0２０１７

平成２９年度金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

令和元年１０月

金沢医科大学はじめに

平成 29 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成 17 年度から平成 26
年度まで実施していた萌芽的研究を、平成 27 年度からは奨励研究（スタートアップ）に変更するなどして、研究の多様化にも対応しています。
平成 19 年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成 29 年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域には 42 件（共同研究 9 件、奨励研究 33 件）の申請があり、14 件（共同研究 4 件、奨励研究
10 件）を採択いたしました。また、看護学領域では、共同研究 2 件の申請のうち、1 件を採択いたしました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後、これらの共同研究と奨励研究で得られた研究成果を、社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

令和元年 10 月
金沢医科大学学長

神田享勉

目‒ ‒ ‒ ‒ 次‒
‒
‒
はじめに‒
‒

平成 ᵐᵗ 年度ᴾ 共同研究成果報告書ᴾ>医学領域@C2017－1. 疾患 iPS 細胞を用いたヒルシュスプルング病の病態解明と創薬スクリーニング系の開発
研究代表者・河 野 美 幸･･････
C2017－2.

胎児マイクロキメリズムの細胞種と混入経路の解明
研究代表者・清 川 悦 子･･････

C2017－3.

5

アルツハイマーモデル動物・脳波異常とその機序のインビボ解析
研究代表者・加 藤 伸 郎･･････

C2017－4.

19移植腎障害における糸球体・間質線維化に関する機能分子の検討
研究代表者・横 山仁･･････

13

>看護学領域@
C2017－5.

看護師の Professional QOL の構造－気質，共感性，コーピング
スタイルとの関連性研究代表者・田 中 浩 二･･････

17ᴾᴾ
平成 ᵐᵗ 年度ᴾ 奨励研究成果報告書ᴾ>医学領域@S2017－1. 糖尿病腎の解糖系が演じる病理的意義の解明
研究代表者・金 﨑 啓 造･･････

23

S2017－2.

Saffold ウイルスの未知なる蛋白 Large Leader の発現機序解析研究代表者・姫 田 敏 樹･･････

S2017－3.

統合失調症における認知機能障害の全ゲノム関連解析研究代表者・康 山 俊 樹･･････

S2017－4.

27

31

B 型ナトリウム利尿ペプチド (BNP) の肺炎予後予測因子としての評価：前向きコホート研究研究代表者・薄 田 大 輔･･････

35

S2017－5.

胎盤バリアの形成機序の解明～母体への胎児細胞混入の経路となるか？～
研究代表者・小 林 良 祐･･････

S2017－6.

HPV16E7 HIS２残基の役割と N-end rule pathway
研究代表者・田 崎 隆 史･･････

S2017－7.

39

43

移植後糖尿病および心血管合併症予防におけるアディポネクチンの測定意義の解明
研究代表者・足 立 浩 樹･･････

S2017－8.

47

可溶性ウロキナーゼ受容体 (soluble urokinase receptor : suPAR) を指標とするネフローゼ症候群 (NS) の新たな診断・治療指針の確立
研究代表者・藤 本 圭 司･･････

S2017－9.

51

抗酸化タンパク Peroxiredoxin6 の角膜創傷治癒抑制効果の解明
研究代表者・谷 村 直 紀･･････

55

S2017－10. 脱ユビキチン化酵素 USP10 による造血幹細胞維持機構解明
研究代表者・宇 谷 公 一･･････

59平成  年度



共同研究成果報告書
医 学 領 域 %～
看護学領域 %

１．研究課題名：疾患 iPS 細胞を用いたヒルシュスプルング病の病態解明と創薬スクリーニング系の開発（研究番号 C2017-1）
２．キーワード：１）ヒルシュスプルング病 (Hirschsprung's disease)
２）iPS 細胞 (iPS cells)３）細胞外マトリクス (extracellular matrix)
３．研究代表者：河野 美幸・医学部・教授・小児外科学
研究分担者：芝本利重・医学部・教授・生理学 II

吉崎尚良・医学部・講師・小児外科学

中川誠人・京都大学 iPS 細胞研究所・講師・未来生命科学開拓部門

奥田修二郎・新潟大学大学院医歯学総合研究科・准教授・ﾊﾞｲｵｲﾝﾌｫｰﾏﾃｨｸｽ分野
４．研 究 目 的
腸管は運動や分泌・吸収の調節を行う Enteric neural system (ENS) と呼ばれる神経系を持つ。
ENS は胎生期に神経堤由来細胞である enteric neural crest-derived cells (ENCCs) が腸管を口側から肛門側に遊走し，成熟することで形成される。この過程の異常は Hirschsprung 病 (HSCR)をはじめとする腸管神経節異常症の原因となる (Heanue TA et al. Nature reviews. Neuroscience2007)。HSCR の治療は，無神経節腸管の切除と肛門への吻合が根治術となる。しかし指定難病にもなっている全結腸型，小腸型の腸管神経節欠損の症例では死亡率が高く，腸管神経の移植療法の可能性が模索されているが，出生後の腸管から単離培養した ENCCs は，ホスト腸管への遊走，定着が弱く実現には至っていない (Stamp LA et al. American journal ofphysiology. Gastrointestinal and liver physiology 2017)。そのような状況下，Fattahi らは，ヒトの多能性幹細胞（ES 細胞）を ENCCs に分化誘導し，出生後の無神経節腸管に移植すると病変部に神経節を形成し，病変部腸管の運動能が回復することを報告した (Fattahi F et al. Nature,2016)。そこで我々は，この方法を自家移植しやすい iPS 細胞向けに改変し HSCR 患者の iPS細胞を使い，HSCR モデルマウスに ENCCs を移植する移植モデルを構築し，HSCR 疾患由来
ENCCs の機能を解析することで腸管神経節疾患への再生医療の可能性を検証する。
５．研 究 計 画（全体の研究統括を河野が担当）① 疾患 ENCCs の移植先ホスト腸管への定着と神経系の形成を促進するための創薬研究（吉崎が担当）
Yang らの研究より，発生後期（マウスでは E15.5 以降）から腸管への神経堤由来細胞の定着は著しく阻害されることが知られている。iPS 細胞誘導型 ENCCs の腸管移植にもこの問題が生じることが予想されるため，ENCCs の腸管への定着を阻害する因子，促進する因子の候補を探索する。そして ENCCs の細胞運動能，神経分化能の亢進が確認された薬剤は，移植実験に併用し腸管神経節症の治療に利用できるか検証する。

− 1 −② HSCR モデルマウスを用いた ENCCs 移植実験（吉崎，芝本が担当）
iPS 細胞から分化誘導した ENCCs は HSCR のモデルマウスである EDNRBls/ls（大腸末端の神経節がないモデルマウス）の腸管に埋め込み，移植 6 週間後に移植した腸管神経系の解析を行う。形成された腸管神経の評価は免疫組織染色による検証と，形成された腸管神経の生理機能は，新しく形成された大腸へ投射する腸管神経の電気活動を芝本教授の協力の元，電気生理学的に調べることで検証する。ヒト iPS を移植する場合免疫抑制剤を併用する。
③ 疾患 iPS 細胞のゲノムから HSCR 関連遺伝子変異の探索（中川，吉崎，奥田が担当）
HSCR 患者由来 iPS 細胞から，HSCR 原因遺伝子の同定を目的に，HSCR 患者血液からゲノム DNA を抽出し，全エクソンシーケンスを行い SNP の決定を行う。ヒルシュスプルング病
原因遺伝子を含む細胞内シグナルネットワークからの距離で SNP を持つ遺伝子の HSCR への関係性をスコアリングし，候補遺伝子を抽出する。
６．研 究 成 果
① 疾患 ENCCs の移植先ホスト腸管への定着と神経系の形成を促進するための創薬研究
我々は，昨年度の共同研究 (C2016-3) において，マウス腸管発生の継時的トランスクリプ
トーム解析と ENCCs 運動解析とを組み合わせ，ENCCs 遊走を亢進させる因子の探索を行ってきた。この結果，フィブロネクチンが ENCCs の遊走を亢進し，VI 型コラーゲンがフィブ
ロネクチン誘導性の細胞運動を抑制することを明らかにした (Nishida S. et al. Biochem
Biophys Res Commun 2018)。本課題ではこの知見を発展させ，VI 型コラーゲンが多く発現している漿膜をコラゲナーゼで損傷させ，フィブロネクチンを処理することで ENCCs の移植
効率が増加するか ex vivo の移植実験系を立ち上げ検証した。その結果，レシピエントマウス
腸管のコラゲナーゼ処理で ENCCs の接着効率が亢進すること，さらにフィブロネクチン処
理で筋層への浸潤能が亢進することを明らかにした（図 1）
。
A

C

PBS

Col
移植腸管神経B
PBS

Col

Col+FN

Col+FN

図1 ex vivo 腸管神経移植実験
マウス腸管をシリコンシートにピン止め(A左）、蛍光タンパク質発現神経細胞塊を滴下(A右)、3日培養後、蛍光顕微
鏡観察(B)、薄切切片を作製し蛍光免疫染色（C)、Colはコラゲナーゼ処理、FNはフィブロネクチン処理を示す− 2 −② マウスを用いた ENCCs の in vivo 移植実験
ex vivo 移植実験と同様の結果が実際の生きたマウスの腸管で確認できるか in vivo 移植実験を行った。コラゲナーゼ処理腸管では，対照の PBS 処理腸管と比べ有意に ENCCs の伸展範
囲が広いことが分かった（図 2）。現在この成果を “Tsuyoshi Kuwahara et al. Recipient colon
preoperative treatment with type I collagenase and fibronectin promote colonization of transplanted
enteric neural stem cells” として論文にまとめている。
③ iPS 細胞の樹立
HSCR 患者及び健常者の末梢血より単核球を単離し，この単核球から CytoTune iPS 2.0 を用い iPS 細胞を樹立した。現在ヒルシュスプルング病患者 11 例，ヒルシュスプルング病類縁疾
患 2 例，健常者 2 例の iPS 細胞を樹立している。そのうち，HSCR 患者 6 名，類縁疾患患者 2名，健常者 2 名の全エクソンシークエンスを行った。現在シークエンス結果から SNP のコールを行い，その解析を進めている。
A

B

C

PBS

Col

図2 in vivo 腸管神経移植実験
マウス蛍光タンパク質発現腸管神経を使ったin vivo移植実験。ECM分解酵素を浸したろ紙を腸管体側側に当て加温(A）、この方法では血管に損傷でない（B)。KikumeGR発現腸管神経を移植、1週間後に開腹し顕微鏡観察（C）。
現在マウスの生存率、移植後腸管への影響を検証中。 Colはコラゲナーゼ処理

７．研究の考察・反省
ex vivo 移植実験と同様の結果が実際の生きたマウスの腸管で確認できるか in vivo 移植実験を行った際，コラゲナーゼ処理を腸管の体側のみに限定することで，手術時の出血の抑制に成功したものの，術後の癒着が生じる個体があり，その癒着が実験の再現性の低下を招き，移植効率について統計的な有意差を出すことが困難であった。試行錯誤の上，癒着防止材のセプラフィルムを処置することで，比較的再現性のある実験系にすることができた。しかしこの検討に半年ほどかかってしまったため，予定していた iPS 細胞を使った病態解析実験が大幅に遅れることになった。現在まで疾患 iPS 細胞は，全結腸欠損型 3 例，短域型 8 例（内1 例はダウン症併発型），類縁疾患 2 例，と広いバリエーションの疾患 iPS 細胞の樹立がされている。今後は，疾患 iPS 細胞を利用した遺伝子変異と疾患のフェノタイプとの相関などの解析も同時に進めていきたい。
８．研 究 発 表
該当なし

− 3 −

１．研究課題名：胎児マイクロキメリズムの細胞種と混入経路の解明（研究番号 C2017-2）
２．キーワード：１）栄養膜細胞 (trophoblast)２）細胞融合 (cell fusion)３）DOCK ファミリー (Dock family)４）インテグリン (integrin)
５）蛍光蛋白質 (fluorescence protein)
３．研究代表者：清川 悦子・医学部・教授・病理学 I研究分担者：東海林博樹・一般教育機構・教授・生物学
湊宏・医学部・教授・臨床病理学（採択時）

大黒多希子・金沢大学・学際科学実験センター・教授・遺伝子改変動物分野
４．研 究 目 的
キメラリズムとは一つの個体に異なる遺伝情報（＝染色体）から成る細胞が存在することであり，マイクロキメリズムとは混入している細胞の数が少ないものを指す。妊娠・出産によって，胎児の細胞が母親に移入することも知られており，胎児マイクロキメリズムと呼ばれる。ヒト材料やマウス実験などの複数の研究室の報告から，混入細胞が存在することは確からしいが，母体・胎児間には血液胎盤関門によって物質交換が通常起こらない仕組みであり，混入細胞の種類や，混入時期，経路は不明である。本研究では，発光および蛍光蛋白質
発現マウスを用いて，混入する細胞種や混入の機構を明らかにすることを目的とする。また胎盤の表面は栄養膜細胞が融合して合胞体が形成されているが，この融合が不全に陥ることでマイクロキメリズムが起こるとも考えられている。培養細胞を用いてこの融合の分子機構を明らかにする。
５．研 究 計 画①

蛍光蛋白質を GFP のトランスジェニックマウス（以下 TG）のオスと，野生型のメスのマウスを交配し，母体における胎仔由来の細胞を FACS を用いて肝臓から細胞を単離したが，マウスの他の様々な臓器での混入細胞の検出が出来なかった。検出感度が良いとされる蛍光蛋
白質とルシフェラーゼのハイブリッドであるナノランタン（阪大永井ら，PNAS, 2015）を発現する TG マウスを搬入し，野生型のマウスと交配後の出産後のマウスでの細胞を検出する。
また肝臓における GFP 抗体を用いた染色では非特異的な染色像が得られたため，膜に局在し，マウス組織には存在しないヒト CD4TG マウス（東京理科大・岩倉洋一郎博士が作製後，理研に委託）も搬入し出産後のマウスでの細胞を検出する。

②

培養細胞を用いた実験では汎用の BeWo 細胞でも融合効率が悪く細胞融合の効果を判定す
る条件が整っていないので，条件を確立する。アクチンを制御する DOCK ファミリーの発現やその他関連遺伝子群の発現を JEG 細胞と BeWo 細胞で比較し，細胞融合に与える影響を薬− 5 −剤などを用いて検討する。
６．研 究 成 果①

ナノランタンおよびヒト CD4 を発現する TG マウスを搬入した。ナノランタン TG マウス
は基質をマウスに投与することにより IVIS にて発光を確認した。この♂マウスと ICR♀を交配し産後 1 週間で発光を調べたが，ナノランタンを発現する仔では発光が確認されたが，母体では検出されなかった。
母体から臓器を取り出して検索したが，やはり発光は確認できず，
現行のシステムでは検出限界以下であると結論した。
ヒト CD4 の TG マウスの♂と ICR の♀を交配させ，ヒト CD4 に対する抗体を用いて染色を行ったが，非特異染色はなかったものの陽性細胞は検出されなかった。TG マウスの免疫染色も各臓器で行ったが，胎盤と胎仔の肝臓でのみ形質膜に陽性像を認めたが，全ての臓器でヒト CD4 が発現している訳でなく，この実験には適していないマウスであると考えられた。

②

低分子量 G 蛋白質 Rac1 の活性化因子として，DOCK ファミリーと DBL ファミリーの 2 群がある。まず，BeWo 細胞でよく発現している
DOCK ファミリーを調べるために，BeWo および

RT-qPCRによる定量

JEG 細胞から RNA を抽出し qPCR を行ったところ，

1.20E-02

右図のような違いがみられた。BeWo，JEG 細胞共1.00E-02に DOCK1 と DOCK5 が発現しており，BeWo 細胞

8.00E-03
6.00E-03

ではほぼ同等であるが，JEG 細胞では DOCK１が4.00E-03

DOCK5 に比して優位である。各々の阻害薬とし2.00E-03て，DOCK1 は TBOPP (Tajiri, Cell Rep., 2017) と0.00E+00

BeWo

JEG

DOCK5 は C21 (Vibes, Nat Commun., 2015) が報告されているのでこれらを処理したところ，100 uMの C21 処理 48 時間で BeWo 細胞は死滅するのに対し，JEG は生き残った。逆に 25－50uM のTBOPP 処理では BeWo 細胞が生き残りやすいという結果を得た。DBL ファミリーのなかでも主要な Trio と Tiam1 を阻害するとされている Z62954982 は効果がなかったことから，BeWo
では DOCK5 が Rac1 を介する生存を含む細胞機能に主要な役割を担っていると考えられた。
BeWo 細胞を Forskolin 処理すると細胞融合が起こるが，条件を検討した結果，膜移行信号を付加した GFP 細胞を島状に生育させ，固定後蛍光色素 Hoechst33342 により核染色を施し，
2 核以上の細胞を数えることで融合能を調べることとした。その結果，Forskolin 処理には及ばないが，50uM C21 処理単独で細胞融合を引き起こすことが明らかとなった。
７．研究の考察・反省
各種 TG マウスを用いて母体への混入細胞を同定する研究は成功していないが，細胞融合の実験においては新規の知見を得ることが出来た。これまで DOCK5 は破骨細胞の融合に必須であると報告されており，今回の結果はこれまでの報告と逆の結果である。MDCK 細胞を用いた実験では，C21 処理により ERK，AKT, NFkB 経路が活性化されることを見出している− 6 −ので (Xu…Kiyokawa. Mol Vis., 2017)，FRET バイオセンサーを用いて ERK 活性化の経時的変化や，Rac1 活性化パターンも調べ，英文論文としてまとめる。
８．研 究 発 表
なし

