Feb. 2015

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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55（ 55 ）住木・梅澤記念賞受賞講演会記録
2014 年 10 月 6 日，学士会館 320 号室【2014 年度受賞講演，座長：中田雅也】

抗生物質の化学構造多様性を生み出す酵素の発見とそれら酵素による生物的全合成
渡辺賢二
静岡県立大学薬学部ていることなどが挙げられる。最近の研究開発に

1. はじめによって難培養微生物の培養技術も着々と向上しつつある。しかしながら，新規天然物を獲得するた

これまでに多くの生物活性物質が天然から単離めのこういったアプローチは決して真新しいもの

され，それらをリードとした医薬品が市場に送りではなく，どちらかと言えば伝統的な天然物化学

出されてきた。一方で，極めて有用な活性を持つの研究手法であると言える。

天然物が，生産起源からの生産量が極めて低いあ

近年のゲノム解析の目覚ましい進展によって，るいは生産起源が培養できないなどの理由によっ

多くの生物の遺伝子情報を容易に手に入れられるて必要十分量供給できない場合が存在する。天然

ようになった。例えば糸状菌に関しては，遺伝子物はすべて生合成酵素によって作られるため，こ情報およびこれまでの分子生物学的研究結果かうした酵素遺伝子を入手し発現することができれら，実験室における一般的な糸状菌の培養法ではば，供給に大きな問題のある有用海洋天然物など

二次代謝産物生合成遺伝子の転写活性は低いこと

を安定に生産できる可能性もある。我々は有用天が 明 ら か と な っ た。実 際 に 糸 状 菌 Aspergillus

然物の生合成遺伝子群を大腸菌，出芽酵母，糸状ﬂavus では，55 種類の二次代謝産物生合成遺伝子

菌を発現宿主として用い，複雑な構造を有する化

クラスターが染色体上にコードされていることが合物の生産を達成してきたのでそのいくつかを紹示されているが，生成物である天然物が単離され介する。また一方で，現状では新規天然物の獲得

生合成経路が明らかとなっているのは数種類のみが益々難しくなってきている。その理由としてである。また，特定の培養条件に限られるが本菌は，（1）長い歴史の中で数多くの天然物が探索さ

種のトランスクリプトーム解析の結果からも，二れ，既に発見されてしまったこと（2）採集できる

次代謝産物の生合成を司る遺伝子群の転写活性が生物，培養できる微生物は限られた一部の種であ低いことも示唆されている。つまり，糸状菌のゲることから，これらが化合物多様性の限界となっノム上に生合成遺伝子はコードされているが天然［Proceedings］ KENJI WATANABE: Effective use of heterologous hosts for characterization of biosynthetic

enzymes allows production of natural products and promotes new natural product discovery.

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物として生産を確認できない化合物が多数存在すとの学術的，産業的な重要性は不変である。このると考えられる。そこで我々は，糸状菌が持つ潜ような状況の下，天然物の生合成遺伝子を用い化

在的な二次代謝産物生合成能力を活用することで合物の獲得を目指す新しい融合研究分野であるシ

新規天然物の創製および得られる化合物の生合成

ンセティックバイオロジー（合成生物学）による取機構の精密解析が可能となれば天然物化学に新しり組みが行われている。本講演では，休眠型生合い方法論を付け加えられると考えた。しかしなが成遺伝子クラスターの活性化および天然物生合成

ら，遺伝子クラスターの転写活性が極めて低い場

遺伝子の異種発現系による生物合成と酵素機能解合，その生合成遺伝子の mRNA を単離し cDNA

析に関して得られた我々の研究結果も紹介する。

を合成することは困難である。そこで，転写されていないと推定される目的生合成遺伝子の転写因
子を糸状菌菌体内で発現できれば，転写活性を増2. 抗生物質リファマイシンの前駆体
生合成

大させることができるのではないかと考えた。あるいは，こういった生合成遺伝子がエピジェネ

Rifamycin，ansamitocin P-3，geldanamycin はそ

ティクス制御により転写活性が低い場合は，クロの構造中に芳香環もしくはナフトキノンを持ち，マチン構造の改変によって転写活性を増大させる

ポリケタイド鎖がアミド結合により環化したラクことができる。これらの手法を組み合わせること

タム構造を持つアンサマイシン系ポリケタイドにで，新規化合物の単離へと繋がる。さらに，目的分類される。放線菌が生産するこれらポリケタイ

生合成遺伝子の cDNA を獲得することができれ

ドは抗生物質あるいは抗ガン剤のリード化合物とば，遺伝子工学的な異種発現システムの確立されして使用され極めて有用である。特に rifamycin

た出芽酵母を用い，精製酵素による in vitro 合成の誘導体である rifampicin は 1960 年代以来，結核系で新規化合物の生合成に関する精密機能解など感染症治療薬として使用されてきた。さらに

