金 沢 医 科 大 学 研 究 推 進 事 業 ［ 特 別 推 進 事 業 ］［ 特 別 奨 励 研 究（ ＡＢ･ ）］ 成 果 報 告 書

平成

年

27

月

11

金沢医科大学

金 沢 医 科 大 学

平成２７年１１月

はじめに

金沢医科大学研究推進事業の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 24 年度に開学 40 周年を迎えたことをきっかけとし、本学における研究のさらなる活性化と若手研究者の育成を図り、部門間の枠を超えた研究を推進するため、新たに研究推進事業を実施しました。これは、特色ある
独創的な研究等を助成し、医学の充実・発展に寄与することを目的としています。また、本事業では、本学を代表する本格的な特色ある研究への発展を期待する[特別推進研究]、本学卒業生が研究代表者となって遂行する[特別奨励研究(Ａ・Ｂ)]の 3 つの種目を設けました。
平成 23 年度に学内公募を行った結果、[特別推進研究]に 7 件の申請があり 6件を採択、[特別奨励研究(Ａ)]には 11 件の申請があり 10 件を採択、[特別奨励研究(Ｂ)]には 18 件の申請があり 18 件全てが採択されました。本書はこれらの研究課題について、研究成果をまとめたものであります。
今後、本事業で得られた研究成果を社会に還元するとともに、本学の研究基
盤の一層の充実と学術研究の益々の発展を期待します。
最後に、本事業実施にあたり、多大なご支援をいただきました竹越 襄理事長に心より御礼申し上げます。また、本報告書の取りまとめの労をとられた研究
業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

平成 27 年 11 月
金沢医科大学
学長

勝田

省吾

目

次

はじめに

金沢医科大学研究推進事業
特別推進研究 成果報告書
SR2012－01. イメージングが拓く癌研究研究代表者・清 川 悦 子 ････････
SR2012－02.

１

加齢制御へのアプローチ-老化因子と動脈硬化および発がんの接点研究代表者・友 杉 直 久 ････････

SR2012－03.

７

へき地高齢化社会における心の健康医療システム構築を目指した包括的研究
研究代表者・川 﨑 康 弘 ････････

SR2012－04.

15

メタボリック症候群に伴う心、腎、肝障害の発生機序の解明と飲酒の影響研究代表者・堤SR2012－05.

幹 宏 ････････

19

透 ････････

35

研究代表者・古 家 大 祐 ････････

37

センチネルリンパ節陰性 SM 胃癌に対する内視鏡的局所全層切除術の開発
研究代表者・伊 藤

SR2012－06.

栄養応答による炎症惹起機構の統合的理解とその制御法の確立

特別奨励研究（Ａ） 成果報告書
AR2012－01.

前立腺癌における癌幹細胞と新たなバイオマーカーの探索研究代表者・宮 澤 克 人 ････････

AR2012－02.

排卵過程における gelatinase の関与とその作用機構について研究代表者・藤 井 亮 太 ････････

AR2012－03.

4549

細胞接着因子の心筋細胞における解析研究代表者・赤 澤 純 代 ････････

53

AR2012－04.

水晶体の正常環境は低酸素状態である―その遺伝子発現様式と白内障発症との関連研究代表者・長田ひろみ ････････

AR2012－05.

57

ラット脊髄損傷モデルにおける、Hyaluronidase-4 のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン消化作用研究代表者・川 原 範 夫 ････････

AR2012－06.

61

IgG4 関連疾患の疾患指標因子および免疫グロブリン対応抗原の探索
研究代表者・正 木 康 史 ････････

AR2012－07.

65

NBI 拡大内視鏡を用いた胃粘膜微細表面構造変化の背景に存在する遺伝子異常の解明
研究代表者・白 枝 久 和 ････････

AR2012－08.

69

穿刺吸引細胞診における単眼モニターと測距センサー使用による安全性向上への検討
研究代表者・下 出 祐 造 ････････

AR2012－09.

71

カロリー制限により誘導される血漿中 SIRT1 調節因子に対する網羅的プロテオーム及び microRNA 解析による探索
研究代表者・津 田 真 一 ････････

AR2012－10.

73

ステロイド誘発性大腿骨壊死の遺伝子修飾骨髄由来組織幹細胞の全身投与による予防研究代表者・市 堰

徹 ････････

77

研究代表者・柴田奈央子 ････････

81

特別奨励研究（Ｂ） 成果報告書
PR2012－01.

翼状片組織における酸化ストレスマーカーの発現と翼状片予防薬の開発

PR2012－02.

実験的アナフィラキシーショック時の脳循環動態の放射線医学的検討
研究代表者・豊 田 一 郎 ････････

PR2012－03.

85

肺腺癌の AQP 発現調節機構におけるHIF-1/ヒストン修飾による新規制御法の開発研究研究代表者・町田雄一郎 ････････

87PR2012－04.

血管平滑筋細胞のエストロゲン受容体遺伝子発現を調節するエピジェネティック調節機構の解明：
核骨格-CTCF 系による力学的情報伝達研究代表者・入 谷

PR2012－05.

敦 ････････

91

愛 ････････

95

研究代表者・伊 藤 弘 樹 ････････

99

血管内皮細胞 Sirt1 の高脂肪負荷による内皮機能障害と耐糖能障害に対する改善効果とその機序の解明（血管内皮特異的 Sirt1 高発現マウスによる解析）
研究代表者・渡 邊

PR2012－06.

高グルコースクランプ下経口糖負荷試験を用いた
インクレチン効果の新しい評価法の開発

PR2012－07.

睡眠時無呼吸症候群の新しい治療法の開発
研究代表者・齋 藤 雅 俊 ････････ 103

PR2012－08.

心房細動患者における Taurine 動態の検討
研究代表者・藤 林 幸 輔 ････････ 107

PR2012－09.

AQP1 遺伝子修飾組織幹細胞と bFGF トリガー刺激による新規弾性軟骨再建法の開発
研究代表者・柳 下 幹 男 ････････ 111

PR2012－10.

抗繊維化ペプチド AcSDKP の臓器保護作用における重要性の検討研究代表者・永 井 貴 子 ････････ 115

PR2012－11.

ティッシュ－マイクロアレイの作製と細胞内信号伝達の網羅的解析研究代表者・黒 瀬

PR2012－12.

望 ････････ 119

動脈硬化症と骨代謝に及ぼす運動療法の効果研究代表者・石 田 良 子 ････････ 121

PR2012－13.

ラットアナフィラキシーショック時の肺血管収縮に対する肝血管造影法による検討
研究代表者・北 楯 優 隆 ････････ 123

PR2012－14.

マウスアナフィラキシー肺血管・気道収縮に対する
パラクリン的調節機構の解明
研究代表者・四 宮 祥 平 ････････ 125

PR2012－15.

過敏性肺炎における免疫制御受容体の機能解析研究代表者・東 野 茉 莉 ････････ 129

PR2012－16.

特発性拡張型心筋症におけるアミノ酸代謝異常に関する検討
研究代表者・若 狭PR2012－17.

稔 ････････ 133

血清サイトカイン測定によるゲフィチニブ薬剤性肺炎の早期発見法の開発
研究代表者・中 川

PR2012－18.

研 ････････ 135

新規 12 員環マクロライド系抗菌薬（EM900）における抗腫瘍作用の検討
研究代表者・及 川

卓 ････････ 139

特別推進研究
成果報告書

ＳＲ２０１２-０１～０６

１．研究課題名：イメージングが拓く癌研究（研究番号

SR2012-01）

２．キーワード：１）蛍光イメージング (fluorescent imaging)２）がん (Cancer)３）組織マイクロアレイ (Tissue Microarray)４）遺伝子多型 (genetic polymorphisms)５）細胞内信号伝達 (intracellular signal transduction)
３．研究代表者：清川研究分担者：宮澤悦子・医学部・教授・病理学 I
克人・医学部・教授・泌尿器科学

上田

善道・医学部・教授・病理学 II川原範夫・医学部・教授・整形外科学

佐久間
有沢
黒瀬

勉・医学部・教授・呼吸器外科学（退職）
富康・医学部・教授・消化器内科学
望・医学部・学内講師・臨床病理学

４．研 究 目 的
1) FRET バイオセンサーをはじめとした細胞レベルの蛍光ライブイメージング
2) 臨床検体における蛍光イメージング
3) ティッシュ―マイクロアレイの作成の 3 つの技術を、研究分担者がこれまで行ってきた研究に導入し、蛍光イメージングによって癌を理解することを目的とした。また、細胞培養、DNA 関連の機器・試薬を臨床研究棟に充実させ、お互いが使用できる環境を作るというハード面での協力体制だけでなく、
実験手法・試料を惜しみなく提供し、臨床棟における研究を活性化させ、今後の研究に繋げる基礎を作ることも目的とした。
５．研 究 計 画
これまで培養細胞やモデルマウスで得てきた知見を、臨床検体で確認する手法を整える、
また逆に、臨床検体を用いた免疫染色から重要であると考えられた経路を、培養細胞を用いた蛍光イメージングで調べるというように、基礎実験と臨床実験を両方向性に情報交換し、癌への理解を深める。具体的には、① 清川・黒瀬はマイクロアレイによる臨床検体の網羅的解析を立ち上げ、低分子量 G 蛋白質の臨床検体での活性検出系を確立し、またそれに関連するリン酸化蛋白質の免疫染色を立ち上げ、臨床検体における信号伝達の理解を進める。②
清川・宮澤はヒト尿管由来細胞を用いた類器官培養を確立し、HMGB1 の腎がんにおける機能を明らかにする。③ 上田・佐久間・川原は肺癌や軟部腫瘍で発現と転移、薬剤耐性に関連するとされているアクアポリンの機能をエンドサイトーシス、細胞骨格の観点から蛍光イ
メージングで明らかにする。④ 清川・有沢はこれまで進めてきた患者検体を用いたメチル‑ 1 ‑化を初めとする遺伝子解析に加え、透明化試薬による消化管の微細構造の可視化を行い、遺伝子変化と内視鏡所見、血管走行の相関を理解する。
６．研 究 成 果
各々のプロジェクトに関しては、下記の通り。
①

臨床検体からのマイクロアレイの作製。本学病院の剖検例・手術例からの腎がんにおいて、マイクロアレイを作製し、免疫染色、活性化型 Rac の検出を試みた。リン酸化抗体は染色状態が定まった抗体もあるが、培養細胞で用いることが出来たものでも臨床検体では困難なものがあり、染色像の評価を含めて詳細な解析を待っている状態である。また Racの活性化検出も、組織アレイを用いて行ってみたが、固定した培養細胞でも結果が安定しないため、実験条件を確立する必要がある。また類器官の早期・後期で発現の異なる分子、
Ripply1 に注目し、その機能解析を行っており、論文にするデータをまとめているところである（投稿準備中）。
②

ヒト尿細管由来の細胞を入手し、類器官培養を試みたが、成功しなかった。HMGB1 の

上記①のマイクロアレイを用いた染色を行ったが、全ての症例で核に染色され細胞外に出ているとしても、ごく微量であることが示唆された。また、これまで報告のあるリン酸化
酵素活性 ERK の活性化は誘導することが出来ないことを培養細胞に FRET バイオセンサーを発現させ、HMGB1 を添加するという実験で確かめた。また組織マイクロアレイを用いた免疫染色では、リン酸化酵素の活性と HMGB1 の発現と臨床とは相関しないという
preliminary な結果を得ている。詳細な解析を行い、論文投稿の準備をする。
③

蛍光アクアポリンを発現するシステムを構築した。軟部腫瘍のモデルである HT1080 細胞では、赤色蛍光タンパク質との融合蛋白質をして発現させた各種エンドサイソームのマーカー、Rab ファミリーのどれとも共局在することがなく、また過剰発現させても薬剤の耐性に変化が見られなかった。HT1080 細胞を用い、遺伝子強制発現ならびにノックダウン
により、浸潤に関わる偽細胞突起の細胞膜におけるアクアポリン (AQP1) の局在と同部近傍細胞骨格の変化を蛍光イメージングで確認した。その結果を、ヒト軟部肉腫症例における解析に応用し、in vivo でも同様な現象が機能し、生命予後に影響している結果を得た（投稿準備中）。アクアポリン (AQP5) の発現亢進もヒト軟部肉腫の生命予後に関与することを明らかした（投稿準備中）。
ヒト肺癌におけるアクアポリンの発現調節にプロモーター領域のアセチル化状態の変化が関わっていることを明らかにした（投稿準備中）。
④

患者検体を用いた遺伝子解析では胃の正常組織において、IL17A の多型が DAPK や

CDH1 メチル化に影響を与えていることを明らかにした（研究業績）。また TTX-r ナトリウ
ムチャンネル Na(V) 1.8/SNS (sensory-neuron specific) の蛋白質をコードする SCN10A の遺伝子多型が、ピロリ菌感染を示さない機能性胃腸症と関連があることを明らかにした（研究業績）。
また、Scale という透明化試薬を剖検より得られた全臓器で行ったが、消化管は処理によ‑ 2 ‑り大変もろくなり、顕微鏡を用いた観察は不可能であったため、そこで停止した。
当初の最終目標の一つであった臨床検体への FRET バイオセンサーの導入は、現時点では人的・時間的余裕がなく、見送らざるを得ない状況である。
７．研究の考察・反省
臨床研究棟における研究施設の整備は、ほぼ同時期に採択された私立大学戦略的研究基盤
形成支援事業「脂質ワールド」が、臨床研究棟 6 階や 7 階の共同機器エリア・低温室などの部屋の整備を行い、細胞培養室・ウイルス感染実験施設に必要な安全キャビネットや培養装置を導入し、使用できるように整えた。「脂質ワールド」で購入した 2 光子励起顕微鏡のレーザーは高額でありその保証のためのシステムも本研究費で整備し、本研究で得られた成果
を生体イメージングにてさらに発展させる準備を整えた。また科研費の間接経費や大型実験
機器申請を共同して行い、危険物などを扱うためのドラフト（臨床研究棟 6 階）や、マイクロダイセクションの購入設置、炭酸ガス供給型蛍光顕微鏡を移動するなどを進め、整備はかなり整った。しかし、当初計画していた定期的なミーティングは行うことはなかった。代わりにメールにて連絡、あるいは、セミナーに参加し合うことでお互いの研究背景・成果を把握するように務めた。
研究成果に関しては、足りていないと考えている。その原因としては、全員が、特に診療に携わる医師が多忙であり、研究に専念できる状況でなかったことが挙げられる。代わりに研究を進めることが出来る、技術を持ったテクニカルスタッフや、研究担当ポスドク（あるいはスタッフ）などの雇用があれば、研究が進んだのではないかと考えられる。また診療業
務がない、総医研スタッフや、基礎講座との連携も図るべきであったと反省している。
上記６のなかで、投稿準備中とあるものは、可及的速やかに論文を投稿する。また、当初立てた仮説が棄却された実験に関しては、その結果をまとめて論文投稿が可能かどうか検討する。具体的には、組織マイクロアレイに関しては、他臓器の癌でも試み、同様にリン酸化
酵素群、G 蛋白質の関与する信号伝達の可視化にチャレンジする。また、Ras（膵臓がん・大腸癌で変異が報告）、Rho（今年になって胃癌で変異が報告された）など、Rac 以外の低分子
量 G 蛋白質でも同様の手法で活性が検出できるか検討するために、研究費の取得に努める。
ヒト軟部肉腫において、アクアポリン (AQP5) のリン酸化状態と活性化 G 蛋白の関係を検討し、ヒト軟部肉腫において、アクアポリン局在の調整に関わる細胞膜リン脂質の関与に関し検討し、論文投稿に努めたい。
８．研 究 発 表
① Yoshizaki H, Kuwajima Y, Minato H, Kiyokawa E.: Regulation of Ripply1 expression in MDCK
organoids. Biochemical and Biophysical Research Communications. in press, 2015.
Abstract: Epithelial organs are made of a well-polarized monolayer of epithelial cells, and theirmorphology must be maintained for their proper function. To examine the genes that are specifically‑ 3 ‑expressed in the late stages of cystogenesis and are involved in maintaining the morphology of themature cysts, we performed a microarray analysis comparing the mRNA expression between the earlyand late stages of Madin–Darby Canine Kidney (MDCK) cystogenesis. We found that one of the genecandidates, Ripply1, was expressed higher in the late stages, and its expression was also transiently
much higher in the early stages. Although the protein expression showed similar kinetics, depletion of
Ripply1 had only a slight effect on organoid growth. Unexpectedly, we found that the Ripply1 protein
is degraded by the proteasome system. Mutant analysis suggests that Ripply1 is not ubiquitinateddirectly, but rather is degraded only after binding to Transducin-like Enhancer of Split (TLE)1, atranscriptional repressor. Ripply1 is degraded in the nucleus, and this degradation is inhibited during
the mitosis. These data indicate for the first time that Ripply1 expression is regulated at the protein
level.
② Minato H, Kiyokawa E.: Activated K-RAS and its effect on morphological appearance. J Biochem,
156(3): 137-145, 2014.
Abstract: RAS genes are frequently mutated in various human tumours. These mutations cause
GTPase RAS to remain locked in constitutively active signals through the downstream cascades
leading to proliferation. A series of earlier studies reported on the morphological appearance of cells
upon RAS activation. Classically, morphologic changes of fibroblasts have been used to confirm theoncogenic activity of RAS. Recent works found that the active RAS induces benign and malignant
morphological changes in organoids, which are an in vitro model system for epithelial tissue. The
studies of animal models support the basic oncogenic features of RAS revealed in vitro, while also
providing evidence that the effects of RAS activation in vivo are different from those in vitro. The
pathological observation of the various human materials indicates that the oncogenic RAS participates
in metaplasia, which occurs before proliferation, and that RAS promotes mucin production in variousorgans. These morphological analyses may shed light on important signalling pathways that meritinvestigation in vitro.
③ Arisawa T, Tahara T, Shiroeda H, Minato T, Matsue Y, Saito T, Fukuyama T, Otsuka T, Fukumura A,
Nakamura M, Shibata T.: Genetic polymorphisms of SCN10A are associated with functional
dyspepsia in Japanese subjects. J Gastroenterol, 48(1): 73-80, 2013
Abstract: BACKGROUND: Visceral sensory impulses are transmitted via C-fibers from thegastrointestinal tract to the central nervous system. The tetrodotoxinresistant (TTX-r) sodium channel,
Na(V) 1.8/SNS (sensory-neuron specific), encoded by SCN10A, has been identified on C-fibers. We
attempted to clarify the association between functional dyspepsia (FD) and SCN10A
non-synonymous polymorphisms (2884 A>G, 3218 C>T and 3275 T>C).
METHODS: The study was performed in 642 subjects (345 with no symptoms and 297 with FD). We
employed a multiplex polymerase chain reaction single-strand confirmation polymorphism‑ 4 ‑(PCR-SSCP) method to detect the gene polymorphisms.
RESULTS: The 3218 CC homozygotes had a reduced risk for the development of FD [odds ratio (OR)0.589; 95 % confidence interval (CI) 0.402-0.864; p = 0.0067]. In addition, both 2884 A>G and 3275
T>C, which were in linkage disequilibrium, were also associated with the development of FD (p =0.039 and 0.028, respectively). Each 2884 G carrier, 3218 CC homozygote, and 3275 C carrier had areduced risk for the development of both epigastric pain syndrome (EPS) and postprandial distresssyndrome (PDS). The subjects with the 2884 G allele, 3275 C allele, and no 3218 T allele had areduced risk for FD (OR 0.618; 95 % CI 0.448-0.853; p = 0.0034). This haplotype was associatedwith a reduced risk for both EPS and PDS (p = 0.0011 and 0.0056, respectively). In addition, there
was a significant association between FD and this haplotype in Helicobacter pylori-negative subjects(OR 0.463; 95 % CI 0279-0.9768; p = 0.0029).
CONCLUSION: We conclude that genetic polymorphisms of SCN10A are closely associated with FD(both EPS and PDS), especially in H. pylori-negative subjects, in Japanese.
④ Arisawa T, Tahara T, Tsutsumi M, Shibata T.: Influence of IL17A polymorphisms on the aberrant
methylation of DAPK and CDH1 in non-cancerous gastric mucosa. BMC Medical Genetics 201213(59), 2012
Abstract: Background: CpG island aberrant methylation is shown to be an important mechanism ingene silencing. The important role of IL-17 in inflammatory response to H. pylori colonization has
been indicated. We investigated the influence of IL17A polymorphisms, -197 G > A (rs2275913) and*1249 C > T (rs3748067), on the methylation of DAPK and CDH1.
Methods: Gastric mucosal samples were obtained from 401 subjects without malignancies.
Methylation status of gene was determined by MSP. The genotyping of IL17A was performed by
PCR-SSCP.
Results: Methylations of DAPK and CDH1 were seen in 196 and 149 of all 401 subjects, respectively.
Overall, *1249 T carrier was associated with a decreased risk for DAPK methylation, whereas-197 G > A was not. In the subjects older than 60 years old, *1249 T carrier was more strongly
associated with gene methylation and -197 A carrier tended to be associated with an increased risk for
CDH1 methylation. When evaluating by inflammation promoting haplotype (-197 mutant carrier with
*1249 homozygote), this haplotype had a more strongly increased risk for both DAPK and CDH1
methylations in comparatively older subjects. Both atrophy and metaplasia scores were significantly
increased with age in -197 A carrier or *1249 CC homozygote, whereas were not in -197 GG
homozygote or *1249 T carrier. PG I/II ratio was more significantly decreased in -197 A carrier thanin GG homozygote under influence of H. pylori infection.
Conclusions: In -197 A allele carrier with *1249 CC homozygote, the methylations of both DAPK
and CDH1 may be increased gradually, but more rapidly than the other genotypes, with age andaltered gastric mucosal structure induced by H. pylori infection.

‑ 5 ‑１．研究課題名：加齢制御へのアプローチ-老化因子と動脈硬化および発がんの接点-（研究番号
SR2012‐02）
２．キーワード：１）エイジングプロセス (aging process)２）細胞周期 (cell cycle)
３）血管新生 (angiogenesis)
４）動脈硬化 (arteriosclerosis)
５）組織保護 (tissue protection)
３．研究代表者：友杉直久・総合医学研究所・教授・先端医療研究領域

研究分担者：石垣靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

池田
森山
赤尾

崇之・医学部・講師・生化学 II学・金沢医科大学氷見市民病院・教授・泌尿器科
浩慶・医学部・准教授・循環器内科学

４．研 究 目 的
本プロジェクトは、エイジングプロセスと動脈硬化・がんの発症に関する基礎と臨床を結ぶ斬新なトランスレーショナル研究のプラットフォームを提供し、創薬開発に寄与することを目的としている。「酸化ストレスを誘発する因子群」と「酸化ストレス発生後の反応系」
を集中的に解析することを目的とし、当初計画をやや縮小し、以下の 4 課題に焦点を当てた。
「誘発因子群」
1. 細胞周期：ヒト RNA 結合因子を標的とした創薬システムの開発（分担石垣）2. 血管新生：がん悪性度と血管新生、：血管形成関連因子発現（分担池田）「反応系」
3. 動脈硬化：心血管疾患における骨代謝関連分子と細胞外マトリックス代謝（分担赤尾）4. 組織保護機能：造血刺激製剤および高濃度水素水による組織保護機能の解明（分担森山）５．研 究 計 画
1) 細胞周期（分担石垣）：RBM8A と Magoh の細胞内機能を明らかにするために、ノックダウ
ン実験を行って細胞増殖への関与を確認し、さらに、免疫染色実験で細胞内の局在を明らかにする。また、リン酸化制御の役割を解析するために、細胞内および試験管内リン酸化
アッセイを構築して、リン酸化部位や意義について検討を行う。
2) 血管新生（分担池田）：新生血管に関わる VEGF/sFlt-1/hnRNP D の制御機構を明らかにする。
また、転移性が異なるがん細胞株が、腫瘍内に異なった微細構造をもつ血管を誘導することを利用して、その分子基盤を解明することにより、がん転移能決定機構を、遺伝子発現の差とそのシグナル系から明らかにする。これらの因子・遺伝子につき、網膜（連続内皮型）、肝臓（類洞様血管）、腎臓（有窓型血管）での正常血管ネットワーク形成における機‑ 7 ‑能を個体レベルで検証する。
3) 動脈硬化（分担赤尾）：Rotablator 治療は、冠動脈壁の病変を赤血球サイズ以下に粉砕して削り取ることを原理としている。よって本治療により、血管壁構成成分が冠循環に流出し、体循環に一定時間停滞すると予想される。本研究では、Rotablator 治療によって冠循環さらには体循環に流出する血管壁由来分子さらには細胞を、細胞外マトリックス代謝に焦点を絞って分析することで、石灰化病変の臨床的ならびに分子遺伝学的に明らかにする。また、動脈硬化症の危険因子である ABCA1 の変異に対し、既存の治療法の有効性を検討する。
4) 組織保護機能（分担森山）：高蓚酸尿症ラットモデルで惹起される腎機能障害および腎内での蓚酸カルシウム結晶形成機序には、活性酸素による細胞障害が関与していると考えられている。今回我々は高濃度水素水の活性酸素障害抑制能を用い、動物モデルに自由飲水させることにより、腎障害およびカルシウム結晶の尿細管細胞への付着回避が可能であるか検討する。
６．研 究 成 果
1)細胞周期（分担石垣）：RNA 結合因子 RBM8A の、ノックダウンがアポトーシスを誘導すること、同時に中心体の数的な異常を引き起こすこと、また、この分子が中心体に局在していること、中心体への局在時には結合因子 Magoh や中心体因子と結合している可能性が高いことを明らかにした(1,2)。さらに 2 つのセリンがリン酸化されること、このリン酸化は大部分の RBM8A 分子で起きていることを明らかにした。リン酸化の意義を明らかにするために、セリンをアラニンに置換した変異体を細胞内に発現させると、中心体へ局在することから、リン酸化そのものは中心対局在に関与していない可能性が考えられた。リコ
ンビナントタンパク質による試験管内のリン酸化アッセイや細胞での強制発現系を利用した結果、結合因子がリン酸化の阻害に働くことを明らかにした(3)。以上の実験結果から、
RBM8A は翻訳後速やかにリン酸化を受けた後に Magoh と結合し、RNA の代謝に関わると考えられる。おそらく、その一部が何らかの制御を受けて中心体の成熟に関与していると思われる。以上の結果を英文論文に発表するとともに、RNA-タンパク質の複合体形成を観察する技術の展開について総説をまとめて発表した(4,5)。
RBM8A のリン酸化の意義は未だに明らかではないので、変異体を細胞内に発現させた時の影響について解析を行っていきたい。リン酸化を行うキナーゼを同定するために、
siRNA ライブラリーを利用した探索を行ったが、候補キナーゼは同定できなかった。この
結果は、複数のキナーゼが補完的に RBM8A をリン酸化している可能性を示唆するものと思われる。今後はプロテオミクス的な手法等を活用してキナーゼの本体を明らかにし、リン酸化の意義について明らかにしていきたい。また、中心体への局在機構は未だに不明な点が多いため、実験系を工夫して分子機構に迫っていきたいと考えている。

2)血管新生（分担池田）：新生血管の特性の一つとして、vascular endothelial growth factor(VEGF)を取り込むことにより血管新生を抑制する機能を持つ soluble fms-like tyrosine
kinase-1 (sFlt-1)の発現が、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D (hnRNP D)の過剰発現によ‑ 8 ‑り抑制されることを明らかにした(6)。腫瘍血管からそれぞれ血管内皮細胞を分離し遺伝子発現の差を明らかにして、類洞様血管構造形成を行う血管内皮細胞側の遺伝子（群）を同定した。ルイス肺がん由来高転移性細胞株と低転移性細胞株の一次腫瘍の違いを比較した
ところ、高転移性腫瘍内の一部の血管は肝臓類洞マーカーとして知られる LYVE1 の発現が認められた。類洞マーカーの LYVE1 はリンパ管マーカーとしても知られており、高転移性腫瘍がリンパ管を引き込む活性が高いか、もしくは高転移性腫瘍の分泌する成分が血管内
皮前駆細胞をリンパ管内皮細胞に分化させている可能性が考えられた。
一方、高転移性および低転移性一次腫瘍から CD31 陽性の血管内皮細胞を MACS で分離
し、マイクロアレイにより遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、高転移性がん細胞で発現が上昇している遺伝子が約 15 種類、発現が低下している遺伝子が約 10 種類同定され、定量 PCR でそれらの発現を確認した。
また、高転移性細胞の conditioned medium は ES 細胞に対する LYVE1 の発現誘導能が顕著に高く、高転移性細胞の分泌する因子群は血管内皮細胞のリンパ管内皮細胞への分化誘導能が高い可能性が示された。
以上の結果から、リンパ管内皮細胞マーカーの LYVE1 の発現が、高転移性腫瘍血管では低転移性腫瘍血管の約 4 倍高いことが示された。また、高転移性腫瘍血管では VEGF 受
容体の 1 つである NRP1 の発現が低下していた（論文準備中）。今後は、以上の発現に差のあった血管形成関連因子（群）が類洞様血管形成を誘導することを、in vitro およびマウス
個体レベルで検証するとともに、そのシグナル系を解明する予定である。
3)動脈硬化（分担赤尾）：ATP に依存したトランスポーターABC1 は、apoA-I にリン脂質やコレステロールを受渡し HDL を新生するが、その変異は動脈硬化症の危険因子である。このような変異が存在していると、プラバスタチン治療によるうっ血性心不全のリスクを低下させることができないことを明らかになり、動脈硬化症の進展因子の多様性が示唆された(7)。また、Rotablator 治療の前後で、骨代謝関連分子（オステオポンチン、マトリックス
グラプロテイン、オステオプロテゲリン、オステオカルシン、フェチュイン A など）、細胞
外マトリックス (MMPs, TIMPs, Tenascin C)を測定した結果、高度石灰化を伴う冠動脈病変の血管壁には骨代謝関連分子であるオステオポンチン、細胞外マトリックスである MMP9、血管炎症を反映する PTX3 の存在が強く示唆され、骨代謝関連分子（オステオポンチン）や細胞外マトリックス (MMP9, Tenascin C) と血管炎症マーカー (PTX3) との関係より高度石灰化を伴う動脈硬化性心血管疾患の病態には骨代謝関連分子ならびに細胞外マトリッ
クス、そして局所の炎症が深くかかわっていることが示され、新たな動脈硬化の増悪因子が明らかになった（論文準備中）。

4)

組織保護機能（分担森山）：腎機能障害は高濃度水素水投与群にて血清クレアチニン値お
よび BUN 値に影響与えず、組織への影響も PAS 染色で確認する限り保持されていた。Tap
water 群で確認されている蓚酸カルシウム結晶沈着や腎尿細管細胞の apoptosis 変化は高濃度水素水投与群では非常に少なく抑制されていた。高濃度水素水の短期間自由飲水で腎機能障害や結石形成につながる腎組織内での結晶凝集や接着などが回避可能であり、特別な‑ 9 ‑薬剤ではなく水素含有の多い飲料水を摂取するだけで組織障害から回避が可能であり、今後はヒトでの腎機能障害予防や尿路結石症の予防に大きく寄与する可能性が示唆された（論文準備中）。
７．研究の考察・反省本プロジェクトは、動脈硬化やがんなどのエイジングプロセスに関する基礎と臨床を結ぶ
トランスレーショナル研究のプラットフォームを提供し、創薬開発に寄与することを目的として開始した。
「エイジングプロセスの誘発因子群」として、1) 細胞周期（分担石垣）と、2) 血管新生
（分担池田）を対象とした。細胞周期研究では、従来遺伝子を運ぶために必要と考えられていた蛋白質の一群 (EJC) が、がん細胞分裂にも重要な役割を演じていることを見出し、特に細胞分裂期において Magoh/RBM8A が多機能を有していることを裏付ける成果として、ノッ
クダウンによる apoptosis 誘導、中心体への局在、リン酸化ポイント等が明らかにされた。それぞれ世界に先駆けた成果であり、今後の細胞周期を標的とした抗がん剤創薬にも貢献できるものと考えられる。一方、血管新生研究では、VEGF の発現を制御する sFlt-1/ hnRNP D 系の関与が明らかにされ、また、高転移性癌細胞に誘導された腫瘍血管の特徴として、血管内皮細胞のリンパ管内皮細胞への分化の可能性が示された。これらの知見は、易転移性の機序を標的とした抗がん剤の開発につながるものと期待される。
「エイジングプロセスの反応系」としては、3) 動脈硬化（分担赤尾）と、4) 組織保護機
能（分担森山）を対象とした。ABAC1 変異をもつ動脈硬化症例の解析や、Rotablator 治療の前後で得られる血液材料から動脈硬化性病変を評価した画期的な研究になった。その結果、遺伝子変異があっても、そのリスク改善にプラバスタチンが有効であることや、動脈硬化性
心血管疾患の病態には骨代謝関連分子や細胞外マトリックス、そして局所の炎症が深くかかわっていることを明らかにした。これらの結果は、動脈硬化に対しては多様な治療手段が必要であることを示唆しており、今後の治療戦略に大きく貢献できるものと思われる。
今回の研究により、エイジングプロセスの臨床応用までを意識したプラットフォームを提供することができた。今後の、創薬への展開や治療法の開発が期待される。
８．研 究 発 表
① Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Hashimoto M, Shimasaki T, Iwabuchi K, Tomosugi N: Depletionof RNA-binding protein RBM8A (Y14) causes cell cycle deficiency and apoptosis in human cells.
Exp Biol Med 238:889-897(2013)
Abstract: RBM8A (Y14) contains an RNA-binding motif and forms a tight heterodimer with Magoh.
The heterodimer is known to be a member of the exon junction complex that forms on mRNA before
export and it is required for mRNA metabolism processes such as splicing, mRNA export andnonsense-mediated mRNA decay. Recently, deficient cellular proliferation has been observed in
RBM8A- or Magoh-depleted cells. These results prompted us to study the role of RBM8A in cell‑ 10 ‑

cycle progression of human tumour cells. The depletion of RBM8A in A549 cells resulted in poor cell
survival and the accumulation of mitotic cells. After release from G1/S arrest induced by a double
thymidine block, the RBM8A-silenced cells could not proceed to the next G1 phase beyond G2/M
phase. Finally, the sub-G1 population increased and the apoptosis markers caspases 3/7 wereactivated. Silenced cells exhibited an increased frequency of multipolar or monopolar centrosomes,
which may have caused the observed deficiency in cell cycle progression. Finally, silencing of either
RBM8A or Magoh resulted in mutual downregulation of the other protein. These results illustrate that
the RBM8A-Magoh mRNA binding complex is required for M phase progression and both proteins
may be novel targets for anticancer therapy.
② Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Hashimoto M, Iwabuchi K, Tomosugi N: RNA binding protein
RBM8A (Y14) and MAGOH localize to centrosome in human A549 cells. Histochem Cell Biol
141:101-109 (2014)
Abstract: RBM8A (Y14) is carrying RNA-binding motif and forms the tight heterodimer with
MAGOH. The heterodimer is known to be a member of exon junction complex on exporting mRNAand is required for mRNA metabolisms such as splicing, mRNA export and nonsense-mediatedmRNA decay. Almost all RBM8A-MAGOH complexes localize in nucleoplasm and shuttle between
nuclei and cytoplasm for RNA metabolism. Recently, the abnormality of G2/M transition and aberrant
centrosome regulation in RBM8A- or MAGOH-deficient cells has been reported. These results
prompt us to the reevaluation of the localization of RBM8A-MAGOH in human cells. Interestingly,
our immunostaining experiments showed the localization of these proteins in centrosome in addition
to nuclei. Furthermore, the transiently expressed eYFP-tagged RBM8A and Flag-tagged MAGOH
also co-localized with centrosome signals. In addition, the proximity ligation in situ assay was
performed to detect the complex formation in centrosome. Our experiments clearly showed that
Myc-tagged RBM8A and Flag-tagged MAGOH formed a complex in centrosome. GFP-tagged PLK1
also co-localized with Myc-RBM8A. Our results show that RBM8A-MAGOH complex is requiredfor M-phase progression via direct localization to centrosome rather than indirect effect.
③ Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Ma S, Tomosugi N: Phosphorylation status of humanRNA-binding protein 8A in cells and its inhibitory regulation by Magoh. Exp Biol Med (Maywood).
240:438-45 (2015)
Abstract: The RNA-binding protein 8A (RBM8A)-mago-nashi homolog, proliferation-associated(Magoh) complex is a component of the exon junction complex (EJC) required for mRNA
metabolism involving nonsense-mediated mRNA decay (NMD). RBM8A is a phosphorylated proteinthat plays some roles in NMD. However, the detailed status and mechanism of the phosphorylation of
RBM8A is not completely understood. Therefore, in this study, we analyzed in detail RBM8A
phosphorylation in human cells. Accordingly, analysis of the phosphorylation status of RBM8A‑ 11 ‑

protein in whole-cell lysates by using Phos-tag gels revealed that the majority of endogenous RBM8A
was phosphorylated throughout the cell-cycle progression. Nuclear and cytoplasmic RBM8A andRBM8A in the EJC were also found to be mostly phosphorylated. We also screened thephosphorylated serine by mutational analysis using Phos-tag gels to reveal modifications of serine
residues 166 and 168. A single substitution at position 168 that concomitantly abolished thephosphorylation of serine 166 suggested the priority of kinase reaction between these sites.
Furthermore, analysis of the role of the binding protein Magoh in RBM8A phosphorylation revealed
its inhibitory effect in vitro and in vivo. Thus, we conclude that almost all synthesized RBM8A
proteins are rapidly phosphorylated in cells and that phosphorylation occurs before the complex
formation with Magoh.
④ Nakamura Y, Ishigaki Y. Immunostaining and time-lapse analysis of vinblastine-induced paracrystal
formation in human A549 cells. Oncol Lett 8: 2387-2392 (2014)
Abstract: Vinblastine is a vinca alkaloid that binds to tubulin and inhibits microtubule formation incells. Vinblastine treatment results in the formation of paracrystalline aggregates in the cells, which
are formed from tightly packed tubulin molecules. Mitotic spindle assemblies in treated cells are
disrupted and cell cycle progression is arrested at the mitosis phase. Vinblastine is therefore widelyused for cancer treatment. However, the mechanism underlying paracrystal formation has not been
fully elucidated. The present study attempted to observe paracrystal formation in human A549 cells.
Initally, paracrystal formation was detected using the anti-tubulin antibody. Secondly, theexogenousuly

expressed

RFP-conjugatedtubulinalso

formedparacrystals.

