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カビ Premium(1 遺伝子)報告書

シリアル番号XXXXXxx

管理番号 SIID

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作業完了日

202x 年 xx 月 xx 日

発

202x 年 xx 月 xx 日行

日

極秘資料

本報告書の使用にあたっての確認事項
1.

本報告書は株式会社テクノスルガ・ラボ 技術責任者による承認済みです。

2.

研究発表 (論文投稿) や特許明細書への転用を除き、本報告書の一部または全部をそのままあるいは改変して第三者へ転用などされた場合には、株式会社テクノスルガ・ラボは一切の責任を負いかねます。

3.

当社受託サービス等は、試験・研究用途を目的として販売しております。当社受託サービス等を医療や臨床診断などの試験・研究目的以外へご使用される場合、これに起因する損失・損害等については、当社では一切の責任を負いかねます。

技術責任者

印

株式会社テクノスルガ・ラボ 研究センター 技術部〒424-0065

静岡県静岡市清水区長崎 388 番地の 1

TEL：054-349-6211

FAX：054-349-6121

Mail：tsl-contact@tecsrg.co.jp

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検体情報
検体名SAMPLE

SIID

受取日

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202x 年 xx 月 xx 日

備考:
目的
巨視的および微視的形態観察 (以下、カビ第一段階試験) および rDNA の ITS 領域塩基配列解析の結果から、検体の帰属分類群を推定します。
方法
1. 前培養条件
・ 培地

BD Difco Potato Dextrose Agar (Becton Dickinson, USA)・ 培養温度27°C

・ 培養期間

1 週間

・ その他条件

好気培養

2. rDNA の ITS 領域塩基配列解析
・ DNA 抽出

物理的破砕法・ PCR 増幅

PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio, Japan)・ サイクルシーケンス

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)PCR 増幅: ITS5, NL4
シーケンス: ITS5, ITS4ABI PRISM 3500xl Genetic Analyzer System(Thermo Fisher Scientific)

・ 使用プライマー1) 2)
・ シーケンス・ 塩基配列決定

ChromasPro 2.1 (Technelysium, AUS)・ BLAST 相同性検索 3)

解析ソフトウェア: ENKI v3.2 (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
データベース
DB-FU15.0 (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank)
検索日: 202x 年 xx 月 xx 日

・ 簡易分子系統解析

系統樹の推定: 近隣結合法 4)
塩基置換モデル: Kimura-2-parameter 5)
樹形の信頼性評価: ブートストラップ法 6) (1,000 反復)＊ 塩基配列決定は、シーケンサーからの生データ (エレクトロフェログラム) を当社技術者が目視により確認し、修正を行った後に決定しています。

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簡易分子系統樹で示す株名末尾の略記号は次の通りです。
略記号

タイプの種類T

基準標本 / 基準株、又はどのタイプか不明な場合 / タイプ由来株

HT

ホロタイプ (Holotype, 正基準標本) / ホロタイプ由来株

NT

ネオタイプ (Neotype, 新基準標本) / ネオタイプ由来株LT

レクトタイプ (Lectotype, 選定基準標本) / レクトタイプ由来株IT

アイソタイプ (Isotype, 副基準標本) / アイソタイプ由来株

ET

エピタイプ (Epitype, 解釈基準標本) / エピタイプ由来株

PT

パラタイプ (Paratype, 従基準標本) / パラタイプ由来株

R

参照菌株 (Reference strain)A

信頼のおける培養株 (Authentic culture / strain)

3. カビ第一段階試験
4 種類の平板培地で培養後に巨視的観察 (コロニー観察) を行ない、コロニーの直径・色調 (表面および裏面)・表面性状・可溶性色素産生の有無等に関して記録を行ないました。
コロニー色調に関する記述は Kornerup and Wanscher 7) に準拠しました。また、以下をもちいて微視的観察を行いました。
・ 培地

BD Difco Potato Dextrose Agar (Becton Dickinson, USA)
2% Malt Agar (MA)
Bacto Oatmeal Agar (Becton Dickinson, MD, USA) (OA)
LcA 培地 (三浦培地) (LcA)

・ 培養温度27°C

・ 培養期間

1 週間～4 週間

・ 顕微鏡

光学顕微鏡 BX51 (Olympus, Japan) (微分干渉観察含む)
実体顕微鏡 SMZ800 (Nikon, Japan)

