カラムの小型化による溶媒消費量の削減

アプリケーションノート

クロマトグラフィー全般、飲食業界

著者

概要

John W. Henderson Jr.

LC カラムの内径 (ID)、長さ、および粒径を減らすことにより、溶媒消費量を最大 86%

Agilent Technologies, Inc.

削減し、1 回あたりの分析時間を最大 67% 短縮することができます。本実験では、ZOR-2850 Centerville Road

BAX Eclipse Plus C18 を使用し、ダイエット炭酸飲料のアイソクラティック分離とヒッWilmington, DE 19809

コリー燻製調味料のグラジエント分析を行いました。カラムの内径 (ID)、長さ、およびUSA粒径のうち 1 つ、2 つ、または 3 つすべてを減らしたカラムに置き換えることにより、溶媒消費量の削減および分析時間の短縮を実現できることを示しています。

はじめに• ZORBAX Eclipse Plus C18 ソルベントセーバPlus、
3.0 mm × 100 mm、3.5 µm (部品番号 959961-302)

最近の傾向として、より環境負荷の少ない手法が好まれるよう• ZORBAX Eclipse Plus C18ソルベントセーバHT、3.0 mm × 50 mm、1.8 µm (部品番号 959941-302)になっています。高速液体クロマトグラフィー (HPLC) の分野
においては、有機溶媒の使用量を削減することにより、環境負移動相:荷を明確に減らすことができます。溶媒の使用量削減は、環境だけではなく、経済的にもメリットがあり、さらには今後避け

ボトル A: 水られない課題でもあります。2009年現在、世界的なアセトニト

ボトル B: アセトニトリル

リル不足が液体クロマトグラフィー (LC) 業界に影響を及ぼしつ配合は図 1、2 を参照してください。

つあり、アセトニトリルの節減が急務となっています。

LC 器具:

アジレントが1990年代後半に発売したソルベントセーバー (3.0Agilent 1200 シリーズ サーモスタット付きカラムコンパートメ
ント SL を下記の構成で使用しました。

ID) カラムは、HPLC における溶媒節減の先駆けとなりました。
本アプリケーションノートでは、4.6 mm x 150 mm カラムを使用した一般的な LC 手法 2 種類を、それぞれソルベントセーバを用いた手法に変換しています。1 つはダイエット炭酸飲料の• G1312B バイナリポンプ。流量はカラム寸法に準ずる (各図参照)

分析で、サッカリン、カフェイン、アスパルテーム、および安• G1316B 温度制御カラムコンパートメント (TCC)、25 °C に設

息香酸のアイソクラティック分離を行います。もう 1 つは、肉定を味付けするための濃縮ヒッコリー燻製調味料の成分分析で• G1315C ダイオードアレイ検出器 (DAD)す。多くの成分を含む複雑な混合物であるため、各成分の分離にはグラジエントを使用します。

– ヒッコリー燻製調味料: 202 nm、4 nm 帯域幅、およびリファレンス波長 360 nm、100 nm 帯域幅。G1315-60025 フ
ローセル (パス 6 mm、容積 5 µL)。レスポンスタイムは、元のメソッドでは 1 s に設定し、分析時間の短縮に合わせ最近の LC カラムでは、より短いカラムに、より小さな粒径の充てん剤を充てんすることにより、溶媒の使用量を減らしており、さらには分析時間の短縮にも成功しています。本実験でて延長する。

は、2つの 4.6 mm x 150 mm メソッドを、3.5 µm 粒径による– ダイエット炭酸飲料 : 202 nm、 4 nm 帯域幅、およびリファレンス波長 360 nm、100 nm 帯域幅。G1315-60025 フ
ローセル (パス 6 mm、容積 5 µL)。レスポンスタイムは、元のメソッドでは 1 s に設定し、分析時間の短縮に合わせRapid Resolution (RR)、および 1.8 µm 粒径による Rapid
Resolution High Throughput (RRHT) メソッドとして実施しており、溶媒使用量の削減と分析時間の短縮を実証しています。て延長する。