Additionally,

immunostaining with the anti-RBM8A antibody overlapped with paracrystal images obtained from
RFP conjugated tubulin. This suggested that the localization of the RBM8A proteins was adjacent to
the tubulin molecules prior to vinblastine treatment. Furthermore, a time-lapse analysis wasdeveloped for paracrystal formation in viable human A549 cells. This was achieved using exogenous
expression of fluorescent proteins conjugated with tubulin and time-lapse microscopy. It may beconcluded that the indicated method was successful for the real-time analysis of paracrystal formationin human cells.
⑤ Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T. Observation of localization and structure of RNA-protein
complexes using light and electron microscopy. J Electr Microsc Tech Med Biol (in press)
Abstract: Between transcription in the nucleoplasm and translation by ribosomes on the roughendoplasmic reticula in the cytoplasm, transcripts undergo various processing events such as splicing,
capping, and poly-adenylation as well as pass through nuclear pore complexes. During each of these
events, mRNA molecule interacts with various proteins to form mRNA-protein complexes (mRNPs).
Visualizing mRNPs is crucial for understanding the mechanisms underlying mRNA processing andelucidating the structure of mRNPs during cellular metabolism. The observation of specific‑ 12 ‑

localization of mRNPs is also important for understanding gene expression mechanisms inpredetermined sites in cells. Recent advances in mRNA imaging permit the detection of real-timemRNA localization in living cells. For this purpose, various labeling techniques are available for thedetection of specific mRNA molecules in living cells. Conversely, electron microscopy is known tohave higher resolution than light microscopy, and it has been used to observe various types of
biological materials. Transmission electron microscopy has been used to visualize the structure of
Balbiani ring-derived large mRNA in insect cells. Furthermore, cryo-electron microscopy has also
been used to analyze the structure of isolated mRNPs. In this review, we introduce advances inmRNA analysis using light and electron microscopy and introduce new perspectives of mRNP
visualization in cells.
⑥ Takayuki Ikeda, Yasuo Yoshitomi, Takeo Shimasaki, Hideki Yamaya, Takashi Kobata, Yasuhito
Ishigaki, Naohisa Tomosugi, Yoshino Yoshitake, Hideto Yonekura. Regulation of soluble Flt-1(VEGFR-1) production by hnRNP D and protein arginine methylation. (in preparation)
Abstract: Soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1), which is produced by mRNA alternativepolyadenylation, functions as a potent inhibitor of angiogenesis by trapping the vascular endothelial
growth factor (VEGF). However, the precise regulatory mechanism of sFlt-1 production is not clear.
In the present study, we report that vascular sFlt-1 production is regulated by heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein D (hnRNP D) through its arginine methylation. hnRNP D overexpression decreasedsFlt-1 mRNA in human microvascular endothelial cells (HMVECs). In contrast, the reduction of
hnRNP D levels induced an increase in sFlt-1 production. Overexpression of an hnRNP D mutant inwhich the arginine residue of the known arginine methylation motif (arginine–glycine–glycine; RGG)
was replaced with alanine did not reduce the level of soluble form RNA produced from the Flt-1
minigene. We also demonstrated that overexpression of arginine methyltransferase decreased thesoluble form RNA level, whereas overexpression of arginine demethylase and addition of
methyltransferase inhibitors increased sFlt-1 mRNA levels. Furthermore, we showed that hnRNP D
bound to Flt-1 pre-mRNA. These findings indicated that hnRNP D and arginine methylation haveimportant roles in the regulation of Flt-1 mRNA alternative polyadenylation.
⑦ Akao H, Polisecki E, Schaefer EJ, Trompet S, Robertson M, Ford I, Jukema JW, de Craen AJM,
Packard C, Buckley BM, Kajinami K. ABCA1 Gene Variation and Heart Disease Risk Reduction in
the Elderly during Pravastatin Treatment. Atherosclerosis. 2014 Jul;235(1):176-81.
Abstract: AIMS: Our goals were to examine the relationships of a specific ATP-binding cassettetransporter A1 (ABCA1) variant, rs2230806 (R219K), on baseline lipids, low-density lipoproteincholesterol (LDL-C) lowering due to pravastatin, baseline heart disease, and cardiac endpoints on
trial.
METHODS AND RESULTS: The ABCA1 R219K variant was assessed in 5414 participants in‑ 13 ‑PROSPER (PROspective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk) (mean age 75.3 years), who had
been randomized to pravastatin 40 mg/day or placebo and followed for a mean of 3.2 years. Of thesesubjects 47.6% carried the variant, with 40.0% carrying one allele, and 7.6% carrying both alleles. No
effects on baseline LDL-C levels were noted, but mean HDL-C increased modestly according to thenumber of variant alleles being present (1.27 vs 1.28 vs 1.30 mmol/L, p = 0.024). No relationships
between the presence or absence of this variant and statin induced LDL-C lowering response or CHD
at baseline were noted. However within trial those with the variant as compared to those without thevariant, the overall adjusted hazard ratio for new cardiovascular disease (fatal CHD, non-fatal
myocardial infarction, or fatal or non-fatal stroke) was 1.22 (95% CI 1.06-1.40, p = 0.006), while forthose in the pravastatin group it was 1.41 (1.15-1.73, p = 0.001), and for those in the placebo group it
was 1.08 (0.89-1.30, p = 0.447) (p for interaction 0.058).
CONCLUSION: Our data indicate that subjects with the ABCA1 R219K variant may get significantly
less heart disease risk reduction from pravastatin treatment than those without the variant.

‑ 14 ‑

１．研究課題名：へき地高齢化社会における心の健康医療システム構築を目指した包括的研究（研究番号SR2012-03）

２．キーワード：１）高齢化社会 (aging society)２）へき地 (remote rural area)
３）生体ストレス (biological stress)
３．研究代表者：川﨑
研究分担者：神田康弘・医学部・教授・精神神経科学
享勉・医学部・教授・地域医療学

森本茂人・医学部・教授・高齢医学

岩淵邦芳・医学部・教授・生化学 I加藤伸郎・医学部・教授・生理学 I

八田稔久・医学部・教授・解剖学 I米倉秀人・医学部・教授・生化学 II

４．研 究 目 的
平成 23 年 7 月に厚生労働省は地域医療の基本方針となる医療計画として 5 大疾患（がん、
脳卒中、心臓病、糖尿病、精神疾患）を指定した。精神疾患が追加された理由として、高齢化に伴う認知症と社会状況の深刻化によるうつ病の患者数増加が今後もつづくことが予想され、国民に広く関わる疾患として重点的な対策が必要と判断されたことがあげられる。特に問題とされているのは 60 歳以上の高齢者に自殺者が多いことで、日本の高齢者の自殺率
は諸外国と比較しても高く、都市部に比べて農村部で高いことなどがわかっている。高齢者の自殺の背景には、健康問題という持続的な身体苦痛、対人交流や生活環境の不良、診療を避ける傾向などが認知症やうつ病の発症リスクとなり、発見の遅れが重篤化や不幸な転帰につながっているという事実がある。研究チームの森本・神田らは、過疎地高齢者の生活機能低下の発現にうつ状態の存在が大きく関与していることを明らかにしている。本プロジェク
トの臨床研究では、認知症とうつ病という二つの病態の相互作用と、疾病自体の問題と患者に生じる心理・社会的問題の相互作用について過疎地高齢者における実態を調査・把握し、それに基づいて個々の病態に応じた革新的な予防・治療法を開発することを試みる。基礎研究においては、うつ病、認知症モデルマウスに対する革新的な治療法の開発を進めてきた加藤、発生工学的手法による胎生期での遺伝子欠損法を用いて、知と心の疾患スペクトラムの種々の側面を示す疾患モデル動物群の作製法の開発を進めてきた米倉、八田、さらにこれらの疾患に共通する最も重要な細胞生理学的イベントである細胞死を制御するメカニズムの解析を進めてきた岩淵が連携することで、知と心の疾患の発症メカニズムに迫るとともに、その治療法の開発を目指す。

‑ 15 ‑

５．研 究 計 画
本プロジェクトでは、厚生労働省の医療政策である精神疾患とへき地医療福祉に力点をおいた臨床研究を組織する。すなわち、①認知症とうつ病という患者数が多く死亡率も高い疾患を対象とし、病態解明のために基礎医学で見いだされた知見を臨床医学において確認することで知識を統合する。②得られた知見をもとに、妥当性や再現性のある対象の特定（診断）法を開発する。それらは簡便なスクリーニングから、高度な臨床診断技術までが含まれる。
③診断された対象の病態に応じ、実行可能で患者・家族、および医療・福祉・行政等の各分
野で利用でき、効果に満足できるような介入（予防・治療）法を開発する。精神疾患成因に関する「神経形成不全仮説」によれば、ストレス障害・気分障害は中枢神経系（特に海馬）の発達期にその潜在的基底が構成される。すなわち、ストレス耐性が脆弱な脳が発達期に形成されると、成熟期に至って他の人がコーピング（克服）可能なストレスであっても耐えられずストレス障害として顕在化し、やがてそれがうつ病など他の病像へと進展していく。この仮説を検証するため本プロジェクトの基礎研究では、胎生期のマウス脳に様々な遺伝子に対する shRNA を発現させ、遺伝子発現欠損の状態で生まれてきたマウスの成熟期での行動を解析することにより、認知症単発モデル、うつ病単発モデルまたは併発モデルマウスの作製を目指す。さらにこれらのマウスを用いて、神経系の発達障害、とりわけ海馬における神経細胞死に、血管関連因子の発現異常、DNA 損傷とその修復因子の発現異常が関与していな
いかを調べるとともに、発現欠損遺伝子のレスキューにより疾患発症の抑制を試みる。
６．研 究 成 果
（臨床研究）住民を対象とした心の健康の啓発普及活動として、内灘町と氷見市において「認知症サポーター養成講座」を開催するために、内灘町と共催で講師養成研修を平成 26
年 6 月に開催し、内灘町職員と民生委員、金沢医科大学医学部と看護学部の学生および教員、
金沢医科大学病院の医師、看護師、事務職員など、42 名の講師を養成した。氷見市の僻地医療対象地域に居住する 65 歳以上の高齢者を対象とした現地調査は、平成 25 年 8 月と平成 26
年 8 月におこなわれた。調査員は金沢医科大学医学部と看護学部の学生および教員、金沢医科大学病院の医師、看護師、臨床心理士、作業療法士、臨床研修医など、のべ 50 名で、調査手技修得のために事前に 6 時間の研修を受けた。調査員は一連の活動参加前後において、認知症や精神疾患に対する理解や、対象障害者に対する共感性が向上することが質的調査により確認された。のべ 250 戸の訪問調査がおこなわれ 100 例の高齢者住民のデータが収集された。その結果、対象高齢者の認知症の程度は境界域から軽度であり、生活障害度、認知機能、嗅覚機能の成績には関連が見られた。平成 25 年の調査結果については、氷見市の包括支援センターや氷見市民病院の地域医療センターと情報を共有し医療機関受診等の契機となった。
内灘町に在住する高齢者の匿名化生活機能評価基本チェックシートデータ、健康診査デー
タから後に要支援・要介護状態となった対象を抽出し、初年度の独立有意関与因子につき健常例を対照群として Cox-Hazard 回帰分析により検討し、幾つかの特徴が予測因子となり得ることを確認した。

‑ 16 ‑

（基礎研究）認知症における運動の効果、抗糖尿病薬の有効性を検証する目的で、APE ノックアウトマウスに高脂肪食を 3 か月摂取させると認知機能の低下を生じさせた。抗糖尿病薬（DPP4 阻害剤）か自発運動で認知機能を改善させられるか検討したところ、自発運動群
では記憶障害の指標である Moris

Water Maze テストに、すぐれた改善効果が認められた。

また組織の重量比較でも、脳の委縮が抑制され、脂肪肝になった肝腫大が軽減していた。
アルツハイマー病モデル、強制水泳うつ病モデルに加えて、臨床的にしばしばみられるア
ルツハイマー病とうつ病を合併したモデルマウスの作製に成功した。うつ病モデルマウスについては、トランスクリプトーム解析が進行しており、その他のマウスについても順次進めていける状態となった。さらに平成 25 年度には、血清、血漿、尿から安定してエクソソームと miRNA を精製できるようになった。これにより、モデルマウスの脳を用いたエクソソー
ム解析も可能となった。
母体に何らかの刺激を与えることにより、母-胎児間 LIF シグナルリレーの破たんを誘導し、胎児脳形成障害を引き起こす系が確立された。母体の炎症による胎児脳形成障害は、母体由来の IL-6 が胎児脳に移行し直接神経細胞死を引き起こすとする、従来の脳破壊モデルとは異なる全く新しいモデルである。大脳皮質の損傷によって発現する何らかの液性因子が、海馬機能に影響を与えることが示唆された。また DNA 損傷修復蛋白質の減少が、神経幹細胞の分化を誘導し、神経幹細胞の枯渇を引き起こす可能性が示唆された。
７．研究の考察・反省（臨床研究）僻地高齢者の現地調査では、対象集団の特徴を定量的に観察評価できるまでの症例数を得ることは困難であるため、質的研究や症例研究の手法をもちいる必要がある。
高齢者の病態と関連する生物学的な特徴を科学的に抽出するために、金沢医科大学病院と氷見市民病院を受診する高齢者を対象に臨床研究をおこなっているが、地域連携を強化しながら対象の収集に努め、調査や診療連携に使用している指標に加えて、病態を高度な医学的検査も施行する。これらの結果を英文論文とする計画である。
（基礎研究）計画していた、精子への shRNA 発現ウイルス感染による遺伝子発現欠損マウスの作製には成功していない。現在、脳海馬へのレンチウイルスの直接注入による遺伝子発
現ノックダウンを検討している。また組織・細胞特異的に DNA 切断酵素 Cre を発現するトランスジェニックマウスを用意し、Cre 依存性に shRNA を発現するレンチウイルスを注入して組織・細胞特異的な遺伝子ノックダウンを行う方法も検討している。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 17 ‑

１．研究課題名：メタボリック症候群に伴う心、腎、肝障害の発生機序の解明と飲酒の影響（研SR2012-04）

究番号

２．キーワード：１）メタボリック症候群 (metabolic syndrome)２）アルコール性肝障害 (alcoholic liver disease)３）非アルコール性脂肪肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis)
４）終末糖化産物 (advanced glycation end-products)５）肝虚血再灌流障害 (hepatic ischemic-reperfusion injury)
３．研究代表者：堤研究分担者：北山幹宏・医学部・教授・肝胆膵内科
道彦・医学部・教授・心血管カテーテル治療科

石崎昌夫・医学部・准教授・衛生学

上西博章・金沢医科大学病院・准教授・生活習慣病センター

中西由美子・金沢医科大学病院・准教授・健康管理センター
芝本利重・医学部・教授・生理学Ⅱ

竹内正義・総合医学研究所・教授・先端医療研究領域

清水章・医学部・非常勤講師・腎臓内科学 （日本医科大学・第一病理学・教授）

４．研 究 目 的
肥満を基盤にして発症する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化などの生活習慣病の罹患率が急増している。特に、内臓脂肪型肥満は心血管合併症に強く関連するだけでなく、内臓脂肪組織からの遊離脂肪酸およびアディポサイトカインが門脈を介して肝臓に取り込まれることから、脂肪肝をはじめ非アルコール性脂肪肝炎(NASH)を発生させ、インシュリン抵抗性高血糖をもたらすことになる。一方、飲酒は様々な臓器に大きな影響を与える生活習慣のひとつであるが、特に肝、心、腎および血管に対して大きな影響を及ぼす。今回、内臓脂肪型肥満に伴う糖尿病、高脂血症をはじめ心・腎血管障害および NASH の発生機序を明らかにするとともに、それらの発生に及ぼす飲酒（常習および機会飲酒）の影響について検討することとした。
５．研 究 計 画
1) 動物モデルを用いた検討① 過 食 に よ り 肥 満 、 高 脂 血 症 、 糖 尿 病 お よ び 脂 肪 肝 を 自 然 発 症 す る OLETF (Otsuka
Long-Evans Tokushima Fatty) ラットとその wild type である OLET (Otsuka Long-Evans
Tokushima) ラットにエタノールを投与し、メタボリック症候群に及ぼす飲酒の影響について検討を行った。
② Wister 雄性ラットに 5%含有アルコール飼料を投与し、アセトアルデヒド由来終末糖化産物 (AA-AGE) がアルコール性脂肪肝に及ぼす影響について検討を行った。

‑ 19 ‑

③ ICR マウスにアルコールを長期間投与し、アルコール性脂肪肝から肝癌が発生し得るか否かについて検討を行った。
④ in vivo および in vitro における肝虚血再灌流障害に及ぼすアルコールおよび肥満の影響とその予防に関する検討を行った。
⑤ AGEs に対するモノクローナル抗体の作成を行った。
2) 臨床研究① 健康管理センターおよび生活習慣病センターを受診したヒトを対象に、肥満度、食事内容、
運動状況、各種血液学的検査を飲酒量別に解析し、メタボリック症候群に及ぼす飲酒の影
響を明らかにするとともに、冠動脈の石灰化指数、腹部超音波による脂肪肝の有無と動脈硬化に及ぼす影響についても検討を行った。
６．研 究 成 果
① OLETF ラットおよびその wild type の OLET ラットに 10%エタノールあるいは水 10ml を週
5、3、2、1 回、3 週間投与を行ったが、OLETF ラットでは、週 1 回のエタノール投与によって、NASH が発症したが、OLET ラットでは、週 5 回のエタノール投与によっても肝組織に明らかな変化は認められなかった。また、体重の増加に伴って CYP2E1 が誘導されることも示し、誘導された CYP2E1 によってエタノールが代謝される際に活性酸素がされることも明らかしたが、この活性酸素により肥満による単純性脂肪肝から NASH が発症することを証明した。
② アセトアルデヒド由来の AGE、すなわち AA-AGE はエタノールの代謝に伴って生じ、極めて肝毒性が強いことを培養肝細胞を用いた検討により明らかにした。また、エタノール含有液体飼料で 4 週間飼育したラット肝では、主に中心静脈域の肝細胞において産生されること、産生された AA-AGE は 6 週間の禁酒により消失することを抗 AA-AGE 抗体を用いた免疫組織化学的染色により明らかにした。以上のことから、中心静脈周囲性に起こるアルコール性肝障害の発生に AA-AGE が関与していることが示唆された。
③ アルコールを 60 週から 70 週間と長期間マウスに投与することにより、肝細胞癌が高率に発生することを示し、長期間の飲酒による慢性的な肝細胞傷害が、肝細胞の老化を促進させ、肝細胞癌の発生にも促進的に作用していることを明らかにした。
④ 肥満に伴う高脂血症、糖尿病および脂肪肝は、動脈硬化を促進することを明らかにしたが、動脈硬化の発生の早期マーカーとして γ-GTP が有用であることを示唆する成績が得られた。
⑤ 生体内で生成される各種 AGEs の中でも、特に糖代謝中間体に由来するグリセルアルデヒ
ド由来 AGEs(GA-AGEs)は、糖尿病血管合併症の発症・進展に強く関わっている他、NASHなどの肝疾患にも関与することが示されているが、今回、GA-AGEs に対するモノクローナ
ル抗体の作成に成功した。
⑥ 肝虚血再灌流障害ラットモデルを用い、
γGTP 活性を特異的に阻害する薬剤である GGｓToPの投与が肝虚血再灌流障害の発生を抑制することを確認することができた。また、肥満ラットに対して運動療法を行い、その後の肝虚血再灌流障害について検討したが、運動療法‑ 20 ‑

により、虚血再灌流による肝障害の程度を抑制する可能性のある知見が得られた。
７．研究の考察・反省
本研究により、肥満に伴って生じる単純性脂肪肝から NASH の発生に、週 1 回程度の飲酒が関与していることが明らかになったので、今後、非アルコール性脂肪肝患者について検討を行いたいと考えている。また、肥満に伴う高脂血症、糖尿病および脂肪肝は、動脈硬化を促進することを明らかにし、動脈硬化の発生の早期マーカーとして血清 γ-GTP 値が有用であることを示唆する成績が得られた。今後、前向きのコホート研究を行い、血清 γGTP 値の有用性の検討を行いたい。ラットを用いた検討により、アルコール性肝障害の発生に AA-AGEの関与を示唆する成績が得られたので、アルコール性肝障害患者の血清 AA-AGE 値の検討を行う予定である。また、GA-AGE のモノクローナル抗体を用い、アルコール性および非アルコール性患者について測定し、両疾患の差異等々の検討を行うことにしている。本研究では、肥満、飲酒が肝虚血再灌流障害を増悪させること、運動療法や γGTP 活性阻害薬が、その予防に極めて有効であることも明らかにすることができた。本研究では、狭心症および心筋梗
塞患者を対象に、冠動脈の狭窄率、冠動脈の閉塞数および再発率をメタボリック症候群の有無と飲酒量別に解析し、飲酒の及ぼす影響を明らかにすることを企図していたが、研究期間内でデータを解析することができなかったが、今後引き続いて検討する予定である。また、
家兎 NASH 肝硬変モデルを用い、脂肪肝から NASH、NASH から肝硬変の継時的推移を検討し、NASH 発生の因子を明らかにし、高脂血症、糖尿病と動脈硬化の関係についても検討することを企図したが、NASH 肝硬変モデルの家兎が高価であり、本研究費では購入することができなかったが、今後研究費を捻出して検討する予定である。
８．研 究 発 表
① Zhang W, Shibamoto T, Kuda Y, Shinomiya S, Kurata Y. The responses of the hepatic andsplanchnic vascular beds to vasopressin in rats. Biomed Res. 2012; 33(2): 83-88.
Abstract: Vasopressin, a vasoactive peptide, causes vasoconstriction via V1a vasopressin receptors.
Unlike other vasoconstrictor agents, vasopressin also has vasodilatory properties. The purpose of thisstudy was to determine the effect of vasopressin on hepatic and splanchnic circulation in SpragueDawley rats. The experiments were conducted in not only isolated blood- and constant flowperfusedlivers but also anesthetized spontaneously breathing rats. In anesthetized rats, portal venous pressure(Ppv), systemic arterial pressure (Psa), central venous pressure, and hepatic blood flow (HBF) of
combined portal venous and hepatic arterial blood flow were continuously measured, and splanchnic
vascular bed resistance (Rspl) defined by (Psa - Ppv) / HBF was determined. In perfused livers,
vasopressin at 0.1-1,000 nM caused weak venoconstriction as evidenced by small increase in Ppv. In
anesthetized rats, when vasopressin was injected into the portal vein as a bolus consecutively at
0.01-100 nmol/kg, Psa increased dose-dependently with the peak increment of 60 ± 18 mmHg at 100
nmol/kg. Ppv and HBF decreased, with resultant increase in Rspl, indicating splanchnic‑ 21 ‑

vasoconstriction. In conclusion, hepatic venoconstrictor action of vasopressin was weak in rats.
Vasopressin causes splanchnic vasoconstriction, resulting in a decrease in HBF and Ppv inanesthetized rats.
② Zhang W, Shibamoto T, Kuda Y, Kurata Y, Shinomiya S, Kida M, Tsuchida H. Vascular perfusion
limits mesenteric lymph flow during anaphylactic hypotension in rats. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol. 2012; 302(10): R1191-R1196.
Abstract: To determine fluid extravasation in the splanchnic vascular bed during anaphylactic
hypotension, the mesenteric lymph flow (Q(lym)) was measured in anesthetized rats sensitized with
ovalbumin, along with the systemic arterial pressure (P(sa)) and portal venous pressure (P(pv)). Whenthe antigen was injected into the sensitized rats (n = 10), P(sa) decreased from 125 ± 4 to 37 ± 2
mmHg at 10 min with a gradual recovery, whereas P(pv) increased by 16 mmHg at 2 min andreturned to the baseline at 10 min. Q(lym) increased 3.3-fold from the baseline of 0.023 ± 0.002
g/min to the peak levels of 0.075 ± 0.009 g/min at 2 min and returned to the baseline within 12 min.
The lymph protein concentrations increased after antigen, a finding indicating increased vascularpermeability. To determine the role of the P(pv) increase in the antigen-induced increase in Q(lym),P(pv) of the nonsensitized rats (n = 10) was mechanically elevated in a manner similar to that of thesensitized rats by compressing the portal vein near the hepatic hilus. Unexpectedly, P(pv) elevation
alone produced a similar increase in Q(lym), with the peak comparable to that of the sensitized rats.
This finding aroused a question why the antigen-induced increase in Q(lym) was limited despite thepresence of increased vascular permeability. Thus the changes in splanchnic vascular surface area
were assessed by measuring the mesenteric arterial flow. The mesenteric arterial flow was decreasedmuch more in the sensitized rats (75%; n = 5) than the nonsensitized P(pv) elevated rats (50%; n = 5).
In conclusion, mesenteric lymph flow increases transiently after antigen presumably due to increased
capillary pressure of the splanchnic vascular bed via downstream P(pv) elevation and perfusion andincreased vascular permeability in anesthetized rats. However, this increased extravasation issubsequently limited by decreases in vascular surface area and filtration pressure.
③ Mutusmi Tsuchishima, Joseph George, Hisakazu Shiroeda, Tomiyasu Arisawa, Tsutomu Takegami,
Mikihiro Tsutsumi: Chronic Ingestion of Ethanol Induces Hepatocellular Carcinoma. Dig Dis Sci
2013; 58:1923–1933
Abstract: BACKGROUND: Chronic intake of alcohol increases the risk of gastrointestinal andhepatic carcinogenesis. The present study was focused to investigate the incidence and mechanism ofpathogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC) during chronic ingestion of alcohol without any
additional hepatic injury.
METHODS: Ethanol was administered to Institute for Cancer Research male mice through drinking
water for 70 weeks at concentrations of 5 % (first week), 10 % (next 8 weeks), and 15 % thereafter.

‑ 22 ‑

The animals were killed at 60 and 70 weeks, the livers were examined for hepatic tumors, andevaluated for foci of cellular alteration (FCA). Immunohistochemical staining was performed in theliver sections for cytochrome P4502E1 (CYP2E1), 4-hydroxy-nonenal (4-HNE), and proto-oncogene,c-Myc.
RESULTS: At the 60th week, 40 % of the mice in the ethanol group had visible white nodules (5-10mm) in the liver, but not in the control mice. At the 70th week, several larger nodules (5-22 mm) were
present in the livers of 50 % mice in the ethanol group. In the control group, one mouse developed asingle nodule. All nodules were histologically trabecular HCC composed of eosinophilic andvacuolated cells. In the livers of both control and ethanol group, several foci with cellular alteration
were present, which were significantly higher in ethanol group. Staining for CYP2E1, 4-HNE andc-Myc depicted marked upregulation of all these molecules in the FCA.
CONCLUSIONS: Our data demonstrated that upregulation of CYP2E1 and subsequent production ofreactive oxygen species along with the persistent expression of c-Myc play a significant role in thepathogenesis of HCC during chronic ingestion of ethanol.
④ Hayashi N, George J, Takeuchi M, Fukumura A, Toshikuni N, Arisawa T, Tsutsumi M:
Acetaldehyde-derived Advanced Glycation End-products Promote Alcoholic Liver Disease. PLoS
One 2013; 26;8(7):e70034.
Abstract: BACKGROUND: Chronic ingestion of ethanol increases acetaldehyde and leads to the
production of acetaldehyde-derived advanced glycation end-products (AA-AGE). We evaluated the
toxicity of AA-AGE on hepatocytes and studied the role of AA-AGE in the pathogenesis of alcoholic
liver disease (ALD).
METHODS: Rat hepatocyte cultures were treated with N-ethyllysine (NEL) or AA-AGE and the cell
viability was evaluated using MTT assay. Male Wistar rats were fed with liquid diet containing 5%ethanol for 8 weeks following normal diet for another 12 weeks. A group of animals was sacrificed at
4th, 6th, and 8th week and the remaining animals at 12th, 14th, 16th, 18th, and 20th week. The liver
sections were stained for AA-AGE and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE). Liver biopsy obtained from
ALD patients was also stained for AA-AGE and 4-HNE.
RESULTS: Hepatocyte viability was significantly reduced in cultures treated with AA-AGE comparedto NEL treated or control cultures. Severe fatty degeneration was observed during chronic
administration of ethanol increasing from 4-8 weeks. The staining of AA-AGE and 4-HNE wascorrelated with the degree of ALD in both rat and human. In rats, hepatic fatty degeneration wascompletely disappeared and the staining for both AA-AGE and 4-HNE returned to normal at 12th
week of abstinence. Staining for AA-AGE and 4-HNE was completely absent in normal human liver.
CONCLUSIONS: The data demonstrated that AA-AGE is toxic to hepatocytes, but not NEL. Chronic
ethanol ingestion produces AA-AGE and reactive oxygen species that contribute to the pathogenesisof ALD. Abstinence of alcohol results in complete disappearance of both AA-AGE and 4-HNE along‑ 23 ‑

with fatty degeneration suggesting that AA-AGE plays a significant role in the pathogenesis of ALD.
⑤ Kitadate M, Shibamoto T, Tsutsumi M, Tonami H. Portal venular constriction during anaphylactic
shock in anesthetized rats. Biomed Res. 2013; 34(2): 61-68.
Abstract: Hepatic venoconstriction occurs in rat anaphylactic hypotension. However, the exact
venoconstrictive site remains unknown, and we therefore attempted to determine its location by using
hepatic venography and histology. Anaphylaxis was induced in anesthetized Sprague-Dawley rats byi.v. administration of ovalbumin antigen. Venography of the portal vein (n = 8) was obtained atbaseline and maximal hepatic venoconstriction. We separately examined photomicrographs of theliver sections. Along with systemic hypotension, portal venous pressure increased to a peak of 28 ± 3
cm- H2O at 2 min after antigen injection. Post-antigen portal venography revealed that 40% of portal
venuls (76 vessels/total 188 vessels) with diameters from 160 to 300 μm were not visualized,
suggesting that stenosis or obliteration occurred distally. The corresponding upstream portal vessels
exhibited markedly bulging. Stenosis was also observed in some portal branches with diameters from180 to 420 μm (9%; 17 vessels/total 188 vessels). Light microscopically, most portal venules with anestimated baseline diameter less than 110 μm showed stenosis, but statistically significant stenosis
was found in those with baseline diameters of 20-70 μm. In conclusion, anaphylactic hepatic
venoconstriction occurs over a wide range of portal veins with diameters less than 420 μm, and occurs
markedly in portal venules with diameters less than 70 μm in anesthetized rats.
⑥ Toyota I, Tanida M, Shibamoto T, Wang M, Kurata Y, Tonami H. MRI reveals edema in larynx (butnot brain) during anaphylactic hypotension in anesthetized rats. Allergy Asthma Immunol Res. 2013;
5(6): 389-396.
Abstract: Purpose: Anaphylactic shock is sometimes accompanied by local interstitial edema due toincreased vascular permeability. We performed magnetic resonance imaging (MRI) to compare edemain the larynx and brain of anesthetized rats during anaphylactic hypotension versus
vasodilator-induced hypotension.
Methods: Male Sprague Dawley rats were subjected to hypotension induced by the ovalbumin antigen(n=7) or a vasodilator sodium nitroprusside (SNP; n=7). Apparent diffusion coefficient (ADC) andT2-relaxation time (T2RT) were quantified on MRI performed repeatedly for up to 68 min after the
injection of either agent. The presence of laryngeal edema was also examined by histologicalexamination. Separately, the occurrence of brain edema was assessed by measuring brain watercontent using the wet/dry method in rats with anaphylaxis (n=5) or SNP (n=5) and thenon-hypotensive control rats (n=5). Mast cells in hypothalamus were morphologically examined.
Results: Mean arterial blood pressure similarly decreased to 35 mmHg after an injection of theantigen or SNP. Hyperintensity on T2-weighted images (as reflected by elevated T2RT) was found in
the larynx as early as 13 min after an injection of the antigen, but not SNP. A postmortem histological‑ 24 ‑

examination revealed epiglottic edema in the rats with anaphylaxis, but not SNP. In contrast, nosignificant changes in T2RT or ADC were detectable in the brains of any rats studied. In separate
experiments, the quantified brain water content did not increase in either anaphylaxis or SNP rats, ascompared with the non-hypotensive control rats. The numbers of mast cells with metachromatic
granules in the hypothalamus were not different between rats with anaphylaxis and SNP, suggesting
the absence of anaphylactic reaction in hypothalamus.
Conclusion: Edema was detected using the MRI technique in the larynx during rat anaphylaxis, but
not in the brain.
⑦ Zhang W, Shibamoto T, Tanida M, Wang M, Sun L, Kurata Y. Rat hepatic and splanchnic vascularresponses to anaphylactic shock, compared with hemorrhagic or vasodilator-induced shock. In Vivo.
2013; 27(4): 485-493.
Abstract: BACKGROUND: Hemodynamics during anaphylactic shock remain unclear. We
determined hepatic and splanchnic responses to anaphylactic hypotension, compared withhemorrhage or sodium nitroprusside (SNP)-induced hypotension, in anesthetized rats.
MATERIALS AND METHODS: Portal pressure, systemic arterial pressure (SAP), central venous
pressure, portal and hepatic arterial blood flow were measured. Splanchnic (Rspl), portal venous(Rpv), and hepatic arterial (Rha) resistances were determined.
RESULTS: In rats with anaphylaxis induced by an intravenous injection of the ovalbumin antigen(n=6), hemorrhage (n=6), and SNP (2 mg/kg, n=6), SAP decreased similarly. During anaphylaxis,
Rha and Rspl decreased only at 30 s after the antigen injection. Notably, Rpv increased markedly.
During hemorrhage, Rspl and Rha increased and decreased, respectively, with Rpv not changing.
After SNP, Rha and Rspl decreased with Rpv not changing.
CONCLUSION: Hepatic and splanchnic vascular responses differ according to the type of shock.
Anaphylactic hypotension is characterized by markedly increased portal venous resistance.
Splanchnic and hepatic artery dilatation occurs only at the beginning of hypotension in anesthetizedrats.
⑧ Wang M, Tanida M, Shibamoto T, Kurata Y. Alpha-adrenoceptor antagonists and chemical
sympathectomy exacerbate anaphylaxis-induced hypotension, but not portal hypertension, in
anesthetized rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2013; 305(8): R900-R907.
Abstract: Anaphylactic shock is sometimes life-threatening, and it is accompanied by hepatic
venoconstriction in animals, which, in part, accounts for anaphylactic hypotension. Roles of
norepinephrine and α-adrenoceptor in anaphylaxis-induced hypotension and portal hypertension were
investigated in anesthetized ovalbumin-sensitized Sprague-Dawley rats. The sensitized rats wererandomly allocated to the following pretreatment groups (n = 6/group): 1) control (nonpretreatment),2) α1-adrenoceptor antagonist prazosin, 3) nonselective α-adrenoceptor antagonist phentolamine, 4)‑ 25 ‑

6-hydroxydopamine-induced chemical sympathectomy, and 5) surgical hepatic sympathectomy.
Anaphylactic shock was induced by an intravenous injection of the antigen. The systemic arterialpressure (SAP), central venous pressure (CVP), portal venous pressure (PVP), and portal venous
blood flow (PBF) were measured, and splanchnic [Rspl: (SAP-PVP)/PBF] and portal venous [Rpv:(PVP-CVP)/PBF] resistances were determined. Separately, we measured efferent hepatic sympathetic
nerve activity during anaphylaxis. In the control group, SAP markedly decreased, followed by agradual recovery toward baseline. PVP and Rpv increased 3.2- and 23.3-fold, respectively, after
antigen. Rspl decreased immediately, but only transiently, after antigen, and then increased 1.5-foldlater than 10 min. The α-adrenoceptor antagonist pretreatment or chemical sympathectomy inhibitedthe late increase in Rspl and the SAP recovery. Pretreatment with α-adrenoceptor antagonists, oreither chemical or surgical hepatic sympathectomy, did not affect the antigen-induced increase in Rpv.
Hepatic sympathetic nerve activity did not significantly change after antigen. In conclusion,
α-adrenoceptor

antagonists

andchemical

sympathectomy

exacerbate

anaphylaxis-induced

hypotension, but not portal hypertension, in anesthetized rats. Hepatic sympathetic nerves are not
involved in anaphylactic portal hypertension.
⑨ Kuda Y, Kurata Y, Wang M, Tanida M, Shibamoto T. Major contribution of vasospasm-induced
coronary blood flow reduction to anaphylactic ventricular dysfunction assessed in isolated
blood-perfused rat heart. Cardiol J. 2014; 21(1): 11-17.
Abstract: BACKGROUND: Cardiac anaphylaxis is accompanied by coronary spasm and decreased
left ventricular (LV) contractility. However, it has not been determined experimentally whether LV
dysfunction during anaphylaxis is induced mainly by reduced coronary blood flow (CBF) or direct
negative inotropic actions of chemical mediators. To demonstrate the major role of CBF reduction inanaphylactic LV dysfunction, we determined LV contractility during anaphylaxis and forcible CBF
reduction maneuver to reproduce the anaphylaxis-induced CBF reduction in isolated blood-perfused
rat hearts.
METHODS: Isolated hearts from Wistar rats in the ovalbumin-sensitized anaphylaxis, non-sensitizedflow reduction, and non-sensitized time control group were subjected to coronary perfusion withblood at a constant pressure and measurements of CBF and LV pressure. Cardiac anaphylaxis was
induced by intracoronary injections of ovalbumin antigen.
RESULTS: In response to antigen administrations, sensitized anaphylaxis group rat hearts showeddecreases in CBF and the maximum increasing rate of systolic LV pressure (dP/dtmax) with anincreased coronary vascular resistance as evidence of coronary spasm. The non-sensitized flow
reduction group rat hearts whose CBF was forcibly reduced as in anaphylaxis showed the same
degree of dP/dtmax reduction.
CONCLUSIONS: The contractile failure during cardiac anaphylaxis is caused mainly by decreased
CBF due to coronary spasm.

