様式３

愛媛大学沿岸環境科学研究センター
共同利用・共同研究拠点「化学汚染・沿岸環境研究拠点」
共同研究報告書
平成２９年２月２８日
化学汚染・沿岸環境研究拠点 拠点長 殿
申請者（研究代表者）
所属機関

愛媛大学大学院農学研究科

職

准教授

氏名

石橋 弘志

下記の共同研究について、別紙の通り報告します。
１ 研究課題
残留性有機汚染物質による PPARα活性化能の比較生物学的解析
２ 研究組織
氏名

代表者
石橋 弘志
分担者
平野 将司

拠点対応教員
岩田 久人

所属

職

分担研究課題愛媛大学大学院農 准教授
学研究科

cDNA クローニング

熊本高等専門学校

アミノ酸配列解析

講師

愛媛大学沿岸環境 教授
科学研究センター

３ 研究内容 （別紙）３−１ 研究課題名
残留性有機汚染物質による PPARα 活性化能の比較生物学的解析

３−２ 共同研究者名（所属を含む）
平野将司（熊本高等専門学校）

３−３ 研究目的
ポリ 臭 素 化ジ フ ェニ ルエ ー テ ル (PBDEs) な ど の臭 素 系難 燃 剤 (BFRs)や ペ ル フ ル オ ロ オ ク タ ン ス ル ホ ン 酸 (PFOS) な ど の 有 機 フ ッ 素 化 合 物(PFCs) は 、 ス ト ッ ク ホ ル ム 条 約 に よ り 新 た な 残 留 性 有 機 汚 染 物 質 (newPOPs) として指定され、高い学術的・社会的関心を集めている。これまで
new POPs による地球規模での汚染現状を明らかにするため、化学分析による濃度分布や環境動態、さらには生物蓄積などに関する研究が行われてきた。しかし、new POPs の毒性影響に関する知見は限定的であり、ストックホルム条約の目的である「人の健康の保護」に加え「環境の保護」を推進するためには、生物多様性の保全を考慮し、多種多様な生物種を対象とした new POPs の毒性影響評価やその毒性発現機序の解明、さらにはリスク評価を行うことが極めて重要である。
ペルオ キシ ソー ム増 殖剤応 答性 受容 体 (PPAR) は核 内受 容体 スーパ ーファミリーに属し、糖・脂質代謝に関与する種々の標的遺伝子を調節する転写因子である。哺乳動物では 3 種類のサブタイプ (PPARα, β/δ 及び γ) が存在する。ペルオキシソーム増殖因子は 、脂肪酸結合タンパク質、アシルCoA オキシダーゼなど脂肪酸輸送関連タンパク質やペルオキシソーム性 β酸化酵素の発現レベルを変化させ、齧歯類では肝細胞の増殖、アポトーシスの抑制、肝腫瘍の形成などの毒性を示すことが知られている (Peraza etal., Toxicol. Sci., 2006)。これらの毒性作用の発現には PPARα の介在が必要であり、PPARα 欠損マウスではペルオキシソーム増殖因子による肝腫瘍の発現はみられない。これまで new POPS を対象とした研究では、PFCs によるマウスやヒトの PPARα の活性化が明らかにされており (Peraza et al.,Toxicol. Sci., 2006)、ヒト培養細胞系を用いた研究では、 POPs に指定され

