博 士 （ 医 学 ）石 川 康暢
学 位 論 文 題 名

常染色体優性多発性嚢胞腎疾患モデルメダカの表現型の解析
学位論文内容の要旨【背景と 目的】 常染色体 優性遺伝 性多発 性嚢胞腎(ADPKD)の原因遺伝子としてPK
D1とPKD2が同定さ れてお り、その 機序とし てツー ヒット説が提唱されている。近年ヒトPKD2のC末端欠失変異体を遺伝子導入されたラットで腎嚢胞を認めたとの報告もあることから、欠失変異体がド ミナン トネガティブとして働く可能性も示唆されている。そこでPkdlおよびPkd2の欠失変 異体を 遺伝子導入したモデルメダカが作成されたが、Pkdlの系統では嚢胞を認めず、Pkd2の系 統では 腎嚢胞を認めるものの少数であった。そこで今回導入した変異体遺伝子をホモ接合体とする、すなわち変異体遺伝子のコピー数を増やすことにより、嚢胞形成が促進するかを確認し、表現型を解析することを目的とした。
【材料と 方法】 PkdlまたはPkd2変異体遺 伝子が 筋肉以外 の全身で 発現するE
F‑
1a―Aプロモータ ーを使 用した系 (Pkdl EF1ロ 系、Pkd2｜EF1ロ系）とドキシサイクリン(DOX)によって発現 が誘導 される系(
PkdlTetーOn誘導系、Pkd2Tet−On誘導系）の4種類の系統のメダカをホモ化に交配し、サザンブロッティングで導入遺伝子を確認した。導入遺伝子コピー数にはドットブロツ卜法、発現量の確認にはrealt
imeP
CRで解析した。表現型の解析には、
Hematoxylin‑Eosin (HE)染色でそれぞれの系統の生後1、2、3、4、5ケ月を各5匹ずつ腎、および肝の嚢胞の発現を観察し、1切片における平均嚢胞数と断面の総面積における嚢胞面積の割合 である cysticindexを計測した。嚢胞を形成する要因の検討としては嚢胞構成細胞にはLTL/DBA
免疫 染色を、繊毛にはacetylated―tubulin
免疫染色を、細胞増殖にはPCNA染色を、 そして アポトーシスにはTUNEL染包を施行した。また、DOXが嚢胞の成長を促進す
ると 報 告 され てい るため 、Pkdlおよび Pkd2のEFla系も 孵化後 よりDO
X暴露し 、成魚で の病 理 像 、 1切 片 に お け る 平 均 嚢 胞 数 、 お よ び cystic indexを 計 測 し た 。
【結果】サザンブロッティング法では全ての系統で予想される長さのバンドが確認され、遺伝子導入を確認できた。ドットブロット法、realtimeP
CRによる遺伝子コピー数、発現量の解析 ではい ずれの解 析でもPkd2 EFla系が 最も多かった。HE染色ではいずれの系統も孵化後50月 では全 ての個体 におい て腎嚢胞 を認め、Pkd
2Tet―On誘導系が最も嚢胞形成が著明であった。また、Pkd2Tet―On誘導系のみで肝嚢胞を認めた。1切片における平均嚢胞数、cysticindexは各系統とも経時的に増加を認め、Pkd2Tet―On誘導系が他の系統と比較して顕著に高値であった。LTL/DBA
免疫染色で嚢胞はLT
L、DBAともに陰性の遠位尿細管／集合管由来 であり 、Pkd
2Tet―On誘導系の一部でLT
L陽性の近位尿細管由来の嚢胞を認めていた。acetylated一tubulin染色ではいずれの系統においても嚢胞構成細胞で繊毛が少なく、欠落して いるも のも認められた。PCNA染色では野生型の尿細管と比較していずれの系統においても 、嚢胞 ではPC
NA陽陛細胞が有意に多く、またP
kd2TetーOn誘導系では尿細管でもPCNA陽性細胞 が有意 に多かっ た。TUNE
L染色で はいずれの系統においても嚢胞形成細胞で
TUNEL
陽 性 細 胞を 認 め なか っ た 。DOXに 暴露し たP
kdlおよ ぴP
kd2のEFla系 の腎病理 を確認したと ころPkdl E
F1ゼ 系では 1
切片 における 平均嚢胞数、cysticindexは増加傾向を認め、Pkd2 EFla系では 1
切片 におけ る平均嚢 胞数、 cystic indexはとも に有意に増加を認めた。
―20―

