密に集積した部位では，分子複合体の中に目的分子が存在し抗原露出が少ない，或いは，抗体の浸透が悪いなどの理由でシグナルが得られないことが多く，目的分子の分布を細胞全SDS 処理凍結割断レプリカ免疫標識法の神経組織への応用

体に亘って定量的に解析することは難しい．一方，包埋後標

Application of SDS-digested Freeze-fracture
Replica Labeling for Molecular Localizationin Neural Tissues

試料間で結果が安定しないなど，再現性の高い結果を得るこ

識法はタンパク質が密に集積した部位でもシグナルが得られるが，抗体が適用できる確率が低く，出来ても感度が低い，とが難しい 1）．また，これら超薄切片を用いた標識法では膜タンパク質に対する標識が細胞の断面像の上に観察されるので，目的分子の細胞膜上分布を 2 次元的に解析することや細胞膜上分子と細胞内膜上分子の標識を明瞭に区別しながら解深澤有吾，重本 隆

一Yugo Fukazawa and Ryuichi Shigemotoａ

生理学研究所・脳形態解析部門

要旨

細胞膜上の機能ドメインを構造と分子局在の両面から理解することが，細胞間情報伝達の分子機構の理解に必要である．SDS 処理凍結割断レプリカ標識法は細胞膜の微細構造と分子分布を高解像度で定量的に観察できる方法
だが，種々の細胞が混在する生体組織に適用するには技術的な改良が必要であった．そこで本稿では脳組織に適用するために我々が行った工夫について解説した．この方法に取り組む方々の一助になれば幸いである．

キーワード：凍結割断レプリカ，高圧凍結，分子局在，免疫標識，細胞膜析することが難しいなどの問題もある．
そこで我々は細胞膜上に発現している分子を選択的に，また，より定量的に電子顕微鏡レベルで解析できる方法として，故・藤本和博士が発明された SDS 処理凍結割断レプリカ標
識 法（SDS-digested freeze-fracture replica labeling 法， 以 下SDS-FRL 法）2）に着目し，SDS-FRL 法を神経組織に応用できるように最適化してきた．既に，SDS-FRL 法が既存法の欠点を補完し，より定量的な分子局在情報が得られることを示している 3 ～ 5）．そこで本稿では，SDS-FRL 法の原理や利点と欠点，また，現在我々が行っている神経組織を用いた解析プロトコールや留意点について解説する．
2.

SDS-FRL 法の原理

SDS-FRL 法は，既に各分野で頻繁に用いられてきた凍結割断レプリカ法と SDS 処理によるタンパク質可溶化と変性，

1.

そして免疫金標識法の 3 つを組み合わせた方法である（図 1）．
はじめに凍結割断レプリカ法の原理は，凍結組織中では脂質 2 重膜の多細胞生物は機能的に特殊化した細胞により構成されてい疎水結合面が最も結合力が弱く，割断時に頻繁にこの疎水性る．それぞれの細胞は全ての細胞が共通に持つ基本構造に加面で脂質 2 重膜が剥離され，細胞膜内面が露出されることにえて，それぞれ固有の機能を果たす上で必須な細胞形態や細よる．この際，細胞外側の膜内面（exoplasmic face, E-face）

胞内小器官を発達させていることが光学顕微鏡や電子顕微鏡或いは，細胞内側の膜内面（protoplasmic face, P-face）の 2を駆使して見事に明らかにされてきた．一方，近年の生化学面が露出し，脂質膜に発現していた分子はどちらかの膜に分的解析や分子生物学的解析によって細胞の固有機能を担う分配される．SDS-FRL 法では分子をレプリカ膜に均一に固定子的な基盤が明らかにされつつあり，これら機能分子が細胞化する目的で薄い炭素膜（～ 5 nm）を蒸着する．次にプラ構造上のどこに，いつ，どれだけ発現しているのかを明らか

チナを角度を付けて蒸着し，膜の凹凸や膜タンパク質が膜面にし，機能や反応との相関をとり，更には因果関係を明らかから突出した部分を陰影付け，その後，さらに炭素膜を蒸着にすることが生命現象のより深い理解へ向けた次のステップして膜全体を補強する．この一連の処理により割断表面に露だと考えられる．このためには電子顕微鏡を用いた分子局在出した単層の脂質膜とそこに存在するタンパク質が固定化さ解析がもっとも解像度が高く，各機能分子の微細構造上の分れ，免疫標識工程に十分に耐えられる強度のレプリカ膜を作

