博 士 （ 医学 ） 中 野賢 司
学 位 論 文 題 名Fpklp Fpk2p
蛋白質リン酸化酵素による脂質二重層非対称性の制御
学位論文内容の要旨【背景と目的】真核生物の細胞膜において、リン脂質は二重層の内層と外層とで非対称に分布する事が知られている。一般にフオスファチジルセリン(PS)とフオスファチジルエタ
ノールアミン(PE)は細胞膜の内層に分布し、フオスファチジルコリンやスフインゴミエリン、gly
colipidは外層に分布する。リン脂質非対称性はATP依存性の卜ランスポーターによって維持されているとされ、4型のP‑typeA
TPaseは、フリップと呼ぱれる外層から内層へのりン脂質の輸送に関わっていると考えられている。出芽酵母において、4型のP‑type
ATPaseに は5つ のメ ンバ ーがあり、それぞれDrs2p，Neolp，Dnflp，Dn也p，Dnf3pである。 DnflpとDnQpは 細胞 膜に局在し、DnflpとD
lnf2pの欠失は細胞膜上のフリップ活性を低下させる。Drs2pはエンドソームとゴルジ体に局在し、ゴルジ体と輸送小胞上でのフリップに関わる事が示されている。Drs2pやDnnpゆnf2pゆnf3pは、それぞれLeIn3p‐Cdc50pファミリーと複合体を形成する事が最近報告されている。
現在この領域ではりン脂質の非対称性の調節機構や、その上流のシグナルを明らかにする事が重要になってきている。最近Cdc50p‐Drs2pがYp
Blp侶2p（Rabファ ミリーのsmanGTP謎es）のエフェクターであるRグlpと相互作用し、YpBlp居2p．RcylpがC
dc50p‐Drs2pを調節することでエンドソーム‐ゴルジ体間の輸送小胞の形成を促進している事が明らかにされ てい る。 しか しな がらDnnpとDnf2p
はいずれもRヴlpとは相互作用しないことが分かっ てい る。 これ はkmp‐Dmゆnf2pが Yp
t31め2p．Rcylp経路とは異なる経路で制御される事を示唆する。そこで本研究は、Dnflp
ゆn也pの機能に関わる遺伝子を、c出5D△欠損
株 の 合 成 致 死 ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 探 索 す る 事 を 目 的に 開 始 し た 。
【方法と結果】
cdc50A
欠損株の合成致死スクリーニングを施行し、他のいくっかの遺伝子と共に同定した
遺伝 子 YNR047wをFPK1と 名付 けた 。 F・ pk
lpはセ リン ・ト レオ ニ ンキ ナー ゼで あり、キナ ー ゼ活 性を 減衰 させ る点 変異 もCDC50と 合成 致死とな る事が分かった。またFPK
1の キ ナ ー ゼ ド メ イ ン と よ く 似 た 配 列 を も つ 遺 伝 子 KIN82を FPK2と 名 付 け た 。
Cdc50p‑dep
leted fpkl
A二重変異株における成長阻害はFPK2を欠損させる事でさらに憎悪し、またC
dc
50p‑depleted」曇爐nゑ丘ぬ三重変異株はエンドシティックリサイクリング
経路に異常が生じ、リサイクリ ングマーカーであるS
nclpとTlglpが細胞内の異常構造物中で共局在することが示唆され た。これらはFpklp
爪pk2pが 相補的な機能を有し、それぞれCdc
50p．Dr82pと機能的に関連する事を示唆する。
触´△彦舵△二重欠損株はD弧珊ycinに対して増殖感受性を 示し、またビオチン化した
R．009‐0198を使用して細胞膜上のフオスファチジルエタノールアミン（PE）を可視化したと‑ 455―

