コヒーレントラマンイメージング用
ポータブル型・完全ファイバー型・デュアル出力・広帯域・波長可変光源

著者
Maximilian Brinkmann 1,2,5
Alexander Fast 3,5
Tim Hellwig 1,2
Isaac Pence 3
Conor L. Evans 3
Carsten Fallnich 1, 4
1. 応用物理学会（ドイツ、ミュンスター）
2. Refined Laser Systems 社（ドイツ、ミュンスター）
3. ウェルマン光医学センター（米国、ボストン、マサチューセッツ総合病院）
4. エクセレンス・クラスター/先端研究施設「Cells in Motion (CiM)」（ドイツ、ミュンスター大学）
5. 筆頭著者＜要旨＞
本研究では、光パラメトリック発振器を励起する分散整合したモードロックレーザーをベースとした「コヒーレントラマンイメージング用・高速・波長可変・デュアル出力・完全ファイバー型
レーザー光源」について述べる。出力するポンプ光とストークス光の最大出力は、それぞれ170mW,400mW であり、生成可能なパルス幅は両方とも 7 ピコ秒である。波長可変機構には機械的遅延ラインは不要で、任意波長の切り替えを 5m 秒以内で 2700cm-1 以上に亘ってすべて電子的に行うことができた。コンパクトなセットアップで 25m/s2 以上の耐衝撃性を有する
ような信頼性のある動作を実現しており、ゆえに、移動式カートに載せて動作させるのに最適である。このポータブル光源と実験室にある商用の参照システムの両方を用いてマウスと人の皮膚組織のイメージングを行うと、質的に同等の結果が得られ、ポータブル光源がコヒーレントラマ
ン顕微鏡に適していることが確認された。
本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 ライセンスの条項に基づき光学会が発行した。
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1. はじめに
コヒーレントラマン散乱（CRS）は、非破壊的・ラベルフリー・高化学選択性での分析が可能であり、それゆえ必要なサンプル前処理が少なくなるため、特に生体の生きたままの状態（in vivo）
での研究や画像診断に適している。この手法は、癌診断[1,2]、染色不要の病理組織学[3]、薬剤研究[4]、その他の医学関連分野で使用されるが、複雑な光源が必要とされるために CRS の診断システムは臨床現場で滅多に見られない。CRS 手法に理想的な光源は、同期した 2 波長のパル1ス列を出力することができる光源だ。異なる分子振動の共鳴を探針で捉えることができるようにするために、この 2 波長のパルス列における波数の差は 500cm-1～3550cm-1 の間で波長可変できる。これらのパルス列はフェムト秒又はピコ秒領域にて発生させることができるが、ピコ秒パルスを発生できることの方が望ましい。というのも、ピコ秒パルスはフェムト秒パルスよりも狭帯域化しているので、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）や誘導ラマン散乱（SRS）、さらには CARS におけるより弱い非共鳴バックグラウンド（分子振動に由来しない
信号）[5]を検出するための高いスペクトル選択性が得られるからだ。上記の要件に一致する同期したパルス列は、同期的に励起された光パラメトリック発振器（OPO）[6,7]から生成することができ、実験室での用途に適している。自由空間型 OPO システムは、新鮮なヒト組織を固定した状態で研究[8-12]するために何ヶ所かの臨床現場で用いられてはいるが、術中や臨床で使用するには複雑性や設置面積、医療用フローティングテーブルの必要性といった問題に対処しなければならない。そのため、内視鏡[13]や顕微鏡[14]を含めたコヒーレントラマン散乱（CRS）
を臨床に容易に適応できるようにするための測定ができるように、多くの研究が熱心に行われている。König[15]は、臨床環境におけるイメージング手法として、高機動性・自動化 CARS ト
モグラフを発表したが、この CARS トモグラフィでは、必要となる 2 色のレーザーパルスが SC
光を発生させるためにフォトニック結晶ファイバ（PCF）を励起するチタンサファイアレーザーから放射された。しかしながら、SC（スーパーコンティニューム）光を発生させるには、スペ
クトルパワー密度が低く（<20mW/nm）、波長可変・狭帯域スペクトルフィルタを用いて異なる波長のパルスを抽出する必要がある。従って、スーパーコンティニューム光をベースにした
波長可変光源の出力は、通常 5mW 未満であり[16]、その一方で in vivo イメージングでは出力は、通常最大 50mW となる。さらに、自由空間型ファイバーカップリング及びビーム伝送には、医療用フローティングテーブルから離れて手術を行うために、ビームをアクティブに安定化させる必要があった。
対照的に、完全ファイバー型の光源は機械的に安定しており、アライメントや安定化させるための労力はほぼ不要である。ファイバーオプティクスの利点を活かして、Orringer ら[12]は、術中の組織学的計測を実現するためにポータブル仕様のカートに収められた CRS の統合型臨床システムを開発した。しかしながら、このシステムにはモード同期した Yb（イッテルビウム）添加及び Er（エルビウム）添加ファイバーレーザーが用いられており、ファイバーレーザーの利得帯域幅が制限されているので[17,18]、C-H 伸縮領域（2700cm-1～3100cm-1）における振動共鳴の信号のみしか得られなかった。同様の理由で、モード同期した Yb（イッテルビウム）
