倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1415

チロシンリン酸化に着目した敗血症の病態解明と新規治療法の開発
代表研究者

松本佳則

岡山大学学術研究院医歯薬学域

腎・免疫・内分泌代謝内科学

研究准教授

Investigation of mechanistic insights into the roles of kinases for inflammation
Principal Researcher

Yoshinori Matsumoto,Department of Nephrology, Rheumatology, Endocrinology and Metabolism, Okayama University Faculty of Medicine,Dentistry and Pharmaceutical Sciences Research Associate Professor

敗血症は外来抗原に対する異常な免疫応答により活性化された炎症細胞からサイトカインが異常産生されることで生じるが、その発症機序は不明である。TLR（Toll-like receptor：Toll 様受容体）は自然免
疫制御、サイトカイン産生に不可欠の受容体で、様々な抗原による TLR シグナルの異常活性化は敗血症など難治性炎症疾患の病因となることが知られているが、TLR の制御機構や TLR が病態形成に関与する分子生物学的機序は不明である。本研究では炎症発生に関わる 3BP2 が、敗血症の原因となる TLR 異常活性化に関わる分子生物学的メカニズムを明らかにする。
Abnormal innate immune response to commensal pathogens with subsequent excessive cytokine andchemokine production is considered to be a pathogenesis of autoinflammatory disorders. However, theregulatory mechanism of host responsiveness to bacterial pathogens during development ofautoinflammation is not fully elucidated. In the present study, we have provided mechanistic evidence of
how Tankyrase, a member of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) family, negatively regulates Toll
receptor signaling.

1．研究背景・目的に関与する分子生物学的機序は不明である。

敗血症性ショック（エンドトキシンショック）“SH3BP2（3BP2）”は pleckstrin homology（PH）

は、外来抗原に対する異常な免疫応答により活性ドメインの他、Src homology 3（SH3）ドメイン含化された炎症細胞からサイトカインが異常産生さ有タンパクに結合するプロリンリッチ領域や、リれることで生じるが、その発症機序は不明である。

ン酸化チロシンに結合する SH2 ドメインを有し、抗生物質の他は保存的加療が中心で、未だ有効な受容体と細胞内シグナルを仲介するチロシンキナ

治 療 法 も 確 立 さ れ て い な い 。 TLR （ Toll-likeーゼのアダプタータンパクである。2001 年にreceptor：Toll 様受容体）は自然免疫制御、サイ3BP2 のミスセンス変異が、顔面骨の炎症性骨破壊、トカイン産生に不可欠の受容体で、様々な抗原に⻭⽛の脱落を特徴とする希少遺伝性骨疾患“チェよる TLR シグナルの異常活性化は敗血症性ショルビズム”の原因であることが報告された。その後、ックなど難治性炎症疾患の病因となることが知ら

トロント大学の Prof. Rottapel 研究室は 3BP2 がれているが、TLR の制御機構や TLR が病態形成

poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）メンバ

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成ーである“Tankyrase”に結合して ADP リボシル化に我々はシグナル伝達に関わると予測される 6 つ

された部位に、E3-ubiquitin ligase の RNF146 がの細胞内チロシン（Y616-Y761）に着目し、6 チ結合し、3BP2 をユビキチン化、分解する経路を発ロシン全てをフェニルアラニンに置換した TLR2見した。更にチェルビズム変異 3BP2 は Tankyrase（6Y→F）プラスミドを作製した。これを 293T 細に結合出来ず、その結果生じた 3BP2 の代謝障害胞に発現させて、SRC/Syk による NF-kB 活性をで蓄積した 3BP2 が破骨細胞を異常活性化し、骨検討したところ、TLR2（6Y→F）は完全に NF-kB破壊をきたすチェルビズムの発症機序を解明した。

活性が失われ、SRC/Syk 存在下でも活性化しなかそこで我々は、正常な 3BP2 代謝が恒常性維持にった。

重要と考え、3BP2 代謝に関わる因子の生体内機能を明らかにしてきた。まず 3BP2 の別の基質蛋白2.2 TLR2（Y647）が TLR2 活性化に関与するである ABL に着目し、3BP2 により活性化した

