倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1402

KRAS 遺伝子変異を持つ癌に対する PRMT5 を介した新しい癌幹細胞維持機構を標的とした癌治療法の確立
代表研究者

阿部芳憲

日本医科大学先端医学研究所遺伝子制御学部門

助教

Establishment of therapeutic strategy for KRAS-mutant cancer targeting
PRMT5-mediated cancer stem cells maintenance machinery
Principal Researcher

Yoshinori Abe,
Department of Molecular Oncology, Institute for Advanced Sciences, Nippon Medical School Assistant Professor

膵管由来細胞株などを使った解析から、PRMT5 は KRAS の活性化によって発現が亢進し、癌幹細胞の維持に重要な役割を果たす遺伝子群の発現誘導に関わることが分かった。In vitro 実験系で膵臓癌由来癌細胞株に PRMT5 阻害剤を処理すると、細胞増殖能や癌幹細胞自己複製が顕著に抑制された。さらに既存の抗癌剤との併用処理による相乗効果で、その抑制効果は亢進した。さらにヌードマウス皮下に癌細胞を移植して腫瘍形成後、PRMT5 単剤処理または PRMT5 阻害剤と既存の抗癌剤との併用処理によって、腫瘍縮小効果も認められた。
PRMT5 expression was enhanced downstream of KRAS in normal pancreatic ductal-derived cells andPDAC cells. Upregulated PRMT5 was involved in genes expression associated with tumor stemness.
These data suggest suppression of PRMT5 activity attenuates PDAC cell proliferation and CSC
maintenance. Then, we examined the effect of PRMT5 inhibitor treatment. PRMT5 inhibitor treatment
suppressed cell proliferation and cancer stem cells (CSCs) maintenance. Furthermore, combination
treatment of PRMT5 inhibitor and conventional anti-cancer drug further suppressed cell proliferation andCSCs maintenance through their synergy effect. Then, xenografted tumor was also shrunk after PRMT5inhibitor treatment as well as combination treatment of PRMT5 inhibitor and conventional anti-cancerdrug.

1．研究内容悪い癌と言える。全膵臓癌の 95%で KRAS 遺伝子

1.1 研究の背景と目的変異が見られるが、KRAS 遺伝子変異を持つ癌に

膵臓癌は癌が進行するまで自覚症状はなく、早対しては KRAS の立体構造上、KRAS に対する阻期発見が難しい。さらに膵臓癌は、直径 2 cm 以下害剤開発は困難とされる。最近、特定の変異を持の小さな癌でもすぐに周囲への浸潤や転移を伴う

つ KRAS に対する阻害剤が開発されたが、KRASことが多いなど、極めて悪性度が高い。現在、全遺伝子変異は多岐にわたるため、全ての KRAS 遺ての癌の 5 年生存率の平均が約 60%になる中、膵伝子変異癌に効果を示すものではない。

臓癌の 5 年生存率は約 5%とされ、極めて予後の現在、腫瘍消失を目指す治療法開発において、

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癌幹細胞が新たな標的として注目されている。これ、細胞増殖や幹細胞の維持に関与している可能れまでの研究から、癌幹細胞のみが腫瘍形成能や性が考えられた。

転移能を有し、腫瘍形成の起点になると考えられ

そこで RAS の下流で PRMT5 の発現誘導に直接ている。したがって癌幹細胞を消失させることが関与する転写制御因子の特定を試みた。その結果、できれば、KRAS 遺伝子変異を持つ肺癌の消失へ

RAS 下流で活性化される転写制御因子のうち、つながることが期待される。PRMT5 は基質とな

cMYC または STAT3 によって発現制御されているタンパク質のアルギニン残基をメチル化し、遺ることも分かった（図 3）。

伝子発現制御や細胞内シグナル伝達を通じて ES細胞や組織幹細胞の維持に関わる。また、PRMT51.3 PRMT5 の機能抑制による細胞増殖能および癌は癌での発現亢進が報告されており、高発現の幹細胞自己複製の抑制による腫瘍形成抑制効

