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核酸の生体内可視化を目指した１９F 核磁気共鳴プローブの開発

Author(s)坂本, 隆

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科学研究費助成事業研究成果報告書: 1‑4

Issue Date

2013‑06‑03

TypeResearch Paper

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publisher

URL

http://hdl.handle.net/10119/11387

RightsDescription

研究種目：若手研究（Ｂ）, 研究期間：2011〜2012,
課題番号：23750185, 研究者番号：80423078, 研究分
野：核酸化学・バイオイメージング, 科研費の分科・細目：複合化学・生体関連化学

Japan Advanced Institute of Science and Technology

様式Ｆ-１９
科学研究費助成事業（学術研究助成基金助成金）研究成果報告書
平成２５年

６月

３日現在

機関番号：13302
研究種目：若手研究（Ｂ）
研究期間：2011～2012
課題番号：２３７５０１８５
研究課題名（和文） 核酸の生体内可視化を目指した１９F 核磁気共鳴プローブの開発
研究課題名（英文） Development of molecular probes for nucleic acids imaging
based on 19F NMR/MRI研究代表者
坂本 隆（SAKAMOTO TAKASHI）
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアルサイエンス研究科・助教
研究者番号：８０４２３０７８
研究成果の概要（和文）：生体内で核酸を直接イメージングすることを目指し、19F MR による核酸イメージングが可能な、新規分子プローブの検出感度の改善を目的に種々のフッ素ラベル剤を合成し機能評価を行った結果、(1) キラル制御された新規フッ素ラベル剤により 5 倍以上のS/N 比の改善、(2) フッ素ラベル剤のマルチラベリングにより 2.4 倍の検出感度の向上、また、(3) ケミカルシフトレシオ変化型プローブの創成に成功した。
研究成果の概要（英文）：To improve the detection limit of the probe for 19F MR detection
or imaging of target nucleic acids, new 19F labeling reagents were synthesized andintroduced to the 5’ end of oligonucleotide probe having stem-loop structure. Resultsof the 19F NMR measurement in the presence of target DNA suggesting that the 19F labels
having mono chiral structure have 5-fold large S/N ratio compared with racemic one, andthe multi labeling is effective for improvement of detection limit. Furthermore, the probe
capable of ratiometric detection of target DNA was successfully developed.
交付決定額（金額単位：円）

交付決定額

直接経費
3,500,000

間接経費
1,050,000

合計4,550,000

研究分野：核酸化学・バイオイメージング
科研費の分科・細目：複合化学・生体関連化学
キーワード：分子プローブ・核酸・イメージング・核磁気共鳴
１．研究開始当初の背景
PET（陽電子断層法）や MRI（核磁気共鳴画像法）など、近年の生体内可視化技術の発展は目覚ましく、種々の疾患の診断、治療効果判定に重要な役割を果たしている。最近では疾患特異的マーカータンパク質を標的とするアルツハイマー病（Dimou, E. et al., Curr.
Alzheimer Res., 6, 312 (2009) ） や ガ ン（ Domingues, R.C. et al., Am. J.
Roentgenol., 192, 1012 (2009)）診断用分子プローブが開発され、これらの疾患の早期発見につながるものと期待されている。一方
で、多くの疾患関連遺伝子の発見により、核酸類は疾患マーカーとして確固たる地位を築きつつある（He, Y.D., Cancer Biomark.,
2, 103 (2006), Pawitan, J. A., Int. J. Clin.
Pract., 63, 1378 (2009)）。つまり核酸は格好の生体内可視化の標的分子であるととらえる事ができる。このことから生体内で標的核酸を可視化することができれば、種々の核酸類を指標とした生体イメージングによる疾患の診断、治療効果判定が可能になると期待できる。
多くの夾雑物が混在する生体内で標的分子のみを可視化するには、高いシグナル−ノイズ（S/N）比および高いシグナル−バックグラウンド（S/B）比で検出が可能な分子プローブが求められる。このような観点から、近年、19F 核磁気共鳴（19F MR）が注目を集めている。19F を用いた MRI では、（１）19F の天然存在比が 100%であるため、入手が容易でコストが低い、（２）NMR 感度が比較的高い（1H 核の 80%程度）、（３）低バックグラウンド等の理由から、イメージングプローブの新たな検出法として注目を集めている。最近ではより高い S/B 比をもつプローブとして、常磁性緩和促進（PRE）効果による距離依存的な MR シグナル消失を用いた 19F MR シグナル OFF/ON型の酵素活性イメージングプローブが報告され、ガンマーカー酵素類のイメージングに成功している（Mizukami, S. et al., J. Am.
Chem. Soc., 130, 794 (2008)）。
２．研究の目的
本研究では生体内で核酸を直接イメージングすることを目指し、生体バックグラウンドの低い 19F MR による核酸イメージングが可能な、新規分子プローブの創製を目的とした。
既に標的 DNA 存在下でのみフッ素 MR シグナ
ルを示す、OFF/ON 型のプローブの開発に成功していたが、検出感度の低さ(数 µM)が問題であった。そこで、検出感度の改善を目的に、(1) キラル制御された新規フッ素ラベル剤の開発、(2) マルチラベリングによる検出感度改善、を試みた。また、定量検出を目的に(3) ケミカルシフトレシオ変化型プローブの創成、を試みた。

