博 士 （生 命科 学） 細口健作
学位論文題名
Bio−organic chemistry of protein glycosylation（夕ンパク質の糖鎖修飾に関する生物有機化学研究）

学位論文内容の要旨
糖鎖修飾はタンバク質 の翻訳後修飾の1つとして知 られており、ヒトの全夕ンパク質の50％程 度は N
結 合型 あ るいは〇結合型糖鎖により修 飾を受けていると言われている。糖鎖は細胞間コミュニケー ションやタンバク質の品質管理など、生命を維持していく生物学的現象のみならず、ガン の転移やウィルス感染などの疾病への関与も示されるなど、糖鎖生物学に関する研究が精 力的に行われてきた。しかしながら、一般的に糖夕ンバク質上の糖鎖構造は多様かつ不均 一であり、遺伝子学的手法を用いた均一な糖鎖構造を有する糖夕ンバク質の調製が困難で あることから、生化学的手法と有機化学的手法の融合が糖鎖生物学研究の推進に必要であ ると考えられる。そこで本研究ではタンバク質の糖鎖修飾の制御と機能解析に関する生物有機化学研究を行った。
第1章では研究背景として、生物有機化学を用いた 糖鎖生物学研究について概説している。
第2章ではシアル酸転移酵素(Sialyltransferase，SiaT)阻害剤の新規ハイスループットス
ク リ ー こ ン グ 法 の 確 立 と 、 a2， 3‑SiaT選 択 的 阻 害 剤 の 獲 得 に っ い て 述 ぺ る 。
具体的には、1，3双極子付加環化反応(Click反応）を用いることにより、本来の糖ドナーであ るCMP‑NANA (Cytidi
ne‑monophosp
hate‑Nacetylneuraminic acid)を基本骨格とした約70種類の阻害剤候補化 合物ライプラりを構築した。次に、MSによる定量解析の ため、
aoWR (aminooxy‑ tryptophanylarginine)を有する糖 受容体を用い、MAI」DI‑TOFMSを基盤としたSiaT反応の評価 法を確立した。この方法で阻害剤候補ライプラりを評価したところ、a2，6‑
SiaTに対しては阻害活性を示さないが、d2，3‑SiaTに対しては有意な阻害活性を示す酵素選択的な新規阻 害剤を得ることができた。本手法はSiaTのみならず、他の糖転移酵素の阻害剤開発にも応 用できる極めて有用な手法であると考えられる。また、SiaTが生合成を担っているシア1」ル糖鎖はガンの転移やウィルスの感染などの疾病に関与していることから、本手法で得ら れた阻害剤は糖鎖の生合成制御剤としてのみならず、医薬への応― 1427―

用も期待される。
第3章 では 第2章 で副 次的 に見 出さ れた 、CMP‑NANAよ り 良好 な基質となる誘導体の構造情報をもとに、sin
gle photon emlssi
on comput
edtomography(SPECT)
測定に向けたシj
アリル化糖夕ンパク質の新規放射性同位体標識法を確立した。
具体的には、Click
反応に より得られたフェノール基を有するCM
P‑NANA
誘導体に対し、1251による芳香族求電子置換反応を行い、続けてSiaT反応を行うことにより、糖夕ンバク質のN結合型糖鎖に選択的に 放射性同位体ラベル化されたシアル酸を導入することができた。シアル酸は糖夕ンパク質の体内動態や血中滞留性に 寄与することから、今後SPEC
Tなどを 用い たシ アリ ル化 糖夕 ンパ ク質 の体 内動 態解 析に 応 用さ れることが期待できる。
第4章 では 、分化、発生において重要な役割を担っているNotch
シグナリングにおける糖 鎖 の 役 割 を 、 糖 ベ プ チ ド の 化 学 合 成 と NMRに よ る 立 体 構 造 解析 によ り解 明し た。
Notch
受容体は種々の細胞 の運命決定においてシグナル伝達分子として働くことが知られて いる 膜貫通型糖夕ンパク質で ある。DeltaやJaggedという 2種類のりガンドとの親和性がN
otch
受容体の〇・Fucos
e糖鎖修飾により制御され、分化シグナルとなることが報告されているが、分子単位での詳細な制御機構に関しては未だ明らかになっていない。Notch
受 容 体 に お い て 、 ル ガ ン ド と の 結 合 に 必 須 で あ る EGF11． EGF
12のう ちEGF12の みがFucos
yl糖鎖 を有 して いる こ とか ら、 EGF12におけるO‑Fucosel
糖鎖修飾がりガンドとの相互 作用 に極めて重要であると考 えられる。よって本研究では様々な糖鎖構造を有する
E
GF12糖 ベプ チド を化 学合 成 によ り調 製し 、NMRに よる 立 体構 造解析と得られた構造の比較を行った。その結果、糖鎖はEGF12ベプチドの局所的な立体構造の形成に関与することでりガンドとの相互作用を制御している可能性が示唆された。
第5章 では 各種 EG
F12フラ グメ ント ベプチドを固相合成によ って調製し、むvitroにてP
rotein‑O‑fucosylt
ransferase‑l(Pofutl)
反応を行うことで、Pofutlによる基質の立体構造認識機構を明らかにしようと試みた。
第 6章で は第 2章 、第 3章、 第4章 、第 5章 を総 括し 、夕 ンバ ク 質の 糖鎖 修飾 に関 して生物有機化学的な研究が有用であることを論じた。

‑ 1428ー学位論文審査の要旨
主 査 教 授 西 村 紳 一 郎
副 査 教 授 綾 部 時
芳
副 査 教 授 菅 原 一
幸
副 査 教 授 門 出 健
次

