技術ノート

チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験に関する操作の検討
須井哉，新妻健，高橋俊孝，佐々木澄志，倉冨美紀，原巧Examination of test procedures for chromosomal aberration test
in cultured Chinese hamster cells
Hajime SUI, Takeru NIITSUMA, Toshitaka TAKAHASHI,
Kiyoshi SASAKI, Miki KURATOMI, Takumi HARA
材料および方法

諸言
哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験（in1．材料

vitro 染色体異常試験）は，染色体の構造異常を有1.1陽性対照物質する細胞あるいは倍数性細胞の出現頻度を調べる

マイトマイシンC（MMC，協和発酵キリン）
を試験で，化学物質の有害性調査，医薬品や医療機最終濃度0.1 µg/mL（短時間処理のS9 mix非存在器の開発段階において，遺伝毒性を評価する際の下）および0.05 µg/mL（連続処理）
で用いた．また，

標準的バッテリー試験の 1 つとして，実施が行政シクロホスファミド（CP，Sigma Aldrich）を最終的に要求される．In vitro 染色体異常試験は，細濃度10 µg/mL（短時間処理のS9 mix存在下用）で胞播種，被験物質による細胞処理，コルセミド用いた．

処理による細胞周期の M 期停止，スライド標本

1.2細胞と培養条件作製，光学顕微鏡下における標本観察，というチャイニーズ・ハムスター雌肺由来の CHL/IU手順で行われる ．試験の説明や試験操作に関す細胞（入手先：JCRB 細胞バンク）を使用した．

る注意点については成書 も存在するが，国際的培養は新生児牛血清を 10 vol% 添加したイーグに認められた最新の標準的な試験方法は OECD

ル MEM 培養液（10%NBCS/MEM）を用い，CO2TG473（2016） に記載されている．したがって，インキュベーター
（37℃，5% CO2 の加湿条件下）

化学物質の安全性評価は OECD TG473（2016）に内で行った．

準拠して実施される．

1.31）

2）

3）

弊所では OECD TG473（2016）に準拠した試験を安定して遂行するため，2017 年に行われた染色体異常試験の実験場所の変更を機に，試験のタS9 mix

表 1 で用時調製した．
2．実験方法2.1

播種細胞数の検討

イムスケジュールの見直しも視野に入れて従来の現在，当研究所では播種細胞数を 4⊗104 個 /試験操作を見直すこととなった．特に，細胞播種

φ60 mm ディッシュとし，細胞処理は細胞播から細胞処理までの日数短縮および固定から標本種から 3 日後に行っている．今回，細胞播種か作製までの期間に柔軟性を持たせることを目的とら細胞処理開始までの日数を短縮するため，播し，播種細胞数および固定細胞の保管の可否につ種翌日に細胞処理を開始した場合の処理細胞数いて，それぞれ検討を行ったので，それら検討のおよび染色体異常を有する細胞数に対する影結果を紹介する．

響を検討した．実験は計 1～3 回行った．また，実験を複数回行った播種細胞数については，各実験の測定値を用いて平均値を算出した．
30⊗104 個 /mL の細胞懸濁液を調製し，播種細安全性事業部安全性評価室
20

胞数が 30，40，60，90 および 120⊗104 個 / ディッ技術ノートシュとなるように細胞懸濁液をφ 60 mm ディッ

mol/L の塩化カリウム水溶液を用いて低張処理

シュに添加した．

し，カルノア液［メタノール：氷酢酸 =3：1（v/v）］

短時間処理（6 時間処理および 18 時間の回復で固定した後，スライドグラスへ滴下した．ス時間）の S9 mix 非存在下および存在下，ならライドグラスは自然乾燥し，70%メタノールにびに連続処理（24 時間処理）の計 3 処理条件
（2浸した後，3%ギムザ液を用いて染色した（スラディッシュ/条件）のそれぞれに無処理群を設定しイド標本の作製）．スライド標本はコード化し，た．各ディッシュには最低でも合計液量が 3 mL

「化学物質による染色体異常アトラス（JEMS・となるように培地を加えた（表 2）．

MMS 分科会編）」4）による分類法に基づき構造播種翌日（約 19～20 時間後）
，0.05% トリプシ異常を有する細胞（300 細胞 / 群）および倍数性ン溶液で細胞を剥離し，コールターカウンター細胞（600 細胞 / 群）を分析した．

で細胞数を測定し，処理開始時（day 1）における構造異常を有する細胞数および倍数性細胞数細胞数を算出した．すべての処理条件について，については，陰性対照群と陽性対照群との間で処理開始 22 時間後にコルセミドを添加（最終濃フィッシャーの正確確率検定（p<0.01，片側）度：0.1 µg/mL）し，2 時間培養を行った．処理を行った．