添加ファイバーレーザー及びダイオードレーザーをベースにした、最近発表された非実験室用ファイバー型内視鏡 CARS 分光システムの測定対象も、C-H 伸縮領域に制限された[19]。多くの
場合、C-H 伸縮領域における振動成分からトモグラフィで評価するのに十分なコントラストを得ることができるが、実際には C-H 伸縮領域とは別の領域の振動成分を測定対象とした用途が多い。関連用途には、200cm-1 付近における重水素化医薬品のスクリーニング[20]、指紋領域
における腫瘍の分類[21]、又は酸化重水素（D2O）を用いたプローブ測定による代謝反応の可視化[22]が含まれる。従って、これらすべての用途では広帯域・波長可変光源が必要となる。
ファイバー型の OPO（FOPO）は、自由空間型 OPO よりもはるかに安定しており、四光波混合(FWM)過程を利用して広帯域波長可変性を得ることができる[23-26]。四光波混合(FWM)に必
要な位相整合条件が満たされると、それに伴って励起パルスがスペクトル的に高エネルギー側/
低エネルギー側へシフトしたアイドラー光に変換されるが、これはファイバーの分散と非線形性
2の相互作用[27]によって成立する。通常、それにより短波長側の励起波長が出力パルスにおいて長波長側にシフトするように、位相整合曲線が鋭いピークを持つ。波長可変に伴って繰り返し周波数が様々に変動する間、動作させるのに必要な励起モード同期を維持するために、励起レーザーと FOPO の間のタイミング同期を補償する必要がある。これは通常、この 2 台の共振器のうちの 1 台における機械的遅延ステージによって実現する[23]。このような自由空間光用の遅延ラインは、外部からの摂動や機械的摩耗が発生しやすいことによってファイバー型システムの安定性を低下させてしまう。さらに、機械的遅延ステージによって、達成可能な波長可変速度が数秒間に制限されてしまう。この時間は CRS における通常のデータ取得時間よりも長くなり、
マルチカラーイメージングにはマイナスであると見なされている。この問題は、励起レーザーとしてファイバーカップリング・利得スイッチング型レーザーダイオードを使用し、電子的手段だ
けで励起レーザーの繰り返し周波数を可変することによって、完全統合型ファイバーシステムにて解決できるだろう[28]。ただし、この研究では、四光波混合(FWM)で得た利得スペクトルの位相を固定し、レーザーダイオードの発振波長をフォトニック結晶ファイバ（PCF）のゼロ分散波長付近に固定することで FOPO が指紋領域のみで波長可変するようにした。このような寄与特性を持つ光源はモードロック発振器をベースとしており、40nm 程度の波長可変を可能とした。このモードロック発振器は四光波混合(FWM)に対応したフォトニック結晶ファイバ（PCF）
を用いて FOPO を同期的に励起する励起光源とし、励起波長のみを波長可変することで指紋領域、サイレント領域、高波数領域という利得帯域幅 2700cm-1 にわたってシフトできるような鋭いピークを持つ位相整合曲線を示した。しかし、位相整合が鋭いピークを持つ場合、波長可変領域における励起レーザーと FOPO 間の繰り返し周波数が全く一致しないということを考慮に入れなければならない。
上記の機械的遅延ラインを用いずに波長可変領域全体にわたって励起レーザーと OPO を同期させるために、特許取得済みの分散のない波長可変機構を導入した。この分散のない波長可変機構
は、チャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）を介して両方の共振器の分散整合を実現した。チャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）は、励起レーザ
ーと FOPO の共振器における異なる分散を補償し、共振器の分散に関連した波長可変を行っている間に生じる励起レーザーにおける繰り返し周波数の変動がそれに対応した FOPO における繰り返し周波数の変動と等しくなるようにした。波長可変を行うために励起レーザーに搭載する必要があったのは電子制御・ファイバーカップリング型・波長可変フィルタだけであったため、OPO はすべて融着接続された光ファイバー心線で完全に構成されているのでコンパクトかつ高堅牢性を誇る。下記に、市販されている最先端の実験室用・参照光源と比べた、光源における耐衝撃性能試験の結果と生体医学イメージングの有用性に関する検証結果について述べる。
2. ポータブル・広帯域波長可変・ファイバー型・光パラメトリック発振器
図 1 に示すように、完全ファイバー型システムは Yb 添加ファイバー発振器をベースとしており、可飽和吸収ミラー（SAM）によるモードロック動作をした。パルス幅は 7 ピコ秒、出力は約 2mWである。カスタムメイドなファイバーカップリング対応・電子制御型・波長可変フィルタを用いて 1 ミリ秒未満にて 1020nm～1060nm の間でパルスの中心波長を完全電子制御により波長可変できた。中心波長 1040nm におけるレーザーシステムの繰り返し周波数は 40.5MHz であった。特に選んだチャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）は、発振器の分散と後続の FOPO の分散とを整合させたのと同時に、励起発振器の「アウトカプラー」（25%の3伝送）として機能した。前置増幅後、励起パルスを光源とするダブルクラッドの Yb 添加ファイ
バーをベースにした 2 台の電力増幅器で十分なパルスエネルギーを生成した。その結果、1 つのアームで単一共振型 FOPO を励起し、コヒーレントラマン散乱（CRS）におけるストークスとしてアプリケーション用に 2 つ目のアームから増幅された励起パルスを出力した。この励起パルスの出力は約 400mW、パルス幅は 7 ピコ秒（図 2 の a 参照）、スペクトル幅は約 0.6nm であった。

