Journal of Assisted Reproduction

ISSN 1881-9028

Vol.20 No.1
2017

日本IVF学会雑誌
Vol.20 No.1

日本IVF学会雑誌
Vol.20 No.1

2 017

日本IVF学会雑誌 Journal of Assisted Reproduction（JAR）

論 文
ー原 著 ー
受精障害に対する rescue-ICSI の培養成績及び胚移植成績について･･･････････････････････････････････････････････

3

古橋 孝祐，矢田 桃子，辻 優大，大月 純子，岩﨑 利郎，伊藤 宏一，水澤 友利，松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック

ー原 著 ー
アンチミュラリアンホルモン（AMH）低値症例における年齢階層別 ART 継続成績････････････････････････････

8

國島 温志 1,2，安藤 寿夫 1 ，松尾 聖子 1,2，鈴木 範子 1 ，北見 和久 1,2 ，池田 芳紀 1,2，梅村 康太 2，岡田 真由美 2，河井 通泰 21

豊橋市民病院 総合生殖医療センター
2

同 産婦人科

ー原 著 ーICSI 後の 1PN 由来胚が妊娠に至らない原因の探索････････････････････････････････････････････････････････････････････ 13
井頭 千明，大月 純子，古橋 孝祐，片田 雄也，辻 優大，岩﨑 利郎，松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック

ー原 著 ー
高齢患者の少数採卵症例における紡錘体可視化と胚発育･････････････････････････････････････････････････････････････ 18
松本 由香 1，佃 笑美 1，佐藤 学 1，橋本 周 1，中岡 義晴 1，森本 義晴 2
1
2

IVFなんばクリニック

HORACグランフロント大阪クリニック

ー原 著 ー
2 種類の精子調整法における培養成績の比較 － 2 種類の精子調整法について･ ････････････････････････････････ 21
横田 梨恵，古橋 孝祐，辻 優大，大月 純子，伊藤 宏一，水澤 友利，松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック1

2

第20回 日本 IVF 学会学術集会 開催概要･････････････････････････････････････････････････････････････････････

25

日本 IVF 学会会雑誌発行における投稿論文募集のお知らせ･･･････････････････････････････････････････

26

日本 IVF 学会雑誌 投稿規定･ ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

27

一般社団法人 日本 IVF 学会 定款･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

29

一般社団法人 日本 IVF 学会 役員･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

35

編集委員会･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

36

日本 IVF 学会雑誌 Vol. 20，No. 1，3 - 7，2017

ー原著 ー

受精障害に対する rescue-ICSI の培養成績及び胚移植成績について
古橋 孝祐，矢田 桃子，辻 優大，大月 純子，岩﨑 利郎，伊藤 宏一，水澤 友利，
松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック 〒 650-0021

兵庫県神戸市中央区三宮町 1-1-2

三宮セントラルビル

要 旨： IVF 周期において受精障害を回避するため，採卵当日に rescue-ICSI（以下 r-ICSI）を実施したので報告する．2012 年 6 月から 2014 年 12 月までに回収卵数が 4 個以上の IVF 2, 547 周期を r-ICSI の対象とした．r-ICSI 群の受精率は 81. 3% と通常 ICSI（c-ICSI）群の 75. 1% より有意に高く，r-ICSI 後の
3PN 率は 5. 3% であり，c-ICSI 群の 2. 8% より有意に高かった．
受 精 率 0% の 頻 度は r-ICSI 導入前 0. 8%であったが，r-ICSI 導入後 0.1%と低くなった．また r-ICSI，c-ICSI 胚の凍結融解単一胚盤胞移植 1, 526 周期の臨床妊娠率，生児獲得率は r-ICSI 43. 4%，26. 4%，
c-ICSI 38. 8%，28. 1% で妊娠率，生児獲得率に有意差はなかった．以上の結果から r-ICSI は臨床上有用であると考えられた．
キーワード：rescue ICSI，ICSI，受精障害，低受精率

緒言日に実施する rescue ICSI（ 以下 r-ICSI） を導入した．
その後，当院では後藤 10）らにより r-ICSI 導入後の培養成

IVF を施行する場合，精液所見が良好であるにもかか績について報告を行った．しかしながら，先の検討ではわらず完全受精障害が 2 ～ 3% 程度の割合で発生し 1），

r-ICSI 導入直後（n=712 周期）ということもあり，r-ICSI

また IVF 後に原因不明の低受精率が 10 ～ 20% の頻度

由来胚の移植後の成績について症例数が限られていた

これは予測する事が困難であるため，完で発生する ．

ため，胚移植成績についての評価は十分ではなかった．

全受精障害を回避するため採取した卵子を IVF と ICSI

その後 r-ICSI 症例数が増加し（n= 2, 547 周期），移植対に分けて受精させる Split ICSI が広く臨床応用されて象胚も増えたことから，今回我々は r-ICSI 由来胚の移植

いる．
しかしながら Split ICSI では，本来 ICSI を必要と後の臨床妊娠率について解析を行ったのでここに報告しなかった患者にも ICSI を実施する可能性を否定でき

する．

2）

ず，また，IVF と ICSI の胚発生を比較すると IVF 胚の方が，胚発生が良好であるという報告も見られる 3- 6）．

表1

当院における IVF の適応基準

日本産科婦人科学会の見解として，ICSI の適応は
「男

精子濃度

20 × 10 6/ml

性不妊や受精障害など，本法以外の治療によっては妊

精子運動率

20％以上

娠の見込みが極めて低いと判断される夫婦のみを対

運動精子数

10 × 10 6/ml

SMI

50 以上

象」7）としている．当院では IVF での低受精率を可及的に避け，かつ IVF にて受精可能な独自の適応所見を設定することを目的に，過去に橋本 8）らが IVF にて受精率が対象と方法

30％以上を獲得するための精液所見について，さらに， 1．対象北風 9）らが SQA-V（Medical Electronic Systems Ltd．
Israel）による SMI（Sperm Motility Index）値も加え，2012 年 6 月から 2014 年 12 月までに r-ICSI につい

IVF・ICSI・Split ICSI の適応基準を定義した（表 1）．
当て説明を行い，同意が得られた媒精卵数 4 個以上の IVF

院ではこの基準に沿って受精方法を選択しているが， 適応 2, 547 周期（22, 347 個）を対象として後方視的にそれでもなお発生する完全受精障害をより効果的に回検討を行った．媒精 4 時間又は 6 時間後の第Ⅱ減数分裂避する方法を模索した結果，2012 年 6 月より採卵当中期（M Ⅱ）卵に対する第 2 極体放出卵の割合（%）を基

受付 2017 年 4 月 10 日 / 受理 2017 年 5 月 10 日
責任著者：古橋 孝祐 e-mail［ furuhashi@hanabusaclinic.com ］

3

準に r-ICSI の適応を判断した．
また，同期間における回常な運動精子を用いて穿刺注入した（c-ICSI 群）（図１）．

収卵子数 4 個以上の conventional-ICSI（以下 c-ICSI） 受精判定は媒精18 ～ 20 時間後に行い，global mediumが適応とされた 1, 527 周期（9, 959 個）を比較対象とし （Life Global，Canada）+10% HSA（Life Global，て，検討期間内の計 4, 074 周期について培養成績を検Canada）を用いて胚培養を行った．卵子，胚の培養は討した．
そして，その後の妊娠成績の比較として r-ICSI

37℃，5. 5%CO ₂，5%O ₂，89. 5%N ₂ の気相条件下で胚，c-ICSI 胚の凍結融解単一胚盤胞を移植した 1, 526

培養を行った．

周期について胚移植後の転帰を解析した．

3．
胚盤胞凍結・融解胚移植

2．
採卵，
精子調整，
媒精，r-ICSI 及び培養方法

胚盤胞の凍結融解には当院で作成した凍結融解液を使

卵 巣 刺 激 法 は， 原 則 と し て long protocol，short

用した．
融解後，移植に用いるまで10%HSA（LifeGlobal，

protocol または antagonist protocol を用い，poor

Canada）添 加global medium（LifeGlobal，Canada）

responder の症例や mild stimulation を希望する症例ににて回復培養を行い，その後，凍結融解単一胚盤胞移植をは自然周期，またはクロミフェンあるいはレトロゾール行った．

を使用した．
採卵から 3- 5 時間後，単層密度勾配法を用

4．
分割期胚及び胚盤胞の形態学的評価

いて遠心分離した後に swim up 法を用いて回収した運分割期胚の評価は Veeck の分類 11） を用いて行い，動良好精子を使用し媒精に供した．IVF には Universal

Day 2時，Grade 1，2の4 cell及びGrade 3の5 cell以IVF Medium（Origio，Denmark）を用いた．
媒精 4 時間

上の胚を良好分割期胚とした．また，胚盤胞の評 価は後に第 2 極体（以下 2PB）放出により受精を予測し， Gardnerの分類 12）を用いて，Grade 3BB 以上を良好胚盤
2PB が確認できた卵が成熟卵数の 30% 以上であった場

胞とした．

合はc-IVF群とした．2PBが成熟卵数の30%未満であっ

5．
評価項目

た場合は，更に 2 時間後に観察し，その際に 2PB が成熟

c-ICSI群，c-IVF群，r-ICSI適応IVF群および，r-ICSI

卵数の 30% 以上であった場合は r-ICSI は不適応（c-IVF

適応 ICSI 群における受精率，3 前核（3PN）率，分割率，群に含む）とした．2PB が 30% 未満であった場合， 良好分割胚率，D 5 胚盤胞発生率，D 5 良好胚盤胞率
2PB を放出している卵子およびその他の未熟な卵子， および凍結融解単一胚盤胞移植成績を比較検討した．
極体不明瞭な卵子にはr-ICSIを施行せず r-ICSI 適応IVF

胚盤胞発生率は採卵から 5 日目に胚盤胞への成長を認群とし，2PB が確認できず， 第 1 極体のみの卵子に対しめた胚とした．

て ICSI を施行した（r-ICSI 適応 ICSI 群）．
c-ICSI は前培養後に顆粒膜を除去した卵子に，
形態正

図1

4

また，統計学的解析にはχ2 検定を用い，P< 0. 05 を有意差ありとした．

検討期間内における回収卵子４個以上 4,074 周期の内訳

表2

表3

各群における臨床成績

各群における胚移植成績率は17. 9%（5/28）であった（表2）．
また，2PBが確認されずr-ICSIが必要と判断されたICSI 群（r-ICSI適応 ICSI 群）の受精率は81. 3%（538/662），r-ICSI 後3PN 率は5. 3%（35/662），
分割率は88. 5 %（476/538），
良好分割胚率は37.0%（176/476），胚盤胞発生率は27. 2%（104/382），
良好胚盤胞率は28. 8%（30/104）
であった
（表2）
．2PBが
媒精卵子中30%未満でありr-ICSIの適応となった，132
周期中41周期の31.1%（41/132）でr-ICSI実施卵子にの※両群間に有意差なし

