倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1466

シングルセル解析とリピドーム解析を用いた、急性腎障害が慢性腎臓病へ移行する機序の解明
代表研究者

山本毅士

大阪大学医学系研究科

医員

Unraveling the pathophysiology of AKI to CKD transition by integrating
single-cell RNA sequencing and lipidomic analyses
Principal Researcher

Takeshi YAMAMOTO,
Department of Nephrology, Osaka University Graduate School of Medicine Clinical Fellow

2016 年⼤隅良典⽒がオートファジー研究によりノーベル医学⽣理学賞を受賞された。我々はこれまで腎疾患におけるオートファジー研究に取り組んできた。今回、急性腎障害の回復期において、オートファジー関連遺伝⼦ Atg5 は、傷害ミトコンドリアを選択的に除去するマイトファジーと、ミトコンドリア再⽣を促進することによって、慢性腎臓病への進展を抑制することがわかった。今後シングルセルとリピドームの統合解析を⽤い、細胞運命決定因⼦と病態関連脂質を同定し、創薬・バイオマーカー確⽴につなげたい。
Acute kidney injury (AKI) elevates the risk of chronic kidney disease (CKD) progression, but themolecular mechanism underlying the AKI to CKD transition remains elusive. Here, the authors show thatautophagy is reactivated during both the recovery phase and immediately after AKI, and that induced
deletion of autophagy gene Atg5 in proximal tubular epithelial cells (PTECs) after AKI exacerbates CKD
progression. Mechanistically, the ATG-conjugation system promotes mitochondrial biogenesis via theautophagy-independent transcription factor EB (TFEB)-peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γ coactivator-1α (PGC-1α) axis as well as autophagy-dependent removal of damaged
mitochondria. This novel mechanism may have potential therapeutic implications for preventing the AKI
to CKD transition.

1．研究内容（AKI to CKD transition と呼ばれる：Clin J Am

はじめにSoc Nephrol. 2008, Kidney Int. 2013）．AKI では

従来，急性腎障害（Acute Kidney Injury: AKI）

近位尿細管細胞(PTECs)の障害が中⼼的な役割をは⾃然治癒する病態と考えられていたが，近年の果たすと考えられている⼀⽅で，CKD では⽷球臨床研究により，⾼い致死率に加え，慢性腎臓病

体硬化・近位尿細管障害・遠位尿細管障害などの（Chronic Kidney Disease: CKD）・末期腎不全

広範なネフロン障害と間質の線維化を特徴とする．

（End Stage Renal Disease: ESRD）に⾄る予後不AKI 後，障害を受けた尿細管を含め，腎のどの構良な致命的な病態であることがわかってきた

成細胞がどのように回復あるいは不全に⾄るか，

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CKD の特徴に⾄るのかの詳細な分⼦機序は解明

トファゴソーム可視化マウス（GFP-LC3 マウス）されていない．オートファジーは主要な細胞内分にリソソーム阻害薬クロロキン注射の有無による解システムであり，細胞成分の代謝回転を担うこ増加分をオートファジーフラックスとして測定しとで細胞内恒常性を維持し，また細胞が負荷を受た [1-4]．いずれも雄マウスのみを使⽤した．マ

けると傷害性物質を排除するために亢進する．

ウス虚⾎再灌流傷害(Ischemia-Reperfusion injury:

我々はこれまで「腎疾患における尿細管オートフIRI)は，8 週齢に対して⽚腎虚⾎ 35 分を⾏い再ァジーの役割」を研究し，加齢・⽼化 [引⽤⽂献

灌流後，経時的な解剖・観察を⾏った．さらに当1]・肥満・脂肪毒性 [2,3]・糖尿病 [4]は「オート研究室にて樹⽴した Atg5 ⽋損近位尿細管細胞ファジー不全（脂質代謝異常・オートファジー停（Atg5 (-) PTEC）と，Atg5(-) PTEC に Atg5 を滞状態）」を引き起こし，「AKI への脆弱性」につreconstitution した Atg5 (+) PTEC を使⽤し培ながることを報告してきた [5]．⼀⽅，近年，急養細胞による機序追究を⾏った．培養液として速なシングルセル RNA-sequence 技術の進歩に5%FBS を含んだ low glucose (LG) DMEM を使より，個々の細胞の個性を維持したまま細胞の性⽤した．

