11

酵素を用いたL-2-ナフチルアラニンの合成
半
大
河
柿
石

澤
江
久
野
谷
黒

正
賢
和
敬

敏
剛
治
久
均
彦

Chemo−enzymatic Synthesis of L-2-Naphthylalanine
Satoshi HANZAWA
Seigo OE
Kenji TOKUHISA
Kazuhisa KAWANO
Hitoshi KAKIDANI
Takahiko ISHIGURO

L-2-Naphthylalanine (Nal) was synthesized by the enzymatic transamination between 2-naphthylpyruvate (NPA)and L-glutamate (Glu) using a hyperthermostable aminotransferase (MsAT) from the hyperthermophile

Thermococcus profundus. The equilibrium of this exchange reaction considerably shifted to the Nal side due to
its low solubility. Hence, the amino acid separated out as the reaction proceeded. Using this methodology, theproduct of optical purity above 99％ee was obtained in 93％ yield from 180 mmol/L of NPA and 360 mmol/Lof Glu. MsAT exhibited high activity toward a wide range of α-amino acids and 2-keto acids, thus providing
a new convenient route to a variety of unnatural amino acids.

1．緒

酵素を触媒として用いることを生化学的方法と呼ぶ

言が、有機化学的に合成したアキラルな前駆体に酵素をL-2-ナフチルアラニン（Nal、Fig.１）の様な非天然型アミノ酸をペプチド医薬やペプチドミミック構造の作用させることで目的物が非常に高い不斉収率で得られる。

医薬の合成に利用すると、天然のペプチドでは得られ今回我々が注目したNalは偏頭痛薬FK-888、喘息ない特性を付与することができる。薬物受容体構造の薬／偏頭痛薬NKT-343、S-18523、MEN-10930及びプ研究やコンビナトリアルケミストリーの進歩とあいま

ロテアーゼ阻害剤SA-7060などの部分構造として利用って今後こうした構造の医薬は増加していき、それにが試みられている非天然型アミノ酸である（Fig.１）4-5）。

伴って非天然型アミノ酸の需要も増加していくと推測

Nalはこれらの他にも様々なペプチド性化合物の構成される。天然に存在しないアミノ酸は発酵法では製造ユニットとして利用が試みられている。Nalはこのよできないため、これらは有機合成法で製造されるが、うに多様な医薬品の合成原料として利用されているに幾つかの非天然型アミノ酸の場合は有機合成法と生化も関わらず、効率よく不斉合成する方法が確立されて学的方法を組み合わせて生産されている 。ここではいなかった。そこで我々はNalの効率の良い不斉合成

1-3）（ 11 ）12

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

酸など調味料や飼料用に大量生産されており安価に入手できる天然型アミノ酸を副原料として、簡単なプロ
O
OH

H2N

O

N

セスで非天然型アミノ酸を得ることができ、しかも目

N

N
H

N

O
L-2-Naphthylalanine

的物はほぼ100％eeの光学純度で得られる。そのためO

OH
FK-888 Fujisawa

以前から大腸菌などのATを用いて非天然型アミノ酸の合成が試みられてきた8-9）。T. profundusのATは従来

O

H
N

O
HN

N

N N
NO2 H

N
H

NKT-343

NovartisO

OのATに比べて耐熱性が高いのはもちろんのこと、よO

り広範な天然型アミノ酸に作用するという特徴が報告

N

N
H

O

されていた7）。このことから本酵素は非天然型アミノ酸の合成のための汎用的な触媒になるのではないかと

MEN-10930 Menarini

考えられた。なお、本酵素は発見者の小林哲夫博士
O（理化学研究所、現名古屋大）によってMsAT（Multi

O
N
H

N
N

N
N

O

OH

OH
N
N N
N

Fig.１

S-18523 Servier

substrate aminotransferase）と命名されていたので、

O

O

O

SA-7060

OHN
H

本稿でも以降はMsATと称する。我々はMsATを用い

OてNalを効率よく合成する方法を開発し8-9）、また、この方法の適用の範囲を知るため種々の非天然型アミノ

Santen酸に対するMsATの基質特異性を解析した。本稿はそL-2-Naphthylalanine (Nal) and peptidomimetic
investigational drugs.

の結果を報告する。

2．材料及び方法法の確立を目指して検討を開始した。また非天然型ア〔1〕酵素及びその調製方法

ミノ酸の開発中医薬への利用状況を調査すると、Nalを初めとしてL-チエニルアラニン、L-ビフェニルアラ

MsATの遺伝子は遺伝子配列データーベースである

ニン、L-ターシャリロイシン等の疎水性アミノ酸の利

GenBank[http://www.ncbi.nlm.nih.gov]に受入番号用例が多く見出された。Nalを題材に不斉合成方法を

AB027131として公開されている。この遺伝子を小林研究することで、これら非天然型アミノ酸を合成する

哲夫博士（名古屋大学）より譲り受け、酵素生産性をための基礎技術を構築できると考えられた。

向上させる遺伝子操作を行った後に大腸菌HB101株にところで、近年になって100℃付近の高温を好んで形質導入した。この組換え体微生物をTG培地（1L中生育する超好熱菌と呼ばれる微生物群が知られるようの培地組成；Tripticase peptone（BBL, USA）50g、になった。こうした微生物の持つ酵素は高い生育温度

