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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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395 ( 51 )日本抗生物質学術協議会奨励賞受賞講演会記録

2011 年 11 月 4 日，学士会館 320 号室【2011 年度受賞講演，座長：清田浩】

ペニシリン低感受性 B 群連鎖球菌 (Group B streptococciwith reduced penicillin susceptibility, PRGBS)の臨床分離，流行株の解析木村幸司
名古屋大学大学院医学系研究科分子病原細菌学

B 群連鎖球菌に関してことを推奨し7⬃9)，多くの先進国で導入され，米B 群 連 鎖 球 菌 (Group B Streptococcus, GBS,

国では早期型新生児 GBS 感染症が 1000 件の出産

Streptococcus agalactiae) は，しばしば健常人の腸につき 1.7 件から 0.6 件となり，新生児の GBS 感管，女性生殖器から分離される菌種であるが，新染症防止に一定の効果をあげている10)。本邦にお生児の敗血症，髄膜炎の筆頭原因菌であり，一定いても，多くの医療施設において，GBS を保菌すの割合（欧米人では約 37%，日本人では約 15%，る妊婦に対し，予防的に抗生物質を投与している人種間で差があるとされている。）で成人女性がようであるが，本邦における GBS 感染症の正確膣に無症候性に保菌していることが知られている。

な発生率が報告されておらず，年次推移は不明で

GBS による侵襲性感染症を発症した児の約 5% がある。

死亡し，一命を取り留めた場合には，視覚，聴覚一方， GBS は，高齢者や糖尿病，癌等の基礎障害や精神遅滞が頻発するとされており，特に低疾患をもつ患者にも侵襲的な感染症を引き起こす

出生体重児が GBS 感染症の発症率が高いとされこと，院内感染の原因菌となることが知られてい1⬃6)。 GBS 侵襲性感染症は，その死亡率のる11,12)。成人の GBS 感染症においても第一選択薬

高さ，また，重篤な後遺症を頻発すること，新生は，ペニシリン系薬であるとされており，ペニシ児医療の発達から低出生体重児が増加してきていリンを含む b -ラクタム系薬に低感受性あるいは耐ることから，極めて重要な細菌感染症である。そ性を獲得した株の出現は，今後， GBS 感染症ののため，米国の Centers for disease control and pre-

治療において深刻な問題に発展する恐れがある。ている

vention (CDC) 等は，GBS の新生児への垂直感染を避けるため， GBS を膣等に保菌する妊婦に対し，分娩時にペニシリン等の抗生物質を投与する[Proceedings] KOUJI KIMURA: Analysis of clinically isolated epidemic clone of group B streptococciwith reduced penicillin susceptibility, PRGBS.

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これまでの b -ラクタム系薬に対する B 群連鎖球菌の薬剤感受性

64—26Dec. 20112）。また，一部の PRGBS は，アンピシリン，セファゾリン，セフェピム，セフォタキシムにも低これまで B 群連鎖球菌は，すべて b -ラクタム系感受性を示した。 Pulsed ﬁeld gel electrophoresis

薬に感受性であると考えられてきた。しかしなが(PFGE) 解析により，14 株のうち 12 株は，遺伝的ら，GBS に関する一部の感受性試験においては，な関連性が認められず，多様な遺伝的背景をもつ

b -ラクタム系薬に非感受性である菌株の存在が， GBS から PRGBS が発生しうることが示唆された学会などで報告されてきた。ただし，それらの報（図 1）。b -ラクタム系薬に耐性または低感受性を告は，感受性試験の誤差によるものか，真の非感示す肺炎球菌等の他の菌では，その耐性，低感受受性菌株の出現であるかなどが明確ではないもの

性機構として，高分子量のペニシリン結合タンパが多かった。そのため， Clinical and laboratory

ク群 (penicillin-binding proteins, PBPs) がアミノb -溶酸置換を獲得し， b -ラクタム系薬に耐性 /低感受血連鎖球菌において，b -ラクタム系薬に耐性を示性を獲得することが知られている。我々は，14 株

す菌株は存在しないとし，GBS においては，b -ラの PRGBS の PBPs (PBP1A, 1B, 2A, 2B, 2X) の遺クタム系薬の resistant, intermediate の判定基準値

