1

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

1

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法
野村 昌代 *1, 杉本 泰俊 *2 , 鷲尾 和也 *2
Determination of Diuron in Feeds by LC-MS
Masayo NOMURA *1, Yasutoshi SUGIMOTO *2 and Kazuya WASHIO *2( *1 Food and Agricultural Materials Inspection Center, Fukuoka Regional Center(Now Fertilizer and Feed Inspection Department),*2

An

Food and Agricultural Materials Inspection Center, Fukuoka Regional Center)
analyticalmethodfordeterminationof

diuron

in

feeds

using

liquidchromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) was developed.

After

addition of 15 mL (30 mL for grass hay) of water, the sample was left for 30 minutes.

Diuronwas extracted with 100 mL of acetone and filtered. (The extract was topped up to 200 mL for grasshay.)

All sample solution (20 mL of the sample solution for grass hay) was condensed.

After

the addition of 5 g of sodium chloride (10 mL of water and 5 g of sodium chloride for grass hay)
into the condensed solution, the sample solutions were purified by Chem Elut cartridge withhexane and evaporated to dryness.

The residue was dissolved in cyclohexane-acetone (4:1).

It was purified by gel permeation chromatography (GPC) with cyclohexane-acetone (4:1) and
Sep-Pak Plus Florisil cartridge with hexane-acetone (17:3).

The eluate was evaporated todryness and dissolved in 2 mL of methanol, and subjected to LC-ESI-MS for determination of
diuron.

The LC separation was carried out on an ODS column (ZORBAX Eclipse XDB-C18,

2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm (Agilent Technologies)) using methanol-2 mmol/L ammonium acetate
solution (13:7) as a mobile phase.

The determination was performed in selected ion monitoring(SIM)[M(12C91H1035Cl214N216O)+H]+ion

12

mode
1

35

using
37

14

16

+

( [M( C9 H10 Cl Cl N2 O)+H] ion at m/z 235 for ryegrass straw).

at

m/z

233

A recovery test was

conducted using two kinds of formula feed, corn, oats hay and ryegrass straw spiked with diuron at
0.2 and 0.02 mg/kg (4 and 0.4 mg/kg for oats hay, 2, 1 and 0.4 mg/kg for ryegrass straw).

The

mean recoveries of diuron were 84.8~99.2 % and the relative standard deviations (RSD) were
within 7.8 %.

A collaborative study was conducted in seven laboratories using formula feed forbreeding hen and corn and oats hay spiked with diuron at 0.05 mg/kg (4 mg/kg for oats hay).
The mean recovery of formula feed for breeding hen was 92.3 %, and the repeatability andreproducibility in terms of the relative standard deviations (RSDr and RSDR) were 4.7 % and 12 %respectively.

These values were 86.9 %, 3.3 % and 12 % for corn ; 91.0 %, 2.6 % and 8.3 % foroats hay respectively.
Key words: 残留農薬 pesticide residue ; フェニル尿素系除草剤 phenylurea herbicide ; ジウ
ロン diuron ; 液体クロマトグラフ質量分析計 liquid chromatograph-mass spectrometer*1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター福岡センター，現 同肥飼料安全検査部*2（独）農林水産消費安全技術センター福岡センター

2

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)(LC-MS) ; エレクトロスプレーイオン化法 electrospray ionization (ESI) ; ゲル浸透クロ
マ ト グ ラ フ ィ ー gel permeation chromatography (GPC) ; 飼 料 feed ; 共 同 試 験collaborative study

1

緒

言

ジウロンはデュポン社によって開発された非ホルモン型のフェニル尿素系除草剤であり，光合成
電子伝達系 II を阻害する．日本では 1960 年に登録されており，畑地，果樹園，非農耕地などで広く使用されている 1) ．
国内の食品，添加物等の規格基準における残留農薬基準値は，小麦及びとうもろこしで 0.7 ppm，
大麦及びライ麦で 0.6 ppm，その他の穀類で 0.05 ppm となっている．
ジウロンの定量法は，「平成 17 年度飼料の有害物質等残留基準設定等委託事業」において，液体クロマトグラフ質量分析計一斉分析法 2)が検討されたが，鶏用配合飼料及び乾牧草での添加回収試
験の回収率が低かったことから，一斉分析法への適用は不可能と判断された．また，食品では，厚生労働省よりウレア系 6 農薬の液体クロマトグラフ及び液体クロマトグラフ質量分析計を用いた同時分析法 3) が試験法として通知されている．
飼料中のジウロンの個別定量法としては，（財）日本食品分析センターが「平成 19 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業」において開発した方法（以下「分析センター法」という．）4) がある．筆者らはこの分析センター法を基に，飼料分析基準 5) への適用の可否について検討したので報告する．
なお，ジウロンの構造式を Fig. 1 に示した．

