フグ毒添加による Vibrio alginolyticus の増殖促進効果
斎 藤 俊 郎・池 田 貴 哉・仁 科 徳 啓

The effect of tetrodotoxin on growth of V. alginolyticus
Toshio Saito, Takaya Ikeda and Tokuhiro Nishina

東海大学海洋研究所研究報告第 29 号（2008），53 − 59 頁別刷
Reprinted from Bull. Inst. Oceanic Res. & Develop.,
Tokai Univ.（2008）, 29, 53−59

東海大学海洋研究所研究報告第 29 号（2008）53 − 59 頁

Bull. Inst. Oceanic Res. & Develop., Tokai Univ.（2008）, 29, 53 − 59

フグ毒添加による Vibrio alginolyticus の増殖促進効果
斎 藤 俊 郎 1）・池 田 貴 哉 1）・仁 科 徳 啓 2）

The effect of tetrodotoxin on growth of V. alginolyticus
Toshio Saito1）, Takaya Ikeda1）and Tokuhiro Nishina2）

Abstract
We conducted experiment to determine the function of tetrodotoxin（TTX）in Vibrio alginolyticus. V.
alginolyticus was isolated from the digestive tube of kusafugu（Takifugu niphobles）and they were cultured
under aerobic condition at 25℃ for 48 hours in the medium of 3 % Nacl Buffered Peptone Water added with
crude -TTX. We used 3  of medium with TTX concentration of 30 MU/ in our experiment. Opticaldensity（OD）of the medium was measured by a spectrophotometer at the wavelength of 660 nm. After
48 hours, OD of the medium in the sample with crude-TTX was found to be about twice than that of thecontrol. Furthermore, growth pattern of V. alginolyticus in control was undergoing stationary phase, whileV. alginolyticus in crude TTX sample was still in logarithmic growth phase. Our result indicated that crudeTTX has an inducing effect on growth of V. alginolyticus.

緒

生菌 Pseudomonas sp.（Yasumoto et al.）が発見され，

言

フグ毒の起源が細菌であることが分かったのである．

フグ毒は長期に亘りフグ類特有の毒であると信じ現在では，フグ毒はフグ毒産生菌により産生され食られてきた．ところが，1964 年カリフォルニアイモ物連鎖を介して上記生物群さらにはフグ類に蓄積されリ Taricha torosa（Mosher et al.）からフグ毒が検出さると考えられるようになった．これは同時に，生物界れ，フグ類以外の生物がフグ毒を保有することが明におけるフグ毒の全容が明らかになりつつあることもらかとなった．これをきっかけとして，以後主に軟意味している．

体，棘皮動物（成田，1988），節足，扁形，紐形動物（宮このようにフグ毒の全容が明らかになるにつれ，フ沢，1988）からフグ毒が続々と発見されることとなっグ毒研究分野では「多くのフグ毒産生あるいは保有生た．そして 1986 年には，スベスベマンジュウガニ物におけるフグ毒の機能」が新たな問題となっている．

Atergatis floridus の消化管からフグ毒産生菌 Vibrio

フグ類におけるフグ毒の機能としては，トラフグsp.（Noguchi et al.）が，また石灰藻体表からフグ毒産Takifugu rubripes が皮膚からフグ毒を分泌することが1） 東海大学海洋学部〒 424-8610 静岡市清水区折戸 3-20-1

School of Marine Science and Technology, Tokai University,
2） 株式会社中部衛生検査センター

3-20-1 Orido, Shimizu-ku, Shizuoka 424-8610, Japan〒 428-0007 島田市島 663-3

Chubu Food and Environmental Safety Centere,（2007 年 11 月 8 日受付／ 2008 年 1 月 7 日受理）

663-3 Shima, Shimada 428-0007, Japan

54

斎藤俊郎・池田貴哉・仁科徳啓

見出され，フグ毒を自己防御に用いている可能性が報におけるフグ毒の機能は不明であるが，著者らは上記告されている（Saito et al ., 1985）．また、スベスベマの諸事実を根拠として，フグ毒が本種フグ毒産生菌のンジュウガニも硬い皮膚からフグ毒を分泌し，フグ毒増殖に益することを予想した．

