博 士 （ 医 学 ） 竹 内 理 恵
Suppressed Intrinsic Fibrinolytic Activity
by h/Ionoclonal Anti Beta‑2 Glycoprotein I Autoantibodies
Possible rvIechanism for Thrombosis In Patients
With Antiphospholipid Syndrome（モノクローナル抗ロ2GPI抗体の内因系線溶活性抑制作用と、抗リン脂質抗体症候群患者における血栓形成の成因への関与についての研究）

学位論文内容の要旨
1．緒言
抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipidsyndrome，APS)
は，各臓器の動脈及び静脈の血栓症や習慣 流産な ど妊娠合 併症を はじめ とする 多彩な臨床症状を呈する症候群であり、血清中に 抗 リ ン 鵬 質 抗 体 ガ 検 出 ざ れ る 。 抗 リ ン 脂 質 抗 体 に は 、 固 相 酵 素 抗 体 法 (Enzymeimmunoassay，EIA)で検出され血清糖蛋白であるp2‑glycoproteinI（p2GPI)を対応抗原とす
る抗 カルジ オリビ ン抗体 （aCL‑抗p 2GPI抗体） と、活 性化部 分トロン ボプラ スチン 時同などの りン脂 質依存性 の凝固 時間の 延長で 検出されるループスアンチコアグラント(lupusanticoagulant，LA)などガある。これらの抗体と血栓形成の成因の関係については、まだ不明な点も 多い。 一方、凝 固第xn因子は、 内因系 凝固活 性の1nmatorとして知られるガ、同時に内因 系線溶 活性のinitiatorでもあ る。過 去の報 告では 、B2GPIガ凝固第XII因子の作用を抑 制 す る とさ れ て お り、 抗 p 2GPI抗体 も B2GPIを 介 して凝 固第XII因 子の活 性に作 用するこ とガ予 想された 。以上 の背景 から、 p 2GPI、モ ノクロ ーナル抗p2GPI抗体の内因系
線 溶 活 性 へ の 影 書 、 さ ら に 、 凝 固 xn因 子 活 性 化 へ の 影 響 を 検 討 し た 。
2．方法
はじ めに、 内因系 線溶活性 測定の ため合 成基質を用いた測定系を確立した。ユーグロブ
リン 分画にプ ラスミ ノ―ゲ ン、リ ン脂質 、合成墓買S‑2251を加え、カオリンを添加すること により 、xn因子 を卜リ カーと した内 因系線 溶活性ガ 活性化 され、 プラス ミンガ 生成される。生成したプラスミンによつて合成基質S‑2251
ガ発包し、これを吸光度計で測定した。
カ オリ ン の 有 無の 吸 光 度 の差 を内因 系線溶 活性と した。 10名の健 常者血 漿か6標 準血漿（PNP） を作成 し、ユ―グロブリン分画を調整後、12．5、25、59、100％に希釈し内因系線溶 活性 を 測 定 して 標 準 曲 線と して使 用した 。モノ クロー ナル抗 p 2GPI自己抗 体は、 抗p2GPI自 己 抗 体 を も つ モ デ ル マ ウ ス NZW/BXSB‑F1から 作 成 し たWBCAL‑1と 、 APS患 者から得たIgM抗体であるE1ぬC9の2種類を用いた。
ま ず 、 PNPか6作 成し た ユ ーグロ ブリン 分画に p2GpIを段階 希釈し 加え、 内因系 線溶活性 を 測 定 し 、 続 い て 、p2GPI存 在下 で ユ ー グロ ブ リ ン 分画 に WBCAL． 1およ び EY2C9を添 加し 内 因 系 線溶 活 性 を 測定 して、 p2（mnお よび抗 p2（彈n抗 体の内 因系線 溶活性に 対― 345―

す る影書を 検討し た。さ らに、 p2GPI完全 欠損患 者血漿か ら作成したユーグ口ブリンにB
