博士（医学）清水紀宏
学位論文題名VEGF‑mediatedAnglogeneSlSlSlmpalr
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terHeartS（ 心 不 全 モ デ ル ハ ム ス タ ー に お い てア ンギ オ テ ンシ ン 受容 体 拮 抗薬 は血管新生 を抑制す る）

学位論文内容の要旨ー ．
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慢 性 心 不 全 は 心 疾 患 の 末 期 像 で あ り 、 心 移 ． ド ｛ 数 が 限 ら れ る 中
そ の 病 態 の 解 明
治 療 法 の 検 討 は 重 要 で あ る と 考 え ら れ る 。 緲 梗 敷 心 筋 炎 な ど の 心 、 障 害 後 、 心 筋 リ 、デ リ ン グ を 通 じ て 次 第 に 心 不 全 は 進 行 す る 》 筋 【 デ リ ン グ の 過 程 筋 は レ ニ ン ． ア ン モオ テ ン シ ン 系 （ M S 系 ） の 活 性 化 が 強 く 関、 鳩 細 胞 肥 大 、 線 維 に 細 胞 増 殖 、 細 胞 ，ル芽ジ』
外基質の産生を伴い、心室拡大が進行する。そして、アンジオテンシン変換酵素阻害薬(ACE阻害薬）を用いてRAS系を阻害することでりモデリングの抑制、生命予後の改善が認められるといわれている。アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)
は今までのR
andomizedC
ontrolTrialから 単独でACE阻 害薬を超える効果は無いものの忍容性に優れ、ACE阻害薬が使用できない場合に代用できるというのが現時点での一般的な認識である。一方、アンジオテ
ンシ ンIIは強カ な血管新 生誘導作用を持ち、その作用はアンジオテンシンtypel(ATI）受容体からvascular endothelial growthfactor (VEGF)の活性化を介することがわかっている。しかし、心血管系においてRAS系を阻害する薬剤を使用した場合、血管新生が抑制されるか否かはいまだ定説はない。
また、慢性心不全モデルとしてBIOT02がモデル動物として広く使用されてきた。このモデルでは、ジストロフイン関連糖タンパク複合体を構成する6−サルコグリカンが欠損しており、週令とともに心筋細胞壊死が進み、13週令で全例に明らかな心機能障害を認
め.20週 令で心不 全兆候を 認める。 心筋細胞壊 死の生ずる原因として6−サルコグリカンが欠損するために生ずる微小血管レベルで血管攣縮による虚血や再灌流障害、細胞内Ca2+ハンドリングの異常など複合的な原因によると考えられる。我々が今までにBIOT02を用 いて5，13， 20週令で心 不全の進 行と血管新 生との関 係を検討 してきた 。その結果、心不全進行とともに、毛細血管密度は低下し、血管周囲のみならず心筋細胞間にも線維化が亢進し、血管から心筋細胞までの拡散距離が増加し、心筋細胞環境が悪化するにも関わらず、VE
GF．Fl
tー1．アンジオポイエチン1・アンジオポイエチン2などの血管新生分 子 の発 現 は増 加 せ ず、 相対 的に血管 新生障害が 起きてい ることを 報告して きた。
II. 目 的
ACE阻害薬とARBを心不全モデルハムスターB
IO T02に投与し、その治療効果と有効性の機 序 、 特 に 血 管 新 生 と い う 観 点 か ら 両 薬 剤 の 差 異 を 検 討 す る 。
― 328ーni. 方 法
心不全モデルハムスターBIOT02に6週令から薬剤の経口投与を開始した。ACE阻害薬は、心不全治療薬としてもっとも一般的なエナラプリルを選択し、30mg/kg/dayで投与した。
ARBは、AT1選 択性の強 いバルサルタンを選択し、40mg/kg/dayで投与した。コントロー
