藻類 Jpn.J.Phyco.
l(Sorui)44:1
59‑
163，
November10，1996

金ふ耐附
光化学系活性測定法
佐藤典裕・都筑幹夫
東京薬科大学生命科学部
192・03東京都八王子市堀之内 1
432‑
1NorihiroSato叩 dMikioT
suzu
ki1
996・Measuremen
tofa
ctiv
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hotosystems1an
d1
1.Jpn.J.Phycol.(Sorui)

44:
159‑
163.
Me出odstomeasureactiv
i
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Chlamydomonasr
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fdodecyl・s，D‑maltoside
由 明01間 reinhardtii，dodeの'l‑s，D‑mallos肱 PAGE，
pholosys
lem1，
photosyste
m11，
向lakoid
KのIndexWords:Ch/amymembranes.

はじめに1)光合成の電子伝達系

光合成は，光エネルギーを利用して酸化還元反応を光合成の電子伝達系は 2つの光化学系を介して水かひきおこし， ATPや NADPHにエネルギーを蓄えた後，Fig.J)。光化らNADP"を結ぶ酸化還元物質からなる (有機化合物を合成する反応である。このうち， ATPや学系には，光エネルギーを受けて励起される集光性クNADPHを得るまでは，チラコイド膜で行われる。チロロフィルとそのエネルギーを受け取り，電子を放出1のタンパク質複合体
ラコイド膜には光化学系 I及 び 1する反応中心クロロフィルがある。どちらの型のクロがあり，これらの複合体が光エネルギーを化学エネル

ロフィルも，タンパク質と結合しており，集光性クロギーに変換する。ここでの化学エネルギーとは，種々ロフィル・タンパク質複合体(LHC)，反応中心クロロの物質にもたらされた還元状態であり，これらは電子フィル・タンパク質複合体 (RC)を形成している。藻を放出して酸化される。そのため，チラコイド膜で起類や維管束植物では，反応中心クロロフィルは，クロこる一連の酸化還元反応を光合成電子伝達系というロフィル aであり，集光性クロロフィルはクロロフィ(Fig.J)0 NADP"はこの電子伝達系の終点に位置して還ル aとbあるいは aとcである。なお，ラン藻や紅藻で元され，その電子伝達に伴って形成されるプロトンのはLHCの代わりにフイコピリソームが光を受ける。藻濃度勾配を利用して A叩が合成される。本稿では，光類ではカロチノイドやフコキサンチンも光を吸収しク，光化学系 11の活性測定法
合成電子伝達系の光化学系 1と各々の活性を担うタンパク質複合体の単離方法について紹介する。

ロロフィルへそのエネルギーを渡す。まず，光化学系11の LHCが光を受けると LHCのクロロフィル聞でエネルギーの受け渡しが起こり反応中心クロロフィルへ渡される。そこで電荷が分離し電子を放出する。これによって生じる強力な酸化力は， Z (RCを構成してい佐藤・都筑

160

分子生物学の分野にまで広がっている。電子伝達活性NADP+は，主に，酸素電極による酸素の濃度変化の測定ある
いは分光学的な測定により求められる。本稿では，クラミドモナスで、の，酸素電極を利用した光化学系 I及びIIの活性測定例を紹介する。
(a)活性測定のためのストック溶液
プラストシアェン{シータロJ.dFig・
1 光合成の電子伝達系(佐藤和彦 1992.光合成器官の分子.
23.宮地重遠(編)光合成，朝倉書庖，東京より構築と機能， p一部を改変).矢印は電子の流れを示す。 P680:光化学系 H反応中心，P7∞:光化学系 I
反応中心， phe:フェオフィチン， Cyt:d: フェレドキシン， fp: フェレドキシン
チトクローム， FNADP+酸化還元酵素。

1. 0.
5M Mesffr
is緩衝液 pH8.1

4と0.
5MTris緩衝液 pH0.
5M Mes緩衝液 pH5.
.
11
こする。
9.
0を混合し， pH82. 100mM塩化アンモニウム。
3. 37mMp‑ベンゾキノン

