From Eye to Insight

FALCON FLIM
Manual20191120_JP

FLIM 操作手順
1. FLIM 測定画面の起動

2ページ

2. レーザーと検出器のキャリブレーション

2ページ

3. Trigger Level の調整

2ページ

4. Detector の選択

5ページ

5. Photon/Pulse の調整

6ページ

6. 繰返し回数の検討

4

ページ

7. ROI の設定

9ページ

8. Fit15

ページ

9. FLIM Image Fit

25

ページ

10. データの保存

31

ページ

11. Separation of Photons by Lifetime Tuning 33

ページ

12. Phasor Plot

ページ

34

Tips
＊FLIM を起動後、Intensity 画像で Gating を行う場合は LAS X を一度閉じてください＊FLIM を起動すると Gating のチェックボックスが非表示となりますが、数値は適用されますので、必ず FLIM を起動する前にチェックボックスを外してください＊PMT は FLIM 撮影に使用できません＊FLIM に使用できるのは、パルスレーザーかつ Notch Filter がある波長だけです（十分に明るいサンプルの場合、他の波長でも使用できる可能性があります）＊以下の Wizard とは併用できません HyVolution Wizard、Lightning Wizard、Smart STED
Wizard、FRAP and FRAP XT、Matrix Screener（FLIM 画像に Huygens や Lightning 処理を行うことは可能）＊FLIM の解析のみを行う場合は、デスクトップ上の「LAS_X_SingleMoleculeDetection.exe shortcut」を起動してください、FLIM 画面のみが立ち上がります。LASX Small では解析できません。
＊STED775 は WLL とパルスのタイミングの同期を取ります。
そのため、 STED775 が ON のとき、WLL の Pulse 幅（Hz 数）は変更できません。
WLL の Pulse 幅（Hz 数）が 80 MHｚ以外の場合、STED775 を ON にできません。

1

Fast FLIM 画像の取得（FLIM、FRET、Pattern Fit で共通）
上図 FLIM ボタンを押すと、下図 FLIM 用画面がサブモニターで開きます。

レーザーと検出器のキャリブレーションを行います。
Tools から FLIM Calibration を開きま7
サブモニター右上にある○す。
＊WLL など（MP 以外）の場合：Automatic から Calibrate を行います。

SMD-HｙD の場合、Trigger Level から Decay Curve の Background レベルを調整します＊Calibration を行うと、Sequence の設定が消えます。
2

＊Pulse Picker（オプション）が搭載されている場合 Acquire Menu / 発振波長設定画面右上にあるボタンを押すと下記画面が表示されます。赤枠部分をクリックすると、プルダウン

メニューが表示され、10、20、40、80 MHz から選択することができます （搭載されていない場合
は 80 MHｚ固定）
蛍光寿命が長いサンプルの場合は、Hz 数をさげた方がより正確に計測できます。
ex. 80 MHz < 6 nsec、＊下図赤枠内の Ref.Line [nm]の数値が励起波長と同じであることを確認してください＊STED775 は WLL とパルスのタイミングの同期を取ります。
そのため、 STED775 が ON のとき、WLL の Pulse 幅（Hz 数）は変更できません。
WLL の Pulse 幅（Hz 数）が 80 MHｚ以外の場合、STED775 を ON にできません。
＊MP の場合：Manual を選択し、NIM2-4（番号は仕様により異なります）を選択します。下図赤丸
部分の Trigger Level を赤四角部分の Pulse 幅が右側のグラフのようになるまで変えます。

3

FLIM Settings（メインモニター側）
Filter Supported WLL-Lines：Notch フィルターが入っている波長が表示されます。基本的にこれらの波長以外は FLIM に使用できません。サンプルが十分明るい場合、励起を他の波長にすることができる
可能性があります。（表示される波長は仕様により異なります）。

Definition of FLIM image acquisition timeLine Repetitions

設定数だけ繰返しスキャンを行い、Photon が検出される時間を測定します。（Intensity 画像では設定数分の Line Accumulation が行われます）

Frame Duration

設定時間中スキャンを繰り返し、Photon が検出される時間を測定します。（Intensity 画像では、設定数分の Frame Average が行われます）

Frame Repetitions

設定数分だけスキャンを行い、Photon が検出される時間を測定します。Line Repetitions と組み合わせて使用できます。（Intensity 画像
では設定数分の Frame Average が行われます）

Acquire until max …

ある Pixel の Photon 数が設定した数値に達するまで、測定を続けま

photons/pixelす。（Intensity 画像では、Frame Average が行われます）

Sum of all Channels

検出された合計 Photon 数

Brightest Channel

最も明るい検出器

Dimmest Channel

最も暗い検出器

4

Specialist Settings：最大 4 基までの SMD-HyD などの検出器を 1 つの検出器として扱うことができる設定です。
赤矢印部分をクリックすると、左図下側が表示され、使用する検出器を選択できます。
ON になっていて FLIM に使える検出器が表示されますSingle Detector

FLIM で使用でき、ON になっている検出器が表示されます。(SMD-HyD、
HyD、4-Tune(NDD)が使用できます)

Multiple Detector

複数の検出器を 1 つ検出器として扱う場合に選択します。「＋」で検出器を追加できます。

All Detectors

FLIM に使用できるすべての検出器を組み合わせて使用する場合に選択します。
（FLIM 検出に用いる検出器の数を変えても、Intensity 画像に影響はありません。検出器の数を増やすことで Pile up effect が抑制されます。また、検出できる最大 Photon 数が増えることでより速く蛍光寿命の測定できます。検出される Photon 数が検出器同士で同じになるようにレーザー強度や検出波長幅を設定します。次ページ Pixel Intensity Histogram 参照）