布解析に適している．しかし，現在広く用いられている超薄製する 6）．レプリカ膜作製後は，生化学的解析で頻繁に用い切片を用いた免疫電子顕微鏡法（包埋前標識法と包埋後標識られるイオン性界面活性剤 SDS で処理し，固定化されなかっ法）は必ずしも万能ではない．包埋前標識法は，組織切片のた生体分子を除去する．固定化された分子も SDS 化による表面からの距離に依存してシグナルが減弱し，また，我々が変性を受ける．この SDS 化によりレプリカ膜はまるで電子

主に研究対象としている神経シナプスのようにタンパク質が顕微鏡で微細形態が観察可能なウェスタンブロット膜のようａ〒 444–8787 愛知県岡崎市明大寺町字東山 5–1
TEL: 0564–59–5279; FAX: 0564–59–5275
E-mail: yugo@nips.ac.jp
2008 年 3 月 28 日受付144な状態となるので，この後に免疫金標識 2 次抗体を用いた免疫標識を行えば，目的分子の生体膜上局在を電子顕微鏡レベ
ルで 2 次元的に可視化し，免疫金標識の分布を定量的に解析できる．
顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 SDS-FRL 法の原理
固定，或いは無固定の組織を急速凍結し（1），低温下で割断すると脂質 2 重膜の疎水性面で頻繁に割断が起こる（2，太線）．
割断により暴露された膜内面に薄い炭素膜を蒸着後，プラチナを蒸着して膜の凹凸情報を可視化し，最後に炭素を蒸着しレプリカ膜を作製する（3）．SDS 溶液中で組織を溶解除去した後（4），免疫金標識抗体を用いて目的分子を標識し（5），電子顕微鏡下で金標識の分布を観察する．P-face に分配された目的分子は，細胞内ドメインを認識する抗体で，E-face に分配された目的分子は，細胞外ドメインを認識する抗体でのみ検出可能である．

3.

SDS-FRL 法の利点と欠点

4.

脳スライス用の SDS-FRL プロトコール

SDS-FRL 法の利点は，なんと言っても細胞膜下構造にか我々が行っている標準的なプロトコールを表 1 にまとめかわらず標的膜分子を均一に検出し，その分布を 2 次元的にた．レプリカ作製を除き，その他のプロトコールはどの研究可視化できる点にある．既存の免疫電子顕微鏡法の場合，目室でも容易に行えることが分かると思う．レプリカ像を正確的分子周囲の環境や抗原部位の他分子との結合状態が抗体のに解釈し，正確な解析をするために，組織構造が電子顕微鏡浸透に影響するが，SDS-FRL 法の場合，SDS 処理による非下で容易に判別できるスライスのトリミングを行い，最終的固定化分子の除去により，目的分子の抗原部位が均一に露出に電子顕微鏡グリッドにマウントするまで組織構造情報を保される．それ故，高い検出効率と高い定量性の両方が可能とつよう，細心の注意を払って各操作を行う．

なる．また，細胞膜に発現した分子を細胞内膜系に発現して無固定脳からのスライスも使用するが，固定脳に比べて一いる分子と分けて解析できる点，シナプス前と後の細胞膜の個体から得られるスライスの数が限られ結果の再現性も低い

ように互いに近接した細胞膜上に発現する分子を明瞭に区別ので，殆どの場合パラホルムアルデヒドで弱めに固定した脳して解析できる点が挙げられる．その他にも，複数の分子種を用いている．スライス培養や電気生理学的実験に用いた後の細胞膜上の共存関係を 2 次元的に可視化することもできの急性脳スライスも同様な方法で解析可能である．その際はる．

