研究報告
秦野研究所年報
40, 10-14（2017）

マウスモデルにおける経口食物アレルギーの発症機序：…
抗原吸収に及ぼす媒体の影響
本橋寛子，新藤智子，桑形麻樹子
Mechanism of oral food allergy in the mouse model: Effects of the medium on intestinal absorption of the allergenic antigen
Hiroko MOTOHASHI, Tomoko SHINDO, Makiko KUWAGATA

In this study, we aimed to investigate effects of the antigen medium (medium L: an emulsion mixed withlinoleic acid, lecithin and physiological saline) used for sensitization in food allergy mouse model on intestinal
absorption of allergenic antigen after oral administration. We examined the effect of medium L on theabsorption of intact ovalbumin (OVA) from the small intestine into portal vein blood and the uptake of OVA
into the small intestine. As a result, it was shown that the medium L increased the absorption of OVA into
the portal vein from the small intestine, maintaining the OVA concentration in the blood until 60 mins after
intraintestinal administration, and further increasing the uptake of OVA in the small intestine epithelium.
From these results, it is considered that medium L may cause a change in immune response in the small
intestine by promoting the absorption of OVA.

諸言（OVA）をマウスに経口投与しても感作は成立し現在日本人のほぼ 2 人に 1 人が喘息，アトピーないが，媒体としてリノール酸とレシチンのエマ性皮膚炎，花粉症や食物アレルギーなど何らかのルション（媒体 L）を用いて OVA を経口投与したアレルギー疾患を持つといわれている ．その中場合には，特異抗体を産生させ，感作を成立させでも，食物アレルギーは命に関わる危険性のあるることができる．さらに，感作されたマウスに多アナフィラキシーショックの要因となる割合が高量の OVA を経口投与するとヒスタミンの遊離をい．食物アレルギーの主要な感作経路は腸管であ伴った全身性アナフィラキシーを発症する．

1）ると考えられている．腸管には腸管免疫系が存在

腸管における免疫系は，腸管から取り込まれたし，食物などに対しては，経口免疫寛容という免抗原により刺激を受けて反応すると考えられるこ

疫抑制作用が働く．この様な機能が備わっているとから，先に我々が開発したマウスモデルの食物にも関わらず，なぜ感作成立に方向づけられるのアレルギー誘発条件より，経口投与に使用する媒かについては未だに明らかとなっていない．

体の違いが，取り込まれる段階の抗原の挙動に影

著者らは，近年，食物アレルギーの患者数が増響を及ぼすことが予想された．そこで，本研究で加していることから，脂肪酸摂取量の増加や摂取は投与直後の抗原の挙動と感作成立との関連を調時の性状などのヒトの食生活環境中で増加していべることを目的とし，感作時の抗原の腸管からのる何らかの因子が食物アレルギーの引き金になる吸収に媒体の違いが及ぼす影響を検討した．と考えた．いくつかの因子とアレルギー発症との関連を検討し，それらの因子を組み合わせた媒体

材料および方法を用いて食物抗原を経口投与することで，マウス

1．動物

2）に食物アレルギーを誘発させることに成功した ．

動物は日本チャールス・リバー株式会社から購入

すなわち，生理食塩水（媒体 S）を媒体として代表した7～8週齢のBALB/c雌マウスを使用した．実験的なアレルギー誘発抗原である卵白アルブミンに際し，16時間の絶食を行った．すべての動物実

10

研究報告

験は｢一般財団法人食品薬品安全センター秦野研究

OVA 量に媒体の違いがおよぼす影響を検討し所動物実験に関する指針｣に基づいて実施した（承認た．3. 2 項において門脈血を採取後，小腸を採番号：1160100A，1160303Aおよび1160349A）．

取した．採取した小腸を上部から 6 等分に分割

2．抗原および投与媒体した後，それぞれの管腔内を PBS 1 mL で洗浄抗原として OVA（Grade Ⅲ，Sigma-Aldrich,し，小腸管腔内に残存した OVA を回収した．

St. Louis, MO）あ る い は FITC（Fluorescein

回収した洗浄液を遠心分離後，得られた上清中isothiocyanate）で標識した FITC 標識 OVA を用の OVA 量を直接 ELISA にて測定した．さらに，いた．また，既報 に基づき，経口投与媒体とし得られた結果から小腸管腔内に残存する OVAて生理食塩水（媒体 S）またはリノール酸とレシチ量の総量を算出した．

