未固定非脱灰試料からの多目的新鮮凍結切片の作製と応用
川 本 忠 文Key words •F
硬組織(hard tissues)、植物(plants)、昆虫(insects)、新鮮凍結切片(fresh frozen section)、
全身切片(whole‑body section)、組織化学(histochemistry)、酵素組織化学(enzyme histo‑
chemistry)、免疫組織化学(immuno histochemistry)、遺伝子組織化学(in situ hybridization)

はじめに
近年、遺伝子解析や遺伝子工学を主体とする分子
細胞生物学が降盛を極め、生命科学、医療、品種改良等の分野で極めて大きな力を発揮している。これ
らの研究において、タンパクの局在を免疫組織化学的手法により明らかにすることに加えて、組織における遺伝子の発現部位や発現時期を明らかにすること、遺伝子操作した遺伝子の発現状態を確認すること等が重要になってきている。これらの目的にはパラフィン包埋試料あるいは凍結試料から作製した切片が使用されているが、固定や脱灰等によるタンパ
クの変性や可溶性成分の溶出等の問題がある。タン
パクの変性については抗原性賦活化処理が行われているが、それでも対応できない試料がある。凍結切
片は、固定・脱灰等による組織への影響を回避することができるが、形態を良好に保った凍結切片を作製することが困難な試料（例えば、肺、眼球、皮膚、植物など）、極めて困難な試料（骨等の硬組織を含む
試料）がある。
そのような試料から形態を保持した凍結切片を作製するために様々な手法が試みられ、それらの中で粘着支持材を使用する方法が最もよい結果となっている。これまで粘着支持材として梱包用粘着テープが使用されてきたが、近年凍結切片作製用の粘着フィルム（クライオフィルム）が開発され、実用化された。クライオフィルムを使用することにより、従来の方法で凍結切片を作製することが困難な試料（例えば、硬組織を含む試料、肺、眼球、皮膚、植物等）、性状の異なった組織を含む試料（例えば、全身マウス）等から形状が保持された極めて薄い（2 μm）凍結切片を特別な技術、訓練なくして作製することができるようになった。凍結切片は、未固定非
脱灰の新鮮試料から作製することができるため、図１に示すように様々な目的に使用することができる。
本項では、クライオフィルムを用いた凍結切片作製と応用について述べる。内容は次の通りである。
Ⅰ . 凍結包埋Ⅱ . 切片支持用粘着フィルム
Ⅲ . 凍結薄切
Ⅳ . 切片の染色
Ⅴ . 切片の封入
Ⅵ . 切片の転写
Ⅶ . L M D による微小試料採取
Ⅷ . ＥＰＭＡ観察
Ⅸ . オートラジオグラフィ
Ⅹ . 応用写真

Ⅰ.

凍結包埋

凍結切片の品質は、凍結包埋時の氷晶形成による組織の損傷程度と、薄切時の切片の均一性（厚さ等）により決まる。前者については研究者自身の知識（経験）、技量により大きな差が現れる。後者については、器材、装置によるところが大で、現在の凍結ミクロトームは特別な試料（硬組織、大きな試料）を除いて均一な凍結切片を作製することができる性能を持っている。つまり、高級機を使用した場
合、凍結切片の品質は、凍結包埋で決まってしまうと言っても過言ではない。
新鮮試料や大きな試料は、氷晶による組織の損傷

鶴見大学歯学部・R I 研究センター
日本組織細胞化学会編 組織細胞化学 2005

pp。95‑107 （2005）

96

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際

図１ 凍結切片の応用
LMD:lasser microdissection, CLSM:共焦点レーザー走査顕微鏡を受けやすく、赤血球や筋等のように特に損傷を表１冷媒 （国際化学物質安全性カードによる）受けやすい組織に対しては細心の注意が必要である。損傷を受け易い試料については、試料のみを可
能な限り急速凍結し、試料が解凍しないように迅
速に凍結包埋しなくてはならない。
凍結包埋ブロックの作製については、凍結切片の採取にクライオフィルムを使用するため、包埋剤、凍結包埋ブロックの形状に注意が必要となる。
まず凍結包埋上の注意点を述べ、次いで基本的な手技を述べる。