を自己防御に用いていることが示唆されている（Saito
et al ., 2006）．

以上の状況を踏まえ，本研究ではフグ毒産生菌 V.
alginolyticus におけるフグ毒の機能究明の一環とししかしながら，フグ毒産生菌を初めとする細菌にて，以下の 2 つを行うことにした．まず 1 つは供試

おけるフグ毒の機能については全く究明が進んでいな

クサフグの毒量，特に消化管内容物毒量を測定する

い．わずかにフグ毒の抗菌性が 10 種の細菌に対してことである．2 つはクサフグ消化管から単離した V.

調べられ，フグ毒には抗菌性がないこと（清水，1989）

alginolyticus をクサフグ由来のフグ毒添加培地で培養が示唆された程度である．

し，フグ毒が本種細菌の増殖に及ぼす影響を検討する

著者らはフグ毒産生菌におけるフグ毒の機能解明ことである．

に当たり，本細菌類がフグ毒保有生物の消化管から見材料と方法出されるとの一連の報告に着目している．一例を挙げ
ると Noguchi ら（1987）は，ショウサイフグ Takifugu

1.

snyderi 消化管からフグ毒および同関連物質を産生す

1−1

クサフグ毒量測定
供試魚る菌を見出し，これを V. alginolyticus と同定してい2006 年 6 月 28 日神奈川県観音崎にある観音崎大橋

る．この結果は，当然ながらフグ毒産生菌は消化管下の海岸で，産卵のため集まったクサフグ Takifugu内に生息していることを示している．さらに，加納niphobles（Fig. 1）224 個体を手網で採集した．毒量測（1989）はショウサイフグを初めとするフグ類 6 種の消定には，その内の雄 10 個体，雌 10 個体の計 20 個体を化管内容物の毒量を調べ，いずれについても毒が認め用いた．体長，体重については Table 1 に示した．残られたこと，すなわち消化管内にはフグ毒が存在するりの 204 個体の使用法については後述する．

ことを報告している．

1−2

毒量測定

上記の諸結果を概括してみると，フグ毒産生菌 V.

採集したクサフグは直ちに冷蔵で当研究室に運搬

alginolyticus が生息する消化管，すなわち環境には，し，毒量測定まで−40 ℃で凍結保存した．毒量測定にフグ毒が存在していることが分る．未だフグ毒産生菌

際しては，まず半解凍状態のクサフグを消化管，消Fig. 1

Kusafugu Takifugu niphobles.

フグ毒による V. alginolyticus の増殖促進

化管内容物，胆嚢，肝臓および生殖腺に解剖し，各部

2−355

添加用フグ粗毒に含まれる酢酸の除去

位の毒量を『食品衛生検査指針Ⅱ』（厚生省環境衛生局，フグ粗毒添加培地による V. alginolyticus の培養に1978）中のフグ毒検査法により調べた．なお，部位重先立ち解決すべき問題があった．それはフグ粗毒に抽量が微量なものは適宜合一して測定に供した．また，出液の酢酸が混入すること（Fig. 2）である．酢酸が V.

毒量が 5 MU/g 未満の場合，これを無毒とし計算時にalginolyticus の増殖に与える悪影響を考慮すると，事は無毒を 0 として扱った．

前に酢酸を取り除くことが必要となった．そこで以下

2.

