June 2009〈資

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

253 ( 75 )料〉
日本抗生物質学術協議会・ファイザー感染症研究助成
海外留学研究成果報告

ヒト末梢血単球状の Fcg R1 の活性化による自己反応性

T 細胞誘導能を持った未熟樹状細胞の分化誘導の研究
田中志幸
京都大学ウィルス研究所

細胞制御研究分野

留学先：カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部

微生物 免疫学部門

免疫系において抗原抗体複合体 (IC) は宿主の自然免疫系の活性化とそれに伴う炎症反応の惹起に重要な役割を果たしている。特に，IgG 抗原抗体複合体 (IgG-IC) が単球状に存在する Fcg 受容体 (Fcg R) に結合して活性化することは自己免疫性疾患や III 型アレル
ギーなど組織傷害性の炎症性疾患の病態生理に関与している。
我々は固相化されたヒトの IgG を用いて単球状の Fcg R を刺激することにより自然免疫系の重要な機能を担う樹状細胞 (DC) が分化誘導されうるかを調べた。我々は固相化 IgGによる単球刺激は CD1b, CDC86, CD206 などを発現する未熟樹状細胞 (iDC) の分化を誘導し得た。また，この作用は Fcg RI (CD64) を介した GM-CSF の転写誘導に依存していることが分かった。しかしながら，固相化 IgG で誘導した iDC は GM-CSF で誘導した

iDC に比べて，CD86 の発現レベルがより高い一方で MHC class II, CD32, CD206, CD14はより低く，異なる細胞表面マーカーのパターンを示した。さらに，固相化 IgG 誘導 iDC
は GM-CSF 誘導 iDC に比べて自己のリンパ球においても同種のリンパ球においてもリンパ球増殖刺激能が高かった。
これらのことから，抗原抗体複合体による Fcg RI の活性化によって引き起こされる特異的未熟樹状細胞は自己反応性リンパ球刺激を介して抗原抗体複合体に関連した自己免疫疾患の発症機序に関与している可能性が示唆された。

Report of Research Grant: The Japan Antibiotics Research Association･Pﬁzer Research Fund on Infectious
Diseases.
MOTOYUKI TANAKA: Activation of Fcg R1 on monocytes triggers differentiation into immature dendritic cells
that induce autoreactive T cell responses.

254 ( 76 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

June 2009

抗原抗体複合体 (IC) の形成はリウマチ性関節炎(0.2⬃10 U/ml) によっても単球から CD1b⫹DC を誘(RA) や全身性エリトマトーデス (SLE) などの自己導することができる。GM-CSF と IL-4 を併用する

免疫疾患の病態生理に関わる一連の炎症反応を惹一般的な in vitro の単球由来 DC は CD1b と CD209

1⬃3)。この IC が炎症反応を引き起こすメカを両方発現するのに対して組織中や末梢血中のニズムの一つは IC が免疫グロブリン分子の Fc 部

CD1b 陽性 DC は CD209 を発現しないことから，分の受容体に結合し架橋することである。特にTLR 刺激や低用量 GM-CSF で誘導される

IgG で構成される IC は単球・マクロファージ系のCD1b ⫹DC はより生理的であると考えられる。

細胞上に発現する Fc g 受容体 (Fc g R) を架橋す

Fcg R が単球状に発現されることと，単球が樹状る 。Fcg R の架橋はこれらの細胞によるオプソニ細胞に分化することに基づいて，我々は単球状のン化された外来抗原の貪食作用や，抗体依存性細Fcg R 刺激が樹状細胞への分化を惹起し，その樹胞傷害活性 (ADCC) や様々な種類の炎症性サイト状細胞が自己免疫疾患の発症を引き起こすような

起する

4)

カインやケモカインの産生を引き起こす

5,6)

。

獲得免疫応答を誘導するのではないかと仮説を立ヒ ト で は Fcg RI (CD64), Fcg RII (CD32), Fc-てた。

g RIII (CD16) と三種の異なるクラスの Fcg R が存

材料・方法

在することが示されており，発現分布，機能や
4)

IgG アイソタイプとの親和性がそれぞれ異なる 。 リガンド・抗体
CD32 と CD16 が IgG に対して低い親和性（Kd⫽10⫺5⫺7から 10 ）を示すのに対して CD64 は⫺8 4)

TLR2/1 リ ガ ン ド (Mycobacterium tuberculosis
19kD lipopeptide) は購入した (EMC Microcollec-

IgG 高親和性の受容体である (Kd⫽10 ) 。CD64

tions)。結核菌抽出物は文献にあるように超音波

は単球，マクロファージあるいはインターフェロ

破 砕 し た も の を 14)， Dr. JOHN BELISLE (Colorado

ン g で刺激された顆粒球などミエロイド系の細胞State University, Fort Collins, CO) か ら 提 供 さ れに特異的に発現する。また，CD64 の架橋によった。GroES 蛋白質は国立アレルギー感染症研究所て TNF-a , IL-6 や GM-CSF などの炎症性サイトカとの契約 (N01-AI-25469 “Leprosy Research Sup-

インの産生が引き起こされることが分かっていport”) に基づいて Dr. PATRICK BRENNAN から提供さ7⬃9)れた。 GroES ペプチド 15) は SynPep を用いて合成

