酵母 Cryptococcus humicola UJ1 の D-アスパラギン酸酸化酵素
遺伝子の異種細胞における発現と諸性質の解析
環境生物化学研究室
指導教官

高橋俊之

山田良平 解良芳夫 高橋祥司

背景D-アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素には、D-アラニン (D-Ala) などの中性 D-アミノ酸と塩基性 D-アミノ酸を基質とする D-アミノ酸酸化酵素 (DAO)と、D-アスパラギン酸などの酸性アミノ酸を基質とする D-アスパラギン酸酸化酵素(DDO) の 2 種類存在する。DDO はフラビン酵素であり、牛腎臓から世界で初めて完全精製され諸特性が解明された。DDO は多くの哺乳類のほか鳥類、両生類、魚類などの組織に存在することが明らかにされているが、当研究室では微生物由来としては初めて酵母 Cryptococcus humicola UJ1 (UJ1) から本酵素を均一に精製することに成功した。UJ1 由来の本酵素は牛腎臓などに由来する DDO とは明らかに異なる酵素学的諸特性をもつことが示されたが、未だに本酵素の構造面における知見は乏しいままである。
本酵素の構造面に関する知見を得ることができれば、既に多くが明らかになっているDAO の構造と比較することにより、それぞれの基質特異性の違いを決定しているアミノ酸残基の特定が期待できる。これが明らかになれば幅広い基質特異性を持つ、または逆に特定の D-アミノ酸に対してのみ特異性を示す D-アミノ酸酸化酵素の創出が可能である。この研究を行うためには容易に、かつ多量に本酵素を精製できる発現・精製系が必要である。そこで本酵素 cDNA を単離し、DNA 組換え技術を用いた異種細胞における大量発現系の構築を検討する。また、精製した組換え酵素が酵母 UJ1 から精製した本酵素と同様の酵素学的諸性質を持ち、今後構造面に関する研究に使用できるか検討する。

実験と結果
1. 酵母 Cryptococcus humicola UJ1 由来 DDO の cDNA の調製
酵母 Cryptococcus humicola UJ1 (UJ1) 由来 DDO (ChDDO) の cDNA を大腸菌に組込むことで組換え本酵素の大量発現が期待され、また、遺伝子に変異を導入してアミノ酸残基を置換することで酵素反応部位の研究を進めることが可能になる。本酵母の全 cDNA は、D-アスパラギン酸を唯一の窒素源として培養した細胞から調製した全RNA を鋳型とし、逆転写酵素 を用いて調製した。ChDDO cDNA の増幅は、明らかにされていたゲノム

ChDDO 遺伝子の末端配列をもとに作成したプライマーを使用した PCR により行った。ChDDO cDNA の増幅はアガロースゲル電気泳動解析により確認した(Fig. 1)。予想された ChDDO 遺伝子の cDNA とゲノム DNA の長さの差

は 70 bp とわずかであることから、その差を確認することは困難である。そこで PCR 産物の長さを短くして電気泳動の分離を良くするため、イントロレーン
M ： DNA サイズマーカー
1 ： ゲノム DNA を鋳型とした PCR 産物
2 ： 1 の PstⅠ/XhoⅠ切断断片3 ： 全 cDNA を鋳型とした PCR 産物
4 ： 3 の PstⅠ/XhoⅠ切断断片

[kbp]
23.1
9.46.64.42.32.0

アガロースゲルを臭化エチジウムで染色ン配列を含むように制限酵素

Pst Ⅰ/Xho Ⅰで切断した PCR
産物と未処理の PCR 産物をM 1 2 3 4
Fig. 1 ChDDO cDNA の PCR による増幅の確認

アガロースゲル電気泳動解析した。その結果、全 cDNA を鋳型にした PCR 産物の方は制限酵素未処理、処理済共にゲノム DNA を鋳型にした増幅産物よりも予想された長さだけ短かったことから、ChDDO cDNA が増幅されたことが明らかになった。また、この増幅産物の塩基配列は
ゲノム ChDDO 遺伝子から推測された cDNA の配列と一致したことから、この増幅産物を発現実験に用いることにした。

2.

