ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程

一般社団法人 日本病理学会
The Japanese Society of Pathology

ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程

初版作成担当日本病理学会 ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程策定ワーキンググループ

委員長

小田 義直

委員 畑中 豊，桑田 健，森井 英一，金井 弥栄，落合 淳志

本規程策定にあたって
近年，悪性腫瘍の病理組織・細胞検体を用いた体細胞遺伝子検査は急増しており，今後は次世代シー
クエンサー等の新規技術を用いたゲノム診断（遺伝子パネル検査）の臨床導入が見込まれている．一般社
団法人日本病理学会（以下，本学会）では，ゲノム等オミックス研究に適した質の高い病理組織検体を全国のバイオバンク等で収集できることを目指して『ゲノム研究用病理組織検体取扱い規程』（以下，研究用規程）を2016 年 3月に策定し，我が国の病理医・臨床医・臨床検査技師・バイオバンク実務者における病理組
織検体の取扱い指針を示した．これに続き本学会では，ゲノム診断検討委員会および医療業務委員会の連携のもとワーキンググループを設置し，今後日常診療下での実施が想定されるがんゲノム診断での使用に耐えうる病理組織・細胞検体に関する『ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程』（以下，診療用規程）を策定することとした．
本診療用規程では，ゲノム診断で要求される病理組織・細胞検体のうち，とくに最も利用が見込まれ，検体の取り扱い方法により検体の品質差が生じやすいホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed,
paraffin-embedded; FFPE）検体の適切な作製・保管方法について示した．本診療用規程が，がんゲノ
ム医療中核拠点病院や連携拠点病院をはじめとする実際の診療にゲノム情報を用いる医療機関のみならず，日常業務下で作製される病理検体が今後のゲノム診断に供される可能性のあるすべての医療機関の病
理医や病理技師，さらには検体採取にかかわる臨床医を対象とした実用の書となるよう心がけた．なお「ゲノム診療」の対象範囲については，今後の技術革新や知見の集積，ゲノム診療環境の整備状況等を踏まえ刻々と変化していくことが想定されるが，現時点では，医薬品の投与可否判定等の診断に用いられることを重視し，「コンパニオン診断薬等に該当する体外診断用医薬品の製造販売承認申請に際し留意すべき事
1
項について」，もしくは「遺伝子検査システムに用いるDNAシークエンサー等を製造販売する際の取扱い
2について」に基づき薬事承認され，保険診療下ですでに実施されている製品（体外診断用医薬品および医3療機器），もしくは「がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会 報告書」
で示された制度設計のなかで，今後承認および保険診療下での実施が想定される製品で適用可能となる検体品質と位置付けている．本診療用規程の初版では，現在臨床研究等で用いられている高い網羅性を有する遺伝子パネル解析やエクソー
ム解析等で要求される検体品質については副次的な取扱いとしたが，今後薬事承認および保険適用等の状況を踏まえ，適時改訂・更新を行う必要があると考える．本診療用規程では，その根拠となる実証デー
タを合わせて呈示した．当該データの取得にあたっては，当学会において実施した検討のほか，複数の公的研究プロジェクト（研究班）および複数のゲノム診断関連企業の協力を得て行った．

1 コンパニオン診断薬等に該当する体外診断用医薬品の製造販売承認申請に際し留意すべき事項について（平成 26 年 2 月19日付

厚労省課長通知：https://www.pmda.go.jp/files/000159090.pdf）
2 遺伝子検査システムに用いるDNA シークエンサー等を製造販売する際の取扱いについて（平成 28 年 4月28日付厚労省課長通知：https://www.pmda.go.jp/files/000213137.pdf）
報告書（http://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10901000-KenkoukyokuSoumuka/0000166310.pdf）

3 がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会

本診療用規程は，日本病理学会およびその他関連学会が行うがんゲノム診療従事者向け教育・研修プ
ログラムでの教育ツールとしても利用される予定である．本診療用規程が，今後本格的にゲノム診断を用いた病理診断および日常業務の一助となることを期待する．

平成 30 年 3月1日

一 般社団法人日本病 理学会
理事長

深山 正久

ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程
ワーキンググループ委員長

小田 義直

目

次

1. 診療における病理組織･細胞検体の現状… ……………………………………………………………… 1

2. ホルマリン固定パラフィン包埋組織･細胞検体の適切な取扱い… …………………………………… 3
2.1 プレアナリシス段階… ………………………………………………………………………………… 4a）固定前プロセス………………………………………………………………………………………… 4b）固定プロセス…………………………………………………………………………………………… 5c）固定後プロセス………………………………………………………………………………………… 7
2.2 アナリシス段階… ……………………………………………………………………………………… 8a）FFPEブロックの選択と薄切およびHE染色標本へのマーキング… ……………………………… 8b）FFPE検体からの核酸抽出… …………………………………………………………………………10

3. 検体取扱いに関する実証データ……………………………………………………………………………13

4. 参考資料………………………………………………………………………………………………………39

補遺………………………………………………………………………………………………………………42

01

診療における病理組織･細胞検体の現状
01

日常の病理組織診断では，生検もしくは手術等により採取・切除された組織の FFPE 検体や新鮮凍結
診療における病理組織 細･胞検体の現状検体等が主として用いられるが，その大部分を前者が占め，形態診断に加え，生体分子の検索を目的とした分子診断に供される．また細胞診断を目的に採取された細胞検体のうち，穿刺吸引や体腔液採取などによって得られた一部の細胞検体からも，FFPE 検体（セルブロック）の作製が行われており，平成 28 年の診療報酬改定において当該標本作製が算定可能となったことを背景に，近年その利用が高まっている．こうした組織・細胞の FFPE 化は，室温下における長期保管や繰り返しの検索を可能にし，さらには様々な技術開発により，最近では網羅的な分子解析が可能となったことから，診療のみならず，研究における利用が加速している．研究利用においては，FFPE 化による核酸やタンパク等の生体分子の変性を最小限にとどめ，新鮮検体により近づけた検体作製が望まれるが，このような研究利用までを意識した検体の取り扱いは多くの医療機関で困難と考えられてきた．しかしながら次世代シークエンシング法（next-generation
sequencing; NGSもしくは massively parallel sequencing; MPS，以下 NGS）などの新規技術の臨床導入を目前に控え，今後診療を目的として作製されるすべての FFPE 検体に対し，これら技術を用いたゲノム診断での利用に耐えうる一定水準以上の品質が求められるようになり，対応が急務となっている．
FFPE 検体を用いた分子診断のプレアナリシス段階では，多数の影響因子が知られており，各施設におけるこれらの情報（条件）の把握は検体を採取・提出する臨床医，標本作製担当者およびその管理者においては不可欠といえる（表1）．このうち固定プロセスで用いられるホルマリンは，核酸やタンパクに化学的および物理的修飾を引き起こし，検体品質にきわめて大きな影響を与えることが広く知られており，これま
でにも肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌における治療効果予測検査（いわゆるコンパニオン診断）関連のガイド
ラインやガイダンスなどにおいて，固定プロセスに関する推奨が示されている．また固定前プロセスの管理，
特に臓器の摘出後から固定までの時間（冷虚血時間 ; cold ischemic time）は，生体分子の不可逆的変化を最小化するうえで極めて重要であり，このプロセスが不適切な場合は，作業手順の見直しにより大きな改善が期待できる．
表1

FFPE 検体を用いた分子診断のプレアナリシス段階における主な影響因子

プレアナリシス
段階の工程

工程の主な
責任・担当者

固定前プロセス・血流停止から摘出までの時間（温虚血時間 ; warm ischemic time）
臨床医・摘出から固定までの時間（冷虚血時間 ; cold ischemic time）（検体採取医）・組織の大きさ影 響 因 子固定プロセス

病理医
病理技師

・ホルマリン固定液の組成や濃度，pH・ホルマリン固定の時間や温度・ホルマリン固定時の固定液容量と組織量の比率
・固定液の組織浸透法（浸漬，注入，マイクロウェーブ加速など）