な凍結試料を作製することができる。
氷晶形成による損傷は組織により異なり、筋組

１ ． 凍結包埋上の注意

織や赤血球などは冷却プロパンあるいはイソペン

１）冷却剤について１）

タン等を使用しなければ良好な組織像を呈さない。

表１に示すような冷却剤が試料凍結に使用され、大部分の組織は他の冷却剤でも十分に組織を観察

液体窒素を除いて、冷却装置あるいはドライアイス

することができる。冷却剤として冷却アセトンをか液体窒素で冷却して使用する。液体窒素は温度が推奨する文献もあるが、アセトンは凍結試料や凍最も低いために試料凍結に適していると思われがち

結包埋剤中に浸透し、薄切面へのクライオフィル

であるが、試料を没入すると気泡が試料表面を包みムの貼付の妨げとなるために避けなくてはならな

込み、冷却能を低下させる欠点がある。冷却能は、液い。

体窒素で冷却した液体プロパンが最も良く、次いで

２）化学固定試料の凍結

イソペンタンである。ペンタンとヘキサンは沸点が氷晶形成による組織の損傷はパラフォルムアルデ

高く安全で扱いやすい冷却剤で、しかも比較的良好

ヒド(paraformaldehyde: PFA)等で組織を化学固定す未固定非脱灰試料からの多目的凍結切片の作製と応用

9 7

ることにより改善するが、固定時間が長くなると

２）試料をステンレス製カゴに載せて冷却剤に入クライオフィルムの粘着支持力が低下する。化学

れ、カゴを動かしながら急速凍結する（図２ ‑ Ａ、固定による氷晶形成による組織損傷の軽減は、還Ｂ）。

流固定を数分間行うことによっても顕著である。

３）試料の大きさに合ったステンレス製包埋容器

クライオフィルムの粘着支持力は、還流固定を 1 0に適当量の３〜５％C M C ゲルを入れる（図２ ‑分程度行っても殆ど低下しないので、実験に問題Ｃ）。

がなければ短時間の還流固定、還流固定ができな
い試料は短時間の浸漬固定をするとよい。
３）氷晶防止剤

２、３）

従来の凍結包埋では、氷晶形成による組織の損傷をさけるために氷晶防止剤（ショ糖、DMSO、PVP、グ

４）凍結試料表面の冷却剤を拭き取り、凍結試料を
CMC ゲル中に没入する。
５）凍結試料の解凍を避けるために包埋容器を冷却剤に沈め、包埋容器を動かして急速凍結する（図２ ‑ Ｄ）。

リセリン等）が使用されている。氷晶防止剤の濃度

６）CMC ゲルの上部が少し凍結した時に包埋容器をが高くなると効果が大きいが、凍結ブロックが柔ら引き上げ（10 〜 20 秒後）、CMC ゲルの上面を液面かくなり、組織を支持できなくなって組織の脱落や上に出し、その状態で CMC ゲルを完全に凍結する

チャタリング等の原因になる。硬組織試料において（図２ ‑ Ｅ）
。 （注意：没入状態で完全凍結するとは硬い包埋ブロックが望ましく、氷晶防止剤を使用

凍結 CMC ブロックにクラックが発生する。
）

する場合は、できるだけ低濃度で使用する。本法の７）CMC ゲルの凍結後、包埋容器から凍結 CMC ブ

ように試料のみを急速凍結する場合、固定試料であロックを取り出し、凍結ミクロトームの試料台にれば氷晶防止剤を用いなくても光顕観察に問題ない

強く押し付けることにより試料台に接触した凍結

凍結試料を作製できる。

CMC の一部を解凍する（図２ ‑ Ｆ，Ｇ，Ｈ）。

４）凍結包埋剤

８）CMC ブロックの接着後、試料台を冷却液に没入

OCT コンパウンドは、氷晶の出来にくい包埋剤で、するか、クリオスタッタの試料凍結台に置くこと

クリオスタット内で氷晶防止剤中に浸漬した試料をにより一部解凍した CMC ゲルを凍結し、CMC ブ

凍結包埋することができる便利な包埋剤である。しロックを試料台に固定する（図２ ‑ Ｉ、Ｊ）。

かし、凍結 OCT の硬さでは硬い組織を支持することができない。
カルボキシメチルセルロース（CMC）ゲルは、全

３．
プロトコール２（特殊な試料）
３．プロトコール２
プロトコール２（１）大きい試料

身オートラジオグラフィ用切片を作製するために使基本的手順は、プロトコール１と同じであるが、用されてきた包埋剤で、急速凍結しないと CMC ゲル

試料凍結時のクラックを避けるために次の事に注意

中に氷晶が形成され、凍結薄切の障害となる欠点がする。

ある。しかし、凍結 CMC は非常に硬く、骨などの硬・試料のクラックは凍結開始後ほぼ決まった時間

組織を十分に支持することができる。更に、切片の（試料の大きさにより異なる）に発生するので、そカーリングは OCT に比べて少なく、且つ薄切によるの直前に試料を CMC ゲル中に入れ、凍結包埋する