図 1：実験の概略図。SAM：可飽和吸収ミラー; Yb3+：イッテルビウム添加ファイバー; CFBG：
チャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング; DC-Yb3：ダブルクラッド Yb 添加ファイバ
ー; SMF：シングルモードファイバー; PCF：フォトニック結晶ファイバー

縦軸：規格化｜自己相関

縦軸：線形予測 パワースペクトル密度（任意単位）

横軸：時間（ピコ秒）

波長（nm）

図 2：(a) 励起パルス及び信号パルスにおける測定された強度自己相関（IAC）トレース。半値
全幅は常に 7 ピコ秒であった。
(b) 791.5nm における信号パルスの典型的な測定スペクトル
FOPO の線形共振器は、ファイバ再帰反射器と研磨が施された反射率 約 4%の FC/PC コネクタとの間に配置された 50cm 長のフォトニック結晶ファイバー（NKT Photonics 社製 LMA-PM-5）
及び 155m 長のシングルモードファイバー（Nufern 社製 PM780-HP）によって形成された。
その共振器長に従って FOPO の本来の繰り返し周波数は 657kHz であったが、出力信号パルスの繰り返し周波数は励起 パルスの繰り返し周波数 によってのみ決定され 、 その値である
40.5MHz と等しくなった。つまり、各時点で多数の信号パルスが励起パルスの時間間隔と等し
い時間間隔で OPO 共振器内を循環していた。従って、高調波モード同期[29]の効果と同様に、OPO を 40.5MHz のときに高調波励起した。特に長距離でのファイバー伝送を実現するファイ4

バー共振器を選び、共振器内に狭帯域の分散フィルタを挿入した[28,30]。これは、ファイバでの分散により、フィードバック信号のパルスが一時的に引き伸ばされ、循環している信号パルスにおける狭帯域のスペクトル部分のみが隣り合う励起パルスと重なり、増幅されたということだ。
この分散フィルタリングによって、信号パルスにおける半値全幅（FWHM）帯域幅が約 12cm-1まで狭帯域化した（図 2 の b 参照）。これは、選択性の高いコヒーレントラマン散乱（CRS）に適しており、液体中における典型的な振動線幅と一致する。比較のために、ファイバー長を5m に短くすると（本来の繰り返し周波数である 40MHz に対応）、それ以外では変化のない
FOPO において、出力パラメータを他に大幅に変更することなく、分散フィルタを用いてより広帯域に補償ができ、スペクトル帯域幅は 31cm-1 となる。

a) 縦軸：信号波長（nm）/ 相対波数（cm-1）
横軸：励起波長（nm）b) 縦軸：繰り返し周波数（MHz）
横軸：励起波長（nm）
チャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）を用いていない励起レーザー
チャープ・ファイバー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）を用いた励起レーザー
FOPO：ファイバー型・光パラメトリック発振器
図 3：(a) 励起波長の関数として信号パルスを発生させるための半値全幅の最大利得を表すスペクト
ルの位置。左の縦軸は信号波長を示し、右の縦軸は信号パルスと励起パルス間の相対的な波数を示す。
(b) FOPO の繰り返し周波数（青線）、CFBG を用いた励起レーザーの繰り返し周波数（黒色の一点鎖線）、CFBG を用いていない励起レーザーの繰り返し周波数（赤色の破線）
図 3 (a)は、フォトニック結晶ファイバ（PCF）の位相整合曲線であり、励起波長を 1020nm から 1060nm に波長可変することで、共鳴する信号パルスを発生させる四光波混合の利得を750nm から 980nm へシフトさせることができ、その結果、570cm-1 から 3300cm-1 の間で励起パルスと信号パルスにおける波長可変のエネルギー差が生じることを示している。図 3 (b)で示すように、励起パルスと信号パルスにおけるこのカップリングした波長可変の過程で、FOPO の繰り返し周波数は 127kHz まで変化したが、それに対し、チャープ・ファイバー・ブ
ラッグ・グレーティング（CFBG）を用いていない励起発振器の繰り返し周波数は 7kHz までしか変化しなかった。波長を可変させる間に同期励起を維持するため、自由空間光用の遅延ライン
でこの不整合を補償する場合、励起レーザー又は FOPO のどちらかの光路長を最大 2cm に変更する必要があった。前述したように、このような遅延ラインやそれに関連のある自由空間光用の5ファイバーカップリングは、外部からの摂動によるミスアライメントの影響を受け易かった。そのため、図 3 (b)にて赤色の破線で示すように、特化したチャープ・ファイバー・ブラッグ・グ
レーティング（CFBG）を用いて、励起パルスの繰り返し周波数の変動とそれに関連した FOPO
における共鳴する信号パルスの繰り返し周波数の変動とを一致させた。このように、励起パルスと信号パルスは波長可変領域全体にわたって本質的に同期性を維持したままであり、光信号を波長可変するために FOPO 又は励起共振器の光路長を機械的に変化させる必要はなかった。さらなる利点として、機械的慣性による波長可変速度の制限はなくなったが、セトリングタイムが約5m 秒であることによって、新たな波長で FOPO の安定化を図る必要があった。その結果、最大 2700cm-1 の掃引幅とは関係なく、波長掃引時間は 5m 秒というこれまでにない波長可変速度が実現した。

