博士（医学）堀内勝己
学 位 論 文 題 名Tr
eacherCollins
症候群本邦8症例におけるTCOF1遺 伝 子 解 析
学位論文内容の要旨【 緒言 】Treacher Collins
症候群(TCS，OMI!
d 154500)は胎生期の第―，第二鰓弓 の発育障害によって 生じる顎顔面の形態異常を主症状とする先天異常症候群である。主症状は顔面の形成異常 で，眼瞼裂斜下，頬部低形成，下眼瞼の部分欠損，下顎低形成，耳介形成異常，外耳道閉 鎖，伝音性難聴，不正咬合，口蓋裂などである。知能は大部分が正常であるが，難聴のた めに二次的な精神発達遅滞をきたす例がある。発症頻度 は5万人に1人と言われているが ，本邦における発症頻度はさらに低いものと推察される。遺伝形式は常染色体優性遺伝形 式をとり，家族歴を有する症例は40％で，残り60％は新 生突然変異によるものである。
1993年，連鎖 解析により5q32―5q33.
1に遺伝子座が決定され，1996
年 ポジショナルク
ローニングによ りT
COFl (Treacher Collins‑ん溜カces曲ett
j5伽dr伽eJ 遺伝子が責任遺伝子として単 離された。形DFi
遺伝子はexo
nl〜25よりなり，1，411
個 のアミノ酸からな るnuCl
eola
rphO
Spho
prot
einであ るtrea
Cleをコ ード する 。trea
cleは他のタン パク質と結合して核 と細胞質問を往復していると考えられており，7珊F！遺伝子の変異により
生 じ´ たtrea
cleは， 核小 体内 に局 在で きず 細胞 質に 散在 す るこ とが 知られてい る。
形n冂 遺伝 子の 変異 は， 現在 まで Tc
S68家系 において51種類が報告されている。 発症機構としては， 相同染色体のー方のアレルが変異，欠失することにより，遺伝子産生物が半減し病気を引 き起こすハプロ不全が考えられている。本邦においては．これまでTcSにお ける 責任 遺伝 子粥 卿の解析を行った報告はない。そ こで，本邦における1・csと7m冂
遺 伝 子 の 関 連 を 調 べ る 目 的 で ， TCS患 者 8例 の 弛 伽 遺 伝 子 解 析 を 行 っ た 。
【対象と方法】 北海道大学医学部附属病院形成外科および埼玉県立小児医療センターを受診 し， TCSと 診断 され た8症例 を 対象 とし た。 内訳は男性患者4例，女性患者4例で ，いずれも家族歴を 有さない散発例である。インフオームドコンセントに基づき本人ないし代諾者の同意を得 た後，採血を行い末梢血有核細胞よりDNAを抽出した。PcR−sSC
P分析に
よ るス クリ ーニ ング を行い，健常人の泳動パターンと 違いを認めた検体はDNA
シー クエンス解析を行っ た。欠失，挿入変異の認められたアレルのうち，塩基配列の解読が困難な症例に対し，TAクローニングを行い，塩基配列を確認した。
【 結果 】弛 湘遺 伝子 ，exon
l〜25のSSC
P解析を行い泳動パターンの違いよルシーク エンス解析を行った 結果，疾患の原因となる変異が8例中7例で検出された。これらはすぺて，
正 常ア レル と変 異ア レルのへテロ体であった。変異の 種類は，欠失変異が3例，挿 入変異 が2例 ，欠 失・ 挿入 複合 変異 が1例 ，exon領 域3 末 端の一塩基置換が1例であっ た。
欠失，挿入変異 例では全例フレームシフトにより早期終止コドンがっくられることが予想された。7例中6例の変異はこれまでに報告のない種類のものであった。 また，特定部位への変異の集中 は認められなかった。変異の検出されなかった1例ではexon
1〜25すべてー 571―

において SSCP解析およびシークエンス解析を行ったが，exon
23にC3938T(A1313V)の一塩基置換が検出されたのみで，この一塩基置換は健常人においても検出された。したがって，
これは一 塩基多 型(Single Nucleotide Polymor
phism；SNP)で あって，本疾患の病因となる変異ではないと考えた。
【考察】 現在ま で欧米を 中心に 報告され ている TCO
F1
