6藻類
Jpn. J. Phycol.（Sôrui）61: 6-10, March 10, 2013

藻類食プロティストが関与するクロロフィルの「解毒」代謝
横山亜紀子 1・柏山祐一郎 2,3クロロフィルは，藻類が太陽の光エネルギーを捉え，かつ，テロール類やキサントフィル色素類と結合した摩訶不思議なそれを電気化学的なポテンシャルに転換する，光合成の初期分子が見いだされる。しかしこれらは通常は主要な成分では過程に不可欠な有機分子である。地球の生態系のほとんど全無いためか，その起源や生物学的・生化学的な意義を解明すての構成要素は，究極的にこの光合成によって有機物の化学る研究ほとんどなかった。

ポテンシャルの形で蓄えられたエネルギーを利用しているた

こ れ ら 奇 妙 な 色 素 群 の 中 で も， 特 に 異 様 な 構 造 を 持 つめ，クロロフィルは地球生命圏を支える重要な分子だといえ化 合 物 が， 本 稿 の 主 役 に 抜 擢 さ れ る に 到 っ た「 シ ク ロ エる。しかし，クロロフィルには，生物にとっては猛毒（！）の，「一重項酸素」と呼ばれる活性酸素を生み出す「光毒性」と呼ばれる重大な負の側面がある。私たち大型の多細胞生物は，普段の生活でこのクロロフィルの光毒性が問題となることはないが，海洋や湖沼で微細な藻類を食べて生きる微生物たちにとっては重大な問題である。光が透過する体を持つ微生物の場合，餌として取り込んだ藻類を消化する過程で，遊離したクロロフィルやその誘導体が活性酸素を発生させてしまうノ ー ル 」 と 呼 ば れ る 化 合 物 群 で あ る（ 図 １ b）。 正 し く は「132,173-Cyclopheophorbide a enol（ジュウサンニ ジュウナナ
サン シクロフェオフォルバイド エー エノール）」などという長ったらしい名前であるが，如何せん面倒である。この略称には，CPP, CPP516 とか CYCLO などが使われていたが，Kashiyama, Yokoyama et al. (2012) では cPPB-aE と略した。
ここで斜体で「a」とあるのは，クロロフィル a の誘導体であることを意味し，実は cPPB-bE（クロロフィル b の誘導体）と，細胞を破壊される危険があるためだ。これを回避するになどの相同体も存在する。しかし何れにせよ，日本語の口述は，クロロフィルを素早く分解して活性酸素の発生を押さえには馴染まない。そこで，言語の意味的な厳密さを多少犠牲るか，活性酸素を除去する機構が必要である。昨年我々の研にしても，我々は一連の相同体の総称として「シクロエノー

究グループでは，藻類を捕食するプロティストが，光毒性をル」という用語を用いる。何しろシクロエノールは，生物界回避するための，クロロフィル代謝による光毒性回避機構のに普遍的に見いだされ，底泥まで含めた水圏環境全体ではク一端を解明した論文を発表した（Kashiyama, Yokoyama etal. 2012）。本稿ではこの論文に至るまでの数奇で紆余曲折な裏話をたどりながら，クロロフィル代謝機構の主人公とそれを取り巻く状況について解説する。
環境中に見いだされる謎の色素たち話は柏山の古い研究に遡る。古生物学が出自である柏山

ロロフィル類に匹敵するかそれ以上の量が存在し，かつ，微生物生態学的に重要な化合物である，というのが我々の主張であり，使い勝手の良い名前が必要だと考えたからである。
シクロエノールを巡る研究史研究の現場には時として不思議な展開が待ち受けているものである。「シクロエノール」は，実は 40 年近く前に，ドは，過去の光合成生物の痕跡から太古の環境や生命進化を研イツの有機合成化学のラボにおいて，純粋な化学的興味（クとする分子化石の研究に携わってきた。地層中から見つか

