分子から生命現象を眺める－RETがん遺伝子の発見から学んだこと－

分子病理学・腫瘍病理学
高橋 雅英

2020年3月13日名古屋大学最終講義

山極勝三郎と藤浪鑑

https://museum.umic.jp/yamagiwa/doctor01-2.html
2020/5/27

h<ps://www.kiseichu.org/singlepost/2018/01/08/1%E6%9C%8813%E6%97%A5%EF%BC%88%E5%9C%9F%EF%BC%
89%EF%BD%9E%E3%80%8C100%E5%B9%B4%E5%89%8D%E3%81%AE%E5%AF%84%E7%94%9F%E8%99%AB%E6%95%99%E8%82%B2-%E2%80%95%E8%97%A4%E6%B5%AA%E9%91%91%E3%81%8C%E8%AC%9B%E7%BE%A9%E3%81%AB%E4%BD%BF%E3%81%A3%E3%81%9F%E6%8E%9B%E5%9B%B3%E3%80%8D%E9%96%8B%E5%82%

名古屋大学腫瘍病理学（旧第二病理学）教室における癌ウィルス研究

大島福造（1895～1977）
家鶏肉腫ウィルス研究星野宗光(1932～1988)
マウス乳がんウィルス研究マウス乳がんウィルスの感染により発生した唾液腺がん

保坂康弘・松本明(1979)『電子顕微鏡図説ウイルス学』朝倉書店
105頁

©wikipedia©wikipedia

ウィルスがん遺伝子Srcが細胞由来の遺伝子であることの発見（Michael Bishop & Harold Varmus, 1976)1989年ノーベル生理学医学賞

h<ps://www.bu.edu/biology/people/proﬁles/geoﬀreym-cooper/ 2020/6/5

https://efraimracker.library.cornell.edu/lecture-series/71 2020/5/27

著作権等の都合により、ここに挿入されていた画像を削除しました。

https://campusplanning.hms.harvard.edu/facilities-operations 2020/6/5a

DNAトランスフェクション+リン酸
カルシウム

DNAの沈殿物

がん細胞DNA添加

2週間培養
がん遺伝子を取り込んだ細胞が増殖してくる（focus)

NIH3T3細胞点突然変異によるRAS 遺伝子の活性化

Tabin et al. Nature (1982)
Reddy et al. Nature (1982)
Taparowski et al. Nature (1982)

RETがん遺伝子の発見（1985）

1. Internal Dele/on
A遺伝子

2. Rearrangement
B遺伝子

C遺伝子

遺伝子再構成によるRETがん遺伝子の活性化
TRIM27/RFP遺伝⼦RET遺伝⼦活性化融合RET遺伝⼦(キメラ遺伝⼦）
チロシンキナーゼ活性の上昇
細胞増殖（腫瘍化）©wikipedia

Takahashi et al. Cell (1985)
Takahashi et al.
Mol. Cell. Biol. (1987)

Nature (1985)
慢性骨髄性白血病におけるBcr-Abl融合遺伝子の発見

Cell (1985)

RET遺伝子の変異によって発症する疾患
遺伝子再構成による活性化
甲状腺乳頭がん：5~30％（Cell, 1990年）
肺腺がん：1〜2％（Nature Medicine, 2012年）
大腸がん、乳がん、唾液腺がん

点突然変異による活性化

多発性内分泌腫瘍症2型（Nature, 1993，1994年）
散発性甲状腺髄様がん

点突然変異や遺伝子欠失などによる不活性化
Hirschsprung病（Natute, 1994年）

甲状腺乳頭がんにおけるRET融合遺伝子
シグナル配列システインリッチ領域

カドヘリン様構造

膜貫通ドメインキナーゼドメイン

Human RET
CCDC6

RET/PTC1

RI a

RET/PTC2NCOA4

RET/PTC3

甲状腺がんで検出された10番染色体の逆位

Pierotti et al. PNAS (1992)

名古屋大学編

1990年4月～2020年3月

多発性内分泌腫瘍症2型の臨床像(Multiple Endocrine Neoplasia 2: MEN2)
MEN 2AMEN 2B甲状腺髄様癌

甲状腺髄様癌

FMTC
甲状腺髄様癌

副腎褐⾊細胞腫 副腎褐⾊細胞腫
副甲状腺過形成 粘膜神経腫
消化管神経節腫
マルファン様体型

MEN2B : Multiple Endocrine Neoplasia 2B
Mucosal neuroma

Marfanoid habitus

Ann Dermatol Vol. 22, No. 4, 2010
Arq Bras Endocrinol Metab vol.52 no.8 São Paulo Nov. 2008