遺伝 子の変 異は，欠失変異が32種類， 挿 入変 異が10種 類，ミス センス 変異が1種類， ナンセ ンス変異 が5種類，ス プライ
シング変 異が3種類で ，欠失 変異が全 体の6割弱をしめている。これらの変異は特定の部位への偏りがなく遺伝子全体にわたって存在しているのが特徴である。欠失，挿入変異はフレーム シフト により早期終始コドンが導かれる。今回の本邦症例で検出された7種類の変異の傾向も欠失変異が多く，これまでの報告例と一致し、欠失，挿入変異はフレームシフトによ り早期 終始コドンヘと変化していた。また，exon領域の3 末端における一塩基置換はこ れまで 1症例の報告があり、イントロンがスプライスされず早期終止コドンが出現することが確認されている。今回の症例においても、exonの部位に違い弦あるものの、
3 末 端 に お け る ー 塩 基 置 換 によ り 同様 な こ とが 生 じて い る と推 測 さ れる 。
TCO
F1
遺 伝子の変異は，今回の解析を含め家系ごとに異なっていることが多いが，同じ変異が複 数の家 系で認められているものもある。その中で唯一高頻度に見られるのが，1例でも検 出され たexon24の5塩基欠 失の変異 (nt4135delGAAAA)
であ る。これはこれまで報告のあ る変異 全体の16％(13/69家系） に相当 する。こ の部位 の塩基配列は，Aの連続配列とAAGの繰 り返し配 列がみ られ，こ のため にreplication slippageが起きて欠失が生じたものと推測される。また，他の一塩基および二塩基の欠失，挿入変異に関しても変異近傍の塩基配列の特徴よりrep
licationslippageが原因で変異が生じたと考えられる。
一方，欠失・挿入複合変異である25塩基欠失，3塩基挿入例については，欠失の前後にCTGGGGとCCCCAGの6塩基配列 が存在す る。こ の6塩 基がpalindromic siteとなり結 合し， その間の部分がループ構造を形成し欠失したと想定され，その欠失部にTTCの3塩基が挿入し，変異を持った塩基配列ができ上がったと推測される。
これら の結果より，TCO
F1遺伝子の一方のアレルに変異が存在すると、全く機能を有しな い 遺 伝 子 産 物 が 作 ら れ ， こ の こ と が TCSの 病 因 に な る と 考 え ら れ る 。
【結語】 今回の 報告は本 邦にお ける初め てのものであると同時に，検出された7種類中6種類の変 異はこ れまで欧 米で報 告されて いる51種類とは別な新奇変異であった。また，本邦におけるTCSの発症には欧米人同様，TCO
F1遺伝子が関与していることが解明された。
今後，TCOF1
遺伝 子のコー ドする treacleの 機能の解 明や，TCO
F1遺伝子に関わるその他の遺伝子 との相 互関係を明らかにすることが，TCS発症の病因や表現型の違いなどを解決するために必要な研究課題である。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 杉 原 平 樹
副 査 教 授 小 林 邦 彦
副 査 教 授 三 浪 明 男

学 位 論 文 題 名TreacherCollins症候群本邦8症例におけるTC
OF1遺伝子解析
Treacher Collins症候群(TCS)
は胎生期の第一，第二釼弓の発育障害によって生じる顎顔面の形態異常を主症状とする先天異常症侯群であり，症状は眼瞼裂斜下，頬部低形成，下眼瞼の部分欠損，下顎低形成，耳介形成異常，外耳道閉鎖，伝音性難聴，不正咬合，口蓋裂などである。発症頻度は5万人に1人と言われているが，本邦における発症頻度はさらに低いものと推察される。遺伝形式は常染色体缶性遺伝形式をとり，家族歴を有する症例は40％で，残り60％は新生突然変異によるものである。TC
Sの責任遺伝子であるTC
O
F1遺伝子の変異は，現在までTC
S68
家系において51種類が報告されている。発症機構としては，相同染色体の一方のアレルが変異，欠失することにより，遺伝子産生物が半減し病気を引き起こすハプロ不全が考えられている。本邦においては，これまでT
CSに韜ける責任遺伝子7rO
F1の解析を行った報告はなく，本邦におけるT
C
SとTC
O
