― 75 ―微生物変換によるインジゴの生産―菌株の分離と諸性質―
高橋

巧佑＊・上松仁Production of Indigo by Bioconversion― Isolation of a producer and its properties ―Kousuke TAKAHASHI ＊ and Hitosi AGEMATU（平成20年11月28日受理）
For indole transformation to indigo, we isolated Acinetobacter calcoaceticus BT8 from aKurokawa oil field, Akita prefecture, with an enrichment culture. A. calcoaceticus BT8 grewwell on an agar plate containing 300μg/ml of indole and produced indigo around their colonies.
This indicates that indole is oxidized to 3-hydroxyindole by monooxygenase in the cells, andthen that 3-hydroxyindole is chemically oxidized to form indigo by oxygen outside the cells.
The monooxygenase was considered to be induced by indole to metabolize it. Therefore,
indole was added to a medium when its carbon source was consumed completely to induce theenzyme efficiently. In the optimized conditions, the yield and the formation rate of indigo
were estimated to be 21% and 7.1 mg/Lh, respectively.

1.

緒言

青色染料のインジゴ（藍）は，最も古い天然染料の一つである。少なくとも BC2000年のミイラを包んでいた麻布が藍で染められていたことが知られている。1800年代の終わり頃まで，インジゴはアフリカやアジア，南アメリカに広く分布するコマツナギ属（Indigofera）という植物から得られていた。日本では，絹を使うことを禁止され綿が庶民の衣服として好まれた江戸時代にタデ科の蓼藍（タデアイ）が栽培され，藍染として盛んにインジゴによる染色が行われた。その後，Alfred von Baeyer がインジゴの構造を決定し1887年に初めてインジゴの合成が行われ，1897年に BASF により工業的合成法が開発された。1913年までには天然インジゴはほぼ合成インジゴに取って替わられた。2002年の全世界におけるインジゴの生産量は 1 万 7 千トンである。
インジゴによる染色を理解するには，藍染の原理（図 1）を知る必要がある1）。インジゴは 2 分子のインドールが 2 位で二重結合した構造である。まず，＊

秋田高専専攻科学生

秋田高専研究紀要第44号

藍を含んだ植物（タデアイの葉）を採取する。インドールは植物中では 3 位にグルコースが結合したインジカンとして存在している。この葉をつぶすと葉の中に存在する加水分解酵素によりグルコースが外れてインドキシル（3-hydroxyindole）が生じる。
また，「すくも」を作る場合は，100日間発酵させる。
この間にインジカンは微生物などの加水分解酵素によりインドキシルに変わる。インドキシルは空気により酸化されてラジカルになり，2 分子が重合して

