Graduate School Research Meeting Presentation-大学院歯学独立研究科第 1 0 4 回 中 間 発 表 会 プ ロ グ ラ ム
第 86 回 大 学 院 研 究 科 発 表 会 プ ロ グ ラ ム
大学院学生等が、これまでの研究成果を発表します。
どなたでも聴講できますので、多数の参加をお待ちしております（聴講申込不要）

場 所：実習館 2 階 総合歯科医学研究所セミナー室
日 時：2019 年 10 月 30 日（水）17 時 25 分 開会－2019 年 10 月 30 日（水）－
No.

17：25

1

2

［中 間 発 表］
17：30～18：00

4

審査委員

「骨形成制御因子であるスクレロスチンを欠損させたマウスにおける主査：中村浩教授
副査：各務教授：田口教授

開会挨拶 高橋研究科長

司会：吉成 教授

BMP 誘導性の異所性骨の解析」
中村 圭吾 3 年 健康増進口腔科学講座 口腔健康分析学［中 間 発 表］
18：00～18：30「マウス皮質骨由来幹細胞によるスフェロイドの凍結保存法の検討」

司会：各務 教授3

演題名・発表者

発表区分・予定時間

董 宏偉

3 年 硬組織疾患制御再建学講座 硬組織発生・再生工学

主査：平賀教授
副査：大須賀教授：中道講師［大学院発表］18：30～19：00「口腔粘膜由来細胞から形成された自発的スフェロイドの特性評価と 主査：平賀教授

司会：各務 教授

李［大学院発表］19：00～19：30「マウス緻密骨由来細胞から形成された自発的スフェロイドは高い分

司会：各務 教授

陳 凱 3 年 硬組織疾患制御再建学講座 硬組織発生・再生工学

皮膚由来細胞によるスフェロイドとの比較」
3 年 硬組織疾患制御再建学講座 硬組織発生・再生工学化能を持つ優れた幹細胞を有する」

副査：川原教授：小出講師
主査：小林教授
副査：正村准教授：上原講師

Graduate School Research Meeting Presentation

中間発表会申込書（課程博士）
Application Form for Midterm Meeting (For the Doctoral Course)
申込日
学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）

氏
攻

分

中村 圭吾

野

口腔健康分析学

主 指 導 教 員
Chief Academic Advisor

職名：
Position

副 指 導 教 員

職名：

Vice Academic Advisor

Position

職名：
Position

題

日
Day

年

2017

Year

㊞

名

Major Field

演

Entrance Year

月
Month

なかむら けいご

Name in Full

専

入 学 年

ID♯ G1706

年
Year

名

Title of Presentation（題名が英文の場合、和
文も記入）

教授

氏名：

教授

氏名：

講師

氏名：

吉成 伸夫

Name

宇田川 信之

Name

小出 雅則

Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

PositionName㊞

骨形成抑制因子であるスクレロスチンを欠損させたマウスにおける BMP 誘導性の異所性骨の解析雑誌名：公 表 （ 予 定 ）学 術 雑 誌 名

Journal巻
Vol.

Journal where
published

著

者

号

頁

～

No.

Page

公表 ・ 印刷中 ・ 投稿中 ・ 予定

年

月

Year

Month

Publication / In print / Submitted / Other

名

Author’s Name

第 1 希望日
Date of the 1st choice

発表希望年月日
Date of Publication

連

絡

先

Contact Address

2019

月
Month

30

日
Day

第 2 希望日

年

月

日

Year

Month

Day

その他希望日年月日

Date of the other choice

Year

Month

Day

※要相談

長野県塩尻市広丘郷原 1780 松本歯科大学歯科保存学講座
TEL：

0263 （51） 2026

主査

職名：

氏名：

副査

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

中間審査委員考10

Date of the 2nd choice※以下記入不要 / For official use only

備

年
Year

携帯：
Cellular phone

090 （5120） 1668

Graduate School Research Meeting Presentation

発表内容の要旨（課程博士）
Abstract of Presented Research (For the Doctoral Course)
学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）

氏
攻

分

1706

入 学 年
Entrance Year

2017

なかむら

けいご

名

中村

圭吾

野

口腔健康分析学Name in Full

専

ID♯G

Major Field

主 指 導 教 員

年

Year

吉成 伸夫

Chief Academic Advisor

発 表 会 区 分Type of Meeting

中間発表会

･

大学院研究科発表会･

松本歯科大学学会

Midterm Meeting / Graduate school research meeting presentation /The Matsumoto Dental University Society

