アデノ随伴ウイルス受容体 AAVR を利用した
新規 AAV アフィニティーカラムの開発
牧
渡
吉
栗
田
井

野
邉
田
原
中
出

友 理 子＊ 1
和
哉＊ 2
浩
平＊ 1
健
人＊ 1
亨＊ 1
輝
彦＊ 3

Development of Novel Affinity Column for Purification and Analysis of AdenoAssociated Virus (AAV) Using the AAV Receptor (AAVR)
Yuriko MAKINO
Kazuya WATANABE
Kouhei YOSHIDA
Kento KURIHARA
Toru TANAKA
Teruhiko IDE

Adeno-Associated Virus (AAV) is a non-pathogenic virus classified in the Parvoviridae family with a diameter of
20 - 30 nm. AAV vectors that contain therapeutic genes have been developed and widely used as gene therapy drugs.
There are various types (serotypes) with different cell tropism, and most of them enter and infect cells throughbinding to the AAV receptor (AAVR; KIAA0319L). Utilizing the highly specific interaction between AAV and AAVR,
we have developed the affinity chromatography column anchoring AAVR as a ligand. This column is expected to be
used for purification and analysis of various AAVs with maintaining the affinity to the AAVR and the infectivity.
The AAVR was expressed by Escherichia coli and an acid-resistant AAVR (AVR) was created by molecular
evolution engineering method. AVR was immobilized on gel as a ligand, and the gel was used to prepare an affinity
chromatography column (AVR Column). AAVs were bound to the AVR column at neutral pH and subsequently
eluted by denaturing the AVR at acidic pH. The AAVs showed a single peak in the chromatogram, and based on thepeak area, the AVR column was found to be used to quantify the AAV capsid number with a range from 2.0 x 109 to
1.0 x 1014 cp. A wide range of serotypes (AAV1, 2, 5, 8, 9, etc.) that infect via AAVR were detected, while AAV4, which
infects without AAVR, could not bind to the column. Additionally, the analysis of AAV mutants showed a correlation
between elution time and infectivity. These results suggest that the infectivity can be evaluated by using an AVR
Column. Furthermore, we succeeded in detecting AAV in culture supernatants and cell lysates, indicating that the
AVR Column is applicable for the detection of AAV production in culture without purification.
In conclusion, we have succeeded in development of an affinity chromatography column (AVR Column) anchoring
AVR as a ligand. Also, based on the aforementioned results, the AVR Column is expected to be further utilized for
determination of AAV capsid numbers without the need for dilution, evaluation of the infectivity of AAV without areporter gene, screening of AAV mutants, and monitoring of AAV production.
＊1＊2

ライフサイエンス研究所
ライフサイエンス研究所

生物機能工学グループ
装置開発グループ＊3

ライフサイエンス研究所

17

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

ち、酸性下で AAV と AVR の結合親和性を変化させ

1． 序論

ることで、AAV のピークを取得することに成功した。

アデノ随伴ウイルス（Adeno−Associated Virus；

本稿では、創製した大腸菌発現型 AVR の性能評価おAAV）は、パルボウイルス科に属する非病原性のウイ

よび各種 AAV の AVR カラムによる分析結果を報告する。

ルスである。AAV は VP1、VP2、VP3 などのタンパク

この技術により、高品質な AAV を精製し、分析す質で構成され、直径 20 ～ 30 nm の正二十面体の外殻ることができれば、AAV ベクターの開発の一助とな粒子（カプシド、cp）を形成している 1）。AAV には、ると考えられる。AAV ベクターは遺伝性希少疾患や組織指向性の異なる様々な種類（血清型）が存在し、癌などに対する革新的な治療法であり、SDGs（持続カプシドの改良により機能が向上したさまざまな AAV