et al. 1975）。分子酸素を遮断したフラスコの中で，有機溶媒に溶かされたクロロフィルの人為的な誘導体である究するべく，藻類が生産するクロロフィル（図１a）を起源る「化石ポルフィリン」と呼ばれる赤い色素がクロロフィルを起源としていること，そうした分子化石に到る中間的なクロロフィルの分解産物が現在の水圏環境の底泥などから見つかることなどは，以前の藻類学最前線の稿で紹介した（柏山2010）。しかし，環境中から見いだされるクロロフィルの誘導体には，光合成器官で機能することが報告されたことのない，奇妙な構造を持つ分子種が知られてきた。例えば，クロロフィル類の多くでは，それらの光化学的な機能を担うテトロリン環の化学の研究）のもとに初めて「誕生」した（Falkpyropheophorbide methyl ester にある特殊な強塩基，それに続いてリン酸バッファーを作用させることで，分子内での縮環反応によりクロリン環にエノール基を持たせた化合物が作り出された。結果としてそれらの化合物は，クロロフィル類に特徴的な exo- 五員環に隣接した exo- 七員環を有する…

まあ，このあたりはテキトウに読み飛ばしていただいても構わないのだが，ともかく図１b に示すような色素が人工的にラピロール構造（クロリン環）に，エステル結合により脂溶作られた。この物質は，有機溶媒中では不安定な化合物であ性の炭化水素鎖である「フィトール」と呼ばれるアルコールり実験系での取り扱いが難しく，合成の反応機構の詳細も分が架橋しているが（図１a），堆積物などを抽出して分析すると，このフィトールの代わりにコレステロールなどの各種スからず，彼らのやり方以外の有機合成はうまくいかないのである。

7a)

Chlorophyll a: R = CH3

ǯȭȪȳ࿢

Chlorophyll b: R = CHOb) 13 ,17 -Cyclopheophorbide a enol: R = CH
2313 ,173-Cyclopheophorbide b enol: R = CHO

RR

N

N

32NHN

NHN

Mg
N

MeOOCON䜽䝻䝻䝣䜱䝹
OOH

ȕǣȁȫؕᲢȕǣȈȸȫᦋᲣ

OO䝅䜽䝻䜶䝜䞊䝹
図１. クロロフィルとシクロエノールの化学構造式。

そんなこともあってか，これ以降この化合物の化学的な研究は途絶える。しかし，その十一年後，今度は天然物としてシクロエノールが報告された。海綿（樹状角質海綿目の Darwinella oxeata） の 組 織 か ら 抽 出 さ れ た も の だ が，この研究はあくまで化合物の化学的な研究に留まっている（Karuso et al. 1986）。さらに十年以上が経ち，二十世紀も暮れが差し迫った頃，ちらほらと環境試料（海洋の表層堆積物や海水中の懸濁粒子）から抽出されたという報告が相次い漠然とした疑いを抱いていた。その一方で，シクロエノールの不安定性に起因する “分析の再現性の低さ”（Louda et al.
2000）を強く認識させられていた。よって，シクロエノールの信頼性の高い分析には，標準試料を入手することが重要であると考えた。こうして彼は，2010 年 4 月，地球科学の世界を離れて，筑波大学化学の有機合成ラボである野本信也研究室の門を敲くこととなった。
このころ柏山は，シクロエノールは堆積物中ではなく，水だ（Ocampo et al. 1999, Goericke et al. 2000, Louda et al.
2000, Ostrovsky & Yacobi 2001）。さらに，Goericke et al.
(2000) では，化合物の同定が不完全ながらも，シクロエノー塊中で生成し，それが海底に降り積もっているのではないなどの多細胞動物プランクトン，繊毛虫（Strombidinopsisあった。このため，純度の高いシクロエノールの標品を合成

ルを濃集あるいは生産する生物として，オキアミや貝形虫acuminatum） や 従 属 栄 養 性 の 渦 鞭 毛 藻（Amphidiniumおよび Noctiluca scintillans）が示唆された（「糞粒」のsp.ᅗ䠍抽出分析）。しかし，この化合物の不安定性による分析の再現性の低さなど多くの問題が残り，結局その後環境試料中かかと疑い始めていた。これを証明するためには，色素濃度が低い水試料から抽出を行ない，極微量の成分としてシクロエノールを高速液体クロマトグラフィーで検出する必要がし，できればクロロフィル誘導体に特徴的な自家蛍光を利用して HPLC- 蛍光検出計を用いた分析が望ましいと考えた。
ᶓᒣ䞉᯽ᒣ
し か し， 文 献 に よ る 合 成 レ シ ピ（Falk et al. 1975, Ma &Dolphin 1999）を読む限りはかなり簡単にみえるが，シクらの報告は途絶えた。それ以降は，2008 年には二枚貝（イロエノール合成は難渋を極めた。結局，野本教授の援助を得ることが報告されたのみであった（Louda et al. 2008）。