RET mutations in MEN 2

MEN2A型変異RETのリガンド非依存性２量体化による活性還元条件

非還元条件

IP: an.-RET

IB:anti-pY

Asai et al. Mol. Cell. Biol. (1995)

MEN2型遺伝子変異によるRETの活性化機構

S-S結合

ヒルシュスプルング病におけるRET遺伝子の変異
膜貫通領域
シグナル配列システイン領域

キナーゼドメイン
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RETh"ps://asylumeclec.ca.com/malady/malady.htm 2020/5/27

P20L C142S F393L C609Y E762Q F873QR972G
S32L R231HP399L C609W S765P F893L P973L
R475Q C618R S767R R897Q M980T
L40P
E251K
P64L
C620R
K907E P1039Q
R330Q
G93S
L1061P
S690P
E921K M1064
RETタンパクの成熟障害
細胞表面への発現障害

チロシンキナーゼ 細胞内シグナル活性の低下
伝達障害ヒルシュスプルング型変異RETの細胞表面発現障害

Iwashita et al. Hum. Mol. Genet. (1996)

RETタンパクの成熟過程
RET 170kDa
Cell Membrane

RET 150 kDaＧｏｌｇｉ

ＥＲ
糖鎖修飾

RET mutations in MEN 2

Cys 609, 611, 618, 620変異によるMEN2AとHSCRの合併

Gain-of-function mutations（生後）（甲状腺C細胞）Loss-of-funcHon mutaHons（胎生期）

Ito, Iwashita et al. Cancer Res. (1997), Takahashi et al. Hum Mutat. (1999)

GDNF

Science (1993)

GDNF:グリア細胞由来神経栄養因子

GDNF/RET signaling
GDNF/RET signaling
GDNF:Glial Cell Line-derived
Neurotrophic Factor

RET GDNF
GFRa1

グリア細胞由来神経栄養因子©wikipedia

PP

PP

Dr. Arnon Rosenthal

神経系の発生（腸管神経系など）
腎臓の発生
精子形成
Nature (1996), Nature (1997)

GDNF

GFR
a1raftRET

SNT/FRS2
GRB2
SOS

p85

p110

PI3-K

pY1062SHC
GRB2SOS

GAB1/2
RAC

RAS
RAF

SHP2
AKT

MEK1

RHO

Lamellipodia

FAK

ERK1/2CREB
ELK-1

Cell Survival
Cell Proliferation

NFkB

Focal Adhesion
Stress Fiber

Takahashi M. Cytokine Growth Factor Rev (2001)

RET変異マウスにおける巨大結腸症

Jijiwa et al. Mol. Cell. Biol. (2004)

RET変異マウスにおける腸管神経系の欠損

マウス大腸大腸近位部正常

大腸遠位部欠損（Acetylcholinesterase staining)

Asai et al. Development (2006)

腸管神経系の発生

RET, GFRa1を発現する神経堤細胞が食道から肛門まで6−7週間かけて移動し、腸管神経系が形成される。

腸管の間質細胞にGDNFが発現

RET変異マウスにおける腎臓の低形成

正常マウスの腎臓

変異RETマウスの腎臓腎臓の発生中腎管

腎臓

後腎組織

尿管芽

青：RET, GFRa1が発現している部位
赤：GDNFが発現する部位
GDNF/Ret signaling and the development of the kidney.
Costan;ni F, Shakya R.
Bioessays. 2006 Feb;28(2):117-27. doi: 10.1002/bies.20357.

正常精巣

正常

変異RET

RETの変異マウスにおける精巣の低形成

変異RET

精子形成を認めない

RET変異マウスにおける精子幹細胞の消失（PLZF 染色)
aP0

P7P14P28

Wt

Hob IHC using serial section
RET

PLZF

c12

PLZF positive cells/tubule
Wt

10He8

Ho6420P0P7P14P21P28

RET positive cells also express PLZF Jijiwa, Kawai et al. Genes Cells (2008)

精子幹細胞の生存・維持にはセルトリ細胞から分泌されるGDNFが精子幹細胞に発現しているRETに作用することが必須である。

精子GDNF分泌

精祖細胞(精子幹細胞)RET
GFRa1

セルトリ細胞GDNF/GFRa1/RETシグナル伝達系の生理機能

GDNF
GFRa1/RET

神経系の発生（胎生期の腸管神経細胞の精子幹細胞の維持（幹細胞の生存シグナル）

口側から肛門側への運動能の制御）

腎臓の発生（胎生期の尿管芽のBranchingの制御）

RET遺伝子の変異によって発症する疾患
遺伝子再構成による活性化
甲状腺乳頭がん：5~30％（Cell, 1990年）
肺腺がん：1〜2％（Nature Medicine, 2012年）
大腸がん、乳がん、唾液腺がん

