「様式３－A」

課題番号 41

新規がん治療標的としての M16 プロテアーゼの研究［１］組織
代表者：西 英一郎
（滋賀医科大学薬理学講座）
対応者：堀内 久徳（東北大学加齢医学研究所）
分担者：大野 美紀子（滋賀医科大学薬理学講座）
西 清人（京都大学 循環器内科）
研究費：物件費 25 万円，旅費 5 万円
［２］研究経過
がんの発症進展は多元的に制御されている。中でも細胞外環境、核におけるエピジェネティックス・転写制御は、互いを感知し影響を及ぼしながらがん進展への悪循環を形成していると考えられる。
我々はM16ファミリーのメタロプロテアーゼ、ナルディライジン（NRDC）をHB-EGF結合タンパク質として同定し（EMBO.J,2001）、NRDCがHB-EGFやTNFαなどの細胞外ドメイン切断による活性化を介して細胞外環境を調節すること（JBC,2006、Nat. Neurosci. 2009など）、また核内では複数のパートナー分子と協働して転写コレギュレーターとして働いていること（NatCommun.2014, Diabetes 2016など）を示し、NRDCが細胞局在に応じた多機能性を有することを明らかにした（下図）。

一方NRDC欠損マウスは、複数の発がんモデル（大腸、胃、肝細胞がんなど）および炎症性疾患モデルにおいて著明な疾患抵抗性を示し（EMBO Mol Med 2012, Sci Rep 2017など）、NRDC抑制ががん治療につながる可能性が示唆された。我々は、NRDCの核内転写調節作用の少なくとも一部は自身の「プロテアーゼ活性に依存」しており、さらにNRDCのがん細胞増殖作用が「p53の転写活性抑制を介する」（JCI Insight in press）ことを見い出し、既存薬ライブラリーなどを用いてNRDCのプロテアーゼ活性阻害薬スクリーニングを行った。
その結果、約30000種類の小分子化合物のうち約140種類の陽性化合物同定に成功した。
一方加齢研受け入れ教員の堀内らは、臨床上頻用されている既存薬のうち、標的分子が示唆されているものの薬理活性が充分説明できない薬に注目し、ビオチン化化合物を用いて標的分子を効率よく同定する方法を開発した。予備実験の結果、薬物XがNRDCに結合することが示唆された。本課題では、①NRDCがいかなる分子機構を介してがん進展を制御しているかを、特にNRDCの酵素活性の役割に注目して解明すること、②薬物の標的分子としてのNRDCの意義を明らかにすることを目的とする。
対応者である加齢医学研究所堀内久徳教授とは、適宜メールにて研究打ち合わせを行っている。さらに 2017/11/22 には申請代表者が加齢研を訪問し、共同研究についての報告、意見交換を行った。
［３］成果（３－１）研究成果
本年度は，以下に示す研究成果を得た。
目的① NRDC によるがん進展制御機構の解明（特にNRDC の酵素活性の役割に注目して）
NRDC のプロテアーゼ活性の個体レベルにおける役割を明らかにするために、酵素活性欠損変異体
NRDC ノックインマウスのジーンターゲティング法による作製を試みた。
複数の陽性ES 細胞（TT2 細胞）が得られ、野生型胚とアグリゲーション法にて混合、仮親マウスへ移植し、複数のキメラマウスを得ることに成功した。
目的② 薬物の標的分子としての NRDC の意義解明
これまでに以下 1)の結果が得られ、機能アッセイを行うために 2, 3)を準備中である。
1) HEK293T 細胞溶解液からビオチン化 X ビーズを用いて X 結合タンパク質を抽出。我々が独自に作製した抗 NRDC モノクローナル抗体にて、NRDCがコントロールビーズには結合しないが、X ビーズには明らかに結合していることを確認。
2) NRDC 機能アッセイに使用するリコンビナント
NRDC タンパク質の作製（バキュロウィルスシステム）