単球系の細胞は様々な受容体刺激によって活性

した。

る

。

化されて樹状細胞を含む抗原提示細胞など自然免
疫や獲得免疫の調節に関わる細胞群に分化す

固相化ヒト IgG

る10,11)。我々は以前，単球状に発現している特定

健常人ドナーのプール血清由来ヒト IgG (Equi-の Toll 様受容体 (TLR) を刺激することによって，

tech-Bio, Inc, Kerrville, TX) はエンドトキシン無単球を強力な抗原提示能を伴った CD1b 陽性樹状

含有の PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) に様々な濃⫹細胞 (CD1b DC) と貪食能の高い CD209 陽性マク

度 (0.2⬃125 m g/ml) で溶解し，プラスチック製培

ロファージの二種類の細胞に急速に分化させうる

養プレート上に 4°C で overnight インキュベーショ

12)⫹

事を示した 。 CD1b DC はハンセン病においてンしてから使用した。培養開始前にコーティング

は感染部位に局在し病原体への抵抗性に関わってしたプレートを PBS で 2 回洗浄した。

いることが示されている

12,13)。また， in vitro でTLR 刺激のみならず低用量の GM-CSF

June 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

255 ( 77 )フローサイトメトリー分析

単球の分化誘導インフォームドコンセント (UCLA Institutional

以下の抗体をフローサイトメトリー分析に用い

Review Board #92-10-591-33) を得られた健常人ド

た 。 BCD1b3.1（ 抗 CD1b16), mIgG1k ）， 4A76

ナーから全血を採取し，末梢血単核球 (PBMC) を（ 抗 CD1b， Beckman Coulter, mIgG2a）， HI149

Ficoll-Hypaque (Ficoll-Paque; Pharmacia Biotech （抗 CD1a, BD Biosciences），AD5-8E7（抗 CD1c,AB) 濃度勾配遠心法で分離した。末梢血単球はMiltenyi Biotec）， L243（ 抗 HLA-DR, BD Bio-

PBMC か ら Percoll (Amersham Bioscience, Upp-

sciences），MEM-233（抗 CD80, Caltag Laborato-sala, Sweden) 濃度勾配法で分離した。特に記載のries），2331（FUN-1）（抗 CD86, BD Biosciences），

な い 場 合 ， 単 球 の 培 養 は 37 ° C で グ ル タ ミ ン

HB14（ 抗 CD40, Caltag Laboratories）， GHI/61(2 mM)，ペニシリン (100 U/ml)，ストレプトマイ （抗 CD163, BD Biosciences）， 19.2（抗 CD206），
シン (100 m g/ml) と 10% 非働化 FCS (OMEGA Sci-

DCN46（抗 CD209, BD Biosciences），TüK4（抗entiﬁc, CA) を添加した RPMI1640 培地で行った。 CD14, Caltag Laboratories），3G8（抗 CD16, Cal単球の刺激は培地のみ，固相化 IgG あるいは非固

tag Laboratories）， FLI8.26（ 抗 CD32, BD Bio-

相 化 IgG (0.04⬃125 m g/ml), rGM-CSF (0.2⬃10

sciences）， 10.1（ 抗 CD64, BD Biosciences），

U/ml), 結核菌由来 19 kD リポペプチド (10 m g/ml)

M5E2（ 抗 CD14, BD Biosciences）， HB15e（ 抗の各存在下で 2 日ないし 3 日間培養した。

CD83, BD Biosciences）， SCO6（ 抗 CDw116,⫹⫹

末梢血単球中の CD16 と CD64 分画について

Immunotech）および適切なアイソタイプコントの実験では，前述のように単球を分離してから抗ロ ー ル (Caltag Laboratories, Sigma-Aldrich, BD

CD16MACS ビーズ (Miltenyi Biotec) を添加してBiosciences)。

4°C で 20 分間培養した。磁気カラム通過分画を
CD64⫹ 単球とし，磁気カラム吸着分画を CD16⫹分画とした。磁気カラム分離操作はそれぞれ 2 回ずつ行った。

GM-CSF リアルタイム PCR
単球は培地のみ，固相化 IgG（コーティング溶
液中濃度 0.04⬃25 m g/ml）あるいは 19 kD リポペ
プチド (10 m g/ml) の存在下で 3 時間刺激し，文献

Fcg R, GM-CSF ブロッキングアッセイに記載されている方法で RNA を抽出し cDNA を

上述のように分離した単球に 20 m g/ml の 3G8合成した17)。GM-CSF のプライマー配列は以下の（抗 CD16 抗体， BioLegend）， AT10（抗 CD32 抗

通 り ： forward, 5⬘-GCCTCACCAAGCTCAAGG-

体 ， AbD Serotec）， 10.1（ 抗 CD64 抗 体 ， AbD

G-3⬘; reverse, 5⬘-GGAGGGCAGTGCTGTTTG-

Serotec），107.3（マウス IgG1k アイソタイプコン

TAG-3⬘。 PCR 反 応 に は Sybr Green PCR Masterト ロ ー ル ， BD Biosciences）， BVD2-23B6（ 抗Mix (BioRad)を使用した。GM-CSF のサンプルご

GM-CSF 抗体，BD Biosciences）あるいは R35-95との比較定量と標準化は文献に記載された方法で（Rat IgG2a アイソタイプコントロール，BD Bio-

