博士 （ 医 学 ） 笠 松

純

学 位 論 文 題 名Variable lymphocyte receptorの 遺 伝 学 的 解 析学 位論文内容の要旨【 背 景 と 目的 】

抗原レセプターであるB cell receptor (BCR)とTcell receptor (TCR)は遺伝子の再構成によって多様な抗原結合領域を形成し，進入してきた抗原を直接，あるいは主要組織適合
遺 伝 子 複 合 体 (MHC)を 介 し て 抗 原 特 異 的 に 認 識 す る 。 し か し ， TCR/BCR/MHCは 有 顎脊椎動物でのみ同定され，無顎脊椎動物（メクラウナギ類・ヤツメウナギ類）や無脊椎動物
では 同定 され て いな い。近年，TCR/ BCRと同様に，遺伝子の再構成によっ て多様性を創出する新規抗原レセプターvariable lymphocyte receptor（VLR)がヤツメウナギ類で発見された。VLRはleucine‑rich repeat(LRR)から構成されるglycosylphosphatidylinositol(GPDア ン カ ー 型 夕ン バク 質で あり ，細 胞ご とに LR
Rの 配列 と数 に多 様性 が生 じる 。さら に ， LRRの N末 端 と C末 端 側 に 存 在 す る N末 端 LRRド メ イ ン (LRRNT)お よ び C末端 LRRド ヌ イ ン (LRRCT)も 多 様 性 に 寄 与 す る 。 こ れ ま で に VLRAお よ び VLRBが 同 定され てい る。 血 清中 に抗 原特 異的 V
LRBが分 泌さ れる こと から ，VLRBは 抗 体として機能している。本研究では，VLRの遺伝学的基盤を明らかにする目的で，＠既知のVI」Rとは異な る 新 規 VLR遺 伝子 の同 定， ◎ メク ラウ ナギ 類VLR
遺 伝子 の 染色 体マ ッピ ング ，◎ VLRと類 似し たド メ イン 構造を有するナメクジウオ類LR
R含有遺伝子(LRR‑containing gene:五ビのの同定をおこなった。
【材料と方法】

＠ウミ ヤツメ由来exp
ress
ed sequence tagのデータベースを構 築し，既知のVLRを用いて相 同 性 検 索 を お こ な っ た 。 得 ら れ た VLR様 遺 伝 子 （ VLRJike)の 完 全 長 cDN
A配 列を 決定し， 各種配列解析をおこなった。また，組織分布と発現量，および免疫刺激に対する応答 性を 調べ る ため ，RT‑
お よび Real‑time PCRをおこなった。また，GPIアンカー型夕ン
バク質 か否かを調べるため，VLR‑likeを強制発現させた培養細 胞を用いてG
PIのアンカー部位を 切断するphos
phatidylinos
itol‑specificp
hos
phol
ipaseC(PI‑PLC)処理し，フ口ーサ
イ トメ トリ ー にて 解析 した 。◎ メク ラウ ナギ 類VLRAおよびVLRBをコードするbacterialartificial chromosome (BAC) DNAを用いたfluorescenceinsituhybridization(FISH)
解析をお こない，染色体上の位置を同定した。◎既知のル．ロを用いて相同性検索をおこなった。
【 結果】

＠同定されたV
LR‑likeのドメイン構造および再構 成前のgermlineVLR
構造（ぎぬ・めを含むゲノム構造を既知のVLRと比較したところ，ル．ロ．likeのそれら構造は既知のV
LRと基本 的 に 一 致 し てし ゝた 。し かし ，ぎ V
LRAとぎ VLRBでは LR
RNTとLRR
CTの一 部ま たは 完
全 な 欠 失 が 見 られ るの に対 し， ぎル R・Zえbで は完 全な LR
RNTおよ びLRR
CTが存 在し ていた。単一遺伝子座からLRRの配列と数を異にする多様な転写産物が得られた ことから，― 208―