図1

藍染め過程での化学変化

― 76 ―
高橋巧佑・上松仁とを目指し，インドールの 3 位を水酸化してインド水に不溶なインジゴが生成する。こうしてできた堆
キシルを生成する菌の探索を様々な環境の土壌から肥状の塊を「すくも」と言う。次に，藍染の方法について述べる。インジゴは水に不溶な為，染色する行った。
ためには可溶化しなければいけない。「すくも」を大きなかめの中で灰汁（あく）とふすま，お粥，糖2. 実験方法
分などとともに混ぜて放置し，発酵させて還元し，2.1 培地組成及び培養条件
藍のロイコ体であるロイコインジゴ（白藍）に変えて水に溶けるようにする。そして，この中に繊維を本研究で使用した分離培地の組成は，酵母エキス漬け込み，ロイコインジゴを吸着させた後に引き上（pH 6.8）0.1%，ポリペプトン 0.1%，KH2PO4 0.1%，げて，空気にさらして酸化させインジゴに戻して藍である。なお，寒天平板分離培地は1.5%の寒天を加の染色を行う。このインジゴをロイコインジゴにすえた。培養温度は通常30℃で，試験管培養のときはる過程を「建てる」と言い，微生物により還元する
レシプロシェーカで，フラスコ培養のときはロータ場合を「発酵建て」，ハイドロサルファイトなどのリーシェーカで振とう培養した。
還元剤を使う場合を「化学建て」と言う。工芸品としての藍染は「すくも」を用いた「発酵建て」で染2.2 フェノール，インドール資化性菌の集積培養
色を行うが，工業的には合成インジゴを用いて「化畑，公園，山林，油田などから土壌を採取し，耳学建て」でデニムなどの染色を行う。
かきに一杯程の土壌をフェノールもしくはインドー
染料で繊維を染色する為には，それに先立つ染着
ルを最終濃度100μg/ml 添加した分離培地 2ml を入れた試験管に入れて，30℃で一晩，振とう培養を行っという過程が必要になる。染着とは染料分子の繊維た。菌の生育による濁りが見られた培養液200μl をへの吸着で，絹や毛などのタンパク質繊維への吸着
新たに先と同じ組成の分離培地に植菌して，30℃でではイオン結合，疎水性相互作用などが，綿などのさらに一晩，振とう培養を行った。この 2 回の集積
セルロース繊維への吸着では水素結合が主な結合に培養で生育してくる菌は，フェノールもしくはインなる。藍染めでは 2 つの染色法を行うことができる。
ドール資化菌，あるいは耐性菌のどちらかであると一つはインドキシルを繊維に吸着させ空気酸化して予想した。
インジゴにして染色する方法。もう一つはロイコインジゴを繊維に吸着させて空気酸化してインジゴに2.3 インジゴ生産菌の分離戻して染色する方法である。前者は一般に「藍の生2 回目の集積培養液からインジゴ生産菌を分離す葉染め」と言われ，アルカリ性にする必要がないのるために，培養液を生理食塩水で適当に希釈して，でアルカリに弱い絹の染色に適している。しかし，100μg/l のインドールを添加した寒天平板分離培地
インドキシルは酸化されやすく不安定で扱いにくいに塗布して，30℃で一晩培養した。インジゴ生産菌ので藍染めでは後者の方法が用いられている。
はコロニーの周辺がインジゴの生成により青くなる
現在，工業的なインジゴの製造法としては，アニリンとクロロ酢酸，あるいはアニリンと青酸（シので，非生産菌との区別が容易であった。
アン化水素）およびホルムアルデヒドを原料として N- フェニルグリシン塩を製造し，これを高温で2.4 インジゴの定量アルカリ溶融してインドキシル化合物とした後，更液体培養により生成したインジゴは遠心分離で回にこれを空気酸化する方法が採られている（ホイマ
収し，培養液と等量の N, N- ジメチルホルムアミド
ン・プレガー法）。しかしながらこれらの方法は， （DMF）に溶かして，分光光度計で600nm の吸光度
有害な化学薬剤を原料とする，反応工程が多段階で （A600）を測定した。ε＝15,900 /M cm からインジきわめて複雑である，毒性の高い副生物が生成する， ゴ濃度を求めた2）。但し，相対的なインジゴの生産多量の水酸化カリウムと水酸化ナトリウムを使用し量を比較するときは A600を用いた。
なければならずこれらの回収再使用に際して多大のエネルギーを消費する，またそのための特殊な装置
2.5 HPLC 分析が必要である，等の問題点を抱えている。
インジゴの HPLC 分析は以下の条件で行った。
そこで，本研究では化学品の原料として広く流通カラム：ZORBAX SB-Aq（4.6I.D. ×150mm）
しているインドールを原料として微生物変換により移動相：70% MeOH（v/v）
インジゴを環境負荷をかけずに経済的に生産するこ
流速：0.5 ml/min
平成21年２月

― 77 ―
微生物変換によるインジゴの生産

カラム温度：40℃
検出：UV 280nm（インジゴのみ分析するときは600nm）
この分析条件で，インジゴ，インジルビンの保持時間はそれぞれ，9.18分，23.7分であった。
インドールの HPLC による定量は以下の条件で行った。
カラム：YMC JH-307（4.6I.D. ×75mm）
移動相：60% MeOH（v/v）
流速：1.0ml/min
カラム温度：40℃
検出：UV 280nm
この条件でインドールの保持時間は2.1分であった。
2.6 インジゴ生産菌の同定
10F : 5’-GTTTGATCCTGGCTCA，
800R : 5’-TACCAGGGTATCTAATCC の 2 つのプラ
イ マ ー を 用 い て， 生 産 菌 の ゲ ノ ム の16SrDNA 領
域 を PCR 法 に よ り 増 幅 し， 得 ら れ た DNA 断 片（753bp） を シ ー ク エ ン ス 後，National Center for3）
Biotechnology information（NCBI）の BLAST サー
チでホモロジー検索を行った。

