平 成
年 度

26

金沢医科大学共同研究成果報告書・奨励研究成果報告書

２０１４

平成２６年度金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

平成平成２８年１０月

年

28

月

10

金沢医科大学

金沢医科大学はじめに

平成 26 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成 17 年度からは、奨励
研究に萌芽的研究の枠を設けるなど研究の多様化にも対応しています。
平成 19 年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成 26 年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域では、共同研究に 10 件の申請があり 4 件を採択、奨励研究に 38 件の申請があり 15 件が採択されました。また、看護学領域では、共同研究に申請のあった 1 件が採択されました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後、これらの共同研究と奨励研究で得られた研究成果を、社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

平成 28 年 10 月
金沢医科大学
学長

神田

享勉

目

次

はじめに

平成 26 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2014－1. インフルエンザ肺炎の発症機構の解明
研究代表者・長 内 和 弘･･････
C2014－2.

1

産科小児科の連携による胎児脳機能発達と乳幼児期脳神経発達についての疫学研究研究代表者・西 条 旨 子･･････

C2014－3.

RNA 結合因子の機能解析と診断マーカー探索
研究代表者・石 垣 靖 人･･････

C2014－4.

5

9

オートファジーを標的とした糖尿病合併症の病態解析研究代表者・古 家 大 祐･･････ 13[看護学領域]
C2014－5.

助産師教育における実習の安全管理に関する教育モデルの構築と検証：教育モデル枠組みの検討
研究代表者・岩谷久美子･･････ 17

平成 26 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2014－1. 樹状細胞内におけるオステオポンチンとガレクチン９によるシグナル伝達の制御と自己免疫疾患増悪機構の解明
研究代表者・有 川 智 博･･････ 21
S2014－2.

肥満モデル動物の自律神経系に及ぼす nesfatin-1 の役割
研究代表者・谷 田

S2014－3.

守･･････ 23

ミトコンドリア恒常性維持機構の破綻と糖尿病腎症に関する研究研究代表者・北 田 宗 弘･･････ 27

S2014－4.

経口抗線維化ペプチド薬の開発
研究代表者・金 﨑 啓 造 ･･････ 33

S2014－5.

ユビキチン化を介した DNA 末端連結による抗ガン剤感受性獲得機構の解析
研究代表者・逆 井

S2014－6.

良･･････ 37

宿主細胞内 pH によるフラビウイルス複製調節機構
研究代表者・田 崎 隆 史･･････ 41

S2014－8.

冠動脈切削後流出分子を標的とした動脈硬化
新規評価法の開発
研究代表者・赤 尾 浩 慶･･････ 43

S2014－9.

味覚 BMI 開発のための脳内味覚地図の解明
研究代表者・薗 村 貴 弘･･････ 47

S2014－10. Saffold ウイルス感染は１型糖尿病誘発のトリガーとなるのか？
研究代表者・姫 田 敏 樹･･････ 51
S2014－11. 中枢神経原発悪性リンパ腫におけるインターロイキン 10
レセプターおよびシグナル伝達分子による増殖機構の解明
研究代表者・笹 川 泰 生･･････ 55
S2014－12. マウスを用いた胃上皮再生の蛍光イメージング研究代表者・武田はるな･･････ 57
S2014－13. SPECT-MRI 融合画像による嗅神経障害の自動評価システムの開発研究代表者・奥 田 光 一･･････ 61
S2014－14. アナフィラキシーショック時の胃の循環と収縮機能の統合的研究研究代表者・九 田 裕 一 ･･････ 63
S2014－15. 中心体における Exon junction complex (EJC) 因子の構成解析研究代表者・辰 野 貴 則 ･･････ 65※奨励研究 S2014-7（島崎猛夫・総合医学研究所先端医療研究領域・准教授）の成果報告については、特許戦略上、平成 26 年度版（平成 28 年度発行）への掲載を控えることとした。特許出願及び論文発表後に掲載する予定である。

平成 2６年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2014-1～4

看護学領域

C2014-5

１．研究課題名：インフルエンザ肺炎の発症機構の解明（研究番号 C2014-1）
２．キーワード：１）Ａ型インフルエンザウイルス (influenza virus type A)２）インフルエンザ肺炎 (influenza pneumonia)
３）肺サーファクタント (lung surfactant)４）発症機構 (pathogenesis)
３．研究代表者：長内研究分担者：石橋村木
野田和弘・医学部・教授・呼吸器内科学
隆治・看護学部・教授・医科学
靖・岩手医科大学・教授・微生物学講座
岳志・東京大学医科学研究所・准教授（※上記の所属・職名は平成 27 年 3 月 31 日時点）

４．研 究 目 的
インフルエンザを適切に制御することは重要である。制御法のひとつに重症化の阻止と治療がある。重症化したインフルエンザの中で、特にウイルス性肺炎は致死的疾患である。近年発生した A 型インフルエンザにおいても肺炎や急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) の症例が多く報告され、その病態の理解と治療法の確立は急務となっている。本研究の目的は、インフ
ルエンザ肺炎の発症機構に関する基礎的研究を行い、重症化に寄与する要因を解析することである。
５．研 究 計 画
重症のインフルエンザ肺炎（ARDS を含む）の基本的な病態はウイルス増殖によって生じた肺胞障害とそれに引き続く換気障害である。本研究では、肺胞由来の初代培養細胞や株化細胞に A 型インフルエンザウイルスを感染させ、ウイルス感染が肺胞細胞に与える影響を細胞生物学的およびウイルス学的な面から解析する。特に、ウイルス感染により傷害を受けた
肺胞上皮細胞内での肺サーファクタントの合成との関連性も検討する。本研究で得られる成果により新規の治療薬開発のための基礎的な知見も得られると期待される。
６．研 究 成 果
平成 26 年 8 月 1 日付で研究代表者の村木靖が岩手医科大学に異動することとなったため、
平成 26 年 6 月 23 日付で長内和弘が本研究の研究代表者となった。
平成 25 年度の研究で、A 型インフルエンザウイルスの代表的な分離株 A/Aichi/2/68 (H3N2)がラットから単離した肺胞 II 型細胞において増殖することを明らかにした。そこで平成 26
年度では、この細胞における A 型インフルエンザウイルス弱毒株 A/Osaka/164/09 (H1N1 pdm)
および強毒株 A/Norway/3487/09 (H1N1 pdm) の増殖を解析し、その違いを明らかにすることを目標としていた。しかし、ウイルス感染実験の主担当者である村木の異動により新鮮なラ− 1 −ット単離細胞を利用することが困難になったため、まず肺胞由来の株化細胞を用いて解析することとした。
平成 26 年度の研究において得られた成果を記す。
（１）肺胞上皮由来の株化細胞である A549 細胞における A 型インフルエンザウイルスの増殖が明らかになった（担当：長内、石橋、村木）
継代中の A549 細胞をシャーレに播種し、

図1

Osaka
NorwayViral titer (Log10 PFU/ml)(1)-1 材料と方法：
2 日後に A 型インフルエンザウイルス弱毒
株 A/Osaka/164/09 (H1N1 pdm) および強毒株 A/Norway/3487/09 (H1N1 pdm) を multiplicity
of infection (moi) = 0.1 で 感 染 さ せ 、
TPCK-trypsin 存在下（最終濃度 1 ug/ml）で37℃で培養した。

0

IL-6 expression (Fold of MOCK)中のウイルスをプラーク法により定量した。
また細胞内に発現した IL-6, IL-8, induced
NO synthase (iNOS) そして surfactant protein

12000
8000
4000
0

(1)-2 結果：感染細胞の上清中のウイルスタイターは、
104～106 plaque-forming unit (PFU)/ml であっ た （ 図 1 ）。 各 日 と も 、 強 毒 株った（図１）。
感 染 細 胞 内 の 各 種 炎 症 マ ー カ ー (IL-6,

強毒株感染細胞でより高値を示し、強毒株がより強い炎症反応を起こしていることが示された（図 2, 3）。一方、iNOS の mRNA
量は全経過を通じて差を認めなかった（図4）。このことは、少なくともこの系においては、炎症の惹起に NO は関与していない− 2 −iNOS expression (Fold of MOCK)

図4

験系にも反映されていることが明らかとなした（図 2-5）。IL-6 と IL-8 の mRNA 量は

20

4
Osaka
Norway

16
12
8
4

1

ける病原性の強さが A549 細胞を用いた実IL-8, iNOS)および SP-D の mRNA 量を定量

23Days post infection

02
3Days post infection

4

20
Osaka

16

Norway

12
8
4
0
1

図5

SP-D expression (Fold of MOCK)

A/Osaka/164/09 より高値を示し、ヒトにおIL-8 expression (Fold of MOCK)1

図3A/Norway/3487/09 の タ イ タ ー が 弱 毒 株

OsakaNorway

16000(SP)-D の mRNA を real time-PCR で定量し
た。

4

20000

図2

感染 1～4 日後に細胞上清を回収し上清

1
2
3
Infection (days post infection)

2
3
Days post infection

4

1

Osaka
Norway

0.8
0.6
0.4
0.2
0
1

2
3
Days post infection

4

ことを示唆する。
SP-D の mRNA 量も、全経過を通じて差はなかった（図 5）。A549 細胞は確立された付着能を有する株化細胞であり、細胞表面が空気に触れることはない。すなわち SP を合成する必要がないことが主な原因であると示唆された。
（２）今後の感染実験に必要な細胞を準備できた（担当：村木、野田）
上記の知見は A549 細胞を用いての解析には限界があることを示唆する。そこで研究分
担者の村木靖と同一の研究機関（岩手医科大学医学部臨床検査医学講座）の諏訪部章教授に、同教授の研究グループで確立した「肺胞 II 型細胞の性状を維持するラット初代培養細胞の分離法」をご指導いただいた。この細胞に A 型インフルエンザウイルスを感染させ解析することで、さらなる研究の進展を期待している。
７．研究の考察・反省
A549 細胞において、2 つの A/H1N1pdm09 株 (A/Norway/2009、A/Osaka/2009) が効率よく増殖し、しかも元株の持つ病原性の違いが反映されていることが明らかになった。また炎症の程度が株により異なることも判明した。すなわち適切な細胞を準備することで、目的を達成できる可能性が強くなった。６（２）で述べた細胞を用いることでさらなる進展が期待できると思われる。
８．研 究 発 表
Masuoka T, Nakamura T, Kudo M, Yoshida J, Takaoka Y, Kato N, Ishibashi T, Imaizumi N, Nishio M.
Biphasic modulation by mGlu5 receptors of TRPV1-mediated intracellular calcium elevation insensory neurons contributes to heat sensitivity. Br J Pharmacol 2015; 172: 1020-1033.
Abstract: BACKGROUND AND PURPOSE: Elevation of glutamate, an excitatory amino acid,during inflammation and injury plays a crucial role in the reception and transmission of sensory
information via ionotropic and metabotropic receptors. This study aimed to investigate themechanisms underlying the biphasic effects of metabotropic glutamate mGlu5 receptor activation on
responses to noxious heat.
EXPERIMENTAL APPROACH: We assessed the effects of intraplantar quisqualate, anon-selective glutamate receptor agonist, on heat and mechanical pain behaviours in mice. In addition,
the effects of quisqualate on the intracellular calcium response and on membrane currents mediatedby TRPV1 channels, were examined in cultured dorsal root ganglion neurons from mice.
KEY RESULTS: Activation of mGlu5 receptors in hind paw transiently increased, then decreased,
the response to noxious heat. In sensory neurons, activation of mGlu5 receptors potentiated
TRPV1-mediated intracellular calcium elevation, while terminating activation of mGlu5 receptors
depressed it. TRPV1-induced currents were potentiated by activation of mGlu5 receptors undervoltage clamp conditions and these disappeared after washout. However, voltage-gated calcium
currents were inhibited by the mGlu5 receptor agonist, even after washout.

− 3 −CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS: These results suggest that, in sensory neurons, mGlu5
receptors biphasically modulate TRPV1-mediated intracellular calcium response via transient
potentiation of TRPV1 channel-induced currents and persistent inhibition of voltage-gated calcium
currents, contributing to heat hyper- and hypoalgesia.

− 4 −１．研究課題名：産科小児科の連携による胎児脳機能発達と乳幼児期脳神経発達についての疫学研究（研究番号 C2014-2）
２．キーワード：１）ダイオキシン (dioxin)２）新生児脳波 (neonatal EEG)３）臍帯血 (umbilical cord blood)４）脳神経発達 (neurodevelopment)５）追跡調査 (follow-up study)
３．研究代表者：西条旨子・医学部・教授・公衆衛生学

研究分担者：早稲田智夫・医学部・講師・産科婦人科学（採択時）新井田
西条

要・金沢医科大学病院・准教授・遺伝子医療センター
寿夫・富山大学大学院・医学薬学研究部・教授・システム情動科学

４．研 究 目 的
近年、日本やアメリカなどの先進国で発達障害児（広汎性発達障害、多動注意欠陥症候群
や学習障害を含む）が増加し、親の高齢化や高学歴、妊娠出産時の異常、環境汚染などとの関連が予想されているが、日本における疫学調査は少ない。これまで我々は、環境汚染物質の胎児期暴露と乳幼児期の脳神経発達との関連性を明らかにすることを目的に、ベトナムにおいて新生児コホートを追跡調査し、ダイオキシン高暴露群の男児が、乳児早期に微細運動能力の低下を示すことを報告してきた。また、3 歳時の追跡調査では、高汚染群に自閉症様症状やコミュニケーション発達の遅れを示す児が多いことを報告した。
そこで本研究は、親の要因や環境汚染などにより生じた胎児期の微細脳障害が、生後の脳神経発達過程及び高次脳機能に影響を及ぼすという仮説を検証することを目的とし、胎児脳機能発達の指標として新生児脳波を測定し、そのパラメーターと胎内ダイオキシン暴露の関連性および生後の脳神経発達との関連性について、産科と小児科の連携により追跡的に明らかにする。
５．研 究 計 画
当院産婦人科および富山大学付属病院産婦人科にて出産予定で妊娠経過観察中の女性に研究参加を要請し、承諾の得られた 150 名につき、外来でのインフォームドコンセントを取得した後、本人と夫の社会経済要因や心理状態（EPDS を用いたうつ傾向）、妊娠中の栄養状況
や食行動、既往歴、妊娠出産の経過につき問診し、データベースの作成を行う。また、対象者の出産時に臍帯血血清と臍帯の採取を行い、検体を冷凍保存する。さらに、生後 2-3 日に、新生児の脳波を標準的なモンタージュを用いて双極誘導で記録した。その全記録を動睡眠(AP) と静睡眠 (QS) の二相に分類した後、単極誘導に変換し、MATLAB ソフトウェアにてノイズを除いた後、NUROGUIDE ソフトウェアにて、FFT power や FFT coherence などの脳波パラメータを、各周波数（δ、θ、α、β、high-β、γ、high-γ）毎に算出し、汚染度により比較する。

− 5 −なお、北陸の検体収集に先立ち、すでに収集しているベトナムの検体についても、臍帯血中ダイオキシンとの比較による、母乳中ダイオキシン濃度の胎内暴露指標としての有用性の検討や、ダイオキシン高濃度暴露による脳神経発達障害児の早期発見指標としての社会情動
適応行動問診票の検討を行う。
６．研 究 成 果
1）妊婦の EPDS（エジンバラ産後うつ尺度）は胎児感情評定尺度の拮抗指数と正の相関が認められ、うつ傾向が胎児への思いにも影響を及ぼしていることが推察された。また、EPDS は
妊婦の経済状態（収入）と負の相関、睡眠の点数と正の相関を示しており、経済的ゆとり感がないこと、睡眠の質が良くないことがうつ傾向を増加させていると考えられた。
2）食行動 DEBQ の 3 尺度（抑制的摂食、情動的摂食および外発的摂食）の平均値を比較したところ、満腹まで食べる習慣の「ある」群は「ない」群に比べ外発的摂食の平均値が有意に高かった。また、情動的摂食は非妊時の体重と負の相関、妊娠中の体重増加と正の相関を示し、
外発的摂食は非妊時の身長と負の相関を示した。これらのことから、怒りや不安などの情動の高まりが大きい妊婦ほど体重増加が大きいことが示唆された。
3）金沢医科大学病院産婦人科で分娩に至り、母乳提供の同意を得られた 16 症例（初産 7 症例、
経産 9 症例）を対象とした。１か月検診時に母乳を採取し、ダイオキシン濃度を GC-MS により測定した。その結果を 10 年前に採取され、同様な方法で測定された 39 症例（初産 15症例、経産 24 症例）のダイオキシン濃度と初経産に分けて比較した。その結果、経産婦ではダイオキシン・フラン類の母乳中の濃度は減少しており、全体としては 10 年前と比較し、母乳中の濃度は有意に減少していた。初産婦ではフラン類に関しては有意に減少していたが、ダイオキシンに関しては有意な減少は認められなかった。
4）ベトナム・ビエンホア市に居住する同一の母親の母乳中と臍帯血中のダイオキシン濃度を測定し、母乳中ダイオキシン濃度が臍帯血中ダイオキシン濃度により示される胎児へのダイオ
キシン暴露量を反映していることを明らかにした。特に 4 塩化ダイオキシンは濃度レベルもほぼ等しく、相関性も高かった。このことから、母乳中ダイオキシンは、授乳による乳児のダイオキシン暴露を示しているだけでなく、胎児期のダイオキシン暴露を反映していることが示された。一方、臍帯血中テストステロン値は、母乳中ダイオキシン高値群で低値群と比べ有意に低かった。ゆえに、胎児期のダイオキシン暴露による胎児のテストステロン値の低下が示唆されていると考えられた。なお、臍帯血中エストロゲン値についても同様な検討を行ったが、ダイオキシン暴露と有意な関連性は得られなかった。
5）ベトナム・ダナン市のダイオキシン汚染地域で 2008 年より出生コホートを立ち上げ、発達障
害の発症に関するダイオキシンの影響を研究するのを目的として、追跡調査をすすめている。
このダナン市コホートで、3 歳以降に自閉症傾向が高ダイオキシン暴露群で認められたため、同じ集団の 1 歳時の社会情動発達検査を含むベーリー発達検査とダイオキシン暴露の関連性について遡って検討した。その結果、認知、言語、運動の各指標はダイオキシン暴露と関連性は認められなかったが、高 TCDD 暴露群は社会情動発達尺度の点数が低暴露群に比べ有意に低かった。このことから、１歳という早期にもダイオキシンが自閉症の中核症状である社会情動発達に影響を及ぼしている可能性が示唆された。