F1遺伝子の関連を調べる目的で，TC
S患者8例のT
CO
F1
遺伝子解析を行った。解析にあたり，インフオームドコンセントに基づき本人ないし 代諾者 の同意を 得た。 対象とし た8例 の内訳は男性患者4例1女性患者4例で，いずれも家族歴を有さない散発例であった。解析の結果，疾患の原因となる変異が8例中7例で検出され，変異の種類は，欠失変異が3例，挿入変異が2例，欠失・挿入複合変異が1例，exon
領域3 末端の一塩基置換が1例であった。欠失，挿入変異例では全例フレームシフトにより早期終止コドンがっくられることが予想された。また，7例中6例の変異はこれまでに報告のない新奇のものであった。変異の検出できなかった1例ではexonl^‑25
すぺてにおいてSSCP
解析およびシークエンス解析を行ったが，exon23にC3938T(A1313V)の一塩基置換が検出されたのみで，このー塩基置換は健常人においても検出された。したがって，これは一塩基多型(
SingleNucleotidePolymor
phism;SNP)であって，本疾患の病因となる変異ではないと考えた。TCOF1遺伝子の変異は，今回の解析を含め家系ごとに異なっていることが多いが，同じ変異が複数の家系で認められているものもある。その中で唯一高頻度に見られるのが，7例中1例に検出されたexo
n24の5塩基欠失の変異(nt4135delGAAAA)であり，これはこれまで報告のある変異全体の16％(13/69家系）に相当する。この部位の塩基配列は，Aの連続配列とAAG―573―

の繰り返し配列がみられ，このためにスリップ複製が起きて欠失が生じたものと推測される。
また，他のー塩基韜よび二塩基の欠失，挿入変異に関しても変異近傍の塩基配列の特徴よル
スリップ複製が原因で変異が生じたと考えられる。一方，欠失・挿入複合変異である25塩基欠失，3塩基挿入例については，欠失の前後にCTGGGGとCCCCAGの6塩基配列が存在する。この6塩基がpal
indr
伽icsiteとなり結合し，その問の部分がループ構造を形成し欠失したと想定され，その欠失部にTTcの3塩基が挿入し，変異を持った塩基配列ができ上がったと推測される。これらの結果より，7℃卿遺伝子のー方のアレルに変異が存在すると、全く機能を有 し な い 遺 伝 子 産 物 が 作 ら れ ， こ の こ と が TCSの 病 因 に な る と 考 え ら れ た 。
公開発表にあたり、副査三浪明男教授より，1）形D阿遺伝子の変異にv
ariationが多い理由，2）変異の起きる原因，3）研究の臨床的意義について質問があり，次いで，副査小林邦彦教授より，1）発生段階での遺伝子産物の発現部位，2）変異をもった患者での鹸NAの発現の有無，3）変異が検出できなかった症例におけるその他の解析手段，4）7卿1遺伝子に多いと言われているSN
Psの意義 ，5）ピタミンAとこの遺伝子との関係について質問およびコメントがあった。次に主査杉原平樹教授より，l冫疾患の表現型と遺伝子変異の関連性について，
2）患者に遺伝子異常が見っかった後に両親の遺伝子異常が判明するケースの有無について質問があった。いずれの質問に対しても，申請者は自らの研究内容と文献を引用し，妥当な回答をした。最後に，遺伝子治療講座の崎山幸雄教授より，今回はすぺての症例が典型的なものであったが，今後，非定型例を解析していくことにより疾患の表現型と遺伝子との関連，お よ び 遺 伝 子 診 断の 意義 など が明 らか に なっ てい くだ ろう との コメ ント があ った 。
この論文は，本邦におけ るT
CSのZぬR遺伝子解析を初 めて行い，本邦のTcSの発症に欧米人同様北婀遺伝子が関与していることを明らかにした点で高く評価され，今後，TcSの発症原因や7ぬR遺伝子機能の解明にっながることが期待される。
審査員一同，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ
申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判定 した 。

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