MALDI − TOF ／ MS による 1 細胞のリン脂質解析
榎本
伊 集 院谷本

愛智典

子＊ 1子＊ 1之＊ 1Single-Cell Analysis of Phospholipids by Matrix Asisted Laser Desorption
Ionization / Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF/MS)
Aiko ENOMOTO
Tomoko IJUINNoriyuki TANIMOTO

It is thought that cancer cells have composition and material property characteristics different from those ofnormal cells. However, since each cancer cell has different properties, characteristic analysis of single cells is aneffective method of assessing malignancy of cancer cells.
By capturing cells using Dielectrophoresis microwell array technology developed by Tosoh and adding a matrix
agent to the plate, we detected the phospholipid of a single cell in a micropore by MALDI-TOF/MS analysis.
Measuring phospholipids of model cancer cells with different malignancies by this method suggests that thecomposition ratio of phosphatidylinositol, which is a kind of phospholipid, varies depending on malignancy.

リン脂質測定を行った 1）。レーザー径を細胞のサイズ1．はじめにより小さくすることで、1 細胞のみのリン脂質 MS ス

がん細胞は成分組成、物性などにおいて正常細胞とペクトルを得ることは可能だが、細胞が多数連なった異なる特徴を有すると考えられている。しかし、がん組織を測定する以上、複数の細胞にまたがってレー細胞は 1 細胞ごとに性質が異なる為、細胞単位での特ザーが照射されてしまう可能性がある。単一細胞のス性解析が、がん細胞の悪性度（転移能）評価を行う上ペクトルを確実に得るためには、個々に分離した細胞で有効である。の質量分析を行う必要がある。

細胞の成分を測定、同定する技術として、質量分析が 挙 げ ら れ る。MALDI − TOF ／ MS（Matrix AssistedLaser Desorption − Time of Flight ／ Mass Spectrometry）

2．がんとリン脂質は、マトリックスと呼ばれるイオン化促進試薬と試料

がんは遺伝子の病気である。正常な体細胞の遺伝子を混合し、レーザーを照射することでイオン化を行うが外部因子によって突然変異を起こして細胞自体の形質量分析法の一種である。試料分子を壊さないソフト態や性質を変え、無制限に増殖した結果が「がん」でなイオン化と高感度な検出が可能であり、生体分子なある。がん細胞の形質変化は細胞同士の接合や細胞骨どの測定に広く用いられる。

格、細胞膜の構造など細胞表面に表れることが知られKawashima らは、MALDI − IMS により 10 μ m 直径ている。がん細胞の細胞膜は正常の細胞と同様にリンのレーザーで組織切片を測定することで、がん細胞の脂質を主な成分としているが、その構成比は正常細胞＊1㈱東ソー分析センター

解析グループと異なり、さらにがんの悪性度によっても異なること
がヒトの肝細胞がん組織 2） や乳がん組織 1） で報告さ
89

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

れている。

晶を作製する。導電性ポリマー製の平面ディスポーザ

リン脂質は、グリセリンやセラミドにリン酸と脂肪ブルプレート（FlexiMass − DS Targets：島津製作所製）酸が結合し、さらにリン酸にアルコールがエステル結上に、モデルがん細胞とマトリックスの混合結晶を作合した構造を持つ。親水性頭部の種類によっていくつ製し、リン脂質の測定を試みた。

かのクラスに分別され、疎水性尾部の 2 本の脂肪酸の炭素数および二重結合数の違いにより、分子種は数千［1］前処理種になる。細胞膜は細胞と外環境を隔てるために両親細胞表面のリン脂質を検出するためには、MALDI媒性のリン脂質を主要成分として構成されており、細− TOF ／ MS 測定用サンプルプレート（FlexiMass − DS胞における数々の調節反応に関与していることが知らTargets：島津製作所製）に対象となる細胞とマトリッれている。リン脂質の機能として、細胞形態変化の誘クスの混合物を載せる必要がある。細胞の調製には一導や細胞増殖シグナルの促進、アクチン細胞骨格系を般的にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）等の等張液を使再構築するセカンドメッセンジャーの役割などが挙げ用することが多いが、PBS で懸濁した細胞をサンプルられる。

プレート上に滴下し、乾燥させると塩が析出するため、がんとリン脂質の関係については多くの報告がある。

良好なスペクトルが得られない可能性が高い。多量のリン脂質の一種であるホスファチジルセリン（Fig. １

塩はしばしば目的成分のイオン化を妨げるため、サンa）はがん細胞の増殖に関わるシグナル経路を制御すプルの脱塩が必須となる。そこで、細胞懸濁液をマトることや、ホスファチジルイノシトール（Fig. １b）リックスで洗浄後にサンプルプレート上に載せる方のリン酸化は細胞増殖を促進する遺伝子の活性化に関法 3）を検討した。

