代謝物予測におけるヒト肝細胞
スフェロイド培養系の有用性の検討

P144*王鞍 孝子1)2), 太田 之弘1)3), 長尾 卓也1)4), 楠元 久美子1)4), 小枝 暁子1)5),
上田 忠佳1)6), 八尋 寛司1)8), 田村 朋子1)8), 城村 友子1)9), 池谷 武志1)9),
小関 恵美子1)9), 和田 一輝1)10), 内藤 一史1)11), 井上 由紀子1)7), 高橋 直希1)7), 岩井 久和1)7)1)安全性評価研究会 スフェロイド分科会, 2)丸石製薬株式会社, 3)中外製薬株式会社, 4)株式会社住化分析センター, 5)株式会社イナリサーチ,
6)DSファーマバイオメディカル株式会社, 7)株式会社三和化学研究所, 8)STEMバイオメソッド株式会社, 9)株式会社トランスパレント,
10)日本ベクトン・ディッキンソン株式会社, 11)日本チャールス・リバー株式会社

Table 1. Cell-able とMSAの培養系における各代謝物の検出結果（全培養期間）

Introduction
肝細胞あるいは肝ミクロソームを用いた薬物のin vitro代謝試験は探索研究だけ
でなく、ヒトに初めて投与するときに必要とされる試験である（ICH-M3（R2））。特に代謝物の安全性を評価する上で、ヒト代謝物をできるだけ早い段階で検討することが望まれている。これまで単層培養法などのin vitro代謝試験では、臨床で確認されている代謝物の5～6割程度の検出に止まり、その中でも第2相の代謝物生成は低いと報告されている1,2) 。そこで、安全性評価研究会スフェロイド分
科会では、より生体に近いと考えられている三次元培養系で、長期培養が可能とされるヒト肝細胞スフェロイドを用いて、各種化合物の代謝物の予測性を検討し、スフェロイド培養系の有用性を評価した。

Methods＜培養系＞
・凍結ヒト肝細胞 2 Lot , CR（日本チャールス・リバー , lot no. Hu8110）,BD（ベクトン・ディッキンソン, lot no.228）
・フィーダー細胞 ：マウス線維芽細胞3T3-Swiss albino（8×103 cells/well）
・培養プレート: 2種, Cell-ableTM 96well plate （トランスパレント）,
MSA （Micro Sphere Array, STEMバイオメソッド）・培地 : Cell-able; RM101 （1%FBSを含む、トランスパレント）
MSA; 10%FBS添加ウィリアムスE培地

Cell‐able
施設
内訳＜代謝物産生および検出＞
スフェロイドを形成後、Day0, 2, 7,14及び21に10µMの各種化合物8種（Acetaminophen, Midazolam, Diclofenac, Lamotorigine, Salbutamol,
Propranolol, Imipramine及びTestosterone）を添加し、2～3日間あるいは7日間曝露した。培養上清中に産生された代謝物と基質とをLC/MS/MSを用いて測定し、内標（IS）に対するresponseを求めた。 代謝活性の指標としての基質減少率は、対照well
として、Feeder cellのみに各基質を添加したものを用意して（Feeder無しの培養系では培地のwell）、対照wellのresponseを100%として減少率を算出した。

＜実験スケジュール＞

MSA（Feeder細胞の有無で評価）

Cell-able（肝細胞2Lotで評価）

Day -7 ：Feederなし：肝細胞を播種
Co-culture ：Feeder細胞と肝細胞を１：１で播種
肝細胞数 5.7×104 cells/well(48 well plate)Day -5 ：Feeder細胞を播種
Day -2 ：肝細胞を播種
2×104 cells/well(96 well plate)

5 施設（A, B, C, D,
E）
MSA
1 施設
（E）

化合物名の下段は主代謝酵素を示す＊保持時間の異なる位置異性体臨床で認められる代謝物の検出結果はTable １のとおり、グルクロン酸抱合及び硫酸抱合の第2相代謝物の検出が可能であった。
特に、LamotorigineとSulbtamol の代謝物は、 in vitro試験において検出が不可能と報告されていたが3)、今回のspheroid培養（Cell-able)では検出できた（Fig. 2） 。
MSAではCo-cultureの方がFeederなしの場合よりも代謝物産生能が高かった。

