サイトメトリー／分光計

光学とフォトニクスが進展させる
スペクトルフローサイトメトリー
バーバラ・ゲフベルト
高性能なスペクトルフローサイトメトリーの新興世代が、新たな応用をもたらし、より低コストで届くようになっている。
サイトメトリー（細胞計測）は、細胞の大きさや形状や構造といった特性、マルチパラメータ解析を行う現在の性スを作成する。1 つの色素に対して 1 つ能に達している。のフィルタと検出器（通常は光電子増倍細胞集団の量、機能的な細胞状態、さしかし、蛍光分子の開発がオプショ

管（PMT））の枠組みとなる。そのため、らに特 定 のタンパク質 とその位 置、ンの広がりをもたらした一方で、多数色の追加は、ハードウエアとパネル設DNA といった物質などを評価する。の蛍光分子を扱うことは、色やフィル計が複雑になることを意味する。

細胞生物学だけでなく、日常的な血液タを注意深く選択する必要があるといさらに、異なる組織や生物からの細検査や疾患診断を含めた臨床応用ではう困難でもある。特殊な色素はしばし胞を同定することにもフローサイトメト頼みの綱となっている。

ば従来のフローサイトメトリーで必要リーは挑んでいる。これにはデータ解流体中で細胞の特性を計測するためになるが、色を追加すると染色がかす析のために、幅広く、マルチパラメーに、レーザ光を利用する蛍光技術がフみやすくなり、スペクトルの溢出効果タの代償マトリクスが必要となる（ 1 ）。

ローサイトメトリーだ。フローサイトによってマスクされる。スペクトルプ

メトリーは、多くのエンジニアや研究ロファイルに近い、またはオーバーラ者によるハードウエアと試薬のイノベ

ップする色素は識別を困難にし、解像ーションを経て、ここ 20 〜 30 年にわ度が制限される。

分光計を足すだけ検出器、光学、ミリ秒以下の計算能、フルスペクトル計測の近年の発展（ 2 ）にたって大きく進歩している。彼らの共従来のフローサイトメトリーは複数より、スペクトル（もしくはマルチス同開発によって、1 秒あたり数万個ののレーザを必要とし、ダイクロイックミペクトルまたはハイパースペクトル）フ細胞という割合で個々の細胞に対してラーを用いて独立したシグナル検出パ

ローサイトメトリーが近年登場し、こサンプル注入口
シース液注入口

サンプルの従来の検出

流れ

スペクトル検出

検出器
CCD
フィルタ

シース液の流れダイクロイックミラー
レーザビーム38

2019.5 Laser Focus World Japan

スペクトルグラフ

図 1 フローサイトメトリーでは、ラベルされた細胞の流れがレーザビームの前を通過し、細胞から放射される光を対物レンズが集める。従来のシステ
ムでは、励起される細胞のラベルにレーザの波長を合わせ、対物レンズが集めた光はダイクロイックミラーとフィルタを経 由 して PMT に伝 達 される。
スペクトルシステムでは、各レーザからの光がすべてのラベルを照射し、初期のシステムでは蛍光を直線状の検出器アレイに分布する分散系光学を特徴とした（ http://nolanlab.com/spec。
tral-fc.html より引用（ 4 ））

れらの限界に立ち向かっている。超高の技術をベースにした、North­ern Li­

速の光学分光計を内蔵するスペクトル

ghts と呼ばれるコンパクトなシステム

フローサイトメトリーのシリーズを発表した（図 3 ）。

は、従来のフ（3）商業システムの有用性は、従来のフローサイトメトリーよりシンプルな光ローサイトメトリーでは困難だった条学パスで少ないコンポーネントから構成され、少ないレーザでより高品質な結果をもたらす。
どちらの形式のフローサイトメトリ
ーでも、懸濁液中の蛍光ラベルされた細胞は、ラベルを励起するのに合わせ

図２ スペクトルフローサイトメトリーシス
テムの最新版では、サンプルから放射された蛍光は光学ファイバベースの低密度光波長多重通信（CWDM）の分波器部品に伝送される。
ここでは、スペクトルプロファイルを検出するためにフォトダイオードアレイを用いる。
（提供：サイテック・バイオサイエンス社）