質を解析すること，さらに機械学習アルゴリズム②シングルセル解析とリピドーム解析を⽤いたを⽤いて軌道解析(Trajectory analysis)により分化

AKI to CKD transition の病態解明シングルセ経路を推定することが可能となった．以上の背景

ル解析として，コントロール，マウス IRI 2 ⽇後，から，本研究では，「AKI 後オートファジー不全・5 ⽇後，2 週間後の腎臓のシングルセル

脂質代謝異常を伴い致命的な障害を受けた不全近RNA-sequence を 1 万細胞/sample，5 万リード/位尿細管が，⽷球体や他の尿細管にもダメージを細胞で実施し（⼤阪⼤学免疫学フロンティア研究波及させ，さらに周囲に強く炎症や線維化を惹起センター: IFReC にて実施），腎構成細胞のクラスし，CKD に⾄る」との仮説をたて，①AKI to CKD

タリングを⾏い，RNA velocity 解析を⾏った．同過程におけるオートファジーの挙動と役割を詳細

じ IRI 処置・解剖を⾏った腎臓のサンプルをリピに検討し，同時に②シングルセル解析で AKI to

ドーム解析に供し，九州⼤学⽣体防御医学研究所

CKD 過程（障害尿細管の分化経路および制御シトランスオミクス医学研究センターメタボロミク

グナルの同定）を網羅的に解析し，さらにリピド

ス分野⾺場健史教授，和泉⾃泰准教授との共同研

ーム解析の統合により AKI to CKD 過程の全容を究継続中である[3, 6]．

解明することを⽬的とした．
結果及び考察実験⽅法①遺伝⼦改変マウス・虚⾎再灌流傷害-腎線維化モ①遺伝⼦改変マウス・虚⾎再灌流傷害-腎線維化モ

デルを⽤いた AKI to CKD transition の病態解明

デルを⽤いた AKI to CKD transition の病態解明

⽚側 35 分の IRI 処置を⾏った後，経時的な観察

当研究室にて樹⽴した C57BL/6 系統の近位尿細を⾏った．近位尿細管特異的オートファジー不全

管特異的 Atg5 ノックアウトマウス（KAP-Creマウスでは IRI 3 週間後には野⽣型マウスに⽐しAtg5 flox マウス），薬剤（タモキシフェン）誘導て炎症反応遷延，腎線維化の増悪を認めた．オー性近位尿細管特異的 Atg5 ノックアウトマウス

トファゴソーム可視化マウスを⽤いて IRI 後のオ（NDRG1-CreERT2 Atg5 flox マウス）とそれぞートファジーフラックスを検討したところ，IRI 6れの対照となる野⽣型マウスを使⽤した [1-4]．

時間後(急性期)と 1 週間後(回復期)とに 2 峰性のマウス腎のオートファジー活性の評価には，オーピークを認めた (図 1A)．タモキシフェン誘導性

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近位尿細管特異的オートファジー不全マウスにこと，2)AKI 後には多様な腎構成細胞が相互に作IRI 後タモキシフェンを投与することにより回復⽤しあうことにより，AKI 後の修復や CKD への期におけるオートファジーのみを不全にしたとこ

進展に関わるという興味深い点に気付き，1)AKIろ同様に野⽣型マウスに⽐して腎線維化が増悪し後の尿細管細胞の修復や萎縮に⾄る分⼦機構ならた．IRI 後の経時的な検討により IRI 1 週間後にびに 2)腎構成細胞間のシグナル伝達機構を解明す

おいて野⽣型マウスではマイトファジーが活性化ることが AKI to CKD transition の病態の理解・すると同時に PGC1α 依存性にミトコンドリア治療法の開発に重要であるという結論に⾄った．

再⽣が亢進していた．⼀⽅オートファジー不全マその⽬的を達成すべく，IRI 2 ⽇後，5 ⽇後，2 週

ウスではマイトファジーを認めずミトコンドリア間後におけるサンプルをシングルセル再⽣も低下していた．不死化 PTECs を⽤いた検RNA-sequence に供した．まず，腎構成細胞のク討 に よ り ， Atg5 は TFEB の 核 移 ⾏ を 介 し てラスタリングを⾏い，腎臓が 13 種類の細胞からPGC1α を活性化することが⽰された (図 1B)．

構成されることを明らかとした (図 2A)．現在まAKI の回復期において Atg5 はマイトファジーとでに，RNA velocity 解析を⽤いて AKI 後近位尿同時にミトコンドリア再⽣を促進することにより，細管の分化過程を推定したところ，近位尿細管はAKI から CKD への進展を抑制することがわかっ

AKI 後，定常状態に戻る修復尿細管と炎症性サイた (図 1C)．

トカインなど CKD の進展に関わる遺伝⼦を⾼発②シングルセル解析とリピドーム解析を⽤いた

現する修復不全尿細管の 2 つのクラスターに分岐

AKI to CKD transition の病態解明していくことを明らかにした (図 2B)．引き続き，上記の検討を進めていく中，1)病態に中⼼的な役

RNA velocity 解析のみならず，SCENIC を⽤いた割を果たす近位尿細管細胞は同⼀個体内であって転写因⼦活性をはじめ，更なる検証を⾏うことにも AKI 後に完全に修復される細胞と，修復がうま

