倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1452

ナノ粒子界面の精密設計に基づいた
DNA ナノシステムによる感染症のその場診断技術の開発
代表研究者

大石基

筑波大学

数理物質系

物質工学域

准教授

Development of point of care testing for infectious diseases using
DNA nano-systems based on precise design of interface of nanoparticles
Principal Researcher

Motoi Oishi,
Division of Materials Science, Faculty of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba Associate professor

本研究では、ナノ粒⼦界⾯の精密設計に基づいて調製した DNA 化⾦ナノ粒⼦の⻑期保存条件の検討および蛍光による核酸検出の検討を⾏った。−20 ℃で DNA 化⾦ナノ粒⼦溶液を保存することで、2 か⽉
間 Au-S 結合の切断による DNA の脱離を防ぐことが可能であった。また、この DNA 化⾦ナノ粒⼦を⽤いて、⾜場介在型 DNA 鎖交換反応を素反応とした酵素フリーな蛍光シグナル増幅機能を有する新規なDNA ナノシステムを⾦ナノ粒⼦界⾯において構築することに成功した。
In this study, optimization of the preservation conditions of DNA-modified gold nanoparticles andfluorescence detection of nucleic acid were investigated. Note that the cryopreservation at ‒ 20 ºC wascapable of preventing the DNA dissociation though the cleavage of Au‒S bonds. Furthermore, a new DNA
nano-system on the surface of DNA-modified gold nanoparticles was successfully created based on
toehold-mediated DNA displacement reactions, and eventually, the system showed enzyme-freeamplification of the fluorescence signal.

1．研究内容PCR 法では、特殊な装置が必要、酵素を⽤いるが1.1 背景と研究⽬的故に⼿間のかかる検体からの標的核酸の単離（前近年、ウイルスおよび細菌を病原体とする感染処理）が必要、増幅・検出に数時間かかるなどの症（新型コロナウイルスなど）が世界各地で流⾏理由から、感染症の「その場」診断には⼗分とはし⼤きな問題となっている。しかし、これら感染⾔い難いのが現状である。したがって、感染症の症において、未だに効果的なワクチンおよび薬剤「その場」診断においては、酵素および装置を⽤が少ないのが現状である。したがって、感染症のいない⾼感度検出システムの開発が「鍵」となる。

早期拡⼤防⽌および適切な初期治療の観点から、本研究では、申請者が独⾃に開発した「ナノ界感染症の「その場」診断の重要性が⾼まっている。

⾯構築法」を基盤として⾦ナノ粒⼦界⾯にナノ反

現在、感染症の診断には、酵素を⽤いた病原体由応場を構築し、酵素および装置フリーな連鎖的（⾃来の核酸の増幅・検出に基づく PCR（polymerase発的）DNA ハイブリダイゼーション（⼆本鎖形成）

chain reaction）法が実⽤化されている。しかし、に基づく⾦ナノ粒⼦の新奇凝集反応により、感染倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成症の病原体由来の標的核酸を「その場」で検出で図１a）に⽰すように蛍光共鳴エネルギー移動きる DNA ナノシステムを開発することを⽬的に（FRET: Förster Resonance Energy Transfer）をしている。本助成期間においては、「ナノ界⾯構築利⽤した。具体的には、H1-DNA/PEG 化⾦ナノ法」により調製した⾦ナノ粒⼦の⻑期保存条件お粒⼦上の H1-DNA は、ヘアピン構造を形成していよび⾦ナノ粒⼦を⽤いた蛍光による核酸検出の検るため、蛍光⾊素である FAM は⾦ナノ粒⼦近傍討を⾏った。に存在する。この近接している状態では、FAM から⾦ナノ粒⼦への FRET が起こるため、FMA が発1.2 結果と考察光することはできない。⼀⽅、Au-S 結合の切断を最初に「ナノ界⾯構築法」によりチオール（SH）介して⾦ナノ粒⼦から脱離した H1-DNA の FAM