図 4：波長可変領域において測定された信号光の強度
図 4 は、波長可変領域全体にわたる信号パルスの最小出力は 130mW であったことを示している。出力された信号パルスの FWHM の幅を測定したところ、波長可変領域全体において 7 ピコ
秒であった。図 2 (a)は、サンプルの自己相関トレースであり、3 次分散及びファイバー共振器
における非線形効果が生じたことを表す小さなショルダーの形をした「マイナーショルダー」という波形の変化が観測されたことを明らかにしている。このわずかな時間的波形の歪みにもかかわらず、信号パルスのエネルギーの 92%が励起パルスのエネルギーと重なった。これは、信号
パルスと励起パルスが時間的に重なりをもつという点でよく一致したことを意味する。コヒーレ
ントラマン散乱（CRS）イメージングでは、通常、強度の強い信号を生成するために約 3 ピコ
秒という より短い時間幅をもつパルスを用いるが[31]、7 ピコ秒幅のパルスを用いると最大15Hz のフレームレートで生体深部を生きたままの状態（in vivo）で画像診断できることが分かっている[6]。従って、本研究では 7 ピコ秒のパルス幅を選択した。追加される可能性のある光伝送ファイバー又は内視鏡においてと同様に使用する光源において、強度の強い信号の生成と非線形歪みの低減がトレードオフの関係にあることを示すのに便利であるからだ。我々は、一般化した非線形シュレディンガー方程式に基づく数値モデリングにより、達成可能なスペクトル分解能を大幅に低下させることなく、最大 50mW の平均出力をもつ光源の出力パルスを 2m 長のシングルモード・大モード面積（LMA）ファイバーに入射して伝送できることを確認した。より高い出力を得るには、カゴメ格子型の中空コアファイバーの使用をお勧めする[13]。
コヒーレントラマン散乱（CRS）での測定に際して機動性に優れた動作を実現するため、我々は50 x 40 x 15cm3 のコンパクトな設置面積を持つポータブル型・受動冷却の筐体に光源を取り付けた。電子機器及び励起ダイオードの冷却は、分離した標準サイズの 19 インチラックマウン
ト筐体に搭載したシングル仕様の CPU ファンによって行った。この光源が非定常状態にある場
6

合の適用性を実証するために、シンプルな実験台の上に上記ポータブル型の筐体を載せ、輸送や取扱中に生じる衝撃に対する動作の評価を行った。図 5 は、3 軸加速度計で測定した実験台に発生した加速度とフォトダイオード（ローパスフィルターで 500kHz 以上の周波数成分を減衰）で同時に測定した FOPO の出力を示す。通常の歩行時の速度で、軽く実験台を押したり壁にぶつけた際に発生した加速度が最大 25m/s2 のときの衝撃を受けても、出力の変動はたったの10%であった。摂動が加わった直後、FOPO は本来の元の状態に戻り、多少の不注意な取り扱いが行われた後でも動作することを確認した。廊下にて実験台を任意の位置に動かすと、加速度が最大 1m/s2 の振動が発生し、測定された出力のノイズレベルは 1%以下となった。ミュンス
ター大学（ドイツ）-ウェルマン光医学研究所（米国・ボストン）間を車や飛行機で何千キロにわたって輸送をした後でも、再調整や微調整を必要とせずに、レーザーシステムがすぐに測定できる状態にあったことから、実環境下におけるレーザーシステムの耐衝撃性とターンキー操作も実証された。この高信頼性の性能とコンパクトな設置面積により、術中超音波用装置や麻酔器械台のような機動性に優れた実験台にシステムを容易に組み込むことができる。レーザー光源をコンピューターにて制御し、光ファイバーでレーザーパルスを顕微鏡へ伝送できることで、操作するのに技術的な専門知識は必要なく、このシステムがレーザー実験室以外の場所における CRS
イメージング技術の確立に向けた重要な 1 歩となると言える。