− 7 −

１．研究課題名：アルツハイマーモデル動物・脳波異常とその機序のインビボ解析（研究番号C2017-3）

２．キーワード：１）海馬 (hippocampus)
２）ニューロン興奮性 (neuronal exitability)
３）シナプス可塑性 (synaptic plasticity)４）カルシウム測光 (calcium channel)５）アルツハイマー病モデル (animal model for Alzheimer’s disease)３．研究代表者： 加藤伸郎・医学部・教 授・生理学Ⅰ

研究分担者： 小野宗範・医学部・准教授・生理学Ⅰ伊藤哲史・医学部・准教授・解剖学Ⅱ

川原茂敬・富山大学・大学院理工学研究部・教授・工学

大森治紀・京都大学・医学研究科・名誉教授

４．研 究 目 的
海馬で観測される同期的リズム活動であるシータ波は，学習・記憶能力と高い相関がある。
アルツハイマー病 (AD) 発症の早期検出を目的として，我々が使用してきた AD 病態モデル
マウス 3xTgAD mice における学習中および自発行動中の海馬シータ波を解析する。これにより，発症以前から発症初期にかけて検出されるシータ波の異常と学習障害との相関を明らかにし，加えて，その連関のメカニズムをシナプス可塑性の観点から解析する。このマウスでは 6 ヶ月齢から神経細胞外にアミロイドβ(Aβ) が蓄積し，10–12 ヶ月齢には神経細胞死と学習・記憶障害を示す。Aβ蓄積が始まる 6 ヶ月齢前後における海馬依存的学習障害の進行
状況と海馬シータ波の異常の関係を明らかにすることができれば，アルツハイマー病の早期検出・早期治療に役立つことが期待できる。我々はこれまでに 3xTg マウスにおける BK 型カリウムチャネルの活性低下を in vitro 解析において明らかにし，また BK チャネル活性を回復させるとモデルマウスの認知症状が改善されることを行動実験によって報告してきた。分子と行動レベルの知見は相関しているが，さらに因果関係に近づくには神経回路網の働きをインビボで解析することが不可欠である。そのため本研究で海馬脳波を解析し，そのイオンチャネルメカニズムを探求する。
５．研 究 計 画
本研究では，3xTgAD モデルにおいて BK チャネル活性抑制およびそれに伴うシナプス可塑性の変調が，どのようにして行動レベルでの認知学習障害をもたらすのか，また，我々が臨床への橋渡しトランスレーションに着手した光刺激アルツハイマー治療法による認知改善がどのような神経生物学的背景に立脚しているのかを，以下の２つの観点からインビボ電気
生理実験を行うことによって解明する。
1− 9 −（課題１）学習・記憶において重要な役割を果たす海馬の同期的神経活動（type 2 シータ波）を解析することにより，アルツハイマー病の発症を早期において検出できるような手法の開発に貢献する。そのために，(1) アルツハイマー病モデル 3xTgAD mice の発症前後の月齢において，(2) 主として type2 シータ波が寄与する非空間学習課題である瞬目反射条件付けを用いて，(3) 海馬依存性が異なる複数の課題を設定し，(4) 学習中の海馬シータ波のダイナミクスを解析する。さらに，学習に伴うシータ波の特徴的変化以外に，シータ波の生成メカニ
ズムそのものに障害が生じる可能性もあるので，(5) 薬理的に type 1 シータ波と type 2 シー
タ波を分別して月齢依存的変化を解析し，Aβの蓄積（細胞内・細胞外）や学習・記憶障害の進行状況との相関を検討する。
（課題２）活動電位（スパイク）１発当たりのカルシウム増加を評価するために PME シス
テムを用いる。これは分担研究者・大森が開発した計測システムで，装置は金沢医科大学に移設済みである。PME は脳の深部で神経電気活動と光現象を同時に記録できる測光パッチ電極であり，蛍光励起と蛍光記録が可能で深部脳組織での電気および光応答がインビボで同時記録できる。局所に薬剤の注入もできる。この PME を用いて極低侵襲の光刺激 AD 治療法の神経生物学的な基盤メカニズムをインビボで明らかにする。まず，シナプス伝達の長期可塑性およびスパイクタイミング依存可塑性 (STDP) との関連において，AD モデルマウスと野生型マウス間でスパイク１発当たりのカルシウム濃度上昇を比較する。我々の開発してきた
光刺激治療パラダイムを AD モデルに賦与した前後でスパイク１発当たりのカルシウム増加の評価を行う。抗体や阻害剤を使って我々の「BK チャネル関与仮説」をインビボで検証する。刺激電極の慢性留置により同一個体 AD モデルから長期間にわたり複数回記録を試み，
光刺激治療パラダイムの神経生物学的根拠をより明確にする。
６．研 究 成 果
（課題１）まず海馬シータ波を安定して発生させるため，回転トレッドミルと無痛脳固定装
置を組み立てて歩行中マウスから海馬脳波を記録できるようにした。同時に記録電極からは蛍光レーザー光を照射することにより，電極先端近傍の集合的カルシウム増加を観測できるようにした。カルシウム指示薬はアデノウイルスによる GCAMP の発現が最も効果的であることが判明した。このような準備の下で，4 本の電極を眼瞼に刺入して窒素ガスによるパフ（エアパフ）を組み合わせて音とパフの連合を習得させるトレース瞬目反射学習を課して，その際のカルシウム測光とシータ波計測の同時施行を目指した。パフ後の反応期間におけるカルシウム上昇とシータ周波数コンポーネントの増加は見出した。しかし，音を組み合わせた連合学習をさせる段階で充分な学習を安定して引き起こすことがまだ実現できておらず，
野生型とアルツハイマー型モデルにおける差異の解析には至っていない。
（課題２）第一に測光電極 (PME) システムによる計測を AD モデルマウスのひとつである
トリプルトランスジェニックマウス (3xTg) に適用し，電気生理的計測とカルシウム測光を同時施行し，野生型と AD モデル間で海馬のシータ波とそれに随伴する集合的カルシウム記
録し，両者間の違いをマクロ的に見出すことを進めた。その結果，集合的カルシウム増加は2− 10 −

AD モデルにおいて低下傾向にあった。現在，AD モデルにおいても行動実験で測定される認知機能には個体差が見られるため，実際に空間学習や識別学習などの課題をさせて，AD モ
デル個体間で認知能力およびシータ波惹起性歩行行動に随伴するカルシウム増加の間に相関があるかどうかの確認を進めた。第二に，集合電位と集合的カルシウム測光だけでなく，単一ニューロンにも使えるように PME システムに改良を加えた。まず，光の誘導性を高めることを試みた。従来はニッケル被覆が電極先端近くには及ばない構造であったが，この部分にシリコンポリマー樹脂を電極ガラス管外壁に塗布することにより屈折率を変え，より強力なレーザー蛍光が電極先端に誘導できるようになってシグナルそのものが大きくなった。カ
ルシウム蛍光プローブの GCAMP を発現させる際にアデノウイルス (AAV) 1 型を使っていたが，AAV9 型を使用することにより発光量を増大させることができた。第三に，本研究では
光刺激アルツハイマー療法の神経生物メカニズムをシナプスレベルで解明することをめざしているが，AD マウス認知学習をより効果的に改善する光刺激パラメータ検討の一環として10Hz 刺激の有用性を明らかにした。
７．研究の考察・反省
音とパフの間隔を長くすることで，海馬依存性が強まると考えられるため，種々の間隔を試みて検討する。その上で AD モデルと野生型の間で差異の出るパラメータに集中して取り組む。測定の比較的容易な集合電位と集合的カルシウム増加の同時計測を施行しながら記録感度を高めることに注力し，集合的ではなく単一細胞からの記録もできるような状態を目指してさらに改良を試みる。
８．研 究 発 表
Ono M, Muramoto S, Ma L, Kato N. Optogenetics identification of a neuronal type with a glass
optrode in awake mice. J Vis Exp. 2018; 136: DOI: 10.3791/57781.
Abstract: It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neuralcircuits. Recent advances in optogenetics have enabled the identification of the neuronal type in invivo electrophysiological experiments in broad brain regions. In optogenetics experiments, it iscritical to deliver the light to the recording site. However, it is often hard to deliver the stimulation
light to the deep brain regions from the brain's surface. Especially, it is difficult for the stimulation
light to reach the deep brain regions when the optical transparency of the brain surface is low, as isoften the case with recordings from awake animals. Here, we describe a method to record spike
responses to the light from an awake mouse using a custom-made glass optrode. In this method, thelight is delivered through the recording glass electrode so that it is possible to reliably stimulate therecorded neuron with light in the deep brain regions. This custom-made optrode system consists ofaccessible and inexpensive materials and is easy to assemble.

3− 11 −

１．研究課題名：移植腎障害における糸球体・間質線維化に関する機能分子の検討（研究番号 C2017-4）
２．キーワード：１）腎移植 (renal transplantation)２）二重鎖 DNA 損傷 (double strand DNA breaks)３）VI 型膠原線維 (collagen type VI)４）アディポサイトカイン (adipocytokines)
５）ヒト組織適合抗原 (human leukocyte antigens)３．研究代表者：横山仁・医学部・教授・腎臓内科学

研究分担者：岩淵 邦芳・医学部・教授・生化学Ⅰ
友杉

直久・総合医学研究所・嘱託教授・天然変性蛋白質創薬科学研究部

足立浩樹・医学部・臨床准教授・腎臓内科学

砂谷優実・医学部・講師・生化学Ⅰ

松井佑樹・医学部・助教・腎臓内科学（採択時）

４．研 究 目 的
慢性移植腎症コホートを用いて，non-classical HLA である HLA-G の腎尿細管上皮細胞における発現および高分子アディポネクチン (adiponectin, ADPN) が移植腎機能障害に対して抑制的に作用する一方，移植後年数の経過につれ，移植腎糸球体係蹄内皮細胞（CD34 陽性）の DNA 損傷数と，糸球体における VI 型膠原線維量の増加に伴う不可逆的な糸球体線維化が生じる事を見出した。本研究では，１）未だ不明である糸球体係蹄内皮細胞からの VI 型
膠原線維の分泌機序を明らかとし，糸球体線維化抑制の可能性を検討する。２）腎の近位尿細管上皮細胞における DNA 損傷の意義，HLA-G および ADPN の発現機序を解明する。この機序解明は，ヒト移植腎の尿細管間質を主座とする急性とくに細胞性拒絶と間質線維化を伴う慢性拒絶の抑制を考える上で重要な意味をもつと考えられる。
５．研 究 計 画
（１）移植腎症の疾患コホート作成と解析（横山，足立，松井担当）：
1) 金沢医科大学において 2007 年以後に腎移植および腎生検が実施された移植腎症（137 例）の疾患コホートの後向き調査において，経年的な腎機能予後調査を行う。
2) 移植腎生検例の Banff 分類による移植腎病変，腎線維化のスコア化および免疫蛍光抗体法
を用いたリン酸化 (γ-) H2AX を指標とした DNA 損傷の発現細胞核数による定量化および尿細管上皮細胞を中心とした腎固有細胞における HLA-G1 および ADPN 発現の半定量的評価を行う。
3) 血清 ADPN 分画および HLA-G5 とこれらの関連分子の経時的測定を行う。
（２）培養ヒト糸球体内皮細胞 (HGEC) による VI 型膠原線維分泌における細胞内シグナル伝達− 13 −

経路の解析（岩淵，砂谷担当）：
DNA 損傷を持ったヒト糸球体内皮細胞による VI 型膠原線維分泌における，細胞内シグナ
ル伝達経路の解析：Primary human glomerular endothelial cells (Sciencell Research Labo) passage
3 を, DNA 損傷誘発剤マイトマイシン C (MMC) あるいは活性酸素種 H2O2 処理し，DNA 損
傷を誘発する in vitro 実験系を使用する。
1) 核内で DNA 損傷を認識し，VI 型膠原線維分泌を誘導する司令塔因子である ATR が，細胞質に貯蔵されている VI 型膠原線維の細胞外分泌を誘導するというシグナル伝達機構の全容を明らかにする。①ATR が細胞質に存在する否かを免疫蛍光抗体染色で調べる。②ATR はリン酸化酵素である。その基質が VI 型膠原線維輸送因子として見出した Annexin A2 であるか否かを，リン酸化抗体を用いたウエスタンブロットで解析する。③Annexin A2 が VI 型膠原線維を輸送している証拠を得るため，両者の細胞内結合を免疫蛍光抗体染色および共免疫沈降法で検出する。
2) DNA 損傷を受けた糸球体内皮細胞は，老化 senescence に陥る可能性があるため，内因性βガラクトシダーゼの活性（老化のマーカー）を調べる。老化に陥った細胞は，様々な炎症性
サイトカインを分泌するため，培養上清中の各種サイトカイン濃度を ELISA 法により測定する。
（３）培養ヒト近位尿細管上皮細胞における HLA-G および ADPN 産生の解析（横山，友杉担当）：
1) Primary human proximal tubular epithelial cells (Sciencell Research Labo) passage 2-3 をこれまで報告されている誘導因子（サイトカイン：TGF-β，γ-IFN, TNF-α，ホルモン：dexamethasone
and hydrocortisone，progesterone 等）を用いて，mRNA の発現を定量化する。
2) 蛋白産生について，①培養細胞の免疫蛍光抗体染色，②培養上清および③培養細胞 cell lysateの Western blot 法による分子量確認および濃度を測定する。
3) HLA-G 発現 pTEC の細胞性免疫に対する制御効果：至適誘導条件が確定された次のステップとして評価する。①MoDC 機能評価，②細胞共培養による活性化評価，③CD4+Th0 細胞の共培養下の機能評価を行う。
4) 臨床試料における検討：生検組織での pTEC 発現と検討１）で確認された至適誘導因子の血清濃度との比較を行う。
６．研 究 成 果
（１）移植腎症の疾患コホート作成と解析：
2007 年以後に腎移植および腎生検が実施された移植腎症（137 例）の疾患コホートを後向き調査した。移植腎生検例の Banff 分類による移植腎病変，腎線維化のスコア化および免疫
蛍光抗体法を用いたリン酸化 (γ-) H2AX を指標とした DNA 損傷の発現細胞核数による定量化および尿細管上皮細胞を中心とした腎固有細胞における HLA-G1 の半定量的評価を行った。
また，血清 ADPN 分画および HLA-G5 とこれらの関連分子の経時的測定を実施した。その結果の一部を PLoS One および Clin Exp Nephrol に公表した。
（２）培養ヒト糸球体内皮細胞による VI 型膠原線維分泌における細胞内シグナル伝達経路の解析：− 14 −

DNA 損傷を持ったヒト糸球体内皮細胞による VI 型膠原線維分泌における，細胞内シグナ
ル伝達経路の解析：Primary human glomerular endothelial cells (Sciencell Research Labo) passage
3 を, DNA 損傷誘発剤マイトマイシン C (MMC) あるいは活性酸素種 H2O2 処理し，DNA 損
傷を誘発する in vitro 実験系を使用し，以下を明らかにした。
1) DNA 損傷による VI 型膠原線維分泌の誘導シグナルの同定：DNA 損傷時のシグナル伝達で中心的な役割を果たす 3 つのキナーゼ (ATM，ATR，DNA-PK) をそれぞれに対する特異的な阻害剤 (KU55933，VE-821，Nu7441) で抑制し，VI 型膠原線維の分泌が抑制されるか否かを調べた。その結果，VI 型膠原線維の分泌は，ATR 阻害剤である VE-821 処理により低下した。
この結果より，HGEC では ATR が DNA 損傷を認識し，VI 型膠原線維分泌シグナルの誘導分子であることが判明した。
2) 1)で同定した司令塔分子の下流で働く VI 型膠原線維の細胞内輸送分子候補を見出した。28
種類ある膠原線維の中で，VI 型膠原線維だけは分泌前に細胞内で高度な線維体に組み立てら
れ，高分子分泌のための特別な exocytosis 機構により分泌されることが報告されている(Bateman J, Nat Rev Genet 2009)。そして，輸送タンパク質である Annexin A2 が VI 型膠原線維の分泌において中心的な役割を果たすという報告もある (Dassah M, J Cell Sci 2014)。そこで，
DNA 損傷誘発後の細胞内 Annexin A2 の細胞膜移行を免疫蛍光抗体染色により解析した。その結果，Annexin A2 の移行も VI 型膠原線維と同様に VE-821 で阻害されることがわかった。
この結果より，Annexin A2 が DNA 損傷で ATR により活性化されたシグナル下流で VI 型膠原線維を輸送するタンパク質である可能性が示唆された。
（３）培養ヒト近位尿細管上皮細胞における HLA-G 産生の解析：
1) Primary human proximal tubular epithelial cells (Sciencell Research Labo) passage 2-3 をこれまで報告されている誘導因子（サイトカイン：TGF-β，γ-IFN，TNF-α，ホルモン：dexamethasone
and hydrocortisone，progesterone 等）を用いて，HLA-G mRNA の発現誘導因子を確認した。
2) HLA-G 産生について，①培養細胞の免疫蛍光抗体染色，②培養上清および③培養細胞 celllysate の Western blot 法により発現形式を確認した。
3) 生検組織での pTEC 発現と検討１）で確認された至適誘導因子の血清濃度との比較では，
当該誘導因子の測定において十分な感度が得られなかった。
７．研究の考察・反省
今回の移植腎コホート研究により高分子 ADPN による慢性期移植腎障害の抑制と血管保護作用が改めて確認された。更に二重鎖 DNA 障害の修復および虚血再灌流による増悪が急性期移植腎機能障害（グラフト機能発現遅延あるいは無機能腎）の指標として有用である事を見出し論文化した。一方，当初に予定した培養ヒト近位尿細管上皮細胞における HLA-G お
よび ADPN 産生の解析については，各分子の発現条件を確認したのみで十分な機能解析までには至らなかった。今後，適切な機能評価系を用いるとともに生検組織 pTEC 発現例における各誘導因子の濃度測定を工夫する必要がある。
また，In vitro の実験系でヒト糸球体内皮細胞における DNA 損傷を ATR が認識し，Annexin− 15 −

A2 が VI 型膠原線維分泌に関連している可能性を見出した。今後，この結果を細胞老化等のヒト組織における評価とも合わせて検討する必要がある。
８．研 究 発 表
Nomura-Nakayama K, Adachi H, Miyatake N, Hayashi N, Fujimoto K, Yamaya H, Yokoyama H.
High molecular weight adiponectin inhibits vascular calcification in renal allograft recipients. PLoS
One. 2018; 13: e0195066.
Abstract:

BACKGROUND: Adiponectin (ADPN) prevents the development/recurrence of

cardiovascular events via its anti-atherogenic effects.