与することが知られている。リン脂質の解析はがんのサンプルとして肺がん細胞株である PC − 9（非小細メカニズムを知るうえで非常に重要であり、がん細胞胞肺がん）、マトリックスは 9 −アミノアクリジン（9の増殖を抑制する新規創薬ターゲットの探索において− AA）を用いて試料作製を行った。サンプルプレート細胞のリン脂質解析手法の確立は大きな意義がある。にエタノールで溶解した 9 − AA を滴下、乾燥後に 9 −AA 水溶液で洗浄及び懸濁した細胞サンプルを 10 細胞

3．平面プレートを用いた細胞リン脂質測定／ spot となるように滴下し、乾燥した。測定直前にエタノールを滴下し、再結晶化後に測定を行った。

MALDI − TOF ／ MS による測定では、通常、マトリックスと呼ばれるイオン化促進剤と試料を溶媒に溶解［2］MALDI − TOF ／ MS 測定

し、混液を滴下後、室温風乾により結晶を作製する手MALDI − TOF ／ MS の 測 定 方 法 の 検 討 を 行 っ た。

法（Dried − Droplet 法）によって、測定試料の前処理

MALDI − TOF ／ MS は MALDI − 7090（島津製作所製）を行う。測定用プレートには導電性材料が用いられ、を使用し、固体 UV レーザー（355nm）で測定を実施

通常は金属製または導電性ポリマー製の平面プレートした。測定モードは negative モード（陰イオン検出モー上に、Dried − Droplet 法によりマトリックス－試料結ド）、レーザー径は 100 μ m、レーザー強度は 70 ～ 90とした。直径 1mm 以上あるマトリックス結晶中から、（a）

直径 10 ～ 20 μ m 程度の 1 細胞を見つけるのは、装ORROOO

PNH2O

COO(A)

O（b）
R
R

OO

Fig.１

置付属の CCD カメラの倍率、分解能では困難である（Fig. ２）。そこで、レーザーを少しずつ走査しながらOO

90

OH

O(B)

-OO
POOH

O
HOOH
OH
OH

Structure of Phospholipids,（a）Phosphatidylserine,（b）Phosphatidylinositol

Fig.２ (A)Digital microscope image of Matrix- cells cocrystal
on flat plate(×50), (B)CCD camera image of Cocrystal

東ソー研究・技術報告第 62 巻（2018）

スペクトルを確認し、リン脂質由来と推定されるピーマトリックスを加えて室温風乾した。デジタルマイク

クを検出次第、照射を停止する手法を取った。

ロスコープで確認したところ、いくつかの細孔内に細Fig. ３に PC − 9 細胞の MALDI − TOF ／ MS スペクト胞が捕捉されていることが確認できた。

ルを示す。m ／ z = 835、861、885 周辺に検出されたイオンは、質量からホスファチジルイノシトール（PI）［2］MALDI − TOF ／ MS 測定由来と推定された。いずれのイオンも検出量が小さく、

MALDI − TOF ／ MS 付 属 の CCD カ メ ラ 画 像 で、 基S ／ N（シグナルノイズ比）は 1 ～ 6 程度と低感度であっ板の各微細孔が視認出来た（Fig. ４）。各微細孔の直た。原因として、結晶中の細胞位置が分からないため、径が 30 μ m、微細孔の間隔が 20 μ m であることから、レーザーが細胞の一部分にしか当たらず、イオン化量微細孔内全体をレーザー照射でき、かつ隣接する微細の減少、すなわち感度の低下を招いていたことが推測

孔が照射範囲内に入らないよう、レーザー径を 50 μされる。

m に設定した。レーザーの照射位置を細孔に合わせて調整し、スペクトルを取得した。Fig. ５に MALDI− TOF ／ MS スペクトルを示す。m ／ z ＝ 835（16：0 ／4．微細孔基板を用いたリン脂質測定18：1）、861（18：0 ／ 18：2）、885（18：0 ／ 20：4）に

平面プレート上の結晶中の細胞探索は困難であると考え、東ソー㈱が開発した CTC（Circulate Tumor4）PI 由来イオンが観測された。
平面プレートを用いた測定時と比較して、微細孔基を使用し、捕捉板で測定したスペクトルの方が、S ／ N ＝ 7 ～ 55 と改したがん細胞を MALDI − TOF ／ MS により測定する手善しており、感度が高くなる傾向が見られた。原因と法を検討した。

して、微細孔を CCD カメラで視認できるようになっCells）捕捉用の微細孔アレイ基板たことで、細胞全体をレーザー照射範囲内に収められるようになったことが考えられる。その他に、レーザー［1］前処理細胞を一つずつ測定するために、ライフサイエンス

