倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：2 年助成（最終報告）■受領№1407

新規の薬物依存治療法確立を目指した
ペプチド GPCR のアレスチンバイアスリガンド開発
代表研究者

加藤英明

東京大学大学院総合文化研究科先進科学研究機構

准教授

Development of an arrestin-biased ligand for peptide GPCRs to establish a novel
drug addiction treatment.
Principal Researcher

KATO Hideaki,
The University of Tokyo, Komaba Institute for Science Associate Professor

近年 GPCR の 1 つであるニューロテンシン受容体（NTSR1）のアレスチンバイアスリガンドが薬物依存症の治療薬として有望視されている。そこで本研究では NTSR1 と G タンパク質、アレスチンとの複合体構造解析を行ない、得られた構造を比較することで G タンパク質シグナルを選択的に阻害する化合物の開発を目指した。現在までに NTSR1-アレスチン複合体、NTSR1-Gi,Go, Gq 複合体の構造解析に成功し、30 の候補化合物を得ることに成功している。
Recently, arrestin-biased ligands for the neurotensin receptor (NTSR1) have been viewed as a potential
candidate for the treatment of drug addiction. In this study, we tried to solve the NTSR1 structures incomplex with G protein or arrestin and compare them to develop compounds that selectively inhibit G
protein signaling. To date, we have successfully solved the structures of the NTSR1-arrestin, -Gi, -Go,and -Gq complexes, and have succeeded in obtaining 30 candidate compounds.

1．研究内容シグナル経路の活性化によるものであることがわ

覚せい剤やアルコール、ニコチンなどに対するかり、アレスチン経路を選択的に活性化させるア

薬物依存症患者数は日本だけでも数千万人以上とレスチンバイアスリガンドが俄かに注目を集めて考えられており、これらの依存症に対する安全性いる。本研究において、代表研究者は自身のこれの高い治療法を確立することは喫緊の課題である。

までの GPCR 構造解析にて培った経験を生かし、本研究では薬物依存症の治療標的として近年注目

NTSR1 とアレスチン複合体、G タンパク質複合体されている G タンパク質共役型受容体（GPCR）、の構造解析を目指した。また、得られた構造を比ニューロテンシン受容体（NTSR1）に着目する。

較することで、NTSR1 が G タンパク質と特異的NTSR1 の作動薬であるニューロテンシン（NT）に相互作用する部位を検出し、in silico の化合物スには薬物依存症の緩和効果があることが報告されクリーニングおよび細胞用いたアッセーを利用していたが、そのシグナル多様性から様々な副作用て、G タンパク質シグナルを選択的に阻害する化を示すため、治療薬としては利用不可能であった。

合物を開発することを狙った。

近年、NT による治療効果は NTSR1 のアレスチン

本研究では、プロジェクト全体を（1）hNTSR1-

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：2 年助成（最終報告）

アレスチン（Arr2）複合体の cryoEM 構造解析、

hNTSR1 と Arr2 の結合界面にはホスファチジル（2） hNTSR1-G タンパク質複合体の cryoEM 構イノシトール（PtdIns（4,5）P2）が結合しており、造解析（3）hNTSR1-Arr2 複合体と各種 hNTSR1-G細胞ベースの機能解析と組み合わせることで、タンパク質複合体の構造比較に基づいた

hNTSR1 による Arr2 の活性化にはこの PIP2 の結「hNTSR1 と G タンパク質との結合を阻害する低合が重要であることを見出すことができた。以上分子化合物」の設計評価、という 3 つの課題に分の結果は Nature 誌の Article に掲載された。

割しておこなった。
課題２ hNTSR1-Gq, Go 複合体のクライオ電子顕課題１ hNTSR1-Arr2 複合体のクライオ電子顕微

微鏡構造解析

鏡構造解析

既 に 代 表 研 究 者 は

既に代表研究者は

hNTSR1-Gi1 複合体のクライ

hNTSR1-Gi1 複合体のクオ電子顕微鏡構造を解明した

ライオ電子顕微鏡構造を経験を有していたため、同様解明した経験を有していの手法を用いて hNTSR1 タンたため、同様の手法を用いパク質、Gq, Go タンパク質をて hNTSR1 タンパク質を調製した。得られた精製タン

