u hybridization 法で決める最近の乳癌治療
免疫染色と in situ
Recent Trends of Breast Cancer Therapy Decided by the Results of Immunohistochemistry
and in situ
u Hybridization
黒住昌

史Masafumi Kurosumiａ要旨

埼玉県立がんセンター病理診断科

近年，癌の薬物療法は癌細胞の生物学的な性状によって適応を決定するいわゆる「tailor-made therapy」の方向に進んでいる．特にホルモン依存性癌である乳癌では，ER（estrogen receptor）もしくは PgR（progesterone receptor）陽性の患者のみが内分泌療法の対象になっている．また，ヒト上皮細胞増殖因子受容体である HER2 に対するモノクローナル抗体製剤である trastuzumab が，HER2 のタンパク過剰発現ないしは遺伝子増幅のある乳癌に有効であることが明らかになり，広く臨床で使用されるようになった．
現在，これらの治療法の適応を決めるために，ER, PgR の発現状況と HER2 タンパクの過剰発現の有無を免疫組織化学的方法（IHC法）で，HER2 遺伝子増幅を ISH 法（FISH, SISH, CISH）で検索することがスタンダードになった．このような乳癌領域における新しい展開は，長年の基礎的，臨床的研究の結実であり，地道な研究と実地医療が結びついた理想的な事例の 1 つと思われる．

キーワード：HER-2, ER, PgR, FISH, DC-SISH

1.

る SISH（silver ISH）法や色素を用いる CISH（chromogenicはじめにISH）法が開発され，通常の光学顕微鏡でも遺伝子増幅検査

免疫組織化学 IHC（immunohistochemistry）的方法であるが可能になった．筆者は 25 年前から IHC 法や ISH 法の臨床

蛍光抗体法は 1940 年代，酵素抗体法は 1960 年代に開発され，応用の可能性について追究してきたが，最近になってようや生物学，細胞学，組織学，病理学などの分野の基礎研究に利く治療に直結する検査法として評価されるようになり，形態用され，数多くの研究成果が発表されている．その後，IHC学を長く行ってきた者としては非常に感慨深いものがある．

法の技術の著しい進歩と一次抗体の質の向上によって実地臨

本解説では，特に乳癌領域での免疫染色および ISH 法の意

床の場でも使えるレベルに達し，多くの臓器の病理診断に必義と現状について概説する．

要不可欠な検索方法になった．その中で特に乳癌領域においては，1990 年代になって治療法の選択に IHC 法が利用され

2.

ER，PgR の免疫組織化学的判定るようになり，ER（estorogen receptor），PgR（progesterone

2.1

ホルモンレセプター検索の意義

receptor），HER2（human epidermal growth factor receptor 2）

1895 年に Beatson は再発乳癌に対して卵巣摘出術を施行の発現状況の検索は必須な項目になり1），世界中でルーチンし，内分泌療法が乳癌に有効であることを最初に報告した．に行われるようになった．本邦においてもいずれも保険収載

その後，種々の内分泌療法が開発されたが，1970 ～ 80 年代され，正式の診療報酬を請求できるようになった．一方，特の多くの生化学的研究によって内分泌療法はホルモンレセプ

定の RNA もしくは DNA の局在を検索できる in situ hybridi-

ター陽性の乳癌のみ有効であることが明らかになった2）．まzation（ISH）法は 1970 年代に確立され，ISH 法，FISH（flu-た，乳癌の標準的な初期治療の戦略を協議する St. Gallen コ

orescence ISH）法が基礎研究の分野で広く利用されるようンセンサス会議では，2001 年に「乳癌の内分泌療法の適応になった．その後，1990 年代になって FISH 法も乳癌領域でを決定するためには乳癌組織における ER と PgR の発現状臨床応用されるようになり，HER2/neu 遺伝子の増幅状況の況を検索することが必要である．」という recommendation が検査法として行われるようになり1），やはり保険収載されて発表された3）．すなわち，ホルモンレセプター陽性の患者は，いる．さらに FISH 法を発展させた方法として銀粒子を用いanti-estrogen 剤，LH-RH analog 剤，aromatase 阻害剤などを用いた内分泌療法の対象となり，ホルモンレセプター状況に基づいた治療法の選択が行われるようになった．

ａ〒 362–0806 埼玉県北足立郡伊奈町小室 818 番地
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2009 年 1 月 5 日受付30

2.2 免疫染色の評価方法と Score 別頻度
ホルモンレセプターの検査方法としては，1990 年代まで
は DCC 法や EIA（enzyme immunoassay）法などの生化学的顕微鏡 Vol. 44, No. 1（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

