平 成
年 度

27

金沢医科大学共同研究成果報告書・奨励研究成果報告書

２０１５

平成２７年度金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

平成

平成２９年１０月

年

29

月

10

金沢医科大学

金沢医科大学はじめに

平成  年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成  年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成  年度からは、奨励
研究に萌芽的研究の枠を設けるなど研究の多様化にも対応しています。
平成  年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成  年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域には  件（共同研究  件、奨励研究  件）の申請があり、 件（共同研究４件、奨励研究 件）を採択いたしました。また、看護学領域では、３件（共同研究１件、奨励研究２件）の申請のうち、２件（共同研究、奨励研究各１件）を採択いたしました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後、これらの共同研究と奨励研究で得られた研究成果を、社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。平成  年  月
金沢医科大学学長 神田 享勉

目‒ ‒ ‒ ‒ 次‒
‒
‒
はじめに‒
‒

平成 ᵐᵕ 年度ᴾ 共同研究成果報告書ᴾ>医学領域@C2015－1. RNA 結合因子の機能解析と診断マーカー探索
研究代表者・石 垣 靖 人･･････ C2015－2. オートファジーを標的とした糖尿病合併症の病態解析研究代表者・古 家 大 祐･･････ C2015－3. ヒト幹細胞由来心筋細胞における自動能の発現機構解明とバイオペースメーカーシステム設計
研究代表者・倉 田 康 孝･･････ C2015－4. 抗血栓療法の最適化を目指した集学的診断法の開発
研究代表者・梶 波 康 二･･････ >看護学領域@
C2015－5. 認知症グループホームの介護職におけるストレス緩和支援に関する研究
研究代表者・河野由美子･･････ ᴾᴾ
平成 ᵐᵕ 年度ᴾ 奨励研究成果報告書ᴾ>医学領域@S2015－1. Physiological role of HPVE7-UBR4 interaction mediated by
the N-end rule pathway
研究代表者・田 崎 隆 史･･････ 
S2015－2.

GLP-1 による摂食及び血圧調節作用における脳内メカニズムの解明
研究代表者・谷 田  守･･････ 

S2015－3.

内皮細胞 FGF 受容体 1 が演じる腎線維化抑制機構の検討
研究代表者・金 﨑 啓 造･･････ 

S2015－4.

Saffold ウイルス感染受容体の探索と宿主細胞内におけるカプシド蛋白の安定性解析
研究代表者・姫 田 敏 樹･･････ 

S2015－5.

オートファジーによるガレクチン４発現制御を軸とした胎盤形成機構の解明
研究代表者・有 川 智 博･･････ 
S2015－6.

霊長類コモン・マーモセットを用いた脳内味覚地図の解明
研究代表者・薗 村 貴 弘･･････ 
S2015－7.

虚血性腸炎のマウス蛍光イメージング
研究代表者・武田はるな･･････ 

S2015－8.

角膜痛・ドライアイの新規治療薬開発を目指した角膜神経終末の代謝型グルタミン酸受容体 mGluR5 の機能解析
研究代表者・益 岡 尚 由･･････ 

S2015－9.

慢性閉塞性肺疾患における気道可逆性の病態解析
研究代表者・水 野 史 朗･･････ 
S2015－10. メチオニン制限による抗老化ならびに糖尿病腎症抑制効果に関する研究
研究代表者・北 田 宗 弘･･････ 
S2015－11. Y14 変異導入による TAR 症候群モデル細胞の構築及び機能解析研究代表者・辰 野 貴 則･･････ 
S2015－12. 簡便・迅速・安価なオンデマンドゲノムコピー数
解析法の開発と臨床応用研究代表者・新 井 田  要･･････ 
S2015－13. 低酸素性肺高血圧マウスの病態解析研究代表者・四 宮 祥 平･･････ 
S2015－14. アナフィラキシー時における胃自律神経活動の解析研究代表者・九 田 裕 一 ･･････ 
S2015－15. 微小乳頭状癌のリンパ管浸潤の分子機構解明
研究代表者・相川あかね･･････ 
S2015－16. 癌細胞エクソソームによる細胞間相互作用の分子機構の解明
研究代表者・山 本 聡 子･･････ >看護学領域@S2015－18. 介護保険施設における入浴ケア体制と介助者の疲労の実態
研究代表者・橋 本 智 江･･････ 
※奨励研究6（大野美樹・医学部神経内科学・助教）は、十分な症例数の確保ができず、１年間の研究期間延長の措置がとられた。成果報告については、平成  年度版（平成  年度発行）に掲載する予定である。



平成  年度



共同研究成果報告書
医 学 領 域 %～
看護学領域 %

１．研究課題名：RNA 結合因子の機能解析と診断マーカー探索（研究番号 C2015-1）
２．キーワード：１）RNA 結合因子 (RNA binding)２）脳腫瘍 (brain tumor)
３）RBM8A
４）TAR 症候群 (TAR syndrome)
３．研究代表者：石垣 靖人・総合医学研究所・教 授・生命科学研究領域
  研究分担者：島崎 猛夫・総合医学研究所・准教授・先端医療研究領域
        岩淵 邦芳・医学部・教授・生化学Ⅰ 中田 光俊・金沢大学医薬保健研究域医学系・教授・脳・脊髄機能制御学    中沢  実・金沢工業大学工学部・教授・情報工学科
４．研 究 目 的RNA 結合因子の中でもエクソンとエクソンのつなぎ目に形成されるエクソンジャンクシ
ョン複合体 (EJC) は、mRNA の分解や輸送に必須のタンパク複合体と考えられてきた。しかし、独自の研究から、本来 RNA の代謝に働く EJC は、同時に細胞分裂装置である中心体へ局在し染色体の正確な分配にも関与することが明らかになってきた。
しかし、全ての EJC 構成因子が中心体へ局在するのか、それとも一部が移動するのか、あるいは mRNA を伴って局在するのか否かは未だに明らかにされていない。
一方、EJC のヒトやマウスにおける変異体が報告されるようになってきたが、いずれも多彩な症状を示すため、個体や分化した細胞での挙動について整合性のとれる説明がなされていない。EJC の各因子が個別に果たす役割が存在するのか、あるいは EJC として働く機能が多様であるのかも明らかにされていない。
本研究では、RNA 結合因子である EJC が、中心体成熟を含めた様々な生命現象に、どのような段階にどんな機序で機能しているのかを分子から細胞、個体レベルで明らかにすることを目指す。
また、公共データベースの検索から、脳腫瘍組織において EJC の発現が多数の症例で変動していることを見いだしてきた。これを患者予後と掛け合わせて解析してみると、脳腫瘍組織において EJC 発現が高い患者の生存率が有意に上昇していることを突き止めた。この解析
結果に基づき、本申請は単に基礎研究にとどまらず、EJC 発現量の脳腫瘍患者の予後マーカーとしての有用性を検討し、診断あるいは治療に貢献することを目指す。この結果を上述の基礎的な知見と合わせて、腫瘍の進展における EJC の新しい役割を提案していきたい。
５．研 究 計 画(1)ノックダウンやゲノム編集などを利用した遺伝子改変技術による EJC 各因子の欠損細胞を構築し、Y14 以外の EJC 因子の細胞機能への関与を明らかにする。(2)イメージング技術− 1 −を改良して各因子の局在を明らかにし超微細構造中の局在と局在のメカニズムを解き明かす。
(3)データベースを活用した解析から、ヒト組織を検索し新しい癌の診断マーカーを提供する。
EJC の発現量が脳腫瘍の予後に影響することが分かっても、脳腫瘍患者で何故予後に影響するのかを説明できるモデルがなければ診断から治療につながる発見には至らない。このため、培養細胞系を利用した解析結果から、臨床で得られたヒト腫瘍での発現量変動と患者予後との関連を分子レベルで説明できるモデルを提案する。
６．研 究 成 果 (1) EJC 因子のタンパク質修飾に関する解析
EJC 遺伝子のリン酸化変異体作製についてはリン酸化部位の変異体を多数作製して解析を行ってきた。タンパク質がリン酸化を受けると泳動度が極端に遅くなる PhosTag ゲルを利用してリン酸化の検出を行った。従来のアイソトープの取り込みを利用した解析手法と比較しても、簡便であり、なおかつ修飾を受けたタンパク質の割合をウエスタンブロットで検出できる点でも優れた手法であった。その結果、細胞内においては RBM8A 分子の大部分がリン酸化修飾を受けていること、リン酸化部位は 166 および 168 番目のセリンであること、166のリン酸化には 168 のリン酸化が必要であること等が明らかになった。さらに、試験管内リン酸化系を構築し、結合因子の Magoh がリン酸化に阻害的に働くことを明らかにしてきた。
以上の実験結果は、RBM8A はタンパク質として合成された直後にリン酸化修飾を受け、その後 Magoh と複合体を形成して核内へ移行することを示唆すると考えられる。さらに、リン酸化を受けるセリンをアラニンに変えた変異体を細胞内に発現させて局在を観察したところ、中心体への局在が観察されたことから、リン酸化は中心体局在のシグナルとはならないことが示唆された。
さらに多数のリン酸化部位変異体を作製して網羅的に局在を解析したところ、リン酸化を受けない変異体では、意外なことに核内の核小体へ局在することが明らかとなった。野生型は核小体へはほとんど局在しないことから、本来 mRNA に結合する RBM8A タン
パク質が rRNA 合成の場である核小体へ局在することを防ぐことがリン酸化の役割であると予想される（論文投稿中）。
(2) EJC 因子のゲノム編集実験
 ゲノム編集技術を利用して EJC 構成因子のひとつである Casc3 の欠失細胞の作製を試みた。
ゲノム編集は標的遺伝子の DNA にランダムに変異を入れて破壊する手法であり、ヌルアレ
ルを作製できれば RNAi とは違って完全に発現を欠損した細胞を得ることが可能である。方法としては Crispr/Cas9 誘導型のプラスミドベクターを利用し、エクソン内に存在する PAM
配列を指標としてガイド RNA を設定した。このプラスミドベクターを細胞内に一過性に導入した後、常法に従って DNA を抽出して標的配列を PCR により増幅した。PCR 産物についてサーベイヤーアッセイを行ったところ複数の変異配列が検出された。限界希釈法によりクローン化した細胞について、PCR 産物のシーケンスを行ったところ、多数の欠失が片側または両側アレルに観察された。構築された Casc3 欠損細胞は、トランスクリプトームに変化が− 2 −現れず、ゲノム傷害への感受性も変化しなかった。これらの結果は、従来 EJC の一員として認識されて来た Casc3 が、解析した限りでは遺伝子発現に影響せず、またストレス環境下においても重要な役割を果たしていないことを示唆する。
EJC を欠損したヒトにおいては、精神発達遅延、橈骨血小板減少症など多彩な病態が知られている。このため、EJC 因子を欠損したマウス個体を作製して、新しい病態モデルを確立することことを試みた。マウス RBM8A 遺伝子の両末端を標的とする Crispr/Cas9 系ベクターを構築し、120 個の受精卵へ導入後仮親子宮へ戻した。１回目の導入の結果、８個体を得ることができた。このうち２系統について交配を行い系統の確立を行った。C57BL/6 系統のバックグランウドマウスであったが、予想以上に繁殖成績が悪く１系統は完全に絶えてしまった。飼育環境を変えることで繁殖するようになってきたので、継続して１系統の確立を目指していく予定である。
(3) 脳腫瘍予後マーカーの探索
脳腫瘍における EJC 遺伝子の発現を検索した結果、４つの因子が予後マーカーの候補遺伝
子として残ってきた。これらの因子について、マイクロアレイプローブの確認実験を行い、データベースでの発現変動が遺伝子特異的で信頼できるものであることを確認してきた。確認できた遺伝子群に対して、抗体を購入あるいは作製して性格付けを行ってきた。また、各因子の mRNA 量を定量できるリアルタイム PCR プライマーの作製を終えた。今後はリアル
タイム PCR および免疫染色による発現量の変動と予後との相関を解析して、新しい予後診断
マーカーの確立を目指していきたい。

(4) その他
EJC 因子に結合する Upf2 タンパク質については、免疫電顕法の活用により複合体形成場所
が核内である可能性を明らかにしてきた。従来提案されてきたモデルでは核外での結合が信じられてきたが、今回の我々の報告では、新たに核内での結合があり得ることを証明できた。
また、電子顕微鏡による EJC 因子の細胞内局在も行っているが、免疫電顕法における画像解析の自動化を試みている。具体的には免疫電顕像をソフトウエア上に取り込み、余分なノイズをフィルタリングしてシグナルを鮮明化し、数値化処理を行うことでシグナルの集積や局在を定量化できる手法の開発を行っている。現在さまざまなフィルタリングの手法を試みた
上で、シグナルの数値化処理プロトコールを検討している。
７．研究の考察・反省
RBM8Aのリン酸化制御については新規のモデルを提出し、これを検討するための研究提案
が科学研究費補助金基盤Cに29年度から採択され、さらに研究を深めていく予定である。また、脳腫瘍のマーカーについては同じ研究室の中村有香助手が挑戦的萌芽研究を28年度から採択されており、研究を完遂する予定である。現在、検体の解析を進めているが明確な結果を出せておらず、さらに研究を進めていきたいと考えている。一方で、脳以外の臓器に発生− 3 −し た 腫 瘍 に お け る RBM8A の 発 現 が 予 後 に 影 響 す る と す る 報 告 も 今 年 提 出 さ れ て お り（Enhanced RBM8A expression in human hepatocellular carcinoma. Int J Clin Exp Med 2017;10:598-607など）、発表を急ぐ必要もあると考えている。なぜ、RBM8A遺伝子の発現が予後に関わるのかは明らかにはされていないが、トランスクリプトームの量的、質的変動や中心
体制御異常がゲノムの不安定性を引き起こし悪性化につながる可能性が考えられる。マウスにおけるゲノム編集実験は繁殖効率の悪さに進展が遅かったが、変異により繁殖が低下した
わけでもなさそうなので、何とか系統を維持して研究成果につなげたいと考えている。また、細胞におけるゲノム編集技術は一定の水準に達し、他の遺伝子についても応用を行っている。
今後ますますの普及が期待できる技術と考えられる。電子顕微鏡観察と合わせて他研究者との共同研究を実施していきたいと考えている。
８．研 究 発 表Tatsuno T, Nakamura Y, Ma S, Tomosugi N, Ishigaki Y. Nonsense-mediated mRNA decay factor
Upf2 exists in both the nucleoplasm and the cytoplasm. Mol Med Rep 2016; 14: 655-660.
Abstract: Upf2 protein predominantly localizes to the cytoplasmic fraction, and binds to the exon
junction complex (EJC) on spliced mRNA. The present study aimed to determine the cellular sitewhere the interaction between Upf2 and EJC occurs. First, the cell lysate was fractionated into thecytoplasm and nucleoplasm, and western blotting to detect levels of Upf2 protein was performed.
Upf2 was clearly detected in the cytoplasm and in the nucleoplasm. Secondly, immunostaining was
performed, and the majority of Upf2 was detected in the cytoplasmic perinuclear region; a small
quantity of Upf2 was detected in the intranuclear region. RNase treatment of the cells reduced theUpf2 immunostained signal. The immunopurified fractions containing nuclear and cytoplasmic Upf2
also contained one of the EJC core factors, RBM8A. These results implied the existence of Upf2 in
the nucleoplasm and the cytoplasm, and it appeared to be involved in the construction of the mRNA
complex. In order to verify the construction of Upf2-binding EJC in the nucleoplasm, an in situ
proximity ligation assay was performed with anti-Upf2 and anti-RBM8A antibodies. These results
demonstrated that their interaction occurred not only in the cytoplasmic region, but also in theintranuclear region. Taken together, these results suggested that Upf2 combines with EJC in both thecytoplasmic and the intranuclear fractions, and that it is involved in mRNA metabolism in humancells.

− 4 −１．研究課題名：オートファジーを標的とした糖尿病合併症の病態解析（研究番号 C2015-2）
２．キーワード：１）オートファジー (autophagy)        ２）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)        ３）たんぱく質制限 (protein intake restriction)４）線維芽細胞増殖因子 21 (Fibroblast growth factor 21)
５）アディポネクチン (adiponectin)
３．研究代表者：古家 大祐・医学部・教 授・糖尿病・内分泌内科学
  研究分担者：金﨑 啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学
北田 宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学中村 二郎・愛知医科大学医学部・教 授・内科学講座糖尿病内科
神谷 英紀・愛知医科大学医学部・准教授・内科学講座糖尿病内科
４．研 究 目 的
生体は様々な栄養応答シグナルによって恒常性を維持しているが、加齢および肥満によるその破綻は肝臓や脂肪細胞の慢性炎症とインスリン抵抗性を惹起する。その結果、加齢に伴い著増するメタボリックシンドロームや糖尿病に代表される代謝障害と様々な動脈硬化性疾患を併発して、個々の QOL を損なうとともに生命予後も悪化する。今回、栄養応答シグナ
ルの破綻によるオートファジー機構の制御不全がこれらの健康障害を引き起こすと仮説し、検討を行う。本研究では、飽食の時代にある今、栄養シグナルの破綻を介する代謝疾患の分子基盤を解明するとともに、その対策を目指す。
５．研 究 計 画
1）24 週齢の肥満 2 型糖尿病ラット (Wistar Fatty rat) に、通常食 (Protein 23.84%, Lipid 16.8%,
Carbohydrate 59.36%, Energy 3.55kcal/g; STD)、低たんぱく質食 (Protein 5.77%, Lipid 16.48%,
Carbohydrate 77.75%, Energy 3.54kcal/g; LPD) にて 20 週間介入して、代謝検査（HbA1c、イン
スリン値、シスタチン C）、組織検査（Masson-Trichrome 染色, PAS 染色, Kim-1 免疫染色, 電子顕微鏡検査、CD68 免疫染色）と、栄養応答シグナル（mTOR 経路：p-S6RP 免疫染色, オートファジー関連：p62 免疫染色）、アポトーシス関連：cleaved caspase3 を検討した。一部のラットには、30％カロリー制限を行い同様に組織の検査をした。さらに、LC3-GFP トランス
ジェニックマウスを用い、オートファジーを可視化した。
2）6 週齢の肥満 2 型糖尿病ラット (Wistar Fatty rat) に、通常食 (Protein 23.84%, Lipid 16.8%,
Carbohydrate 59.36%, Energy 3.55kcal/g; STD)、低たんぱく質食 (Protein 5.77%, Lipid 16.48%,
Carbohydrate 77.75%, Energy 3.54kcal/g; LPD) にて 24 週間介入して、上述した代謝検査に加えて、血中 FGF21、アディポネクチン値を測定した。

− 5 −６．研 究 成 果
1）糖尿病ラット (DM)-STD 群では、非糖尿病コントロールラット (CONT) と比べ体重、脂肪重
量、腎重量の増大を認めたが、DM-LPD 群では
体重、
脂肪重量、
腎重量ともに有意に減少した。
平均血圧は 4 群間において差はなかった。摂食図 1．マッソントリクローム染色による
尿細管間質および糸球体の線維化

量は自由摂食下で、DM 群に比べ DM+LPD 群では食事介入実験期間中、平均 15.5%減少していた。DM-STD 群において CONT に比べ上昇した HbA1C 値、CHO 値は LPD 群で有意に低下したが、ITT、GTT、IRI 値、TG 値、FFA 値は両群間で有意な差はなかった。食事介入開始時の UAlb/Cr 比および ULFAB/Cr は、それぞれ
CONT 群に対して、DM-STD 群では有意に増加していた。介入 20 週後においては、CONT 群に比べ DM-STZ 群では UAlb/Cr 比、血漿シスタチン C 値の有意な増加を示した。DM-LPD 群
では DM-STD 群と比べ UAlb・ULFAB・シスタチン C 値の有意な低下を認めた。マッソン/
トリクローム染色による尿細管間質および糸球体の線維化は、CONT に比して DM-STD 群においては著明に尿細管間質および糸球体の線維化は改善した（図 1）。また DM-STD 群で増加した腎皮質 3 型コラーゲンの mRNA 発現も同様に DM-LPD 群で低下した。尿細管障害ス
コア、Kim-1 免疫組織染色強度、腎皮質 Kim-1mRNA 発現はいずれも DM-STD 群では CONTと比較して増加し、DM-LPD 群で低下した。
CD68 免疫組織染色強度、
腎皮質 CD68、
MCP-1、
IL-6、TNF-alpha、TLR2 mRNA 発現は CONTに 比 べ て DM-STD 群 で 有 意 に 増 加 し 、DM-LPD 群で改善を認めた。
DM-STD 群では、
近位尿細管細胞におけるミトコンドリアの断片化および膨化の増加、腎皮質におけるcleaved caspase3 発現の増加（アポトーシ
スの増加）を認めたが、DM-LPD 群で改善した（図 2）。
DM-STD 群では、
CONT 群 に 比 し 、
p62・p-S6RP 免疫染
色強度の増強を認めるが、DM-LPD 群にて改善した。DM 群
にて増加する腎皮質− 6 −