Cl

O

Cl

N
H

N

Diuron3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea
C9H10Cl2N2O

MW: 233.1

CAS No.: 330-54-1
Fig. 1

Chemical structure of diuron

2
2.1

試

実験方法

料

市販の配合飼料（ブロイラー肥育後期用及び肉用牛肥育用），とうもろこし及び乾牧草（えん麦
乾草及びライグラスわら）をそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕し，供試試料とした．
なお，添加回収試験に用いた配合飼料の一例を Table 1 に示した．

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

3

Table 1
Compositions of the formula feeds
Proportion
Formula feed
Ingredient types
Ingredients
types
(%)
For broiler
Grains67
Milo, Cornfinishing chick Oil seed meal
22
Soybean meal, Rapeseed meal
Animal by-products
2
Fish meal, Chicken meal, Feather meal
Others9
Animal fat, Calcium carbonate, Calcium phosphate, Salt,
Garlic powder, Green tea extract, Fermented milk powder,
Dried yeast cell wall, Cinnamon, Pumpkin seed, Feed additives
For beef cattle Grains
75
Corn, Barley
Brans
17
Wheat bran, Corn gluten feed
Oil seed meal
7
Soybean meal, Rapeseed meal
Othes
1
Calcium carbonate, Salt
2.2
1)

試

薬

ジウロン標準液
ジウロン標準品（関東化学製，純度 99.9 %）25 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてジウロン標準原液を調製した（この液 1 mL はジウロンとして 0.5 mg（f = 0.999）を含有する．）．使用に際して，標準原液の一定量をメタノールで正確に希釈し，1 mL 中にジウロンとして 0.01，0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，
1，2 及び 4 µg を含有する各ジウロン標準液を調製した．

2)

試薬等
アセトニトリル，メタノール及び蒸留水は液体クロマトグラフ用試薬を用いた．アセトン，
ヘキサン及びシクロヘキサンは残留農薬試験用試薬を用いた．特記している以外の試薬については特級を用いた．

2.3
1)

装置及び器具液体クロマトグラフ質量分析計：
LC 部：島津製作所製

Prominence

MS 部：島津製作所製

LCMS-2010EV

2)

振とう機：タイテック製

3)

ロータリーエバポレーター：BÜCHI Labortechnik 製

4)遠心分離器：久保田製作所製

5)

多孔性ケイソウ土カラム：Varian 製

6)ゲル浸透クロマトグラフ：島津製作所製

レシプロシェーカーSR-2W
R-210

5100
Chem Elut，20 mL（20 mL 保持用）
GPC システム

ポンプ：LC-10ATvp
オートサンプラー：SIL-10AP
フラクションコレクター：FRC-10A
7)

合成ケイ酸マグネシウムミニカラム：Waters 製

Sep-Pak Plus Florisil cartridge（充てん剤量

910 mg）にリザーバーを連結したもの
8)

メンブランフィルター：東洋濾紙製

DISMIC-25HP（孔径 0.45 µm，直径 25 mm，PTFE）

4

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

2.4

定量方法

1)

抽
i

出

乾牧草

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 30 mL を加え，

30 分間静置後，更にアセトン 100 mL を加え，60 分間振り混ぜて抽出した．200 mL の全量
フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した．先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過し，更に全量フラスコの標線までアセトンを加えた．この液 20 mL を 300 mL のなす形フラスコに正確に入れ，40 °C 以
下の水浴で 3 mL 以下まで減圧濃縮し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
ii

