、遠心分離、懸濁を本数を少なくしながら、上清が薄茶色になるまで 3 回程
⑭最終的に 1 本にまとめて約 50ml の懸濁液とし、冷蔵保存（4 ℃）する。
週間以内に使用することが望ましい。）の⑮ 懸 濁 液 の 調 製 は 極 力 使 用 直 近 に 行 い 、 冷 蔵 保 存 し た 場 合 で も 速 や か に 使 用 す る 。（ 2⑯ 使 用し た 器 具 は、 廃 棄 す るか （ 使 い 捨 ての 器具 ）、熱湯 もしく は次亜 塩素酸 液によ り

他

消毒する。

― 35 ―-5-

は じ め に

5

手法のポイント（２）調製懸濁液の休眠胞子密度の測定①蛍光染色液の調製
1.カルコフルオール・ホワイト M2R（Calcofluor white M2R、別名：Fluorescent brightener
28、Tinopal LPW、Fluostain 1、化学式：C40H42N12O10S2Na2）0.02g を秤量し、100ml 蒸留
水（または、0.1M リン酸バッファー pH7.2；0.1M Na2HPO4･12H2O + 0.1M NaH2PO4･2H2O）にマグネチックスターラーを用いて溶かす。
2.ろ紙（Advantec No.6）でろ過する。
3.適量（2ml 程度）ずつ、クライオバイアル（2ml 容程度）に小分けし、冷凍保存（-20

手 法 の 詳 細℃）する。
②検鏡試料の作製
1.休眠胞子懸濁液は通常 100 倍希釈する。すなわち、懸濁液 100 μ l に（滅菌）蒸留
水 900 μ l を添加して 10 倍希釈し、これをもう一度繰り返す。
2.冷凍保存した 0.02%カルコフルオール・ホワイト M2R を使用する際に室温に放置、あるいは、温水につけて解凍する。
この際に、撹拌すると、試薬の結晶粒子も拡散してしまうので注意する。

留3.100 倍希釈した被検液 0.2ml を 1.5ml 容程度のマイクロテストチューブにとり、蛍光染 色 液 0.2ml（ 結 晶の 粒 子 が 入 らな い よ う に上 清を用 いる） を加え 、タッ チミキ サ
ーで良く混合する。

意

4.混合した被検液をトーマ（Thoma）血球計算盤に 1 滴滴下し、カバーグラスを密着させて、プレパラートを作成する。

点③計数
1.蛍光顕微鏡で通常 200 倍で青く発色した休眠胞子数を形（球形）や大きさ（約 3 μ m）

そを踏まえて識別し、計数する（写真）。
形態等の確認の際には、適宜 400 倍で検鏡する。
2.最小のマスで 4 × 4 マス、即ち三重線内を 1 視野とし、この中の休眠胞子を 8 ヶ所の程度で計数する。

他― 36 ―-6-休眠胞子数（X）＝個数（n）÷（a × b × c × 10-3）×希釈倍率× da(縦)× b(横)× c(深さ)は調査した容量
d：蛍光染色液を等量入れた場合

d=2

一番小さいマス目は a × b ＝ 0.05 × 0.05 ､ c ＝ 0.1mm で、
X ＝ n ÷(0.05 × 0.05 × 0.1 × 10-3 ×マス目数)×希釈倍率× 2＝ｎ× 4000 × 103 ÷マス目数×希釈倍率× 2

手法のポイント

3.休眠胞子数の算出は以下のとおりである。

は じ め に5
＝ n × 8 × 106 ÷マス目数×希釈倍率（個 休眠胞子／ ml）
X ＝ n × 8 ／ 16 × 108 （個 休眠胞子／ ml）＝ n × 5 × 107 （個 休眠胞子／ ml）

手 法 の 詳 細

マス目数は 4 × 4 ＝ 16、希釈倍率は 100 倍の場合、

留
意
点
そ
の
他

― 37 ―-7-

は じ め に

5

手法のポイント

３．根こぶ病菌汚染土壌の調製
根こぶ病菌の土壌中の病原菌密度（休眠胞子密度）の異なる根こぶ病菌汚染土壌（0 ～ 10

6個／ g 土壌）を調製する。
（１）接種休眠胞子懸濁液の調製
XX+1① 1 × 10 個休眠胞子／ g 土壌を調製する場合、4 × 10 個休眠胞子／ ml に希釈した懸濁液を、土壌 1kg あたり 25ml 接種する。
例えば、1 × 106 個／ g 土壌を 1kg 調製する場合には、前項で調製した懸濁液にメス