ルの研究をされている，同じく筑波大学の小林正美准教授のガイ科の Perna perna）の消化管にシクロエノールが濃集す流浪する研究：裏話あれこれ・・・て少量のシクロエノール合成標品を手に入れた。クロロフィ
ラボで，その合成標品の光化学的物性を調べたところ，なんとこのシクロエノールの標品がほとんど全く自家蛍光を発せここからは，結構個人的な話にはなるが，今回の研究を理ず，蛍光検出は無理であることが判明した。さらに，酸素存解しやすいと考え，研究背景を時系列にそって解説しよう。

在下では，濃度が低いシクロエノール溶液はたちまち分解さ柏山が初めてシクロエノールの重要性に接したのは，2008れて無色になってしまうことも分かった。これでは酸素存在年，海洋研究開発機構において，黒海などの高度に有機物に下での定量的な分析は容易ではない。泣きっ面に蜂である。

al. 2010）してからである。当時の分析技術では，海底が淀「Detoxification catabolism of chlorophyll」仮説「シクロエノールは嫌気的水塊の環境指標ではないか」と，が結局道を開くこととなる。2011 年 4 月，立命館大学の有富む嫌気的な堆積物からシクロエノールを検出（Kusch etんで無酸素になるような堆積物のみで検出されることから，しかし研究というのは不思議なもので，この望まない発見8

機生物化学研究室に移籍した柏山は，「天然環境中から，どかく，ひとたび分析が可能になってみると，この化合物はあうやら生物が関与して作られるらしい奇妙なクロロフィル誘

らゆる水圏環境から検出された。まず堆積物に関していえば，導体が見つかる」という話を民秋均教授に振ったとき，意外印旛沼，東京湾に始まり，琵琶湖，伊勢湾そして立命館キャな言葉を耳にした。クロロフィルの光毒性。有機化学出身でンパス内のため池の泥に到るまで遍在し，しかも驚くべきこも生物物理出身でもない柏山には想像もしなかった話であとに，検出される全クロロフィル誘導体に関してシクロエる。民秋教授が言うには，クロロフィルは光により活性酸ノールが軒並み 50 ％を超えるのである。つまりこれまで報素を発生させる能力を持ち，微生物にとって危険な化合物で告されていなかったのは，単にシクロエノール分析手法に問あるはずだというのだ。その光毒性を回避するための工夫の題があっただけなのである。

結果，それら奇妙なクロロフィル誘導体が作られているのでさらに重要なことは，シクロエノールが表層水から検出さはないか，と。柏山はとっさに「蛍光を出さないクロロフィれたことである。しかも分析した全ての試料からだ。印旛沼

ル誘導体」であるシクロエノールの話を切り出した。なぜなに始まり，東京湾，琵琶湖，立命館キャンパス内の池の水，ら，蛍光を出さないことは，光毒性がないことを強く示唆す後日になるが，伊勢湾，熊野灘沖太平洋，三方五湖（水月湖るからだ。この時初めて，シクロエノール ＝ detoxification

catabolite of chlorophyll という仮説が産まれた。この証明には，再現性があり定量的な分析法を確立することが必要である。ところがいくら分析を繰り返しても，シクロエノールが HPLC 分析の過程で分解してしまい，濃度が低いと全く検出できない。ただし，逆に言えば，濃度が高ければ場合によっては検出される。実際，横山とともに印旛沼で採取した堆積物からシクロエノールは検出できた（未公表）。と三方湖），余呉湖，さらには柏山の実家の庭の手水鉢の中の水にいたるまで，シクロエノールは様々な水圏生態系から発見された。もちろんそれらの水には藻類が生息しているた
め，検出される主な色素はクロロフィル a などの光合成色素であるが，分解物中の単一化合物としてはシクロエノールが必ずと言っていいほど最も量が多かった。
犯人は藻類食プロティスト！