固定後プロセス

病理医
病理技師

・組織プロセッサーのタイプおよび機器試薬の交換頻度
・脱水・透徹条件（試薬の種類，温度，時間など）
・パラフィン浸透条件（パラフィンの種類，温度，時間など）

1

診療を念頭においた遺伝子パネル解析におけるFFPE 検体の利用は，複数の国内の臨床研究プロジェクトで進んでいる．大規模ゲノムスクリーニング研究プロジェクト（SCRUM-Japanプロジェクト）では，消化器がんを対象としたGI-SCREEN 試験において日常診療下で作製された 2000 例以上の FFPE 検体が解析に用いられている．このプロジェクトでは，参加 20 施設からFFPE 検体が提出されているが，検体品質には施設間差が認められており実証データ①，FFPE 検体の品質の現状に関する重要なデータが得られている．
また国立がん研究センターにおいて行われている，標準治療を終了したがん患者を主な対象とした約100
遺伝子の遺伝子パネル検査（NCC オンコパネル検査）を行う臨床研究プロジェクト（TOP-GEARプロジェクト）では，200 例以上の多がん種の FFPE 検体が用いられている．このプロジェクトでは DNA 品質に関する指標を確立するなど実証データ②，FFPE 検体を使用した遺伝子パネル検査の国際基準準拠下での院内実施の検証等が行われている．
2017年には厚生労働省主導のがんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会が立ち上げられ，当該医療の推進に必要な薬事承認や保険適用等の制度設計が議論されており，2017年 7月時点において表 2のような整理・区分が示されている．このうち保険診療下で遺伝子パネル検査の実施が想定されている区分では，病理部門を有する医療機関に対し，NGS 等の新規技術での使用に耐えうる検体作製が求められることが予想される．上述の GI-SCREEN 試験では，こうした区分に該当すると考えられる小型および比較的網羅性の高い遺伝子パネルが使用されており，現行のルーチン検体の品質と遺伝子パネルのサイズとの関係を理解するうえで参考となる実証データ①．
分子診断を高い精度で行うためには，検査の成否を左右する検体の品質管理は極めて重要である．治療選択に直結しているコンパニオン診断において，不適切な処理が行われた検体の使用が原因で検査が実施できない，あるいは誤った結果がもたらされた場合は，患者の治療機会の損失につながり，大きな不利益を被ることとなる．多遺伝子の検査情報を保証しなければならないゲノム診断（遺伝子パネル検査）においては複数遺伝子を対象とするため，その結果の質を保証するためには，現行の単一遺伝子検査以上に，より厳格な検体の品質管理が求められることに十分留意しなければならない．2017年10月に日本臨床腫
瘍学会，日本癌治療学会，日本癌学会の三学会合同で発刊された「次世代シークエンサー等を用いた遺伝子パネル検査に基づくがん診療ガイダンス（第1.0 版）」においても，適切に品質管理された検体の使用が言及されており，本診療用規程を参考にすることが明記されている文献1．
表2

本邦において今後想定されるNGSを用いたゲノム診療の臨床導入当初の形態 *ゲノム関連検査の種類

実施主体

診療制度

薬事的に確立した検査項目のみ（コンパニオン診断薬）

各医療機関・衛生検査所にて実施

医学的に意義がある遺伝子のパネル検査（承認された医薬品のない
遺伝子を含む）（NGS パネル）

一定の要件を満たす医療機関を指 （必要に応じて先進医療の実施を経定（がんゲノム拠点（仮））て）薬事承認し，保険診療可とする

全ゲノムシークエンス・免疫関連検査等

一定の要件を満たす医療機関での実施

薬事承認・保険診療先進医療を活用した保険外併用療養
で対応

*：本表は
「がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会」
資料を一部改変し作成（http://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10901000-Kenkoukyoku-Soumuka/0000162155.pdf）．

2

02

ホルマリン固定パラフィン包埋組織･細胞
検体の適切な取扱い

本診療用規程では，主としてがんゲノム診断の今後の臨床導入への速やかな対応を目指し，最も利用が見込まれ，臨床研究を積極的に行う先端的医療機関のみならず，診療を専らとする一般医療機関においても要求されうる検体品質を保持した FFPE 検体の適切かつ標準的な取扱い方法（プレアナリシス段階）を以下に定める．またゲノム診断に供するFFPEブロックの選択方法や薄切方法などのアナリシス段階の一部

02の作業プロセスについてもあわせて解説する．

ホルマリン固定パラフィン包埋組織
細胞検体の適切な取扱い

FFPE 検体では，形態診断に影響を及ぼさず，また免疫組織化学法による分子診断（とくにコンパニオン診断）で推奨される検体作製が同時に求められるため，固定時間の際立った短縮化は困難であり，固定による核酸やタンパクの一定の変性は不可避となる．FFPE 検体は，血液等の液状検体に比べかなり多くの工程と時間を経て作製されるため，病理技術・診断業務のリソースに限りのある医療機関においては，
僅かな作業改善においても大きな負担となる可能性があるが，可能な限り本診療用規程の推奨に準じた対応を求めたい．
本診療用規程は，先行策定された研究用規程に加え，後述の実証データや文献情報等に基づき，以･下の凡例に従い推奨するものであり，「診療ガイドライン」等に見るような EBM に基づいた推奨グレードは挙げていない．推奨については，日常診療におけるベストプラクティスとして推奨される事項（clinicalrecommendation; C）と，ゲノムスクリーニング（網羅性の高いゲノム解析）に基づいた介入研究や保険診
療外のゲノム診断等への利用が考慮される場合に推奨される事項（research recommendation; R）に区分した．なお本推奨は今後のゲノム診断状況を踏まえ，適時改訂・更新が必要であると考える．

凡例（C）： 日常診療において推奨される事項（R）： 臨床研究等への利用を考慮する場合に推奨される事項（N）： 回避すべき事項

3

2.1 プレアナリシス段階a）固定前プロセス《切除・採取直後の組織の取扱い》
1. 手術により切除された組織は，摘出後は速やかに冷蔵庫など4℃下で保管し，1時間以内，
遅くとも3 時間以内に固定を行うことが望ましい（C）文献 2，研究用規程1
2. 内視鏡的に切除等された消化管組織など，比較的小型の組織については，速やかに固定
液に浸漬し固定を行うことが望ましい（C）
3. 生検により採取された組織は，速やかに固定液に浸漬し固定を行う（C）
4. ホルマリン固定パラフィン包埋化を行う細胞検体は，必要な前処理を適切に行ったのちに，可及的速やかに固定液に浸漬し固定を行う（C）
5. 手術により切除された組織においては，摘出後30 分以上室温で保持することは極力回避
する（N）[ 補足説明 ]1補

これまでの報告では，乳癌の切除から固定までの時間が，ISH 法（HER2 ）では 2 時間，IHC 法（ホルモン受容体）では1時間を超えると，検査結果に影響を与えるとされており文献 3，これを踏まえ，乳癌のASCO/CAP のガイドラインでは1時間以内の固定を推奨している文献 2．

1補一般的な固定液であるホルマリンの浸透速度は1mm/ 時間程度であることを考慮し，とくに手術検体では，切り出しまでに充分な固定が行える程度の厚みまで，固定前に適切に入割することが推奨される（C）文献 4．

1-3 補臨床研究等への利用を考慮する場合，いずれの組織も切除・採取後は可及的速やかに固定液に浸漬し，固定を行うことが求められる（R）研究用規程1．

1,5 補

固定前プロセスの煩雑さ等から，一般に，生検検体に比べて手術検体のほうが，核酸品質や単位体積 / 面積あたりの収量が低くなる場合が多い（C）実証データ②③，文献 5．

4補細胞検体のうち，体腔液検体については，固定前に細胞検体の集塊化処理を行う．この処理法（セ
ルブロック作製法）は，遠心分離細胞収集法や細胞固化法に大別され，それぞれ複数の方法が存在し現在用いられているが，いまだ標準化されていない．これら処理法におけるゲノム診断への利用の適否については不明であるが，国内では，細胞固化法であるアルギン酸ナトリウム法，
遠心分離細胞収集法である遠心管法やクライオバイアル法などは比較的多くの施設で用いられ，
コンパニオン診断などでの使用には耐えうることが確認されている文献 6．

4b）固定プロセス《ホルマリン固定液の組成》
6. ホルマリン固定液の組成は，酸性や非緩衝ではなく，中性緩衝ホルマリン溶液を固定に用いることが望ましい（C）

02

7. ホルマリン濃度は10%（3.7% ホルムアルデヒド）を用いることが望ましい（C）

ホルマリン固定パラフィン包埋組織
細胞検体の適切な取扱い[ 補足説明 ]6,7 補

現在実施されているIHC 法を用いた複数のコンパニオン診断において，すでに10% 中性緩衝ホ
ルマリン溶液が推奨されている（表3）．IHC 法によるタンパク発現の検索は，ホルマリン固定液の組成と濃度に影響を受けることが示されている文献 7．またΔCt 値や DIN 値を指標とした DNA
品質に関する検討においても10% 中性緩衝ホルマリン溶液の使用を支持する結果が得られている研究用規程 2．
国際共同企業治験等においてFFPE 検体の提出が求められる際，10% 中性緩衝ホルマリン溶液

