平 成
年 度

21

金沢医科大学共同研究成果報告書・奨励研究成果報告書

２００９

平成２１年度金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

平成
年

23

月

10

平成２３年１０月

金沢医科大学

金沢医科大学はじめに
平成 21 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研
究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成 17 年度からは、奨励研究に萌芽的研究の枠を設けるなど研究の多様化にも対応しています。
平成 19 年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成 21 年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域では、共同研究に 12 件の申請があり 6 件を採択、奨励研究に 24 件の申請があり 10 件が採択されました。また、看護学領域では、共同研究に2 件の申請があり 1 件を採択、奨励研究に 2 件の申請があり 2 件とも採択されました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後、これらの共同研究と奨励研究を中心に学術研究が益々発展し、本学の研究基盤が充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員
会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

平成 23 年 10 月
金沢医科大学
学長

勝田

省吾

目

次

はじめに

平成 21 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2009－1.

抗がん剤感受性に関わる新しい分子細胞機構の解明とその耐性克服への応用研究代表者・元 雄 良 治 ····· 1

C2009－2.

全身性自己免疫疾患における血清デオキシリボ核酸分解
酵素 I（DNase I）に関する研究研究代表者・河 合 康 幸 ····· 9C2009－3.

医工連携による母－胎児間シグナル伝達機構を担う組織構築の解明
研究代表者・八 田 稔 久 ···· 13

C2009－4.

新規疾患、IgG4 関連多臓器リンパ増殖性疾患(IgG4+MOLPS)の確立のための研究研究代表者・梅 原 久 範 ···· 17

C2009－5.

53BP1 依存性 DNA 損傷修復経路阻害による癌治療のための基礎的研究
研究代表者・岩 淵 邦 芳 ···· 41

C2009－6.

重症心不全患者に対する心臓矯正ネット開発
研究代表者・秋 田 利 明 ···· 45[看護学領域]
C2009－7.

単科精神科病院における看護実習受け入れの影響－看護師の意識の変化より―研究代表者・長井麻希江 ···· 49

平成 21 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2009－1.

ヒト心房・心室筋由来バイオペースメーカーの作成と最適システム設計（Gene Therapy）に関する非線形力学的解析
研究代表者・倉 田 康 孝 ···· 53

S2009－2.

ガレクチン 9 によるウイルス増殖制御-細胞内因子としてのガレクチンの作用機構研究代表者・東海林博樹 ···· 69

S2009－3.

全身性自己免疫疾患における肥満因子(レプチン)に関する研究研究代表者・藤 田 義 正 ···· 73

S2009－4.

タイラーウイルス L 蛋白の持続感染における機能的役割の解析研究代表者・姫 田 敏 樹 ···· 75

S2009－5.

mRNA-タンパク質複合体の細胞内構造の解析研究代表者・石 垣 靖 人 ··· 109

S2009－6.

53BP1 による p53 非依存的転写調節機能の解明
研究代表者・松 井

S2009－7.

理 ···· 129

水輸送分子 aquaporin-1, -5 を標的にした
新規肺癌治療法の確立のための基礎研究
研究代表者・島 崎

S2009－8.

都 ··· 133

慢性疲労症候群の漢方治療における中枢神経系の再生機構研究代表者・守 屋 純 二 ··· 147

S2009－9.

レンチベクターシステムを用いた可溶型 VEGF 受容体産生機構の解明と産生制御法の確立
研究代表者・池 田 崇 之 ··· 151

S2009－10.

新生児中枢神経発達に影響を及ぼす母乳シグナル伝達物質の網羅的解析研究代表者・島村英理子 ··· 165

[看護学領域]
S2009－11.

プリセプターが捉える新人看護師が遭遇する
臨床判断の困難性研究代表者・北 村 佳 子 ···· 175

S2009－12.

高齢者施設における要介護高齢者の食事摂取状況と食事援助の実態調査
研究代表者・橋 本 智 子 ··· 179

平成 2１年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2009-1～6

看護学領域

C2009-7

１．研究課題名：抗がん剤感受性に関わる新しい分子細胞機構の解明とその耐性克服への応用（研究番号C2009-1）

２．キーワード: １）薬剤耐性 (drug resistance)２）ゲムシタビン (gemcitabine)３）膵癌 (pancreatic cancer)４）グリコーゲン合成酵素キナーゼ (GSK３β)
３．研究代表者：元雄

良治・医学部・教授・腫瘍内科学

研究分担者：島崎猛夫・医学部・講師・腫瘍内科学友杉

直久・総合医学研究所・教授・先進医療研究部門

石垣

靖人・総合医学研究所・講師・共同利用部門

源利成・金沢大学・がん研究所・教授・腫瘍制御研究分野

４．研 究 目 的
膵癌に対する第一選択の抗がん剤である塩酸ゲムシタビン(GEM)の奏効率は 20％以下であり、奏効率の改善や、新規分子標的薬などの開発が求められている。最近、我々は膵癌細胞において GEM により誘導される新規アポトーシス関連分子の発現変化や、GSK3β（glycogensynthase kinase ３β）が、がん細胞の生存・増殖に基幹的な役割を示すこと明らかにした。
これらの結果を基に、既に GSK３β を新しい治療ターゲットとした研究を進めている。我々は GSK3β 阻害剤(GSKI)と GEM の併用により、GEM への感受性が高まることを見出し、その併用効果を動物実験で確認している。
本研究では、がん細胞の GEM 耐性分子機構を修飾することにより、GEM の耐性克服と感受性向上の方策を考案・開発することを目的とする。
５．研 究 計 画
１）膵癌培養細胞のGEM感受性の検討と感受性規定因子の同定、GSKIの作用機序の解明：
ヒト膵癌由来培養細胞株(PANC-1)を、GEMで処理し、またGSKIの併用効果について解析し、それぞれのがん細胞の薬剤応答プロファイルを作成する。データマイニングについては、既に構築したバイオインフォマティクス解析システムを利用する。これにより見出される候補
遺伝子についてそれぞれRNA干渉法などの分子生物学的手法を用いてがん細胞における機能を解析する。また、これらの遺伝子の発現修飾によるGEMの薬効の変化を解析し、GEM感受性や耐性を規定する分子を同定する。さらに、これら分子の発現制御機構については、マイクロRNA (miRNA)アレイ法により解析する（担当 島崎・石垣）。
２）p53, c-myc, GSK3βに関する検討：それぞれに関して、ウエスタンブロッティング、免疫沈
降、RNA干渉などの手法を用いて、3者の関係、関連する遺伝子群との関係、上記1にて見出された候補遺伝子との関係などを明らかにする（元雄、源担当）。

‑ 1 ‑３）ヌードマウス移植膵癌・肺癌モデルにおける検討：膵癌培養細胞株のヌードマウス移植モデ
ルを作成し、GEMの全身投与に加えて、上記１で同定した因子の発現調節や、GSSIの投与（腹腔内）により移植腫瘍の増殖・浸潤・転移におよぼす効果と宿主（ヌードマウス）への有害事象を観察する（島崎・友杉）。
６．研 究 成 果１） 膵癌培養細胞の GEM 感受性の検討と感受性規定因子の同定、GSKI の作用機序の解明： すでに膵癌細胞と肺癌細胞について薬剤感受性を明らかにし、GEM 感受性や、GSKI の感受性及びその併用療法による相乗効果などを評価し、これらの機序に関係する遺伝子群を同定した。

２） p53, c-myc, GSK3β に関する解析：GEM の抗腫瘍効果には p53 と c-myc 関連遺伝子群が関与し、これらの発現は mRNA、蛋白レベルいずれにおいても、GSK3βにより修飾されることも見出している。GEM の感受性に影響し、GSKI が深く関与していると思われる遺伝子（TP53INP1）について、その重要な機能として、GEM による p53→p21 の活性化パスウェイの経路に深く関与し、TP53INP1 欠損細胞では、p21 の活性化が弱くなることを見出した。
３）ヌードマウス移植膵癌モデルにおける検討：計画の通りの治療処置後に各腫瘍を切除し、腫瘍組織を病理形態学的に検討すると同時に、PCNA 染色による増殖期細胞分画の計測、
TUNEL 法によるアポトーシス検出や、組織から高純度 RNA を調整し、GEM 耐性分子やアポトーシス関連因子群の発現を定量的 RT-PCR 法にて解析した。とくに GEM 単独群に比し、GSKI
併用群における腫瘍増殖の抑制・アポトーシス促進を見出した（投稿中）。
７．研究の考察・反省
GEM と GSKI の併用の分子細胞機構が明らかとなり、今後の臨床試験の基礎的エビデンスになると考えられた。また細胞内シグナル伝達経路に関する成果は、p21 の活性化に TP53INP1が重要な働きを持つことを示し、重要かつ新しい知見である。反省点としては多くの種類の膵癌培養細胞を用いた解析が不十分であったことである。
現在 GEM と GSK 阻害剤の併用療法の臨床試験を実施中である。また基礎研究としては、GEMが膵癌細胞のシグナル伝達経路の変化・形態変化などを惹起することと、癌細胞の悪性度の変化との関連性とその分子機構を明らかにしていきたい。
8．研 究 発 表
Xia QS, Ishigaki Y, Sun L, Chen R, Motoo Y: [Effect of anti-cancer drugs on the expressionof BIC/miR-155 in human pancreatic cancer PANC-1 cells].
Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2010; 90: 123-127. (in Chinese, MLDB)
Xia QS, Ishigaki Y, Zhao X, Shimasaki T, Nakajima H, Nakagawa H, Takegami T, Chen
ZH, Motoo Y: Human SMG-1 is involved in gemcitabine-induced primary
microRNA-155/BIC upregulation in human pancreatic cancer PANC-1 cells. Pancreas
2011; 40: 55-60. ( MLDB)
中谷 直喜：ゲムシタビン感受性の分子機構における TP53INP1 の意義. 金医大誌 2010; 35:
152-158.

‑ 2 ‑‑ 3 ‑

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‑ 8 ‑

１．研究課題名：全身性自己免疫疾患における血清デオキシリボ核酸分解酵素 I（DNase I）
に関する研究（研究番号C2009-2）

２.キーワード: １）全身性自己免疫疾患（systemic autoimmune diseases）
２）全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）
３）デオキシリボ核酸分解酵素 I（deoxyribonuclease I）
４) 診断マーカー（diagnostic marker）
５) 遺伝子多型（gene polymorphism）
３.研究代表者：河合康幸・医学部・講師・循環制御学（循環器内科学）

研究分担者：田中真生・医学部・准教授・血液免疫制御学（血液免疫内科学）

正木

康史・医学部・准教授・血液免疫制御学（血液免疫内科学）

梶波

康二・医学部・教安田

年博・福井大学・医学部・教授・病態遺伝生化学

授・循環制御学（循環器内科学）

４. 研 究 目 的全身性エリテマトーデス（SLE）や慢性関節リウマチ（RA）を含む全身性自己免疫疾患は、多様な臓器障害による多彩な臨床症状を呈し、迅速かつ適切な診断・治療が予後を左右する。またこれらの患者に対する長期ステロイド治療は様々な合併症を引き起こし、患者の生活の質を低下させる。既存の血清学的活動性マーカーによる、同疾患の活動性評価およびステロイド減量のための治療効果判定は、病態によっては適応できない場合もあり、より有用なマーカーが望まれている。
血清 DNase I レベルは、SLE 患者において健常者よりも低値であると報告されている。しかし SLE の活動性および治療効果と血清 DNase I との関連を調べた研究はほとんどない。また DNase I は遺伝的に決定される多型形質であり、3 つの多型（1 型、1-2 型、2 型）に分けられる。本研究の目的は①全身性自己免疫疾患における血清 DNase
I レベルと活動性や様々な臓器症状との相関を検討し、さらに診断マーカーとして
DNase I の実用化を図ること、②DNase I タンパクの多型が特定の全身性自己免疫疾
患患者の遺伝的危険因子となり得るか検討することである。

５. 研 究 計 画
１）全身性自己免疫疾患患者の活動性の評価および検体採取
血液免疫内科外来および病棟において、全身性自己免疫疾患患者を治療前後で活動性を評価するとともに、経静脈的に患者血清試料を採取し、血清分離後、活性測定および DNase I 多型決定まで－80℃の超低温庫で保存する。（田中、正木）
２）DNase I 活性測定および DNase I タンパク型判定‑ 9 ‑前項で得られた超低温庫の保存血清試料の DNase I 活性を single radial enzyme
diffusion method にて測定する。またヒト DNase I 抗体を用いて酵素免疫測定法により DNase I 濃度を測定する。さらに同じ試料を等電点電気泳動で分離し、活性染色法により型判定を行う。（安田）３）全身性自己免疫疾患患者の DNase I レベルの検討
前項で得られた結果から全身性自己免疫疾患と血清 DNase I 活性の関連を検討する。検討した全身性自己免疫疾患は SLE、関節リウマチ（RA）およびシェーグレン症候群（SjS）である。
４）血清 DNase I レベルと全身性自己免疫疾患患者の活動性および治療効果との相関
対象患者の活動性評価は既存の標準的方法（SLE では SLE 活動性指数：SLEDAI法）を用いて行い、治療効果判定はこれらの活動性指標に臨床症状を加え、総合的に膠原病専門医が行う。得られた結果から血清 DNase I レベルと活動性、治療効果との相関を評価し、既存の血清学的マーカーとの比較も行い、統計学的処理により
DNase I の全身性自己免疫疾患における活動性マーカーとしての有用性を立証する。
（田中、正木、梶波、河合）
５）血清 DNase I 活性と濃度の相関
中央検査室での DNase I 測定実現化のため全身性自己免疫疾患患者における血清
DNase I 活性と濃度が相関することを検証する。（安田、河合）
６）全身性自己免疫疾患における遺伝的危険因子としての DNase I 多型の検討得られた結果と健常日本人における DNase I 多型の頻度を比較することで、あるタンパク型が、全身性自己免疫疾患の遺伝的危険因子であるか検討する。またこの多型と血清 DNase I レベルや臓器障害との関連も検討する。（田中、正木、梶波、河合）

６． 研 究 成 果１）全身性自己免疫疾患患者の DNase I レベルの検討
測定した血清 DNase I 活性（Mean±SD）は SLE 患者（N=34）8.5±2.7 U/L、
RA 患者（N=21）12.2±2.8 U/L、SjS 患者 10±2.8 U/L であった。また健常人（N=70）の血清 DNase I 活性は 11.7±3.6 U/L で SLE 患者の血清 DNase I 活性は有意に健常人より低値であった（P<0.001）。他の全身性自己免疫疾患である RA や SjS 患者の血清 DNase I 活性は健常人の値と有意差は認められなかった。
２）血清 DNase I レベルと全身性自己免疫疾患患者の活動性および治療効果との相関
上記の結果より、SLE 患者の活動性 SLEDAI 法で評価し、血清 DNase I 活性との関連を検討した。SLEDAI 法で SLE の活動性をスコアー化し 0～2 が inactive、
3～5 が mild active、6 以上が active と 3 群化した。血清 DNase I 活性は inactive
群 11.9±3.0 U/L、mild active 群 8.6±2.4 U/L、active 群‑ 10 ‑

7.0±1.3 U/L であり、

SLE の活動性が高くなるにつれて、血清 DNase I 活性は低値になる傾向が認められた。Inactive 群の血清 DNase I 活性は健常人と比較して有意差は認められなかったが、mild active 群や active 群と比較して有意に高値であった（それぞれ P<0.001、
P<0.05）。ただし mild active 群と active 群の間には血清 DNase I 活性は有意差が認められなかった。個々の症例においても活動性と血清 DNase I 活性の相関が認められ、臨床血清学的な活動性マーカーである抗 DNA 抗体や補体との相関が認められた。さらに治療効果に応じて血清 DNase I 活性も変動していた。
３）血清 DNase I 活性と濃度の相関
血清 DNase I 活性と濃度に有意な相関は認められなかった。
４）SLE と DNase I 遺伝子多型
SLE 患者 31 例で DNase I 遺伝子多型を決定し、健常人との比較検討を行った。
健常人と比較して SLE 患者では 2 型の割合が多く、対立遺伝子頻度では DNASE1*2
が SLE 患者で健常人と比べ有意に高値であった（SLE 患者：48%、健常人：44%、
P<0.05）

７．研究の考察・反省
今回の結果から血清 DNase I 活性が SLE 活動性の新たな指標となる可能性およびDNase I 遺伝子多型 2 型が SLE 発症の危険因子である可能性が示唆された。今後は症例数を増やして SLE 患者における血清 DNase I 活性の有用性をさらに検証するとともに、活動性による血清 DNase I 活性変動のメカニズムについて研究を進めていきたい。また中央検査室レベルでの活性測定の開発を行なう。

8． 研 究 発 表三木美由貴

全身性エリテマトーデス（SLE）における血清デオキシリボ核酸分解

酵素 I（DNase I）に関する研究.

金医大誌‑ 11 ‑

2010; 35: 159-165.