図 2．ミトコンドリア形態異常は LPD
にて改善したp-S6RP 発現の増加は、STD→LPD に飼料をスイッチ 2 週間後で減少したが、DM-STD 群とDM-LPD 群間で p-Akt 発現に差はなかった。
2）6 週齢からの DM-LPD 介入は、摂餌量に DM-STD 群と差がないものの、有意な体重増加と脂肪重量の抑制がみられた。随時血糖、HbA1c、空腹時血糖は、LPD 介入によって有意に減
少し、空腹時インスリン値は有意に LPD 介入によって、STD 群と比べて低下した（図 3）。
これらの結果から、LPD 介入によってインスリン感受性の亢進が示唆された。そこで、その分子機構を明らかにする目的に、代謝改善作用を有するアディポネクチンおよび FGF21 の血中濃度を測定した。CONT 群に比べて DM-STD にて低下したアディポネクチンおよび FGF21
濃度は、LPD 介入によって改善していた。
７．研究の考察・反省
低たんぱく質介入によって、糖尿病腎症におけるオートファジー機構の破綻の改善が有効な治療手段であることも報告できた。また、低たんぱく質食による早期からの介入は、糖尿病の増悪を改善する、つまりメタボリックへルスを誘導することを見出した。その分子機構
は、代謝改善作用を有するアディポネクチンと FGF21 の増加による可能性が示唆された。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Ogura Y, Koya D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.
Int J Nephrol Renovasc Dis 2016; 9: 279-290.
Abstract: Diabetic nephropathy is the most common cause of end-stage renal disease. Therefore,
novel therapies for the suppression of diabetic nephropathy must be developed. Rodent models areuseful for elucidating the pathogenesis of diseases and testing novel therapies, and many type 1 andtype 2 diabetic rodent models have been established for the study of diabetes and diabetic
complications. Streptozotocin (STZ)-induced diabetic animals are widely used as a model of type 1
diabetes. Akita diabetic mice that have an Ins2+/C96Y mutation and OVE26 mice that overexpress
calmodulin in pancreatic β-cells serve as a genetic model of type 1 diabetes. In addition, db/db mice,
KK-Ay mice, Zucker diabetic fatty rats, Wistar fatty rats, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty ratsand Goto-Kakizaki rats serve as rodent models of type 2 diabetes. An animal model of diabetic
nephropathy should exhibit progressive albuminuria and a decrease in renal function, as well as thecharacteristic histological changes in the glomeruli and the tubulointerstitial lesions that are observedin cases of human diabetic nephropathy. A rodent model that strongly exhibits all these features ofhuman diabetic nephropathy has not yet been developed. However, the currently available rodent
models of diabetes can be useful in the study of diabetic nephropathy by increasing our understandingof the features of each diabetic rodent model. Furthermore, the genetic background and strain of eachmouse model result in differences in susceptibility to diabetic nephropathy with albuminuria and thedevelopment of glomerular and tubulointerstitial lesions. Therefore, the validation of an animal model
reproducing human diabetic nephropathy will significantly facilitate our understanding of the− 7 −underlying genetic mechanisms that contribute to the development of diabetic nephropathy. In thisreview, we focus on rodent models of diabetes and discuss the utility and limitations of these models
for the study of diabetic nephropathy.
② Kitada M, Ogura Y, Koya D. The protective role of Sirt1 in vascular tissue: its relationship to vascular
aging and atherosclerosis. Aging (Albany NY) 2016; 8: 2290-2307.
Abstract: Cardiovascular disease (CVD) due to atherosclerosis is the main cause of death in both theelderly and patients with metabolic diseases, including diabetes. Aging processes contribute to thepathogenesis of atherosclerosis. Calorie restriction (CR) is recognized as a dietary intervention for
promoting longevity and delaying age-related diseases, including atherosclerosis. Sirt1, an
NAD+-dependent deacetylase, is considered an anti-aging molecule and is induced during CR. Sirt1
deacetylates target proteins and is linked to cellular metabolism, the redox state and survival pathways.
Sirt1 expression/activation is decreased in vascular tissue undergoing senescence. Sirt1 deficiency inendothelial cells (ECs), vascular smooth muscle cells (VSMCs) and monocytes/macrophages
contributes to increased oxidative stress, inflammation, foam cell formation, senescences impaired
nitric oxide production and autophagy, thereby promoting vascular aging and atherosclerosis.
Endothelial dysfunction, activation of monocytes/macrophages, and the functional and phenotypicalplasticity of VSMCs are critically implicated in the pathogenesis of atherosclerosis through multiple
mechanisms. Therefore, the activation of Sirt1 in vascular tissue, which includes ECs,monocytes/macrophages and VSMCs, may be a new therapeutic strategy against atherosclerosis andthe increasing resistance to the metabolic disorder-related causal factors of CVD. In this review, we
discuss the protective role of Sirt1 in the pathophysiology of vascular aging and atherosclerosis.

− 8 −１．研究課題名：ヒト幹細胞由来心筋細胞における自動能の発現機構解明とバイオペースメーカ
ーシステム設計（研究番号：C2015-3）
２．キーワード：１）ES/iPS 細胞由来心筋細胞 (ES/iPS cell-derived cardiomyocyte)２）心筋自動能 (cardiac automaticity)
３）バイオペースメーカー (biological pacemaker)
４）数理モデル (mathematical model)
５）コンピュータ・シミュレーション (computer simulation)
３．研究代表者：倉田 康孝・医学部・特任教授・生理学Ⅱ
研究分担者：久留 一郎・鳥取大学大学院医学系研究科・教授・再生医療学
４．研 究 目 的
本研究の目的は、ヒト ES/iPS 細胞由来心筋細胞の分化成熟過程における電気生理学的特性を実験的に解析して数理モデル化し、非線形システムの分岐理論に基づいて「ヒトの発生過程における心筋細胞自動能の発現制御機構（心臓拍動の初発機構）を解明する」と共に、幹細胞由来心筋ペースメーカー細胞のバイオペースメーカーとしての有用性とその機能強化方法を実験的・理論的に検証して「実用的バイオペースメーカー開発のための実験的・理論的基盤を確立する」ことである。
「ヒトの発生過程における心臓自動能発現機構の解明」は、心臓生理学における最重要課題の一つであり、本研究の生理学的意義は明確である。また、「実
用的バイオペースメーカーの開発」は、機械式ペースメーカーに代わる徐脈性不整脈の新たな治療法として循環器学・不整脈学分野で注目されているテーマであり、本研究は、高齢化社会で増加しつつある徐脈性不整脈の画期的治療法を開発する上でも極めて有用である。
５．研 究 計 画
平成 27 年度は、まず、ヒト ES/iPS 細胞から分化誘導した心筋細胞から HCN4（過分極活性化陽イオンチャネル蛋白）陽性洞結節型ペースメーカー細胞（および固有心筋細胞）を効
率的に分別採取する方法を確立し、分取した細胞の分化成熟過程における電気生理学的特性（活動電位波形・各イオンチャネル電流動態）の経時的変化をパッチクランプ法により解析する。さらに、文献的に収集した実験データと合わせてデータベースを作成し、成人心筋データとの相違点と分化成熟過程での電気生理学的特性の変化を分析する。
一方、ヒト（成人）心筋細胞モデル（Kurata 2005 モデル、Nygren 1998 モデル、Courtemanche
1998 モデル、Grandi 2010 モデル他）をベースモデルとし、電気生理学的特性に関するデー
タベースを基にパラメータ調整を行い、「ヒト幹細胞由来心筋洞結節型ペースメーカー細胞」の数理モデルを構築する。ワークステーション (HP Z820, Hewlett-Packard Japan) および数値
計算・シミュレーション用ソフトウェア MATLAB (Math Works, USA) を用いてモデル細胞のパラメータ依存性分岐構造（自動能発現過程での安定性とダイナミクスの変化）を解析し、− 9 −幹細胞由来ペースメーカー細胞における自動能発現の非線形力学的機序（各形質膜イオン電流系と筋小胞体 Ca2+遊離・細胞内 Ca2+動態の寄与）を検証する。
６．研 究 成 果１）幹細胞由来心筋ペースメーカー細胞の分別採取方法の確立と電気生理学的特性の解明
ヒト ES/iPS 細胞より心筋細胞を樹立し、分化誘導した心筋細胞を効率的に分取精製する方法を確立した。ペースメーカー細胞（特殊心筋）は HCN4 をイオンチャネルマーカーとして分化誘導し、抗 HCN4 抗体を用いて、セルソーターによる HCN4 陽性洞結節型ペースメーカ
ー細胞（および固有心筋細胞）の同定と効率的な分別採取を可能にした。また、固有心筋マーカーMlc2v を用いた固有心筋細胞の分取も可能となった。
分取した ES 細胞由来心筋細胞について、分子生物学的特性の解析とパッチクランプ法による電気生理学的特性（活動電位波形・形質膜イオンチャネル電流動態）の解析を行い、①
HCN4 単独陽性細胞は洞結節細胞の電気生理学的特性を有すること、②Mlc2v 単独陽性細胞
は固有心筋、HCN4/Mlc2v 二重陽性細胞はプルキンエ線維の電気生理学的特性を有することを明らかにした。さらに、HCN4 単独陽性洞結節型ペースメーカー細胞では、過分極活性化
陽イオンチャネル電流 (If) が大きいこと、Na+チャネル電流と内向き整流 K+チャネル電流(IK1) が極めて小さいこと、L 型 Ca2+チャネル電流 (ICaL) と遅延整流 K+チャネル電流の密度は従来の成人心筋のデータに合致することも判明した。
また、ヒト iPS 細胞由来心筋細胞についても、HCN4 遺伝子座へ GFP 遺伝子をノックインするための BAC ベクターを用いた GFP 発現 HCN4 陽性ペースメーカー細胞の選別分取方法を確立し、活動電位・イオンチャネル電流の測定に成功した。
２）ヒト幹細胞由来心筋細胞モデルの作成と分化成熟過程における自動能発生機序の解明
ヒト（成人）心筋細胞モデル（Kurata 2005 モデル、Nygren 1998 モデル、Courtemanche 1998
モデル、Grandi 2010 モデル他）をベースモデルとし、上記の電気生理学的特性解析データを基に各ヒト心筋細胞モデル（各イオン輸送系）のパラメータ値を調整して、「ヒト幹細胞由来
洞結節型ペースメーカー細胞」の非線形力学系モデル（連立非線形常微分方程式）を構築した。Kurata 2005 モデルでは、IK1 電流の抑制による安定平衡点の消失（サドル－ノード分岐）に伴って自動能が発現し、さらに If 電流を組み込むことにより、実験的に観察されるヒト幹細胞由来洞結節型ペースメーカー細胞の自発性活動電位波形をよく再現することができた。
他のモデルでは IK1 抑制と If 導入のみで自動能は発現しなかったが、背景電流を調整（内向き
電流を増強または外向き電流を抑制）して安定平衡点を消失させることにより自発性活動電位を再現できることが判明した。
さらに、幹細胞由来心筋細胞の分化成熟過程における各イオン電流動態の変化を分岐パラメータの変化としてシミュレートし、モデル細胞の定常状態・周期軌道とその安定性のパラ
メータ依存性変化を表す分岐図を作成することができた。モデル細胞のパラメータ依存性分岐パターンを非線形力学系の分岐理論に従って比較解析した結果、分化成熟過程における自動能の発現は主に「ICaL 電流による平衡点（定常状態）の不安定化」に起因しており、If 電流− 10 −

や筋小胞体 Ca2+遊離は必須ではないと結論された。
７．研究の考察・反省
平成 27 年度の研究により、ヒト ES 細胞由来心筋ペースメーカー細胞（および固有心筋型細胞）の分別採取方法が確立され、その電気生理学的特性が明らかとなったが、実用的バイオペースメーカーの開発を可能にするには、「幹細胞由来ペースメーカー細胞の自律神経作用薬への反応性の解析と徐脈モデル動物心臓への移植実験」ならびに「バイオペースメーカー
機能強化方法の多細胞モデルを用いた理論的検証」が必要である。今後、実験面では、①自律神経作用薬が HCN4 陽性洞結節型ペースメーカー細胞の自動能を促進・抑制（自発性活動
電位頻度を調節）できるか否かの検証、②各イオンチャネル電流阻害薬（verapamil, E4031,
chromanol 293B など）への反応性の解析、③電位依存性色素を用いた 96 穴マイクロプレート
での安定的な膜電位測定法の確立、④分取・組織化した HCN4 陽性ペースメーカー細胞の徐脈性不整脈（房室ブロック）モデル動物心臓（心室）への移植方法の確立とバイオペースメ
ーカー活性（自動能のロバスト性と心室ドライブ機能）の評価などが必要になると考えられる。また、理論的解析としては、①新たなヒト幹細胞由来洞結節型ペースメーカー細胞モデ
ルを用いたバイオペースメーカー細胞としての機能（自動能のロバスト性）の理論的評価、②ペースメーカー細胞に正常成人心室筋細胞をギャップ結合で連結した多細胞モデルを用いたバイオペースメーカー機能（自動能の電気緊張性負荷に対するロバスト性と心室筋ドライブ機能）発現条件の検証、③自動能調節イオン電流系導入・修飾によるバイオペースメーカ
ー機能変化の解析に基づいた実用的バイオペースメーカーシステム設計・開発手法の提案が必要と考えている。
８．研 究 発 表
① Sogo T, Morikawa K, Kurata Y, Li P, Ichinose T, Yuasa S, Nozaki D, Miake J, Ninomiya H, Shimizu
W, Fukuda K, Yamamoto K, Shirayoshi Y, Hisatome I. Electrophysiological properties of iPS
cell-derived cardiomyocytes from a patient with long QT syndrome type 1 harboring the novel
mutation M437V of KCNQ1. Regen Ther 2016; 4: 9-17.
Abstract: Introduction: Long QT syndrome type 1 (LQT1) is caused by mutations in KCNQ1
coding slowly-activating delayed-rectifier K+ channels. We identified the novel missense mutation
M437V of KCNQ1 in a LQT1 patient. Here, we employed iPS cell (iPSC)-derived cardiomyocytes toinvestigate electrophysiological properties of the mutant channel and LQT1 cardiomyocytes.
Methods: To generate iPSCs from the patient and a healthy subject, peripheral blood T cells werereprogrammed by Sendai virus vector encoding human OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC.
Cardiomyocytes were prepared from iPSCs and human embryonic stem cells using a cytokine-based
two-step differentiation method and were subjected to patch clamp experiments.
Results: LQT1 iPSC-derived cardiomyocytes exhibited prolongation of action potential duration(APD), which was due to a reduction of the KCNQ1-mediated current IKs; Na+, Ca2+ and other K+− 11 −

channel currents were comparable. When expressed in HEK293 and COS7 cells, the mutant KCNQ1
was normally expressed in the plasma membrane but generated smaller currents than the wild type.
Isoproterenol significantly prolonged APDs of LQT1 cardiomyocytes, while shortening those ofhealthy ones. A mathematical model for IKs-reduced human ventricular myocytes reproduced APD
prolongation and generation of early afterdepolarizations (EADs) under -adrenergic stimulation.
Conclusions: QT prolongation of the LQT1 patient with the mutation M437V of KCNQ1 was caused
by IKs reduction, which may render the patient vulnerable to generation of EADs and arrhythmias.
② Kurata Y, Tsumoto K, Hayashi K, Hisatome I, Tanida M, Kuda Y, Shibamoto T. Dynamicalmechanisms of phase-2 early afterdepolarizations in human ventricular myocytes: insights frombifurcation analyses of two mathematical models. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2017; 312:
H106-H127.
Abstract: Early afterdepolarization (EAD) is known as a cause of ventricular arrhythmias in long
QT syndromes. We theoretically investigated how the rapid (IKr) and slow (IKs) components ofdelayed-rectifier K+ channel currents, L-type Ca2+ channel current (ICaL), Na+/Ca2+ exchanger current(INCX), Na+-K+ pump current (INaK), intracellular Ca2+ (Cai) handling via sarcoplasmic reticulum (SR),and intracellular Na+ concentration (Nai) contribute to initiation, termination, and modulation ofphase-2 EADs, using two human ventricular myocyte models. Bifurcation structures of dynamical
behaviors in model cells were explored by calculating equilibrium points, limit cycles (LCs), andbifurcation points as functions of parameters. EADs were reproduced by numerical simulations. The
results are summarized as follows: 1) decreasing IKs and/or IKr or increasing ICaL led to EAD
generation, to which mid-myocardial cell models were especially susceptible; the parameter regions
of EADs overlapped the regions of stable LCs. 2) Two types of EADs (termination mechanisms), IKs
activation-dependent and ICaL inactivation-dependent EADs, were detected; IKs was not necessarily
required for EAD formation. 3) Inhibiting INCX suppressed EADs via facilitating Ca2+-dependent ICaLinactivation. 4) Cai dynamics (SR Ca2+ handling) and Nai strongly affected bifurcations and EAD
generation in model cells via modulating ICaL, INCX, and INaK Parameter regions of EADs, often
overlapping those of stable LCs, shifted depending on Cai and Nai in stationary and dynamic states. 5)
Bradycardia-related induction of EADs was mainly due to decreases in Nai at lower pacing rates. This
study demonstrates that bifurcation analysis allows us to understand the dynamical mechanisms of
EAD formation more profoundly.

− 12 −

１．研究課題名：抗血栓療法の最適化を目指した集学的診断法の開発（研究番号 C2015-4）
２．キーワード：１）抗血栓療法 (anticoagulant therapy)
２）ワルファリン (warfarin)
３）Xa 阻害薬 (Xa inhibitor)
４）薬理遺伝学 (pharmacogenomics)
５）薬効モニタリング (drug monitoring)
３．研究代表者：梶波 康二・医学部・教 授・循環器内科学
  研究分担者：河合 康幸・医学部・准教授・循環器内科学    赤尾 浩慶・医学部・臨床准教授・循環器内科学   斉藤 竜平・医学部・助 教・循環器内科学    斎藤 嘉朗・国立医薬品食品衛生研究所・部長・医薬安全科学部
        佐井 君江・国立医薬品食品衛生研究所・室長・医薬安全科学部
４．研 究 目 的
心房細動や深部静脈血栓症に続発する脳梗塞や肺梗塞の予防には的確な抗血栓療法が不可欠である。従来はビタミン K 代謝拮抗薬ワルファリンがその中心であったが、薬物反応性の個人差が大きく、ビタミン K など栄養素摂取量に影響される難点があった。これらの克服を期待され新規抗血栓薬（トロンビンおよび Xa 阻害薬）が 2010 年以降臨床応用されているものの、その有効性および安全性に関する臨床指標は未確立である。特に投与前に効果と副作用を予知し、治療設計の最適化を目指した検討は皆無である。その大きな障壁として薬効ならびに副作用を規定する素因の人種差ならびに個体差が指摘されており、ゆえに日本人独自の知見を多角的に集積・分析する必要がある。
本研究では、抗血栓療法最適化を目指し、その薬効と副作用を予測するため、遺伝子・バイオマーカー・環境要因の情報を統合した集学的診断法開発を目指す。動脈硬化治療薬の薬
理遺伝学に関し成果を積み重ねてきた代表者らが、副作用を含む薬物療法における日本人の特徴を世界に発信してきた斎藤グループと共同で、抗血栓療法に関する新知見を探索しその早期臨床実用化を目指す、新しいスタイルの医学・薬学統合研究である。
５．研 究 計 画
従来頻用されてきたワルファリンおよびヘパリン、および新規抗血栓薬であるトロンビン阻害薬および Xa 阻害薬について、新規開始例について研究の趣旨を説明し文書で同意を得た後に前向きに登録する。いずれも対象例の臨床情報を収集と、遺伝子解析用ならびにバイ
オマーカー解析用血液サンプルを集積する。
検討項目としては、①研究代表者らのスタチンおよびワルファリンに関する成果を基盤に薬物動態と薬動力学に関わる候補遺伝子高頻度多型、および全ゲノム網羅的解析を用い遺伝− 13 −