glycerol 35g、Na2HPO4 7g、KH2PO4 3g、NH4Cl 1g、に適応した結果、様々な物理・化学的ストレスへも抵

NaCl 0.5g、MgSO 4・7H 2O 0.74g、FeSO 4・7H 2O

抗性が高くなっており、産業上の有用性が期待されて0.073g、CoCl2・2H2O 0.044g）に植菌して37℃で51時

い る 6 ）。 こ れ ら 超 好 熱 菌 の 酵 素 の う ち 、 我 々 は間、通気攪拌培養した。培養終了後、6,000xg、30分

Thermococcus profundusのアミノトランスフェラー間の遠心分離によって大腸菌菌体を集め、0.1M Tris-

ゼ（AT）に着目した 。ATはScheme１に示す2-アミ

HCl緩衝液（pH7.5）にけん濁して超音波破砕処理をノ酸と2-ケト酸の間での立体選択的なアミノ基交換反行った。細胞破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた応を触媒する酵素である。ATを用いるとグルタミン

上清にピリドキサール−5 −リン酸を１mMになる様

7）

O

O
MsAT, pH7, 70℃

O−

O Na

＋

NH3

O
Sodium (2-naphthyl)pyruvate(NPA)

O

O

HOOC

O−

HOOC

＋

L-2-Naphthylalanine(Nal)
O−

NH3

O

L-Glutamate(Glu)

2-Ketoglutarate(2-KG)

Scheme１（ 12 ）

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

13に加えて、70℃で30分間加熱処理した。この処理で凝クロロベンゼン1.5Lに溶解してラジカル開始剤溶液

集する不純物を再度遠心分離により除去し、得られた

1.55Lを調製し、また臭素840gをクロロベンゼン4Lに上清を0.1M Tris-HCl（pH7.5）に一晩透析した。この

溶解して臭素溶液を調製した。次いで、2-メチルナフ

溶液に等量のアセトンを加えてMsATを沈殿させ、タレン569gをクロロベンゼン2Lに溶解して水600mlを

1mM PLPを含む0.1M Tris-HCl（pH7.5）に再度溶解し加え、約80℃で攪拌しつつ、先に調製したラジカル開た。Nalの合成にはこの粗酵素溶液を用いた。その他

始剤溶液750mlを加えた。続いて臭素溶液を7.5時間かの2-アミノ酸や2-ケト酸に対する酵素活性を評価する

けて滴下し、臭素化反応を行った。臭素の滴下開始後

場合はさらに80℃で30分間の再加熱処理を行ったのち

2.5時間経過した時点及び5時間経過した時点でラジカにTSKgel DEAE-トヨパール650Mで精製し、SDS-ポ

ル開始剤を補給するため、それぞれ350ml及び450ml

リアクリルアミドゲル電気泳動的に均一であることをの同溶液を滴下漏斗を用いて1時間かけて投入した。

確認した酵素標品を用いた。

臭素溶液の滴下終了後3.5時間加熱を続けた後、反応〔2〕酵素活性の測定

液を放冷した。以上の操作は全てアルゴン雰囲気下で酵素活性は2-ナフチルピルビン酸ナトリウム（NPA）

行った。この反応液は冷却すると二層に分離した。そとグルタミン酸（Glu）を基質として1分間あたりに1の水層を除き、有機層を水1.5Lで2回、飽和食塩水

μmolのNalを生成させる酵素量を1ユニット（単位U）

1.5Lで1回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾として表した。すなわち、10mM NPA及び10mM Glu

燥して減圧下溶媒を留去すると2-（ブロモメチル）ナフを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）1mlを1.5ml容遠心

タレン74％及び2-（ジブロモメチル）ナフタレン14％

分離管（エッペンドルフ社製）にとり、70℃で5分間を含む混合物が残渣として得られた。この残渣にヘキ加熱を行い、次いで予め緩衝液で適度に希釈した酵素

サメチレンテトラミン（HMT）113g、酢酸1L及び水溶液を10μl加えて70℃で正確に5分間加熱した。加熱

1Lを加えて溶解し、攪拌しつつ6時間環流した。その終了後、反応液に1N酢酸を0.5ml添加し直ちに氷冷し後、18時間放冷し、反応液中に析出した固体を吸引ろて反応を停止させた。生成物のNalは本章第6節で述べ

過により回収した。真空乾燥機で乾燥したところ、2-る方法で定量した。

ナフトアルデヒド524gが純度97％の固形物として得〔3〕NPAの有機合成られた。2-メチルナフタレンからの収率は83.7％だった。

NPAは2-メチルナフタレンを出発原料としてメチル基の臭素化を経て2-ナフトアルデヒドを合成し（2）5（2-ナフチリデン）
ヒダントインの合成（Scheme２） 、ついでそれとヒダントインの縮合で2-ナフトアルデヒド312g（2mol）にヒダントイン得られる5-ナフチリデンヒダントインをNaOHで加水

