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飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法

技術レポート

1 飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法
山本 謙吾 *

1緒言

イソフェンホスはバイエル社が開発した無色液体の有機リン系殺虫剤であり，主にさとうきび，落花生の土壌害虫の防除に用いられている．
わが国では，飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令（昭和 51 年農林省令第 35 号）の規定により，とうもろこし中のイソフェンホスの残留基準は 0.02 ppm と規定されている．ここでいうイソフェンホスとはイソフェンホスと代謝産物であるイソフェンホスオキソンをイソフェンホス含量に換算したものの和として表している 1) ．
イソフェンホス及びイソフェンホスオキソンは，飼料分析基準の有機リン系農薬の系統的分析法（その 1） 2) により同時分析が可能であるが，当センターの検査分析でスクリーニング的に繁用している農薬のガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）による一斉分析法 2)（以下「一斉法」という．）は，イソフェンホスオキソンが分析対象に含まれていない．そこで，イソフェンホスオキソンの一斉法への適用の可否について検討したので，その概要を報告する．
なお，イソフェンホス及びイソフェンホスオキソンの構造式を Fig. 1 に示した．

SOOOPNHOOOONHOO

Isofenphos

Isofenphos-oxon

isopropyl (RS)-O-[ethoxy(isopropylamino)

isopropyl (RS)-O-[ethoxy(isopropylamino)

phosphinothioyl]salicylate

phosphinyl]salicylate

C15H24NO4PS

MW: 345.4

C15H24NO5P

CAS No.: 25311-71-1
Fig. 1

試

MW: 329.3

CAS No.: 31120-85-1

Chemical structures of isofenphos (left) and isofenphos-oxon (right)

22.1P

実験方法

料

市販の成鶏飼育用配合飼料及び乾牧草（アルファルファ乾草）をそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕して用いた．検討に用いた配合飼料の配合割合を Table 1 に示した．

*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

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飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Formula feedtypes
for layer

Table 1Compositions of the formula feed
Ingredient
Proportion
Ingredients
types
(%)
Grains61 Corn, Milo
Oil seed meal
27 Soybean meal, Rapeseed meal, Corn gluten meal
Animal by-products
1 Fish meal
Others11 Calcium carbonate, Animal fat,Calcium phosphate, Salt

Paprika extract, Silicic anhydride, Feed additives
2.21)

試薬

イソフェンホスオキソン標準液
有機リン系農薬混合標準液 B グループ（和光純薬工業特注品，イソフェンホスオキソン他
13 農薬各 20 µg/mL）を標準原液とした．
使用に際して，上記標準原液の一定量を 2,2,4-トリメチルペンタン－アセトン（4+1）で正確に希釈し，1 mL 中にイソフェンホスオキソンとしてそれぞれ 0.02，0.05，0.1，0.2 及び 0.5µg を含有する各標準液を調製した．

2)

アセトニトリル，酢酸エチル，ヘキサン，シクロヘキサン及びアセトンは残留農薬分析用試薬を用いた．

2.3

装置及び器具1)

ガスクロマトグラフ質量分析計：島津製作所製

2)

ゲル浸透クロマトグラフ：島津製作所製

GCMS-QP2010

GPC システム

ポンプ：LC-20AT
オートサンプラー：SIL-10AP
フラクションコレクター：FRC-10A
3)

振とう機：タイテック製

4)

ロータリーエバポレーター：BÜCHI 製

5)

多孔性ケイソウ土カラム：Varian 製

6)グラファイトカーボン／アミノプロピルシリル化シリカゲル積層ミニカラム

ストロングシェーカー
R-200

Chem Elut，20 mL（20 mL 保持用）

：Supelco 製
7)SR-2DW

ENVI-Carb/LC-NH2（500 mg/500 mg）

合成ケイ酸マグネシウムミニカラム：Waters 製

Sep-Pak Plus Florisil cartridge（充てん剤量910 mg）にリザーバーを連結したもの
8)
2.4

メンブランフィルター：Waters 製

WTPS フィルター（孔径 0.5 µm，直径 25 mm）

定量方法
定量は，一斉法により実施した．ゲル浸透クロマトグラフ条件を Table 2 に，ガスクロマトグ

ラフ質量分析計による測定条件を Table 3 に示した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 2
Operating conditions of GPC for analyzing isofenphos-oxonColumn
Shodex CLNpak EV-2000 AC (20 mm i.d.×300 mm, 15 µm)
Guard columnShodex CLNpak EV-G AC (20 mm i.d.×100 mm, 15 µm)
EluentCyclohexane - acetone (4:1)
Flow rate
5 mL/minFraction volume