5

Live ボタンを押すと、メインモニターに通常の Intensity 画像が、サブモニターに簡易的な Fast
FLIM 画像が下図のように表示されます。
蛍光寿命が擬似カラーで表示されます。
（蛍光寿命が短いと青側、長いと赤側）画
像上で右クリックするとShow Data Cursor と Export Image が表示されます。Show Data Cursor を選択す
ると、下記画像のようにカーソルがある
Pixel で検出された Photon 数と簡易的な蛍光寿命が表示されます。

こ の Photon 数 を 参 考 に し て 、 FLIM
Settings で繰返し回数などの設定を行います。
上 図 下 側 に あるをクリックすると下図が表示されます。

上側が検出された Photon の検出時間とその頻度を表示し、下側が蛍光寿命の擬似レインボーカ
ラー表示範囲を表示しています。
△を移動することで輝度の調整または、蛍光寿命の擬似カラー表
示コントラストを変更できます。
a ：Pixel Intensity Histogram と○b ：Lifetime Decay
画像の下に○

Curve が表示されます。
（Live、Capture、Start の Scan 中、随時更新されます）
Pixel Intensity Histogram* （ * 次 ペ ー ジ 参 照 ） ： 検 出 器 あ た り のPhoton/Pulse 数が表示されます。
HyD の場合はこの値が 0.5 を、また SMD-HyD、APD、4-Tune の場合は 1 を超えないように、レーザー強度や検出波長幅を調整します。
（表示される色は輝度イメージで指定した擬似カラーに依存します）

Pixel あたりの Photon 数を参考にして、FLIM Settings で繰返し回数などの設定を行い Scan します。
6＊検出器あたりの Photon/Pulse 数が多く、かつ HyD の場合 0.5、SMD-HyD、APD、4-Tune の場合は 1 を超えないようにすることが重要です。
Photon が検出されてから、次の Photon を検出できるようになるまで処理に一定の時間がかかります。その処理中に次の Photon が来た場合、Photon を検出することができないため、正確に測定することができず、本来の蛍光寿命より短く測定されてしまう現象を pulse pile-up effect と呼びます。このため検出器あたりの Photon /Pulse 数を 0.5 または 1 を越えないようにすることが重要です。（検出器あたりの Photon /Pulse 数が 0.5 または 1 を超えた場合でも、Photon Filter：
Standard（11 ページ参照）で該当する Pulse を除去することで、pulse pile-up effect のない、より正確な計算結果を得ることができます。
左図は pile-up effect がある場合とない
場合の比較
a ：pile-up effect がある場合○
b ：pile-up effect がない場合○＊正確な蛍光寿命を測定する際、必要な Photon count の目安
蛍光分子 1 個：100、2 個：1000、3 個 10000＊Pulse Picker（オプション）が搭載されている場合、Acquire Menu / 発振波長設定画面右上にあるボタンを押すと下図画面が表示されます。

Frequency からパルス幅（Hz 数：80、40、20 MHｚなど）を選択します。

パルス幅（Hz 数）は前回使用者の設定が残ります。

7

8-① 蛍光寿命の計算に用いるデータの範囲（ROI、時間、検出器）を指定できます。
9 ページ
8-② FLIM イメージの表示画面 Live などの Scan 中、Fast FLIM の結果がリアルタイムで表示されます。下側にあるプルダウンメニューから各検出器で検出された画像のコントラスト調整を行うことができます。
12 ページ
8-③ Curve Fitting を行う際のパラメーターの設定が行えます。
15 ページ
8-④ 右側に Decay Curve が表示されます。左側に Pixel Intensity Histogram などが表示されます。Live などの Scan 中は Decay Curve と Pixel Intensity Histogram がリアルタイムで表示されます。
27 ページ
8-⑤ 画像をもとに Curve Fitting を行った結果が表示されます。
30 ページ
8-⑥ FLIM 測定結果の保存を行えます。
31 ページ
8-⑦ データのインポートやエクスポート、画面表示設定などが行えます。
31 ページ88-①
解析に用いる Frame、検出時間、検出器の指定を行うことができます。
ROI の設定方法
上段左から順に①ブラシ：速く動かすほど幅が太くなります。それが ROI になります。
②ポリゴン：クリックした所を頂点に持つ多角形が ROI になります。最後の場所でダブルクリックすると最初の点と自動でつながります。
③四角：2 回クリックします。2 点を結んだ線を対角線にもつ四角形が ROI になります。
④楕円：2 回クリックします。2 点を結んだ線を対角線にもつ四角形に内接する楕円が ROI になります。
⑤円：クリック＆ドラッグします。クリックした場所からドラッグした場所が直径となる円が ROI にな
ります。
⑥Pixel 指定：クリックした場所が ROI になります。
⑦ROI の選択：ROI の移動、サイズの変更が行えます。
⑧ROI の全選択：選択された全ての ROI の移動などが行えます。
⑨選択された ROI の削除
⑩元に戻す
⑪やり直し
⑫ROI の自動認識：画面上でクリックすると ROI が自動認識・作成されます。
Invert：画像の色調の反転を行います。
作成した ROI を一つのエリアとして扱うことができるようになりますNew

最初の ROI を作ると ROI 1 は自動的に作成されます。New を押すまで全てのROI が一つのエリアとして認識されます。追加する場合は ROI（エリア）を選択し、ROI を作成します。

Rename

選択された ROI（エリア）の名前変更

Remove

選択された ROI（エリア）の削除

Reset

全ての ROI（エリア）の削除

上図のように Region に ROI 1、ROI 2 などのように表示されます。

9

From、To

スキャンしたフレームの中から、解析に用いるフレームを選択することができますPixel Binning

ピクセルのビニングをかけることができます

Lifetime Binning

蛍光寿命のビニングをかけることができます。（Binning をかけることで、
Photon 数が少なくてもより正確な Curve Fitting を行うことができます）
赤線部分を掴んで移動させることで、計測に使用する Pulse 内での計測時間範囲を指定することができます。表示される時間は使用する Pulse Laser の Hz 数（Pulse の間隔）により異なります。
赤線部分を掴んで移動させることで、計測に使用する Pulse 内での計測時間範囲を指定することができます。
Select from image を押すと下記画面が表示されます。

