はじめに

平成 24 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成 17 年度からは、奨励
研究に萌芽的研究の枠を設けるなど研究の多様化にも対応しています。
平成 19 年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成 24 年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域では、共同研究に 10 件の申請があり 4 件を採択、奨励研究に 30 件の申請があり 11 件が採択されました。また、看護学領域では、共同研究に 3 件の申請があり 1 件を採択、奨励研究に 4 件の申請があり 2 件が採択されました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後、これらの共同研究と奨励研究で得られた研究成果を、社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

平成 26 年 10 月
金沢医科大学
学長

勝田

省吾

目

次

はじめに

平成 24 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2012－1. ミトコンドリア機能制御による老化･代謝疾患の新たな治療法の確立
研究代表者・古 家 大 祐･･････ 1
C2012－2.

動脈硬化治療薬による最適化治療を目指した
遺伝子・バイオマーカー診断法の開発
研究代表者・梶 波 康 二･･････

C2012－3.

9免疫制御受容体による急性灰白脳脊髄炎・脱髄疾患の制御機構の解明
研究代表者・中 村

C2012－4.

晃･･････ 13

スフィンゴ脂質による腫瘍細胞の浸潤（転移）抑制療法の開発
研究代表者・岡 崎 俊 朗･･････ 17[看護学領域]
C2012－5.

点滴静脈内注射の血管外漏出の有無の客観的判定指標の開発
研究代表者・松 井 優 子･･････ 21

平成 24 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2012－1. mRNA-タンパク質複合体の構造変化の解析
研究代表者・石 垣 靖 人･･････ 25
S2012－2.

QT 延長症候群における早期後脱分極の発生機序と最適制御法の解明：ヒト心室筋細胞の標準モデルを用いた非線形力学的アプローチ
研究代表者・倉 田 康 孝･･････ 29

S2012－3.

胎盤の形態形成におけるガレクチンの機能解析研究代表者・有 川 智 博･･････ 33

S2012－4.

高度たんぱく質制限の尿細管オートファジー活性化を介した糖尿病腎症発症・進展抑制機序の解明
研究代表者・北 田 宗 弘･･････ 35

S2012－5.

新規抗線維化療法の開発：抗線維化ペプチドを用いた
miRNA array 解析から得られた知見から研究代表者・金 﨑 啓 造･･････ 39

S2012－6.

Saffold ウイルスの病原性解明を目指した感染受容体の同定研究代表者・姫 田 敏 樹･･････ 45

S2012－7.

N-end rule 経路の生理機能研究代表者・田 崎 隆 史･･････ 49

S2012－8.

カドミウムによる慢性腎臓病 CKD の動脈硬化危険因子に関する研究研究代表者・西 条 旨 子･･････ 53

S2012－9.

可溶型 VEGF 受容体（可溶型 Flt-1）の血管新生・脈管形成における役割の解明
研究代表者・池 田 崇 之･･････ 57

S2012－10. アドレノメデュリンを用いた多発性硬化症に対する新規治療法の開発
研究代表者・北 村 彰 浩･･････ 61
S2012－11. TLR9 シグナルの新規制御分子 Sortilin の機能解析研究代表者・和 田 俊 樹･･････ 65[看護学領域]
S2012－12. 大学病院精神科病棟での隔離・身体拘束の施行実態
および看護介入との関連研究代表者・長 山

豊･･････ 69

S2012－13. 透析維持期にある 2 型糖尿病患者が家族に思いを抱くという体験研究代表者・岡 山 未 来･･････ 73

平成 24 年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2012-１～４

看護学領域

C2012-５

１．研究課題名：ミトコンドリア機能制御による老化・代謝疾患の新たな治療法の確立（研究番号

C2012-1）

２．キーワード：１）ミトコンドリア（mitochondria）
２）老化（aging）
３）代謝疾患（metabolic disease）
４）オートファジー（autophagy）
５）サーチュイン（sirtuin）
３．研究代表者：古家大祐・医学部・教授・糖尿病・内分泌内科学

研究分担者：金﨑啓造・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

北田宗弘・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

前川聡・滋賀医科大学医学部・教授・内科学講座（糖尿病・腎臓・神経内科）

久米

真司・滋賀医科大学医学部・特任助教・内科学講座（糖尿病・腎臓・神経内科）

４．研 究 目 的
総務省統計局からの報告では、65 歳以上の高齢者人口（平成 24 年９月 15 日現在推計）は3074 万人で、総人口に占める割合は 24.1％となっている。この現状に加えて、小子化問題を考慮すると 20 年後には 30％強が 65 歳以上となり、わが国は超高齢化社会に突入すると言っても過言ではない。こうした問題に対処するための重要な解決策は、高齢者が肉体的・精神的健康を維持して、個人としても社会においても生産的な老後を送ることを可能にしていくことである。したがって、老化疾患と老化に伴って著増する糖尿病など代謝疾患に対して、根本的な老化制御メカニズムの理解に基づいた新たな治療法を講じていくことがわが国にとって急務の課題である。
そこで我々は、1）カロリー制限食同様にオートファジーを惹起しうる食事介入治療を開発し得ないかと考えた。予備的検討にて高脂肪食負荷によりオートファジー系破綻が生じ、高脂肪食負荷下、高ケト原性アミノ酸含有食投与によって脂肪肝が組織学的に改善していることも見い出している。本研究では高ケト原性アミノ酸含有食がミトコンドリア機能制御を介した新たな治療戦略になる可能性を検証することを目的とした。2）たんぱく質摂取制限の糖尿病および糖尿病腎症に対して、栄養応答反応の制御によって可能か否かを検討した。
５．研 究 計 画
1）マウス（C57Bl6）を用い、高脂肪食・ケト原性アミノ酸含有高脂肪食をあたえる。12 週、24 週後に耐糖能・エネルギー代謝を評価し屠殺。各臓器を採取し組織学的・生化学的・分子生物学的検討を行う。オートファジーを可視化する事ができる LC3-GFP マウスを用い、オートファジー機構の演じる役割を詳細に検討する。

－1－

2）２型糖尿病 Wistar fatty (fa/fa)ラット（６週齢雄）と対照ラットを通常食（たんぱく質 22%、
脂質 5.4%、炭水化物 66.5%）群とたんぱく質制限食（たんぱく質 5%、脂質 10%、炭水化物 76.2%）群に分別し、28 週間飼育した。体重・摂食量・血糖値（空腹/随時）・血圧を４週間ごとに測定し、28 週後に HbA1C 値・インスリン値（IRI）
・インスリン耐容能試験（ITT）
・
脂質（総コレステロール・中性脂肪（TG）・遊離脂肪酸（FFA））・尿アルブミン排泄量（UALB）・腎重量・腎組織（メサンギウム領域の拡大・線維化）を評価した。
６．研 究 成 果
1）8 週齢のマウスを、通常食、
高脂肪食、高脂肪食+ケト原性アミノ酸食（脂質、炭水化物エネルギー比率は通常食と同様、12、16 週後に耐糖能、肝臓の組織検査（oilred O 染色）、肝臓におけるA

Control diet

BC

オートファジー関連シグナ
ル、内臓脂肪の大きさとマクロファージ浸潤を検討した。その結果、摂食量に変

図 1. 高脂肪食による非アルコール性脂肪肝(NAFLD)が、ケト原性アミノ酸によって改善する

わりはないが、ケト原性ア
ミノ酸食群によって高脂肪食群と比較して、１）体重が有意な減少、２）内臓脂肪重量（Epididymal fat）が有意に減少とマクロファー
ジの浸潤の減少、３）オートファジーの亢進、４）非ア ル コ ー ル 性 脂 肪 肝（NAFLD）の改善（図 1）、
５）耐糖能異常の改善、が認められた。さらに、上流図 2. 高脂肪食による栄養応答シグナルの破綻が、ケト原性アミノ酸によって改善するの分子メカニズムとして、
高脂肪食群における肝臓での LKB1-AMPK シグナルの低下と mTOR の活性化が、ケト原性
アミノ酸食によって改善されていた。さらに、高脂肪食群でみられた SIRT1 の発現低下も、ケト原性アミノ酸食によって改善されていた（図 2）。
2）糖尿病ラットの両群間で摂食量に差はなかったが、通常食群と比較してたんぱく質制限食
群で、体重・腎重量の減少、血糖値・HbA1C 値・IRI 値の低下、ITT の改善、TG・FFA 値－2－の低下、さらに UALBの低下及び、腎組織の改善を認めた（図 3）。
なお、血圧に差はなかった。
７．研究の考察・反省
以上の結果から、
1）ケト原性アミノ酸によって、高脂肪食時におけるオートファジーの低下が非アルコール性
脂肪肝（NAFLD）形成

図 3. たんぱく質制限によって腎組織障害は改善すると耐糖能異常に重要な役割を演じていること、さらにケト原性アミノ酸による栄養応答シグナルの破綻の改善が、
オートファジー機構を介して、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）形成と耐糖能異常を改善しえることが明らかとなった。
2）高度たんぱく質制限は、２型糖尿病ラットにおける糖・脂質代謝の改善と腎保護効果を示した。今後、栄養応答反応の制御によって改善したのか、詳細に検討する。
８．研 究 発 表
① Kanasaki K, Shi S, Kanasaki M, He J, Nagai T, Nakamura Y, Ishigaki Y, Kitada M, Srivastava SP,
Koya D. Linagliptin-mediated DPP-4 inhibition ameliorates kidney fibrosis in streptozotocin-induced
diabetic mice by inhibiting endothelial-to-mesenchymal transition in a therapeutic regimen. Diabetes
2014; 63: 2120-2131.
Abstract: Kidney fibrosis is the final common pathway of all progressive chronic kidney diseases,of which diabetic nephropathy is the leading cause. Endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT)
has emerged as one of the most important origins of matrix-producing fibroblasts. Dipeptidyl
peptidase-4 (DPP-4) inhibitors have been introduced into the market as antidiabetes drugs. Here, we
found that the DPP-4 inhibitor linagliptin ameliorated kidney fibrosis in diabetic mice without
altering the blood glucose levels associated with the inhibition of EndMT and the restoration of
microRNA 29s. Streptozotocin-induced diabetic CD-1 mice exhibited kidney fibrosis and strong
immunoreactivity for DPP-4 by 24 weeks after the onset of diabetes. At 20 weeks after the onset of
diabetes, mice were treated with linagliptin for 4 weeks. Linagliptin-treated diabetic mice exhibited a
suppression of DPP-4 activity/protein expression and an amelioration of kidney fibrosis associatedwith the inhibition of EndMT. The therapeutic effects of linagliptin on diabetic kidneys wereassociated with the suppression of profibrotic programs, as assessed by mRNA microarray analysis.

－3－

We found that the induction of DPP-4 observed in diabetic kidneys may be associated with
suppressed levels of microRNA 29s in diabetic mice; linagliptin restored microRNA 29s andsuppressed DPP-4 protein levels. Using cultured endothelial cells, we found that linagliptin inhibited
TGF-β2–induced EndMT, and such anti-EndMT effects of linagliptin were mediated throughmicroRNA 29 induction. These results indicate the possible novel pleiotropic action of linagliptin torestore normal kidney function in diabetic patients with renal impairment.
② Kitada M, Koya D. The use of calorie restriction mimetics to study aging. Methods Mol Biol 2013;
1048: 95-107.
Abstract: Calorie restriction (CR) has a variety of effects on extending lifespan and delaying theonset of age-related diseases, and it is accepted as the only established experimental antiaging
intervention. Several pharmacological agents that can replicate the beneficial effects of CR, called
calorie restriction mimetics (CRMs), have been identified. The nutrient-sensing pathways including
those involving sirtuins (especially SIRT1) and mammalian target of rapamycin (mTOR) may
regulate the physiology of CR, and candidate CRMs that modulate these specific pathways have been
identified and investigated using animal models. In this chapter, we focus on candidate CRMs
including sirtuin-activating compounds (STACs) and mTOR inhibitors, their slowing of aging, andmethods for evaluation of lifespan and metabolic disorders.
③ Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Tsuda S, Kanasaki K, Koya D. Calorie restriction in
overweight males ameliorates obesity-related metabolic alterations and cellular adaptations throughanti-aging effects, possibly including AMPK and SIRT1 activation. Biochim Biophys Acta 2013;
1830: 4820-4827.
Abstract: Background: Calorie restriction (CR) is accepted as an experimental anti-aging paradigm.
Several important signal transduction pathways including AMPK and SIRT1 are implicated in theregulation of physiological processes of CR. However, the mechanisms responsible for adaptations
remain unclear in humans.
Scope of review: Four overweight male participants were enrolled and treated with 25% CR of theirbaseline energy requirements for 7weeks. Characteristics, including body weight (BW), body massindex (BMI), %fat, visceral fat area (VFA), mean blood pressure (MBP) and VO2 max, as well as
metabolic parameters, such as insulin, lipid profiles and inflammatory makers and the expression ofphosphorylated AMPK and SIRT1 in peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs), were
determined at baseline and then after 7weeks. In addition, we assessed the effects of the serum
collected from the participants on AMPK and SIRT1 activation and mitochondrial biogenesis incultured human skeletal muscle cells.
Major conclusions: After CR, BW, BMI, %fat, VFA and MBP all significantly decreased, while VO2
max increased, compared to those at baseline. The levels of fasting insulin, free fatty acid, and－4－inflammatory makers, such as interleukin-6 and visfatin, were significantly reduced, whereas theexpression of phosphorylated AMPK and SIRT1 was significantly increased in PBMNCs collected
after CR, compared to those at baseline. The skeletal muscle cells that were cultured in serum
collected after CR showed an increase in AMPK and SIRT1 activity as well as mitochondrial
biogenesis.
General significance: CR is beneficial for obesity-related metabolic alterations and induces cellular
adaptations against aging, possibly through AMPK and SIRT1 activation via circulating factors.
④ Xu L, Kanasaki M, He J, Kitada M, Nagao K, Jinzu H, Noguchi Y, Maegawa H, Kanasaki K, Koya D.
Ketogenic essential amino acids replacement diet ameliorated hepatosteatosis with altering
autophagy-associated molecules. Biochim Biophys Acta 2013; 1832: 1605-1612.
Abstract: Ketogenic amino acid (KAA) replacement diet has been shown to cure hepatic steatosis, aserious liver disease associated with diverse metabolic defects. In this study, we investigated theeffects of KAA replacement diet on nutrition sensing signaling pathway and analyzed whether
induction of hepatic autophagy was involved. Mice are fed with high fat diet (HFD) or KAA
replacement in high-fat diet (30% fat in food; HFD)-fed (HFDKAAR) and sacrificed at 8, 12, 16 weeks
after initiation of experimental food. Hepatic autophagy was analyzed in protein expression of several
autophagy-associated molecules and in light chain-3 green fluorescent protein (LC-3 GFP) transgenic
mice. HFDKAAR showed increased AMP-activated protein kinase (AMPK) phosphorylation andenhanced liver kinase B1 (LKB1) expression compared to control HFD-fed mice. The
KAA-HFD-induced activation of AMPK was associated with an increased protein expression of
sirtuin 1 (Sirt1), decreased forkhead box protein O3a (Foxo3a) level, and suppression of mammaliantarget of rapamycin (mTOR) phosphorylation compared with the HFD-fed mice. The intervention
study revealed that a KAA-replacement diet also ameliorated all the established metabolic andautophagy defects in the HFD-fed mice, suggesting that a KAA-replacement diet can be usedtherapeutically in established diseases. These results indicate that KAA replacement in food could bea novel strategy to combat hepatic steatosis and metabolic abnormalities likely involvement of an
induction of autophagy.
⑤ Kitada M, Kume S, Kanasaki K, Takeda-Watanabe A, Koya D. Sirtuins as possible drug targets intype 2 diabetes. Curr Drug Targets 2013; 14: 622-636.
Abstract: The rising incidence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major public health problem
in industrialized countries, and new therapeutic strategies to prevent T2DM are urgently needed
worldwide. It is well known that calorie restriction (CR) can retard the aging process in organisms
ranging from yeast to rodents and delay the onset of numerous age-related diseases, including
diabetes. Molecules that mimic CR metabolically may therefore represent new therapeutic targets forT2DM. Sirtuin1 (SIRT1), the mammalian homolog of Sir2, was originally identified as a－5－

NAD+-dependent histone deacetylase, and its activity is closely associated with longevity under CR.
Growing evidence suggests that SIRT1 regulates glucose-lipid metabolism through its deacetylase
activity for many known substrates and has many roles in the metabolic pathway through its direct orindirect involvement in insulin signaling in insulin-sensitive organs, including adipose tissue, liverand skeletal muscle. In addition, SIRT1 regulates insulin secretion, and adiponectin production,
inflammation, gluconeogenesis, circadian rhythms and oxidative stress, which together contribute to
the development of insulin resistance. Moreover, the overexpression of SIRT1 and several SIRT1
activators have beneficial effects on glucose homeostasis and insulin sensitivity in diabetic animalmodels and humans. Therefore, SIRT1 may represent a new therapeutic target for the prevention of
diseases related to insulin resistance and T2DM. In addition, SIRT3 and SIRT6 play crucial roles inglucose and lipid metabolism. In this review, we summarize the current understanding of thebiological functions of SIRT1, SIRT3 and SIRT6 in metabolism and discuss their potential role astherapeutic targets in T2DM.
⑥ He J, Xu Y, Koya D, Kanasaki K. Role of the endothelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosisof chronic kidney disease. Clin Exp Nephrol 2013; 17: 488-497.
Abstract: All types of progressive chronic kidney disease (CKD) inevitably induce renal fibrosis, thehallmark of which is the activation and accumulation of a large number of matrix-producing
fibroblasts or myofibroblasts. The activated fibroblasts or myofibroblasts are derived from diverse
origins, such as residential fibroblasts, vascular pericytes, epithelial-to-mesenchymal transition(EMT), and bone marrow (circulating fibrocytes). Recently, endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT) or endothelial-to-myofibroblast transition has also been suggested to promote fibrosis and isrecognized as a novel mechanism for the generation of myofibroblasts. Similar to EMT, during
EndMT, endothelial cells lose their adhesion and apical-basal polarity to form highly invasive,
migratory, spindle-shaped, elongated mesenchymal cells. More importantly, biochemical changes
accompany these distinct changes in cell polarity and morphology, including the decreased expressionof endothelial markers and the acquisition of mesenchymal markers. This review highlights evidence
supporting the important role of EndMT in the development of renal fibrosis in CKD and its
underlying mechanisms, including novel biological significance of microRNA regulation.
⑦ Kanasaki K, Taduri G, Koya D. Diabetic nephropathy: the role of inflammation in fibroblast
activation and kidney fibrosis. Front Endocrinol (Lausanne) 2013; 4: 7.
Abstract: Kidney disease associated with diabetes mellitus is a major health problem worldwide.
Although established therapeutic strategies, such as appropriate blood glucose control, blood pressure
control with renin-angiotensin system blockade, and lipid lowering with statins, are used to treat
diabetes, the contribution of diabetic end-stage kidney disease to the total number of cases requiring
hemodialysis has increased tremendously in the past two decades. Once renal function starts declining,－6－

it can result in a higher frequency of renal and extra-renal events, including cardiovascular events.
Therefore, slowing renal function decline is one of the main areas of focus in diabetic nephropathy
research, and novel strategies are urgently needed to prevent diabetic kidney disease progression.
Regardless of the type of injury and etiology, kidney fibrosis is the commonly the final outcome ofprogressive kidney diseases, and it results in significant destruction of normal kidney structure andaccompanying functional deterioration. Kidney fibrosis is caused by prolonged injury anddysregulation of the normal wound-healing process in association with excess extracellular matrix
deposition. Kidney fibroblasts play an important role in the fibrotic process, but the origin of the
fibroblasts remains elusive. In addition to the activation of residential fibroblasts, other importantsources of fibroblasts have been proposed, such as pericytes, fibrocytes, and fibroblasts originatingfrom epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition. Inflammatory cells andcytokines play a vital role In the process of fibroblast activation. In this review, we will analyze thecontribution of inflammation to the process of tissue fibrosis, the type of fibroblast activation and thetherapeutic strategies targeting the inflammatory pathways in an effort to slow the progression ofdiabetic kidney disease.
⑧ Kume S, Kitada M, Kanasaki K, Maegawa H, Koya D. Anti-aging molecule, Sirt1: a novel
therapeutic target for diabetic nephropathy. Arch Pharm Res 2013; 36: 230-236.
Abstract: Caloric restriction prolongs the lifespan of many species. Therefore, investigators haveresearched the usefulness of caloric restriction for healthy lifespan extension. Sirt1, an
NAD+-dependent deacetylase, was identified as a molecule necessary for caloric restriction-related
anti-aging strategies. Sirt1 functions as an intracellular energy sensor to detect the concentration of
NAD+, and controls in vivo metabolic changes under caloric restriction and starvation through its
deacetylase activity to many targets including histones, nuclear transcriptional factors, and enzymes.
During the past decade, investigators have reported the relationship between disturbance of Sirt1
activation and the onset of aging- and obesity-associated diseases such as diabetes, cardiovasculardisease and neurodegenerative disorders. Consequently, a calorie restriction-mimetic action of Sirt1 is
now expected as a new therapy for these diseases. In addition, recent studies have gradually clarified
the role of Sirt1 in the onset of kidney disease. Its activation may also become a new target oftreatment in the patients with chronic kidney disease including diabetic nephropathy. In this article,
we would like to review the role of Sirt1 in the onset of kidney disease based on previous studies, anddiscuss its possibility as the target of treatment in diabetic nephropathy.
⑨ Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Kanasaki K, Koya D. Sirtuins and renal diseases:
relationship with aging and diabetic nephropathy. Clin Sci (Lond) 2013; 124: 153-164.
Abstract: Sirtuins are members of the Sir2 (silent information regulator 2) family, a group of class
III deacetylases. Mammals have seven different sirtuins, SIRT1-SIRT7. Among them, SIRT1, SIRT3－7－