縦軸：パワー（任意単位）加速度（m/s2）
横軸：時間（秒）Impacts：衝撃 / Driving：駆動
図 5：実験台に載せた光源のストレステストの結果。下の図は、実験台に発生した加速度で、実験台が受けた衝撃と実験台が移動することにより生じる振動とに分けたものである。上の図は、同時に測定された光源の出力信号のパワーを示す。
3. 方法
生物医学関連のイメージング用としての光源を発表する際の最初のデモンストレーションで、
我々はヒト皮膚及び動物皮膚における真皮構造を観察する CARS 顕微鏡法のための光源を用いた。CARS 顕微鏡法は、皮膚の状態の変化[33,34]や薬剤のスクリーニング[35,36]、癌診断[8,37,38]などの皮膚科学の研究[32]に一般的に用いられる。実施されたイメージングの発表は、
励起パルス（7 ピコ秒幅）及び信号パルス（3 ピコ秒幅）、低出力（70mW）発振の FOPO の7

暫定版を用いて行った。
3.1.

顕微鏡法

FOPO から出力された信号パルス（780nm から 980nm へ波長可変）は励起パルスとして使用
し、励起レーザーから増幅されたパルス（1020nm～1060nm の間で波長可変）は CARS 顕微鏡法のためのストークスパルスとして使用した。励起パルス及びストークスパルスを空間的かつ時間的に重ね、テレスコープを使用して 2 つのビーム径を拡大し、最終的に市販されている倒立顕微鏡（日本・オリンパス社製「IX-81」）に導入した。この倒立顕微鏡は、共焦点レーザー
走査型顕微鏡（日本・オリンパス社製「FV1000」）に組み合わせたものである。CARS 顕微鏡
法は、重なった状態の励起パルスとストークスパルスを顕微鏡の 20 倍対物レンズ（開口数 0.75,
日本、オリンパス社製「UPLSAPO20X」）の後焦点面に結像させることによって行った。レー
ザー出力は、焦点における励起ビームとストークスビームの平均出力が 15mW になるように調整した。反ストークス信号光は逆方向（後ろ方向）に集光させ、ショートパスダイクロイックミ
ラー（米国 バーモント州・クロマテクノロジー社製「750dcxr」）及び半値全幅 60nm のバン
ド パ ス フ ィ ル タ ー （ 中 心 波 長 650nm, 米 国 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 ・ セ ム ロ ッ ク 社 製「FF01-650/60-25」）を用いて励起ビーム及びストークスビームから分離した。さらに、ア
ナログ信号を検出するために高周波増幅器（ドイツ・Femto 社製「HCA-400k-50M」）で光電子を増幅した印加電圧 0.7kV の光電子増倍管（フォトマル, PMT）（日本 浜松ホトニクス社製「H7422PA-50」）に反ストークス信号光を入射させた。ビームのスキャニングや画像の取得には、市販されているオリンパス社製 Fluoview シリーズの「FV10-ASW」ソフトウェアを使用した。512 x 512 ピクセルの画像は、1 フレームあたり平均 4 回のカルマン渦、4 μ秒の 1 ピ
クセルあたり電子ビームの滞在時間（pixel dwell time）で取得した。さらに、対物レンズを Z
軸方向に 1μm 間隔で動かして連続的にフレーム画像を取得することで 3 次元画像を得て、オー
プンソースパッケージ「Fiji」[39]で画像の解析を行った。ノイズ除去には、しみ抜きフィルタを用いて各ピクセルをそのピクセルの近傍 3 x 3 ピクセルの中央値に置き換え、すべての画像に適用した。マルチスペクトル画像を疑似カラー表示し、画像解析ソフト「Fiji」における「マージカラーチャンネル」のツールで異なるスペクトル成分を重ね合わせて表示した。時間ごとに色分けした機能を介した ICE（In Circuit Emulator)のルックアップテーブル（LUT：色対応表）
を用いて連続して取得した画像を色分けすることで、ボリュームデータ（3 次元立体画像）を 2次元画像に投影した。
3.2.

生物組織試料の準備

ヒ ト 組 織 の 試 料 は 、 MGH （ 米 国 マ サ チ ュ ー セ ッ ツ 総 合 病 院 ） で 規 定 さ れ た プ ロ ト コ ル
2017P002396 に基づき、個人識別不能化され適用免除に該当する廃棄された顔の皮膚組織から得た。得られた組織ブロックは、最適切断温度の媒体に包埋し、ミクロトームを用いて 30 μm の厚さに薄く切断した。次に、ヒト組織を顕微鏡用のスライドガラス（ピンク研磨）に置き、カバーガラスなしで直接画像化した。マウス組織の試料は、MGH（米国マサチューセッツ総合病院）で規定されたプロトコル 2017N000225 に基づき、マウスを犠牲死させ廃棄されたホモ個体（nu/nu）のヌードマウスから得た。マウスの耳を優しく削り取り、PBS（リン酸緩衝液）に浸したレンズペーパーで拭き取った。次に、切除した耳をガラス底培養皿（MatTek 社製「P35G-0-14-C」）にそのまま置き、又は 5 μL の DMSO（ジメチルスルホキシド）を表面に8加え、すぐにイメージングした。イメージング用のコロイド溶液は、市販のオリーブオイルと重水素化されたジメチルスルホキシド（米国・マサチューセッツ, ケンブリッジアイソトープ社試
薬 品番：DLM-10-10x0.75）から作成した。また、市販のルキソリチニブを粉末状にして直接顕微鏡用のスライドガラスに置き、その上にカバーガラスを載せてイメージングを行った。
4. 顕微鏡法の結果及び議論
4.1.

