令和 3 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書

BRI2/BRI3 のユビキチン化阻害による⾰新的アルツハイマー病創薬麻生悌二郎
高知大学教育研究部医療学系 遺伝子機能解析学講座【研究の背景】
アミロイド前駆体（APP）結合タンパク質である BRI2 と BRI3 は、APP 上のβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼの結合部位をマスクして APP のプロセシングを阻害し、アミロイドβ（Aβ）の産生を抑制する。両 BRI 因子は Aβとも相互作用して Aβオリゴマーの形成も抑制する。さらに、BRI2 は Insulin degrading enzyme（IDE）の細胞からの分泌量を増加させ、Aβの分解も促進する 1）。同時に BRI2 は、２型糖尿病の発症および同病へのアルツハイマー病合併に深く関わる膵島アミロイドポリペプチド（IAPP; 別名アミリン）のオリゴマー形成の抑制や IDE を介した IAPP の分解促進にも寄与する 2）（図 1 の❶〜❺）。
また、BRI2 遺伝子の片方のアレルの変異は、正常 BRI2 量の減少による Aβ 産生の亢進を招き、アルツハイマー病類似の臨床症状と神経病理学的所見を示す家族性の英国型認知症（familial British dementia; FBD）並びにデンマーク型認知症（familial Danish dementia; FDD）の発症原因になることが知られている 1）。
ビキチンリガーゼ（NRBP1-E3）が BRI2/BRI3 を選択的にユビキチン（Ub）化して分解に導く（図 1）ことを発見した。また、神経系細胞における NRBP1 の機能阻害が、BRI2/BRI3 の細胞内在量の増加と共に Aβ産生量の有意な減少を誘導することを明らかにした 3）。以上より、NRBP1 と BRI2/BRI3 間の相互
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Cu

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能となり、アルツハイマー病に対する根本治療薬の創製に資するのではないかと着想し（図 1）、当該阻害剤探索のための; D = CG%l4A

9EAB:CG& IDEb-><F@G? AbAbg-><F@G?

APP'$Ab

Ab ; D = CG

1. NRBP11ADBRI2/BRI3"22# 3*
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アッセイ系を構築した。

【⽬) IAPP

BRI2 /BRI3

作用を特異的に阻害する化合物を開発すれば、両 BRI 因子の抗アルツハイマー病機能を人為的に活性化させることが可$

BRI2/BRI3

NRBP1

D3
D4 NRBP1DDB1P
IAP( IDE

NRBP1-E3B
C

IAPP

最近私どもは、NRBP1 を基質認識タンパク質としてもつユ的】本研究では、NRBP1 と BRI2/BRI3 間の相互作用を特異的に阻害する化合物の探索を行い、革新的アルツハイマー病治療薬の開発に寄与することを目的とする。

【⽅法】

タンパク質間相互作用（PPI）の阻害を予測して分子設計・合成され、かつ合成展開が可能な AMED 中分子化合物（15,000 サンプル）のライブラリーを用いてハイスループットスクリーニング（HTS）を実施した。尚、BRI2 の方が BRI3 に比べて強力な Aβおよび IAPP への毒性低減作用を有するため、HTS には BRI2 を用いた。分泌型 Gaussia ルシフェラーゼ（Gluc）を N 末側（luci; Gn）と C 末側（ferase; Gc）の２つの断片に分割して不活性体とし、それぞれを BRI2、NRBP1 と連結させて、BRI2-Gn、NRBP1-Gc の２種類の発現コンストラクトを作製した。両融合体を培養動物細胞で共発現させた際、BRI2 とNRBP1 が相互作用できる場合に限り、Gn と Gc が近接して培養上清の Gluc 活性が回復し発光が検出されるが、化合物に24

先進医薬研究振興財団2022 年度

研究成果報告集

令和 3 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書

より BRI2 と NRBP1 間の相互作用が阻害されると発光が検出されなくなる二分子発光補完法を用いた。
一次評価では、化合物濃度 5 μM にて、NRBP1-BRI2 間相互作用に対する阻害率が 50％以上かつ細胞増殖阻害率が50％以下であった化合物を選抜した。二次評価では、濃度依存的に NRBP1-BRI2 間相互作用を阻害する化合物を選抜した。また、全長 Gluc を用いたカウンター試験を行い、非特異的な阻害作用を示す化合物を除外した。

【結果】

理化学研究所の創薬・医療技術基盤プログラム（理研 DMP）の支援のもと、15,000 化合物を含む次世代創薬シーズライ
ブラリーを対象に二分子発光補完法による一次評価を実施し、321 個のヒット化合物を得た。次いで、NRBP1-BRI2 間相互作用阻害の濃度依存性試験、カウンター試験および細胞毒性試験から成る二次評価を実施し、19 個のヒット化合物を得た。
構造を確認したところ、これらヒットの中には共通並びに類似の母核構造を有する化合物が複数個含まれていることが判明している。

【考察】

本研究開始前に実施した初回 HTS では、3 万種類の化合物（低分子 9,600 個; 天然物 20,400 個）を対象にスクリーニングを行い、12 個のヒット化合物を得た。これらヒットを培養神経細胞に添加した結果、天然物由来の２つの化合物が、細胞内 BRI2 量の増加と Aβ の産生の抑制を誘導することが判明し、本創薬コンセプトの実証に成功した。しかしながら、両ヒット化合物とも分子構造が複雑で合成展開が困難なことが判明したため、本研究では PPI の阻害が期待でき、合成展開が可能な中分子化合物のライブラリーを用いて HTS を実施した。今回 19 個の二次ヒット化合物が取得できたため、今後はこれら化合物が BRI2 の細胞内在量の増加と共に Aβ の産生および凝集の抑制を誘導できるか細胞系での評価を実施していく予定
である。

【臨床的意義・臨床への貢献度】
現在アルツハイマー病に対する根治療法は存在しない。NRBP1-E3 阻害剤が創出されれば、APP 以外のセクレターゼの基質の切断には影響を及ぼさずに Aβおよび IAPP の毒性低減に薬効を発揮可能と想定されるため、セクレターゼ阻害剤やアデュカヌマブに比べて優位性があると考えられる。重大な副作用の発現を伴うことなく、アルツハイマー病に対する根本治療薬となることが期待される。

【参考・引⽤⽂献】
1. Del Campo M., and Teunissen C.E. (2014). Role of BRI2 in dementia. J. Alzheimer’s Dis. 40, 481–494.
2. Oskarsson M.E., Hermansson E., Wang Y., Welsh N., Presto J., Johansson J., and Westermark G.T. (2018). BRICHOS
domain of Bri2 inhibits islet amyloid polypeptide (IAPP) fibril formation and toxicity in human beta cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 115, 2752–2761.
3. Yasukawa T., Tsutsui A., Tomomori-Sato C., Sato S., Saraf A., Washburn M.P., Florens L., Terada T., Shimizu K.,
Conaway R.C., Conaway J.W., and Aso T. (2020). NRBP1-containing CRL2/CRL4A regulates amyloid β production
by targeting BRI2 and BRI3 for degradation. Cell Rep. 30, 3478-3491.

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