博士（医学）秋野文臣
学 位論 文題名

Cytogenetic Abnormalities of Tumor‑AssociatedEndothelial Cells in Human Malignant Tumors（ヒト 悪性 腫瘍 にお ける 腫瘍 内血管内皮細胞の染色体異常）

学 位 論 文 内 容 の要 旨

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nttumors are relevant to human TECs (hTECs) f:om human epithelial malignant tumors.
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enitor cells― 323−

(EP.Cs) .in mTECs in vivo, w.e investigated the .percentage.of progenitor marker‑positive cells among
freshly isolated mTECs and its correlation with aneuploidy. Uncultured mTECs or mNECs wereimmunostained with CD133. CD133+ and CD133‑ mTECs /mNECs were compared for aneuploidy
using quantitative FISH analysis. (4). It has been reported that centromere‑associated protein‑E(CENP‑E) is related to aneuploidy. Thus, levels of CENP‑E mRNA were analyzed in TECs andNECs by quantitative RT‑PCR.
{R.esults] (1). FISH analysis of immunostained tissue sections confrrmed the presence.of.CD31+
aneuploid cells, determined as aneuploid ECs, in tumor vessels. In contrast, there were no aneuploidECs in normal renal vessels. hTECs isolated from human RCC show aneuploidy. In human RCCs,
22‑5.8% (median 3.3%) of uncultured hTECs were aneuploid, wheiezs .nonnal EC.s were diploid. (2).
mTECs isolated from epithelial tumor xenografts are aneuploid. Quantitative analysis indicated that
55% of OSRC‑2‑ECs and 36% of HSC‑3‑ECs were aneuploid. When the cells were cultured, FISH
analysis showed that the frequency of mTEC aneuploidy increased t0 96% and 55%.In dual FISH
study, no human FISH signal in mTECs was detected (3). The percentage of CD133+ cells inmTECs was 26% (OSRC‑2‑ECs) and 31% (HSC‑3‑ECs), whereas that in mNECs was 16%.
Aneupliud cells were detected in CD133+ and CD133‑ mTECs, whereas CD133+ and CD133‑
mNECs were diploid. Among mTECs, aneuploid cells were observed more frequently in
CD31+CD133+cells than in CD3+CD133‑cells. (4). CENP‑E expression was significantly lower in
mTECs (both OSRC‑2‑ECs and HSC‑3‑ECs) compared to mNECs. Furthermore, compared to all
human NECs (hNECs, HMVECs, and HUVECs), hTECs expressed significantly lower levels ofCENP‑E.
[Discussion] We previously reported aneuploidy in mTECs isolated from nonepithelial tumors,
liposarcoma, and melanoma However, chromosomal aberrations of hTECs isolated from humanmalignant epithelial tumors have not been reported.
Here w.e show that hTECs,like tumor cells, are cytogenetically abnormal. In order to .evaluate
the ploidy of hTECs quantitatively, we used hTECs freshly isolated from human RCC tissues. FISH
analysis of freshly isolated and cytospun ECs provided additional evidence of hTEC aneuploidy inhuman RCC tissue sections. For comparative analysis, we also isolated hNECs from locations in thesame specimens, apart from the tumor, during total nephrectomy. hTECs showed aneuploidy(average 33% with chromosome 7 probes and 35% with chromosome 8 probes) in all 20 samples,
whereas hNECs were diploid with the 3‑4% score which is in normal range and is considered to bebackground.
However, the mechanisms underlying TEC aneuploidy in malignant epithelial tumors are not
yet understood. We addressed the mechanisms of TEC aneuploidy using cross‑species tumor models
that allow host cells to be distinguished from tumor cells.'In the mouse epithelial tumor xenograftmodel, more than 35% of mTECs were aneuploid, even when not cultured. This result is consistent
with our previously reported demonstrations of aneuploidy in mTECs isolated from nonepithelial
tumors, liposarcoma, and melanoma. ECs in various types of tumors, epithelial or nonepithelial, may
be aneuploid, suggesting chromosomalinstability of mTECs. This is contrary to the traditional
concept that TECs are normal and genetically stable. Our observations suggest that aneuploidy inTECs is not a rare phenomenon that is seen ‑only in hematopoietic tumors but is actually a‑common
feature of most malignant tumors. In our uncultured mTECs, fusion between mTECs and humantumor cells was not seen because aneuploid mTECs were not found to hybridize with human probe
in the dual‑probe FISH analysis,
Interestingly, CD31+CD133+ cells showed more aneuploidy compared to CD31+CD133‑ cells. On
the other hand, among uncultured mNECs, CD31+CD133+ cells did not include aneuploid cells. We
speculate that immature ECs in tumors may have escaped cell cycle arrest and maintained
aneuploidy in the tumor microenvironment. Progenitor cells with cell cycle deficiency harbor
aneuploidy, and as the cells mature, their checkpoint efficiency increases. Our data demonstrating
frequent aneuploidy in CD31+CD133+ cells support the hypothesis that progenitor cells contribute tomTECs aneuploidy.
Regardless of the actual mechanisms involved, our results showing the presence of chromosomal
aberrations in hTECs indicate another aspect of abnormality of tumor stromal cells in carcinoma.
[Conclusion] This is the first report showing cytogenetic abnormality of hTECs in careinoma,― 324 ‑

