103●新規非多孔性イオン交換カラム TSK−GEL STAT
シリーズの特性とその応用
バイオサイエンス事業部 セパレーションメディア製造部 セパレーションセンター
東研 バイオサイエンス事業部 技術部 遺伝子Ｇ
バイオサイエンス事業部 セパレーションメディア製造部 セパレーションセンター

村中 和昭
岩枝 俊直
中西睦
森山 弘之

分析から、分析時間に数十分を要するタンパク質の電1．はじめに荷異性体の分離まで、幅広く対応可能なカラムシリー

近年、バイオテクノロジーの発展に伴い、タンパクズとなっている。また充填剤基材の改良を行うことで、質、核酸など生体構成物質の分析、分取には種々の方当社従来非多孔性型充填剤では分析困難であった低分法が提案されている。その中でも液体クロマトグラフ

子量試料の分析にも対応可能なカラムである。またカィーを用いた分析、分取手法は古くから行われている

ラムサイズ、および充填剤粒子径は、生体試料分析に手法であるが、対象化合物の広さ、自動化の容易さ、用いられる装置の耐圧性を考慮し、さらに低温で使用操作の容易さ、そして実用的な感度と迅速性などの面される可能性も合わせ、一般的な測定流速においてにおいて、液体クロマトグラフィーに変わる分析、分10MPaを越えない様に設計されている。核酸分析用

取手法は提案されておらず、今後も発展していくもの

カラムについては、タンパク質分析とは用いられる装と考えられる。

置や測定条件（温度）が異なることから、分離を優先

当社ではバイオテクノロジーに用いられる液体クロしたカラム設計となっている。

マトグラフィー装置、および充填カラムの開発を行っ

当社はすでに高分離分析に適した非多孔性充てん剤てきたが、近年ハイスループット分析、高分離能分析カラムとしてTSK−GEL NPRシリーズを有している。

に対する要求が高まり、高い試料吸着容量、および高NPRシリーズは発売当時、飛躍的に高い分離性能を短分離能を有するカラム充填剤の開発に着手し、アニオ時間で得られるカラムであったが、粒子径が小さいン、およびカチオン交換型のイオン交換カラムである（2.5um）ため操作圧が高くなりやすく、また低分子STATシリーズを上市した。本報告ではSTATシリーズ

量試料溶出パターンが広がりやすい欠点を有していの特性とその応用について紹介する。

た。STATシリーズでは充填剤基材製法を見直し、また新規表面修飾法を採用することにより、充填剤粒子径がNPRシリーズより大きいにもかかわらず、高い分2．TSK−GEL STATシリーズの特徴

離性能を維持し、かつ、NPRシリーズでは困難であっSTATシリーズには、表１に示すように高速分析用た低分子試料分析にも対応するカラムとなっている。

カラム、高分離分析用カラム、およびDNA等の核酸

一般的に非多孔性充填剤は、多孔性粒子の様に粒子分析に適したカラムを揃え、分析時間１分以内の高速細孔が実質的に存在しないため、試料の粒子内拡散が

表１

TSK−GEL STATシリーズ仕様

カラムサイズ
充てん剤基材
粒子径
イオン交換基TSKgel Q−STAT
3.0mmI.D.×3.5cm 4.6mmI.D.×10cm
親水性ビニルポリマー
10μm
7μm
四級アミン

TSKgel DNA−STAT
4.6mmI.D.×10cm
親水性ビニルポリマー
5μm
四級アミン

カラムサイズ
充てん剤基材
粒子径
イオン交換基TSKgel SP−STAT
3.0mmI.D.×3.5cm 4.6mmI.D.×10cm
親水性ビニルポリマー
10μm7μm
スルフォプロピル

TSKgel CM−STAT
3.0mmI.D.×3.5cm 4.6mmI.D.×10cm
親水性ビニルポリマー
10μm
7μm
カルボキシメチル（ 103 ）104

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

無いことから、高い分離能を示すことが知られている。

12

しかし、多孔質充填剤と比較して充填剤表面積が極端10に小さくなるために、試料吸着容量が大きく低下する操作圧［MPa］

ことが知られている。試料吸着容量が低いと、大過剰の主成分中の微量不純物の分析などにおいて、微量成分の検出感度不足や、分離性能の低下などの問題も引き起こす可能性がある。STATシリーズでは、充填剤864の表面修飾法の改良により、NPRシリーズと比較して、CM−STATSP−STAT2