１．研究課題名：医工連携による母－胎児間シグナル伝達機構を担う組織構築の解明（研究番号C2009-3）

２．キーワード：１）胎盤（placenta）
２）栄養膜（trophoblast）
３）胎盤関門（placental barrier）
４）透過型電子顕微鏡（transmission electron microscope）
５）画像解析（imaging analysis）
３．研究代表者：八田稔久・医学部・教授・分子細胞形態科学(解剖学Ⅰ)研究分担者：渡辺弥壽夫・金沢工業大学・情報学部・教大谷浩・島根大学・医学部・教授・情報学系情報工学科

授・発生生物学

島田ひろき・医学部・講師・分子細胞形態科学(解剖学Ⅰ)

島村英理子・医学部・講師・分子細胞形態科学(解剖学Ⅰ)

４． 研 究 目 的
我々は、インターロイキン 6 ファミリーサイトカインの一つである白血病抑制因子（LIF）のシグナルが、胎盤を介して母から胎児へ伝達され、大脳皮質ニューロン産生に協調的に作用することを明らかにした（Shimanura et al., 2010）。このシグナル伝
達過程では、分子の乗り換えにより情報のみが胎児に伝達される。すなわち、胎盤は母と胎児をまたぐ情報のトランスミッターと位置づけることができる。しかし、従来の血液－胎盤関門の概念をもっては、この機能を合理的に説明することができない。
母親由来の情報伝達分子が、絨毛細胞からセカンドメッセンジャーを誘導し、それが特定のトラフィッキング・システム無しに、極めて短時間に 6 層からなる胎盤関門を通過するとは考えにくいからである。我々は、母体血と胎児由来の毛細血管が、胎盤
絨毛のただ一つの細胞（合胞体性栄養膜）によって直に連絡されることを示唆する所
見を得ており、それが前述の機能と形態の乖離に対する回答になると期待される。本
研究課題では、母－胎児間の情報ネットワークにおける組織学的なバックボーンを明らかにするとともに、血液－胎盤関門の新しい概念を提唱することを目的とする。
５． 研 究 計 画
妊娠各時期の胎盤絨毛について、完全連続超薄切片の作成と透過型電子顕微鏡（TEM）による観察を行い、得られた画像を立体再構築する。最終的に、血液－胎盤関門の 3 次元モデルを作成し、栄養膜合胞体細胞が母体絨毛血液間腔（母体側）と胎児血管を繋いでいることを証明する。
以下の 3 項目が研究の主たる課題である。
（１）連続超薄切片の安定したプレパレーション法の確立
100 枚以上の連続超薄切片を安定して回収できる方法論を確立する。
（２）TEM およびレーザー顕微鏡観察
複雑な細胞境界を自動的に抽出するアルゴリズムに適した電顕標本の前処理法を検討する。

‑ 13 ‑

（３）組織像の 3 次元立体再構築
得られた TEM 画像データをもとに立体再構築を行うための画像処理法の検討を行う。

６． 研 究 成 果
１） 連続超薄切片の安定したプレパレーション法の確立
H20 年度の検討により、大型の孔を有する電顕用 4 分割ワイドメッシュ（1 マス：333
×250μm）を用い、薄切された切片の形状がメッシュ孔のサイズに合うようにブロックをトリミングすることで、複数枚の超薄切片を一枚のグリッドに乗せてゆく方法により、100 枚を超える連続切片を安定して確保することが可能となった。この方法では、複数枚の超薄切片が一枚のグリッドに乗っているため、撮影のためのグリッド交換回数を減らすことができ、その結果、大幅に作業効率を改善することができた。電顕切片の作成・回収については、当初の目標を達成することができた。
２） TEM用標本の前処理による観察画像のハイコントラスト化
常法どおりの電顕標本染色法では胎盤絨毛組織の細胞境界のコントラストが低く、細胞膜を抽出する画像処理アルゴリズムを適用するための画質としては不十分であることが分かった。このため、標本作成段階で、酢酸鉛によるブロック染色を追加し、膜系のコントラストを上げる処理を施した。その結果、良好なハイコントラスト画像がえられ、画像解析処理に耐えうる標本作製法が確立した。
３） TEM画像のデジタル化
本学現有のデジタル TEM を用いて撮像したところ、複雑な細胞境界を描出するには解像度が足りないことが分かった。撮影ソフトに付属する機能を使ってタイリング撮影も検討したが、一枚の完成画像取得に大変長い時間かかるうえに、電子線による切片の破損が生じるため、低倍撮影が可能な TEM を用いて従来どおりフィルムで撮影したほうが良いことが分かった。さらに、撮影倍率 800-1000 倍の電顕フィルムをフラットベッド型
スキャナによりデジタル化(16bit, 2400 dpi)し、画像処理用データ・ライブラリとした。
この条件でフィルム画像をデジタル化したものは、本学に設置されているデジタル TEMで撮影した画像よりも高精細であり、微細構造の抽出に適していることが確認された。
４） TEM画像の連続二次元観察
血管内皮と胎盤絨毛表層にある合胞体層が一つの細胞でつながっていることを示す所見が得られた。
５） 高精度連続スケール断面画像の統合技術の開発
Watershed アルゴリズムを用いた領域抽出法と V-Cat ソフトウエアを用いた 3 次元画像統合法を組み合わせて、胎盤の 2 次元デジタル連続画像から 3D モデルを自動的に作成するための基礎技術を確立することができた。

‑ 14 ‑

７．研究の考察・反省（１）超薄切片プレパレーション技術
本研究課題において最も技術的難易度が高く、研究遂行の上での律速段階と想定されていた「広視野」かつ「数百枚以上のオーダーでの安定した連続超薄切片」の作成方法
については、本研究課題の開始前年度から初年度までに行った様々な試行錯誤の結果、安定して（損失率 10％以下、連続 100 枚以上）連続切片が得られる方法論が概ね確立された。今回採用した方法では、支持膜を用いずに、グリッド枠で切片を保持するため、グリッド枠に接着する部位は観察不能となるため、視野の狭小化を避けることができな
い。また、切片中央付近には支持する構造物が無いため、切片のたわみが生じやすい欠点も認められた。当初採用していた、グリッドに支持膜を貼る方法では、うまく切片をすくえば全視野の観察が可能であるという利点を持つ。しかし、作成される支持膜のク
オリティをコントロールすることが困難なため、せっかく連続切片を作成しメッシュ上に回収しても、支持膜が厚すぎるためコントラストが極めて低い像しか得られないことがしばしば認められるなど、安定した画像の取得が困難であった。本研究の目的である
母体側と絨毛血管を結ぶ組織構築の全景を描出するためには、高倍率かつ広視野での観察という背反する条件の克服が必須であるため、現在持いている大口径グリッドにクオ
リティの高い支持膜を安定して作製する技術の開発が必要であると考えられた。
（２）画像処理法
ミクロレベルからマクロレベルまでの連続スケールの連続断面像情報を有する 3 次元モデルの構築を自動化するためのシステム開発を目指して研究を行った。今回の研究によって、ミクロレベルの高精度連続断面画像を対象に、画像統合と立体構築のための基礎技術を開発することができた。
連続 TEM 画像に対する統合的な画像処理システムの研究開発は、共同研究者・渡辺の研究室の卒業研究および大学院生の研究テーマとして採用されており、金沢工業大学と金沢医科大学で締結した医工連携の実践という観点からも、有意義な取り組みがなされていると評価される。
８． 研 究 発 表
Shimada H, Hirai K-I, Simamura E, Hatta T, Iwakiri H, Mizuki K, Hatta T,
Sawasaki T, Matsunaga S, Endo Y and Shimizu S: Paraquat toxicity induced byvoltage-dependent anion channel 1 acts as an NADH-dependent oxidoreductase. J
Biol Chem 2009; 284: 28642-28649 (MLDB)
Simamura E , Shima da H , Higashi N, Uchishiba M, Otani H , Hatta T :Maternal leukemia inhibitory factor (LIF) promotes fetal neurogenesis
via a LIF-ACTH-LIF signaling relay pat hway. Endocrinology. 2010; 151:
1853- 186 2 . (MLDB)‑ 15 ‑

１．研究課題名：新規疾患、IgG4 関連多臓器リンパ増殖性疾患(IgG4+MOLPS)の確立のための研究（研究番号C2009-4）

２．キーワード：１）細胞・組織 (cell・tissue)２）生体分子 (biomolecule)３）自己免疫性疾患 (autoimmune disease)４）IgG4
３．研究代表者：梅原研究分担者：竹上岡崎
吉野久範・医学部・教授・血液免疫制御学（血液免疫内科学）

勉・総合医学研究所・教和一・関西医科大学・教授・分子腫瘍学研究部門
授・消化器内科学

正・岡山大学大学院医歯薬学総合研究科・教授・病理学

４． 研 究 目 的
IgG4 関連多臓器リンパ増殖性症候群(IgG4+MOLPS)は、血清 IgG4 高値を特徴としたリンパ増殖性の疾患で、リウマチ膠原病領域および自己免疫性膵炎の領域で注目を浴びている。当疾患の報告や解析は本邦が世界に先んじているが、この病態を全身性疾患として捉え組織的な解析を行っているのは日本のグループのみで、私は、日本シェーグレン研究会のメンバーを中心にリウマチ膠原病領域に加え、眼科、口腔外科、消化器内科、腎臓内科、呼吸器内科、病理医、基礎研究者など領域の異なる医師と研究者がチームを作り、疾患概念を確立し、日本初の新たな疾患単位として世界に発信するため、厚生労働省難治性疾患研究班を組織し、その研究班班長を務めている。当共同研究チームは、厚生労働省難治性疾患研究班で得られた解析結果や収集サンプルを
DNA micro array 解析およびプロテイミクス解析を用いて、IgG4 関連疾患の原因関連
遺伝子および関連蛋白を同定しようと試みた。
５． 研 究 計 画
梅原らを中心にした厚生労働省難治性疾患研究班は、班研究の一環として，年間 100
例程度の登録を呼びかけ、IgG4 関連疾患の特徴をさらに明確にした。研究期間を通じて，
DNA micro array 解析，蛋白 SELDI-TOF-MS 解析により免疫グロブリン IgG4 の病因的意義を明らかにする．そのために，竹上勉教授（金沢医科大学分子腫瘍学研究部門）を中心による病因病態解析グループをした。登録症例で使用可能な病理検体のあるものに関して、以下の検索を行なった。
（１）DNA 解析：新たに登録され SRL から DNA 分離後送付されてきた検体については、IgG4 関連全身性疾患の診断確定後、Sjögren 症候群典型例および健常人の末梢血 DNA を対照として DNA micro-array にて遺伝子発現プロファイルを解析する。

‑ 17 ‑

(a) 組織・細胞からの RNA の抽出には RNA 抽出キット RNeasy（QIAGEN）を利用して行う。
(b) 得られた RNA を用いて RT-PCR あるいは定量性のあるリアルタイム PCR（装置 7900HT(AB)）
を行い、発現 mRNA 量、差異を測定する。
(c) 各種遺伝子の発現レベルを網羅的に解析するためには、抽出 RNA に標識等を施し、DNA チ
ップ法ーマイクロアレイ(Affymetrix)を活用する。
(d) この際に、網羅的解析では、費用および時間的に、有用な情報を得ることが困難と思われる。従って、1）炎症関連遺伝子群、2）サイトカイン遺伝子群、3）ケモカイン遺伝子群、
4）B 細胞のクラススイッチに関連する遺伝子群などの着目し解析を行う。
（２）MALDI-MS/MS 解析：新たに登録され SRL から血清分離後送付されてきた検体については、
分画をトリプシン処理し MALDI-MS/MS（AXIMA-TOF/TOF、島津）で配列解析し同定する。
(a) 最終分画に含まれる標的蛋白質は、トリプシンなどの酵素を用い断片化し、得られた複数のペプチドの質量を島津製作所の AXIMA-TOF/TOF にて測定し、ゲノム情報などに基づいて作製されたタンパク質データベースと照合し、PMF (peptide massfingerprinting)法で同定する。
(b) PMF に加え、AXIMA-TOF/TOF および nanoFrontier（LC-MS/MS）で蛋白質/ペプチドを同定する。
(c)より病態と関連した蛋白同定を行うために，同一症例で経時的にステロイド治療前後あるいは経過的に採取できた血清について SLEDI-TOF-MS 解析を行う。

６． 研 究 成 果（１）DNA マイクロアレイ分析にて患者 2 人のステロイド治療前後で、発現量が 3 倍以上変化のあった遺伝子を 36 個抽出した。また患者 2 人の治療前後 4 検体と健常人 4 人間で、発現量が 3 倍以上の差を認めた遺伝子を 21 個抽出した。
DNA マイクロアレイで抽出した遺伝子の中から、Charcot-Leyden crystal protein (CLC) 、
interleukin 8 receptor alpha (IL8RA) 、 interleukin 8 receptor beta (IL8RB) 、
membrane-spanning 4-domains subfamily A member 3 (MS4A3) 、defensin alpha 3 (DEFA3) 、defensin alpha 4 (DEFA4) においてリアルタイム PCR にてバリデーションを行なった。
MS4A3、DEFA3、DEFA4 では患者治療前後において、治療前で発現が有意に低く、患者健常
人間においても患者群で発現が有意に低かった。CLC、IL8RA、IL8RB では患者健常人間においては患者群で発現が有意に低かったが、患者治療前後においては発現に有意差は認めなかった。
（２）蛋白解析の結果、IgG4 関連疾患治療前の血清では IgG1, IgG4, Ig lambda 鎖, Ig kappa
鎖の増加、Alpha-1 antitrypsin, Apolipoprotein, Complement4, C1q, Serum amyloid A
protein precursor などの炎症性因子の増加、免疫システム調節に関連する Clusterin、
IgG4 関連疾患と同様に、血清 IgG4 値が上昇する皮膚自己免疫疾患として報告されている‑ 18 ‑

天疱瘡の病因因子である Desmoglein の増加が認められた。コントロールに用いた健常人
では、IgG4 などの免疫グロブリンや補体の増強は確認されず、IgG4 関連疾患由来の血清
では、コントロールに比べ、異なる発現パターンを示した。

７．研究の考察・反省
今回、IgG4 関連疾患患者の末梢血単核球における mRNA 量を網羅的に解析し、その病態解明を試みた。その結果、健常人と比較し IgG4 関連疾患患者では、上記の遺伝子の発現異常が確認された。また、IgG4 関連疾患において疾患特異的に変動するタンパク質の網羅解析では、上記の候補蛋白が抽出できた。IgG4 関連疾患の病態には、プロテアーゼ/プロ
テアーゼ阻害物質の均衡がクラススイッチの誘導に関与し、IgG4 合成の制御に関連している可能性が示唆されるが、その詳細な機序は不明である。今後、全患者において、上記の遺伝子群や蛋白群の検討を行う予定である。

８． 研 究 発 表
MasakiY,

KuroseN,

UmeharaH.

IgG4-relateddisease:A

novel

lymphoproliferative disorder discovered and established in japan in the 21st
century. J Clin Exp Hematop, 2011; 51(1): 13-20.（MLDB）
Masaki Y, Iwao H, Nakajima A, Miki M, Sugai S, Umehara H. IgG4-relateddisease (IgG4+MOLPS)-diagnostic criteria and diagnostic problems. Current
Immunology Reviews, 2011; 7: 172-177.（MLDB）
Masaki Y, Sugai S, Umehara H. IgG4-related diseases including mikulicz's disease
and sclerosing pancreatitis: diagnostic insights. J Rheum, 2010; 37: 1380-1385.
（MLDB）

中島章夫

岩男遥

IgG4 関連疾患のトランスクリプトーム解析. 金医大誌 2010; 35: 89-96.
IgG4 関連疾患のプロテオミクス解析. 金医大誌、2010; 35: 131-139.

‑ 19 ‑

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１．研究課題名：53BP1 依存性 DNA 損傷修復経路阻害による癌治療のための基礎的研究（研究番号C2009-5）

２．キーワード：１）DNA 二本鎖切断（DNA double-strand break）
２）放射線照射（X-irradiation）
３）非相同末端結合修復（non-homologous end joining）
４）DNA ligase 4５）53BP1

３．研究代表者：岩淵邦芳・医学部・教授・ゲノム医科学（生化学 I）

研究分担者：橋本光正・医学部・助教・ゲノム医科学（生化学 I）

松井理・医学部・助教・ゲノム医科学（生化学 I）

渡邉

直人・医学部・教高野

文英・金沢大学大学院自然科学研究科・薬学系・准教授

授・放射線診断治療学（放射線医学）

４． 研 究 目 的
X 線照射により発生する DNA 二本鎖切断(double-strand break：以下 DSB)に対して細胞は、非相同末端結合、相同組み換えの 2 つの修復経路を備えている。前者は、G1期を含めたすべての細胞周期に機能しているが、後者は、DNA 複製時の姉妹染色分体を鋳型として損傷部位を修復するため、S、G2 期にしか機能しない。これを細胞周期側からみると、G1 期には 2 つの修復経路のうちの一方、非相同末端結合修復経路しか機能していないことになる。これまで非相同末端結合修復経路は、DNA-PK/Ku70/Ku80
複合体が DNA 断端を認識し DNA ligase 4 が断端を連結する経路（以下 classic 経路）
ひとつしかないと考えられていた。研究代表者が見出した 53BP1 は、DSB の発生に伴い速やかに DSB 部位に集積することから、DSB の修復に関与することが想定された。
研 究 代 表 者 は こ れ ま で 、 遺 伝 子 欠 損 細 胞 を 用 い た 遺 伝 学 的 解 析 か ら 、 ① 53BP1 がclassic 経路とは別の経路で非相同末端結合に関与していること、②53BP1 依存性非相
同末端結合修復経路（以下 53BP1 経路）においても、最終的には DNA ligase 4 で断端を連結すること、③classic 経路と 53BP1 経路の両者を同時に不活性化すると、G1 期
細胞は DSB を修復することができず X 線に対して極めて高感受性となることを見出した。本研究は、53BP1 経路の本態を明らかにするとともに、そこで得られた知見をもとに G0-G1 期で停止しているため既存の抗癌剤が効かない休眠中（dormant）の癌細胞を標的とする新たな抗癌療法を開発することを第一の目的とした。
一方 53BP1 は、DSB 部位に集積し個々の DSB に対応する点状物(dot)を形成する。この性質を利用すると、光学顕微鏡を用いて核に存在する DSB 数を容易に定量することができる。放射線内部照射による癌治療においては、かなりの程度の治療後骨髄抑‑ 41 ‑