最後に、ソルベントセーバカラム技術と RRHT カラムサイズを組み合わせることにより、溶媒の使用を最大限に抑えられるこ

カラムと配管のコネクタとして、フィンガータイトフィッティとを実証しました。

ング (部品番号 5065-4426、10個入り) を使用し、カラムの脱着を容易にしました。

実験

結果と考察

試料:
水性濃縮ヒッコリー燻製調味料およびダイエット炭酸飲料は、カラム径の縮小地元のスーパーで購入しました。いずれも、特別な処理は施さ

Solvent Saver 3.0 mm ID カラムの特筆すべき点は、既存の 4.6mm ID カラムを相当品と置き換えるだけで溶媒使用量を 50 %ずに、直接 0.2 µm シリンジフィルタ経由でオートサンプラバイアルに注入しました。

以上削減し、感度も向上させられることです。

元のメソッドで使用したカラム:

溶媒使用量の削減は、以下の数式で示すように、カラム内径の比率の 2 乗に比例して流量が削減されることにより、実現され• ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 mm x 150 mm、5 µm(部品番号 959993-902)ています。

Solvent Saver 方式で使用したカラム:

F3.0 id/F4.6 ID = カラム径 2 3.0 ID/カラム径 24.6 ID• ZORBAX Eclipse Plus C18、3.0 mm x 150 mm、5 µm(部品番号 959993-302)2移動相の定線速度における、低いほうの流量は、以下で求めることができます。

F3.0 ID = F4.6 ID × カラム径 23.0 ID/カラム径 24.6 ID
ダイエット炭酸飲料のアイソクラティック分析結果を図 1 に示します。流量を 1.0 mL/min から 0.43 mL/min に減らすことにより、移動相を分析あたり 57 % 削減することに成功しています。また、3.0 mm ID カラムへの注入量が半減しているにもかかわらず、クロマトグラフのピーク高が同じことから、感度がほぼ 2 倍となっていることがわかります。

mAU
3503002502001501005001

1. サッカリン
2. カフェイン
3. アスパルテーム4. 安息香酸

2432mAU
35030025020015010050046810分10分

3.0 mm × 150 mm、5 µmソルベントセーバEclipse Plus C18
0.43 mL/min × 12 min = 分析 1 回あたり溶媒 5.2 mL2移動相:温度:
検出:
フローセル:
データレート:
注入量:
機器名:
試料:

図 1.

4.6 mm × 150 mm、5 µm Eclipse Plus C18
1 mL/min × 12 min = 分析 1 回あたり溶媒 12 mL

468A: 20 mM リン酸
B: アセトニトリル
A:B (79:21)
25 °C
UV 220 nm、16、基準 = 420,203 mm、2 µL
1s4.6 mm カラムに対し 3 µL、3.0 mm カラムに対し 1.5 µL
1200 SL
フィルタ済みダイエット炭酸飲料 0.2 µm

ダイエット炭酸飲料のアイソクラティック分離にソルベントセーバEclipse Plus C18 カラムを使用することで移動相を 57 % 削減

3カラムサイズの削減は、グラジエントメソッドにおいても有効です。濃縮ヒッコリー燻製自然調味料を 4.6 mm × 150 mm、5µm Eclipse Plus C18 カラムと 3.0 mm × 150 mm、5 µm カラムでそれぞれグラジエント分離した結果を図 2 に示します。低流量の 3.0 mm ID カラムを使用することにより、移動相を分析あたり 58 % 削減することに成功していることがわかります。ただし、溶出の遅い化合物は、左寄りに表れており、3.0 mm ID カラムの使用によってリテンションタイムが延びていることがわかります。

4.6 mm × 150 mm、5 µm Eclipse Plus C181 mL/min × 36 min = 分析 1 回あたり溶媒 36 mLmAU12010080604020時間 (分)%B

02425.5
28.5
28.8
361080
100
10010

停止

02mAU

4681012143.0 mm × 150 mm、5 µmソルベントセーバEclipse Plus C180.43 mL/min × 36 min = 分析 1 回あたり溶媒 15.1 mL

120
10080
60
4016分

18時間 (分)%B02425.5
28.5
28.8
36

1080
100
10010停止

20024681012141618分

ディレイボリュームを考慮していないためリテンションタイムがシフト
移動相:
温度:
検出:
フローセル:
データレート:
注入量:
機器名:
試料:

図 2.