試料キャリアーに挟むスペーサーをスライスの厚みに合わせ一方，欠点としては，脳のように複雑な組織構造を持つ組る必要が有る．

織の場合，レプリカ像の解釈，特に個々の膜面断片が，興奮作製したレプリカ膜の形を最後まで保つために，スタラー性神経細胞，抑制性神経細胞やグリア細胞などどの細胞なのによる撹拌や激しい振とうは行わない．60 rpm でレプリカか，どのシナプス結合なのか，また，樹状突起上の位置や軸膜が溶液中で揺れるくらいの振とうで十分に均一な組織の可索起始部，シナプスの膜特化領域など，どの細胞膜上の機能溶化や抗体反応が行える．また，レプリカ膜は反応や移動のドメインなのか，と言ったそれぞれの膜面の由来を形態から際に染色皿や白金線に付着し，これを解離させる際にもっと判断しにくいことが挙げられる．また，割断には厚みが無く，も損傷しやすい．そこで付着防止のために全ての溶液に低濃さらに目的構造を選択的に割断することが出来ないので，厚度のウシ血清アルブミンを添加している．

い組織スライスを用いても目的細胞や目的構造のレプリカ膜標的細胞の細胞膜上に発現しているマーカータンパク質がを効率よく集めることが難しく，また，目的の構造が部分的判明している場合には多重染色を行う．その場合，定量解析にしか複製されないことも多々ある．そのため，SDS-FRLする分子に対する 1 次抗体反応を先に行い，その後，マーカー法を神経組織へ応用するために行った工夫は，「1 枚の凍結分子に対する 1 次抗体を反応し，2 次抗体反応も段階的に行組織から確実に可能な限り多くの情報を得るための工夫」とう．この 2 次抗体は大きさの異なる金標識が付いたものを用言える．

い顕微鏡下で区別できるようにしている（図 2）．

最近の研究と技術

SDS 処理凍結割断レプリカ免疫標識法の神経組織への応用

145【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

表1

生理学研究所脳形態解析部門での標準 SDS-FRL プロトコール

組織スライスの作製・未固定脳，或いは，パラフォルムアルデヒド（0.5, 2, 4％）で潅流固定した脳を摘出し，70–150 μm 厚のスライスを作製する．
・1.5 ミリ大にトリミングし，固定脳スライスの場合は 30％グリセリン −0.1 M リン酸緩衝液に 4°C で一晩浸漬する．
高圧凍結・高圧凍結装置（HPM010）を用いて，銅，或いは，金キャリアーに鋏んだスライスを凍結する．この際，市販の事務用両面テープをドーナツ状に挟みスペーサーとして使用し，トリミングした組織は中央の穴に入れて凍結する．
・凍結した試料は液体窒素中に保存する．
レプリカ作製・凍結割断レプリカ作製装置（BAF060）に双面レプリカテーブルにセットした凍結試料を装着し，−110 から −120°C に試料温度を安定させる．凍結組織を割断したら，・第 1 層：炭素を 90 度から回転蒸着（0.3 nm/sec 以下の蒸着速度で 5 nm）
・第 2 層：プラチナを 60 度から一方向蒸着（1 nm/sec 以下で 2 nm）
・第 3 層：炭素を 90 度から回転蒸着（15 nm）
SDS 処理による非固定化組織の溶解除去
・組織付きレプリカ膜を SDS 溶液（2.5％ SDS, 20％ sucrose, 15 mM Tris-HCl 緩衝液，pH 8.3）に移し，80°C で 18 時間振とうする．
免疫反応
・SDS 溶液で 1 回洗浄する．
・洗浄緩衝液（0.1％ Tween-20, 0.05％ BSA, 0.05％ NaN3, 25 mM Tris-HCl buffered saline, pH 7.2）で 3 回洗浄する．
・ブロッキング液（洗浄液に BSA を加え最終 5％濃度にしたもの）で室温 1 時間処理する．
・1 次抗体反応：1 次抗体を BSA を 1％含む洗浄液（1–5 μg/ml, 30 μl）に希釈した溶液中で，15°C で 1 晩以上振とうする．
・洗浄緩衝液で 3 回洗浄する．
・ブロッキング液で室温 30 分処理する．
・2 次抗体反応：金コロイド標識 2 次抗体をブロッキング液に希釈し（1 μg/ml, 30 μl），15°C で 1 晩以上振とうする．
・洗浄緩衝液で 3 回洗浄する．
・純水で 1 回洗浄：この時，白金線を用いてレプリカ膜を水面に展開する．
・パイオロフォルム膜やホルムバール膜を張った電子顕微鏡用グリッドにマウントする．
電子顕微鏡観察5.

