ことが行われてきた．しかし，試料を傾斜させるこの手法は，傾斜後に同一部位を捜すのが煩雑であるだけでなく，2 枚の画像の撮影に時間差ができてしまうために，顕微鏡内でリア

リアルタイム 3D 走査電子顕微鏡の医学生物応用
Application of a Newly Developed RealTime 3D Scanning Electron Microscopeto the Biomedical Research

ルタイムに観察できないことなど，実際の観察において避けられない問題点もあった．さらに，得られた写真の観察も，裸眼による平行視または交叉視が一般的なことから，必ずしもすべての人が同じように「見える」とは限らないというジレンマもあった．また，スクリーンへの投影においても，偏光板を付けた特殊な 2 台のプロジェクタと偏光メガネが必要で，こうした煩雑な状況が，SEM の 3D イメージングの普及を阻んできたのではないだろうか．

牛木ａｂ

辰男 ，伊東 祐博 ，伊藤岩田太ｄ，甲賀 大輔ａｃ

広 ，ところが，近年のさまざまな技術の進歩により，SEM のステレオ（3D）観察にも新しい時代が訪れようとしている．

Tatsuo Ushiki, Sukehiro Ito, Hiroshi Ito, Futoshi Iwata

ここでは，SEM の一般的な 3D 観察法と，私たちが最近開and Daisuke Koga

発したリアルタイム 3D-SEM について，生物応用例を中心

ａ

新潟大学大学院医歯学総合研究科顕微解剖学分野ｂ（株）日立ハイテクノロジーズ先端解析システム第一設計部
ｃ（株）ナナオ映像商品開発部
ｄ
静岡大学工学部機械工学科
要旨

走査電子顕微鏡の通常の撮影法では単眼視の画像しか得られない．より立体的な画像を得るためには，試料台を傾斜させた 2 画像の立体視を行うが，この方法ではリアルタイムの観察ができない．そこで，われわれは，電子線傾斜方式と 3D 液晶モニタを用いて，リアルタイムで3D 表示ができる顕微鏡を開発した．本稿では，その簡単な原理と，生物応用としての 3D イメージング，さらにマニピュレーションへの応用について紹介する．に紹介する．
2.

試料傾斜法による一般的な 3D イメージング

すでに述べたように，SEM による 3D 画像の取得には，試料を機械的に傾斜してステレオペア像を撮影する手法が古．この手法そのものには特に新くから行われている（図 1A）
しいところはないが，最近の試料ステージの進歩や液晶モニタ技術やコンピュータ技術の発展から，このステレオペアの情報を，以前より簡単かつ能率良く撮影し有効に表示することが可能になっている．たとえば，撮影については，モーター駆動のユーセントリック試料ステージを用いることで，比較的能率の良い連続傾斜撮影が可能である．また，表示モニタについては，液晶モニタ技術の発達により，従来の偏光メガ

キーワード：走査電子顕微鏡，立体視，3D 液晶モニタ，生物試料，マニピュレーションネを用いて観察するタイプのモニタ以外にも，メガネをいっさい用いることなく裸眼で立体映像を見ることができる裸眼
3D 液晶モニタも開発されてきており，これらのモニタを用

1.

はじめに走査電子顕微鏡（SEM）は，電子線を試料表面に照射し走査することにより，観察物の表面形状を立体的に表示することができる魅力的な電子顕微鏡である．この特徴を生かして，材料系のみならず生物系においても，多様な応用が行われてきた．とくに，医学生物学の分野では，透過電子顕微鏡
では知ることができない，細胞や組織の立体微細構造の解析に役立ってきた 1）．
ところで，得られた SEM 像は，そのままではカメラで写した写真のように単眼視の情報のため，SEM 本来の三次元画像が十分に生かされているとはいえない．そこで，SEMが実用化された当初から，両眼視観察を行うために，試料を機械的に傾斜して視差角のある 2 枚のステレオペア像を得る
ａ〒 951–8510 新潟市中央区旭町通 1–757
TEL: 025–227–2058; FAX: 025–224–1767
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2010 年 7 月 20 日受付
198

