2016/6/23

20160610 SPRUC研究会「放射光構造生物学研究会」
第5回会合

構造生物学ビームラインでの顕微分光測定奥村英夫(公財)高輝度光科学研究センター (JASRI)

タンパク質X線結晶構造解析と分光測定

12016/6/23

タンパク質X線結晶構造解析と分光測定のコンビネーション
X線構造解析

反応中間状態の構造決定
シナジー効果

動的解析

結晶分光解析
- 紫外/可視吸収- ラマン- 蛍光- IR

X線回折実験条件の最適化（X線損傷の評価）

結晶化条件の最適化

フィードバック

分光学的手法への期待
紫外/可視吸収分光●色素、金属などの補因子を含む金属タンパク質、光受容タンパク質- 放射線由来の変化の検出
・金属活性中心の還元・硫黄結合の断裂 etc.
- タンパク質反応中間状態のモニタリング、同定
ラマン分光
共鳴ラマン分光●共鳴によるシグナルの増大- 補因子由来バンドのアサインメント、変化のモニタリング
非共鳴ラマン分光●補因子不要- 基質、化学種の特定、振動バンドの識別- 差スペクトルによる特定の振動バンドのアサインメント（活性部位-基質間相互作用の検出など）
蛍光- 難認性試料（クライオループ内結晶）の可視化- 補因子や基質の存在、酸化還元状態の確認

SPring-8 MXBLにおいては、紫外/可視吸収顕微分光測定環境を整備してきた

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SPring-8 MXBLの顕微分光装置

SPring-8 タンパク質結晶構造解析ビームライン (MXBL)
マイクロフォーカス
(BL32XU)

巨大分子複合体(BL44XU)• 巨大結晶格子に適した平行ビーム> 500 Å・微小結晶の測定に特化した光学系< 10 μm・微小結晶のハンドリング
Micro DiffractometerP2 station
for Virus

Micro Focus Optics

リモートアクセス
高速ネットワーク

ハイスループット(BL26B1/2,
BL38B1, BL12B2)

高分解能構造解析(BL41XU)

・安定した偏向電磁石光源
・自動化
・メールインデータ収集
・顕微分光測定2010/07/09

Changer• 高精度データ測定• 原子分解能構造解析

データサーバー・巨大データストレージ・オンライン解析・データベース

Visualization of H-atom

Substrate Complex

32016/6/23-

可視吸収顕微分光装置
SPring-8 BL26B2 （理研BL）
単純かつ高速な測定
ヘムタンパク質などの色素・金属タンパクに対応
ファイバーコンデンサーレンズ
測定光X-ray• 測定波長: 400 ~ 800 nm• 最大OD: ~ 3• フォーカスサイズ: Φ100 m• 測定時間: 50 ms• 分光器: USB2000(Ocean Optics Inc.)

ゴニオメータ
100m

対物レンズ

Sample: heme-protein (P450)-

顕微紫外/可視吸収分光装置
SPring-8 BL38B1 （共用BL）
ダブルモノクロによる高分解能単色光
フォトマル検出器を使用した高精度測定 ・測定可能波長域:750~250 nm
紫外域の測定に対応(750-300 / 500-250 nm切換え)
・ビームサイズ：~ 50 μm x 50 μm
・最大OD: ~3・フォトンデザイン社製分光装置
Glucose Isomerase(300×300×20 μm3)

4

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測定モードの切換え実験装置の切換え

X線

サンプル

測定光

紫外可視
顕微分光モード

X線回折実験モード

ダブルモノクロメーター

X線

分光測定の光軸とX線は同軸
サンプル位置でのフォーカス
l=436nm, Size=50 x 50μm2

分光測定タワーの上下: ~30s
300-750nmの測定時間： ~4min

分光測定とX線の同時測定は不可

構造解析と吸収分光を組み合わせた研究例

52016/6/23～Tobacco nitrite reductase (aNiR)～(BL38B1)396552568

α band peak(Siroheme)
3.2 MGy

WatC

WatC’

