倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：2 年助成（中間報告）■受領№1461

新規の生体イメージングモデルを駆使した血栓器質化機構の解明
代表研究者

原哲也

神戸薬科大学准教授

Novel in vivo imaging model assessing DVT organization
mechanism
Principal Researcher

Tetsuya Hara,
Kobe Pharmaceutical University, Associate Professor

蛍光顕微鏡での励起光の照射下に 10-20 秒程度観察すると秒単位でリアルタイムで血栓形成がおこることが再現性をもって確認できた。血栓形成は血流速度が低いほど、おこりやすく、血栓面積が増加することがあきらかになった。次に、マルチカラーイメージングによる、血管内皮の接着因子、各種血球成分と実際の血栓形成の生体下での時空間的制御機構を明らかにするため、フィブリン、白血球、血小板などの複数分子、血球を同時に生体下にイメージングすることに成功した。さらに、我々は本モデルで形成された血栓を二光子顕微鏡で観察することにも挑戦し、より詳細に４次元データとして血栓の基質化反応が観察可能であった。
We established new in vivo murine DVT imaging model using conventional fluorescence microscopy.
After 10-20 seconds of irradiation of excitation light, we reproducibly observed DVT formation in murine
femoral/saphenous vein. Thrombus formation is flow velocity-dependent as seen in clinical situation. We
next tried to image multi-color imaging to explore the mechanism of endothelial cell and several
hematological cells using in vivo imaging. We could image fibrin, leukocyte, and platelets simultaneously
in vivo. We also succeeded in imaging DVT using two-photon microscopy in vivo.

1．研究内容なった。すなわち、本血栓モデルは実臨床と同様

1-1. 静脈速度と血栓形成の定常状態での関連性に血流速度依存性であることが証明できた。

ex vivo でラベルした赤血球を用いて血流を測定し、静脈結紮後の血流にどの程度の個体差がある

1-2. マルチカラー生体分子イメージングによる血栓制御機構の解明のかを明らかにする。そして静脈速度と血栓形成蛍光標識した抗好中球抗体や抗血小板抗体、フまでの時間の相関を数値化する。これまでの前実

ィブリンをマウスに経静脈投与することによって、験では静脈血流速度が遅いほど、血栓形成は早く、生体下に好中球や血小板と血栓形成時の挙動が可血流依存性であることがわかっている。この関連視化できる。マルチカラーイメージングによる、性を数値化した。

血管内皮の接着因子、各種血球成分と実際の血栓結果、血栓形成は血流速度が低いほど、おこ形成の生体下での時空間的制御機構を明らかにすりやすく、血栓面積が増加することがあきらかにることが可能である。具体的には白血球と血小板倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：2 年助成（中間報告）

は各種抗体以外にもローダミン６G を用いて安価

老化マウスでは予想に反して、小型の血栓が形成に標識可能である。実際にフィブリン、白血球、されることが想定される。また、器質化が進んだ血小板などの複数分子、血球を同時に生体下にイ白色血栓が形成されることが明らかになりつつあメージング可能であることを確認した。

る。これらを総合すると、現時点では器質化のス

1-3. 赤血球ラベルによる血栓形成における赤血球ピード亢進が起こっているものと思われる。これの役割の解明
これまでの前実験的な観察により、血栓形成時はすなわち CTEPH 病変の形成にも影響を及ぼしている可能性が高く、今後も解析をすすめていく。には赤血球の大きさとほぼ等しい円形の構造物が凝集し、それが徐々に血管内皮に接着し、血栓形2．発表（研究成果の発表）成が開始されることがわかりつつある。この2-1 原

FITC-dextran により⿊く抜ける円形構造物が赤（SPC)シンポジウム「包括的血栓止血モデルの実血球であることを明らかにするために、赤血球を践と応用」

蛍光ラベルして、生体イメージングを行った。しof deep venous thrombosis

かし、FITC ラベルした赤血球は血栓形成後にすみ血学会学術集会（オンライン哲也、日本血栓止血学会学術推進委員会
Novel murine in vivo imaging model
第４３回日本血栓止2021 年）

やかに FITC シグナルが減衰するため、また、実際の赤血球の中でのラベルされた赤血球の割合が2-2 原 哲也、In Vivo Imaging of Venous Thrombus

低いために、当初の目的である、⿊い円形構造物

and Pulmonary Embolism Using Novel Murine Venousが赤血球であることを直接的に視覚的に証明する

Thromboembolism Model 国際血栓止血学会 2021

ことは不可能であった。

（オンライン 2021 年）

1-4. 二光子顕微鏡への応用
本モデルをこの二光子顕微鏡に応用して観察で2-3 Takami M, Hara T, Okimoto T, Suga M, Fukuzawa

きれば、より高い精度で深部まで観察可能となる。

K, Kiuchi K, Suehiro H, Akita T, Takemoto M,

そこで、我々は本モデルで形成された血栓を二光Nakamura T, Sakai J, Yatomi A, Nakasone K, Sonoda Y,

子顕微鏡で観察した。結果、より詳細に４次元デYamamoto K, Takahara H, Hirata KI. Electrophysiologicalータとして血栓の基質化反応が観察可能であった。

and Pathological Impact of Medium-Dose External

引き続き、二光子顕微鏡を用いた血栓器質化機構

Carbon Ion and Proton Beam Radiation on the Leftを可視化、解明を進めていく。

Ventricle in an Animal Model. J Am Heart Assoc.
2021;10:e019687.

1-5. 血管老化マウスにおける血栓器質化反応の解析2-4 Suzuki M, Tanaka H, Yokota S, Hara T, Ueda

「高齢者では血栓の器質化反応（炎症細胞浸潤Y, Hirata KI. Multiple cardiac complicationsや線維化）が早いために、血栓溶解が不完全とな

associated with collagen disease. J Echocardiogr.

り、器質化血栓として肺動脈に残存して CTEPH

2020;10.1007/s12574-020-00504-7.となる」という仮説に基づき、血管のみが老化した遺伝子改変マウス（TRF-2DN マウス：血管老2-5 Yoshikawa S, Hara T, Suzuki M, Fujioka M,化マウス）に静脈血栓を形成し、炎症細胞浸潤やTaniguchi Y, Hirata KI. Imatinib Dramatically

線維化形成を経時的に観察し、野生型（WT）マImproved Pulmonary Hypertension Caused byウスと比較する。これまでの研究結果では、血管Pulmonary Tumor Thrombotic Microangiopathy倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
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Associatedwith

Metastatic

BreastCancer. Int Heart J. 2020;61:624-628.
2-6 Hisamatsu E, Nagao M, Toh R, Irino Y, Iino T,Hara T, Tanaka H, Satomi-Kobayashi S, Ishida T,Hirata KI. Fibronectin-containing High-Density
Lipoprotein is Associated with Cancer Cell
Adhesion and Proliferation. Kobe J Med Sci.
2020;66(1):E40-E48.