倉田奨励金研究報告書｜2017 年度（第 49 回）助成■受領№1341

オーダーメイド医療を志向した薬剤性低 Mg2+血症感受性遺伝多型の機能解析

代表研究者

五十里 彰

岐阜薬科大学生命薬学大講座生化学研究室

1．研究⽬的教授を報告してきたが、その改善作⽤を有する化合物

医療現場では分⼦標的治療薬とコンパニオン診はほとんど明らかになっていない。そこで本研究

断を組み合わせることにより、個別化医療の推進

では、低Mg2+⾎症の回避に向けたオーダーメイドが期待されている。⼀般的に個別化医療は治療効医療を実現するため、低Mg2+⾎症誘発薬剤による果の向上だけでなく、副作⽤の低減にも有⽤であTRPM6の発現低下を抑制する化合物を探索した。

る。抗がん剤の抗上⽪成⻑因⼦受容体（EGFR）抗体の効果予測因⼦としてKRAS遺伝⼦の変異の2．研究内容有無が測定され、⾼い治療効果が得られるように

2.1 TRPM6 発現に対する抗がん剤の効果なったが、20％もの⾼頻度で低Mg ⾎症の副作⽤腎臓の⽷球体でろ過された Mg2+ のうち、5〜10%が遠位尿細管から再吸収される。遠位尿細管の管腔側に発現する TRPM6 と、⾎管側に発現する ACDP2 を介して、Mg2+が経細胞的に輸送されると考えられている。これまでに我々は、ラット
腎尿細管由来 NRK-52E 細胞に TRPM6 Mg2+チャネルが発現し、その発現が抗がん剤のエルロチニブ処理によって低下することを報告した。糖尿病治療薬のロシグリタゾンが TRPM6 の発現低下を改善することを⾒出したので、その作⽤機序を検討した。

2+が出現する。また、胃潰瘍の第⼀選択薬であるプロトンポンプ阻害剤（PPI）、⾼⾎圧の治療に使⽤される利尿剤、臓器移植や膠原病の治療に使⽤される免疫抑制剤の投与により、低Mg2+⾎症の出現が国内外で多数報告されている。低Mg2+⾎症は致死性の不整脈や⾼カリウム⾎症とともに慢性腎臓病を引き起こすため、適切な処置が必要である。
しかし、現在の低Mg2+⾎症の治療では、原因薬剤の投与の中⽌や減量が必要とされ、原疾患の治療効果が低減する可能性が⾼い。さらに、⾎中Mg2+濃度の正常化に数週間の時間を要する場合もあり、薬物治療の⻑期中断が⼤きな問題になっている。
このように、Mg2+代謝の異常は薬物治療の⼤きな障害になっているにも関わらず、有効な予防・治療法は未開発である。その原因として、薬剤性低Mg2+ ⾎ 症 の 発 症 機 序 が 未 解 明 で あ る こ と や 低Mg2+⾎症の予測が困難であることが考えられる。
こ れ ま で に 我 々 は 、 薬 剤 性 低 Mg2+ ⾎ 症 にTRPM6 Mg2+チャネルの発現低下が関与すること

2.2 抗がん剤による TRPM6 の発現低下に対するロシグリタゾンの改善効果
NRK-52E細胞からRNAを抽出後、リアルタイムPCR法でmRNA量を解析した。エルロチニブ存在
下 、 ロ シ グ リ タ ゾ ン の 処 理 に よ っ て TRPM6mRNA量が有意に増加したが、ACDP2やTRPM6のホモログであるTRPM7の発現量は変化しなかっ た （ 図 1 ）。 ロ シ グ リ タ ゾ ン は peroxisome
proliferator-activated receptor γ（PPARγ）のアゴニストとして作⽤することが報告されているた

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め、PPARγアンタゴニストであるGW-9662の効添加すると、時間依存的に細胞内遊離 Mg2+濃度が果を検討したところ、TRPM6の発現増加が有意に増加した。ロシグリタゾンの前処理によって Mg2+阻害された。次に、PPARγのリン酸化と核移⾏濃度の変化量が増⼤し、この効果は GW-9662 のに対するロシグリタゾンの効果を検討した。ロシ共処理によって阻害された。これらの結果は、リグリタゾン未処理細胞で、PPARγは主に細胞質

アルタイム PCR の結果と⼀致する。ロシグリタゾに分布していた（図2）。ロシグリタゾン処理によンによって増加した TRPM6 は細胞膜に分布し、り、PPARγのリン酸化量と核内の分布量が増加

Mg2+チャネルとして機能することが⽰唆された。

した。この効果は、GW-9662の共処理によって阻害された。以上の結果から、ロシグリタゾンはPPARγのリン酸化と核移⾏を介して、TRPM6の発現を増加させることが⽰唆された。

