博 士 （ 医 学 ） 眞 岡知 央
学 位 論 文 題 名

胆管結紮による肝不全モデル動物における腎 血 行動 態異 常につい ての解析
学位論文内容の要旨【背景 と目的 】「肝腎 症候群 」(Hepatorenal syndrome，以下 HRS)は肝機能 が著しく障害された状態において合併する急性あるいは亜急性の腎機能障害と定義され，正常肝機能を持つ慢 性腎不 全患者に H
RS
患者の腎臓を移植した場合に腎機能が回復したことなどが報告されていることなどから機能的腎障害と考えられている．
HRSの 発症機 序に血行 動態異常が深く関わることが示されており，肝機能低下に伴い血管作動物質の産生や消費が生じ，内臓血管抵抗の低下と心拍出量増加に伴う循環動態の変化が惹起され，腎臓では腎血管抵抗の増大により腎血流量の低下が生じるとされているが，詳細な機序にっいては未だ明らかになっていない．
腎臓には血行動態の自動調節機構が存在し，主要な調節機構として，血管そのものが本質的に備えている筋原反応と，単一ネフロンにおける糸球体濾過量を最適化するための尿細管
糸 球体 フ イ ード バ ッ ク機 構 (Tubuloglomerular feedback，以 下TGF)の2種類が 知られている．糖尿病・高血圧などの全身性疾患ではこれらの機構の破綻と病態への関与が明らかにされている，
そこで本研究においては，「HRSは血行動態異常に基づく機能障害である」という観点からHR
Sにおけ る腎血行 動態異常を明らかにすることを目的とした．実験に供する動物モデ
ルとして，胆管結紮によるラッ卜およびマウス肝機能障害モデルを作成し，腎臓の血行動態ならびにそれに関わる因子にっき検討した．
【対象と方法】
く1．胆管 結紮モデ ルの作製 ＞8週齢のSD
ラ ットお よび，TGFの主 要なメデ ィエータ ーであ るア デ ノ シン と ー 酸化 窒 素 (NO)の 関与 を 検 討す る た め， 8‑1
2週 齢 のAl adenosinereceptor
ノッ クアウト マウス (AIAR)，brain Ni
tric OxideSynt
hases
ノックアウトマウス(bNOS)，endotheli
al Nitric OxideSynt
ha8esノック アウトマ ウス（ eNOS）に対し胆管結紮 （BdeDuct
Ligation，以下BDL）を行い，対照として開腹のみ行った偽手術（Sham）群を作成した．ラットは手術施行2週間後，マウスは10日後に肝機能・腎機能を評価した・
く2．動脈 手動クラ ンプによ る自動 調節能の 測定＞ 胆管結紮術を施行2週間後のラットを使用し腎血行動態測定実験を行った．右大腿動脈より腹部大動脈内にカテーテルを挿入し腎灌流圧 （RPP）を測定 した． 腹部大動脈の腎動脈分岐直上に手動クランプを掛け，大動脈を 絞 扼 し ， 腎 灌 流 圧 を 約 10mmHg前 値 よ り 軽 度 低 下 さ せ （ mddclamp： E1） 続 いて 約20mmHg低下 させて（ 皿odera托clamp：E2）腎動 脈に設置 した超音波流量により総腎血流量（RBF）を 測定した ．更に グラスフ ァイバー 製の超 音波プローブ2本をそれぞれ腎表面か ら約 1mm， 約 3mmの 深 さ に挿 入 し 皮質 表 層 （SBF）， 深 層 血流 信 号 （DBF） を測 定した．
く3．Micr叩unct
町e法を 用いた 尿細管糸 球体フ イードバ ック反応の検討＞マイクロプレッシヤーシステムに接続した硝子ピペッ卜（先端経：2111n）を近位尿細管に穿刺し，これを尿細管圧測定用の圧ピペットとした．同部位より下流の尿細管を固形ワックスで閉塞し尿― 302ー

