博 士 （ 医 学 ） 高 橋 正 典

学位論文題名Epiregulin asama］ OrautOCrine／ paraCrine
丘迎torreleasedfromtheE
RK＿andp
38MAPK‐acti
vated
VaSCularSm
OOthnluSC
leCe11S（血管平滑筋細胞脱分化因子としてのエピレグリンの同定とその発現およびシグナル解析）

学位論文内容の要旨
I．背景
今日の成人疾患の多くを占 める虚血性心疾患や脳血管疾患は、その基礎疾患として動脈硬化に起因することが知られでいる。この動脈硬化は血管内皮細胞の障害が弓Iき金となるが、さらに続いて中膜平滑筋細胞が分化 型から脱分化型へと形質転換し、増殖・遊走すると共に細胞外基質、増殖因子やサイ卜カインを分泌して最終的に内膜肥厚をきたす。これは、経皮的冠動脈インターベンション後の再狭窄病変の形成においても同様と考えられている。このように血管平滑筋細胞の形貿転換は、血管病変形成の鍵となる重要な現象である。
血管平滑筋細胞の形質転換を誘起する因子（脱分化因子）は現在多数知られており、これら脱分化因子の下流のシグナル伝達系を解析することで形質転換のメカニズムを明らかにしようとする研究が数多くなされている。しかし、これらの研究は血清存在下で増殖・継代した培養血管平滑筋細胞（脱分化型平滑筋細胞 ）を用いているため、分化型平滑筋細胞から脱分化型平滑筋細胞への形覧転換の分子機構を的 確に解析することが不可能であった。そこで、申請者は分化型形質 を維 持可能な血管平滑筋細胞の初代培養系を確立し、これ を用いて形質転換の分子機構の解析を進めた。この過程で、 分化型平滑筋細胞に強制的にERKとp38M
APKを活性化させる・と、ヘパリン非結合性のタンパク質因子を分泌し、周囲の分化型平滑筋細胞を脱分化させることを見出した。この分泌因子による 平滑筋細胞の脱分化は、EGF受容体チロシンキナ―ゼの特異的阻害剤（AG1478）で著明に抑制されるため、EGFファミリ―の増殖因子であることが示唆された。
II．目 的
本研究では、上記の分泌性血管平滑筋細 胞脱分化因子を同定し、この因子による平滑筋細胞脱分化の分子機構を明らかにすること、さらに動脈硬化巣やパル―ン傷害モデルなどのりモデリングを受けた血管組織と正常血管組織におけ るこの因子の発現を比較し、本因子と動脈硬化症の発症・進展の関わりを検討することを目的とした。
II
I.方法
ラット大動脈由来の血管平滑筋細胞をラミニン上で｜GF‑Iの存在下に培養を行う分化型血管平滑筋 細胞の初代培養系を用いて 以下の解析を行った。培養血管平滑筋細胞の形質の評価 は形態 、 収 縮 能 、 お よ ぴ RT‑P
CRによ る平 滑筋 細胞 分子 マ ―カ ―の m
RNAの発 現を 指標 にし た。
MEK1（ERKkinase)
およびMKK6（p38MA
PKkinase）のactiv
eformのトランスフェクションにより両MAPKを強制的に活性化させた血管平滑筋細胞の培養上清をへパリン‐アフイニティーおよび一 26−