フグ毒添加培地による V. alginolyticus の培養

2−1の 2 つの対策を立てた．

クサフグ消化管からの V. alginolyticus の単離

1 つはエバポレーションを繰り返すことによりフクサフグ採集時，その場で 4 個体から各消化管を取グ粗毒中の酢酸を除くことである．この時，フグ粗り出した．次いでそれぞれを滅菌済みのキャップ付遠毒 600 MU につき 25  の割合で蒸留水を加えエバポ沈管（15  容，IWAKI）に入れ当研究室に冷蔵で運んレーションを行い，乾固すると蒸留水添加とエバポだ．なお，解剖時にはクサフグ体表由来の雑菌混入をレーションの工程を繰り返した．酢酸臭が無くなるま防ぐため，80 % エタノールを含ませた脱脂綿で体表でを目安にこれを計 5 回行った（以後エバポレーショをよく拭いた後，滅菌済みのハサミとピンセットを用ン処理）．さらに 1 つの対策は，まず抽出時に必要ないて消化管を取り出した．

酢酸量を入れ，これをエバポレーション処理した対照

翌日，冷蔵保存中の消化管それぞれから内容物を区を設けることである．その際フグ粗毒に含まれる酢取り出し各試験管に入れた．次いでそれぞれに 9 倍量

酸量は，粗毒 600 MU に対し氷酢酸 0.24  とした．のアルカリ性ペプトン水（日水製薬株式会社）を加え，2−4

フグ毒添加培地による V. alginolyticus の培養

37 ℃で 24 時間培養した．培養後白金耳で本培養液を前培養：前述した様に V. alginolyticus の菌株はゼCHROMagarTM Vibrio（CHROMagar, 関東化学）平板

ラチンデスクに保存されている．そこでまずゼラチ

V.
培地に画線塗布した．これを 37℃で 24 時間培養後，ンデスク 1 枚を，3 % NaCl 添加 SCD 培地ダイゴ（日水alginolyticus と思われるコロニーから白金耳で菌を採取した．これらの菌は，TSI 寒天培地（日水製薬株式会社），LIM 培地（日水製薬株式会社），塩分濃度を 0, 1,8, 10 % に各調整した Nutrient Broth（Difco）による生化学的性状試験，ラピッド ID32E アピ試験（日本ビオメリュー株式会社）およびテスト紙によるオキシダーゼ試験（栄研化学）で同定した．
同定，単離された V. alginolyticus は，フグ毒添加培地による培養時までゼラチンデスク法（柳澤，1978）により保存した．
なお、上記同定試験は実験開始時だけでなく，本培養（2 − 4 で後述）終了時でも行なった．
2−2

添加フグ毒

フ グ 毒 添 加 培 地 に よ る V. a l g i n o l y t i c u s の 培
養 で は， 添 加 フ グ 毒 と し て フ グ 毒 純 品（ALEXISC ORPORATION ）およびクサフグから粗抽出した
フ グ粗毒の 2 種類を用いた．
フグ粗毒の抽出に用いたのは，前述のクサフグ採集時に入手した 200 個体である．なお，この時のクサフ
グ体長は 90.3 〜 159.2 mm，体重は 32.3 〜 138.8 g であった．これらから取り出した肝臓を合一し，Fig. 2 に示すフグ毒抽出法でフグ粗毒を総量 45,000 MU 得た．

Fig. 2

Procedure of separation of TTX fraction.

56

斎藤俊郎・池田貴哉・仁科徳啓製薬株式会社）が 10.0  入った試験管に入れ，25 ℃分栄養価を減少させた方が，フグ毒の効果が明確になで 18 時間培養した．次いで，PBS（−）（日水製薬株式ると予想したからである．

5会社）で 10 倍希釈し，その菌液 0.1  を 3 % NaCl 添

次いで，試験区ごとに調整溶液を 1  と上記した

加 BUFFERED PEPTONE WATER（OXOID）（以下

前培養後の希釈菌液 1 （菌数：2 × 103 細胞）を入れ，BPW）が 9.9  入った試験管に接種，25 ℃で 12 時間

各総量 20  とした．この際，調整溶液の内訳は各試培養した．前実験の結果から，この時点の菌は対数増験区で異なっている．すなわち，フグ粗毒区ではエバ殖期中期にあることが分っている．また次項に示す本ポレーション処理したフグ粗毒水溶液 1 （600 MU）

