博 士（医 学）加藤菜穂子
学位論文題名Regulation of Chk2 gene expressionlnlymphoidmalignanCieS：
inV01VementofepigenetiCnleChaniSmS
inHOdgkin SlymphomaCe111ineS（ リ ン パ 系 悪 性 腫 瘍 に お け る Chk2遺 伝 子 の 調 節 機 構 ：ホジキンリンパ腫細胞株におけるエピジェネテイック機構の関与）

学位論文内容の要旨
背景：Chk2
は種を超えて構造 が広く保存された核内セリン・スレオニンキナーゼで、DNA傷害下において活性化し、ゲノムの恒常性維持機構の一端を担う分子である。一且、放射線，抗がん剤等によりDNA損傷が生じると、Ataxia‑telangiectasia‑mutated(ATM)が速やかにりン酸化され、Chk2をりン酸化することによりChk2は活性化される。活性化
され た C
hk2はそ の下 流分 子で ある p53、E2Fl、PML、cdc25C、Brcal等を制御し、その結果として細胞周期停止、又はアポトーシスが誘導され、ゲノムの恒常性が維持される。
Chk2
ナ細胞ではDNA傷害（放射線）に対するアポトーシスの 誘導が低下していることが報告 さ れて いる。また、大多数にp53の変異を認め家族性に癌を多発するLi‑frau
menisyndromeに おいて、p53に変異のなぃ患者群でgermlineにChk2遺伝子変異が見っかったことから、p53同様癌抑制遺伝子のーっとも考えられている。
こうした癌抑制遺伝子の破綻が発癌や病勢の進行に関与すると考えられており、様々な癌細胞において、遺伝子変異や発現異常が報告されてきた。近年、癌抑制遺伝子のエピジ
エネティックな発現抑制

genesilencing が発癌または病勢進行の機序として注目されてきており、遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化またヒストン蛋白の脱アセチル化、メチル化といった修飾によルクロマチン構造が変化し｀転写抑制がなされることが知られている。
今回、DNA傷害下におけるゲノムの恒常性維持機構におい て重要な役割を果たすC
hk2分子について、リンパ系悪性腫瘍の細胞株を用い、その発現動態、制御機構について検討してみた。
結果
1．

9種類のりンパ系悪性腫瘍の細胞株(Hodgk
in's disease(HD)
3系統、Follicu
larlymphoma2系統 、Tcell leuke
mia1系統 、Bcell lymphoma2系 統 、Bur
kitt slymp
homa1系統）をそれぞれWe
stern blot、Northern blot
で蛋白、mRNAの発現ー 564ー

を 比 較 し て みた と こ ろ 、全 て の H
D細 胞 株で の み C
hk2の発 現 が 低下 し て い た。
2, Chk2
遺 伝子のゲ ノム解 析（シー クエン ス）を2系統の H
D細胞株 について 行った
ところ、特にChk2遺伝子の変異は認められなかった。このことからC
hk2の発現低下にエピジェネッティックな制御の関与が考えられた。
3. 工ピ ジェネ ティック 制御と して、ま ずChk2
プロ モーター 領域の D
NAの過 剰なメチル化に ついて検 討した 。HD細胞を DNAの脱メチル化剤(
5‑aza‑cleoxycitidine)で処理した ところ、 Chk2の発現 が増強 された。 このこと からChk2発現抑制の原因として、DNAの過剰なメチル化の関与が考えられた。
4. 次にヒストン蛋白の脱アセチル化について検討するため、ヒス卜ン脱アセチル化阻害薬く rnichostatinAISodiumbutylate）で HD細胞を 処理したところ、Chk2の発現が増強 された。このことから、C
hk2発現抑制の原因として、ヒストン蛋白の脱アセチル化も関与することが示唆された。
5．

C
hk2
プロモーター領域のヒストン脱アセチル化について、クロマチン免疫沈降法（Chipa8say）を用いて検討したところ、C
hk2が発現しているコントロール細胞と比較しHD細胞でアセチル化は低下していた。更にヒストン脱アセチル化阻害剤処理により、C
hk2プロモーター領域のアセチル化は回復することが認められた。また、ヒストンアセチル化と同様に

genesilencing の原因となるヒストンH3K9のメチル化について も、Chipassayを用い て検討したところ、HD細胞では著明にメチル化されていた。
6．

最 後に、ヒ ストン 脱アセチ ル化阻害剤（Sodiumbutylate）によるC
hk2発現の上昇 が 、HD細 胞に お け る放 射 線 感受 性に与 える影響 について 検討丶 した。Sodiumbutylate処理したH
D細胞では無処理の細胞よりも、放射線によるアポトーシスが強く誘導された。
結論
以 上の結果 より、 今回用い たH
D細胞 株におい てC
hk2の発 現はエピ ジェネティック機構により抑制されており、Sodiumbutylate等の薬剤投与によりその抑制機構を解除すると 、HD細胞に おける放射線感受性が上昇した。このことから、エピジェネティック機構に対する薬剤と従来の放射線や化学療法を組み合わせることにより、抗腫瘍効果を高め、より効果的な治療法になる可能性が示唆された。