伝子のシークエンス解析からそれらの推定アミノ

standards institute (CLSI) は， GBS を含む(break point) を設定していない 。また，CDC も酸配列を決定し，b -ラクタム系薬感受性 GBS 2 株「GBS においては，b -ラクタム系薬耐性が確認さの PBP のアミノ酸配列と比較検討した。その結13)7)れた株はない」としている 。

果， PRGBS の PBP1A, 1B, 2A, 2B には，数個のランダムなアミノ酸置換を認めたが，PBP2X はト

ペニシリン低感受性 B 群連鎖球菌

ランスペプチダーゼドメインに多数のアミノ酸置

我々は，1995⬃2005 年に国内において臨床分離換が集積していた。その中で，ペニシリン耐性肺された 14 株のペニシリン低感受性 B 群連鎖球菌

炎球菌の PBP に認められるモザイク構造のような(Group B streptococci with reduced penicillin sus-

構造ではなかったが， PRGBS では，一株を除いceptibility, PRGBS) について，慎重かつ厳密な菌て全ての株が， Q557E と V405A の何れか一方ま種同定と薬剤感受性試験を実施するとともに分子たは両方のアミノ酸置換を PBP2X に獲得してい14)。 14 株 のた（図 2）。 Q557E， V405A の両アミノ酸置換部

PRGBS は，すべて喀痰由来の菌株で，分離患者位はトランスペプチダーゼドメインの活性中心を。分離県は，関東の多くは高齢者であった（表 1）形成すると考えられる領域のごく近傍に位置するを中心に全国各地に分布していた。菌種同定としこと，また，ペニシリン低感受性 B 群連鎖球菌のて ， CAMP test， 生 化 学 同 定 ， ribosomal RNAPBP2X に認められた Q557E 置換は，解析の進んﬁngerprinting，ラテックス凝集試験を， ATCC 株でいるペニシリン耐性肺炎球菌の PBP2X に認め2 株を陽性コントロールとして行い，いずれの株られる Q552E 置換に相当することが，アミノ酸配も GBS であることを確認した。厳密な最小発育阻列の保存性から考えられた。 PRGBS で認められ止濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC)

た PBP2X の Q557E や V405A のアミノ酸置換が，の測定により，全ての PRGBS は，確かに，ペニPRGBS における b -ラクタム系薬低感受性機構のシリン (MIC 0.25⬃1 m g/ml)，オキサシリン (MIC主たる要因であることが考えられた。そこで，

2⬃8 m g/ml)，セフチゾキシム (MIC 4⬃128 m g/ml)

Q557E， V405A それぞれのアミノ酸置換をもつに低感受性を獲得していることが確認された（表PBP2X 遺伝子を b -ラクタム系薬感受性の GBS 株

生物学的に耐性機構を解析した

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表 1.

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菌株の特徴と分離場所，分離年

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表 2.

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9 種類の b -ラクタム系薬の PRGBS に対する MIC 値 (m g/ml)

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図 1.

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399 ( 55 )PRGBS のパルスフィールドゲル電気泳動像

同一医療施設から分離された 2 株を除き，すべてバンドパ
ターンが異なり， PRGBS は遺伝的背景の異なる菌株群であることが分かる。
（文献 14 より改変して掲載）に相同組み換え (homologous recombination) によ一のタイプに分類され，遺伝的に同一な背景をり導入し allelic exchange（対立遺伝子交換）を実持った株が複数の州にまたがって広がっているこ施した。作成された対立遺伝子交換株は，親株のとを CDC らのグループは示唆している。

PRGBS と同様にペニシリン，オキサシリン，セ

我々の報告以降，日本の他のグループ16)，カナ

フチゾキシムに低感受性を示したことから，

ダの 2 つのグループ17,18) からも，それぞれ PBP2X

PBP2X における Q557E ， V405A の両置換が， 遺伝子に変異のある PRGBS の存在が報告されてPRGBS の b -ラクタム系薬低感受性の主たる要因いる。

。
であることが証明された（表 3）

CDC を中心としたグループは，米国で 2003 年に高齢者の血液から分離された 4 株の PRGBS にペニシリン低感受性 B 群連鎖球菌の検出法の開発ついて解析し，我々の報告と同様に PBP2X に共我々は， PRGBS を多くの医療機関の細菌検査通して Q557E のアミノ酸置換が認められることを室で検出できるようにするために，KB ディスク15)明らかにした 。また，4 株の PRGBS は，複数のを用いたディスク拡散法によって PRGBS を検出

州 か ら 分 離 さ れ た も の の ， multilocus sequenceできるように開発した19)。日本国内で市販されてtyping (MLST) により，4 株すべて ST19 という同いる b -ラクタム系薬を含有している KB ディスク400 ( 56 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 2.