その他の飼料

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 15 mL を加え，30 分間静置後，更にアセトン 100 mL を加え，60 分間振り混ぜて抽出した．300 mLのなす形フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．ろ液を
40 °C 以下の水浴で 15 mL 以下まで減圧濃縮し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理 I
試料溶液に塩化ナトリウム 5 g（乾牧草は水 10 mL 及び塩化ナトリウム 5 g）を加え，これを多孔性ケイソウ土カラムに入れ，5 分間静置した．300 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていたなす形フラスコをヘキサン 5 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次カラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下し，ジウロンを溶出させた．更に，ヘキ
サン 85 mL をカラムに加えて同様に溶出させ，溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
シクロヘキサン－アセトン（4+1）10 mL を正確に加えて残留物を溶かし，この液を 10 mLの共栓遠心沈殿管に入れ，1,000×g で 5 分間遠心分離した後，上澄み液をメンブランフィルタ
ーでろ過し，ゲル浸透クロマトグラフィーに供する試料溶液とした．

3)

ゲル浸透クロマトグラフィー
試料溶液 4 mL（乾牧草は 2 mL）をゲル浸透クロマトグラフに注入し，ジウロンが溶出する
画分を 50 mL のなす形フラスコに分取し，40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．ゲル浸透クロマトグラフの条件を Table 2 に示した．
ヘキサン 10 mL を加えて残留物を溶かし，カラム処理 II に供する試料溶液とした．
Table 2
ColumnGuard column
EluentFlow rate
Fraction volume

4)

Operating conditions of GPC for analyzing diuron
Shodex CLNpak EV-2000AC (20 mm i.d.×300 mm, 15 µm)
Shodex CLNpak EV-G AC (20 mm i.d.×100 mm, 15 µm)
Cyclohexane-acetone(4:1)
5 mL/min90~110 mL

カラム処理 II
合成ケイ酸マグネシウムミニカラムをヘキサン 5 mL で洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，液面が充てん剤の上端に達するまで流出させた．
50 mL のなす形フラスコをミニカラムの下に置き，試料溶液の入っていた容器をヘキサン－

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

5アセトン（17+3）2 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次ミニカラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下してジウロンを溶出させた．更に，ヘキサン－アセトン（17+3）19 mL を
ミニカラムに加え，同様に溶出させた．
溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
メタノール 2 mL を正確に加えて残留物を溶かし，液体クロマトグラフ質量分析計による測定に供する試料溶液とした．
5)

液体クロマトグラフ質量分析計による測定
試料溶液及び各ジウロン標準液各 2 µL を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，Table 3の測定条件に従って，選択イオン検出クロマトグラムを得た．
Table 3Operating conditions of LC-MS for analyzing diuron
Agilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm)
Methanol-2 mmol/L ammonium acetate solution(13:7)
0.2 mL/min
40 °C
Electrospray ionization (ESI)
Positive
N2 (1.5 L/min)

ColumnMobile phase
Flow rate
Column temperature
Ionization
Mode
Nebulizer gas
Heat block temperature 200 °C
CDL temperature
250 °C
Monitor ion
m/z 233 (235 for rye grass straw)

6)

計

算

得られた選択イオン検出クロマトグラムからピーク面積又は高さを求めて検量線を作成し，試料中のジウロン量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

6

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Sample 10.0 g
add 15 mL（30 mL for grass hay）of water
allow to stand for 30 min
add 100 mL of acetone and shake for 60 min
filtrate under suction filter (No.5B)
wash with 50 mL of acetone（grass hay ; top up to 200 mL with acetone）
All Sample solution (grass hay ; 20 mL)
evaporate to the volume of 15 mL（grass hay ; 3 mL）under 40 °C
add 5 g of NaCl（grass hay ; add 10 mL of water and 5g of NaCl）
Chem Elut cartridge
apply sample solution and allow to stand for 5 min
wash and elute with 5 mL of hexane (three times)
elute with 85 mL of hexane
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 10 mL of cyclohexane-acetone（4:1）
centrifuge for 5 min at 1,000×g
filtrate with membrane filter（0.45 µm）
GPC
apply 4 mL（grass hay ; 2 mL）of sample solution
collect 90~110 mL fraction
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 10 mL of hexane
Sep-Pak Plus Florisil Cartridge (prewash with 5 mL of hexane)
apply sample solution
wash and elute with 2 mL of hexane-acetone（17:3）（three times）
elute with 19 mL of hexane-acetone（17:3）
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 2 mL of methanol
LC-MS