み受精卵が得られた．この132周期の内訳として，初回ART症例が59.1%（78/132），2回目症例が18. 2%（24/結果

媒精4個以上のIVF 適応群2, 547周期の平均年齢は36.4±4.3歳，平均採卵回数は2.0±2.2回であった．2,547

132），3 回目以降症例が22.7%（30/132）
であった．
また，
r-ICSI導入後，検討期間内において媒精卵数が4個以上の周期において，受精卵が全く得られず治療キャンセルとなった周期は0.1%（3/2547）であった．

周期のうち94. 8%（2415/2547）
は，第2 極体が30% 以上

同期間におけるc-ICSI 1, 527周期の平均年齢は37. 3

確認できたためICSIは不必要と判断した（図1）．ICSIが不±4. 4歳，
平均採卵回数は2.1±2. 3回であった．c-ICSI

必要と判断し，c-IVFのみ実施した2,415周期の受精率は群の受精率は75.1%（7476/9959），ICSI後3PN率は2.8%

76. 9%（16290/21176），3PN 率は9.1%（14810/16290）， （276/7476），分割率は91. 0%（6801/7476），良好分割
分割率は86.6%（14110/16290），
良好分割胚率は55. 5%

胚率は48.1%（3272/6801）， 胚盤胞発生率は35. 4%（7829/14110），胚盤胞発生率は50. 8%(5642/11107), （1859/ 5253），良好胚盤胞率は35. 9%（668/1859）
良好胚盤胞率43.5%(2456/5642)であった
（表2）
．
2,547

であった（表2）．また，凍結融解単一胚盤胞移植の妊娠周期のうち5. 2%（132/2547）
においては，2PBの割合が成績としてr-ICSI由来胚53周期の臨床妊娠率は43. 4%

媒精卵子中30%未満であったため，r-ICSIが必要な卵子 （23/53），流産率は26.1%（6/23）であった ．c-ICSI由があると判断した（図1）．2PBの割合が媒精卵子中30%

来胚 1473周期の臨床妊娠率は38. 8%（572/1473），臨

未満でありr-ICSIの適応となるが，その中で2PBが確認さ

床妊娠当たりの流産率は22. 9%（131/572），胚移植当

れr-ICSIは不要と判断されたIVF 群（r-ICSI適応 IVF 群）のたりの生児獲得率は28.1%（414/1473）であり臨床妊

受精率は30. 5%（155/509），3PN 率は5. 8%（9/155）， 娠率，流産率ともに両群間に有意な差は見られなかった
分割 率は84. 5%（131/155），良 好 分割 胚 率は41. 2% （表3）．
（54/131），胚盤胞発生率は51. 9%（28/54）
，
良好胚盤胞

5

考

察

今回，我々は先の後藤らの報告と同様に，媒精卵数が4個以上の症例で媒精6時間後に2PB放出の割合が30％未満の症例に限ってr-ICSIの対象とし，その後の胚発育並びに妊娠成績について同期間のc-ICSIと比較検討を行うことでr-ICSIの胚移植成績について解析を行うことを目的とした．本検討結果より，r-ICSIの適応になるが，2PBが確認されr-ICSI不要と判断した場合のIVF周期の受精率は30.5%であった．
また，r-ICSIの適応であった31.1%（41/132）の周期でr-ICSI実施群にのみに受精卵が得られた．この132周期の中には，過去のIVF
周期にて受精が確認されているIVF 2回目以降の症例も含まれており，r-ICSIを施行しなければ低受精率であったと考えられた症例も散見されたことから，事前にIVF
後低受精率になる症例を見極める事は非常に困難であるという事が確認出来た．
また，r-ICSIを導入して以降，検討期間内に回収卵子が4個以上のIVF周期において，受精率 0% の頻度は 0.1%（3/ 2547）であった．これは13）
r-ICSI導入前（2011年1月～12月）の0. 8%（15/1826）

から有意に減少する結果となった（p=0. 0003）．
また，芝原 16）や山本 17）らは全卵不受精のため起こり得る移植キャ
ンセルを減らすためにr-ICSIは有効であったと報告をしている．
今回の検討において，
r-ICSI後の3PN率（5.3%）
はc-ICSI後の3PN率（2. 8%）と比較し，有意（p<0. 05）に上昇するという先の後藤らの検討とは異なった結果となった．しかしながら，r-ICSIを実施することで完全受精障害又は低受精率であったと考えられた症例を救済することができた．
また，r-ICSI後の3PN胚作出の割
平林 15）らは5. 3%合について，
芝原 14）らは3PN率4. 6%，と我々と同程度の割合であったという報告をしている．
Nagy 18） やYuzpe 19） らは r-ICSIはc-ICSIと比較し，
ICSIを実施するタイミングが遅れることによる卵子のagingから生じる胚発育又は妊娠継続率の低下を報告している．
一方でChen 20）らは媒精6時間後のrescue ICSIの臨床妊娠率は48%であったという報告をしており，
ま有意
た平林 15）らはr-ICSI後の妊娠率はc-ICSI と比較し，な低下は見られなかったと報告をしている．今回我々は
r-ICSI由来胚盤胞とc-ICSI由来胚盤胞における凍結融
解単一胚移植（n=1,526周期）の検討を行った結果，臨床妊娠率及び流産率 ，並びに生児獲得率において両群間に有意な差は認められなかったという平林 15）らと同様の結果が得られた．以上の結果より，採卵当日のr-ICSIは
臨床上有効であると考えられた．

6

参考文献
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8) 橋本洋美・後藤栄・坪内美紀・泉陽子・吉村由香理・笠原優子・
塩 谷 雅 英：精 液 所見における当院 の split ICSI の 適 応．JMamm Ova Res, 21: 209-213, 2004.
9) 北風桃子・後藤栄・橋本洋美・松永雅美・苔口昭次・塩谷雅英：
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10) 後藤優介・緒方洋美・古橋孝祐・片田雄也・角本知世・梶原
綾乃・十倉陽子・山田聡・緒方誠司・水澤友利・松本由紀子・
岡本恵理・苔口昭次・塩谷雅英：受精障害に対する Rescue
ICSI の臨床的有効性の検討． 日受精着床会誌，31: 10-14,
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couceptus, 2nd ed., pp 151-153, Williams & Wilkins Co,
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11th World Congress on in Vitro Fertilization & Human
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Press, 1999.
13) 古橋孝祐・緒方洋美・片田雄也・角本知世・梶原綾乃・十倉
陽子・山田聡・緒方誠司・水澤友利・松本由紀子・岡本恵理・
苔口昭次・塩谷雅英： 当院におけるレスキュー ICSI について．
J Mamm Ova Res, 30: S53, 2013.
14) 芝原隆司・深作悠・箕浦博之 : rescue ICSI での 3PN 率の低減方法 −卵の成熟度と Polscope を用いて−．日受精着床会誌，
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16) 芝 原 隆司・深 作 悠・箕 浦 博 之 : 媒 精 6 時間 後での rescue
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17) 山本新吾・西山和加子・有馬薫・野見山真理・小島加奈子 :媒精 7 時間後に行う rescue ICSI の有用性．日受精着床会誌，
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18) Nagy ZP, Rienzi LF, Ubaldi FM, Greco E, Massey JB, Kort
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7

日本 IVF 学会雑誌 Vol. 20，No. 1，8 - 12，2017

ー原著 ー

アンチミュラリアンホルモン（AMH）低値症例における
年齢階層別ART 継続成績
國島 温志 1,2 ，安藤 寿夫 1 ，松尾 聖子 1,2，鈴木 範子 1，北見 和久 1,2，池田 芳紀 1,2，
梅村 康太 2，岡田 真由美 2，河井 通泰 21

豊橋市民病院

総合生殖医療センター , 2 同 産婦人科

〒 441-8570

愛知県豊橋市青竹町字八間西 50

要 旨： 卵巣予備能の新たな指標としてアンチミュラリアンホルモン（anti-Müllerian hormone;以下,AMH）が注目を集めているが，AMH低値症例での継続治療成績に関する研究は少ない．
今回，当院で血中AMH値を測定した症例を対象とし，年齢階層別，AMH値別に採卵数，妊娠率，生産率，初回妊娠に至るまでの採卵周期数などの関連を検討した．
採卵数は年齢に関係なくAMH低値群で少なかった．
妊娠率・生産率は高年齢群ほど低下したが，AMHの影響は限定的であった．
低AMH群では妊娠に至るまでより多くの周期数が必要な傾向にあったが，周期を重ねる毎に累積妊娠率が向上した．
このようにAMHは卵巣予備能を反映する
が，卵の質的低下と明らかな関連は認めず，AMH低値症例でも卵子さえ得られれば治療を継続し周期を重ねることで妊娠率を向上させられた．
キーワード：AMH，アンチミュラリアンホルモン，卵巣予備能，高年妊娠緒

データベースを用いて初回採卵前後にAMHを測定した

言患者を対象とし，AMH 1.0 ng/mLをcut off値として近年，ART において血中アンチミュラリアンホルモ

AMH 低値症例での ART における年齢階層別の採卵率

ン（anti-Müllerian hormone; 以下 , AMH）測定が普及しや妊娠率，初回妊娠に至るまでの採卵周期数などにつており，卵巣予備能の有力な指標の一つとして活用さいて検討した．

れている．卵巣内には胎児期をピークとして多数の1- 5）

原始卵胞があり，加齢に伴い減少するが，原始卵胞から対象と方法

リクルートされる胞状卵胞も加齢とともに減少すると言われている 1）．AMH は女性において出生後から閉経

当院では1996 年よりART を行っており，2013 年かに至るまでの間，主として二次卵胞の顆粒膜細胞から

らART 施行前の全例に AMH 測定を行い，6 か月毎に分泌されており，血中濃度は二次卵胞数を反映すると再 検している．AMH 検 査 法は，2016 年 5月までは4）を採用し，エスアールエル
考えられている ．従来より卵巣予備能の指標として， AMH GenII 法（ELISA 法）
2）

年齢，超音波検査で確認できる胞状卵胞数，月経期の血 （東京）に委託して 2 回測定の平均値が報告値となって
中 FSH，inhibin B などがあるが 3），AMH は FSH と異いたが，2016 年 6 月から外注業者がビー・エム・エル

なり月経周期による自然変動が少ないことも利点とさ （東京）に変更されたのに伴いアクセス AMH 法（CLEIA
れている 5, 6）．AMH は年齢とともに低下することがよ9,10）を採用している．本研究では，当院 ART 治療デー
法）

