この使用説明書をよく読んでから使用してください。

* 2009 年 9 月改訂(第 2 版)
2005 年 6 月作成

パラフィン包埋切片用

研究用試薬

貯包法 ：2−8℃保存
装 ：170 テスト(17ｍL×1 本)
500 テスト(17ｍL×3 本)
有効期間 ：製造後 1 年 6 ヶ月

ヒストファイン シンプルステイン MAX-PO(G)[凍結切片およびその他の標本]
不安定な抗原の場合、凍結切片標本を用いる。組織は液体窒素あるいはドライアイス-アセトンで冷やした n-ヘキサン中で急速凍結し、包埋には O.C.T.
コンパウンドあるいは類似の包埋剤を使用する。新しく切り出した切片は、あらかじめ 0.02%poly-L-lysine 水溶液などの組織切片用接着剤で被膜し空気乾燥したスライドに付着させ、十分に乾燥させた後、常温 10 分間、100%アセトンあるいは、4℃10 分間、4%パラホルムアルデヒド-PBS 溶液で固定する。
スライドは直ちに染色する。もし直ちに使用しない場合は、−80℃で保存することができるが、切片を冷凍庫で、長く保存しすぎると染色強度が落ちることがある。
もし、内因性ペルオキシダーゼあるいは赤血球や顆粒球の含量が多くない場
合は内因性ペルオキシダーゼの不活性化の処理ステップを省略できる。

【全般的な注意】*
1. 研究用としてのみ使用すること。
2. 検体は感染の危険があるものとして取り扱いに注意すること。

【内容】

アミノ酸ポリマーに、ペルオキシダーゼとFab’にした抗ヤギIg(動物種：ウサギ)を結合させた標識ポリマー。液状。安定化タンパク質と抗菌剤を含むMOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)緩衝液(pH6.5)にて即時使用可
能な濃度に調製済み。

【製Code：414161
Code：414162

法】

1. 免疫した動物血清より精製したIgGフラクションを消化し、F(ab')2を作製する。
2. 抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーで抗原特異的なF(ab')2を精製する。
3. 固相化したヒト血清タンパク質による吸収操作を行う。
4. ペルオキシダーゼとアミノ酸ポリマーを結合させ、それにF(ab')2を還元して得たFab'を結合させる。

○切片および標本の準備[パラフィン包埋切片]
切片を 3−6μｍに薄切し、スライドに付着させる。もし、熱による抗原賦活化処理やタンパク分解酵素処理を行う場合は、0.02％poly-L-lysine あるいはシランなどの組織切片用接着剤を使用する。

【用途及び原理】*[検体標本スライドの準備]*
検体標本スライドとして１検体あたり、2 枚準備する。
１枚は、試薬対照スライドとして、第一抗体のかわりにネガティブコントロール（ヤギ正常血清）を使用して染色操作を行う。

ヤギ第一抗体に用いる免疫組織化学染色用試薬。組織切片上の抗原に結合したヤギ第一抗体に反応させることで、抗原・抗体・ポリマー・酵素の複合体を形成することができる。この複合体の酵素活性を利用し、基質を発色させることで、抗原部位を染色することが可能である。

[検体対照スライドの準備] *・陽性コントロールスライド
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ目的抗原が存在することを確認している組織切片スライド
・陰性コントロールスライド
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ目的抗原が存在しないことを確認している組織切片スライド

