博 士 （ 医 学 ） 増 田孝 裕
学 位 論 文 題 名

抗うつ薬、ノルアドレナリン、セロトニンが成体海馬歯状回由来神経前駆細胞に及ぼす影響についての研究
学位論文内容の要旨【背景と目的 】
現 在 、 う つ 病 の 治 療 は 、 セ 口 ト ニ ン (5‑HT)や ノ ル ア ド レ ナ リ ン (NA)と いっ た モノ アミン を 増 加 さ せ る 薬 剤 （ 選 択 的 5‑HT再 取 り 込 み 阻 害 薬 、 5‑HT/NA再 取 り 込 み 阻 害 薬 な ど ）に よ る 薬 物 療 法 が 中心 と なっ てい る。 これ ら 抗う つ薬 は投 与 して から 数時 間以 内 に脳 内の5‑HT、 NAを 増 加 さ せ る こ と が 動 物 実 験 で 示 さ れ て い る が 、 臨 床 で の 治療 効果 発 現ま でには 数 週 間 の 慢 性 投 与が 必 要で ある 。従 って 、 抗う つ薬 によ る 治療 メカ ニズ ムと し てモ ノアミ ン 増 加 だ け で は 説明 が 難し く、 他の メカ ニ ズム が注 目さ れ てき てい る。 近年 、 成体 の脳に おし ゝて も海 馬 歯状 回(DG)で は、 神 経幹 ・前 駆細 胞が 存在し 、それらが増殖、分化すること に よ り 神 経 細 胞 が新 生 され るこ とが 明ら か にさ れて いる 。 臨床 にお ける 抗う つ 薬に よるう つ 病 の 症 状 改 善 の 時 間 経 過 と 類 似 し て 抗 う つ 薬 を 動 物 に 慢 性 投 与 する とDGの 神経 幹・
前 駆 細 胞 の 増 殖 は 促進 さ れる 。逆 にう つ病 発 症の 危険 因子 と 考え られ るス トレ ス を負 荷す
る こ と に よ っ て DGの 神 経 幹 ・ 前 駆 細 胞 の 増 殖 は 抑 制 さ れ る 。 さ ら に は海 馬神 経 新生 を阻害 し た 動 物 を 用 い ると 抗 うつ 薬に よる 抗う つ 様作 用が 消失 す るこ とな どが 報告 さ れて いる
こ と か ら 、 抗 う つ 薬の 治 療メ カニ ズム の新 し い仮 説と して 海 馬神 経新 生促 進仮 説 が提 唱され 、 注 目 を 集 め て いる 。 抗う つ薬 が海 馬神 経 新生 を増 やす メ カニ ズム につ いて は 、神 経栄
養 因 子 発 現 誘 導 な どを 介 した 間接 的な 作用 の 可能 性が 示唆 さ れて いる が、 ほと ん ど明 らかに な っ て い な い 。 本研 究 では 、抗 うつ 薬の 海 馬神 経新 生増 加 のメ カニ ズム を明 ら かに する
た め に 、 抗 う つ 薬 、 NA、 5‑HTが 成 体 ラ ッ ト DG由 来 神 経 前 駆 細 胞 の 増 殖 、 分 化 、 ア ポ トーシスに及ぽ す影響について検討した。
【方法と結果 】
まず 成体 ラッ ト 海馬 歯状 回由 来の 神経前駆細胞(Adult rat Dentate gyrus‑derived neuralPrecursor cell， ADP)の 培 養 系 を 確 立 し た。 8週 齢の 雄性 SDラッ トの DGを 切り 出 し、 酵素処 理し て細 胞を 単 離し た。 その 後、 Percoll溶 液を 用い た密 度勾 配 遠心 法に より 目的各分を分 取 し 、 単 層 培 養 法に て 培養 した 。培 地は B27 supplyment bFGFを含 むneurobasal培 地を用い無血清下 で、poly L‑ornithine‑lami
nin coatin
g dishで培養した。増殖してきた細胞における 特 異 的 マ ー カ ー の発 現 を免 疫螢 光抗 体法 で 検討 した とこ ろ 、神 経幹 ・前 駆細 胞 のマ ーカ
ー で あ る Nestin、 GFAP、 SOX2陽 性 で あ り 、 immature neuronマ ー カ ー で あ る DCX、 Proxl
陰 性 で あ っ た 。 ま た 、 増 殖 細 胞 の マ ー カ ー で あ る BrdU陽 性 で あ る こ とも 確認 さ れた が、細 胞 を 長 期 間 培 養 する と 増殖 能が 低下 する こ とか ら増 殖能 は 限定 的な もの であ っ た。 さらに 、 分 化 誘 導 因 子 であ る レチ ノイ ン酸 存在 下 で細 胞を 培養 す ると 、二 ユー 口ン の マー カー
で あ る Tujl陽 性 細 胞 、 ア ス ト 口 サ イ ト の マ ー カ ー で あ る GFAP陽 性 細 胞、 また ご く少 数では あ る が オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の マ ー カ ー で あ る 04陽 性 細 胞 が 検 出 され たこ と から 分化
能 も 認 め ら れ た 。 従っ て 、神 経幹 ・前 駆細 胞 の特 徴を 有し て いる こと が確 認さ れ た。 そこー 433−