1.6

0.080

結晶の吸収スペクトル
照射還元に伴うSirohemeのピークシフト

照射還元に伴う活性部位付近の水のマルチコンフォメーションの喪失＞顕微分光で確認しつつ、取得した低線量データで検証

広島大学 片柳研究室
Proteins 80:2035-45 (2012)

NADH-Cytochrome b5 Reductase••

FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADH •からcytochrome b5への電子伝達を触媒する •酵素
脂肪酸代謝や、薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の還元に関与

嫌気環境で還元型結晶作成
再酸化過程の構造を解析

M. Yamada, T. Tamada et al., J. Mol. Biol., 425, 4295-4306 (2013)62016/6/23

NADH-Cytochrome b5 Reductase
60分大気暴露後（X線照射前）

還元型（X線照射後）還元型（X線照射前）•••

還元型結晶において、nincotine adenine dinucleotideがNAD+として存在することを確認
還元型構造が、X線照射前後において影響を受けていないことを確認
大気暴露後、再酸化型構造への移行を確認

M. Yamada, T. Tamada et al., J. Mol. Biol., 425, 4295-4306 (2013) （改変）オンライン顕微吸収分光測定の問題点• 結晶の大きさ、厚さが合わない場合が多い– 結晶が厚い場合、吸収が大すぎるため、結晶の選定、あるいは結晶化の工夫が必要→ 数10mまでが適切。結晶試料による分光測定に適した薄い結晶は回折実験時には不適切な場合がある– 近年の難結晶化サンプルの増加に伴い、フォーカスサイズに対し結晶が小さい場合も→ ～150m程度必要• 紫外域分光の場合、芳香族アミノ酸の区別がほとんどつかず、また吸収も大きいため解析が困難

ラマン分光の導入によって、新たな相補的知見が得られないか？

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顕微吸収分光に向けた結晶化法
A = log

I0=εLCI

Measurement
Light

光路の増大に従い、吸収も増加

intensity

coefficient

スペーサー
テープ

Light path

A：Optical density (OD)
I0：Incident intensity
I ： Transmitted
C： Concentration
L ： Light path length
ε ：Molar extinction

CrystalMeasurement
Light

疎水処理済
カバーガラス

Glucose Isomerase
43kDa, 338 residues
I222

CrystalLight path

薄い板状結晶が吸収測定には最適

疎水処理済
スライドガラス

0.02mmの厚さのフィルムをスペーサーとしてつかうことで0.3～0.5mm程度の薄い板状結 晶 が 得 ら れ た 。 280nm で の 吸 収 は ～1.9OD程度に抑えられた。

レーザー加工機による結晶加工
Co-Axial Optics
N2-Gas CryoN2-Gas Cryo Stream Cooler
Stream Cooler

X-Y-Z-ϕ Gonio stage

冷N2 ガス
吹付け装置

Laser Oscillator

Galvanic Mirror System

Mini κ-GonioHead••••••

Wavelength: 193.4nm
Pulse width: <1.3ns
Pulse power: < 1J/pls
Repeat cycle: 1kHz ～ 400kHz
Beam size: FWHM = 4 m、1/e widht = 8～9 mComplex with Galvanic mirrors system and X-Y-Z-φ stage

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Demonstration movie
to process the crystal

Real Speed Movie

Cross: 50m
Laser Power: 1uJ/pls, Repitation rate: 1kHz、Scan speed: 0.1mm/sec

レーザー加工結晶の利用例
400 um

180 um

180 um東京医科歯科大 沼本修孝先生

X-ray

マシコヒゲムシ巨大ヘモグロビンの結晶

Spectroscopy

30 um

9

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レーザー加工結晶の顕微分光測定
マシコヒゲムシ巨大ヘモグロビンの結晶
2Oxy型

1.81.6
1.41.2

還元剤ソーキングによる変化

1結晶10s結晶260s0.8結晶390s

Deoxy型

0.60.40.20450500550

600650700

東京医科歯科大 沼本修孝先生

オンライン顕微吸収分光測定の問題点• 結晶の大きさ、厚さが合わない場合が多い– 結晶が厚い場合、吸収が大すぎるため、結晶の選定、あるいは結晶化の工夫が必要→ 数10mまでが適切。結晶試料による分光測定に適した薄い結晶は回折実験時には不適切な場合がある– 近年の難結晶化サンプルの増加に伴い、フォーカスサイズに対し結晶が小さい場合も→ ～150m程度必要• 紫外域分光の場合、芳香族アミノ酸の区別がほとんどつかず、また吸収も大きいため解析が困難