制がみられる。しかし各症例において、骨髄抑制の程度を放射線内部照射後直ちに予測することはできない。本研究は、放射線内部照射直後の患者末梢血リンパ球の 53BP1dot 数を数えることによる 造血細胞に対する 新たな DNA 損傷定量法を開発し、さらにこれを用いて、照射数週後に発生する骨髄抑制の程度を予見できるかどうかを明らかにすることを第二の目的とした。
５． 研 究 計 画
第一目標は、岩淵、橋本、松井、高野が担当した。研究期間中に、ユビキチン E3リガーゼである Rad18 依存性に 53BP1 がモノユビキチン化されることが明らかになった。そこで、53BP1-/-および Rad18-/- マウス胎児線維芽細胞を用いて 53BP1 経路における Rad18 の役割、53BP1 モノユビキチン化の意義を調べた。また、53BP1 経路を特異的に阻害する薬剤の発見を目的に、高野から天然物質のライブラリーの供与を受け、岩淵、橋本が 53BP1dot の形成を阻害する物質のスクリーニングを行った。
第二目標は、岩淵、渡邉が担当した。正常人の末梢血リンパ球に X 線照射を行った
後、リンパ球の 53BP1dot を検出し、線量と DSB 数との関係をあらわす標準曲線の作製を行った。また、放射線内部照射治療を受けた患者さんから末梢血リンパ球を採取し、実際に患者リンパ球に 53BP1dot が見られるか否かを確認した。
６． 研 究 成 果
ユビキチン E3 リガーゼである Rad18 が、53BP1 と同様に、細胞への X 線照射に反応して DSB 部位に集積し dot を形成することを見出した。X 線による Rad18 の dot 形成
は G1 期細胞においてのみ 53BP1 依存性であり、さらに Rad18 と 53BP1 との結合依存性であった。Rad18 は、in vitro で 53BP1 の 1268 番目のリジン残基をモノユビキチ
ン化し、さらに、Rad18 は 53BP1 のモノユビキチン化を介して 53BP1 の dot を安定化させた。53BP1 および Rad18 は、G0-G1 期細胞に発生した DSB の修復を亢進させた。
Rad18 による DSB 修復の亢進には 53BP1 と Rad18 の結合、Rad18 による 53BP1 のモノ
ユビキチン化が必要であった。以上より、G0-G1 期細胞において Rad18 は、53BP1 との結合を介して DSB 部位に集積し、その後 53BP1 をモノユビキチン化することにより
53BP1 の DSB 部位でのクロマチン結合を安定化させ、その結果 53BP1 による DSB の修復を亢進させることが示唆された。

骨肉腫細胞株 U2OS に、蛍光物質 EGFP を融合させた 53BP1 を発現させるプラス
ミドを導入し、EGFP-53BP1 を恒常的に発現する細胞クローンを作製した。これにより、生細胞の 53BP1dot 形成を蛍光顕微鏡下で容易に観察できるようになった。
X 線照射後の 53BP1dot 形成を阻害する物質の、天然物質ライブラリーからのスク
リーニングを開始した。最初の 9 物質については、53BP1dot 形成を抑える活性が見いだせなかった。

‑ 42 ‑

健常者 7 人より末梢血リンパ球を採 取し、異なった線量の X 線照射を行い、照射量とリンパ球に発生する DSB 数の関係を表す標準曲線を作製した。末梢血リンパ球 の 場 合 、 DSB の 検 出 に は 、 53BP1 よ り リ ン 化 H2AX の ほ う が 有 利 で あ っ た 。
I-131MIBG を用いた放射線内部照射治療後の患者さん 1 人から末梢血リンパ球を採取し、抗リン化 H2AX 抗体で DSB の検出を試みたところ、DSB が検出された。
７．研究の考察・反省
53BP1経路 は、 classic経路と異なりリン酸化の制御を受けていないことが予想されていた。今回Rad18 が、53BP1 のモノユビキチン化を介して 53BP1 経路を制御していることが明らかになった。我々は以下のようなモデルを提唱する。1)G0-G1 期細胞においてRad18 は、53BP1 との直接結合を介してDSB部位に集積し、dotを形成する。
2)Rad18 はDSB部位で 53BP1 のK1268 をモノユビキチン化する。3)モノユビキチン化された 53BP1 は可動性が減少し、DSB部位でのクロマチンとの結合がより強固となる。
4) Rad18 は、53BP1 経路でDSBの非相同末端結合修復に関与している。
モノユビキチン化を介した DNA 損傷修復経路の制御としては、シスプラチンなど DNA
クロスリンンカーによる DNA 損傷の修復経路での FANCD2 が知られている。紫外線による DNA 損傷、DNA 複製阻害による DNA 損傷など、他の DNA 損傷に対する修復経路においても同様な制御機構が働いている可能性も考えられる。
53BP1 経路に関する新たな発見があったため、当初の計画とやや異なった研究内容になってしまった。特に 天然物質ライブラリーからの 53BP1dot 形成阻害物質のス

クリーニングの進行が不十分であった。
８． 研 究 発 表なし‑ 43 ‑

１．研究課題名：重症心不全患者に対する心臓矯正ネット開発（研究番号

C2009-6）

２．キーワード：１）重症心不全（Heart failure）
２）心臓リモデリング（Cardiac remodeling）
３）心臓矯正ネット（Cardiac supporting net）
４）心臓 3 次元モデル（Cardiac 3D model）
５ ） 心 臓 有 限 要 素 法 シ ミ ュ レ ー シ ョ ン （ Cardiac Finite element
analysis）
３．研究代表者：秋田研究分担者：山部利明・医学部・教授・心血管外科学(胸部外科学)

昌・金沢工業大学・工学部・教授・機械工学瀬戸雅宏・金沢工業大学・工学部・特別研究員･機械工学

倉田康孝・医学部・准教授・生理機能制御学(生理学Ⅱ)

勝田省吾・医学部・教授・腫瘍病理学(病理学Ⅱ)

４． 研 究 目 的
心不全患者では収縮力の低下を補うためより拡大した状態で収縮・弛緩を繰り返す
が、この代償機転は心拡大の進展（心臓リモデリング）とともに破綻し、心不全の進行や致死的不整脈の合併により毎年米国で 5 万人が死亡する。この心臓リモデリングの進展防止が重症心不全治療の鍵となっている。本研究は、重症心不全患者の心臓リモデリングに対する新しい治療法としての心臓矯正ネットの設計手法の開発と慢性心不全モデルでの有効性の検証を行い、臨床応用までの基礎データをそろえることにある。

５． 研 究 計 画
金沢工業大学と共同で、心臓矯正ネット最適化設計のための、有限要素法を用いた
心臓拡張期・収縮期の壁張力シミュレーションプログラムの開発を行う。具体的には
金沢医科大学心臓血管外科教室で、(1)慢性心不全モデルブタの作成と収縮能・拡張能の評価、(2)心臓矯正ネット装着時の収縮能・拡張能の変化の評価と至適サイズの決定、(3)食道心 エコーを 用 いて右心 室 ・左心室 の 壁運動を 記 録し、壁 運 動解析プ ロ グラム（Philips 社製 QLAB）を用いて壁歪み計測と壁張力の計算を行う。これらの結果を用いて正常心および不全心での拡張期・収縮期の心筋物性値を割り出す。次に金沢工業大学（山部昌教授）で(1) 有限要素法プログラム（ANSYS）を用い、心不全ブタと同じ形状・サイズの 3 次元心臓モデルを作成する。 (2)動物実験で得られた拡張期と収縮期の心室形状、心内圧から心室壁張力を計算し、有限要素法によるシミュレーション
結果と照合する。(3)コンピュータ編み機で製作された心臓矯正ネットを装着した場合‑ 45 ‑

C:\Documents and Settings\user242\デスクトップ\239787-医科大 共同研究成果報告書\C2009-6 秋田修正.docxの拡張期および収縮期の壁応力の変化をシミュレーションする。 (4)有限要素法における各要素の変形量を元に心臓全体の圧容量曲線の変化をシミュレーションし、一回拍出量が維持された状態で心室壁張力が最小となるネットの形状とサイズ（厚さ・強さ）を決定する。これらの結果から、任意の形状・大きさの心不全心に対して至適な心臓矯正ネットの設計が可能となる。平行して、慢性心不全モデルに対して心臓矯正
ネット装着群と非装着群に分け、心臓矯正ネットの慢性効果を急性実験同様に圧容量曲線を用いて検証する。実験終了後心臓を取り出し組織切片を作成し、心筋変性の程度（心筋細胞脱落・繊維化、Matrix Metalloproteinase ２&９)を評価し組織学的な検討も行う（金沢医科大学病理 II ,勝田教授指導）。最終的には、実際の心不全患者の心臓の収縮期・拡張期の 3 次元画像を MRI もしくは造影 CT を用いて抽出し、患者個人の心臓 3 次元モデルを作成、有限要素法を用いて心臓矯正ネットの装着前後の心拍出量の減少が許容できる範囲（10%減）で心室壁張力が最小となるネットの形状・サイズ（厚さ・強さ）をシミュレーションし、最適なネット設計を行うプログラムを作成することを目標とする。また、不全心（心臓矯正ネット装着前後）に生じる致死的不整脈に適切に対処するため、心不全における不整脈の発生機序とその最適制御方法をコンピュータ・シミュレーションにより解析し、制御理論の妥当性を実験的に検証する（金沢医科大学生理機能制御学・倉田担当）。

６． 研 究 成 果【金沢医科大学心臓血管外科担当分】
1）心臓矯正ネットの正常心に対する収縮能、拡張能に及ぼす影響を検討した。ブタの右心室、左心室に圧容積測定カテーテルを留置し、右室・左室圧容量曲線を計測した。Just
fit の心臓矯正ネットから 5％ずつサイズを縮小し、心臓矯正ネットの正常心に対する収縮能、拡張能に対す効果を検討した（Phase I study）。右室に対する拡張障害（拡張時定数τ、minimum dp/dt）が左室より早期出現することを明らかにした（2010.3.7 日
本循環器学会総会で発表）。
2）次に心臓矯正ネットの慢性心不全心に対する収縮能、拡張能に及ぼす影響を検討した。
高頻度心房刺激（200bpm）3 週間によるブタ慢性心不全モデル（LVEF 20% , LVEDV 200%）を作成し、右心室、左心室に圧容積測定カテーテルを留置し、右室・左室圧容量曲線を計測した（Phase II study）。正常心同様 Just fit の心臓ネットから 5％ずつサイズを縮小し、心臓矯正ネットの収縮能、拡張能に対す効果を検討した。正常心では収縮能（Emax）に対する効果は明らかでなかったが、慢性心不全心では心拍出量は減少するものの収縮能（Emax）は有意に改善した。正常心同様右心室に対する拡張障害（拡張末期
圧容積関係）が左室より早期出現することを明らかにした（2010.10 月 日本胸部外科学
会総会）。
3）心臓矯正ネットの慢性心不全に対する Reverse remodeling 効果を検討した（Phase III‑ 46 ‑

C:\Documents and Settings\user242\デスクトップ\239787-医科大 共同研究成果報告書\C2009-6 秋田修正.docx

study）。 ビ ー グ ル 犬 を 用 い 左 開 胸 、 冠 動 脈 結 紮 に よ る 後 下 心 筋 梗 塞 に よ る 虚 血 性 心 筋症・僧帽弁閉鎖不全モデルを作成した。対照群と心臓矯正ネット装着群の 2 群に分け、ネット装着群は心筋梗塞作成 1 週間後に再開胸し Just size の心臓矯正ネットを装着する。3 ヶ月後、胸骨正中切開を行い、右心室・左心室圧容積計測用カテーテルを挿入し、心臓矯正ネットの両心室収縮能、拡張能に対する Reverse remodeling 効果を検討した。
実 験 終 了 後 、 心 臓 を 摘 出 し 、 心 臓 の Remodeling と 密 接 に 関 係 す る Matrix
metallo-protease 9 のタンパク発現（Western blot）を検討した。心臓矯正ネット群で心臓の拡張（左室拡張末期径、左室収縮末期径）が抑制され、収縮能（Emax, LVEF）が改善されることを明らかにした。また非梗塞領域での MMP-9 の発現が抑制されることを見いだした。これらの結果は 2011.10 月の日本胸部外科学会総会で発表予定である。これらの３つの実験結果は英文誌に投稿準備中である。
4）心臓 CT および心臓 MRI 画像から心臓壁を抽出し、心臓 3 次元モデル作成する手法を金沢工業大学と確立した。
【金沢工業大学分担分】
1）心臓 CT および心臓 MRI 画像から抽出された心臓壁データを修正し、今回の共同研究補
助金で購入した 3 次元 CAD ソフトを用いて、心臓 3 次元モデルを作成した。
2）作成した 3 次元モデルに内外 2 層の心筋配列を加味した心臓 3 次元モデルを作成した。
有限要素法を適応し、壁張力を計算し、圧容積関係をシミュレーションした。
3）心臓ネットの物性値計測とモデル化

心臓矯正ネットのなかにバルーンを入れ容量圧曲線を計測し、等方向性のシートとしてモデル化を行った。
4）心臓矯正ネットを装着した場合の左室圧容量曲線と 1 回拍出量の変化をシミュレーショ
ンした。
【金沢医科大学生理学Ⅱ担当部分】
1）まず慢性心不全における不整脈発現機構を明らかにするため、慢性心不全状態の固有心筋で発現が増加する過分極活性化陽イオンチャネル電流（Ｉｆ）の自動能誘発作用について、心筋細胞の非線形力学系モデルを用いたシミュレーション及び分岐構造解析により検討した。
2）過分極活性化陽イオンチャネル電流（Ｉｆ）の心筋自動能誘発・維持作用を理論的に解析した結果、過分極状態のペースメーカー細胞やＩｆ電流が増加する不全心筋では、Ｉ
ｆ電流の増減により分岐現象（自動能の発現・停止）が生じ、Ｉｆ電流依存性の自動能が発現し得ることが明らかとなった。慢性心不全状態の固有心筋では重症度に比例してＩｆ電流発現が増加するため、Ｉｆ電流による異常自動能発現状態への分岐が不全心筋に お け る 不 整 脈 発 現 機 構 の 一 つ で あ る と 考 え ら れ た 。 本 研 究 成 果 の 一 部 は 既 に Am J

Physiol （研究論文１）に報告済みである。
７．研究の考察・反省‑ 47 ‑

C:\Documents and Settings\user242\デスクトップ\239787-医科大 共同研究成果報告書\C2009-6 秋田修正.docx

今回の我々の研究で、正常心機能の心臓に対しては、心臓矯正ネットはもっとも正確な収縮能の指標である収縮末期圧容積関係（Emax）に関して右室・左室ともに改善効果はなかったが、右室拡張能が左室拡張能に先行して障害されることを見いだした。
高頻度刺激による慢性心不全モデルでの検討では、心臓矯正ネットは縫縮依存性に
右室左室ともに収縮能（Emax）の改善をもたらすが、拡張能（拡張末期圧容積関係：
EDPVR）は右室が左室より早期に障害されることを明らかにした。ビーグル犬の後下壁
心筋梗塞モデルにおいて有意の僧帽弁閉鎖不全を作成することができず、虚血性僧帽弁閉鎖不全に対する心臓矯正ネットの有用性を検討ができなかった。冠動脈側副血行が多い犬での実験モデル設定に問題があった。今後実験動物を豚に替えて行う予定である。
本研究の成果を元に、経産省補助金「課題解決型医療機器・器具の開発・改良に向けた病院・企業間連携事業」に「重症心不全患者に対するテイラーメイド方式の心臓形状矯正ネットの開発」統括研究代表者（金沢医科大学心臓血管外科部門教授秋田利明）、副統括研究代表 （金沢工業 大学山部昌 副学長）と して採択さ れた（研究 費合計
4500 万円）。医療器具としての製品化にむけての補助金であり、平成 23 年度内に心臓矯正ネットの設計手法確立（心臓壁抽出法の確立、コンピュータ編み機入力のための心臓矯正ネット用型紙プログラム作成、心臓矯正ネット物性試験・耐久試験）と慢性心不全モデルでの心臓矯正ネットの至適形状評価を行う予定である。
８． 研 究 発 表
Kurata
Y,
T.
Roles
of
MatsudaH,
Hisatome
I,
Shibamotohyperpolarization-activated current I f in sinoatrial node pacemaking: insightsfrom bifurcation analysis of mathematical models. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2010; 298: H1748-H1760.（MLDB）‑ 48 ‑

１．研究課題名：単科精神科病院における看護実習受け入れの影響－看護師の意識の変化より―（研究番号

C2009-7）

２．キーワード: １）看護学実習 (clinical nursing practice)２）単科精神科病院 (psychiatric hospital)
３）精神科看護 (psychiatric nursing)４）介入研究 (intervention research)
３．研究代表者：長井麻希江・看護学部・助研究分担者：橋本教・精神看護学

智江・看護学部・助教・高齢看護学中村幸志・医学部・准教授・健康増進予防医学

中川東夫・医療法人松原会七尾松原病院・院

北岡

和代・看護学部・教長

授・精神看護学４．研 究 目 的
本研究の目的は、単科精神科病院で働く看護師が、初めて看護実習生を受け入れることによりどのような影響を受けるのか、計画当初の看護師の意識に限定せず、提供されているケ
アの変化も含めて評価することとした。それにより、看護学実習を受け入れることのメリッ
ト・デメリットを明確にし、より良い実習指導環境づくりに資することを目指している。

５．研 究 計 画
研究デザインは、看護実習生受け入れという介入に対して看護師がどのような影響を受けたのか、質問紙調査およびインタビュー調査の両側面から評価を行う介入研究である。本研究の実施にあたり、金沢医科大学疫学倫理審査委員会の了承を得た（平成 21 年 10 月 26 日、受付番号 61）。
１）質問紙調査①対象

介入群：看護学実習が行われる病棟に所属する准看護師、正看護師。
対照群：看護学実習が行われない病棟に所属する准看護師、正看護師。

②調査時期

実習開始時点（2009 年 4 月上旬）および終了後（同年 8 月上旬）の 2 時点である。

③データ収集方法
調査項目は、基本情報（11 項目）、看護師が抱くストレス（NJSS（Nursing Job Stress Scale）のうち「職場の人的環境に関するストレッサー」7 項目、「看護職者としての役割に関するスト
レッサー」5 項目、「患者との人間関係に関するストレッサー」2 項目）、看護師のストレス反応（バーンアウト）として MBI-GS（Maslach Burnout Inventry –General Survey)16 項目の計
41 項目である。説明書とともに自己記入式調査票を配布し、記入後は各自に封印してもらい、
ナースセンターに投函箱を備えて 1 週間の留め置き式調査を行った｡④解析方法
実習開始時、終了時の2時点における介入群及び対照群の調査項目得点変化量について、
Mann-Whitney U testを行った。実習開始時、終了時の2時点における介入群の得点の比較については、Wilcoxon signed-rank sum testを行った。いずれも優位水準p＜0.05とした。
２）インタビュー調査①対象‑ 49 ‑

実習が行われた病棟より、無作為に看護師 3 名、准看護師 3 名を選出した。また、コメディ
カルスタッフからも無作為に 6 名選出して、グループインタビューを実施した。
②調査時期

