「様式３－A」

課題番号 3

コンパートメント境界形成モデルにおける細胞表面張力の実測［１］ 組織代表者：井上 高良（国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター：以下 NCNP 神経研究所）

以上の計画の立案・遂行に際しは, 加齢研小椋研究室固有の研究基盤と小椋研が東北大学工学部野村研と共同開発した先端技術基盤の適用を中核に位置づけ,どのような技法が細胞表面張力の実測に有効でどのような力覚関連遺伝子群の導入を行うべきかを勘案した。

対応者：小椋 利彦（東北大学加齢医学研究所）
分担者：浅見井上
久保野村淳子 （NCNP 神経研究所）
由紀子（NCNP 神経研究所）
純（東北大学加齢医学研究所）
慎一郎（東北大学工学部）

研究費：物件費 7 万 8 千円，旅費 22 万 2 千円
［２］ 研究経過
近年, 個体の発生・分化・加齢に関わる研究開発は，その必要性を増しつつある。本共同研究課題では，脊椎動物の脳・中枢神経系の発生過程で表出されるコンパートメントユニット（neuromeres：詳細は図１A 参照）の境界形成・維持機構を独自のモデルシステムや実験系を駆使して細胞・分子レベルで明確にすることを主目的とした（詳細は図１B 参照）。
これまでに研究代表者らは, マウス初期胚コンパートメント間で differential な発現様式を示す細胞間接着分子カドヘリン（参考文献 1-3）に着目し, 異なるカドヘリンサブクラスを発現する培養細胞を二次元で混和するだけでコンパートメント様境界が形成されることを見出している（未発表）。本共同研究課
題では前年度に引き続き, この境界形成モデルをより脊椎動物生体の脳・神経系の状況へ近づけるため,すべての神経上皮細胞で発現している細胞間接着分子N-cadherinをマウス繊維芽細胞由来のL細胞に安定導入した新規細胞株を樹立し, そこへ多重カドヘリンを誘導発現後、二次元混和培養を行った際にできるコンパートメント様境界形成において細胞の表面張力がどのように分布するのかを、物理的手法や各種力覚関連遺伝子の動態観察によって初めて体系的に明らかにすることをめざした。

図１： A（左）脊椎動物中枢神経系の発生は一層の細胞シートからなる神経板 neural plate が巻き上がって神経管 neural tube となってくびれ切れ, 内部に陥入するところから始まる（時間は図の上から下へ進行）。
（右）Hamburger・Hamilton によるニワトリ初期胚脳の発達様式（時間は図の左上から左下, そして右上から右下へ進行）。神経板/管には,前後軸に沿って順次『くびれ』が生じ, これらくびれを基点として神経管が精妙に折り畳まれることによって脳の原型（右下）が創られる 。これら くびれの幾つかが互いに細胞が混和しないコンパートメントユニット
neuromere の境界として定義できる ことがわかっている。
B（左）研究代表者が構築した 2D 細胞シートモデルによると異なるカドヘリンサブクラスの発現境界部（図の中央部）に太い２本のベルトで示したアクチン細胞骨格を基盤としたネットワークが形成され, これらが作用することで強い表面張力が生じるとともに, 細胞同士の混和が制限され, コンパートメントユニットが産み出される可能性が示
唆されている（研究代表者未発表データ）。(右)脊椎動物の中枢神経系
発生過程で認められるコンパートメントユニット neuromere の境界部は必ずくびれており, これが神経管の折り畳みによってできる脳の3D形態表出の基盤となっている （A 右）。この『くびれ構造』が 2D 細胞シートモデルのコンパートメント境界部で認められる表面張力制御機序とどのような関係にあるのかを探るのが本研究の最終目標である。