①の移動、②および③に数値を入力することで、上限および下限を設定できます。
④Intensity または FastFLIM を切替えることで、下限以下および上限以上の表示方法を変更することができます。
Intensity

下限以下および上限以上を赤で表示します

FastFLIM

下限以下および上限以上をグレーで表示します10Standard (High Speed)： Photon/Pulse 数が 1 の時の Photon の検出時間を計測に用います（2 つ以上の Photon が検出された場
合 Pulse は計測に用いません）。最も正確な方法で、デフォルトで選択されています。検出器あたりの Photon/Pulse 数が 1（SMDHyD または 4-Tune の場合）または 0.5（HyD の場合）以下になる
ように調整してください。これらの値よりも多くすると pulse pile-up
effect*が大きくなります。
（*7 ページ参照）
Standard (High Speed)

Photon/Pulse 数が 1 の時の Photon の検出時間を計測に用います（2 つ以上の Photon が検出された場合 Pulse は計測に用いません）。最も正確な方法で、デフォルトで選択されています。
検出器あたりの Photon/Pulse 数が 1（SMD-HyD または 4Tune の場合）または 0.5（HyD の場合）以下になるように調整してください。これらの値よりも多くすると pulse pile-up effect*が大きくなります。
（*7 ページ参照）

All Photons

Photon/Pulse 数に依らず、検出されたすべての Photon の検出
時間を計測に用いますFirst Photon

Photon/Pulse 数に依らず、最初に検出された Photon の検出時間を計測に用います

Manual assign Detectors

通常、検出器ごとに Photon が検出された時間をもとに蛍光寿命が計算されます。しかし、複数の検出器を組み合わせること
で、Pile-up effect を小さく、より速く蛍光寿命の計算をすることができます。ここでは、どの検出器を組み合わせるかの選択を行うことができます。検出器あたりの Photon/ Pulse 数が同程度のもの同士のほうが、より正確な蛍光寿命を得ることができます。(5 ページ参照)

11

8-②

A
○

１：画面にあわせて表示
２：ズームアウト
３：表示倍率の設定(%)
４：ズームイン
５：Pixel 等倍表示B○

表示項目は、FLIM、FRET、Pattern Fit で異なりますが、この段階で操作できるのは下記の 4 つです。
Intensity

検出された Photon 数に応じて Pixel ごとにグレースケールで表示します

Fast FLIM

蛍光寿命の平均値を Pixel ごとに擬似カラーで表示しますχ2

χ2 検定の結果による尤度、モデルの信頼性をピクセルごとに表示しますFree

下図左側の枠線内部分をクリックすると下図右側プルダウンメニューが表示されます。これらのパラメーターを明るさやコントラストに割当てて表示することができます。

FLIM Image Fit（25 ページ参照）後、次ページの表示項目が追加されます12FLIM の場合
Components

各 Channel を RBG で表示します

Grayscale

各 Channel をグレースケールで表示します

Lifetime

Components 数に応じて Channel に分け、蛍光寿命を Rainbow カラーで表示します。

FRET の場合
Efficiency

Apparent FRET の結果をもとに Pixel ごとの平均 FRET 効率を擬似カラーで
表示します

FRET

FLIM-FRET も結果をもとに Pixel ごとの平均 FRET 効率を擬似カラーで表示
します

Binding

FLIM-FRET の結果と Förster 距離をもとに Pixel ごとの平均 Donor-Acceptorの結合率（%）を擬似カラーで表示します

Distance

FLIM-FRET の結果と Förster 距離をもとに Pixel ごとの平均 Donor-Acceptorの距離を擬似カラーで表示します

Pattern Fit の場合
Components

各 Channel を RBG で表示します

Grayscale

各 Channel をグレースケールで表示します

C ：Display Options for the Channels○

45①各 Channel を重ね合わせて表示②各 Channel を個別に並べて表示③個別と重ね合せ両方を表示④下図の明るさと蛍光寿命などのコントラストの調整画面を表示⑤下図の蛍光寿命などのコントラストスケールバーの表示

13

D ：Contrast Setting○

左記画像のチェックボックスを OFF にすると画像の表示をOFF にすることができます。
上記画像赤枠部分をクリックすると、Photon が検出された数とその頻度をグラフにした Events[kCnts]と、Pixel 毎の蛍光寿命とその頻度をグラフにした Fast Lifetime [ns]の下記画像が表示されます△は任意の位置に設定可能です。

Auto Range

範囲の自動調整を行います

Full Range

全範囲を選択します

B で Free を選択した場合、上記枠部分をクリックすると、下記画像が表示パラメーターを変更す○ることができます。

14

FLIM 画像の保存
画像上で右クリックすると下記左側の画像が表示されます。
Export Raw Image を選択すると下記右側の画像が表示されます。

Save Pallet image as RGB のチェックを入れると、FLIM 画像が RGB 画像として保存されます。
JPG と BMP は 8 Bit で、それ以外は 16 Bit で出力されます。
Save Pallet image as RGB のチェックを外すと下記画像が表示されます。