タグ融合組換え ChDDO 発現ベクター構築の検討
ChDDO の構造面における研究を行うためには容易、かつ大量に本酵素を精製する必要がある。そこで大量発現が期待できる大腸菌を宿主として用いて、精製を容易にするタグ融合組換え ChDDO を生産させる発現ベクターの構築を検討した。
始めに、N 末端インテイン融合 ChDDO 発現ベク
タ ー pTED7 (Fig. 2) を 構 築 し 、 発 現 用 大 腸 菌
Rosetta (DE3) に導入した。このベクターはインテインタグ (約 45 kDa) を S-S 還元剤で切断すること

Fig. 2 pTED7 のプラスミド地図

により、余分なペプチドを付加させることなく、組換え本酵素を 1 段階の精製過程で単一に精製出来る。また、この大腸菌は組換え蛋白質の大量発現に必要な T7 RNA polymerase を生産し、かつ真核生物に多く使われているコドンに対応している。この形質転換体を用いて N 末端インテイン融合 ChDDOを誘導発現させた (Table 1、Fig. 3)。これらの結果から、N 末端インテイン融合
ChDDO は大量発現するが、封入体を形成してしまうことが明らかになった。ChDDOはホモ四量体であるため四次構造の形成をインテインが妨害している可能性が考えられる。
次に N 末端 His タグ融合 ChDDO 発現ベクター pECDH2 (Fig. 4) を構築し、発現用大腸菌 Rosetta (DE3) に導入した。このベクターは 6 個の L-ヒスチジン残基からなる小さいタグを付加させるため、四次構造の形成を阻害しない可能性が強く、かつ1 段階の精製過程で単一に精製出来る。ベクター pET15b に ChDDO cDNA を挿入して構築した。この形質転換体を用いて N 末端 His タグ融合 ChDDO を誘導発現させた (Table 1、Fig. 5)。これらの結果から、N 末端 His タグ融合 ChDDO は発現されなかったことが明らかになった。この原因として、ベクターの構築に失敗している可能性が考えられた。
しかし、その可能性を検討するよりもタグを持たない組換え ChDDO の精製を試みた方が早いため、タグ融合 ChDDO を用いたアフィニティクロマトグラフィーによるワンステップの精製の検討は一度中止することにした。
残渣懸濁液

無細胞抽出液

無細胞抽出液

残渣懸濁液

[kDa]
97.466.3
42.430.0
20.1

M12345678(A) CBB 染色レーン
M 蛋白質サイズマーカー
IPTG − 無細胞抽出液
1 E. coli BL21 (DE3)2 E. coli Rosetta (DE3) IPTG − 無細胞抽出液
IPTG ＋ 無細胞抽出液
3 E. coli BL21 (DE3)4 E. coli Rosetta(DE3) IPTG ＋ 無細胞抽出液
IPTG − 残渣懸濁液
5 E. coli BL21 (DE3)6 E. coli Rosetta(DE3) IPTG − 残渣懸濁液
7 E. coli BL21 (DE3)
IPTG ＋ 残渣懸濁液
8 E. coli Rosetta(DE3) IPTG ＋ 残渣懸濁液

M12345678(B) ウェスタンブロッティング
ChDDO
約 40 kDa
ChDDO + Intain 約 95 kDa

Fig. 3 pTED7 導入形質転換体の無細胞抽出物と残渣の SDS-PAGE (A) とウェスタンブロット 解析 (B)
無細胞抽出液は蛋白質 7.5 μg をアプライした。残渣は各無細胞抽出液の回収量と同じ体積の破砕バッファーに懸濁した後、各無細胞抽出液と同体積アプライした。分離ゲルには 10 % アクリルアミドゲルを用いた。
[kDa]
97.4
66.3
42.4

レーン
M ： 蛋白質 サイズマーカー
1 ： 無細胞抽出液
2 ： 残渣懸濁液
ChDDO
約 40 kDa
ChDDO + His タグ 約 42 kDa30.020.1

Fig. 4 pECDH2 のプラスミド地図

M
12pECDH2 導 入 形 質 転 換 体 の 無 細 胞 抽 出 物 と 残 渣 のSDS-PAGE
分離ゲルに 12 % アクリルアミドゲルを用いた以外は Fig. 3 と同様の方法で行った。
Fig. 5

Table 1 作成した形質転換体の無細胞抽出液の DDO 活性

IPTG
E. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli

BL21 (DE3)
BL21 (DE3)
BL21 (DE3)
BL21 (DE3)
Rosetta (DE3)
Rosetta (DE3)
Rosetta (DE3)
Rosetta (DE3)
Rosetta (DE3)/////////

pTYB11pTYB11
pTED7
pTED7pTYB11
pTYB11pTED7pTED7pECDH2+++++Protein conc.
(mg/ml)
6.99
4.82
7.60
3.92
6.36
4.71
7.94
2.03
4.50

Total activity
(U)
0.190
0.122
81.3
0.793
0.110
0.152
59.9
0.668
06.84

Specific activity(U/mg)
0.00272
0.00255
1.09
0.02130.00185
0.003450.820
0.0352
0.152

IPTG (Isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)：Final concentration was 1.0 mM
1U = µmol / min

3.