実習指導終了後（2009 年 8 月下旬～9 月）③調査方法
看護師に対しては、「看護実習生を受け入れることにより、自分の意識や提供しているケアにどのような影響を受けたのか」をテーマに、あらかじめインタビュー用のトピックガイドを作成した。コメディカルスタッフに対しては、「看護実習生を受け入れることにより、病棟看護師の意識や提供しているケアにどのような影響があったか」をテーマにした。研究代表者が、対象者らと直接連絡を取り合い、彼らの同意が得られた場合に日程調整を行った。
④データ収集方法
看護師への個別インタビュー、コメディカルスタッフへのグループインタビューともに研究代表者がトピックガイドに沿ってインタビューを実施した。対象者らの同意を得てその内容をIC リコーダーにて録音し、逐語録を作成して質的データとした。
⑤データ分析方法
まず、データ全体を熟読して研究者間で検討し、データを意味ある最小限の文節または文章で区切った上で、「ケアを提供する際の看護師の意識の変化」と「ケア行動の変化」とに大きく分けた。その後、区切った文節や文章を単独で理解できるような文章にコード化しながら、繰り返し出現するテーマを余白に書き出した。次に、余白に書き出したテーマと各コードとの関連を検討していき、テーマの表現を吟味しながらカテゴリーおよびサブカテゴリーを抽出した。
分析結果は研究者間で何度もその妥当性を検討した。
６．研 究 成 果
１） 質問紙調査の結果① 対象者の属性
介入群（実習病棟）30 名、対照群（非実習病棟）14 名より回答を得た。両群ともに男女比2 対 3 程度であり、婚姻状況、教育歴、看護師免許の有無、自己学習時間、健康状態に有意差はみられなかった。年齢については介入群が対照群よりも有意に低く、精神科勤務年数も少なかった（un paired-t

test、p＜0.05）。

②両群の得点変化量
両群の看護師において、バーンアウト状態であると認められたものはおらず、ストレイン得点およびバーンアウト各下位尺度（疲弊感、シニシズム、職務効力感）得点の変化量に有意差は認められなかった。
③実習開始前後における介入群の得点の比較
実習病棟の看護師において、看護学実習を受け入れる前と終了後の 2 時点でのストレイン
得点、バーンアウト各下位尺度（疲弊感、シニシズム、職務効力感）得点、自己学習時間に有意差は認められなかった。
２）看護師に対するインタビュー調査の結果
実習病棟に所属する看護師に対するインタビューデータを分析した結果、看護師の意識の変化、提供されているケア内容の変化、看護業務体制の変化に大別された。以下にその分析結果を示す（『』はカテゴリーを、【】はサブカテゴリーを示す）。
看護師の意識の変化としては、『専門職意識の向上』『初心を取り戻す』『緊張感の出現』という 3 つのカテゴリーが抽出された。
『専門職意識の向上』について、サブカテゴリーと‑ 50 ‑

して得られたものは【学習意欲の向上】【モデルとしての自覚】【現状に対する問題意識】であった。
ケア内容の変化としては、『接遇の向上』『積極性の高まり』『創意工夫』『個別性の尊重』『療養環境の改善』というカテゴリーが得られた。
看護業務体制の変化としては、『看護記録の見直し』『申し送りの見直し』というカテゴリ
ーが抽出された。
３）コメディカルスタッフに対するインタビュー調査の結果
コメディカルスタッフに対するインタビュー内容については、現在、逐語録を分析中である。
７．研究の考察・反省
看護学実習を受け入れることによる単科精神科病院看護師にもたらされる影響について、ストレス要因およびバーンアウト反応の調査結果から、介入群と対照群間の有意な差および介入群の実習前後の有意な変化は認められなかった。初めて実習生を受け入れて生じる環境の変化や、実習指導という新たな負担に対して、看護師らのストレス要因やストレス反応に大きな変化はなかったと評価できる。
看護師にもたらされたケア提供上の影響について、看護師の意識としては専門職意識の向上、初心を取り戻す、緊張感の出現など、ポジティブな変化が示唆された。専門職意識の向上としては、学習意欲の向上、モデルとしての自覚、現状に対する問題意識という、さらに具体的な内容が認められた。単科精神科病院における看護の質は、総合病院に比べて他分野の看護師との共同作業や共通の管理体制がなく、精神科独自の発展を遂げていると考えられる。また、疾患の特性から他科のように面会が活発でないことや、他科の患者およびその面
会者などとの交流もなく、閉鎖的になりやすい。本研究結果から、看護実習生を初めて受け入れることにより、初心を取り戻したり、緊張感が生まれるなど、良い刺激を受けたことが窺われる。さらに実習指導という役割が増えたことにより、専門職として学習することやモデルとしての見本を示す必要性を自覚し、現状のケアに対する疑問も生じるなど、現状を変えて行こうとする意識が出現したと考えられる。
実際に提供されているケア内容としては、看護師らの主観ではあるが、接遇の向上、積極性の高まり、創意工夫、個別性の尊重、療養環境の改善など患者の QOL 向上に資する変化が生じたことが示唆されている。これらについては、現在分析中のコメディカルスタッフからの評価と比較する必要がある。また業務体制の変化としても、看護記録の見直し、申し送りの見直しなど従来の方法を見直す動きが認められ、これらもケアの質を向上させていくことにつながる可能性がある。
本研究結果から、単科精神科病院において看護学実習を受け入れることは、看護師のメン
タルヘルスを悪化させることなく、看護師の意識やケア内容に良い変化をもたらすことが示唆された。開かれた精神科病院を目指して外部者を積極的に受け入れること、実習指導という教育的な役割を担うことの効果であると考えられた。
8．研 究 発 表
現在、残されたインタビューデータ（コメディカルスタッフを対象としたグループインタビ
ュー）の分析および論文作成を進めており、誌上発表することを目指している。

‑ 51 ‑

平成 2１年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2009-

1～１0

看護学領域

S2009-１1～１2

１．研究課題名：ヒト心房・心室筋由来バイオペースメーカーの作成と最適システム設計（Gene Therapy）に関する非線形力学的解析（研究番号 S2009-1）
２．キーワード：１）ヒト心筋（human cardiac myocytes）
２）自動能（automaticity）
３）バイオロジカル・ペースメーカー（biological pacemaker）
４）分岐理論（bifurcation theory）
５）コンピュータ・シミュレーション（computer simulation）
３．研究者氏名：倉田康孝・医学部・准教授・生理機能制御学（生理学Ⅱ）

４． 研 究 目 的
徐脈性不整脈（洞不全症候群・房室ブロック）の治療として人工ペースメーカー植込みが行われてきたが、近年、徐脈性不整脈の新たな治療法として、バイオペースメ
ーカーの開発が期待されている。方法論の一つとしての”Gene Therapy”は、遺伝子操作によって固有心筋に自動能（バイオペースメーカー活性）を発現させるものであり、心臓ドライブの可能なバイオペースメーカーの作成は実験的に成功してはいるが、自動能の安定性などに問題があり、未だ実用には至っていない。理想的バイオペース
メーカーシステムの設計開発には、心房・心室筋自動能の発生機序を深く理解し、ペースメーカー機能（自動能のロバスト性・ドライブ機能）を強化する手法を理論的に究明する必要があるが、バイオペースメーカー開発のための理論的研究は皆無である。
心筋細胞における自動能の発現は、非線形システムに生じる分岐現象(パラメータに依存した安定性とダイナミクスの質的変化)の一つと考えられる。従ってバイオペースメーカーの開発には、心筋自動能の発生機序はもとより心筋細胞の分岐構造の特徴を明らかにする必要があり、非線形力学系の分岐理論に基づく新たな理論的・実験的アプローチが不可欠である。本研究の目的は、イオンチャネル遺伝子操作によるヒト心房・心室筋由来バイオペースメーカー作成および機能強化の手法をヒト心房・心室筋細胞モデルを用いて非線形力学的に解析し、自動能ロバスト性と心臓ドライブ機能に優れた最適バイオペースメーカー細胞作成のためのシステム設計(最適イオン電流調節方法の解明)を行うことである。分岐理論を基礎とした新しいアプローチにより、人工ペースメーカーに代わるバイオペースメーカー開発のための理論的基盤を確立することを最終目標とする。
５． 研 究 計 画
本研究では、イオンチャネル遺伝子操作による効率的なバイオペースメーカー細胞の作成とペースメーカー機能強化の手法をヒト心房筋・心室筋細胞の非線形力学系モ
デルを用いて検証する。具体的な目標は以下の通りである。
① 心筋自動能の発現・維持における過分極活性化陽イオンチャネル電流（I f ）の役割を明らかにし、ヒト心房筋細胞モデルのI f 電流導入および内向き整流K + チャネル電流（I K1 ）抑制時の分岐構造を非線形力学系の分岐理論に従って解析して、バイオペースメーカー活性の発現条件と力学的機序（各イオンチャネル電流系の役割）を究明するとともに、ヒト心室筋細胞との相違点を明らかにする。
② ヒト心房筋由来バイオペースメーカー細胞と正常細胞のモデルを連結して多細胞
カップルモデルを作成し、バイオペースメーカー機能（電気緊張性負荷に対する自‑ 53 ‑

動能のロバスト性・心房ドライブ機能）への各種自動能調節イオン電流系導入の影響を解析し、最適なペースメーカー機能強化方法を検証する。これらの結果をヒト
心室筋細胞での解析結果と比較し、バイオペースメーカー作成上の問題点を明らかにする。
（１）分岐構造解析システムの構築とバイオペースメーカー活性発現条件の解析方法
既存のヒト心房筋細胞モデルを利用し、科学技術計算・シミュレーション用ソフト
ウェア（MATLAB 7）、分岐解析用ソフトウェア（MATCONT）を用いて、①活動電位の再構成とそのダイナミクスのパラメータ依存性変化（分岐パターン）の計算・プロット、② モ デ ル シ ス テ ム の 平 衡 点 （定 常 状 態 ）と そ の 安 定 性 の 計 算 の た め の 解 析 シ ス テ ム（MATLABプログラム群）を作成する。I K1 電流抑制およびI f 電流導入（あるいは他のイオン電流系の修飾）を分岐パラメータの変化（各チャネルコンダクタンスの変化）としてシミュレートし、モデル細胞システムにおける定常状態・周期軌道とその安定性のパラメータ依存性変化を表す“分岐図”を作成する。得られた分岐図から、各イオ
ン電流系修飾におけるモデルシステムの分岐構造を解析することにより、バイオペー
スメーカー細胞作成手法としての妥当性を比較検証し、最適なバイオペースメーカー
細胞作成手法を提案する。
（２）自動能調節電流導入による心房筋由来バイオペースメーカー機能強化方法の解析作成したヒト心房筋由来バイオペースメーカー細胞の機能とその強化方法を検証するために、ヒト心室筋由来バイオペースメーカー細胞について行った手法（Kurata
et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 292: H701-H718, 2007）を適用する。即ち、バイオペースメーカー細胞と正常心房筋細胞をギャップ結合により連結した多細胞
カップルモデルを構築し、イオンチャネルおよびギャップ結合のコンダクタンスをパラメータとする分岐図を作成する。バイオペースメーカー細胞への自動能調節イオン
電流系組込みによるペースメーカー機能（過分極負荷に対するロバスト性・心房筋ドライブ機能）の変化を、自動能が消失する臨界ギャップコンダクタンス値および心房筋ドライブ可能なギャップコンダクタンス領域を指標として解析する。これらの解析結果から、自動能調節イオンチャネル遺伝子導入による最も効果的なバイオペースメ
ーカー機能強化方法を提案するとともに、ヒト心室筋由来ペースメーカー細胞の解析
結果と比較することにより、心房筋と心室筋でのバイオペースメーカー作成上の問題点と相違点を明らかにする。
６． 研 究 成 果（１）ヒト心房筋由来ペースメーカー細胞モデルの作成（ペースメーカー活性発現機序の解明）
ヒト心房筋細胞モデルでは、I K1 電流の抑制のみでは分岐現象は生じず、自動能（バイオペースメーカー活性）は発現しなかった。この結果は、I K1 電流の抑制のみでサド
ル－ノード分岐が生じ自動能が出現したヒト心室筋細胞モデルの場合とは異なっていた。そこでI K1 電流除去心房筋細胞モデルにおいて自動能の発現条件を検証した結果、背景電流の内向きシフト、L型Ca 2+ チャネル電流増強あるいはI f 電流導入によりホップ
分岐（平衡点の不安定化）が生じ、心房筋細胞由来バイオペースメーカー細胞を作成できることが示された。また、自動能発現におけるI f 電流の役割とI f 電流導入効果を
さらに詳細に解析した結果、①I f 電流は自動能発現に必須ではないが心房筋からの電気緊張性負荷に対するロバスト性強化作用をもつこと、②I f 電流導入のみではバイオ‑ 54 ‑

ペースメーカー細胞作成は困難である（他の電流系の修飾が必須である）こと、③ヒト心室筋細胞と異なりI f 電流導入 によるバイオペースメーカー活性発現にI K1 電流抑制は必須ではないことが明らかとなった。さらに、心房筋細胞由来ペースメーカー細胞における自動能の発現機構は洞結節の生理的自動能と本質的に同じであることも明らかとなった。
（２）ペースメーカー細胞のロバスト性とその強化方法（ペースメーカー電流修飾の効果）
多細胞カップルモデルを用い、バイオペースメーカー細胞モデルの電気緊張性負荷に対するロバスト性への各ペースメーカー電流（I f 電流、Ｔ型Ca 2+ チャネル電流、持続性内向き電流、低電位活性化Ｌ型Ca 2+ チャネル電流）導入の影響を解析した結果、以下の結論を得た：①I f 電流の増強は心房筋からの電気緊張性負荷に対するペースメ
ーカー細胞のロバスト性を強化できない。②ペースメーカー細胞の電気緊張性負荷に対するロバスト性の強化には持続性内向き電流の増強が有効である。③Ｔ型Ca 2+ チャ
ネル電流・低電位活性化Ｌ型Ca 2+ チャネル電流の増強でもペースメーカー細胞のロバ
スト性は強化されるがその作用は比較的弱い。これらの結果は、以前に報告したヒト
心室筋由来バイオペースメーカー細胞への各電流系導入の効果とほぼ同じであった。
７．研究の考察・反省本研究では、固有心筋に生じる自動能を非線形システムに生じる分岐現象として捉え、その発現条件と機序を非線形力学系の分岐理論に基づいて解明することにより、ヒト心筋自動能の発現におけるI f 電流の役割を明らかにするとともに、心房筋細胞由来バイオペースメーカー細胞の作成手法および自動能の電気緊張性（過分極）負荷に対するロバスト性と心房ドライブ機能強化方法を理論的に検証した。本研究の成果は、自動能発生機序及びその制御方法の解明や最適バイオペースメーカーシステム設計において、非線形力学系理論に基づく心筋細胞分岐構造の解析が極めて有用であることを示している。
このように非線形システム論的アプローチは有用かつ不可欠な方法論であると考えられるが、現時点では問題点も多い。その第一は、細胞モデル自体の完成度が低いことであり、さらなる実験的検証とモデルシステムの継続的改良が必要である。また、本研究では組織レベルでの解析も試みる予定であったが、実験データ不足と計算時間の制約により実現できなかった。ヒトバイオペースメーカーにおける自動能発現機構と分岐構造の組織レベルでの解析が可能となれば、イオンチャネル遺伝子発現調節手法に基づく理想的なバイオペースメーカーシステム設計のための理論的基盤を確立することができるはずであり、今後の重要な課題であると考えている。
８． 研 究 発 表MatsudaH,
Hisatome
I,
Shibamoto
T.
Roles
of
KurataY,
hyperpolarization-activated current I f in sinoatrial node pacemaking: insightsfrom bifurcation analysis of mathematical models. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2010; 298: H1748-H1760.（MLDB）‑ 55 ‑

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１．研究課題名：ガレクチン 9 によるウイルス増殖制御-細胞内因子としてのガレクチンの作用機構-（研究番号

S2009-2）

２．キーワード：１）レクチン（lectin）
２）ガレクチン（galectin）
３）ウイルス（virus）
４）ウイルス増殖制御（regulation of viral growth）
３．研究者氏名：東海林博樹・准教授・一般教育機構（生物学）

４． 研 究 目 的ガレクチンはβ-ガラクトシドを認識する動物レクチンファミリーで、哺乳類では15 ほどのメンバーが知られている（ガレクチン 1〜17；種によりメンバーに違いがある）。ガレクチンは、免疫系制御、胚発生制御、腫瘍形成など多様な作用を持つとされるが、いずれも詳細については不明な点が多い。
我々はこれまで主に、免疫系におけるガレクチン作用の解析を行い、ガレクチン８が、好中球の活性化や各種血球系細胞の接着誘導を起こすことや、ガレクチン９が T細胞の細胞死を誘導すること等を明らかにしてきた。これらはいずれも、ガレクチン
を細胞外から作用させており、ガレクチンタンパク質が細胞表面の糖鎖を介して作用する結果と考えられる。しかし、ガレクチンタンパク質はいずれも分泌のためのシグナル配列を持たず、未知の非古典的経路により一部のタンパク質が分泌されるものの、細胞外からの作用はマイナーな作用である可能性が高い。事実、ガレクチンタンパク
質の分布を解析すると、実は細胞内（細胞質、核など）にこそ多くのガレクチンタン
パク質が分布している。したがって、ガレクチンタンパク質は細胞外にてレクチンとして機能するとともに、細胞内において、糖鎖結合を介さない作用を持つことが推測される。実際、ガレクチン１や３が核内にて mRNA スプライシング因子として機能すること、ガレクチン 12 が細胞質にて細胞周期の制御に関わること、ガレクチン３がβカテニンと結合して Wnt シグナルの制御に参加することなど、ガレクチンの細胞内因子としての作用の報告が散見される。しかし、充分に確立した細胞内ガレクチン機能の報告は未だ無い。本研究では、培養系において細胞内ガレクチン９がアデノウィル
ス増殖に抑制的に働く系をモデルとして、細胞内ガレクチン９の作用機構の解明を目指した。

