博 士 （ 医 学 ） 下 國 達 志
学位 論文 題名
Chemosensitivity predictionlneSOphagealSquamouSCen●CarClnoma： NOVelmarkergeneSand●e伍 CaCyー prediCtionformulaeuSlngtheireXpreSSlondata（ 食道癌における抗癌剤感受性予測：新規効果予測遺伝子の同定とそ れ ら の 発 現 量 を 用 い た 効 果 予 測 モ デ ル の 開発 ）学位論文内容の要旨【背景゜目的】食道癌 は難治性の固形癌である。治療成績の向上を目指して様々な治療開発研究が進められ、現時点
では術前 ・術後化学療法が、生存期間延長のための最も有効な治療手段のーつとされている。しかしながら、他 の癌と同様、同一の治療法であってもその効果には著明な個体差がある。抗癌剤化学療法の効
果 の投 与前 予測 、す なわ ち至 適治 療の 個別選 択が 食道 癌においても強く求められている。
これま での研究から、腫瘍組織における遺伝子発現プロファイルが効果予測に重要であることや幾っかの有用 なバイオマーカーが示唆されてきたが、いまだ広範な臨床展開が期待できる予測系の確立には至ってい ない。薬剤応答は多因子によって構成される複雑系である。同じ薬剤・レジメンでも個々の腫瘍間で薬 剤応答を規定する遺伝子発現プロファイルは大きく異なる。効果予測の大きな障壁となっている巧妙で 複雑な薬剤応答機構、その理解に基づいた簡便で正確な 効果予測系の開発が望まれている。
本研究 ではヒト培養食道癌細胞株を用いて、まず、2種の網羅的遺伝子発現解析と定量的遺伝子発現解析を通 じて食道癌特異的な効果予測遺伝子を選択し、次いでそれらの遺伝子発現量を用いた沈v
itro
抗癌剤効果予測モデル、さらに臨床効果予測モデルの確立を試みた。
【材料・方法】
ヒト 食道 癌細 胞 株(KYSE) 20株を 用い 、2種 の網 羅的 遺伝 子発 現解 析(cDNA microarrayとoligo‑nucleotide array)と 、8抗 癌剤 （5・FU、CDDP、 MMC、 DOX、 C
PT‑1
1、 S
N‑38、 TXL、 IXT)にお ける
MTT assayを行った。得られた発現量 とI
C50値に関し、順位相関解析を行い、各々の薬剤の効果に深く関連する 遺伝子を抽出、これら多くの候補遺伝子の中から1）抗癌剤効果へ関連することが機能的にすでに証明 された遺伝子、と、2）機能 的意義は未確定ながら、発現量と抗癌剤効果との間に強い相関性が認めら れた遺伝子、を効果予測指標遺伝子候補として選択した 。これら遺伝子に関して定量的遺伝子発現解 析(real‑time RT‑PCR)を行い、両者の相関性に関し再現性が認められた遺伝子を効果予測遺伝子として 選択した。次に、これらの遺伝子の発現量から、複数の抗癌剤効果を同時に予測可能とするモデルの作成を試みた。すなわち、real‑timeRT‑PCR
による効果予測遺伝子の発現量を説明変数(Xl X2 …，り）、各種抗癌剤のIC50値を反応変数タ）とし、重回帰分析を用いてy xiei十x2e2十…十昂ら十a(e1,…
―36−らは係数、aは定数）からなる沈vitro
効果予測モデルを求めた。重回帰分析には広島大学原医研計量生
物 分野で開発さ れたNLRegを用いた。さらに 、同一の遺伝子セットを用いて、食道癌における術後補助 化 学 療 法 (5‑FU based)の 臨 床 効 果 （ 無 再 発生 存期 間、 生存 期間 ） の予 測モ デル を設 定し た。
【結果】
1．効果予測候補遺伝子のスクリーニング