生体組織の Ex vivo（生体外）光トモグラフィー計測及び市販のシステムとの比較

医療分野に適したケミカルコントラスト及び Z 軸方向の光学断層像の機能を実証するために、
ヌードマウスから取得した、ヒト皮膚に類似した真皮の特徴をいくつか含むマウスの耳の組織を
ex vivo にて画像化した。連続して得た XY 平面は、脂質分子の CH2 対称伸縮振動に帰属する
ラマンシフト 2845cm-1 の CARS 顕微鏡法で視覚化した。ファイバー型の OPO（FOPO）で得られた結果を評価するため、フェムト秒発振器と光パラメトリック増幅による周波数可変モジュールを装備した参照光源（米国 カリフォルニア州・Spectra-Physics 社製「Insight DS+」）を用いて、同様の手順（詳細は本論文の第 3 章参照）で同じ関心領域（ROI）のイメージングを行った。このデュアル出力（2 波長）の参照光源から発生されたパルスは、パルス幅が約 100～200 フェムト秒・繰り返し周波数が 80MHz であった。参照光源の出力に関して、1 つは1041nm に波長固定・ストークスビームとして使用し、もう 1 つは 803nm に波長設定・
2845cm-1 の CH2 対称伸縮における振動特性に一致させた。フェムト秒パルス出力・励起光源の方の帯域幅（約 145cm-1, つまり 8nm）は、ハイパースペクトルイメージングにて多数のラマン共鳴の情報をスペクトル分解するには広過ぎたが、フェムト秒パルスは広帯域スペクトルのC-H 伸縮領域からの信号を得るのに適していた。フェムト秒光源の特徴となる高いピークパワ
ーを活かして高非線形信号を生成することができるので、参照光源に代表されるフェムト秒光源
は、一般的に非標識（ラベルフリー）の形態学的イメージングに用いられる。強度の強い信号を生成し高いスペクトル分解能を得られるかという点で、参照光源と提示された狭帯域ピコ秒シス
テムの間のこの機能性の違いにより、画像が有する定量的情報が本質的に異なってしまう。従って、比較は定量的に有意ではないが、同じ視野から参照光源を用いて撮影した画像は、正解デー
タ（ground truth）として機能し、予想される形態画像の内容、すなわち脂腺、脂肪細胞、皮下脂肪を示す。
図 6 は、(a) FOPO 光源 及び (b) 参照光源を用いて画像化した皮膚表面から約 30 μm 深部の関心領域を示している。どちらの画像においても、皮脂の分泌顆粒が蓄積した、脂質に富んだ脂腺細胞（sebocytes）から構成されている脂腺をはっきりと区別することができ、（暗調の）核とともに個々の脂腺細胞の境界が明確に定義されている。腺の中心部（水色で表示）で、成熟した脂腺細胞によって分泌された個々の皮脂の分泌顆粒を観察できる。図 6 (a) の脂質に富んだ脂腺の領域において、信号対バックグラウンド強度比（SB 比）が約 2 倍高いのは、FOPO の励
起光がより狭帯域化（約 12cm-1）したため、非共鳴信号の寄与が減少した結果である。図 6は、さらに、(C) FOPO 光源 及び (d) 参照光源を用いて表面から約 30～60 μm 深部から取得した耳の皮膚組織の断層写真を色分けして示している。上記のように、ポータブル型 FOPO を用いて得られた画像内容は、固定型の参照光源を用いて得られた画像内容と同等である。皮膚表面の下の脂腺（青色表示）の下は、真皮脂肪細胞（赤紫色表示）、最下層は皮下組織層（赤色表示）である。図 6 (d) の画像において、画像のコントラストを高効率で低減させている理由と9

なる光の散乱の程度（ヘイズ）が均一なのは、FOPO と比べて参照光源からの励起光の帯域幅が広帯域化した結果、非共鳴バックグラウンドの強度が大きくなったことに起因していた。毛嚢脂腺（図 6(a)参照）の特徴と同様にこれらの真皮構造（図 6(c)参照）をスペクトル分解することは、皮膚科学（例えば、病気や治療[40,41]によって影響を受けるような全分泌している間の動的変化の観察）を研究する上で重要な要素であり、また、これらをスペクトル分解することで、ファイバー型の光源が最先端のレーザー光源に匹敵するということも確認された。