ころ、細胞分裂後期においても細胞膜外層に局在する事が分かった。これらの結果は fpkl△
彦舵△二 重欠損株における細胞膜上のPEが、野生株と比較して外層に多く局在する事を示唆するものである。次にJ触´△触2△二重欠損株における細胞膜上のフリッパーゼ活性を、
螢光ラベ ルしたりン脂質を使用して検討した。その結果、触仏彦舵△二重欠損株におけるフリッパ ーゼ活性は野生株と比較して低く、PEのみならずフオスファチジルコリン（PC）やフオスファチジルセリン（PS）に対しての活性も低かった。さらにF．pklpの点変異を用いた 実験 により、フリッパーゼ活性はFpklp
のりン酸化能依存的である ことも分かった。
これらの結果は、廟ロ△血ロ△二重欠損株や、Dnnp
ゆnf2pのsubu血であるた閉ヨ△欠損株
で見られ るphen0炒peとよく似ており 、Fpklp／Fpk2pがD
nflp‐Lem3やDnf2p・Lem3と同様の機能を持つことを示唆した。そこで私は、カ弛´△彦セ2△二重欠損株におけるDnnp
ゆnf2pの発現量を検討したところ、野生株とj
触仏彦セ2△二重欠損株で大差ないことが分かった。
またDnnpゆI皿pの局在部位をショ糖濃度勾配遠心法や顕微鏡観察 において検討したとこ
ろ 、野 生株 と触 ´ △彦 た2△二 重欠 損株 で変 わ らな いと いう結果が 得られた。一方でmI岬 ． Fpklpと Dnnp‐ GFPが 同 じ 局 在 パ タ ー ン を 示 す 事 か ら 、Fpklp／ Fpk2pが直 接
Dnflpゆnf2pを制御していると言う仮説が立てられるに至った。
そこ で私 は血 uロ0キ ナー ゼア ッセイを行い、精製したFp
klpが5種 類のフリッパーゼ（Dnnp，DnQp，DIめp，D硲2p，Neolp）をそれぞれりン酸化するか検討した。その結果、Dlmpと Dnf2pがFpklpに より 効率 よく りン 酸化 され るこ とが 判明した。一方でNeolpはほとんどりン酸化されなかった。
以上 の結果から、Fpklp暦pk2pはDnnpゆnf2pをりン酸化することで その機能を活性化
し 、 リ ン 脂 質 二 重 層 非 対 称 性 の 制 御 を 行 っ て い る こ と を 示 唆 する 。
【考察】
本研究では、FpklpとF
pk
2p
がりン脂質二 重層の非対称性の制御を行っている事を明らかにした。この制御にはFpklpのりン酸化能が必須であると言う結果から、Fpk
lpの基質はりン酸化されることでフリッパーゼ活性をもつ事が示唆される。fpklAfpk2A二重欠損株がlem
3A欠損株 と似たphenotypeを示す事や 、D
nnpゆnf2pがF
pk
lpによっ て効率よくりン酸化されることから、Fpklp暦pk2pはDnnpゆnf2pの上流に位置し、その 活性を制御している事が考えられる。
現在までにRcylpがDrS2p．Cdc50pの上流因子であり、Drs2p‐Cdc50pの機能を制御していることが報告されている。本研究では4型のP‐卿eATPaseに対する新 たな制御機構を明らかにしているが、FpklM、．plQpがDnnp
ゆ虹Zpのどのアミノ酸をりン酸化するのか、またりン酸化依存的にD虹flp
ゆn也pのフリッパーゼ活性が上昇するのかは、今後解明すべき重要な課題である。本論文で出芽酵母を用いて得られた知見が、ヒトをはじめとする高等細胞におけるりン脂質二重層の非対称性を解析するための契機となり、種々の分子機序を解明する上で有効に活用される事が期待される。