− 6 −6）新生児脳波については、2015 年の 8 月にベトナム・ビエンホア市ドンナイ総合病院で出生した新生児 27 名について測定した。次に、その記録を AS と QS の 2 つの睡眠相に分けた後、異なった周波数ごとの（δ、θ、α、β、high-β、γ、high-γ）の左右の FP 電極（前額部誘導）、T 電極（側頭部誘導）、C 電極（頭頂部誘導）、O 電極（後頭部誘導）の FFT Power と、FP 電極間および O 電極（後頭部）間、左右の同側の FP と O 電極（後頭部）の間の FFT Coherenceの分娩方法や在胎週数、児の体格などの産科的基本情報との関連を検討した。最後に、居住地の汚染度による各 FFT Power と FFT Coherence の違いを検討した。その結果、在胎週数は、右側頭部 high-β、右頭頂部β、high-βの FFT Power と有意な正の相関が認められた。また、分娩様式の違いでは、経腟分娩で生まれた新生児の左脳の FFT Power が、帝王切開で生まれた子供に比べ有意に大きく、左前頭部ではδ以外の全ての周波数で、左側頭部と頭頂部ではα、high-γで、左後頭部ではθ、α、γ、high-γで、有意な違い（FFT Power 高値）が認められた。また、対象地域を高汚染地域と中等度汚染地域に分けると、高汚染地域に居住する
母親の出生児の左前頭部のδ、θ、αの FFT Power が有意に低かった。これらのことから、早産傾向や帝王切開などの産科的要因およびダイオキシン高暴露によって、脳の神経活動が低下傾向になる可能性が示唆された。また、FFT Coherence については、在胎週数との関連性は認められなかったが、出生児の体格、特に身長や腹囲と、前頭部と同側後頭部間の Coherenceとの間に正の相関が認められた。特に、左脳の前頭後頭部間と身長との間では、θ以外の周波数で有意な正の相関を認め、身長が高いほど、Coherence も大きかった。しかし、腹囲との正の相関は、左右共に、δ、θ、αで認められた。高汚染地域に居住する母親の出生児では、右前頭部と体側側頭部および対側頭頂部の high-γの FFT Coherence が有意に大きかった。
これらのことから、成長のよい新生児では左脳の神経活動の同期性が良好なのに対し、高度なダイオキシン汚染によって右脳の高周波の左脳との同期性が過剰になる可能性が示唆された。今後は、母乳中ダイオキシンの測定結果と FFT Power および FFT Coherence の相関性を解析していきたい。
７．研究の考察・反省
妊娠中の睡眠の質や食習慣も妊婦のうつ状態と関連があることから、生活習慣から産後うつ予防のためのアプローチも有効である可能性を示すことができた。また、情動によって食行動が変化し、それが体重増加に結びついていることも、今回の調査で明らかとなり、妊産婦の健康管理で重要な体重コントロールについても、心理的な要因を加味した指導も考えられた。しかし、研究参加に同意が得られた症例が少ない上に、データの欠損も認められ、解析対象数が少なかったことが大きな反省点である。
これまでにも、臍帯血と母体血や母乳との比較は行われてきたが、測定感度以下の臍帯血検体が多く、十分な比較ができていない論文も多い。本研究では、母乳と臍帯血をペアで採取し、ペアデータとして比較できた結果、少ない検体数でも有意な結果が得られたと考えられる。しかし、母乳中濃度は TCDD や総ダイオキシン毒性指数では良い指標であるが、フラン類については、臍帯血の濃度の方が高く、母乳を用いた測定では、過少評価になる可能性があることを示唆した。また、臍帯血中テストステロンについてはダイオキシンについては報告がなく、新しい知見となると考えられる。また、臍帯血中テストステロンは、小児期に− 7 −おける男児の女子的な遊びの傾向と関連があることが報告されており、今後の追跡調査が必要である。
自閉症の早期発見において、1 歳半あるいは 2 歳時点のスクリーニングが勧められているが、本研究により、1 歳児においても社会情動発達指標にはダイオキシン暴露による低下が軽度ではあるが認められ、かなり早い時期から自閉症傾向が発現在する可能性が示唆された。
新生児脳波については、調査の進行が遅れ、脳波の解析やダイオキシンの測定も遅れていることが反省点である。
しかし、解析に用いる脳波パラメーターの設定や解析方法も確立し、日本とベトナムでの脳波の測定も終了し、現在追跡調査を行って、6 ヵ月児脳神経発達調査を終了したところである。今後解析を進め、ダイオキシン暴露や母親の要因との関連について検討、発表していく予定である。
８．研 究 発 表
Pham TT, Nishijo M, Nguyen AT, Tran NN, Van Hoang L, Tran AH, Nguyen TV, Nishijo H: Perinatal
dioxin exposure and the neurodevelopment of Vietnamese toddlers at 1 year of age. Sci Total Environ
2015; 536: 575-581.
Abstract: Dioxin concentrations remain elevated in both the environment and in humans residing
near former US Air Force bases in South Vietnam. This may potentially have adverse health effects,
particularly on infant neurodevelopment. We followed 214 infants whose mothers resided in adioxin-contaminated area in Da Nang, Vietnam, from birth until 1 year of age. Perinatal exposure todioxins was estimated from toxic equivalent (TEQ) levels of polychlorinated dibenzodioxins andpolychlorinateddibenzofurans(PCDDs/Fs-TEQ),

and2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(2,3,7,8-TetraCDD) concentrations in breast milk. In infants, daily dioxin intake (DDI) was used as anindex of postnatal exposure through breastfeeding. Neurodevelopment of toddlers was assessed using
the Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Edition (Bayley-III). No significant
differences in neurodevelopmental scores were exhibited for cognitive, language or motor functions
between four exposure groups of PCDDs/Fs-TEQ or 2,3,7,8-TetraCDD. However, social-emotionalscores were decreased in the high PCDDs/Fs-TEQ group and the high 2,3,7,8-TetraCDD groupcompared with those with mild exposure, after adjusting for confounding factors. Cognitive scores in
the mild, moderate, and high DDI groups were significantly higher than those in low DDI group, butthere were no differences in cognitive scores among the three higher DDI groups. These results
suggest that perinatal exposure to dioxins may affect social-emotional development of 1-year-old
toddlers, without diminishing global neurodevelopmental function.

− 8 −１．研究課題名：RNA 結合因子の機能解析と診断マーカー探索（研究番号C2014-3）

２．キーワード：１）Y14
２）脳腫瘍 (brain tumor)
３）イメージング (imaging)４）リン酸化 (phosphorylation)５）中心体 (centrosome)
３．研究代表者：石垣研究分担者：島崎

靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

猛夫・総合医学研究所・准教授・先端医療研究領域

岩淵邦芳・医学部・教授・生化学Ｉ

中田光俊・金沢大学医薬保健研究域医学系・教授・脳・脊髄機能制御学

中沢実・金沢工業大学工学部・教授・情報工学科

４．研 究 目 的RNA 結合因子の中でもエクソンとエクソンのつなぎ目に形成されるエクソンジャンクシ
ョン複合体 (EJC) は、mRNA の分解や輸送に必須のタンパク複合体と考えられてきた。しかし、独自の研究から、本来 RNA の代謝に働く EJC は、同時に細胞分裂装置である中心体へ局在し染色体の正確な分配にも関与することが明らかになってきた。
しかし、EJC 構成因子全てが複合体を形成して中心体へ局在するのか、それとも一部が移動するのか、あるいは mRNA を伴って局在するのか否かといった詳細については未だに明らかにされていない。
また、EJC の一員である Y14 (RBM8A) はリン酸化制御を受けることが報告されてきたが、具体的に細胞内で修飾される部位や、リン酸化の生物学的な意義は明らかにされてきていな
い。
一方、EJC のヒトやマウスにおける変異体が報告されるようになってきたが、いずれも多彩な症状を示すため、個体や分化した細胞での挙動について整合性のとれる説明がなされていない。EJC の各因子が個別に果たす役割が存在するのか、あるいは EJC として働く機能が多様であるのかも明らかにされていない。
本研究では、RNA 結合因子である EJC が、中心体成熟を含めた様々な生命現象に、どのような段階にどんな機序で機能しているのかを分子から個体レベルで明らかにすることを目指した。
また、公共データベースの検索から、脳腫瘍組織において EJC の発現が多数の症例で変動していることを見いだしてきた。これを患者予後と掛け合わせて解析してみると、脳腫瘍組織において EJC 発現が変動していた患者の生存率が有意に上昇していることを突き止めた。
この解析結果に基づき、本申請は単に基礎研究にとどまらず、EJC 発現量の脳腫瘍患者の予後マーカーとしての有用性を検討し、診断あるいは治療に貢献することを目指す。この結果− 9 −を上述の基礎的な知見と合わせて、腫瘍の進展における EJC の新しい役割を提案していきたい。
５．研 究 計 画
(1)ノックダウンやゲノム編集などを利用した遺伝子改変技術による EJC 各因子の欠損細胞を構築し、Y14 以外の EJC 因子の中心体制御への関与を明らかにする。(2)イメージング技術を改良して各因子の局在を明らかにし超微細構造中の局在を解き明かす。(3)データベースを活用した解析から、ヒト組織を検索し新しい癌の診断マーカーを提供する。EJC の発現量が脳腫瘍の予後に影響することが分かっても、脳腫瘍患者で何故予後に影響するのかを説明できるモデルがなければ診断から治療につながる発見には至らない。このため、培養細胞系を利用した解析結果から、臨床で得られたヒト腫瘍での発現量変動と患者予後との関連を分子レベルで説明できるモデルを提案する予定である。
６．研 究 成 果
EJC のリン酸化変異体作製については、研究成果の論文中に記載したようにリン酸化部位の変異体を多数作製して解析を行ってきた。方法としては、タンパク質がリン酸化を受けると泳動度が極端に遅くなる PhosTag ゲルを利用してリン酸化の検出を行った。従来のアイソ
トープの取り込みを利用した解析手法と比較しても、簡便であり、なおかつ修飾を受けたタ
ンパク質の割合をウエスタンブロットで検出できる点でも優れた手法であった。その結果、細胞内においては RBM8A 分子の大部分がリン酸化修飾を受けていること、リン酸化部位は166 および 168 番目のセリンであること、
166 のリン酸化には 168 のリン酸化が必要であること等が明らかになった。さらに、試験管内リン酸化系を構築し、結合因子の Magoh がリン酸化に阻害的に働くことを明らかにしてきた。以上の実験結果は、RBM8A はタンパク質として合成された直後にリン酸化修飾を受け、その後 Magoh と複合体を形成して核内へ移行することを示唆すると考えられる。さらに、リン酸化を受けるセリンをアラニンに変えた変異体を細胞内に発現させて局在を観察したところ、中心体への局在が観察されたことから、リン酸化は中心体局在のシグナルとはならないことが示唆された。この過程で、これまで細胞質にのみ存在すると言われてきた Upf2 が、核内にも存在することが示唆されてきた。この結果は、EJC と、その結合因子が従来のモデルとは異なるスキームで相互作用しうることを示
唆する。
さらに、ゲノム編集技術を利用して EJC 変異体作製を試みた。siRNA によるノックダウン
実験から、EJC 構成因子の中で、EJC の形成には必要であるが欠損が細胞致死に結びつかない因子についてゲノム編集による遺伝子破壊を試みた。ゲノム編集は標的遺伝子の DNA に
ランダムに変異を入れて破壊する手法であり、ヌルアレルを作製できれば RNAi とは違って完全に発現を欠損した細胞を得ることが可能である。方法としては Crispr/Cas9 誘導型のプラ
スミドベクターを利用し、エクソン内に存在する PAM 配列を指標としてガイド RNA を設定した。このプラスミドベクターを細胞内に一過性に導入した後、常法に従って DNA を抽出− 10 −

して標的配列を PCR により増幅した。PCR 産物についてサーベイヤーアッセイを行ったと
ころ複数の変異配列が検出された。限界希釈法によりクローン化した細胞について、PCR 産物のシーケンスを行ったところ、多数の欠失が片側または両側アレルに観察された。作製できたノックアウト細胞を解析した結果、EJC のコアとなるタンパク質群は中心体へ局在する
ものの、その相互作用や細胞増殖への寄与はばらばらであり、複雑な関係を持つことが明らかとなった（投稿中）。
さらに EJC を欠損したヒトにおいては、精神発達遅延、橈骨血小板減少症など多彩な病態が知られている。このため、EJC 因子を欠損したマウス個体を作製して、新しい病態モデルを確立することことを試みた。標的遺伝子の両末端を標的とする Crispr/Cas9 系ベクターを構築し受精卵へ導入後仮親子宮へ戻した。その導入の結果、変異を有する１個体を得ることができた。また、患者由来細胞が入手できないこともあり、株化細胞において患者と同様の変異を導入中である。片側アレルは欠失であるが、反対側アレルは SNP であるため、ゲノム編集によりオリゴ DNA との組換えを行って変異体を構築していく予定である。
脳腫瘍における EJC 遺伝子の発現をデータベース中で検索した結果、４つの因子が予後マーカーの候補遺伝子として残ってきた。これらの因子について抗体を購入あるいは作製して性格付けを行ってきた。また、各因子の mRNA 量を定量できるリアルタイム PCR プライマーの作製を終えた。現在は臨床検体を活用し、リアルタイム PCR および免疫染色による発現量の変動と予後との相関を解析中であり、新しい予後診断マーカーの確立を目指している。
また、電子顕微鏡による EJC 因子の細胞内局在も行っているが、免疫電顕法における画像解析の自動化を試みている。具体的には免疫電顕像をソフトウエア上に取り込み、余分なノイズをフィルタリングしてシグナルを鮮明化し、数値化処理を行うことでシグナルの集積や局在を定量化できる手法の開発を行っている。現在さまざまなフィルタリングの手法を試みた上で、シグナルの数値化処理プロトコールを検討している。
７．研究の考察・反省
中心体局在のメカニズムについては、中心体へ局在するキナーゼとの近接を Duo-link 法によって示すことができたが、このキナーゼが Y14 のリン酸化を行っているのかは明らかにしていない。Y14 の大部分がリン酸化されていることは予想外の実験結果であり、その制御については未だに明らかにすることができないでいる。特にキナーゼの特定については様々な実験手法を用いた解析を行ってきたが、おそらくは複数のキナーゼが互いに補填し合いながら Y14 をリン酸化してしまう仕組みが存在し、同定を阻んでいる。今後はリン酸化の意義をさらに解明していくとともに、キナーゼ群の特定を行っていきたい。
８．研 究 発 表
① Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Ma S, Tomosugi N. Phosphorylation status of humanRNA-binding protein 8A in cells and its inhibitory regulation by Magoh. Exp Biol Med (Maywood)
2015; 240: 438-445.

− 11 −

Abstract: The RNA-binding protein 8A (RBM8A)-mago-nashi homolog, proliferation-associated(Magoh) complex is a component of the exon junction complex (EJC) required for mRNA
metabolism involving nonsense-mediated mRNA decay (NMD). RBM8A is a phosphorylated proteinthat plays some roles in NMD. However, the detailed status and mechanism of the phosphorylation of
RBM8A is not completely understood. Therefore, in this study, we analyzed in detail RBM8A
phosphorylation in human cells. Accordingly, analysis of the phosphorylation status of RBM8A
protein in whole-cell lysates by using Phos-tag gels revealed that the majority of endogenous RBM8A
was phosphorylated throughout the cell-cycle progression. Nuclear and cytoplasmic RBM8A andRBM8A in the EJC were also found to be mostly phosphorylated. We also screened thephosphorylated serine by mutational analysis using Phos-tag gels to reveal modifications of serine
residues 166 and 168. A single substitution at position 168 that concomitantly abolished thephosphorylation of serine 166 suggested the priority of kinase reaction between these sites.
Furthermore, analysis of the role of the binding protein Magoh in RBM8A phosphorylation revealed
its inhibitory effect in vitro and in vivo. Thus, we conclude that almost all synthesized RBM8A
proteins are rapidly phosphorylated in cells and that phosphorylation occurs before the complex
formation with Magoh.
② Tatsuno T, Nakamura Y, Ma S, Tomosugi N, Ishigaki Y. Nonsense-mediated mRNA decay factor
Upf2 exists in both the nucleoplasm and the cytoplasm. Mol Med Rep 2016; 14: 655-660.
Abstract: Upf2 protein predominantly localizes to the cytoplasmic fraction, and binds to the exon
junction complex (EJC) on spliced mRNA. The present study aimed to determine the cellular sitewhere the interaction between Upf2 and EJC occurs. First, the cell lysate was fractionated into thecytoplasm and nucleoplasm, and western blotting to detect levels of Upf2 protein was performed.
Upf2 was clearly detected in the cytoplasm and in the nucleoplasm. Secondly, immunostaining was
performed, and the majority of Upf2 was detected in the cytoplasmic perinuclear region; a small
quantity of Upf2 was detected in the intranuclear region. RNase treatment of the cells reduced theUpf2 immunostained signal. The immunopurified fractions containing nuclear and cytoplasmic Upf2
also contained one of the EJC core factors, RBM8A. These results implied the existence of Upf2 in
the nucleoplasm and the cytoplasm, and it appeared to be involved in the construction of the mRNA
complex. In order to verify the construction of Upf2‑ binding EJC in the nucleoplasm, an in situ
proximity ligation assay was performed with anti‑ Upf2 and anti‑ RBM8A antibodies. These
results demonstrated that their interaction occurred not only in the cytoplasmic region, but also in theintranuclear region. Taken together, these results suggested that Upf2 combines with EJC in both thecytoplasmic and the intranuclear fractions, and that it is involved in mRNA metabolism in humancells.

