「様式３」課題番号 １４繊毛構築を制御する新規シグナル経路の同定とその機能解析［１］組織代表者：水野 健作（東北大学大学院生命科学研究科）
対応者：安井 明（東北大学加齢医学研究所）
分担者：菅野 新一郎（東北大学加齢医学研究所）
千葉 秀平（東北大学大学院生命科学研究科）
大橋 一正(東北大学大学院生命科学研究科)

は不明な点が多く残されている。
母中心小体遠位への輸送小胞の融合過程において低分子量 G 蛋白質 Rab8 が重要な機能を担うことが知られている。私達は最近、進化的に保存された Ser/Thrキナーゼである NDR が血清飢餓による一次繊毛形成に関与することを見出した。NDR はがん抑制遺伝子
MST/Hippo の下流因子であるが、私達は、血清飢餓による繊毛形成において中心的な役割を担う Rab8 のGDP-GTP 交換因子(GEF)である Rabin8 が NDR の基質としてリン酸化されることを見出した。さらに、NDR2による Rabin8 の Ser-272 のリン酸化は、Rabin8 のホス

研究費：物件費 40 万円

ファチジルセリンへの結合を弱め、Sec15 への結合を強めるスウィッチとして、中心体近傍での Rab8 の活性化と CV の形成に寄与していることを示唆する結果を［２］研究経過
真核細胞の多くは，細胞表面に一本の非運動性繊得た。本共同研究では、NDR の一次繊毛形成におけ毛（一次繊毛）を有している。一次繊毛は細胞外からのシグナル伝達経路を解明することを目的として解析を機械的・化学的シグナルを受容するアンテナとして機行った。その結果、NDRの新規基質であるPI4KIIIが能し、細胞の増殖・分化の制御や組織の形態形成・機一次繊毛形成に関与することを見出した。また、NDR能発現に重要な役割を果たしている。そのため、一次の活性化因子である Furry の結合蛋白質として SIRT2繊毛の形成や機能の不全は嚢胞性腎疾患、網膜変性を同定し、この結合が紡錘体微小管のアセチル化に症、肥満、多指症、内臓逆位等の複合的症状を呈する寄与していることを明らかにした。

る機能をさらに解明し、一次繊毛構築を制御する新規疾患の原因となることが知られており（繊毛症ciliopathyとよばれる）、繊毛形成関連遺伝子群の同定と繊毛形［３］成果成機構の解明は医学的にも重要な研究課題として、多くの研究者の注目を集めている。
一次繊毛は、母中心小体に由来する基底小体、そこから伸長した微小管構造である軸糸、軸糸を取り囲む繊毛膜を基本構造とする。一次繊毛の構築は、1)増殖抑制シグナルによる中心体の母中心小体遠位側

図 1. NDR によるリン酸化を介した PI4KIIIと14-3-3の結合のモデル図

への輸送小胞の繋留と融合（繊毛小胞 ciliary vesicle（３－１）研究成果(CV)の形成）、2) CV 直下での微小管軸糸の伸長と本年度は，以下に示す研究成果を得た。

CV の伸長による繊毛鞘の形成、3) 繊毛鞘の細胞表(1) 繊毛形成における PI4KIIIの機能

層膜への融合、の３段階で進行するが、最初の段階で最近、NDR の新規基質として PI4KIII が報告されあるCVの形成に関わる小胞輸送と融合機構についてた。PI4KIIIはゴルジ体に局在し、PI4P の産生やRab11 のリクルートを介して、ゴルジ体から細胞膜へのた。

小胞輸送を制御することが知られているが、一次繊毛形成における PI4KIIIの機能は不明である。まず、（３－２）波及効果と発展性など

NDRによるPI4KIIIのリン酸化部位としてSer-277を同本共同研究では、NDR キナーゼ経路を中心にし定した。PI4KIIIは PKD によって Ser-294 がリン酸化さて、一次繊毛形成を制御するシグナル伝達機構の解れ、14-3-3と結合することが報告されており、Ser-277