・ マウント液

ラクトフェノール液＊ 方法に記載の会社名、製品名は一般に各社の日本および各国での商標または登録商標です。

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結果
1. rDNA の ITS 領域塩基配列解析
表 1. DB-FU に対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された rDNA の ITS 領域塩基配列解析データ
登録名
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus welwitschiae
Aspergillus niger
Aspergillus tubingensis
Aspergillus tubingensis
Aspergillus vadensis
Aspergillus tubingensis
Aspergillus brasiliensis
Aspergillus luchuensis
Aspergillus niger
Aspergillus tubingensis
Aspergillus sclerotioniger
Aspergillus lacticoffeatus
Aspergillus ibericus
Aspergillus pulverulentus
Aspergillus ellipticus
Aspergillus ellipticus
Aspergillus ibericus
Aspergillus carbonarius
Aspergillus piperis
Aspergillus neoniger
Aspergillus hortai
Aspergillus fumigatus
Aspergillus costaricaensis
Aspergillus heteromorphus
Aspergillus eucalypticola
Aspergillus luteorubrus
Aspergillus felis

株名CBS120.49
CBS554.65
ATCC16888
CBS139.54
CBS113.46
CBS643.92
CBS127.49
CBS113365
CBS134.48
CBS101740
KACC46772
NRRL326
NRRL4875
CBS115572
CBS101883
CBS121593
CBS55865
NRRL5120
CBS707.79
NRRL35644
NRRL369
CBS112811
CBS115656
CBS124230
ATCC9197
CBS115574
CBS117.55
CBS122712
MSTFP2246
CBS130245

Accession No.
AJ280006
FJ629337
AF138904
FJ629340
FJ629351
AJ280008
AJ280007
FJ629368
FJ629354
FJ629321
JX500081
EF661186EF661193
NR_077192
FJ629336
AY656625
EU821317
EF661194
AJ280014
EF661200
EF661204
EU821316
FJ491682
KP987087
AY939790
DQ900602
EU821305
EU482439
MT179305
KF558318

相同率
581/581 (100.0%)579/579 (100.0%)579/579 (100.0%)579/579 (100.0%)578/578 (100.0%)578/581 (99.5%)
578/581 (99.5%)
576/579 (99.5%)
576/579 (99.5%)
575/580 (99.1%)
557/560 (99.5%)
548/548 (100.0%)545/548 (99.5%)
560/579 (96.7%)
560/579 (96.7%)
561/582 (96.4%)
509/512 (99.4%)
530/549 (96.5%)
528/548 (96.4%)
528/549 (96.2%)
527/548 (96.2%)
505/514 (98.2%)
462/464 (99.6%)
541/593 (91.2%)
534/584 (91.4%)
460/468 (98.3%)
487/516 (94.4%)
444/446 (99.6%)
534/588 (90.8%)
530/586 (90.4%)

BSL2

注 1) BSL (バイオセーフティレベル) はレベル 2 以上を表記し、空欄はレベル 1 を意味します。
注 2) 網掛けは、簡易分子系統解析に供した配列データを示します。

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表 2. 国際塩基配列データベースに対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された rDNA の ITS 領域塩基配列解析データ
登録名
Aspergillus welwitschiae
Aspergillus welwitschiaeAspergillus welwitschiae
Aspergillus welwitschiae
Aspergillus awamori a
Aspergillus awamori a
Aspergillus awamori afungal sp.
Aspergillus niger
Aspergillus foetidus aAspergillus awamori a
Aspergillus welwitschiae
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus welwitschiae
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus sp.
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus foetidus a

株名BLH_22
BLH_21CBS 139.54b
LCFAn40_Mutant
LCFS5_Wild
cgys02
IFM 61597-Accession No.
OW988528
OW988050
OW985914
OW983422
ON054324
ON054316
ON054315
MZ081452
OM436885
OM436872
OM265281
OL711714
MZ422922
MZ422921
MZ568150
MZ568139
MZ568138
MZ568135
MZ568134
MZ568133
MZ374728
MZ374618
MZ374587
MZ448205
MZ448204
MZ266619
MZ156976
MW837779
LC602036
ON054326

相同率
581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)581/581 (100.0%)580/581 (99.8%)a これらの種は現在、Aspergillus 属の種として国際的に認められていないため、簡易分子系統解析からは除外しました（ICPA-International Commission of Penicillium and Aspergillus<http://www.aspergilluspenicillium.org/>）。

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0.01

19

Aspergillus welwitschiae CBS139.54 ET (FJ629340)

9Aspergillus niger CBS113.46 _ (FJ629351)

12

Aspergillus niger ATCC16888 T (AF138904)

13

Aspergillus niger CBS554.65 T (FJ629337)

7

Aspergillus niger CBS120.49 _ (AJ280006)

58

Aspergillus niger NRRL326 T (EF661186)

SIID00000-ITS
708960513794

Aspergillus tubingensis CBS643.92 _ (AJ280008)
Aspergillus tubingensis CBS127.49 _ (AJ280007)
Aspergillus vadensis CBS113365 T (FJ629368)
Aspergillus tubingensis CBS134.48 T (FJ629354)
Aspergillus luchuensis KACC46772 ET (JX500081)
Aspergillus tubingensis NRRL4875 T (EF661193)

