博 士 （ 医学 ） 宮島 直 人
学 位 論 文 題 名ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ TRIM68に よ る
ア ン ド ロ ゲ ン受 容 体 転 写制 御学 位 論 文 内 容の 要 旨【背 景と目的】

アンド口ゲン受容体(AR)は初期前立腺癌の みならず、ホルモン不応性

前立 腺癌における増殖、進展にも大きく関与している。A
Rの転写活性は転写共役因子（活性化 因子・抑制因子）により正と負の制御がされている。転写共役因子の研究は、ホルモン不 応性前立腺癌の発生メカニズム、治療法開発を考える上で非常に重要である。A
Rや転写共 役因子の活性調節は、これらの核内・外への移行、複合体の形成・分解・安定化など種々 の機構により制御されていると考えられている。ユピキチン・プ口テアソーム系蛋白分解 システムはりン酸化、アセチル化、ヌチル化などと並ぶ タンバク質の翻訳後修飾機
構の ーつである。この系は、基質特異性をもつユビキチンリ ガーゼが標的夕ンバク質をユピ キチン化し、プ口テアソームと呼ばれる複合体で速やかに分解することにより、細胞周期 制御やシグナル伝達、癌化などの生命現象に関与している。近年、ARや転写共役因子も、 このユビキチン・プロテアソーム系により分解・安定化され、転写活性が制御されている 可能性が示されている。今回我々は、ある種の自己抗体 として知られていたTR
IM68が新 規のユビキチンリガーゼであり、ARの転写活性化因子であることを見出したので報告する。
【方 法と結果】T
RI
M68が実際にユピキチンリガーゼ活性を有しているかを調べるために、
パキ ュ口ウィルスシステムを用いて組み換えTRIM
68
夕ンパク 質を精製しユビキチンアッセイを行った結果、TRI
M68が実際にユピキチン1」ガーゼ活性を有していることが判明した。
定 量PCR法に より TR
IM68の mR
NA量は 、種々の癌細胞 株のうち前立腺癌細胞株LNCa
Pで特異 的に 発 現増加していた。免疫沈降法によりTRIM68とA
RはLNCaP細胞内で結合し 、さらにア ンドロゲン付加により核内での結合が増強された。レポ ーターアッセイではTR
IM68はARの転写活性を有意に促進させた。プロテアソーム阻害剤を使用したレポ一夕ーアッセ
イに より、その転写活性促進能はュピキチンルガーゼ活性、プ口テアソーム活性依存性である ことが示された。さらに既知の転写活性化因子であるTIP60と結合・共同し、ARの転写活 性を相乗的に促進させた。RNA干渉法によりLNCaP
細胞内 の内在性TRIM68の発現を抑制させると、ARの転写活性は減弱した。TR
IM68をLI¥T
CaP
細胞に過剰発現させると細胞培養液中 のPSA
分泌は増加し、発現抑 制によりPSA分泌は減少した 。細胞増殖アッセイでは、
TR
IM68の発現抑制はL
NCaP細胞の 増殖能を低下させた。癌化能を反映するコ口二ー形成能
アッ セイでは、TRI
M68の発現抑制はLN
CaP細胞の足場非依存性増殖（コ口二一形成能）を低下させた。ヒト前立腺癌検体の定量PCR法では、正常組織に比べ、前立腺癌組織でTRI
M68のmRNA発現量は増加していた。さらにヒト前立腺癌検体の免疫組織染色においても、正常組織 に比ベ、前立腺癌組織でTR
I
M68のタンパク質発現量が増加していることが判明した。
【考 察】近年、ARの転写活性はりン酸化、アセチル化、ユビ キチン化等の翻訳後修飾に― 419―