←Day 0 ：化合物曝露開始 曝露時間（2-days, 7-days）←Day 2 ：化合物曝露開始 曝露時間（2/3-days, 7-days）←Day 7 ：化合物曝露開始 曝露時間（2-days, 7-days）←Day 14 ：化合物曝露開始 曝露時間（2-days, 7-days）←Day 21 ：化合物曝露開始 曝露時間（2-days, 7-days）← 培地交換 3回/週
培養上清をアセトニトリル除蛋白後、LC/MS/MSで分析（分析条件は文献を参考）

Results
緑色系及び青色の棒グラフは抱合体を示す

Fig 1. 2Lotの肝細胞（BD及びCR）による代謝比較―Cell-ableによるTestosterone
及びAcetaminophenの代謝
Testosterone及びAcetaminophenで示すように、今回用いた凍結ヒト肝細胞では、代謝の相違は質的な差は小さく、量的な差が認められた。
基質の反応率（基質減少率）からみた代謝活性はほぼ28日間（曝露7日間を含む）持続しており、Day 0 の代謝活性に対するDay 21の平均値は、Cell-ableで約98%, MSA（Feederなし）で約82%であった。

Fig 3. Midazolam, Diclofenac及びImipramineのCell-ableによる代謝物
産生と基質減少率の推移

本実験で用いた8つの基質では、同一培養期間における基質減少から評価した総代謝量は、2日間よりも７日間の曝露の方が高かった。
代謝物産生は未変化体の抱合だけではなく、多段階で産生する抱合体も産生した。
その抱合化は2日間よりも7日間曝露の方が高い傾向であった。
Midazolamの場合、2日間曝露には水酸化体が認められたが, 7日間曝露では抱合体のみとなった。
一方、Diclofenac及びImipramineの場合
では、7日間曝露においてもそれぞれ水酸
化体及びN-oxideが認められた。

Conclusion

Lamotorigine
255.97>109.0(ES+)
3.62×105

Lamotorigine-N-glucronide
432.0>256.0(ES+)
8.84×104

Fig 2. Lamotorigine （左）及びSalbutamol （右）の代謝物のLC/MS/MS分析

IS258.17>133.0(ES+)
8.29×105

Reference1)Anderson S, Luffer‐Atlas D, Knadler MP. (2009). Chem Res Toxicol 22, 243‐256.
2)Dalvie D, Obach RS, Kang P, Prakash C, Loi C‐M, Hurst S, Nedderman A, Goulet L, Smith E, Bu H‐Z, Smith DA. (2009). Chem Res Toxicol 22, 357‐368.
3) Wang WW, Khetani SR, krzyzewski S, Duignan DB, Obach RS. (2010). Published online before print . DMD October 2010 vol. 38 no. 10 1900‐1905 .

長期培養可能な本スフェロイド培養系はヒトの代謝物を予測する上で有用なツールになることが分かった。
Acknowledgment
本発表にあたり、ご助言、ご指導頂きました安全性評価研究会（谷学）のスフェロイド分科会の会
員各位に感謝申し上げます。
第38回 日本トキシコロジー学会, パシフィコ横浜, 2011年7月13日
www.postersession.com

P-159 肝毒性評価におけるヒト肝細胞スフェロイド培養法の有用性検討(1)○長井 大地1),14), 大辻 摩希子2),14), 柿木 基治2),14), 片木 淳3),14), 松本 範人3),14), 金田 信也4),14), 吉岡 祐一郎4),14),
井上 由紀子5),14), 岩井 久和5),14), 長尾 卓也6),14), 池谷 武志7),14), 小関 恵美子7),14), 城村 友子7),14), 田中 翔8),14),
八尋 寛司9),14), 田村 朋子9),14), 上田 忠佳10),14), 内藤 一史11),14), 和田 一輝12),14), 王鞍 孝子13),14)
1) 日本化薬株式会社 , 2) エーザイ株式会社, 3) 小野薬品工業株式会社, 4) 株式会社大塚製薬工場, 5) 株式会社三和化学研究所,
6) 株式会社住化分析センター, 7) 株式会社トランスパレント, 8) 財団法人 食品農医薬品安全性評価センター,
9) STEMバイオメソッド株式会社, 10) DSファーマバイオメディカル株式会社, 11) 日本チャールス・リバー株式会社,
12) 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社, 13) 丸石製薬株式会社, 14) 安全性評価研究会 スフェロイド分科会