ラマン分光の導入によって、新たな相補的知見が得られないか？

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X線照射による吸収スペクトルの変化
ソーマチン結晶(Cryo-protectant: 30% Glycerol) に0、2.7 、20 MGyのX線を照射したときの吸収スペクトル- X線損傷によって400 nm 付近に幅広い吸収ピークが見られた- 20 MGy 以上の照射では、クライオプロテクタントによる吸収変化が大きすぎるために、差スペクトルを計算することが難しい

オンライン顕微吸収分光測定の問題点• 結晶の大きさ、厚さが合わない場合が多い– 結晶が厚い場合、吸収が大すぎるため、結晶の選定、あるいは結晶化の工夫が必要→ 数10mまでが適切。結晶試料による分光測定に適した薄い結晶は回折実験時には不適切な場合がある– 近年の難結晶化サンプルの増加に伴い、フォーカスサイズに対し結晶が小さい場合も→ ～150m程度必要• 紫外域分光の場合、芳香族アミノ酸の区別がほとんどつかず、また吸収も大きいため解析が困難

ラマン分光の導入によって欠点を回避し、新たな相補的知見が得たい112016/6/23

結晶構造解析とラマン分光を組み合わせた研究例（海外の事例）

X線結晶構造解析と非共鳴ラマン分光を組み合わせた研究例

X-ray radiation-induced damage in DNA monitored byonline Raman
McGeehan JE. et al. J. Synchrotron Rad. (2007). 14, 99-108

8-bromo-2’-deoxyguanosine

European Synchrotron Radiation Facility(ESRF) ID14-EH2結晶へのX線照射前後のラマンスペクトル

ラマンROIスペクトルのモニタリング。X照射に従い、C-Brバンド(293cm-1)が減衰している。

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X線結晶構造解析と非共鳴ラマン分光を組み合わせた研究例

Raman-assisted crystallography reveals end-on
peroxide intermediates in a nonheme iron enzyme
Katona G et al. Science 2007, 316:449-453.

スーパーオキシドレダクターゼ(SOR)の反応中間状態結晶構造。活性部位において鉄およびH2O2の結合状態が確認された。

SOR結晶（E114A変異体）のラマンスペクトル。
- H218O2処理により、～567cm-1と～802cm-1に変化が見られた。
自然酸化還元では見られない。
- X線照射前後において変化はなく、構造は保たれていると考えられる。

新規顕微ラマン/吸収分光装置の開発

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2016/6/23

オフライン
顕微ラマン/吸収分光装置の開発
オフライン装置全体 （SPring-8 外周側室に設置）
クライオ吹付装置

カセグレン鏡レンズ
光学系
試料分光器

分光器・検出器

試料周辺部

吸収用
白色光源

吸収用
測定光

ラマン用
レーザー

SD2000(OceanOptics)

ペルチェ冷却
CCD検出器HORIBA分光器
iHR320グレーティング（自動切換）

ファイバー信号 1) 吸収測定： 250～850nm
入力ポート2) ラマン測定：400～1000nm
測定波長範囲レーザー光サイズ
分光器 iHR-320 (HORIBA)
焦点距離
100m