［３］ 成果（３－１）研究成果
本年度は，以下に示す研究成果を得た。

① 新 規 モ デ ル 細 胞 株 （ cadherin::XFP doubletransfectants：N-cadherin をマウス繊維芽細胞由来 L細胞株で安定発現させることで神経上皮細胞様に変化したクローンを単離し, そこへtet-ON誘導系を用いて各種カドヘリンと蛍光分子を異なる組み合わせで同時発現可能とした細胞株群, もしくは
cadherin-XFP transfectants：カドヘリン-蛍光分子融合蛋白を誘導発現可能とした細胞株群）の樹立に成功し, これらを二次元混和培養してコンパートメント様境界が形成される過程をコンフォーカル顕微鏡下でタイムラプス観察した。その結果, 境界付近でのカドヘリン分子動態や細胞分裂様式が初めて明確となり, 境界面に沿って張力が発生する可能性が示唆された 。現在上記モデル細胞株に力覚関連遺伝子のひとつである Yap の EGFP 融合蛋白質導入を試み,境界形成に応じてどのような挙動を示すのかについて解析を行なっている。これと同時にストレッチチ
ャンバー上で上記モデル細胞株を培養し,チャンバーに平面方向の張力をかけることによって境界部の細胞ダイナミクスやYapを含めた力覚関連遺伝子の発現動態を探る実験も開始した。さらにこれら系にtraction force microscopy の原理を適用することから張力の実測につなげる準備が進行中である。
② 細胞表面張力の物理的実測を行うため, コンパートメント境界形成モデルへ Giant Unilamellar
Vesicle との電気的融合を用いたマイクロパーティ
クルの導入を試み, 0.2 および 1µm 径のものに関しては細胞あたり数十個のパーティクルが〜80％の細胞に取り込まれる条件を見出した。そこで磁気ビーズ導入後, 光ピンセットによる細胞張力測定を試みたが, 熱の発生で細胞へのダメージが強かったた
め, 現在ポリスチレンビーズ等の導入至適条件を検討中である。
以上で得られた結果は上記培養モデルのみならずマウス胚発生過程においても同様なのか、独自に醸成したトランスジェニックシステム（参考文献 3, 4）や全胚培養系への電気穿孔法（参考文献 5, 6）を用いて検討を施し、今後明確にしてゆく予定である。
（３－２）波及効果と発展性など
本共同研究により，研究者間の交流が飛躍的に活性化し，当初予定していたコンパートメント境界モデルにおける細胞表面張力の実測に留まらず、小椋研で機能解析が進行中の力覚関連遺伝子群の役割をコンパートメント境界モデルもしくは発生マウス個体で考察するステップへと進捗 した。また，本共同研究で得られた結果は，平成 30 年度東北大学加齢医学研究所共同利用・共同研究課題の新規申請等に結びつき，今後さらなる発展が期待されている。
［４］ 成果資料
本年度において本共同研究からの直接的な成果論
文は無いが、今後の研究展開の基盤となる成果として以下の論文を発表した（本研究課題参画者に下線）。
(1) Inoue, Y. U., Morimoto, Y., Hoshino, M. and Inoue,T. (2018). Generation of Pax6-IRES-EGFP
knock-inmousevia
thecloning-free
CRISPR/Cas9 system to reliably visualize
neurodevelopmental dynamics. Neurosci. Res.
in press. （マウス前脳コンパートメントの可視化）(2) Owa, T., Taya, S., Miyashita, S., Yamashita, M.,

Adachi, T., Yamada, K., Yokoyama, M., Aida, S.,
Nishioka, T., Inoue, Y. U., Goitsuka, R.,Nakamura, T., Inoue, T., Kaibuchi, K. andHoshino, M. (2018). Meis1 coordinates cerebellar
granule cell development by regulating Pax6transcription, BMP signaling and Atoh1
degradation. J. Neurosci. 38, 1277-1294.
参考文献 （本研究課題参画者に下線）
1.

Inoue, T., Chisaka, O., Matsunami, H. and Takeichi, M.
(1997). Cadherin-6 expression transiently delineates
specific rhombomeres, other neural tube subdivisions
and neural crest subpopulations in mouse embryos.
Dev. Biol. 183, 183-194.

2.

Inoue, T., Nakamura, S. and Osumi, N. (2000). Fatemapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev.
Biol. 219, 373-383.

3.

Inoue, Y. U., Asami, J. and Inoue, T. (2009). Genetic
labelingofmouserhombomeres
byCadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores therole of cadherins in hindbrain compartmentalization.
Neurosci. Res. 63, 2-9 [Cover Article].

4.

Asami, J., Inoue, Y. U., Terakawa, Y. W., Egusa, S. F. andInoue, T. (2011). Bacterial artificial chromosomes as
analytical basis for gene transcriptional machineries.
Transgenic Res. 20, 913-924.

5.

Inoue, T. and Krumlauf, R. (2001). An impulse to thebrain-using in vivo electroporation. Nature Neurosci. 4Suppl., 1156-1158.

6.

Osumi, N. and Inoue, T. (2001). Gene transfer into
cultured mammalian embryos by electroporation.
Methods 24, 35-42.