2021

令和 3 年度

金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

令和 5 年 10 月

金沢医科大学はじめに

令和 3 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では，平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や，
学部，
大学院，総合医学研究所，他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。平成 19 年度からは，看護学部が設置されたことに伴い，医学領域と看護学領域に分けて募集しています。また，奨励研究にスタートアップの枠を設けるなど研究の多様化にも対応しており，
令和 2 年度にはライフイベントにより研究活動を中断した研究者への支援として，リスタートの枠を新設いたしました。
令和 3 年度は，医学領域には 17 件（共同研究 7 件、奨励研究 10 件）の申請があり、9 件（共同研究 4 件、奨励研究 5 件）を採択いたしました。また、看護学領域では、3 件（共同研究 1 件、奨励研究 2 件）の申請のうち、2 件（共同研
究、奨励研究各 1 件）を採択いたしました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後，これらの研究で得られた研究成果を，社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に，本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会，研究推進課並びに関係各位に感謝します。

令和 5 年 10 月
金沢医科大学
学長

宮澤

克人

目

次

はじめに

令和 3 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2021-1. 血液細胞分化モデルの解明と急性骨髄性白血病の新規治療法の開発
小内伸幸
C2021-2.

･･････

5

先進医療の実現を目指した変形性膝関節症の新しい細胞治療法の開発
川原範夫

C2021-4.

1

脂肪幹細胞経鼻自家移植による嗅覚再生医療の基盤研究
志賀英明

C2021-3.

････

･････

8

益岡尚由

･････

11

石井和美

･････

15

･････

18

･････

21

姫田敏樹

･････

24

林

･････

27

慢性疼痛による神経精神機能を司る神経回路の異常の解析と治療標的の探索

[看護学領域]
C2021-5.

モロー反射が起こせる赤ちゃん人形の開発

令和 3 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2021-1.
腸管神経発生における RET トランスシグナル調節の役割
安井良僚
S2021-2.

翼状片における Nrf2 抗酸化経路の役割と新規予防薬の開発
柴田奈央子

S2021-3.

抗 RNA ウイルス自然免疫応答における脱ユビキチン化酵素
USP10 の役割

S2021-4.

シングルセル解析を用いた腎線維化プロセスの解明
義大

S2021-5.

γ-GTP 阻害剤 GGsTop によるアルコール性肝障害の抑制効果と作用機序の解明
久保田龍一

･････

29

･････

31

[看護学領域]
S2021-6.

家事育児タスクに着目した育児支援プログラム開発と効果検証
北濱まさみ

令和 3 年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2021-1～4

看護学領域 C2021-5

１．研究課題名：血液細胞分化モデルの解明と急性骨髄性白血病の新規治療法の開発（研究番号
C2021-1）
２．キーワード：１）単球 (monocyte)２）顆粒球 (granulocyte)３）細胞分化 (cell differentiation)４）造血幹細胞 (hematopoietic stem cell)５）血液前駆細胞 (hematopoietic progenitor cell)
３．研究代表者：小内 伸幸・医学部・教授・免疫学
研究分担者：齋藤 史路・医学部・助教・免疫学
小笠原千絵・医学部・特定助教・免疫学
樗木 俊聡・東京医科歯科大学難治疾患研究所・教授・生体防御学分野
金山 剛士・東京医科歯科大学難治疾患研究所・助教・生体防御学分野
４．研 究 目 的
造血幹細胞は自己複製能と多分化能を持ち，一生に渡って全ての血液細胞を産生し，造血を維持している。
現在広く受け入れられている血液細胞分化モデルは造血幹細胞を頂点とし，その下流に多能性前駆細胞 (multipotent progenitor: MPP) が存在し，この多能性前駆細胞から
共通骨髄 球系前 駆細胞 (common myeloid progenitor: CMP) と共通 リンパ 球系前駆 細胞(common lymphoid progenitor: CLP) が分化してくる二分岐階層性モデルである。このモデル
では骨髄球-赤血球系細胞分化とリンパ球系細胞分化が最初の分岐点であるとしている。しかし，単一細胞を用いた遺伝子発現解析結果や移植実験から多分化能を持つ共通骨髄球系前駆細胞が存在しない可能性が示唆された。この CMP の存在は二分岐階層性モデルの基盤となる前駆細胞であり，同細胞が存在しないとなると正しい分化モデルが何であるか検討する必要がある。
こうした中，
申請者は血液細胞分化の最初の分岐点の指標となる新規細胞表面マー
カーX を同定した。この X は造血幹細胞には発現せずに MPP と CMP に発現し，MPP と CMPが X 陽性と X 陰性に二分されることを見出している。
本研究では，この X+MPP と X-MPP，さらに X+CMP と X-CMP の分化能を検討し，真の血液細胞分化経路解明を目指す。
５．研 究 計 画
本研究では X 陽性，
X 陰性の多能性前駆細胞 (multipotent progenitor: MPP) や X 陽性 CMP，
X 陰性 CMP の in vitro 及び in vivo における多分化能の検討を行う。また純化したこれら血液前駆細胞から RNA を抽出して定量的 PCR によって各血液細胞の分化系譜決定因子の mRNA
発現量を解析する。さらに X 遺伝子の下流に cre を組み込んだ新規細胞運命追跡実験システ
ムを構築し，X＋前駆細胞由来の娘細胞の，また定常状態の造血にどの程度貢献しているか解－ 1 －析を行い，真の血液細胞分化モデルの解明を目的とする。
(1) X+MPP 及び X-MPP の in vitro 及び in vivo における分化能の検討（齋藤，小笠原担当）
マウス骨髄細胞を PE-Cy5 標識された系列 (lineage: Lin) マーカー抗体カクテルと Cy5 マイ
クロビーズを用いて造血幹細胞と血液前駆細胞が濃縮された Lin-細胞分画を粗精製する。その後 c-kit, Sca-1, CD48, CD150, CD135, X 抗体にて染色し，MPP を純化し，in vitro コロニー形
成能実験を行い，in vitro における分化能を検討する。また，CAG-EGFP マウスの骨髄から
EGFP+X+MPP 及び EGFP+X-MPP を純化し，半致死量の放射線を照射した B6・SJL マウスに移植し，in vivo における分化能を検討する。
(2) X+CMP 及び X-CMP の分化能の検討（齋藤，小笠原担当）
マウス骨髄細胞から上記の方法と同様に Lin -細胞分画を粗精製し，CD117, Sca-1, CD34,
FcγRII/III, X 抗体にて染色し，X+CMP と X-CMP を純化し，in vitro コロニー形成能実験及びサイトカインを用いた培養システムを用いて各系列細胞への分化能を検討する。
(3) 定量的 PCR による分化系譜決定因子発現の解析（金山，樗木担当）
純化した X+MPP，X-MPP，X+CMP と X-CMP から RNA を抽出し，逆転写反応を行い，
Sybrgreen を用いた定量的 PCR 方法によって分化系譜決定因子の mRNA 発現量を解析する。
(4) X の発現特性を活かした細胞運命追跡実験による X+前駆細胞の分化能と自然状態における造血への貢献度の検討（小内，齋藤，小笠原担当）
X 遺伝子の exon6 の 3’領域に P2A-cre 遺伝子を挿入した construction を作製する。その後，
crispr-cas9 技術を用いた同 construction を受精卵にマイクロインジェクションによって導入し，
X-cre 遺伝子改変マウスを作製する。このマウスを Rosa26-flox-stop-flox-EYFP レポーターマウ
スと交配し，X-cre/Rosa26-LSL-EYFP マウスを作製する。その後，末梢血を採血し，各系列
細胞中の EYFP 発現をフローサイトメーターによって解析する。
６．研 究 成 果
(1) X+多能性前駆細胞の同定
これまで多能性前駆細胞 (MPP) は赤血球系細胞に分化能が偏った MPP2，骨髄球系細胞に分化能が偏った MPP3，さらにリンパ球系細胞に分化能が偏った MMP4 が同定されていた。
そこで，今回，X を発現する新規前駆細胞を同定するために，造血幹細胞，多能性前駆細胞を含む Lin-Sca-1+c-kit+細胞分画を 14 種類の抗体によって多重染色し，tSNE 解析を行った結果，従来の MPP3 中に新規 X+MPP3 細胞を同定した。
(2) X+MPP 細胞の分化能の検討
新たに同定した X+MPP3 の分化能を検討するために，MPP2，従来の MPP3，X+MPP，X-MPP3，
MPP4 を純化し，in vitro コロニー形成実験を行った。この結果，従来の MPP3 では 25%が混合コロニー，15%が赤血球系コロニー，60%が単球，顆粒球から構成される骨髄球系コロニーを形成した。一方で，X+MPP3 は骨髄球系コロニーのみ形成し，赤血球及び混合コロニーは全く形成しなかった。これとは逆に X-MPP3 は 75%が赤血球系コロニーを形成した。また，
MPP4 は従来の報告と同様に骨髄球系コロニーのみを形成した。このように X を用いること－ 2 －で従来の MPP3 から骨髄球系細胞分化能が分離可能であることが明らかになった。
さらに，これら MPP の in vivo における分化能を検討するため，CAG-EGFP マウスの骨髄から純化した各前駆細胞 1x104 個を致死量の放射線を照射した B6・SJL マウスに移植した。
移植後，各マウスから継時的に末梢血を採血し，FCM 解析によって各系列細胞中の EGFP 陽性率を解析することによって分化能を評価した。X+MPP3 は in vivo において主に顆粒球，単球に分化し，B 細胞への分化能は僅かに示したが，赤血球への分化能は全く示さなかった。
MPP2 と X-MPP3 は主に赤血球へと分化し，骨髄球系細胞と B 細胞への分化能も示した。一方で，MPP4 は骨髄球系細胞と B 細胞への分化能を示した。これらの結果から，X を用いると MPP 中から赤血球系細胞分化能を明確に分離可能であることが明らかになった。
(3) X を発現する共通骨髄球系前駆細胞 (CMP) の分化能の検討
共通骨髄球系前駆細胞 (CMP) を X とマクロファージ刺激因子 (macrophage stimulating
factor: M-CSF) の受容体である CD115 で染色すると X-CD115-，X+CD115-，X+CD115+ CMPの 3 つの亜群に分かれることが明らかになった。そこでこれら３つの亜群のコロニー形成能を検討した。驚くべきことに，X-CD115-CMP は赤血球コロニーのみ，X+CD115-CMP は顆粒
球と単球に，X+CD115+CMP は単球のコロニーのみ形成した。また，樹状細胞への分化能を検討したところ，X+CD115-CMP と X+CD115+CMP は樹状細胞への分化能を示したが，X-CD115-CMP は同細胞の分化能は全く示さなかった。従来，CMP は多能性を有する前駆細胞を含むと考えられていたが，X と CD115 を用いると赤血球系前駆細胞である X-CD115-CMPと骨髄球系前駆細胞である X+CD115-CMP と X+CD115+CMP に分離可能であることが明らかになった。
(4) 分化系譜決定因子の発現解析
これまでの結果から，X を用いると赤血球系細胞分化能と他系列分化能を分離あることが明らかになってきた。そこで X-CD115-，X+CD115-，X+CD115+ CMP の 3 つの亜群から mRNAを抽出し，cDNA を合成して定量的 PCR によって分化系譜決定因子の発現を検討した。この
結果，X-CD115-CMP では赤血球系細胞分化に必須転写因子 GATA1 と GATA2 の発現が強く，
顆粒球/単球分化に必須な転写因子 PU.1，CEBPa，Irf8 の発現が非常に低かった。一方で，
CEBPa，
Irf8 の発現が高く，
X+CD115-CMP と X+CD115+ CMP は X-CD115-CMP とは逆に PU.1，
GATA1 と GATA2 の発現が低かった。特に X+CD115-CMP では顆粒球分化に重要な CEBPa の発現が高く，X+CD115+ CMP では単球と樹状細胞分化に必須な Irf8 の発現が高い結果であった。このように分化系譜決定転写因子発現レベルでも X-CD115-CMP，X+CD115-CMP と
X+CD115+CMP 分化能との相関があった。
(5) X の発現特性を活かした細胞運命追跡実験による X+前駆細胞の分化能の検討
自然状態における X+MPP の由来の娘細胞を検討するため，X-cre/Rosa26-LSL-EYFP マウスを作製した。このマウスの末梢血を生後 5 週目から経時的に採血し，各系列細胞中の EYFP
陽性率をフローサイトメトリーによって解析した。この結果，驚くべきことに単球，顆粒球，樹状細胞，B 細胞の 95%以上が EYFP 陽性となった。また，T 細胞は 77%，NK 細胞は 53%
が EYFP 陽性であった。一方で，赤血球と血小板は EYFP が 0%であった。X+MPP は赤血球