た。
そこで，芳香族化合物に対する耐性が高い菌が成育していると期待できる油田の土壌からの菌の分離を試みた。秋田市の黒川油田の汲み上げポンプ周辺（図 2）の原油が染み込んだ土壌を採取し，集積培養によりインジゴ生産菌 5 株（BT6～10）を分離した。また，草生津川周辺から採取した土壌サンプル

図2

黒川油田の汲み上げポンプ

図3

インジゴ生産菌のコロニー

2.7 NTG 変異処理
インジゴ生産菌のインドール耐性能を上げるた
めに N- メチル - N ’- ニトロ - N - ニトロソグアニジン（NTG）による変異処理を行った。菌株を 2ml の分離培地に植菌して30℃で一晩振とう培養した。この培養液から7500rpm，8 分の遠心分離により菌体を回収し，0.1M クエン酸緩衝液（pH 5.5）で 2 回洗浄後， 菌 体 に0.4ml の NTG 液（250μg/ml） と0.6ml の0.1M クエン酸緩衝液（pH 5.5）を加えて30℃で30分間振とうした後，遠心分離により菌体を回収し，生理食塩水 2ml で 3 回洗浄を行った後，回収した菌体に分離培地 1ml を加え，この菌液20μl を 2ml の分離培地に植菌して30℃で一晩振とう培養した。培養液を適当に希釈して目的の濃度のインドールを添加した寒天平板培地に塗布してインドール耐性菌の分離を行った。
3.

実験結果および考察

3.1 インジゴ生産菌の分離
一般的な土壌から集積培養により35株（BK1～35）のインジゴ生産菌を分離した。しかし，これらの菌株はインドール濃度100～200μg/ml が成育限界であったので蓄積するインジゴの量が不十分であっ秋田高専研究紀要第44号

― 78 ―
高橋巧佑・上松からも 5 株（BT1～5）のインジゴ生産菌を分離した。
草生津川からの分離株はインドール耐性が150μg/ml であったが，黒川油田から分離した株は300μg/ml であった。BT8 株はインドール濃度300μg/ml の寒天平板でコロニーを作ると，コロニーの周りがインジゴの生成により青くなり（図3A），これを顕微鏡で見るとコロニーの周りにインジゴの結晶が生成しているのが観察された（図3B）。このことからインドールは菌体内に取り込まれモノオキシゲナーゼにより酸化されてインジカンになり，一部が菌体外に排出されて水溶液中の酸素により化学的に酸化されてインジゴになり結晶化したものと考えた。
3.2 インジゴ生産菌の遺伝的安定性
インジゴ生産菌を継代培養をしていくと生産能が脱落していくことが一般に見られることから，インジゴ生産菌の遺伝的安定性を調べた。インジゴ生産菌をインドール濃度300μg/ml の液体培地で30℃で一晩振とう培養してインジゴの生産を確認後，インドール濃度300μg/ml の寒天平板に塗布してインジゴを生産しない白色コロニーが生じるか見た。その結果，BT8 株においては白色コロニーの出現が全く見られず遺伝的安定性が高いことが分かり，以後の実験に用いることにした。

仁由来の炭素源が無くなってからインドールを資化するために誘導される誘導酵素であると考えた。したがって，栄養源が豊富な培地ほどインドールを資化する必要がないのでインドール酸化酵素は誘導されないことになる。
3.5 BT8 株の NTG 変異処理
インジゴの生産量は培地に添加するインドール濃度に比例している。BT8 株のインドール耐性を上げることによりインジゴ生産能力の向上を図った。
BT8 株 の イ ン ド ー ル 耐 性 は400μg/ml ま で で あ った。そこで，NTG により BT8 株に突然変異を起こさせ，その中からより高濃度のインドールを添加した寒天平板で生育できる菌のスクリーニングを行った。その結果，500μg/ml でも生育できる菌を分離することが出来，BT8-1A 株と名付けた。
3.6 インドールの添加時期の検討
BT8-1A 株を分離培地に植菌して，培養の初めからインドールを添加すると300μg/ml が限界だった。
それ以上の濃度では生育しなかった。そこで，30℃で培養開始後に時間をおいて400μg/ml のインドールを添加してインジゴへの変換実験を行った。