一般に AMH 低値では採卵数が少なく知られており 7, 8），

タベースを用いて 2013 年1月～ 2016 年 5月に AMH

くなることが ART 治療において問題となっている ．

を測定し，かつ測定前後18 ヵ月の間に初回採卵をおこ

40 歳以上においては AMH の低下は妊娠予後不良を反なった患者を対象とし，AMH 1. 0 ng/mL 未満だった

映するという報告もあるが ，AMH の低い症例でも妊症例（以下，低 AMH 群）と1. 0 ng/mL 以上 4. 0 ng/mL

娠に至る例はありその関連性についてはいまだ明らか未満の症例（以下，対照群）を抽出して検討に用いた．当5）2）にはなっていない ．しかしながら，継続的に患者を院では AMH 測定を月経周期の任意の時期で行っていフォローアップし，年齢も加味した AMH 低値例の ARTるが，主に 30 歳代以上女性において月経周期内変動が治療経過を示した研究は稀有である．
本研究では，継続

僅かにあることや 11），同一患者の測定でも測定毎に値がして治療している女性が多く含まれる当院 ART 治療の上下することを考慮し，AMH 初回測定から 3 回目まで

1）

受付 2017 年 1 月 21 日 / 受理 2017 年 5 月 16 日
責任著者：國島 温志 e-mail［ kunishima-atsushi@toyohashi-mh.jp ］

8

に1回でもAMH 1. 0 ng/mL 未 満だった患者をAMH

採卵のための刺激法は，個別化調節卵巣刺激法（以下，低値群と定義した．
事前に検討した結果，AMH 4.0 ng/mL

iCOS）により行い，各患者各周期毎に不妊因子や種々の以上では高年齢の患者が極端に少なくなるなど低 AMH

データにより総合的に検討してGnRH アゴニスト法や群との比較検討に適していないと判断し，本研究におい

GnRHアンタゴニスト法，FSH/HMG，
クロミフェン（以下，ては対照群を毎回の測定においてAMH 1. 0 ng/mL 以

CC），アロマタ―ゼ阻害薬（以下，AI），CC+FSH/HMG，

上 4. 0 ng/mL 未満だった症例とした．

AI+ FSH/HMGなどを選択した．各サブグループの周期

低 AMH 群の症例は 88 名 384 周期あり，初回採卵毎の調節卵巣刺激法は，Ⅰl 群でアゴニスト法13 周期時点での患者年齢の中央値は 39 歳
（28 歳～ 48 歳）で （long: 5,short: 4,ultra long: 3,ultra short:1），アンタゴ
あった．また，対照群の症例は138 名 282 周期あり，初ニスト法 28 周期，その他（CC，AI，FSH/HMGなど）
22

回採卵時点での患者年齢の中央値は 36 歳
（26 歳～ 44

周期，Ⅰ h 群でアゴニスト法 65 周期（long: 35,short:

歳）であった．なお，妊娠（分娩・流産・異所性妊娠）し13,ultra long:16,ultra short:1），アンタゴニスト法46周

た患者はそれぞれ独立した患者として解析した．ここで h期，その他12周期，Ⅱl群でアゴニスト法11周期（long:7,

群：AMH high 群（AMH 1. 0 ng/mL 以上 4. 0 ng/mL

short: 3,ultra long:1,ultra short: 0），アンタゴニスト法未満），l 群：AMH low 群（AMH 1. 0 ng/mL 未満）と65 周期，その他 64 周期，Ⅱh 群でアゴニスト法 57 周期定義する．また初回採 卵時点での年齢階層別にⅠ群： （long: 32,short:15,ultra long:10,ultra short: 0），アン
36 歳未満，Ⅱ群：36 歳以上 41歳未満，Ⅲ群：41歳以上， タゴニスト法39周期，その他11周期，Ⅲl群でアゴニスト
とも定義した．この定義を用いるとⅠl 群：20 名 63 周期， 法10 周期（long:1,short: 8, ultra long: 0, ultra short:1），
Ⅰh 群：65 名123 周期，Ⅱl 群：35 名140 周期，Ⅱh 群：

アンタゴニスト法 69 周期，その他 102 周期，Ⅲh 群でア

58 名107 周期，Ⅲl 群：33 名181周期，Ⅲ h 群：15 名

ゴニスト法12 周期（long: 6,short: 5,ultra long:1,ultra

52 周期となる（表 1）．各サブグループにおける平均年齢

short:0），アンタゴニスト法31周期，その他 9周期であっは，Ⅰl 群 32. 6 歳，Ⅰh 群 32. 3 歳，Ⅱl 群 37. 9 歳，Ⅱh

た（表 3）．有意差検定には以下の図 1，図 2 には Mann-

群 37. 9 歳，Ⅲl 群 42. 6 歳，Ⅲ h 群 42. 3 歳であった．各Whitney U 検定，
図 3，図 4 にはχ2 検定を用いた．

サブグループにおける平均 AMH は，Ⅰl 群 0. 51，Ⅰh 群
2.63，Ⅱl群0.39，Ⅱh群2.54，Ⅲl群0.37，Ⅲh群2. 23であった．以上の各群の詳細を表 2 に示した．

表1

AMH 値別，年齢群別のサブグループの設定
36 歳以上41 歳未満41 歳以上低 AMH 群
（1.0ng/mL 未満）

Ⅰl 群

Ⅱl 群

Ⅲl群

対象群
（1.0ng/mL 以上
4.0ng/mL 未満）

Ⅰh 群

Ⅱh 群

Ⅲh群

Ultra
long法

Ultra アンタゴ
short 法 ニスト法 その他

Ⅰl

5

4

3

1

28

22

Ⅰh

35

13

16

1

46

12

Ⅱl

7

3

1

0

65

64

Ⅱh

32

15

10

0

39

11

Ⅲl

1

8

0

1

69

102

Ⅲh

6

5

1

0

31

9

※その他：FSH/HMG，クロミフェン（以下，CC），アロマタ―ゼ阻害薬（以下，AI），CC+FSH/HMG，AI+FSH/HMG など

サブグループの患者背景

症例数

各サブグループにおける iCOS 周期数
Long 法 Short法

36 歳未満

表2

表3

Ⅰl

Ⅰh

Ⅱl

Ⅱh

Ⅲl

Ⅲh

20

65

35

58

33

15

63
123
140
107
181
52
周期数
（症例あたり）（1-6）（1-12）（1-19）（1-5）（1-17）（1-9）

結果

低AMH群と対照群での比較において，周期あたりの平均採卵個数（変性卵を除いた正常卵数）はⅠl群3.03個/

平均年齢
（歳）

32.6

32.3

37.9

37.9

42.6

42.3

周期，
Ⅰh群7.77個/周期，
Ⅱl群2.01個/周期，
Ⅱh群8.44

平均 AMH（ng/mL）

0.51

2.63

0.39

2.54

0.37

2.23

た
（図1）
．

※各年齢群における有意差なし
AMH：アンチミュラリアンホルモン個/周期，Ⅲl群1.72個/周期，
Ⅲh群7.67個/周期であっ妊娠に至った胚に由来する採卵周期での平均採卵個
数はⅠl群3.78個（34/9），Ⅰh群9.09個（418/46），Ⅱl9

群2.91個（32/11），Ⅱh群10.5個（408/39），
Ⅲl群2.25

58. 5％（38/ 65），Ⅱl 群 22. 9％（8/ 35），Ⅱh 群 31. 0％

個（9/ 4），
Ⅲ h 群 12. 0 個（48/ 4）であった（図 2）．

（18/ 58），Ⅲl 群 3. 0％（1/ 33），Ⅲh 群 6.7％（1/15）で患者あたりの妊娠率は，Ⅰl群45.0％（9/20），Ⅰh群あった（図 4）．

70.8％（46/65），
Ⅱl群31.4％（11/35），
Ⅱh群67.2％

初回妊娠に至るまでに要した累積周期数を図 5 に示

（39/58），Ⅲl群12.1％（4/33），Ⅲh群26.7％（4/15） した．それぞれの群における平均周期数はⅠl群 3. 2 周期，であった（図3）．

Ⅰh 群 1. 61周期，Ⅱl 群 3. 3 周期，Ⅱh 群 2. 26 周期，Ⅲl

患者あたりの生産率は，Ⅰl 群 40. 0％（8/ 20），Ⅰh 群

群 3. 75 周期，Ⅲh 群 1. 5 周期であった．

図1周期あたりの平均採卵個数（変性卵を除いた正常卵数）のサブグループ間の比較

図2

妊娠に至った胚に由来する採卵周期での平均採卵個数のサブグループ間の比較

図3

患者あたりの妊娠率のサブグループ間の比較

図4

患者あたりの生産率のサブグループ間の比較

（周期数）

Ⅰl
Ⅰh
Ⅱl

1
2
3
4
5 以上
1
2
3
4
5 以上

2
0

0

1
2
3
4
5 以上

3
3

1

1

3
3
3

1
1

1

Ⅱ h 23

4
5 以上

Ⅲl

Ⅲh

1
2
3
4
5 以上
1
2
3
4
5 以上

0

1
0
0

2

19

11

6

1
1
1

0
0
0

26

16

3

2
3

5

10

15

20

25

30

初回妊娠に至った症例数（名）図510

初回妊娠に至るまでに要した周期数のサブグループ間の比較

考察

AMH低値のみを理由に妊娠を諦めるのではなく，適切なiCOSによって妊娠を期待できると思われた．

今回の研究では，AMH低値女性で継続してARTを行本研究の限界として，当院では地勢学的に独立して人った場合に低AMH群において，高年齢層で採卵個数は

口移動の少ない愛知県東三河圏内の患者のみにART治少なくなり，治療周期数が長くなる傾向にあった（図1・療を行っており転院患者が極めて少ないが，検討期間終図5）．
妊娠率は患者あたりでも周期あたりでも高年齢層

了直前に治療を開始したためデータが不十分な患者もにおいて低下が見られた．低AMH群と対照群を比較し含まれていることや，Kaplan-Meier法等を用いて分析たところ，両群とも加齢による妊娠率の低下を認めた．

可能な超反復不成功例はごく一部にしか存在しないこ

同一年齢群間の比較ではAMHの大小により採卵数の違とが挙げられる．採卵刺激法がiCOSであることも継続

いは明瞭だったが，妊娠率の違いは限定的であった（図1

治療を行うメリットにもなっているが，一方でデータ分～図4）．
初回妊娠までの周期数の比較では，低AMH群

析において結論を導き出す支障にもなっているとも考では周期を重ねるごとに徐々に妊娠率が上昇したが，対えられる．

照群では1-2周期での妊娠率が高い一方，それ以上周期

今後の課題として，AMHのアッセイ法は発展途上でを重ねても妊娠率の上昇はあまりみられなかった（図5）． あり，本稿でも述べた最新の測定法ではAMH低値症例
石井ら 12）によりAMHが低い症例での調節卵巣刺激の有の検査精度も向上してきていることから，新しいアッセ

