JAIMA Season 2021
機器分析が支える、豊かな暮らしと産業のフロンティア

次世代シーケンサー・質量分析計を用いた腸内細菌叢の解析

No.13

国立研究開発法人理化学研究所 生命医科学研究センター 粘膜システム研究チーム
宮内栄治 / 中西裕美子
ん、自閉症スペクトラム障害などあらゆる疾患に1. はじめにおいて腸内細菌叢の乱れが関与していることが示

われわれの体には自身の細胞数より多い約 40

唆されてきた。さらに、糞便中の代謝産物を解析兆個の細菌が生息している。特に腸管には内容物するメタボローム解析により、腸内細菌が産生す１グラムあたり 100 億～１兆個にも及ぶ細菌が存る代謝産物が宿主に大きな影響を与えることも明在し、腸内細菌叢を形成している。細菌との共生らかになってきた。本稿では、NGS を用いた腸関係は出生と同時に始まり、われわれの成長に伴内細菌叢構成菌の解析や質量分析計を用いた代謝い腸内細菌叢を構成する菌の種類も変化する。成産物の解析について、そのサンプル調整方法や解人では約 1,000 種類の腸内細菌が一定のバランス

析手法を概説する。

を保ちながら共生しており、その種類や存在比は個人間で大きく異なる。

2. NGS を用いた腸内細菌叢解析

腸内細菌叢を構成する細菌の多くは偏性嫌気性

NGS を用いた腸内細菌叢の解析は、全ゲノムで培養が困難なものが多く、分離培養を介した手配列を網羅的に解読するメタゲノム解析と、ゲノ法では網羅的な細菌の特定は難しかった。1980

ム中の 16S rRNA 遺伝子配列のみを解読するメ

年代ごろから培養を介さない解析が行われるよう

タ 16S 解析に分けられる。メタ 16S 解析では菌になり、2000 年頃には定量的 PCR やターミナルの機能に関する情報は得られないものの、必要とRFLP など分子生物学的手法で菌叢構成の解析がするデータ量が少ないため、安価に大量のサンプ進められた。その後、次世代シーケンサー（Nextルを解析することが可能である。メタ 16S 解析

Generation Sequencer, NGS）の普及により腸内には Illumina 社の NGS（MiSeq や HiSeq）が使細菌叢を網羅的にかつ低コストで解析することがわれることが多く、一度のランで最大 384 サンプ可能となった。これにより腸内細菌叢の研究が飛ルの解析が可能である。実際のメタ 16S 解析手躍的に加速し、腸管の疾患だけでなく、肥満やが順を以下で解説する（図１）。

図１. 一般的なメタ 16S 解析の概要
糞便などから抽出した菌由来ゲノム DNA から 16S rRNA 遺伝子領域を PCR で増幅する。Illumina 社の MiSeq などで PCR 産物の塩基配列を解読する。アウトプットファイル（FASTQ ファイル）からの一連の解析は全てオープンソースプログラムで行うことができる。

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２−１. DNA 抽出

２−２．ライブラリ調製

NGS を用いた解析では、糞便などから抽出し上記のように、メタ 16S 解析ではゲノム中のた腸内細菌由来の DNA を用いる。多様な腸内細16S rRNA 遺伝子の配列のみを解読する。16S

菌から偏りなく DNA を抽出するため、ビーズをrRNA は細菌種間で配列が保存された保存領域用いた物理的な菌体破砕やリゾチームなどによると、細菌種により特異的な配列を含む可変領域溶菌が用いられる1。現在では、あらゆるメーカー（V1-V9 の９箇所）で構成される（図２）。各菌のから糞便サンプルに特化した DNA 抽出キット

16S rRNA 遺伝子配列はデータベースとして公開も販売されている。一方、DNA 抽出法によってされており、これを用いることにより NGS で解菌体からの DNA 抽出効率が異なり、手法の違い読した配列から菌種を特定することができる。メが解析結果に大きく影響することも明白である1。

タ 16S 解析では可変領域を含む 16S rRNA 遺伝

このことから、異なるデータセットを比較する場子の一部（〜500bp）を PCR で増幅し、その配列合などは、DNA 抽出法の違いによる影響を考慮を NGS で解析する。この際、サンプルごとにバーする必要がある。