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GBS の PBP2X の模式図

PRGBS に共通して見られる V405A, Q557E 両アミノ酸変異は， PBP2X のトランスペプチダーゼドメインの活性中心を形成すると思われるモチーフのごく近傍に存在する。
（文献 14 より改変して掲載）

表 3.

組換え体に対する b -ラクタム系薬の MIC (m g/ml)を全て検討した結果，オキサシリン，セフチゾキ

くの医療機関の細菌検査室で行われているディスシム，セフチブテンの各 KB ディスクが PRGBS のク拡散法であり，特殊な装置や高価な機器，試薬。特検出に有効であることを明らかにした（図 3）を必要としないため，安価で簡便に PRGBS を検に典型的な PRGBS はセフチブテンディスクの周出でき，世界中の多くの細菌検査室で実施可能でりに増殖阻止円を形成しないため，一目瞭然にあると考えられる。

PRGBS を検出することができる。この方法は，多THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS
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縦軸はペニシリンの MIC 値。横軸は，ディスク拡散法の増殖阻止円の直径。交差の数字は，菌株数。A は，ペニシリン G ディスクを用いた場合。B は，オキサシリンディスク，C はセフチゾキシムディスク，Dはセフチブテンディスクを用いた場合。ペニシリン G ディスクでは，ペニシリン感受性株とペニシリン低感受性株を区別できないが，オキサシリンディスク，セフチゾキシムディスク，セフチブテンディスクの場合では，ペニシリン低感受性株の増殖阻止円の直径が，ペニシリン感受性株の増殖阻止円の直径よりも小さい傾向が認められる。
（文献 19 より改変して掲載）

図 3. ペニシリンの MIC 値とディスク拡散法の増殖阻止円の直径との比較
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表 4.

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Dec. 2011PRGBS の Sequence types とその数数週間の間隔をあけて連続して PRGBS が分離(n⫽3, 11%), ST4 (n⫽1, 4%), ST358 (n⫽1, 4%),
ST464 (n⫽1, 4%)となった（表 4）。eBURST 解析

された症例

PRGBS は，PBP2X 遺伝子に変異を獲得していにより，ST458 と ST1 は，同じ clonal complex にるため，どの程度の病原性を有しているか，また，。日本におけ属することが明らかとなった（図 4）

どの程度の臨床的危険度があるか等は，現在のとる PRGBS は， ST458 と ST1 を含む特定の clonal

ころ不明である。我々は PFGE 解析， MLST 解complex から多く出現しているが， PFGE 解析の

析， PBP2X 遺伝子変異解析より，遺伝的に同一結果を考え合わせると遺伝的に関連性の薄い菌株と考えられる PRGBS が数週間の間隔をあけて同群から多源的に出現しているようである。幸いな

一の患者の褥瘡から分離された症例を発表した20)。

ことに新生児髄膜炎からの分離株で多いとされてこの症例から， PRGBS が生体内に数週間の間，いる ST17 は，今回の調査では PRGBS のなかには生存しうることを示唆した。

認められなかった。

PRGBS の遺伝的背景に関して

PRGBS の多剤耐性化

日本で分離された PRGBS は， Pulsed ﬁeld gel

PRGBS の，他系統の抗菌薬に対する感受性をelectrophoresis (PFGE) により遺伝的に関連性の薄検討した結果，マクロライド系薬，キノロン系薬

い菌株から多源的に出現していることが示唆されに耐性を獲得している傾向があり，統計学的に優た14,21)。また，PBP 遺伝子の変異箇所を解析する位であることを明らかにした。このことからことによっても， PRGBS が多源的に出現していPRGBS は多剤耐性化傾向があることが明らかに21)ると考えられた 。しかしながら，米国 CDC は，なった。
（論文投稿中）米国で分離された PRGBS 4 株について MLST を行い，4 株とも ST19 になることから，米国では特15)

