博 士 （医 学 ）辻幸子

学 位論 文題 名
Proteasome Inhibition Induces Selective Motor Neuron
Death in Org
anotypic Sli
ce Cultures（脊髄スライス培養を用いた運動ニューロンのプ ロテ アソ ー ム障 害に対する特 異的脆弱性に関す る検討）
学 位論文内容の要旨

A．研究目的筋萎 縮性側索 硬化症(ALS)は全身の進行性筋萎縮，筋力低下を来たし，呼吸筋麻痺や肺炎のため平均3年で死に至る神経変性疾患の一種である．上位・下位運動二ユーロンが系統的に変性脱落するがその原因は不明である．現在対症療法が主であり，進行を抑制する治療は内服薬が一種類のみでその効果も約3ケ月の延命に過ぎないことから，病態解明と根 治療法の 開発が急 務である ．約10％が 家族性でそのうち20％以上がスーバーオキ
シ ド ディ ス ム ター ゼ 1 (SODl)の変異に よること が解って おり，変 異SOD1を導入し た腫瘍系細胞やトランスジェニックマウス・ラットを用いた研究が盛んに行われている．これら のモデル は大部分を占める孤発性ALSと共通点は多いが，病態の一面しか見ていない危険がある・
神経変性疾患を分子細胞学的に研究する際に，系統的に侵されやすいこュー口ン（例えぱパーキンソン病の中脳黒質ドバミン細胞）とその他の種類のニューロンの動態を比較しその 特殊性を 検討する手法がよく用いられる．ALSでは脊髄運動二ユーロンがその対象となるが，運動ニューロンの選択的培養や，雑多な脊髄こューロンの分散培養後に運動二ユーロンを正確に同定するのは難しい．このため，我々はまず運動こューロンの同定が正確かつ容易に行えるスライス培養法を確立することを第一の課題とした．スライス培養では脊髄水平方向の構造が保たれるため前角という位置情報があり免疫染色と組み合わせると前角運動ニューロンを正確に同定できる．
パー キンソン 病やALSなどの神経変性疾患では，その病理像において，特定の細胞群が特異的に脱落すると同時に残存細胞内に疾患特異性の高い封入体が見られることが特徴である．近年の免疫染色法などの発達により封入体はユピキチン陽性でプ口テアソームサプュニットも巻きこまれていることが報告されており，ユピキチン・プ口テアソーム系(UPS)を介 した蛋白 分解障害が病態形成において重要な役割を果たしている可能性が指摘さ れている ．そこで，ALSの病態解明を目的とし，確立したスライス培養系を用いてプロテアソーム障害が運動二ユーロンにもたらす影響について検討することを第二の課題とした．
BI研究方法生 後 6日 目 の SDラ ット を ケ タ ミ ンで 深麻 酔後 ，脊 髄腰 膨大 を採 取し400ymにス ライスした．培養液を満たした六穴プレート内に物質交換が可能な多数の小孔が空いた膜を置き ，ス ライ スを 膜上 に載 せて 半気 相下 で2週 間培 養， 培地交換は週2回行った．培養10〜 11日目にプロテアゾーム阻害剤であるラクタシスチンまたはエポキソミシンに曝露し，36〜 72時間後に免疫組織染色法などを用いて生存細胞数を評価した．生存運動二ユーロンは脊髄前角に存在する抗非ルン酸化ニューロフイラメント抗体であるSMI 32陽性の大型細胞で胞体の5倍以上の長さの突起を持っものと定義した．後角ニューロンのマーカーとして抗カルレチニン抗体を用いた．
本 研 究 は 北 海 道大 学 医 学 部 動 物 実験 に 関す る指 針に基 づぃ て行っ た．
C．研究結果ラク タシ スチ ンSpMに曝 露するとスライス全体のプロテアソーム活性はコントロールの 30 ‑40％ に低 下し た． SMI‑32で 免疫 染色す ると 曝露 後約36時間から前角運動ニューロンで突起の断片化が見られるようになり，72時間後では運動ニューロンの変性・脱落が 見ら れた が， 後角 ニュ ーロンではこのような変化は見られなかった．ALSではりン酸化ニューロフィラメント陽性運動ニューロンが出現することから，SMI‑32と抗リン酸化ニ ュ ーロ フィラ メン ト抗 体く SMI 31ま たは SMI34との 二重 染色 を行 った とこ ろ， リン酸 化 ニ ュ ー ロ フ ィ ラ メ ン ト 陽 性 運動 ニュー ロン は曝 露後 48時 間で 有意 に増 加し た・
Aいで傷害されやすい運動ニューロンはCa2＋結合蛋白の発現が少なくCa2＋緩衝能が低いことが報告されている．我々の系でも緩衝能の高いC
a2＋結合蛋白であるカルピンディン，カルレチニンの免疫染色は運動ニューロンでは陰性だった．カルレチニン陽性後角細胞はラクタシスチン弘Mに曝露しても有意な変化はなかった（p冫o．05）．更に，細胞透過性の細胞内Ca2＋キレ一夕ーであるBAIyI、A一AMをラクタシスチンと同時に添加すると運動ニューロンは有意に保護された（pくo．Ol）ことから，細胞内Ca2＋が運動ニューロンの特異的脆弱性に関与している可能性が示唆された・
D．考察
運動ニューロンは特にプロテアソーム障害に脆弱であること，変性初期には神経突起の変性とニューロフィラメントのルン酸化を伴うこと，Ca2→動態が重要であることを示した・
神経変性疾患の進行には様々なカスケードがクロストークしていると考えられているが，中 でも UPS障害は 神経 変性 疾患全般において関与が想定されている．特にパーキンソン病で研究が進んでいるが，当教室では過去の論文で中脳ドバミンニューロンはプロテアソームが障害されても比較的脱落しにくいことを示している．今回の結果から，プロテアソー ム活 性低 下は ALSに おい て脊髄運動ニューロンの特異的脆弱性を決める重要な要素となりうることが示された．
実際のAい患者ではcytosolicpm繊闘活性の変化はないという報告が一件ある他に患者
脊髄のプロテアソーム活性について詳細に検討した報告はなく，今後の検討が待たれる・
今後，プロテアソーム障害の下流の経路について詳細を明らかにできればAL
sの病態解明と進行抑制に有用であろうと考えている．
E●結諭
脊髄スライス培養法を確立し，運動ニューロンはプロテアソーム障害に特に脆弱であることを示した．運動ニューロンの特異性には細胞内Ca2＋の増加が重要な役割を果たしていると考えられた．
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学位論 文審査の要旨
主査
副査
副査

