総説

シアノバクテリアの概日時計タンパク質 KaiC が1 日を計る仕組み
伊藤（三輪） 久美子✉

名古屋大学 大学院理学研究科 生命理学専攻 計時機構グループ
アノバクテリア（Synechococcus elongatus PCC 7942）の概日時計タンパク質 KaiC、KaiA、KaiB と ATP を試験官内で混ぜるだけで、そのリン酸化状態は概日リズムを示す。主役の KaiC は典型的な ATP 加水分解酵素（ATPase）の構造をとる。KaiC の ATPase 活性は極めて低いが、単独で温度補償性を示し、概日リズムの速度（振動数）と相関することから、ペースメーカーとして概日リズムの温度補償性と周期を規定すると考えられる。この活性を基盤とした Kai の時計システムは、これまで想定されてきた転写・翻訳や分子同士の相互作用等を必要としない、全く新規の概日時計機構の存在を示している。本稿では KaiC の ATPase 活性の解析から我々（名古屋大学 近藤孝男研究グループ）が想定した、シアノバクテリアの概日時計システムについて解説する。

１．はじめにう酸素発生能を獲得し、さらに植物の葉緑体へ進化し多くの生物は概日時計を持つことによって、地球のたとされるシアノバクテリアは、明確な概日リズムを昼夜環境に適応し、たくみに生活することができる。

示し、概日時計解明のための重要なモデルでもある。

概日時計は時計として不可欠な３つの条件（約 24 時

本稿では当研究室で展開されたシアノバクテリアの間周期、周期の温度補償性、環境への同調性）を満た

時計システムの研究、特に周期決定および温度補償性すことで地球上での生活に有利となり、長い進化の過の仕組みについて解説し、タンパク質のみで構成され程で広く生命の基本システムとして発展してきた 1。

る新たな概日時計のモデルを提案する。

従ってその本質を理解するためには、安定した振動のシナリオだけでは不十分で、これら３つの特徴を裏付

２．シアノバクテリアの時計システムけている物質的基礎を説明しなければならない。生命

シアノバクテリアの概日時計遺伝子 kaiA, kaiB,の進化の初期過程で水を分解する光合成とそれに伴kaiC（kai は回の意）は、1996 年頃に生物発光を利
図１ シアノバクテリアの概日振動の特性
A. 概日時計の試験管内での再構成 3。KaiC, KaiA, KaiB と ATPを試験管内で混合して 30℃に保ち、サンプリングを行った。
電気泳動によって KaiC のリン酸化状態を調べた。KaiC タンパ
ク質はリン酸化バンド（上）と非リン酸化バンド（下）として検出される。リン酸化状態は約24 時 間 周 期 で 振 動 し た 。 B.
KaiC リン酸化リズムの周期の温度補償性 3, 5。C. 周期変異体のシアノバクテリアの温度補償性（投稿準備中）。25, 30, 35℃の周期から求めた温度係数 Q10を、30℃の周期に対してプロットした。温度で反応速度が全く変化しない時、Q10=1 となる。32種のシアノバクテリアの周期変異体は周期の温度補償性を示した。D. 調和振動と緩和振動。

✉miwa@bio.nagoya-u.ac.jp
時間生物学Vol. 24, No. 1 (2018)23

用した分子遺伝学的解析によって見出された 2。kaiC振動の性質を持つことを示唆する一方で、リズムの持遺伝子の発現が自己制御されることから、当初は真核続性は緩和振動として説明が容易である。実際に、生物と同様に転写・翻訳フィードバックモデルが当て

KaiC リン酸化リズムの反応温度低下に伴う振幅の低はまると考えられていた。しかし 2005 年に３つの精下、さらに低温にすることによる振動の消失の観測等製された Kai タンパク質と ATP を試験管内で混ぜるによって、このリズムの調和振動的な性質が示唆されだけで、KaiC のリン酸化状態が安定した 24 時間振ている 8。