3) TNFαシェディングアッセイの準備（THP-1 細胞を陽性コントロール：リポポリサッカライドで刺激し、培地中 TNFα量を ELISA を用いて測定）。
本アッセイにて、2)で作製したリコンビナント
NRDC を加えて、TNFαシェディングの増強を確認する。そこに各濃度の X を投与し、NRDC のシェディング増強に及ぼす効果を検討する。
（３－２）波及効果と発展性など
NRDC は細胞内外の独立した作用点でがん進展に寄与しているユニークな分子であり、治療標的としての新規性が高い。遺伝子欠損によるがん進展抑制の度合いは高度で、かつ腸管上皮特異的欠損において腸発がんが抑制されるなど細胞自律的に働くこと、p53 機能を顕著に制御すること、さらにヒト手術標本がん部における発現亢進も明らかなことから、同阻害薬が治療に有効である可能性は高い。本共同
課題では特に、NRDC のプロテアーゼ活性ががん進展にいかに寄与しているかに注目して研究を進める（目的①）。
特に次年度あるいは次々年度に予定している酵素活性欠損変異体ノックインマウスの解析にて、プロテアーゼ活性の生物学的役割とがん治療標的としての意義をある程度明らかにできると考えている。結果が陽性の場合は、NRDC 酵素活性阻害薬として全く新しいタイプの抗がん薬開発につながる可能性がある。
一方目的②の薬物 X は臨床の場で汎用され、高い有効性が確認されている。これまでに複数の標的分子が示唆されているが、その薬効を充分説明できない可能性がある。受け入れ教員堀内らは、薬物 X の結合タンパク質のひとつとしてNRDC を同定した。
NRDC 欠損マウスの表現型は、X の薬効と NRDCの機能がリンクする可能性を示唆している。本課題の遂行が X の薬効の分子機構理解に大きく寄与し、さらに有効な薬剤開発につながることが期待される。
［４］成果資料
本共同研究に関連する研究成果が掲載されている
主要論文リスト（1）Yoon WH, Sandoval H, Nagarkar-Jaiswal S, Jaiswal M,
Yamamoto S, Haelterman NA, Putluri N, Putluri V,
Sreekumar A, Tos T, Aksoy A, Donti T, Graham BH, Ohno
M, Nishi E, Hunter J, Muzny DM, Carmichael J, Shen J,Arboleda VA, Nelson SF, Michael F. Wangler MF, Karaca E,Lupski JR, and Bellen HJ
Loss of Nardilysin, a mitochondrial co-chaperone for-Ketoglutarate Dehydrogenase, promotes mTORC1
activation and neurodegeneration
Neuron 93: 115-131, 2017
doi: 10.1016/j.neuron.2016.11.038（2）Kimura Y, Ikuta K, Kimura T, Chiba T, Oshima H,Oshima M, *Nishi E, *Seno H
Nardilysin regulates inflammation, metaplasia, and tumors inmurine stomach
Sci Rep. 7: 43052, 2017
doi: 10.1038/srep43052.
（3）
Kasai Y, Toriguchi K, *Hatano E, Nishi K, Ohno M, Yoh T,Fukuyaman K, Nishio T, Okuno M, Iwaisako K, Seo S, Taura K,Kurokawa M, Kunichika M, Uemoto S, *Nishi E
Nardilysin promotes hepatocellular carcinoma throughactivation of signal transducer and activator of transcription 3Cancer Sci. 108: 910-917, 2017
doi: 10.1111/cas.13204.
（4）Chen PM, Ohno M, Hiwasa T, Nishi K, Saijo S,
Sakamoto J, Morita Y, Matsuda S, Watanabe S, Kuwabara Y,Ono K, Imai M, Inoue K, Murai T, Inada T, Tanaka M, Kita T,
Kimura T and *Nishi E
Nardilysin is a promising biomarker for the early diagnosis of
Acute Coronary Syndrome
Int J Cardiol. 243: 1-8, 2017
doi: 10.1016/j.ijcard.2017.04.047.
（5）Fujii T, *Nishi E, *Ito H, Yoshitomi H, Furu M, Okabe N,Ohno M, Nishi K, Morita Yus, Morita Yug, Azukizawa M,
Okahata A, Tomizawa T, Kimura T, and Matsuda S
Nardilysin is involved in autoimmune arthritis via the regulationof TNF- secretion
RMD Open 3: e000436, 2017
doi: 10.1136/rmdopen-2017-000436（6）Morita Y, Ohno M, Nishi K, Hiraoka Y, Saijo S, Matsuda S,
Kita T, Kimura T and *Nishi E
Genome-wide profiling of nardilysin target genes reveals its rolein epigenetic regulation and cell cycle progression
Sci Rep. 7: 14801, 2017
doi: 10.1038/s41598-017-14942-4.