演題名 / Title of Presentation
骨形成抑制因子であるスクレロスチンを欠損させたマウスにおける BMP 誘導性の異所性骨の解析

発表要旨 / Abstract【目的】
歯周炎は進行に伴い歯槽骨が吸収し、歯の喪失につながる疾患である。しかし現在の歯科治療では、高度に吸収された骨を完全に回復することは困難であり、歯槽骨再生治療の発展が期待されている。
骨細胞から分泌されるスクレロスチンは、Wnt/βcatenin シグナルを阻害し骨形成を阻害するタンパク質である。スクレロスチンをコードする SOST 遺伝子の喪失は頭蓋骨における骨の過形成を特徴とする硬結性骨硬化症を引き起こす。同様に、Sost 遺伝子欠損マウスでは頭蓋骨や長管骨で骨量が増加することが報告されている。本研究では、スクレロスチン欠損マウスにおいて Bone Morphogenetic Protein (BMP)
誘導性の異所性骨の骨形成量や骨密度が増加するかを検討し、骨再生におけるスクレロスチンの発現と働きを解明することを目的とした。
【方法】
スクレロスチン欠損マウスとして Sost-Green ホモマウス (Sost G/G) 、Sost-Green ヘテロマウス (Sost
G/+)、対照として C57BL6 マウス (WT) を使用した。コラーゲンペレットを BMP-2 に浸漬し、8 週齢雄のマウスの大腿部内側に BMP ペレットを埋入した。その後、14、28 日経ったのち BMP により誘導された異所性骨と大腿骨および脛骨を採取した。各群は 7 匹とした。採取した異所性骨と大腿骨をマイクロ CT で形態、骨形成量 (BV/TV) 、骨密度 (BMD) を解析したのち凍結切片を作成し、組織学的解析として
Sost-Gree による蛍光の発現を観察した。また、スクレロスチンの免疫染色を行った。
【結果】
WT の異所性骨では抗スクレロスチン抗体染色でスクレロスチン陽性の骨細胞を認めたが、蛍光観察において Green 陽性の骨細胞は認めなかった。Sost G/+の異所性骨では蛍光観察において、Green 陽性の骨細胞を認めた。Sost G/G の異所性骨では抗スクレロスチン抗体染色でスクレロスチン陽性の骨細胞を認めなかったが、蛍光観察において Green 陽性の骨細胞を認めた。これらの結果より、Sost G/G ではスク
レロスチンのタンパク質発現が欠失していることが確認された。
埋入後 14 日の異所性骨では、WT と比較して Sost G/G の異所性骨の大きさや湿重量は同程度であっ
た (WT = 16.4 mg, SG/G = 18.5 mg)。マイクロ CT において、BMP ペレットを取り囲む外殻に多孔質な石灰化像を認め、Sost G/G の外殻は厚いことが観察された。WT と比較して Sost G/G の異所性骨のBV/TV (WT = 4.59%, SG/G = 9.04%)と BMD (WT = 468 mg/cm3, SG/G = 602 mg/cm3) は有意に増加した。
埋入後 28 日の異所性骨では、WT と比較して Sost G/G の異所性骨の大きさや湿重量は同程度 (WT= 11.7 mg, SG/G = 10.0 mg) であった。マイクロ CT において、BMP ペレットを取り囲む外殻に層板様構造の石灰化像を認め、Sost G/G の外殻は厚いことが観察された。WT と比較して Sost G/G の異所性骨のBV/TV は有意に増加した (WT = 5.27%, SG/G = 9.58%) 。同様に、BMD は増加傾向を示した。 (WT= 763 mg/cm3, SG/G = 943 mg/cm3) 。
【結論】
BMP 誘導性の異所性骨では埋入後 14、28 日で Sost-Green によるスクレロスチン遺伝子の発現を認めた。スクレロスチン欠損マウスにおいて、異所性骨の骨形成量や骨密度は埋入後 14 日および 28 日で増加した。異所性骨において、スクレロスチンは過剰な骨形成を防いでいる可能性が示された。

Graduate School Research Meeting Presentation

中間発表会申込書（課程博士）
Application Form for Midterm Meeting (For the Doctoral Course)