A: 水
B: アセトニトリル
35 °C
UV 210 nm、4、基準 = 380,103 mm、2 µL
1s2 µL または 1 µL
1200 SL
1:10濃縮ヒッコリー燻製自然調味料のグラジエント分離にソルベントセーバEclipse Plus C18 カラムを使用することにより移動相を 57% 削減

4ピークのリテンションの差異は、ディレイ時間の差、すなわちグラジエントが G1316B バイナリポンプ内における組成点からカラムヘッドへ到達するまでの時間の差によるものです。フ
ローパスの容積はそのまま、流量のみ減るため、グラジエントのカラム到達時間が長くなるのです。これにより、溶出ピークが遅くなります。
リテンションタイムの差異を最小限に留める方法の 1 つとして、グラジエントの組成点からカラムまでのフローパス容積を減らすことです。フローパスのこの箇所を「ディレイボリューム」といいます。G1316B ポンプからスタティックミキサと接続キャピラリの 1 つを省くことにより、簡単にディレイ容積を減らすことができ、ディレイ時間の差を縮めることによって 2つのクロマトグラムを近づけることができます (図 3 参照) [1]。

食用濃縮ヒッコリー燻製自然調味料mAU

4.6 mm × 150 mm、5 µm Eclipse Plus C18F = 1、パルスダンプナおよびミキサ使用

12010080604020時間 (分)%B

02425.5
28.5
28.8
36108010010010停止

02mAU468101214

3.0 mm × 150 mm、5 µmソルベントセーバEclipse Plus C18
F = 0.42、パルスダンプナ使用、ミキサ非使用

12010080
60402016分

18時間 (分)

%B

024
25.5
28.5
28.8
361080100
10010停止02

46810121416

ディレイボリューム削減によりリテンションタイムがそろう

図 3.

G1316B ポンプからスタティックミキサを省くことによりディレイボリュームが削減され、ピークがそろう

518分

カラム長の短縮と粒径の縮小

す。グラジエント分析に短い RRHT カラムを使用した場合の結溶媒使用量の削減と分析時間の短縮は、ソルベントセーバカラ果を図 4 に示します。溶媒使用量はカラム長に比例します。分

ムの採用以外にも、5 µm カラムをより短い RRHT 1.8 µm (また析時間もカラム長に比例しており、こちらは効果がより顕著では RR 3.5 µm) カラムに置き換えることによっても実現可能であることがわかります。

食用濃縮ヒッコリー燻製自然調味料
分析 1 回あたり溶媒 36 mL

4.6 mm × 150 mm、5 µm Eclipse Plus C18
1 mL/min × 36 min = 分析 1 回あたり溶媒 36 mLmAU

時間 (分)%B

02425.5
28.528.83610801001001080604020

停止

0246810121416分18

分析 1 回あたり溶媒 24 mL

4.6 mm × 100 mm、1.8 µm RRHT Eclipse Plus C18
1 mL/min × 24 min = 分析 1 回あたり溶媒 24 mL
溶媒使用量 33 % 減、分析時間 33 % 減

mAU

時間 (分)%B

01617.119.119.3241080100100105040302010停止

02468分1210

分析 1 回あたり溶媒 12 mL

4.6 mm × 50 mm、1.8 µm RRHT Eclipse Plus C18
1 mL/min × 12 min = 分析 1 回あたり溶媒 12 mL
溶媒使用量 67% 減、分析時間 67% 減

mAU
3025201510501
移動相:
流量:
温度:
検出:
フローセル:
データレート:
注入量:
機器名:
試料:

図 4.