点突然変異による活性化

多発性内分泌腫瘍症2型（Nature, 1993，1994年）
散発性甲状腺髄様がん

点突然変異や遺伝子欠失などによる不活性化
Hirschsprung病（Natute, 1994年）

チロシンキナーゼ阻害剤による甲状腺がんの治療効果

Schlumberger et al.
N Engl J Med (2015)

「RETという遺伝子を見つけてくれた先生に ほんまにもう感謝ですよね」

NHKスペシャル “がん治療革命”が始まった～プレシジョン・メディシンの衝撃～（2016年11月）

CD109タンパク質• RETによって発現誘導される遺伝子の1つとして同定(Hashimoto et al. Oncogene 2004)• α2-マクログロブリン/C3,C4,C5ファミリーに属するGPIアンカー型膜タンパク質．(Lin et al, 2002; Solomon et al, 2004)• ヒトCD109はfurinaseにより180kDaと25kDaのタンパクに切断され，分泌型CD109がTGF-βシグナルの制御に関与する．(Hagiwara et al, 2010)
分泌型CD109180kDa

CD109-180kDa
断片
CD109-25kDa
断片
GPI

ラフト

furinasecleave site

ヒト腫瘍細胞株におけるCD109の発現CD109遺伝子は種々のヒト由来細胞株に発現している．

(Hashimoto et al, Oncogene 2004)

グリオブラストーマおよび扁平上皮癌由来細胞株で特に強く発現している．

グリオーママウスモデルにおけるCD109の意義

野生型マウスはCD109ノックアウトマウスに比べ予後不良であり(A)，CD109は血管周囲に局在している(B)．
Shiraki, Mii et al. J. Pathol (2017)ヒトグリオーマ組織におけるCD109の意義

Grade II/IIIグリオーマでは、CD109高発現群は低発現群に比べ予後不良であり(A)，ヒト組織においてもCD109は血管周囲に局在する(B)．
Shiraki, Mii et al. J. Pathol (2017)

脳腫瘍幹細胞におけるCD109の発現分化誘導させた細胞に比べ，脳腫瘍幹細胞はCD109を高発現し(A)，テモゾロミドを投与したマウス組織では，CD109陽性腫瘍細胞が残存していた(B)．
脳腫瘍幹細胞はCD109陽性であり治療抵抗性を示すと考えられる．

マウス皮膚二段階発癌モデル
Sunagawa, Mii et al.
Oncotarget (2016)

n=9* P < 0.05

CD109-/-

CD109+/+ CD109/-

1cm
CD109が欠損することで皮膚腫瘍の出現が遅れ，腫瘍体積も低下した．
しかし、乳頭腫から扁平上皮癌への悪性化率には変化が見られなかった。

著作権等の都合により、ここに挿入されていた画像を削除しました。

神経堤細胞の移動

腸管神経細胞の移動

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白血球の遊走h<ps://www.mc.vanderbilt.edu/lens/arPcle/?id=192&pg=999 2020/5/27

Aktキナーゼはどのように細胞運動を制御するか新規Akt結合タンパクとしてのGirdinの発見(Yeast two-hybrid screening)

RERQKS (1416)(1870 aa)

Girdin(APE,GIV,HrPR)

NTCoiled-coilCT
Akt binding region

Enomoto, Murakami et al. Dev. Cell (2005)

Girdinはアクチン結合タンパクであり、運動する細胞の先導端のラメリポディア形成に重要な役割を果たす

矢頭ラメリポディア

Vero fibroblasts

Girdinの発現のノックダウンによる細胞運動障害

Control siRNA + GFP-actin

Girdin siRNA + GFP-actin

Vero FibroblastAｋｔによるGirdinのリン酸化は運動する細胞の先導端における細胞骨格の再構成により、ラメリポディア形成に関与するEnomoto et al. Dev. Cell (2005)

Breast cancer

Girdin expression
Jiang et al. Cancer Res, 2008
Wang et al. Pathol Int, 2016

がん細胞の集団的浸潤
リンパ管浸潤像
Gastric adenocarcinoma自然界の集団(的)移動
Single migration

Collective migrationwww.wired.com/2013/03/powers-of-swarms/

Girdinは癌細胞の集団的移動に関与する

Wang et al. Cancer Sci. （2018）

Girdin KOマウスにおける海馬および嗅球の構造異常
Wild-type (+/+) mice

Knockout (-/-) mice

海馬RMS

P6

嗅球P6WT

HoEnomoto et al. Neuron (2009), Wang et al. J Neurosci (2011)

RMS

GirdinはDynaminと結合し、Cadherinのエンドサイトーシスに関与する

Girdin (250 kDa)