However, few long-term studies haveexamined the changes in serum ADPN levels and arterial calcification seen in renal allograft
recipients.
SUBJECTS AND METHODS: The effects of the serum ADPN level on arterial calcification were
examined in 51 Japanese renal allograft recipients. Abdominal aorta calcification was evaluated oncomputed tomography using the aortic calcification area index (ACAI). The change in the ACAI
and serum high-molecular-weight (HMW) - ADPN fractions were studied over an 8-year period. The
arterial expression of ADPN, ADPN receptors (AdipoR)1 and 2, and T-cadherin (cadherin-13) werealso examined by immunohistochemistry.
RESULTS: 1) The change in the ACAI were grouped into quartiles and compared with the alterationsin the serum levels of each ADPN fraction over an 8-year period. The change in the ACAI wasmuch lower in the patients with highly elevated HMW-ADPN levels.

2) Multiple regression

analysis demonstrated that an advanced age at transplant and a history of cardiovascularcomplications were associated with an increased change in the ACAI, while higher HMW-ADPN
concentrations were associated with improvements in the ACAI.

Serum HDL-C level was also

identified as a positive factor to increase serum HMW-ADPN level.

3) In immunohistochemical

examinations, ADPN was detected on CD31-positive arterial endothelial cells from renal allograft
biopsy samples. ADPN co-localized with T-cadherin and AdipoR1, but only partially co-localizedwith AdipoR2.
CONCLUSION: Both HMW-ADPN and HDL-C might inhibit the progression of vascular
calcification by promoting ADPN binding to vascular endothelial cells via T-cadherin and AdipoR in
Japanese renal allograft recipients.

− 16 −

１．研究課題名：看護師の Professional QOL の構造－気質，共感性，コーピングスタイルとの関連性（研究番号 C2017-5）
２．キーワード：１）看護師 (nurses)
２）バーンアウト (burnout)
３）抑うつ (depression)４）共感 (empathy)
５）メンタルヘルス (mental health)３．研究代表者：田中 浩二・看護学部・准教授・精神看護学
研究分担者：大江 真人・同志社女子大学看護学部・助教・看護学科（採択時）
池内 里美・看護学部・講師・公衆衛生看護学
山田奈津子・看護学部・助教・成人看護学
北村 佳子・看護学部・講師・成人看護学
新井 里美・看護学部・助教・精神看護学
森河 裕子・看護学部・教授・医科学
紺家千津子・看護学部・教授・成人看護学（採択時）
小幡 光子・看護学部・教授・成人看護学
中島 素子・看護学部・教授・公衆衛生看護学（採択時）
４．研 究 目 的Professional Quality of Life (ProQOL) は，共感満足 (compassion satisfaction；CS)，バーンア
ウト (burnout；BO)，共感疲労 (compassion fatigue；CF) の 3 つのサブスケールからなる援助
職者の QOL を測定する概念である (Stamm, 2010)。1970 年代後半から 1980 年代初頭にかけて，トラウマへの認知とトラウマ犠牲者への介入の必要性が認識されるようになるにつれて，援助者が業務によってクライエントの苦痛の二次的被害を受けていることが明らかにされた。
これは，ケアリングのコストとして認識されるようになった (Figley, 1995)。このような背景の中で，共感による影響を包括的に評価するために ProQOL スケールが開発された (Figley,
1995; Figley & Stamm, 1996; Stamm, 2002, 2010)。ProQOL には，仕事環境の他に，個人の性格やトラウマへの曝露などが関与している (Stamm, 2010)。これまで救急部門やがん看護，精神看護，小児看護，老人看護，人工妊娠中絶ケアなどあらゆる領域で仕事環境や個人の性格との関連から看護師の proQOL が明らかにされている (Mooney et al, 2017; Stacey et al, 2016;
Galiana et al, 2017; Mangoulia et al, 2015; Roney, Acri, 2018; Kolthoff et al, 2017; Mantshi et al,2018) が，看護師がもともともっている気質との関連については着目されていない。気質は，個人のパーソナルキャラクターを形作る基盤になるものであり，看護師の ProQOL に影響を与える重要な要因であると想定した。そこで，本研究では，日本の臨床看護師における気質と ProQOL の関連を明らかにすることを目的とした。

− 17 −

５．研 究 計 画
１）看護師の Pro QOL の構造について，気質との関連性から明らかにする。
２）Pro QOL を構成する看護師の情緒的体験について，質的記述的に明らかにする。
６．研 究 成 果

表1. Demographic characteristics (n=1259)

１）看護師の ProQOL と気質との関連性

N

％

男性
女性

88
1171

㻣
㻥㻟

30歳未満
30－40歳未満
40－50歳未満
50歳以上

475
350
226
208

㻟㻣㻚㻣
㻞㻣㻚㻤
㻝㻤
㻝㻢㻚㻡

10年未満
10－20年未満
20－30年未満
30年以上

608
302
184
165

㻠㻤㻚㻟
㻞㻠
㻝㻠㻚㻢
㻝㻟㻚㻝

一般病棟
救命救急センター
産婦人科病棟
小児科病棟
精神科病棟
外来
手術室
その他

758
34
50
82
46
133
95
61

㻢㻜㻚㻞
㻞㻚㻣
㻠
㻢㻚㻡
㻟㻚㻣
㻝㻜㻚㻢
㻣㻚㻡
㻠㻚㻤

看護専門学校
短期大学
大学
大学院

712
139
377
22

㻡㻢㻚㻢
㻝㻝
㻞㻥㻚㻥
㻝㻚㻣

准看護学校

9

㻜㻚㻣

スタッフ
管理職

1114
145

㻤㻤㻚㻡
㻝㻝㻚㻡

有
無

943
316

㻣㻠㻚㻥
㻞㻡㻚㻝

有
無

225
1034

㻝㻣㻚㻥
㻤㻞㻚㻝

悲観
気分
バリバリ
イライラ
不安

832
807
327
603
315

㻢㻢㻚㻝
㻢㻠㻚㻝
㻞㻢
㻠㻣㻚㻥
㻞㻠㻚㻡

性別

①対象者の属性
表 1 に属性と TEMPS-A の各気質の傾向有の者の人数を示す。サンプルの年代

ほとんどは女性 (93%) であり，年代は30 歳未満 (37.7%) と 30－40 歳未満(27.8%) で 65.5%を占め，経験年数は10 年未満の看護師が 608 人 (48.3%)

経験連数と約半数を占めていた。経験年数の平均 は ， 13.6 ± (11.2) 年 で あ っ た 。
TEMPS の悲観は 832 人 (66.1%)，気分変動は 807 人 (64.1%)，
バリバリは 327所属

人 (26%)，
イライラは 603 人 (47.9%)，
不安は 315 人 (24.5%) にその傾向が認められた。5 つの気質のうち，いずれ
か 1 つ以上を有する者は，1148 人(91.2%) であった。
最終学歴②属性と ProQOL の関係
表 2 に属性と ProQOL の関係を示す。
CS と 関 連 し て い た の は ， 年 齢(p=.000) ， 経 験 年 数 (p=.000) ， 所 属(p=.04) ， 最 終 学 歴 (p=.000) ， 職 位

職位(p=.000)，身内の死別経験 (p=.001) であった。年齢では，30 歳未満に比べて死別経験

他の年齢階級は有意に点数が高く，経験年数でも 10 年未満に比べて他の経験年数は有意に点数が高かった。所属
では，産婦人科病棟は手術室に比べて有意に点数が高かった。
最終学歴では，家族の障害や重篤な疾患

ＴＥＭＰＳ

短大は専門学校や大学に比べて有意に点数が高かった。職位では，管理職者
はスタッフに比べて有意に点数が高か− 18 −

表2. 対象者のcharacteristicsとProQOLの関連
CS

N
mean

BO

SD

a

49.5 ± 9.4
50.0 ± 10.1

.629

b

mean

CF

SD

a

50.2 ±
50.0 ±

9.7
10.3

.835

51.7
49.3
48.7
48.7

±
±
±
±

10.1
10.0
.000***
9.8
9.7

51.1
48.7
50.1
48.1

±
±
±
±

10.0
10.3
.000***
9.4
9.5

50.8
47.3
47.5
48.0
48.1
48.2
53.0
47.1

±
±
±
±
±
±
±
±

10.3
9.3
9.6
7.6
.000***
9.8
8.5
9.5
11.3

49.8
47.5
51.4
46.7
52.0

±
±
±
±
±

9.9
9.7
10.1 .001**
10.0
2.6

E

mean

SD

a

49.4 ±
50.0 ±

10.4
10.0

.598

50.8
49.0
49.2
50.6

±
±
±
±

10.2
10.1
10.0
9.4

.030*

50.5
48.9
49.8
50.5

±
±
±
±

10.3
9.8
10.4
8.5

.127

50.9
44.9
50.8
49.8
46.1
49.2
48.2
49.1

±
±
±
±
±
±
±
±

10.1
9.5
9.2
9.3
9.0
9.6
10.9
9.3

.000***

49.6
49.0
51.0
49.8
53.8

±
±
±
±
±

10.0
9.3
10.2
9.4
10.8

.106

E

性別
男性
88
女性 1171年代
30歳未満
30－40歳未満
40－50歳未満
50歳以上

475
350
226
208

48.1
50.0
52.3
51.9

± 10.2± 10.2.000***
± 8.9
± 9.5

.029***

10年未満
10－20年未満
20－30年未満
30年以上

608
302
184
165

48.6
50.5
51.6
52.5

± 10.1± 10.3.000***
± 8.8
± 9.6

.003**

一般病棟
救命救急センター
産婦人科病棟
小児科病棟
精神科病棟
外来
手術室
その他

758
34
50
82
46
133
95
61

49.7 ± 10.3
50.3 ± 7.2
54.3 ± 9.5
50.8 ± 8.9
50.1 ± 9.0
50.6 ± 9.9
48.0 ± 10.7
50.7 ± 8.7

最終学歴
看護専門学校
短期大学
大学
大学院
准看護学校

712
139
377
22
9

50.0
52.9
48.8
54.6
48.1

.045*

.004**.001**.002**.054

経験連数.004**.003**

所属

属
性
要
因

.04*

.01*

± 9.8
± 9.9
± 10.1 .000***± 11.2
± 7.0

.017*

.046*
.0.23*.01*.009*.001**

.018*
.047*

職位
スタッフ 1114
管理職 14549.5 ± 10.0.000***
54.1 ± 9.1

50.2 ±
48.4 ±

10.1
9.3

.044*

50.1 ±
49.5 ±

10.0
9.8

.492

50.6 ± 10.0.001**
48.3 ± 9.9

49.8 ±
50.6 ±

10.2
9.3

.194

50.3 ±
49.2 ±

10.0
10.1

.112

身内の死別経験
有
無

943
316

家族の障害や重篤な疾患
有 225
無 103450.5 ± 10.3
49.9 ± 9.9.41950.7 ± 10.6
52.3 ± 10.0.253.000***
49.9 ±
9.9
49.5 ± 10.0a; 一元配置分散分析
b; 一元配置分散分析で有意差のみられたものにBonferroni検定を実施した。
* p<.05 ** p<.01 *** p<.001

った。身内の死別経験がある人は，無い人と比較して有意に点数が高かった。
BO と関連していたのは，年齢 (p=.000)，経験年数 (p=.000)，所属 (p=.000)，最終学歴(p=.001)，職位 (p=.045) であった。年齢では，30 歳未満は他の年齢階級に比べて有意に点数が高く，経験年数でも 10 年未満は 10 年～20 年未満および 30 年以上と比べて有意に点数が高かった。所属では，手術室は産婦人科病棟，小児科病棟，外来と比べて有意に点数が高かった。最終学歴では，大学は短大に比べて有意に点数が高かった。職位では，スタッフは管理職者と比較して有意に点数が高かった。
CF と関連していたのは，年齢 (p=.030)，所属 (p=.001)，家族の障害や重篤な疾患の有無(p=.000) であった。所属では，一般病棟は救命救急看護，精神科病棟と比べて有意に点数が高かった。家族に障害や重篤な疾患がある人は，無い人に比べて有意に点数が高かった。

− 19 −

表3 TEMPSとProQOLの関連（経験年数10年未満群）（n = 608）

CS
mean
悲観
T
E
M
P
S

有
無
気分
有
無
バリバリ 有無イライラ 有
無
不安
有
無

51.5
54.9
51.2
54.1
56.7
51.0
50.2
54.0
50.2
53.8

BO
SD

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

9.7
10.4
10.1
9.8
10.5
9.5
10.0
9.7
10.3
9.8

ｐ
a)

mean

.000 ***

49.7
41.8
50.1
43.7
43.4
48.2
51.4
44.6
52.4
44.2

.001 **.000 ***.000 ***.000 ***

SD
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

9.6
8.6
9.9
8.9
10.5
9.5
9.9
8.8
10.3
8.9

CF
ｐ
b)
.000 ***.000 ***.000 ***.000 ***.000 ***

mean

SD

52.1
47.3
52.8
46.0
51.8
50.0
53.7
48.2
57.6
47.8

± 10.2
± 9.8
± 9.8
± 9.9
± 10.7± 10.1± 10.3
± 9.6
± 9.9
± 9.2

ｐ
c)
.000 ***.000 ***.059.000 ***.000 **** p<.05 ** p<.01 *** p<.001a) 共変量: 性別、所属、最終学歴、職位、死別経験の有無b) 共変量: 性別、所属、最終学歴、職位c) 共変量: 性別、所属、家族の障害や重篤な疾患の有無

表4 TEMPSとProQOLの関連（経験年数10年以上群）（n = 651）
CS
mean
悲観
T
E
M
P
S

有
無
気分
有
無
バリバリ 有無イライラ 有
無
不安
有
無

51.0
52.2
51.2
51.9
55.5
49.7
50.5
52.0
50.5
51.7

BO
SD

±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

9.9
9.4
10.4
8.7
9.9
9.3
10.7
8.8
11.3
9.3

ｐ
a)

mean

.146
.362
.000 ***.041 *
.188

51.1
45.2
51.4
45.4
46.4
50.1
52.7
46.5
54.1
47.3

SD
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±

9.4
9.5
9.6
9.1
9.7
9.8
9.3
9.4
10.0
9.3

CF
ｐ
b)
.000 ***.000 ***.000 ***.000 ***.000 ***

mean

SD

51.5
45.4
52.0
44.9
49.8
49.1
52.2
47.2
56.3
47.0

± 9.8
± 8.1
± 9.9
± 7.8
± 9.6
± 9.8
± 10.0
± 8.8
± 9.7
± 8.6

ｐ
c)
.000 ***.000 ***.380.000 ***.000 **** p<.05 ** p<.01 *** p<.001a) 共変量: 性別、経験年数、所属、最終学歴、職位、死別経験の有無b) 共変量: 性別、経験年数、所属、最終学歴、職位c) 共変量: 性別、経験年数、所属、家族の障害や重篤な疾患の有無③気質と ProQOL の関係
経験年数 10 年未満群と 10 年以上群で対象者の層化を行ったうえで TEMPS と ProQOLとの関連を分析した。一元配置分散分析の結果，若手層とベテラン層で CS, BO の得点に有意な違いがあったこと，看護実践では経験年数が個人や集団の特徴を現わすうえでの指標としてよく使われることから，経験年数で層化して共分散分析を行った。
表 3 に経験年数 10 年未満の者の TEMPS と ProQOL の関連を分析した結果を示す。CS
得点は，性別，所属，最終学歴，職員，身内の死別経験を配慮しても，悲観傾向有, 気分
変動傾向有, イライラ傾向有, 不安傾向有が，各傾向無より有意に低く，バリバリ傾向有が傾向無より有意に高く示された。BO 得点は，性別，所属，最終学歴，職位を配慮して− 20 −