な水酸基を持つリンカーとして (R)あるいは(S)-3-アミノ-1,2-プロパンジオールを用いた。アミノ基に 3,5-ビストリフルオロメチル安息香酸を縮合、トリチル化、アミダイト化を経て、新規フッ素ラベル剤の合成を行った。Stem-Loop 型のオリゴ DNA（CCTACGCCA
ACAGCTCCgtagg）の 5’末端にフッ素ラベル剤を導入し、3’末端に Gd-DOTA 錯体を導入した プ ロ ー ブ を 合 成 し 、 標 的 オ リ ゴ DNA（gtagttGGAGCTGTTGGCGTAGGcaag）存在下での 19F NMR 測定結果から検出感度の改善効果を評価した。
(2) マルチラベリングによる検出感度改善
ジオール骨格を持つフッ素ラベル剤の場
合、DNA 固相合成により容易に複数のフッ素ラベル剤をプローブに導入することが可能である。そこで、従来型の DNA フッ素ラベル剤をプローブの 5’末端にタンデムに複数個導入することで、プローブあたりのフッ素原子含有量を増やし、検出感度の改善を試みた。
(3) ケミカルシフトレシオ変化型プローブの創成

３．研究の方法

標的核酸の定量検出を目指す場合、ケミカルシフトが標的核酸の濃度依存的に変化（レシオ変化）することで、信頼性の高い定量検出が可能となる。そこで、5’末端にヘキサメチレンリンカーを介して 3,5-ビストリフルオロメチル安息香酸を導入したプローブを合成し、標的核酸添加によるケミカルシフトの変化を調べた。

(1) キラル制御された新規 DNA フッ素ラベル剤の開発

４．研究成果従来型のフッ素ラベル剤（2-アミノ-1,3プロパンジオールを骨格に使用）では、ラベル剤合成時に鏡像異性体が生成していたた
め、19F MR シグナルが２本線となり、検出感度を低下させる一因となっていた。そこで、合成時の鏡像異性体生成を防ぐため、非等価(1) キラル制御された新規 DNA フッ素ラベル剤の開発(R)あるいは(S)-3-アミノ-1,2-プロパンジオール骨格に 3,5-ビストリフルオロメチル安息香酸を縮合させたホスホロアミダイトユニットを良好な収率で得ることができた。
各フッ素ラベル剤をオリゴ DNA の 5’末端に導入し（収率 93%以上）、精製後、19F NMR を測定した結果、いずれも先鋭な１本線のシグ

図２
図１

開発した新規フッ素ラベル剤の構造

新規フッ素ラベル剤で修飾したプローブの 19F NMR スペクトルナルを示し、従来型でみられた２本線は観測されなかった。従来型のフッ素ラベル剤の場合と S/N 比を比較した結果、それぞれ 63（R体）、70（S 体）、12（従来型）となり、約 5.8倍の S/N 比の改善に成功した。
(2) マルチラベリングによる検出感度改善
従来型のプローブの最低検出濃度が 2.5 µM程度であったのに対して、上記の改良型プローブでは 1 〜1.2 µM で、２倍以上の検出感度改善が見られた。しかしながら数十〜数百nM しか存在しない細胞内 RNA を検出するには更なる検出感度の改善が必要である。そこで、従来型フッ素ラベル剤を Stem-Loop 型プローブの 5’末端に連続的に複数個ラベル（1 個、２個および４個導入）した核酸検出プローブを合成した。ラベル効率はほぼ定量的であった。標的 DNA 存在下で 19F NMR 測定を行った
結果、２個連続して導入したプローブで、2.4倍の検出感度向上が見られ（検出限界 500 nM程度）、細胞内 RNA 検出に適用可能なプローブの開発に成功した。今後、細胞内 RNA 検出に挑戦する。

図４

レシオ検出用に開発した新規フッ素ラベル剤の構造

プローブ+ 標的DNA(0.5 eq.)+ 標的DNA(1.0 eq.)