【考察】本研究において導入した遺伝子変異体をホモ接合体とする、すなわち変異体遺伝子のコピー数を2倍に増やすことで全ての系統において嚢胞形成を認めることができ、ドミナントネガテイブな機序でも嚢胞形成をすると考えられた。本研究に溜けるトランスジェニ
ックメダカで嚢胞形成がヒトAD
PK
Dと同じく緩徐であったのは変異 体遺伝子の発現量が比較的少なく、正常遺伝子の不活化が少なかったことが要因として考えられた。嚢胞形成が最も顕著なPkd2
Te
t―On誘導系は導入遺伝子数が少なく、導入遺伝子数のみが嚢胞形成に関与していないことが示唆されたため、嚢胞形成に差を認めた原因をさらに検証した結果、DOXの暴露による違いの可能性が考えられ た。その確認のため、EF1ば系のメダカをDOXに暴露したところ、Pkd2
EFla
では嚢胞形成が促進され、PkdlE
Flば系でも同様の傾向が認められ、DOXるーっ の要因として考えられた。DO
Xはテトラサイクリン系の抗生剤であり、ADPKD患者の嚢胞の成長を促進する可能性があることから、使用には注意を要することが示唆された。
LTL/DBA
免 疫染色では嚢胞は遠位尿細管／集合管由来であり、ヒトADPKDと同様の結果を示した。ただPkd2
Tet−On誘導系のみで近位尿細管由来の嚢胞を少数ながら認め、これはPkd2
Tet−On
誘 導系は最も嚢胞形成が著明であったため、嚢胞形成が近位尿細管まで及んだものと考えられた。嚢胞構成細胞では繊毛の消失、欠落が認められていた。魚類では尿流が緩徐であるため、その尿細管細胞は運動性繊毛を有し、尿流を作り出す役割を果たしており、一方ヒト尿細管細胞は胎生期には運動´性繊毛として機能しているが、出生後には運動J陸織毛は認められるものの多くは一次繊毛とし て尿流を感知する機械的センサーの役割を果たしている。本研究のメダカで嚢胞形成が著明であった理由のーっには運動性繊毛の関与が考えられた。細胞増殖は全ての系統で認めて られており、特に嚢胞形成が最も著明であったP
kd2Tet−On
誘 導系では正常尿細管においても細胞増殖を認めており、これは嚢胞の前駆段階をみていたものと考えられた。細胞増殖が強いP
kd2Tet―On誘導系が最も嚢胞形成が著明で、肝嚢胞を認めた理由と考えられた。P
kd2TetーOn誘導系の卜ランスジェニックメダカは嚢胞形成が著明であり、薬剤曝露試験において有用な新たなモデル動物となる可能性が示唆された。
【結論】メダカPkdlおよびPkd2の欠 失変異体遺伝子導入メダカをホモ接合体にすることで腎嚢胞および肝嚢胞を発現させた。Pkd2TetーOn誘導系が最も嚢胞形成が著明であり、薬剤曝露試験の有用な新たなモデル動物 となる可能性を示した。嚢胞形成の要因としてDOXによる暴露の可能性も示唆された。嚢胞構成細胞で繊毛の発現が低下していたことから．、欠失変異体遺伝子が繊毛の形成に影響を及ばしている可能性が示唆された。嚢胞形成には細胞増殖が関与しており、Pkd2
Tet−On誘導系の正常尿細管における細胞増殖は嚢胞の前駆段階を見ている可能性が示唆された。

