アプリケーションノート

医薬品とバイオ医薬品

Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18カラムを用いた塩基性成分のピーク形状の改善
ギ酸移動相を用いた従来の C18 カラムとの比較におけるLC/MS 感度の向上

著者

Anne Mack
Agilent Technologies, Inc.

概要

6 種類 の 塩基性医薬品化合物 を、 ギ酸 とアセトニトリルのグラジエントで分離します。荷電表面 のAgilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 カラムと従来の C18 結合相カラムという 2 種類の表面多孔質粒子 C18 カラムを比較します。単純なギ酸移動相と塩基性成分に対して、荷電表面カラムは従来の C18 カラムと比較して、より良好なピーク形状を示しました。より複雑な緩衝液入り移動相を使用す

ると従来の C18 カラムの性能を改善できますが、緩衝液塩によるイオン抑制の結果として LC/MS 感度が低下します。

はじめに

実験方法

この研究では、荷電表面多孔質粒子カラムで液体クロマトグラフィーには、表面多孔質粒子の LC カラムが広く使用されています。これらのカラムは 全多孔質粒子カラムの同等製品と比較して、低圧で高効率です。1この効率の良さは主に、物質移動距離がより短く、カラムにあ る InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 カラムの性能について示します。このカラムを使

この 実 験 で は、Agilent 1290 Infinity II LC

基性医薬品化合物のピーク形状と感度が向上

LC/MS （LC/TQ）を使用しました。システム

システム と Agilent Ultivo トリプ ル 四 重 極用すると、従来の C18 カラムと比較して、塩ボリュームと分散 を抑えるために、標準構成します。のシステムに改良を加えました。表 1 に、詳充填されている粒子サイズの分布 がきわめて細なシステム構成を示します。カラムには、表狭いためです。

1 に示す 2 種類の LC カラムを使用しました。

2

表 2 ～ 4 は、LC と TQ のメソッドパラメータ

表面多孔質粒子カラムで最も一般的な粒子サを示しています。

イズは 2.5 ～ 3 µm です。これらの粒子の効率 は 従来 のサブ 2 µm カラムと同等ですが、約 50 % の背圧が生成されます。この分離効率の高さが、近接して溶出するピークの分解能を高 め、また低い背圧 により、使用できるLC 機器の幅が広がります。

ア ジ レ ン ト は 先 頃、2.7 µm InfinityLab

Poroshell 120 粒子に関する新しい結合相ケ

表 1. システム構成
Agilent 1290 Infinity II LC システムの構成• デガッサ• シールウォッシュポンプ

Agilent 1290 Infinity II

フレキシブルポンプ（G7104A）• 35 µL 溶媒ミキサー：Agilent Jet Weaver、35 µL/100 µL（p/n G4220-60006）• ファームウェア：B.07.23 [0009]• サンプルサーモスタット（p/n G7167-60101）

ミストリを開発しました。この相は、シリカ表面• 計量パラメータ：シートアセンブリ PEEK 0.12 mm、サンプルループ 20 µL、に正電荷を加えた後、C18 結合相で粒子を官能化することにより作成しました。InfinityLabPoroshell 120 CS-C18 カラムは、 ギ酸 のよ

うな 弱 イオン 強度 の 移動相条件下 での 塩基分析ヘッド 20 µL• オートサンプラ & ヒーター：キャピラリ、ステンレス製、0.12 × 105 mm、SL/SL（p/n 5500-1238）

Agilent 1290 Infinity II

バイアルサンプラ（G7129B）• バイアル、スクリュートップ、茶色、ラベル付き、認定、2 mL、100 個（p/n 5182-0716）

性成分 に対して、 ロード性能とピーク形状 を• キャップ、スクリュー、青、PTFE/赤シリコンセプタム、100 個（p/n 5182-0717）• バイアルインサート、250 µL、ガラス製、樹脂足付き、100 個（p/n 5181-1270）向上させます。ギ酸 は 理想的 な移動相添加剤• ファームウェア：D.07.23 [0009]

であり、LC 分析においてシンプルで再現性の高 い 条件 を生成します。ギ酸 を使用することにより、LC/MS 検出での優 れた互換性 など、LC 検出器間での高度な移管メソッドが実現可能 になります。非常 に 柔軟性 の 高 い 2.7 µm

InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 カラムは

• 内蔵タイプ：G7129B• 3.0 µL 熱交換器

Agilent InfinityLab LC シリーズ

一体型カラムコンパートメント（G7130A）

Agilent Ultivo LC/TQ（G6465A）

間で簡単に移管できます。

Agilent 1290 Infinity II ダイオードアレイ

検出器（G7117B）

0.075 mm（p/n 5067-5961）• カラム & フローセル：キャピラリ、ステンレス製、0.075 × 220 mm、SV/SLV（p/n 5067-4784）• ファームウェア：B.07.23 [0009]