contrary to traditional belief. Aneuploid TECs that organize tumor tissue surrounding the stroma
might affect tumor progression and metastasis. It is suggested that cytogenetic alterations in tumor
vessels of carcinoma can occur and may play a signifcant role in modifying tumor‑stromalinteractions.

325 ‑学位論 文審査の要旨
主 査

教 授

笠 原 正 典副査 教授 近藤 哲
副査 教授 野々村克也

学位論文題名Cytog
eneticAbnorm
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mor
−Associa
tedEndothelial Cells in Human Malignant Tumors（ ヒト 悪性 腫瘍 にお ける 腫瘍内 血管 内皮細胞の染色体異常）

がん組織はがん細胞だけではなく、繊維芽細胞、血管内皮細胞、血液系細胞などの問質細胞から構成されている。がん細胞は細胞生物学的に異常細胞であるのに対し、問質細胞である血 管内 皮細 胞は 正常 細 胞で ある と考 えら れて きた 。マ ウス にお いて ヒト腫瘍細胞のxenograft
か ら分離された腫瘍血管内皮細胞(TEC)に染色体異常があることは報告されていたも のの 、ヒ トが ん組 織 中の 血管 内皮 細胞 にも 染色 体異 常が ある かは 不明であった。
申 請者 はCD31
抗 体を 用 いて 20例 の腎 がん 検体 から ヒト 腫瘍 血管 内皮 細胞(hTEC)だけを 分 離 し 、 hTECに FISHを 行 い 細 胞 の ploidyを 検 討 し た 。 そ の 結 果 hT
ECはaneuploidであ る事 が示 され た。また分離されたhTECを長期培養し、その 性質を検討したところ、継代 後の hTECでも 血管内皮マーカーの発現を維持していること 、またaneuploidyが増加して おり 核が 巨大 化し て いる こと 、細 胞分 裂期のmotor proteinであるC
ENP‑Eの発現が低下していることが示され、ヒトがん組織中の血管内皮細胞にはcytogen
eticな異常があることを明らかとした。
さらに申請者はヒトがん細胞のxenograft
マウスからマウス腫瘍血 管内皮細胞(mTEC)を分離し、これを用レゝてそのTECのaneuploidyのメカニズムについて 検討している。その結果、この細胞異常はがん細胞と血管内皮細胞との融合によってもたらされたものではない
こ と 、 mTECの 中 に は 幹 細 胞 マ ー カ ー で あ る CD133陽 性 細 胞 が 存 在 し 、こ の細 胞群 に
aneuploidyが高いことが示された。
副 査の 近藤 哲教 授か ら 3
つ の質 問が あっ た。 （DhTECの aneuploidyの 割合が35％程度
で あ る が 、 が ん 細 胞 の 方 の aneuploidの 割 合 は ど の 程 度 で あ っ た の か ？ ◎ hTECのCE
NP‑Eの 発現 が低 下し て いる のは がん 細胞 が何 らか の因 子を 出し てい る為なのか？◎hT
ECがaneuploidyを伴うような異常細胞であることは、がんに とってみれば、増殖に有利と考えられるのか？
申 請 者 は 上 記 質 問 に 対 し ＠ CD31陰 性 の 分 画 に 存 在 す る 腎 が ん 細 胞 は hTECよ り
aneuploidy
が 高く 、腎 癌 細胞 株で のFIS
Hで も細胞のほとんどはaneuploidであること◎
正常 血管 内皮 細胞 (NEC)をが ん細 胞の condit
ioned medium
で暴 露すると細胞異常が起こるという実験結果を例に出し、がん細胞 がりりースする未知の因子があり、その中にhT