cDNAmicroarray、oligonucleotidearrayを用いたスクリーニングにより、抽出された候補遺伝子数（順位 相 関 、 Pく 0.05)は 各 々 、 5‑FUで 500と 520、 MMCで 494と 997、 DOXで 644と 978、 CDDPで 479と 867、 TXLで 437と 1105、 TXTで 416と 291、 CPT‑11で 619と 311、 そ し て SN− 38で 509と 1007であった。
2．効果予測遺伝子の決定
1）上記候補遺伝子のうち、すでに抗癌 剤効果関連遺伝子としての機能が証明された50遺伝子について検索したと ころ、スクリーニングの範囲を拡大（いずれかのアレイにおいてPく0.1までの相関を示した遺伝子）す ることで、6種の抗癌剤に対 する11遺伝子が候補として選択された。real‑timeRT‑PCRでの再現性確認 を経て、最終的に5抗癌剤に 対する5遺伝子(5‑FU： DP
YD、DOX： BC
L2、CDD
P： GS
TP1、CPT‑
11： X
RCC1、SN‑
38： MGMT)
を効果予 測遺伝子とした。2）遺伝子 発現量と抗癌剤感受性が双方のアレイ解析において強い相関を示すゆく0.
01)遺伝子として20遺伝子が候補として選択された。real‑time
RT‑P
CRでの 再現 性確 認を 経 て、 最終 的に 4
抗 癌剤 に対 す る9遺伝子(5‑FU： B
4G
AL
T5、UG
CG、KB
P1、
DO
X： NR
CA
M、CDDP：ー4R
FR
P1、tF
IT
M1、KIA
A0685、．S
IP
AI
L2、CPT‑11： CALU)
を効果予測遺伝子とした。
3．4
種抗癌剤に対する沈vitro効果予測モデル
選択 した 2組の 遺伝 子、 すな わち 1）既 知5遺伝 子と 2）新 規9遺 伝子 、の 2
セ ット を効果予測遺伝子とし、それ らの発現量を用いて、4種の抗癌剤I
C50値を同時に予測可能とする沈v
itro
効果予測モデルをそれぞれの 遺伝子セットで求めた。作成したモデルはいずれも高い効果予測の可能性を示したが、新規 9遺 伝 子 か ら 構 成 さ れ る モ デ ル が よ り 相 関 性 ・ 予 測 性 が 高 い こ と が 示 唆 さ れ た 。
4．臨床効果予測モデル
2組の遺伝子セットに関する臨床検体(14検体）の発現データから、 生存期間および無再発生存期間を臨床効果指標とする予測モデルを設定し、新たな4検体を試験サンプルとしてその有用性を検討した。
同モデルにつ いてもめv
itro
効果予測モデルでの結果と同様、新規9遺伝子によるモデルの予測優位性が示唆された。
【考察】
抗癌剤効果 予測モデルの確立研究を長期にわたり継続してきた。その成果として、様々な臓器由来のヒト腫瘍細胞 19株を用いた解析により、既知12遺伝子を用いた8種の抗癌剤効果の加vitro予測モデル、および高度進 行胃癌における5‑FU臨床効果予測モデルをすでに報告し ている。しかしながら、癌種によって効果予 測指標遺伝子が異なること、また、cDNA microarrayのみを用いた候補遺伝子の抽出や抗癌剤効果関連 遺伝子として機能的に証明された遺伝子のみに焦点を当 てた解析には明らかに限界がある。本研究で は対象を難知性固形癌の代表である食道癌にしぼり、発現量ー抗癌剤感受性の相関解析のみから有カな 因子をスクリーニングするために、2種の網羅的遺伝子発現解析を同時に行い、より有カで特異的な効 果予測遺伝子の選択を試みた。選定した既知5遺伝子は、複数の基礎・臨床研究において― 37―

