博士（理学）大野
学位論文題名剛

Mycoplasrnaargむ凡むmアルギニンデイミナーゼの分子ク口一ニングとその免疫抑制機序の解析
学位論文内容の要旨

1986
年、 F ujiw araとEl
ln erはヒト マクロフ アージ様細胞株、U937の培養上清中 にヒトリ ンパ球の 増殖を強く抑制する免疫抑制因子の存在を報告した。当研究室 ではこの 因子の単 一精製を達成し、リンパ球幼若化阻止因子（LBIF）と命名した 。本研究 ではこの 因子の同定、遺伝子の単離とその全構造の決定、そして、
LBIFの免 疫抑制メ カニズ ムの分子機序を解明することを目的とした。本論文の要旨は以下の5点である。
1）ヒトマクロファ―ジ様細胞株、U937の培養上清中に存在する免疫抑制因子、LBIFを単一精製し、ヒト、および、マウスTリンパ球の増殖、さらに、多くの腫瘍細胞株の増殖を抑制することを明らかにした。また、この因子の同定を行った結果、L
BIFはヒ ト培養細 胞に感 染してい たM
ycoplロsm
ロ ロr
gininiが産生するL‑
アルギニン分解性酵素、アルギニンデイミナーゼ（EC3，5．3.
6）であることを明らかにした 。この酵 素はL‑
ア ルギニンを加水分解して、L‑シトルリンとアンモニアに変換する。
2）M． ロr
gininiアルギニ ンデイミ ナーゼ 遺伝子をクローニングし、その全塩
基 配列 を 決 定 した 。 こ の結 果、オ ―プン リーデイ ングフレ ームは 1，230 bpで410個のアミ 丿酸をコ ードしていた。また、N末端アミノ酸の解析から成熟型アルギニ ンデイミ ナーゼ分 子は開 始コドン のMet残基が除かれS
er残基から始まる409個のアミノ酸によって構成されていることが明らかになった。これから推定される

46分子量は46，372であった。この遺伝子の5 側非翻訳領域には転写開始シグナルの‑10，‑35様配列 、および りボゾー ム結合 配列のSh
ine‑Dalgarno（SD）配列が認められた。また、3．側非翻訳領域には転写終結シグナルと考えられる2つの逆方向の 繰り返し 配列が 存在して いた。さらにこの遺伝子には低GC含量、および、ナンセ ンスコド ンTGAがTrp
コ ドンとし て使用 されると ぃうマ イコプラ ズマ属 特有の特徴が認められた。
3）マイコプラズマ種間におけるアルギニンデイミナーゼの酵素学的性質−至適温 度、至適 pH、金属 イオン要求性、ミカエリス定数−には類似性が認められた。
しかしながら、アルギニンデイミナーゼ分子の分子量、等電点、サプユニット構造、さ らには遺 伝子の 制限断片 長多型（RFLP）の解析からその蛋白、遺伝子構造には多形性が存在することが示唆された。
4）アルギニンデイミナーゼによる免疫抑制の分子機序の解明を試みた。この結果 、リンパ 球では L‑シトルリンをL‑アルギニンに変換する尿素サイクル中の律速酵 素、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ASS）の遺伝子が組織特異的な発現制御を受けており、酵素活性が著しく低いことが明らかになった。このため、L‑アルギ
ニンは細胞増殖に必須のアミノ酸であるが、リンパ球はアルギニンデイミナーゼ活性によって生成したL‑シトルリンをL‑アルギニンに変換できないために免疫抑制が起きることが明らかになった。また、腫瘍細胞株を用いた解析で、アルギニンデイミナーゼにより増殖抑制を受ける腫瘍細胞株の抑制メカニズムもりンパ球の場合と同一であることが明らかになった。一方、アルギニンデイミナーゼによる増殖抑制を 受けない 細胞株 ではASS遺伝子の 発現が 認められ 、この活性が存在するためにL‑
シ トルリン を利用 することが可能になり、増殖を行うことが明らかになった。
5）ヒト 悪性黒 色腫細胞 株は調ぺ たかぎ りの全て におい て、invi
troでアル ギニンデイミナーゼによる増殖抑制を受け、この抑制機序はルンパ球の場合と同一のASS遺伝子 の低発 現による ものであることが明らかになった。また、invivoにおいてもァルギニンデイミナ―ゼ分子の抗腫瘍活性が報告されており、この分子の組織特異的な遺伝子の発現制御メカニズムにもとづぃた増殖抑制活性より、癌治療への応用の可能性が考えられた。
また、種々の自血病患者の自血病細胞におけるASS遺伝子の発現を検討した結果、

