DNA でコードされたセンサーによる Ca2+ イメージング
Imaging with Genetically encoded Ca2+ sensors
中井淳

一Junichi Nakaiａ要旨

理化学研究所・脳科学総合研究センター・記憶学習機構研究チーム・副チームリーダー

蛋白質でできたカルシウムセンサーは，DNA により符号化（コード）されているので，DNA でコードされたカルシウムセンサー（GECS）と呼ばれる．したがって，GECS は，その DNA を細胞に導入することにより，細胞内でセンサーの蛋白質が合成されて機能するようになる．GECS には発光センサーと蛍光センサーがあるが，近年の蛍光 GECS の進歩には目覚しいものがある．本講座
では GECS の種類とその特徴を説明し，蛍光 GECS の応用例を紹介して，その可能性について論じる．GECS は in vivo での細胞機能のモニターに優れており，現在，生物個体への応用が精力的に進められている．今後，移植・再生医療関連の研究にも応用されると予想される．

キーワード：GFP，発光，蛍光，カルシウム，センサー

1.

2. Ca2+ の光学的測定法

はじめに細胞内（特に細胞質内）のカルシウムイオン（Ca2+）は，2.1

蛍光カルシウム指示薬

セカンドメッセンジャーの一つであって，筋肉の収縮，ホル現在広く一般に使用されているのは，Fura2 や Fluo3 など

モンや神経伝達物質の分泌，神経細胞の可塑的変化など生体の蛍光 Ca2+ 指示薬による光学測定である．蛍光 Ca2+ 指示薬

内のほとんどすべての生命現象に関与しており，細胞内のには salt 型とエステル型がある．salt 型は水溶性で，よく利Ca2+ 濃度の測定は，広く細胞機能をモニターするうえで非常用される方法は，電気生理の電極内に入れて，細胞に直接注に有効な手段である．

入して使用するものである．エステル型は，Acetoxymethyl

Ca2+ の光学測定は 1960 年代後半からエクオリンを用いて化された蛍光 Ca2+ 指示薬（Fura2AM など）で，脂溶性のた行われるようになり，1980 年代にはいり蛍光 Ca2+ 指示薬がめ細胞膜を通過しやすくなっている．細胞外に投与すると，実用化されると，CCD カメラなどの測定装置の発達も伴っ細胞内に移動し細胞内のエステラーゼにより分解されて本来2+て，Ca の光学的測定は極一般的な手法となった．さらにのカルシウム指示薬となり機能する．培養細胞や脳スライス

1990 年代後半からは，Green Fluorescent Protein（GFP）ななどに使用され，最近ではエステル型の蛍光カルシウム指示2+

どの蛍光蛋白質を用いた Ca センサーが開発されるように2+2+なった．また蛍光 Ca 指示薬を用いた脳の in vivo Ca 測定などの方法も開発され，新たな可能性が開けてきた．

薬を直接生体内に注入して in vivo で Ca2+ イメージングする（図 1）．エステル型は指示薬の細胞方法も開発されている 1）
内への導入が容易なため，今日最もよく利用されている．蛍

我々はこれまで GFP を用いて蛍光 Ca2+ センサー（G-CaMP）

光 Ca2+ 指示薬の欠点としては，Salt 型では細胞への導入にを開発してきた．本稿では，細胞内遊離 Ca2+ のイメージンテクニックを要する点である．エステル型では細胞特異的にグ法，特に遺伝子でコードされた Ca2+ センサーを用いる方導入することは難しいが，細胞によって色素の取り込みが異法について解説し，その応用例を紹介する．最近は in vivoなることもある．また，細胞内のエステラーゼ活性が低いとの動物でカルシウム動態を解析することが盛んに行われるよ

うまくいかない．そのほか，細胞内コンパートメントに蓄積うになってきた．DNA でコードされた Ca2+ センサーはそのされたり，長時間観察すると細胞から排除されることがある．

目的に適したものとして期待されている．

冷却 CCD カメラやレーザー顕微鏡を用いて観察することができる．
2.2

Genetically encoded Ca2+ sensor（GECS）DNA でコードされたカルシウムセンサーａ〒 351–0198 埼玉県和光市広沢 2–1
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2008 年 2 月 1 日受付

