博 士 （ 医 学 ） 高 柳

見学 位 論 文題 名Establishmentofnovel ani
mal model forHu
manT― cell Leukemia Virus Typelinf
ection・ I
uslnghumanCRMltranSgenlCratS（ ヒトCRM
1トランス ジェニックラットを用いた
新 規ヒト自血病ウイルスI型感染動物モデルの樹立）

学 位論文 内容の要旨
ヒ ト白 血病 ウイ ルス 1型(Human T‑cellleu
kemia vi
rus t
ype l:HTLV‑1)は成人T細胞
白 血 病 (ATL)や HTLV‑1関 連 脊 髄 症 (HAM/TSP)の 原 因 と な る レ ト ロ ウ イ ル ス で あ る 。
全世界でおよそ2000万人の感染者がいると 推定されており、日本においても120万人が感染し てい る。 HTLV‑1の感染経路は主 に母乳を介する母子感染であり、他にも精液を介する水平感染や輸血による感染が知られてい る。HT LV‑1
感染者の2‑3％が50‑60年という長い潜 伏期 間を 経てATLを発症するが、その機序は不明である。ま た、ATL
は高カルシウム血症や免疫不全を併発し、既存の抗癌剤に対して抵抗性であるため予後が不良となる場合が多い 。現 在、 AT
Lの 発症 機序 を解 明し 、治 療法を開発するためにHT
LV‑1
感染動物モデルの構 築が 望ま れている。ラットは飼 育が容易で遺伝子操作が可能である事からHT L
V1
感染動物モデルの有カな候補である。本研究 では HTLV‑1
感染ラットモデ ルの構築を目的として以下に示す3つのテーマについて取り組んだ。
（ 1） ヒ ト CRM1ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク く Tg)ラ ッ ト に お け る HTI」 V‑l増 殖 の 解 析【目 的と 意義 】ラ ットにおけるHTLV‑1の増殖はヒト に比べて著しく悪い。本研究室ではこ の 原 因 が ヒ ト CRMl(hCRMl)の 持 つ env/gag mRNAの 核 外 輸 送 能 を ラ ッ ト
CRMl(rCRMl)が欠 くこ とに あ るこ とを 示し てき た。 そこ で、 HT LV‑
1感 染小動物モデルの構 築を 目的 とし て、 hCRMl Tgラッ トを 作製 し、T細胞におけるHTL
V‑1の増殖をexd voで検討した。
【材 料と 方法 】Tgラッ トに おけ るhCRM
lの 発現はウ エスタンブロット法により調べた。
Tg及 び 野 生 型 (Wt)ラッ トの T
細 胞に HT
LV‑1を感 染さ せ不 死化 させ るこ とに より IL‑2依存的な増殖を示す15の細胞株(Wt:6，Tg:9)が得られ、このうち10細胞株(Wt:3，Tg:7)について は IL‑2非 依 存的 に培 養し た。 各細 胞株 にお ける HT
LV‑1の 増殖 はELISA法 を用 いた 培
養 上 清 中 の p19 gagの 定 量 、 及 び HTLV‑1 Gag及 び Env特 異 的 抗 体 を 用 い た FACS解 析により評価した。
【 結 果 】 hCRMlを 発 現 す る Tgラ ッ ト に お い て 、 hCRMlは 内 在 性 の rCRMlと 同 様 の 発現 パ タ ー ン を 示 し た 。 FACS解 析 の 結 果 、 全て のhCR
Ml T
g細 胞株 にお いて p19Gagの産
生 を 認 め た の に対 し、 全て のWt細胞 株で はGagの生 産は 認め られ なか った 。一 部の Tg
ラッ ト由 来の 細胞 では g
p46 E
nvの発 現も 見ら れた 。ま た 、Tg細胞 株は Wtのものに比べ培養上清中に100‑1000倍のp19を生産した。 ．
【 結 論 と 考 察 】 hCRMlを 発 現 さ せ る こ と によ り、 ラッ トT細 胞に おけ るHTLV‑1の複 製が亢 進し た。 TaxやRexの産生はどの細胞株において も有意な差が見られないのに対し、− 282―細 胞内及び 培養上 清中のGag産生が T
gラット 細胞株に おいて 有意に上 昇していることから 、 hCRMlが unspliced formの mRNA輸 送 に 機 能 し HTLV‑1の 複 製 に 寄 与 して い る もの と 考 えら れ る 。本 研 究 によ り hC
RMl Tgラット がH
TL
V1
感 染小動 物モデル になり うる可能性が高いことが示された。
（2）F