も，悲観傾向有, 気分変動傾向有, イライラ傾向有, 不安傾向有が，各傾向無より有意に高く，バリバリの傾向有は傾向無より有意に低く示された。CF 得点は，性別，所属，家族の障害や重篤な疾患の有無を配慮しても悲観傾向有, 気分変動傾向有, イライラ傾向有, 不安傾向有が，各傾向無より有意に高く示された。
表 4 に経験年数 10 年以上の者の TEMPS と ProQOL の関連を分析した結果を示す。CS
得点は，性別，経験年数，所属，最終学歴，職員，身内の死別経験を配慮してもイライラ
傾向有が傾向無より有意に低く，バリバリ傾向有が傾向無より有意に高く示された。悲観,
気分変動, 不安の各傾向の有無で CS 得点に有意な関連はみられなかった。BO 得点は，性別，経験年数，所属，最終学歴，職位を配慮しても，悲観傾向有, 気分変動傾向有, イラ
イラ傾向有, 不安傾向有が，各傾向無より有意に高く，バリバリの傾向有は傾向無より有意に低く示された。CF 得点は，性別，経験年数，所属，家族の障害や重篤な疾患の有無を配慮しても悲観傾向有, 気分変動傾向有, イライラ傾向有, 不安傾向有が，各傾向無より有意に高く示された。
２）Pro QOL を構成する看護師の情緒的体験
23 名の看護師に半構成的インタビューを実施した。看護師は，共感満足のみならず，共感
疲労やバーンアウトにつながるような情緒的体験が忘れられない記憶として残されており，
それが看護師として働き続けるための原動力や覚悟となっていた。看護師自身のライフヒス
トリーに基づく，ProQOL については，現在分析中である。
７．研究の考察・反省
看護師の気質と ProQOL の関連については，以下のような興味深い現象をみとめた。前述のように ProQOL には若手層とベテラン層で有意な違いがあったことから，経験年数 10 年未
満群と 10 年以上群で層化して，各 Temperaments との関連について，共分散分析を行った。
経験年数 10 年未満群において，悲観, 気分変動, イライラ, 不安の各傾向有は，傾向無に比較して有意に CS が低く，BO と CF が有意に高かった。これは，バリバリを除く 4 つの気質とうつ症状との相関が有意であったとする看護師を対象とした先行研究 (Kikuchi et al, 2014)の結果と類似している。
また本研究結果では悲観, 気分変動の各傾向有の看護師が 6 割以上，
イライラ傾向有の看護師が約 5 割と高かった。これらのことから，総合病院の看護師に対するメンタルヘルスでは悲観, 気分変動, イライラ, 不安の傾向に着目した対策が重要であろう。TEMPS‐A 日本語版において，イライラは，悲観，気分変動，不安と有意な相関を示しており，バリバリ気質は，他の気質と相関がなく，独立している (Matsumoto, 2005) ことが報告されている。本研究結果からも，悲観, 気分変動, イライラ, 不安は根本的に同質である
ことが考えられよう。一方，興味深いことにバリバリの傾向有群は，無群と比較して有意にCS が高く，BO は低かったが，CF に有意差はなかった。このことから，バリバリの傾向有の人は，共感による疲労を体験しても，満足を体験する力が高いことから，バーンアウトが低くなっていることが考えられた。ゆえにバリバリは看護師のメンタルヘルスに対して保護的に働いているといえよう。また興味深いことに，経験年数 10 年以上群では，BO と CF は

− 21 −

10 年未満群と同じ結果であったが，CS の結果は異なっていた。経験年数 10 年未満群における悲観, 気分変動, 不安の各傾向有は，傾向無と比較して有意に CS が低かったが，経験年数
10 年以上群においては，傾向有と傾向無で CS の有意な関連はみられなかった。すなわち，悲観, 気分変動, 不安の各傾向有は，傾向無に比較して BO や CF のリスクが高いが，一方では CS に両者の差はなかったことから，共感による疲労はしていても，同時に満足する機会も増えていることが考えられた。このことは，経験年数の増加が compassion による満足体験の増加につながったのか，あるいは疲労はしていても満足も体験できている看護師が 10 年以上勤続できているのか分からないが，Cohen et al (2017) が CS は CF のマイナス面を軽減しうることを述べているように，いずれにしても，経験年数は悲観, 気分変動, 不安の影響を緩衝する作用があることが考えられた。
８．研 究 発 表
期間中に，成果発表をすることができなかった。研究１（横断調査），研究２（質的調査）
ともに分析途中の段階である。

− 22 −

平成  年度



奨励研究成果報告書
医 学 領 域 5～      

１．研究課題名：糖尿病腎の解糖系が演じる病理的意義の解明（研究番号 S2017-1）

２．キーワード：１）糖尿病 (diabetes)
２）腎臓線維化 (kidney fibrosis)
３）解糖系 (glycolysis)
４）Warburg 効果 (Warburg effect)３．研究者氏名：金﨑 啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学（採択時）
４．研 究 目 的
腎臓はエネルギー出納，特に糖代謝においても重要な役割を演じる。尿からの糖再吸収，糖新生，及び糖利用も行われるが，その詳細な分子機構は未だ不明な点も多い。その中で近位尿細管における解糖系の演じる病的意義に関しては未だに，その存在自体が活発な debate
topic と認識される。予備的検討で糖尿病腎尿細管における異常な解糖系活性化，培養細胞における epithelial mesenchymal transition (EMT) が解糖系の阻害により抑制されることを見出だした。これらの結果は糖尿病腎における過剰な解糖系の抑制が，EMT program を抑制する
ことにより新たな治療戦略となる可能性を示唆する。今回の検討により，今まで明らかでなかった腎臓近位尿細管における解糖系の病理学的意義を明らかにする。
５．研 究 計 画
今回の検討では，腎臓線維化を惹起しやすい系統である CD-1 マウスを用いて１型糖尿病
モデル動物を作成し，線維化の程度，線維芽細胞多様性と解糖系活性化の相関，および解糖系阻害薬投与との相関を解析した。さらに異常解糖系惹起の分子機構を追求するため，ヒト
近位尿細管培養細胞（HK-2 細胞）を用いて検討を行った。特に今回の解析では，癌の異常
解糖系 Warburg 効果に対して誘導効果を有する HIF-1と HIF-1 を抑制する働きを有する
NAD-dependent deacetylase Sirt3, さらにピルビン酸の乳酸への代謝を促進し，ミトコンドリアの機能異常を惹起すると考えられるピルビン酸キナーゼ (PKM) 2 の機能異常に関して注目して解析した。
６．研 究 成 果
歴史的には腎，特に近位尿細管においてエネルギー代謝の中心は脂肪酸酸化 (FAO) であり，解糖系活性はないかあっても極めて低いと考えられてきた。しかしながらこれらの根拠は，著しい実験系の限界が存在した 1960〜70 年代の報告を踏襲しており，近年の研究や我々の予備的検討の結果を説明するに満足できるものではない。今回の申請においては，「糖尿病腎における異常解糖系活性化が治療標的となる」という新たな仮説を証明することが主たる目標であった。

− 23 −

1) STZ 糖尿病腎（糖尿病誘導 6 ヶ月後）において，線維化が生じやすい CD-1 系統では線維化が生じにくい C57BL６系統に比して，近位尿細管における Sirt3 が抑制されていた。Sirt1は抑制されなかった。
2) Sirt3 siRNA の in vivo 投与ノックダウンにより，より早期に糖尿病腎臓線維化が進行した。
3) これら STZ-誘導糖尿病 CD-1 マウス，Sirt3 siRNA 投与糖尿病腎の線維化は EMT 誘導，
異常解糖系酵素の発現増加を伴った。
4) そのような異常解糖系活性化は，STZ 誘導糖尿病マウスのみではなく，自然発症１型糖尿病 KK/Ta-Ins2Akita マウスにおいても同様の変化が認められた。
5) 異常解糖系抑制効果を有する 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) および dichloroacetic acid (DCA)
投与は STZ-誘導糖尿病 CD-1 マウスにおける腎線維化を抑制した。
6) 培養 HK-2 細胞において TGF-１刺激は Sirt3 を抑制し，Sirt3 抑制は PKM2 dimer 形成とHIF-1異常集積依存的に EMT を誘導した。
## これらのデータはすでに研究発表 8-①論文 (Srivastava et al 2018) にて公表している。
７．研究の考察・反省
癌研究領域において癌細胞における好気性解糖 (Warburg Effect) の演じる役割の解析により，癌細胞が解糖系を用いて腫瘍増大・血管新生・免疫逃避機構 etc.を効率よく実現していることが近年明らかとなってきた。
その代謝の特徴は原発臓器の代謝とは全く異なっており，
代謝改変の病理学的意義は各臓器，状態により異なるものと考えられる。
腎臓近位尿細管において解糖系活性は極めて弱いと考えられてきたが，通常は極めて弱い
解糖系が糖尿病マウス腎において異常に活性化しており，その異常解糖系が腎線維化の維持に寄与していると考えられていた。これらの発見は，今まで積極的な再検証なきまま既成事実化して捉えられてきた「近位尿細管に解糖系は存在しない」という通説に対して疑義を呈するとともに手法を変更した新たな解析の重要性をも示唆している。
現在，この解糖系を標的とした治療戦略を考案中である。
８．研 究 発 表
① Srivastava SP, Li J, Kitada M, Fujita H, Yamada Y, Goodwin JE, Kanasaki K, Koya D. SIRT3
deficiency leads to induction of abnormal glycolysis in diabetic kidney with fibrosis. Cell Death Dis
2018; 9: 997.
Abstract: The regulation of aberrant glucose metabolism in diabetes associated-kidney fibrosis is
not well known. In this study we found the suppression of SIRT3 protein level in diabetic kidney,
displays responsibility in fibrogenic programming associated with aberrant glycolysis and suchabnormal glycolysis is the therapeutic target in diabetes associated-kidney fibrosis. When analyzing
different strains of streptozotocin-induced diabetic mice model (fibrotic model: CD-1, less fibrotic
model: C57Bl6), we found SIRT3 suppression was associated with kidney fibrosis in fibrotic CD-1;− 24 −

further SIRT3 suppression by systemic administration of SIRT3 siRNA in the diabetic mice, showed
profound fibrogenic phenotype in the kidney. Such suppression in SIRT3 was associated with theinduction of transforming growth factor-β (TGF-β)/smad signaling, higher level of HIF1α
accumulation and PKM2 dimer formation; these alterations subsequently led to abnormal glycolysis
and linked abnormal mesenchymal transformations in vivo and in vitro. Inhibition of such aberrant
glycolysis suppressed fibrogenic programming and restored SIRT3 level as well. Such aberrant
glycolysis was confirmed in the KK/Ta-Ins2Akita mouse, the mouse model of progressive diabetic
kidney disease. These data demonstrate that SIRT3 deficiency promotes abnormal glycolysis which is
responsible for the fibrogenic pathway in diabetic kidney. Restoration of SIRT3 could be analternative strategy in combating diabetes associated-kidney fibrosis via inhibition of aberrant
glycolysis.
② Yang F, Takagaki Y, Yoshitomi Y, Ikeda T, Li J, Kitada M, Kumagai A, Kawakita E, Shi S, Kanasaki
K, Koya D. Inhibition of Dipeptidyl Peptidase-4 Accelerates Epithelial-Mesenchymal Transition andBreast Cancer Metastasis via the CXCL12/CXCR4/mTOR Axis. Cancer Res 2019; 79: 735-746.
Abstract:

Dipeptidyl peptidase (DPP)-4 is a multifunctional glycoprotein involved in various

biological and pathologic processes. DPP-4 has been widely recognized as a therapeutic target for
type 2 diabetes mellitus but is also implicated in the development of human malignancies. Here, weshow that inhibition of DPP-4 accelerates breast cancer metastasis via induction of CXCL12/CXCR4,
which activates mTOR to promote epithelial-mesenchymal transition (EMT). In cultured cells, DPP-4
knockdown induced EMT and cell migration. Treatment with the DPP-4 inhibitor KR62436 (KR)promoted primary tumor growth and lung metastasis in a 4T1 tumor allograft mouse model; DPP-4
knockdown in 4T1 cells displayed similar phenotypes in vivo and in vitro. KR treatment enhanced thelevels of CXCL12/CXCR4 and phosphorylated mTOR, which were associated with the induction of
EMT in metastatic cancer cells. KR-induced EMT in cancer cells was inhibited by treatment with the
CXCR4 inhibitor AMD3100 or the mTOR inhibitor rapamycin, and AMD3100 suppressed
KR-induced metastasis in vivo. Our findings suggest that DPP-4 plays a significant role in cancer
biology and that inhibition of DPP-4 promotes cancer metastasis via induction of the
CXCL12/CXCR4/mTOR/EMT axis. SIGNIFICANCE: These findings reveal that inhibition of DPP-4
increases the metastatic potential of breast cancer. This is especially important given the potential useof DPP-4 inhibition as a therapeutic strategy for type 2 diabetes.
③ Gao R, Kanasaki K, Li J, Kitada M, Okazaki T, Koya D. βklotho is essential for the anti-endothelial
mesenchymal transition effects of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline. FEBS Open Bio 2019; 9:1029-1038.
Abstract: Endothelial-mesenchymal transition (EndMT) has emerged as an essential bioprocess
responsible for the development of organ fibrosis. We have previously reported that fibroblast growth− 25 −

factor receptor 1 (FGFR1) is involved in the anti-EndMT effect of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline(AcSDKP). FGFR1 is expressed on the cell membrane and performs its biological function throughinteraction with co-receptors, including βklotho (KLB). However, it remains unknown whether KLB
is involved in the anti-EndMT effects of AcSDKP. Here, we demonstrated that AcSDKP increased
KLB expression in an FGFR1-dependent manner and that KLB deficiency induced AcSDKP-resistant
EndMT via the induction of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. In cultured
endothelial cells, AcSDKP increased KLB protein level in an FGFR1-dependent manner throughinduction of the FGFR1-KLB complex. KLB suppression by small interfering RNA transfection did
not affect FGFR1 levels and resulted in the induction of EndMT. In contrast to the EndMT observed
under FGFR1 deficiency, the EndMT induced by KLB suppression was not accompanied by the
induction of Smad3 phosphorylation; instead, KLB-deficient cells exhibited induced activation of the
MAPK/extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase (MEK) and ERK pathways. Treatment
with the specific MEK inhibitor U0126 diminished KLB deficiency-induced EndMT. Consistent withthis finding, AcSDKP did not suppress either EndMT or MEK/ERK activation induced by KLB
deficiency. Application of either FGF19 or FGF21 synergistically augmented the anti-EndMT effectsof AcSDKP. Taken together, these results indicate that endogenous peptide AcSDKP exerts its activity
through induction of the FGFR1-KLB complex in vascular endothelial cells.
④ Takagaki Y, Shi S, Katoh M, Kitada M, Kanasaki K, Koya D. Dipeptidyl peptidase-4 plays apathogenic role in BSA-induced kidney injury in diabetic mice. Sci Rep 2019; 9: 7519.
Abstract:

Diabetic kidney disease (DKD) is appeared to be higher risk of declining kidney

function compared to non-diabetic kidney disease with same magnitude of albuminuria.
Epithelial-mesenchymal transition (EMT) program of tubular epithelial cells (TECs) could be
important for the production of the extracellular matrix in the kidney. Caveolin-1 (CAV1), dipeptidyl
peptidase-4 (DPP-4) and integrin β1 have shown to be involved in EMT program. Here, we founddiabetic kidney is prone for albuminuria-induced TECs damage and DPP-4 plays a vital role in suchparenchymal damages in diabetic mice. The bovine serum albumin (BSA) injection induced severe
TECs damage and altered expression levels of DPP-4, integrin β1, CAV1, and EMT programs
including relevant microRNAs in type 1 diabetic CD-1 mice when compared to non-diabetic mice;teneligliptin (TENE) ameliorated these alterations. TENE suppressed the close proximity among
DPP-4, integrin β1 and CAV1 in a culture of HK-2 cells. These findings suggest that DPP-4 inhibition
can be relevant for combating proteinuric DKD by targeting the EMT program induced by thecrosstalk among DPP-4, integrin β1 and CAV1.