切片の縮みが少ない利点がある。また、クライオ

ことによりクラックを軽減する事ができる。

フィルムとの粘着性においても OCT より優れてい・低温度の冷却剤（液体窒素等）を使用するとクラッる。試料に応じて３〜５％濃度で使用され、自前でクが発生しやすいので、氷晶による組織の損傷に作製することができるが、市販の４％CMC（FINETEC

問題がなければ、ヘキサン＋ドライアイス（約 ‑75

Co. Ltd. 府中市 ) を調整する方が簡便である。

℃）、装置で冷却したヘキサン（‑95℃）等を使用することにより軽減することができる。

２．
プロトコール１（標準的な試料）
２．プロトコール１
プロトコール１（
１）試料を採取する（還流固定した試料は、摘出後直ちに凍結してもよい）。

２）小さい試料
基本的手順は、プロトコール１と同じであるが、凍結包埋時に解凍するような小さな試料は、試料の

98

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際

図２

凍結包埋手順

解凍を避けるために包埋方法の一部を修正する。

凍しないように凍結包埋する。

・包埋容器中の CMC ゲルを冷却剤で少し凍結した

４）植物試料後、凍結試料を C M C ゲル中に入れて凍結包埋す

・豆等の乾燥穀類から凍結切片を作製する場合は、る。あるいは包埋容器中の CMC ゲルを完全に凍結

穀類に水分を含ませてから凍結包埋する。

した後、CMC ブロックに試料より少し大きめの穴・稲の葉のように撥水性の試料から凍結切片を作を作り、そこに CMC ゲルと試料を入れて凍結包埋製する場合は、表面活性剤（例えば、Tween20 等）

する。

で親水処理してから凍結包埋する４）。

３ ） 極めて小さい試料

５）昆虫

上記の方法でも試料が凍結包埋中に解凍するよう

・比較的大きい昆虫はプロトコール１で凍結包埋すな試料は、次の方法により試料の解凍を避けながらる。ショウジョウバエ等の小さい昆虫は CMC ゲル

凍結包埋する。

中に入れて凍結包埋する。

・凍結試料を CMC ゲル中に入れて試料表面に少量のCMC ゲルを付着させ、直ちに冷却剤に入れて急速４．
凍結包埋ブロックの保存．凍結包埋ブロックの保存凍結する（試料の解凍を避けるために敏速に行う）。
凍結試料を包埋容器に入れて凍結包埋しても解凍する恐れがなくなる大きさになるまでこの操作を繰返Ⅱ.

切片支持用粘着フィルム

これまで、凍結切片支持用粘着フィルムは使用直す。

前に専用の粘着剤 ( Cryoglue ) をサランラップに塗布

・凍結試料に CMC ゲルをコートする方法でも試料がすることにより準備していた５，６）。現在は、専用の解凍するような小さい試料は、CMC ゲルをコート

粘着剤を塗布したプラスチックフィルムを剥離紙にした試料を急速凍結し、それを上記の方法により解密着させたシート状のものが販売（FINETEC Co. Ltd.

未固定非脱灰試料からの多目的凍結切片の作製と応用

9 9

府中市 ) され、使用時に切断するようになっている（図３）。使用目的に応じて、Cryofilm Type 1、Cryofilm
Type ２、Transfer film、LMD film の４タイプが用意されている（表２）。各フィルムは随時改良され、現在は− 4 0 ℃程度まで切片を粘着支持することができ、しかも染色切片を永久標本として封入保存できるようになっている。適当な粘着フィルムがない場
合は、特殊用途向けの粘着フィルムも用意されているので、メーカーに問い合わせることもできる。各タイプの特徴は次の通りである。
１．
Cryofilm Type １シリーズ
１．Cryofilm
この粘着フィルムは表２に示すような目的に使用できる。Type 1B は、Type 1 に比べ耐熱性が改善され、

図３

粘着フィルムの準備

70℃中に放置しても殆ど収縮しない。アセトン、キシレン等の有機溶媒に対する対薬品性も改善され、このシリーズの欠点は、切片をグリセリン封入

アセトン固定を行える。また、切片の脱水後、キシすると、保存中に粘着剤が染色される場合（トルイレンを経てパラフィン切片封入剤（Entellan Neu 等）

ジンブルー等）があることである。

で永久標本として切片を封入保存できる。切片をグ
リセリン封入する場合は、Type 1 か Type 1B(6)を使２．
Cryofilm Type ２シリーズ
２．Cryofilm