Scheme 1

Analytical procedure for diuron in feeds

3
3.1

結果及び考察

質量分析計条件の検討
分析センター法では，ジウロンのイオン化法としてエレクトロスプレーイオン化（ESI）法（以下「ESI 法」という．）の正イオンモードが用いられていることから，本法においても ESI 法を用
いて検討を行った．
ジウロンの標準液を，今回の分析条件においてスキャンモードにて測定したところ，Fig. 2 のようなマススペクトルが得られ，モニターイオンとして最も感度のよい m/z 233（ 35Cl2 体のプロ
トン付加分子[M(12C91H1035Cl214N216O)+H]+ ）を用いることとした．ライグラスわらについては，
m/z 233 では妨害ピークが認められたため、m/z 233 の次に感度のよい m/z 235（ 35Cl37Cl 体のプロ
トン付加分子[M(12C91H1035Cl37Cl14N216O)+H]+）を用いることとした．

7

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Fig. 2
3.2

Mass spectrum of standard solution of diuron

検量線の作成調製した 0.01，0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1，2 及び 4 µg/mL のジウロン標準液各 2 µL を液体

クロマトグラフ質量分析計に注入し，得られたクロマトグラムのピーク面積及び高さを求めて検量線を作成した．
その結果，検量線は Fig. 3 のとおり 0.01~4 µg/mL（注入量として 0.02~8 ng）の範囲で直線性を示した．
R² = 0.9983

Peak area/ arb.units

Peak height/ arb.units

R² = 0.9991

0

1

2

3

4

Concentration of diuron/ µg/mL

Fig. 3
3.3

0

1

2

3

4

Concentration of diuron/ µg/mL

Calibration curves of diuron by peak area (left) and peak height (right)

多孔性ケイソウ土カラムの溶出画分の検討
多孔性ケイソウ土カラム処理の溶出画分の確認を行った．
肉用牛肥育用配合飼料を 2.4 の 1)により抽出した液にジウロンとして 1 mg/kg 相当量を添加し，2.4 の 2)の多孔性ケイソウ土カラム処理に供する試料溶液とし，その後，本法により操作した後，溶出画分の回収率を確認した．
その結果，Table 4 のとおりジウロンは 0~100 mL に溶出し，100 mL 以後の画分には溶出されなかった．以上の結果から，本カラムにおける溶出には分析センター法と同様にヘキサン 100 mLを用いることとした．

8

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Table 4

Elution pattern from Chem Elut cartridge

Fraction volume (mL)

0~50
93

a)

Recovery of diuron (%)

~100
5

~150
0

~200
0

Total
98

a) Mean (n=2)
3.4

ゲル浸透クロマトグラフィーの溶出画分の検討
ゲル浸透クロマトグラフィーの溶出画分の確認を行った．
肉用牛肥育用配合飼料を 2.4 の 1)及び 2)により操作した試料溶液にジウロンとして 1 mg/kg 相

当量を添加し，2.4 の 3)のゲル浸透クロマトグラフィーに供する試料溶液とし，80 mL から 115 mLの間を 5 mL 間隔で分画した．その後，本法により操作した後，溶出画分の回収率を確認した．
その結果，Table 5 のとおりジウロンはシクロヘキサン－アセトン（4+1）90~110 mL の画分に溶出され，90 mL 以前及び 110 mL 以後の画分には溶出されなかった．分析センター法では，シクロヘキサン－アセトン（4+1）85~105 mL の溶出画分を分取しているが，本法ではシクロヘキサン－アセトン（4+1）90~110 mL の溶出画分を分取することとした．
Table 5Fraction volume (mL)80~85
0Recovery of diuron (%)
a)

~90
0

Elution pattern from GPC

~95
9

~100
54

~105
31

~110
3

~115
0

Total
97

a) Mean (n=2)
3.5合成ケイ酸マグネシウムミニカラムの溶出画分の検討
合成ケイ酸マグネシウムミニカラムの溶出画分の確認を行った．
肉用牛肥育用配合飼料を 2.4 の 1)，2)及び 3)により操作した試料溶液にジウロンとして 1 mg/kg

相当量を添加し，2.4 の 4)のカラム処理 II に供する試料溶液とし，10 mL を負荷した後にヘキサン－アセトン（17+3）でジウロンを画分に溶出した．その後，本法により操作した後，溶出画分の回収率を確認した．
その結果，Table 6 のとおりジウロンはヘキサン－アセトン（17+3）0~25 mL の画分で溶出し，25 mL 以後の画分には溶出しなかった．以上の結果から，本カラムにおける溶出には分析センター法と同様にヘキサン－アセトン（17+3）25 mL を用いることとした．
Table 6

