アプリケーションノート

医薬品とバイオ医薬品

Agilent 7697A ヘッドスペースサンプラ、8890/5977 GC/MSD システムを用いたN-ニトロソジメチルアミンおよびN-ニトロソジエチルアミンの分析

US FDA ガイダンスに基づく AT1 受容体拮抗薬の不純物分析

著者

Abbey Fausett
Agilent Technologies, Inc.

概要

このアプリケーションノートでは、Agilent 8890 GC による AT1 受容体拮抗薬中 の 不純物分析 を米国食品医薬品局 (US FDA) メソッドに 従って実行する方法 を説明します。このワークフローでは、

Agilent 7697A ヘッドスペースサンプラ (HSS) と 5977 GC/MSD を用います。分析結果は、予測した検出値と一致しました。

はじめにを用いた原薬と最終製品の両方の分析につい世界保健機構 によると、25 歳以上の成人の35 ～ 46 % が高血圧症です 1。高血圧症 は、世界中で 10 億人以上の人に影響を及 ぼしています 。バルサルタン、ロサルタンなどのア2ンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) は、世界中 で入手 でき比較的安価 なため、高血圧症の治療用に一般的に処方されている薬剤です。ARB のメカニズムはアンジオテンシン IIとその受容体との結合を阻害し、血管の収縮を防ぎ、効果的に血圧を低下させます 。
32018 年 7 月、汚染物質リスクに起因するバルサンタン製品の世界規模のリコールが発表されました。最初 に 特定された 汚染物質 は、

N-ニトロソジメチルアミン (NDMA) です。USFDA は、製造施設向けの指針として、バルサンタン製品中の発がん性が疑 われる不純物を出荷前 にスクリーニングする手順 を公開しました 4。2 つ目 の汚染物質 は、最初 の汚染物

質 NDMA のリコールの直後に特定され、欧州医薬品庁によって確認されました 5。この N-ニトロソジエチルアミン (NDEA) は NDMAと同様 に、発 がん性 のある物質 に分類され、AT1 受容体拮抗薬 クラスの 医薬品 に 共通するテトラゾール環の合成中 に二次生成物として生成されると考えられています。この新しく確認された汚染物質 がテトラゾール環と関連していたことで、最初のリコールが拡大し、製造中 のすべての AT1 受容体拮抗薬 に影響しました。欧州医薬品庁 の 報告書 を受 け、US

FDA は 2 種類 の 汚染物質 に 単一メソッドで対処するための 補足 の 規制手順 を作成しました。この 修正 により、調製用溶媒 が 変更され、別 の GC カラムが用いられることになりました 。2019 年 1 月に発行されたこの文書
6では、GC/MS とヘッドスペースサンプリングて、NDMA と NDEA の定量下限 (LOQ) 値をそれぞれ 0.10 ppm と 0.05 ppm に定めていメソッド条件
Agilent 7697A ヘッドスペースサンプラ条件

オーブン温度130 ° C

では Agilent 8890 GC システムが 7890 シス

トランスファーライン温度

185 ° C示します。

注入時間ます。FDA の手順は Agilent 7890A GC で実行されましたが、このアプリケーションノートテムと同等 の 優 れた 性能 を有していることを実験方法

NDMA および NDEA 標準は非希釈のものをMilliporeSigma 社 (米国マサチューセッツ州バーリントン) から購入しました。FDA のガイ
ダンス 6 では、純度 99.0 % 以上の 1-メチル-2-ピロリジノン (NMP) を使用するよう定 め

ループ温度

バイアル平衡化時間

デフォルト

充填圧力

15 psi

ループ充填モード

所定の条件に従った場合に、溶媒不純物から温度にも適用できるため、試料調製に純度の低いオーブンタイプのデータは、この評価を含め、FDA プロトコルを遵守して取得しました。