学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）

氏
攻

分

野

硬組織発生・再生工学

主 指 導 教 員
Chief Academic Advisor

職名：
Position

副 指 導 教 員

職名：

Vice Academic Advisor

Position

職名：
Position

演

題

入 学 年

2017

年
Year

月

9

Month

日
10 Day

年
Year

㊞

董 宏偉

Major Field

2019

Entrance Year

名

Name in Full

専

ID♯ G 1712

申込日

教授

氏名：

教授

氏名：

教授

氏名：

各務 秀明

Name

芳澤 享子

Name

長谷川 博雅

Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

㊞

名

Title of Presentation（題名が英文の場合、和文も記入）

マウス皮質骨由来幹細胞によるスフェロイドの凍結保存法の検討
雑誌名：

公 表 （ 予 定 ）学 術 雑 誌 名

Journal

著

者

号

巻

頁

～

No.

Vol.

Journal where
publishedPage

公表 ・ 印刷中 ・ 投稿中 ・ 予定

年

月

Year

Month

Publication / In print / Submitted / Other

名

Author’s Name

第 1 希望日
Date of the 1st choice

発表希望年月日
Date of Publication

連

絡

先

Contact Address

2019

月
Month

30

日
Day

第 2 希望日

年

月

日

Year

Month

Day

その他希望日年月日

Date of the other choice

Year

Month

Day

口腔外科
（ 内線 ） 2066

TEL：

主査

職名：

氏名：

副査

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

中間審査委員考10

Date of the 2nd choice※以下記入不要 / For official use only

備

年
Year

携帯：
Cellular phone

（

）

※要相談

Graduate School Research Meeting Presentation

発表内容の要旨（課程博士）
Abstract of Presented Research (For the Doctoral Course)
学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）氏

名Name in Full

専

攻

分

野

Major Field

ID♯G

年

Year

硬組織発生・再生工学
各務 秀明

発 表 会 区 分

中間発表会

Type of Meeting

2017

Entrance Year

董 宏偉

主 指 導 教 員
Chief Academic Advisor

入 学 年

1712

･

大学院研究科発表会･

松本歯科大学学会

Midterm Meeting / Graduate school research meeting presentation /The Matsumoto Dental University Society

演題名 / Title of Presentation

マウス皮質骨由来幹細胞によるスフェロイドの凍結保存法の検討
発表要旨 / Abstract

目的：浮遊状態で細胞塊を形成するスフェロイド培養法は，従来のシャーレ上で行う平面培養と比較して優れた幹細胞の選択的培養法であることが知られている．また，われわれのグルー
プでは，特殊な低接着性プレートを用いることで，効率的に高い幹細胞性を有する自発的スフ
ェロイドの形成を行う方法を開発し，報告してきた．これら細胞を再生医療に応用するためには凍結保存方法の確立が必須であるが，これまでスフェロイドの凍結保存方法については十分な検討が行われていなかった。凍結保存では、凍結保護剤の種類や浸漬時間、凍結速度などさ
まざまな条件によって生存率が変化する。特にスフェロイドでは細胞塊を形成しているため、通常の培養細胞と比較して，凍結保護剤の浸透条件には差があることが予測される。マウス皮質骨由来細胞(CBDCs)から形成された自発的スフェロイドは，優れた幹細胞性や，高い骨・神経系細胞への分化能を有する．本研究では，この CBDCs から形成されたスフェロイドを用いて，スフェロイドに適した凍結保存法と，凍結解凍が細胞機能へ与える影響について検討する．
材料と方法：雄３週令 C57BL/6J マウス脛骨および大腿骨を取り出した後に細切し，コラゲナ
ーゼにて処理を行った．得られた細胞をα-MEM に 10％牛胎児血清と bFGF を加えた基礎培地
にて平面培養を行い，CBDCs を得た．2 継代目の細胞を低接着性シャーレに播種することで，自発的スフェロイドを得た。24 時間後にスフェロイドを回収し，５，１０，１５，２０％のジメチルスルホキシド (DMSO)ととともに緩徐凍結法にて-80℃まで冷却し，その後液体窒素中で保管した．解凍後，CCK-8 および CK−17（いずれも同仁化学研究所）を用いて，生存細胞数と細胞障害の程度を測定した．次に凍結保護剤による凍結前（非凍結群）と凍結解凍後のス
フェロイド由来細胞（凍結群）の幹細胞マーカーの発現を検討した．また．７日間骨分化誘導培地にて培養後，骨分化能を検討した．凍結解凍後のスフェロイドをβ- TCP ブロック（オスフェリオン，オリンパステルモバイオマテリアルス）へ播種し，SCID マウスの背部皮下へ埋入した．4 週後に摘出し，μCT にて撮影後，脱灰，包埋，薄切し，組織学的検討を行った．
結果：解凍後の細胞生存は DMSO5%の群で最も高く，細胞障害の程度もこの群が最も低かった．
この条件で凍結したスフェロイドについて，幹細胞のマーカーである CD29、
CD14、CD105、
Sca1、KLF4 の発現を比較したところ，凍結前と凍結解凍後で有意差は認められなかった。次に非凍結群と凍結群の骨分化能を検討した．
非凍結群と凍結群の ALP 活性はそれぞれ 0.58±0.11と 0.66±0.19 で、有意差は認められなかった。また，骨分化マーカーである BSP、Osterix、DMP1 の発現も非凍結群と凍結群の間にも有意差は認められなかった。凍結群のスフェロイド
を SCID マウスへ移植後４週のサンプルを解析したところ，μCT 画像，およびヘマトキシリ
ンエオジン骨組織の再生が認められた．
結論：CBDCs によるスフェロイドを作製し，スフェロイド状態での凍結保存の条件と解凍後の細胞の機能について検討を行った，適切な条件を選択することで，凍結解凍後も一定の生存率が得られた．凍結解凍後も細胞の幹細胞性，骨分化能は維持されており，凍結保存を行っていない細胞と同等と考えられた．今後凍結保存されたスフェロイドの in vivo における骨再生能について，さらに検討を行っていく予定である．