Introduction

Results

初代培養肝細胞は肝毒性評価に有用な系であるが，従来の単層培養法では，肝臓の有する代謝機能などの長期維持が困難であり，毒性検出のために高濃度の化合物曝露が必要，あるいは，代謝活性化による毒性検出が不十分，など必ずしも生体の反応を反映できていない問題点もあった．
そこで，より生体に近い3次元構造によって種々の肝機能を維持した状態で長期間の培養が可能とされるスフェロイド培養を用いて，ヒト肝細胞に対する長期
曝露での化合物の毒性評価を実施し，肝毒性評価におけるスフェロイド培養系の有用性を検討した．

スフェロイド培養におけるAlbumin分泌量及び細胞形態の経時的推移【Micro Sphere Array (MSA)】

Control(0.5%DMSO)

1500

Lot: 228
Lot: Hu8110

1000
500
0
0

3

6

9

12

15

18

Control(0.5%DMSO)

250Albumin secretion(ng/day/well)Albumin secretion(ng/day/well)【Cell-able】

Lot: 228
Lot: Hu8110

200
150
100
50
0
0

21

3

6

Experimental period (day)

9

12

15

18

21

Experimental period (day)Methods (culture condition)
Cell-ableTM

Micro Sphere Array(in 48 well)(96 well)
STEMバイオメソッド㈱㈱トランスパレント
Lot No.:228(日本ベクトン・ディッキンソン㈱ )Lot No.: Hu8110(日本チャールス・リバー㈱ )10% FBS, ITS Dex, EGF
添加Williams E培地

培地量
曝露条件
測定項目

100 μL400 μL

薬剤含有培地を週3回，3週間曝露

AST，ALT，LDH，γ-GTP，Albumin【Cell-able】

フィーダー細胞と共培養の場合，より安定したスフェロイド形成が可能
Nonadherent area

feeder cells
Adherent area
(3T3)
Our technology can separate nonadherent area from adherent area.
This technology enables spheroids with a uniform size on plate.

【Micro Sphere Array】

肝細胞のみでスフェロイド形成が可能
スフェロイド肝細胞

肝特異機能の一つであるAlbumin産生は，肝細胞ロット間差あるいは培養日数毎の増減はあるものの，培養期間を通じて維持されていることが確認された．

6
5

400

4

2

0

0

0

0

3

10

30

100

0

Day -9 -7 -5-2-1 0Dose(µM)
3-300
1-100
20-1620
0.3-30
1-100
3-300
2

5

7

臨床Cmax(µM)
1.3
0.05
5.42
0.03
1.13
0.14

9

12 14 16

19 21

共通作業
Cell-able
Micro Sphere
Array

フィーダー細胞播種

肝細胞播種

10

30

100

300

1000

Day 217501000 16
12

500

500

8

250

4

0
3

10

30

100

0

0

300

0

3

10

30

AST(Lot. 228)
Albumin(Lot. 228)

3500 24

Day 5

100

300

2500

8

2000

6

1500

4

両肝細胞ロットでの変化は，ほぼ同様であっ
たが，Albumin分泌量ではロット228でより低用量から低下を示し，高感受性傾向であった．

(µM)

〈Cell-able〉 Lot. Hu8110

AST(Lot. Hu8110)
Albumin (Lot. Hu8110)

Day 161000

Day 21

0
0

1

3

10

30

800
600

12

400

8

500

4

0

0

200
0

100

0

〈Micro Sphere Array〉
50

1

3

10

30

AST(Lot. Hu8110)

01

Day 21

40

200
150

30

100
20

50

10

曝露，サンプル採取（逸脱酵素，Albumin）

3

10

0
1

0

3 10 30 100

1

3 10 30 100

01100 (µM)〈MSA〉 Lot. Hu8110(100µM, Day5) (10µM, Day12)

Flutamide曝露において，AST逸脱量の増加がCell-ableでDay5以降，MSAでDay12以降に認められた．なお，MSAでは高用量で低値傾向，
中・低用量で逸脱量の増加傾向が認められた.
Albumin量は両培養系共に曝露期間に応じて
おおよそ用量に依存した低下を示した.
Albumin生成能はAST逸脱量の変化が見られない用量から低下を示し，肝機能評価の鋭敏な指標として有用であると考えられた．