コード配列を付加することで、最大 384 サンプルを混合し同時にシーケンシングすることができる（図２）。

図２. メタ 16S 解析のライブラリ調製
16S rRNA 遺伝子の可変領域（V1-V2 や V3-V4 領域など）を PCR で増幅する。この際、サンプルごとに異なるバーコード配列をプライマーに付加することで複数サンプルを一度にシーケンシングできる。

２−３．シークエンシング・データ解析
Illumina MiSeq を用いたシークエンシングでは、一般的にライブラリの両端から 250bp またオリティスコアが含まれ、クオリティの低い配列を除去することで正確なデータのみを抽出することができる。

は 300bp を並列処理で解読する。一度のランは腸 内 細 菌 叢 の デ ー タ 解 析 に は、 一 般 的 に

40 〜 50 時間ほどで完了し、最大で 3000 〜 5000

QIIME22 や R（DADA2 や Phyloseq パッケージ）万リードのデータを取得することができる。解などオープンソースのプログラムが用いられる。

読後はバーコード配列に従ってサンプルごとにまた、SILVA や RDP といった公共の 16S rRNA

FASTQ フォーマットのデータが出力される。

データベースを用いることで得られたリードの菌

FASTQ ファイルには DNA の塩基配列とそのク種を特定することができる。QIIME2 や R を用

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7いた解析方法も公開されており、これらに従って解析を進めることで腸内細菌叢の構成を知ることができる。

４．メタボローム解析
メタボローム（metabolome）とは代謝物の総既述のとおり、ヒトの腸内細菌叢は約 1000 種体（metabolites+ome）を意味し、代謝物は酵素類ほどの菌で構成されており、そのデータは複雑タンパク質により産生される分子量 1000 以下のなものとなる。そこで、サンプル間の腸内細菌叢低分子化合物を指す。これら代謝物を網羅的に計構造の類似度を２〜３次元で可視化する主座標分測することをメタボローム解析と呼ぶ。近年、腸析などの多変量解析が多用される。また、グルー内細菌研究においてメタボローム解析が多数行わプ間で有意差のある個々の菌を検出する場合はれ、腸内細菌が産生する代謝物や腸内細菌が関わ

LEfSe3 などのオープンソースコードが用いられる代謝反応は宿主の疾患等の原因となりうる場合る（図１）。

や、もしくは、宿主の恒常性の維持に重要であるという報告があり、腸内細菌研究においてメタボ

３．ポータブルシーケンサーによる菌叢解析
現 在、 メ タ ゲ ノ ム 解 析 も メ タ 16S 解 析 も４−１．メタボローム計測の手法

Illumina 社の NGS を用いるのが主流である。一

メタボローム解析には大きくターゲット分析と方、ポータブル型のシーケンサーの登場により、ノンターゲット分析があり、ターゲットとする代菌叢解析研究の幅が広がりつつある。Oxford

謝物や代謝経路が決まっている場合はターゲット

Nanopore Technologies 社が開発した手のひらサ分析を行い、バイオマーカー探索などターゲットイズのシーケンサー MinION は、USB でノートが決まっていない場合はノンターゲット分析を行PC に接続して使用する。また、サンプル調製にい、データ比較から差がある代謝物をスクリーニ

複雑な実験機器も必要としないことから、研究室ングする。

外での on-site シーケンシングが可能である。実

メタボローム解析に用いる機器には核磁気共鳴

際、エボラウイルスや亜熱帯マラリア原虫など持装置（NMR）、ガスクロマトグラフィー質量分析

ち運びが困難な検体を現地で解析するのに活用さ計（GCMS）、液体クロマトグラフィー質量分析れた例が報告されている4,5。

計（LCMS）、キャピラリー電気泳動質量分析計

MinION は腸内細菌叢のような複雑なサンプル（CEMS）、イメージング質量分析計（IMS）等がのシーケンシングも可能である。新生児の糞便ある。目的とする代謝物が親水性か疎水性等によサンプルを用いた研究では、抽出した DNA のメり、適切な抽出法と計測法を選択する必要がある。

