倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1464

肺循環補助を目指した拍動心筋組織付き人工血管グラフト開発
代表研究者

松浦勝久

東京女子医科大学

先端生命医科学研究所

准教授

Development of artificial blood vessel graft with pulsatile cardiac
tissue for the pulmonary circulation support
Principal Researcher

Katsuhisa Matsuura,Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Associate Professor

循環を補助する心筋組織の作製には、心筋組織の収縮・弛緩機能の向上が不可欠である。そこで本研
究では、拍動する管状心筋組織への応用を目指し、配向を制御した心筋組織の収縮・弛緩機能およびその機序について検討を行った。ヒト iPS 細胞由来の心筋細胞を逆 V 字型に微細加工したフィブリンゲル上に播種することで、配向の揃った心筋組織を作成することに成功した。配向した心筋組織は一方向性かつ同期的収縮性の向上により、収縮・弛緩機能が向上することが明らかとなった。
To create cardiac tissue for assisting circulation, it is essential to improve the contractile and relaxation
functions of myocardial tissue. In this study, we investigated the contraction/relaxation function andmechanism of alignment-controlled cardiac tissue with the aim of applying it to tubular myocardial tissue
fabrication. By seeding human iPS cell-derived cardiomyocytes on inverted V-shaped micro-processed
fibrin gel, we succeeded in fabricating aligned cardiac tissue. The aligned cardiac tissue showed improved
contractile and relaxation functions through unidirectional and synchronous contraction.

1．研究内容ヒト iPS 細胞より我々独自の 3 次元浮遊撹拌懸組織工学を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋組濁培養によって心筋細胞へ分化誘導し、心筋細胞織は、再生医療や疾患・創薬研究への応用が世界の純化を行った。フローサイトメトリー法を用い中で進められている。本研究は、拍動によって肺た心筋細胞の純度解析は、分化および純化後の心循環補助を可能とする移植用心筋組織の開発を目筋トロポニン T 陽性細胞は約 89％であった。また指すものであり、そのためには心筋組織の機能向これまでの我々の検討より、純化後の非心筋細胞上が不可欠である。心臓においては、収縮弛緩機は、心臓由来線維芽細胞に特性が類似した線維芽能を担う心筋細胞の向きが揃ったレイヤー状の組細胞様細胞であることが明らかとなっている

織が少しずつ向きを変え層状に重なることで、効（Biomaterials. 166(2018)109-121）。また心臓線率的な拍出を生み出すことに寄与すると考えられ維芽細胞は、心筋細胞の増殖を促すなど、心筋組ている。そこで移植用心筋組織内の心筋細胞の配織の機能的向上に寄与することも報告しており向制御による収縮弛緩機能への影響とその機序に（Biomaterials. 32(2011)7355-7362）、Regen Ther.

ついて検討を行った。

4(2016)92-102)、心筋細胞と線維芽細胞様細胞を倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成用いることで、より機能的な心筋組織の構築が可度および最大弛緩速度の向上が認められた（図 3）。

能と考えられる。

さらに、β受容体刺激剤であるイソプロテレノー

次に心筋細胞の配向を可能にする培養基材表面ルの添加によって、非配向心筋組織および配向心の開発を行った。心筋細胞を単に培養皿上で培養

筋組織のいずれにおいて有意な自律拍動数、収縮するだけでは配向せず、またプラスチック製の培機能、弛緩機能の向上が認められた一方、弛緩速養皿の接着し培養された状態では、心筋組織とし度の変化率は、配向心筋組織において有意の大きての収縮・弛緩機能を評価することは困難である。

いことも明らかとなった。

我々はこれまでにフィブリンゲル上で心筋細胞を次に、配向心筋組織の収縮・弛緩機能向上の機培養し、独自の張力測定システムを用いることで、序について検討した。MYL2、MYH6 などの収縮心筋組織の収縮・弛緩機能評価を実現してきた。

タンパクや RYR2 等の細胞内カルシウム制御遺伝

そこで本研究では、心筋細胞の配向制御を可能に子および GJA1 などのギャップジャンクション遺するフィブリンゲルを作成することで、心筋細胞伝子の発現は、分化誘導直後に比して、非配向心の配向と収縮・弛緩機能の関係性を評価すること筋組織および配向心筋組織で有意に上昇が認めらとした。微細加工したシリコンウェハを用いて熱れたが、配向および非配向心筋組織間で大きな違プリントしたシクロオリフェンポリマーを鋳型といは認められず、個々の心筋細胞の成熟化の関与してストライプ上に V 字型の溝を有するポリジメは少ないと考えられた。一方で、心筋組織内の心チルシロキサンを作成し、その上にフィブリンを筋細胞の収縮の向きおよびタイミングを画像解析塗布することで逆 V 字型の隆起を有する微細加工にて評価したところ、配向心筋組織内の心筋細胞フィブリンゲルを作成した（図 1）。またヒト iPS