流を遮断，さらに下流へ人工尿細管液で満たしたガラスピペット穿刺し，ヘンレループ内に灌流させる人工尿細管液量を0‑40nl/m.
inまで任意に変化させた．このときに圧ピペットで測定される尿細管内圧をS
topflowpressure（Pヨf）とした，
く4．ア ンギオテ ンシン 受容体阻 害薬投 与実験＞ 胆管結紮術を施行1週間後のラットを使用し，RPP， RBF， SBF， DBFの 基礎 値 を 測 定後 ， ア ンギ オ テ ンシ ン 受 容体阻 害薬で ある RNH6270 (OlmesartanMedoxomil活 性 体 ）を O.lmgikg． 体 重を 静 注 した ．投与後 のRPP，RBF，SBF，DBFを経時的に観察した．
く 5． アン ギ オ テン シ ン 受容 体 (ATl)の評 価 ＞胆 管結紮手 術2週 後のラ ットより 片腎を摘 出し，全 腎組織 を用いて A
T1
受容 体の発 現程度を ウエス タンブロ ット法 で確認した，
【結果】
く1>SD
ラットにおいては，総ビリル′ビン(T‑bil)，アスパラギン酸アミノトランスフェラー ゼ (AST)，ア ラ ニンアミ ノトラ ンスフェ ラーゼ (AI」T）値は B
DL群 でS
ham群よ りも有意 に 上 昇 し て い た， ま た 血 清ク レ ア チニ ン (Cr)， 尿素 窒 素 (UN)値は BDL群で Sham群よ り 有 意に 上 昇 して お り ，24時 間ク レ ア チニ ン ク リ アラ ン ス (Ccr)が BD
L群でSham
群よ りも有意 に低下 していた． Wildtypeマウス（以下WT)に対して同様の検討を行った結果 ほ ぼ ラッ ト と 同様 で あ った ． AI
AR， bNOS， e
NOSのノ ッ ク アウ 卜 マ ウスで は，eNOS
群 で 血 清Cr値 がWT
群 に比較 し有意な 上昇を認 めたが ，AIA
R群， bNO
S群では有 意差を 認めなかった．
く2＞測 定装置を 設置後 15分間静置し定常状態となった値をbaselineとして測定後，更にtime control (C)を計測した，RB
Fは，El，E2におけるtimecontrolからの変化率がSh
am群ではElで‑3.
9％，E2で‑7.
3％であったが，BD
L群ではE1で．13.
8％，E2で‑20.
7％とSh
am
群 に比較し 有意に 大きな変化を示した．S
BFの変化率は，BDL群においてElで．3.
1％，E2で‑5.
5％の低下 を認め ，Sham
群に比較しても有意な低下を認めたが，DBFの変化率はEl，E2とも両群問に有意差を認めず，かつtimecon
trol
Irこ対しても有意差を認めなかった．
く 3>定常 状 態 （Onl′min)に おいて， P
ヨfはSh
am
群 の40.
6+5.87 mmHgに対 し，BDL群で29.
2士6.36mm
Hgと有意に低下していた．20nl/min，40nl/min
ではSham群のPヨfが徐々に低下しT
GF反 応を 明 確 に示 す の に対 し ， B
DL群で はP
sfの 低下を 認めなか った．変 化率(APヨf）でみると40nl/minの時にSham群が‑
25.
8d:7．28％と0nl/minの時に比べて大きく低下しているのに比べBDL群では‐13.
72+13.
54％と低下の割合が小さく，両者間には有意差を認めた．
く4>Z1RBF，4SBF，ADB
Fは，各 経過時 間時点に 韜いて 両群間に 有意差 を認めなかった．
く 5>両 群 の 腎 に お け る AT1受 容 体 蛋 白 の 発 現 程 度 は ， 有 意 差 を 認 め な か っ た ．
【結論】胆管結紮モデルラットでは，糸球体尿細管フイードバックの著しい障害を認めた．
腎血管の自動調節能も胆管結紮モデルラットでは障害を受け，特に皮質血管において著明な障害を認め，深部血管と差異を認めた．すなわち，肝障害時の腎機能低下には，腎血行動態異常，特に血行動態調節能カの破綻が大きく寄与していると考えられる．eNO
Sノックアウトマウスでは野生型に比較し胆管結紮により有意な腎機能の低下を認めており，NO産生系の異常が深く関与していると考えられるが，レニン・アンギオテンシン系の異常にっいては
有 意 な結 果が 得 られ ず ，そ の 関与 につ いては 更なる検討を 要する．

― 303―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 筒 井 裕 之
副 査 教 授 浅 香 正 博