シンプルステインＭＡＸ-ＰＯ（G）：ペルオキシダーゼ：Fab’にした第二抗体：アミノ酸ポリマー

ヤギ第一抗体以上の検体対照スライドを用意し、検体標本スライド及び試薬対照スラ
イドと並行して、検体の準備から染色処理、検鏡までの全工程を行う。

抗原ヒト組織切片○操作方法注)*本品が認識するヤギ IgG は、ウシ IgG とその構造の一部が酷似しているため、本品を用いて免疫組織化学染色を行う場合、後述の目的で、ウシ IgG の他、BSA、カゼイン、スキムミルク等、ウシ由来成分を含む試薬を使用した時、試薬中に含まれる微量のウシ IgG と本品が交差反応し、組織切片上に非特異染色を呈する場合がある。
本品を使用の際は、この点を十分留意の上、試薬対照スライドを併用するなどの対策を講じること。
・非特異染色の回避目的のブロッキング試薬
・非特異染色の回避目的も含めた洗浄液(PBS 等に添加)
・第一抗体の安定を目的とした第一抗体希釈液【用法・用量(操作方法) 】○検体の準備[パラフィン包埋切片]
高濃度の固定液にさらしたり、長時間の固定を行うと、組織崩壊や抗原変性を生じさせることがある。従って、組織形態や抗原活性を維持した最適固定を得るため、できるだけ新鮮で小さな組織切片（約 1cm×1cm×0.5cm）の使用と、下表の固定液の使用を勧める。
固定液
10%(緩衝)ホルマリン
20%ホルマリン

固定時間
24-48 時間
12-24 時間-1-

[必要な試薬、器具]*
・スライドガラス・乾燥器・タイマー・染色ドーゼ・キシレン
・95%エタノール
・100%エタノール
・洗浄用容器・PBS(｢PBS Code:415223｣を使用することを推奨する。または下記にて調製する。)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(ｐH7.6±0.2)
NaCl
7.75g
1.50g
K2HPO4KH2PO40.20g
精製水１L・スライドスタンド
・精製水・湿潤箱
・3％過酸化水素加メタノール(30%過酸化水素水をメタノールで 10 倍希釈)・ヤギ第一抗体・ネガティブコントロール（ヤギ正常血清）
・ 基質溶液(ヒストファイン DAB 基質キット、シンプルステイン DAB 溶液あるいはシンプルステイン AEC 溶液を使用することを推奨する。
）
・対比染色試薬・カバーガラス
・封入剤
・ティッシュペーパー ・光学顕微鏡
・組織切片用接着剤（0.02％poly-L-lysine、シランなど）
・抗原賦活化液(必要な場合)

[脱パラフィン]
1.キシレン処理(1) スライドをキシレンに 3 分間浸す。
(2) 余分な液を振り払い、別のキシレンに 3 分間浸す。
(3) 余分な液を振り払い、さらに別のキシレンに 3 分間浸す。

○判定上の留意事項(1) 必ず各検体対照スライドの染色結果と比較して、染色結果を判定すること。
(2) 明瞭な染色を得るには、包埋剤を完全に除去することが大切である。
パラフィンの残存物は、バックグラウンド染色を強める原因となる。
(3) 一般的にタンパク質や基質反応生成物の非免疫的結合により、偽陽性結果が観察される場合がある。偽陽性結果は赤血球による偽ペルオキシダーゼ反応やサイトクローム C による内因性ペルオキシダーゼ反応によっても起きることがある。
(4) 検体組織の壊死部分は、抗体が非特異的に結合しやすく、非特異染色の原因となりやすいので、陰性コントロールスライドと比較し、十分注意して判定すること。
(5) 間質系のコラーゲンは固定後疎水性となって抗体と結合しやすくなり、また、陰性に帯電しているため陽性に帯電している抗体と結合しやす
く、非特異染色の原因となりやすいので、陰性コントロールスライドと比較し、十分注意して判定すること。
(6) 顆粒球の一部およびマクロファージなどは細胞膜表面に Fc レセプターを有するため、抗体の Fc 部分と結合する可能性がある。抗体本来の特異的反応部位以外に染色が現れることがあるため、必ず陰性コントロールスライドと比較し、十分注意して判定すること。

