倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1438

鉄の吸収と体内輸送能力を強化したアルカリ性不良土壌でも良く育つ樹木ポプラの作出とバイオマス増産
代表研究者

増田寛志

秋田県立大学助教

Production of novel poplar which shows superior growth in calcareous soils withenhanced iron absorption and translocation ability, and increased biomass
production
Principal Researcher

Hiroshi Masuda,
Akita Prefectural University, Assistant Professor

アルカリ性不良⼟壌では植物が鉄⽋乏に陥りやすい。樹⽊ポプラの鉄吸収能⼒を⾼める三価鉄還元酵
素遺伝⼦ refre1/372 と、鉄の体内輸送を促進するニコチアナミンの⽣合成酵素遺伝⼦ HvNAS1 を導⼊した形質転換ポプラを作出した。鉄⽋乏の⽔耕栽培と、アルカリ⼟壌を⽤いた栽培実験の両⽅において、形質転換ポプラは鉄⽋乏症状が緩和され、野⽣型に⽐べ良好な⽣育を⽰した。本法により、アルカリ性不良⼟壌におけるポプラのバイオマス⽣産量の向上が期待される。
Plants are susceptible to iron deficiency in calcareous soils. We produced poplar transformants byintroducing the ferric reductase gene refre1/372, which enhances the iron absorption capacity of poplar,
and the nicotianamine biosynthetic gene HvNAS1, which promotes the transport of iron in the plant body.
In both iron-deficient growing experiments, -Fe hydroponic cultivation and calcareous soil cultivation, thetransformed poplar exhibited less iron deficiency symptoms and grew better than the wild type. Thisfinding will contribute to increased poplar biomass production in calcareous soils.

1．研究内容産と競合する。樹⽊バイオマスは、それ⾃体が⾷

1.1 研究の背景と⽬的糧ではないことに加え、斜⾯や丘陵地など、耕作

バイオエタノールなどのバイオ燃料はガソリンに適さないところでも栽培可能であり、⾷糧⽣産のように貯蔵や運搬が容易である。また、バイオと競合しないという利点がある。特にポプラは⽣マス資源は、バイオマスプラスチックなど素材や育が早く、⾼温、低温、乾燥などの環境ストレス資材として活⽤できるなど、化⽯燃料の代替に⽤にも強く、砂漠の緑化にも⽤いられており、不良いることが可能である。このようにバイオマス⽣⼟壌におけるバイオマス⽣産に⼤変有望な植物で産を⾼めることが、化⽯燃料の使⽤の抑制と、地ある。

球温暖化対策には必須である。⼀⽅で、サトウキ

不良⼟壌のうち、北アフリカ、中東、中国⻄部、ビやトウモロコシ、ソルガムなどの草本バイオマ

アメリカ中央部など、アルカリ⼟壌が世界の 1/3

ス植物では、それ⾃体が重要な作物であり⾷糧⽣を占める。アルカリ⼟壌では、鉄イオンが⼟壌中倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成に沈殿し、ほとんど溶けださないため、植物が吸(35S promoter) につなげた遺伝⼦発現カセット

収出来ず、これが植物の⽣育の主な制限要因となを作成した。それらをつなげ、ポプラの⼟壌からる。そこで、鉄を⼟壌から吸収・体内輸送しやすの鉄を吸収する能⼒を⾼める遺伝⼦ (refre1/372 )く、鉄⽋乏に強いポプラの新品種を作出することと、鉄の植物体内での輸送能⼒を⾼める遺伝⼦で、アルカリ性不良⼟壌におけるバイオマス⽣産(HvNAS1 )を同時に野⽣型ポプラ(P. tremula とを向上出来ると考えた。

P. tremuloides の掛け合わせ品種)に導⼊し、形質ポプラが⼟壌から鉄を吸収するには、他の双⼦転換ポプラを作出した(図 2)。

葉植物と同様に、沈殿しやすい三価鉄をより溶けやすい⼆価鉄に還元する酵素 (三価鉄還元酵素)の働きが重要である(図 1)。また、植物が合成するニコチアナミンが植物体内で鉄イオンをキレートして錯体を作ることで、植物体内における鉄の輸送と分配に寄与する(図 1)。ポプラのこの⼆つの能⼒を強化する遺伝⼦を導⼊することで、ポプラの鉄吸収と体内輸送能⼒を強化し、鉄⽋乏耐性能を付与することが出来ると考えた。
図 2 今回の研究に⽤いたポプラに鉄⽋乏耐性能を付与する遺伝⼦と導⼊した品種
1.2.2 鉄⽋乏⽔耕栽培による耐性検定
ポプラの苗を鉄も含んだ通常の⽔耕液 (ホーグランド液を⼀部改変)で栽培した。その後、鉄を完全に抜いた状態 (鉄⽋乏状態)で⽔耕栽培した。鉄図１ ポプラの鉄吸収機構

⽋乏栽培後 30 ⽇⽬において、野⽣型のポプラ

PtFRO2 : ポプラの内⽣の三価鉄還元酵素遺伝⼦、(WT)では、新葉が⽩くなり、深刻な鉄⽋乏クロロ

PtIRT1 : ポプラの⼆価鉄輸送体 (⼟壌から根へのシスの症状を⽰した。クロロフィルの合成に鉄は鉄の吸収関わっている)、PtNAS2 : ポプラのニコチ必須であるため、植物が鉄⽋乏状態になるとこのアナミン⽣合成酵素遺伝⼦ように葉が⻩⾊から真っ⽩に変化する。⼀⽅で、形質転換ポプラの R/W 1-1 では、新葉が緑⾊を⽰