－ 3 －と血小板以外の全ての血液細胞へと分化し，特に単球，顆粒球，樹状細胞，B 細胞はほとん
ど X+MPP から由来することが明らかとなった。
７．研究の考察・反省
近年，CMP を用いたシングルセル RNA-sequencing の結果から，CMP 中には赤血球系細胞と骨髄球系細胞（単球，顆粒球と樹状細胞）へ分化可能な多能性細胞が含まれない可能性が示唆されている。本研究で我々は X と CD115 を用いると CMP が X-CD115-，X+CD115-，
X+CD115+CMP の亜群に分かれることが明らかになった。さらにこれら亜群の分化能を検討した結果，X-CD115-CMP が赤血球系前駆細胞，X+CD115-CMP が顆粒球/単球前駆細胞，
X+CD115+CMP は単球/樹状細胞前駆細胞と CMP が 3 つの異なる前駆細胞から形成されていることが明らかになり，やはり我々の実験結果から，CMP 中には多能性細胞が含まれないことが明確になった。また，我々は CMP の上流に位置する MPP 中に X+MPP を見出した。この X+MPP は優れた骨髄球系細胞への分化能を有し，赤血球系細胞への分化能がほとんどないことが in vitro 及び in vivo における解析結果から明らかになった。また X の発現特性を活かした細胞運命追跡実験結果から，X+MPP は骨髄球系細胞，リンパ球系細胞へとは分化したが，赤血球と巨核球には全く分化しなかった。これらの結果は，X+MPP が骨髄球系細胞とリンパ球系細胞の分化起源であることと，血液細胞分化経路において最初の分岐点が骨髄球系
細胞-リンパ球系細胞と赤血球系細胞であることを示唆し，これまでのドグマを書き換える重要な研究結果である。
また急性骨髄性白血病モデルにおいて X を発現する癌幹細胞を見出している，今後はこの癌幹細胞の幹細胞性を解明していく予定である。
８．研 究 発 表
論文投稿準備中－ 4 －１．研究課題名：脂肪幹細胞経鼻自家移植による嗅覚再生医療の基盤研究（研究番号 C2021-2）
２．キーワード：１）嗅覚障害 (olfactory impairment)２）脂肪由来間葉系幹細胞 (adipose-derived mesenchymal stem cells)３）神経栄養因子 (neurotrophic factor)
４）経鼻投与 (nasally administration)５）嗅上皮 (olfactory epithelium)
３．研究代表者：志賀 英明・医学部・准教授・耳鼻咽喉科学
研究分担者：三輪 高喜・医学部・教授・耳鼻咽喉科学
石垣

靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

八田稔久・医学部・教授・解剖学 I硎

澄仁・総合医学研究所・講師・先端医療研究領域

瀧淳一・金沢大学・医薬保健研究域・医学系・核医学・協力研究員

４．研 究 目 的
嗅覚障害の原因疾患として感冒（上気道炎）の頻度が高く（日本鼻科学会編. 嗅覚障害診
療ガイドライン 2017），新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) においても嗅覚障害が発症することが明らかとされている (Lechien et al. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2020)。嗅覚障害患者の増加に伴い火災の察知の遅れによる重大事故が多発する危険性が危惧されるが，感冒後嗅覚障害の治療法は確立していない。以上より嗅覚障害の画期的治療法の開発が早急に望まれている。嗅細胞の分化成熟や軸索伸長には，神経栄養因子が不可欠であるが，神経栄養因子
製剤の長期投与はがん化リスクもあり実用化されていない。一方，脂肪幹細胞は多種の神経栄養因子を分泌することで知られる (Sadat et al. BBRC 2007)。脂肪幹細胞の自家移植療法における重要な懸念の一つは，経静脈投与では肺塞栓症のリスクと神経栄養因子の分泌量に個人差があると予想されることである。そこで本研究では，嗅覚障害治療における脂肪幹細胞
経鼻自家移植療法の実現可能性を明らかとするため，脂肪幹細胞の嗅上皮障害マウスへの経鼻移植実験による前臨床研究を行うことを目的とした。
５．研 究 計 画
メチマゾール投与嗅上皮障害マウスにおいて，GFP トランスジェニックマウス大腿脂肪由来幹細胞（GFP マウス脂肪幹細胞，Cyagen Biosciences, CA, USA）の生理食塩水懸濁液を経鼻投与後の酪酸臭に対する忌避行動観察（嗅覚忌避行動観察）と嗅上皮再生状態の免疫組織化
学染色による組織学的解析を行った。また ELISA 解析による神経栄養因子（NGF：神経成長因子，BDNF：脳由来神経栄養因子，IGF-1：インスリン様成長因子-1 および IL-15/IL-15 レセ
プター複合体）の濃度を GFP マウス脂肪幹細胞上清と細胞調整液 ADSC-1 とで比較した。細
胞調整液では basic-FGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）濃度も ELISA で解析した。さらにメ－ 5 －チマゾール投与嗅上皮障害マウスに対する健常ボランティア脂肪幹細胞経鼻投与による嗅覚
忌避行動観察を行った。また健常ボランティア脂肪幹細胞上清における NGF 濃度を ELISAで解析した。
上記の実験全般について研究分担者の三輪と石垣の指導のもと，研究責任者の志賀などが行った。免疫組織化学染色は総合医学研究所のサポートを受けた。実験方法について研究分担者の八田，硎および瀧に助言を受けた。
６．研 究 成 果
GFP マウス脂肪幹細胞の経鼻投与 24 時間後ではマウス鼻腔内に GFP 発現細胞の集団を認めたが，嗅上皮には GFP 発現細胞は認めなかった。幹細胞経鼻投与３日後にはマウス鼻腔内の GFP 発現細胞は消失していた。幹細胞経鼻投与 14 日後で生食点鼻群と比較して GFP マウ
ス脂肪幹細胞投与群では嗅覚忌避行動の回復促進と嗅上皮における成熟嗅細胞の増加が認められた。さらには経鼻投与 24 時間後の嗅上皮において NGF の発現を脂肪幹細胞投与群の嗅上皮で認めた。一方で BDNF の発現増加は認めなかった。GFP マウス脂肪幹細胞経鼻投与 24
時間後のマウス鼻腔における GFP 陽性細胞の周囲に NGF 発現を認めた。
GFP マウス脂肪幹細胞上清の ELISA 解析では NGF の発現を認めたほか，BDNF 発現もわずかに認めた。IGF-1 および IL-15/IL-15 レセプター複合体の発現は細胞上清には認めず，細胞調整液には解析対象の 4 因子すべての発現を認めなかった。また細胞調整液には高濃度のbasic-FGF 発現を認めた。
4 名分の健常ボランティア脂肪幹細胞をそれぞれメチマゾール投与嗅上皮障害マウスに経鼻投与して嗅覚忌避行動を観察したところ，1 名の健常ボランティア脂肪幹細胞が嗅覚再生効果をもたらしたのに対し，1 名が軽度改善効果を認め 2 名が生食群と同様のレベルであった。また上記４名分の健常ボランティア脂肪幹細胞に 2 名分を追加し，6 名分の健常ボラン
ティア脂肪幹細胞上清における NGF 濃度を ELISA で解析したところ，コントロールの細胞調整液 ADSC-1 と比較し 4 倍から６倍程度の NGF 濃度の増加を認めたが，GFP マウス脂肪幹細胞上清における NGF 濃度に比べて全体に低濃度であった。
GFP マウス脂肪幹細胞または健常ボランティア脂肪幹細胞の経鼻投与後から還流固定・解剖までの期間で呼吸不全に至ったマウスは認めなかった。
７．研究の考察・反省
以上より嗅上皮傷害モデルマウスにおいて脂肪幹細胞の経鼻移植による嗅上皮再生と嗅覚
忌避行動の回復促進作用が明らかとなった。また，嗅上皮再生機序として脂肪幹細胞から分泌される神経栄養因子の関与が示唆された。さらには経鼻移植後 3 日以内に移植幹細胞が消失することが明らかとなり，移植細胞が長期に残存する可能性は低いと考えられた。本研究の結果から脂肪幹細胞の経鼻移植により肺塞栓症のリスクを回避できると考えられた。
細胞調整液の ADSC-1 にはウシ胎児血清が含有しており，過去の論文で局所投与による嗅上皮再生促進作用が示されている basic-FGF が高濃度で発現していたため，脂肪幹細胞上清－ 6 －投与実験は今回行わなかった。脂肪幹細胞投与の際には十分に細胞を洗浄後に生理食塩水に懸濁してマウスへ経鼻投与したので，細胞調整液自体の影響の可能性は低いと考えられる。
さらに脂肪幹細胞から分泌された NGF が嗅上皮再生に関わっている可能性が示され，これまで嗅細胞の分化成熟に NGF が関与しているとの過去の知見があらためて確認された意
義は大きいと考える。一方で健常ボランティア脂肪幹細胞が分泌する NGF はマウス脂肪幹細胞と比較して少なく, 脂肪幹細胞経鼻自家移植による嗅覚障害治療の臨床研究における個人差の可能性も嗅上皮障害モデルマウスによる嗅覚忌避行動実験などから示唆された。上記の問題を解決するため脂肪幹細胞の調整段階で何らかの工夫をすることにより NGF 分泌能を高める必要性がある。今後は新たな脂肪幹細胞調整方法により臨床応用の実現性を高めていきたい。
以上より，本研究で示された脂肪幹細胞経鼻移植の安全性と有効性を基礎に，数年以内には欧州で嗅覚障害の標準的治療となっている嗅覚刺激療法への上乗せ効果を検証する臨床研究への展開が期待できる結果であった。
本研究結果の一部は以下の学会報告を行ったほか，英文論文を発表した。
国際学会（一般演題）：① Tomoko Ishikura, Hideaki Shiga, Yuka Nakamura, Takako Kanitani, Yasuhito Ishigaki, Takaki Miwa:
Treatment with nasally administered adipose-derived stem cells from GFP transgenic mice inolfactory impaired mice, The 20th Asian Research Symposium in Rhinology, Online, 2021.09.
全国学会（一般演題）：② 石倉友子, 志賀英明, 三輪高喜: マウス脂肪幹細胞経鼻投与による嗅上皮傷害マウスにおける嗅上皮再生, 第 61 回日本鼻科学会総会, 金沢, 2022.10. 若手優秀発表賞受賞③ 石倉友子, 志賀英明, 中村有香, 蟹谷貴子, 石垣靖人, 三輪高喜. 嗅上皮傷害マウスにおける脂肪幹細胞経鼻移植の検討. 耳鼻咽喉科ニューロサイエンス 2022; 35: 52-53.
④ 石倉友子, 志賀英明, 熊井理美, 三輪高喜: 脂肪幹細胞経鼻移植の前臨床試験, 第 59 回日
本鼻科学会総会, 東京, 2020.10. プラチナ賞受賞
８．研 究 発 表
① Tomoko Ishikura, Hideaki Shiga, Yuka Nakamura, Takako Kanitani, Yasuhito Ishigaki, Takaki Miwa.
Olfactory Regeneration with Nasally Administered Murine Adipose-Derived Stem Cells in Olfactory
Epithelium Damaged Mice. Cells 2023; 12: 765.
② 志賀英明, 石倉友子, 三輪高喜. 嗅神経性嗅覚障害診断と嗅覚再生医療の展望. 日本味と匂学会誌 2023; 30: 7-13.
③ 志賀英明, 三輪高喜. オルファクトシンチグラフィから嗅覚再生研究へ. 日本鼻科学会会誌
2023; 62: 222-224.
④ 志賀英明, 三輪高喜. ポストコロナ時代における嗅覚障害の核医学画像診断. 金沢大学十全
医学会雑誌 2022; 131: 95-97.