Auto Range

蛍光寿命や明るさの最小値と最大値を認識し、自動的に変換します。出
力画像に定量性はありません。

Fixed Range

蛍光寿命の値を指定した割合で輝度値へ変換します。蛍光寿命の構成成分が複数含まれている場合、すべて同じ割合で変換されます。出力画像に定量性があります。

per Grey Level

指定した割合で、輝度値に変換します。出力画像に定量性があります。

Range

指定した範囲を輝度値に振り分けます。出力画像に定量性があります。

Individual Range

蛍光寿命の値を指定した割合で輝度値へ変換します。蛍光寿命の構成成分が複数含まれている場合、個別に指定した割合で変換されます。出
力画像に定量性があります。

15

8-③ Fit Settings

FLIM の場合

FLIM 用画面で FLIM を選択します。

Fit

8-⑤で選択されている ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行います

Fit All

8-⑤で選択されている全ての ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行い
ます

FLIM

Fit Setting で行った計算をもとに画像解析・

Image

表示を行いますFit…

Exponential

いくつの蛍光寿命から Curve が構成されているか選択します。（左記画像Components

は Components を 3 として計算した場合の結果、構成される Component
数の決め方は 34 ページ参照）

Select Fit Model…

計算式の選択を行います。（詳細な計算式は選択時に表示されます）

n-Exponential

IRF の形を考慮し、Curve の最初の方を使って計算します。相対的な蛍光Reconvolution

寿命を算出し、比較するのに有効です。

with IRF
n-Exponential

IRF の影響を受けない Curve の後ろ側を計算に使うため、蛍光寿命を精確

Tail Fitに測定できます。＊500 nsec 以下など IRF より短い蛍光寿命が含まれる
場合、使用できません。

Lifetime ()蛍光寿命を表示します

Amplitude

該当する蛍光寿命で検出された Photon 数からバックグランドを除去した値

Tail Offset

バックグラウンド（Curve の裾野部分の時間で検出された Photon 数）

IRF Background

IRF を考慮したバックグランドの蛍光強度（IRF を測定した場合に有効）

IRF Shift

IRF のピークと Photon 検出のピークのズレ（IRF を測定した場合に有効）

Intensity

該当する蛍光寿命で検出された Photon 数

Sum Amplitude

検出された Photon 数からバックグランドを除去した値

Mean , Intensity

Intensity を考慮した ROI 全体での加重平均蛍光寿命

Weighted
Mean , Amplitude

Amplitude を考慮した ROI 全体での加重平均蛍光寿命

Weighted
χ2

χ2 検定の結果による尤度、モデルの信頼性を表示します16Fit of the Lifetime Decay Curve: Determining the Number of Exponential Components
計測された Life time Decay Curve と理論値での Fitting をおこない、含まれている蛍光寿命の数とその位置を算出します。
a ：検出された Photon 数（Intensity）○と励起されてから検出されるまでの時
間（Time）の平均をプロットしたもの（実測）

Fit Settings で Fit Model を選択し、Exponential Components を 1 として Fit します。
a （実測）に加え○b （理論）と○c （偏差）が表示されます。
Fitting を行うと Decay Curve の画面に○以下の点を確認します。
a と○b の Curve が重なっていること
・○
c の変動が小さいこと
・○・Fit した後の FLIM 画像にノイズが入っていないこと
・χ2 の尤度が 1 に近いこと
これらが合致しない場合、Component の数が 1 つであることが否定されます。その場合、Exponential Components を 2、3 などに変更して上記項目を確認します。
＊Time Gate や Intensity Threshold (10 ページ参照)で反射やノイズなどのシグナルを取り除きFitting に用いる範囲を変更することで、より正確な蛍光寿命を測定できる場合があります。

17

例①、②、③は Components 数がそれぞれ 1、2、3 の場合を表示しています。
a ：実測と理論の Curve が一番重なっている。
○
b ：偏差の変動が一番少ない○c ：χ2 の尤度が一番 1 に近い○①、②、③のうち③がこれらに合致しているため、Components 数が 3 となります。

18

8-③ Fit Settings

FRET の場合

FLIM 用画面で FRET を選択します。

Fit

18-⑤で選択されている ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行います

Fit All

18-⑤で選択されている全ての ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行い
ます

FLIM

Fit Setting で行った計算をもとに画像解析・

Image

表示を行いますFit…

Förster Distance

FRET 効率が 50%になるときの分子間距離（蛍光色素の組み合わせによって変わります）

Unquenched Donor Lifetime

FRET が起きていない Donor の蛍光寿命

Unquenched Donor Amplitude

FRET が起きていない Donor のバックグラウンドを除去した蛍光強度

Quenched Donor Lifetime

FRET が起きている Donor の蛍光寿命

Quenched Donor Amplitude

FRET が起きている Donor のバックグラウンドを除去した
蛍光強度

Tail Offset

バックグラウンド（Curve の裾野部分の時間で検出された
Photon 数）

IRF Background

IRF を考慮したバックグランドの蛍光強度（IRF を測定した場合に有効）IRF Shift

IRF のピークと Photon 検出のピークのズレ（IRF を測定した場合に有効）FLIM FRET Efficiency

Donor の蛍光寿命変化をもとに計算された FRET 効率

Apparent FRET Efficiency

蛍光の輝度変化をもとに計算された FRET 効率

FRET Intensity

FRET が起きている Pixel で検出された Photon 数

Binding

Donor と Acceptor の結合割合（Acceptor と結合している
Donor の割合（%））

Donor-Acceptor Distance

Förster Distance と FLIM FRET 効率をもとに計算されたDonor と Acceptor の平均分子間距離（nm）

χ2

χ2 検定の結果による尤度、モデルの信頼性を表示します
19

FLIM FRET の計算方法
Acceptor のない Donor のみのサンプルを用いて FLIM 解析を行います。
Donor の蛍光寿命が 1 つの場合：Mono-Exponential Donor を選択し、Fit を行い、Unquenched
Donor Lifetime の値をコピーします
Donor の蛍光寿命が複数ある場合： Fit を行い、Mean , Amplitude Weighted の値をコピーします
FRET のサンプルに対して FLIM 解析を行います
Unquenched Donor Lifetime のチェックをはずし、コピーした値を貼り付けたあと Fit を行います。
Donor の蛍光寿命が 1 つの場合、Fit Model は Mono-Exponential Donor を選択します
Donor の蛍光寿命が複数ある場合、Fit Model は Multi-Exponential Donor を選択します