用性について報告があるが，当院では低AMH群ではアイ法での研究が必要と思われる．

ゴニスト法，アンタゴニスト法以外にも多様な刺激法を多く用いており，対照群ではアゴニスト法，特にlong法

謝を多く用いていた．

辞

Kedemらの報告13）では，AMH 0. 2 ng/mL 以上1.0 ng/

本論文の内容は2016年10月に神戸市で開催された

mL未満の低値群とAMH 0.2 ng/mL未満の超低値群を

第19回日本IVF学会学術集会での口演発表に内容を追比較して妊娠率に有意差は見られなかった．
本研究中で加してまとめたものです．発表の機会を与えてくださっ

AMH低値のcut off値を1.0 ng/mLとしたのは，臨床的た学術集会長の塩谷雅英先生ならびに理事長の森本義にはAMHが1.0 ng/mLを下回った時に患者医療者双方

晴先生，座長の労をお取りいただきました浅田義正先生

が心理的にART継続を懸念し始める傾向があるからでに深謝いたします．

ある．
また，本研究で使用されたAMH GenII法（ELISA法）
では測定下限値が0.10 ng/mLであり，低値における検査の信頼性が低いことなども考慮した．
既に当院にも導

参考文献

入済の次世代検査法であるアクセスAMH法（CLEIA法） 1） 土信田雅一・沢野知美・黒沢郁恵・木村恭子・藤森宏子・戸屋真由美・京野廣一：ART による卵巣反応性と AMH．産科では測定下限値が0.02 ng/mLと向上しており低値における信頼性も高くなっているため，わが国のような高年齢女性患者が多い傾向にある母集団における，より低い
cut off値での検討も今後は実施できると考えられる．
本研究では，我が国の現状を反映した30歳代後半から40歳代前半の自己卵によるARTにおいて，AMH値
が低値であるというだけで挙児を諦めるといった結論
ではなく，もともと年齢的に挙児の厳しい高年齢層においても適切なARTによって挙児を目指すことが可能であることを示唆する結果が得られた．AMH値が生産率と相関し妊娠予後を予測する可能性があるという
Lukaszukらの報告 14）や，AMH値が卵巣刺激の応答不良の予測因子となるというMcllveenらの報告 15）があるが，本研究では各年齢層における低AMH群と対照群の間で生産率には有意差が認められず，低AMH群でも周期を重ねることで出産に至る症例も認められた．
加齢など他のファクターを考慮する必要は勿論あるものの，と婦人科，78: 941-946, 2011.
2） 田島敏秀・後藤哲也・向田哲規・岡親弘・高橋克彦：当院の40 歳以上の患者における血中 AMH 値と IVF 妊娠予後との相関についての検討．日受精着床会誌，30: 1-6, 2013．
3） 下中麻奈美・鈴木望文・大川莉歩・榎本恵・中野成美・石井
鈴奈・藤田陽子・庄田亜紀子・中尾佳月・堀川道晴・根岸広明：
年齢からみた抗ミューラー管ホルモンと体外受精における臨床成績．日受精着床会誌，33: 65-71, 2016．
4） 藤本尚・神谷博文：新試薬 AMH GEN II ELISA による抗ミューラー管ホルモン測定～ JISART 他施設共同研究．日受精
着床会誌，30: 111-116, 2013．
5） 佃笑美・井上朋子・橋本周・佐藤学・赤松芳恵・中岡義晴・
森本義晴：AMH を考慮した ART 治療戦略．日受精着床会誌，
32: 98-103, 2015.
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Xella S, Volpe A : Anti-Müllerian hormone measurement
on any day of the menstrual cycle strongly predicts
ovarian response in assisted reproductive technology. Hum
Reprod, 22: 766-771, 2007.
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11Müllerian hormone values for 17,120 women presenting tofertility centers within the United States. Fertil Steril, 95:
747-750, 2011.
8） Visser JA, de Jong FH, Laven JS, Themmen AP: AntiMüllerian hormone: a new marker for ovarian function.
Reproduction, 131: 1-9, 2006.
9） 柳田小百合・松本則之・森和雄：CLEIA 法を用いたアンチミューラリアンホルモン（AMH）測定試薬の基礎的検討．医学と薬学，72: 1095-1101, 2015．
10） Demirdjian G, Bord S, Lejeune C, Masica R, Riviere D,
Nicouleau L , Denizot P, Marquet PY: Performance
characteristics of the Access AMH assay for the quantitative
determination of anti- müllerian hormone（AMH）levels on
the Access family of automated immunoassay systems. Clin
Biochem, 49: 1267-1273, 2016.
11） Lambert-Messerlian G, Plante B, Eklund EE, Raker C,
Moore RG: Levels of antimüllerian hormone in serum
during the normal menstrual cycle. Fertil Steril, 105: 208213, 2016.
12）石井鈴奈・鈴木望文・大川莉歩・榎本恵・中野成美・下中麻
奈美・藤田陽子・庄田亜紀子・中尾佳月・堀川道晴・根岸広明：体外受精・胚移植における血中 Anti-Müllerian Hormone 低値症例（0.5 ng/ml 以上 1.1 ng/ml 未満）に対する調節卵巣刺激の有用性の検討．日受精着床会誌，33: 6-10,2016.
13） Kedem A, Haas J, Geva LL, Yerushalmi G, Gilboa Y,
Kanety H, Hanochi M, Maman E, Hourvitz A: Ongoing
Pregnancy Rates in Women with Low and Extremely Low
AMH Levels. A Multivariate Analysis of 769 Cycles. PLoS
One, 8: e81629, 2013.
14） Lukaszuk K, Liss J, Kunicki M,Jakiel G,Wasniewski T,
Woclawek-Potocka I, Pastuszek E: Anti-Müllerian hormone（AMH） is a strong predictor of live birth in women
undergoing assisted reproductive technology. Reprod Biol,
14: 176-181, 2014.
15） Mcllveen M, Skull JD, Ledger WL: Evaluation of the utilityof multiple endocrine and ultrasound measures of ovarian
reserve in the prediction of cycle cancellation in a highrisk IVF population. Hum Reprod, 22: 778-785, 2007.

12

日本 IVF 学会雑誌 Vol. 20，No. 1，13 - 17，2017

ー原著 ー

ICSI 後の 1PN 由来胚が妊娠に至らない原因の探索
井頭 千明，大月 純子，古橋 孝祐，片田 雄也，辻 優大，岩﨑 利郎，
松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック 〒 650-0021

兵庫県神戸市中央区三宮町 1-1-2

三宮セントラルビル

要 旨： ICSI- 1PN 胚は，ほとんどの胚に染色体異常があり妊娠に至らないことが報告されている．本研
究では IVF- 1PN および ICSI- 1PN の臨床成績の解析と，ICSI- 1PN において染色体異常率が高くなる原因模索のため，1PN の大きさに着目検討した．2011 年 1 月～ 2015 年 12 月に移植を行った 9, 733 周期の臨床成績を解析し，2013 年 1 月～ 2015 年 2 月にタイムラプス観察を行った 79 個について 1PN 核
面積を IVF，ICSI 別に算出し比較検討を行った．臨床成績は，IVF 胚において 1PN と 2PN 間に有意差を認めなかった一方，ICSI- 1PN 胚からの妊娠は得られなかった．ICSI- 1PN の平均核面積は IVF- 1PN に比べ有意に小さかった（P= 0. 028）
．本研究から，ICSI- 1PN 胚が妊娠に至らない原因は，ICSI 時の紡錘体穿刺（吸引）による紡錘体の損傷と関連する可能性が考えられた．
キーワード：ICSI- 1PN，IVF- 1PN，凍結胚盤胞移植，核面積緒

一方我々は，雌雄前核は核膜消失直前まで大きくな

言ること，および出産に至った胚の雌雄前核消失直前の生殖補助医療（ART）を行うと，IVF および ICSI 後の面積差が出産に至らなかった胚に比べ有意に小さいこ

受精判定時に前核を 1 個のみ認める胚（以下 1PN 胚）をこのことから，核面積と染色体量にはとを報告した 11）．

確認することがある．1PN 胚の発生機序は一般的に， 相関がある可能性を考え，この仮説を基に ICSI- 1PN の
雌 雄 前 核 形 成 の 非 同 期 性 1）， 雌 雄 2 前 核 の 融 合

染色体量異常と 1PN の面積異常が関連するかを検討す（syngamy） ，もしくは単為発生であると考えられていると同時に，IVF および ICSI 由来 1PN 胚の妊娠成績解る．1PN 胚であっても，前二者が発生原因の場合は 2

析を行うことで，ICSI- 1PN 胚において妊娠が得られ倍体である可能性がある一方で，単為発生が原因の場ない原因を模索することを目的とした．

2）

合は 1 倍体である．IVF および ICSI 由来の 1PN 胚（以下 IVF- 1PN 及び ICSI- 1PN）の染色体解析を行った報対象と方法

告では，分割期胚および胚盤胞ともに 2 倍体の胚が存在することが明らかとなっている 1, 3, 4）．1PN 胚の 2 倍体

1．対象の割合は，ICSI- 1PN 胚に比べ IVF- 1PN 胚で高いこと ，【1PN 由来胚における臨床成績の解析】
5）

また，分割期胚で発生を停止した胚より胚盤胞まで発2011 年 1 月～ 2015 年 12 月に凍結融解単一胚盤胞

さらに，胚盤生した胚で高いこと が報告されている．

移植をした 9, 733 周期の後方視的解析を行った．IVF-

胞まで発生した胚には 1 倍体の胚は存在しなかったと

2PN 由来胚盤胞を移植した 6, 852 周期，ICSI- 2PN 由

3）の報告がある．当院では IVF 学会（第 13 回）にて， 来胚盤胞を移植した 2, 760 周期を対照とし，IVF- 1PN

3, 6）

1PN 胚であっても胚盤胞まで発生した胚であれば 2 倍由来の胚盤胞移植 97 周期，ICSI- 1PN 由来の胚盤胞移体の胚が存在すること，IVF- 1PN 胚は ICSI- 1PN 胚に

植 24 周期の臨床妊娠率，流産率，生児獲得率，先天異常

比べ 2 倍体の割合が高いことを報告した 7）．現在，当院率の比較検討を行った．1PN 胚の移植は，2PN 胚を優での 1PN 胚の取り扱い方法は，基本的に胚盤胞まで培先し，移植可能な胚が 1PN 胚のみの場合に限り，移植を養し，胚盤胞まで発生した胚であれば移植可能な胚とし行うか患者と相談の上実施した．

ている．施設により 1PN 胚を移植の対象としない場合 【1PN の面積比較】もあるが，移植により挙児を得たという報告もある 8- 10）．

2013 年 1 月～ 2015 年 2 月にタイムラプスにて培養

しかしながら，IVF- 1PN 胚からの出産は多くの施設でを行った胚のうち，受精判定時に 1PN が認められた

経験するも，ICSI- 1PN 胚からの出産報告は少ない．

IVF 由来胚 : 39 個，ICSI 由来胚 : 40 個の計 79 個を比較

受付 2017 年 5 月 22 日 / 受理 2017 年 6 月 9 日
責任著者：井頭 千明 e-mail［ igashira@hanabusaclinic.com ］