抗癌剤効果の指標とな りうることが証明されており、新規9遺伝子は抗癌剤効果に関する機能は未知ではあるものの、その発現量が抗癌剤効果と密接に関連する遺伝子である。いずれも効果予測指標として有用なものと考えられるが、各々単独での薬剤効果予測には限界があった。しかしながら、重回帰分析を用いてこれら2セットの効果予測遺伝子の発現量の相互関係を理解し、それらを効果という単一指標に変換することで、面ガむりおよび臨床での抗癌剤効果を簡便かつ正確に予測しうることが示された。
このことは、食道癌化 学療法の個別化に大きく貢献するものと考えられる。現在、新規9遺伝子の機能解析、さらに有カな効果予測規定遺伝子の探索を続行するとともに、確立したモデルの実践的価値を評価するためのprospecti
ve studyを計画している。

ー 38―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 福 田諭副 査 教 授 藤 堂
省

学位論文題名Chemosensitivity prediction in esophageal squamous cellcarcinoma:Novel marker genes andefficacy一 prediction formulae uslngtheireXpreSS10ndata（食道癌における抗癌剤感受性予測：新規効果予測遺伝子の同定とそれらの発現量を用いた効果予測モデルの開発）

難治 性固形癌の食道癌において現時点では、補助化学療法が生存期間延長のための有効な治 療方法のひとっとされている。しかしながら、その効果には著明な個人差があり、化学療法の効果の投与前予測、ならびに至適治療の個別選択が強く求められている。しかし、腫瘍 の薬剤応答機構が複雑であるために、現在までのところ広範な臨床展開が期待できる予測 系の確立には至っていない。本研究では、食道癌におけるテイラード化学療法の実現のた め、選択した複数のマーカー遺伝子の発現量を用いた抗癌剤の効果予測モデルの確立を試みた。ヒト培養食道癌細胞株を用いて、2種の網羅的遺伝子発現解析(cDNAmicroarray、
olig
onucleotidearray)の遺伝子発現量とM'IT
アッセイによるIC50値の間で順位相関解析を行い、8種類の抗癌剤効果に関与する多数の候補遺伝子を抽出し、real‑timeRT‑PC
Rによる定 量的遺伝 子発現 解析を通 じて抗癌 剤効果 に関与す る食道 癌特異的な効果予測規定遺伝子 （既知5遺伝子 および 新規9遺伝子 ）を選定 した。次 いで重回帰分析を用いて、それら2セット の遺伝子 発現量 の相互関 係を基盤とするinv
itro
抗癌剤効果予測モデルを作成した 。さらに 食道癌 臨床検体 において 、5‑FUをべ ースと する術後補助化学療法を施行された症例の臨床効果指標（全生存期間および無再発生存期間）を予測するモデルを、inv
itro
効 果 予 測 モ デ ル と 同 一 の 2つ の 遺 伝 子 セ ッ ト を 用 い て 作 成 で き る こ と を 示 し た 。
公開 発 表 にあ た り 、副 査 の福 田教授 より1）夕キサ ン系薬 剤、MMCに関す る効果予 測
規定 遺伝子が選定されてこなかった理由、2） 5‑FUにおけるinvitro効果予測モデルと臨
床効 果予測モ デルで の結果の 相違、3）新 規9
遺 伝子に関 する現在までの知見、について質問があった。これらの質問に対し、1）既知遺伝子に関しては順位相関解析のscreeningの範囲を広げても抽出されなく、新規遺伝子についてはreal‑timeRT‑
PC
Rの遺伝子発現解析においてvalidationが得られなかった。今後は新規遺伝子におけるscreeningの範囲を広げ、―39−

可能性 のある 遺伝子 に関して、順次real‑timeRT‑PCRでのvalidationを図る必要がある。

、2）

臨 床 症 例に お い て 、5‑FUの総 投 与 量 が症 例 毎 に 異な る こ と や低 用 量 の CDDPが投 与 さ れて い る こ と な ど、 純 粋 な 5‑FU治 療で な い こ とが 原 因 と 考え ら れ る 。今 後 、 症 例間 の 抗 癌 剤
regimenを 統 一 し た 形 で の 前 向 き 研 究 に より 、 予 測 モデ ル を 再 度作 成 す る 検討 が 必 要 である。

、3）

'ARFRP1： trans‑
Golginetw
orkに属し小胞輸送に関与、B4G
ALT5：糖転移酵素のひと つ 、 UGCG： 糖 脂 質 の 合 成 に 関 与 、 NRCAM： 神 経突 起 の 成 長に 関 与 。

、 と の 回 答が あ った。
副 査 の 藤 堂 教 授 か ら は 、 1） 2種 の 網羅 的 遺 伝 子発 現 解 析 を同 時 に 用 いた 理 由 、 2） 作 用
機 序 の 異 な る 複数 の 抗 癌 剤の 効 果 を 単一 の 予 測 式で 示 す こ との 是 非 、 につ い て 質 問が あ った。 こ れ ら の質 問 に は 、1）

microarrayに よ る網羅 的遺伝 子発現 解析か らscreeningさ れて

く る 多 数 の 候 補遺 伝 子 の 中か ら 、 あ る特 定 の 遺 伝子 を 選 定 する た め の 方法 論 が 確 立さ れ てい な い 。 発 現 量一 抗 癌 剤 効果 の 相 関 解析 の み か ら、 よ り 有 カな 遺 伝 子 を選 択 す る 一手 段 として 、 2種 の 網 羅 的遺 伝 子発現 解析を 用いた 。