60~150 mL

Table 3
ColumnOperating conditions of GC/MS for analyzing isofenphos-oxon
Rtx-5ms (0.25 mm i.d.×30 m, 0.25 µm film thickness)
Column temperature
70 °C (1 min) → 25 °C /min → 150 °C → 3 °C /min →200 °C → 8 °C /min → 280 °C (10 min)Injection mode
Splitless (60s)
Injector temperature
280 °C
Carrier gas
He 1.0 mL/min
Transferline temperature 250 °C
Ion source temperature 230 °C
Ionization
Electron ionization
Ionization energy
70 eV
Monitor ionm /z 229 (for quantitation), 201 (for confirmation)

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飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Sample (Grass hay 5.0 g, others 10.0 g)
add 15 mL of water and allow to stand 30 min
add 100 mL acetonitrile and shake for 30 min
filtrate under suction filter (No.5B)
wash with 50 mL of acetonitrile
Filtrate
evaporate to the volume of 15 mL under 40 °C
Chem Elut cartridge
apply sample solution and allow to stand for 5 minelute with 100 mL of hexane-ethyl acetate (1:1)
Hexane-ethyl acetate solution
add 1mL of diethylene glycol-acetone (1:49)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 10 mL of cyclohexane-acetone (4:1)
filtrate with membrane filter (< 0.5 µm)
GPC
apply 5 mL of sample solution
collect 60~150 mL fraction
add a drop of diethylene glycol-acetone (1:49)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 2 mL of ethyl acetate
ENVI-Carb/NH2 cartridge (prewashed with 10 mL of ethyl acetate)apply sample solution
elute with 8 mL of ethyl acetate
add a drop of diethylene glycol-acetone (1:49)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in hexane-acetone (7:3) (Grass hay 5.0 mL, others 10.0 mL)
Sep-Pak Plus Frolisil cartridge (prewashed with 5 mL of acetone and 5 mL of hexane)
apply 4.0 mL of sample solution
elute with 6 mL of hexane-acetone (7:3)
Eluteadd a drop of diethylene glycol-acetone (1:49)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 2.0 mL of 2,2,4-trimethylpentane-acetone (4:1)
GC/MS
Scheme 1

Analytical procedure for isofenphos-oxon in feeds

33.1

結果及び考察モニターイオンの設定
イソフェンホスオキソンのモニターイオンは，食品の分析法である「GC/MS による農薬等の一斉試験法（農産物）」別表 3) で規定するモニターイオンを準用して，定量イオンとして m/z229，確認イオンとして m/z 201 を採用した．
参考として 0.5 µg/mL のイソフェンホスオキソン標準液 1 µL を GC-MS に注入し，スキャンモ

飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法

51ードで測定したマススペクトルを Fig. 2 に示した．

Fig. 2
3.2

Mass spectrum of isofenphos-oxon

検量線の作成調製した 0.02，0.05，0.1，0.2 及び 0.5 µg/mL のイソフェンホスオキソン標準液各 1 µL を GC-MS に注入し，得られた選択イオン検出クロマトグラムのピーク高さから検量線を作成した．
その結果，検量線は 0.02~0.5 µg/mL（注入量として 0.02~0.5 ng）の範囲で直線性を示した（Fig.
3）．

Peak height/ arb.units

R² = 0.9993

00.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Concentration of isofenphos-oxon/ μg/mL