− 26 −

１．研究課題名：Saffold ウイルスの未知なる蛋白 Large Leader の発現機序解析（研究番号 S2017-2）
２．キーワード：１）Saffold ウイルス (Saffold virus, SAFV)２）Leader 蛋白 (leader protein)３）非構造蛋白 (non-capsid protein)
３．研究者氏名：姫田 敏樹・医学部・准教授・微生物学
４．研 究 目 的
Saffold ウイルス (SAFV) は，主に小児の急性胃腸炎や急性上気道炎から検出されるピコ
ルナウイルス科のウイルスである。申請者らはこれまでに，髄膜炎患者髄液からの SAFV 分離を報告し，さらに，持続感染しうることを報告した。また，同種同属に分類されるタイラーウイルス (TMEV) も持続感染するが，ウイルスポリ蛋白とは異なる読み枠で合成される
L*蛋白と，ポリ蛋白の一部である Leader 蛋白のふたつの非構造蛋白が重要な役割を担っていることを明らかにした。しかし，SAFV では TMEV の L*に相当する蛋白は合成されず，持続感染に寄与するウイルス蛋白は不明である。申請者らは，ポリ蛋白の開始コドンより上流に同フレームで存在する開始コドンと終始コドンに着目し発現系を用いて解析したところ，終始コドンが読み飛ばされ異なるサイズの未知の蛋白 (Large-Leader, LL) が合成されることを見出した。さらに，この LL の開始コドンの可能性のある 5 つの AUG を変異させて LL の開始コドン同定を試みたところ，LL は非 AUG コドン由来である可能性が示された。そこで本
研究では，効率的なウイルス増殖に関わるウイルス側因子のひとつとして，この新たに見つかった LL に注目し，LL が持続感染に及ぼす影響を明らかにすることを目指した。
５．研 究 計 画
これまでに 3xFLAG tag を C 末端に付加して行った発現系による予備的解析で，LL 蛋白
は，ポリ蛋白（通常の Leader 蛋白はポリ蛋白の N 末端の蛋白である）の開始コドン (1042
AUG) と同じフレームでより上流から，かつ，910nt，934nt，979nt に存在する終始コドンを
read through して合成されることが示唆された。しかし，同フレームに存在する 5 つの AUG(664，868，904，949，955nt) および 775CUG に変異を導入してもその発現が消失することはなく，LL 蛋白は非 AUG コドンからの翻訳により合成されている可能性が強く示された。
そこで，3xFLAG 標識 LL 蛋白を抗 FLAG 抗体を用いて免疫沈降 (IP) し，電気泳動にて分離
後 PVDF 膜に転写したものを Edman 分解法に供することで，LL 蛋白の N 末端のアミノ酸 5残基の配列を決定することから開始コドンを同定する。N 末端ブロックされている場合は，
IP 精製した LL 蛋白を Trypsin に加えて，
Asp-N，
Asp-N + Glu-C などの protease で in-gel digestion
を行い，それぞれの方法で作出されるペプチド試料を用いて LC-MS/MS 測定を行う。得られた MS/MS スペクトルから，予想されるアミノ酸配列のみを含む自作のデータベースに対− 27 −

して検索を行い，マッチしたペプチドの配列を調べ最も N 末側の配列にヒットしたペプチドから N 末端を推定する。
後者の方法は，新潟大学大学院医歯学総合研究科 腎研究センター 腎構造病理学分野 研究推進機構共用設備基盤センターの吉田豊先生にご協力いただく。
また，ピコルナウイルスの IRES 依存的翻訳では，開始コドンを含むかまたはその上流の領域にリボソーム結合部位として Yn-Xm-AUG motif が存在することが知られている。SAFVにおいてもポリ蛋白の開始コドン上流には４つの Yn-Xm-AUG motif 様の配列が存在している。しかし，LL 蛋白については開始コドンが不明のため Yn-Xm-AUG motif の関与が全く不明である。したがって，開始コドンが同定された後に，該当する Yn-Xm-AUG motif があるのかどうか，また，非 AUG コドンによる翻訳がそのモチーフに依存するのか否かについて，
コンピューター解析および変異導入実験により解析する。
６．研 究 成 果
本研究では，SAFV と関連疾患の因果関係を明らかにすることを最終目的とし，効率的なウイルス増殖に関わるウイルス側および宿主側因子を同定することを目指した。
SAFV ポリ蛋白の IRES 依存的翻訳では，904nt に存在する AUG がリボソーム結合部位として機能し 1042nt に存在する AUG が翻訳開始点として利用されることを明らかにした。しかし，ポリ蛋白開始コドンより上流の非 AUG から翻訳されるサイズの大きい LL 蛋白については，Edman 分解法および LC-MS/MS のいずれにおいても N 末端配列を同定することは出来なかった。また，LL 蛋白は，ウイルス感染時および感染性 RNA 導入時には検出することが出来ず，発現プラスミドを用いた実験系でのみ起こるアーティファクトである可能性が示唆された。これらの理由より，LL 蛋白についての詳細な解析は中止した。
そこで，ウイルス増殖に関わる宿主側の候補分子として注目していた脱ユビキチン化酵素
USP10 について，SAFV の感染・増殖への関与を解析した。その結果，USP10 ノックダウン(KD) 細胞において SAFV 感受性が亢進することが明らかとなった。さらに，USP10 の変異体によるレスキュー実験では，USP10 の G3BP1 結合部位を含む N 末領域を欠損させた
USP10-delN の発現においては，USP10 KD 細胞における SAFV 感受性亢進を抑制することは出来ず，また，USP10 の脱ユビキチン化活性を欠如させた USP10-C418A 変異体では，SAFV
感受性亢進を一部抑制するものの完全に回復させることは出来なかった。これらのことから，
USP10 は SAFV 感染に抑制的に機能し，それには N 末領域が重要であることが示唆された。
そこで，USP10 結合蛋白である G3BP1 をノックダウンしたところ SAFV 感受性は著しく亢
進し，USP10 の SAFV 増殖に対する抑制作用は G3BP1 を介していることが示された。
７．研究の考察・反省
実験計画当初に注目していた LL 蛋白については，特定の実験条件下でのみ発現する蛋白であり，自然条件下でのウイルス感染時には発現しない蛋白である可能性が強く示唆されたため，実験計画を変更することとした。申請者らは，ウイルス増殖に関わるウイルス側因子として LL 蛋白に，宿主側因子として USP10 に注目していたことから，LL 蛋白の解析を中− 28 −

止し，USP10 のウイルス感染に及ぼす影響を解析した。
一部のピコルナウイルス感染において，G3BP1 は，ストレス顆粒の形成や IRES への結合によるウイルスゲノム複製阻害等に関与する感染応答分子として報告されている。本研究結果からは，USP10 の SAFV 増殖抑制作用は G3BP1 を介したものであることが示唆されたことから，USP10 はウイルス感染応答を制御するマスター因子である可能性が考えられた。これらのより詳細な機序解明は，効率的ウイルス分離法の開発に繋がり，コッホの原則を満たした関連疾患との因果関係の証明を可能にすることが期待される。
８．研 究 発 表
該当なし

− 29 −

１．研究課題名：統合失調症における認知機能障害の全ゲノム関連解析（研究番号 S2017-3）
２．キーワード：１）統合失調症 (schizophrenia)
２）認知機能障害 (cognitive impairments)
３）知的機能低下 (intellectual decline)４）非罹患近親者 (unaffected relatives)
５）全ゲノム関連解析 (genome wide association study)
３．研究者氏名：康山 俊樹・医学部・助教・精神神経科学（採択時）
４．研 究 目 的統合失調症は，臨床的にも遺伝的に異種性を示す複雑でありふれた精神障害である。また，
家族集積性があり，遺伝率 80%の多因子遺伝を示す精神障害である。この異種性を軽減する
ために，統合失調症という診断よりも疾患の中核症状である認知機能障害が中間表現型として注目されている。統合失調症の認知機能障害には，注意機能，実行機能および言語流暢性などが含まれ，その障害は，患者だけでなく近親者にも認められ家族集積性があり，遺伝率
30–80%を示すことから，統合失調症と同様に遺伝要因が関わり，双方に共通する遺伝基盤が示唆されている。数百万もの遺伝子多型 (SNP) を同時に調べる全ゲノム関連解析 (GWAS)
は，疾患に関わる SNP を同定するための強力な解析手法であり，様々な common disease の遺伝機構の解明目的で用いられている。これまでに世界中からサンプルを集め行われた統合失調症の大規模 GWAS では，108 個のゲノム座位が同定されている (Nature. 2014)。同様に，健常者における認知機能の大規模 GWAS でも，2 個のゲノム座位を同定され，遺伝的共通性を支持している (Mol Psychiatry. 2017)。しかし，これらは欧米人を主に対象としたため，アジア人も同様に遺伝的共通性を示すかは不明である。
統合失調症の非罹患第 1 度近親者は，罹患期間，疾患重症度および服薬の影響を受けず，患者の半分の遺伝的リスクを有することから，統合失調症にて障害される認知機能や脳構造/機能などの中間表現型 (Biotype, Intermediate Phenotype) との関連の検討に有用である。これまでの認知機能の GWAS では，対象者に患者だけでなく非罹患第 1 度近親者を含めた研究はほとんどない。
本研究では，統合失調症患者，非罹患第 1 度近親者および健常者間における認知機能を検討する。3 群間で異なる認知機能や統合失調症に特異的な認知機能障害を同定し，同被験者より採取した血液サンプルより DNA，RNA および血漿を抽出して，統合失調症の認知機能障害に関わる分子遺伝基盤を解明することを目的とする。
５．研 究 計 画
対象：精神神経科・総合医学研究所 大井一高講師，精神神経科 嶋田貴充助教らと共に統合失調症患者，非罹患第 1 度近親者および健常者を対象とした Biotype を用いたゲノム研究− 31 −

「SNARP: Schizophrenia Non-Affective Relative research Project」を遂行しており，対象者のリクルートを継続している。これまでに患者 200 例，非罹患第 1 度近親者 100 例，健常者 150
例をリクルートしている。
認知機能：(i) 病前推定 IQ，(ⅱ) 現在の IQ，および (ⅲ) Intellectual Decline という３つの知
能 Biotype を評価する。(i) 病前推定 IQ は，JART (Japanese Adult Reading Test) にて評価する。
(ⅱ) 現在の IQ は，WAIS-Ⅲ (Wechsler Adult Intelligence Scale-Ⅲ) にて知能全般を評価する。
(ⅲ) Intellectual Decline は，WAIS-Ⅲの全検査 IQ と JART にて評価した病前推定知能の差分である。これらは，陽性・陰性症状とは独立しており，統合失調症患者の社会機能，QoL および転帰などに関わる重要な因子である。
ジェノタイピング：DNA は，研究協力者の東京都医学総合研究所 池田和隆プロジェクトリー
ダー，
西澤大輔主席研究員により Illumina GWAS アレイチップ (Infinium OmniExpressExome-8
v1.4 Kit) を用いて全ゲノムのジェノタイピングを行っている。現在，次世代シーケンサーによる Whole Genome Sequencing が普及してきているが，多数のサンプルのタイピングを行うには膨大な費用を要するため，本研究では GWAS アレイを用いる。また，血中の BDNF を測定している。患者，非罹患第 1 度近親者および健常者の全ゲノムのジェノタイピング，血中の BDNF データを用いて，統合失調症の認知機能障害に関わる分子遺伝基盤を解明する。
６．研 究 成 果
金沢医科大学精神神経科学にて遂行中の SNARP よりリクルートした 125 例の統合失調症
患者，61 例の非罹患第 1 度近親者および 107 例の健常者間で (i) 病前推定 IQ，(ⅱ) 現在のIQ，および (ⅲ) Intellectual Decline を評価した。さらに，対象者を Intellectual Decline の程度に基づいて，知的機能が低下している Deteriorated 群と知的機能が保たれている Preserved 群に分類して，どのような要因がこの分類に寄与しているかを検討した。
病前推定 IQ，現在の IQ
ともに統合失調症患者，非罹患近親者および健常者群間で差異を認めた（右図）。
健常者と比べて，統合失調症患者と非罹患第 1 度近親者では，病前 IQ と現在のIQ は共に低値を示した。統合失調症患者と非罹患第 1
度近親者間では，病前 IQに差異を認めなかったが，現在の IQ は，非罹患第 1
度近親者と比べて統合失調症患者において低値を示し− 32 −

た。また，統合失調症患者群のみ病前 IQ からの低下である Intellectual Decline を認めた。
非罹患第 1 度近親者と健常者の大部分は，Intellectual Decline を認めなかったため，非罹患
第 1 度近親者と健常者群では，知的機能が低下している Deteriorated 群に分類される人は，ほとんどいなかった。統合失調症患者と非罹患第 1 度近親者群において，知的機能が保たれている Preserved 群は，知的機能が低下している Deteriorated 群よりも，高い教育年数を示した。
７．研究の考察・反省
本研究結果から，統合失調症患者や非罹患第 1 度近親者における病前知的機能レベルの障害は発症前から存在し，引き続いて起こる知的機能の低下は，統合失調症の発症時期周辺に生じることが示唆された。病前知的機能障害と発症時/後の知的機能の低下には，それぞれ異なる病態が関わっている可能性がある。今後，(i) 病前推定 IQ，(ⅱ) 現在の IQ，(ⅲ) Intellectual
Decline という表現型について，統合失調症患者，非罹患第 1 度近親者および健常者においてGWAS を行い，統合失調症の認知機能障害に関わる分子遺伝基盤を解明していく。
本研究の反省点としては，より有用な認知機能の表現型の抽出に時間を要して，期間内に統合失調症の認知機能障害の GWAS 解析まで至らなかった点が挙げられる。しかし，本研究対象者のジェノタイピングは完了しており，現在，ジェノタイピングデータの Quality Controlを遂行中であるため，今年度中には既存のサンプルにおける認知機能障害の GWAS をまとめていく予定である。
８．研 究 発 表
Ohi K, Shimada T, Kataoka Y, Koide Y, Yasuyama T, Uehara T, Okubo H, Kawasaki Y. Intelligence
decline between present and premorbid IQ in schizophrenia: Schizophrenia Non-Affected Relative
Project (SNARP). Eur Neuropsychopharmacol 2019; 29: 653-661.
Abstract: Schizophrenia patients (SCZ) display widespread cognitive deficits that are strongly
associated with functional outcomes. Cognitive impairments occur along a genetic continuum among
SCZ, their unaffected first-degree relatives (FRs) and healthy controls (HCs). Although SCZ impairs
the premorbid intelligence quotient (IQ) and causes a subsequent intelligence decline (ID), a decreasein present IQ from the premorbid level, it remains unclear when during the illness course these
impairments develop. Differences in premorbid and present IQ and ID were investigated among 125
SCZ, 61 FRs and 107 HCs, using analysis of covariance and a paired t-test. Furthermore, thesesubjects were classified into preserved and deteriorated IQ groups based on the degree of ID, and weinvestigated which factors contribute to this classification. We found significant differences inpremorbid and present IQ among the diagnostic groups. Compared with HCs, SCZ and FRs displayed
lower premorbid and present IQ. There was no significant difference in premorbid IQ between SCZ
and FRs, but SCZ had a significantly lower present IQ than FRs. Only SCZ showed a significant ID.
As most FRs and HCs did not display an ID, there were fewer subjects with deteriorated IQ among− 33 −

FRs and HCs than among SCZ. Subjects with preserved IQ showed higher educational attainment
than those with deteriorated IQ among SCZ and FRs. These findings suggest that the impairment of
premorbid IQ and the ID in SCZ become evident before and around the time of onset, respectively,
and different pathophysiological mechanisms might be related to these impairments.

− 34 −

１．研究課題名：B 型ナトリウム利尿ペプチド (BNP) の肺炎予後予測因子としての評価：前向きコホート研究（研究番号 S2017-4）
２．キーワード：１）B 型ナトリウム利尿ペプチド (B-type natriuretic peptide)２）予後因子 (prognostic marker)
３）肺炎 (pneumonia)
３．研究者氏名：薄田 大輔・金沢医科大学氷見市民病院・助教・総合診療科
４．研 究 目 的
肺炎は，本邦の死亡原因の 3 位を占め，高齢者の増加に伴い，今後更に治療のみならず予防や早期発見など総合的な観点から対策が必要である。一方，肺炎の病態は多様性があり，診療担当医師の背景も様々であることから，簡易かつ迅速に判定可能な予後予測因子の臨床的意義は非常に大きいと考えられる。本研究では，B 型ナトリウム利尿ペプチド (BNP) 値の肺炎の予後予測因子としての有用性を検証することを目的とした。
５．研 究 計 画
金沢医科大学氷見市民病院において，肺炎診療に携わる内科系医師を研究協力者として，コホート研究を実施した。2012 年 1 月 1 日から 2017 年 12 月 31 日の研究期間において，市中肺炎 (CAP)，誤嚥性肺炎 (AP)，医療・介護関連肺炎 (HCAP) のいずれかと診断され入院し，入院後 24 時間以内に BNP 値が測定された例を研究対象に含めた。入院時診断が上記以外の肺炎の例，急性心不全合併例，18 歳未満の例，外傷を合併した例，他院へ転院した例，
入院後に肺炎が否定された例は除外した。対象となった症例に対して文書で本研究に関する説明を行い，同意を得られた者を最終的な研究対象として登録した。
登録後，人口統計学的データ，初診時理学所見，各種検査データ，また過去に肺炎の予後予測因子と報告されている因子のデータを電子カルテより収集し，対象患者は退院までフォローアップする。主要アウトカムは 30 日死亡とした。
データ登録完了後，まず研究対象例全例において，上記各因子に対して単変量解析（連続変数データについては 2 標本 t 検定，名義変数データについては χ2 検定あるいは Fisher の正確検定）を行い予後との関連を検討した。その後，統計学的有意差 (p < 0.05) を認めた因子を交絡因子として多変量解析（Cox 比例ハザード分析）に投入し，予後予測因子との関連について検討した。多変量解析において BNP 値で有意差が認められた場合には，研究対象例をCAP と非 CAP（AP あるいは HCAP）に分け，それぞれに対して同様の解析を行った。併せて，ROC 曲線を描き，最も正確に予後予測可能な BNP 値を求めた。
なお，研究の症例数が十分に集まらない場合には，院内の内科系医師に対して再度本研究について周知し，入院時の BNP 採血に協力するよう依頼した。
本研究遂行に当たり，臨床感染症学および氷見市民病院総合診療科医師の協力のもと，デ− 35 −