300g、エタノールアミン122g、及び純水1.6Lを加えて分解することにより得た（Scheme3）11-12）。詳細を以アルゴン雰囲気下、100℃で8時間加熱して5-（2-ナフチ

下に述べる。

リデン）ヒダントイン441gを得た（収率92.6％）。

（1）2-ナフトアルデヒドの合成（3）NPAの合成

10）

5-（2-ナフチリデン）ヒダントイン476g（2mmol）、減2,2 -アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）65.7gをBr2, AIBN, H2O

HMT, 50％ Acetic acid

Br

O

Reflux, 8.5 h

Scheme２

O

O

O
O

HN

NH
O

Ethanolamine, H2O
100 ℃, 8.5 h

NH
HN

Reflux, 7.5 hOScheme３（ 13 ）O Na

NaOH aq.
O

14

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

圧下超音波処理して脱気した水6L、及びNaOH240gをた。次いでエタノール35μl及びトリエチルアミン5μl

10Lガラス容器に投入し、アルゴン雰囲気下加熱環流を加えて攪拌し、さらにPITCを5μl加えて室温で25し、100℃で7.5時間撹拌した。反応終了後反応液を熱〜30分間静置して試料中のアミノ酸をPITC化した。

時濾過し、氷酢酸120gを添加した後、4℃で終夜放置

PITC化後、溶媒及び過剰のPITCを減圧デシケーター

した。析出物をろ取した後、100mlの冷水で2回、中で1.5〜2時間吸引して減圧除去し、PTC-Gluを100mlのエーテルで2回、さらに2Lのアセトンで洗浄

HPLCで定量した。HPLCは本章第6節の条件に準じた。

した。30℃で恒量に達するまで真空乾燥を行い、目的

また、一部の実験ではJ.K.International社製グルタミ物であるNPAを得た。

ン酸定量キット（商品名F-Kit）を用いて定量した。

〔4〕溶解度の測定〔8〕2-KGの定量

NalまたはNPAを純水にけん濁し、所定の温度で302-KGはo-フェニレンジアミンを用いてキノキサリン

分間攪拌した。この際、Nal又はNPAが溶解しきらず誘導体としてHPLCで定量した 14）。試薬溶液としてに沈殿物をして残存する様に過剰に添加した。攪拌後、

5mM

直ちにけん濁液を吸引ろ過して上清を回収し、100倍

タノールを含む0.5N塩酸を、また内部標準溶液としに希釈してHPLCで溶解したNal及びNPAを定量した。

て1mMピルビン酸水溶液を調製した。試料溶液50μl

HPLCの条件は後述する（本章第6節）。

に内部標準溶液50μl及び試薬溶液50μlを加え、密栓〔5〕Nalの酵素合成

し遮光して100℃で2.5時間反応を行った。反応後直ちグルタミン酸1ナトリウム塩1水和物7.9g（42mmol）

o-フェニレンジアミン及び0.7Mメルカプトエに氷水で冷却し、HPLCで生成物を定量した。HPLC

を純水85mlに溶解し、70℃とした。この溶液に5Nは本章第6節の条件に準じた。

NaOHを滴下してpH8付近としたのち、原料のNPA5g〔9〕光学純度の測定（21mmol）を投入して約5分間撹拌して溶解し、酵素

Nalの光学純度はTSKgel Enantio Llカラムを用いた200Uを投入した。反応の追跡のため、経時的に反応HPLCで測定した。溶離液には1mM硫酸銅水溶液を用液を分取しNPAとGluの消費量及びNalと2-ケトグルタ

いた。溶離液の流速は1.0mlとし、検出は254nmで行

ル酸（2-KG）の生成量を定量した。NPA及びNalの定った。標準物質にはSigma社製のL体、D体及びラセ

量は本章第5節に述べる方法で、Gluは本章第6節で述ミ体のNalを使用した。

べる方法で、また2-KGは本章第7節に述べる方法で定〔10〕各種2-ケト酸（ナトリウム塩）の有機合成

量した。なお、本反応液はスラリーであるため攪拌し

MsATの基質特異性を解析するためFig.２に示す2-

つつ採取を行った。反応が停止した後、溶液を室温まケト酸を合成した。これらは対応するL-アミノ酸が開で冷却して生成した沈殿物をろ集した。この粗生成物

発中医薬の部分構造として利用されているものであを1N塩酸に溶解して不溶物をろ過して除去し、次いる。合成はそれぞれに対応する市販のアルデヒドを出で5N NaOH水溶液を徐々に加えてpH2.0として室温で発原料として、本章第3節に述べた方法に準じて行っ