－ 7 －１．研究課題名：先進医療の実現を目指した変形性膝関節症の新しい細胞治療法の開発（研究番号 C2021-3）
２．キーワード：１）変形性膝関節症 (knee osteoarthritis, Knee OA)２）Lipogems３）脂肪由来幹細胞 (adipose derived stem cell)
４）MFAT (micro-fragmented adipose tissue)５）滑液 (synovial fluid)
３．研究代表者：川原 範夫・医学部・教授・整形外科学
研究分担者：平田 寛明・医学部・助教・整形外科学
山田 壮亮・医学部・教授・臨床病理学
中村有香・総合医学研究所・助手・生命科学研究領域

大澤敏・金沢工業大学・バイオ・化学部・教授

山本直樹・藤田医科大学・治験・臨床研究支援センター・特任教授

４．研 究 目 的
変形性膝関節症（Knee OA）は日本において自覚のある患者数は 1000 万人，潜在的な患者数は 3000 万人とされ，非常に頻度が高く高齢化に伴って増加しつつある疾患である。保険で認められた治療には薬物による保存療法と手術療法などがあるが，近年保険では認められていない自由診療で幹細胞の移植による治療が普及しつつある。
中でも培養された脂肪由来幹細胞 (ADSC) の関節腔内への投与は様々な手法が開発されてきたが，時間がかかる，あるいは費用が比較的高額等の問題点が指摘されてきた。
一方，Lipogems キットを用いて破砕した脂肪組織である MFAT (Micro-Fragmented Adipose
Tissue) の投与は簡便かつ安価で OA 患者の負担も少ないが，欧米に比べて我が国では未だにほとんど普及していない。 患者の自己負担を軽減するためには MFAT 投与法の保険収載が望ましいが，そのために必要な先進医療制度下での臨床研究が未だ実施されていない。
そこで，Lipogems よる MFAT 投与法を保険収載化することで，その恩恵を広く多数の患者さんに及ぼすことを目的として，臨床および基礎的な研究を実施する。まず，Lipogems による MFAT 投与法の有効性を既存治療法の治療成績と比較することで有効性を実証する。
さらに試験管内で比較を行うことにより培養 ADSC に対する MFAT の優位性を検証し，より有効な治療法の開発を目指す。
５．研 究 計 画
（1）Kellgren Lawrence 分類 gradeⅡ 10 例，Ⅲ 10 例に対して，3 ヶ月から半年間の有効性について，保険収載されている標準的な治療であるヒアルロン酸関節内注射と比較することにより検証する。ヒアルロン酸関節内注射は，Kellgren Lawrence 分類の Grade，症例数を合致さ－ 8 －せ，標準的加療計画である 5 週間連続投与を行う。その後の関節内注射は症状の経過を診ながら適宜追加していく。
3 ヶ月から半年の経過観察で治療の有効性を VAS，KOOS の改善度を用いて評価し，Lipogems
により用意された MFAT による治療により得られた改善度などのデータと比較検討を行う。
Lipogems 法に関しては同じグレードの OA 患者各 10 例の合計 20 例で検証を行う。
（2）先進医療申請準備を進める。
（3）MFAT 由来脂肪由来幹細胞の滑液耐性：投与される MFAT および培養 ADSC は関節腔内に投与されて治療効果を発揮するが，投与時に接するのは関節腔内の滑液である。現在までに関節腔内に投与された細胞や組織に対して滑液が与える影響はほとんど研究されていない。
しかし，投与後の細胞が狙い通りの治療効果を発揮するためには滑液の影響を検討する必要がある。このため，投与される MFAT や ADSC に滑液が与える影響を分子レベルで解析し投与方法の改良を目指す。滑液サンプルについては，既に臨床研究支援室のフリーザー室担当者の支援を受けて収集・バンク化を進めていく。
６．研 究 成 果
（1）今年度は 4 例において Lipogems による MFAT 投与法による治療を実施してきた。これまでの安全性試験を含めた治療成績は概ね良好であり，目立った副反応などは認められていな
い。また，投与用の脂肪組織から幹細胞を分離し性格づけを実施しており，今後は予後との相関が見られる因子を，特に細胞から分泌される因子に着目してスクリーニングしていきた
いと考えている。
（2）培養 ADSC に関する知見が集積していることから，新規な培養方法の開発に重点を移した
先進医療の申請についても検討を行った。
（3）患者由来滑液バンクの構築を進めてきた。現在も収集を継続して行っている。基礎研究か
ら産学連携まで幅広い応用を検討あるいは実施中である。
（4）Knee OA の ADSC を用いた細胞治療において，実臨床の治療プロトコールでは ADSC は生
理食塩水に懸濁してから膝関節内に投与される。生理食塩水に懸濁した ADSC は，Knee OA
由来の滑液に暴露されることで ADSC の生細胞率が有意に向上した。また，生細胞率向上のメカニズムを探索するために ADSC の滑液暴露時における網羅的遺伝子発現変動を DNA マ
イクロアレイにより解析したところ，細胞増殖・生存に関与する多数の遺伝子発現量が変動していることが明らかとなった。
その中で，癌幹細胞において細胞生存や増殖に関与する FOSL1 に着目した。遺伝子発現解析の結果を裏付けるために滑液を暴露した ADSC の FOSL1 の発現上昇を RT-PCR およびウエス
タンブロットにより確認したところ，DNA マイクロアレイと同様の結果が得られた。また
ADSC における滑液暴露による細胞生存率上昇に FOSL1 が寄与を証明するために，siRNA により ADSC の FOSL1 をノックダウンしたところ，滑液による細胞生存率が有意に低下した。
これらの実験結果は，滑液の添加は ADSC 中の FOSL1 遺伝子の発現を上昇させることで，細胞の生存率を上昇させていることが明らかとなった。今後は FOSL1 による細胞増殖制御機－ 9 －構を明らかにして，臨床応用への検討を進めていきたいと考えている。
７．研究の考察・反省（1）研究計画に記載された実験計画を実施し，実験系の整備を行ってきた。
（2）今年度で得られた研究成果を基に先進医療の申請につなげるが，研究に必要な経費を試算したところ，かなり高額になることが推定されたため，今後の予算獲得について情報収集を進めていく予定である。
（3）Knee OA の滑液は ADSC における FOSL1 の発現を上昇させ，関節腔内における細胞生存に寄与していた。自家培養 ADSC による Knee OA の治療において FOSL1 を標的とすること
は，関節腔内での細胞生存率の向上を目的とした細胞製剤の開発に繋がることが期待される。
（4）先進医療の実現を目指した Knee OA の新しい細胞治療法の開発においては，関節腔内でのADSC の生存可能性を評価することは必須である。したがって，滑液の影響を評価する実験
系は細胞治療の開発には不可欠である。今回の研究成果により In vitro での評価系を確立することができた。
８．研 究 発 表
① Atsushi Fuku, Yasuhiko Taki, Yuka Nakamura, Hironori Kitajima, Takashi Takaki, Terutsugu Koya,
Ikuhiro Tanida, Kaori Nozaki, Hiroshi Sunami, Hiroaki Hirata, Yoshiyuki Tachi, Togen Masauji,
Naoki Yamamoto, Yasuhito Ishigaki, Shigetaka Shimodaira, Yusuke Shimizu, Toru Ichiseki, Ayumi
Kaneuji, Satoshi Osawa, Norio Kawahara. Evaluation of the Usefulness of Human Adipose-Derived
Stem Cell Spheroids Formed Using SphereRing® and the Lethal Damage Sensitivity to Synovial Fluid
In Vitro. Cells 2022; 11: 337.
② Hironori Kitajima, Takuya Sakamoto, Tetsuhiro Horie, Ayane Kuwano, Atsushi Fuku, Yasuhiko Taki,
Yuka Nakamura, Ikuhiro Tanida, Hiroshi Sunami, Hiroaki Hirata, Yoshiyuki Tachi, Naoki Yamamoto,Yasuo Iida, Yasuhito Ishigaki, Sohsuke Yamada, Shigetaka Shimodaira, Yusuke Shimizu, Toru
Ichiseki, Ayumi Kaneuji, Satoshi Osawa, Norio Kawahara. Synovial Fluid Derived from Human Knee
Osteoarthritis Increases the Viability of Human Adipose-Derived Stem Cells through Upregulation of
FOSL1. Cells 2023; 12: 330.