次の表に、メソッド条件まとめています。今回の分析は高速 GC オーブン (240 V) で実行しましたが、このオプションは結果を得るうえで必須ではありません。ヘッドスペースメソッドの開発に有用な別のオプションとして、ヘッドスペーストランスファーラインアクセサリがあります。これを用いると、構成 を変えずに同じ注入口でヘッドスペース注入機能と液体注入機能に対応できます。表 1 に、この実験で使用した 消耗品 を示します。標準液 を FDAガイダンスに従って準備し、さらに 1 µg/mLのポイントを追加して準備しました。

ヘリウム

220 ° C

スプリット

スプリット比とできない場合 があるかもしれません。本報

デフォルト

Agilent 8890 GC パラメータ

注入口 (スプリット/のターゲット化合物の分離能が向上しました。

るためのパラメータを柔軟に設定できる場合

レベル 5

充填モード

モード

溶媒を使用すると、分離能の良いデータを得

1分

20 mL

バイアル撹拌

スプリットレス)

この分析は、その他のグローバルな規制機関

15 分

バイアルサイズ (mL)られています。しかし、より高 い純度 の 溶媒(99.7 %、MilliporeSigma) を使用したところ、

180 ° C

5:1

吸気口圧力 (初期)
平衡化時間7.33 psi240 V 高速オーブン
1分

40 ° C で 0.5 分間

オーブンプログラム

20 ° C/min で 160 ° C に昇温、10 ° C/min で 240 ° C に昇温、
2 分間ホールド

合計サイクルタイム:16.5 分

Agilent J&W DB-1701、

カラム

30 m × 250 µm、1.0 µm

定流量

モード

流量

1 mL/minAgilent 5977 GC/MSD 条件

イオン源タイプ

エクストラクタマスフィルタモード

選択イオンモニタリング (SIM)

イオン源温度NDMA m/z

NDEA m/z

230 °C74.00102

レンズ直径

6 mm

四重極温度

NDMA ドウェル
NDEA ドウェル

150 °C
150150

表 1. 分析で使用した消耗品
説明

ヘッドスペースバイアル (20 mL)

2

部品番号5182-0837

バイアルキャップ

5183-4477

GC セプタム5183-4759

エクストラクタレンズ (6 mm)

G3870-20448

GC ライナ

5190-2295

カラム DB-1701

122-0733

結果と考察

リテンションタイムは FDA 規制で提供される種からターゲットピークが十分に分離していま

キャリブレーションポイント (0.025、0.05、分離は十分に行われ、溶媒およびマトリックスす。図 1 に、クロマトグラム例を示します。

リテンションタイムと一致しました。図 2A と2B に、NDMA と NDEA の 最も低い 3 つの0.1 μg) の重ね表示を示します。

NDMA

NDEA

3.1 3.3 3.5 3.7 3.9 4.1 4.3 4.5 4.7 4.9 5.1 5.3 5.5 5.7 5.9 6.1 6.3 6.5 6.7 6.9 7.1 7.3 7.5 7.7 7.9 8.1 8.3 8.5 8.7 8.9 9.1 9.3 9.5Time (min)図 1. NMP 中の NDMA および NDEA の 1 μg 標準混合物の選択イオンモードでのクロマトグラム。

NDMA のリテンションタイムは 5.80 分、NDEA のリテンションタイムは 7.25 分

AB

図 2. 3 つのキャリブレーションポイントでの NDMA (A) と NDEA (B) の重ね表示

3

2 つ の 検 量 線 は Agilent MassHunter

NDMA キャリブレーションの統計値

Quantitative Analysis ソフトウェアを用 いて標準の量生成しました。LOQ と検出限界 (LOD) を検量線の下限で調べるために、定量結果を 0.025µg から 0.5 µg の検量線に対して処理しまし×103

相関で、フルレンジの検量線を 0.025 µg から2.5100 µg まで延長します。図 3A および 3B に、この機器で得られた低レベルの検量線を示します。LOD は、最少のオンカラム注入量により少 なくとも S/N 比 3:1 以上 で 定義 されます。NDMA および NDEA のキャリブレーションにおいて、0.025 μg の最少ポイントはこの各化合物の検量線を生成後、検量線内の 3 つNDMA
y = 4718.244533 * x + 9.425785
R2 = 0.99900