動を発生すること（KaiC リン酸化リズム）が明らか

ガリレオが発見したこの調和振動（振り子）の等時になり、転写・翻訳によらない計時機構が存在するこ性は、ホイヘンスやフックによって機械式時計のペーとが示された（図 1A）3。この KaiC リン酸化リズム

スメーカーに組みまれ、その精度を飛躍的に向上させは幅広い温度で周期の温度補償性を示し、温度サイクた。概日時計の周期も正確で、いくつかの生物では１ルに同調するなど、概日時計の３つの条件を満たす

日に数分から 10 分程度の揺らぎでリズムを刻むこと

1B）3-5。我々は、わずか３つのタンパク質で高が知られている 1, 9。我々の解析でも KaiC のリン酸等生物の概日時計に匹敵する特性を示すこの単純な化リズムの周期も同程度の精度を持つことが確認さ計時機構は、概日時計の謎を解明するために最も適しれた。概日時計の精度は地球の自転という極めて精度たシステムであると考え、そのメカニズムの解析を進の高い周期に対応するために重要だが、調和振動を利めてきた。

用することでこれが可能になるのかもしれない。

３．周期の温度補償性からみた概日時計の特性

４．KaiC の ATPase 活性と分子内フィードバック（図

生体におけるほとんどの生化学反応の速度は温度

Kai タンパク質が刻む概日リズムは、どのようにしに依存して変化し、温度が 10℃上がるとその速度はて温度の影響を受けない周期性を示すことができる2-3 倍になる（温度係数 Q10=2-3、Q10 は反応温度をのだろう？その答えは KaiC が ATP を分解する活性10℃あげたとき、反応速度が何倍になるかを表す）6。

（ATPase 活性）の中に書き込まれているようだ 10, 11。

概日時計は季節変化などによる外界温度の違いがあKaiC のアミノ酸配列は RecA などの ATP 加水分解っても、周期の温度補償性という特別な仕組みにより、酵素（ATPase）に類似している 12。しかしその ATP一定の周期を保つ。我々は 30 種以上の kaiC 周期変分解活性はほとんどゼロといっていいほど低く、1 分異体の温度補償性を調べたが、幅広い周期の変異体で子の KaiC は 1 日あたりわずか 10 から 15 個の ATP温度補償性は成立した（図 1C）。突然変異で周期が変を分解するのみ（多くの酵素活性の 1 万分の 1 以下）わっても温度補償性は普遍的に成立するという事実である 10。しかし、KaiC の ATPase 活性は広い範囲

は、周期の温度補償性が周期の決定機構より基本的なの温度で安定で、温度補償性を示す（図 2A）。さらに性質として備わっていることを示唆している。

周期変異体の KaiC タンパク質の ATPase 活性を調べ概日時計研究のパイオニア、E. Bünning は概日リると、短周期の KaiC では ATPase 活性が高く、長周ズムの特徴を検討し、概日リズムは調和振動（単振動）期の KaiC では ATPase 活性が低くなり、ATPase 活と緩和振動の 2 つの性質を併せ持つことを示唆した性と振動数（周期の逆数）との間に比例関係が見られ（図 1D）7。調和振動はバネや振り子の振動に代表さる（図 2B）。この２つの結果は温度補償性と周期といれ、フックの法則に従う物理的振動で振動の持続にエう概日時計のもっとも重要な特徴を KaiC の ATPase

ネルギーを消費しない。振幅は振動系に与えられたエ反応が規定していることを意味しており、この反応がネルギーによって容易に変わるが、周期はフックの法

概日時計の最も基本的なペースメーカーであること則の物理的定数（振り子の長さやバネの強さ）によりを予期させる。

決定され、振幅に依存しない（振り子の等時性）。一KaiC の ATPase 活性が示すこの２つの性質は方、緩和振動は、細胞内で想定すれば、プログラムさKaiC だけで実現される。この事実は KaiC 内部に概れた生化学反応のループ（反応が蓄積することで順次日時計のペースメーカーとしての本質的な仕組みがスイッチングが起こり、次のステップに進行する）で内蔵されていることを意味する。一方で、KaiC だけ説明される。従って速度は生化学反応が律速となり、ではリン酸化リズムをはじめ、いかなる概日振動も発周期は温度によって反応速度が変われば容易に変わ生しないことに注意されたい。すなわち概日周期とそるが、振幅はスイッチングの閾値で決定され不変であの温度補償性は概日振動が発生して測定されるのでる。周期の温度補償性は概日リズムの基礎機構が調和はなく、振動していない KaiC タンパク質の構造内に時間生物学Vol. 24, No. 1 (2018)24