行った17)。

sciences）を加え氷上で 20 分間インキュベーショ
ンしてから，固相化 IgG コーティングした培養
ウェルに移した。

T 細胞アッセイ
リンパ球混合試験 (MLR) では，Fcg R 刺激された，あるいは rGM-CSF で誘導された CD1b 陽性細胞を前述の様に準備し，放射線処理した。同種256 ( 78 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

June 2009

MLR には HLA 不一致の健常人ドナーから採取し次に我々は固相化 IgG 刺激または rGM-CSF 刺

た T 細胞を使用し自己 MLR には単球を採取した

激で得られた CD1b 陽性細胞の表現型を比較検討のと同一人物の T 細胞を使用した。T 細胞の分離した。それぞれの刺激での CD1b 発現レベルが同には Rosette Sep T cell enrichment cocktail (Stem

等となるように，25 m g/ml でコーティングした固Cell Technologies) を用いた。単球に培地のみある

相化 IgG 刺激した単球と 0.2 U/ml の rGM-CSF で

いは T 細胞浮遊液を加えた。培養上清中の IFN-g

刺激した単球を培養 2 日目に回収して，様々な細濃度を ELISA 法 (BD Biosciences) で測定し，T 細胞表面マーカーで染色しフローサイトメトリーで18)胞の増殖を文献に記載された方法で測定した 。

分析した（図 1c）。固相化 IgG 刺激した単球とMHC class II 拘束性の実験では，単球の分化と放rGM-CSF 刺 激 し た 単 球 は 共 に ， MHC class II,

射線照射を前述の様に行い，分化した樹状細胞をCD40, CD86 (B7.2) の高発現と CD16 (Fcg RIII),

以前我々が報告した GroES 蛋白質あるいは GroES

CD64 (Fcg RI), CD14 の発現低下を示し，未熟樹

ペプチド特異的な MHC class II 拘束性 T 細胞と共状細胞に似た表現型であった。しかしながら，明培養した12)。

確な相違点もあった。CD86 の発現レベルは固相化 IgG 刺激した単球でより高く， 一方， MHC

class II, CD32 (Fcg RII), CD206（マンノース受容結果
Fcg R の活性化は単球の分化を誘発する体）と CD14 はより低かった。これらの結果は固Fcg R を介した活性化によって in vitro でサイト

相化 IgG 刺激で誘導した未熟樹状細胞は rGM-

カインで単球から誘導された樹状細胞の成熟化をCSF で誘導したものと似ているが異なる細胞であ19)抑制することができることは知られていた 。今ることを示唆していると考えられた。

回，我々は Fcg R 刺激が未分化の末梢血単球に与える直接の影響について研究した。健常人末梢血

固相化 IgG による単球の Fcg R 刺激は GM-CSF

から分離した単球をプラスチック培養ウェル状にの転写活性を誘導する

様々な濃度 (0.04⬃125 m g/ml) で固相化した健常人

GM-CSF が Fcg R 活性化による単球の CD1b 発血清由来の IgG (hIgG) の存在下で培養した。培養現に関与しているかどうか検討するために，まず2 日目に細胞を回収して樹状細胞マーカーである

我々は Fcg R の活性化によって GM-CSF の mRNA

CD1b の発現レベルをフローサイトメトリーを用の転写が引き起こされるか調べた。そのために，いて測定した。その結果，固相化 IgG はコーティ

末梢血単球を固相化 IgG で刺激し単球中の GM-

ング時の濃度依存性に CD1b の発現を誘導した

CSF mRNA 量をリアルタイム PCR で測定した。

（図 1a）。一方，固相化せずに培養液に直接加えその結果，固相化 IgG は用量依存性に GM-CSF

た IgG は単球状の CD1b 発現を誘導しなかった。

mRNA を誘導し，25 m g/ml の固相化 IgG 刺激によ

以前，我々はリコンビナント GM-CSF (rGM-CSF)

る mRNA 量 は 10 m g/ml の TLR2/1 リ ガ ン ド

で二日間刺激したヒト末梢血単球が未熟樹状細胞（19 kD リポペプチド）による刺激に近かった（未の 形 態 と CD1b 発 現 を 含 む 表 面 マ ー カ ー 発 現

刺激単球に比較して 50 倍 vs 45 倍）（図 2a）。まパターンと機能を備えるようになることを示した， Fcg R 刺激した単球は TNF-a , IL-6, IL-1b な

12,20)。CD1b の平均輝度 (MFI) では rGM-CSF 刺どのほかの炎症性サイトカインも産生したが rGM-

激に及ばないものの，固相化 IgG による CD1b 発

CSF 刺激した単球では炎症性サイトカインは産生。
現比率は rGM-CSF 刺激と匹敵した（図 1b）

されなかった。

たJune 2009

図 1.