2.エタノール処理(1) 100%エタノールに 3 分間浸す。
(2) 余分な液を振り払い、別の 100%エタノールに 3 分間浸す。
(3) 余分な液を振り払い、95%エタノールに 3 分間浸す。
(4) 余分な液を振り払い、別の 95%エタノールに 3 分間浸す。
3.洗浄
余分な液を振り払い、PBS でよくすすぐ(3 分間ずつ容器を 2 度かえるか、または洗浄びんを使用する)。
[染色手順]
1.ブロッキング試薬による処理（内因性ペルオキシダーゼの除去）(1) 余分な水分を取り除くためスライド上の切片周辺を注意深く拭く。
(2) 切片が完全に覆われるようにブロッキング試薬（3％過酸化水素加メタノール）に浸し、常温(15−25℃)で 10−15 分間反応させる。
（5 分間ずつ容器を 2 度かえるか、または洗浄び(3) PBS でよくすすぐ。
んを使用する。
）【使用上又は取り扱い上の注意】*

2.第一抗体の添加・反応(1) スライド上の切片周辺を注意深く拭く。
(2) 切片が完全に覆われるようにヤギ第一抗体 2 滴を各標本スライド、陽性コントロールスライドおよび陰性コントロールスライドに滴下する。
(3) 試薬対照スライドには、ヤギ第一抗体のかわりにネガティブコントロール（ヤギ正常血清）2 滴を滴下する。
(4) 常温(15−25℃)あるいは 4℃で反応させる（各第一抗体についている添付書のインキュベーション時間を守る）。
(5) PBS でよくすすぐ。
3.シンプルステイン MAX-PO(G)の添加・反応(1) スライド上の切片周辺を注意深く拭く。
(2) 切片が完全に覆われるようにシンプルステイン MAX-PO(G) 2 滴をすべてのスライドに滴下する。常温(15−25℃)で 30 分間反応させる。
(3) PBS でよくすすぐ。
4.基質溶液の添加・反応(1) スライド上の切片周辺を注意深く拭く。
(2) 切片が完全に覆われるように基質溶液 2 滴を滴下する。常温(15−25℃)
で 5−20 分間反応させる。
(3) 精製水でよくすすぐ。

1.取り扱い上（危険防止）の注意(1) 検体は、取り扱い者に感染を引き起こす危険性がある。従って、適切な取り扱いを必要とする。
(2) 皮膚などへの接触は避けること。
2.使用上の注意(1) 試薬は 2−8℃で保存すること。
(2) 使用前に常温(15−25℃)に戻して使用すること。
(3) 使用期限の過ぎた試薬は使用しないこと。
(4) 染色過程のいかなる時点においても切片を乾燥させてはならない。試薬と反応させている間、切片を湿潤箱に入れておくと乾燥を防ぐことができる。
(5) 抗原は熱に弱いので、組織を包埋する際に、パラフィンの温度を 58℃以上に上げてはならない。
(6) 脱パラフィンに用いるキシレンおよびエタノールは、スライドを 40枚処理するごとに取り替える。
(7) ステロイドやその他小さな分子は、有機溶媒に極めて溶けやすく、抗原の損失を防ぐには、固定剤の選択に注意する必要がある。
3.廃棄上の注意(1) 検体組織に接触した器具・試薬および試薬容器等は感染の危険性があるので、オートクレーブで 120℃、20 分間滅菌処理するか、または1.0V/V％次亜塩素酸などの消毒液に浸して一晩処理すること。

[対比染色](1) 対比染色試薬にスライドを浸す。
(2) 流水洗する。
[封入]
基質溶液が AEC 発色の場合はこのまま水溶性封入剤で、DAB 発色の場合は、水洗、脱水、キシレンによる透徹後、非水溶性封入剤で封入する。

【測定結果の判定法】*○判定方法
光学顕微鏡によって陽性反応を観察する。
染色結果の判定は、3 種類の対照スライドとの比較により行う。
・陽性コントロールスライド陽性所見が得られる。
・陰性コントロールスライド
陽性を呈する細胞が認められない。
・試薬対照スライド陽性を呈する細胞が認められない。このスライドが染色されれば、非特異的なタンパク結合などによる非特異的反応が考えられる。