用しないと保存中に気泡が発生する場合がある。永用途は表２に示す通りで、Type 1 シリーズに比べ久標本とする場合は、Type 1B(6)と Type 1B(12)をて粘着剤が染色されることは殆どなく、トルイジン

使用することができ、作業性は Type 1B(12)がよい。

ブルー染色を行うことができる。Type 2B は、フィル

表２粘着フィルムの種類と用途（平成１７年２月２８日現在）

100

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際用する。
ムの平滑性が改善されているが、アセトン、キシレ

・硬組織用には、特殊鋼製とタングステンカーバイ

ン等の有機溶媒に対する対薬品性は低く、現時点

ド製があり、切削性と耐久性においてタングステ（平成 17 年 2 月 28 日）ではパラフィン切片用封入剤

ンカーバイド製が圧倒的に優れている。タングス

で切片を永久標本として封入保存できない（将来的テンカーバイド製には、一本刀と替刃式（Leica TC-には、永久標本対応型が供給されるであろうから購65）があり、替刃式は専用替刃ホルダーが必要にな

入時に確認するとよい）。

るが、切片の品質、作業性、経済性等を総合的にみて優れている。

３．
Transfer film
３．Transfer
Transfer シリーズは、粘着フィルムを用いて作製

２）切削角
物を切削すると、せん断（刃先の切削部位で切削した切片を、粘着フィルムに貼り付いた状態で染色片（切片）が折れる現象）が起こる。この現象は、切を行った（未染色でも転写可）後、スライドグラス

削角、切片の厚み、試料の硬さ等により異なり、切に切片のみを転写することができる。凍結切片用と削角が大きいほど、切片が厚いほど、試料が硬いほパラフィン切片用があり、目的にあったフィルムとど顕著に現れる。軟組織用ナイフの切削角は小さく、プロトコールを使用する。

しかも組織が柔らかいので問題になることは少ない。
しかし、硬組織用ナイフの切削角は大きく、せん断

４．
LMD film
４．LMDが起こりやすい。筆者の経験では、硬組織試料は 3

レーザマイクロダイセクションによる微小試料採取のために開発された粘着フィルムで、切片が粘着

μ m 程度以下にしないと解決できない場合が多い。
３）切削温度フィルムに貼り付いた状態でレーザ光で切断し、微従来の OCT コンパウンドに包埋した試料であれば小試料片を採取することができる。切断した試料片− 15℃程度で良好な凍結切片を作製することができは遺伝子解析に使用することができる。

る。CMC ゲル包埋の場合も同様に、軟組織であれば、− 15 〜− 20℃程度で良好な凍結切片を作製できる。

Ⅲ.