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

257 ( 79 )固相化したヒト IgG による Fcg R の活性化は CD1b 陽性未熟樹状細胞の分化を誘導する

a. 様々な濃度の固相化 IgG，可溶性ヒト IgG (0.04⬃125 m g/ml) あるいはリコンビナント GM-CSF (10 U/ml) で単球を刺激し，培養 2 日目に CD1b 陽性細胞の百分率をフローサイトメトリーで求めた。データは 3 回の独立した実験から平均
CD1b 陽性細胞百分率と標準誤差を示した。
b. 固相化 IgG (25 m g/ml), rGM-CSF (10 U/ml) で単球を刺激，あるいは未刺激で 2 日間培養して，抗 CD1b 抗体でラベルしフローサイトメトリーで測定した。ドットプロットは 3 回の独立した実験の一つを示している。
c. 固相化 IgG (25 m g/ml), rGM-CSF (0.2 U/ml) あるいは培地のみで単球を刺激し，培養 2 日目に細胞を回収し抗 CD1b抗体と図に示したマーカーで共染色した。フローサイトメトリー上で CD1b 陽性細胞にゲートをかけ，データを少なくとも 3 回の独立した実験の平均輝度 (MFI) と標準誤差で示した。

258 ( 80 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 2.

62—_3

June 2009

固相化 IgG による単球上の Fcg R 活性化は GM-CSF 転写活性を誘導する

a. 単球を 3 時間固相化 IgG (0.04⬃25 m g/ml) あるいは TLR2/1 リガンド (10 m g/ml) で刺激した後，細胞を回収してリア
ルタイム PCR を行った。3 回の独立した実験からの未刺激細胞に対する mRNA の増加率の平均値と標準誤差を示した。
b. 抗 GM-CSF 抗体あるいはアイソタイプコントロールの存在下または非存在下に単球を固相化 IgG (0.2 m g/ml) で刺激した。培養 2 日目に CD1b 陽性細胞の百分率をフローサイトメトリーで求めた。データは 2 回の独立した実験のうちの1 回を示している。

さらに我々は， GM-CSF が Fcg R 刺激による

HLA-DR, GM-CSF 受容体の発現レベルを比較し

CD1b 発現誘導に必要かどうかを明らかにするた

た。健常人由来末梢血単球を CD14, CD16, CD64

めに，単球を抗 GM-CSF ブロッキング抗体またはと 同 時 に CD32, CD116（ GM-CSF 受 容 体 a 鎖 ）そのアイソタイプコントロールの存在下に固相化のモノクローナル抗体でラベルして，CD14 陽性

IgG 刺激を行った。抗 GM-CSF モノクローナル抗

単球についてフローサイトメトリーで検討した。

体によるブロッキングによって固相化 IgG による

文献上で報告されていたように，CD14 陽性単球

CD1b 発現レベルはアイソタイプコントロールまは比較的少数の CD16⫹CD64⫺ 細胞と比較的多数

たは抗体未添加の場合に比べておよそ 60% 低下しの CD16⫺CD64⫹ 細胞に分かれていた（図 3a）。両た（図 2b）。これらのデータは固相化 IgG による方の細胞集団の CD32 と HLA-DR の発現レベルは

単球刺激は GM-CSF の転写を誘導し， 十分な

ほ ぼ 同 等 だ っ た （ 図 3b ）。 興 味 深 い こ と に ，CD1b 陽性未熟樹状細胞への分化に必要であるこ

CD16⫺CD64⫹ 細胞は CD16⫹CD64⫺ 細胞にくらべとを示した。

て高いレベルの CD116 を発現していた（図 3c）。
また， CD1a と CD1b はどちらの細胞集団にも発末梢血単球における Fcg R の発現の検討
文献上，ヒトの末梢血単球は主に 2 つの細胞集CD16⫺CD64⫹ 細胞がより高い CD116 発現レベル

CD14brightCD16⫺CD64⫹ の単球から成り立つことを示したことから，これらのデータはが報告されている。これらの細胞集団のうちどち

CD16⫺CD64⫹ 単球が CD1b 陽性未熟樹状細胞のらが CD1b 陽性未熟樹状細胞の前駆細胞であるか前駆細胞である可能性がより高いことを示唆してを調べるために，我々は二種類の単球上の Fcg R,いる。

CD16 CD64⫺(CD40, CD80, CD86) は同程度に発現していた。

の単球と団，CD14dim⫹

現していなかった。MHC class I と共刺激分子群

June 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 3.

62—_3

259 ( 81 )ヒト末梢血単球分画における Fcg R の発現

a. ヒト末梢血単球を抗 CD14，抗 CD16，抗 CD64 モノクローナル抗体でラベルした。CD14 陽性単球分画におけるCD16 と CD64 の発現をドットプロットで示した。
b, c. CD14⫹CD16⫹ 分画と CD14⫹CD64⫹ 分画をそれぞれ抗 CD32，抗 HLA-DR，抗 CD116 抗体でラベルした。データ
は 3 回の独立した実験の MFI の平均値と標準誤差を示している。（左側および中央）

固相化 IgG は CD64 を介して CD1b 陽性未熟樹状mRNA 転写活性においても調べた。前述のように細胞への分化を惹起する

Fcg R 刺激と CD64 ブロッキングを行い，培養開始

どちらのヒト末梢血単球集団が CD1b 陽性未熟

3 時間後に細胞を回収して GM-CSF mRNA を測定

樹状細胞の前駆細胞であるか，より明らかにするした。その結果，抗 CD64 抗体存在下では 73%，

ために，Fcg R と IgG の Fc 部分との結合を阻害す

抗 CD16 抗体存在下では 32% の GM-CSF 転写活るモノクローナル抗体を利用した。まず始めに，性抑制が見られたが，アイソタイプコントロール

CD1b の細胞表面発現レベルへの Fcg R ブロッキン

では見られなかった（図 4b）。抗 CD32 抗体を用グ抗体の効果を調べた。抗 Fcg R 抗体あるいはアいたブロッキングでも GM-CSF 転写活性と CD1b