Aspergillus brasiliensis CBS101740 T (FJ629321)
Aspergillus sclerotioniger CBS115572 T (NR_077192)

図 1. rDNA の ITS 領域塩基配列に基づく簡易分子系統樹
左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾の略記号は菌類の命名規約上のタイプの種類を、“_”はスペース（空白）を示します。

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2. 巨視的観察 (コロニー観察)
コロニー観察の結果、各平板培養物には下表に示す特徴が認められました。
表 3. 巨視的観察結果 (1 週間)培地

コロニー
直径 (mm)

PDA

65–85

MA

色調※

表面性状

可溶性色素*

表：Brownish grey (5F-2)
裏：Pale yellow (2A-3)

ビロード状－42–45

表：Brownish grey (5F-2)
裏：Yellowish white (4A-2)

ビロード状－

OA

62–67

表：Brownish grey (5F-2)～
White (5A-1)
裏：Pale yellow (2A-3)

ビロード状－

LcA

65–75

Brownish grey (5F-2)～
White (5A-1)

ビロード状－※() 内は Kornerup and Wanscher 7) で用いられている「色」の Code No.を示しています。
*「可溶性色素」の欄内の「−」は観察されなかったことを示しています。

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PDAMAOALcA

図 2. 各平板培地の巨視的観察像 (1 週間)

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3. 微視的観察 (形態観察)
・栄養菌糸
菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、無色～茶褐色、有隔壁菌糸の形成が認められました。
・無性生殖器官
1. 柄および分生子形成細胞
柄 (分生子柄) は栄養菌糸から直立し、非分岐、無隔壁で、表面は平滑、無色～やや着色していました (図 3, 4)。柄の基部には L 字型から T 字型の柄足細胞の形成が認められました。柄の先端が膨らみ、頂嚢の形成が観察されました (図 4)。頂嚢は亜球形～卵形の形状を示しました (図 5)。頂嚢のほぼ全縁からメトレおよび分生子形成細胞であるフィアライドが形成される単列アスペルジラムの構造を示しました(図 5, 6)。フィアライドは首の短いアンプル形でした (図 5, 6)。
2. 分生子
分生子はフィアロ型分生子で、球形、1 細胞、表面は棘状、無色～茶褐色でした (図6)。
・有性生殖器官
約 4 週間の培養検体からは有性生殖器官の形成は確認出来ませんでした。

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図 3. 微視的観察像 (スケールバーは 50 µm)

図 4. 微視的観察像 (スケールバーは 10 µm)

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図 5. 微視的観察像: 分生子形成構造 (スケールバーは 10 µm)

図 6. 微視的観察像: 分生子 (スケールバーは 5 µm)
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考察
微生物同定システム「ENKI」を用いた DB-FU および国際塩基配列データベースに対す
る BLAST 相同性検索の結果、検体の rDNA の ITS 領域塩基配列は子嚢菌門の一種である
Aspergillus niger および Aspergillus welwitschiae の複数の塩基配列に対し相同率 100%の相同性を示しました (表 1, 2)。
DB-FU に対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹 (図 1) において、検体は Aspergillus niger の系統群に属し、その中でも Aspergillus niger および Aspergillus
welwitschiae の複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示しました。
コロニー性状および形態観察の結果、検体は各種平板培地で黒色～黒褐色、ビロード状、裏面が白色～淡黄色に着色するコロニー性状を示し (図 2、表 3)、栄養菌糸から直立した柄の先端部が膨らみ、その周囲からメトレおよびフィアライドが形成され、1 細胞で球形～亜球形、黒褐色、表面が微棘状のフィアロ型分生子が形成される様子が観察されました(図 3～図 6)。検体で観察された特徴は、rDNA の ITS 領域塩基配列解析で検体の帰属が推定される Aspergillus niger group の特徴 8) に類似していると考えられました。しかし、今回の観察結果から種レベルの帰属分類群の推定は難しく、より詳細な観察が必要だと考えられます。
以上のことから、今回の rDNA の ITS 領域塩基配列解析および形態観察の結果において、検体を Aspergillus niger または Aspergillus welwitschiae と同定いたします。

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まとめ検体名SIID

帰属分類群

バイオセーフティ
レベル

SAMPLE

00000

Aspergillus niger Tiegh.またはAspergillus welwitschiae (Bres.) Henn.