学位論文題名Bio―organic chemistry of protein glycosylation（夕ンパク質の糖鎖修飾に関する生物有機化学研究）

糖鎖修飾はタンバク質の翻訳後修飾の1つとして知られており、ヒトの全夕ンバク質の50％ 程度 はN結合 型あ るい は〇 結 合型 糖鎖 によ り修 飾を受けていると言 われている。
糖 鎖は細胞問コミュニケーションやタンバク質の品質管理など、生命を維持していく生物学 的現象のみならず、ガンの転移やウィルス感染などの疾病への関与も示されるなど、糖鎖 生物学に関する研究が精力的に行われてきた。しかしながら、一般的に糖夕ンバク質上の 糖鎖構造は多様かつ不均一であり、遺伝子学的手法を用いた均一な糖鎖構造を有する糖夕 ンパク質の調製が困難であることから、生化学的手法と有機化学的手法の融合が糖鎖生物 学研究の推進に必要であると考えられる。本論文ではタ ンバク質の糖鎖修飾の制御と機 能解 析に 関す る生 物有 機化学研究をユニークな方法論により記述している。
第1章では研究の背景として 、生物有機化学を主たるアプローチ戦略とした糖鎖生物学研究とその意義について概説している。
第2章ではシアル酸転移酵素 (Sialyltransferase，Sia
D阻害剤の新規ハイスループット
ス ク リー ニン グ法 の確 立と 、d2，3． SiaT選択 的阻 害剤の獲得について 述べている。
具体的には、1，3双極子付加環化反応（C1ick反応）による阻害剤候補化合物ライプラりの構 築 と、 MAIーDI・TOFM
Sを 基盤 とし たSiaT
反 応の 新し い評価法を確立したことで、d2，3・Sia
Tに対して有意な阻害活性を示す選択的な新規阻害剤を得ることができた。本手法
はSia
Tのみならず、他の糖転移酵素の阻害剤開発にも応用 できる極めて有用な方法論であ ると考えられる。また、SiaTが生合成を担っているシアルル糖鎖はガンの転移やウィルス の感染などの疾病に関与していることから、本手法で得られた新規阻害剤は糖鎖の生合成 機構の解明のためのツールとしてのみならず、医薬品への応用研究等についても大いに期待される。
第3章 では 第2章 で見 出さ れた 、天 然型 のCMP．NAN
Aよりも優れた基質 となる新規な誘 導 体の 構造 情報 をも とに 、s血呂lephotonemissioncomputedtomography（SPECD測定― 1429ー

を目 的とする シアリル 化糖夕ン バク質の 新規放射性 同位体標 識法を確 立した。
すな わ ち 、 Click
反 応により 得られ た芳香族 C
MP‑NAN
A誘導体 を1251によ り置換反 応
を行 い、こ れをSiaT
反 応に用い ることに より、 糖夕ンバク質のN結合型糖鎖に選択的に放射性同位体ラベル化されたシアル酸を導入することができた。シアル酸は糖夕ンバク質の体 内動態 や血中滞 留性に 寄与する ことか ら、今後 SPECTなどを用いたシアリル化糖夕ンパク質の体内動態解析に応用されることが期待できる。
第4章で は、分化 、発生 において重要な役割を担っているNotch
シグナリングにおける糖鎖 の役割 を、モデ ルとな る糖ベプ チドの 化学合成 とNMRによる立体構造解析により考察した。
Notch受容体は種々の細胞の運命決定においてシグナル伝達分子として働くことが知られて いる膜 貫通型糖 夕ンバ ク質であ る。DeltaやJaggedと いう2種類のり ガンドとの親和性 がNo
tch受容体の O‑Fucos
e糖鎖修 飾によ り制御され、分化シグナルとなることが報告されているが、分子レベルでの詳細な制御機構に関しては未だ明らかになっていない。
Notch受 容 体に お し ゝて、リ ガンド との結合 に必須で あるEG
F11． EGF
12の うちEG
F12のみ がFucosy
l糖鎖を 有してい ることか ら、EGF12におけ るO‑
Fucose糖鎖 修飾がりガンドとの相互作用に極めて重要であると考えられる。よって本研究では様々な糖鎖構造を有するE
GF12糖ベ プ チ ドを 系 統 的化 学 合 成に よ り調 製し、 N
MRによ る立体 構造解析 と得られ た構造 の比較を 行った 。その結 果、糖 鎖はEG
F12ベプチドの局所的な立体構造の形
成 に 関 与 す る こ と で り ガン ド と の相 互 作 用を 制 御 し てい る 可 能性 が 示 唆さ れ た 。
第5章で は各種EG
F12
フラ グメント ペプチ ドを固相 合成によって調製し、血vitroにてProtein‑O‑
fucosyltransferase‑l(Pofutl)
反応を行うことで、Pofutlによる基質の立体構造認識機構をについて推察している。
第6章 で は 第2章 、第 3章、 第4章 、第5章を総 括し、 夕ンバク 質の糖鎖 修飾に 関して生 物 有 機 化 学 的 な ア プ ロー チ が有 効 であ るこ と を結 論 して い る。
以上のように、糖鎖生合成の制御、糖夕ンパク質の体内動態解析、糖鎖がべプチドの立体構造に及ぼす影響、さらに糖転移酵素の基質特異性の解明に向けた広範な研究成果は糖鎖生物学研究に大きく貢献するものである。よって申請者は北海道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格があるものと認める。

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