博士（医学）中川雅夫

学位論文題名MALTl contains nuclear export signalsand
regulatescytoplasm
iclocalizati
onofBQL10(MALT1はnuclear exportsignalを持ち、BCL10の 細 胞 質 へ の 局 在 を 制 御 す る ）学 位論文内容の要旨［目的と背景］
MALTリン パ腫 は非 ホジキ ンリ ンパ 腫の 中で 三番 目に 頻度 が高 く（ 約8％ ）、 節外性リ ンパ 腫の 大部 分を 占める 疾患 であ る。 MALTリン パ腫には三つの特徴的な染色体転座が存在する。t (11；18) (q21；q21)転座ではllq21のAPI2と、18q21のMALT1が融合遺伝
子 API2−MALT1を 形成 する。t(14；18) (q32；q21)転座では14q32のIgHエンハンサーによ って llq21のMALT1遺伝子が過剰発現する。t(l；14) (p22；q32)転座では14q32のIgH
プ ロ モ ー タ ー に よ っ て lp22にあ るBCL10遺伝 子が 過剰 発現す る。 これ らAPI2― MALT1、 MALT1、BCL10全て が細胞 質に おい でNF−kBを活 性化することが近年明らかになった。しかし、NF‑KB活性化以外の機能について検討した報告はない。
一般 に、 ある 分子 の細胞 内局 在と その メカ ニズ ムを検討することは、機能解析を進め る上 で重 要な 情報 となる。そこで本実験ではAPI2−MALT1、MALT1、BCL10の細胞内局在 とそ のメ カニ ズム を検討 する こと を目 的と した 。特 に臨 床検 体に おい てBCL10の免疫 染 色 像 は 多 彩 で あ る こ とが知 られ てい る。 MALTリン パ腫 の発 生母 細胞 であ るpost
germinal centerの Bリ ン パ 球 で は BCL10は 細 胞 質 に 染 色 さ れ る の に 対 し、t(11；18)(q21；q21)およぴt（1；14)(p22；q32)転座を持つM
ALTリンパ腫症例では核に染まる。このメカニズムについても考察を加えた。

［方 法と 結果 ］
COS7細 胞に おい て一 過性 発現 させ たMALT1お よびAPI2―MALT1は細胞質に局在する。
一 般 に nuclear export signal(NES)とい う約 10個 程度の 短い アミ ノ酸 配列 を有 する
分子 は核 内で 担体 タン パク CRM1と結 合し 、能 動輸送によって核外に排出され、細胞質に移 動す るこ とが 知ら れて いる 。そ こで NES阻 害薬 であ るレ プト マイ シン B(LMB)を使用し たと ころ 、MALT1お よび API2―MALT1は核 に強く 蓄積 した 。こ のこ とか らMALT1およぴ API2−MALT1はNESを持 つこ とが 示唆 され た。
MALT1のど の部 分にNESが 存在 する のか を検 討する ため に数 種類 のdeletion mutantを作 成し た。 これ らの 細胞 内局 在を 比較 検討 した結 果、 MALT1の 329番 目か ら380番目のア ミノ 酸か らな る領 域と (NESI領域 ）、 461番目か ら562番 目の アミ ノ酸 からなる領域(NES2領域 ）に NESが 存在 する こと が示 唆さ れた。
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こ の NES1領 域と NES2領 域 が 本 当 に 核 外輸 送さ れる 機能 があ るの かを 確認 するた めに 、 こ れ ら の 領域 そ れ ぞ れ に GFPを 結 合さ せた fusionタン パク を作 成し た。 GFP自 体
は 核 に 局在 する のに 対し 、NES1お よび NES2結合 GFPタ ンパ クは 細胞 質の みに 存在し た。一 方、 LMB処 理後 は核 内に 局在 を変 えた 。こ の結 果か らNES1およびNES2は実際にGFPを核外に輸送する能カがあることを示すことができた。
一 般 にNESの アミ ノ酸配 列に はバ リエ ーシ ョン はあ るも のの 、あ る程 度典 型的な 配列 パ タ ー ン が ある こ と が 知 ら れ て 韜 り 、 約 10個 程 度 の 短 い ア ミ ノ 酸配 列の 中に 4つの疎 水性 アミ ノ酸 （特 にロ イシン が多 い） が存 在す ると いう 構造をとる(NESコンセン
サスシークエンス：Lx（1−3）Lx（2−3）LxL)。MALTのNES1領域においては、358番目から365番 目 の ア ミ ノ 酸 配 列 が (LTNLLRQL)最も NESの 候補 足り える 配列 で、 また 、この 配列は 種を 超え て保 存さ れて いた。 この アミ ノ酸 配列 の後 ろニ っのロイシンをアラニンに 変 え た コ ン スト ラ ク ト (NESI mutant)を 作成 した。 Wild typeは 細胞 質内 に局在 す
る の に 対し て、 NESl mutantは 核に 局在 した 。こ の事 実か ら358番目 から 365番目の アミ ノ 酸 配列 (LTNLLRQL)こ そが NESで ある と同 定し た。 一方 、NES2領 域で も同 様に検 討したが、本研究においてはNESを同定するには至らなかった。
COS7細 胞 に おい て 一 過 性 発 現 さ せ た BCL10は 細 胞 質 と 核 に 局 在 し た 。BCL10は LMBに よ っ て局 在を 変え ず、 NESを 持た ない こと が示 され た。 BCL10はMALT1と会 合して 複合 体 を 形 成 す るこ と が 知 ら れ て い る 。 そこ でMALT1と BCL10を COS7細胞 に共 発現さ せ、そ れぞ れの 細胞 内局 在を 観察し た。 BCL10は 細胞 質の みに存 在し、MALT1と局在を共に し て いた 。一 方、 LMB処 理を 加え ると 、BCL10、MALT1共 に核 に存 在し てい た。こ の事 実 か ら BCL10は MALT1に よ っ て 核 外 に 輸送 され てい るこ とが 明ら かに なっ た。一 方、 API2一 MALT1と BCL10を COS7細 胞 に 共 発 現 さ せ て も 、 BCL10の 局 在 は 変 化 せ ず、 API2− MALT1に は BCL10を 核 外 輸 送 す る 能 カ は な い こ と が 明 ら か に な っ た 。