凍結薄切

しかし、組織により− 20℃では硬さが足りず良好な

凍結薄切で、切片の品質に影響を与えるのは、ナ

切片を作製することが困難な場合がある。その様なイフ、切削角、切削温度、切削速度等である。まず

試料は、温度を下げて試料を硬くして薄切する。例

良好な切片を得るための注意点を、続いて凍結薄切

えば、老齢マウスの脳は、− 20℃で薄切すると脳組手順について述べる。

織にヒビ割れ状の模様が現れる場合があり、ヒビ割
れは、より低い温度（例えば、− 30℃）で薄切する

１．薄切上の注意

ことにより改善する。

１）ナイフについて

４）切削速度

薄切操作で最も切片の品質に影響を与えるのはナ

・薄切は、試料にもよるが、ゆっくりと薄切するとイフの鋭利さである。現在は替刃が主流で、ナイフ

良い切片を作製できる。切片の厚みは、薄切速度にの研磨が問題になることは殆どなく、いかに目的により変化するので一定速度で薄切する。

適した替刃を選択し、刃先の状態を正確に把握するかにかかっている。

２．
プロトコール１（通常薄切）
２．プロトコール１
プロトコール１（

・軟組織用には、数社から色々な形状の替刃が販売

１）CMC ブロックを固定した試料ホルダーを凍結ミされている。大きく分けると、切片の流れを良くす

クロトームの試料台に装着し、試料温度がクリオるためにフッ素樹脂でコートした替刃と、切片のスタット温度に達するまで放置する（通常、20 〜

カーリングを防ぐための無コートの替刃がある。ク

30 分）
。

ライオフィルムを用いる方法では、切片のカーリン
グを心配する必要がないため切削性の良いものを使

２）目的の試料面までトリミングした後、鋭利な刃先部分を切削部位に移動する。

未固定非脱灰試料からの多目的凍結切片の作製と応用

３）切片の厚みを３μ m 程度に設定し、連続して切削できることを確認する。

101

３．
プロトコール２（切片の大量薄切）
３．プロトコール２
プロトコール２（
１）プロトコール１の１）〜５）の手順で薄切する。

４）粘着フィルムをフィルム貼付用ピンセットで薄切

２）薄切後、直ちに凍結切片が貼り付いた粘着フィ面に置き、次いでフィルム密着用具（柔らかい紙、布ルムをクリオスタットから取り出し、解凍する。

等でもよい）で確実に薄切面に密着する（図４ ‑ Ａ，

３）15 〜 30 秒後、解凍切片の切片面を下に向けて 100％エタノールに入れ、次いで P F A 等の固定液に移Ｂ）。
５）一定速度（2mm ／秒程度）で、ゆっくりと薄切す
る（図４ ‑ Ｃ）。

す（図５）。固定液中の切片を必要に応じて取り出して使用する。

６）凍結切片が貼り付いた粘着フィルムの両端を両面

４）水洗は、図６のようにクリップで固定して行う。

テープで冷却したスライドグラス（クリオスタット
４．
プロトコール３（硬組織の凍結薄切）
４．プロトコール３
プロトコール３（

内）に固定する。
７）粘着フィルムを固定したスライドグラスをクリオ
スタットから取り出し、凍結切片を解凍する（図５）。

１）タングステンカーバイド製替刃で目的試料面までトリミングする。

８）15 〜 30 秒間の放置（半乾き）後、100％エタノー２）トリミング後、鋭利な刃先を切削部位に移動し、ル中に入れ、次いで P F A 等の固定液に移す。完全に次いで切片の厚みを３μ m 程度に設定して切片が乾燥することもできるが、組織によりヒビ割れが現

連続して切削できることを確認する。

れる場合がある。

３）粘着フィルムをフィルム貼付用ピンセットで薄

図４ 凍結薄切•@
粘着フィルムの貼付、 B ：粘着フィルムの密着、C ：凍結薄切
矢印１: 粘着フィルム、矢印２：粘着フィルム貼付用ピンセット、矢印３：密着用具

図５

切片の処理

102

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際の注意を払う。
２．
組織化学、
免疫組織化学等への未固定非脱．組織化学、
組織化学、免疫組織化学等への未固定非脱灰切片の応用８），９），1 0 ）染色手技は上記と同じであるが、未固定非脱灰切片は剥離し易いので染色操作に注意する。切片の剥離は、凍結乾燥、あるいは解凍切片の完全乾燥により改善する。凍結乾燥は、クリオスタット内の温度の低い場所（‑20℃以下）で行う。5 μ m 程度の切片であれば 1 時間ほどで乾燥し、乾燥状態は切片の色（白くなる）で判定できる。

図６ 切片の水洗クリップで固定した切片

鮮明さは、抗原の種類にもよるが凍結乾燥切片が優れている場合が多い。凍結乾燥切片を使用する場

切面に置き、フィルム密着用具（柔らかい紙、布等でもよい）で確実に密着する（図４ ‑ Ａ，Ｂ）。
４）切削部位（刃先）での凍結切片の剥離を避ける
ために、筆で粘着フィルムを軽く押し、筆を左右に動かしながら、ゆっくりと一定速度で薄切する。

合、組織中の気泡を除去するために脱気操作（切片を 1 0 0 ％エタノールに入れて真空容器内に置く）を行ってから使用する。
上記の方法でも切片が剥離する場合、切片を P F A
で１〜２分程度の浸漬固定を行う。

５）切片が貼り付いた粘着フィルム（粘着フィルム切片）の切片面を冷却したステンレス板に向けて置き、冷却ゴム製ローラーで切片を粘着フィルムに確実に密着する（全てクリオスタット内で操
作）。

Ⅴ.

