水産基盤整備調査報告書

干潟の有害物質浄化能力の調査
独立行政法人水産大学校・食品化学科
微生物研究室・芝恒男・前田俊道・古下学
平成12年〜14年

緒言

河川から干潟に運ばれる有害物質は，干潟を構成する砂粒子に沈着して分解されることが示唆され1,2)，干潟は海を汚染から守るうえで重要な働きをしていると思われる。
フェノール関連化合物は界面活性剤や消毒薬として広く利用されているが，有害な働きを持つものが多い。排水されたこれら化合物は河川により運ばれて海に達するが，これらが干潟に沈着されて，そこで分解されれば海の汚染を未然に防ぐことが出来る。そこで本研究ではフェノール関連化合物のなかのピスフェノールA（BPA）に注目し，このBPAの干潟域での分解能を分解細菌の分布から明らかにし，これによって環境浄化における干潟の有効性を明らかにしたい。

調査方法
ビスフェノールA（BPA）分解細菌の分離
BPAは水に不溶で、培養液に混合できないのでシリカゲルに吸着させて培地を作製した3)。
すなわちシリカゲルCosmmsil C18 0PN（ナカライテスク株式会社）1gに500ppmBPA
トルエン溶液10mlを加えた後、ヘキサン50mlを加え、緩やかに撹搾し、5分間静置した。
その後、トルエン-ヘキサン溶液60mlを取り除き、30℃〜40℃で乾燥させた。この時除去したトルエンーヘキサン溶液からは、BPAは検出されなかったため、BPAはすべてシリカに吸着していると考えられた。乾燥したシリカを表1に示す無機培地100ｍｌに加え、オートク
レーブした。尚、BPAは和光純薬工業株式会社のものを用いた。
分解細菌の分離のため、海浜砂を採集し，これを調整した培地に10％濃度で接種し、30℃で振とう培養を行った。BPAの減少の見られた培養液から1白金耳とり，これをPPES−Ⅱ3）
寒天平板培地に塗布して，分解細菌を分離した。
BPAの分析
BPAの抽出においては，培養上清からは等量のクロロホルムを用いて抽出した。またシリー270一

カゲルからは、培養液中の乾燥させた約0．01gのシリカゲルをジエチルエーテルで3回抽出し、ロータリーエバポレーターで乾固させ、クロロホルム1ｍｌを加え、このクロロホルム溶液をサンプルとした。なお、あらかじめBPAの抽出効率は、3回の連続抽出で90％以上であることを確認している。
BPA量（ベンゼン環相当量）は、順相HPLCおよび吸光光度計法で調べた。ベンゼン環相
当量は277nmでの吸光値から求めた。

表・1

BSA分解分離のための基礎培地

025g

KNO3
NH4C1

020g

NaH2PO4・2H20

0，03

Na2HPO4・12H20

0．07g

COMB
5％ferricg

O．10mlcitrate

O．20ml

VB12溶液1．00ml

Tris

1．20g

人工海水

1000

ml

COMB；ZnSO4・7H20，0．125g；MnC12・4H20，0。157g；
H3BO3，0．06g；CoCl2・6H20，0。37g；NiCl2・6H210。02g；Na2MoO4・2H20，0，04g；25％HC1，1．Om1；蒸溜

水，1000ml

細菌数の計測培養液中の細菌数は落射蛍光顕微鏡を用いた直接顕微鏡法により調べた。すなわち菌体をエチジウムブロマイド4)で染色し、フィルター上に集めて観察した。
BPA分解細菌の分布調査
図1に示す地点で，サンプリングを行った。各採集地点で、海浜砂を採取し，これを10％、1％、0．1％濃度で、先に示したシリカゲル無機培地（50ppmBPA）に接種し、3段階3本立てのMPN法でBPA分解細菌数を求めた。培養は、30℃で21日間振とう培養した。尚、各試験管中のBPAが30％以上減少した管を陽性とした。
BPA分解細菌の分類調査分離されたBPA分解細菌については，16S rDNAの解析およびグラム染色，オキ
シダーゼ，カタラーゼ活性，さらにはAPI20NEによる生理性状検査を行った。

一271一

図1．採集地点

ビスフェノールA分解細菌のリアルタイムPCRによる定量
16SrRNA遺伝子の領域において分解能が見られたYY‑1株に特異的であると思われる28
残基の蛍光プローブを設計した。また，この3'および5'末端域において17残基および15残基のプライマーを設計した（図2）。このPCRプライマーセットを用いて，108残基のDNA断片を増幅しながら，これと蛍光プローブとのハイブリダイゼーション（リアルタイムPCR）を行った。リアルタイムPCRの反応液組成を表2に示す。

