博 士 （生 命科 学）上谷晋也
学 位 論 文 題 名転 写 コ 1Jプ レ ッ サ ー KAP1に よ る
サイトカインシグナル調節機構の解析
学位論文内容の要旨（序論）
サイトカインは細胞から放出される生理活性物質のひとっで，細胞同士の情報伝達に用いられており，生体の恒常性維持に必要不可欠な因子である。サイトカインの機能異常は，感染，自己免疫疾患，癌など様々な疾患の病因となることが知られており，サイトカインシグナルの制御機構を解明することは，疾病治療において非常に重要なことだと考えられる。現在までに多数のサイトカインが発見され，またそのシグナル制御機構も解明されっっあるが，まだ十分ではなぃ。我カの研究室では，サイトカインのひとっであるI
L‑6のシグナル制御機構を調べる中で ，転写コリプレッサーK
RAB‑associated proteinl(KAPl)が，その制御に深 く関 与し てい るこ とを 明ら か にし た。 KAP1は発見当初，KRAB zinc finger protein(KRAB‑ZFP)と呼 ばれる転写抑制因子群のコリプレッサーとしで同定され たが，我々は，転写因子STAT3と直接結合して，IL‑6誘導性のSTA
T3のセリンリン酸化を抑制することで，IL．6シグナルを負に制御することを明らかにした。本研究では，サイトカインシグナルに対するKAP1のさらなる機能を追究する目的で，IL．6と同じ炎症性サイトカインであるT
N
F‐aのシグナリング や，S1ヽA
T1
およぴST
AT2（ST．AT3のフんミリー蛋白質）により活性が制御されているIFN．aのシグナリングに対して，KAP1の作用を調べた。（なお，解析にはヒト 胎 生 腎 癌 細 胞 株 293T細 胞 お よ び ヒ ト 子 宮 頚 癌 細 胞 株 HeLa細 胞 を 用 い た 。 ）（ 第1章： KAP
1によるTNF‑aシ グナル制御機構の解析）
TNF‑aシ グ ナ ル 伝達 系に 対す るKAP1の 影響 を 調べ る為 ，siR
NAを用 いて KAP
1遺 伝子を ノ ック ダウ ンし （以下KAPl KD)，TNF‑
a誘導性のI
L‑6発現に対する影響を調べた。その 結 果， K
APl KD下で は， IL‑6の 発現 誘導 がmRN
Aレ ベル およ ぴ蛋 白質 レベルで増強する こ とが 明ら かと なった。また，TNF‑a誘導性のI
L‑6発現に深く関与している転写因子
NFー K
Bに 対す るKAP1の影響を，レポーターアッセイにより調べたと ころ，KAPl KD細胞
ではN
F‑KBの 転写 活性も増強しているこ とが明らかとなった。これらのことより，KA
P1は 通 常 TNF‑a/NF‑KBシ グ ナ ル に 対 し て ， 抑 制 的 に 働 い て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
続 いて ，KAP
1に よる NF‑KB
転 写 活性 調節 機構の解析を行った。TNF‑aが細胞に作用する と，細胞質内でIKB‑aの分解 が起き，それに伴い，IKB‑aと結合していたNF‑KB(p50，p65)は，細胞質から核内に局在変化を起こす。さらにNF‑KBは，核内移行後，ゲノム上の標 的遺伝子のプロモーター領域に結合し，転写を誘導すると言われている。そこで，まずIKB‑aの分解に対するKAPl KDの影響を調べたところ，殆ど 影響は認められなかった。続
い て，p65の核移行およびクロマチン(IL‑6プロモーター）への結合を，免疫染色法およびChIPアッ セイ によ り調 べた とこ ろ， KAPl K
Dに より TNF‑a
刺 激 後の p65核内貯留の割合
一 1485―

が 増 加 し ， ま た IL‑6プ ロ モ ー タ ー ー の 結 合 量 も 増 加 す る こ と が 分 か っ た 。
p65の核内貯留および標的遺伝子プロモーターへの結合に は，p65の翻訳後修飾，特に
K310のア セチ ル化 が関 与し て いるという報告があることか ら，KAP
1のp65アセチル化に対す る影響を調べた。その結果 ，KAPl KDによりp65のアセチル化が増強することが確認された。