3.3 BT8 株の菌株同定
シークエンスした配列をNCBIの BLAST 検索にかけたところ，登録されているAcinetobacter calcoaceticus
16S ribosomal RNA（ 登 録 番 号：EF432578） の22番目から774番目までの塩基配列と完全に一致したことから，BT8 株を Acinetobacter calcoaceticus BT8と命名した。Acinetobacter はグラム陰性の桿菌で運動性を有さず，広く環境中に存在する細菌である。
3.4 インジゴ変換の培地検討
菌濃度が高いほどインジゴ生産量が高いと考え，分離培地の濃度を 2, 3, 4 倍と上げた高濃度培地と大腸菌の培養で使われている LB 培地（トリプトン1.0%，酵母エキス0.5%，塩化ナトリウム1.0%，グルコース0.1%，pH 7.2）を用いてにてインジゴの生産実験を行った。24時間培養で通常の分離培地では濁度（A680）が0.95であったのに対して，4 倍濃度の培地では1.71，LB 培地では2.57と菌体濃度が増加した。しかし，インジゴの生産量（A600）はインドー
ル400μg/ml 添加でそれぞれ，3.32，0.54，0.41と培地濃度の低い分離培地での生産量が最も高かった。
この結果から，インドールを酸化する酵素は，培地

図4

インドール添加時期の検討

図 4 の結果より，培養開始 3～4 時間でのインドー
ルの添加が最も生産量が高いことが分かる。この時期は菌の対数増殖期の初めに当たると考えられ，最もタンパク質の生合成が盛んな時期である。誘導酵素であるインドール酸化酵素を多量に誘導するためにはこの時期にインドールで誘導をかける必要があると判断した。この時期を逃して 4 時間以降に添加
平成21年２月― 79 ―微生物変換によるインジゴの生産した場合にはすでにタンパク質の合成時期を過ぎているので誘導酵素が余り作られなくなる。図 5 に培養開始後，0，3，5，7，9 時間後のインドール添加のフラスコ培養試験の結果を示す。0 時間の添加では菌の生育は見られず，5 時間後の添加が最もインジゴの蓄積量が多かった。9 時間後では菌は生育しているが変換は全く見られなかった。

図5

フラスコ培養によるインドールの添加時期

3.7 BT8-1A 株の培養の経時変化
先にインドールの最適な添加時間が分かったが，最適培養時間は培養温度，培養条件により変わるので，菌体濃度（A680）と関連付けることにした。
そこで，BT8-1A 株の分離培地，30℃，フラスコ培
養（20ml/100ml-F）における pH と菌体濃度の経時変化を測定した。結果を図 6 に示す。

図6

時，炭素源が無くなっているのでインドールを添加すると効果的にインドール水酸化酵素を誘導することができる。芳香族化合物の資化は水酸化から始まる。この時の濁度（A680）は0.21であるので，インドールの添加時期は，以後の実験では濁度が0.2～0.3になったときとした。
3.8 添加するインドール量の限界と変換収率
インドール添加の最適なタイミングが分かった
ので，BT8-1A 株が果たしてどのくらいのインドール濃度まで変換できるのか実験した。分離培地，28℃，フラスコ培養（10ml/100ml-F），濁度（A680）が0.36に な っ た と き， 最 終 濃 度 で100，200，300，400，500μg/ml のインドールの DMSO 溶液を添加した。培養を22時間まで行い生成したインドールを定量した。図 7 に示すように500μg/ml 添加では菌が生育せず変換は起きなかった。BT8-1A 株のインジゴ変換の限界濃度は400μg/ml であった。インジゴの生産量はインドール濃度が高くなるにつれて増加した。図 8 に示すように，インドールからインジゴへの変換収率は，添加量が増えるにつれ増加し，400μg/ml 添加で収率が最も良く21％であった。収率が低いのは菌がインドールを資化しているためと考えた。

