研究班番号【 ３９ 】

酵素反応における活性剤の影響について
化学班：津田 歩風

AbstractEnzymes are one of protein which function as catalysts in the body. There are a lot of enzymes
which have reached maximum speed of be able to be expected from diffusion control. However,sometimes such as enzymes impose reins on there’s ability. I researched if enzyme reaction bylactic acid dehydrogenase adds in activator, the speed of enzyme reaction will be quicker. The
result is enzyme reaction was quicker.

要約
酵素は生体内で触媒として働くタンパク質であり、拡散律速から予想される最大速度（1×106-8M s ）にまで進化した酵素が多く存在する。しかし、そのように高度な能力を備えた酵素でも、生体内の環境下では、必要とされる活性のみを発揮し、活性を抑制していることがある。本研究では、乳酸脱水素酵素は活性化剤を加えると反応速度が上がり、拡散律速の衝突回数に近づくのか検証した。今回は、乳酸脱水素酵素の酵素反応の基質の1つであるNADHが生成物NAD＋に変化する時のNADHの減少量を測定することで反応速度を求めた。その結果、反応速度は活性剤FBPを添加することで拡散律速の衝突回数から期待される値（1×106-8 M-1s-1）に近づいた。
-1 -1

１．はじめに酵素は生体内で触媒として働くタンパク質である。また、ほとんどの酵素反応の速度は、ミカエリス・メンテンの関係（v = kcat[E]0[S]/([S]+Km)）1)によって決まる。このミカエリス・メンテンの関係は、v=(kcat/Km)[E][S]とも表すことができ、また(kcat/Km)は二次反応速度定数である。酵素の中には拡散律速の衝突回数から期待される最大速度(kcat/Km)が（1×106-8 M-1s-1）にまで進化した酵素が多く存在する。2)しかし、そのように高度な能力を備えた酵素でも、生体内の環境下では、必要とされる活性のみを発揮し、活性を抑制していることがある。そのような酵素の場合には、反応溶液のpH変化や温度変化、活性剤の添加によって、反応速度を上げ、活性を促進させることができる。その酵素の例として、乳酸脱水素酵素3)が挙げられる。
乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸、NADH、H+を基質とし、乳酸とNAD+を生成物とする反応を可逆的に触媒する(図1)が、その活性調節は４量体の構造（図2）によって可能となっている。本研
究では、乳酸脱水素酵素は活性剤を加えると反応速度が上がり、拡散律速速度の衝突回数に近づくのか検証した。

２．研究手法
乳酸脱水素酵素の酵素原液67.1 µMを0.5 Mリン酸緩衝液（pH7.0）で100倍希釈し、671 nMの酵素液を作成した。1 mM 水酸化ナトリウム水溶液27 mlとNADH57 mgを混合させ、3 mM NADHを作成した。
≪実験１≫活性剤が入っていない時の酵素反応の速度式の確認
0.5 Mリン酸緩衝液100 µL、3 mM NADH 50 µL、50 mMピルビン酸ナトリウム溶液、蒸留水をプラスチックセルに添加し、溶液を混合させた(表1)。セルホルダー内を25℃一定に保っている吸光度計にセルをセットし、酵素を添加していない時のNADHがNAD+に変化する時の波長340nmの吸光度変化を確認した。吸光度が変化していないことを確認した後、吸光度計からセルを取り出し、671 nM 乳酸脱水素酵素50 µl (終濃度: 3.4 nM)を添加し、溶液を混合させた。再びセルを吸光度計にセットし、吸光度変化を確認した。ピルビン酸ナトリウム溶液の濃度を変えて、この操作を繰り返し行い、吸光度の変化を測定した（表2）。この吸光度変化の酵素を添加してから10秒間を酵素反応の初速度として算出した。その初速度を用いて酵素分子が１秒間あたりに働く回数である「見かけの速度定数(kapp)」を計算した。この初速度とミカエ
リス-メンテンの関係（v = kcat[E]0[S]/([S]+Km)）を用いて、酵素分子が単位時間あたりに基質を生成物に変換する分子数（kcat(s-1)）とミカエリス定数（Km = [E][S]/[ES]）とを算出した。その結果から、それらの数値からkcat/Kmの値を計算し、酵素反応速度を拡散律速の反応速度と比較した。
ピルビン酸濃度（mM）
0.00
0.25
1.00
2.00
4.00
5.00
8.00
リン酸緩衝液３mM NADH
乳酸脱水素酵素
ピルビン酸水
計

