博 士（ 生命 科学 ）鈴木哲矢
学 位 論 文 題 名酸 化 損 傷 ヌ ク レ オ チ ド 誘 発 変 異の塩基除去修復蛋白質による抑制
学位 論文内容の要旨［研究背 景］
呼吸 、エ ネ ルギ 一代 謝な ど の内 在的要因や電離放射線、 紫外線などの外在的要因によ り生体内 で は 活 性 酸 素 (ROS)が 生 じ る 。 こ の 活 性 酸 素 は DNAや そ の 前 駆 体 (dNTP)と 反 応 す る ことが知ら れている。これらの損傷を 受けたヌクレオチドは、遺伝子上に突然変異を引き起こし、癌や老化、 多くの遺伝性疾患の原因と なると考えられている。生体 はこれらの損傷に対して複数の防 御機 構を 備 えて いる 。そ れ らの 中で 塩基 除去 修 復は 、特 に活性酸素により生じるDNA損傷を効 率 良 く 除 去 で き る 修 復 機 構 の ― つ で あ る 。 酸 化 損 傷 DNAは 、 直 接 DNAが 酸 化 を 受 け る こと や、 ヌク レ オチ ドプ ―ル 中 に生 じた酸化ヌクレオチドが DNAポリメラーゼによりDNA中 に取り込まれる ことにより生じる。DNA構成 塩基の中でもグァニンは酸化されやすく、8‑ヒドロキシグァ
ニ ン (8‑OH‑Gua)を 生 じ る 。 DNA中 に 生 じ た 8‑OH‑Guaに 対 し て は dCTPだ け で な く dATPも取り込 まれることが明らかにされ ており、またヌクレオチドプ―ル中に生じる8七ドロキシ‑dGTP(8‑OH‑dGTP)は DNAポ リ メ ラ ― ゼ の 基 質 と な り 、 誤 っ た 塩 基 (A)に 対し て 取り 込ま れる ことが 報 告 さ れ るなど 、変 異の 誘発 に関与 して いる こと が示唆 され てい る。
本研 究で は 、8‑OH‑Guaに よ る変 異誘 発に 対す る 塩基 除去 修復 の関 与 を明 らか にする ため、
大 腸菌 の塩 基除去修復酵素欠損 株、siRNAにより塩基除去修 復酵素をノックダウンしたヒ ト由来の 培養 細胞 の 系を 用い て、 酸 化損 傷に よる 変異 誘 発と その 修復 メカ ニ ズム の解 析を行 った。
［結 果お よ び考 察］本腿 萱！ 三 おLナ 歪 鰹極
大 腸 菌 塩 基 除 去 修 復 酵 素 endonuclease川 (Nth)欠 損 株 NKJ1002 (nth)、 endonuclease
VIII (Nei)欠損 株NKJ1003 (nei)に塩 化 カル シウ ム法 を用 い て、 8‑OH‑dGTPを 導入 し、 リ ファンピ シン 耐 性を 指標としたrpoBア ッセイにより変異体率を算 出し、コント口‑ル（水処理 ）の変
異 体 率 を 差 し 引 く こと で 、 そ の 変 異 体 率 の 上 昇量 を 各 株 で 比 較 し た 。
野 生 型 に 比 べ て nth欠 損 株 に お い て 8‑OH‑dGTPの 導 入 に よ り 誘 発 さ れ た 変 異 体 率 が 2.7倍 増 加 し 、 8‑OH‑dGTPに よ り 誘 発 さ れ る 特 徴 的 な 変 異 で あ る A:Tか ら C:Gへの トラ ンス バ―
ジョ ン変 異 体率 が増 加し てい た 。一 方、 nei欠損 株に おい て 誘発 変異体率は野生株に比 べて増加傾 向に あ るも のの 、顕 著な 変 化は みら れなかった。しかし ながら、nei欠損株において もA:Tから C:Gへの 変異 の 割合 が増 加し てい た 。
