博 士 （ 理 学 ） 田 中 剛 範

学位論文題名Computer‑aided molecular modelingandsequenceanalysesofrepe
at‑containingpr
oteins（ 繰 り 返 し ア ミ ノ 酸 配 列 を 持 つ 蛋 白 質 に 対す る，コンピュー夕技術を用いた分子構造モデリングおよび配列解析）

学位論文内容の要旨

く序冫
近年の遺伝子工 学的技術や装置の発展によ り、11万を超える数の蛋白質 のアミノ酸配列がこれまでに決定されているが、その配列中に、単一のアミノ′酸から数十残基のオリゴペプチドを一単位とし、それが連続して繰り返す配列（タンデムリピート）を含む蛋白質が多く存在していることが知られている。これらのタンデム リピート領域は、その構造的・進化的意味についてはもちろん、基礎医学的な観点からも注目されている が、これまでにこの種の領域を網羅的に扱った研究はほとんど行なわれていなかった。その理由として、タンデムリピート領域に関するしっかりとした定義、情報の収集および整理がなされていなかった事、また タンデムリピート領域の原子レベルでの立体構造決定はあまり進んでおらず、研究の基礎にできる構造情報がほとんど無かった事などが挙げられる。
本研究ではこの 非常に特徴的な配列領域に 注目し、コンピュータ技術を 積極的に利用して大量の情報を高速 かつ網羅的に検索・処理する ことで、その構造的および進化的な意味を明らかにすることを目的 と し て 、 代 表 的 な 以 下 の 2種 類 の 繰 り 返 し 配 列 に つ い て 種 々 の 解 析 を 行 な っ た 。
くp260Kの立体構造予測とCa2゛結合能カの測定＞
p260lfは 、カ エル 嗅 上皮 細胞質より 単離された217残基からなる Ca2゛結合蛋白質である。p260Kのアミノ酸配列は、 その前半部分と後半部分が 非常に高い相同性を示し、さらに各々がSl00蛋白質とよく類似している。
Sl00蛋白質はその配歹IJ中に、EFハンドとして知られるへりックスーループ―ヘリックスの超二次構造を 持 っ た Ca2゛ 結 合 モ チ ー フ を 2つ (N末 端 側 に 位 置 す る Sl00に 特有 なp8eudo EFハン ドと 、 C末端側に 位 置す る典 型的 な EFハ ンド ）含 んで い る。 p260Kの 前半 およ び後 半 部の 配列とSl00蛋白質 の配列とのアラインメン卜の結果、p260lfが2つのSlOO‑hkeドメインと、それらのドメイン間をっなぐりンカーからな る 事が 示さ れた 。 各ド メイ ンの N末 端側 に位 置 する配列領域は Sl00蛋白質のpseudo EFハン ドとよく 類 似し てい たが 、 C末端 側のEFハン ド領域には典型的なEFハン ドモチーフと比較して、Ca2+結合ループの部分に4残基ずつの挿入が見られた。
我々はこのアラインメント結果と、apo‑Sl00ロ二量体の溶液構造を元にしてホモロジーモデリングを実行し 、 p260lfの 立体 構 造モ デルを構築 した。得られたp260lf一分子 の予測構造は、この蛋白質 がSl0Oロニ量体と著しく類似したフオールディングを十分にとり得ることを明らかに示した。二つのSlOO‑likeドメインを結ぶりンカーループの構造および配置はドメイン本体の立体構造に全く障害を与えずに存在していた。また各SlOO‑likeドメインのC末端側 に位置するEFハンド領域は、 4残基の挿入にも関わらず、通常より長いCa2゛結合ループをもってヘリックス―ループーヘリックスの超二次構造を完全に保っており、構造 的な矛 盾は見られなかった。よって 我々はこれを新規なパター ンのEFハンドであると提案し た。
実際のp260lf溶 液に対するCa2十‑titlationの結果から、p260lfは一分子あたり4個のCa2゛を結合し、円偏 光 二色 性(CD)及 び 螢光 スベクトル の測定結果は、そのCa2゛の 結合と同時に大きな立体構造 変化― 241―が起きていることを示 した。
以上の結果から我々 は、p260lfがSl00蛋白質フ ァミリーの新たな一員であり 、またp260lfが持つ新規なパターンのEFハン ドもCa2゛を結合する能カが あると結論づけた。
くロイシン‐リッチ・リピート蛋白質ファミリーの配列解析と分子進化＞
ロイシン‐リッチ‐リピート(LRR)
は、ロイシン残基を豊富に含んだ20〜30残基が一単位として繰り返されるタンデムリピートであり、パクテリアからヒトに至るまでの多くの生物種で、100種類以上の蛋白質中に見いだされて いる。しかし、一般に同一 の蛋白質内ではLRRの繰り返 し単位同士が比較的よく類似しているが、異な る蛋白質問ではその繰り返 し単位の長さや保存性の高い残基の種類などが著しく異なるため、これまでLRR蛋白質の分子進化の解析はほとんど進展していなかった。
タン デム リピ ー ト配 列は 一般 に、 そ の元 とな るモチ ーフ配列が不等交差などの 遺伝子重複（geneduplication)によって、そのりピート数を増加させることで生成されていったと考えられている。我々は、個 々の 蛋 白質 のLRR領 域が 祖先 のLRR単 位か ら どの よう な進 化過 程 を経 て形 成さ れて い った のか を明 らか にす る為 、 LRRの 各 繰り返し単位をそれぞれ独立 に扱い、分子進化の系統樹 を作成するためのプ ログ ラム パッ ケ ージ であ るMOLPHYを 用い て、 それら 単位配列問の相関関係を総 合的・系統的に評価した。
この解析手 法を適用した結果、small proteoglycanファミリーの蛋 白質は、基本的に異なった2種類の LRR単 位 配列 Sと Tが(STT)のよ うに 3つ 一組 と なっ て高 次の りピ ー ト単 位を形成 している事が示された。またSlit蛋白質の場合は、(XABCABC)のように、より複雑な二 次・三次のhigh‑orderなりピートが存在し、そ の上数カ所でLRR単位でのdeletionが起きていることが 示された。これらの結果を基にして 構築された、各フんミリ 一内におけるLRR領域の分子 進化モデルは、LRRのりピー ト数増加の過程が不規則・無秩序に起きているのではない事を強く示唆するものであった。
くまとめ＞
コンピュータの大 量・高速な情報処理能カを利 用して、実験的に明らかにすることが困難な蛋白質分子の立体構造のモデ ルを提案し、また、繰り返し 配列領域の進化過程に関するモデルを構築した。一方で、これらは全てがコンピュータの能カによるものではなく、その出カを人間が生物学的・物理学的知識を以 って デ ータ を解 析し 、 また コン ピュ ータ に フイードバッ クすることなしには成しえな かった。
配列情報・立体構 造情報の増加に伴い、本分野 におけるコンピュータの有用性はますます高くなる事は明白である。そこ にどれだけ専門の研究者の持 つ生物学的・物理学的知見を積極的に取りこめるかが重要であることを、 本研究では示すことが出来た と考える。