oxp3及びCTL
A‑4発現HT
LV‑1
感染ラット細胞の機能解析【 目的と意 義】制 御性T細胞は転 写因子 であるFoxp3の発 現を特徴 とする T細胞の亜集団で ある。こ れらの T細胞は免疫抑制機能を有しており、免疫寛容の維持に機能している。
近年、ATL細 胞に お け る制 御 性 T
細 胞 の 関連 分子であ るF
oxp3やCTL
A‑4の発現 亢進が 報
告 されてお り、病 態との関 わりが示 唆され ている。本研究ではHTL
V‑
1
感染ラット細胞株を 用 い て 制 御 性 T細 胞 関 連 分 子 の 発 現 と 免 疫 抑 制 機 能 と の 関 連 を 検 討 し た 。
【 材 料 と方 法 】 I
L‑2依存 性 及 び非 依 存 性の 増殖を示 す9及 び13種類 のH
TL
V‑
1感染 ラット 細胞株を 用いた 。Foxp3の発現はR
T‑
PC
R法及ぴウエスタンブロット法により確認した。
各 細胞株の 抑制機 能を評価 するため 、CFSEラベ ルした ラット脾 臓T
細 胞と共培養し、抗CD3抗 体 に よ る 増 殖 刺 激 後 3日 に お け る CFSE強 度 を FACS解 析 に よ り 測 定 し た 。
【 結 果 】解 析 に 用い た 22
細 胞 株 のう ち それ ぞれ10
細 胞株にお いてFoxp
3及びCTLA‑4の発現を認めた。Foxp3
発現はIL‑2依存性の細胞株において非依存性の状態よりも高かった。
Foxp3お よ ぴ CTLA‑4発 現 細 胞 株 に お い て T細 胞 の 増 殖 抑 制 機 能 が 確 認 さ れ た 。
【 結 論 と 考 察 】 本 研 究 に よ り 制 御 性 T細 胞 関 連分 子 で ある Fox
p3及 び CTLA‑
4発 現 とHT
LV‑1
感 染細胞 株による 免疫抑制 機能と の関連が示唆された。このことはヒトとラットHTLV‑1
感 染モデ ルの相同 性をさら に示し ている． 今後の 研究によ り生体 内におけるAT
Lの 発症や病 態と制 御性T細胞関連 分子の 発現との 関連が 明らかに なる事が 期待される。
（3）ラットにおけるHTL
V‑1母子感染の解析【目的と 意義】母 乳を介 する母子 感染は H
TL
V‑1の主要な感染経路である。日本では断乳による新生児への感染防止が試みられ成果を上げているが、完全には感染を防止出来なぃ。
又，母乳育児には多くの利点があり、断乳は多くの問題を抱えている。動物モデルを用いてH
TL
V‑1の母児感 染を再 現するこ とが可 能となれ ば、新たな感染防御法の開発にっながることが期 待される 。本研 究ではラ ットモ デルを用 いて母子間のHTL
V‑1感染を明らかにする事を試みた。
【材料と方法】妊娠前、又は妊娠中のラットに対しH
TI亅V‑l感染ラット細胞株を経口若し
くは経腹 腔で接種 した。 さらに、 感染ラ ットより 生まれたFl世代を交配しF2世代を作出した。こ れらの感 染ラッ トより乳汁の採取を行った。HTLV‑
1
感染を評価するためラット
血漿 中 の p
19Gagを EL
ISA法に て 、 末梢 血 及 び 乳汁 DNA
中 の プ ロウ イ ル スを N
ested PCR
法に て 検 出し た 。 乳汁 中 の H
T LV‑1特 異的 抗 体 の 検出 に は P
A法 を 用い た 。Cell‑free
HTLV‑1感 染 系 を 用 い て ウ イ ル ス 感 染 に 対 す る 乳 汁 の 影 響 を 評 価 し た 。
【結果】 感染ラッ トより 生まれた、又は授乳を受けた同腹子群のラットにおいてp19Gag
及び HTLV‑1プロ ウ イルス が検出 された。 HTL
V‑1感染は F2世代に おいても 確認され た。
経腹 腔 で HTI」 V‑l感 染ラ ッ ト 細胞 株 を 接種 し た ラ ット よ り 得ら れ た 乳汁 中にお いてHTI」V‑lプロウ イルス を検出し た。こ れらの乳 汁中にはH
T
LV‑1特異的抗体も検出され、抗 体 を 含 む 乳 汁 は 量 依 存 的 に cell‑freeウ イ ル ス の 感 染 を 阻 害 し た 。
【結論と 考察】本 研究に よルラッ トにお いても母 子感染がHT
LV‑1の自然な伝播経路である事、母乳を介する感染が起こっている可能性が示唆された。また、乳汁中への移行抗体がウイルス の感染防 御に関 与している可能性が示唆された。今後ラットに茄けるHTL
V‑1
母子感染の詳細を明らかにする事により、新たな母子感染の防御法の発展にっながる事が期待される