素因を探索する。②また梶波・河合の研究を基盤に、新規バイオマーカーとしてエイコサノ
イドなど血小板/凝固因子活性化に関与する物質を、GC/MS, LC/MS, CE-MS を用い網羅的・体系的に定量し、薬効指標に連鎖する物質を同定する。③同時に斉藤が報告した調査用紙を用いビタミン K 経口摂取量を定量し、①および②への影響を検証する。薬効指標として、①凝固系各種検査値等のサロゲート指標、②脳梗塞や心筋梗塞など心血管イベント、さらに③
副作用（薬疹や肝障害に加え出血性イベントなど薬理作用の有害事象）を設定する。これには斎藤・佐井らの日本人における副作用規定因子の研究成果を応用する。
６．研 究 成 果１）ワルファリンの薬効に与えるビタミン K 摂取量の影響に関与する新規遺伝素因の同定
斉藤らが報告したビタミン K 経口摂取がワルファリン薬効に与える影響について、ビタミ
ン K 吸収に関わる分子として同定された腸管上皮に発現するコレステロール吸収トランスポーターNPC1L1 の機能的遺伝子多型の関与を検討した。
すなわち、ワルファリン投与中の連続 232 例を対象に、NPC1L1 高頻度多型 4 種を検討し、質問紙法によって定量したビタミン K 摂取量ならびにワルファリン薬効 (PT-INR) との関係
を、ビタミン K 代謝に関与する VKORC1 高頻度多型 (rs9923231) 別に比較した。その結果、
VKORC1 高頻度多型変異アレル保有例では、コレステロール吸収亢進と連鎖する NPC1L1 高
頻度多型 rs2072183 野生型ホモ接合例が同多型のヘテロ例に比較して、同等の PT-INR であるにもかかわらずビタミン K 摂取量が有意に少なかった。一方 VKORC1 高頻度多型変異アレ
ルを持たない例（野生型ホモ接合例）では、このような NPC1L1 高頻度多型 rs2072183 の影
響は認められなかった。
これにより、経口ビタミン K 摂取量のワルファリン薬効に与える影響には、VKORC1 とNPC1L1 の機能的高頻度遺伝子多型の相互作用が関与すると結論された（日本循環器学会学術集会発表、2016 年 3 月）。
２）Xa 阻害薬投与患者における凝固線溶系の変動とその規定因子の探索
新規抗凝固薬である Xa 阻害薬投与患者を対象に、Xa 阻害薬血漿中濃度を Xa 活性として間接測定するとともに、凝固線溶系各種臨床指標を同時測定し、最終服薬からの経過時間を考慮し、実臨床における経時的薬効の推移、ならびにその規定因子を探索した。
すなわち、Xa 阻害薬のうちアピキサバンとリバーロキサバン投与中の外来症例を対象に、
STA-Liquid Anti-Xa®を用いて Xa 濃度を間接測定するとともに、D ダイマー、フィブリンモ
ノマー、プロトロンビンフラグメント F1+2 を測定した。その結果、Xa 濃度間接測定系は十分な同時ならびに異時再現性をもって機能した。また予想外に低値を認めた症例では F1+2の異常高値を伴っており、服薬コンプライアンスの低下から抗凝固療法低下を期待しているものと推測でき、臨床的に有用な薬効モニター法であることが示唆された（欧州心臓病学会
発表、2016 年 8 月）。
次に、心房細動に対するカテーテルアブレーション治療目的に入院した 16 例（アピキサバ− 14 −

ンおよびリバーロキサバンとも 8 例）を対象に、凝固系活性化の指標である F1+2 に着目し、Xa 阻害薬の最終服薬からの時間経過ならびに間接測定した Xa 活性との相互関係を検討した。
その結果、Xa 阻害薬血中濃度低値の時間帯に F1+2 産生が亢進する可能性が、特に 1 日 1 回投与の薬剤の場に強いことが示唆され、Xa 阻害薬による抗血栓療法に際し考慮すべき点と考えられた（日本循環器学会学術集会発表、2017 年 3 月）。
７．研究の考察・反省
ワルファリンの栄養薬理遺伝学解析では、関与する遺伝子多型の頻度が欧米人と日本人では大きく異なることが知られている。ビタミン K 経口摂取量に着目した研究成果を見出した
ことで、日本食に対応した知見を積み重ねることになり、今後の発展が期待される。当初日
本人特有のプラットフォームを用いた GWAS 解析を予定していたが、解析受託業者の状況が変化し、やむを得ず順延せざるを得なかった。今後再度検討を計画している。
Xa 阻害薬による抗凝固療法のモニタリングに際し、有用性の高い凝固線溶マーカーを同定することができた。今後は、保存してある検体を用いて、その規定因子の探索を進めるとともに、同じく遺伝子分析用検体を用いた薬効に関わる遺伝素因を候補遺伝子アプローチ、さらには GWAS を用いて解析する予定である。当初検討項目としていた薬剤投与に伴う有害事象については、その頻度が低く、よって影響する要因の探索には至らなかった。今後の長期経過観察においての検討事項としたい。
上記２事項とも、現在論文化作業を進めている。
８．研 究 発
 表該当なし

− 15 −

１．研究課題名：認知症グループホームの介護職におけるストレス緩和支援に関する研究（研究番号 C2015-5）
２．キーワード：１）認知症グループホーム (group homes for dementia)        ２）介護職 (care workers)        ３）施設管理者 (facilities managers)     ４）教育の認識 (perception of education)
３．研究代表者：河野由美子・看護学部・講 師・在宅看護学
  研究分担者：櫻井志保美・看護学部・准教授・公衆衛生看護学（採択時）        小泉 由美・看護学部・准教授・老年看護学        森山  治・金沢大学人間社会研究域・教授・経済学経営学系
４．研 究 目 的認知症グループホームの管理者における介護職員への教育指導の認識を明らかにし、グループホームにおける教育支援システムを提案する資料とする。
５．研 究 計 画1）対象者：調査協力が得られた認知症グループホーム施設管理者 10 名程度。人数は管理者を対象とした先行研究を基準に決定した。
2）施設管理者とは：施設の開設後 3 年経過している施設管理者とし、認知症対応型グループホームを運営する管理者であり、かつ教育研修等を企画運営している管理者とした。
3）対象者募集：郵送で石川県内のグループホーム全 165 施設の管理者あてに協力依頼し、研究協力の得られた管理者に対し口頭と文書で説明と同意を得た。
4）方法①自記式質問紙調査②半構成面接調査
5）データ収集①属性、入居者、組織、管理等について自記式質問紙を用いて調査した。
②介護職教育の取り組みにおける管理者の認識、介護職としての意識向上への取り組みに対する思いや実際についてインタビューを行った。
③面接はインタビューガイドを用いて一人 60 分程度行い、会話は録音した。
6）分析方法①自記式質問紙調査は各項目を集計した。
②面接は IC レコーダーに録音し、それを基に逐語録を起こし、カテゴリを洗練し抽象度の高いカテゴリを生成した。
③質的研究を専門的に実施している共同研究者から助言を受け内容妥当性に努めた。

− 17 −

7）倫理的配慮①所属機関の倫理審査委員会の承認を得て実施した（No.15-17）。
②研究協力者には研究の趣旨、目的、方法等を文書と口頭で説明し、文書による同意を得た。
③途中で研究参加の中止による不利益を被らないことを説明した。
④得られたデータは研究者が厳重に保管し、プライバシーの保護に努める。また、本研究以外に使用しないことを説明した。
６．研 究 成 果
1）参加者の背景
男性 3 名、女性 8 名。平均年齢 59.9 歳(48-81 歳)。管理者経験年数は 1 年から 21 年であった。有資格は介護福祉士、社会福祉士、看護師等であった。医療保健福祉の資格のない管理者が 1 名いた。
2）抽出されたカテゴリ①『介護職に必要な知識や技術の習得』②『認知症高齢者の意思を尊重した態度』③『主体性と責任感を発揮する行動』④『入居者とスタッフとの良好な関係性』⑤『スタッフ間の情報交換や良好な人間関係』⑥『他職種・他施設との交流の促進』⑦『管理者役割の認識』⑧『スタッフの人材活用のための調整』⑨『スタッフ育成の基盤つくり』の９項目であった。
７．研究の考察・反省
認知症グループホームの管理者における介護職への教育指導に関する認識について９項目のカテゴリが抽出された。認知症 GH の管理者は、介護職として必要な知識と技術を習得し、認知症高齢者の意思を尊重した態度で接することや主体性と責任感を発揮する行動等を介護職に求めていた。そのため、スタッフ育成の基盤づくりを行うとともに、他職種・他施設との交流を促進する必要性を感じていた。
また、GH の運営には、入居者とスタッフとの良好な関係性やスタッフ間の情報交換や良好な人間関係が欠かせないことを認識していた。そして、管理者として、スタッフの人材活用のための調整や入居者とスタッフが良好な関係性を保持するために見守りや必要時に支援する等後方支援の必要性を感じていた。
教育支援システムを提案するにあたって、介護職に必要な知識や技術の習得を目的とした研修会開催や他職種・他施設職員との交流を通して学習する研修会等の必要性が示唆された。
８．研 究 発 表
現在、論文投稿にむけ作成中である（日本在宅ケア学会誌投稿予定）。学会発表は以下のとおりである。
・ 河野由美子，桜井志保美，小泉由美，森山治：認知症グループホームの管理者における介護職への教育指導に対する認識，第 22 回日本在宅ケア学会学術集会，（札幌市，2017 年７月）．

− 18 −

平成  年度



奨励研究成果報告書
医 学 領 域 5～
看護学領域 5



１．研究課題名：Physiological role of HPVE7-UBR4 interaction mediated by the N-end rule pathway（研究番号 S2015-1）
２．キーワード：１）ヒトパピローマウイルス (HPV)
２）UBR4３）発がん (carcinogenesis)
４）タンパク質相互作用 (protein interaction)
３．研究者氏名：田崎 隆史・総合医学研究所・准教授・生命科学研究領域
４．研 究 目 的
子宮頸がんを引き起こすヒトパピローマウイルス (HPV) の発癌メカニズムとして、
HPV16 E7 蛋白と宿主ユビキチンリガーゼ UBR4 の相互作用の重要性が報告されている。これまでの研究で、UBR4 の UBR box 領域が E7 蛋白との結合に重要であることを明らかにした。このことは、HPV 感染によって E7 蛋白が宿主 UBR4 に結合し、N-end rule 経路を制御していることを示唆している。本研究は、N-end rule 経路による UBR4-E7 分子相互作用を解
明し、発がんへの関与を探ることを研究目的とする。
５．研 究 計 画
これまでの結果は、UBR4 と HPV16 E7 の結合には N-end rule 基質の結合部位である UBRbox が重要であることを示唆している。本研究は、引き続き、結合部位の詳細な同定とその生理学的役割の解析を分子生物学・生化学的手法を用いて行う。E7 結合部位の最小単位を特定し、E7 タンパク質が N-end rule pathway を阻害するかを明らかにする。
６．研 究 成 果
抗 flag 抗体ビーズを用いた免疫沈降実験により、UBR4 は E7-flag 及び pRB 結合活性を失った変異型 E7(d21-24)-flag と強く結合できるが、変異型 E7(d6-10)-flag との結合は弱いことが示された。次に、UBR4 断片を作成し結合実験を行ったところ、UBR box 領域を含む事が重要である事がわかった。UBR box 領域は、N-end rule 基質の結合部位として重要な領域である。そこで、UBR4 のモデル基質である R-peptide beads と、細胞可溶化液及び E7 を混合した
ところ、E7-flag および E7(d21-24)-flag は、UBR4 -R-peptide 結合を特異的に阻害するが、UBR4への結合能が低い変異型 E7(d6-10)-flag では、その阻害が顕著に弱いことがわかった。
UBR4-E7 結合が N-end rule 阻害剤によって阻害される結果と合わせ、UBR4-E7 相互作用はN-end rule 基質結合部位 UBR box 領域を介していることを示唆している。次に、HPV16E7 をマウス胎仔由来繊維芽細胞において発現させたところ、UBR4 遺伝子欠損細胞では、E7 が、より不安定になる事が分かった。これらの結果から、UBR4 は E7 と結合して安定化させ、E7 の生物活性を制御している事が考えられた。

− 19 −


７．研究の考察・反省
本研究は、E7 と UBR4 のタンパク質―タンパク質相互作用の解析を目的としているが、E7 はウイルス由来タンパク質であるため、大腸菌内での大量発現が容易ではないことが技術的な課題であった。そこで、HPV16 型 E7cDNA 配列を大腸菌系に最適化させることで、安定した発現が可能になった。この組換え E7 タンパク質を用いて、UBR4 上の E7 結合部位を約800 アミノ酸（UBR4 の全長は約 5100 アミノ酸）程度まで絞ることができたが、今回特定した領域より小さな UBR4 断片は、HEK293 細胞内でうまく発現しなかったため、さらに狭い領域に絞ることができなかった。この領域は UBR box domain を含んでおり、UBR box 依存の結合阻害アッセイを行った。その結果、E7 と UBR4 との結合が UBR box 領域を介している事が強く示唆された。一方、この結合の生理学的意義ははっきりとわかっていない。一つの可能性としては、UBR4 欠損細胞内では E7 タンパク質が非常に不安定になる事から、UBR4
が E7 と結合して E7 を安定化している可能性がある。今後の研究では、UBR box と E7 結合についてさらなる解析を進め、E7 安定性の分子メカニズムを明らかにする必要がある。
８．研 究 発 表Tasaki T, Nukuzuma S, Takegami T. Impaired Japanese encephalitis virus replication in p62/SQSTM1
deficient mouse embryonic fibroblasts. Microbiol Immunol 2016; 60: 708-711.
Abstract: The role of the autophagy adaptor protein p62/SQSTM1 in Japanese encephalitis virus(JEV) replication in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) was investigated. Amounts of JEV RNA
and E protein were significantly smaller in p62-deficient cells than wild-type cells at 24 hr
post-infection (p.i.). JEV RNA quantitation and viral plaque assays showed significant reductions inviral titers in p62-deficient cell culture fluid. Our results indicate that JEV replication is impaired in
p62-deficient MEFs, suggesting that p62 positively regulates JEV replication in host cells.

− 20 −

１．研究課題名：GLP-1 による摂食及び血圧調節作用における脳内メカニズムの解明（研究番号
S2015-2）
２．キーワード：１）視床下部 (hypothalamus)２）肥満 (obesity)３）インクレチン (incretin)
４）マウス (mouse)
５）循環調節 (cardiovascular regulation)
３．研究者氏名：谷田 守・医学部・准教授・生理学Ⅱ
４．研 究 目 的研究代表者は、摂食調節に関与する神経ペプチドである nesfatin-1 や脂肪組織由来ホルモンである leptin が中枢神経系に作用して自律神経を調節する仕組みを解析してきた。本研究では、末梢組織の小腸から分泌され血糖調節ホルモンの一つであるグルカゴン様ペプチド(GLP-1) が中枢神経系を介して摂食及び血圧調節に関与していることに着目して (Physiol
Behav. 2013 Oct 2;122:201-7.)、その脳内メカニズムについて解析することを目的とした。具体的には、ラット又はマウスへ GLP-1 を脳室内投与して、肥満や高血圧を抑える経路の仕組みを解析した。
５．研 究 計 画
【実験動物】
Wistar 系雄ラット又は ICR 系雄マウスを用いた。食餌性肥満マウスは、ICR 系雄マウスに高脂肪食（60％脂肪、HFD60、オリエンタル酵母工業）を 8 週間自由摂取させ、高脂肪食マ
ウスとして用いた。
【摂食実験】
12 時間絶食させたラットまたはマウスを用いて、GLP-1 の脳室内投与後 4 時間、12 時間で摂食量を測定した。
【電気生理実験】
ラット又はマウスを用いてウレタン・クラロース麻酔下で血圧調節に関与する腎臓交感神経活動と動脈圧を計測して、GLP-1 の脳室内（ラット；10 nmol, マウス; 1 nmol）や視床下部神経核への投与効果について解析した。
【生化学実験】
12 時間絶食させたマウス（コントロールマウス、高脂肪食マウス）を用いて、GLP-1 の脳室内投与後 15 分で脳・視床下部をサンプリングして視床下部での細胞内シグナル伝達分子のリン酸化レベルを定量した。

− 21 −

６．研 究 成
 果
【摂食実験】
 ラット及びマウスに、GLP-1 を脳室内に投与すると、投与後 4 時間で有意に摂食量が減少
したが、投与後 12 時間ではマウスではなくてラットの摂食量が有意に減少した。また体重についても GLP-1 投与後 12 時間でラットの体重が有意に減少した。
さらに高脂肪食マウスの摂食量へ及ぼす GLP-1 の投与効果を検討した結果、GLP-1 投与後4 時間で有意に摂食量が減少した。
【電気生理実験】
麻酔下ラットに、GLP-1 を脳室内投与すると、交感神経腎臓枝の活動と血圧が増大した。
また麻酔下マウスにおいても同様に交感神経腎臓枝の活動が増大した。
さらに、GLP-1 の視床下部室傍核への微量投与が交感神経腎臓枝の活動と血圧を促進させた。vehicle1 投与では、ラット及びマウスの神経活動においても明らかな変化は観察されなかった。
【生化学実験】
GLP-1 をマウス脳室内に投与すると、視床下部での PKA によるリン酸化基質の発現レベルが増大したが、他の細胞内伝達シグナル (MAPK/ERK, PI3K/Akt, AMP-kinase) のリン酸化レ
ベルは変化しなかった。また、高脂肪食マウスでも同様に GLP-1 投与によって PKA リン酸
化基質の発現が増大した。
７．研究の考察・反省
摂食調節作用をもつ GLP-1 をラット又はマウスの脳室内に投与したところ、投与後 4 時間
で摂食量が減少したことから、小腸から産生されるインクレチンが血液中を介して脳内に作用して摂食を抑える作用をもつことがわかった。この作用の脳内機構として、本研究で示した、視床下部での PKA 経路が関与する可能性が考えられる。予備検討であるが、PKA 阻害剤を投与すると、GLP-1 投与による摂食抑制作用が減弱されることがわかっている。今後は視床下部のどの神経核に存在する PKA シグナルが摂食調節に関与しているか検討する必要がある。
本研究で、麻酔下ラットへの脳室内又は視床下部室傍核内 GLP-1 投与が血圧と腎臓交感神経活動を増大させることを示したが、麻酔下マウスへの GLP-1 脳室内投与は交感神経活動を促進させたが、血圧を上昇させなかった。このことについて、他の摂食抑制作用をもつホルモンである leptin についても同様で、覚醒下ではなくて、麻酔下のマウスに leptin を脳室内投与しても血圧は上昇しないことがわかっている (Neuroscience. 2013 May 15;238:297-304)。
従って、マウスでの実験では、血圧調節に麻酔が影響する可能性が高い為、覚醒下での解析を行う必要性が示唆され、今後検討を行う予定である。
本研究では、急性実験で GLP-1 の効果を検討したが、創薬への応用について検討する為には、慢性実験で GLP-1 の有効性を疾患モデル動物で検討する必要がある。本研究では、GLP-1の急性脳室内投与が高脂肪食性肥満マウスの摂食量を抑制させたことから、慢性投与で肥満− 22 −

動物の摂食を抑える可能性も示唆している。一方で、GLP-1 は急性投与で血圧上昇を引き起こす為、GLP-1 を慢性投与した際に、血圧を上昇させないで、摂食及び体重減少作用が検出される GLP-1 投与量を検討する必要性が考えられる。
８．研 究 発 表なし（現在、執筆中）− 23 −

１．研究課題名：内皮細胞 FGF 受容体 1 が演じる腎線維化抑制機構の検討（研究番号 S2015-3）
２．キーワード：１）腎線維化 (kidney fibrosis)２）内皮－間葉細胞分化転換 (EndMT)３）fibroblast growth factor 1 (FGFR1)
４）N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP)
３．研究者氏名：金﨑 啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学
４．研
 究 目 的
腎線維化は組織傷害遷延に関連する創傷治癒機構不全と細胞外基質 (ECM) の蓄積に起因する。腎臓線維芽細胞は線維化に寄与し、内皮細胞-間葉系細胞分化 (EndMT) は線維芽細胞
活性化において重要な役割を演じる。アンジオテンシン変換酵素 (ACE) の基質ペプチドである N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP) が、優れた抗線維化効果抗 EndMT 効果を有することを我々は以前報告した。AcSDKP は糖尿病腎やサイトカイン刺激で抑制された線
維芽細胞成長因子受容体 1 (FGFR1) の発現リン酸化を正常化させ、FGFR1 は microRNA let7
ファミリーを介して EndMT を阻害する。しかしながら、AcSDKP による抗 EndMT 効果の分子機構や、AcSDKP と FGFR1 間の相互作用は不明である。本研究によって、線維化腎における内皮細胞 FGFR1 の生物学的意義を明らかとするとともに、AcSDKP の作用点としての
FGFR の意義を確認する。
５．研 究 計 画
FGFR1 による EndMT 制御とその分子機構、及び腎線維化における意義を明らかにするため、次の研究項目を実施している。
1) 内皮細胞 FGFR1 と AcSDKP 間の相互作用の有無の確認とその意義
2) 内皮細胞 FGFR1 が内皮細胞ミトコンドリア恒常性において演じる役割の検討
3) 内皮細胞特異的 FGFR1 ノックアウトマウスの作成と解析
６．研 究 成 果
現時点までに次の実験結果を得ている。
1) Duolink proximity ligation assay にて AcSDKP と FGFR1 が相互作用する可能性が明らかとなった（図１）。
2) AcSDKP は TGF-2 により抑制される FGFR1 発現を正常化した。
3) FGFR1 の中和抗体投与下では、AcSDKP による抗 TGF 2-smad3 リン酸化抑制効果が抑制された（図１）。
4) AcSDKP の mutant peptide ではこれら 1)〜3) の効果は確認できなかった。
5) FGFR1 の中和抗体投与下では、TGF-2 刺激誘導 EndMT に対する AcSDKP による抑制効− 25 −

