医療環境委員会主催セミナー
医療環境中の上⽔について考えるⅡ〜⽔に関連する医療関連感染 ＜各論＞〜

E. coli

2024年5⽉17⽇web

レジオネラ症・Legionella属菌による感染症の総称

P. aeruginosa

医療環境におけるレジオネラの⽔質検査

ポンティアック熱型（予後良好）
肺炎型（重症例が多い）

・Legionella属菌は69菌種（未登録5菌種）

好気性グラム陰性桿菌、0.3〜0.9 x 2〜20µm
BCYE培地など特殊な培地が必要
⼟壌や河川、湖沼などの⾃然⽔系で⽣息、または空調設備、冷却塔⽔、循環式浴槽⽔、給湯器などの⼈⼯⽔系中に⽣息する⾃由⽣活アメーバーに寄⽣している。
レジオネラ症の診断症例中98%以上はL. pneumophila ⾎清群1である。

⼤阪⼤学⼤学院医学系研究科
変⾰的感染制御システム開発学寄附講座/感染制御学講座
⼤阪⼤学感染症総合教育研究拠点(CiDER)
⼤阪⼤学医学部附属病院感染制御部

⼭本 剛

・感染経路

エアロゾルや粉塵の吸⼊により起こる。
マクロファージ内で増殖し、⾼齢者や新⽣児、免疫不全者はハイリスク者

E. faecium
Osaka University Graduate School of Medicine /CiDER/Hospital Infection Control

1

http://www.iph.osaka.jp/s012/050/010/030/050/20181121153857.html

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レジオネラ肺炎患者の診断と喀痰性状レジオネラ症患者から分離された原因菌レジオネラ肺炎と診断された124⼈のうち、喀痰検査を実施した104⼈が対象
・83％が尿中抗原陽性

必ずしも膿性痰ではない・尿中抗原陽性例で培養陽性が47%
全てL. pneumophila SG1・尿中抗原陰性例で培養陽性が78%
L. pneumophila SG1
29%
L. pneumophila SG3
43%
L. pneumophila SG914%
L. longbeachae
14%
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針
Osaka University Graduate School of Medicine /CiDER/Hospital Infection Control

3J Clin Microbiol. 2024 Apr 10;62(4):e0166523.

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4喀痰グラム染⾊

BCYEα培地上のコロニー
グラム染⾊ Legionella

レジオネラ菌を⽬的とした検体採取・臨床検体・呼吸器材料︓喀痰、BAL、気管内吸引物、胸⽔・呼吸器材料以外︓⾎液、髄液、⼼のう⽔など・抗体価測定や尿中抗原検査もある。

・環境検体

喀痰ヒメネス染⾊・冷却塔⽔︓直接落下⽔か受⽫中央部の表層⽔
・浴槽⽔︓容器に触れないように、柄杓を利⽤して浴槽中央部を採⽔・給湯⽔︓蛇⼝やシャワーヘッドよりそのまま採取。
・蛇⼝やシャワーヘッド︓綿棒で拭い⽣⾷1〜2mlで懸濁。

WYOα寒天培地

国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

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滅菌容器に採取をする。
乾燥を防ぎ、雑菌の混⼊を避ける。
冷蔵保存（2⽇以内）または凍結保存。

滅菌したポリエチレン容器に500mL⼊れる。
塩素を含む場合は、25%チオ硫酸Naを500倍にして中和（容器は市販品あり@350）。
検⽔の種類、採⽔場所、⽇時、設備名、⽔温、pH、残留塩素濃度などを記⼊。
直射⽇光を避けて、6から18℃で輸送し2⽇以内に検査。残余⽔は4〜8℃で保管し再検査は5⽇以内で実施。

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冷却塔⽔および温泉⽔・循環浴槽から検出されるレジオネラ菌
⾃然環境中からの分離
表層部の⼟壌︓6.3%
表層部と20〜30cmの⼟壌︓10%
⾎清群1が多く、次いで⾎清群3病院の⽔からの分離
カナダの病院︓67.9%
⼤学病院︓65.8%
冷却塔からの分離
⽇本︓60.8〜61.3%
⾎清群1が多く、次いで⾎清群5や6
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

衛⽣微⽣物技術協議会第39回研究会（滋賀）Osaka University Graduate School of Medicine /CiDER/Hospital Infection Control

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採⽔箇所によるレジオネラ属菌の検出率
採⽔箇所
掛け流し式
循環式計

検体数

検出数

検出率

浴槽⽔

533260%湯⼝⽔

512039%浴槽⽔

291138%湯⼝⽔271452%

160

7748%

家庭内におけるレジオネラ検出状況︓「レジオネラ検査の標準化及び消毒等に係る公衆浴場等における衛⽣管理⼿法に関する研究」

初回検出時洗浄効果の確認

採取条件
検⽔
スワブ

検査法

培養検査
遺伝⼦検査
アメーバー増菌法

https://mhlw-grants.niph.go.jp /system /files /2015/154061/201525002B/201525002B0005.pdf
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検査⽬的

