第２回
体細胞遺伝⼦検査の検査精度に関する調査研究︓
肺癌 EGFR 遺伝⼦変異検査

研究報告書

⽇本病理学会 医療業務委員会
精度管理委員会
平成 29 年 2 ⽉ 12 ⽇ 報告⽬次

1. 背景および⽬的 ........................................................................................ 3
2. ⽅法 .................................................................................................... 3
3. 結果 .................................................................................................... 5
4. 考察 .................................................................................................... 7
5. 今後の対応 ............................................................................................ 7
6. 参考⽂献............................................................................................... 8
7. 研究組織............................................................................................... 8
8. 謝辞 .................................................................................................... 9※ 本報告書に記載のある別添資料 3 および 4 は，参加医療機関および本調査研究関係者⽤の報告資料となっている．

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1. 背景および⽬的
近年，病理組織・細胞検体を⽤いた悪性腫瘍の体細胞遺伝⼦検査は急増している．特に遺伝⼦変異検査については，年間約 10 万件が治療選択のためのコンパニオン診断として現在実施されており
1)，検査項⽬も肺癌における EGFR 変異検査 2)，⼤腸癌における KRAS 遺伝⼦変異（現在は RAS変異へ移⾏ 3）），消化管間質腫瘍（GIST）における KIT 遺伝⼦変異検査に加え，2015 年からは悪性⿊⾊腫における BRAF 遺伝⼦変異検査が新たに加わり，今後さらに増加する⾒込みとなっている．このうち肺癌 EGFR 変異検査は，その半数以上を占めており，多くは登録衛⽣検査所（いわゆる検査センター）によって実施されている．当該検査法については，登録衛⽣検査所において開発された薬事未承認検査法（LDT）法に加えて，近年 Scorpions-ARMS 法，Cobas 法が相次いで体外診断⽤医薬品（IVD）として承認され，医療機関における導⼊・実施がより容易となった．⽇
本病理学会精度管理委員会による病理学会認定施設や登録施設を対象とした 2014 年のアンケー
ト調査では，本検査の院内実施率は約 8%，また厚⽣労働科学研究費補助⾦研究班（桑⽥班）によるがん診療連携拠点病院を対象とした調査でも，ほぼ同様の結果が得られ，医療機関での実施が徐々に進んでいることが明らかとなった．
⼀⽅，これら遺伝⼦変異検査は分⼦標的治療のコンパニオン診断として治療選択に直結していることから，より厳密な精度保証体制が求められるが，医療機関で実施される検査精度の実態については，いまだ把握出来ていない．さらには今後，特に肺癌領域では，組織検体を使⽤したマルチプレックス遺伝⼦診断（いわゆるクリニカル・シーケンス）の臨床導⼊も検討されており，実施施設における検体取り扱いなど，質保証体制の把握が重要となっている．また将来的には外部精度評価（EQA）体制の構築が求められる.
本研究では，昨年度に引き続き，国内の医療機関における体細胞遺伝⼦検査（とくに遺伝⼦変異検査）の検査精度や検査実施体制を把握するため，①EGFR 変異検査を対象とした精度調査ならびに②本研究の参加医療機関を対象としたアンケート調査を⾏った．

2. ⽅ 法1) 参加医療機関
本調査研究は，昨年度⾏った第⼀回調査の参加医療機関，⽇本病理学会認定施設のうちメーリングリスト登録のある施設への電⼦メール案内，⽇本病理学会や⽇本臨床細胞学会ホームページ上およびニュースレターによる告知を⾏い，本研究への参加申込のあった⾃施設で EGFR 変異検査を実施している医療機関 29 施設を対象に⾏った．
32) リファレンス検査
協⼒企業によるリファレンス検査は，IVD 承認製品販売企業 2 社，登録衛⽣検査所 4 社，その他企業 1 社の計 7 社において⾏った．

3) FFPE 標準サンプルを⽤いた精度調査
精度調査には，遺伝⼦改変より作製された変異型の細胞株から作製され，⽶国 CAP サーベイにおいても利⽤実績のある Horizon Diagnostics 社製 FFPE 標準サンプル 3 種を⽤いた（下表）． 研究事務局より，FFPE 標準サンプルの⼀⻫発送（4℃）を⾏い，その到着後 2 週間以内に各医療機関において FFPE 標準サンプルからの EGFR 変異検査を実施した．各医療機関は，所定の記⼊フォーム（別添資料 1）へ結果を記⼊後，研究事務局へ返送した．