－ 10 －

１．研究課題名：慢性疼痛による神経精神機能を司る神経回路の異常の解析と治療標的の探索（研究番号 C2021-4）
２．キーワード：１）慢性疼痛 (chronic pain)２）ドライアイ (dry eye)３）うつ (depression)４）前帯状皮質 (anterior cingulate cortex)
５）神経回路 (neural circuit)
３．研究代表者：益岡 尚由・医学部・教授・薬理学研究分担者：冨永 貴志・徳島文理大学・神経科学研究所・教授
４．研 究 目 的
慢性疼痛は，しばしば不安やうつ等の神経精神機能に異常をきたすことが知られている。
しかしながら，その発生機序の理解は進んでおらず，病態の脳内神経メカニズムを解明してその予防ならびに治療法を早期に確立させることが望まれている。本研究では，研究代表者が確立したドライアイ誘発慢性疼痛モデルマウスを用いて，慢性疼痛によりどのように気分・情動に関連する脳部位の神経回路が変化しているかについて，膜電位感受性色素を使った光計測により明らかにする。さらに，神経回路レベルで明らかにした異常に，どのような分子メカニズムが隠れているのかを，薬理学的，分子生物学的，免疫組織学的，電気生理学的ツールを用いて明らかにする。本研究を通して，慢性疼痛により引き起こされる神経精神機能の異常の病態を明らかにして，その予防ならびに治療に資する標的分子の探索を進め，最終的に末梢の感覚情報と気分・情動を繋ぐ中枢神経系の情報処理システムの理解に繋げる。
５．研 究 計 画
本研究は，はじめに研究代表者がすでに確立しているマウスのドライアイ誘発慢性疼痛モデルを用いて，気分・情動がどのように変化してるか行動学的解析を行う（担当：益岡）。その後，気分・情動を支える脳部位においてどのような神経回路の興奮異常（興奮性抑制性ニューロン不均衡）が起きているかを，光計測で明らかにする（担当：冨永）。また，見出された神経回路の興奮異常を引き起こす分子メカニズムを薬理学的，免疫組織化学的，電気生理学的，分子生物学的技術を用いて明らかにする（担当：益岡）。
６．研 究 成 果
はじめに，ドライアイ誘発慢性疼痛モデルマウスにおける精神機能を評価するため，モデル動物を作製してオープンフィールド試験，強制水泳試験ならびにスクロース嗜好試験を実施した。モデル動物には，角膜障害の程度が小さい眼窩外涙腺摘出マウスと重度の障害を伴う眼窩内外涙腺摘出マウスを用いた。その結果，いずれのマウスでも，強制水泳試験におけ－ 11 －

る無動時間の延長（抑うつ行動），スクロース嗜好性の減少（抑うつ行動），オープンフィー
ルド試験における中央部滞在時間の減少（不安行動）が観察された（図１）。しかし，不安・
抑うつ行動が観察されるタイミングは，角膜障害が軽度な眼窩外涙腺摘出マウスでは 12 週から，重度の障害を伴う眼窩内外涙腺摘出マウスでは 6 週からであり，角膜障害の程度が大きいほど行動変化が早く現れた。

図１ 涙腺摘出によるマウスの行動変化
軽度なドライアイ症状を示す眼窩外涙腺摘出マウスでは 12 週目から，重度の症状を示す眼窩内外涙腺摘出マウスでは 6 週目から，強制水泳試験における無動時間の延長（上段），スクロース嗜好性の減少（中段）およびオープンフィールド試験における中央部滞在時間の減少（下段）が観察された。*P < 0.05

次に，モデル動物で不安・抑うつ行動が示されるタイミングで，偽手術ならびに涙腺摘出マウスより脳を取り出して，活動電位の伝播パターンの違いを解析した。具体的には，マウスから前帯状皮質または海馬を含むようにスライス標本を作製して膜電位感受性色素を導入した後，前帯状皮質１，前帯状皮質２，大脳皮質運動野の第Ⅱ/Ⅲ層または海馬 CA1 野の放線状層を電気刺激した。その結果，海馬では偽手術群と涙腺摘出群の間で違いはみられなか
ったが，前帯状皮質１もしくは２の刺激では涙腺摘出群で活動電位の伝播範囲や脱分極の持続時間が抑制された（図２）。
また運動野の刺激では，両群間で伝播範囲に違いはなかったが，脱分極持続時間は短縮していた。また，これらの違いは，10 µM Gabazine（GABAA アンタゴニスト）存在下でも消失しなかった。

－ 12 －

図２ 各脳部位を電気刺激した際の膜電位の伝播パターンの比較
上段：前帯状皮質１を電気刺激すると，偽手術マウスでは活動電位は大脳皮質を側方（運動野）ならび腹側方向（前帯状皮質２）に伝播する。しかしながら，ドライアイモデルマウス
ではこの伝播が強く低下した。また，脱分極の程度が小さくなり，持続時間も短縮した。中段：運動野の場合は，両マウスで伝播範囲に大きな違いはなかったが，モデルマウスで脱分
極持続時間の減少が生じた。下段：海馬の放線状層と遠位樹状突起層において，偽手術群とモデルマウス群の間で電位変化に違いはなかった。

７．研究の考察・反省
本研究より，ドライアイ誘発慢性疼痛モデルにおいても不安・抑うつ関連行動が誘発されることを明らかにすることができた。また，不安・抑うつ関連行動は，ドライアイ症状の重症度に依存して発症のタイミングが早まることを示すこともできた。
精神機能に異常を示す眼窩外涙腺摘出 12 週目もしくは眼窩内外涙腺摘出 6 週目のマウスのスライス標本において，情動や認知に重要な役割を果たす前帯状皮質の興奮性や興奮伝播が顕著に低下することを見出した。特に前帯状皮質内や隣接する運動野への情報の伝播が抑制されており，大脳皮質内での情報処理に異常が生じていることが予想された。抑うつでは，自発運動量の減少が認められるが，このような神経回路異常が関連しているものと考えられる。さらに，高濃度の GABAA アンタゴニスト存在下で両者の伝播の違いは消失しなかった－ 13 －

ことから，伝播異常の原因は抑制性ニューロンの入力増加に伴う神経回路の抑制ではなく，興奮性ニューロンによる伝導・伝達に異常があることが予想された。一方で，同じく情動と関連する脳領域の海馬には異常が見られないことも分かった。
次年度は，伝播異常が認められた脳領域について詳細な形態学的解析を進めていく予定である。
８．研 究 発 表
① Takayoshi Masuoka. Pain regulation by peripheral glutamate and its abnormalities. 金沢医科大学雑誌 2022; 47: 1-6.
② Katsuya Nakano, Hitomi Nakazawa, Qiang He, Junsuke Uwada, Takeshi Kiyoi, Takaharu Ishibashi,
Takayoshi Masuoka. Voluntary wheel-running activities ameliorate depressive-like behaviors inmouse dry eye models. Frontiers in Behavioral Neuroscience 2022; 16: 925128.