V
LR‑likeは遺 伝子 の再 構成 をお こ なう こと が示 唆さ れた。 よって，VLR‑likeをVLR
Cと命 名 し た 。 VLRCで は ぎ ル ．ロ ビ由 来の LR
RNTとLRR
CTを含 む 転写 産物 が発 現さ れる 。
また，LRRCT
でも 遺伝子の再構成が生じるものの，その多様性は低いことが示唆された。
PI‑PLC処 理実 験か ら， VL
RCはGPIアン カー 型夕 ンバ ク質 であ る こと が示 され た。 立体構 造 の 予 測 を お こ な っ た と こ ろ ， VLRCの LRRCTに は VLRAお よ び VLRBが 有 す る 多 様性に富む突出構造が存在しなかったことから ，他のVLRと異なる立体構造を持つことが予測さ れた。VLR
Cの組織発現分布を調べたところ，末梢血自血 球で最も発現が高かった。
しかし，その発現量はVLRBの発現量と比較し て60 ‑‑‑100倍程度低く，免疫刺激による発現 亢 進 も 見 ら れ な か っ た 。◎ FI
SH解析 の結 果か ら， VL
RAお よび V
LRBは同 一染 色体 上に離 れて存在していることが示された。◎探索の結果，約400個のLCGを同定した。多くのLCGは膜貫通領 域を持ち，レセプターとして機能していることが示唆された。レセプタ
ー 型 LCGは ロ ． ロ と 同 様 に LRR関 連 ド メ イ ン (LRR， LRRNT， LRRCT)の み か ら な る
LRR型 と ， LRR関 連 ド メ イ ンと Ig様 ドメ イン を含 むLRR/Ig型 に大 別さ れた 。ま た， これ ら の 遺 伝 子 群 の LRRの 数 や 配 列 は 遺 伝 子 に よ っ て 異 な っ て い た 。
【 考察】

＠ 本 研 究 で 同 定 さ れ た VLRCは 完 全 な LRRNTと LRRCTを 有 し て い る こ と か ら ， 最 も 原
始 的な 構造を維持するVLRであることが示唆された。また，LRRNTが多様性に寄与せず，
LRRCTの 多 様 性 も 低 い こ と か ら ，VLRC
で はLRRが主 たる 多様 性を 創出 する こと が示 唆
さ れ た 。 VLRCは VLRBと 同 様 に GP
Iア ンカ ー型 夕ン バク 質で あり ， かつ C
末 端に は多 量体形成に重要な複 数のシステイン残基を持つことから，VI」R
Cは膜表面に発現するレセプ
タ ー型 以外に，分泌型として放出される可能性が ある。VLR
Bの発現を誘導する免疫刺激で もVLRCの 発現 が誘 導さ れず ，正 常 状態 での 発現 量も 低い ことから，VLR
Bとは異なる機 能を 有す るこ とが 示唆 され た。 VLR
CのLRR
CTに は可変性に富む突出構造が存在せず，
そ の配 列の 多様 性が 低い こと から VLR
Bと は異 なる 抗原 結合 様式をとり，VLRBとは異なる 抗原 を認 識す る可 能性 があ る。 ま た， ◎染 色体 進化 の過 程でV
LRAとVLR
Bが離れたことは，組換えや遺伝子変換を抑制し，両遺伝子の機能的分化を促進した可能性がある。◎現在，ウニゲノムやナヌクジウオゲノムでは，toll‑likerecep
torなどのパターン認識レセプター (PRR)が著 しく 増加 して いこ とか ら ，LCGは PR
Rと して 機能 して いる 可能 性が ある 。
【結 論】

本研究と最近の研究報告を合わせると，生物はその進化の過程で二種類の生体防御戦略を獲得した ことが示唆される。すなわち，第一の戦略は遺伝子重複 によってPRRの数と種類を増加させることで進入してくる抗原に対抗する戦略である。第二の戦略は少数の遺伝子が多様性を 創出する機構を獲得し，進入してくる抗原に対抗する戦略である。また，VI
亅R
は抗体が認識しにくい糖鎖を認識することから，抗体に替わる実験試薬や診断試薬，治療薬として使用 できる可能性がある。したがって，VLR研究は生物学と医学をつなぐトランスレーショナル・リサーチとなり得る。

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学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査
副査