13

対象とした．
タイムラプスにて培養を行った症例は，年

添加 mHTF に 1 分間浸漬した．その後，室温の 0. 75M，

齢 40 歳未満および採卵回数 3 回以下の IVF および ICSI

0. 5M，0. 25M，0. 125M+ 20% SSS 添加 mHTF に，1. 5

施行卵数 4 個以上の患者を対象とした．

分間，1. 5 分間，2. 5 分間，2. 5 分間と段階的に平衡化させ胚を移動した．その後， 20％ SSS 添加 mHTF 中

2. 採卵，
精子調整，媒精，ICSI および培養方法
卵巣刺激法は，原則としてlong protocol，short protocolに 5 分間浸漬し融解を行い，移植に用いるまで global
medium+ 10% HSA にて胚培養を行った．

または antagonist protocol を用い，poor responder の

黄体補充は，月経 2 日目よりエストラジオール添付剤

症例や mild stimulation を希望する症例には自然周期の使用を開始し，15 日目よりプロゲステロン膣座薬，やクロミフェン・フェマーラを使用し，必要に応じて

16 日目よりジドロゲステロン 15mg を連日投与したホ

HMG を投与する等個別に対応した．卵胞発育とエスト

ルモン補充周期と，排卵日に排卵後 2, 5, 8日目よりhCG

ラジオール値をモニターしながら管理し，第二主席卵

3, 000 単位を筋肉内投与し，排卵後 2 日目よりプロゲス

胞径が 18mm を越えた時点で hCG 5, 000 単位またはテロン膣座薬投与，排卵後 5 日目よりエストラジオール

gonadotropin releasing hormone agonist: GnRHa

添付剤を併用した自然周期にて行った．

300μg の点鼻を行い，36 時間後に経膣超音波ガイド

胚移植は経膣超音波ガイド下にてファイコン IVF カ

下にて採卵を行った．回収した卵子は Universal IVF

テーテルⅠ型（Fuji Systems, Japan）
等のソフトカテー

Medium（Origio a/s, Jyllinge, Denmark）中で採卵からテルを用いて行った．

3 ～ 5 時間の前培養を行った．
精子は単層密度勾配法での遠心分離の後に swim up 法を用いて運動良好精子を回収した．IVF は精子濃度を 10 万 /ml に調整し媒精に

4. 胚盤胞の形態学的評価
胚盤胞の評価は，Gardner の分類を用いて胚の発生供した．ICSIは前培養後に顆粒膜細胞を除去した卵子に， 段階を Grade 1 ～ 6，内細胞塊（inner cell mass: ICM）
形態が正常な運動精子を不動化しマイクロマニュピ

形態を A ～ C，栄養外胚葉細胞（trophectoderm: TE）
形

レーターを装着した倒立顕微鏡（OLYMPUS, IX- 73）を態を A ～ C に分類し，Grade 3BB 以上を良好胚盤胞，

用いて穿刺注入した．受精判定は媒精後 18 ～ 20 時間

Grade 3BB 未満を不良胚盤胞とした．

後に行い，global medium（Life Global, Canada）+ 10%
HSA（Life Global, Canada）を用いて胚培養を行った． 5. 評価項目
卵子，胚の培養は 37℃ , 5. 5% CO ₂, 5. 0% O ₂, 89. 5%
N ₂ の気相条件下で行った．

超音波検査により子宮内に胎嚢が確認できたものを臨床妊娠とし，また，経過観察にて胎児に心拍が認められなかった症例，および心拍が認められるもその後心3. 胚盤胞凍結・融解胚移植

拍が消失した症例を流産とした．胎嚢が確認されるも，胚盤胞の凍結融解には当院で作成した凍結融解液をその後患者と連絡が付かず経過が不明の症例は，流産用いた．7. 5% ethylene glycol（v/v, Sigma Aldrich,率，生児獲得率および先天異常率から除外し解析を

Germany: EG）+ 7. 5% Dimethyl sulfoxide（v/v, Sigma

行った．
統計学的解析にはχ² 検定を用い，有意水準 5％

Aldrich, Germany: DMSO）+ 20% Serum Substituteで有意差検定を行った．

Supplement（v/v, Irvine Scientific, USA: SSS）添加
modified HTF（Irvine Scientific, USA: mHTF）を平衡
化 液 と し， 胚 を 10 分 間 浸 漬 し た．ガ ラ ス 化 液 に は

6. タイムラプス観察システム®
タイムラプス観察システムにはEmbryoScope Time-（以下，15%EG+ 15% DMSO+ 20% SSS 添加 mHTF を用いた． lapse System（Vitrolife, Gothenburg, Sweden）
平衡化した胚をガラス化液に投入し，F ストロー管

EmbryoScope）を使用した．内蔵カメラの設定は 15 分

0. 25ml（FUJIHIRA Industry co., ltd, Japan）の先端を間隔，focal plane 7 の設定とした．IVF 胚は採卵当日斜めに切除した胚凍結用ストローの先端に少量のガラの媒精後 4 時間後に顆粒膜細胞を除去した後に培養をス化液とともに乗せ，直ちに液体窒素に投入した．
ガラ

開始し，ICSI 胚は ICSI 施行後に培養を開始した．受精

ス化液に浸漬してからの液体窒素投入までの時間を 90

判定までUniversal IVF Medium（Origio a/s, Jyllinge,秒以内とした．

Denmark）
で培養を行い，受精判定後は global medium+10% HSA（Life Global, Canada）
胚の融解は，胚凍結用ストローを液体窒素から取り （Life Global, Canada）
出し，直ちにストローの先端部を 37℃に加温した 1Mを用いて胚培養を行った．胚の培養は，無加湿，37℃

Sucrose（Sigma Aldrich, Germany: Suc）+ 20% SSS

6.0% CO₂, 5.0% O₂, 89.0% N₂の気相条件下で行った．

14

IVF-2PN 群: 43.0%，ICSI-1PN 群: 0.0%，ICSI-2PN 群:

7. 1PN の面積測定
EmbryoScope の画像を用いて 1PN の核直径の長辺38. 2%であった．IVFに おける流 産 率 はIVF-1PN 群:と短辺を測定した（図 1）．
前核の大きさは前核消失直前

26. 3%，IVF-2PN 群: 23.4%，
生児獲得率はIVF-1PN 群:まで増大することから，測定は前核消失の直前に行っ

29. 2%，IVF-2PN 群: 32.7%，
先天異常率はIVF-1PN 群:

た．1PN面積（μm²）
は楕円の公式より，長辺
（μm）
/2×

4. 2%，IVF-2PN 群: 2. 5%であり，いずれもIVF-1PN 群と

短辺
（μ m）
/ 2 ×πを用いて算出した．

IVF-2PN 群間に有意差を認めなかった（表1）．
一方，ICSI1PN 群からの妊娠は得られず，臨床妊娠率はICSI-2PN 群と比べ有意に低い結果となった（P<0.001）
（表2）
．IVF
における良好胚盤胞に限定した臨床妊娠率は，
IVF-1PN群:
60.0%，IVF-2PN 群: 53.4%， 流 産 率 はIVF-1PN 群:
18. 5%，IVF-2PN 群: 21. 8%，
生児獲得率はIVF-1PN 群:
48. 9％，IVF-2PN 群: 41.6%，
先天異常率はIVF-1PN 群:

図1
1PN の核直径
矢印（実線，点線）部分を測定

5. 3%，IVF-2PN 群: 2.1%であった．IVFにおける不良胚盤 胞に限 定した臨 床 妊 娠 率は，IVF-1PN 群: 23.1%，
IVF-2PN 群: 29.1%， 流 産 率 はIVF-1PN 群: 45. 5%，
IVF-2PN 群: 27. 3%，生児獲得率はIVF-1PN 群: 11. 8％，
IVF-2PN 群: 21.0%，先天異常率はIVF-1PN 群: 0.0%，
IVF-2PN 群: 3.6%であり，良好胚盤胞と不良胚盤胞とに結果限定した臨床成績において，いずれもIVF-1PN 群とIVF2PN 群間に有意差を認めなかった（表1）．

【1PN由来胚における臨床成績の解析】
胚移植あたりの臨床妊娠率は，IVF-1PN 群: 40. 2%，

表1

IVF 胚における臨床成績

表2

ICSI 胚における臨床成績【1PNの面積比較】
2，
1PNの平均核面積は，
IVF-1PN群: 720.8µm（±114.4）

15

ICSI-1PN群 : 666.4µm 2（±105. 2）であり，ICSI-1PN群の平均面積は IVF-1PN 群に比べ有意に小さかった（P=0.028）（表3）．

いかと推察した．
一方，1PNの平均核面積の検討により，1PNの核面
積はIVF-1PN胚よりICSI-1PN胚で有意に小さいこと

考が明らかとなった．Otsu らによれば，1PN核直径29μm

察以下の胚では胚盤胞へ発生しないこと，さらに，IVF胚本研究からIVF-1PN胚97個の移植により28人の挙において1PN核直径29μm以上であった胚盤胞は，染児が得られた．IVF胚において，臨床妊娠率，流産率，生色体解析の結果全て2倍体であったことを報告してい児獲得率，先天異常率は，1PNと2PN間に有意差を認る 6）．また，MateoらはICSI-1PN胚の染色体解析と核めなかった．
さらに良好胚盤胞と不良胚盤胞別での臨床

面積の比較検討により，平均核直径と平均核面積が，2

成績の比較検討においても，全ての項目で有意差を認め

倍体胚では30.5μm，732.8μm²，1倍体胚では27.9μm，なかった．
我々の研究結果は，IVF-1PN胚から挙児が得

616μm²と報告し，染色体異常と核面積には有意差はと一致し，さらに1PN胚であって認められなかったものの，2倍体胚が1倍体胚に比べ核も胚盤胞まで発生した胚であれば，形態に関わらず2PN

これ
直径，核面積が大きい傾向にあることを述べた 13）．

られたという報告

8-10）

胚と同等の生児獲得率が期待できることを示したが， らの報告では1PNの核面積が染色体異常に関与していICSI-1PN胚からの妊娠例は得られなかった．この結果る可能性を示唆しており，さらに本研究の結果であるはItoiらの報告 10）と一致したが，一方でTsujiらによれば， ICSI-1PN胚から妊娠例が得られなったことと，ICSIICSI-1PN胚の臨床妊娠率は21.4％（9/42）であり，さ1PN胚の核面積がIVF-1PN胚のものより有意に小さか．
本研究ったことから，我々はICSI-1PN胚が妊娠に至らなかっのICSI-1PN胚の移植数は24周期であり，Tsujiらの移た原因が，染色体配列の異常，あるいは紡錘体形成の異植数と比較し少なく，さらにトリガーからICSIまでの時常に関与しているのではないかと推察した．

らに5人の挙児を得たことが報告されている12）間の差が異なる為，Tsujiらの報告と異なったのではな

表3

図2

ICSIを施行する際，第一極体を12時に固定した場合，

1PN における核面積

紡錘体が第一極体付近にない卵子における ICSI の模式図
a：第一極体を 12 時とした場合，紡錘体が 9 時の位置に存在する卵子.
b：卵細胞質膜の穿破の為の吸引.
c：卵細胞質膜の穿破の為の吸引による，紡錘体の損傷.
d：精子の注入 .
e：損傷を受けた紡錘体付近での受精.
f：紡錘体の損傷による異数性異常のある 1PN の形成 .