析 1〜3）も達成されるであろう。

rifapentine，rifaximin といった主に C-3 位に関す

現代においても新たな新規天然物を取得するこる rifamycin 誘導体が合成され，薬剤耐性病原微図 1. アンサマイシン系ポリケタイドの化学構造

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57（ 57 ）図 2. AHBA 推定生合成経路

図 3. P8/1-OG および N-acetyl P8/1-OG 生合成生物に対して使用されてきた（図 1）。

よ り 酸 化，RifK に よ り glutamine か ら ア ミ ノ 基

Rifamycin の ポ リ ケ タ イ ド 炭 素 格 は， 1 つ のを 導 入 さ れ た 後，RifM に よ り kanosamine を 生

nonribosomal peptide synthetase（ NRPS ）-like

合 成 し，さ ら に RifN に よ り リ ン 酸 化 さ れ，loading module と 10 個 の ポ リ ケ タ イ ド 鎖 伸 長

phosphoglucose isomerase に よ り 3-amino-3-deoxy-

module により生合成され，さらに相同性検索に

D-fructose 6-phosphate （aminoF6P）を，続 い て

よって amide synthase と予測されている RifF で環transketolase により 1-imino-D-erythrose 4-phosphate

化されると考えられている。我々は，アンサマイ （iminoE4P）を 生 合 成 す る と 予 測 さ れ て い た。
シン系ポリケタイドの開始単位である 3-amino-5-

IminoE4P は RifH に よ り 3,4-dideoxy-4-amino-D-hydroxybenzoic acid（AHBA）の生合成に必要とarabino-heptulosonic acid 7-phosphate（aminoDAHP），

なる 7 つの遺伝子（図 2），ならびに rifamycin 生合

RifG による環化反応で5-amino-5-deoxy-3-

成遺伝子中で最も大きく，発現タンパク質として

dehydroquinic acid（aminoDHQ）を，さらに RifJ に確認することができなかった rifA を同時に大腸菌

よ り 5-amino-5-deoxy-3-dehydroshikimic acidで発現し，その生合成産物である P8/1-OG［2,6- （aminoDHS），そして RifK により AHBA を生合d i m e t h y l - 3 , 5 , 7 - t r i h y d r o x y - 7（
- 3′-amino-5′-

成 す る と 予 測 さ れ（図 2），こ の iminoE4P か らhydroxyphenyl）-2,4-heptadienoic acid］お よ び N-

AHBA までの生合成は，shikimic acid 生合成と類

acetyl P8/1-OG の生物合成に成功した（図 3）。

似しており大変興味が持たれた。

4）

まずはじめに，これら生合成遺伝子 rifG, -H, -J,

2-1. AHBA 生合成遺伝子発現ベクターの構築
AHBA は，UDP-glucose を出発基質とし RifL に-K, -L, -M, -N をそれぞれ単独で発現させ，その発現を確認したところ，rifG, -J を除く 5 種生合成遺58（ 58 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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図 4. （A）AHBA 生合成遺伝子発現プラスミドマップ；（B）RifA の再構築；（C）発現プラスミ
ドマップ

伝子の発現は確認された。そこで ansamitocin P-3

peptide synthetase-like loading module と三つのポ開始単位の生合成遺伝子で相同性検索の結果 rifG

リケタイド鎖伸長 module からなり，全長 15 kbp，

および rifJ とそれぞれ 71% および 53% の相同性をその翻訳産物である巨大 polypeptide は 530 kDa で示した asm47 と asm23 の発現を試みた。その結あることが知られている（図 2）。これまでこの巨果，asm47 と asm23 両者はそれぞれ単独で発現す

大生合成遺伝子の大腸菌による発現は不可能でることが確認された。大腸菌はポリケタイド生合

あった。そこで rifA を RifLM＋RifM1 と RifM2＋成における伸長単位である methylmalonyl-CoA のRifM3 の二つの別々の polypeptide として発現さ生合成経路を持たないため，その生合成に必要とせた後，その機能の再構築を試みた。