図 1 SEM の 3D イメージング法（試料傾斜法 A と電子線傾斜法 B）
A．試料傾斜法では，一度撮影した後に，試料を 4 ～ 8° 傾けて，同一視野を再度撮影することによりステレオペア像を取得する．B．電子線傾斜法では，電子線を光路上で傾斜（チルト）させて，視差角のあるステレオペア像を取得する．

顕微鏡 Vol. 45, No. 3（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

いると，誰でも簡単にステレオペアの立体視が可能である．

ステレオペア像を同時に取得することができるようにしていまた，コンピュータが一般化したことで，取得したステレオる．電子線の傾斜の切替は高速走査にも対応しており，そのペア像をアナグリフ（赤青画像）表示などに簡単に変換でき

結果，TV スキャンでもフレームレートは半分になるが，3Dるようになり，赤青メガネを使って普通のモニタや印刷媒体像の観察が可能である．したがって，この装置に 3D モニタ

でも自由にステレオ画像を楽しめるようになってきたを搭載することで，観察者は，SEM の操作をしながらリア（図 2）．さらに，低倍率から高倍率まで段階的に 3D 像を撮

ルタイムで 3D 画像を観察することが可能である．現状の影し，コンピュータ上のブラウザで自由に拡大や縮小を行う

3D-SEM 観察においては ± 2 ～ 3° の視差角があれば，十分ことや，数度単位で連続的に傾きを変えて撮影した複数の画な立体感が得られることがわかってきている．また，この装像を用いて，標本を回転することも可能である．こうした，置ではステレオペア像を一回のボタン操作で簡単に撮影する

3D コンテンツの集積により，従来の単眼視の観察では見落ことができるので，予め試料の凹凸情報を TV スキャンまたしがちな情報や錯覚に陥っていた情報を，正確に把握するこはスロースキャンモードで十分理解した上で，目的のステレ

2）とが可能になってきている ．
3.

オペア像を撮影することができる（図 4）．
観察時の 3D モニタについては，多様な形式のものが現在

リアルタイム 3D-SEM による 3D イメージング市販されてきている．したがって，観察時にはステレオペア試料を機械的に傾斜して得られる 2 枚のステレオペア像画像をアナグリフ表示して赤青メガネで 3D 観察する方法やは，試料傾斜さえできれば市販されているどの装置において専用の偏光メガネを用いる 3D 液晶モニタが一般的である．

も撮影が可能である．しかし，この方法では 2 枚の画像を別々に撮影しているので，SEM の試料室に置かれた標本をリアルタイムに 3D 観察することはできない．この問題を解決するためには，SEM 観察時に電子線を傾斜させて，リアルタイムにステレオペア像を取得する方式（電子線傾斜方式，
図 1B）が便利である．実際に，視差角の調節や低真空観察にも応用できることから，これまでにもこの方式を用いたス
テレオ SEM がいくつか考案されてきている 3）．しかし，解像度や表示法の問題などから，実用的な装置がなかなか出てこなかった．
そこで，最近私たちはこの問題を克服したリアルタイム
3D-SEM の開発を行ってきた（図 3）4,5）．電子線を傾斜させる方法はさまざまであるが，この装置ではレンズの偏向作用を利用して電子線を傾斜させている．電子線の傾斜は 1 ライン
単位ごとに左右の傾斜を切替え，同一のラインを右傾斜視野，

図 3 リアルタイム 3D-SEM の基本構成
電子線を 1 ラインごとに傾斜させ，ステレオペア画像を同時に取得し，3D モニタにより直接 3D 表示ができるようになっている．また，電子光学系には，電子線傾斜時に発生する軸外収差を低減するため，収差低減レンズ，傾斜コイルを追加してある．

左傾斜視野と 2 回走査することで視差のある 2 枚（左右）の

図 2 試料傾斜法で撮影したラット気管の 3D 像（アナグリフ表示）
この標本では試料を 4° 傾けてステレオペア像を取得している．

最近の研究と技術

リアルタイム 3D 走査電子顕微鏡の医学生物応用

図 4 リアルタイム 3D-SEM で撮影したラット膵臓の外分泌部（アナグリフ表示）
電子線傾斜法によりステレオペア像をリアルタイムで取得したもの．この標本は，KOH 処理法でコラーゲン成分を取り除いてあるので，腺房がはっきり立体的に見えている．腺房間の細い紐状の構造は毛細血管である．

199【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

さらに最近では，特別なメガネを用いないで，そのまま裸眼いる．医学生物学分野における一般的な使用においては，十で 3D 観察が可能な 3D モニタが開発されている．この裸眼分な性能といえるだろう．

3D モニタについては，リアルタイム 3D-SEM に搭載することで，あたかも自分の眼で自然に標本を眺めるような気分で4.

