倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1454

質量分析イメージングを用いた自己免疫性疾患の病態解明
代表研究者

河野通仁

北海道大学病院

リウマチ・腎臓内科

助教

Study of mechanism on autoimmune diseases using mass
spectrometry imaging
Principal Researcher

Michihito Kono,
Department of Rheumatology, Endocrinology and Nephrology, Faculty of Medicine, Hokkaido University Assistant Professor

全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症などの自己免疫性疾患ではインターロイキン-17 産生CD4 陽性細胞(Th17)と制御性 T 細胞(Treg)のバランス異常が病態に関わっている。本研究では生体内で産生される代謝産物 X によりマウス T 細胞の Th17 の分化は抑制され、Treg の分化は促進されることを明らかにした。マルチオミクスによりそのメカニズムも明らかとなった。また質量分析イメージングにより生体内の代謝産物の分布についても明らかとなった。
Dysregulation of T helper 17 (Th17) and regulatory T (Treg) cells contributes to the pathophysiology ofmany autoimmune diseases. Here, we show that an endogenous metabolite X, inhibited Th17 celldifferentiation and promoted Treg cell differentiation by orchestrating the metabolic and epigeneticreprogramming. Mechanistically, X suppressed glycolysis in Th17- and Treg-polarizing T cells. Imaging
mass spectrometry is also used to clarify the distribution of metabolites in vivo. These results indicate that
cellular metabolism could be a therapeutic target for the autoimmune diseases.

1．研究内容酵素フォスファターゼ、グルタミナーゼ 1 など対

1.1 はじめに応する酵素が自己免疫性疾患の治療ターゲットに全身性エリテマトーデス(SLE)ならびに多発性なりうることを明らかにした(1-4)。このように細硬化症(MS)は神経を侵す代表的自己免疫性疾患

胞内代謝は様々な疾患の新規治療ターゲットとなである。免疫抑制療法が使用されているが感染症りうることが明らかとなってきている。

が問題となっており、新規治療薬が望まれる。

近年生体内で産生されるある抗炎症性代謝産物

細胞内代謝は細胞の生存、分化、増殖に重要でX が細菌、ウイルスの増殖抑制効果をもつことがある。主要な細胞内代謝には解糖系、グルタミノ明らかになった。X はマクロファージの活性化をライシス、脂肪酸代謝などがある。申請者らは T抑制することは明らかとなっているが、T 細胞へ細胞細胞内代謝に注目して研究を行い、IL-17 産の影響は明らかになっていない。本研究では X の生 CD4 陽性細胞(Th17)は制御性 T 細胞(Treg)とT 細胞分化ならびに T 細胞関連自己免疫性疾患へ比較し解糖系、グルタミノライシスに依存していの治療効果を明らかにすることを目的とした。

ること、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸脱水素倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成

1.2 方法

1.2.3 モデルマウスへの治療実験

1.2.1 X が T 細胞分化に与える影響の検討

代表的な T 細胞関連動物モデルである、実験的

まず B6 マウスの脾臓から naïve CD4 陽性 T 細自己免疫性脳脊髄炎を用いて X の腹腔内投与を行胞を分離し、X の有無で Th17、Treg 分化条件化い、治療実験を行った。具体的には 8 週齢の B6に培養を行い、Th17、CD4 陽性 CD25 陽性 Foxp3マ ウ ス に 100 μ g の myelin oligodendrocyte

陽性 T 細胞(Treg)への分化に変化があるかフロー

glycoprotein (MOG)ペプチドと complete Freund’

サイトメトリー法を用いて検討した。次に同様の

s Adjuvant の emulsion を 200ml 背部に皮下注した。

条件で RNA シークエンシング(RNA-Seq)、メタ同日ならびに 2 日後に 100μl の PBS に溶解した

ボローム解析、ATAC シークエンスを行った。さ百日咳毒素 100ng/mouse を day0、2 に腹腔内注射

らに細胞内代謝の変化について細胞外フラックスし、EAE を起こした。マウスは連日体重ならびにアナライザーを用いて検討を行った。また、上記

clinical score をつけた。day 14 にマウスは安楽死により注目した代謝酵素について酵素活性についさせ、脊髄ならびに浸潤細胞を採取した。X は週 3て検討を行った。

回腹腔内投与を行った。

1.2.2 質量分析イメージングの条件検討

1.3 結果と考察

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

1.2.1 X が T 細胞分化に与える影響の検討(MALDI)イメージングでは質量分析計を用いてB6 マウスの脾臓から naïve CD4 陽性 T 細胞をタンパク質、ペプチド、代謝物、バイオマーカー、分離し、X の有無で Th17、Treg 分化条件下に培薬物の分布を可視化でき、また網羅的解析も可能養を行ったところ、X の添加により Th17 の分化である。本研究では Solarix XR を用いて質量分析は濃度依存性に抑制され、Treg の分化は促進したイメージングを行った。