ータ収集および解析を行った。
６．研 究 成 果
研究期間中，計 1081 人が登録された。うち，538 人が除外され，この除外理由の内訳は，408 人が BNP 未測定，87 人が研究対象以外の型の肺炎，43 人が急性心不全合併例であった。
除外対象となった 538 人と研究対象となった 543 人の 2 群間で，臨床情報や検査データなど
各パラメータについて有意差は見られなかった。研究対象となった 543 人の内訳は，CAP225
人，非 CAP338 人であり，死亡率はそれぞれ 13％，16％であった。非 CAP のうち，42 人が耳鼻咽喉科医による嚥下内視鏡評価を受け，150 人が言語聴覚士，119 人が看護師の嚥下機能評価を受けた。一方，27 人は全身状態不良のため嚥下機能評価未実施であった。非 CAP338人の内訳は，AP195 人，HCAP143 人であり，HCAP のうち 92 人が AP を併発していた。543
人の BNP 平均値は 219.8±387 pg/mL であった。
CAP と非 CAP 間の各パラメータの比較では，性別，敗血症性ショック，意識障害，胸水，入院期間，また収縮期血圧，ヘモグロビン，ク
レアチニン，血清ナトリウム，血清クロール，血清カルシウム，C 反応性タンパクの各測定値に有意差を認めた (p < 0.05)。
研究対象全例に対する単変量解析では，播種性血管内凝固，敗血症性ショック，意識障害，
胸水と，BNP，収縮期血圧，拡張期血圧，体温，経皮動脈血酸素飽和度，ヘモグロビン，アルブミン，乳酸脱水素酵素，尿素窒素，アルブミン／尿素窒素比，クレアチニン，血清カリ
ウムの各測定値で死亡との関連が見られた。また，Cox 比例ハザード分析では，BNP（カットオフ値 220 pg/mL，ハザード比 1.99，95%信頼区間 1.16-3.4，p = 0.01），意識障害，胸水，
播種性血管内凝固，収縮期血圧値が，死亡の独立した予後因子であった。
他方，CAP，非 CAP 別の検討では，CAP において敗血症性ショック，意識障害，胸水とBNP，収縮期血圧，体温，経皮動脈血酸素飽和度，アルブミン，アルブミン／尿素窒素比，
クレアチニン，血糖の各測定値が，また HCAP において播種性血管内凝固，敗血症性ショッ
ク，意識障害，悪性腫瘍と，BNP，体温，経皮動脈血酸素飽和度，乳酸脱水素酵素の各測定値で，それぞれ死亡との関連が見られた。Cox 比例ハザード分析では，CAP において尿素窒
素値，胸水が，また非 CAP において BNP 値（カットオフ値 220 pg/mL，ハザード比 2.27，
95 %信頼区間 1.3-3.95，p = 0.004），悪性腫瘍，播種性血管内凝固，敗血症性ショック，意識障害が死亡の独立した予後因子であった。さらに非 CAP において BNP 値についての ROC 曲線を描いたところ，202.8 pg/mL が至適カットオフ値 (AUC = 0.66) となり，この時の感度
54.6%，特異度 73.1%であった。
７．研究の考察・反省
本研究の知見を述べると，1 点目は，CAP，非 CAP 両者において，BNP 高値ほど死亡率が高くなり，特に非 CAP では 202.8 pg/mL が死亡の至適カットオフ値である点である。肺炎による死亡率が高い本邦では，この点は臨床的に重要と考えられ，また AP や HCAP の予後予測因子として報告されたマーカーはまだないことから，これは新しい知見となりうる。加え− 36 −

て，AP あるいは HCAP に対して入院時に BNP 単一の測定を行うことにより予後を予測できる点や複数の項目を集めて煩雑な計算をする必要がない点も，臨床家にとっても十分役立つと思われる。2 点目は，BNP は心不全のマーカーとみなされているが，肺炎の予後マーカーとしても役立つ可能性がある点である。この面からも，BNP は客観的で日常診療における運用に有用であると考えられる。一方，通常，BNP は液体量，血管圧，電解質バランスを制御する急性期反応物質としての役割を持っているが，肺炎，特に AP や HCAP における BNP 上昇病理生理学的機序はまだ十分明らかにされていない。
本研究では何点かの制限がある。単施設研究であること，除外された患者群の検討がなされていないこと，回復期の BNP 値低下を確認しておらず急性期の一過性上昇が示されていな
いこと，CAP と非 CAP の 2 群間の背景因子に有意差が見られたパラメータが何点かあった
こと，非 CAP における BNP 上昇の機序が示されていないことである。今後さらに研究を進め，これらの点を明らかにする必要がある。
８．研 究 発 表
Usuda D, Furumura Y, Sangen R, Hashimoto Y, Kawamukai J, Muranaka E, Kawai Y, Kasamaki Y, Iinuma
Y, Kanda T. Evaluation of B-type natriuretic peptide as prognostic marker in patients with pneumonia: A
prospective cohort study. Intern Med Rev 2018; 4: DOI: http://dx.doi.org/10.18103/imr.v4i3.690.
Abstract: Background: Pneumonia is the leading cause of death due to infection among the elderly
in developed countries. We validated the usefulness of B-type natriuretic peptide (BNP) as aprognostic marker for pneumonia.
Methods: We carried out a prospective cohort study at Kanazawa Medical University Himi Municipal
Hospital. We enrolled patients admitted between 1 January 2012 and 31 October 2016 with diagnosesof community-acquired pneumonia (CAP), non-CAP composed of aspiration pneumonia (AP) andhealthcare-associated pneumonia (HCAP) whose BNP levels had been determined within the first 24
hours of admission. After enrollment, we collected baseline, demographic, clinical and laboratory
characteristics, and outcome data. Primary outcome was defined as 30-day death. We applied
univariate and multivariable Cox-regression analysis to each parameter to identify predictors of death
for all included cases, CAP, and non-CAP.
Results: Of the 543 subjects included in the study, 205 were diagnosed with CAP and 338 with
non-CAP. In the univariate analysis of the 543 subjects, mean BNP levels were associated with death(p = 0.0000); and in the multivariate analysis, BNP remained an independent predictor of mortality(cut-off points 220 pg/mL, hazard ratio (HR) 1.99, 95 % confidence interval (CI) 1.16-3.4, p = 0.01).
A similar situation was found in univariate analysis of CAP and non-CAP (p = 0.0008, 0.0000,
respectively), and in multivariable Cox-regression analysis of non-CAP (HR 2.27, 95 % CI 1.3-3.95,
p = 0.004).
Conclusions: BNP level may be a useful single prognostic marker for AP or HCAP.

− 37 −

１．研究課題名：胎盤バリアの形成機序の解明～母体への胎児細胞混入の経路となるか？～（研究番号 S2017-5）
２．キーワード：１）胎盤 (placenta)２）マイクロキメリズム (microchimerism)３）細胞融合 (cell fusion)４）アクチン骨格 (actin cytoskeleton)
５）蛍光蛋白質 (fluorescent proteins)
３．研究者氏名：小林 良祐・医学部・助教・病理学Ｉ（採択時）
４．研 究 目 的
妊娠の過程で胎児由来の細胞が母親の体内に移入したものは胎児マイクロキメリズムと呼ばれている。母体では胎児マイクロキメリズムが高頻度で発生しているにも関わらず，胎児細胞の混入機序に関する知見は極めて乏しい。妊娠中に母子間の境界面となる胎盤バリア（栄養膜細胞＋栄養膜細胞合胞体）の破綻が胎児細胞混入の経路になるという仮説に基づき，本研究ではヒト培養細胞モデルを用いて，栄養膜細胞の合胞体形成および維持の機構を明らかにすることを目的とする。
５．研 究 計 画
① ヒト絨毛癌細胞株を用いた培養条件下での解析系を確立する。具体的には，細胞膜および核を可視化する蛍光タンパク質を細胞に導入し，顕微鏡下で合胞体の形成を定量化する解析系を確立する。また，生体条件に近い３次元培養により合胞体形成を促す実験系を確立する。
② 合胞体形成に伴う細胞構造の変化が Syncytin1 機能の下流にあるのか，またその変化が合胞体化のどの過程に重要なのかを調査するため，薬剤処置や遺伝子発現制御によって細胞構造変化を調節し，合胞体形成率を検証する。また，筋芽細胞等の合胞体化で重要性が示される
Rac1 の活性化が栄養膜細胞においても重要か阻害剤やノックダウン，さらには FRET バイオ
センサーを用いた Rac1 活性化のライブイメージング観察によって検証する。
６．研 究 成 果
① 低分子量Ｇ蛋白質 K-RAS のファルネシル基を付加した Green Fluorescent Protein (GFP-X) とヒストン H1 と赤色蛍光蛋白質 (H1-mCherry) との融合蛋白質とを発現するヒト絨毛癌細胞
株 BeWo 細胞株を，ウイルス感染によって樹立した。蛍光強度は他の汎用の培養細胞に比べて弱かったため，感染を 2 回繰り返すことで顕微鏡観察に足る蛍光強度を持つ細胞株を得た。
まず細胞融合の条件を検討した。BeWo 細胞は E-cadherin を発現する上皮細胞ではあるが，増殖が盛んな場合重層化する傾向があり，細胞融合の判定が困難となることがわかった。ス
ライドガラスを 8 分割した 1 孔あたり 1.25×104 細胞を撒き，48 時間後に 50 M Forskolin，− 39 −

10％血清，抗生物質を含む HamF12-K（通常の HamF12 培地よりアミノ酸成分とピルビン酸
が 2 倍になっている）に置換し，48 時間後に細胞を固定し，蛍光顕微鏡で島状に生育する細胞群を観察するプロトコルを確立した。Forskolin は高濃度で処理すると細胞毒性が強いことから上記の濃度が適当であると判断した。他に融合を開始させる薬剤として，BeWo 細胞でForskolin と共に加えると融合増強効果があると報告がある脱リン酸化酵素阻害薬 bpV[pic](Vargas et al., J Mol Biol., 2009)，がん細胞の融合を引き起こすとの報告がある塩化コバルト(Fei et al., Lab Invest., 2018) を用いたが，融合率に著変はなかった。
マイクロ流路内で BeWo 細胞を培養し，流速による刺激を加えると細胞融合が促進される(Miura et al., Nat Commun., 2012) を模倣し，細胞を培養皿に接着させた後，振盪器内で培養したところ，細胞は死滅した。更に胎盤の硬度を模するため，マトリゲル上，コラーゲン上で細胞を培養したものの細胞は網目状に増殖し，胎盤のようにシート状に生育することはなかった。
細胞融合は細胞固定後に蛍光顕微鏡下での観察によって行うが ，核マーカーである
H1-mCherry の蛍光も減弱する傾向があったため，核は固定後に蛍光色素 Hoechst33342 で染色することにより，可視化することとした。GFP-X が境目なく発現しており，2 核以上ある細胞を融合細胞と判定したところ，コントロール群でも 10％程度融合していたが，Forskolin
処理により，30－50％に上昇することがわかった。
② Forskolin 処理によって Syncytin1 の発現が誘導され，形質膜に局在し，隣接する細胞の形質膜にある ASCT2 と会合することで細胞融合が開始すると報告されてきた。Syncytin1 およびASCT2 の発現ベクター，および培養栄養膜細胞で融合を促進すると報告がある Cadherin-11(Getsios et al., Dev Biol., 2003) の発現ベクターを構築し，BeWo 細胞に発現させてみたが，
Syncytin1 は発現が確認できず，他の 2 つのタンパク質は発現はしていたものの，融合を促進
することはなかった。Syncytin1 が発現しない理由は不明なままであるが，栄養膜細胞の融合を担うのは Syncytin1 ではなく Syncytin2 であることが最近なって報告されたため (Lu, et al.,Cell Rep., 2017)，Syncytin1 について今後は解析することがないので，ここで一旦終わりとした。
低分子量 G 蛋白質 Rac1 の活性を検出する FRET バイオセンサーを発現する BeWo 細胞株を樹立し，上記①で確立した条件で融合を誘導したところ，コントロールでは形質膜に存在するバイオセンサーが，融合した細胞では細胞質に取り込まれ点状になったり，蛍光が減弱する蛍光にあった。同じ脂質不可配列を持つ GFP-X でも細胞内に取り込まれたり，蛍光が減弱する傾向があるため，Forskolin によって細胞形質膜からのエンドサイトーシスの経路がなんらか影響を受けていると考えられた。またライブイメージングの結果から，Forskolin 処理
により島状に生育する細胞塊の外周にある細胞が葉状突起を形成し大きくなる傾向があることがわかった。細胞融合を示すのはこの外周の細胞であることが多いので，このようなアクチン骨格の変化が細胞融合になんらかの影響を与えていると考えられた。

− 40 −

７．研究の考察・反省
細胞融合の実験は歴史が古く様々なプロトコールがあり，今回の研究でもこれらを参考にして行ったものの，再現性を得ることが難しく，その原因も明らかではなく，実験条件を確立するのに時間がかかってしまったのが反省点である。島状に増殖する細胞における細胞融合が生体内のシート状に生育する栄養膜細胞の融合と同等であるのかも大きな点であると考えるが，栄養膜細胞以外で融合の報告がある，筋芽細胞，破骨細胞，マクロファージなどで重要とされるアクチン骨格やそれを制御する信号伝達経路が融合時に変化する可能性が示唆されたことは重要であると考える。
８．研 究 発 表なし

− 41 −

１．研究課題名：HPV16E7 HIS２残基の役割と N-end rule pathway（研究番号 S2017-6）
２．キーワード：１）N 末端則経路 (N-end rule pathway)２）ヒトパピローマウイルス E7 (HPV E7)３）タンパク質相互作用 (protein interaction)
３．研究者氏名：田崎 隆史・総合医学研究所・准教授・生命科学研究領域
４．研 究 目 的E3 ユビキチンリガーゼ UBR4 は UBR box 領域を介してヒトパピローマウイルス 16 型
(HPV16) の癌タンパク質 E7 と結合し複合体を形成する。この結合には E7 の N 末端から 2
番目のヒスチジン残基 (His2) が重要であること示唆されているが，その分子相互作用の性
質は不明である。
本研究では，UBR4 との結合における E7 第 2 アミノ酸残基の役割を解析し，HPVE7 が N-end rule 基質になりえるのか検証することを目的とする。
５．研 究 計 画
HPV16 E7 の His2（N 末から 2 番目のヒスチジン）の役割を検証するために，（1）HPV16E7
変異体の大腸菌タンパク質発現系での作製，（2）E7-flag タンパク質を用いた UBR4 結合アッセイを行った。
６．研 究 成 果（１）HPV16E7 変異体の大腸菌タンパク質発現系での作製
ウイルス由来タンパク質の HPV16E7 は，大腸菌内での発現効率が悪く十分な量を得る事が難しい。これまで報告者は，HPV16E7 cDNA 配列内のレアコドンを最適化し，大腸菌
Rosetta-gami2 (DE3) pLysS 中で，E7-flag タンパク質を高効率に作製することに成功した。この E7-flag cDNA 中の ORF 第 2 コドン（CAC，His をコードする）を変異させ，報告者が確立した大腸菌発現系を用いて，異なるアミノ酸を第 2 アミノ酸残基に持つ変異 E7-flag タンパク質を作製した。第 2 アミノ酸残基として，Arg, Lys，Asp，Ser，Asn，Ile，Cys，Phe，Ala ま
たは Pro を持つ変異 E7-flag タンパク質を大腸菌中で発現させたところ，Lys，Asn，Ile，Phe
または Pro を第 2 アミノ酸残基に持つ変異 E7-flag タンパク質 (MK，MN，MI，MF，MP) を得ることに成功した。一方，第 2 アミノ酸残基が Arg，Asp，Ser，Cys または Ala の場合は発現量が非常に少ないかほとんど無かった。
（２）E7-flag タンパク質を用いた UBR4 結合アッセイ
E7 の C 末端には Flag タグが融合されており，高発現している E7-flag タンパク質を含む大腸菌可溶化液と，抗 FLAG 抗体アガロースを混合することで E7-agarose beads を簡易に作製することが出来る。この，E7-beads と HEK293 細胞可溶化液を 4℃で混合することで，結合したヒト UBR4 を E7-beads に吸着させることができる。野生型の E7-flag タンパク質 (WT) を− 43 −

陽性コントロール，6 番目から 10 番目のアミノ酸残基を欠如している E7-flag タンパク質(d6-10) を陰性コントロールとし，（１）で作製した変異 E7-flag タンパク質とヒト UBR4 タ
ンパク質との結合アッセイを行った。その結果，第 2 アミノ酸残基が Pro の場合 (MP)，陰性
コントロールと同様にヒト UBR4 に対する結合能が低下した（図１）。

図 1：変異 E7-flag タンパク質を用いた UBR4 結合アッセイ
７．研究の考察・反省
これまでの研究で，98 アミノ酸残基からなる HPV E7 の N 末端側に UBR4 結合に重要な部位があることが分かっている。本研究では E7 の第 2 アミノ酸残基に着目し UBR4 との結合
アッセイを行った。その結果，野生型の His 残基と性質が似ている正電荷を側鎖にもつ Lys
残基，疎水性の性質を持つ Ile，Phe 残基，親水性の性質の Asp，Asn 残基の場合，変異 E7タンパク質は UBR4 結合能を維持していた。一方，疎水性でタンパク質の一次構造において唯一の環状イミノ酸のプロリン (Pro) の場合 UBR4 への結合能が低下した。第 2 アミノ酸残基の位置にプロリンが存在することで E7 の高次構造がどのように変化するのか現段階では不明である。UBR4 タンパク質側の E7 結合部位は N-end rule 基質結合部位と重複していることが示唆されており，N-end rule 基質結合部位である UBR box 領域と E7 タンパク質の N 末
端領域との分子相互作用に第 2 アミノ酸残基が関与していることが明らかになった。
本研究では，20 アミノ酸残基を全て試験する予定であったが，大腸菌発現系との相性の問題で一部の変異 E7-flag タンパク質のテストが出来なかった。将来，すべてのアミノ酸残基をテストするためには化学合成ペプチドもしくは別の発現系を使用する必要がある。
HPVE7 タンパク質は，子宮頸がんにおけるがん化において重要なウイルスタンパク質であることが既に報告されている。宿主側のユビキチンリガーゼである UBR4 タンパク質との分子相互作用が明らかになることによって，新たな薬物ターゲットになることが期待される。
８．研 究 発 表
① Kim ST, Lee YJ, Tasaki T, Hwang J, Kang MJ, Yi EC, Kim BY, Kwon YT. The N-recognin UBR4 of
the N-end rule pathway is required for neurogenesis and homeostasis of cell surface proteins. PLoS
One 2018; 13: e0202260.
Abstract: The N-end rule pathway is a proteolytic system in which single N-terminal amino acidsof proteins act as a class of degrons (N-degrons) that determine the half-lives of proteins. We have

