博士（医学）内田浮学 位 論 文 題 名

塩基性線維芽細胞増殖因子―キトサン複合体(bFGFーChitosan)
から のbFGFの 徐放 と活 性維 持 に関 する 研究
学 位論文内容の要旨

成長因子は細胞増殖と細胞分化を誘導し組織再生に大きく関与しており、シグナル伝達の中でも最も重要な生体分子であると広く認められている。しかし、成長因子は変性しやすく、そのため 、 室温 や 生 体内 (37°C)では、 短い期 間でしか 活性を 保つこと ができな い。こ の問題点 に対する解決策のーっは、「細胞」や「Scaffold」に大量かつ頻回に成長因子を直接投与することである。しかし残念なことに、この方法では感染や再生組織の腫瘍形成を惹起する可能性がある。
それ以外の解決策としては、生体活性物質を徐放させるドラッグデリバリーシステムの応用がある。この技術により適当な量を適切なタイミングで長い期間、目的とする物質を徐放させることが可能になる。この技術を応用すれば、成長因子を長期間徐放させることが可能になり、良好な組織再生が得られると考えられる。
塩基 性線維 芽細胞増 殖因子 (basic Fibroblast GrowthFactor以下bFGF)
は細胞増殖因子の1っであり、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの様々な細胞に対し細胞増殖を促進 させる 成長因子 として 報告されている。実際に、bF
GFの臨床応用は創傷治癒の分野で既に実行 されて おり、優 れた結 果が報告されている。bFG
F
は細胞外マトリックスに含まれるへパラン硫酸またはへパリンなどの多糖類と複合体を形成し内部に貯蔵されること、細胞外マトリック
スと の複合 体が生体 内にお ける変性や酵素分解からbFGFを保護している可能性などが報告されてい る。したがって、多糖類のうちの1っであるキトサンは、生体内と同じ温度下でも同様に生体活性物質を貯蔵できる可能性があると著者らは考えた。
キトサンに生理活性物質を導入する手法には、共有結合、ポリイオンコンプレックスを用いる手法、埋入・混入による手法が考えられる。共有結合は反応に専門知識が不可欠であるが、安定性が高く、また徐放化等の制御が可能であることより、大いに発展性が期待されるため、この共有結 合を用 い、新規 のb
FGF‐キ トサン化 合物（ 以下bF
GF‑Chitosan)を 開発し た。共有結合で合 成 した bFG
F‑Chitosa
nは 、 生体 内 と 同じ 37
゜Cと いう増殖 因子にと っては 過酷な環 境下におい て、ポ リイオン 結合や 分子間結合よりも安定性があると考えられる。本研究では、b
FGF
はSH‑Chitosanと共 有 結 合で 結 合 して い る ため よ り 長期 の 徐 放が 得 ら れ ると仮 説を立て た。
本研 究 で は、 第 一にSH‑ChitosanとbFGFを 結合さ せる方法 を確立す ること 、次に成 長因子が 変 性し や す い環 境下 で14日後に bFG
F‑Chitosan
複 合体か ら徐放さ れたbF
GFの 量を測定 し、bFG
Fが活性を保っていることを証明することを目的とした。
SH‑Chitosanの作り 方の詳 細は、過 去の論 文を参考 にした。要約すると、4gのキトサン粉末に1％の酢酸200mlを加えて、2％(w/v)のキトサン溶液(
pH2.
68)を作製する。キトサン溶液(3.
5− 319−g） に 50 mMの sodium phosphate buffer solution (44 ml， pH8.0)と 2mMの EDT
Aお よ び150mMのNaClに溶 解 し 、最 後 に 112 mgの 2‑
Iminothiolaneを 加 え 、100％窒 素 下で 室温で 3時間 攪拌さ せて合成する。キトサンと反応しなかった2‑Iminothiolaneは膜透析にて取り除き、