補な面を持つ 2 枚のレプリカ膜が作製できる双面レプリカ法
脳スライス用の工夫点や実験機器等を用いている．この方法では凍結組織を引き裂くことで割断

凍結割断レプリカが作製できれば SDS-FRL 法は可能であするので組織中のどの部位で割断するかは調節できないが，る．しかし，実験結果の精度と再現性の向上，レプリカ像の一つの細胞膜から相補的な P，E 両面のレプリカ膜が容易に解釈を容易にするために以下の実験機器で行っている．主要得られ，単一細胞膜からより多くの形態情報や分子局在情報な装置とその理由を示す．

が得られる（図 2）．我々は頻繁に，片方を目的分子の標識

5.1

高圧凍結（HPM010，BAL-TEC 社製）用に，もう片方を細胞種や膜ドメインの同定用に用いている．

一つの凍結組織からより多くの情報を得るために後述する

5.3

双面レプリカを作製するが，そのためには比較的良い凍結状製）

態を組織切片の深部まで均一に得る必要があり，この点で高定量的な分子局在解析を行うためには，分子標識が再現性

圧凍結法が最も適している．また，組織のオリエンテーショ

良く得られるレプリカ膜が安定に作製できる実験基盤が必要

ンが判別し易く，また，比較対象領域が含まれるレプリカ膜である．凍結割断を再現性良く行い，脂質 2 重膜上の分子をを作製できるように，最大で直径 2 ミリの組織が凍結できる

レプリカ膜上に均一に固定化するためには，割断温度と炭素大きな試料キャリアーを使用している．

膜の蒸着速度を一定に保つことが重要であると我々は考えて5.2

双面レプリカ作製用試料台

凍結割断レプリカ作製装置（BAF060，BAL-TEC 社

いる（表参照）．そのため試料温度と蒸着速度がモニターで凍結割断レプリカで最も頻繁に用いられる割断法はナイフきるようにレプリカ作製装置を改造している．特に樹状突起による割断であるが，この方法では個々の脂質 2 重膜の片側や絨毛のような小さい突起状膜構造からレプリカ膜を作製すからしか観察試料が得られない．このため同時に解析できるる際には，−115°C 前後の高い温度で割断を行うと割断面が分子が限られ，また，観察対象を同定するのに十分な情報が比較的良く細胞膜に沿うので実験上都合が良い．しかし，こ得られないことがある．そこで我々は 1 枚の凍結組織から相の温度域の直上では氷の昇華速度が急激に増加し，また，急146

顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 2 重免疫金標識した双面レプリカ像
グルタミン酸受容体標識を相補な 2 枚のレプリカ膜（A, E-face, B, P-face）で比較した．ラット海馬 CA1 領域錐体細胞の樹状突起．
A）AMPA 型グルタミン酸受容体の全てのサブユニットを認識する抗体の免疫金標識（5 nm）と，NMDA 受容体サブユニット1（NR1）の免疫金標識（10 nm）．どちらも細胞外ドメインを認識する抗体を使用．B）AMPA 型グルタミン酸受容体 GluR2/3サブユニットの細胞内アミノ酸配列に対する免疫金標識（5 nm）．シナプス後足場タンパク質 PSD-95 の免疫金標識（10 nm）を用いてシナプス後膜特化領域を同定した．NMDA 受容体はシナプスに限局して発現しているが，AMPA 受容体はシナプス外にも多く発現していることが分かる．

速な炭素の蒸着は昇華を加速してしまう．レプリカ膜作製時断する上でも，ステレオ像を観察することが有効である（図に昇華が激しく起きた時のレプリカ膜には膜面上分子の周囲3）．これらの理由から観察試料を最低 +/+/−45°傾斜できる試や膜面周囲に水分子の再凝縮が起きることがあり，これが免料ホルダーが必要である．

疫標識の低下や非特異反応の増加に繋がるので，適切な試料温度を保ち氷の昇華を抑えながら一定の速度以下で炭素を蒸6.