BT8-1A 株の培養の経時変化
図7

添加インドール量と生成したインジゴ濃度

培養開始とともに pH が下がっていく。これは培地成分中の炭素源を異化代謝して有機酸が生成した為である。そして培養 5 時間から pH が上昇してい3.9 インドールの消費速度の測定る。これは炭素源を全て消費して次にアミノ酸を異水に不溶なインジゴを経時的に正確に定量する
化代謝する際にアンモニアが生成したからである。 のは難しいので，インドールの消費速度からイン培養10時間で全ての栄養源を消費尽くして定常期にジゴの生成速度を予想した。30℃，フラスコ培養入る。この結果よりインドールを添加するタイミン （100ml/500ml-F），濁度0.34（培養 4 時間後）で300
グは pH が上昇し始める培養 5 時間後になる。このμg/ml のインドールを添加した。その後，経時的に秋田高専研究紀要第44号

― 80 ―
高橋巧佑・上松

図8

各添加量における変換収率

サンプリングして培養液中のインドール濃度を定量した。結果を図 9 に示す。矢印が300μg/ml のインドールを添加した時期である。2 回添加した。1 回目添加の減少の直線部分から傾きを求めるとインドールの消費速度は39.2 mg/Lh であった。先の300μg/ml 添加の収率18％から計算するとインジゴの生成速度は7.1 mg/Lh と予想される。また，培養30時間まで変換活性が持続することが分かった。
3.10 微生物を用いた絹の藍染
本研究の目的は藍染めに用いることができるインジゴを製造することにある。最終的に生成したインジゴは遠心分離により回収してアルカリ条件下，ハイドロサルファイトで還元してロイコインジゴにして木綿を染着，染色することができる。
一方，もう一つの染色法であるインドキシルによる絹の染色を試みた。双極分子であるインドキシルは絹などのタンパク質に吸着するが，セルロースには吸着しない。建て染めはアルカリ条件下で行うためタンパク質である絹を痛めることになる。中性で絹を簡単に藍染めできる方法が求められている。
37℃，フラスコ培養（100ml/500ml-F），濁度0.34（培養2.5時間後）で300μg/ml のインドールを添加した。同時に煮沸処理をした 2 個の繭（蛹は取り除いている）をフラスコに入れて振とうした。1.5時
間で繭を鮮やかな藍色に染色することができた。
4.

結論

黒川油田の原油が染み込んだ土壌からインドール資化性を指標にした集積培養により Acinetobacter

仁

図9

インドール消費速度の測定

calcoaceticus BT8 株を分離した。BT8 株はインドー
ル濃度300μg/l の寒天平板上で生育することができ，通常の畑などから分離した菌よりもインドール耐性が高かった。インドールをインジゴへ変換するインドール 3 位水酸化酵素はインドールの資化に関わる誘導酵素であると予想され，培地の炭素源が枯渇する次期（濁度 A680＝0.2～0.3）が最適なインドールの添加時期であった。誘導された水酸化酵素は30℃培養では培養30時間まで活性が持続した。この時のインジゴ最高生成速度を7.1mg/Lh と予想した。変
換収率は400μg/l インドール添加で21％であった。
他のインドールは菌により資化されたと考える。
今後の予定は，BT8-1A 株で変換できるインドー
ル濃度の限界が400μg/ml なので，更にインドール耐性を上げることによりインジゴの蓄積濃度を上げていく。さらに，染色したい場所に不安定なインドキシルを微生物により生成することができるので，この微生物変換の特性を活かした藍染めの開発を行っていきたい。
参考文献
1） 青柳太陽：「工芸のための染料の科学」，理工学社，pp.24-34（1994）
2） A. Meyer, M. Wursten, A. Schmid, H-P E.
Kohler, and B. Witholt :“Hydroxylation ofIndole by Laboratory-evolved
2-Hydroxybiphenyl 3-Monooxygenase”,
J. Biological Chemistry, 277, 34161-34167（2002）
3）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

平成21年２月