博 士 （ 医 学 ） 林俊 治

学位論文 題名
p73andM
DM2confertheresistanceofepidermoid carcmoma to clSplatinbyblOCkingp53（シスプラチン耐性獲得機構におけるp73の機能についての解析）

学位論文内容の要旨
はじめにDNA
損傷 を含む 様々なス トレスに 応答し た細胞周 期の停 止や細胞 死の誘 導過程においてp53は重要な役割を果たす。p53は塩基配列特異的な転写制御因子として機能し、p21，MD
M
2 Bax，などの細 胞周期停 止や細 胞死を誘 導する 下流標的 遺伝子 群の発現を昂進する。また、DN
A障害に応 答 し てp53はSer15． Ser20など 複 数 箇 所のり ン酸化を 介して 活性型へ と変換 し、p53に対す る E3
ユ ピ キ チン ル ガ ーゼ で あ るMDM2と の 相互作用 が阻害さ れ分解 されずに 核に集 積する。抗癌 剤の耐性 獲得に は多彩な 分子生 物学的機 序が報 告されて いるが、 p53の 状態がDN
A
損
傷に応答 した細胞 の感受 性を決定 付ける 重要な因 子のー つであると考えられている。p53の変異によっ てDNA
損 傷に対 する正常 な応答 が阻害さ れ、p53を介す る細胞死 誘導経 路の欠損が腫瘍化能、 抗癌剤耐 性獲得 過程にお いて重 要である と考え られる。 一方、p73はp53と構造的及び機 能 的 に非 常 に類 似するが 、多く のヒト腫 瘍組織 における p73の 変異は稀 であり、 しかも
p73欠 損マ ウ ス では 腫瘍の発 生は観 察されな い。し かし、DNA損傷 に起因す るp53を 介した 細胞死 誘 導 には p73
あ るいはp63の共 発現が必 要であ ることが 報告さ れる一方 で、p73はその 標的配 列 へ の結 合 を競 合阻害し てp53の転写活 性化能 を減弱さ せるこ と、なら びに卵巣 癌由来の細 胞 株 でp73の発 現により D
NA損 傷に対す る抵抗 性が増加 するこ とを示す 報告があ る。p73は癌 細胞 に おけ る 抗癌 剤 耐性 獲得 に 関与 する可 能性が示唆され ている。
実験・結 果様々なヒ ト悪性 腫瘍由来 の細胞株 を用い て半定量 RT−PCRを行い、 転写レ ベルでのp53
ファミリ ー の 発現 を 調べ た。ヒト 鼻咽喉 癌KB細胞株 におい てはシス プラチ ン耐性株 (KCPー4）でのみp刀の高発 現が検 出され、 シスプ ラチン感 受性株(KCP−4の 親株であ るKB
3一1及びルパータン ト 株 K
CP― 4R)で はp刀 の 発現 は 低 レベ ル だった 。p刀 の発現 レベルと シスプラ チン耐 性の程 度 が 良く 相 関し ているこ とから 、KB細胞株 のシス プラチン 耐性獲 得にp刀が関与 する可能性が示 唆された 。MTTアッセイ の結果 、K
CP−4細胞 はKB
3−1細 胞に比 較し約60倍、KCPー4R細胞はKB3一1細胞に 比較し約 3倍の シスプ ラチン耐 性を示 した。次 に、シ スプラチン濃度を3ないし90uMで 各種細 胞を培養 し(
3uM
では 、K
B3ー1細 胞，KCP−4R細胞のみが細胞死となるが、90u
MではKCP−4細胞も細 胞死とな るシス プラチン 濃度で ある。） 、p73、p53
お よびこれらのー 31−