で 、zn vrvoでDGの神経新生を促進すること が報告されている4種の抗う つ薬(5‑HT
再取り込み阻害薬フルオキセ チン、三環系抗うつ薬イミプラミン、NA再取り込み阻害薬レボ
キ セチ ン、 モノ アミ ン酸 化酵 素阻 害薬 トラ ニル シ プ口 ミン ）及びNA、5‑HTがADPの増殖、二ユー口ン分化、アポトーシスに及ぽす影響について検討した。増殖作用はAlamarB
lueassay
法を用いて評価した。二ユーロン分化はレチノイン酸により分化誘導されるニュー口ン(Tu1陽性 細胞 ）を 、ア ポト ーシ スは スタ ウロ ス ポリ ンに より誘導さ れるTUN
EL
陽性細胞を免疫染色にて検出 、カウントし、陽性率の変化を指標に評価した。その結果、4種の抗うつ薬、5―H
TはA
DPの増殖、ニューロン分化、アポトーシスのいずれに対しても影響 を及 ぽさなか った。一方、NAはADPのニュ ーロン分化、アポトーシスには影響を及ぽさ なか った が、 A
DP増 殖を 有意 に促 進した。NAのAD
P増殖促進作用ヌカニズムを検討するために、RT‐PCR法を用いてADPにおけるアドレナリン受容体（AR）サプタイプのmR
NA
発 現を 検討 した とこ ろ、 a1A丶 a1B丶aかa2c、p1及びp2‐ARのmRNA発現が確認された。
NAのADP
増 殖促進作用は、プラゾシン（Q1一A
R非選択的アンタゴニスト）、ヨヒンピン（眦―AR非選択的アンタゴニスト）によっては拮抗されず、プロプラノロール（B―AR非選択的アンタゴニスト）により拮抗されたことから、p‐ARが関与していると考えられた。さら に 、 NAの AD
P増 殖促 進作 用は CG
P20712A（p1一AR選択 的ア ンタ ゴこ スト ）に よっ ては拮抗されず、ICI・118，551（B2一AR選択的アンタゴニスト）によって拮抗された。またサルメテロール（p2イ瓜選 択的アゴニスト）刺激によってもADP増殖の促進が認められたこと か ら 、 NAの ADP増 殖 促 進 作 用 は p2￣ ARを 介 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。
【考察】
DG
における神経幹・前 駆細胞は、形態、特異的マーカーの発現、増殖能などの特徴か
ら現在4つのステージに分類されているが、ADPはその特徴からtype￣2acenに近いearlyprogenitorcellに相当す ると考えられた。血vfv
D研究により、NAがDGの神経幹・前駆細胞の増殖に関与している ことは報告されている。今回の結果によりNA
はB2・ARを介してearlyprogenitorcellの増殖を促進している可能性が初めて示された。従って、抗うつ薬の海馬神経新生促進作用のメカニズムとして、抗うつ薬が直接的に神経前駆細胞に作用するのではなく、脳内NA濃度を 増加させ、神経前駆細胞上のB2一AR刺激を介した神経前駆細胞の増殖促進作用が一部関 与している可能性が示唆された。一方、5‐HTはNAと異なりADPに対する作用が認められなかったことから、神経前駆細胞には直接作用せずに周辺の成熟神経細胞などに作用して神経栄養因子などの発現を誘導して神経新生を間接的に促進する作用が主流なメカニズムなのかもしれない。
これまでに、DGの神経幹・前駆細胞増殖制御におけるp2‐ARの関与についての検討は、mvんD
ではなされていないことから、今後めv
んDでの検討が必要であると思われる。また、
ADPはB21AR刺激により増 殖促進されたが、その下流の作用メカニズムを明らかにすることにより、抗うつ薬による海馬神経新生促進のメカニズムがより明らかになると共に新規抗うつ薬のターゲット分子発見に繋がることも期待される。
【結論】
抗うつ薬は、脳内NA濃 度を増加させ、海馬歯状回のeadyprogenitorce
11s上のp21ARを刺激してeadyprogenitorcellsを増殖促進させることによって海馬神経新生を促進させている可能性が示唆された。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 藤 田 博 美
副 査 教 授 森 本 裕 二
副 査 教 授 渡 邉 雅 彦
副 査 教 授谷 温神之副 査 教 授
山小司