そうなると，勢い，「誰がシクロエノールを作っているのだ」

シクロエノールは水圏環境に遍在する！という話になるのは道理である。もちろん柏山も，立命館大になる。2010 年 4 月柏山は，以前から面識のあった筑波大にクロレラを食べさせる実験などに取り組んだ。過去の研究

時間は 1 年遡って，柏山が筑波大学に移ってきたときの話学の稲垣祐司准教授に，つくば藻類・プロティストフォーラ学に移った早い段階から模索を始めており，最初はミジンコに節足動物の糞粒からシクロエノール様化合物が検出された

ムで化石ポルフィリンの話をしてほしいと誘われた。折しも，同大学の井上勲教授の著書「藻類 30 億年の自然史」を感動という報告があったからである（Goericke et al. 2000）。しかしどうしてもミジンコはシクロエノールを作ってくれなと共に読了したばかりであり，柏山はこの話を喜んで受けかった。その「糞粒」に含まれていたというシクロエノールた。これを機に，柏山は筑波大学の藻類・プロティスト研究は，そもそも彼らの餌生物・物質に含まれていたのではない者たちと面識を得たが，とりわけ横山との再会は，その後のか。そうすると犯人はほかの微生物か。バクテリアだろうか。

シクロエノール研究に重大な転機をもたらした。その後，日そもそも多様な微生物の中から犯人を特定することがそんな本地球惑星科学連合の学際セッションのコンビーナとしてのに容易だとは思えなかった。柏山は，犯人捜しに関しては長誘いを横山が受けたのを機に研究の方向性が徐々に生物側へ期戦を覚悟しかけていたが，ここでも横山の入れ知恵で突破と近づいて行く。横山は当時，共同研究者の理研・守屋繁春口が開かれる。答えはあっさりと見つかった。

博士とともに継続的に印旛沼で定期サンプリングを行ってい横山は当時，東京湾沿岸から，奇妙な珪藻食いのプロティたが，2011 年 3 月 11 日の午前中のサンプリングに柏山も同行する。大学に戻ってサンプル処理を始めた途端，それまでストを単離し，珪藻 Skeletonema と共に二員培養することに成功していた。遺伝子解析からケルコゾアに属することが経験した事のない揺れに襲われた。立命館大学への赴任が決分かったこの鞭毛虫は，餌の珪藻に近づくと，まるで触覚のまっていた柏山は震災の余韻から逃げるように予定よりも早先で餌をさぐるアリのように，鞭毛を珪藻に接触させながら，くつくばを去った。

しばらくの間，珪藻をつつき回す。すると突然，細胞の一部

その 2011 年の晩春には，その印旛沼の底泥試料から，続にくぼみのようなものが見え始め，珪藻を縁どるようにアいて水試料を濾過したガラスファイバーフィルターからシクメーバ状に変形し，ついには自分の細胞長よりもずっと大きロエノールが検出された。さらに，横山と守屋博士が継続的な珪藻を丸呑みする。しばらくすると珪藻を食胞に抱えたま観測を行なっていた東京湾沿岸の底泥試料と水フィルター試

ま２本の鞭毛を使って泳ぎ回る。最後はあたかも靴下を脱ぎ料が届き，泥・水どちらからもシクロエノールが検出された。

去る様に珪藻から体を離し，またもとの球状の鞭毛虫に戻る

夏までには，柏山はついに微量のシクロエノールを定量分析する HPLC メソッドに到達していた。このかなり異様なメソッドに関しては，話が脇にそれるので本稿では措く。とものである（図 2）。捨てられた珪藻の細胞内部には，縮んだ色素体が赤褐色に変色していた。横山は，この培養試料を柏山に送って色素分析を依頼した。

9

それは本当に目を疑うデータであった。ケルコゾアと珪藻の二員培養系で，餌の珪藻が本来持っていたクロロフィルはわずかしか検出されず，代わりに検出された全クロロフィル誘導体の実に 80 ％強がシクロエノールだったのである。横山は筑波大学の石田健一郎教授と中山剛講師の研究室の学生たち（特に白鳥峻志氏）の協力を得ながら，プロティストの二員培養株を，次々と柏山に送りつけた。ケルコゾアに続いて，色素を持たない藻類食のストラメノパイル生物，セントロヘリドに属する太陽虫などから次々とシクロエノールが検出された。一方で，藻類を食べてもシクロエノールはおろか，クロロフィルの本質的な代謝分解は行なっていない生物も，オピストコンタに近縁なプロティストで見つかった。過去の文献も含めて考察し（Goericke et al. 2000），シクロエノー
ルは「ストラメノパイル - アルベオラータ - リザリア群（SAR群）とクリプト藻 - 有中心粒類 - テロネマ類 - ハプト藻群（CCTH 群）」に属する藻類食のプロティストが，クロロフィルの代謝産物として作り出している」という結論に到って，いよいよ論文投稿という話になった。
色素体のクロロフィル自家蛍光が消える！