‑ 26 ‑

⑩ Wang M, Shibamoto T, Kuda Y, Sun L, Tanida M, Kurata Y. Angiotensin II and vasopressin are
involved in the defense system against anaphylactic hypotension in anesthetized rats. Eur J Pharmacol.
2014; 731:38–43
Abstract: Anaphylactic shock is sometimes life-threatening, but the defense system against thiscirculatory failure was not fully understood. Ameliorating roles of angiotensin (ANG) II andvasopressin in anaphylactic hypotension were investigated in anesthetized ovalbumin-sensitizedSprague-Dawley rats. The sensitized rats were randomly allocated to the following pretreatmentgroups (n=7/group): (1) control (non-pretreatment), (2) ANG II synthesis inhibitor captopril, (3) ANG
II receptor antagonist losartan, and (4) V1a vasopressin receptor antagonist. Anaphylactic shock was
induced by an intravenous injection of the antigen. The systemic arterial pressure (SAP), central
venous pressure (CVP), portal venous pressure (PVP) and portal venous blood flow (PBF) were
measured, and splanchnic vascular resistance (Rspl: (SAP-PVP)/PBF) was determined. In the control
group, SAP markedly decreased, followed by a gradual recovery toward baseline. Rspl transiently
decreased immediately after antigen, and then increased 1.5-fold at 15 min and thereafter. The
pretreatment with either losartan, captopril or V1a receptor antagonist augmented the initial fall of
SAP and attenuated the SAP recovery along with augmentation of the late increase in Rspl. The 2-hsurvival rate was significantly smaller in either pretreatment group than in the control group (100%).
Plasma levels of ANG II and vasopressin increased to 3.8- and 9.8-fold, respectively, at 30 min after
antigen in the control group, whereas captopril pretreatment inhibited the increase in ANG II. In
conclusion, inhibition of ANG II or vasopressin exacerbates anaphylaxis-induced hypotension inanesthetized rats.
⑪ Takahiro Minato, Mikihiro Tsutsumi, Mutsumi Tsuchishima, Nobuhiko Hayashi, Takashi Saito,
Yasuhiro Matsue, Nobuyuki Toshikuni, Tomiyasu Arisawa, Joseph George: Binge alcohol
consumption aggravates oxidative stress and promotes pathogenesis of NASH from obesity induced
simple steatosis. Mol. Med. 2014 ; 20:490-502
Abstract: The pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is a two-stage process in which
steatosis is the "first hit" and an unknown "second hit." We hypothesized that "a binge" could be a"second hit" to develop NASH from obesity-induced simple steatosis. Thirty-week-old male Otsuka
Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) rats were administered 10 mL of 10% ethanol orally for 5, 3, 2,
and 1 d/wk for 3 consecutive weeks. As control, male Otsuka Long-Evans Tokushima (OLET) rats
were administered the same amount of alcohol. Various biochemical parameters of obesity, steatosis
and NASH were monitored in serum and liver specimens in untreated and ethanol-treated rats. The
liver sections were evaluated for histopathological alterations of NASH and stained for cytochrome
P-4502E1 (CYP2E1) and 4-hydroxy-nonenal (4-HNE). Simple steatosis, hyperinsulinemia,
hyperglycemia, insulin resistance, hypertriglycemia and marked increases in hepatic CYP2E1 and‑ 27 ‑

4-HNE were present in 30-wk-old untreated OLETF rats. Massive steatohepatitis with hepatocyte
ballooning was observed in the livers of all OLETF rats treated with ethanol. Serum and hepatic
triglyceride levels as well as tumor necrosis factor (TNF)-α mRNA were markedly increased in all
ethanol-treated OLETF rats. Staining for CYP2E1 and 4-NHE demonstrated marked increases in thehepatic tissue of all the groups of OLETF rats treated with ethanol compared with OLET rats. Ourdata demonstrated that "a binge" serves as a "second hit" for development of NASH fromobesity-induced simple steatosis through aggravation of oxidative stress. The enhanced levels of
CYP2E1 and increased oxidative stress in obesity play a significant role in this process.
⑫ Wang M, Shibamoto T, Tanida M, Kuda Y, Kurata Y. Mouse anaphylactic shock is caused by reduced
cardiac output, but not by systemic vasodilatation or pulmonary vasoconstriction, via PAF andhistamine. Life Sci 2014;116(2):98-105.
Abstract: AIMS: Systemic anaphylaxis is life-threatening, and its pathophysiology is not fully
clarified. Mice are frequently used for experimental study on anaphylaxis. However, thehemodynamic features and mechanisms of mouse anaphylactic hypotension remain unknown.
Therefore, we determined mechanisms of systemic and pulmonary vascular response to anaphylactic
hypotension in anesthetized BALB/c mice by using receptor antagonists of chemical mediators.
MAIN METHODS: Anaphylaxis was actively induced by an intravenous injection of the ovalbumin
antigen into open-chest artificially ventilated sensitized mice. Mean arterial pressure (MAP),
pulmonary arterial pressure (PAP), left atrial pressure, central venous pressure, and aortic blood flow(ABF) were continuously measured.
KEY FINDINGS: In sensitized control mice, MAP and ABF showed initial, transient increases,
followed by progressive decreases after the antigen injection. Total peripheral resistance (TPR) did
not decrease, while PAP initially and transiently increased to 18.5±0.5mmHg and pulmonary vascular
resistance (PVR) also significantly increased. The antigen-induced decreases in MAP and ABF wereattenuated by pretreatment with either a platelet-activating factor (PAF) receptor antagonist, CV6209,
or a histamine H1 receptor antagonist, diphenhydramine, and were abolished by their combination.
Diphenhydramine augmented the initial increases in PAP and PVR, but did not affect the decrease of
the corresponding MAP fall. The antagonists of either leukotriene C4 or serotonin, alone or in
combination with CV6209, exerted no significant effects.
SIGNIFICANCE: Mouse anaphylactic hypotension is caused by a decrease in cardiac output but not
vasodilatation, via actions of PAF and histamine. The slight increase in PAP is not involved in mouse
anaphylactic hypotension.
⑬ Takeuchi M, Takino J, Sakasa1-Sakai A, Taketa T, Ueda T, Tsutsumi M, Hyogo H, Yamagishi S:
Involvement of the TAGE-RAGE system in non-alcoholic steatohepatitis: Novel treatment ofstrategies. Wold J Hepatol. 2014; 27:880-893.

‑ 28 ‑

Abstract: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a major cause of liver disease around theworld. It includes a spectrum of conditions from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis(NASH) and can lead to fibrosis, cirrhosis, liver failure, and/or hepatocellular carcinoma. NAFLD isalso associated with other medical conditions such as obesity, diabetes mellitus (DM), metabolic
syndrome, hypertension, insulin resistance, hyperlipidemia, and cardiovascular disease (CVD). In
diabetes, chronic hyperglycemia contributes to the development of both macro- and microvascularconditions through a variety of metabolic pathways. Thus, it can cause a variety of metabolic andhemodynamic conditions, including upregulated advanced glycation end-products (AGEs) synthesis.
In our previous study, the most abundant type of toxic AGEs (TAGE); i.e., glyceraldehyde-derived
AGEs, were found to make a significant contribution to the pathogenesis of DM-induced angiopathy.
Furthermore, accumulating evidence suggests that the binding of TAGE with their receptor (RAGE)
induces oxidative damage, promotes inflammation, and causes changes in intracellular signaling andthe expression levels of certain genes in various cell populations including hepatocytes and hepatic
stellate cells. All of these effects could facilitate the pathogenesis of hypertension, cancer, diabetic
vascular complications, CVD, dementia, and NASH. Thus, inhibiting TAGE synthesis, preventing
TAGE from binding to RAGE, and downregulating RAGE expression and/or the expression of
associated effector molecules all have potential as therapeutic strategies against NASH. Here, we
examine the contributions of RAGE and TAGE to various conditions and novel treatments that target
them in order to prevent the development and/or progression of NASH.
⑭ Wang M, Shibamoto T, Shinomiya S, Yamamoto Y, Kurata Y, Kuda Y, Tanida M, Toga H. Pulmonary
vascular and airway responses to systemic vasoconstrictors in anesthetized BALB/c mice. J
Cardiovasc Pharmacol. 2015;65(4):325-334.
Abstract: There is no systematic study in which the effects of vasoactive substances were
investigated on pulmonary vascular resistance (PVR) in in vivo mouse by directly measuring cardiac
output and the inflow and outflow pressures in the pulmonary circulation. We determined the
responses of PVR, total peripheral resistance (TPR), and airway pressure (AWP) to angiotensin II,
endothelin-1, vasopressin, phenylephrine, and thromboxane A2 analog U46619 in anesthetized
BALB/c mice. Pulmonary arterial pressure, left atrial pressure (LAP), and aortic blood flow were
measured. TPR increased dose-dependently in response to consecutive administration of all
vasoconstrictors except vasopressin which reduced TPR at the highest dose of 100 nmol/kg. At highdoses of vasoconstrictors, pulmonary arterial pressure and AWP increased due to increased LAP, asdemonstrated by the separate LAP elevation experiments. When LAP transiently increased at highdoses, PVR did not increase but decreased. Nonetheless, enodothelin-1, angiotensin II, and U46619
increased PVR. Vasopressin at 100 nmol/kg increased AWP without LAP elevation. In conclusion, thehigh doses of the vasoconstrictors studied here exert indirectly a transient pulmonary vasodilatory and
AWP increasing actions due to pulmonary congestion evoked by strong systemic vasoconstriction.

‑ 29 ‑

Nevertheless, enodothelin-1, angiotensin II, and U46619 cause pulmonary vasoconstriction, andvasopressin constricts airway in anesthetized BALB/c mice.
⑮ Takeuchi M, Sakasa1-Sakai A, Taketa T, Ueda T, Takino J, Tsutsumi M, Hyogo H, Yamagishi S:
Serum levels of toxic AGEs (TAGE) may be a promising novel biomarker in developmen andprogression of NASH. Medical Hypotheses. 2015;84:490-493.
Abstract: Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) ranges from simple steatosis to nonalcoholicsteatohepatitis (NASH), leads to fibrosis and potentially cirrhosis, liver failure, and hepatocellular
carcinoma, and is one of the most common causes of liver disease worldwide. NAFLD has also been
implicated in other medical conditions such as insulin resistance, obesity, metabolic syndrome,
hyperlipemia, hypertension, cardiovascular disease, and diabetes. Continuous hyperglycemia has been
implicated in the pathogenesis of diabetic micro- and macro-vascular complications via various
metabolic pathways, and numerous hyperglycemia-induced metabolic and hemodynamic conditions
exist, including the increased generation of various types of advanced glycation end-products (AGEs).
We recently demonstrated that glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs), the predominantcomponents of toxic AGEs (TAGE), played an important role in the pathogenesis of angiopathy indiabetic patients. Moreover, a growing body of evidence suggests that the interaction between TAGE
and the receptor for AGEs may alter intracellular signaling, gene expression, and the release of
pro-inflammatory molecules and also elicits the generation of oxidative stress in numerous types ofcells including hepatocytes and hepatic stellate cells. Serum levels of TAGE were significantly higher
in NASH patients than in those with simple steatosis and healthy controls. Moreover, serum levels of
TAGE inversely correlated with adiponectin (adiponectin is produced by adipose tissue and is ananti-inflammatory adipokine that can increase insulin sensitivity). Furthermore, immunohistochemical
staining of TAGE showed intense staining in the livers of patients with NASH. Serum levels of TAGE
may be a useful biomarker for discriminating NASH from simple steatosis. The administration of
atorvastatin (10 mg daily) for 12 months significantly improved NASH-related metabolic parametersand significantly decreased serum levels of TAGE. The steatosis grade and NAFLD activity score
were also significantly improved. These results demonstrated that atorvastatin decreased the serum
levels of TAGE in NASH patients with dyslipidemia and suggest the usefulness of TAGE as abiomarker for the attenuation of NASH. Serum levels of TAGE were significantly higher in non-B or
non-C hepatocellular carcinoma (NBNC-HCC) patients than in NASH subjects without HCC orcontrol subjects. TAGE may be involved in the pathogenesis of NBNC-HCC, and could, therefore, bea biomarker that could discriminate NBNC-HCC from NASH. We propose that serum levels of TAGE
are promising novel targets for the diagnosis of and therapeutic interventions against NASH.
⑯ Toshikuni N, Asaji T, Nakanishi Y, Nagasawa S, Uenishi H, Tsutsumi M: Elevated serum

gamma-glutamyl transpeptidase levels and fatty liver strongly predict the presence of carotid plaque. J‑ 30 ‑Atheroscler Thromb 2015; 22(10):1051-60
Abstract: AIM: There is a strong relationship between carotid atherosclerosis and futurecardiovascular disease (CVD). This study sought to clarify the association of fatty liver and anelevated serum gamma-glutamyl transpeptidase (GGT) level with carotid atherosclerosis.
METHODS: We reviewed the medical records of subjects who underwent medical checkups at our
institute. Carotid atherosclerosis and fatty liver were assessed using ultrasound (US), and predictorsof increased carotid intima-media thickness (IMT) and carotid plaque were identified using a logistic
regression model.
RESULTS: In total, 958 subjects (564 men, 394 women; median age, 59 years) were enrolled. The
median value of the mean carotid IMT was 0.713 mm, and the frequency of carotid plaque was 19.5%.
For the highest quartile of the mean carotid IMT (≥0.863 mm), a male sex, older age, hypertension(HT), dyslipidemia (DL) and type 2 diabetes mellitus (DM) were identified as independent predictors.
A male sex, older age, HT and elevated serum GGT level were found to be significant predictors of
the presence of carotid plaque. In addition, fatty liver correlated with the existence of carotid plaque.
When the combination of the serum GGT level and presence or absence of fatty liver was included asa variable in the analysis, a male sex, older age, HT and fatty liver with a serum GGT level of ≥83
IU/L (90th percentile) (odds ratio 3.21, 95% confidence interval 1.27-8.12, p=0.014)were identified tobe significantly associated with carotid plaque.
CONCLUSIONS: This study suggests that the simultaneous presence of an elevated serum GGT leveland fatty liver is highly predictive of carotid plaque.
⑰ Wang M, Shibamoto T, Kuda Y, Tanida M, Kurata Y. Systemic vasoconstriction modulates the
responses of pulmonary vasculature and airway to vasoconstrictors in anesthetized rats. Exp Lung Res.
2015;41(6):324-34.
Abstract: PURPOSE: The physiological responses of the pulmonary vasculature and airway tovarious vasoconstrictors were studied using isolated perfused lungs and pulmonary arteries, but these
responses were not systematically studied in in vivo rats. We determined these responses andmodulating effects of systemic circulation in anesthetized rats.
METHODS: We measured directly pulmonary arterial pressure (PAP), left atrial pressure (LAP),
aortic blood flow, and airway pressure (AWP) to determine pulmonary vascular resistance (PVR),
following injections of angiotensin II (ANG II), endothelin-1 (ET-1), vasopressin, phenylephrine andthromboxane A2 mimetic U46619 in anesthetized SD rats.
RESULTS: ANG II, phenylephrine and vasopressin at high doses caused strong systemic
vasoconstriction and left heart overload, resulting in a transient increase in LAP and pulmonary
congestion, which consequently decreased PVR. Nonetheless, prior to LAP elevation, PVR was
slightly but significantly increased by ANG II and phenylephrine. In contrast, ET-1 and U46619
substantially increased PVR in the absence of LAP elevation, while vasopressin did not increase PVR.

‑ 31 ‑

In separate experiments, PAP and AWP increased when LAP was forcedly elevated. AWP wasincreased by U46619 through bronchoconstriction and by the other agents through increased
LAP-induced pulmonary congestion.
CONCLUSION: Airway constriction is induced by U46619, and pulmonary vasoconstriction is
induced strongly by U46619 and ET-1, and weakly by ANG II and phenylephrine, but not byvasopressin in anesthetized rats. ANG II, vasopressin and phenylephrine exert indirectly a transientpulmonary vasodilatory action due to pulmonary congestion evoked by strong systemic
vasoconstriction, which may account for weak pulmonary pressor responses to these agents.
⑱ Sun L, Tanida M, Wang M, Kuda Y, Kurata Y, Shibamoto T. Effects of anesthetics on the renal
sympathetic response to anaphylactic hypotension in rats. PLoS One. 2014 Nov 25;9(11):e113945.
doi: 10.1371/journal.pone.0113945. eCollection 2014. Erratum in: PLoS One. 2015;10(2):e0118042.
Abstract: The autonomic nervous system plays an important role in rat anaphylactic hypotension. It
is well known that sympathetic nerve activity and cardiovascular function are affected by anesthetics.
However, the effects of different types of anesthesia on the efferent renal sympathetic nerve activity(RSNA) during anaphylactic hypotension remain unknown. Therefore, we determined the renal
sympathetic responses to anaphylactic hypotension in anesthetized and conscious rats and the roles ofbaroreceptors in these responses. Sprague-Dawley rats were randomly allocated to anesthetic groups
that were given pentobarbital, urethane, or ketamine-xylazine and to a conscious group. The rats weresensitized using subcutaneously injected ovalbumin. The systemic arterial pressure (SAP), RSNA andheart rate (HR) were measured. The effects of sinoaortic baroreceptor denervation on RSNA during
anaphylaxis were determined in pentobarbital-anesthetized and conscious rats. In all of the sensitized
rats, the RSNA increased and SAP decreased after antigen injection. At the early phase within 35 minof the antigen injection, the antigen-induced sympathoexcitation in the conscious rats was
significantly greater than that in the anesthetized rats. Anaphylactic hypotension was attenuated in the
conscious rats compared to the anesthetized rats. The anesthetic-induced suppression of SAP and
RSNA was greater in the order ketamine-xylazine >urethane = pentobarbital. Indeed, in the rats treatedwith ketamine-xylazine, RSNA did not increase until 40 min, and SAP remained at low levels after
the antigen injection. The baroreceptor reflex, as evaluated by increases in RSNA and HR in responseto the decrease in SAP induced by sodium nitroprusside (SNP), was suppressed in the anesthetizedrats compared with the conscious rats. Consistent with this finding, baroreceptor denervation
attenuated the excitatory responses of RSNA to anaphylaxis in the conscious rats but not in the
pentobarbital-anesthetized rats. RSNA was increased markedly in conscious rats during anaphylactic
hypotension. Anesthetics attenuated this antigen-induced renal sympathoexcitation through the
suppression of baroreceptor function.
⑲ Shibamoto T, Kuda Y, Tanida M, Wang M, Kurata Y. Exercise attenuates ischemia-reperfusion injury‑ 32 ‑

of nonalcoholic fatty liver of the OLETF rat. J Gastroenterol Pancreatol Liver Disord. 2015;2(2):1-6
Abstract: Background: Steatotic livers are increasingly used for liver transplantation and thestrategy to minimize its disadvantage is required. We determined whether exercise could protect liver
against ischemia-reperfusion (IR) injury in the anesthetized hyperphagic, Otsuka Long-Evans
Tokushima Fatty (OLETF) rat, an animal model of the metabolic syndrome.
Methods: At 16th week of age, male OLETF rats (n=7/group) were randomized to the groups ofsedentary (OLETF-SED)-IR, exercise (OLETF-EX)-IR, and OLETF-non IR. Non-hyperphagic,
control strain Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats were similarly assigned. Rats in theexercise groups were subjected to treadmill running 6 days a week for 5 weeks. Rats wereanesthetized with intraperitoneal pentobarbital and subjected to partial liver ischemia (70%) for 30
min and subsequent reperfusion for 120 min. IR injury was evaluated by plasma alanine
aminotransferase(ALT)concentration,

bile

flow

rate,

liver

histopathology,

andhepatic

microcirculation of the left lateral lobe analyzed by laser Doppler flowmetry.
Results: Increases in body and liver weight were attenuated in the OLETF-EX rats as compared with
the OLETF-SED rats. The ALT levels after reperfusion in the OLETF-EX rats were smaller than thatin the OLETF-SED rats, and were comparable to those in the LETOSED and -EX rats. Exercise
attenuated the IR-induced reduction of liver blood flow and morphological hepatic damages as
observed in the OLETF-SED group. In contrast, exercise provided no influences on
the LETO rats.
Conclusion: Exercise attenuated the liver steatosis and IRinduced disturbances of hepatic
microcirculation and parenchymal injury in the hyperphagic, OLETF rats.

‑ 33 ‑

１．研究課題名：センチネルリンパ節陰性 SM 胃癌に対する内視鏡的胃局所全層切除術の開発（研究番号SR2012-05）

２．キーワード：１）SM 胃癌 (submucosa-infiltrating gastric cancer)２）センチネルノードナビゲーション (sentinel node navigation)３）内視鏡的全層切除術 (endoscopic full-thickness resection)
３．研究代表者：伊藤研究分担者：木南透・医学部・教授・消化器内視鏡学
伸一・医学部・准教授・一般・消化器外科

北方

秀一・医学部・准教授・消化器内視鏡学

川浦健・医学部・講師・消化器内視鏡学

４．研 究 目 的
早期胃癌において clinical stage I、大きさ 40mm 以内の病変であれば、sentinel node conceptが成り立つ。術中にセンチネルリンパ節生検を行い転移陰性であれば他のリンパ節郭清を省略することが可能となる。現在、粘膜下層浸潤胃癌（SM 胃癌）はリンパ節郭清を伴う定型手術が行われているが、術後の食事摂取量低下や停滞感などの術後障害が多く見られるのが現状である。しかし、SM 胃癌の約 8 割はリンパ節転移陰性であり、過剰な廓清・切除が行われていることになる。そこで、SM 胃癌のうち術中リンパ節生検にて転移陰性と診断された症例に対し、内視鏡で局所全層切除を行う新たな手術手技の開発・確立を目的とし、研究を行ってきた。切除範囲を最小限に抑え、胃の機能を温存した機能温存手術であり、患者のQOL の向上に寄与しうる。
５．研 究 計 画
胃の局所切除を行う際の問題点は、(1) 穿孔により胃が虚脱し内視鏡視野が不良になる。
(2) 胃液の流出により腹腔内感染の危険性が生ずる。(3) 腫瘍が腹腔内に露出することにより播種の危険性が生ずることがあげられる。これらの問題点を解決する為に、ブタ切除胃および生体ブタを用い、実験を行う。具体的には、漿膜に支持糸をかけ牽引する方法（牽引法）、
漿膜にシートをあて閉鎖腔を作る方法（漿膜被覆法）を検討する。牽引法では、支持糸のかけ方、数、牽引する方向などの検討が必要となる。漿膜被覆法では、シートの素材、固定方法などの検討を行う。
手技の安全性が確認された後、臨床応用を行う。臨床応用に関し、倫理委員会において臨床研究申請を行い、承認を得ている。対象は、術前に上部消化管内視鏡検査および超音波内視鏡検査で深達度 SM と診断された早期胃癌症例で、IC を行い臨床研究に同意が得られた症例とする。

‑ 35 ‑

６．研 究 成 果
動物実験において、腹腔鏡補助下に内視鏡的全層切除術を安全に行うことが可能であることが示された。支持糸による牽引法では前壁側の切除は可能であったが、後壁側の切除は難易度が高く技術的に困難であった。漿膜被覆法では噴門・幽門近傍はシートで密閉することが困難であったが、後壁病変に対しても切除が可能であり、有用性が高いと考えられた。腫瘍を腹腔に露出させず、かつ、内視鏡で病変の位置を確認しながら、最小限の切除マージンで全層切除を行うことが可能な新たな術式（漿膜被覆法、sealed EFTR）を開発した。
動物実験で安全性の確認した後、臨床治験を開始した。現在までに 7 例が治験に登録された。7 例中 5 例でセンチネルリンパ節転移陰性が確認され、内視鏡的全層切除術を行った。
７．研究の考察・反省
漿膜被覆法の開発により、腫瘍を腹腔に露出させず、かつ、内視鏡で病変の位置を確認しながら、最小限の切除マージンで全層切除を行うことが可能となったが、病変の部位や、個体差による困難例に対してさらなる工夫・改善は必要であり、今後の課題である。
８．研 究 発 表
① Tohru Itoh, Hidekazu Kitakata, Shinichi Kinami, Ken Kawaura, et al. New treatment strategy for
submucosa-infiltrating gastric cancer without sentinel node metastasis: A pilot study oflaparoscopy-assisted endoscopic full-thickness resection in an in vivo porcine model. ENDOSCOPIC
FORUM 2015; 31: 17-26.
Abstract: The sentinel node (SN) concept in early gastric cancer has been validated, and minimized
gastrectomy with individualized selective and modified lymphadenectomy for early gastric cancer
with negative SN has become feasible. The aim of this study was to evaluate the feasibility and safetyof endoscopic full-thickness resection (EFTR) for submucosa-infiltrating (SM) gastric cancer without
SN metastasis in an in vivo porcine model.
In each of pigs (female, 30-40kg), a virtual lesion, about 2-3cm in size, was assumed, andlaparoscopic SN biopsy (lymphatic basin dissection method) and endoscopic full-thickness resection
were carried out. Analysis was conducted of the location and number of SNs, the time taken for eachprocedure and the size of the mucosa and serosa in each resected lesion.
Counter-traction with a pair of grasping forceps enabled safe and accurate full-thickness resection
within a reasonable lapse of time, using only the IT knife and/or Hook knife.
Our findings suggested that laparoscopy-assisted EFTR may serve as a useful means for thetreatment of SM gastric cancer without lymph node metastasis.

‑ 36 ‑

１．研究課題名：栄養応答による炎症惹起機構の統合的理解とその制御法の確立（研究番号
SR2012‐06）
２．キーワード：１）代謝異常 (metabolic unhealthy)２）カロリー制限 (calorie restriction)３）オートファジー (autophagy)４）サーチュイン 1 (SIRT1)５）mTOR
３．研究代表者：古家大祐・医学部・教授・糖尿病・内分泌内科学

研究分担者：北田宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

金崎啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

赤澤純代・医学部・准教授・総合内科学

渡邊愛・医学部・協力研究員・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
「栄養応答による炎症惹起機構の統合的理解とその制御法の確立」は、飽食の時代にある
今、不適切な栄養摂取によって惹起される慢性炎症と代謝疾患の分子基盤を解明するとともに、その対策を目指すものである。特に、栄養応答シグナルが如何に代謝組織や血管組織に炎症を惹起するのか、また、その炎症に対する免疫応答がどのように破綻を来たしているのかを、オートファジーに着目してそれら分子基盤を解明する。さらに、それら変異を制御できる食料科学に基づいた治療法の開発を目指す。
５．研 究 計 画
1) カロリー制限食同様にオートファジーを惹起しうる食事介入治療を開発し得ないかと考えた。予備的検討にて高脂肪食負荷によりオートファジーシステムの破綻が生じ、高脂肪食
負荷下、高ケト原性アミノ酸含有食投与によって脂肪肝が組織学的に改善していることも見出している。本研究では高ケト原性アミノ酸含有食がミトコンドリア機能制御を介した新たな治療戦略になる可能性を検証することを目的とした。マウス (C57Bl6) を用い、高脂肪食・ケト原性アミノ酸含有高脂肪食をあたえる。12 週、24 週後に耐糖能・エネルギー代
謝を評価し屠殺する。各臓器を採取し組織学的・生化学的・分子生物学的検討を行う。オートファジーを可視化する事ができる LC3-GFP マウスを用い、オートファジー機構の演じる役割を詳細に検討する。
2) ヒトボランティアに対して 25%カロリー制限を 7 週間行い、サーチュインの活性化とともに代謝マーカーの推移を検討する。
3) 培養単球において、サーチュイン 1 (SIRT1) の活性異常によるオートファジーの破綻が炎症反応を惹起するか否かを検討する。

‑ 37 ‑

６．研 究 成 果1) 8 週齢のマウスを、通常食、高脂肪食、高脂肪食+ケト原性アミノ酸食（脂質、炭水化物エ
ネルギー比率は通常食と同様）、12、16 週後に耐糖能、肝臓の組織検査（oil red O 染色）、肝臓におけるオートファジー関連シグナル、内臓脂肪の大きさとマクロファージ浸潤を検討した。その結果、摂食量に変わりはないが、ケト原性アミノ酸食群によって高脂肪食群と比較して、１）体重の有意な減少、２）内臓脂肪重量 (Epididymal fat) の有意な減少とマ
クロファージ浸潤の減少、３）オートファジー亢進、４）非アルコール性脂肪肝(NAFLD)の改善、５）耐糖能異常の改善、が認められた。さらに、上流の分子メカニズムとして、
高脂肪食群における肝臓での LKB1-AMPK シグナルの低下と mTOR の活性化が、ケト原性
アミノ酸食によって改善されていた。さらに、高脂肪食群でみられた SIRT1 の発現低下も、ケト原性アミノ酸食によって改善されていた。
2) ヒトボランティア 4 名を 7 週間に亘り、1 日に必要なエネルギー摂取量から 25%制限をした。
継時的に骨格筋の生検、採血して単核球単離と血清分離、代謝パラメータ-（脂質、血糖、インスリン値）、炎症マーカー（IL-6、MCP-1、visfatin、高感度 CRP）を検討した。カロリ
ー制限後に、骨格筋ミトコンドリアの増加、インスリン感受性の亢進、炎症マーカーの低下、単離単核球における SIRT1 発現の増加が認められた。さらに、カロリー制限後の血清にて培養した骨格筋細胞において、AMPK および SIRT1 の増加と活性化、酸化ストレス応
答性の獲得がみられた。
3) SIRT1 活性を阻害した培養単核球において、オートファジー不全とともに炎症反応 (TNF-α、IL-6) の増強が認められた。
７．研究の考察・反省
研究目的である栄養応答による炎症惹起機構の統合的理解とその制御法の確立に関して、栄養応答反応である SIRT1-オートファジーシステムの維持が必須であることを見出した。さらにその制御法として、カロリー制限およびケト原性アミノ酸介入が有用である可能性を見出した。しかし、栄養応答による炎症惹起機構を制御できる、かつ臨床応用可能なマイクロRNA の同定を試みたが結論を得るには至らなかった。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Kanasaki K, Koya D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidneydisease. World J Diabetes. 2014 Jun 15;5(3):342-56
Abstract: Diabetic kidney disease (DKD) is the most common cause of chronic kidney disease,leading to end-stage renal disease and cardiovascular disease. The overall number of patients with
DKD will continue to increase in parallel with the increasing global pandemic of type 2 diabetes.
Based on landmark clinical trials, DKD has become preventable by controlling conventional factors,
including hyperglycemia and hypertension, with multifactorial therapy; however, the remaining risk
of DKD progression is still high. In this review, we show the importance of targeting‑ 38 ‑

remission/regression of microalbuminuria in type 2 diabetic patients, which may protect against the
progression of DKD and cardiovascular events. To achieve remission/regression of microalbuminuria,
several steps are important, including the early detection of microalbuminuria with continuous
screening, targeting HbA1c < 7.0% for glucose control, the use of renin angiotensin system inhibitors
to control blood pressure, the use of statins or fibrates to control dyslipidemia, and multifactorial
treatment. Reducing microalbuminuria is therefore an important therapeutic goal, and the absence of
microalbuminuria could be a pivotal biomarker of therapeutic success in diabetic patients. Other
therapies, including vitamin D receptor activation, uric acid-lowering drugs, and incretin-related
drugs, may also be promising for the prevention of DKD progression.
② Kitada M, Koya D. Renal protective effects of resveratrol. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:568093.
Abstract: Resveratrol (3,5,4′-trihydroxystilbene), a natural polyphenolic compound found in grapes
and red wine, is reported to have beneficial effects on cardiovascular diseases, including renal
diseases. These beneficial effects are thought to be due to this compound’s antioxidative properties:
resveratrol is known to be a robust scavenger of reactive oxygen species (ROS). In addition to
scavenging ROS, resveratrol may have numerous protective effects against age-related disorders,
including renal diseases, through the activation of SIRT1. SIRT1, an NAD+-dependent deacetylase,
was identified as one of the molecules through which calorie restriction extends the lifespan or delays
age-related diseases, and this protein may regulate multiple cellular functions, including apoptosis,
mitochondrial biogenesis, inflammation, glucose/lipid metabolism, autophagy, and adaptations tocellular stress, through the deacetylation of target proteins. Previous reports have shown thatresveratrol can ameliorate several types of renal injury, such as diabetic nephropathy, drug-induced
injury, aldosterone-induced injury, ischemia-reperfusion injury, sepsis-related injury, and unilateral
ureteral obstruction, in animal models through its antioxidant effect or SIRT1 activation. Therefore,
resveratrol may be a useful supplemental treatment for preventing renal injury.
③ Kitada M, Koya D. SIRT1 in Type 2 Diabetes: Mechanisms and Therapeutic Potential. Diabetes
Metab J. 2013 Oct;37(5):315-25.
Abstract: The prevalence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) has been increasing worldwide.
Therefore, a novel therapeutic strategy by which to prevent T2DM is urgently required. Calorie
restriction (CR) can retard the aging processes, and delay the onset of numerous age-related diseases
including diabetes. Metabolic CR mimetics may be therefore included as novel therapeutic targets forT2DM. Sirtuin 1 (SIRT1), a NAD+-dependent histone deacetylase that is induced by CR, is closely
associated with lifespan elongation under CR. SIRT1 regulates glucose/lipid metabolism through its
deacetylase activity on many substrates. SIRT1 in pancreatic β-cells positively regulates insulin
secretion and protects cells from oxidative stress and inflammation, and has positive roles in the‑ 39 ‑

metabolic pathway via the modulation in insulin signaling. SIRT1 also regulates adiponectin secretion,
inflammation, glucose production, oxidative stress, mitochondrial function, and circadian rhythms.
Several SIRT1 activators, including resveratrol have been demonstrated to have beneficial effects on
glucose homeostasis and insulin sensitivity in animal models of insulin resistance. Therefore, SIRT1
may be a novel therapeutic target for the prevention of T2DM, implicating with CR. In this review,
we summarize current understanding of the biological functions of SIRT1 and discuss its potential asa promising therapeutic target for T2DM.
④ Kitada M, Koya D. The use of calorie restriction mimetics to study aging. Methods Mol Biol.
2013;1048:95-107.
Abstract: Calorie restriction (CR) has a variety of effects on extending lifespan and delaying theonset of age-related diseases, and it is accepted as the only established experimental antiaging
intervention. Several pharmacological agents that can replicate the beneficial effects of CR, called
calorie restriction mimetics (CRMs), have been identified. The nutrient-sensing pathways including
those involving sirtuins (especially SIRT1) and mammalian target of rapamycin (mTOR) may
regulate the physiology of CR, and candidate CRMs that modulate these specific pathways have been
identified and investigated using animal models. In this chapter, we focus on candidate CRMs
including sirtuin-activating compounds (STACs) and mTOR inhibitors, their slowing of aging, andmethods for evaluation of lifespan and metabolic disorders.
⑤ Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Tsuda S, Kanasaki K, Koya D. Calorie restriction in
overweight males ameliorates obesity-related metabolic alterations and cellular adaptations throughanti-aging effects, possibly including AMPK and SIRT1 activation.

