博 士 （ 医 学 ） 勝 村 紘 一 リ カ ル ド
学位論文題 名
Quantitative evaluation of the role of Epsteinー Barr virus
immediate― early protein BZLFl inB− cell transformation(EBウイルス前初期遺伝子B
ZL
F1のB
リンノヾ球トランスフオーメーションにおける役割の検討）

学位論文内容の要旨
背景E
pstein‑Barrvirus(EBV)はヒト癌ウイルスのーつである。E
BV
はinv
itro
でヒトBリンバ球を無限増殖（不死化）させる活性を持ち、パーキットリンパ腫、日和見リンバ腫、胃癌、上咽 頭癌と いった様 々な腫瘍性疾患に関係している。E
BVはその生活環において潜伏感染と溶 解感染 のニつの 感染様式を持つ。大部分の腫瘍細胞において、EB
Vは潜伏感染の状態で存 在して いること から、今までEB
Vによる発癌メカニズムについての研究は潜伏感染下で発現する遺伝子に焦点を当てて行われてきた。しかし、腫瘍細胞の一部に自発的に溶解感染に移行する細胞が認められる事や一部の溶解感染遺伝子がB1」ンバ球の感染初期に発現する事、そして、溶解感染時にI
L―6、IL‑10、IL‑13といった増殖因子が誘導されると報告さ れた事 から溶解 感染もEBVによる発癌に貢献するのでは、という可能性が指摘されてきた。そこで、我々は溶解感染遺伝子が発癌に寄与する可能性を検討するために、潜伏感染か ら溶解 感染へ移 行するためのスイッチとなるウイルス転写因子B
Z
LF
1を欠失した組換えウ イルス を作製し ウイルス産生に対する影響及びBリンパ球の不死化に対する影響を解析した。
手法
BZL
F1遺 伝 子を 含むウイ ルスゲ ノムをク 口ーニン グし、 それを用 いてBZ
LF
1に欠失 変異を 導 入し た タ ーゲテイ ングベク ターを 作製した 。電気 穿孔法を 用いて GFP発現 E
BV（野生型 EBV)感染Akat
a細胞 にターゲ ティン グベクタ ーを遺伝 子導入 した後、hygromycin
選択 に より 相 同 組 換え に よ って BZLF1遺 伝子 がノッ クアウト されたEBV(ZKO‑EBV)を含むAkata細胞を 樹立した 。さら にこの細 胞を抗 ヒトIgG抗体でウイルス産生誘導を行う事によ り 得ら れ た ウイルス 液をEB
V陰性Akata細胞に 感染さ せ、再び hygro
mycin選択を 行う
事 に より ZKO‑EBV単独感染 Akata
細 胞を樹立 した。 相同組換 えの確 認はサザ ンブロッ トに よ り 行 っ た 。 野 生 型 EBV感 染 AGS細 胞 、 ZKOー EBV感 染 AGS細 胞 は BZLF1強 制 発 現に よ ルウ イ ル ス 産生 誘 導 を行 っ た 野生 型 E
BV
感染 Akata
細 胞、ZKO−EB
V感染Akata細胞を AG
S細 胞 と 共培養す る事で樹 立した 。E
BV
感 染細胞 における ウイル ス遺伝子 の発現はイ ム ノブ 口 ッ ト、螢光 免疫染色 、RT―PC
R、FACSで 評価した 。ウイ ルス産生 はE
BV
陰性
Dau
di細 胞 に感 染 後 、GFP陽性 率 、 E
BNA陽性率 により 評価した 。ZKO‑EB
Vのトラン スフオ ー ヌー シ ョ ン 活性 は 同 じカ 価 の 野生 型 EB
Vと ZKO− EBVを 段 階 希釈 してヒ トB
リ ンバ球に感染させる事で評価した。また、ウイルスゲノムのコピー数の変化はサザンブロット
及びFISHにより検討した。
― 379―