and SIRT6 are induced by calorie restriction conditions and are considered anti-aging molecules.
SIRT1 has been the most extensively studied. SIRT1 deacetylates target proteins using the coenzyme
NAD+ and is therefore linked to cellular energy metabolism and the redox state through multiple
signalling and survival pathways. SIRT1 deficiency under various stress conditions, such as metabolicor oxidative stress or hypoxia, is implicated in the pathophysiologies of age-related diseases including
diabetes, cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders and renal diseases. In the kidneys,
SIRT1 may inhibit renal cell apoptosis, inflammation and fibrosis, and may regulate lipid metabolism,autophagy, blood pressure and sodium balance. Therefore the activation of SIRT1 in the kidney may
be a new therapeutic target to increase resistance to many causal factors in the development of renal
diseases, including diabetic nephropathy. In addition, SIRT3 and SIRT6 are implicated in age-relateddisorders or longevity. In the present review, we discuss the protective functions of sirtuins and theassociation of sirtuins with the pathophysiology of renal diseases, including diabetic nephropathy.
⑩ Takeda-Watanabe A, Kitada M, Kanasaki K, Koya D. SIRT1 inactivation induces inflammation
through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun 2012;
427: 191-196.
Abstract: Inflammation plays a crucial role in atherosclerosis. Monocytes/macrophages are some of
the cells involved in the inflammatory process in atherogenesis. Autophagy exerts a protective effectagainst cellular stresses like inflammation, and it is regulated by nutrient-sensing pathways. The
nutrient-sensing pathway includes SIRT1, a NAD+-dependent histone deacetylase, which is
implicated in the regulation of a variety of cellular processes including inflammation and autophagy.
The mechanism through which the dysfunction of SIRT1 contributes to the regulation of
inflammation in relation to autophagy in monocytes/macrophages is unclear. In the present study, wedemonstrate that treatment with 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide(Sirtinol), a chemical inhibitor of SIRT1, induces the overexpression of inflammation-related genes
such as tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 through nuclear factor (NF)-κB
signaling activation, which is associated with autophagy dysfunction, as shown through p62/Sqstm1
accumulation and decreased expression of light chain (LC) 3 II in THP-1 cells. The autophagy
inhibitor, 3-methyladenine, also induces inflammation-related NF-κB activation. In p62/Sqstm1
knockdown cells, Sirtinol-induced inflammation through NF-κB activation is blocked. In addition,
inhibition of SIRT1 is involved in the activation of the mammalian target of rapamycin (mTOR)
pathway and is implicated in decreased 5'-AMP activated kinase (AMPK) activation, leading to theimpairment of autophagy. The mTOR inhibitor, rapamycin, abolishes Sirtinol-induced inflammation
and NF-κB activation associated with p62/Sqstm1 accumulation. In summary, SIRT1 inactivationinduces inflammation through NF-κB activation and dysregulates autophagy via nutrient-sensing
pathways such as the mTOR and AMPK pathways, in THP-1 cells.

－8－１．研究課題名：動脈硬化治療薬による最適化治療を目指した遺伝子・バイオマーカー診断法の開発（研究番号C2012-2）

２．キーワード：１）動脈硬化性心血管疾患（atherosclerotic cardiovascular diseases）
２）個別化医療（individualized medicine）
３）スタチン（statin）
４）ワルファリン（warfarin）
５）薬理遺伝学（pharmacogenomics）
３．研究代表者：梶波研究分担者：河合康二・医学部・教授・循環器内科学

康幸・医学部・准教授・循環器内科学

赤尾浩慶・医学部・臨床准教授・循環器内科学

石田良子・医学部・助杉山

雄一・独立行政法人理化学研究所 ｲﾉﾍﾞｰｼｮﾝ推進ｾﾝﾀｰ・特別招聘研究員

前田

和哉・東京大学大学院薬学研究科・講師

斎藤嘉朗・国立医薬品食品衛生研究所・部長・医薬安全科学部

黒瀬光一・国立医薬品食品衛生研究所・室長・医薬安全科学部

教・循環器内科学

４．研 究 目 的
生活習慣の欧米化と高齢者人口の急激な増加により、狭心症や心筋梗塞など動脈硬化性心血管疾患は近年増加の一途を辿り、その克服は大きな社会課題となっている。近年これら疾患に対し有効性の確立された種々の治療法が登場したが、その中で、投与前に効果と副作用を予知し、治療設計の最適化を実現したものは皆無である。その大きな障壁の一つとして薬効ならびに副作用を規定する素因の人種差ならびに個体差が指摘されており、日本人独自の知見を多角的に集積・分析する必要がある。
本研究は、動脈硬化治療薬による最適化治療を目指し、薬効と副作用を予測するための遺伝子・バイオマーカーを用いた統合的診断法開発を試みるもので、平成 20 年度以降参加し成果を挙げている NEDO プロジェクト共同研究を基盤に、薬物動態・薬効・副作用の定量的解
析により創薬研究をリードしてきた東京大学杉山グループ、薬物副作用に関し日本全国から集約された情報を元に世界に向けて研究成果を発信してきた国立医薬品食品衛生研究所の斎藤グループと共同で、現行の薬物治療が持つ限界を打破する新知見を得、その早期臨床実用化を目指す、新しいスタイルの医学・薬学統合研究である。
５．研 究 計 画
頻用される動脈硬化治療薬であるコレステロール低下薬と抗血小板薬を対象に、i）既投与
例の後ろ向き研究、ii）臨床適応に沿った新規投与例の前向き研究により、バイオマーカー
解析ならびに遺伝子解析用サンプルを集積するとともに、臨床情報を収集する（国内９大学－9－からなる共同研究チームを既に発足させている）。
薬効（コレステロール低下率などのサロゲート指標、心血管イベントなどハードエンドポイント）規定因子としては、杉山・前田らによって薬物動態や薬効に関わることが示された遺伝子群における遺伝子多型を、副作用（横紋筋融解などの筋障害）関連因子については斎
藤・黒瀬らが従来蓄積した日本人における副作用規定因子を中心に、それぞれ検討する。同時に新規バイオマーカー探索として、梶波・河合らの従来研究を基盤に植物ステロールや心筋障害マーカー、さらには血栓関連分子を測定する。
６．研 究 成 果
（１）有害事象発現症例の集積
・金沢医科大学および国内８大学（山梨、神戸、近畿、和歌山県立医科、徳島、福岡、熊本、佐賀）の共同研究チームを発足した。各施設の倫理委員会承認後、スタチン投与例対象とした後ろ向き研究として、筋障害発症例を登録し、バイオマーカー解析ならびに遺伝子解析用サンプル収集を開始。２０１４年３月までに計３１例が登録された。これら症例を対象に、既報において筋障害発症との連鎖が認められた候補遺伝子多型６種について解析を完了した（発表予定）（梶波、河合、赤尾、石田）。
・各施設におけるスタチン投与症例総数との関係から、筋障害発症頻度についての日本人初のデータとなることが期待される（発表予定）（梶波、河合、赤尾、石田）。
・横紋筋融解症等に関し、２０１４年２月末までに、全国より患者ゲノム DNA および臨床情報を計１２６例収集した。ケースカードによる診断確定が可能であった１２０例中３４
例はスタチン関連の筋障害と考えられた。２５０万多型を測定しうる DNA マイクロアレ
イを用いてゲノム網羅的遺伝子多型解析を行い、日本人健常人データと比較したところ、免疫系、細胞骨格、神経機能関連遺伝子等の領域に、統計学的な多重性補正後も有意に関連する多型を数種見出した。またスタチン処方例に限定した場合、トランスポーター、免疫系、シグナル伝達関連遺伝子等の領域に関連する多型を検出した（発表予定）
（斎藤、梶
波）。
（２）薬効規定因子の探索
・実臨床例において、マイクロドース法を用い atorvastatin 薬物動態が OATP1B1 遺伝子多型
により有意に異なることを明らかにし、その後の薬効との関連分析結果を合わせて現在論文作成中である（抄録 Circ J 76(suppl I)I-1799, 2012：梶波、河合、赤尾、杉山、前田）。
・スタチンを用いて行われた大規模臨床研究(PROSPER)において細胞からのコレステロール
引き抜きに関与する膜トランスポーターABCA1 遺伝子の機能的高頻度多型がスタチンによる心血管イベント抑制効果の有意な規定因子であることを報告した（論文①：梶波、赤尾）。
・動脈硬化性心血管病治療に用いられる抗凝固薬であるワルファリンの薬効規定因子を食事からのビタミン K 摂取量を考慮した薬理栄養遺伝学の観点から検討し、VKORC1 遺伝子変異アレル保持者では摂取量の影響が大きいことを見出した（論文②：梶波、河合、赤尾、－ 10 －

石田）。
７．研究の考察・反省スタチンに関して、筋障害の発症頻度が予想外に低いことが明らかとなり、当初計画した研究進捗予定の修正が必要であった。また基礎研究における薬物代謝の人種差の背景となる
分子メカニズムに関する諸研究結果を合わせて考察すると、この現象（筋障害が低頻度であること）それ自体が日本人の特徴である可能性が想定された。ゲノム網羅的遺伝子解析結果
が進捗しつつあることから、これを踏まえて今後の研究発展に期待される。
８．研 究 発 表
① Akao H, Polisecki E, Schaefer EJ, Trompet S, R obertson M, Ford I, Jukema JW, de Craen AJM,
Packard C, B uckley BM, Kajinami K; PROspective Study of Pravastatin in the Elderl y at Risk
(PROSPER) Investigator. ABCA1 gene variation and heart disease risk reduction in the elderly duringpravastatin treatment. Atherosclerosis 2014; 235: 176-181.
Abstract: Aims: Our goals were to examine the relationships of a specific A TP-binding cassettetransporter A1 (ABCA1) variant, rs2230806 (R219K), on baseline lipids, low-density lipoproteincholesterol (LDL-C) lowering due to pravastatin, baseline heart disease, and cardiac endpoints on
trial.
Methods and results: The ABCA1 R219K variant was assessed in 5414 participants in PROSPER(PROspective Study of Pravastatin in th e Elderly at Risk) (mean age 75.3 years), who had been
randomized to pravastatin 40 mg/day or placebo a nd followed for a mean of 3 .2 years. Of thesesubjects 47.6% carried the variant, with 40.0% carrying one allele, and 7.6% carrying both alleles. No
effects on baseline LDL-C levels were noted, but mean HDL-C increased modestly according to thenumber of variant alleles b eing present (1.27 vs 1.28 vs 1.30 mmol/L, p = 0 .024). No relationships
between the presence or absence of this variant a nd statin induced LDL-C lowering response or CHD
at baseline were noted. However within trial those w ith the variant as compared to those w ithout thevariant, the overall adjusted hazard rat io for ne w cardiovascular disease (fatal CHD, non-fatal
myocardial infarction, or fatal or non -fatal stroke) was 1.22 (95% CI 1.06-1.40, p = 0.006), while forthose in the pravastatin group it was 1.41 (1.15-1.73, p = 0.001), and for those in the placebo group it
was 1.08 (0.89-1.30, p = 0.447) (p for interaction 0.058).
Conclusion: Our data indicate that subjects with the ABCA1 R219K variant may get significantly lessheart disease risk reduction from pravastatin treatment than those without the variant.
② Saito R, Takeda K, Yamamoto K, Nakagawa A, Aoki H, Fujibayashi K, Wakasa M, Motoy ama A,
Iwadare M, Ishida R, Fujioka N , Tsuchiya T, Akao H, Kawai Y, Kitayama M, Kajina mi K.
Nutri-pharmacogenomics of w arfarin anticoagulation therapy: VKORC1 genotype-dependent
influence of dietary vitamin K intake. J Thromb Thrombolysis 2014; 38: 105-114.

－ 11 －

Abstract: Warfarin is the most widely prescribed oral anticoagulant, but lar ge interindividual
variations exist in the dose required to a chieve comparable therapeutic effects. Several clinical andgenetic variables have been identified that influence warfarin dosing. However, interactions between
genotype and nutrition rem ain uncertain in term s of dietary vitamin K intake. To investigate
genotype-nutrient interactions in warfarin anticoagulation therapy, 202 consecutive outpatients (M/F
= 142/60, mean age, 69 y ears) undergoing treatment with warfarin were enrolled. Prevalent single
nucleotide polymorphisms in VKORC1 and CYP2C9 were genotyped, and dietary vitamin K intake
during the week preceding the blood sa mpling was quantitatively estimated by a dietitian-assisted
questionnaire. Patients were classified according to low, medium, or high vitamin K intake. The mean
daily warfarin dose in subjects with a VKORC1-1639 A/A genotype was significantly smaller thanthat with a -1639A/G genotype (2.74 vs. 3.91 mg/day, respectively, p < 0.0001). D ose requirements
did not differ between subjects with a CYP2C9 *1/*3 genotype versus a CYP2C9 *1/*1 genotype. In
subjects with a variant VKORC1-1639 G allele, th e mean daily w arfarin dose w as significantly
attenuated by low vita min K intake com pared with medium and high intake a fter adjustment forcovariates (3.4 vs. 5.0 vs. 4.0

mg/day, respectively, p = 0.028). N o such genoty pe effects wereobserved in h omozygous patients for the VKORC1-1639 A allele. The results o f the present study
suggest that the capacity of dietary vitamin K intake to influence warfarin dose requirements during
anticoagulation therapy is VKORC1 genotype-dependent, at least in part.

－ 12 －

１．研究課題名：免疫制御受容体による急性灰白脳脊髄炎・脱髄疾患の制御機構の解明（研究番号C2012-3）

２．キーワード：１）多発性硬化症（Multiple Sclerosis）
２）タイラーウイルス（Theiler's virus）
３）免疫受容体（Immunoreceptor）
４）樹状細胞（dendritic cell）
５）マクロファージ（Macrophage）
３．研究代表者：中村研究分担者：大原松井
高井晃・医学部・教授・免疫学
義朗・医学部・教授・微生物学
真・医学部・教授・神経内科学
俊行・東北大学加齢医学研究所・教授・遺伝子導入研究分野

４．研 究 目 的TV 感染による急性灰白脳脊髄炎・多発性硬化症モデルにおける免疫受容体の機能解析
タイラーウイルス（Theiler's virus: TV）はマウスに急性灰白脳脊髄炎や、持続感染・脱髄疾患（TV-induced demyelinating disease: TV-IDD）を引き起こす。前者はポリオの、後者は多発性硬化症（Multiple sclerosis: MS）の動物モデルとして利用されている。TV は抗原提示細胞である樹状細胞（dendritic cell: DC）に感染するが、感染経路は不明であり、また DC 分画のうち、ウイルスの増殖抑制に働く I 型 Interferon（IFN）を、生体において最も多く産生する形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC: pDC）の役割も明らかになっていない。一方、ごく

最近になり申請者らは、免疫制御受容体 PIR-B 欠損（Pirb ）pDC において TLR9 刺激による IFN やサイトカイン産生が亢進することを見いだしている。そこで本研究では、TV 感染
モデルにおける pDC の役割ならびに、免疫制御受容体の関与について明らかにすることを目的とする。
５．研 究 計 画
（１）TV 感染における pDC の役割の検討
TV-IDD は TV の脳内接種により誘導されるが、末梢から侵入すると考えられる TV が中枢神経系に至る感染経路は不明である。そこで本研究では、蛍光標識した TV を静脈または局所投与することにより、脾臓およびリンパ節内の各種免疫細胞の挙動について、特にウイルス排除に関与していると考えられる pDC を中心に検討する。また抗体投与により、生体内のpDC を特異的に除去できることから、pDC を除去したマウスにおいて TV-IDD を誘導し、疾患発症率や重症度、脱髄病変について検討を行う。さらに pDC を in vitro にて TV に感染させたのちに、未感作のマウスに移入することにより、pDC が病変の重症度に寄与しているかどうか検討を行う。これらの実験により、従来まったく知られていなかった、TV-IDD にお－ 13 －

ける pDC の役割が明らかになることが期待される。
（２）TV 侵入経路の検討－免疫制御受容体と TV の結合能の検討－
DC においては TV 感染初期に、TV が細胞表面に結合することが確認されている。しかしながら TV の受容体については不明のままである。一方、免疫制御受容体は、さまざまな細菌やウイルスと結合することが知られている。そこで本研究においては、Fc 受容体をはじめとする免疫グロブリン様受容体に焦点をあて、各受容体の遺伝子欠損マウスから誘導した
DC や pDC と、TV との結合についてフローサイトメトリー（FCM）を用いて検討し、さらに受容体のリコンビナントタンパク質と、TV との親和性についても検討する。これらの実験により、免疫制御受容体が TV 感染の標的分子となっている可能性を明らかにする。
（３）TV-IDD における免疫制御受容体の役割の検討
免疫制御受容体を欠損すると、さまざまな刺激に対する DC や pDC のサイトカイン産生が減弱もしくは亢進することが判明している。そのため TV との結合の有無に関わらず、これらの受容体は、疾患の治療標的分子となる可能性がある。そこで各種免疫制御受容体の遺伝
子欠損マウスにおいて TV-IDD を誘導し、病態に寄与する受容体について検討する。また実験１と同様に、TV 感染後の DC や pDC の移入実験や、実験２で結合が確認できた受容体のリコンビナントタンパク質、あるいは抗体を投与し、TV-IDD の病態に与える影響を検討する。これらの実験により、TV-IDD、さらには MS の新規治療標的分子としての免疫制御受容体の可能性を追求する。
６．研 究 成 果（１）TV は pDC に結合・感染せず I 型 IFN 産生を誘導しない
はじめに、TV による pDC の I 型 IFN 産生について検討した。その結果、IFN 産生はほとんど認められなかった。
また IL-12 産生について検討したところ、通常型 DC（conventional DC:
cDC）と比較して、pDC では著明に低下していた。そこで細胞内での TV の複製について、外殻の構成タンパク質である VP1 の合成を指標に検討したところ、cDC では VP1 の発現が認められたが、pDC では認められなかった。さらに細胞表面への TV の結合を FCM により検討したところ、pDC には TV が結合しないことが明らかとなった。以上の結果から、pDCには TV に結合する受容体が発現していないために、I 型 IFN の産生が誘導されないと考えられた。pDC は IFN 分泌を介して NK 細胞や CD8T 細胞を活性化するが、TV-IDD では T 細胞の誘導が低下していることが判明している。TV は pDC に認識されないことにより、宿主の I 型 IFN による免疫応答を回避している可能性があると考えられた。
（２）TV の侵入経路、TV 受容体の探索
免疫グロブリン様受容体やその会合分子の遺伝子欠損マウス由来細胞を用いて、TV との結合について FCM を用いて検討した。その結果、膜会合分子である DAP12 や FcRγ鎖欠損
マクロファージにおいても、野生型と同様に TV との結合が認められた。また、これらの細胞では TV 投与後、細胞内での VP1 の発現も認められ、DAP12 や FcRγ鎖との会合が発現や機能に必須な受容体は、TV との結合や感染には寄与していないと考えられた。一方、これ－ 14 －

まで TV の細胞表面への結合にはシアル酸が必須であることも報告されている。そこで pDCと cDC においてマイクロアレイ解析を行い、cDC のみで発現しており、上記の条件を満たす
10 種類の受容体を TV 受容体の候補として選定した。候補受容体において、siRNA によるノックダウン実験を行い、TV 結合能に与える影響を検討した。その結果、TV との結合が 15%程度、減少する受容体が見られた。現在、リコンビナントタンパク質と TV との相互作用を、
表面プラズモン共鳴法（ビアコア）により検討中である。
（３）PIR-B は TV 感染によるマクロファージの IL-6 産生を抑制している
PIR-B は抑制性の免疫制御受容体であり、マクロファージにおいてブドウ球菌やサルモネラ菌などと結合し、サイトカイン産生を抑制することが報告されている。TV 感染においては、マクロファージが産生する IL-6 が、TV の増殖を抑制することが報告されている。そこ

で Pirb マクロファージを用いて、TV 感染後の IL-6 産生について検討した。その結果、Pirb

マクロファージでは野生型に比べて IL-6 産生が亢進していたことから、PIR-B は IL-6 産生を抑制することにより、TV-IDD の発症に関与している可能性が考えられた。FCM による解析


では、Pirb マクロファージで TV 結合量がやや減少していたことから、ビアコアによる PIR-B
と TV の相互作用についても検討を行っている。また、研究開始後から行っている Pirb マ
ウスと TV 感受性である SJL マウスの戻し交配マウスが４世代以上となっており、今後個体レベルでの PIR-B の役割を明らかにする予定である。
７．研究の考察・反省
本研究結果により、TV は pDC による免疫応答を回避することで持続感染している可能性が考えられた。研究計画においては、MS や、TV-IDD と同じ MS モデルである実験的自己免
疫性脳脊髄炎において pDC の関与が指摘されていたため、TV-IDD においても pDC が重要な役割を果たしていると仮定した。しかしながら、TV の pDC 感染の有無の検討に試行錯誤し、