16通常3時の位置から穿刺を行う．これは紡錘体が第一極Chromosomal status of uni-pronuclear human zygotes
following in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm
体付近に存在することから，紡錘体の損傷を避けるため
injection. Hum Reprod, 10: 132-136, 1995.
である．
しかし紡錘体を可視化した報告では，19％の卵 5） Staessen C, Steirteghem V: The chromosomal constitution
子で穿刺位置に紡錘体が確認されたと述べられている 14）．
of embryos developing from abnormally fertilized oocytes
after intracytoplasmic sperm injection and conventional inさらにICSIは，精子を卵子に注入するにあたりインジェ
vitro fertilization. Hum Reprod, 12: 321-327, 1997.
クションニードルによって卵細胞質膜を穿破しなけれ
6） Otsu E, Sato A, Nagaki M, Araki Y, Utsunomiya T:
ばならない．
通常のICSIでは，卵細胞質膜を穿破するた
Developmental potential and chromosomal constitution of
めにはインジェクションニードルによる卵細胞質膜のembryos derived from larger single pronuclei of humanzygotes used in in vitro fertilization. Fertil Steril, 81: 723吸引が必須である．
以上のことから，我々は，ICSI-1PN
724, 2004.
胚の発生原因として，紡錘体が第一極体付近にない卵子
7） 水田真平，後藤栄，橋本洋美，黒田泰史，松本由紀子，水（第一極体を12時に固定した場合，9時の位置に紡錘体
澤友利，緒方誠司，山田聡，苔口昭次，塩谷雅英 : IVF おが存在する卵子：図2a ）にICSIを施行した際の受精がよび ICSI 後 1 前核が見られた胚の発生と胚盤胞における染色体解析．日 IVF 会誌，2010.
関与しているのではないかと考えた．紡錘体が9時の位
8） Gras L, Trounson A: Pregnancy and birth resulting from
置に存在する卵子に精子を注入する場合，穿破の為の卵transfer of a blastocyst observed to have one pronucleus
細胞質膜の吸引により，近傍に位置する紡錘体を含めてat the time of examination for fertilization. Hum Reprod,
吸引し，これが原因で紡錘体を損傷する可能性がある．
14: 1869-1871, 1999.
さらに精子を注入することで，損傷を受けた紡錘体の付 9） Dasig D, Lyon J, Behr B, Milki A: Monozygotic Twin Birth
After the Transfer of a Cleavage Stage Embryo Resulting
近での受精が起こり，精子側の核膜と卵子側の核膜が一from a Single Pronucleated Oocyte. J Assist Reprod
緒に形成され，異数性異常のある1PNが発生したのではGenet, 21: 427-429, 2004.
ないかと考えた（図2 ）．
10）Itoi F, Asano Y, Shimizu M, Honma H, Murata Y: Birth ofn i ne nor ma l hea lt hy babies fol low i ng t ra ns fer of
本研究から，1PN胚であってもIVF由来かつ胚盤胞
blastocysts derived from human single-pronucleateまで発生した胚であれば2PN胚と同等の生児獲得率を
zygotes. J Assist Reprod Genet, 32: 1401-1407, 2015.
期待できることが示唆された．
一方で，ICSI由来の1PN11）Otsuki J, Iwasaki T, Tsuji Y, Katada Y, Sato H, Tsutsumi
胚は出産例が報告されているものの，当院では胚盤胞へ
Y, Hatano K, Furuhashi K, Matsumoto Y, Kokeguchi S,
Shiotani M: Potential of zygotes to produce live births can
発生しても妊娠例は得られなかった．
今後ICSI-1PN胚を
be identified by the size of the male and female pronuclei
移植の対象に出来るかどうかさらに検討する必要性がjust before their membranes break down. Reprod Medある．また，ICSI-1PN胚が妊娠に至らなかった原因のBoiol, 16: 200-205, 2017.
一つとして，紡錘体穿刺による紡錘体染色体複合体の損 12）Tsuji H, Tokoro M, Fukunaga N, Asano E, Kounogi S,
Asada Y: Clinical utility of monopronuclear zygotes
傷が関連するのではないかと示唆された．それゆえ，
obtained after intracytoplasmic sperm onjection（ICSI）.
ICSIを行う際に紡錘体の位置を確認し，紡錘体の損傷をASRM, 359-360, 2016.
防ぐことで，1PNの発生を減らすことができるのでは13）Mateo S, Parriego M, Boada M, Vidal F, Coroleu B, Veiga
ないかと推測した．
A: In vitro development and chromosome constitution ofembryos derived from monopronucleated zygotes after
intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril, 99: 897-902,
参考文献
2013.
14）内山一男・菊池理仁・家田祥子・山下直樹・竹原祐志・貝嶋弘
1） Staessen C, Janssenswillen C, Devroey P, Van Steirteghem
恒・加藤修：LC-Polscope による卵子紡錘体観察の有用性 . J
AC: Cytogenetic and morphological observations of single
Mamm Ova Res, 25: 105-110, 2008.
pronucleated human oocytes after in-vitro fertilization.
Hum Reprod, 8: 221-223, 1993.
2） Levron J, Munne S, Willadsen S, Rosenwaks Z, Cohen J:
Ma le and Fema le G enomes Associated in a Single
Pronucleus in Human Zygotes. Biol Reprod, 52: 653-657,
1995.
3） Liao H, Zhang S, Cheng D, Yang Q, Lin G, Gu Y, Lu C,
Gong F, Lu G: Cytogenetic analysis of human embryos andembryonic stem cells derived from monopronuclear
zygotes. J Assist Reprod Genet, 26: 583-589, 2009.
4） Sultan KM, Munne S, Palermo GD, Alikani M, Cohen J:

17日本 IVF 学会雑誌 Vol. 20，No.1，18 - 20，2017

ー原著 ー

高齢患者の少数採卵症例における紡錘体可視化と胚発育
松本 由香１，佃 笑美１，佐藤 学１，橋本 周１，中岡 義晴１，森本 義晴 22

１
IVFなんばクリニック 〒 550-0015 大阪府大阪市西区南堀江 1-17-28
HORACグランフロント大阪クリニック 〒 530-0011 大阪府大阪市北区大深町 3-1 グランフロント大阪タワー B 15F

要 旨： OosightTM Imaging Systemを用いて成熟卵子1,133 個の紡錘体観察を行い，加齢による受精・胚発育の影響を検討した．紡錘体可視群では不可視群に比べ受精率が高く（80. 2 vs. 54. 8），39 歳以下：
A 群に比べて40 歳以上：B 群で紡錘体レターダンス（nm）が低く（1. 64 vs. 1. 54），長径（µm）が長かった（12. 2 vs. 13. 3）．また，体内成熟卵の可視群では B 群でレターダンスが低く（1. 63 vs. 1. 54），長径が長かった（12. 2 vs. 13. 3）が，受精率，移植可能胚率，胚盤胞到達率及び妊娠率に差は認めなかった．体内成熟卵の不可視群及び体外成熟卵の可視群・不可視群では年齢による差を認めなかった．採卵数が少ない高齢患者において貴重な卵子の利用率を上げるため，紡錘体観察による成熟判定を一つの指標とすることは有用と考えられた．
キーワード：OosightTM Imaging System，紡錘体，成熟，加齢緒

卵子を，OosightTM Imaging Systemを用いて紡錘体言観察を行い，紡錘体の有無，紡錘体レターダンスおよび形態的な卵子の成熟判定は，第一極体の放出をもっ長径について解析を行った．紡錘体レターダンスとは，て判断している．しかし，第一極体の放出は第一減数分

紡錘体を透過する光が微小管の複屈折性によって遅延

裂終期に起こり，第一極体の確認だけでその卵子が第して生じる光の差の距離を計測したもので，高度な分子二減数分裂中期であるかは不明である．卵子が受精可配列を持つ紡錘体ではレターダンスが高くなる．

能な状態まで成熟するためには紡錘体の再形成が必要

検討 1：年齢 39 歳以下と40 歳以上に分け，紡錘体可であり，第一極体放出直後は第一減数分裂終期である

視率，紡錘体レターダンス，長径，正常受精率，異常受精ことに留意する必要がある．紡錘体可視化システムを用率，移植可能胚率（Day 3 にて5 細胞以上，
フラグメント

いて非侵襲的に紡錘体を観察することで，正確な成熟

25% 未満），胚盤胞到達率，臨床妊娠率を比較検討した．

判定を行うことが可能となり，紡錘体可視と受精・胚発検討 2：裸化処理時に成熟卵子であった体内成熟卵と，育との関連や加齢による紡錘体の伸長，面積増加など

裸化処理時に MⅠ卵子で ICSI 施行までに極体放出しの形態変化が報告されている1, 2）．特に高齢患者は得らた体外成熟卵とに分け，39 歳以下と40 歳以上で紡錘れる卵子が少なく，正確な成熟判定をすることで貴重な

体可視率，紡錘体レターダンス，長径，正常受精率，異卵子の利用率を上げることができると期待される．そこ

常受精率，移植可能胚率，胚盤胞到達率，臨床妊娠率で，本研究では，紡錘体可視と受精・胚発育への加齢のを比較検討した．

影響を調べるため，少数採卵症例において紡錘体観察と臨床成績を年齢別に比較検討した．

結果

紡錘体観察を行った成熟卵子 1, 133 個のうち，可視対象と方法

群 839 個（74. 1％），不可視群 294 個（25. 9％）であり，

2013 年 2 月から2016 年 6 月に ICSI 施行前に紡 錘

平均年齢はそれぞれ 40. 6 歳と 41. 0 歳で差はなかった．

体観察を行った 446 症例 632 周期の 1,133 個の成熟

正常受精率は可視群で有意に高く（80. 2 vs. 54. 8,

卵子を対象とした．採卵した卵子は37℃，6％ CO 2 ，5％

P< 0. 01）
，異常受精率は可視群で有意に低かった（4. 5O 2 環境下で培養を行い，卵丘細胞除去は，80 IU/mL

vs. 12. 2, P< 0. 01）．

リコンビナントヒアルロニダーゼ（ICSI Cumulase ， 検討 1：紡錘体観察を行った卵子のうち 39 歳以下で成®

Origio 社）を用いて行った．第一極体放出が確認できた
受付 2017 年 6 月 3 日 / 受理 2017 年 6 月 19 日
責任著者：松本 由香 e-mail［ matsumoto@ivfnamba.com ］

18

熟卵子は 345 個，40 歳以上で 788 個であった．紡錘体

可視率は 39 歳以下で 75. 3％，40 歳以上で 73. 6％とス及び長径に年齢による差はなく，正常受精率，異常受差はなかった．しかし，40 歳以上で紡錘体レターダンス