手 法 の 詳 細シリンダーを用いて滅菌蒸留水を適量加えて 4 × 107 個／ ml に調整し、25ml を接種することになる。
通常、前項により得られる休眠胞子懸濁液は 1 × 109 個／ ml 程度はあるから、最も汚染程度の高い 1 × 106 個／土壌の調製に必要な 4 × 107 個／ ml でも約 25 倍の希釈が必要となる。
② 1 × 105 個／土壌の調製に必要な 4 × 106 個／ ml の希釈懸濁液は、上記の 4 × 107 個／ ml 希釈懸濁液を 10 倍希釈して調整する。
③同様にして、4 × 102 個／ ml の希釈懸濁液まで調整する。

留④病原菌密度の高い方から低い方へと調整していくため、作業に際しては、使用する器
具や手指などによるコンタミ（汚染、混入）に注意する。

意（２）休眠胞子懸濁液の接種①汚染程度の低い土壌から順に接種、調製する。
②供試土壌を 70L 等の厚手の大型ポリ袋に入れて平らにならし、所定の希釈休眠胞子懸点

濁液を霧吹きで噴霧接種する。
この際、1 名がポリ袋の上部を外側から持ち上げて内部に空間を作り、周辺への病原そ菌の拡散を防止するため、別の 1 名がポリ袋内で噴霧すると良い。
③一度に全量を噴霧するのではなく、土壌表面が湿るたびに、袋の外側から中の土壌を混合し、数回に分けて接種する。

の④最後に、ポリ袋の口を閉じて、土壌全体をよく混合する。この際に、指先でポリ袋に穴を開けないよう注意する。
⑤土壌量が多い場合には、ポリ袋の代わりにコンテナー（60 × 40cm 程度、高さ 10 ～他

15cm 程 度 ） を 用 い 、 透 明 塩 ビ な ど で 上 部 を 覆 っ て 、 噴 霧 し た 休眠 胞 子 懸 濁液 が 周 囲に飛散しないように注意しながら作業する。
土壌を混合する際には移植ごて等を用いる。

― 38 ―-8-

根こぶ病菌汚染土壌を栽培容器に詰め、検定する植物を播種して栽培し、発病検定を行う。
（１）栽培環境の準備①接種した土壌を硬質ポリ鉢（4 号ポット：直径 11.5cm、高さ 10cm、または 3 号ポッ
ト：直径 9cm、高さ 9cm、底に寒冷紗を敷く、3 ～ 5 反復／病原菌密度）に詰める。

手法のポイント

４．植物の栽培：発病検定試験

は じ め に5
必要事項（病原菌濃度など）を記載したラベルを立てる。
リ鉢は病原菌密度別にバット（330 × 330mm、高さ 100mm）に入れる。
③試験ベッド上に保温マット（ファーマット等）を敷き、さらに塩ビを 2 重に敷いて、間隔を空けてバットを配置する（写真：下）。
④この際、試験状況に応じて、周辺への汚染防止を図るため、大型コンテナーを用い、その中にバットを配置する。
⑤栽培場所はコンクリート製の床面を有する温室やガラス室が望ましいが、ビニールハ

手 法 の 詳 細②相互のコンタミを防ぐため、水管理を病原菌密度ごとに行う必要があることから、硬質ポウスでも可能である。後者の場合は特に大型コンテナーの利用を推奨する。

留（２）栽培方法①病原菌密度の低い方から、1 鉢につき 13 ヶ所（4 号ポットの場合は 10 ヶ所）に 2 粒ず
は連続して使用可能である。

意

つ浅めにピンセットで播種する。病原菌密度の低い方から高い方に作業すれば、器具②試験時期に応じて 25 ℃に設定した保温マット（ファーマット等）を利用する。

点③かん水は上部からは行わず、バットに加えて底面から、生育に応じて土壌表層が乾かない程度に行う。この時、底面に水が多量に残るほどかん水すると、立枯れが生じや④播種 4 ～ 5 日経過後、発芽不良の場合は追播する。