Biochim Biophys Acta. 2013

Oct;1830(10):4820-7.
Abstract: BACKGROUND: Calorie restriction (CR) is accepted as an experimental anti-aging
paradigm. Several important signal transduction pathways including AMPK and SIRT1 are implicatedin the regulation of physiological processes of CR. However, the mechanisms responsible foradaptations remain unclear in humans.
SCOPE OF REVIEW: Four overweight male participants were enrolled and treated with 25% CR of
their baseline energy requirements for 7weeks. Characteristics, including body weight (BW), bodymass index (BMI), %fat, visceral fat area (VFA), mean blood pressure (MBP) and VO2 max, as wellas metabolic parameters, such as insulin, lipid profiles and inflammatory makers and the expressionof phosphorylated AMPK and SIRT1 in peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs), were
determined at baseline and then after 7weeks. In addition, we assessed the effects of the serum
collected from the participants on AMPK and SIRT1 activation and mitochondrial biogenesis incultured human skeletal muscle cells.
MAJOR CONCLUSIONS: After CR, BW, BMI, %fat, VFA and MBP all significantly decreased,‑ 40 ‑

while VO2 max increased, compared to those at baseline. The levels of fasting insulin, free fatty acid,and inflammatory makers, such as interleukin-6 and visfatin, were significantly reduced, whereas theexpression of phosphorylated AMPK and SIRT1 was significantly increased in PBMNCs collected
after CR, compared to those at baseline. The skeletal muscle cells that were cultured in serum
collected after CR showed an increase in AMPK and SIRT1 activity as well as mitochondrial
biogenesis.
GENERAL SIGNIFICANCE: CR is beneficial for obesity-related metabolic alterations and induces
cellular adaptations against aging, possibly through AMPK and SIRT1 activation via circulating
factors.
⑥ Xu L, Kanasaki M, He J, Kitada M, Nagao K, Jinzu H, Noguchi Y, Maegawa H, Kanasaki K, Koya D.
Ketogenic essential amino acids replacement diet ameliorated hepatosteatosis with altering
autophagy-associated molecules. Biochim Biophys Acta. 2013 Oct;1832(10):1605-12.
Abstract: Ketogenic amino acid (KAA) replacement diet has been shown to cure hepatic steatosis, aserious liver disease associated with diverse metabolic defects. In this study, we investigated theeffects of KAA replacement diet on nutrition sensing signaling pathway and analyzed whether
induction of hepatic autophagy was involved. Mice are fed with high fat diet (HFD) or KAA
replacement in high-fat diet (30% fat in food; HFD)-fed (HFD(KAAR)) and sacrificed at 8, 12, 16
weeks after initiation of experimental food. Hepatic autophagy was analyzed in protein expression ofseveral autophagy-associated molecules and in light chain-3 green fluorescent protein (LC-3 GFP)
transgenic mice. HFD(KAAR) showed increased AMP-activated protein kinase (AMPK)
phosphorylation and enhanced liver kinase B1 (LKB1) expression compared to control HFD-fed mice.
The KAA-HFD-induced activation of AMPK was associated with an increased protein expression of
sirtuin 1 (Sirt1), decreased forkhead box protein O3a (Foxo3a) level, and suppression of mammaliantarget of rapamycin (mTOR) phosphorylation compared with the HFD-fed mice. The intervention
study revealed that a KAA-replacement diet also ameliorated all the established metabolic andautophagy defects in the HFD-fed mice, suggesting that a KAA-replacement diet can be usedtherapeutically in established diseases. These results indicate that KAA replacement in food could bea novel strategy to combat hepatic steatosis and metabolic abnormalities likely involvement of an
induction of autophagy.
⑦ Kitada M, Kume S, Kanasaki K, Takeda-Watanabe A, Koya D. Sirtuins as possible drug targets intype 2 diabetes. Curr Drug Targets. 2013 Jun 1;14(6):622-36.
Abstract: The rising incidence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major public health problem
in industrialized countries, and new therapeutic strategies to prevent T2DM are urgently needed
worldwide. It is well known that calorie restriction (CR) can retard the aging process in organisms
ranging from yeast to rodents and delay the onset of numerous age-related diseases, including‑ 41 ‑

diabetes. Molecules that mimic CR metabolically may therefore represent new therapeutic targets forT2DM. Sirtuin1 (SIRT1), the mammalian homolog of Sir2, was originally identified as a
NAD+-dependent histone deacetylase, and its activity is closely associated with longevity under CR.
Growing evidence suggests that SIRT1 regulates glucose-lipid metabolism through its deacetylase
activity for many known substrates and has many roles in the metabolic pathway through its direct orindirect involvement in insulin signaling in insulin-sensitive organs, including adipose tissue, liverand skeletal muscle. In addition, SIRT1 regulates insulin secretion, and adiponectin production,
inflammation, gluconeogenesis, circadian rhythms and oxidative stress, which together contribute to
the development of insulin resistance. Moreover, the overexpression of SIRT1 and several SIRT1
activators have beneficial effects on glucose homeostasis and insulin sensitivity in diabetic animalmodels and humans. Therefore, SIRT1 may represent a new therapeutic target for the prevention of
diseases related to insulin resistance and T2DM. In addition, SIRT3 and SIRT6 play crucial roles inglucose and lipid metabolism. In this review, we summarize the current understanding of thebiological functions of SIRT1, SIRT3 and SIRT6 in metabolism and discuss their potential role astherapeutic targets in T2DM.
⑧ Kume S, Kitada M, Kanasaki K, Maegawa H, Koya D. Anti-aging molecule, Sirt1: a novel
therapeutic target for diabetic nephropathy. Arch Pharm Res. 2013 Feb;36(2):230-6.
Abstract: Caloric restriction prolongs the lifespan of many species. Therefore, investigators haveresearched the usefulness of caloric restriction for healthy lifespan extension. Sirt1, an
NAD(+)-dependent deacetylase, was identified as a molecule necessary for caloric restriction-related
anti-aging strategies. Sirt1 functions as an intracellular energy sensor to detect the concentration of
NAD(+), and controls in vivo metabolic changes under caloric restriction and starvation through its
deacetylase activity to many targets including histones, nuclear transcriptional factors, and enzymes.
During the past decade, investigators have reported the relationship between disturbance of Sirt1
activation and the onset of aging- and obesity-associated diseases such as diabetes, cardiovasculardisease and neurodegenerative disorders. Consequently, a calorie restriction-mimetic action of Sirt1 is
now expected as a new therapy for these diseases. In addition, recent studies have gradually clarified
the role of Sirt1 in the onset of kidney disease. Its activation may also become a new target oftreatment in the patients with chronic kidney disease including diabetic nephropathy. In this article,
we would like to review the role of Sirt1 in the onset of kidney disease based on previous studies, anddiscuss its possibility as the target of treatment in diabetic nephropathy.
⑨ Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Kanasaki K, Koya D. Sirtuins and renal diseases:
relationship with aging and diabetic nephropathy. Clin Sci (Lond). 2013 Feb;124(3):153-64.
Abstract: Sirtuins are members of the Sir2 (silent information regulator 2) family, a group of class
III deacetylases. Mammals have seven different sirtuins, SIRT1-SIRT7. Among them, SIRT1, SIRT3‑ 42 ‑

and SIRT6 are induced by calorie restriction conditions and are considered anti-aging molecules.
SIRT1 has been the most extensively studied. SIRT1 deacetylates target proteins using the coenzyme
NAD+ and is therefore linked to cellular energy metabolism and the redox state through multiple
signalling and survival pathways. SIRT1 deficiency under various stress conditions, such as metabolicor oxidative stress or hypoxia, is implicated in the pathophysiologies of age-related diseases including
diabetes, cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders and renal diseases. In the kidneys,
SIRT1 may inhibit renal cell apoptosis, inflammation and fibrosis, and may regulate lipid metabolism,autophagy, blood pressure and sodium balance. Therefore the activation of SIRT1 in the kidney may
be a new therapeutic target to increase resistance to many causal factors in the development of renal
diseases, including diabetic nephropathy. In addition, SIRT3 and SIRT6 are implicated in age-relateddisorders or longevity. In the present review, we discuss the protective functions of sirtuins and theassociation of sirtuins with the pathophysiology of renal diseases, including diabetic nephropathy.
⑩ Takeda-Watanabe A, Kitada M, Kanasaki K, Koya D. SIRT1 inactivation induces inflammation
through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun.
2012 Oct 12;427(1):191-6.
Abstract: Inflammation plays a crucial role in atherosclerosis. Monocytes/macrophages are some of
the cells involved in the inflammatory process in atherogenesis. Autophagy exerts a protective effectagainst cellular stresses like inflammation, and it is regulated by nutrient-sensing pathways. The
nutrient-sensing pathway includes SIRT1, a NAD(+)-dependent histone deacetylase, which is
implicated in the regulation of a variety of cellular processes including inflammation and autophagy.
The mechanism through which the dysfunction of SIRT1 contributes to the regulation of
inflammation in relation to autophagy in monocytes/macrophages is unclear. In the present study, wedemonstratethat

treatmentwith

2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide (Sirtinol), a chemical
inhibitor of SIRT1, induces the overexpression of inflammation-related genes such as tumor necrosis
factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 through nuclear factor (NF)-κB signaling activation, which is
associated with autophagy dysfunction, as shown through p62/Sqstm1 accumulation and decreased
expression of light chain (LC) 3 II in THP-1 cells. The autophagy inhibitor, 3-methyladenine, also
induces inflammation-related NF-κB activation. In p62/Sqstm1 knockdown cells, Sirtinol-induced
inflammation through NF-κB activation is blocked. In addition, inhibition of SIRT1 is involved in theactivation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway and is implicated in decreased
5'-AMP activated kinase (AMPK) activation, leading to the impairment of autophagy. The mTOR
inhibitor, rapamycin, abolishes Sirtinol-induced inflammation and NF-κB activation associated with
p62/Sqstm1 accumulation. In summary, SIRT1 inactivation induces inflammation through NF-κB
activation and dysregulates autophagy via nutrient-sensing pathways such as the mTOR and AMPK
pathways, in THP-1 cells.

‑ 43 ‑

特別奨励研究（Ａ）
成果報告書

ＡＲ２０１２-０１～１０１．研究課題名：前立腺癌における癌幹細胞と新たなバイオマーカーの探索（研究番号
AR2012-01）
２．キーワード：１）前立腺癌 (prostate cancer)２）癌幹細胞 (cancer stem cell)
３）NANOG
４）OCT4５）hypoxia-inducible factor-1
３．研究代表者：宮澤研究分担者：森田克人・医学部・教授・泌尿器科学
展代・医学部・学内講師・泌尿器科学

４．研 究 目 的
我が国では急激な前立腺癌患者の増加が認められており(CA Cancer J Clin 57: 190,2007)、
その早期発見における PSA 検査の有用性は確立されている。しかし、PSA グレー値での生検非陽性率は 70〜80%であり患者負担、医療費などから不必要な生検を回避するための
PSA 以外の有効なツールやバイオマーカーの開発が国際的に急務となっている。一方、近年、各種臓器において発生する癌の幹細胞起源説が提唱されており、前立腺癌でも上皮ではなく幹細胞から発生するという報告がなされている (J CIin Oncol 26: 2806, 2008; J Cell
Physiol 216: 332, 2008; BJU Int 96: 1219, 2005)。本研究では癌幹細胞の分離法の一つである
表面マーカーに着目して前立腺癌幹細胞の同定と診断における有用性を樹立する。
５．研 究 計 画
正常前立腺、前立腺肥大症、前立腺癌各 50 検体の生検組織を用いて CD117、CD133、
CD44、34βE12、CK18、p63、AR、PSA、CXCR4、Oct-4、ALDH1 に対して酵素抗体法による免疫組織染色を行い前立腺癌に相関する表面マーカーを同定する。
同定された分子についてレーザーマイクロダイセクション法と TALPAT 法および PCR 法を用いて遺伝子レベルでの発現解析を行う。
その結果に基づき最も相関する表面マーカーに対する ELISA 法による血中濃度測定キットを作製する。
このキットを用いて生検陰性例 50 例から基準値を設定するとともに前立腺癌症例 50 例
での測定値を求める。また、手術、放射線治療、内分泌治療、化学療法後の測定値の推移を観察する。特に臨床上の大きな問題であるホルモン不応性前立腺癌での測定値は前立腺
癌幹細胞の概念を支持する有用な根拠となることが予想されるので再燃後生検組織との比較検討を行う。
プロスペクティブに ELISA 法による血中濃度の測定を行い PSA 値、組織像、組織学的悪性度などとの多変量解析を行い独立因子あるいは PSA との相補因子としての有効性を‑ 45 ‑

検証する。
６．研 究 成 果
今回検討を行った表面マーカーのうち CD44、CD133、OCT-3、SOX2、GDF3OCT-4 は正常
前立腺組織、前立腺肥大症組織、前立腺癌組織での染色性に有意な相関を認めなかった。一
方、OCT-4 は前立腺癌組織での陽性率が高く正常前立腺組織、前立腺肥大症組織での染色性は低かった。この結果から前立腺癌における癌幹細胞の候補分子の一つとして OCT-4 が示唆され、PSA などの既存の腫瘍マーカーの補助腫瘍マーカーとしての展開も考えられた。
７．研究の考察・反省
免疫組織染色で前立腺癌組織に有意に発現している癌幹細胞表面マーカーの同定を行えた。
この成果は近年、提唱されている各種臓器において発生する癌の幹細胞起源説が前立腺癌でも上皮ではなく幹細胞から発生するという報告を指示する結果であると思われる。
反省点は PCR による遺伝子レベルでの同定に至らなかった。また、臨床応用を目指しての ELISA 法による血中濃度の測定の確立にも至らなかったことである。その理由は抗体の選択など組織染色による特定に想定外の時間を要し限られた研究期間内に次のステップに移行できなかったことによると思われる。
８．研 究 発 表
① Katsuhito

Miyazawa,

Takuji

Tanaka,Dan

Nakai,

NobuyoMoritaandKoji

Suzuki.

Immunohistochemical expression of four different stem cell markers in prostate cancer: Highexpression of NANOG in conjunction with hypoxia‑inducible factor‑1α expression is involved in
prostate epithelial malignancy. Oncol Lett 8: 985-992, 2014
Abstract: Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a variety of cancer types, including
prostate cancer. The aim of the present study was to evaluate the immunohistochemical expression of
NANOG, octamer 4 (OCT4), cluster of differentiation 133 (CD133) and NESTIN, which are all CSC
markers, and assess their function in prostate carcinogenesis. A total of 114 patients were referred to
the Kanazawa Medical University Hospital (Uchinada, Japan) having presented with elevated serum
prostate-specific antigen levels and/or abnormal digital rectal examinations, and underwent transrectal
ultrasound sonography guided eight core biopsies. The prostate pathological specimens werere-evaluated for selection in this study. When specimens were diagnosed as prostate cancer,
immunohistochemical analysis of the four different stem cell markers (NANOG, OCT4, CD133 andNESTIN) and hypoxia-inducible factor (HIF)-1α was performed. Prostate cancer was found in 38
cases (33.3%), while the other patients had benign prostate hyperplasia with prostatitis. All prostatecancers were histopathologically identified as adenocarcinomas of various grades, and cancer cells
and intraepithelial neoplasia (high grade) were immunohistochemically shown to express NANOG
and OCT4, but not CD133 and NESTIN. The intensity of NANOG expression was much greater than

‑ 46 ‑

that of OCT4, and the positivity and intensity of the four stem cell markers, including NANOG, were
elevated with high Gleason scores. A significant correlation was observed between the NANOG- andHIF-1α-positive

regions.

The

CSC

markers,inparticular

OCT4

and

NANOG,

were

immunohistochemically expressed in prostate cancers. Furthermore, HIF-1α expression may affect
NANOG and/or OCT4 expression. The findings of the current study suggested that NANOG
expression may be a biomarker for the diagnosis of prostate cancer, and the coexpression of NANOG
and HIF-1α may be involved in prostate carcinogenesis.

‑ 47 ‑

１．研究課題名：排卵過程における gelatinase の関与とその作用機構について（研究番号
AR2012-02）
２．キーワード：１）排卵 (ovulation)２）マトリックスメタロプロテアーゼ (matrix metalloproteinase)３）ゲラチナーゼ (gelatinase)
４）卵巣 (ovary)５）ラット (rat)
３．研究代表者：藤井研究分担者：甲野牧野田亮太・看護学部・准教授・医科学
裕之・看護学部・教授・医科学
知・医学部・教授・産科婦人科学

４．研 究 目 的
排卵過程において卵胞壁頂部が破れ卵を放出するためには、プロテアーゼを介した同部の細胞外マトリックス崩壊が必須事象である。1990 年代には排卵における卵胞壁溶解にプラス
ミンとマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）群が関与するとの仮説が提唱されたが、未だ哺乳類の排卵機構の解明は十分になされていない。一方、哺乳類に比べ単純な卵胞構造をもつメダカを用いた排卵研究により、排卵酵素として gelatinase、MT1-MMP、MT2-MMP 同定され、排卵過程における MMP 群の関与があらためて注目されるようになっている(Ogiwara K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:8442-8447, 2005)。本研究では未だ明らかになっていない哺乳類の排卵過程における MMP 群の関与を明らかにし不明な点の多い排卵現象解明への一助とすることを目指す。
５．研 究 計 画
本研究では、未だ明らかになっていない哺乳類の排卵過程における MMP 群の関与を明らかにするために、排卵過程に最も重要とされている分泌型 MMP の gelatinase に注目し、排卵過 程 に お ける gelatinase の 関 与 なら び に 排 卵関 連 酵 素 とさ れ る 細 胞膜 型 MT1-MMP、
MT2-MMP との相互作用を明らかにすることを目的としている。
そのために、gelatinase に対する特異的インヒビターを排卵刺激したラットの片側卵巣ブル
サ内に投与し、インヒビター投与時期による排卵抑制状況、主要排卵関連メディエーターとの関連について検討する（藤井）。さらに、インヒビターの投与時期によるラット卵巣の MMPsの発現、MMP 活性および卵胞壁基底膜の形態学的変化を比較し、排卵過程における gelatinaseの時間依存的関与ならびに MT1-MMP、MT2-MMP との相互作用を明らかにしていく（藤井、甲野、牧野田）。

‑ 49 ‑

６．研 究 成 果
gelatinase に対する特異的インヒビター (H-Cys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys-OH:
GEL-INH) を過排卵刺激した未熟雌ラットの片側卵巣ブルサ内に投与し、インヒビター投与
時期による排卵抑制状況を調べたところ、hCG による排卵刺激 4 時間後にインヒビター投与を行った際のみ有意な排卵抑制が確認され(Fig. 1.)、gelatinase の時間依存的な排卵への関与が示唆された。この現象については、採取卵巣組織の光顕により、多数の未破裂卵胞が残存していたことからも確認された(Fig. 2.)。

(Fig. 1.) The number of ovulations/ovary after intrabursal administration of gelatinase inhibitor(GEL-INH) around the left ovary and vehicle (0.9% (w/v) NaCl) on the contralateral side at 0 h, 4 h
and 8 h after hCG. Bars indicate 10-90% range; boxes indicate 25-75% range; central lines indicate
medians. *Significantly (p < 0.05) lower than control.

(Fig. 2.) Light microscopic view (20 h after hCG) of the rat ovary after intrabursal injection (4 h).
Corpora luteas are abundant in the ovary of the control side (A) whereas several large unruptured
follicles remain in the GEL-INH-treated ovary (B). Scale bars = 300 µm.
排卵刺激 4 時間後にインヒビター投与を行ったラット卵巣組織中における古典的主要排卵関連メディエーター：Prostaglandin E2(PGE2) と Plasminogen activator (PA) の組織中濃度・活性を検討したところ、PGE2 (Fig. 3.)・PA (Fig. 4.)ともに有意な変化は認められておらず、
gelatinase がこれらのメディエーターとは独立した排卵関連酵素であることが推察された。

‑ 50 ‑

(Fig. 3.) Prostaglandin E2 (PGE2) concentrations in rat ovaries taken at 12 h after hCG stimulation.
The animals were injected intrabursally with 1 mmol l-1 of gelatinase inhibitor (GEL-INH) on the left
side, and with vehicle (0.9% (w/v) NaCl) on the contralateral side at 4 h after hCG. Bars indicate
10-90% range; boxes indicate 25-75% range; central lines indicate medians.

(Fig. 4.) Plasminogen activator (PA) activity levels in rat ovaries taken at 12 h after hCG stimulation.
The animals were injected intrabursally with 1 mmol l-1 of gelatinase inhibitor (GEL-INH) on the left
side, and with vehicle (0.9% (w/v) NaCl) on the contralateral side at 4 h after hCG. Bars indicate
10-90% range; boxes indicate 25-75% range; central lines indicate medians.
７．研究の考察・反省
gelatinase の作用発現はサイトカインを介した遺伝子発現の誘導や、プロエンザイム(progelatinase) の活性化 (MT1-MMP) 、酵素活性の抑制 (TIMP-2) などにより複雑に局所制御されているものと考えられるが、排卵期卵巣におけるその実体は未だ解明されていない。
本研究で行った in vivo モデルによる特異的短時間作用型インヒビター投与と排卵数との比較結果は、排卵期卵胞頂部において実際に起こる gelatinase の作用活性化とその時期を理解するうえで今後役立つものと思われる。齧歯類の hCG 刺激 4 時間後の卵巣については、卵胞
壁頂部の基底膜崩壊が始まる時期であることや、卵胞基底膜周囲の gelatinase 酵素活性が認められること、MT1-MMP mRNA の発現が顆粒膜細胞層から progelatinase A が豊富な莢膜間‑ 51 ‑

質細胞層へとシフトすることは報告されている。しかしこの時期における progelatinase A 制
御因子 (MT1-MMP, TIMP-2) の詳細な発現は未だ示されておらず、本研究のモデルを使ってそれらを確認できなかったことは反省点である。今後、分子生物学的な手法などを用いてgelatinase の作用機構をさらに明らかにしていくことが望まれる。
PGE2 は排卵期中期（hCG 刺激後 6-10h）に上昇する主要な排卵メディエーターとして知られ、他組織では gelatinase の合成を誘導すると報告されていた。しかしながら gelatinase の作
用は PGE2 の上昇ピーク以前に発現していること及び GEL-INH 投与が排卵期卵巣の PGE2 合成に影響を及ぼさなかったことから、gelatinase はプロスタグランディンに制御されてはいな
い独立した排卵関連因子であることが示された。
PA についても MMPs 同様に排卵期の重要な蛋白分解酵素と考えられており、PA の主要酵素であるプラスミンが gelatinase を活性化し得ることも報告されている。そのため GEL-INH
投与による PA 系への影響の有無を確認し、gelatinase が PA 系とは独立した排卵関連酵素であることを示した。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 52 ‑

１．研究課題名：細胞接着因子の心筋細胞における解析（研究番号

AR2012‐03）

２．キーワード：１）心筋 (cardiac myocyte)
２）DOCK ファミリー (DOCK family)３）細胞接着 (Cell adhesion)４）接着斑 (Focal adhesion)５）線維芽細胞 (fibroblast)
３．研究代表者：赤澤研究分担者：清川純代・医学部・准教授・総合内科学
悦子・医学部・教授・病理学 I

４．研 究 目 的
心肥大は血流負荷に適応する反応であり、カテコールアミン・増殖因子などの他に、機械的刺激も原因であると考えられている。機械的刺激を感知するのは、インテグリンからの細胞接着に関与する分子群であると考えられている。細胞接着斑は培養細胞で観察される構造
で接着関連の分子の集合体であるが、生体内での存在は疑問視されている。しかし、インテ
グリンや細胞接着斑に存在するチロシンリン酸化酵素 FAK を欠失したマウスでは、血流負荷により、左室拡張を呈する心肥大と線維化が起こることが知られていることから、心筋の適応反応に重要であることは確かである (J. Clin. Invest., 2006) 。本研究では、培養細胞において細胞接着を制御する機能を持つ分子群の発現・活性制御を心筋細胞において調べることで心筋の適応の分子機構を明らかにする。
５．研 究 計 画
病理学 I の実験室・研究室にて、下記の実験を清川および研究員、および大学院生・助教が行い、赤澤と結果についてディスカッションする。
1) マウス心筋細胞の培養法の確立。DOCK1 の分子数の見積もり。
2) DOCK ファミリーの発現を調べ、また心筋細胞における接着斑の構造を見る。
６．研 究 成 果
1) 当初の計画では、マウスの心筋細胞を得て培養する予定であったが、時間がなく出来ていなかった。そこでそれよりは実験が簡便である、ラット心筋由来の培養細胞 H9C2 細胞を入手し、マウスやラットなどのげっ歯類の細胞株との発現を比較した。下記 2－2) を参照のこと。
2-1) 免疫染色による発現の確認：
DOCK ファミリーのなかでも、低分子量 G 蛋白質 Rac1 に対する活性を持つと報告のある DOCK1～5 の、マウス心臓における免疫染色を行った。心筋細胞において陽性所見を得たものは、DOCK1 と DOCK5 の 2 種類であり、DOCK3 は間質の紡錘形細胞に陽性所見を‑ 53 ‑

得、DOCK2、DOCK4 では染色されなかった。また DOCK1 および DOCK5 の染色は、心筋のなかでも収縮帯によく集積しているように見えた。これは、心筋では接着斑の蛋白質が収縮帯にあるというこれまでの所見と一致する。
2-2) ウエスタンブロットによる発現の確認：
野生型マウス臓器を用いてウエスタンブロットを行ったが、培養細胞に過剰発現させた
場合のバンドや腎臓での内因性の発現は確認できたものの、心臓において内因性の DOCKファミリーのバンドは検出が出来ていないことから、心臓での DOCK1 および DOCK5 の発現量は現行の方法では検出限界以下であることがわかった。
心臓からの細胞単離はすぐにはできないので、それは実験が簡便である、ラット心筋由来の培養細胞 H9C2 細胞を入手し、マウスやラットなどのげっ歯類の細胞株との発現を比較した。用いた細胞群は、３Y1 細胞（ラット線維芽細胞）、NRK（ラット腎尿細管細胞）、
IEC-6（ラット小腸上皮細胞）、NIH3T3 細胞（マウス線維芽細胞）、C2C12 細胞（マウス骨格筋細胞）、LEC（マウスレンズ上皮細胞）、EpH4（マウス乳腺細胞）の 8 種類である。内因性コントロールのチュブリンで発現量を補正したところ、NIH3T3 細胞の発現が安定して高いことがわかった。以下、これを 100%とした場合の相対値をカッコに示す。次いで、レンズ上皮細胞 (約 60%) 、H9C2 細胞 (約 40%) の順で発現量が高かった。面白いことに、
NRK (5%以下) や IEC-6 (20%) 、EpH4 (10%) などの正常であるとされている上皮細胞では発現が低かった。レンズ上皮細胞も野生型マウスから単離されたものであるが、ウエスタ
ンブロットを用いた結果では、上皮マーカーである E-Cadherin が発現しておらず、また形
態も紡錘形であり、正常の上皮細胞であるとは言い難い。また DOCK1 の発現が高い HER2
陽性乳がん患者は予後が悪い報告 (Laurin et al., PNAS, 2013) を考えると、乳腺以外の細胞でも正常では DOCK1 の発現が抑制されている可能性を示唆している。また上皮以外の細胞では、心筋細胞と類似の筋肉細胞である C2C12 細胞では、発現が低く (20%弱) 、また同じ線維芽細胞でもラット由来の 3Y1 細胞は NIH 細胞に比べて発現が低く (20%程度)、細胞の起源によって発現が制御されている訳ではないこともわかった。HER2 陽性乳癌細胞で発現が上昇していることを考えると、細胞自身が分泌している増殖因子やサイトカインによって、DOCK1 の発現が変化する可能性が示唆される。そこで、NIH3T3 細胞の培養上清に H9C2 細胞を加え、DOCK1 の発現が変化するか検討している。また、H9C2 細胞に、細胞増殖の指標である FRET バイオセンサーを発現させ、NIH3T3 細胞と混合培養し、心筋細胞の情報伝達が変化するかの実験も行っている。何らかの効果が得られれば、DOCK1 のノックアウトも行いその効果への DOCK の発現の影響も検討する。これは、心筋梗塞などでは、虚血に陥った細胞が壊死すると心筋は再生せずに線維化が起こる。この過程において、線維芽細胞が周囲心筋細胞に何らかの影響を与えているか、検討するモデルとなる。
７．研究の考察・反省研究代表者の診療及び教育活動等の多忙により、研究については計画通りに進まなかった
要因もあるが、それは、ある程度予想されたことであったので、病理学 I の西濱・春田研究‑ 54 ‑

員が実験実務を担当する計画であり、当初は実験に参画していた。しかし、2013 年 7－8 月にそろって退職したことで、実験が思うように進まなくなった点が予想外であった。その間研究は滞ったものの、2014 年 4 月からは、大学院生として病理学 I 所属の徐暁鶴が、2015 年
1 月からは、病理学 I 所属の相川あかね助教が、他プロジェクトでも同じ手法を用いるため、
DOCK1 のウエスタンや、培養細胞への FRET バイオセンサーの導入などを行うことによって、研究が進んだ。今後、もし同様の研究を遂行する場合は、専属の大学院生か、あるいは
テクニカルスタッフ（力量によっては専属である必要はないと考えられる）を、研究に従事させることが必須ではないかと思う。
研究内容に関しては、6 の項でまとめたが、心筋における接着斑の役割という当初の計画からは外れた形になるが、DOCK1 の細胞間の発現比較という実験結果から、線維芽細胞に注目することに方向転換された。しかし、心筋細胞の機能からかけ離れるのではなく、線維芽細胞の分泌による他の細胞（心筋細胞や上皮細胞）への影響を DOCK の発現から捉えることが可能になったと言える。このような多細胞の細胞機能制御は疾患を考える上で重要であり、その役割を検討するための新規の基礎データを得られたことは大きいと考える。2 年以内に英文誌への掲載を目指して、上記の態勢で引き続き研究を継続し、得られた成果を形に残したいと考えている。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 55 ‑

１．研究課題名：水晶体の正常環境は低酸素状態である―その遺伝子発現様式と白内障発症との関連（研究番号

AR2012-04）

２．キーワード：１）水晶体 (lens)２）白内障 (cataract)３）低酸素 (hypoxia)４）紫外線曝露 (ultraviolet ray exposure)５）遺伝子発現 (gene expression)
３．研究代表者：長田ひろみ・医学部・助教・眼科学
研究分担者：池田崇之・医学部・講師・生化学Ⅱ

米倉秀人・医学部・教授・生化学Ⅱ

佐々木洋・医学部・教授・眼科学

４．研 究 目 的
白内障は世界の失明原因の約半分近くを占めており、白内障発症の発症機序の解明とそれに基づく予防や治療の開発は世界的に大きな課題と言える。これまでの疫学研究から紫外線曝露などがリスクファクターとして明らかになってきたが、発症機序には未だに未解明な部分が多い。関与する遺伝子（群）の実態も未解明な部分が多い。本研究は、白内障の発症に関連する遺伝子的要因の一端を明らかにすることを目的とする。
水晶体組織は正常状態で低酸素状態 (Hypoxia) にある。水晶体組織において、水晶体上皮付近は酸素濃度は 2%以下と報告されている (Semin. Cell Dev. Biol. 19:125-133, 2008) 。発生期の水晶体近傍は血管が豊富で十分な酸素濃度が維持されているが、出生後は血管が退縮し低酸素状態となる (Anat Embryol 200:403–411, 1999; European Journal of Cell Biology 90:440–
448, 2011) 。しかしながら、低酸素状態への変換の際にどのような遺伝子が重要なのかといった研究はまったく行われていない。水晶体の低酸素適応に関与している遺伝子の発現に異常が生じた場合に、白濁が生じ白内障へつながる可能性が考えられる。
また、白内障の第一のリスクファクターである紫外線曝露は、低酸素状況下におかれたレンズ細胞で起こっているはずであるが、実際に in vivo や低酸素下で紫外線曝露されたレンズ細胞の遺伝子発現変化についてはほとんど研究がなされていない。
本研究では、低酸素下で新陳代謝を行うことが正常状態である水晶体組織について、低酸素下と通常酸素下での遺伝子発現を比較することにより、水晶体組織の特有な遺伝子発現様式を明らかにする。また、in vivo および低酸素下で紫外線曝露されたレンズ細胞の遺伝子発現変化を明らかにする。
５．研 究 計 画
(Ⅰ)手術摘出ヒト水晶体上皮細胞の初代培養を用いて、低酸素状態と通常酸素状態で発現に差‑ 57 ‑

がある遺伝子（群）を同定する。
(1) インフォームドコンセント取得のうえ、白内障手術時に切除した水晶体上皮組織の提供を受け、通常酸素濃度と低酸素濃度 (1-3%) で組織培養を行い、RNA を分離する。
(2) 通常酸素濃度と低酸素濃度で培養したヒト水晶体上皮から分離した RNA を用いてAffymetrix DNA ミクロアレイ解析を行い、両者で発現に差のある遺伝子（群）を同定する。
(Ⅱ) 低酸素下での UV 曝露により発現変動する遺伝子（群）を同定する。
(1) 株化ヒト水晶体上皮細胞 (SRA01/04) を用いて、低酸素条件下および通常酸素濃度条件
化において UV-B 曝露を行い RNA を分離する。
(2) Affymetrix DNA ミクロアレイを用いて、低酸素条件下と通常酸素濃度条件下での UV-B
曝露に伴う遺伝子発現変化を比較し、低酸素濃度下で特異的に発現変動する遺伝子（群）を同定する。
(Ⅲ) in vivo（個体）での UV 曝露により発現変動する遺伝子（群）を同定する。
(1) マウスの片眼に UV-B 曝露を行い、24 時間後に水晶体上皮部分を分離し、RNA を分離する。一方の眼には覆いをして UV-B 曝露せず、コントロールとする。
(2) Affymetrix DNA ミクロアレイを用いて、UV-B 曝露に伴う遺伝子発現変化を UV-B 非曝露と比較し、UV-B 曝露で特異的に発現変動する遺伝子（群）を同定する。
(Ⅳ) 重要性が示された遺伝子につき機能の解明を行う。
(1) 重要性が示された遺伝子について、過剰発現および発現ノックダウンの影響（増殖、接着、細胞運動、細胞分化状態等）を培養水晶体上皮で解析する。
(2) 重要性が示された遺伝子について、白内障患者水晶体上皮や白内障動物モデルでの発現解析を行う。また、当該遺伝子を過剰発現および発現ノックダウンした実験動物を作製し、水晶体機能や白内障発生への影響を明らかにする。
６．研 究 成 果(Ⅰ) 手術摘出ヒト水晶体上皮細胞の初代培養を用いて、低酸素状態と通常酸素状態で発現に差がある遺伝子（群）を同定する。
(1) インフォームドコンセント取得のうえ、白内障手術時に切除した水晶体上皮組織の提供を受け、通常酸素濃度と低酸素濃度 (2% O2) で組織培養を行い RNA を分離してAffymetrix DNA ミクロアレイ解析を行った。
(2) 独立した実験を 2 回行い、両者で共通して 2 倍以上の発現変化が認められた 11 遺伝子（低酸素下で上昇する遺伝子：FABP3、SLN、AK3L1、PADI2、VTN、ANGPTL4、PDK1、
IL1B、SLC22A3、低酸素で低下する遺伝子：RANBP3L、PRSS35）を同定した。
(3) 胎生期のマウス水晶体上皮細胞から RNA を分離し、レンズ発生過程での遺伝子発現変化を解析した。
(Ⅱ) 低酸素下での UV 曝露により発現変動する遺伝子群を同定する。
(1) 株化ヒト水晶体上皮細胞 SRA01/04 に対し、低酸素条件下 (2% O2) および通常酸素濃度‑ 58 ‑