続 いて ，p65のア セチ ル化 に対 する KA
P1の調 節機 構を 調 べた。p65のアセチル化にはST
AT3が関 与し てい ると ぃう 報告 がある。TNF‑aの刺激が細 胞に加わると，STA
T3
はりン酸化を受け，特にS727のりン酸化は，p65へのp300（アセチル基転移酵素）リクルートを促進 する作用があり，この機能 を通して，STA
T3はp65のアセチル化を調節すると言われてい る。 そこ で， KA
P1がSTAT3の 上記 機能 を介 して ，p65のアセチル化を調節しているのか 解析 した 。そ の結 果， KAP
1は T
NF‑a
誘 導性 のSTAT
3セ リンリン酸化に対して抑制的に働き，またp65へのp300結合に対しても，抑制的に作用することが，免疫沈降実験により明らかとなった。
上 記の 結果 から ，KAP1の TNF‑aシグ ナル 制御 機構 に， STAT3が深く関与している可能性が 考え られ ，最 後に その 依 存性を調べる為，STAT3欠損下でのKAPl K
Dの影響をRTPCR法に より調べた。その結果，KAPl KDによるIL‑6誘導増強作 用が，S′rAT3欠損下で抑制されることが明らかとなった。
以 上の 結果 より ，KAP1は TNF‑aシグ ナル に対 して 抑制 的 に働き，その作用にSTAT3が関与していることが明らかとなった。
（第2章：KAP
1によるI
FN‑a/STATlシグナル制御機構の解析）
KAP1と STAT3が結 合す るこ とを受けて，まず免疫沈降実験 により，過剰発現および内在性のKAP1とS′r
AT1の結合を調べたところ，両者の結合が確認された。また，IFN・a
刺激 に よ る Sn灯 1の 転 写 活 性 に 対 す る KAP1の 影 響 を 調 べた と ころ ，KAPlKD下で は転 写活性が増強することがレポーターアッセイにより分かった。さらに，STA
T1の標的遺伝子である IRF‐ 1や Mxlの 発現 誘導 も増 強す るこ とが ，RT一PCRの 結果より明らかとなった。
続いてこのメカニズムを調べる為，IFN‐a刺激により誘導されるS
T
AT
1
のりン酸化，核移行，クロマチン（IRF‐1プロモーター）への結合を調べたところ，リン酸化や核移行にはKAP1K
Dの影響が見られなかったものの，クロマチンヘの結合量が増加していることが確認された。 さら に， KRAB￣ZFPをは じめ複数の転写因子に対するKAP1の転写抑制作用に，HDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）が関与しているという報告があることから，HD
AC阻害剤（トリコ スタ チン A）を 用い て， KAP1のSn灯1転 写抑 制作 用に対 する影響を調べた。その結果 ， KAP1の 抑 制 作 用 に HDACの 酵 素 活 性 が 必 要 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。
一 方， ウィ ルス 感染 時に 見ら れるS
W灯1
転写活性に対して も，KAP1が抑制作用を持っのか につ いて 調べ るた め， Ep
stein Barr
ウィルス由来の癌 現遺伝子L
MPlをH
eL
a細胞で過剰 発現 させ て， KA
PlKDの 影響 を R
TIPC
R法 によ り調 べた。 その結果，IFN．a刺激の際と同じく，KAP1が抑制的にはたらくことが明らかとなった。
（結 論）
本 研究ではサイトカインシグナル伝達に対するKAP1の調節 機構の解析を行い，第1章では ，KAP1がTNF‑a/NFーKB
シグナリングに対して 抑制的に働くこと，またその抑制機構にSTAT3が 関与 して いる こと を明らかにした。ま た第2章では，IFN‑a/STATlシグナリングに 対し て もKAP
1が 抑制 的に 働き ，そ の抑 制機 構に HDACが関与していることを明らかにした 。