234

A: 水
B: アセトニトリル
1 mL/min35 °C
UV 210 nm、4、基準 = 380,103 mm、2 µL1s1 µl
1200 SL
1:10RRHT カラムによる分析時間の短縮と溶媒使用量の削減

65時間 (分)%B088.59.59.6121080
10010010停止6分

カラム径縮小、カラム長短縮、および粒径縮小の複合効果
内径 3.0 mm、より短いカラム長、およびより小さな粒径を組み合わせることにより、溶媒使用量と分析時間をさらに減らすことができます (図 5 参照)。RRHT カラム構成により、元の 4.6mm x 150 mm メソッドと比較した場合、溶媒使用量は 57 〜86 % 減となり、分析時間は 36 分から 12 〜 24 分まで短縮されます。

食用濃縮ヒッコリー燻製自然調味料

3.0 mm × 150 mm、5 µmソルベントセーバ Eclipse Plus C18
F = 0.42、パルスダンプナ使用、ミキサ非使用
溶媒使用量 57% 減、分析時間 0% 減
mAU1008060402002.557.5102.557.51012.53.0 mm × 100 mm、1.8 µmソルベントセーバHT Eclipse Plus C18
F = 0.42、パルスダンプナ使用、ミキサ非使用
溶媒使用量 86% 減、分析時間 67% 減mAU
80
6040200
2.557.5分

RR および RRHT メソッドの採用による溶媒使用量のさらなる削減

7%B02425.5
28.5
28.8361080
1001001015

3.0 mm × 100 mm、3.5 µmソルベントセーバPlus Eclipse Plus C18
F = 0.42、パルスダンプナ使用、ミキサ非使用
溶媒使用量 72% 減、分析時間 33 % 減

mAU
10080
6040200

図 5.

12.5

時間 (分)

停止分17.5
時間 (分)%B01617.1
19.119.32410801001001015停止
分17.5
時間 (分)%B

088.59.59.612108010010010停止図 6 では、ダイエット炭酸飲料のアイソクラティック分析におしかし、大幅な分析時間短縮および溶媒使用量削減には、このいて図 5 同様に粒径とカラム長を変更した結果を示していまようなデメリットを補って十分な魅力があると言えます。ます。ここでも、 RR および RRHT カラムの使用により、最大た、多くの場合、より素早く、より短い RRHT メソッドの移動

67 % の分析時間短縮と、最大 86 % の溶媒使用量削減が実現さ相を最適化することにより、分解能を改善することもできまれています。ダイエット炭酸飲料の例を始めとする多くのケーす。分解能の改善には、分析時間と溶媒使用量を若干増やす必スでは、元の方法でも成分が十分に分離できているため、分析要がありますが、最終的な最適 RRHT メソッドの分析時間およ時間が短縮されても分解能はさほど低下しません。ただし、

び溶媒使用量は、元のメソッドと比べて明らかに少なくなりま

ヒッコリー燻製調味料のようにピークが多数存在する場合にす。メソッドの最適化を不便であれば、いくつかの既製 RRHTは、近接ピークの分解能が低下するおそれがあります。

カラム長 (30、50、75、100、150 mm) から選択することにより、十分な分解能を実現しつつ、時間と溶媒を節約することができます。

ダイエット炭酸飲料
1mAU
350
300
250
200
150
100
5004324689分

3.0 mm × 100 mm、3.5 µmソルベントセーバPlus Eclipse Plus C18
F = 0.43
溶媒使用量 72% 減、分析時間 33 % 減
移動相:

246分

3.0 mm × 50 mm、1.8 µmソルベントセーバHT Eclipse Plus C18
F = 0.43
溶媒使用量 86% 減、分析時間 67% 減

温度:
検出:
フローセル:
データレート:
注入量:
機器名:
試料:

2

図 6.

1. サッカリン
2. カフェイン
3. アスパルテーム
4. 安息香酸

2mAU
300
250
200150100500mAU
250200150
1005003.0 mm × 150 mm、5 µmソルベントセーバEclipse Plus C18
F = 0.43
溶媒使用量 57% 減、分析時間 0% 減

4分

RR および RRHT メソッドの採用による溶媒使用量のさらなる削減

8

A:20 mM リン酸
B:アセトニトリル
A:B (79:21)
25 °C
UV 220 nm、16、基準 = 420,20
3 mm、2 µL
1s
4.6 mm カラムに対し 3 µl、3.0 mm カラムに対し 1.5 µL
1200 SL
フィルタ済みダイエット炭酸飲料 0.2 µm