タゲノム解析を MinION で行っている6。その結図３では代謝物の属性と計測可能な分析を示して果、Klebsiella や Enterobacter といった病原菌いるが、このように代謝物の性質に対して適しただけでなく、抗生物質耐性遺伝子の検出に成功し測定法を選択する必要がある。ている6。特筆すべきは、これらのデータを 1 時間のシーケンシングで取得できている点である。
MinION はシーケンシングと同時にリアルタイムで解析を行うことができる。
そのため、目的のデータ量を取得できた時点でシーケンシングを終了できるという柔軟性を有する。このことは、迅速な診断や治療選択が求められる新生児の壊死性腸炎において非常に有益であると考えられる。

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ローム解析は必須の解析項目となりつつある。

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質量分析計（TQMS）を使用することで多数の化合物に対し Multi Reaction Monitering（MRM）を組むことができ、数百成分の一斉分析が可能になったことから、多成分を対象としたワイドターゲット分析に活用されている。
４− 2．メタボロームデータの統計解析
分析結果から得られた代謝物のデータマトリク
スを作成後、多変量解析や代謝マップに落とし込
図３. 代謝物の物性と分析可能な計測装置

んで解析を行う。多変量解析の手法には、重回帰分析、判別分析（PLS）、主成分分析（PCA）、因NMR 法は親水性代謝物、もしくは疎水性代謝子分析、相関分析などがある。これらの解析を行物を広く計測することが可能であり、ノンターうにあたり、最近では有償・無償のプログラムがゲット分析にも活用できるが、質量分析計と比較提供されており、無償のものとしては R のパッし感度が低いという問題がある。質量分析計の高ケージから多数のツールが公開されている。
また、感度化は進んでいるものの、性質の違う多数の化

MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.

合物を同時に計測することは難しい。LCMS を

ca/faces/home.xhtml） は McGill 大 学 の Xia 研

使用した測定では、分析カラムにより保持・分離究室が無償提供しているツールであり直感的に使できる化合物が異なるため、性質ごとにカラムを用でき初心者でも比較的使用しやすいツールであ選択し測定を構築する必要がある。GCMS は比る。近年ではメタボローム解析から得られるデー較的分離能が高く多成分の分析が可能であるが、タが膨大になりつつあるため、代謝物の変動パ不揮発性の化合物に対して誘導体化処理を行う必ターンを階層的クラスタリング（HCA）等でク要があり前処理がやや煩雑になる。CEMS は他ラスタリングし、Co-abundance group（CAG）の測定系では難しいイオン性の高い化合物や幅広を作成し、CAG の代表値として PCA のスコア

い親水性代謝物の測定が可能であるが、装置の操を使用し、CAG を比較する手法も用いられてい作がやや煩雑であり、生体サンプルなどの高塩濃る7。

度のサンプルでは計測が不安定になることもある。また、近年の新しい計測法である IMS は生

４− 3．腸内細菌研究におけるメタボローム解析

体組織の切片など平面状の試料における各微小測

腸内細菌はさまざまな代謝物を産生すること定点のマススペクトルを測定することで代謝物ので、宿主の代謝に深く関与しているという報告が局在を可視化できることが利点である。

多数ある。下記に代表的な腸内細菌由来の代謝物

LCMS、GCMS、CEMS の用途の違いは主にについての機能を紹介したい。

化合物を分離するクロマトグラフィーに依存する腸内細菌の代謝物のうち、短鎖脂肪酸（SCFA）が、質量分析計自体も近年急速に発展しメタボである酢酸、プロピオン酸、酪酸の効果についてローム解析の用途が拡大している。ノンターゲッはこれまでに多数報告されている。われわれのグト分析においては、ハイブリッド型四重極 - 飛行