そすくなるので注意する。
⑤ 10 日目頃（本葉が展開し始めた頃）、1 ヶ所あたりそれぞれ 1 個体に間引きする。但⑥追肥は生育に応じて 10 日目、20 日目に底面より液肥でＮ 10kg ／ 10a 換算量程度を施のし、1 ポットあたり 10 個体以上を確保する。
用する。（栽培期間が長い場合はその後も適宜施肥する。）― 39 ―-9-他⑦播種後 35 日程度栽培し、次項に従い発病を調査する。

は じ め に

5

手法のポイント

５．発病調査根系における根こぶ病の発病程度をポリ鉢ごとに 1 個体ずつ調査する。
（１）生育状況①地上部の生育状況を必要に応じて記録しておく。
根こぶの大きさは、感染・肥大の時期と地上部の生育状況に応じるため、感染が比較的早期の場合、地上部の生育自体が悪くなり、結果として、根こぶの肥大が進まないことがある。その場合、発病度が低く算出される場合がある。

手 法 の 詳 細（２）発病程度の調査①調査に際し、植物体をポリ鉢から土壌ごと取り出し、水中で根を傷めないように丁寧に洗浄する（写真）。
②植物体 1 個体ごとに以下の基準に従って発病程度を調査し、次頁のような調査票を用いて集計する。
ここで、肥大とは健全根の太さの 3 倍程度以上のふくらみがある場合を指す。

留

発病程度

発病状況

意
点

区分

細区分

０

０

：

根こぶなし

１

１

：

側根のみに根こぶあり

２２S：

主根の５０％未満に根こぶあり

２L：

主根の５０％未満に肥大した根こぶあり

３S：

主根の５０％以上に根こぶあり

３L：

主根の５０％以上に肥大した根こぶあり

３そ（３）発病度の算出
発病度はポットごとに以下の式により算出する。

の発病度＝（１×ｎ 1 ＋２×ｎ 2 ＋３×ｎ 3）／（３× N）×１００
ｎ i ：発病程度の区分がｉの個体数
Ｎ ：全個体数

他

病原菌密度ごとに、平均および標準誤差を求める。
（４）留意点①使用したポリ鉢やバット等は、廃棄あるいは次亜塩素酸
で消毒、洗浄する。
②汚染土壌や植物体はオートクレーブなどで蒸気消毒してから廃棄する。
植物体の場合は焼却処分でも良い。

― 40 ―- 10 -

区 菌密度３Ｌ ３Ｓ ２Ｌ ２Ｓ

3

102

1
2
3
4
5
合計
平均

4

103

1
2
3
4
5
合計
平均

5

104

1
2
3
4
5
合計
平均

6

105

1
2
3
4
5
合計
平均

7

106

1
2
3
4
5
合計
平均

他

1
2
3
4
5
合計
平均

S.E.

の

101

発病率 発病度
0
101
2
10
103
104
105
106

そ

2

S.E.

点

1
2
3
4
5
合計
平均

発病
有 無 全株数 発病率 発病度

意

0

0

留

1

１

手 法 の 詳 細

DRC
試験日
（
）
地名
（
）
土壌の種類
（
）
作物名
（
）
品種
（
）
栽培日数
（
）

手法のポイント

DRC 作成のための発病調査票（例）は じ め に5

― 41 ―- 11 -

は じ め に

5

手法のポイント

６．DRC の作成
（１）DRC の作成
横 軸 に土 壌 中 の 病原 菌 密 度 （接 種 休 眠 胞 子密 度）、 縦軸に 発病度 をとり 、得ら れた結 果をプロットし、DRC（病原菌密度－発病度曲線）を作成する。（縦棒は標準誤差を示す。）①根こぶ病非汚染土壌の場合接種した病原菌密度（休眠胞子密度）に応じて、発病度が高くなる関係が得られる。

手 法 の 詳 細

100

発病度

80
60
40
20

留

0

1

10
10 2
10 3
10 4
10 5
土壌中の病原菌密度 （個 休眠胞子／g 土壌）

0

10 6

意
②根こぶ病汚染土壌の場合
原土の汚染程度までは一定の直線関係を示し、その後、発病度が高くなる関係が得ら

点

れる。

そ

るが、汚染程度が高い場合は有用な DRC は得られない可能性がある。ただし、その汚染程度が低い場合は DRC の立ち上がり等が把握でき、診断に際して参考となりう
場合でも高菌密度における発病度の値から、ある程度の情報（発病助長的か、発病抑止的かなど）を得られる。