昇華させたPベンゾキノン 20mg
，蒸留水 5m1。
測定日ごとに作成し，暗黒下で保存。 p・ベンゾキノンは，時計皿に取り，ガスバーナーで熱し昇華させる。この時，時計皿の上に冷やしたるD1タンパク質のチロシン)や Mnクラスターを通して水を分解し電子を引き抜く。この時，酸素が発生すビーカ一等を用意し，その底面に黄色の針状結品を得る。ドラフト内で行うこと。

る。反応中心から放出された電子はフェオフイチンか

4. 30mMフェリシアン化カリウム

A，QBといったキノン電子受容体の順番で伝達さら， Q5. 還元型 2，6‑ジクロロフェニルインドフェノール溶液れる。一方，光化学系 Iでも， LHCが光を受け励起さ2，6‑ジクロアスコルピン酸ナトリウム 2 mg，れた反応中心は電子を放出し， A。を還元する。その反ロフェニルインドフェノール(DCIP)3mg，蒸Iより伝達されてきた電子によ
応中心自身は光化学系 I

留水 IOml。測定日ごとに作成し，暗黒下で保り還元される。 A。へ渡された電子は， AI(ビタミン K1)や FX，FA/F
B といった鉄.硫黄クラスターなどを通っ∞存。
6. 2mMメチルピオロゲン溶液て，最終的にはフェレドキシン ‑NADP+酸化還元酵素

メチルピオロゲンはパラコートのことである。

による NADP+の還元に利用される(非循環型電子伝猛毒なので取り扱いに注意すること。

達)。また，電子の一部は光化学系 Iに戻る(循環型電子伝達)。
このように光合成の電子伝達系は，水を電子供与体とし， NADP+を最終電子受容体とする多段階の酸化還7. 100mMシアンイヒカリウム。

1月毎に l回作成。

8. 3・(3，4・ジクロロフェニル)ー 1，1‑ジメチルウレア(DCMU) 4.
2mg，エタノール 1m1，蒸留水 99ml

元反応鎖である。従って，外部より適当な電子供与体と受容体を組み合わせて与えることにより，光合成電子伝達系の特定部分の電子伝達を人為的に行わせることができ，その活性を測定できる。
2) 光化学系 lおよび Hの活性測定法

緑藻クラミドモナスは，主要色素としてクロロフィ，bを有し，また，チラコイド膜の単離等，生化学ルa的な操作が容易なため，高等植物の光合成のモデル系として古くから研究されてきた。また，従属栄養的に生育が可能で，かつ I倍体なので光合成に関する突然変具体が得やすく，その遺伝的解析も可能である。最近では，葉緑体ゲノムと核の形質転換系も開発され，その生物材料としての用途が，遺伝子操作を利用した(b)細胞の調盤細胞を遠心 (3000・g，5min) で沈殿させ，緩衝液(50m MT
ricinepH7.5) に懸濁する。この際，クロロフィル濃度が 60μg‑ml.1となるよう調整する。この懸濁液をストックして活性測定に用いるが，クラミドモ
ナスの場合，測定開始までの間に細胞が沈むと活性が低下してしまうので，スターラー等で撹はんを続ける。なお，細胞を光独立栄養的に育てると，対数増殖期，直線増殖期，定常期へと生育のステージが進み，それに伴いクロロフィルあたりの光化学系活性が下がっていく。筆者らは，最も活性の高い対数増殖期の細胞[充てん細胞体積 (packedcellvolume) で Oふ 0.
5ml.1の細胞濃度]を用いて光化学系活性を測定してμl・

光化学系複合体の活性測定法と分離法いる。

161化アンモニウムは脱共役する。

(c) 測定(c‑l)光化学系 H活性

M V+2e‑+2H+一一う勘iVH2

ここでは，水を電子供与体，p‑べンゾキノンあるいはフェリシアン化カリウムを電子受容体として光化学~+02 一→ MV+ 叫O 2 (MV，メチルピオロゲン)系E活性を測定する。なお，p‑ベンゾキノンは膜透過性なので，活性測定には細胞をそのまま用いる。反応3)光化学系 l複合体および光化学系 1複合体の単離

l‑Iの細胞懸液組成は以下の通りである。 12μ.gChl・m

方法

濁液 ，20m MMes!
frispH8，1.300μM p・ベンゾキノン，光化学系H複合体等のクロロフィルとタンパク質の2mM塩化アンモニウム。活性は水の分解に伴う酸素複合体は，チラコイド膜からイオン交換クロマトグラ発生から求める。また，膜非透過性であるフェリシア

