博 士（医 学）金田聡

学 位論 文 題名
末 梢 血 リ ン パ 球 GRKmRNA定 量 に よ る
心不 全重 症度判定の試 み
学位論文内容の要旨
p ARに代 表 さ れる 細 胞 膜 7
回 貫 通 型の GTP
結 合 蛋 白質 連 関 受容 体 （ GCR： Gprote
incouledreceptors）を特異的に修飾するりン酸化酵素（GRK：G‑
proteincoupledreceptorkinase） と し て 現在 ま で に6種 類 がクロ ーニン グされて いる（GRK1〜6)。この うち、
GRK2、 GRK3、 GRK5が p
ARを りン 酸 化 しdowIllregulationを引 き 起 こす と 考 えら れ てお り、 心臓 では（ 永K2、GRK5の 発現が確 認され ている。 心不全患 者の心 室筋にお いてGRK2発 現 量が 増 加 して い る 報 告や 、 心 不全 動 物 モデ ル に おけ る GR
KmRN
A発 現 量 の増加 の報 告 な どか ら 、 心 不全 の 病 態に GRK
活 性 亢 進に よ る p
ARリン 酸化が 大きく影 響して いる と 推 測さ れ る 。 本研 究 で は、 心不全重 症度の 指標とし ての末 梢血リン バ球GR
KmRN
A発現 量測定の意義を確立することを目的として、（1）カテコラミン慢性投与が心筋（浪K2、GRK5発現に 与える 影響、（ 2）心 筋と末 梢血リン バ球の GRK2、（永K5
発現量の相関、 （3）GRKmR
NAの 持続時 間（代謝 回転速度）、（4）ヒト心不全の重症度とく浪K発現量の関係について検討を加えた。
対象・方法
心筋と末 梢血リ ンバ球の G
RK
発 現量の相 関を検討 するた めのラッ トモデル：ウィスター
ラット（12週齢、体重約350g)の背部皮下に浸透圧ポンプを植え込み、Norepinephrine0.
5彫g瓜 〆 min（ NE群 、 n＝ 6） ま たは Iso
proteren01
1．0肛g
瓜 〆min（lSO群 、n＝6） を2週間 連 続 投与 し た 。対 照 群 （CN1群 、n＝ 6）に は 0．01NHaを 同 様に2週間連 続投与した。 2週 間の 薬 物 投与 期 間 終了 後 に 、Pentobarbital（50mg瓜g）に て麻酔 し末梢血 約10mlをへバ リン採血 した後、 心臓を 摘出し液体窒素中で急速冷凍した後一80℃に保存した。末梢血はFicon‐Isopaque （Pharmacia、Sweden）を用いた濃度勾配遠心法によルリン
バ球を分離した
GRKmRNAの代 謝 回 転速 度 を 検討 す る ため の ラ ッ トモ デ ル ：ウ ィ ス ター ラ ッ ト（ 12週齢、体重 約350g）に0．01
NHClに溶解したI
soproterenol（25mびkガ日）を2週間毎日一回皮下投与 した。 対照群は 等量の 0．01NHClを皮下投与した。2週間の薬物投与期間の終了時に心臓 を摘出 したIS
014D
群 およぴそ の対症群 である C
Nlr1
4D
群 に加えて、薬剤非投与
期 間 を さ ら に 2週 間 加 え た IS028D群 と CN他 8D群 を 作 成 し た （ 各 群 4匹 ）心不全患 者にお けるりン バ球GR
K発現量 の検討： 研究期 間中に北 海道大学医学部附属病院循 環 器 科に 入 院 した 心 不 全患 者 の 中から 、NYH
A分類 H
度お よびm度の心 不全患者 各4名を無作 為に抽 出し採血 を行な った。前 述の方法でりンバ球を分離した。採血に際しては、研究 目的を 十分に説 明し全 ての患者 から文書によるインフオームドコンセントを得た。
定量 的 RT‐ PCR
法 ： 採 取し た り ン バ球 、心室 筋よりSinglestep法にて totalRNAを調製‑ 477 ‑