の

100

他

80

発病度

高汚染土壌の例

6040
低汚染土壌の例

20

本来のDRC

0
0

1

10
10 2
10 3
10 4
10 5
接種した病原菌密度 （個 休眠胞子／g 土壌）― 42 ―- 12 -

10 6

土壌条件、作物の種類・品種、病原菌の病原性、薬剤施用歴などにより DRC は変動す
るため、土壌中の病原菌密度が同じでも発病程度は異なる。
100
発病しやすい場合
土壌条件や植物の種類・品種など
により変動

60
40

発病しにくい場合

20
0
0

1

10

2

3

4

10
10
10
10
土壌中の病原菌密度 （個 休眠胞子/g土壌）

5

10

6

留

（３）DRC の利用法：DRC 診断

手 法 の 詳 細根こぶ病発病度80

手法のポイント（２）DRC に影響する要因

は じ め に

5

DRC に基づいて根こぶ病診断を行うことができる。
詳細は「DRC 診断マニュアル」（2014）参照。

意（例）発病ポテンシャルの予測
・DRC で発病助長的か、発病抑止的かを評価できる。

点・圃場の病原菌密度を DRC に当てはめ、発病度を予測できる。
100

そ

推定される
根こぶ病の
発病度

60

の

発病度

80

40

他

実測した
土壌中の
病原菌密度

20
0
0

1

10
10 2
10 3
10 4
10 5
土壌中の病原菌密度 （個 休眠胞子／g 土壌）― 43 ―- 13 -

10 6

は じ め に

5

手法のポイント
手 法 の 詳 細留意点そ「アブラナ科野菜根こぶ病におけるDRC（病原菌密度－発病度曲線）作成マニュアル」の（2014年2月28日）（2014年11月25日改訂）

他

独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構

近畿中国四国農業研究センター
環境保全型野菜研究領域〒623-0035

京都府綾部市上野町上野200
TEL 0773-42-0109

許可なき複製を禁じます
14 -―
―- 44

より低コストなPCR-DGGE解析手法
より低コストなPCR-DGGE解析手法
M M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 91010M M

株式会社リーゾ
株式会社リーゾ
茨城県つくば市天久保2-9-2-B201
茨城県つくば市天久保2-9-2-B201
http://www.rizo.co.jp/
http://www.rizo.co.jp/− 45 −

は じ め に

1

はじめに
はじめに

手法のポイント
手 法 の 詳 細⼟壌中の微⽣物相を解析する⼿法は、⼤別して「微⽣物を培養してその性質を調べる⽅法（培養法）」と「培養を経ずに微⽣物群を直接調べる⽅法（⾮培養法）」の２つのアプローチがあり、PCR-DGGE法は後者に該当します。
環境中に存在する微⽣物の⼤半は、培養法では検出が難しいため、⼟壌中の微⽣物相をありのまま観察するためには⾮培養法の⽅が適しています。⾮培養法には、
PCR－DGGE法のようにDNAを利⽤する⽅法のほか、FISH法を始めとする菌体を直接観察する⽅法や、キノンプロファイリングを始めとする化学分析法等、様々な⽅法が開発されています。
ここでは、低コストで⼟壌からDNAを抽出し、PCR－DGGE法で分析する⼿法について解説します。

留
意
点
そ
の
他
― 46 ―

手法のポイント2

手法のポイント
手 法 の 詳 細このマニュアルは、PCR-DGGE法による検査サービスを現実化するために、とにかく『低コスト』にすることを⽬的として、農業環境技術研究所により開発された解析マニュアルを改変する形で開発したものです。必要な検査結果がきちんと出ることを確認しながら、⾼額なキットを安価な試薬に置き換え、ステップ数を極限まで減らして、消耗品コストのみならず時間コスト（＝⼈件費）を抑えて作成しています。
あくまでも、⼟壌のDNA検査を低コストでルーチンに⾏うことを⽬的としている
ため、研究等、より⾼品質のDNAや⾼精度の美しい泳動像が必要な場合には、従来の解析マニュアルでの分析をお勧めします。⽬的によって、適宜使い分けていただ
ければ幸いです。