HighQカ ラ ム ク ロマ 卜 グ ラフイ ーで分 画し、 各々の 分画の 脱分化 能およ びシグ ナル伝達 系を解 析した。 エピレ グリン の発現 は抗エ ピレグリ ン抗体 およぴRトP
CRにより解析した。さらに、ヒト動脈硬化
巣お よびラ ットの バルー ン傷害 モデルに おける エピレ グリン の発現 を免疫 染色法 により 検討した 。
IV．結果
ERKと p38MAPKを 強 制 的 に 活 性 化 さ せ た 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 培 養 上 清 (CM1） は 著 明 な 平 滑筋 細 胞 脱 分 化 能 を 有 し 、 ERKと p38MAPKの 両 MAPK系 お よ ぴ PKB（ Akt） の 活 性 化 が 認 め ら れた。 CM1をへ パリン ‐アフ イニテ ィーで分 画する と脱分 化活性 は非結 合分画 にのみ 認めら れた。さ らに、 こ の へ パリ ン 非 結 合分 画を HighQカラ ムクロ マ卜グ ラフイー で分画 したと ころ、 0.3MNaCIで溶出 し た 分 画 （ E3） が 脱 分 化 活 性 を 示 した 。 E3によ る 血 管 平滑 筋 細 胞 の脱 分 化 は 、AG1478の 添 加
ま た は ERK阻 害 剤 (PD98059)、 p38MAPK阻 害 剤 （ SB203580)の 両 者 の 添 加 に よ り 抑 制 さ れ た 。
また 、 E3に よ る 両 MAPK系 の活 性 化 も これ ら の 阻 害剤 に よ り 抑制 さ れ た 。こ の ことか ら、E3に 含まれ る 脱 分 化 因 子 は EGF受 容 体 を 介 し て 両 MAPK系 を 活 性 化 さ せ て 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 脱 分 化 を誘起 す る こ とが 示 唆 さ れた 。 HighQカ ラ ム ク ロマ ト グラ フイ― におけ る脱分 化因子 の溶出 パター ン
はEGFフ ァ ミ リー の 増 殖 因子 で あ る エピ レ グ リ ンと 類 似 す るた め 、 CM1およ び E3を抗エ ピレグ リン抗体を用 いて免 疫沈降 法を行 ったと ころ、 エピレ グリン が検出さ れた。 さらに 、抗エピレグリン中和
抗 体 の 添 加 で E3に よ る 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 脱 分 化 は 抑 制 さ れ た 。 以 上 に よ り 、 ERKと p38MAPKの 活 性 化 を 受 け た 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 培 養上 清 に 含 まれ る 脱 分 化誘 導 因 子 はエ ピ レ グ リン で あ ること が 同 定 され た 。 ま た、 分 化 型 血管 平 滑 筋 細胞 を エ ピ レグ リ ン で 刺激 す ると 、ERK、 p38MAPKと共にPKB(Akt)が 活性化 された 。
血 管 平 滑 筋 細 胞 の 脱 分 化 因 子 で あ る 不 飽 和 LPAま た は PDGF‑BBの 刺 激 を 受 け た 分 化 型 血管 平 滑 筋 細 胞 は 、 短 時 間 （ 30分 以 内 ）で エ ピ レ グリ ン mRNAの 発 現を 誘 起 し 、こ の 発 現 は24時 間
以上 持 続 し て見 ら れ た 。ま た 、 こ れら 脱 分 化 因子 で 誘導 される エピレグ リンの 発現は 、PD98059とSB203580の 両 者 を 添 加 す る こ と で 完 全 に抑 制 さ れ たが 、 各 々 単独 で は 完 全に は 抑 制 され な か った。 さ ら に 、ヒ ト 動 脈 硬化 症に おける エピレ グリン の発現 をRトPCRに より検 討した ところ 、動脈 硬化巣 で は エ ピレ グ リ ン が発 現 し て いた の に 対 し正 常 血管 では見 られなか った。 抗iピレ グリン 抗体を用 い た 免 疫組 織 染 色 の結 果 、 動 脈硬 化 の 初 期病 巣 （ 形 質転 換 を 起 ｀こ し た中 膜平滑 筋層） にエピレグリ ンの発 現が認 められ た。また、ラットバル―ン傷害モデルでのエピレグリン発現の検討では、
1日 目 に 血 管 内 腔 に 発 現 し 、 2日 目 に は 中 膜 内 側 で 発 現 し 、 や が て7日 目に 新 生 内 膜に 拡 が っ ていたが、 21日目 には消失 してい た。
v．考察
本 研 究 で ERKお よ び p38MAPKを 強 制 的 に 活 性 化 さ せ た 血 管 平 滑 筋 細 胞 が 分 泌 す る 脱 分 化
因子 が エ ピ レグ リ ン で ある こ と を 同定 し た 。さら に、不飽 和LPAま たはPDGF‑BBの 刺激を 受けた 分化型 血 管 平 滑筋 細 胞 か らも 両 MAPK系 依 存 性に エ ピ レ グリ ン が 生 成・ 分 泌 さ れる 。 こ れ ら培 養系
で の 解 析 結 果 か ら 、 ERKと p38MAPKの 協 調 的 活 性 化 に よ り 脱 分 化 誘 導 を 受 け た 血 管 平 滑 筋 細胞は迅 速にエ ピレグリ ンの発 現・分 泌を誘 起し、分泌されたエピレグリシがさらに自己・傍分泌的に近隣 の 分 化 型血 管 平 滑 筋細 胞 の 脱 分化 を 促 進する ことが示 唆され た。ま た、本 研究に より初 めて動脈 硬 化 巣 での エ ピ レ グリ ン の 発 現を 明 ら かにし た。動脈 硬化巣 でのエ ピレグ リンの 発現は 形質転換を 起こし た中膜平 滑筋層 に限定 される ことか ら、エ ピレグ リンは 血管平滑 筋細胞 の増殖・遊走より も、む しろ血管平 滑筋細胞 の形質転 換の極早 期に関与 している 可能性が高 い。

− 27ー学位論文審査の要旨
主 査 教 授 長 嶋 和 郎
副 査 教 授 三 輪 聡 一
副 査 教 授 北 畠
顕

学位論 文題 名● 一 ●Epiregulin asama］ OrautOCrine／ paraCrlne
factorreleasedfromthe
ERK‐ andp38
MAPK‐ acti
vated
VaSCularSmOOthmuSCleCe11S（ 血 管平 滑 筋細 胞 脱 分化 因子 としての エピレグ リンの同 定と．