検査の対象

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新⽣児ユニットの給⽔に関連したアウトブレイクの原因微⽣物

Antimicrob Resist Infect Control (2021) 10:77

家庭内におけるレジオネラ検出状況︓「レジオネラ検査の標準化及び消毒等に係る公衆浴場等における衛⽣管理⼿法に関する研究」
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12⻭科ユニットの給⽔に関連したアウトブレイクの原因微⽣物

国⽴感染症研究所Burkholderia cepacia,
Chryseomonas luteola
Pseudomonas fluorescens
Ralstonia pickettii
Sphingomonas paucimobilis
Pseudomonas aeruginosa

⽇本建築衛⽣管理教育センター

Legionella pneumophila
non-tuberculous mycobacterialspecies

Antimicrob Resist Infect Control (2021) 10:77

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環境からのレジオネラ属菌の検査フロー

記載内容の違い

ろ過濃縮法

冷却遠⼼濃縮法

国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

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16濃縮検⽔を⽤いた検査

濃縮検⽔を⽤いた検査
環境⽔は原則として⾮濃縮検体と濃縮検体（ろ過濃縮法と冷却遠⼼濃縮法）を並⾏して検査する。
採取された検体の菌数を予測出来ないので、レジオネラ属菌数が少ないことが推定される場合においては、濃縮検⽔のみでもよい（清掃消毒直後の検⽔等）。
ろ過濃縮法はISO 11731 2017
冷却遠⼼濃縮法はJIS K 0350-50-10:2006

⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針
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国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

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濃縮検⽔を⽤いた検査

ろ過濃縮法（推奨）

検⽔500 mLを直径47mm、孔径0.20〜0.22μmのポリカーボネートメンブランフィルターで吸引ろ過する。フィルターを剥がし5mLの滅菌超純⽔で1分間ボルテックスする（100倍濃縮）。超⾳波処理でより効率良く菌が回収できる。
注意点）
・孔径0.40〜0.45μmでは菌が通過してしまう。
・セルロース系フィルターは菌の回収率が下がる。
・濁度の⾼い検体ではろ過が困難な場合がある。

冷却遠⼼濃縮法（ろ過濃縮ができない場合に実施）
滅菌した蓋付きの遠⼼管に検⽔200mLを⼊れ、6,000gで10分⼜は3,000gで30分、15〜25℃で遠⼼する。
注意点）
・遠⼼はブレーキ設定せず、⾃然に停⽌するのを待つ。
・上清は、滅菌ピペットもしくはアスピレーター等で除去する。
・管壁に付着した菌は良く洗い剥がす。

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国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）

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検体の処理⽅法

検⽔の前処理と培養検査

環境⽔には夾雑菌（⽷状菌や緑膿菌など）が存在し、レジオネラ菌属の回収効率を下げる原因となるため、酸や熱を加えることで夾雑菌の発育を抑制する。夾雑
菌が多い場合は、熱処理に酸処理を加えて⾏う。

酸処理
濃縮検⽔に0.2M HCl KCl緩衝液（pH2.2）を等量加えて、室温で5分間反応させる。
Bacillusの発育抑制を⽬的。キット化された商品が市販されている。

熱処理

濃縮検⽔1〜2mlを50℃で20分（汚染が強い場合は30分）加温。処理後は直ぐに室温（氷冷不可）に戻す。緑膿菌などブドウ糖⾮発酵菌の発育抑制を⽬的。
注意）60℃,4分以上処理すると検出率が低下する。

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国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）
⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

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培養検査

レジオネラ属菌が検出された場合

未処理検体と処理済み検体をそれぞれ100μL培地に接種する。

①⼈が直接吸引する可能性のない場合

102cfu/100ml以上のレジオネラ属菌が検出された場合、直ちに清掃・消毒等の対策を講じる。
また、対策実施後は検出菌数が検出限界（10cfu/100ml未満）以下であることを確認する。

例︓未処理検体に100μL、酸処理検体に100μL 、熱処理検体に100μL
発育菌は数量をカウントするので、培地⼀⾯に塗り広げる。

②浴槽⽔、シャワー⽔等を⼈が直接吸引するおそれがある場合

接種後は36±1℃で培養を⾏い、2⽇⽬から毎⽇確認し最⻑7⽇間培養する。
通常では3⽇⽬から微⼩コロニーが確認され、5〜7⽇⽬で直径3〜5mmのコロニーの発育を認める。

レジオネラ属菌数の⽬標値を10cfu/100ml未満とし、レジオネラ属菌が検出された場合、直ちに清掃・消毒等の対策を講じる。
また、対策実施後は検出菌数が検出限界以下であることを確認する。