Fig. 3
3.3

Calibration curve of isofenphos-oxon

妨害物質の検討
4 種類の配合飼料（成鶏飼育用，肉豚肥育用，肉用牛肥育用，乳用牛飼育用），3 種類の乾牧草（アルファルファ乾草，スーダングラス乾草，えん麦乾草），えん麦，大麦，とうもろこし，ビールかす，ふすま，なたね油かす及び綿実について，本法に従って選択イオン検出クロマトグ
ラムを作成し，イソフェンホスオキソンの定量を妨害するピークの有無を検討した．その結果，

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飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

イソフェンホスオキソンの定量を妨害するピークは認められなかった．
3.4

添加回収試験
成鶏飼育用配合飼料及びアルファルファ乾草にイソフェンホスオキソンとしてそれぞれ 50，

100 及び 500 µg/kg 相当量添加した試料を用い，本法に従って 3 回併行分析を実施し，回収率及び繰返し精度を検討した．
その結果は，Table 4 に示したように，平均回収率が 124~161 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 14 %以下であり，この結果は，一斉法検討の際の平均回収率及び繰返し精度の目標値 4)（平均回収率：50~200 %，RSD：20 %以下）に適合していた．
Table 4

Recoveries of isofenphos-oxon from two kinds of feed

Spikedlevel(µg/kg)

Formula feedfor layera)

Recovery(%)

Alfalfa hayb)

RSD(%)a)

Recovery(%)b)

RSD(%)

500

150

0.71478.1

1001245.2

15514501392.2

1615.6a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
3.5

定量下限及び検出下限
本法によるイソフェンホスオキソンの定量下限について，イソフェンホスと同様に試料中 50µg/kg を目標として以下の検討を行った．
成鶏飼育用配合飼料及びアルファルファ乾草にイソフェンホスオキソンとして 50 µg/kg 相当量を添加した試料を用いて添加回収試験を行い，得られるピークの SN 比並びに回収率及び繰返し精度を求めた．その結果，SN 比は 10 以上であり，平均回収率は 139 及び 161 %，繰返し精度は RSD として 5.6 %以下であった．検出下限は，イソフェンホスと同様 SN 比 3 を確保できる 20µg/kg であった（Table 4）．
3.6

共同試験
飼料中のイソフェンホスの残留基準はイソフェンホスと代謝産物であるイソフェンホスオキソンをイソフェンホス含量に換算したものの和として規定されていることから，本法の再現精度を確認するため，イソフェンホス及びイソフェンホスオキソンについて共同試験を実施した．成鶏
飼育用配合飼料及びアルファルファ乾草にイソフェンホス及びイソフェンホスオキソンとしてそれぞれ 50 µg/kg 相当量を添加した試料を用い，独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部，同札幌センター，同仙台センター，同名古屋センター，同神戸センター，同福岡センターの 6 試験室で共同分析を実施した．
イソフェンホスオキソンについての結果を Table 5 に示した．成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 98.4 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及びRSDR）として 13 %及び 21 %であり，HorRat は 0.96 であった．アルファルファ乾草では，平均回収率は 107 %，RSDr 及び RSDR はそれぞれ 9.8 %及び 22 %であり，HorRat は 0.99 であった．

飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法

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また，イソフェンホスについての結果を Table 6 に示した．成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 107 %，RSDr 及び RSDR はそれぞれ 6.4 %及び 10 %であり，HorRat は 0.47 であった．ア
ルファルファ乾草では，平均回収率は 119 %，RSDr 及び RSDR はそれぞれ 4.4 %及び 23 %であり，HorRat は 1.0 であった．
なお，参考のため，各試験室で使用したガスクロマトグラフ質量分析計の機種等を Table 7 に示した．

Table 5Lab. No.

Collaborative study for isofenphos-oxon
Formula feed for layer
Alfalfa hay(µg/kg)(µg/kg)

1

42.4

54.0

31.6

45.2

2

37.7

48.8

46.5

49.3

3

37.8

35.1

53.2

50.7

4

57.5

67.1

67.0

68.2

5

44.2

51.3

48.2

51.9

652.9

61.2

70.6

59.7

5050(µg/kg)

49.2

53.5a)

Recovery (%)

98.4107b)

RSDr （%）

139.8c)212222220.96

0.99

Spiked level (µg/kg)
Mean valuea)

RSDR （%）d)

PRSDR (%)
HorRata)n=12b)

Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)

Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories
calculated from the modified Horwitz equation

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飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Table 6
Lab. No.