中和晶析を行った。生成物の光学純度は得られた結晶

た。なお、4-チアゾリルピルビン酸の原料である4-チを1N塩酸に溶解した後、本章第9節に述べる方法で測

アゾリルアルデヒドは市販品としての入手が困難だっ定した。

たため4-メチルチアゾールを出発原料として合成し〔6〕Nal及びNPAの定量た。すなわち、四塩化炭素中、N-ブロモサクシンイミ

Nal及 び NPAは TSKgel ODS-80TMカ ラ ム （ Φド、酢酸及び2,2 -アゾビスイソブチロニトリルの存在

4.5mm×15cm）によるHPLCで定量した。溶離液には下、アルゴン雰囲気下で4-メチルチアゾールのメチル

0.14M酢酸ナトリウム−0.5％トリエチルアミン緩衝液

基をブロモ化し、次いでアルゴン雰囲気下、10％硫酸（pH6.35）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で水溶液中で加熱環流することにより、4-チアゾリルア

分離を行った。検出は254nmで行い、流速はルデヒドを得た。
トリメチルピルビン酸は30g（0.3mol）のtert-ブチ

0.8ml/minとした。
〔7〕Gluの定量

ルメチルケトンを出発原料とし、0.6molのKMnO 4をフェニルイソチオシアネート（PITC）でGluのアミ含む1.3Lの0.6M NaOH中、0℃で4時間の酸化反応によノ基を修飾しフェニルチオカルバモイル（PTC）誘導って合成した。さらに反応液をHClでpH1-2とし、エー体とした後にHPLCで定量した 。試料溶液に内部標

テル抽出により得られた油状物を−20℃で結晶化し、準として1mMのセリン水溶液を等量加えて良く混合

酵素基質として使用した。

13）し、その10μlを2ml容のガラス製サンプル管に採取し（ 14 ）

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

COO−

O

Phenylpyruvate

COO−

O

O

2-Naphthylpyruvate

15

COO−

1-Naphthylpyruvate

N
S

H3C

S
O

COO−

4-BiphenylpyruvateO

2-Thienylpyruvate

Fig.２

O

COO−

O

COO−

4-Thiazolylpyruvate

CH3
CH3
COO−

Trimethylpyruvate

3-Substituted 2-keto acids examined.

〔11〕各種2-ケト酸に対する酵素活性の測定の種類や濃度を検討したところ、前章第1項で述べた

芳香族2-ケト酸に対する活性は10mMの目的とするTG培地で本菌株を培養した場合に、培養液1mlあたり

2-ケト酸及び10mM Gluを基質としたほかは、本章第2194Uと最も高い酵素生産性が得られた。以上に述べ節にのべた酵素活性測定方法に準じて測定した。酵素

た生産菌株及び培地を用いて得た2Lの培養液より酵

反応速度は目的の2-ケト酸に対応する芳香族アミノ酸

素活性約39万Uの無細胞抽出液を調製した。この溶液（Sigma等から購入）を標準物質として、生成物をにPLPを1mM添加すると酵素活性は約1.5倍に増加しHPLCで定量して求めた。脂肪族2-ケト酸も同様に酵た。純粋なTpMsATの比活性を190U/mgとすると、素反応を行ったが、本章第7節に準じて生成物をPTC

TpMsATの生産量は培養液1Lあたり1.5gと推定され誘導体とし、本章第6節に準じた方法で定量した。

た。我々はこの結果をもって当面は十分な発現量が得られたものとした。

3．実験結果次いで70℃、30分間の加熱処理を行い、大腸菌由来〔1〕酵素の調製の蛋白質の除去を試みたところ酵素の比活性は2倍以

発現プラスミド12種類及び大腸菌7株（K12株、上に向上した。この酵素液にアセトンを加えて一度

RB791株、W3110株、MC4100株、C600株、HB101株

MsATを沈殿として回収し、再度緩衝液に溶解した。

及びKY1436株）を用いてMsAT発現量を比較し、生以降のNal合成にはこの酵素液を用いた。

産菌株として大腸菌HB101株をプラスミドpATD2

また、詳細な活性評価を行うためにはさらに精製し（市販プラスミドPUC118から誘導したもの）で形質た酵素を用いた。上記の粗酵素液を80℃で30分間加熱

転換したものを選択した。また培地の炭素源／窒素源

処理し15）、DEAE-Toyopearlを2回行うことでSDS-ポリ

Table１ Purification of MsAT
Volume（ml）

Activitya（U/ml）

Protein（mg/ml）

Specific activity（U/mg）

Total activity
（U）

Yield
（％）

Cell free extract

380

1,020

27.5

37.1

387,100100

PLP addition

380

1,460

26.2

55.9

555,900144

1st heat treatmentb

300

1,100

9.33

118

329,100

85

Acetone precipitate

110

2,400

21.9

101

263,90068

2nd heat treatmentc

1105

2,790

22.3

125

293,000

76

DEAE Toyopearl

1630

306

2.71

113

192,600

50

Ammonium sulfate

55

1,510

28.5

51

83,00021

DEAE Toyopearl

120

415

2.74

151

49,80013

a

Activity was determined by measuring the amount of L-2-Naphthylalanine formed from 10 mM 2-Naphthylpyruvateand 10 mM L-glutamate.
b
Heated at 70℃ for 30 min.
c
Heated at 80℃ for 30 min.

