技術ノート

母動物へのペントバルビタール投与による胎児の麻酔状態に関する検討
瀬沼美華1，吉田由香1，三枝克彦2，高島宏昌1
Fetal anesthetization by maternal pentobarbital sodium treatment
Mika SENUMA1, Yuka YOSHIDA1, Katsuhiko SAEGUSA2, Hiromasa TAKASHIMA1

緒言るまでの間，人道的処置を施さずに胎児を放置し近年，げっ歯類の胎児や新生児を動物実験に用ておくことは非人道的であると考えられている 5）．

いる場合には，成獣と同様に鎮痛・麻酔等の処置現在，げっ歯類の胎児や新生児に対する鎮痛・や，完全に意識を消失した状態で安楽死を施す等

麻酔および安楽死の手段としては以下の 4 つがの人道的な取り扱いを考慮する必要があるとの声考えられている 6,7）．

が高まり，動物実験における胎児や新生児の麻酔法あるいは安楽死法が見直されている．2007 年①ペントバルビタール等の腹腔内・胸腔内への過量投与に は，National Institute of Health（NIH），Animal②深麻酔下での塩化カリウムの心臓内投与

Research Advisory Committee（ARAC）の“Guidelines③深麻酔下での液体窒素や固定液への浸漬

for the Euthanasia of Rodent Feti and Neonates”が④麻酔下での頚椎脱臼，断頭，放血等の物理的改正され，この中で「卵巣あるいは子宮摘出操1,2）

手段作を行う際には，胎児は母体から摘出後，速やかこれらの手段はいずれも，各胎児に直接処置をに安楽死させるべきである」と記載されている．

行わなければならず，リスク評価における催奇形

以前は，催奇形性試験等ではジエチルエーテル性試験において膨大な数の胎児を扱うことを考えを用いて，母動物に麻酔を行ってきた．しかし，ると作業者の負担が大きい．また，胎児および新ジエチルエーテルには呼吸器刺激性があり母動物生児へのペントバルビタールの腹腔内あるいは皮に影響があること，労働安全衛生上の問題がある下投与では，皮膚の真皮が薄いことから投与後にことから近年では使用されていない ．その後，ジ皮膚からの麻酔薬の漏出によって，投与量が不均エチルエーテルに代わる吸入麻酔薬としてセボフ

一になることがあり，児によっては麻酔が不十分

ルランを使用してきたが，一般的に吸入麻酔薬はとなる可能性も考えられる．

3）

胎盤を通過しないことから ，胎児への麻酔はほ

今回われわれは，バルビツール系麻酔薬の胎盤とんど期待できない．実際に催奇形性試験等にお透過性が良い 8）ことに注目し，ペントバルビター

いても室温に胎児を保っただけでは胎児の体重測

ルを経胎盤的に胎児に投与することにより，一腹定や外表観察後，標本固定操作時に，疼痛に対すの全胎児を深麻酔状態とすることを目的に検討をる反応は明瞭ではないものの，生存している胎児実施した．さらに，主に麻酔，鎮痛の目的で利用が散見される．また，胎児観察中に室温に放置さされる合成麻薬であるフェンタニルにより，痛みれた胎児が観察終了時には死亡していたとしても，が軽減される 9） ことを目的に，マウスではペン凍死，失血死あるいは呼吸困難等の原因で死亡す