大 腸 菌 の 8‑OH‑dGTPの 分 解 酵 素 で あ る MutTと 塩 基 除 去 修 復 酵 素 で あ る 、 Nth、 Neiを二重 欠損 し た大 腸菌 株(mut Tlnth、 mut Tlnei)を用いて、同 様にrpoBアッセイにより自 然突然変 異 体 率 を 調 べ 、 MutTの 欠 損 に よ り 内 在 的 に 蓄 積 さ れ る 8‑OH‑dGTPの 誘 発 変 異 に 塩 基 除去修 復欠 損 が与 える 影響 を調 べ た。
mutTlnthの 二 重 欠 損 株 に お い て mutTの 単 独 欠 損 株 に 比 べ て 、 自 然 突 然 変 異 体 率 が 2倍 程 度 高 か っ た 。 一 方 、mut Tlnei二 重欠 損株 では mutT単 独欠 損株 と同 程 度の 自然 突然 変異体率 しか 示 さな かっ た。
ー 1361ー以上の結果から、Nthが8‑OH‑dG
TPが誘発する変異を抑制していることを明らかにした。
喧塾動物鋼胞！三葢ける解盤
ヒ トの 塩基 除去 修復 酵素 であ る O
GG1、MYH、NTH1、及びNE
IL
1をsiR
NAによルノ ックダ
ウンした293
T細胞に、レポ―タ一遺伝子supFを有する複製型プラスミドp2
189‑Stulを導入
後、浸透圧シフト法により8‑OH‑dGTPを細胞に導入した。培養後、細胞から複製されたプラスミ
ド を 回 収 し 、 指 示 大 腸 薗 KS40/pOF105に 導 入 し 、 supF変 異 体 率 を 算 出 し た 。
dGTPに 比較 して 8‑
OH‑d
GTPの導 入に より 変異 体率 が増 加し た 。8‑OH‑dG
TPが誘 発する
変異は、M
YHのノ ックダウンにより減少した。この結果は、MYHが8‑OH‑
dGTPによる変異誘発を促進していることを示している。また、OG
G1、NT
H1、NEI
L1をノックダウンした細胞では8‑OH‑dGT
P
誘発変異体率の顕著な変化は見られなかった。
さらに、OGG
1、MYH、NTH1、及びN
EI
L1をノ ックダウンした293
T細胞I
こ 、p21
89‑StulのsupF遺伝 子中 に8‑OH‑Gua:Cまた は 8‑OH‑Gua:
A塩 基対 を含 むプ ラス ミドを導入し た。培養 後 、 細 胞 か ら 複 製 さ れ た プ ラ ス ミ ドを 回 収し 、同 様に supF変異 体率 を算 出し た。
従 来 の 研 究 か ら 予 想 さ れ る よ う に OGG1、 MYHを ノ ッ ク ダ ウ ン し た細 胞に おい て、
8‑
OH‑Guaニcにより誘発される変異体率は増加した。さらに、NEIL1、NT
H
1をノックダウンした
細胞 にお いて も8‑OH‑Gua:C誘発 変 異体 率は増加した 。これらの結果は、DNA中に 生じた
8‑OH‑Gua:Cに よ り 誘 発 さ れ る 変 異 を OG
G1、 MYH、NTH1
及 びNEIL
1が 抑制 して いる ことを示している。
―方で、8‑O
HーGua:
A
塩基対を含むプラスミドの変具体率はM
Y
Hのノックダウンにより減少したが、OGG
1、NTH1、NEIL1のノックダウンでは変異体率の変化はみられなかった。このこと
は 、 MYHが 8‑OH‑Gua:Aの Aを 除 く こ と で Gニ Cへ 変 換 し て い る こ と を 示 し て い る 。
［結論］
活性酸素により生じる酸化損傷である8‑OH‑Guaについて大腸菌と哺乳動物細胞を用いて変異誘発と塩基除去修復酵素の関連についての解析を行った。
大腸菌ではNthが、8‑OH‑dG
T
Pにより誘発される変異を抑制していることを示した。またヒト培 養 細 胞 で は 、 OGG1、 MYHに 加 え て NEIL1、 NTH1も DNA中 の 8‑OH‑Guaに よ る 変 異誘発 を抑 制す る作 用が ある ことを明らかにした 。さらに、MYH
は8‑
OH‑Gua:A形成による
8‑OH‑dGT
P誘発変異を促進していることが示唆された。