精率，移植可能胚率，胚盤胞到達率および臨床妊娠率にが有意に低下し（1. 64 nm vs. 1. 54 nm, P< 0. 01），紡も差はなかった．
不可視群では体内成熟卵，体外成熟卵

錘 体長 径が 有意に伸長した（12. 2 µm vs. 13. 3 µm,

ともに年齢による差はなかった．

P< 0. 01）．
可視群，不可視群ともに，39 歳以下と40 歳以上で正常受精率，異常受精率，移植可能胚率，胚盤胞考

到達率，
臨床妊娠率に差はなかった
（表 1）
．

察

検討 2：紡錘体観察を行った成熟卵子のうち体内成熟

近年，OosightTM Imaging System によって非侵襲

卵は 1, 027 個，
体外成熟卵は 106 個であった．
体内成熟

的かつ短時間に卵子紡錘体観察を行うことで，より正卵，体外成熟卵それそれで，可視群と不可視群に分け， 確な成熟判定が可能になった．藤田らは紡錘体可視群
39 歳以下と 40 歳以上で比較した結果を表 2 に示した． では不可視群に比べて受精率が 22. 8% 高くなると報 告
体内成熟卵の可視群では，40 歳以上で紡錘体レター

しており 1），本検討でも紡錘体可視群で不可視群に比べダンスが有意に低下し（1. 63 nm vs. 1. 54 nm, P< 0. 01）， 受精率が 25. 4% 高く同様の結果となった．また，加齢に紡錘体長径が有意に伸長した（12. 2 µm vs. 13. 3 µm,

より紡錘体の形態は伸長するとの報告があり 2），本検討

P< 0. 01）．
体外成熟卵の可視群では，紡錘体レターダン

では，39 歳以下と40 歳以上の比 較で紡 錘 体可視 率

表1表2

紡錘体可視群・不可視群の年齢による比較

体内成熟卵と体外成熟卵の年齢による比較

19

に差はなく，40 歳以上で紡錘体レターダンスが低下し， 歳以上で裸化処理時に MⅠ卵子であった場合，その後長径が長い結果となった．

体外成熟しても極体放出からの時間が短く卵子成熟が年齢に関係なく紡錘体不可視群では可視群に比べ正十分ではない可能性があり，ICSI 実施までの時間を考

常受精率が低く，異常受精率が高かったが，その後の正慮することや紡錘体観察による成熟判定の必要性が示

常受精胚の発育に影響は認められなかった．

唆された．高齢患者では採卵数が少なく移植や凍結

紡 錘 体可視 群と不 可視 群に分けて 39 歳 以下と40がキャンセルになる可能性が高いため，卵子の利用率を歳以上で比較すると，どちらの群でも年齢による成績の上げるために紡錘体観察による成熟判定を一つの指標差は認められなかったが，妊娠率は 40 歳以上で低い傾として用いることは有用であると考えられる．

向が見られた．紡錘体不可視の原因が第二減数分裂中期に至っていない為か，紡錘体の変形や形成不全なのかは経時的に観察していない為判断できないが，紡錘体不可視卵の ICSI では可視卵に比べて紡錘体損傷によって異常受精率が高くなる可能性や，加齢による紡錘体の形態変化は正常な染色体分離や極体放出に影響がでる可能性がある．
今回対象としたような採卵数が少ない症例において，裸化処理時 MⅠ卵子であっても ICSI 実施までに成熟した卵子は貴重な卵子の一個であるが，体外成熟卵は体内成熟卵よりも紡錘体が大きく，受精・発生率が低くなるとの報告もある 3）．Otsukiらは第一極体放出直後に染色体が 凝集して紡 錘体が観察できない期間（gerephase）があると報告しており 4），gere-phaseと予測される卵子を救済する方法として経時的な紡錘体観察を行って ICSIを実施するという報告もある 5）．そこで，裸化
処理時に成熟卵子であった体内成熟卵と，裸化処理時
MⅠ卵子でありICSI 実施までに成熟した体外成熟卵に分けて検討を行った．体内成熟卵では，40 歳以上で紡錘体レターダンスが低下し，長径が長くなったが，体外成熟卵では差は認められなかった．採卵時第一極体を認めた卵子において紡錘体レターダンスの高低は卵子の質と関連するとの報告 6）があり，体内成熟卵では成熟からより時間が経過しているので紡錘体の加齢による形態変化が卵子の質に影響している可能性があり，体外成熟卵では年齢に関係なく成熟からの時間経過が短く，紡錘体の形態変化前に観察している可能性がある．
極体放出後の成熟卵子は経時的変化によって受精・発生能が変化するとの報告や 2），紡錘体不可視卵は1時間程度追加培養を行って紡錘体が可視化できる状態で
ICSIを行うことで成績が向上するとの報告もあるが 7），
今回の検討では，体外成熟卵において第一極体放出から紡錘体観察までの時間を考慮していない為，第一極体放出からの時間との関連についても検討が必要と考えられる．
今回の検討から，紡錘体可視卵は不可視卵に比べて正常受精率が高く，加齢によって紡錘体の形態変化は見られるが，胚発育への影響は認められなかった．40

20

参考文献
1）藤田陽子・池田玲奈・下中麻奈美・櫛野鈴奈・池田千秋・堀川
道晴・根岸広明：卵子紡錘体の視覚化と，ICSI 後の胚発生能についての検討．日受精着床会誌，30（1）：55-59, 2013．
2）星野由美：卵成熟における紡錘体の形成メカニズムと加齢による紡錘体への影響．日 IVF 会誌 , Vol.17, No.2: 2-7, 2014．
3）星野由美・佐藤優介・坂井知津香・佐藤英明：卵成熟における紡錘体形成と染色体分配の分子メカニズム．日臨エンブリオ
ロジスト会誌，第 12 号 : 1-7, 2010.
4）Otsuki J, Nagai Y: A phase of chromosome aggregation
during meiosis in human oocytes. Reprod Biomed, 15: 191197, 2007．
5）Otsuki J, Momma Y, Takahashi K, Miyakura S, Nagai Y:
Timed IVM followed by ICSI in a patient with immature
ovarian oocytes. Reprod Biomed, 13: 101-103, 2006．
6）林奈穂子・芝原隆司・深作悠・箕浦博之・川戸浩明：卵子の成熟度と紡錘体の retardance の関係から得られた良質な卵子の条件．日受精着床会誌， 32（1）： 32-35, 2015．
7）北坂浩也・福永憲隆・永井利佳・服部久美子・桑原真弓・佐々木美緒・吉村友邦・糸井史陽・田村聡子・園原めぐみ・立木都・
塩沢直美・佐野美保・羽柴良樹・浅田義正：紡錘体は ICSI のタイミングの指標となるか？．日受精着床会誌，26（1）：24-27，2009．

日本 IVF 学会雑誌 Vol. 20，No.1，21- 24，2017

ー原著 ー

2 種類の精子調整法における培養成績の比較－ 2 種類の精子調整法について
横田 梨恵，古橋 孝祐，辻 優大，大月 純子，伊藤 宏一，水澤 友利，
松本 由紀子，苔口 昭次，塩谷 雅英
英ウィメンズクリニック 〒 650-0021

兵庫県神戸市中央区三宮町 1-1-2

三宮セントラルビル

要 旨： ARTの精子調整過程において単層パーコール法の後に swim up 法を行うという組み合わせが採用されることがあるが，工程が増えることで取り違えなどのミスが起きる恐れがあり，遠心によるストレスを増やす可能性がある．そこで，作業を簡便かつ効率化する可能性を検討するために，2 層パーコール法単独による方法を試み，単層パーコール –swim up 法と精子調整結果，胚培養結果を比較した．その結果，2 層パーコール法は単層パーコール -swim up 法に比べ平均運動精子濃度が高かったが，受精率，胚盤胞発生率などの胚培養成績には差はなかった．以上，2 層パーコール法を用いると単層パーコール –swim up 法に比べ，多くの運動性を得られ，精子調整時間が短縮可能で，工程が減少するために取り違えの可能性が減少する優れた精子調整法であると考えられた．
キーワード：精子調整，swim up 法，パーコール

緒言

体外受精では形態良好かつ運動性の高い精子を用い増えて業務が煩雑となり，取り違えなどのミスが起こる恐れも考えられる．
一方，不連続多層法である2 層法は単層法よりも良好ることが重要であるため，精子調整過程によって精漿成分， 精子を回収でき 4, 5），ウィルス除去において他の方法よりも死滅精子や奇形精子などの受精を妨げる不要物を除去し， 効果的であるという報告がある 6）．また，2 層パーコール
良好運動精子を選別する必要がある．精子調整は培養液

法は，単層パーコール法とswim up法を行うよりも調整時による洗浄や遠心分離が一般的であるが，それによって精間の短縮が望める．
そこで，良質な精子を効率よく獲得し，子が受ける影響について考慮する事は不可欠と言える．

作業を簡便にすることでよりシンプルなワークフローを目

精子調整方法については，密度勾配遠心法やswim up

指すため，swim up法を行わず 2 層パーコール法（300g）

法など施設により様々な検討が行われている．
密度勾配遠単独処理による精子調整法の条件確立を行い，単層パー

心法は運動精子をより多く回収するという目的から多くのコール法の後にswim up法を行う従来法との比較検討を施設が実施しており，パーコール法として汎用されてきた． 行ったのでここに報告する．
パーコールはpolyvinylpyrrolidone（PVP）でコーティング
されたコロイドシリカゲルであることから精子選別に適し

対象と方法ており1），非運動精子や異常なDNAを持つ精子を除去することが可能である 2）．

1．対象

また，swim up法は精子の運動性を利用した精子回

2015 年11月から2016 年 2月の期間で採卵を行い，採収法であり，密度勾配遠心法の後にswim up法を行うこ

精後30 分以内の新鮮 射出精液で運 動精子濃度10×とで奇形精子や DNAフラグメンテーションを除去できる

106/ml以上かつ回収卵数が4個以上のIVF48 症例（495

当院でも体外受精の精子調整においという報告 2）がある．

個）を対象として検討を行った．2 層パーコール法と単層て良好運動精子獲得のため，単層におけるパーコール法

パーコール -swim up法でそれぞれ精子調整を行い，調整（600g）の後にswim up法を採用している．しかし，swim

後の精液所見を比較した．
また，同一症例で得られた卵子

up法はパーコール処理に比べて精子の回収率が低く3）， を均等になるよう無作為に 2 群に分け，2 層パーコール法
精子処理後に十分な精子を回収できないという問題点が群の 236 個と単層パーコール -swim up法群の 259 個にある．また，swim up法を行うことで精子調整の工程がおいてIVFを施行し培養成績を比較した．
また，この研究受付 2017 年 5 月 29 日 / 受理 2017 年 6 月 21 日
責任著者：横田 梨恵 e-mail［ yokota@hanabusaclinic.com ］

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は，施設内倫理委員会の承認の下，患者の同意のもとに 〈2 層パーコール法の手順〉
（図 1）
行った.