件におけるスペクトルフローサイトメトリーの可能性を強調する研究成果を引き出した。例えば 2016 年の研究では、心臓と腸といった組織の細胞集団を解析したソニーのシステムの性能が示された。21のパラメータ（そのうち19は蛍た波長のレーザビームの前を 1 つずつ通過する。従来のフローサイトメトリ抽出するためのスペクトルデータの分光分子）を特徴付け、特定の集団を高いーでは、各レーザは 3 〜 5 色を励起で析である。スペクトルの非混合は正確解像度で分析し、自家蛍光を効率よくきる。光学システムには、細胞から放なラベル強度を推定でき、大きなスペ処理した。これらは従来のフローサイト射された光を集め、ダイクロイックミ

ルトルオーバーラップの蛍光色素を解メトリーでは不可能だったことだ（1）。

ラーとフィルタを通じて検出器に誘導像できる。この処理で使われるアルゴ後の研究ではスペクトルフローサイする対物レンズが含まれる。スペルト

リズムは、従来のフローサイトメトリ

トメトリーを用いて、非小細胞肺がん

ルフローサイトメトリーでは、各シスーの代償マトリクスを置き換え、自家（ NSCLC ）の患者から採取した組織サテムレーザは、使用するすべてのラベ蛍光を独立パラメータとして扱う。

ンプルを使用した腫瘍・免疫システムのルを励起する。初期のスペルトル法のこれは複雑でなく高性能かつ柔軟なダイナミクスが調べられた（ 5 ）。NSCLCいくつかは、プリズムや回折格子など機器である。研究者には、アッセイ設は最も一般的な肺がんの種類であり、の分散的光学を利用して蛍光シグナル計時により多くの選択がある。

通常はステージが進展するまで診断さ（各細胞にある生体色素、ナノ粒子、蛍光タンパク質）を直線状の検出アレ（1）商品化がさらに研究を促進れない。近年の免疫療法の進歩は新たな治療法をもたらす可能性がある一方、イに分配する（図 1） 。半導体検出器、革新者の中でスペクトルサイトメト研究者は理解のための新規マーカーを通信光学、計算能が進展する近年のさリーの構想が生まれたのは、1980 年

同定する必要があり、そのようなマーらなる革命により、わずか 3 つのレー代前半だった。高感度な PMT アレイ

カーを見つけるには生物学的なダイナザで 24 色以上の高品質なデータ出力が利用可能になったことで、米パデュミクスを理解する必要がある。というフルスペクトル計測が可能となー大（ Purdue University ）のサイトメ

NSCLC の組織サンプルと、循環腫っている（図 2 ）。この最新の手法は、トリー研究室の研究者が試作システム

瘍細胞（ CTC ）のための血液サンプル

より広い科学者がスペクトルサイトメを開発できるようになるまで 20 年もかを組み合わせて調べた研究では、一細トリーを受け入れることにつながってからなかった。パデュー大のチーム

胞レベルで複数の免疫と腫瘍マーカーいる。

は設計に関する特許を米国で取得したを同時にプロファイルするためにサイ従来のフローサイトメトリーが蛍光が、これは後にソニーのライフサイエテック社の Aurora が使われた。免疫色素の放射ピークを検出する一方、スンス事業にライセンスされた。2014年、

マーカーと腫瘍マーカー両方の高レベ

ペクトルフローサイトメトリーは各粒

ソニーは商業的に入手できる初のシスルな発現と、CTC 量で示される疾患子の全蛍光スペクトルを計測し、幅広テムである SP6800 スペクトルアナライ悪性度の間に関連があることが明らか

い連続波長における放射スペクトル形ザを発表した。同年、米サイテック・バになった。これらの研究から得られる

（3）

（4）

イオサイエンス社（ Cytek Biosciences ）知見は免疫システムとがん細胞、このスペクトルフローサイトメトリーのという会社が設立され、直後に Aurora

二者の相互作用の理解を早め、疾患の大きな特徴は当然、スペクトルの非混スペクトルフローサイトメーターを発売

診断やモニタリング、そして創薬を加合だ。すなわち、明らかにする情報をした。続く 2018 年には、特許出願中速させるだろうと、研究者は言及する。

状を識別する。

（1）

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サイトメトリー／分光計

図３ サイテック社は、ス
ペクトルフローサイトメーターである Northern Lights
を通じて、より多くの研究者がフローサイトメトリーを利用しやすくなることを目指している。これは、明らかに性能が劣る機器と同等の価格で 24 色以上解析できる。光学設計と非混合アルゴリズムにより、大きくオーバーラップするスペクトルを含む広範囲で低コストな色素を利用できる。