イソタイプコントロールの存在下または非存在下発現誘導の抑制が観察されたが，その程度はにおいて単球を固相化 IgG で刺激した。その結果，

CD64 ブロッキングよりも小さかった。

培養 2 日目の時点で抗 CD64 抗体の存在下で刺激

CD14 陽性単球のうち CD16⫺CD64⫹ 細胞集団した単球では抗体非存在下に比べて CD1b の発現が CD1b 発現細胞の前駆細胞かどうか明らかにすレベルが 46% 低下していたが，抗 CD16 抗体やアるために，二つの単球集団を磁気ビーズを用いてイソタイプコントロールでは発現抑制は認められ分離してから固相化 IgG で刺激した。 CD14 陽性なかった（図 4a）。

単球全体と CD16⫺CD64⫹ 細胞集団は固相化 IgG

次に CD64 のブロッキングの効果を GM-CSF

刺激と rGM-CSF 刺激の両方において CD1b を発

260 ( 82 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

June 2009

図 4. 固相化 IgG で引き起こされる CD1b 陽性細胞の分化は CD64 依存性である

a. 図示したブロッキング抗体またはアイソタイプコントロール (10 m g/ml) の存在下あるいは非存在下に末梢血単球を固相化 IgG (0.2 m g/ml) で刺激した。培養 2 日目に細胞を抗 CD1b 抗体で標識し，フローサイトメトリーを行った (n⫽2)。
b. 図示したブロッキング抗体またはアイソタイプコントロール (10 m g/ml) の存在下あるいは非存在下に末梢血単球を固相化 IgG (0.2 m g/ml) で刺激した。培養 3 時間目に細胞を回収し mRNA を抽出し，GM-CSF mRNA の転写活性をリアル
タイム PCR で測定した (n⫽2)。
c. 抗 CD16 抗体標識磁気ビーズを用いて，末梢血単球を CD16 陽性と CD16 陰性集団に分離した。CD16 陽性，CD16
陰性集団または未分離の単球を固相化 IgG (25 m g/ml) あるいはリコンビナント GM-CSF (0.2 U/ml) で 2 日間刺激した。
回収した細胞中の CD1b 陽性細胞の百分率をフローサイトメトリーで測定した (n⫽2)。

現したが， CD16⫹CD64⫺ 細胞集団は未刺激細胞

性細胞が両方とも未熟樹状細胞の表現型を示すこと同程度の CD1b しか発現しなかった（図 4c）。

とから，我々はこれらの CD1b 陽性細胞の T 細胞⫺⫹

結論として，固相化 IgG は CD16 CD64 単球上活性化能を検討した。Fcg R 活性化と rGM-CSF 刺の CD64 を介して GM-CSF の産生を誘導し，その激によって分化した未熟樹状細胞の機能を My-

結果 CD1b 陽性未熟樹状細胞への分化を起こすとcobacterium leprae 10 kDa GroES 蛋白由来のペプ考えられた。

チドを認識する MHC class II 拘束性 T 細胞クローンである 9-14B GroES 細胞への抗原提示能を持っ

Fcg R 刺激で分化した CD1b 陽性未熟樹状細胞はて比較した。どちらの CD1b 陽性未熟樹状細胞もT 細胞を活性化する

T 細胞クローンの増殖と IFN-g の産生を惹起した

Fcg R 刺激と rGM-CSF 刺激で得られた CD1b 陽が， rGM-CSF 刺激による未熟樹状細胞のほうがJune 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

図 5.

62—_3

261 ( 83 )Fcg R 刺激で分化した CD1b 陽性未熟樹状細胞は T 細胞を活性化する

a. MHC クラス II 拘束性についての実験では，単球を前述したように培養液のみ，固相化 IgG または GM-CSF で刺激して分化誘導した。回収した樹状細胞を MHC クラス II 拘束性 T 細胞株（1⫻104 個）と GroES 蛋白または GroES ペプチ
ドと共培養した後，培養上清の IFN-g ELISA と T 細胞増殖試験を行った。図示したデータは 2 回の実験の 1 回を示す。
b. リンパ球混合試験 (MLR) では，前述した方法で固相化 IgG またはリコンビナント GM-CSF で分化した CD1b 陽性細胞を得た。同種 MLR では HLA 不適合ドナーから，自己 MLR では単球を得たのと同一のドナーから Rosette Sep T cellenrichment cocktail (StemCell Technologies) を用いて T 細胞を得た。T 細胞：抗原提示細胞の比率は 10 : 1 から 300 : 1まで変化させ，IFN-g を ELISA (BD Biosciences) で測定した。T 細胞の増殖はトリチウム取り込み試験で測定した。図示
したデータは 3 回の実験のうちの 1 回を示す。

