上原記念生命科学財団研究報告集, 30 (2016)

13. 抗ベーチェット病医薬化学基盤開発
野口博司*静岡県立大学 薬学部 生薬学教室
Key words：ベーチェット病，HLA，分子認識，分子動力学シミュレーション，構造生物学

緒言ベーチェット病（BD）は、口腔内のアフタ性潰瘍、眼症状、皮膚症状、外陰部潰瘍など、全身の臓器に急性の炎症を起こす原因不明の難治性炎症疾患であり、現在でも失明率は高い。BD は 1972 年に難病指定され、病因･病態が研究されてきたが、未だ原因は明らかとされておらず、新たな治療法の開発にむけた病因･病態研究の新展開が求められている。これまでの研究から、発症には遺伝因子と環境的因子があると考えられており、遺伝因子としてヒト白血病抗原HLA（human leukocyte antigen）のハプロタイプ HLA-B*51:01 や HLA-A*26:01 等と高い相関を示すことが認められている。SNP（single nucleotide polymorphism）解析の進歩によって抗原ペプチドの結合部位近傍にアミノ酸残基の変異が見いだされたが、BD 発症の分子メカニズムの解明には至っていない。BD はシルクロード病とも称され中東から日本、韓国にわたる地域に高頻度にみられる。従って、本病に関する研究は東アジア、特に日本が先導的に取り組むべき課題である。本研究では、BD 発症の最初の免疫応答に関わり、第一の疾患感受性遺伝子である HLA-B*51:01 とHLA-A*26:01 に着目した。HLA は 2 つのポリペプチド鎖、α 鎖と β 鎖から構成されるタンパク質であり（図 1A）、α 鎖に存在するペプチド結合溝を介して抗原ペプチドと結合し（図 1B）、T 細胞表面の受容体 TCR（T cell receptor）に抗原を提示する。HLA の多様なエピトープ認識機構に関して、これまで幾つかのエピトープペプチドとの複合体 X
線結晶構造解析が報告され、相互作用メカニズムが明らかになっている。しかし、BD 発症に関わる原子レベルの構造基盤はほとんど得られていない。また、2012 年に McCluskey、Rossjohn、Purcell らによって抗 HIV 薬アバカビルとHLA-B*57:01 との複合体構造が報告され、アバカビル過敏症のメカニズムが原子レベルで明らかとなった１）。そこで本研究では、BD 発症に関与する HLA のエピトープ選択性を分子動力学（MD）シミュレーションによって明らかにすると共に、実験的手法によるエピトープ選択性の解明と HLA のエピトープ選択性を制御する低分子化合物の探索基盤の構築を目指し、組換え HLA タンパク質の調製を行った。

方法、結果および考察
１．MD シミュレーションによる HLA のエピトープ選択性の解析
BD 発症に関わる HLA のエピトープ選択性を明らかにするため、BD 発症に関わる HLA-B*51:01 と HLA-A*26:01、
BD 発症に関与しない HLA-B*35:10 と HLA-A*11:01 を対象に、BD 発症に関わると考えられている 9 アミノ酸残基（ AAAAAIFVI ） か ら な る MICA-TM （ major histocompatibility complex class I chain related gene Atransmembrane）ペプチドとの複合体構造について、プログラム AMBER10 を用いた MD シミュレーションを行った

TIP3P で発生させた約 65,000 原子の水分子を含む 86 × 90 × 88 Å3 の区画に入れた。系には周期境界条件を課し、エネルギー最小化と平衡化の後、時間ステップを 2 fs とし、等圧･等温アンサンブル（NTP）で 50 ns の計算を行った。一般に、HLA クラス I のペプチド結合溝には少なくとも５つのサブサイト（S1-S2、S3、S4S6、S7、S8-S9）があることが知られている（図 1）。

２）。初期構造はプログラム*現所属：日本薬科大学 薬学教育推進センター
1図 1． HLA クラス I の構造（A）リボンモデルで示した HLA クラス I の基本構造。HLA は 2 つのポリペプチド鎖、α 鎖（緑）と β 鎖（シアン）から構成される。α 鎖は 3 つのドメイン、α1、α2、α3 に分けられる。α1 ドメインと α2 ドメインとの間にはエピトープが結合する溝（ペプチド結合溝）がある。
（B）分子表面モデルで示した α 鎖のペプチド結合溝。5 つのエピトープペプチドが結合する部位（サブサイト）（S1-S2、S3、S4-S6、S7、S8-S9）を、それぞれ黄、マジェンタ、青、オレンジ、シアンで示した。

図 2． HLA と MICA-TM ペプチドとの相互作用（A）BD 発症に関与する HLA-B*51:01、（B）BD 発症に関与する HLA-A*26:01、（C）BD 発症に関与しない HLAB*35:01、（D）BD 発症に関与しない HLA-A*11:01。サブサイトの色は図１に対応する。それぞれのサブサイト
において MICA-TM ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸残基を示した。
MD シミュレーションの結果、４つの HLA において MICA-TM ペプチドの認識に違いが見られた（図 2）。

2後述する結合自由エネルギーとアミノ酸変異の解析から、BD 発症に関与する HLA-B*51:01 と HLA-A*26:01 において、特に N70、T73、Y99、K146、Y159 は MICA-TM ペプチドどの相互作用に重要なアミノ酸であった。また、MM/PBSA（molecular mechanics / Poisson-Boltzmann surface area）法によって結合に伴うギブズの自由エネルギー

