博士（医学）伊藤甲雄
学 位 論 文 題 名cv9イ ン テ グ リ ン の り ガ ン ド 認 識 機 構 とり ン パ 節 外 移 出 調 節 に関 す る 研 究
学 位論文内 容の要旨

［背景］インテグリンは細胞外マトリックスの受容体として働き、細胞の接着や遊走、生存などを誘導することが報告されている。a9インテグリン（以下a9)はa,4インテグリン（以下a4)と種々のりガンドを 共有していることや、一次構造の相同性から独立したサブファミリーに分類されている。めとa4の共通のりガンドのー っであるオステオポンチン(OPN)
は分子中央部に159RG
D161
配 列を有し、晒pi、av[33インテグリンなどのRGD受容体と結合する。
またその下流のR168とS169の間にトロンビン切断部位が存在し、露出した162SVVYGLR168
配列を 介し てa4、め と結 合す る。 特に めは トロ ン ビン 切断 型OPNと のみ 接着する。OPNはマク ロフ ァー ジの IL‑12産生 を介 した T
細 胞の Thlへの分化、腫瘍の浸潤、 転移など多彩な機能を有していることカ§報告されており、当研究室ではO
PNに対する中和抗体や遺伝子欠損マウスを用いた検討から、関節炎や肝炎におい てOPNが病態形成に重要な役割を持つことを報告してきた。OPNの機能はトロンビン等プロテアーゼ切断による構造変化と、それにより結合する受容体の変化、更には、リン酸化 等の翻訳後修飾などによって変化しうる。プロテアーゼは炎症において局所で活性化する ことが報告されていることから、炎症状態 では OPNとイ ン テグ リン の結 合様 式が 変化することが予測される。更 にa4とめは共にOPN
上 のSVVY
GLR配列 を結 合領 域と して いる が 、そ の結 合機 構の 違いに ついては不明
であ った 。ま た、 OP
Nは G
166とL167の 間で M
MP‑3/‑7により切断を受けるが 、これに対するa4、め の接 着に ついての研究も断片的である。そこで、初めにa4とa9の 細胞接着と遊走におけるOPN機能部位の同定を行った。
次に、炎症におけるめの機能を解析するために、 リンパ管内皮細胞(LEC)上のめに着目した。め遺伝子欠損マウスはりンパ管の弁の形成不 全による乳び胸症を示し、出生後早期に死亡することから、LEC上で発現するめの重要性が示唆された。更に、リンパ管新生因子で ある V
EGF‑A、 ーC、 ‑Dは a9に 接着 する こと が報 告さ れて いる が、 成体におけるLEC上のめの機能は不明であった。そこで、マウスに完 全フロイントアジュバント(CFA）を投与することにより炎症を誘導し、当研究室で樹立した抗めインテグリン抗体（55A2C）を用いてLE
Cにおけるめの機能を解析した。
［ 方 法 と 結 果 ］ OPN機 能 部 位 の 解 析 の た め に OPNN末 断 片 （ RAANhalOの SVVYGLR配 列をー っず つAに置 換 した りコ ンビ ナン トタ ンパク質を作製した。同様にし てM
MP切断型Nhalf（MMPRAANhalDを作 製し た。 また C
HOーK1細 胞に 、叫 とめ をそ れぞれ 遺伝子導入し安定発現細胞株（叫／CHO‐K1、a9／CHO―K1細胞）を樹立した。これらを用いて細胞接着試験と細胞 遊走 試験 を行 い、各変異体とRAANhalfに対する接着性、遊走性との比 較を行った。
細胞接着試験の結果、SVVY
GL
R上で叫との接着に重要なアミノ酸はV164、Y165、L167であり、 めで はV164、 Y165、L167、R168であること、MMPRAA
Nhalfは甜／CHO‐K
1細胞に対して有意な接着性を示したが、d9／C
H0‐K1細胞に対しては接着性を示さないことが分かった。
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こ の結 果 と 一致 し て 、V164
A、 Y165A、L167A変異体 は叫と a9/CH
O‑
Kl細胞 いずれ に対しても遊 走性が低 下した 。a4/CH
O‑
Kl細胞はさ らにV163Aに対し ても細胞 遊走の低下を示した。