結像
分解能
波長精度
駆動速度

320mm

30x12mm0.03nm±0.1nm

80nm/sec

Synapse CCD検出器 (HORIBA)
CCD冷却

ピクセルサ
イズ
画素数

ペルチェ冷却-75℃

26m

1024 x 256

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2016/6/23

測定モードの切り替え
吸収測定モード

吸収測定
出力ポート

試料透過光

試料観察モードカセグレン鏡
レンズ

ミラー
UP

ラマン測定モード

試料観察用
CCDカメラ
観察照明光
入力ポート

ミラーの挿抜で簡便に変更可能

レーザー入力ポート
ライン
フィルター

試料画像
照明光

レーザー光
カセグレン鏡
レンズ

ミラー
DOWN

ミラー
UP

カセグレン鏡
レンズ

ミラー
DOWN

エッジフィルター
ミラー
DOWN

ラマン信号
出力ポート

ラマン信号

ユーザー利用提供中

オフライン装置でのデータ測定
ラマン分光測定（結晶）100K, Cd-He Laser Power: Max,Integ Time: 10sec, Average Num.: 10Front Slit: 0.1, Glating: 1800, Blaze; 400nm

ヘムタンパク質結晶(100K)

サンプル提供/測定/データ処理協力：理研RSC

 最高分解能 1cm-1で高精度ラマン測定が可能

當舎博士・久保博士

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2016/6/23

共鳴ラマン & 吸収分光測定 (同一サンプル)
NO結合ヘムタンパク質結晶 (100K)

Single crystal Raman spectrum

n4AbsorbanceIntensity

n7Single crystal visible
absorption spectrum

nFe-NO

Raman shift /cm-1

Wavelength /nm

サンプル提供/測定/データ処理協力：理研RSC

當舎博士・久保博士

 結晶の同一部分で、顕微紫外可視吸収分光とラマン分光測定が可能

オンライン顕微ラマン/吸収分光装置の開発
装置全体 （実機）

光学系
吸収測定
光源

 オフライン装置の光学系をベースとし、ビームライン定盤に設置するための小型設計
 紫外可視吸収分光とラマン分光、試料観察を同時に実現するために、対物レンズにミラー集光光学系を使用
 分光器・検出器はオフライン機と同様、
HORIBA iHR-320/SyanpseおよびOceanOptics SD2000を使用

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2016/6/23• 分光測定の光軸上にX線透過用貫通穴を持つ• 試料観察顕微鏡を兼ね、同時並行的にX線回折実験が可能（X線上流側）装置内模式図（側面）X線

紫外可視吸収測定用光ファイバ

ラマン光励起用
レーザ光ファイバ
切換平面鏡①
観察用照明光光ファイバ

穴付き平面鏡
（X線導入部）
切換平面鏡②

ラマン光測定用
光ファイバ
ズームレンズ

観察用カメララマン光学系

実験ハッチ外から紫外可視吸収分光・ラマン分光・サンプル観察の切り替え、観察カメラの倍率変更を操作可能

ラマン分光テスト測定（溶液）

Indene (in capillary)

14000
12000

RT, Cd-He Laser Power: Max,Integ Time: 10sec, Average Num.: 10
Front Slit: 0.1, Glating: 1800, Blaze; 400nm

Intensity (Counts)

10000
8000
6000
4000
2000
0-100

100

300

500

700

900

Relative cm-1

1100

1300

1500

1700

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ビームライン BL26B2 への設置イメージ
ゴニオメータオンライン
顕微分光装置CCD検出器

吸収測定用
光源

サンプルチェンジャーSPACE 現在、ビームラインへの設置テスト、調整中
 2016B期より、BL26B2にてテスト運用開始予定

JASRI タンパク質結晶解析推進室

理研 放射光科学総合研究センター
利用システム開発研究部門

馬場 清喜
河野 能顕
清水 伸隆
（現 高エネルギー加速器研究機構）

熊坂 崇

上野 剛
引間 孝明
山本 雅貴

新規顕微ラマン吸収分光装置の開発研究は、文部科学省「創薬等支援技術基盤プラットフォーム」の助成を受けて行いました。

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2016/6/23

顕微分光装置の利用について（利用の問い合わせ）• 顕微紫外可視吸収分光装置 BL38B1– 奥村英夫 （分光装置利用）
okumurah@spring8.or.jp– 馬場清喜 （ビームタイム）
baba@spring8.or.jp• オフライン装置• オンライン顕微ラマン/吸収分光装置 BL26B2– 奥村英夫 （分光装置利用）
okumurah@spring8.or.jp– 河野能顕 （分光装置利用、レーザー加工機）
ykawano@spring8.or.jp

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