粒子径が大きく表面積がさらに小さくなるにもかかわQ−STAT
0

らず、飛躍的に高い試料吸着容量を示す充填剤とした0（図１）。STATシリーズの吸着容量は、7umの高分離分析用カラムにおいて多孔質基材の1／3程度の吸着容量（体積当たり）を有していることから、マイクロ分取にも十分に使用することが可能である。

102030カラム温度［℃］
Conditions
Column Size 4.6mmI.D.×10cm
Particle size 7μm（CM−STAT，SP−STAT）
Mobile Phas 10mmol／L MES buffer（pH 6.2）
20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
（Q−STAT）

図２

TSK−GEL STATシリーズのカラム温度と操作圧

吸着容量［BSA g／g−dry gel］

50

速度の影響が存在しないことから、測定流速に対する40

カラム性能の変化が小さいことが特徴である。図３で

STATシリーズ

30

はTSKgel Q−STATを用い、カラム効率と測定流速の影響を多孔質充填剤と比較した図であり、測定流速を20早くしても、カラム性能の低下が小さいことがわかる。
10NPRシリーズ

3.300510
粒子径［μm］

図１

試料負荷量依存性

非多孔性充填剤は多孔質粒子と比較し、著しく表面15積が小さいため、試料吸着容量が小さくなる欠点を有している。当社従来型非多孔性充填剤であるNPRシリ

アニオン交換型充てん剤STATシリーズとNPRシリーズのタンパク質吸着容量ーズは粒子径2.5umと小さいため、多孔性充填剤で一般的である10um充てん剤より、粒子径効果により粒3．TSK−GEL STATシリーズの基本特性
3.11.4

操作圧

1.2

内径4.6mm×長さ10cmの分析カラムにおける、カラ1.0

ム温度と操作圧の関係を図２に示した。
STATシリーズは使用上限操作圧を10MPaとしており、室温においては1.5mL／min程度の流速で使用可能である。また熱によるタンパク質の変性を回避するた

理論段高さ

TSK−GEL STATシリーズ粒子径7um、カラムサイズ

0.80.60.4

め、低温で測定されるケースもあるが、STATシリー

0.2

ズでは低温においても1.0mL／minでの使用が可能であ0.03.2

Q−STAT0.0

り、低温での分析でも、スループットの低下を極力抑えたカラム仕様となっている。

多孔質充填材（10um）

0.5

1.0

1.5

2.0

流速［mL／min］
Conditions
Column Size 4.6mmI.D.×10cm
Eluent20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
SampleCytidine−monophosphate（CMP）

流速依存性

TSK−GEL STATシリーズは非多孔性充填剤である
ため、多孔性粒子で観測される粒子内部での試料拡散（ 104 ）

図３

多孔質充てん剤とSTATシリーズにおける流速と理論段高さの関係

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）105

子外表面積が16倍大きいが、細孔が実質的に存在しないため、吸着容量は一般的な10um多孔性粒子と比較

TSKgel DEAE−NPRし1／10 程度となっている。TSK−GEL STATシリーズ
STATシリーズ
5μm

は充填剤粒子径としてNPRシリーズより大きい粒子設定となっており、NPRよりも粒子外表面積が小さくなるため吸着容量ではより不利となるが、充填剤の表面7μm

修飾法を改良することにより、高い試料吸着容量を示す充填剤とした。図４は、同一サイズカラムに充てん10μmしたTSK−GEL STATシリーズ各粒子径充てん剤とNPRシリーズの試料負荷量依存性を比較した。NPRカ0

ラムに比べ試料負荷依存性に優れることがわかる。

46810

溶出時間［min］
Conditions
Column Size 4.6mmI.D.×3.5cm
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：0.5mol／L NaCl in A（pH 8.5）
Gradient
B 0 to 100％ 10min Linear
1.0mL／minFlow−rate
SampleConalbumin, Ovalbumin, Trypsin Inhibitor