トバルビタールと併用投与する検討を実施した．

1 毒性学第 1 研究室

材料および方法4）

2 試験業務管理室

投与には，ペントバルビタールナトリウム（ソ39秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

表 1-1投与物質および投与量（マウス）

表 1-2投与物質および投与量（ラット）

ペントバルビタール

セボフルラン

フェンタニル

ペントバルビタール

セボフルラン（静脈内；mg/kg）（吸入）（静脈内；5 µg/kg）（静脈内；mg/kg）

（吸入）

表20あり

なし

0あり

20ありなし5あり

30ありなし10あり50なし

なし

30あり

50なし

10ありあり20ありあり30ありあり評点

子宮壁を通じての観察（帝王切開時，開腹直後に観察）

胎児の動作
5． 胎児の動きに合わせて子宮壁の局所が持ち上がる
0． 暗紫色で生体反応に乏しい摘出後の胎児の観察（色調および痛覚刺激に対する反応）
色調

頭部の動作

5． ピンク色，明るい赤色

5． 上下あるいは左右に絶え間なく動かす

3． 赤紫色3． 自発的に頭部を動かすことがある

1． 青紫色1． 刺激を与えた時のみ反応がある

0． 蒼白

0． 刺激を与えても反応がない

発鳴

四肢あるいは尾の動作

5． 明瞭な声で，刺激を与えなくても頻繁に鳴く

5． 四肢あるいは尾を絶え間なく動かす

3． 間隔を空けて，自発的に鳴くことがある

3． 四肢あるいは尾を動かすことがある

1． 刺激を与えた時のみ鳴く

1． 刺激を与えた時のみ反応がある

0． 刺激を与えても鳴かない

0． 刺激を与えても反応がない

呼吸

ツイストあるいはローリングの動作

5． 通常の呼吸（反復して開口呼吸する）

5． 絶え間なく動いている

3． 間隔を空けて，呼吸することがある

3． 自発的にツイストあるいはローリングすることがある

1． 刺激を与えた時のみ明瞭な呼吸をする

1． 刺激を与えた時のみ反応がある

0． 呼吸が抑制されている

0． 刺激を与えても反応がない

ムノペンチル，以下ペントバルビタールとする，金網床ケージに個別に収容し，固型飼料（CE-2，共立製薬，東京），吸入麻酔薬としてセボフルラ日本クレア）および水道水（秦野市水道局給水）ン吸入麻酔液（マイラン製薬，大阪）を用いた．

を自由摂取させて飼育した．

また，一部のマウスではフェンタニル注射液 0.1mg（第一三共，東京）を併用した．

妊娠動物を得るために雌雄動物を 1 対 1 で終夜同居させ，翌朝，膣垢内に精子あるいは膣栓が動物は，Crl:CD（SD）系妊娠雌ラットおよび認められた動物を交尾成立として，この交尾確認

Crj:CD-1（ICR）系妊娠雌マウスを使用した．温日を妊娠 0 日とした．ラットは妊娠 21 日，マウ度 21 ～ 25℃，湿度 40 ～ 75％，換気設定約 15スは妊娠 18 日をそれぞれ帝王切開日とした．投回 / 時間，明暗サイクル 12 時間（点灯時間 7 ～与当日の体重を基準にペントバルビタール 5，10，19 時）に設定された飼育室内で，マウスは床敷20，30 あるいは 50 mg/kg を静脈内投与し，20 分を入れたプラスチック製ケージ，ラットは金属製

経過した後，放血により安楽死させ，帝王切開し40

技術ノートた．さらに，マウスでは，フェンタニル 5 µg/kg を催奇形性試験等で使用しても胎児生存率を見誤る

静脈内投与後，ペントバルビタール 10，20 あるいことはないと考えられた．

は 30 mg/kg を静脈内投与する群を設けた（表 1）．

マウスの帝王切開 1 時間後の胎児の生存率は，対照群は，セボフルランによる吸入麻酔で母動物フェンタニル投与に関係なく，ペントバルビターを麻酔状態とした．母動物の麻酔状態が十分でル 30 mg/kg 以上の投与群において有意に低下しない可能性がある 30 mg/kg 以下の投与群では，た（表 3）．

セボフルラン吸入による麻酔を補助的に実施しラットの帝王切開 1 時間後の胎児の生存率は，た後，放血により安楽死させ帝王切開した．50

10 mg/kg 投与群で有意に低下したが，30 mg/kg

mg/kg 投与群では，セボフルランの併用麻酔は以上の投与群では，低下傾向が認められたものの行わず，放血により安楽死させ帝王切開した．

有意差は認められなかった（表 4）．

開腹後最初に，操作を行わない状態で子宮壁

2．麻酔状態および観察スコアの推移（図1，2）

を通して胎児の動作を観察した（表 2）．その後，帝王切開直後の胎児の動作について子宮壁を通右子宮角卵巣側から膣側，続いて左子宮角卵巣側じて観察したところ，対照群では胎児の動きに合から膣側の順に胎児を摘出し，生死を確認後，最わせて子宮壁の局所が持ち上がるのに対し，ペン初に取り出された外表奇形の認められない 6 匹

トバルビタール 30 mg/kg 以上の投与群では胎児の生存胎児について，保温条件下で１時間にわたの動作は確認できなかった．ラットでは 5 およびり 10 分おきに，クリッピングによる痛覚刺激を10 mg/kg 投与群，マウスでは 10 および 20 mg/尾根部に与え，胎児の刺激に対する反応を観察しkg 投与群で，胎児のわずかな動きが観察された．