ΔGbind を算出した（表 1）。
表 1． 結合に伴うギブズの自由エネルギー ΔGbind

ΔGbind は分子力学エネルギー ΔEMM、溶媒和の自由エネルギー ΔGsol、エントロピー項 TΔS の総和であり、ΔGbind が小さい方が強く相互作用する。
ΔGbind は分子力学エネルギー ΔEMM、溶媒和の自由エネルギー ΔGsol、エントロピー項 TΔS の総和であり、ΔGbindが小さい方が強く相互作用することを意味する。算出された ΔGbind から、それぞれの遺伝子座（HLA-B と HLA-A）における MICA-TM ペプチドとの相互作用を比較した。HLA-B では、BD に関与する HLA-B*51:01（－46.4 kcal/mol）
は BD 発症に関与しない HLA-B*35:01（－36.2 kcal/mol）よりも強く相互作用、同様に HLA-A においても、BD 発症に関与する HLA-A*26:01（－21.5 kcal/mol）は BD 発症に関与しない HLA-A*11:01（－15.7 kcal/mol）よりも強く相互作用することが示された。本研究によって、BD 発症に関与する相互作用の構造基盤を得ることが出来た。今後はHLA が関与する他の疾患におけるエピトープ選択性の解明や低分子化合物による選択性の変化メカニズムの解明が期待できる。
２．HLA 組換えタンパク質の調製相互作用スクリーニングや X 線結晶構造解析を行うには、十分な量の HLA タンパク質が必要である。そこで、BD発症に関与する HLA-B*51:01 と HLA-A*26:01 を対象に、大腸菌を用いた組換えタンパク質の調製を行った。大腸菌での生産効率を上げるため、目的遺伝子を全て大腸菌のコドンに変更した cDNA を利用し、α 鎖と β 鎖を同時に大腸菌内で発現させる共発現系も検討した。既報を参考に、HLA-B*51:01（α 鎖）と HLA-A*26:01（α 鎖）の細胞外領域、あるいは β 鎖をアンピシリン耐性の発現ベクターに組み込んだ。宿主大腸菌として BL21（DE3）を用い、IPTG（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）の添加によって発現を誘導した。誘導後、温度を 20 ℃または 37 ℃で培養を行った。培養後、遠心分離によって得られた菌体を SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gelelectrophoresis）に供し、泳動ゲルを CBB（Coomassie Brilliant Blue）染色することで、目的タンパク質の発現の有無を確認した（図 3）。

3図 3． HLA 組換えタンパク質の発現の確認
M はサイズマーカー、（－）は IPTG 誘導前、20 と 37 は IPTG 誘導後にそれぞれ 20 ℃と 37 ℃での培養。A26、B51、β2m はそれぞれ HLA-A*26:01、HLA-B*51:01、β2m 単独での発現。A26/β2m と B51/β2 は α 鎖と β鎖の共発現。ゲルにおいて、α 鎖と β 鎖のバンドをそれぞれ緑とシアンの矢印で示した。
その結果、HLA-B*51:01 に関して、37 ℃での培養では良好な発現を示したが（図 3、Lane 6）、20 ℃での低温培養では発現量が著しく少なかった（図 3、Lane 5）。β 鎖との共発現系においても、同様な傾向を示した（図 3、Lane 14と Lane 15）。一方、HLA-A*26:01 に関しても、20 ℃と比較して、37 ℃での培養では良好な発現を示した（図 3、Lane2 と Lane 3）。興味深いことに、HLA-B*51:01 とは異なり、β 鎖との共発現系においては 20 ℃の低温培養においてもHLA-A*26:01 は良好な発現を示し、β 鎖との共発現の効果が見られた（図 3、Lane 11）。すなわち、HLA-A26:01（α鎖）と β 鎖との共発現系では α 鎖と β 鎖が相互作用しており、それによって α 鎖の発現が向上したと考えられる。
また、β 鎖については何れの条件でも良好な発現を示した。次に、発現タンパク質の可溶性を確認するために、菌体を超音波破砕し、その遠心上清を SDS-PAGE に供した（図 4）。

4図 4． HLA 組換えタンパク質の可溶化の確認（37 ℃培養）
M はサイズマーカー、Lysate は超音波破砕後、Sup.は超音波破砕後の遠心上清を示す。可溶性に関しては 20 ℃培養でも同様な結果であったため、37 ℃培養の結果のみ示す。
その結果、何れの条件においても発現タンパク質のほとんどは不溶性であり、尿素を用いたリフォールディングによって可溶化する必要があると考えられた。以上の結果から、本研究によって BD 発症に関わる HLA タンパク質の X 線結晶構造解析や相互作用スクリーニングを行うのに十分な組換えタンパク質を得ることが出来ると見込まれた。今後は HLA 組換えタンパク質を大量に調製し、構造生物学的研究を進めていく。

共同研究者
本研究の共同研究者は、東京大学大学院医学系研究科の竹内不二夫、蕪城俊克、タイ王国チュラロンコン大学理学部の Supot Hannongbua、静岡県立大学薬学部の橋本博である。本稿を終えるにあたり、本研究をご支援いただきました
上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます。

文献1） Illing P T, Vivian J P, Dudek N L, Kostenko L, Chen Z, Bharadwaj M, Miles J J, Kjer-Nielsen L, Gras S,Williamson N A, Burrows S R, Purcell A W, Rossjohn J, McCluskey J. Immune self-reactivity triggered bydrug-modified HLA-peptide repertoire. Nature 2012;486(7404):554-8. doi: 10.1038/nature11147. PubMed
PMID: 22722860
2） Kongkaew S, Yotmanee P, Rungrotmongkol T, Kaiyawet N, Meeprasert A, Kaburaki T, Noguchi H,Takeuchi F, Kungwan N, Hannongbua S. Molecular Dynamics Simulation Reveals the Selective Binding of
Human Leukocyte Antigen Alleles Associated with Behçet's Disease. PLoS One 2015;10(9):e0135575-88. doi:
10.1371/journal.pone.0135575. PubMed PMID: 26331842

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