武田セミナー４12月8日

ゲノム編集の医療・産業応用と知財動向

濡木 理
東京大学大学院理学系研究科

Cas9-sgRNA
RuvC
PAM
Non-target DNA
strandTarget DNA strand

HNH
5′

RepeatGuide (spacer)
Anti-repeat

sgRNA(single-guide RNA)3′

Jinek et al. Science 2012, Cong et al. Science 2013

ゲノムの切断は自然に修復される

NHEJ

HDR

ノックアウトノックイン

Repair遺伝子をカット&ペーストで書き換えることで、遺伝子変異が原因となる疾患を治療することができる。
体外および体内でのゲノム編集医療
体外
自己細胞採取• 自己の細胞を編集するのでドナー探しと移植拒絶を解消

ゲノム編集
正常化した
自己細胞の注射
体内

全身投与

局所投与

• 外来遺伝子が残らないクリーンな方法• 短時間かつ効率のよい設計と導入が可能

NATURE MEDICINE Vol21(2)201
4

CRISPR CAR-Tを使った臨床試験は米中でもう始まっている
四川大学(中国)肺がん臨床試験

Penn大のがん臨床試験• 四川大学華西医院You Lu（盧鈾）教授のチーム• CRISPRを用いてT細胞の攻撃力を高めるように遺伝子を編集• 肺ガン患者を対象の治験• 2016/10/28日に試験開始• Carl June教授が率いるチーム• CRISPRを用いてT細胞を編集• 皮膚ガンなどの18人のガン患者を対象に3施設で2年間の治験• 有名個人投資家、ショーン・パー
カーの基金が250億円を投資• Novartis社の細胞治療チームがCarl JuneのTmunity Theraに移籍

5世界初の体内ゲノム編集（アメリカ、2017.11）

最大の課題は基本特許の欧米独占• 基本特許はカリフォルニ
ア大特許とブロード研特許が有力• 特許紛争は数年は継続する見通し• それでも欧米企業は続々と参入• 日本の大手企業は特許を危惧して参入を躊躇

2017.4.7 日経新聞 朝刊 総合2面

7

CRISPR-Casを医療応用する際の障壁
CRISPRの現在の競争分野• NHEJ and HDR• Cohesive end
formation (e.g.
Cpf1, dualCas9)

DirectedEditing

Time andSpacecontrol•Spatial control•Duration Control•Split Cas9

Nuclease
Engineering• Mining New
CRISPR
enzymes• Hi-fidelity Cas9
•Shorter/no PAM•Mini/micro-Cas9

Delivery•Nano-vehicle•Virus vector (e.g.
AAV)
•RNP

RNP:Ribonucleoprotein
8Nureki Nishimasu Feng

Our collaboration started
Since 2009.

First crystal structure of Cas9 complex

Nishimasu et al. Cell (2014) Anders et al. Nature 2014 (Jul)Cas9を用いた切らないゲノム編集
遺伝子On/Offツール

塩基置換ツール

転写活性化ドメイン
脱アミノ化酵素

Base editingゲノム編集におけるSpCas9の問題
 SpCas9はオフターゲットが多い

 SpCas9は大きすぎて（4 kb）ウイ
ルスベクターに乗らず、細胞への導入効率が低い
 SpCas9はあまりに厳密にPAM（NGG）を認識しすぎるため、自由にゲノム編集ができない

PAMの単純化

単純なPAMを認識するCas9改変体の利点
1．編集の自由度が上がる

3．正確に塩基置換できる
C→T

2．大きな欠失のリスクを回避

4．効率的な遺伝子のOn/Off

論理的なSpCas9のエンジニアリング

NGG
Since 2015

NG

NGG
NN

C
G

NG
C
G

R1333 R1335

N
N

C
GArg Arg

C
G

R1333 R1335A

試験管内でのDNA切断(TGG)
WT SpCas9

VRRRR + D1135V/E1219F
ARRRR + D1135V/E1219FARRRR + D1135V

ARRRR

Nishimasu et al. Science, in press

試験管内でのDNA切断(TGN)ヒトHEK293T細胞内でのゲノム編集活性

Nishimasu et al. Science (201ヒトHEK293T細胞内でのゲノム編集活性

Nishimasu et al. Science (201C→Tの塩基置換活性
Target-AID
SpCas9/SpCas9-NG D10A nickase

AID

PmCDA1 cytidine
deaminaseNishida et al. Science 2016

C→Tの塩基置換活性
Mutation frequency (%)

Poly-C

Nishimasu et al. Science (201C→Tの塩基置換活性
Mutation frequency (%)