多数の機器および検出器プラットフォーム間で使用できるため、さまざまな機器を備えたラボ• ヒーター & カラム：InfinityLab クイックコネクトアセンブリ、105 mm、• Agilent Jet Stream ESI イオン源

• 超低分散 Max-Light カートリッジフローセル、10 mm、0.60 µL（p/n G4212-60038）• UV ランプ（p/n 5190-0917）• ファームウェア：D.07.23 [0009]• Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18、2.1 × 100 mm、2.7 µm（p/n 695775-942）

Agilent LC カラム• 従来の C18、表面多孔質粒子、2.1 × 100 mm、2.7 µm

表 2. UHPLC メソッドパラメータ
メソッド

カラム

Agilent InfinityLab1Poroshell 120 CS-C18、

2.1 × 100 mm、2.7 µm（p/n 695775-942）

23

従来の C18、表面多孔質

粒子、2.1 × 100 mm、

A：水

B：アセトニトリル

C：2 % ギ酸水溶液
A：水

B：アセトニトリル

2.7 µm

C：2 % ギ酸水溶液

従来の C18、表面多孔質

B：アセトニトリル

粒子、2.1 × 100 mm、

2.7 µm

2

移動相

A：水

C：200 mM ギ酸アンモニウム水溶液、pH 3.0溶出条件

0.4 mL/min、5 分で注入量

カラム温度

2 ～ 35 % B、分析を通して 5 % C で一定に保持

0.4 mL/min、5 分で5 µL の 5 µg/mL

通して 5 % C で一定に---または---

10 ～ 50 % B、分析を保持

0.4 mL/min、5 分で11 ～ 51 % B、分析を通して 10 % C で一定に保持

標準

0.5 µL の 50 ng/mL
標準30 ℃今回の実験で分析した 6 種類の医薬品化合物は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。図 1 に、化合物の構造を示します。また、表 5 に、それぞれの 分析濃度 を示します。ギ 酸 アンモニ

ウム も Sigma-Aldrich から 購 入 しました。
ギ 酸（p/n G2453-85060）お よ び LC/MS

グレ ード の ア セト ニトリル （p/n G2453-85050）はアジレントから入手しました。水

表 3. LC/TQ イオン源メソッドパラメータ
ガス温度

設定ポイントMS ソース

150 ℃

ガス流量

12 L/minシースガス温度

250 ℃

ネブライザ

20 psi

シースガス流量

5 L/min

キャピラリー電圧

2000 Vは、Milli-Q システム（Millipore 社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）で製造し、0.2 µm フィルタでろ過した 18 MW のものを使用しました。
アテノール

表 4. LC/TQ 取り込みメソッドパラメータ
化合物名

アテノール

アテノール

フラグメンタ

（V）

（V）

267

145

110

28（m/z）

CE

267

56

110

28

329

161.9

110

35329

91

110

60

メトプロロール

268.2

133

110

20

268.2

77

110

69

266

116

113

12

266

72

113

16

ピンドロール

249

116

110

16

249

56

110

28

プロプラノロール

260

116

95

16

260

56

95

28

メトプロロール

オクスプレノロール
オクスプレノロール

メトプロロール

プロダクト（m/z）

ラベタロールラベタロールピンドロール

プリカーサ

ピンドロール

プロプラノロール

極性

ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブ
ポジティブオクスプレノロール

表 5. 標準の濃度
ラベタロール

成分（溶出順序）

アテノール

ピンドロール

メトプロロール

プロプラノロール

高濃度標準（水で前処理）

低濃度標準（水で前処理）

5 µg/mL

50 ng/mL

5 µg/mL

50 ng/mL

5 µg/mL

50 ng/mL

オクスプレノロール

5 µg/mL

50 ng/mL

5 µg/mL

50 ng/mL

プロプラノロール

5 µg/mL

50 ng/mL

ラベタロール

図 1. 対象化合物

3

結果と考察が改善できることを示しています。ピーク幅の

図 2 は、 表 5 に 示 す 高濃度標準 を 使用 して、表 2 の 3 種類 の 分析 シナリオの 性能 を比較したものです。上段のクロマトグラムは、InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 カラムと単純 なギ酸移動相 による 6 種類 の 塩基性医薬品化合物の分離 を示しています。中段のクロマトグラムは、従来の C18 カラムと同一移動相による性能を示しています。ここでは、荷電表面の C18 と比較してより幅の広いピークが生成されました。下段のクロマトグラムは、ギ酸アンモニウム緩衝液入り移動相を使用することにより、従来の C18 カラムのピーク幅