は、非配向心筋組織に比して配向を制御した向き

細胞由来心筋細胞の直径は約 26 マイクロメートに一方向性の収縮を示すとともに、心筋組織内のルであることから、微細加工フィブリンゲル上の心筋細胞の収縮のタイミングのずれが有意に小さ

逆 V 字型の隆起の高さは 10 マイクロメートル、いことが明らかとなった（図 4）。すなわち、心筋隆起間距離は 30 マイクロメートルにデザインし組織の機能向上には、個々の心筋細胞が一方向性た。に協調的に機能するための適切な環境が必要であ

微細加工したフィブリンゲル上にヒト iPS 細胞ることが示唆される。

由来心筋細胞を播種したところ、加工処理なしの最後に、非配向心筋組織と配向心筋組織のグルフィブリンゲル上へ播種した心筋細胞に比して有コース消費量および乳酸産生量を比較したところ、意に配向度が向上した（図 2）。フーリエ解析を用両群で差を認めなかった。したがって、配向心筋

い て 算 出 し た 配 向 度 の 指 標 で あ る orientation

組織では非配向心筋組織に比して、同じグルコー

index は、加工処理なしフィブリンゲル上で培養しス消費量で 2 倍以上の張力を生み出すと考えられた心筋細胞で 1.15、微細加工したフィブリンゲルる。

上で培養した心筋細胞で 1.5 であり、成体ラット以上より、心筋細胞の配向制御により、より機心臓の配向度が 1.6 であることから、生体に近い能的な心筋組織の構築が可能と考えられる。本知配向度を有する心筋組織の作成が可能となったと見を基盤として、現在配向心筋シートの積層化に考えられる。さらに配向心筋組織の収縮・弛緩機よる力学的評価を進めており、肺静脈への循環補能を評価したところ、自律拍動下および電気刺激助を可能にする心筋組織開発が加速するものと考による 75ppm、120ppm での拍動状態においても、える。

非配向心筋組織に比して有意に張力、最大収縮速倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
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Bioengineered

humanstem

Cardiomyocytes cannot be aligned simply bycell-derived cardiac muscle tissue is being applied

culturing them on a culture dish, and it is difficult

worldwide for regenerative medicine and disease

to evaluate their contractile and relaxing functions

and drug discovery research. This study aims to

as cardiac tissue when they are adhered to anddevelop transplantable pulsatile cardiac tissue thatcultured on a plastic culture dish. Recently wecan assist pulmonary circulation. In the heart, it ishave developed the cardiac tissue contractile

believed that layered tissues with aligned cardiac

measurement system that enables to directly

cells,

theevaluate the contractile and relaxation function ofcontraction-relaxation function, gradually change

cardiomyocytes cultured on fibrin gel. In this study,

their orientation and overlap in layers, thereby

we evaluated the relationship between the alignment

contributing to the generation of efficient beating.

of cardiomyocytes and their contractile/relaxation

Therefore, we investigated the effect on thefunctions by preparing fibrin gels that enable thecontractile

itsalignment control of cardiomyocytes. We preparedmechanism by controlling the alignment ofpolydimethylsiloxane with V-shaped grooves on

cardiomyocytes

the stripes using a thermos-printed cyclo-oleiphenewhich

areandresponsiblerelaxation
inpluripotent

theforfunction
cardiacandtissue

fortransplantation.

polymer as a template on a micro-processed silicon

We induced cardiomyocyte differentiation fromwafer, and applied fibrin on it to create ahuman iPS cells into cardiomyocytes by ourmicro-processed fibrin gel with inverted V-shaped

original 3D suspension culture system andridges (Figure 1). Since the diameter of humanpurified the cardiomyocytes. The purity of

iPS cell-derived cardiomyocytes is approximately

cardiomyocytes

cytometry

26 micrometers, the height of the inverted

showed that the percentage of cardiac troponin

V-shaped ridges on the micro-processed fibrin gel

T-positive

was designed to be 10 micrometers and theanalyzed

cells

afterbyflow

differentiation

andpurification was approximately 89%. Our previous

distance between the ridges was 30 micrometers.

studies have also shown that non-cardiac myocytes

Seeding of human iPS cell-derived cardiomyocytes

after that purification are fibroblast-like cellson micro-processed fibrin gel significantly improved

whose characteristics are similar to heart-derived

the alignment of the cardiomyocytes compared tofibroblasts

166(2018)109-121).

those seeded on non-micro-processed fibrin gel

Cardiac fibroblasts have also been reported to(Figure 2). The orientation index, an index ofcontribute to the functional enhancement oforientation calculated by Fourier analysis, was 1.15

cardiac tissue, such as promoting cardiomyocyte

for cardiomyocytes cultured on non-micro-processedproliferation (Biomaterials. 32(2011)7355-7362),

fibrin gel and 1.5 for cardiomyocytes cultured on

Regen Ther. 4(2016)92-102), and the use of

micro-processed fibrin gel. Since the orientation

cardiomyocytes and fibroblast-like cells may

index of the adult rat heart was 1.6, it is now

enable the construction of more functional cardiac

possible to create cardiac tissue with a degree oftissue.

alignment similar to that of living tissue. When the(Biomaterials.