使⽤した FFPE
標準サンプル

サンプル#1

サンプル#2

サンプル#3

5% EGFR L858R
mutant type(HD129)

5% EGFR L861Q
mutant type(HD132)

20% EGFR T790M
mutant type(HD126)

4) 検査実施体制に関するアンケート調査
本研究では，検査実施体制に関するアンケート調査を実施した（別添資料 2）．

5) 調査研究のスケジュール
本研究は，概ね以下のスケジュールで実施された．
申込受付期間2016 年 8 ⽉下旬〜10 ⽉上旬

研究事務局からの送付期間

2016 年 10 ⽉中旬〜10 ⽉下旬

各研究協⼒施設からの返送期間

2016 年 11 ⽉上旬〜11 ⽉中旬

調査結果の解析期間

2016 年 12 ⽉上旬〜2017 年 1 ⽉下旬

調査結果の開⽰時期

2017 年 2 ⽉上旬

43. 結 果
今回の参加医療機関（29 施設）の施設区分は．都道府県がん診療連携拠点病院が 8 施設（28%），地域がん診療連携拠点病院が 18 施設（62%），その他が 3 施設（10%）であった．また、参加医療機関において使⽤されている検出⽅法は，IVD 法が 9 施設，⾮ IVD 法が 20施設であった．参加医療機関および協⼒企業における精度調査結果を図 1 に⽰す．
サンプル#1 の L858R 変異型では 28 施設（97%）で変異が検出できた．検出できなかった 1 施設については，解析⽅法としてダイレクトシーケンス法/ Fragment（length)解析法/ Cycleave 法（3 法を組み合わせ）を使⽤していた．サンプル#2 の L861Q 変異型は 21 施設 (72%)で検出できた。検出されなった 8 施設(28%)の施設では、当該変異型の測定が対象外となっていた．また，サンプル#3 の T790M 変異型では，28 施設（97%）で変異が検出できた.検出されなかった 1 施設
においては当該変異型が測定対象外となっていた．IVD 法（Therascreen 法 [Scorpions-ARMS法]および Cobas 法）を使⽤していた 9 施設では，サンプル#1，#2，#3 のいずれのサンプルにおいても，変異型が適切に検出できた．今回、サンプル#2 L861Q、サンプル#3 T790M の変異型が検索対象外となっていた施設では、Q-Probe 法（8 施設）や Fragment (length) 解析法（1 施設）が⽤いられていた.
協⼒企業（7 社）で実施された 9 検査（IVD 法︓5 社，⾮ IVD 法︓4 社 [PNA-LNA Clamp法，PCR-Invader 法，ダイレクトシーケンス法，Q-probe 法]）において、8 検査 (89%) では変異型が適切に検出できた．検出されなかった 1 検査は、ダイレクトシーケンス法であり，5%以下の低頻度の変異型であるサンプル#1，#2 にわずかなピークが検出されたものの，変異なしと判定された．同
企業では、診療⽬的では IVD 法が使⽤され，ダイレクトシーケンス法は研究⽬的として使⽤されている（今回は参考データ）. 詳細は別添資料 3 参照

図 1 参加医療機関および協⼒企業における精度調査の結果
5アンケート調査のうち，遺伝⼦変異検査の実施体制に関する調査結果を図 2 に⽰す．施設認定では，ISO15189 認定施設は全体の 14%（4/29 施設）にとどまった（a）．遺伝⼦変異検査の実施部⾨としては，病理検査・診断部⾨が全体の半数以上を占めていた（b）．内部精度管理体制は 70%近い数値で整っていた．また，EQA への参加は 53.6%と，前回の調査（28%）から倍増していた（c）．その他の結果は，別添資料 4 にまとめた．