･

6,7 補

で固定された FFPE 検体との条件が必須となる場合もある．
表3

コンパニオン診断関連ガイダンス等における固定プロセスの推奨文献 2, 8-15
推奨ホルマリン
固定液

推奨ホルマリン
固定時間

10% NBF

6 〜 72 時間＜ 6 時間は回避

10% NBF

6 〜 48 時間

RT-PCR 法

10% NBF

手術検体 18 〜 36 時間
生検検体 4 〜 24 時間

タンパク

IHC 法

10% NBF

6 〜 48 時間

HER2

タンパク

IHC 法

HER2

DNA

ISH 法

10% NBF

6 〜 48 時間

大腸癌

RAS(KRAS/NRAS)

DNA

PCR-rSSO 法

10% NBF

6 〜 48 時間

悪性
黒色腫

BRAF

DNA

リアルタイムPCR 法等

―

―

がん種

乳癌

肺癌

胃癌

効果予測
マーカー

検査対象分子

検査法

HER2

タンパク

IHC 法

HER2

DNA

ISH 法

ER/PgR

タンパク

IHC 法

EGFR

DNA

リアルタイムPCR 法等

ALK

タンパク

IHC 法

ALK

DNA

FISH 法

ROS1

RNA

PD-L1

10% NBF; 10% 中性緩衝ホルマリン（neutral buffered formalin），－；記載なし

5

《ホルマリン固定時間》
8. 組織検体（手術検体，内視鏡的に切除された検体，生検検体）では，コンパニオン診断等の推奨を考慮し（表3），6 〜 48 時間の固定を行うことが望ましい（C）実証データ④⑤，研究用規程 29. 固定不良（固定不足・過固定）による品質劣化は回避しなければならない（N）《ホルマリン固定処理に使用する固定液量》
10. ホルマリン固定に使用する固定液の容量は，組織量に対し10 倍量の固定液を用いることが望ましい（C）《ホルマリン固定処理時の温度》
11. ホルマリン固定時の処理温度は，室温でよい[ 補足説明 ]8補

ホルマリン固定による核酸品質への影響として，核酸の断片化のほか，核酸塩基の化学修飾が知られており，特にシトシンの加水分解に伴う脱アミノ化によりウラシルに置換し，その後のPCR 増幅反応によってチミンが生成（C＞T 置換）することが知られている文献16, 17．この反応は固定時間の延長により増加し，72 時間から顕著となることから，48 時間以内の固定が望ましい（C）実証データ④～⑦．

8補

気管支腔内超音波断層法（EBUS）等を用いて生検採取される微小な組織検体や細胞検体では，より短い固定時間で処理が完了するため，業務上支障のない範囲で固定時間の短縮化（たとえば 6 〜24 時間）に努めることが望ましい文献12．

8補

固定不良，特に7日間以上固定された検体では，NGS 用のライブラリーの作製（特に網羅性の高い遺伝子パネル使用する場合）が困難となる（N）実証データ④⑤，研究用規程 2,3．

8補

手術検体において診療残余の病変部が存在し，将来のゲノム診断利用を考慮しうる場合，もしくはゲノム診断を目的として再生検を行う場合などでは，核酸の保存に優れた非ホルマリン系固定液の使用を考慮してよい（R）研究用規程 4．

6c）固定後プロセス《脱灰処理》
12. 硬組織を含む検体をゲノム診断に供する可能性がある場合は，酸 脱灰を回避し（N），
EDTA 脱灰を行うべきである（C）研究用規程 502《組織のプロセッシング》

ホルマリン固定パラフィン包埋組織
細胞検体の適切な取扱い

13. 従来型の組織プロセッサー（密閉式自動固定包埋装置）の使用は問題ないが，使用薬剤の管理（交換頻度等）の影響については不明である．また迅速型（連続迅速自動固定包埋装置）では，いまだ十分なデータは得られていない《FFPEブロックの保管》
14. FFPEブロックの保管は，室温でよいが，多湿を避け冷暗所が望ましい（C）．ゲノム診断を目的として作製された FFPEブロックは，冷蔵下の保存が望ましい（R）文献18･《未染色 FFPE 標本の保管》
15. 未染色 FFPE 標本の形態で保管する場合は，低温保管やパラフィンコーティングなどの核酸品質劣化を防止する対応を行うことが望ましいが，原則薄切後時間が経過した未染色
FFPE 標本のゲノム診断への使用は避け（N），可能な限りFFPEブロックから再薄切をすることが望ましい（C）[ 補足説明 ]15 補パラフィンコーティングは，マニュアル・マイクロダイセクションや核酸抽出等の作業へ影響を与える場合があり注意を要する．

7

2.2 アナリシス段階a）FFPEブロックの選択と薄切および HE 染色標本へのマーキング《FFPEブロックの選択》
1. ゲノム診断に供する検体は，病理診断時に作製された HE 染色標本の観察や病理診断報告書の記載等に基づき，解析に必要な腫瘍量を有するFFPEブロックを，原則病理医が選択する．このとき出血や壊死，炎症細胞などの非腫瘍細胞が多いブロックの使用は可能な限り避ける（C, R）
2. 同一患者において，切除・採取時期が異なる検体が複数存在する場合は，作製時期が最新の検体を第一選択とすべきである（C, R）実証データ⑧～⑫《FFPEブロックの薄切および未染色標本の作製》
3. FFPEブロックの薄切時には，検体ごとにミクロトーム刃を交換するなど，他検体のコンタ
ミネーションに十分注意する．またグローブを着用するなど，核酸分解防止に努めることが望ましい（C）《HE 染色標本による確認とマーキング》
4. ゲノム診断用に作製した未染色 FFPE 標本から，再度 HE 染色標本を作製し，原則病理医が標本上にマーキングするとともに腫瘍量（総腫瘍細胞数）や腫瘍割合（標本中の全細胞に占める腫瘍細胞の %）を判定する（C）文献19[ 補足説明 ]2補

FFPEブロックの核酸品質は経年劣化していくことが明らかとなっている 実証データ⑧～⑫．経年による影響は，NGS の場合，使用する遺伝子パネルにより異なるが，作製後3 年以内の FFPEブロックの使用が望ましい（C, R）実証データ⑧，文献 20．

2補FFPEブロックは，保管開始とともに検体品質指標（ΔCt 値）や NGS 解析の成功率が変化するなど，核酸品質が経年劣化することが GI-SCREEN 試験の結果から明らかになっており，可能な限りFFPEブロック作製時期が新しいものを用いることが望ましい（C）実証データ⑧．

4補一般にパネル検査に必要な DNA 量は10 ～ 500ngである．ただし必要な量は使用する遺伝子パネルや NGS 機器の種類によって異なることから，腫瘍量や腫瘍割合の判定を担当する病理医は，その把握が必要である（C, R）．

8

4補１有核細胞から得られるDNA 収量は6 pg 程度と見積もられる．仮に10 ng の DNAを得る場
合には約 2000 細胞（未染色標本上では腫瘍細胞が豊富なエリアが少なくとも60〜100㎟程度）
からの抽出が必要とされている文献 21．

4補腫瘍割合について，SNV（single nucleotide variant）や Indel（small insertion and deletion）などの変異検出では 30% 以上，CNA（copy number alteration）検出を含む場合は 50% 以上の腫瘍細胞を含むように，また遺伝子発現量の測定では，可能な限り非腫瘍細胞を含まない

02ようにすることが望ましい．腫瘍割合が満たない場合は，用手的に非腫瘍部分の除去（マニュホルマリン固定パラフィン包埋組織
細胞検体の適切な取扱い

アル・マイクロダイセクション）が必要となる（C, R）．なお NGSを用いたがん遺伝子パネルによるターゲットシークエンシングでは，通常ターゲット領域のシークエンス・カバレッジを250 〜
500x 以上として，変異アレル頻度（variant allele frequency; VAF）の検出閾値を5 〜 10%とすることが推奨されている文献 20 ～ 22．
4補HE 染色標本観察時の腫瘍割合を病理診断報告書へ記録しておくことが望ましい．非腫瘍組織の除去操作を実施した場合は，実施した旨と除去操作実施後の腫瘍割合をゲノム診断報告書へ記載する（C）．