教授 畠山鎮次
教授 藤田博美
教 授 佐々 木秀 直

学位論文題名Proteasome Inhibition Induces Selective Motor Neuron
Dea
thinOrga
not
ypicS
liceC
ultures（ 脊 髄 ス ラ イ ス 培養 を用い た運 動ニ ュー ロン のプロテアソーム障害に対する特異的脆弱性に関する検討）
申請者の学位論文は，近年神経変性疾患全般において重要な病態とみなされているユピキチンプロテアソーム系障害に着目し，培養脊髄細胞において運動二ユーロンが特にプロテアソーム障害に対して特異的脆弱性を示すことを明らかにしたものである。本研究で用いられた培養方法に関しては本邦では殆ど行われていない脊髄スライス培養法を取り入れた点に工夫が見られる．スライス培養法は筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動二ユーロンの特異性脆弱性を解析する際に海外の研究者ではよく取り入れられている手法であるが，従来の分散培養法に比ベ正確に運動ニューロンを同定することができることをまず示した．この培養を2種のプロテアソーム阻害剤（ラクタシスチンとエポキソミシン）に曝露し，免疫染色法で運動二ユーロンと後角二ユーロンの比較を試み，運動二ユーロンの特異的脆弱性を証明した．さらに，他のALS病因仮説との関連について論じ，カルシウム緩衝能低下仮説に着目した．免疫螢光染色法を用いてカルシウム結合蛋白の発現を検討し，運動二ユーロンで発現低下が見られることを示した．また，細胞内カルシウムキレーターで運動二ユーロン死が回避できることから，プロテアソーム障害による運動二ユーロン死にはカルシウム動態の破綻が関与していると結論した．副査の藤田教授より神経細胞密度が不均一でプロテアソーム阻害剤一様に作用しているか，カルシウム緩衝能の実態に関する質問があった．次に主査の畠山教授より細胞死の形態に即した客観的細胞死定量法に関した質問と神経変性疾患全体におけるユピキチンプロテアソーム系障害の関与に関しての質問，さらに試薬の濃度設定に関する示唆があった．最後に副査の佐々木教授が培養法に関する質問と細胞内凝集体形成の関与についての質問をした．申請者はいずれの質問や示唆に対しても過去の文献
報 告 や 未 発 表 デ ー タ を 引 用 し て 概 ね 妥 当 な 解 答 を し た ・
申請者の研究はALSの病理学的特徴である脊髄前角運動二ユーロンの選択的脱落変性のメカニズムを検討する上で価値のある実験モデルと言える．申請者の目標はALSの病態機序の解明にある。この実験系をもとに運動二ユーロン死の分子機構を検討し、発症機序に関する研究に展開することが期待される．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した．