Elution pattern from Florisil mini column
Hexane-acetone (17:3)
Hexane0~10 mL 0~10 mL ~20 mL ~25 mL ~30 mL
a)
0
84
11
1
0
Recovery of diuron (%)

Total
96

a) Mean (n=2)
3.6

妨害物質の検討
市販の配合飼料（肉用牛肥育用，乳用牛飼育用，ブロイラー肥育後期用，種鶏飼育用，子豚育成用及び種豚飼育用），とうもろこし，大麦，小麦，えん麦，マイロ，ふすま及び乾牧草（えん
麦乾草，アルファルファ乾草及びライグラスわら）を用い，本法に従って調製した試料溶液を液

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

9体クロマトグラフ質量分析計に注入し，妨害ピークの有無を確認したところ，ライグラスわらのみにおいて定量を妨げるピークが認められたが，モニターイオンを m/z 235 に変更すると妨害ピークは認められなかった．このため，ライグラスわらの測定においては，モニターイオンを m/z 235に変更する必要があった．
なお，妨害物質の検討で得られた選択イオン検出クロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．
(A)

(B)

Fig. 4SIM chromatograms of blank solutions

LC-MS conditions are shown in Table 3.
(A) Sample solution of corn (not spiked)(B) Sample solution of formula feed for beef cattle (not spiked)(Arrows indicate the retention times of diuron.)
3.7

添加回収試験
2.1 で調製したブロイラー肥育後期用配合飼料，肉用牛肥育用配合飼料及びとうもろこしにジウロンとして 0.2 及び 0.02 mg/kg 相当量，えん麦乾草に 4 及び 0.4 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，本法により 3 点併行で定量し，回収率及び繰返し精度を検討した．その結果は，Table 7のとおり，ジウロンの平均回収率は 84.8~97.5 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSD）として 6.9 %以下の成績が得られた．また，妨害ピークが認められたライグラスわらに 2，1 及び 0.4
mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，m/z 235 のモニターイオンを用いて定量した結果，平均回
収率は 90.3~99.2 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSD）として 7.8 %以下の成績が得られた．
なお，添加回収試験で得られた選択イオン検出クロマトグラムの一例を Fig. 5 に示した．

10

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Table 7

Recoveries of diuron from five kinds of feed
Feed types

Formula feed for
Spikedlevel broiler finishing chick(mg/kg) Recoverya) RSDb)
(%)
(%)
4
2
1
0.4
0.2
84.8
6.9
0.02
95.0
2.6

Formula feed
for beef cattlea)

Recovery
(%)

Corn
b)

RSD
(%)

a)

Recovery(%)

Oats hay
b)

RSD
(%)

a)

Recovery
(%)
97.2

97.5
88.0
95.8

4.2
5.4

96.6
94.2

Ryegrass straw
b)

RSD
(%)
1.0

2.6

a)

b)

Recovery
(%)

RSD
(%)

98.3
90.3
99.2

7.8
5.5
1.5

2.2
3.1

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
(A)

(B)

Fig. 5SIM chromatograms of diuron

LC-MS conditions are shown in Table 3.
(A) Standard solution (The amount of diuron is 0.8 ng.)(B) Sample solution of formula feed for broiler finishing chick spiked diuron at 200 µg/kg(Arrows indicate the peak of diuron.)