組換え ChDDO 発現条件の最適化
今後 ChDDO の構造面に関する研究を進めるため、大腸菌を宿主にして発現させた組換え ChDDO が酵母 UJ1 から精製した ChDDO と同様の性質を持っているか確認する必要がある。そこで組換え
ChDDO の精製・特徴付けを行う上で高いChDDO 発現量を得ることを目的として、発現条件の最適化を行った。組換え
ChDDO 発現ベクターは pECD5 (高橋助

Fig. 6 pECD5 のプラスミド地図

手により構築。Fig. 6) を使用した。大腸菌

Table 2 宿主による DDO 活性の差異

での組換え蛋白質の大量発現において一般

Host strain的に試される条件を検討した。その結果、宿DDO Specific activity

(U)

1.66
2.48

104
99.3

E. coli BL21 (DE3)
E. coli Rosetta (DE3)

主は E. coli Rosetta (DE3)、培地は TB 培

DDO Total activity(U1/mg)

Condition：LB medium, 30℃, IPTG 1.0 mM, Induction time 6 h
1Unit = µmol/min

地、培養温度は 30℃、IPTG 濃度は 1.0 mM、誘導時間は 6 時間に決定した (Fig. 7, 8)。
(A)(B)(C)

50

Total activity(U/100 ml- culture)

Activity (U/g- wet cell)

Total activity(U/100 ml- culture)

100
10050

10000LB

2×YT

MediumTB

500253037

Temperature (°C)

Fig. 7 組換え ChDDO 発現条件の最適化 (A) 培地、(B) 培養温度、(C) IPTG 濃度

00.5

1IPTG concentration (mM)

2LaneM :Marker proteins[kDa]

1 : Crude extract

8100

Growth

5004Growth (OD600)

Total activity (U/100 ml-culture)

12Total activity

150

97

2 :10- 35%(NH4)2SO4 precipitate66

3 : Butyl sepharose
4 : SP sepharose

42Recombinant ChDDO
40 kDa300481216202420014M

1234Induction time (h)Fig. 9 各精製段階の SDS-PAGE

Fig. 8 IPTG による ChDDO 誘導発現と菌生育の経時変化

4.

大腸菌 E. coli Rosetta (DE3)/pECD5 からの組換え ChDDO の精製最適化された条件を使い、大腸菌 E.

Table 3 大腸菌からの組換え ChDDO の精製

coli Rosetta (DE3)/pECD5 から組換え ChDDO を発現させ、これまでにStepTotal activity(U)Protein(mg)Specific activity(U/mg)

Purification(fold)

Yield(%)

Crude extract

1210

997

1.211100確立された精製法に従って精製した

10- 35% (NH4)2SO4
precipitate

706116

6.09

5.03

58.3

(培養→超音波破砕→10-35 % 硫安沈

Butyl sepharose

464

7.57

61.2

50.5

38.3

SP sepharose

161

1.32

123101

13.4

殿→疎水性クロマトグラフィー→陽イ

Starting material was 14.1 g of wet cell

オン交換クロマトグラフィー)。精製表を Table 3 に示した。この操作で組換え本酵素を単一に精製することができた。

5.