Poly-C

Nishimasu et al. Science (201非相同末端結合修復と相同組み換えの効率

F1-AGT F2-GGT

F3-TGA

F4-AGC R1-CGC R2-AGA R3-CGA

EGFP

WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut
WTx3.7NG
NG26Mut

HDR (Red) and NHEJ (Blue) Frequencies (%)

20181614121086420

B-CGG

Collaboration with Dr. Miyaoka

GUIDE-seq 法によるオフターゲット解析コメにおけるSpCas9-NGによるゲノム編集
RB

OsU6pro::sgRNAPZmUbi::Cas9::T35STNos

P2x35S::HPT::T35STNos

LB

SpCas9-WT
SpCas9-NGv1TTAAATCCTAGCTACGCCAC

Agrobacterium mediatedtransformation

PAM
TGG
TGG
TGT
TGC
TGA

Chr.
471186Locus NameNGG-On1
NGG-On2
NGT-On1
NGC-On1
NGA-On1
Heteroduplex mobility assay

DNA extraction fromindependent transgenic calli

Transgenic calli
M

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

non-transgenic

Target sequence (20-nt)

3weeks

PCR products of the top 2 highly
mutated calli were sequenced toestimate the mutation frequency.

コメにおけるSpCas9-NGによるゲノム編集
Target sequence(20-nt)
PAM
Locus Name
Targetsequence(20-nt)Chr. PAM
Chr.

TGG
4 TGGNGG-On14TGG
7 TGGNGG-On27TTAAATCCTAGCTACGCCACTTAAATCCTAGCTACGCCACTGT
11 TGTNGT-On111TGC
8 TGCNGC-On18TGA
6 TGANGA-On16TAAAATCCTAGCTACGCCACTGG
1 TGGNGG-Off1TAAAATCCTAGCTACGCCAC
1TAAAATCCTAGCTACGCCACTGG
9 TGGNGG-Off2TAAAATCCTAGCTACGCCAC
9TTAAATCCTAGCTAAGCCACTTAAATCCTAGCTAAGCCAC
TGG
12 TGGNGG-Off312TTAAATCCTAGCTACGCTACTGT
1 TGTNGT-Off1TTAAATCCTAGCTACGCTAC
1TTAAATCCTAGCTACGCTACTGT
12 TGTNGT-Off2TTAAATCCTAGCTACGCTAC
12TTAAATCCTAGATACGCCACTGC
5 TGCNGC-Off1TTAAATCCTAGATACGCCAC
5TTAAATCCTTGCTACGCCAC
TGC
8 TGCNGC-Off2TTAAATCCTTGCTACGCCAC
8TTAAATCCTAGCTACGCTAC
TGC
11 TGCNGC-Off3
TTAAATCCTAGCTACGCTAC
11TAAAATCCTAGCTACGCCACTGA
5 TGANGA-Off1
TAAAATCCTAGCTACGCCAC
5TAAAATCCTAGCTACGCCAC
8TAAAATCCTAGCTACGCCACTGA
8 TGANGA-Off2TTAAATCCTAGTTACGCCAC
12TTAAATCCTAGTTACGCCACTGA
12 TGANGA-Off3Chr.3TCT
Chr.3 TCT NCT-Off
TTAAATCCTAGCTACGCCACTTAAATCCTAGCTACGCCAC
Chr.5
TAC
Chr.5 TACNAC-Off
Chr.9
TTT
Chr.9 TTT NTT-Off

Averagemutation
Average mutation
frequency(%) frequency
Locus Name
SpCas9-WT
SpCas9-NGv1 SpCas9-N
SpCas9-WT
66.3
NGG-On1
66.332.7
32.7
79.7
NGG-On279.7 7.6
7.6
0.0
NGT-On1
0.093.3
93.3
0.0
NGC-On1
0.053.5
53.50.0
NGA-On10.017.4
17.4
19.3
NGG-Off1
19.3 0.00.034.0
NGG-Off234.0 <1<1
NGG-Off30.00.0 0.00.0
N.D.
NGT-Off1
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGT-Off2
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGC-Off1
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGC-Off2
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGC-Off3
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGA-Off1
N.D.0.0
0.0
NGA-Off2
N.D.0.0
0.0
N.D.
NGA-Off3
N.D.0.0
0.0
N.D.
NCT-Off
N.D.0.0
0.0
N.D.
NAC-Off
N.D.0.0
0.0
N.D.
Endo et al. (2018) Nature Plants in press
NTT-Off
N.D.0.0
0.0
N.D.