５． 研 究 計 画（１）細胞内ガレクチン９の動態について、ガレクチン９を高発現する培養細胞の抽出液を用いて、ゲルろ過法やショ糖密度勾配遠心法などにより解析する。

‑ 69 ‑

（２）アフィニティークロマトグラフィーによりガレクチン９と核酸との相互作用につていて検討する。
（３）in vitro 翻訳系や逆転写系に対する各種組換えガレクチン添加の影響を解析する。
（４）正常ヒト臍帯静脈内皮細胞における、各種ウィルス感染様刺激によるガレクチン
９発現誘導機構を解析する。
（５）HEK293 細胞-アデノウィルス感染系に、ガレクチン９がおよぼす影響について解析する。
６． 研 究 成 果（１）ガレクチン９を発現する細胞株（Jurkat T-cell）の細胞質成分をゲルろ過法により分 画 す る と 、 細 胞 内 ガ レ ク チ ン ９ は リ ボ ソ ー ム な ど の 高 分 子 複 合 体 と と も に void
volume に現れた。
さらに、別のガレクチン９高発現細胞株（THP-1）を用い、ショ糖密度勾配遠心法
における細胞内ガレクチン９の挙動を解析したところ、ガレクチン９は free リボソームを含む画分に現れた。
（２）各種組換えガレクチンタンパク質を固定化したカラムを用いて、RNA との相互作用を検討したところ、ガレクチン９が最も高い親和性を示した。
（３）翻訳過程へのガレクチン９の関与を検討するため、 in vitro 翻訳反応系に組換えガ
レクチン９を添加してみたが、影響は認められなかった。ところが、 in vitro 逆転
写反応系に組換えガレクチン９を添加すると、濃度依存的に反応を抑制することが判明した。その効果は、競合阻害剤として大量の細胞由来 totalRNA を共存させることで打ち消された。
（４）正常ヒト臍帯静脈内皮細胞にウィルス感染様刺激（polyIC）を与えると、インター
フェロンβの発現を介してガレクチン９の発現誘導が起こることが判明した。
（５）遺伝子導入によりガレクチン９を過剰発現させた HEK293 細胞では、コントロール細胞に比べてアデノウィルスの増殖が抑制される。しかし、同様の HEK293 細胞-アデノウイルス感染系に、組換えガレクチン９タンパク質を添加しても、影響は認められなかった。すなわちこのアデノウイルス増殖抑制作用は、細胞内ガレクチン９によるものであることが判明した。

７．研究の考察・反省（１）細胞内ガレクチン９の動態
本研究の成果から、細胞内ガレクチン９は、タンパク質とRNAからなる巨大な複合体に含まれている可能性が示された。しかし、細胞質成分は基本的には糖鎖は含まない。このため、ガレクチン９と巨大複合体との結合は、ガレクチン９のレクチン活性（糖鎖結合活性）によるものでは無く、ガレクチン９とタンパク質あるいはRNAとの‑ 70 ‑

直接の相互作用によるものと考えられる。このうち、RNAとの相互作用についてはア
フィニティークロマトグラフィーや in vitro 逆転写反応阻害実験などから証明されたが、タンパク質との相互作用も関係しているか否かについては今後検討が必要である。
（２）ガレクチン９によるウイルス増殖制御
細胞培養系において、①ウイルス感染様刺激により、インターフェロンβの発現を介してガレクチン９の発現が誘導されること、②細胞内ガレクチン９の過剰発現によりウイルス増殖抑制効果が認められることから、生体内においても抗ウイルス作用を持つ可能性が考えられる。
しかし、そのメカニズムの詳細はほとんど解明できておらず、今後まずはガレク
チン９と相互作用する細胞内因子（タンパク質、RNAなど）のさらなる解析が必要である。これにより、細胞内ガレクチン９が、ウィルスゲノムに直接結合してウィルス
ゲノムの侵入を検知するのか（ウイルスセンサー）？あるいは免疫誘導のためのシグ
ナル分子として働くのか？あるいは、ウイルスゲノムの複製に影響を及ぼすのか？など、抗ウイルス作用における細胞内ガレクチン９作用点の同定につなげたい。その上で、動物個体を用いた実験により、生体内での抗ウィルス作用への関与について検討していきたい。

８． 研 究 発 表
Eriko Simamura, Hiroki Shimada, Hiroki Shoji, Hiroki Otani, and Toshihisa
Hatta. Effects of melanocortins on fetal development. Congenital Anomalies
2011; 51: 47-54.（MLDB）‑ 71 ‑

１．研究課題名：全身性自己免疫疾患における肥満因子(レプチン)に関する研究（研究番号S2009-3）

２．キーワード：１）レプチン（leptin）
２）B 細胞（B cell）
３）骨髄（bone marrow）
４）アポトーシス（apoptosis）
５）脂肪細胞（adipocyte）

３．研究者氏名：藤田義正・医学部・講師・血液免疫制御学（血液免疫内科学）

４． 研 究 目 的
栄養状態と免疫系とは密接に関連していることが知られており、低栄養状態では著明な免疫不全となり、感染症や悪性腫瘍の有意な増加をもたらすとされているが、その機序についてはいまだ十分に解明されていない[Chandra RK: Am J Clin Nutr 1997,
Scrimshaw NS, SanGiovanni JP: Am J Clin Nutr 1997]。近年、単なる脂肪の貯蔵臓器と考えられていた脂肪細胞から TNF、PAI-1、adiponectin 等の多数の生理活性物質が産生されていることが発見され、脂肪組織による免疫系への調節機能が考えられるようになってきた[Zhang Y, et al: Nature 1994, Hotamisligil GS, et al: Science1993]。1994 年フリードマンらは遺伝性肥満マウス（ ob/ob マウス）のポジショナルク
ローニングにより肥満遺伝子産物（レプチン）を単離同定した[Zhang Y, et al: Nature
1994]。レプチンは脂肪細胞から分泌される 16kDa のペプチドで、レプチンは肥満によって増加し、るいそうで減少する。現在のところレプチンは視床下部でレプチン受容体に結合して満腹中枢を刺激することによって食欲を抑制し、また末梢ではエネルギ
ー産生を亢進させ、体重を減少させると考えられている。その一方で、レプチン受容体は末梢血 T 細胞や造血幹細胞にも発現が認められ、増殖因子としての作用や炎症性
サイトカインの分泌、Th1 反応への促進作用など、レプチンが免疫系に対する多様なモジュレーターとなっていることが報告されている[Lord GM, et al: Nature 1998]。
したがって今回、レプチンによる B 細胞に対する作用を解明することを目的とし研究を行った。

５． 研 究 計 画
まずマウスに 60 時間の絶食を行い骨髄、脾臓の B 細胞数、サブセットの検討を行う。絶食を行うことにより、脂肪組織が減少し血中レプチン濃度が著明に低下するため、それにより B 細胞がどのように変化するかを検討する。次に絶食中にレプチンを持続的に補充することにより、B 細胞の変化が抑制されるかどうかをみることにより、‑ 73 ‑

絶食による B 細胞の変化が血中レプチン濃度の低下によるものであることを証明する。
またマウス骨髄から分離した B 細胞に in vitro でレプチンを加え、in vivo でみられた結果がレプチン受容体を介した B 細胞に対する直接作用であるかどうかを検討する。

６． 研 究 成 果
マウスに 60 時間の絶食ストレスを与えると、アポトーシスにより著明な脾臓 B 細胞、骨髄 B 細胞の減少が認められ、特に B220 陽性 IgM 陰性骨髄 B 細胞に顕著であった。
絶食中にレプチンを持続的に投与することにより、骨髄 B 細胞の減少が抑制され、レ
プチンによるアポトーシス抑制作用が認められた。またレプチン欠損マウス、レプチ
ン受容体欠損マウスでは骨髄 B 細胞が減少しており、B220 陽性 IgM 陰性細胞において顕著であった。一方、in vitro では B 細胞に対してレプチンによるアポトーシス抑制
作用は認められなかった。
scid マウスにレプチン受容体欠損マウスの骨髄を移植したところ、コントロールマウ
スをドナーとした場合と同様に正常なリンパ球の形成が認められた。
以上の結果から、マウス骨髄 B 細胞に対するレプチンのストレス誘発アポトーシスの抑制作用は、B 細胞上のレプチン受容体を介した直接作用ではなく、内分泌代謝系
や自律神経系などを介した間接的な作用によるものであることが示唆された。

７．研究の考察・反省
レプチンは T 細胞に対して、レプチン受容体を介したアポトーシス抑制作用を示す
ことが多数の報告により明らかとなっている。これまで B 細胞に関する報告は無かったが、本研究により in vivo で B 細胞に対するアポトーシス抑制作用が確認され、さらに in vitro の実験結果や scid マウスへの骨髄移植実験から、B 細胞に対するアポトーシス抑制作用が T 細胞と異なりレプチン受容体を介した直接的な作用ではないことが示唆された。マウスに対する acute starvation は血中レプチン濃度を著明に低下させるが、それとともに強いストレスを与えるためグルココルチコイドを上昇させ、その結果リンパ球がアポトーシスにより減少することが知られている。したがって、レプチンは絶食ストレスを緩和することによりグルココルチコイドの上昇を抑制するなど、絶食によって生ずる内分泌代謝系の異常を是正することにより間接的なアポトーシス抑制作用を in vivo で示しているのではないかと考えられた。今後さらに内分
泌系を含めた検討を進める方針である。

８． 研 究 発 表なし‑ 74 ‑

１. 研究課題名：タイラーウイルス L 蛋白の持続感染における機能的役割の解析（研究番号 S2009-4）
２. キーワード：１）タイラーウイルス（Theiler’s murine encephalomyelitis virus, TMEV）
２) 持続感染（persistent infection）
３) マクロファージ（macrophage）
４) L 蛋白（L protein）
５) L* 蛋白（L* protein）
３. 研究者氏名：姫田 敏樹・医学部・助 教・生体感染防御学（微生物学）

４. 研 究 目 的本研究は、タイラーウイルスが引き起こす脱髄の機序を明らかにすることで、特定疾患である多発性硬化症に対する治療法の開発や創薬ターゲットの探索を行うことを最終ゴールとしており、本申請課題は、その基礎的データの一端となるウイルスの持続感染機序を L 蛋白の機能的役割の解析から明らかにすることを目的とする。

５. 研 究 計 画
本研究では、マクロファージへのウイルス持続感染において重要な役割を担っていると考えられるウイルス粒子非構成蛋白 L の機能を明らかにすることを目的とし、L 蛋白発現マクロファージ細胞株を樹立することで、L 蛋白単独発現による宿主細胞の遺伝子発現プロファイルの変化を DNA
microarray 法により解析して、L 蛋白発現に対して応答する宿主側因子を探索することを計画した。
L 蛋白は細胞毒性を発揮することがこれまでの実験から明らかとなっており、単純な発現系の利用
では、遺伝子導入された細胞が死滅してしまい、L 蛋白発現細胞株の樹立は不可能である。そこで申請者は、導入遺伝子発現のオン・オフを自由に調節できるテトラサイクリン誘導発現システム（Retro-X Tet-off advanced inducible expression system / clontech）を利用し、L 蛋白発現マ
クロファージ細胞株の樹立を計画した。

６. 研 究 成 果
上述の通り、テトラサイクリン誘導発現システムを利用した L 蛋白発現マクロファージ細胞株の樹立を行い、導入遺伝子の発現誘導の調節を試みた。しかし、L 蛋白の細胞毒性は予想以上に強く、遺伝子発現の誘導後、直ちに細胞死が誘発され、L 蛋白の発現を Western blotting で証明することはできなかった。さらに、宿主細胞の遺伝子発現プロファイルの変化を解析するために計画していた、L 蛋白発現の量的・時間的なコントロールも同じ理由から困難であった。これらのことから、別の新たな解析方法として、下記の３つのストラテジーから、ウイルスの持続感染機序を解析した。
1) タイラーウイルス持続感染マクロファージの樹立とサイトカインプロファイル
2) L 蛋白欠損変異ウイルスのマクロファージにおける増殖能の解析‑ 75 ‑

3) L蛋白の細胞毒性機序の解析と抗アポトーシス蛋白L* との関連性の解析

1) タイラーウイルス持続感染マクロファージの樹立とサイトカインプロファイル
マウス由来マクロファージ細胞株 J774 にタイラーウイルス DA 株を感染させ、生存し続ける細胞をDA 持続感染細胞として分離培養した。ウイルス持続感染は、ウイルス抗原の免疫染色および産生されるウイルスの感染力価測定により確認した。そして、DA 持続感染 J774（P-10／70 days）の培養上清中に分泌されるサイトカインをサイトカイン抗体アレイにより解析した。
DA 持続感染 J774 は、ウイルスを 1～8 pfu/cell 程度常に産生していたことから、持続感染の成立が証明された。また、ウイルス抗原保有率は 40 % 程度に維持されており、感染細胞と非感染細胞が適度なバランスで混在していることが明らかとなった。サイトカイン抗体アレイからは、DA 持続感
染において特徴ある変化として、3 種（IL-10, G-CSF, BLC）の増加と１種（IFN-γ）の減少が認められた。IFN-γの減少からはアポトーシスの低下が、IL-10 の増加からは CTL の抑制が考えられ、持続感染への関与が示唆された。また、G-CSF 投与による MS の悪化と、抗 BLC 抗体投与による EAE の改善が報告されていることから、G-CSF および BLC の増加は、ウイルス性脱髄の増長に関与している可能性が示唆された。
【 研究発表 1 】

2) L蛋白欠損変異ウイルスのマクロファージにおける増殖能の解析
L タンパク欠損ウイルス（ΔL）およびL蛋白の 3 つの特徴的なドメイン（Zn-finger domain, acidic
domain, S/T domain）を各々欠損させた変異ウイルス（ΔZ、ΔA、ΔS/T）を作製し、growth kinetics
解析を行った。ただし、L蛋白の欠損により遺伝子配列を共有するL* 蛋白も欠落することから、その発現を補うために、細胞にはL* 蛋白発現マクロファージを用いた。比較対象としてはL* 蛋白のみを非産生とした変異ウイルスのDAL*-2 を用いた。
ΔLウイルスは、L* 蛋白発現マクロファージにおいても増殖することができず、ウイルス増殖にはL蛋白が不可欠であることが証明された。L* 蛋白がウイルスのマクロファージ内増殖に不可欠であることは既に報告済みであることから、LおよびL* 蛋白それぞれ単独の発現ではウイルス増殖は起こらず、両蛋白の共存がTMEVのマクロファージ内増殖に不可欠であることが強く示唆された。さらに、ΔZお
よびΔS/Tウイルスでは、DAL*-2 と同様にL* 蛋白存在下における増殖の回復が認められたが、ΔAウイ
ルスでは、ΔLウイルス同様その増殖が著しく抑制された。このΔAウイルスにおけるマクロファージ
内増殖能の欠落は、acidic domainがウイルス増殖に関わるL蛋白の責任領域であることを示唆していると考えられた。
【 研究発表 2 】
3) L蛋白の細胞毒性機序の解析と抗アポトーシス蛋白L* との関連性の解析
L 蛋白は、I 型インターフェロンの産生を抑制することから、免疫応答回避に不可欠な蛋白であると考えられているが、その一方で、上述の通り強い細胞毒性を発揮することも明らかである。そこで、
L 蛋白に対する感受性がマクロファージと比して低い BHK 細胞に、L 蛋白を一過性に発現させることで、その細胞毒性機序を解析した。

‑ 76 ‑

Annexin V 染色によるフローサイトメトリー解析に加え、caspase-3 active form および cleaved
PARP の Western blotting 解析により、L 蛋白発現細胞ではアポトーシスが誘導されていることが明らかとなった。さらに、抗アポトーシス作用を持つL* 蛋白が、このL 誘導アポトーシスを抑制することが、L と L* の共発現により明らかとなった。これらのことから、L と L* による巧みな‘免
疫応答からの回避’と‘宿主細胞死の制御’が、持続感染に重要な役割を担っていることが示唆された。
【 研究発表 3 】
さらに、部分欠損L* 蛋白を用いた解析から、L* 蛋白は、ミトコンドリア移行シグナルを持つことが明らかとなり、L* 蛋白の抗アポトーシス作用は、ミトコンドリアにおいて発揮されていることが示唆された。
【 研究発表 4 】

７. 研究の考察・反省研究開始当初の計画通りの進行は、標的蛋白の細胞毒性により叶わなかったが、研究計画の見直し
により、L およびL* 蛋白による宿主細胞の免疫応答と細胞死の協調的な制御が、TMEV持続感染の成立に不可欠であることが明らかとなり、さらには、持続感染細胞の樹立とサイトカインプロファイル
からは、脱髄発症に関与する可能性のある宿主側因子が示唆されるなど、当初の研究目的は達成されたと考えられる。
近年、ヒトを自然宿主とするカルジオウイルス Saffold virus (SAFV) が初めて分離同定された。
このウイルスは、マウスカルジオウイルスである TMEV と遺伝子レベルで最も高い相同性を示し、 現
在未知のその病原性が、脱髄疾患との関連を含め、注目を浴びている。今後は、これまでに得られた
TMEV 研究の成果を礎とし、SAFV の分子ウイルス学的解析に着手することで、ヒトカルジオウイルスの病原性解析を展開していきたい。

８. 研 究 発 表
1. Himeda T, Okuwa T, Muraki Y, Ohara Y. Cytokine/chemokine profile in J774 macrophagecells persistently infected with DA strain of Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV).
J. Neurovirol., 2010; 16: 219-229.（MLDB）
2. Ichinose-Asakura K, Taniura N, Himeda T, Nojiri M, Okuwa T, Ohara Y. Leader (L) of
Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) is required for virus growth in a murine
macrophage-like cell line. Virus Res., 2010; 147: 224-230.（MLDB）
3. Okuwa T, Taniura N, Saito M, Himeda T, Ohara Y. Opposite effects of two nonstructuralproteins of Theiler’s murine encephalomyelitis virus regulates apoptotic cell death in BHK-21
cells. Microbiol. Immunol., 2010; 54: 639-643.（MLDB）
4. Himeda T, Okuwa T, Nojiri M, Muraki Y, Ohara Y. The anti-apoptotic protein L* of Theiler’s
murine encephalomyelitis virus (TMEV) contains a mitochondrial targeting signal.
Virus Res., 2011; 155: 381-388.（MLDB）‑ 77 ‑