講座

DNA でコードされたセンサーによる Ca2+ イメージング

センサー自体は蛋白質でできている．センサーをコードする DNA を細胞に導入すると，細胞内でセンサー分子が生合成される．センサーの遺伝子は培養細胞や動植物のゲノムに121【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

組み込むことができ，センサーを目的の細胞（組織）に特異的に発現させることができる．また，長期間の観察にも適している．さらに，センサーにタグを付加したり，他の蛋白質と融合させることにより（これらも DNA の組み換えで行う），例えば，ミトコンドリア，核，小胞体，形質膜直下など目的の細胞小器官や局所にセンサーを選択的に発現させることも可能である．GECS は大きく分けて 2 種類に分けられる．一つは発光 Ca2+ センサーであり，もう一つは蛍光 Ca2+ センサーである．
2.2.1

発光 Ca2+ センサー

2.2.1.1

エクオリン：エクオリンは，オワンクラゲから発見された Ca2+ 結合蛋白質で，Ca2+ が結合すると青く発光する性質がある．最も古くから利用されている GECS で，遺伝子がクローン化されるまでは精製したエクオリンを細胞に注入して使用していた．クローン化されたエクオリンの遺伝子産物はアポエクオリンと呼ばれ，このままでは Ca2+ が結合しても発光しない．cofactor（セレンテラジン coelenterazine）を加えると（膜透過性セレンテラジンが販売されている），細胞膜を透過して，細胞内でアポエクオリンと結合しエクオリンができる．エクオリンに Ca2+ が結合するとアポエクオリンと cofactor に分離すると共に cofactor が分解し，発光する．
2.2.1.2 Bioluminescence resonance energy transfer（BRET）
センサー：BRET センサーは，エクオリンと GFP を融合さ

図 1 蛍光 Ca2+ 指示薬を用いた脳神経細胞の in vivo Ca2+ イメー
ジング：Multicell bolus loading（MCBL）法A）エステル型の蛍光 Ca2+ 指示薬を，13 日齢のマウスの大脳皮質に微量注入した後 30 分～ 1 時間後に，二光子励起レーザー顕微鏡を用いて Ca2+ イメージングを行った．頭蓋骨は薄く削ってある．B）骨を通して撮影した蛍光画像．C）別のマウス（5日齢）を用いた実験で得られた 4 つの神経細胞の蛍光変化．自発活動が観測される．（文献 1 を改変）せたもので，Ca2+ が結合するとエクオリン部分から GFP 部
分 へ と エ ネ ル ギ ー 移 動 が 起 こ り， 緑 色 の 蛍 光 を 出 す 2）．

松ホトニクス）などの視野を半分に分けて 2 波長の画像を 1

BRET センサーは，エクオリン単独より多くの光を出し，台の CCD カメラに同時に取り込む装置を用いるか，または，GFP を含んでいるため，GFP の蛍光を調べることで発現をフィルターチェンジャーにより波長を切り替えて 1 台の確認できるので，今後エクオリンは BRET センサーに置きCCD カメラで交互に撮影する必要がある．共焦点（または換わっていく可能性がある．

2 光子）レーザー顕微鏡であれば，多くの物は 2 波長測定が発光 Ca2+ センサーの利点は，励起光を必要としないので励起光による光毒性がないことである．欠点として，セレン可能である．
2.2.2.2

単一蛍光蛋白センサー：もう一方の単一蛍光蛋白テラジンを加える必要があり，セレンテラジンが徐々に消費センサーは，分子内に蛍光蛋白質を 1 つしか持たず，センサーされること．また，後述する蛍光センサーに比べると放出さに Ca2+ が結合すると立体構造が変わり，それにともない蛍れる光が弱く，多くの場合光子計数器を使用する必要があり，

光 蛋 白 の 蛍 光 特 性 が 変 化 す る（ 図 2 右 ）． こ の 仲 間 に は

微細な部分からのシグナルの検出や，高速撮影には適していcamgaroo, G-CaMP, pericam, Case16 がある 8 ～ 11）．このタイプない．の Ca2+ センサーは大きな蛍光変化を示し，多くは一波長励2.2.2GFP を用いた蛍光 Ca2+ センサー