（ 15 ）

16

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

両者の純水に対する溶解度を比較した（F i g . ４ ）。
1

2

3

4

5

NPAの溶解度は温度に大きく依存し、70℃では常温6付近の約6倍の溶解度を示した。一方、Nalの溶解度は94K

いずれの温度でもNPAより低く、また温度依存性も67K

顕著には認められなかった。そのため、両者の溶解度の差は高温域では常温付近より広いものとなった。な43K

おNal飽和水溶液はいずれの温度でもpH7であった。
NPA飽和水溶液は常温ではpH9付近だったが、温度の30K上昇にともなってpHが低下し、70℃ではpH7となった。
〔3〕 Nal収率に対する原料濃度の影響

20K

両者の溶解特性から、高濃度のNPAを原料として
Nal合成反応を行うとNalは沈殿物として生成して反応
Fig.３

系から排除され、反応の平衡がNal生成ヘシフトする

SDS-PAGE analysis of MsAT preparations
in each purification step. Lane 1, marker
proteins ; lane 2, cell extract of recombinant
E. coli HB101 harboring plasmid pATD2 ;Lane 3, supernatant after heating at 70℃
for 30 min ; lane 4, precipitate by adding 50％(V/V) acetone ; lane 5, supernatant after
heating at 80℃ for 30 min ; lane 6,
purified MsAT after DEAE-Toyopearl
chromatography.

ことが期待された。そこでNal収率に対するNPA濃度の影響を調べた。ここではアミノ基供与体のGluはNPAと等量（モル比）とし、酵素の添加量は10,000U/lとした。70℃で一晩反応を行い、反応が平衡に達した時点でのNal収率をFig.５に示した。NPA
濃度が50mmol/l以下の場合、収率は約50％だったが、NPA濃度の上昇とともに収率も向上し、180mmol/lでアクリルアミドゲル電気泳動的に均一なMsAT標品がは85％の収率が得られた。次いで、収率をさらに向上得られた（Fig.３）。全精製工程を通しての酵素の回させるためNPAに対するGluの濃度比を検討した。

収率は13％だった（Table１）。

NPAに対してGluを二当量用いることで収率は約95％〔2〕NPA及びNalの水に対する溶解度にまで向上した（Fig.６）。

Nalは双イオン性の化合物であり、一方NPAは陰イ〔4〕pH及び温度の影響

オン性の化合物であるため、ATが高い活性を示す中NPA濃度を180mmol/lとし、二当量のGluの存在下性付近のpHでは両者の溶解度が大きく異なることがで反応を行った場合の最適pHと温度を測定した。

予想された。そこで、Nal合成条件の検討に先立ち、
100

Yield（％，mol/mol）

350

Concentration（mmol/l）

300
250
200
150
100

90

80

70

60

50
50
0
20

30

40

50

60

50

100

150

200

Substrate concentration（mmol/l）

Temperature（℃）

Fig.５
Fig.４

0

70

Solubility of NPA (◯) and Nal (●) in aqueous
solution at various temperatures. Bothcompounds were stirred in water at a given
temperature for 30 min. Undissolved materials
were removed by filtration. NPA and Nal in thefiltrate were determined by HPLC.

（ 16 ）

Effect of the initial concentrations of NPA and
Glu on the yield of Nal. Using an equimolar
ratio of NPA and Glu, the reaction was carriedout at pH 7.2 and 70℃ for 16 h, catalyzed by
100,000 U/l MsAT. The reaction mixture wasdiluted hundred fold by 0.1N NaOH to dissolve
Nal precipitate. Nal and NPA in the solution
were determined by HPLC.

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

17

70℃で反応を行うとpH8付近で反応初速度は最大だっ

100

Yield（％，mol/mol）

た（Fig.７）。次いでpH8での初速度への反応温度の影
90

響を調べると90℃で最大だった（Fig.８）。ところが、さらに16時間反応を継続した場合の収率は70℃で最も80高くなり、それ以上の温度では急激に低下した（Fig.
８）。本反応条件下でMsATは90℃で最も高い触媒活70性を示すものの、70℃を超える温度では酵素の失活も進むため反応が終点に至らないものと考えられた。

60〔5〕反応の経時変化
50

1

1.25

1.5

1.75

180mmol/lのNPAを出発原料として、二当量のGlu

2及び2000U/lのMsATの存在下、pH8.0、70℃において、
Glu/NPA（mol/mol）

アルゴン雰囲気下で反応を行った場合の反応の経時変

Effect of the initial concentrations of Glu on
the yield of Nal. The reaction was carriedout at 180 mol/l NPA and various concentrationsof Glu. Other conditions were the same as
the legend to Fig.5.

