蛍光バイオイメージング／顕微鏡

生命が持つ速度で見る
高解像度なマルチカラー 3Dイメージング
ダン・カレン、ヘンリック・チャーデン、ミカエル・マイコフスキー
革新的なレーザ蛍光技術である掃引共焦点平面励起（ SCAPE ）顕微鏡法は、以前の手法の限界を克服し、幅広いライフサイエンス分野での有用性を提供している。
生命科学の多様な分野の研究者たち

は、単一スポットを走査する速度に物が、試料に側面からアクセスする必要が共通して求めているものに、3D 蛍理的な限界があるからだ。さらに、1ピがあり（それゆえ特別な準備も必要）、

光顕微鏡ツールがある。3D 蛍光顕微

クセルあたりの滞留時間が短いため、3D データを構築するにも時間がかか

鏡ツールは、高速で高画素数、一細胞最速の共焦点走査には高出力のレーザる。さらに、光学系の同期とステージ分解能が特徴で、対象物に光損傷をほを必要とするが、結果として生きたサの移動が必要で、これらの技術は複雑とんど与えずに画像を取得できる。多ンプルに大きな光損傷を与えてしまう。

かつスローである。

くの開発と技術的な改善にもかかわら二光子顕微鏡法は光損傷を劇的に抑米コロンビア大（ Columbia Univer­

ず、確立された技術のほとんどは、前えるが、このような一点アプローチにはsity ）のズッカーマン精神・脳・行動研究

述したパラメータの少なくとも 1 つを速度・解像度・体積のトレードオフがあ所（ Zuckerman Mind Brain Behavior

妥協するトレードオフがいまだに存在り、結果として同じ問題に直面する。最Institute ）のエリザベス・ヒルマン教授している。

近開発された高速な音響光学変調器（ Elizabeth Hillman ）と彼女の同僚は、（AOM）は、事前に選択した小さな体積マウントの有無に限らず、さまざまなを高速に走査できるが、この方法は巨サンプルの形状をサポートしながら、例えば、共焦点顕微鏡法は、マルチ大な体積または動く生物に限定される。

上記の制限を超える革新的なアプロー

ヘルツの繰返周波数にて巨大な xyz 体

従来のライトシート顕微鏡法では、チの開発に取り組んだ。成功した結果積を高解像度で画像化できない。これ

xy 面全体を同時にサンプリングできるは、2015 年 に初 めて掲 載 された（ 1 ）。

進歩とトレードオフ

図１ SCAPE では、線形状のビームを用いる顕微鏡の一次対物レンズの軸外照明によって、斜めにライトシートを形成する（ a ）。SCAPE は、照射された平面の連続イメージを取得しながらライトシートを走査することで、立体画像を構築する（ b ）。

ラ軸162021.1 Laser Focus World Japanーラー

1CS メラレーン

メラ鏡

図 ２ 可 動 調 節 ミ ラー は
SCAPE 2.0 の重要な要素の 1 つである。ヒルトン教授提供。

ルルン
ン 1ルントン

ン
2ン

112ン 2なトルル

ン

0
な ン ルのあるトるン

る

1な ン ル

アップデートされたバージョンである

端を通る軸外パスを使用することで、ために、対物レンズの上流に走査ミラ（2）SCAPE 2.0 は 2019 年 に報 告 され、顕微鏡の真の xy 平面に対して 45 度のーを使用する。走査ミラーは、移動す

ライフサイエンスで幅広い有用性を認

位置で励起光シートを作成できることるライトシートで焦点を維持するため、めた独ライカ・マイクロシステムズ社を発見した（図 1 ）。この斜面からの蛍蛍光を反射させてリダイレクトする役（ Leica Microsystems ）が現在使用権

光を画像化するために、斜面顕微鏡に目もある。ミラーの動きに合わせて平を取得している。

似た手法を使用し、対物レンズのイメ面を重ねることで、3D ボリュームの画ージング面を回転させて正確にカメラ像を素早く、繰り返し生成できる。

SCAPE の原理
ヒルマン教授は次のように説明す。ヒルマン教授のSCAPE 2.0 の詳細（図 2 ）は、説明す

チームは、ライトシートを左右に動かするほどの利点がある。傾斜した平面（視の焦点を合わせる（3）る。
「シングルまたはマルチビーム走査では真に高速なイメージングを実現できないと考えていた。仮に必要とする走査速度を得られたとしても、各ピクセルの滞留時間が短すぎるため、許容できるシグナルノイズ比で画像を取得できないだろう。そこで、ライトシー
ト顕微鏡について考え始めた。当時のほぼすべてのシステムでは、試料の周辺でお互いに 90 度となるよう対物レン