起一波長測定のセンサーなので測定が単純である．その反面

現 在 GFP を 用 い た 蛍 光 Ca2+ セ ン サ ー に は，fluorescentresonance energy transfer（FRET）センサーと単一蛍光蛋白センサーの 2 種類がある．

表1

Genetically encoded Ca2+ sensor（GECS）

発光 Ca2+ センサーのグループ

2.2.2.1 FRET センサー：FRET センサーは色の異なる 2発光センサー

エクオリンなど種類の蛍光蛋白質を用いるもので，センサーに Ca2+ が結合

BRET センサー

GFP- エクオリン融合蛋白（G5A など）

すると 2 つの蛍光蛋白の間の FRET 効率が変わり，放出され る 蛍 光 が 変 化 す る（ 図 2 左 ）．FRET セ ン サ ー に は，Cameleon, FIP-CBSM, TN-L15, F2C, YC6.1 な ど が あ る3 ～ 7）

蛍光 Ca2+ センサーのグループ
FRET センサー

cameleon, FIP-CBSM, TN-L15,
YC6.1, F2C

単一蛍光蛋白センサー

camgaroo, G-CaMP, pericam,
Case16（表 1）．利点は，ratio 測定による安定な計測ができることである．ratio 測定には異なる 2 つの波長の画像を取り込む必要がある．そのため CCD カメラを 2 台用意するか，w-view（浜122

顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 蛍光カルシウムセンサーの模式図A）FRET センサー（cameleon の例）．Ca2+ が Calmodulin（CaM）に結合すると立体構造が大きく変化して CFP と YFP の距離や配向が変化して，FRET が起こりやすくなる．B）単一蛍光蛋
白センサー．蛍光蛋白は 1 つしかなく，Ca2+ が Calmodulin（CaM）に結合すると立体構造が変わり，立体構造の変化が蛍光蛋白に影響を与え，蛍光特性が変化する．

FRET センサーに比べると測定の安定性や pH 変化に対する安定性が劣る．蛍光が暗いものが多いが改良されて徐々に良くなってきている．冷却 CCD カメラやレーザー顕微鏡を用いて観察することができる．
どちらの蛍光 Ca2+ センサーも，生体内で合成され，発光センサーのような cofactor を必要としないため，一旦細胞に組み込んでしまえばセンサー分子の安定した発現が期待でき，いつでも測定できる利点がある．励起光をあてる必要はあるが，蛍光は発光に比べて格段に出てくる光の量が多いので，リアルタイムの測定や微細な部分からのシグナルの検出に向いている．
3.

GECS の応用

発 光 Ca2+ セ ン サ ー に せ よ， 蛍 光 Ca2+ セ ン サ ー に せ よ，

図 3 FRET 型の蛍光 Ca2+ センサー（CerTN-L15）を脳神経細胞に発現する遺伝子導入マウス
CerTN-L15 は TN-L15 を改良した FRET 型のセンサーである．
CerTN-L15 を大脳皮質の神経細胞に発現するマウスから脳スライス標本を作製し，グルタミン酸を投与した．A）大脳皮質
2/3 層の神経細胞の蛍光画像．スケールは 10 μm．B）細胞 1から記録した Citrine（黄色い蛍光蛋白）の蛍光強度の変化と，Cerulean（シアン色の蛍光蛋白）の蛍光強度の変化．C）細胞1 および細胞 2 における蛍光比（Citrine/Cerulean）の変化．D）
微小電極（写真 A の矢頭）を用いて記録した細胞 2 の電位変化．
（文献 12 を改変）

GECS は DNA によりコードさせているため，適切なプロモーターを用いることにより目的の細胞にセンサーの蛋白質を発図 4 は心筋のミオシン軽鎖キナーゼのプロモーターを用現させることができる．したがって，GECS は，線虫などのいて G-CaMP2 をマウスの心筋特異的に発現させた例であような蛍光 Ca2+ 指示薬の導入が困難な場合や，細胞特異的る 13）．心臓の収縮に伴い，心房に続いて心室筋で Ca2+ が増に観察したいとき，細胞内の局所での変化の観察，長期間の加していることがわかる．また β アゴニストであるイソプ測定などに向いている．次にいくつかの応用例を示す．