FLIM FRET 効率は以下のように算出されます20

8-③ Fit Settings Pattern Fit の場合
FLIM 用画面で Pattern Fit を選択します。
左図は ROI を 2 つ作成し Fit を行った結果

Fit

8-⑤で選択されている ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行います

Fit All

8-⑤で選択されている全ての ROI について、設定した Parameter をもとに計算を行い
ます

FLIM

Fit Setting で行った計算をもとに画像解析・

Image

表示を行いますFit…

Tail Offset

バックグラウンド（Curve の裾野部分の時間で検出された Photon 数）

Amplitude

輝度値

Background

バックグラウンドレベル

Shift

IRF と蛍光のズレ

Intensity Sum検出された Photon 数からバックグランドを除去した値

Intensity Integral

指定した ROI 内の合計輝度値

Effective Integral

指定した ROI と同じ蛍光寿命をもつ箇所の合計輝度値

Fractional Intensity

指定した ROI と同じ蛍光寿命をもつシグナル量が全体のシグナル量に占める割合（合計は 1）

χ2

χ2 検定の結果による尤度、モデルの信頼性を表示します21Pattern Fit (Dye Separation with FLIM)の方法

a 、○bDefine reference sample ○1. Pattern Fit にします2. Fast FLIM 画像または Decay Diversity Map 上に ROI を指定します
Fast FLIM 画像上に ROI を指定した場合、Decay Diversity Map 上の相当する場所が赤く表示されます。また Decay Diversity Map 上に ROI を指定した場合、Fast FLIM 画像の相当する
Pixel が赤く表示されます。ROI を複数選択することも可能です。

c 、○
d 、○
e 、○
f ：Add ROI を押すと、それまで選択していたすべての ROI に対する Pattern と
3. ○Curve が新たに追加されます22g ：FLIM Image Fit を行うと ROI と同じ蛍光寿命をもつ場所が分離して表示されます。
○

4. 作製した ROI に対して Fitting を行います
5. Pattern Image Fit により ROI の数に応じて画像を出力されます23

8-③ Fit Settings Mean ROI の場合＊タイムラプスイメージの場合のみ有効です①Mean ROI を選択後、FLIM、FRET または Pattern FIT を選択します。

②任意の箇所に ROI を設定すると、FastFLIM の結果（③ROI 中の平均 Photon 検出時間と④
その Photon 数）が表示されます。
（＊グラフの線の色は ROI を囲んだ線の色と対応します）

24

8-③ Fit Setting
Fit（FLIM、FRET、Pattern Fit で共通）

チェックが入っていると Curve をもとに自動算出されます。チェックをはずすと値を入力でき、計算結果に反映されます。

Global

過去のデータから右記パラメーターを引用して計算を行うことができます

Fit Setting 画面上で右クリックすると、下記画像が表示されます。
Copy to Clipboard

Fit した結果をクリップボードに保存します

Export…

Fit した結果をエクセル/CSV に保存できます

Export and show…

Fit した結果をエクセル/CSV に保存した上で、エクセルを開きます

Limits…

各パラメーター上で右クリックすると、そのパラメーターの Fitting に用いる範囲を指定できます

Probability Level…

確率変数を選択・指定できます（デフォルトはσ1）（σ1：68.27%、σ2：95.45%、σ3：99.73%）

Error Correlation plot…

Ordinate と Abscissa で選択したパラメーターをBootstrap 法で下図のように表示することができますOrdinate

選択したパラメーターを Y 軸として表示します

Abscissa

選択したパラメーターを X 軸として表示します

Probability Level

確率変数の選択・指定を行えます。オレンジの枠内が確率変数の範囲内であることを示します

25

FLIM Image Fit…をクリックすると下図のウインドウが開きます。
A の表示は FLIM、FRET、Pattern Fit で異なります）（○

B と○C の操作方法は 10 ページ Intensity Threshold と同じです。
○
A Parameter to fit：チェックを入れると Pixel ごとの計算結果が画像として表示されます。
○

FLIM、FRET、Pattern Fit で表示される項目が異なります。
FLIM の場合
Lifetime

蛍光寿命

Amplitude

蛍光強度

Tail offset

バックグランドの蛍光強度

IRF Background

IRF を考慮したバックグランドの蛍光強度（IRF を測定した場合に有効）

IRF Shift

IRF のピークと蛍光強度のピークのズレ（IRF を測定した場合に有効）＊Lifetime のチェックボックスは外れています。チェックを ON にすると、漏れ込みをチェックできるようになります。
FRET の場合
Unquenched Donor Lifetime

FRET が起きていない Donor の蛍光寿命

Unquenched Donor Amplitude

FRET が起きていない Donor の蛍光強度

Quenched Donor Lifetime

FRET が起きている Donor の蛍光寿命

Quenched Donor Amplitude

FRET が起きている Donor の蛍光強度

Tail Offset

バックグラウンドの蛍光強度

Pattern Fit の場合
Tail Offset

バックグランドの蛍光強度

Amplitude

蛍光強度

B Histogram：検出された Photon/Pixel 数を横軸に、その頻度を縦軸にしたもので、Threshold○と Pixel Binning で調整できます。
Threshold