チ オ ール 基 が 修飾 さ れ た キト サ ン (SH‑Chitosan)を 作成 した。 次にSH‑ChitosanにbFGFを導入し 、bFGF‑Chitosanを作成 した。実 際の化 学反応は 以下の ようなものである。まず、3.0mlの 0.1MNH4HC03 buffer (pH 8.0)に 1.
0 mgの SH‑Chitosanを 溶 か し た溶 液 を 作製 し 、 bFGF(1.
0 mg)を 添 加 した 。 bFGFは 熱で容易 に変性 してしま うため 、この混 合溶液 を7日 間4°Cの低温 でゆっ くりと反 応させ た。っぎ に、SH‑Chitosanとジス ルフィド結合しなかったbFGFを取り 除 くた め 、 7日 間 4゜ C
で 透析膜 （分子量 100，000)を用い て透析し た。SH
‑Chitosanに対するbF
GFが結合し た割合を 決定す るため、 アミノ 酸分析を 行った 。凍結乾燥したbF
GF‑Chitosanを高 真空脱 気下、6NHC1で加水分 解（110℃、24h）し、 遊離ア ミノ酸と グルコ サミンを アミノ酸 分析器 を用いて 測定し た。
凍結 乾 燥 した bFGF‑Chitosan(1.0mgを1m1のキチ ナーゼ （2ルg′ml）とキト サナーゼ （4pg／ml） の混 合 溶 液 に加 え 、 37゜ Cにて 溶 解 した 。 1、4、7、10、14日目に 放出され たbFG
Fを含 有する 上清を新 しい溶 液と交換 した。採取したbF
GFを含有した上清はサンプルとして採取し 、 ．80° Cで 冷 凍 保 存し た bF
GF． C
hitosanから 放 出し たb
FG
Fの量は ELISAを 用いて評 価した。 また、 14日目に放 出され たb
FG
Fの活性 を調べ るため、 細胞増 殖能を評 価した 。細胞増殖アッ セイは ヒト線維芽細胞を播種し、サンプル溶液を含んだ培養液で2日間培養した。細胞数はWS
T・8法にて吸 光度を測 定する ことによ り計測 した。コ ントロ ールはbF
GFが 入って ない群と14日間 37°Cで暴露さ せたbF
GFを 入れた群 を用い た。
アミ ノ酸分 析の結果ではbF
G
F自体から分解されたアミノ酸とキトサンから分解されたD．グル
コサ ミンが bFG
F．C
hit08
anに含 まれるこ とが判 明した。 S
H一chitosan
分子 に対す るbFG
F分子の割 合は1対160であった 。bF（押 は経時的 に量は 減少する ものの 、14日間放 出され ることを
確 認 した 。 bF
GFは 24時間で39． 7pgの bF（ 押 が 放出 し 、 14日 後 は 1． 6pgの bFGFが放 出された 。 また 、 14日 目 に 徐 放さ れたbF
GF
群は 、2種類のコ ントロ ール群と 比較し有 意に細 胞増殖
能 を 有し て い た。 こ の 結 果より、 bFG
F・Chit08anから 徐放さ れたbF
GFが37゜Cの 恒温室で 温めら れても 、14日間に わたり 細胞増殖 能を維 持したこ とが証明 できた。また、2種類のコントロ ー ル群 の 間 での 有 意 差 はなかっ た。この ことに より、bF
GF単独を14日 問37゜Cで曝露 する
とそ の活性 はほとん ど失わ れてしま うことと が示さ れた。
本研 究の限 界はbFG
Fの徐放と細胞増殖能の評価がinvitroでしか行われていないことである。
今後 の研究 において 、inviv0の評 価が必要 である 。
共有 結 合 にて bFGF‐ Chitosanが 作 製さ れ た こと が 確認で きた。こ の合成 物からbFGFが14
日問 活性を 保ったまま徐放されたことをinvitroで証明した。この合成物で作製した8caffoldが欠 損 し た 組 織 の 再 生 を 促 し 、再 生 医学 の 分 野で 応 用 でき る 可能 性 が 大い に ある 。