図 6：ex vivo（生体外）イメージングした新鮮なマウスの耳の組織の 3D ボリュームデータ（容積画像）を色深度で投影したもの。振動共鳴角周波数（Ω）= 2845cm-1 における CARS イメ
ージで、画像のコントラストを形成する脂質分子を表している。深度データをもとに色分け表示
された各画像のスケールバーは、それぞれ画像の下に表示されており、その基準点は 0μm における皮膚表面である。その結果、ファイバー型光源（a, c）及び 参照光源（b, d）を用いて、容積画像を得ることができた。
（a, b）：脂質に富んだ脂腺（c, d）：脂腺から脂肪細胞までの皮膚構造、及び 皮下脂肪
フェムト秒参照光源を励起光源に使用して得た広帯域スペクトルによって、全体的により高輝度の光を出力することができるが、画像のコントラストは低くなる。なぜなら、（b）及び（d）にある非共鳴信号の寄与が大きくなるからである。
4.2.

スペクトル分解によるコヒーレントラマン分光イメージング

高信頼性及びシンプルさを兼ね備えているのはもちろん、ファイバー型光源をコヒーレントラマ
ン散乱（CRS）に用いる大きな魅力は、自動計測型の高速データ収集と広帯域での波長可変が可能だということだ。急速に進化している試料の視覚化や化学的な特異性をもつ生きた生物の生検に対応するには、ビデオレートのハイパースペクトルイメージングが必要である。しかしながら、従来のレーザーシステムでは波長掃引幅の制限があり（掃引幅ごとの波長可変速度が 1 秒以上かかった）、ハイパースペクトルイメージングにおけるフレームレートを 1 Hz 未満に制限してしまう。その結果、被写体ぶれが生じ、高解像度の画像を得ることができなくなる。読み出し時
10

間に比べて無視できる程度に短い波長可変時間が必要となる。まず、ハイパースペクトルイメー
ジングでの評価に FOPO が適していることを明らかにするために、我々は、低消費電力で、かつ信号の相対遅延を 5 ミリ秒以内に調整することなく、CH2 伸縮振動と CH3 伸縮振動間にて
CARS で用いられる励起波長の切り替えを行うことで、ヒト皮膚組織の薄切切片における脂質とタンパク質の分布を測定した。この波長可変速度では、100 fps（フレーム/秒）の速度でイメージングを行い波長可変とデータ取得を同じ速さで行うと想定すると、1 秒ごとに最大 100 点（波数）を選択的に得ることができる共鳴ラマン分光でのイメージングが可能となる。ここで紹介するイメージング技術に関するセッションでは、ヒト皮膚組織を表皮から真皮までの深さ1mm の範囲で 30 μm の厚みで垂直方向に切断した。図 7 は、厚み 30 μm の皮膚切片から取得したヒトの脂腺の断面像である。FOPO から得られた励起パルスとストークスパルスにより、
CH2（図 7(a)参照）及び CH3（図 7(b)参照）伸縮振動の成分の分布をそれぞれ別々にイメージ
ングすることができた。脂腺の中心は脂質に富んだ脂腺細胞で満たされているのがわかるが、脂腺の周辺は主に前脂肪細胞・上皮細胞・コラーゲン線維などの構造タンパク質で構成されている。
ここで示されたマルチスペクトルデータの取得は、可動部品を使用したり温度変化を考慮したりせずに、FOPO で高速・完全電子制御の波長可変をすることで容易に行うことができた。

図 7：厚さ 30 μm で薄切した皮膚組織切片からのヒト脂腺の画像(a)：2845cm-1（CH2 対称振動）の波長可変域で得られた CARS 画像(b)：2934cm-1（CH3 非対称振動）の波長可変域で得られた CARS 画像(c)：上記(a)と(b)の 2 色の画像を統合したもの。脂質（緑/黄色）及びタンパク質（橙/赤色）の分布が不均質であることを明らかにしている。
このシステム（FOPO）が、CH 伸縮領域外でもイメージング装置としての機能性に優れている
ことを明らかにするため、我々は CARS 顕微鏡の光源に FOPO を用いて、溶液とマウスの耳組織の両方における脂質と重水素化合物/ジメチルスルホキシド（dDMSO）の分布のイメージングを行った。対象となる 2130cm-1（CD 伸縮振動）と 2845cm-1（CH2 伸縮振動）への励起
波長の切り替えを高速で行うことで、相対的に信号を遅延させる必要がなく、脂質のコロイド混合液（青色/図 8(b)参照）における dDMSO 滴を個々にイメージングすることができた。1%以下の RMS 値における励起パルスとストークスパルスのパルス間振幅変動が低いことにより、
dDMSO の均質的な関心領域（ROI）で 1600 以上の SN 比を達成した。図 9 (a)は、生体医学
イメージングの関連画像で、ex vivo（生体外）でマウスの耳組織に用いた dDMSO の分布を示す。ここで、dDMSO（2130cm-1, CD 伸縮振動）が皮膚表面から浸透し、真皮乳頭（赤色表示）
内のヒダと隣接する皮下脂肪（2845cm-1, CH2 伸縮振動, 青色表示）に貯蔵していく様子を皮膚組織の約 60 μm 深部から平面的に観察した。図 9 (b)は、市販の化学療法薬であるルキソリ
チニブの結晶構造解析において CN（2250cm-1, 黄色表示）結合と CH（2845cm-1, 青色表11示）結合が共局在している様子である。FOPO が、特定の伸縮振動領域への波長可変を選択的に行うことができることを実証している。脂質と重水素化した成分を高い特異性で区別することは、
創薬スクリーニング[20]や生物の代謝変動のイメージング[22]といった、いくつかの生物医学研究において重要であり、これまでの完全ファイバー型・可動式システムでは表示することができなかった。