結果
樹 立 さ れ た ZKO‑EBV感 染 Akata細 胞 は サザ ンブ ロッ トか らZKO−EBVが単 独感 染し ている事が確認さ れた。まず、ウイルス産生におけるBZL
F1の役割を調ぺたところ、野生型EBV
感 染Akata細 胞は 抗ヒ トIgG抗体 やTPA/n B
Aで 処理 する 事で 約50％の細胞に溶解感染遺伝子の発現が 起こルウイルスゲノムの増幅、子孫ウイルスの産生が認められた。それに対し て 、 ZKO‑EBV単 独 感 染 Akata細 胞 は 抗 ヒ ト IgG抗 体 や TPA/n BA処 理に よる ウイ ルス
産生誘導には 全く反応せず、溶解感染遺伝子の発現やウイルスゲノムの増幅、子孫ウイルスの産生は全 く認められなかった。しかし、BZLF1を強制発現させた場合、溶解感染遺伝子の発現、ウ イルスゲノムの増幅、子孫ウイルスの産生が認められた。ただし、子孫ウイル スの 産生 は弱 く、 それ を 用い てZKO‑EBVのトランスフオーメーション活性を検討する事は困難であ った。そこで、より効率の良いウイルス産生系を造るために、ウイルス産生を 誘 導 し た Akata細 胞 と AGS細 胞 を 共 培 養 す る 事 で 野 生 型 EBV感 染 AGS細 胞 、 及 びZKOー EBV感 染 AGS細 胞 を 樹 立 し た 。 野 生 型 EBV感 染 AGS細 胞 で は 10‑20％ の 細 胞 で 自発的な溶解感染が認められ，それに伴って自発的なウイルスゲノムの増幅、子孫ウイルスの産 生 が 認 めら れた 。そ れに 対し て 、ZKO‑EBV
感 染AGS細胞 では Ak
ata細胞 の場 合と 同様に 溶解 感染 遺伝子の発現やウイル ス産生は認められなかった。しかし、AGS細胞にBZL
F1を発現させた場合、6Xl06GFPindu
cingunit/ml程度の高いカ価のウイルス液が得られた。
こ れに より 、ZKO‑
EBVを用 いて 潜伏 感染 成立 にお ける BZL
F1の役 割を検討する事が可能と なっ た。 AG
S細胞を用いて同力価のウイルス液を調整し、ま ず、ヒトBルンバ球に野生型 EB
Vを 感染 させ た時 には 、一 過性 にBZLF
1が 発現 する が、 Zl
く o−E
BVを感染させた時にはBZ
LF1は発現しない事を確認した。次 にトランスフオーメーション活性を評価したと
こ ろ、 野生 型EBV、ZKO‑EBVとも に約 l
Xlos TDso/rrilで あり 、BZL
F1の有無で大きな差は 認め られ ず、 ZKO− E
BVも 野生 型EBVと 同様 、効 率的 に ヒト B
リ ンバ球を不死化する事が 明 ら か と な っ た 。 樹 立 さ れ た 不 死 化 Bリ ン バ 球 (LCL)で は 野 生 型EBV感染 株で のみ自発的な溶解 感染遺伝子の発現が認められたが、増殖速度、潜伏感染遺伝子の発現バターン には 違い は認められなかった。 また、サザンプ口ットやFISHによる解析では両者とも
約 5コ ピ ー のウ イル スゲ ノム を保 持し てお りBZLF
1の 有無 によ る感 染細 胞中 のEBVゲノ
ムコピー数に おける違いは認められなかった。
考察
今 回 の 結 果か らBZLF
1が E
BV感染 Bリン パ球 、上 皮細 胞で 溶解 感 染を 起こ す為 に必 須の因子である事 が示された。それに対し、Bリンパ球に感染させたときに不死化効率に差が無 くLCLの性 状に も特 に差 が認 めら れな かっ たこ とか ら B
ZLF1、 及びそれに誘導される
溶 解感 染遺 伝子 はBリ ンバ 球に おけ るEBVの潜 伏感 染の 成立 に対 しては影響を与えない
事 が明 らか とな った 。こ れ はEBVが 少数 の潜 伏感 染遺 伝 子の みで 効率的にB
リンバ球を不 死化 でき るこ とを 示し て いる 。し かし、BZ
LF
1はインターフウロンァやTNFaのシグナル を抑 制す る事 、ま た、 BZL
F1に誘 導さ れるB
IL
F1、BNLF
2a、BGLF5としゝった溶解感染
遺 伝子 はHLA‑Iの発現を抑制する事が報告されてしゝる。これ らの報告はB
ZL
F1が宿主の免疫監視機構からの逃避に寄与する可能性を示唆している。そこで我々は今後、そうしゝった 観点 から BZ
LF1がEBVに よ る病 態形 成に 寄与 して いる 可能 性を 検討する予定である。
結諭
BZLF
1は E
BVが溶 解感 染を 起 こし 、子 孫ウ イル スを 産生 する 為に 必須の遺伝子である。
BZLF
1、 及び それによって誘導される溶解感染はBリンパ球における潜伏感染の成立には影響しない。

− 380〜学位論文審査 の要旨
主 査 教 授 有 川 二 郎
副 査 教 授 志 田 壽 利
副 査 教 授 高 田 賢 藏

学位論文題名Quantitativeevaluati
onoft
heroleofEpstei
n−Bar
rvirusimmediat
e―earlyprot
einBZLFlinB−celltra
nsformation(EBウイル ス前初期遺 伝子BZL
F1のB
リン パ球トランスフオーメーションにおける役割の検討）