100μL
50μL
50μL

1.0 mL≪実験２≫活性剤の活性速度の測定
実験１の基質溶液のピルビン酸ナトリウム溶液の添加量40 µl(終濃度:2 mM)の一定に保ち、活性化剤fructose-1,6-bisphosphate（FBP）の添加量を変え、実験１と同様の実験を行った。
≪実験３≫活性剤を添加した時の活性速度の測定
実験２の結果をもとにして、FBPの濃度を1 mM、5 mMの2点に設定し、ピルビン酸ナトリウム溶液の濃度を変え、実験１と同様の実験を行った。

３．結果≪実験１≫活性剤が入っていない時の酵素反応の速度式の確認
実験結果から見かけの速度定数 (kapp) を算出し、図3に■でプロットした。kappは、基質の濃度を上げると大きくなり、さらに基質の濃度を上げると一定の値に近づいた。ミカエリス・メンテンの理論曲線に代入するとKm の値は2 mM、kcat の値は 16 (1/s)、 kcat/Km の値は 8.0×103 M-1s-1となった。
≪実験２≫活性剤の活性速度の測定
実験結果から見かけの速度定数(kapp)を算出し、図4にプロットした。結果より、FBPの濃度が1 mMになった時、見かけの速度定数は最大まで近づくことが確認された。そこで、今回添加するFBPの濃度を1 mMと5 mMに設定した。
≪実験３≫活性剤を添加した時の活性速度の測定
実験結果からkappを算出し、図3に ◆でプロットした。FBPを 1 mM添加すると、FBPを添加していない時のkappと比較して、FBPを添加した時の方がkappの値が大きくなった。ミカエリス・メンテンの式より、Kmの値は 0.05 mM、kcat の値は 16 (1/s)、kcat/Km の値は 3.2×104 M-1s-1となった。また、FBPが5 mMを添加した時のkappを算出し、図4にプロットした。Km の値は 0.01 mM、kcatの値は 16 (1/s)、kcat/Km の値は 1.6×106 M-1s-1となった。さらに基質濃度を大きくすると、見かけの速度定数が小さくなるという新たな現象が見られた。そこで、図4を基質濃度が0.1 mMまでの実験結果を図5に示した。Kmの値
は 0.03 mM、kcatの値は 21 (1/s)、kcat/Km の値は 7.0×105 M-1s-1となった。

４．考察
実験１より、活性剤が入っていない時の乳酸脱水素酵素の反応速度は、基質濃度が濃くなると、見かけの速度定数も大きくなり、またミカエリス・メンテンの理論曲線に沿って大きくなるため、ミカエリス・メンテンの式（v = kcat[E]0[S]/([S]+Km)）が成り立つと考えられる。その時のkcat/Kmの値は8.0×103 M-1s-1となり、拡散律速から期待される値（1×106-8 M-1s-1）2)と比較して遅いことがわかった。実験３より、FBPを 1 mM添加した時にも実験１と同様に、ミカエリス・メンテンの式が成り立つと考えられる。その時のkcat/Kmの値は 3.2×104 M-1s-1となり、実験１でのFBPなしのものと比較すると、大きくなることがわかった。FBPを 5 mM添加した時は、基質濃度が薄い時（0.1 mMまで）では、ミカエリス・メンテンの式が成り立つと考えられる。その時のkcat/Kmの値は 7.0×105 M-1s-1となり、FBP１ mMの時と比較する(図4)と、拡散律速から期待される値に近づくことがわかった。
実験３のFBPを5 mM添加した時、基質濃度が濃くなると、反応速度が遅くなり、ミカエリス・メンテンの式が成り立たなくなった理由は、FBPを多量に添加し、基質濃度も上げたことで、酵素の形が変形し、基質が結合しにくくなったのではないかと考える。

５．結論
乳酸脱水素酵素は、活性剤であるFBPを添加すると、拡散律速から期待される値に近づくことがわかった。

６．参考文献ならびに参考Webページ
1) 高校の教科書 “化学”, p 366-381, 第一学習社
2) Radzicka, A. and Wolfenden, R. (1995) Science 267, 90-93
3) Protein Data Bank (https://www.rcsb.org)
７. 謝辞
本研究に当たり大阪大学のseeds プログラムの一環として倉光成紀教授にお世話になった。この場を借りて厚く御礼申し上げる。