(図 1)。

図 1 X は Th17 分化を抑制し、Treg の分化を促進する

Th17 分化条件では X の添加により 567 個の遺遺伝子の発現は 770 個亢進、806 個減少し、GO伝子が有意差をもって発現亢進し、502 個で発現解析では Amide biosynthetic process や HIF-1が 低 下 し て い る こ と を 見 い だ し た 。 Genesignaling pathway など細胞内代謝に関連が強いもontology(GO)解析では Glycolysis/Gluconeogenesisのが複数挙げられた。X により Th17 と Treg 分化や HIF-1 signaling pathway など代謝に関連が強いで共通して変動した遺伝子は 582 個あり、GO 解ものが複数挙げられた。一方 Treg では X により

析では Glycolysis、HIF-1 signaling pathway など

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成に加え、複数の細胞内代謝経路が挙げられた。

評価では、X の添加により解糖系の代謝産物は減

Th17、Treg で共通して変動した遺伝子のうち、少していた。
そのほか Th17 分化では代謝産物 Y、発現の変動が大きい上位には Il2、Ccr6、Il17f なTreg では代謝産物 Z が有意差をもって変動しておど T 細胞の分化として既報があるものに加え、細り、それらに関連する酵素活性も X の添加により胞内代謝に関連するこれまでに既報のない新規の変化していた。上記の結果が X によるエピジェネ遺伝子も多数認められ、T 細胞関連自己免疫性疾

ティックな変化によるという仮説をたて、患の新たな治療ターゲットの候補になりうると考ATAC-Seq を行ったところ、Th17 分化においてえられた。現在 naïve CD4 陽性 T 細胞に対し、は Il17a、Treg では foxp3 のメチル化が変化してsiRNA を用いてこれらの治療ターゲット候補遺伝いた。

子のノックダウンを行い、Th17、Treg 分化への影響を検討している。

1.2.2 質量分析イメージングの条件検討
Solarix XR を用いて質量分析イメージングを行

上記の結果から細胞外フラックスアナライザーった。脳、腎など複数の臓器で多数の細胞内代謝を用いて Glycolytic rate assay による解糖系の測定産物の検出に成功した(図 2)。部位により特異的なを行ったところ、Th17、Treg いずれも Basal代謝産物なども認め、今後さらに治療による変化

glycolysis ならびに compensatory glycolysis ともになどについて検討を進めていく予定である。

X の投与により低下していた。メタボロミクスの

図 2 質量分析イメージングの一例(マウス腎臓)

1.2.3 モデルマウスへの治療実験を好んで使用するか、またその細胞内代謝の抑制

まず代表的な T 細胞関連動物モデルである、実が疾患の治療ターゲットとなりうることが明らか

験的自己免疫性脳脊髄炎を用いて X の腹腔内投与となってきた。例えば本研究で注目した Treg の分を行い、治療実験を行った。X の腹腔内投与によ化については解糖系、グルタミノライシスの抑制

り clinical score、体重減少は改善し、X による治には影響を受けにくいが、脂肪酸代謝の抑制によ療効果が認められた。

り Treg の分化は抑制される。一方、IL-17 産生
CD4 陽性 T 細胞は解糖系、グルタミノライシスに

X は生体内で産生される抗炎症性代謝産物のひ依存している。これらの細胞による違いをうまくとつである。近年癌領域や免疫学領域において細利用することで細胞内代謝をターゲットとした新胞内代謝の研究が飛躍的に進歩している。それに規治療薬の開発が期待される。

より細胞の生存、分化、機能に細胞内代謝が重要であること、さらには細胞によりどの細胞内代謝倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
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2．発表（研究成果の発表）
現在論文投稿中。学会での発表は特許の関係もあり、ありません。

３．謝辞
最後になりましたが本研究の遂行にあたり、ご支援をいただいた公益財団法人日立財団ならびに関係者の皆様に心より感謝申し上げます。また、特許取得のため一部のデータを公表できないことに関しまして、ご理解を賜れますと幸いです。公益財団法人
日立財団の益々のご発展を祈念いたします。

４．引用文献1. Kono M, Yoshida N, Maeda K, Tsokos GC.
Transcriptional factor ICER promotes glutaminolysis
and the generation of Th17 cells. Proc Natl Acad Sci
U S A. (2018)115:2478-2483. doi:10.1073/pnas.1714717115
2. Kono M, Yoshida N, Maeda K, Skinner NE, PanW, Kyttaris VC, et al. Pyruvate dehydrogenase
phosphatase catalytic subunit 2 limits Th17
differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. (2018)
115:9288-9293. doi:10.1073/pnas.1805717115
3. Kono M, Yoshida N, Maeda K, Suarez-Fueyo A,Kyttaris VC, Tsokos GC. Glutaminase 1 Inhibition
Reduces Glycolysis and Ameliorates Lupus-like
Disease in MRL/lpr Mice and Experimental
Autoimmune Encephalomyelitis. Arthritis Rheumatol.
(2019). doi:10.1002/art.41019
4. Kono M, Maeda K, Stocton-Gavanescu I, Pan W,
Umeda M, Katsuyama E, et al. Pyruvate kinase M2
is requisite for Th1 and Th17 differentiation. JCIInsight. (2019)4. doi:10.1172/jci.insight.127395