抗原提示能は優れていた（図 5a, 5b）。これに対た未熟樹状細胞はより強い同種 /自己 T 細胞増殖

して，同種リンパ球を用いたリンパ球混合試験

能を持つと言う点で rGM-CSF 刺激で得られた未(MLR) では Fc g R 活性化 CD1b 未熟樹状細胞は

熟樹状細胞と機能的に異なると言うことを示唆し

rGM-CSF 誘導細胞の 2 倍から 5 倍の T 細胞増殖能ている。

を示した（図 5c）。さらに， CD1b 陽性未熟樹状細胞の前駆細胞を得た健常ドナーと同一ドナーか考察ら採取したリンパ球を用いた自己 MLR 試験では，

IC による自然免疫系の細胞に発現する Fc 受容

やはり Fcg R 活性化 CD1b 未熟樹状細胞は rGM-体の活性化は疾患において組織傷害性の炎症を引

CSF 誘導細胞よりも強い T 細胞増殖能を示した

き起こす。この研究で我々は，ヒト末梢血単球に（図 5c）。これらのデータは Fcg R 活性化で得られ発現している Fcg R を活性化することによって，

262 ( 84 )THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

June 2009

単球が CD1b 陽性未熟樹状細胞へ分化することを

GM-CSF 単独で誘導した未熟樹状細胞の形態，細明らかにした。この樹状細胞の分化機序には胞表面マーカーの表現型や強い抗原提示能はこれ

CD64 (Fcg RI) を介したシグナルと GM-CSF の転らの細胞が過去に報告された未熟樹状細胞と同様

写活性上昇が必要であった。前駆細胞となる単球のものであることを示し12,24)，ハンセン病皮膚病

は GM-CSF 受容体を高発現する CD16⫺CD64⫹ 分

変やヒトリンパ組織に分布する未熟受容細胞の細画であり，固相化 IgG によって特異的に活性化さ胞表面マーカーの発現パターンと関連性が深いこれ未熟樹状細胞へ分化していることが示唆された。

とも示した 12)。今回の研究で，我々は Fcg R を活Fcg R 活性化による未熟樹状細胞と rGM-CSF 刺激性化された単球が GM-CSF 転写活性を増加させ，による未熟樹状細胞では表現型と機能に相違点が

抗 GM-CSF 抗体で CD1b 陽性樹状細胞の分化を抑あり，Fcg R 活性化樹状細胞は rGM-CSF 刺激樹状制できることを示すことによって， Fcg R を活性細胞に比べてより効果的に自己あるいは同種の T化された単球が CD1b 陽性未熟樹状細胞へ分化す

細胞増殖を刺激することができた一方で，細菌由

るには GM-CSF が不可欠であることを示した。

来抗原の提示能では劣っていた。

GM-CSF はその mRNA や蛋白が炎症組織や自己獲得免疫応答を調節する自然免疫応答の能力の免疫病患者から検出されることから，自己免疫病

発生や調節は樹状細胞の機能によるところが大きの機序に関与していると考えられる25)。しかしな

い 21)。過去の文献では単独のあるいは複数のサイ

がら， CD1b 発現を誘導する能力を比較するとトカインの組み合わせによる樹状細胞の分化や成Fcg R 活性化と rGM-CSF 刺激の間には違いがあ

熟化に関する研究に焦点を当ててきた 。免疫複る。最大限の Fcg R 活性化（コーティング溶液中

合体に関連した自己免疫疾患や炎症性疾患の発症の IgG 濃度： 25 m g/ml）と同等の CD1b 発現レベ

機序においても樹状細胞は重要な役割を演じていルを得るのに必要な rGM-CSF は以前の実験で使る22,23)。しかしながら，Fcg R の架橋による活性化

用されていた量の 1/5 から 1/50 量 (0.2 U/ml) でしかと単球への樹状細胞への分化との間の関連や機序ない。同様に，健常人血清中や滑膜液中に検出さについてはまだよく分かっていなかった。また，れる GM-CSF 量はきわめて低いか，検出感度以下

それに関する研究はサイトカインで誘導された樹である 26)。慢性関節リウマチ (RA) 患者の滑膜液状細胞に関するものに限られていた。今回の研究中においてすら GM-CSF 濃度は 0.2 U/ml（ GM-は単球の Fcg R の架橋はそれ単独でも未熟樹状細CSF 約 35 ng/ml 相当）よりもずっと低い25)。さら胞への分化を引き起こし，その未熟樹状細胞は自に，これら二つの未熟樹状細胞は異なる表現型を

己の T 細胞増殖を刺激しうることを明らかにした。

示し，重要なことには， Fcg R 活性化未熟樹状細我々の得た知見は免疫複合体の存在はそれ自体で胞は自己ないし同種 T 細胞を強力に刺激できる。

も自己免疫病の症状や免疫複合体病を引き起こす

これらの知見は Fcg R で誘導される未熟樹状細胞のに十分なきっかけになりうることを示唆していの分化は GM-CSF に依存してはいるが，別のシグる。

ナルやサイトカインがこの特殊な未熟樹状細胞の19)GM-CSF と IL-4 の組み合わせで単球を刺激する

分化に関わっているに違いないことを示している。

ことにより免疫療法にも有用な強力な単球由来樹

Fcg R の自己免疫疾患の病態生理への関与は細状細胞を誘導することができるが，我々はこれま

胞内ドメインに ITAM モチーフを持つ CD32a とでに GM-CSF 単独で単球を刺激することでも未熟

ITIM モチーフを持つ CD32b の対による相反的な樹状細胞を誘導できるモデルを確立した 12,20)。

制御を軸に研究されてきた27,28)。特に，CD32b はJune 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_3