2.5 TRPM6 の転写活性に対するロシグリタゾンの効果
TRPM6 のプロモーター領域を組み込んだルシフェラーゼレポーターベクターを⽤いて、TRPM6

2.3 抗がん剤による TRPM6 発現低下に対するロシグリタゾンの改善効果の転写活性に対するロシグリタゾンの効果を検討した。ロシグリタゾンの処理によって TRPM6 のPPARγはretinoid X receptor（RXR）と⼆量体プロモーター活性が増⼤し、この効果は GW-9662を形成するため、蛍光免疫染⾊法でRXRの局在をの共処理によって阻害された（図 3）。PPARγの調べたところ、ロシグリタゾンやGW-9662の処理結合が予測されるプロモーター領域に変異を導⼊によって局在は変化せず、核内に分布した。そのしたところ、ロシグリタゾンによるプロモーターため、RXRに内因性基質が結合しており、ロシグ活性の増加が阻害された。また、クロマチン免役

リタゾンによるTRPM6の発現増加にRXRの局在沈降法において、ロシグリタゾンによって変化は関与しないことが⽰唆された。⼀⽅、ロシTRPM6 のプロモーター領域と PPARγの結合量グリタゾンによるTRPM6の発現増加はRXRアンが増加し、この効果が GW-9662 の共処理によっタゴニストであるHX-531の処理で阻害されたたて阻害された。

め、PPARγが作⽤する際にRXRが活性化状態で以上の結果から、糖尿病治療薬として使⽤され存在する必要があると⽰唆された。これまでにるロシグリタゾンは、Mg2+再吸収の促進作⽤を有我々は、TRPM6の発現量がERK1/2、c-Fos、c-Junすることが⽰唆された（図 4）。薬剤性低 Mg2+⾎といった細胞内シグナル伝達因⼦によって調節さ症の副作⽤のリスクが⾼い患者には、事前に Mg2+れることを報告している。これらのリン酸化に対製剤や Mg2+吸収促進剤を投与することにより、原するロシグリタゾンの効果を検討したが、いずれ疾患の治療効果が向上することが期待される。

もリン酸化量は有意に変化しなかった。そのため、ロシグリタゾンは既知のシグナル伝達経路に関与

３．発表（研究成果の発表）せず、PPARγに選択的に作⽤することが⽰唆さ

1. 髙階 優⾐、眞鍋 綾、遠藤 智史、松永 俊之、れた。

⻑⾕川 元、五⼗⾥ 彰：MAPキナーゼ経路の活性化を介したクエン酸ナトリウムによる2.4 Mg2+輸送に対するロシグリタゾンの効果

TRPM6マグネシウムチャネルの発現増加、⽇Mg2+感受性蛍光指⽰薬の KMG-20 を⽤いて、本薬学会第139年会、千葉、2019年3⽉22⽇

細胞内への Mg2+流⼊に対するロシグリタゾンの2. 丸中 歌菜、松永 俊之、遠藤 智史、古⽥ 巧、効果を検討した。Mg2+不含溶液に 1 mM MgCl2 を

⻑⾕川 元、五⼗⾥ 彰：家族性低マグネシウム

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⾎症におけるクロ―ディン-16の細胞内蓄積とchannel

治療戦略、第65回中部⽇本⽣理学会、愛知、

all-trans-retinoic acid in erlotinib-treated renal

2018年11⽉16⽇

tubular epithelial cells. Journal of Cellular

3. 髙階 優⾐、眞鍋 綾、遠藤 智史、松永 俊之、

expression

byrosiglitazone

andPhysiology, 234, 6, 8951-8962 (2019)⻑⾕川 元、五⼗⾥ 彰：腎尿細管上⽪細胞にお6. Takashina, Y., Manabe, A., Hasegawa, H.,

けるTRPM6マグネシウムチャネルの発現に対Matsunaga, T., Endo, S., Ikari, A., Sodium

するクエン酸ナトリウムの効果、第82回⽇本⽣

citrate increases expression and flux of Mg2+

化学会中部⽀部例会、岐⾩、2018年5⽉19⽇

transport carriers mediated by activation of

4. Takashina, Y., Manabe, A., Tabuchi, Y., Ikari,

MEK/ERK/c-Fos pathway in renal tubular

A., Cyanidin increases the expression of Mg

epithelial cells. Nutrients, 10, 10, 1345 (2018)2+

transport carriers mediated by the activation ofPPARα in colonic epithelial MCE301 cells.
Nutrients, 11, 3, 641 (2019)
5. Manabe, A., Furukawa, C., Hasegawa, H.,
Matsunaga, T., Endo, S., Ikari, A., Upregulationof transient receptor potential melastatin 6

図1

Mg2+ チャネルの発現に対するロシグリタゾンの効果

図2

PPARγの細胞局在に対するロシグリタゾンの効果倉田奨励金研究報告書｜2017 年度（第 49 回）助成

図3

図4

TRPM6 の転写活性に対するロシグリタゾンの効果

ロシグリタゾンによる TRPM6 発現と Mg2+再吸収の増加機構