は じ め に手法のポイント

留
意
点
そ
の
他

― 47 ―

は じ め に

3

手法の詳細
手法の詳細

手法のポイント＜PCR-DGGE法による⼟壌微⽣物相の分析法＞

手 法 の 詳 細Ⅰー１

Ⅰ ⼟壌試料からDNAを抽出する
Ⅱ 対象遺伝⼦（rDNA）をPCR増幅する
Ⅲ DGGEにより分析する
Ⅳ バンドパターンを数値化して⽣物多様性指数を算出するという⼿順で⾏う。

⼟壌試料の取り扱い

１）⼟壌は任意の⽅法で採取する。
採取した⼟壌は乾燥しないように気をつけながら２ｍｍ⽬の篩いにかけ、植物残さ等をできるだけ取り除く。⼤きめの容器に⼊れて⼗分に混和する。

留２）マイクロチューブに、１）の⼟壌を0.4ｇ量りとり、DNA抽出まで保冷（１⽇以上かかる場合は冷凍）する。

意（検査機関に送付する場合には、この状態で冷凍便で送付する。0.4ｇを量りとることが難しい場合には、数グラムをジップつきのビニール袋に⼊れて冷凍送付する
ことも可）

点
そ
の
他
― 48 ―

DNA抽出意点
その他― 49 ―

留【抽出⼿順】
1）ステンレスボール１個とグラスビーズ150μlの⼊った2mlスクリューキャップチューブに0.4gの試料と1100μlのDNAすいすい-Eを加える。
2）粉砕装置にチューブをセットし、粉砕処理を⾏う。（3000rpm、１分）
3）14000rpmで5分間遠⼼し、上清200μlを新しいチューブに移す。
4）上清に200μlのDNAすいすい-Eと100μlの10％酢酸を加えてよく転倒混和し、14000rpmで5分間遠⼼する。
5）遠⼼後のチューブに直接100μlのフェノール：クロロホルム（下層）を加えてゆっくり
10回程度転倒混和し（⽩濁する程度）、14000rpmで5分間遠⼼する。
6）上清200μlを新しいチューブに移し、200μlのイソプロパノールを加えてよく転倒混和する。
7）ゲノムDNA⽤カラムにのせて、10000rpmで1分間遠⼼し、流下液を捨てる。
8）400μlの70％エタノールをカラムにのせて、10000rpmで1分間遠⼼し、流下液を捨てる。これを2回⾏う。
9）新しいチューブにカラムをセットし、50μlの滅菌蒸留⽔をカラム中央にのせ10000rpmで1分間遠⼼し、溶出液を回収する。
10）溶出したDNA溶液は5-10μl程度をアガロースゲル(1％)で電気泳動(30分)し、DNAが抽出できていることを確認する。

手 法 の 詳 細【使⽤するもの】カッコ内は平成27年12⽉現在、リーゾで使⽤しているもの（参考）・2mlスクリューキャップチューブ（Watson スクリューチューブ 1392-200-SS-Y）
・４ミリ径ステンレスボール（⾈辺精⼯ GT-1）
・グラスビーズ（アズワン ガラスビーズ BZ-1）
・ゲノムDNA⽤カラム（FavorPrep Gemonic DNA Extraction column）
・DNAすいすい-E（リーゾ DS-0008）
・10％酢酸・フェノール：クロロホルム（1：1）
・イソプロパノール
・70％エタノール・粉砕装置（TAITEC μT-12）
・微量⾼速遠⼼機

手法のポイント

Ⅰー２

は じ め に3

は じ め に

3

手法のポイントⅡ

PCR【⼀般細菌相】⼀般細菌相の解析⽤プライマーとして、真正細菌16S rRNA遺伝⼦のV6-8可変領域を標的とする以下のプライマーセットを使⽤する。

手 法 の 詳 細Forward Primer : F984GC
5-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gaa cgc gaa gaa
cct tac-3'（下線部はGC clump）
Reverse Primer : R1378
5'-cgg tgt gta caa ggc ccg gga acg-3ʼ
【PCR条件】
TOYOBO「KOD-Plus」と5×PCRすいすいで作成した2×PCR PremixBufferを使⽤
し、以下の条件で反応を⾏う。