(a) 検査室（実施区域）の認定等取得状況について(b) 遺伝⼦変異検査の実施部⾨について(c) SOP 整備・内部精度管理・外部精度評価について

図 2 遺伝⼦変異検査の実施体制に関するアンケート調査の結果

6

4. 考 察1) ⾮ IVD 法における検出対象変異型について
現在，EGFR 遺伝⼦では数多くの変異の種類が報告されているものの，治療効果予測上の意義が不明なものが多数含まれている 2)．このうち IVD 法では，主要な感受性変異である ex21/L858R 変
異や ex19/DEL 変異に加え，EGFR 阻害剤治療の効果予測上の意義が明らかとなっている低頻度の感受性変異（ex18/G719X 変異, ex21/L861Q 変異）や抵抗性変異（ex20/T790M 変異，ex20/INS 変異）の検出が可能となっており，保険点数は 2500 点での算定が可能となっている．⼀⽅，⾮ IVD 法でも保険診療が可能（この場合は 2100 点）となっているが，どの範囲までの変異型を検出するかは，医療機関側に委ねられている．実際本調査においても，前回の調査同様に⾮ IVD法実施施設間で変異検出項⽬数にばらつきが認められた．ex19/DEL 変異，ex20/T790M 変異，ex21/L858R 変異の検出はほぼ全ての施設で導⼊されていたが，ex20/INS 変異，ex20/S768I変異はそれぞれ 25％，15％の導⼊にとどまった．また，今回の調査対象の ex21/L861Q 変異検査の導⼊率は 60％（⾮ IVD 法使⽤の 20 施設中 12 施設）であり，実際に残りの 40％（8 施設）で変異は検索されていなかった．5%以下の低頻度の変異型のうち，効果予測上の意義が明らかとなっている ex18/G719X 変異（1.9%），ex21/L861Q 変異（1.6%），ex20/INS 変異（2.1%）の 3 変異型を併せると全体の 5%以上を占める．これらの変異型の検出を⾏うことについて検討していく必要がある.

2) 検出精度について
本精度調査では，前回と⽐較し，変異割合の低い FFPE 標準サンプルを⽤いたが（サンプル#1 と#2 は 5%，#3 は 20%），IVD 法を⽤いた参加医療機関においては，全サンプルで変異が検出された．また⾮ IVD 法においても，検出が⾏われなかった場合を除き，概ね全サンプルで変異が検出され（サンプル#1︓95% [19/20 施設]，#2︓100% [12/12 施設]，#3︓100% [19/19 施設]），参加医療機関においては適切な検出感度で EGFR 変異検査が実施されていると考えられた．

5. 今後の対応
本調査研究の結果および課題を踏まえ，EGFR 変異検査を含め，組織や細胞検体を⽤いた体細胞遺伝⼦検査の外部精度評価の事業化について，⽇本病理学会・精度管理委員会において協議を⾏う．

76. 参考⽂献
1) 第 7 回 遺伝⼦・染⾊体アンケート調査報告書, ⼀般社団法⼈ ⽇本衛⽣検査所協会, 20142) 肺癌患者における EGFR 遺伝⼦変異検査の⼿引き 第 3.05 版，⽇本肺癌学会，20163) ⼤腸がん診療における遺伝⼦関連検査のガイダンス 第 3 版, ⽇本臨床腫瘍学会, 2016

7. 研究組織
本研究は，⽇本病理学会・医療業務委員会 精度管理委員会の本研究の担当委員が，研究事務局運営を含め主体となって⾏い，また厚⽣労働科学研究費補助⾦「先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築」研究班との合同作業として進めた．
⽇本病理学会 医療業務委員会 委員⻑

森 井

⽇本病理学会 医療業務委員会 精度管理委員会 委員⻑

増 ⽥ しのぶ⽇本病理学会 医療業務委員会 精度管理委員会 委員・担当委員

畑 中

豊 *,***桑 ⽥

健 **⽇本病理学会 医療業務委員会 精度管理委員会 委員

英 ⼀

⽻場礼次

鍋島⼀樹

中 ⻄陽 ⼦

⼤林千穂

⻤ 島宏

⽊佐貫篤

笹 島 ゆう⼦
滝 野寿

津 ⽥均和 ⽥了吉⽥正⾏*︓研究事務局**, ***

︓厚⽣労働科学研究費補助⾦研究班 **研究代表者，***研究分担者

8. 謝 辞本研究実施にあたり，FFPE 標準サンプルをご提供頂いた株式会社理研ジェネシス，シスメックス株
式会社に深謝致します．また IVD 承認製品販売企業でのリファレンス検査を実施頂いた株式会社キアゲン，ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社，登録衛⽣検査所でのリファレンス検査を実施頂いた株式8