方法が主に行われてきたが，本邦では 2003 年にようやく

J-Score 1 と 2 の症例はわずか 2.7％に過ぎなかった．一方，

IHC 法による検索が認められた．IHC 法では ER，PgR 染色

PgR では，J-Score 3：68.1％，J-Score 2：4.8％，J-Score 1：6.2％，のいずれも癌細胞の核が染色されるため，核の染色状況にJ-Score 0：21.0％であり，10％以上の細胞が陽性の症例はよって陰性か陽性の判断を下すことになるが，判定方法や判68.1％であった（図 2）．多くの施設では，術後の内分泌療法定基準については国際的に統一されていないのが現状であは主に Score 3 の症例に行っており，再発時には Score 2, 1

る．日本乳癌学会の「適切なホルモンレセプター検索に関すの症例についても内分泌療法を考慮している．本邦の多くのる研究」班では，2005 年に班員のコンセンサスに基づいて施設では，現在はこの J-Score に基づいて判定を行っている5）．

日本独自の判定基準（J-Score）を提唱した．J-Score は染色一方，判定基準の 1 つとして，1998 年に Allred らが提唱占有率のみで判定し，染色強度を考慮しない基準である．占した Score 分類が最近になって注目されており，いくつかの有率の cutoff 値については，St. Gallen 国際会議のコンセン臨床的な研究結果が報告されている．この判定基準（A-Score）

サスの cutoff 値が 10％であったため 10％を major cutoff line

で は， 染 色 さ れ た 細 胞 の 占 有 率 に よ っ て PS（Proportionにした．また，いくつかの臨床試験で 1％も cutoff 値にしてScore）を 6 段階に，染色強度によって IS（Intensity Score）いることから，1％も minor cutoff line として採用した．そのを 4 段 階 に 分 類 し て い る．PS は，Score 0（ 全 く 陰 性 ），結果，判定 Score の内容は，J-Score 0：陰性，J-Score 1：陽Score 1（1/100 未満），Score 2（1/100 ～ 1/10），Score 3（1/10性細胞占有率 1％未満，J-Score 2：陽性細胞占有率 1％以上～ 1/3），Score 4（1/3 ～ 2/3），Score 5（2/3 以 上 ） で あ り，10％未満，J-Score 3：陽性細胞占有率 10％以上ということにIS は，Score 0（negative），Score 1（weak），Score 2（inter-なった．また，判定区分としては，陰性：J-Score 0，境界域：mediate），Score 3（strong） で あ る． 最 終 的 に は 2 つ の4,5）

J-Score 1, 2，陽性：J-Score 3 とした（表 1） ．埼玉県立がんScore 値を合計して Score 0, 2 ～ 8 の 8 段階に分類しているセンターの 439 症例での Score 別頻度は，ER では，J-Score 3：（図 3）6）．この Score と内分泌療法の効果との関係では Score

77.9％，J-Score 2：0.9％，J-Score 1：1.8％，J-Score 0：

3 以上で治療効果があると報告されている7）．埼玉県立がん19.4％であり，10％以上の細胞が陽性の症例が 77.9％を占めセンターの ER 陽性 354 例の Score 別頻度は，A-Score 7–8：て い た（ 図 1）
． ま た， 微 妙 に 染 色 さ れ る 判 定 の 難 し い

表1
1．判定スコア
J-Score 0
J-Score 1
J-Score 2
J-Score 3

乳癌学会判定基準（J- スコア）
陽性細胞数陰性
陽性細胞占有率
陽性細胞占有率
陽性細胞占有率

1％未満
1％以上 10％未満10％以上

2．判定区分
陰性
境界域
陽性

J-Score 0
J-Score 1, 2
J-Score 3
図 2 PgR 判定における J-Score 別頻度
内分泌療法の適応となる Score 3 は 68.1％を占めていた．

図 1 ER 判定における J-Score 別頻度
内分泌療法の適応となる Score 3 は 77.9％を占めていた．

解説

免疫染色と in situ hybridization 法で決める最近の乳癌治療

図 3 Allred score の評価方法
染色細胞の占有率によって 6 段階，染色強度によって 4 段階のScore で評価し，それぞれの Score の合計を算出し，総 Scoreとして評価する．

31【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

80.8％，A-Score 6：9.3％，A-Score 5：4.8％，A-Score 4：2.8％，
A-Score 3：1.1％，A-Score 2：1.1％であり（図 4），A-Score5）

7–8 から 2 まで順に頻度が低くなっていた ．2008 年の San

3.