Next, we developed a culture substrate surface

contractile and relaxing functions of the alignedthat enables the alignment of cardiomyocytes.

cardiac tissue were evaluated, significant increases

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in contractile force, maximal contraction velocity,smaller in aligned cardiac tissues than that in theand maximal relaxation velocity were observed

nonaligned cardiac tissue, suggesting that thecompared to the non-aligned cardiac tissue, both

improvement of contractile force in aligned

under spontaneous beating rate and at 75ppm andcardiac tissue might be in part mediated by

120ppm on the electrical pacing (Figure 3).

synchronous cardiomyocyte contraction.

Furthermore, the treatment with isoproterenol, aFinally, we evaluated the changes in glucose andβ-receptor stimulator, significantly increased thelactate concentrations in the supernatant after

spontaneous beating rate, contractile function,

incubation for 48 h. No significant differences

and relaxation function in both non-aligned andwere observed in glucose consumption and lactatealigned cardiac tissue, while the rate of change inproduction between the two groups. However, therelaxation velocity was significantly greater inaligned cardiac tissues had more than twice thealigned cardiac tissue.

impulse per glucose consumption that of the

Next, we examined the mechanism of thenonaligned cardiac tissue. This suggests that aligned

improvement of contractile and relaxation

cardiac tissues generated greater contractile force

functions in aligned cardiac tissues. mRNA

with similar glucose consumption.

expression levels of contractile proteins such as

Based on the above, it is considered possible to

MYL2 and MYH6, intracellular calcium-regulated

construct more functional myocardial tissue by

proteins such as RYR2, and gap junction proteins

controlling the orientation of cardiomyocytes.

such as GJA1 were significantly increased in

Based on these findings, we are currently

non-aligned and aligned cardiac tissues comparedevaluating the mechanical properties of layered

to cells immediately after differentiation induction.

aligned cardiac cell sheets, which will accelerate

However, no significant differences were observed

the development of myocardial tissue that can bebetween non-aligned and aligned cardiac tissues,

used to assist circulation to the pulmonary vein.

suggesting that the maturation of individualcardiomyocytes might be less involved. On theother hand, when the direction and timing ofcontraction of cardiomyocytes in the cardiac tissue
were evaluated by the motion capture analysis, it
was found that cardiomyocytes in aligned cardiac
tissue exhibit unidirectional contraction in acontrolled orientation relative to non- aligned
cardiac tissue. The timing of contraction at fivedesignated points varied in non-aligned cardiac
tissue, but cells in aligned cardiac tissues showedsynchronous contraction (Figure 4). Furthermore,
the standard deviation of the time from thebeginning of measurement to first peak
contraction at these 5 points was significantly倉田奨励金研究報告書 第 52 集｜2020 年度（第 52 回）助成
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研究成果概要図

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2．発表（研究成果の発表）

of the Japanese Circulation Society SS16. New1)Takada T, Sasaki D, Matsuura K, Miura K,

developments of iPS cell research (特別セッション、

Sakamoto S, Goto H, Ohya T, Iida T, Homma J,オンライン、2022 年)

Shimizu T, Hagiwara N. Aligned human induced
pluripotent stem cell-derived cardiac tissue improves
contractile properties through promoting unidirectionaland synchronous cardiomyocyte contraction.
Biomaterials.30;281:121351, 2021
2)松浦勝久

iPS 心筋組織を用いた肥大型心筋症の病態理解と新規治療法への期待

東京 HOCM

フォーラム 2021 in 札幌 （教育講演、オンライン、2021 年）
3)Takuma Takada、Katsuhisa Matsuura.

Cardiomyocytealignment control promotes the electrical integrationand improves the contractile function of humancardiac tissue. American Heart Association Sessions
2021 (オンライン、2021 年)
4)松浦勝久
御に挑む

多能性幹細胞由来心筋組織の配向制

第 21 回日本再生医療学会総会 （シンポジウム、オンライン、2022 年）
5)Takuma Takada 、 Katsuhisa Matsuura.

Newinsights on the pathophysiology of non-genetic
heart disease. The 86th Annual Scientific Meeting