学 位 論 文 題 名

抗うつ薬、ノルアドレナリン、セロトニンが成体海馬歯状回由来神経前駆細胞に及ぼす影響についての研究
うつ病 治療には ノルアドレナリン(NA)やセロトニン(5‑HT)を増加させる薬剤が使用されており、これら抗うつ薬による治療メカニズムに成体海馬歯状回における神経細胞新生の関与が 示唆さ れている。本論文では、抗うつ薬、5‑HT、NAが成体海馬歯状回の神経前駆細胞に及ぽす直接作用を明らかにすることを目的に、成体ラット海馬歯状回由来神経前駆細胞(ADP)の培 養系を確立し、ear
lyprogenitorc
ellの特徴を有することを明らかにした 。 ま た、 ADPの 増殖、分 化、アポ トーシ スに対す る種々 抗うつ薬 、NA、5‑HTが及ぼす 影 響 につ い て 検討 を 行 い 、NAが ロ2レ セプタ ーを介 してADPの増殖を 促進す ることを見出した。
森本教授との質疑応答では、海馬の神経新生増加がどのようにしてうつ病改善に結びっくのか？に対し、海馬は情動を司る扁桃体などとネットワーク形成をしていることなどから新たな神経ネットワーク構築を介してうつ症状改善にっながっている可能性があると回答し、海馬神経新生を増やすことで認知症治療には期待できないのか？に対しては、新生された神経が記憶に関与することも報告されていることから認知症治療に対しても期待できるかも しれな いと回答 した。 渡邊教授 との質 疑応答では、ADP増殖促進作用を示した
N
A濃度は 生理的に 妥当な濃度なのか？に対し、海馬スライスの電気生理実験では数十脚のNAが必 要である ことから 、シナ プス間隙 中では 今回用い た高濃 度のNAが存在しうると考えて いると 回答した 。cAMP‑CRE
Bリン酸 化のシグナル伝達経路の活性化は神経前駆細胞でも 認めら れるのか ？に対 しては、 in vivo
研究では、Br（lU陽性細胞ではCREB
リン酸化が認められていないことから神経前駆細胞ではこのシグナル伝達経路の活性化が起きていないのかもしれないと回答した。では、ロ2レセプター刺激によってどのようなシグナル伝 達経路 が活性化されているのか？に対しては、MAPKの活性化もひとつの候補であると回答した。神谷教授との質疑応答では、1回のパーコール分離操作では目的外の細胞カゞ増殖してくることは無いのか？に対しては、無血清条件下という厳しい培養条件なので他の細 胞が増 殖してく ること は比較的 少ない が、ホモジニアスなADPを得られる確率‑ 435―

は2‑3回に1回である 。そのため毎回、免疫染色にてその純度を確認してから実験に使用し てい ると 回答した。ADPと異なるタイ プの神経幹・前駆細胞に対しては5‑HTは作用を示すのか？に対して は、stemlikecellに対して5‑HTは増殖促進作用を示すといった報告があると回答した。 小山教授との質疑応答では、一昔前の研究である抗うつ薬投与によるロ レセ プタ ーの脱感作はどのロサブタイプであるのか？に対して、 大脳皮質のロ1レセ
プ ター に対 する報告が多いと回答し、ロ2作動薬による抗うつ作用の臨床報告はないのか？に対しては、古 くに報告があり、その作用オンセットが三環系抗うつ薬に比ベ早いことが示されていると 回答した。Brd
Uをイメージングすることによって患者脳で神経新生を検出できないのか ？に対しては、BrdUの検出は死後脳でないと難しいが、瓜m，Iなどで神経幹前駆細胞を検 出できるという報告もあるので可能であると思うと回答した。藤田教授との質疑応答では 、神経系でのストレス応答は何か細胞内の分子レベルでわかっているのかcに対しては、グルココルチコイドなどによって神経新生が抑制されるという程度のことしかわかってお らず、細胞内の分子レベルに関しては不明であると回答し、低酸素条件で培養を検討した ことがないのかマに対しては、低酸素条件における神経前駆細胞の培養の報告がないこと から試したことがないが興味深いので今後の検討課題としたいと回答した。In v
ivoでの神経新生に薬剤の慢性投与が必要なのに比ベ、invi
troでのNA
処置期間 が3日間 では整合性があわないのでな いか？に対してはm v
rvoでは薬物動態面の影響が あり 、脳 内で常にNAが増加しているわけではないと考えられるが 、in vi
troでは3日間常時高濃度のNAに 晒されているために、短い処置時間で反応するのではないかと考えていると回答した。
この論文は、新た な神経前駆細胞の培養系を確立し、神経前駆細胞の増殖、分化、アポトーシスに対して抗 うつ薬、NA、5‑HTが及ぼす影響について検討することにより、非常に興味深い知見を見 いだしたことで高く評価され、今後、抗うつ薬の作用機序の解明や新た な 抗 うつ 薬 の 標 的 の 発 見 な ど に 対 し て 更 な る 研 究 の 発 展 が 期 待さ れ る 。
審査員一同は、こ れらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 けるのに十分な資格を有するものと判定した。

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