化をFig.９Aに示した。一方Fig.９Bには好気条件で反応を実施した結果を示す。Fig.９Aの条件では93％の収率が得られたが、Fig.９Bでは収率は約40％にとど

1.5

1.0

lnitial reaction rate
(μmol・min−1・m−1)

lnitial reaction rate
(μmol・min−1・ml−1)

0.8

0.6

0.4

100

80
1.0
60

40
0.5
20

0.2

6

7

8

9

0.0

10

60

Fig.８

Effect of pH on the initial reaction rate. The
reaction was carried out at 70℃ using 180
mmol/l NPA, 360 mmol/l Glu and 5000
U/l MsAT.

250

60
100
40
50

450

[Glu] (mmol/l)

80

150

20
0

0
0

100

200

300

400

350

300

250

400

100

200

80

150

60
100
40
50

20
0

0
0

100

200

300

400

Time (min)Time (min)

Fig.９

0

Effect of temperature on the initial reaction rate (●)
and Nal yield (◯). The reaction was carried out at
pH 8.0 for 10 min (●) or 16 h (◯) using 180
mmol/l NPA, 360 mmol/l Glu and 5000 U/l MsAT.

[Nal], [NPA] or [2KG] (mmol/l)

100

200

Yield (％, mol/mol)

300[Nal], [NPA] or [2KG] (mmol/l)[Glu] (mmol/l)

350

90

B

A

400

80

Temperature（℃）

pH

450

70

Yield (％, mol/mol)

0.0

Fig.７

Yield（％，mol/mol）

Fig.６

Time course of Nal synthesis under an argon atmosphere (A) and aerobic conditions (B). Concentrationsof NPA (◯), Nal (●), 2-ketoglutarate (▲) and Glu (△) were monitored throughout the reaction.
The conversion yield of this reaction is indicated by (×).

（ 17 ）

18

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

まった。Fig.９Bでの収率が低い原因は反応系内の何が、その他の芳香族及び脂肪族アミノ酸に対して高い

らかの成分が酸化して触媒毒が生成し、酵素を失活さ活性を示した。

せたことによると推測している。反応系に硫化水素を添加して酸素を除去した場合にもFig.９Aと同様の結4．考果が得られた（データは示さず）。

察

本研究で構築したNal合成法はNPAとNalの溶解度〔6〕生成物の光学純度の差によってNalを沈殿生成させることが特徴である。

反応液をろ過して回収した反応生成物の光学純度を

これにより反応の平衡はNal生成に偏り、副原料の測定した結果をFig.10Aに示した。Fig.10Bは標準物質

Gluを過剰に用いることなく、かつ単純な反応系でのD、L-Nalを反応生成物に混合したものである。反

Nalを効率良く合成することが可能となった。また、応生成物はL-体に相当する単一のピークを示し

Nalをろ過によって回収すると、副原料のGlu及び副（Fig.10A）、光学純度は99.5％ee以上だった。

生成物の2-ケトグルタル酸（2KG）及び未反応のNPA〔7〕種々2-ケト酸及びアミノ酸に対する酵素活性は上清に残存し、Nalと分離される。このために比較

種々の2-ケト酸及びアミノ酸に対するMsATの活性的純度の高いNalを簡単に得ることができた。酵素反をTable２に示した。トリメチルピルビン酸に対して応生成物を沈殿として得ることは当社のアスパルテーは本酵素は全く活性を示さなかったが、その他の芳香

ム（APM）合成技術と共通するものであり16）、本方法

族2-ケト酸にはNPAに対してと同様に高い活性を示しを工業化する場合にはAPM合成技術が活用できるもた。また、アミノ酸を基質として活性評価した場合にのと期待している。

もL-ターシャリロイシンには全く活性を示さなかった

本方法のもう一つの特徴は耐熱性が極めて高い超好熱菌由来の酵素を用いることにある。原料のNPAの水に対する溶解度は温度によって大きく影響を受ける
が、目的物のNalは中性pHではいずれの温度でも溶解性が低い。耐熱性酵素を用いたことで反応温度を高くA)設定することが可能となり、NPAを5重量％という生産性の面からほぼ十分な濃度に仕込んで反応を行うことができた。さらに条件を検討すればより高濃度で反Table２ Activity of purified MsAT toward various
amino acids and 2-keto acids
Substrate
Phenylpyruvatea
2-Naphthylpyruvatea
1-Naphthylpyruvatea
4-Biphenylpyruvateb
2-Thienylpyruvatea
4-Thiazolylpyruvatea
Trimethylpyruvatea
L-Phenylalaninec
L-Alaninec
L-Norvalinec
L-Leucinec
L-Isoleucinec
L-tert-Leucinec
L-Norleucinec

B)

a

D-Nal

Fig.10

L-Nal

TSKgel Enantio L1 HPLC of the reaction product(A) and the mixture of the product and authentic
D,L-Nals (B). Authentic Nal was purchased from
Sigma.

Specific acitivity
μmol/min/mg
230
190
69
320
107
174
0
230
150
240
150
70
0
230

Activity was determined by measuring rhe amount ofL-amino acids formed from 10 mM 2-keto acid and 10
mM l-glutamate.
b
Determined by measuring the amount of L-4-biphenylalanine
formed from 1.25 mM 4-biphenylpyruvate and 10 mM
L-glutamate.
c
Determined by measuring the amount of L-glutamate
formed from 10 mM 2-ketoglutarate and 10 mM L-aminoacid.