Graduate School Research Meeting Presentation

大学院研究科発表会申込書（課程博士）
Application Form for Graduate School Research Meeting Presentation (For the Doctoral Course)

学

籍

番

号

Student ID No.

氏

李 妮

攻

分

野

硬組織発生・再生工学

Major Field

主 指 導 教 員
Chief
Advisor

Academic

職名：
Position

副 指 導 教 員

職名：

Vice Academic Advisor

Position

職名：
Position

月

9

Year

Month

2

日
Day

年

2017

Entrance Year

名

Name in Full

専

入 学 年

ID♯ G1711

年

2019

申込日

Year

㊞

教授

氏名：

教授

氏名：

教授

氏名：

各務 秀明

Name

芳澤 享子

Name

宇田川 信之

Name

職名：

㊞

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

演題
名 Characterization of spontaneous spheroids from oral mucosa-derived cells and theirdirect comparison with spheroids from skin-derived cells/口腔粘膜由来細胞からTitle of Presentation（題名が英文の 場合、形成された自発的スフェロイドの特性評価と皮膚由来細胞によるスフェロ
和文も記入）
イドとの比較
雑誌名：
公 表 （ 予 定 ）学 術 雑 誌 名
Journal where
published

著

者

Journal2019 Jun 24;10(1):184. doi: 10.1186/s13287-019-1283-0
2019

名Author’s Name

Stem Cell Research & Therapy

年

6

Year

公表

月

PublishedMonth李妮 李憲起 陳凱 董宏偉 各務 秀明
大学院研究科発表会･

松本歯科大学学会

Graduate school research meeting presentation / The Matsumoto Dental University Society

発表会名及び
発表希望年月日
Date of Publication

連

絡

先

Contact Address

第 1 希望日2019

Date of the 1st choice

備

究
査

発
委

考

月
Month

30

日
Day

第 2 希望日

年

月

日

Year

Month

Day

その他希望日年月日

Date of the other choice

Year

Month

Day

※要相談

李 妮
TEL：

表
員

10

Date of the 2nd choice

（

携帯：

）

Cellular phone※以下記入不要 / For official use only

研
審

年
Year

主査

職名：

氏名：

副査

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

080 （ 7880 ） 9305

Graduate School Research Meeting Presentation

発表内容の要旨（課程博士）
Abstract of Presented Research (For the Doctoral Course)
学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）

氏
攻

分

入 学 年

1711

李 妮

野

硬組織発生・再生工学

Major Field

主 指 導 教 員
Chief Academic Advisor

発 表 会 区 分Type of Meeting

2017

Entrance Year

名

Name in Full

専

ID♯G

年

Year

各務 秀明
中間発表会

･

大学院研究科発表会･

松本歯科大学学会

Midterm Meeting / Graduate school research meeting presentation /The Matsumoto Dental University Society