2GPI存 在 ・ 非 存在 下 で 抗 p2GPI抗 体 を添 加 し 内 因系線溶 活性を 測定し 、抗B2GPI抗体のp 2GPI依 存性 を 確 認 した 。次に 、抗B2GPI抗体の 内因系 線溶への 作用機 序を明 らかに する た め 、次 の 実 験 をお こ なった。 はじめ に凝固 XII因子活 性化に 対する p2GPIおよ ぴ抗p2GPI抗 体の影 fを検討 するた め以下 の方法 を用いた 。リン 脂質を十分に加えたプレカリク
レ イン欠乏 血漿に カオリ ンを添 加する ことに よりXII因 子ガ活 性化され、生成した活性化XII因 子 （ XlIa） を 合 成基 質 S‑2302で測 定 し た 。p2GPI存 在下 で WBCAL‑1お よ びEY2C9を 加えて、 XII因子 活性化 へのこれ 6の抗体 の影書 を検討 した。 っづい て過剰 なXIlaを加え た 条 件で p 2GPI、 WBCAL‑1存 在下で の内因 系線溶 活性の 測定を 行い、 モノクロ ーナル
抗 B2GPI抗体の 作用の 変化を 観察し た。
最 後に 、 APS患 者の 内 因 系 線溶 活 性 を 評価 す るた め、14名 のAPS患者 および 、18名の健 常者の血 漿から ユーグ ロブリ ン分画 を作成し、内因系線溶活性を測定し比較検討した。
3．結果
PNPか ら 作成 し た ユ ーグ ロ ブ リン にp2GPIを添 加し内 因系線 溶活性 を測定 したとこ ろ、p2GPIの 濃 度 依 存的 に 内 因 系線 溶 活 性 は有 意 に 抑 制さ れ た。ま た、一 定濃度 のp2GPI存在下で 、モノ クロー ナル抗 B2GPI抗体を 添加し て内因 系線溶 活性を 測定したところ、抗体の濃度 に依存 して内 因系線 溶活性は 著しく 抑制さ れた。 また、 p2GPI欠乏血漿から作成したユ ー グロ ブリン に、． B2GPIの存 在・非存 在下で モノク ローナ ル抗p2GPI抗体を加 えたと こ ろ 、 p 2GPI存 在 下 で の み 内 因 系 線 溶 活 性 の 抑 制 効 果 ガ 見 6れ た 。
プ レ カ リク レ イ ン 欠乏 血 漿 およ び合成 基買S‑2302を用い た凝固xn因子活 性化の実 験に
お い て 、 p 2GPIは XIIaの 生 成 を 有 意 に 抑 制 し た 。 ここ に WBCAL‑1お よ ぴEY2C9を 添加する と 、 こ れら の モ ノ クロ ― ナ ル 抗B 2GPI抗 体 は B2GPIの XII因子 活 性 化 の抑 制 作用 を阻害 し た 。 さら に 、 過 剰な XIIa存 在 下 で 内因 系 線 溶 活性 を測 定した ところ 、B2GPI存在下でWBCAL‑1はXII因子 活性化 を抑制 した。
抗リン 脂質抗 体症候 群患者 血漿か ら作成 したユー グロブ リン分 画の内因系線溶活性は、健常者 群と比 較し、 有意に 低下して いた。
4．結 語ユ ーグロブ リン分 画の内 因系線 溶活性 を測定するため、合成基買S‑2251を用いた新しい測定 系を作 成した 。この 測定系 では、 プラス ミノ―ゲン過剰状態のユ―グロブリン分画にカオ リンを 加え、 内因系 線溶を 刺激し 、カオ リンにより生成したプラスミンを測定し内因系 線 溶 活性 と し た 。こ の 測 定 系を用 いて82GPIおよび 抗p2GPI抗体 の、ユ ―グロ ブリン分画 の内因 系線溶 に対す る影Iを 検討し た。f2GPIは 従来報 告され たとおり、内因系線溶活性 の抑制 作用を 示した 。また 、ニ種 類のモ ノクローナル抗B2GPI抗体はいずれも内因系線溶 活性を 抑制し 、その 効果は 、p2GPI依存 性であ った。