計算に用いる閾値を設定します。左下の欄に直接入力または、Histogram
中のバーを動かすことで設定できます。結果は、右隣の画面 C に反映されます。

Pixel Binning

検出された Photon 数が少ない場合、Binning を行うことで Photon/Pixel が増え、より正確な計算を行うことができるようになります26

C Preview：○
A 、○
B で設定した画像が表示されます。下記パネルから表示サイズを調整すること○ができます。
6

7①画面に合せて表示します②ズームアウト③ズーム倍率を指定できます④ズームイン⑤Pixel 等倍表示にします⑥輝度画像を Grayscale で表示 閾値以下は赤で表示⑦Fast FLIM 画像で表示 閾値以下はグレーアウトして表示
D OK：○

FLIM の場合 Fit Setting/Exponential Components で選択した数、Pattern Fit の場合作成した
ROI 数の Channel に分けられます。

27

8-④ Fit
Photon 数を縦軸に、計測された時間を横軸にしたグラフ

a ：IRF（Instrument Response Function）レーザーや検出器などシステムすべてを含めた時間分○

解能を示す関数b ：励起してから検出された Photon 数をプロットしたもの○

グラフの左右両端をつまみ、動かすと計算に用いる範囲の指定を行えます。
グラフ上で右クリックすると、下図が表示されます。
Rescale自動で縦軸のスケールを調整し元の状態に戻しますShow Legend

線の色と名前（ファイル名 ROI 名 Channel名）を上記グラフ中に表示します

Show Data Cursor

グラフ上でマウスをおいた線上の名前、時間、Photon 数を表示します

Intensity logarithmic

縦軸を線形目盛から対数目盛に切替えます

Show number

グラフで選択した範囲の Photon 数と全体にPhotons

占めるその割合を表示します

Export diagram

グラフをエクセル/CSV に保存します

data…
Export diagram data

グラフをエクセル/CSV に保存した上で、ファand show

イルを開きますCopy diagram data

グラフデータをクリップボードにます

clipboard
Export Image

グラフを TIFF、JPEG、PNG、BMP、GIF で
保存します
28

Histogram
FLIM、FRET、Pattern Fit で、また項目によって表示されるパラメーターが異なります。選択するものによって、表示される Histogram のパラメーターは変わります。
Pixel Intensity

Photon/Pulse を横軸に、そのピクセル数

Histogramを縦軸にしたグラフ
Fast FLIM Histogram ： 励 起 さ れ て か ら
Photon が検出されるまでの時間を横軸に、その頻度を縦軸にしたグラフ

Fast FLIM

励起されてから Photon が検出されるまで

Histogramの時間を横軸に、その頻度を縦軸にしたグ
ラフ

Efficiency

FLIM FRET 効率を横軸に、その頻度を縦Histogram

軸にしたグラフDonor-Acceptor Distance Histogram ：Förster 距離をもとに計算された分子間距
離を横軸に、その頻度を縦軸にしたグラフ

Donor-Acceptor

FLIM FRET 効率を横軸に、その頻度を縦Distance

軸にしたグラフHistogram

Donor-Acceptor Distance Histogram ：Förster 距離をもとに計算された分子間距
離を横軸に、その頻度を縦軸にしたグラフ

Binding Histogram

Acceptor と結合している Donor の割合を
横軸に、その頻度を縦軸にしたグラフ

Decay Diversity

蛍光寿命を縦軸に、その標準偏差を横軸Mapにしたグラフ29

Histogram 上で右クリックすると、下図が表示されます。

Rescale自動で縦軸のスケールを調整し元の状態に戻しますShow Legend

線の色と名前（ファイル名 ROI 名 Channel 名）を上記グラフ中に表示しますShow Data Cursor

グラフ上でマウスをおいた線上の名前、時間、Photon 数を表示します

Intensity logarithmic

縦軸を線形目盛から対数目盛に切替えます

Show number Photons

グラフで選択した範囲の Photon 数と全体に占めるその割合を表示します

Export diagram data…

グラフをエクセル/CSV に保存します

Export diagram data

グラフをエクセル/CSV に保存した上で、エクセルを表示します

and showCopy

diagramdata

グラフデータをクリップボードにコピーしますclipboard
Export Image

グラフを TIFF、JPEG、PNG、BMP、GIF で保存します30

8-⑤ FLIM 計算結果の表示
画像取得後は、使用した検出器の数だけ下記画像のように表示されます。

Image Fit を行うと、結果が反映され FLIM の場合下記画像のように表示されます。

上図グラフ上で右クリックすると下記画面が表示されます。

Select Columns…

表示項目の選択ができます。表示項目できるは FLIM、FRET、
Pattern Fit で異なります

Copy table content

表示項目について全ての行をクリップボードにコピーします

Copy selected Rows

選択されている行の表示項目をクリップボードにコピーします。

Copy all

Select Columns…で選択/表示されていない項目についても全ての行をクリップボードにコピーします

Export table content…

表示項目について全ての行を Excel/CSV に保存できます

Export selected rows …

選択された行を Excel/CSV に保存できます

Export all…

Select Columns…で選択されていない項目も含めて全ての行
を Excel/CSV に保存できます

Export table content and表示項目について全ての行を Excel/CSV に保存し、ファイルを

show…

開きます

Export selected rows and表示項目について選択された行を Excel/CSV に保存し、ファイ

show…

ルを開きますExport all and show…

Select Columns…で選択されていない項目も含めて全ての行
を Excel/CSV に保存し、ファイル開きます

Parameter Plot…

Ordinate と Abscissa で選択したパラメーターを Bootstrap 法
で表示することができます（次ページ参照）

31

8-⑥ FLIM 画像など解析後のデータを保存できます。
Save Results…

FLIM 画像としての情報を保持した状態で解析結果が保存されます。
Raw データへ上書きはされません。

Save Image…

FLIM 画像としてではなく、通常の輝度画像と同様に保存されます。保存
後、3D 画像の作成などを行うことができます。FLIM に関する情報は保存されないため、再度解析を行うことはできません。