培養では，この菌液を PBS（−）でさらに 103 倍希釈し，とし，結果的に本試験区の毒濃度は 30 MU/とし

3

菌数を平均 2 × 10 細胞 /にして供試した．

た．フグ毒純品区では，純品 600 MU に前項 2 − 3 で本培養：実験方法の概要を示すと，試験区は 4 つ，示した量の酢酸および蒸留水を入れエバポレーションすなわちフグ粗毒を添加したフグ粗毒区およびフグ毒処理した 1  とし，上記同様毒濃度を 30 MU/ とし純品を添加したフグ毒純品区の 2 つと，エバポレーた．なお，毒濃度を 30 MU/ としたのは，クサフグション処理をした酢酸を添加した酢酸区および蒸留水

消化管内容物の毒量試験結果を参考にした（後述）．酢のみ加えた蒸留水区の 2 対照区の計 4 試験区とした．

酸区では，フグ粗毒 600 MU に含まれる酢酸（2 − 3 項

次に各試験区で V. alginolyticus を好気条件下，25 ℃，参）をエバポレーション処理した 1  とした．蒸留水

48 時間培養後，各細菌数を分光光度計で測定するも区では蒸留水 1  とした．5 つ目の三角フラスコは分のである．以下，具体的に述べる．

光光度計測定時のブランク用とし，調整溶液の蒸留水

三角フラスコ（100  容）を 5 つ用意し．それぞれ

1  と細菌を含まない培養液，すなわち 3 % NaCl 添に BPW を 3 倍 希 釈 し，NaCl を 添 加 し た 3 % NaCl−

加 BPW を PBS（−）で 10−3 倍希釈した 1.0  を加えた．

BPW/3 を 18  入れた．BPW を希釈する理由は，幾なお，上記各試験区の調整溶液は，全て 0.2 μm のフィ

Table 1 Toxicity distribution in different parts of the body of kusafugu Takifugu niphobles.

フグ毒による V. alginolyticus の増殖促進

ルター（ADVANTEC）で濾過滅菌したものである．
各試験区 3 本の試験管を用意し，それぞれに各三角57に 合 一 し て 測 定 し た 値 で あ る が， 雄 60 MU/g， 雌88 MU/g となった．

フラスコ内の培地を 3.0  入れ 25 ℃で 48 時間培養し肝臓では，雄の 10 個体平均毒量は 90 ± 109 MU/g，た．なお，ブランク用は試験管 1 本とした．

雌の同じく平均毒量は 201 ± 520 MU/g となり，雌の2 − 5 V. alginolyticus の菌数測定方が高い傾向が見られた．しかし，個体差が大きく有各試験区の菌数は，分光光度計（Thermo Spectronic）

意（t−検定，P<0.05）な性差は認められなかった．

を用い，波長 660 nm で測定した．測定は培養開始を生殖腺は，雄では 10 個体無毒，雌では 10 個体平均含め 1 時間毎に合計 49 回行った．各試験区 3 本の試験で 134 ± 183 MU/g と，明らかに雌の方が高かった．

管吸光度を測定し，平均値をその時点での値とした．

2.

これらの値を元に各試験区の増殖曲線を作成した．

結1.

果

フグ毒添加培地による V. alginolyticus の培養
Fig. 3 に本培養（2 − 4 参）の結果を提示した．
各試験区の増殖曲線を概観すれば，フグ毒純品区，酢酸区および蒸留水区に比して，フグ粗毒区では著しく増殖促進が生じていることが分かる．

クサフグ毒量測定
Table 1 にクサフグの部位別毒量を示した．

すなわち，培養 48 時間後の吸光度を見ると，酢酸

まず消化管では，雄では 10 個体の平均毒量は 11 ±区および蒸留水区は 0.48 ± 0.01（平均±標準偏差）
およ15 MU/g，雌では同じく平均毒量 85 ± 236 MU/g とび 0.45 ± 0.00 であるのに対し，フグ粗毒区では約 2 倍なり，雌の方が高毒となった．しかし、有意（t−検定，の 0.90 ± 0.00 と有意（t−検定，P<0.05）に高くなった．