し 、 逆 転 写 反 応 で cDNAを 得 た 。 total RNA 10ngに 相 当 す る cDNAを も と に PCR法 でGRK2、 GRK5の mRNA発 現 量 を 定 量 し た 。 PCRプラ イマ ーに は、 すで に報 告さ れて い る
Rat GRK2 cDNA配列 、Rat GRK5 cDN
A配 列情 報を もと に合 成し た。 また 、各 サン プ ル毎の 増幅 効 率の 差を補正する目的で、同一 のPCR
ブライマーで増幅され 標的c
DN
Aと塩基数 の 異 な る 内 部標 準DNAを作 成し その 一定 量を 反応 系 に加 えた 。増 幅さ れた D
NAは 、ethidium bromide (0.5mg/ml 含 む ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で 分 離 し た 後 、 UVtransilluminator
上で写真に記録 した。各サンプルのDN
A量はデンシトメトリーにて求めた 。 得 ら れ た GRK cDNA量 を 内 部 標 準 DNA量 で 除 し た 値 を 求 め 、 標 的 遺 伝子 （GRK）の 標 準 化 mRNA量と した 。 GRK m
RNAの代 謝回 転速 度の 検討 、お よび 心不 全患 者に お ける GRK mRNA発 現 量 の 検 討 に お い て は 、 そ れそ れの サ ンプ ルに おけ るGAP
DH発現 量 にて標準化を行なった。
統 計 処 理 ： 得 られ た結 果 は「 平均 値土 標準 偏差 」で 表記 した 。有 意差 の検 定に は 、unpaired t‑testを 用 い 、 p値 が 0.05未 満 の 場 合 に 有 意 差 あ り と 判 定 し た 。
結果と考察
Isoproterenolの2週間 投与で、心筋およぴりンバ球のGRK5 mR
NAの発現量は対照群に比較し て有 意に 増加 して いた。全ての個体を用いた検討から、 心筋とりンバ球のGRK発現の 間 に は 有 意 な 相 関が ある こと が示 され た。 これ らの 結果 は 、GRK mRN
Aの 転写 効率が、血中のカテコラミン濃度により制御されている可能性を示唆している。末梢リンバ球と心 筋の 間で GRK発 現量に強い相 関があるという事実は、心不全による血中カテコラミン濃 度上 昇の 影響 を受 けた りン バ球 GRKの 定量 から、心臓に おけるp受容体リン酸化の程度 を推 測可 能で ある こと を示 して いる 。 次に GRK m
RN
Aの安定性（代謝回転速度）検討す る目 的で 、Isoproterenol
連 続投与により上昇したG
RK
発 現が、投与中止後2週間で前値 に回 復す るか どう かを検討した。1日1回の間欠的な投与 であっても、2週間連続して投 与す るこ とに より 、心 筋GRK5 mRN
A発 現は 有意に増加し た。投薬中止後2週間で、
心 肥 大 は regressionし て い た が 、 GRK5 mRNA発 現 量 は 高 値 を 維 持 し て い た 。 GRK2m
RNAにお いて も投 薬中 止後2週間 で高値を維持している傾向が観察されたが、 有意差を認 める にい たら なか った 。GRK mRNAの 亢 進が 投薬中止後どの程度持続するのか、今後の検討が必要と思われる。NY
HA
クラスu度およびnr度の心不全患者の末梢リンノヾ球にお け る GRK mRNA発 現を 比較 検討 した 結果 、NYHA‑II度群 に比 べて NY
HA−III度群 ではGRK2、 GRK5と も に mRNA発 現 量 は 有 意 に 高 値 を 示 し て お り 、 予 想 さ れ た 様 に 、GRK発現 量と 心 不全 重症度との間 には正の相関があることが示唆された。今回の検討では症例数が少ないことから、今後はより対象患者数を増やし、重症度や治療に対する反応性（p遮断薬やァンジ オテンシン変換酵素阻害薬など）、短期的・長期的生命予後との相関などについての検討が必要であると思われた。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 北 畠顕副 査 教 授 川 口明副 査 教 授 三 輪 秀 一
聡