ンの混合液（リノール酸：レシチン＝ 4：1）と生

3.42）

小腸組織中に取り込まれる
FITC 標識 OVA 量

理食塩水を等量混合したエマルション（媒体 L）を用いた．投与時の抗原濃度および用量は，食物ア既報 5）を参考に，小腸管腔に直接抗原を注入

レルギーのマウスモデル実験における感作条件 2）

し，媒体の違いが小腸組織（小腸上皮およびパと同一の 1 mg/mL および 100 µL とした．

イエル板）に取り込まれる OVA 量におよぼす影

3．実験方法響を，FITC 標識 OVA を用いて検討した．吸3.1. OVA の腸液内分解の経時変化（in vitro）

入麻酔下でマウス（媒体 S および媒体 L 投与群：動物を用いた OVA の吸収実験を行う前に，各 10 匹）の左腹部を切開し小腸を露出させた．

小腸における OVA の分解におよぼす媒体の直小腸の 2ヵ所を結紮することでパイエル板 1 個接的影響を，人工腸液を用いた in vitro 消化試含む小腸の閉塞空間（以下ループ）を作製した．

験で調べた．既報 に準じて，各媒体に溶解同様に同じマウスの小腸において隣接したパイし た OVA を 人 工 腸 液（10 mg/mL pancreatin,エル板を含むループをもう 1 つ作製した．それ

0.05 M KH 2 PO 4 , pH6. 8）に添加し，37℃で 5ぞれのループに媒体 S あるいは媒体 L に溶解し分から 60 分間反応させた．反応液中のタンパ

た 1 mg/mL FITC 標 識 OVA 溶 液 100 µL を 注

ク質を SDS-PAGE にて分画し，抗 OVA 抗体を入した後，37℃下で 2 時間反応させた．反応後，用いてウェスタンブロッティングにより未分解ループ部分の小腸をそれぞれ切り出して管腔内OVA およびその分解物を検出した．

を PBS で洗浄した後，小腸上皮とパイエル板

3.2

小腸から門脈血中に移行するに分け，それぞれの重量を測定した．重量の 9

未分解 OVA 量の測定

倍量の 0. 3%SDS 溶液を加えホモジナイズし，3）媒体の違いが小腸における OVA の吸収にお遠心分離後，上清中の蛍光強度を測定した．得よぼす影響を直接的に調べるため，十二指腸にられた蛍光強度から，それぞれの媒体で作成しそれぞれの媒体に溶解した OVA を直接投与し，た検量線を用いて，組織 1 g 当たりに取り込ま小腸から吸収された物質の最短移行先である門れた FITC 標識 OVA 量を求めた．

脈血への移行を調べた．吸入麻酔下でマウス（媒体 S および媒体 L 投与群：各群および各経過時

結果間につき各 6 匹）の左腹部を切開し，十二指腸を1．OVA の腸液内分解の経時変化（in vitro）露出させた．既報 を参考に，媒体 S あるいはIn vitro 消化試験における，それぞれの媒体に媒体 L に溶解した 1 mg/mL OVA 溶液 100 µL をよる OVA 分解の経時変化を図 1 に示した．媒体

十二指腸内に投与し，37℃下 5 分から 60 分間経

S では反応時間 60 分まで未分解 OVA が残存して過後，門脈血を採取した．得られた血液を遠心いるが，媒体 L では反応時間 30 分を過ぎた後に分離後，血清を回収し，血清中未分解 OVA 濃

OVA が分解された．

度をサンドイッチ ELISA にて測定した．

2．小腸から門脈血中に移行する未分解 OVA 量4）3.3

小腸管腔内に残存する OVA 量の測定

門脈血中の未分解 OVA は，媒体 L では経腸投

既 報 を 参 考 に， 小 腸 管 腔 内 に 残 存 す る

与後 5 分で媒体 S と比べ有意な高値を示し，60 分4）11秦野研究所年報…Vol.…40.…2017

図 1 OVA の腸液内分解の経時変化（in vitro）
Std.： Standard OVA

図2＊＊

小腸から門脈血中に移行する未分解 OVA 量

媒体 S と比較した有意差（P ＜ 0.01）を示す．

図3

小腸管腔内に残存するOVA量（総量）の経時変化＊有意差（P ＜ 0 . 05）を示す．
＊＊有意差（P ＜ 0 . 01）を示す．

まで高値を維持した．一方，媒体 S では，ほとんの残存量に有意な差は認められなかった．

ど上昇が認められなかった（図 2）．

4．小腸組織中に取り込まれる FITC 標識 OVA 量

3．小腸管腔内に残存する OVA 量

小腸上皮およびパイエル板いずれにおいても，小腸管腔内に残存する OVA の総量の経時変化

媒 体 S に 比 べ て 媒 体 L を 用 い た 時 の FITC 標 識を図 3 に示した．経腸投与後 5 分以降，媒体 S，OVA の取り込み量が有意に高値を示した（図 5）．