－ 14 －

１．研究課題名：モロー反射が起こせる赤ちゃん人形の開発（研究番号 C2021-5）
２．キーワード：１）看護技術教育 (nursing skills education)２）モロー反射 (morrow reflection)３）新生児 (newborn baby)４）看護教育 (nursing education)５）母性看護学 (maternal nursing)
３．研究代表者：石井 和美・看護学部・講師・基礎看護学（2023 年 6 月 30 日時点）
研究分担者：北濱まさみ・看護学部・准教授・母性看護学・助産学
河合 宏之・金沢工業大学・工学部ロボティクス学科・教授
４．研 究 目 的
リアリティを追及したモロー反射が起こせる赤ちゃん人形の開発を目的とし，製作したモ
ロー反射が起こせる赤ちゃん人形の抱っこを学生に体験してもらい，体験時の反応や感想や気づきを明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
モロー反射とは，新生児の原始反射であり，生後 2，3 か月頃までみられる上肢の進展後，抱き着くようにして屈曲する動きのことをいい（奈良間ら 2020），音や光，感触など，外部からのさまざまな刺激によって生じる。新生児への看護技術において，しばしば経験する反射であり，急な動きへの対応が求められる。抱っこから降ろされる感覚もモロー反射を引き起こす原因となっているが，現在の新生児モデル人形（以下，赤ちゃん人形）では，モロー
反射など児の動きに対応しながら学生が練習することはできないため，よりリアリティのある演習方法の考案を検討していた。そこで，ロボット製作にかかわる工学系の教員，学生と共同し，モロー反射が起こせる赤ちゃん人形の作成を開始した。
対象は，本学看護学部 3 年生の調査同意が得られた 18 名で，試作品人形の抱っこおよびモロー反射を体験後に気づきや感想を質問した。質問内容は，1．人形を抱っこした感想，2．
モロー反射が起こった時にどう感じたか，3．人形の改良点，4．自由記載とした。分析は複数の教員で行い，質問項目について，学生の気づきや感想内容をコード化し，類似性と相違性を検討したうえでカテゴリ分類した。
本研究は研究者の所属施設倫理委員会の承認を得て実施し，対象者には，口頭・書面での説明を行った。拒否や途中辞退による不利益がないよう配慮した。

－ 15 －

【試作品の人形について】

NPKDOLL 製：リボーンベビードール
身長 46 cm／体重 1.75 kg（非防水）
モロー反射を起こすための装置として腕にバネを，胴体に巻き取り機構とモーターを搭載し，Arduino（マイコンボード）を用いてモロー反射を再現した。背中側に配線をまとめ，抱っこが可能となるようにした。
配線の先に反射を引き起こすスイッチを設置し，学生が抱っこをしている際に，教員がスイッチを持ち，タイミングを見て反射を起こさせる。なお，反射前の人形の姿勢は反射と同様にスイッチを押すことで腕を曲げた状態にしておくことが必要である。

６．研 究 成 果
人形を抱っこした学生の反応は，人形の「軽さ」や「硬さ」などの機械感を感じていたが，モロー反射が起こった時は，人形の動きに対する驚きや感動の記載がみられた。しかし，モーター音の大きさや動きのぎこちなさなどに対して指摘があり，改良点として人形の見た目や質感に関するもの，モロー反射の機能面に関するものが挙げられた。自由記載では，製作への期待や激励が記載されていた。
1．学生が人形を抱っこした感想については，「軽い」31％，「機械感」25％，「硬い」16％，「かわいい」16％，「リアリティを感じる」6％，「その他」が 6％であった。2．人形が動いた
時，（モロー反射が起こったとき）にどう感じたかは，【人形が動いたことへの驚き，嬉しさ，
喜び】，【機械感，ロボット感と動きに対する違和感】，【音が大きく気になる】，【モロー反射に対する疑問】がカテゴリとして生成された。それをふまえて，3．改良点については，「静
音性」，
「重さ」
「動きのなめらかさ」「柔らかさ」や「声に反応する」「動く，泣く」
，
「コード
レス化」，
「防水機能」が挙げられた。4．自由記載では，「人形が完成するとよりリアルな演習が行えると思う」，「モロー反射が起こる人形があることで，母性実習前の人形での抱っこの練習や母親の抱っこの練習に役立つのではないかと感じた」，「モロー反射を見たことがな
い学生からしても赤ちゃんがどんな動きをするかのイメージがつきやすく実習に役立つと思った」，「実際に技術の練習で使うことが出来たらより技術の向上に繋がると思った」など【演
習での技術の向上に対する期待】や「すごい」「これからもっと改良されていくのが楽しみ」，「改良を重ねて，実際に人形としてできたらすごい役立つと思う」など【製作に対する期待】が聞かれた。また，「顔が可愛かった」，「名前があること，性別がちゃんとあることは愛着がわいてよいと思った」，「手を自由に触れたらいけないとのことでどう抱いていいのか戸惑った」という意見もあり，【人形の見た目や名前の重要性】に着目する学生もみられた。

－ 16 －

７．研究の考察・反省【考察】
1．学生の反応について人形が動くことに対して，驚きや嬉しさ，喜びを感じており，実際の練習で使うことで技術向上に繋がることを期待していた。
2．人形の評価と改良点について
機械音や重さ，動きの滑らかさなどの人形のリアリティを求める声が多かった。特に，今回の対象学生が 3 年次の母性看護学臨地実習において実際に新生児とも関わった経験がある学生であり，実際の新生児とは異なる点をより具体的に指摘できたのではないかと考える。これらにより機能面において具体的な改良点が明らかとなり，人形の重さや質感などのリアリティも追求していく必要があることが分かった。
【反省・今後の課題】
調査は，本来の計画通りには進まず当初の予定より遅れた。その理由として，調査実施予定の 2021 年 8 月に県内おいて緊急事態宣言が発令されたことが挙げられる。これにより，学外者の立ち入りが困難となり，調査時期を遅らせることとなった。しかし，9 月以降も状況が改善しなかったため，調査実施は 11 月となった。また，調査実施においては学外者と学生との対面は感染リスクが大きいため，共同研究者は zoom での参加となったが，最終的には本年度の研究計画を遂行できた。さらに，本研究後に試作品 3 号が完成しており，今後の調査計画をさらに進めてよりリアリティのある赤ちゃん人形の製作を目指したい。
８．研 究 発 表
現在，日本看護学教育学会誌に論文を投稿中である。

－ 17 －

令和 3 年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2021-1～5

看護学領域 S2021-6

１．研究課題名：腸管神経発生における RET トランスシグナル調節の役割（研究番号 S2021-1）
２．キーワード：１）ENCCs (enteric neural crest-derived cells)２）Ret シグナル (Ret signaling pathway)
３）腸管神経系 (enteric nervous system)
３．研究者氏名：安井 良僚・医学部・講師・小児外科学
４．研 究 目 的
Ret は受容体型チロシンキナーゼで，脊椎動物の神経細胞の運動，生存，分化の制御において重要な役割を果たす。Ret は 4 種類のリガンドとそれぞれに対応した 4 つの共受容体と複合体を形成し，下流にシグナルを伝達する。我々はこの Ret の共受容体として働く GFRA
ファミリーとリガンドの組み合わせが，マウス腸管発生のステージで大きく変化すること，
中でも腸管神経の Ret が間葉系細胞の GFRA1 と trans 複合体を形成し，腸管神経前駆細胞の遊走を促進することを発見した。本課題は，その共受容体とリガンドの変化が Ret シグナルと腸管神経発生にどのような影響を与えるのか，そのシグナルの変化と生理的意義を明らかにすることを目的とする。
５．研 究 計 画５.1

腸管発生期における，Ret とその共受容体 GFRA1，GFRA2 の局在と発現量の変化の確認
Ret シグナルは複数の共受容体と複合体を形成することが知られる。そこで腸管神経発生のステージで，どの組み合わせの複合体が形成されるのか，免疫蛍光抗体染色と定量 PCR を使い調べた
５.2 Ret と GFRA1 の trans 複合体が ENCCs 遊走に与える影響の観察
５.1 の研究成果から Ret を発現する ENCCs 周辺の組織に GFRA1 が発現していることが確認された。ENCCs 以外に発現する GFRA1 が ENCCs の遊走に影響を与えるか，GFRA1 発現，未発現の NIH3T3 細胞を作製し，ENCCs との共培養下における ENCC 遊走への影響を調べた。
５.3 Ret と GFRA1 の trans 複合体が Ret シグナルに与える影響を解析
Ret と GFRA1 を発現する NIH3T3 細胞，NIH3T3RetGFRA1，Ret を発現する NIH3T3 細胞，
NIH3T3Ret，GFRA1 を発現する NIH3T3 細胞，NIH3T3GFRA1 を作製し，Ret とその共受容体
GFRA1 の cis シグナルと trans シグナルの入力の違いを，ウエスタンブロットを用いて解析した。
６．研 究 成 果
我々は定量 PCR を使い Ret のリガンド GDNF と NRTN，共受容体の GFRA1 と GFRA2 の発現をマウス腸管の E10.5 から E15.5 にかけて定量した。その結果 E13.5 を境に GDNF-GFRA1から NRTN-GFRA2 へ Ret シグナルがスイッチしていることが明らかになった。さらにその－ 18 －

局在を調べたところ，E11.5-12.5 にかけて Ret は神経細胞に発現しているものの GFRA1 は周辺の間質細胞に多く発現していること，E15.5 では神経細胞特異的な発現に変化していることが分かった（図 1）。さらにこのスイッチングは，細胞密度依存的に GDNF と NRTN，EDN3のバランスが調節していることを明らかにした。Ret の共受容体 GFRA1 が Ret の発現していない間質細胞で発現している意義を明らかにするために腸管神経前駆細胞と GFRA1 発現および未発現の NIH3T3 細胞を用意し，共培養系における腸管神経前駆細胞の遊走能を調べた。
その結果 GFRA1 発現 NIH3T3 細胞との共培養系で腸管神経前駆細胞の遊走能が亢進することが分かった（図 2）。Ret 下流のシグナルを調べたところ，GFRA1 発現 NIH3T3 細胞との共培養系では Ret タンパク質の安定性，ERK リン酸化の持続時間が亢進していた（図 3）。以上の結果から，trans-Ret シグナルは GDNF による Ret の分解を抑制しそのシグナルを増強する
ことで神経前駆細胞の遊走能を亢進させていることが示唆された。