果は消失した（図１）。
6) FGFR1 中和抗体の代わりに、FGFR1 の基質である FRS2 の siRNA を用いた FRS2 ノック
ダウン細胞でも同様の結果が得られた。
7) 内皮細胞恒常性に重要で integrin1 抑制効果を有する MAP4K4 は FGFR1 中和抗体投与により抑制された。
また、FGFR1 と MAP4K4 間には相互作用が観察された（Duolink proximity
ligation assay と免疫沈降法）（図１）。
8) AcSDKP は MAP4K4 リン酸化を誘導し、FGFR1 中和抗体投与の元ではこれは抑制された。
9) 内皮細胞恒常性を破綻させる DPP-4 と integrin1 間の相互作用は、AcSDKP により抑制されるが、MAP4K4 siRNA を用いた MAP4K4 ノックダウン細胞では AcSDKP による抑制効
果は消失した。
10) STZ 誘導糖尿病 CD-1 マウスにおいて、血管内皮細胞において FGFR1 が低下し、EndMTが誘導されるが、AcSDKP 投与によりこれは抑制された。
11) 内皮細胞に FGFR1 中和抗体を投与することにより、内皮細胞ミトコンドリア数が低下、ミトコンドリアバイオジェネシスの障害が生じた。
12) 内皮細胞 FGFR1 選択的ノックアウトマウスに関しては、作成が終了し、現在糖尿病を誘導した。2017 年 7 月に屠殺予定。

図１ AcSDKP と FGFR1 の相互作用による EndMT 抑制効果
AcSDKP と FGFR1 の近接相互作用を確認した。AcSDKP と FGFR1 間の相互作用は FRS2 とMAP4K4 の相互作用を誘導し、結果として integrin1 は抑制される。Integrin1 は TGFの受容体のヘテロ２両体形成とそれに引き続く smad3 リン酸化に重要である。この結果として、
AcSDKP は EndMT を抑制することが考えられる。

７．研究の考察・反省
今回の検討から、今まで作用点が不明であった AcSDKP の内皮細胞における作用点が明らかとなった。AcSDKP は 4 アミノ酸で構成される小ペプチドであるため FGFR1 との相互作用に関しては duolink proximity ligation assay のみにて観察され、免疫沈降法など通常のタンパク− 26 −

相互作用を確認する方法は困難であった。そのような実験上の限界は存在するものの、
AcSDKP の細胞膜状の作用点として FGFR1 を見いだす事ができたことは、今後内皮細胞
FGFR1 に対するアゴニストや半減期を延長した AcSDKP 模倣ペプチドの開発など今後発展性のある知見を確認する事ができた。
８．研 究 発 表
① Ueki N, Kanasaki K, Kanasaki M, Takeda S, Koya D. Catechol-O-methyltransferase deficiency leads
to hypersensitivity of the pressor response against angiotensin II. Hypertension 2017; 69: 1156-1164.
Abstract: Catechol-O-methyltransferase (COMT) metabolizes 2-hydroxyestradiol into 2-methoxyestradiol(2-ME); COMT deficiency has shown to be associated with hypertension in men and preeclampsia,
the disease associated with hypersensitivity of pressor response against angiotensin II (Ang II). Here,
we found that COMT deficiency could explain the hypersensitivity of pressor response against Ang II
in mice because of the lack of 2-ME-dependent suppression of angiotensin II receptor type 1 (AT1R).
Male C57BL/6 mice were subjected to COMT inhibitor (COMTi: 25 mg/kg per day) or oil (control)for 4 weeks, with or without low-dose Ang II infusion (ANGII: 70 ng/kg per minute) for the last 3
weeks. The Ang II-infused mice were treated with 2-ME (10 ng/d) or vehicle for the last 1 week. We
obtained the following experimental groups: control, ANGII, COMTi, COMTi+ANGII, andCOMTi+ANGII+2-ME. We performed similar experiments using the in vivo administration of smallinterfering RNA of COMT instead of COMTi. Neither ANGII nor COMTi exhibited significant
alterations in systolic blood pressure. Compared with ANGII or COMTi, COMTi+ANGII displayed
significantly higher systolic blood pressure, albuminuria, and glomerular endotheliosis; 2-ME
normalized such alterations. Similar phenotypes were observed in COMT small interfering
RNA-treated mice. In the aorta of COMT-deficient mice, AT1R expression was increased; 2-ME
suppressed AT1R expression. The 2-ME exhibited peroxisome proliferator-activated receptor γ
agonistic activity in vitro and ex vivo plasma from pregnant female mice as well. In vitro, 2-ME
suppressed both basal and Ang II-induced AT1R levels in a peroxisome proliferator-activated receptor
γ-dependent manner. The 2-ME is relevant to combat COMT deficiency-associated hypertensive
disorders via suppression of AT1R by its peroxisome proliferator-activated receptor γ activity.
② Srivastava SP, Shi S, Kanasaki M, Nagai T, Kitada M, He J, Nakamura Y, Ishigaki Y, Kanasaki K,
Koya D. Effect of antifibrotic microRNAs crosstalk on the action of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline
in diabetes-related kidney fibrosis. Sci Rep 2016; 6: 29884.
Abstract: N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP) is an endogenous antifibrotic peptide. We
found that suppression of AcSDKP and induction of dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4), which is
associated with insufficient levels of antifibrotic microRNA (miR)s in kidneys, were imperative tounderstand the mechanisms of fibrosis in the diabetic kidneys. Analyzing streptozotocin(STZ)-induced diabetic mouse strains, diabetic CD-1 mice with fibrotic kidneys could be− 27 −

differentiated from less-fibrotic diabetic 129Sv mice by suppressing AcSDKP and antifibrotic miRs
(miR-29s and miR-let-7s), as well as by the prominent induction of DPP-4 protein expression/activity
and endothelial to mesenchymal transition. In diabetic CD-1 mice, these alterations were all reversedby AcSDKP treatment. Transfection studies in culture endothelial cells demonstrated crosstalkregulation of miR-29s and miR-let-7s against mesenchymal activation program; such bidirectional
regulation could play an essential role in maintaining the antifibrotic program of AcSDKP. Finally, weobserved that AcSDKP suppression in fibrotic mice was associated with induction of both interferon-γ
and transforming growth factor-β signaling, crucial molecular pathways that disrupt antifibrotic miRs
crosstalk. The present study provides insight into the physiologically relevant antifibrotic actions of
AcSDKP via antifibrotic miRs; restoring such antifibrotic programs could demonstrate potential
utility in combating kidney fibrosis in diabetes.
③ Nitta K, Shi S, Nagai T, Kanasaki M, Kitada M, Srivastava SP, Haneda M, Kanasaki K, Koya D. Oraladministration of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline ameliorates kidney disease in both type 1 andtype 2 diabetic mice via a therapeutic regimen. Biomed Res Int 2016; 2016: 9172157.
Abstract: Kidney fibrosis is the final common pathway of progressive kidney diseases including diabetic
nephropathy. Here, we report that the endogenous antifibrotic peptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline(AcSDKP), the substrate of angiotensin-converting enzyme (ACE), is an orally available peptide drug
used to cure kidney fibrosis in diabetic mice. We utilized two mouse models of diabetic nephropathy,
streptozotocin- (STZ-) induced type 1 diabetic CD-1 mice and type 2 diabetic nephropathy model
db/db mice. Intervention with the ACE inhibitor imidapril, oral AcSDKP, or imidapril + oral AcSDKP
combination therapy increased urine AcSDKP levels. AcSDKP levels were significantly higher in the
combination group compared to those of the other groups. AcSDKP oral administration, either
AcSDKP alone or in addition to imidapril, ameliorated glomerulosclerosis and tubulointerstitial
fibrosis. Plasma cystatin C levels were higher in both models, at euthanasia, and were restored by all
the treatment groups. The levels of antifibrotic miRs, such as miR-29 or let-7, were suppressed in thekidneys of both models; all treatments, especially the combination of imidapril + oral AcSDKP,
restored the antifibrotic miR levels to a normal value or even higher. AcSDKP may be an oral
antifibrotic peptide drug that would be relevant to combating fibroproliferative kidney diseases suchas diabetic nephropathy.
④ Shi S, Kanasaki K, Koya D. Linagliptin but not Sitagliptin inhibited transforming growth factor-β2-induced
endothelial DPP-4 activity and the endothelial-mesenchymal transition. Biochem Biophys Res
Commun 2016; 471: 184-190.
Abstract: Dipeptidyl peptidase (DPP)-4 plays an important role in endothelial cell biology. We haveshown that the DPP-4 inhibitor Linagliptin can inhibit the endothelial-mesenchymal transition(EndMT) and ameliorate diabetic kidney fibrosis associated with the suppression of DPP-4 protein− 28 −

levels via the induction of miR-29. The current study demonstrated that such effects of Linagliptin on
endothelial cell profibrotic programs were drug-specific but not class effects. In the cell-free system,
both Linagliptin and Sitagliptin inhibited recombinant DPP-4 activity in a concentration-dependent
manner. Linagliptin can inhibit all of the following: DPP-4 activity and protein level, integrin β1
protein levels, EndMT, and DPP-4 3'UTR activity; Sitagliptin, however, inhibited none of these in thecurrent study. Additionally, TGF-β2 induced both the induction of VEGF-R1 and the suppression of
VEGF-R2 levels in endothelial cells, and both were inhibited by Linagliptin but not by Sitagliptin.
miR-29, the miR that negatively regulates the 3'UTR of DPP-4 mRNA, was suppressed by TGF-β2
and restored by Linagliptin but not by Sitagliptin. Following the overexpression ofpCMV-DPP-4-GFP and pCMV6-Myc-DPP-4 in endothelial cells, the proximity of Myc-DPP-4 andDPP-4-GFP was suppressed by Linagliptin but not by Sitagliptin, suggesting that only Linagliptin
inhibited the homo-dimer formation of DPP-4 in endothelial cells; this difference in activity between
the two gliptins could explain their diverse effects on endothelial cell biology. In conclusion, each of
the DPP-4 inhibitors may have unique drug-specific effects.

− 29 −

１．研究課題名：Saffold ウイルス感染受容体の探索と宿主細胞内におけるカプシド蛋白の安定性解析（研究番号 S2015-4）
２．キーワード：１）Saffold ウイルス（Saffold virus, SAFV）
        ２）SAFV 感染受容体（receptor for SAFV infection）
        ３）カプシド蛋白（capsid protein）
３．研究者氏名：姫田 敏樹・医学部・准教授・微生物学
４．研 究 目 的
Saffold ウイルス (SAFV) は、主に胃腸炎や上気道炎から検出されるが、報告者らは無菌性髄膜炎患者髄液からの SAFV 分離を報告し（Virol. J. 8: 110. 2011）、さらに、１型糖尿病剖
検例の膵臓に SAFV 抗原が検出されるが 2 型からは検出されないことを見出した（未発表）。
これらの検出例は、SAFV が同じピコルナウイルス科に属するエンテロウイルス等と同様に多様な病原性を持つことを強く示唆しており、SAFV の詳細なウイルス学的解析は、アウト
ブレイク発生時の対応準備という観点から極めて重要である。報告者らは、SAFV がウイル
ス結合分子の細胞表面発現密度に依存して持続感染することを報告しているが（PLoS One.
8(1):e53194. 2013）、感染受容体と考えられるその結合分子の正体は依然不明である。そこで本研究では、SAFV 感染受容体の探索を目指す。また、これまでの実験過程で、感染受容体との結合を担うカプシド蛋白 VP1 が宿主細胞内で極めて不安定であることが見出されたことから、VP1 を含むすべてのカプシド蛋白の細胞内における安定性を解析し、SAFV の感染・増殖への影響を調べる。
５．研 究 計 画
（１）SAFV 感染受容体の同定①HeLa 細胞（HeLa, RCB0007）を FCS 添加 MEM または CS 添加 MEM にて、それぞれ２
週間以上培養し、異なる SAFV 感受性を誘導する。SAFV 感受性の誘導が確認できたら、それぞれの細胞から total RNA を抽出・精製し、DNA マイクロアレイ Human Gene 1.0 ST
array (Affimetryx) にて、遺伝子発現の変化を比較解析する。得られた結果を用いて、FCS 添
加 MEM で培養した SAFV 高感受性 HeLa 細胞で発現の増加している細胞膜タンパクをス
クリーニングし、SAFV 感染受容体としての候補因子をリスト化する。得られた候補因子
リストについて、各々の cDNA を発現ベクターにサブクローニングし、SAFV 非感受性細胞である BHK-21 細胞にそれぞれを発現させることで、SAFV 感受性を獲得するか否かを検証し、SAFV 感染受容体を同定する。
②SAFV 高感受性 HeLa 細胞から cDNA ライブラリーを作製し、SAFV 非感受性 BHK-21 細胞に導入する。この細胞集団に SAFV を感染させ、SAFV 感受性を獲得した細胞を単離する。
単離した細胞をシングルセル RT-PCR 法に供することで、導入されている cDNA を同定す

− 31 −

る。同定した cDNA について各々個別に BHK-21 細胞に改めて導入し、SAFV 感受性を獲得するか否かを検証する。
（２）Tag 標識 SAFV カプシド蛋白の細胞内における安定性解析
報告者らは、SAFV 中和抗体を所有しているが、個別のカプシド蛋白に対する抗体は所有していない。そこで、FLAG 標識した各カプシド蛋白を作製（p3xFLAG-CMV14 発現ベクタ
ー使用）し発現系に供することで、その安定性を Western blotting で比較解析する。ここで用いる SAFV のジェノタイプは 3 型とする（SAFV-3）。極めて不安定であることが見出された
SAFV-3 の VP1 を基準にその他のカプシド蛋白（VP4, VP2, VP3, VP0）の安定性を比較することで、子ウイルス粒子の産生効率に関わるウイルス蛋白を見極める。
６．研 究 成 果（１）SAFV 感染受容体の同定①DNA マイクロアレイ解析の結果、SAFV 高感受性 HeLa 細胞で 3 倍以上高発現している膜タンパクとして 57 の分子が挙げられた。これらの分子について、各 cDNA を各々サブク
ローニングし、ランダムにグループ分けして SAFV 非感受性細胞に共発現させたところ、7 つの遺伝子の組み合わせ【Ras association domain family member 5, IL-27 receptor alpha,receptor activator of NF-kB, desmocollin 2, platelet/endothelial cell adhesion molecule, odd
Oz/ten-m homolog 3, chondroitin sulfate proteoglycan 4】で発現させた細胞の一部において、
SAFV の感染が確認された。しかし、感受性の獲得は必ずしも再現されるものではなく、適切な分子比の制御が不十分である可能性や、安定した感染に必要な分子が含まれていな
い可能性が考えられ、最終的な同定には至らなかった。なお、各々個別の発現系では、SAFVの感染は認められなかった。
②SAFV 接種後、感受性を示した 50 個の細胞について、各々を単離し導入されている cDNAを決定した。その結果、beta-2-microglobulin をはじめとする 20 種の候補遺伝子が同定された。そこで、これらの分子を各々個別に SAFV 非感受性 BHK-21 細胞に発現させ、SAFV
感受性を獲得するか否か調べたが、いずれも感受性を獲得するものは得られなかった。
（２）Tag 標識 SAFV カプシド蛋白の細胞内における安定性解析
SAFV の構造蛋白である VP1, VP2, VP3, VP4 のうち、特に VP1 が細胞内での発現後に速やかに分解されることが明らかとなった。このウイルス構造蛋白の細胞内での不安定性は、効率の良いウイルス増殖において不利に働くことが予想され、このことが培養細胞におけるウイルス分離を困難にしている可能性が考えられた。また、アミノ酸配列のコンピューター
解析から、SAFV 構造蛋白 VP1 には、タンパク質の不安定性に関与するとされる PEST 配列（Pro, Glu, Ser, Thr に富む配列）が含まれていることが示された。そこで、PEST 配列欠損変異体の発現解析、および、発現後も安定であるタイラー脳脊髄炎ウイルス（Theiler's Murine
Encephalomyelitis Virus (TMEV)、自然宿主はマウス）の VP1 に PEST 配列を導入した発現解− 32 −

析を行ったところ、VP1 の不安定性に関わる責任領域のひとつが PEST 配列であることが明らかとなった。さらに、他のウイルス構造蛋白または非構造蛋白の共存が SAFV-VP1 の安定性に及ぼす影響を調べるために行った共発現系の解析から、他の構造蛋白の共存下では VP1の安定性が上昇し、カプシド形成に伴い PEST 領域がマスクされ VP1 の分解が抑制される可能性が示された。また、プロテアソーム阻害剤 MG132 の添加によっても VP1 の分解は抑制された。
７．研究の考察・反省
本研究結果より、SAFV 感染受容体は、1 分子からなるものではなく複合体として機能するものである可能性が示唆された。特に １ ②の結果で得られた beta-2-microglobulin は、一部のコクサッキーウイルスやエコーウイルスにおいて co-receptor として利用されており、SAFV 感染受容体も同様に複数の分子からなる複合体である可能性が考えられる。感染受容体が複数の分子による複合体からなると仮定した場合、非感受性細胞に感受性を獲得させる
方法での探索は条件設定が容易ではない。そこで、マウスノロウイルスの感染受容体同定に利用された CRISPR knockout pooled library を用いて感受性細胞の感受性を消失させることか
ら感染受容体を同定する方法を検討することが、SAFV 感染受容体の同定にも有用であると考えられた。また、カプシド蛋白の安定性解析からは、ウイルス分離培養時に VP1 蛋白の分解を抑制することができれば、ウイルス分離効率を向上させられる可能性が示された。ウイルス蛋白の成熟に関わるプロテアーゼを阻害しないタンパク質分解阻害薬の探索・同定が今後の課題である。
８．研 究 発 表
該当なし

− 33 −

１．研究課題名：オートファジーによるガレクチン４発現制御を軸とした胎盤形成機構の解明（研究番号 S2015-5）
２．キーワード：１）ガレクチン 4 (galectin-4, Gal-4)２）胎盤形成 (placentation)３）オートファジー (autophagy)４）細胞浸潤 (trophoblast invasion)５）栄養膜細胞 (trophoblasts)
３．研究者氏名：有川 智博・一般教育機構・講師・生物学
４．研 究 目 的
妊娠初期において胎児栄養膜細胞は低酸素環境にあり、この環境は母体との融合に重要である胎盤栄養膜細胞の浸潤作用を正に制御すると考えられている。胎盤は出生後に生じる唯一の臓器であり、胎児の栄養供給やガス交換、免疫学的支援などを司る胚発生にとって重要な器官であり、胎盤栄養膜浸潤の異常は子宮内胎児発育遅延、妊娠高血圧症などの疾患と関連が深いことが明らかにされている。我々はガレクチンの機能が発生・分化の制御、免疫調節など多岐にわたることに注目し、主に腸管に発現するとされていた Gal-4 が胎盤組織の栄養膜細胞でも発現すること、さらにラット由来胎盤栄養膜幹細胞 (Rcho-1) の分化過程において、Gal-4 の特異的な発現低下を明らかにした。近年、オートファジーが胎盤形成に寄与することが報告され、この実験系でも低栄養条件で分化誘導することからオートファジーが関与している可能性が高く、実際に in vivo においてオートファジーのマーカーである LC3の集積が脱落膜（decidua）認められること、また分化と同時に Gal-4 の発現が低下すること、加えて脱落膜でのオートファジーマーカーである LC3 II/I 率が上昇することを明らかにしてきた。
本研究では胎盤でのガレクチン４の発現に注目し、「ガレクチンによるオートファジーの制御機構を中心とした胎盤形成機構の解明」を目的とし、実施した。
５．研 究 計 画
すでに前述のように一定の結果を得ていることから、本課題研究では Rcho-1 栄養膜細胞における Gal-4 発現の意義、またオートファジーによる Gal-4 発現制御への関与を明らかにする。① オートファジー阻害剤を用いた Gal-4 の上流解析と、② in vivo において、栄養膜細胞での Gal-4 強制発現による母体への浸潤に対する影響について注目し解析した。②の具体的な方法としては、レンチウイルス等を用いてマウス受精卵に Gal-4 を強制発現させた後、発生状況を詳細に経時的に観察し、本来発現が低下すべき Gal-4 を過剰に発現する場合、胎盤発生にどのように影響を与えるか、さらにオートファジーに対する影響についても解析する実験系を予定した。

− 35 −

６．研 究 成 果本研究単年度では、in vitro 培養系を主に用いた解析を行い、以下のような成果を得た。
① オートファジー阻害剤 (3-methyladenine, Bafilomycin) を用いた解析により、
ラット Rcho-1
栄養膜細胞の分化過程にはオートファジーが正に関与する。
② Rcho-1 栄養膜細胞の分化の際、Gal-4 の発現低下や、母体側への浸潤の際重要な MMP-9の高発現が認められるが、いずれの上流にもオートファジーが関与する。
③ Rcho-1 栄養膜細胞の分化過程において Gal-4 発現を維持し続けても、MMP-9 の発現には影響はないが、Rcho-1 細胞の接着能が上昇する。
７．研究の考察・反省 上記の結果から、血管の未発達な胎盤では、その母体側と胎盤間領域において低栄養状態となり、その結果、オートファジーが引き起こされると考えられる。
発動したオートファジーは、分化に寄与し、MMP-9 の発現を誘導しつつ、Gal-4 の発現を抑制する。本来
Gal-4 は細胞接着に関与しており、Gal-4 の発現が低下することで、母子間インターフェ
イス構築に重要な胎仔側細胞の浸潤が進むと考えられる（右図）。以上のように本研究
課題に対する支援により、上記の成果が得て、論文報告、学会報告を行った。しかしながら、マウス生体を用いた研究については様々な制約により達成できなかったため、今後は本研究課
題を発展的に展開することを目的とし、新たな実験系を構築する予定である。
８．研
 究 発 表Arikawa T, Liao S, Shimada H, Inoue T, Sakata-Haga H, Nakamura T, Hatta T, Shoji H. Galectin-4
expression is down-regulated in response to autophagy during differentiation of rat trophoblast cells.
Sci Rep 2016; 6: 32248.
Abstract: Placental development and trophoblast invasion of the maternal endometrium establish thematernal-fetal interface, which is critical for the developing embryo and fetus. Herein we show thatoverexpression of Galectin-4 (Gal-4) during trophoblast differentiation inhibited the enlargement of
Rcho-1 cells (a model for rat trophoblast differentiation) and promoted cell-cell adhesion, whereas
trophoblast specific markers and MMP-9 activity were not affected. In the rat placenta, microtubule
associated protein 1 light chain 3 alpha (LC3) protein, an autophagy marker, is highly expressed on
the maternal side of the decidua where Gal-4 expression is weak. In vitro assays showed that theexpression of trophoblast-specific differentiation markers was reduced by 3-Methyladenine (3-MA)
and Bafilomycin A1, known as autophagy inhibitors, compared to control cells. Furthermore, Gal-4− 36 −

expression in Rcho-1 cells, which is normally down-regulated during differentiation, was notattenuated in the presence of autophagy inhibitors, suggesting that autophagy is upstream of Gal-4
expression. We herein describe a possible mechanism by which autophagy regulates trophoblast
differentiation via regulation of Gal-4 expression in order to establish the maternal-fetal interface.