留
意
点
そ

1) 2×PCR PremixBuffer の組成（1.5ml分）
5×PCRすいすい（リーゾ PS-0002)
10×KOD-Plus-BufferdNTPs(2mM)
MgSO4(25mM)
滅菌蒸留⽔

600μl
300μl
300μl
120μl
180μl

2) Primer Mix(F984GC/R1378) の組成（100μl分）
滅菌蒸留⽔
F984GC(100μM)

60μl
20μl

R1378(100μM)

20μl

の
他
― 50 ―

反応液組成(25μl反応系)※節約バージョン
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(F984GC/R1378) 0.5μl
Template DNA
0.5μl

12.5μl
8.5μl
2.5μl
0.5μl

手 法 の 詳 細

1μl
1μl

25μl
17μl
5μl
1μl

手法のポイント3) 反応液組成(50μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(F984GC/R1378)
Template DNA

は じ め に3留そ6) DGGE⽤泳動サンプルを⽤意する。５μlのPCR産物に、９μlの５×PCRすいすいを添加し混合する。５）の泳動像から、増幅量が少ないと思われる場合には、10μlを上限として
PCR産物の量を増やす。同様に、増幅量が多い場合には、半量を下限として減らす。

点5) PCR産物4μl程度をアガロースゲル(2％)で電気泳動(15分)し、産物が得られていることを確認する。

意4) 反応サイクル
94℃-2分 → [94℃-15秒，55℃-30秒，68℃-30秒] ×34の他― 51 ―

は じ め に

3

手法のポイントⅡ

PCR【⽷状菌相】

手 法 の 詳 細⽷状菌相の解析⽤プライマーとして、真正細菌18S rRNA遺伝⼦を標的とする以下のプライマーセットを使⽤する。
Forward Primer : NS1
5'-gta gtc ata tgc ttg tct c-3'
Reverse Primer : GCFung5'-cgc ccg ccg cgc ccc gcg ccc ggc ccg ccg ccc ccg ccc cat tcc ccg tta ccc gtt
g-3'（下線部はGC clump）【PCR条件】
TOYOBO「KOD-Plus」と5×PCRすいすいで作成した2×PCR PremixBufferを使⽤し、以下の条件で反応を⾏う。

留
意
点
そ

1) 2×PCR PremixBuffer の組成（1.5ml分）
5×PCRすいすい（リーゾ PS-0002)
10×KOD-Plus-BufferdNTPs(2mM)
MgSO4(25mM)
滅菌蒸留⽔

600μl
300μl
300μl
120μl
180μl

2) Primer Mix(NS1/GCFung) の組成（100μl分）
滅菌蒸留⽔
NS1(100μM)

60μl
20μl

GCFung(100μM)

20μl

の
他
― 52 ―

0.5μl12.5μl
8.5μl
2.5μl
0.5μl
0.5μl

手 法 の 詳 細反応液組成(25μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(NS1/GCFung)
Template DNA

1μl

25μl
17μl
5μl
1μl
1μl

手法のポイント3) 反応液組成(50μl反応系)
2×PCR PremixBuffer
滅菌蒸留⽔
10×BSA(4mg/ml)
KOD-PlusPrimer Mix(NS1/GCFung)
Template DNA

は じ め に3留そ6) DGGE⽤泳動サンプルを⽤意する。５μlのPCR産物に、９μlの５×PCRすいすいを添加し混合する。５）の泳動像から、増幅量が少ないと思われる場合には、10μlを上限として
PCR産物の量を増やす。同様に、増幅量が多い場合には、半量を下限として減らす。