P

Coiled-coil domain

N-terminal domain

PP PActin binding

Weng et al. EMBO J. (2014)

PEHO症候群におけるGirdin遺伝⼦変異
Progressive encephalopathy with oedema, hypsarrhythmia
and optic atrophy (PEHO) syndrome:
A rare Mendelian (autosomal recessive) phenotype comprising severe
retardation, early onset epileptic seizures, optic nerve/cerebellar atrophy,
pedal oedema, and early death.

c.2313delT/p.Leu772X

GirdinNTCoiled-coil

CT1 CT2

Girdinの変異によって発症するPEHO症候群の臨床像

A, small cerebrum and cerebellum, pachygyria/lissencephaly,thin corpus callosum
B, microcephaly, edema of the maxillary region and dorsum of hand and footNahroski et al. Brain (2016)

Girdinファミリー分子

DapleはWntシグナルによる細胞運動に関与する
o Daple is involved in the non-canonical Wnt/Rac pathway
leading to cell migration.
o Daple increases the Dvl/aPKC interaction to activate Rac.

Takagishi et al. Nat. Commun.
(2012)

Daple遺伝子の変異はヒトの水頭症を発症する

Human DAPLE/CCDC88C
mutations cause hydrocephalus(Ekici et al. 2010).

Daple KO マウスでは脳室内の狭窄、閉塞などは認めない

Daple+/+

麻酔下にてEvans Blueを右側脳室へ注入し１分後に解剖
aabcdb
LV

Daple-/-eefghc
3V

fLVdAqg3V

4V
hAq4V2mm

Daple KOマウスにおける脳室上衣細胞の繊毛運動異常

Basal Body, Basal Footの配列異常

Dapleは微小管と繊毛基部のBasal Body, Basal Footの極性に関与する

Basal Foot Basal bodyDaple KOマウスでは気管、内耳の繊毛異常を伴う

https://www.wikiwand.com/en/Mucus 2020/5/27

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Cell Rep. Takagishi et al. (2017)

Girdinファミリー分子

RETGDNF
RETのリガンド
腸管神経系の発生
腎臓の発生
精子幹細胞の維持

癌遺伝子として機能
甲状腺がん
肺がん
MEN2A, MEN2B

AKT, MAPK, DOK, FRS2
RET下流の細胞内シグナル伝達系の解析

CD109

GZF1
GDNFによる誘導遺伝子

TRIM27

RETによる誘導遺伝子
RETとの遺伝子再構成
扁平上皮がん、肺腺がん 転写抑制因子
グリオブラストーマの増殖・ 細胞の集団移動に関与
悪性化に関与毛の発生、骨代謝に関与

Girdin Family
Girdinの細胞の増殖因子依存性の細胞集団移動における機能、PEHO症候群
DapleのWnt依存性の細胞平面極性における機能水頭症の原因遺伝子？

MeflinCell-Cell接触により発現誘導されるタンパク
間葉系幹細胞における機能、CAFにおける機能小さな発見を自身の手で大切に育てる分子病理学・腫瘍病理学教室（旧第二病理学） 学位取得者

谷口 雅彦
磯村 毅
宮崎 貢一
浅井 直也
村雲 芳樹
和田 応樹
坂田 慶太
飯田 健一
丸山 彰一
岩下 寿秀
伊藤 信二
大岩 幹直
長谷川 央
岩田 洋介
中山 誠子
村上 秀樹
斉藤 充尋
浅井 昌美
石黒 義浩
野崎 千佳

川井 久美
黒川 景
下野 洋平
林泰仁
根東 順子
林裕倫
TEZEL GAYE
福田 敏史
渡邉 剛
河尻 愛恵
西川 美紀子
下山 芳江
福田 直行
橋本 瑞生
児玉 良典
時々輪 真由美
前田 健吾
金毅
松浦 哲生
森永 貴理

下野 圭子
内田 真由実
檀原 敦
井戸 智景
北村 倫也
佐藤 朋子
長谷川 正規
姜平
塚本 裕久
萩原 純孝
加藤 琢哉
長谷川 太作
黒土 愛萩倉 美奈子
齋藤 尚二
松下 悦史
王
芸
岩越 朱里
高岸 麻紀
堀尾 麻衣子

三井 伸二
小原 圭
新美 薫
宮地 紘樹
坂倉 寛紀
翁良
山村 由美子
大森 健治
村松 彩
ARA HOSNE
服部 行紀
前田 啓子
韓一芃
砂川 真輝
陸大輔
白木 之浩
SHANIYAABUDUREYIMU
王
暁澤原昭壽
水谷 泰之

ご清聴ありがとうございました