条件化において UV-B 曝露 (30mJ) を行い RNA を分離した。
(2) Affymetrix DNA ミクロアレイを用いて、低酸素条件下と通常酸素濃度条件下での UV-B
曝露に伴う遺伝子発現変化を比較し、低酸素濃度下で特異的に発現変動する遺伝子（群）を同定した。
(Ⅲ) in vivo（個体）での UV 曝露により発現変動する遺伝子（群）を同定する。
(1) 8 週齢マウス (C57bl/6J) の片眼を覆ったのち、裸眼に UV-B 照射 (30mJ 相当) を行った。
24 時間後にレンズを摘出し、水晶体の核部分を除去して水晶体上皮部分を分離した。
(2) 水晶体上皮部分より RNA を分離し、Affymetrix DNA ミクロアレイを用いて UV-B 曝露で特異的に発現変動する遺伝子を同定した。独立した実験を 2 回行い、2 回の実験で共通して 1.5 倍以上に上昇する遺伝子を 68 遺伝子、0.66 倍以下に発現低下する遺伝子を 2遺伝子同定した。また、「organismal injury and abnormalities」、「ophthalmic disease」のパ
スウエイ、および OTX2、RHO、NRL を upstream regulator とするパスウエイが変動していることが示された。
(Ⅳ) 重要性が示された遺伝子につき機能の解明を行う。
現在、継続中である。
７．研究の考察・反省
本研究により、水晶体上皮細胞が低酸素状態に移行する際の発現変動を明らかにすることができた。また、in vivo で UV-B 曝露された水晶体上皮の遺伝子発現変化、および低酸素下で UV-B 曝露された水晶体上皮細胞の遺伝子発現変化を明らかにすることができた。これらの結果は、水晶体の形成および機能維持、紫外線曝露による機能異常の機構を考えるうえで重要な基礎データとなりうると考えられる。
反省点として、結果の公表が遅れているので、早急に論文化を目指したい。
８．研 究 発 表
投稿準備中。

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１．研究課題名：ラット脊髄損傷モデルにおける、Hyaluronidase-4 のコンドロイチン硫酸プロテ
オグリカン消化作用（研究番号

AR2012-05）

２．キーワード：１）ヒアルロニダーゼ 4 (hyalronidase-4)２）脊髄損傷 (spinal cord injury)３）ラット脊髄切断モデル (rat spinal cord hemisection model)
４）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (Chondroitin sulfate proteoglycans)５）抑制効果 (inhibitory effect)
３．研究代表者：川原研究分担者：加藤範夫・医学部・教授・整形外科学
伸郎・医学部・教授・生理学Ⅰ

石垣靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

奥田

鉄人・医学部・非常勤講師・整形外科学

４．研 究 目 的
脊髄の損傷後、損傷周囲に反応性アストロサイトが凝集しコンドロイチン硫酸プロテオグ
リカン (CSPGs) を主とするグリア瘢痕を形成することで軸索再生が阻害される。このCSPGs は chondroitinase ABC (ChABC) という細菌由来の外因性の酵素によって減少させ、脊髄の再生を促すことが可能であるが、同様の酵素の脊髄内での存在は不明である。
この CSPGs がラット脊髄半切モデルでは時間経過により自然に減少していくことから、生体脊髄内に ChABC と同様の酵素が存在し作用していることが考えられる。その酵素としてhyaluronidase-4 (Hyal-4) の可能性が報告されたことから、我々は抗 Hyal-4 抗体を作製し、ラット脊髄半切モデルにおいて Hyal-4 の存在を証明し、その発現時期についても知見を得ることができた。この Hyal-4 はどの細胞に由来するのか、また損傷後の軸索伸長に対する影響など詳細に検討することで、この Hyal-4 という内因性の CSPGs 消化酵素の脊髄内での役割を明確にしたいと考える。
５．研 究 計 画
脊髄損傷モデルは、CSPGs の自然現象が確認される脊髄半切モデルを使用した。切断モデ
ルの損傷部で CSPGs、Hyal-4、反応性アストロサイトについて CS56（CSPGs のマーカー）、
抗 Hyal-4 抗体、GFAP（アストロサイトのマーカー）を用いて蛍光免疫染色を行い発現部位の関係性を確認した。
CSPGs の消化を Hyal-4 が行っていることを証明するため、我々が作製した抗 Hyal-4 抗体
を用いて、損傷部への単回投与および浸透圧ポンプを用いた持続投与を行った。単回投与では損傷部周囲 3 ヶ所に 1µL ずつ Hyal-4 抗体とコントロールとして IgG（ウサギ血清由来）の投与を行い、持続投与では 0.11µL/hr で 4 週間まで投与できる浸透圧ポンプを用いて抗 Hyal-4
抗体、IgG の投与を行った。各時点で、凍結切片を作製し、CS56（CSPGs のマーカー）、GFAP‑ 61 ‑（アストロサイトのマーカー）の蛍光免疫染色を行い、Hyal-4 をブロックした場合の CSPGsの自然消失が見られるかどうかを検討した。
in vivo 実験においては、損傷部における GFAP 領域と、Hyal-4 領域が類似しており、アストロサイトが発現している可能性が高く、Hyal-4 を発現する細胞を特定するため、CSPGs を多量に含む Aggrecan をコーティーングしたディッシュにて胎生ラット脳由来の初代アストロサイトを培養し、免疫蛍光染色、ウエスタンブロット、マイクロアレイを行い in vitro でア
ストロサイトの役割について検討した。
６．研 究 成 果
脊髄切断モデルにおいて Hyal-4 と反応性アストロサイトの免疫染色では、損傷部辺縁に集積する GFAP 領域から損傷部に向けて一部オーバーラップする形で Hyal-4 領域が存在し、CS56 もまた GFAP 領域と一部オーバーラップする形で損傷部に集積していた。強拡大では、反応性アストロサイト周囲に存在する Hyal-4 が確認でき、反応性アストロサイトから Hyal-4が発現している可能性が示唆された。
Hyal-4 の抑制効果の検討では、抗 Hyal-4 抗体単回投与モデルでコントロール群（IgG 投与）と比較し、CSPGs の発現量に有意差は認めなかった。持続投与モデルでは、3 週まではコン
トロール群と比較し、有意差は認めなかったが、4 週で有意差を認めた。コントロール群は3 週と比べ CSPGs の発現量は有意に減少したが、抗 Hyal-4 抗体投与群では有意に増加した。
GFAP に関しては両群間で差は認めなかった。ラット脊髄半切モデルにおいては、Hyal-4 を抑制することで自然に消化されていた CSPGs が消化されずに残存していた。このことから、
Hyal-4 が CSPGs の内因性消化酵素の可能性が示唆された。
脊髄損傷の損傷部に CSPGs が多量に発現する。CSPGs が豊富にある状態を再現するためAggrecan をコーティーングしたディッシュで培養したアストロサイトは、反応性アストロサ
イトへ変化させることができなかった。マイクロアレイでは、Aggrecan コーティーングで培養したアストロサイトの Hyal-4 遺伝子はコントロール（Aggrecan コーティーングなしで培養）と比べて発現の増幅は認めなかった。CSPGs のみの条件下ではアストロサイト自体に変化はなく他のシグナルによって Hyal-4 を発現するか検討しなければならない。
７．研究の考察・反省
本研究により、生体内では明らかにされていない CSPGs の内因性消化酵素の一つに Hyal-4の可能性が示唆され、脊髄損傷部での Hyal-4 の発現方法が確立できれば今後の脊髄損傷治療の選択肢となりうると考えられた。
脊髄損傷は、臨床では挫傷による受傷機転が殆どであり、脊髄挫傷モデル、切断モデルでは損傷の程度が異なる。より臨床に近い挫傷モデルでの検討も予定していたが、専用のインパクターが必要であり、機器を準備することができず検討ができなかった。
今後は、Hyal-4 を発現している細胞を確認し、発現様式を明らかにすることで脊髄損傷部
での Hyal-4 の発現を増幅できるか、また、挫傷モデルと切断モデルでの損傷部の変化を検討‑ 62 ‑

する必要がある。
８．研 究 発 表
該当なし。

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１．研究課題名：IgG4 関連疾患の疾患指標因子および免疫グロブリン対応抗原の探索（研究番号
AR2012-06）
２．キーワード：１）IgG4 関連疾患 (IgG4-related disease)２）トランスクリプトーム解析 (Transcriptome analysis)３）プロテオミクス解析 (Proteomics analysis)４）CD14 抗原 (CD14 antigen)５）濾胞樹状細胞 (follicular dendritic cell)
３．研究代表者：正木康史・医学部・教授・血液免疫内科学

研究分担者：岩男

悠・医学部・助教・血液免疫内科学

中島章夫・医学部・助教・血液免疫内科学

４．研 究 目 的
IgG4 関連疾患は 21 世紀に入り本邦より発信された新たな疾患概念であり、全身の諸臓器にリンパ球と IgG4 陽性形質細胞増多による肥大、肥厚、腫瘤形成性病変を形成し、血清学的にも高 IgG4 血清を呈するリンパ増殖性疾患である。また、本疾患は中等量ステロイドが著効するという特徴を有する。本疾患の発見以前は、それぞれの臓器毎に異なった診断をくだされ、誤った治療が行われてきた可能性が高い。例えば、膵病変は膵臓癌の診断のもとに膵頭十二指腸切除のような侵襲の大きな手術が行われ、リンパ節病変は悪性リンパ腫や多中心性 Castleman 病の診断のもとに抗がん化学療法が行われ、一方で涙腺・唾液腺病変（いわゆるミクリッツ病）はシェーグレン症候群の診断のもとに対症療法のみで経過観察されてきた。現在は IgG4 関連疾患の診断がくだされ、適切な治療（ステロイド治療）が行われ多くの患者にとって福音となっている。一方で、明らかに異なった疾患を IgG4 関連疾患と誤診し、不適切なステロイド治療が行われている事例も散見され、注意を要する。
本疾患の病因に関して多くの研究がなされており、Th2 優位のサイトカインバランス、Tregの活性化などが明らかとなってきているものの、それらを更に上流で引き起こす根本的な病因はまだ不明である。IgG4 関連疾患の根本的な病因や新たな疾患活動性マーカーを探索するために、トランスクリプトーム解析 (DNA microarray) およびプロテオミクス解析（二次元電気泳動）を行う。また、多クローン性に増加する免疫グロブリンが認識する抗原を同定するために、ファージ・ディスプレイライブラリーを用いた発現クローニングを行う。更に検索可能な病理組織について、今まで多く検索されてきたリンパ系細胞以外の免疫担当細胞（単球、マクロファージ、樹状突起細胞）につき、免疫組織染色を追加しその分布を検討する。
５．研 究 計 画
本研究では IgG4 関連疾患の病因病態を解析するための基礎的研究を主目的として計画し、新たな診断マーカーや予後因子を探るための、遺伝子発現・蛋白発現の解析を行った。

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IgG4 関 連 疾 患 は今までの検討から、IgG2、IgG4、IgE が高値を呈し、Th2 優位のサイトカ
イン・プロファイルを呈し、Treg が活性化している事が判ってきているが、それらを更に上流で制御する根本的な病因は分かっていない。遺伝子レベルでの制御を検索するために DNA
microarray 解析を行い、更に蛋白発現を二次元電気泳動で解析した。また本疾患で産生される免疫グロブリンが何を認識する抗体であるかを探る事により病因に迫れる可能性があり、IgG4 関連疾患症例のプール血清を用いて、ランダム・ペプチド・ライブラリーを用いたファージ・ディスプレイによる発現クローニングを行った。更に病理免疫染色を追加し、既によく調べられているリンパ球以外の免疫担当細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞）の分布
および抗原発現を再評価した。具体的には CD68（マクロファージ）、CD163（M2 マクロファージ）、CD21（濾胞樹状細胞）、CD14（単球など）、CD16（単球）を染色し検討した。
６．研 究 成 果
本研究で得られたマーカー候補について、特許出願し登録された。
「IgG4 関連疾患診断用マーカー及びその利用」出願番号：特願 2010-194326（登録日；平成27 年 3 月 6 日）発明者：梅原久範、正木康史、友杉直久、石垣靖人（出願人：学校法人金沢医科大学）
病理組織の免疫染色の再検討の結果、IgG4-RDでは濾胞樹状細胞がCD14を特異的に発現していることを見出した。CD14は元々は単球のマーカーだが、IgG4-RDではCD14陽性濾胞樹状細胞が存在し、病因に関与している事を報告した。
７．研究の考察・反省
トランスクリプトームおよびプロテオーム解析の結果より、幾つかの自然免疫系分子（CLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、CXCR1、IL8RA、CXCR2、MS4A3 などの遺伝子、およびクラス
テリン、α1 アンチトリプシンなどのタンパク）の発現が健常者に比べ優位に低下している事を見出し、これらは IgG4 関連疾患の診断に有用と判断し特許申請に至った。しかしながら、これらはあくまでも結果であり、根本的な病因とはまだ決められない。
またファージディスプレイの解析では、患者血清に特異的に反応する幾つかのクローンを得たものの、そのアミノ酸解析の結果からは有意な抗原を同定できなかった。イタリアのグ
ループは同様の手法から H.pyroli 関連の抗原を報告したが、この結果の汎用性は現在否定的である。IgG4 関連疾患が自己免疫疾患ではなく、増加している免疫グロブリンも多クローン性である事から、このような手法で有意な結果を得る事は困難かもしれない。
そこで免疫組織の再検討を行う事とした。IgG4 関連疾患の病理組織学的特徴は、リンパ球と IgG4 陽性形質細胞増多、特徴的な線維化（花筵様線維化）、閉塞性静脈炎、リンパ濾胞形
成、好酸球増多などであるが、その中でも我々はリンパ濾胞形成が本疾患の重要な鍵を握る所見と考え、リンパ濾胞の目立つ組織を検討した。その結果、CD14 陽性樹状細胞は本疾患にのみ存在し、対象群（反応性リンパ節炎、多中心性 Castleman 病、シェーグレン症候群）
ではこの所見は認められなかった。今後は CD14 陽性樹状細胞を組織からのマイクロダイセ‑ 66 ‑

クションあるいは生細胞を用いたフローサイトメトリー法よりソーティングし、発現するサイトカインやケモカインを検討し、本疾患の根本的な病因に迫りたい。
８．研 究 発 表
① Satoh-Nakamura T, Kurose N, Kawanami T, Nakamura T, Iwao-Kawanami H, NakajimaA, Miki M,
Sakai T, Fujita Y, Tanaka M, Fukushima T, Masaki Y. CD14+ follicular dendritic cells in lymphoidfollicles may play a role in the pathogenesis of IgG4-related disease. Biomedical Res (Tokyo) 36(2)143-153,2015
Abstract: Proliferated IgG4(+) plasma cells are polyclonal, suggesting that the pathogenesis of
IgG4-related disease (IgG4-RD) involves upstream events related to the regulation of IgG4 expansion.
We hypothesized that lymphoid follicle formation may play an important role in the pathogenesis of
IgG4-RD. Using various antibodies, especially against monocyte, macrophage, and folliculardendritic cell markers, we immunohistochemically assessed the distribution of immune cells in
lymphoid follicles. Pathological findings of tissue samples from patients with IgG4-RD (n = 22),
reactive hyperplasia (n = 3), multicentric Castleman's disease (n = 3), and Sjögren's syndrome (n =13) were analyzed. CD14-positive lymphoid follicles were observed only in patients with IgG4-RD,
andCD14-positive

cells

were

identified

asfolliculardendritic

cells

by

multicolor

immunohistochemistry. There were few differences in the distributions of other cell types between the
IgG4-RD and control groups. The presence of CD14(+) follicular dendritic cells in lymphoid follicles
may play a pathophysiological role in IgG4-RD.

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１．研究課題名：NBI 拡大内視鏡を用いた胃粘膜微細表面構造変化の背景に存在する遺伝子異常の解明（研究番号

AR2012-07）

２．研究代表者：白枝久和・医学部・准教授・肝胆膵内科

研究分担者：有沢富康・医学部・教授・消化器内科学

研究分担者：林伸彦・医学部・講師・肝胆膵内科

研究分担者：松江泰弘・医学部・助教・肝胆膵内科

研究分担者：湊貴浩・医学部・助教・肝胆膵内科‑ 69 ‑

１．研究課題名：穿刺吸引細胞診における単眼モニターと測距センサー使用による安全性向上への検討（研究番号

AR2012‐08）

２．キーワード：１）甲状腺癌 (thyroid

carcinoma)

２）超音波 (ultrasonography)
３）穿刺吸引細胞診 (fine needle aspiration cytology)
３．研究代表者：下出祐造・医学部・講師・頭頸部外科学

研究分担者：辻裕之・医学部・教授・頭頸部外科学

三輪

高喜・医学部・教授・耳鼻咽喉科学

４．研 究 目 的
甲状腺や頸部リンパ節病変に対する超音波ガイド下穿刺吸引細胞診 (FNA) は今や必須の検査となり近年画像精度も向上している。しかし穿刺にはおおくの血管や神経における誤刺入等の合併症が生じやすい。そのような検査を安全に施行するため当科では検査支援機器を
金沢工業大学との医工連携で共同開発しているので報告する。
５．研 究 計 画
頸部穿刺に対して普段の穿刺に近い姿勢で、モニターを見やすく、検者にわかりやすい穿
刺深度の情報提供を目指し金沢工業大学との医工連携で検査支援機器を開発した。
６．研 究 成 果
穿刺時の先端の描出が唯一の確認法であったが、本機器の開発により、更に聴覚情報を付加する事で穿刺距離がより明確となり、医療事故の防止や、残された Data が万が一医療事故を生じた際の訴訟において重要な情報となり得る可能性が示された。
また、下記の通り特許を取得するに至った。
特許取得：特許登録番号

第 5565701 号

発明の名称：穿刺操作支援システム
出願人：金沢医科大学、金沢工業大学
発明者：下出祐造、辻裕之、高羽正人

他

７．研究の考察・反省
現在初期試作機を作成枝、ライオンパワー株式会社の協力のもとに改良型試作機を作成し、今後各種医療分野への適応を目指し改良を重ねていたが、同社との連携継続困難となり、現在代わりの業者を改めて検討中である。

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８．研 究 発 表① 甲状腺結節性病変や頸部リンパ節に対する穿刺吸引細胞診の検討とその支援機器について．
化学工業

65：577-581、2014.

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１．研究課題名：カロリー制限により誘導される血漿中 SIRT1 調節因子に対する網羅的プロテオ
ーム及び micro RNA 解析による探索（研究番号

AR2012-09）

２．キーワード：１）カロリー制限 (Caloric restriction)２）サーチュイン 1 (SIRT1)
３．研究代表者：津田真一・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

研究分担者：小西一典・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

西澤誠・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
肥満／メタボリック症候群／2 型糖尿病患者数は急増しているが、食事摂取量の修正はこれらの病態改善において最も重要である。摂取カロリー制限 (CR) は、酵母～げっ歯類・サルにおいて、寿命を延長する効果を発揮することが知られている。ヒトでは、この CR が、実際に寿命の延長効果を示すかどうかは、今のところ明らかにはされていないが、抗糖尿病／酸化ストレス／炎症／抗動脈硬化／悪性腫瘍発症効果を含む様々な健康上の利益をもたらす可能性を有することが報告されている。それら CR による有益な効果は、NAD+依存性脱アセチル化酵素 SIRT1 の活性化を介してもたらされる可能性が実験動物において示されている。しかし、ヒトにおける CR が SIRT1 の活性化をきたすかどうか、もしそうなら、SIRT1の発現を調節する因子とその機構は何かについては十分には明らかとされていない。したがって、今回の研究の目的は、①ヒトにおける CR が SIRT1 の発現・活性化を誘導するかを検証し、②CR による SIRT1 の発現・活性化の調節因子の探索・同定を行うことである。
５．研 究 計 画
肥満者 (n=4) を対象に行った 25% CR 前後の血漿（既に検体は採取済み）を用い、以下を行う。
① プロテオーム解析（ProteinChip SELDI システム）
見出した標的分子の同定:精製条件に関して至適カラム（イオン交換、逆相）、精製バッフ
ァー条件（pＨ,塩濃度、有機溶媒濃度）を決定した後、抽出サンプルを TEFCO Peptide PAGE
ゲル 16%により分離し、目的バンドの切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、MS/MS
スペクトルの検出を行う。その後、Swiss-Prot 検索にて同定する。
② Micro RNA アレイ解析 （超高感度 DNA チップ“3D-Gene®”、東レ）
遺伝子発現プロファイルをシグナル経路別に分類した遺伝子群に分け（Gene set enrichment
analysis (GSEA) を用いる）、SIRT1 と関連する可能性のある、糖・脂質代謝、ミトコンドリ
ア、あるいは炎症関連シグナル系において変化の大きい候補をしぼる。
③ ①、②で得られた候補蛋白及び、候補 micro RNA に対する過剰発現及び、ノックダウンを
HEK293 細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞において行い、SIRT1 発現と活性化に対する機能‑ 73 ‑

解析を行う。
さらに、メタボリック症候群、2 型糖尿病患者において、血漿中の標的蛋白あるいは、
microRNA に対する解析を行い、単核球中の SIRT1 発現と糖・脂質代謝及び炎症マーカーとの疾患関連性を検証する。
６．研 究 成 果
カロリー制限（25%制限）が、SIRT1 を活性化するのかをメタボリック症候群患者を対象に検証した (n=4)。その結果、カロリー制限開始 3 週後から、末梢血単核球における SIRT1
発現・活性化の増加を、さらに体重・内臓脂肪を含む体脂肪の減少、インスリン感受性の増加、中性脂肪・遊離脂肪酸の減少、炎症関連因子の減少傾向をも認め、7 週（試験終了）までそれらの効果は持続していた。さらに、患者の血清をヒト培養骨格筋に添加し、SIRT1 活
性・ミトコンドリア・バイオジェネーシスをカロリー制限前・後で比較検討したところ、カロリー制限後の血清刺激で、SIRT 活性・ミトコンドリア量ともに増加傾向を示すことを見出した (Kitada M et al. BBA, 2013)。
Micro RNA アレイ解析 （超高感度 DNA チップ“3D-Gene®”、東レ）をヒトサンプルについて行ったが、カロリー制限前後で明らかに変化する microRNA を見出すには至らなかった。
７．研究の考察・反省
カロリー制限は、これまで報告されてきた動物実験同様、ヒトにおいても SIRT1 の発現と活性化を誘導する。またカロリー制限後の血清を培養細胞に附置すると SIRT 活性・ミトコ
ンドリア量が増加したことから、カロリー制限の効果は血液を介して全身的に発揮される可能性が強く示唆される。microRNA は血液を介して全身の様々な細胞・組織に取り込まれ、
遺伝子発現を制御していると考えられている。今回、カロリー制限前後のヒト血漿サンプル
において網羅的に microRNA 解析を施行したが、サンプル数が N=4 と少なく、カロリー制限
前後で明らかに変化する microRNA を見出せなかった。プロテオーム解析は、なお検討中である。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Tsuda S, Kanasaki K, Koya D. Calorie restriction in
overweight males ameliorates obesity-related metabolic alterations and cellular adaptations throughanti-aging effects, possibly including AMPK and SIRT1 activation. Biochimica et Biophysica Acta
1830 (2013) 4820–4827
Abstract: BACKGROUND: Calorie restriction (CR) is accepted as an experimental anti-aging
paradigm. Several important signal transduction pathways including AMPK and SIRT1 are implicatedin the regulation of physiological processes of CR. However, the mechanisms responsible foradaptations remain unclear in humans.
SCOPE OF REVIEW: Four overweight male participants were enrolled and treated with 25% CR of‑ 74 ‑

their baseline energy requirements for 7weeks. Characteristics, including body weight (BW), bodymass index (BMI), %fat, visceral fat area (VFA), mean blood pressure (MBP) and VO2 max, as wellas metabolic parameters, such as insulin, lipid profiles and inflammatory makers and the expressionof phosphorylated AMPK and SIRT1 in peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs), were
determined at baseline and then after 7weeks. In addition, we assessed the effects of the serum
collected from the participants on AMPK and SIRT1 activation and mitochondrial biogenesis incultured human skeletal muscle cells.
MAJOR CONCLUSIONS: After CR, BW, BMI, %fat, VFA and MBP all significantly decreased,
while VO2 max increased, compared to those at baseline. The levels of fasting insulin, free fatty acid,and inflammatory makers, such as interleukin-6 and visfatin, were significantly reduced, whereas theexpression of phosphorylated AMPK and SIRT1 was significantly increased in PBMNCs collected
after CR, compared to those at baseline. The skeletal muscle cells that were cultured in serum
collected after CR showed an increase in AMPK and SIRT1 activity as well as mitochondrial
biogenesis.
GENERAL SIGNIFICANCE: CR is beneficial for obesity-related metabolic alterations and induces
cellular adaptations against aging, possibly through AMPK and SIRT1 activation via circulating
factors.

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１．研究課題名：ステロイド誘発性大腿骨壊死の遺伝子修飾骨髄由来組織幹細胞の全身投与による予防（研究番号

AR2012-10）

２．キーワード：１）酸化ストレス (Oxidative stress)２）低酸素 (hypoxia)
３）ステロイド (steroid)４）骨壊死 (osteonecrosis)
５）骨髄由来組織幹細胞 (BM-MSC)
３．研究代表者：市堰徹・医学部・准教授・整形外科学

研究分担者：兼氏

歩・医学部・教授・整形外科学

松本忠美・医学部・教授・整形外科学

上田善道・医学部・教授・病理学Ⅱ

前岡勇人・医学部・講師・整形外科学（退職）４．研 究 目 的
大腿骨頭壊死は難治性疾患であり、一旦壊死に陥ってしまった場合、ADL は非常に障害されてしまうことから手術加療を要することが多い。しかしながら、本疾患の機序に関しては、
これまでの盛んな研究にもかかわらず、未だ解明には至っておらず、有効な予防法もはっき
りしていないことが現状である。従って、本疾患の機序解明と予防法の究明については非常に重要な課題とされている。
これまで当科では近年様々な疾患での関与が認められている酸化ストレスに注目し、家兎およびラットにて動物モデルの作成を通して、ステロイド投与後早期に骨内での DNA 酸化
傷害、抗酸化剤による骨壊死抑制の可能性および酸化ストレス単独誘発による骨壊死発生について報告した。これまでの報告で、本病態の最終的な原因は虚血‐低酸素であることは意見の一致をみている。しかしながら、これまでの大腿骨頭壊死症に関する報告では虚血-低酸素が動物実験での骨内や骨細胞自体にどのように作用するのかを示した報告はなく、ステロ
イドの骨細胞への直接作用と低酸素との関連もはっきりした指摘はない。
一方、ステロイド添加による培養骨細胞でアポトーシスが生じていることが報告されているが、ネクローシスとの関連は報告がなく、多くの点が不明である。そのため実際にステロイドによる骨細胞死の形態や誘導因子、もしくは低酸素の影響について検討する必要があると考えられる。我々は、実験①として当科で作成した酸化誘発 Rat 大腿骨頭壊死モデルにおける骨頭内低酸素状態の有無と時期および、実験②として組織の低酸素、ステロイド添加における骨細胞壊死誘導について検討した。また、ステロイド誘発性大腿骨壊死と酸化ストレスの関係、生体内過酸化の標的が大腿骨血管内皮であること、さらに Vitamin E の抗過酸化作用を利用した壊死予防法を報告した。しかし、その予防効果は部分的で、
angiogenesis-osteogenesis coupling に着目した新たな予防法の確立が課題となった。今回、実‑ 77 ‑

験③として、骨髄由来組織幹細胞 (BM-MSC) の傷害血管修復機能を有することに着目し、BM-MSC の全身投与による大腿骨頭壊死予防法の確立とその機序の分子レベルでの検証を目的とした。
５．研 究 計 画
(1)

酸化誘発剤であるブチオニンスルフォキシミン (BSO) を Rat に 500g/kg 腹腔内に投与した大腿骨頭壊死モデル (Ichiseki T et al, Arthritis Rheum 2011) を使用した。大腿骨頭内における HIF-1α の発現を、免疫組織化学的および Western blot 法にて確認した。さらに他臓器での発現との比較を肝臓、骨幹部、腎臓で行った。

(2)

マウス培養骨細胞である MLO-Y4 を用いて実験を行った。培養は 20%酸素環境下（正常酸素環境下）、1%酸素（低酸素）環境下、デキサメサゾン 1µM (Dex)を添加したもの、低酸
素環境下において Dex を添加したものをそれぞれ 24 時間培養し、総細胞数に対する細胞死の 割 合 を 測 定 し た 。 次 に 骨 代 謝 に 関 係 し て い る Wnt シ グ ナ ル の 抑 制 因 子 で あ る
Dickkopf-1(Dkk-1)を用いて、Dex 添加時や低酸素環境下における MLO-Y4 の Dkk-1 の発現を測定した。また Dkk-1 siRNA を用いて Dkk-1 をノックダウンし、細胞死の状態を確認した。すべての群で、細胞死の割合の測定には Apoptoric/Necrotic Cells Detection Kit を用いて蛍光免疫染色を行い、1 視野あたりの総細胞数に対するアポトーシス、ネクローシクの数の割合を測定した。また Dkk-1 siRNA の抑制効果を確認するため未転写のものと control、
Dkk-1 siRNA を転写したものをそれぞれ細胞死の割合を測定し、ウエスタンブロットでも同様に行った。

(3)

これまでのステロイド誘発大腿骨壊死に関する実験で確立した骨壊死動物実験モデルであるウサギ・ステロイド投与骨壊死モデル (Ichiseki T et al, Rheumatol 2005) を用い、骨髄由
来間葉系組織幹細胞 bone marrow derived-mesenchymal stem cell BM-MNC の経静脈全身投与によるステロイド誘発性大腿骨壊死の予防効果を病理組織学的に検討した。

６．研 究 成 果
(1)

酸化誘発ラットにおける大腿骨頭内での虚血-低酸素の状態は HIF1 の発現から、酸化誘発後 6 時間以降という非常に早期の段階で、発生していることが確認できた。また、肝臓、腎臓、骨幹部と比較して約 10 倍以上の発現から、非常に強い低酸素状態に陥っていることが確認できた。

(2)

培養骨細胞を 24 時間低酸素環境下にさらした場合、アポトーシス、ネクローシスともに少なく、Dex 添加のみ（通常濃度の酸素下）でも同様であった。一方、低酸素環境下＋Dex
添加を行い、生体下での Angiogenesis-osteogenesis coupling (AOC) 障害に似た環境を再現したところ、有意に細胞死が増加した (p<0.01) 。特にネクローシスの割合が著しく増加した。
また、Dkk-1 の発現は Dex 添加のみで著明な発現を認め、Dkk-1 siRNA を転写することで有意に発現量が低下したことを確認した (p<0.01) 。さらに Dkk-1 をノックダウンすることによって、細胞死自体の割合が有意に減少した (p<0.01) 。

‑ 78 ‑

これらのことから、Angiogenesis 障害もしくは Osteogenesis 障害のいずれかの単独では骨細胞壊死までは陥らないこと、骨細胞壊死の発生には AOC 障害の成立が必要であることが考えられた。従って、血管内皮・骨芽細胞の酸化ストレスからの保護と傷害細胞自身の修復に着目した新たな予防法の確立が重要と考えられた。
(3)

Angiogenesis-osteogesis coupling (AOC) に着目したステロイド誘発性大腿骨壊死に対する有効な予防法の確立を目指し、骨髄由来間葉系組織幹細胞

bone marrowderived-mesenchymal stem cell (BM-MSC) の血管保護・傷害血管修復機能に着目し、BM-MSCの経静脈的全身投与による大腿骨壊死予防の確立とそこで働く分子機構の解明を目指し研究を進めた。
ウサギ・ステロイド投与骨壊死モデルにおいて BM-MSC の静脈内投与により壊死発生率は約 70%から約 10%に低下を認めた。
現在、GFP 遺伝子導入 BM-MSC の静脈内投与により壊死部への細胞集積を共焦点蛍光顕微鏡による確認を行うことに向けて検討をすすめている。
７．研究の考察・反省
本研究の培養細胞を使用した研究から、AOC 障害の成立が骨壊死誘導に非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、この知見は今後の研究に有用であると考えている。
一方で、BM-MSC の経静脈的全身投与による大腿骨壊死予防の確立に対しては、当初予定していた期間内での最終的な検討が困難であった。
しかしながら、本検討を行うことによって BM-MSC 投与による骨壊死予防における今後の課題が明確になってきたため、今後も継続して検討を行う方針である。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 79 ‑

特別奨励研究（Ｂ）
成果報告書

ＰＲ２０１２-０１～１８

１．研究課題名：翼状片組織における酸化ストレスマーカーの発現と翼状片予防薬の開発（研究番号PR2012‐01）

２．キーワード：１）翼状片 (Pterygium)２）DNA マイクロアレイ解析、遺伝子オントロジー解析(Microarray analysis and Gene Ontology analysis)３）抗酸化蛋白 (Antioxidant protein)４）上皮間葉系移行 (Epithelial mesenchymal transition)
３．研究代表者：柴田奈央子・医学部・助教・眼科学
研究分担者：河上裕・医学部・講師・眼科学（異動により不参加）

矢口裕基・医学部・助教・眼科学（退職により不参加)

久保江理・医学部・教授・眼科学

４．研 究 目 的
翼状片は、球結膜上皮が角膜に侵入する眼疾患で、乱視が増加し視機能低下と充血など美容上の問題を引き起こす。眼部表面は皮膚と同様、直接太陽紫外線に曝される場所であり、その発症要因は紫外線が強く関係している。翼状片発症機序については、これまでに紫外線による酸化ストレスが関与しているという報告や glows factor、上皮間葉系移行、炎症メディ
エーターなどが関与している報告もあるが病態はまだ不明の点も多い。そこで、本研究では切除されたヒト翼状片組織において、DNA マイクロアレイ解析及び遺伝子オントロジー解析を行い、遺伝子を網羅的に解析した。発現の多くみられた遺伝子について、翼状片頭部と体部でその発現量を比較することで翼状片発症のメカニズムの解明することが目的である。また、抗酸化蛋白 PRDX6 の発現や上皮間葉系移行 (EMT) についてリアルタイム PCR、プロ
テインブロットを用いて測定し翼状片組織発症との関係を検討する。
５．研 究 計 画
①検体採取

翼状片及びコントロール正常結膜

翼状片は角膜輪部を境に頭部と体部を分けて採取②翼状片 3 サンプルを用いて DNA マイクロアレイ解析、遺伝子オントロジー解析を施行③DNA マイクロアレイ解析で得られた発現遺伝子についてウエスタンブロットとリアルタイ
ム PCR 法により翼状片頭部と体部での発現量をコントロール正常結膜と比較する。
また、αSMA、PRDX6、カタラーゼにおいても同様に各組織の発現量の比較を行う。
④培養結膜上皮細胞への紫外線照射による蛋白の発現変動を測定し検討する。
６．研 究 成 果
河上裕と矢口裕基は、異動と退職により分担者より除外した。

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計画①の成果：担当者

柴田奈央子

2012 年から 2015 年の期間に、文章による同意を得た、翼状片組織 32 サンプル、コン
トロール正常結膜組織 9 サンプルを採取した。
計画②の成果：担当者