点5) PCR産物4μl程度をアガロースゲル(2％)で電気泳動(15分)し、産物が得られていることを確認する。

意4) 反応サイクル
94℃-2分 → [94℃-15秒，50℃-30秒，68℃-30秒] ×35の他― 53 ―

は じ め に

3

手法のポイント

Ⅲ

DGGE

表1

泳動条件

DGGEにはBioRad社製DCodeシステムを⽤いる。

手 法 の 詳 細条件

⼀般細菌相⽤

⽷状菌相⽤

ゲル濃度

６％

７％

変性濃度勾配50％→70％20％→45％

泳動温度

58℃

60℃

泳動電圧

50V

50V

泳動時間

18時間

20時間

＜ゲルストック溶液の作成＞
表2の組成に従い、ゲルストック溶液を調製する。

留表2
⼀般細菌相⽤

⽷状菌相⽤

70％変性

20％変性

45％変性

40％アクリル
アミド／ビス
37.5：115ｍｌ

15ｍｌ

17.5ｍｌ17.5ｍｌ50×TAE

2ｍｌ

2ｍｌ

2ｍｌ

2ｍｌ

ホルムアミド

20ｍｌ

28ｍｌ

8ｍｌ

18ｍｌ

尿素

21ｇ

29.4ｇ

8.4ｇ

18.9ｇ

超純⽔

to 100ml

to 100ml

to 100ml

to 100ml

意

50％変性

点
そ
の
他

― 54 ―

ゲルの組成（細菌相⽤）
⾼濃度
70％変性

50％変性

16ml

ゲルストック

144μl

10％APS

144μl

TEMED

14.4μlTEMED

14.4μl点

ゲルの組成（⽷状菌相⽤）
⾼濃度
ゲルストック

低濃度
20％変性

16ｍｌ

ゲルストック

16ml

144μl

10％APS

144μl

TEMED

14.4μlTEMED

14.4μlの10％APS

そ

45％変性

意

10％APS

留16ｍｌ

ゲルストック

表4

低濃度

手 法 の 詳 細表3

手法のポイント＜ゲルの作成＞
１）DCodeのマニュアルに従い、プレートを組み⽴て、キャスティングスタンドに固定して、ゲル注⼊⽤のチューブをプレートの中央部にテープで固定する。
２）10％過硫酸アンモニウム溶液を調製する（冷凍保存が可能）。
３）表3、表4に従い、清潔なビーカー等にゲル溶液を調製する。
４）直ちにシリンジに吸い取り、チューブを装着してグラジエントフォーマーにセットし、各チューブの端を１）の注⼊⽤チューブとY-フィッティングでつなげる。
５）グラジエントゲルフォーマーのホイールを⼿前⽅向にゆっくり回してゲルを注⼊する。
チューブを外してコームを差し込む。
６）チューブとシリンジを洗浄する（ゲルが固まらないうちに）。
７）3時間以上重合させる。

は じ め に3

他

― 55 ―

は じ め に

3

手法のポイント
手 法 の 詳 細＜泳動＞
１）1×TAEバッファーを7リットル作成し、泳動槽のFill-Runの間まで注ぐ。ヒーターをONにして設定温度を泳動時の温度＋5℃に合わせる。
２）ゲルからコームを抜き取り、ゲルのかすなどを取り除き、ウェル部を洗浄する。
３）ゲル板をDCodeのコアに取り付ける。300ml分のバッファーを取り分けてから、泳動槽にセットする。取り分けたバッファーをコア上部に戻す。
４）ポンプをONにしてバッファーを泳動槽のMaximumラインまで満たす。泳動時の温度より2℃⾼めに設定し、温度が安定するまで待つ。
５）上部ユニットを取り外し、各ウェルにサンプルをアプライする。両端にはマーカーをアプライする（細菌⽤：DGGEマーカーⅢ、⽷状菌⽤：DGGEマーカーⅣ、ニッポンジー
ン社製）。
６）設定温度を表１の泳動条件に合わせ、ポンプをONにする。温度が安定したら、表1の泳動条件に従って泳動を開始する。

留
意
点

＜染⾊＞
１）コアを解体してガラスプレートを取り出す。
２）スペーサーを端からゆっくり持ち上げるようにして、ガラス板（⼩）をはがす。
３）ガラス板（⼤）に張り付いた状態のゲルを慎重にはがし取り、染⾊⽤の容器に移す。
ゲルを適当量の精製⽔で洗浄する。
４）80mlの1×TAEバッファーと8μlのSYBR GreenⅠを加え、穏やかに振とうしながら20分間染⾊する。
５）撮影装置のマニュアルに従って泳動像を画像化する。