径が小さくなったことによるノイズの低減なども考え研究所で開発した微細孔アレイ基板を用いた試料作製られる。平面プレートで測定した際には、結晶中の細を検討した。微細孔アレイ基板上にマンニトール水溶胞にレーザーが照射される確率を少しでも大きくする液で懸濁した細胞を導入し、自然に微細孔内に細胞がために、レーザー径を 100 μ m として測定を行ってい沈殿したのを確認した後、マンニトール水溶液を除去してマトリックスを導入後に乾燥させた。しかし、デジタルマイクロスコープ（キーエンス製、VHX − 900）

(A)

(B)

で撮影を行ったところ、沈殿していた細胞がマトリックスの結晶化とともに微細孔外に出てしまっており、測定が難しいことが分かった。
そこで、微細孔アレイ基板上にマンニトール水溶液で懸濁した細胞を導入後、誘電泳動により微細孔内に細胞を捕捉した 4）。ポリ− L −リジンによって細胞を基Fig.４

板に固定した後、マトリックス溶液で洗浄し、さらに835100885100861

80％ Intensity％ Intensity

80
6040200

images of micropores, (A) Digital microscope ,(B) CCD camera equipped in MALDI-TOF/MS

60
40200820

840

860

880

900

Fig.３

MALDI-TOF/MS spectra of single malignant
cell on flat plate

820

840

860

880

900

m/zm/zFig.５

MALDI-TOF/MS spectrum of single cancer
cell in micropore

91

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

た。微細孔を用いた測定では、CCD カメラで細孔がMALDI − TOF ／ MS スペクトルを Fig. ６に示す。PC確認できるため、おおよその細胞位置が推定できる。

− 9、PC − 14 それぞれについて、複数の微細孔で測定

そのため、レーザー径を 50 μ m に絞ることが可能とを行った。PC − 9 では m ／ z ＝ 885（18:0 ／ 20:4）の PIなり、細胞以外の夾雑物のイオン化が抑えられた可能が高い強度で検出されているのに対し、PC − 14 では性がある。

m ／ z ＝ 863（18:0 ／ 18:1）、835（16:0 ／ 18:1）の PI が高強度で検出されている。悪性度の異なるがん細胞間で、5．悪性度の異なる細胞のリン脂質組成比較
4. で確立した 1 細胞測定技術を用いて、悪性度の異なるがん細胞のリン脂質組成比較を行った。
悪性度の異なるがん細胞（非小細胞肺がん PC − 9：悪性度中、非小細胞肺がん PC−14：悪性度高）について、4.［1］の手法で試料調製した。

PI 組成比の有意な差が見られた。

6．まとめ
1 細胞のリン脂質組成を確認するため、モデルがん細胞の MALDI − TOF ／ MS 測定を行った。
Dried − Droplet 法による測定では細胞探索が困難であった。CTC 検出装置用の微細孔アレイ基板を用い、1 細胞の MALDI − TOF ／ MS 測定を実施した。その結PC−9

果、PC、PI 由来イオンの検出に成功した。従来のプレートを用いた手法と比較し、細胞探索が容易となり、感度も上昇する傾向が見られた。
本手法は、CTC 1 細胞の悪性度評価の手法として利用できる可能性がある。

7．謝

本研究は東ソー㈱ライフサイエンス研究所細胞診断

100％ Intensity

辞80

グループおよび調査・企画

60

微細孔基板の提供を受けて実施致しました。ご協力頂

40いた方々に、感謝を申し上げます。

200820

840

860
m/z

880

グループの技術的指導、

900

参考文献

PC−14１）M. Kawashima, N. Iwamoto, N. Kawaguchi − Sakita,
M. Sugimoto, T. Ueno, Y. Mikami, K. Terasawa,
TA. Sato, K. Tanaka, K. Shimizu, M. Toi, Cancer
Sci. 2013 Oct;104（10）:1372 − 9.
２）Y. Morita, T. Sakaguchi, K. Ikegami , N. Goto− Inoue, T. Hayasaka, VT. Hang, H. Tanaka, T.
Harada, Y. Shibasaki, A. Suzuki, K. Fukumoto,K. Inaba, M. Murakami, M. Setou, H. Konno, JHepatol. 2013 Aug;59（2）:292 − 9％ Intensity

10080３）X. Zhang, M. Scalf, TW. Berggren, MS. Westphall,

60

LM.Smith, J Am Soc Mass Spectrom.Apr;17（4）:490400Fig.６92− 499,（2006）.

20820

840

860m/z880

900

MALDI-TOF/MS spectra of malignant cell,PC-9(low-grade) and PC-14(high-grade)４）最上聡史、森本篤史、飯嶋和樹、秋山泰之、片山晃治、二見達、東ソー研究・技術報告、58（2014）