− 37 −

１．研究課題名：霊長類コモン・マーモセットを用いた脳内味覚地図の解明（研究番号 S2015-6）
２．キーワード：１）味覚 (gustation)２）コモン・マーモセット (common marmoset)３）juxtacellular recording 法 (juxtacellular recording)４）ブレインマシンインターフェイス (brain-machine interface, BMI)
５）島皮質 (insular cortex)
３．研究者氏名：薗村 貴弘・医学部・講師・解剖学Ⅱ（採択時）
４．研 究 目 的
ブレインマシンインターフェイス (BMI) の近年における進歩
はめざましく、自分の頭で考えた通りに動く義手の開発や、聾者の聴覚を取り戻す人工内耳の開発、さらにはそれらの臨床応用も盛んに行われている。しかし、味覚障害や、舌癌、事故などで舌やその周囲を喪失し、味覚を失ってしまった人に対する味覚 BMIの試みは、未だほとんど行われておらず、他の感覚と比較して大きく後れを取っているのが現状である（図１）。
口腔の主な機能は栄養の摂取であるが、単に食物摂取ではなく自らの口を通して「美味しく食べること」は QOL の向上に極めて重要であり、当然のことながら、味覚は「美味しく食べること」について最重要な感覚である。今日あまりにも聞き慣れたこの「QOL」という言葉を直訳すれば、「生活の質」という日本語になるが、この四文字の字の中に入っている唯一のヒトの臓器は「舌」であることを鑑み、本研究は、人生の最後の瞬間まで美味しく、かつ、安心安全に食べることの重要性、そしてそのために、口から味を感じながら生活することの重要性を再認識し、味覚 BMI の開発を目指した。
味覚BMI の実用化に向けて必要な要素は、大きく以下の３つである。
(1) 末梢部位の味覚センサーの開発(2) 末梢味覚センサーと中枢味覚神経回路との接続方法とそのツール開発(3) 中枢味覚神経回路の詳細な『脳内の味覚地図』の解明(1)と(2)に関しては、工学系の研究である程度の機器が形となってきていることから、現段
階での味覚BMIの実現に向けて現時点で最も重要となるのは (3) の詳細な『脳内の味覚地図』の解明である。従来の研究により、舌で感知され末梢の神経節を経た味覚刺激は、最初の中継核である延髄の孤束核へ達し、その後、大きく以下の２つの経路に分かれることが知られている。
❶ 結合腕傍核を経て扁桃体へ達する味覚神経回路❷ 視床の後内側腹側核小細胞部 (VPMpc) で中継され、島皮質や梨状皮質などへ達する味覚神経回路− 39 −

❶の扁桃体に達する味覚路は、空腹によって食物を摂取しようとする行動や、逆に毒物のような有害物を摂取しないようにするなど、その個体の生命維持に関わると考えられている。
一方、❷の視床を経て島皮質、梨状皮質、大脳皮質一次味覚野などに至る味覚路は、より高
次の美味しさや味の質、嗜好性などの認知に関わると考えられている。ラットなどの齧歯類
は❶の生命維持の神経回路が味覚の主体となっており、❷のような美味しさを感じる高次の味覚路が未発達であるのに対して、我々霊長類では、❷の美味しさを感じる味覚路が発達している。そこで本研究では、近年、新たに開発された細胞外記録法であるjuxtacellular recording
法を、味覚回路がヒトに近い霊長類のうち、日本が世界に先駆けて実験動物化に取り組んでいるコモン・マーモセットに対して用いることにより、基本五味の味刺激を脳に与えながら、
標的味覚神経細胞を単一細胞レベルで可視化し、それぞれの味が、どの位置に、どのようなパターンで情報を伝えているのか電気生理学的な裏付けのもとで、形態学的に精密に解析し、「美味しさ」を感じる高次の味覚神経回路の基本構造を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
成体コモン・マーモセットをイソフルラン麻酔下とデクスメデトミジン鎮静下で定位脳手術装置に固定し、背部から頸椎を剖出させて延髄の孤束核へガラス電極を刺入し、その舌に対して、甘味、苦味、酸味、塩味、旨味の５種類を本実験用に作製した味覚刺激装置を用いて味刺激を加え、刺激に反応して発火する島皮質の神経細胞を juxtacellular recording 法を用いて単一ユニット記録を行い、ガラス電極経由で、テトラメチルローダミンカダベリンを注入した。灌流固定後、脳を摘出して連続凍結切片を作製し、免疫組織化学法を用いて可視化
して、デジタル標本作製システムにより全標本を網羅的に撮影し完全なトレースを行い三次元再構築し、形態学的な所見の取得を目指した。
６．研 究 成 果成体コモン・マーモセットに対して juxtacellular recording 法による記録と標識を行い、詳細な島皮質からの味覚地図を作成するために、現在、三次元再構築ソフトウエア Amira を用いて完全な立体再構築を目指している。また、juxtacellular recording 法と並走して従来型の形態学的手法によって、ラット脳内味覚地図の作成も随時行い、味覚中継核である結合腕傍核(parabrachial nucleus) から、これまで報告されていた視床後内側腹側核小細胞部 (parvicellularpart of the posteromedial ventral thalamic nucleus; VPMpc) の他に、視床の中心傍核 (paracentral
thalamic nucleus; PC)、内側中心核 (central medial thalamic nucleus; CM)、束傍核 (parafascicularthalamic nucleus; PF) 等への投射があることを、順行性トレーサーの biotinylated dextran amine(BDA) を用いて明らかにした。また、これらの視床中継核から、線条体 (CPu)、扁桃体線
条体移行部 (ASt)、扁桃体外側核 (LA) 等への投射も明らかにした。
また、本研究の工程で最終的に必要となる電子顕微鏡の試料作成の過程の作業水準を向上
さ せ る 発 明 と し て 、「 ブ レ ー ド ホ ル ダ ー 、 試 料 ホ ル ダ ー 及 び ト リ ミ ン グ 方 法 （ 特 願2017-069601）」を出願した。

− 40 −

７．研究の考察・反省
使用した成体コモン・マーモセットが、供給元の鹿児島大学医学部の動物実験施設の学内の他の研究者の使用状況が優先される関係で、比較的老齢のコモン・マーモセットから試験的に供給される経緯により、想定よりも神経細胞の反応が弱くデータの取得が困難で、未だ充分なデータは収集できていないのが現状である。さらにこの新たな細胞外記録法である
juxtacellular recording 法は、その手法の特性上、やや遠隔投射先の標識が不鮮明となる確率が一定割合あり、この点を克服すべく、pal-GFP プラスミド注入法による高感度で正確な可視化法を試みている。これらのより高感度の手法を導入することで、今後はより正確な脳内味覚地図の完成が期待できると考えている。
８．研 究 発 表
なし

− 41 −

１．研究課題名：虚血性腸炎のマウス蛍光イメージング（研究番号 S2015-7）
２．キーワード：１）バイオセンサー (biosensor)２）生体イメージング (in vivo imaging)３）二光子励起顕微鏡法 (two photon microscopy)
４）消化管 (gastrointestinal tract)５）上皮再生 (epithelial regeneration)
３．研究者氏名：武田 はるな・医学部・助教・病理学Ⅰ（採択時）
４．研 究 目 的
虚血性腸炎は血栓などにより血流が減少するために、上皮細胞が虚血により壊死し、炎症や潰瘍を生じる疾患である。虚血状態が解除されると上皮細胞の再生が起こる。その際の細胞動態や責任細胞、分子機構はまだ明らかになっていない。本研究では虚血性腸炎マウスモ
デルを作成し、二光子励起顕微鏡を用いてリアルタイムに観察することで腸上皮細胞の再生過程を明らかにする。
５．研 究 計 画
FRET バイオセンサーを発現するマウス（FRET マウス）の腸管膜動脈の血流を遮断することで腸管の一部に虚血状態にし、上皮損傷を引き起こすモデル用い、上皮再生の経時的変化を観察する条件を検討する。処置後 1－2 日後に、二光子励起顕微鏡を用い、生体マウス腸管の虚血を引き起こした部分において、細胞動態を観察する。リン酸化酵素 ERK などの活性化状態を視覚化することで、腸上皮の修復過程を観察し、分子機構を明らかにする。
６．研 究 成 果
A．虚血性腸炎マウスモデルの観察
麻酔したマウスから腸管を露出し、腸間膜動脈の一部をクリップにより血流を遮断する（左図）。動脈が支配する腸管の両端も結紮し、1時間ほど虚血状態にする。
クリップをはずし、糸をゆるめて血流を再還流させてから、閉腹する。組織標本の観察結果から、虚血後 24
時間後には、上皮の再生が始まることが明らかになった。また 2 光子顕微鏡では、SHG(Second Harmonic Generation) という方法でコラーゲン線維を可視化できるので、その像から、虚血から修復の過程にある部位を同定し、イメージングすることが可能であることがわかった。

− 43 −

B．上皮特異的に FRET バイオセンサーを発現するマウスの作製
リン酸化酵素 ERK や PKA のバイオセンサーを全身に発現するマウスにおける修復過程では、様々な細胞が動いており、形態から上皮を同定することが困難であることがわかった。
そこで、腸上皮特異的にFRET バイオセンサーが発現するウマウスを樹立することにした。タモキ
シフェン（エストロゲンのアナログ）投与下で腸上皮特異的に発現するCre マウス（Villin-CreER
マウス）と、コンディシ
ョナルに FRET バイオセ
ンサーを発現するマウス（FRET-lox-マウス）を搬入した。この 2 種類のマウスを交配し、エ
ストロゲンを投与することで、腸上皮特異的に FRET バイオセンサーを発現させることが可能となった（上図）。
HE 染色で見たように上皮細胞が単層で損傷部位をカバーしている像が二光子顕微鏡でも確認できた。また、免疫染色にてこれらの上皮細胞は E-カドヘリンを発現していることも確認した（左図）。
また、Yap の核移行（活性化を示す）が免疫染色よりわかった。
リン酸化 ERK の活性を検出する FRET
バイオセンサーを発現するマウスでは、修復上皮において FRET/CFP 値が高い、
すなわち、ERK の活性が高いことがわかった（左図）。同じ実験を別のリン酸化酵
素 PKA の FRET バイオセンサーマウスで行ったところ、修復上皮では活性が低い
ことが確認された。
C．生体腸上皮細胞への核酸の導入
最近、腸上皮細胞に一過性に蛋白質を発現させる方法 (Imajo M. et al., Nat. Cell Biol. 17:
7-19, 2015) が報告された。この系を用い、プラスミド DNA や RNA を導入することができれば、修復上皮細胞における分子機構が明らかにする実験ができると考え、試行した。蛍光付
加の RNA を導入することには成功したが、プラスミド DNA の発現は確認できなかった。導− 44 −

入効率は低く、虚血修復上皮の部位に導入される効率は非常に低く、二光子励起顕微鏡で観察するには効率が悪く現実的ではないことがわかった。
７．研究の考察・反省
ほぼ計画通りの実験を確実に進めることができた。ERK の活性化には様々な経路があるが、EGF 受容体からの経路が腫瘍であることが知られている。最新の報告により、Yap の活性化に起因する EGF 受容体を介した ERK の活性化経路が、腸上皮再生の過程において重要な役割を果たしていることが示された (Gregorieff A. et al., Nature 526: 715-8, 2015)。本実験で用いている虚血性腸炎モデルにおいても、同様のメカニズムが働いているかを検証すると共に、細胞増殖、細胞動態との関連を解析し明らかにできれば、と考えている。
８．研 究 発 表なし

− 45 −

１．研究課題名：角膜痛・ドライアイの新規治療薬開発を目指した角膜神経終末の代謝型グルタ
ミン酸受容体 mGluR5 の機能解析（研究番号 S2015-8）
２．キーワード：１）角膜神経 (corneal nerves)
２）グルタミン酸 (glutamate)３）ATP４）セロトニン (serotonin)
３．研究者氏名：益岡 尚由・医学部・准教授・薬理学
４．研 究 目 的
近年、長時間のオフィスワーク、コンタクトレンズの装着や加齢により涙液の分泌量低下とそれに伴う角膜表層の破壊が起こり、ドライアイを発症する患者が急増している。ドライ
アイは目の痛み、違和感、疲れなど様々な症状を引き起こす慢性炎症性疾患であり、これらの自覚症状を抑えることがドライアイ治療において非常に重要である。近年、ドライアイによる眼表面の不快感は、涙液蒸発に伴う温度低下と浸透圧上昇を検出する角膜内在性の三叉神経（以後、角膜神経）終末の発火活動の亢進と関連していることが明らかになってきた(Belmonte et al., Curr Ophthalmol Rep. 2015; 3: 111-121)。
一方で、グルタミン酸は末梢組織において炎症時に感覚神経や傷害細胞から遊離され、炎症性メディエータとして機能していることが明らかになってきている。その受容体のひとつである Gq/11 蛋白質に共役する代謝型グルタミン酸受容体 mGluR5 は、神経系において神経細胞の膜興奮性やシナプス伝達効率を調節する鍵分子であり、情動・記憶、感覚情報の伝達など様々な神経生理機能に深く関与していることが指摘されている。これまでに我々は末梢か
ら種々の感覚情報を受容して脊髄後角に伝える後根神経節 (DRG) ニューロンにおいて、
mGluR5 を活性化すると侵害受容器である TRPV1 の反応性が顕著に変化する現象を明らかにしている。しかしながら、末梢組織に内在する感覚神経終末において mGluR5 を介する本現象が機能し、生理機能制御にどのように関与しているか否かは明らかでない。そこで、侵害受容性神経に対して強い影響を与えるグルタミン酸受容体が温度・浸透圧感受性の角膜神経の発火活動に対してどのような影響を与えるか、炎症性メディエータである ATP やセロトニン (5-HT) と比較検討して、ドライアイにおける角膜神経の発火活動亢進に関与しているか検討することを目的とした。
５．研 究 計 画
はじめに、モルモットの角膜 ex vivo 標本を用いた冷却感受性角膜神経終末のシングルユ
ニット記録を行うことのできる実験系のセットアップを行う。その後、グルタミン酸ならびに ATP、セロトニンを潅流することにより角膜神経終末の自発発火活動がどのように変化す
るか明らかにする。

− 47 −

６．研 究 成 果
本研究では、はじめに角膜神経の自発活動検出を実施した。4‐6 週齢のモルモ
ットより角膜標本を作製して、チャンバー内に固定してシングルユニット記録した。温度感受性に関しては、ペルチェ装
置により急速にチャンバー内温度を下げることによりその反応性を検討した。その結果、Fig.1 に示すように冷却刺激を与えると一過性に角膜の自発発火活動の頻度が顕著に増加することが確認できた。
次に、
冷却感受性神経を検出した後に、侵害受容性神経に対して強い影響を与えるグルタミン酸受容体が角膜神経に対してどのような影響を与えるか、自発発火

Fig.1 角膜神経の冷却刺激に対する応答性
眼 表面の生 理学的 温度である 34℃から20℃に急速にチャンバー内の温度を低下させる（上段）と、角膜の神経発火活動の頻度（下段）が顕著に増加し、その後消失する。再び
34℃に戻すと、自発発火活動が再開する。

活動が安定した後に4 分間グルタミン酸（30‐300 μM）を還流投与した。しかしながら、角膜神経においてグルタミン酸
はいずれの濃度でもほとんど影響を及ぼさないことが判明した。一方、そのほかの炎症性メディエー
タである ATP および 5-HT（300 μM お
よび 1 mM）を 4 分
間還流投与すると、一部の角膜冷却感受

Fig.2

ATP および 5-HT は冷却刺激感受性の角膜神経の自発発火活動を増加させる。
チャンバー内を 34℃に維持した状態で ATP（中段）および 5-HT
（下段）を還流すると、自発発火活動 (unit activities) が徐々に増加した。発火活動の増加は、それぞれを washout した後も長時間維持された。一方、グルタミン酸（上段）は自発発火活動にほとんど影響を与えなかった。

性神経の自然発火活動が徐々に増加した。これらの薬物を washout しても長時間 (>10 min) 発火活動の増加が維持された。
７．研究の考察・反省本研究から、グルタミン酸は角膜の冷却感受性神経の自発発火活動に対して影響を与えな− 48 −

いことが明らかになった。したがって、グルタミン酸はドライアイにおける角膜神経発火の亢進に影響を与えている可能性は低いものと考えられる。今回は、実験系立ち上げの遅れにより冷却刺激に対する反応性の変化について解析ができなかったため、この点については今
後検討していきたい。また、ATP や 5-HT は発火活動の増加が観察されたが、その作用機序については明らかにされていない。今後、どのような受容体を介したものであるか詳しい作用機序について解析したい。
８．研 究 発 表
① Masuoka T, Kudo M, Yoshida J, Ishibashi T, Muramatsu I, Kato N, Imaizumi N, Nishio M.
Long-term activation of group I metabotropic glutamate receptors increases functional
TRPV1-expressing neurons in mouse dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci 2016; 10: 79.
Abstract: Damaged tissues release glutamate and other chemical mediators for several hours. Thesechemical mediators contribute to modulation of pruritus and pain. Herein, we investigated the effectsof long-term activation of excitatory glutamate receptors on functional expression of transient
receptor potential vaniloid type 1 (TRPV1) in dorsal root ganglion (DRG) neurons and then on
thermal pain behavior. In order to detect the TRPV1-mediated responses in cultured DRG neurons, wemonitored intracellular calcium responses to capsaicin, a TRPV1 agonist, with Fura-2. Long-term (4h) treatment with glutamate receptor agonists (glutamate, quisqualate or DHPG) increased the
proportion of neurons responding to capsaicin through activation of metabotropic glutamate receptor
mGluR1, and only partially through the activation of mGluR5; engagement of these receptors wasevident in neurons responding to allylisothiocyanate (AITC), a transient receptor potential ankyrin
type 1 (TRPA1) agonist. Increase in the proportion was suppressed by phospholipase C (PLC), protein
kinase C, mitogen/extracellular signal-regulated kinase, p38 mitogen-activated protein kinase ortranscription inhibitors. Whole-cell recording was performed to record TRPV1-mediated membranecurrent; TRPV1 current density significantly increased in the AITC-sensitive neurons after thequisqualate treatment. To elucidate the physiological significance of this phenomenon, a hot plate test
was performed. Intraplantar injection of quisqualate or DHPG induced heat hyperalgesia that lasted
for 4 h post injection. This chronic hyperalgesia was attenuated by treatment with either mGluR1 or
mGluR5 antagonists. These results suggest that long-term activation of mGluR1/5 by peripherally
released glutamate may increase the number of neurons expressing functional TRPV1 in DRG, which
may be strongly associated with chronic hyperalgesia.
② Masuoka T, Kudo M, Yamashita Y, Yoshida J, Imaizumi N, Muramatsu I, Nishio M, Ishibashi T.
TRPA1 channels modify TRPV1-mediated current responses in dorsal root ganglion neurons. Front
Physiol 2017; 8: 272.
Abstract: The transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channel is highly expressed in a
subset of sensory neurons in the dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia of experimental− 49 −

animals, responsible for nociception. Many researches have revealed that some TRPV1-positive
neurons co-express the transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) channel whose activities areclosely modulated by TRPV1 channel. However, it is less investigated whether the activities of
TRPV1 channel are modulated by the presence of TRPA1 channel in primary sensory neurons. This
study clarified the difference in electrophysiological responses induced by TRPV1 channel activation
between TRPA1-positive and TRPA1-negative DRG. TRPV1 and TRPA1 channel activations were
evoked by capsaicin (1 μM), a TRPV1 agonist, and allyl isothiocyanate (AITC; 500 μM), a TRPA1
agonist, respectively. Capsaicin perfusion for 15 s caused a large inward current without adesensitization phase at a membrane potential of -70 mV in AITC-insensitive DRG (current density;
29.6 ± 5.6 pA/pF, time constant of decay; 12.8 ± 1.8 s). The capsaicin-induced currents in
AITC-sensitive DRG had a small current density (12.7 ± 2.9 pA/pF) with a large time constant of
decay (24.3 ± 5.4 s). In calcium imaging with Fura-2, the peak response by capsaicin was small andduration reaching the peak response was long in AITC-sensitive neurons. These electrophysiologicaldifferences were completely eliminated by HC-030031, a TRPA1 antagonist, in an extracellularsolution or 10 mM EGTA, a Ca2+ chelator, in an internal solution. Capsaicin perfusion for 120 s
desensitized the inward currents after a transient peak. The decay during capsaicin perfusion was
notably slow in AITC-sensitive DRG; ratio of capsaicin-induced current 60 s after the treatment per
the peak current in AITC-sensitive neurons (78 ± 9%) was larger than that in AITC-insensitive
neurons (48 ± 5%). The capsaicin-induced current in the desensitization phase was attenuated by
HC-030031 in AITC-insensitive DRG. These results indicate that (1) TRPV1-mediated currents in
TRPA1-positive neurons characterize small current densities with slow decay, which is caused by
TRPA1 channel activities and intracellular Ca2+ mobilization and (2) desensitization of
TRPV1-mediated current in TRPA1-positive neurons is apparently slow, due to appending
TRPA1-mediated current.