より制御されてしゝることが分かってきた。特にタンパク質分解系であるユピキチン化は、ARや転写 共役因子を分解することによって適切な転写活性調節を行っていると言われている。 E3ユピキチンリガーゼはA
Rの転写制御において重要な役割を担っていると思われる。TRI
M68がさまざまな細胞株の中で、前立腺癌細胞株LNCaPに特異的に発現していることが判明した。これにより、TRI
M68は前立腺の機能に特異的に働いていることが予想される。TRI
M68とARの結合を免疫沈降と免役染色にて示したが、さらに、LN
Ca
P細胞の核内におけるTRI
M68とARの結合がアンド口ゲンを加えることでより増強されることが判明した。
これは T
RI
M68が、アンド口ゲンにより形成されるARの転写複合体のーつである可能性を示して いる。 さらにTR
IM68は 、LNCa
P
のみならずさまざまな前立腺癌細胞株におけるARの転写活性を促進させることがわかった。一方、RNA干渉法を用いたTR
IM68の発現抑制は
LNCaP
細 胞のAR転 写活性を 抑制し た。これにより、TR
IM68が前立腺癌細胞においてARの転写活性化因子であることが示された。ユビキチン化された基質夕ンパク質は、プ口テアソームと呼ばれる複合体によって認識され取り込まれ分解される。プ口テアソーム阻害剤を使用 した実験から、TRI
M68のAR転写促進作用にはプ口テアソームが必要であるということが わかった。TRI
M68はARを直接ユピキチン化しないため、TRI
M68のA
R
転写活性促進作用は、何らかのAR転写抑制因子をユピキチン・プ口テアソーム系で分解することによって起こる結果と予想される。アンド口ゲンにより、ARや転写共役因子は転写複合体として核内に集合し転写を促進する。そして、次々と新たな転写を行っていくためには、転写を終了し たARや転写共役因子の速やかな離散・分解が必要であるとの報告がある。今回、TRI
M68が転 写活性化 因子のー つであ るTI
P60と結合し、相乗的にAR転写活性を促進させることが分かった。この結果から、TRI
M68は転写抑制因子をュピキチン化して分解することにより、転写活性化因子や転写抑制因子の集合を促進させる仮説が示唆される。TRI
M68は、前立腺癌の最も信頼のおける腫瘍マーカーであるPSAを増加させ、TRI
M68の発現抑制はPSAを減少させた。さらにTRI
M68の発現抑制は、前立腺癌の細胞増殖や足場非依存性増殖（コ口二ー形成能）を有意に抑制させた。これらの結果により、TR
IM
68はP
S
A等の転写産物や癌化能に関与する重要な因子であることが予想される。さらに、臨床検体を使用した定量的RT―PC
R法や免疫組織染色により、TRIM
68は隣接正常組織に比べて前立腺癌で有意に高発現していることがわかった。以上より、ARの転写活性化因子であることを考え合わせると、TR
IM68は前立腺における発癌やその進展に大きく関与している可能性があると思われる。
【結論 】 今回我々は、T
R
IM68が新たなARの転写活性化因子であることを示した。その機序は ュビキチンリガーゼであるT
RI
M68が、何らかのAR転写抑制因子をュピキチン化して分解することによるものと予想される。したがって、T
RI
M68が標的とする基質夕ンパク質の同 定が重要となる。今後、T
RI
M68
等のAR関連ユピキチンリガーゼやプ口テアソームが、ホルモン非依存性癌や転移性前立腺癌などの難治性進行性前立腺癌に対する新たな治療法の標的となり得る可能性があると思われる。