カウント
（%）

0.80.6

これは、移動相塩であるギ酸アンモニウムの比較内のすべての成分に対して同等の全リテ

InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 カラムとれらの各分離では、このクロマトグラフィーのンションを保証するために、アセトニトリルのカウント
（%）

0.6

濃度 の 同じ成分 を使用しています。各 カラムに対して最適 な 性能条件 を選択しました。つ

まり、CS-C18 とギ酸、および従来の C18 とギ酸アンモニウムです。両方のカラムのすべての成分に対してピーク形状は許容範囲内でし

ピーク幅

Agilent InﬁnityLab Poroshell 120 CS-C18 と0.07（表 2 のメソッド 1 の条件）

0.06

ギ酸移動相

0.05
0.04
従来の C18 とギ酸移動相（表 2 のメソッド 2 の条件）

0.03
0.02
0.01

0.2

カウント
（%）

0.8
0.6

アテノール0

従来の C18 とトリフルオロ酢酸移動相

CS-C18 とギ酸（表 2 のメソッド 3 の条件）

従来の C18 とギ酸

0.4

従来の C18 とギ酸アンモニウム

0.2
00.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8
取り込み時間（分）図 2. 塩基性医薬品化合物のクロマトグラフィー性能の比較

4

薬品化合物の分析結果が改善されています。

再度比較しました。ここでは、表 5 に示す低0.40×1021.0

び低濃度での LC/MS 検出における塩基性医荷電表面および従来の C18 カラムを図 3 で0.20.8

ギ酸移動相を使用することにより、高濃度およグラジエントを多少変更しました。

0.40×1021.0

イオン抑制によるものでした。

ピン
ドロール
メトプロローオルクス
プレノローラルベタロール
プロ
プラノロール×102
1.0

たが、従来の C18 では感度が低下しました。

図により改善されていることがわかります。こアテノール

カウント
（%）

Noise (RMS) = 0.2379; SNR (1.076 min) = 1360.2
×102×1021.076
1.01.00.50.50カウント（%）

×102 Noise (RMS) = 0.1776; SNR (0.984 min) = 509.4
1.00.50×102
1.00.50

Noise (RMS) = 0.4435; SNR (2.601 min) = 404.0 ×102 Noise (RMS) = 1.2022; SNR (3.440 min) = 83.2
1.0
2.601

0.5

0.984

0.500
0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）オクスプレノロール

Noise (RMS) = 1.6578; SNR (3.782 min) = 602.5
×102
3.782
1.0カウント（%）

メトプロロール

ピンドロールNoise (RMS) = 0.5936; SNR (2.385 min) = 628.3
Noise (RMS) = 0.9838; SNR (3.236 min) = 311.9
×102
2.385
3.236
1.0

3.44000.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）ラベタロール

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）プロプラノロール

Noise (RMS) = 0.1341; SNR (4.256 min) = 1616.9
4.256

Noise (RMS) = 0.5842; SNR (4.376 min) = 408.5
4.376

Noise (RMS) = 0.3682; SNR (4.271 min) = 224.2

Noise (RMS) = 0.5842; SNR (4.633 min) = 199.3
4.633

0.50カウント（%）×102
1.0 Noise (RMS) = 1.6044; SNR (4.077 min) = 315.0
4.077

0.5

4.271

0
0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）

1800

S/N

1600

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6
取り込み時間（分）CS-C18 とギ酸

従来の C18 とギ酸アンモニウム

1400
1200
1000
800
600
400
200
ア
テノー
ル
ピン
ドロー
ル
メトプロロオークルス
プレノロールラベタロープルロプ
ラノロール0

図 3. 低濃度標準での LC/MS 感度の比較

5結論

荷電表面 の InfinityLab Poroshell 120 CS-

C18 カラムにより、塩基性成分の性能が改善

参考文献
1.

Gratzfield-Hugsen, A.; Naegele, E.
Maximizing Efficiency Using Agilent
InfinityLab Poroshell 120 Columns.
Agilent Technologies application note,publication number 5990-5602EN,
2016.

2.

Meyer, V. R. Practical HighPerformance Liquid
Chromatography. Fourth Edition,Wiley, 2004; p. 34.

されました。従来の C18 結合相と同一移動相と比較して、単純なギ酸移動相の条件下で性能が改善されました。非常に高くシャープな優れたピーク形状が得られており、これにより分解能と感度が向上しました。従来の C18 カラ

ムでも、より複雑 な緩衝液入り移動相を使用することにより、同等のピーク形状を生成できます。ただし、緩衝液塩のイオン抑制により、LC/MS 感度が低下しました。

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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2020
Printed in Japan, June 12, 2020
5994-2094JAJP
DE.2064930556