て い る ポ リ 塩 化 ビ フ ェ ニ ル (PCBs) で 誘 導 さ れ た 炎 症 や ア テ ロ ー ム 性 動脈 硬 化 に 対 す る PPARα の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る (Arzuaga et al.,Cardiovasc. Toxicol., 2007)。このことは、PFCs や PCBs が PPARα を起点とした情報伝達機構を撹乱し、生理機能の生体恒常性に影響することを意味している。しかしながら、PCBs と化学構造の類似した BFRs などの new
POPs について、PPARα シグナル伝達系に与える影響を調査した研究はほとんどない。
申請者は、これまでにロシア・バイカル湖に生息する水棲哺乳類バイカ
ル ア ザ ラ シ を 対 象 と し て 、 PFCs の 汚 染 実 態 や 蓄 積 特 性 を 明 ら か に し た(Ishibashi et al., Environ. Sci. Technol., 2008a)。一方、PFCs の潜在的な毒性影響を解明するため、アザラシ PPARα の完全長 cDNA クローニングを試み、水棲哺乳類で世界初となる単離に成功した (Ishibashi et al., Environ.
Sci. Technol., 2008b)。また、野生集団のアザラシ肝臓中の PPARα 遺伝子と薬 物 代 謝 酵 素 チ ト ク ロ ー ム P450 4A (CYP4A) タ ン パ ク 質 は 、 蓄 積 し た
PFCs によって発現が誘導されていることを明らかにし、 in vitro レポーター遺伝子アッセイ系を用いて PFCs による PPARα 依存的標的遺伝子の活性化も証明した (Ishibashi et al., Environ. Sci. Technol., 2011)。
そこで水棲哺乳類だけでなく、系統学的・生態学的に重要な多種多様な生物種を対象として、PPARα を介した情報伝達機構に対する new POPs の影響を評価するため、本研究ではイヌに着目した。伴侶動物であるイヌは、ヒトと生活環境を共有しているため、ヒトの生活環境から検出される化学物 質 に 曝 露 さ れ や す い と 考 え ら れ る (Storelli et al., Sci. Total Environ.,2009)。これまでイヌ血清中の平均 PFCs 濃度は PFOS の 25 ng/mL（濃度範囲：12-57 ng/mL）が最も高く、次いで PFHxS の 10 ng/mL（濃度範囲：0.89-32ng/mL）、PFNA の 3.5 ng/mL（濃度範囲：0.16-8.5 ng/mL）、PFOA の 2.5 ng/mL（濃度範囲：0.12-9.4 ng/mL）の順で検出 され、生体影響が懸念されている (Guruge et al., Chemosphere, 2008)。今回は PPARα cDNA をクローニングし、その推定アミノ酸配列の解析を行った。

３−４ 研究内容

LaMer から分与された肝臓試料を用い、試料は RNA 抽出時まで-80℃で保 存 し た 。 遺 伝 子 ク ロ ー ニ ン グ は 、 既 報 (Ishibashi et al., Environ. Sci.
Technol., 2008a) に従い、肝臓から total RNA を抽出し、mRNA を精製後、RT-PCR 法にて部分配列を得て、5’-および 3’-RACE 法により、全長の塩基配列を決定した。なお、推定アミノ酸配列の解析は、MacVector ver. 15.1.5を用いて実施した。

３−５ 研究成果
肝臓試料から PPAR cDNA の全長クローニングを行った。得られた塩基配列は 1407 bp の Open Reading Frame を有し、468 個のアミノ酸残基をコードしていた。本研究で単離した PPAR と他の脊椎動物 PPARα 分子種のアミノ酸配列を用いて系統学的解析を行ったところ、PPAR のアミノ酸配列は PPARα clade に属することが確認できた。
そこで、これまで報告されている他哺乳類の PPARα 分子種のアミノ酸配列との相同性を比較したところ、domestic cat、Amur tiger、Pacific walrus
および Baikal seal と最も相同性が高く (98%)、ついで human (95%)、rat(91%) および mouse (90%) の順であった (図 1)。また、各 domain の相同性比較では、すべての哺乳類 DNA-binding domain (C domain) では 97%以上の高い相同性を示し、ligand
binding/dimerization domain (E/Fdomain) では
domestic cat、Amur tiger、
Pacific walrus お
よび Baikal sealと 99%の高い相同性を、他の哺乳類とは

図 1 各生物における PPARα アミノ酸配列の相同性比較 (%)

92-98%の相同性を示した。これらアミノ酸配列の種間比較の結果から、
PPARα 分子種は哺乳類間で高く保存されていることが明らかとなった。
しかしながら、E/F domain におけるアミノ酸配列の相違は、リガンドプロファイルの差として反映されることが報告されている (Nagasawa et al.,Biochem. Pharmacol., 2004)。PPARα リガンドとの反応に関与すると推測される 272/279 番目のアミノ酸は、dog では domestic cat や human と同様にIle/Thr であり、rat や mouse (Phe/Met) と異なっていた。これらのことから、dog は rat や mouse などの実験動物とは異なる PPARα リガンドプロファイルを示すと考えられた。

図2

各生物の PPARα リガンド感受性に関与すると考えられるアミノ酸の比較

３−６ 今後の課題
PPARα cDNA クローンを用いたレポーター遺伝子アッセイ系を構築し、new POPs による転写活性化能を測定する。また、PPARα アミノ酸配列の272/279 番目を変異したドメインの作製を試み、PPARα のリガンドに対する感受性や種間差を明らかにする必要がある。

３−７ 成果発表リスト（論文・学会発表など）
該当なし