P <0.05）な性差は認められなかった．

また，増殖曲線を見ると，フグ毒純品区，酢酸区およ

消化管内容物を見てみると，雄では <5〜13 MU/g，び蒸留水区の各細菌は，培養開始後 8 時間位までは激雌では <5 〜 28 MU/g の範囲となった．全体を通じてしく増殖し，その後 18 時間位までは対数増殖期であの最高毒量は 28 MU/g であった．前述した本培養でり，18 時間以降では増殖の勢いは衰え，徐々に定常はこの値を根拠に添加フグ毒量を 30 MU/とした．

期に入っている．ところが，フグ粗毒区では培養 48

胆 嚢 に つ い て は， 各 胆 嚢 重 量 が 少 な か っ た た め時間後も増殖の勢いは衰えなかった．

Fig. 3 The growth curve of V. alginolyticus during 48 hours.

58

斎藤俊郎・池田貴哉・仁科徳啓

また，本培養終了時における各試験区の同定試験
では，全試験区 V. alginolyticus のみであることが分alginolyticus の生存に良い影響を与える」ことを強く示唆している．

かった．

フグ毒純品区では，フグ粗毒区の様な増殖促進は起論1.

議

クサフグ毒量測定こらなかった．また，フグ毒純品区の増殖曲線は，酢酸区および蒸留水区と遜色無かった．これらの結果
は，フグ毒純品が V. alginolyticus の増殖を促進させ今回消化管からも毒量が測定された．雄雌共に 10ないこと，よって，フグ毒純品とフグ粗毒とでは質的個体中 5 個体が無毒（<5 MU/g）であったが，雄雌共に異なることを示唆している．これに関連して，フグに肝臓毒量が 3 桁代と高いと消化管にも毒量が認めら

毒は精製が進み純粋となると難水溶性になること（平れており，両者に相関があることが分かる．著者らは田，1979）が知られている．生体は，そのほとんどがこの理由を，クサフグが消化管を介して毒を吸収し，水分と言っても過言ではない．その生体の中でフグこの毒を肝臓において蓄積するからだと考えている．

毒が難水溶性であることは非常に考えにくい．そのた

これをさらに具体的に言えば，2 つのことが考えられ

め，長年「生体内のフグ毒の状態は純品と異なるのでよう．口から摂取されたフグ毒は，消化管で吸収されないか．
」と問題視されているが未解決である．詳しいる．そのため，1 つは ｢ 多くのフグ毒を摂取した個体メカニズムは未知であるが，著者らは上記の質的違いの消化管には，吸収されたフグ毒が存在している ｣ こ

故に，フグ毒純品区で増殖促進が起こらなかった可能とである．さらに，吸収されたフグ毒はその後肝門脈性を考えている．

を経て肝臓に移動する．今回卵巣にも毒が認められる

3.

総合的観点からの論議

ことから分かる様に，肝臓に移動したフグ毒のあるも今まで示してきた諸結果を踏まえ，著者らは，「クサのは血液を介してフグ毒を必要とする全身に運ばれるフグを初めとするフグの消化管において，フグ毒は V.と考えられる．よって，2 つ目の理由としては「何らalginolyticus 等のフグ毒産生菌の維持に関与しているかの理由から肝臓からのフグ毒が消化管に蓄積してい可能性」を考えている．

る」ことも考えられる．

この理由は，以下の 3 つである．

今回，消化管内容物から毒量が検出された個体が見1 つは，フグ毒産生菌がフグの消化管から単離されられたが，消化管内容物に毒が認められる理由としてる（Noguchi et al., 1987）と共に，消化管内容物からフは，2 つを考えている．1 つは，当然これらクサフググ毒が検出される（加納，1989）ことである．つまり、がフグ毒含有餌生物を摂食した故が考えられる．もうフグ毒産生菌はフグ毒の存在する環境に生息している