その他― 56 ―

⽣物多様性指数の算出

手 法 の 詳 細１）泳動像のデータを画像処理して、バンドの数と、各バンドの強さを数値化する。このとき、検出感度と検出範囲を適宜調整する。
２）⽣物多様性指数算出⽤のエクセルファイルに数値を⼊⼒する。
３）4種類の⽣物多様性指数が算出される。
Shannon Wienerʼs index（Hʼ）＝ -∑Pi LN Pi
Simpson index（1-D）＝1- Σ(Pi)2
Richness：the number of bands
Evenness：Hʼ/ln(Richness)

手法のポイントⅣは じ め に

3

留意点

←泳動中の様⼦

その他

バンド検出の例（左の画像から検出）

泳動像の例（細菌相）― 57 ―

は じ め に

4

留意点

留意点

手法のポイント【留意点】

・DNAが取れない、量が極端に少ない→DNAすいすい-Eを室温に⻑く放置するとｐHがアルカリ性に傾き、シリカカラムにDNAが吸着しにくくなることがある。⼟の種類や状態によっては、微⽣物量が少なく、DNAの量も少ない可能性がある。

手 法 の 詳 細・抽出したDNA溶液が着⾊している→腐植の多い⼟壌では、抽出したDNA溶液が薄茶⾊に⾒えることがある。PCRがかからない場合には、市販のDNA精製カラム等で再度精製する。
・PCRで増幅しない→鋳型DNAの濃度もしくは精製度が疑われる場合には、DNAを再度精製する。
→PCR⾃体がうまく⾏かない場合には、使⽤しているバッファー、プライマー、滅菌⽔等を刷新してやり直す。ネガティブコントロールに増幅が⾒られる場合も同様。

留意
点・ゲルの作成がうまくいかない→ゲルが固まる前に漏れる場合には、キャスティングがうまくできていないことが原因であることが多い。ガラス板とスペーサーの底⾯をしっかり揃えてクランプで固定する。
→ゲルが固まらない・固まるのが遅い原因としては、APSが古くなっている、TEMEDが少ない、室温が低い等が考えられる。APSは⽤事調製するのが望ましい。
→ガラス板が汚れていると、ゲル注⼊時に気泡が残る場合がある。しっかり洗浄し、乾燥させてから使⽤する。

その・上部バッファーが抜け落ちる→コアを⼀度引き上げ、ガラス板を外してセットしなおす。コアとプレートの間に隙
間なくガスケットが挟まっていることを確かめる。

他― 58 ―

・泳動がうまくいかない→規定時間で終了しているのに泳動が進みすぎる場合には、TAEバッファーの劣化が考えられる。1回ずつ捨てる必要はないが、状態を⾒ながら数回ごとに新しいものに変える。

・バンドがぼんやりする→DCodeの⼿前側のゲルのみを使⽤する（奥側にはスペーサーもゲルも⼊っていない
ダミープレートを設置する）。

留意・パターンがゆがむ→両端のレーンはゆがみやすいので、出来るだけ使わない。
→変性勾配が歪んでいる可能性がある。アクリルアミドの重合がゆっくり進むよう、
ガラスプレートとゲル溶液を冷やし、できれば室温を低めに設定する。

手 法 の 詳 細・染⾊時にゲルが破れてしまう→ガラス板からゲルをはがす際、乾燥すると破れやすいので、細く絞った⽔道⽔や洗ビンなどで⽔をかけながらはがす。染⾊バットに移す際、折りたたんで持ち上げることが難しければ、多めの⽔で流すように移しても良い。

手法のポイント【留意点】（つづき）

は じ め に

4

点
そ
の
他

― 59 ―

は じ め に

5

その他
その他

手法のポイント

本マニュアルを⽤いた解析に関するご質問、ご相談につきましては、株式会社
リーゾまでご連絡ください。⽣物多様性指数算出⽤のファイルもご提供可能です。
解析機器をお持ちでないお客様には、解析代⾏サービスも提供しております。詳
しくは、リーゾのウェブサイトをご覧ください。

手 法 の 詳 細株式会社リーゾ
茨城県つくば市天久保2-9-2-B201
Tel：029-852-9351 FAX:020-4623-5611
Mail：info@rizo.co.jp

留
意
点
そ
の
他

株式会社リーゾウェブサイト http://www.rizo.co.jp/

2016/2/9― 60 ―