1.2
分離能変化率［0.6ug負荷時＝1］21.00.8

図５

Q−STAT（10um）
Q−STAT（7um）
DNA−STAT（5um）
DEAE−NPR

0.60.4

アニオン交換カラムによる各粒子径充てん剤の分離比較

4．TSK−GEL STATシリーズの応用例

0.2

4.10.001

10Q−STATQ−STATカラムによるヌクレオチド分離クロマトグ

100

試料負荷量［ug］

ラムを図６に示す。アデニン（A）、シトシン（C）、

Conditions
Column Size 4.6mmI.D.×3.5cm
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：0.5mol／L NaCl in A（pH 8.5）
GradientB 0 to 100％ 10min Linear
1.0mL／minFlow−rate
SampleConalbumin, Ovalbumin, Trypsin Inhibitor（each protein 0.6〜25ug）

グアニン（G）、チミン（T）およびウラシル（U）の各リン酸エステルがすべて分離している。またデオキシ体を分離することも可能である（図７）。
図８には、タンパク質消化物の標準品として市販さいる。STATシリーズは、NPRシリーズの有する操作U圧が高くなる点、また試料中の微細不溶物などにより詰まり易いなどの欠点を解決するため、粒子径設定を2d−GTP

子径が小さいほど分離性能は高くなることが知られてATP

分離性能は、一般的に充填剤の粒子径と相関し、粒TTP
2d−UTP

C,A

2d−GDP
2d−CTP

分離性能

2d−UDP

3.4

2d−CDP
2d−ADP
TDP

分離能の試料負荷量依存性（Conalbumin−Ovalbumin）

TMP
2d−UMP2d−GMP

図４2d−AMP
2d−CMP

れているBSA Digestの分離比較を示す。STATシリー

G２〜４倍に大きくした。このため一般的には粒子径2.5umの非多孔性充填剤を用いたNPRシリーズと比較すると分離性能が1.5〜２倍悪化する。同じサイズの0カラムを用いてタンパク質の分離を比較した図５では102030Elution time［min］

充てん剤の製法、および表面修飾法を見直して開発さConditions
ColumnTSKgel Q−STAT（4.6mmI.D.×10cm）
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：0.5mol／L NaCl in A（pH 8.5）
Gradient B 0 to 50％ 60min Linear
Flow−rate 1.5mL／min

れたSTATカラムは分離性能の低下がほとんど見られていないことがわかる。

図６（ 105 ）TSKgel Q−STATカラムによるヌクレオチドの一斉分析106

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

は分子量が多いほど（リン酸基が多いほど）保持力が5 −GTP
2d−5 −GTP強くなり、遅く溶出されるが、核酸の配列の影響も大2d−5 −GMPきく影響する。STATシリーズでは、NPRシリーズで2d−5 −GDP
5 −GMP困難であった、後半に溶出される高分子量域での分離

5 −GDPが改善されており、電気泳動法により確認されるバンドのすべてが分離されている。
STATシリーズは、ヌクレオシドの溶出パターンがG

3.5−Cyclic GMP良好であり、吸着容量も大きいことからPCR産物の分取にも有効なカラムである。PCRには原材料として数種のヌクレオシドが用いられるが、これら原材料と生0510

15成物の分離を短時間に行うことが可能である（図10）。

20Elution time［min］

図７Conditions
ColumnTSKgel Q−STAT（4.6mmI.D.×10cm）
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：0.5mol／L NaCl in A（pH 8.5）
Gradient
B 0 to 50％ 30min Linear
Flow−rate 1.5mL／min

4.3

TSKgel Q−STATカラムによるグアニジンヌクレオチド類の一斉分析る。電荷異性体の分離分析には、カチオン交換カラム

SP−STAT／CM−STAT

抗体は近年医薬品に用いられる様になっており、その品質管理法の一つとして当社SW系カラムを用いたゲルろ過分析と共に、電荷異性体の管理も行われていを用いたクロマトグラフィーによる分析用いられている。図11に抗体の電荷異性体を分離したクロマトグ
ラムを示す。STATシリーズでは、試料の有するわずかな電荷の違いにより分離することが可能である。
また、タンパク質医薬品の生体内での残存期間を長TSKgel DEAE−NPR