･

9b）FFPE 検体からの核酸抽出《核酸抽出》
5. ゲノム診断に使用する核酸抽出試薬は，診療での使用に適した標準化された市販キットの使用が望ましい（C）．また使用する各ゲノム診断法において推奨されている市販の核酸抽出キットがある場合には，それを用いることが望ましい（C, R）《核酸の純度および収量の確認》
6. 抽出した核酸は，分光光度計等によるA 260/A 280 比の測定や，DNAについては蛍光法によるdsDNA 濃度の測定等を行い，純度や収量を確認することが必要である（C, R）《核酸品質の確認》
7. 核酸抽出を行った FFPE 検体が長期保管されている場合や過固定等による核酸の品質低下が懸念される場合，核酸品質の確認が推奨される（C, R）[ 補足説明 ]5補

市販の核酸抽出キットを用いた FFPE 検体からの核酸抽出においては，キット間で純度や収量に差異があり，選択には注意が必要である文献 23．

5補

ホルマリンにより生成した化学修飾（シトシン塩基の脱アミノ化）を核酸抽出時に酵素的（ウラシル -DNA N- グリコシラーゼ；UNG）に除去・校正することにより，アーティファクトを有するリードの生成を抑える（ホルマリン固定により生じた変異を正しい塩基配列に戻す）ことが可能である
実証データ⑫，文献17．

6補FFPE 検体から抽出した核酸の純度を示すA 260/A 280 比は，一般にDNAでは1.7～1.9 程度，
RNAでは1.9 ～2.1程度の範囲とされており，低値を示す場合はタンパク等の混入が考えられ注意を要する．また DNA中にRNA が混入した場合，A 260/A 280 比はやや高値を示す文献 24．また他の混入物の確認のためA 260/A 230 比やA 220 〜A320 間のスキャンニングについても確認をする
ことが望ましい．

7補10

核酸品質確認方法には，ΔCt 値をはじめ，表 4 のような指標が知られている．

表 4 FFPE 検体の核酸品質確認のための主な指標
指

標

対

象

説

明

リアルタイム PCR（DNA）もしくはリアルタイム RT-PCR（RNA）法により得られるC t 値を用いて核酸品質を評価する方法で，特殊な機器を必要としない簡便な方法である．D N A 品質評価では，異なる長さの2 種のアンプリ
コンサイズ（例：50 〜100 bp 程度の短鎖アンプリコンと，100 〜300 bp
Ct 値 /ΔCt 値

DNA/RNA02程度の長鎖アンプリコンなど）から得られるC t 値の差（ΔC t 値）を指標とする方法が，一般に用いられている．国内大規模ゲノムスクリーニング研究

ホルマリン固定パラフィン包埋組織
細胞検体の適切な取扱い（SCRUM-Japan/GI-SCREEN 試験 文献 25）においては，2000 例を超える
FFPE 検体に対し，Thermofisher社が開発したΔCt 値アッセイが行われ，その有用性が示されている．
DIN（DNA Integrity Number）はアジレント社のAgilent 2200/4200
DIN

DNA

TapeStationシステムを用いた Genomic DNA ScreenTape assay で測定したデータをgDNAの分解度に応じて1〜10 にスコア化された値であり，
FFPE 検体の DNA 品質評価が可能である．

･

Q - va l u e は国立がん研究センター中央病院が開発した D N Aの品質指標でQ-valueDNAあり文献 26，リアルタイム PCR 法を用いて得た測定値（Ct 値）を蛍光法による測定値（dsDNA 濃度）で割った値である．Q-value 0.2 以上におけるシーケ
ンス（NCC オンコパネル v2 使用時）の成功率は約 85%である．
DV200 はイルミナ社が開発した RNAの品質指標であり，AATI 社の Fragment
Analyzer またはアジレント社のAgilent 2100 bioanalyzerを用いて，

DV200

RNA

200ヌクレオチド以上の R N A 断片の割合を算出する．D V200 による品質区
分は，＞70% の場合は High，50 〜70% の場合は Medium，30 〜 50%の場合は Low，＜30% は Too degradedとしており，＜30% の FFPE 検
体では，RNAシーケンスのライブラリー調製への使用を推奨していない．

11

03

検体取扱いに関する実証データ

本診療用規程策定にあたっては，ゲノム診断の実用化を目指した臨床研究を推進している，以下の研究班等およびこれに関係している医療機関および研究機関および関連企業の協力を得て，実証データおよび参考データを収集し，編集・編纂を行った．

●協力･連携研究班等
厚生労働科学研究費 研究班
先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築に関する

03

研究（【H26－がん政策－一般－005】研究期間：2014 年度～ 2016 年度）
桑田 健

検体取扱いに関する実証データ

研究代表者

国立がん研究センター研究開発費 研究班
がんゲノム情報を用いた全国レベルでの precision medicine 体制構築に関する研究（【28-A-5】研究期間：2016 年度～ 2018 年度）
研究代表者

吉野 孝之

国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）委託事業 研究班
産学連携全国がんゲノムスクリーニング事業 SCRUM-Japan で組織した遺伝子スクリーニング基盤を利用した、多施設多職種専門家から構成された Expert Panel による全国共通遺伝子解析・診断シス
テムの構築および研修プログラムの開発（【17ck0106233h0002】研究期間：2016 年度～ 2018 年度）
研究開発代表者

吉野 孝之

がんゲノム個別化医療の実現に向けた遺伝子診断共通カリキュラム構築と教育・研修プログラムの実証的開発研究（【16ck0106232h0001】研究期間：2016 年度～ 2018 年度）
研究開発代表者

西尾 和人

13

●実証解析担当機関および協力機関等
北海道大学病院
ゲノム･コンパニオン診断研究部門
畑中

豊

病理診断科/ 病理部
丸川 活司，畑中 佳奈子，三橋 智子，松野 吉宏
国立病院機構 北海道医療センター（連携病理診断実施医療機関）
広瀬 徹，髙橋 宏明
国立がん研究センター《SCRUM-Japan/GI-SCREEN-Japanプロジェクト》

東病院 病理・臨床検査科
桑田

健

東病院 消化管内科
吉野 孝之
東病院 臨床研究支援部門トランスレーショナルリサーチ推進部
バイオバンク・トランスレーショナル
岡本

リサーチ支援室渉，須藤 智久，三木 いずみ

先端医療開発センター 臨床腫瘍病理分野
藤井 誠志
先端医療開発センター ゲノムトランスレーショナルリサーチ分野
（柏）
土原 一哉
《TOP-GEARプロジェクト》

先端医療開発センター ゲノムトランスレーショナルリサーチ分野
（築地）
市川

仁，久保

崇，河野 隆志中央病院 臨床検査科
角南 久仁子，落合 淳志
中央病院 先端医療科
山本昇

近畿大学医学部
ゲノム生物学教室
西尾 和人，坂井 和子
腫瘍内科部門
武田 真幸
外科学教室
光冨 徹哉

14

特定非営利活動法人バイオチップコンソーシアム（JMAC）《経済産業省・国際標準共同研究開発事業：医療用バイオチップ実用化促進に向けたヒト核酸の測定プロセスに関する国際標準化》

的場

亮，山本 伸子，中江 裕樹●実証解析実施協力企業（五十音順）
イルミナ株式会社
株式会社キアゲン
サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社
シスメックス株式会社

03

株式会社 DNAチップ研究所
株式会社理研ジェネシス

検体取扱いに関する実証データ●調査協力企業（五十音順）
アジレント・テクノロジー株式会社
イルミナ株式会社
株式会社医学生物学研究所
エムエス機器株式会社（アジェナバイオサイエンス）
株式会社キアゲン
サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社
サクラファインテックジャパン株式会社
シスメックス株式会社
株式会社 DNAチップ研究所
ナノストリングテクノロジー
バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社
株式会社理研ジェネシス
ロシュダイアグノスティックス株式会社

