博 士 （ 医 学 ） 鈴 木 正 己
学 位 論 文題 名
亅Xenopus laevis Macrophage Migration Inhibitory Factor
Is Essential for Axis Formation and Neural Development（アフリカツメガエルの体軸形成及び神経発生におけるマクロファージ遊走阻止因子の関与），学位論文内容の要旨

マクロファー ジ遊走阻止因子(MIF)は，マ クロファージの無秩序な運動を阻害するりン
パ球由来の因子として発見されたサイトカインである，当初MIFの主要な機能はマクロファージを感染部位に集積させることであると考えられたが，その後の研究により，MIFは多種の細胞によって産生され，Tリンパ球の活性化，細菌感染によるエンドトキシンショックの増悪，異性化酵素活性，酸化還元酵素活性，細胞増殖の制御及び細胞死の抑制，自然免疫の調節等多くの機能を有するタンパク質であることが明らかにされた．この多機能性を考慮す
ると，哺乳類等 脊椎動物の発生においてもMIFが関与することが推測されたが，MIFのノックアウ卜マウスは予想に反して正常に発生することが示されている．ノックアウトマウスは多くの場合遺伝子産物の機能特定に有用であるが，その作成過程において目的遺伝子の欠失を補償する変化が発生する可能性がある，このため，MIFのノックアウ亅トマウスが正常に発生することからは，発生におけるMIFの関与を否定できなぃ．本研究では，アフリカツメガ
エルXenopuslaevisの初期胚においてMIFの産生を阻害することにより，発生過程におけるMIFの役割を示すことを目的とした．
阻害実験を行 うにはX
enopus M
IF (XMIF)をコードするcDNAの配列が必 要となる．このため，Xenopus胚に由来し哺乳類MIFに相同性を有するE
xpressedSequenceTag(EST)の配列を用いてプラ イマーを合成し，」Yenopus肝RNAからRapidAmplifi
cati
onofc
DNAEnds(RACE)法に より ，YM7F
cDNAの 全 長を クローニングした．得られ たcDN
Aによルコードされるアミノ酸配 列は，哺乳類MIFと約70％一 致し，異性化酵素活性の中心であるN末端のプロリン残基，その周囲に存在する芳香族の残基群，及び酸化還元酵素活性の中心である2個のシステイン 残基は，X
MI
Fにおいて保存されていた，XM
IF，哺乳類MIF，及びMIFに低い相同性を有するタンパク質であるD‐ドーパクロム異性化酵素（DDT）のアミノ酸配列により 作成 した 分子系統樹におけるXM
IFの占める位置は，XMI
Fが哺乳類MIFに相当する分子であるという仮定を支持した．p‐ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質として測定した異性化酵素活性はラ ッ卜M
IFとXMIFにおいて同程 度であった．X
線結晶構造解 析により決定した XM
IFの立 体構造は，哺乳類MIFの構造に極めて類似していた． さらに，成体におけるMイ げmRN
Aの 発現は脳，腎で強く，これはラットMFの発現パター ンに類似していた．以上のこ とから，Aを門。p甜s
においてXMIFは哺乳類MIFと同一の機能を担う分子であることが強く示唆された．
娩灯叩甜s
胚中のA
〃Fm
RN
Aを分析した結果，AW
Fは卵割期から胞胚期まで多量に検出され，嚢胚期に減少し た後，尾芽胚期に再び増加していた．胚中のAがFRNAをmsf
f ハイブリダ
イゼーションにより検出すると，胞胚期には動物極周辺に局在が認められた．嚢胚期には背― 248