教授

有賀教授

小野江和則教授

笠原正典

教授

畠山鎮次

准教授

岩渕和也

正学 位 論 文 題 名Variablelym
phocytereceptorの遺伝学的解析
学位 申請 者笠 松純 の学 位論 文審 査 は、 平成 21年 2月 4日午 後1時から2時まで 医学研究科 長室 にお いて 行わ れた 。
（（学位論文の内容要約））Variablelym
phocytereceptor（VLR）は無顎脊椎動物（ヤツヌウナギ類とメクラウナギ類）に固有の抗原レセプター分子であり、T細胞レセプ夕一やB細胞レセブターと同様に遺伝子の再 構成 によ って多様性を獲得する。現在までに 瓰脳およびVLR
F3の2遺伝子が同定されている。抗原特異的なVLRBが血清中に分泌され、かつ主要な凝集反応因子であることから、
VLRは抗体として機能してい ることが明らかとなっている。申請者は、＠新規V
LR遺伝子の単離 ・同 定、 ＠メクラウナギVL
R遺伝子の染色体マッピング、◎ナメクジウオ V
LR様遺伝子の同定にっいて、それそれ得られた研究成果を発表した。＠では相同性検索によって同定した新規V
LR遺伝子、VL
RCの遺伝学的解析と発現解析からその機能について議論した。
次い で、 ◎で は同一染色体上に2っのV
LR遺伝子が 連鎖していることから、染色体進化に伴う VLRの機 能分化に ついて議論した。次いで、◎ではVLRのドメイン構造と類似した多数の遺伝子群をナメクジウオゲノムから同定し、その機能にっしヽて推察した。最後に申請
者の研究成果および近年報告されている研究結果を総合的に概観することにより生物の抗原 認 識 戦 略 の 多 様 性 に つ し ヽ て 言 及 し 、 VLR研 究 の 医 学 へ の 応 用に つい て論 じた 。
（（質疑応答の内容））
有賀正教授から、生体内におけるVLRの半減期および補体因子との関連性についての質問があった。申請者はVLRの半減期につしヽては未だ不明であるが、免疫後の抗血清を用いることで補体価が上がるという過去の研究を弓I用し、VLRと補体因子の相互作用が存在する可能性があると回答した。次いで小野江和則教授より、申請者が同定した新規VL
R遺伝子、
VLRCの遺 伝子 発現が非常に低いことから、VLRCがヒトイム丿グロブリン（Ig)Dのように特殊な機能を有している可能性が指摘された。加えて、無顎脊椎動物がもっりンバ球の種類にっいて質問があった。申請者は前者の質問に対しては、抗VLR
C抗体を用いたウエスタンブロット解析からV
LRCをタンバク質として検出していることを述ベ、VLR
Cが特殊な免疫機能を有している可能性があると回答した。また後者の質問に対しては、VLR
AおよびVL
RBはそれそれ異なる細胞集団で発現されていることから 、少なくとも機能的に分化した2種類のりンバ球が存在すると考えられると回答した。次 いで畠山鎮次教授からV
L
Rの多量体化機構について質問があった。申請 者は培養細胞系でVLRが多量体構造を形成すること、およびC末端側のシステイン残基が分泌型VLRで保存されているという過去の研究を引用し、V
LRの多量体化はヒトIgのように他のタンパク質因子（J鎖）を必要とせず、C末端のシステイン残基によるジスルフィド結合によって生じる可能性を指摘した。次いで岩渕和也准教授からりンバ球は単一のVLR分子を発現しているのか否か、また機能的に胸腺に相当する器官が無顎脊椎動物に存在するのか否かについて質問があった。申請者は前者の質問に対して、過去の研究から対立遺伝子排除が報告されていることを述ペ、無顎脊椎動物
のり ンバ 球は ヒ トの T
細胞やB細胞と同様に単一のVLR分子を発現していると考えられていると回答した。また後者の質問に対して、無顎脊椎動物では胸腺に相当する器官が発見されていないと回答した。さらに、無顎脊椎動物の腸管縦隆起では幼生期にはりンバ球の分裂が盛んに認められるが、同隆起は成体になると退縮することから胸腺と類似した免疫学的・発生学的特徴を示すことについて述ベ、無顎脊椎動物では腸管縦隆起が胸腺として機能している可能性があると回答した。最後に、指導教員である笠原正典教授から、本研究の歴史的背景と今後の研究の展望について質問があったが、申請者は具体例を交え、適切に回答した。
（（学位 論文に対する審査員の評価））
この論 文内容は、I
mmunogenetics誌やGe
nome R
esearch誌等に掲載され、国際的に高く評価され ている。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位 なども併せ、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定し た。

ー 211―