学 位 論 文 題 名胆管結紮による肝不全モデル動物における腎血 行 動態 異常 について の解析「 肝 腎症 候 群 」(Hepatorenal syndrome， 以下HRS)
は 肝機能が 著しく 障害され た状態において合併する急性あるいは亜急性の腎機能障害と定義され，機能的腎障害と考えられている．肝障害に続き血管作動物質の産生が生じ，腎血流量の低下が生じるとされているが，詳細な機序については未だ明らかになっていない．
腎臓の主要な血行動態調節機構として，血管そのものが本質的に備えている筋原反応と，単一ネフロンにおける糸球体濾過量を最適化するための尿細管糸球体フイードバック機構(Tubuloglomerular feedback， 以 下TGF)の 2種 類が あ り ，HRSにお い て これ ら 調 節機構の異常を明らかにすることを実験の目的とした，実験に供する動物モデルとして，胆管 結紮(bileductligation，以下BDL)によるラットおよぴマウスの肝機能障害モデルを作成した．
SDラットお よび， TGFの主 要なメデ ィエー ターのー っであ る一酸化窒素の関与を検討するため，brainNitr
icO
xideS
ynthases
ノックアウトマウス，endothelialNitricOxide
Synthases
ノッ クアウ トマウス (eNOS)に対し 胆管結紮 を行い ，対照として偽手術(Sham)
群 を作成 した，ラットは手術施行2週間後，マウスは10日後に肝機能・腎機能を評価し，BDL群 でSham
群 よ り も有 意 な 肝酵 素 ， 血清 ク レ アチ ニ ン (Cr)値 の上 昇 を 認め た ． マ
ウ ス に お いて は ， e
NOS群で 血 清 C
r値 が W
ild type群に 比 較 し有 意 な 上昇 を 認 めた ．
腎血行動態測定実験にはラットのモデルを用いた．腹部大動脈に手動クランプを掛け，
大 動 脈 を 絞 扼 し ， 腎 灌 流 圧 (RPP)を 約 lOmmHg前 値 よ り 低 下 さ せ(mild clamp: El)
続いて約20mmHg低 下 させ て (moderate clamp: E2)腎 動 脈に設置 した超 音波流量 と，腎 表面 に設置し た超音 波プロー ブにより 総腎血 流量(RBF)，皮質 表層(SBF)，深層 血流信 号(DBF)を測定し た．ま た，主要 な血管 作動物質 である レニン―アンギオテンシン系の 関 与 の 検討 の た め， RPP， RBF， SBF， DBFに つ い て は， アンギオ テンシ ン受容体 阻
害 薬であ るO
lmesartan Medoxomil
活性体投与後の変化を経時的に観察した，さらに，ラッ トより 片腎を摘出し，全腎組織を用いてAT1受容体の発現程度をウエスタンブロット法
で 確 認 し た ． RBFは ， El， E2に お け る controlか ら の 変 化 率が BDL
群 で Sham群 に比較 し 有 意 に大 き な 変化 を 示 した ， SB
Fの 変 化率 は BD
L群 にお いてSh
am
群に 比較し ても有 意な低 下を認めたが，DBFの変化率は両群聞に有意差を認めなかった．アンギオテンシン 受 容 体 拮抗 薬 の 投与 後 は ，RBF，SBF，DBFに ついて， その初 期値から の変化 率は各― 304ー

経過 時間時 点におい て両群問 に有意 差を認め なかっ た．両群の腎におけるAT
1受容体蛋白の発現程度にも差を認めなかった．
次に，TGF反応についての検討を行った．硝子ピペットを近位尿細管に穿刺し，ヘンレ
ルー プ内に 灌流させ る人工尿細管液量を0‑40nl/minまで任意に変化させたときの近位尿細管内圧(stopflowpressure，以下Pヨf）を測定した．定常状態において，PヨfはSham
群に対 し，BDL群で有 意に低下 してい た．20 nlUmin，40nl/minではSham群のPヨfが徐々に 低 下 し TGF反 応 を 明 確 に 示 す の に 対 し ， BDL群 で は P
sfの 低 下を 認 め なか っ た ．
以上より，胆管結紮モデルラットでは，腎血管の自動調節能においては特に皮質血管で著明に障害され，深部血管と差異があり，また糸球体尿細管フイードバック反応の著しい障害を認め，肝障害時の腎機能低下には，血行動態調節能カの破綻が大きく寄与していると考 えられ た．これ にはNO産生系の異常が関与している可能性があるが，レニン・アンギオテンシン系の異常については有意な結果が得らなかった，以上が論文の要旨である．
学位 申 請 者眞 岡 知 央の 学 位 論 文公 開 発 表は ，平 成22年2月1日午後2時8分より 医学部臨床大講堂において行われた．申請者はスライドを用いなカミら約20分に渡って学位論文内容の発表を行った，
その後，副査筒井裕之教授より，本実験で使用されたモデルにっいてアンギオテンシン受容体の発現の部位による違い，アンギオテンシン受容体拮抗薬の投与で腎機能が回復す
る か ど う か ， 臨 床 的 に 考え ら れる 治療 法 につ い て質 問 があ った ．
この質問に対して申請者は，腎の部位によるアンギオテンシン受容体発現の違い，アンギオテンシン受容体拮抗薬の投与による腎機能回復効果については本研究では未検証であるが，肝腎症候群の血行動態異常は複数の血管収縮因子，血管拡張因子の作用が複雑に関与していると推測されることから，単一の薬剤投与での治療は困難ではないかと回答した．
次いで，副査浅香正博教授より，本実験で使用されたモデルについてビリルビンの腎機能に与える影響について，エンドトキシンの関与について，およびこのモデルが肝硬変に至っているのかどうか，にっいて質問があった，
ま た ， 主 査 小 池 隆 夫 教 授 よ り ， ′ 本 実 験 で 使 用 さ れ た モ デ ル が ， 肝 腎 症 候群のモデルとして妥当であるかどうか，腎組織に非可逆的変化が起きるのかどうかについて質問があった．
これらの質問に対して申請者は，本モデルにおいては，組織学的異常が認められなかったことからビリルビンやエンドトキシンの影響はあっても限定的であると考えられ，また，本モデルは完全な肝碩変には至っていないが，肝腎症候群の初期の段階を再現するものとして は一定 の妥当性 があるものと考えられると回答した．質疑応答の時間は約15分であった，
この論文は，肝機能障害時の腎血行動態変化についての詳細を明らかにした点で評価され ，今 後 のさ ら に詳細な病 態解明の一助 となることが 期待される，審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請者 が博士（ 医学）の 学位を 受けるの に十分 な資格を 有する ものと判 定した．

− 305一