ル群を 含め3群で 以降の検 定を行っ た。各群は 24匹より成 り、その 中で12匹は 生命予後を確 認するた め死亡するまでの自然予後を観察、2匹は20週令で血管造影を行うために、10匹は39週令で心機能解析、組織学的、生化学的検討を行うため、犠牲死させた。
（1）心体重比の測定、血清中のas
para
gina
te aminotr
ansferase，クレアチニンを酵
素法で ，アンジ オテンシ ンIIをRIA法で 測定した。（2）心エコー図法、心カテーテル法で心 機能の測 定を行っ た。（3） ノーザンブ ロット法でcollagen
I，VEGFの発現を検討した。（4）アザン染色を行い線維化率を算出した。レクチンによる免疫染色を行い毛細血管密度を算出した。（5）SPring8での放射光を用いて微小血管造影を行い、血管密度を視覚的に判定した。（6）自然予後を観察しK
aplan―Meieranalysisにより生存率の検定を行った。
IV 結 果（1）心 体重比は コントロール群（C群）バルサルタン群（V群）で有意に大きく、エナラプリル群（E群）では有意に小さかった。asparag
inateaminotr
ansferase，クレアチ
ニンの 血中濃度 は三群とも有意差を認めなかった。アンジオテンシンIIの血中濃度はC群に比 較し、V群 では有意に高値を示し、E群では有意に低値であった。（2）心エコー図では 左室拡張 末期径は V群でE群よ りも有意に 大きく、左室短縮率はE群でC群より改善を認 めたもの の、V群は E群、V群よ り悪化を認 めた。僧 帽弁流入 血流では C群、V群ともに 一峰性の flowを認め、著明な拡張障害が示唆された。E群では二峰性のflowを認め、拡張障害が改善されていることが示唆された。いずれの指標も心拍数や血圧の影響を受けるとされるが、心拍数は三群間で有意差を認めず、左室内圧は薬剤投与群では若干低下する ものの、 V群とE群で は有意差 を認めなか った。左 室拡張末 期圧はV群 でC群、E群と比 較して有 意に高値 を示した 。左室dP/dt maxとdP/dt minは V群でC群、 E群よりも悪化 を示した 。（3）VEGF mRNAの 発現はE群 はC群と有意 差を認め なぃもの の、V群
で はC群よ り 有意 に 低 下し て い た。 CollagenImRNAの 発現は V群でE群、C群 より有意に高値 を示し、 E群ではC群 よりも低 値を示した 。（4）線 維化率は V群でC群よ り有意に高値 を示し、 E群ではC群 より有意 に低値を示 した。心筋細胞密度はV群でC群より有意に低 値を示し 、E群でC群 より有意 に高値を示 した。毛細血管密度は逆にV群でE群、C群より 低値を示 した。E群 とC群では 有意差を認 めなかった。（5）微小血管造影でもV群はC群 より血管 は粗に観察できた。（6）死亡した個体は解剖し、うっ血肝・胸水・有意な肺重量の増加を全例で確認し、心不全死であったことを確認した。E群では有意に生存率が改善したものの、V群では有意に生存率が悪化した。
V． 考 察RA
S系は血管新生と密接に関係しており、阻害する方向に働くか、あるいは促進する方向に働くのかは使用する薬剤によって、また臓器によっても異なる。ACE阻害薬はアンジオテンシ ンIからア ンジオテンシンIIへの変換を阻害するぱかりでなくブラディキニンの分解も阻害する。ブラディキニンはBl受容体、B2受容体を活性化するがいずれもノックアウトマウスを用いた研究より血管新生を促進する方向に働くとされる。今回の検討では
エナラプリルは血管新生に対して有意な影響を与えなかったがRAS系阻害に伴う血管新生阻害作用とプラディキニンによる血管新生促進作用がうち消しあったものと推測した。AR
BはAT1受容 体を阻害 するがフ イードバ ックによル アンジオテンシンIIは増加し、AT2受容体を刺激するといわれている。AT2受容体は拮抗薬を用いた研究から血管新生阻害に働くとされている。今回の検討でバルサルタンは血管新生を阻害したが、AT1受容体阻害とAT2受容体刺激の相互作用によるものと推察した。