― 1362ー学位論文審査の要旨
主 査

准 教 授

紙 谷 浩 之

副査
副査

教授
教授

原島秀吉
松田 彰

副 査

教 授

有 賀 寛 芳学 位 論 文 題 名

酸化損傷ヌクレオチド誘発変異の塩基除去修復蛋白質による抑制
鈴木 哲矢君は、酸化損傷ヌクレオチドが誘発する変異に対する塩基除去修復蛋白質の影響を解 明することを目的に本研究を行った。酸化損傷ヌクレオチドは、生体内で内在的に発生す る活性酸素によルヌクレオチドプール中で生ずると考えられる。鈴木君は、生細胞に酸化 損傷ヌクレオチド／酸化損傷塩基を含むプラスミドDNAを導入する方法を用いて、様々な研究を行った。
まず 、鈴木君は、ヌクレオチドプール中に生じる酸化dG
TPで ある8―ヒドロキシーdGTP(8‑OH‑dGTP)に着目し、大腸菌の塩 基除去修復酵素欠損株に8‑OH―（lGTPを導入し、誘発される変異を解析した。大腸菌塩基除去修復酵素endonucleasem（Nm）欠損株NIくJ1002（n脚、endonucleaseVm（Nei）欠損株NKJ1003（nピめに塩化カルシウム法を用いて8―OH‐dGTPを導入し 、ワDBアッセイにより変異体率を算出した。その結果、 鈴木君は、門m欠損株におい ては 野生 型 に比 べて 8― OH―dGT
P誘発変異体率が約2．7倍増加 することを見出した。
8―OH‐dG
TPにより誘発される変異であるA：TうC：Gトランスバージョンの割合も同時に増加していた。また、門8f欠損株においては、誘発変異体率は野生株に比べて増加傾向にあるものの顕著ではなかった。しかし、凡甜欠損株においてもA：TうC：Gトランスバージョンの割合が 増加していた。さらに鈴木君は、主要な8―OH―dG
TP分解酵素を欠損しているために内在的 に8ーOH−dG
TPが細胞内に蓄 積していると考えられるm甜 げ株に着目し、NmやNei
欠損の影 響を調べた。その結果、mMr列門m二重欠損株においてはm げの単独欠損株に比べて自然突 然変異体率が2倍程度高いことを見出した。一方、m rm8f二重欠損株では、m
甜げ単独欠損 株と同程度の自然突然変異体率しか示さなかった。以上の結果から、鈴木君は、Nmが8―OH−dG
TP誘発変異を主として抑制していると結論づけた。
次に 鈴木君は、siRNAにより塩基 除去修復酵素をノックダウンしたヒト由来の293T細胞を用いて、ヒト塩基除去修復酵素と8−ヒドロキシグアニン（8―OH−Gua、G由来の酸化損傷塩基）／8‐OH―dGTPが誘発する変異との関連を調べた。293T
細胞の塩基除去修復酵素（OGG1、MYH、 NTH1、 及 び NEIL1） を siRNAに よ ル ノ ッ ク ダ ウ ン し 、レ ポー タ ー遺 伝子 s
ゆ F遺伝 子中 に8ー OHー Guaを 含む 複製型プ ラスミドを導入した。その結果、OGG1、MYHをノックダウンした細胞において、8‐OH‐〔maによって誘発された変異体率は増加した。さらに、
鈴木君は、NTHl、N1三ILlをノックダウンした場合においても8‐OH−GIla
誘発変異体率が増加する ことを見出した。これらの結果は、DNA中に生じた8‐OH―（haにより誘発される変異 を OGG1、 MYH、 NTH1及 び NEIL1の 4種 の 塩 基 除 去 修 復 酵 素が 抑制 し てい るこ とを 示しており、鈴木君は予想外の知見を得た。
―1363ー最後に、 鈴木君 は、OGG1、MYH、NTH1、 及びNE
IIー1をノックダウンした293
T細胞に、
sup
F遺伝子を 含む複製型プラスミドと8．O
H‐dGTPを導入した。培養後、細胞から複製されたプラスミドを回収し、指示大腸菌K
S40／p
OF105に導入し、ゴMpF
変具体率を算出した。
その結果 、M
YHの ノック ダウンに より、 8．OH・dGT
P誘発変異は減少した。また、OGG1、NT
H1、NE凡1をノックダウンした場合には、8‐OH｜dG
TP
誘発変異体率に顕著な変化は観察されなか った。以 上の結果から、鈴木君は、MYHが8ーOH‐dG11Pによる変異誘発を促進しているこ と、及び 、OGG1、NTm、NEIL1の8‐OH‐dG
TP
誘 発変異を 抑制する機能は低いことを明らかにした。
以上、鈴木哲矢君は、活性酸素により生じる酸化損傷である8‐0H‐Gua／8‐0H‐dG
口が誘発する変異に関して、大腸菌とヒト細胞の塩基除去修復酵素との関連を明らかにした。酸化損傷は、内在的要因や様々な外在的要因により生ずる活性酸素の作用により生成し、変異・癌・神経変性・老化などとの関連が指摘されている。鈴木君の研究を基盤として、さらなる研究の展開が可能であると思われる。しゝずれの審査委員も、博士の学位の授与に十分な研究を行ったものと判断した。
よって鈴木哲矢君は、北海道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格のあるものと認める。

− 1364―