Collaborative study for isofenphos
Formula feed for layer
Alfalfa hay(µg/kg)(µg/kg)155.960.9

61.7

64.7

2

44.5

46.3

43.6

41.7

3

49.6

58.7

84.0

79.8

457.2

60.8

61.0

62.8

5

50.9

53.9

49.6

51.2

651.5

54.5

59.2

52.5

Spiked level (µg/kg)

5050

Mean value a) (µg/kg)

53.7

59.3

Recovery a) (%)

107119b)

RSDr （%）

6.4

4.4

RSDR c)（%）

1023

PRSDR d)(%)
HorRat22220.47

1.0a)n=12b)

Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)

Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories
calculated from the modified Horwitz equation

Table 7Lab.No.
123456

Instruments used in the collaborative study
GC column
GC-MS(i.d.×length, film thickness)
RESTEK Rtx-5MS
SHIMADZU GC-MS QP2010(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)
RESTEK Rtx-5MS
SHIMADZU GC-MS QP2010Plus(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)
Agilent Technologies DB-5MS
Thermo Electron FOCUS/POLARISQ(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)
Thermo Electron TR-5ms SQC
Thermo Electron FOCUS/POLARISQ(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)
RESTEK Rtx-5MS
SHIMADZU GC-MS QP2010(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)
Agilent Technologies HP-5MS
SHIMADZU GC-MS QP2010(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)

4まとめ

ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた飼料中のイソフェンホスオキソンの定量法について検討したところ，次の結果を得た．
1)

イソフェンホスオキソンの定量イオンとして m/z 229，確認イオンとして m/z 201 を採用した．

飼料中のイソフェンホスオキソンのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法

552)

イソフェンホスオキソンの検量線は 0.02~0.5 ng の範囲で原点を通る直線性を示した．

3)

4 種類の配合飼料（成鶏飼育用，肉豚肥育用，肉用牛肥育用，乳用牛飼育用），3 種類の乾牧草（アルファルファ乾草，スーダングラス乾草，えん麦乾草），えん麦，大麦，とうもろこし，ビールかす，ふすま，なたね油かす及び綿実について，本法に従って選択イオン検出クロマトグラムを作成したところ，イソフェンホスオキソンの定量を妨害するピークは認められなかった．

4)

配合飼料及び乾牧草にイソフェンホスオキソンとして 50，100 及び 500 µg/kg 相当量を添加し，添 加 回 収 試 験 を 実 施 し た 結 果 ， 平 均 回 収 率 は 124~161 % ， そ の 繰 返 し 精 度 は 相 対 標 準 偏 差（RSD）として 14 %以下であった．

5)

本法によるイソフェンホスオキソンの定量下限及び検出下限は，イソフェンホスと同様に試料中で 50 µg/kg 及び 20 µg/kg であった．

6)

成鶏飼育用配合飼料及びアルファルファ乾草にイソフェンホスオキソンとして 50 µg/kg 相当量を添加した試料を用いて 6 試験室において共同試験を実施した結果，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 98.4 %，繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）としてそれぞれ 13 %及び 21 %，HorRat は 0.96 であり，アルファルファ乾草では，平均回収率は 107 %，繰返し精度及び室間再現精度は RSDr 及び RSDR としてそれぞれ 9.8 %及び 22 %，HorRat は 0.99 であった．

文1)

献農林水産省消費・安全局長通知：“飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令の施行について”，平成 18 年 5 月 26 日，18 消安第 2321（2006).

2)

農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 20 年 4 月 1 日，19
消安第 14729 号 (2008).

3)

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について”，平成 17 年 1 月 24 日，食安発第 0124001 号 (2005).

4)

野﨑 友春，堀米 明日香，渡部 千会：飼料研究報告，31，39 (2006).