可能な開発目標）の「すべての人に健康と福祉を」に変異体も開発されている

2 − 4）。AAV の内部に、治療薬代表される治療への貢献を目的とする。

となる遺伝子を挿入した AAV ベクターは、遺伝子治療用医薬品として主に欧米で広く利用されている 5）。
AAV9（血清型 9）ベクターとして日本で承認された、脊髄性筋萎縮症（SMA）治療薬ゾルゲンスマ（オナセムノゲンアベパルボベック）は記憶に新しい。この遺2．実験方法［1］野生型 AVR 大腸菌発現型プラスミドおよび形質転換体の作製

伝子治療用医薬品は日本で 2020 年 5 月に保険適用さアデノ随伴ウイルス（AAV）受容体 AAVR のアミノ

れ、一度の投与で運動機能の劇的な改善がみられたと

酸配列（UniProt : Q8IZA0）のうち、野生型 AVR に相6）の報告もある 。

当するヌクレオチド配列のコドンを、ヒト型から大腸

一方で、医薬品として製造した AAV には、遺伝子菌型に変換した。次に、発現ベクター pET26b（Merckを含まない空カプシドや、カプシドの変性による感製）にライゲーションし、野生型 AVR 大腸菌発現型

染能が低下した AAV など多数の不純物が含まれるこ

プラスミドを作製した。

とが課題である。現在の技術では、これらすべての［2］AAV および VLP の調製

不純物を認識し、除去することができず、課題の改

AAV ベクターは常法 14, 15）に従い作製した。すなわち、善が急務である。製造した AAV の品質は、一般的に5−10％（v ／ v）のウシ血清を含む D−MEM 培地（富士使用される分析技術により総合的に判断される

7）が、フイルム和光純薬製）45 mL が入った T−225 フラスコ

現状では標準的な評価系が確立されていない。中で（Thermo Fisher Scientific 製）5 枚で HEK293T 細胞をも、細胞への感染能は遺伝子治療薬として重要な性

培養し、構造遺伝子として GFP（Green Fluorescent

能であり、感染能を有する正常な AAV のみを精製し、Protein）をコードするプラスミド pAAV−GFP、各種

AAV の構造や感染能を分析する方法が求められてい血清型（AAV1，2，5，8，9 など）のカプシドをコーる。各種 AAV のほとんどは、AAV 受容体（AAVR；

ドするプラスミド（総称して pRCX Vector）および

KIAA0319L）との結合を介して細胞へ侵入して感染

pHelper Vector（タカラバイオ製）の 3 種類のプラス

する

8 − 11）。そこで我々は、AAVR との相互作用によりミドとともに、ポリエチレンイミン（Polysciences 製）

AAV を精製・分析可能な、アフィニティークロマトを添加して複合体を形成させて遺伝子を導入後、5％グラフィーカラムの開発に着手した。

（v ／ v）CO2，37℃で 3 日間静置培養した。なお、VLP

AAVR は 5 つの細胞外ドメイン（PKD1 ～ PKD5）、（構造遺伝子を含まない AAV）は、pAAV−GFP を遺伝

膜貫通領域および細胞内領域から構成されており、子導入しない以外は同じ方法で作製した。培養後、剥AAV との結合は主に PKD1 および PKD2 が関与する

離した細胞を回収し、− 80℃ で冷凍保存した。冷凍ことが明らかとなっている

12，13）。そこでまず、AAVR

し た 細 胞 を、 破 砕 液（20 mM Tris−HCl, 0.5 M NaCl,のドメイン PKD1 から PKD2 の領域（以下、野生型

4 mM MgCl2, 0.01 ％（w ／ v）Tween 20（ 商 品 名 ），pH

AVR）を大腸菌において安定的に発現する系を確立し7.4）10 mL に懸濁した。Benzonase（Merck 製）を加た。次に、進化分子工学的手法により AVR に変異をえて 37℃ , 1 h 静置後、4℃ , 10 min, 13,000 × g で遠加えて耐酸化した変異体（以下、耐酸型 AVR）を創

心分離し、上清を得た。得られた上清を孔径 0.22 µm製した。最後に、精製した耐酸型 AVR をリガンドとのフィルターに供し、浮遊物を除去して細胞破砕液としてゲルに固定化して充填した、AAV 分析用のアフィした。なお、浮遊細胞 HEK293F を用いた場合には、ニティークロマトグラフィーカラム（AVR カラム）を