図３ SCAPE 2.0の10vpsでとらえたショウジョウバエの幼虫が動くときの 3 つのイメージ。ここでは、腹側固有受容ニューロンを GFP でラベルし、488nm 励起を用いてイメージングした。黄色から青までの色は、サンプル中の異なる深 度 からの信 号 を示 す。
詳細は R. Vaadia et al.（ 4 ）及び本研究のリアルタイムビデ
オシーケンスは http://bit.ly/
SCAPE2019 を参照。

ズを 2 つ設置する必要があった。そこで生じた疑問は、単一の対物レンズ構成の中に、ライトシートのマルチピクセルの利点を組み合わせることはできないか、ということだった」。
チームは、高開口数の対物レンズのLaser Focus World Japan 2021.117

蛍光バイオイメージング／顕微鏡

yt = 0.1 s

t = 0.16 s

t = 0.31 s

xy50 µmz

図４ 3 枚の写真は、ゼブラフィッシュの心臓の拍動をリアルタイムで、100vps で撮影したビデオから作成した。上が z 軸からの画像、下が x 軸からの画像である。連続イメージでは、心臓の心室が圧縮されると流出弁が開き、心房から充満する。心臓壁の内皮細胞は EGFP（緑）で、赤血球はDsRed（赤）でラベルしている。2つの蛍光体は488nmレーザ光（サンプルでは0.6mW）で励起した。ビデオを含む詳細はV. Voleti et al.（2）を参照。

野軸に対して斜めにあるライトシーることで解決した。検出パスには、励幅と、掃引ごとのカメラフレーム数にト）をイメージングする問題は、キャプ起光で使用されるファセットに隣接す

よって、システムの視野と x 方向のサチャした蛍光を中継し、第 2 の対物レるファセットが含まれている。
「ポリゴンプリング密度が決定する。ボリューンズを使用して中間点で実際の斜め画

ンミラーは SPACE で最初の発想だっムレートやサンプリング密度、視野を像を形成することで解決した。この画たが、すぐに、ガルバノミラーを 1 枚上げるには、より高速なカメラを使用像は、ライトシート面をカメラに平面使用するほうがシンプルで効果的であする。チームのイメージングのほとん的に焦点を合わせるため、約 127 度のることに気づいた。この変更により、

どは標準的な sCMOS カメラを使用し角度で設置した第 2 の対物レンズを通システム構築が簡便で安価となり、よているが、増強器を内蔵した超高速じてキャプチャされる。

り多くの光をカメラに誘導し、システ

CMOS カメラを用いることで 300vps

カメラ上の最終的な画像は、サンプムの走査パターンを制御することが容のイメージングに到達した。

ル内から見た斜めの y­z 平面であり、易になった」と、ヒルトン教授は説明

通常は長方形である。ほとんどの組織する。

ライトシートは画像視野軸 z に対して斜めに掃引されるため、各深度スラへの光の透過が限られるため、y に対ガルバノミラーの他に可動部品がな

イスは次のスライスに対してわずかなする z 方向がより狭くなっている。そいため、SCAPE の全体スピードを制限補正がある。顕微鏡のコンピュータはのようなサンプルでは、カメラを走査するものは、カメラのフレームレートと簡単な変換を行い、この「傾斜」を補して、z の深さに対応する行数を少なシグナルノイズ比（ SNR ）のみである。

正して歪みのない 3D 画像ボリュームくして読み出すことが有用である。こ

特定の実験によっては、ガルバノミラを生成する。

れにより、より高速でイメージングでーは 10 〜 100Hz で走査する。これは、きる。例えば、使用するカメラに依存

前 例 の な い 10 〜 100 ボ リュ ーム / 秒

するが、1000 〜 18000fps の間 で 200（ vps ）に相 当 する。SCAPE では、 直機能的指標や蛍光タンパク質を含む行を読み出すことができる。

線的な掃引に続いてほぼ瞬時にリセッ

複数の蛍光体を同時にモニタリングす

走査同期の課題は最初、ポリゴンミ

トされる、従来の鋸歯状走査パターンることで、動的な挙動（筋肉の動きなラーを使用するライトシートを走査すを使用する。ガルバノミラー掃引の振ど）と分子組成、細胞構造、神経信号

182021.1 Laser Focus World Japan

デジタルレーザ変調などとの相関関係を把握できる。このイクロイックミラーで構成されるイメをもたらした。これには、構造や機能ような応用を SCAPE が容易にサポーージスプリッタを用いた多波長検出ににおける遺伝的要因と環境要因の影響

ト で き る の は、 米 コ ヒ レ ン ト 社

よって補完される。この装置は、スペが含まれる。従来の顕微鏡法ではタイ（ Coherent ）のプラグ・アンド・プレイ

クトルが分かれた画像を最大 1280 ボ

ムゲーティングが必要で、2 〜 4Hz のの OBIS 光励起半導体レーザ（ OPSL ）クセル幅の視野で投影するが、単一波自然な心拍による不規則な不整脈などを用いた多波長励起による。スペクト長動作と比較してイメージングスピーの詳細を必然的に見逃してしまう。赤ルが分かれた 2 つ以上のイメージをカドに影響はない。