フィー，ショ糖密度勾配遠心法，ポリアクリルアミドン化カリウムを電子受容体として用いる場合は，細胞電気泳動法 (PAGE)等を利用して単離してきた(例，をあらかじめ破砕し，チラコイド膜を露出させる必要

deVitryeta
J.1991)。これらの方法で複合体が精製さがある。筆者らは，細胞懸濁液 10凶を 15凶のプラスれた結果，各複合体におけるサブユニットや色素の組チック遠心チュープに取り，氷上で冷やし，次いで，成，光化学反応に携わる因子の同定，複合体の構造解・2∞IP，トミー精工)で， 90%以上のソニケーター (UR析が進展した(例， Ikeuchi1992)。前二者の方法に比細胞が破砕されるまで処理している。細胞が壊れすぎべ，ると光化学系活性が落ちるので，光化学系 H活性が最を高い解像度で分離し，それらを同時に精製できる利PAGEを用いた方法には，ゲル上に複数の複合体大になるソニケーターの出力，処理時間を調べる必要点がある。これまでの PAGEでは，チラコイド膜を可がある。この時の反応液組成は， 12μ.
gC
1叫・m
1‑1の細胞漆化する際や界面活性剤をゲルに添加する際に，リチ破砕液 ，20m MMes!
frispH8，
1. 1mMフェリシアン化

ウムドデシル硫酸やオクチルグルコシド等を使用してカリウム， 2mM塩化アンモニウムとする。
クラミドモナスの野生株では ，p‑ベンゾキノン，フェリシアン化カリウムを電子受容体とした場合，それぞれ約 300，200仰 nol02・(mgChl)
ー1・hr‑I程度の活性が認められる。

きた。しかし，これらの界面活性剤は，タンパク質複合体からクロロフィルを遊離し，また複合体のサプユニット聞の結合を著しく破壊するという欠点がある。
そこで，私たちはよりマイルドな方法として，クラミドモナスのチラコイド膜をドデシル ‑s，D‑マルトシド(DodGlc2)で可溶化し，ポリアクリルアミド電気泳動(c・2)光化学系 I活性

ここでは光化学系 I
活性の測定に還元型の 2，6・ジクロロフェニルインドフェノール (DCIP)，メチルピオロにかけた結果，光化学系の複合体がクロロフィルを遊離せずに，またサプユニット数もある程度保持した状
Satoeta
J.1995)。
態で単離されるようになった (ゲンをそれぞれ電子供与体，電子受容体として用いた例を紹介する。これらの物質は膜透過性ではないので，細胞を破砕する。光化学系 I活性が最大になるソニケーターの出力，処理時間をあらかじめ調べておく。なお，反応組成は以下の通りである。 2.
4μgChl・m
1‑1の破砕した細胞懸濁液，20m MMes!
fris緩衝液 pH
21μMDCIP，2mMアスコルビン酸ナトリウム， 80
8.
1，4mMKCN，2μMメチルピオロゲン， 6μMDCMU，0.

mM塩化アンモニウム。活性はメチルピオロゲンの再酸化に伴う酸素吸収から求める。また，光化学系 Hでは，酸素 1分子の発生につき， 4個の電子が水よりヲ￨き抜かれるが，当量の電子が光化学系 Iに伝達されると2分子の酸素が吸収されることになる(次式参照)。なお， DCMUとシアン化カリウムは，それぞれ光化学系 Eとカタラーゼによる酸素発生を阻害し，塩(a) チラコイド膜の単離と可溶化

まず，ショ糖密度勾自己遠心を用いたクラミドモナスのチラコイド膜精製法を紹介する (Chua組 dBennoun0C)で行う。 11975)。全ての操作は低温 (0‑41の細胞2，500・g，5min)，細胞を沈殿させる。
培養液を遠心し (O.
3M ショ糖， 25m MHepes/KOHpH7，5.1m MMgC~を含む緩衝液で洗浄後，同じ緩衝液 20m1で懸濁する。細胞をソニケーター(あるいはフレンチプレス，ガラスピーズ等)で破砕し，破砕液を遠心 (2，∞0・g，lOmin)にかける。可溶性タンパク質やミトコンドリア等を含む上清を除き，沈殿をガラスホモジナイザ一等を使.
3M ショ糖， 5m MHepes/KOHpH7ムlOm M
い， 0EDTAを含む緩衝液 20凶に懸濁する。これにより，チラコイド膜のスタッキングをなくし， Ca2+依存性