Viral Production Medium（Thermo Fisher Scientific作製した。AVR カラムに中性で AAV を結合させたの製）培地 120 mL で培養後、プラスミドを AAV−MAX

18

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

Transfection Kit（Thermo Fisher Scientific 製）を使用［5］表面プラズモン共鳴（SPR）法による親和性評価

して遺伝子導入し、界面活性剤により抽出して、不溶

VLP2 をアミンカップリング法により固定化した成分を遠心により除去し、孔径 0.22 µm のフィルター

Series S Sensor Chip CM5（Cytiva 製）を Biacore 8K 装に供した上清を細胞破砕液とした。得られた各種細置（Cytiva 製）に挿入した。希釈液 A（20 mM HEPES（4胞 破 砕 液 を、 溶 液 A（20 mM Tris−HCl, 0.5 M NaCl,−（2−HydroxyEthyl）−1−PiperazineEthaneSulfonic acid），

pH 8.0）であらかじめ平衡化した POROS AAVX ゲル

150 mM NaCl，
10 mM CaCl2，0.005％ Tween20，pH 7.4）

（Thermo Fisher Scientific 製）充填カラムにアプライを使用して 0.0078 ～ 5 µM に希釈した AVR を用いて、した。溶液 A で洗浄後、溶液 B（0.1 M Acetate, 0.5

VLP2 に対する結合親和性を評価した。得られたデー

M NaCl, pH 2.5）で AAV ベクター（総称して AAVX

タを Biacore Insight Evaluation ソフトによりフィッ−GFP） を 溶 出 し た。 中 和 液（1.0 M Tris−HCl，20

ティングし、その結合速度定数および解離速度定数よmM MgCl2, pH 8.5）を 1 ／ 4 量加えることで中和し、り、親和性 K D 値を算出した。

AAVX−GFP 濃度を AAVpro Titration Kit（タカラバイ［6］示差走査熱量測定（DSC）法による耐熱性評価

オ 製 ） に よ る qPCR お よ び AAV Titration ELISA Kit

AVR を希釈液 B（20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH（PROGEN 製）で定量した。

7.4）を用いて濃度 1 mg ／ mL に調製した。示差走査熱［3］ELISA 法

量測定（DSC）装置（Malvern 製）を用いて、温度上［1］で作製したプラスミドで大腸菌 BL21（DE3）

昇による AVR の変性温度 T m 値を測定した。

株（NBRC 108896）を形質転換し、カナマイシン含［7］AVR の大量生産

有 2 × YT 培地にて 37℃ で一晩培養して前培養とし［4］で創製した AVR をコードする遺伝子を、［1］た。前培養液を植菌して本培養を開始し、2 h 後に氷と同様に発現ベクター pET26b（Merck 製）にライゲー

上にて冷却して、終濃度 0.1 mM IPTG（Isopropyl−β−

ションし、耐酸型 AVR 大腸菌発現型プラスミドを作

D−thiogalactopyranoside） を 添 加 し た。25 ℃ で 一 晩製した。大腸菌 BL21（DE3）株を形質転換し、カナ培養後、培養液を採取し、遠心分離で集菌した。得ら