― 242―

学位論文審査の要旨
主査

教授

新田 勝 利副査

教授

山岸 晧 彦

副査

助教 授

渡邉信久

副査

助教 授

出村副査

教授

誠松島 範 男 （札 幌医科 大学保健 医療学部 ）学 位 論文 題 名Computer‑aided molecular modelingand sequence analyses of repeat‑containlngproteinS（ 繰 り 返 し ア ミ ノ 酸 配列 を 持つ 蛋白 質に 対す る ，
コ ンピ ュ ー夕 技 術を 用いた分 子構造モデ リングおよ び配列解析 ）本研 究は以下 の2っの部 分からなる 。
p260lfの立 体構造予 測とCa2゛結 合能カの測 定

p260lfは、カ エル嗅上 皮細胞質より単 離された 217残基から なるCa2゛結合 蛋白質である。p260lfのアミノ酸配列は、
そ の 前半 部 分と 後 半 部分が非 常に高い 相同性を示 し、さら に各々が Sl00蛋白質とよく 類似して いる。p260lfの 前半および 後半部の配列とSl00蛋白質の配列とのアライン メントの 結果、p260lfが 2っのSlOO‑likeドメインと、それらのドメイン間をつなぐ りンカー からなる 事が示され た。各ド メインの N末端側に 位置する 配列領域はSl00蛋 白 質の pseudo EFハ ン ドと よ く類 似 し てい た が、 C末 端 側 のEFハ ンド 領 域には 典型的な EFハンドモ チーフと比 較して、 Ca2゛結合ループの部分に4残基ずつの挿入 が見られ た。実際 のp260lf溶液に対 する実験結果から、p260lfは一分子あたり4個の Ca2←を結合 し、そのCa2゛の結合と同時に大きな立体構造変化が起きていることを 示した。
以上 の結果か ら申請者 は、p260lfがSl00蛋白 質ファミリーの新たな一員であり、またp260lfが 持つ新規 なパ夕一 ンのEFハンド もCa2゛を結 合する能 カがある と結論づけた
ロイ シン‐リ ッチーリ ピート蛋白 質ファミ リーの配列解析と分子進化 口イシン‐
リ ッ チー リ ピー ト (LRR)は 、 ロイ シ ン残 基 を 豊富 に含 んだ20〜30残 基が一単 位とレて 繰り返さ れるタン デムリピー トであり 、バクテリアからヒトに至るまでの多くの生 物種で、 100種類以上 の蛋白質中 に見いだ されてい る。申請 者は個々 の蛋白質

の LRR領 域 が 祖 先 の LRR単 位 か ら どの よ う な 進化 過程 を経て 形成 され たの かを 明ら かに する為 、LRRの 各繰 り返 レ単位をそれぞれ独立に扱い、分子進化の系統樹を作 成 す る た め の プ 口 グ ラ ム パ ッ ケー ジ で あ るMOLPHYを用い て、 それ ら単 位配 列間の相関関係を総合的・系統的に評価レた。
この解析手法を適用した結果、small proteo
glyc
anファミリーの蛋白質は、基本的に異 な っ た 2種 類 の LRR単 位 配 列 Sと Tが （ STT） の よ うに 3つ 一 組 と な っ て 高 次 のり ピー ト単位 を形 成し てい る事 が示された。またSlit蛋白質の場合は、(XABCABC)の ように、より複雑な二次・三次のhigh‑orderなりピートが存在し、その上数力所で LRR単 位で のdeletionが 起き ていることが示された。これらの結果を基にして構築 さ れ た 、 各 フ ァ ミ リ ー 内 に お ける LRR領域 の分 子進 化モ デル は、 LRRの りピ ー
ト 数増加の過程が不規則・無秩序に起きているのではない事を強く示唆するものであった。
学位論文の公開発表の質疑応答では、申請者は自ら行った実験の結果や過去の論文 の 内 容 を引 用 し 、 豊 富 な 知 識に 基 づ い て 質 問 に明 快 に 回 答 し た 。
以上 のよう に申 請者 は、 EF‑hand型カルシウムタンパク質の新しいメンバーを発見 し、夕ンデムリピート配列についていくっかの重要な知見を示した。審査員一同は これらの成果を高く評価し、申請者が北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格が充分にあるものと認定した。