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FEWBlue TA Cloning Kit (pTAKN-2)

商品名:

商品番号DS130

商品名
FEWBlue TA Cloning Kit (pTAKN-2)
pTAKN-2 Vector, linearized
2 × Ligation Buffer
Ligase Mixture
M13 Forward Primer
M13 Reverse Primer

容量20 reactions
20 µl (50 ng/µl) ×1
100 µl20 µl100 µl (3.2 pmol /µl)
100 µl (3.2 pmol /µl)

DS130L

FEWBlue TA Cloning Kit (pTAKN-2), LargepTAKN-2 Vector, linearized
2 × Ligation Buffer
Ligase Mixture
M13 Forward Primer
M13 Reverse Primer

80 reactions
20 µl (50 ng/μl) ×4
100 µl × 420 µl × 4100 µl (3.2 pmol /µl) × 4100 µl (3.2 pmol /µl) × 4

保存条件:-20℃

はじめにFEWBlue TA Cloning Kit は、PCR 産物と T ベクター間の T-A 塩基対形成に基づいた、PCR クローニングキットです。2 × Ligation Buffer には、PCR 産物と T ベクターのライゲーション反応に必要な、全ての因子が含まれており、簡便かつ高いライゲーション効率を実現しています。
ライゲーション操作は PCR 産物を、pTAKN-2 Vector と 2 × Ligation Buffer、そして Ligase mixture とを混合し、16℃で 30 分インキュベートするだけです。このライゲーション産物は、直接コンピテントセルの形質転換に用いることができます。

PCR クローニング操作
1.

DNA 増幅反応
TAクローニングを成功させるには、PCR産物の質と量が最も重要です。ポイントを以下に列記します。
●

PCR 断片末端への 3’-A 付加効率が、PCR 産物と T ベクターとのライゲーション効率に大きく影響します。ノンプルーフリーディング DNA ポリメラーゼによる PCR 断片末端への 3’-A 付加効率は、PCRプライマーの 5’末端が A であるとき、最も高いことが知られています。用いる PCR プライマーの 5’末端に、A を付与することをおすすめします。

●

PCR 断片末端への 3’-A 付加効率を上げるため、PCR 反応の最後に 70℃、10 分の付加ステップを行うことをおすすめします。

●

プルーフリーディングDNAポリメラーゼ は、PCR断片末端への3’-A付加効率が低いので、この酵素によるPCR増幅産物を直接クローニングした場合、クローニング効率が低くなってしまいます。｢平滑末端を有するPCR産物のクローニング｣（ｐ. 3）を参照し、PCR断片末端への3’-A付加反応を行うことをおすすめします。
1Ver. 1.6

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PRODUCT INFORMATION●TAクローニングの前に、アガロースゲル電気泳動にてPCR産物の量および質の確認を行ってください。

●

PCR 反応直後のPCR産物は、TAクローニングを阻害する物質を含んでいます。プライマーダイマーや目的外のPCR産物に由来する擬陽性を減らし、クローニング効率を上げるためにも、PCR産物はシリカベースのスピンカラムで精製してからTAクローニングに用いることをおすすめします。

●

PCRのテンプレートが、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドDNAであるときは、テンプレート自体が、TAクローニングのバックグランドになってしまう可能性があります。その場合は、PCR反応後、50-100μｌの反応液に、直接10-20 uniｔs のDpnI を加え、37℃で30分インキューベートして、テンプレートを分解することをおすすめします。分解後はシリカベースのスピンカラムで精製し、クローニングに用います。

2.

ライゲーション反応
1. 氷上にて、以下の 10μｌライゲーション反応溶液を調製する。
pTAKN-2 vector (50 ｎｇ/μｌ)
1μｌ
PCR 産物
Xμｌ*1
2 × Ligation Buffer
5μｌ
Ligase Mixture
1μｌ*2
滅菌水
variable
全容量10μｌ
2. 16℃で 30 分反応。
3. 反応物をそのままコンピテントセルの形質転換に用いる* 3* 4。