レベル 1

バイオセーフティレベルについて

菌類についてのバイオセーフティレベルの分類指針は、微生物株保存機関や文献により若干異なりますので、本報告書においては Atlas of clinical Fungi 9) を参考に示します。
レベル
GRAS

内容
食品にひろく応用利用されている危険性の少ない生物。

1

無脊椎動物に棲息、共生する腐生菌または植物病原菌。ヒト（動物）への感染は、偶発的、表在性であり、非深部性あるいは軽症である。

2

基本的には無脊椎動物に棲息するが、ヒト（動物）組織内においても比較的生育性を示す菌種。
重度の免疫不全患者では、深部性かつ日和見感染性の真菌症を引き起こす。また、表在性の感染を引き起こす病原菌も、本レベルに分類される。

3

健常人でさえも、重篤な深在性真菌症を引き起こす可能性のある病原菌。

推定帰属菌種の分離源情報
推定菌種
分離源
引用文献

Aspergillus niger Tiegh.

BSL

レベル 1

世界各地に分布土壌、植物、果実、豆類、食品、空中、繊維、木材、皮革、ハウスダスト、プラスチック、等
Samson RA, Houbraken J, Thrane U, Frisvad JC, Andersen B. Food andIndoor Fungi. Utrecht: CBS KNAW Fungal Biodiversity Centre; 2010.

備考

簡易分子系統解析において、検体とクラスターを形成した種の情報です。

推定菌種

Aspergillus welwitschiae (Bres.) Henn.

分離源
引用文献
備考

BSL

レベル 1各種植物体上（裸子植物ウェルウィッチア Welwitschia、ニンニク、ブドウ、ドライフルーツ、コーヒー、ココアなど）
Horn S-B, Lee M, Kim D-H, Varga J, Frisvad JC et al. Aspergillus luchuensis,
an industrially important black Aspergillus in East Asia. PLoS ONE
2013;8:e63769.
簡易分子系統解析において、検体とクラスターを形成した種の情報です。

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本報告書に付随する電子データ一覧
データ内容
塩基配列テキストファイル
エレクトロフェログラム
画像形式
txt
ab1jpg補足
1. 本報告書における学名表記は Dictionary of the fungi 第 10 版 10) のウェブ版である Index
Fungorum に基づいています。
2. データベース DB-FU は、当社と国立遺伝学研究所との共同開発品です。当データベースの塩基配列データは、GenBank、DDBJ、ENA などの国際塩基配列データベースに登録されている膨大なデータを吟味した上で、「菌種の絞り込み」に有効と考えられる塩基配列データを選抜し、収録したものです。
3. 国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank) に対する相同性検索の結果は、検索を実施した時点の情報です。国際塩基配列データベースの登録情報は常に更新されており、論文などを投稿する前には再度相同性検索することをお勧めします。
4. 今回の解析結果のうち、簡易分子系統樹はアライメント結果の編集は行っておらず、論文等の投稿を前提としたものではありません。
5. バイオセーフティレベル (BSL) は、当該種に対し定められています。従って、本報告書で示す検体の BSL はあくまでも目安であり、お預かりした検体の帰属分類群の推定が困難な場合には BSL が示せないこともあります。BSL は最低でもレベル 1 となりますが、レベル 1 であっても日和見感染が報告されている種もあり、その安全性を保障するものではありません。また、検体の近縁菌種の BSL が 2 以上である場合、その検体は同等の取扱いをされることをお勧めいたします。本報告書でお知らせした BSL は、微生物株保存機関である ATCC (American Type Culture Collection)、CBS (WesterdijkFungal Biodiversity Institute) および Atlas of clinical Fungi 9) によります。また、当該菌種の BSL に関する情報が見当たらない種については「不明」と表記しています。
「不明」の場合も微生物同定用 DNA データベース DB-FU の BLAST 検索結果の表では出力されていません。
6. 本報告書に関するご質問等につきましては、株式会社テクノスルガ・ラボ 技術部までお問合わせください。

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引用文献1)White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal
RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ (editors).
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press; 1990. pp.
315–322.

2)

O’Donnell K. Fusarium and its near relatives. In: Reynolds DR and Taylor J (editors). The
Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics.
Wallingford: CAB International; 1993. pp. 225–233.

3)

Altschul SF, Madden TF, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z et al. Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res
1997;25:3389–3402.

4)

Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetictrees. Mol Biol Evol 1987;4:406–425.

5)

Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions throughcomparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 1980;16:111–120.

6)

Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution
1985;39:783–791.

7)

Kornerup A, Wanscher JH. Methuen handbook of colour, 3rd ed. London: Eyre Methuen;
1978.

8)

Samson RA, Houbraken J, Thrane U, Frisvad JC, Andersen B. Food and Indoor Fungi. TheNetherlands: CBS KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht; 2010.

9)de Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. Atlas of clinical fungi, 2nd edition. Utrecht:
Centraalbureau voor Schimmelcultures; 2000.

10) Kirk PM, Cannon PF, Minter DW, Stalpers JA. Dictionary of the fungi, 10th edition.
Wallingford: CAB International; 2008.

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