E11.5

E12.5

E15.5

GFRA1

GFRA2

NIH3T3

NIH3T3

NIH3T3GFRA1a

NIH3T3GFRA1a

NIH3T3GFRA1b

NIH3T3GFRA1b

700000The Area of Neurosphere spreading （AU)GDNF containing
Control medium
medium

図1 The localization of GFRA1 and GFRA2 during intestinal development

6000005000004000003000002000001000000NIH

A1acontrol

A1b

NIH

A1a

A1b

GDNF

図2 RET-GFRA1b trans signaling promotes migration of ENCCs in a GDNFdependent manner－ 19 －

120

0

5

120

0

RET9+GFRA1a0

GFRA1a
5 120

GFRA1b0
5 120

RET9+GFRA1a’

5

NIH
5 120

RET9+GFRA1a0

GFRA1b

RET51+GFRA1a’

RET51+GFRA1aGFRA1a

RET51+GFRA1a

NIH
0 5 120NIH

GDNF stim.
(min)
RET
pY

GFRA1

GFRA1

Tubulin

図3 RET-GFRA1b trans signaling extends the duration of Ret tyrosine phosphorylation

７．研究の考察・反省
GDNF によるシグナル伝達は，Ret 受容体チロシンキナーゼとともに GFRαとの受容体複合体によって媒介される。しかし，神経系全体，特に前脳では Ret よりも GFRα受容体の方が広く発現している。実際，上記と同様に，発生期の腸管では GFRA1 が ENCC よりも広く発現していることが観察された。Ret 非存在下での GFRαシグナル伝達の生理的機能は，2つ提唱されている。一つは，Ret を発現していない細胞では，GFRA 分子は実際には何もしていないという仮説である。その考えを支持するいくつかの証拠が発表された（榎本ら，2004年）。もう 1 つの仮説は，GFRαは Ret とは無関係に，おそらく NCAM と協力してシグナルを発しているのではないかというものである。今回の我々の結果は，これら 2 つの仮説とは異なり，Ret の cis シグナルを増強するという結果を示した。このような報告は他になく本研
究は新たな仮説を提唱する結果に至った。Ret シグナルは腸管神経だけでなく，腎機能，中枢神経などでも重要な働きを持つことから，この研究成果は腸管神経発生だけでなく広く神経生理における Ret シグナル調節の新たな仕組みを提唱することにつながることが期待される。
８．研 究 発 表
該当なし

－ 20 －

１．研究課題名：翼状片における Nrf2 抗酸化経路の役割と新規予防薬の開発（研究番号 S20212）
２．キーワード：１）翼状片 (pterygium)２）酸化ストレス (oxidative stress)
３）Nrf2 シグナル経路 (Nrf2 signaling pathway)
３．研究者氏名：柴田奈央子・医学部・学内講師・眼科学（採択時）
４．研 究 目 的
翼状片は，原因にはストレスや，結膜への刺激，炎症反応，ウィルス感染などの関与が報告されている。翼状片の成長は，不正乱視，角膜瘢痕，眼球運動制限，慢性的な眼表面の炎症を引き起こす。翼状片の病態は，角膜輪部幹細胞異常，角膜の基底膜と細胞外基質の変性や上皮間葉系移行 (EMT) の異常，血管新生，線維血管性組織の造成を特徴とする。
現在のところ，翼状片は外科的切除が唯一の治療法であるが，再発例や進行例では切除後も角膜混濁や不正乱視が残存する症例もある。Nuclear factor- (erythroid-derived 2-) like 2(Nrf2)シグナル経路は，多くの生体の調節因子であり，抗酸化，抗炎症，抗線維化反応において重要な役割を果たすことが報告されている。Nrf2 は転写因子として，第Ⅱ相解毒酵素
や Peroxiredoxin6 (Prdx6)，Catalase (Cat) などの抗酸化タンパクの発現を誘導し，抗酸化能を増強させる。この Nrf2 制御系の機能不全が，白内障をはじめとする種々の眼疾患に関与しているとされている。眼表面組織でも紫外線 (UV) などの外的刺激により Nrf2 シグナル経路の不活化による抗酸化能の減弱を生じることが，翼状片の病態に関与している可能性がある。本研究では翼状片発症における Nrf2 シグナル経路の関与を明らかにし，その活性化薬による翼状片治療または予防の可能性を明らかにすることである。
５．研 究 計 画
1) ヒト翼状片組織における Nrf2 経路の活性化と誘導される抗酸化タンパクの発現を解析する。
ヒト翼状片手術時に切除された結膜翼状片組織と，コントロールとして結膜弛緩手術時に切除された結膜組織を，患者の同意を得て採取する。翼状片頭部，体部および結膜弛緩
による結膜より RIPA buffer にてタンパク抽出し，Nrf2-ARE 抗酸化経路により誘導される抗酸化酵素 Prdx6, Cat のタンパク発現をウェスタンブロット法により解析する。
2）Nrf2 活性化薬 (DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine (SFN-NAC) ) の酸化ストレスに対するHuman corneal epithelial cells (HCEC) の保護効果を解析する。
i) SF-NAC の UV-B 照射により誘導される HCEC 細胞障害の保護効果
HCEC に，UVB (0-100mJ/cm2) 照射による酸化ストレスを負荷し，培養液に SFN-NAC(0-20μM) をそれぞれ添加する。酸化ストレスにより生じる ROS レベルの測定を H2DCFADA アッセイで，細胞生存率の低下を MTS アッセイで測定する。

－ 21 －

ii) HCEC における SFN-NAC による Nrf2 経路の活性化の確認
HCEC に対し，培養液に SFN-NAC (0-20μM) をそれぞれ添加する。HCEC よりタンパクを抽出（核分画と細胞質分画）し，Prdx6, Cat のタンパク発現をウェスタンブロット法により解析する。Nrf2 の転写活性を TransAM® Nrf2 転写活性/定量 (DNA-binding ELISA for
activated Nrf2 transcription factor) で測定する。
６．研 究 成 果1) ヒト翼状片組織における抗酸化タンパク Prdx6 と Cat mRNA 発現
ヒト翼状片頭部 (H) と体部 (B) 組織においては，コントロールの結膜組織 (C) と比較して，
Nrf2-ARE 抗酸化経路により誘導される抗酸化遺伝子である Prdx6 と Cat のタンパク発現量が減少していた（図 1; p<0.01, C ver H, C ver B, Turkey）。
2）Nrf2 活性化薬 (DLSulforaphane N-acetyl-Lcysteine (SFN-NAC) ) の酸化ストレスに対するHuman corneal epithelial
cells (HCEC) の保護効果
i) SFN-NAC の UVB 照射により誘導される HCEC 細
胞障害の保護効果
HCEC に，UVB (0100mJ/cm2) 照射し，培養液に SFN-NAC (0-30μM) をそれぞれ添加すると，UVB により上昇す
る ROS レベルが抑制され（図なし），細胞生存率の低下も有意に抑制された（図 2）。
ii) HCEC における SFN-NAC の Nrf2経路の活性化HCEC に対し，培養液に SFNNAC (0-20μM) を添加すると，投与 後 6 ， 24 時 間 後 に Prdx6 （ 図3A），Catalase（図 3B）のタンパ
ク発現が SFN-NAC の濃度依存性に上昇した（図 3）。さらに SFNNAC (0-20μM) 投与により，HCEC のタンパクの核分画では非投与群 (0) と比較して，Nrf2
転写活性が有意に上昇した（図 4）。

－ 22 －

７．研究の考察・反省
翼状片は，UV の暴露や酸化ストレスが発症に関与しているが，強いまたは慢性的・持続的酸化ストレスにより，Prdx6 や Cat といった内因性の抗酸化酵素の発現が抑制されている
ことが明らかになった。つまり，翼状片組織では，外因性の酸化ストレスなどの刺激により内因性の抗酸化防御機構が低下し，翼状片発症を誘導・促進させている可能性が示唆された。また角膜上皮細胞 (HCEC) では，Nrf2 活性化薬である SFN-NAC を投与すると UVB
ストレスによる細胞死や ROS 産生が抑制されており，SFN-NAC は翼状片における UVB 暴
露による細胞障害からの保護効果を示すことが示唆された。さらに，HCEC において，
SFN-NAC の投与は内因性抗酸化タンパクである Prdx6 や Cat を誘導しており，Nrf2 の転写活性の上昇も確認できた。つまり SFN-NAC は，Nrf2 の転写活性を上昇させ，Prdx6 や Cat発現を誘導していることが示唆された。よって，SFN-NAC は角膜をはじめとする眼表面のUVB ストレスの直接的保護効果だけではなく，内因性抗酸化防御機構を高め細胞保護効果を示すことが明らかとなり，翼状片をはじめとする酸化ストレスや UV ストレスが関連する眼疾患の予防薬になりうる可能性がある。反省点としては，当初の実験計画に遅れが生じたことである。今後 Nrf2 発現抑制させた HCEC をもちいて，細胞保護効果が減弱するかどうか確認する予定である。
８．研 究 発 表なし