学 位 論 文 題 名末 梢 血 リ ン パ 球 GRKmRNA定 量 に よ る
心 不全 重症度判定 の試み
pアドレナリン受容体（, AR)に対するりン酸化酵素(GR
K： G‑proteincoupledreceptorkinase)のう ち、 GR
K2、GRK5の 発現が心臓で確認されている。心不 全患者の心室筋におい てGRK2
発 現量 が 増加 して いる 報告 や、 心不 全動 物モ デルにおけ るG
RK m
RN
A発現量の増 加の 報告 など か ら、 心不 全の 病態 にGRK活 性 亢進 によ るpAR
リン 酸化が大きく影響して いると推 測される。申請者は、心不全重症度の指標としての末梢 血リンバ球GRK mRNA
発現量測 定の意義を確立することを目的として、(1)カテコラミン慢性投与が心筋G
RK2、GRK5発現に 与える影響、(2)心筋と末梢 血リンバ球のG
RK2、GRK5発現量の相関、(3) GRKmRNAの持続 時間（代謝回転速度）、(4)ヒト心不全の重症度とGRK
発 現量の関係について検討を加えた。ラットの背部皮下に浸透圧ポンプを植え込み、Norepinephrine0.
5,ug/kg/min(NE群）またはIso
proterenoll.
O/Lg/kg/min(ISO群）を、対照群にはO.
OINHCI(CNT群）を2週間連続投与し、末梢血約10mlをへバリン採血した後、心臓を摘出した。定量的R
T‑PCRの 結果 から 、ISO群は CN
T群 に比 較し て心 筋お よび りン バ球 のGRK5 mRN
Aの 発現 量が 有意に増加 していた。全ての個体を用いた検討から、心筋とりンバ 球のGRK発現の問には有意 な相関が あることが示された。これらの結果は、GRK mR
NAの転写 効率が、血中のカテコラミン 濃度により制御されている可能性を示唆すると共に、リ ンバ球GRKの定量から、心不全時 の心臓におけるp受容体リン 酸化の程度を推測可能であることが示された。ラットにIs
oproterenol (25mg/kg/日）を 2週間毎日1回皮下投与したIS
014D群およびその対症群 であ るCNT1
4D群 を作 成し た。 また 、薬 剤非 投与 期間 をさ らに 2週間 加え たIS028D群と CN I28
D群 を作 成し 、GRK発現が投与 中止後2週間で前値に回復す るかどうかを検討した 。1日1回 の間欠的な投与であっても、2週間連続して投与することにより、心筋GR K
5mRNA
発 現は 有意 に 増加 した 。投 薬中 止後 2週 間 で、 心肥 大はCN I28D群と同程度にまで退 縮 し て い た が GRK5 mRNA発 現量 は高 値を 維 持し てい た。 GRK2 mRNAに お いて も同 様に 高値を維 持している傾向が観察された。これらの結果から、GRKmRNAの代謝回転が緩除に進行 することが明らかとなった。研究期間中に北海道大学医学部附属病院循環器科に― 479 ‑

入院した心不全患者の中から、インフオームドコンセントを得られたNY
HA‑
I
I度およびII
I度の 心不 全患 者 各16名を 無作 為に 抽出 し採 血を 行なった。NYHA‑II度およびm度の心不全患 者の 末梢 血 リン バ球 にお ける G
RK m
RNA発現 を比較検討した結果、予想 された様にNYHA‑II度 群 に 比 ぺ て NYHA‑IH度 群 で は GRK2、 GRK5と も に mRNA発 現 量 は 有 意に 高値を示しており、GRK発現量と心不全重症度との間には正の相関があることが示唆された。
また 、NYHA‑II度の 患者 10
名 の検 討か ら、 ACE
阻 害薬の服用により、GRK2、GRI
く5のいずれも発現量が有意に低下していることが示された。今後はより対象患者数を増やし、重症度や治療に対する反応性（p遮断薬やACE阻害薬など）、短期的・長期的生命予後との相関などについての検討が必要であ ると思われた。
学位論文の発表に際し、副査の川口教授より動物モデルの作成について、および薬剤投与による変化の機序についての質問があった。ついで、副査の三輪教授より、薬剤による血行動態の変化について、ならびに心筋肥大の刺激経路についての質問があり、最後に主査の北畠教授から臨床データにおける薬剤治療との関連、本研究の臨床での応用についての質問があった。申請者は自身の研究結果に基づぃて、あるいは文献的考察により、これらの質問に概ね適切に回答した。
本論文は、心不全時の受容体機能抑制機構に関する分子レベルでの検討をとおして、全く新しい心不全重症度の指標を見出 した点で高く評価される。
審査貝一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請 者が 博 士（ 医学 ）の 学位 を受 ける のに 充分な資格を有するものと 判定した。

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