化ヘアピン型 H1-DNA（H1）とチオール（SH）

は、⾦ナノ粒⼦からの距離が離れることで FRET化ポリエチレングリコール（PEG）を Au-S 結合が解消され FMA が発光できるようになる。すなを介して共固定させた H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒わち、各温度で所定期間保存した H1-DNA/PEG⼦を調製した。しかし、この H1-DNA/PEG 化⾦化⾦ナノ粒⼦溶液の遠⼼分離を⾏い、その上澄みナノ粒⼦は、溶液中において時間の経過とともに溶液の蛍光（FAM）測定を⾏うことで Au-S 結合

Au-S 結合の切断による DNA の脱離が起こるため、の安定性を評価した。H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒

⻑期保存できないことが問題となっている。した⼦溶液を異なる温度（25, 4, および−20 ℃）で⻑がって、調製した H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒⼦を期間（56 ⽇間＝2 か⽉間）保存した際、保存時間

⻑期保存した際の Au-S 結合の安定性を評価し、に対する⾦ナノ粒⼦から脱離した H1-DNA の割保存温度の最適化を⾏った。この H1-DNA/PEG合（%）を図１b)⽰す。保存温度が⾼くなるにつ化⾦ナノ粒⼦の Au-S 結合の安定性を評価には、れ脱離する H1-DNA の割合は⾼くなることが明a)らかとなった。⼀⽅、−20 ℃で 2 か⽉間保存した消光（FRET）

H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒⼦は、凝集を起こさず脱離したH1-DNA

H1-DNA

蛍光 F

FFPEG→F

⾼い分散安定性を保ち、かつ Au-S 結合の切断にFFFFF

蛍光色素→ F（F: FAM）

F
F

様々な温度における保存F

H1-DNA/PEG化金ナノ粒子（168 本/粒子）

脱離したDNA (%)b)

H1-DNAが脱離した金ナノ粒子

よる DNA の脱離を全く起こさないことが明らかとなった。
次に、この H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒⼦を⽤いて新規な DNA ナノシステムを構築し、標的 RNA

7049 %

6038 %

5025 °C

4015 %

2011 %

4 °C

6%100-20 °C-1007

標 的 RNA の 検 出 の 原 理 を 図 ２ a) に ⽰ す 。
H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒⼦上の H1-DNA は、ヘ22 %30の検出を⾏った。この DNA ナノシステムによる

14212835424956

時間（⽇）

アピン構造を形成しているため、蛍光⾊素である
FAM は⾦ナノ粒⼦近傍に存在する。この近接している状態では、FAM から⾦ナノ粒⼦への FRET が起こるため、FMA が発光することはできない。また、この H1-DNA/PEG 化⾦ナノ粒⼦の溶液に別図1 a) H1-DNA/PEG化⾦ナノ粒⼦のAu-S結合ののヘアピン型 DNA（H2：燃料）を加える。⼀⽅、安定性評価の概要、b) 異なる温度で⻑期間保存時混合した際にヘアピン構造を有する H1 と H2 のにおける脱離した H1-DNA の割合（%）

間で⾜場介在型 DNA 鎖交換反応を起こすことは倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成a)F

消光

ヘアピンDNA→
（H1）

F

F

PEG

標的RNA
（T）

+

F

H2

H1

←蛍光色素（F: FAM）

発光

FF+

T
発光：金ナノ粒子と蛍光色素の距離が離れることでFRETが解消

蛍光共鳴エネルギー移 H2（燃料）動（FRET）により消光
H1-DNA/PEG化金ナノ粒子
FFFstart here

発光H1F

標的RNA（T）

F

H2

H1-DNA/PEG化
金ナノ粒子

F

足場介在型DNA鎖交換反応① （T ⇔ H1）

F

H1F

←足場

H2（燃料）

FFT ↑足場中間体b)c)[target RNA]:
10 nM
5 nM

1.1
1.0

1.1

240 min180 min
120 min

1.0
0.9

0.9
0.8

0.8

2 nM

0.7
0.6
0.5

1 nM

0.4
0.3

500 pM

0.2
0.1
003060200 pM
100 pM
50 pM
90 120 150 180 210 240 20 pM
10 pM
5 pM
time (min)0M

normalized F

normalized FH1↑F
足場

F

DNAサーキット

足場介在型DNA鎖交換反応② （T ⇔ H2）

消光FF60 min

0.70.630 min

0.50.40.30.20.10012345678910 11[target RNA] (nM)