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１．研究課題名：抗 RNA ウイルス自然免疫応答における脱ユビキチン化酵素 USP10 の役割（研究番号 S2021-3）
２．キーワード：１）サフォールドウイルス (Saffold virus, SAFV)
２）脱ユビキチン化酵素 USP10 (ubiquitin specific peptidase 10, USP10)
３）自然免疫応答 (innate immune responses)
４）ストレス顆粒 (stress granules, SG)５）インターフェロン (interferon, IFN)
３．研究者氏名：姫田 敏樹・医学部・准教授・微生物学
４．研 究 目 的
Saffold ウイルス (SAFV) は，主に小児の胃腸炎や上気道炎などから検出されるピコルナウ
イルス科（プラス鎖一本鎖 RNA）のウイルスである。ピコルナウイルス感染は細胞内において様々な感染応答を引き起こすが，その詳細は不明な点が多い。脱ユビキチン化酵素
USP10 は，ストレス顆粒 (Stress Granules: SG) 形成をはじめ，オートファジー，DNA 修復など，細胞のストレス応答や自然免疫応答の様々な局面で機能する，細胞の恒常性維持におけるマスター分子と考えられている。報告者らはこれまでに，USP10 が SAFV の培養細胞での増殖を抑制することを見出した。
そこで本研究では，SAFV の感染制御に関わる宿主因子として脱ユビキチン化酵素 USP10に注目し，RNA ウイルス感染に対する自然免疫応答において USP10 がどのように機能しているのか，特に SG やアグリソームの形成，および IFN 応答に着目し，その分子的機序を明らかにすることを目的とする。
５．研 究 計 画
1) ストレス顆粒応答の解析
SAFV 高感受性細胞 HeLa-N を素材とし，USP10 ノックダウン (KD) HeLa-N 細胞を作製し，加えて，KD 細胞に USP10 を過剰発現させた細胞を作製した。ウイルスは SAFV-3 に加え，Leader 蛋白に変異を導入したウイルス SAFV-Lcys をストレス顆粒形成を阻害しない変異体として用いた。各細胞にこれらのウイルスを 5 pfu/cell で感染させ，感染 9 時間後におけるストレス顆粒の動態を抗 G3BP1 抗体を用いた免疫細胞染色により検出した。
2) IFN 応答の解析
HeLa-N 細胞を材料として，USP10 KD 細胞，USP10 の G3BP1 / PABP 結合部位を含む N
末領域を欠損させた USP10-delN 発現細胞，USP10 の脱ユビキチン化活性を欠如させた
USP10-C418A 発現細胞を作出した。これらの細胞に対する SAFV の感染効率を，CPE 出現を指標にして比較した。また，USP10 KD 細胞における SAFV 感染時の IFN 応答ならびにIRF-3 の細胞内局在について解析した。

－ 24 －

６．研 究 成 果1) ストレス顆粒応答の解析結果
SAFV 感染では，ごく一部の細胞にストレス顆粒がみられたのに対し，SAFV-Lcys 感染では，ストレス顆粒陽性細胞が顕著に増加した。この結果は，これまでの報告から予想された通り SAFV 感染によりストレス顆粒形成が誘導され，それを Leader が抑制していることを示すものであった。また，CPE 観察からは USP10 が SAFV 増殖を抑制することが確認されたが，ストレス顆粒の染色パターンは，USP10 KD HeLa-N 細胞，および，USP10 過剰発
現 HeLa-N 細胞のいずれにおいても変化はなく，ウイルス感染後ストレス顆粒形成へのUSP10 の関与は認められなかった。
以上より，USP10 による SAFV の増殖抑制は，ストレス顆粒形成を介したものではない
ことが示唆された。USP10 は多機能蛋白であり，サイトカイン応答など他の感染応答にも関与していると考えられることから，次は，IFN 応答への関与に注目して引き続き SAFV 増
殖抑制における USP10 の役割を解析した。
2) IFN 応答の解析結果
USP10 KD 細胞において SAFV 感受性が亢進することが再確認された。USP10 KD 細胞
における USP10 変異体によるレスキュー実験では，USP10-delN は SAFV 感受性亢進を抑制しなかったが，USP10-C418A は SAFV 感受性亢進を一部抑制した。これらのことから，
USP10 は SAFV 感染に抑制的に機能し，それには G3BP1 結合部位を含む N 末領域が重要であることが示唆された。そこで，USP10 結合蛋白である G3BP1 をノックダウンしたと
ころ SAFV 感受性は著しく亢進し，USP10 の SAFV 増殖に対する抑制作用は G3BP1 を介していることが示唆された。しかし，USP10 KD 細胞における SAFV 感染後のストレス顆
粒形成に変化は認められないことから，USP10-G3BP1 複合体の関与は SG 形成とは異なる機序であることが示唆された。また，脱ユビキチン化活性は不可欠ではないが，ウイルス増
殖抑制の効率化に関与していることが示唆された。これらのことから，ウイルス感染に対する IFN 応答について調べた結果，USP10 は SAFV 感染後の IFN 発現誘導を増強させることが示された。そこで次に，IFN 発現の制御因子である IRF-3 の細胞内局在を解析したとこ
ろ，USP10 KD 細胞では IRF-3 の核内移行がみられないことが明らかとなった。
以上より，USP10 の持つウイルス感染に対する抑制能は，G3BP1 や IRF-3 に依存する
IFN 応答の抑制であることが示唆された。
７．研究の考察・反省
USP10 の SAFV 増殖抑制作用には G3BP1 結合部位を含む N 末領域が重要であり，
USP10-G3BP1 複合体を介した反応がその主役であることが強く示唆された。しかし，USP10
KD 細胞における SAFV 感染後の SG 形成に変化は認められないことから，USP10-G3BP1複合体を介した SAFV 増殖抑制作用は SG 形成とは異なる機序であることが示唆された。
他方，USP10 KD 細胞では，ウイルス感染時の IRF-3 核内移行が低下しており，USP10 の－ 25 －

脱 Ub 化活性も関与する可能性が考えられた。G3BP1 は，RIG-I/dsRNA に結合して活性化させ IFN 誘導を顕著に亢進させることが報告されており，USP10 はこの IFN による感染応
答を亢進させている可能性が強く示唆された。
本研究では，ウイルス感染時の SG 形成を介した感染応答に USP10 が関与する可能性に新規性を見出し注目していたが，それには否定的な結果となった。一方，ウイルス感染に対する IFN 応答過程に USP10 が関与する可能性が示されたが，この点については新規性が少ないと判断された。したがって，本研究の継続は行わないこととなった。
研究過程で必要性を強く感じたのが，ウイルスの感染や増殖，細胞間伝播等を容易に確認するための，感染のマーカーとなる蛍光タンパク質を発現する組換えウイルスである。本研
究以外でも常にその必要性が感じられていた。そこで，同研究室の大桑孝子氏と共同で，蛍光タンパク UnaG 発現組換え SAFV を作出し，その高い有用性を確認したため、この UnaG
発現組換え SAFV について報告した。
８．研 究 発 表
Takako Okuwa*, Toshiki Himeda*, Koichi Utani, Masaya Higuchi. Generation of a recombinant
Saffold Virus expressing UnaG as a marker for the visualization of viral infection. Virology Journal
2023; 20: 175. *equally contributed.

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１．研究課題名：シングルセル解析を用いた腎線維化プロセスの解明（研究番号 S2021-4）
２．キーワード：１）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)
２）シングルセル解析 (single-cell analysis)
３）腎線維化 (renal fibrosis)
３．研究者氏名：林義大・医学部・助教・糖尿病・内分泌内科学（2022 年 9 月 30 日時点）

４．研 究 目 的
糖尿病腎症は，慢性腎臓病の主たる原因疾患である。腎臓の線維化は慢性腎臓病の進行過程において共通の機序であり，細胞外基質の産生に重要な役割を果たすと考えられている筋
線維芽細胞の由来に関してはこれまで複数の報告があるもののいまだに議論が繰り広げられている。この理由として腎臓は血管内皮・尿細管上皮を始めとして多くの細胞から構成されていることが挙げられる。実際に我々は糖尿病腎において内皮細胞-間葉細胞分化 (EndMT)および上皮細胞-間葉系細胞分化 (EMT) が腎線維化に重要な役割を演じていることを報告しているが，その詳細なメカニズムは未だに不明なことも多い。シングルセル解析は腎臓の様に多数の細胞腫が存在する臓器において，細胞同士がどの様に相互作用を及ぼし環境に反応するかに関して，組織を細胞レベルで理解することを可能にする技術である。腎線維化を来しやすい 2 型糖尿病ラットおよびマウスを用いて，複数の腎線維化ステージでのシングル
セル解析を行い，線維化におけるシグナルを同定する。
５．研 究 計 画
① C57BLKSdb/db の腎にてシングルセル解析を行い，糖尿病状態の腎構成細胞で誘導されるシグナルおよび表現系の違いを生じる原因を同定する。通常食をコントロール (db/m) および 2型糖尿病 (db/db) マウスに与え，8 週齢，16 週齢，24 週齢で屠殺。gentleMACS Dissociators
を用いて腎から単細胞懸濁液を調製，セルカウンターを使用し細胞の viability を確認する。
Chromium コントローラーを用いてシングルセルレベルで遺伝子発現解析を行い，筋線維芽細胞活性化の中心となる細胞シグナル変異を同定する。
② CD-1db/db マウスは C57BLKSdb/db マウスと比較し 24 週齢で強い腎線維化を認める 2 型糖尿病
モデルマウスである。CD-1db/db の腎にてにシングルセル解析を行い，糖尿病状態の腎構成細胞で誘導されるシグナルおよび表現系の違いを生じる原因を同定する。通常食をコント
ロール (db/m) および 2 型糖尿病 (db/db) マウスに与え，8 週齢，16 週齢，24 週齢で屠殺。
①と同様にシングルセル解析を行い，細胞シグナル変異を同定する。
６．研 究 成 果
現在，単細胞懸濁液の調整を行っており，すべての週齢の単細胞懸濁液を調製後にシング
ルセル解析を行う予定としている。

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７．研究の考察・反省
昨年 10 月に島根大学医学部へと勤務地を変更し，同学にて学外研究を行っている。シング
ルセル解析に必要な機器を導入予定であったが，納期の遅れに伴い 2023 年 4 月となったため島根大学にて本課題を進められない状況であった。研究環境が整ったため，本課題の研究を再開する予定である。
８．研 究 発 表なし