-2-

妨害物質と問題対策*
問題点
考えられる原因○陽性コントロー ①切片が乾燥している。
ルスライド及び標
本スライドの染色 ②包埋剤が不適当あるいが認められない、はパラフィン包埋組織あるいは弱い。
からのパラフィン除去が不完全である。
③緩衝液中の微量のアジ化ナトリウムがペルオキシダーゼを不活性化し、染色を不可能にする。
④酵素や抗体反応が不十分。

○陽性コントロー ①抗原が固定あるいは包ルスライドは染色埋過程で変性したり、マされるが、標本ススクされている。
ライドは染色されない。
②自己消化により抗原が破壊されている。
③組織に存在する抗原が少ない。
○全ての染色ス ①内因性ペルオキシダー
ライドのバックグラ
ゼを不活性化するためウンドが強く染色の処理が不十分。
される。
② 非特 異結 合 成 分が ある。
③自己消化の結果、組織液に遊離した抗原が過剰に存在する。
④不完全なパラフィン除去。
⑤不十分な抗体の洗浄。

対策①切片を湿潤させた後は、湿潤箱などを用いて乾燥させない。
②適当な包埋剤を選択する。また、包埋組織から、パラフィンを完全に除去する。
②キシレン、エタノール溶液を取り替える。
③アジ化ナトリウムを含有しない緩衝液を使用する。
③緩衝液を取り替える。
④古い基質溶液を取り替える。
④各ステップでの水分の拭き取りを完全にする。
④抗体との反応時間を十分にする。特に、第一抗体では添付書のインキュベーション時間を守る。
①抗原の中には、固定や包埋に敏感なものがあるので、穏やかな固定剤を使用し固定時間を短縮する。
①場合によっては、染色前に抗原を露出させるため、熱による抗原賦活化処理ある
いはトリプシンなどのタンパク分解酵素処理を行う。
②可能な限り、生検あるいは外科組織を使用する。
③インキュベーション時間を長く設定する。
①ブロッキング試薬（3％過酸化水素加メタノール）による処理を確実に行う。
②第一抗体の添加前に 10％ウサギ正常血清で処理する。
③可能ならば、新鮮な組織を包埋する。
④キシレン、エタノール溶液を取り替える。
⑤抗体の洗浄を十分に行う。

⑥室内温度が高すぎて、酵素反応が早すぎる。

⑥常温（15−25℃）にコントロールする。
⑥反応時間を短縮する。

⑦*切片が乾燥している。

⑦*切片を湿潤させた後は、湿潤箱などを用いて乾燥させない。

⑧ * ブロッキング試薬、洗浄液、および第一抗体
希釈液の成分にウシＩｇＧが含まれている。(Ｐ1：【用途及び原理】注）参照）○反応中に組織 ①抗原によってはその同切片がスライドか定のために、熱による抗らはがれてしまう。
原賦活化処理あるいは第一抗体との長時間の反応を必要とする。このような場合には、はがれ易くなる。

⑧*ウシＩｇＧ不含の溶液を用いるか、試薬対照スライドを併用し、特異染色範囲を特定する。

①0.02％poly-L-lysine、シランなどの組織切片用接着剤を使用する。

【貯蔵方法・有効期間】
貯蔵方法：2−8℃保存
有効期間：製造後 1 年 6 ヶ月

【包装単位】*
製品名
ヒストファインMAX-PO(G)シンプルステイン

コード414161414162

上記キットと組み合わせて使用することを推奨する。
製品名
コード
DAB 基質キット
発色基質（試薬 A）
基質緩衝液（試薬 B）
発色試薬（試薬 C）

包装単位
170 テスト(17mL×1 本)
500 テスト(17mL×3 本)

包装単位
500 テスト

425011

3mL×1 本
3mL×1 本
3mL×1 本

問合せ先、製造販売元、販売元は次頁に記載。

-3-【問合せ先、製造販売元、販売元】〒104-8402 東京都中央区築地 6-19-20
TEL：03-3248-2208
FAX：03-3248-2243-4-