HER2 の免疫組織化学的判定

3.1

HER2 過剰発現検索の意義

Antonio Breast Cancer Symposium で発表された tamoxifen とHER（human epidermal growth factor type）2/neu は，ヒト

exemestane の効果を比較検討した TEAM trial の病理学的検

上皮細胞増殖因子受容体（EGFR（）遺伝子に類似した構造を討では，A-Score 7–8 以上が治療に対して有効であるという示す癌遺伝子として発見された．HER2 は細胞の増殖や悪性結 果 で あ っ た． 一 方，PgR 陽 性 347 例 の Score 別 頻 度 は，化に関与するとされており，予後因子としても重要視されて

A-Score 7–8：58.2％，A-Score 6：15.6％，A-Score 5：いる．一方，抗癌作用を有する trastuzumab は遺伝子を組み11.5％，A-Score 4：5.2％，A-Score 3：6.6％，Score 2：2.9％

換えた HER2 モノクローナル抗体であり，乳癌の治療薬と5）であり（図 5），これもほぼ Score 順に頻度が低くなっていた ．

して 1998 年に米国で承認されている．trastuzumab は HER2TEAM trial の症例群では，PgR は A-Score 5 点以上が治療にが過剰発現している癌にのみ効果が認められ，一般的には対して有効であった．このように，A-Score は内分泌療法剤

HER2 タンパクの過剰発現は IHC 法で，HER2 遺伝子の過剰である tamoxifen や aromatase inhibitor の適応を決める上で発現は FISH 法で検索されている1）．2001 年 6 月に IHC 法がも重要視されており8），Score の正しい判定が望まれている．

保険収載されている．
3.2 免疫染色の評価方法と Score 別頻度
IHC 法では，癌細胞の細胞膜に HER2 タンパクが局在するため，陽性細胞では細胞膜が縁どりされるように染色されてくる．染色性は面積と強度で判定され，10％以上の癌細胞が染色された場合のみ強度について評価する「10％ルール」がキットの基準として用いられている．また，染色強度に従って 4 段階に分けて判定している．Score 0 は 10％未満の癌細胞の膜が陽性を示すか全く染まらないもの，Score 1 は膜が不完全に染まるもの，Score 2 と Score 3 は膜がきれいに縁どりされて染まるもので，弱から中等度に染まるものを Score．浸潤巣の2，強く染まるものを Score 3 と判定する（図 6）
みで判定し，乳管内進展巣では判定しない．また，細胞質が染色されても判定の対象とはしない1）．埼玉県立がんセン
タ ー に お け る 1,482 症 例 の 判 定 結 果 は，Score 0：33.7％，図 4 ER 陽性例における A-Score 別頻度
ホルモン剤の効果が高いといわれている Score 7–8 は 80.8％を占めていた．

Score 1：38.0％，Score 2：15.7％，Score 3：12.9％ で あ り，Score 2 以上が 28％を占めていた（表 2）．trastuzumab 治療の適応基準については現在も議論されているが，Score 3 の患者は治療対象とし，Score 2 は FISH 法で遺伝子増幅が確

図 5 PgR 陽性例における A-Score 別頻度
ホルモン剤の効果が高いといわれている Score 5 以上は 85.3％を占めていた．

32

図 6 IHC 法の HER2 染色像10％以上の癌細胞の膜が完全に強く染色される場合に Score 3と判定する．

顕微鏡 Vol. 44, No. 1（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

表2
Score0IHC 法 HER2 スコア別乳癌患者数1+2+3+3.3

HER2 遺伝子増幅の判定

totalFISH 法では，蛍光を発する HER2 遺伝子の数と対照となる CEP17 の数との比で遺伝子増幅の有無を判定する方法がnumber499563232

1881,482％

34381613100（埼玉県立がんセンター，2001–2007 年）

とられている（図 7）．CEP17 は 17 番染色体のセントロメア部分のことであり，ほとんどの正常細胞では HER2 と同数が認められる．HER-2/CEP17 の比が 2.0 以上の場合（PathVysion 法）に HER2 遺伝子の増幅があると判断されている．
2003 年 4 月（転移性乳癌のみ），2008 年 4 月（すべての浸潤性乳癌）に FISH 法が保険収載された．埼玉県立がんセン
ターの Score 2 の症例について FISH 法で再検査したところ，そのうち 66％が陽性と判定されたことから，HER2 の推定陽性率は 23.6％となる．日本の浸潤性乳癌患者を 40,000 人とするとその約 25％，10,000 人ほどが trastuzumab の適応となりうると推定された．2007 年 1 月に ASCO/CAP が発表した HER2 のガイドラインでは，FISH 法の判定において，「陽性」「陰性」の他に HER2/CEP17 のシグナル比が 0.8 ～ 2.2の部分を「Equivocal（境界域）」とし，HER2/CEP17 のシグ
ナル比 > 2.2 を「陽性」と判定する基準に改訂された．今後の臨床試験の結果により，ASCO/CAP の判定基準が世界的

図 7 FISH 法の蛍光写真像
HER2 がオレンジ，CEP17 がグリーンの蛍光を発している．
HER2/CEP17 のシグナル比が 2.0 以上の場合を陽性と判定する．