佐藤・都筑

1623M.W.
(KDa)

(1)

(2)

PSIPSIILHCII‑ALHCII‑B

(3)

(4)

74.4→
ECmト国百 ωucentoEM4ω 主百‑oE

49.6→
37.2→

24.8→

12.
4→

5.
.
*9DlstanceIromtheTop0
1Resolv
lngGel(cm)
棋の DodGlc2/
PAGE
Fig.
2 クラミドモナスのチラコイドldGlc?/PAGE (ディスク12.
5μgChlを含むチラコイド朕を Doゲル)にかけ，主に 4怒のクロロフィル ータンパク 質複合体のバンドを得た。

Fig.
3 クラミドモナスの各クロロフィルータンパク質複合体のSDS/PAGEdGl
c2/
PAGE (ディスク12.
5μgChlを含むチラコイド膜の Doゲル ) で待られた各クロロフィル ー タンパク 1~ 複合体のバンドATPaseやトラップされた澱粉粒を放つ 。次いで ，遠心(50，000・g，IOl11in)により沈殿した j
換を 1.
8Mショ糖，
51
11MH巴pes/KOHpH7.
5，101
11MEDTAを含む緩衝液(Fig.
2，1‑4)を切り 出 ，し SDS/PAGEにかけ，サプユニ γ ト組成を調べた 。各被合体に特異的に検出されるタンパク質 (星印)は，バンド 1，2がそれぞれ光化学系 l複合体，光化学系 1コア複合体であり ，また バン ド3，4は共に光化学系 nの LHCであることを 示 している 。

151111に懸濁する 。 この懸溺液 51
111に， 1.3M ショ fl.
f，51
11MJ‑
lep巴s/
KOHpH7.
5，101
11MEDTAを含む緩術液 2，0.5Mショ糖， 51
11MHepes/
KOHpH7.
5を含む緩衝1111液51111を順に上層し，遠心 (160，000・g，1hr) にかけ.
3M とる。 この結果，チラコイドJ莫と限点が，各々 10.
5M シヨ糖層に浮上する 。チラコイド膜を回収し， 5(b) ドデシルマルトシ ド電気泳動
上清を 以下の要領でディスクあるいはスラプ電気泳

m MHepes/KOJ‑
lpJ‑
l7
ム101
11MEDTAを含む緩衝液で 4動にかける 。なお ，ゲルに載せるク ロロ フィルは， 0.
64倍に希釈し ，使用 するまで ‑800Cで保存する 。

同 Chl.mm‑2以下とする 。

44離したクラミドモナスのチラコイ ド肢 を，クロロ
1.
5Illg・1ll1.
.
5%フィルの終濃度が 0になるよ うに ，0DodGlc，501
11MTris/HCI
pH7.
5，101
1
1
MNaCIの緩衝液
2で，1IJ寺問，可溶化する 。 次 い で ¥ 不 溶 回 分 を 遠 心(5500・g，5min)で沈殿させる 。チラコイドl換を可溶化する際の DodGJ
c2の泌度は ，至 j
邑波度領域が狭く ，高すぎると 複 合 体 が分解し，逆に低すぎる と後合体が充分には可溶化されないので，注訟を要する 。

Ji:
J.紺i
ゲル:2.
5% (w
巴ighl/vo.
l)ア ク リルア ミ ド，62m M

Tris
川C
IpH6.
7，0.
01% (weight/vo.
l) DodGlc2
分離ゲル :5% (weight/vo.
l)アクリルアミド， 3751
11M.
01% (w
巴ighl/vo.
l) DodGlc
ヲ
Tr
is/HClpH8.
9，0電極用緩衝液 :5IllM Tris，38m Mグ リシン
Jのゲルとして ，絞合体のサブユニッ ト組電気泳動)f