マイシン含有 2 × YT 培地にて 37℃ で一晩培養し、前れた菌体を BugBuster Protein Extraction Kit（Merck

培養とした。前培養液を植菌して本培養を開始し、2製）を用いて、発現した AVR を含むタンパク質抽出

h 後に氷上にて冷却して、終濃度 0.1 mM となるよう液を調製した。VLP2 を固定化した 96 穴マイクロプ

IPTG を添加した。25℃で一晩培養後、培養液を 4℃ ,レート（Nunc 製）を用意し、先に調製したタンパク

20 min, 12,100 × g で遠心分離し、菌体を回収した。

質抽出液を添加して 固相の VLP2 と 30℃ で 1 h 反応

回収した菌体 1 g に対し、溶液 C（20 mM Tris−HCl,

させた。反応終了後、洗浄液（20 mM Tris−HCl, 150

150 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 7.4）を 5 mL 添加

mM NaCl, 0.05％ Tween20, pH 7.4）で洗浄し、100 ng

し、超音波発生装置（久保田商事製、インソネーター／ mL に希釈した Rabbit anti−6−His Tag 抗体（Bethyl

201M）を用いて、8℃ , 10 min、出力 150 W で菌体をLaboratories 製）を 100 µL ／ well で添加した。30℃ で破砕した。菌体破砕液を 4℃ , 20 min, 12,100 × g で遠1 h 反応後、前記洗浄液で洗浄し、TMB Peroxidase

心分離し、上清を回収した。得られた上清を、あらか

Substrate（KPL 製）を 50 µL ／ well で添加した。1.0 M

じめ溶液 C で平衡化した、Ni Sepharose 6 Fast Flowのリン酸を 50 µL ／ well で添加することで発色を止め、（Cytiva 製）50 mL を充填した XK26 ／ 20 カラム（Cytiva

マイクロプレートリーダー（Tecan 製）にて 450 nm

製）にアプライした。溶液 C で洗浄後、溶液 D（20の吸光度を測定した。

mM Tris−HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH［4］進化分子工学的手法を利用した耐酸型 AVR の創製

7.4）で溶出した。得られた溶出液を、溶液 E（20 mM

AVR 遺伝子をコードするポリヌクレオチド部分に、

Tris−HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4）に透析した。

エラープローン PCR によりランダムに変異を導入した。

［8］AVR 固定化ゲルおよび AVR カラムの作製得られた PCR 産物を発現ベクター pET26b（Merck 製）

当社独自のベースゲル（非多孔性、平均粒子径 5にライゲーションし、大腸菌 BL21（DE3）株を形質µm）の表面に、固定化用の官能基を導入し、AVR を転換して、ランダム変異体ライブラリとした。生産性固定化した。作製した AVR 固定化ゲル 約 1 mL を、や酸処理後の残存活性を指標として評価し、ランダムステンレス製空カラム 4.6 mm I.D. × 75 mm に充填

変異体ライブラリから耐酸性の向上した変異体を取得

して AVR カラムを作製した。AVR カラムを、HPLCした。変異を組合せることで、耐酸型 AVR を創製した。

M40A（島津製作所製）に接続し、Table 1 に示す方法を標準として各種 AAV を分析した（Fig. 1）。
19

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

Table１
Product Name
FillerColumnConditions of use

AVR Column
Substrate
Average particle size
LigandSize
Material
Temperature
Flow rate
Buffer A
Buffer B
Gradient Program

Equipment specifications
Non-porous hydrophilic polymer
5μm
Modifed human AAV receptor expressed in E.coli
4.6 mm I.D. × 75 mm
SUS
15 - 20℃
0.5 mL/min
15 mM Acetate-Na, 10 mM Glycine,
50 mM CaCl2, pH 6.0 or 4.5
15 mM Acetate-Na, 10 mM Glycine,
50 mM CaCl2, pH 2.0
0-10 min A 100%, B 0% (Wash A)
10-55 min From B 0% to B 100% (Linear Gradient)55-58 min B 100% (Wash B)
58-70 min A 100%, B 0% (Wash C)＊
When the sample contains impurities, 20 minutes of Wash A
is recommended. 60 minutes of Linear gradient is also used.

a）AVR immobilized resin

Resin
（5μm）

b－2）AVR Column
4.6 mm I.D. × 75 mm，1 mL Resin

Q. Xie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(16), 10405(2002)

＊

Fig.１

b－3）Chromatography
A Buffer：pH 4.5, B Buffer：pH 2.0

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

b－1）AAV＊

AVR

300
250

Peak of AAV

B 100％

200
150
100
50 B 0％0
0 10 20 30 40 50 60
Retention time［min］

Schematic representation of AVR Column

3．結果と考察［1］耐酸型 AVR および固定化ゲルの性能評価

耐酸性に加えて安定性の向上も認められた（Table 2）。
ゲルに固定化し、充填したカラムを使用して耐久性を測定した結果、野生型 AVR と異なり、100 回以上