柴田奈央子

久保江理

翼状片組織 3 サンプルと正常結膜組織１サンプルを使用し、DNA マイクロアレイ解析
及び遺伝子オントロジー解析を行った。正常結膜組織よりも 2 倍以上に発現している遺伝子を検討した結果、3 サンプル中 2 サンプルで特に Matrix metalloproteinase9 (MMP9) 、Keratin24 (KRT24) が多く発現していた。また、遺伝子オントロジー解析では細胞外基質に関わる遺伝子組成及び血管伸長に関与する遺伝子組成がみられた。コントロールに比べて 2 分の 1 以下の発現量であった遺伝子としては、ウイルス防御に対する反応低下や自然免疫に対する反応低下、アポトーシスを含めた蛋白質分解能の低下がみられた。
計画③の成果：担当者

柴田奈央子

久保江理

リアルタイム PCR
Microarray analysis で翼状片 3 サンプル中 2 サンプルで発現が 4 倍以上になっていた
遺伝子 MMP9 と KRT24 について PCR で発現確認を行った。細胞外マトリックスの分
解や創傷治癒に関わっている MMP9 はコントロールを 1 とした場合、翼状片頭部で 753、
翼状片体部で 1075 と多くの MMP9 の発現を認めた。翼状片頭部と体部では有意差はなかった。
KRT24 はコントロールを 1 とした場合、翼状片頭部で 954.9、翼状片体部で 195.4と頭部で有意に発現していた。
抗酸化蛋白 Prdx6 は real time PCR 法で翼状片体部で有意に高く発現がみられた。
Catalase においてはコントロールと比較して差異はなかった。
ウェスタンブロット法
翼状片頭部と体部における KRT24 の発現量は Western blot の結果、頭部で多く発現がみられた。αSMA の発現量については WB では全体的に発現量は低かったが、コントロールでほとんどみられず翼状片頭部及び体部で発現がみられた。
抗酸化蛋白である Peroxiredoxin6 (Prdx6) の発現量を検討したところ、WB 法で32kDa 付近に翼状片頭部に発現量の増加を認めた。
Catalase については翼状片頭部で高い傾向があったが有意差はなかった。
計画④の成果：担当者

柴田奈央子

ヒト結膜線維芽細胞を培養し、紫外線を照射することによる MMP9 と Prdx6 の発現変動について検討した。MMP9 については紫外線照射量が多い程強く発現する傾向にあった。
Prdx6 については紫外線照射量が多い程発現量は低下する傾向にあるが、結果にばらつきがあった。

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７．研究の考察・反省
コラーゲンの分解に重要な MMP9 の発現上昇は、進行した翼状片ほど多くなることが報告されている (S.F.Yang et.al IOVS October2009) 。MMP は炎症性刺激により活性化され、創傷治癒や癌の進行などの病的過程に関与している。翼状片では輪部組織において多種類の MMPがみられ、これが Bowman 膜の侵食に関与していると推測する報告がある (N.Dushku et al.
Arch Ophthalmol.2001) 。今回のマイクロアレイ解析においても、MMP9 の発現上昇はみられたが、頭部と体部では発現量に有意差はなかった。これは、採取サンプルにおける輪部組織の含有量の違いだった可能性がある。KRT24 (Keratin) と翼状片に関する報告は今までになく、
KRT24 は、比較的高分化な腫瘍でみられるとされている。本研究では翼状片頭部に有意に発現しており、翼状片病態における腫瘍性を表す結果と考えられた。上皮間葉系移行 (EMT) のマーカーである αSMA は本研究でも翼状片でみられた。創傷治癒の場合、αSMA を産生する
筋上皮細胞は代償性に増殖し、その発現は良性腫瘍を示唆している。つまり、翼状片は、輪部角膜の腫瘍性変化や EMT により発症することが示唆される。
Prdx6 は抗酸化タンパクである。水晶体に関する研究において、PRDX6 は種々の細胞外刺激により発現が誘導され生体防御反応を行なっており、加齢や酸化ストレスの上昇に伴い、Prdx6 は低下することが今まで明らかになっている (Kubo E et al. Mech Aging Dev. 2006) 。現在まで、Prdx6 と翼状片の関連をみた報告は今までにない。本研究において、Prdx6 が翼状片頭部で発現量が低く、体部で高いという結果をえたが、これは頭部で酸化ストレスが多いことが推測される。
本研究においての反省点は、ヒト翼状片検体は充分量を採取できたが、正常結膜組織検体の採取が少なかった点である。正常結膜検体の対象を結膜弛緩症患者と限定したため症例数が少なかったものと考えた。MMP9 のタンパクレベルの測定が、抗 MMP9 抗体のクオリティが悪く検出できず、検討できていないため、今後タンパク抽出方法や抗体を変更し再検討する予定である。翼状片の抗酸化能について検体のばらつきが多く、明らかな結果が得られなかった。よって、培養系で検討する予定である。初代培養ヒト結膜線維芽細胞の紫外線照射
実験についてはある程度成果は上げられたがまだ実験段階であり、今後は初代培養ヒト角膜上皮細胞を用いてさらなる実験を予定している。今後はヒトサンプルの症例数増加と、培養実験の追加実験をし、データを解析し論文を完成させる予定である。
８．研 究 発 表
投稿準備中。

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１．研究課題名：実験的アナフィラキシーショック時の脳循環動態の放射線医学的検討（研究番号

PR2012-02）

２．キーワード：１）アナフィラキシー (anaphylaxis)
２）MRI
３．研究代表者：豊田一郎・医学部・助教・放射線医学

研究分担者：利波久雄・医学部・教授・放射線医学

４．研 究 目 的
アナフィラキシーショックにおける脳病変の解析については、研究が進んでいない。そこ
で、ラットのアナフィラキシーショックモデルにおいて脳循環動態に注目して放射線医学的に次の 2 点に絞り検討する。
①マクロ的な脳循環動態の解明：脳血管造影による脳血流の調節②ミクロ的な脳循環（脳微小循環）動態の解明：脳 MRI による脳血液関門の透過性変化
５．研 究 計 画
アナフィラキシーショックの脳循環動態の解明検討をラットアナフィラキシーショックモ
デルで行う。
1) 脳血管の収縮弛緩挙動：脳血管造影で脳血管径を測定して収縮・弛緩の挙動を解明
2) 脳血液関門の変化：(1) 脳 MRI による細胞内水腫と血管外水腫の検討(2) Fluorescein-Evans Blue の二重指示薬による BBB 血管透過性の精細な検討期待される成果として以下の 2 点が考えられる。
1) アナフィラキシーに対して脳血管が収縮 or 弛緩するかは興味深く本研究で明らかとなる。
2) 脳血管透過性と組織学的検討では、アナフィラキシー時には鋭敏な検出指示薬である NFの漏出は多くの部位で予想される。一方、EB の漏出は BBB の欠落部位や弱い部位で増強し、さらに肥満細胞の局在とその活性化（脱顆粒）と関連することが予想される。特に、脳幹部であれば、血管運動中枢への関連性が示唆され、アナフィラキシー低血圧の循環中
枢制御の研究への発展性につながるものである。
６．研 究 成 果
ラットのアナフィラキシー低血圧時において、脳内に浮腫や肥満細胞の賦活化は認められなかった。アナフィラキシー低血圧時に MRI で有意な T2RT の上昇を認め、浮腫の存在が示唆された。組織学的に喉頭蓋に浮腫の存在が証明された。

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７．研究の考察・反省本研究の主要な知見は、MRI でアナフィラキシー低血圧時に喉頭で早期に浮腫を示唆する
信号変化を認めたが、脳には変化がなかった。脳の浮腫性変化の発生機序としては、血管性脳浮腫と細胞傷害性脳浮腫の 2 つが考えられる。血管性脳浮腫は肥満細胞によるサイトカイン放出により誘起されるという報告があるが、本研究では肥満細胞数に変化はなく、脱顆粒像も認められなかった。これは血管性浮腫の欠如に矛盾しない。細胞傷害性脳浮腫はアナフィラキシー低血圧における脳循環不全により発生する可能性が考えられた。しかし、本研究では脳に浮腫性変化は認められなかった。これは血圧低下の程度および持続時間が不十分だ
った可能性がある。
８．研 究 発 表
① Ichiro Toyota, Mamoru Tanida, Toshishige Shibamoto, Mofei Wang, Yasutaka Kurata, and Hisao
Tonami. MRI Reveals Edema in Larynx (But Not in Brain) During Anaphylactic Hypotension in
Anesthetized Rats. Allergy Asthma Immunol Res. Nov 2013;5(6):389-396
Abstract: Purpose: Anaphylactic shock is sometimes accompanied by local interstitial edema due toincreased vascular permeability. We performed magnetic resonance imaging (MRI) to compare edemain the larynx and brain of anesthetized rats during anaphylactic hypotension versus
vasodilator-induced hypotension.
Methods: Male Sprague Dawley rats were subjected to hypotension induced by the ovalbumin antigen(n=7) or a vasodilator sodium nitroprusside (SNP; n=7). Apparent diffusion coefficient (ADC) andT2-relaxation time (T2RT) were quantified on MRI performed repeatedly for up to 68 min after the
injection of either agent. The presence of laryngeal edema was also examined by histologicalexamination. Separately, the occurrence of brain edema was assessed by measuring brain watercontent using the wet/dry method in rats with anaphylaxis (n=5) or SNP (n=5) and thenon-hypotensive control rats (n=5). Mast cells in hypothalamus were morphologically examined.
Results: Mean arterial blood pressure similarly decreased to 35 mmHg after an injection of theantigen or SNP. Hyperintensity on T2-weighted images (as reflected by elevated T2RT) was found in
the larynx as early as 13 min after an injection of the antigen, but not SNP. A postmortem histologicalexamination revealed epiglottic edema in the rats with anaphylaxis, but not SNP. In contrast, nosignificant changes in T2RT or ADC were detectable in the brains of any rats studied. In separate
experiments, the quantified brain water content did not increase in either anaphylaxis or SNP rats, ascompared with the non-hypotensive control rats. The numbers of mast cells with metachromatic
granules in the hypothalamus were not different between rats with anaphylaxis and SNP, suggesting
the absence of anaphylactic reaction in hypothalamus.
Conclusion: Edema was detected using the MRI technique in the larynx during rat anaphylaxis, but
not in the brain.

‑ 86 ‑

１．研究課題名：肺腺癌の AQP 発現調節機構における HIF-1／ヒストン修飾による新規制御法の開発研究（研究番号

PR2012‐03）

２．キーワード：１）肺癌 (lung carcinoma)
２）アクアポリン 1 (aquaporin 1)
３）HIF-1α４）ヒストン修飾 (histone modification)
３．研究代表者：町田雄一郎・医学部・助教・呼吸器外科学
研究分担者：佐久間勉・医学部・教授・呼吸器外科学（退職）４．研 究 目 的
肺癌は高い浸潤・転移能を特徴とする。近年、分子標的薬の開発により治療に幅が生まれたが、その効果は満足できるものではない。アクアポリン aquaporin (AQP) は、あらゆる生命現象の基盤をなす水分子に対する特異的チャネルとして発見された (Preston GM, et al.
Science 1992) 。近年、細胞増殖や浸潤・転移などがんの生物学的特性に重要な役割を果たしている可能性が提唱され (Verkman AS, et al. J Mol Med 2008) 、我々は AQP1 の過剰発現が術後転移発生と生命予後に密接に関係していることをこれまでに明らかにした (Machida Y, etal, Hum pathol 2011) 。
エピジェネティックは、同一 DNA 配列から異なった表現型を誘導する仕組みで、癌における遺伝子発現抑制での役割が現在注目されている。肺癌細胞を含め AQP1 の腫瘍細胞での発現調節機構の報告は数少なく、エピジェネティック制御機構に関しては全く知られていな
い。エピジェネティックな遺伝子の発現制御には、DNA のメチル化、ヒストン修飾とクロマ
チン再構築が互いに協調・拮抗し遺伝子発現の制御に関わっているが、種々の腫瘍におけるこれまでの情報から、申請者は「肺癌浸潤先進部での AQP 遺伝子の発現誘導においてヒストン修飾が重要な役割を演じているのでは」という仮説に至った。
肺腺癌の浸潤先進部において lamellipodia 形成促進を介し浸潤・転移能の亢進に関わる
AQP1 の発現亢進における HIF-1 系を介したヒストン修飾酵素の発現調節による エピゲネ
チックな遺伝子発現調節機序の関与を明らかにする。
５．研 究 計 画
(1) 肺癌における検討
2001 年～2008 年に金沢医科大学呼吸器外科で切除された 92 例肺癌症例を対象とし、
H3K4me2(dimethylated histone 3 lysine 4) 、 H3K9Ac(acethylated histone 3 lysine 9) 、H3K18Ac(acethylated histone 3 lysine 18) 、 H3K27me3(trimethylated histone 3 lysine 27) 、
H4R3me2(dimethylated histone 4 arginine 3)の 5 つヒストン修飾と肺癌の病期、細胞分化度、FDG-PET の集積、術後再発の関連及び AQP1・HIF-1α との関連について検討した。ヒストン‑ 87 ‑

修飾に関しては免疫組織染色を行い、50%以上発現を高発現、50%以下発現を低発現と定義した。また、免疫染色には Spiral array 法による組織マイクロアレイを作製し、染色条件の均一化を図った。統計解析は X2 検定で行った。また、無症候性生存率は Kaplan-Meier 法を用いた。
(2) 肺腺癌における検討
2001 年～2008 年に金沢医科大学呼吸器外科で切除された 81 例肺腺癌症例を対象とし、(1)で使用した 5 つヒストン修飾を用い、免疫染色を行った。免疫染色スコアは H-score を用いて行い、H-score<150 のものを低発現、H-score≧150 のものを高発現と定義した。Cox 比例ハ
ザードモデルを用いて肺腺癌の術後再発とヒストン修飾の発現の関連を解析し、Kaplan-Meyer 法により作製した生存曲線を log-rank test により検定した。さらには HIF-1 及び AQP1・LSD1 との関連や FDG-PET・血管新生因子と関連について検討した。
(3) 肺癌組織を用いた Western blot
使用したのは (1) で使用した 5 つのヒストン修飾を用いた。タンパクはリーシス・バッフ
ァ（50mM のトリス-HCl、pH 7.6、10%のグリセロール、5mM の酢酸マグネシウム、0.2mMのエチレンジアミン四酢酸、1mM のフェニルメチルスルホニル弗化物と 1%のナトリウム・
ドデシル硫酸塩）を使用して抽出された。抽出されたタンパク (10μg) は、10%ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行った。ニトロセルロース膜は、2μg/ml の濃度で、抗ポリクローナル抗体を使用して、4℃で終夜反応した。ブロットは、室温で 1 時間ヤギ抗ウサギ IgG 抗体を用いて行った。ニトロセルロース膜は Chemiluminescence Luminol Reagent で反応し、そして、ATTO Light-capture を使用して撮影した。更に、Western blot 法による蛋白発現を加え、フリーソフト ImageJ を使用してゲル電気泳動の定量解析を行った。
(4) in vitro での検討
3 つの肺腺癌細胞株 (ABC1、RERF-LC-Ad1、RERF-LC-MS) を使用した。21%酸素下で培養した細胞株と BIONIX-2（スギヤマゲン、日本）を用いて 1%酸素下 72 時間で培養された細胞株を作製し、Western blot 法を用いてタンパクの発現を評価した。
(5) 統計解析
臨床的エンドポイントは、治療開始から転移（転移のない生存）の時間であった。AQP 発
現と臨床病理因子の間の比較のために、X2 検定を使用し、p<0.05 で統計学的に有意であるとみなした。すべての統計解析は、StatView ソフトウェアを使用して行われた。
６．研 究 成 果
(1) 肺癌における検討
H3K4me2 は、術後再発 (p=0.039) 、肺癌の病期 (p=0.005) 、細胞分化 (p<0.001) と有意差を認めた。H3K9Ac と H3K18Ac も肺癌の細胞分化と有意差を認めた。H4R3me2 は FDG-PETの集積 (p=0.029) と有意差を認めた。ヒストン修飾の中でも H3K4me2 は肺癌における重要な因子であることが解明された。しかし、AQP1・HIF-1α とヒストン修飾には関連性を認めなかった。

‑ 88 ‑

(2) 肺腺癌における検討
肺腺癌細胞のヒストン修飾における陽性率 (H-score≧150) は、H3K4me2 が 54.3%、H3K9Ac
が 23.5%、H3K18Ac が 18.5%、H3K27me3 が 25.9%、H4R3me2 が 42.0%であった。H3K4me2の高発現は、肺腺癌の術後再発率と有意な関連性を認めるとともに、術後の無症候性生存期間の有意な短縮が示唆された (p=0.0029) 。単変量解析・多変量解析でも有意な関連性を認め、
H3K4me2 は独立した予後因子であることが示唆された。
肺腺癌におけるヒストン修飾と腫瘍マーカー (CEA、SLX、SCC、CYFRA、ProGRP) との関連を検討したが、有意差は認められなかった。ヒストン修飾と腫瘍マーカーとの関連は示
唆されなかった。また、ヒストン修飾と FDG-PET 検査との関連では、H3K4me2 が FDG-PETの集積 (p=0.0201) と有意差を認めた。H3K4me2 は、topoisomerase Ⅱとの相関係数が 0.758(p=0.001) 、PCNA との相関係数が 0.790 (p<0.001) であり、強い相関を示し血管新生に強く関わるものと考えられた。H3K4me2 は、悪性腫瘍の進展に重要な役割をしていることが示唆された。
StageⅠの肺癌における再発率・生存率に関して LSD1 の高発現は有意差を認めた。術後再発及び生存に関して、肺癌の術後再発率と死亡率に有意な関連性を認めた。
(3) 肺癌組織を用いた Western blot
Western blot 法では、5 つヒストン修飾を用いて行った。術後再発を認めた肺腺癌でH3K4me2 の発現を認め、術後再発を認めなかった肺腺癌で H3K4me2 の発現を認めなかった。
更 に ImageJ を 使 用 し H3K4me2 の ゲ ル 電 気 泳 動 の 定 量 解 析 を 行 い 、 有 意 差 を 認 め た(p=0.012) 。
(4) in vitro での検討
AQP1 は、21%下の 3 つ細胞株で発現を認め、1%下の細胞株では 21%下の細胞株に比べて発現が増強した。一方で、EZh2 は 21%酸素下細胞株で ABC1 のみ発現していたが、1%酸素下細胞株では 3 株共に発現の状況を認めた。EZH2 は低酸素下で発現亢進する可能性がある。
AQP1 と JMJD2B の関連性は認められなかったものの、AQP1 は低酸素下で発現が増強され、それは発現増強過程として EZH2 経路を経由する可能性が示唆された。
LSD1 は、21%下の 4 つ細胞株で発現を認め、1%下の細胞株では 21%下の細胞株に比べて発現は不変であった。LSD1 と AQP1・EZH2 との関係は不明確であった。
７．研究の考察・反省
今回の研究を踏まえて、AQP1 の発現亢進における HIF-1 系を介したヒストン修飾酵素の発現調節によるエピゲネチックな遺伝子発現調節機序の関与を明らかにすることはできなかった。しかし、肺癌特に肺腺癌においてヒストン修飾が重要な因子であることが示唆された。このヒストン修飾は、肺癌の腫瘍増大に重要に関わっていると考えられ、肺癌の進展において今後解明していかなければならない重要な課題だと考えられた。予定した研究計画と少し異なるが、新たな発見ができたと考え、今後の研究につなげていきたいと考える。

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８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 90 ‑

１．研究課題名：血管平滑筋細胞のエストロゲン受容体遺伝子発現を調節するエピジェネティッ
ク 調 節 機 構 の 解 明 ： 核 骨 格 -CTCF 系 に よ る 力 学 的 情 報 伝 達 （ 研 究 番 号
PR2012-04）
２．キーワード：１）エストロゲン受容体 (estrogen receptor)２）遺伝子発現 (gene expression)
３）CTCF
４）力学的負荷 (mechanical stress)
５）動脈硬化 (atherosclerosis)
３．研究代表者：入谷研究分担者：大黒岩井

敦・医学部・助教・高齢医学
正志・医学部・准教授・高齢医学
邦充・看護学部・教授・医科学

４．研 究 目 的
エストロゲンは炎症性サイトカイン産生を抑制し、血管平滑筋細胞（以下 SMC）の増殖な
らびに遊走を抑制することによって動脈硬化過程における血管リモデリングを抑制すると報告されている (Xing D et al. Arterioscl Thromb Vasc Biol 29;289,2009) 。しかし、閉経後女性や男性にエストロゲン補充療法を施行しても冠動脈硬化を退縮させ得ないばかりか、逆に急性
冠症候の発症率を増加させるなど動脈硬化性疾患を増悪させる可能性があることがわかってきた (Waters DD et al. JAMA 20：2432,2002) 。この理由として、動脈硬化組織ではエストロ
ゲン受容体（以下 ER）の発現量が減少していることが注目されている (Nakamura Y et al. Mol
Cell Endocrinol 30;219, 2004) 。
ところで、動流血管壁は内腔を流れる血液の周期的拍動流が引き起こすずり応力と、壁の円周方向の伸展ストレスを常に受けている。このストレスは SMC に感知されて遺伝子発現が変更されて動脈壁リモデリングへとつながると考えられる (Hu Y et al. FASEB J 12:
1135-1142, 1998) 。そのメカニズムを考える上で、遺伝子へのストレス信号の伝達を仲介する要素として、核の骨格構造に存在する蛋白である CCCTC 結合因子（以下 CTCF）に注目した (Dunn KL et al. Exp Cell Res: 288: 218-223, 2003) 。CTCF は一般的に多くの遺伝子のプロ
モータ部分に結合し、遺伝子発現を調節する働きを有している。ER 遺伝子プロモータにも結合する可能性を考えた。
仮説として、細胞外からの力学的ストレスが歪として CTCF のプロモータ結合性の変化に影響し、ER プロモータ活性が変化し ER 遺伝子発現量も変化する可能性を考えた。
本研究では、培養 SMC 系において、CTCF が ER 遺伝子発現に及ぼす影響、および力学的ストレスが ER 遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。さらに、ER 発現量と CTCF 発現量の関係を実際の動脈硬化組織で比較検討するために、ヒト剖検冠動脈組織で免疫組織化学を施行した。

‑ 91 ‑

５．研 究 計 画① 培養血管平滑筋細胞における CTCF の ER 発現に対する影響の検討
ヒト大動脈平滑筋細胞を培養し、CTCF 特異的 siRNA を Lipofectamine RNAiMAX (GE) によって導入することで、CTCF mRNA をノックダウンした。またヒト CTCF cDNA を遺伝子改変操作により pCI-neo 発現 vector (Promega) に連結し、Lipofectamine LTX と Plus reagent(GE) によって細胞へ遺伝子導入して過剰発現させた。更に、力学的負荷を与えるために、シリコンラバーに gelatin をコートした上に SMC を培養し、モータで周期的伸展刺激をかけた。
【入谷担当】
total RNA を抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (ABI) により cDNA を合成し、SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa Bio) と 7900 FAST real time PCR system (ABI) により目的とする遺伝子発現量を計測した。β-actin 遺伝子を内因性コントロールに使用した。細胞からRIPA バッファーにより蛋白を抽出、SDS-PAGE を施行、ウエスタンブロットし、抗体（抗CTCF 抗体、抗 ER-α 抗体、抗 ER-β 抗体、抗 β-actin 抗体）により目的蛋白の発現量を検索した。【岩井・入谷担当】② ヒト剖検 4 症例の冠動脈組織における CTCF と ER の蛋白発現の免疫組織化学的検討
高齢医学科で剖検を施行した冠動脈疾患 4 症例のホルマリン固定―パラフィン包埋冠動脈
組織標本切片に対して抗 CTCF 抗体、抗 ER-α 抗体、抗 ER-β 抗体、抗 SM α-actin 抗体を用いた酵素抗体法を施行した。HE 染色も施行した。
【大黒担当】
６．研 究 成 果
① SMC に対する CTCF mRNA ノックダウンを施行した結果、real time PCR で測定した mRNAは 29+4 % (n=8, p<0.01) に減少し、ER-α mRNA は 28+7 % (n=8, p<0.01) に、 ER-βmRNA は
36+5 % (n=8, p<0.01) に減少した (Fig 1) 。しかし、CTCF 遺伝子過剰発現を施行しても、
ER-α mRNA は 101+3 % (n=8,ns) に、ER-βmRNA は 98+10 % (n=8, ns) にと、有意な変化を示さなかった (Fig 2) 。周期的伸展刺激により、ER-α mRNA は 45+10 % (n=8, p<0.01) に、
ER-βmRNA は 61+9 % (n=8, p<0.01) に減少した (Fig 3) 。さらに、CTCF 遺伝子過剰発現を施行して後、周期的伸展刺激を行ったところ、ER-α mRNA は 97+ 8% (n=8,ns)に、
ER-βmRNA は 102+ 8% (n=8, ns) にと、遺伝子発現はほぼ完全に回復した (Fig 4) 。以上、
CTCF は ER の遺伝子発現を支持する働きを有することが示唆された。

‑ 92 ‑

② 剖検冠動脈組織では CTCF、ER-α、ER-β の免疫原性はいずれも α-actin 陽性 SMC の核に存在した。動脈硬化の存在しない部分の中膜 SMC ではほとんどの細胞核が CTCF、ER-α、ER-βの免疫原性を有していたが、動脈硬化新生内膜に散在する SMC ではこれらを同時に有さない細胞核も認められた。動脈硬化の脂質沈着プラークや石灰化プラークを有する内膜では、線維性被膜が厚いところでは CTCF、ER-α、ER-β の免疫原性は減少していなかった (Case1) 。しかし、急性心筋梗塞症例で破綻を起こしたプラークの薄い被膜内に少数存在した
SMC の核にはいずれの免疫原性も認められなかった (Case 2) 。以上、免疫組織化学でとらえた ER 発現は CTCF 発現と挙動が同様であり、動脈硬化進展巣内の細胞では減少、消失することが示唆された。

‑ 93 ‑

７．研究の考察・反省① 考察
培養細胞系における遺伝子発現解析、および動脈硬化組織における免疫組織化学により、SMC では CTCF が ER 発現に貢献していることが示唆された。細胞に対する伸展負荷実験の結果、CTCF 依存性に ER の発現量が負荷で減少したことから、CTCF が力学的負荷によるER 遺伝子発現制御に積極的に関与することが示唆された。
② 反省と今後の課題
伸展刺激では装置の面から培養細胞の数が限られるため、ウエスタンブロットはサンプルが不足していい結果が得られなかった。
今後直接関係したテーマとしては、ER 遺伝子発現制御領域における CTCF 結合サイトを発見することである。方法としては、CTCFBS などのバイオインフォーマティクスを検討し、狙い撃ちでクロマチン免疫沈降を施行して実際の結合を証明する。さらに、3C (Chromosome
Conformation Capture analysis) 法により、ER 遺伝子プロモータが伸展刺激後核骨格と結合しているかを調べる。ER 遺伝子プロモータの核骨格への結合が CTCF 依存性であるかを調べる。
ヒト剖検組織では、動脈硬化の一時点での状態しかとらえられないので、動脈硬化進展の各時相における変化を継時的にとらえるため、アポ E 欠損マウスなどの動物モデルで検討する必要もある。
８．研 究 発 表
投稿準備中。

‑ 94 ‑

１．研究課題名：血管内皮細胞 Sirt1 の高脂肪負荷による内皮機能障害と耐糖能障害に対する改善効果とその機序の解明（血管内皮特異的 Sirt1 高発現マウスによる解析）（研究番
号

PR2012-05）

２．キーワード：１）サーチュイン 1 (Sirt1)２）血管内皮細胞 (Endothelial cell)３）高脂肪食 (High-fat diet)３．研究代表者：渡邊研究分担者：北田愛・医学部・協力研究員・糖尿病・内分泌内科学
宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
血管内皮における Sirt1 の発現および、その活性増強により、1) 高脂肪食による血管内皮機能障害を抑制できるか、2) 血管内皮のインスリン・シグナル伝達作用の改善効果を介して、高脂肪食負荷時にみられる、骨格筋でのインスリン抵抗性（糖取り込みの低下）をも改善できるかについて、血管内皮特異的 Sirt1 高発現マウスを用いて明らかにする。
５．研 究 計 画
① 高脂肪食負荷＋血管内皮細胞特異的 Sirt1 高発現マウス（EC-Sirt1-TG マウス）（20 週）による検証・血管障害（大動脈・腎臓）の機能評価：尿アルブミン排泄、シスタチン C 測定、大動脈
血管拡張能（アセチルコリン刺激）/白血球ローリング・組織評価（大動脈・腎臓）：Oil Red-O、
PAS、Fibronectin・Macrophage（F4/80）免疫染色、Masson-Trichrome 染色・炎症関連（大動脈・腎臓）：MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α 発現・酸化ストレス：8-OHdG（血/尿/mtDNA
中・免疫染色）・アポトーシス（大動脈・腎臓）：TUNEL 染色、caspase- 3、PARP 発現・Sirt1
発現/活性（大動脈・腎臓）：アセチル化蛋白の評価 (NF-kB、p53、FOXO3、PGC-1α、eNOS、
IRS-2) ・糖/脂質代謝/インスリン・シグナル伝達：体重、血圧、摂食量、血糖、インスリン、脂質、糖化-Hb、MRI（筋肉・脂肪分布）、腹腔内ブドウ糖/インスリン負荷試験、グルコースクランプ・血管内皮インスリン伝達関連分子：インスリン静脈内投与下でのインスリン受容体チロシンリン酸化、IRS-1、-2 発現とリン酸化/アセチル化、Akt リン酸化、eNOS
リン酸化、caveolin リン酸化、FITC-インスリンの内皮細胞へのインスリン取り込み② 単離血管内皮細胞・Sirt1 過剰発現/ノックダウン血管内皮細胞（レトロウイルスを用い Sirt1
過剰発現 (pBABE-Sirt1) 、Sirt1 ノックダウン (pSUPER-Sirt1) を樹立）における検証
血管内皮細胞における Sirt1 の炎症関連シグナル抑制効果、インスリン取り込み・デリバリーの増加に対する効果をインスリン・シグナル伝達系への作用の面から、Sirt1 高発現ある
いは、ノックダウン細胞を用いて明らかにする。

‑ 95 ‑

６．研 究 成 果
高脂肪食を 20 週間負荷した野生型マウスでは、尿中アルブミン排泄量（血管内皮障害マーカー）が通常食野生型（対照マウス）に比べて、有意に増加したが、EC-Sirt1-TG マウスでは、
高脂肪食負荷にもかかわらず、尿アルブミン排泄量が、減少していた。また、野生型高脂肪
食負荷マウスでみられる耐糖能障害（HbA1c・空腹時血糖値・随時血糖値の増加、インスリ
ン負荷テストの障害）が、EC-Sirt1-TG マウスで改善していた（下図）。

① 野生型（通常食）、②EC-Sirt1-TG（通常食）、③野生型（高脂肪食）、④EC-Sirt1-TG（高脂肪食）、（N=6、♯:p＜0.05vs 他群）
各群のマウスの大動脈における Sirt1 および、ICAM1 の mRNA 発現をリアルタイム PCRにて評価した。大動脈における Sirt1 の mRNA 発現は、EC-Sirt1-TG 群にて野生型と比較して有意に増加を認めた。ICAM1 の mRNA 発現は野生型（高脂肪食）にて野生型（通常食）と比較して有意に増加していたが、EC-Sirt1-TG マウスでは高脂肪食負荷をしたにも関わらず、野生型（高脂肪食）にて認められた ICAM1 の発現増加は有意に減少し、野生型（通常食）と同等レベルとなった（下図）。
① 野生型（通常食）、② EC-Sirt1-TG（通常食）、③ 野生型（高脂肪食）、④

EC-Sirt1-TG（高脂肪食）、（N=6、♯:p＜0.05vs 他群）

腎糸球体 PAS 染色においてメサンギウ
ム領域の拡大の有無を評価したところ、野生型（高脂肪食）マウ
スにてメサンギウム
領域の拡大を認めたが、EC-Sirt1-TG（高脂肪食）マウスでは認めず、野生型（通常食）ある
いは、EC-Sirt1-TG（通常食）マウスとほぼ同等であった（右図）。
動脈硬化症の病態形成に動脈壁の微小炎症が関連している。単球/マクロファージは炎症の形成に重要な役割を果たしている。さらにオートファジーは炎症に対して抑制効果を発揮す
ることが報告されている。今回、Sirt1 の炎症形成機序に対する役割に関して、炎症-Sirt1-オ‑ 96 ‑

ートファジーの観点から、化学的 Sirt1 阻害薬を用いて検証した。その結果、Sirt1 の活性低下は、単球におけるオートファジー機能の低下を介して炎症を惹起する可能性が明らかになった (Takeda-Watanabe A et al. BBRC, 2012)
７．研究の考察・反省
血管内皮 Sirt1 の抗炎症、血管内皮保護作用：高脂肪負荷による尿アルブミン排泄量の増加
が EC-Sirt1-TG マウスにおいて低下を認めたこと、高脂肪負荷にて増加した大動脈 ICAM-1の mRNA 発現もまた EC-Sirt1-TG マウスにおいて低下を認めたことから、血管内皮 Sirt1 は抗炎症、血管内皮保護作用を発揮する可能性が考えられた。実験計画にあげているさらなる
詳細な血管機能的評価、組織学的評価、酸化ストレス/アポトーシス関連の評価は引き続き継続中である。血管内皮 Sirt1 の糖脂質代謝への影響については、HbA1c、血糖値、インスリン負荷試験の結果から、EC-Sirt1-TG マウスでは糖代謝、特にインスリン抵抗性の改善効果が示唆される。その分子機構を明らかにするために、引き続き、インスリン伝達機構への影響を中心に解析を行っている。
８．研 究 発 表
① Takeda-Watanabe A1, Kitada M, Kanasaki K, Koya D. SIRT1 inactivation induces inflammation
through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2012
Oct 12;427(1):191-6. doi:

10.1016/j.bbrc.2012.09.042. Epub 2012 Sep 17.

Abstract: Inflammation plays a crucial role in atherosclerosis. Monocytes/macrophages are some of
the cells involved in the inflammatory process in atherogenesis. Autophagy exerts a protective effectagainst cellular stresses like inflammation, and it is regulated by nutrient-sensing pathways. The
nutrient-sensing pathway includes SIRT1, a NAD(+)-dependent histone deacetylase, which is
implicated in the regulation of a variety of cellular processes including inflammation and autophagy.
The mechanism through which the dysfunction of SIRT1 contributes to the regulation of
inflammation in relation to autophagy in monocytes/macrophages is unclear. In the present study, wedemonstratethat

treatmentwith

2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide (Sirtinol), a chemical
inhibitor of SIRT1, induces the overexpression of inflammation-related genes such as tumor necrosis
factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 through nuclear factor (NF)-κB signaling activation, which is
associated with autophagy dysfunction, as shown through p62/Sqstm1 accumulation and decreased
expression of light chain (LC) 3 II in THP-1 cells. The autophagy inhibitor, 3-methyladenine, also
induces inflammation-related NF-κB activation. In p62/Sqstm1 knockdown cells, Sirtinol-induced
inflammation through NF-κB activation is blocked. In addition, inhibition of SIRT1 is involved in theactivation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway and is implicated in decreased
5'-AMP activated kinase (AMPK) activation, leading to the impairment of autophagy. The mTOR
inhibitor, rapamycin, abolishes Sirtinol-induced inflammation and NF-κB activation associated with‑ 97 ‑

p62/Sqstm1 accumulation. In summary, SIRT1 inactivation induces inflammation through NF-κB
activation and dysregulates autophagy via nutrient-sensing pathways such as the mTOR and AMPK
pathways, in THP-1 cells.
② Kitada M1, Kume S, Kanasaki K, Takeda-Watanabe A, Koya D. Sirtuins as possible drug targets intype 2 diabetes. Curr Drug Targets. 2013 Jun 1;14(6):622-36.
Abstract: The rising incidence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major public health problem
in industrialized countries, and new therapeutic strategies to prevent T2DM are urgently needed
worldwide. It is well known that calorie restriction (CR) can retard the aging process in organisms
ranging from yeast to rodents and delay the onset of numerous age-related diseases, including
diabetes. Molecules that mimic CR metabolically may therefore represent new therapeutic targets forT2DM. Sirtuin1 (SIRT1), the mammalian homolog of Sir2, was originally identified as a
NAD+-dependent histone deacetylase, and its activity is closely associated with longevity under CR.
Growing evidence suggests that SIRT1 regulates glucose-lipid metabolism through its deacetylase
activity for many known substrates and has many roles in the metabolic pathway through its direct orindirect involvement in insulin signaling in insulin-sensitive organs, including adipose tissue, liverand skeletal muscle. In addition, SIRT1 regulates insulin secretion, and adiponectin production,
inflammation, gluconeogenesis, circadian rhythms and oxidative stress, which together contribute to
the development of insulin resistance. Moreover, the overexpression of SIRT1 and several SIRT1
activators have beneficial effects on glucose homeostasis and insulin sensitivity in diabetic animalmodels and humans. Therefore, SIRT1 may represent a new therapeutic target for the prevention of
diseases related to insulin resistance and T2DM. In addition, SIRT3 and SIRT6 play crucial roles inglucose and lipid metabolism. In this review, we summarize the current understanding of thebiological functions of SIRT1, SIRT3 and SIRT6 in metabolism and discuss their potential role astherapeutic targets in T2DM.