た．その際，独自に作成したスコア（表 2）を用胎児の色調について観察したところ，対照群でいて，胎児摘出後の胎児の色調，発鳴，呼吸，頭は呼吸が明瞭に認められるとともに摘出後 10 分部の動作，四肢あるいは尾の動作，全身動作（ツ以降より時間の経過に伴ってほぼ全例でピンク色イストあるいはローリング）を評点化した．痛覚あるいは赤色になる胎児が観察された．マウス

刺激に対する行動を観察した児以外の胎児についの 30 mg/kg 以上，ラットの 10 mg/kg 以上の投ても，帝王切開後 1 時間保温した．胎盤重量を与群では，時間の経過とともに青紫色になる胎児測定し，帝王切開 1 時間経過後に全胎児の体重が観察された．観察 1 時間経過後の心拍の確認を測定した後，開胸して心拍動の有無で生死を判によれば，青紫色を呈した胎児は死亡している児断した．

であることが多かったことから，これらの児では帝王切開所見は一腹単位に集計し，各群の平均観察時間中に徐々に死亡したものと考えられる．

値を求めた．対照群とペントバルビタール群を比マウスの 10 および 20 mg/kg 投与群，ラットの較し，多重比較検定を実施した（有意水準 5％）．

5 mg/kg 投与群では，麻酔の覚醒とともに呼吸がスコアに関しては，Steel-Dwass の多重比較検定明瞭に認められ，ピンクあるいは赤色になる胎児（両側検定）を実施した．

が観察された．

なお，全ての実験操作は，｢財団法人食品薬品

帝王切開直後の胎児の痛覚刺激に対する反応

安全センター秦野研究所動物実験に関する指針｣

は，マウス，ラットともに対照群とペントバルビに基づいて実施した．

タール各投与群との間では有意差が認められた．
対照群では，帝王切開直後から刺激に対して反応結果および考察がみられ，時間の経過とともに刺激に対する反応

1．胎児生存率が強くみられた．対照群で帝王切開直後の痛覚刺帝王切開直後の胎児の生存率では，マウス，ラッ激に対する反応が低下していることは以下の理由

トともいずれの投与群においても対照群との差がが考えられる．ヒト胎児においては，20 ～ 32 週認められなかったことから，この実験の条件下で齢の早産児に比較して満期産児では疼痛に鈍感には経胎盤にて投与したペントバルビタールの影響なっており，これは大脳におけるエンドルフィンにより，子宮内で胎児が死亡する可能性はなく，やセロトニンの作用によるとされている 10）．ま41

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

表 3．帝王切開の結果（マウス，妊娠 18 日）
群（mg/kg）

母動物数

着床数
子宮内 外表奇形数
Total Mean ± S.D. 死亡数 Total （%）

ペントバルビタール単独投与群
0 a）
457 14.3 ± 1.3 b）
20530
650
5フェンタニル併用群
10 + f5520 + f5530 + f55群（mg/kg）

母動物数

雄胎盤重量（g ; Mean±S.D.）

雌雄

雌700.01.44 ± 0.07 b） 1.40 ± 0.09 b） 0.10 ± 0.02 b） 0.09 ± 0.01 b）

73
9374

14.6 ± 1.5
15.5 ± 2.3
14.8 ± 2.2

259001

0.0
0.0
1.4

1.41 ± 0.09
1.42 ± 0.09
1.41 ± 0.11

1.40 ± 0.06
1.40 ± 0.12
1.35 ± 0.12

0.09 ± 0.01
0.09 ± 0.01
0.11 ± 0.02

0.09 ± 0.01
0.09 ± 0.01
0.10 ± 0.01

72748614.4 ± 0.9
14.8 ± 2.9
17.2 ± 3.1705

100

1.4
0.0
0.0

1.42 ± 0.08
1.49 ± 0.09
1.37 ± 0.03

1.36 ± 0.03
1.46 ± 0.08
1.32 ± 0.05

0.10 ± 0.02
0.10 ± 0.01
0.10 ± 0.00

0.09 ± 0.02
0.10 ± 0.01
0.09 ± 0.01

生存率（0hr）c）

生存胎児数（0hr）
Total

雄 / 雌

ペントバルビタール単独投与群0 a）
450
31 / 1920
5306505フェンタニル併用群
10 + f5
520 + f5
530 + f55

胎児体重（g ; Mean±S.D.）d）
生存率（1hr）

生存胎児数（1hr）

Mean ± S.D.

（%）

Total

雄 / 雌

Mean ± S.D.