図 2 KaiC ATPase 活性の特性
A. 温度補償性。野生型の KaiC の ATPase 活性を、超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）を用いて様々な温度で測定した 5, 10。
KaiC のみで ATPase 活性は温度補償性を示した。B. 振動数との相関。野生型と 4 つの周期変異体の ATPase 活性をその振動数（周期の逆数）に対してプロットした。ATPase 活性（黒丸）は振動数と相関を示した 10。全ての変異体の ATPase 活性の Q10（白丸）はほぼ 1 となり、温度補償性を示した（投稿準備中）。C. 温度ステップに対する応答（投稿準備中）。野生型の KaiC を氷温から 30℃に移し、ATPase 活性の時間変動を調べた。ATPase 活性は温度ステップ直後に安定時の活性の 2 倍以上に上昇し、緩やかに減少して安定な活性を保った。

潜在的に記憶されていることになる。この一見受け入衡状態も温度の影響が小さいことが予想される。つまれがたい事実は、止まってしまった振り子が地上の重り、この KaiC 分子内でのフィードバック系で KaiC力のもとで調和振動を発生した時の振動周期を振りリン酸化リズムの周期の温度補償性が実現されるだ子の長さとして記憶していることと全く同じ関係にろう。

なっており、KaiC は単独で振り子の性質を潜在的にもっていることを強く示唆している。

KaiC の内部にこのような仕組みがあるとすれば、外部からの刺激によって緊張状態を乱せば、ATPaseどのようにしてそのようなことが可能であろう

活性が変化し、活性が元に戻る様子を観察できるだろか？我々は可能性の１つとして分子内フィードバッう。KaiC リン酸化リズムは温度サイクルに同調するクを想定している。通常の ATPase では ATP 分解にことから、我々は温度変化が KaiC の緊張状態を乱すより発生したエネルギーはすみやかに他の分子へ移刺激になりうると考えた。そこで図 2C に示すようにされ、様々な物理的または化学的仕事がなされるとも

氷 温 から 30℃ へ 温 度ス テッ プ を 行な っ たと きのに次の ATP 分解が繰り返されるが、KaiC の場合にKaiC の ATPase 活性を測定したところ、温度ステッはこのエネルギーは同一の KaiC 分子内に蓄積され、プ直後の活性は安定時の活性の 2 倍以上に上昇し、緩タンパク質内部構造にバネの復元力のような緊張状やかに減少して一定の活性を保った（図 2C）。この結態（テンション）を生成し、自身の ATPase 活性を強果は、温度上昇で KaiC の緊張状態が一度緩み、そのく抑えるのではないだろうか。KaiC 分子内に蓄積し後に平衡状態を生じさせる緊張状態に戻ったとみなたエネルギーは、時間とともに分子外へと放出されるすことが可能だろう。さらに周期変異体の KaiC タン（もれる）と考えられる。そのエネルギーのもれが緊パク質を用いて調べると短周期ほど速く活性が低下張状態に比例すると想定すれば、ATP 分解によるエし、長周期ほど緩やかに活性が下がった。KaiC 変異