PCRはABIprism7700を用い、95℃，10分のプレヒートを行い、95℃，15秒と60℃，1分を50サイクル行った。

一272一

表2

リアルタイムPCR液の組成

10xTaqMan1）ufferA．2．00μl

MgC軽（25mM）

2．80μ1

1猫A（4m9／m1）

2．00！∠1（し〜TP（1〔）mM）

0．40μ1dCTP（1〔）mM）

0．40μ1dGTp（10mM）〔）．40μ1dUTP（20mM）

0．40μ1

フォワードブライマー（100pmo1／μ1）

0．06μ1

リバースブライマー（100pmo1／μ1）

0．06μしDNAブローブ（11、2pmo1／μ1）

0．35μ1

AmpnTaqGokl（5U／μD

O．10μlAmpHTaq

Erase（1し』／μ1）

0．20μlTemplate

2．00μ】

滅菌ミリQ水を加え全量を20μ1としたN

フォワードプライマー

DNAプローブ丁

リバースプライマー

図2．プライマーおよびプローブ領域

一273一

DNAプローブ法によるBPA分解細菌の分布調査
5gの干潟の砂を，DNA抽出緩衝液（100mM Tris−HCl，100mM［pH8．0］，100mM

sodiumphosphate［pH8．0］，1．5M

sodiumEDTA

NaC1，1％CTAB），ProtemaseＫ液，20％SDS，クロロホルム等で順次処理してDNAを抽出し，これを電気泳動用ゲルを持ちいて精製した。このDNAを鋳型DNAとして用い，先に示したHPCR法に準じて定量的HPCR
を行った。

調査結果

1．現場細菌群集によるビスフェノールAの分解
図3は下関市内長府扇橋付近に広がる干潟から採取した細菌群集によるBPAの好気的分解過程を示している。図に示される様に50ppm濃度でBPAを添加した海水に1％濃度で干潟の砂を接種したとろ，細菌数がおよそ30時間で1ｍｌあたり107にまで増大し，かつBPAが150時問余りでゼロにまで減少した。BPAがゼロにまで減少したのは，細菌群集によって完全分解されたことを示す。一方細菌数が107にまでしか増大しなかったことは，分解菌がBPAを資化していないことを示唆している。
2．ビスフェノールA分解菌の分布
海浜にビスフェノールA分解菌の存在が確認されたので，ビスフェノールA分解菌の分布をMPN法で調べた。図1に採集場所，表3に調査結果を示す。
表3に示すように，分解菌は，海浜環境に普遍的に分布するものの，その細菌数は，わずかに1グラム砂当たり，1あるいは0．1細胞レベルであった。
3・ビスフェノールA分解菌の単離
図4は下関市木屋川河口の干潟から分離した細菌YY−1株を，BPAを50ppm濃度で添加したペプトン培地に接種した時の増殖分解曲線を示している。この場合用いた培地にはペプトンが含まれているので，細菌は10時間ほどで濁度が1をこえるにまで増殖し，またBPAは図1に示したと同じように，2段階からなる減少を経て，ゼロにまでに減少した。

一274一

図3．干潟細菌群衆によるビスフェノールAの分解

表3．ピスフェノールA分解菌の分布
採集地点

5搬菌数（細胞数／グラム）

ゆめタウン裏

2,3

長府港

0,4

木屡川

0,9

長府の扇橋下

2,3

台道漁港横

0,3以下

大海漁港横

0,3以下

秋穂石材採石場横

0,1

はしの川

2,3

周防大橋下

（）,3以ド白土海水浴場

0．9−275一一方この菌を，同様に，有機物としてビスフェ
ノールAのみを含む培地に接種したところ、
分解および増殖のいずれも観察されなかった。
したがって、ほん菌はビスフエノールAを完
全分解、すなわちビス
フェノールAのベンゼン環を開環するものの，
ビスフェノー一ルAを資化出来ない細菌である
ことがわかった。

図4．YY−1株増殖／BPA分解曲線

4．ビスフェノールA分解菌の分解に果たす海浜干潟の役割
海浜干潟にはビスフェノールA分解菌が普遍的に存在するものの、その分解菌はビスフェノールAを資化出来ない。このような場合，分解が促進されるには，分解菌の増殖がビスフェノールA以外の有機物によって支えられる必要があるが，このような働きを海浜砂中の有機物が果たしているものと考えられた。そこで，海浜砂に分解菌とビスフェノールAを接種して，ピスフェノールAが分解されるかについて調べた。その結果表4に示すように，1）現場に分解菌がいなくても分解菌を接種すると分解が進むこと，2）この間に分解菌が増殖していることがわかった。これまでに分解菌をビスフェノールAを含んだ海水に接種しても，分解も細菌の増殖も起きないことを確認、しているので，海浜砂の環境は，分解菌の増殖を助けるなかで，ビスフェノールAの分解無機化を促進する作用のあることが示された．

