愛知学院大学薬学会誌

第 12 巻

癌転移を標的とした新しい創薬探索基盤の開発とその実践研究代表者：原 敏文（医療生命薬学研究ユニット）
研究分担者：中島健一（医療生命薬学研究ユニット）
研究分担者：森田あや美（医療生命薬学研究ユニット）
1. 腹 膜 転 移 細 胞 モ デ ル を 用 い た ス ク リ ー ニ ン

衛生環境および医療技術の向上は、日本人の長寿化をもたらした。一方で、癌患者の数は増加のグの有効性についての検討一途を辿っており、1981 年より現在に至るまで、本研究では、独自に樹立した親細胞株と腹膜転日本人の死因の第 1 位は癌である。近年、癌の検移好発細胞株をペアとし、腹膜転移細胞モデルと出技術の進展により、癌の早期発見が可能となり、して実験に用いた。癌の転移を標的とする化合物

これに伴い癌の予後は改善されつつある。また、は、腹膜転移好発細胞株に選択的に細胞生存能、次世代シークエンサーの開発により、癌発生の原遊走能や浸潤能に影響を与えることが予想される。

因となる遺伝子を迅速かつ高精度に解析することそこで、本モデルを用いて、筆者らはスクリーニが可能となった。そのため、癌の原因遺伝子を直ング基盤の確立を試みた。まず、細胞内 ATP 量の接標的とする分子標的薬の開発も急速に進んでい定量に基づく細胞生存のスクリーニング方法による。さらに、癌の原因遺伝子を直接標的とせず、り、腹膜転移細胞モデルを用いたスクリーニング

免疫システムを活性化することで癌を治療する免の予備検討を行った。親細胞株および腹膜転移細疫療法が注目を集め、また成果もあげている。つ胞株をそれぞれ、384 穴プレートに 1 穴当たり 500まり、癌治療も向上的に発展を続けているのが現細胞ずつ加え、1 日後に植物抽出エキスを最終濃状である。一方で、癌患者の予後の劇的な改善に

度 0.1 µg/ml、もしくは 100 µg/ml となるように加は至っていない。その原因の一つは、癌による死えた。3 日間細胞を培養した後、サンプル毎の ATPの直接的な原因が癌の転移によるためである。こ量を測定するため、CellTiter-Glo (Promega)を 384

れまで、癌の転移を標的とする治療薬は、開発さ穴プレートの各サンプルに直接添加し、発光量をれておらず、転移を起こした癌患者の治療法の選プレートリーダーSpark (Tecan)により検出した。

択肢は制限されている。つまり、癌転移を標的と植物抽出エキスの溶媒であるジメチルスルホキした治療薬が開発できなければ、今後も癌によるシド(DMSO)のみを加えたサンプルを陰性コント死亡者数は減少することはないと予想される。言ロールの基準とした。植物抽出エキスを最終濃度い換えれば、癌転移を標的とした治療薬が開発で0.1 µg/ml で添加したところ、親細胞株および腹膜きれば、癌予後の劇的な改善が期待できる。

転移後発細胞株ともに、その影響は少なかった

著者ら研究グループは、これまでにスキルス胃(図 1)。その一方で、植物抽出エキスを最終濃度癌の患者より独自に複数のスキルス胃癌細胞株

100 µg/ml と高濃度で添加した際には、植物エキス(親細胞株)を樹立し、さらにこれら細胞株をヌー

植物抽出エキス濃度

腹膜転移好発細胞株を樹立した。これら細胞株を用いて、癌転移に関わる分子機構の解明を進めてきた。本研究では、独自の腹膜転移転移細胞モデルを用いて、癌転移能を標的とした化合物をスクリーニングするための、これまでにない機能的ス

20.1 µg/ml

1.5
10.50

癌転移を標的とする治療薬の開発のための創薬探0.5

11.5親細胞株

索基盤の確立を目指している。

2100 µg/ml

1.510.500クリーニングシステムの開発を行った。本研究は、植物抽出エキス濃度
腹膜転移好細胞発株

腹膜転移好発細胞株

ドマウス胃に同所性移植を繰り返したことにより、

200.5

11.52親細胞株

図 1. 癌転移細胞モデルを用いた 1 次スクリーニングの結果

32

によっては親細胞株および腹膜転移後発株ともに量的に解析することも可能となった。低濃度のハ細胞数に大きく影響を与えることが明らかとなっービマイシンで処理した際、細胞の大きさや形なた。また、腹膜転移後発細胞株を選択的に細胞生どには変化がない一方で、顕著な細胞運動能の低存に影響を与える植物エキスは少ないことも見出下を検出できることが明らかとなった。