ー 283―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 志 田 壽 利
副 査 教 授 高 田 賢 藏
副 査 教 授 今 村 雅 寛

学位論文題名Establishmen
tofnovelan
imalmodelforHumanT−cell Leu
kemia VirusTypeli
nfe
ction
● ●
uslnghumanCRMltranSgenlCratS（ ヒトCRM1
トラン スジェニッ クラットを用いた新規ヒト自血病ウイルスI型感染動物モデルの樹立）

本 論文では ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV―1）の増殖を促進するヒトの因子であるhumanCR
Ml (hCRMl)を発現す るトラ ンスジェ ニックラット(Tgラット）を用いた種々のHTL
V―1
感染モデ ル を 樹 立 す る 事 を 目 的 と し て 、 3つ の テ ー マ に つ い て 研 究 を 行 っ た 。
ラ ットにお けるHT
LV−1の増 殖がヒ トに比べて悪い原因として、hCRMlの持つenv/gagmRN
Aの核外輸送能をラットC
RMl(rCRMl)が欠いている事が明らかとなっている。この知見を元にH
T
LV―1
感 染小動物 モデル の改良を 目的と してhCRMlTgラットが樹立された。h
CRMlTgラットにおけるCR
M1の 発現を ウエスタ ンブロッ ト法に より解析したところ、hCRMlの発現は内在性のrCRMlと同様 で あった。 次にhCRMl Tg
ラ ットT細胞に おけるHTL
Vー1の 増殖を解 析する ために、 Tg及びwt
ラ ット由来 のT細胞をHT
LV−1により不死化し、HTL
V一1感染ラット細胞株の樹立に成功した。これ らの細胞 株にお けるHT
LV―1Gag
産生をE
L
ISA法及びFAC
S解析により測定したところ、hCRMlTgラ ット由来 の細胞 株におい てはwt
ラ ット由来 のもの に比べ有 意に高い Gag発現が認められた。
制 御性T細胞は 免疫抑制 機能を 有するT細胞の亜集団である。近年、ATL細胞において制御性T細胞の関連分子であるFoxp3やCTLA―4の発現が報告されており、機能的な相関が示唆されている。
HTLV―1
感染 ラット 細胞株に おける 制御性T細胞関 連分子 の発現を 調べたところFoxp3は18細胞株 中9細 胞株に おいて、 CTLAー4は19細胞株 中10細胞株において発現が確認された。次に各細胞株のT細胞増殖抑制機能を評価したところ、解析に用いたF
oxp3+/CT
LA―4+である3細胞株の全て、Foxp3または CTLAー4を発現し ている 6細胞 株中3細胞株 において T
細 胞の増殖抑制機能が確認された。一方解析に用いたF
oxp3―IC
TLA―4ーである3細胞株においてはT細胞の増殖を抑制したかった 。これら の結果 より制御 性T
細 胞関連 分子であるFoxp3及びCT
LA―4発現とHTL
V―1感染細胞株による免疫抑制機能との関連が示唆された。
母乳を介する母子感染はHT
LV―1の主要な感染経路であり、動物モデルを用いてHT
LV―1の母児―284−

感染を再現することが可能となれば、新たな感染防御法の開発にっながることが期待される。そこで、本論文ではラットモデルを用いて母子間のHTLV−1感染を明らかにする事を試みた。HTL
V―1
感染ラットより生まれた、又は授乳を受けた同腹子群のラットに対してHT
LV←1の検出を試みた結果、各群内のラットにおいて血漿中p19Gag及びHT
L
Vー1プロウイルスが検出される事を確認した。
さらに、経腹腔でHT
LV
一1感染ラット細胞株を接種したラットより得られた乳汁中においてHTL
V―1
プロウイルスを検出した。これらの乳汁中にはHTL
V‑1特異的抗体も検出され、抗体を含む乳汁は量 依存的に cellーfree
ウイ ルスの 感染を阻 害した 。これに よルラ ットにお いても母子感染がHTLV‑1の自然な伝播経路である事、母乳を介する感染が起こっている可能性が示唆された。また、
乳 汁 中 へ の 移 行 抗体 が ウイ ル ス の感 染 防御 に 関 与し て いる 可 能 性が 示 唆 され た 。
発表後、高田賢三教授よルラット細胞に対するH
T
LV―1の侵入効率やT細胞抑制機能を示したラッ ト細胞株とヒト制御性T細胞との比較についての質問があった。また、今村雅寛教授よルヒト
では稀な例であるH
T
LV―1
経胎盤感染がラットにおいて多く見られる理由と、中和抗体を含む乳汁を授乳された同腹子においてもHT
L
V―1感染が見られた理由についての質問があった。最後に志田壽利教授よりH
TL
V‑1
感染ラットモデルの現状と展望についての質問があった。申請者はそれぞれの質問に対し現在までに得られている実験結果をふまえ自身の考えと今後の展望を述べた。質疑に対する応答は概ね妥当だった。
こ の論文はhCRMlTg
ラットのH
T
L
V―1感染動物モデルとしての有用性を示した点、またヒトの場合で報告されているHTLV―1感染細胞と制御性T細胞との機能的な相関や母乳中におけるプロウイルス及び移行抗体の存在をラットモデルにおいても示した点が高く評価され、今後ラットモデ
ルが治療と予防法開発や、生体内におけるAT
Lの病態やH
T
L
V―1
感染機構の解明に役立っことが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請 者が博士（ 医学）の学 位を受ける のに充分な 資格を有す るものと判 定した。

― 285ー