線維芽細胞をめぐる最新の知見

線維芽細胞の収縮と筋線維芽細胞
Contraction of Fibroblasts, and Myofibroblasts
伊奈啓輔，北村裕和，藤倉義久

Keisuke Ina, Hirokazu Kitamura and Yoshihisa Fujikuraａ要旨

大分大学医学部生体分子構造機能制御講座構造解析分野

糖尿病性腎症の尿細管間質に出現する筋線維芽細胞は，活性型線維芽細胞とも呼ばれ線維等の細胞外基質の蓄積すなわち線維化をもたらす．また，その形態的特徴から細胞の収縮ひいては線維化組織の収縮を来たすと考えられ，線維芽細胞と平滑筋細胞の中間に位置付けられてきた．筋線維芽細胞の由来は，TGF-β1 の作用を受け線維芽細胞等の特定の細胞が α 平滑筋アクチン（αSMA）等を発現する分化転換によることが示されてきた．筋線維芽細胞の最大の形態的特徴である αSMA の発現の意義について，腎線維芽細胞を用いた in vitro 培養系で検討した．結果，収縮には αSMA の発現は必ずしも必要ではなく αSMA が発現していない線維芽細胞もストレスファイバーを形成し収縮を起こし，αSMA が発現している場合収縮は増強することが示唆された．また，αSMA 発現の細胞内シグナル経路と収縮の細胞内シグナル経路は異なり別の事象と考えられた．

キーワード：線維芽細胞，筋線維芽細胞，α 平滑筋アクチン，線維化，糖尿病性腎症

胞が収縮し，細胞とコラーゲン等の線維性細胞外基質との連
1.

はじめに結を介して線維化組織全体の収縮を来たすのであろうと考え

糖尿病は，40 歳以上の国民の 10 人に 1 人が罹患している．

られてきたものの詳細は明らかにされていない．

糖尿病の合併症の腎症を発症すると，放置すれば腎不全から死

また，筋線維芽細胞の由来については線維芽細胞なのか，に至る．わが国では，腎不全で血液透析を行っている患者の上皮細胞なのか，あるいは骨髄細胞（circulating fibrocyte）2）原因疾患のうち，最も多いのは糖尿病である．年々増加の一なのかという問題がある．

途を辿っている．この腎症の予防，治療法を開発することを目的に，腎症発症メカニズムの解明を研究テーマとしてきた．

本稿では線維芽細胞からの筋線維芽細胞への分化転換における αSMA の発現の意義について検討し，考察を加える．

糖尿病性腎症の病理組織像は，糸球体硬化症と尿細管間質の線維化である．このうち間質の線維化は，その程度が腎機能低下の程度とよく相関することが指摘されて

1）

2. 自然発症糖尿病動物の KKAy マウスの腎尿細管間質の線維化と筋線維芽細胞の出現以来，注目されるようになった．この間質の線維化が生じるメカニズ

2 型糖尿病モデル動物の KKAy マウスは，糖尿病発症 10ムとして，腎の炎症から腎内に線維化誘発サイトカインの週においてヒトの糖尿病性腎症のⅡ～Ⅲ期に相当する腎症をTGF-β1 の発現が亢進し，その作用を受け特定の細胞が筋線呈する．蛋白尿は有意に増加し，組織像は尿細管間質の線維維芽細胞に分化転換することが大変重要であると考えられ化を来たしている．この時期，尿細管上皮細胞や間質細胞にた．すなわち活性型線維芽細胞とも呼ばれる筋線維芽細胞は，TGF-β1 が 検 出 さ れ る． ま た， 間 質 の 血 管 以 外 の 部 分 に

TGF-β1 の作用を受け細胞外基質の産生分泌の亢進を来たし，αSMA 陽性細胞が認められる．腎臓の大きさはコントロール

一方では細胞外基質の消化を抑制する PAI-1，TIMP の産生に比し差はない．このように，糖尿病動物では腎間質に線維を亢進し，細胞外基質特にコラーゲン線維の蓄積を起こし線化が生じ，腎の細胞内に TGF-β1 が発現し，間質に αSMA 陽2）維化をもたらすとする，多くの報告がなされてきた ．

性の筋線維芽細胞が出現していた（図 1）3）．

ところが，筋線維芽細胞の最大の特徴である α 平滑筋ア

我々は，この筋線維芽細胞の由来を間質の線維芽細胞と考クチン（αSMA）の発現の意義については，αSMA により細え，次に in vitro の細胞培養系を用いて腎線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化転換を試みた．

ａ〒 879–5593 大分県由布市挾間町医大ヶ丘 1–1
TEL: 097–586–5631; FAX: 097–586–5632
E-mail: kina@med.oita-u.ac.jp
2008 年 2 月 14 日受付

特集

線維芽細胞の収縮と筋線維芽細胞

3.