な る propionyl-CoA carboxylase を コ ー ド し た

二つの polypeptide として発現させた後，機能をpccB および accA1 を発現させるためのベクター再構築させるため rifamycin 生合成遺伝子と同様を構築し，それらの発現を確認した。次に大腸菌に巨大ポリケタイド合成酵素を翻訳産物に持ち，を用い AHBA を生合成させるため，上記 7 つの詳細な研究がなされてきた erythromycin 生合成に

AHBA 生合成遺伝子と 2 つの methylmalonyl-CoA

おける polypeptide linker を用いた。ポリケタイド

生合成遺伝子を一つの T7 promoter による制御下合成酵素は，それぞれの polypeptide 内に存在するで，各生合成遺伝子の上流部に ribosome binding

intra-polypeptide linker と，特 定 の polypeptide 間site（rbs）を連結し，一つの T7 terminator で転写の親和性を上昇させる inter-polypeptide linker の 2を終結させるオペロンを構築した（図 4A）。

種の linker を持つ。これらの機能により基質とその生成物が module 間を効率よく chain transfer

2-2. rifA 発現ベクターの構築
RifA は開始単位取り込みに必要な nonribosomal

さ れ る と 考 え ら れ て い る。今 回 の 実 験 で はerythromycin 生合成遺伝子にコードされている一Feb. 2015

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59（ 59 ）組 の inter-polypeptide linker を 用 い た（図 4B）。 の染色体に組み込んだ大腸菌である。rifA 発現ベ

RifA を RifLM＋RifM1 と RifM2＋RifM3 の二つのク タ ー と AHBA お よ び methylmalonyl-CoA 生 合polypeptide に分け，前者 C 末端側に erythromycin

成遺伝子の発現ベクターを共発現し，ファーメン

生 合 成 module 2 の C 末 端 側 inter-polypeptide

ターを用いた培養で 2 L の培養液から 2 種の生合

linker（M2C）を，後者 N 末端側に同じく module

成産物を分離精製した。本化合物は ESI-MS より

3 の N 末端側 inter-polypeptide linker（M3N）を連

分 子 量 292 お よ び 357 を 与 え， 1H NMR よ り

結 さ せ る こ と で，そ の 一 対 の inter-polypeptide

P8/1-OG および N-acetyl P8/1-OG と確認され，二linker が 持 つ 親 和 性 を 利 用 し，発 現 さ れ た 両

つの別々の polypeptide として発現された RifA はpolypeptide が互いに親和性を持つように発現ベ

天然に存在するタンパク質と同じ活性を持つこと

クターを構築した。以上の操作により，二つの T7が示された。従って合計 11 個の ORF は全て発現

promoter によって発現の制御を受け，二つの rbs， され天然と同様の機能を持ち，これら生合成酵素
T7 terminator を持つ rifA 発現ベクターを得た（図によって P8/1-OG を生合成することが証明され

4C）。

た。
我々の知見はポリケタイド生合成研究におけ

2-3. AHBA 生合成遺伝子の発現および生合成

る，大腸菌を用いた場合の巨大遺伝子の発現，そ得られた発現ベクターを用い形質転換大腸菌をれによって得られる発現タンパク質を用いた酵素

培養し，培養液から生合成産物を得た。本化合物

化学的研究および生合成産物の取得を可能にしは ESI-MS より分子量 176 を与え， H NMR およた。

1

び C NMR より AHBA と確認された。従って得13られた AHBA 生合成遺伝子発現ベクターは，組み込まれた合計 9 つの ORF 全てが，機能を持つタン

3. 抗腫瘍性生物活性物質エキノ
マイシンの生物全合成

パク質として発現されたことを示した。我々の詳細な研究により大腸菌を用いた実験においては，

Echinomycin （図 5）， vancomycin， bleomycin

開始単位の類似基質として加えられた benzoic

A2，cyclosporin A，gramicidin S，tyrocidine A 等

acid および 3-hydroxybenzoic acid は大腸菌の菌体の化合物は，複雑な構造とその多様性から様々な内へ取り込まれるが，AHBA は取り込まれないこ

生理活性を持つ天然物である。天然においてこれとが確認されている。AHBA はラクタム環形成に

らの化合物は，NRPS によって生合成されること

おいて必要不可欠であり，AHBA 生合成を大腸菌が知られている。多くの NRPS は，複数の酵素がで可能にしたことは，以後の rifamycin 生合成研繋がったモジュールと呼ばれる基本単位複数個か究にとって大きな成果となった。

らなる巨大ポリペプチドである。モジュールは
アミノ酸が縮合する回数だけ存在し，その機能は2-4. rifA の 発 現 お よ び P8/1-OG と N-acetyl P8/