― 21ー

学位論文審査の要旨
主査 教授 小 池隆夫
副査 教授 笠 原正則
副査 教授 野々村克也

学 位 論 文 題 名

常 染色体優 性多発性 嚢胞腎 疾患モデ ルメダカの表現型 の解析
常染色体優性遺伝性多発性嚢胞腎の発症機序としてツーヒット説が提唱されているが、欠失変異体が野生型の機能を阻害するドミナントネガティブ説の可能性も示唆されている。
そ こでへテロ接合体では少数の嚢胞形成しか認めなかった欠失変異体を遺伝子導入したモデ ルメダカをホモ接合体とすることにより、嚢胞形成が促進するかを確認し、表現型を解析 した。 EF―1
ぱ 一AプロモーターでPkdlまたはPkd2
変異体遺伝子が発現する系(PkdlEF1a系、 Pkd2EFla系）と ドキシサ イクリ ン(DOX)に よって 発現誘導 される系 (Pkdl Tet−On誘 導系、 Pkd
2 Tet−On誘導 系）の4種類の系統のメダカをホモ化に交配した。遺伝子発現量 はPkd2
EFla系が 最も多 かった。 病理で は各系統 とも孵 化後5ケ月では 全ての 個体に腎嚢 胞を認め、嚢胞の数と面積は経時的に増加を認めた。Pkd2Tet―On誘導系が最も嚢胞形成が著明であり、肝嚢胞も認めた。嚢胞はほとんどが遠位尿細管／集合管由来であり、Pkd2Tet−On誘導系の一部で近位尿細管由来の嚢胞を認めていた。嚢胞構成細胞では繊毛が少なく 、欠落しているものも認められた。野生型の尿細管と比較して各系統とも、嚢胞では細胞 増殖が有意に多く、Pkd2Tet―On誘導系では尿細管でも有意に多かった。DO
Xが嚢胞の成長 を促進すると報告されているため、EF
1ば系も孵化後よりDOX暴露して腎病理を確認したと ころPkdl E
F1ぱ 系では 嚢胞数、面積は増加傾向を認め、Pkd
2EFla系ではともに有意に増 加を認 めた。メ ダカPkdl
お よびPkd2の 欠失変異 体遺伝子導入メダカをホモ接合体にする ことで腎嚢胞および肝嚢胞を発現させ、ドミナントネガティブな機序でも嚢胞形成をする と考えられた。P
kd2Tet−On誘導系が最も嚢胞形成が著明であり、薬剤曝露試験の有用な 新たな モデル動 物とな る可能性を示した。嚢胞形成の要因としてDOXによる暴露の可能性 も示唆された。嚢胞構成細胞で繊毛の発現が低下していたことから、欠失変異体遺伝子が 繊毛の形成に影響を及ばしている可能性が示唆された。嚢胞形成には細胞増殖が関与して おり、Pkd2Te
t−On誘導系の正常尿細管における細胞増殖は嚢胞の前駆段階を見ている可能性が示唆された。
質疑応答では副査の笠原正則教授から、本実験におけるドミナントネガティブの証明、今回できたメダカで胎生致死とならなかった理由、Pkdりの系統の方で嚢胞ができた機序、嚢 胞形成 を進める D0xを 利用した T
etsystemを 用いた理 由、ADPK
Dの発症 機序に っいての質 問があり、それぞれ、マウスの抗体と交差性がなく証明できなかったこと、遺伝子発現量 が少な く胎生致 死にな らなかっ たこと 、Caチャネ ルであ る腸セと D
OXのCa濃度低下のー 22―

作用 が相乗効果となった可能性があること、2009
年の報告なので作成時には予想していな
かっ たこと、ツーヒッ卜説とドミナントネガティブ説が混在している可能性を回答した。
次い で副査の野々村克也教授から、魚類を哺乳類と同じモデルとしての是非、DO
Xを投与する タイミングの検討、このモデルを使用した今後の展望にっいての質問があり、それぞれ、 ネフロンが保たれ遺伝子と表現型がともに相同性のある疾患も報告されているため可であ ること、DOX投与を遅らせる検討はないが途中中止でも嚢胞形成はかわらないこと、
大量 薬剤スクリーニングと嚢胞形成を認める機序の解明を検討していることを回答した。
さら に主査の小池隆夫教授より、ドミナントネガティブの証明にっいての展望：他のCa
チャ ネルに関する薬剤は検討、このモデルにおける肝嚢胞の検討にっいての質問があり、
細 胞 で の 検 討 、 Ca拮 抗 薬 投 与 の 検 討 、 細 胞 増 殖 や繊 毛の 検討 の予 定を 回答 した 。
い ずれの質問に対しても、申請者は過去の文献報告や未発表であった実験結果などを引用し 、概ね適切に回答した。
こ の論文は、腎嚢胞形成メカニズムを解析するためのモデル動物という点で高く評価さ
れ 、 今 後 の 薬 剤 曝 露 試 験 の 有 用 な 新 た な モ デ ル 動 物 と し て期 待 さ れ る 。
審 査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請 者が 博士 （医学）の学位を受ける のに充分な資格を有するものと判定した。

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