− 12 −

１．研究課題名：オートファジーを標的とした糖尿病合併症の病態解析（研究番号 C2014-4）
２．キーワード：１）オートファジー (autophagy)
２）糖尿病 (diabetes)
３）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)４）たんぱく質制限 (protein intake restriction)
３．研究代表者：古家大祐・医学部・教授・糖尿病・内分泌内科学

研究分担者：金﨑啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

北田宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

中村二郎・愛知医科大学・医学部・教神谷

英紀・愛知医科大学・医学部・准教授・内科学講座糖尿病内科

授・内科学講座糖尿病内科

４．研 究 目 的
生体は様々な栄養応答シグナルによって恒常性を維持しているが、加齢および肥満によるその破綻は肝臓や脂肪細胞の慢性炎症とインスリン抵抗性を惹起する。その結果、加齢に伴い著増するメタボリックシンドロームや糖尿病に代表される代謝障害と様々な動脈硬化性疾患を併発して、個々の QOL を損なうとともに生命予後も悪化する。今回、栄養応答シグナ
ルの破綻によるオートファジー機構の制御不全がこれらの健康障害を引き起こすと仮説し、検討を行う。本研究では、飽食の時代にある今、栄養シグナルの破綻を介する代謝疾患の分子基盤を解明するとともに、その対策を目指す。
５．研 究 計 画
24 週齢の肥満 2 型糖尿病ラット (Wistar Fatty rat) に、通常食 (Protein 23.84%, Lipid 16.8%,
Carbohydrate 59.36%, Energy 3.55kcal/g; STD)、低たんぱく質食 (Protein 5.77%, Lipid 16.48%,
Carbohydrate 77.75%, Energy 3.54kcal/g; LPD) にて 20 週間介入して、代謝検査（HbA1c、イン
スリン値、シスタチン C）、組織検査（Masson-Trichrome 染色、PAS 染色、Kim-1 免疫染色、
電子顕微鏡検査、CD68 免疫染色）と、栄養応答シグナル（mTOR 経路：p-S6RP 免疫染色、
オートファジー関連：p62 免疫染色）、アポトーシス関連：cleaved caspase3 を検討した。一部のラットには、30％カロリー制限を行い組織検査を行った。さらに、LC3-GFP トランスジェ
ニックマウスを用い、オートファジーの可視化した。
６．研 究 成 果
体重、脂肪重量、腎重量、平均血圧：糖尿病ラット (DM)-STD 群では、非糖尿病コントロールラット (CONT) と比べ体重 (CONT:DM-STD=537.7±32.3g:816.5±66.1g, n=7-9, p<0.001)、
脂肪重量 (CONT:DM-STD=25.0±5.1:132.5±14.9g, n=7-9, p<0.001)、腎重量 (CONT:DM-STD=
2.96±0.18:4.00±0.31g, n=7-9, p<0.001) の 増 大 を 認 め た が 、 DM-LPD 群 で は 体 重− 13 −

(DM:DM+LPD=816.5±66.1:724.5±57.0g,

n=7-9,

p<0.05) 、 脂 肪 重 量 (DM:DM+LPD=

132.5±14.9:105.2±11.8g, p<0.01)、腎重量 (DM:DM+LPD=4.00±0.31:2.16±0.18g, n=7-9, p<0.01)
ともに有意に減少した。平均血圧は 4 群間において差はなかった。摂食量は自由摂食下で、DM 群に比べ DM+LPD 群では食事介入実験期間中、平均 15.5%減少していた。
糖・脂質関連検査：DM-STD 群において CONT に比べ上昇した HbA1C 値 (CONT:DM-STD=
3.35±0.37:6.01±0.49%, p<0.001)、CHO 値 (CONT:DM-STD=92.±25.2:170.7±47.8mg/dl, p<0.05)
は LPD 群で有意に低下 (HbA1c DM:DM+LPD=6.0±0.49:4.79±0.55%, p<0.05) (CHO DM:DM+
LPD=170.7±47.8:87.4±36.2mg/dl, p<0.05) したが、ITT、GTT、IRI 値、TG 値、FFA 値は両群間で有意な差はなかった。
腎機能関連検査：食事介入開始時の UAlb/Cr 比および ULFAB/Cr は、それぞれ CONT 群
20.1±26.2μg/gCr(UAlb/Cr), 6.7±3.3μg/gCr(ULFAB/Cr) に対して、DM-STD 群 1048.4±1432.5μg/gCr,
p<0.05(UAlb/Cr), 44.8±24.4μg/gCr, p<0.001(ULFAB) と有意に増加していた。介入 20 週後におい て は 、 CONT 群 に 比 べ DM-STZ 群 で は UAlb/Cr 比 (CONT:DM-STD=1023.2±1151.0:
12172.8±8557.3μg/gCr, p<0.001) ULFAB/Cr 比 (CONT:DM-STD=6.17±4.74:135.39±183.0μg/gCr,
p<0.05)、血漿シスタチン C 値 (CONT:DM-STD=0.78±0.46:1.73±0.43mg/l, p<0.001) の有意な増加を示した。DM-LPD 群では DM-STD 群と比べ UAlb (DM-STD：DM+LPD 12172.8±8557.3：
921.4±904.8μg/gCr, n=7-9, p<0.001)・ULFAB (DM-STD：DM+LPD 135.4±183.0：6.44±7.58μg/gCr,
n=7-9, p<0.05)・シスタチン C 値 (DM-STD：DM+LPD 1.73±0.43：1.01±0.43mg/l, n=7-9, p<0.05)の有意な低下を認めた。
腎組織の線維化、尿細管障害：マッソン/トリ
クローム染色による尿細管間質および糸球体の線維化は、CONT に比して DM-STD 群においては著明に尿細管間質および糸球体の線維化は改善した（図 1）。また DM-STD 群で増加した腎皮質 3 型コラーゲンの mRNA 発現も同様に

図 1．マッソン/トリクローム染色による
尿細管間質および糸球体の線維化

DM-LPD 群で低下した。尿細管障害スコア、
Kim-1 免疫組織染色強度、腎皮質 Kim-1mRNA 発現はいずれも DM-STD 群では CONT と比較して増加し、DM-LPD 群で低下した。
炎症性変異：CD68 免疫組織染色強度、腎皮質 CD68、MCP-1、IL-6、TNF-a、TLR2 mRNA
発現は CONT に比べて DM-STD 群で有意に増加し、DM-LPD 群で改善を認めた。ミトコンド
リア形態的変異、アポトーシス：DM-STD 群で

図 2．ミトコンドリア形態異常は LPD にて改善した

は、近位尿細管細胞におけるミトコンドリアの断片化および膨化の増加、腎皮質における cleaved caspase3 発現の増加（アポトーシスの増加）を認めたが、DM-LPD 群で改善した（図 2）。
オートファジー、mTOR シグナルの変異：DM-STD 群では、CONT 群に比し、p62・p-S6RP− 14 −

免疫染色強度の増強を認めるが、DM-LPD 群にて改善した。
DM 群にて増加する腎皮質 p-S6RP発現の増加は、STD→LPD に飼料をスイッチ 2 週間後で減少したが、DM-STD 群と DM-LPD
群間で p-Akt 発現に差はなかった。以上より、2 型糖尿病ラットの尿細管細胞では、mTORC1の活性化を介したオートファジー機構の低下と、それに起因するミトコンドリア障害・酸化ストレス・炎症・アポトーシスの増加が生じているが、低たんぱく質食は、mTORC1 の低下とオートファジー機構の回復を誘導することで、障害を受けたミトコンドリアの除去と細胞機能の恒常性を維持し、2 型糖尿病による腎機能障害を改善した。
７．研究の考察・反省本研究では、哺乳類で確認されているオートファジーの糖尿病の各臓器における役割を解明するとともにその対策を目指した。腎臓および肝臓でも糖尿病におけるオートファジーの破綻が、糖尿病腎症を進展させる、非アルコール性脂肪肝炎を惹起することを報告できた。
さらに、低たんぱく質およびケト原性アミノ酸介入によって、それぞれの臓器におけるオー
トファジー機構の破綻の改善が有効な治療手段であることも報告できた。しかし、当初に予定していた脳臓器特異的オートファジーマウスの作成による、オートファジー機構の生理学的意義の検証には至らなかった。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Ogura Y, Suzuki T, Sen S, Lee SM, Kanasaki K, Kume S, Koya D. A very-low-protein dietameliorates advanced diabetic nephropathy through autophagy induction by suppression of themTORC1 pathway in Wistar fatty rats, an animal model of type 2 diabetes and obesity. Diabetologia
2016; 59: 1307-1317.
Abstract: AIMS/HYPOTHESIS: The efficacy of a low-protein diet (LPD) on diabetic nephropathy
is controversial. We aimed to investigate the renoprotective effects of an LPD and the underlying
molecular mechanism in a rat model of type 2 diabetes and obesity.
METHODS: Diabetic male Wistar fatty (fa/fa) rats (WFRs) were treated with a standard diet(23.84% protein) or an LPD (5.77% protein) for 20 weeks from 24 weeks of age. We investigated theeffect of the LPD on renal function, fibrosis, tubular cell damage, inflammation, mitochondrial
morphology of proximal tubular cells (PTCs), apoptosis, autophagy and activation of mammaliantarget of rapamycin complex 1 (mTORC1).
RESULTS: Kidney weight, albuminuria, excretion of urinary liver-type fatty acid binding protein,levels of plasma cystatin C and changes in renal histology, including fibrosis, tubular cell damage andinflammation, were aggravated in WFRs compared with non-diabetic Wistar lean rats (WLRs).
Fragmented and swelling mitochondria accumulated in PTCs and apoptosis were enhanced in thekidney of WFRs. Immunohistochemical staining of p62 and p-S6 ribosomal protein (p-S6RP) in the
tubular lesions of WFRs was increased compared with WLRs. The LPD intervention clearlyameliorated damage as shown by the assessment of renal function and histology, particularly− 15 −

tubulointerstitial damage in diabetic kidneys. Additionally, the 5.77% LPD, but not the 11.46% LPD,
significantly suppressed p-S6RP levels and increased microtubule-associated protein light chain 3-IIlevels in the renal cortex. The LPD intervention partially decreased HbA1c levels in WFRs, and nodifferences in mean BP were observed among any of the groups.
CONCLUSIONS/INTERPRETATION: A very-low-protein diet improved advanced diabetic renal
injuries, including tubulointerstitial damage, by restoring autophagy through the suppression of themTORC1 pathway.
② Nitta K, Shi S, Nagai T, Kanasaki M, Kitada M, Srivastava SP, Haneda M, Kanasaki K, Koya D. Oral
Administration of N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline Ameliorates Kidney Disease in Both Type 1
and Type 2 Diabetic Mice via a Therapeutic Regimen. Biomed Res Int 2016; 2016: 9172157.
Abstract: Kidney fibrosis is the final common pathway of progressive kidney diseases including
diabetic

nephropathy.

Here,

we

reportthat

theendogenous

antifibrotic

peptideN-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP), the substrate of angiotensin-converting enzyme(ACE), is an orally available peptide drug used to cure kidney fibrosis in diabetic mice. We utilized
two mouse models of diabetic nephropathy, streptozotocin- (STZ-) induced type 1 diabetic CD-1 miceand type 2 diabetic nephropathy model db/db mice. Intervention with the ACE inhibitor imidapril,oral AcSDKP, or imidapril + oral AcSDKP combination therapy increased urine AcSDKP levels.
AcSDKP levels were significantly higher in the combination group compared to those of the othergroups. AcSDKP oral administration, either AcSDKP alone or in addition to imidapril, ameliorated
glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis. Plasma cystatin C levels were higher in both models,at euthanasia, and were restored by all the treatment groups. The levels of antifibrotic miRs, such as
miR-29 or let-7, were suppressed in the kidneys of both models; all treatments, especially the
combination of imidapril + oral AcSDKP, restored the antifibrotic miR levels to a normal value oreven higher. AcSDKP may be an oral antifibrotic peptide drug that would be relevant to combating
fibroproliferative kidney diseases such as diabetic nephropathy.

− 16 −

１．研究課題名：助産師教育における実習の安全管理に関する教育モデルの構築と検証：教育モ
デル枠組みの検討（研究番号 C2014-5）
２．キーワード：１）助産師教育 (midwifery education)２）安全管理 (safety management)
３）助産実習 (clinical practice)４）教育モデル (educational model)
５）助産学生 (midwifery students)
３．研究代表者：岩谷久美子・看護学部・講師・母性看護学・助産学
研究分担者：島田啓子・金沢大学医薬保健研究域保健学系・教授・看護科学領域健康発達看護学講座

４．研 究 目 的
助産師教育における実習の安全管理に関する教授活動と安全管理教育に必要な内容を把握し、教育モデル枠組みを検討する。
５．研 究 計 画
1）助産実習の安全管理教育に必要な内容と教授活動および課題の明確化（研究代表者：研究総括、研究分担者：結果解析）(1) 研究デザイン：質的記述的研究、因子探索研究。
(2) 調査対象：北陸地方を中心に助産師教育機関（大学・大学専攻科・短大専攻科・大学院・大学院・専門学校）の教員 10 名であった。
(3) データ収集：半構造化面接調査で、助産実習中の安全管理教育内容や必要な安全管理教育と教授活動および課題について面接した。
(4) データ分析：内容分析法を用いた。分析の確証性を得るために、助産学教育の専門家にスーパーバイズを受けた。
(5) 倫理的配慮：研究実施にあたり倫理審査を受けた。（金沢医科大学：No.204）
・実施する前に、研究の概要と目的を説明し、研究への参加は自由意思であり、拒否、中断の自由、それによる不利益がないことを説明し、同意署名を得た。
・データの集計・分析は、個人が特定されないようにコード化して情報を取り扱った。
・研究等の実施期間終了後はすみやかにデータ消去、もしくは紙の場合はシュレッダーで破棄することを伝えた。
・本研究は学内以外の学会等で発表する可能性があることを説明した。
・得られた結果については本研究目的以外では使用しないことを説明した。
・起こりうる危険や不利益などについて配慮した。
2）助産実習の安全管理に関する教育モデル（案）の検討（研究代表者及び研究分担者）
上記 1) の結果を参考に、安全管理能力育成に向けた教育モデルを作成した。作成には助− 17 −

産師教育に関する有識者から助言を受けた。
６．研 究 成 果
1）助産実習中の実際の安全管理教育内容や必要な安全管理教育と教授活動および課題を抽出した。
(1) 助産学実習の安全管理に関する教授活動は、「安全の視点から実習前学習を支援する」「未
然に事故を防ぐため、指導者と共に周到に用意する」「助産ケアに対する学生の力量を見極める」「周産期で起りうる事故を予測でき対策がとれるように指導する」「施設における医療安全管理体制について説明する」「感染防止対策について指導する」「災害時の対応について説明する」「安全なケアをチームとして行動できるように支援する」「学生の体調を観察する」「専門的自律能力を育てる」の 10 カテゴリーが抽出できた。
(2) 安全管理に関する助産実習教育の課題は、「学内の安全管理教育の不統一」「教員個々の力量による安全管理指導の差」「分娩に伴う実習形態の多様性による指導の困難さ」「実習施設による安全管理体制の相違」「学生の特性による安全管理教育の困難さ」があげられた。
2）1）の結果をふまえ、助産実習の安全管理能力育成に向けた教育モデル（案）は、助産師養成
校も実習施設も多様性があること、安全管理には、学生自身の安全と母子の安全、施設の安全保障があること等から、学士課程の助産学生で母子の安全に焦点を絞り、助産学生の分娩介助実習における安全管理能力に関する教育モデル（案）とした。作成した教育モデル（案）の構成内容は、次に示す(1)～(4)とした。
(1) 助産学生は、看護基礎教育を基盤に安全管理能力はさらに強化されるとした。
(2) モデルの横軸は、学生の保助看養成指定規則を満たす分娩介助例数の進行を示した。
(3) モデルの縦軸は、安全管理能力の修得レベルを示した。
(4) 学生の卒業時の安全管理目標を“分娩介助において母子安全なケアが提供できる”として４つの目標 (Course Outcomes) を立案し、その際のリクス例を提示した。Course Outcomesがらせん状に、経験を積みながら向上していくことを示した。
７．研究の考察・反省
助産学実習の分娩介助に関する安全管理の教授活動 10 カテゴリーと助産実習教育の課題 5
カテゴリーが明らかになった。安全管理教育の強化の必要性と、その方法として、学内演習
では、実習環境と類似した臨場感のある演習方法や教材選択の工夫等が必要であった。また、各教育施設によって、安全管理教育内容に違いがみられ、教員個々の力量による指導の差があるという意見等があった。個々の教育施設によって安全管理教育内容に違いがみられたことは、学生が卒業時に備わっているべき安全管理に関する看護実践能力にも違いが生じると予想される。故に、助産学生が卒業時に到達すべき安全管理能力について明らかにする必要性が示唆された。
以上の質的調査結果を考慮し、構成要素を検討した上で教育モデルを作成した。今後の課
題は、作成した助産学生の分娩介助実習における安全管理能力に関する教育モデルを検証す− 18 −

ることである。
８．研 究 発 表
① Iwatani K, Yamazaki C, Tamura K, Shimada K: Teaching activities for safety management in
midwifery training, 11th The ICM Asia Pacific Regional Conference, (Yokohama, ’15.07), The ICM
Asia Pacific Regional Conference 2015 program & abstract book, 322, 2015.
② Iwatani K, Yoshida S, Kanamori K, Yamazaki C, Izuhara

M, Shimada K: Challenges of safety

management guidance as part of skilled birth attendance training, 19th East Asian Forum of Nursing
Scholars, (Chiba, ’16.03), 19th EAFONS_East Asian Forum of Nursing Scholars, 50, 2016.
③ Iwatani K, Shimada K: Content validity and utility of a proposed safety management education model
for birth assistance in midwifery clinical practice. J Tsuruma Health Sci Soc, Kanazawa University
2015; 39: 13-24.
Abstract: Purpose: This study was performed to develop an educational model of safety
management in midwifery clinical practice for midwifery students and to examine the content validity
and utility of this model.
Methods: A provisional four-step educational model was developed for teaching safety management
skills in birth assistance. First, semi-structured interviews were conducted with birth assistanceeducators, and elements that they deemed necessary for safety management education were extracted(Step 1). Following Bloomʼs theory of education, Step 2 served to develop an education model
proposal based on the ndings obtained in Step 1. In Step 3, 102 birth assistance educators completed
a paper survey to evaluate the proposed modelʼs content validity based on a four-point Likert scale toevaluate how well they understood the proposed model. Finally, in Step 4, the proposed model was
revised to develop educational model version 1 based on the suggested revisions from survey
responses. The content validity and utility of this educational model version 1 were examined by 10
educators, including ve new birth assistance educators who replaced ve of the originally surveyed
educators.
Results: The proposed educational model was composed of six extracted categories. Four categories,“Objectives of safety management education,” “Midwife ethics,” “Appropriate reporting,communication, and consultation,” and “Infection prevention,” were set as course outcomes, while
the remaining two categories, “Experiences of birth assistance” and “Safety knowledge andtechniques,” were expressed on a horizontal axis representing ve stages of learning and a verticalaxis representing the level of growth, respectively. Of the 102 participants that provided valid
responses, 88 (86%) “Agreed (including partial revisions)” with the proposed model. Safety
management education abilities were clearly dened with reference to opinions on the need for more
concrete descriptions of safety management abilities in the proposed model. Furthermore, in responseto requests for description of the relationship of safety management with experiences of birthassistance and the sequence of learning in experiences of birth assistance, six stages were added to the− 19 −

axis ranging from understanding of labor and delivery to autonomy. Educational model version 1 waspresented with the level of growth on the vertical axis designated as the level of achievement of safety
management abilities and representing the interaction of the three domains in Bloomʼs taxonomy ofeducational objectives, and the four course outcomes shown as a curve on the axis. All 10 respondents
agreed that model version 1 had content validity and was “applicable” in practice.
Conclusion: The results suggested the validity of the content and utility of the proposed safety
management education model for birth assistance in midwifery clinical practice.