L-アミノ酸を基質とし，少なくとも condensation

1-OG の生合成（C）， adenylation （A）， peptidyl carrier protein

rifA の発現は大腸菌 BAP1 を使用した。BAP1 （PCP）の 3 個の触媒ドメインによりアミド結合形
は apo-acyl carrier protein（apo-ACP）を holo-ACP

成反応を触媒することにある。遺伝子工学的手法に変換するために必要な酵素 phosphopantetheinylを用い，ドメイン変換あるいは異なった起源のモ

transferase をコードした sfp 遺伝子を BL21（DE3） ジ ュ ー ル を 組 み 合 わ せ る こ と に よ り，様 々 な60（ 60 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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図 5. Echinomycin と triostin A の化学構造

NRPS を作製し，さらに構造の複雑な優れた生理3-2. QXC 生合成経路および QXC 遺伝子発現ベ活性を持つ非天然型化合物の生合成が期待されてクターの構築QXC（2）の生合成経路は相同性の高い酵素遺いる。
我々はこれまで遺伝子工学的手法を用いた生合伝子の機能に基づき，図 6A に示したように予想

成研究の報告例がなく，depsipeptide の一つで抗し た。ま ず 出 発 基 質 で あ る L-tryptophan が 一 旦

腫瘍性抗生物質として広く知られる echinomycin

adenylation さ れ，aminoacyl thioester 酵素中間体（1）に注目し，その全生合成遺伝子のクローニンが形成された後，hydroxylation，加水分解によりグおよび生合成に必要な合計 16 個の生合成遺伝

3 へと変換される（Ecm2, -8, -12, -13）。続いてイ子を同時に大腸菌で発現し，echinomycin の生物

ンドール環の酸化開裂，アミドの加水分解により全合成を達成した。

5〜9）β-hydroxykynurenine（4）を与える（Ecm11, -14）。
さらに非常に珍しい酸化的アミノ基転移を経て 5

3-1. Echinomycin 全生合成遺伝子のクローニングを与えた後，酸化的脱炭酸，環化が生じ 6 に変換

Echinomycin 全 生 合 成 遺 伝 子 は Streptomyces

され，最終的に空気酸化により 2 を生合成する

lasaliensis の全 DNA より作製されたコスミドラ （Ecm3, -4）。
イブラリーをスクリーニングすることによって得

次に大腸菌を用いて 2 を生産させるため，上記られた。それぞれ異なった 2 個の挿入断片を含む

8 個 の 生 合 成 遺 伝 子 そ れ ぞ れ に T7 promoter，

コスミドの解析から，本生合成遺伝子クラスター

ribosome binding site お よ び T7 terminator を 連 結の全長は約 40 kb からなることがわかった。相同し，T7 promoter による制御下で発現する multiple

性 検 索 の 結 果，開 始 単 位 で あ る quinoxaline-2-

gene polycistronic 発現ベクター A を構築した。こcarboxylic acid （QXC, 2） は Ecm2, -3, -4, -8, -11,

れまでに多くの polyketide synthase（PKS）および-12, -13, -14 によって生合成されることが，またNRPS の塩基配列が決定されてきたが，その多く

1 の二量体型ペプチド骨格は ecm1, -6,-7 およびは放線菌由来の GC 含量の高い塩基配列であるこ

fabC によって形成され，最後に ecm 17 および -18とが知られている。そこでこれら生合成遺伝子をによって特徴的な thioacetal 構造へと変換される大腸菌で高発現させるために，大腸菌において翻と予測された。このほか本クラスターには耐性遺訳頻度が低いコドンに対応する tRNA をコードし伝子等を加え，合計 17 個の機能予測可能な openた領域を上記発現システムに加えた。それによreading frame（ORF）と 1 個の機能不明 ORF おより，2 生合成遺伝子をさらに高発現できる発現ベ

び 1 個の不活性タンパク質をコードした遺伝子をクター B を構築した。

含んでいた。

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61（ 61 ）図 6. Echinomycin 生合成経路

3-3. Echinomycin 生合成における octadepsipeptideドメインが含まれている。続いて 2 個の NRPS モ

骨格生合成遺伝子および echinomycin 耐性遺伝子

ジュール（M3, M4）で構成される Ecm7 によって発現ベクターの構築

L-Cys および L-Val が順次縮合される。この場合もEchinomycin 骨 格 生 合 成 の 詳 細 な 経 路 は，図M3，M4 には N-メチル化を触媒する M ドメイン