− 50 −

１．研究課題名：慢性閉塞性肺疾患における気道可逆性の病態解析（研究番号 S2015-9）
２．キーワード：１）プロカテロール (procaterol)
２）慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive lung disease：COPD)
３）低吸収領域 (low attenuation area：LAA)
４）β2 アドレナリン受容体 (β2-adrenergic receptor：ADRB2)５）気腫多様性 (emphysema heterogeneity)３．研究者氏名：水野 史朗・医学部・准教授・呼吸器内科学
４．研 究 目
 的本研究の目的は、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 患者における肺気腫分布の多様性と慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 患者における主たる治療薬であるβ刺激剤に対するβ2 アドレナリン受容体 (ADRB2) 遺伝子多型を解析し、COPD肺気腫患者における気管支拡張剤による治療反応に関する、形態的・遺伝的な患者特性を明らかにすること、さらに喘息合併 COPD の診断に関する肺構造的・遺伝的因子を特定することである。
５．研 究 計 画
a.気腫分布多様性と呼吸機能障害・治療反応性との関係
金沢医科大学呼吸器内科通院中の 10 pack year 以上の喫煙歴のある 211 名の患者群の胸部High resolution computed tomography (HRCT) 画像より、肺気腫分布（上肺野-下肺野、右肺左肺、肺野中心-胸膜辺縁）に対する偏りを、画像解析ソフトを用いて計算し (Emphysema
heterogeneity index: EHI)、EHI と procaterol 20μg 吸入後の一秒量の改善量 (ΔFEV1) と改善率
(Bronchodilator response：BDR) の関連を解析することにより、気腫性病変の分布、多様性が呼吸機能に及ぼす影響を検討した。
気腫多様性に関しては、胸部 HRCT 画像の DICOM データより胸部 CT 画像解析ソフト（LungVisonTM ver 2.1, Cybernet 社）を用いた画像処理により、撮影された全肺野から気腫病
変の肺野に占める割合 (%Low attenuation area: %LAA) を部位別に測定し、各患者の%LAAの分布から EHI を以下の様に算定した。
EHI% (upper-lower) = {%LAA 上肺野 -%LAA 下肺野 }/{%LAA 上肺野 +%LAA 下肺野 } × 100(%)
EHI% (right-left) = {%LAA 右肺 -%LAA 左肺 }/{%LAA 右肺 +%LAA 左肺 } × 100(%)
b.ADRB2 遺伝子多型と気腫多様性との関係
同様の患者群より PAXgene DNA 採血管を用いて採取した血液検体より genomic DNA を抽出し ADRB2 遺伝子多型 (ADRB2 Arg16Gly) を PCR-RFLP 法により測定し、遺伝子多型の違いと気腫分布の多様性を比較検討し、遺伝子多型が原因と考えられる COPD のフェノタイプ
を上述の気腫多様性を組み合わせて検討した。

− 51 −

６．研 究 成 果
気腫多様性と気道可逆性の検討では、気道可逆性陽性群（ΔFEV1 ≧ 200 ml かつ BDR ≧ 12%）において、EHI% (upper-lower) が気道可逆性陰性群（ΔFEV1 < 200 ml または BDR < 12%）に比して有意に低下しており、上肺野有意の気腫病変を持つ群は procaterol による気管支拡張効果が弱いことが明らかとなった。また、気腫性病変の程度 (%LAA) と一秒量は弱い負の相関を持ち (r = -0.17, p < 0.05)、気道可逆性陰性群では一秒量と%LAA との間に負の相関を認めていた (r = -0.270, p < 0.0001)。気腫多様性の左右差 EHI% (right-left) については、前述の気道可逆性に有意な差は認めなかった。
気道可逆性陽性群と陰性群では、気腫の重症度、血清 IgE 値や末梢血好酸球分布を含む患者背景に有意な差は認められなかった。また、ADRB2 Arg16Gly 遺伝子多型群間での検討では、COPD 患者群における ΔFEV1、BDR%とも多型間での有意な差は認めなかった。しかしながら、上述の気腫多様性を組み合わせて患者群を上肺野有意である EHI% (upper-lower)>10と気腫分布に偏りの少ない EHI% (upper-lower)≦10 群に分けて検討した場合には、ADRB2
Arg16Gly 遺伝子多型の Arg/Arg 遺伝子群が Arg/Gly、Gly/Gly 遺伝子群に比して procaterol 投
与後の ΔFEV1、BDR%いずれもが有意に高いことが判明した。
７．研究の考察・反省
本研究の結果より、肺気腫の分布による気道可逆性に影響を与える因子を胸部 CT 画像よりある程度推定することが可能であることが明らかとなった。COPD は気道病変と気腫病変が存在し、いずれの因子も閉塞性換気障害による呼吸不全をもたらす。気腫病変の多様性は現在の CT 画像の解析から容易に測定、検討することが可能であり、治療反応性に関する予測もある程度可能と考えられる。しかしながら、本研究の気腫多様性の検討結果のみでは気道病変優位の COPD 患者群における気道可逆性の予想は困難である。気管支喘息患者や欧米で多い Cystic Fibrosis 患者では、β刺激剤の気道拡張効果は ADRB2 Arg16Gly 遺伝子多型により影響を受ける事は過去の報告でも認められているが、COPD 患者では上述のように気腫病変の多様性が、遺伝子多型による気道可逆性に影響し、遺伝子多型のみの検討ではβ刺激剤の効果を推定することは困難であることが示唆される。しかしながら、COPD 患者においても気腫による呼吸機能の影響が比較的弱い上肺野優位の気腫を持つ群においては、ADRB2
Arg16Gly 遺伝子多型の影響がβ刺激剤による反応性の違いが認められることが明らかとなった。
気腫病変の多様性の検討には、上肺野-下肺野、右肺-左肺の他、肺門-辺縁部の分布が呼吸機能に影響することが報告されている。本研究では、肺門-辺縁部の分布に関しての検討は
CT の三次元的データ解析の困難さから現時点では行っていない。肺門部の気腫は気道周囲の支持組織の低下より、胸膜下の気腫性病変に比して閉塞性障害を発症しやすく、この形態的変化が気管支拡張剤に対する影響を受けるであろう事は容易に想定される。今後、同病変の変化による検討を追加し、さらなる COPD フェノタイプのさらなる検討を行っていきたい。
COPD 患者における気道可逆性有無は、喘息合併 COPD (ACO) の診断に重要な意味をもつ。

− 52 −

過去の報告では、COPD 患者群の数割が喘息を合併するとの報告が多い。しかしながら本研究で明らかとなったように、気道可逆性には気腫多様性が関与しており、好酸球性炎症である気管支喘息の因子を持たないものの、気道可逆性陽性であることより、ACO として診断される病態が存在することが示唆される。喀痰好酸球や呼気一酸化窒素濃度の測定により好酸
球性炎症の存在が明らかに確認される群以外の ACO として診断される群には、気腫多様性と ADRB2 遺伝子多型の違いによる気管支拡張剤の効果が異なる群の存在を考慮する必要がある。
本研究は短時間作用性のβ2 刺激剤である procaterol の気道拡張作用を検討したものである。
実際の臨床では、短時間作用性β刺激剤は軽症 COPD や喘息患者の発作時の屯用として用いられる事が多く、長期間作用性β刺激剤の効果を判定し、本研究で認められた影響が実際の臨床の場で有用であるかを検討する必要がある。また、COPD でβ刺激剤と同様に重要な気管支拡張剤である抗コリン剤の効果についても今後同様に ADRB2 Arg16Gly 遺伝子多型による呼吸機能改善効果が認められるかどうかの検討を行って行きたい。
８．研 究 発 表
該当無し（現在投稿中）。

− 53 −

１．研究課題名：メチオニン制限による抗老化ならびに糖尿病腎症抑制効果に関する研究（研究番号 S2015-10）
２．キーワード：１）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)２）低たんぱく質食 (low-protein diet)
３）メチオニン (methionine)４）オートファジー (autophagy)
３．研究者氏名：北田 宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学
４．研
 究 目 的
2 型糖尿病腎症を含む慢性腎臓病の末期腎不全への進展を抑制するため、たんぱく質制限
による食事療法が推奨されているが、糖尿病腎症に対するその腎保護効果と発現機序は十分に解明されていない。一方、たんぱく質制限は寿命延長効果を有するが、その効果は、アミノ酸の中で、特にメチオニン制限によると報告されている。申請者は、既にたんぱく質制限が抗酸化ストレス・炎症効果を発揮して 2 型糖尿病（Wistar fatty (fa/fa) ラット）の腎症を改善することを見出しているが、そのたんぱく質制限の効果がメチオニン制限を介して発揮されているかどうかは明らかではない。したがって、本研究は、メチオニン制限の糖尿病腎症抑制効果とその機序を抗老化の観点から検証し、より有効な腎保護のための新たな食事療法
を含む治療法の確立を目指すことを目的とする。
５．研 究 計 画
低たんぱく質食の進展した糖尿病腎症に対する腎保護効果が、メチオニン制限を介して発揮されるかどうかを明らかにするために、24 週齢の糖尿病（Wistar fatty (fa/fa) ラット）およびコントロール非糖尿病ラット（雄）について、
1) Wistar lean 非糖尿病コントロール
2) Wistar fatty (fa/fa) 糖尿病ラット
3) Wistar fatty (fa/fa) 糖尿病ラット＋低たんぱく質食（5.77%たんぱく質）
4) Wistar fatty (fa/fa) 糖尿病ラット＋低たんぱく質食＋メチオニン負荷（メチオニン含有量は通常食を同等；0.64%）に分別した後、20 週間の食事介入を行い、以下について評価・検討した。
体重、腎重量、HbA1c、尿中アルブミン排泄量、腎尿細管間質線維化および尿細管障害；マッソントリクローム染色、3 型コラーゲン・Kim-1 mRNA 発現（RT-PCR）、炎症：CD68・TNFα mRNA 発現(RT-PCR)、オートファジー関連：p62・p-S6Ribosomal protein (S6RP)（ウエス
タンブロット）− 55 −

６．研 究 成 果
体重・脂肪量・HbA1c 値は、非糖尿病ラットに比較して、糖尿病ラットにて有意に増加し、低たんぱく質食にて部分的に減少したが、メチオニン負荷にてそれらの効果は減弱した。また、腎重量・尿中アルブミン排泄量・尿細管間質の線維化（マッソントリクローム染色および腎皮質 3 型コラーゲン mRNA 発現で評価）・尿細管障害および炎症（腎皮質 Kim-1・CD68・
TNF-αmRNA 発現にて評価）は糖尿病ラットにて有意に増加し、低たんぱく質食にて著明に改善したが、メチオニン負荷は、それらに対する改善効果は消失した。さらに、オートファ
ジー関連マーカーに関しては、糖尿病腎皮質において増加が認められる p62 および mTORC1の下流分子の一つである S6RP のリン酸化（ウエスタンブロット）の増加、つまりオートフ
ァジーの減弱と mTORC1（mammalian target of rapamycin complex1）経路の活性化は、低たんぱく質食で改善するも、メチオニン負荷にて両者とも増加が認められた。
７．研究の考察・反省
これまでに我々は、低たんぱく質食が、糖尿病腎症に対する腎保護効果を発揮することを報告したが、今回、低たんぱく質食に通常食と同等になるようにメチオニンを負荷した飼料を作成し、糖尿病ラットに与えたところ、糖尿病誘導性腎障害（尿アルブミン排泄量・腎線維化・尿細管障害・炎症）に対する低たんぱく質食の腎保護効果は減弱～消失した。また、低たんぱく質食は糖尿病状態の腎で活性化する mTORC1 および減弱するオートファジーを、それぞれ低下および回復することと関連して、腎保護効果を発揮するが、通常食レベルまでのメチオニン負荷は、それら低たんぱく質食の効果を減弱した。以上の結果は、低たんぱく質
食の腎保護効果がメチオニン制限を介していることを示唆する。現在、さらに、メチオニンのみを低たんぱく質食レベルまで制限した飼料による検討を行っている。それではいかなる機序によりメチオニンが、低たんぱく質食の腎保護効果を減弱するのか？メチオニンは、細胞内で SAM（S-アデノシル メチオニン）に代謝され、さらに Gnmt (glycine N-methyltransferase)
により、SAH に代謝されるが、今回我々は、糖尿病腎において SAM 代謝の中心的役割を果たす酵素である Gnmt の発現が非糖尿病ラットに比較して有意に低下していること、免疫組
織染色において、主に糖尿病ラット腎近位尿細管細胞において SAM の染色強度が増強していることを見出している。したがって、現在、糖尿病腎における Gnmt の低下とメチオニン
代謝産物 SAM 代謝の変異に焦点を当て、それらによる腎障害進展機序の解明を行っている。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Ogura Y, Koya D. The protective role of Sirt1 in vascular tissue: its relationship to vascular
aging and atherosclerosis. Aging (Albany NY) 2016; 8: 2290-2307.
Abstract: Cardiovascular disease (CVD) due to atherosclerosis is the main cause of death in both theelderly and patients with metabolic diseases, including diabetes. Aging processes contribute to thepathogenesis of atherosclerosis. Calorie restriction (CR) is recognized as a dietary intervention for
promoting longevity and delaying age-related diseases, including atherosclerosis. Sirt1, an− 56 −

NAD+-dependent deacetylase, is considered an anti-aging molecule and is induced during CR. Sirt1
deacetylates target proteins and is linked to cellular metabolism, the redox state and survival pathways.
Sirt1 expression/activation is decreased in vascular tissue undergoing senescence. Sirt1 deficiency inendothelial cells (ECs), vascular smooth muscle cells (VSMCs) and monocytes/macrophages
contributes to increased oxidative stress, inflammation, foam cell formation, senescences impaired
nitric oxide production and autophagy, thereby promoting vascular aging and atherosclerosis.
Endothelial dysfunction, activation of monocytes/macrophages, and the functional and phenotypicalplasticity of VSMCs are critically implicated in the pathogenesis of atherosclerosis through multiple
mechanisms. Therefore, the activation of Sirt1 in vascular tissue, which includes ECs,monocytes/macrophages and VSMCs, may be a new therapeutic strategy against atherosclerosis andthe increasing resistance to the metabolic disorder-related causal factors of CVD. In this review, we
discuss the protective role of Sirt1 in the pathophysiology of vascular aging and atherosclerosis.
② Kitada M, Ogura Y, Koya D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. Int
J Nephrol Renovasc Dis 2016; 9: 279-290.
Abstract: Diabetic nephropathy is the most common cause of end-stage renal disease. Therefore,
novel therapies for the suppression of diabetic nephropathy must be developed. Rodent models areuseful for elucidating the pathogenesis of diseases and testing novel therapies, and many type 1 andtype 2 diabetic rodent models have been established for the study of diabetes and diabetic
complications. Streptozotocin (STZ)-induced diabetic animals are widely used as a model of type 1
diabetes. Akita diabetic mice that have an Ins2+/C96Y mutation and OVE26 mice that overexpress
calmodulin in pancreatic β-cells serve as a genetic model of type 1 diabetes. In addition, db/db mice,
KK-Ay mice, Zucker diabetic fatty rats, Wistar fatty rats, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty ratsand Goto-Kakizaki rats serve as rodent models of type 2 diabetes. An animal model of diabetic
nephropathy should exhibit progressive albuminuria and a decrease in renal function, as well as thecharacteristic histological changes in the glomeruli and the tubulointerstitial lesions that are observedin cases of human diabetic nephropathy. A rodent model that strongly exhibits all these features ofhuman diabetic nephropathy has not yet been developed. However, the currently available rodent
models of diabetes can be useful in the study of diabetic nephropathy by increasing our understandingof the features of each diabetic rodent model. Furthermore, the genetic background and strain of eachmouse model result in differences in susceptibility to diabetic nephropathy with albuminuria and thedevelopment of glomerular and tubulointerstitial lesions. Therefore, the validation of an animal model
reproducing human diabetic nephropathy will significantly facilitate our understanding of theunderlying genetic mechanisms that contribute to the development of diabetic nephropathy. In thisreview, we focus on rodent models of diabetes and discuss the utility and limitations of these models
for the study of diabetic nephropathy.