実験計画を見直すことになった。今後、TV 受容体の同定や Pirb SJL マウスでの解析を行い、TV-IDD における受容体の役割を明らかにするとともに、MS の新たな治療戦略としての可能性を追求していく予定である。
８．研 究 発 表
該当なし。

－ 15 －

１．研究課題名：スフィンゴ脂質による腫瘍細胞の浸潤（転移）抑制療法の開発（研究番号C2012-4）
２．キーワード：１）スフィンゴ脂質（sphingolipids）
２）スフィンゴミエリン（sphingomyelin）
３）遊走（migration）
４）腫瘍細胞（tumor cell）
５）サイトカイン（cytokine）
３．研究代表者：岡崎研究分担者：元雄

俊朗・医学部・教授・血液免疫内科学
良治・医学部・教授・腫瘍内科学

上田善道・医学部・教授・病理学Ⅱ

田中真生・医学部・准教授・血液免疫内科学

五十嵐靖之・北海道大学先端生命科学研究院・教授
矢冨平林

裕・東京大学大学院医学系研究科・教授・内科学
義雄・独立行政法人理化学研究所脳科学総合研究センター・チームリーダー

４．研 究 目 的
現在、放射線療法、化学療法、外科的治療法により、種々の悪性腫瘍においてその腫瘍サ
イズの縮小や細胞消失を指標とする寛解状態を効率に達成できる。しかしながら、その後の腫瘍細胞の再増殖ならびに他の部位への浸潤（転移）による再発発症が、患者の予後改善にとって大きな障害となっている。したがって、既存の治療剤とは異なる有害事象が少なく、長期に安全に使用可能な腫瘍増殖・浸潤（転移）に対する抑制効果を持つ新規寛解維持療法の開発が望まれる。
本研究では、細胞レベルとマウス動物モデルで、細胞膜上のミクロドメインにおけるスフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）によるスフィンゴ脂質ＳＭ制御が遊走シグナルや接着シ
グナル抑制を介して悪性リンパ腫、肺がん、膵がんの各腫瘍細胞における遊走、接着、浸潤（転移）を阻害することを明らかにし、細胞レベルのみならずマウス浸潤モデルで外来性ＳＭを投与し、腫瘍細胞の浸潤（転移）抑制が可能であることをしめし、スフィンゴ脂質による新規浸潤（転移）抑制剤開発の研究端緒としたい。
５．研 究 計 画
本研究では、セラミドの直接の抗腫瘍効果と並んで悪性腫瘍の治療効率改善のために重要な第３の手段である腫瘍細胞の浸潤（転移）の抑制におけるスフィンゴ脂質、ＳＭ効果の意
義を明らかにする。ＳＭＳの制御による膜ミクロドメインのＳＭ減少が悪性リンパ腫、肺がん、膵がんの腫瘍細胞の遊走、接着、浸潤を増強し、細胞レベルとマウスモデルにおいて投与されたＳＭ（経口的ＳＭや経静脈的ＳＭリポゾーム）が膜ミクロドメインでの遊走因子（ＣＸＣＬ１２）や接着因子（ＩＣＡＭ１など）シグナルを介した腫瘍細胞の浸潤（転移）を抑制することを明らかにする。

－ 17 －

＜平成 24 年度＞
Ｉ：in vitro で腫瘍細胞の遊走、接着におけるＳＭ変化の意義について検討。
（１）各種腫瘍細胞株と血管内皮細胞ＭＡＥＣにおいて siRNA によるＳＭＳ阻害時に、Ｓ
Ｍ減少とセラミド増加を質量分析法にて確認し、逆に細胞外ＳＭ投与時の膜ＳＭ増加を質量分析法にて確認する。
（２）上記条件時に、腫瘍細胞株のＣＸＣＲ４発現を検討し、ＣＸＣＬ１２刺激による遊走の程度をボイデンチャンバー法で測定する。
ＩＩ：in vivo で、腫瘍細胞のＳＭＳの siRNA 細胞が野生型マウスでの浸潤を促進するか。
また、ＳＭＳ−ＫＯマウスにおける各種腫瘍細胞の浸潤モデルでＳＭＳ欠損が浸潤促進作用を示すことを明らかにする。
６．研 究 成 果
（進捗状況）
上記、平成 24 年度の計画、Ｉ，ＩＩについて、以下に示すように、研究成果が得られて、白血病細胞においてＳＭＳ制御による遊走能の調整が行われることが明らかになり、当初の計画のほぼ９０％が達成された。
（研究成果）

上図に示したように、ＳＭＳ遺伝子を欠損した、ＭＥＦでは、質量分析によってスフィ
ンゴミエリンがコントロールに比べて、非常に減少していることが判明した、ＳＭＳ１は
恒常的なＳＭ産生機構で、ＳＭＳ２は膜に存在して、細胞内のＳＭが外部刺激で減少する
ような状況で活性化すると考えられている。したがってこの結果は、ＳＭＳ１／２の同時
ＫＯ— ＭＥＦでは、ＳＭが測定感度以下で、ＳＭＳ１と２の単独欠損の場合には相互に補完的に働いて、ＳＭを産生していることが示唆された。

－ 18 －

上記のＳＭＳ１／２，１，２遺伝子の欠損ＭＥＦで tranwell による遊走能を検討したところ、コントロールに比べて、それぞれが有意に遊走能を亢進した。特にＳＭＳ１／２欠損ダブルＫＯ— ＭＥＦでは、遊走能は 4 倍以上に増加した。このことは、膜状のＳＭが欠損している場合には、ミクロドメインでのスフィンゴ脂質構造が変化して、遊走シグナル
が out-in する機構を亢進することが示唆された。
７．研究の考察・反省
腫瘍細胞の遊走能の制御がスフィンゴ脂質、特にスフィンゴミエリンの細胞膜ミクロドメ
インでの量的調節によりなされていることがあきらかとなったため、実際の臨床検体におけるＳＭの変化が、浸潤転移と関連するかについて、今後検討が必要と思われる。
８．研 究 発 表
Taniguchi M, Okazaki T, The role of sphingomyelin and sphingomyelin synthases in cell death,
proliferation and migration-from cell and animal models to human disorders. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids 2014; 1841: 692-703.
Abstract: Sphingomyelin constitutes membrane microdomains such as lipid raft, caveolae, andclathrin-coated pits and implicates in the regulation of trans-membrane signaling. On the other hand,sphingomyelin emerges as an important molecule to generate bioactive sphingolipids throughceramide. Sphingomyelin synthase is an enzyme that generates sphingomyelin and diacylglycerol
from phosphatidylcholine and ceramide. Although ceramide has a well-known role as a lipid mediator
to regulate cell death and survival, the only known biological role of sphingomyelin regulated bysphingomyelin synthases was limited to being a source of bioactive lipids. Here, we describe the basic
characters of sphingomyelin synthases and discuss additional roles for sphingomyelin and－ 19 －

sphingomyelin synthase in biological functions including cell migration, apoptosis, autophagy, andcell survival/proliferation as well as in human disorders such as cancer and cardiovascular disorders.
It is expected that a better understanding of the role of sphingomyelin regulated by sphingomyelin
synthase will shed light on new mechanisms in cell biology, physiology and pathology. In the future,novel therapeutic procedures for currently incurable diseases could be developed through modifying
the function of not only sphingolipids, such as sphingomyelin and ceramide, but also of theirregulatory enzymes. This article is part of a Special Issue entitled New Frontiers in Sphingolipid
Biology.

－ 20 －

１．研究課題名：点滴静脈内注射の血管外漏出の有無の客観的判定指標の開発（研究番号C2012-5）
２．キーワード：１）血管外漏出（extravasation, infiltration）
２）点滴静脈内注射（intravenous infusion）
３）サーモグラフィー（thermography）
３．研究代表者：松井研究分担者：坂井真田優子・看護学部・准教授・基礎看護学
恵子・看護学部・教授・基礎看護学

弘美・東京大学大学院医学系研究科・教授・健康科学・看護学専攻老年看護学/創傷看護学分野
須釜淳子・金沢大学医薬保健研究域・教授・健康増進科学センター

紺家千津子・看護学部・教授・成人看護学４．研 究 目 的
点滴静脈内注射における血管外漏出は、浸透圧性障害、循環不全性障害、血管内皮細胞障
害、物理機械的障害などにより、潰瘍などの皮膚障害を引き起こす。血管外漏出の要因には患者の組織耐久性や体動などがあるため、全ての血管外漏出の予防は困難であり、現在、抗がん剤の点滴静脈内注射における血管外漏出は 0.03～1.3％に起こるとされている。抗がん剤の漏出による皮膚障害は漏出量が多いほど治癒しにくいことから、その後の皮膚への影響をできる限り少なくするためには、血管外漏出を早期に発見することにより血管外への漏出量を少なくすることが重要である。これまで、臨床において血管外漏出の有無の鑑別は、患者自身の疼痛の訴えや、看護者が針先周囲の発赤や腫脹、滴下状態の観察などの方法で行われてきた。しかし、これらの方法による血管外漏出の鑑別は客観性に乏しく確実性が低い。
そこで、血管外漏出の有無を客観的に評価する手段として、赤外線サーモグラフィー（以下、サーモグラフィー）に着目した。サーモグラフィーは、皮膚表面の温度を皮膚に接触す
ることなく感知できる機器である。留置針を介して滴下される輸液の温度は 25～28℃程度であり、人体の皮膚表面温度は 34～36℃であることから、サーモグラフィーではこの温度差を描出でき、輸液が漏出する像が描出できるのではないかと考えた。
本研究の目的は、サーモグラフィーによる点滴静脈内注射における血管外漏出の有無の鑑別の可否を検証することである。明らかにする課題は、①血管外漏出ではどのような画像が描出されるか、②血管外漏出後、どれだけの時間（輸液量）で鑑別可能な像が得られるか、③痛みを自覚する前に血管外漏出の有無を鑑別できる画像が描出できるかの 3 点である。
５．研 究 計 画
１）研究デザイン：実験研究

症例集積２）対象：対象は健康な成人 6 名（男性 2 名、女性 4 名）で、包含条件を 20 歳以上の医療従事－ 21 －

者、除外条件を過去に血管穿刺による迷走神経反射などの異常を経験したことがあること、対象部位に皮膚疾患があることとした。
３）血管外漏出モデル（以下、漏出モデル）：漏出モデルとして、前腕の皮下組織に太さ 22G、長さ 25mm の留置針を刺入し、輸液ポンプを用いて生理食塩水を 1.7ml/分で滴下した。漏出有りの基準を、 滴下前・滴下後ともに留置針の先端が皮下組織内に留置されており、
かつ滴下後の留置針の先端周囲の皮下組織の厚さが滴下前に比べ増加していることとした。
４）実験方法：(1) 静脈内注射の実験
対象者の左右いずれかの前腕の静脈に留置針を留置した。滴下前に超音波画像を撮影した。輸液ポンプを用いて生理食塩水を 1.7ml/分の速度で滴下した。生理食塩水を滴下中
10 秒毎に、サーモグラフィーで留置針先端周囲の撮影と痛みの観察を行った。滴下時間
は 4 分（滴下量 6.6ml）とし、滴下終了後に再度、超音波画像を撮影し、留置針先端が静脈内にあること、皮下組織の厚さが滴下前と同じであることを確認した。
(2) 漏出モデルの実験
漏出モデルとして、同じ対象者の反対側に漏出モデルを作成した。超音波画像を撮影しながら刺入し、静脈内に留置した際と同じ深さに留置した。同時に、留置針先端が皮下組織内にあることを確認し、皮下組織の厚さを測定した。滴下時間は、対象者がナースコー
ルを押すと判断する程度の痛みが出現するまでとした。滴下時間は最長 4 分（滴下量6.6ml）までとした。滴下後に再度超音波画像を撮影し、留置針先端が皮下組織内にあること、滴下前よりも滴下後の皮下組織の厚さが増加していることを確認した。滴下後の皮下組織の厚さは、6 例全員が増加しており、その増加量は 0.2－0.7mm だった。
５）評価方法：
点滴静脈内注射と漏出モデルで、滴下中のサーモグラフィー画像と疼痛を比較し、漏出モデルに特徴的な画像を抽出した。滴下開始から漏出に特徴的な画像が得られるまでの時間を測定した。
痛みを自覚する前に漏出を描出できるかを明らかにするために、漏出モデルにおいてサーモグラフィーで血管外漏出が鑑別可能になるまでの時間と、対象者がナースコールを押すと判断する程度の痛みが出現するまでの時間を比較した。
６．研 究 成 果
サーモグラフィーの画像上、血管外漏出における特徴的な画像として、留置針先端周囲の皮膚に円形（楕円形を含む）の低温域（長径 9－23mm）が 6 名全員に認められた。また、この血管外漏出に特徴的な画像は滴下開始 50－110 秒後に描出された。サーモグラフィーで血管外漏出の漏出が鑑別できた時点の滴下量は 1.4－3.0ml だった。ナースコールを押す程度の痛みを感じる前にサーモグラフィーで鑑別可能であった対象は 5 名で、１名は痛みと同時に鑑別可能な画像が得られた。

－ 22 －

７．研究の考察・反省
サーモグラフィーでは対象者がナースコールを押す程度の痛みを感じる前に血管外漏出の有無が鑑別可能な画像が得られた。このことから、サーモグラフィーの使用は従来の方法よ
りも迅速に、かつ疼痛の訴えのない患者においても血管外漏出が鑑別できる可能性が示唆された。
本研究には、対象の身体的特徴、実験の設定上の限界があった。今回の対象は体格や血管の走行・太さなどの身体的特徴を考慮して選抜した対象ではなかった。今後、サーモグラフ
ィーで血管外漏出を描出しにくい対象の特徴の有無を明らかにする必要がある。また、サーモグラフィーによる血管外漏出の鑑別精度は、室温、留置針の太さ、輸液の速さや輸液の内容などに影響されると考えられる。したがって、今後これらが異なる条件での検証が必要である。
８．研 究 発 表
松井優子, 村山陵子, 田邊秀憲, 大江真琴, 福田守良, 元雄良治, 我妻孝則, 木下幸子, 坂井恵子, 紺家千津子, 須釜淳子, 真田弘美. 健康成人を対象にした点滴静脈内注射の血管外漏出モ
デルにおけるサーモグラフィー画像の分析. 看護理工学会誌 2014; 1: 4-11.
要旨: 点滴静脈内注射の血管外漏出は皮膚に炎症や潰瘍を引き起こすことがあるため、早期発見が重要である。しかし、臨床の看護師による血管外漏出の鑑別方法は客観性に乏しい。
本研究は、血管外漏出の有無の客観的評価指標の開発を目的に、健常者６名を対象にサーモ
グラフィーを用いて血管外漏出を鑑別できることを検証した。漏出モデルとして、前腕の皮下組織に留置針を刺入し生理食塩水を 1.7ml/分で滴下した。対照群として、反対側の前腕の静脈内に留置針を刺入し、同様に滴下した。漏出の確認として、超音波診断装置を用いて留
置針先端の位置と、滴下前後の皮下組織の厚さを観察した。滴下後 10 秒ごとにサーモグラフ
ィーで針先周囲を撮影したところ、漏出モデルでは６名全員に滴下開始２分以内に針先を中心に広がる円形の低温域が出現した。サーモグラフィーにより、非接触的かつ迅速に点滴静脈内注射の血管外漏出が鑑別できる可能性が示唆された。

－ 23 －

平成 24 年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2012-

１～１１

看護学領域

S2012-１２～１３

１．研究課題名：mRNA-タンパク質複合体の構造変化の解析（研究番号S2012-１）

２．キーワード：１）mRNA
２）タンパク質（Protein）
３）イオン液体（ionic liquid）
４）走査型電子顕微鏡（SEM）
５）mRNA-タンパク質複合体（mRNP）
３．研究者氏名：石垣靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

４．研 究 目 的メッセンジャーRNA（mRNA）は、細胞の核内で転写され、さまざまな修飾を受けた後に核膜孔を通過して細胞質へと輸送され翻訳へと導かれる。われわれは、mRNA-タンパク質複合体の高次構造形成機構の解明を目指し、透過型電子顕微鏡と免疫染色を組み合わせた手法
により、この構造を半定量的に可視化する方法を提案してきた（Ishigaki et al., 2010, Ishigaki etal., 投稿中）。
一方で mRNA に結合するタンパク質複合体の細胞内機能をノックダウン実験にて明らかにしてきた。意外なことに、RNA 結合因子の一部を癌由来細胞において siRNA によりノッ
クダウンさせてみると、細胞周期の G2/M 期に停止し、M 期細胞の割合が有意に上昇してア
ポトーシスが誘導されることを明らかにしてきた（Ishigaki et al., 2013）。この結果は RNA 結合因子が発現低下すると細胞周期進行にかかわる遺伝子の発現に異常をきたす可能性と、
RNA 結合因子自身が細胞周期進行に何らかの役割を持っている可能性を示唆する。そこで本研究では、RNA 結合因子の細胞相局在を詳細に解析して、新しい機能を提案するとともに、
イオン液体を利用した新しい電子顕微鏡観察手法を開発し、mRNA を中心とする核酸―タン
パク質複合体を観察できる手法を確立することを目指した。これまでに、単独または２量体を形成したタンパク質の構造は、結晶構造解析や核磁気共鳴法などで可視化されてきたが、本研究では細胞内で形成された多数のタンパク質からなる複合体を単離し、その形態変化を様々な処理条件で解析することにより、細胞内での動的な複合体変化の仕組みを明らかにすることを目指した。
５．研 究 計 画
イオン液体を用いた SEM 観察法を mRNA-タンパク質複合体構造の可視化に応用するために、まずは複合体の細胞内局在を詳細に解析するとともにライブイメージング系の構築を試みた。免疫沈降による複合体の単離を行い、イオン液体法を利用した単離複合体の走査型電子顕微鏡下での観察を行うこととした。さらにライブイメージングを試みるとともに、細胞でのノックダウン実験による関連因子の特定を行うことを目指した。

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６．研 究 成 果
まず、各種 RNA 結合因子の中で、エクソンジャンクション複合体（EJC）の各因子に対する抗体を作製して免疫染色を行った。興味深いことに、自家製および市販されている抗RBM8A 抗体を用いた免疫染色において、中心体における共局在を示唆する結果を得ることができた。単に非特異的な染色を観察している可能性を否定するために、一過性にタグを付加した RBM8A を外部から発現させてみると、これまでの報告と一致して核内にシグナルが認められたが、同時に中心体にも局在が観察された。すでに発表した論文のなかで、RBM8Aのノックダウンが中心体の数的な異常を引き起こすことも報告しており、これらの結果を総合すると RBM8A が中心体に局在して、その正常な成熟に関わることが示唆される。このRBM8A が他の RNA 結合因子と複合体を形成している可能性を明らかにするために DuoLink
アッセイを行ったところ、中心体近傍での複合体形成を示唆する結果が得られた。さらにシュークロース密度勾配法により細胞を分画して中心体の画分をウエスタンブロットで解析してみると、RBM8A を初めとする EJC 各因子が検出されることが明らかとなった。以上の結果から、EJC の中心体への局在と、その意義を明らかにすることができた（Ishigaki et al.,2014）。さらに、複合体の「かたち」を観察することを目指し、免疫沈降により精製した RNAタンパク質複合体を固定処理した後にイオン液体によりコーティングを行った。イオン液体による走査型電子顕微鏡観察については、培養細胞を利用して十分な経験があり（Ishigaki etal., 2011）、2014 年度の医学生物学電子顕微鏡技術学会において学会賞を授与されている。この方法を活用して複合体の走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、免疫沈降をおこなったビーズ上に雲状の形態を観察することに成功した。この複合体の大きさは様々であり、数十ナ
ノメートルからマイクロメートル単位まで様々であった。この結果は mRNA の多様さを反映しているものと考えているが、透過型電子顕微鏡下で観察される複合体のサイズが 200-300
ナノメートル程度であることを考えると、多少大きすぎる感がある。
７．研究の考察・反省
蛍光タンパク質を発現させてライブイメージングを試みたが、タグを付加した RNA 結合因子を発現ベクターに導入して細胞内で発現させると、一過性では細胞死を誘導してしまい
解析できなかった。また、安定発現系の確立を同時に目指したが、クローンを取ることができなかった。タグを変えても同様の結果であったことから、RNA 結合因子の構造は厳密に保たれていることが必要であると考えられる。また、イオン液体法によって観察された複合体の性格付けを厳密に行う必要があるが、プロテイン G 標識アガロースで精製してきたために、抗体での染色が困難であり、非特異的な抗血清によるブロッキング等を試みたものの完璧とはいいがたい結果しか得られなかった。ビーズ上にトラップされた複合体は、ウエスタンブ
ロットと RT-PCR により、確かに mRNA-タンパク質複合体であることは確認されているが、今後更に細かい実験条件の検討が必要であると考えている。イオン液体法ではコーティング
剤であるイオン液体に、さまざまな低分子化合物をとけ込ませることが可能であり、将来的には走査型電子顕微鏡下で観察している複合体が ATP などの添加により構造変化を起こし－ 26 －

ているムービーを撮影してみたいと考えている。
８．研 究 発 表
Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Hashimoto M, Iwabuchi K , Tomosugi N: RNA-binding protein
RBM8A (Y14) and MAGOH localize to centrosome in human A549 cells. Histochem Cell Biol 2014;
141: 101-109.
Abstract: RBM8A (Y14) is carry ing RNA-binding motif and form s the tight heterodim er with
MAGOH. The heterodimer is known to be a member of exon juncti on complex on exporting m RNA
and is required for mRNA metabolisms such as splicing, m RNA export and nonsense-mediatedmRNA decay. Almost all RBM8A-MAGOH complexes localize in nucleoplasm and shuttle between
nuclei and cytoplasm for RNA metabolism. Recently, the abnormality of G2/M transition and aberrant
centrosome regulation in RBM8A- or MAGOH-deficient cells has been reported. These results
prompt us to the reevaluation of the loca lization of RBM8A-MAGOH in human cells. Interestingly,
our immunostaining experiments showed the localization of these proteins in centroso me in addition
to nuclei. Furtherm ore, the transiently e xpressed eYFP-tagged RBM8A and Flag-tagged MAG OH
also co-localized with cen trosome signals. In a ddition, the proxim ity ligation in situ assa y was
performed to detect the co mplex formation in centroso me. Our experiments clearly showed that
Myc-tagged RBM8A and Flag-tagged MAGOH formed a complex in centrosome. GFP-tagged PLK1
also co-localized with Myc -RBM8A. Our results show that RBM8A-MAG OH complex is requiredfor M-phase progression via direct localization to centrosome rather than indirect effect.