− 20 −

平成 2６年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2014-1～15

１．研究課題名：樹状細胞内におけるオステオポンチンとガレクチン９によるシグナル伝達の制
御と自己免疫疾患増悪機構の解明（研究番号S2014-1）

２．キーワード：１）ガレクチン 9 (galectin-9, Gal-9)２）オステオポンチン (osteopontin, OPN)
３）MHV-68
４）I 型インターフェロン (type I interferon)５）インターロイキン 27 (interleukin-27, IL-27)
３．研究者氏名：有川智博・一般教育機構・講師・生物学

４．研 究 目 的
自己免疫疾患の発症には、自己抗原に対する炎症の持続が必須であり、樹状細胞が誘導す
る IL-17 産生ヘルパーT 細胞（Th17 細胞）がその発症及び持続に寄与することが明らかにされた。炎症の持続には様々な要因が想定されるが、ウイルスの持続感染もその一つであると考えられている。近年、I 型インターフェロンシグナルで発現誘導されたオステオポンチン(OPN) がインターロイキン 27 (IL-27) を抑制し、Th17 細胞分化を誘導する経路が明らかにされた。しかしながら、自己免疫疾患発症や増悪に関する各段階には不明な点が多く残されている。本研究では、IL-27 及び Galectin-9 (Gal-9) に注目し、樹状細胞による I 型インターフ
ェロン受容メカニズム並びにウイルス持続感染による自己免疫疾患発症機序解明を目的とした分子基盤の構築を目指す。
５．研 究 計 画
樹状細胞は抗原提示細胞として獲得免疫の中心をなす細胞群の一つであり、OPN はこの樹状細胞から分泌され、T 細胞分化誘導能を有することが明らかにされている (Fig.1)。さらに自己免疫疾患と関連の深い I 型ヘルパーT 細胞 (Th1) には可溶
性 OPN (sOPN) による正のフィードバック機構が存在する。遺伝子欠損マウスなどの知見から、I型インターフェロンシグナルの下流において細胞内 OPN (intracellular OPN, iOPN) が IL-27 生成を阻害することにより、Th17 細胞分化を抑制することが示された (Fig.1)。一方で、I 型インターフェロンはウイルスに対する感染防御にも重要な物質であることが知られているが、そのシグナルの下流シグナルは不明な点が多く、未だ詳細な分子メカニズムは明らかにされていない。そこで本研究ではこの分子メカニズム解明の基盤構築を、ヘルペスウイルス肺感染マウスモデルを用いた解析を中心に行う。樹状細胞に発現する細胞内 OPN に注目しその発現メカニズム（分子、シグナル経路）について解− 21 −

析を行う。同時に機能的類似点の多い Gal-9 とのクロストークを含めた細胞内シグナル経路を明らかにする。
６．研 究 成 果
本研究単年度では、IL-27p28、EBI3、IL-27 及び Gal-9 遺伝子欠損マウスを用いて MHV68
ウイルス肺感染マウスモデル解析を行った。主な成果は以下の通りである。
①

マウス肺における MHV-68 感染時における Chemokine 産生への IL-27 (p28) の影響を解析したところ、MHV68 はおもに上皮細胞及び肺胞マクロファージに感染し、IL-27 産生はおもに樹状細胞及び間質マクロファージ (Mφ) に見られることが分かった。
MHV68 感染により肺上皮細胞は I 型 IFN を産生し、その結果、IFNβ は Mφ における p28②発現を誘導することがわかった。
一方、MHV-68 感染時に II 型肺胞上皮細胞での Gal-9 発現が観察された。そこで Gal-9③欠損マウスを用いて解析を行ったところ、野生型と比して炎症抵抗性を示した。
７．研究の考察・反省
in vivo ウイルス感染モデルの解析結果から、単年度の成果として IL-27p28、EBI3、IL-27
及び Gal-9 遺伝子欠損マウスの MHV68 ウイルス肺感染マウスモデルにおける表現型を明らかにすることができた。ただ、今回は in vivo 表現型比較に留まったため、今後はその分子メカニズムに迫るべく、さらに in vitro 系での解析を進める。また、申請者は近年米国 Duke 大
学との共同研究により、CD40 シグナルが iOPN と IRAK-1 を経由するシグナルを活性化し、IL-10 発現を誘導することを明らかにした (PNAS, 2014)。これらの結果も合わせ、今後は OPNと Gal-9 を軸とする樹状細胞機能の制御機序を解析し、自己免疫疾患発症機序の解明を継続して行う。上記ウイルス感染モデルや in vitro 系での解析結果については今後学会、論文発表を行う予定である。
８．研 究 発 表なし（論文投稿準備中）− 22 −

１．研究課題名：肥満モデル動物の自律神経系に及ぼす nesfatin-1 の役割（研究番号 S2014-2）
２．キーワード：１）自律神経 (autonomic nerve)２）肥満 (obesity)
３）高脂肪食 (high fat diet)４）神経ペプチド (neural peptide)５）代謝 (metabolism)
３．研究者氏名：谷田守・医学部・准教授・生理学Ⅱ

４．研 究 目 的
我々は、これまで動物の自律神経系を基盤にしたホメオスタシス調節の意義について研究を行ってきた。近年、摂食調節物質が末梢組織や脳で同定されており、最近では脳・視床下部で産生され摂食を抑える nesfatin-1 が発見された。Nesatin-1 は交感神経系を活性化させることは分かっているが、肥満動物に対しても同様に摂食抑制や交感神経活性化作用があるか否かについてはよくわかっていない。そこで、本研究では摂食抑制の神経ペプチドである
nesfatin-1 が肥満モデル動物の自律神経系や摂食調節系に作用するか否か検討して、肥満と自律神経系調節における nesfatin-1 の役割を解析することを目的とした。
５．研 究 計 画
【肥満モデルラットの作製】
Wistar 系雄ラットに高脂肪食（60％脂肪、HFD60、オリエンタル酵母工業）を 8 週間自由摂取させた高脂肪食ラットを作製した。また、レプチン受容体突然変異モデルラットである
Obese Zucker 雄ラット（三協ラボラトリー）についても解析を行った。
【電気生理実験】
高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラットを用いて、ウレタン・クラロース麻酔下で脂質代謝に関与する白色脂肪交感神経活動を計測した。nesfatin-1 の第三脳室内投与効果についてコントロールラット（Wister 系雄ラット）の nesfatin-1 投与反応と比較検討した。
【生化学実験】
12 時間絶食させたラット（コントロールラット、高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラット）
を用いて、nesfatin-1 の第三脳室内投与後 30 分で脳・視床下部をサンプリングして視床下部
MAP キナーゼ（ERK1/2 リン酸化レベル）を定量した。
【摂食実験】
12 時間絶食させたラット（コントロールラット、高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラット）
を用いて、nesfatin-1 の第三脳室内投与後 4 時間、12 時間で摂食量を測定した。

− 23 −

６．研 究 成 果【電気生理実験】
コントロールラットと同様に、高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラットでは、nesfatin-1 を第三脳室内に投与すると、白色脂肪組織の交感神経活動が増大した。また vehicle 投与では、いずれのラットの神経活動においても明らかな変化は観察されなかった。
【生化学実験】
コントロールラットと同様に、高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラットでは、nesfatin-1 を第三脳室内に投与すると、視床下部での ERK1/2 リン酸化レベルが増大した。
【摂食実験】
コントロールラットと同様に、高脂肪食ラット及び Obese Zucker ラットでは、nesfatin-1 を第三脳室内に投与すると、投与後 4 時間で有意に摂食量が減少したが、投与後 12 時間では
vehicle 投与と変化が観察されなかった。
７．研究の考察・反省本研究では、摂食抑制ペプチドである nesfatin-1 による自律神経及び摂食調節作用が肥満動物に対して有効か否か検討することを目的とした。その結果、nesfatin-1 は肥満モデルラットである高脂肪食ラットとレプチン受容体変異ラットの交感神経活性化及び摂食抑制を引き起こした。従って、nesfatin-1 はレプチン受容体を介さないで肥満抑制効果をもつことが明らかになった。
また本研究では、nesfatin-1 が脳・視床下部 MAP キナーゼを活性化させるので、高脂肪食
ラットとレプチン受容体変異ラットにおいてもこの作用を検討した結果、いずれの肥満ラットにおいても nesfatin-1 投与によって視床下部 MAP キナーゼが活性化された。このことは、肥満動物で nesfatin-1 による肥満抑制作用は、脳・視床下部を介していることを示唆している。
本研究では、急性実験で nesfatin-1 の効果を検討したが、創薬への応用について検討する
為には、慢性実験で nesfatin-1 の有効性を肥満動物で検討する必要がある。特に、nesfatin-1は急性投与で血圧上昇を引き起こすことがわかっている為、nesfatin-1 を慢性投与した際に、血圧上昇を引き起こさないで、摂食及び体重減少作用が検出される nesfatin-1 投与量を検討しなければならない。従って、今後は慢性実験で nesfatin-1 の有効性を検討する。
８．研 究 発 表
Tanida M, Gotoh H, Yamamoto N, Wang M, Kuda Y, Kurata Y, Mori M, Shibamoto T. Hypothalamic
Nesfatin-1 Stimulates Sympathetic Nerve Activity via Hypothalamic ERK Signaling. Diabetes 2015;
64: 3725-3736.
Abstract: Nesfatin-1 acts on the hypothalamus and regulates the autonomic nervous system.
However, the hypothalamic mechanisms of nesfatin-1 on the autonomic nervous system are not wellunderstood. In this study, we found that intracerebroventricular (ICV) administration of nesfatin-1− 24 −

increased the extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity in rats. Furthermore, the activity ofsympathetic nerves, in the kidneys, liver, and white adipose tissue (WAT), and blood pressure wasstimulated by the ICV injection of nesfatin-1, and these effects were abolished owing topharmacological inhibition of ERK. Renal sympathoexcitatory and hypertensive effects were also
observed with nesfatin-1 microinjection into the paraventricular hypothalamic nucleus (PVN).
Moreover, nesfatin-1 increased the number of phospho (p)-ERK1/2-positive neurons in the PVN andcoexpression of the protein in neurons expressing corticotropin-releasing hormone (CRH).
Pharmacological blockade of CRH signaling inhibited renal sympathetic and hypertensive responses
to nesfatin-1. Finally, sympathetic stimulation of WAT and increased p-ERK1/2 levels in response to
nesfatin-1 were preserved in obese animals such as rats that were fed a high-fat diet and leptin
receptor-deficient Zucker fatty rats. These findings indicate that nesfatin-1 regulates the autonomic
nervous system through ERK signaling in PVN-CRH neurons to maintain cardiovascular function andthat the antiobesity effect of nesfatin-1 is mediated by hypothalamic ERK-dependent
sympathoexcitation in obese animals.

− 25 −

１．研究課題名：ミトコンドリア恒常性維持機構の破綻と糖尿病腎症に関する研究（研究番号S2014-3）
２．キーワード：１）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)２）サーチュイン 3 (Sirt3)
３）ミトコンドリア (mitochondria)４）酸化ストレス (oxidative stress)５）オートファジー (autophagy)
３．研究者氏名：北田宗弘・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
糖尿病の患者数の増加に伴い、今後、糖尿病腎症（腎症）に罹患する患者数の増加が危惧される。腎症は末期腎不全から透析療法のみならず、心血管疾患発症・進展のリスクを上げ、患者の健康寿命および生活の質 (QOL) を著しく損なう。現在のところ、腎症に対する治療は、腎臓に対する悪化因子に対して、生活習慣の改善、血糖・血圧・脂質管理などを中心に包括的に行うことが推奨されている (Kitada et al. World J Diabetes, 2014)。その治療には一定の効果は認められるものの未だ十分とは言い難い。加齢（老化）は、糖尿病・心血管疾患・
慢性腎臓病 (CKD) を含む老化関連疾患発症・進展の危険因子であり (Coresh et al. Am J
Kidney Dis, 2003)、“老化の制御”が、腎症抑制の新規治療の標的となり得る。
カロリー制限 (CR) は、酵母から哺乳類まで、寿命延長あるいは老化関連疾患の発症を抑制する“抗老化”効果を示す介入法として認識されている (Fontana et al. Sience, 2010)。CR
が抗老化効果を示す分子機序として、NAD+依存性脱アセチル化酵素（サーチュイン）の活性化が重要な役割を果たしている可能性がある (Kitada et al. Clin Sci, 2012) ため、本研究においては、腎症の発症・進展抑制を目指した新規治療標的として CR により誘導される抗老化分子であるサーチュインに着目した。サーチュインの心血管疾患、中枢神経疾患、腎疾患
を含む老化関連疾患に対する発症・進展抑制効果はこれまでにも報告されてきており、特に加齢腎の病態形成における Sirt1 について、Kume らは Sirt1 の腎尿細管細胞における老化に関連した低酸素誘導性オートファジーの機能低下の回復を介した腎の老化（異常ミトコンド
リアの集積と機能低下）抑制機構を明らかにした (Koya et al. J Clin Invest, 2010)。我々もまた、
2 型糖尿病 (Wistar Fatty) ラットの腎障害（炎症性変化）とミトコンドリア形態異常（クリステの消失、膨化）が Sirt1 の低下と随伴して生じていること、24 週間の 40％CR によって糖尿病ラットの近位尿細管部位におけるミトコンドリア形態異常が、非糖尿病ラットと同等に改善すること、その分子機構として Sirt1 の活性化を介するオートファジー機構の維持が重要な役割を演じている可能性を見い出した (Kitada et al. Ex Diabetes Res, 2011)。これらの結果は、腎症の発症・進展には、尿細管における Sirt1 の低下に基づくミトコンドリア機能異常が重要な役割を果たしていることを示している。尿細管間質障害の程度が腎症を含む CKD におけ− 27 −

る腎機能予後を規定するとの報告もあることから、尿細管 Sirt1 の活性化を介したミトコンド
リア機能の恒常性の維持が腎症に対する新規治療に繋がる可能性がある。
一方、Sirt3 はミトコンドリア内に主に存在するサーチュインである。ミトコンドリアは、活性酸素の生成に関わる重要な細胞内器官の一つであるが、糖尿病状態では、ミトコンドリ
アからの活性酸素生成亢進に起因するミトコンドリア酸化ストレスを生じることが知られている。その結果、腎症を含む糖尿病合併症の発症・進展に関与している。酸化ストレスは老化促進因子の一つであるが、Sirt3 は、Mn-SOD (Qiu et al. Cell Metab, 2010)、イソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ 2 (IDH2) (Someya et al. Cell, 2010) を含む抗酸化酵素の脱アセチル化を介して酸化ストレスを軽減し、ミトコンドリアの恒常性維持に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。しかし、Sirt3 の抗酸化ストレスあるいはミトコンドリア恒常性維持を介した腎症の発症・進展に対する意義は明らかではない。したがって、本研究では、2 型糖尿病ラ
ット腎症の病態形成におけるミトコンドリア酸化ストレスおよびミトコンドリア恒常性維持の破綻に対する Sirt3 の意義を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
2 型糖尿病 (Zucker diabetic fatty (fa/fa)) ラット (ZDF)（チャールズリバーより購入）と非糖尿病 Zucker Lean ラット (ZL) を 7 週齢からそれぞれ通常食 (STD) と 40％カロリー制限(CR) 群に分別した。体重・血糖値は 1 週間ごとに測定し、20 週間後のト刹時に採取した各サンプルにおいて、HbA1c 値、腎重量、血漿シスタチン C 値を測定した。尿アルブミン、liver-type fatty acid binding protein (L-FABP)および 8-OHdG 排泄量（尿中クレアチニン補正）
は、食事介入開始前および介入 18 週間後において代謝ケージにより蓄尿して採取したサンプ
ルを各 ELISA キット（NEPHRAT II, Exocell, Inc.(尿アルブミン), R & D systems, Inc.(尿L-FABP, 血漿シスタチン C), 日本油脂(尿 8-OHdG)）にて測定した（なお 8-OHdG は 18 週
後のみ測定）。腎の線維化は、マッソントリクローム (MT) 染色（糸球体及び尿細管間質の線維化スコア）および 3 型コラーゲン mRNA 発現（腎皮質, RT-PCR）にて、尿細管細胞障害
は、Kidney injury molecule-1 (Kim-1) 免疫組織化学 (IHC) （抗 Kim-1 抗体; R & D systems, Inc.,
100:1, 半定量化によるスコア）および mRNA 発現（腎皮質, RT-PCR）にて評価した。炎症性変化は CD68 IHC（抗 CD68 抗体: Serotec.,50:1, 半定量化によるスコア）および mRNA 発現、炎症関連遺伝子である IL-6・TNF-α mRNA 発現（腎皮質, RT-PCR）にて評価した。近位尿細管ミトコンドリア形態的観察を電子顕微鏡にて評価した。酸化ストレスは、上記の尿中
8-OHdG 排泄量に加え、腎皮質から抽出したミトコンドリア DNA 中の 8-OHdG 含有量を
ELISA 法（日本油脂）にて、また各群の腎における Mn-SOD および IDH2 アセチル化をそれ
らの特異的抗体を用いたウエスタンブロット法にて評価を行った。さらに Sirt3 発現およびミトコンドリア蛋白のアセチル化もまたそれぞれの標的蛋白に対する特異抗体（Sirt3 抗体およびリジンアセチル化抗体, Cell signaling）を用いたウエスタンブロットにより評価した。腎におけるオートファジーは p62 発現を、ミトコンドリアの分裂は DRP 発現をそれぞれの特異的− 28 −

抗体によるウエスタンブロットで評価した。すべての動物実験は金沢医科大学動物生命実験センターに申請し許可されており、動物実験指針にしたがい行った。
６．研 究 成 果
HbA1c 値は、ZL 群と比較して、ZDF-STD 群において有意な増加を認め（HbA1c 2.95±
0.34%(ZL), 8.8±0.9%(ZDF+STD), ZL vs. ZDF+STD p＜0.001）、ZDF+CR 群で部分的に低下を認めた(5.8±1.69%, ZDF+STD vs. ZDF+CR p＜0.001)。腎重量、尿アルブミンおよび L-FABP
排泄量、血漿シスタチン C 値は、ZL 群に比べて、ZDF+STD 群で増加し（腎重量 3.24±0.34 g(ZL), 2.53 ± 0.14g(ZDF+STD), ZL vs. ZDF+STD p ＜ 0.01,n=5, 尿 ア ル ブ ミ ン /Cr 0.035 ±0.023mg/gCr(ZL), 0.66±0.34mg/gCr (ZDF+STD), p＜0.01, n=5, L-FABP/Cr 2.17±0.99μg/gCr(ZL), 29.7±21.8μg/gCr (ZDF+STD), p＜0.01 , n=5 ,血漿シスタチン C