ロテレノールを投与すると心筋内の Ca2+ が増加し，陽性変図 3 は FRET 型の蛍光 Ca2+ センサーである CerTN-L15 を力作用が現れることがわかる．この遺伝子改変マウスは，不脳神経細胞に特異的に発現させた例である 12）．カルシウム整脈の発生メカニズムの解明に役立つと期待されている．

上昇により Citrine（黄色）のシグナルは増加し，
Cerulean（シ図 5 は Na+-K+ ATPase の C 末端に単一蛍光蛋白 Ca2+ セン

アン色）のシグナルは減少している．両者の比をとることにサーである G-CaMP2 を融合させたものである 14）．融合蛋白よりセンサーの濃度の変化などの影響を受けない安定した測

質は形質膜に輸送されるため，センサーは形質膜直下の細胞定を行うことができる．

質側に局在することになる．エステル型の Fura2AM を取り

講座

DNA でコードされたセンサーによる Ca2+ イメージング

123【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 G-CaMP2 を心臓に特異的に発現する遺伝子導入マウス
A）G-CaMP2 を導入したマウスの心臓を還流し，CCD カメラにより Ca2+ イメージングを行った．まず心房（図の 1 番）の蛍光変化が起こり，続いて下の心室（図の 2 番）の蛍光強度が増加する．B）心房（トレース 1）および心室（トレース 2）の蛍光強度の時間的変化．C）β アゴニスト（イソプロテレノール）の効果．（文献 13 を改変）込ませて同時測定をおこなっているが，Fura2AM はどの細胞にも取り込まれる（細胞 a も細胞 b も蛍光変化が観察される）．一方 G-CaMP は遺伝子を取り込んだ細胞だけが発現し． ま た，て い る（ 細 胞 a の み で 蛍 光 変 化 が 観 察 さ れ る ）Fura2AM は細胞質の Ca2+ 変化を全体として捕らえているが，Na+-K+ ATPase と融合した Ca2+ センサーでは膜直下の局所のCa2+ 変化を捕らえることになる．
4.

おわりに

この総説では，カルシウムイメージング法について簡単に紹介した．特に，蛋白質でできた Ca2+ センサーについてやや詳しくその特徴を述べるとともに，応用例を紹介した．
GECS はまだ改良が続けられているセンサーであって，今後，さらに高性能な GECS が開発され，応用が進むと期待される．
再生医療は 21 世紀の医療として，現在多くの注目を集めている．再生医療において，再生した細胞の位置と機能を in

図 5 G-CaMP2 を細胞膜直下に限局して発現させた例
G-CaMP2 を Na+-K+ ATPase の C 末 端 に 付 加 し た 融 合 蛋 白α2(f)G-CaMP2 を作成した．したがって G-CaMP2 は細胞膜直下のみに発現することになる（上段の図）．この融合蛋白をDsRed と共に培養細胞に発現させた（中段の図）．細胞 a はDsRed と α2(f)G-CaMP2 を同時に発現している細胞で，細胞 bは DsRed も α2(f)G-CaMP2 のいずれも発現していない細胞である．蛍光 Ca2+ 指示薬である Fura2 は細胞特異性がないので細胞 a にも細胞 b にも取り込まれている．5HT 投与時の蛍光変化を Fura2 と α2(f)G-CaMP2 で同時測定を行った（下段の図）．
Fura2（上のトレース）では細胞 a も細胞 b も反応が見られる．
α2(f)G-CaMP2（下のトレース）では細胞 a のみに反応が見られる．（文献 14 を改変）

vivo でモニターすることは重要である．この目的に GECSは 非 常 に 有 効 で あ る と 思 わ れ る（ 注 ）． 今 後 GECS がEmbryonic stem（ES）細胞や人口多能性幹（iPS）細胞に組み込まれ，利用されることが予想される．
（注）極最近 G-CaMP2 を移植に応用した例が報告された 15）．
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