線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換

ここで，筋線維芽細胞の定義をしておかなければならない．
線維化，肉芽組織だけではなく様々な分野で筋線維芽細胞は95【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 腎の αSMA に対する免疫組織化学染色（IgG-gold-silver法）．（a）C57BL 正常マウス 尿細管間質の血管平滑筋細胞のみが陽性に染色されている．
（b）KKAy 自然発症糖尿病マウス
尿細管間質に血管平滑筋以外に陽性の細胞（矢印）が存在している．筋線維芽細胞と考えられた．
（文献 3 の Figure 4 を改変）

図 2 NRK49F 細胞の単層培養でのストレスファイバー．
（a，c）
ファロイジン―ローダミン蛍光染色 （b，d）αSMA に対する免疫蛍光染色 （a，b）コントロール培地 ストレスファイバー
はファロイジン陽性であるが αSMA 陰性である．従って線維芽細胞と考えられる．（c，d）TGF-β1 添加培地 ストレスファイバーはファロイジン，αSMA ともに陽性である．従って筋線維芽細胞と考えられる．

登場するが，「結局，この細胞は何なのか」ということをよmodified fibroblast（筋線維芽細胞）は，機能的には線維芽細く耳にする．大変わかりにくい細胞である．歴史から見てい胞のコラーゲン等の細胞外基質産生能と収縮能を有し，線維くと理解の助けになるかもしれない．

芽細胞と平滑筋細胞の中間型であると述べている．この時点

1971 年に，Gabbiani らはラットの皮膚創傷肉芽組織の中に，では，筋線維芽細胞という言葉は使われていない．また，アmodified fibroblast が出現すると透過型電顕所見のみで論じてクチンについての言及もない．まだアクチンは 1 種類しか知いるのが筋線維芽細胞の最初の報告である 4）．その微細構造られていなかった時代である．αSMA という名称は当然出ての特徴は，本来の線維芽細胞に見られる発達した粗面小胞体，こない．αSMA が同定されたのは 1978 年頃であり，それま多くのミトコンドリアに加えて，以下の 3 つの構造物の存在ではストレスファイバーが筋線維芽細胞の大きな特徴と考えが挙げられている．
（1）「fibrillar system」として，細胞の長られていたようである．今では通常の線維芽細胞もストレス軸に平行に走る線維束が存在し，その細胞膜直下の部分と束ファイバーを形成することが知られている．このようにのところどころには電子密度の高い部分を有するとし後のスαSMA により構成されたストレスファイバーが筋線維芽細胞トレスファイバーに相当する構造物を示している．また，（2）の形態的な主な特徴とされるのに少し時間を要した．αSMA「nuclear deformation」として，核が深いしわを形成したりアが筋線維芽細胞の条件の 1 つに挙げられるようになってからコーディオン様の浅いしわを形成しているとし，この核の変も，細胞骨格の表現型としてアクチンフィラメントと中間径化は，ヒスタミン等により収縮した平滑筋細胞，心筋細胞，フィラメントの各種組み合わせの中に αSMA が陰性のもの

内皮細胞に見られる形態変化であり，細胞収縮を意味するとも含めている場合があり混乱を引き起こしているようであし て い る． さ ら に，（3）「surface differentiations」 と し て，る．一方，1998 年 Schürch らは，電顕的特徴としては，①この細胞と細胞外基質（基底膜様物質）のつながり，細胞間ストレスファイバー，② fibronexus（細胞と細胞外基質とのの接着斑による結合を指摘している．いずれも，細胞が収縮，③細胞間結合として付着部位，focal adhesion と思われる）