、 2）

regimenを 統一し た形で の前向 き研究によ る 評 価 が必 要 で あ るが、 本研究 の仮説 として挙 げた「 複数の 抗癌剤 ．regiI11enに 対する効果 予 測 を 単一 の 式 で 同時 に 表 す 」こ と は 実 際上 難 し く 、多 剤 併 用 で複 数の regimenから なる抗 癌 剤 化 学療 法 の 現 状を 考 慮 す ると 、 将 来 的に はreginlen毎の 効果予 測モデ ルを確 立し、
予 測 値 を 比 較 して い く 方法 が 実践 的 と 考え ら れる 。

、と の 回答 が あ った 。

最 後 に 主 査 の 秋 田 教 授 よ り 、 1） 新 規 9遺 伝 子 の 薬 剤 感 受 性 へ の関 与 、 2） 既 知5遺 伝子
よ り も 新 規 9遺 伝 子 で 構 成 さ れ る 予 測 式 が 有 用 と な っ た 理 由 、 3） 進行 癌 ・ 再 発癌 症 例 におけ る ． 効 果予 測 、 に ついて 質問が あった 。これら の質問 に対し 、1）

新規遺 伝子を 導入した食 道 癌 細 胞の 抗 癌 剤 感受 性 試 験 にお し ゝ て 、幾 つかの遺 伝子が 耐性・ 感受性 を変化 させている 結 果 が 得ら れ て い るこ と （ 広 島大 学 で の 継続 研 究 内 容） 、 肺 癌 細胞 株PC‐ 6とその CDDP耐性株 （PC−6／ CDDP）にお いて、 今回選 択した ィRFRP｜の real‐timeRT‐PCRでの 遺伝子 発現
量を み る と PC・ 6／ CDDPに お い て発 現 量 の 増加 が あ る こと 臼 触 ； ：胆 ヱ が汎 用性の あるCDDP
効果 規 定 因 子で あ る 可 能性 ） な ど 、今 回 選 択 した 新規遺伝 子に関 するproInisingな結果 が得ら れ て い る 。 新 規 9遺 伝 子 が 食 道 癌 特異 的 な 因 子か ど う か も含 め て 、 さら に 解 析 を進 め ていく 必 要 が ある 。

、 2）

新規 9遺 伝 子 は 既知 5遺 伝 子 よ りも 、 各 々 の発 現量が 抗癌剤 効果と 強 く 相 関 す るこ と か ら 、遺 伝 子 発 現量 か ら 構 成さ れ る 重 回帰 式 に お いて よ り 相 関の 高 い
モデ ル を も たら し た も のと考 えられ る。

、3）

進行・再 発癌な どの担 癌状態 におい ては臨

床 効 果 指 標 と して 腫 瘍 縮 小効 果 が 加 わる こ と に なる 。 進 行 ・再 発 食 道 癌に 対 す る 治療 と して 化 学 療 法 よ りも 放 射 線 化学 療 法 が 優先 さ れ る 現況 に お い て、 抗 癌 剤 効果 予 測 モ デル を 作成する ことは 難しく 今後の課 題とな る。

、との 回答が あった 。

本 論 文 は 、抗 癌 剤 効 果に 関 連 す る限 定 し た 遺伝 子 セ ッ トの 発 現 量 から 、 複 数 の抗 癌 剤 の効 果 を 同 時 に 予測 す る モ デル の 作 成 を試 み た 興 味深 い 報 告 であ り 、 今 後の 研 究 の 展開 が 期待され る。
審 査 員 一 同は 、 こ れ らの 成 果 を 高く 評 価 し 、大 学 院 課 程に お け る 研鑽 や 取 得 単位 な ど も併せ 申 請 者が 博 士 （医 学 ）の学位 を受ける のに充 分な資格 を有す るものと 判定し た。

― 40 ‑