会社エスアールエル，株式会社 LSI メディエンス，株式会社ビーエムエル，株式会社保健科学研究所，さらにリファレンス検査に参加協⼒頂きましたアークレイ株式会社に深謝致します．

9日本病理学会・精度管理委員会 および 厚生労働科学研究費補助金「先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築」研究班 合同

第２回
肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究

別添資料 1

2016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究

検査結果記入用紙
ご施設名（お名前（））

本調査研究で使用された測定・解析方法についてお教えください ----------------------------------！ IVD 法をご使用の場合は，以下「①」にチェックを入れてください．
！ 非 IVD 法（home-brew 法）をご使用の場合は，以下「②-1」「②-2」の両方にチェックを入れてください．

①ご使用の IVD 法（キットと医療機器）□Scorpions-ARMS 法（キアゲン社：therascreen EGFR 変異検出キット RGQ）
□コバス法（ロシュ社：コバス EGFR 変異検出キット）②-1 ご使用の非 IVD 法（home-brew 法）の検出原理□ダイレクトシーケンス法□Q-Probe 法□NGS 法

□PCR-SSCP 法□Fragment（length）解析法□PNA-LNA Clamp 法□PCR-RFLP 法□PCR-Invader 法□iPLEX 法□Cycleave 法□SMAP 法□その他（）②-2 上記方法を用いたルーチンにおいて検査（検出）対象にしている変異タイプ（種類）エクソン 18： □G719A□G719S□G719C

エクソン 20： □挿入変異□S768I□T790M

エクソン 21： □L858R□L861Q

エクソン 19： □欠失変異

1/2

2016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究

検査結果記入用紙本調査研究での測定・解析結果についてお教えください -------------------------------------------

項目

EGFRmt #1

EGFRmt #2

EGFRmt #3

得られた DNA 抽出液のDNA 濃度 (ng/uL)[吸光度法での測定:必須]得られた DNA 抽出液のDNA 濃度 (ng/uL)[蛍光法での測定:任意*]DNA の得られた DNA 抽出液の収量と溶液量 (uL)品質
Abs260/280(ratio)

コメント欄（なにかあればご記入ください）

検出結果

変異の検出

□ 変異なし□ 変異なし□ 変異なし□ 変異あり□ 変異あり□ 変異あり□ 測定不能□ 測定不能□ 測定不能「変異あり」の場合
変異タイプ

コメント欄
（なにかあればご記入ください）*: 測定していない場合は，記入不要です2/2日本病理学会・精度管理委員会 および 厚生労働科学研究費補助金「先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築」研究班 合同

第２回
肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究

別添資料 22016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究

体細胞遺伝子検査に関するアンケート調査用紙
ご施設名（お名前（））

ご施設に関するご質問 ------------------------------------------------------------------------ご施設の種別をお教えください□都道府県がん診療連携拠点病院□地域がん診療連携拠点病院□その他

EGFR 変異検査全般に関するご質問 -----------------------------------------------------------(1) 当該検査で，使用する検体の頻度について検体種別にお教えください．
！ 目安は，「よく使用」は全体の 30%以上，「たまに使用」は 5～30%未満，「ほとんど使用せず」は 5%未満です．
「FFPE」は「ホルマリン固定パラフィン包埋」の略です．

① 新鮮凍結組織□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず② 手術・切除検体の FFPE 組織□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず③ 生検検体の FFPE 組織□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず④ 胸水の FFPE セルブロック□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず⑤ 擦過細胞診検体□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず⑥ 気管支洗浄液（液状検体）□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず⑦ 胸水（液状検体）□よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず⑧ 生検針先洗浄液（液状検体） □よく使用□たまに使用□ほとんど使用せず⑨ その他（□たまに使用□ほとんど使用せず） □よく使用(2) 当該検査の年間実施件数および EGFR 変異陽性率についてお教えください．
貴施設

年間 （）件EGFR 変異陽性率 （）%！ 関連病院等，貴施設以外の検査も受託している場合は，別途以下もご記入ください．

貴施設以外

年間 （）件EGFR 変異陽性率 （）%(3) 検体提出から結果返却までの時間（Turn Around Time; TAT）について，平均的な日数をお教えください．
□3 日以内□4-7 日□8-10 日□11-14 日