図 2 hNTSR1-Gq調製し、さらに、Arr2 にパク質同士を混合し、複合体複合体の cryo-EMを調製したのち、試料グリッ構造

ついては過去に報告された手法（Kang et al., Nature,2015）に基づいて発現精製

図 1. hNTSR1-Arr2 の複合体構造ドを作成し、これを用いてcryo-EM データ収集を行なった（クライオ電子顕を行なった。得られた精製タンパク質同士を用い微鏡としては東京大学の所有する Krios を利用）。て hNTSR1-Arr2 複合体調製を試みたが、安定な得られたデータを RELION、cryoSPARC を用いて複合体形成には GRK5 による hNTSR1 のリン酸化解析することにより、最終的に hNTSR1-Gq 複合が重要であることが判明したため、hNTSR1, Arr2体（図 2）、Go 複合体の cryo-EM を決定することに加えて GRK5 の発現精製条件を確立するとともに成功した（図 3）。特に Go 複合体については、に、GRK5 による hNTSR1 のリン酸化条件の最適

これまで報告されたことのない、複合体形成反応

化 を 行 な っ た 。 さ ら に 、 Arr2 と hNTSR1 のにおける新規の中間体 3 種を見出すことに成功しsulfo-LC-SDA を用いた光クロスリンクを行うこた。
（現在代表研究者を最終著者及び責任著者としとでこの複合体を安定化させ、最終的にて論文準備中。）

hNTSR1-Arr2 複合体のクライオ電子顕微鏡構造
を 4.2Å という分解能で決定することに成功した（図 1）。得られた構造から、hNTSR1 に結合するArr2 の配向は hNTSR1 と類似の GPCR である
rhodopsin に結合する Arr の配向とはまるで異なる（90 度近く回転している）ことが判明し、今までの当該研究領域における研究者の予想とは異なり、Arr の GPCR に対する結合様式には驚くほどの多様性が存在していることが判明した。さらに、

図 3 NTSR1-Go 複合体の 3 状態中間体 cryo-EM 構造

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：2 年助成（最終報告）

課題３ アレスチンバイアスアゴニストの設計
課題 1, 2 によって得られた複合体構造を比較することで、hNTSR1-G タンパク質複合体、またはhNTSR1-Arr2 複合体に特異的な GPCR-G タンパク質/アレスチン間の相互作用の検出を試みている。両構造の比較から、Arr2 と G タンパク質はそ
れぞれα5 ヘリックス、finger loop を GPCR の細胞内側のくぼみに突き刺すようにして結合していることが判明したが、その深さはα5 ヘリックスと比較して finger loop の方がヘリックス 1 ターン程度浅いことがわかった。そこで、この深さの差を利用して G タンパク質の結合は阻害するがArr2 の結合は阻害しない定分子化合物を in silicoにて設計したところ、候補となる化合物を 30 種得ることに成功している。

2．発表（研究成果の発表）
国内外の学会誌、学会講演会等における発表があれば５件程度記載。
記載内容：氏名、題目、誌名、巻、号、頁（年次）、学会名（場所、年次）
1．Huang, W., Masureel, M., Qianhui, Q., Janetzko,J., Inoue, A., Kato, H.E., Robertson, M.J.,
Nguyen, K.C., Glenn, J.S., Skiniotis, G., Kobilka,
B.K. Structure of the neurotensin receptor 1 incomplex with β-arrestin 1. Nature 579, 303-308(2020)
2．Hideaki Kato, Structural basis for the recognitionof salient signals by GPCRs, 第43回日本神経科学大会, Zoom, 2020年7月30日
3．Hideaki Kato, CryoEM analysis of the GPCRneurotensin receptor 1 signaling complexes, 第93回日本生化学会大会, Zoom, 2020年9月15日
4．○Hideaki Kato, CryoEM analysis of the GPCR
neurotensin receptor 1-G protein complex forthe future engineering of biased allostericmodulator, 第 418 回 CBI 学 会 講 演 会 , Zoom,
2020年11月30日

5．松井俊貴, 小柳淳暉, 加藤英明 クラスA GPCRの構造生物学 月刊「細胞」The CELL 53 (5),4-7 (2021)