11

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

3.8

定量下限及び検出下限
本法の定量下限及び検出下限を確認するために，ブロイラー肥育後期用配合飼料，肉用牛肥育用配合飼料，とうもろこし及び乾牧草（えん麦乾草）に，ジウロンをそれぞれ添加し，本法に従って分析を 3 点併行で実施し，得られたピークの SN 比が 10 及び 3 となる濃度をそれぞれ求めた．
ブロイラー肥育後期用配合飼料，肉用牛肥育用配合飼料及びとうもろこしに，ジウロンとして0.005 及び 0.01 mg/kg 相当量，乾牧草（えん麦乾草）に 0.1 及び 0.2 mg/kg 相当量を添加した試料について，本法に従って分析を 3 点併行で実施した結果，SN 比が 10 となる濃度は，0.01 mg/kg（乾牧草では 0.2 mg/kg）であり，本法の定量下限は 0.01 mg/kg（乾牧草では 0.2 mg/kg）であった．
なお，その結果は Table 8 のとおり，0.01 mg/kg 相当量添加における平均回収率は 93.3~95.0 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 6.2 %以下であり，0.2 mg/kg 相当量添加の乾牧草（えん麦乾草）については，平均回収率は 90.0 %，その繰返し精度は RSD として 5.6 %であった．
検出下限は SN 比が 3 となる濃度から 0.003 mg/kg（乾牧草では 0.06 mg/kg）であった．
また，ライグラスわらにおいて，添加回収試験により m/z 235 のモニターイオンを用いて得られるピークの SN 比を求めた．その結果，ピークの SN 比が 10 となる濃度は 0.2 mg/kg であり，本法の定量下限は 0.2 mg/kg であった．なお，その結果は Table 8 のとおり，平均回収率は 95.0 %，その繰返し精度は RSD として 3.1 %であった．検出下限は SN 比が 3 となる濃度から 0.06 mg/kg
であった．
Table 8Recoveries and near level of limit of quantification of diuron
Feed types
Formula feed for
Formula feedCorn
Oats hay
Ryegrass straw
broiler finishing chickfor beef cattle

Spikedlevel(mg/kg) Recoverya) RSDb)
(%)
(%)
0.2
0.1
0.01
93.3
6.2
0.005
90.0
19

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb) Recoverya) RSDb)
(%)
(%)
(%)
(%)
90.0
86.7

95.0
76.7

5.3
20

93.3
100

5.6
29

95.0

3.1

3.1
10

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
3.9

共同試験
本法の再現精度を調査するため，共通試料による共同試験を実施した．
配合飼料（種鶏飼育用配合飼料）及びとうもろこしにジウロンとして 0.05 mg/kg 相当量，乾牧草（えん麦乾草）にジウロンとして 4 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，株式会社島津総合
分析試験センター，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，独立行政法人農林水産消費安全
技術センター肥飼料安全検査部，同仙台センター，同名古屋センター，同神戸センター及び同福岡センター（計 7 試験室）において本法に従って共同試験を実施した．
その結果は Table 9 のとおりであり，配合飼料では平均回収率は 92.3 %，その室内繰返し精度
及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 4.7 %及び 12 %であり，HorRat

12

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)は 0.53 であった．とうもろこしでは，平均回収率は 86.9 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 3.3 %及び 12 %であり，HorRat は 0.54 であった．乾牧草では，平均回収率は 91.0 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 2.6 %及び 8.3 %であり，HorRat は 0.63 であった．
参考のため，各試験室で使用した液体クロマトグラフ質量分析計の機種等を Table 10 に示した．
Table 9Lab. No.
1
2
3
4
5
6
7
Spiked level (mg/kg)a)Collaborative study results of diuron

Formula feed
for breeding hen（mg/kg）
0.04600.03950.05090.04900.04260.04250.0516
0.05310.04530.0446
0.03890.03920.0492
0.05350.050
0.0461
92.3
4.7
12
22
0.53

Corn

Oats hay（mg/kg）
0.03850.04300.04890.04750.03700.03920.04720.04800.04520.0447
0.03630.03630.04890.04780.050
0.0435
86.9
3.3
12
22
0.54

（mg/kg）
3.89
4.06
4.04
4.08
3.43
3.20
3.41
3.56
3.71
3.64
3.35
3.28
3.70
3.61
4.0
3.64
91.0
2.6
8.3
13
0.63

Mean value (mg/kg)
Recovery a) (%)
RSDr b) (%)c)
RSDR (%)
PRSDR d) (%)
HorRata) n=14b) Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc) Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd) Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation

飼料中のジウロンの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

13

Table 10

Lab.No.
1
2
3
4
5
6
7

Instruments used in the collaborative study
LC column
Instrument(i.d.×length, particle size)
Shimadzu
Agilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
LCMS-2010EV（2.1×150 mm，5 µm）
Shimadzu
Agilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
LCMS-2010EV（2.1×150 mm，5 µm）
Shimadzu
Shimadzu Shim-pack VP-ODS
LCMS-2010EV（2.0×150 mm，5 µm）
WatersAgilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
micromass Quattro micro API （2.1×150 mm，3.5 µm）
Agilent Technologies
Kanto Chemical Mightysil RP-18 GP
Agilent 1100 Series G1946A （2.0×150 mm，5 µm）
Shimadzu
Agilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
LCMS-2010EV（2.1×150 mm，5 µm）
WatersAgilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
ACQUITY TQ Detector（2.1×150 mm，5 µm）