− 44 −

previously identified a family of mammals N-recognins (termed UBR1, UBR2, UBR4/p600, andUBR5/EDD) whose conserved UBR boxes bind N-degrons to facilitate substrate ubiquitination andproteasomal degradation via the ubiquitin-proteasome system (UPS). Amongst these N-recognins,
UBR1 and UBR2 mediate ubiquitination and proteolysis of short-lived regulators and misfolded
proteins. Here, we characterized the null phenotypes of UBR4-deficient mice in which the UBR box
of UBR4 was deleted. We show that the mutant mice die around embryonic days 9.5-10.5(E9.5-E10.5) associated with abnormalities in various developmental processes such as neurogenesis
and cardiovascular development. These developmental defects are significantly attributed to theinability to maintain cell integrity and adhesion, which significantly correlates to the severity of null
phenotypes. UBR4-loss induces the depletion of many, but not all, proteins from the plasma
membrane, suggesting that UBR4 is involved in proteome-wide turnover of cell surface proteins.
Indeed, UBR4 is associated with and required to generate the multivesicular body (MVB) whichtransiently store endocytosed cell surface proteins before their targeting to autophagosomes andsubsequently lysosomes. Our results suggest that the N-recognin UBR4 plays a role in the
homeostasis of cell surface proteins and, thus, cell adhesion and integrity.
② Kim ST, Lee YJ, Tasaki T, Mun SR, Hwang J, Kang MJ, Ganipisetti S, Yi EC, Kim BY, Kwon YT.
The N-recognin UBR4 of the N-end rule pathway is targeted to and required for the biogenesis of theearly endosome. J Cell Sci 2018; 131: jcs217646.
Abstract: The N-end rule pathway is a proteolytic system in which single N-terminal residues ofproteins act as N-degrons. These degrons are recognized by N-recognins, facilitating substratedegradation via the ubiquitin (Ub) proteasome system (UPS) or autophagy. We have previously
identified a set of N-recognins (UBR1, UBR2, UBR4/p600, and UBR5/EDD) that bind N-degrons
through their UBR boxes to promote proteolysis by the proteasome. Here, we show that the 570 kDa
N-recognin UBR4 is associated with maturing endosomes through the interaction with Ca2+-boundcalmodulin. The endosomal recruitment of UBR4 is essential for the biogenesis of early endosomes(EEs) and endosome-related processes such as the trafficking of endocytosed protein cargoes anddegradation of extracellular cargoes by endosomal hydrolases. In mouse embryos, UBR4 marks andplays a role in the endosome-lysosome pathway that mediates the heterophagic proteolysis of
endocytosed maternal proteins into amino acids. By screening 9,591 drugs through DrugBank
database, we identify picolinic acid as a putative ligand to UBR4, which inhibits the biogenesis of
EEs. Our results suggest that UBR4 is an essential modulator in the endosome-lysosome system.

− 45 −

１．研究課題名：移植後糖尿病および心血管合併症予防におけるアディポネクチンの測定意義の解明（研究番号 S2017-7）
２．キーワード：１）アディポネクチン (adiponectin)２）腎移植 (renal transplantation)３）動脈硬化 (atherosclerosis)
４）心血管合併症 (cardiovascular disease)３．研究者氏名：足立 浩樹・医学部・臨床准教授・腎臓内科学
４．研 究 目 的
慢性移植腎障害の原因は，大きく免疫学的，非免疫学的原因に分類され，後者のひとつとして脂質異常症が移植腎機能に影響すると報告されている。さらに，腎移植患者では非腎移植患者と比較して心血管疾患による死亡率が高いことが報告されており，心血管疾患の合併は移植腎機能のみならず生命予後の点においても重要であると考えられる。一方，心血管合併症のリスク因子としてメタボリック症候群の構成因子（肥満，糖尿病，高血圧症，脂質異常症）も重要である。メタボリックシンドロームを中心とした代謝異常，心血管病の病態は，種々のアディポサイトカインの産生異常が関わっている。特にアディポネクチン (ADPN) は，
抗糖尿病，抗動脈硬化作用を有するアディポサイトカインであり心血管合併症の病態に深く関与している。
腎移植患者において長期にわたり，ADPN を含む脂質マーカーや免疫抑制剤などの薬剤と血管石灰化を評価した報告は今までされていない。また，血管内皮細胞への ADPN 結合機序として，その受容体および T-cadherin が報告されているが，移植腎組織における実態は不明である。本研究の目的は，腎移植患者における動脈石灰化のリスク因子，ADPN の動脈石灰化の抑制作用および移植腎組織における ADPN 発現について調査を行い，血清 ADPN 測定が腎移植患者の心血管合併症の予知マーカーとしての有用性を検討することである。
５．研 究 計 画
当院で腎移植後，2008 年の観察開始時に血清クレアチニン値が 3mg/dl 以下で，2016 年まで生着していた腎移植レシピエント 51 例（移植別：生体腎移植 44 例，献腎移植 7 例，男女別：男性 34 例，女性 17 例）を対象とした。方法は腹部大動脈を ACAI (aortic calcification areaindex) で評価し，8 年間の腹部大動脈石灰化と血清 ADPN 分画の変化量との関連について評価を行った。加えて観察開始時の移植腎機能および血清脂質マーカーと ADPN 分画との関連についても評価した。さらに移植腎生検組織の新鮮凍結切片を用いて，抗 ADPN，ADPN-R1，
R2，Cadherin-13（T-カドヘリン）抗体を用いた移植腎生検組織染色を行い，その局在について検討を行った。

− 47 −

６．研 究 成 果・観察開始時と 8 年後の移植腎機能および血清脂質マーカー，ADPN，ACAI の比較
2008 年の血清高分子量ならびに非高分子量 ADPN 濃度はどちらも eGFR と負の相関を示した（各々r = -0.300，p < 0.032 and r = -0.385，p < 0.005）。eGFR は観察開始時と比較し 8 年後に低下していた (p = 0.037)。また血清脂質マーカーの LDL-C，TG，nonHDL-C，HDL-C は，
観察開始時と 8 年後と比較し有意差はみられなかった。血清 ADPN 分画において観察開始時と観察終了時と比較し，高分子量および非高分子量 ADPN 濃度について有意差は認めなかったが，観察終了時において高分子 ADPN 比率は高値を示し，非高分子量 ADPN 比率は低値を示した (p = 0.0044，0.0047，respectively)。他方，腹部大動脈石灰化について ACAI にて評価した結果，観察開始時と比較し観察終了時には高値を示した (p < 0.001)。
さらに，高分子量 ADPN 濃度の 1 年平均変化量を目的変数とし重回帰分析を行った結果，
HDL-C 値の 1 年平均変化量の増加が有意な改善因子となった。
・血管石灰化と血清 ADPN 分画との関連および血管石灰化に対する影響因子
ACAI の 1 年平均変化量をそれぞれ四分位で階層別に分け，血清 ADPN 分画の 1 年平均変化量との関係について評価した。その結果，石灰化が強くなるにつれて，高分子量 ADPN 濃
度およびその比率は低下する傾向がみられた。一方，非高分子量 ADPN 濃度においては一定の傾向は認められなかったが，その比率においては，石灰化が強くなるにつれて比率は増加
する傾向がみられた。さらに ACAI の 1 年平均変化量に影響した因子について重回帰分析にて検討を行った結果，ACAI の 1 年平均変化量に対しての増悪因子は移植時の高齢ならびに心血管合併症の既往であり，改善因子は高分子量 ADPN 比率の 1 年平均変化量の増加であった。
・移植腎生検組織における ADPN の発現
移植腎組織の新鮮凍結切片を用いた ADPN および CD31 の発現を検討した。抗 ADPN 抗体を用いた組織染色において，CD31 陽性内皮細胞に沿って陽性となっており，ADPN の腎細動脈における局在を確認した。加えて AdipoR1 抗体および R2 抗体の発現と ADPN との共局
在を検討すると，AdipoR1 および一部 R2 の血管内皮細胞上での共局在を認めた。一方，抗Cadherin-13 (T-cadherin) 抗体による染色においては，Cadherin-13 は血管内皮上に連続して発現しており，血管内皮細胞上に認められる ADPN と一致して血管内皮細胞上での共局在を認めた。
※当該研究成果の一部を International Society of Nephrology, Tokyo（2018 年 2 月）にて発表。
Hiroki Adachi, et al. 演題名 High-molecular-weight adiponectin inhibits the progression of vascular
calcification and cardiovascular disease in Japanese renal allograft recipients
７．研究の考察・反省
今回の検討において，HDL-C は高分子量 ADPN 比率と正の相関を示し，LDL-C ならびにnonHDL-C は，高分子量 ADPN 比率と負の相関を示した。加えて腹部大動脈の石灰化の検討において，石灰化が進んでいる群ほど高分子量 ADPN 濃度および比率が低値を示した。透析− 48 −

患者において石灰化は Ca ならびに P の関与が強く，脂質異常の関与が弱くなると報告されているが，本研究の結果から腎移植後に CKD ステージ G5D から G2～G3aT 程度に腎機能が回復することで，腎移植例における脂質異常症への治療介入は，高分子量 ADPN の増加を介して血管石灰化を抑制する可能性があると考えられる。
本研究において，検討症例数が 2 例と少なく定量化や石灰化との関連など詳細な分析はできなかったが，移植腎生検組織の動脈内皮細胞上で ADPN の線状発現が認められた．さらに，ADPN 受容体の分布について，腎内の筋性動脈血管内皮細胞では AdipoR1 の優位発現および血管中膜の平滑筋細胞では AdipoR2 がより優位に発現していることを確認した。しかし，血管内皮細胞における AdipoR1 の発現は，非連続的であることから，血管内皮細胞における線状に連続的な ADPN 発現には，ADPN 受容体以外の関与が示唆された。今回，ADPN と
T-Cadherin との結合についても検討し，これまでのマウスの実験報告と同様に ADPN と
T-Cadherin の連続的な共局在を認めたことより，ヒトにおいても T-Cadherin が ADPN との接着分子として作用している可能性が示唆された。今後，ヒトにおける ADPN と血管石灰化についての ADPN 発現等の定量的な組織学的検討を進めるとともに，さらに前向き調査による
長期的な臨床研究を行う必要がある。
８．研 究 発 表
該当なし

− 49 −

１．研究課題名：可溶性ウロキナーゼ受容体 (soluble urokinase receptor : suPAR) を指標とするネフローゼ症候群 (NS) の新たな診断・治療指針の確立（研究番号 S2017-8）
２．キーワード：１）可溶性ウロキナーゼ受容体 (suPAR)２）蛋白尿 (proteinuria)
３）原発性ネフローゼ症候群 (primary nephrotic syndrome)
３．研究者氏名：藤本 圭司・医学部・講師・腎臓内科学
４．研 究 目 的
ウロキナーゼ受容体 (urokinase receptor: uPAR) は，細胞膜と glycosylphosphatidylinositol(GPI) アンカーによって結合した分子であり，腎では糸球体上皮細胞と尿細管上皮細胞に発現し，細胞の可動性に関与している。2008 年に Reiser のグループは糸球体上皮細胞表面に発現している uPAR が同じ細胞膜上のβ3 インテグリンに作用し (cis-interaction)，細胞内シグナ
ル伝達を介して糸球体上皮細胞の可動性を変化させ，その障害を惹起している可能性を示した【Nat Med 14: 55-63, 2008】。さらに，同グループは，GPI アンカーが切断されることにより血中に遊離される可溶性ウロキナーゼ受容体 (soluble urokinase receptor: suPAR) が巣状分節性糸球体硬化症 (FSGS) 患者血中で上昇しており，suPAR が糸球体上皮細胞β3 インテグリンと結合してこれを活性化することにより蛋白尿および FSGS 様病変が生じることを示し，
suPAR が FSGS 発症に関与する液性因子であると結論づけた。しかし，その後，世界中で行われた追試において，血清 suPAR レベルと尿蛋白量が相関しない例が多く報告されており，
血清 suPAR の病勢マーカーとしての有用性は疑問視されている。一方，北京大学のグループ
は，FSGS において尿 suPAR が尿蛋白量と相関することを報告している（単変量解析のみ。
交絡因子を考慮した多変量解析は施行されていない）。その結果の解釈として，尿中 suPAR
は循環血中 suPAR およびポドサイト細胞膜上 u-PAR が遊離した suPAR の総量を反映していると考えられるため，上記の 2 つの機序によるポドサイトβ3 インテグリン活性化によるポドサイト障害およびその結果としての尿蛋白量を反映しているのではないかという仮説を提唱している。本研究は，（１）FSGS に限定せず，原発性ネフローゼ症候群全体において，ネフローゼ症候群の病勢変化（尿蛋白量）を尿中 suPAR が反映しているか，交絡因子を考慮した多変量解析によって検討し，その病勢マーカーとしての有用性を評価すること，（２）尿中
suPAR が尿細管上皮細胞β3 インテグリン活性化を介して蛋白尿を惹起している可能性について検討することを目的とする。
５．研 究 計 画
原発性ネフローゼ症候群患者 (n=36) を対象に以下の検討を行う。
（１）尿蛋白量と尿 suPAR レベルの相関性の検討：
横断的検討：免疫抑制療法前の baseline 値を用い，尿蛋白量を目的変数とし，尿 suPAR，− 51 −

Selectivity Index，eGFR を説明変数とした重回帰分析を行う。
縦断的検討：免疫抑制療法開始後 2 カ月間の変化量を用い，尿蛋白変化量を目的変数とし，
尿 suPAR 変化量，Selectivity Index，eGFR 変化量を説明変数とした重回帰分析を行う。
（２）腎組織活性型β3 インテグリン免疫蛍光染色実験：
腎組織活性型β3 インテグリンの局在と染色強度について，正常腎組織および原発性ネフ
ローゼ症候群組織型別に免疫蛍光染色法にて検討する。
（３）尿 suPAR レベルと尿-L-FABP レベルとの相関性の検討：
６．研 究 成 果（１）尿蛋白量と尿 suPAR レベルの相関性の検討：
横断的検討（単変量解析）では，baseline の尿蛋白量と尿 suPAR レベルに有意な相関を認めた (r = 0.499, P = 0.002)。また，表Ⅰに示すように交絡因子（eGFR および Selectivity Index）
による影響を治療開始後 2 カ月間の考慮した多変量解析による横断的検討においてもbaseline の尿蛋白量と尿 suPAR レベルに有意な相関を認めた。
縦断的検討（単変量解析）では，治療開始後 2 カ月間の尿蛋白変化量と尿 suPAR レベル変化量に有意な相関を認めた (r = 0.410, P = 0.013)。また，表Ⅱに示すように交絡因子（治療開始後 2 カ月間の eGFR 変化量および baseline の Selectivity Index）による影響を考慮した多変量解析による縦断的検討においても治療開始後 2 カ月間の尿蛋白変化量と尿 suPAR レベル変化量に有意な相関を認めた。
重回帰分析による横断的検討（表Ⅰ）
目的変数：UP（0M）
変数名

β

SE(β)

stdβ

t値

P値

尿 suPAR(0M)

0.001

0.001

0.448

2.700

0.012

eGFR(0M)-0.0270.046-0.116

0.589

0.600

S.I.

0.503

10.557

0.009

0.048

0.962

UP(0M), baseline の尿蛋白量; 尿 suPAR(0M), baseline の尿 suPAR; eGFR(0M), baseline の eGFR;
S.I., baseline の Selectivity Index
重回帰分析による縦断的検討（表Ⅱ）
目的変数：⊿UP（2M）
変数名

β

SE(β)

stdβ

t値

P値

尿⊿suPAR(2M)

0.001

0.001

0.358

2.193

0.036

尿⊿eGFR(2M)-0.0750.063-0.197

1.189

0.243

S.I.

-1.500

9.485

0.025

0.158

0.876

⊿UP(2M), 治療開始後 2 カ月間の尿蛋白変化量; 尿⊿suPAR(2M), 治療開始後 2 カ月間の尿
suPAR 変化量; 尿⊿eGFR(2M), 治療開始後 2 カ月間の eGFR 変化量; S.I., baseline の Selectivity
Index− 52 −

（２）腎組織活性型β3 インテグリン（AP-5）免疫蛍光抗体法染色実験：
図 1 に正常腎組織，図 2 に FSGS 腎組織の活性型β3 インテグリン免疫蛍光抗体法染色実験の結果を示す。正常腎組織においては，活性型β3 インテグリンは近位尿細管刷子縁に局在し，染色強度は弱かった。FSGS 腎組織においても活性型β3 インテグリンは主に近位尿細管刷子縁に局在していたが，その染色強度は強かった。その他の原発性ネフローゼ症候群でも活性型β3 インテグリンは主に近位尿細管刷子縁に局在し，膜性腎症（MN）では FSGS と同程度に染色強度は強く，微小変化型ネフローゼ症候群（MCNS）では中等度の染色強度であった（表Ⅲ）。一方，正常腎組織，原発性ネフローゼ症候群腎組織ともに糸球体係蹄にβ3 インテグリンは染色されなかった。

− 53 −

表Ⅲ．

Staining intensity: 0, absent; 1, very weak;
GCW, glomerular capillary wall.