高流量

このような高流量 (4.6 mm ID カラムにおける 2.9 mL/min に相50 mm (および 100 mm) の RRHT カラムは、Agilent 1100 などの旧型 LC にも対応していますが、Agilent 1200 Rapid ResolutionLC に対して最適化されています。耐圧性能は最大 600 bar です。流量を 0.43 mL/min から 1.25 mL/min に増やしたところ、分析時間は約 1/3 になりましたが、溶媒使用量にはほとんど変わりませんでした。図 7 に示すように、時間削減の影響は、圧当) における圧力も、1200 LC システムおよび ZORBAX RRHT カラムの耐圧性能 (600 bar) であれば余裕で対応できます。カラム径の縮小、カラム長の短縮、粒径の縮小、および流量の増加を組み合わせることにより、移動相を 83 % 減らし、分析時間を85 % 減らすことができました。

力の上昇として表れました。

ダイエット炭酸飲料

1mAU
300250200150
1005003150100234523453.0 mm × 50 mm、1.8 µmソルベントセーバHT Plus Eclipse Plus C18
F = 1.25 (P = 464 bar)
分析 1 回あたり溶媒 1.9 mL、溶媒使用量 83 % 減、分析時間 85% 減

5001

図 7.

673.0 mm × 50 mm、1.8 µmソルベントセーバHT Plus Eclipse Plus C18
F = 0.43 (P = 181 bar)
移動相:
分析 1 回あたり溶媒 1.6 mL、溶媒使用量 85 % 減、
分析時間 65 % 減

1mAU
200

1. サッカリン
2. カフェイン
3. アスパルテーム
4. 安息香酸

21mAU
250
200
150
100
500

4.6 mm × 150 mm、5 µm Eclipse Plus C18
F = 1.0 (P = 96 bar)
分析 1 回あたり溶媒 11 mL

2高流量によるさらなる時間短縮

9温度:
検出:
フローセル:
データレート:
注入量:
機器名:
試料:

849分

A: 20 mM リン酸
B: アセトニトリル
A:B (79:21)
25 °C
UV 220 nm、16、基準 = 420,203 mm、2 µL
1s
4.6 mm カラムに対し 3 µL、3.0 mm カラムに対し 1.5 µL
1200 SL
フィルタ済みダイエット炭酸飲料 0.2 µm

結論
本実験により、カラムの 3 つのパラメータ、内径、長さ、粒径を変更することにより、溶媒使用量および分析時間の両方またはいずれかを大幅に減らせることが示されました。溶媒使用量の削減に関しては、カラム内径およびカラム長の変更が最も大きく影響し、粒径を調整することによって分解能も維持できることがわかりました。それぞれの最適な組み合わせは、メソッドの最終目的や研究室の制限に依存するため、用途や研究所によって異なります。
カラム内径を 4.6 mm から 3.0 mm に縮小した場合の標準的な溶媒使用量削減率は 57 %です。より短い RRHT カラムで内径 3.0 mm を採用した場合、溶媒使用量と分析時間をさらに減らすことができます。カラム長はいくつか用意されているため、分解能、溶媒使用量、および分析時間のバランスを必要に応じて調整することができます。また、4.6 mm ID カラムから 3.0 mm IDソルベントセーバカラムへの移行により、感度向上も実現することができます。

Solvent Saver カラム (3.0 mm ID) および RRHT カラム (1.8 µm) の対応 LC は、Agilent
1100 および 1200 です。Agilent 1200 および RRHT カラムは、高圧に耐えられるように設計されているため、流量を上げてさらなる時間短縮を図ることができます。

参考資料
1.

John W. Henderson, Jr., William Long, and Cliff Woodward, "High Throughput
Gradient Optimization by Easily Minimizing Delay Volume," Agilent Technologies
publication 5989-6665EN

2.

John W. Henderson Jr. and William J. Long, "Tailoring Speed, Sensitivity, andResolution in an RRHT Analysis of Cardiac Drugs," Agilent Technologies publication
5989-5899EN

詳細情報
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www.agilent.com/chem/jp をご覧ください。

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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc., 2009
Published in Japan
April 8, 2009
5990-3882JAJP