し組織の収縮を来たすことを示唆している．このように接着帯とギャップ結合，④発達した粗面小胞体，⑤核のくぼ

96

顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

み，⑥飲み込み小胞，⑦細胞周囲が部分的に基底膜におおわれている，を挙げている 5）．この後 2004 年には，αSMA により形成されたストレスファイバーと細胞―細胞外基質のつながりを筋線維芽細胞の形態学的な定義として挙げられるに至った 6）．ストレスファイバーの形成は，細胞と細胞外基質とのつながりと密接に関係していると考えられるからか，最近では血管以外で間質に αSMA のストレファイバーを有する細胞を筋線維芽細胞と呼ぶのが通例になっている．もっと簡略化し，肉芽組織や線維化組織に出現している αSMA 陽性細胞を筋線維芽細胞としている報告も多々見られる 7）．ところで今では，肉芽組織などで筋線維芽細胞 myofibroblastに形質転換する前に protomyofibroblast という前駆細胞が存在することが指摘されている 8）．この細胞は，αSMA 陰性のストレスファイバーを形成し，機能的には migration をする，とされている．この細胞が前出の αSMA 陰性の筋線維芽細胞といわれたものかもしれない．
以上をふまえて，ラット腎線維芽細胞 NRK49F 細胞を invitro で単層培養し αSMA 陽性のストレスファイバーが検出された細胞を筋線維芽細胞と呼ぶこととした．糖尿病動物の実験で示唆されたように，TGF-β1 を 2 日間作用させるとこの線維芽細胞は筋線維芽細胞へと分化転換した．TGF-β1 を作用させないコントロール群では，αSMA 陽性ストレスファイバーを有する細胞はほとんど認められなかった．サブタイ
プの如何を問わず全ての線維性アクチンを染め出すファロイ
ジン―ローダミン染色を行うと，コントロール群も TGF-β1

図 3 FPCL 内の細胞の透過電顕像．（a）コントロール培地（b）TGF-β1 添加培地 ともに同様にストレスファイバー（矢印）が示されている．（文献 9 の Figure 3 を改変）作用群もほぼ同様にストレスファイバーが染め出された．
TGF-β1 作用群では，ストレスファイバーのほぼ 100％がわれることはよく知られている．即ち，TGF-β1 Ⅱ型受容体

αSMA 陽性のものから陽性率がさほど高くないものまで様々に TGF-β1 が結合しⅠ型受容体をリン酸化し活性化して，存在した（図 2）．

Smad2/3 のリン酸化から，Smad4 を動因し complex を形成し4.て核内に移行し転写因子として DNA に結合し，形質を発現線維化組織の収縮する．しかし，他のシグナル経路も存在することが知られて次に，肉芽組織や線維化組織の in vitro モデルとされていいる．我々は，αSMA 発現に関する経路として，p38MAP キ

るⅠ型コラーゲンゲルを用いた実験系により組織の収縮につナーゼ，p44/42MAP キナーゼ，PI3 キナーゼ，Rho キナーゼ

いて検討した．ゲルの上に NRK49F 細胞を乗せ，あるいはの 各 経 路 に つ い て 調 べ た．P38MAP キ ナ ー ゼ 阻 害 剤中に入れ（FPCL），FPCL を培養液中に浮遊させ，その収縮

SB203580 を TGF-β1 とともに作用させたところ，αSMA 陽度 を 測 定 し た． 単 層 培 養 の 場 合 と 同 じ 濃 度 で 同 じ 時 間性のストレスファイバーを有する細胞数は TGF-β1 単独作用

TGF-β1 を作用させたところ，コントロール群に比し著明に群に比しおよそ半減していた．P44/42MAP キナーゼ阻害剤

FPCL は収縮した．収縮した FPCL にアクチン脱重合剤のサ

PD98059，PI3 キナーゼ阻害剤 Wortmannin，Rho キナーゼ阻

イトカラシン D を作用させると FPCL は弛緩した．このと害 剤 Y27632 あ る い は hydroxyfasudil を 作 用 さ せ た 群 は，き細胞は星形あるいは紡錘形から円形化し，ファロイジン―αSMA の発現に変化を認めなかった．また，TGF-β1 と同時

ローダミン染色ではストレスファイバーが消失していた 9）．に TGF-β1 受容体阻害剤 TRB を作用させた場合，ストレス続いてサイトカラシン D を除去すると，FPCL は再度収縮しファイバーを形成する αSMA の発現はほぼ完全に抑制されていった．細胞の形態も元の形に戻っていった．これらのこることを確認した．以上のことは，αSMA の発現には少なくとからサイトカラシン D は可逆的にアクチンを脱重合するとも TGF-β1 受容体の活性化を介し p38MAP キナーゼ経路がことにより収縮を抑制し，細胞収縮にはアクチンのストレス関与していることを示唆している．

ファイバー形成が必要であることが示された（図 3）．
5. αSMA 発現の細胞内シグナリング経路
TGF-β1 の細胞内シグナリングは，Smad 経路を介して行特集

線維芽細胞の収縮と筋線維芽細胞

6.

FPCL 収縮の細胞内シグナリング経路

まず，TGF-β1 とともに TRB を作用させることにより収縮がほぼ完全に抑制されることを確認した．次に，上述の各97【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

経路の TGF-β1 誘発 FPCL 収縮への関与について検討した．

発現と収縮は別の事象と考える必要がある．αSMA が発現す

Y27632 あるいは hydroxyfasudil により約 50％の収縮抑制がると収縮が増強する，と考えられた．

認められ，SB203580 でも同程度の収縮抑制効果がみられた．
Hydroxyfasudil と SB203580 の併用ではほぼ 100％収縮は抑8.