［ 考察 ］
これ まで MALT1及び API2−MALT1は 細胞 質に のみ 存在 する 分子と考えられていた。本研 究は MALT1、API2― MALT1が核 セ細 胞質 を往 復し てい るこ とを示した最初の報告である 。 こ の細 胞内 輸送 シス テム はNESとい う高 度な シス テム を介 してお り、 さら にこ のNESは種 を超 えて 保存 され てい るこ とか ら、MALT1が核 と細 胞質問を往復することがりン パ球 の生 理的機 能に おい て何 らか の重 要な 役割 を担 って いる可能性があることを示
し てい る。 API2− MALT1に おい ては、核内でMALTリンパ腫形成、維持に働いている可能
性 も 考 え ら れ 、 こ れ ま で の MALTリ ン パ 腫 研 究 に 新 し い 視 点 を 与 え る も の で あ る 。
本 研 究 で は BCL10が MALT1に よ っ て核 外に 輸送 され てい るこ とを初 めて 示し た。 この 新し い知 見から 、BCL10の多 彩な細胞内局在メカニズムを説明することが可能である。 正 常 リン パ球 では MALT1がBCL10を核外 に輸 送し てい る。 その 結果 、BCL10は 細胞 質優 位に局在すると考えられる。t (11；18)転座を有するMALTリンパ腫症例では片方の18番 染色 体は 転座に よっ てAPI2ー MALT1を形成している。API2−MALT1はBCL10を核外に輸送 す る 機能 は持 たな い。 全長 を有 するMALT1は転 座を 有し ない 18番染 色体 から しか 供給 され ない ため、 BCL10に 対し て相 対的 にタン パグ 量が 減少 する。この結果、MALT1は全 て の BCL10を 核 外 輸 送 す る こ と が で き ず 、 一 部 は 核 内 に 残 存 す る と 考 え ら れ る。 t（1；14)転座 を有 する MALTリンパ腫症例ではBCL10が過剰発現しているためにMALT1が 相対 的に 不足す る。 この 結果 、BCL10は核に多量に残存する。この細胞内局在メカニズ ム モ デ ル は BCL10の 組 織 免 疫 染 色 像 と 非 常 に 相 関 し て い る 。
一 485―

［結語］
本研究によりM
AL
T
1ならびにAP
I
2ーM
AL
T
1がN
E
Sによって核と細胞質を往復している
こ と を示 し た 。さ ら に、 MA
LT1はBCL10を核 外 輸 送す る こと も 明ら か にした。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 武 蔵
学
副 査 教 授 浅 香博
副 査 教 授 今 村 正 寛雅学位論文題名MALTl contains nuclear export signals andregulatescyt
oplasmicloc
alizationofBCL10(MALT1は nuclear export signalを 持ち 、BCL10の 細 胞 質 へ の 局在 を制 御す る）