側帯域に 少量のmRNAが検出された．神経胚期には前方神経板に局在した発現が認められた
初期尾芽胚期には発現量が増加し，前部神経組織に最も強い発現が検出された，後期尾芽胚期には，MIFは眼胞及び脳で強く発現し，背部にも発現が認められた．切片の観察により，
MIFは 頭 部 問 充 織 及 び 体 節 に お い て も 少 量 発 現 し て い る こ と が 示 さ れ た ．
MI
F産 生の 阻害 （ノ ック ダウ ン） は， MIFに特異的なモルホリノオリゴ マー(MO)を初期胚に注 入し，MIF m
RNAの翻訳を阻害することにより行った．注 入するM
Oとしては，ク
ローニン グしたcDNAの5 末端(‑59)から翻訳開始点付近までの配 列から標的部位を選択し，M01(‑1〜24に相補的）及びM02(‑28〜―4に相補的）を合成 した，これらは無細胞
翻 訳 系 に お い てMIF RNAの翻 訳を 阻害 し， M01が M
02より 高 い阻 害効 率を 示し た， MIFmR
NAは尾 芽胚中の神経組織において多量に発現していたことから ，4細胞期胚の背側の2割球にMOを注入した，M01
注入胚の発 生には嚢胚期まで異常が認められなかったが，神経胚期への移行が阻害され，神経板は形成されなかった，尾芽胚期に相当する時期(stage32)での観察において頭部及び尾部の構造に顕著な形成不全が見られ，体長が短縮した．これらの胚では神経組織が発生せず，脳，脊髄，眼胞，耳胞が欠損していた．また，神経マーカーであるzic‑2及びnrp‑lの発現がinsitu
ハイブリダイゼーションにより検出されなかった．さらに脊索，体飾等の中胚葉組織も発生しなかった．この効果がMI
Fのノックダウンによる特異的なものであることを確認するため，MI
FRNAを用いた回復実験を行った．この目的に用いるMIFRNAは，MIF由来の5 非翻訳 領域を含まないものIとし，翻訳の阻害には，5 非翻 訳領 域の 一部 に 相補 的で ある M02を用 いた ，M02を単独で注入した場合 ，その効果は
M01注入の効果より弱かったが，注入 量を増加することにより，MOI注入胚と同様の表現型が得ら れた，M02とMIF RNAを共注入することにより，頭部及び 尾部の構造が部分的に回復し，神経管が形成され，体長も部分的に回復した ．一方，共注入により脊索等の中胚葉組織は形 成されなかった．この結果から，M0
注入により生じた変化のうち，少なくとも中胚葉組織 の欠損以外はM
IFのノックダ ウンによる特異的な効果であることが強く示唆された． MIF R
NAの共注入による回復が部分的であった原因は不明であるが，RNAの注入により産生さ れたMIFが必要量より少なか った可能性，及び正常胚においては多量のMIFを産生しない 細胞中で注入RNAからMIFが産生されたことが周囲の細胞 の正常な分化を阻害した可能性が考えられる．
MI
Fが神経発生に関与する可能性は ，正常胚におけるM
IFmRNAの発現パターンから予想されたが，MOの注入により中胚葉組織の形成が阻害されたことは予想外であった．X
enopusにおいて，後期嚢胚期の背側中胚葉に脊索が形成され，これが神経組織を誘導することから，
MO注入に よる神経発生の阻害の一部は，脊索の形成阻害による間接的なものであった可能性がある ．この点については今後確認を要するが，今回の結果は，Xenopus
においてMIFが前後軸の形成と神経発生に必要であり，背腹軸の形成は少なくとも部分的にMIFに依存することを示すものである，
本研究 は，MIFがXenopusの発生に必要な因子であることを明らかにした．この結果は，哺乳類の 発生においてもMIFが重要な役割を有することを示唆している，今後Xenopusの発生におけるMIFの関与を分子レベルで解明することが，哺乳類の発生を理解する上でも有用であると考えられる．

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学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 長 嶋 和 郎
副 査 教 授 田 中 一 馬