0.74±0.12 (ZL),

0.97±0.039 (ZDF+STD), p＜0.01, n=5）、ZDF+CR 群にて低下（腎重量 2.41±0.14 g, ZDF+STD vs.
ZDF+CR, p＜0.01, n=5, 尿アルブミン/Cr 0.025±0.034, ZDF+STD vs. ZDF+CR, p＜0.01, n=5,
L-FABP/Cr 2.87±0.92, ZDF+STD vs. ZDF+CR, p＜0.01, n=5）したことから、CR は糖尿病ラットにおける腎肥大、糸球体・尿細管障害、腎機能を改善することが示された。腎の MT 染色
における糸球体および尿細管間質の線維化スコア、腎皮質における 3 型コラーゲン mRNA 発
現、さらに尿細管障害マーカーの一つである尿細管における Kim-1 発現が ZL 群に比べて、
ZDF+STD 群で有意な増加を認めた。腎における炎症性変化は、ZL 群に比較して、ZDF+STD
群において、CD68 陽性細胞の尿細管間質への浸潤および腎皮質における mRNA 発現、また炎症関連遺伝子である、TNF-α, IL-6 の mRNA 発現の有意な増強を認めた。さらに電子顕微
鏡下における近位尿細管細胞のミトコンドリアの形態観察では、ZL 群と比較して ZDF+STD
群で、ミトコンドリアの膨化、断片化あるいはクリステの不明瞭化などの形態異常を認めた。
これら ZDF+STD 群でみられた腎線維化、尿細管障害、炎症性変化、ミトコンドリア形態異常はすべて、20 週間にわたる CR により改善された。これら CR による糖尿病に起因する腎障害の改善効果は HbA1c 値が部分的な低下にとどまったにも関わらず ZL 群とほぼ同等までに改善を認めたことより、血糖低下効果を超えた作用であると考えられる。
酸化ストレスは腎症を含む糖尿病合併症の発症・進展の成因であるのみならず、老化促進因子としても重要である。酸化ストレスマーカーである尿中 8-OHdG 排泄量は、ZL 群に比べて 、 ZDF+STD 群 で 有 意 な 増 加 を 認 め た （ 尿 8-OHdG/Cr 15.6 ± 5.3ng/mgCr(ZL), 35.0 ±15.7ng/mgCr (ZDF+STD), ZL vs. ZDF+STD, p＜0.05, n=5）ことから、糖尿病状態における酸化ストレスの増強が本実験で用いた ZDF ラットにおいても生じていることが示された。しかし
尿 8-OHdG 排泄量は、腎のみならず全身的な酸化ストレス状況を反映していると考えられることから、腎における酸化ストレスを評価するために、ミトコンドリア腎皮質から抽出したミ
トコンドリア DNA における 8-OHdG 含有量を測定した。その結果、ZDF 群の腎ミトコンド
リアでは、ZL 群に比べて、有意にミトコンドリア DNA 中の 8-OHdG 含有量が増加（ミトコンドリア酸化ストレスの亢進）していることが明らかとなった（7.61±1.27ng/mg DNA(ZL),
11.4±0.48ng/mg DNA(ZDF+STD), ZL vs. ZDF+STD, p＜0.01, n=3）。糖尿病ラットにおける腎− 29 −

ミトコンドリア酸化ストレス増強機序として、本研究においては、ミトコンドリアにおける主な抗酸化酵素である、Mn-SOD, IDH2 に焦点を当てた。Sirt3 は、ミトコンドリア蛋白のア
セチル化/脱アセチル化の制御において中心的役割を果たす酵素であり、Mn-SOD, IDH2 の抗酸化酵素活性は、Sirt3 による脱アセチル化により制御を受けていることが報告されている(Qiu et al. Cell Metab, 2010, Someya et al. Cell, 2010)。腎ミトコンドリア蛋白のアセチル化は、
リジンアセチル化抗体によるウエスタンブロットにて評価したが、ZL 群に比較して、ZDF
群で有意増加していること、さらに Mn-SOD および IDH2 アセチル化抗体によるウエスタン
ブロットの結果は、両酵素ともに、ZL 群に比べて、ZDF+STD 群でそれらの増強を示した。
一方 Sirt3 発現は ZL 群に比較して ZDF 群で増加を認めた。これらの結果から糖尿病腎では、
Sirt3 発現が増加するにも関わらず、Sirt3 活性が低下しているため、Mn-SOD および IDH2 のアセチル化が亢進し、ミトコンドリア酸化ストレスが増強した可能性が考えられる。しかし、
Sirt3 活性の低下の機序としては、高血糖状態による解糖系代謝経路の亢進、ミトコンドリア
への代謝産物の負荷などによる細胞内あるいはミトコンドリア内 NAD+/NADH 比の低下が原因していると考えられるため、現在腎における NAD+/NADH 比の測定を行っている。また、
酸化ストレスによるアポトーシスの過程では、PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) -1 が活性化され、その際、NAD+が消費されることが報告されている。したがって、糖尿病状態における腎構成細胞のアポトーシスと PARP-1 の活性化が NAD+の低下と関連して Sirt3 の活性低下に寄与しているかどうかを現在検証中である。
７．研究の考察・反省
通常ミトコンドリアは酸化ストレスを含む細胞内ストレスにより障害を受けると、その障害部位を分裂し切り離した後、ミトコンドリアバイオジェネーシスの増加と引き続き生じる
ミトコンドリア融合によりその恒常性が維持される。分裂し断片化したミトコンドリアはオートファジー（ミトファジー）により分解され、リサイクルされる。本研究における電子顕微鏡による近位尿細管細胞ミトコンドリアの形態的観察において、糖尿病ラットでは、ミトコンドリアの膨化、断片化などの形態異常が存在していること、また DRP（ミトコンドリア
分裂関連蛋白）の発現増加および p62 の蓄積（オートファジー低下の際に増加）を認めた。
これらの結果から糖尿病腎近位尿細管では、ミトコンドリア酸化ストレス亢進⇒ミトコンド
リア分裂増加⇒オートファジー機能低下による断片化ミトコンドリアの細胞内蓄積⇒更なる
酸化ストレス、炎症、尿細管細胞機能障害⇒腎線維化⇒腎機能低下をきたしている可能性が推察される。
今後の課題・展望として、糖尿病腎尿細管における Sirt3 の活性低下が、糖尿病状態に起因する腎障害の原因として重要であるかどうかの直接的な証明が必要である。そのために、培養尿細管細胞を用い、siRNA による Sirt3 ノックダウン（活性低下を模倣）によるミトコンド
リア蛋白のアセチル化、Mn-SOD および IDH2 アセチル化およびそれら酵素活性と酸化スト
レス、炎症、ミトコンドリア形態異常、オートファジーの評価を行う。さらにオートファジ− 30 −

ーあるいは、ミトコンドリア分裂/融合の制御に関わる蛋白の機能制御に Sirt3 が関与しているかどうか、その点に関する新たな標的蛋白を見出したい。
８．研 究 発 表
Kitada M, Ogura Y, Kota D: Role of Sirt1 as a regulator of Autophagy. In Hayat MA (Ed),
Autophagy: cancer, other pathologies, inflammation, immunity, infection, and aging Vol.8,
Amsterdam, Elsevier, Academic Press, 2016; 89-100.
Abstract: Sirt1, a NAD+-dependent deacetylase, has been implicated in cellular processes, including
cell survival, metabolism, and adaptation to cellular stress. Autophagy plays an important role in themaintenance of intracellular homeostasis by removing protein aggregates and damaged organelles.
Nutrient-sensing pathways include the mammalian target of rapamycin (mTOR), AMP-activatedkinase (AMPK), and Sirt1 pathways and regulate autophagy machinery depending on nutrient status.
Sirt1 may induce autophagy directly by deacetylating autophagy-related genes (Atg) 5 and 7 and LC3.
In addition, Sirt1 deacetylates FOXOs and modulates the expression of autophagy regulatory
molecules. Sirt1-deacetylated FOXO1 stimulates the expression of Rab7, a small GTPase that is a
crucial factor in the maturation of autophagosomes and endosomes. Sirt1 also deacetylates FOXO3,
leading to activation of its transcriptional activity and subsequent Bnip3-mediated autophagy.
Furthermore, nutrient-sensing pathways interact with each other, and Sirt1 may indirectly induce
autophagy via the activation of AMPK and inhibition of the mTOR pathway. Thus, Sirt1 regulates
autophagy machinery through multiple mechanisms.

− 31 −

１．研究課題名：経口抗線維化ペプチド薬の開発（研究番号S2014-4）

２．キーワード：１）糖尿病性腎症 (diabetic nephropathy)
２）腎線維化 (kidney fibrosis)
３）アンジオテンシン変換酵素阻害薬 (ACE inhibitor)
４）内因性抗線維化ペプチド (endogenous anti-fibrotic peptide)５）マイクロ RNA (microRNA)
３．研究者氏名：金﨑啓造・医学部・准教授・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
腎線維化（糸球体硬化・尿細管間質線維化）は糖尿病腎症を含む腎機能障害を伴う進行した慢性腎疾患共通の組織像である。しかしながら、線維化を直接標的とした治療法は確立していない。内因性生理活性ペプチド N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP) はアンジオ
テンシン変換酵素 (ACE) により代謝される抗線維化ペプチドであり、様々な進行性線維増殖疾患モデル動物を用いた検討で、抗線維化効果を示すことが報告されてきた。これらすべての報告は AcSDKP 持続皮下投与による抗線維化効果の確認であるが、臨床応用する際は内服薬がより汎用性が高いと考え、AcSDKP 経口投与による腎の抗線維化効果を検討した。
５．研 究 計 画
①AcSDKP 経口投与予備実験
生後 8 週齢の野生型 CD-1 マウスに AcSDKP (1mg, 10mg) 経口投与し、投与 2 時間後の血中、尿中 AcSDKP 濃度を測定した。
②1 型糖尿病モデルに対する経口 AcSDKP 投与実験
生後 8 週齢の野生型 CD-1 マウスに streptozotocin (STZ) [200mg/kg] を腹腔内単回投与した、STZ 誘発性糖尿病マウスを用いた。糖尿病発症後 16 週から ACE 阻害薬 imidapril [2.5mg/kg
BW/day] を開始する群、20 週から imidapril に AcSDKP [1mg/day 3 回/week] を追加する群と未治療糖尿病群、非糖尿病群の 4 群を比較検討し、糖尿病発症 24 週で屠殺した。AcSDKP
経口投与開始前（糖尿病発症 20 週後）、AcSDKP 最終投与直前、及び AcSDKP 最終投与直後、2 時間後、24 時間後の尿中 AcSDKP 濃度の推移を定量した。
③2 型糖尿病モデルに対する経口 AcSDKP 投与実験
db/db マウスを用い、コントロール群として db/m マウス用いた。db/db マウスは 20 週齢から imidapril 単独群、AcSDKP 単独群、imidarpil+AcSDKP 群、未治療 db/db マウス群の 4 群とし、db/m マウス群を加えた 5 群を比較検討、24 週齢で屠殺した。AcSDKP 経口投与開始前（20週齢）、AcSDKP 最終投与直前、及び AcSDKP 最終投与直後、2 時間後、24 時間後、48 時間後（屠殺直前）の尿中 AcSDKP 濃度の推移を定量した。
②、③共に食事は自由摂取、経口投与以外は自由飲水とした。各群における屠殺時血中− 33 −

AcSDKP 濃度・腎機能評価のため血中シスタチン C を測定し、腎臓における線維化を組織学・
蛋白発現解析にて比較検討した。また、抗線維化 microRNA (miR)である miR-let7 及び miR-29
発現について腎臓サンプルを用い、定量的 PCR 解析を行い各群で比較検討した。
６．研 究 成 果
①AcSDKP 経口投与予備実験
AcSDKP (1mg, 10mg) 経口投与にて、投与 2 時間後の血中、尿中 AcSDKP 濃度が投与量に依存して上昇した。
②1 型糖尿病モデルに対する経口 AcSDKP 投与実験
尿中 AcSDKP 濃度は投与毎一過性に上昇、屠殺直前の尿は他群に比し、imidapril＋AcSDKP
併用群で有意に高濃度であった。血中 AcSDKP 濃度も同様の結果を認めた。尿細管間質線維化・メサンギウム領域拡大は、imidapril 単独群に比し imidapril＋AcSDKP 併用群でさらに改善を認めた。細胞外基質蛋白 fibronectin 及び、活性化線維芽細胞マーカー蛋白 FSP-1、α-SMAの発現は、Western blot 解析にて未治療糖尿病群で増加、imidapril 単独群に比し imidapril＋
AcSDKP 併用群でさらに発現が抑制された。未治療糖尿病群で上昇した血中シスタチン C 濃
度は、各治療群で低下を認めた。miR-let7 および miR-29 は、未治療群の腎では有意に低下していたが、imidapril 単独群で軽度改善、imidapril＋AcSDKP 併用群でほぼ正常化した。
③2 型糖尿病モデルに対する経口 AcSDKP 投与実験
db/db マウスでは尿細管間質線維化は顕著ではないものの、糸球体硬化・メサンギウム領
域拡大は未治療群に比し imidapril 単独群、AcSDKP 単独群で軽度の改善を認め、imidapril＋
AcSDKP 併用群でさらに改善した。Fibronectin、FSP-1、α-SMA の蛋白発現は Western blot 解析にて、db/m に比し db/db 未治療群で上昇傾向を呈し、各治療介入群で発現の抑制を認めた。
血中シスタチン C は db/m に比し db/db 未治療群で有意に上昇したが、すべての治療介入群でほぼ正常化した。miR-let7 および miR-29 は、db/m に比し db/db 未治療群で低下、imidapril
単独群と AcSDKP 単独群においては軽度の改善にとどまったが、imidapril＋AcSDKP 併用群
で有意な改善を認めた。
７．研究の考察・反省
我々の研究チームは既に AcSDKP が糸球体メサンギウム細胞増殖抑制、抗炎症、TGF-β シ
グナル抑制、miR-let7 発現増強を介した内皮細胞-間葉系分化抑制効果を発揮し、腎線維化を抑制することを報告してきた。持続皮下投与のみならず、AcSDKP 経口投与においても同様に抗線維化効果があることが明らかとなり、AcSDKP は糖尿病腎に対する経口抗線維化ペプ
チド薬となる可能性が示唆された。さらに最近我々は、AcSDKP レベルが低下しやすい糖尿病系統マウスでは、線維化が誘導されやすいこと、miR let-7 と miR-29 はクロストークを形成し相互依存関係があることも明らかなってきた。このように、AcSDKP 補充療法は抗線維化療法として極めて理論的であり、今後臨床応用を目指し検討中である。

− 34 −

８．研 究 発 表① Nitta K, Shi S, Nagai T, Kanasaki M, Kitada M, Srivastava SP, Haneda M, Kanasaki K, Koya D. Oral
Administration of N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline Ameliorates Kidney Disease in Both Type 1
and Type 2 Diabetic Mice via a Therapeutic Regimen. Biomed Res Int 2016; 2016: 9172157.
Abstract: Kidney fibrosis is the final common pathway of progressive kidney diseases including
diabetic

nephropathy.

Here,

we

reportthat

theendogenous

antifibrotic

peptideN-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP), the substrate of angiotensin-converting enzyme(ACE), is an orally available peptide drug used to cure kidney fibrosis in diabetic mice. We utilized
two mouse models of diabetic nephropathy, streptozotocin- (STZ-) induced type 1 diabetic CD-1 miceand type 2 diabetic nephropathy model db/db mice. Intervention with the ACE inhibitor imidapril,oral AcSDKP, or imidapril + oral AcSDKP combination therapy increased urine AcSDKP levels.
AcSDKP levels were significantly higher in the combination group compared to those of the othergroups. AcSDKP oral administration, either AcSDKP alone or in addition to imidapril, ameliorated
glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis. Plasma cystatin C levels were higher in both models,at euthanasia, and were restored by all the treatment groups. The levels of antifibrotic miRs, such as
miR-29 or let-7, were suppressed in the kidneys of both models; all treatments, especially the
combination of imidapril + oral AcSDKP, restored the antifibrotic miR levels to a normal value oreven higher. AcSDKP may be an oral antifibrotic peptide drug that would be relevant to combating
fibroproliferative kidney diseases such as diabetic nephropathy.
② Shi S, Kanasaki K, Koya D. Linagliptin but not Sitagliptin inhibited transforming growth
factor-β2-induced endothelial DPP-4 activity and the endothelial-mesenchymal transition. Biochem
Biophys Res Commun 2016; 471: 184-190.
Abstract: Dipeptidyl peptidase (DPP)-4 plays an important role in endothelial cell biology. We haveshown that the DPP-4 inhibitor Linagliptin can inhibit the endothelial-mesenchymal transition(EndMT) and ameliorate diabetic kidney fibrosis associated with the suppression of DPP-4 protein
levels via the induction of miR-29. The current study demonstrated that such effects of Linagliptin on
endothelial cell profibrotic programs were drug-specific but not class effects. In the cell-free system,
both Linagliptin and Sitagliptin inhibited recombinant DPP-4 activity in a concentration-dependent
manner. Linagliptin can inhibit all of the following: DPP-4 activity and protein level, integrin β1
protein levels, EndMT, and DPP-4 3'UTR activity; Sitagliptin, however, inhibited none of these in thecurrent study. Additionally, TGF-β2 induced both the induction of VEGF-R1 and the suppression of
VEGF-R2 levels in endothelial cells, and both were inhibited by Linagliptin but not by Sitagliptin.
miR-29, the miR that negatively regulates the 3'UTR of DPP-4 mRNA, was suppressed by TGF-β2
and restored by Linagliptin but not by Sitagliptin. Following the overexpression ofpCMV-DPP-4-GFP and pCMV6-Myc-DPP-4 in endothelial cells, the proximity of Myc-DPP-4 andDPP-4-GFP was suppressed by Linagliptin but not by Sitagliptin, suggesting that only Linagliptin− 35 −

inhibited the homo-dimer formation of DPP-4 in endothelial cells; this difference in activity between
the two gliptins could explain their diverse effects on endothelial cell biology. In conclusion, each of
the DPP-4 inhibitors may have unique drug-specific effects.