内 因系線溶 のinitiatorで ある凝 固XII因 子活性化 に対し て、従 来の報告ではB2
GPIおよび、 マウス を免疫 して作 成した ボリク ローナ ル抗p2GPI抗 体は凝 固XII因子活性化を抑制
す る とさ れてい たガ、 今回の我 々の実 験では 、p2GPIは 凝固xn因 子活性 化に抑 制的に 作用す るガ、 モノク ロ―ナ ル抗p2GPI自己抗体 はp2GPIの 作用に 拮抗す るように作用した。
こ の 作 用の ち ガ い につ い て は 、異種 抗原に 対する 抗p2GPI抗 体と自己 抗体と しての 抗B
2GPI抗 体のエ ピトー プの相違 と関連 してい るかもしれない。また、X
IIa過剰状態でもモノクロ ―ナル 抗p2GPI抗 体は内 因系線 溶活性を 抑制した。このことから、モ丿クローナル抗p2GPI抗 体は、 凝固XII因 子活性 化の抑 制では なく、 XIIaの作用 、またはそれより下流のXIIaに よって 活性化 されるプ レカリ クレイ ンの作用などに影鬢して、内因系線溶活性を抑制す ると予 想され た。
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A
P
S患者のユーグロブリン分画では、健常者群に比較して内因系線溶活性ガ低下しており、抗B 2GPI抗体の内因系線溶活性抑制作用ガ臨床的にもAPS
患者の血栓形成の病態に閲与していると考えられる。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 今 村 雅 寛

学 位論文題名
Suppressed Intrinslc Fibrinolytic Activity
by IVIonoclonal Anti Beta‑2 GlycoproteinIAutoantibodies：Possible rvIechanism for Thrombosis In Patients
WitbC Antiphospholipid Syndrome（ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 j82GPI抗 体 の 内 因 系 線 溶 活 性 抑 制 作 用 と 、 抗 リ ン
脂 質 抗 体 症 候 群 患 者 に お け る 血 栓 形 成 の 成因 へ の 関与 に つい て の 研究 ） ．

抗リ ン脂質抗 体症候群 (APS)は，各臓 器の動脈及び静脈の血栓症や習慣流産な ど妊娠合 併症をは じめとす る多彩な臨 床症状を 呈する症 候群であり、血清 中に抗リ ン脂質抗 体が検出 される。抗 リン脂質 抗体のひ とつである抗カルジオルピン抗体（＝抗[32GPI抗体）は、p2−glycoproteinI（p2GPI）を対
応 抗 原と し 、固 相 酵 素抗 体法で検 出される 。一方、凝 固第XII因子 は内因系 凝 固 活 性 の initiatorと し て 知 ら れ る が 、 同 時 に 内 因 系 線 溶 活 性 のinitiat orでも ある。過 去の報告 では、[3GPIが 凝固第XII因子 の作用を抑制 す ると さ れて お り 、抗 p2GPI抗体もp2GPIを 介して凝 固第XII因子の 活性化に 作用する ことが予 想された 。以上の背景から、32G
PI、モノク口ーナル
抗p2GPI抗 体の内因系線溶活性、凝固第XII因子活性化への影響を検討した。