‑ 78 ‑

‑ 79 ‑

‑ 80 ‑

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‑ 100 ‑‑ 101 ‑‑ 102 ‑‑ 103 ‑‑ 104 ‑‑ 105 ‑‑ 106 ‑‑ 107 ‑‑ 108 ‑１．研究課題名：mRNA-タンパク質複合体の細胞内構造の解析（研究番号S2009-5）

２．キーワード：１）メッセンジャーRNA（mRNA）
２）Y14（Y14）３）Upf2（Upf2）
４）EJC（EJC）
５）翻訳（Translation）
３．研究者氏名：石垣靖人・総合医学研究所・准教授・共同利用部門

４． 研 究 目 的
遺伝子情報は DNA から写し取られた mRNA を介してタンパク質へと翻訳されていく。
細胞の中で RNA はキャッピング、スプライシング、ポリ A 付加などといった複雑な代謝と輸送を経つつ、様々な形態をとって翻訳の場へと移動していくと考えられている。
細胞内の mRNA 分子は単独で存在する訳ではなく、様々な結合タンパク質によって介添えされており、これらの結合因子と代謝に関わる因子との相互作用により代謝を受けていく。
Daneholt らのグループは蚊の唾液腺を利用して巨大 mRNA を電子顕微鏡下で観察し、転写直後から固まりを形成すること、核膜孔を長細くなって通過すること、そして核膜孔から細胞質側へ通り抜けてきた先端から翻訳が始まることを報告してきた。しかし、観察できる mRNA の種類は 1 種類に限られ、蚊を材料とする限り、分子生物学的手法の応用も疾患との関わりを調べることも非常に困難である（Zhao et al ., 2002 など）。本研究の最終的な目的は、遺伝子操作が容易なヒト細胞内で mRNA が細胞内で形成する構造を解き明かすことにより、疾患との関連や構造の構成因子を探索することである。
本研究申請では、輸送されていく mRNA とタンパク質の複合体の形態を観察することを目的として、タンパク質を標的とした免疫電顕の系を構築して観察を試みた。さらに、mRNA 結合因子の局在情報から、細胞周期進行における新規の機能探索を行った。
５． 研 究 計 画（１） RNA 結合タンパク質の細胞内検出系を確立する。
（２） mRNA-タンパク質１分子の高次構造を電子顕微鏡下でより詳細に解析する。また正常細胞に加えて転写障害が疑われるヒト遺伝疾患由来細胞での解析も行う。
（３） 欠損細胞が得られない mRNA 結合因子群の RNAi 誘導による網羅的ノックダウン法
を用いて構造の形成因子を探る。
６． 研 究 成 果
ヒト肺がん由来細胞を用いて RNA 結合因子に対する抗体で染色したところ、走査電子顕微鏡にて核内、核膜孔、細胞質に線状あるいは塊状のシグナルが観察された。これらのシグナルは RNA 分解酵素処理、RNAi によるノックダウンにより減弱が認められた。さらに、エネルギーフィルター電子顕微鏡によりシグナル周辺にリン原子特有のシグナルが認められたことから、観察されるシグナルは RNA 分子に結合しているものと推察された。検出したタンパク質は生化学的な解析結果からエクソンジャンクショ
ンごとに結合していることが証明されており、金コロイド粒子によって検出されるシ‑ 109 ‑

グナルはエクソンとエクソンのつなぎ目の位置を表していると考えられる。従って、このシグナルの集積は折りたたまれた RNA 分子の構造を反映し、線状のシグナルは伸びきった RNA 分子の形状を反映すると考えられる。
この結果を走査型電子顕微鏡においても検討するために、免疫沈降した複合体をビーズ上でイオン液体を利用した新規方法により解析することも試みた。以上の研究か
ら、mRNA 結合タンパク質を免疫電顕法で検出することにより、世界に先駆けてひとつずつの mRNP の形態をヒト細胞内で可視化することに成功した。この成果を論文として英文発表するとともに、成果は 2010 年度医学生物学電子顕微鏡技術学会・奨励賞を受賞した。
また、この研究の過程で RNA 結合タンパク質が中心体などに局在することを明らかにした。意外なことにノックダウン細胞は M 期での細胞周期停止を引き起こし、その後にアポトーシスが誘導されることを明らかにした。結合因子群のプロテオミクス解析および DNA マイクロアレイを利用したトランスクリプトーム解析から、mRNA 結合因子のノックダウンが遺伝子発現の異常を引き起こして M 期停止に至ったと考えるよりはタンパク質複合体形成を通じて中心体や紡錘糸に局在し M 期進行を進めていると考えている。従って、本研究で対象とした RNA 結合因子のいくつかは、抗がん剤の新規標的分子となりうる（国際、国内特許出願中）。
今後さらに RNA 結合因子群の細胞内局在情報を詳細に明らかにし、細胞周期ごとに解析を進めていきたいと考えている。
７．研究の考察・反省
免疫電顕によるタンパク質群の検出に予想以外に時間がかかった点が反省される。
特に透過型電子顕微鏡による解析は半分が投稿中のままであり現在までに発表できなかった。走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡を分子生物学が応用できるレベルに工夫した点は学会でも高く評価された。ノックダウン細胞のアポトーシス誘導から、見出した RNA 結合因子の新規機能について特許出願を終えたので論文受理を急ぎたい。
８． 研 究 発 表
Ishigaki Y, Kurihara T, Nakamura Y, Zhao X, Takata T, Izumi S, Takegami T,
Tomosugi N, Nakagawa H: Ultrastructural localization of Upf2 and its binding tomRNA molecules in human cells. J. Electr. Microsc. Technol. Med. Biol. 2010；24:
8-13.
Ishigaki Y, Nakamura Y, Takehara T, Nemoto N, Kurihara T, Koga H, Nakagawa H,
Takegami T, Tomosugi N, Miyazawa S, Kuwabata S: Ionic liquid enables simple
and rapid sample preparation of human culturing cells for scanning electron
microscope analysis. Microsc Res Tech 2011; 74: 415-420.（MLDB）
Ishigaki Y, Nakamura Y, Takehara T, Kurihara T, Koga H, Takegami T, Nakagawa
H, Nemoto N, Tomosugi N, Kuwabata S, Miyazawa S: Comparative study ofhydrophilic and hydrophobic ionic liquids for observing cultured human cells by
scanning electron microscopy. Microsc Res Tech (in press) （MLDB）‑ 110 ‑

‑ 111 ‑‑ 112 ‑‑ 113 ‑‑ 114 ‑‑ 115 ‑‑ 116 ‑‑ 117 ‑‑ 118 ‑‑ 119 ‑‑ 120 ‑‑ 121 ‑‑ 122 ‑‑ 123 ‑‑ 124 ‑‑ 125 ‑‑ 126 ‑‑ 127 ‑１．研究課題名：53BP1 による p53 非依存的転写調節機能の解明（研究番号S2009-6）

２．キーワード：１）53BP1
２）癌抑制遺伝子産物（tumor suppressor）
３）転写調節（transcriptional regulation）
４）蛋白質・蛋白質相互作用（protein-protein interaction）
３．研究者氏名：松井理・医学部・助教・ゲノム医科学（生化学Ⅰ）

４．研 究 目 的
53BP1 は DNA 二重鎖切断に応答して、切断部位周辺に速やかに集積し、細胞周期の停止（細胞周期チェックポイント）およびその後の DNA 修復に関与する。近年、53BP1の DNA 損傷部位への集積機構について急速に解明が進んでいるが、集積した 53BP1 が、その後その場でどのように DNA や他の蛋白質と相互作用し、機能しているかということについては未だ不明である。我々は 53BP1 が転写因子である癌抑制遺伝子産物 p53と結合する点に着目し、その転写活性との関連について調べ、これまでに以下の結果を得た。
１）RNAi による 53BP1 のノックダウンにより、DNA 損傷依存的かつ p53 依存的な p21 の発現が著しく抑制されることを見出し、53BP1 が p53 の転写活性に重要であることを明らかにした（p53 特異的転写調節）。
２）以前に、遺伝子導入により 53BP1 を細胞内で過剰発現させると p53 による転写活性が増強されることを見出していたが、最近この 53BP1 過剰発現による転写活性の増強が p53 とは無関係かつ非特異的に起きることを明らかにした（p53 非特異的転写調節）。
p53 特異的転写調節は、明らかに DNA 損傷時における 53BP1 の機能を反映していると思われるが、p53 非特異的転写調節についてはその生理的意義、作用機序等、全く不明である。そこで、この点を明らかにすることを目的に本研究を行った。

５．研 究 計 画
１）様々な領域を欠失させた変異型 53BP1 を作製し、これを細胞内で過剰発現させることにより、p53 非特異的な転写活性の増強に関与する 53BP1 領域を明らかにする。
特に、クロマチンとの結合が転写活性の増強に必須かどうかを明らかにする。
２）近年、53BP1 は ATM-KAP1 経路を介するクロマチン構造変換の制御に関わっていることが示唆されている。そこで、この経路に関与する蛋白質について、RNAi による発現抑制、または遺伝子導入による過剰発現を行い、53BP1 による転写活性の増強に関与しているかどうかを明らかにする。

‑ 129 ‑

６．研 究 成 果
まず 53BP1 による p53 非特異的転写活性増強効果の普遍性を検証するため、ヒト由来の様々な癌細胞を用いて転写増強活性を調べた。p53 特異的プロモーターとして
p21 プロモーター、Bax プロモーター、また、p53 非特異的プロモーターとして SV40
プロモーター、TK プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター発現ベクターを用いてルシフェラーゼアッセイを行った。正常な p53 を持つ細胞（HCT-116（大腸癌）、
MCF-7（乳癌）、U2OS（骨肉腫））では、p21、Bax プロモーターの活性は 53BP1 の強発現によって著しく増強されたのに加えて、SV40、TK プロモーターの活性も同様に増強が認められた。しかしながらこの時、内在性の p21 の発現量は 53BP1 の強発
現によって、ほとんど増加が認められなかったことから、転写増強効果が p53 だけでなく、細胞の全体的な転写活性に及んでいたことが示唆された。さらに p53 遺伝子を欠損した細胞（Saos-2（骨肉腫））においても、SV40、TK プロモーターの活性も同様に増強効果が認められた。以上の結果から、53BP1 の強発現による p53 に非特異的な転写活性増強効果は、細胞の種類によらず、普遍的であることが示唆された。
次に、53BP1 のどの領域が転写活性の増強効果に必要なのかを明らかにするため、
53BP1 の既知の様々な機能ドメインについて、アミノ酸配列を置換したり、ドメインを欠失させた変異体を作製し、これらを用いて前述と同様にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、驚くべきことに、クロマチンとの結合活性を持たない Tudor ド
メインに変異を持つ 53BP1 変異体においても、p53 非特異的転写増強効果は全く失われなかった。我々は当初、53BP1 の p53 非特異的転写活性増強効果について、53BP1
がクロマチンに直接結合し、その構造を劇的に変換させることがその原因であると予想していたので、この結果は非常に意外であった。一方、53BP1 の C 末端領域にある
BRCT ドメインを欠損させた変異体において、増強効果がわずかではあるが抑制された。以上の結果から、53BP1 による p53 非依存的転写活性の増強には、53BP1 の BRCT
ドメインが関与していることが示唆された。
53BP1 の BRCT ドメインと相互作用する蛋白質は、これまでに我々の同定した p53
以外には報告されていなかった。そこで、この領域に結合する別の蛋白質がこの機能に関与すると予想し、新たに BRCT ドメインに結合する蛋白質の検索、同定を試みた。
53BP1 の核移行シグナルと BRCT ドメインを含む 53BP1 の C 末端領域と FLAG-HAペプチドを融合した組換え蛋白質を発現する細胞株を作製し、その細胞抽出物から抗FLAG 抗体ビーズによるアフィニティー精製を行い、53BP1 の BRCT ドメインを含む蛋白質複合体を分離・精製した。その蛋白質複合体を SDS-PAGE で分離後、泳動ゲルから蛋白質バンドを抽出し、質量分析装置で同定を試みたところ、新規 53BP1
結合蛋白質として、annexin A2 を見出した。

‑ 130 ‑

７．研究の考察・反省本研究では、53BP1 を過剰に発現させた時に起こる p53 非特異的転写増強効果について様々な癌細胞を用いて調べた結果、この現象が普遍的であることが明らかになった。しかし、実際には全ての細胞で 53BP1 が大量に発現されているわけではなく、従ってこの現象はおそらく、53BP1 の持つ本来の機能が別の形で現れているものと推察される。本研究期間内にこの点を明らかにすることはできなかったが、今後も解析を継続して行い、作用機序を解明する。
本研究では、p53 非特異的転写増強効果に、53BP1 のBRCTドメインが必要である
ことを明らかにした。BRCTドメインは、癌抑制遺伝子産物の一つであるBRCA1 のC末端領域（ BRCA1, C-Terminal）と構造的に相同的な機能ドメインで、他の多くのDNA修復関連蛋白質やチェックポイント関連蛋白質にも広く見出されており、重要性が指摘されている。特に多くのBRCTドメインは、蛋白質のリン酸化部位を認識し、そこに結合することが報告されている。53BP1 のBRCTドメインについては、これまで、我々が以前に報告したp53 以外の結合蛋白質は見出されてはいなかったが、今回、p53 の関与しないであろう機能にBRCTドメインが必要であることが明らかになったことから、我々は、p53 以外のBRCTドメイン結合蛋白質を検索し、その結果、新たにannexin A2 を同定した。annexin A2 は、細胞内でリン酸化により機能調節が行われることが報告されており、53BP1 のBRCTドメインに結合しているannexin A2 について解析したところ、リン酸化型であることが示唆された。また、annexin A2 は、細胞内において主に細胞質で働いていると考えられているが、一部、核と細胞質の間を出入りしていることも報告されている。この核内のannexin A2 については、未だにその生理的役割が不明である。したがって、今回、核蛋白質である 53BP1 との結合が明らかになったことにより、annexin A2 の核内での働きについて、解明の糸口になるかもしれない。今後は、53BP1 のp53 非特異的転写増強効果にannexin A2 が関与しているのかどうかについて、解析を進めていく。

８. 研 究 発 表なし‑ 131 ‑

１．研究課題名：水輸送分子 aquaporin-1, -5 を標的にした新規肺癌治療法の確立のため
S2009-7）の基礎研究（研究番号２．キーワード：１）肺癌（lungcarcinoma）

２）アクアポリン（AQP）
３）微小乳頭状成分（micropapillary）
３．研究者氏名：島崎都・医学部・助教・病理病態学（病理学Ⅱ）

４． 研 究 目 的
肺腺癌浸潤・転移の制御法確立を目指し、生命現象に必須の水輸送にかかわる AQP
分子の細胞移動能亢進という新たな機能に注目し、AQP-1、-5 の肺腺癌浸潤部での発現を他のがん関連遺伝子発現と比較解析すると共に、肺腺癌細胞の細胞移動への関与の実証と関係する細胞内シグナル伝達経路の解明を行う。
５． 研 究 計 画①肺腺癌浸潤部における AQP-1 と AQP-5 の発現解析
１）早期浸潤性肺腺癌（Noguchi C 型）の浸潤部と非浸潤部における蛋白発現の比較解析
a. 本学呼吸器外科で外科的に切除された Noguchi C 型肺腺癌 50 症例*1 を用いた浸潤部、非浸潤部、正常肺組織部からの tissue array の構築
b. 抗 AQP-1、AQP-5 ポリクローナル抗体 (Alpha diagnostics)を用いた免疫染色*1.

2001 年～2008 年の手術症例。

支援とアイデア：本学呼吸器内科、呼吸器外科とはこれまでの研究で協力体制を構築している。Tissue array 作製は富山大学付属病院病理部

福岡順也博士の支援を受ける。Tissue array の導入で研究推進の迅速化と免疫染色の精度を向上できる。
２）Noguchi C 型肺腺癌浸潤部と非浸潤部がん細胞での AQP-1 と AQP-5 遺伝子発現定量解析
a. 凍結切片の作製と laser capture microdissection / real time RT-PCR 法*2 による AQP-1 と AQP-5 遺伝子発現定量解析
b. real time RT-PCR のための AQP-1、-5 遺伝子、標準化のための G3PDH 遺伝子用 primer/ probe は Assay-On-Demand Gene Expression Products (Applied Biosystems)より入手*2. ハ イ テ ク リ サ ー チ セ ン タ ー 遺 伝 子 研 究 室 設 置 の PALM robot-microbeam(Carl-Zeiss 社製)と Prizm 7700 (Advanced Biosystems 社)を使用
支援とアイデア：Laser-captured microdissection / real time RT-PCR の応用に
より in situ での遺伝子発現定量を可能にする。
３）AQP-1, -5 の発現とがん関連遺伝子発現、臨床病理学的因子との比較
a. Tissue array を用いた免疫染色での EGFR、E-cadhelin、βcatenin、MT1-MMP,‑ 133 ‑

MMP-2、

vimentin、p53、Rb、PCNA 発現との比較検討
b. 病期、リンパ節転移、術後再発、予後との統計学的解析②培養肺腺癌細胞を用いた AQP-1、AQP-5 による細胞移動制御の in vitro での実証
１）AQP-1、AQP-5 遺伝子導入による cell motility、migration 能の修飾
a. 樹立肺癌細胞での AQP-1、AQP-5 遺伝子発現解析
b. 低発現細胞株への AQP-1、AQP-5 遺伝子導入（lipofection 法による）
c. Motility, invasion, adhesiveness の解析
i.

Scratch 法による cell motility assay

ii.

Matrigel filter を用いた invasion assay

iii. Fibronectin / laminin への adhesion assay
支援とアイデア：樹立肺癌細胞株の提供とトランスフェクションへの支援を協力研究者である金沢大学医学部がん研究所

源利成博士より受ける。トランスフェクシ

ョン用 plasmid として wild type の他、PCR-based site-direction mutagenesis
を用い PKA pathway 及び membrane trafficking 領域の変異 plasmid も作製することで AQP 分子内の機能部位の特定を可能にする。
２）Si RNA 法を用いた AQP-1、AQP-5 遺伝子ノックダウンによる cell motility、migration
能の修飾
a. AQP-1、AQP-5 高発現細胞株、１）で作製した wild type AQP-1、AQP-5 遺伝子導入細胞株を使用
b. AQP-1、AQP-5 および陰性対照実験用 siRNA は Stealth Select RNAi (in vitrogen)より入手
c. Motility, invasion の解析
i.