0
0

30

(100µM, Day5) (30µM, Day19)

Albumin (Lot. Hu8110)

Day 12Day 5100(300 µM, Day5)

Diclofenac曝露において，AST逸脱量の増加及び形態的変化がDay5以降で認められ，Albumin分泌量の低下はASTの変化に先行して，かつ低用量から認められた．

16

1000

2

Lot. Hu8110(300 µM, Day5)

3000 20

10

培地交換

3

20

12

Cumulative AST leakage (mIU/well)

Compounds
Diclofenac
Flutamide
Benzbromarone
Chlorpromazine
Troglitazone
Tacrine01500 24300 µmMethods (compounds & schedule)

500

300

Day 14

Flutamide 〈Cell-able〉

培養9日目

1000

4

100

16
14
12
10
8
6
4
2
0

1500

6

1

Lot. 228

2000

8

200

2

AST(Lot. Hu8110)
Albumin (Lot. Hu8110)

Day 5

10

300

3

枠内

培養2日目

500 12Day 20Microwell 細胞非接着面

AST(Lot. 228)
Albumin(Lot. 228)

Diclofenac 〈Cell-able〉

枠

枠外

day21

3 10 30 100 (µM)

Conclusions

化合物曝露による毒性発現の概略の変化として，高濃度では曝露初期にASTの上昇が，低用量域では曝露期間に応じてASTの上昇あるいはAlbumin
分泌量の低下が見られ，単層培養系の短期・高濃度曝露では検出できない反復曝露による肝細胞障害の検出が可能であると考えられた．
本培養系は長期服用下で発現する肝障害の評価や肝毒性発現機序解析に有用であると考えられた.

Benzbromarone
Cumulative AST leakage(mIU/well)スフェロイド培養法は従来の単層培養法に比べて長期間の細胞形態の維持及びAlbumin産生や代謝活性を指標とした肝機能の維持が可能であった.

25
20

0 μM
180 μM0 μM
180 μM

20 μM
540 μM
20 μM
540 μM

Troglitazone
0 μM
10 μM
0 μM
10 μM

60 μM
1620 μM
60 μM
1620 μM 400
30

Lot. 228

Chlorpromazine

1 μM
30 μM
1 μM
30 μM

3 μM
100 μM
3 μM
100 μM

Lot. 228

25

0 μM
3 μM
0 μM
3 μM

0.3 μM10 μM
0.3 μM
10 μM

1 μM
30 μM
1 μM
30 μM

25

3 μM
100 μM
3 μM
100 μM

10 μM
300 μM
10 μM
300 μM

400

Lot. Hu8110

600

300

20

20

200 15400 15

15

0 μM
30 μM
0 μM
30 μM

800 30Lot. 228300〈Cell-able〉

Tacrine

200

10

10

10

5

5
0

0
2

7

14

100

200

100

5

0

0

2

21

D

7

ft

i iti ti

14

21

2

7

14

21

◆

Albumin secretion(ng/day/well)

1%FBS含有 RM-101培地

100 µmday14

Albumin secretion(ng/day/well)培地

Hepatocytes

day 7薬物代謝活性（基質減少率，Ⅰ・Ⅱ相系代謝物生成）は，ほぼ21日間維持していることが確認された（ポスターP-144参照）．

－

800 spheroids are formed in each well of 96-well Cell-able.
4(2 x 10 cells/well in 96-well Cell-able)

day 2

Albumin secretion (ng/day/well)

フィーダー細胞5.7x104 cells/well

day21

Albumin secretion(ng/day/well)

2x104 cells/well
3T3-Swiss albino(JCRB9019)
8x103 cells/well

播種細胞数

day14

day 7

両培養系ともスフェロイド形成後，約1ヶ月の培養が可能であり，培養期間中のスフェロイド形態は安定して維持されていた．

Cumulative AST leakage (mIU/well)