学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 松田 正教授 前仲勝実
准教授 尾瀬農之講師 南保明日香

学 位 論 文 題 名転 写 コ 1Jプ レ ッ サ ー KAP1に よ る
サイト カインシ グナル調節機構の解析
サイトカインは細胞から放出される生理活性物質のひとっで，細胞同士の情報伝達に用いられており，生体の恒常性維持に必要不可欠を因子である。サイトカインの機能異常は，感染，自己免疫疾患，癌など様々な疾患の病因となることが知られており，サイトカインシグナルの制御機構を解明することは，疾病治療において非常に重要なことだと考えられる。現在までに多数のサイトカインが発見され，またそのシグナル制御機構も解明されつっあるが，まだ十分ではなぃ。本論文はサイトカインのひとっであるI
L‑6のシグナル制御機構を調べる
中で，転写コリプレッサーKR
AB‑associated proteinl(KAPl)が，その制御に深く関与してい るこ とを 明ら かに した。KAP1は発 見当初，KRAB zinc fingerprotein (KRAB‑ZFP)と呼ばれる転写抑制因子群のコリプレッサーとして同定されたが，さらに最近，転写因子
S
TAT3と 直接 結合 して ， I
L‑6誘導 性の S
TAT3の セリ ンリン酸化を抑 制することで，IL‑6シグナルを負に制御することを明らかにした。特に本論文では，サイトカインシグナルに対するK
AP
1のさらなる機能を追究する目的で，IL‑6と同 じ炎症性サイトカインであるTN
F‑aのシ グナ リン グや ，STAT
1お よび S
TAT2に より 活性 が 制御 され てい るIFN‑aのシ グナリ
ングに対して，KAP1の作用を検討し，以下の点を明らかにしており、博士（生命科学）の学位を授与するに十分であると判断した。
1.K
AP
1によるT
NF
‑a
シグナル 制御機構の解析
TNF‑aシ グ ナ ル 伝 達系 に対 する KA
P1の影 響を 調 べる 為， siRNAを 用い てKAP1遺伝 子をノ ック ダウ ンし （以 下KAPl KD)，TNF‑a誘導性のIL‑6発現に対する 影響を調べた。その結 果， K
APl KD下で は， IL‑6の 発現 誘導 がmRN
Aレ ベル およ び蛋 白質 レベ ルで 増強するこ とが 明ら かと なっ た。また，TNF‑a誘導性のIL‑6発現に深く関与 している転写因子
NF‑KBに 対す るKAP1の 影響 を ，レ ポー ター アッ セイ により調べたところ，KAPl KD細胞
では NF‑KBの 転写 活性 も増 強していることが明らかとなった。これら のことより，KAP
1は 通 常 TNF‑a/NF‑KBシ グ ナ ル に 対 し て ， 抑 制 的 に 働 い て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
続 いて ，KAP
1に よる NF‑KB転写 活性 調節 機構 の解 析を行った。T
NF‑aが細胞に作用す
ると，細胞質内でIKB・aの分解が起き，それに伴い，IKB‑aと結合していたNF‑KB(p50，p65)は，細胞質から核内に局在変化を起こす。さらにNF‑KBは，核内移行後，ゲノム上の− 1487一

標的遺伝子のプロモーター領域に結合し，転写を誘導すると言われている。そこで，まずIKB‑aの 分解に対 するKAPl KDの影響を調べた ところ，殆ど影響は認められなかった。続いて，p65の核移行および クロマチン(IL‑6プロモーター）への結合を，免疫染色法およびChIPアッ セイ によ り調 べた とこ ろ， KAPl K
Dに より TNF‑a刺激 後の p65核内 貯留 の割 合が 増 加 し ， ま た IL‑6プ ロ モ ー タ ー へ の 結 合 量 も 増 加 す る こ と が 分 か っ た 。