1.2 研究内容し、⽣育も良好であった(図 3A)。葉のクロロフィ

1.2.1 耐性植物の作成

ル含有量と⾼い相関のある SPAD 値を調べると、ポプラの鉄の吸収能⼒と体内輸送能⼒を強化す

野⽣型では鉄⽋乏の栽培⽇数と共に新葉の SPADるため、⾼ pH でも活性を保持する三価鉄還元酵値が低下していくのに対し、形質転換体ポプラは素の遺伝⼦ (refre1/372 )を、ポプラの根で鉄⽋乏⾼い SPAD 値を維持出来ていた(図 3B)。さらに、時に発現が誘導されるプロモーターの制御下で発形質転換ポプラの乾物重が野⽣株に⽐べて 1.5 か現させる遺伝⼦発現カセットを作成した。また、ら 2 倍に増加した。また、形質転換ポプラにおけニコチアナミン⽣合成酵素遺伝⼦ (HvNAS1 )を、る導⼊遺伝⼦の発現を鉄⽋乏条件の根において定ポプラの体内全体で⾼発現させるプロモーター

量的 RT-PCR で確認した(図 3C)。野⽣型では

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Refre1/372 は全く発現が⾒られず、HvNAS1 の発⽔耕液にて栽培後 39 ⽇⽬の個体の葉を 1 枚ずつサン現もほとんど⾒られなかった。わずかに発現が⾒プリングし、ICP-OES よる鉄の濃度を分析したられるのは、内⽣の PtNAS2 の発現を検出してい(n=1)。WT: 野⽣型のポプラ、R/W 1-1、R/W 4-1:るものと推測される。⼀⽅で、形質転換ポプラの形質転換ポプラの系統

R/W 1-1 と R/W4-1 系統では、概ねどの個体でも導⼊遺伝⼦である Refre1/372 と HvNAS1 の顕著な発現が確認された。また新葉のニコチアナミンの内在量を調べると、形質転換ポプラ

1.2.3 ⾼アルカリ性⼟壌における耐性検定
さらに pH 9.6 の⾼アルカリ性である⾙化⽯⼟

R/W1-1

壌を⽤いた栽培実験を⾏った(図 4)。ポットはと R/W4-1 において、顕著な蓄積を確認すること1/5000 a のサイズのワグネルポットを⽤い、肥料が出来た(図 3D)。また鉄⽋乏にて⽔耕栽培後、39として上記の鉄⽋乏⽔耕液を週に 1 度、各個体⽇⽬の葉の鉄濃度を分析した(図 3E)。野⽣型ポプ

50ml 施⽤し栽培した。⼟壌栽培試験においても、

ラに対し、形質転換ポプラの葉の鉄濃度が 2 倍か

形質転換ポプラは野⽣型に⽐べ良好な⽣育を⽰しら 3 倍⾼く、鉄の⼟壌からの吸収や体内輸送能⼒た(図 4A)。野⽣株は栽培と共に新葉の SPAD 値のが強化されていることが⽰唆された。

低下がみられ、クロロフィル含有量が低下していたが、形質転換ポプラは⾼い SPAD 値を維持し、クロロフィル含有量の低下は⾒られなかった（図4B）。

図 3 ポプラの鉄⽋乏⽔耕栽培による耐性評価試験
A:鉄⽋乏の⽔耕液で 30 ⽇間栽培した個体の写真、B:
第 4 葉⽬の新葉の SPAD 値の経⽇変化(n=4)、C: 鉄図５ ⾙化⽯⼟壌における栽培実験

⽋乏 30 ⽇⽬の各個体の根における導⼊遺伝⼦の発現pH 9.6 の⾙化⽯⼟壌でポプラをポット栽培した。

量の定量的 RT-PCR による解析(n=3)、D: LC-MSMS

A: 栽培後 34 ⽇⽬の植物体の写真 B:第 6 葉⽬の新による新葉におけるニコチアナミンの内材量の解析

葉の SPAD 値の経⽇変化 WT: 野⽣型のポプラ、(n=1)。E:⽔耕栽培後のポプラの葉の鉄濃度、鉄⽋乏

R/W 1-1 と 4-1:形質転換ポプラ (n=4)

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1.3 まとめと展望
これらの結果から、Refre1/372 と HvNAS1 の⼆つの導⼊遺伝⼦は形質転換ポプラで適切に発現、機能し、鉄の吸収や体内輸送能⼒が強化されることで、形質転換ポプラに鉄⽋乏耐性能を強化できることが明らかになった。本⼿法により作出されたポプラを⽤いることで、⾙化⽯⼟壌、⽯灰質⼟壌等の⾼アルカリ性不良⼟壌におけるポプラのバイオマス⽣産量が向上し、不良⼟壌の緑化や地球温暖化の解決へつながることが期待される。

2．発表（研究成果の発表）
学会講演会
⽒名：増⽥寛志、成⽥匠、MAY SANN AUNG、
前⽥慶介、坂本真吾、光⽥展隆、⼩林⾼範、
勝⽥幹也、⼩川敦史、頼泰樹、服部浩之、
⻄澤直⼦
題⽬：鉄⽋乏耐性能を強化した樹⽊ポプラの作出
学会名：⽇本⼟壌肥料学会年会 (北海道⼤学(オンライン)、2021 年)