ー 320 ‑

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 三 浪 明 男
副 査 教 授 安 田 和 則
副 査 教 授 藤 堂
省学 位論文題名

塩基性線維芽細胞増殖因子―キトサン複合体(bFGF―Chitosan)
か らの bFGFの 徐 放と 活性 維持 に関 す る研 究

塩 基性 線 維 芽 細胞増 殖因子(basicFi
broblastGrowt
hFa
ctor以下bFGF)は細胞 増殖
因 子の1っであ り、線維 芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの様々な細胞に対 し細胞 増殖を促 進させ る成長因 子として 報告さ れている。実際に、bFGFの臨床応用は創 傷治癒 の分野で 既に実 行されて おり、優 れた結 果が報告されている。b
F
GF
は細胞外マトリックスに含まれるへパラン硫酸またはへパリンなどの多糖類と複合体を形成し内部に貯 蔵され ること、 細胞外 マトリッ クスとの 複合体 が生体内における変性や酵素分解からbFGFを保護し ている可 能性な どが報告 されて いる。し たがっ て、多糖 類のうちの1っであるキトサンは、生体内と同じ温度下でも同様に生体活性物質を貯蔵できる可能性があると考えた。キトサンに生理活性物質を導入する手法には、共有結合、ポリイオンコンプレックスを用いる手法、埋入・混入による手法が考えられる。共有結合は反応に専門知識が不可欠であるが、安定性が高く、また徐放化等の制御が可能であることより、大いに発展性 が 期 待 さ れ る た め 、 こ の 共 有 結 合 を 用 い 、 新 規の bFG
F― キ トサ ン 化 合物 （ 以 下bFGF‑Chitosan)を 開 発 した 。 共 有 結合 で 合 成し た bF
GF‑Chitosanは、 生 体 内 と同 じ37
゜Cと いう増殖 因子に とっては 過酷な環 境下に おいて、 ポリイ オン結合 や分子間結合
よ り も 安定 性 が あ ると 考 え られ る 。 本研 究 では 、bFGF
はSH‑Chitosanと共 有結合で 結合 し て い る た め よ り 長 期 の 徐 放 が 得 ら れ る と 仮 説を 立 て た。 本 研 究で は 、 第一 にSH‑Chitosanと b
FGFを結 合 さ せる 方 法 を確 立 する こと、次 に成長因 子が変 性しやす い
環 境 下 で 14日 後 に b
FGF‑
Chitosan複合 体 か ら徐 放 さ れた bFG
Fの 量 を測 定 し 、bFGFが活 性を保 っている ことを 証明する ことを目 的とし た。採取したbFGFを含有した上清はサン プ ル と し て 採 取 し 、‑80゜Cで 冷 凍保 存 し た b
FGF‑
Chitosanか ら 放 出し た bF
GFの 量は ELISAを 用 い て 評 価 し た。 ま た 、14日 目 に放 出 さ れた bFG
Fの 活 性を 調 べ るた め 、細胞増殖能を評価した。細胞増殖アッセイはヒト線維芽細胞を播種し、サンプル溶液を含ん だ 培 養液 で 2日 間培養し た。細胞 数はWST‑8法にて 吸光度 を測定す ること により計 測
し た 。 コ ン ト ロ ー ル は bFGFが 入 っ て な い 群 と 14日 間 37゜ Cで 暴 露 さ せ た bF
GFを 入れ た 群 を用 い た 。bF
GF
は 経時的に 量は減 少するも のの、 14日間放出 される ことを確 認し た 。 また 、 14日目に 徐放され たbF
GF
群は 、コント ロール と比較し 有意に 細胞増殖 能を 有して いた。本 研究の 限界はbF
GFの 徐放と 細胞増殖能の評価がinv
itroでしか行われて いない ことであ る。今 後の研究において、invivoの評価が必要である。共有結合にて− 321←

bFG
F‑Chitosanを 作 製し 、 こ の合 成 物 から bFG
Fが 14日間活性 を保っ たまま徐 放されたこと をinv
itroで証 明した 。
審査 に 当 た り、 藤 堂教授か ら、bF
GFに 注目した 理由お よびCh
itosanを 利用した 理由につ いて質 問があっ た。bF
GFが 既に臨床 応用さ れていてその有効性・安全性が確立している点をC
hitosanにはアミノ基がっいており化学修飾しやすい点を挙げ適切に回答した。
安 田 教授 か ら は 、invivoにお けるbFGF‑Chitosanの分 解とbF
GFの 徐放され る機序と 熱に よ って bFGFが 失 活 しな か っ た機 序 に つい て 、さ らには bFGF‑Chitosanの 分解され る
最適 なcurvepatternについ ての質問 があっ た。Chitosan
が 生体内で はlysozyme
により分 解 され う る 点 とChitosanとbFGFが高 分子化合 物とな り失活を 防いだ 可能性を 過去の文献 を引用 し回答し た。ま た、常に同程度に緩やかに分解させるcurvepatternが最適である と回答 した。三 浪教授 から他の 増殖因 子やサイ トカインなどをbFGFのかわりに導入できる可能性についての質問があった。同様な手技を用いて、チオール基を含むたんぱく質を C
hitosanに導入 できる 可能性を 述べた 。
今 回発表し た方法は 他のgrowt
hfactorに対しても応用できる可能性があり、論文記載
し た scaffold materialは 再 生 医 学 へ の 応 用 が 期 待 で き る も の と 考 え ら れ た 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ 申請 者 が 博 士（ 医学） の学位を 受ける のに十分 な資格 を有する ものと 判定した 。

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