な標準になる可能性がある．HER2 検査のさらなる展望として，将来的に導入が期待される新たな HER2 遺伝子増幅の検査法を紹介する．FISH 法では，HER 遺伝子増幅を蛍光シグナルとして描出させるため評価には蛍光顕微鏡が必要であ認された場合のみ治療対象とするという考え方が一般的であることと標本の永久保存ができないという難点がある．それる．2006 年から術後療法においても trastuzumab が使われるに対し，新しい方法である SISH 法は銀粒子，CISH 法は色ようになり，より厳密な基準によって HER2 status を評価す

素産生物質によって染色体シグナルを可視化するので，通常る必要があるといわれており，2007 年 1 月に ASCO/CAP はの光学顕微鏡下で判定でき，標本の永久保存が可能である．

新しい HER2 検査ガイドラインを発表した．すなわち，IHC

Single-color の SISH 法と CISH 法では 2 枚の連続切片を作製法では強い染色を示す癌細胞が 30％以上の場合に Score 3 とし，CEN17 と HER2 遺伝子の増幅を別々に検索しなければ判定する「30％ルール」に改訂され，今後 10％ルールに替ならないが（図 8），2008 年の ASCO で我々のグループが発わる可能性がでてきている．

表した DC-SISH（dual color-SISH）法は FISH 法と同様に 1

図 8 SISH 法の顕微鏡像
a．CEN17 が黒色の dot として描出されている．b．HER2 遺伝子が黒色の dot もしくは cluster で描出されている．HER2/
CEN17 比が 2.0 以上の場合を陽性と判定する．

解説

免疫染色と in situ hybridization 法で決める最近の乳癌治療

33【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

してきた．さらに日常の臨床で使われるようになり，多くの企業が改良や研究開発に力を注いだため，技術と精度は著しく進歩した．一方，乳癌医療においてはいくつかの重要な生物学的因子が明らかになり，tailor-made therapy として治療法の選択にも関わってくるようになった．このような物質の存在診断は，当初は生化学的方法で行われていたが，現在では組織，細胞像を確認する in situ での判断が重要視され，形態学的な検査法である IHC 法および ISH 法が主流になってきた．このように長年の基礎的な研究の積み重ねが実地医療の場において極めて有用な実を結ぶことがあることが実証された例である．
文

図 9 DC-SISH 法の顕微鏡像
CEN17 が赤色の dot として，HER2 遺伝子が黒色の dot で描出されている．
CER2/CEN17 比が 2.0 以上の場合を陽性と判定する．

枚の切片で HER2 遺伝子（黒い粒子）と CEN17（赤い粒子）を同時に光学顕微鏡下で評価できる方法であり，新しい方法として有望視されている（図 9）9）．さらに，IHC 法と SISH法の組み合わせにより，HER2 遺伝子増幅と HER2 タンパクの過剰発現を同時に判定できる方法も確立されつつある．このように HER2 検査の精度向上を目指し，新たな検査法の開発も進められている．
4. まとめIHC 法と ISH 法は基礎的研究の中で開発された形態学的な技術であり，各方面の基礎研究の分野で発達してきた．そ

献1）黒住昌史：乳腺疾患の臨床，金原出版，東京，pp. 91–95（2006）
2）Kurosumi, M.: Breast Cancer, 10，97–104（2002）3）Goldhirsch, A., Glick, J.H., Gelber, R.D., Coates, A.S. and Senn, H.J.:J. Clin. Oncol., 19，3817–3827（2001）
4）Umemura, S., Kurosumi, M., Moriya, T., Oyama, T., Arihiro, K.,
Yamashita, H., Umekita, Y., Komoike, Y., Shimizu, C., Fukushima, H.,
Kajiwara, H. and Akiyama, F.: Breast Cancer, 13，232–235（2006）5）Kurosumi, M.: Breast Cancer, 14，189–193（2007）
6）Allred, D.C., Harvey, J.M., Berardo, M. and Clark, G.M.: Mod.
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Janicke, F., Miller, W.R., Evans, D.B., Dugan, M., Brady, C., QuebeFehling. E. and Borgs, M.: J. Clin. Oncol., 19，3808–3816（2001）9）Nitta, H., Hauss-Weqrzyniak, B., Lehrkamp, M., Murillo, A.E.,
Gaire, F., Farrell, M., Walk, E., Penault-Llorca, F., Kurosumi, M.,Dietel, M., Wang, L., Loftus, M., Pettay, J., Tubbs, R.R. and Grogan,T.M.: Diagn Pathol, in pressの後，実際の病理診断の分野にも取り入れられ，大きく進歩

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顕微鏡 Vol. 44, No. 1（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】