p65の 核内貯留 およぴ標的遺伝子プロモーターへの結合には，p65の翻訳後修飾，特にK310のア セチ ル化 が関 与し てい ると いう報告があることから，KAP1のp65アセチル化に対す る影 響を調べた。その結果，KAPl KDによりp65のアセチル化が増強することが確認され た。 続いて，p65のアセチル化に対するKAP1の調節機構を調べた。p65のアセチル化にはSTAT3が関与している とぃう報告がある。TNF‑aの 刺激が細胞に加わると，S′rAT3はりン酸化を受け，特にS727
のりン酸化は，p65へのp300（アセチル基転移酵素）リクルートを促進する作用があり，この機能を通して，S′PA
T3はp65のアセチル化を調節すると言われ てい る。 そこ で， KAP1がSTAT3の 上記 機能 を介 して ，p65のアセチル化を調節している のか 解析 した 。そ の結 果， KA
P1はTNF‑a誘 導性 のSTAT
3セ リンリン酸化に対して抑制的に働き，またp65への p300結合に対しても，抑制的に作用することが，免疫沈降実験により明らかとなった。
上記の結果から，KAP1のTNF‑aシグナル制御機構に，S′I
ヽAT3が深く関与している可能性が考えられ，最後にその依存性を調べる為，S′I
ヽA
T
3欠損下でのKAPlKDの影響をRT
I
PCR法に より 調べ た。 その 結果 ，KAPlKDによるIL‐6誘導増強作用が，S11AT3欠損下で抑制されることが明らかとなり，KA
P1はTN
F．aシグナルに対して抑制的に機能し，その機能にはSTA
T3が関与しているこ とが明らかとなった。
2.
K
AP1によるIF
N‑a/STAT
lシグナル制御機構の解析
KA
P1とSTAT3が 結合 する こと を受けて，まず免疫沈降実験 により，過剰発現および内在 性の KA
P1とSn灯1の 結合 を調 べたところ，両者の結合が確 認された。また，IFN．d刺激 に よ る STAT1の 転 写 活 性 に 対 す る KAP1の 影 響 を 調 べ た と ころ ，KAPlKD下で は転 写活性が増強する ことがレポーターアッセイにより分かった。さらに，STA
T1の標的遺伝子であ る IRF． 1や Mx1の 発 現 誘 導 も 増強 する こと が， R
PPCRの 結 果よ り明 らか とな った 。
続いてこのメ カニズムを調べる為，IF
N．a
刺激により誘導されるST
AT
1
のりン酸化，核移行，クロマチン（IRF．1
プロモーター）への結合を調べたところ，リン酸化や核移行にはK
A
P1
KDの影響が見ら れなかったものの，クロマチンヘの結合量が増加していることが確認された 。さ らに ，KRAB． ZF
Pを はじ め複数の転写因子に対するKAP1の転写抑制作用に，HDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）が関与しているとぃう報告があることから，HDA
C阻害剤（トリ コス タチ ンA） を用 いて ，KAP1の STAT1転写 抑制 作用 に対 する影響を調べた。その結果 ， KAP1の 抑 制 作 用 に HDACの 酵 素 活 性 が 必 要 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。
一方 ，ウ ィル ス感 染時 に見 ら れるSn灯1
転写活性に対して も，KAP1が抑制作用を持っの かに つい て調 べる ため ，Ep8tein．Ba
rr
ウィルス由来の癌 現遺伝子L
MP1をHeLa細胞で過 剰発 現させて，I
廴廿1K
Dの影響をRTIPCR法により調べた。 その結果，IFNーQ刺激の際と同じく，KAP1が抑制的に機能することが明らかとなった。
以上，本論文で はサイトカインシグナル伝達に対するKAP1の調節機構の 解析を行い，KAP1が TNF‑a/NF‑KBシ グ ナ リ ン グ に 対 し て 抑 制 的 に 働 く こと ，ま たそ の抑 制機 構にSTAT3が関与していることを明らかにした。ま た，IFN‑a/STATl
シグナリン グに対してもKAP1が 抑 制 的 に 働 き ， そ の 抑 制 機 構 に HDACが 関 与 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。

― 1488―