凍結ヒト肝細胞

day 2

0

0
2

7

14

21

(day)

f

Acknowledgments
本発表にあたり，ご助言・ご指導を頂いた安全性評価研究会 スフェロイド分科会の会員各位に感謝申し上げます．

肝毒性評価におけるヒト肝細胞スフェロイド培養法の有用性検討（2）○岩井 久和1) 14) , 井上 由紀子1) 14), 柿木 基治2) 14)，大辻 摩希子2) 14), 田中 翔3) 14), 長井 大地4) 14), 上田 忠佳5) 14),
八尋 寛司6) 14), 田村 朋子6) 14), 池谷 武志7) 14), 城村 友子7) 14), 小関 恵美子7) 14), 太田 之弘8) 14), 金田 信也9) 14),
吉岡 祐一郎9) 14), 松本 範人10) 14), 片木 淳10) 14), 楠元 久美子11) 14),内藤 一史12) 14), 王鞍 孝子13) 14)P-1601)株式会社三和化学研究所, 2) エーザイ株式会社, 3) 財団法人食品農医薬品安全性評価センター, 4) 日本化薬株式会社,
5) DSファーマバイオメディカル株式会社, 6) STEMバイオメソッド株式会社, 7) 株式会社トランスパレント, 8) 中外製薬株式会社,
9) 株式会社大塚製薬工場, 10) 小野薬品工業株式会社, 11) 株式会社住化分析センター, 12) 日本チャールス・リバー株式会社,
13) 丸石製薬株式会社, 14) 安全性評価研究会

スフェロイド分科会

Results

Introduction

Hepatocyte（Lot No.228）Control (0.5% DMSO)のアルブミン濃度及びAST濃度推移

10

400
300
200
100
0

5

7

12

14

16

AST Lab. B
AST Lab. C

19

21

400

5

albumin Lab. A
albumin Lab. B
AST Lab. A
AST Lab. B002（ day）

5

7

9

12

14

16

19

21

（ day）

9

12

14

16

19

21

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0

(day)

400L/well

AST, ALT, LDH, -GTP, Albumin

フィーダー細胞と共培養した場合，より安定したスフェロイド形成が可能

120
100
80
60
40
20
0
2

5

7

9

12

14

16

19

21 (day)

7

14

(day)

20
15
10
5
0
7

14

(day)

Cell-able Hepatocyte Lot No.228

800 spheroids are formed in each well of 96-well Cell-able.
(2 x 10^4 cells/well in 96-well Cell-able)

21

25

0

Cell-able

400
300
200
100

21

0
2

5

7

9

12

14

16

19

21
(day)

14
12
10
8
6
4
2
0

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0

7

14

(day)

21

1.5
1
0.5
0

0

7

14

(day)

0

21

7

14

21

(day)

両ロットのスフェロイドとも高用量で早期からアルブミン産生量の低下がみられ，投与の延長により低用量でも同様の変化がみられた。

Day7_4000M

Day7_Control

4000 mol/L
mol/L
4000  mol/L

Cumulative ALT leakage

72000  mol/L
2000  mol/L

Cumulative(mIU/well)ALT leakage(mIU/well)0

Albumin secretion (% of control)

301000  mol/L1000  mol/L

Cell-able Hepatocyte Lot No. Hu8110
500

Cumulative AST leakage

60

5500  mol/L
500  mol/L

Hepatocyte Lot No. 228

120
90

2

250 mol/L
mol/L
250  mol/L

Cumulative albumin secretion(g)Cell-able(mIU/well)
Cumulative
AST leakage(mIU/well)

培養条件

Nonadherent
Nonadherent area
area

Hepatocytes

10

600

200

0  mol/L
0  mol/L

Cumulative AST leakage
Cumulative AST leakage(mIU/well)(mIU/well)

100L/well

Hepatocytes

9150

10％FBS, ITS Dex, EGF添加Williams E培地

各培地に溶解した薬液を週3回, 3週間曝露,95％空気, 5％CO2, 37℃, インキュベータ

測定項目

AST Lab. A

15

800

0
5

Cumulative
albumin secretion
Albumin secretion(μg)(g)Albumin secretion (ng/day/well)ー

培地量Cell-able TM

Albumin secretion(ng/24hrs/well)

5.7ｘ104 cells/well

1% FBS含有RM-101培地

培地

albumin Lab. C

Acetaminophen

Albumin secretion(% ofofcontrol)
Albumin secretion(%Control)