成の分析等，サンプルが少量で済む場合には ，デイス

光化学系複合体の活性測定法と分離法

163クゲル(長さ 5cm，直径 0.
5cm) を，また複合体に結光合成電子伝達系の他の部位の活性も詳細に測定でき合している脂質の分析等，サンプルを大量に必要とする。またチラコイド膜の DodGlc2/PAGEは，クロロる場合には，スラブゲル (8.
2XI3.
8XO.
8cm3) を使う。

フィルを遊離せずに光化学系複合体を分離できるの電気泳動は，暗条件下，先端の緑色のバンドが分離ゲで，複合体レベルでの光化学系の量を正確に知ることルから流出する前に終える。ディスクゲル，スラプゲが可能である。光化学系活性は，植物の生理状態を知

ルでは各々， 1 V，2 Vの定電圧条件下，低温下 (0‑る lつの指標であり，温度や光の環境要因等で変化す0C)で行うが，温度上昇による複合体の分解，あるい
4/PAGEることが示されてきた。そして，この DodG1c2∞ ∞はクロロフィルの遊離を抑えるため，泳動中のゲルのにより，複合体レベルでの光化学系の量的及び質的変温度には注意が必要である。

動の追跡が可能となった。なお，ここでは触れなかっFig.
2は，ディスクゲル電気泳動後のゲル上でのクたが，クロロフィル蛍光を用いて光化学系 Hの状態をロロフィルのバンドの分布を 675nmのクロロフィルのtaJ.1989)知る方法もある。 Ho1mesらの論文 (Holmese吸収で示したものである。主に 4つのバンドが認めらが参考となろう。

れ，いずれもタンパク質との複合体である。各バンド
Fig.
3)は，の SDS電気泳動によるサプユニット組成 (移動度の大きいものから順に，光化学 I複合体，光化

謝辞
本稿は，川口昭彦博士，園池公毅博士のご指導のも学系 Hコア複合体，及び 2種類の LHCIIであることをとで行った研究をもとにしている。この場を借りて，示している。

お礼を申し上げます。

なお，各複合体をゲル中から精製するには，まず複ris/HC
1pH7.
8の合体を含むゲルを切り出し， 20m MT

参考文献20，α)().
g，緩衝液中でホモジナイズする。次いで，遠心 (Chua，N.H.，叩dBennoun，P.1
975.Thy
1akoi
dmembrane30min) にかけ，ゲル片を沈殿させ，上清を更に超遠po1ypeptideso
fCh
1amydomonasr
einhard
凶 : Wi1d勾 pe心(160，000g，12h) にかける。得られた沈殿を 50mM

andmutantstrainsdeficienti
np
hotosystemIIreactionTris/HC
1pH7.
5，10m MNaC1，0.
5M スクロースの緩衝液に懸濁し，・80Cで保存する。
0DodGlciPAGEで精製した光化学系複合体の色素や光化学活性の詳細な解析はまだ進めていないが，精製の過程でクロロフィルが遊離しないことから想像できるように，いわゆる境界脂質と呼べるものも保持されている (Satoeta
J.
1995)
oDodGlciPAGEにより単離された光化学系複合体は，チラコイド膜の機能発現における脂質の役割を解明する糸口になるのではと考えている。

center.Proc.Nat.
1Acad.S
ci.USA72，2175‑
2179.
deVitry，c.
，Diner，
B.A.andPopot，
1.L.1
991.Photosys
包m
11parti
c1esf
romCh]，嗣 rydomonasre
血，ha出i:p町 ifiω且o，nmallsubuni
tcomposition，andmo
1ecu
1arweight，s.
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Ch10rophyllafluorescencep
redictstota
lphotosynthetic/N02‑undert
ransiente
1ectronflowt
oC020
rN03‑

con
ditions.P
1antP
hysio.
19
1，3
31・3
37.
I
keuchi，M.1
992.S
ubuni
tp
roteinso
fp
hotosystemII.Bot.
Mag.Tokyo1
05，327・373.
Sato，
N.，
Sonoike，K.
，Tsuzuki，M.andKawaguchi，
A.1995.

4)おわりに本稿では，光化学系活性の最も基本的な測定方法を紹介したが，既に種々の人工的な電子受容体，電子供与体が見いだされており，光化学系活性のみならず，Impairedphotosyste
m11inamutantofCh
1amydomonasreinhardtiidefectiv
einsu
1foquinov
osy1diacy1g1ycero.
1Eur.J.B
iochem.234，16‑
23.