L ともに残存 OVA 量は減少し，特に媒体 S ではさらに，媒体 L を用いた場合，パイエル板と比べ顕著で有意であった．また 30 分以降では両媒体小腸上皮において FITC 標識 OVA の取り込み量ともに小腸にほとんど残存していなかった．

が有意に増加した．

経腸投与後 5 分から 60 分の小腸部位ごとに残存 す る OVA 量 の 経 時 変 化 を 図 4 に 示 し た． 両考察

媒 体 と も に 5 分 か ら 10 分 に お い て は 小 腸 上 部

本研究では，抗原投与に用いる媒体の違いが経（Section 1-3）に OVA が残存していたが，いずれ口投与直後の小腸における抗原の吸収に影響するの経過時間および部位においても媒体間で OVAかを検討した．

12

研究報告

図4

小腸管腔内に残存する OVA 量（部位別）の経時変化

Section 1-6： 小腸上部から下部まで 1 から順に番号を付した．

In vitro 消化試験により反応時間 5 分から 30 分
では小腸内での OVA 分解に媒体の違いによる影響がないことが確認されたことから，マウスを用いて，小腸からの門脈血中への未分解 OVA の吸収を調べた．媒体 S を用いて経腸投与した際の OVA 吸収量は，リン酸緩衝塩類溶液を媒体とし経口投与を行っている実験 6）と同程度であったが，媒体 L では明らかに高値を示し，媒体 L が小腸から門脈血中への未分解 OVA の吸収を増加させることが明らかとなった．しかしながら，小腸管腔内の OVA の残存量やその経時変化に媒体間図5で明らかな差は認められず，媒体の違いが管腔内＊＊

小腸組織中に取り込まれた FITC 標識OVA量有意差（P ＜ 0 . 01）を示す．の OVA の動態を変化させることによって小腸での吸収を増加させることを示す結果は得られなかった．

体 L における OVA の経腸投与後 5 分から 10 分に

近年では，腸管を介した免疫応答における抗原かけては，小腸上部にのみ OVA が残存し，経腸の取り込み口であるパイエル板だけでなく上皮投与後 5 分ですでに門脈血中に OVA が検出され細胞自体も抗原を取り込むことが報告されていたことから，小腸上部の上皮組織が媒体 L によるる ．本研究において媒体 L は小腸上皮およびパOVA 吸収の主体となっていることが考えられた．

イエル板ともに OVA の取り込み量を増加させた

また，媒体 L は，小腸内に OVA がほとんど残存が，パイエル板に比べ小腸上皮からの OVA 取りしていない経腸投与後 60 分においても門脈血中込み量が多いことが明らかになった．さらに，媒の OVA 濃度を維持させることから，上皮組織中7）13秦野研究所年報 Vol. 40. 2017に抗原を留まらせることが考えられた．
本研究において，媒体 L は小腸組織および門脈血中への OVA 吸収を増加させることが明らかと

proteins and effect of preheating on the digestion.
Biol. Pharm. Bull. 2003 ; 26 : 969 -9734)

Matsuda T, Kato Y: Digestion and gastrointestinal

なり，これらの作用により，免疫系の反応に変化

absorption of the 14-16 kDa rice allergens. Biosci.

を生じさせる可能性が示唆された．我々は，媒体
L と同様にリノール酸を含みレシチンによりエマルション化された食品を日常的に摂取している．

Yamada C, Yamashita Y, Seki R, Izumi H,Biotechnol. Biochem. 2006; 70: 1890-1897
5)Knoop KA, Kumar N, Butler BR, Sakthivel SK,Taylor RT, Nochi T, Akiba H, Yagita H, Kiyono H,

媒体 L と同様の食品と抗原を同時に摂取すること

Williams IR: RANKL is necessary and sufﬁcientで発症する食物アレルギーの感作成立の一因とし

to initiate development of antigen-sampling M
cells in the intestinal epithelium. J. Immunol.て，摂取後早期の小腸組織への抗原の取り込みが関与していることが示唆された．

2009; 183: 5738–5747
6)

Kurisaki J, Okajima T, Nadano D, Matsuda T:

文献
1)
2)

Absorption migration and kinetics in peripheral
中尾篤人 : アレルギー克服への期待と興奮 . 実験医

blood of orally administered ovalbumin in a

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新藤智子,金澤由基子,斎藤義明,臼見憲司,小島幸一 , 手島玲子 : 経口感作および経口惹起によるマ3)

72: 2555 - 2565
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Chinthrajah RS, Hernandez JD, Boyd SD,

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2003 ; 8 : 14 -16

mechanisms of food allergy and food tolerance. J.

Takagi K, Teshima R, Okunuki H, Sawada J:Allergy. Clin. Immunol. 2016 ; 137: 984- 97

Comparative study of in vitro digestibility of food

14Matsubara T, Aoki A, Honjoh T, Mizumachi K,