47一

急性 白 血 病細 胞 （ ALL，AML）で はASS
遺 伝子の 発現亢進 が認め られたが 、慢性自血 病 細 胞（ CLL，CML） は正常 レペルで あった 。このこ とは、 ASS
遺伝 子の発現制御メカニズムと自血病の発症の分子機序との間には何らかの関連性があることを示唆し た。さ らに、CML
では慢性期においてはASS遺伝子の発現は低いものの、急性転化 すると 30倍以上の 発現亢 進が認め られた。C
ML
自血病患者の急性転化はその90ワ。以上が3年以内に死亡するが、今日、臨床的診断でこれを予測することは困難であ ること から、AS
S遺伝子 の発現 異常をマ ーカー にするこ とにより、C
M
Lの 急 性 転 化 を 分 子 生 物 学 的 に 予 知 す る 方 法 の 可 能 性 が 示 唆さ れ た。

学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査

教授
教授
教授

東杉本
菊地市郎
和則
九二三

学 位論文題名
Mycoplasma argmJnJ
ア ル ギニ ン デイ ミナ ー ゼの 分 子ク ロ ーニ ン グとそ の免疫抑制機序の 解析

1986
年 、Fujiwaraと Ellnerはヒ トマ ク ロフ ァ ージ 様 細胞 株 、U937の 培 養上 清 中に ヒ トリ ンパ 球 の増 殖 を 強 く 抑 制 す る 免 疫 抑 制 因 子の 存在 を 報告 し た。 当 研究 室 では この 因 子の 単 一精 製 を達 成し 、 リン バ 球 幼 若 化 阻 止 因 子 （ LBIF） と命 名し た 。申 請 者は 、 この 因 子の 同定 、 遺伝 子 の単 離 とそ の全 構 造の 決 定 、 そ し て LBIFの 免 疫 抑 制 メ カ ニ ズ ム の 分 子 機 序 に 関 す る 研 究 を 行 な っ た 。
1)
ヒ ト マ ク ロ フ ア ー ジ 様 細 胞 株 、 U937の 培 養 上 清 中 に 存 在 す る 免 疫 抑 市 U因 子 、 LBIFを 単一 精 製
し 、 ヒ ト 、 お よ び マ ウ ス Tリ ン バ 球 の 増 殖 、 さ ら に、 多 くの 腫 瘍細 胞株 の 増殖 を 抑制 す るこ とを 明 らか に し た 。 ま た 、 こ の 因 子 の 同 定を 行な っ た結 果 、LBI
Fはヒ ト 培養 細胞 に 感染 し てい た M
ycopl
asm．aargininiが産 生 する L− アル ギ ニン 分 解性 酵 素、 アル ギ ニン デ イミ ナ ーゼ（EC3.
5．3．6）であ ることを明 らか に した 。 この 酵素 は L− アル ギ ニン を 加水 分解し て、L−シトル ルンとアンモ ニアに変換す る。 ＿2）M.arginini
アル ギ ニン デ イミ ナ ーゼ 遺 伝子 をク ロ ーニ ン グし 、 その 全塩 基 配列 を決定 した。この 結 果 、 オ ー プ ン 1J
一 デ イ ン グ フ レ ー ム は 1， 230bp
で410個の アミ 丿 酸を コ ード し てい た 。ま た、 N
末 端 ア ミ ノ 酸 の 解 析 か ら 成 熟 型 アル ギニ ン デイ ミ ナー ゼ 分子 は 開始 コド ン のMet
残 基 が除 か れSer残基から始ま る409
個 の ア ミ ノ 酸 に よ っ て 構 成 さ れ て いる こ とが 明 らか にな っ た。 こ れか ら 推定 され る 分子 量 は 46,372で あっ た 。こ の 遺伝 子 の5 側 非翻 訳 領域 に は転 写 開始 シグ ナ ルの ‑10，‑
35様配 列、 お よび り ボ ゾ ーム 結 合配 列 のShine‑Dalgarno（SD)
配 列 が認 め られ た 。ま た、 3
f側非 翻 訳領 域 には 転写 終 結
シ グ ナ ル と考 え られ る 2
つ の逆 方 向の 繰り 返 し配 列 が存 在 して い た。 さら に この 遺 伝子 に は低 G
C含量、49