− 36 −

１．研究課題名：ユビキチン化を介した DNA 末端連結による抗ガン剤感受性獲得機構の解析（研究番号S2014-5）

２．キーワード：１）DNA 二本鎖切断 (DNA double-strand break)２）非相同末端連結 (non-homologous end-joining)
３）相同組換え (homologous recombination)４）DNA 複製 (DNA replication)５）カンプトテシン (camptothecin)
３．研究者氏名：逆井良・医学部・助教・生化学Ⅰ

４．研 究 目 的
DNA 二本鎖切断 (DSB) は非常に強い細胞毒性を持つ DNA 損傷であり、放射線やカンプ
トテシン (CPT) を含む抗がん剤により誘導される。通常 DSB は、non-homologous end joining(NHEJ) または homologous recombination (HR) の経路で修復されるが、申請者は、CPT で誘導される DNA 複製を介した DSB（以後 RM-DSB）では、NHEJ で修復されると細胞死に至ることを見出しており、NHEJ の亢進が、CPT の抗腫瘍効果の増強につながると考えられる。
申請者のこれまでの解析から、CPT による NHEJ 因子 DNA-PK の活性化がユビキチン−プ
ロテアソーム系で制御されており、細胞死を誘導する事を明らかにしてきた。そこで、RNAi
スクリーニングにより、DNA-PK 活性化に関わるユビキチン化因子を探索し、UbcH5c を同定した。本研究では、UbcH5c による RM-DSB 応答の制御機構を明らかにすることを目的としている。
これまで放射線による DSB と RM-DSB はほとんど区別されずに解析されてきた。しかし
RM-DSB では修復経路により細胞運命が大きく異なるため、RM-DSB の修復経路を理解する
ことは CPT 等による化学療法の効果を高める上で非常に有益となる事が期待される。
５．研 究 計 画
本研究では、RM-DSB に注目し、UbcH5c による NHEJ 経路の制御機構を明らかにすることを目的とし、以下の点について解析を行った。
①Ku タンパク質と DNA 末端構造との関連
DNA-PK は、Ku タンパク質依存的に DNA 末端に結合して活性化する。そこで、RM-DSB
に対する DNA-PK 活性化における Ku タンパク質の関与について、RNAi および Ku 欠損マウ
ス細胞を用いて解析した。
また、DNA 末端構造については、とくに DNA 末端の削り込み反応である DNA end resectionと RM−DSB における DNA-PK 活性化との関連について、end resection 因子の RNAi により解析を行った。

− 37 −

②E2 ユビキチン結合酵素 UbcH5c の機能②-1. UbcH5c の DNA 損傷応答への影響：RM-DSB に対する UbcH5c の機能について、CPTを用い、DNA-PK 以外の DNA 損傷応答因子の局在や修飾、さらには損傷周辺のヒストンの修飾への影響を解析した。
②-2. E3 リガーゼおよび基質の探索：RNAi スクリーニングにより UbcH5c が同定されたことから、UbcH5c との関連が報告されている E3 ユビキチンリガーゼを絞り込み、DNA 損傷応答への関与でさらに絞り込んだ遺伝子群に対し２次 RNAi スクリーニングを行い、E3 リガーゼの同定を試みた。
③UbcH5c-DNA-PK 経路の染色体不安定性に及ぼす影響（平成 27 年度以降）
DNA-PK 経路と抗がん剤感受性との関連を明らかにするため、まずは DNA-PK 経路が染色体異常を引き起こすかどうかについて、M 期における染色体標本を作成し、中でも特に radialchromosome と呼ばれる NHEJ に由来すると考えられる染色体異常に対して解析を行った。
６．研 究 成 果
① Ku タンパク質に関する検討は難航しており、Ku タンパク質の寄与については解析できていない。DNA 末端構造と DNA-PK 活性化との関連については、end resection 因子である CtIPのノックダウン細胞において解析を行った。CtIP ノックダウン細胞では、DNA-PK の活性化は亢進し、end resection が DNA-PK 活性化に対し抑制的に働いていると考えられる。UbcH5c
ノックダウンおよび計画③で同定した E3 リガーゼ SIAH1 ノックダウンでは、CtIP ノックダ
ウン細胞においても DNA-PK の活性化を抑制したことから、UbcH5c-SIAH1 経路は、DNA 末端構造とは別の機構で DNA-PK の活性化を制御していると考えられる。
② UbcH5c の機能としては、DNA-PK の活性化および DNA-PK のリン酸化基質と考えられる RPAのリン酸化に必要であること以外、他の DNA 損傷因子の挙動にほとんど影響は見られなかった。DNA 損傷マーカーとして有名なヒストン H2AX のリン酸化は、UbcH5c/SIAH1 ダブル
ノックダウンにより強く抑制されることが観察された。DNA-PK の活性化が抑制されている結果と考えられる。RNAi スクリーニングによる E3 リガーゼの探索は、データベースから最終的に 28 遺伝子まで絞り込んで解析した。その結果、上述の SIAH1 を同定した。SIAH1 ノックダウン細胞では、UbcH5c ノックダウンと同様に、CPT の時のみ、DNA-PK の活性化に抑制が見られた。これにより、UbcH5c-SIAH1 の経路で DNA-PK および NHEJ が制御されていると考えられる。
③ 染色体異常に関して、UbcH5c ノックダウン細胞で解析を行い、Radial chromosome の出現が減少しており、NHEJ 活性が下がっていると考えられる。SIAH1 ノックダウンでは現在までのところ染色体異常の減少は観察できていない。さらに、この Radial chromosome の発生は、離れた位置にある染色体同士が融合することで生じることから、離れた DSB の NHEJ への関与が示唆されている 53BP1 についても検討したところ、53BP1 ノックダウン細胞でも染色体異常が下がっており、UbcH5c-SIAH1-DNA-PK 経路は、53BP1 依存的に染色体異常を発生させ、細胞死を誘導すると考えられる。

− 38 −

７．研究の考察・反省
Ku タンパク質の関与については、ノックダウンがうまく機能せず、タンパク質レベルは 9割ほど減少しているにもかかわらず、コントロールサンプルでの DNA-PK 活性化への影響が見られなかったことから RNAi での解析は断念した。また、Ku 欠損のげっ歯類の細胞でも検討したが、げっ歯類ではヒトと比べ DNA-PK の発現と活性が低く、検出できなかった。そこで、ヒト DNA-PK を導入した同様の細胞を入手し、検討を試みたが、コントロール細胞とKu 欠損細胞でヒト DNA-PK の発現量が合わずに、解析に用いることはできなかった。今後、
Ku のコンディショナルノックアウト細胞を使って解析する予定である。
UbcH5c-SIAH1 による DNA-PK の制御機構は、DNA end resection とは関係していなかった
ため、Ku タンパク質の除去に関与しているのではないかと考えている。Ku タンパク質の除去に関してはほとんどメカニズムが分かっていないが、Ku タンパク質の局在を観察できれば、UbcH5c-SIAH1 による影響は解析可能と考えられる。
染色体異常に関しては、SIAH1 ノックダウンで抑制が見られなかったのは予想外であるが、ノックダウン条件等を再検討する余地はあると考えている。最近、染色体の構造を保持する
コヒーシンタンパク質が radial chromosome の発生を抑制することが報告されたため、コヒー
シンタンパク質とのダブルノックダウンで解析することで、影響を観察できるかもしれない。
反省点としては、２年で論文化とならなかった点である。できるだけ早く結果をまとめ、論文にしたいと考えている。
８．研 究 発 表
該当なし。

− 39 −

１．研究課題名：宿主細胞内 pH によるフラビウイルス複製調節機構（研究番号S2014-6）

２．キーワード：１）細胞内 pH (intracellular pH)２）日本脳炎ウイルス (Japanese encephalitis virus)
３）ウイルス複製 (viral replication)４）Bafilomycin A1
３．研究者氏名：田崎隆史・総合医学研究所・准教授・生命科学研究領域

４．研 究 目 的フラビウイルスは細胞質内で複製され小胞体からゴルジ体を通過して細胞外へ分泌される。
その際、furin による pH 依存性のウイルス膜タンパク質切断が、ウイルス成熟化に必要である。これまでの研究で、日本脳炎ウイルス (JEV) に感染した細胞の小器官内 pH を上昇させると、複製ウイルス量が約 4 倍上昇することが示唆された（未発表）。これは新しい知見であり、本研究においてフラビウイルスの複製調節機構における宿主細胞内 pH の寄与をさらに検討する。
５．研 究 計 画
Bafilomycin A1 は、vacuolar H(+)-ATPase (V-ATPase) 阻害により分泌経路の pH を上昇させ、フラビウイルス成熟化に関与する furin の酵素活性を阻害することが知られている。バフィロ
マイシンによる、JEV 増加に Furin が関与しているのか調べるために、Furin 阻害剤による JEV
複製の影響を検討する。さらに、この結果に基づき、V-ATPase subunit 遺伝子を shRNA 法等
により阻害し、細胞内 pH、あるいはそれ以外の因子と JEV 複製調節がどのように関連しているのかを検討する。
６．研 究 成 果
(1) 日本脳炎ウイルスの持続感染細胞 JK-1 を用いて、バフィロマイシンの他、MG132（プロテアソーム阻害剤）、E-64d（システインプロテアーゼ阻害剤）の影響を検討した。その結果、バフィロマイシン処理によって、細胞質中（ウイルス粒子）の E タンパク質が増加し、その効果は濃度依存的であることが分かった。さらに、JEV RNA の定量を、RT-qPCR および、
RT-dPCR（デジタル PCR）を用いて行ったところ、細胞質中の JEV RNA（ウイルス粒子）の増加が、バフィロマイシン濃度依存的に顕著であった。培養液中の JEV RNA 量もバイフィ
ロマイシンによって増加していた。これらの結果から、JK-1 細胞において、バフィロマイシ
ンは、JEV 複製に何らかの影響を及ぼし、細胞質中の、ウイルス粒子の量を増加させることが示唆された。
(2) (1)の結果が Furin 活性阻害によるものなのか、検討した。JEV 持続感染株 JK-1 細胞を濃度の異なる Furin Inhibitor I を添加した培養液中で 24 時間培養し、細胞質と膜画分に分画した。分

− 41 −

画されたタンパク質を western blot 法で解析した。しかし、Furin 阻害剤による JEV 複製に対する影響は見られなかった。
７．研究の考察・反省
リソソーム膜状などに局在する vacuolar H(+)-ATPase (V-ATPase)は、細胞内 pH の調節に深くかかわっている。その特異的な阻害剤バフィロマイシンは、プロトンポンプによる H+の流入を阻害し、リソソーム内の pH（通常約 6 以下）を中性に引き上げる効果を持つ。リソソーム中のプロテアーゼ Furin はフラビウイルスの粒子表面タンパク質の切断により、ウイル
ス成熟化に関与している事が示唆されている。本研究では、バフィロマイシンの効果を JEV
持続感染細胞 JK-1 で調べた所、ウイルス量が増加する事を見出した。次に、Furin の関与について、Furin 阻害剤を用いて検討したところ、ウイルス E タンパク質の量には影響が見られなかった。以上の結果から、バフィロマイシンによる V-ATPase 阻害は、JEV 複製に関与している事が強く示唆された。細胞内小器官の pH 調節とウイルス複製が関連していると考えられる。一方、Furin 活性との関連は見られなかった。研究計画で予定していた V-ATPase のsiRNA による阻害実験には至らなかった。
８．研 究 発 表
該当なし（論文準備中）。

− 42 −

１．研究課題名：冠動脈切削後流出分子を標的とした動脈硬化新規評価法の開発（研究番号S2014-8）
２．キーワード：１）動脈硬化性心血管疾患 (atherosclerotic cardiovascular disease)２）冠動脈石灰化 (coronary artery calcification)３）高速回転式冠動脈粥腫切除術 (rotational coronary atherectomy)
４）石灰化関連分子 (calcification related molecule)５）炎症性マーカー (inflammatory biomarker)
３．研究者氏名：赤尾浩慶・医学部・准教授・循環器内科学

４．研 究 目 的
近年、生活習慣の欧米化や高齢人口の増加により狭心症や心筋梗塞などの動脈硬化性心疾
患は増加の一途を辿り、その克服は大きな社会課題である。冠動脈硬化症による狭窄病変に対し、心臓カテーテルでの病変部のバルーン拡張やステント留置術が行われるが、冠動脈硬化症では、(1)高度な石灰化などの進行病変、(2)びまん性病変、(3)血管解離などの合併症が多い、(4)再狭窄率が高い、など治療に難渋する未解決の問題も多い。現在高度冠動脈石灰化病
変に対する治療には rotablator での切削術が積極的に行われている。Rotablator 治療は石灰化を始めとする進行した冠動脈硬化症に対する debulking device であり、動脈壁の病変を赤血球サイズ以下に粉砕して削り取り、血管壁構成成分が冠循環に流出し、体循環に一定時間停滞すると考えられる。そのため、治療後に冠循環から体循環に流出する動脈硬化壁由来分子および細胞を解析し、石灰化関連分子、細胞外マトリックス代謝関連分子とその調節機構の変動を炎症性マーカーの推移とともに臨床的、細胞生物学的に分析し、進行したヒト冠動脈硬化症の病態を明らかにし、早期発見、新たな治療法および予防法の開発へつなげることを目的とする。
５．研 究 計 画
(1) 末梢血中の石灰化関連分子濃度の測定
Rotablator 施行前、施行直後、3 時間後、24 時間後の各分子（オステオポンチン、オステオプ
ロテゲリン、オステオカルシン、Fetuin-A）の体循環血中濃度を末梢血から測定し rotablator
施行前後での経時的変化の有無を調べる。
(2) 細胞外マトリックス代謝関連分子濃度の測定
同時に細胞外マトリックス代謝関連分子である MMPs、TIMPs、Tenascin C (TNC) を測定し、(1)との相互関係を考慮して、その測定意義を解析する。
(3) 炎症性マーカー濃度の測定
同時に炎症性マーカーである高感度 CRP (hsCRP)、ペントラキシン 3 (PTX3) を測定し、(1)との相互関係を考慮して、その測定意義を解析する。

− 43 −

(4) microRNA の測定
冠動脈疾患と強い関連性のある microRNAs (miRNAs) の中で、特に血管平滑筋、マクロファージとの関係が報告されている miR-181a, miR-133a, miR-155 を治療前後の末梢血で測定する
ことにより、これら miRNAs が冠動脈壁内に存在する可能性およびヒト冠動脈硬化症との関連性を調査する。
６．研 究 成 果
Rotablator 治療を施行した連続 90 症例（M 55, F 35: 平均年齢 69±9 歳）を登録した。
(1) 末梢血中の石灰化関連分子濃度の測定
・Rotablator 施行前、施行直後、3 時間後、24 時間後に静脈血採血を施行しオステオポンチン、
オステオプロテゲリン、オステオカルシン、Fetuin-A を測定した。
・オステオポンチン値 (mean±SD, ng/ml) は治療直後から有意に増加を認め（治療前 759.8±506.1、治療直後 898.2±532.0）、3 時間後 (1276.8±48.2) にピークを認め、その後 24 時間後には低下した (892.4±590.2) (p<0.0001)。
・しかし、オステオプロテゲリン、オステオカルシン、Fetuin-A 値に関しては治療前後での有意な変化は認められなかった。
・治療前のオステオポンチン値とオステオプロテゲリン値は有意な正相関 (p<0.0001, r=0.471)を認めそれぞれは hsCRP (p=0.0001, r=0.398, p=0.0118, r=0.272) と PTX3 (p<0.0001, r=0.468,
p<0.0001, r=0.412) とも有意な正相関を認めた。今回石灰化関連分子と炎症との関係を明らかにし現在論文作成中である（第 80 回日本循環器学会学術集会発表 3 月仙台

抄録 Circ J

2016, 80 (suppl.Ⅰ):I-2332）。
(2) 細胞外マトリックス代謝関連分子濃度の測定
・細胞外マトリックス代謝関連分子 MMPs、TIMPs、Tenascin C (TNC) を(1)と同様に経時的に測定した。
・MMP9 値 (ng/ml) は 3 時間後にピークを認め（治療前 34.6±19.7、3 時間後 48.1±43.9）、その後 24 時間後には低下した (37.9±40.5) (p<0.05)。
・TIMP1 値 (ng/ml) は治療 24 時間後に有意な増加を認めた（治療前 138.0±67.9、24 時間後
191.9±65.8）(p<0.0001)。
・TIMP2 値 (ng/ml) は治療 24 時間後に有意な増加を認めた（治療前 62.4±25.0、24 時間後
71.2±27.6）(p<0.05)。
・MMP2、TNC 値は治療前後での有意な変化は認められなかった。
・治療前のオステオポンチン値と TNC 値は有意な正相関 (p<0.0001, r=0.446) を認め、それぞれは hsCRP (p<0.0001, r=0.526, p<0.0118, r=0.449) と PTX3 (p=0.0001, r=0.416, p=0.0097,
r=0.286) ともに有意な正相関を認めた。
・また、治療前の MMP9 値と PTX3 値も有意な正相関 (p<0.0001, r=0.422) を認めた。
(3) 炎症性マーカー濃度の測定
・炎症性マーカーである hsCRP、PTX3 を測定した。

− 44 −

・血管内皮細胞や血管平滑筋、マクロファージ、白血球などから直接産生され動脈硬化と密接な関連をもつ PTX3 値 (ng/ml) は治療直後から増加し（治療前 4.7±3.6、治療直後 5.6±4.1）、
3 時間後 (8.1±5.1) にピークを認め、その後 24 時間後には低下を認めた (7.0±6.2) (p<0.0001)。
・hsCRP 値 (ng/ml) は治療 24 時間後に有意な増加を認めた（治療前 3061±7754、24 時間後8585±13342）(p<0.0001)。
・PTX3 はオステオポンチンと同様治療後 3 時間にピークを認める有意な増加を認めた。また治療前のオステオポンチン値と治療前 PTX3 値とは有意な正相関 (p=0.0001, r=0.416) を認め、さらに両者の上昇幅にも有意な正相関 (p<0.0001, r=0.464) を認めた（ESC Congress 2014発表

8 月 Barcelona 抄録 Eur Heart J (2014) 35 (Suppl 1):643）。

７．研究の考察・反省
今回の研究では rotablator 施行前後での経時的採血により、石灰化関連分子、細胞外マトリックス代謝関連分子、炎症性マーカーの挙動の違いが存在することを見出した。このことは
従来報告されていた動脈硬化関連分子において、動脈硬化壁に存在し動脈硬化発症に関与しているものと、血液中を循環することで動脈硬化に関与しているものとが存在することが示唆された。反省点としては、Rotablator 治療という特殊な device での治療でありかつ、治療終了後 3 時間後、24 時間後の採血を行うため、冠静脈洞からの経時的な採血が施行できず、
冠循環における変化を直接確認することが出来なかったことである。今後採取した検体を用いて microRNA の測定ならびに血管壁由来分子を含むプロテオミクス解析を行うことにより、進行したヒト冠動脈硬化症に存在する蛋白を特定し、動脈硬化進展機序の更なる解明およびその新しい評価法の開発に展開させていきたい。
８．研 究 発 表
該当なし。現在、論文投稿の準備中である。

− 45 −

１．研究課題名：味覚BMI開発のための脳内味覚地図の解明（研究番号S2014-9）

２．キーワード：１）味覚 (gustation)２）中枢神経系 (central nervous system)３）juxtacellular recording 法 (juxtacellular recording)４）ブレインマシンインターフェイス (brain-machine interface)５）孤束核 (solitary nucleus)
３．研究者氏名：薗村貴弘・医学部・講師・解剖学Ⅱ

４．研 究 目 的ブレインマシンインターフェイス (BMI) の近年における進歩はめざましく、自分の頭で考えた通りに動く義手の開発や、聾者の聴覚を取り戻す人工内耳の開発、さらにはそれらの臨床応用も盛んに行われている。その一方で、味覚障害や、舌癌、事故などで舌やその周囲を喪失し、味覚を失ってしまった人に対する味覚 BMI の試み
は、未だ行われていない（図１）。
口腔の主な機能は栄養の摂取であるが、単に食物摂取ではなく自らの口を通して「美味しく食べること」は QOL の向上に極めて重要であり、当然のことながら、味覚は「美味しく食べること」について最重要な感覚である。本研究は、人生の最後の瞬間まで美味しく、かつ、安心安全に食べることの重要性、そしてそのために、口から味を感じながら生活することの重要性を再認識し、味覚 BMI の開発を目指した。
味覚BMI の実用化に向けて必要な要素は、大きく以下の３つである。
(1) 末梢部位の味覚センサーの開発(2) 末梢味覚センサーと中枢味覚神経回路との接続方法とそのツール開発(3) 中枢味覚神経回路の詳細な全貌、『脳内の味覚地図』の解明
それぞれの現段階での開発状況を鑑みると味覚 BMI の実現に向けて現時点で最も重要となるのは(3)の詳細な『脳内の味覚地図』である。『脳内の味覚地図』の概要はこれまでに解析されており、舌からの味覚は、延髄の孤束核から、視床の後内側腹側核小細胞部 (VPMpc)
で中継され大脳皮質へ至る。しかし、舌で感じる甘味、苦味、酸味、塩味、旨味の５種類の味、それぞれについて、別々の細胞が平行して情報を伝えるのか、または単独の細胞が、何種類かの味を同時に伝えるのか、またその詳細な位置はそれぞれどこなのかなどが不明であるため、BMI の電極を刺す場所が定まらない。
そこで本研究では、近年、新たに開発された細胞外記録法である juxtacellular recording 法
を用いて、甘味、苦味、酸味、塩味、旨味の５種類の味、それぞれの味刺激を脳に与えながら、標的味覚神経細胞を単一細胞レベルで可視化し、それぞれの味が、どの位置に、どのよ− 47 −