Save Results または Save Image を押すと、左記画面が開き名前を付けて保存することができます。保存先は開いている lif になります。

Save Pallet Image as RGB得られた Fast FLIM や FLIM 画像の蛍光寿命イメージを、蛍光寿命に応じて RGB の輝度
イメージに変換して保存します。保存された画像には蛍光寿命の情報が含まれないので、解析に用いることはできません（右図上から 3 つめのボタンを押すと、3 色に分割表示されます）。

Auto Range

蛍光寿命や明るさの最小値と最大値を認識し、自動的に変換します。出
力画像に定量性はありません。

Fixed Range

蛍光寿命の値を指定した割合で輝度値へ変換します。蛍光寿命の構成成分が複数含まれている場合、すべて同じ割合で変換されます。出力画像に定量性があります。

per Grey Level

指定した割合で、輝度値に変換します。出力画像に定量性があります。

Range

指定した範囲を輝度値に振り分けます。出力画像に定量性があります。

Individual Range

蛍光寿命の値を指定した割合で輝度値へ変換します。蛍光寿命の構成成分が複数含まれている場合、個別に指定した割合で変換されます。出
力画像に定量性があります。

32

8-⑦
File
New Experiment

新しい Project を作成します。名前を自由に設定できます。

Open

過去に撮影したデータを開きます

Experiment…
Import…

PicoQuant を使用して撮影したデータを開きます。（.pt3、.ptu など）

Export…

Time Gate など設定した範囲内のデータを.pt3、.ptu または.bin としてエクスポートしますExport Raw

Time Gate などの設定によらず全てのデー

Data…

タを.pt3、.ptu または.bin としてエクスポート
します

Save

lif として新規/上書き保存します

Save as…

lif として名前を付けて保存します

Close

選択されている lif ファイルを閉じます

Close All

開いている全ての lif ファイルを閉じます

Exit

FLIM 用画面を閉じます

Settings
画面の表示色を変更できます。

33

SPLIT （Separation of Photons by Lifetime Tuning）
励起光の出力を共焦点で撮影する程度または少し明るめの強さに、また STED 光の出力を設定
し撮影を行います（これまでの STED の半分程度、未検討の場合は 30～40%程度から検討を行ってください）。
1. 撮影データに対し、2 成分で Fitting
2. FLIM Image Fit （Background は 0 に設定）。
3. Save Image から Auto Range を選択し保存します。
＊STED 光はこれまでの半分程度で分離可能です。
分からない場合は 20-30%程度からはじめてください。
＊STED-FLIM のメリット
STED で分解能を上げる方法として Gated STED （gSTED）があります。STED 光が照射された箇所では誘導放出が起こり、蛍光寿命が短くなります。gSTED は励起してから取得までの時間をずらし、誘導放出が起こした箇所からのシグナルを捨て、STED 光が照射されていない中心部
分からだけのシグナルを得ることで分解能を上げる方法です。より蛍光寿命を短く、誘導放出を起こすため、STED パワーを上げる必要がありました。また励起から取得開始までの「捨てるシグナル」にも中心部分からのシグナルが含まれているため、シグナルは減っていました。それを補うた
め励起を上げていました。しかし、STED-FLIM では Fitting により STED 光が照射された箇所とその中心箇所を分離するため、シグナルを捨てる必要がなく、STED パワーを押さえることができます。その結果、褪色しにくくなります。

左 ： gSTED
励起 6%、STED 60%、0.3 - 6.0 nsec
中央：STED-FLIM で分離した STED 光により蛍光寿命が短くなった箇所
右 ：STED-FLIM で分離した STED 光が照射されていない箇所
励起 3%、STED 30%
Lanzanò L et al Nat Commun. 2015 Apr 2;6:6701. doi: 10.1038/ncomms7701.

34

Phasor Plot
Phasor Plot は FLIM の結果を下図のように視覚的に表示したもので、FLIM 画像の各 Pixel がプロットされます。そのため、モデルの選択や蛍光寿命の構成成分数について検討を行う必要がありません。

蛍光寿命は右下が一番短く、半円(Universal Circle)の線上を通り左下に行くに連れ長くなります。単一の蛍光寿命を持つ場合、半円の線上に分布します。一方、複数の蛍光寿命を持つ場合、半円の内側に分布します。

Ref: ISS, FLIM Analysis using the Phasor Plots35

𝐼 (t) = 𝐼 (0) ∑ 𝛼 𝑒 /式(1)＊𝐼 (t):t 時間後に検出されたフォトン数、𝛼 、𝜏 ：𝑖番目の Amplitude と蛍光減衰時間
IRF やノイズを考慮すると、式(2)となる𝐼(t) = IRF ⊗ 𝐼 (t) + n(𝑡) = IRF ⊗ 𝐼 (0) ∑/𝛼𝑒+ n(𝑡)

式(2)式(2)においてフーリエ変換を行うと、式(3)が得られる

g , (ω) =

∫

, ( )

∫

(

)

, ( )

s , (ω) =

∫

, ( )

∫

(

, ( )

)

式(3)

式(1)を式(3)に組み込むと、Phasor Plot と蛍光寿命の関連性を示した式(4)が得られる

g=∑

𝑠=∑

式(4)

＊𝑓 : 𝑖番目の蛍光寿命の全フォトン数
蛍光寿命が 1 成分の場合
式(4)は式(6)に変換できる

g=

s=

τ=

式(5)

(𝑓 𝑔 )式(6)

蛍光寿命が複数成分含まれる場合
式(4)は式(6)に変換できるg=∑g=(𝑓 𝑔 )s=∑s=

36

A Phasor を選択すると上記画面が表示されます○B ○D Phasor Plot 表示画面設定○
C ○D Phasor Plot 表示画面で選択した範囲が○F で設定した色で表示されます。デフォルトは○Intensity 表示です。
D Phasor Plot 表示画面○
E ○D Phasor Plot 用のツールバー○
F ○E で選択したツールバーと結果の表示画面○
G ○C で ROI を指定した際、○D に表示する ROI を選択することが出来ます
○