15

実証データ実証データ①

日常診療下で作製されたFFPEブロックの遺伝子パネル検査適用性と核酸品質の施設間差《内 容》
・ 国内大規模ゲノムスクリーニング研究プロジェクトSCRUM-Japan/GI-SCREEN 試験参加 20
施設から提出された診療時に作製された消化器癌の FFPE 検体（生検および手術検体）2866 検体のうち，40 症例以上の検体提出を行った施設を対象に解析した．
・ FFPE 検体をサーモフィッシャー・サイエンティフィック社の米国 CLIAラボへ送付し，同ラボの手順書に従った検査が実施された．必要に応じてマニュアル・マイクロダイセクションが実施され，DNA および RNA 抽出後にΔCt 値アッセイによる確認が行われた．品質基準を満たした検体を対象に，Ion PGM

TM

03

システムを用いたターゲットシークエンシング（Oncomine Cancer

検体取扱いに関する実証データ

Research Panel（ OCP; 143 遺伝子）および Oncomine Solid Tumour DNA/Fusion

New
Transcript kit（CE-IVD; 26 遺伝子）
；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）が行われた．

100%

ΔCt値品質区分別割合

80%
60%
40%
20%
0%
ALL

A

B

C

D

ΔCt値品質区分

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

■：PCR増幅不良検体■：低品質検体■：中間品質検体■：⾼品質検体● ΔCt 値に基づき検体を３つの区分（高品質，中間品質，低品質）に分類し，Ct 値が得られなかった検体は PCR 増幅不良検体とした．全体（上図；All）では高品質検体が 45%，中間品質検体が 33%，低品質検体または PCR他増幅不良検体は 21% を占めた．40 症例以上の検体提出を行った16 施設における検体品質の施設間差は顕著だった．

19

New

100%

解析成功割合

80%
60%
40%
20%
0%
ALL

A

解析成否別区分

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

143遺伝⼦パネル、26遺伝⼦パネル解析いずれも失敗した検体
143遺伝⼦パネル解析は失敗したが、26遺伝⼦パネル解析は成功した検体
143遺伝⼦パネル解析が成功した検体● ΔCt 値が得られた検体（高品質，中間品質，低品質）における網羅性の高いパネル（143 遺伝子パネル）
および小型のパネル（26 遺伝子パネル）解析での成否については，前図と同様の結果が得られ，低品質検体または PCR他増幅不良検体の割合が大きい施設では，両パネルの不成功割合も高かった．このNew
集計においても16 施設における施設間差は顕著であった．全体（上図；All）では，網羅性の高いパネル
2/27

核酸品質とクリニカルシーケンスの成功率が成功した検体は73%，小型のパネルのみが成功した検体が15%，両パネルが不成功となった検体は12%であった．

シークエンス成功割合

100%■ 143遺伝⼦パネル（OCP）

80%■ 26遺伝⼦パネル（CE-IVD）

60%
40%

ΔCt値品質
区分

20%
0%
■⾼品質
⾼品質

■中間品質
中間品質

■低品質
低品質

OCP
(%)

CEIVD
(%)

■⾼品質

89.1

96.9

■中間品質

64.5

87.6

■低品質

8.9

36.6

ΔCt値品質区分● 各品質区分別のシークエンス成功割合では，高品質検体では143 遺伝子パネルの成功割合は約 89%，
26 遺伝子パネルでは約 97%であった．

20

実証データ②

日常診療下で作製されたFFPEブロックから得られたDNAの品質《内 容》
・ TOP-GEARプロジェクト第1期（登録期間：2013 年 4月〜 2016 年 5月）において解析対象となった 233 症例の多がん種の FFPE がん組織検体について，得られた DNAの品質を検討した．

⽇常診療下で作製されたFFPEブロックから得ら・ 本プロジェクトでは，Q-value（qPCR 測定 DNA 量／蛍光法測定二本鎖 DNA 量）をFFPE 検体
由来 DNAの品質値として用い，手術検体と生検検体を分けて，評価を行った（他院取り寄せ検れたDNAの品質体のため未調査を含む）．

03

Q-valueQ-value

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6

手術

1.8

検

1.6

未調査

1.4

Q-valueQ-value

1.6

P<0.001

2.0
生

1.8

検体取扱いに関する実証データ

2.0

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4

0.2

0.2

0.0

0.0

手術
⼿術

生

0.4

⽣検
検

● Q-value は検体ごとに大きく異なる．手術検体より生検検体の方が，品質が良い傾向が見られた．

21

実証データ③

日常診療下で作製されたFFPEブロックから得られたDNAの収量《内 容》
・ TOP-GEARプロジェクトの第1期において解析対象となった 233 症例の多がん種の FFPE がん
組織検体について，使用した組織体積と得られた DNA 収量を調査した．
・ 本プロジェクトにおいては，10 μm × 5 の薄切からキアゲン社の QIAamp DNA FFPE Tissue
Kitを用いてDNAを抽出した．組織断面積を計測し，その測定値に50 μmをかけて組織体積

6

手術

5

未調査

3
単位体積当りDNA収量（µg/mm
単位体積当たりDNA収量（µg/mm）3）

r=-0.4907

生3
単位体積当りDNA収量（µg/mm
単位体積当たりDNA収量（µg/mm）3）を計算し，手術検体と生検検体を分けて評価を行った（他院取り寄せ検体のため未調査を含む）．
⽇常診療下で作製されたFFPEブロックから得られたDNAの量

検

4
3
2
1

0

10

20

30

40

50

6
5
4
3
2
1
0

手術
⼿術

生

0

P<0.0017

⽣検
検

組織体積（mm3）● 単位体積当りの DNA 収量は検体ごとに大きく異なる．手術検体より生検検体の方が，単位体積当りのDNA 収量が高い傾向が見られた．

22

実証データ④

ホルマリン固定時間延長が検体品質および NGS用ライブラリー
調製に与える影響《内 容》
・ 単一施設において，切除後のホルマリン固定時間（1，2，3，7および14日）の影響を確認するために精度管理用に作製された大腸癌手術検体を用いて検討した．
・ 市販の FFPE 組織用 DNA 抽出キット（キアゲン社）を用いてDNA 抽出を行ったのちに，リアル
タイム PCR 法を用いた DNA 品質の確認を行い，品質基準を満たした検体を対象に，MiSeqシ
ステム（イルミナ社）を用いたアンプリコンシーケンス（TruSeq Amplicon Cancer Panel；イル
ミナ社）のライブラリー調製を行った．

8

ΔCt値

ΔCt値

4

12

A

Illumina FFPE QC assay

2
0

D2

D3

D7 D14

D1

D2

Case 1

D1

D2

BIOMED-2 QC assay

D3

D7 D14

D1

D2

Case 1Case 2
12

C

10

2

D3

D7 D14

Case 2

Thermo FS GIS QC assay

D

8
6
4
2

0

0
D1

D2

D3

D7 D14

D1

D2

Case 1D3

D7 D14

D1

Case 2

E

Thermo FS RNase P QC assay

D2

D3

D7 D14

D1

Case 1

15

1.2
1

D2

D3

D7 D14

Case 2F

Thermo FS RNase P QC assay

0.8

相対値

ΔCt値

0

D7 D14

ΔCt値

ΔCt値

D3

4

20

4

-8
D1

6

B

-4

-2

8

Illumina TST26 DNA QC assay

検体取扱いに関する実証データ

6

03

0.6

10

0.4

5

0.2
0

0
D1

D2

D3

D7 D14

Case 1

D1

D2

D3
Case 2

D7 D14

Ctr D1 D2 D3 D7 D14Case 1

Ctr D1 D2 D3 D7 D14Case 2● 本遺伝子パネルで使用が推奨されているイルミナ社 FFPE QC assayを用いたΔCt 値測定による品質確認では，7日および14日固定検体は基準を満たさなかった（A；赤線はカットオフ）．他のアッセイにおいても同様の結果が得られた（B-F）．

23

● 前述の GI-SCREEN 試験では，特定のハウスキーピング遺伝子のアンプリコンサイズの異なるプライ
マーセットを用いたアッセイにより，３つに区分化（高品質，中間品質，低品質）されている（D）．この検討では，FFPEブロック作製後3 年の検体を使用しているが，固定２日間のものではΔCt 値は品質区分が中間品質となっている．RNase P 遺伝子のアンプリコンサイズの異なるプライマーセットを用いたアッセイでは，通常のΔCt 値測定ではなく（E），検量線を利用した指標が推奨されている（F）．各アッセイについては補遺 3を参照．
症例2