ネルギーの生産とエネルギーのもれが一致するとこ体の周期が長くなるほどその ATP 分解活性が低いころで平衡し、以後安定な緊張状態を維持できると考えとから、KaiC 変異体間に見られる平衡状態へ移行すられる。生命で見られる多くのフィードバックが複数るまでの時間の違いは、我々が想定した ATP 分解にのタンパク質による化学反応のループで成立するの起因する緊張状態の程度の差として表れたと解釈すに対し、これは単一のタンパク質の内部で起こる”分ることが可能となる。つまり、KaiC の ATP 分解で発子内フィードバック”である。その実体は分子内に生生したエネルギーは温度変化がもたらす活性の変動じる歪みのような、KaiC の機械的特性による自動制を打ち消し、安定した緊張状態で平衡する。だとすれ御と想定できる。温度に大きく依存する化学反応と異ば緊張状態としての KaiC の「バネ」の強さは概日振なり、分子構造に由来する機械的特性は温度に影響さ動の速さを規定することが可能だろう。物理的なバネれにくいと予想され、分子内フィードバックによる平の単振動ではバネが強くなれば周期が短くなるが、同時間生物学

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図 3 KaiC の時計モデル
A. CI と CII の相互作用モデル。CI の ATPase は調和振動の性質を持つペースメーカー、CII のリン酸化サイクルは振動の駆動力として機能する。CI の ATP 分解によるエネルギーは分子内フィードバックによって緊張状態を生成する。CI の緊張状態は、CIIのリン酸化サイクルのタイミングを制御し、CII は CI に振動を持続するエネルギーを与えることによって安定な概日時計を構成する。この仕組みは機械式振り子時計の脱進機（図４）を想定させ、CI を振り子、CII をゼンマイと見立てることができる。B.
野生型と温度補償性変異体のリン酸化リズム（投稿準備中）。30 から 45℃のリン酸化リズムを示した。野生型は全ての温度で約24 時間周期を示すのに対し、温度補償性変異体は温度依存的に高温で短周期になった。野生型では KaiC の 2 つのドメイン（CIと CII）が時間依存的に相互作用するが、温度補償性変異体では相互作用が異常になったために CII が本来持つ温度依存な性質が表れたと考えられる。

様のことが KaiC でも起こっているのではないか。な存する緩和振動の特性を持つことが考えられるが、CIお KaiC の緊張状態を示唆する構造変化の可能性が、がペースメーカーとして CII の活性（自己リン酸化お結晶構造解析により報告されている 11。

よび自己脱リン酸化）のタイミングを制御することによって、リン酸化サイクルの周期は CI の調和振動と５．KaiC の２つの ATPase ドメイン間の相互作用に同じものになり温度補償性を獲得するのかもしれなよる安定した概日振動

い。

バネや振り子の調和振動のもつエネルギーは保存

一方、CI の調和振動は CII のリン酸化サイクルに量であるが、実際には摩擦などにより失われ、振動はよって生じる CII の「動き」から、その調和振動を持いずれ減衰する。調和振動が安定な振幅を維持する自続させるエネルギーを得るのではないだろうか。CII励振動を生成するには外力を供給する必要がある。

は CI の調和振動と同じ周期になっているので、ごくKaiC の場合も同様で、KaiC だけでは振動は発生せ僅かなエネルギー供給でも繰り返し起こることで共ず、ここに KaiA と KaiB を加えると ATPase 活性と鳴し、安定した振動が持続できるだろう。これまでのリン酸化状態が安定な概日リズムを発生する。Kai の研究から KaiA は CII に結合して CII の ATPase 活

時計システムが安定なリズムを示すために、KaiC が性を上昇させることで KaiC の自己リン酸化を促進す

2 つの ATPase が重複したドメイン（CI と CII）からること 17-19、KaiB は CI に結合して KaiA の機能を阻構成され、KaiA と KaiB の補助によって 2 つのドメ害することで KaiC を自己脱リン酸化に転じさせるこインが互いに相互作用することが重要だと我々は考と 14, 20 が分かっている。調和振動（CI）と緩和振動えている（図 3A）。KaiC の２つの ATPase ドメイン、（CII）の相反する性質をもつ 2 つの振動が、1 つのCI と CII のうち、CI は全体の ATPase 活性の半分以KaiC 分子内で相互作用し、安定な自励振動を生じる上を担い、調和振動の性質を持つペースメーカーとしと考えられる。こうしたデザインで安定した調和振動て機能し、CII の ATP 活性はリン酸化サイクル（KaiCが可能なことは自然界にも工学の分野でも多くの例の自己リン酸化および自己脱リン酸化）を駆動する 10, 13。