ECの CENP‑Eの 発 現 を 低 下 さ せ る 因 子 も 含 まれ てい る可 能性 があ る こと ◎aneuploidyのmTECは 薬 剤 抵 抗 性 が あ り 、 増 殖 因 子 に 対 す る 反 応 性 が 高 い 事 実 が あ り 、 TECにaneuploidyが あ る こ と は が ん の 増 殖 に と っ て 有 利 だ と 推 測 す る と 回 答 し た 。
主 査の 笠原 正典 教授 か ら6つの 質問 があ った。＠hT
ECの染色 体異常の詳細はどうであ― 326 ‑っ た のか マ ◎ 全染 色 体 のセ ッ ト が 倍加 するよう な変化 であるの か？◎数 の異常 だけでは な く構 造 異常は あったの かc◎ 腎がん だけでな く他の がん種で も腫瘍血 管内皮 細胞のaneuploidyが あ る の か ？ ◎ 腎 癌 の su
btypeに よ りhTECの aneuploidyの 割合 に 相 違は
見 ら れ る の か ？ ◎ CD133陽 性 の mTECに aneuploidyが 高 い 理 由 は な ぜ か マ
申請者は上記質問に対し＠karyotypeまでは調べていないため詳細は分からなしゝが、がん細胞 と同じ ようなラ ンダムな 異常で あると推 測され ること◎ マウス での過去の報告では
karyotypeが調べられており、各染色体がランダム増減していたこと、◎マウスの報告では数の 異常だ けではなく転座などの構造異常もみとめられたことから、hTECでも同様に構造異常 もある のではな いかと推 測され ること◎ pilotstudyで肺がん、肝臓がん、食道がん
で も 腫瘍 血 管 内皮 細 胞 のaneuploid
yは 見 られ る こ と◎ subtypeと aneu
ploidyの割 合に相関 はない こと◎幹 細胞など imm
atur
eな細胞 ではcellc
yclearr
estが働きにくくなっている との報 告があり、結果としてaneu
ploidの細胞であってもapoptosisに至らないためではないかと回答した。
副査 の 野 々村 克 也 教授 か ら 4つの 質 問があっ た。◎ 他のがん 種から分 離され たT
ECと本 実 験で の 腎がん から分離 されたTECとの 間に相違 はある のか？◎ 腎がん では血管 新生阻害を目的とした分子標的薬が臨床適応されているが、TECで同薬剤の感受性は高いのか、低 い のか マ ◎ 抗が ん 剤 に対 す る 薬 剤感 受性はど うか？ ◎骨髄由 来の血管 内皮細 胞はがん組織ではどこに存在しているのか？
申請 者は上 記質問に 対し◎ 比較して いないためわからないが、腎がんはhypervascularであり分離される血管内皮細胞の数も多いため、がん細胞からの影響も多くなるのではないか と 推 測 する こ と ◎分 子 標 的薬 に 対 する 薬 剤 感 受性 は 調 べて い な いが 、 TE
Cは NE
Cと比較 し感受 性が低い と推察さ れるこ と、◎マ ウスの TEC
では 5‑FUおよびvincristineなどの抗がん剤の感受性が低いとの報告があること、◎抗がん剤治療後のがん組織において中心がnecrosisとなって退縮しても周辺部は増殖していることがあるが、この際骨髄由来の血管内皮細胞は増殖部分に集積しているとの報告があり、骨髄由来の血管内皮細胞はがんの増殖 が 活 発 な 部 分 に 存 在 す る の で は な い か と 推 測 し て い る と 回 答 した 。
この 論 文は ，ヒト がん組織 でもTE
Cのaneuploidyが 存在する ことを 初めて提 示した点で高く評価され，今後のがん組織におけるがん微小環境を解明する発端になると期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ
申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る もの と 判 定し た 。

‑ 327 ‑