博 士 （ 理 学） 上 堂 地 美佳
学位 論

文題名The diversity of proteinstructures and functions（ 蛋 白 質 の 構 造 と 機 能 の多 様 性 に関 す る 研究 ）学 位 論 文 内 容 の要 旨

生物は、遺伝子の変異・挿入・欠失・重複・融合を繰り返し、進化・多様化してきた。遺伝子の進化は、蛋白質の進化をもたらし、いくっかの蛋白質は、その基本機能を保ちながらも生物種によって独特の機能を獲得して多様性を示す。このような機能の多様性を示す蛋白質の構造と機能を解析する
事は、蛋白質の構造と機能の相関、また進化・多様化を解明するための有カな手がかりになると期待できる。 本研究では、筋収縮、ATP再生系そして酸素運搬に際して独自の機構を持つ生物に焦点を当て、それ に関与する蛋白質について、分子生物学、生理・生化学、X線結晶解析学の手法を用い、それぞ れ の蛋 白質の 構造と機能の 関連性そしてそ の多様性につ いて検討した 。
（1）軟体動物の筋肉収縮制御機構について
筋収縮は、細胞内Ca2
゛濃度の上昇に伴うミオシンATPaseの活性化によって起こる。脊椎動物横紋筋
では、Ca2
゛はアクチン繊維上に存在しているト口ポニンCに結合し、収縮制御はト□ポミオシン(TM)．ト口ポニン(TN)系によって行われている。一方、二枚貝の貝柱閉殻筋ではCaz
゛はミオシンに結合するため、 ミオシン自身が制御蛋白質であるが、完全な制御にはTM‑TN系が必要であり、二重の制御機構が存在 している。また、閉殻筋では、ATPをほとんど消費せずに張カを発生し続けるというキャツチ現象が知られているが、その機構は不明である。本研究では、ホッキガイ閉殻筋より新しく見いだした分子量230Kの蛋白質についてマイオニンと名付け、その単離・精製と機能の解析を行った。マイオニンのアミノ酸組成は、ミオシン繊維のコアを形成しているパラミオシンと類似していた。また、バラミオ シンの分子量はマイオニンの約1/2の110Kであることから、マイオニンはバラミオシンタイプの2ドメイン構造であると推定した。さらに、マイオニンはミオシンのM
gz
十―ATPase
活性のC
a2
゛感受性を低下させる機能を持つことを明らかにした。これらの結果は、ホッキガイ開殻筋には、ミオシン、TM‑TN系に加 えて、マ イオニ ンが関与する第3の制御系が存在すること、そしてマイオニンのキヤッチ機構への関与を示唆するものであった。
次に、 TMを高収率 で迅速 に精製する方法を考案し、この方法でウサギとホタテガイ横紋筋よりTMを精製してミオシンのM
gz
十‑ATPase
活性に与える影響を検討した。Baileyが示した従来の方法は、筋肉のア セ ト ン粉 末 より TMを調製す る方法 で、調製 に4日 を要し た。一方 、今回 考案した T
Mの調製 法は、 筋 肉 から 塩 抽 出し て 得 た 天然 ア ク 卜ミ オシン (NAM)
よ りT
Mを調製 する方 法である 。調製 は1日で 完 了 し、 従 来 の方 法 の 4〜6倍 と いう 高 収率でTMが 得られ た。ホタ テガイ 横紋筋TMの ウサギ― 189ー