を見出すことができる（7 節）。

この CII のリン酸化サイクルは複数の化学反応から構成されるループからなるため 14-16、周期が温度に依

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６．温度補償性変異体のスクリーニング

による CII の制御の異常が脱リン酸化位相で顕著に

前節で KaiC の機能が 2 つの ATPase による機能生じていることが示唆される。周期の温度補償性をも的分業で行われることを提案した。この分業は２つのたらす CI と CII の相互作用は普通の歯車のように常ドメインの機械的カップリングで実現されていると時かみ合っている静的でリジットな結合ではなく、時考えられるが、その動きはタンパク質内部構造の微細間（位相）限定的であり、作用にも方向性が必要なのな動きによるものと考えられ、直接示すことは容易でだろう。

はない。今後の構造生物学的な解析が期待されるところだが、現時点でこの可能性を検討するため、図１に７．機械式時計のデザインと概日時計のデザイン示した KaiC の周期変異体の温度補償性を再検討し3 節で述べたように、物体に平衡状態からのずれがた。先にも述べたようにほとんどの場合、周期が変化生じたとき、ずれに比例した復元力が生じればフックしても温度補償性は維持されるが、例外的に温度補償の法則が成立するので、調和振動が発生する。この振性が弱くなった変異体（シアノバクテリアの発光リズ動の周期は振幅が変わっても変化せず、振動エネルギムが高温下で短周期になる）が見出された（図 1C）。

ーは保存される。この振動は多数の分子の統計的振る変異体のリン酸化リズムも高温で周期が短くなり、舞いに基づく化学反応ではなく、フックの法則に規定45℃ではわずか 8 時間の超短周期になる（図 3B）。一されたマクロな物体の物理的な運動であり温度の影方、変異体の ATPase 活性も温度依存的に高温で上昇響もほとんど受けない。したがって Bünning が指摘したが、これは CI ではなく、CII の ATPase 活性上したように周期の温度補償性を特徴とする概日振動昇によるものであった。このことから、この変異体はの基礎として重要である 7。なお、細胞内の運動や構CI による CII の制御が効かなくなった変異体であり、造維持に関与する多くの ATPase は、力学的トルクをCII 本来の温度依存（緩和振動であるため）な性質が発生することができる。従って KaiC ATPase の高次表れたと考えられる。またこの変異体の周期（8-10 時構造内に、物理学的メカニズムに基づいた調和振動を間）が野生型の概日周期よりはるかに短いことは重要起こすカラクリが潜んでいることは十分考えられるである。CI が自身の周期より短い周期である CII のことであろう。

振動を制御することは、CII の反応を停止させるなど一方、概日時計のもう 1 つの重要な特徴は振動が持の単純な仕組みで可能であるが、周期の長い CII の反続することである。生命現象にこの持続性を説明する

応を加速することは容易ではないことことに注意さ仕組みを探した時、まず候補になるのは緩和振動であれたい。

り、実際に細胞内の様々な周期の振動がこのモデルでKaiC の ATPase 活性とリン酸化活性のリズムを調説明できる。概日時計のモデルとして考えられている

べると、変異体の両活性はリン酸化位相では野生型と転写・翻訳のフィードバックモデルも緩和振動のモデ変わらなかったが、脱リン酸化位相では野生型と比べルである。我々は当初シアノバクテリアでもこれが成て高かった。つまり、この変異型 KaiC における CIり立つと考えたが、周期の温度補償性の説明がどうし
図 4 機械式振り子時計の脱進機
A. 脱進機。振り子に連動する「アンクル」と、ゼンマイによって駆動する「歯車（ガンギ車）」とで構成される。B. 脱進機の動き。ゼンマイの動力で回転し続けようとするガンギ車の動きを、振り子の調和振動と連動するアンクルの 2 つの爪が止めたり（ロック）、外したりすることで、ガンギ車は一定の間隔で回転する。
一方でガンギ車の回転は、振り子にその振動を持続するためのエネルギー（インパルス）を与える。