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１．研究課題名：ＱＴ延長症候群における早期後脱分極の発生機序と最適制御法の解明：ヒト心室筋細胞の標準モデルを用いた非線形力学的アプローチ（研究番号S2012-2）

２．キーワード： １）ヒト心筋細胞（human cardiac myocytes）
２）数理モデル（mathematical models）
３）非線形力学（nonlinear dynamics）
４）分岐解析（bifurcation analysis）
５）コンピュータ・シミュレーション（computer simulation）
３．研究者氏名： 倉田康孝・医学部・教授・生理学Ⅱ
４．研 究 目 的
本研究の目的は、ヒト心室筋細胞の電気生理学的特性を記述する非線形力学系モデルを用い、QT 延長症候群（LQTS）における致死的不整脈の原因となる早期後脱分極（EAD）の発生機序を解明すると共に、合理的な EAD 制御（治療）理論を構築することである。
LQTS は多形性心室性頻拍（TDP）を生じ、突然死の主原因の一つとなっている。心室固有筋の活動電位持続時間延長に伴って生じる EAD が TDP のトリガーになると考えられており、LQTS における EAD の発生機序とその制御方法を解明することが、TDP 発生機序の理解とその合理的治療法の確立に不可欠である。先天性 LQTS の病因はイオンチャネル遺伝子の異常であるが、活動電位の再分極に寄与する遅延整流 K+チャネル電流（IK）の動態が EAD発現を規定する重要な因子であると考えられる。我々は以前より、洞結節の生理的自動能及び心室・心房筋における異常自動能のシミュレーションとその発生機序の非線形力学的解析を手がけており、モデル細胞の分岐構造―自動能発現停止過程における安定性とダイナミク
ス―を解析することにより、自動能の発生機序解明やバイオペースメーカーシステム設計を行ってきた。本研究では、LQTS 症例の心室筋細胞から得られた異常イオンチャネル電流動態の電気生理学的データを基に、EAD を再現できる“ヒト LQTS モデル心室筋細胞”を作成し、モデル細胞のパラメータ依存性分岐構造を解析することにより、EAD 発現の条件と力学的機序（IK の役割）、その合理的抑制方法を検証した。
５．研 究 計 画
本研究では、まずLQTS症例の臨床データ（遺伝子解析・変異チャネルの電気生理学的特性）を基に、IKの抑制或いはNaチャネル電流（INa）の非不活性化成分を想定してEADを再現できる“ヒトLQTSモデル心室筋細胞”を作成する。そのパラメータに依存した分岐構造とEAD発現性を解析し、EAD発現の力学的機序―特にIKの役割―と刺激頻度依存性のメカニズムを解明する。さらにパラメータ調節・仮想薬物負荷によるEAD抑制効果を検証し、LQTSにおけるEADの発現制御方法―特にIKの修飾によるEAD抑制処方―を明らかにする。

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（１）ヒト LQTS モデル心室筋細胞の作成と分岐構造解析・EAD のシミュレーション
既成のヒト心室筋細胞モデル（Kurata et al, Biophys J, 2005; Carro et al, Phil Trans R Soc A,
2011; O’Hara et al, PLOS Comput Biol, 2011）とそれらを基に作成した標準モデルを用い、IK（速い活性化成分 IKr 又は遅い活性化成分 IKs）の抑制（変異チャネル電流動態を設定）
或いは INa の非不活性化成分を想定して、EAD を再現できる“ヒト LQTS モデル心室筋細胞”を作成する。PC ワークステーション及び数値計算用ソフトウェア（MATLAB 7）を用い、１）活動電位の再構成と活動電位パラメータの計測、２）活動電位のパラメータ依存性変化（分岐・EAD 発現パターン）の解析・プロット、３）システムの平衡点（定常状態）とその安定性の解析を行うためのシステム（MATLAB プログラム群）を作成する。予測される EAD の発現条件を分岐パラメータ（IK・内向き整流 K+チャネル電流コンダクタンス、
IK 活性化時定数、INa 非不活性化成分の割合など）の変化としてシミュレートし、モデル細胞の平衡点（定常状態）とダイナミクス（周期軌道）及びその安定性のパラメータ依存性変化を表す“分岐図”を作成する。得られた分岐図を基に、各パラメータに依存したモ
デルシステムの分岐構造を比較解析し、EAD の発現条件（各 IK 成分の抑制による EAD 発
現性の変化）とその動力学的機序（各 IK 成分の役割）を解明する。さらに EAD 発現の刺激頻度依存性を解析し、その機序を細胞内イオン（Na+, Ca2+）濃度変化の観点から解析する。
（２）ヒト LQTS モデル心室筋細胞における EAD 発現抑制方法の解析
EAD を再現できるヒト LQTS（LQT1-3）モデル心室筋細胞を用い、各 IK 成分のコンダ
クタンス或いは活性化時定数を変化させた際の EAD 発現性を解析し、各 IK 成分について
EAD 発現を抑制し得る最小コンダクタンスと活性化キネティクスの EAD 発現への影響度を計測する。さらに、各 IK チャネル及び Na チャネルに作用する薬物（抗不整脈薬）のチ
ャネルへの結合・解離動態のモデルを可能な限り組み込み、EAD 発現を抑制し得る最小濃度を各薬物について求める。これらのデータを基に、各 LQTS タイプにおける EAD 発現抑制のための標的パラメータと最適薬物を選択し、合理的な EAD 制御方法を提案する。
６．研 究 成 果
ヒト心室筋細胞モデルにおいて、IKr 又は IKs の抑制或いは INa 非不活性化成分の増大を設定することにより、EAD を再現できる“ヒト LQTS（LQT1-3）モデル心室筋細胞”を作成することができた。さらに、モデル細胞のパラメータ依存性分岐パターンを非線形力学系の分岐理論に従って解析するための分岐構造解析システムを構築し、モデルシステムのパラメータ（IKr, IKs 及びＬ型 Ca チャネル電流のコンダクタンス、IK 活性化時定数、INa 非不活性
化成分の割合など）に依存した分岐構造を解析することにより、ヒト固有心筋における EAD発現の条件、力学的機序に関する以下の結論を得た：（１）EAD は脱分極領域のホップ分岐（平衡点安定化）点近傍で生じる。
（２）LQTS では、脱分極領域でのホップ分岐点のシフトに伴って生じる EAD 発現パラメータ領域の拡大或いはシステムの EAD 発現パラメータ領域への近接化により EAD 発現が促進される。（３）IKs の遅い活性化ゲート変数（遅いサブシ－ 30 －ステム）の増加に伴って速いサブシステムのホップ分岐（平衡点不安定化）が生じ、リミッ
トサイクル（極限周期軌道）様の膜電位振動が出現することから、EAD は「IKs の遅い活性化に伴って消失する一過性の周期軌道」と考えることができる。
また、EAD の刺激頻度依存性―心拍数増加による EAD 抑制―の機序を解析した結果、（１）
刺激頻度の増加に伴って EAD 発現パラメータ領域の縮小と細胞内 Na+濃度の増加が生じること、（２）細胞内 Na+濃度の変化が EAD 発現に大きな影響を及ぼす（Na+濃度の増加によってEAD が抑制される）ことが明らかとなり、細胞内 Na+濃度の変化が EAD 発現の刺激頻度依存性に関与していることが証明された。さらに、各 IK 成分のコンダクタンス或いは活性化
時定数を変化させた際の EAD 発現性を解析し、各 IK 成分について EAD 発現を抑制し得る
最小コンダクタンスと活性化キネティクスの EAD 発現への影響度を計測した結果、LQTS のタイプによらず、IKr 活性化（電流増強作用をもつ薬物）または IKs 活性化促進（活性化時定数の減少）が、EAD 発現抑制に極めて有効であることが明らかとなった。
７．研究の考察・反省本研究では、ヒト心室筋細胞モデルの分岐構造解析を行い、LQTS における EAD の発生機
序と制御方法を非線形力学的観点から明らかにすることができた。
本研究の特色の第一は、“ヒト心室筋細胞の LQTS モデル”を作成したことであり、より臨
床症例に即した解析が可能となった。さらに、本研究の最大の特色は、“EAD を非線形シス
テムに生じる分岐現象として捉え、その発生機序と制御方法を非線形力学系の分岐理論に基づいて解明した”ことである。非線形システム論的アプローチ―モデル心筋細胞の分岐構造解析―は、実心筋細胞における分岐現象（自動能発現・消失）の予測と制御に関する理論体
系構築に必要不可欠な方法論であり、自動能・不整脈発生機序の体系的解明、不整脈制御理論の確立やバイオペースメーカーシステム設計を可能にするものである。
研究計画では各抗不整脈薬の IK チャネル及び Na チャネルへの結合・解離動態モデルを組
み込み、EAD 発現を抑制し得る最小濃度を各薬物について網羅的に決定する予定であったが、
薬物－チャネル結合・解離動態に関する実験データの不足と計算速度の制約により、一部の薬物（Na チャネルブロッカー、IKr 活性化薬）に限定せざるを得なかった。今後、ヒト心筋細胞モデルの改良と共に、薬物－チャネル結合・解離動態と各 LQTS タイプにおける合理的EAD 発現抑制方法（最適薬物の選択）の解析を進める必要があると考えている。
８．研 究 発 表
Kurata Y, Hisatome I, Tanida M, Shibam oto T. Effect of hy perpolarization-activated current If on
robustness of sinoatrial n ode pacemaking: theoretical study on influence of intracellular Na+
concentration. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2013; 304: H1337-H1351.
Abstract: To elucidate the effects of hyperpolarization-activated current If on robustness of sinoatrial
node (SAN) pacemaking in connection w ith intracellular Na+ concentration (Nai) changes, wetheoretically investigated 1) the i mpacts of If on dy namical properties of SAN model cells during－ 31 －

inhibition of L-type Ca2+ channel currents (ICaL) or hyperpolarizing loads and 2) If-dependent changes
in Nai and their effects on dynamical properties of model cells. Bifurcation analyses were performed
for Nai-variable and Nai-fixed versions o f mathematical models for rabbit SAN cells; equilibrium
points (EPs), limit cycles (LCs), and their stability were determined as functions of model parameters.
Increasing If conductance (gf) shrank ICaL conductance (gCaL) regions of unstable EPs and stable LCs(rhythmic firings) in the Nai-variable system but slightly broadened that of rh ythmic firings at lower
gf in the Nai-fixed system. In the Nai-variable system, increased gf yielded elevations in Nai at EPs
and during spontaneous osc illations, which caused EP stabilization and shrinkage in the para meterregions of unstable EPs and rhythmic firings. As gf increased, parameter regions of unstable EPs andstable LCs determined for hyperpolarizing loads shrank in the Nai-variable system but were enlarged
in the Nai-fixed system. These findings suggest that 1) If does n ot enhance b ut rather atte nuatesrobustness of rabbit SAN cells via fa

cilitating EP stabilization and LC destabilization even inphysiological gf ranges; and 2) the enhancing ef fect of If on robustness of pacem aker activity, which
could be observed at low er gf when Nai was fixed, is actually reversed b y If-dependent changes inNai.

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１．研究課題名：胎盤の形態形成におけるガレクチンの機能解析（研究番号S2012-3）

２．キーワード：１）ガレクチン４（Galectin-4）２）胎盤形成（Placentation）
３）オートファジー（Autophagy）
４）浸潤性胎盤栄養膜細胞（Invasive trophoblasts）
５）マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）
３．研究者氏名：有川智博・一般教育機構・講師・生物学

４．研 究 目 的
妊娠初期において胎児栄養膜細胞は低酸素環境にあり、この環境は母体との融合に重要である胎盤栄養膜細胞の浸潤作用を正に制御すると考えられている。一方で、細胞分化を含む
様々な細胞活動に重要なオートファジーの当浸潤作用への関与は未だ報告されていない。本
研究では胎盤でのガレクチン４の発現に注目し、「オートファジーによる胎盤形成の制御とガレクチン４を中心とした栄養膜細胞分化機序の解明」を目的とした。
５．研 究 計 画
本研究課題では、以下の項目を中心に検討し、得られた結果から胎盤形成におけるオート
ファジーと Gal-4 発現の意義を解析した。
①

胎盤でのガレクチンとオートファジーマーカーである LC3 の経時的局在パターン比較。

②

in vitro 培養系を用いたオートファジーによるガレクチン４発現の解析。

６．研 究 成 果
本課題研究により、以下の点が明らかになった。
ガレクチン４（Gal-4）と LC3 の発現は、脱落膜を境界にした互いに排他的なパターン

①

を示す。
②

ラット栄養膜細胞（Rcho-1）の分化系において、3-Methyladenine（3-MA、AP 阻害剤）
を用いた結果、Trophoblast 特異的な分化マーカーの発現が低下し、MMPs 活性の低下が認められた。

③

分化に伴った細胞サイズの増大は、Gal-4 の強制発現によって阻害された。
我々は以前、Rcho-1 の分化に伴い、Gal-4 の発現が低下することを報告している。今回

Rcho-1 の分化系において、オートファジーの阻害剤である 3-Methyladenine を分化培地に添加したところ、分化マーカーの発現が低下し、胎児側から母体側への栄養膜細胞の浸潤能に重要である MMP-9 酵素活性が抑制され、さらに Gal-4 発現が低下せずに維持された。そこでGal-4 を Rcho-1 で過剰発現させたところ、Rcho-1 分化に特有である細胞の大型化や細胞運動の抑制が観察されたことから、オートファジーは胎盤形成に重要な用意用膜細胞の母体への－ 33 －

浸潤を制御し、Gal-4 はその現実化因子である可能性が示唆された。さらに 12dpc のラット胎盤における LC3 タンパク及び Gal-4 の発現は、それぞれ母体脱落膜と、栄養膜細胞を中心とした胎児側に限局していることから、オートファジーによる Gal-4 の発現制御によって栄養
膜細胞分化が制御されている可能性が示唆された。本研究課題は、採択期間中に研究計画をほぼ完全に達成したといえる。
７．研究の考察・反省
本研究課題の成果として、Rcho-1 で発現する Gal-4 は、従来知られているものよりも分子量が小さい新規 isoform である可能性が高いことがわかった。Gal-4 は従来腸上皮に特異的に発現するといわれており、上皮細胞の極性形成に重要と考えられている因子である。栄養膜細胞の invasive trophoblast への分化は上皮-間葉移行（EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition）
様の現象であることを考えると、Gal-4 の新規 isoform の発現抑制が細胞の極性消失の引き金となっている可能性が高い。今後はこの新規 Gal-4 の isoform をターゲットに絞り、さらに詳細な解析を進めていく予定である。
８．研 究 発 表
Arikawa T, Simamura E, Shimada H, Nakamura T, Hatta T, Shoji H. Significance of sugar chain
recognition by galectins and its involvement in disease-associated glycosylation. Congenit Anom
(Kyoto) 2014; 54: 77-81.
Abstract: Galectins are β-galactoside-binding lectins that participate in a wide range of biologicalprocesses. Galectins are distributed both inside and outside cells and are believed to have roles in both
intra- and extracellular milieus. One of the well-recognized functions of galectins is stabilization of
glycoproteins on the cell surface, thereby promoting stable signal transduction and transport ofsubstances such as glucose. Glycoprotein-associated diseases, including congenital disorder ofglycosylation (CDG, previously called carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome), comprise a
disease family established only in the last decade. Although numerous in vitro glycobiology studies
have been performed, including investigation of glycan-galectin interactions and of galectin action in
cultured cells, a few in vivo studies have investigated molecular mechanisms of galectin actions inanimal models. Both in vitro and in vivo studies are needed in order to better determine the biologicalsignificance of sugar chain recognition. Hitherto, some reports have focused on the role of impaired
sugar chain recognition and galectin function in the development of diverse diseases, including
rheumatoid arthritis, diabetes mellitus, colitis, and cancer. We recently focused on the function of
galectins in immunity and embryogenesis, and in this review we summarize the diseases related todisorders of sugar chain-galectin interaction and discuss the role of galectins as potential risk factors
for some congenital and acquired diseases. These diseases are disorders of immunity, metabolism, andcell differentiation. This approach to understanding the significance of sugar chain recognition by
galectins may open up a new field into the nature of glycoprotein-related diseases, including CDG.

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１．研究課題名：高度たんぱく質制限の尿細管オートファジー活性化を介した糖尿病腎症発症・進展抑制機序の解明（研究番号S2012-4）

２．キーワード：１）糖尿病腎症（Diabetic nephropathy）
２）高度たんぱく質制限（Very low protein diet）
３）オートファジー（Autophagy）
４）サーチュイン（Sirtuin）
５）炎症（Inflammation）
３．研究者氏名：北田宗弘・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
2 型糖尿病腎症を含む、慢性腎臓病の末期腎不全への進展を抑制するため、たんぱく質制限による食事療法が推奨されているが、糖尿病腎症に対するその腎保護効果は明らかではない。また、腎保護効果の発現機序も十分に解明されていない。したがって、申請者は、2 型
糖尿病腎症において、①たんぱく質制限食が腎症の進展を抑制し得るか、また、②その分子生物学的機序（特に、高度たんぱく質制限食の腎尿細管のオートファジー機構に与える効果について）、③高度たんぱく質制限の栄養学的安全性を 2 型糖尿病動物（Wistar fatty (fa/fa)ラット）を用いて明らかにする。
さらに、糖尿病腎症の発症・進展機序における微小炎症に単球/マクロファージが如何に関与しているか、栄養応答シグナル変異とオートファジー機能の観点から検証する。
５．研 究 計 画
実験 1: たんぱく質制限が、腎尿細管において、糖尿病により生じる栄養応答シグナルの変異の是正による、オートファジーの活性化を介した機序により、糖尿病腎症の進展抑制効
果を発揮することを検証する。2 型糖尿病（Wistar fatty (fa/fa)）ラットにおける、たんぱく質
制限の腎オートファジーに与える影響・効果を、栄養応答シグナル変異の是正という観点から検証する。また、高度低たんぱく質食では、アミノ酸バランスの崩壊、異化亢進、糖代謝への影響など栄養学的問題を生じる可能性がある為、糖・脂質代謝への影響及び、さらに肝臓・骨格筋においても、腎臓と同様に、オートファジーおよび、栄養応答シグナルの変異を検証する。
実験 2: 単球/マクロファージにおける炎症惹起機序における栄養応答シグナルの変異とオートファジーとの関連性を明らかにするため、THP-1（ヒト単球細胞株）に Sirt1 阻害薬を附置し、オートファジーおよび炎症惹起反応を評価する。
６．研 究 成 果
実験 1: 2 型糖尿病腎症の発症・進展抑制に対する高度たんぱく質制限の腎保護効果と糖･－ 35 －