コメにおけるSpCas9-NGによる塩基置換
Cas9-NGv1-CBE (Kobe Univ. Target AID)Cas9-NGv1-ABE

実用化のための3大課題を解決する高機能Cas9を立体構造に基づいたCRISPR酵素のエンジニアリングにより創出
オフターゲット(類似箇所)
切断

高認識化

切断可能箇所(PAM)の制限

スーパー
Cas9

自由度アップ小型化
低導入効率29

医療応用血液凝固因子の遺伝的変異によって起こる
Prof. Omori

出血X

F9F8

血友病 A : FVIII
血友病 B : FIX

1
♂
5,000

Blood level ofcoagulation factor

Blood level ofcoagulation factor
血液凝固因子遺伝子細胞治療Intervention

長時間の治療効果

ゲノム編集によるFIX-欠失マウスの作成

Ohmori et al. Sci. Rep. (2017)

U.S. panel gives yellow light to human embryo editing
Science News, By Jocelyn Kaiser
Feb.14, 2017

VSOne cells

1,000,000,000,000 Cells

アデノ随伴ウイルスを使ってゲノム編集により血友病マウスを作製

AAV injection induced
Hemophilia phenotype

Ohmori et al. Sci. Rep. (2017)

FIX因子のイントロンにエキソン2-8を挿入、あるいは相同組み換えで治療
AAV8-SaCas9

AAV8-Targeting

HDR

Insertion at NHEJ

Ohmori et al. Sci. Rep. (2017)静脈注射一本で血友病Bが完治
FIXの増加Higher dose

Lower dose

Ohmori et al. Sci. Rep. (2017)

血液凝固時間CRISPRの産業利用~産業においてCRISPRの産業利用~産業において

40

背景

自然災害

異常気象

飢餓と貧困

食料の安定供給を維持するためには、育種のスピードアップが必須

4242

品種改良の方法（交雑育種法）

美味しいが病気に弱い交配

美味しくないが病気に強い目的とする特性をもった品種をかけあわせ様々な特性をもった作物がうまれる

長い年月
が必
要

目的に近いものを選び、再びかけあわせこれを繰り返し・・・

美味しくて病気に強い作物がうまれる

目的の個体を得るまでに10年程度必要
3様々な品種改良の方法
技術の進展により、様々な品種改良法が生み出されてきた。今、新たな品種改良法として期待されているのが、「ゲノム編集」と呼ばれる技術。
交雑育種法
交配

突然変異

選抜・交配を繰り返し

ガンマ線照射や薬剤浸漬

突然変異を誘発
味は良いが病気に弱い

味は悪いが病気に強い

味が良く病気に強い

二十世紀(ナシ黒斑病)

遺伝子組換えゴールド二十世紀(黒斑病抵抗性)

ゲノム編集

微生物
害虫に強くなる害虫に弱いが 害虫に強くて遺伝子を微生物から 味は良い作物に味が良い取りだす
入れる
作物

他の生物から遺伝子を導入

はさみタンパク質で狙った遺伝子を切断する

修復される時に、遺伝子が書き換わる

目的の作物を効率的に作出可能

元々持つ遺伝子を効率よく変異

44 4

突然変異育種とゲノム編集育種

Newton 2018年 3月号より引用

放射線育種
人工制限酵素ウィキペディアより引用

変異がランダムに生じる45

突然変異育種とゲノム編集育種の比較
突然変異育種

ゲノム編集育種

変異の入り方ランダムに変異が入る

狙って変異導入

変異する
遺伝子数複数（かなり多数）

通常１つ

メリット

様々な性質の変異体が得られる

欲しい性質の変異体が効率よく得られる問題点目的とする変異体が得ら 形質とその遺伝情報がれない場合も多い。
分かっていないと利用で不要な変異が導入されるきない。
4646

遺伝子組換え育種とゲノム編集育種の比較
従来の遺伝子組換え育種

ゲノム編集育種

導入する
遺伝子

CRISPR/Cas9遺伝子などを導外来遺伝子を導入する必要が入するが、最終品種に外来遺伝ある。その遺伝子の働きで新規子は残らない。近年、遺伝子導形質が発現するため、入を伴わないゲノム編集も可能
外来遺伝子は残るとなってきている。