時間生物学

Vol. 24, No. 1 (2018)27

ても困難であった。そこで安定して持続する調和振動

ATPase 活性とリン酸化リズムという異なる機能をを考えた時、17 世紀に発明された機械式の振り子時分担させることで、CI の「バネ」が振動を持続する計は大変良いモデルであった。振り子時計は等時性をことを可能にした。今後、KaiC の CI と CII それぞ持つ振り子と、ゼンマイの動力による歯車の回転が、れの生化学的活性と原子レベルの構造を明らかにす

脱進機と呼ばれる装置で組み合わされる（図 4）。脱ることによって、「バネ」を実現する分子内フィード進機は振り子につながったアンクルと呼ばれる爪と、バック、 駆動力を供給し細胞内を制御するリン酸化ゼンマイにより駆動されるガンギ車と呼ばれる特殊サイクル、そして「脱進機」として機能する CI と CIIなかたちの歯車から構成される。ガンギ車の回転速度の分子内カップリングの仕組みを具体化することがは振り子により制御され高い時間精度を得るとともできるだろう。なお真核生物に KaiC のホモログは存に、歯車の形状によりゼンマイのエネルギーが振り子在しないが、ATPase は生命の最も基本的酵素であるに一時的に与えられ（インパルス）、振り子は持続性ので、KaiC のような機能をもつ ATPase が潜んでいを獲得する。脱進機は通常の歯車のように常時かみあることを否定するのは時期早尚であろう 21。KaiC タっているのではなく、位相限定的に方向性をもった作

ンパク質に潜む「バネ」と「脱進機」の実体は、機械用をするように設計され、2 つの振動の長所を併せ持式振り子時計の発明よりはるか昔に生命が獲得したつ振動を可能にしている。

からくりであることは明らかなのだから。

こうした振動は自励振動とよばれるが、時計以外にも安定した周期を必要とする多くの装置や物理現象謝辞（管楽器、弦楽器、電気的発振器など）で知られておこの解説は我々が名古屋大学大学院理学研究科で、り、いずれも振動の周期を規定する調和振動（それぞ2010 年ごろから行ってきた KaiC の ATPase 機能にれ周波数を規定する弦、管内の空気柱の弾性、コンデ基づく概日リズム発生機構の研究をまとめたものでンサーとコイルによる時定数回路が相当する）とそれあり、本研究をまとめた成果は現在投稿準備中である。

を増幅、安定化する振動体（振幅を持続させる弓、息この研究は CREST（シアノバクテリアの概日システによる空気の流れ、真空管やトランジスタによる増幅ム、2007-2012）, 科研費特別推進研究（24000016 シ器が相当する）の組み合わせで構成されている。

アノバクテリアの時計タンパク質による概日時間のこのデザインを KaiC 分子内に想定すると、CI の生成機構、 2012-2017）、基盤研究 A( KaiC 概日時計

ATPase 活性を振り子、CII のリン酸化サイクルをゼの動作プログラム：２つの ATPase の協働の生理・生ンマイにあてはめることができる（図 3A）。CI の ATP

化学的解析,2017-2019)（いずれも代表近藤孝男）の支分解によるエネルギーは KaiC 分子内に蓄積し、これ援で実施された。一連の解析で重要な貢献をされた岡が引き起こす分子内緊張がバネとして機能して、調和野（今井）圭子博士（関西医科大学）、村山依子博士

振動を発生させる潜在性を獲得し、ペースメーカーと（九州大学）、高井直樹博士（横浜市立大学）、村中智して機能する。一方 CII のリン酸化サイクルは KaiA

明博士（京都大学）、この間研究を指導していただいと KaiB の作用で回転力を獲得し、本来は温度依存的た近藤孝男博士に深く感謝いたします。に回転する振動体として機能する。この 2 つの過程がKaiC 分子内に構成された脱進機でかみ合うことで、温度の影響をうけない周期と安定した振幅をもつリ

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