‑ 98 ‑

１．研究課題名：高グルコースクランプ下経口糖負荷試験を用いたインクレチン効果の新しい評
価法の開発（研究番号PR2012-06）

２．キーワード：１）インクレチン (incretin)２）グルカゴン様ペプチド-1 (glucagon-like peptide-1、GLP-1)３）グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド(glucose-dependent insulinotropic polypeptide、GIP)
４）グルコースクランプ (glucose clamp)
３．研究代表者：伊藤研究分担者：中川弘樹・医学部・助教・糖尿病・内分泌内科学
淳・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
2 型糖尿病患者ではインクレチン (Incr) 効果の減弱が知られているが、その機序は明らかではない。また、Incr ホルモンである GLP-1 と GIP それぞれの作用が Incr 効果に占める割合は明らかではなく、内因性 GLP-1・GIP による効果を症例毎に検討できる評価法はない。
これらを知ることができれば、個々の症例における Incr 効果減弱の病態生理を把握し、例えば、それに基づく糖尿病治療薬の効果的選択の参考となり得る。
高血糖グルコースクランプ下で経口糖負荷試験を行うことにより Incr 効果の評価が可能と考えられる。この際のインスリン分泌量を GLP-1・GIP 分泌量の関数の和として表記し、条件を変えて 2 回の試験を行えば、2 元連立方程式が得られる。これを解くことで、Incr 効果における GLP-1・GIP それぞれのインスリン分泌促進効率と効果全体への寄与率を、被験者毎に算出可能となることが期待される。本研究では、上記発想による Incr 効果評価の可能性の検証を第一の、次いで、本評価法を用いることで 2 型糖尿病患者における Incr 効果の特性を明らかにすることを第二の目的とした。
５．研 究 計 画
2 型糖尿病患者ならびに非糖尿病対照者に対して一夜絶食の後、人工膵臓を用い高血糖（目標 200 mg/dL または空腹時血糖＋100 mg/dL のいずれか高い方）グルコースクランプを実施する。開始 1 時間後、血糖値が安定した時点で経口糖負荷［マルトース 0.5 g/kg 単独またはマルトース＋α グルコシダーゼ阻害薬 (αGI；miglitol 0.125 mg/kg) ］を行い、負荷後 2.5 時間まで高グルコースクランプを継続する。この間 5-10 分間隔で採血を行い、血中インスリン(IRI) 、C-ペプチド (CPR) 、総 GLP-1、総 GIP を測定する。マルトース単独負荷とマルトー
ス＋αGI 負荷は 1-3 週間隔で順不同とする。
2 回のグルコースクランプ下経口糖負荷試験で得られた各ホルモンの血中濃度曲線より曲線下面積 (AUC) を求め、以下の連立方程式を解き、定数 A、B を求める；‑ 99 ‑

マルトース単独負荷時

AUC(IRI) = A＊AUC(GLP-1) + B＊AUC(GIP)

マルトース＋αGI 負荷時

AUC(IRI)'= A＊AUC(GLP-1)'+ B＊AUC(GIP)'

AUC(IRI)を Incr 効果と定義すれば、定数 A、B が GLP-1・GIP それぞれのインスリン分泌促進効率（≒β 細胞の Incr ホルモン感受性）を示し、A＊AUC(GLP-1)と B＊AUC(GIP)の
AUC(IRI)に対する比より両ホルモンの寄与率が算出される。
研究代表者と研究分担者はともに、本研究の全過程に関して均等に貢献した。
６．研 究 成 果
数回に及ぶ予備実験の後、糖尿病患者 vs.非糖尿病対照者、各男性 6 名 (54.6±10.1 vs.
53.1±7.3 歳、BMI 25.9±2.9 vs. 22.5±1.2、HbA1c 6.5±0.3 vs. 5.5±0.08%) において、1 名につき 2回の検査を実施した。
IRI・CPR は高血糖クランプのみにて緩やかな上昇を示したが、経口糖負荷 10-25 分後に急
激な立ち上がりの増加を示し、Incr 効果が明瞭に観察された。高血糖クランプ自体によるイ
ンスリン分泌増加の影響を除くため、試験毎に経口負荷前の IRI・CPR の推移より外挿法により移動基礎レベルを求めた。また、被験者および試験間で Incr 効果発現までの時間にかな
りのバラツキが観察されたため、IRI の立ち上がり時間を揃えた相対時間に基づき血中ホルモン濃度の比較を行った。
研究計画で述べた 2 元連立方程式より算出される定数 A、B については、予備実験で病態
生理学的に妥当な値を得ることができたものの、対象者数を増やすと、時に負の値が算出されることもあり、評価法として採用することは困難であった。
しかし、糖尿病患者 vs.非糖尿病対照者の群間比較より、以下の知見を得た。
a) Incr 効果を移動基礎レベルからの増加分の絶対値として、あるいは増加分の総濃度に対する比率として、いずれの方法で定義しても、糖尿病患者における Incr 効果は対照者に比し低下していた。
b) GLP-1・GIP ともに、糖尿病患者 vs.対照者で血中濃度上昇に有意差を認めなかった。
c) 全例を用いた重回帰分析では、絶対値として定義された Incr 効果は経口負荷前 IRI 増加量＿と負荷後 GIP 増加量により規定されたが（自由度修正決定係数R2 0.76）、比率として定義された Incr 効果（計算の上で負荷前 IRI 増加量が数値に組み込まれる）は、GLP-1 および＿GIP 増加量により規定された (R2 0.19) 。
＿

d) 上記の所見は対象を糖尿病患者に限定しても観察されたが（R2 絶対値および比率 Incr 効
果につき各々0.97、0.67）、非糖尿病者では、いずれの定義を用いた場合でも Incr 効果を規定する有意な因子は見い出されなかった。
以上の成績は、糖尿病患者における Incr 効果の減弱は、Incr 非特異的な β 細胞自体のブドウ糖応答性低下の反映に過ぎない部分がかなりあるとともに、一部には、何らかの Incr 特異的な機序の破綻も関与している可能性があることを示唆している。この Incr 特異的機序は、健常者で Incr ホルモン分泌量以外の系として作用していると考えられた。

‑ 100 ‑

７．研究の考察・反省
当初、2 回の負荷試験より得られたホルモン分泌量より連立方程式を解くことで、個々の被験者毎に β 細胞の GLP-1・GIP に対する感受性を求めるというユニークな発想で開始した本研究であったが、例数を増やすに従い有意な定数を算出することができない被験者も出現、評価法として利用することはできなかった。その理由のひとつに Incr ホルモン測定誤差の大きさが挙げられる。特に GLP-1 は、血中変動に比してアッセイ誤差が大きく (CV 12-15%)、
定数算出上での大きな躓きとなった。
しかし、誤差の混入だけであるならば、群間比較を用いて GLP-1・GIP の β 細胞感受性の差異を求めることは可能なはずである。すなわち、Incr 効果とそれを規定する因子の重回帰分析により、糖尿病患者と対照者とで同じモデルが採用されれば、独立変数 GLP-1・GIP の係数に β 細胞感受性の差が反映すると考えられる。だが実際には、糖尿病患者で驚くべき高い決定係数 (0.97) を示したモデルは、非糖尿病者では全く有意ではなかった。この結果は、Incr 効果は GLP-1 と GIP の分泌量の関数の和であるという単純な仮説が成立しないことを示しているとも考えられる。いずれにせよ、こうした事実を、実際の検討により確認し得たことの意義は大きい。
本研究において明らかとなったもう一つの問題点として、実際の糖尿病患者の多くに本評
価法は応用できないであろうことが挙げられる。今回の糖尿病被験者のコントロール状況は極めて良好で、また経口糖負荷は 75g の 1/3～1/2 相当の少量であった。にもかかわらず、糖尿病患者では経口負荷後、グルコース注入量は完全に停止、血糖はクランプ目標値を（僅かながらも有意に）越えた。したがって、より血糖コントロールの不良な被験者では、グルコ
ースクランプが成立しないことが容易に想像される。類似の方法を採用した先行研究が数編報告されているが、こうした問題点を明記した報告は一篇もなく、自ら行うことで見い出さざるを得なかったことは貴重な経験であった。
以上、多くの反省点のある本研究であるが、依然として、個々の臨床症例における Incr 効果評価法としてのグルコースクランプ下経口負荷試験の可能性は大きいと考える。上記弱点克服のため、高インスリン血症・正常食後血糖クランプ下での標準食負荷試験を検討しており、この条件下でも Incr 効果が観察され得ることを予備実験で確認している。
８．研 究 発 表
Ito H, Nakagawa A, Nishizawa M, Kitada M, Nagai T, Watanabe A, Konishi K, Tsuda S, Kanasaki K,
Nakabayashi H, Koya D. The characteristics of the incretin effect evaluated by oral sugar load under
the hyperglycemic clamp in diabetic and non-diabetic humans. として投稿準備中。

‑ 101 ‑

１．研究課題名：睡眠時無呼吸症候群の新しい治療法の開発（研究番号PR2012‐07）

２．キーワード：１）睡眠時無呼吸低呼吸症候群(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome: OSAHS)
２）鼻マスク式持続陽圧呼吸 (Continuous Positive Airway Pressure: CPAP)
３）簡易型軟部組織牽引装置 (Simple model cervical soft tissue traction device)４）舌根部断面積 (Base of tongue cross section area)
３．研究代表者：齋藤研究分担者：黄雅俊・医学部・助教・呼吸器内科学
正寿・医学部・講師・呼吸器内科学（退職）４．研 究 目 的
鼻マスク式持続陽圧呼吸 (CPAP) は睡眠時無呼吸低呼吸症候群 (OSAHS) の最も普及した治療法だが、継続できない患者が約 25%存在する。また、CPAP は上気道に陽圧を負荷するため、本来もっている上気道陰圧反射による防御機能を低下させている。下顎と甲状軟骨との間の軟部組織を経皮的に牽引する方法や下顎から両側頚部を含めた前頚部までを体外から持続吸引する方法で上気道開存性を改善することで、生体の防御機構を温存したより自然な治療法を開発することを目的とする。
５．研 究 計 画
いびきまたは無呼吸を主訴に金沢医科大学病院睡眠障害センターを受診した患者のうち、呼吸機能が正常な OSAHS 患者を対象とする。全例ポリソムノグラフィーを施行し睡眠呼吸障害の種類と重症度を評価する。プロトコールのデータ収集はインフォームド・コンセントを得てから行い、以下の測定を行った。
(1) 今回の研究では 3M 社製の両面テープ＃1510 と CPAP マスク固定バンドを改良し作成した
簡易型軟部組織牽引装置を用い、舌根部断面積の測定と軟口蓋部鼻気道抵抗の測定、上気道虚脱性の評価（Pcrit 測定）を行う。アコースティック・レフレクション法による舌根部
断面積の測定と、アンテリオール法とポステリオール法を組み合わせた方法を用いて軟口
蓋部抵抗を測定する。覚醒時の上気道虚脱性の指標である Pcrit の測定は、上気道に急速に陰圧を負荷 (NEP) し約 0.1 秒以内の上気道フローから測定する方法を用いて測定する。
(2) 舌根部断面積の測定と軟口蓋部鼻気道抵抗の測定は、座位・仰臥位で行う。Pcrit の測定は仰臥位で行う。測定時に開眼させ覚醒していることを確認しながら施行する。座位と仰臥位で 10 呼吸間測定し体位による変化を評価する。上記の測定を行った患者において同日の終夜ポリソムノグラフィー (PSG) を施行しながら、軟部組織の牽引前後での無呼吸重症度の比較検討を行う。
(3) PSG では鼻圧センサーで鼻気流を、サーミスターで口気流を、インダクタンス・プレチス
モグラフィ（レスピトレース）で腹部と胸部の呼吸運動を測定する。睡眠状態は脳波 2 チ‑ 103 ‑

ャンネル、眼球運動、及び顎下表面筋電図で判定する。経皮酸素飽和度 (SpO2) と心拍数はパルスオキシメータで測定する。閉塞性無呼吸は呼吸努力があるにも関わらず 1 回換気量が直前の安定呼吸時の 10%以下に減少し、しかも 10 秒以上継続したときとする。閉塞性低呼吸は呼吸努力があるにも関わらず 10 秒以上の期間、
1 回換気量が 50%以下に減少し、しかも SpO2 が 3%以上低下するかまたは覚醒反応が起きたときとする。無呼吸、低呼吸の1 時間あたりの回数を無呼吸/低呼吸指数 (AHI) とし、AHI が 5 未満を健常者、5～14 を軽症、15～29 を中等症、30～49 を重症、50 以上を最重症とする。
(4) 下顎から両側頚部を含めた前頚部までを覆うマスクを作成し、マスクを通して持続陰圧を-4cmH2O～-21cmH2O まで変動させ体外から持続吸引する方法を開発し覚醒時の上気道開存性の評価を行う。
６．研 究 成 果
簡易型軟部組織牽引装置を用い、軽症から重症までの OSAHS 患者 21 名でデータ採取することができた。AHI が 25%以上改善したものは 8 名（改善例）、AHI の変化がなかったもの
が 6 名（不変例）、AHI が 10%以上悪化したものは 7 名（悪化例）であった。改善例、不変例、悪化例いずれも OSAHS の軽症から重症の症例が存在した。簡易型軟部組織牽引装置の有効群と無効群において、年齢 (53±14 vs 45±10 p=0.18) 、AHI (/hr) (32±17 vs 46±31
Arousal index (/hr) (29±10 vs 49±33

p=0.27) 、

p=0.12) 、首周囲径 (cm) (39.5±3.6 vs 41.5±5.1 p=0.34) 、

2

BMI (kg/m ) (27.3±6.2 vs 28.1±4.9 p=0.72)、覚醒時の舌根部断面積 (cm2) の座位 (3.53±1.06 vs
3.71±0.43 p=0.61) 、側臥位 (2.72±0.41 vs 3.02±0.35 p=0.1) 、座位-側臥位 (0.81±1.02 vs
0.89±0.38 p=0.7) 、覚醒時の軟口蓋部抵抗 (cmH2O/L/s) の座位 (0.59±0.64 vs 1.12±1.5 p=0.45) 、側臥位 (0.59±0.69 vs 1.94±2.78 p=0.15) 、座位-側臥位 (0.05±0.58 vs 1.28±1.85 p=0.15) 、覚醒
時の Pcrit 上気道閉鎖圧 (cmH2O) (-9±3.6 vs -8.4±5.5 p=0.81) に有意差は見られなかった。
覚醒時の上気道測定値の比較では、舌根部断面積 (cm2) が有効群（座位 3.53±1.08 vs 仰臥位 2.72±0.41 p=0.06）、無効群（座位 3.71±0.43 vs 仰臥位 3.02±0.35 p<0.001）となり、無効群
で覚醒時に座位から仰臥位への体位変換で、舌根部断面積が有意に狭くなっていた。軟口蓋部抵抗 (cmH2O) は、有効群 （座位 0.59±0.7 vs 仰臥位 0.59±0.72 p=0.69）、無効群（座位1.12±1.13 vs 仰臥位 1.94±1.78 p=0.08）で、有意差は見られなかった。
簡易型軟部組織牽引装置による牽引の有無による比較では、仰臥位の舌根部断面積は、有効群（牽引なし 2.72±0.47 vs 牽引あり 2.89±0.43 p=0.27）と無効群（牽引なし 3.02±0.35 vs 牽
引あり 3.01±0.39 p=0.94）ともに有意差はみられなかった。
簡易型軟部組織牽引装置による牽引の有無で比較すると、仰臥位の 8cmH2O 負荷し睡眠時の上気道病態に近い Pcrit(cmH2O) は、有効群（牽引なし-1.3±2.1 vs 牽引あり-4.9±5.4 p=0.27）と無効群（牽引なし-2.1±4.8 vs 牽引あり-1.3±3.9 p=0.61）ともに有意差はみられなかった。
中等症から重症までの OSAHS で本法が有効な症例が存在した。無効群で覚醒時舌根部断面積が座位から仰臥位への体位変換で有意差をもって狭くなっていた。
次に、CPAP マスクを下顎の前頚部にあて、マスクを通して持続陰圧を-4cmH2O～-21 cmH2O‑ 104 ‑

まで変動させ体外から持続吸引する方法で、覚醒時の舌根部断面積の測定を行った。PSG を施行した OSAHS 患者 10 名を対象とした。持続吸引なしの舌根部断面積の平均は 3.45cm2 で、-21cmH2O で持続吸引を行うと舌根部断積の平均は 3.77cm2 と有意に拡大した。
PSG 測定中に同じ方法を用いて、2 名の OSAHS 患者で、AHI の改善がえられるか検討した。1 名は 69 歳、男性、BMI=28.2kg/cm2、AHI=15 回/hr（中等症）であったが、持続吸引-21cmH2O
を用いて AHI=10/hr に改善し、もう 1 名は 27 歳、女性、BMI=18.6kg/cm2、AHI=20 回/hr（中等症）では持続陰圧吸引で AHI=3/hr と正常化した。
両側の側頚部から前頚部を含めた広範囲を持続吸引するため､歯科用デントシリコンを用い頚部全体を覆うマスクを試作。マスクの中央から持続陰圧を付加できるようにチューブ挿入口を作り、そこから持続陰圧を負荷した。持続陰圧を-4,-8,-12,-16cmH2O と徐々に上げていき、咽頭断面積の測定を行った。健常者で測定したところ、陰圧が強くなるにつれ、舌根部
断面積は大きくなり、-16cmH2O では無負荷時に比べ舌根部断面積は 1.5 倍に拡大した。
広範囲の頚部を持続吸引する方法では、咽頭周囲の組織圧をさらに低下させると考えられ、両側の側頚部から前頚部を含めた広範囲を持続吸引するためのマスクをギブスで用いる素材を用い作成しているが、持続陰圧負荷で隙間などから空気が入り、十分な持続陰圧をかけられないことや、各自の頸部の形状が異なることなどから作成は難しかった。
７．研究の考察・反省
簡易型軟部組織牽引装置を用い、軽症から重症までの OSAHS 患者 21 名でデータ採取することができた。中等症から重症までの OSAHS で本法が有効な症例が存在した。無効群で覚醒時舌根部断面積が座位から仰臥位への体位変換で狭くなり、上気道開大筋の活動性が低下する睡眠時にはさらに狭くなることで効果が乏しかったと考える。
次に、CPAP マスクを下顎の前頚部にあて、体外から持続吸引する方法で、覚醒時の舌根部断面積が開大した。持続吸引で軟部組織の組織圧を軽減し、舌根部が広がったと考えられる。広範囲の頚部を持続吸引する方法では、咽頭周囲の組織圧をさらに低下させると考えられ、両側の側頚部から前頚部を含めた広範囲を持続吸引するためのマスクをギブスで用いる素材を用い作成しているが、持続陰圧負荷で隙間などから空気が入り、十分な持続陰圧がかけられないことや、患者個々の頸部の形状が異なることなどから技術的に作成できなかった。
実験器具を作成している企業にも作成を依頼したが、直接被験者へ使用するもので、作成していただける企業が見つからなかった。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 105 ‑

１．研究課題名：心房細動患者における Taurine 動態の検討（研究番号PR2012-08）

２．キーワード：１）心房細動（atrial fibrillation）
２）アミノ酸（amino acids）
３）酸化ストレス（oxidative stress）
３．研究代表者：藤林幸輔・医学部・助教・循環器内科学

研究分担者：梶波康二・医学部・教授・循環器内科学

４．研 究 目 的
タウリンは、心筋細胞に多く分布する含硫アミノ酸として知られ、浸透圧や陽イオン、酵
素活性、受容体等を調節する因子として機能し、さらに抗酸化作用を有すると言われている。
特に、細胞内 Ca２＋濃度を調節することで、タウリンは、抗不整脈作用を示す可能性が示唆されている(Satoh H and Sperelakis N:Review of some action of taurine on ion channels of cardiac
muscle cells and others.Gen Pharmacol 30, 451-463, 1998)。しかし、不整脈患者における、タウ
リンの血中濃度や体内動態は、未だ明らかにされておらず更なる検討が必要である。本研究の目的は、心房細動患者におけるタウリンの動態を明らかにすることである。
一方で、これまでの観察で、タウリンと興奮性アミノ酸であるグルタミン酸が心房細動患者において共に変動することが示唆されており、各々の心房細動との関連についても研究課題とした。
５．研 究 計 画
本研究では、心房細動患者 50 例（疾患対象）および心機能正常患者 50 例（電気生理学的検査対象者）にて、冠静脈内 (Cs) 、大動脈内 (Ao) のタウリンおよびグルタミン酸濃度を測定し、左房径、左心耳血流速度、生化学的検査と比較検討を行い、心房細動とタウリン、
グルタミン酸との関係について評価を行った。
当院に入院したカテーテルアブレーション目的の心房細動患者 50 例（疾患対象）および心機能正常患者 50 例（電気生理学的検査対象者）を対象に、冠静脈洞内 (Cs) 、大動脈内 (Ao)
同時採血よりタウリンおよびグルタミン酸濃度を測定し、冠静脈洞内 (Cs) と大動脈内 (Ao)における濃度の差、左房径、左心耳血流速度、生化学的検査における相関を検討した。研究代表者は、これらの検査を行い、研究分担者とともに研究結果の考察を行った。
６．研 究 成 果
心房細動群（af 群）とコントロール群（Control 群）を比較し、af 群で有意にグルタミン酸
およびタウリン濃度が高値であった。また、酸化ストレスマーカーとして dROM テスト（hydroperoxide の測定）を行ったところ、血漿グルタミン酸濃度と正の相関関係が認められた。心房細動のリスク因子と共にアミノ酸で多変量解析を行ったところ、血漿グルタミン酸‑ 107 ‑

濃度は、心房細動の独立した危険因子であった。一方で、合成経路の異なる血漿グルタミン
酸とタウリン濃度に強い正の相関関係が認められた。
心房細動患者におけるアミノ酸（タウリンおよびグルタミン酸）の検討を行い、これらが心房細動の発症と、酸化ストレスを介し、有意に関係していることが明らかになった。このようなデータは、これまでに報告されてない。
７．研究の考察・反省
これまでの、研究からグルタミン酸は、その受容体を介して酸化ストレス生成の刺激となることが知られており、タウリンは抗炎症もしくは抗酸化ストレス様に作用すると報告されている。また、最近の基礎研究では、グルタミン酸受容体刺激を介し細胞よりタウリンが露出する機序も認められており、これらの関連による変化を観察しえたものと推察された。また、心臓の前後（Ao および CS）にてそれぞれのアミノ酸を定量し、心筋におけるアミノ酸
動態を解析したが、一定の傾向は認められなかった。今回の研究では、心房細動患者におけるグルタミン酸と酸化ストレスの関係が示唆されたものの、これらに介在する反応系は明らかでなく、酸化ストレスを生成するその他の因子についても評価しきれていないことから、さらなる検討が必要と考えられた。
Table 1. Spearman rank correlates between aortic and trans myocardial
gradients of Glu and Tau with chinial variables in whole study subjects※ P＜0.05※※ P＜0.01※※※ P＜0.001
rS‑ 108 ‑

Table2. Univariate and multivariate logistic regression analysis for paroxysmal atrial fibrillation

BMI:body mass index, CI:confidence interval, EF:ejection fraction, GFR:Glomerular filtration rate,
HT:hypertension, LAD:left atrial dimension, OR:odds ratio, T-chol:total cholesterol.
BMI, EF, LAD, eGFR, and T-chol were subjected to analysis as per 1 kg/m2, 1 %, 1 mL/min/1.73m2, and1 mg/dl increase, respectively. Age and Tau were per 10-year and 10-nmol/mL increase, respectively. As
for sex, male or female were assigned to 1 or 2, and for hypertension, absence or presence were 1 or 2,
respectively. Model 1 includes all clinical and laboratory variables in addition to Glu, not Tau. Model 2does all variables in addition to Tau, not Glu.

８．研 究 発 表
T. Shintaro, F. Kosuke, K. Kouji
Circulating Glutamate and Taurine Associate with Reactive Oxygen Species in Paroxysmal Atrial
Fibrillation（in preparation）‑ 109 ‑

１．研究課題名：AQP1 遺伝子修飾組織幹細胞と bFGF トリガー刺激による新規弾性軟骨再建法の開発（研究番号

PR2012-09）

２．キーワード：１）軟骨膜細胞 (auricular perichondrial cell)２）間葉系組織幹細胞 (tissue mesenchymal stem cell)
３）アクアポリン 1 (aquaporin 1)４）塩基性繊維芽細胞増殖因子 (basic fibroblast growth factor)
５）軟骨再生医療 (cartilage reconstruction)
３．研究代表者：柳下幹男・医学部・助教・形成外科学

研究分担者：川上重彦・医学部・教授・形成外科学

４．研 究 目 的
顔面の弾性軟骨欠損・変形に対する有効な治療法の開発は形成外科領域における重要課題の一つである。組織工学的手法を用いた自家培養軟骨細胞移植による再建が試みられてきたが、三次元的な形態形成が困難なことから臨床応用には未だ遠く、新たな発想によるブレー
クスルーが切望されている。本研究で申請者は、aquaporin 1（以下 AQP1）遺伝子発現修飾を加えた組織幹細胞と basic fibroblast growth factor（以下 bFGF）によるトリガー刺激を用いた新たな弾性軟骨の三次元的形態形成法の確立を目指す。
５．研 究 計 画
AQP1 遺伝子発現修飾組織幹細胞を用いた新たな弾性軟骨再建法の開発を目指し、以下の 4
項目を検討する：
1. AQP1 遺伝子の発現修飾（遺伝子導入による強制発現；siRNA によるノックダウン）による細胞増殖、接着、移動、分化への影響に関する in vitro での検証
1) ヒト及びウサギ耳介軟骨膜由来組織幹細胞への影響
2) ヒト骨髄間葉系幹細胞への影響
2. AQP1 遺伝子発現修飾細胞と bFGF トリガー刺激下による三次元的弾性軟骨形態形成効果のin vivo での検討
1) ヒト及びウサギ耳介軟骨膜由来組織幹細胞への遺伝子修飾2) ヒト骨髄間葉系幹細胞への遺伝子修飾
上記を研究計画としていたが、AQP1 遺伝子発現修飾による細胞増殖を達成することができなかったため、以下研究計画を追加した。
1. 軟骨膜細胞における AQP1 の発現のさらなる検討
2. AQP1 と耳介軟骨膜の間葉系組織幹細胞・軟骨前駆細胞との関係の検討
3. AQP1 発現と移動能との関係の検討
4. In vivo での MMP-1 inhibitor による軟骨膜細胞増殖の抑制と AQP1 発現の関係の検討‑ 111 ‑

６．研 究 成 果
1. 軟骨膜細胞における AQP1 の発現を Western blot 法にて解析し、ヒト耳介軟骨膜に加え、ウ
サギ耳介軟骨膜でも分子量 28kDa の AQP1 の発現が検出された。
2. Kobayashi ら (Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 14479-84) が、ヒト耳介軟骨膜の間葉系幹細胞・軟骨前駆細胞は CD44 陽性、CD90 陽性、CD34 陰性で、高い増殖能・多機能分化能を有することを明らかにした。これをもとに、ウサギ耳介増殖軟骨膜における間葉系幹細胞・軟骨前駆細胞と AQP1 との関係を検討した。bFGF 注入後の増殖軟骨膜部において AQP1 の高い発現が認められ、さらに CD90 の発現パターンと比較して、AQP1 発現はより増殖軟骨膜部に限局していた。
3. AQP1 とアクチンの蛍光抗体二重標識法による観察では、bFGF 注入によるウサギ増殖軟骨
膜細胞において、増殖軟骨膜部中～浅層部の増殖軟骨膜細胞の突起に一致すると考えられる二重標識所見を検出した。さらに培養ウサギ耳介軟骨膜細胞第 3 代継代細胞を用いた検討でも、AQP1 は細胞膜全体での、アクチンは細胞膜近傍の細胞膜内での広範囲な発現に加え、特に細胞突起部での両者の関係が重標識により示された。
4. ウサギ耳介軟骨再生における in vivo の検討で、matrix metalloproteinase 1（以下 MMP-1）のⅠ型コラーゲン分解とその後の微小血管侵入が、軟骨膜内間葉系幹細胞の周囲のニッチの破綻に影響するのではないかと推測された。MMP inhibitor を用いて、増殖軟骨膜細胞とAQP1 の発現について in vivo で検討を試みた。現時点では有用な結果は得られていない。
７．研究の考察・反省
軟骨膜細胞における AQP1 の発現を Western blot と in vivo において発現が明らかとなった。
さらに耳介軟骨膜の間葉系幹細胞・軟骨前駆細胞を示す、CD44 陽性、CD90 陽性細胞の発現パターンと AQP1 発現は同様であり、AQP1 発現が耳介軟骨膜細胞の間葉系組織幹細胞・軟骨前駆細胞の性質の一つと考えられた。
増殖軟骨膜細胞において AQP1 とアクチンの発現を検討したところ、細胞突起部での両者の発現が示された。これにより AQP1 の軟骨膜細胞の移動能への関与が支持された。
AQP1 の発現が関与した増殖軟骨膜細胞の動態についてさらに検討するため、MMP
inhibitor を使用して、軟骨膜細胞増殖の抑制を試みたが、現時点で有用な結果を出すことはできなかった。
今回の研究で、増殖軟骨膜細胞における AQP1 の発現と、AQP1 の移動能への関与について新たな知見を得ることができた。しかし、研究目的である三次元的軟骨形態形成を達成することはできなかった。AQP1 遺伝子の発現修飾に成功しなかったため、AQP1 の接着、移動、分化への影響を in vitro で検証することができなかった。このことにより他の方法として
軟骨膜内間葉系幹細胞の周囲のニッチの破綻に影響を及ぼしていると予想される MMP-1 に対して、inhibitor を利用して増殖軟骨膜細胞を in vivo で抑制することにより AQP1 の役割を検討することを試みた。未だ MMP-1 inhibitor である vatimastat の局所投与の濃度や注入時期などについては確立しておらず、今後はこれらを確立することによりさらに研究を進めたい‑ 112 ‑

と考えている。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 113 ‑

１．研究課題名：抗線維化ぺプチド AcSDKP の臓器保護作用における重要性の検討（研究番号PR2012-10）
２．キーワード：１）糖尿病性腎症 (diabetic nephropathy)２）線維化 (fibrosis)
３．研究代表者：永井研究分担者：金崎貴子・金沢医科大学氷見市民病院・助教・内分泌・代謝科
啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
レニンーアンギオテンシン系阻害薬であるアンギオテンシン変換酵素阻害薬 (ACE-I) は、同一視されがちなアンギオテンシン受容体拮抗薬 (ARB) とは性格が異なる。ACE の基質には、アンギオテンシンⅠ以外にも重要な生理活性物質が存在するが、それら ACE 基質の中で ACE-I 投与により血中濃度が上昇し、抗線維化・抗増殖・抗アポトーシス・血管新生作用を有し、単独で優れた臓器保護作用があることが示された N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl- proline(AcSDKP) に注目して、AcSDKP 血中濃度が ACE-I 有用性の中で重要な役割を演じると仮定して検討を行った。また、糖尿病腎線維化治療薬として AcSDKP を用いることを目標に、糖尿病腎線維化マウス系統間による違いと AcSDKP レベルの相関の検討も試みた。加えて、糖尿病腎における抗線維化 microRNA 抑制が演じる役割と標的蛋白の同定、その相互作用に関して検討した。
５．研 究 計 画
実験 1（永井）：ACE-I 投与による AcSDKP の相加的抗線維化効果を調べるために、生後 6 週
CD1 マウスに streptozotocin (STZ) を腹腔内へ単回投与し、STZ 誘導 1 型糖尿病腎症モデルマ
ウスを作成。その時点から 4 カ月後に ACE-I のイミダプリル単独あるいは ACE-I＋AcSDKPの追加投与、または ARB の TA-606 単独を各々マウスに投与。各マウス群の腎組織を用いてPAS 染色および MTS 染色にて線維化を評価。またマウス血漿および尿中の AcSDKP 濃度も測定。EndMT 過程を調べるために薄切腎組織に対して内皮マーカーCD31 及び間葉系マーカ
ーαSMA および FSP1 染色を行い、二重染色陽性細胞を EndMT 過程の細胞と認識して蛍光顕微鏡で解析した。
実験 2（永井）：AcSDKP による抗 EndMT 効果の in vitro 解析を行うために、ヒト培養内皮細胞 (HMVEC) を用い、サイトカイン (TGF-β2、TNF-α、IL-1β) で刺激、2 時間の AcSDKP 前
孵置を行い、計 72 時間の培養後、AcSDKP の有無によって比較検討し、さらに蛍光抗体法により CD31 及び SM22α の発現を調べ、Western

blot 法によって CD31、VE カドヘリンと FSP1

さらに Smad3 の蛋白発現を検討した。
実験 3（永井）：AcSDKP による抗 EndMT 効果における microRNA let-7 family 制御機構及び let-7の標的 TGFβR1 についての検討を施行。糖尿病モデルマウス凍結腎臓サンプルを用いて‑ 115 ‑

microRNA を含む total RNA を抽出後、microRNA array 解析、定量的 PCR を施行し、let-7を解析。Westernfamilyblot 法により fibroblast growth factor receptor (FGFR)1 リン酸化，FGFR1 蛋

白量を解析し、また薄切腎組織を用い、let-7 の標的である TGFβR1 と CD31 を二重染色し、蛍光顕微鏡で解析した。
実験 4（金崎）：糖尿病腎線維化マウス系統間による違いを検討。生後 6 週の 2 系統 (CD-1、
Sv129) マウスへ streptozotocin (STZ) 投与で糖尿病を誘導。糖尿病誘導 6 カ月後に各々マウスの薄切腎組織を PAS 染色および MTS 染色にて線維化の評価し、腎 DPP-4 蛋白発現・尿中AcSDKP 濃度、腎 microRNA 発現、IFN-γ を各々のマウスで定量した。さらに糖尿病誘導 4カ月後の腎線維化が重篤な糖尿病 CD-1 マウスへ、2 ヶ月間の AcSDKP 持続皮下投与による治療効果も評価した。
実験 5（金崎）：HMVEC を用いて TGF-β 刺激下の AcSDKP 孵置による microRNA let-7、miR29の評価、各々の過剰発現・antagomir を用いた拮抗に対する microRNA レベル、IFN-γ、FGFR1の評価を行った。
６．研 究 成 果
実験 1：マウスの組織学的解析において、糖尿病モデルマウスでは糸球体肥大および PAS 陽性のマトリックス蓄積、MTS 染色で強く尿細管間質線維化が認められたが、イミダプリル治療
群では糸球体硬化と尿細管間質の線維化が部分的に、イミダプリル＋AcSDKP 治療群では腎線維化がほぼ完全に抑制された。TA-606 に抗線維化効果は見られなかった。糖尿病マウスの血中 AcSDKP 濃度はコントロールに比べ低下傾向にあったが、イミダプリル投与で上昇を認
め、イミダプリル＋AcSDKP 追加投与ではその約 5.5 倍へ増加が見られた。メサンギウム領域拡大、尿細管間質の線維化は AcSDKP 血漿濃度と逆相関していた。糖尿病マウスではEndMT を呈している細胞数が増加していたが、イミダプリル治療群では部分的に抑制、イミ
ダプリル＋AcSDKP 治療群では完全に抑制された。TA606 治療群には EndMT の抑制は認められなかった。
実験 2：HMVEC 細胞を用いた実験では、敷石状外観を呈する内皮細胞がサイトカイン刺激にて紡錘形へ形態変化したが、AcSDKP の共孵置で形態変化は抑制された。内皮細胞の形態変化とともに確認された EndMT（内皮マーカー (CD31) の消失と間葉系マーカー (SM22α) の発現増加）は、AcSDKP の共孵置で抑制された。サイトカイン刺激で CD31 および VE カド
ヘリン蛋白発現量減少かつ FSP1 増加が見られたが、AcSDKP 追加投与にて各々の変化は抑制され、また同様に Smad3 のリン酸化も抑制された。
実験 3：microRNA array 解析の結果、let-7 family は糖尿病腎で抑制されていたが、イミダプリ
ル＋AcSDKP 処置にてほぼすべての let-7 量が正常化傾向を示した。定量的 PCR 解析でも、
イミダプリル＋AcSDKP の処置によって let-7 量の回復を確認した。また Western blot 解析では、糖尿病で低下していた FGFR1 リン酸化および FGFR1 蛋白量および遺伝子発現量が、イ
ミダプリルにより部分的に、イミダプリル＋AcSDKP で完全に回復した。培養細胞 HMVEC
においても、サイトカイン刺激で抑制されていた FGFR1 発現と FGFR1 リン酸化は共に‑ 116 ‑

AcSDKP 共孵置で正常化した。糖尿病マウス内皮細胞で TGFβR1 は発現増加していたが、イ
ミダプリル投与で部分的に、AcSDKP 追加で完全に抑制されていた。
実験 4：糖尿病 CD-1 マウスでは糸球体硬化と尿細管間質線維化を認めたが、Sv129 マウスにおいては軽微な変化に留まった。糖尿病 CD-1 マウスでは、尿中 AcSDKP 濃度の低下を認め、
IFN-γ・DPP-4 蛋白発現（共に microRNA29 の標的蛋白）/酵素活性は増加したが、Sv129 マウ
スではこれらの変化は認めなかった。miR29 および miR let-7 は糖尿病 CD-1 マウス腎で正常
マウス腎に比し抑制されたが、Sv129 マウス腎では抑制されなかった。AcSDKP 持続皮下投
与糖尿病 CD-1 マウスで線維化と共に DPP-4 蛋白・IFN-γ がすべて抑制され、miR let-7 及びmiR29 は共に正常化した。
実験 5：AcSDKP は、HMVEC において TGF-β 刺激によって抑制された miR29 と miR let-7 を共に正常化した。HMVEC における miR let-7 過剰発現は miR29 発現も増加させ、一方 antagomir
で miR let-7 を阻害すると miR29 も抑制された。
同様に miR29 の過剰発現/阻害により miR let-7
発現増強/抑制を認め、miR29 と miR let-7 間の両方向的制御が抗線維化/抗 EndMT プログラムに重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、miR29 阻害により INF-γ が増加し、
FGFR1 発現と miR let-7 も抑制されるが、IFN-γ 中和抗体によりこれらは正常化した。
７．研究の考察・反省点
糖尿病では内因性抗線維化ペプチド AcSDKP が低下し、AcSDKP により惹起される FGF
受容体を介した microRNA let-7 の発現量も低下していたが、ACE-I と AcSDKP 併用療法によって内因性抗線維化プログラムを改善し、腎の抗線維化効果をもたらすことが示唆された。
さらに、AcSDKP は microRNA29 と microRNA let-7 間の抗線維化 microRNA クロストークを介して生理的に重要な役割を担う可能性が示唆された。AcSDKP 投与が糖尿病腎の線維化への有効な治療戦略になると期待される。反省点としては、予定していた各マウス系統からの
初代培養細胞を用いた EndMT さらに EMT（上皮-間葉系分化）の検討を達成できていない点である。今後も最終的な目標として、AcSDKP の糖尿病腎線維化治療薬の可能性を目指していく。
８．研究発表① Sen Shi, Swayam Prakash Srivastava, Megumi Kanasaki, Jianhua He, Munehiro Kitada, Takako
Nagai, Kyoko Nitta, Susumu Takagi, Keizo Kanasaki, Daisuke Koya. Interactions of DPP-4 andintegrinβ1 influences endothelial-to-mesenchymal transition. Kidney International 2015 Apr 1. doi:
10.1038/ki.2015.103.
Abstract: Integrin β1 and dipeptidyl peptidase (DPP)-4 play roles in endothelial cell biology.
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-A inhibits endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT) through VEGF-R2, but through VEGF-R1 promotes EndMT by reducing the bioavailabilityof VEGF-A. Here we tested whether DPP-4-integrin β1 interactions have a role in EndMT in the renal
fibrosis of diabetic nephropathy. In streptozotocin-induced fibrotic kidneys in diabetic CD-1 mice,‑ 117 ‑

levels of endothelial DPP-4, integrin β1, and phospho-integrin β1 were all higher and associated withplasma cystatin C elevation. The DPP-4 inhibitor linagliptin ameliorated kidney fibrosis, reduced
plasma cystatin C levels, and suppressed endothelial levels of DPP-4, integrin β1, andphospho-integrin β1. In cultured endothelial cells, DPP-4 and integrin β1 physically interacted.
Suppression of DPP-4 by siRNA was associated with suppression of integrin β1 and vice versa.
Knockdown of either integrin β1 or DPP-4 resulted in the silencing of TGF-β2-induced TGF-β
receptor heterodimer formation, smad3 phosphorylation, and EndMT. DPP-4 negatively regulated
endothelial viability signaling by VEGF-R2 suppression and VEGF-R1 induction in endothelial cells.
Thus, DPP-4 and integrin β1 interactions regulate key endothelial cell signal transduction in both
physiological and pathological conditions including EndMT. Hence, inhibiting DPP-4 may be atherapeutic target for treating kidney fibrosis in diabetes.Kidney International advance online
publication, 1 April 2015; doi:10.1038/ki.2015.103.