進化分子工学的手法により、野生型 AVR と比べて

AAV2 を分析してもほとんど素通りせず、ピーク形状

耐酸性が向上した耐酸型 AVR を創製した。SPR およも変化しないことがわかった（Fig. 2）。以上の結果よび DSC により、AAV との親和性および耐熱性を評価

り、安定的に AAV の分析が可能なカラム（AVR カラム）したところ、親和性は野生型とほとんど変わらないにの開発に成功した。

もかかわらず、耐熱性を示す T m 値が約 10℃ 向上し、

20

東ソー研究・技術報告

Table２

第 66 巻（2022）

Comparison between Wild－Type (WT) and
Acid－Resistant (AR) AVR

Binding affinity : KD（Serotype2）
Binding affinity : KD（Serotype5）
Thermal stability : Tm

WT AVR
1.1 × 105
2.7 × 106
52.5℃

AR AVR
4.1 × 106
3.4 × 106
62.0℃a）WT AVR Column
Peak Time［min］

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

Chromatography

#100
#80

32
31
30
29
28

100%
Peak Area#40#20

Elution Time33

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Injection No.［＃］FT ／ Binding ratio

80%

FT

60%
40%

Binding

20%
#1
0

0%

20
40
Retention Time［min］

60

#1

#20

#40
Cycle

#80

#100

b）AR AVR Column
Peak Time［min］

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

Chromatography

#100
#80

Peak Area

#20

Fig.２

38
37
36
35

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Injection No.［＃］FT ／ Binding ratio

FT

80%
60%

Binding

40%
20%

#1
0

39

100%

#40

Elution Time

40

20
40
Retention Time［min］

60

0%

#1

#20

#40
Cycle

#80

#100

Chromatographic performance of AVR Columns anchoring (a) Wild－Type (WT) and(b) Acid－Resistant (AR) AVR［2］AVR カラムによる分析

方で、AAVR を介さずに感染する AAV4 は素通りし、（1）各種血清型の分析

溶出ピークを確認できなかったことから（Data Not

AAVR をノックアウトすることで、感染率が低下する血清型（AAV1, 2, 5, 8, 9 など）と、感染能に変化
16）

Shown）、AAVR を介した感染能との相関を確認した。
（2）定量分析。作

AAV2 Titration ELISA 2.0R Kit（PROGEN 製）によ製した AAV の各種血清型を AVR カラムにより分析

り粒子数を算出した AAV2（2.5 × 1013 cp ／ mL）を、希したところ、AAVR を介して感染する血清型につい釈液（50 mM Acetate−Na, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2,てはゲルに結合し、溶出ピークを得た（Fig. 3）。一