*1 ライゲーション反応には、モル量で、pTAKN-2 Vector DNA (50 ng, 0.028 pmol)の2–6倍量のPCR断片DNAを用いることをお勧めします。例えば、1,000 bpのPCR断片の場合、 36 ｎｇ(0.056 pmol) 以上を用いてください。もちろん、本キットは低バックグランドと高いクローニング効率を有することから、それより少ない量でも、充分クローニング可能です（実験例 p４参照）。また、クローニング前に、PCR産物は吸光度測定のみでなく、ゲル電気泳動にて確認することをおすすめします。目的のPCR断片が、充分量増幅されているか、副反応物が生じていないか確認できます。電気泳動の際は、バンドの染色具合から、DNA量が概算可能な分子量マーカー〔例えば、Dynamarker DNA Low D(#M112)あるいはDynamarker DNA High D (#DM122）〕の使用をおすすめしま○R○Rす。
*2 Ligase Mixture は最後に加えてください。
*3 ライゲーション反応産物は、直接ケミカルコンピテントセルの形質転換に用いることができます。ライゲーショ
ン反応産物はコンピテントセルの容量の 5％に収まる量を使用してください。ライゲーション反応産物は形質転換時まで、-20℃にて保存可能です。 DynaCompetent® Cells DH5α (#DS220)または DynaCompetent® Cells JM109(#DS210)の使用をお勧めします。
*4 カナマイシンの至適濃度の範囲はアンピシリンに比べて狭いことが知られています。寒天培地中のカナマイシン濃度は 25 µg/ml をお勧めします。

2Ver. 1.6

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3.

クローンの取得
形質転換によって得られたコロニーを、ピックアップし、25μg/ml カナマイシンを含む 3-5 ml の LB 培地で一晩培養後、プラスミドを抽出して、制限酵素処理やシークエンスでご確認ください。
また、キット付属のシークエンスプライマーセット、あるいは目的遺伝子の増幅に使用した PCR 用プライマーを用いた、コロニーPCR によっても確認できます。

4.

シークエンシング

インサートをシークエンスするために、下記、2 種のシークエンスプライマーが添付されています。
M13 Forward Primer: 5’- TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13 Reverse Primer: 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’
M13 Forward Primer はクローニングサイトの 77 塩基上流に、M13 Reverse Primer はクローニングサイトの92 塩基下流にアニールします。

その他いくつかの情報
1.

平滑末端を有する PCR 産物のクローニング
プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼによって増幅した場合、そのPCR産物は平滑末端が主となります。そのようなPCR産物を、Tベクターにクローニングする場合は、3’末端に、以下のようにして、Aを付加する必要があります。
1. 平滑末端PCR産物に1 unitのTaq DNA polymeraseを添加する*1。
2. 72 ℃ で10分反応。
3. シリカベースのスピンカラムにて精製する*2。
*1 PCR反応を行ったバッファー中にバッファー交換することなく、そのまま加えて良い。
*2 スピンカラムを用いると、溶出量によってはPCR産物が、希釈されてしまうことがあります。その場合は、エタノール沈澱で、濃縮してから、TAクローニングに用いてください。

実験例

30,000

種々の量の約 1 kbp の PCR 断片を、DynaExpress TA PCR Cloning Kit を用いてクローニングした結果を示した。4μｌライゲーション産物を用いて 100 µlのDynaCompetent® Cells

DH5α (#DS220)

を形質転換し、約 1/4 量を LB プレートに塗布した。白いバーは、白色コロニ

Transformants on the plate2.

25,00020,00015,00010,0005,000

0ー数を、青いバーは、青色コロニー数0を示している。バックグランドと擬陽性

5102040 (ng)Amount of PCR fragmentsが低く、かつ高いクローニング効率を示している。

3Ver. 1.6

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トラブルシューティング問題

わずかか、全くコロニーが形成されない場合可能性

解決法

コンピテントセルが、不適切な保管や配送管理によって死滅している可能性があります。

プレートの抗生物質が異なっている可能性があります。

プレートを確認してください。必要なら、プレートを作り直します。

プルーフリーディング DNA ポリメラーゼを用いて PCR を行った場合。

プルーフリーディング活性を有する DNA ポリメラーゼを用いて増幅した場合、その PCR 産物は平滑末端が主となるので、TAクローニングには適していません。3’末端への A の付加が必要です。「平滑末端を有する PCR 産物のクローニング」を御参照ください。