PRMT5 は予後不良因子の一つとなることが示唆

果されている。最近になって、PRMT5 は癌幹細胞

まずは in vitro 実験系を使って PRMT5 の機能の維持にも関与することが分かってきた。我々の抑制による効果を検証した。7 種の膵臓癌由来癌

先行研究から PRMT5 による癌幹細胞維持機構の細胞株に PRMT5 阻害剤を処理すると、癌細胞お一つとして、PRMT5 を介した癌幹細胞の維持とよび癌幹細胞の生存率が低下したが、PRMT5 阻深く関わる転写制御分子 GLI1 の活性化経路を見害剤に対する感受性は細胞間で異なっていた（図出した （Yoshinori Abe, et al., Comm. Biol. 2,3）。なおデータは示さないが、PRMT5 阻害剤処Article number: 23 （2019））。さらにこの新しい理による生存細胞の低下は、アポトーシスの誘導癌幹細胞維持機構は、KRAS 遺伝子変異を持つ膵によるものであった。さらに PRMT5 阻害剤処理

臓癌や大腸癌でも機能することも見出した。このによる PRMT5 阻害剤に対する感受性を規定することから、PRMT5 を介した癌幹細胞維持機構を新たな候補因子も明らかにすることができた（特抑制すれば、KRAS 遺伝子変異を持つ癌幹細胞の許申請の都合上、詳細な結果の掲載は控えさせて消失につながることが期待される。

いただきます）。この結果をもとに、PRMT5 に対申請者が見出した PRMT5 を介した癌幹細胞維する感受性が低い癌細胞に対して、膵臓癌治療に持機構を標的とする、KRAS 遺伝子変異を持つ癌用いられている既存の抗癌剤（特許申請の都合上、に対する癌治療法を臨床治験へ移行するべく、薬剤名は控えさせていただきます）と PRMT5 阻

PRMT5 の機能抑制による癌幹細胞維持能の抑制害剤を併用処理した。その結果、細胞増殖能およ効果と腫瘍縮小効果を検証する。さらに PRMT5

び癌幹細胞自己複製が両阻害剤の相乗効果によっ阻害剤とすでに癌治療に用いられている、既存のて顕著に抑制された（図 4）。また PRMT5 の機能抗癌剤と PRMT5 の機能抑制との併用による癌幹を阻害すると、癌幹細胞の維持に重要な役割を果細胞維持能の抑制効果と腫瘍縮小効果も検証する。

たす SOX2、OCT4、NANOG 遺伝子や、膵臓癌幹細胞の維持に関わる遺伝子（DCLK1、MSI1/2）

1.2 PRMT5 は KRAS の恒常的活性化による細胞のの発現が抑制した。このことから、PRMT5 は膵

癌化の過程で発現が亢進する臓癌幹細胞において、癌幹細胞の維持に必要な基正常膵管由来細胞株（HPNE 細胞）に変異型本因子や膵臓癌幹細胞の維持に関わる因子の発現KRAS 遺伝子（KRAS G12D）を安定発現させると、制御に重要な役割を果たすことが考えられた。な

PRMT5 の発現亢進が見られた（図 1）。このこと

お、KRAS 遺伝子変異を持つ肺癌細胞についてもから、PRMT5 は RAS の下流で発現が正に制御さ同様の実験を行ったが、膵臓癌由来癌細胞株と比倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
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べ、全般的に PRMT5 阻害剤に対する感受性が低の膵臓癌由来癌細胞株を使った。その結果、かったため、詳細な解析は膵臓癌のみを対象にす

PRMT5 阻害剤単剤処理でも腫瘍増大を抑制するることとした。

ことができた。さらに PRMT5 と既存の抗癌剤と次に、ヌードマウスへの癌細胞株移植によるの併用投与によって、腫瘍縮小効果が見られた（特腫瘍形成抑制効果を調べた。Tet-ON システムを許申請の都合上、詳細な結果の掲載は控えさせて使って、ドキシサイクリン存在下で PRMT5 に対いただきます）。

する siRNA を発現誘導できる癌細胞株を樹立し、この細胞をヌードマウス皮下に移植した。移植腫
瘍の体積が約 150 mm3 に達した時点で飲水にドキ
シ サ イ ク リ ン を 添 加 し て 、 PRMT5 に 対 す る
siRNA の発現を誘導させたところ、腫瘍の増大を抑制することが分かった（図 5）。
これらの結果をもとに、膵臓癌由来癌細胞株をヌードマウス皮下に移植後、腫瘍体積が 150 mm3に 達 し た 時点 で PRMT5 阻 害 剤 単独 、 ま た は

図 2: 膵臓癌由来癌細胞株に Stattic (STAT3 阻害PRMT5 阻害剤と既存の抗癌剤の併用投与を行っ剤) またはF10058-41 (MYC 阻害剤) を処理した