メリット

植物が持ってない全く新たな性質を加えることが可能

自然突然変異と同じものができる

規制

カルタヘナ法や食品衛生法の規制を受ける

検討中

問題点

染色体上のどの位置に挿入されるか制御できない。

形質とその遺伝情報が分かっていないと利用できない。
7

狙って変異を導入する必要性

・作物の遺伝子・ゲノム情報が塩基配列レベルで明かになってきた・タンパク質工学・比較ゲノム研究の進展により有用遺伝子がデザインできるよ
うになってきた・１～数塩基の違いが、有用な形質を作物に付与する場合も多い。

脱粒性を決める配列
日本晴 ATTTCA
カサラス ATTGCA

ゲノム上の標的とする遺伝子に狙いを定め、塩基配列レベルで改変できれば突然変異育種の効率は大きく向上する48

イネにおけるゲノム編集個体作出の流れ

種子からのカルス誘導

標的遺伝子への変異導入

遺伝子導入

２週

２週

RB

LB

gRNA

Cas9

マーカー

３週
変異植物体の再生

モチ米を作る

TGTTAGGGACCTTGCACTGACTGCAGGAGGAACCAGCCGCTG
TGTTAGGGACCTTGCACTGACTG-AGGAGGAACCAGCCGCTG
TGTTAGGGACCTTGCACTGACT--AGGAGGAACCAGCCGCTG
TGTTAGGGACCTTGCACTGA----AGGAGGAACCAGCCGCTG
TGTTAGGGACCTT-----------AGGAGGAACCAGCCGCTG
TGTTAGGGACCTTGCACTGACTGCTAGGAGGAACCAGCCGCTG

ウルチ

ウルチ

-1 x1
-2 x1
-4 x6-11 x3+1 x2

モチ50

お米にb-カロテンを蓄積させる

Golden Rice：遺伝子組換え技術で育成したβ-カロテンを蓄積するお米同様のお米をGM技術でなくゲノム編集技術で作れないだろうか？
オレンジカリフラワーにおけるor遺伝子の変異を参考にイネor遺伝子を改変β-カロテンを蓄積するイネ培養細胞（カルス）を作出することに成功

51

シンク能改変イネの隔離ほ場栽培

2017年度から野外隔離ほ場での評価を開始、今年度は２年目
籾数あるいは粒重を増やす遺伝子を改変したゲノム編集系
統の野外隔離ほ場栽培

１穂当たりの籾数や米粒の大きさなどの収量に関する特性について調査

52

トマトの日持ちを良くする

色づいてからの日数

原系統

CRISPR/Cas9-で作った系統
系統 1
系統2

従来育種で作った系統

7

従来育種で作った系統はF1にして初めて利用可能
30

ゲノム編集で作った系統はF1にしなくても色づく60

53
伊藤ら BBRC (2015)
Nature Plants (2017)

ソラニン含量が低下したジャガイモ

α-ソラニン

CYP88B1
ヤモゲニン
阪大 村中教授ら(肝臓の脂質代謝改善)

54

涙が出なくて味が良いタマネギ
Ig Novel
Prize
2013

Isoalliin

ｱﾘｲﾅｰｾﾞｱﾘｲﾅｰｾﾞの少ない
ﾀﾏﾈｷﾞ
ｽﾏｲﾙﾎﾞｰﾙ

1-propenylsulfenic acidpyruvic acid +ammonia
Imai et al.
Nature2012

LFS

Lachrymatory
Factor (LF)(spontaneously)Thiosulfinates（チオスルフィネート）タマネギの風味を生む“味が良く健康に良い”

催涙因子
55
ハウス食品 今井氏より

穂発芽耐性コムギ
穂発芽（圃場で種子が発芽してしまう）
オオムギの種子休眠性QTLの原因遺伝子の同定

Qsd1遺伝子 （岡山大学）
Sato et al. (2016) Nature Communications

Qsd2遺伝子 （農研機構）
Nakamura et al. (2016) Current Biology

コムギは異質6倍体であり、6個の遺伝子の改変が必要
コムギの形質転換56

ブドウの果皮色改変
シャインマスカット＝ブドウの希望の星

着色あり（Myb活性あり）

Myb

着色なし

Myb

（Myb活性なし）
レトロトランス
ポゾンの挿入2006年品種登録
ブドウの女王「マスカットオブアレキサンドリア」の孫●マスカット香●肉質良好●日持ち性良●裂果性なし●栽培容易

ゲノム編集によりレトロトランスポゾンを欠失

着色なし（Myb活性なし）

着色あり（Myb活性あり）

 2014年 日本農業新聞で果実の売れ筋ランキング第1位として5年連続選出
 日園連の2013年調査では、巨峰, デラウェア, ピオーネについで、主要22県におけるブドウの生産面積第4位(656ha)
 Kgあたり単価（H26.08）：シャインマスカット（¥1,778）、巨峰（¥835）

Myb

Myb

赤い「シャインマスカット」

標的変異による有用作物の作出（海外）アクリルアミド低減ジャガイモ

雄性不稔トウモロコシ

Djukanovic et al. (2013) Plant J.
Clasen et al. Plant Biotechnol. J.