− 57 −

１．研究課題名：Y14 変異導入による TAR 症候群モデル細胞の構築及び機能解析（研究番号；
S2015-11）
２．キーワード：１）エキソンジャンクション複合体 (EJC)        ２）血小板減少症橈骨欠損症 (TAR) 症候群
３）Y14 (RBM8A)
３．研究者氏名：辰野 貴則・総合医学研究所・助教・生命科学研究領域
４．研 究 目 的
Y14 は、スプライシング時に mRNA のエクソンのつなぎ目付近で形成される複合体 Exon
Junction Complex (EJC) の構成因子の一つである。EJC は、Y14 に加え、MAGOH、eIF4A3、
CASC3 の４因子をコアとして構成され、RNA の輸送、分解等の代謝経路に関与する。また、ヒトにおいて Y14 遺伝子の変異・欠失は TAR 症候群を引き起こすことが報告されている（Albers C.A. et al., 2012、Alachkar A. et al. 2013）。
研究代表者らは、これまでに Y14 が中心体に局在し、中心体複製へ関与することを報告してきた。さらに、前年度の奨励研究により、Y14/Magoh だけでなく EJC コア因子の eIF4A3
および CASC3 についても中心体に局在することが明らかとなった。しかし、マウスにおいては Y14 の片アレルの欠失のみで重大な影響を受けることから、TAR 症候群患者においてみられる Y14 の遺伝子発現の恒常的低下により引き起こされる細胞機能の異常をマウスにより再現することは不可能であると考えられた。そこで、TAR 症候群患者が有する遺伝子型と同様な変異を細胞に導入することで Y14 発現量の低下を引き起こした時に細胞に与える影響を明らかにするべく、本研究を行った。
５．研 究 計 画
TAR 症候群における遺伝子変異は主として Y14 の遺伝子を含む遺伝子領域の欠損およびSNPs からなる。そこで、CRISPR/Cas9 法によりゲノム編集を行い、TAR 症候群患者と同様な Y14 変異を持つ細胞を作成し、作成した細胞について、Y14 の発現量および Y14 周辺の遺伝子の発現に与える影響を明らかにする。また、細胞に導入した Y14 の変異が細胞の形態・増殖・細胞周期に与える影響を明らかにする。
６．研 究 成 果
CRISPR/Cas9 法による遺伝子切断部位を決定するため、まず、HeLa 細胞より DNA を抽出し、Y14 遺伝子周辺配列を PCR にて増幅後、シークエンス解析を行った。結果として、HeLa
細胞の Y14 遺伝子周辺配列においては数か所の変異は存在したものの大きな変異は認められなかった。そこで、遺伝子切断部位を決定するために、PAM 配列に基づいて標的配列の検索を行ったが、TAR 症候群患者が持つ SNPs 周辺にはオフターゲットの少ない標的配列が存在− 59 −

しなかった。そこで、SNPs の導入には CRISPR/Cas9 の中でオフターゲットを回避する方法として用いられている Cas9 nickase を使用して実験を行った。しかし、Cas9 nickase の切断効率は低く、SNPs 変異の導入が行うことができないと考えられたため、まず Y14 遺伝子欠損を導入し、その後に長鎖 DNA を用いて相同組み換えにより変異を導入する方法に切り替えて実験を進めることにした。
そこで、Y14 のタンパク質コード領域及び TAR 症候群で認められる SNPs の外側で遺伝子切断を行う CRISPR/Cas9 用のガイド RNA を作成し、Y14 の遺伝子座を 1 アレルのみもつ細胞株の構築を試みた。この方法により、一部のアレルを欠損させた変異細胞を作成することはできたが、HeLa 細胞は染色体数が正常なヒト細胞に比べて多いことに加えて、染色体不安
定性等の理由により、1 アレルのみもつ細胞株の作製及び一部のアレルを欠損した細胞株の継代による維持ができず、HeLa 細胞からモデル細胞を作成することは困難であることが明らかとなった。
HeLa 細胞での TAR 症候群モデル細胞の構築が困難であることが明らかとなったことから、染色体数が正常な細胞に近いとされる HCT116 に細胞を変えて実験を進めることにした。
HeLa 細胞と同様に Y14 遺伝子周辺配列のシークエンス解析の後、CRISPR/Cas9 によるゲノム編集を行った。HCT116 細胞については、片アレル欠損細胞を作成することができ、もう片アレルについても変異が導入されていたが、細胞の増殖速度や形には目立った影響は認められなかった。
７．研究の考察・反省本研究から、がん細胞を用いて、TAR 症候群のような片アレルごとに異なる変異を持つ疾患のモデル細胞の構築は困難であることが明らかとなった。前年度に作製を行った CASC3
ノックアウト細胞については、CRISPR/Cas9 により HeLa 細胞であっても簡単に細胞株の構築ができたが、今回のような特殊な変異の場合はカリオタイプやゲノム不安定性を含め、様々な要因についての考察が必要であったため、当初の研究計画に比べ、大幅に時間がかかってしまった点が反省点として挙げられる。今後、ゲノム編集ツールによる変異の導入を行う場
合には、CRISPR/Cas9 のみに傾倒するのではなく、ベクター構築こそ煩雑であるものの標的
配列の自由度が高い TALEN などを含め、実験計画を立てる必要があると考えられた。また、本研究で得られた細胞に関して、さらに変異を導入し、モデル細胞の構築を進め、TAR 症候群の発症機構を詳細に調べることで論文化したいと考えている。
８．研 究 発 表
該当なし。

− 60 −

１．研究課題名：簡便・迅速・安価なオンデマンドゲノムコピー数解析法の開発と臨床応用（研究番号 S2015-12）
２．キーワード：１）遺伝子診断 (genetic diagnosis)
２）染色体検査 (chromosomal analysis)３）コピー数多型 (copy number variant)４）臨床遺伝学 (clinical genetics)５）遺伝子変異 (gene mutation)
３．研究者氏名：新井田 要・総合医学研究所・准教授・先端医療研究領域
４．研 究 目 的現状の遺伝学的検査において、ゲノムレベルの遺伝子の大欠失や重複、或いはコピー数多型を検出するには、MLPA 法や DNA マイクロアレイ法を用いるのが主流である。しかしこ
れらの方法は、検査試薬の原価そのものが高く、コスト面から一般診療への導入が困難である。また、解析対象となるゲノム領域を必ずしもカバーしておらず、汎用性にかける事も問題である。そこで今回、ゲノム上の任意の遺伝子領域のコピー数を簡便・迅速・安価に測定する新技術である MugCap (Multiple gene competitive amplification) 法の開発に着手した。本法の反応条件を至適化し、精度を評価した上で、最終的には金沢医科大学病院集学的医療部遺
伝子医療センターにおける実地臨床に応用する事が目的である。
５．研 究 計 画
MugCap 法の原理は単純である。PCR プライマーと同様、ターゲット特異的な 20mar のプ
ローブ配列を DNA の同一鎖上に設計する。各プローブには共通の 20mar の PCR プライマー
配列が連結されている。この 40mar のオリゴヌクレオチドの合成は通常のプライマー合成と同様に安価に外注できる。プローブを DNA の目的の領域にハイブリダイゼーションさせ、プローブ間を Taq DNA polymerase で合成し、Taq ligase で接続する。酵素は同時に加え 60℃、
15 分の反応で完了する。共通 PCR プライマーで増幅すると、ターゲット間で競合 PCR とな
り、コピー数を反映して増幅される。これをアガロースゲル電気泳動したイメージをフリー
ソフト (Image J) で定量解析する。
研究に用いる DNA 検体は、金沢医科大学病院遺伝子医療センターを受診し、遺伝学的検査を受け、染色体 G 分染法、FISH 法、または DNA マイクロアレイ法でゲノムレベルのコピー数異常が検出された患者さんの残余検体を用いる。遺伝学的検査の結果説明の際に、文書を用いて本研究の内容を説明し、研究参加に対する同意・非同意を得る。なお、本研究は、金沢医科大学遺伝子解析研究に関する倫理審査委員会の承認を得た（受付番号 111）。

− 61 −

６．研 究 成 果
当初、研究計画に記した方法にて複数のゲノム領域のコピー数の定量化を試みたが、領域毎、プローブ毎にデータのばらつきが大きく、また再現性に乏しい事が明らかとなった。そこで MugCap 法の原理から見直し、以下の 2 点を改良することにより、実用的なレベルに完成することができた。１点目は伸長反応酵素の変更である。当初は 5’側プローブからの伸長反応に Taq polymerase を使用していたが、この酵素は 5’ to 3’ exonuclease 活性を持つために、伸長して 3’側プローブに達した際に停止せず、3’側プローブを 5’端より分解しながらさらに伸長反応を継続する。Taq polymerase が 3’側プローブを全て分解した場合、共通プライマー
配列は遊離するため PCR 反応で増幅されなくなる。この反応と Taq ligase による結合反応とが競合するために、実験毎、プローブ毎に有効な PCR テンプレートの産生量にばらつきが生じる。この結果、安定した定量性（コピー数測定）が得られない。そこで伸長反応酵素を 5’
to 3’ exonuclease 活性を持たない Klen Taq polymerase に変更する事で問題を解決し、安定した結果が得られるようになった。２点目は解析手法の変更である。当初はアガロースゲル電気泳動のイメージをフリーソフト (Image J) で解析し、ピークの面積比からコピー数の変動を算定していたが、この方法ではバックグラウンドピークの水準を一律に規定する事が難しく、実験毎、プローブ毎の誤差が大きくなる。そこで共通 PCR プライマーの片方を蛍光標識し、キャピラリーシーケンサ―によるフラグメント解析を行った。これによりばらつきのない安定した結果が得られるようになった。
以上の改良により安定したデータが得られるようになり、MugCap 法は実用レベルの技術となった。現在は金沢医科大学病院遺伝子医療センターで行う遺伝学的検査の補助診断として利用し、さらなるデータの集積を行っている。他の手法に比べ、原価が検体あたり 1,000
円以下と格安であり、オンデマンドで任意のゲノム領域を調べることができ、汎用性が高い。
本法は染色体構造異常に伴う欠失や重複の診断のみならず、結節性硬化症（TSC1, TSC2 遺伝子）や神経線維腫症 1 型（NF1 遺伝子）など、患者の 5-10％程度に遺伝子レベルの大欠失を認めるメンデル遺伝病の診断にも有用である。
７．研究の考察・反省研究開始当初は、安定したデータが得られないのは実験条件の問題と考え、各種パラメー
タを至適化しようと試行錯誤を繰り返したが、結局徒労に終わった。別の研究で古い論文を読み返しているときに、Taq polymerase が 5’ to 3’ exonuclease 活性を持つことに気がつき、
MugCap 法の原理的な問題点が明らかとなった。そこで同活性を持たない Klen Taq polymeraseを採用することで、問題が解決された経緯である。Taq polymerase の 5’ to 3’ exonuclease 活性
は、リアルタイム PCR における Taqman probe にも応用されており周知の事実であったが、過去に発表されている MugCap 法類似の複数の方法においても Taq polymerase が使用されており、その影響に気がつかなかった。このため時間を要したが、最終的には、実用的な検査システムを確立することができたと考える。
また、検出法をフラグメント解析に変更したことにより、検出領域の多重化が容易である− 62 −

事が示された。異なる共通 PCR プライマー配列を持つプローブを混合して同時にハイブリダ
イゼーションした場合、各プライマー毎に異なるプローブセットでプロービングした領域を増幅できることが確認された。プライマー毎に異なる蛍光色素で標識すれば、フラグメント
解析上は PCR 産物を混合して１サンプルとして流すことができるため、一度に解析できる領
域の数は飛躍的に向上する。今後は、この特性を生かし、比較的頻度の高い、或いは臨床上重要な微細欠失症候群を網羅的にスクリーニングする診断パネルを作成する予定でいる。
８．研
 究 発 表本研究の成果は現在学術誌に投稿準備中である。

− 63 −

１．研究課題名：低酸素性肺高血圧マウスの病態解析（研究番号 S2015-13）
２．キーワード：１）肺循環 (pulmonary circulation)２）マイクロ RNA (micro RNA)３）肺動脈性肺高血圧ラットモデル (pulmonary arterial pulmonary hypertension)４）低酸素性肺高血圧ラットモデル (hypoxic pulmonary hypertension)
３．研究者氏名：四宮 祥平・医学部・助教・呼吸器内科学
４．研 究 目 的
肺高血圧症は、肺血管のリモデリングが原因で肺動脈圧の異常な上昇を認め、極めて予後不良な難治性疾患である。一般的には安静臥位での右心カテーテルによる平均肺動脈圧が 25mmHg 以上を超える場合に診断できる。しかし右心カテーテル検査は侵襲的であり、少なからず合併症のリスクを抱えた検査である。一方で心エコー検査も有用とされているが、偽陽性や偽陰性となることもしばしばである。近年血清もしくは血漿などの体液中のマイクロ RNA（以下 miR）が様々な疾患や生物学的プロセスの低侵襲な診断に使用できるバイオマーカーとして期待されている検査方法として期待されている。そこで我々は肺高血圧ラットモデルを用いて、血清中およびエクソソームを抽出して miR 発現を測定し、各種病態マーカーとしての相関を検討した。
５．研 究 計 画
血管内皮増殖因子受容体薬 (Su5416) を生後 6 週のラットに皮下投与 (20mg/kg) した後、酸素濃度 10%の低酸素環境に 3 週間暴露させることで原発性肺高血圧モデルラット（以下 SuHx；n=4）を作成した。また低酸素性肺高血圧ラットモデル（以下 Hx；n=4）についても、
生後 7 週のラットを 4 週間低酸素環境に暴露させることで作成した。
それぞれのモデルラットは購入 5 週間後にサクリファイスした。サクリファイス時に胸骨正中切開を施行し右室圧および肺動脈圧を測定した。測定後左心室より脱血死させたのち肺および心臓を摘出した。右肺の一部を RNA 測定用およびタンパク質測定用にそれぞれ
RNA lator の中もしくは凍結保存した。左肺は病理組織用に 10cm H2O の圧をかけて肺を膨らませながらホルマリン固定した。心臓は右心室と左心室＋中隔に分けてそれらの重量を測定して比（Fulton 比）を算出した。そして右心室を RNA 用、タンパク質用そして病理組織用に切り分けた後、それぞれ RNA lator もしくは凍結もしくはホルマリンにて保存した。
血中のエクソソームは exoRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen) を用いて抽出し、予備実験として Su-Hx 群および Hx 群、コントロール群（以下 NOX；n=4）における RT-PCR による miR
マイクロアレイ解析を行い、NOX 群と比較して miR の発現に有意差のあるものを抽出した。
さらに血液細胞中、肺組織中の RNA も Paxgene RNA exraction kit および miRNeasy mini kit
を用いて抽出して標的 miR を RT-PCR にて検討した。

− 65 −

６．研 究 成 果NOX 群と比べて Su-HX 群および Hx 群で 5 週間後の体重は低体重であった。また Su-Hx
群と Hx 群との比較においても Hx では有意な体重の差を認めていた。ヘマトクリットについては Hx 群で NOX 群および Su-Hx 群と比較して有意に上昇していた。右室収縮期圧はHx 群で 40mmHg、Su-Hx 群では 55mmHg 程度まで上昇しており、平均肺動脈圧としてもHx 群で 25mmHg、Su-Hx 群で 30mmHg 以上と NOX 群と比較して有意に上昇していた。右心肥大を見るための Fulton 比についても Su-Hx 群、Hx 群いずれにおいても NOX 群と比較して上昇しており、Su-Hx 群では Hx 群と比較しても上昇していた。肺の病理組織像を見てみても、Hx 群では肺動脈壁の肥厚を認めており、Su-Hx 群では Plexiform lesion を認めていた。
本研究では miR マイクロアレイ解析で抽出した標的 miR の中から miR-202-5p、miR-494、
miR-30e、miR-664-1-5p、miR-674-3p、miR-103-3p、miR-25-5p、miR-326-5p、miR-625-5p を選択した。エクソソーム中の miR の発現は miR-30e、miR-664-1-5p、miR-103-3p が Su-Hx 群
および Hx 群でそれぞれ低下しており、さらに Su-Hx 群は Hx 群と比較してさらに低下していた。一方肺組織中の発現を見てみると、miR-202-5p および miR-494 の発現が増加しており、特に miR-202-5p においては Su-Hx 群で NOX 群と比較して有意差をもって増加していた。エクソソームにおける miR の発現と組織での発現、エクソソームと血球においての発現における相関係数を検討したところ、miR-664-1-5p のみにそれぞれの正の相関を認めていた。また肺動脈圧との相関についても検討したところ、miR-30e および miR-103-3p の 2 種類に弱いながら負の相関を認めていた。
７．研究の考察・反省
miR は近年癌領域において早期発見に有用とされており研究が進んできている。今回我々の行った研究は、肺動脈性肺高血圧モデルラットである Su-hypoxia ラットおよび低酸素性
肺高血圧モデルラットにおける miR の発現について検討を行い、肺動脈性肺高血圧症および低酸素性肺高血圧症における miR の発現低下もしくは増加している種類を見つけることにより肺高血圧症の早期発見につながるものと考えた。
肺高血圧症における miR の発現についての文献は多数見られるが、主に BMPR2 シグナルにおける miR 発現についてのものと、低酸素に関連する miR 発現についての論文が多い［Negi V, Chan SY. JCI Insight. 2017］。肺高血圧症におけるバイオマーカーとして重要なのは肺動脈圧との相関性であるが、今回行った研究で相関があったのは miR-30e と miR-103-3p
のみであった。miR-103 は近年癌遺伝子としての機能をもつことから注目されている miR の一つである［Geng L et al. Int J Mol Sci. 2014, Yu D et al. Oncol Lett. 2012, Fu X et al. Prostate.
2016］。特に胃癌の進行において重要とされており［Ueda T et al. Lancet Oncol. 2010］、浸潤や転移に関与していると考えられている［Kim BH et al. J Surg Oncol. 2013］。一方で Hif1βの発現を抑制することで肺動脈平滑筋細胞の増殖を抑える働きを持つとされており［DengB et al. Life Sci. 2016］、肺動脈平滑筋細胞が増殖している肺高血圧症において miR-103 の発− 66 −

現が低下していることは矛盾しない結果である。
miR-30e は肺癌細胞の成長と腫瘍形成に関連している miR の一つである［Markou A et al.
Lung Cancer. 2013］。また腫瘍細胞の増殖と浸潤にも関与しているとされている［Wang Y et
al. Clin Cancer Res. 2009, Schepeler T et al. Oncogene. 2012, Presneau N et al. Br J Cancer. 2013,
Hu J et al. Int J Cancer. 2011, Silva J et al. Eur Respir J. 2011］。そのことから miR-30e は細胞増殖のコントロールに関与しているものと考えられており、Zong ら［Zong Y et al. Circ J, 2017］
は Ubiquitin-conjugating enzyme E21 を介し、miR-30e が血管平滑筋細胞の増殖と遊走を阻害することを報告した。さらに Liu ら［Liu FY et al. Sci Rep. 2016］は miR-30e を過剰発現させることで血管内膜と血管平滑筋の増殖が抑制されることを報告した。以上のことからも
miR-30e の発現低下の結果、肺高血圧症の病理像である血管内皮細胞と血管平滑筋の増殖が起こったものと思われる。
肺高血圧症は、肺動脈平滑筋細胞のアポトーシスへの抵抗性も特徴の一つである。FoxO
は細胞の増殖をコントロールする鍵となる転写因子の一つである。Savai ら［Savai R et al.
Nat Med. 2014］は肺高血圧肺では FoxO1 の発現が低下することにより肺動脈平滑筋細胞の増殖が起こることを報告した。miR-664-1-5p は骨肉腫細胞における FoxO4 を介した増殖に関与しているとされている［Chen B et al. Biomed Pharmacother. 2015］。今回我々のデータでも、miR-664-1-5p はエクソソーム中、肺組織中、血液細胞中のいずれでも Hx 群および SuHx 群で低下しており、肺高血圧症における肺動脈平滑筋細胞のアポトーシスにも関与している可能性があると思われた。
現在、治療による miR-30e 発現の変化について検討している最中であり、また今後エクソソーム中に発現変化を認めていた miRNA の肺動脈内の発現分布を ISH また miRNA の標的
タンパクの肺内発現を IHC で確認し、肺血管細胞における機能発現までの検討をおこなう
予定である。
８．研 究 発 表
追加実験などを行った後、今後行う予定である。

− 67 −

１．研究課題名：アナフィラキシー時における胃自律神経活動の解析（研究番号 S2015-14）
２．キーワード：１）アナフィラキシーショック (anaphylactic shock)２）胃の交感神経 (gastric sympathetic nerve)
３）胃の迷走神経 (gastric vagal nerve)４）求心性神経 (afferent nerve)５）遠心性神経 (efferent nerve)
３．研究者氏名：九田 裕一・医学部・助教・生理学Ⅱ
４．研 究 目 的
アナフィラキシーショックは時として致死的となる緊急性を要する疾患であり、消化器症
状として嘔吐、腹痛、下痢などを伴う。
研究代表者は前年度、アナフィラキシーショック時にラット胃の動脈血流量及び排出能の低下や胃の運動性の亢進が起こることを認めた。胃を支配する自律神経系は胃の運動や循環動態の調節に関与しているが (Blair et al, J Physiol 253: 493-504, 1975; Gershon et al, J Physiol
189: 317-327, 1967)、胃の自律神経がアナフィラキシーショックによる胃の運動及び排出能に関与するか否かについてはよくわかっていない。
本研究は、麻酔下でラットのアナフィラキシーを惹起して、胃を支配する自律神経の求心路と遠心路の活動がどのようにして変化するか電気生理学的解析を行った。
５．研 究 計 画
麻酔下において卵白アルブミンで感作した Sprague-Dawley ラットに抗原 (0.6mg) を静脈内投与しアナフィラキシーショックを惹起させ、体血圧、胃を支配する交感神経活動または迷走神経活動（遠心性及び求心性の神経活動；合計４つの神経活動）を 1 時間測定した。同様にコントロールとして非感作ラットに抗原を投与し、1 時間測定した。迷走神経の求心路の確認は CCK8 (20μg) の静脈内投与で行い、遠心路の確認はグレリン (3μg/kg) の静脈内投与で行い、反応が検出されたラットを解析した。
６．研 究 成 果抗原の静脈内投与によりアナフィラキシーを惹起すると体血圧は低下し、20 分後に最低値になり、その後徐々に回復した。
胃の遠心性交感神経活動はアナフィラキシーショックで抗原投与直後から投与後 10 分まで有意に増大したが、求心性の交感神経活動はアナフィラキシー群、コントロール群で有意な変化はなかった。
一方、胃の遠心性迷走神経活動には有意な変化はなかったが、求心性の迷走神経活動はア
ナフィラキシーショックで抗原投与後から投与後 20 分まで有意に増大した。