‑ 329−

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学 位論文 審査の要旨
主 査 教 授 安 田 慶 秀
副 査 教 授 川 口 秀 明
副 査 教 授 北 畠
顕

学位論 文題名● ● ● ●VEGF‑mediated Ang10geneSlSlSlmpal
red
byAngiotenSintypelReCeptorBlOCkade
inCardiomyopathiCHamSterHeartS（ 心不 全 モ デル ハムスタ ーにおい て
アンギオテンシン受容体拮抗薬は血管新生を抑制する）

慢性心不全は心疾患の末期像であり、心移植のドナー数が限られる中、その病態の解明、治療法の検討は重要であると考えられる。心筋リモデリングの過程にはレニン・アンジオテ ンシン系 (RAS系）の 活性化が強く関与し、心筋細胞肥大、線維芽細胞増殖、細胞外基質 の産生を 伴い、心 室拡大 が進行す る。ア ンジオテ ンシン受容体拮抗薬(ARB)
は今までのR
andomized Co
ntrol Trialから 単独でア ンジオ テンシン変換酵素阻害薬(ACEI）を超える効果は無いものの忍容性に優れ、ACEIが使用できなぃ場合に代用できるというのが現時 点での一 般的な認 識であ る。一方、アンジオテンシンIIは強カな血管新生誘導作用があ るといわれているが、心血管系においてRAS系を阻害する薬剤を使用した場合、血管新生が抑制されるか否かはいまだ定説はない。
ま た、慢性心不全モデルBI
OT02ハムスターでは、サルコグリカンが欠損するために生ずる 微小血管 レベルで 血管攣 縮による虚血や再灌流障害、細胞内Ca2+ハンドリングの異常など複合的な原因により、週令とともに心筋細胞壊死が進行するといわれている。そこで、ACE阻害薬 とARBをB
IO T02ハ ムスタ ーに投与 し、その 治療効果と有効性の機序、特に血管新生という観点から両薬剤の差異を検討した。
BIO T02ハム ス タ ーに 6週 令か ら 薬 剤の 経 口 投与 を 開始 、ACE
Iとして エナラ プリルを30mg/kg/dayで、 ARBとし てバルサ ルタン を40mg/kg/dayで投与した。心体重比はコントロ ール群（C群）バルサルタン群（V群）で有意に大きく、エナラプリル群（E群）では有意に小さかった。asparaginateaminotransferase，クレアチニンの血中濃度は三群とも有 意差を認 めなかっ た。ア ンジオテンシンIIの血中濃度はC群に比較し、V群では有意に‑331−高値を示し、E群では有意に低値であった。心拍数は三群問で有意差を認めず、左室内圧は薬剤投与群では若干低下する ものの、V群とE群では有意差を認めなかった。心エコー図で の 左室 拡張 末期 径は V
群 でE群 より も有意に大きく、左室内径短縮率はE群でC群より有 意 に大 きく、V群は E群、V群より低下を認めた。僧帽弁流入血流ではC群、V群ともに一 峰 性の flowを認め、著明な拡張障害が示唆され た。E群では二峰性のflowを 認め、拡張障害が改善されていることが示唆された。PeakpositivedP／dtとPeaknegatived
P/dt
はV群 でC群 、E群よ りも 低下 を示 し た。ノーザンブ ロット法で検討を行ったVEGF m
RN
Aの発 現 はE群は C群と 有意 差を 認め なぃ ものの、V群 ではC群より有意に低下して いた。
CollagenImRNAの発 現は V群 でE群 、C群よ り 有意 に高 値を 示し 、E群で は C
群 より も低値を 示 した 。アザン染色を行い算出した線維化率は V
群でC群より有意に高値を示し、E群ではC群より有意に低値を示した。レクチンを用いた免疫染色を行い算出した毛細血管
密度 は V群 でE群 、C群よ り低 値を 示 した 。E群と C群で は有 意差 を認めなかった 。放射光に よ る心 筋内微小血管造影でもV群はC群より血管 は粗に観察できた。E群では 有意に生命子後が延長したものの、V群では有意に生存率が低下した。本研究において、バルサルタンは血管新生を抑制した結果、リモデリングに悪影響を与え心機能の低下、生存率の低下を認めた。エナラプリルは血管新生には有意な影響を与えず、従来の報告通ルリモデリングを抑制し、生命子後を延長する事を明らかにした。
口頭発表に際し、川口教授か ら臨床試験との差異、アンジオテンシン2型受容体を刺激した 際 のVEGFの変化、アンジオテンシン1型受容体拮抗薬を投与した時の心筋細 胞の変化、ハムスターにおける薬物動態についての質問があった。次いで安田教授から心不全モデルハムスターBI
O T02の心筋障害の機序、ヒトにおける疾患との相同性、放射光を用いた血管造影の臨床応用についての質問があった。最後に北畠教授から使用薬剤の適否、使用量の適否、血中濃度について、また他の動物モデルでの研究結果、アポトーシスの関与についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は過去の実験データや関連論文を引用し、概ね妥当な回答を行った。
この論文は、RAS系と血管新生との関連と心不全の薬物治療への新しいアプローチとして意義のあるものとして高く評価され、今後この分野における更なる研究の発展が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ 申 請者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 けるのに充分な資格を有するものと判定 した。

ー 332ー