着する必要が有る．

6.1 特異的標識の評価

5.4 インキュベーター

その他の留意点

電子顕微鏡下で観察している標識が，どの程度目的分子の標識結果の再現性を確保するためのもう一つの重要な実験分布を示しているのかを知ることは，他の免疫標識実験と同基盤は，免疫標識過程の再現性である．そのためには SDS

様 SDS-FRL 法でも重要である．上記のプロトコールを 1 次化と免疫金標識を均一且つ安定に行えるよう，温度と時間を抗体を抜いて実施した場合，レプリカ上に金標識は殆ど残ら一定に保ち，且つ，レプリカ膜を常に適度に振とうすることない．それでも使用する 1 次抗体の種類と濃度によっては，が重要である．そこで温度と振とう条件が正確に制御できる非特異的標識が無視できない場合もあり，特異的標識と非特ハイブリダイゼーションオーブンを使用している．

異的標識の比較を行う必要がある．我々の研究室では目的分

5.5

試料傾斜可能な試料ホルダーを実装した透過型電子子の遺伝子欠損マウスから作製したレプリカ膜を用いたり，顕微鏡（Tecnai10, FEI）

目的分子を発現していない細胞や脳領域から作製したレプリ細胞膜は立体的な細胞構造物なので，透過型電子顕微鏡下カ膜を用いて，目的分子に対する特異的標識とそれ以外の標で観察する際に，個々の膜の凹凸に合わせて観察対象が最も識との割合を評価している．また，用いた抗体が認識する抗広く投影されるように傾斜させないと面積の誤差が大きく原部位とは反対の膜内面の標識（細胞外ドメインに対する抗なってしまう．また，レプリカ像と標識の分布をより正確に体なら P-face の標識，細胞内ドメインならば E-face の標識）解析したり，レプリカ膜に対する非特異的な標識の有無を判を検討することも有効と考えられる．

最近の研究と技術

SDS 処理凍結割断レプリカ免疫標識法の神経組織への応用147【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 3 免疫金標識したレプリカ膜の電子顕微鏡ステレオ像
ラット海馬 CA1 錐体細胞の樹状突起上シナプス．NMDA 受容体サブユニット（NR1）標識（10 nm）．ステレオ像を観察するとレプリカ膜が立体的であることが分かる．全ての標識金粒子がレプリカ膜の後ろに見える．レプリカ膜に対する非特異的標識がある場合はレプリカ膜の手前に標識が見える．

6.2

膜上分子の割断時の分配について

FRL 法を用いることで観察対象の同定が容易になり，像の各膜貫通分子が脂質 2 重膜の割断時にどの様に外側と内側解釈を正確に行えるようになった．現時点ではまだまだ改良の脂質膜に分配されるかについてはまだ良く分かっていなの余地が残され，対象とする分子に合わせて工夫する必要がい．SDS-FRL 法は原理的にイムノブロット法に近いが，目有るが，空間解像度と緻密な分子定量が網羅的にできる点で的分子がどちらの膜に分配されるかにより露出される抗原部

電子顕微鏡レベルの分子局在解析技術は必須である．この方位が異なることに注意する必要がある（図 1）．新規の目的法がそれぞれの研究目的に合わせてさらに改良され，多岐に分子を解析する場合は，細胞内と細胞外の抗原部位を認識す亘る研究テーマに適用できる方法になることを期待している抗体をそれぞれ用意し，特異的標識が多く得られる抗体でる．

解析を行っている．
6.3

多重染色

複数の目的分子が特に狭い膜領域に集積している場合，標識に用いる抗体の立体障害の影響を無視できない．そこで定量的な分子局在解析は 1 レプリカにつき 1 種類と考えた方が良い．定量したい目的分子の標識を先に行い，その後，マーカー分子などの標識を行うことで目的分子の標識の定量性を確保できる．
7．おわりに
本稿ではより多くの研究者に SDS-FRL 法の原理と実際の実験過程を理解して頂くことを目的に，脳スライスで実験を行う上でポイントとなることを中心に記述した．実際の研究例については，これまでに報告した研究論文 3 ～ 5） や他の技術解析書 7 ～ 9） を参照して頂きたい．凍結割断レプリカ法は1960 年代に発明され，日本の多くの研究機関でも導入されたが現在では形態学領域での使用は少ない．これは組織レプ

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リカ像の解釈の困難さが原因の一つと考えられるが，SDS-148

顕微鏡 Vol. 43, No. 2（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】