制 さ れ た．PD98059 及 び Wortmannin は 効 果 な か っ た．

αSMA 発現の有無にかかわらず，TGF-β1 は線維化組織のTGF-β1 に よ る FPCL の 収 縮 に は，Rho キ ナ ー ゼ 経 路 と収縮をもたらすことが示されたわけであるが，この収縮は糖p38MAP キナーゼ経路が関与していることが示唆された．ク

尿病性腎症では腎線維化から腎不全に至る際の腎萎縮に相当

ロストークを含めたこれらの詳細な機序は不明である．Rho

すると考えられた．

キナーゼ活性化からアクチン―ミオシンの相互作用による収縮に至る経路は以下のように考えられた．Rho キナーゼはミ糖尿病性腎症における腎線維化組織の収縮の意味

結論としては，線維化組織の収縮には αSMA の発現（筋線維芽細胞）が絶対条件とはならないと考えられた．

オシン軽鎖のリン酸化を促進することが知られているが，それでは，他に αSMA 発現の意義は何であろうか．形態

Y27632 を用いて調べたところ支持する結果が得られた．さ的な最大の特徴である αSMA の発現と機能的最大の特徴のらに，ミオシン ATPase 阻害剤 BDM を投与することにより線維蓄積との直接の関連を考えることも可能かもしれない．

収縮は抑制されることが示された．以上から，Rho キナーゼ

サイトカラシン D を作用させることによりコラーゲン産生が活性化されると，ミオシン軽鎖のリン酸化が亢進し，ミオ分泌能が抑制されるとする報告がある 10）．これらは今後のシン ATPase が活性化され，アクチン―ミオシン相互作用に検討課題である．

よる収縮が起こるのではないかと考えられた 9）．
一方，コントロール培地による収縮の細胞内シグナリング
も TGF-β1 受 容 体 の 活 性 化 を 介 し，Rho キ ナ ー ゼ 経 路 とp38MAP キナーゼ経路が関与していることが示唆された．これは，線維化状態の FPCL でコラーゲン線維等の細胞外基質が細胞を刺激し，TGF-β1 を分泌促進させ autocrine 作用により TGF-β1 受容体が活性化され細胞内経路へとシグナル伝達されていったものと考えられた．
7. αSMA の発現と収縮の関係
In vitro の以上の結果をまとめてみると，以下のようになる．
αSMA が発現していない線維芽細胞もストレスファイバーを形成し，細胞の収縮ひいては組織の収縮をもたらす．収縮にはストレスファイバーの形成が必要であり，αSMA の発現は必ずしも必要ではない．αSMA 発現の細胞内シグナリング
は，p38MAP キナーゼ経路が関与し，Rho キナーゼ経路はほとんど関与していない．収縮のシグナリングは，p38MAP キ

文献1）Lane, P.H., Steffes, M.W., Fioretto, P. and Mauer, S.M.: Kidney Int.,
43，661–667（1993）
2）Simonson, M.S.: Kidney Int., 71，846–854（2007）3）Ina, K., Kitamura, H., Tatsukawa, S., Takayama, T., Fujikura, Y. andShimada, T.: Med. Electron Microsc., 35，87–95（2002）
4）Gabbiani, G., Ryan, G. and Majno, G.: Experientia, 27，549–550（1971）
5）Schürch, W., Seemayer, T.A. and Gabbiani, G.: Am. J. Surg. Pathol.,
22，141–147（1998）
6）Chaponnier, C. and Gabbiani, G.: J. Pathol., 204，386–395（2004）
7）Roson, M.I., Cavallero, S., Penna, S.D., Cao, G., Gorzalczany, S.,Pandolfo, M., Kuprewicz, A., Canessa, O., Toblli, J.E. and Fernandez,
B.E.: Kidney Int., 70，1439–1446（2006）
8）Hinz, B., Pittet, P., Smith-Clerc, J., Chaponnier, C. and Meister, J.-J.:Mol. Biol. Cell, 15，4310–4320（2004）
9）Ina, K., Kitamura, H., Tatsukawa, S., Miyazaki, T., Abe, H. andFujikura, Y.: Virchows Arch., 451，911–921（2007）10）Hubchak, S.C., Runyan, C.E., Kreisberg, J.I. and Schnaper, H.W.: J.
Am. Soc. Nephrol., 14，1969–1980（2003）

ナーゼ経路と Rho キナーゼ経路が関与している．αSMA の98

顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】