そ の 発現 お よ びシ グ ナル 解 析 ）血管中膜平滑筋細胞が分化型から脱分化型ーと形質転換する現象は血管病変形成にとって極めて重要である。申請者は、分化型形質を維持可能な血管平滑筋細胞の初代培養系を確立し、これを用いて形質転換の分子機構の解析を進めた。この過程で、分化型平滑筋細胞 に強制 的にERKとp38M
APKを活性化させると、ヘパリン非結合性のタンパク質因子を分泌し、周囲の分化型平滑筋細胞を脱分化させることを見出した。この分泌因子による平滑筋細胞の脱分化は、EGF受容体チロシンキナーゼの特異的阻害剤(AG1478)で著明に抑制されるため、EGFファミリーの増殖因子であることが示唆された。そこで、この分泌因子を同定し、この因子による平滑筋細胞脱分化の分子機構を明らかにし、さらに動脈硬化巣やバルーン傷害モデルなどにおけるこの因子の発現を検討し、本因子と動脈硬化症の発症・進展 の関わ りを検討 した。分化型血管平滑筋細胞にERKとp38MA
PKを強制的に活性化させた
血 管平滑 筋細胞の 培養上 清(CMl)は 著明な 平滑筋細胞脱分化能を有し、ERKとp38M
APKの両M
APK系およ びP
KB (Akt)の活性化が認められた。CM
1をへパリンーアフイニティーで分画すると脱分化活性は非結合分画にのみ認められた。さらに、このへパリン非結合分画をHighQ
カラ ムクロマ トグラ フイーで 分画し たところ、0．3MNaClで溶出した分画(E3)が脱分化活性を示した。E3による血管平滑筋細胞の脱分化は、AG
1478の添加またはERK阻害剤(
PD98059)、p38MAPK
阻 害剤(SB203580)の 両者の 添加によ り抑制さ れた。また、E3による両MAPK系の活性化もこれらの阻害剤により抑制された。このことから、E3に含まれる脱分化因子はEGF受容体を介して両MAPK系を活性化させて血管平滑筋細胞の脱分化を誘起することが示唆された。High
Qカラムクロマトグラフイーにおける脱分化因子の溶出パター 28一

ーン はEGF
フ ァミ リーの増殖因子であるエピレグ リンと類似するため、CM1
お よびE
3を抗エピレグリン抗体を用いて免疫沈降法を行ったところ 、エピレグリンが検出された。さらに、抗エピレグリン中和抗体の添加でE3による血管平 滑筋細胞の脱分化は抑制された。以上により、ERKとp38M
APKの活性化を受けた血管平滑筋 細胞の培養上清に含まれる脱分化誘導因子はエピレグリンであることが同定された。また 、分化型血管平滑筋細胞をエピレグリンで刺激すると、ERK、p38
M
APKと共にPKB(Akt)が活´陸化された。血管平滑筋細胞の脱分化因子である不飽和LPAまたはPDG
F−BBの刺激を受けた分化型血管平滑筋細胞は、短時間(30分 以内 ）で エピ レ グリ ンmRNAの 発現 を誘起し、この発現は24時間以上 持続して見られた。また、これら脱分化因子で誘導されるエピレグリンの発現は、PD98059とSB203580の両者を添加することで完全に抑制されたが、各々単 独では完全には抑制されなかった。
さらに、ヒト動脈硬化症におけるエピレグリンの発現をRT−PCRにより検討したところ、動脈硬化巣ではエピレグリンが発現していたのに対し正 常血管では見られなかった。抗エピレグリン抗体を用いた免疫組織染色の結果、動脈硬化 の初期病巣（形質転換を起こした中膜平滑筋層）にエピレグリンの発現が認められた。ま た、ラッ卜バルーン傷害モデルでのエピレグリン発現の検討では、1日目に血管内腔に発現し、2日目には中膜内側で発現し、やがて7日目に新生内膜に 拡がっていたが、21日目には消失していた。本研究で、脱分化誘導 を受 けた 血管 平滑 筋細 胞は ERKと p38MA
PKの活 性 化に より 迅速 にエピレ グリンの発現・分泌を誘起し、分泌されたエピレグリンがさらに 自己・傍分泌的に近隣の分化型血管平滑筋細胞の脱分化を促進することが示唆された。ま た、エピレグリンは血管平滑筋細胞の 形 質 転 換 の 極 早 期 に 関 与 し て いる 可 能 性 が 高 い こ と が 示 唆さ れ た 。
口 頭発 表に 際し、 副査の三輪教授からエピレグリン単独での形質転換べの 寄与、他の増殖 因子 との 協調作 用について質問があった。次いで副査の北畠教授よりエ ピレグリンの受 容体 、お よび臨 床応用についての質問があった。最後に主査の長嶋教授 からエピレグリ ンの 血管 修復に 関するプロセスの解釈、および平滑筋細胞の分化維持培 養系の手技につ いて 質問 があっ た。いずれの質問に対しても、申請者は研究結果に基づ いて、あるいは文献的知識により、概ね適切に回答し得た。
この論文は、血管平滑筋細胞の形質転換における エピレグリンの発現およびシグナル伝 達 系 を 明 ら か に し た も の と して 意 義 の あ る も のと 評 価 さ れ た 。
審 査員 一同 は、こ れらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取 得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充 分な資格を有するものと判定した。

― 29―