‑ 118 ‑

１．研究課題名：ティッシュ－マイクロアレイの作製と細胞内信号伝達の網羅的解析（研究番号PR2012-11）
２．キーワード： １）ティッシュ－マイクロアレイ (Tissue Microarray)２）パラフィン (Paraffin)３）G 蛋白 (G protein)４）腎細胞癌 (Renal cell carcinoma)
３．研究代表者：黒瀬研究分担者：湊望・医学部・学内講師・臨床病理学
宏・医学部・教授・臨床病理学

４．研 究 目 的組織マイクロアレイ (Tissue Microarray, TMA) とは、臨床病理検体のパラフィンブロック
から検討したい箇所をコア状にくり抜き、それを集約して、1 つのブロックに整列させて再包埋したものである。免疫染色法の開発によって、様々な蛋白質の発現の有無を光学顕微鏡下で検出することが可能となったが、臨床材料から得られる癌の組織型や細胞形態は極めて多彩、かつ複雑であり、その染色態度、分子機構も症例毎に異なっていると思われる。それ故、一度に多数の組織切片を同時に染色し、網羅的に分析することが可能な TMA は、コストや効率性の観点から画期的な研究方法と言える。本研究は、本学でこのシステムを構築し、臨床各科に提供することを第一の目的とし、それを用いて癌の分子機構を研究することを第二の目的としている。
５．研 究 計 画研究代表者（黒瀬）は、TMA に必要な機器（ティッシュ・アレイヤー装置；東屋医科器械）
を臨床病理学に設置し、TMA 技術を習得することで、本学の基礎研究を幅広く支援・推進するための基盤づくりにつとめた。また、TMA を用いた癌の分子機構を研究するために、本学病院の剖検例・手術例から得られた腎細胞癌症例を用いて、パラフィンブロックを選定して
TMA 標本を作製した。
研究分担者（湊）も TMA 技術を習得し、豊富な臨床病理学の経験と知識を活かして、研究代表者に助言した。
６．研 究 成 果
TMA 技術を習得し、本学の基礎研究を幅広く支援・推進するための基盤づくりができた。
また、腎細胞癌症例のパラフィンブロック標本を用いて、TMA 標本を作製した。現在、免疫染色にて、活性化型 Rac の検出を試み、染色像の評価を含めて詳細な解析を待っている状態である。更に Rac の活性化検出も、組織アレイを用いて行ってみたが、固定した培養細胞でも結果が安定しないため、実験条件を確立する必要がある（投稿準備中）。

‑ 119 ‑

７．研究の考察・反省
本学で TMA を活用するための基盤づくりができたが、TMA の存在と有効性が臨床各科に十分に周知され、浸透したとは言い難い。今後は臨床各科に TMA の有効性を啓発し、TMAの技術指導をしながら、TMA の有効利用を推進していかなければならない。一方、コストや効率性の観点からも、TMA の有用性を検証していく必要があると思われる。
TMA に関しては、他臓器の癌でも試み、同様にリン酸化酵素群、G 蛋白質の関与する信号伝達の可視化にチャレンジしていきたい。
８．研 究 発 表
① 清川悦子、黒瀬望：Establishment of method to detect small GTPase activity in Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded materials.（投稿準備中）② 清川悦子、黒瀬望：Function of Ripply1 in organoid structures.（投稿準備中）‑ 120 ‑

１．研究課題名：動脈硬化症と骨代謝に及ぼす運動療法の効果（研究番号２．研究代表者：石田研究分担者：赤尾良子・医学部・助教・循環器内科学
浩慶・医学部・准教授・循環器内科学

上記研究課題は研究代表者都合により辞退することとなった。

‑ 121 ‑

PR2012-12）

１．研究課題名：ラットアナフィラキシーショック時の肝血管収縮に対する肝血管造影法による検討（研究番号

PR2012-13）

２．キーワード：１）アナフィラキシーショック (Anaphylactic shock)２）静脈造影 (Venography)３）ラット (rat)
３．研究代表者：北楯
研究分担者：芝本優隆・医学部・助教・放射線医学
利重・医学部・教授・生理学Ⅱ

４．研究の目的アナフィラキシーショックの血圧低下に肝血管収縮による門脈圧亢進の関与が報告されており、特にラットではその肝血管収縮部位は類洞より門脈側であるとの報告があった。しかし、その門脈における正確な部位は不明であった。そこで、門脈造影および組織学的に門脈における血管収縮部位を特定することを試みた。
５．研 究 計 画
SDラットを用いてアナフィラキシーモデルを作成。麻酔下に実験を行った。各種モニターを使用し、体血圧、門脈圧の監視下に、アナフィラキシーショックを惹起させ、門脈造影を撮影し計測および検討を行った。また、別の感作ラットと非感作ラットを用いて、同様の麻酔下で抗原投与後、肝臓を摘出しホルマリンで固定後、切片標本を作製、HE染色を行い顕微鏡下に組織学的検討を行った。
研究代表者

北楯

優隆が実験の実施および結果の解析、検討を行った。

研究分担者

芝本

利重が実験全般に対する指導を行った。

６．研 究 成 果
抗原投与によりアナフィラキシーショックにより体血圧の減少が認められると共に、門脈静脈圧が抗原投与後2分で最大点の28±3cmH20へ上昇した。
門脈造影では、抗原投与にてアナフィラキシーショックが生じると、160 から 300 ㎛の径を有する血管が視覚化されなくなった。この所見は末梢側の門脈が狭窄もしくは閉塞が生じている事が示唆された。
組織学的検討では、コントロール群の内皮細胞数と血管径に関する回帰直線 (D=2.27N) が得られた。
この式から得られた予測血管径に対してアナフィラキシー群では 110 ㎛以下の大部分の門脈小静脈は狭窄を呈していた。更に 20 から 70 ㎛の血管で収縮に有意差が認められた。

‑ 123 ‑

７．研究の考察・反省
ラット肝血管収縮部位が 70 から 80 ㎛以下の門脈細静脈に存在し、それらは体循環の血管抵抗である細動脈に機能的に相当することが示唆された。
研究開始時点では、門脈における平滑筋細胞を免疫染色まで行う予定であったが、時間的な制約および技術的に未熟であったため行う事が出来なかった。今後の課題としたいと考えている。
８．研 究 発 表
① Masataka Kitadate，Toshishige Shibamoto，Mikihiro Tsutumi，and Hisao Tonami. Portal venular
constriction during anaphylactic shock in anesthetized rats. Biomedical Research 34 (2) 61-68，2013
Abstract: Hepatic venoconstriction occurs in rat anaphylactic hypotension. However, the exact
venoconstrictive site remains unknown, and we therefore attempted to determine its location by using
hepatic venography and histology. Anaphylaxis was induced in anesthetized Sprague-Dawley rats byi.v. administration of ovalbumin antigen. Venography of the portal vein (n = 8) was obtained atbaseline and maximal hepatic venoconstriction. We separately examined photomicrographs of theliver sections. Along with systemic hypotension, portal venous pressure increased to a peak of 28 ± 3
cm- H2O at 2 min after antigen injection. Post-antigen portal venography revealed that 40% of portal
venuls (76 vessels/total 188 vessels) with diameters from 160 to 300 μm were not visualized,
suggesting that stenosis or obliteration occurred distally. The corresponding upstream portal vessels
exhibited markedly bulging. Stenosis was also observed in some portal branches with diameters from180 to 420 μm (9%; 17 vessels/total 188 vessels). Light microscopically, most portal venules with anestimated baseline diameter less than 110 μm showed stenosis, but statistically significant stenosis
was found in those with baseline diameters of 20-70 μm. In conclusion, anaphylactic hepatic
venoconstriction occurs over a wide range of portal veins with diameters less than 420 μm, and occurs
markedly in portal venules with diameters less than 70 μm in anesthetized rats.

‑ 124 ‑

１．研究課題名：マウスアナフィラキシー肺血管・気道収縮に対するパラクリン的調節機構の解明（研究番号

PR2012-14）

２．キーワード：１）アナフィラキシー (anaphylaxis)
２）肺循環 (pulmonary circulation)３）一酸化窒素 (nitric oxide)４）β2 受容体 (β2-adrenocptor)
３．研究代表者：四宮研究分担者：倉田祥平・医学部・助教・呼吸器内科学
康孝・医学部・教授・生理学Ⅱ

４．研 究 目 的全身性のアナフィラキシーは、肺血管収縮と気管支収縮による右心後負荷に寄与する可能性があり、最終的にアナフィラキシーによる血圧低下を起こす。しかしアナフィラキシーに対する肺循環の反応はマウスではよく分かっていない。今回麻酔下の BALB/c マウスで、全身アナフィラキシーに対する肺血管性および気管支の反応を観察し、またこれらの反応における β-アドレナリン受容体、一酸化窒素とシクロオキシゲナーゼ代謝物の役割を明らかにする。
５．研 究 計 画
1 週間に 1 回、計 2 回卵白アルブミンで感作したのち、外頸静脈、頸動脈よりカニュレー
ションを行い中心静脈圧と体血圧を測定し、気管切開を行って気道内圧測定も行う。その後開胸下にて超音波血流計を大動脈に留置し大動脈血流を、右心室にカテーテルを直接穿刺して留置して右室拡張期圧を測定する。各種血管作動薬（β 受容体拮抗薬、インドメタシン、
L-NAME など）を投与してから、抗原を投与してアナフィラキシー反応時の肺循環動態を測定する。
６．研 究 成 果
アナフィラキシーは、開胸人工呼吸器下に感作マウスへアルブミン抗原を静注することによって誘発した。平均動脈圧、収縮期の肺動脈圧、中心静脈圧、気道内圧と大動脈血流を連続的に測定した。コントロールマウスにおいて、抗原投与後より平均動脈圧と大動脈血流量は持続的減少した一方で、収縮期肺動脈圧と気道内圧が上昇しなかった。対照的に、β2-アド
レナリン受容体アンタゴニストである ICI 118,551 (0.2mg/kg; n = 6) または L-NAME(50mg/kg; n = 6) を前投与したグループでは肺動脈収縮期圧が、抗原投与後 1.5 分に 7mmHg増加した一方で、β1-アドレナリン受容体アンタゴニストであるアテノロール (2mg/kg; n = 6)
またはインドメタシン (5mg/kg; n = 6) では上昇は認められなかった。L-NAME を前投与したマウスでは、肺高血圧は測定期間中である 30 分間持続していた。いずれのグループにおい‑ 125 ‑

ても、抗原投与後に気道内圧は有意に変化しなかった。結論として、全身アナフィラキシー
に対する肺循環反応においては右心後負荷を増加させなかった。従ってマウスにおいては静脈還流の減少がアナフィラキシーによる血圧低下の一因となる可能性はないと考える。β2アドレナリン受容体の活性化と一酸化窒素（β1-アドレナリン受容体活性化またはシクロオキ
シゲナーゼ代謝物ではなく）は、抗原によって誘発された肺血管収縮を減弱させるということも判明した。
７．研究の考察・反省本研究では方法論的な限界があった。第一に右心室の心室収縮期圧を肺動脈として置き換えたことである。これは右室収縮期圧が肺動脈とほぼ等しいからである。右室収縮期圧は肺動脈圧と同じではないが、マウスにおける肺動脈圧の連続的な測定はアナフィラキシーショックによる低い動脈血流量では困難であった。第二に、準 PVR（それを我々はここで報告した）は正しい PVR でなかった。そのために、平均 PAP と左心房圧の測定は必要とされた。
しかしながら、マウスで左心房圧または肺動脈楔入圧を測定することも、あまりに難しかった。その代わりに我々は左心房圧をゼロと仮定した。以上のことから本研究では肺動脈圧もしくは肺血管抵抗を過小評価したかもしれない。
８．研 究 発 表
① Shinomiya S, Shibamoto T, Kurata Y, Kuda Y, Zhang W, Tanida M, Toga H. Nitric oxideandβ2-adrenoceptors

activation

attenuate

pulmonaryvasoconstriction

duringanaphylactic

hypotension in anesthetized BALB/c mice. Experimental lung research, 39, 119-129, 2013
Abstract: Systemic anaphylaxis accompanies pulmonary vasoconstriction and bronchoconstriction,
which may contribute to increased right heart afterload, and finally anaphylactic hypotension.
However, the pulmonary response to anaphylaxis is not known in mice. We determined the pulmonary
vascular and bronchial response to systemic anaphylaxis in anesthetized BALB/c mice. We also
clarified the roles of β-adrenoceptors, nitric oxide, and cyclooxygenase metabolites in these responses.
Anaphylaxis was induced by an intravenous injection of the ovalbumin antigen into open-chest
artificially ventilated sensitized mice. Mean arterial pressure, systolic pulmonary arterial pressure,
central venous pressure, airway pressure, and aortic blood flow were continuously measured. In
sensitized control mice, mean arterial pressure, and aortic blood flow substantially decreased soonafter the antigen injection, while systolic pulmonary arterial pressure and airway pressure did notincrease. In contrast, in mice pretreated with either the β(2)-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 (0.2mg/kg; n = 6), or L-NAME (50 mg/kg; n = 6), but not with the β(1)-adrenoceptor antagonist atenolol(2 mg/kg; n = 6) or indomethacin (5 mg/kg; n = 6), systolic pulmonary arterial pressure increased by
7 mmHg at 1.5 min after antigen. In L-NAME pretreated mice, pulmonary hypertension was
sustained over 30 min of the experimental period. Airway pressure did not significantly change after
antigen in any mice studied. In conclusion, pulmonary response to systemic anaphylaxis does not‑ 126 ‑

increase the right heart afterload and, therefore, may not contribute to the initial decrease in venous
return and anaphylactic hypotension in anesthetized mice. β(2)-adrenoceptor activation and nitricoxide, but not β(1)-adrenoceptor activation or cyclooxygenase metabolites, attenuate theantigen-induced pulmonary vasoconstriction.

‑ 127 ‑

１．研究課題名：過敏性肺炎における免疫制御受容体の機能解析（研究番号PR2012-15）

２．キーワード：１）過敏性肺臓炎 (Hypersensitivity pneumonitis)２）トリコスポロン・アサヒ (Trichosporon asahii)３）免疫制御受容体 (Immunoregulatory receptor)
４）ヘルパーT 細胞 (Helper T cell)５）樹状細胞 (dendritic cell)
３．研究代表者：東野研究分担者：中村茉莉・医学部・助教・呼吸器内科学
晃・医学部・教授・免疫学

４．研 究 目 的
過敏性肺炎 (hypersensitivity pneumonitis, HP) は、微生物や低分子量の無機物といった抗原を反復吸入することによって起こる間質性肺疾患である。組織学的には肉芽腫性病変を主体とし、Ⅲ・Ⅳ型アレルギー反応とされるが、その発症機序については不明な点が多く残されている。HP の代表的な抗原として、欧米で農夫肺の原因となる細菌 Saccharopolyspora
rectivirgula や、本邦で夏型過敏性肺炎の原因となる真菌 Trichosporon asahii (T.asahii) が知られており、いずれもマウスにおいて HP を引き起こす。
Dectin-1, 2 は C 型レクチンファミリーに属する受容体で、真菌細胞壁成分のなかでもDectin-1 は β-glucan を、Dectin-2 は α-mannan を認識する。Dectin-1, 2 ともに抗原提示細胞である樹状細胞 (dendritic cell, DC) やマクロファージ等の免疫細胞に発現しており、これまで
Candida albicans (C.albicans) を用いた感染実験において、その排除に重要な役割を果たすことが報告されている。しかしながら、
T.asahii における Dectin-1,2 の役割は不明のままである。
そこで我々は、T.asahii を抗原とした HP モデルを Dectin-1, 2 欠損マウスで検討することで、これまで知られていなかった新たな HP の発症機序を解明することを目的とする。
５．研 究 計 画
(1) Dectin-1, 2 欠損マウスにおける HP モデル誘導と病理学的検討
野生型 (C57BL/6：B6) マウスおよび Dectin-1, 2 欠損マウスにおいて、T.asahii 抗原を 3 日
間経鼻投与し、抗原感作を行う。14 日目に再吸入し、HP モデルを誘導する。21 日目（再感作後 7 日目）に病理学的検討を行う病理組織学検討を行う。
(2) HP モデルにおける気管支肺胞洗浄液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) の検討
HP モデルでは、BALF 中の肺胞マクロファージ、好中球やリンパ球分画は増加している。
そこで、野生型および Dectin-1, 2 欠損マウスにおいて、HP 誘導後の BALF 中の細胞分画の変化や、フローサイトメトリーを用いて行う。
(3) 肺細胞におけるヘルパーT 細胞分画の検討
HP モデルの発症には IFN-γ を産生する Th1 細胞 (type I helper T cell) と IL-17 を産生する‑ 129 ‑

Th17 細胞 (T helper 17 cell) の関与が指摘されている。そこで HP 誘導後の肺細胞を採取し、Th1/1h17 細胞の分化を細胞内染色により検討する。
(5) Dectin-1, 2 によるヘルパーT 細胞分化制御機構の検討
Dectin-1, 2 は抗原提示細胞に発現しており、C.albicans を用いた感染実験においては、
Dectin-1, 2 は DC の産生する IL-12 を介して Th1 細胞を、IL-1β、IL-23 を介して Th17 細胞を分化誘導させることが知られている。そこで、野生型および Dectin-1, 2 欠損マウスの骨髄から DC を誘導し、T.asahii 刺激後、これらのサイトカイン産生量を ELISA や定量的 PCR法を用いて測定する。
６．研 究 成 果
(1) Dectin-1 は過敏性肺臓炎の発症に必須である。
過敏性肺臓炎は B6 マウスおよび Dectin-2 欠損マウスで発症したが、Dectin-1 欠損マウスでは殆ど認められず、病理スコア上でも有意に Dectin-1 欠損マウスで低下していた。
(2) Dectin-1 欠損マウスでは肺胞洗浄液中の炎症細胞浸潤が減少していた。
Dectin-2 欠損マウスでは過敏性肺臓炎が誘導されたため、B6 および Dectin-1 欠損マウスにおいて BALF 内の細胞分画を検討した。その結果、Dectin-1 欠損マウスでは再感作 1 日目の好中球および 7 日目の単球由来のマクロファージ分画が有意に減少していた。
(3) Dectin-1 は Th17 細胞を誘導する。
B6 および Dectin-1 欠損マウスにおいて再感作 7 日目の肺細胞を採取し、Th1/17 分画を検討した。その結果、Dectin-1 欠損マウスでは Th17 分画が有意に低下していた。一方、Th1 分
画は B6 および Dectin-1 欠損マウス間では変わらなかった。
(4) Dectin-1 は IL-23 産生抑制する。
DC からの IL-23 は Th17 分化に必須のサイトカインである。骨髄細胞より誘導した DC に
おいて、T.asahii 刺激後の上清中の IL-12p70 および IL-23p19 を測定した。B6 および Dectin-1欠損マウスともに IL-12p70 は検出限界以下だったが、IL-23p19 は Dectin-1 欠損マウスで有意に低下していた。
７．研究の考察・反省
本研究は T.asahii の抗原性が低く、また Dectin-1 欠損マウスの交配が一貫して安定しなかったことから、長期間の研究期間を費やした。現在、論文作成中で投稿予定である。一方、
本研究結果により、Dectin-1 は T.asahii による過敏性肺臓炎の発症に重要な役割を果たしていることが明らかになった。また、Dectin-1 は DC からの IL-23 産生を介して Th17 細胞を誘導し、疾患の発症に関与していると考えられた。Th17 細胞は好中球やマクロファージを活性化し、肉芽腫形成に関与していることが報告されている。これまで過敏性肺臓炎は、Th1 ある
いは Th17 細胞の関与が指摘されている。Dectin-1 は Th1 細胞誘導には影響を与えなかったことから、夏型過敏性肺臓炎においては、Th17 細胞が優位に作用しており、Dectin-1 を介した
Th17 細胞の活性化が発症に寄与していると考えられた。

‑ 130 ‑

８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 131 ‑

１．研究課題名：特発性拡張型心筋症におけるアミノ酸代謝異常に関する検討（研究番号PR2012-16）
２．キーワード：１）特発性拡張型心筋症 (idiopathic dilated cardiomyopathy)
２）タウリン (taurine)
３．研究代表者：若狭研究分担者：河合青木稔・医学部・助教・循環器内科学
康幸・医学部・准教授・循環器内科学
洋文・医学部・助教・循環器内科学

４．研 究 目 的
含硫アミノ酸であるタウリンは心不全の動物モデルにおいて心筋の線維化および心筋リモデリングを抑制する働きがある事が報告されている。しかし、人体における血中タウリン濃度、体内動態に関しては未だ解明されておらず、更なる検討が必要である。本研究の目的は、特発性拡張型心筋症 (DCM) 患者の冠静脈内 (Cs) と上行大動脈部基部 (Ao) での血中タウ
リン濃度を測定し心機能との関連性を検討した。
５．研 究 計 画
特発性拡張型心筋症 (DCM) 患者の連続 51 例と心機能正常者 40 例の冠静脈内 (Cs) と上行大動脈部基部 (Ao) でのタウリン濃度を測定し、心エコーで評価した左室駆出率 (LVEF) 、
左室短縮率 (FS) 、E/A、左室拡張末期径 (LVDd) との関連性を検討した。
６．研 究 成 果
DCM 患者において、Cs の平均タウリン濃度と Ao の平均濃度に差は認めなかった。EF が30%未満の群 (n=19) の Ao 平均タウリン濃度は EF が 30%以上の群 (n＝32) の Ao 平均タウ
リン濃度に比べ有意に低下していた (54.1±21.2 vs 68.2±17.8, p=0.014) 。DCM 患者において、Ao 平均タウリン濃度と EF との間には有意な正の相関関係を認めた (R＝0.362、P＝0.009) 。
また、Ao 平均タウリン濃度と FS との間にも有意な正の相関関係を認めた (R＝0.334、P＝0.009) 。さらに LVDd とは有意な負の相関関係を認めたことがわかった (R＝‐0.280、P＝0.046) 。E/A とは相関関係は認めなかった。
７．研究の考察・反省
DCM 患者においてタウリンが心機能と関連しており、タウリン濃度が高ければ高いほど心機能が保たれていた。今後、心機能低下患者に対しての新たな治療法の一つになる可能性が示唆された。しかし心筋内でタウリンがどの程度存在し、生理活性をどのように有しているかは不明である。したがって心筋生検施行し心筋標本を用いて心筋内のタウリン濃度を測定し、様々なマーカーを測定することによってタウリンの生理活性を検討する必要がある。

‑ 133 ‑

８．研 究 発 表
投稿準備中。

‑ 134 ‑

１．研究課題名：血清サイトカイン測定によるゲフィチニブ薬剤性肺炎の早期発見法の開発（研究番号PR2012-17）

２．キーワード：１）肺癌 (lung carcinoma)２）薬剤性肺障害 (Drug-induced lung injury)３）ゲフィチニブ (Gefitinib)
３．研究代表者：中川研・医学部・講師・呼吸器内科学

研究分担者：長内和弘・医学部・教授・呼吸器内科学

４．研 究 目 的
分子標的治療薬であるゲフィチニブ（イレッサ®）や、エルロチニブ（タルセバ®）は、上皮成長因子受容体 (Epidermal growth factor receptor;EGFR) を阻害し、アポトーシスの誘導や腫瘍血管の新生を抑制するなど、肺がん治療での有効性が報告され、最近では、アファチ
ニブ（ジオトリフ®）の臨床での使用も可能になり、肺癌治療の選択肢が広がっている。一方、急性肺傷害・間質性肺炎の誘発など重篤な副作用も報告されているが、その機序についてはまだ明らかにされていない。今回、Ⅱ型肺胞上皮細胞株やヒト血清を用いサイトカインの変動を評価することで急性肺傷害・間質性肺炎の発生機序を検討し、分子標的肺がん治療
薬による薬剤性肺障害の早期発見を目指す。
５．研 究 計 画
1. II 型肺胞上皮様細胞（ヒト肺腺癌細胞株 A549 細胞）でのゲフィチニブ、エルロチニブ、
クリゾチニブ刺激による IL-8 分泌・発現の評価
2. 肺腺癌患者血清での炎症性サイトカイン濃度の測定
６．研 究 成 果以前の研究でゲフィチニブに刺激されたⅡ型上皮細胞（A549 細胞）から分泌される炎症性サイトカイン測定し、TGF-b1、IL-8、IL-1b、IL-6、TNF-a のうち、IL-8、TGF-β1 の濃度上昇を認めている。IL-8 は高濃度のゲフィチニブ刺激による細胞数の減少に見合うような IL-8 分
泌の減少はみられず、細胞当たりの IL-8 分泌は高濃度のゲフィチニブ刺激で増加した。Ⅱ型
肺胞上皮様細胞として、ヒト肺腺癌細胞株 A549 細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、宮城）を使用。ゲフィチニブを各濃度で A549 細胞に投与し、24、48、72 時間
培養後の細胞数、培養上清内の炎症性サイトカインを測定した。
７．研究の考察・反省
IL-8 は高濃度のゲフィチニブ刺激による細胞数の減少に見合うような IL-8 分泌の減少はみられず、細胞当たりの IL-8 分泌は高濃度のゲフィチニブ刺激で増加した。

‑ 135 ‑

ゲフィチニブ以外にもエルロチニブ、クリゾチニブによる変化が予想される。今後は肺非小細胞癌患者でゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ投与が行なわれた患者血清
での炎症サイトカインの変化を検討していく。
８．研 究 発 表
① Min Zhou, Kazuhiro Osanai, Makoto Kobayashi, Taku Oikawa, Ken Nakagawa, Shiro Mizuno,
Yasushi Muraki, Hirohisa Toga. Adenovector-Mediated Gene Transfer of Lysophosphatidylcholine
Acyltransferase 1 Attenuates Oleic Acid-Induced Acute Lung Injury in Rats. Critical Care Medicine,42(11):e716-24, 2014.
Abstract: OBJECTIVE: Lysophosphatidylcholine is generated through the hydrolysis ofphosphatidylcholine by phospholipase A2 and reversely converted to phosphatidylcholine bylysophosphatidylcholine

acyltransferase

1.

Althoughlysophosphatidylcholine

isapotentproinflammatory mediator and increased in several types of acute lung injuries, the role oflysophosphatidylcholine acyltransferase 1 has not yet been addressed. We aimed to investigate
whether the exogenous expression of lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 could attenuate acutelung injury.
DESIGN: Randomized, prospective animal study, including in vitro primary cell culture test.
SETTING: University medical center research laboratory.
SUBJECTS: Adult male Sprague-Dawley rats.
INTERVENTIONS:

Recombinantadenoviruses

carrying

complementaryDNA

encoding

lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 or lacZ (Ad-lacZ) as a control was constructed. Alveolar
type II cells were isolated from rats and cultured on tissue-culture inserts. Rats were pretreated withan endobronchial administration of the recombinant adenovirus. One week later, they were IV
injected with oleic acid. The lungs were examined 4 hours post oleic acid.
MEASUREMENTS AND MAIN RESULTS: Adenoviruses carrying complementary DNA encoding
lysophosphatidylcholine

acyltransferase

1-infected

alveolar

type

II

cells

showedlower

lysophosphatidylcholine levels and a decreased percentage of cell death compared with
Ad-lacZ-infected cells or noninfected cells after exposure to hydrogen peroxide for 1 hour. Comparedwith Ad-lacZ plus oleic acid-treated lungs, adenoviruses carrying complementary DNA encoding
lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 plus oleic acid-treated lungs showed a lower wet-to-dry
lung weight ratio, a higher lung compliance, lower lysophosphatidylcholine contents, higher
phosphatidylcholine contents, and a lower apoptosis ratio of alveolar type II cells. Histologicalscoringrevealed

that

the

adenoviruses

carrying

complementaryDNA

encoding

lysophosphatidylcholine acyltransferase 1-treated lungs developed oleic acid-induced lung injuries
that were attenuated compared with those of Ad-lacZ-treated lungs.
CONCLUSIONS: Exogenous expression of lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 protects
alveolar type II cells from oxidant-induced cell death in vitro, and endobronchial delivery of a

‑ 136 ‑

lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 transgene effectively attenuates oleic acid-induced acutelung injury in vivo. These results suggest that lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 plays aprotective role in acute lung injury.

‑ 137 ‑

１．研究課題名：新規 12 員環マクロライド系抗菌薬（EM900）における抗腫瘍作用の検討（研究番号PR2012-18）

２．キーワード：１）肺癌 (lung cancer)２）マクロライド (macrolide)３）慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary disease)３．研究代表者：及川研究分担者：水野卓・医学部・学内講師・呼吸器内科学
史朗・医学部・准教授・呼吸器内科学

４．研 究 目 的
気管支拡張症患者やびまん性汎細気管支炎患者におけるマクロライド系抗菌薬の有用性についてはすでに確立されている。マクロライド系抗菌薬の少量長期投与は臨床現場でもよく行われている治療法であるが、抗菌活性を有するがゆえに耐性菌誘導が問題となる。近年、抗菌活性をなくし抗炎症作用に特化した 12 員環マクロライド系抗菌薬であるエリスロマイ
シン 900（以下 EM900）が開発されるに至っている。これらの薬剤による抗炎症作用についての検討が進んでいるが、過去に 14 員環マクロライド系抗菌薬で検討されていたような抗腫瘍作用については報告がない。今回、EM900 における抗腫瘍作用の有無について検討する。
５．研 究 計 画
まずは in vitro において、マウスおよびヒト肺腺癌細胞株を用い、エリスロマイシン 900（以下、EM900）による抗腫瘍作用の有無、EM900 と抗癌剤を併用した際の抗腫瘍作用の増強効
果の有無をみる。In vitro にて抗腫瘍作用が確認できれば in vivo での検討も行う。マウスに
マウス肺腺癌細胞株を皮下移植し、コントロール、EM900、抗癌剤、EM900＋抗癌剤を投与し、経時的な腫瘍径を測定、治療効果の有無を確認する。治療効果に差異が認められれば、14 日後マウスより血液および腫瘍組織を採取、後にサイトカインや組織所見の検討を行えるようにしておく。
６．研 究 成 果
エリスロマイシン 900 シリーズは、北里大学が研究開発中であるが、薬剤の安定性が不十分なことより、まだ研究開発段階の薬剤であり、提供をうけることが難しいことが判明した。
既存のマクロライドを用い、A549、肺血管内皮細胞に対し低酸素刺激および喫煙刺激を加えた際に惹起される炎症に対し、マクロライドによる炎症抑制効果について検討する実験を行った。結果、マクロライドによる炎症抑制効果は明らかには認められなかった。
７．研究の考察・反省
計画段階において、エリスロマイシン 900 シリーズの入手・作成に対する具体的なプラン‑ 139 ‑

が乏しく、結果薬剤を入手・作成することが困難と判明したことが最も大きな反省点である。
既存のマクロライドにおける検討を行うも、期待した結果は得られなかった。血管内皮細胞における機能解析過程において、遺伝子発現と疾患重症度との相関が認められ、論文投稿予定である。
８．研 究 発 表
投稿準備中。

‑ 140 ‑

金沢医科大学研究推進事業
特別推進研究特別奨励研究(Ａ･Ｂ)
成果報告書

編 集
発行所

平成 27 年 11 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

禁無断転載