切片の封入

切片の封入では、粘着フィルムの基材であるプラ
スチックフィルムがカバーグラスの代わりになり、
粘着フィルムとスライドグラスの間にグリセリンあ６）粘着フィルム切片をクリオスタットから取り出し、解凍する。
７）解凍後、切片面を下に向けて 100％エタノール中に入れる。

るいはパラフィン切片用封入剤で切片を封入する。
蛍光免疫染色では、蛍光の退色を軽減するために市販の封入剤あるいは自前で調整した封入剤 1 1 ） を使用する。油浸レンズで観察する場合、更にパラフィ

８）次いで切片面を上に向け、容器を真空容器中にン用封入剤を用い、カバーグラス下に封入する。

置き、気泡が出なくなるまで脱気する（数十秒で気泡がでなくなる）。

１．グリセリン封入

９）直ちに、粘着フィルム切片の切片面を下側に向けて PFA 等の固定液に入れる。

グリセリン封入は、組織の収縮が殆どなく、非常に奇麗な組織像を示す。標本の保存期間は染色により異なり、免疫染色では６年間保存した標本でも問題なく観察することができる。グリセリンに溶出す

Ⅳ.

切片の染色

１．
通常の染色、
組織化学、
免疫組織化学
１．通常の染色、
通常の染色、組織化学、
組織化学、免疫組織化学

る染色剤（例えば、トルイジンブルー、エオジン等）
７）が用いられた場合、長期保存中に色素が拡散して鮮染色は、粘着フィルムに貼り付いた切片に染色液明さが悪くなる場合がある。そのため、グリセリンを滴下して行う。染色性、酵素反応等は、パラフィ封入した標本は、できるだけ早く撮影記録する。

ン包埋切片に比べて格段に良い。免疫染色条件（抗グリセリン封入には、Cryofilm Type 1、あるい

体濃度、反応時間）はパラフィン切片の条件と異なは Cryofilm Type 1B(6)、Cryofilm Type 2B(6)等のる場合がり、染色条件を決定してから染色する。水粘着フィルムを使用し、下記の手順で封入する。

洗は切片の剥離を避けるために緩やかな流水中で行

１）染色切片の水洗後、30％グリセリンを切片上にう（図６）。腱、軟骨等は、特に剥離し易いので細心滴下する（図７Ａ）。

未固定非脱灰試料からの多目的凍結切片の作製と応用

103２）切片を両面テープでスライドグラスに固定している場合は、切片部分を両面テープから切り離す。クリップでスライドグラスに固定している場
合は、クリップを外す。
３）粘着フィルム切片の切片面を 30％グリセリンを塗布したスライドグラスに向けて置く（図７Ｂ）。
４）余分な封入剤を濾紙で押し出しながら吸い取り、粘着フィルムをスライドグラスに密着する（図７Ｃ）。（注意：グリセリンを除きすぎると保
存中に気泡が現れる場合がある（特に硬組織）。
対策として、少し多めにグリセリンを残すか、少し高い濃度のグリセリンを使用する。）
５）粘着フィルムの密着後、不要部分を切り取る。
図７

切片の封入

Ⅵ.

切片の転写

６）切片を一昼夜放置する。切片がスライドグラスと粘着フィルムの間にサンドイッチ状態で保存される（図７Ｄ）。
２．永久標本パラフィン切片用封入剤（Entellan Neu 等）を使用することにより標本をパラフィン切片と同様に永久標本とすることができる。切片はグリセリン封入と同様にプラスチックフィルムとスライドグラスの間にサンドイッチ状態で封入保存される。組織像は鮮明であるが、組織がキシレンにより収縮し、ひび割れが現れる場合がある。
永久標本作製にはキシレン対応型粘着フィルム（Cryofilm type 1B(6),1B(12)等）を使用する。封入は下記の手順で行う。
１）凍結薄切の「プロトコール２」で作製した切片を使用する。
２）染色・水洗（図６）後、クリップを外し、粘着
フィルム切片をエタノール系列で脱水する。
３）脱水後、キシレンで約２分間透徹する。
４）粘着フィルム切片の切片面をパラフィン切片用封入剤を塗布したスライドグラスに向けて置く。
標本の出来上がりは、封入剤の塗布状態で決まり、できるだけ一様な厚さで、薄く塗布する。
５）余分な封入剤を濾紙で軽く押し出しながら除く。