脂質代謝に及ぼす影響を検証するため、2 型糖尿病モデル動物である、Wistar fatty (fa/fa)ラット（6 週齢雄）と対照ラットを通常食（たんぱく質 22%、脂質 5.4%、炭水化物 66.5%）群とたんぱく質制限食（たんぱく質 5%、脂質 10%、炭水化物 76.2%）群に分別し、28 週間飼育した。体重・摂食量・血糖値（空腹/随時）・血圧を 4 週間ごとに測定し、28 週後に HbA1C
値・インスリン値（IRI）・インスリン耐容能試験（ITT）・脂質（総コレステロール・中性脂
肪（TG）・遊離脂肪酸（FFA））・尿アルブミン排泄量・腎重量・腎組織（PAS および、マッソン・トリクローム染色によるメサンギウム領域の拡大・線維化）を評価した。糖尿病ラットの両群間で摂食量に差はなかったが、通常食群と比較してたんぱく質制限食群で、体重および腎重量の有意な減少、血糖値・HbA1C 値・IRI 値の有意な低下、また ITT（area under the
curve）の改善を認めた。総コレステロール値は、通常食群と比較して、たんぱく質制限食群
で有意な低下を認めたが、中性脂肪値は両群間で差はなかった。さらにたんぱく質制限食群
は、通常食群と比較して、尿中アルブミン排泄量の有意な低下及び、腎組織（メサンギウム
領域の拡大と尿細管間質の線維化）の改善を認めた。なお、血圧に差はなかった。以上より、
高度たんぱく質制限は、2 型糖尿病ラットにおける糖・脂質代謝の改善と腎保護効果を示す
ことを見出した。糖尿病腎症のどの時期からのたんぱく質制限食の介入が腎保護効果を発揮するかどうかを検証すべく、6 週齢からのたんぱく質制限に加え、12 週齢および、24 週齢からのたんぱく質制限食を開始する群を作成し、高度たんぱく質制限の糖尿病腎症抑制効果を検討した。その結果、12 週齢さらに 24 週齢の Wistar fatty ラットにおいても高度たんぱく質
制限は、糖尿病ラットにおいて認められる尿中アルブミン排泄量および、糸球体、尿細管間質の線維化を抑制した。
実験 2: 血清除去培地で培養した THP-1 細胞に Sirt1 阻害薬（サーチノール 10μM およびEX-52710μM）を附置するとオートファジーの低下（LC3 II 低下および p62/sqstm1 の増加）と、炎症の増加（p-NF-kB 発現増加、TNF-αおよび IL-6mRNA 発現増加）を認めた。また、
オートファジー阻害薬（3-メチルアデニン）は、炎症の増加（p-NF-kB 発現増加、TNF-αおよび IL-6mRNA 発現増加）を示したことから、オートファジーの低下が炎症惹起に関与していることが示唆された。その機序としてオートファジー低下の際に細胞内に蓄積する
p62/sqstm1 に着目した。siRNA により p62/sqstm1 をノックダウンするとサーチノールによる
p-NF-kB の発現増加は抑制された。さらに Sirt1 の抑制に対する他の栄養応答シグナル（AMPK,mTOR）の変異をみたところ、p-AMPK の低下および p-mTOR の増加を認めた。mTOR 阻害薬であるラパマイシン（100ng/ml）はサーチノールにより誘導されるオートファジーの低下
および炎症惹起を抑制した。以上より、Sirt1 低下に基づく栄養応答シグナル変異はオートフ
ァジーの低下を介して単球における炎症惹起に関与している可能性が示唆された。
７．研究の考察・反省
高度低たんぱく質制限は、6 週齢、12 週齢、24 週齢のいずれの時期からの介入においても、糖尿病腎症でみられる尿アルブミン排泄量の増加、また、糸球体および尿細管間質の線維化病変を抑制し腎保護効果を発揮すると考えられる。その分子メカニズムに関して、栄養応答－ 36 －

シグナル（サーチュイン、AMPK、mTOR）の変異およびオートファジーとの関連に焦点をあて、なおも検証中である。ラットを自己繁殖し、さらにたんぱく質制限の効果を長期にわたり観察するため、実験結果を得るにはかなりの長期間を要している。
THP-1 細胞において、Sirt1 の活性低下による AMPK および mTOR の変異に起因したオー
トファジーの低下（p62/sqstm1 の増加）が p-NF-kB の増加を介して炎症を惹起することを明らかにした。しかし、その詳細な機序（p62/sqstm1 による NF-kB 経路の活性化機序、AMPKとの関連性など）は明らかではないため、さらなる検証が必要である。
８．研 究 発 表
① Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, Kanasaki K, Koya D. Sirtuins and renal diseases:
relationship with aging and diabetic nephropathy. Clin Sci (Lond) 2013; 124: 153-164.
Abstract: Sirtuins are members of the Sir2 (silent information regulator 2) family, a group of class
III deacetylases. Mammals have seven different sirtuins, SIRT1-SIRT7. Among them, SIRT1, SIRT3and SIRT6 are induced by calorie restriction conditions and are considered anti-aging molecules.
SIRT1 has been the most extensively studied. SIRT1 deacetylates target proteins using the coenzyme
NAD+ and is therefore linked to cellular energy metabolism and the redox state through multiple
signalling and survival pathways. SIRT1 deficiency under various stress conditions, such as metabolicor oxidative stress or hypoxia, is implicated in the pathophysiologies of age-related diseases including
diabetes, cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders and renal diseases. In the kidneys,
SIRT1 may inhibit renal cell apoptosis, inflammation and fibrosis, and may regulate lipid metabolism,autophagy, blood pressure and sodium balance. Therefore the activation of SIRT1 in the kidney may
be a new therapeutic target to increase resistance to many causal factors in the development of renal
diseases, including diabetic nephropathy. In addition, SIRT3 and SIRT6 are implicated in age-relateddisorders or longevity. In the present review, we discuss the protective functions of sirtuins and theassociation of sirtuins with the pathophysiology of renal diseases, including diabetic nephropathy.
② Takeda-Watanabe A, Kitada M, Kanasaki K, Koya D. SIRT1 inactivation induces inflammation
through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun 2012;
427: 191-196.
Abstract: Inflammation plays a crucial role in atherosclerosis. Monocytes/macrophages are some of
the cells involved in the inflammatory process in atherogenesis. Autophagy exerts a protective effectagainst cellular stresses like inflammation, and it is regulated by nutrient-sensing pathways. The
nutrient-sensing pathway includes SIRT1, a NAD+-dependent histone deacetylase, which is
implicated in the regulation of a variety of cellular processes including inflammation and autophagy.
The mechanism through which the dysfunction of SIRT1 contributes to the regulation of
inflammation in relation to autophagy in monocytes/macrophages is unclear. In the present study, wedemonstrate that treatment with 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide－ 37 －

(Sirtinol), a chemical inhibitor of SIRT1, induces the overexpression of inflammation-related genes
such as tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 through nuclear factor (NF)-κB
signaling activation, which is associated with autophagy dysfunction, as shown through p62/Sqstm1
accumulation and decreased expression of light chain (LC) 3 II in THP-1 cells. The autophagy
inhibitor, 3-methyladenine, also induces inflammation-related NF-κB activation. In p62/Sqstm1
knockdown cells, Sirtinol-induced inflammation through NF-κB activation is blocked. In addition,
inhibition of SIRT1 is involved in the activation of the mammalian target of rapamycin (mTOR)
pathway and is implicated in decreased 5'-AMP activated kinase (AMPK) activation, leading to theimpairment of autophagy. The mTOR inhibitor, rapamycin, abolishes Sirtinol-induced inflammation
and NF-κB activation associated with p62/Sqstm1 accumulation. In summary, SIRT1 inactivationinduces inflammation through NF-κB activation and dysregulates autophagy via nutrient-sensing
pathways such as the mTOR and AMPK pathways, in THP-1 cells.
③ Kitada M, Kume S, Kanasaki K, Takeda-Watanabe A, Koya D. Sirtuins as possible drug targets intype 2 diabetes. Curr Drug Targets 2013; 14: 622-636.
Abstract: The rising incidence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major public health problem
in industrialized countries, and new therapeutic strategies to prevent T2DM are urgently needed
worldwide. It is well known that calorie restriction (CR) can retard the aging process in organisms
ranging from yeast to rodents and delay the onset of numerous age-related diseases, including
diabetes. Molecules that mimic CR metabolically may therefore represent new therapeutic targets forT2DM. Sirtuin1 (SIRT1), the mammalian homolog of Sir2, was originally identified as a
NAD+-dependent histone deacetylase, and its activity is closely associated with longevity under CR.
Growing evidence suggests that SIRT1 regulates glucose-lipid metabolism through its deacetylase
activity for many known substrates and has many roles in the metabolic pathway through its direct orindirect involvement in insulin signaling in insulin-sensitive organs, including adipose tissue, liverand skeletal muscle. In addition, SIRT1 regulates insulin secretion, and adiponectin production,
inflammation, gluconeogenesis, circadian rhythms and oxidative stress, which together contribute to
the development of insulin resistance. Moreover, the overexpression of SIRT1 and several SIRT1
activators have beneficial effects on glucose homeostasis and insulin sensitivity in diabetic animalmodels and humans. Therefore, SIRT1 may represent a new therapeutic target for the prevention of
diseases related to insulin resistance and T2DM. In addition, SIRT3 and SIRT6 play crucial roles inglucose and lipid metabolism. In this review, we summarize the current understanding of thebiological functions of SIRT1, SIRT3 and SIRT6 in metabolism and discuss their potential role astherapeutic targets in T2DM.

－ 38 －

１．研究課題名：新規抗線維化療法の開発：抗線維化ペプチドを用いた miRNA array 解析から得られた知見から（研究番号S2012-5）

２．キーワード：１）腎線維化（renal fibrosis）
２）内因性抗線維化ペプチド（endogenous anti-fibrotic peptide）
３）細胞外基質（extracellular matrix）
４）アンジオテンシン変換酵素（ACE inhibitor）
５）糖尿病性腎症（diabetic nephropathy）
３．研究者氏名：金﨑啓造・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
線維性増殖疾患の発症進展過程において、線維芽細胞はコラーゲン線維の産生などを介して中心的な役割を演じる。その線維芽細胞の由来として、内皮細胞間葉系分化（EndMT）を介した内皮細胞由来線維芽細胞の分化機構・意義に注目が集まっている。予備的検討において我々は、内因性抗線維化ペプチド（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline: AcSDKP）に抗 EndMT効果があること、AcSDKP が EndMT 誘導・細胞分化に関係の深い遺伝子群を標的とした
microRNA（miRNA）群を制御していることを Array 解析にて見出した。今回、それら miRNAの意義を詳細に検討し、AcSDKP の作用機構における意義を解明するとともに、EndMT を標的とした新たな抗線維化療法の手がかりをつかむ。
５．研 究 計 画
動物実験: 8週齢のCD1マウスを三共ラボサービスから購入した。streptozotocin (STZ)（200mg/kg）を腹腔内に単回投与、1型糖尿病モデル動物を作製。糖尿病誘導16週後糖尿病マウス
を次の様に5群に分類（コントロール, アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ACE-I）imidapril [2.5mg/kg BW/day], AcSDKP [500 g/kg BW/day], AcSDKP + imidapril, アンジオテンシン受容体拮
抗薬TA-606 [3 mg/kg BW/day]）した。 Imidapril 及びTA-606 は飲水からの投与、AcSDKPは
osmotic mini-pumpによる持続皮下注射を行った。マウスは24週で屠殺した。屠殺１週間前に血圧を測定（tail-cuff法（BP-98A instrument (SoftrBeijing)）。屠殺時に得られたサンプルは、組織学的定量、EndMT解析、western blot 解析、microRNA定量を行った。血中および尿中のAcSDKP濃度も測定した。Imidapril, TA-606は田辺三菱製薬からMTAのもと供与頂き、AcSDKPはアサビオバイオの小俣貢先生から供与頂いた。
細胞実験: 培養内皮細胞（HMVEC）を用いて、TGF-もしくはTGF-+TNF-,IL-1のmixによる刺激を行いAcSDKP孵置の有無でEndMT解析、その分子機構およびmicroRNAの解析もおこなった。

－ 39 －

６．研 究 成 果
ACE-I 阻害薬投与下 AcSDKP 追加投与による抗線維化効果
AcSDKP は ACE の基質であり、ACE 阻害薬に AcSDKP を追加投与する事でさらなる血中濃度の上昇が期待でき、理想的併用療法が実施できる。今回、糖尿病性腎症に対する既存の治療法である ACE-I に AcSDKP を追加投与し、その腎保護効果と線維芽細胞活性化機構における意義を検討した。糖尿病性腎症のモデル動物として、線維化を惹起するモデルである STZ
誘導 1 型糖尿病モデル CD-1 マウスを用いた。STZ 投与後６ヶ月でマウスを屠殺。糖尿病群
は収縮期血圧低下、体重減少、腎臓体重比および肝臓体重比の増加、心臓体重比の低下が認められ、治療介入の影響を認めなかった。尿中アルブミン排泄は糖尿病で上昇し imidapril,
TA-606 のいずれでも低下し、imidapril+AcSDKP でその差は有意であった。

図 1：STZ 誘導糖尿病マウスにおける腎線維化と AcSDKP による治療効果。糖尿病マウスにおける糸球体硬化と尿細管間質線維化は、imidapril で部分的に、imidapril+AcSDKP 追加投与でほぼ完全に改善した。しかしながら、ARB である TA-606 には抗線維化効果は認められなかった。

組織学的解析では、コントロールに比し糖尿病マウスにおいて糸球体肥大および PAS 陽性のマトリックス蓄積、MTS（マッソントリクローム）染色における尿細管間質線維化、尿細管上皮の萎縮、扁平化が認められた。imidapril 治療群では、糸球体硬化と尿細管間質線維化は部分的に抑制され、imidapril と AcSDKP 併用療群では、腎線維化は糸球体-尿細管間質とも
ほぼ完全に抑制された。TA-606 治療群では、抗線維化効果は皆無であった（図 1）。糖尿病
マウスではコントロールに比し血漿 AcSDKP 濃度の低下傾向を認めた。imidapril 治療群では血漿 AcSDKP 濃度は上昇を認め（P=0.05）、imidapril+AcSDKP 追加投与群ではさらに約 5.5倍増加を認めた。AcSDKP 単独投与による AcSDKP 血漿中濃度および抗線維化効果は
imidapril と同程度であった。尿中 AcSDKP 濃度と尿中クレアチニン濃度比に関しては、コン
トロールマウスに比し糖尿病マウスでは有意な低下、imidapril+AcSDKP 投与により有意に上昇した。TA-606 治療群においては血中、尿中とも糖尿病マウスよりやや低値であった（有意差なし）。血漿 AcSDKP 濃度と組織学的パラメーターの比較検討結果、血漿 AcSDKP 濃度と－ 40 －

糸球体肥大には相関を認めなかったが、メサンギウム領域の拡大、尿細管間質の線維化に関しては AcSDKP 血漿濃度と逆相関していることを見出した。これらの抗線維化効果は糖尿病腎における EndMT 抑制を伴った。
AcSDKP による内因性抗線維化プログラムは microRNA let-7 誘導と相関
Chen らは、microRNA let-7 が TGF--smad 刺激伝達機構を抑制する事を示した（Cell Report2012）。腎臓サンプルを用いた microRNA array 解析結果から、microRNA mmu-let-7 family が糖尿病腎で抑制され、ほぼすべての microRNA let7 family が imidapril+AcSDKP 併用療法により正常化した。その他に EndMT や EMT 惹起すると関係する、mmu-miR-21, -23, -148, -125, お
よび -200 families, に関しては let-7 family の変化に比し軽度であった。microRNA array により得られたいくつかの microRNA（mmu-let-7f-5P, mmu-let-7g-3P, and mmu-let-7i-3P）に関しては qPCR にて確認し、糖尿病で低下した let-7 family が imidapril で部分的に、imidapril+AcSDKPにより正常化した。microRNA let-7 family は fibroblast growth factor（FGF）受容体を介した刺激伝達機構により制御されていると報告されている。糖尿病マウスにおいて FGF 受容体のリン酸、総 FGF 受容体タンパク量は低下しており、imidapril+AcSDKP により完全に回復した。このような FGF 受容体発現に対する AcSKDP 効果は、FGF mRNA 発現増加を伴っていた。FGF 受容体を介した microRNA let-7 family は TGF- 1 型受容体（TGFR1）発現レベルを低下させる。我々の検討でも、糖尿病マウスでは内皮細胞に TGFR1 強発現が認められるが、imidapril では部分的に、imidapril+AcSDKP で完全に抑制された。
培養 HMVEC においても、TGF- は hsa-let-7 family を低下させ、AcSDKP は hsa-let-7
microRNA をほぼ正常レベルまで回復した。TGF-2, IL-1, TNF-の３種サイトカイン刺激により、FGF 受容体発現、リン酸化は供に抑制され、AcSDKP 供孵置により供に正常化した。
７．研究の考察・反省
血管内皮細胞は、常に血液と接することより流血中の各種抗原-化学物質に晒され続け、血管障害の際の主たる標的である。障害を受けた内皮細胞の一部はその表現型を改変、内皮細胞としての機能・特徴を失いながらも生存を続け、内皮細胞間葉系分化（EndMT）を経て線
維芽細胞様の表現系を呈すると報告されている。EndMT を経た線維芽細胞の腎臓や心臓など臓器線維化や腫瘍組織における血管新生・細胞外基質産生における病理学的意義が注目されている。今回の我々の検討では ACE の基質であり ACE-I の投与により血中濃度が上昇する
内因性抗線維化ペプチドは糖尿病で低下しており、AcSDKP により惹起される FGF 受容体を介した microRNA let-7 の発現も低下していた。ACE-I と AcSDKP 併用療法により、内因性抗線維化プログラムを改善する事が可能であった。この結果は AcSDKP-FGF 受容体-let-7 という抗 EndMT-抗線維化プログラムが糖尿病で低下している事、その機構が治療標的である事を示唆している。現在本システムを標的として抗線維化ペプチド薬の開発を行っている。

－ 41 －

８．研 究 発 表① Nagai T, Nitta K, Kanasaki M, Koya D, Kanasaki K. The biological significance of angiotensin-converting
enzyme inhibition to combat kidney fibrosis. Clin Exp Nephrol (in press) 2014.
Abstract: Both angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACE-I) and angiotensin II receptor
blocker have been recognized as renin-angiotensin system (RAS) inhibitors. These two RAS
inhibitors are rarely recognized as drugs with distinct pharmacological effects in the clinic or mostclinical trials. Some preclinical basic research and clinical trials indicate that ACE-I might display
superior organ-protective effects, especially anti-fibrotic effects. Such anti-fibrotic effects of ACE-I
could be associated with an endogenous anti-fibrotic peptide, N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline(AcSDKP). In this review, we focused on the anti-fibrotic effects of RAS inhibition and theendogenous anti-fibrotic peptide AcSDKP.
② Kanasaki K, Nagai T, Nitta K, Kitada M, Koya D. N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline: a valuable
endogenous anti-fibrotic peptide for combating kidney fibrosis in diabetes. Front Pharmacol 2014; 5:
70.
Abstract: Fibroproliferative diseases are responsible for 45% of deaths in the developed world.
Curing organ fibrosis is essential for fibroproliferative diseases. Diabetic nephropathy is a common
fibroproliferative disease of the kidney and is associated with multiorgan dysfunction. However,therapy to combat diabetic nephropathy has not yet been established. In this review, we discuss thenovel therapeutic possibilities for kidney fibrosis in diabetes focusing on the endogenous anti-fibrotic
peptide, N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP), which is the substrate for angiotensin-converting
enzyme and exhibits meaningful anti-fibrotic effects in various experimental models of fibrotic
disease.
③ Kanasaki K, Shi S, Kanasaki M, He J, Nagai T, Nakamura Y, Ishigaki Y, Kitada M, Srivastava SP,
Koya D. Linagliptin-mediated DPP-4 inhibition ameliorates kidney fibrosis in streptozotocin-induced
diabetic mice by inhibiting endothelial-to-mesenchymal transition in a therapeutic regimen. Diabetes
2014; 63: 2120-2131.
Abstract: Kidney fibrosis is the final common pathway of all progressive chronic kidney diseases,of which diabetic nephropathy is the leading cause. Endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT)
has emerged as one of the most important origins of matrix-producing fibroblasts. Dipeptidyl
peptidase-4 (DPP-4) inhibitors have been introduced into the market as antidiabetes drugs. Here, we
found that the DPP-4 inhibitor linagliptin ameliorated kidney fibrosis in diabetic mice without
altering the blood glucose levels associated with the inhibition of EndMT and the restoration of
microRNA 29s. Streptozotocin-induced diabetic CD-1 mice exhibited kidney fibrosis and strong
immunoreactivity for DPP-4 by 24 weeks after the onset of diabetes. At 20 weeks after the onset of
diabetes, mice were treated with linagliptin for 4 weeks. Linagliptin-treated diabetic mice exhibited a－ 42 －

suppression of DPP-4 activity/protein expression and an amelioration of kidney fibrosis associatedwith the inhibition of EndMT. The therapeutic effects of linagliptin on diabetic kidneys wereassociated with the suppression of profibrotic programs, as assessed by mRNA microarray analysis.
We found that the induction of DPP-4 observed in diabetic kidneys may be associated with
suppressed levels of microRNA 29s in diabetic mice; linagliptin restored microRNA 29s andsuppressed DPP-4 protein levels. Using cultured endothelial cells, we found that linagliptin inhibited
TGF-β2-induced EndMT, and such anti-EndMT effects of linagliptin were mediated throughmicroRNA 29 induction. These results indicate the possible novel pleiotropic action of linagliptin torestore normal kidney function in diabetic patients with renal impairment.
④ Nagai T, Kanasaki M, Srivastava SP, Nakamura Y, Ishigaki Y, Kitada M, Shi S, Kanasaki K, Koya D.
N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits diabetes-associated kidney fibrosis and endothelial-mesenchymaltransition. Biomed Res Int 2014; 2014: 696475.
Abstract: Endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) emerges as an important source offibroblasts. MicroRNA let-7 exhibits anti-EndMT effects and fibroblast growth factor (FGF) receptor
has been shown to be an important in microRNA let-7 expression. The endogenous antifibrotic
peptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP) is a substrate of angiotensin-converting
enzyme (ACE). Here, we found that AcSDKP inhibited the EndMT and exhibited fibrotic effects thatwere associated with FGF receptor-mediated anti-fibrotic program. Conventional ACE inhibitor plus
AcSDKP ameliorated kidney fibrosis and inhibited EndMT compared to therapy with the ACE
inhibitor alone in diabetic CD-1 mice. The endogenous AcSDKP levels were suppressed in diabetic
animals. Cytokines induced cultured endothelial cells into EndMT; coincubation with AcSDKP
inhibited EndMT. Expression of microRNA let-7 family was suppressed in the diabetic kidney;
antifibrotic and anti-EndMT effects of AcSDKP were associated with the restoration of microRNA
let-7

levels.