組換え ChDDO の特徴付け
精製された組換え ChDDO の特徴付けを行い、過去の研究で明らかになった性質と一致するか確認した。

0.5ユニットからなるホモ四量体であり、至適温度、pH0.4に失活した。D-アスパラギン酸に対して強い基質特異性を示し、最も強力な競合阻害剤はマロン酸だった。
スペクトルは FAD 酵素特有の形状を示した。これらは全て UJ1 から精製した ChDDO と等しかったことから、本組換え酵素は ChDDO の構造面に関する研究に使用できることが明らかになった。

Kav

その結果、本組換え酵素は分子質量約 40 kDa のサブは 37℃、pH 7.5 で、熱耐性は 45℃ を超えると急激

Chymotrypsinogen A

0.6

OvalbuminAlbumin
Aldolase

0.3

Recombinant ChDDO

Catalase(164 kDa)

0.2
Ferritin

0.1
44.55Log Mr

5.5

Fig. 10 ゲル濾過クロマトグラフィー
による未変性組換え ChDDO の分子質量の推定

Optimal pH
100

Optimal temperature

Thermal stability

100

Recombinant
ChDDO10.06

100

Recombinant ChDDO +Malonate

ChDDO

ChDDO

67Recombinant
ChDDO1500.02

Recombinant
ChDDO10550

Recombinant
ChDDO

0.04

Absorbance

50

Relative activity (%)

Relative activity (%)

Relative activity (%)

ChDDO

8910

11010

pH

30

50

70020

Temperature (ºC )40

Recombinant ChDDO +
D-Asp

060

250

Temperature (ºC )350
450
W av ele ngth (nm)550

1 Purified from E. coli Rosetta (DE3)/pECD5.

Fig. 12Fig. 11 組換え ChDDO の至適 pH、至適温度、熱耐性
Table 4 DDO の基質特異性

Table 5 酵素反応速度に関する各値

Relative activity (%)1
Substrate(20 mM)

Recombinant ChDDO2

ChDDO3D-Asp

100100

D-Glu(0.5)4

0.4

NMDA

15.3

9.4

L-Asp--

L-Glu--

D-Ala--

D-Asn--

D-Gln-

0.7

D-Leu-

D-Pro-

D-Ser-

-

D-Arg

-

組換え ChDDO の可視スペ
クトル

Substrate

EnzymeKm1(mM)

Vmax1(U/mg)

kcat
(S-1)

kcat/Km(S-1・M-1)

D-Asp

Recombinant ChDDO2

2.92± 0.23

124±3.00

82.6

28300

ChDDO

3.65± 0.12

81.3 ± 0.9

54.4

14900

62.6 ± 3.51

D-GluRecombinant ChDDO2

2.30± 0.09

2.00

25.0± 3.5

3.04± 0.06

2.04

13.4

Recombinant ChDDO2

85.3 ±24.3

57.2 ±16.3

38.1

447

ChDDO

28.0 ± 2.1

15.8 ± 0.8

10.6

378

ChDDO
NMDA

152

1 means±SE
2 Purified from E. coli Rosetta (DE3)/pECD5.

Table 6 ChDDO に対する阻害剤の効果
Relative activity (%)1-Inhibitor(20 mM)

Recombinant ChDDO2

ChDDO-Malonate

39.6

46.9

D-Malate

66.8

65.8

meso-Tartrate

95.3

90.6

Benzoate

93.9

93.1

EDTA

110

93.8Citrate

96.0

99.4

-

1 The activity of ChDDO with D-Asp was 100%.
2 Purified from E. coli Rosetta (DE3)/pECD5.
3 Purified from Cryptococcus humicola UJ1.

(Biochim. Biophys. Acta, 1294(1996) 153).
4Calculated from Table 5.

1 The activity of ChDDO with no inhibitor was 100%.
2 Purified from E. coli Rosetta (DE3)/pECD5.

総括
1.

酵母 Cryptococcus humicola UJ1 の D-アスパラギン酸酸化酵素の cDNA を単離し、塩基配列を明らかにした。

2.

N 末端インテインタグおよび His タグ融合 ChDDO の発現を検討したが、インテインタグ融合酵素は封入体を形成した。また、His タグ融合酵素は発現しなかった。

3.

組換え ChDDO 発現ベクター pECD5 を用いた際の最適な発現条件は、宿主 E.

coli Rosetta (DE3)、TB 培地、培養温度 30℃、誘導発現に用いる IPTG の終濃度 1.0mM、誘導時間 6 時間だった。
4.

E. coli Rosetta (DE3)/pECD5 無細胞抽出液から精製を行った結果、湿重量 14.1 gの菌体から比活性 123 U/mg の単一な ChDDO が 1.32 mg 得られた。

5. 組換え ChDDO の諸性質は酵母 Cryptococcus humicola UJ1 から精製した本酵素と同じ性質を示したことから、構造面に関する研究に使用できることが確認できた。