学位論文題名Xe7zopuslaevisMa
crophag
eM
ig
r
at
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nhibi
tor
yFa
ctor
IsEs
sent
ia
lf
orA
xi
sFor
mat
iona
ndNeuralDevelopment（アフリカツメガエルの体軸形成及び神経発生におけるマクロファージ遊走阻止因子の関与）
マクロ ファージ遊走阻止因子（MIF)
は細胞内外の多様な現象に関与する調節分子であり、特に細胞増殖と細胞死の制御等の普遍的かっ基本的機能を有することから、発生においても 重要な役割を有することが推測されるが、ノックアウトマウスを用いた実験ではM
IFが 発生に関与する証拠が得られていなかった。本研究では発生過程におけるMIFの役割を示すため、アフリカツメガエルX
enopuslaev
isの初期胚においてMIFの産生を阻害し、その効果を検討した。
X
enopus M
IFを コード するcD
NAの全 長をク ローニン グし、 それを用いてX
enopusMI
Fの性質を哺乳類MIFとの間で比較した結果、異性化酵素活性、立体構造、臓器での発現量が類似 していた。胚におけるM
I
FmR
NAの量は、卵割期から胞胚期まで及び尾芽胚期で多かった。神経胚期以降の主要な発現部位は、神経組織であった。MI
Fに特異的なアンチセンス モ ル ホリ ノ オ リ ゴマ ‑ (MO)を4細 胞期胚 に注入し てM
IFの 産生を 阻害した 結果、嚢胚期まで発生は正常に進行したが、神経胚期ーの以降が完全に停止し、神経板が形成されなか った。尾芽胚期に相当する時期において、MO注入胚の頭部及び尾部に重度の形成不全が発生し、体調が短縮した。また脳、脊髄、眼胞、耳胞、脊索、体飾が消失した。これらの効果のうち、少なくとも中胚葉由来組織（脊索及び体節）への影響以外はM
I
Fの産生阻 害 による 特異的な もので あること が、MOとMIF R
NAを共 注入し た胚の表 現型の 回復によ り確認された。従って、本研究ではMIFがX
enopusの発生において体軸形成及び神経発生に必要な因子であることが明らかとなった。
公開発表にあたって、副査の田中教授から線虫、植物でMIFが形態形成に関与する可能性、XenopusでMIFが分泌されているか、異性化酵素活性の活性部位変異体を用いた実験の必要性について質問があった。これに対し申請者は線虫でも形態形成に関与しているであろうが4種のホモログあって解析が難しいと推測され、植物でも関与している可能性はあるがそれを示す実験結果はないこと、Xenopusで分泌されるかは確かめていなぃが哺乳類同様に全身的及び局所的分泌の可能性があること、活性部位変異体を用いた実験は必要だが現在その途上であり結果は得られていないことを説明した。副査の長嶋教授から実験系とし てX
enopusを 選んだ のはMI
Fを補償する因子がなぃことによるものか、MI
Fの産生阻害により神経発生のどの段階で停止するか、異性化酵素活性部位変異体を用いる実験で― 250―

予測され る結果 について質問があった。これに対し申請者はXenopus
胚中のMIF産生阻害においては時間的な因子により補償が起きなかったか、Xenopusでは哺乳類より補償が起こりにくいためと思われること、原腸陥入は正常に起こるが神経板は形成されず、その間で脊索の形成される領域に変化が発生していると推測されること、酵素活性と生物活性の関係は哺乳類MIFでも複雑であり、変異体を用いた実験の結果は予測できなぃことを説明した 。 主 査の 浅香 教授か らM
IFの 抗原性に ついて 、MOの効果 及びMOを 選択した 理由について、ノックアウトマウスにおける補償の問題と従来の研究に対する再評価の必要性について、 M
O注入胚 の生存に対する影響について質問があった。これに対し申請者は、哺乳類MIFは非常 に相同性 が高く抗 体の作 成が難し いこと 、MOによる 阻害は100％には達しなぃがそれに近い場合もあり、多くの場合高い阻害効率が得られるので標準的方法となっていること、従来の研究の再評価が必要になる可能性もあり、新規の研究では目的遺伝子に類似する遺伝子の挙動に注意すべきこと、尾芽胚期以降において致死的となることを説明した。
本研究に よりXenopusの体軸形成及び神経発生におけるMIFの必要性を示したことは、今後哺乳 類の発 生課程における体軸形成及び神経発生の分子機構の解明にっながると考えられ、そこで得られる知見は神経疾患、癌等病態の理解にも寄与することが期待できる。
審査員一同はこれらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

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