転 写 標的 遺 伝 子群の 発現レベ ルを半 定量RT―PCRで調 べた。そ の結果 、p53p2TVAFI,およ びMDM
2の 発 現 レベ ル は 一定 で あ った 。 KC
P−4細胞 における p73
はシ スプラ チン3u
Mで高発 現した が 、90ル Mでは 発 現 レベ ル が 顕著 に 低 下した。 KB3ー1細胞 ではp刀の発 現は検出 できず 、KCP
− 4R細 胞で もp刀の発現 レベル は微弱だ った。 また、多 剤耐性関 連遺伝 子、DN
A損傷認 識遺 伝 子、 お よ びDN
A修復関連 遺伝子 群の発現 レベル はシスプ ラチン耐 性との 相関関係 を示さ
なか った。 さらに、 蛋白レ ベルでの p73の 発現を調 べたが転 写レベ ルと同様 だった。p53の発現レ ベルは 、KB3ー1細 胞および KCP−4R細胞では 極めて低いが、シスプラチン処理によってその 発 現レ ベ ル は著し く高まり 、KCPー4細 胞におい ても、 3uM
では その発 現レベル に変化 は認
め ら れな い も のの、 90u
Mでは著 しい高発 現が観察 された 。シスプ ラチン 処理によ るp53の誘導 に は、 Ser15の り ン酸 化 が 伴っ て い たが 、S
er20およびSer392のりン酸 化は検出 できな かった。K
B3―1細胞およびKCP―4R細胞に比較しKCPー4細胞におけるMDM2およびp21賣AFiの発現は高い レベル で維持さ れ、9011Mのシス プラチ ン処理で さらにその発現が高まった。これらの遺伝子 産物の 発現昂進 は転写 レベルで はなく 蛋白レベ ルでの安 定化に 起因する ことが示唆された 。 これ ら の 実験結 果から、 シスプ ラチン処 理によ るK
B細胞の 細胞死 誘導には p53Ser15のりン 酸化が 必要であ ると推 察された。この可能性を検討する目的で、KB3−1細胞にりコンピナン ト アデ ノ ウ イ ルス を 用 いて p73aを 過 剰発 現 さ せた 。 p73aの 過 剰発 現によ り、p53および
MDM2が 高発現し たが、 p53Ser15のり ン酸化 は検出さ れなか った。ま た、MTTアッセイの結果
p73dを 過 剰 発現 させたKB3―1細胞は コン卜口 ールに 比較し約 1．5倍か ら3倍 のシスプ ラチン
耐 性 を獲 得 し 、しか もシスプ ラチン 処理によ るp53Se
r15のりン酸 化が阻 害されて いた。 最後にp73を 標 的とし たsiRNAプ ラスミ ドを構築 しKC
Pー4細 胞に導入 した後 、MTT
ア ッセイ を行った 。この 結果、p73の発 現が抑制 された K
CPー4細胞ではコント口ール細胞と比較し約半分の生存 数とな り、シス プラチ ンに対す る感受 性が高ま った。
考察
KC
Pー4細胞には K
B3−1細胞とは異なり能動的なシスプラチン排出機構が存在することが既に報告 されて いる。し かし、 細胞内に おける シスブラ チン集積 の減少 とシスプ ラチン耐性度との明 確な相 関関係は なく、 K
B細胞には 未だに 解明され ていな いシスプ ラチン耐 性獲得機構が存 在 する と 推 察され る。本研 究の結 果、KCP−4
細 胞にお けるシス プラチ ン耐性と p73
お よびMDM2の 発 現 量が 非常に相 関して いること が明らか になっ た。Vikhanskayaらの報 告に示 されて い るp73の 過剰 発 現 と様 々 な D
NA修 復関 連 遺 伝子 群 の 発現 亢 進 お よびDN
A損傷抵 抗性と の関連 は認め られなか った。 MDM2は多剤耐 性pー91Y
COPr
oteinを誘導することが報告されているが、K
B3ー 1細胞 およびKCP−4細胞に おけるpー91
YCOproteinの 発現は 明確では ない。 我々の実 験 結果 か ら 、KB
3―1
細 胞およ びKCPー4R細胞に おいてシ スプラチ ンに応 答したp53のSer15のル ン酸化 が検出さ れるの に対して、KCP−4細胞においては高濃度のシスプラチン処理によって の みp53の Ser15が り ン 酸化 さ れ た。 ま た 、膵 癌 細 胞に お い て p53Se
r46リン酸 化の欠 失によ りp53の細胞死 誘導能 が著しく 低下す るという 報告から も、DNA損傷に 起因する細胞死誘
導過 程にお けるp53のりン 酸化の有 無は極 めて重要 である。KB3−1細胞にアデノウイルスを用いてp73aを 過剰 発 現 させ る と 著し い MDM2の発現 昂進が認 められ、 p53
Se
r15のりン 酸化が 阻害 さ れ、 シ ス プラチ ンに対す る感受 性が低下 した。 この実験 結果は、 p73
あ るいはMDM2がKB− 32−細胞におけるシスプラチン耐性獲得に関与することを強く示唆する。MDM2はp53のN末端に結合しp53のSer15のりン酸化を阻害することから、p73の過剰発現によりMDM2が安定化し、p53のSer15のりン酸化が阻害されることは十分に考えられることである。ヒト肺癌細胞由来株でp73の存在下でMDM2が安定化すること、ならびに大腸癌においてsiRNAを用いてMDM2をノックダウンした結果シスプラチン感受性が高まることが報告されている。p73依存性にMDM2が安定化されるにいたる詳細な分子生物学的機序はいまだ不明であるが、今回の研究結果は新たな制癌剤耐性獲得機構の存在を明らかにすると同時に、制癌剤耐性克服の新たな戦略を提供するものと期待される。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 藤 堂
省学 位論文題名
p73 and l¥/IDM2 confer the resistance ofepidermoid carclnonlatOClSplatinbyblOCkingp53（シスプラチン耐性獲得機構におけるp73の機能についての解析）

