GS1-3-3

LIFE2013	  2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

住環境アレルゲン Der f1 連続計測のための	 
光ファイバ式蛍光免疫計測システム	 Fiber-optic Fluoroimmunoassay System for On-site Detection of Der f1 in Residential Environment○	 三木大輔	  	  宮島久美子	  	  荒川貴博	  	  三林浩二（東医歯大）	 
Daisuke MIKI, Kumiko MIYAJIMA, Takahiro ARAKAWA, Kohji MITSUBAYASHI,
Tokyo Medical and Dental University
Abstract: A fiber-optic fluoroimmunoassay system for Dermatophagoides farinae allergen (Der f1) was developed andapplied to a flow analysis system. This system measures Der f1 as fluorescene of sandwich-type immune complexesformed by capture antibodies, Der f1, and fluorescently labeled detection antibodies. The immune complexes wereadsorbed on the optical fiber probe surface. An evanescent light, generated by total internal reflection of laser propagatingin the probe, excites fluorophores binding immune complexes. The fluorescence was detected by the photo diode as currentvalues. The calibration range determined by fluorescence of immune complexes was from 0.98 to 250 ng/ml and the assay
time was within 16 minutes. As another quantification method of Der f1, the fluorescence increasing rate during thebinding reaction between antigen and fluorescent-labeled antibody was calculated. The calibration range was equal tomentioned above, and the assay time was shortened to 6 minutes. The flow immunoassay system thus allows on-site
detection of allergens in residential atmosphere with high precision.
Key Words: Optical Fiber, Allergen, Antigen-Antibody Reaction, Fluoroimmunoassay, Dermatophagoides Farinae
1. はじめに
近年，気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の有病率は年々増加傾向にあり，世界的な社会問題となっている (1,2)．疾患を引き起こすアレルゲンの中でも特に重要なものとしてダニアレルゲンが挙げられる．アレル
ギーを引き起こすダニのほとんどは，屋内塵中の総ダニ数の 50~90%を占めるチリダニ科に属するコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae) と ヤ ケ ヒ ョ ウ ヒ ダ ニ (D.
pteronyssinus) である．これらのダニは寝具や畳，絨毯などに多く存在し，その死骸や排泄物などに含まれるタンパク質が強い抗原性を示す．
こうしたアレルギーの発症予防や症状改善の対策としては，原因物質であるアレルゲンの除去・回避が重要であり，汚染レベルを明らかにし，環境整備に役立てるためにもアレルゲンを簡便かつ迅速に高感度計測する技術やシステムが必要とされている．現在行われている環境中アレルゲンの測定法には免疫計測が広く用いられているが (3-5)，特別な施設や煩雑な操作を必要とすることや，結果を得るまでに時間を要するといった課題が残されており，家庭環境での計測に向けたシステムの簡便化や高速化が期待される．
本研究では，主要な環境アレルゲンであるコナヒョウヒ
ダニ由来のDer f1を対象とし，アレルゲン動態評価のための計測システムの開発およびシステムの高速化，高感度化を行った．

免疫複合体の蛍光色素が励起され，放出される波長 670 nmの蛍光を再度プローブにて集光した．光学フィルタにて励起光の戻り成分を遮断しつつ，プローブ側面の抗原に基づく蛍光をフォトダイオードにて検出することで，抗原の定量を行った．

Fig. 1Fiber-optic fluoroimmunoassay system	 2-2	 Der f1 測定における蛍光免疫計測
Der f1 の測定は，装置に捕捉抗体付きプローブ，抗原溶液（100 µl），及び標識抗体溶液（100 µl）をセットし行った．
また，従来法との比較のため非競合 ELISA 法にて Der f1 の2．実験方法
2-1	 光ファイバ式蛍光免疫計測の原理測定を行った．ELISA 法では，二次抗体にビオチン標識抗体

Fig. 1 に光ファイバ式蛍光免疫計測の原理を示す．まず，捕捉抗体を側面に固定化した光ファイバ型プローブ（長さ：4 cm, 材質：ポリスチレン）に抗原を結合させ，さらに蛍光標識抗体を結合させることでサンドイッチ型の免疫複合体を形成した．本プローブに，レーザーダイオードから照射した励起光（650 nm）を導入することで，プローブ側面近傍にエバネッセント光が発生する．この光によりプローブ側面の（2 µg/ml），酵素溶液にストレプトアビジンペルオキシダー
ゼ（0.25 µg/ml），発色基質液に 3％過酸化水素を加えた 2 mM
ABTS 加 70 mM リン酸-クエン酸緩衝液を各 100 µl/well ずつ用いて，405 nm での吸光度を分光光度計（SH-1000Lab, コロナ電気（株））にて測定した．
本システムの Der f1 に対する選択性を確認するため，Derf1（50 ng/ml），Der f2（コナヒョウヒダニ由来, 50 ng/ml）（精製ダニ抗原 rDer f2 AB-N-1, Lot F7-03, 生化学バイオビジネ