図 2 a) ⾜場介在型 DNA 鎖交換反応を素反応とした新規な DNA ナノシステムによる標的 RNA の検出原理、b) 様々な標的 RNA 濃度における時間に対する規格化した蛍光強度（ F ）の変化。c) 様々な標的 RNA 濃度における各検出時間と規格化した蛍光強度（ F ）の変化。
ない。次いで、標的 RNA（T）を含む検体を加え起こす。すなわち、再⽣した T は、同⼀粒⼦上でると、粒⼦表⾯の H1 の⾜場を介して T との⾜場

⾜場介在型 DNA 鎖交換反応①および②の触媒と介在型 DNA 鎖交換反応①が起こり、ヘアピン構して働くことになる。最終的には、⾦ナノ粒⼦と造が直鎖構造に変化（開環）する。さらに、粒⼦蛍光⾊素である FAM との距離が離れることで表⾯の H1/T は、⾜場を介して H2 と⾜場介在型FRET が解消され FMA が発光できるようになる。

DNA 鎖交換反応②を起こし、同時に T がリリー

図２b)には、様々な標的 RNA 濃度存在下における、スされる。このリリースされた T は、粒⼦表⾯に時間に対する規格化した蛍光強度（F ）の変化を隣接する H1 と⾜場介在型 DNA 鎖交換反応①を⽰す。標的 RNA の⾮存在下（0 M）においては、

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
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蛍光強度の変化はほとんど認められなかった。⼀における安定性およびDNA鎖交換反応の評価」

⽅、標的 RNA の存在下においては、標的 RNA 濃

⽇本分析化学会第70回分析化学会年会 （オンライ度および時間に依存して蛍光強度が増加しているン、2021年）ことが確認された。これらのことから、標的 RNAを触媒とした DNA サーキット（蛍光シグナルの増幅）が⾦ナノ粒⼦界⾯においても成⽴していることが明らかとなった。また、様々な標的 RNA濃度における、各検出時間（30, 60, 120, 180, 240分）と蛍光強度（normalized F ）の関係を図２c)に⽰す。全ての検出時間において、標的 RNA 濃度の蛍光強度の関係は良い直線性が認められた。これら標的 RNA 濃度と蛍光強度の直線性は、標的RNA 濃度に対して pM レベル 〜nM レベルの範囲で確認できることから、3 桁ほどの広い定量範囲を有していることが明らかとなった。さらに、検出限界濃度（LOD: Limit of Detection）は、検出時間が⻑くなるにつれて低くなることが確認された。すなわち、検出時間 30 分において LOD = 24
pM (pM: 10-12 M)および検出時間 240 分においてLOD = 4.0 pM をそれぞれ達成することができた。
本研究を遂⾏するにあたり、多⼤なご援助を賜りました「公益財団法⼈ ⽇⽴財団倉⽥奨励⾦」に厚く御礼申し上げます。

2．発表（研究成果の発表）
国内外の学会誌、学会講演会等における発表があれば５件程度記載。
記載内容：⽒名、題⽬、誌名、巻、号、⾴（年次）、学会名（場所、年次）
１ ） Shotaro juji and Motoi Oishi “ Long-term
Cryopreservation of Ready-to-Use DNA-Modified
Gold Nanoparticle Derivatives: Effect ofPreservation Temperature on Their DNA
Dissociation and Functional Stability” Bulletin of

the Chemical Society of Japan (2022) 95, 3, 410‒
412.
２）⼗字祥太郎、⼤⽯

基 「Au-S結合によってDNAを修飾した⾦ナノ粒⼦誘導体の⻑期保存