より AKI to CKD の進展に重要な転写因⼦を同定

く働かず萎縮に⾄る細胞に⼆分され，萎縮に⾄っしていく予定である．

た細胞が CKD への進展に中⼼的な役割を果たす

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図 1．遺伝⼦改変マウス・虚⾎再灌流傷害-腎線維化モデルを⽤いた AKI to CKD transition の病態解明
A: AKI to CKD transition におけるオートファジーフラックスの変化，B: AKI to CKD transition における TFEB の核移⾏，C: 本研究で解明した AKI to CKD 移⾏機序の概要図

図 2．シングルセル解析とリピドーム解析を⽤いた AKI to CKD transition の病態解明
A: シングルセル解析における腎構成細胞のクラスタリング, B: RNA velocity 解析

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おわりにProximal Tubule Autophagy Differs in Type 1 andAKI の回復期において Atg5 はマイトファジー

2 Diabetes. J Am Soc Nephrol, 30 (6): 929-945と同時にミトコンドリア再⽣を促進することによ(2019)

り AKI から CKD への進展を抑制することがわ5.

かった．今後さらにシングルセル解析追究とリピObesity-related tubulopathy. Nephrology, 15 (1):

ドーム解析との統合的解析を⽤い，尿細管細胞運108-116 (2022)

命の決定にかかわる転写因⼦と病態関連脂質代謝

6. Minami S, Yamamoto T, Takabatake Y,

物を同定し，創薬・バイオマーカー確⽴につなげ

Takahashi A, Namba T, Matsuda J, Kimura T,たい．

Kaimori JY, Matsui I, Hamano T, Takeda H,YamamotoT,Takabatake

Y,IsakaY:

Takahashi M, Izumi Y, Bamba T, Matsusaka T,
引⽤⽂献Niimura F, Isaka Y: Lipophagy maintains energy

1. Yamamoto T, Takabatake Y, Kimura T,

homeostasis in the kidney proximal tubule during

Takahashi A, Namba T, Matsuda J, Minami S,

prolonged

Kaimori JY, Matsui I, Kitamura H, Matsusaka T,

1629-1647 (2017)

starvation.

Autophagy,13(10):Niimura F, Yanagita M, Isaka Y, Rakugi H:Time-dependent
Implications

indysregulation
aging

andofautophagy:

mitochondrial

homeostasis in the kidney proximal tubule.
Autophagy, 3; 12 (5): 801-13 (2016)

2．発表（研究成果の発表）
国内外の学会誌、学会講演会等における発表があれば５件程度記載。
記載内容：⽒名、題⽬、誌名、巻、号、⾴（年2. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A,次）、学会名（場所、年次）

Kimura T, Namba T, Matsuda J, Minami S,

本研究内容（⼀部）は，“ATG-Conjugation System

Kaimori JY, Matsui I, Matsusaka T, Niimura F,Counteracts

AKI

Yanagita M, Isaka Y: High-Fat Diet-Induced

Coordinating

Mitophagy

Lysosomal Dysfunction and Impaired Autophagic

Biogenesis.”として論⽂投稿中である．

Flux Contribute to Lipotoxicity in the Kidney. J

また、本研究内容（⼀部）は，2022年11⽉18⽇第52Am Soc Nephrol, 28 (5): 1534-1551 (2017)回⽇本腎臓学会⻄部学術⼤会 ⼭本毅⼠

3. Yamamoto T, Takabatake Y, Minami S, Sakai S,

シンポジウム1「時間空間的ネットワークで考える

Fujimura R, Takahashi A, Namba-Hamano T,DKDの基礎研究」【演題】DKDにおけるオルガネラク

Matsuda J, Kimura T, Matsui I, Kaimori JY,ロストーク－オートファジー にて発表予定である.

Takeda H, Takahashi M, Izumi Y, Bamba T,
Matsusaka T, Niimura F, Yanagita M, Isaka Y:Eicosapentaenoic acid attenuates renal lipotoxicity
by restoring autophagic flux. Autophagy, 17 (7):1700-1713 (2021)
4. Sakai S, Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi
A, Namba-Hamano T, Minami S, Fujimura R,
Yonishi H, Matsuda J, Hesaka A, Matsui I,
Matsusaka T, Niimura F, Yanagita M, Isaka Y:

toCKD
andTransition

byMitochondrial