3⽇固定
3日固定

2⽇固定
2日固定

1⽇固定
1日固定

症例1

Library QC
Average size [bp]Case 1Case 2

D1

D2

D3

D7

D14

D1

D2

D3

D7

D14

309

311

311

320

321

315

312

318

312

316

Size distribution [%]

4.7

8.3

9.1

13.4

13.4

6.2

7.3

10.9

12.4

13.6

Concentration [ng/uL]

11.1

9.0

3.9

0.8

1.1

25.7

12.1

1.1

0.5

0.6

● 150ng の DNAを用いてライブラリー調製し，アジレント社の2100 bioanalyzerを用いて，ライブラ
リー QC の確認を行った．イルミナ社 FFPE QC assay によるΔCt 値測定の品質確認で検体 QC の基準に満たなかった7日固定および14日固定検体では，ピークが観察されなかった．1日，2日，3日
固定検体では，すべての検体においてピークが確認されシークエンス結果が得られたが，症例 2の3
日固定検体のピークは微小であった．

24

実証データ⑤

ホルマリン固定時間延長による塩基置換アーティファクト生成への
影響

《内 容》
・ TruSeq Amplicon Cancer Panel（イルミナ社）を用いたアンプリコンシークエンスによる解析
を，1，2 および 3日間固定した 2 症例の大腸癌手術検体を用いて検討した．

1250

A: 全変異頻度

03

症例1

1000
検体取扱いに関する実証データ

塩基置換数/シークエンス領域総塩基数（35kb）

固定⽇数間の塩基置換アーティファクトの⽐較
・ サンプル調製に関する詳細は実証データ④を参照．

750
500
250
0
症例2

1250
1000
750

New

固定⽇数間の塩基置換アーティファクトの⽐較（0.1%以下）
500■ 1⽇固定■ 2⽇固定■ 3⽇固定

250

1250

T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

C>A

A>T

A>G

A>C

DEL
del

B: 変異頻度0.1%以下のみ

症例1

1000
750
500

1250

T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

A>T

A>G

A>C

del

ins

0

C>A

250

症例2

1000
750
500

■ 1⽇固定■ 2⽇固定■ 3⽇固定

250
T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

C>A

A>T

A>G

A>C

DEL
del

0
INS
ins

塩基置換数/シークエンス領域総塩基数（35kb）

INS
ins

0

25

● ΔCt 値等を指標にDNA 品質を検討したところ，7日固定および14日固定検体は当該遺伝子パネル使
用上の品質基準を満たさず，またライブラリー作製が不成功となったため，本検討では1日，2日および 3日固定検体のみを用いた．
● 得られたシークエンスデータの解析を行ったところ，固定1～3日の間で，総リード数，リード深度に大きな偏りは認められなかった．
● 本遺伝子パネルのシーケンス領域の総塩基数（35kb）における各タイプの塩基変化数を解析したところ，
C＞T 置換をはじめ，A＞G 置換，A＞T 置換などの塩基変化数の増加が，ホルマリン固定 3日目から急速に顕著になった（A）．固定によるアーティファクト変化である可能性が高いと判断される変異頻度が 0.1% 以下のものに絞り，再解析をおこなったところ，塩基変化数は全塩基変化数（A）と近似した数
となった
（B）．

26

実証データ⑥

ホルマリン固定時間延長による総リード数への影響《内 容》
・ 2 種の小型遺伝子パネル（GeneRead Actionable Insight Tumor Panel（12 遺伝子）
[AIT12]；キアゲン社および TruSight Tumor 15 Kit（15 遺伝子）[TST15]；イルミナ社）を用いたアンプリコンシークエンスによる解析を，1日，3日および 7日固定を施した4 検体（大腸癌
2 例，肺癌1例，胃消化管間質腫瘍（GIST）1例）を用いて検討した．
・ TST15についてはリアルタイム PCR 法を用いた DNA 品質の確認を行い，品質基準を満たしていることを確認し，解析を行った（実証データ④ - 検体 QCチェックデータB）．

03
検体取扱いに関する実証データ

・ AIT12を用いた遺伝子変異パネル解析では 40ng の dsDNAを用いてライブラリー作製を行い，ライブラリー QCを行った後に，GeneReaderシステム（キアゲン社）で解析を行った．
・ TST15 を用いた遺伝子変異パネル解析では 20ng の dsDNAを用いてライブラリー作製を行い，ライブラリー QCを行った後に，MiSeqシステム（イルミナ社）で解析を行った．

総リード数

3000000

A

Qiagen AIT12 Panel

2000000
1000000
0
D1

D3

D7

D1

Mean

D3

D7

D1

Colon

D3

D7

D1

Colon

D3

D7

D1

Lung

D3

D7

GIST
(stomach)

総リード数

6000000

B

Illumina TST15 Panel

4000000
2000000
0
D1

D3
Mean

D7

D1

D3
Colon

D7

D1

D3
Colon

D7

D1

D3
Lung

D7

D1

D3

D7

GIST
(stomach)27

● いずれの小型遺伝子パネルにおいても，1～7日固定検体での解析が可能であり，核酸品質が低い
FFPE 検体に対して特に有用であることが推察された．一方，総リード数は，ホルマリン固定時間が延長するに従い，減少した．なお，固定時間延長に伴う総リード数の減少は，使用する遺伝子パネルによってその影響の度合いは異なる．

28

実証データ⑦

ホルマリン固定時間がマイクロアレイ測定へ与える影響《内 容》
・ 乳癌再発予後予測検査で使用されているマイクロアレイ法（GeneChip Human Genome
U133 + 2.0 arrays; アフィメトリクス社）における固定の影響を検討するため，1，2，3，7
および14日固定を施した乳癌検体（11例）を用いて検討した．

New・ 各検体から抽出されたRNA 100ngを用いてcDNAの合成を行い，その収量確認を行った後に，固定時間と各マイクロアレイパラメータ

マイクロアレイへのハイブリダイゼーション及び蛍光強度の検出を実施した .

03
検体取扱いに関する実証データ● 逆転写反応後の cDNAの収量，マイクロアレイの QC 項目であるSF 値 *1 および %P 値 *2 について検討を行ったところ，いずれの項目においても，3日固定以降有意な変化が認められた（*:p＜0.05, **:p＜0.01）.
*1 全プローブ発現量の平均蛍光強度を反映する値であり，平均蛍光強度を一定の値まで補正するための係数で示される．高値はアレイが暗いことを意味し，サンプル品質や手順等に問題があり，適切に測定できていないことを表す.
*2 全プローブのうち発現しているプローブの割合であり，一定割合以下の場合は適切に測定できていない可能性が高く，マイクロアレイデータの信頼性が低いことを表す.

29

New

● マイクロアレイ全体のプローブ発現量に与える影響について，固定時間1日を対照とした相関解析を実施したところ，固定時間延長に伴い相関係数が低下し，とくに発現量の低いプローブの相関が著しく低
下した .

30

実証データ⑧

FFPEブロック保管期間が DNA 品質に与える影響《内 容》
・ GI-SCREEN 試験参加 20 施設から提出された診療時に作製された消化器癌の FFPE 検体（生検および手術検体）のうちパネル解析が実施された 2668 検体を対象に調査した．

New・ サンプル調製の詳細は実証データ①を参照．

検体採取/ブロック作製時期と核酸品質の関係

03

80%
60%

ΔCt値品質区分

40%■：PCR増幅不良検体■：低品質検体■：中間品質検体■：⾼品質検体

検体取扱いに関する実証データ⊿Ct値品質区分別割合

100%

20%

New

0%

検体採取/ブロック作製時期と核酸品質の関係
100%

解析成功割合80%

解析成否別区分60%

143遺伝⼦パネル、26遺伝⼦パネル解析いずれも失敗した検体

40%

143遺伝⼦パネル解析は失敗したが、26遺伝⼦パネル解析は成功した検体

20%

143遺伝⼦パネル解析が成功した検体

0%● 高品質検体の割合は，経年的に低下する一方，低品質検体の割合は増加した（上図）．また解析の成否についても同様の傾向が認められた
（下図）．

31

実証データ⑨

FFPEブロック保管期間が DNA 品質に与える影響《内 容》
・ TOP-GEARプロジェクト第1期前半において実際にNCC オンコパネル解析を行った131症例の FFPE がん組織検体について，パラフィンブロックの保管期間の影響を検討した．
・ これらの情報が得られた検体について，一次 PCR 収量及び Q-valueと比較した．一次 PCR 収
量については，SureSelect XT Reagents 単独で NGSライブラリーを調製した検体に限定しホルマリン固定時間、FFPEブロック保管期間がた．
DNA品質に与える影響
2.0