それでは TLR2 の 6 つの Y のうちどれがシグナ

ABL が骨芽細胞の必須転写因子である RUNX2 のル伝達に重要なのか？TLR2（6Y→F）プラスミド

転写活性を高めることで、骨芽細胞の分化を促進のフェニルアラニン 1 つをチロシンに Add backする機序を報告した。更に RNF146 をマクロファして 6 つのプラスミド（F616Y、F641Y、F647Y、ージでノックアウトしたマウスを作製し、同マウ

F653Y、F715Y、F761Y）を作製し、293T 細胞でスが破骨細胞の異常活性化による骨粗鬆症を呈す

NF-kB 活性の検討を行ったところ、TLR2（F647Y）ることを明らかにした他、RNF146 の骨芽細胞でがシグナル活性をレスキューさせることを見出しのノックアウトマウスも作製し、これらの新生児た（図 2）。

は致死的な頭蓋骨欠損や肺胞形成障害を呈することも報告した。本研究では、Tankyrase-3BP2 分解2.3 Tankyrase KO マウスはサイトカインストーム経路に着目し、炎症発生に関わる 3BP2 が、敗血を起こす症の原因となる TLR 異常活性化に関わる分子生TLR2 リン酸化及びシグナル活性化の過程で、物学的メカニズムを明らかにする。

3BP2 はどの様な役割を果たすのか？その疑問を明らかにするため、Tankyrase をマクロファージ

2．研究内容分 画 で ノ ッ ク ア ウ ト （ KO ） し た マ ウ ス

2.1 TLR2 チロシンリン酸化が TLR 活性を制御する（Tnks -/-Tnks2 fl/fl LysM-Cre）を作製した。そのそれでは 3BP2 はどの様に炎症を惹起するの結果、Tankyrase KO マウスは細胞内 3BP2 が増加か？その疑問を明らかにするために、サイトカイし、TNF-αをはじめとする炎症性サイトカインのン産生に重要なマクロファージの TLR シグナル産生亢進によるサイトカインストームを起こし、経路に着目して検討を進めた。3BP2 はチロシンキ炎症細胞の多臓器浸潤から敗血症と同様の病態をナーゼのアダプター蛋白であるため、我々は TLR呈した（図 3）。

チロシンリン酸化がシグナル活性化のカギになるのではないかと考えた。TLR2 は膜貫通蛋白で、2.4 Tankyrase KO 細胞は TLR2 リガンドへの感受病原体を認識する細胞外領域、膜貫通領域及びシ性が亢進するグナル伝達に関わる細胞内領域から成る。まずTankyrase KO マウスの骨髄より分離したマク

我々は、チロシンキナーゼである SRC/Syk がロファージを、TLR2 のリガンドであるバクテリTLR2 のチロシン残基をリン酸化し、TLR2 の NF-

ア 由 来 の 抗 原 （ Heat Killed PorphyromonasκB 活性を亢進させることを証明した（図 1）。次gingivalis; HKPG）で刺激して、サイトカインの倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
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mRNA 発現量を検討したところ、KO マクロファ

MF, Chruscinski A, He F, Asano Y, Katsuyama T,ージはこれらのリガンド刺激により WT と比べてSada KE, Wada J, Rottapel R. Tankyrase represses

有意にサイトカイン産生が亢進し、3BP2 は TLR

autoinflammation through the attenuation ofの感受性を高めることが示唆された（図 4）。

TLR2

signaling.

TheJournal

Investigation. 132(7):e140869, 2022

図 1,2：293T 細胞を用いた NF-κB ルシフェラー
ゼアッセイ。
図 3：野生型（WT）と Tankyrase KO マウスの血清中 TNF-α濃度。
図 4：野生型（WT）と Tankyrase KO マウスマク
ロファージを HKPG で刺激し、0-24 時間で回収した細胞の Il6 mRNA 発現量の解析。
3．今後の展開
本研究では、Tankyrase、3BP2 により制御される TLR チロシンリン酸化という新しい概念から自然免疫、サイトカイン産生、炎症に関わる TLRシグナル経路の新たな制御機構を明らかにした。
本研究の最終目標は、敗血症の病態改善を可能にする新規薬剤の開発である。本研究を更に深化させ、敗血症に応用可能な薬剤の開発に取り組んでいる。本研究のご支援を頂きました日立財団の皆様方に感謝申し上げます。

2．発表（研究成果の発表）
Matsumoto Y, Dimitriou ID, La Rose J, Lim M,
Camilleri S, Law N, Adissu HA, Tong J, Moranof

Clinical