Scratch 法による cell motility assay

ii.

Matrigel filter を用いた invasion assay

支援とアイデア：SiRNA 実験は本学総医研石垣先生の指導下に行う。
６． 研 究 成 果
肺腺癌の新たな予後不良因子として近年提唱された微小乳頭状成分
micropapillary component に注目し、その高侵襲性に関わる分子機構の解明と臨床応用を目指す。
1. アレイ実験は終了し、現在種々の分析法と、インジェヌイティパスウェイ解析 (IPA)
データベースを用い、データ解析を行っている。
2. 今回、微小乳頭状成分の高侵襲性に関わる分子の一つとして水分子輸送膜蛋白である
aquaporin(AQP) 1, 3, 5 の細胞増殖、移動能亢進という新たな機能に注目し、遺伝
子、蛋白発現解析を行った。
肺癌多数例での AQP1, 3, 5 の免疫染色での発現解析
159 例のヒト肺癌中、癌細胞における AQP1, 3, 5 の発現を免疫染色したところ、それぞれ 71％,44％,56%の症例で陽性を認めた。陽性率は高分化型腺癌で高く、低分化型‑ 134 ‑

腺癌や未分化型癌では低く、扁平上皮癌は陰性であった。肺腺癌中、癌浸潤部ではAQP1,

5 では極性喪失と細胞質内発現も伴う過剰発現が観察された。AQP1 は浸潤性発育と関連し、浸潤最先端部の lamellipodia での発現も確認された。AQP1 が過剰発現している腫瘍は、micropapillary 成分を有する腺癌（p=0.011）と粘液産生型腺癌（p=0.045）において、手術後の転移が有意により高い結果になった。カプラン・マイヤーの分析によって、増加した AQP1 発現患者は AQP1 低発現レベル（ログランク検定 p=0.031）を示している患者と比較して、無症候性生存率で有意差を示した。無症候性生存率は、AQP1 過剰発現の腺癌で特に micropapillary 成分を含んだ腺癌症例で、明らかだった。
AQP 遺伝子発現と腫瘍進展との関係
micropapillary 成分を伴う肺腺癌においては、AQP1 の過剰発現は明らかな予後不良因子であることが明らかとなった
７．研究の考察・反省
細胞レベルでの検討が乏しいため、AQP-1、AQP-5 と関係する細胞内シグナル伝達経路の解明が今後の課題と考えられる。
１）EGFR 系
a. AQP-1 、 AQP-5 低 発 現 株 に お け る EGF 添 加 に よ る 発 現 誘 導 と cell motilitiy,invasion 能の修飾
b. AQP-1、AQP-5 高発現株における EGFR kinase inhibitor(PD153035) 添加による cell
motilitiy, invasion 能の修飾
２）Ras/ERK/Rb シグナル系
a. AQP-1、AQP-5 高発現株における MAPK/ERK kinase inhibitor (U0126)153035) 添加による cell motilitiy, invasion 能の修飾
３）Src 系との関係
a. AQP-1、AQP-5 発現と phosphorylated Src（活性化 Src）の免疫沈降・western blot法による解析
８． 研 究 発 表
Relationship of aquaporin 1, 3 and 5 expression in lung cancer cells to cellulardifferentiation, invasive growth and metastasis potential.
Yuichiro Machida, Yoshimichi Ueda, Miyako Shimasaki, Katsuaki Sato, Motoyasu
Sagawa, Shogo Katsuda and Tsutomu Sakuma.

Hum. Pathol.

2010; 42: 669-678.

（MLDB）
アクアポリン： がん細胞浸潤の新たなプレーヤー
上田善道、 島崎都 、町田雄一郎、高原豊、氷見祐二、石垣靖人、佐藤勝明、佐久間勉、栂博久、川上重彦、勝田省吾. 金沢医大誌. 2010; 35: 61-67.

‑ 135 ‑

‑ 136 ‑‑ 137 ‑‑ 138 ‑‑ 139 ‑‑ 140 ‑‑ 141 ‑‑ 142 ‑‑ 143 ‑‑ 144 ‑‑ 145 ‑‑ 146 ‑１．研究課題名：慢性疲労症候群の漢方治療における中枢神経系の再生機構（研究番号S2009-8）

２．キーワード：１）東洋医学（Kampo medicine）
２）慢性疲労症候群（Chronic fatigue syndrome）
３．研究者氏名：守屋純二・医学部・助教・総合内科学（総合診療科）

４． 研 究 目 的
慢性疲労症候群 (Chronic Fatigue Syndrome：CFS) は原因不明の微熱を伴う強い疲労感を主症状とし、著しく生活の質が損なわれる疾患群である。CFS の症状は中枢神経系の病理的変化を伴っていることが推測されているが詳細は不明であり、未だ適切な動物モデルが確立していない疾患である。同疾患でみられる多様な臨床症状や現在までの研究から、その病態は中枢神経系、免疫系の変調が関与しているものと考えられている。しかし依然として確立した治療法がないため、漢方薬など生薬による治療効果の検証とその作用機序の解明を目標に、CFS マウスモデルを用いて中枢神経系の変化を形態的、機能的に解析する。漢方医学は薬理作用が明らかにされていない事が多く、多因子が混在し病因がはっきりしない CFS で有用性を基礎デ－タとして示せ
れば価値を明らかにでき、本疾患の病態解明に貢献できると考えた。また、臨床症状、病態的に類似した項目の多いうつ症状の病態にノルエピネフリンの低下が報告され(Neuropsychobiology, 2007)、 BDNF 低 下 と と も に 海 馬 容 積 が 縮 小 す る (Duman, Biol
Psychiatry, 2006)ことから,BDNF 蛋白を海馬に直接注入することでうつ状態を改善させた(Shirayama, J Neurosci, 2002)ことが報告された。しかし,脳内 BDNF と CFS 病態に関する報告は現在までなく、これに対してマウスモデルを用い、脳内 BDNF mRNA の関連性の強い遺伝子に注目し、漢方薬による治療効果を神経の可塑性や神経新生という視点から解析する。
これまでの研究成果として、①Brucella Abortus antigen の反復投与を行い CFS の
マウスモデルを作製した。モデルは持続し慢性に経過する自発運動量低下を示し、ヒトでの同疾患でみられる主症状である長期間にわたる活動性の低下に一致していた。
②本モデルでを用いて 漢方薬（補中益気湯）を投与したところ、一過性だが活動性の上昇がみられたことから CFS の病態には漢方治療により症状の改善を認めることが示された。③本モデルにおいて脳重量は減少し、特に海馬容積の有意な減少を認め、BDNF
mRNA と Bcl-2 の mRNA 発現量が同部で有意に低下していた。以上より、CFS の中枢神経系での病態の解析を更に詳細に行い、漢方による治療の有用性を機能的、構造的に基礎デ－タとして示し、漢方治療が有効であるかを検証すること、脳内 BDNF など転写因子の遺伝子発現の変化と CFS 病態に関する報告を行い、広く BDNF の低下する疾患(う‑ 147 ‑

つ病,認知症)への治療法の選択幅を広げることを研究の目的とした。
５． 研 究 計 画
慢性疲労症候群マウスモデルにおける漢方薬の神経細胞保護効果検討する。
脳内 BDNF と受容体発現に関与し脳の活性化が起こり脳再生作用を来たすのか,組織内遺伝子発現,免疫組織染色,In Situ Hybridization によって解析する。
8 週齢雌 の Balb/c マウスを用 い、Brucella Abortus antigen の尾静脈反 復投与（0.2ml/回を 2 週間毎に計 6 回試行）を行い作成した CFS マウスモデルに対し、臨床的に認知症、うつ状態など CFS と同様に活動性の低下する疾患に用いられる漢方薬である抑肝散加陳皮半夏を投与する。これにより免疫系及び中枢神経系の機能にも良好な改善をもたらすかどうかを検討する。
CFS マウスモデル投与群、未投与群に分けて脳（海馬）を主体に機能的、構造的に解析する。同部の BDNF/CREB 系の因子の誘導とアポトーシス抑制因子である Bcl-2 の抑制効果を脳内で明らかにする。脳重量は、すべての群について屠殺時に評価する。
半分は 10%緩衝ホルマリン液で固定し、切片を作製して Nissl 染色を行い半分をリア
ルタイム PCR 用に保存する。また、漢方投与群は抑肝散加陳皮半夏を飼料に混在する方法とし、治療群として①高用量（0.18）投与群（n=7）、②低用量（0.09％）投与群（n=6）③無治療マウスモデル群（n=7）の合計 3 群に分け、用量依存による効果も検討する。これらに正常対照群を比較し、各項目の有意差検定を行う。

６． 研 究 成 果
過去の実験形式と同様に、CFS マウスモデルを作成。上記の 3 群間で各項目を比較、検討した。項目として自発運動量、海馬組織内の遺伝子発現を確認するため、同部 BDNF、
CREB、Akt1、MAPK1 を定量化し、各群の海馬、副腎、脾臓など各種臓器を摘出し重量を測定。これらを統計解析した。自発運動量は 3 群間では有意な差はみられず、モデルマウスの治療による活動性の改善はみられなかった。海馬における各種遺伝子発現については BDNF、CREB は群間比較では有意差は認めなかったが、高用量投与群と無治療マウスモデル群の比較において、治療により Akt1 の発現量増加があり、また MAPK1
は高用量投与群で、他の 2 群と個々に比較したところ発現量低下を示していた。各パ
ラメーターは ANOVA を用い、P<0.05 を有意差とした。その他臓器の解析、比較検討は現在進行中である。

７．研究の考察・反省
今回の実験では、CFS の臨床症状から推測され、今までの研究で解明されてきている同疾患の中枢神経系の機能的、病理的な変化を、BDNF/CREB 系を解析することで解明しようと考えた。特に MAPK1 は神経細胞の分化、再生や生存に亢進に重要な項目であり、記憶学習機能の亢進を示すとされている。また、Akt1 は活性化により神経細胞‑ 148 ‑

のアポトーシス抑制、生存促進に重要とされている。現在、これらのパラメーターに他群間比較で有意差を示した事に対し我々の先の同モデルを用いた実験結果を参考にし、海馬の免疫染色など組織的な変化も確認していき、同部形態的変化を含め評価、考察をすすめている。また、反省として治療群の投薬が餌に混合する方式であったた
め、全個体で均一量の投与でなかった可能性もある。しかし漢方薬は剤形より高濃度となるため、長期の経口ゾンデを用いた直接投与はマウスの消耗が強く継続困難なこともあり更に検討が必要と考えた。また、今後の課題は遺伝子発現で有意差を示した
項目に対し、蛋白発現や他のパラメーターに対する影響、関連を検討することで、中枢神経系への治療効果をより詳細に解明したいと考えた。

８． 研 究 発 表
実験結果を解析し、本年度中の投稿を目指し準備中である。

‑ 149 ‑

１．研究課題名：レンチベクターシステムを用いた可溶型 VEGF 受容体産生機構の解明と産生制御法の確立（研究番号S2009-9）

２．キーワード：１）血管新生（angiogenesis）
２）血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor）
３）ヒト毛細血管内皮細胞（human microvascular endothelial cell）
４）選択的 3’端プロセシング（alternative 3’-end processing）
５）レンチウイルス（lentivirus）

３．研究者氏名：池田崇之・医学部・助教・ゲノム医科学（生化学Ⅱ）

４． 研 究 目 的
血管新生は、各組織の形態形成や維持に重要である一方、がんの増殖・転移、糖尿病血管合併症など病的な条件の発生や進展に深く関与している。したがって、血管形成のメカニズムを解明し、その制御機構を明らかにすることは、極めて重要な課題である。
血管内皮増殖因子（VEGF）は血管新生における主要促進因子であり、血管内皮細胞膜に結合した受容体を介して血管新生を促進する。近年、膜結合領域を持たない
可溶型 VEGF 受容体（可溶型 Flt-1）が、同じ遺伝子から mRNA 選択的 3’端プロセシ
ングにより産生され、膜型受容体に対し拮抗的に働いて血管新生を抑制することが明らかにされた。池田は、主要な血管新生の場であるヒト毛細血管内皮細胞（HMVEC）が可溶型 Flt-1 を産生していることを確認した。可溶型 Flt-1 mRNA の選
択的 3’端プロセシングは第 13 イントロン内のポリ A シグナルと最終エクソン内のポ
リ A シグナルの選択によるもので、その選択を決めるメカニズムはいまだ未解明である。本研究では、可溶型 Flt-1 産生を制御する mRNA 選択的 3’端プロセシング機
構を明らかにし、新たな血管新生制御メカニズムを解明する。

５． 研 究 計 画
可溶型 Flt-1 産生を制御している Flt-1 pre-mRNA 上の配列を既に同定していることから、以下のように選択的 3’端プロセシングを制御しているタンパク質の同定とその調節メカニズムの解析を行った。
(1) レ ン チ ウ イ ル ス ベ ク タ ー シ ス テ ム を 用 い た 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 系 と ノ ッ ク ダ ウ ン 系を確立する。
(2) レンチウイルスベクターシステムを用いて、Flt-1 選択的 3’端プロセシングを制御している RNA 結合タンパク質を同定する。
(3) 可溶型 Flt-1 産生の調節を行う血管新生関連因子を同定する。

‑ 151 ‑

(4) レンチウイルスベクターシステムを用いて、可溶型 Flt-1 過剰産生が血管新生に与える影響を明らかにする。

６． 研 究 成 果(1) レンチウイルスベクターシステムの確立
初代培養ヒト毛細血管内皮細胞（HMVEC）の遺伝子導入には、一般的に使われているリポフェクション法では導入効率が悪く、他の方法を利用する必要があった。そこで、１）導入効率がほぼ 100%である、２）導入された遺伝子は容易にゲノム DNAに組込まれ安定した発現が達成できる、３）そのまま動物モデルへ応用できることから、レンチウイルスベクターシステムを確立した。すでに明らかにしている mRNA 選
択的 3’端プロセシング制御配列を認識配列に持つ RNA 結合タンパク質の cDNA を過剰発現用レンチウイルスベクターである pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP にクローニン
グした。レンチウイルスを HMVEC に感染させ、導入効率が 100%であることと、導入した遺伝子が発現していることを確認した。さらに、RNA 結合タンパク質の shRNA
ノックダウンベクターを作製するための siRNA 配列を設計し、pSIH-H1 ベクターに組込んだ。レンチウイルスを HMVEC に感染させ、mRNA レベルでもタンパクレベルでも 80%以上のノックダウン効果があることを確認した。以上のことから、HMVEC への遺伝子導入にレンチウイルスベクターシステムが有効であることが示され、過剰発現系およびノックダウン系が確立できた。
(2) RNA 結合タンパク質の同定
過剰発現およびノックダウンレンチウイルスベクターを HMVEC に導入し、内因性
Flt-1 の選択的 3’端プロセシングに及ぼす影響を解析した。制御配列を認識する RNA
結合タンパク質のうち hnRNP A0、hnRNP D、HuR の過剰発現で膜型に対する可溶型の産生比（可溶型／膜型比）が減少した。また、制御配列は可溶型 Flt-1 の 3’端切断に必要な因子 CstF64 の結合部位でもあることが予想されることから、CstF64 を過剰発現して可溶型／膜型比を解析したが、大きな変化は見られなかった。hnRNP A0 とHuR で可溶型／膜型比が減少したことから、ノックダウンによって可溶型／膜型比が増加することが予想されたが、どちらも変化は認められなかった。以上より、制御配列に結合する RNA 結合タンパク質の過剰発現で Flt-1 選択的 3’端プロセシングの人工的制御ができる可能性が示された。
(3) 可溶型 Flt-1 産生制御因子の探索
HMVECを生体での主要な血管新生因子である低酸素状態（2.5% O 2 以下）にしたと
ころ、可溶型Flt-1 の産生が顕著に抑制されることを見出した。可溶型Flt-1 の発現がmRNA、タンパク質ともに約 6 割まで減少していた。また、低酸素刺激下で活性化され、血管新生関連因子の発現を誘導する転写因子HIF-1 が可溶型Flt-1 産生の抑制に関‑ 152 ‑

与しているかどうかを、HIF-1 の分解を誘導する水酸化酵素の阻害剤DMOGを用いて検討した。HMVECにDMOGを添加したところ、可溶型、膜型Flt-1 ともに増加し、低酸素刺激で見られた可溶型Flt-1 産生の特異的抑制は見られなかった。以上のことから、
低酸素刺激が可溶型Flt-1 産生を調節している因子の１つであり、低酸素刺激で誘導されるHIF-1 の活性化は直接関与していないことが示唆された。
(4) 可溶型 Flt-1 過剰産生が血管新生に与える影響
レンチウイルスで可溶型 Flt-1 を過剰発現させた HMVEC を用いて、VEGF 添加による細胞増殖に与える影響を解析した。ベクターを導入した HMVEC では、VEGF によって細胞増殖が誘導されたが、可溶型 Flt-1 の過剰発現により細胞増殖は抑制された。
したがって、HMVEC で産生された可溶型 Flt-1 がオートクリンで VEGF による細胞増殖を抑制することが示された。

７．研究の考察・反省
本研究により、低酸素刺激が可溶型 Flt-1 産生を抑制することが明らかとなり、可溶型 Flt-1 産生制御メカニズムの一端が解明された。低酸素刺激で誘導される HIF-1による遺伝子発現調節は可溶型 Flt-1 産生の抑制には直接関与していないことが示唆され、新たなメカニズムが Flt-1 選択的 3’端プロセシングに機能している可能性が示された。レンチウイルスを用いた過剰発現系により、Flt-1 選択的 3’端プロセシング制
御配列に結合する RNA 結合タンパク質が可溶型 Flt-1 産生に影響することが明らかとなったが、ノックダウンによる可溶型 Flt-1 産生に及ぼす影響を解析することによってRNA 結合タンパク質の機能を検証する必要がある。また、制御配列が可溶型 Flt-1 の産生に必要な CstF の結合部位と考えられることから、RNA 結合タンパク質と CstF の競合によって制御されている可能性が考えられ、メカニズムをさらに詳しく解析する必要がある。さらに、低酸素刺激では RNA 結合タンパク質も CstF も mRNA レベルでの量的変動が認められなかったことから、タンパク質量の調節や翻訳後修飾なども考慮する必要がある。可溶型 Flt-1 がオートクリンで VEGF による細胞増殖を抑制する
ことが示されたことから、可溶型 Flt-1 産生を mRNA プロセシングの段階でコントロールすることによって血管新生を制御できる可能性が示唆され、今後、Flt-1 選択的 3’
端プロセシングの詳細なメカニズムを解明し、新たな血管新生制御法の確立を目指したい。

８． 研 究 発 表
Ikeda T, Sun L, Tsuruoka N, Ishigaki Y, Yoshitomi Y, Yoshitake Y, Yonekura H.
Hypoxia down-regulates sFlt-1 (sVEGFR-1) expression in human microvascularendothelial cells by a mechanism involving mRNA alternative processing.
Biochem J 2011; 436：399-407.（MLDB）‑ 153 ‑

‑ 154 ‑‑ 155 ‑‑ 156 ‑‑ 157 ‑‑ 158 ‑‑ 159 ‑‑ 160 ‑‑ 161 ‑‑ 162 ‑‑ 163 ‑‑ 164 ‑１．研究課題名：新生児中枢神経発達に影響を及ぼす母乳シグナル伝達物質の網羅的解析（研究番号

S2009-10）

２．キーワード：１）神経新生（Neurogenesis）
２）初乳（Colostrum）
３）プロテオミクス（Proteomics）
４）乳腺細胞（Breast cells）
５）DNA アレイ（DNA array）
３．研究者氏名：島村

英理子・医学部・講師・分子細胞形態科学（解剖学Ⅰ）

４． 研 究 目 的
これまでに我々は、ラットの経胎盤による LIF-ACTH-LIF 母胎間シグナル伝達が胎児神経前駆細胞の増殖を促すことを明らかにし、胎盤のシグナルトランスデューサーとしての役割を提唱してきた。ラット出生時の脳はヒトの胎生 20 週頃に相当し、出生後急速な発達を遂げることから初乳には脳発達に関わる重要な因子が含まれていると予想された。本研究では、20 週以降の母胎間シグナル伝達の胎盤に相当する媒体としてラット乳腺細胞および母乳を想定し、乳腺細胞の DNA アレイ解析、および母乳蛋白質の網羅的解析を行った。また、完全栄養管理下で実験を行うラット新生児の人工哺育システムを構築することを目的とした。

５． 研 究 計 画
i.