高オレイン酸ダイズ

うどん粉病耐性コムギ

58
Haun et al. (2014) Plant Biotechnol. J.

Wang et al. (2014) Nat. Biotechnol.

優良形質を集めた品種を迅速に育成
交配
品種A

品種B

品種C

品種D

耐病性遺伝子耐虫性遺伝子

多収遺伝子

良食味遺伝子交配と選抜の繰り返し

スーパー品種

ゲノム編集
耐病性

多収

良食味

耐虫性
標的変異により一挙に改良

スーパー品種59

野生トマトをゲノム編集で一気に栽培トマトに
病気に強い
野生トマトに・コンパクトな草型
・揃いの良い結実・果実を大きく・高ビタミンCの形質を一気に導入

Domestication ofwild tomato isaccelerated bygenome editing
Li et al. (2018)
Nature60
Biotechnology

トリプトファン高蓄積米（飼料米用）

61

雑賀ら (2012)

ゲノム編集で作られた黒ずまないマッシュルーム（褐変抑制変異を導入）ゲノム編集の農水畜産物の品種改良での利用プラチナTALENを用いたブタでの遺伝子改変(明治大学と広島大学の共同研究）

筋肉の細胞が２倍になった!!

読売新聞（平成27年11月13日）

日本人に非常になじみの深いクロマグロやウナギの天然資源は危機的な状況にある
2014.11.17. 国際自然保護連合（IUCN）が絶滅危惧種に指定

CRISPRの国際動向と今後

コア技術の次の競争の最前線はミドルウェアと応用開発広がり続けるCRISPR技術の地平線• デリバリー(送達技術)• 酵素エンジニアリング

遺伝子制御

ゲノム編集
“ビッグバン”

診断
食品
IT業界との対比OS

ミドルウェアアプリケーション販売
71

東大の改変CRISPR酵素技術をベースに設立されたEdiGENEは日本で最初かつ唯一のCRISPR創薬ベンチャー••••••

設立 2016年1月 (東大認定ベンチャー)
事業内容: CRISPR技術を用いた医薬品開発、プラットフォーム技術提供
所在地: 日本法人 エディジーン株式会社 (東京都中央区)
米国法人 EdiGENE Inc. (Cambridge, MA)
株主 役員、外部支援者、みずほキャピタル、SMBCベンチャーキャピタル、NVCC
役員
濡木理 : 社外取締役 創業科学者
東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻 教授(現任)東京大学理学部卒 同大学院

森田 晴彦 : 代表取締役CEO
株式会社レグイミューン(理研ベンチャー) 前代表取締役兼CEO株式会社ワイズセラピューティックス(東大ベンチャー)、ブーズ・アレン・アンド・ハミルトン株式会社、キリンビール株式会社、東京大学工学部卒、同大学院修了

竹田 英樹: 社外取締役
株式会社Medical Patent Research 代表取締役
株式会社ヘリオス (理研ベンチャー) 前代表取締役、藤沢薬品工業株式会社
大阪大学理学部生物学科卒、同大学院理学研究科博士修了

田島照久: 非常勤監査役 公認会計士
田島公認会計士事務所 代表
中央青山監査法人
社外監査役 (クオンタムバイオシステムズ、オンコセラピー、プリズムバイオ他)
神戸大学経営学部卒

山形哲也 MD, Ph.D. : シニアディレクター
GlaxoSmithKline、Tempero Pharmaceuticals、 Joslin Diabetes Center、Harvard Medical School、東京大学医学部卒, 同大学院修了

72

東大独自の「切らないCRISPR 」技術= GNDM(ガンダム)システムは遺伝子をピンポイントでオン・オフできる
ガイド

核酸誘導制御遺伝子調節
タンパク

転写活性化/抑制化
ヒストン脱/メチル化・アセチル化

CRISPR-GNDM (Guide Nucleotide-Directed Modulation) システム

部位特異的
ヒストン修飾遺伝子ON/OFFAc

Me

ガイドRNA
ターゲット遺伝子mini-dCas9

わざと切れなくした
小型改変CRISPR酵素gRNA: guide RNA=ゲノム上の特定の位置をポイントする

73