一276一

表4。ビスフェノールA分解に果す海浜砂の役割
砂の種類

細菌接種量（m1）

分解量（％）

菌数（Log）

吉母（オートクレーブ）
0．0
0
5．59
吉母（オートクレーブ）
1．0
8．3
6．25
吉母（オートクレーブ）
2．0
10．9
6．94
吉母（オートクレーブ）
3．0
26．6
7．15
吉母（オートクレーブ）
3．5
46．2
7．40
吉母
0，0
0
7．23
吉母
1．0
17．1
7．32
吉母
2．0
16．9
7．30
吉母
3．0
30，1
7．32
吉母
3．5
47．4
7．53
扇橋下（オートクレーブ ）0．0
05．45
扇橋下（オートクレーブ） 1，0
12．8
7．71
扇橋下（オートクレープ） 2．0
14．8
7。68
扇橋下（オートクレーブ） 3．0
25．6
7．69
扇橋下（オートクレーブ） 3．5
46．3
7．83

5．BPA分解細菌の直接計数
MPN法で，BPA分解細菌数がおおよそ1グラムの干潟砂あたり，一桁の細菌数が得られたが，この値は，実験開始前に予想した細菌数から比べはるかに少ない。少ない理由として，BPA分解細菌に直接BPA資化能がないために実際よりも低い値が得られたと考えられる。そこで，再び干潟の砂を採取して，これよりDNAを抽出してDNAプローブ法によりBPA分解細菌数を調べることを試みた。
まず始めに分解菌YY−1株の遺伝学的性状を調べ，この細菌の系統的特性を調べた
ところ，図5に示すようにYY−1株はαプロテオバクテリアのStappia stelluateに近縁であることがわかり，Stappia sp.YY−1株と呼ぶのが妥当だと判断された。
次にこの系統樹および塩基配列を基にDNAプローブ作成したところ，図6に示す
ように，特異的にStappia sp.YY−1株検知するDNAプローブが得られた。

一277一

図5．YY−1株の系統学的位置

図6．DNAプローブの特異性

一278一

図で特異性が確認されたDNAプローブを用いて表5に示す干潟についてBPA分解細菌の分布を調べたところ，図7に示すように，干潟の砂1グラム当たり，103〜104細胞のBR〜分解細菌が干潟に分布していることが分かった・特に人工砂浜の油谷YYビーチでも、自然の干潟および海浜に劣らな
いBR、分解細菌の分布が確認され，人工干潟も充分に梁境浄化能を有することが示された。

表5，干潟砂採集場

所

状況

木屋川干潟（浜田川河口）

どろ木屋川干潟（波打ち際）

海泥砂

油谷湾干潟（波うち際）

海泥砂

油谷町YYビーチ（人工砂浜）

砂

水産大学校前桟橋先底泥砂

海泥砂

水産大学校前海砂砂

永田川永田大橋付近

どろ

YY1分離場所

永田川河口
水産大学校前海水産大学校前桟橋先底泥廻油谷町YYビーチ
油谷湾干潟

木屋川干潟
木屋川河ロ

図7．DNAブローブ法で測定された干潟砂泥1g当たりのビスフェノール分解細菌数

考察および適用

一279一

河川から海に流れ込むフェノール関連有害物質は，その低い水溶性のために干潟を構成する砂粒子に吸着濃縮されやすい。この過程は，1）海水環境に有害物質が流れ込むことを低減するとともに，2）砂粒子上に有害物質が濃縮されてなんらかの生物過程を受けることを意味している。砂粒子上の有害物質が直接貝に摂取されれば，食物連鎖を経て人間への影響が心配されるし，一方細菌により分解されれば，干潟は有害物質の浄化場所として有効に機能していることになる。
そこで本研究ではフェノール関連化合物のなかのビスフェノールA（BPA）に注目し，このBPAの干潟域での分解能を分解細菌の分布から明らかにすることを試みた。その結果1）
干潟細菌群衆はBPAを完全分解しうること，2）干潟中にあるBPA以外の有機物が細菌の増殖を助け，その結果BPAの分解が促進されること，3）干潟や海浜砂にはBPAを分解飽きる細菌が，砂1g当たり10，000細胞もいることが分かり，これによって環境浄化における干潟の有効性が明らかになった。
干潟の有害物質浄化能が明らかになったので，今後も干潟の保全回復が望まれるのは言うまでもない。また干潟をさらに有効に利用するためには，無害な有機物を干潟に添加して有害物質分解細菌を選択的に増殖（プレバイオチクス）させ，干潟の分解能を飛躍的に高める手法の開発も期待される。

引用文献

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