0.01％ Tween20, 0.01％ PuronicF−68, pH 6.0）で 3 倍がみられない血清型（AAV4 など）が存在する

21

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

150

B 100％

100
50

B 0％

Serotype1
4.1×1011 cp

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

0
1600

800
Serotype2
8.5×1011 cp
0
1400

700
Serotype5
1.2×1012 cp
0
1800

900
Serotype8
1.8×1012 cp
0
3000

1500
Serotype9
2.0×1012 cp
0

0

10

20

30

40

50

60

70

Retention Time［min］

Detection of various AAV serotypes

800
700

B 100％

600
500
400
300
200

B 0％

100
0

0

10

20
30
40
50
60
Retention Time［min］

70

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

Fig.３

30
25
20
15
10
5
0

0

10 20 30 40 50 60 70
Retention Time［min］

10000

Peak Area

1000

R2 ＝ 0.9990

100
10
1
1.0E＋09

1.0E＋101.0E＋11
AAV2［cp］

Fig.４

22

1.0E＋12Calibration curve obtained with AVR Column

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

ずつ希釈し、2.8 × 1011 cp ／ mL まで希釈した。各サン得られたクロマトパターンを Fig. 5 に示す。（b）～

9（e）（すなわち AAV1−GFP および AAV2−GFP との混

プル 40 µL を AVR カラムにアプライし、1.4 × 10 ～12

1.0 × 10 cp の検出を試みた。結果、ピーク面積とカ合物）のクロマトパターンは、（a）AAV2−GFP に相当

プシド数の検量線により、AAV の粒子数 を定量可能

するピークと（f）AAV1−GFP に相当するピークの計 2であることがわかった（Fig. 4）。なお、UV 検出器を本現れ、かつ各ピークの高さは混合比をほぼ反映して使用した場合には、約 1014 cp まで定量できる。一般

いた。以上の結果から、AVR カラムを用いることで、8異なる血清型の AAV の混合物を含む試料から、当該～ 10 cp ／ mL への希釈を要する一方で、AVR カラム

血清型の AAV を分析できること、さらに各血清型のは検出レンジが広く、溶液量によりアプライ量を変更

混合比を分析できることがわかった。さらに、キメラでき、希釈不要の検出が可能である。

AAV は単一ピークを示したが、各血清型ともピーク（3）キメラ AAV の分析の位置や形状が異なっていた。ゼータサイザー Ultra

的な ELISA 法は感度が高いために、非常に薄い約 109各血清型のカプシドを構成するタンパク質（VP）（Malvern 製）を用いた動的光散乱法（DLS）によりを 融 合 し、 各 血 清 型 の 組 織 指 向 性 を 有 し た キ メ ラ

AAV の粒子径を求めたところ、いずれも粒子径では

AAV の研究が報告されている

17）

。そこで、
（a）から（g）

差異はみられなかった。AVR カラムを使用することに示す AAV サンプル、すなわち、（a）AAV2−GFP 溶

で、粒子径といったカプシド形状の差異ではなく、カ液（1.0 × 1012 cp ／ mL）、（b）（a）80％ と（f）20％ とプシド構造を反映した分析が可能であることがわかっの混合溶液、（c）（a）60％ と（f）40％ との混合溶液、た。

（d）（a）40％ と（f）60％ との混合溶液、（e）（a）20％（4）培養液からの直接分析およびモニタリング
浮遊細胞にプラスミドを遺伝子導入したのち、1 日と（f）80％ との混合溶液、（f）AAV1−GFP 溶液（1.0 ×
12

10 cp ／ mL）および（g）キメラ AAV1 ／ 2（AAV1 の目から 7 日目まで随時 1 mL 培養液を採取した。500

カプシド遺伝子と AAV2 のカプシド遺伝子をコードすµL は遠心して上清を回収し、培養上清液とした。残るプラスミドを同時に細胞に導入して製造した AAV）

りの 500 µL には界面活性剤を添加して 37℃、2 h 振を 250 µL 使用し、AVR カラムにより分析した。

とう後、遠心して上清を回収し、細胞破砕液およびa）DLSb）Affinity Chromatography using AVR Column
Peak of Peak of
AAV2 AAV1
（a）

（f）

AAV1

（g）

Chimeric
AAV1/2

1

AAV2：AAV1
100：0

AAV2

10

100
Size［nm］

1000

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

（a）

（b）
80：20
（c）
60：40
（d）
40：60
（e）
20：80
（f）
AAV2：AAV1
0：100（g）
Chimeric
AAV1 ／ 2

20

Fig.５

30
40
Retention Time［min］

50

Analysis of the chimeric AAV

23

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）b）Cell Lysate＋Cell Culture

3000

Day 1
Day 2
Day 3
Day 4
Day 7

2500
2000
AAV8

1500
1000
500
0

Day 7
Day 4
Day 3
Day 2
Day 1

B 0％

0

B 100％

20
40
60
Retention Time［min］

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

a）Cell Culture

3000

Day 1
Day 2
Day 3
Day 4
Day 7

2500
2000
AAV8

1500
1000

80

500

Day 3,4
Day 2
Day 1

B 0％

0

B 100％

Day 7

0

20

40

60

80

Retention Time［min］

Fig.６

AAV－production monitoring

培養上清液の混合物とした。いずれも孔径 0.22 µm のムにアプライしたところ、素通り画分がみられるととフィルターに供した後、各 200 µL を AVR カラムにア

もに、溶出ピークがブロード化し、肩の部分（変性プライし、ピークの検出を試みた。結果を Fig. 6 にAAV）とメインピーク（正常 AAV）が検出された（Fig.