た。本実験では、in vitro 実験系から明らかになった、PRMT5 阻害剤に対する感受性の異なる 2 種

ときの PRMT5 発現量の減少
a, c. 膵臓癌由来癌細胞株に STAT3 阻害剤 (a)または MYC 阻害剤 (c) を 48 時間処理したときの PRMT5 タンパク質発現量をウエスタンブロット法を行って調べた。b, d. 膵臓癌由来癌細胞株に STAT3 阻害剤 (a) または MYC 阻害剤 (c)を 48 時間処理したときの PRMT5 mRNA 発現量をリアルタイム定量 PCR 法を行って調べた。
この結果から STAT3 の活性が低い細胞で(AsPC-1) は cMYC が PRMT5 の発現制御を担い、cMYC の発現が低い細胞 (Panc10.05) では
STAT3 が PRMT5 の発現制御を行っている可能性が考えられた。

図 1: HPNE 細胞に変異型 KRAS（KRAS-G12V）を安定発現させたときの PRMT5 の発現亢進
a. KRAS-G12V 発現細胞での PRMT5 の mRNA 発現量。細胞からRNA を抽出し、cDNA へ逆転写した。これらのサンプルを使って
qPCR 法を行ってPRMT5 のmRNA 発現量を調べた。
b. KRAS-G12V
発現細胞における PRMT5 タンパク質発現量。細胞からタンパク質を回収し、ウエスタンブロット法を行って、PRMT5 のタンパク質発現量と KRAS-G12V 発現による、様々な細胞増殖シグナルの活性化を調べた。

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図 3: 膵臓癌由来癌細胞株に GSK3203591 (PRMT5 阻害剤) を処理したときの生存細胞の割合
a, c. 膵臓癌由来癌細胞株の癌細胞および癌幹細胞に PRMT5 阻害剤を 72 時間（癌細胞: a）または 7 日間（癌幹細胞: b）処理したときの生存細胞の割合を MTT 法を行って調べた。

図5: Tet-ONシステムによるPRMT5 siRNAを発現誘導できる膵臓癌由来癌細胞株の腫瘍形成能a, b.ドキシサイクリン存在下で PRMT5 siRNA を発現誘導でき、ルシフェラーゼを安定発現する MIA-PaCa2 細胞をヌードマウス皮下に移植した。腫瘍の大きさが 150 mm3 に達した時点で 1.0 mg/mlのドキシサイクリン入り飲水に交換し、自由摂取させて PRMT5 の発現を抑制させた。そのときの腫瘍形成能を経時的に調べた。測定前にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを腹腔内投与し、酵素と基質の反応による化学発光を in vivo imaging system（IVIS）で定量化し、腫瘍の大きさの指標とした（n=5）
。a.に IVIS の測定例を示し、b.に腫瘍形成能のグラフを示す。コントロールはヒト遺伝子を発現抑制しない siRNA を発現誘導した細胞とした。c. PRMT5 発現抑制から 32 日後のマウスから採取した腫瘍。d. ヌードマウスにできた癌細胞移植腫瘍の重さ（n=5）
。
図 4: 膵臓癌由来癌細胞株に GSK3203591 (PRMT5 阻害剤) を処理したときの生存細胞の割合
a, b. 膵臓癌由来癌細胞株の癌細胞および癌幹細胞に PRMT5 阻害剤と既存の抗癌剤を 72 時間（癌細胞: a）または 7 日間（癌幹細胞: b）処理したときの生存細胞の抑制率を MTT 法を行って調べた。c, d. a,b の結果をもとに併用処理による生存細胞の抑制率が相乗的か否かを判定する BLISS スコア（Stat Biopharm Res. 2018; 10 (2): 112–122.）を算出した。BLISS スコアが高いほど、両阻害剤の相乗効果が高いと判断される。

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2．発表（研究成果の発表）
国内外の学会誌、学会講演会等における発表があれば５件程度記載。
記載内容：氏名、題目、誌名、巻、号、頁（年次）、学会名（場所、年次）
1．阿部芳憲, 田中信之
PRMT5はEGFR変異非小細胞癌において癌幹細胞維持と薬剤耐性獲得に関わる
日本癌学会 第79回日本癌学会学術総会（2020）
2．佐野匠, 阿部芳憲, 田中信之
肺癌におけるSTAT3とPRMT5の相互活性化機構の役割
日本分子生物学会 第44回日本分子生物学会年会（2021）