明を目的として研究を実施し、昨年度は NDR によるの近傍配列は14-3-3の結合モチーフと類似しているこ

Rabin8 のリン酸化が繊毛小胞、繊毛膜の形成に重要とから、NDR によるリン酸化が PI4KIIIと 14-3-3 の結な役割を担っていることを明らかにした(Chiba et al.,合に関与している可能性について検討した。GST プ

EMBO J., 2013)。また、本年度は、NDR の新たな基質

ルダウンアッセイにより、PI4KIII (WT)は GST-14-3-3

として同定された PI4KIIIも一次繊毛形成に必要であと結合するが、PI4KIII (S277A) は結合できないことることを明らかにした。今後は、NDR-Rabin8 及びから、PI4KIIIは Ser-277 のリン酸化依存的に 14-3-3

NDR-PI4KIII経路が嚢胞性腎疾患など繊毛性疾患にと結合することが明らかになった (図 1)。次に、Ser-277関与している可能性を解明していくことが重要である。のリン酸化が PI4KIIIの脂質キナーゼ活性に与える

また、MST/Hippo 経路は Drosophila の遺伝学的解析影響について検討した。PI を基質とする脂質キナーにより、増殖阻害から分化を促す主要ながん抑制遺伝

ゼアッセイの結果、PI4KIII (WT)と比較して、非リン酸子として知られるようになってきたが、MST/Hippo の下化型 PI4KIII (S277A)は野生型と同等の活性をもつが、流因子である NDR 経路は哺乳類細胞内における機擬似リン酸化型 PI4KIII (S277D)は野生型より顕著に能の理解がほとんど進んでおらず、増殖阻害・分化シ高い活性をもつことが示された。したがって、NDR にグナルによる NDR 経路の機能解析は今後の重要なよるPI4KIIIのSer-277のリン酸化はPI4KIIIの活性を研究課題であると考えられる。一次繊毛形成は増殖サ促進することが示唆された。PI4KIIIが一次繊毛形成イクルからの遷移と分化状態を特徴付けるイベントでに必要であるかを検証するために、網膜色素上皮由あり、NDR 経路が中心体から基底小体への変換を保来 hTERT-RPE 細胞を用いて、一次繊毛形成に対する障し、細胞の分化状態を規定する重要なシグナル経PI4KIIIの発現抑制効果を検討した。その結果、路の１つであることが予想され、基礎生物学的にも、医PI4KIIIを発現抑制した細胞では一次繊毛形成が顕学への応用面においても、今後の研究の発展が期待著に抑制された。今後は、NDR による PI4KIIIのリンされる。本共同研究により，加齢研研究者との交流が酸化や 14-3-3 との結合が一次繊毛形成において果た飛躍的に活性化し，プロテオーム解析などの協力にす役割を明らかにしていくことが重要である。

よって研究が著しく進展した。

(2) Furry 結合タンパク質の同定
Furry はNDR に結合しそのキナーゼ活性を促進［４］成果資料することが知られている。本共同研究では、Furry(1) Nagai, T., Ikeda, M., Chiba, S., Kanno, S., andの結合蛋白質を解析し、微小管脱アセチル化酵素でMizuno, K. Furry promotes acetylation of microtubules inある SIRT2 を同定した。Furry は N 末端領域でthe mitotic spindle by inhibition of SIRT2 tubulin

SIRT2 と結合し、その微小管脱アセチル化活性を抑deacetylase.J. Cell Sci.,126（19), 4369-4380(2013).

制した。Furry の N 末端断片を過剰発現すると、間(2) Nagai, T., and Mizuno, K. Multifaceted roles of Furry

期及び分裂期の微小管のアセチル化レベルの上昇がproteins in invertebrates and vertebrates.

認められた。また、Furry を発現抑制した細胞ではJ. Biochem., 155(3), 137-146 (2014)

分裂期紡錘体の微小管アセチル化レベルが低下していること、このアセチル化レベルの低下は SIRT2阻害剤である AGK2 によって回復することを見出した。以上の結果から Furry は SIRT2 の微小管脱アセチル化酵素活性を阻害することで分裂期紡錘体の微小管アセチル化を促進していることが示唆され