6BC に示したように予想した。NRPS の A ドメイ

がそれぞれ 1 個ずつ存在した。必要な構成成分がン と 高 い 相 同 性 を 示 す Ecm1 に よ っ て 2 がすべて揃ったペプチド鎖は図 6C に示す機構によadenylation さ れ 活 性 化 さ れ た 後， ArCP と aryl

り thioesterase（TE）ドメインの触媒作用で二量体

thioester 酵 素 中 間 体 を 形 成 す る。次 い で 2 個 の化および環化により 7 を与える。酸化酵素 Ecm17

NRPS モジュール（M1, M2）で構成される Ecm6

によりジスルフィド結合が形成されて triostin A（8）によって L-Ser および L-Ala が縮合される。この際に 変 換 さ れ た 後，メ チ ル 化 酵 素 と 予 想 さ れ る

M1 には L-Ser 由来の不斉中心をエピメリ化する E

Ecm18 の作用で S-メチル化後，sulfonium ylide を

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経由して thioacetal が生成されると予想した。ますることが立証された。最近我々は Ecm18 の X 線

た，echinomycin 生合成遺伝子クラスターには耐構造解析に成功したので，合わせて紹介する予定性遺伝子と推定された ecm16 を確認した。大腸菌である。

菌体内で生合成された echinomycin の DNA 結合

本研究成果は echinomycin 生合成の全過程を分活性による宿主大腸菌の死滅を防ぐことを目的と子レベルによる変換反応として詳細に解析するこ

して，ecm16 も合わせて発現ベクターに組み込むとを可能とし，一つの複雑な構造を有する生理活ことを試みた。そこで上記生合成遺伝子を ecm1,性天然物の全生合成遺伝子を発現することで，有-16, -17, -18, fabC, sfp と ecm6, -7 の二つのグルー

機合成化学による全合成とは全く異なる方法論をプに分け，2 の生合成遺伝子発現ベクター A と同用いた天然物供給の可能性を示した。

様に multiple gene polycistronic 構造を持つ，2 個の異なる発現ベクター C および D を構築した。得4. Spirotryprostatin の生物全合成られた合計 4 個の発現ベクターを一つの細胞中で安定に複製し遺伝子発現させ生合成産物を得るた

糸状菌 Aspergillus fumigatus が産生する超微量

め，それぞれ 4 種の異なる複製開始点および薬剤

成 分 spirotryprostatin の 生 物 全 合 成 を 目 指 し た

耐性遺伝子を持つ発現ベクターによる発現システ

我々の研究成果を報告する。

Spirotryprostatin 類は糸状菌 A. fumigatus BM939

ムを構築した。

株より発見された化合物である 10）。同糸状菌をは

3-4. Echinomycin および triostin A の生物全合成じめとした Aspergillus 属や近種である Penicillium

上記 4 個の発現ベクターを BL21（DE3）で共発

属 糸 状 菌 か ら は spirotryprostatin と 同 様 に現し，ファーメンターを用いた培養で 2 L の培養

L-tryptophan と L-proline からなる diketopiperazine

液から生合成産物 0.3 mg を分離精製した。本化合骨格を有した数多くの類縁化合物が発見されてお物は ESI-MS より分子量 1139［M＋K］＋，1123［Mり，これらの化合物は 5 員環もしくは 6 員環が 4＋＋Na］ ，1101［M＋H］ および 1053［M-SCH3］

ないし 5 つ連続した共通骨格を有している。そのを与え， H NMR より 1 と確認され，発現された生物活性としては，動物細胞に対する細胞周期阻合計 16 個の生合成酵素は天然に存在するタンパ

害活性などが知られている 11）。

＋

＋

1

ク質と同じ機能を持ち，大腸菌によって 1 を生産

Spirotryprostatin A および B は A. fumigatus の約可能であることが証明された。さらに，thioacetal

400 L もの培養液中からそれぞれ，1.2 mg およびの 形 成 に 必 須 と 予 測 さ れ た ecm18 を 含 ま な い

11 mg 程度しか得られない超微量成分である。有triostin A 生 合 成 遺 伝 子 発 現 ベ ク タ ー の 作 製 を望な薬剤リード化合物の候補であるにも関わら行った。これを上記と同様に発現させ，ファーメ

ず，さらなる詳細な生物活性の評価を行うには化ンターを用いた培養で 2 L の培養液から生合成産合物量が絶対的に不足している。その興味深い生物 0.5 mg を分離精製した。本化合物は ESI-MS お