ードできる。このシステムによって、通常なら 3 〜 4 本のチューブを必要とする大量の情報を、1 つのサンプルから抽出できる。わずかな量しか利用できない腫瘍を必要とするがん研究では重要だ。
Northern Lights は、すべてのアプリケーションに対して 1 つの光学機器構成を用いる。そのため、従来のフローサイトメトリーで使われる、しばしば高価でメンテナンスが煩雑なレーザと比較して手のかからないレーザであり、実験エラーを削減して時間を節約できるだろう。この企業はシステムの使いやすさと合理化されたシステム設計を強調しており、購入者はシステム事実、がん研究はフローサイトメト新興世代の機能をフルに利用できる。
ほとんどのサイトメータは、光子をリーの需要を推進するのに一役買って「フローサイトメトリーがもたらす恩検出して電子に変換するために PMTいる。研究者が同意する巨大な市場が恵は科学コミュニティによく知れ渡っを使うが、サイテック社のシステムは、今後数年間で劇的に成長するだろう。ているものの、ケタ違いの費用とワーこの処理をするために小型のアバラン

スペクトルフローサイトメトリーは、クフロー集約的な特徴のために採用がシェフォトダイオード（ APD ）を使用し急速に伸びているがん研究の分野に特遅れている」と、サイテック・バイオサている。APDは消しゴムサイズのため、に適している。そこには、治療に対しイエンス社の CEO ウェンビン・ジャンシステムの小型化に寄与し、さらに高て予想される患者の反応を決めるのに氏（ Wenbin Jiang ）は述べる。「かつてい感 受 性 をもたらす。 これにより、役立つ免疫プロファイル、腫瘍を標的ごく少数の科学者だけが利用可能だっ400 〜 900nm において高い量子効率とするよう白血球を改変する新規治療たものを、より多くの研究者が利用し（ QE ）を持つ。PMT よりノイズは 3 分法であるキメラ抗原受容体（ CAR ）-Tやすい高度な装置を製作するミッショの 2 に下がる。ノイズは染色をぼやか細胞療法、がんを殺すために患者自身ンに取り組んでいる」。

すため、APD はより高い解像度をもの免疫システムを支援するがん免疫療

このミッションを遂行するため、サたらす。

イテック社は Northern Lights シリー

サイテック社には、スペクトルフロ

現在、がん免疫療法では、細胞の遺ズを発表した。これは、スペクトルサーサイトメトリーを多くの「限界に挑伝子プロファイルを得るためにゲノミ

イトメトリーの導入費用を劇的に抑む者たち」の手にもたらすための製品

クス技術を用いる。しかし、ゲノミクえ、特にがん研究で重要な性能とした。

ロードマップがあると、ジャン CEO はスのプラットフォームは細胞の種類とNorthern Lights は 1 レーザ（ 9 色まで）言う。次のイノベーションは何をもた状態を明らかにできるものの、不均一から 3 レーザ（ 24 色以上）にアップグレらすのだろうか。

法が含まれる。

な（ヘテロな）細胞集団で実施するのは困難だ。そのため、通常はゲノミクス技術を用いる前にセルソータを使用する。一方スペクトルフローサイトメトリ
ーは、ヘテロな集団にある個々の細胞の状態を迅速かつ客観的に解明できる。

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参考文献（ 1 ）S. Schmutz, M. Valente, A. Cumano, and S. Novault, PLoS ONE, 11, 8, e0159961（ 2016 ）.
（ 2 ）J. P. Nolan and D. Condello, Curr. Protoc. Cytom., 63, 1, 1.27.1–1.27.13（ 2013 ）.
（ 3 ）G. Grégori et. al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 377, 191–210（ 2014 ）.
（ 4 ）See http://nolanlab.com/spectral-fc.html.
（ 5 ）X. Wang et al., Proc. AACR Annual Meeting 2018, Chicago, IL（ Apr. 14- 18, 2018 ）;doi:10.1158/1538-7445.am2018-2112.

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