うなパターンで情報を伝えているのか電気生理学的な裏付けのもとで、形態学的に明らかにし、味覚 BMI、すなわち「人工の舌」の実用化へ向けて基礎的な知見を供給することを目的とした。
５．研 究 計 画
１０週齢の Wistar ラットをイソフルラン麻酔下とデク
スメデトミジン鎮静下で定位脳手術装置に固定し、背部から頸椎を剖出させて延髄の孤束核へガラス電極を刺入し、そのラットの舌に対して、甘味、苦味、酸味、塩味、旨味の５種類を本実験用に作製した味覚刺激装置を用いて味刺激を加え、刺激に反応して発火する孤束核の神経細胞を juxtacellular recording 法を用いて単一ユニット記録を行い、ガラス電極経由で、テトラメチルローダミン
カダベリンを注入した。これらのラットを灌流固定後、脳を摘出して連続凍結切片を作製し、免疫組織化学法を用いて可視化して、デジタル標本作
製システムにより全標本を網羅的に撮影し完全なトレースを行って三次元再構築し、形態学的な所見を取得した。
６．研 究 成 果
juxtacellular recording 法による記録と標識を１５例程度行
い、詳細な孤束核からの味覚地図を作成するために、現在、三次元再構築ソフトウエア Amira を用いて立体再構築を行っている。また、juxtacellular recording 法と並走して従来型の形態学的手法によって、ラット脳内味覚地図の作成も随時行い、
味覚中継核である結合腕傍核 (parabrachial nucleus) から、これまで報告されていた視床後内側腹側核小細胞部(parvicellular part of the posteromedial ventral thalamic nucleus;
VPMpc) の 他 に 、 視 床 の 中 心 傍 核 (paracentral thalamic
nucleus; PC)、内側中心核 (central medial thalamic nucleus; CM)、
束傍核 (parafascicular thalamic nucleus; PF) 等への投射がある
ことを、順行性トレーサーの biotinylated dextran amine (BDA)を用いて明らかにした。また、これらの視床中継核から、線条体 (CPu)、扁桃体-線条体移行部 (ASt)、扁桃体外側核 (LA)等への投射も明らかにした。
７．研究の考察・反省
新たな細胞外記録法である juxtacellular recording 法は、その手法の特性上、やや遠隔投射− 48 −

先の標識が不鮮明となる確率が一定割合あったが、ここ数年で、より明瞭で正確な可視化法が順次開発されており、はるかに高い成功率で可視化できる環境が整いつつある。これらのより高感度の手法を導入することで、より正確な脳内味覚地図の完成が期待できる。
またラットなどの齧歯類と、ヒトなどの霊長類は、味覚神経回路に異なる部分があるため(Pritchard et al., Exp. Neurol. 165: 101-117, 2000、Chandrashekar J et al., Nature 444: 288-294,
2006) ラットの味覚を解析するだけでは BMI への応用に向けては不充分と考え、現在はラットと並行して霊長類であるコモン・マーモセットを用いた研究を進行させている。コモン・
マーモセットは、日本が世界に先駆けて実験動物化に取り組んでおり (Sasaki et al., Nature
459: 523-527, 2009)、トランスレーショナルリサーチの切り札として現在注目が集まっている。
このコモン・マーモセットに juxtacellular recording 法を用いて「霊長類の脳内味覚地図」を明らかにすること、さらに、これに加えて味覚 BMI の臨床応用に向けて、よりヒトに近い形
での具体的な術式や電極の選定などの検討を行っていく。
さらにラットまたはマーモセットの脳に実際に味覚センサーを接続し、これによって得られるデータを再度フィードバックして『脳内の味覚地図』のより高度な解析を行うことを計画している。
８．研 究 発 表
Iwai H, Kuramoto E, Yamanaka A, Sonomura T, Uemura M, Goto T. Ascending
parabrachio-thalamo-striatal pathways: Potential circuits for integration of gustatory and oral motor
functions. Neuroscience 2015; 294: 1-13.
Abstract: The medial parabrachial nucleus (MPB) and external part of the medial parabrachial
nucleus (MPBE) relay gustatory, oral mechanosensory and other visceral information in the rat brain
and reportedly project not only to the parvicellular part of the posteromedial ventral thalamic nucleus(VPMpc) but also to the ventrocaudal part of the intralaminar thalamic nuclei. Generally, theintralaminar thalamic nuclei project topographically to the caudate putamen (CPu); however, it isunclear where the ventrocaudal part of the intralaminar thalamic nuclei projects within the CPu. Thus,
we visualized neural pathways from the MPB and MPBE to the CPu via the ventrocaudal part of theintralaminar thalamic nuclei using an anterograde tracer, biotinylated dextran amine, and a retrograde
tracer, cholera toxin B subunit. We found that the MPB and MPBE sent a relatively stronger input tothe ventrocaudal part of the intralaminar thalamic nuclei such as the oval paracentral thalamic nucleus(OPC), central medial thalamic nucleus (CM) and parafascicular thalamic nucleus (PF) andretroreuniens area (RRe) as compared to the VPMpc. In turn, these thalamic nuclei projected to theventral part of the CPu with the topographical arrangement as follows: the OPC to the ventrocentral
part of the CPu; ventrolateral part of the PF to the ventrolateral part of the CPu; and the caudal part of
the CM, ventromedial part of the PF and RRe to the ventromedial part of the CPu. Further, we foundthat the VPMpc rather projected to the interstitial nucleus of the posterior limb of the anterior
commissure than the CPu. The ventral part of the CPu is reported to be involved in jaw movement as− 49 −

well as food and water intake functions. Therefore, these parabrachio-thalamo-striatal pathways that
we demonstrated here suggest that gustatory and oral mechanosensory information affects feeding
behavior within the ventral part of the CPu.

− 50 −

１．研究課題名：Saffold ウイルス感染は１型糖尿病誘発のトリガーとなるのか？（研究番号S2014-10）
２．キーワード：１）Saffold ウイルス (Saffold virus, SAFV)
２）１型糖尿病 (type 1 diabetes)
３）急性膵炎 (acute pancreatitis)
３．研究者氏名：姫田敏樹・医学部・准教授・微生物学

４．研 究 目 的
ヒトを自然宿主とするカルジオウイルスとして 2007 年に同定された Saffold ウイルス(SAFV) は、主に胃腸炎、上気道炎などから検出されるが、急性膵炎の小児の便から SAFVが検出されたことが小児感染症学会において報告され、同時期に申請者らは、緩徐進行型１型糖尿病を含む２例の１型糖尿病剖検例の膵臓に SAFV 抗原が観察されることを明らかにした。これらの結果は、SAFV の膵臓に対する病原性を強く示唆しており、今後、SAFV が１型糖尿病の誘発要因のひとつとして注目される可能性は極めて高い。そこで本研究では、SAFV の膵臓に対する病原性を明らかにすることを目的とし、１型糖尿病および急性膵炎を対象として、SAFV 感染と疾患の関係を調査した。
５．研 究 計 画
申請者らはこれまでに、１型糖尿病剖検例２例、２型糖尿病９例および非糖尿病２例の膵
臓パラフィン包埋切片と抗 SAFV 抗血清を用いた免疫組織化学染色により、１型糖尿病においてのみ SAFV 抗原の染色性が認められることを確認した。そこで本研究では、引き続き剖
検例および末梢血を対象として、免疫染色によるウイルス抗原の検出、ならびに、RT-PCR
によるウイルスゲノムの検出を試みた。免疫組織学的解析では、ホルマリン固定パラフィン
包埋 (FFPE) 膵臓組織切片をウサギ抗 SAFV-3 抗血清（高知県衛生研究所 細見卓司 先生より分与）を用いて免疫染色しウイルス抗原の検出を試みた。末梢血における SAFV ゲノムの検出は、糖尿病患者の血液（４５例）を対象として RT-PCR により実施した。また、手足口病様症状を呈した後に急性膵炎を発症し他のウイルス感染が否定的な小児を対象とし、SAFV 遺伝子の検出および抗体価の測定を行った。
６．研 究 成 果
２型糖尿病剖検例 FFPE 膵臓組織切片９例を追加解析したが、SAFV 抗原は検出されなかった。１型糖尿病剖検例は追加解析できなかったが、これまでに１型糖尿病では２例中２例
が SAFV 抗原陽性であるのに対し、２型糖尿病では１８例全てが SAFV 陰性となり、今回得られた２型糖尿病における SAFV 抗原陰性結果は、SAFV 感染が１型糖尿病に特異的である可能性を示唆する傍証として価値あるものと考えられる。糖尿病患者の末梢血単核球（４５− 51 −

例）を対象として行った RT-PCR では、５例から SAFV ゲノム (5’UTR) が検出された。これ
ら５例の病型の内訳は、１型２例、２型１例、型不明２例であり、１型糖尿病に特異的な傾向はみられなかった。ただし、本結果は季節性（流行性）の一過性感染を否定できない条件であるため、最終的な結論を得るためには、引き続き規模を拡大した解析が必要である。一方、手足口病様症状を呈した患者（１例）の便および血液の解析からは、SAFV ゲノムが検出され、著しい抗体価の上昇が認められ報告した。この結果は、SAFV 感染が急性膵炎に関わる可能性を示しており、SAFV の膵臓病原性を示唆する症例として重要であると考えられた。
７．研究の考察・反省
免疫組織学的解析では、１型糖尿病剖検例の FFPE 膵臓組織切片（２例中２例）における浸潤組織球に強い抗 SAFV-3 抗体染色性が観察され、２型糖尿病１８例および非糖尿病２例においては、全く染色性が認められなかった。この結果は、SAFV 感染が１型糖尿病と密接に関連している可能性を示唆していると考えられた。末梢血を対象とした SAFV ゲノムの検出では、１型および２型の両方から陽性例が認められたものの、季節性感染の可能性を否定しきれず、１型糖尿病との因果関係を明らかにするには至らなかった。一方、急性膵炎患者
からは SAFV 感染を示す結果が得られ、SAFV の膵臓病原性を強く示唆するものと考えられた。しかし、これらの疫学的解析では、症例の集まり具合が律速となり、病原性解明に想定以上の時間がかかるという問題が浮上した。そこで今後は、モデルマウス作出を視野に入れた SAFV 感染受容体の同定や、分子ウイルス学的観点からのウイルス蛋白の機能解析等を主として、SAFV の病原性解明を進めていきたい。
８．研 究 発 表
Ito H, Miyagaki S, Sakaue S, Matsui F, Katsumi Y, Otabe O, Torii J, Itagaki T, Himeda T, Okuwa T,
Ohara Y. Saffold cardiovirus infection in a 2-year-old boy with acute pancreatitis. Jpn J Infect Dis. (inpress), doi: 10.7883/yoken.JJID.2015.488.
Abstract: Saffold cardiovirus (SAFV) identified from a stool sample in 2007 is thought to be
associated with respiratory disease and gastroenteritis. On the other hand, the animal experimentssuggested that the major viral load following SAFV intraperitoneal inoculation into mice is thepancreas. However, up to date, there have been no reports of SAFV being detected from patients withpancreatitis. This report presents a unique case which developed a relapsing acute pancreatitis (AP)after hand, foot and mouth disease and suspected of SAFV-1 infection. A 2-year-old boy was admitted
to the hospital because of severe abdominal pain. His serum amylase and lipase levels were elevated.
Enhanced computed tomography showed pancreatic swelling and dilation of main pancreatic duct,leading to the diagnosis of severe AP. The viral genome of SAFV-1 was detected by RT-PCR fromfecal samples. Furthermore, serum neutralization titer against SAFV was elevated during the AP and
decreased after 1 year. These findings strongly suggest the patient developed an SAFV-1 infection− 52 −

concurrent with AP. Therefore, we propose a cohort study is required to clarify a relation between
SAFV and the AP hereafter.

− 53 −

１．研究課題名：中枢神経原発悪性リンパ腫におけるインターロイキン 10 レセプターおよびシグナル伝達分子による増殖機構の解明（研究番号S2014-11）

２．キーワード：１）中枢神経系リンパ腫 (central nervous system lymphoma)２）び漫性大細胞型B細胞リンパ腫 (diffuse large B-cell lymphoma)
３）インターロイキン10 (interleukin-10)４）脳脊髄液 (cerebrospinal fluid)５）シグナル伝達分子 (signaling molecule)３．研究者氏名：笹川泰生・医学部・助教・脳神経外科学（採択時）

４．研 究 目 的
中枢神経悪性リンパ腫（び漫性大細胞型B細胞リンパ腫）の生存期間中央値は約3年であり、脳腫瘍の中でも予後不良な悪性新生物である。予後を改善するために、早期診断と有効な治療薬の確立が重要となる。
本研究ではヒト中枢神経悪性リンパ腫の増殖におけるインターロイキン 10 レセプターと関連シグナル伝達分子の関与を臨床病理学および培養細胞を用いて検討する。これにより、
ヒト中枢神経悪性リンパ腫の IL-10 の関連シグナル分子の抑制を介した中枢神経悪性リンパ腫の分子標的療法への基盤を確立する。
５．研 究 計 画
実験1: IL-10レセプターおよび関連シグナル分子を免疫組織学的に検討する。手術で切除した検体（病理標本）を用いて免疫組織学的にIL-10レセプターと関連シグナル（分子JAK1-3,
STAT1-6）の発現を検討する。
実験2: 実験1で施行した結果をもとにして、ウェスタンブロット法による各シグナル分子のタンパク定量解析を行う。
６．研 究 成 果
リンパ腫細胞におけるIL-10およびレセプターの免疫組織学的検討ではリンパ腫細胞内に過剰発現を認めた。関連シグナルにおいては JAK2、およびSTAT3の発現を認めた。しかしながら、これらの発現様式は脳脊髄液IL-10との相関は明らかではなかった。
７．研究の考察・反省
中枢神経リンパ腫患者においてIL-10の過剰分泌が証明された。またJAK2およびSTAT3の発現も認め、リンパ腫増殖の関連シグナル因子である可能性が示唆された。ウェスタンブロット法による各シグナル分子のタンパク定量解析を行っている段階である。また今後、培養細胞を用いて中枢神経リンパ腫患者の増殖においてIL-10の過剰分泌がどのように関与してい− 55 −

るのか解明したい。
８．研 究 発 表なし

− 56 −

１．研究課題名：マウスを用いた胃上皮再生の蛍光イメージング（研究番号S2014-12）

２．キーワード：１）バイオセンサー (biosensor)２）生体イメージング (in vivo imaging)３）二光子励起顕微鏡法 (two photon microscopy)
４）消化管 (gastrointestinal tract)５）上皮再生 (epithelial regeneration)
３．研究者氏名：武田

はるな・医学部・助教・病理学Ｉ

４．研 究 目 的
急性の胃潰瘍は、非ステロイド性消炎鎮痛薬の服用やストレスによる胃酸分泌の亢進などによって引き起こされる。胃潰瘍の修復は、潰瘍部位に炎症性細胞が蓄積してサイトカインを分泌し、さらに、周囲の正常胃粘膜細胞が潰瘍部に移動し増殖することで修復されていくと考えられている。In vitro の実験などから上皮の修復過程にはリン酸化酵素 ERK の活性化を伴う細胞増殖などが関わっていることが示されているが、生体の胃腺は複雑な三次元構造
をとっており、二次元における修復過程と同じ機構で制御されているかは検証されていない。
近年蛍光タンパク質を利用したバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウス（FRETマウス）の開発と、二光子励起顕微鏡の開発により、生体内において細胞レベルで ERK などのリン酸化酵素の活性化状態を視覚化できるようになってきた。これらの技術を用い、胃潰瘍のモデルマウスにて生体イメージングを行うことで上皮修復に関与する分子機構と細胞動態を明らかにする。
５．研 究 計 画
① 胃潰瘍マウスモデルの作成
インドメタシンの投与による胃潰瘍形成の報告 (Wallace et al., Am J Pathol, 178, 2011) を参考に、薬剤の投与量・方法などを定め、病理組織切片を作製して潰瘍から修復過程までの変化を経時的に観察し、実験系の確認を行う。
② 生体イメージング
ERK や PKA の活性を検出する FRET バイオセンサーを発現するトランスジェニックマウ
スに胃潰瘍を引き起こし、その後二光子励起顕微鏡にて生体イメージングを行う。マウスの胃を二光子励起顕微鏡でイメージングするには、麻酔したマウスを開腹した後、胃の漿膜側に顕微鏡の対物レンズを当てて数分ごとに画像を取得するため、マウスの固定方法や観察を行うための条件確立を行う。
６．研 究 成 果
インドメタシン (20 mg/kg) を経口投与した後、24 時間後と 6 日後に胃の病理組織切片を− 57 −

作成し観察したところ、24 時間後には上皮の脱落が誘導され、6 日後には再生上皮が潰瘍部を覆っている像が確認された。次に、FRET マウスにて胃潰瘍を誘導し、24 時間後に二光子励起顕微鏡を用いた生体イメージングにて潰瘍部の観察を行った。胃は小腸に比べて筋層が厚く、内腔の胃上皮が対物レンズから離れるため焦点を合わせることが難しく、さらに蠕動
運動や拍動の影響を受けるため同じ部位を長時間観察することが困難であった。また、胃の漿膜側から潰瘍部を同定することが困難であったことなどから消化管上皮の再生過程を観察する別のモデルが必要となった。
そこで、拍動の影響を受けにくく、筋層が比較的薄い小腸において再生上皮の動態を観察することとした。小腸は観察部位を体外に取り出せるため拍動の影響を受けにくく、さらに、観察部位の両端を閉じて中を生理食塩水で満たし膨らませた状態にすることで蠕動運動の影響を低減させることができる。小腸において上皮損傷を引き起こすために、虚血性腸炎マウ
スモデルの作成方法を文献 (Guan et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 297, 2009) を参考にしながら行った。まず、麻酔したマウスを開腹後、回腸を栄養する腸管膜動脈をクリップにより血流を遮断し、50 分から 1 時間虚血状態にすることで上皮損傷を誘導する。その後クリップを解除して腸を体内に戻し、上皮の再生を促す。このモデルでは血流を遮断した
血管によって支配される部分に上皮損傷が誘導されるため、2 光子励起顕微鏡観察の際に損傷部位を漿膜側より特定しやすいという利点がある。
虚血後 24 時間、48 時間における小腸の病理組織切片を作成し観察した。虚血誘導後 24 時
間では上皮細胞が壊死している様子が観察され、好中球などの炎症性細胞が集積していた。
虚血後 48 時間では、損傷部位を覆い始めている再生上皮が観察された。これらの結果から、再生上皮の動態を 2 光子励起顕微鏡で観察するには虚血誘導後 48 時間が適していることが示された。
ERK の活性を検出する FRET バイオセンサーを発現するマウスに虚血性腸炎を引き起こし、
48 時間後に上皮損傷部位を 2 光子励起顕微鏡で観察したところ、損傷部位には炎症細胞が集積しており、上皮細胞との区別が困難であった。そこで、腸上皮細胞特異的に FRET バイオ
センサーを発現するモデルを導入することとした。これは腸上皮細胞特異的発現を示す蛋白質である Villin のプロモーター制御下で組み換え酵素・Cre が発現するマウスと、lox-STOP-lox
配列を 5’上流に持ち Cre 存在下でのみ FRET バイオセンサーが発現するマウスを交配し、腸上皮細胞特異的に FRET バイオセンサーを発現させるシステムである。このマウスに虚血性腸炎を誘導し、上皮損傷部位を二光子励起顕微鏡で観察を行ったところ、損傷部位を覆う再生上皮で ERK の活性が高いことが明らかになった。
７．研究の考察・反省
胃潰瘍による上皮損傷部位を生体イメージングにて観察することはできなかったが、代わりとなる虚血性腸炎のマウスモデルを確立し、小腸の上皮損傷・修復部位の観察が可能となった。今後、再生上皮細胞における ERK の活性化が細胞増殖に関与しているのか、細胞運動に関与しているのかについて明らかにし、さらに ERK 活性化の分子機構を解明することを目− 58 −