37

B
36-○

Harmonic

D Phasor Plot の右下に位置する短フーリエ変換の際パルス変調を行うことで、○い蛍光寿命の位置を見やすくすることができます (最大値は 9)
ThresholdPhasor 表示する際の閾値 (デフォルトは 5)

No Filter

Filter なし

FilterMedian Filter の切り替えとその度合いの設定

Preview

撮影中に Phasor を見るときに使います。Live 中でも SN を上げることができま
す。

38

D
36-○

a Universal Circle○
B 円に含まれた範囲に対応するピクセルが 34-○
C 上で線と同じ色で表示されます○
c Phase Shift の角度が表示されます○
D それぞれの Lifetime をあらわします。Monoexponential component の場合 Universal circle○

上に表示され、Multiexponential component の場合 Universal circle の内側に表示されます。
e ツールバー選択画面○

Zoom
Click and Drag した箇所の拡大表示
Reset
拡大表示解除SelectCursor などの選択および移動
Draw Cursor
2 つ目の Cursor を作製 （40 ページ参照）
Draw Ratio Cursor for two Components
2 つの蛍光寿命が含まれる場合に使用 （42 ページ参照）
Draw Ratio Cursor for three Components
3 つの蛍光寿命が含まれる場合に使用 （43 ページ参照）
Draw Connected Color Coding Line
青から赤に変化する直線を引けます （41 ページ参照）
Draw Connected Color Coding Lines
青から赤に変化する多関節の線を引けます （41 ページ参照）
39

Draw Connected Color Coding Triangle
青から赤に変化する三角形を作成できます （41 ページ参照）
Draw FRET Trajectory
Donor の Lifetime 変化から FRET 効率を算出できます （44 ページ参照）
Draw Cursor
選択後、蛍光寿命の中心をクリック

a 表示/非表示切り替え○
B 対応するツールのアイコンが表示されます○
c 表示色設定 ツールおよび、画像の対応箇所がこの色で表示されます
○
D 削除
○

Lifetime [ns]円で囲まれた範囲の平均蛍光寿命

Radius

円のサイズ

P

Phasor Plot 上で表示する際に ON

Ic に表示されている画像に○がつきます
36-○

Name

Project 名が表示されます

Channel

撮影に使われた Channel が表示されます40Adding Color Coding in the Phasor Diagram

1．①で任意のツールを選択します。
2．②、③、④の場所でクリックすると⑤のように青から赤へ変化する線が表示されます。白い線(⑥)の範囲内に対応する Pixel は⑦で対応する色で表示されます。範囲外の Pixel は白で表示さ
れます。

41

Determining and Visualizing the Lifetime using the Phasor Method

1． Phasor(①)を選択すると、画面中央下側に Phasor Diagram (②)が表示されます。
強いシグナル(a)と弱いシグナル(b)を分離・識別するには
2． Phasor Diagram (②)で Phasor Diagram 上で(a)と(b)のクラスターの形がはっきりとするよ
うに調整します。
3． Cursor (③)をドラッグしながら移動させます。
4． Cursor にマウスを合わせ、センターホイールを回し Cursor のサイズを調整します。
5． ⑥に下記パラメーターが表示されます。
Lifetime

蛍光寿命

RadiusCursor のサイズ

6． Tool Bar(⑤)から Cursor を追加することができます。
7． 3．と 4．を行い、Cursor を調整します。

42

Determining the Ration of Two Components in the Phasor Diagram

1． Draw Ratio Cursor for two Components(①)を選択します。
2． ②と③のエリアの中心をクリックします。
3． ④のように②と③がつながります。
4． Cursor を⑤の位置にまでクリック＆ドラッグします。
5． ⑥に下記パラメーターが表示されます。
Ratio②と③の比率Lifetime 1, Lifetime 2②と③との蛍光寿命

Radius⑥の Cursor のサイズ

43

Determining the Ration of Three Components in the Phasor Diagram

1． Draw Ratio Cursor for three Components(①)を選択します。
2． ②、③と④のエリアの中心をクリックします。
3． ⑤のように②、③と④がつながります。
4． Cursor を⑥の位置にまでクリック＆ドラッグします。
5． ⑦に下記パラメーターが表示されます。
Ratio②、③と④の比率 (合計 1)

Lifetime 1, Lifetime 2、Lifetime 3②、③と④の蛍光寿命

Radius⑥の Cursor のサイズ

44

Drawing a FRET Trajectory in the Phasor Diagram

1． Draw FRET Trajectory(①)を選択します。
2． 自家蛍光に相当する箇所(②)をクリックします。
3． FRET を起こしていない Donor (Unquenched Donor)に相当する箇所(③)をダブルクリックします。
4． ④の FRET Trajectory を蛍光寿命が短くなっている個所を通るように調整します。
5． Cursor(⑤)をクリックし、Trajectory 上を移動させます。
6． ⑥に下記パラメーターが表示されます。
Unquenched 

FRET が起きていない Donor の蛍光寿命

Quenched

FRET が FRET が起きている Donor の蛍光寿命

Background

Backgroud のノイズ比

FRET Efficiency

FLIM-FRET 効率

45

Phasor 画像の保存
画像上で右クリックし、Export Raw Image を選択すると、下記画像が表示されます。

Save Phasor Mask
_Cｈ0 から 4 まで作成されます。_Ch0 は Gray Scale 画像_Ch1-3 は RGB
Apply Phasor Mask to Image
Cursor で指定された範囲をSave Phasor GS46