充分な量の PCR 断片を、クローニング反応に用いていない可能性があります。

電気泳動か分光光度計にて、PCR 断片の量を計測し、充分量の PCR 断片を TA クローニングに用いてください。
しばしば、スピンカラムによって精製しても、分光光度計では正確な定量ができないことがあります。電気泳動にて検定することをおすすめします。

PCR 産物中に、ライゲーション反応を阻害する物質が混入している可能性があります。

PCR 産物をシリカベースのスピンカラにて精製するか、ゲル電気泳動によるバンドの切り出し精製を行います。

白色コロニーが少ない白色コロニーのみである

クローニングされた PCR 断片が大腸菌にとって毒性が高い可能性があります。
過剰量のライゲーション反応物を、コンピテントセルに加えた可能性があります。
全てのクローンが、目的のインサートを持っている可能性があります。
X-Gal がアガープレートに塗布されていない可能性があります。
PCR のテンプレートとして、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを用い、これが混入してしまった可能性があります。
充分量の抗生物質が入っていないか、抗生物質が活性を失った可能性があります。

主に、ライトブルーあるいは白色だが中央がブルーのコロニーが出る。

lacZ フラグメントが、漏れて半分のコロニーが白色コロニーで、他の半分がブルーあるいはライトブルーのコロニーである場合。

インサートの方向によって、lacZ フラグメントが、漏れて発現している可能性があります。
取得したコロニーが、サテライトコロニーである可能性があります。

液体培地で生育しない。

凍結状態の他のコンピテントセルのチューブをチェックしてください。もし、菌体の沈澱が見られたら、そのチューブは、どこかで一度、溶解し、再凍結した可能性があります。その場合、著しくコンピテンシーが低下しているはずです。
たとえ菌体の沈澱が見えなくても、-20℃程度で放置した場合、著しくコンピテンシーが低下します。pUC19 などの一般的なプラスミドで、形質転換効率を確認してみてください。

発現している可能性があります。

プレートを、37℃より低い、30℃あるいは室温にてインキュベートしてみてください。改善される場合があります。
ライゲーション反応物の量は、ケミカルコンピテントセルの 5％を超えないようにします。
（クローニングの成功。）
充分な X-Gal が含まれているかチェックしてください。
PCR 反応後、反応溶液に制限酵素 DpnI を加えて、テンプレートプラスミドを分解するか、ゲル電気泳動で目的のバンドとテンプレートを分け、バンドを切り出してください。「DNA 増幅反応」を御参照ください。
プレートをチェックしてください。必要なら、新たにプレートを作製しなおします。
このタイプのコロニーを取り、インサートの有無を確認してみます。インサートを含んでいる場合があります。その場合、完全な白色コロニーがむしろインサートを含んでいない擬陽性であることがありますので御注意ください。
両タイプのコロニーを取り、インサートの有無を確認してください。両方ともインサートを含んでおり、方向のみが異なっている場合があります。そのようなインサートは、SD 配列とインフレームの開始コドンを含んでいる可能性があります。
大きな白色コロニーを取るようにします。 また、カナマイシンプレートをチェックしてください。

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PRODUCT INFORMATION

コロニーを液体培養に移す前に、長期に保存してしまった場合。

インサートが、大腸菌にとって幾分かの毒性があり、長期間の保存で、プレート上で死滅してしまった可能性があります。フレッシュに形質転換したプレートから、コロニーを取得してください。

白色コロニーがインサートを含んでいない

プライマーダイマーあるいは非特異的 PCR 反応産物断片がクローニングされている可能性があります。

電気泳動で、明確な単一の目的のバンドが増幅できるようにPCR 反応条件を改良する必要があります。あるいは、目的のPCR 断片のバンドのみを、電気泳動にて切り出し精製して用います。

白色コロニーかつカナマイシンを含む液体培地で培養可能なのに、プラスミド自体が含まれていないクローニングされた PCR 断
片が大腸菌に対して、幾らかの毒性がある場合。

プレートや液体培養を、37℃以下の温度、例えば 30℃や室温で行うと良い場合があります。

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DH5α5Ver. 1.6

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PRODUCT INFORMATIONpTAKN-2 ベクターについて
pTAKN-2はカナマイシン遺伝子を除いて同シリーズのpTAC-2と同一です。

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