乳腺細胞の mRNA 発現の動態：出産日(P0)および P4 day のラット乳腺組織から mRNAを抽出し、DNA マイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的解析を行った。

ii.

P0, P1, P3, P14 のラット母乳を搾乳し、遠心分離操作により得た乳清画分を 2 次
元電気泳動で展開し、主要なスポットを nano-HPLC-ESI-MS/MS で解析した。また、
低分子蛋白およびペプチドは酸処理後にプロテインチップを用いて解析した。人工哺育システムを構築するため、飼育環境の検討とゾンデの選定を行った。

iii. P0 からの人工哺育システムを構築するため、新生児経口投与用ゾンデの開発を行った。

６． 研 究 成 果i.

P0 での発現が P4 に比べて高かったものでは、Gfra3、Igf1、Igf2 が挙げられた。

‑ 165 ‑

ii.

蛋白質の変動は P0 vs P1 で最も大きく 39.1％であったのに対し、P1 以降は各日数間の変動は約 20％と一定であった。また主要蛋白質には glial fibrillary acidic
protein が含まれていた。

iii. 特殊加工したゾンデにより、帝王切開した新生児を８時間毎の経口投与による完全人工哺育にて飼育する事に成功した。また人工ミルクを作成し、完全栄養管理下において、サイトカイン等を定量的に経口投与できるシステムを確立した。

７．研究の考察・反省
新生児神経新生に関わる候補蛋白質は同定されたが、どの母乳画分（脂溶性か水溶性画分か、高分子画分か低分子画分か等）の検討は期間中に行えなかった。今後は、
本申請課題において確立された人工哺育システムにおいて経口投与での画分スクリー
ニング行い、新生児の大脳および小脳における表現系解析を行う必要がある。

８． 研 究 発 表Simamura E, Shimada H, Shoji H, Otani H, Hatta T. Effects of melanocortins on
fetal development. Congenit Anom. 2011; 51: 47-54. (MLDB)
Simamura E, Shimada H, Higashi N, Uchishiba M, Otani H, Hatta T. Maternal
leukemia

inhibitory

factor

(LIF)

promotes

fetal

neurogenesis

viaa

LIF-ACTH-LIF signaling relay pathway. Endocrinology. 2010; 151: 1853-1862.
(MLDB)
Shimada H, Hirai K-I, Simamura E, Hatta T, Iwakiri H, Mizuki K, Hatta T,
Sawasaki T, Matsunaga S, Endo Y and Shimizu S. Paraquat toxicity induced byvoltage-dependent anion channel 1 acts as an NADH-dependent oxidoreductase. J
Biol Chem. 2009; 284: 28642-28649.

(MLDB)‑ 166 ‑

‑ 167 ‑‑ 168 ‑‑ 169 ‑‑ 170 ‑‑ 171 ‑‑ 172 ‑‑ 173 ‑‑ 174 ‑１．研究課題名：プリセプターが捉える新人看護師が遭遇する臨床判断の困難性（研究番号S2009-11）

２．キーワード：１）プリセプター（Preceptor）
２）新人看護師（Newcomer nurses）
３）臨床判断（clinical judgment）
４）困難（difficulty）
５）質的研究（qualitative research）
３．研究者氏名：北村佳子・看護学部・助教・成人看護学４．研 究 目 的
新人看護師教育においてプリセプター制度を導入している施設は多い。また、新人看護師の看護実践能力に関する実態調査はあるが、プリセプターが新人看護師の実践能力や新
人看護教育上の問題をどのように捉えているかは明らかにされていない。本研究の目的はプリセプターが捉える新人看護師の臨床判断における困難を明らかにすることである。
５．研 究 計 画
１）研究デザイン：質的記述的研究（因子探索型）
２）対象者：Ａ病院において平成 20 年度にプリセプターを担った看護師 44 名
３）データ収集方法：自由記述法による留置調査を実施し、「あなたは、新人看護師が患者への看護を実践する上でどのような場面で判断に困ったり、悩んだりしていると感じましたか」について記載してもらった。
４）調査期間：平成 21 年 5～6 月
５）分析方法：研究の問いに対応した文・節を素データとした。素データをコード化、分類
し、カテゴリー化した。
６）研究の厳密性：分析結果が真実であることの信用性を確保するため、確実性については
回答者 25 名のうち、質問紙に氏名の記載があった者７名からメンバーチェックを受けた。
彼らに分析過程と研究結果を示し、7 名全員から妥当であるとの返答を得た。また、研究結果が研究者の偏見や歪みにより影響を受けていないことを示すために、研究メンバー
らが定期的に集合しディスカッションした。さらに、分析方法についてはスーパービジ
ョンを受けた。
７）倫理的配慮：対象者へは研究の目的、方法、プライバシーの保護などを文書と口頭で説明し、質問紙の回答をもって同意とした。なお、本研究はＡ病院看護部の承認を得た。
個人情報の取り扱いについて、収集したデータや関連資料は鍵のかかるキャビネットに保存した。また、回収した質問紙には番号を付け匿名化にした。

‑ 175 ‑

６．研 究 成 果
１）対象者の概要：対象者のうち 25 名から回答を得た（回収率 57％）。臨床経験年数は、
3～ 5 年 が 18 名 、 6～ 10 年 が 4 名 、 11 年 以 上 が 3 名 だ っ た 。 プ リ セ プ タ ー 経験
回数は 1 回が 15 名、2 回が 5 名、3 回が 5 名であった。
２）プリセプターが捉える新人看護師の臨床判断における困難
24 個の素データが抽出され、コード化した。24 個のコードを分類した結果、表 1 のとおり 8 個のカテゴリーを産出した。表 1 の①から⑦までは、新人看護師の実践能力の未熟さからくる判断の困難であった。⑧は新人看護師に課す業務の質と量の不適切さを指摘するものであった。
７．研究の考察・反省
表 1 の通り、①から⑦までのカテゴリーに所属するコード数は 87．5％であった。即ち、プリセプターが捉える新人看護師の臨床判断における困難の大部分が、看護実践能力の未熟さから来るものと捉えていた。このことは井部ら（1998）が行った新人看護師の実態調査、即ち「病院の看護管理者が認知している新卒者の育成上の主な課題には、技術力の不足、経験の再評価の必要性、社会人としての成長が必要なこと、知識と実践の統合が必要である」と同様な結果であった。しかし、この他にプリセプターは⑧新人看護師に対して彼らのキャパシティーを超えた業務を課しているという問題も指摘していた。近年、看護業務の複雑・多様化・国民の医療安全の意識向上の中で、高い看護実践能力が求められている。看護実践能力向上のためには、プリセプター制度を含む新人教育のあり方に、より一層の工夫が必要である。と同時に、看護基礎教育における看護実践能力強化の検討も必要と考える。
本研究結果より、プリセプターは、新人看護師の臨床判断における困難には看護実践能
力の未熟さと併せて新人看護師に課す業務の質と量の不適切さがあると捉えていたことが明らかとなった。本研究の限界は、プリセプターの自由記述によるデータ収集方法をとったためデータ産出が十分とは言えなかった。したがって、今後は濃密なデータを産出するためにインタビューによるデータ収集が必要であると考える。また、新人看護師とプリセプターを対応させて調査を行うことが実態をより鮮明に浮き上がらせることになると考える。
８．研 究 発 表
本研究は、第 4 回看護実践学会学術集会にて発表した。論文発表は、看護実践学会会誌に投稿予定である。
引用文献
1）井部俊子，飯田裕子，今井 恵，他：看護教育における卒後臨床研修のあり方に関する研究
新卒者の卒後臨床研修と臨床実践能力の実態，平成 10 年度厚生省科学研究補助金（医療技術評
価総合研究事業）研究報告書，1998‑ 176 ‑

表1

プリセプターが捉える新人看護師の臨床判断における困難

カテゴリー

コード

①複数の患者ある
いは一人の患者のケア時期の優
先順位の判断能
力の弱さ

・指導者のもと自立した夜勤勤務のとき同時になりだした 2 つのナース
コールに対して優先順位の判断の困難
・少人数スタッフにおける複数患者の異常への優先順位対応困難・複数の患者への優先順位ができない
・バイタルサイン測定時間帯変更判断困難②看護技術の未熟さによる失敗や戸惑い

・輸液ポンプ用の点滴ルートと手動用の点滴ルートの判断がつかない・ケアに拒否的な患者に有効なケアを見つけ出すことができない③変化する症状への対応困難

・対象者に合わせたケア方法の選択困難
・患者の症状に応じた対処行動ができない・はじめて受け持つ気管内挿管した患者とのコミュニケーション確保の困難④病態アセスメン
ト能力の未熟さ

・患者の病状予測が困難
・薬物投与のタイミングの判断困難
・病状不安定患者のアセスメント困難⑤患者の病態像に合わせた薬物投与方法の選択困難・患者の症状に応じた薬物投与方法が判断できない・症状にあわせた薬物投与方法の対応困難⑥説明責任能力の不足

・ケア方法の相違を指摘された時、即座に説明する内容を判断できない
・服薬拒否の患者への説得内容を判断できない・誤った手技で患者に被害を与えた時の患者への謝罪方法の迷い
・自己の看護行為に対する患者の苦情への対応困難
・患児のバイタルサイン測定を何度も挑戦し、不振に思った母親に理由を説明できなかった⑦思考や判断への志向の弱さ

・明確な判断基準がないと判断できない
・患者の状態変化の訴えがあったとき指示なく行動ができない⑧新人看護師のキャパシティーを
超えた業務への配置

・患者の症状に応じた行動選択ができない
・新人の能力を超える業務量が課せられ対応困難
・同僚の援助を得られない場面で患者の緊急事態が生じて対応困難‑ 177 ‑

１．研究課題名：高齢者施設における要介護高齢者の食事摂取状況と食事援助の実態調査（研究番号 S2009-12）
２．キーワード：１）摂食（feeding）
２）食事介助（assisting with feeding）
３）介護保険施設（nursing-care facility）
３．研究者氏名：橋本智江・看護学部・助教・高齢者看護学

４． 研 究 目 的
介護保険施設における要介護高齢者の食事摂取状況と食事援助の実態を明らかにし、食事援助の課題を明確にすることを目的とする。

５． 研 究 計 画
１）対象
Ａ県内にある介護老人福祉施設（以下、特養とする）68 件、介護老人保健施設（以下、老健とする）39 件、介護療養型医療施設（以下、療養型とする）34 件の介護保険施設計 141 件を独立行政法人福祉医療機構が運営している福祉・保健・医療の総合情報サイト「WAM NET」で検索し、抽出した。
２）調査期間
平成 21 年 9 月下旬～10 月下旬
３）調査方法施設宛てに、看護・介護単位（以下、フロアとする）毎に記載できる調査用紙を郵送し、フロアの責任者に回答を求めた。調査用紙は、①回答者の属性（5 項目）、②施
設・フロアの概要（7 項目）、③要介護高齢者の食事摂取状況と食事援助の実態に関する質問（7 項目）の合計 19 項目で構成した。
返信が得られたものを質問項目別に単純集計し、施設種類別、自立度別の違いを比較した。また、自由記載で回答を得たものは、意味内容を検討し、類似性に注目して整理した。
４）倫理的配慮
研究の趣旨、任意の回答であること、データは個人または施設が特定できないようにＩＤ管理し、分析することを説明文書に記載し、調査用紙は無記名とした。返信があったものを同意が得られたとした。

６． 研 究 成 果
１）回収率‑ 179 ‑

調査対象とした 141 施設のうち、回答が得られたのは 63 施設の 185 フロアであった。（回収率 44.7%）そのうち有効回答が得られた 125 フロアを分析対象とした(有効
回答率 67.6%)。対象フロアのうちわけは、特養 75 フロア（60.0%）、老健 32 フロア（25.6%）、
療養型 18 フロア（14.4%）である。
２）回答者の属性
回答者の職種は、介護職 94 人（75.2%）、看護職 24 人（19.2%）、介護支援専門員 7人（5.6%）であった。
３）対象施設の概要
利用者の平均年齢は、特養 86.23±2.44 歳、老健 85.58±1.95 歳、療養型 83.97±
3.27 歳であった。また利用者の平均要介護度は特養 3.64±0.55、老健 3.24±0.39、療養型 4.35±0.45 であった。
４）食事摂取状況
療養型利用者は、経管栄養の利用者が多く、利用者の 50%以上を占める施設が全体の 33.3%あった。老健では、経管栄養の利用者が全体の 20%以上を占める施設は 1 施設のみであるが、特養では 21.3%であった。
自立の利用者が 50%以上を占める施設は、療養型では 0%、老健では 40.7%、特養では 26.7%であった。一部介助の利用者が 50%以上を占める施設は、療養型では 0%、老健では 9.4%、特養では 10.7%であった。全介助の利用者は、いずれの施設でも 50%以下であった。
自立度別にみた、姿勢保持援助の有無、自助具使用の有無、を尋ねた結果を、表１、表２に示した。いずれの施設においても一部介助、全介助に姿勢保持の援助が必要な者が多く、一部介助の中で、老健、特養に自助具を使用している者の割合が多かった。

表１．姿勢保持援助の有無と自立度
フロア（％）

有無療養型(n=18)
7（39）
11（61）

自立老健(n=32)
17（53）
15（47）

特養(n=75)
26（35）
19（65）

一部介助
療養型
老健
特養
(n=18)(n=32)(n=75)
12（67） 29（91） 63（84）
6（33）
3（9）
12（16）

療養型(n=18)
17（94）
1（6）

全介助
老健(n=32)
30（94）
2（6）特養(n=75)
65（87）
10（13）

表２．自助具の使用と食事の自立度
フロア（％）

使用
未使用

療養型(n=18)
5（28）
13（72）

自立老健(n=32)
16（50）
16（50）

特養(n=75)
28（37）
47（63）

一部介助
療養型
老健
特養
(n=18)(n=32)(n=75)
5（28）
21（66） 45（60）13（72） 11（34） 30（40）‑ 180 ‑

療養型
(n=18)
3（17）15（83）

全介助
老健(n=32)
8（25）
24（75）

特養(n=75)
21（28）
54（72）

５）食事援助の実態
食行動の援助を行う上での問題について複数回答で答えてもらった結果「人手不足」や「食事の拒否がある」ことを問題としているところが多く見られた。（図１）

図１．食事援助の問題

また、食事援助をするために、フロアで行っている工夫・改善の取組について自由
記載で尋ねた結果、「食事拒否者への援助の工夫」「食事援助についてのカンファレン
スや学習の機会をつくる」「本人のペースで食べられるような食事時間の設定」「嚥下
機能維持・向上への工夫」「残存機能維持への援助」「家庭的な雰囲気づくり」「食欲増進への援助」などの回答があった。

７．研究の考察・反省
施設種類別の特徴として、医学的管理を必要とする者が入所する療養型に経管栄養の利用者が多く、日常生活を支援する場である特養にも、経管栄養の利用者が少なくないことは、近年報告されている、特養の重度化が進んでいることと一致した。
食事摂取の自立度をみると、全介助や一部介助の利用者の割合は多いとは言えないが、自立して摂取していると判断されている利用者であっても、姿勢保持の援助や自助具を使用している者がみられる。自立または一部介助で食事を摂取するには、食事場面で援助が必要であり、全介助者のみに援助が必要ではないことが調査結果から言える。そのため食事援助場面での人手不足を感じている施設が多く見られていることが考えられた。そこで、姿勢保持援助技術や必要な用具、使いやすい自助具の開発が求められると考える。

８． 研 究 発 表なし‑ 181 ‑

奥付２００9 平成 21 年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

編 集
発行所

平成 23 年 10 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

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