3.0
1.5

2.5

Q-valueQ-value

一次PCR収量（µg）⼀次PCR収量 (μg)

3.5

2.0
1.5
1.0

1.0
0.5

0.5
0.0

~0.5

~1

~2

~3

~4

~5

保管期間（年）
保管期間（年）

~6

>6

0.0

~0.5

~1

~2

~3

~4

~5

~6

>6

保管期間（年）
保管期間（年）● FFPE 検体由来 DNAの一次 PCR 収量及び Q-value は，パラフィンブロックの保管期間と一定の相関を示した．FFPE 検体の長期保管が，DNAの品質不良を引き起こすと考えられた．

32

実証データ⑩

FFPEブロック保管期間が RNA 品質（総リード数）に与える影響《内 容》
・ 非小細胞肺 癌169 症例の FFPE 組 織検体から抽出した RNAを用いて検討した．使 用した
FFPEブロックの作製年は，100 検体が 2007年，49 検体が 2012 年，20 検体が 2013 年であった．
・ 半導体シークエンサー Ion PGMシステムを用いて，Ion AmpliSeqTM RNA Fusion Lung
Cancer Research Panel（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でのアンプリコンシー

肺がんFFPE検体での検討

クエンシングを行った（測定解析は 2014 年に実施）．

New
2/27

検体取扱いに関する実証データ

100%
2013年

FFPE検体割合

80%

2012年

60%

2007年

40%
20%
0%

>200,001

150,001 -100,001 -20,001 -200,000

150,000

100,000

03≦20,000

総リード数● 本融合遺伝子解析パネルにおける総リード数の中央値は，2013 年作製のブロックでは 288,838（最小値157,085－最大値 431,332），2012 年作製ブロックでは 257,516（最小値149,998－最大値
435,890），2007年作製ブロックでは 282,887（最小値 4,987－最大値 562,580）であった．
● 169 検体のうち，総リード数が 20,000 以下となり評価困難と判断された4 例はすべて2007年作製ブ
ロックであった．2007年作製ブロックは，2012 年や2013 年に比べて取得リード数の低下が認められ，経年劣化の影響が考えられた．

33

実証データ⑪

FFPEブロック保管期間が DNA および RNA 品質（リード数）に
与える影響

《内 容》
・ 非小細胞肺癌110 症例の FFPE 検体からDNA および RNAを抽出した．DNA および RNA は，
PicoGreen dsDNA 定量試薬および PicoGreen RNA 定量試薬（サーモフィッシャーサイエン
ティフィック社）を用いて定量した．アンプリコンシークエンスでの遺伝子変異解析および融合
遺伝子解析には，DNA，RNAともに最大10 ngを使用した．
・ Ion PGMシステムを用いて，DNAよりIon AmpliSeqTM Colon and Lung Cancer Panel，RNAよりIon AmpliSeqTM RNA Fusion Lung Cancer Research Panel（ サー モフィッ
シャーサイエンティフィック社）でのアンプリコンシークエンスを行った（測定解析は 2014 年～
2015 年に実施）．

総リード数

10,000
100

5

1

0

B

60
50
40

10,000

30

100

20

1

0

10

C

20
15

10,000

10

100

5

1

0

Input RNA (ng)1,000,000

C>T置換塩基数

総リード数

15
10

1,000,000

総リード数

20

Input DNA (ng)A

1,000,000

ED

FFPE検体割合 (%)● DNAを用いた遺伝子変異パネル解析では，
総リード数の中央値は412,715であった．110 検体のうち，100100
5 検体で総リード数が 50,000 以下となり，また1検体で十分な総リード数が得られたものの，C＞T
置換数が 35と高い値を示し，解析困難と判定された（A, B）．
50

50■：解析困難■：解析可能● RNAを用いた融合遺伝子パネル解析では，総リード数の中央値 256,836 であった．110
検体のうち，

4 検体で総リード数が20,000 以下となり，解析困難と判定された（C）．
0
0
2004~10 2011~13 2014~15

34

2004~10 2011~13 2014~15

総リード数C

15

10,000

10

100

5

1

FFPE検体割合 (%)

20

100

0

D

50

0

100

E

50

2004~10 2011~13 2014~15

0Input RNA (ng)1,000,000■：解析困難■：解析可能2004~10 2011~13 2014~15● DNAを用いた遺伝子変異パネル解析において，解析実施年から4 年以上経過（2004 ～2010 年に作製）した FFPE 検体では解析成功率は 81.8%（n=11），3 年以内（2011～2013 年に作製）の検体では94.8%（n=58），解析実施年（2014 ～2015 年に作製）の検体では 97.6%（n=41）であった（D）．

製）した FFPE 検体では解析成功率は 81.8%（n=11），3 年以内（2011～2013 年に作製）の検体では96.6%（n=58），解析実施年（2014 ～2015 年に作製）の検体では100%（n=41）であった（E）．

35

検体取扱いに関する実証データ● RNAを用いた融合遺伝子パネル解析において，解析実施年から4 年以上経過（2004 ～ 2010 年に作

03実証データ⑫

FFPEブロックの保管期間延長による塩基置換アーティファクトの生成とUNG 処理によるアーティファクトの除去効果《内 容》
・ 1日および 3日固定を施した 2 症例の大腸癌手術検体を対象にTruSeq Amplicon CancerPanel（イルミナ社）を用いたアンプリコンシークエンスによる解析を実施した．解析は 2014 年（FFPEブロック作製直後）および 2017年（作製 3 年後）の2 回実施した．
・ 2017年に実施した解析では，UNG 処理の効果を確認するため，3日固定検体を用いて，2種の核酸抽出キット（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit [ 処理なし]および GeneRead DNA

ブロック保管による塩基置換
アーティファクトの変化（0.1%以下）

FFPE Kit [ 処理あり]；キアゲン社）を用いた比較検討を行った．

T>C

T>G

T>A

G>T

G>C

C>T

G>A

C>G

A>T

C>A

A>C

T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>G

A>T

C>A

A>C

C>T

T>C

T>G

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

0

A>T

0
C>A

500
A>C

500

A>G

1000

DEL
del

1000

■ 2014年■ 2017年

A>T

1500

A>G

T>G

T>C

T>A

G>T

G>C

G>A

C>T

C>G

A>T

C>A

A>C

■ 2014年■ 2017年

3⽇固定

D

C>A

1500

2500
3⽇固定
2000

C

A>G

2000

A>G

0
INS
ins
DEL
del

2500

50

A>G

T>C

0

T>G

T>A

G>T

G>C

C>T

G>A

C>G

50

A>T

0
100

C>A

0
100

A>C

500
A>G

500

ins

1000

del

1000

1⽇固定

■ 2014年■ 2017年

ins

1500

B

del

■ 2014年■ 2017年

症例2

INS
ins
DEL
del

1500

2500
1⽇固定
2000

A

INS
ins

塩基変化数/シークエンス領域総塩基数（35kb）

2000

症例1

ins
INS
del
DEL
A>C

2500

● 1日および 3日固定検体ともに，長期保管期間により，各塩基変化アーティファクトが増加し，特にC＞T 置換では顕著であった（A, B の下図は，上図の拡大）．長期保管期間により増加した塩基変化数
は，保管当初の塩基変化数に比例していた．

36

G>C

C>T

G>A

C>G

A>T

C>A

A>G

T>C

T>G

T>A

G>T

G>C

0
C>T

0
G>A

500

C>G

500
A>T

1000

C>A

1000

A>G

1500

A>C

1500

T>C

■ UNG■ UNG+

2000

T>G

2000

症例2

T>A

2500

■ UNG■ UNG+

G>T

症例1

ins
INS
del
DEL
A>C

2500

ins
INS
del
DEL

塩基変化数/シークエンス領域
総塩基数（35kb）

UNG処理の効果（0.1%以下）● UNG 処理の有無のキット間比較においては，処理なし（UNG－）に比べ，処理あり（UNG＋）の検体で，C＞T 置換塩基数が低減した．一方，T＞C 置換など一部の置換種では置換塩基数が増加した．総リー
UNG 処理により，DNA 品質の改善が期待されるが，効果が一様ではないことから，実施にあたって
は事前検討により効果の程度を確認し，UNG 処理の要否を判断することが望ましい．

37

検体取扱いに関する実証データ

ド数および平均リード深度は，UNG＋で 8 倍以上高くなったことから，すでに報告されているように

03

04

参考資料

A. 研究用規程（ゲノム研究用病理組織検体取扱い規程）
日本病理学会・ゲノム病理診断検討委員会 /ゲノム病理組織取扱い規約委員会作成．2016 年
http://pathology.or.jp/genome/1.

第 3 部「摘出から固定まで」推奨記載および実証データ①：固定までの時間・固定時間・ホルマリンの種類と濃度の DNAの品質に対する影響

2.