演題名 / Title of Presentation

Characterization of spontaneous spheroids from oral mucosa-derived cells and their difference
between spheroids from skin-derived cells/口腔粘膜由来細胞から形成された自発的スフェロ
イドの特性評価と皮膚由来細胞によるスフェロイドとの比較
発表要旨 / Abstract

Background: Our group has developed a novel method for spontaneous spheroid formation
using a specific low-adherence culture plate with around 90-degree water contact angle. In thisstudy, this method was applied for oral mucosa-derived cells. First, the feasibility of
spontaneous spheroid formation was tested. Next, the characteristics of spontaneous spheroids
from oral mucosa- and skin-derived cells were compared with special focus on stemness andneuronal differentiation capability.
Methods: Oral mucosal cells, skin cells and compact bone cells were obtained from C57BL/6J
mice. Passage 2-3 cells were inoculated into the specific low-adherence culture plates to form
spontaneous spheroids. The effect of basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth
factor (EGF) and B27 supplement on spheroid formation and maintenance was assessed.
Immunofluorescence and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(qRT-PCR) were performed to investigate the expression of pluripotency markers, cellproliferation and apoptosis markers and neurogenic differentiation markers.
Results and Discussion: Using this culture plate, spontaneous spheroid formation was feasible.
This process depended on the presence of serum but was independent of the additives such asbFGF, EGF and B27 supplement, although they improved the efficiency and were essential for
spheroid maintenance. The spheroids from oral mucosa-derived cells expressed stem cellmarkers, such as Sox2, SSEA1, Oct4, Nanog, and neural stem cell markers such as Nestin. The
expressions of Sox2, fucosyltransferase 4/FUT4 (SSEA1), and Nestin were relatively higher
under the presence of those additives. The expression of Sox2 in the spheroids from oral
mucosal cells was higher than that in spheroids from skin-derived cells, which was not affectedby the presence of those additives. Both spheroid-forming cell types had the ability todifferentiate into neural and Schwann cells after neurogenic induction, although significantly
higher MAP2, MBP, Nestin and Nurr1 gene expression was noted in the cells from oral
mucosa-derived spheroids. The expression of MAP 2, MBP, and Nestin in the oral mucosal
spheroid-derived cells were exceedingly higher than those in the spheroid-forming cells fromcompact bone-derived mesenchymal stem cells. Despite our expectation, the expression levelsof most of the tested stem cell markers were identical except for Sox2. Sox2 is localized inthese neural crest-like cells, and the cells are a possible source of spheroid-forming cells. The
higher expression of Sox2 in spheroids from oral mucosa-derived cells might be a reflection of
their abundance in oral mucosa.
Conclusions: The results showed that spontaneous spheroids from oral mucosa-derived cells
contain highly potent stem cells, which were as good as skin-derived stem cells. The highexpression of certain neuronal marker genes suggests an advantage of these cells forregeneration therapy for neuronal disorders.

Graduate School Research Meeting Presentation

大学院研究科発表会申込書（課程博士）
Application Form for Graduate School Research Meeting Presentation (For the Doctoral Course)

学

籍

番

号

Student ID No.

氏

陳凱

攻

分

野

硬組織発生・再生工学

Major Field

主 指 導 教 員
Chief
Advisor

Academic

職名：
Position

副 指 導 教 員

職名：

Vice Academic Advisor

Position

職名：
Position

演

題

名Title of Presentation（題名が英文の 場合、和文も記入）

Journal where
published

著

者

名

教授

氏名：

教授

氏名：

教授

氏名：

各務 秀明

Name

Year

氏名：
Name

職名：

氏名：

Position

Name

職名：

氏名：

Position

Name

㊞

田口 明

Name

Spontaneously formed spheroids from mouse compact bone-derived cells retain
highly potent stem cells with enhanced differentiation capability/マウス緻密骨由来細胞から形成された自発的スフェロイドは高い分化能を持つ優れた幹細胞を有する
JournalStem Cells International(Article ID 8469012)

2019 May 5;2019:8469012. doi: 10.1155/2019/8469012
年
Year

5

公表

月

PublishedMonth陳凱 李憲起 李妮 董宏偉 張以鳴 芳澤 享子 各務 秀明
大学院研究科発表会

Date of Publication

連

絡

先

Contact Address･

松本歯科大学学会

第 1 希望日
Date of the 1st choice

2019

備

究
査

発
委

考

10

月
Month

30

日
Day

第 2 希望日

年

月

日

Year

Month

Day

その他希望日年月日

Date of the other choice

Year

Month

Day

※要相談

陳凱
TEL：

表
員

年
Year

Date of the 2nd choice0263 （ 51 ） 2076

※以下記入不要 / For official use only

研
審

日
Day

年

Graduate school research meeting presentation / The Matsumoto Dental University Society