粘着フィルムからスライドグラスへの切片の転写には Transfer film を使用する。転写は染色前あるいは染色後に行うことができる。新鮮凍結切片を未染色の状態で転写すると、転写中に組織が融解する場
合があり、特別な目的がなければ染色後に転写する。
転写手順は下記の通りである。
１）Transfer film に貼り付いた染色切片を気泡が入らないようにシランコートスライドグラスに密着する（グリセリン等の封入剤は使用しない）。
２）ゴム製ローラーあるいは濾紙等を使って余分な水を除去し、数時間放置する。
３）次いで、ヘキサンを入れた密閉ボトルに切片を密着したスライドグラスを入れる（図８ ‑ Ａ）。
４）Transfer film の粘着剤が溶けてプラスチックフィ
ルムがスライドグラスから剥離するまで、スライドグラスを立てた状態でヘキサン中に放置する（図８ ‑ Ｂ）。
５）プラスチックフィルムが剥がれ落ちた後、スライドグラスを新しいヘキサン中に移し粘着剤を完全に溶解除去する（この操作は 2 回行う）
（図８ ‑
Ｃ）。
６）直ちに封入する場合、キシレンを経てパラフィ
ン切片の封入と同様の手順で永久標本として封入

104

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際

図８ 切片の転写•@A : 浸漬、B : プラスチックフィルムの剥離、C ：ヘキサンによる洗浄

図９

L M D による切片の切断する。（注：キシレンへの浸漬時間が長いと収縮に

２．
プロトコール２（可溶性試料）
２．プロトコール２
プロトコール２（より組織が部分的に剥離するので、浸漬時間は短め

１）未固定非脱灰試料から L M D フィルムを用いて凍（１分程度）にする。）

結切片を作製する。

７）転写切片を染色する場合、下降系列のエタノール

２）凍結切片をクリオスタット内で凍結乾燥する。

で DW に戻し、染色操作を行う。染色後、パラフィ

３）切片に水滴が付かないように凍結乾燥切片をシ

ン切片用封入剤あるいはグリセリン等で封入する。

リカゲルを入れた密閉容器に入れてクリオスタッ
トから取り出す。

Ⅶ.

ＬＭＤによる微小試料採取

４）プロトコール１と同様の手順で、切片が貼り付

レーザマイクロダイセクション（LMD)による凍結切いた LMD フィルムを穴あきプラスチック板に固定

片からの微小試料片の採取には LMD フィルムを使用すし、レーザ光により目的部位を切断し試料片を回る。L M D フィルムはレーザ光により容易に切断できる収する。

ように作製された極薄粘着フィルムで、この粘着フィⅧ.

ルムを使用することにより硬組織、可溶性物質を含んだ凍結乾燥切片から微小試料片を採取できる。

ＥＰＭＡ観察 1 2 ）組織中の元素分析には Cryofilm type 1B(12)を使用し、下記の手順で分析試料を作製する。

１．
プロトコール１（通常試料）
１．プロトコール１
プロトコール１（１）凍結薄切「プロトコール２」の手順で、L M D フィ
ルムを用いて凍結切片を作製する。
２）トルイジンブルー、Ｈ ‑ Ｅ染色、免疫染色等を行う。
３）水洗後、図９に示す位置関係で染色切片を穴あき
プラスチック板に粘着テープで固定する。
４）L M D 装置の試料台に粘着フィルムが下になるようにプラスチック板を置く。
５）レーザ光により目的部位を切断し、落下させて試料片を回収する。

１）凍結薄切「プロトコール２」の手順で未固定非脱灰試料から凍結切片（厚さ 10 〜 20 μ m）を作製する。
２）凍結切片をクリオスタット内で凍結乾燥（‑20℃以下）する。
３）切片に水滴が付かないように凍結乾燥切片をシ
リカゲルを入れた密閉容器に入れてクリオスタッ
トから取り出す。
４）切片が室温に達した後、分析部位を切取り、両面テープで EPMA 用試料台に固定する。
５）切片の周囲に銀ペーストをコートし、カーボン蒸着を行った後、EPMA 観察する。

未固定非脱灰試料からの多目的凍結切片の作製と応用

Ⅸ.

水溶性物質のオートラジオグラフィ 13•A14•j105

応用例１ . マウス（5 日齢、５μ m ）、未固定非脱灰、H ‑ E 染色

オートラジオグラフィ用切片作製には C r y o f i l mtype 1B(6)あるいは 2B(6)を使用し、下記の手順でオートラジオグラフィを行う。
１）放射性トレーサーを投与した未固定非脱灰試料から、凍結薄切「プロトコール１」の手順で凍結切片を作製する。
（切片の厚さは、光顕オートラジオ