示す。いずれのサンプルにおいても、AAV8 と思われ7b）。銀染色により分析した結果、VP の分解物はすべる単一ピークを確認した。遺伝子導入後の経過日数にて素通り画分に存在していた。変性 AAV および正常

従って、経時的な AAV8 のピークの上昇がみられ、生AAV はいずれもサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）

産量のモニタリングが可能であることがわかった。まで違いがみられず、製造時に生じる構造変化の異常をた、4 日目までは、細胞上清液中の AAV8 の方が少な

AVR カラムにより識別している可能性が示唆された。

いのに対し、7 日目にはほとんど差がみられないこと（6）感染能との相関
AVR 結合部位の変異による感染能への影響が報告

から、7 日目には細胞が溶解して AAV が溶出している可能性が示唆された。

されている 18）。そこで、文献にならって変異を導入し（5）製造ロット間差

たプラスミドを作製し、感染能の異なる AAV2 変異体

生産量（遺伝子数）の著しく低下した製造ロット

を 18 種類作製した（Fig. 8a）。市販の AAV Titration

品について、VHH をリガンドとした市販のアフィニ

ELISA Kit（PROGEN 製）により、すべての変異体のテ ィ ー ク ロ マ ト ゲ ル で 精 製 し た の ち、 得 ら れ た 溶発現を確認した。変異を付与していない AAV2 を含

出画分を透析して AAV 精製品とした。抗 VPs 抗体

めた 19 種類の各 AAV 培養液を、AVR カラムおよび（PROGEN 製）によるウェスタンブロッティングによ

VHH をリガンドとしたアフィニティカラムでそれぞれり解析したところ、VP の分解物と思われるバンドが分析した。感染能は文献値を参考にした。その結果、複数確認された（Fig. 7a）。当該精製品を AVR カラ

ピークの溶出時間と感染能とに相関がみられ、野生型a）AAV purified with
Product A using VHH

500

VP1, VP2, VP3

48
35
25
20
17
11

Fluorescence Intensity（Ex. 280 nm ／ Em. 350 nm）

MW
(kD)
245
180
135
100
75
63

b）Affinity Chromatography using AVR Column

Impurities（derived from VPs）

Normal
AAV

450
400

Impurities

350

B 100%

300

Abnormal
AAV

250
200
150
100
50
0

B 0%
0

10

20

30

40

Retention Time［min］

Fig.７

24

Analysis of the inhomogeneous AAV

50

60

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

a）AAV2 mutants
Sample No.

RegionMutant

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

－

－
Q263A
S264A
S267A
S267T
H271A
H271F
H271Q
H271T
N382A
G383A
S384A
Q385A
R471A
E499A
T503S
D528A
D529A
D529E

VR－I

VR－III

VR－V
VR－VI

Transduction＊（% relative to WT）
100
39
72
378
864
10
0.02
2
0.6
3
0.1
25
14
318
40
26
2
0.002
20

M. A. Lochrie et al.Journal of Virology, 80(2), 821 (2006)＊c）Product A using VHH

10000

10000

1000

1000

Infectivity vs WT（％）

Infectivity vs WT（％）b）AVR Column

100
10
1
0.1

AAVs with infection rates oflass than 0.1％ were passed
through the column

0.01
0.001

40

45

50

55

Retention time［min］

Fig.８

100
10
1
0.1
0.01
0.001

60

40

45

50

55

60

Retention time［min］

Analysis of the AAV2 mutants with different infection rates

AAV2 と比較して感染能が著しく低下した変異体につピーク形状への影響がなく、安定的に AAV を分析可

いては、素通りすることがわかった（Fig. 8b）。一方、能であることがわかった。ピーク面積から、1.4 × 109

VHH をリガンドとしたゲルの場合には、すべての変異～ 1.0 × 1014 cp の定量や、AAV 培養液の直接分析が可体が同様の溶出時間に溶出されており、感染能との相能となった。さらに、AAVR を介さず感染する血清型