発表会名及び
発表希望年月日

2

芳澤 享子

Name

職名：

2019

Author’s Name

Month

㊞

Position

雑誌名：
公 表 （ 予 定 ）学 術 雑 誌 名

月

9

Year

2017

Entrance Year

名

Name in Full

専

入 学 年

ID♯ G1710

年

2019

申込日

主査

職名：

氏名：

副査

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

職名：

氏名：

携帯：
Cellular phone（）

Graduate School Research Meeting Presentation

発表内容の要旨（課程博士）
Abstract of Presented Research (For the Doctoral Course)
学

籍

番

号

Student ID No.
（ ふ り が な ）

氏
攻

分

入 学 年

1710

陳 凱

野

硬組織発生・再生工学

Major Field

主 指 導 教 員
Chief Academic Advisor

発 表 会 区 分Type of Meeting

2017

Entrance Year

名

Name in Full

専

ID♯G

年

Year

各務 秀明
中間発表会

･

大学院研究科発表会･

松本歯科大学学会

Midterm Meeting / Graduate school research meeting presentation /The Matsumoto Dental University Society

演題名 / Title of Presentation

Spontaneously formed spheroids from mouse compact bone-derived cells retain highly potent
stem cells with enhanced differentiation capability /マウス緻密骨由来細胞から形成された自発的スフェロイドは高い分化能を持つ優れた幹細胞を有する
発表要旨 / Abstract

Objectives: Spheroid culture has been reported beneficial for tissue engineering and celltherapy, since it is regarded as more physiological and may better preserve the characteristics ofstem cells than conventional two-dimensional culture. Although compact bone-derived cells(CBDCs) have been reported as an abundant cell source for mesenchymal stem cells, thecharacter of spheroids from CBDCs is not well known. The results from our recent study
showed the presence of two distinct spheroid-forming mechanisms, i.e. spontaneous andmechanical. In this study, we focused on the spontaneously formed spheroids and the characterof spontaneously formed spheroids from mouse CBDCs was explored.
Materials and Methods: CBDCs were isolated from mouse (C57BL/J) leg cortical bone after
dissection and collagenase treatment. The cells were cultured on a conventional dish and thecells at passage 2 or 3 were used for the following experiments. Spontaneous spheroid
formation was achieved on a low adherent culture plate, which can achieve spontaneous
spheroid formation. The expression levels of embryonic stem cell markers and mesenchymal
stem cell markers were analyzed using immunofluorescence and quantitative reverse
transcription polymerase chain reaction. Then, the cells from spheroids were induced into
osteogenic and neurogenic lineages.
Results and Discussion: The spontaneously formed spheroids from CBDCs were positive for
ES cell markers such as SSEA1, Sox2, Oct4, and Nanog. Additionally, the expressions offucosyltransferase 4/FUT4 (SSEA1), Sox2, and Nanog were significantly higher than those inmonolayer cultured cells. The gene expression of mesenchymal stem cell markers was almost
identical in both spheroids and monolayer-cultured cells, but the expression of Sca-1 was higher
in spheroids. After osteogenic induction, ALP activity of induced spheroid-derived cells was
significantly higher than that of induced monolayer cultured cells. The relative expression
levels of osterix, BSP and DMP1 in spheroid-derived cells was significantly higher than thosein monolayer cultured cells. After 2 weeks of neurogenic induction, the spheroid-derived cells
showed a significantly higher Nestin, MAP2, NGRF and NeuroD expression than those in
induced monolayer cells. Immunofluorescent images showed that the expression of nestin andβIII-tubulin was observed with neuronal cell-like morphology only in spheroid-derived cells. In
contrast, monolayer-cultured cells showed no positive staining for either Nestin or βIII-tubulin. .
These results show the potential usefulness of spheroid-forming cells from CBDCs for future
clinical applications in bone tissue engineering. The results from neurogenic differentiation also
support a potential of future usage of spheroid-forming cells from CBDCs forneurodegenerative disorders.
Conclusion: Spontaneously formed spheroids expressed stem cell markers and showedenhanced osteogenic and neurogenic differentiation capabilities than cells from theconventional monolayer culture, which supports the superior stemness.