およ びナンセンスコドンTG
AがTrpコドンとして使用されるとぃうマイコプラズマ属特有の特徴が認められた。
3）マイ コプラ ズマ種 間におけるアルギニンデイミナーゼの酵素学的性質一至適温度、至適pH、金属イオン要求性、ミカエリス定数一には類似性が認められた。しかしながら、アルギニンデイミナーゼ分子の分子量、等電点、サプユニット構造、さらには遺伝子の制限断片長多型（RFLP）の解析からその蛋白、遺伝子構造には多形性が存在することが示唆された。
4）アルギニンデイミナーゼによる免疫抑制の分子機序について解析を行なった結果、リンパ球ではL．シトルリンをL―アルギニンに変換する尿素サイクル中の律速酵素、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ASS）の遺伝子が組織特異的な発現制御を受けており、酵素活性が著しく低いことが明らかになった。このため、L―アルギニンは細胞増殖に必須のアミノ酸であるが、リンパ球はアルギニンデイミナーゼ活性によって生成したL−シトルリンをL−アルギニンに変換できないために免疫抑制が起きるごとが明らかになった。また、腫瘍細胞株を用いた解析で、アルギニンデイミナーゼにより増殖抑制を受ける腫瘍細胞株の抑制メカニズムもりンパ球の場合と同一であることが明らかになった。一方、アルギニンデイミナーゼによる増殖抑制を受けない細胞株ではASS遺伝子の発現が認められ、この活性が存在するためにLーシトルリンを利用することが可能になり、増殖を行うことが明らかになった。
5）ヒト悪性黒色腫細胞株は調べたかぎりの全てにおいて、加vitroでアルギニンデイミナーゼによる増殖抑制を受け、この抑制機序はりンパ球の場合と同一のASS遺伝子の低発現によるものであることが明らかになった。また、而VIVOにおいてもァルギニンデイミナーゼ分子の抗腫瘍活性が報告されており、この分子の組織特異的な遺伝子の発現制御メカニズムにもとづぃた増殖抑制活性より、癌治療への応用の可能性が考えられた。
また、種々の自血病患者の自血病細胞におけるASS遺伝子の発現を検討した結果、急性自血病細胞（ALL，AML）で はAS
S遺伝子の発現亢進が認められたが、慢性自血病細胞（CLL，CML）は正常レベルであった。このことは、ASS
遺伝子の発現制御メカニズムと自血病の発症の分子機序との間には何らか の関連性があることを示唆した。さらに、CML
では慢性期においてはA
SS遺伝子の発現は低いものの 、急性転化すると30倍以上の発現亢進が認められた。CM
L
自血病患者の急性転化はその90%以上が3年以内に死亡するが、現在臨床的診断でこれを予測することは困難であることから、ASS
遺伝子の発現異常をマーカーにすることにより、CMLの急性転化を分子生物学的に予知する方法の可能性が示唆された。
審査 員一同 は、申 請者 が博士 （理学 ）の学 位を 得るに 十分な 資格を 有する もの と認定 した。

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