された。加えて、細胞遊走アッセイを行ったとこ

Fucci2a システムの腹膜転移細胞モデルへの導ろ、細胞数に影響を及ぼした植物エキスが、細胞入は、Fucci2a 発現プラスミドの細胞株への導入遊走能にも影響を与えることを見出した。これらが最初の段階となる。しかし、腹膜転移細胞モデ結果から、腹膜転移細胞モデルを用いることで、ルの低い遺伝子導入効率の問題と Fucci2a 発現プ

腹膜転移を標的とする化合物のスクリーニングをラスミドが抗生物質耐性遺伝子を有さないことか行うことは可能であると示唆された。しかしながら、Fucci2a 発現プラスミドが導入された細胞をら、ATP 量に基づく細胞生存アッセイでは、細胞選択的に培養することに問題が生じた。そこで、死による細胞数減少なのか細胞周期停止による細セルソーターSH800 (SONY)を用いて、Fucci2a の胞数の減少なのかなど、細胞の応答状況が不明瞭蛍光を示す細胞を選択的に分取することで、であることも明らかとなった。そこで、スクリー

Fucci2a システムを有する細胞集団の獲得を行っニングの際に、細胞の応答状況を捉える方法の確た。これら細胞を用いて、タイムラプス解析を行立が重要であると考えられた。

ったところ、腹膜転移細胞モデルは細胞周期の変化に応じた蛍光を示すことが明らかになった。ま2. 細 胞 周 期 を リ ア ル タ イ ム で 可 視 化 す る

た、ハービマイシンで処理した際の運動能低下のFucci システムの導入と検出系の確立検出にも成功した。しかしながら、セルソーター細胞の応答状況を捉える方法として、筆者らはにより分取した Fucci2a システムを有する細胞集生細胞の細胞周期をリアルタイムに観察するため団は、2 週間程度の培養で Fucci2a システムが細のFluorescent

胞から消失してしまうことが明らかとなった。そIndicatorの原因は、Fucci2a システムが細胞で安定発現し(Fucci)システムの利用に着手した。本研究では、ていないことが考えられ、その改良が必要である

Fucci システムのうち、Fucci2a システム 1)を利用ことが明らかとなった。次年度は、この問題点をし、Fucci2a の細胞株への導入を試みた。また、克服し、スクリーニング系を確立した上で、スク同時に蛍光タンパク質を検出するための検出機器リーニングの実践へと展開していく予定である。

蛍光

プロー

Ubiqutination-basedCell

ブCycleについて検討を行った。
参考文献

細胞で発現する蛍光タンパク質を検出するための機器として、In Cell Analyzer、蛍光顕微鏡、

1. Mort RL, et al., Fucci2a: a bicistronic cell cycle

共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。その結reporter that allows Cre mediated tissue specific

果、共焦点レーザー顕微鏡に炭酸ガスおよび温度

expression in mice. Cell Cycle, 13, 2681-96 (2014)

調節ユニットを接続したタイムラプス解析が最も謝辞

本研究にはマッチすることが明らかとなった。予愛知学院大学医療生命薬学研究所・医療生命薬学

備実験として、Fucci2a の蛍光タンパク質の一つと同じ蛍光波長を有する Calcein で細胞を染色し、タイムラプス解析を行い、細胞動態の検出を検討

助成により、本研究を実施できましたことに感謝申し上げます。

した。また、抗腫瘍効果をもつことが知られるハ

研究成果発表ービマイシンで処理した際の細胞の運動能の変化

学会発表について検討を行った。その結果、共焦点レーザ

1. 野村有紀, 原ーでタイムラプス解析を行うことにより、観察時

敏文, 森田あや美, 小幡徹,

田中基裕, 武井佳史. 第 64 回日本薬学会東海

間内の細胞の遊走状況を詳細に捉えることが可能

支部総会・大会になるとともに、その細胞動態を移動距離から定33

2018 年 6 月（名古屋）