今後の PRGBS に関する研究

定の PRGBS 株が広がっていると報告している 。

我々は全国各地から分離される PRGBS のうち，今回，我々は，日本で分離された PRGBS 28 株に遺伝的に近縁な株群があることを見いだした。こ22)

ついて MLST を行った 。結果， ST458 (n⫽11,の株は多剤耐性化しており，今後，詳細な解析を39%), ST1 (n⫽7, 25%), ST23 (n⫽4, 14%), ST297行う予定である。

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図 4.

64—46403 ( 59 )eBURST 解析による各 Sequence type の関連性

図中の数字は，Sequence type の番号。1 アリルプロファイルの違うものを直線で繋いである。直線の距離は，遺伝的距離を反映したものではない。四角または丸で数字を囲ったものは，今回の PRGBS に含まれていた Sequencetype。丸で囲った数字は，新規の Sequence type。
（文献 22 より改変して掲載）

考察が確定した。CDC を中心としたグループによっても，米国においても PBP2X に同様のアミノ酸置

これまで GBS は b -ラクタム系薬に対し全て感換を獲得した PRGBS が存在することが確認され受性を示すと考えられてきたが，我々の詳細な解たため，今後，CLSI は，GBS の b -ラクタム系薬析により，世界で初めて PRGBS が存在することに対する resistant, intermediate についてのクライ

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テリアやブレークポイントの設定に向けて検討を開発した簡便な検査法（ディスク拡散法）の普及開始することになろう。実際，EUCAST は，我々が強く望まれている。の報告の後に GBS のペニシリンに対するブレークポイントを設定した。

謝辞

我々の研究における 14 株の PFGE 解析の結果か

日本抗生物質学術協議会奨励賞を受賞させて頂らは， PRGBS は，特定の遺伝的背景をもった株き，感謝しております。本研究は，国立感染症研ではなく，遺伝的に多様な複数の GBS 株から多究所細菌第二部（荒川宜親前部長，柴山恵吾部源的に発生していることが示唆された。また，同長）及び名古屋大学大学院医学系研究科分子病一病院で分離された PRGBS が PFGE 解析上，極原細菌学（荒川宜親教授）で主に行ったものであめて類似したパターンを呈した事例があることかり，関係研究室員の皆様に感謝致します。特に黒ら，PRGBS は，医療環境においてヒト – ヒト間で川博史先生，船橋市立医療センターの長野則之，伝播し，院内感染の原因菌となりうる可能性があ由起子両先生，ご指導頂いた荒川宜親先生に深くることも示唆された。他方，米国で分離された感謝致します。

PRGBS における MLST 解析では，ST19 という同一な遺伝的背景に属する PRGBS 株が異なる州から分離されていることから， MRSA や VRE などの 薬 剤 耐 性 菌 と 同 様 に PRGBS に も epidemicstrain（流行株）の存在が示唆されており，今後の PRGBS の拡散が懸念される。

PRGBS は，その存在が確定されて間もないため，今後，解決されなければならない課題が多く
存 在 す る 。 我 々 は ， 厳 密 な MIC 測 定 に よ り ，

PRGBS はペニシリンに低感受性を獲得していることを示したが，実際に髄膜炎等の治療にペニシリンを用いた場合に， PRGBS 株とペニシリン感受性 GBS 株とによる感染症の間で治療効果に差があるか否かについては，厳密な臨床研究の結果を待つ必要がある。また，そもそも現在までにPRGBS の分離が確認されているのは，高齢者の喀痰及び血液であり，PRGBS が新生児に敗血症，髄膜炎などの侵襲性感染症を引き起こす能力をどの程度保持しているか否かも不明である。したがって，GBS による侵襲性感染症の臨床経過に及ぼす PRGBS の影響評価に関する疫学的比較解析研究の実施が重要かつ緊急な課題となっており，そのためには，血液，髄液分離株におけるPRGBS の正確な判定とそれを可能とする我々が

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