開始 24 時間後（day 2），0.05% トリプシン溶液

2.2で細胞を剥離し，コールターカウンターで細胞固定細胞の保管の検討

播種細胞数を 4⊗104 個 / ディッシュとし，計数を測定し，細胞数を算出した．

3 処理条件のそれぞれに陰性対照群（無処理）お

上記実験の結果に基づいて播種細胞数を 30

よび陽性対照群を設定し，播種から 3 日後に細⊗10 個 / ディッシュとし，計 3 処理条件のそれ胞処理を開始した．

4

ぞれに陰性対照群（無処理）および陽性対照群をすべての処理条件について，処理開始 24 時設定し，播種翌日に細胞処理を開始した．陽間後，播種細胞数の検討と同様の操作を行い，性対照群においては，各陽性対照物質溶液（短カルノア固定までの操作を行った．カルノア固時間処理の S9 mix 非存在下および連続処理：定した細胞懸濁液の一部を用いて，固定当日

MMC，短時間処理の S9 mix 存在下：CP）を添（固定 0 日目）にスライド標本を作製した．カル加後，細胞処理を開始した．

ノア固定した残余細胞懸濁液は冷蔵した後，固すべての処理条件について，処理開始 24 時間

定 7，14，24 および 28 日目に播種細胞数の検後，0.05% トリプシン溶液で細胞を剥離し，細討と同様の操作を行い，スライド標本を作製し胞懸濁液を作製した．細胞懸濁液の一部を 0.075た．スライド標本をコード化した後，構造異常

表1S9 mix の組成成分

S9*1

表2

各処理条件におけるディッシュあたりの処理液量

混合比

最終濃度

35 vol%

播種細胞数（×104 個 / ディッシュ）細胞懸濁液量＋添加培地量
（mL）
1 回目

2 回目

3 回目

HEPES

20.67 mmol/L

30

1+21+21+2MgCl2

10.83 mmol/L

40

1.3+1.7NTNT

60

2+12+1NT

2

B 液*・G-6-P

10.83 mmol/L

90

3+03+0NT・β-NADP+10.67 mmol/L

120

NT4+04+0・KCl15.5 mmol/L

・精製水

1−

NT: Not Tested*1：フ ェノバルビタールと 5,6- ベンゾフラボンを投与した雄の Sprague-Dawley 系ラット（7 週齢）の肝臓から調製（家田貿易）．超低温槽（–80℃）内に保管し，製造後 6 か月以内に使用．
*2：超低温槽（–80℃）に保管し，調製後 6 か月以内に使用．

21

秦野研究所年報 Vol. 42. 2019

図1

各播種細胞数の増殖曲線

図2

図3

各播種細胞数の増殖曲線

図4

各播種細胞数の増殖曲線

短時間処理の S9 mix 非存在下

短時間処理の S9 mix 存在下

各播種細胞数の増殖曲線

連続処理を有する細胞（300 細胞）および倍数性細胞（600

れ 3.1～3.2 倍，3.0～3.3 倍，2.8～3.0 倍，2.2～2.7細胞）を分析した．

倍および 2.2～2.5 倍に増加し，それら増加の程度

構造異常を有する細胞数および倍数性細胞数は 30⊗104 個 / ディッシュでは同程度であったが，については，陰性対照群と陽性対照群との間でそれ以外では播種細胞数の増加に伴って低下した

フィッシャーの正確確率検定（p<0.01，片側）（図 2～4）．これらの結果については，播種細胞を行った．

数の増加に伴ってディッシュあたりの細胞密度は高くなるため，播種細胞数の多い方が，より早い結果および考察時期にサブコンフルエント状態に達したことが関播種細胞数の検討与していると考えられた．
4

OECD TG473 では，処理開始後，正常細胞周個 / ディッシュ）の播種後 1 日目（処理開始時）にお期の 1.5 倍に相当する時間に標本作製を行うこと

ける細胞数は，播種当日と比べて，それぞれ 2.9，が要求されている．そのため，各播種細胞数（30，3.3，3.3，3.4 および 3.0 倍に増加し，それら増加

40，60，90 お よ び 120⊗104 個 / デ ィ ッ シ ュ）に つは同程度であった（図 1）．また，各播種細胞数（30，いて，処理開始から播種後 2 日目（処理開始 24 時

40，60，90 および 120⊗10 個 / ディッシュ）の播間後）までの期間における細胞集団倍加を OECD種後 2 日目（処理開始 24 時間後）における細胞数