― 420

学 位論文審査の要旨
主査
副査
副査

教授
教授
教授

野々村畠山
笠原克也
鎮次
正典

学 位 論 文 題 名ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ TRIM68に よ る
アンドロゲン 受容体転写制御
ア ン ド口ゲ ン受容 体(AR)を含 む転写共 役因子はリン 酸化，ア セチル 化やユビ キチン 化等 の翻 訳後修 飾により 活性が 調節され ている． ユピキ チン化は タンバ ク質翻訳 後修 飾の ーつ であり ，ユビキ チンリ ガーゼ（ ユピキヂ ン化酵 素）が標 的夕ン パク質を 認識 する ， 本 研究 は ， ユビ キ チ ン リガ ー ゼ T
RIM68の AR
転 写 活 性への 影響を 解明した ものであ る， TRI
M68は前立 腺癌細 胞株LNCaPで特異的に発現し，ARと結合して転写活性を促進さ せそ の作用は ュビキ チン化活 性依存的であることが判明した． RNA干渉法によりLNCaP
細 胞 内 の内 在 性 TR
IM68
発 現 を抑制さ せると ，AR転写活 性は減 弱し，細 胞増殖能は低 下した ．さらに 臨床検 体を用い た実験において，TRI
M68
は前立腺癌組織でその発現 量 が 増 加 し て い た ， 本 研 究 に よ り ， ユ ビキ チ ン リガ ー ゼ T
RIM68は 新 規の AR転写
活 性化 因 子で あ り ，前 立 腺 癌に 関 連し た タ ンパ ク 質で あ る 可能 性 が示 唆された．
口頭発 表にお いて，笠 原正典 教授より ，前立腺癌検体のグリソンスコア（前立腺癌の組 織分 類） とTR
IM68
発現 量との 相関関係 について の質問 があった ．この 質問に対 し，今 回の 実験 で使用 した臨床 検体に おいては 有意な結 果は得 られなか ったが ，今後検 体数 を増 やし て，臨 床的・病 理学的 因子や生 存率など の各バ ラメータ ーとTRIM
68
発 現量との相 関を検 討するこ とを述 べた．ま た，TR
IM68
自身の発現制御についての質問があった ．こ の質 問に対 し，解析 した限 りではTRIM
68
遺 伝子の 上流にア ンド口 ゲン反応 領域は存在 せず， TRI
M68を発現 制御して いる分子は未だ判明していないことを述べた．またTR
IM68
変 異夕ン バク質を 用いた ドミナン トネガテ ィブ効 果に関し ての質 問があっ た，
この質 問に対 し，ドミ ナント ネガティ プ効果は，基質結合部位を残しっつ，酵素活性部位を欠 失させ た変異体 を導入 すること により，内在性の酵素活性を競合的に阻害して．
本来の 酵素活 性による 効果と は逆の効 果を示すことであると回答した，ついで，畠山鎮‑ 421ー

次教 授より， TRIM68の核内 移行機序と核移行シグナルの有無についての質問があった．
この 質問に対 し，TRIM
68
は 核移行 シグナル を持た ないため ，ARに依 存して核 内移行して い ると 推 測 する が ， 今後 ARを発 現 し て いな い 前 立腺 癌 細 胞株 で あ るPC3細胞 等でTR
IM68の局 在実験 を検討し たいと 回答した ．また ，TRI
M68の基質 候補と なる転写 抑制因子 について の質問 があった ．この質問に対し，HDA
C1，NcoRやSMART等の転写抑制因子はュ ビキチン 化で分 解制御さ れてい ることが 判明し ており， それらが 基質候 補となり得る が，今の ところ H
DAC1につ いては 有意な結 果が得 られていないと回答した．また，結合 蛋白質の 同定法 であるYeasttwohybrid法やpull―dow
nassayを行い ，TRIM68と結合 する転写 抑制因 子の検索 を行い，その中から．TRI
M68がユピキチン化する基質夕ン
バク 質を同定 するこ とが有用 であると回答した．さらに，野々村克也教授より，アンド口ゲ ン除去療 法によ るアンド 口ゲン 非存在下 では， TRI
M68は機能し ていな いのではな
いか との質問 があっ た．この 質問に対し，アンド口ゲン除去療法にても残存する極微量なア ンド口ゲ ンにも 敏感に反 応して しまう可 能性が あること ，またTRI
M68により転写共役 因子の異 常が引 き起こさ れるこ とでARの過 剰な転 写活性化 が起こ り，さら にはホルモ ン抵抗性 前立腺 癌の発生 機序に関与する可能性があると回答した．また，ホルモン抵抗 性前立腺 癌にお けるTRIM68の 発現につ いての 質問があ った．こ の質問 に対し，手術適 応となる ホルモ ン抵抗性 前立腺癌は少ないため検体が入手困難であるが，今後，生 検 など に お ける 微 量 な検 体 で の発 現 解 析 の可 否 を検 討してい きたい と回答し た．
この 論文は ，北海道 医学雑誌 で高く評価され 今後，アンド口ゲン受容体転写制御や前 立 腺 癌 に お け る ユ ピ キ チ ン 化 の 重 要 性 を 認 識さ せ るこ と が 期待 さ れ る．
審査 員一同 は，これ らの成果 を高く評価し，大学院過程における研鑽や取得単位なども併 せ申請者 が博士 （医学） の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した．

‑ 422―