的にして観察を継続する予定である。また、炎症時の好中球においては PKA が ERK 経路を負に制御しているという報告 (Mizuno et al., JEM, 211, 2014) があることから、PKA のバイオセンサーを発現するマウスを用いて上皮細胞においても同様の機構が保持されているかを明らかにしていく予定である。
８．研 究 発 表
該当なし

− 59 −

１．研究課題名：SPECT-MRI 融合画像による嗅神経障害の自動評価システムの開発（研究番号S2014-13）
２．キーワード：１）嗅神経 (olfactory nerve)２）Tl-201 (thallium-201)３）SPECT-MRI
４）画像融合 (image fusion)５）定量解析 (quantitative analysis)
３．研究者氏名：奥田光一・一般教育機構・講師・物理学

４．研 究 目 的
近年、感冒や頭部外傷等による嗅覚障害患者は、嗅神経から嗅球への塩化タリウム (201Tl)の移行が顕著に障害されることがわかってきた。さらに、嗅神経に投与された 201Tl の嗅球への移行率と嗅球サイズには相関性が認められている (r=0.73, P<0.001) [Shiga H,…, Okuda K etal. PLoS One. 8, e57671 (2013)]。201Tl の嗅球への移行率を定量評価するため、まず MRI 画像
にて嗅球の位置および大きさを同定し、嗅球内の 201Tl の放射性カウントを SPECT 画像で計測する必要がある。そのため、核医学診断装置である SPECT 機器と X 線 CT 装置を組み合わせた SPECT-CT で患者を撮像した後に、部屋を変えて MRI 画像を撮像する。そして、CT と
MRI の画像間で位置合わせを行うことで、擬似的に SPECT と MRI 画像を同一機器で撮像したかのような、SPECT-MRI 画像を作成し、解析に用いてきた。本研究では嗅神経障害の自動評価システムの開発を行うための基礎検討を実施した。検討する項目は以下の 2 点である。
Ⅰ．SPECT-CT 画像と MRI 画像間の位置合わせの再現性評価
Ⅱ．正常症例および嗅覚障害患者における 201Tl の嗅球への移行率の計測
５．研 究 計 画
Ⅰ．SPECT-CT 画像と MRI 画像間の位置合わせの再現性評価
9 本の飲料用 PET ボトルを 3×3 列に並べ、対角方向の 3 本に水を満たした状態で SPECT-CT
画像と MRI 画像を撮像する。画像解析ソフトウェアにて MRI 画像のみ X,Y,Z 方向にそれぞれ+10mm ずらした 3 枚の画像を作成し、さらに 3 軸に対して+5 度回転させた画像をそれぞれ作成する。初期条件での SPECT-CT 画像と MRI 画像間の位置合わせの結果 (X 座標 Y 座標
Z 座標のシフト量およびロール角(φ)、ピッチ角(θ)、ヨー角(ψ)) を基準とし、擬似的に画像をスライドさせた場合と回転させた場合の MRI 画像と SPECT-CT 画像の位置合わせ後の座標および角度を調査する。
Ⅱ．正常症例および嗅覚障害患者における 201Tl の嗅球への移行率の計測
健常ボランティア 1 例および嗅覚障害患者 11 例を対象にして 201Tl の嗅球への移行率を計測する。移行率は嗅球での 201Tl の放射性カウントを、投与した 201Tl の放射性カウントで除− 61 −

算することで算出する。投与した 201Tl の体内動態は SPECT 画像にて視覚的に判断することが可能であるため、関心領域を設定し、領域内のカウントを求める。しかし、嗅球での 201Tlの放射性カウントは、MRI 画像で嗅球をトレースすることで関心領域の形状を決定し、その形状を SPECT 画像に複写することで、計測することが可能となる。移行率は頭部の冠状断面、
矢状断面および両データの平均値として表す。
６．研 究 成 果
Ⅰ．SPECT-CT 画像と MRI 画像間の位置合わせの再現性評価
基準画像から X,Y,Z 方向にそれぞれ 10mm ずらした MRI 画像と SPECT-CT 画像を位置合わせした後の座標 (X,Y,Z) および回転角度 (φ,θ,ψ) は、基準となる座標および角度から、それぞれ 0.00±0.02 mm、-0.08±0.05 mm、-0.09±0.10 mm、および 0.00±0.00 deg、0.06±0.06 deg、
-0.10±0.00deg に分布していた。一方で基準画像から 5 度回転させた MRI 画像の変動は X,Y,Z
座標にて、-0.03±0.10 mm、-0.15±0.10 mm、-0.01±0.10 mm、φ,θ,ψ回転角では-0.02±0.03
deg、0.04±0.10 deg、-0.06±0.08 となった。
Ⅱ．正常症例および嗅覚障害患者における 201Tl の嗅球への移行率の計測
健常ボランティア 1 例の 201Tl の嗅球への移行率は、冠状断面、矢状断面および両断面の平均値にて、28%、51%、35%となった。一方で、嗅覚障害患者 11 例の移行率は、6.4±7.0%、
6.1±4.2%、6.1±4.4%となった。また、患者 11 例における嗅球の放射性カウントおよび投与した放射性カウントの変動係数率は 76%-131%であった。
７．研究の考察・反省
SPECT-CT 画像と MRI 画像間の位置合わせの再現性は良好であり、臨床での使用に十分耐えうる精度であった。頭部領域は、呼吸や心拍が画像に及ぼす影響が少ないため同様の精度
で位置合わせが行えるものと推測される。嗅神経障害の自動評価システムを試作するにあたり、自動的に関心領域を設定することを今後計画しているが、症例毎の放射性カウントのばらつきが大きいため、相対的な放射性カウントを用いたアルゴリズムが必要であることが示唆された。
８．研 究 発 表なし

− 62 −

１．研究課題名：アナフィラキシーショック時の胃の循環と収縮機能の統合的研究（研究番号S2014-14）
２．キーワード：１）アナフィラキシーショック (anaphylactic shock)２）胃の血液循環 (gastric circulation)
３）胃の運動性 (gastric motility)
４）胃の排出 (gastric excretion)
５）幽門 (pylorus)
３．研究者氏名：九田裕一・医学部・助教・生理学Ⅱ

４．研 究 目 的
アナフィラキシーショックは時として致死的となる緊急性を要する疾患であり、消化器症
状として嘔吐、腹痛、下痢などを伴う。これらの症状に小腸の関与は既知であるが胃の収縮運動亢進の有無や胃の虚血を惹起する胃血流低下の有無、すなわち胃血行動態については不明である。
胃の運動性に関しては、感作された摘出胃平滑筋では抗原暴露により収縮が亢進するにもかかわらず、感作された麻酔ラットでは胃内への抗原投与により胃の内容物の排出は遅延するとの報告がある。
一方、アナフィラキシーショックモデルで胃の収縮と胃の血行動態を検討した報告はない。
本研究は、麻酔下 in vivo のラットアナフィラキシー実験モデルを用いて、アナフィラキシーによる胃病変について、特に胃の運動機能、胃の排泄能、及び胃の血行動態を統合的に検討することを目的とした。
５．研 究 計 画
麻酔下において卵白アルブミンで感作した Sprague-Dawley ラットに抗原を静脈内投与しア
ナフィラキシーショックを惹起させ、体血圧 (SAP)、中心静脈圧を連続的に測定した。さらに出血と血管拡張剤 (sodium nitropreside : SNP) による低血圧反応と比較した。
1) 胃の動脈流量 (GABF) は開腹後に左胃動脈に超音波血流計プローブを装着して連続的に測定した。さらに門脈にカニューラを留置し、門脈圧 (PVP) を測定した。(SAP－PVP) /GABFの式で胃血管抵抗 (GVR) を求めた。
2) 胃内圧 (IGP)・胃排出能 (GE) 測定実験では胃前庭部にチューブを 2 本留置し、1 本から温生理食塩水をマリオット瓶から定圧 (0～2 mmHg) で胃内に灌流した。同時にもう片方のチューブで、胃の収縮性を調べるために IGP を連続的に測定した。さらに食道を結紮し、生
理食塩水の食道への逆流を防いだ。十二指腸を切開してチューブの先端を十二指腸起始部に留置して、胃からの排出液を小ボトルに採集し、その重量を張力トランスデューサーで連続的に測定した。

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６．研 究 成 果抗原の静脈内投与によりアナフィラキシーを惹起すると SAP は低下し、10 分後に最低値になり、その後徐々に回復した。SNP による低血圧では反応初期の血圧低下がアナフィラキシーショックよりも強かった。なお、出血性低血圧はアナフィラキシーショックと同様な SAP となるように脱血した。PVP はアナフィラキシーショック時でのみ反応直後から有意に上昇し、10 分後には抗原投与前と有意な差がない値まで低下した。出血性低血圧、SNP による低血圧では SAP の低下と共に低下した。GABF はアナフィラキシーショックでのみ反応開始直後に一時的に有意に上昇し、その後すぐに投与前と比較して有意に低下した。出血性低血圧、SNPによる低血圧では SAP の低下直後から低下した。GVR はアナフィラキシーショック時のみ反応開始直後に一時的に有意に低下し、その後上昇するというアナフィラキシーショック特異的な反応が見られた。出血性低血圧では SAP の低下後すぐに上昇し、アナフィラキシーショ
ック群よりも有意に高かった。しかし、SNP による低血圧では 9 分以降から有意に低下した。
アナフィラキシーショック時には、IGP の基底圧と収縮圧の有意な上昇が見られたにもかかわらず有意に GE が低下した。出血性低血圧でも IGP の基底圧と収縮圧の上昇が見られた。
しかし、GE は低下する傾向にあったが有意な差は得られなかった。一方で SNP による低血圧ではアナフィラキシーショックとは逆に IGP の収縮圧の有意な低下が観察され、GE は有意に上昇した。
７．研究の考察・反省
GVR はアナフィラキシーショック時において反応開始直後に GABF の増加とともに一時的に低下し血管拡張が見られた。その後 SAP の低下、GABF の低下に伴い上昇した。それに対し出血性低血圧では上昇のみ、SNP による低血圧では低下のみが見られた。以前に報告されたアナフィラキシーショック時の腸間膜動脈や門脈も抵抗値の変化と同様の反応を見せており、内臓ではアナフィラキシーショック時に抗原投与後初期に血管拡張が限定的に生じ、その後血管が収縮して血流の再分配が行われているという可能性を強く示唆した。
以前の報告では胃の内圧が抗原投与後に一時的に低下することが排出の遅延の原因としていたが、今回の研究ではアナフィラキシーショック時において有意に、IGP の基底圧と収縮圧の上昇が見られたにもかかわらず有意に GE が低下するという結果が得られたことから、
アナフラキシーショック時における排出遅延の原因は幽門の収縮だと考えられる。すなわち、幽門が収縮しているにも関わらず、IGP の基底圧と収縮圧が増加している。これらの胃の反応がアナフィラキシーショック時の臨床症状に見られる腹痛、嘔吐への関与が示唆された。
アナフラキシーショック時における排出遅延の原因は幽門の収縮だと考えられるが今回の研究では幽門の収縮を直接測定していない。特にアナフィラキシーショック時と SNP による低血圧時の幽門の収縮を直接観察、比較を今後検討する必要がある。
８．研 究 発 表
現在、執筆中。

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１．研究課題名：中心体における Exon junction complex (EJC) 因子の構成解析（研究番号 S2014-15）
２．キーワード：１）エキソンジャンクション複合体 (EJC)
２）中心体 (centrosome)３）CASC3
３．研究者氏名：辰野

貴則・総合医学研究所・助教・生命科学研究領域

４．研 究 目 的
これまでに RNA 結合因子の 1 つである Y14 (RBM8A) および MAGOH が RNA の代謝にかかわるだけでなく、中心体に局在してその複製に関与することを報告してきた。また、中心体の異常は細胞分裂などの異常を誘発し、特に神経系の細胞の形成に強く関与していることが知られている。そのため、Y14 の異常による血小板減少・橈骨欠損 (TAR) 症候群および不安症の発症においても、Y14 の中心体での機能が関与することが示唆される。
本研究では、中心体複製・成熟に対する Y14 及び Y14 を含む複合体 (EJC) の役割をヒト細胞および分子レベルで解析し、Y14 の中心体局在・制御機構を明らかにすることで疾患発症機構を解明することを目的として研究を行った。
５．研 究 計 画
１）Y14 と複合体を形成する因子の中心体への局在の解析
免疫染色法により、EJC 因子（Y14、MAGOH、eIF4A3、CASC3 等）に関して、中心体への局在の有無を免疫染色法で抗γ-チューブリン抗体による染色シグナルとの共局在を指標として共焦点レーザー顕微鏡により解析する。さらに、ショ糖密度勾配遠心法により、中心体精製を行い、Y14 を含む EJC 因子をウェスタンブロッティングにて検出することで、EJCが中心体との結合を介して中心体に局在しているかを明らかにする。中心体精製はショ糖密度勾配遠心法にて行い、中心体画分の検出は抗γ-チューブリン抗体で行う。
２）Y14 および EJC の中心体への局在に必要な因子の解析
Y14 及び他の EJC 因子との結合が認められた中心体画分を用いて、それぞれの抗体にて免疫沈降を行う。得られた沈降画分及び上清画分をウエスタンブロッティングにより検出することで中心体への局在に関して複合体を形成する必要があるかを明らかにする。また、Y14
及び EJC は RNA 結合タンパクであることから中心体への局在が RNA 依存的であるかを確認するため回収した中心体画分に対して RNase による処理を施したのちに同様に免疫沈降を行い、各因子の検出を行う。免疫沈降物もしくは上清を質量分析にかけ、EJC 因子に結合しているタンパク質を明らかにする。
６．研 究 成 果①

免疫染色により EJC 因子の検出を行った結果、これまでに報告してきた Y14/MAGOH の場− 65 −

合と同様に、eIF4A3 が中心体の局在していることが明らかとなった。しかし、CASC3 に関しては市販で入手可能な抗体および外注で作製した抗体を用いて免疫染色を行ったが、核内が強く染色される等のこれまでの報告と異なる像が得られ、優良な染色像が得られなかったため、局在の検出はできなかった。
②

ショ糖密度勾配遠心法による中心体画分の分画について、ウエスタンブロッティングでEJC 因子の検出を試みた結果、コア因子である Y14、MAGOH、eIF4A3、CASC3 が全て中心体画分に存在することが明らかとなった。
精製を行った中心体画分について、免疫沈降法により中心体に局在する EJC 因子の複合体③の形成状態の解析を試みたが、免疫沈降により EJC 因子の回収を行うことはできなかった。
④

中心体精製時に RNaseA 処理を施し、中心体画分における EJC の局在を検出した結果、RNase 未処理の場合と同様、すべての EJC コア因子が中心体画分に存在することが明らか
となった。

⑤

免疫沈降による EJC 複合体の構成因子の検出が行えなかったため、個々の因子の必要性について検討するため、CRISPR/Cas9 の系を用いて CASC3 のノックアウト細胞を作成し、その細胞について、同様の実験を行った結果、CASC3 非存在下においても他の EJC コア
因子は中心体に局在することが明らかとなった。

⑥

EJC 因子の免疫染色を行う過程で、EJC 因子である Upf2 について、これまでに報告されていなかった核内の局在が示唆されたため、検証を進めたところ、DuoLink の結果から、Upf2が核内において Y14 の近傍に存在し、複合体を形成していることが明らかとなった。

７．研究の考察・反省
本研究の結果から、全ての EJC コア因子が中心体に局在し、また、その局在は CASC3 非依存的であることを明らかにできた。また、その中心体への結合は RNA に依存しないことも明らかにできた。その一方で、免疫沈降の結果が得られなかったことから、個々の因子がそれぞれ中心体に局在している可能性を排除できなかった。今回、これまでの実験に使用してきた接着系細胞である HeLa 細胞を継続して使用したが、接着系細胞においては、密度勾配遠心法による中心体の精製効率が低いとこが知られていることから、免疫沈降がうまくできなかった原因として、量的な問題である可能性が覗われ、質量分析による EJC 複合体の構
成因子の検出には進めなかった。そのため、浮遊細胞系について、検討を行う必要性があると考えられるが、浮遊細胞については、中心体画分の精製以外の実験において困難である点が存在する。従って、今後、両種の細胞について検討を行い、より良い方法を模索した上で中心体画分における EJC 複合体の構成を明らかにしたい。
８．研 究 発 表
Tatsuno T, Nakamura Y, Ma S, Tomosugi N, Ishigaki Y. Nonsense‑mediated mRNA decay factor
Upf2 exists in both the nucleoplasm and the cytoplasm. Mol Med Rep 2016; 14: 655-660.
Abstract: Upf2 protein predominantly localizes to the cytoplasmic fraction, and binds to the exon

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junction complex (EJC) on spliced mRNA. The present study aimed to determine the cellular sitewhere the interaction between Upf2 and EJC occurs. First, the cell lysate was fractionated into thecytoplasm and nucleoplasm, and western blotting to detect levels of Upf2 protein was performed.
Upf2 was clearly detected in the cytoplasm and in the nucleoplasm. Secondly, immunostaining was
performed, and the majority of Upf2 was detected in the cytoplasmic perinuclear region; a small
quantity of Upf2 was detected in the intranuclear region. RNase treatment of the cells reduced theUpf2 immunostained signal. The immunopurified fractions containing nuclear and cytoplasmic Upf2
also contained one of the EJC core factors, RBM8A. These results implied the existence of Upf2 in
the nucleoplasm and the cytoplasm, and it appeared to be involved in the construction of the mRNA
complex. In order to verify the construction of Upf2‑binding EJC in the nucleoplasm, an in situ
proximity ligation assay was performed with anti‑Upf2 and anti‑RBM8A antibodies. These results
demonstrated that their interaction occurred not only in the cytoplasmic region, but also in theintranuclear region. Taken together, these results suggested that Upf2 combines with EJC in both thecytoplasmic and the intranuclear fractions, and that it is involved in mRNA metabolism in humancells.

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201４

平成 2６年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書編 集
発行所

平成 2８年 1０月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

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