骨格筋合成アクトミオ シンに対する影響を検討したところ、ホタテガイ横紋筋TMはCaz゛濃度に関わらずウサギ骨格筋合成アクトミオシンのM
g2十一A
T
Pase
活性を25010低下させることが確認できた。また、ホタテガイ合成アクトミオシンのM
g2十一A
TPase活性に対しては影響を与えないことから、ホタテガイ横紋筋TM
は、単独では制御機能を持たないことを明らかにした。
（ 2） 無 脊 椎 動 物 に お け る ATP再 生 酵 素 ア ル ギ ニ ン キ ナ ー ゼ の 機 能 と 構 造 の 多 様 性 に つ い てAT
Pは、解糖系、TCA回路、電子伝達系で産生されるが、筋肉や脳などの組織 やミ卜コンドリアでは、急激なATP消費に備えて、高工ネルギーリン酸 基がフォスフんゲンと総称される化合物に貯蔵されている。脊椎動物で は、フォスフんゲンとしてクレアチンリン酸(CrP)が存在し、クレアチンキナー ゼ (CK)が CrPの り ン 酸 基 を ADPに転 移さ せる こと です ばや くATPを再 生す る。 多く の無 脊椎 動物 は 、 CrPの 代 わ り に ア ル ギ ニ ンリ ン酸 (ArgP)とア ルギ ニン キナ ーゼ (AK)を持 つ。 CKは 、分 子
量43Kの二 量体 で あり 、AKの多 くは 分子 量40Kの単量体であ る。本研究では、ホッキガイ閉殻筋より 、軟 体動 物と して は初 めて 分子 量80KのAKを発 見し 、そ の精 製、 cD
NA配列の決定、反応速度論的 解 析 を 行 っ た 。 ま た 、 ナ マ コ 縦 走 筋 よ り 2量 体 AKを 精 製 し、 2量体 A
Kと レて 初め てcDNA
配列を 決 定 し て AKや CKを は じ め と す る フ ォ ス フ ァ ゲ ン の 進 化 ・ 多 様 化 に つ い て 考 察 し た 。
ホッキガイAKは、硫 安分画と各種ク口マトグラフイーによって精製できた。 cDN
A配列とアミノ酸配 列 か ら 、 ホ ッ キ ガ イ AKは ア ミ ノ酸 残基 数724個、 分子 量81Kの 蛋白 質で あ り、 40K夕イ プの AK
遺 伝子 が重 複し た2ドメイン構造であることを明らかにした 。また、ホッキガイA
Kの各基質について ミ カ エ リ ス 定 数 Kmを 求 め た と こ ろ 、 ATP再 生 ヘ 向 か う 正 反応 の基 質で あ るADPと Ar
gPのKmは
他 種 軟体 動物 A
Kと 同程 度で あっ たが 、ArgP
再 生 ヘ向 かう 逆反 応の 基質 であ るATPとArgの Kmは低い傾向にあった。また 、ナマコAKについてもcDN
A配列とアミノ酸配列を決定し、アミノ酸残基数370個 、 分 子 量 42KDaと 算 定 し た 。 ナマ コAKの全 体 的な アミ ノ酸 配列 はAKより もCKに類 似し てい たが、Arg結合部位周辺の構造はAK型を示した。また 、系統樹の解析より、フォスフんゲンは共通の遺伝 子 より AKと CKに 分化 した のち 多様 化が 進ん だ と考 えら れる が、 ナマ コAKはCKに分 化し た原 始遺伝子よりAKに分化したことを示唆する結果を得た。
（3）ヤツメウナギヘモグロピンIの機能と構造について
ヤツ メウ ナギ は最も原始的な 脊椎動物の一種である。多くの脊椎動物ヘモグ口ビン(Hb)が4量体であるのに対して、ヤ ツメウナギHbは単量体／二量体／多量体の平衡状態で存在することなど独自の性質を保持している。 そこで本研究では、カワヤツメよりHbを単離・精製し、生理的性質と立体構造を決定した。
ヤツメウナギHbは、 溶血液をDEAE‑To
yopearlカラムにかけることで精製でき た。溶血液中には分子 量の 異な る4種 類の Hbが 存在 して いた が、 そのうち含有量が90％以上と最も多いHbをHbIとし、解析を進めた。アミノ 酸配列を決定したところ、アミノ酸残基数149個、分子量16．5Kであり、ウミヤ ツメ Hbと 比較 すると4残基の置換があるのみであったが、 ヒ卜H
bロ鎖と比較すると、ヤツメウナ
ギ HbI
で はN末 端が 8残基 長く 、C末端 側の aヘリ ック ス間 のル ープ 部に 欠失 が あっ た。 また 、HbIの酸素結合特性は、HbIが低濃度の時には非協調的であるが、高濃度であると協調性が現れた。さらに、HbI結晶構造を2．3Aの 分解能で決定したところ、単位格子中に12個のHbI分子が存在しており、これ― 190―