観察ができる点が魅力であるが，現在一般に市販されている

このように SEM によるリアルタイムでの 3D メージング

ものでは，モニタに対する視点位置によって右目像と左目像が可能になると，SEM の生物応用の可能性がさらに広がるが入れ替わる「逆視」の現象が起こるなどの問題点もあり，のではないかと思う．たとえば，SEM 内で試料のマニピュ今後のさらなる技術革新が期待される点である．

リアルタイム 3D-SEM によるマニピュレーションレーションを行う際には，リアルタイム 3D-SEM が威力をところで，電子線傾斜方式では，電子線が対物レンズの軸発揮しそうである．それは，マニピュレーションにおいては，外を通過するために，軸外収差が増大し，これに伴い，分解解剖針と試料との立体的な位置関係を正確に把握することが能が低下するなどの問題が起こる．その例として図 5 に熱重要であるからである．その点で，単眼視のリアルタイム観電子型電子源とアウトレンズの構成における電子線傾斜角度察しかできない従来の SEM では，観察している部位の奥行と分解能の関係を示したが，電子線の傾斜角が 3° の場合は，きが実感できないために，細かい操作はなかなか難しかった．

分解能は約 150 nm まで低下することがわかる．これは，観その点でリアルタイム 3D-SEM においては，マニピュレー察倍率 10 万倍で 3 nm の分解能を持つ装置であれば，観察タの操作時においても，両眼視が可能である（図 6）．

倍率と分解能の比よりに換算して，2000 倍程度が実用の限

そ こ で， 私 た ち は， こ の 3D-SEM に 搭 載 可 能 な 小 型 の界と算定できるので，軸外収差の低減を行わない場合は，数マニピュレータを開発してきている（図 7）6）．この小型マニ十倍から 2000 倍程度の観察にしか利用できないことになる．

ピュレータは，原子間力顕微鏡（AFM）の原理をベースに実際に最初に開発した試作 1 号機では，この程度の画像しかしているが，小型化が容易な自己検知型カンチレバーや，ひ得られなかった．しかし試作 2 号機以降では，この軸外収差ずみゲージを付けた解剖針を装着することで，試料の加工がを低減するための工夫をしている．詳しい説明は紙面の都合できるようにしたものである．SEM の試料室に複数台のマから割愛するが，この軸外収差低減の原理をごく簡単に説明

ニピュレータを搭載することが可能なので，試料の両側から，すると，対物レンズで生じる軸外収差とちょうど逆方向の軸ナイフとフォークのように，カンチレバー（と解剖針）を試外収差をわざと光学系に発生させ，これにより両者をキャン料に近づけて操作が可能である．したがって，1 つのカンチセルさせるというものである．実際には，図 3 のように，そレバー（解剖針）で試料を押さえ，もう 1 つのカンチレバーのための偏向コイルと集束レンズ（収差低減レンズ）を対物（解剖針）で試料を加工するなど複雑なマニピュレーションレンズの直上に追加している．こうして，この収差低減レンが可能になってきている．また，ハプティックデバイスを用ズにおいて，対物レンズとは逆方向に電子線を傾斜させて軸いた力覚提示システムを組み合わせることにより，オペレー外収差を発生させることで，対物レンズで生じる軸外収差をタが試料表面の凹凸やカンチレバーの押し込み荷重を体感し打ち消すことが可能となる．その結果，試料面での軸外収差ながらマニピュレーションを行うことができるようになっては軽減され，分解能の低減を防ぐことができるので，汎用型

きた（図 8）．たとえば，試料側の 1 μm の凹凸を受け手側でSEM においても 1 万倍程度の 3D 観察が可能となってきて1 cm ほどの凹凸の変化に増幅することが可能であるし，オ