1/4□15 日以上

2016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究(4) 当該検査の実施において，一度の測定作業で行う検体数の平均をお教えください．
□1～2 検体□3～5 検体□6～9 検体□10 検体以上

EGFR 変異検査の方法・実施に関するご質問 ---------------------------------------------------貴施設で行われている当該検査で使用する DNA の抽出方法についてお教えください．
①FFPE 検体から DNA 抽出する場合□キアゲン社：QIAamp® DNA FFPE Tissue キット□ロシュ社：コバス® DNA プレパレーションキット（FFPE）□プロメガ社：Maxwell® RSC DNA FFPE Kit□その他（）②FFPE 検体以外から DNA 抽出する場合□キアゲン社：QIAamp® DNA Mini Kit もしくは Micro Kit□ロシュ社：DNA Isolation Kit for Cells and Tissues□プロメガ社：Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit□その他（）③自動抽出装置を使用している場合□キアゲン社：QIAcube□プロメガ社：Maxwell® 16 Instrument□その他（）EGFR 変異以外の体細胞遺伝子の変異検査に関するご質問 -------------------------------------(1) 大腸癌 RAS 変異検査の実施状況についてお教えください．院内実施にチェックされた場合は，検査法にもチェック入れてください． ！ 「IVD」は「体外診断用医薬品」の略です．
□外注□院内実施 ⇒ □IVD 法（MBL 社 RASKET 法）□その他（）(2) 悪性黒色腫 BRAF 変異検査の実施状況についてお教えください．院内実施にチェックされた場合は，検査法にもチェック入れてください． ！ 「IVD」は「体外診断用医薬品」の略です．
□外注□院内実施 ⇒ □IVD 法（ロシュ社コバス法）

2/4□その他（）

2016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究(3) 以下の遺伝子変異検査について，院内実施されているものをお教えください．
□GIST KIT 変異検査

□GIST PDGFR 変異検査

□膵癌 KRAS 変異検査

□肺癌 KRAS 変異検査

□大腸癌 BRAF 変異検査

体細胞遺伝子の変異検査実施体制に関するご質問 ----------------------------------------------(1) 検査室（実施区域）の認定・認証取得状況についてお教えください (複数回答可)．
□ISO15189 認定□CAP 認定□その他（□CLIA 認証）

□該当なし
(2) 遺伝子変異検査の実施部門についてお教えください．
□検査部門□病理検査・診断部門□遺伝子検査・診断部門□研究室/研究部門□その他 ()(3) 遺伝子変異検査は，日常何名体制で実施しているかお教えください．
□1 名未満（1 名が他の業務も担当）

□1 名

□2 名

□3 名以上(4) 遺伝子変異検査の検査担当者の配置についてお教えください．
□部門内でローテーションを行うため，一定期間ごとに検査担当者は変わる．
□専任を配置しているため，検査担当者は基本長期間（2 年以上）固定されている．
(5) 遺伝子変異検査の標準操作手順書(SOP)の整備，内部精度管理の実施および記録保管の状
況についてお教えください．
① 検体前処理に関する SOP の整備：

□整備している□整備していない② 変異検査法に関する SOP の整備：

□整備している□整備していない③ 内部精度管理の実施：□実施している□実施していない④ 内部精度管理の実施記録の保管：□整備している□整備していない⑤ 外部精度評価への参加：□参加している□参加していない

本調査研究に関するご質問 --------------------------------------------------------------------(1) 今回，本調査にご参加頂き如何でしたでしょうか．
□満足

□やや満足

□どちらともいえない

3/4

□やや不満

□不満

2016 年度 肺癌 EGFR 遺伝子変異検査の検査精度に関する調査研究(2) 海外では EGFR 変異検査等の体細胞遺伝子検査の外部精度評価を行う実施機関がありますが，国内でもこうした機関は必要とお考えでしょうか．
□必要である□不要である□わからない(3) 今回の調査研究では、調査サンプル数を 3 サンプルとしましたが、適当だったでしょうか．
□適当な数だった□減らすもしくは増やしたほうがよい ⇒ （）サンプルくらいが適当(4) 来年度，同様の内容の調査研究を行った場合，ご参加されますか．
□参加したい□参加したくない□現時点ではわからない(5) 今回の調査研究で，お気づきの点，改善が必要とお感じの点がございましたら，お教えください．

アンケートは以上となります．
ご協力頂きありがとうございました．

4/4