TG473 に記載の計算式［log（ 処理後の細胞数÷処

は，播種後 1 日目（処理開始時）と比べて，それぞ理開始時の細胞数）］÷ log 2］に従って算出した．

各播種細胞数（30，40，60，90 および 120⊗10422技術ノート

表3

播種翌日処理（播種細胞数 30⊗104 個 / ディッシュ）における染色体分析結果

処理条件

実験
1 回目

短時間処理
（S9 mix 非存在下）

2 回目
3 回目
1 回目

短時間処理
（S9 mix 存在下）

2 回目
3 回目
1 回目連続処理（S9 mix 非存在下）

2 回目
3 回目

構造異常を有する細胞数（/300 細胞）

倍数性細胞数（/600 細胞）

陰性対照

50MMC
（0.1）

131*

1

陰性対照

51MMC（0.1）

143*

0

陰性対照

60MMC（0.1）

129*

0

陰性対照

50CP（10）

150*

1

陰性対照

61

処理群
（µg/mL）

CP（10）

156*

0

陰性対照

61CP（10）

98*

0

陰性対照

60MMC
（0.05）

113*

0

陰性対照

10MMC
（0.05）

119*

2

陰性対照

21MMC
（0.05）

132*

0

MMC: マイトマイシン C，CP: シクロホスファミド，*: p<0.01（片側，フィッシャーの正確確率検定）

その結果，各播種細胞数における細胞集団倍加は，の変動範囲（平均値± 2⊗ 標準偏差）内であった．

それぞれ 1.6～1.7，1.6～1.7，1.5～1.6，1.2～1.4

以 上 の 結 果 か ら， 播 種 細 胞 数 を 30⊗104 個 /および 1.2～1.3 であった．したがって，播種細胞ディッシュに変更することにより，播種の翌日に数（30，40 および 60⊗10 個 / ディッシュ）について処理を開始することが可能であると結論した．

4は，同程度の細胞集団倍加であり OECD TG473の要求事項を満たした．また，播種細胞数（30⊗固定細胞の保管の検討

10 個 / ディッシュ）については，すべての処理条染色体分析の結果，各処理条件の陰性対照群お件で，播種後 1 日目（処理開始時）から播種後 2 日よび陽性対照群における構造異常を有する細胞数目（処理開始 24 時間後）の期間における細胞数増加

および倍数性細胞数は，固定後の保管日数に関わの程度の減少が認められなかったことから，30⊗

らず同程度であった（表 4 および 5）．また，各保10 個 / ディッシュが，使用した血清ロットにおけ管日数において，陰性対照群および陽性対照群のる最適な播種細胞数と判断した．

構造異常を有する細胞数および倍数性細胞数は，44

上記の結果を踏まえて，播種細胞数 30⊗10 個 /すべて当研究所における背景データの変動範囲

ディッシュについては，すべての処理条件の陰性（平均値± 2⊗ 標準偏差）内であった．したがって，対照群および陽性対照群についてスライド標本を固定後の細胞懸濁液は，冷蔵で 28 日間，保管可作製し，染色体分析を行った．その結果，すべて能であることが明らかとなった．

4の処理条件の陽性対照群において，構造異常を有今回の検討結果から，適切な播種細胞数を用いする細胞数の有意な増加が認められた（表 3）．また播種翌日の処理開始，固定細胞の保管が試験結た，すべての処理条件の陰性対照群および陽性対果に影響を与えないことが明らかとなり，試験の照群において，構造異常を有する細胞数および倍タイムスケジュールをより柔軟に調整することが数性細胞数は，全て当研究所における背景データ可能となった．信頼性の高いデータをより早く提23

秦野研究所年報 Vol. 42. 2019

表4

固定細胞の保管の検討における染色体分析結果（構造異常）
処理条件

短時間処理（S9 mix 非存在下）
短時間処理（S9 mix 存在下）
連続処理（S9 mix 非存在下）

処理群（µg/mL）

構造異常を有する細胞数（/50 細胞）
0 日目
（固定日）

固定
7 日目

固定
14 日目

固定
24 日目

固定
28 日目

陰性対照

10001MMC（0.1）

2223242425

陰性対照11100CP（10）1818211920

陰性対照

00001

MMC（0.05）

2526252327

MMC: マイトマイシン C，CP: シクロホスファミド

表5

固定細胞の保管の検討における染色体分析結果（倍数性）
処理条件

処理群
（µg/mL）

倍数性細胞数（/100 細胞）
0 日目
（固定日）

固定
7 日目

固定
14 日目

固定
24 日目

固定
28 日目

陰性対照

00000

MMC（0.1）

00000

短時間処理
（S9 mix 存在下）

陰性対照

00000CP（10）

01000

連続処理
（S9 mix 非存在下）

陰性対照

00000

MMC（0.05）

00000

短時間処理
（S9 mix 非存在下）

MMC: マイトマイシン C，CP: シクロホスファミド

供できるよう，今後も，さらなる試験条件の検討

2)

試験法 , 国際的標準化法まで｣ 東京 : サイエンティを重ねる必要がある．

1)

スト社 , 2005
3)

文献of Chemicals No. 473, Paris: Organisation for

Kumaroo V, Kaur P, Gulati D, Putman DL, MurliIshidate M. Jr.: Multilaboratory comparison of invitro tests for chromosome aberrations in CHO
and CHL cells tested under the same protocols.
Environ. Mol. Mutagen. 1997; 29: 189-207

24

OECD: In Vitro Mammalian Chromosomal
Aberration Test. OECD Guideline for the Testing

Galloway SM, Sofuni T, Shelby MD, Thilagar A,H, Marshall R, Tanaka N, Anderson B, Zeiger E,

祖父尼俊雄 編 : ｢染色体異常試験 : メカニズムから

Economic Cooperation and Development, 20164)

日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編 : ｢化学物質による染色体異常アトラス｣東京 : 朝倉書店，
1988