発育コロニーはBCYEα培地とL-システイン不含有培地（⾎液寒天培地など）に再分離し発育を確認する。
国⽴感染症研究所︓病原体検出マニュアル（レジオネラ症）

厚労省監修︓新版レジオネラ症防⽌指針（概要）

⾃施設で判断ができない場合は「⾃主検査でレジオネラ属菌が検出された場合」なども参考

⽇本建築衛⽣管理教育センター︓第4版 レジオネラ症防⽌指針

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24病院内の給⽔・給湯⽔における微⽣物汚染調査
R2A培地

標準寒天培地Methylobacterium spp.
Sphingomonas paucinmobilis

Methylobacterium spp.
Sphingomonas paucinmobilis

Alcaligenes xylosoxidans
Enpedobacter brevis
Chryseobacterium
meningosepticum
Acinetobacter lwoffii
Alcaligenes spp.
Gram Negative Rod

Alcaligenes xylosoxidans
Enpedobacter brevis
Chryseobacterium
meningosepticum
Enterobacter cloacae
Gram Negative Rod

Bacillus spp.
Staphylococcus epidermidis

Bacillus spp.,Bacillus cereus
Staphylococcus epidermidis

GVPCα寒天培地（レジオネラ症防⽌指針推奨培（NHS Pseudomonas属菌培地）地）
Methylobacterium sp.
Legionella pneumophilia

レジオネラ検査⽤培地

NAC寒天培地（⽔道法、従属栄養細菌） （⽔道法、⼀般細菌）培地
⾮選択培地

Alcaligenes xylosoxidans
Agrobacterium radiobacter
Burknolderia cepacia
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas spp.

⽷状菌
⽷状菌
Mycobacterium mucogenicum
環境感染 Vol.24 No.5 pp.303-311, 2009

L-システインを含む
ピロリン酸第⼆鉄チャコールを含む

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販売メーカー

選択剤

栄研化学、関東化学（ Oxoid 製品）、⽇本BCYEα寒天培地 BD 、⽇研⽣物医学、ビオメ なし
リュージャパン、極東製薬⼯業、島津ダイアグノスティック
選択培地
ポリミキシンBWYOα寒天培地 栄研化学
バンコマイシンアムホテリシンB
メルク、関東化学（ Oxoid製品）、⽇研⽣物医学、ビ ポリミキシンB
GVPC寒天培地
オメリュージャパン、極東製薬 バンコマイシン
⼯業、島津ダイアグノスティック
ポリミキシンB
MWY寒天培地 関東化学（ Oxoid 製品）
バンコマイシン
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レジオネラ検査⽤培地

斜光法によるコロニーの確認
極東製薬パンフレットより

L. pneumophila
35℃で5⽇間、好気培養

BCYEαベース
L-システインなし

BCYEαベース
L-システイン有り

MALDI-TOF MSを利⽤して同定

実体顕微鏡
横から光を当てる

L. pneumophila

分離集落の特⻑を利⽤したレジオネラ属菌分別法の有⽤性︓環境感染誌2010,vol25,8-14.

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夾雑菌が発育してレジオネラ属菌が⾒にくい

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MALDI-TOF MSの原理

⾃家発光によるコロニーの確認菌種によって異なる
リボゾーム蛋⽩（種特異性）

薬⽣衛発0919第1号 令和元年9⽉19⽇︓公衆浴場における浴槽⽔等のレジオネラ属菌検査⽅法について同定ができない菌
S. Typhi ↔ Non-typhi Salmonella
E. coli ↔ Shigella
M. tuberculosis,B. pseudomalleiなど
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UVを照射すると⾃家発光する菌が存在

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アメーバー増菌法

培養検査の感度
複数種類使⽤すると感度が上がる

遺伝⼦検査は培養より感度が⾼い培地

未加熱

加熱

LAMP法
（遺伝⼦検査）WYOα寒天培地

5459＋ーGVPC寒天培地

5763＋

6413775859ー285583

MWY寒天培地

培養法

計（n=160）

レジオネラ属菌の性質を利⽤して純培養したアメーバと試料を共培養し、アメーバの中でレジオネラ属菌を増殖させてから検出する⼿法。
⼈⼯培地では発育しない状態のレジオネラ属菌も検出することができる。

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家庭内におけるレジオネラ検出状況︓「レジオネラ検査の標準化及び消毒等に係る公衆浴場等における衛⽣管理⼿法に関する研究」

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検査機関への依頼

地衛研71施設の外部精度管理状況

・最寄りの保健所、地⽅衛⽣研究所と相談・コマーシャル・ラボに依頼をする

厚⽣労働⼤⾂による指定検査機関
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/topics /bukyoku/kenkou/suido/kentoukai/kanri.html
https://www.mhlw.go.jp /content/10900000/000537178.pdf
衛⽣微⽣物技術協議会第39回研究会（滋賀）Osaka University Graduate School of Medicine /CiDER/Hospital Infection Control

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Takehome message
・標準的なレジオネラ属菌の検査法を確認する
・環境検査では採⽔の⽅法、処理法、培養および遺伝⼦検査のどれを使うのか確認する
・外部機関へ委託する場合は委託先の業務内容を確認する（内部精度管理、外部精度評価含む）
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