MALTリンパ腫に特徴的な染色体転座から同定されたAPI2−MALT1、MAL T1、BCL10は、それぞれが細胞質においてNFーlくBを活性化する。しかしNF−1くB活性化以外の機能について報告はない。一般に、ある分子の細胞内局在とそのメカニズムを検討することは、機能解析を進 める上で重要な情報となる。そこで本実験ではAPI2 ‑MALT1、MAL Tl、BCL10の細胞内 局 在 と そのメ カニ ズム を検 討し た。 COS7細胞 にお いて 一過 性発 現させ たMALT1および AP工 2― MAL Tlは 細胞 質に 局在 する 。nucleaで export signal（ NES） 阻害 薬で あるレプトマイシンB（LMB）で処理すると、MALT1
およびAPI2−M
ALT1は核に強く蓄積した。このこ とか らMAL T1およぴ AP工 2― MALT1はNESを持っことが示唆された。MALTl deletionmutantの 細胞内 局在 を比 較検 討し た結 果、 MALT1の329番 目か ら380番目 のア ミノ 酸からな る領域と(NES1領域）、461番目から562番目のアミノ酸からなる領域(NES2領域）にNESが 存在 する こと が示 唆さ れた 。こ のNES1領 域とNES2領 域そ れぞれにGFPを結合させたfusionタンパクは細胞質のみに存在し、LMB処理後は核内に局在を変えた。この結果からNES1およびNES2は実際にGFPを核外に輸送する能カがあることを示した。さらに、MALTの NES1領 域 の point mutation mutantの 検 討 か ら 、 358番 目 か ら 365番 目 の ア ミ ノ酸配 列が NES配 列で ある こと を同 定し た。 COS7細胞に おい て一 過性発現させたBCL10はLMBに よって局在を藩えず、NESを持たないことが示された。一方、MALT1とBCL10を共発現 さ せ る とBCL10は 細 胞 質 の み に 存 在 し、 MALT1と 局 在 を 共 に し て いた 。LMB処 理にてBCL10、MAL Tl共に核に存在し、BCL10はMAL Tlによって核外に輸送されていることが明らかになった。
口 頭 発 表に 際 し 、 副 査 今 村 教 授 よ り MALT1と BCL10の 核 内 で の 機 能、 核内 BCL10陽性症例と陰性症例の差異に関する質問があった。これに対して申請者は、MAL Tlの核内での機能に関する知見は存在しないこと、BCL10が核内で転写活性化に働いていると報告す― 487―

る 論文が過 去に1報あ ること、核内BCL10陽性症例は陰性症例よりも進行期症例が多いと報告されていることを回答した。次いで副査浅香教授より炎症由来と転座由来のNF‑K
Bの差 異、API2―MALT1陽 性症例か らびまん性 大細胞型 B細胞性リ ンパ腫ヘ 進展する症例がない理由について質問があった。これに対して申請者は、転座陽性症例は転座陰性症例に比べて病理学的に進展した症例が多いことから転座からのNF―1
くBの方が増殖に寄与する能カが高い可能性があること、APエ2−MA
LT1陽性症例がびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫へ進展しない理由はまだわかっておらず今後検討しなけれぱぃけない事項であることを回 答した。 さらに主 査武藏教授 よりNF‑KB活性 化から転 写が亢進 する分子 の種類、LMBの 働く機序 と特異性 、MALT1における 核移行シ グナル(NLS）の有無に関する質問があった。これに対して申請者は、NF―1
くB活性化はAPI2などの抗アポトーシス分子や細胞周期活 性化に働 く分子の 発現上昇をもたらすこと、LM
BはCR
M1とNESの結合部位に結合することで能動輸送を阻害すること、LMBはNES特異的であると報告されていること、MALT
1においてNLSの存在を証明した報告は存在しないが、これらの分子量は核膜の受動輸送の限界を 超 え て い る こ と か ら 潜 在 的 に NLSが 存 在 す る 可 能 性 が あ る こ と を 回 答 し た 。
本 研究はMALT1な らびにAPI2− MAL TlがNESによって 核と細胞 質を往復 していることとMALTlがBCL10を核外輸送していることを始めて明らかにしたことで高く評価された。この研究をさらに発展させることで、MALTリンパ腫の治療標的の同定や正常リンパ球における未知の細胞内分子機構の解明に寄与することが期待された。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者が 博 士（ 医 学 ）の 学 位を 受 け るの に 充分 な資 格を有す るものと 判定した 。