（ 18 ）

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

19

応を行うことも可能と考えている。また、MsATを常劣化により触媒毒が発生し、MsATが失活するために温菌である大腸菌で生産したため、本酵素に夾雑する反応の再現性が低下しているものと考えられた。残念蛋白質には基本的に耐熱性がなく加熱処理を行うと凝ながらこの触媒毒の正体は解明できなかったが、集する。そのため加熱処理とアセトン分画を行うだけ

NPAをアセトンで十分に洗浄して精製すること、そでMsATは純度の高い標品として得られた 。そのたして酸素非存在下で酵素反応を行うことで触媒毒の生め本方法では酵素に由来する不純物が反応系に持ち込成が防止されるようになり、再現性よく酵素反応をおまれることが最小限にとどめられている。

こなうことができるようになった20-21）。

15）

Nalを不斉合成する先行技術としては、①ヒダント

以上の様にラボレベルではあるものの簡単かつ生産イン型前駆体をヒダントイナーゼにより光学分割する

性良くNalを合成する方法を確立できたが、他の非天

方法17）、②アズラクトン型前駆体を加水分解してN-ア

然型アミノ酸についてはどうであろうか。MsATで合セチル-D,L-2-ナフチルアラニンを得、さらにアシラー成できる非天然型アミノ酸の範囲はMsATの基質域かゼで光学分割する方法 。③不飽和のアズラクトン型

らある程度推測できると考えている。すなわち、前駆体を一度有機金属触媒で不斉還元して光学活性体

MsATはTable２に示すように様々な基質に対してとし、これを加水分解してN-アセチル-L-2-ナフチルア

NPAに対してと同等の高い活性を示した。これらのラニンを得たのちに、さらにアシラーゼで脱アセチル

うち、1-ナフチル基やビフェニル基などの疎水性が高化する方法 、④フェニルアラニン脱水素酵素によりい置換基を有するアミノ酸はNalと同様に中性pHで等NPAを還元アミノ化する方法

18）

18）

などが報告されてい電点沈殿することが期待できるので、対応するケト酸

る。①の方法は原料の水溶性の問題から仕込み濃度をからNalとの場合と同様にして効率良く合成できると高く設定することができず（数mmol/l程度）、また①考えられる。一方トリメチルピルビン酸及びL-ターシと②の方法ではラセミ体の一方の異性体は無駄になャリロイシンの様にβ炭素から三本に枝分かれした基り、③の方法は不斉還元と酵素分割を組み合わせるの質にはMsATは作用しなかった。従ってMsATを用いで工程が複雑であり、④で用いられた酵素はNPAにてL-ターシャリロイシンを合成することはできないも対する活性が非常に低い。我々の方法ではこの様な先のと結論される。MsATはイソロイシンには活性を示

行技術における様々な問題点が回避されている。

すので、脂肪族アミノ酸ではβ炭素が二本に分かれた

19）

なお、Fig.８Aの反応では2,000Uの酵素を用いて約アミノ酸であれば対応可能である。また、4-チアゾリ

0.2molの目的物が得られたが、精製酵素の比活性を

ルアラニンの様に置換基に正の荷電を持つ2-アミノ酸

190U/mg、酵素の分子量を45,000として計算すると、はpH中性付近で等電点沈殿しないものと予測される

ここで使用した酵素量は約10mg（約0.2μmol）となので、Nalを合成する場合と同様には平衡を目的物側る。すなわち酵素一分子が100万分子のNalを合成したに偏らせることはできない。この様なアミノ酸を合成ことになる。MsATが非常に性能の良い触媒であるこする場合はもう一工夫が必要であると考えられ、それとをここで改めて強調したい。

は今後の課題である。

ところで本方法の検討している際に、2-ナフトアル

なお、我々はMsATのアミノ酸配列情報を元に、デヒドの合成収率の低さと酵素反応の再現性の低さとMsATと同様に広範な基質に作用する当社独自のAT二いう二つの問題がクローズアップされた。我々は安価種類を得ていることを付記する。これらは全ゲノム情な原料である2-メチルナフタレンを出発原料として、報が解明された二種類の超好熱性古細菌 Pyrococcus

そのメチル基の臭素化を経てアルデヒドに誘導するこ

furiosus22)とAeropyrum pernix23)から分離したものであとを試みたのだが、検討開始当初は臭素が芳香環に付り、我々は前者から分離した酵素をPfMsAT、後者か加する副反応のため十分な収率が得られなかった。こらの酵素をApMsATと命名した。これに対応して本報の問題は反応系内に7.5時間という長時間をかけて臭告書で用いたT. profundus由来のMsATはTpMsATと素を徐々に添加することで解決することができた 。