図 5 電子線傾斜角と分解能の相関図
対物レンズの軸外を電子線が通過することにより生じる収差（軸外収差）のために，傾斜角が大きくなるほど，分解能が低下することがわかる．

図 6 ラット腎糸球体とその上の解剖針の 3D イメージング
腎糸球体のとその上部に配置された解剖針の距離が，リアルタ
イム 3D-SEM により実感することができる．アナグリフ表示．

200

顕微鏡 Vol. 45, No. 3（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

5. まとめ
本稿では，SEM の特徴を活かした 3D イメージングの現状と，私たちが最近開発したリアルタイム 3D-SEM について紹介し，今後の可能性の一つとして，この 3D-SEM のマニピュレーションへの応用と現状を述べた．現在，3D イメー
ジング技術は，映画やテレビの世界で脚光を浴び，急速な進展を見せ始めている．3D デジタルカメラや 3D テレビ，3Dパソコン，3D 携帯電話と，次々と 3D 家電が発売されるようになってきていることを思えば，SEM の世界においても，こうした 3D イメージングが標準となることはそんなに遠い
図 7 リアルタイム 3D-SEM の中で利用するために開発したマニピュレーションシステム
マニピュレータは原子間力顕微鏡（AFM）の原理を利用して作製し，ハプティックデバイスを用いた力覚提示システムを組み合わせることにより，オペレータが試料表面の凹凸やカンチレバーの押し込み荷重を体感しながらマニピュレーションを行うことができるようなシステムを構築している．

ことではなさそうである．
また，ここでは触れなかったが，SEM 像の解析においては，得られる画像からいかに定量的な情報を得ることができるかという点についても，忘れてはならない重要な課題である．
この点では，SEM の反射電子像から得られる情報や，ステレオペア像から得られる情報から上手に三次元復構や計測を行う技法についても，さらに検討する必要があるだろう．こうした開発によって，透過電子顕微鏡とは一味も二味も異なる，SEM ならではの世界を切り開いていくことができれば，医学生物学分野に SEM がさらに貢献できるようになるのではないだろうか．
謝

辞

本研究の一部は，文部科学省委託事業「次世代の電子顕微鏡要素技術の開発」で採択された課題「力覚制御による体感型 3D ナノ解剖バイオ顕微鏡の開発」（2006 ～ 2008）と，文部科学省・先端計測分析技術・機器開発事業の開発課題「実用化に向けたリアルタイムステレオ SEM の開発」
（2009 ～2011）による成果であり，ここに謝意を表します．
図 8 リアルタイム 3D-SEM にマニピュレータを装着し，実際に利用している様子

ペレータがカンチレバーを数 N で押し込むと試料に数十 nNの荷重を加わるように設定することができる．これにより，腎臓の糸球体を解剖針で試料内から取り出して任意の場所に移動したり，眼球内の水晶体の水晶体線維をほぐすようなことが可能になってきている．今後さらに試料作製法の工夫を加えることにより，実体顕微鏡の下で解剖するような気分で，SEM 内で試料の微小解剖が可能になるのではないかと期待している．

最近の研究と技術

リアルタイム 3D 走査電子顕微鏡の医学生物応用文献1）Fujita, T., Tanaka, K. and Tokunaga, J.: SEM atlas of cells andtissues, Igaku-shoin, Tokyo-New York, (1981)
2）Ushiki, T.: Actioforma Stereo SEM atlas of mammalian cells andtissues 1, META Corporation Japan, Tokyo, (2009). (ISBN978-4904813-01-0)
3）Pawley, J.B.: Scanning electron microscopy 1978/I, SEM Inc., AFM
O’Hare, IL 1978, 157
4）牛木辰男，他：力覚制御による体感型 3D ナノ解剖バイオ顕微鏡の開発，日本顕微鏡学会第 65 回学術講演会予稿集，96（2009）5）伊東祐博，他：リアルタイムステレオ SEM の実用化開発，日本顕微鏡学会第 66 回学術講演会予稿集，179（2010）6）Iwata, F., Ohara, K., Ishizu, Y., Sasaki, A., Aoyama, H. and Ushiki, T.:Jpn. J. Appl. Phys., 47, 6181–6185 (2008)

201【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】