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LIFE2013	  2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

ス（株）），Cry j1（スギ花粉由来, 50 ng/ml）（Japanese Cedar

1 検体あたり約 6 分であり，バッチ計測に比べて半分以下にPollen Allergen Cry j1, Purified, Lot C1-080636,
HAYASHIBARA BIOCHEMICAL LABS. INC.），Der f1 および短縮された．

Der f 2 を混合させたもの（各 50 ng/ml），Der f1 および Cry j1を混合させたもの（各 50 ng/ml）の 5 種類の抗原溶液を用いて，蛍光免疫計測を行った．
さらに光ファイバの周囲にフローセルを設け，光ファイバを固定した状態でのサンプル溶液及び反応試薬の導入と洗浄蛍光計測のステップを可能にすることで，光ファイバプローブの移動操作を省き，本計測手法の半連続化，高速化を図った．
3. 結果及び考察
3-1	 Der f1 測定における蛍光免疫計測の特性
光ファイバ式蛍光免疫計測による各ステップの蛍光強度変化を Fig. 2 に示す．ステップ[2]における非特異的反応は十Fig. 3

immunoassay system and ELISA

分小さく，二次抗原抗体反応後のステップでは Der f1 濃度に応じた蛍光出力が得られた．本システムでのステップ[3]とCalibration curves for Der f1 measured by proposed

4. まとめ[4]との蛍光出力値の差分から Der f1 の定量特性を求めたと

光ファイバプローブを用いた，住環境中 Der f1 測定のためころ，開発した光ファイバ式蛍光免疫計測において，Der f1の蛍光免疫計測法を開発した．本計測法により，Der f1 を 0.98を 0.98～250 ng/ml の範囲で定量可能であった．測定に要す～250 ng/ml の範囲で定量が可能であった．ELISA 法と比較る時間は，ELISA 法の約 150 分に対し，蛍光免疫計測では 1したころ，同等の定量特性且つ，測定時間は ELISA 法の約検体あたり約 16 分と約 1/10 で，迅速な測定が可能であった．
また，Der f1 以外の各種抗原成分に対する本システムの出力値の比較から，Der f1 含有抗原溶液のみから蛍光出力の増加が確認され，本システムの Der f1 に対する高い選択性が確認された．

1/10（約 16 分/1 検体）と大幅な短縮が可能であった．また，
Der f1 以外の各種抗原成分に対する出力値の比較から，本システムの Der f1 に対する高い選択性が確認された．
さらに，本システムに送液が可能なフローセルを導入することで，光ファイバを固定した状態でのサンプル溶液及び反応試薬の導入と洗浄蛍光計測のステップを可能にした．Derf1 を 0.98～250 ng/ml の範囲で定量が可能であり，ELISA 法と比較したころ，同等の定量特性且つ，測定時間は 6 分であり，バッチ計測に比べて半分以下に短縮された．

Fig. 2

Immunoassay process and fluorescence changes of theDer f1 detection

3-2	 フロー計測における Der f1 の検出フローを導入した蛍光免疫計測によるシステムを用いて，二次抗原抗体反応前後の値の差分から得た，Der f1 の定量特性と，ELISA 法による測定結果との関係を Fig. 3 に示す．フローを導入した光ファイバ式蛍光免疫計測において，Der f1を 0.98～250 ng/ml の範囲で定量可能であった．本計測法は，ELISA 法と比較し，同程度の直線性を持ち，ELISA 法と同程度の定量能力を持つことが確認された．測定に要する時間は参考文献(1) B. Richard, the International Study of Asthma and Allergies
in Childhood (ISAAC) Steering Committee Worldwide
Variation in Prevalence of Symptoms of Asthma, Allergic
Rhinoconjunctivitis, and Atopic Eczema: ISAAC, Lancet,351, 9111, 1225-1232, 1998.
(2) A. Togias, Rhinitis and Asthma: Evidence for Respiratory
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(3) J. A. Asturias, M. C. Arilla, M. Aguirre, N. Gomez-Bayon,A. Martinez, R. Palacios, F. Sanchez-Gascon, J. Martinez,
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Sandwich ELISA, J. Immunol. methods, 229, 61-71, 1999.
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Griffin, K. Haselwandter, A Comparison of Immunological
Assays for the Identification of Tuber spp. and Other Edible
Ectomycorrhizal Fungi, Myco. Research, 103, 4, 403-412,1999.
(5) M. D. Chapman, P. W. Heymann, T. A. E. Platts-Mills,
Epitope Mapping of Two Major Inhalant Allergens, Der pI
and Der fI, from Mites of the Genus Dermatophagoides, J.
Immunol., 139, 5, 1479-1484, 1987.

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