物活性と特徴的なスピロ環構造から，多くの合成

よ び H NMR よ り 8 と 確 認 さ れ た。従 っ て， 化学者の興味を引き，それぞれの研究グループに
1

ecm18 は特異な S-メチル化および転移反応によりおいて各種独創的な方法論に基づく全合成が達成

8 から 1 へと変換する酵素遺伝子であることが証されてきた 12）。そこで我々は，spirotryprostatin 生

明された。この結果大腸菌を用いた発現システム

合成に関与する遺伝子を取得し，出芽酵母およびが持つ利点によって簡便に誘導体生合成を可能に

Aspergillus niger を用いた異種宿主による発現系

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63（ 63 ）図 7. Spirotryprostatin 類の生合成経路

にて spirotryprostatin 生合成経路を再構築するこ

13α-dihydroxyfumitremorgin C が，さらにプレニルとで生物による全合成をおこない，本化合物の効

基転移酵素（FtmH）が働くことで fumitremorgin B

率的な供給を目指すとともに，その特徴的なスピが生成する。最後にα-ケトグルタル酸依存型ジオ

ロ環構造の形成機構を解明することを目的としキシゲナーゼ（FtmF）が働くことで verruculogen

た。

が生成する。このように，主骨格を形成する一つ

Spirotryprostatin の類縁化合物である tryprostatinの NRPS 酵素と多くの種類の修飾酵素が働くこと

類，fumitremorgin 類，verruculogen の生合成につで，数 多 く の 関 連 化 合 物 が 生 産 さ れ て い る

いては，いくつかのグループにより多くの遺伝子

tryprostatin 類であるが，ほぼすべての生合成遺伝の機能が明らかにされている。それによると， 子 の 機 能 解 析 が 行 わ れ て い る に も 関 わ ら ず，

13）

これらの化合物の骨格構造は NRPS である FtmA

spirotryprostatin 類に至る生合成経路やスピロ環により構築され brevianamide F を生合成し，さら形成に関与する生合成遺伝子については同定されにプレニル基転移酵素（FtmB）により tryprostatinていなかった。そこで，まずは出芽酵母によりB が，続いてシトクロム P450 酵素（FtmC）およびspirotryprostatin 類の推定前駆体を生産させるシメチル基転移酵素（FtmD）が働くことで tryprostatin

ステムを構築することとし，その候補化合物としA が生成する（図 7）。続いて，シトクロム P450 酵て demethoxyfumitremorgin C の生産を検討した。

素（FtmE）により indole 環と diketopiperazine 環がDemethoxyfumitremorgin C を 生 合 成 す る 遺 伝 子

縮環し fumitremorgin C を生成し，もう一つ別のは，A. fumigatus IFO4057 株のゲノム DNA からク

シトクロム P450 酵素（FtmG）が働くことで 12α,

ローニングし，自律複製可能な出芽酵母用シャト

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ルベクターへ導入し目的の発現ベクターを構築した。導入した生合成遺伝子群は，ftmA，ftmB，

図 8.

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休眠型生合成遺伝子群の活性化により得られた天然物

ftmC であり，それぞれ酵素の機能は NRPS，プレニル基転移酵素およびシトクロム P450 である。
ま た，生 合 成 遺 伝 子 群 に 含 ま れ る シ ト ク ロ ム

P450 酵素活性の効率的な再生のため，出芽酵母
由 来 NADPH-シ ト ク ロ ム P450 還 元 酵 素 遺 伝 子（NCP1）を合わせて導入した。上記プラスミドを用い目的化合物を出芽酵母発現系で高収量にて合成するために，宿主染色体中に基質供給系遺伝子群を導入することとした。酵母宿主 SCKW5 を上記で構築した適切な発現ベクターで形質転換した
後，液体培養によって 2% ガラクトースを加えことで，転写活性を増加させこれまでに生産の確15°C で発現誘導し，得られた培養液から各種クロ

認できなかった分子を生物合成する方法。成功例

マトグラフィーによって目的化合物を分離精製しと し て 我 々 は，糸 状 菌 Chaetomium globosum にた。その結果，brevianamide F を 22 mg/L，tryprostatin