応用例２ . カニ（５μ m ）、未固定非脱灰、H ‑ E 染色、グラフィには 2 〜 5 μ m、マクロオートラジオグラ

提供：泉恵子氏（（株）ファインテック、アプリケーションセンター）

フィには 5 〜 15 μ m を目安とする。
）
２）凍結切片をクリオスタット内で凍結乾燥（‑20℃以下）する。
３）切片に水滴が付かないように凍結乾燥切片をシ
リカゲルを入れた密閉容器に入れてクリオスタッ
トから取り出し、室温に戻す。
４）安全光下で、切片に光顕オートラジオグラフィに

応用例３ .•@ラット下顎切歯（７ヶ月齢、２μ m ）、未固定非脱灰、トルイジンブルー•õ•Fは厚さ約１μ m の乾燥乳剤膜を、マクロオートラジ
オグラフィにはＸ線用フィルムを密着する。
５）露光後、現像処理を行い、観察する。

おわりに本法により作製された凍結切片の組織学、組織化
学、酵素組織化学、免疫組織化学、蛍光免疫組織化学、
遺伝子組織化学等への応用が始まって数年しか経っ

応用例４ . ラット下大腿骨（７ヶ月齢、２μ m ）、未固定非脱灰、ていないが、これまで極めて困難、あるいは不可能と

トルイジンブルー染色

思われていた研究が可能になり多くの成果を収めてきている。ここに掲載した写真は、その一部で、これから益々応用が広がっていくものと思われる。

謝

辞

応用例の写真を快く提供して頂きました各先生に心よりお礼を申し上げます。
応用例５ . ニジマス稚魚（５μ m ）、未固定非脱灰、H ‑ E 染色、提供：泉恵子氏（（株）ファインテック、アプリケーションセンター）

106

Ⅲ‑2

免疫組織化学法の実際

応用例６ . ショウジョウバエ（５μ m ）、未固定非脱灰、トル
イジンブルー染色、 提供：泉恵子氏（（株）ファインテック、ア
プリケーションセンター）

応用例 10 . 免疫染色（PGP9.5）、マウス（５日齢、５μ m）、未固定非脱灰凍結乾燥、提供：中野由紀子先生（東京医科歯科大学
大学院硬組織構造生物学分野）

応用例 11. 免疫染色（Claudin‑1：赤、核：青）、マウス皮膚（５日齢、５μ m）
、未固定非脱灰凍結乾燥、提供：秦正樹氏（岡山大学歯学部口腔形態学分野）

応用例７ . 稲の葉（10 μ m）、無染色、 提供：前川雅彦先生（岡山大学資源生物科学研究所）

応用例８ . ALPase 活性（青）＆ ACPase 活性（赤）、マウス（５日齢、５μ m ）、未固定非脱灰応用例 12. 免疫染色（Fibrillin-1:緑、α -elastin：赤）、サル眼（10μ m）、平岡満里先生、小嶋直介先生、妹尾春樹先生、（秋田大学
医学部解剖学第二講座）

応用例９ . TRACPase 活性（赤）＆ ALPase 活性（青）、ラット大腿骨（７ヶ月齢、２μ m ）、未固定非脱灰応用例 13. in situ hybridization (i28SrRNA5：黒）、マウス（５日齢、５μ m）、未固定非脱灰凍結乾燥、提供：中野由紀子先生（東京医科歯科大学大学院硬組織構造生物学分野）

応用例 14. カルセインの分布（緑、静脈内投与 30 秒後）、ラット下顎（10 日齢、10 μ m）
、未固定非脱灰凍結乾燥応用例 15 . ＬＭＤによる微小試料片採取、マウス（５日齢、10μ m）、未固定非脱灰応用例 16 . EPMA 分析（Ｋの分布）、マウス（５日齢、20 μ m）、
未固定非脱灰凍結乾燥

文

献1) Schwabe KG, Terracio L: Ultrastructural and thermocouple evaluation of rapid freezing techniques. Cryobiology 17: 571-584 (1980).

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5) Kawamoto T: Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections fromhard tissues, whole-animals, insects and plants 66:
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7) Hiraoka M, Naosuke K Seno-o H: Immunohistochemical Study of the Extracellular Matrices Related to Accommodation in Monkeys. 日眼会誌 106：565-573,(2002)
8) Nakano Y, Kawamoto T, Oda K, Takano Y: Alkalineand Acid Phosphatases in Bone Cells Serve as
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13) Kawamoto T, Shimizu M: Pathway and speed of calcium movement from blood to mineralizing enamel. J.
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14) Kawamoto T: Light microscopic autoradiography forstudy of early changes in the distribution of watersoluble materials. J. Histochem. Cytochem. 38: 18051814 (1990).