4まとめ

飼料中に残留しているジウロンについて，分析センター法を基に，液体クロマトグラフ質量分析計を用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討したところ，次の結果を得た．
1)

イオン化法として，エレクトロスプレーイオン化（ESI）法（正イオンモード），モニターイオンとして，m/z 233（ 35Cl2 体のプロトン付加分子[M(12C91H1035Cl214N216O)+H]+）（ライグラスわらについては， m/z 235（ 35Cl37Cl 体のプロトン付加分子[M(12C91H1035Cl37Cl14N216O)+H]+））を適用したところ良好な測定が可能であった．

2)

検量線はジウロンとして 0.02~8 ng の範囲で直線性を示した．

3)

多孔性ケイソウ土カラムからの溶出画分の検討を行ったところ，溶出溶媒の必要量は 100 mL
であった．

4)

ゲル浸透クロマトグラフィーにおけるジウロンの溶出画分の検討を行ったところ，分取する溶
出画分は 90~110 mL が適当と考えられた．

5)

合成ケイ酸マグネシウムミニカラムからの溶出画分の検討を行ったところ，溶出溶媒の必要量は 25 mL であった．

6)

6 種類の配合飼料及び 9 種類の飼料原料について，本法に従ってクロマトグラムを作成したところ，ライグラスわらのみにおいて，ジウロンの定量を妨げるピークが認められた．そこで，ライグラスわらの測定において，モニターイオンを m/z 235 に変更したところ，定量を妨げるピー
クは認められなかった．

7)

ジウロンとして，2 種類の配合飼料に 0.2 及び 0.02 mg/kg 相当量を，ライグラスわらを除く 2
種類の飼料原料に 4 及び 0.4 mg/kg 相当量を添加し，本法にて添加回収試験を実施したところ，
平均回収率は，84.8~97.5 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSD）として 6.9 %以下の成績が得られた．また，ライグラスわらに 2，1 及び 0.4 mg/kg 相当量を添加し，m/z 235 のモニターイ
オンを用いて定量した結果，平均回収率は 90.3~99.2 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSD）

14

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

として 7.8 %以下の成績が得られた．
8)

本法によるジウロンの定量下限は，試料中で 0.01 mg/kg（乾牧草では 0.2 mg/kg），検出下限は0.003 mg/kg（同 0.06 mg/kg）であり，ライグラスわらについて，m/z 235 のモニターイオンを用いて定量した結果，定量下限は，試料中で 0.2 mg/kg，検出下限は 0.06 mg/kg であった．

9)

種鶏飼育用配合飼料及びとうもろこしにジウロンとして 0.05 mg/kg 相当量，えん麦乾草にジウ
ロンとして 4 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，7 試験室において，本法による共同試験を実施した．その結果，種鶏飼育用配合飼料では平均回収率は 92.3 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 4.7 %及び 12 %であり，HorRat は0.53 であった．とうもろこしでは，平均回収率は 86.9 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度
はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 3.3 %及び 12 %であり，HorRat は 0.54 であった．えん麦乾草
では，平均回収率は 91.0 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDRとして 2.6 %及び 8.3 %であり，HorRat は 0.63 であった．

謝

辞共同試験に参加していただいた株式会社島津総合分析試験センター，財団法人日本食品分析セン
ター多摩研究所の試験室の各位に感謝の意を表します．

文

献

1)

農薬残留分析法研究班編：“最新 農薬の残留分析法［改訂版］”，中央法規出版，338 (2006).

2)

財団法人日本食品分析センター：平成 17 年度飼料の有害物質等残留基準設定等委託事業（分析
法の開発）

3)

飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2005).

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について”，平成 17 年 1 月 24 日，食安第 0124001 号 (2005).

4)

財団法人日本食品分析センター：平成 19 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業

5)

飼料中の有害物質等の分析法の開発，110 (2007).

農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 20 年 4 月 1 日，19 消
安第 14729 号 (2008).