ループも酢酸が病原菌感染を抑制すること、酪酸時間型質量分析計（Q-TOFMS）や四重極オービが免疫応答の抑制に寄与する制御性 T 細胞の分トラップ型質量分析計（Q-Orbitrap MS）を用い化促進することを報告してきた8。SCFA の受容て、検出成分の精密質量とフラグメント情報を体は G タンパク質共役受容体（GPR）41 と 43 でベースとした解析を行うことが可能である。まあり、これらを介してエネルギー恒常性を維持した、ターゲット分析においては、高速三連四重極ている。腸管内においては、SCFA は腸管内分JAIMA Season 2021 Summer9

泌細胞上の GPR41 と GPR43 に結合しインクレチンである glucagon like peptide -1 の分泌を促

５．おわりに進し宿主のインスリン感受性を制御する 9。脂肪NGS の普及に伴い腸内細菌叢の重要性が明ら組織では、SCFA による GPR43 の活性化が脂肪かになり、メタボローム解析により腸内細菌と宿細胞におけるインスリンシグナル伝達を抑制し脂主との相互作用の詳細も明らかになりつつある。

肪蓄積を抑制する 9。このように、SCFA は免疫、MinION のような次世代の NGS も登場し、さら代謝において重要な役割を担っており、生体の恒にはスマートフォンで稼働するタイプの NGS も常性維持において重要な腸内細菌由来の代謝物で開発が行われている。また、腸内細菌だけでなくある。

腸内真菌やバクテリオファージの網羅的解析も行

アミノ酸は通常食事から摂取されるが、腸内細われ、これらの重要性も示されている。このよう菌もタンパク質を分解してアミノ酸を産生、またに、分析装置の進歩や解析対象の拡大により、腸は、新生することができる。腸管内で産生された内細菌叢の理解が今後さらに深まると期待されアミノ酸やアミノ酸由来の代謝物が宿主に吸収さる。

れ、生活習慣病と関わるという研究が多数報告されている。Pedersen らは前糖尿病状態の被験者◉参考文献の糞便のメタゲノム解析および血中メタボローム

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解析を行い、インスリン抵抗性を示す被験者では腸内細菌の分岐鎖アミノ酸産生に関する遺伝子が(2017).
2増加し、血中分岐鎖アミノ酸がインスリン抵抗性

Bolyen, E. et al. Nature Biotechnology 37, 852857, (2019).と相関していることを報告した 10。また、肥満者

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Segata, N. et al. Genome Biology 12, R60, (2011).の腸内細菌叢と血中メタボローム解析を調べた研4

Quick, J. et al. Nature 530, 228-232, (2016).

究では、代謝異常のパラメーターと血清グルタミ

5Runtuwene, L. R. et al. Sci Rep 8, 8286, (2018).

ン酸濃度が負の相関を示していた 11。このように、6Leggett, R. M. et al. Nat Microbiol 5, 430-442,

アミノ酸代謝が血中濃度に反映されることで肥満や糖尿病などの代謝異常に関わることが報告され(2020).
7ているが、アミノ酸がもたらす作用のメカニズムについては未だ明らかとなっていない。

Langfelder, P. & Horvath, S. BMC Bioinformatics
9, 559, (2008).

8Furusawa, Y. et al. Nature 504, 446-450, (2013).

胆汁酸は肝臓で産生され十二指腸乳頭部から分9Kimura, I. et al. Nat Commun 4, 1829, (2013).

泌されて脂質の吸収に寄与する。大部分は回腸末

10Pedersen, H. K. et al. Nature 535, 376-381, (2016).

端にて再吸収されるが、一部の胆汁酸は大腸に移

11Liu, R. et al. Nat Med 23, 859-868, (2017).

行し腸内細菌の代謝を受け二次胆汁酸として存在

12

Yoshimoto, S. et al. Nature 499, 97-101, (2013).

する。この腸内細菌が産生する二次胆汁酸が肝臓

13Hang, S. et al. Nature 576, 143-148, (2019).

がんを誘発することが報告されている 12。また、二次胆汁酸である 3-oxo-lithocholic acid（LCA）が炎症を誘導する Th17 細胞の分化を抑制し、isoalloLCA が Treg の分化促進活性があることが報告されており、二次胆汁酸が宿主免疫系へも影響することが明らかとなってきている 13。

10

Costea, P. I. et al. Nat Biotechnol 35, 1069-1076,

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