（%）

12.5 ± 2.5 b）

87.1 ±9.6 b） 50

31 / 1912.5 ± 2.5 b）

100.0 ±0.0b）

71
88
65

45 / 26
49 / 39
38 / 27

14.2 ± 1.9
14.7 ± 2.9
13.0 ± 2.7

97.1 ± 6.4
93.9 ± 6.6
87.5 ± 11.8

60
39
6

38 / 2218 / 215 / 1

12.0 ± 3.8
6.5 ± 4.8
1.2 ± 0.8

83.6 ± 20.9
41.8 ± 28.6 *9.1 ± 6.0 **

65
7481

35 / 3040 / 34
32 / 49

13.0 ± 0.7
14.8 ± 2.9
16.2 ± 3.6

90.4 ±
100.0 ±
93.7 ±47373325 / 2220 / 1714 / 19

9.4 ± 3.4
7.4 ± 3.4
6.6 ± 3.3

72.3 ± 25.3
50.0 ± 22.2
40.0 ± 14.8 *3.40.04.5

f 5: フェンタニル (5 μg/kg）を併用
a）対照群b）一腹平均c）帝王切開直後の生存率 〔（生存胎児数/着床数）×100〕d）帝王切開1hr後の生存率〔（1hr後の生存胎児数/0hrの生存胎児数）×100〕* :  対照群と比較して有意に低下（ p<0.05）**:  対照群と比較して有意に低下（ p<0.01）

表 4．帝王切開の結果（ラット，妊娠 21 日）
着床数
子宮内 外表奇形数
母動物数（mg/kg）
Total Mean ± S.D. 死亡数 Total（%）
群0 a）
5103050群（mg/kg）
05103050a）

43785
母動物数
43785554092
12773

13.8 ± 2.1 b）
13.3 ± 1.5
13.1 ± 3.7
15.9 ± 1.8
14.6 ± 2.71358
100110

生存胎児数（0hr）
Total
54
3787
119
72

雄 / 雌
22
20
40
57
41/////

32
1747
62
31

雄

雌

98.3 ± 3.3
91.7 ± 14.4
94.8 ± 5.5
93.8 ± 8.6
98.7 ± 3.0

Totalb）

54
34
59
94
54

雄 / 雌
22 / 32
18 / 1629 / 30
43 / 51
32 / 22a）対照群b）一腹平均c）帝王切開直後の生存率 〔（生存胎児数/着床数）×100〕d）帝王切開1hr後の生存率〔（1hr後の生存胎児数/0hrの生存胎児数）×100〕* :  対照群と比較して有意に低下（ p<0.05）
42

雄雌0.46 ± 0.02 b） 0.46 ± 0.03 b）
0.51 ± 0.06
0.50 ± 0.07
0.46 ± 0.04
0.43 ± 0.04
0.49 ± 0.14
0.45 ± 0.09
0.51 ± 0.04
0.51 ± 0.06
生存率（1hr）d）

生存胎児数（1hr）（%）b）

胎盤重量（g ; Mean±S.D.）

5.75 ± 0.25 b） 5.44 ± 0.15 b）
5.95 ± 0.59
5.98 ± 0.39
5.63 ± 0.49
5.31 ± 0.43
5.35 ± 0.20
5.09 ± 0.36
5.58 ± 0.26
5.35 ± 0.18

生存率（0hr）c）

Mean ± S.D.
13.5 ± 1.9
12.3 ± 3.1
12.4 ± 3.6
14.9 ± 2.0
14.4 ± 2.7

0.00.014.3
12.50.0

胎児体重（g ; Mean±S.D.）

Mean ± S.D.
13.5 ±
11.3 ±
8.4 ±
11.8 ±
10.8 ±

1.9
4.7
3.0
3.2
3.1

（%）
b）

100.0 ± 0.0 b）
88.9 ± 19.2
68.4 ± 21.0 *78.0 ± 12.8
75.9 ± 19.0

技術ノート5544

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スコア合計

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� 3��
 2スコア合計

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時間（分）
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時間（分）
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スコア合計

スコア合計

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  !
  !
 50 60

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
  !
   !
   !
  は，一腹6匹の胎児の色調を評点化（0，1，3およAび5点）した平均値の推移を示している．Bは，一腹6匹の発鳴，呼吸，頭部の動作，四肢あるいは尾

"#の動作，全身動作を評点化（各項目0，1，3および
 "#"# 5点）し，合計値の平均値の推移を示している．
"# は，一腹6匹の胎児の色調を評点化（0，1，3およAび5点）した平均値の推移を示している．Bは，一