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１．研究課題名：γ-GTP 阻害剤 GGsTop によるアルコール性肝障害の抑制効果と作用機序の解明（研究番号 S2021-5）
２．キーワード：１）アルコール性肝障害 (alcoholic liver disease)２）脂肪肝 (hepatic steatosis)３）γ-GTP４）GGsTop５）酸化ストレス (oxidative stress)
３．研究者氏名：久保田龍一・医学部・助教・肝胆膵内科学
４．研 究 目 的アルコール性肝障害は，長期にわたる大量飲酒によって肝臓に障害が起きる病気であるが，病態が脂肪肝や肝炎の段階では正常な肝臓へ治癒可能であるため病態進展を防ぐことが重要である。γ-グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTP) 阻害剤 GGsTop は，既存の同阻害剤ア
シビシンよりも特異性と阻害活性が高く，抗酸化剤として化粧品に使用されている極めて安全性の高い薬剤である。これまで申請者は，GGsTop をラット肝虚血再灌流障害モデルに投与することで肝臓中のグルタチオン量が維持され，酸化ストレスが低下し，肝障害が抑制されることを見出してきた。そこで本研究では，GGsTop を脂肪肝まで進展させた慢性アルコー
ル飼育ラットモデルに投与することで肝機能障害抑制効果を期待し，さらにグルタチオン(GSH) 量の維持や酸化ストレスの低減等の分子的作用機序を明らかにすることを目的とする。この研究によってヒトのアルコール性肝障害治療薬への応用が期待できる。
５．研 究 計 画
ラットを Lieber らの方法 (Lieber et al., J Clin Invest 1965) に準じてアルコール含有液体飼料で 4 週間飼育することで病態が脂肪肝まで進展する。この飼育法を用いて，アルコール含
有液体飼料のみと抗酸化剤 GGsTop を同時投与した群に分ける。各群から回収した血清の肝障害マーカー値，肝臓の病理組織学的状態やグルタチオン量を比較することで，GGsTop によるアルコール性脂肪肝の抑制効果を評価する。
以下に具体的な方法を記す。
動物実験：ラット慢性アルコール障害モデルは，6 週齢の雄ラットに 5%アルコール含有液体
飼料（AL 群）で 4 週間飼育することで作製し，コントロール群は同カロリーでアルコール
非含有液体飼料（C 群）にて 4 週間飼育する。その際，GGsTop を 1 日に 1 回 1mg/kg 腹腔内投与する群とコントロールとして生理食塩水を腹腔内投与する群に分け，4 週目に解剖して肝臓及び血清を回収する。
血清マーカーの測定：ラットの血清サンプルを用いて，AST，ALT，尿酸，及びトリグリセ
リド (TG) の値を測定する。

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病理組織解析：ラット肝臓を 10%ホルマリン固定した後，パラフィン包埋し，組織切片を作製する。ヘマトキシリン＆エオシン染色で病理組織学的に炎症の程度を評価する。
肝臓内 GSH の定量：ラット肝臓を 5％スルホサリチル酸溶液中でホモジナイズし，遠心した上清を用いて GSH 定量キット (DOJINDO) で比色定量法にて行う。
γ-GTP 活性の測定：ラット肝臓のライセートを用いてγ-GTP 活性測定キット (Bio Vision)
で比色定量法にて行う。
MDA 量の測定：ラット肝臓のライセートを用いて酸化ストレスマーカーである MDA 量を
MDA assay キット (DOJINDO) で比色定量法にて行う。
６．研 究 成 果
生理食塩水腹腔内投与群では，血清 AST，ALT，尿酸，TG 値は，C 群に比べ AL 群で ASTを除き有意に高値を示し，このことから AL による肝障害発生が示唆された。C 群では，
GGsTop の投与の有無で血清尿酸値のみ有意に低下したが，AL 群では，GGsTop の投与の有無で血清 AST 及び尿酸値が有意に低下した。肝組織中のγ-GTP 活性は，C 群に比べ AL 群
で有意に高値を示し，GGsTop の投与により AL および C 群のいずれにおいても有意に低下した。肝 GSH 量に関しては，C 群に比べ AL 群で有意に低下したが，GGsTop の投与によりC 群，AL 群いずれにおいても大きな変化はみられなかった。一方，肝の MDA 量は GGsTopの投与により，C 群では変化はみられなかったが，AL 群では有意に低下した。
７．研究の考察・反省
慢性飲酒によって生じる血清 AST 値，尿酸値の上昇および肝の酸化ストレスの発生は，
GGsTop 投与により抑制できる可能性が示唆された。GSH (γ-Glu-Cys-Gly) は細胞外でγ-GTP
によってγ-グルタミル結合が切断され Glu と Cys-Gly に加水分解される。Cys-Gly の SH は反応性の高いチオールであり，これが O2·− を発生させることで H2O2 などの活性酸素種を生じさせ，結果的に脂質過酸化等の酸化ストレス障害を引き起こすと考えられている。本研究では，GGsTop 投与によるγ-GTP 活性阻害を介し，Cys-Gly による肝細胞での酸化ストレス発生を抑制することにより，アルコール性肝障害を抑制できる可能性が示唆された。
８．研 究 発 表なし

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１．研究課題名：家事育児タスクに着目した育児支援プログラム開発と効果検証（研究番号
S2021-6）
２．キーワード：１）家事育児タスク (housework childcare tasks)
２）妊産婦支援 (support for pregnant women)
３）子育て支援 (child care support)
４）産後ケア (postpartum care)
５）民間サポート (private support)
３．研究者氏名：北濱まさみ・看護学部・准教授・母性看護学・助産学
４．研 究 目 的
研究目的は，母親の産後の時期による家事育児タスクの変化と育児不安に対応できる育児支援プログラムを開発し，その効果を検証することである。
５．研 究 計 画
調査対象者は，病院の産婦人科外来，健診で保健センターに訪れる母親 200 名に質問紙による調査を行う。調査内容は，step1 では，産後 1 ヵ月および 6 ヵ月時点での家事育児の主たる担当者，民間サポート利用の有無とその割合を知ることとした。Step2 では，母親に集中している家事育児項目に対応できる支援サービスの提供を含めた育児支援プログラムの開発を行うこととする。
６．研 究 成 果
少子高齢化により「赤ちゃんを見るのは自分の子供が初めて」という母親が増えている。
また，子育て世代の祖父母においても，まだ就業していたり，祖父母の親の介護や高齢化などで従来の里帰りの状況とは異なっている。ワンオペ育児に代表されるように，父親の家事育児への参加は少ないのが現状であり，母親は育児不安やストレスを増強させ，産後うつや虐待といった問題が注目されてきている。
このため，母親と夫・家族が産後のどの時期にどのような家事育児項目があり，誰が担当しているのかを知る必要がある。さらに，公的・民間サービスについての周知と利用頻度も併せてみていくことで，家事育児の分担を分けることにつながると考えた。
今回の研究で研究協力が得られた母親と，夫・家族は 140 人で，産後 1 ヵ月・6 ヵ月時点
での家事育児の主たる担当者を明らかにすることができた（表 1）。家事育児タスク表をもとに主たる実施者を調査した結果，1 ヵ月健診時点での里帰り群においては家族（実母）が多く，里帰りなしでは夫が役割を担っていることが確認できた。6 ヵ月時点では，母親が主たる担当となっている項目がほとんどであった。また，いずれの時期も公的・民間サポートの利用は少ないが，6 ヵ月時点では利用項目がやや増加していることが分かった。

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７．研究の考察・反省
北陸 3 県の核家族世帯は 35％程度を占めている（社会生活基本調査報告，平成 28 年，第1 巻生活時間編，総務省，2017 年）。少子化や高齢・若年妊婦の増加により親性の発達は十分とは言えず，育児経験がない母親が多い。育児における母親の孤立化は育児不安やストレスを増強させており，3～4 ヵ月児をもつ母親の約 2 割が「子育てに自信が持てない」との報告があり（妊産婦への支援に関する研究動向とその課題，尾島万里，法政大学大学院紀要，
82 巻，p99-107，2019-03-31），虐待につながるケースもあるとしている。
母親の主たるサポート者は，夫および家族が主であった。出産育児に関する情報は，全期間を通じ，実母や友人，病院などから得ているものが多く，夫からは，手段的や情緒的サポートを得ていた。里帰りする母親においても，実家家族の就業状況等によっては，日中は新生児と母親の二人になる者も少なくなかった。よって里帰りの有無にかかわらず，母親への産後支援は少ない状況がうかがえた。
当県における女性就業率は全国 2 位（51.8％／15 歳以上人口）と高い（共働き夫婦の家事・育児分担の実態，久保圭子，日本労働研究雑誌，59 巻 1 号，p17-26，2018）。
育児休業取得率は，女性の取得率 86.3％，男性の取得率 0.6％と男女でかなりの差がある（石川県の賃金等労働条件実態調査結果報告書，石川労働局雇用均等室 2014）。
里帰りの有無による母親の家事育児負担の結果は想定内であったが，6 ヵ月後も多くの母
親は育児休暇中であることもあってか家事育児負担割合は大きく，夫や家族のサポートには限界があることが明らかとなった。
今回の調査により，里帰りの有無による家事育児タスクの母親の分担割合については想定内であったが，里帰りなしは，家族同居の有無に関わらず，どの時期でも夫や家族のサポートが多く，公的・民間サポートは受けていないことが示された。
また，エジンバラ産後うつ質問票の結果 9 点以上は，里帰り群で 12 名，里帰りなしで 4名であった。特に里帰り群において多い傾向があり，産後うつや児童虐待を防ぐためには，－ 32 －

家族のみならず公的・民間サポートの有効な活用が必要であることが示唆された。
さらに，夫（父親）の家事育児への参加は，父親の育児休業取得にもつながっていくと考えられ，産後うつや児童虐待を防ぐためには，家族のみならず公的サポートの有効な活用が必要であるが，利用するための情報の提供や具体的なプログラムの可視化が必要であることが示唆された。また，今回の研究では「育児支援プログラム」の完成には至っていないため，継続して調査にあたることとし，step2 として，産後時期毎での母親が望むサポート支援，民間サポートや産後ケア事業への参加促進を活用した育児支援プログラムの開発を行う。
８．研 究 発 表
北濱まさみ，笹川寿之: 家事育児タスクに着目した育児支援プログラム開発 ～step1 調査結果～，第 63 回日本母性衛生学会総会・学術集会，神戸，ポスターセッション（デジタルポスター），2022.09.

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2021 令和 3 年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書編 集発行所

令和 5 年 10 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

禁無断転載