改名した。両酵素は極めて耐熱性が高く、95℃で加熱

酵素反応の再現性の低さについては、原料のNPAした際の活性の半減期からするとTpMsATの２倍からの精製が十分でない場合に酵素反応が阻害されるこ３倍の熱安定性を示す。両酵素は非天然アミノ酸を合と、そしてNPA存在下でMsATを加熱するとMsATが成する上で有用性が高いものと期待している24）。

8）

何らかの化学修飾をうけて失活することを見出したことが解決の糸口となった。この化学修飾は酸素が存在

5．ま と めしない場合は抑制された。このことからNPAの酸化（ 19 ）

医農薬中間体として有用なL-2-ナフチルアラニンを

20

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

モデル化合物として、超耐熱性アミノトランスフェラ

10）

久賢治、河野和久、柿谷均、半澤敏、大江正ーゼを用いた不斉合成法を開発した。本法では目的物

剛；特願は99％ee以上の非常に高い光学純度で得られ、また反

11）河野和久、

応液中に沈殿として系外に排除されるために高収率が剛；特願達成され、さらに目的物をろ過によって容易に回収す

12）河野和久、ることができる。MsATは広範なアミノ酸又はケト酸

剛；特願に作用することから、本稿で述べた方法は疎水性非天

久賢治、柿谷均、半澤敏、大江正

2000-139394

T.L. ; J. Chromatogr., 336, 93（1984）

Chromatogr., 273, 245（1983）

１）Taylor, P. P., Pantaleone, D. P., Senkpeil, R. F.

15）大江正剛、柿谷均、半澤敏、河野和久、and Fotheringham, I. G. ; Trends Biotechnol.,16, 412（1998）

治；特願

久賢

2000-357631

16）Oyama, K., Irino, S. and Hagi, N. ; Methods in２）Schulz, A., Taggeselle, R., Tripier, D. andBartsch, K. ; Appl. Environ. Microbiol., 56, 1

Enzymol., 136, 503（1987）17）Syldatk, C., Volkel, D., Bilitewski, U., Krohn,（1990）K., Hoke, H. and Wagner, F. ; Biotechnol.

３）Then, J., Barthsch, K., Deger, H., Grabley, S.
and Marquardt, R. ; EP 0, 533, 216 Al.

Lett., 14, 105（1992）
18）Asymmetric Synthesis Seminar

４）Kawashima, Y., Fujimura, K., Suhara, H.,
Miyawaki, N. and Fujita, Y. : WO 96/14293.

展開とカイロテックの技術

Chem., 55, 5567（1990）

６）Adams, M. W. W., Perler, F. B. and Kelly, R.

20）半澤敏、柿谷均、大江正剛、河野和久、

M. ; Bio/Technology, 13, 662（1995）

治；特願７）Kobayashi, T. ; Program and Abstracts of the
Novo Nordisk

EnzymeSymposium, pp21（1997）

剛；特願

久賢治、柿谷均、半澤敏、大江正

2000-178582

22）柿谷均、大江正剛、半澤敏、

Kobayashi, T., Kudo, T. and Kakidani, H. ;

久；特願
久；特願

久賢治、河野和久賢治、河野和2000-143404

23）柿谷均、大江正剛、半澤敏、

Biotechnol. Lett., 23, 589（2001）

久賢

2000-210693

21）河野和久、

８）Hanzawa, S, Oe, S., Tokuhisa, K., Kawano, K.,９）半澤敏、柿谷均、大江正剛、

講演要旨集（1998）

K., Hibino, Y., Hirai, K., Kondo, K. ; J. Org.

Drugs of the Future, 22, 353（1997）

Anniversary

光学活性体の新19）Asano, A., Yamada, A., Kato, Y., Yamaguchi,５）Lesson, P. A., Rabasseda, X., and Castaner, J. ;久；特願平

2000-32770

14）Hayashi, T., Tsuchiya, H. and Naruse, H. ; J.

6．参考文献5

久賢治、柿谷均、半澤敏、大江正

13）Bidlingmeyer, B.A., Cohen, S.A. and Tarvin,

然型アミノ酸の合成に広く適用できると考えられる。

th2000-13903

久賢治、河野和2000-357630

24）Hanzawa, S., Oe, S., Tokuhisa, K., Kawano, K.,

11-329334

Kakidani, H.；論文投稿中（ 20 ）

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

著者

氏名 半 澤

著
敏

Satoshi HANZAWA

者

氏名 大 江 正 剛

著
氏名Seigo OE者
久 賢 治

Kenji TOKUHISA

21

著

者

氏名 河 野 和 久
Kazuhisa KAWANO

入社 昭和60年４月１日

入社 昭和63年４月１日

入社 平成元年４月１日

入社 平成７年４月１日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 エフテック株式会社

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

研究所

新材料分野

主任研究員

主任研究員

主任研究員

副主任研究員著

著

者

氏名 柿 谷均

Hitoshi KAKIDANI

者

氏名 石 黒 敬 彦
Takahiko ISHIGURO

入社 昭和54年10月16日

入社 昭和58年４月１日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

主席研究員

主席研究員

（ 21 ）