263 ( 85 )自己免疫疾患への感受性の決定因子と考えられての病態生理学的機序において，自然免疫系は獲得きた。実際に，ヒトの CD32b をコードする遺伝子

免疫系の二つの側面，すなわち液性免疫反応を細FCGR2B の 1 アミノ酸残基の多型性が慢性関節リ胞性免疫へと転換させることでリンクさせている。

ウマチの臨床的重傷度と関連することが示されてこの転換は自己反応性 IgG による自己免疫疾患，

きている 29)。 これに対して， CD64 は CD16 やアレルゲンやハプテン複合体反応性 IgG によるア

CD32 に対して IgG への親和性が 10 倍から 100 倍

レルギー反応，あるいは病原性微生物に対する抗も強く，最も高い親和性を持つにもかかわら体で引き起こされる感染症などにおいて起り得る。

23)

ず ，免疫複合体病や自己免疫疾患に果たす役割

いずれにしても，このメカニズムの鍵として CD64

はよく分かっていなかった。 今回， 我々は抗を特定したことは，患者の罹患率や死亡率を悪化

CD64 モノクローナル抗体によって分化が阻害ささせうるこれらの免疫反応を防止する治療法のれることから，Fcg R の中でも主に CD64 が CD1b

ターゲットを提供するものである。

陽性未熟樹状細胞への分化を担っていることをつきとめた。さらに，磁気ビーズ法で分離した未刺⫹⫹

激 の 単 球 の う ち CD16 CD14 分 画 で は な く⫹⫹

謝辞
我々はカリフォルニア大学ロサンゼルス校フ

CD64 CD14 分画が CD1b 陽性未熟樹状細胞へ

ローサイトメトリー共同実験室に設備の利用につ⫹分化したことは，CD64 CD14 単球が CD1b 陽性

いて感謝する。この研究はニューヨークコミュニ

樹状細胞の前駆細胞であることを示唆している。

ティトラストのハンセン病および結核研究のため

⫹

⫹

⫹

CD64 CD14 単球が GM-CSF 受容体をより多くのハイザープログラムと日本抗生物質学術協議会

発現していることもこの考えを支持している。

2005 年度ファイザー感染症基金の支援を受けた。

CD32 の発現レベルは CD64 に比べてかなり高かっ
たにもかかわらず，CD32 のブロッキングの効果

参考文献

は常に CD64 に対する効果よりも小さかった。

1) LORENZ, H. M.; M. HERRMANN & J. R.
KALDEN: The pathogenesis of autoimmune
diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 235
Suppl.: 16⬃26, 2001
2) SCHIFFERLI, J. A. & R. P. TAYLOR: Physiological and pathological aspects of circulating
immune complexes. Kidney Int. 35: 993⬃
1003, 1989
3) SCHMIDT, R. E. & J. E. GESSNER: Fc receptors
and their interaction with complement inautoimmunity. Immunol. Lett. 100: 56⬃67,
20054) RAVETCH, J. V. & S. BOLLAND: IgG Fc receptors. Ann. Rev. Immunol. 19: 275⬃290, 2001
5) BERGER, S.; H. BALLO & H. J. STUTTE: Immune complex-induced interleukin-6, interleukin-10 and prostaglandin secretion byhuman monocytes: a network of pro- andanti-inﬂammatory cytokines dependent on

CD64 活性化による樹状細胞分化への効果は分化のステージに特異的なものである可能性もある。
最近の報告では GM-CSF と IL-4 の組み合わせで刺激中の単球に対して CD64 の架橋を行ったとこ
ろ，CD64 架橋無しの場合に比較して樹状細胞の表現型の発現程度が低く，抗原提示細胞としての機能も阻害されていたという19)。
結論として，我々は固相化 IgG が CD64 の活性化を介してサイトカインの添加が無くても単球か
ら未熟樹状細胞への分化を直接的に引き起こすことを明らかにし，これらの未熟樹状細胞が自己反応性 T 細胞応答を誘導することを示した。 Fcg Rを活性化された単球の CD1b 陽性未熟樹状細胞への分化能は，免疫複合体関連自己免疫疾患あるいは炎症の機序を示すものであるかもしれない。こ264 ( 86 )

6)

7)

8)

9)

10)

11)

12)

13)

14)