血球（ RBC ）のフロー解析に対する完メラ上で同時に取得できるオプションがある。
ヒルトン教授は、以前のレーザタイプと比較して、本研究における OPSL

全な 4D 粒子トラッキングも不可能で出力と範囲の証明ある。ヒルトン教授のチームは、小児

SCAPE の出 力 と範 囲 を証 明 した、

心 臓 学 者 の キ マ ラ・ タ ー ゴ フ 教 授（ Kimara Targoff ）と共同研究を実施

最近の共同研究を 2 つ紹介する。

技術の革新的な利点を複数挙げる。同

全身、脳、神経系を含む、小さな生した。ターゴフ教授の研究室では、ゼ教授は、利用可能な波長と出力レベル

体のイメージングは神経科学のトレンブラフィッシュを用いて、胚におけるの範囲が広いことに言及する。
「数年ドである。ヒルトン教授らは最近、生心臓の先天性異常の原因となり得る遺前 に あ っ た の は 488nm、532nm、きたショウジョウバエの幼虫で遺伝的伝的変異を解明している。この共同研

638nm であり、これくらいしか使用可にコードされたカルシウム感受性蛍光究により、拍動する心臓の周辺を赤血能な出力がなかった。黄色とオレンジタンパク質の高速 3D イメージングに関球が駆け巡る様子を 100vps 以上の動だけが選択肢だった。しかし今日では、する研究を発表した（図 3 ）。幼虫が蠕画で撮影した。また、GCaMP ラベル

一般的に利用できる多くの蛍光体の励動運動しているときの体と神経系の複を利用して、拍動する心臓の中を駆け起にほぼ一致する波長で、数十から数雑なダイナミクスをとらえることで、変巡るカルシウム活性の波を個々にとら百ミリワットのレーザ源を選択でき形するときに体壁に沿った神経細胞がえた（図 4 ）。

る」。SCAPE システムのほとんどが複どう発火するのかをチームは追跡した。

数の自由空間レーザを統合しており、また、 チームは SCAPE を用 いて、ファイバ結合よりもフレキシブルなも生きた齧歯類の大脳皮質内ニューロンのにしていると説明する。
「レーザがコの樹状突起や、マウスの鼻にある嗅（5）要旨
ライフサイエンス全般において、蛍光顕微鏡法は分子、細胞、器官、生体ンパクトで、すべて同一のフォームフ（6）

覚ニューロンの動的な発火の研究、レベルで事象を結びつけるためのツーァクタと、同じ電子インタフェースをそして自由に動く線虫全体のイメージルとして研究者が使用している。生命有していることは非常に便利だ」。こングを実施した。さらに、ゼブラフィが持つ速度で、高解像度なマルチカラれまでいくつかの実験では、5 種類もッシュ胚の心臓の拍動の動的なビデオー（ 3D ）画 像 を記 録 する性 能 であるのレーザ波長を使用していると、ヒルを作成した「 4D 顕微鏡法」は、この研究をさらに。

（2）

トン教授は述べる。また、SCAPE をゼブラフィッシュ胚の心臓の研究で定期的にワークショップや講義に持ちは、脊椎動物の心臓発生に関する知見加速する上で重要な役目を果たそうとしている。

運び、入手可能な OBIS レーザを最小限の再配置で使用していると説明する。
デジタルイメージングは、OPSL のもう 1 つの重要な特徴である。OPSLは最大 25kHz の速度でオンオフが可能
なので、連続するフレームにおいて正確なタイミングで励起波長を交互に切り替えできる。これは、研究室で製作できる、ダイクロイックフィルタとダ参考文献（ 1 ）M. B. Bouchard et al., Nat. Photonics, 9, 2, 113 〜 119（ 2015 ）.
（ 2 ）V. Voleti et al., Nat. Methods, 16, 10, 1054 〜 1062（ 2019 ）.
（ 3 ）C. Dunsby, Opt. Express, 16, 25, 20306 〜 20316（ 2008 ）.
（ 4 ）R. Vaadia et al., bioRxiv, 467274（ 2018 ）.
（ 5 ）E. M. Hillman et al., Curr. Opin. Neurobiol., 50, 190 〜 200（ 2018 ）.
（ 6 ）L. Xu et al., Science, 368, 6487, eaaz5390（ 2020 ）.
著者紹介
ダン・カレンはコヒレント社プロダクトマネージャー、ヘンリック・チャーデンは同社プロダクトラインマネージャー、ミカエル・マイコフスキーはシニアサイエンティフィックセールスエンジニア。
e­mail: dan.callen@coherent.com URL：coherent.com

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