コードされる CHGG_05358（推定 PKS-NRPS，全

Bを4.0 mg/L，demethoxyfumitremorgin C を 2.6 mg/

長 12 kb）の promoter を変換して化合物 17 を得る

L の 収 量 に て 得 る こ と に 成 功 し た。続 い て（2）転写因子を高発現さことに成功した（図 8）。

spirotryprostatin A の生物合成を達成すべく出芽酵せるかあるいはノックアウトすることで休眠型生

母に ftmA, -B, -C, -D, -E およびフラビン依存型モ合成遺伝子群を活性化させ天然物を生物合成する

ノオキシゲナーゼ（fqzB）を導入したが目的化合

方法 14〜16）。成功例として生合成遺伝子群の中に物の生成を確認することができなかった。また， 存在する推定転写因子を高発現させ，A. niger か

ftmA, -B, -E, -G を 導 入 し た 場 合 に お い て もら化合物 18 および多くの類縁体を得ることに成spirotryprostatin B の生成を確認できなかった。そ（3）異種発現宿主に休眠型遺伝子
功した（図 8）。

こで宿主を生産菌と近縁な糸状菌 A. niger を用いを導入し異種発現によって天然物を生物合成させ再度生合成を試みた。これらの遺伝子に強発現る方法 17）。成功例として A. fumigatus にコードさpromoter をそれぞれ連結し異種発現させたとこ

れた合計 6 個の生合成遺伝子群を高発現させ，天ろ，目的とした spirotryprostatin A および B の生産

然の生産菌からはこれまでに単離されていない化を確認し，生物全合成を達成した。

合物 19 の生物合成に成功した（図 8）。上に示した成功例から，これら 3 種類の手法は休眠型生合成

5. 休眠型生合成遺伝子群の活性化による天然物探索法の確立

遺伝子群を活性化させる上で有効であることが実
験的に証明された。
次に，Chaetomium 属糸状菌を分子遺伝学的に機能不明の休眠型生合成遺伝子群を活性化させ容易に取り扱うことができるように改変された変

天然物を生物合成させるため，以下に示す 4 種類

（4）二次代謝産物生合成のエピ
異株 18,19）を用い，の方法を用い天然物の生産を試みた。（1）プロジェネティクス制御因子と予測される遺伝子モーターを天然のものから強発現型へと変換する （veA, laeA, sptJ）を欠損させた。これら遺伝子のFeb. 2015

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65（ 65 ）図 9. veA ノックアウトによる代謝産物の変化

推定機能は，光感受性タンパク質で有性胞子形成

る上限を設定することができる。つまり，もうこ

過程において機能する VeA および DNA のメチルれ以上探索をしても新しい化合物をこの菌種から化に関与するタンパク質（LaeA），ヒストンアセは得られないと見極めができることを意味する。

チル化に関与するタンパク質（SptJ）であると考

天然物探索におけるゲノム解読の重要性はこの点えられている。これらの遺伝子を欠損させ，ヘテにあると我々は考えている。従って上でも述べた

ロクロマチン構造を改変することで，新しい天然

通り，複数の手法を組み合わせることによって今物の創出を試みた。野生株と改変された株を同じ後新しい化合物の探索を効率的に進められると期条件下で培養した後，HPLC を用い分析すること待できる。

で得られる UV-Vis クロマトグラムを比較したところ野生株には無いピークを観測した。これらを単離し構造決定した結果を図 9 に示す。本実験で謝辞北海道大学大学院理学研究院

及川英秋教授に比較した野生株と改変された株の代謝産物に大きは私が学部生以来ご指導ご鞭撻を賜り，深甚なるな変化を観察することができたが，得られた化合

感謝の意を表します。Echinomycin 生合成研究に

物の新規性としては期待通りの結果とはならな

おいて共同で研究を行って頂きました北海道大学

かった。ゲノムが解読された菌種では，その菌種

大学院理学研究院

が生合成できる二次代謝産物（生合成中間体を除ず一緒に実験に励んでくれた学生の皆様に心よりく）の個数を推測できる。すなわち，我々は目的御礼申し上げます。今回講演させて頂いた研究をとした菌株一種類に関して，化合物の探索におけ遂行するために必要となる基礎的な理論，知識お