はじ めに、内 因系線溶 活性測定 のため合成 基質を用 いた測定 系を確立した。 ユーグ口 ブリン分 画にプラ スミノーゲン、リン脂質、合成基質S―2251を加 え、カオ リンを添 加するこ とにより、XII因子を卜リガーとした内因系線溶 活性が活 性化され 、プラス ミンが生成 される。 生成した プラスミンによっ て合成基 質S−2251が発 色し、こ れを吸光度計で測定した。この方法を用い て、32GPIおよ びモノク 口ーナル 抗{32GPI抗体の内因系線溶活性を測定した 。モノク 口ーナル 抗f32GPI抗体と しては、抗p2GPI自己抗体をもつモデルマ ウスNZW/BXSBーFlか ら作成し たWBCAL一1と、 APS患者から得 たIg
M抗体
であ るEY2C9の2種類 を用いた 。p2GPI．およ びモノクロ ーナル抗 p2GPI抗体
はと もにユーグ口ブリン分画の内因系線溶活性を抑制した。{32GPI完全欠損
患者 血漿から 作成した ユーグロ ブリンにp2GPI存在・非存在下でモノクローナル 抗32GPI抗体を 添加し内 因系線溶 活性を測定したところ、モノクローナ
ル抗 32GPI抗体は32GPI抗 体の存在 下でのみ 内因系線溶 活性を抑 制し、モノク口ーナ ル抗p2GPI抗体が [32GPI依存性に 内因系線溶活性を抑制することが確認され た。また、 プレカリ クレイン 欠乏血漿及び合成基質Sー2302を使用した方法 を用いて、 凝固XII因子 活性化に 対する32GPIお よびモノ ク口ーナ
ル抗 {32GPI抗 体 の 影響 を 検討 したとこ ろ、p2GPIはXIlaの 生成を有 意に抑制し た が、 モ ノ ク□ ー ナル 抗32GPI抗 体はXIIaの生 成抑制作 用を示さ なかった 。 過剰 な XIIa存 在下 で もモノク □ーナル 抗p2GPI抗体は 内因系線 溶活性を抑制 したことよ り、モノ ク口ーナ ル抗32GPI抗体 は、凝固 XII因子活性化の抑制 ではなく、 XIIaの作用、 またはそ れより下 流のXIIaによ って活性化される プレカリク レインの 作用など に影響し て、内因 系線溶活 性を抑制
すると予 想された。 また、APS患 者のユー グ口ブリン分画の内因系線溶活性は、健常 者に比ベ有 意に低下 しており 、抗p2GPI抗体の内因系線溶活性抑制作用 が 臨床 的 に もAPS患 者の 血栓形 成の病態 に関与し ているこ とが示唆 された。
質疑応答 においては 、副査の 今村教授 から、p2GPIは生体内の凝固線溶機構におい て主要な働 きを担っ ているの か否か、 モノク□ ーナル抗 体とポリク口 ー ナル 抗 体 の作 用 の違 いの 理由につ いて、モ ノク□ー ナル抗体 のIgG型、IgM型で 作用に差は あるのか 、などに ついて質問があった。ついで主査の浅香教 授から、凝 固第XII因子 の凝固活 性への影 響とそれ に対する p2GPI
およ び 抗p2GPI抗体 の 作 用に つ いて 、 ま た、 APS患者 の 中で IgG型とIgM型の抗体を 持つ者で症 状の差は あるのか 、などに ついて質 問があっ た。最後に副査の 小池教授か ら、内因 系線溶機 構のりン 脂質依存 性につい て、内因系線溶機 構における抗[32GPI抗体の作用部位の可能性について、などの質問があった 。いずれの 質問に対 しても、 申請者は これまで の文献的 報告および実験結 果を引用し 、概ね適 切に回答 した。
本論文に おける検討 から、APS患 者の血栓 形成要因のーっとして内因系線溶活 性 の低 下 が 考え ら れ、 今後 APS患者の血 栓形成の 病態を考 え治療を 行っていく うえで有用 と考えら れた。ま た、本研 究で確立 した内因 系線溶活性測定法 は、APSをはじ め血栓症 などにお ける内因系線溶を評価において、今後の有 用性が期待 される。
審査員一 同は、これ らの成果 を高く評 価し、大 学院課程 における 研鑽や取得単位 なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するも のと判定し た。