フィーダー細胞albumin Lab. B

1000

 ASTは曝露期間を通じ，大きな変動はみられなかった（Cell-able では曝露初期のスフェロイド形成が未熟であった
可能性も考えられた）。

トランスパレント
Lot No. 228 (日本ベクトン・ディッキンソン)
or Lot No. Hu8110 (日本チャールス･リバー)

3T3-Swiss albino
JCRB9019
8ｘ103 cells/wellalbumin Lab. A 施設間差はあるものの，曝露開始21日までアルブミンの産生能が維持された。14日目頃を境にアルブミン産生能が低下する場合も見られたが，その後はその濃度レベルを維持した。

Micro Sphere Array(48wellプレート)
STEMバイオメソッド

2ｘ104 cells/wellAlbumin secretion(ng/day/well)

15

Methods（
Methods（culture condition）
condition）

ヒト凍結肝細胞1200

20
AST leakage(mIU/well)Albumin secretion(ng/day/well)

900
800
700
600
500

2

Cell-ableTM(96wellプレート)

Micro Sphere Array_Hepatocyte Lot No.228
20

Cell-able_Hepatocyte Lot No.228

AST leakage(mIU/well)

肝臓は化合物などの生体異物に対し高い曝露を受けることから毒性が発現し易い臓器である。そのため医薬品等の開発では，生体により近い状態での代謝能を維持した肝細胞を用いた種々の毒性評価が各施設にて試みられている。我々安全性評価研究会スフェロイド分科会では，ヒト肝細胞による長期培養が可能とされ，より生体に近いと考えられている3次元 in vitro 評価系であるスフェロイド培養を用いて，化合物の長期曝露による毒性評価を複数施設にて実施し，その有用性を検討した。

Lot No.228は最高用量でASTの増加がみられたが，その他の項目では明らかな逸脱酵素の増加はみられなかった。
Day21_Control

Lot No.Hu8110ではAST以外にもALTやLDHの増加がみられ，その変化は用量依存的であった。

Day21_250M

Feedercells
cells Adherent
FeederAdherent area
area
Our technology can separate nonadherent area from adherent area.
This technology enables spheroids with a uniform size on plate.

アルブミン産生能の変化は，肉眼的なスフェロイド形態変化とよく相関していた。

100μm

肝細胞のみでスフェロイドを形成することが可能

Imipramine

Acetaminophen 250, 500, 1000, 2000, 4000M
20, 60, 180, 540, 1620M

Imipramine

3, 10, 30, 50, 100M

Ticlopidine
Isoniazid
Cyclosporin A

1, 3, 10, 30, 100M
10, 30, 100, 300, 1000M
1, 3, 10, 30, 100M

40
20
0
2

Dose (Concentration)

Amiodarone

60

Cumulative AST leakage
CumulativeAST
ALT leakage
Cumulative
leakage(mIU/well)(mIU/well)(mIU/well)

Test article

80

5

7

9

12

14

16

19

-9

-7

-5

-2-1 0

2

5

7

9

12

14

16

1.5
1.0
0.5
0.0

(day)
21(day)

5
4
3
2
1
0
0

7

14

(day)

0

(day)

21

7

14

(day)

5
4
3
2
1
0
0

7

Cell- able Hepatocyte Lot No.228
Day7_Control

140
120
100
80
60
40
20
0
2

14

(day)

21

Day7_Control

5

7

9

12

14

16

21

19

21

(day)

50
40
30
20
10
0
0

Micro Sphere Array Hepatocyte Lot No. 228

Day7_100M

Day7_100M

7

14

(day)

21

12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0

(day)

0

7

14

0

7

14

(day)

19

Day14_30M

Day14_Control

21

Day14_50M

5
4
3
2
1
0
(day)

 Cell-ableにおいて100mol/Lでは曝露初期よりア
ルブミン産生能の低下がみられ，5日目にはほとん
ど産生能はみられなかった。

 30mol/Lではさらに細胞への影響が遅れる形で同様の変化が見られた。
 これらの変化はMicro Sphere Arrayでの反応においても同様の変化推移を示した。