大栗博毅准教授，昼夜を問わ66（ 66 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

よび技術をご教授して下さり，多くの助言を頂き

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Feb. 2015

product. J. Am. Chem. Soc. 131: 9347〜9353,
2009
ましたスタンフォード大学 CHAITAN S. KHOSLA 教
7）WATANABE, K. & H. OIKAWA: Robust platform
授，ウイスコンシン大学マディソン校名誉教授
for de novo productions of heterologous
CHARLES R. HUTCHINSON 博 士，ハ ー バ ー ド 大 学
polyketides and nonribosomal peptides in
Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5: 593〜
CHRISTOPHER T. WALSH 教 授，ブ ラ ウ ン 大 学 DAVID
602, 2007
E. CANe 教授，ワシントン大学名誉教授 HEINZ G.
8）WATANABE, K.; H. OGURI & H. OIKAWA: Genetic
FLOSS 博士に心より感謝申し上げます。最後にな
indoctrination of Escherichia coli for innovative
りますが，貴重な試料である spirotryprostatin A，drug discovery by way of heterologous
expression of the echinomycin biosynthetic
tryprostatin A を快くご供与頂きました名古屋大学
pathway. Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 189〜196,
創薬科学研究科 福山 透教授，下川 淳助教に2009
深謝致します。
9）WATANABE, K.; A. P. PRASEUTH, M. B. PRASEUTH,
et al.: Assembling nonribosomal peptide genecluster in a heterologous host. Complex
参考文献
enzymes: overview and peptides. Methods in
1）WATANABE, K.; T. MIE, A. ICHIHARA, et al.:Enzymol. 458: 379〜399, 2009
Detailed reaction mechanism of macrophomate 10）CUI, C.-B.; H. KAKEYA & H. OSADA: Novelsynthase: extraordinary enzyme catalyzing
mammalian cell cycle inhibitors, spiroﬁve-step transformation from 2-pyrones totryprostatins A and B, produced by Aspergillus
benzoates. J. Biol. Chem. 275: 38393〜38401,
fumigatus, which inhibit mammalian cell cycle
2000
at G2/M phase. Tetrahedron 52: 12651〜12666,2）OSE, T.; K. WATANABE, T. MIE, et al.: Insight into
1996
a natural Diels-Alder reaction from the structure 11） ALLEN, J. D.; A. VAN LOEVEZIJN, J. M. LAKHAI, etof macrophomate synthase. Nature 422: 185〜al.: Potent and speciﬁc inhibition of the breast
189, 2003
cancer resistance protein multidrug transporter
3）WATANABE, K.; C. C. C. WANG, C. N. BODDY, etin vitro and in mouse intestine by a novelal.: Understanding substrate speciﬁcity ofanalogue of fumitremorgin C. Mol. Cancer
polyketide synthase modules by generating
Ther. 1: 417〜425, 2002
hybrid multimodular synthases. J. Biol. Chem. 12）EDMONDSON, S. D.; S. J. DANISHEFSKY: The total
278: 42020〜42026, 2003
synthesis of spirotryprostatin A. Angew. Chem.
4）WATANABE, K.; M. A. RUDE, C. T. WALSH, et al.:Int. Ed. 37: 1138〜1140, 1998
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fumitremorgin-type alkaloids in ascomycetes. J.
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Antibiot. 64: 45〜49, 2011
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Total biosynthesis of antitumor nonribosomal
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Biology 2: 423〜428, 200615）NAKAZAWA, T.; K. ISHIUCHI, A. PRASEUTH, et al.:
6）WATANABE, K.; K. HOTTA, M. NAKAYA, et al.:Overexpressing transcriptional regulator in
Escherichia coli allows efficient modular
Aspergillus oryzae activates a silent biosynthetic
incorporation of newly isolated quinomycin
pathway to produce novel polyketide.
biosynthetic enzyme into echinomycin
ChemBioChem 13: 855〜861, 2012biosynthetic pathway for rational design and 16）TSUNEMATSU, Y.; S. ICHINOSEKI, T. NAKAZAWA, etsynthesis of potent antibiotic unnatural naturalal.: Overexpressing transcriptional regulator inFeb. 2015

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

Chaetomium globosum activates a silent
biosynthetic pathway: evaluation of shanorellinbiosynthesis. J. Antibiot. 65: 377〜380, 201217）ISHIUCHI, K.; T. NAKAZAWA, T. OOKUMA, et al.:Establishing a new methodology for genome
mining and biosynthesis of polyketides andpeptides through yeast molecular genetics.
ChemBioChem 13: 846〜854, 201218）WINTER, J. M.; M. SATO, S. SUGIMOTO, et al.:Identification and characterization of the

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67（ 67 ）chaetoviridin and chaetomugilin gene cluster in
Chaetomium globosum reveals dual functions ofan iterative highly-reducing polyketide
synthase. J. Am. Chem. Soc. 134: 17900〜
17903, 201219）ISHIUCHI, K.; T. NAKAZAWA, F. YAGISHITA, et al.:Combinatorial generation of complexity byredox enzymes in the chaetoglobosin A
biosynthesis. J. Am. Chem. Soc. 135: 7371〜
7377, 2013