らの分 子は、2量体、 6量 体、12量体に会合していた。ヒトHb
ロ鎖と比較して付加・欠失していた部分は6量体を 構成する 分子間の接触部に存在していた。以上より、ヤツメウナギHb
Iは、高濃度で多量体 を 形成 し 、協 調的 に 酸素 を 結合 し 得る こ とを 示唆 す る結 果 とな っ た。

ー 191−

学 位 論文 審 査 の 要旨
主査

教授

田中勲

副査

教授

新田勝利

副査

教授 矢澤洋一（北海道教育大旭川校）

副査

助教授

渡邉信久

学位論文題名The diversi
tyof prot
einst
ruc
tur
esandfuncti
ons（蛋 白 質の 構造と 機能の 多様性 に関する 研究）
生物は、遺伝子の変異・重複などにより、進化・多様化し、蛋白質の種分化・機能分化 をもたら した。本 研究では、筋収縮、ATP再生系そして酸素運搬に焦点を当て、 それに関 与する蛋 白質にっ いて、構造 と機能の 関連性そしてその多様性にっい て検討し た。
筋 収縮は、細 胞内Ca2゛濃 度の上昇 に伴うミオシンATPaseの活性化によって起こ る。脊椎動物横紋筋では、Ca2゛はアクチン繊維上に存在しているト口ポニンCに 結 合し 、 収 縮制 御 はト 口 ポ ミオ シ ン (TM)― ト □ポニン (TN)系によっ て行われている。一方、二枚貝貝柱閉殻筋ではCa2゛はミオシンに結合するが、完全な制御 にはTMーTN系が 必要であ り、二重 の制御機 構が存在 している 。本研究では、
ホ ッキガイ閉 殻筋より 新しく見 いだした 分子量230Kの 蛋白質マ イオニンと名付
け 、その単離 ・精製と 機能の解 析を行っ た。マイ オニンの アミノ酸組成は、パラ ミオシンと 類似して おり、バ ラミオシンの分子量はマイオニンの約1/2の110Kで あ るこ と か ら、 マイ オニンはバ ラミオシ ンタイプ の2ドメイ ン構造で あると推定した。さらに、マイオニンはミオシンのMg
2十ーATPase
活性のCa
2゛感受性を低下 させる機能 を持つこ とを明ら かにした 。これら の結果は 、ホッキガイ閉殻筋に 、ミオシン 、TMーTN系に 加えて、 マイオニンが関与する第3の制御系が存在する ことを示唆 するもの であった 。次に、 TMを高収率 で迅速に 精製する方法を考案 し た。 従 来 の方 法で は、調製に 4日を要し たが、今 回考案し た調製法 では、調 製 は 1日 で完 了 し 、従 来 の方 法 の 4〜 6倍と い う 高収 率 で TMが 得ら れ た 。この 方 法 で精 製 し たホ タ テガ イ TMは 、 ホ タテ ガ イ合 成 ア クト ミ オシ ン の Mg2+̲
ATPase活 性に対して は影響を 与えない ことから 、ホタテ ガイ横紋 筋T
Mは、単独では制御機能を持たないことを明らかにした。
― 192―