共通作業

Ticlopidine Ticlopidine
Cell-able
Hepatocyte
Loｔ No.228
Cell-able_Lot
No.228
30

300

培地交換

Conclusionsスフェロイド培養は，これまでの培養法に比べより長期間の培養が可能である事が各施設にて実施したアルブミン産生量の結果から確認された。
化合物の長期間曝露により，比較的低用量でも肝細胞に対して化合物の毒性を検出する事ができた。
評価した逸脱酵素の中ではどの化合物ともASTの上昇が認められた。
ALTやLDHは化合物により反応性が異なり，共通の指標とはならなかった。-GTPに関しては予備検討では相関する傾向がみられたが，今回実験した化合物では毒性を捉える指標として適当ではなかった。
共同研究のP-144の結果からもスフェロイド培養では種々の代謝物が確認されており，本評価系は代謝物を含めた化合物の肝臓に対する毒性評価が可能であると考えられた。

20

200

10

100

Albumin 0 μmol/L

0

0
2

5

7

9

12

14

16

19

Albumin 1μmol/L
Albumin 3μmol/L
Albumin 10μmol/L
Albumin 30μmol/L
Albumin 100μmol/L
AST 0 μmol/L
AST 1μmol/L
AST 3μmol/L
AST 10μmol/LTiclopidine，Cyclosporin A とも高用量では曝露初期にアルブミン産生量やASTの上昇といった肝細胞の障害が見られた。
肝細胞障害は，曝露期間の延長とともに低用量でも認められた。
いずれの化合物ともアルブミンの産生能の変化が顕著であり，それに相関す
るようにASTの上昇が見られた。
ALTやLDHについては，化合物によって上昇する場合とあまり変化が見られない場合があった(データ未掲載）。

AST 30μmol/L
AST 100μmol/L21

Amiodarone 及びIsoniazidについては現在データ集計中である。

（day）

Cyclosporin
A Cell-able
Hepatocyte
Loｔ No.228
Cyclosporin
A Cell-able Lot
No. 228
40

500
400

30

300
20
200
10

100

0

0
2

5

7

9

12
（day）

14

16

19

21

Albumin 0 μmol/L

AST leakage(mIU/well)

曝露，サンプル採取(逸脱酵素，アルブミン）

Albumin secretion(ng/day/well)

フィーダー細胞播種

Albumin secretion(ng/day/well)

肝細胞播種

AST leakage(mIU/well)

Cell-able
Micro Sｐhere
Array

Albumin 1μmol/L
Albumin 3μmol/L

Acknowledgments

Albumin 10μmol/L
Albumin 30μmol/L
Albumin 100μmol/L
AST 0 μmol/L
AST 1μmol/L
AST 3μmol/L
AST 10μmol/L

本発表にあたり，ご助言，指導頂きました安全性評価研究会（谷学）スフェロイド分科会の会員各位に感謝申し上げます。

AST 30μmol/L
AST 100μmol/L

21

6 50mol/Lでは100mol/Lに遅れる形でアルブミン
産生能，AST，ALTの上昇が見られた。
Day14_Control

Day

2.0

(mIU/well)

Methods (Test article & schedule)

100

Cumulative albumin secretion
Albuminsecretion(μg)(g)

培養 9 日目

100  mol/L
100 mol/L

Micro Sphere Array Hepatocyte Lot No. 228

Albumin secretion(% of Control)

培養 2 日目

50  mol/L
50 mol/L

Hepatocyte Lot No. 228

Cumulative ALT leakage
Cumulative ALT leakage(mIU/well)(mIU/well)

Microwell

枠外

30  mol/L
30 mol/L

Cumulative
AST
leakage
Cumulative AST
leakage(mIU/well)(mIU/well)

枠内

10  mol/L
10  mol/L

120
CuAlbumin secretion
Cumulative albumin secretion
(g)
(g)
Albuminsecretion(μg)

Albuminsecretion (% of control)
Albumin secretion(% of Control)