2 層パーコール法は，下層に 90% パーコール，上層に45% パーコールを使用し，下層の 90% パーコールは原液

2．精子調整パーコール（Sigma 社）と10×ハンクス液（Sigma 社）
を9:1〈単層パーコール -swim up 法の手順〉（図 1）の割合で作成して，45% パーコールは 90％パーコールと単層パーコールは，原液パーコール（Sigma 社）と10×ハ

1×ハンクス液（Sigma 社）
を1:1の割合で作成した．採卵

ンクス液（Sigma 社）
で90%パーコールを作成し，Universalの前日に 90% パーコールと45% パーコールを作成し，そIVF Medium（Origio 社）と等量ずつで調整した45％パー

れぞれを15mlチューブと5mlチューブに2mlずつ分注してコールを使用した．採卵の前日に 45％パーコールを作成

インキュベーターにて37℃の条件下で一晩加温した．採し，5mlチューブに1mlずつ分注してインキュベーターにて

卵当日，15mlチューブの 90% パーコールに 45% パーコー

37℃，5. 5%CO 2，5. 0%O 2，89. 5%N 2 の気相条件下

ル1ml，精液の順に重層し，300g 10 分遠心して上清をで一晩平衡化した．
採卵当日，インキュベーターから取り出除去した．
インキュベーターにて37℃，5.5%CO 2，5.0%O 2，

した45% パーコールに，10 分間液化した精液を重層した． 89. 5%N 2 の 気相 条 件下で平 衡 化を行ったUniversal
600g 20 分遠心して上清除去後，インキュベーターにて

IVF Medium（Origio 社）
1mlを15mlチューブに加えてよく

37℃，5. 5%CO 2，5. 0%O 2，89. 5%N 2 の気相条件下

懸濁し，5mlチューブに移し替えてから300g 5 分遠心しで平衡化を行ったUniversal IVF medium（Origio 社）
1mlて上清除去後，Universal IVF Medium 100µlを加えてを加えてよく懸濁してから600g 5 分遠心し，さらに上清

体外受精に使用した．

除 去 後 Universal IVF Mediumを0. 3 ～ 0. 5ml加えて
37℃，5.5%CO2，5.0%O2，89.5%N 2 設定のインキュベー

3．媒精，
培養方法

ター内で swim up 法を行った．液表面近くの浮遊液を前培養終了後，同一症例で得られた卵子をIVF 施行卵

マイクロピペットで 100µl 回収し体外受精に使用した．

数が均等になるよう無作為に 2 群に分け，それぞれ 2 層
パーコール法群と単層パーコール -swim up法群として，精子調整後の運動精子濃度を10×106/mlに調整して実体顕微鏡（SZX12 OLYMPUS, Japan）下にて媒精に供した．IVFにはUniversal IVF Mediumを1ml分注したセンター
ウェルディッシュ（FALCON 353037, BD Biosciences,
USA）を用い，供した卵の数は1ディッシュに対し最大 5 個までとした．
受精判定は媒 精後18 ～ 20 時間 後に行い，global
medium（Life Global, Canada）+10% HSA（Life Global,
Canada）
を用いて胚培養を行った．卵子，胚の培養は37℃，
5. 5%CO ₂，5. 0%O ₂，89. 5%N ₂の気相条件下で培養を行った．
分割期胚の胚観察はDay 2の午後に培養液交換と同時に行い，その後 Day 6まで培養を行った．
胚盤胞での凍結はDay 5で行い，その時点で胚盤胞への発生を認めなかった胚についてはDay6まで培養し，胚盤胞への発生を認めたら凍結した．
4．分割期胚及び胚盤胞の形態学的評価
分 割 期 胚 の 評 価はVeeckの 分 類 7）を用いて行 い，
Day2時，Grade 1，2の4 cell及びGrade 3以上の5 cell以上の胚を良好分割期胚とした．また，胚盤胞の評価はGardnerの分類 8）を用いて，胚の発生段階をGrade1- 6，内細胞塊（inner cell mass : ICM）形態をA-C，栄養外

図 1 単層パーコール-swim up法と2 層パーコール法の手順

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胚葉細胞（trophectoderm: TE）形態をA-Cに分類し，

Grade 3AA 以上を良好胚盤胞とした．

対象症例の全体の回収卵子は495 個で，その内訳は2層パーコール法群が236 個，単層パーコール -swim up法
群が259 個であった．2層パーコール法群および単層パー

5．評価項目
検討項目は精子調整後の平均運動精子濃度，平均非

コール-swim up法群の受精率はそれぞれ77.5%（183/236），

運動精子濃度，平均精子濃度，平均精子運動率，受精率， 72. 2%（187/259），
分割率は 88. 0%（161/183），86.6%
分割率，良好分割期胚率，胚盤胞発生率，および良好胚 （162/187），分割期胚あたりの良好分割胚率はそれぞれ盤胞率（≧ 3AA）とした．
なお，胚盤胞発生率については， 60. 9%（98/161），61.7%（100/162）であった．D 5 胚
分割胚数から初期胚凍結もしくは初期胚移植をした胚を

盤胞発生率はそれぞれ57.4%（74/129），57.9%（73/126），

除いた数を母数とした．胚盤胞発生率は採卵から5日目

D 5 胚盤胞あたりの良好胚盤胞発生率は23. 0%（17/ 74），に胚盤胞への成長を認めた胚とした．

28. 8%（21/ 73）であった．
これら全ての項目において両群

各項目において統計学的有意差検定はχ二乗検定およに有意な差を認めなかった（表 2）.

び Student’s t 検定を用い，P＜0. 05をもって統計学的に有意差ありとした．

7．考察
2 層パーコール法の精子調整過程は単層パーコール-swim up法と比較し，パーコールの遠心処理を10 分，

6．結果
検討対象48 症例において2 層パーコール法群，単層swim-up法を5 ～ 30 分，精子調整全工程における時間を

パーコール -swim up法群の精子調整後所見は平均運動

合計 20 ～ 45 分短縮可能である．Shekarrizら 9）の報告

精 子 濃 度：17. 3±11. 4×10 6/ml，12. 6±3.7×10 6/から，密度勾配法では遠心時間の長さに伴い，精液中の活0. 3±0. 5
ml，
平均非運動精子濃度：0.7±0. 9×10 /ml，性酸素が増加すると示唆しており，遠心時間が短い方が精×10 /ml，平均精子濃度：18. 0±11. 5×10 /ml，15.1

子調整に適していると考えられる．
活性酸素の上昇は精子

6

6

6

および平均精子運動率：94. 8±5. 8%， 運動性の低下，精子核 DNA 断片化に関連するとされてお±16. 0×106/ml，
97. 2±4.1%であり，平均運動精子濃度（P= 0.008），平均

り，DNA 断片化率の高い症例では精子運動率が低下し，非運動精子濃度（P= 0.008）で2 層パーコール法群が単層妊孕性に影響する1）と報告されている．これらのことから，

パーコール –swim up法群に比べて有意に高く，平均精子

活性酸素の産出が抑えられる精子調整方法を選択するこ

運動率（P=0.021）
では単層パーコール法群が2層パーコーとが望ましいと示唆される．

ル法群と比較し有意に高かった（表1）．

Kimらは g の大きさは精子に影響を与えるとしており，

表12 層パーコール法と単層パーコール-swim up法における精子調整後所見の比較

表22 層パーコール法群と単層パーコール-swim up法群における培養成績の比較

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200gでは精子の運動性に影響はないが，400gまたは

spermatozoa. Ibt J Fertil Womens Med, 42: 412-417, 1997.
6） Politch JA, Xu C, Tucher L, Anderson DJ: Separation of
ま600gでの遠心は運動性を低下させると報告している ．
human immunodeficiency virus type 1 from motile sperm
た，600g 以上の遠心は精子の運動性を低下させるがby the double tube gradient method versus other methods.
300g ～ 500gでは精子にほとんど悪影響を及ぼさないと
Fertil Steril, 81: 440-447, 2004.
従来法ではswim up法を行うために密 7） Veeck LL: In: Atlas of the human oocyte and early
いう報告 11）もある．
conceptus, 2nd ed., pp151-153, Williams & Wilkins Co, 1991.
度勾配遠心法で精子を多く回収することを念頭に置いて
8） Gardner DK and Schoolcraft WB: Towards Reproductive
600gを採用していたが，300gでの遠心を選択すること
Certainty: Fertility & Genetics Beyond. Proceedings of theにより精子へのダメージを軽減できる可能性が示唆される．
11th World Congress on in Vitro Fertilization & Human
Reproductive Genetics, pp347-371, Carnforth Parthenon
また，2 層パーコール法は単層パーコール -swim up法
Press, 1999.
に比べて精子調整後の運動精子濃度が有意に高く（表1），9） Shekarriz M1, DeWire DM, Thomas AJ Jr, Agarwal A: A
運動性においてより良好な精子を回収できたことが考えら
method of human semen centrifugation to minimize theれる．
一方，swim up法は運動精子の回収率が低く，パー
iatrogenic sperm injuries caused by reactive oxygen
species. Eur Urol, 28: 31-35, 1995.
コール処理後の所見が不良の場合swim up法を行うこと
10） Kim S, Agca C, Agca Y: Effects of various physical stress
で運動精子数がさらに少なくなり，良好な運動精子を回収
factors on mitochondrial function and reactive oxygen
することが困難となる可能性がある．
species in rat spermatozoa. Reprod Fertil Dev, 25: 1051拝郷ら12）は，密度勾配遠心法単独処理と密度勾配遠心1064, 2013.
法後にswim up法を行う密度勾配遠心法 -swim up法とで 11） Lee WI, Gaddum-Rosse P, Smith WD, Stencher M, Blandau
RJ: Laser light-scattering study of the effect of washing on
臨床成績に有意な差はなく，cIVF周期の精子処理は密度
sperm motility. Fertil Steril, 38: 62-67, 1982.
勾配遠心法単独処理で充分であると示唆している．
本研究12）拝郷浩佑 : Conventional IVF における最適な精子処理方法のにおいて2 層パーコール法と単層パーコール -swim up法
検討～密度勾配遠心法単独処理と密度勾配法ト Swim up 法
併用処理後の臨床成績の比較～ , 第 20 回日本臨床エンブリオを比較したところ，培養成績の全ての項目において両群間ロジスト学会 ワークショップ・学術大会・市民講座 , 2015.
10）に有意な差は見られなかった．
このことから，2 層パーコー

ル法は，単層パーコール -swim up法と同程度の良好精子が回収でき，精子調整において有用であることが示唆された．
本検討においては調整方法の違いによる精子 DNAフ
ラグメンテーションについての解析は行わなかったため，今後は精子 DNAフラグメンテーションへの影響も検討していく必要性が考えられた．

参考文献
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