EBウイ ルス はヒ ト正 常Bリンバ球を不死化（トラ ンスフオーメーション）する活性をもち、バーキットリンパ腫、ホジキン1」ンバ腫、胃癌、上咽頭癌、免疫不全患者における移植後リンパ増殖症などの発症に関与する。申請者 は、E
Bウイルスがコードする転写因子BZLF1が潜 伏感 染 から 溶解感染へのスイッチ蛋白 質であること、また、感染後早期にB
ZLF1の 一過 性発 現 がみ られることをまず説明し、 本研究の目的が、BZL
F1．が Bリンパ球のトランスフオーヌーションに寄与しているか否かを明らかにすることであると説明した。 次に 、BZL
F1ノ ック アウトEB
ウイルスの作製方 法について説明を行った後、結果の説明 へと 話を 進め た。 BZ
LF1
ノックアウトEB
ウイル スは溶解感染への移行が障害されていた 。BZL
F1ノッ ク アウ トウイルスのトランスフオ ーヌーション活性は野生型ウイルスと同 程度 であ った 。樹 立さ れた 不死 化Bリ ンバ 球(LCLと 呼ば れる ）の 細胞 増 殖活性および ウイ ルス ゲノ ムの コピ ー数 は、 BZ
LF1ノッ クア ウト LC
Lと 野生 型LCLで 明 らかな違しゝは認められなかった。以上より、BZLF1の有無はBリンバ球のトランスフオーメーシヨンに影響を与えないと結論した。
質 疑応 答と して 、ま ず志 田教授より、なぜAGS
細 胞は他の細胞株に比べて高いタイターの ウイ ルス を産 生で きる のか質問があった。それに対して申請者は、AGS細胞は遺伝子導 入効 率が 良い こと 、上 皮細胞由来のE
BウイルスはB細胞への感染効率が高いこと、AGSでは 溶解 感染 を 促進 する宿主遺伝子の発現が高 いことなどがその理由として考えられる と説 明し た。 また 、SCIDマウスにおけるLCLの 造腫瘍性を検討した過去の報告について 質問 があ り、 SCIDマウ スの系では、BZL
F1依存 的に溶解感染に入った一部の細胞から産生されたI
L―6が周 囲の潜伏感染細胞の増殖を促進することが報告されていると説明した 。さ らに 、90%以上 のヒトがEBウイルスに感染 しているのになぜ病気にぬるヒトが稀なのか、という質問に対してはャ例えばパーキットルンバ腫におけるマラリア感染や上咽頭癌における塩漬け魚などが発症のコフんクターとして知られており、こうしたコファク ター が 必要 であ るた めに 病気に なる ヒト が稀 なので あろ うと 答えた 。
次に、有川教授より、本研究のような基礎研究が発癌の予防に役立っ可能性があるか、という質問がなされた。申請者は、発癌の予防は難しいかもしれないが、基礎研究が発癌― 381ー

の治 療に役立つ可能性 はあると答えた。一例として、EB N
A1
蛋白質の発現を抑 制する薬剤を 投与 する こと によ りin v
itro
およびinvi
voに おけるL
CLの増殖を抑制でき ることを報告した最近の論文を紹介した。
最 後 に 高 田 教 授 よ り 、 SCID
マ ウス に 移植 した L
CLの増 殖に 対す る B
ZLF1の 影響 とinv
itro
でのL
CL増殖 に対 する BZ
LF1の影響との間に乖離がみられるのはなぜか、 という質問がなされた。それに対して申請者は、inv
itroの方が細胞にとって優しい環境でinvivoはより厳しい環境であるため、in vivoにおいて差が顕在化し易いのではないかと考えられると答えた。それに対して高田教授から、in vivoの実験も行うべきであるとの助言がなされた。
，こ の論文は、BZLF
1遺伝子の有無がin vitroにお けるB
リンパ球のトランスフ オーメー
ショ ンに影響を与えな いことを初めて明確に示した点で高く評価される。組換 えE
Bウイルスの作製は手間と時間のかかる作業であるが、申請者は数多くの実験を根気強く着実におこない、示された実験データは質の高いもの であった。in vivoでの腫瘍増殖に対するB
ZLF1の 影 響に つい ては 今後 の検 討課題であろう。また、様々なEB
ウイルス関 連癌において B
ZLF1が果 たす 役割 につ いて も今後明らかにされるぺきであるが、本研究 で樹立した組換えウイルスはそのような研究において多大な貢献をするものと考えられる。今後のさら なる BZ
LF1の研 究が 、EBウイ ルス関連癌の発症メカニズムの解明および治 療法の開発にっながることが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請 者が 博士 （医 学） の学 位を 受 ける のに 充分 な資 格を有するものと判 定した。

ー 382―