原稿は残念ながら S 誌や N 誌などの派手なジャーナルには丁重に断られてしまったが，賭に出た PNAS（アメリカ科学アカデミー紀要）への Feature Article としての投稿で，幸いにも色よい返事がエディターから返ってきた。しかし，

図 2. 二員培養系でのケルコゾア生物の珪藻捕食シーンの連続観察像。

a. ケルコゾアが鞭毛で珪藻（Skeletonema）に接触。
b-e. アメーバ状になり，細胞内へ珪藻を取り込む。
f. 珪藻を取り込んだまま，鞭毛で遊泳するケルコゾア生物。
g-i. 珪藻の遺骸を細胞外へ出し，もとの球状遊泳細胞へと戻りつつあるケルコゾア生物。

「プロティストが藻類の摂食に際してシクロエノールを作っているというより直接的な証拠を示せ」という，やっかいな注文も付けられていた。そこで我々は，プロティストの食作用に際して，餌の色素体内部のクロロフィルの自家蛍光が消えるはず（シクロエノールは無蛍光性であるため）という仮説を，蛍光顕微鏡観察で証明することにした。代表選手には再び例のケルコゾアが選ばれた。食事をしながら動き回るケルコゾアを追った連続写真（微分干渉像と蛍光像の両方）を撮る。しかも光源の強光によりクロロフィルのブリーチングが起こらない様に一瞬の照射で蛍光像を得る…。この作業はなかなかに手強いものであった。ようやく蛍光撮影に成功すると，餌の色素体が放つ赤い自家蛍光は，ケルコゾアに飲み込まれると数分の内にパタパタパタッ，と消えていく。傾向としてはケルコゾアの細胞中央部付近から順に，クロロフィル自家蛍光の消失が起こるようである。しかし，これを微分干渉像とセットで示す事は難渋を極めた。結局，論文の本編の図（Kashiyama, Yokoyama et al. 2012; Fig. 3）には，異なる消化段階にある 3 つのケルコゾア細胞が映った像と，Supporting Information の中に，1 個体を連続で追いかけた図（Kashiyama, Yokoyama et al. 2012; Fig. S2）を掲載した。

多様性全体を網羅しているとはいえない。そこで，我々の研究グループでは，様々な研究者に協力をあおぎながら，徐々に調査分類群の幅を広げている。まずは先行論文で一度も調査されていないスーパーグループのエクスカバータ生物をターゲットとした。この生物群には細菌捕食性，真核捕食性，吸収栄養性，独立栄養性，そして，近年記載された Rapazaviridis (Yamaguchi et al. 2012) のような混合栄養性のものまで多種多様な栄養様式のものが存在し，この中で，シクロエノールの有無を調べる事は重要であると考えた。先に述べた通り，藻類捕食生物であっても，シクロエノールを必ず生成するわけではない。しかし，この系統内にシクロエノール合成能が備わっているのであれば，たとえ独自色素体を保有していても，緑藻植物の Tetraselmis を補食する Rapaza あたりまではシクロエノールを生成するのではないか？そして独立栄養性生物で段階的にシクロエノールを作らなくなるとしたら・・・そんなことを思いついた横山はまた次々に柏山にサンプルを送りつけた。この顛末については，まだ全てを語る事は出来ないが，実は日本藻類学会第 37 回大会の要旨に記載されているので，軽く触れておこう。光合成生物で後日譚：深化するシクロエノール研究あってもユーグレノイドはシクロエノール合成能があるらし