2, weak;

3, moderate;

4, strong.

（３）尿 suPAR レベルと尿-FABP レベルとの相関性の検討：
横断的検討（単変量解析）では，baseline の尿 suPAR レベルと尿-FABP レベルに有意な相関を認めた (r = 0.522, P = 0.001)。さらに，縦断的解析（単変量解析）においても治療開始後 2 カ月間の尿 suPAR レベル変化量と尿-FABP レベル変化量に有意な相関を認めた (r = 0.395, P = 0.017)。
７．研究の考察・反省
本研究の腎組織免疫蛍光抗体法染色実験結果から，suPAR の標的は糸球体上皮細胞β3 イ
ンテグリンではなく，近位尿細管上皮細胞β3 インテグリンが真の標的である可能性を示唆する新しい知見が得られた。さらに，交絡因子の影響を取り除いた多変量解析においても尿suPAR レベルと尿蛋白量に横断的かつ縦断的に有意な相関を認めた。以上から，糸球体濾過を受けた原尿中の suPAR が近位尿細管上皮細胞に尿細管腔側から作用し，蛋白尿を惹起しているといった病態機序が想定される。また，尿 suPAR と尿 L-FABP とが正相関することから，
尿 suPAR が近位尿細管障害を惹起している可能性も示唆された。
これまで CKD と血中 suPAR
レベルとの関連を報告した論文が散見されるが，その背景の病態機序については特定されていない。一般に，腎機能低下は糸球体病変よりも尿細管間質病変と強く相関することが知られており，suPAR の標的が糸球体であるとすると suPAR と CKD との関連が強いとするこれ
ら論文の根拠は弱い印象があった。しかしながら，本研究結果から，糸球体で濾過された原
尿中の suPAR が近位尿細管上皮細胞障害を惹起し，CKD を進行させるといった仮説が推察されるため，より矛盾なく suPAR と CKD との関連を説明可能となるかもしれない。今後の展望として，尿 suPAR レベルと CKD との関連を疫学的に検討する予定である。
反省点としては，当初予定していた培養近位尿細管上皮細胞への尿添加実験が遅延していることである。β3 インテグリンは近位尿細管刷子縁に発現していると考えられるが，検討した培養尿細管上皮細胞は極性が保たれておらず，刷子縁構造を認めなかった。現在，極性を有する培養近位尿細管細胞を用いた実験や動物への recombinant suPAR 投与実験を検討中である。
８．研 究 発 表なし

− 54 −

１．
研究課題名：抗酸化タンパク Peroxiredoxin6 の角膜創傷治癒抑制効果の解明（研究番号 S2017-9）
２．キーワード：１）角膜創傷治癒 (corneal wound healing)２）上皮間葉系移行 (epithelial mesenchymal transition)３）ペルオキシレドキシン 6 (peroxiredoxin6)４）抗酸化タンパク (anti-oxidant protein)５）酸化ストレス (oxidative stress)
３．研究者氏名：谷村 直紀・医学部・助教・眼科学
４．研 究 目 的
角膜は皮膚と同様に外界と直接接しているために物理的，化学的あるいは生物学的な刺激を絶えず受けている。皮膚の表皮と同様に角膜の上皮も外界の刺激に対するバリアーとなるが，障害をうけた場合には迅速な組織修復機構を行う必要がある。ドライアイによる慢性的な角膜上皮障害や，薬剤アレルギー，ウィルス感染などによる角膜輪部の幹細胞異常なども創傷治癒を遅らせ，角膜バリアー機能の低下をもたらす。治療が奏功しない場合，角膜融解や角膜穿孔の発症や，角膜感染症を合併し，不可逆性の角膜実質混濁を残し，視力が低下する。抗酸化酵素である Peroxiredoxin (Prdx6) は，細胞内で活性酸素種 (ROS) の消去，アポプ
トーシスの抑制作用があることがいわれている。我々は，ヒト培養水晶体上皮細胞 (HLEC)
において，Prdx6 を細胞内に過剰発現すると，H2O2 や高血糖で誘導されたアポプトーシスを抑制するということを報告してきた。糖尿病患者やドライアイ患者では，外傷後や内眼手術後における角膜障害に対する創傷治癒の遅延が見られ，より効果的な治療薬の開発が望まれる。本研究の目的は，Prdx6 の角膜創傷治癒効果と角膜創傷治癒における Prdx6 の役割を解明することである。
図1
５．研 究 計 画
１）SUMO 化を抑制した Prdx6 を過剰発現させるプラスミドの作成
Prdx6 は，過剰な酸化ストレスなどで複数の部位で SUMO により修飾され，抗酸化能が低下する
ことがわかっている。よって，本実 験 で は SUMO 化 を 抑 制 し た
Prdx6 のコンストラクトを作成した。図 1 のようにワイルドタイプ(WT) の GFP-Prdx6 および共同研究者であるネブラスカ医科大学の Singh 教授が作成した
SUMO 修飾される部位 2 か所を変異した GFP-Prdx6K122/142R を入手し，培養実験に使用した。

− 55 −

２）細胞遊走アッセイ
細胞遊走にたいする GFP-Prdx6K122/142R を過剰発現の影響を解析するために以下の実験を行った。
初代培養ヒト角膜上皮細胞 (HCEpC) を Cell Applications (San Diego, CA) より入手し，
24 時間後に，
GFP-vector (Vec)，GFP-Prdx6 および GFP-Prdx6K122/142R
24 well プレートに播種した。
を細胞にリポフェクタミン 2000 (ThermoFisher Scientific Japan, Tokyo) にてトランスフェクシ
ョンさせた。トランスフェクションから 24 時間後に，Cell scratch assay にて創傷治癒を惹起させる。細胞を CELL Scratcher® (AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Shizuoka, Japan) を用いてスクラッチ後，1，6，12，24 時間後に，培養細胞の創傷部からの細胞遊走を倒立位相差顕微鏡にて撮影し，細胞遊走能を Multigauge soft wear (Fuji Film) で画像解析する。
３）細胞生存の測定（テトラゾリウム塩 (MTS*

図 2 GFP-Prdx6K122/142R の細胞局在[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt]): MTS アッセイ）
H2O2 に誘導される角膜上皮細胞死にた
いする GFP-Prdx6K122/142R を過剰発現の影響を解析するために，以下の実験を行った。
初代培養ヒト角膜上皮細胞 (HCEpC) を入手し 96 well プレートに播種し，GFP-vector,
GFP-Prdx6 および GFP-Prdx6K122/142R を細胞

図 3: GFP-Prdx6K122/142R の細胞遊走に対する影響にリポフェクタミンにてトランスフェクシ

3

ョンさせた。24 時間後に，0, 100μM の H2O280を添加した培養液に交換し培養を継続した。
から 24，
48 時間後に，
CellTiter 96® AQueous

60

遊走面積(%)

培養液は 24 時間ごとに交換し最初の交換

3

3One Solution Cell Proliferation Assay (Promega,

40

20

Madison, WI, USA) を行い，細胞生存率を

0

Vec

WT

Prdx6K122/142R

スペクトロフォトメーターで測定した。
図 4：GFP-Prdx6K122/142R の H2O2 による細胞死抑制効果６．研 究 成 果
１）SUMO 化を抑制した GFP-Prdx6K122/142R の過剰発現
HCEpC に GFP-Prdx6K122/142R をトランス
質に GFP-Prdx6K122/142R の局在が観察され，
GFP-Prdx6 の局在と同様の結果となった。

− 56 −

細
胞
生
存
率

150

100



フェクションさせると，図 2 のように細胞

200

50

0

Vec

WT

Prdx6K122/142R

２）SUMO 化を抑制した GFP-Prdx6K122/142R の過剰発現による角膜上皮細胞の遊走能への影響
Cell スクラッチアッセイ後，24 時間後では，GFP-Vec のコントロールをトランスフェクシ
ョンした細胞と比較して，WT (GFP-Prdx6) と GFP-Prdx6K122/142R を過剰発現した角膜上皮細胞のほうが，遊走能が有意に増加していた（図 3）。また，WT に比べて，GFP-Prdx6K122/142Rの過剰発現した HCEpC ほうが，より細胞遊走能を促進した。
３）H2O2 による酸化ストレスによる HCEpC の細胞死に対する SGFP-Prdx6K122/142R の過剰発現の影響
培養液に，100μM の H2O2 を添加し, HCEpC に酸化ストレスをあたえると細胞生存率は低下するが，Prdx6 を前投与すると細胞線損率の減少が有意に抑制されていた。WT に比べて。
GFP-Prdx6K122/142R の過剰発現のほうが，より細胞死を抑制した（図 4）
７．研究の考察・反省
HCEpC に Prdx6 を過剰発現させることで，細胞の創傷治癒能を上昇させ，酸化ストレスによる細胞死を抑制していることが明らかになった。また，SUMO 化を抑制した Prdx6 を過剰発現させると，それら（創傷治癒能，酸化ストレスによる細胞死）に対する影響が，SUMO化を抑止しない場合に比べて，より促進されていた。これらの結果より SUMO 化の抑制は
HCEpC にたいする Prdx6 の抗酸化能，細胞遊走促進機能を高めていることが明らかになった。
反省点としては，当初は SUMO 化を抑制した Prdx6 リコンビナント蛋白の添加実験を計画していたが，現実験室でのリコンビナント蛋白の作成，抽出が難航し，研究計画が予定より大幅に遅れたため，まず GFP-Prdx6 の細胞へのトランスフェクション，過剰発現で実験を開始したことである。創傷治癒モデル動物に SUMO 化抑制 Prdx6 リコンビナント蛋白を点眼で添加する実験では，相当量の蛋白を必要とするため，今後，Prdx6 リコンビナント蛋白の作成が順調に進めば，in vivo の投与実験も行う予定である。
本研究より，Prdx6 の角膜に対する酸化ストレス除去や創傷治癒効果が期待され，今後この点眼による角膜創傷治癒効果が明らかになれば，難治性ドライアイや糖尿病角膜症患者に対する新たな治療薬の開発につながることが期待される。
８．研 究 発 表なし（今後発表予定）− 57 −

１．
研究課題名：脱ユビキチン化酵素 USP10 による造血幹細胞維持機構解明（研究番号 S2017-10）
２．キーワード：１）脱ユビキチン化 (deubiquitylation)２）DNA 損傷応答 (DNA damage response)３）ファンコーニ貧血 (Fanconi anemia)
３．研究者氏名：宇谷 公一・医学部・助教・微生物学
４．研 究 目 的
細胞内蛋白質のユビキチン化は蛋白質の分解や品質管理において極めて重要な反応である。
ユビキチン化システムの異常は癌および免疫異常疾患を含む多くの疾病の根本原因となることが示されている。我々は，蛋白質からユビキチンを切断する脱ユビキチン化酵素である
Ubiquitin Specific Protease 10 (USP10) が，ストレスによって誘導される活性酸素の産生を抑制する制御分子であること，および USP10 のノックアウトマウスが骨髄造血不全を呈することを見いだした。ストレス応答は造血幹細胞を維持するうえでも欠かせないシステムである
ことが知られている。そこで本研究では，USP10 による造血幹細胞の維持機構を解明することを目的とした。
５．研 究 計 画
① USP10 標的蛋白の同定
USP10 が脱ユビキチン化する標的基質蛋白としていくつかの報告があるが，いずれもUSP10-KO マウスの表現型とは合致しない。したがって，未知の USP10 標的分子が存在する
ことが予想される。そこで新たな USP10 標的蛋白の同定のために以下の実験を行う。
(a) USP10 結合蛋白の探索
USP10-KO マウス繊維芽細胞株 (MEF) にタグを付加した WT-USP10 もしくは脱ユビキチ
ン化酵素活性をなくした変異型 USP10 を安定発現させる。これらの細胞より抗タグ抗体を用いて USP10 複合体を精製し，1 次元あるいは 2 次元ゲル電気泳動を行い，WT-USP10 でのみ免疫沈降される蛋白を検出する。ゲルから切り出した後に，LC-MS/MS を用いた質量分析により蛋白を同定する。USP10 結合蛋白のうち，USP10 による脱ユビキチン化によって安定化する蛋白を同定する。
(b) ユビキチン化蛋白の精製による探索
USP10 は脱ユビキチン化酵素であり，USP10-KO 細胞においては USP10 の標的蛋白のユビキチン化が亢進しているはずである。WT および USP10-KO MEF よりユビキチン化蛋白を
抗ユビキチン鎖抗体 (FK2) により精製し，両者における蛋白分子構成の違いを質量分析により比較することで，USP10-KO 細胞でユビキチン化が亢進している蛋白を同定する。
(c) in vitro HSC を用いた USP10 標的蛋白の探索
HSC は SCF や TPO などのサイトカイン添加培地で短期間培養することが可能である。

− 59 −

USP10-WT 及び KO マウスの骨髄あるいは胎児肝臓より HSC を分離後，in vitro 培養を行い，上記 (a)，(b) と同様の実験を実施する。
(d) SIRT1 と USP10 の関連性探索
すでに SIRT1 の免疫沈降により，USP10 並びに G3BP の共沈が認められる結果を得ている。
そこで SIRT1 蛋白質が実際に USP10 の基質なのか，western blot 等で確認する。またスト
レス顆粒形成に SIRT1 が関与するか，SIRT1 ノックダウンまたはノックアウト細胞の蛍光
免疫染色等により検討する。
② USP10-KO マウスにおいて HSC が著減する分子メカニズムの解明
in vitro で培養した USP10 KO HSC は，サイトカイン除去ストレスに感受性が高く，WT にくらべ急速にアポトーシスに陥る (Higuchi M et al., Stem Cell Reports 2016)。このストレス感
受性が USP10 KO マウスにおける HSC の著減の原因となっている可能性がある。そこで上記①で同定した USP10 の基質蛋白が，サイトカイン除去ストレス応答に関与しているか解析する。具体的には USP10 基質蛋白のノックダウンあるいは過剰発現が，in vitro HSC のストレス応答性にどのような影響を与えるか解析する。さらにそれらの HSC を X 線照射したマウスに移植し，in vivo における造血能を検討する。
６．研 究 成 果
上記①に示した実験系では USP10 KO MEF と WT MEF のユビキチン化蛋白質の検出では顕著な増減は見られなかった。そこで実験計画を大幅に変更し，細胞レベルでの表現型を探索し，異常のある経路の蛋白質群に絞って解析することを試みた。USP10-KO MEF で慢性的な酸化ストレスが起きているかどうか検討するため，グルタチオン濃度を WT MEF と比較す
ると，有意にグルタチオンが減少していることを見出した。次にそのような慢性的な酸化ス
トレスが DNA 障害を引き起こす可能性について検討した。すなわち，USP10-KO MEF 細胞を用いて，USP10 のゲノム安定性維持および DNA２重鎖切断に伴う DNA 損傷応答への関与について検討した。γH2AX 染色，comet assay 法により DNA 損傷を解析したところ，
USP10-KO MEF では通常培養下においても DNA 損傷が頻発すること，さらに染色体不安定性の指標である微小核の形成頻度が増加することを見出した。細胞内の還元型チオールを十分に保つことで，酸化型システイン（シスチン）濃度を抑制するとされる L-アセチルシステ
インを添加したが，逆に gH2AX の増加を誘発しただけでなく，WT，KO 間の差も依然として観察された。そのため，このような自発的 DNA 損傷が酸化ストレスによるものという直接的証拠は得られなかった。その一方で，薬剤による DNA 損傷誘導後の DNA 修復を経時的に追跡すると，USP10-KO MEF では修復が遷延化していた。つまり USP10-KO 細胞では DNA
修復経路に異常をきたしていることが示唆された。このことは USP10-KO MEF は DNA 損傷
誘導剤に対して感受性が高いことと一致した。さらに，G1 期に同調した USP10-KO MEF では，WT 同様速やかに DNA 修復が行われる一方，非同調細胞でのカンプトテシン処理後のSister chromatid exchange 活性は，USP10-KO MEF で低下していた。以上より USP10 は DNA
損傷応答における相同組換えに重要な役割を担っており，USP10 の機能不全はゲノム不安定− 60 −

性の一因となりうることが示唆された。現在，相同組み換え修復蛋白質に USP10 の標的蛋白質がないか検討している。
７．研究の考察・反省本研究では，上記した“DNA 損傷応答の異常”という細胞レベルでの表現型が得られたため，その解析を主として行なった。そのため当初予定していた USP10-KO マウスの造血幹細胞を用いた ex vivo の実験系は用いなかった。そのような DNA 損傷応答の異常はファンコー
ニ貧血の原因蛋白質の変異でも生じること，それらの表現型は USP10-KO マウスの呈する骨髄不全と酷似している。そのため本研究成果は USP10 のマウス表現型とこれらの先行モデル
を関連し，位置づけることが可能となり，当初の目的である“USP10 による造血幹細胞の維持機構解明”のために重要な手がかりを得ることができたと考えている。また，“新規 USP10
標的蛋白の同定する”という当初の目的を達成するために，DNA 損傷応答蛋白質に照準を定め解析している。
８．研 究 発 表
特になし

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奥付
  平成  年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書
令和元年  月発行編 集   研究業績評価委員会      発行所   金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学  丁目  番地

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