AcSDKP

restoreddiabetes-orcytokines-suppressed

FGF

receptor

expression/phosphorylation into normal levels both in vivo and in vitro. These results suggest thatAcSDKP is an endogenous antifibrotic molecule that has the potential to cure diabetic kidney fibrosis
via an inhibition of the EndMT associated with the restoration of FGF receptor and microRNA let-7.

－ 43 －

１．研究課題名：Saffold ウイルスの病原性解明を目指した感染受容体の同定（研究番号S2012-6）

２．キーワード：１）Saffold ウイルス（Saffold virus, SAFV）
２）感染受容体（receptor for SAFV infection）
３）持続感染（persistent infection）
３．研究者氏名：姫田敏樹・医学部・准教授・微生物学

４．研 究 目 的
ピコルナウイルス科カルジオウイルス属のウイルスは、げっ歯類にのみ感染すると考えられていたが、2007 年にヒトに感染するカルジオウイルスとして初めて Saffold ウイルス（SAFV）が同定された。その後、腸管症状を呈した患者の便からの検出が数多く報告されているが、申請者は、無菌性髄膜炎患者の髄液からの SAFV の分離を世界で初めて報告した。
これらのことから SAFV は、同科エンテロウイルス属のコクサッキーウイルスやエンテロウ
イルス同様、稀に中枢神経症状を引き起こす病原体である可能性が示唆される。
SAFV はマウス細胞株に感染しないことから、実験動物を用いた病原性解析には、ポリオウイルスやエンテロウイルス等でも前例のある感染受容体のトランスジェニックマウスを用いた研究が不可欠である。しかし、現在のところ SAFV の感染受容体は全く不明である。そこで本研究では、SAFV 感染受容体を同定し、SAFV の病原性解明を加速させることを目的とする。
５．研 究 計 画
本研究開始までに申請者は、ウイルスが細胞に吸着した後、侵入・脱殻の過程を経てウイ
ルスゲノムからのタンパク合成が始まると、細胞内で GFP を発現するキメラウイルスを作出し、さらに、SAFV 感受性ヒト由来細胞株と SAFV 非感受性ハムスター由来細胞株を同定した。この非感受性細胞は、ウイルスゲノムのトランスフェクトにより新たなウイルス粒子を産生することから、ウイルスの複製過程以降には影響がなく、それ以前、細胞への吸着および侵入の過程に感受性細胞との違いを持つ細胞であり、感染受容体の探索に有用であると考えられた。そこで、これらのキメラウイルスおよび細胞株を用いて以下の要領で SAFV の感染受容体を探索した。
（１）SAFV 感受性細胞（HeLa 細胞）から cDNA ライブラリーを作製し、発現ベクターを用いて非感受性細胞（BHK-21 細胞）に導入することで、SAFV 感染受容体を発現する細胞を含む細胞ライブラリーを作製した。この細胞ライブラリーに GFP を発現する SAFV を感染させて GFP の蛍光を観察し、SAFV 感染受容体を発現している細胞を選択した。ここで単離した 1 個の細胞から、Cell Direct cDNA 合成キット（Invitrogen）により 1st strand cDNA を合成し、cDNA ライブラリー作製時の末端配列を利用して PCR を行うことで、感染細胞に導入され、かつ、発現している cDNA をクローニングした。この様にして単離された SAFV－ 45 －

感染受容体 cDNA 候補群について、各々の cDNA を改めて発現ベクターにサブクローニン
グし、非感受性細胞にそれぞれを発現させて非感受性細胞であった細胞が SAFV 感受性を獲得するか否かを検証し、SAFV 感染受容体の同定を試みた。
（２）上記（１）に代わる新たな方法として、HeLa 細胞の SAFV に対する感受性を変化させる培養方法を探索した。そして、これらの細胞間における遺伝子発現の違いを、DNA マイ
クロアレイにより解析し、発現量に２倍以上の違いが見られ、かつ、膜タンパクと考えられる分子群を選択した。この方法で得られた遺伝子群について、各々を SAFV 非感受性細胞（BHK-21）に導入して受容体遺伝子の同定を試みた。
６．研 究 成 果（１）SAFV 感受性 HeLa 細胞から作製した cDNA ライブラリーを、SAFV 非感受性 BHK-21細胞に導入し、SAFV 感受性を獲得したと考えられる GFP 陽性細胞を数百個単離し、導入された感染受容体の候補分子として、beta-2 microglobulin をはじめとする 36 種の遺伝子を特定した。しかし、サブクローニングして行った個別の遺伝子の発現系による解析では、
SAFV 感染を再現出来なかった。また、各候補因子に対する抗体を用いた感染のブロッキ
ングアッセイにおいても、受容体であることは確認できなかった。１細胞あたりに複数の遺伝子が導入されるため、この方法では、目的の遺伝子をクローニングできなかったことが一因であると考えられた。そこで、その欠点を補うために、網羅的解析を導入し、新たな解析を開始した。
（２）上記に代わる新たな方法として HeLa 細胞の SAFV に対する感受性を変化させる培養方法を探索し、培養時に用いる血清（FCS or CS）の違いにより、SAFV 感受性が可逆的に著しく変化することを見出した。また、SAFV 低感受性 HeLa 細胞において、SAFV は持続感染するウイルスであることを世界で初めて明らかに報告した。そしてさらに、SAFV 高感
受性 HeLa 細胞と SAFV 低感受性 HeLa 細胞の間では SAFV の細胞表面への結合量に顕著な違いがみられることを証明し、SAFV の持続感染は、感染受容体の発現密度に依存したものであることを明らかにした（Himeda et al. PLoS ONE 8(1):e53194）。
そこで、両細胞間における遺伝子発現の違いを、DNA マイクロアレイにより解析し、発現量に 2 倍以上の違いが見られ、かつ、膜タンパクと考えられる分子群（58 遺伝子）を同定した。現在、これらの遺伝子を SAFV 非感受性細胞（BHK-21）に導入して受容体遺伝子の同定を試みているが、まだ同定には至っていない。
７．研究の考察・反省
当初予定していた感染受容体の同定には至らなかったが、その探索過程で、HeLa 細胞のSAFV に対する感受性を変化させる方法を見出し、さらには、持続感染ウイルスであることの証明は、今後の SAFV 研究を加速させる重要な成果であったといえる。感染受容体の同定については、今後も引き続き実施予定であるが、その際、ポリオウイルスおよびエンテロウ
イルスの感染受容体同定に成功している小池智先生（東京都医学総合研究所）から頂いた－ 46 －

「cDNA からのアプローチでは、プロモーターの違いによる発現の不確実さや、完全長 cDNA作製の困難さなどが問題となりやすい」との助言に基づき、genomic DNA からのスクリーニ
ングを実施する。
８．研 究 発 表
① Shimizu A, Himeda T, Okuwa T, Muraki Y, Ohara Y. Role(s) of Leader protein of Saffold virus. Clin
Exp Neuroimmunol 2014; doi: 10.1111/cen3.12109.
Abstract: Objective Saffold virus (SAFV) classifi ed in the species Theilovirus of the genus
Cardiovirus is a novel human cardiovirus. The pathogenicity of SAFV in humans still remains unclear.
Viruses in the genus Cardiovirus produce Leader protein, which is a small non-structural protein.
Evidence that Leader protein of murine cardioviruses is a key factor in their biological activities has
been provided. Therefore, the studies on the function of SAFV-L are likely to be important in order toclarify the pathogenicity of SAFV.
Methods We investigated the interferon (IFN) response in the early stage of SAFV infection by
reverse transcription polymerase chain reacti on and the gr owth kinetics of t he chimera virus,
SAFL/DA.
Results The study showed that SAFV-L suppresses the type I IFN response, and that the responsible
region of anti-IFN activity of SAFV-L is a zinc-binding motif. Furthermore, the anti-apoptotic activityof SAFV-L was suggested from the growth kinetics analysis of SAFL/DA.
Conclusions The pres ent study suggested that SAFV-L might be a multifunctional protein; forexample, the suppression of IFN induction, anti-apoptotic effect and/or productive virus growth.
② Himeda T, Hosomi T, Okuwa T, Muraki Y, Ohara Y. Saffold virus type 3 (SAFV-3) persists in HeLa
cells. PLoS One 2013; 8: e53194.
Abstract: Saffold virus (SAFV) was identified as a human cardiovirus in 2007. Although several
epidemiological studies have been reported, they have failed to provide a clear picture of therelationship between SAFV and human diseases. SAFV genotype 3 has been isolated from thecerebrospinal fluid specimen of patient with ase ptic meningitis. This finding is of interest since
Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV), wh ich is the closely related virus, is known tocause a multiple sclerosis-like syndrome in m ice. TMEV persistently infects in mouse macrophagecells in vivo and in vitro, and the viral persistence is essential in TMEV-induced demyelinating
disease. The precise mechanism(s) of SAFV infection still remain unclear. In order to clarify the
SAFV pathogenicity, in the present study, we st udied the possibilities of t he in vitro persistentinfection of SAFV. The two distinct phenotypes of HeLa cells, HeLa-N and HeLa-R, were identified.
In these cells, the type of SAFV-3 infection was clearly different. HeLa-N cells were lyticly infectedwith SAFV-3 and the host suitable for t he efficient growth. On the other hand, HeLa-R cells werepersistently infected with SAFV-3. In addition, the SAFV persistence in HeLa-R cells is independent－ 47 －

of type I IFN response of host cells although the TMEV persistence in mouse macrophage cells
depends on the response. Furthermore, it was suggested that SAFV persistence may be influenced by
the expression of receptor(s) for SAFV infection on the host cells. The present findings on SAFV
persistence will provide the important information to encourage the research of SAFV pathogenicity.

－ 48 －

１．研究課題名：N-end rule 経路の生理機能（研究番号S2012-7）

２．キーワード：１）N-end rule 経路（N-end rule pathway）
２）ユビキチン（Ubiquitin）
３）オートファジー（Autophagy）
４）パピローマウイルス（HPV16）５）遺伝子欠損マウス（Gene knockout mouse）
３．研究者氏名：田崎隆史・総合医学研究所・准教授・生命科学研究領域

４．研 究 目 的
N-end rule 経路の Ubiquitin ligase UBR4 を欠損したマウスは、胎生致死で、細胞内ストレス応答機構の Autophagy や NF-B 経路に異常が見られた。しかし、その分子機構は明らかではない。一方、UBR4 は、子宮頸がんの原因であるヒトパピローマウイルス（HPV）やウシパ
ピローマウイルス（BPV）の E7 蛋白に結合することが報告されている。ストレス応答とがんは密接な関係が知られており、UBR4 欠損モデルを用いて、E7 蛋白との相互作用、その生
理学的意義を分析し、N-end rule 経路の生理学的機能のみならず、ウイルス感染によるがん・病変メカニズムの解明を目的とする。
５．研 究 計 画
(1) UBR4 欠損マウス胎仔由来繊維芽細胞の解析
UBR4 欠損マウス胎仔から、繊維芽細胞（MEFs）を作成し不死化細胞株を樹立する。野生型の同腹子からも同様に不死化繊維芽細胞を樹立し、実験のコントロールとする。UBR4
欠損および野生型 MEFs を用い、増殖における栄養要求性を解析する。
(2) タモキシフェン誘導性 UBR4 欠損マウス（UBR4CKO）の作成
Rosa26CreERT2 遺伝子と UBR box 領域を含む UBR4 エキソンの両側に loxP 配列を挿入した改変遺伝子を持つ遺伝子改変マウスを作成する。
(3) UBR4CKO 胎児由来繊維芽細胞の樹立
UBR4 欠損 MEFs は、通常の 10％牛血清（FBS）では増殖せず、15％FBS を含む培養液を必要とするため、対照群（野生型）との厳密な比較は困難であった。この問題を解決するために、UBR4fl/fl; Rosa26CreERT2（実験群）と UBR4+/+; Rosa26CreERT2（対照群）のMEFs を分離する。タモキシフェン存在下で培養し、細胞内 UBR4 を欠損させる。
(4) HPV16E7 タンパク分子と UBR4 の結合解析
ヒトパピローマウイルス（HPV）16 型が産生する癌タンパク質 E7 は、宿主細胞の UBR4と結合することが知られているが、UBR4 のどの部分に結合するのか、また相互作用の生理学的意義は分かっていない。大腸菌で大量発現した E7 タンパク質と、哺乳類細胞で発現させた様々な UBR4 タンパク質断片との結合解析を行う。

－ 49 －

６．研 究 成 果(1) 通常、胎仔由来繊維芽細胞を分離する
ためには、12-14 日齢の胚を用いるが、UBR4 欠損マウスは胎生致死（E9.0-Ｅ
10.0）のため、E8.5 齢の胚より繊維芽細胞 株 を 作 成 し た 。 Spontaneous
immortalization 法により UBR4+/+（野生型）および、UBR4-/-（欠損）細胞株を樹立した。UBR4-/-細胞は、野生型に比べ増殖が遅く、特に、通常の血清濃度（10％）下では増殖餌を停止した（Fig.1）。
(2)

ピ

ッ

ツ

バ

ー

グ

大

学

Fig.1

UBR4 欠損細胞増殖と血清濃度のUBR4fl/+ ;Rosa26CreERT2/ERT2 mouse を使用した。このマウスを相互交配し、UBR4fl/fl;
Rosa26CreERT2（実験群）と UBR4fl/fl（対照群）を得た。loxP 配列は、N 末端アミノ酸認
識活性を持つ UBR box 配列を挟む様に UBR4 遺伝子上に配置されている。Rosa26CreERT2
遺伝子は、エストロジェン様薬剤 Tamoxifen の投与によって組換え酵素 Cre を発現する。この結果、UBR4 遺伝子を不活化する。
(3) 相互交配させた UBR4fl/+; Rosa26CreERT2/ERT2 妊娠メスから 12-14 日齢の胎児を採取し、頭、内臓を除去し、19 ゲージの注射針を使って残りの部分を培養液中で破砕し、細胞培養
ディッシュで初代 UBR4CKO 細胞（UBR4fl/fl; Rosa26CreERT2）を樹立した。UBR4CKO 細胞を 4-OH Tamoxifen（250 nM）存在下で 5日間培養し、細胞タンパク質を調整、WB法により UBR4 の発現を解析した。この条件では、UBR4 タンパク質は５日間で75％減少することが示された（Fig. 2）。
(4) HPV16E7 全長の C 末端側に GST もしFig.2

くは FLAG を融合させた cDNA を大腸UBR4CKO 細胞に対する 4-OH Tamoxifen 処理の効果。
UBR4（上）、-Actin（下）菌発現ベクターに組み込んだ。HPV16E7 の大きさは約 19KDa と小さいものの、通常の大腸菌株 BL21（DE3）での発現は非常に弱かったため、様々な株を試した。その結果、Rosetta-gami2（DE3）pLysS 株、IPTG 存在下で HPV16E7-flag（E7-flag）蛋白の有意な発現を得ることが出来た。大腸菌由来の E7-flag を FLAG-M2 アガロースビーズに吸着させ、
human UBR4 全長（574 kDa）、UBR4-N 末端断片（274 kDa）、UBR4-C 末端断片（326 kDa）、
LacZ（110 kDa）をそれぞれ発現させた HEK293 細胞抽出液と混ぜ、それぞれの発現タンパ
クが E7-flag に結合するかを調べた。その結果、E7-flag 蛋白は、UBR4 全長と UBR4-N 末断片に特異的に結合することを見出した（Fig. 3）。

－ 50 －

７．研究の考察・反省
UBR4 欠損マウスおよび loxP-ERT2Cre システムによる
UBR4-cko マウスから胎仔由来繊維芽細胞を樹立した。
前者の細胞は、通常の血清存在下（10％濃度）では増殖しないこと、また、オートファジー刺激（アミノ酸欠乏）
下でオートファジー関連因子及び NF-kB 関連因子が過剰に活性化されることから、UBR4 が細胞ストレスに対するシグナル伝達に関与している事が示唆された。一方、
UBR4 と HPV16 由来がん蛋白 E7 の結合アッセイを構築し、解析し、UBR4 上の E7 結合部位が、保存領域 UBR-box
を含む N 末端断片に存在することが明らかになった。今後さらに解析を進め、結合部位の特定を行いたい。細胞系の樹立や、結合解析系の樹立など、実験準備段階の工程が多く、解析があまり進んでいない点が反省である。
しかし、これらは非常に重要な過程であり、今後の研究
Fig.3

進展が期待できる。

UBR4-E7 結合アッセイ

８．研 究 発 表
Kim ST, Tasaki T, Zakrzewska A, Yoo YD, Sa Sung K, Kim SH, Cha-Molstad H, Hwang J, Kim KA,
Kim BY, Kwon YT. The N-end rule proteolytic system in autophagy. Autophagy 2013; 9: 1100-1103.
Abstract: The N-end rule pathway is a cellular proteolytic system that utilizes specific N-terminal
residues as d egradation determinants, called N-degrons. N-degrons are recognized and bound by
specific recognition components (N-recognins) that mediate polyubiquitination of low-abunda nce
regulators and selective proteoly sis through the proteasome. Our earlier work identified UBR4/p600
as one of the N-recognins that promotes N-degron-dependent proteasomal degradation. In this study,
we show that U BR4 is associated w ith cellular car goes destined to autophagic vacuoles an d isdegraded by the lysosome. UBR4 loss causes multiple misregulations in autop hagic pathways,
including an increased formation of LC3 puncta. UBR4-deficient mice die during em bryogenesis
primarily due to defective vascular development in the yolk sac (YS), whe rein UBR4 is associ atedwith a bulk l ysosomal degradation system that absorbs maternal proteins fro m the YS cavity anddigests them into amino acids. O ur results suggest that U BR4 plays a role not only in selective
proteolysis of short-lived regulators thro ugh the proteasome, but also bulk degradation through thelysosome. Here, we discuss a possible mechanism of UBR4 as a regulatory component in the deliveryof cargoes destined to interact with the autophagic core machinery.

－ 51 －

１．研究課題名：カドミウムによる慢性腎臓病 CKD の動脈硬化危険因子に関する研究（研究番号

S2012-8）

２．キーワード：１）カドミウム（cadmium）
２）動脈硬化（arteriosclerosis）
３）慢性腎臓病（chronic kidney diseases）
４）危険因子（risk factors）
５）Renal tubular dysfunction
３．研究者氏名：西条旨子・医学部・准教授・公衆衛生学

４．研 究 目 的
近年、アメリカ合衆国の一般集団において血中および尿中カドミウム（Cd）が抹消血管閉
塞症の有症率の上昇に関連していることが報告され、動脈硬化と Cd の関連性が注目されている。また、慢性腎臓病（CKD）患者の動脈硬化発症の危険因子の一つとしてホモシスチン血症が認められることが報告されているが、アミノ酸の再吸収障害を有する Cd による CKDに関する調査はない。そこで、タイ王国 Cd 汚染地域住民の血中ホモシスチン濃度を測定し、Cd 暴露や腎尿細管障害の指標との関連や動脈硬化の指標である脈波伝播速度（PWV）や足関節上腕血圧比（ABI）との関連を検討し、Cd による CKD の動脈硬化の危険因子を検索する。
５．研 究 計 画
タイ王国北西部 Mae Sot 地区 Cd 汚染地域に居住する 60 歳以上の住民 130 名（男 61 名、
女 69 名）を対象として健康影響調査を行った。Cd 暴露指標として尿中および全血中 Cd を
原子吸光法により測定した。動脈硬化度を表す大動脈 PWV と最も相関の高い brachial ankle
pulse wave velocity（baPWV）と ABI を自動測定装置（form PWV/ABI BP-203RPEII; オムロン）
を用いて測定した。腎尿細管障害の指標として尿中 β2-MG と NAG を測定し、カルシウム（Ca）とリン（P）の fractional excretion（FE）を血清と尿の測定値より算出した。また、腎糸球体障害の指標として、血清クレアチニン（S-Cr）とシスタチン C を測定した。さらに、動脈硬化の一般的な危険因子である空腹時血糖、血清脂質を測定した。また、CKD 患者の動脈硬化発症の危険因子の一つである血清中ホモシスチンおよび血清中ホール PTH を測定し、PWV や ABI との関連を、血清脂質や糖尿病の指標など既知の動脈硬化の指標を調整した上で明らかにする。
６．研 究 成 果
対象者を男女別に尿中 Cd により 2 群に分け（高 Cd 暴露群、低暴露群：5μg/gCr 以上あるいは未満）
、腎障害の指標や血清中ホモシスチンおよび血清ホール PTH、PWV や ABI、血圧－ 53 －