腹6匹の発鳴，呼吸，頭部の動作，四肢あるいは尾の動作，全身動作を評点化（各項目0，1，3および5点）し，合計値の平均値の推移を示している．

ものと判断した．

．本検

マウスのフェンタニル併用投与群の痛覚刺激に討の結果は，げっ歯類においても帝王切開直後の  

対する反応は，ペントバルビタール単独投与群とが深い睡眠状態にあると報告している11）


胎児は無麻酔状態で外来の痛覚刺激に対して低反応であることを示唆するものと考えられる．ペン 

比較して，顕著な差がみられなかった．

トバルビタール投与群（マウスで 10 mg/kg 以上，mg/kg 投与群の全例において，帝王切開直後かラットで 5 mg/kg 以上）では，帝王切開直後か

ら胎児の活動性が低下し，麻酔状態が 1 時間継続

マウスでは，ペントバルビタール 30 および 50

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 ら 20 分以上痛覚刺激に対して反応がみられない
"#

ことから，十分な鎮痛，麻酔効果が得られている
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60


図 2．	胎児の色調（A）および痛覚刺激に対する反応（B）のスコア平均値の推移（ラット）た，Mellor らは，草食動物では出生時前後の児
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50
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40

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   図 1．	胎児の色調（A）および痛覚刺激に対する

反応（B）のスコア平均値の推移（マウス）"#

30

時間（分）


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した．ペントバルビタール 10 および 20 mg/kg


投与群においても，帝王切開直後から胎児の活動







43

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

性は全例で低下したが，摘出後 20 分（投与後 40

文献分）で，刺激に対して反応を示す胎児が約 10％1)認められた．摘出後 20 分以降は徐々に覚醒する胎児が増加し，摘出後 60 分には 10 mg/kg 投与群では約 25％，20 mg/kg 投与群では約 30％の胎児が刺激に対して反応を示した．

2)

AVMA Guidelines on Euthanasia（Formerly
Report of the AVMA Panal on Euthanasia）, 20073)

Close B, Banister K, Baumans V, et al.: Working
party report: Recommendations for euthanasia

ラットでは，10，30 および 50 mg/kg 投与群

of experimental animals: Part 1. Laboratory

において，帝王切開直後から胎児の活動性は全例で低下し，麻酔状態が 1 時間継続した． 5 mg/kg

Guidelines for the Euthanasia of Rodent Feti andNeonates, ARAC Guidelines, 2007

Animals 1996; 30: 293-3164)

Close B, Banister K, Baumans V, et al.: Working

投与群においても，帝王切開直後から胎児の活動

party report: Recommendations for euthanasia

性は全例で低下したが，摘出後 20 分（投与後 40of experimental animals: Part 2. Laboratory分）で，刺激に対して反応を示す胎児が約 12％認められ，摘出後 20 分以降は徐々に覚醒する胎

Animals 1996; 31: 1-325)

処分施行ガイドライン. 日本獣医師会雑誌，2009;

児が増加し，摘出後 60 分には約 30％の胎児が刺激に対して反応を示した．
本実験により，母動物へのペントバルビタール
静脈内投与は胎児を麻酔状態とすることが可能であり，催奇形性試験等での胎児の麻酔法として有効であることが示唆された．母動物への単回投与

62: 17-206)

考えられるペントバルビタールの用量は，マウス
では 10 ～ 50 mg/kg，ラットでは 5 ～ 50 mg/kgであった．しかし，実務での催奇形性試験等を考慮すると，より適切な麻酔薬の用量を見つけ出すこと，麻酔薬投与から帝王切開するまでの時間の短縮が求められることから，さらにこれらについて検討する必要があると考えられる．

44

ACLAM task force, Public Statements: Report ofthe ACLAM task force on rodent euthanasia. 2005

7)日本実験動物医学会: げっ歯類の胎児・新生児の鎮痛・麻酔および安楽死に関する声明，20098)

Mork D, Kessler W, Shaw S: Placental Transferof Pentobarbital in the Rat. Journal of
Pharmaceutical Sciences. 1970; 59 : 803-805

により一腹の全胎児を胎児摘出後 20 分以上（投与後 40 分以上），麻酔状態とすることが可能と䉤内かおり, 高木康博, 黒澤努: げっ歯動物の安楽殺

9)

MRC: Report of the MRC Expert Group on Fetal
Pain. 2001

10) Arthur J: Fetal pain: A red herring in theabortion debate. Free Inquiry magazine. 2005;
44-47
11) Guidelines to promote the wellbeing of animals
used for scientific purposes, AustralianGovernment National Health and Medical
Reserch Council, 2007