クロエノールを代謝するか否かは，どうやら分類群によって３種や真眼点藻類１種，あるいはプラシノ藻類１種（未発表

Kashiyama, Yokoyama et al. (2012) で示したように，シ全く異なっている。しかし，まだ調査した分類群は生物界のい・・・と。これまでの分析では，光合成生物である珪藻類データを含む）からは，全くシクロエノールが検出されてい10ない。ところが，光合成ユーグレナ類は，祖先生物で獲得されたシクロエノール代謝能を保持し続けていて，自らの色素体で合成され利用されているクロロフィルを分解してシクロエノールを作っている。このことは，光合成ユーグレナ類自身の色素体を自ら処分していることを示唆する。実はこの理由について，“あたり” はついているのだが，この先は次の論文を待ってほしい。
さて，しかしそうなると，二次植物だけでなく，本当に一次植物にはシクロエノール代謝能はないのだろうか？また，いつの時代からシクロエノールは作られ，それを化石や堆積物からうまく検出する事はできるのか？さらにシクロエノール合成にかかわる遺伝子は？という疑問が出てくる。まだまだ，多くの謎に満ちたシクロエノールを今後も深く追求していきたい。

引用文献

Falk, H., Hoornaert, G., Isenring, H. P. & Eschenmoser, A. 1975.
Enol derivatives in the chlorophyll series. Preparation of132,173-cyclopheophorbide enols. Helv. Chim. Acta 58: 23472367.
Goericke, R., Strom, S. L. & Bell, M. A. 2000. Distribution andsources of cyclic pheophorbides in the marine environment.
Limnol. Oceanogr. 45: 200-211.
Karuso, P., Bergquist, P. R., Buckleton, J. S., Cambie, R. C., Clark,
G. R. & Rickard, C. E. F. 1986. 132,173-Cyclopheophorbide
enol, the first porphyrin isolated from a sponge. Tetrahedron
Lett. 27: 2177-2178.
Kashiyama, Y., Yokoyama, A., Kinoshita, Y., Shoji, S., Miyashita,

H., Shiratori, T., Suga, H., Ishikawa, K., Ishikawa, A.,Inouye, I.,Ishida, K., Fujinuma, D., Aoki, K., Kobayashi, M., Nomoto, S.,
Mizoguchi, T. & Tamiaki, H. 2012. Ubiquity and quantitative
significance of detoxification catabolism of chlorophyllassociated with protistan herbivory. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
109: 17328-17335.
柏山祐一郎 2010. 地層に眠るクロロフィルの分子「化石」. 藻類 58:
9-12.
Kusch, S., Kashiyama, Y., Ogawa, N. O., Altabet, M., Butzin,M., Friedrich, J., Ohkouchi, N. & Mollenhauer, G. 2010.
Implications for chloro- and pheopigment synthesis andpreservation from combined compound-specific δ13C, δ15N,
and Δ14C analysis. Biogeosciences 7: 4105-4118.
Louda, J. W., Loitz, J. W., Rudnick, D. T. & Baker, E. W.
2000. Early diagenetic alteration of chlorophyll-a andbacteriochlorophyll-a in a contemporaneous marl ecosystem;
Florida Bay. Org. Geochem. 31: 1561-1580.
Louda, J. W., Neto, R. R., Magalhaes, A. R. M. & Schneider, V. F.
2008 Pigment alterations in the brown mussel Perna perna.
Comp. Biochem. Physiol. B 150: 385-394.
Ma, L & Dolphin, D. 1999. The metabolites of dietary chlorophylls.
Phytochemistry 50: 195-202.
Ocampo, R., Sachs, J. P. & Repeta, D. J. 1999. Isolationand structure determination of the unstable 132,
173-Cyclopheophorbide a enol from recent sediments.
Geochim. Cosmochim. Acta 63: 3743-3749.
Ostrovsky, I. & Yacobi, Y. Z. 2001. Cyclopheophorbide a insuspended particles in the meta- and hypolimnion duringoxygen depletion in a subtropical lake. J. Phycol. 37 suppl. 39.
Yamaguchi, A., Yubuki, N. & Leander, B. S. 2012. Morphostasis ina novel eukaryote illuminates the evolutionary transition fromphagotrophy to phototrophy: description of Rapaza viridis n.
gen. et sp. (Euglenozoa, Euglenida). BMC Evol. Biol. 12: 29.
（1 筑波大学，2 独立行政法人日本科学技術振興機構さきがけ，3立命館大学）