くするために、タンパク質にポリエチレングリコール（PEG）を結合した医薬品が近年実際に市販されるよPeak No.32

うになってきている。タンパク質にPEGを導入する反応では、タンパク質にはPEG化試薬が結合できるサイ

TSKgel Q−STAT

トが多く存在するために、PEG化導入量や結合サイト

Peak No.42の異なる種々の異性体が同時に出来てしまう。図12、0246810

Elution time［min］
Conditions
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：0.5M NaCl in A（pH 8.5）
Gradient B 0 to B 100％ 30min Linear
Flow−rate 1.5mL／min
Sample
BSA digest STD（Waters co.）, 10uL inject

図８

TSKgel DNA−NPR
X軸 5分シフト

BSA消化物によるアニオン交換カラムの分離比較
TSKgel DNA−STAT

ズは、NPRシリーズより保持力が強いため素通り成分が少なく、確認できるピーク数が大幅に増加している。
515
Elution time［min］

4.225161820Elution time［min］

DNA−STAT

核酸は一般的に分子量差を利用した電気泳動法により分離、分析されている。この際用いられる分子量マーカー（ここでは1kb DNA Ladder）をアニオン交換

Conditions
Eluent
A：20mmol／L Tris−HCl buffer（pH 8.5）
B：20mmol／L Tris−HCl ＋ 1.0mol／L NaCl（pH 8.5）
Gradient
B 70 to 100％ 24min Linear
Flow Rate 0.5mL／min
Sample1kb DNA Ladder, 3uL inject

クロマトグラフィーにより分離を行った（図９）。ア
ニオン交換クロマトグラフィーにおいても、基本的に（ 106 ）

図９

DNA Ladderによるアニオン交換カラムの分離比較

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）107

Native Lysozyme
Amplified DNA

Mono PEG

PolymerasedNTP
Di PEG

Primer

0.00.5

1.0Tri PEG

1.5

2.0

0.0

0.5
1.0
Elution time［min］

Elution time［min］

Conditions
ColumnSP−STAT（3.0mmI.D.×3.5cm）
Eluent
A：20mM Sodium acetate buffer（pH 5.0）
B：0.5M NaCl in A（pH 5.0）
Gradient
B 0 to 100％ 1.5min Linear
Flow−rate 2.0mL／min

Conditions
ColumnTSKgel Q−STAT（3.0mmI.D.×3.5cm）
Eluent
A：20mmol／L Trisl−HCl buffer（pH 8.5）
B：1.0mol／L NaCl in A（pH 8.5）
Gradient
B 0 to 100％ 1.5min Linear
Flow Rate 2.0mL／min
SamplePCR Products

図101.5

図12 ハイスループットカチオン交換STATシリーズカラムによる、タンパク質PEG化反応の追跡クロマトグラム

Q−STATハイスループットカラムによるPCR生成物の迅速分離

100
SP−STAT90

Tri−PEGDi−PEG
Mono−PEG
NativePeak Area［％］80

CM−STAT

706050403020100051015202503020406080

100

Reaction time［min］

Elution time［min］
Conditions
ColumnSP−STAT, CM−STAT（4.6mmI.D.×10cm）
Eluent
A：20mM MES（pH 6.0）
B：0.1M NaCl in A（pH 6.5）
Gradient
B 20 to 50％ 30min Linear
Flow−rate 1.0mL／min
SampleMAb 1g／L 20uL inject

図13 ハイスループットカチオン交換STATシリーズカラム
による、タンパク質PEG化反応の追跡例

5．おわりに
図11 カチオン交換STATシリーズカラムによる、モノクローナル抗体の精密分析

今回、われわれの開発したイオン交換カラムSTAT
シリーズは、充てん基材および表面修飾法の改良によおよび図13に、タンパク質のPEG化反応をハイスルり低分子量試料からタンパク質、核酸等の高分子量試ープット分析カラムで追跡したクロマトグラムと反応料まで幅広く対応可能であることを確認した。STAT割合をそれぞれ示した。最短では２分間隔での分析もシリーズは非多孔性充てん剤であるため、分離能に優可能であり、PEG化の様な速度の速い反応をクロマトれ且つ、表面修飾法の改良により吸着容量が改善され、グラフィーにより追跡することも可能である。

マイクロ分取にも対応可能となった。さらに用途に適した粒子径設定を行ったことで、操作圧においても汎用性のあるカラムであることから、今後の応用範囲の拡大が期待される。
（ 107 ）