図 8：dDMSO 及びオリーブオイルを混ぜたコロイド混合液の画像(a)：2130cm-1（CD 対称振動）の波長可変域で得られた CARS 画像(b)：2845cm-1（CH2 対称振動）の波長可変域で得られた CARS 画像(c)：上記(a)と(b)の 2 色の画像を統合したもの。脂質及び重水素化した DMSO の分布を分離して観察できる。

図 9：FOPO が、ラマンスペクトルにおける高波数領域とサイレント領域間で選択的に波長可変を行っている様子の画像(a)：ヌードマウスの耳組織に dDMSO を加えた後に、重水素化した DMSO に由来する
2130cm-1 の伸縮振動（CD 対称振動, 赤色表示）及び皮下脂肪に由来する 2845cm-1 の伸縮振動（CH2 対称振動, 青色表示）の波長可変域で得られた 2 色統合の CARS 画像。
(b)：2250cm-1（CN 伸縮, 黄色表示）及び 2845cm-1（CH2 対称伸縮, 青色表示）の波長可変域で得られた画像をルキソリチニブ粉末で 2 色に統合したもの。
5. まとめ
要約すると、5 ミリ秒以内に 2700cm-1 以上にわたって波長可変を行うことができる完全ファ
イバー型のレーザー光源は、コヒーレントラマン散乱顕微鏡に非常に適しているということだ。
従来型のファイバー型光パラメトリック発振器と比較して、この FOPO システムは約 40 MHz
12という高繰り返し周波数で動作するので高速イメージングを実現している。ストークス光と励起光のパルス幅は同じ 7 ピコ秒であり、平均出力はストークス光は最大 400 mW、励起光は最大170mW である。高速波長可変フィルターと出力用のカプラとして特化したチャープ・ファイ
バー・ブラッグ・グレーティング（CFBG）（両方とも OPO を励起光源とするマスターレーザ
ー内に搭載）をベースにした新しいタイプの OPO 用の光源で、広帯域・高速波長可変性を達成した。機械的遅延ラインを用いるなど FOPO を変化させることなく、マスターレーザーと光パ
ラメトリック発振器の両方の発振器が波長可変領域全体にわたって同期性を維持するように、ファイバー・ブラッグ・グレーティング（FBG）によりマスターレーザーと光パラメトリック発振器の分散を整合し、マスターレーザーにおける繰り返し周波数の変動とそれに関連した FOPO
における共鳴する信号パルスの繰り返し周波数の変動とを一致させた。これにより、完全な融着接続の光ファイバーを用いた光学素子から光源を集めることができ、設置面積が 50 x 40 x 15
cm3 のコンパクトな筐体に FOPO システム全体をきっちりと収めることができる。自由空間光用の光学素子及び自由空間光の伝播路がないことで、物理的な力による障害が最小限に抑えられ、最大 25 m/s2 の機械的な加速度下であっても動作することができる。レーザー動作の堅牢性を考慮に入れると、医療現場や診療所、手術室などの厳しい環境でもファイバー型のレーザー光源の今後の適用性が期待できる。さらに、ターンキー操作と小さな設置面積は、ライフサイエンス
における実用的なアプリケーションに対応するための持ち運びできる移動カート型システムを構築するのに重要なポイントである。今回、ファイバー型レーザー光源が、最先端の参照光源と比較して最大 2 倍の速さで波長可変を行い、高空間分解能と高スペクトル分解能での化学選択的・ラベルフリーCARS イメージングを実現することができたということを検証することで、さらなるファイバー型光源の可能性を広げることができる。今後、我々は、誘導ラマン散乱顕微鏡を用いたアプリケーションに向けた光源におけるノイズ性能の特性評価を行う。
要するに、本論文で示した FOPO システムは、医薬品や化粧品の研究（安全性評価）における
in vivo 調査や臨床的な仮想生検を可能にする技術を有している。この光源は、臨床現場でコヒーレントラマン散乱イメージングを行うのに非常に重要な要素になると同時に、標準実験室で通常行われているコヒーレントラマンイメージングをさらに向上させるのである。

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