LEC上の め の 機能 を 解 析す る た めに 、 CF
Aを 投 与 する 前 日 に55A2Cあるいは 対照抗 体を 投与 し 、 CFA投 与6日 後 にり ン パ 節(LN)を 採 取 し 、LECマー カ ー であるLYVE‑1で免疫染色す ることに よルリンパ管新生を評価したが、両群に差は認められなかった。しかしながら、 55A
2C
投与 群に韜 いて髄洞 の空洞 化とCD4+T細胞数 の増加が 認められた。そこで、
CFSEラ ベル し た M
OG35
̲55特異 的 TC
Rト ラン スジェニ ックマ ウス(2D2)C
D4
゛T細胞 を予め
55A
2C
あ るいは対 照抗体 を投与し ておい たマウス に移入 し、MOG35̲55/CFAを免疫し、3日目の鼠 径リンパ 節(iLN)における CFSE゛細胞 を共焦点顕微鏡により計数した。その結果、55A2C投 与 群 に お い て iLNに お け る CFSE+細胞 数 の 顕著 な 増 加 が認 め ら れた 。 一 方、MOG35
̲55を免疫 しなかった場合両群に差は認められなかった。更に、抗a4、aL抗体の投与により L
Nへのりン パ球の 移入を遮 断する 実験を行 い、LNか らのりン パ球の移出について検討し た。その 結果、 対照群で は抗a4、aL抗体の投与によりiL
Nにおける細胞数の減少が見られたが、55A2C投与群ではその細胞数の減少が抑制された。一方、腸間膜LNや、MOG
35̲
55
非免疫 群のiLNでは55A2C投与に よる影 響は認め られな かった。 この結果 は、めが炎症の所属LNに 限局して 細胞移出に関与していることを示唆している。これをさらに検証するた
め、LECを単離 し、め りガンド である OPNやTenascin‑Cで刺激し 、細胞 移出に重要と考えられる SIPの産 生を薄 層クロマ トグラ フイーに よって解析した。その結果、a9リガンドで刺 激す る こ とにより 、培養 上清中の SIPが増 加した 。さらに 、LECにおける SIPの 特異的輸送体 であるSp
ns2の遺 伝子発現 がa9リガ ンド刺激で亢進することが分かった。最後に、55A2C
あ るいは対 照抗体を投与したS
JL/JマウスにPLP
139̲
151/CFAを免疫し、実験的自己免疫性脳 脊髄炎(EAE)を誘導し、臨床スコアを比較した。その結果、55A
2C投与群において臨床スコアの抑制、発症の遅延、脊髄の炎症細胞浸潤及び脱髄斑の形成の抑制が認められた。
一方、iLN細胞を用いた抗原再刺激による細胞増殖及びサイトカイン産生には両群間で差は認められなかった。
［考察 ］OPN
変 異体を 用いた細 胞接着 試験の結 果から、 a4、めの OPNに対 する細胞接着は
R168に違いがあることが分かった。R168はトロンビン切断部位であることから、この部位に対する 接着性の 差によ って、餌 はOPNとの接着 においてトロンビン切断を必要とせず、めはトロ ンビン切 断が必 須である という 相違が現 れること が示唆 された。さらにめはMM
PNhalfに対し ては接 着性がみ られなか った。 炎症においてはMMPやトロンビンなど種カのプロテア ーゼが活 性化す ることか ら、様 々な型に切断されたOPNが存在すると考えられ、めはより限局した状況で機能が発揮されると考えられる。また、この仮説と一致して、55A
2C投与に よる細胞 移出の 抑制は、 CFA投 与により 炎症を誘導した所属LNにおいてのみ観察された。 さらに、 55A2C
投 与によっ てEA
E臨床スコ アの抑 制が認め られた。 リンパ飾におけるT細胞の抗 原認識 は炎症性 疾患に共 通した 現象であ ること から、抗 め抗体の投与はEA
Eのみ な らず 他 の炎 症 性疾 患に お いて も その 治 療効 果が 期 待さ れる 。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 西 村 孝 司
副 査 教 授 笠 原 正 典
内 哲 也
副 査 教 授 守谷司
副 査 教 授 瀬 出 利 光
副 査 教 授 上学 位 論 文 題 名cv9インテグ1）ンのりガンド認識機構とりンノヾ節外移出調節に関する研究