値、肥満度、血清脂質や空腹時血糖、高血圧の治療や喫煙などを比較したところ、男性では高 Cd 暴露群では、有意に高血圧の治療者が少なかったが、他の指標は差がなかった。しかし、女性では、高 Cd 暴露群の尿中 NAG と EF-Ca が有意に高値で、ホール PTH と血清 Caが有意に低値であった。また、女性では、尿中 NAG と EF-Ca は年齢を調整した場合でも、
尿中 Cd との有意な正の相関関係があったが、男性では有意な相関は得られなかったため、女性で Cd 暴露による腎尿細管障害が明らかであり、Cd 暴露の増加に伴い Ca の排泄が多くなることが示唆された。また、Cd 以外の原因による CKD では、血清 P の上昇が認められ、PTH が上昇し、リンの排泄を増加させるが、Cd による CKD では、血清 P は、むしろ低めであり、Cd による Ca 排泄が多く、血清 Ca も低下しているのも関わらず、ホール PTH が低くなっていた。女性では、尿中 Cd と尿中 β2-MG と NAG および EF-Ca が有意な正の相関、血清中ホール PTH とは有意な負の相関が、年齢を調整した上でも認められることからも、このCd による尿細管障害に伴う PTH の低下があると考えられた。
動脈硬化指数 PWV および ABI と尿中 Cd との有意な相関は認められず、Cd 暴露と動脈硬化の直接的な関連は認められなかったが、男性では、動脈血管壁の硬化度を表す PWV と血清ホモシスチン、EF-Ca は年齢を調整しても有意な正の相関があり、女性では ABI と EF-P
およびシスタチン-C との間に、有意ではないが負の相関関係が認められた。そこで、PWVを目的変数とし、ホモシスチン、EF-Ca に、動脈硬化の一般的な危険因子である、年齢、高血圧治療歴、BMI、non-HDL コレステロール、HDL コレステロール、喫煙の有無、空腹時血糖を加えた 9 因子を説明変数とする重回帰分析を行った。その結果、男性では、このモデルが有意であり、Cd 血清ホモシスチンと EF-Ca の上昇が PWV を上昇させる要因となっていた。
しかし、女性では PWV と血清ホモシスチンおよび EF-Ca は PWV と有意な相関を認めなかった。一方、女性では、シスタチン-C、EF-Ca およびホール PTH に動脈硬化の危険因子を加えた 10 因子を説明変数とした、ABI を目的変数とするモデルが有意であり、シスタチン-Cと EF-Ca の上昇が ABI を低下させる要因となっていた。また同様に、EF-P を説明変数に加えたモデルによる ABI の多変量解析も試みたが、有意なモデルは得られなかった。
以上のことから、尿中 Cd で示される Cd 暴露は、動脈効果の指標と直接的な関連は認められなかったが、Cd による腎尿細管障害の一つの兆候である EF-Ca が、女性では抹消動脈の閉塞傾向の増強に関連していることが示された。なお、男性では、腎障害の指標の上昇が尿中 Cd と相関しないことから、この集団で認められた腎障害は Cd 暴露以外の原因による CKD
である可能性があり、血清ホモシスチンとカルシウムの排泄増加は、非汚染地域における一般タイ人男性の動脈壁硬化の危険因子であることが考えられた。
７．研究の考察・反省
Cd 汚染による腎尿細管障害により、特に女性で Ca の排泄が増加することが、動脈壁の硬化ではなく、動脈の内腔閉塞を進行させる要因となることが考えられた。また、女性では、
血清シスタチン-C の上昇も動脈の内腔閉塞の危険因子であったが、Cd 暴露指標との相関性は認められず、他の原因による腎糸球体機能の低下を示しているものと考えられた。

－ 54 －

Navis-Acien らは、アメリカの一般住民において、血中および尿中 Cd が増加するにつれ、ABIの異常者が増加することを報告している。同じ集団で、Menke らも Cd 暴露の増加に伴い虚血性心疾患死亡が増加することを報告している。しかし、これらの報告は、低い Cd レベルの集団における検討であり、Cd 汚染地域においては異なることが予想された。また、Cd 暴露による腎機能障害による CKD の発症と動脈硬化のリスクに関する検討はなされていない。
Cd 暴露集団において、腎尿細管障害の指標である尿中 β2-MG や NAG が上昇することは、よく知られているが、腎尿細管での Ca の再吸収が障害され、尿中 Ca の排泄が増加することが、日本の梯川流域 Cd 汚染地域や、本研究の対象地域であるタイ王国メーソット地区住民で報告されている。しかし、動脈硬化と Cd 暴露による Ca 排泄との関係については汚染地域
住民では検討されておらず、本研究が最初の報告であると考えられる。しかし、メーソット
汚染地域住民は Cd だけでなく、他の原因によると思われる腎機能の低下がみとめられるため、数種類の腎尿細管障害および腎糸球体障害の指標を用いて、尿中 Cd との関連性を検討した上で、Cd による腎障害と動脈硬化との関連性を検討した。血清中シスタチン-C の上昇
は、Cd との相関はなかったが、ABI の低下には強く関連していた。また、腎尿細管での再吸収機能を示す EF-Ca の増加も ABI の低下に関連しており、尿細管障害の中でも Ca の再吸収障害が動脈閉塞のリスクを上昇させることが考えられた。さらに今回は、血管の石灰化を増強することによって動脈硬化を助長するとされる血清中ホール PTH も測定したが、Cd 暴露により障害される腎尿細管におけるリンの再吸収障害の代償として、PTH の低下が、女性で認められ、PTH の低下に伴い ABI も低下していたが、その回帰係数は境界域であり、有意な関連は認められなかった。
血清ホモシスチンは、一般集団や高血圧患者、腎疾患患者、特に高齢者における動脈硬化
危険因子として報告されているが、地域集団における報告は少ない。本研究の男性も平均年
齢 70 歳であり、高度な Cd 暴露と腎障害はあるものの、その腎障害の指標と Cd の関連は認められず、Cd 以外の要因による CKD が推察される高齢者集団である。この集団において、血清ホモシスチンの増加による PWV の上昇が認められたことは、CKD 男性において、血清
ホモシスチンは有用な危険因子であることが示唆されたと考えられる。しかし、Cd による腎機能への影響の強い女性においては、ホモシスチンとの関連性を認めず、腎尿細管障害を主病変とした腎障害については、動脈硬化との関連性が異なる可能性が考えられた。
今後、この集団を追跡調査し、虚血性疾患や動脈硬化性疾患の発症についても検討していきたい。また、今回は、対象者数が限られており、今後は、より多数の住民を対象とした調査を計画していきたい。
なお、この対象集団の CKD 発症の Cd 暴露閾値 benchmark dose を求めた研究結果を、前段階の研究として最初に報告し、動脈硬化リスク因子については、現在論文を作成している。
論文が二つに分かれたため、投稿に時間がかかっていることが反省点である。
８．研 究 発 表
Nishijo M, Suwazono Y, Ruangyuttikarn W, Nambunmee K, Swaddiwudhipong W, Nogawa K,－ 55 －

Nakagawa H. Risk assessment for Thai population: benchmark dose of urinary and blood cadmium
levels for renal effects by hybrid approach of inhabitants living in polluted and non-polluted areas inThailand. BMC Public Health 2014; 14: 702.
Abstract: Background: The aim of the present study was to estimate the benchmark doses (BMD)
for renal effects for health risk assessment of residents living in Cd-polluted and non-polluted areas ina Thai population.
Methods: The study participants consisted of inhabitants aged 40 years or older who lived in a
non-polluted area (40 men and 41 women) and in the environmentally polluted Mae Sot District (230
men and 370 women) located in northwestern Thailand. We measured urinary and blood cadmium
(Cd)

as

markersoflong-term

exposure

andurinaryβ2-microglobulin(β2-MG)

andN-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) as renal tubular effect markers. An updated hybrid approach
was applied to estimate the benchmark doses (BMD) and their 95% lower confidence limits (BMDL)
of urinary and blood Cd for Cd-induced renal effects in these subjects. BMD and BMDL
corresponding to an additional risk (BMR) of 5% were calculated with the background risk at zero
exposure set to 5% after adjusting for age and smoking status.
Results: The estimated BMDLs of urinary Cd for renal effect markers were 6.9 for urinary β2-MG
and 4.4 for NAG in men and 8.1 for β2-MG and 6.1 for NAG μg/g creatinine (Creat) in women.
These BMDLs of urinary Cd (μg/g Creat) for NAG were less than the geometric mean urinary Cd in
the polluted area (6.5 in men and 7.1 in women). The estimated BMDLs of blood Cd (μg/L) were 6.2
for urinary β2-MG and 5.0 for NAG in men and 5.9 for β2-MG and 5.8 for NAG in women. The
calculated BMDLs were similar or less compared with the geometric mean blood Cd (μg/L) in thepolluted Thai area (6.9 in men and 5.2 in women).
Conclusion: The BMDLs of urinary and blood Cd for renal effects were estimated to be 4.4 - 8.1
μg/g Creat and 4.4 - 6.2 μg/L in the Thai population aged ≥ 40 years old, suggesting that more than

40% of the residents were at risk of adverse renal effects induced by Cd exposure in Thailand.

－ 56 －

１．研究課題名：可溶型 VEGF 受容体（可溶型 Flt-1）の血管新生・脈管形成における役割の解明（研究番号S2012-9）

２．キーワード：１）可溶型 Flt-1（soluble Flt-1）２）選択的 3’端プロセシング（alternative 3’-end processing）
３）低酸素（hypoxia）
４）RNA 結合タンパク質（RNA binding proteins）
５）レンチウイルス（lentivirus）
３．研究者氏名：池田崇之・医学部・講師・生化学 II

４．研 究 目 的
血管新生の主要因子である VEGF は血管内皮細胞膜に結合した受容体を介して血管新生を促進するが、受容体の１つである Flt-1 は、細胞膜受容体に加えて mRNA 選択的 3’端プロセ
シングによって細胞外ドメインのみからなる可溶型受容体（可溶型 Flt-1）としても産生されている。この可溶型 Flt-1 は細胞膜受容体と拮抗的に働くことによって血管新生を抑制する作用があることが知られているが（Kendall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709,
1993）、産生制御機構や発生段階の血管新生における生理的な役割は不明な点が多い。
池田は、これまでに可溶型 Flt-1 の産生制御機構について研究を行い、(1) 低酸素刺激によって可溶型 Flt-1 の産生が特異的に抑制されること、(2) その抑制は mRNA 選択的 3’端プロ
セシング段階で行われ、同じ遺伝子から産生される膜型と可溶型の mRNA のうち可溶型
mRNA のみが減少すること、そして(3) その mRNA 選択的 3’端プロセシングは Flt-1 mRNA
前駆体に結合する RNA 結合タンパク質によって制御されていること明らかにしてきた（Ikeda et al. Biochem J., 436, 399-407, 2011）。さらに、選択的 3’端プロセシングを制御する
mRNA 前駆体上の制御配列（cis-element）を同定し、可溶型 Flt-1 の産生を特異的に制御することが可能になったことから、本研究では、未だ不明な点が多い可溶型 Flt-1 の生理的な役割をレンチウイルスを用いて個体レベルで解明する。
５．研 究 計 画
(1) 可溶型 Flt-1 過剰発現および特異的ノックダウンレンチウイルスベクターの作製
可溶型 Flt-1 過剰発現レンチウイルスベクターは、マウス可溶型 Flt-1 cDNA をクローニ
ングし、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP ベクター（System Biosciences 社）に組込んで作製する。また、可溶型 Flt-1 の発現を特異的に抑制する可溶型 Flt-1 ノックダウンレンチウイ
ルスベクターを作製するために、可溶型 Flt-1 のみに見られる配列（イントロン 13 に相当
する 112 塩基）に結合する shRNA をデザインし、pSIH-H1-copGFP ベクター（System
Biosciences 社）に組込む。shRNA の効果は、マウス可溶型 Flt-1 過剰発現ベクターと一緒に 293T 細胞にトランスフェクションし、80%以上の発現抑制を目安に数種類の候補を得る。

－ 57 －

(2) 可溶型 Flt-1 過剰発現、可溶型 Flt-1 特異的ノックダウンマウスの作製と解析
Singer ら（Nat. Protocols 1, 286-292, 2006）の方法に従い、透明体を除去した２細胞期胚に(1)で作製した可溶型 Flt-1 過剰発現または可溶型 Flt-1 ノックダウンレンチウイルスを感染させ、偽妊娠マウスに移植する（受精卵感染法）。Sehgal ら（PLoS ONE 6(7):e21975）の方法によりレンチウイルスをマウスの精巣に感染させる（精原細胞感染法）。出生したマウスの尻尾からゲノム DNA を分離し、ウイルス由来の DNA がゲノム DNA に挿入されているかどうかを qPCR により確認する。さらに、蛍光実体顕微鏡でマーカー遺伝子である GFPの発現を確認するとともに、免疫染色および RT-PCR により各組織での可溶型 Flt-1 の発現を確認する。作製したマウスは血管新生・脈管形成の解析によく用いられる眼組織の形態形成に注目して解析する。網膜およびその他組織の血管ネットワーク形成を血管内皮細胞マーカーである CD31 に対する抗体を用いて解析し、可溶型 Flt-1 の役割を明らかにする。
６．研 究 成 果内皮細胞のマーカーである CD31 および Flk-1 陽性細胞として単離したマウス血管内皮細胞から RNA を分離し、可溶型 Flt-1 cDNA をクローニングして過剰発現ベクターを作製した。
可溶型 Flt-1 の発現を特異的に抑制するために作製した 16 種類のノックダウン用レンチウイ
ルスベクターを過剰発現ベクターとともに 293T 細胞にトランスフェクションし、マウス可
溶型 Flt-1 の発現を定量したところ、4 種類の配列で 60-70%の発現抑制が認められた。
レンチウイルスを用いたトランスジェニックマウスの作成は、まず Singer らの受精卵感染法から行った。この方法では、交配したマウスから卵管を取り出し、受精卵を採取する必要があるが、受精卵をうまく単離することができず、ウイルスを感染させるには至らなかった。
次に、Sehgal らの精原細胞感染法を行った。精原細胞感染法はマウスを麻酔下で開腹することなくそのまま精巣にウイルスを打つことができることから、手技的な制限を受けず、非常に簡便であり安全な方法である。４週齢のマウスの精巣にレンチウイルスを感染させ、生まれてきたマウスのゲノミック DNA にウイルス由来の DNA が挿入されているかどうかを調べた。合計 165 匹のマウスを調べたところ、ウイルス DNA が検出されたマウスは 0 匹であった。Sehgal らの報告では約６割のマウスがトランスジェニックマウスとして生まれていたが、我々の実験ではトランスジェニックマウスは１匹も得られなかった。次に、４週齢より若い方が精巣も小さく、より効率的にウイルスが感染できるのではないかと考え、生後２日のマウスを用いて同様の実験を行った。150 匹のマウスを調べたが、トランスジェニックマウスを得ることはできなかった。ウイルスを感染させた精巣を蛍光顕微鏡で観察したところ、精細管の中でウイルスが感染したことを示す GFP 陽性細胞を確認することができなかった。
７．研究の考察・反省本研究では、可溶型 Flt-1 の生体内での役割を明らかにするために、レンチウイルスを用いたトランスジェニックマウスの作製を試みた。可溶型 Flt-1 の発現を特異的に抑制するためには、可溶型 Flt-1 特異的な配列に対する shRNA を作用させることが最善の方法であると考え－ 58 －

られ、また従来のトランスジェニックマウス作製法に比べ費用と時間を大幅に削減できることが期待された。しかし、受精卵感染法はウイルスを感染させるまでにも至らず、手技的な制限が大きかったのが反省点である。それに対して、精原細胞感染法は手技的な制限を受けない非常に簡便な方法であったため、ウイルスの感染までは容易に行えた。しかしながら、300 匹余りのマウスを調べてもトランスジェニックマウスを得ることはできなかった。Sehgal
らの報告では約６割のマウスがトランスジェニックマウスとして生まれており、本研究ではそれとは大きく異なる結果となった。この方法では精巣の中の間質（精細管の外）にウイル
スを打ち、それが精細管に侵入して精原細胞に感染すると、ウイルス由来の DNA を持った精子が産生されることになる。ところが、精細管の中で GFP 陽性細胞を確認することができなかったことから、ウイルスが精細管の一番外側にある基底膜を超えて精細管内に侵入することができないのではないかと考えている。世界的にも Sehgal らの方法で作成されたトラン
スジェニックマウスが得られていないことから、この方法ではトランスジェニックマウスを作製することが難しいことが明らかとなった。既に他の方法で可溶型 Flt-1 特異的ノックダウ
ンマウスの作製にとりかかっており、今後はそれを用いて可溶型 Flt-1 の生理的な役割を明らかにしていきたい。
８．研 究 発 表
該当なし

－ 59 －

１．研究課題名：アドレノメデュリンを用いた多発性硬化症に対する新規治療法の開発（研究番号

S2012-10）

２．キーワード：１）多発性硬化症（multiple sclerosis）
２）アドレノメデュリン（adrenomedullin）
３）自己免疫性脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE）
４）VCAM-1
５）ICAM-1
３．研究者氏名：北村彰浩・医学部・助教・神経内科学（採択時）

４．研 究 目 的
多発性硬化症は中枢性の慢性炎症性脱髄性疾患で、視力障害や運動障害等が寛解と再発を繰り返す難病である。機序として髄鞘蛋白に対する自己免疫応答の関与が考えられ、Th2 細胞から Th1 細胞へのシフトが再発に関与していると考えられてきた。現在、この Th1/Th2 バ
ランスに立脚した病態解釈から、再発予防には Interferonβが用いられるが、年間再発率を約30%減少させるにとどまり、使用した約 90%の症例で何らかの副作用を認めており、新たな治療法の開発が望まれる。
申請者はこれまで、血管性認知症の新規モデルラットの開発に取り組み確立した（Kitamura
A et al. Neurobiol Aging 2012）。血管性認知症の半分以上をしめる皮質下血管性認知症は、脳慢性低灌流状態に伴い、ミクログリアの活性化等が誘発され神経炎症が生じ、慢性的に脱髄が進行する疾患である（Pantoni L. Lancet Neurol 2010）。病変の主座や病態機序など、皮質下血管性認知症は多発性硬化症と共通した要素を非常に多く有している。今回、多発性硬化症の治療開発の探求に当たり、申請者が今までたずさわってきた血管性認知症研究の側面から考察し、新たな取り組みを行っていきたいと考えた。
多発性硬化症（MS）の炎症性脱髄性変化は活性化 T 細胞が末梢血から脳内へ移行することから始まる。末梢で抗原提示細胞から刺激を受けた T 細胞が VLA-4 や LFA-1 を強く発現し、血管内皮上に発現した VCAM-1 や ICAM-1 等の分子と結合することで血液脳関門の通過が可能となる。VLA-4 に対するモノクローナル抗体である Natalizumab は強力な MS の再発・進行抑制効果を示したが、免疫能が過度に低下し進行性多巣性白質脳症の発症を認め必ずしも安全な治療法とは言えない。
一方、血管作動性ホルモンであるアドレノ
メデュリン（AM）は血管新生・血管保護等の作用に加え、VCAM-1 や ICAM-1 の発現を抑制する作用が明らかとなった。AM を用い、血管内皮側の接着因子を抑制して活性化 T 細胞の脳内移行を阻害し、MS の新たな治療法－ 61 －

図1

の開発に取り組む（図 1）。
５．研 究 計 画
図 2 の様に実験を施行した。まず、MS のモデル動物である実験的自己免疫性脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)
を C57BL/6J マウスに Myelin oligodendrocyte
glycoprotein (MOG) 35-55 ペプチドを免疫し図2て作成した。具体的には、まず MOG 35-55
peptide (Operson biotechnology) 100mg と結核死菌(Mycobabterium Tuberculosis) (Difco) 1mg を不完
全フロンドアジュバント (Sigma F5506) と共に尾底部に皮下投与し、投与 2 時間後に百日咳
毒素 (List Biological Laboratory) 200ng を腹腔内投与した。そして、二日後、百日咳毒素 200ngを腹腔内に追加投与した（図 3）。
EAE 感作と同時に組換え型ヒト成熟型 AM（6図3匹）または生理食塩水（5 匹）の腹腔内 14 日間持続投与を開始した。具体的には、14 日間の持続投与が可能な浸透圧ポンプ (Alzet Model
1002)（図 4）に 50ng/h 換算量の組換え型ヒト
成熟型 AM または同容量の生理食塩水を充填し、マウスの腹腔内に留置した。そして、経時的に行動解析を施行した。なお、評価には下記の様な、EAE ClinicalScore を使用した。

図4[Clinical Score]0; 正常1; 尾の緊張が一部低下

42; 尾の完全麻痺、歩行異常

33; 下肢の不全対麻痺

24; 下肢の完全対麻痺

15; 麻痺が上肢に及ぶ/瀕死状態

00

7 11 15 17 21 28 35 44 53
Control

６．研 究 成 果
生理食塩水投与群は、感作後 11 日から症状が出現（clinical score 0.2±0.12）し、13 日（0.90±0.10）、16 日（2.6±0.10）、－ 62 －