Cell-able

3  mol/L
3 mol/L

Albumin secretion (% of control)枠

0  mol/L
0 mol/L

Cumulative ALT leakage(mIU/well)
Cumulative
ALT leakage

Micro SphereArray

第38回 日本トキシコロジー学会, パシフィコ横浜, 2011年7月13日

21

P-161ヒト肝細胞スフェロイド培養法を用いた反応性代謝物アシルグルクロニドあるいはミトコンドリアDNAポリメラーゼγ阻害剤による肝障害の検出○片木 淳1)14), 松本 範人1)14), 金田 信也2)14), 吉岡 祐一郎2)14), 長尾 卓也3)14), 楠元 久美子3)14), 柿木 基治4)14), 大辻 摩希子4)14),
城村 友子5)14), 小関 恵美子5)14), 池谷 武志5)14), 長井 大地6)14), 上田 忠佳7)14), 八尋 寛司8)14), 田村 朋子8)14), 太田 之弘9)14),
和田 一輝10)14), 内藤 一史11)14), 王鞍 孝子12)14), 岩井 久和13)14)
所属機関: 1) 小野薬品工業株式会社, 2) 株式会社大塚製薬工場, 3) 株式会社住化分析センター, 4) エーザイ株式会社, 5) 株式会社トランスパレント,
6) 日本化薬株式会社, 7) DSファーマバイオメディカル株式会社, 8) STEMバイオメソッド株式会社, 9) 中外製薬株式会社, 10) 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社,
11) 日本チャールス・リバー株式会社, 12) 丸石製薬株式会社, 13) 株式会社三和化学研究所, 14) 安全性評価研究会 スフェロイド分科会

Results

Introduction
抗ウイルス剤として用いられるヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬は，ヒトミトコンドリアDNA合成酵素（DNApolymerase γ）も阻害し，長期投与によりミトコンドリア障害が原因で肝障害を引き起こすことが知られている．また，
非ステロイド性抗炎症剤などカルボン酸を有する薬物がグ
ルクロン酸抱合を受けて生成する反応性代謝物アシルグ
ルクロニドは，肝臓組織蛋白等に共有結合し，肝障害を誘発することが推定されている．これらは薬剤性肝障害により市場から撤退している（Fialuridine, Ibufenac,
Fenclofenac, etc.）．これらの薬剤性肝障害は動物実験や培養肝細胞等を用いたin vitro試験では，その毒作用は殆ど検出されないのが実情である．
近年開発されたヒト肝細胞スフェロイド培養により，代謝機能を維持し長期間の肝細胞の培養が可能となってきた．
本研究では，DNA polymerase γ阻害作用や反応性代
謝物アシルグルクロニドに基づく肝障害を検出することを試みた．

Fialuridine
培養液中のASTの漏出（lot Hu8110）

ヒト肝細胞スフェロイドの形態変化（lot Hu8110 ）Day2

Methods

Day5

Day9

Day12

Day16

Day19

Control(DMSO 0.5%)

培養方法
・凍結ヒト肝細胞（日本チャールス・リバー（lot Hu8110）,
Fialuridine
4
ベクトン・ディッキンソン（lot 228）, 2×10 cells/well）
100μmol/L・フィーダー細胞 :マウス線維芽細胞3T3-Swiss albino
Day7までFialuridineによる変化は認められなかったが，Day9以降,（8×103 cells/well）
AST量増加および形態変化が，Fialuridineの臨床Cmax 1μmol/L・培養プレート: Cell-ableTM 96well plate (トランスパレント）
より濃度に応じて認められた．なお， lot 228も同様の結果であった．
・培地 : RM101 (トランスパレント）

IbufenacDay -5 ：フィーダー細胞を播種
Day -2 ：ヒト肝細胞を播種

Fenclofenac

Day 0 ：化合物曝露開始
Day 2,5,7,9,12,14,16,19 ：培地交換（化合物を含む）
培地中AST量の測定（日立自動分析装置7080）
写真撮影（OLYMPUS IX70/DP12）Conclusions
DNA polymerase γ阻害作用を示すFialuridineは，Day7まで変化が認められなかったが，Day9以降, 臨床Cmaxより濃度に応じたAST
量増加および形態変化が認められた．長期間の培養可能なヒト肝細胞スフェロイドを用いることにより，長期間の化合物曝露によって初めて肝毒性が発生する薬物の毒性検出が可能であり，有用な評価系と考えられた．

Acknowledgments
本発表にあたり，ご助言，指導頂きました安全性評価研究会（谷学）のスフェロイド分化会の会員各位に感謝申し上げます．
第38回 日本トキシコロジー学会, パシフィコ横浜, 2011年7月13日