DNA損傷 を含む 様々なス トレス に応答 した細 胞周期 の停止 や細胞 死の誘 導過程に おいて p53は重要な 役割を 果たす 。p53は塩 基配列 特異的 な転写 制御因 子として 機能し、p21，MDM2 Bax，などの細 胞周期 停止や 細胞死 を誘導 する下流 標的遺 伝子群 の発現 を昂進 する。また、DNA障害に応答 して p53は Ser15・ Ser20など 複数箇 所のり ン酸化 を介し て活性 型へと 変換し 、p53に対 する
E3ユピキ チンリ ガーゼ である MDM2との相 互作用 が阻害 され分 解され ずに核 に集積 する。抗 癌剤の耐性 獲得に は多彩 な分子 生物学 的機序が 報告さ れてい るが、 p53の状態 がDNA損 傷に応答 した細胞の 感受性 を決定 付ける 重要な 因子のー つであ ると考 えられ ている 。一方 、p73はp53と 構造的及び 機能的 に非常 に類似 するが 、p73の変 異は稀 であり 、p53とは 異なる 機能が 指摘され ており、あ る種の 癌細胞 におい て抗癌 剤耐性獲 得に関与する可能性が示唆されている。本研究では、
ま ず様 々 な ヒ ト悪 性 腫 瘍 由来の細 胞株を 用いて 半定量 RTーPCRを 行いヒト 鼻咽喉 癌KB細胞 株のうちシ スプラ チン耐 性株(KCP− 4）での みp73が高 発現す ること を見出 した。 興味深 いこと に細胞 死が 誘 導 さ れる 高 濃 度 シスプラ チンの 条件下 でこの p73の発現 は低下 した。 この発 現変動 は蛋白レ ベルで も同様 の結果 であり 、p73の発 現とシ スプラ チン耐性 が相関 してい た。p53蛋 白の発現レ ベルは 、シス プラチ ン感受 性株では 極めて 低いが 、シス プラチ ン処理 によっ てその 発現
レ ベル は 著 し く増 加 し た 。一方KCP−4細胞 ではp53は 低濃度 シスプ ラチン では発 現は変わ らなかった が、高 濃度シ スプラ チンで 高発現し た。シ スプラ チン処 理によ るp53の誘 導には 、Ser15のりン 酸化を 伴って いたが 、Ser20およ びSer392の 1」ン酸 化は検 出でき なかった 。シス プラチン 処理 に よ る KB細 胞 の細 胞 死誘導 にはp53Ser15のりン 酸化が必 要であ ると推 察され た。次 にり コン ビ ナ ン トア デ ノ ウ イルスベ クター を用い てKB3―1細胞にp73aを過剰 発現さ せた。 MTTアッ セイ の 結 果 p73aを過 剰 発 現 させ た KB3‑1細 胞 は コント 口ール に比較 し約1． 5倍から 3倍のシス プラ チ ン 耐 性を 獲 得 し た。この ときp53および MDM2は高発 現した が、興 味深い ことにシ スプ‑34―

ラチン処理によるp53 Se
r15のりン酸化が阻害された。最後にp73を標的としたsiRNAプラスミドを構築しKCPー4細胞に導入した。半定量RT―PCRによって内因性p73の発現が抑制されていることが確認できた。MTTアッセイの結果p73の発現が抑制されたK
CP−4細胞ではシスプラチンに対する耐性が減弱した。本研究の結果、p73あるいはMDM2がKB細胞におけるシスプラチン耐性獲得に関与することを強く示唆する 。MDM2はp53のN末端に結合しp53のSer15のりン酸化を阻害することから、p73の過剰発現によりMDM2が安定化し、p53のSer15のりン酸化が阻害されることは十分にありうる。p73依存性にMDM2が安定化されるにいたる詳細な分子生物学的機序はいまだ不明であるが、今回の研究結果は新たな制癌剤耐性獲得機構の存在を明らかにした。
公開発表後、副査の畠山教授より1） KC
P4細胞におけるp73のゲノムの変化について2）p73
プ口モーターの制御について、3） KC
P4細胞におけるp53とMDM
2親和性の変化についての質問があった。それに対して1）KCP
4細胞にゲノムの変化はまだ不明であること、2）p53と類似した制御であること、3） p53とMD
M2の親和性の変化については不明であることなどの回答があった。次いで、主査の浅香教授からは1）他の細胞おけるp73の発現について、2）今後の臨床応用について、3） p73
ファミ1」ーの発生分化・薬剤耐性獲得機能の関わりについて4）
シスプラチン以外の様々な抗癌剤に対 する耐性獲得へのアプローチについての質問があった。それに対して1）他の細胞においてはp73の高発現の可能性があるが確認されていないこと2） p73
高発現に対する抑制、あるいは他の遺伝子治療との併用について3）p53
ファミルーそれぞれが密接に関与すること4）他の薬剤耐性機序の可能性についての回答があった。また、副査の藤堂教授より1）薬剤耐性獲得機構におけるANp73の役割について、2）anti−aPOPtoticとproーaPOPtot
icな 遺伝 子発現制御におけるNFkBとp53およびp53
ファミリーの 関係についての質問があった。これに対して1） KCP4において△Np73は変動が少ないこと2）NFkBとp53お よび p
53ファ ミ リー は密 接に りン クし 制御 され てい るこ とな どの 回答 が あった。
本 研究 はp73とMDM2の 発現によりp53のりン酸化が阻害されてシスプラチン耐 性が得られることを示した初めての報告であり、抗癌剤耐性克服への臨床応用が期待されることを示した。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や単位取得なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分な 資格 を有 する もの と判 定し た。

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