ATPは、 解糖系・ TCA回路電子 伝達系で 産生される が、この 他にホスファゲン
キ ナ ー ゼ によ る ATP再 生 系 があ る 。脊 椎 動 物で は 、ク レ ア チン キ ナ ーゼ (CK)が ク レ ア チン リ ン酸 (CrP)の り ン酸 基 を ADPに 転 移 させ る こと で す ばや く ATPを 再 生す る 。多 く の無 脊椎動物 は、CrPの代 わりにア ルギニンリ ン酸(ArgP)とア ル ギ ニ ンキ ナ ーゼ (AK)を 持 つ。 CKは 、 分 子量 43Kの二 量 体 であ り 、 AKの 多く は 分子 量 40Kの 単 量体で ある。本 研究では 、ホッキ ガイ閉殻筋 より、軟 体動物 と して は 初め て 分子 量80KのAKを発 見し、そ の精製、 cDNA配列の決定 、反応速 度 論的 解 析を 行 っ た。 ま た 、ナ マ コ縦 走 筋 より 2量体AKを精製 し、2量体 AKと し て初 め てcDNA配 列 を 決定 し てAKや CKを は じめ とするフ ォスファゲ ンの進化・ 多様化に ついて考 察した。 cDNA配列とアミ ノ酸配列 から、ホ ッキガイAKは分 子 量 81Kの蛋 白 質で あ り 、40K夕 イプ の AK遺 伝 子 が重 複 した 2ド メ イ ン構 造であ ることを 明らかに した。ま た、ホッキ ガイAKの各 基質につ いてミカェリス
定 数 Kmは ATPと Argに つ い て 低 い 傾 向に あ っ た。 ま た、 ナ マ コAKに つい て もcDNA配 列 とア ミ ノ酸 配 列 を決 定 した 。 ナ マコ AKの全体的 なアミノ酸 配列はAK
よ り もCKに 類似 し ていた が、Arg結合 部位周辺 の構造は AK型を示した 。また、系 統 樹の 解 析よ り 、 フォ ス フ ァゲ ン は共 通 の 遺伝 子よりAKとCKに 分化した のち 多 様化 が 進ん だ と 考え ら れ るが 、 ナマ コ AKは CKに分 化した原始 遺伝子よ りAKに分 化したこ とを示唆 する結果 を得た。
ヤツ ヌウナギ は最も原 始的な脊 椎動物の一 種である 。多くの 脊椎動物ヘモグ口 ビ ン(Hb)が 4量 体 であ る の に対 し て、 ヤ ツ ヌウ ナ ギHbは 単量 体 ／ 多量 体 の平衡 状態で存 在するこ となど独 自の性質を 保持して いる。ヤ ツメウナギHbの溶血 液 中に は 分子 量 の 異な る 4種 類の Hbが存 在 し てい た が、 そ の うち 含 有量 が90％以 上 と 最も 多 いHbを HbIと し 、解 析 を 進め た 。 HbIは ア ミノ 酸 残 基数 149個、 分子量16.5Kで あり、配 列は他種 ヤツメウナ ギとは類 似していたが、ヒ卜
Hbロ鎖 と 比 較す る と、 ヤ ツ メウ ナ ギHbIで は N末 端が 8残 基 長く 、 C末 端 側の a
ヘリ ックス間 のループ 部に欠失 があった。 また、HbIの 酸素結合 特性は、HbIが低濃 度の時に は非協調 的である が、高濃度で協調性が現れた。さらに、HbIの結晶 構 造を 2． 3Aの分解能 で決定し たところ 、単位格 子中に12個 のHbI分子が存
在 し てお り 、こ れ ら の分 子 は 、2量 体 、 6量 体、12量 体に会合 していた。 ヒト
Hbp鎖 と比 較 して 付 加 ・欠 失 し てい た 部分 は 6量体を 構成する 分子間の接 触部に存 在してい た。以上 より、ヤ ツメウナギHbIは、高濃度で多量体を形成して、協 調的 に酸 素 を結 合し 得る こと を 示唆 する 結果となった 。
本研究 は、進化 における 蛋白質の構 造と機能 の多様化 について3つの異なる系にお いて研究 したもの であり、その成果は，蛋白質の構造と機能の進化に関して有 益な知見 を与える 。本研究が生物科学に及ぼす貢献には多大なものがあると考 えられ、 よって審 査員一同は申請者が博士（理学）の学位を得る十分の資格が あるもの と認めた 。
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