学 位論文に おいて 、申請者は第1
章では、オステオポンチン(OPN)とその受容体であるa9インテ グリンの 接着様 式を解析 し、第 2章で は、リンパ管内皮細胞上のa9インテグリンの機能にっいて詳細な報告を行った。
前 半（第1章） では、イ ンテグリンファミリーの中で共通の亜群に属するa4及びa9イン
テ グ リ ン が 、 OPN内の SWYG
LRを 共通 の 認 識部 位 と する に も 関わ ら ず 、何 故 、 a4は全長型及ぴトロンビン切断型の両方に結合するのに対し、ロ9インテグリンは切断型にしか結合 しないと いう結 合様式の 差異があ るのか について 検討した。このためにa4，a9インテ
グ リ ン をそ れ ぞ れ遺 伝 子 導入 し た C
HO細 胞を 作 製 し 、SVVY
GLRのア ミ ノ 酸を1っず つAに 置換した トロン ビン切断 型OPN
N末断 片タンパ ク質に対する接着試験、遊走試験を行った 。 こ の結 果 か ら、 a4及び a9イン テ グ リン が SV VYGL
Rを 共 通認 識 配 列と してい るのは、共に接着にV164，Y165，L167を要求しているからであり、ロ4とa9インテグリンの全長型 及ぴトロ ンビン 切断型OP
Nにおけ る接着 性の差は 、a9イン テグリン のみが R168を必須としているからであることを見出した。

また細胞遊走試験においてR168が細胞遊走の抑制においても機能していることを発見した。
後半（第2章）では、inv
itroのみならず、inv
ivoにおける所属リンパ節内リンパ管内皮細胞 上のa9イン テグリ ンの機能 解析を 行った。 in vitroの検討からりンパ管内皮細胞のa9イ ン テ グ リ ン と 、 そ の り ガ ン ド で あ る テ ナ ー シ ンC (TN‑C)の 結 合 がsphin
gosi
ne1phosphate (SIP)
トラ ンスポー ターの S
pns2の発 現上昇 を惹起し 、SIPの分泌を 促進することを発見した。さらに抗ぱ9インテグリン抗体により、所属リンパ節からのりンパ球移出が 抑制され ること を発見し た。実際、invivoにおいて抗a9インテグリン抗体投与により多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)が抑制されることを示した。
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こ のり ンパ 節に 蓄積 した CD4+細胞を正常マウスに移入することで、重篤なEAE症状を誘導することを示した。 これは所属リンパ節においてエフェクター細胞が蓄積している可能性を示すものである。
前半 第1章の OPNの 受容 体に よる 認識 に関 す る研 究に ついては、副査の笠原教授よりOPNの立体構造と、トロ ンビン切断についての報告に関する質問があった。

後 半の第2章 につ いて は、 副査 の瀬 谷教 授よ ルリ ンパ 節 にお ける a9インテグリンと今回着目した
TN‑
C以 外の りガ ンド につ いて 、笠 原教 授よ り 抗a9イン テグリン抗体投与群からのCD4+細 胞の養子移入によりEAEが増悪化する理由、また、正常と炎症状態における抗 ぱ9イン
テ グリン抗体の効果について、また主査の西村教授 より抗a9インテグリン抗体投与後のEAE症 状の 経過 と 、リ ンパ 節内 に貯 留し たT細 胞亜 群に ついて質問を受けた。副査の守内 教授からは、特に1章 と2章の論文の展開について 、表現方法を工夫するように求められた。申請者は、何れ の質問に対しても、自己の実験データや過去の報告を引用しながら概ね適切な回答をなし 得た。
この 論文 はa4及ぴ a9
イ ンテ グリ ンと OPNの 結合 様式 の分 子機 序を in vitroの 実験で明 らかにした。a4インテグリンの機能に関しては多 くの報告がなされており、抗a4インテグリン抗体は抗体医 薬としても自己免疫疾患等に使用されている。一方で、申請者は、本研究において、これ まで不明であった口9インテ グリンの機能を詳細に検討している。
a9インテグリンとりガンドの結合が、in vivoでのりンパ節からの細胞移出にSIPトランスポーターの誘導を介 して関与している事を初めて証明した。これらの成果は、抗a9インテグリン抗体が、他の 難治性炎症性疾患の治療にも応用可能であることを示唆するものである。
審査員一同は、これ らの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 ける の に充 分な 資格を有するものと判定した。

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