− 69 −

７．研究の考察・反省本研究では、胃の遠心性交感神経活動がアナフィラキシーショックで抗原投与直後に有意に増大した。一般的に交感神経の興奮は末梢の血管を収縮させることが知られている。このことは我々の先行研究でアナフィラキシーショックが胃の血管抵抗を上昇させることから(Kuda et al, J Physiol Sci, in press)、アナフィラキシーショックにおける胃の血管収縮作用に交感神経の関与があることが示唆された。
アナフィラキシーショックによって迷走神経活動は求心性の活動が強く上昇した。先行研
究でアナフィラキシーショック時に胃の運動性が亢進することがわかっている (Kuda et al, J
Physiol Sci, in press)。アナフィラキシー直後において胃の迷走神経求心路の活動増大と胃の運動性の亢進が観察されることや、胃での機械的受容をトリガーとして胃求心性神経活動が増大することから (Phillips et al. Brain Res Brain Res Rev 34: 1-26, 2000)、アナフィラキシーシ
ョックによる胃の運動性亢進が胃の機械的刺激を惹起させ求心路の神経を興奮させた可能性が考えられる。
アナフィラキシーによる胃の求心性迷走神経の興奮が、遠心性自律神経調節に果たす役割について、我々の予備検討で、求心路の投射器である延髄孤束核の神経活動が増大することを c-fos の免疫組織化学的解析で確認している。従って、胃の求心路の活動増大が中枢神経系を経て、遠心路自律神経の調節に関与している可能性を示唆している。
本研究では神経活動に関する解析で、アナフィラキシーに伴って増える化学伝達物質の作用に関する解析は行っていない。今後は、除神経モデルおよび摘出胃での詳細な解析を今後検討する予定である。
８．研 究 発 表
現在、論文執筆中。

− 70 −

１．研究課題名：微小乳頭状癌のリンパ管浸潤の分子機構解明（研究番号 S2015-15）
２．キーワード：１）リンパ管 (lymphatic vessels)
２）大腸癌 (colon cancer)
３）低分化胞巣 (poorly differentiated clusters; PDC)
４）マウスモデル (mouse model)
５）浸潤 (invasion)
３．研究者氏名：相川 あかね・医学部・助教・臨床病理学
４．研
 究 目
 的細胞極性の逆転を示す微小乳頭状パターンや低分化胞巣 (poorly differentiated clusters;
PDC) を含む癌は、リンパ節転移リスクが高いことで知られる。一方 MDCK 細胞（イヌ尿細管細胞由来）を 3 次元培養したシストでは低分子量 G 蛋白質 RhoA の活性化により極性が逆転することが明らかになっている。微小乳頭状パターンを細胞集団移動のモデルとして捉え、その形態維持、リンパ行性転移において RhoA 活性化が関与しているという仮説を立て、マウスを用いた担癌生体内蛍光ライブイメージングの手法を確立し検証する。
５．研 究 計 画
リンパ行性モデルとなる大腸癌細胞株を単離した上で、FRET バイオセンサーを発現させ、2 光子顕微鏡下で親株との比較することにより、リンパ行性細胞株の信号伝達の特徴を抽出する。
６．研 究 成 果A) リンパ行性細胞株の単離
BALB/c マウスに化学物質処理したマウス大腸から単離された細胞株 colon26 は、KRas の活性化型変異を有し、BALB/c マウスへの同系移植による転移モデルとして汎用されている。
申請者は脾臓に移植した colon26 細胞を肝転移巣から単離し培養し、再度脾臓に移植するサ
イクルを数回繰り返し、効率よく肝臓に転移する細胞株を単離している。脾臓移植は門脈を経由して肝臓に転移する血行性転移モデルであるので、同細胞を経皮的に直腸に打ち込み、直腸の腫瘍が大きくなった数週間後に解剖し、腹腔内・鼠蹊部の腫脹したリンパ節から細胞単離を行うことで、リンパ行性細胞株の取得と試みた。リンパ節から転移した colon26 細胞が取得できた（CT26-N1）が、その細胞を試験管内で培養した後、再度直腸に移植しても、リンパ節転移株を得ることができなかった。
B) 蛍光蛋白質 GFP を発現する細胞株による移植実験
組織切片で感度よく転移腫瘍を検出するために、colon26 細胞に蛍光蛋白質 GFP を発現する細胞株を樹立し、直腸に移植・解剖後、腫脹リンパ節から連続切片を作製し、GFP 抗体で免疫染色を試みたが、細胞を検出することができなかった。

− 71 −C) リンパ液の可視化
リンパ管からリンパ節への交通を確認する
ため、墨汁を用いて可視化することにした。
細胞懸濁液に墨汁を混合し、マウス尾基部あるいは側腹部皮下に移植した。24 時間後には、
鼠蹊部・腋窩のリンパ節が肉眼的に黒くなるのを確認できたことから、少なくともリンパ液はリンパ節に到達していることが確認できた。また切片を作製して観察したが、リンパ節には墨汁は確認できるものの（上図・右・点線○）、腫瘍細胞は確認できなかった。
D) その他
直腸に移植した部位の組織切片を見直すと、経皮的に移植しているため腫瘍は粘膜下組織～筋層で増殖しており、一部は粘膜側に向かって細胞塊として浸潤しているように見えるが（左図、点線囲み）リンパ管への侵襲像は観察されなかった。リンパ管は粘膜固有層に多いことが知られているので、消化管内腔側からの移植も試みたが、手技的に難易度が高く、うまくいった例でも腫瘍細胞は粘膜には定着せず粘膜下組織への定着をみるのみであり、リンパ管侵襲像は確認できなかった。
C56BL/6 由来の大腸癌細胞 CMT 細胞株を同系移植すると腹腔リンパ節に転移したという情報（愛知がんセ・青木正博博士より私信）から、同細胞を入手し上記直腸移植を試みたが、リンパ節転移株を取得することはできなかった。
７．研究の考察・反省リンパ管を経てリンパ節に転移する腫瘍はヒトでは一般的であるが、マウスの同系移植を用いて、細胞塊として存在する腫瘍塊は確認できたものの、リンパ節転移モデルを作成することはできず、RhoA が活性化しているか否かの実験を組むことができなかった。研究期間
中に大阪国際がんセンター研究所 生化学部 井上正宏博士からリンパ管・血管を問わず脈管内にある腺管は極性が逆転しているとの報告があった (Am J Pathol., 2016)。RhoA の関与は検討されていないが、極性の逆転と脈管侵襲とはなんらか関連があることを示唆するものである。今後はヒト大腸癌外科材料検体を用いて、脈管内の腺管あるいは PDC において、RhoAの下流に位置するリン酸化酵素 ROCK などの活性化を免疫染色で検討することで、仮説を証
明したい。
８．研
 究 発 表なし

− 72 −

１．研究課題名：癌細胞エクソソームによる細胞間相互作用の分子機構の解明（研究番号
S2015-16）
 
２．キーワード：１）細胞間相互作用 (intercellular communication)２）エクソソーム (exosome)３．研究者氏名：山本 聡子・総合医学研究所・助手・先端医療研究領域
４．研 究 目 的
 エクソソームと呼ばれる細胞分泌小胞が、細胞間相互作用において重要な役割をもつことが明らかとなっている。エクソソームにはタンパク質、microRNA、mRNA などの分子が含まれ、これらの物質がエクソソームの授受を介して細胞間を移動し、エクソソームを受け取った細胞の形質を変化させ、種々の生命現象の制御に寄与している。しかし、この研究分野はまだ初期段階にあり、特に物質の選択的ソーティング機構、受け手側の取り込み機構といった基礎的な分子機構は十分に理解されていない。研究代表者が所属する研究室では、細胞間相互作用を観察する培養プレートを開発・実用化し、高感度タイムラプス顕微鏡を使用して受け手側の細胞に取り込まれるエクソソーム動態撮影に成功している。本研究では、この研究ツールの利点を生かし、エクソソーム取り込み機構を中心とした分子機構の解明を行う。
エクソソームの合成・分泌機構については、種々の膜小胞形成に関わる endosomal-sorting
complex required for transport (ESCRT) を形成する一連の分子群や、エクソソームの膜成分であるセラミド合成の律速酵素 neutral sphingomyelinase 2、細胞内の膜小胞輸送に関わる Rab
GTPase ファミリー分子群、ヘパラン硫酸分解酵素である heparanase などの様々な分子が同定されている。しかし、microRNA、mRNA などのエクソソームへのソーティング機構、そして受け手側の細胞によるエクソソームの取り込み機構といった基礎的な分子機構については十分に解明されていない。癌による転移においてもエクソソームが癌の転移しやすい微小環
境構築に働いている可能性が示唆されている。
本研究の学術的な特色・独創的な点として、我々は細胞間相互作用を観察できる細胞培養
プレートを開発し、膵癌細胞のエクソソームを可視化した安定細胞株を樹立している点にある。
今回、別の蛍光色を用いて、相互のエクソソームのやりとりを可視化することも予定した。
既に予備実験にて培養上清を共有した細胞に 0.2μm 穴のフィルターを介してエクソソームが取り込まれる様子のタイムラプス撮影に成功しているため、2 色の蛍光色素を用いて、エクソソームの動態について解析を行う。これまでにエクソソームの取り込みについてタイム
ラプスにて可視化した報告はなく、この利点を活用して、エクソソームの取り込み機構を中心とした分子機構の解明を行う。本研究により、エクソソームのいまだ分かっていない分子機構を明らかにすることにより、種々の生命現象の制御及び各種疾患の治療につなげる事にある。

− 73 −

５．研 究 計 画
1) エクソソームの動態解析：抗がん剤などの各種薬剤による変化を解析する。
2) エクソソーム可視化細胞をもう 1 系統樹立することにより、異なる細胞同士の細胞間相互作用におけるエクソソームの動態を解析する。
６．研 究 成 果
①エクソソーム可視化細胞の樹立
エクソソームには CD63 が好発現していることから、細胞小器官用レポーターベクターを用いて CD63 融合 GFP/luciferase 発現安定膵癌細胞株 (ePANC-1) の樹立に成功しているが、もう 1 系統、RFP を用いた rPANC-1 細胞の樹立を行った。残念ながら、安定細胞株の樹立には失敗したが、一時的な発現を認めた細胞の樹立には成功し、異なる蛍光色を用いたエクソ
ソームの分布の違いについて検討することができた。エクソソームの分布は、細胞内では、自己産生したもの（内来性）と、外来性のものでは、分布が異なり、一部、共局在する像が観察された。
さらに細胞周期とエクソソームの関係、細胞周期と反応性の関係をみるために、細胞周期が可視化されている細胞 (Fucci) に同レポーターベクターを導入し、細胞周期とエクソソー
ム両者を可視化した細胞 (eFucci) も樹立しているが、これらにより、エクソソームの生成には、細胞周期による違いを見出すことができなかった。
②各種薬剤を用いてのエクソソームの動態、産生、分泌、取り込みの検討
エクソソームの形成過程、細胞内移動や分泌、細胞周期との関係をタイムラプス蛍光顕微鏡で経時的に観察した。未だプレリミナリーな状態ではあるが、エクソソームの排泄を定量的に評価する方法を確立でき、薬剤により排泄量が変化することを明らかにすることができた。特に、ある種の抗がん剤では、エクソソームの生成・分泌量が増加することが明らかとなり、今後は、抗がん剤や小分子阻害剤のよるスクリーニングを行う予定としている。薬剤
名や小分子阻害剤ターゲットについては、今後特許申請の可能性があるため、本報告では、匿名とさせていただきます。
７．研究の考察・反省本研究では、別系統のエクソソーム可視化細胞の樹立時間を要し、予定していた主な研究
対象のエクソソームの解析が遅れた。しかし、外来性と内来性のエクソソームの動態をライブで解析することに成功した。
８．研 究 発 表
論文作成中

− 74 −

１．研究課題名：介護保険施設における入浴ケア体制と介助者の疲労の実態（研究番号 S2015-18）
２．キーワード：１）介護保険施設 (long-term care facility)
２）入浴ケア (bathing)３）看護・介護職員 (caregiver)
４）労働負担 (workload)５）ケア体制 (care system)
３．研究者氏名：橋本 智江・看護学部・講師・老年看護学
４．研 究 目
 的本研究の目的は、介護保険施設における入浴ケア体制の実態を明らかにし、介助者の負担に影響する課題を検討することである。
５．研 究 計 画１）調査対象：平成 27 年 6 月現在、独立行政法人福祉医療機構ホームページ WAM-NET に公開されている介護保険施設のうち、A 県、B 県、C 県にある 50 床以上の介護療養型医療施設（以下、療養型とする）、介護老人保健施設（以下、老健とする）、介護老人福祉施設（以下、特養とする）である。特養は従来型とユニット型が存在し、それぞれで入浴ケア体制に違いがあることが予測されたため、同一施設であっても従来型、ユニット型それぞれを別施設として調査対象とした。その結果、対象施設は療養型 29 施設、老健 119 施設、特養従来型
173 施設、特養ユニット型 21 施設の計 342 施設となった。
２）調査方法：調査依頼文と入浴ケア体制に関する調査用紙を施設長宛に郵送し、ケア管理者
1 名に調査用紙の回答を依頼した。調査用紙とともに返信用封筒を同封し、調査協力に同意が得られる場合のみ返信してもらうようにした。
３）データ収集期間：2015 年 10 月 2 日～11 月 30 日
４）調査内容：Ⅰ．回答者の属性、Ⅱ．施設の概要、Ⅲ．入浴ケア体制に関すること（浴室の数、浴槽の種類、入浴ケア実施日数、実施時間帯、担当職員職種、人数、入浴ケア担当時間、休憩時間の有無、入浴ケア時の服装・履物等）
５）分析方法：入浴ケア体制を施設種別ごとに集計し、χ2 検定を用いて施設種別ごとの特徴を検討した。有意水準は 5%未満とした。
６）倫理的配慮：回答者が依頼文を読んで参加の可否を自由に判断できるよう調査依頼文に任意で回答することの説明と、研究協力を辞退しても不利益を被らないことを記載した。研究
協力への同意は、調査用紙の返信があったものを同意が得られたとした。また、調査用紙は無記名で回収し、施設の特定が不可能な状況とし、匿名性の保持に配慮した。回収した調査
用紙、データ入力したファイルは、鍵付きのキャビネット内に管理した。調査項目は、記載に負担がかからないように、約 20 分で完了できる内容とした。

− 75 −

６．研 究 成 果１）回答者の属性と対象施設の概要：調査対象施設のうち、156 施設（療養型 15、老健 53、特養 88）から回答が得られた（回収率 45.6%）。特養についは、従来型とユニット型を別施設として調査対象としたが、ケア体制を確認したところ、従来型であってもユニットケアを導入している施設が半数近くみられたため、従来型とユニット型を合わせて特養として、3 施設種別で分析を行った。
回答者の職種は、介護職が 65.4%、看護職が 17.9%であった。経験年数は、10 年以上の者
が 71.2%と最も多かった。
対象施設の利用者定数は、50 床以上 100 床未満が 102 施設（65.4%）、100 床以上が 53 施設（34.0%）、不明が 1 施設（0.6%）であった。利用者の平均年齢は、いずれの施設も 80 歳
代後半が半数以上であった。平均要介護度は、療養型 4.0～4.6、特養 3.1～4.4、老健 2.9～4.2であり、療養型が最も高かった。
２）入浴ケア体制
施設内にある浴槽は、利用者が臥床した状態で浴槽につかるタイプが特養、療養型のほとんどに設置されており、老健では 66.0%に設置されていた。また、利用者が浴槽をまたいで入る 1 人用のタイプ（以下、個浴とする）は、特養で設置されている施設が多く、老健、療
養型では設置されていない施設の割合が多かった (p < 0.01)。さらに、利用者が浴槽をまたぐ、あるいは歩いて入り、複数人同時に入るタイプは、老健ではほとんどの施設に設置されているが、療養型では設置されていない施設が多かった。
入浴ケアの実施状況は、
表１のとおりいずれの施設も 1 週間のうち 5～6 日間ケアを行っている施設が多く、特養では 7 日間を通してケアを行っている施設がみられた。
表㻝．1施設あたりの1週間の入浴ケア実施日数㼚㻩㻝㻡㻡

介護療養型医療施設
㼚㻩㻝㻡

介護老人保健施設
㼚㻩㻡㻟

介護老人福祉施設
㼚㻩㻤㻣

2～4日

5（33.3）25（47.2）

23（26.4）

5～6日

10（66.7）

28（52.8）48（55.2）

7日

0（0.0）

0（0.0）

16（18.4）

日数

χ 㻞値

㼜値

㻟㻣㻚㻡㻤

㼜 ＜0.01      入浴ケアを実施している時間帯をみると、いずれの施設も午前、昼食後～16 時の時間帯に実施している施設が多く、16 時～夕食前の時間帯は少なかった。夕食後から就寝前の時間帯に実施している該当施設はみられなかった。
老健、療養型においては、入浴ケアを浴室までの誘導係、更衣係、洗身係のように役割を分担して行う方法で実施しているとする施設の割合が多くみられた。一方、誘導、更衣、浴室内の介助全てを 1 人の介助者が 1 人の利用者に対して行う方法（以下、マンツーマンとする）で実施しているとする施設は、老健、療養型に比べ特養に多くみられた (p < 0.01)。
また、介助者が 1 勤務帯に入浴ケアに携わる時間は、いずれの施設も 200 分以下が分析対象の半数を占めているが、201～300 分の施設が特養 30.7%、老健 41.9%、療養型 30.8%みられ、300～500 分の施設も特養、療養型でわずかにみられた（表２）。

− 76 −

さらに、入浴ケア担当時間中の休憩は、随時としている施設が多く、介助者が 1 勤務帯に入浴ケアに携わる時間・休憩時間に関しては、施設種別による違いはみられなかった（表３）。
表㻞．介助者の1勤務帯における入浴ケア担当時間
担当時間

200分以下201～300分
301～500分

㼚㻩㻝㻟㻝

介護療養型
医療施設
㼚㻩㻝㻟

介護老人保健施設
㼚㻩㻠㻟

介護老人福祉
施設
㼚㻩㻣㻡

8（61.5）25（58.1）

50（66.7）4（30.8）1（7.7）

18（41.9）0（0.0）

23（30.7）

χ 㻞値

㻠㻚㻜㻢

表3．入浴ケア時の休憩の有無

㼜値

休憩の有無

介護老人保健施設

介護老人福祉
施設あり㼍

2（13.3）12（22.6）

11（12.5）

なし

2（13.3）7（13.2）19（21.6）

随時㼎

11（73.3）

34（64.2）

58（65.9）

ｐ ＝0.392（2.7）

㼚㻩㻝㻡㻢

介護療養型
医療施設

㼍

㻞

χ 値

㼜値

㻟㻚㻤㻠

㼜 㻩㻜㻚㻠㻞

㼎

入浴ケア担当時間途中の休憩がある. 入浴ケア担当時間中決まった休憩がなく水分補給程度.


７．研究の考察・反省
本研究の結果より、特養には個浴を設置している施設が多く、マンツーマンでのケアを行っている施設が老健、療養型に比べて多い傾向がみられた。特養では、入浴ケアにおいて個別性を重視した体制がとられているといえる。
また、それぞれの施設において入浴ケアは、ほぼ毎日行われていた。さらに、介助者が 1
勤務帯に入浴ケアに携わる時間は、3～5 時間と長時間にわたり、十分な休憩がとられていないことが明らかとなった。これらのことから、利用者の重度化が進む介護保険施設における入浴ケアは、介助量が多いことにより長時間を要しており、介助者の負担の一因となっていることが考えられた。
入浴ケアは高温・多湿の環境下で行われる、介助者の負担が大きいケアの 1 つである。入浴ケアが介助者の心身におよぼす影響については、これまで様々な報告がある。しかし、現状行われている長時間、休憩をとらずにケアを実施している状況での影響を明らかにしたものは見あたらない。本研究では、入浴ケア体制の実態を調査するのみとなったため、今後は、介助者の心身の状況について調査をすすめていき、負担を少しでも軽減するケア体制を構築していく必要があると考える。
８．研 究 発 表橋本智江，川島和代．介護保険施設における入浴ケア体制の実態調査．老年看護学 2017；22：115-122．                              

要旨：利用者の重度化が進む介護保険施設において，入浴ケアは高温・多湿の環境下で行われる，介助者の負担が大きいケアの 1 つである．本研究では，介護保険施設における入浴ケ
ア体制の実態を明らかにし，介助者の負担に影響する課題を検討することを目的とした．方法は，介護保険施設計 342 施設に対し，質問紙を郵送し，入浴ケア体制に関する内容について，ケア管理者に回答を依頼した．その結果，156 施設から回答が得られた（回収率 45.6%）．
介護老人福祉施設では，1 人用の浴槽を設置している施設が多く，マンツーマンでのケアを行っている施設が介護老人保健施設，介護療養型医療施設に比べて多い傾向がみられた．また，介助者が 1 勤務帯に入浴ケアに携わる時間は，200 分以下が半数以上を占めていたが，− 77 −

300 分以上の施設もみられ，3 施設間で違いはみられなかった．これらのことから，介護保険施設における入浴ケアは，利用者の重度化に伴い長時間を要しており，介助者の負担の一因となっていることが考えられた．

− 78 −

奥付
  平成  年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

平成  年  月発行編 集   研究業績評価委員会      発行所   金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学  丁目  番地

禁無断転載