図５

ケミカルシフトレシオ変化型プロー
ブに標的 DNA を添加したときの 19F NMRケミカルシフトの変化

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）+

12

DNA419F

図３

従来型フッ素ラベル剤を複数導入したプローブの 19F NMR シグナル強度(3) ケミカルシフトレシオ変化型プローブの創成
6-アミノヘキサノールリンカーを介して3,5-ビストリフルオロメチル安息香酸を導入したステムループ型オリゴ DNA プローブを合成した。標的 DNA 存在下、19F NMR を測定したところ、標的 DNA 濃度依存的に 19F NMR のケミカルシフトが変化することを見出した。
これを用いた核酸の定量イメージングの可能性が示された。

〔雑誌論文〕（計５件）(1) Atsuo Shigeno, Takashi Sakamoto,
Yoshinaga Yoshimura, Kenzo Fujimoto,
Quick regulation of mRNA functions by a few
seconds of photoirradiation, Organic &BiomolecularChemistry,
10,
2012,7820–7825 【査読有】(2) Kenzo Fujimoto, Kaoru HiratsukaKonishi, Takashi Sakamoto, Tomoko Ohtake,Ken-ichi Shinohara, Yoshinaga Yoshimura,Specific and reversible photochemicallabelingofplasmidDNA
using
photoresponsive
oligonucleotides
containing
3-cyanovinylcarbazole,
Molecular BioSystems, 8, 2012, 491– 494【査読有】(3) Takashi Sakamoto, Takehiro Ami, Kenzo
Fujimoto, 5-Methylcytosine selective
photoligationusing
photoresponsive
oligonucleotides
containing
various5-vinyl-2-deoxyuridines
havinganaromatic group, Chemistry Letters, 41,
2012, 47–49【査読有】(4) Takashi Sakamoto, Hikaru Hayakawa,Kenzo Fujimoto, Development of a potassium
ion sensor for 19F magnetic resonancechemicalshift
imaging
basedonfluorine-labeledthrombin
aptamer,
Chemistry Letters, 40, 2011, 720–721【査読有】(5) Takashi Sakamoto, Yu-ki Shimizu, JunSasaki, Hikaru Hayakawa, Kenzo Fujimoto,Signal turn-on probe for nucleic aciddetection based on 19F nuclear magnetic
resonance,Bioorganic&Medicinal
Chemistry Letters,21, 2011, 303–306.【査読有】〔学会発表〕（計５件）(1) Takashi Sakamoto, Hikaru Hayakawa,Yu-ki Shimizu, Jun Sasaki, Kenzo Fujimoto,Development of nucleic acids based probes
for the 19F MRI/MRS of biomolecules, The
39th International Symposium on Nucleic
Acids Chemistry (ISNAC2012), 2012 年 11 月
16 日、名古屋、愛知.
(2) Takashi Sakamoto, Hikaru Hayakawa, JunSasaki, Satomi Kishi, Kenzo Fujimoto,Development of Nucleic Acids Based–Probes
for the 19F MRI/MRS of Biomolecules, World
Molecular Imaging Congress (WMIC2012),
2012 年 9 月 8 日, ダブリン、アイルランド(3) 早川輝、佐々木淳、坂本隆、藤本健造「フッ素核磁気共鳴によるカリウムイオンセンサーの開発」H23 年度北陸地区研究発表会、2011 年 11 月 18 日、つくば市、千葉(4) 坂本隆、清水勇喜、佐々木淳、早川輝、
藤本健造「フッ素化合物修飾オリゴ DNA を用いた 19F NMR による核酸の検出」第 5 回
バイオ関連化学シンポジウム、2011 年 9 月
12 日、つくば市、茨城(5) 早川輝、佐々木淳、坂本隆、藤本健造「カリウムイオンをセンシングする 19F MRI 用造
影プローブの開発」第 5 回バイオ関連化学シンポジウム、2011 年 9 月 12 日、つくば市、
茨城〔図書〕（計０件）
なし〔産業財産権〕○出願状況（計０件）
なし○取得状況（計０件）
なし

〔その他〕
ホームページ等
なし
６．研究組織(1)研究代表者
坂本 隆（SAKAMOTO TAKASHI）
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアル
サイエンス研究科・助教
研究者番号：８０４２３０７８