表 3 に、結果を示します。

0.1048104.8

0.4954

99.1

0.05

0.1

0.15

0.20.25濃度 (μg)0.3

0.35

0.40.450.5

NDEA キャリブレーションの統計値を 3 つのバイアルにスパイクし、それぞれのバ3標準の量B測定した量(µg)

NDEAy = 2695.485910 * x – 14.249731
R2 = 0.9993

2.01.5レスポンス

化合物 が 検出 されないことを確認しました。

0.100.5-0.52.5

チサンプルを分析して、NDMA および NDEA92.90×10含むようにしました。添加回収試験の前にバッ103.20.5中で添加回収試験を行いました。前述の LOQイアルが 500 mg のバルサルタン医薬錠剤を0.05161.0めています。

をターゲットとして、2 つの最少濃度の標準液0.051.5た。表 2 に、この再現性の評価の結果をまとメソッド性能の最後の評価として、マトリックス

精度 (%)

0.02352.0値を超えていました。のレベルで標準液を 5 回繰り返し分析しましA(µg)

0.025レスポンスた。逆重 み 付 けを用 いて 0.995 以上 の 直線測定した量(µg)

精度 (%)

(µg)

0.025

0.02400.050.0499

96.099.80.100.1050

105.00.50.4961

99.2

1.00.50-0.500.05

0.1

0.15

0.20.25濃度 (μg)0.30.350.40.450.5

図 3. 低レベルのキャリブレーション範囲の直線回帰と検量線に対する処理後の精度
表 2. 標準液の再現性の統計値 (n = 5)
0.025 μg 標準

測定量の平均値% RSD

0.05 μg 標準

NDMA

NDEA

NDMA

NDEA

NDMA

NDEA

0.02490.02480.05180.05060.1012

0.0988

4.95

2.89

6.24

0.7

2.65

4.07

表 3. NDMA および NDEA ターゲット化合物について 3 回の繰り返し

サンプル分析による LOQ の判定
ターゲット LOQ

平均回収率

NDMA

0.10

0.056

0.11

NDEA

0.050.057

0.111 ppm

40.1 μg 標準0.05 ppm

平均回収率0.10 ppm

結論

Agilent 8890 GC は、医薬品 の 安全性スクリーニングに必要な堅牢性と再現性に関して、

参考文献
1.

data. https://www.who.int/gho/

これまで以上 に 優 れた 性能 を備 えています。

ncd/risk_factors/blood_pressure_8890 GC とともに、Agilent 7697A ヘッドス

prevalence_text/en/ - Accessed

ペースサンプラと Agilent 5977 GC/MSD を用いることで、FDA の指令を遵守し、AT1 受
容体拮抗薬中 の 不純物分析で求 められる検Global Health Observatory (GHO)

17June 2019.
2.

http://www.bloodpressureuk.
org/mediacentre/Newsreleases/

出値を達成できます。

1billionpeopleworldwidenowhave
highbloodpressure
3.

Barreras, A.; Gurk-Turner, C.
Angiotensin II Receptor Blockers.
Proc (Bayl Univ Med Cent) 2003, 16(1),123–126. doi:10.1080/08998280.20
03.11927893
4.

GC/MS Headspace Method for
Detection of NDMA in Valsartan Drug
Substance and Drug Products.U.S.
Food and Drug Administration, FY18-176-DPA-S.
5.

European Medicines Agency Reportof NDEA.

6.

Combined N-Nitrosodimethylamine(NDMA) and N-Nitrosodiethylamine(NDEA) Impurity Assay by GC/MS
Headspace.U.S. Food and Drug
Administration, FY19-005-DPA-S.

5

ホームページ

www.agilent.com/chem/jpカストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

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Printed in Japan, September 11, 20195994-1132JAJP