関はみられなかった（Fig. 8c）。

や、感染能が著しく低下した AAV については AVR カ
ラムと結合せず、感染能との相関もみられた。

4．まとめ

以上により、AVR カラムを使用することで、感染能に寄与する AAV 受容体 AAVR に関わる AAV の分析

アデノ随伴ウイルス（AAV）受容体 AAVR のドメが可能となった。この技術は、希釈不要の AAV の定量、インのうち、PKD1 および PKD2 を有するタンパク

変異型 AAV のスクリーニングや生産性モニタリング

質（AVR）の大腸菌発現系を確立した。ELISA 法になどに利用でき、これまでの分析手法に必要な工数をよる AAV および AVR の結合性評価系を構築し、進化大幅に削減できる。また、レポーター遺伝子を持たな

分子工学的手法により耐酸型 AVR を創製した。耐酸

い AAV の感染能評価や、キメラ AAV などのカプシド型 AVR をゲルに固定化し、当該ゲルを充填したカラを改変した AAV の構造認識など、他の分析では見いム（AVR カラム）を使用して各種 AAV の分析を試み

だせない特徴を検出でき、AAV ベクターの品質管理た。その結果、AAV を中性で結合させ、酸性で溶出に重要なファクターになると考える。この技術が、高し、AAV のピークを取得することに成功した。リガ

品質な AAV ベクターの取得や品質管理の一助となる

ンドの耐酸化により、100 回以上繰り返し使用してもことを期待する。
25

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

5．謝辞
本研究においては、第二開発部セパレーション G
小林 秀峰氏および Tosoh USA Inc. 最上 聡文氏（現ライフサイエンス研究所）に、多大なご協力をいただ
きました。この場を借りて深く御礼申し上げます。また、当該報文を作成するにあたってご尽力いただきま
したライフサイエンス研究所

生物機能工学グループ

池浦 隆真氏および同所属

大村 慧太氏に心より感謝を申し上げます。

6．参考文献１）Q. Xie, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 99（16）,10405（2002）
２）K. Adachi, et al., Nat. Commun ., 5, 3075（2014）３）M. A. Bartel, et al., Gene Therapy , 19, 694（2012）４）H. Büning, et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev .,15（12）, 248（2019）５）株式会社シード・プランニング、遺伝子治療薬の現状と将来展望 2022（2022）
６）T. Kimizu, et al., Int. J. Neonatal Screen ., 7（3）, 45（2021）
７）平井宏和、日置寛之、小林和人、株式会社羊土社、
決定版

ウイルスベクターによる遺伝子導入実験

ガイド（2020）
８）H. Mizukami, et al., Virology , 217, 124（1996）９）S. Pillay, et al., Nature , 530, 108（2016）10）S. Pillay, et al ., USA Patent 10633662（2016）11）C. Summerford, et al., Mol. Ther ., 24（4）, 663（2016）12）R. Zhang, et al., Nat. Microbiol ., 4, 675（2019）13）S. Pillay, et al., J. Virol ., 91（18）, e00391−17（2017）14）Takashi Okada, IntechOpen , Gene Therapy−Tools
and Potential Applications Chapter 17（2013）15）R. O. Snyder, and P. Moullier, Humana Press ,Adeno−Associated Virus Methods and Protocols（2016）
16）A. M. Dudek, et al., J. Virol ., 92（7）, e02213−17（2018）
17）B. Hauck, et al., Mol. Ther ., 7（3）, 419（2003）18）M. A. Lochrie, et al., J. Virol ., 80（2）, 821（2006）

26