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学位論文審査の要旨
主査
副査
副査

教授 野口昌幸
教授 志田壽利
准教授 濱田淳一

学 位 論 文 題 名Fpklp Fpk2p蛋 白質 リ ン 酸化 酵 素 によ る
脂質 二重層 非対称性の制御
生体膜を 構成するりン脂質は通常二重層の内外で非対称に分布し ており、この非対称性はりン脂 質輸送体の働きにより形成されると考えられている。最 近、細胞膜外側から細 胞 質 側 へ の 脂 質 輸 送 に 関わ る因 子と して P4型 AT
Paseに 属す るり ン脂 質 トラ ンス ロケースの機 能が注目されている。このりン脂質トランスロケースの 異常により胆汁うっ滞症をはじ め種々の疾患が引き起こされるが、その制御機構につい てはほとんど明らかにされていない。
出芽酵母において、こ のタイプのりン脂質トランスロケースとしてDR
S2、DNFI、DNF2、
DN
F3及びNE01(DRS2ファミリー）が同定されている。 出芽酵母は迅速かっ明確な細胞生物学、分子遺伝学的手法を 用いることができるため、分子細胞生物学領域でモデル生物として 多く の研 究室 で使 用さ れている。申 請者が所属する研究室ではNE01を除くこれらP型ATPaseの機 能的 サブ ユニ ットとしてC，DC50、LEM3及びCRFl(CDC50ファミリー）が同定
さ れ て い る 。 Cdc50pは Drs2pと、 Lem3pはDnflp並 びに Dnf2pと 、Crflpは Dnf3pとそ れぞれ複合体を形成する。 本研究ではりン脂質非対称性の細胞機能や制御機構を解明することを目的に、C，DC50と機能的に関わる遺伝子を合成致死スクリーニングにより検索した。
同 定 し た 遺 伝 子 YNR04 7wを FPK1と 名 付 け た 。 ま た FPK1と 相 同 な 遺 伝 子 KIN82をF'PK2と名付けた。まず、FPKl/FPK2の機能を遺伝学的、細胞生物学的に解析した。cdc50変異株ではエンドシティ ックリサイクリング経路に軽度の異常が見られるが、cdc50fpklfpk2変 異株 では これ が強 く増 悪し た。 LEM3‑DNFl/2の 変異もcdc50変異と合わさると似た よう な表 現型 を示 すこ とか ら、 PI
PKl/2は L
EM3‑DNFl/2と関連す る機能を有することが示唆された。Lem3p‑
Dnfl/2pは主として細胞膜で働 き、細胞膜の脂質輸送を制御している。フオスファチジルエ タノールアミン(PE)に特異的に結合するR
009‑0198
用いて細胞膜上 のPEを可 視化 した とこ ろ、 lem3株と 同様 fpkl fpk2変異 株に おい てPEが細 胞 膜外側に露出していることが明 らかとなった。加えてヵ灯カ舵欠損株における細胞膜上のりン脂質トランスロケース活性 を検討したところ、これもlem3株と同様に低下していることが明らかとなった。
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こ れ らの 結果 から 、Fpklp/Fpk2pがL
em
3p‑DnflpやL
em
3p‑Dnf2pと同様の機 能を持つことが示唆された。カ灯彦舵二重欠損株においてはDnflp/I）nにpの発現量および細胞内局在には変化がなかったこと、m
RFP‐FpklpとDnnp‐GFPが同じ細胞内局在パターンを示す事から、
Fpklp／F
pk2p
がりン酸化により 直接D
nnp／D
nQpを制御している仮説が考えられた。そこで精製 し たFpk
lp蛋白 質を 用い てinvi舶リ ン酸 化ア ッセ イを 行った結果、DnnpとDnf2pがFpklpにより効率よくりン酸化されることが明らかとなった。
本研究により、FpklpとFpk2pによるりン脂質二重層の非対称性の制御について次のような機能が考えられた。（1）FpklpとFpk2pによるりン酸化により活性化されたDnnp、Dnセpは細胞膜上で脂質を輸送し、リン脂質の非対称性を制御する。（2）cぬ卯欠損株においては、リン酸化により活性化されたDnnp、Dn毘pがエンドソーム上のりン脂質非対称性も制御し、輸送小胞の形成を促進する。
発 表 後、 副査 の濱 田淳 一准 教授 から Fpklpによ るDnnpの りン 酸化 部位 とそ の役 割につい て、また、動物 細胞におけるりン脂質トランスロケースの機能について 質問があった。 続 いて 副査 の志 田壽 利教 授か らFpklpに よる りン 酸化 はD
nnp／D
nf2pの トランスロケース活性を活性化するのかど うか、また、Fpklpの他の基 質についても質問があった。
主査 の 野口 昌幸 教授 から はFpklpの 機能 ドメ イン の解 析お よびF
pk2pが合成 致死スクリーニ ングで同定でき なかった理由について質問があった。これらに対し申請 者は、自己の 研 究 成果と 文献 的知識 を基 に誠実 に、 概ね妥 当な 回答を 行っ た。
こ の論文は、リン 脂質トランスロケースの活性制御機構を始めて明らかに したものとして 高く評価され、 今後膜リン脂質非対称性の調節機構とその破綻による疾 患発症メカニズムの解明に繋がることが期待される。
審 査員一同は、こ れらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取 得単位なども併 せ申請者が博士 （医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと 判定した。

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