― 565―

学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 秋 田 弘 俊

学位論文題名● ●RegulationofC
hk2g
eneexpress
10nlnlympho
idmalignanCleS：
inVOl
Ve
n1もntofepi
ge
neti
CmeCh
aniSmS
in
Hodgk
in sl
ymphomacelllines（ リ ン パ 系 悪 性 腫 瘍 に お け る Chk2遺 伝 子 の 調 節 機 構 ：ホジキンリンパ腫細胞株におけるエピジェネテイック機構の関与）

Chk2は主に放射線によるDN
A損傷時に活性化される核内セリン、スレオニンキナーゼで、アポト―シス、細胞周期停止に関与し、癌抑制因子のーっとして考えられている。近年、発癌や病期進行の要因としてエピジェネティクス機構による癌抑制因子の発現制御が注目されている。申請者は本研究において、リンパ系悪性腫瘍におけるC
hk2遺伝子の発現動態とエピジェネティクス機構の関与について検討した。
9種 類のり ンパ系悪 性腫瘍 細胞株を 用い、Northern blotに よりC
hk2m
RNAの発現を比較検討したところHodgkinlym
phoma(HL)
由来細胞株(3/3種）で著明な発現低下が認められた。これらの細胞株ではChk2
遺伝子異常がない事をゲノムシークエンスで確認した。申請者はエ ピジェネティクス機構による転写抑制の機序としてDN
Aのメチル化、ヒストン脱ア
セ チル 化 に つい て 、 それ ぞ れ DN
Aメチル化 阻害剤 5aza−deoxycit
idine (5aza)とHDACinhibitorであるsodiu
mbutylate(SB)を用い検討したところ、HL由来細胞においてC
hk2
mRNAの発現上昇が認められた。またC
hk2
遺伝子プロモータ―領域のヒストン修飾の関与を検討するためにアセチル化ヒストンH3、メチル化ヒストンH3K9の抗体を用い、クロマチン免疫沈 降法を 行った。 H
L由来細 胞L428に対しC
hk2
遺伝子発現の高い細胞株をコンロトー
ルとして使用した。L428
ではコントロールと比較しヒストンH3は脱アセチル化されており、
5aza、SBによルアセチル化の亢進が認められた。また、L428
ではコント口―ルと比較しヒストン H3K9は強く メチル化 されて おり、5aza処理により低下することが認められた。以上の結 果から 、HL由来細 胞株で はD
NAのメチル化とヒス卜ン脱アセチル化がC
hk2mR
NAの発現低 下に関 与し、Chk2プ ロモ― タ―領域のヒストンH3の脱アセチル化とH3K9のメチル化の関 与が示 唆された 。更に S
BによるChk2 mR
NAの発 現上昇と H
L由来細胞での放射線によるアポト―シス誘導への影響をフロ―サイトメトリーにより検討した。その結果、SB処ー566ー

理によりL428細胞の放射線後のアポトーシスの亢進が認められた。本研究ではHLでのChk2遺伝子の発現異常とその機序としてエピジェネティクス機構の関与を明らかにし、HLの病態 解 明 と 治 療 戦 略に 対し 新た な 知見 が得 られ 臨床 的に も重 要で ある と考 えら れた 。
公 開発 表に あた って 副査秋田弘俊教授からChk2下流分子であるp53のHL由来細胞株での性状について、他の機構によるC
hk2発現制御の可能性、エピジェネティクス機構に対する薬剤の治療応用への可能性について質問があった。各々の質問に対し申請者は、HL由来細胞でp53 m
RNA，蛋白が発現していること、悪性リンパ腫でChk2が蛋白レベルで低下している報告があることからエピジェネティクス以外の機構による制御の可能性があること、
S
Bにより放射線照射の感受性増加を認めることから従来の治療法と組み合わせることにより更なる抗腫瘍効果が得られる可能性について回答した。次いで主査畠山鎮次教授より、H
L由来細胞株のC
hk2遺伝子変異、染色体異常についての検討とエピジェネティクス制御に関与するC
hk2遺伝子プロモ―タ一領域の同定について質問があった。各々の質問に対し申請者は、Chk2の転写開始部よルゲノムシ―クエンスを行い遺伝子異常が認められなかったこと、HL由来細胞株では数的異常を含め複雑な染色体異常を有していること、Chk2
遺伝子プロモ―タ一領域と転写因子結合部位が同定されている旨を回答した。最後に、副査今村雅寛教授より、これまでに報告された悪性リンパ腫でのC
hk2の発現異常と比較し本研究で得られた新たな知見について、エピジェネティクス機構によるChk2発現制御と悪性リンパ腫以外の癌種との関連性、Chk2と相似的な働きを有するC
hklに対する検討、本研究が分子標的療法のターゲッ卜となる可能性ついて質問があった。各々の質問に対し申請者は、本研究でH
L由来細胞におけるCHk2 mRNAの転写制御機構が初めて明らかになったこと、肺癌や膣癌でもChk2発現制御にエピジェネテイクス機構の関与が示唆されていること、本研究ではアポ卜―シスの誘導を目的としていたためChklについては検討していないこと、今後臨床の場において個々の患者検体のChk2の発現を検討し分子標的療法として有用となる可能性について回答した。
本研究は悪性リンパ腫細胞株において癌抑制因子であるChk2遺伝子の発現制御を明らかにした点に意義を有し、今後分子標的療法のターゲットとなる可能性が期待される。審査
員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院博士課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （医 学） の学 位 を受 ける のに 十分 な資 格を 有す るも のと 判断 した 。

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