第 3 部「固定液の濃度と種類」推奨記載および実証データ②：固定時間・ホルマリンの種類と濃度のDNAの品質に対する影響

3.

第 3 部「固定時間」推奨記載および実証データ⑧：固定時間・ホルマリンの種類と濃度の DNAの品質に対する影響4.

第 3 部「固定液の濃度と種類」推奨記載および実証データ⑤：ホルマリンを含まない固定液のゲノム
DNAの品質への影響

5.

04

第3部
「脱灰」推奨記載および実証データ⑫：脱灰方法のゲノム DNAの品質に対する影響

参考資料

B. 文 献1.

日本臨床腫瘍学会，日本癌治療学会，日本癌学会合同・次世代シークエンサー等を用いた遺伝子パネル検査に基づくがん診療ガイダンス作成ワーキンググループ作成：次世代シークエンサー等を用いた遺伝子パネル検査に基づくがん診療ガイダンス（第1.0 版）．2017年．

2.

Hammond ME, Hayes DF, Dowsett M, et al. American Society of Clinical Oncology/
College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical
testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 2010;
28: 2784-95.

3.

Khoury T, Sait S, Hwang H, et al. Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers.
Mod Pathol. 2009; 22: 1457-67.

4.

Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on thecontent and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002; 161: 1961–1971.

5.

平成 28 年度 日本医療研究開発機構（AMED）調整費研究事業「オミックス研究用生体試料の取扱いに関する報告書（2017年 8月1日版）」．2017年

6.

平成 27年度 厚生労働科学研究費補助金「先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築に関する研究―分担研究報告書」．2016 年

39

7.

Sato M, Kojima M, Nagatsuma AK, et al. Optimal fixation for total preanalytic
phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including
immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathol Int. 2014; 64: 209-168.

日本病理学会 編：胃癌・乳癌 HER2 病理診断ガイドライン（第1版）．金原出版．2015 年

9.

Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, et al. Recommendations for human epidermal
growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of ClinicalOncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin
Oncol. 2013; 31: 3997-4013.

10. 日本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者におけるEGFR 遺伝子変異検査の手引き（第 3.05
版）．2016 年．
11. 日本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者におけるALK 融合遺伝子検査の手引き（第 2.1
版）．2015 年．
12. Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection oflung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from theCollege of American Pathologists, International Association for the Study of Lung
Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol. 2013; 8: 823-859.
13. 日本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者におけるROS1融合遺伝子検査の手引き（第1.0版）．2017年．
14. 日本肺 癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺 癌患者におけるPD-L1検査の手引き（第1.0 版）．
2017年．
15. 日本臨床腫瘍学会 編：大腸がん診療における遺伝子関連検査のガイダンス（第 3 版）．2016 年．
16. Williams C, Pontén F, Moberg C, et al. A high frequency of sequence alterations is due
to formalin fixation of archival specimens. Am J Pathol. 1999; 155: 1467-71.
17. Do H, Dobrovic A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes andstrategies for minimization. Clin Chem. 2015; 61: 64-71.
18. von Ahlfen, Missel A, Bendrat K, et al. Determinants of RNA quality from FFPE
samples. PLoS One. 2007; 2: e1261.
19. Cree IA, Deans Z, Ligtenberg MJ, et al. Guidance for laboratories performing molecularpathology for cancer patients. J Clin Pathol. 2014; 67: 923-31.

40

20. Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, et al. Guidelines for Validation of Next-Generation
Sequencing–Based Oncology Panels：A Joint Consensus Recommendation of the
Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. J Mol
Diagn. 2017; 19: 341–365.
21. Chen H, Luthra R, Goswami RS, et al. Analysis of Pre-Analytic Factors Affecting the
Success of Clinical Next-Generation Sequencing of Solid Organ Malignancies. Cancers.
2015; 7: 1699–1715.
22. New York State Department of Health. "Next Generation" Sequencing（NGS）guidelines
for somatic genetic variant detection. 2016; Updated and Revised.
23. Janecka A, Adamczyk A, Gasińska A. Comparison of eight commercially available kitsfor DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Anal Biochem.
2015; 476 :8-10.
24. Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al. DNA Qualification Workflow for Next Generation
Sequencing of Histopathological Samples PLoS ONE. 2013; 8: e62692.

04

25. Yoishino T. SCRUM-Japan GI-SCREEN: The nationwide cancer genome screening
参考資料

projects for gastrointestinal cancer in Japan. Annals of Oncology 26（Suppl 7）: vii5,
2015.
26. Tanabe Y, Ichikawa H, Kohno T, et al. Comprehensive screening of target molecules by
next-generation sequencing in patients with malignant solid tumors: guiding entry into
phase I clinical trials. Mol Cancer. 2016; 15: 73.

41

補遺1： 病理部門におけるFFPE 検体の作製と分子診断・ゲノム診断での使用の流れ
研究⽤

⼿術施⾏

新鮮凍結検体

検体

術中迅速⽤
未固定検体

受付

プレアナリシス段階
アナリシス
段階
ポスト
アナリシス
段階
アナリシス
段階

⼀部の
細胞検体

⽣検検体

検体受付・到着確認・組織番号付け
写真撮影
切り出し

検体
処理

包埋

ポスト
アナリシス
段階

内視鏡的
切除検体

⼿術検体

到着確認

固定(写真撮影)

必要に応じて写真

切り出し

撮影・切り出しOCTコンパウンド包埋・急速凍結↓クリオスタットにて
薄切・迅速HE↓
病理医による診断⼿術室直接連絡脱⽔・脱脂・パラフィン浸透固定後パラフィン包埋

パラフィン包埋

薄

薄切

切

染⾊
・封⼊

HE染⾊標本/特殊染⾊標本等の作製

診断

病理医による形態診断

薄切

薄

切

薄

切

鑑別補助診断コンパニオン診断等

ゲノム診断（遺伝⼦パネル検査）

診断

病理医による分⼦診断

専⾨家会議による
意義づけ

報告

診断結果の最終報告

検査結果の最終報告

検査

保管

42

内視鏡施⾏

体腔液検体
FNA検体など[IHC法, ISH法, qPCR法, NGS法等][NGS法等]

スライドガラス・パラフィンブロック保管補遺２： ＜修正後＞
ゲノム診断利用のためのHE 染色標本のマーキング例

A
B

C

大腸癌症例
TP53
p.R175HPIK3CA p.E543K

BC（A）大腸癌標本の全体像．青線；腫瘍細胞が広がっている範囲．黄線；ゲノム診断に用いる範囲．緑線；一部トリミングがのぞましい範囲．
（B）腫瘍細胞塊がみられるものの好中球が多数存在するため使用は避ける．
（C）腫瘍細胞がみられるものの，形質細胞や筋層など非腫瘍細胞が多く存在することから使用は避ける．

43

本規程の冊子版の配布および英語版の公開は，国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）委託事業「産学連携全国がんゲノムスクリーニング事業 SCRUM-Japanで組織した遺伝子スクリーニング基盤を利用した、多施設多職種専門家から構成されたExpert Panelによる全国共通遺伝子解析・診断システムの構築および研修プログラムの開発」平成 29 年度
調整費によるグラントサポートを受け，行われたものである．

ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程
平成30年3月 1 日
発行人

初版発行

一般社団法人 日本病理学会
理事長

深山正久

〒113-0034 東京都文京区湯島1­ 2­ 5 聖堂前ビル7階
TEL

0 3 ­ 620 6 ­ 9 070

FA X

0 3 ­ 620 6 ­ 9 077

http://pathology.or.jp/
E-mail: jsp-admin@umin.ac.jp「ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程」は、ホームページにも掲載しております。

http://pathology.or.jp/