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

the antigen:antibody ratio. Eur. J. Immunol.
26: 1297⬃1301, 1996
MARSH, C. B.; J. E. GADEK, G. C. KINDT, etal.: Monocyte Fc gamma receptor cross-linking induces IL-8 production. J. Immunol.
155: 3161⬃3167, 1995
DEBETS, J. M.; J. G. VAN DE WINKEL, J. L. CEUPPENS, et al.: Cross-linking of both Fc
gamma RI and Fc gamma RII induces secretion of tumor necrosis factor by humanmonocytes, requiring high afﬁnity Fc-Fc
gamma R interactions. Functional activationof Fc gamma RII by treatment with proteases
or neuraminidase. J. Immunol. 144:
1304⬃1310, 1990
KRUTMANN, J.; R. KIRNBAUER, A. KOCK, et al.:Cross-linking Fc receptors on monocytes
triggers IL-6 production. Role in anti-CD3induced T cell activation. J. Immunol. 145:
1337⬃1342, 1990
HERRMANN, F.; S. DE VOS, M. BRACH, etal.: Secretion of granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor by human blood
monocytes is stimulated by engagement of Fc
gamma receptors type I by solid-phase immunoglobulins requiring high-afﬁnity Fc-Fc
gamma receptor type I interactions. Eur. J.
Immunol. 22: 1681⬃1685, 1992
BANCHEREAU, J.; F. BRIERE, C. CAUX, et al.:Immunobiology of dendritic cells. Ann. Rev.
Immunol. 18: 767⬃811, 2000
LANZAVECCHIA, A. & F. SALLUSTO: Regulationof T cell immunity by dendritic cells. Cell
106: 263⬃266, 2001
KRUTZIK, S. R.; B. TAN, H. LI, et al.: TLR activation triggers the rapid differentiation of
monocytes into macrophages and dendritic
cells. Nat. Med. 11: 653⬃660, 2005
SIELING, P. A.; D. JULLIEN, M. DAHLEM, et al.:CD1 expression by dendritic cells in humanleprosy lesions: correlation with effective
host immunity. J. Immunol. 162: 1851⬃
1858, 1999
BECKMAN, E. M.; A. MELIAN, S. M. BEHAR, etal.: CD1c restricts responses of mycobacte-

15)

16)

17)

18)

19)

20)

21)

22)

23)

24)

62—_3

June 2009

ria-speciﬁc T cells. Evidence for antigen
presentation by a second member of thehuman CD1 family. J. Immunol. 157:
2795⬃2803, 1996
KIM, J.; A. SETTE, S. RODDA, et al.: Determinants of T cell reactivity to the Mycobacterium leprae GroES homologue. J. Immunol. 159: 335⬃343, 1997
BEHAR, S. M.; S. A. PORCELLI, E. M. BECKMAN, et al.: A pathway of costimulation thatprevents anergy in CD28- T cells: B7-independent costimulation of CD1-restricted T
cells. J. Exp. Med. 182: 2007⬃2018, 1995
KRUTZIK, S. R.; M. T. OCHOA, P. A. SIELING, etal.: Activation and regulation of Toll-like receptors 2 and 1 in human leprosy. Nat. Med.
9: 525⬃532, 2003
SIELING, P. A.; D. CHATTERJEE, S. A. PORCELLI,et al.: CD1-restricted T cell recognition of
microbial lipoglycan antigens. Science 269:
227⬃230, 1995
LABORDE, E. A.; S. VANZULLI, M. BEIGIERBOMPADRE, et al.: Immune complexes inhibit
differentiation, maturation, and function ofhuman monocyte-derived dendritic cells. J.
Immunol. 179: 673⬃681, 2007
LEE, D. J.; P. A. SIELING, M. T. OCHOA, et al.:LILRA2 activation inhibits dendritic cell differentiation and antigen presentation to T
cells. J. Immunol. 179: 8128⬃8136, 2007
BANCHEREAU, J. & R. M. STEINMAN: Dendritic
cells and the control of immunity. Nature
392: 245⬃252, 1998
WENINK, M. H.; W. B. VAN DEN BERG, P. L.
VAN RIEL, et al.: Fc gamma receptor mediatedmodulation of dendritic cells as a potential
strategy in the battle against rheumatoid
arthritis. Neth. J. Med. 64: 103⬃108, 2006
NIMMERJAHN, F. & J. V. RAVETCH: Fc gamma
receptors as regulators of immune responses.
Nat. Rev. Immunol. 8: 34⬃47, 2008
SALLUSTO, F. & A. LANZAVECCHIA: Efﬁcient
presentation of soluble antigen by cultured
human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating fac-June 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

tor plus interleukin 4 and downregulated bytumor necrosis factor alpha. J. Exp. Med.
179: 1109⬃1118, 1994
25) BELL, A. L.; M. K. MAGILL, W. R. MCKANE,
et al.: Measurement of colony stimulating
factors in synovial ﬂuid: potential clinicalvalue. Rheumatol. Int. 14: 177⬃182, 1995
26) ABDELAAL, M. A.; I. A. HASHIM, T. H. ZAWAWI, et al.: Circadian rhythm of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor innormal subjects and neutropenic hospitalised
patients. Ir. J. Med. Sci. 169: 55⬃57, 2000
27) BANKI, Z.; L. KACANI, B. MULLAUER, et al.:Cross-linking of CD32 induces maturation of

62—_3

265 ( 87 )human monocyte-derived dendritic cells via
NF-kappa B signaling pathway. J. Immunol.
170: 3963⬃3970, 2003
28) SU, K.; H. YANG, X. LI, et al.: Expression
proﬁle of FcgammaRIIb on leukocytes andits dysregulation in systemic lupus erythematous. J. Immunol. 178: 3272⬃3280, 2007
29) RADSTAKE, T. R.; B. FRANKE, M. H. WENINK,
et al.: The functional variant of the inhibitory
Fcgamma receptor IIb (CD32B) is associatedwith the rate of radiologic joint damage anddendritic cell function in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 54: 3828⬃3837, 2006