1 つは，胆嚢経由で消化管に分泌されるフグ毒が消化ことである．2 つは，Watabe ら（1987）がトリチウム管内容物と混合する故である．というのは，胆汁は消でラベルしたフグ毒を無毒のフグに投与し，フグ毒が，化時に消化管に流れ出てくるからであり，さらに今回，生殖腺，肝臓および胆嚢に蓄積されたことを報告し各個体の胆嚢を合一したとは言え，胆嚢からも毒量がていることである．この結果は，肝臓や胆嚢における認められているからである．このことは，非常に重要フグ毒の蓄積が何か意味のあることを伺わせる．3 つな意味を持つと思う故後で詳しく述べる．

は，胆嚢から消化管に流れ出た胆汁が，消化管のミクフグ毒添加培地による V. alginolyticus の培養ロフローラに影響を与える（瀬良ら，1975）故，つま今回，フグ毒純品区，酢酸区および蒸留水区に比しり，胆汁は腸内細菌の環境を作る大きな 1 要因となって，フグ粗毒区の V. alginolyticus は明らかに増殖がているからである．よって，胆嚢に蓄積するフグ毒が促進された．特に，増殖開始後 48 時間において，上消化管のミクロフローラに何らかの影響を与える可能

記３試験区の細菌は定常期に入っているのに対し，フ性は充分考えられる．4 つは，今回好気条件下である

グ粗毒区は今なお対数増殖期である事実は，この増が，クサフグ由来のフグ粗毒が，これまたクサフグの殖促進作用が増殖の質までも変化させる強いレベル

消化管由来の典型的フグ毒産生菌 V. alginolyticus の2.

であることを意味している．よってこれら諸結果は，増殖を著しく促進したからである．よって、本種細菌「好気条件においてフグ粗毒は V. alginolyticus の増殖にとって，フグ粗毒は生存に有利に機能していることを促進させる」こと，さらに「環境中のフグ粗毒が V.

が示唆される．

フグ毒による V. alginolyticus の増殖促進

59

以上より，
「クサフグを初めとするフグの消化管におNoguchi，T．，D．F．Hwang，O．Arakawa，いて，フグ毒は V. alginolyticus 等のフグ毒産生菌のH．Sugita，Y．Deguchi，Y．Shida and維持に関与している可能性」を考えるのである．

K．Hashimoto（1987） Vibrio alginolyticus，

今後は，消化管環境に近い完全嫌気あるいは微好気

a tetrodotoxin-producing bacterium，in条件下でも上記と同様 V. alginolyticus の増殖促進がthe intestines of the ﬁ sh Fugu vermicularis起こるか否かを調べる予定である．また，今回培地にvermicularis．Marine Biol．
，94，625-630 ．

添加したのはフグ粗毒であるため，この増殖促進がフN o g u c h i，T．，J．K．J e o n，O．A r a k a w a ，H．

グ粗毒以外の物質に起因する可能性も否定できない．

Sugita，Y．Deguchi，Y．Shida and K．

そこで早急に，無毒のクサフグから同様の方法で得Hashimoto（1986） Occurrence of tetrodotoxin

た抽出物を添加し V. alginolyticus の培養実験を行な

and anhydrotetrodotoxin in Vibrio sp．isolatedいたい．

from the intestines of a xanthid crab，Atergatis

謝辞floridus．J．Biochem．
，99，311-314 ．
Saito，T．，T．Kohama，K．Ui and S．Watabe（2006）

本論文作成に当たり，クサフグの写真を快く提供

Distribution of tetrodotoxin in the xanthid crab

してくださった元東海大学海洋学部助教授岸本浩和先（Atergatis floridus）collected in the coastal waters（生，時には徹夜に及ぶ実験を共に行なってくれた本学of Kanagawa and Wakayama Prefectures．CBP．
，

海洋生物学科斎藤研究室卒研生の川合敏夫君，またクPart D1，158-162 ．

サフグ採集に協力してくれた同研究室各位に心から感謝する．

Saito，T．，T．Noguchi，T．Harada，O．Murataand K．Hashimoto（1985） Tetrodotoxin as a文

献

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