Adrenomedullin
図5

21 日（2.7±0.20）と急激に増悪した。一方、AM 投与群では、感作後 13 日（0.37±0.16，p<0.05）
から 16 日（1.1±0.30，p<0.05）まで有意な症状の軽減を認めたが、AM 投与終了後、症状は急激に増悪し（21 日 2.6±0.16）有意差は消失した（図 5）（いずれも分散分析法による）。AMによる EAE 抑制効果が明らかになった。
７．研究の考察・反省
今後は、AM の腹腔内投与時間を 14 日から 28 日に延長する。また、投与開始時期も EAEの症状出現が予想される感作後 10 日後に変更して、経時的に行動解析を施行する。そのうえ
で、以下の様な、病理組織学的、末梢血・脾細胞を用いて抗原特異的リンパ球増殖反応、免疫学的解析を経時的に行なう。
【組織学的評価】・脳、脊髄を HE 染色により、基本的形態や細胞浸潤の評価を行う。
・Luxol fast blue 染色により白質の粗鬆化を 4 段階にグレーディングする。また、抗 MBP
抗体、抗 MAG 抗体等を用い、免疫蛍光染色で白質の評価を行う。
・抗 VLA-4 抗体、抗 ICAM-1 抗体を用いて接着因子の発現を評価する。
・抗 Iba-1 抗体、抗 GFAP 抗体を用いて免疫組織化学染色でミクログリア、アストログリアの評価を行う。
【免疫学的解析】末梢血（心臓より採血）と脾細胞を用いて以下の免疫学的解析を行う
・Flow cytometry：（Guo B et al. J Clin Invest 2008）
Th1 細胞の同定：CD4 x CXCR3
Th2 細胞の同定：CD4 x CCR4
Treg 細胞の同定：CD4 x CD25 x CD127 x Foxp3
Th1 機能評価：CD4 x IFN-γ, CD4 x TNF-α
Th2 機能評価：CD4 x IL-4
Th17 機能評価：CD4 x IL-17
・Antigen-specific reaction/cytokine assay：末梢血および脾細胞を MOG 35-55 ペプチドで刺激し、培養上清中の IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-17 等の炎症惹起性サイトカイン、および IL-4,
IL-5, IL-10 等の抗炎症性サイトカインを ELISA により測定する。
そして、AM が MS の新たな治療薬となる可能性を検索する。
８．研 究 発 表
該当なし。

－ 63 －

１．研究課題名：TLR9 シグナルの新規制御分子 Sortilin の機能解析（研究番号S2012-11）

２．キーワード：１）Toll 様受容体（Toll-like receptor）
２）自然免疫（innate immune system）
３）形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell）
３．研究者氏名：和田俊樹・医学部・助教・免疫学

４．研 究 目 的
形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell, pDC）は生体の I 型インターフェロン（interferon, IFN）-α/β産生の大部分を担い、ウイルス感染のみならずさまざまな免疫疾患に関与する免疫担当細胞である。pDC の特徴は、細菌やウイルス由来の非メチル化 CpG-DNAをリガンドとして認識し、I 型 IFN を主体とするサイトカインの産生を誘導する Toll-likereceptor 9（TLR9）を高発現していることである。
我々は、抑制型受容体 PIR-B 欠損（Pirb− /− ）マウスの脾臓 pDC において、CpG-DNA 刺激による IFN-α産生が亢進することを見出した（Mitsuhashi Y et al. Blood 120, 3256-3259 (2012)）。
そこで、pDC における I 型 IFN 産生に関わる新規因子の同定を目的として DNA マイクロア
レイ解析を行った結果、Pirb− /− pDC にて発現量が変動している遺伝子の一つとして Sortilinを見出した。
マクロファージにおいて Sortilin の siRNA によるノックダウンを行ったところ、
CpG-DNA 刺激に依存した IL-10 産生が減少することを見出した。Sortilin と会合する
Progranulin は（Hu F et al. Neuron 68, 654-667 (2010)）、CpG-DNA のキャリア分子として機能することが報告されている（Park B et al. Immunity 34, 505-513 (2011)）。このことから、Sortilin
は Progranulin と CpG-DNA の複合体を TLR9 が局在するエンドソームへ輸送するキャリア分
子としての役割を担っている可能性が推察される。そこで本研究では、DNA マイクロアレイ
解析によって見出した、Sortilin の TLR9 シグナル経路における役割を明らかにすることを目指す。
５．研 究 計 画
本研究では、TLR9 シグナルに関与すると予想される Sortilin の免疫細胞での機能解明を目指すため、以下の実験を行なう。
A．Sortilin の siRNA ノックダウンによるサイトカイン産生量への影響評価
Sortilin の TLR9 シグナルにおける役割を明らかにするため、Sortilin の siRNA ノックダウ
ンがサイトカイン産生に与える影響を、骨髄から分化誘導した pDC で検証する。ノックダウ
ン後の細胞に対して CpG-DNA で刺激を行い、IFN-α、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12 などのサ
イトカイン産生量を qPCR および ELISA で測定する。マクロファージと pDC で Sortilin ノッ
クダウンの影響が異なるかどうかも検討する。

－ 65 －

B．Sortilin と会合する分子の探索
Sortilin は、AP-1 や AP-2 などの小胞輸送アダプター蛋白質と共同して Solute carrier proteinの GLUT4 の細胞内局在を制御する（Willnow TE et al. Curr. Opin. Lipidol. 22, 79-85 (2011)）。
pDC においても Solute carrier protein の Slc15a4 が I 型 IFN 産生に重要である（Blasius AL et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 19973-19978 (2010)）ことから、Sortilin が Slc15a4 の細胞内局在を制御している可能性がある。そこで、Sortilin がマクロファージや pDC において、Slc15a4
及びそのパラログである Slc15a3 に加え、AP-1 や AP-2 など、他の細胞にて会合することが既に知られている分子と会合するか、免疫沈降解析によって検討を行う。CpG-DNA 刺激の有無によって会合状態が変化するかどうかについても検討を行う。
C．トランスクリプトーム解析による I 型 IFN 産生に関わる新規因子の同定
I 型 IFN 産生に関わる新規因子の同定を行なうため、次世代シーケンサーによるトランス
クリプトーム解析を行う。マウス骨髄より pDC を培養し、CpG-DNA の刺激前後の pDC からmRNA を精製する。精製した試料を用いて mRNA-seq を次世代シーケンサーで行い、pDC で発現している全ての mRNA の発現量を定量する。得られたデータ用いて CpG-DNA の刺激前後での mRNA 発現量を比較し、発現変動している遺伝子をリスト化すると同時に、qPCR での発現確認も行う。
６．研 究 成 果
A．Sortilin の siRNA ノックダウンによるサイトカイン産生量への影響評価
B6 マウス及び Pirb− /− マウス由来 pDC より RNA を調整し、DNA マイクロアレイ解析によって発現変動が確認された遺伝子に関して qPCR 解析を行い、DNA マイクロアレイ解析と同様に Pirb− /− にて mRNA 量が変動していることを確認した。並行して、pDC の大量培養を効
率的に行なうため pDC の培養条件を精査し、培養に用いるサイトカイン量や細胞数などの最適化を行った。また、pDC への siRNA 導入条件の検討を行い、ターゲット遺伝子が確実にノックダウンする条件を確立した。
次に、DNA マイクロアレイ解析及び qPCR 解析から Pirb− /− マウスの pDC で発現変動していた遺伝子、Sortilin の siRNA によるノックダウンを行い、CpG-ODN 刺激による IFN-αの産生への影響を、ELISA 及び qPCR 解析によって検討した。結果、ノックダウンによって pDC
での CpG-ODN 刺激に依存した IFN-αの産生が減少することを見出した。一方、qPCR 解析の結果から、CpG-ODN 刺激に依存した IFN-αの mRNA 量の上昇は Sortilin のノックダウン
によって影響されないことが明らかとなった。
B．Sortilin と会合する分子の探索
マウス腹腔より採取したマクロファージを用い、抗 Sortilin 抗体により Sortilin 分子を沈降させ、Slc15a3、Slc15a4 及び AP-2 が共沈降するかをイムノブロットによって解析した。結果、Sortilin と共沈降する分子は確認されなかった。
C．トランスクリプトーム解析による I 型 IFN 産生に関わる新規因子の同定
CpG-ODN 刺激前後の pDC より RNA を調製し、Poly-A 選択的に mRNA を精製した。精製－ 66 －

した mRNA を次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析に供した。その結果、既知の TLR9 シグナル関連遺伝子に加え、新たに発現変動をしている遺伝子も確認された。
７．研究の考察・反省
今回、pDC で Sortilin がノックダウンされると、CpG-ODN 刺激に依存した IFN-αの産生が減少することを見出した。Sortilin ノックダウンによって CpG-ODN 刺激に依存した IFN-αのmRNA 転写活性は変化しないことから、TLR9 による CpG-ODN の認識は Sortilin に依存しないことが示された。以上から、当初想定していた Progranulin を介した TLR9 への非メチル化
DNA の輸送に Sortilin は関与しないことが示された。一方、免疫沈降実験では Sortilin と共沈降する分子を確認することが出来なかった。抗 Sortilin 抗体、抗 Slc15a4 抗体及び抗 AP-2 抗体に関しては市販品を用いたが、抗 Slc15a3 抗体に関しては、市販品が存在しなかった。そのためペプチド抗体を作成したが、本実験に適したものではなかった可能性がある。マクロファージでは、Sortilin が Slc15a4、Slc15a3 及び AP-2 と相互作用していない可能性も考えられるが、免疫沈降実験の条件に関して、細胞の可溶化剤の種類や組成の検討を行っていない
ため、実験条件の精査が今後必要と考えている。
これまでの研究から、Sortilin はその細胞外領域に様々な分子を会合させ、会合した分子を適切な場へと輸送していることが知られている（Willnow TE et al. Curr. Opin. Lipidol. 22, 79-85(2011)）。ごく最近になり、Sortilin が T 細胞において IFN-γと granzyme A の分泌に関与することが報告された（Herda S et al. Immunity 37, 854-866 (2012)）。これらのことから、Sortilin
は pDC において IFN-αを細胞外へと輸送するキャリア分子として機能しており、Sortilin ノ
ックダウンによる pDC での IFN-α産生の減少は、Sortilin による IFN-α分泌が阻害された結果であると推察される。今後は、Sortilin の機能解析に加え、トランスクリプトーム解析によって得られた新規の遺伝子に関する機能解析も試みる予定である。
８．研 究 発 表なし

－ 67 －

１．研究課題名：大学病院精神科病棟での隔離・身体拘束の施行実態および看護介入との関連（研究番号S2012-12）

２．キーワード：１）隔離（seclusion）
２）身体拘束（physical restraint）
３）保護室（seclusion room）
４）看護介入（nursing care）
５）大学病院（university hospitals）
３．研究者氏名：長山豊・看護学部・講師・精神看護学

４．研 究 目 的
精神科病棟における隔離や身体拘束の施行件数は、厚生労働省の調査によると調査開始時（2003 年）から現在にかけて、身体拘束は 1.6 倍、隔離は 1.1 倍になっており増加傾向にある。隔離や身体拘束が増加している背景には、行動制限最小化委員会によるチェック機能の形骸化や、行動制限台帳に基づく横断的なデータを行動制限最小化に有効に活用できていな
いことが影響している可能性がある。国内の精神科急性期病棟 27 施設を対象とした実態調査では、施行期間が隔離は 12.5 日、身体拘束は 13.2 日であり（野田、2009）、欧米が数時間から数日程度であることと比較すると、国内の隔離や身体拘束の施行期間は顕著に長期化している。
大学病院精神科に求められる主要な役割の１つが、様々な身体合併症を抱えた精神疾患患者に対して治療や看護を提供することである。そこで、患者が身体合併症治療を理解できない場合に隔離や身体拘束が実施されることが少なくない。しかし、大学病院精神科を対象とした隔離や身体拘束の施行実態と看護介入との関連を調査した研究はみられなかった。
そこで、本研究では大学病院精神科病棟においての隔離や身体拘束の施行実態を把握し、施行実態と看護介入との関連を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
１）研究デザイン：量的記述的研究、関係探索型研究
２）対象者：平成 23 年 4 月 1 日～平成 24 年 3 月 31 日（観察期間 1 年）に大学病院精神科病棟
2 施設において隔離や身体拘束が実施された患者 90 名
３）データ収集：対象者の診療記録、看護記録、行動制限一覧性台帳より、下記の情報を収集した。
(1)隔離や身体拘束の施行実態に関する情報保護室使用日数（隔離と身体拘束を統合した日数）、隔離や身体拘束の施行日数・施行時
間、開放観察（隔離や身体拘束の中断）の時間を算出した。日数は隔離や身体拘束の開始時点で 1 日とカウントし、午前 0 時を過ぎた時点で日数を加算した。

－ 69 －

(2)隔離や身体拘束の施行目的、主病名（ICD-10 国際疾病分類 10 版（International Statistical
Classification of Diseases and Related Health Problems, 10th Revision）を基準に分類）(3)看護介入：看護介入分類（NIC）原書第 5 版（Nursing Interventions Classification (NIC), 5thedition）を基準に分類した。日勤帯（9 時～19 時）と夜勤帯（19 時～翌日 9 時）に分けて看護介入内容を抽出し、看護介入分類（以下、NIC とする）の介入ラベル、その下位項目である行動ラベルを割り振った。なお、看護介入は病棟内での定例業務は除外し、対象者の個別性に基づいた看護介入に絞って抽出した。1 勤務帯の中で NIC に該当する
看護介入が確認できた場合に 1 行為としてカウントした。
（1 勤務帯に同じ看護介入が複数みられたとしても 1 行為としてカウントした。）最終的に、データ内で確認できた介入ラベルの特性を踏まえて、「行動制限関連ケア」「精神看護ケア」「身体合併症ケア」「日
常生活ケア」の 4 つのカテゴリーに分類した。また、対象施設の看護介入の特性に応じて行動ラベルを一部修正した。
４）データ分析：下記 3 点について統計解析ソフト SPSS version22.0 を用いて分析した。なお、有意水準は 5％未満とした。
(1)施行目的による保護室使用延べ日数、隔離や身体拘束の施行時間に差があるか、
Kruskal-Wallis 検定を用いて検証した。主病名による比較においては一元配置分散分析を用いて検定した後に、Bonferroni の多重比較で因子間の差を検証した。
(2)隔離や身体拘束の施行時間と看護介入の 4 つのカテゴリーとの関連について、Spearmanの順位相関係数を用いて検証した。
５）倫理的配慮：研究対象施設の精神科外来・病棟にて、研究目的・方法・個人情報保護の方
法、倫理的配慮、研究者の連絡先を明記したものを掲示した。研究対象者より調査協力の撤回の希望があった場合は、データより除外することを明記した。
６．研 究 成 果
１）隔離や身体拘束の施行実態
対象者 90 名の行動制限の内訳は、隔離が 44 名（48.9%）、身体拘束が 18 名（18%）
、隔離と身体拘束の両方が 28 名（31.1%）であった。保護室使用延べ日数は 1387 日（平均 15.4
±17.4（標準偏差）日）であった。隔離延べ日数は 792 日（平均 11.2±11.5 日）、隔離延べ時間は 16911 時間（平均 238.18±265.3 時間）であった。身体拘束延べ日数は 611 日（平均13.0±18.0 日）、身体拘束延べ時間は 13818 時間（平均 294.0±435.2 時間）であった。保護室使用延べ日数における各行動制限の割合は、隔離が 57.1％、身体拘束が 44％であった。
開放観察は 58 名（64.4％）に実施され、開放観察延べ時間は 3548 時間（平均 60.1±116.3
時間）であった。隔離と身体拘束を合算した延べ時間のうち、開放観察延べ時間が占める
割合は 11.5％であった。
２）隔離や身体拘束の施行目的、主病名
主な隔離目的は「顕著な不穏・興奮」34 名、「他害行為・迷惑行為」15 名であり、あわせて 68.2％を占めた。主な身体拘束目的では「顕著な不穏・興奮」16 名、「身体合併症の－ 70 －

治療や検査の理解困難」15 名、「自傷・自殺企図」9 名であり、あわせて 87.0%を占めた。
主病名は、統合失調症 25 名（27.8%）、認知症や器質性精神病 24 名（26.7%）、気分障害
20 名（22.2%）であった。
３）看護介入の実態
看護介入の総数は 4133 行為であった。内訳は「身体合併症ケア」104 種類 1526 行為（36.9%）、「精神看護ケア」70 種類 1000 行為（24.2%）、「行動制限関連ケア」29 種類 879
行為（21.3%）、「日常生活ケア」31 種類 728 行為（17.6%）であった。
４）施行目的・主病名による隔離および身体拘束の施行期間の差施行目的による隔離および身体拘束の施行期間の差はみられなかった。また、主要疾患である統合失調症、気分障害、認知症の 3 群による施行期間の差を比較した。その結果、保護室使用延べ日数（p=0.02）との間で有意な差がみられ、多重比較を行うと、統合失調症が気分障害よりも保護室使用延べ日数が有意に長かった（p=0.02）。
５）隔離や身体拘束の施行時間と看護介入との関連
隔離延べ時間との間では、「精神看護ケア」（ρ=0.55、p＜0.01）が正の相関、
「日常生活
ケア」
（ρ=0.31、p=0.01）と「行動制限関連ケア」（ρ=0.27、p=0.02）が弱い正の相関を認めた。身体拘束延べ時間との間では、「身体合併症ケア」（ρ=0.76、p＜0.01）が強い正の相関、「行動制限関連ケア」（ρ=0.68、p＜0.01）、「精神看護ケア」（ρ=0.58、p＜0.01）と「日常生活ケア」（ρ=0.59、p＜0.01）が正の相関を認めた。
７．研究の考察・反省
隔離と身体拘束の施行期間と看護介入との関連において特徴的な違いがみられた。隔離で「精神看護ケア」との間に相関が認められた背景には、患者が積極的な身体合併症治療を必要としない段階となり、看護師は症状管理に関するセルフマネジメント技能や社会適応能力を促進させる看護介入に移行していたことが予想される。身体拘束では、全ての看護介入カ
テゴリーと相関がみられており、看護師は精神症状が不安定な患者に対して、多角的なアプ
ローチを通して身体機能の改善、精神症状の回復に努めていることが考えられる。今後の課題として、多施設調査を継続し、保護室使用患者の特性に応じた看護介入を明確化・精緻化することが求められる。
８．研 究 発 表
現在、論文投稿の準備中である。

－ 71 －

１．研究課題名：透析維持期にある 2 型糖尿病患者が家族に思いを抱くという体験（研究番号S2012-13）
２．キーワード：１）2 型糖尿病（2 type diabetes）
２）透析維持期（sustain dialysis）
３）家族（family）
４）現象学（phenomenology）
３．研究者氏名：岡山未来・看護学部・助教・基礎看護学

４．研 究 目 的
透析維持期にある 2 型糖尿病患者の「家族に思いを抱く」体験の存在を確認し、体験の意
味について明らかにするため、患者から家族に対する思いを聴き、その思いを記述することである。
５．研 究 計 画
・研究デザイン；質的因子探索研究とし、現象学的アプローチを選択する。
・対象者；透析導入され 3 年を経過した 2 型糖尿病患者。10 名程度を予定する。
ただし、10 名のデータ分析後、体験について理解が不十分と判断された場合、人数を増やし、データ収集を継続する。
・データ収集；１）現象学的態度による非構造化面接を実施する。面接内容を録音し、逐語録に起こす。
２）参加者の基礎情報については、カルテを閲覧する。
・データ分析；１）逐語録については、Gorgi の提示した方法に従って行う（下記参照）。
①全体の意味を捉えるため、逐語録を繰り返し丁寧に読む。
②患者の周囲の人々に対する思いについての記述を抜き出し、さらに思いの移り変わりを明確にする。
③同じ状況について語られている部分をまとめて一つの意味単位とし、前後の文脈の流れや全体の意味と関連づけどのような意味を持つのか記述する。
さらに、研究者の受けた印象をまとめる。
④各参加者の記述から共通する意味単位を取り出し、特徴付ける参加者の言葉で表す。
⑤参加者の言葉を抽象化して、中心的なテーマを見出す。
２）基礎情報は、参加者の背景として、表にする。
・真実性の確保；糖尿病看護に長年携わり、なおかつ質的研究の専門家 2 名にスーパーバイズを受ける。
・倫理的配慮；金沢医科大学倫理審査委員会の承認を得て実施する。

－ 73 －

６．研 究 成 果
4 名に面接を依頼し、うち 2 名の承諾を得ることができた。面接では、家族のみならず、
医療者や友人といった「周囲の人々」に対する思いが語られた。そのため、「家族」から「周囲の人々」まで範囲を拡大して、面接を進めることとした。
2 名の面接を終了した段階で、一旦分析を行った。結果、2 名という参加者数ではあったが、４つの共通するテーマを導くことができた（下記参照）。
テーマ 1

透析を受けている自分の状態、又は出来事を支えてくれた人々に、自分が生き延びてこられたことを感謝し、今の自分に出来る限りの恩返しをしたい

テーマ 2

頼ることの出来る人がいることに、そっと安堵する

テーマ 3

年々衰える身体を自覚しながら、周囲の中で役割を果たす自分を拠り所にして今
日を生きる

テーマ 4

自分が成し遂げたいことのために、今、どうしてもこの身体が必要である

７．研究の考察・反省
周囲の人に対する感謝と恩返し、サポートの存在、自分の果たす役割といった、成し遂げたい事柄について、患者自身の中で焦点化することにより、患者は、身体を長らえさせたいという目標を持つことが出来ていた。その目標に沿った医療者の関わりが重要であるという示唆が得られた。
今後は、参加者の条件を広げ面接人数を増やし、本結果を精選し、確立していく必要がある。
８．研 究 発 表
今後、第 1 報として論文を作成する予定である。

※

第 18 回日本糖尿病教育・看護学会（2013 年 9 月, 横浜）にて優秀賞受賞。
岡山未来, 稲垣美智子, 多崎恵子 「透析導入後 3 年経過した 2 型糖尿病患者の周囲の人々に対する思い」－ 74 －

2012

平成 24 年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書編 集
発行所

平成 26 年 10 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

禁無断転載