倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1411

17 型ヘルパーT 細胞を標的とした新規粘膜ワクチンアジュバントの開発
代表研究者

立花雅史

大阪大学大学院薬学研究科

ワクチン・免疫制御学プロジェクト

特任准教授（常勤）

Development of a novel mucosal vaccine adjuvant targeting T helper 17 cells
Principal Researcher

Masashi Tachibana,
Project for Vaccine and Immune Regulation, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University. Specially
Appointed Associate Professor

理想的なワクチンでは、全身免疫応答のみならず粘膜免疫応答をも誘導できる必要がある。我々はこれまでに、全身系投与による粘膜面への抗原特異的な細胞傷害性 T 細胞（CTL）の誘導には、I 型インターフェロン産生を伴う自然免疫の活性化と、続く 17 型ヘルパーT（Th17）細胞の誘導が重要であることを明らかにしている。本研究では、細胞質内核酸センサーである STING のリガンド、および Th17 細胞のマスター転写因子 RORt に対する合成アゴニストの投与により、上記の機構を再現できる可能性も見出した。これは、ヘルパーT 細胞を標的とする次世代型ワクチンアジュバントの実現可能性を示すものである。
It is necessary to induce not only a systemic immune response but also a mucosal immune response for theprevention of infection. We previously showed that activation of innate immunity with type I interferon
production, followed by induction of T helper 17 (Th17) cells, is important for the induction of
antigen-specific cytotoxic T cells (CTL) in mucosal compartments by systemic vaccination. In this study,
we also found that this mechanism could be reproduced by the administration of ligands for STING, acytoplasmic nucleic acid sensor, and a synthetic agonist for RORt, the master transcription factor ofTh17 cells. This indicates the feasibility of next-generation vaccine adjuvants targeting helper T cells.

1．研究内容なワクチンは数少ない。また、現在広く用いられ1.1 目的ているワクチンの多くは液性免疫応答のみを誘導

近年、猛威を振るっているエイズや新型インフするものであり、一定の効果が認められるものでルエンザ感染症、新型コロナウイルス感染症などある。しかしながら、HIV のような易変異性ウイの新興・再興感染症の多くは粘膜面を初発感染部

ルスの場合、中和抗体による認識部位に変異が入位とする粘膜感染症である。これらに対する効果ってしまい中和抗体が効かなくなることが知られ的なワクチンには、全身及び粘膜の双方においてている。また、ワクチンによって誘導される細胞強い免疫応答を誘導可能であることが望まれてい傷害性 T 細胞（CTL）の“質”とエイズ発症の間にる。しかしながら現在のところ、全身免疫応答おは負の相関が認められることが報告されているこよび粘膜免疫応答を同時に強く活性化できるようとからも、ワクチンによって効果的な細胞性免疫倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
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行のワクチンとは異なり細胞性免疫を誘導可能なAddaVax を用いた。AddaVax は、上市されているワクチンは、易変異性病原体に対するワクチンとアジュバントである MF59 と同様のエマルジョンしても極めて高い有効性を示すと期待できる。

型構造を持ち、細胞性免疫を誘導できることが知

我々のこれまでの研究により、アデノウイルスられている。免疫 2 週間後、全身免疫応答が起こベクター（Adv）を筋肉内へ投与することで、全る場として主要な脾臓を解析したところ、身だけでなく粘膜面においても搭載抗原特異的なAddaVax および cGAMP 投与群では OVA 単独投CTL を強く誘導するメカニズムを明らかにして与群に対して抗原特異的 CTL が誘導される傾向いる（Front Immunol. 2017）。さらに腸管粘膜面にあった。これらの個体では小腸の粘膜固有層への CTL 誘導メカニズムに関して、投与部位であ（Lamina propria）においても同様に抗原特異的る筋肉組織やその所属リンパ節における I 型インCTL が誘導される傾向にあった。このことから、ターフェロン（interferon; IFN）産生や炎症性樹cGAMP により腸管粘膜面 CTL 誘導が促進される状細胞（inflammatory dendritic cell; inf DC）誘導機構が存在する可能性が示された。また、を伴う自然免疫の活性化と、続く所属リンパ節にc-di-GMP 投与群では OVA 単独投与群に対して脾おける 17 型ヘルパーT（T helper 17; Th17）細胞臓および腸管粘膜面の両方においてわずかながらの誘導という 2 つのステップが重要であることを

抗原特異的 CTL の増加傾向が認められた。

明らかにしている。そこで本研究では、全身及び粘膜の双方において強い細胞性免疫と液性免疫を

1.2.2 cGAMP や c-di-GMP の投与部位である筋肉に誘導可能な新規ワクチンアジュバントの開発を目

おいて I 型 IFN 産生が誘導される

指し、Adv ワクチンによる免疫応答を模倣できる

次に、投与部位である筋肉における I 型 IFN 発低分子化合物の創出を目的とした。Adv ワクチン

現を確認したところ、OVA 単独投与群に対してによる I 型 IFN の誘導には Adv 由来核酸（ゲノム

AddaVax 投与群では I 型 IFN の発現は低下する傾DNA 等）が重要であることも見出していることか

向にあった一方で、cGAMP や c-di-GMP 投与群

ら、細胞質内核酸センサーである stimulator ofでは発現が増強する傾向が認められた。また inf

interferon genes（STING）に着目し、その内因性DC の前駆細胞である炎症性単球（inflammatoryリガンドである 2’3’-cyclic GMP-AMP（cGAMP）

monocyte; inf Mo）は CCR2 を発現しており、や合成リガンドである 2’3’-cyclic dimeric GMP

CCR2 リガンドである CCL2 や CCL7 は inf Mo（c-di-GMP）などの環状ジヌクレオチド（cyclicの炎症部位への誘引に重要であることが知られてdinucleotide; CDN）の新規ワクチンアジュバントいる。そこで、これらのケモカインの発現についとしての可能性について検討した。ても解析したところ、AddaVax 投与群と同様に、cGAMP や c-di-GMP 投与群においても発現上昇

1.2 結果傾向が認められた。以上の結果および、Adv によ1.2.1 cGAMP 投与により腸管粘膜面に抗原特異的る inf DC 誘導が I 型 IFN 依存的であることを踏まCTL が誘導される

えると、いずれのアジュバントによっても inf Mo

まず、CDN の抗原特異的 CTL 誘導能に関しては誘引されうるが、AddaVax ではなく CDN によ検討を行った。抗原タンパク質として Ovalbuminってのみ inf DC が誘導される可能性が考えられ（ OVA ） を 用 い 、 OVA と cGAMP あ る い はた。

c-di-GMP の混合溶液をマウスの両脚の大腿四頭倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2019 年度（第 51 回）助成
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1.2.3 所属リンパ節において I 型 IFN 依存的に infDC が誘導される現の低下傾向が認められ、Th17 細胞誘導が抑制されることが示唆された。そこで、RORt アゴニス

前述の結果を受け、所属リンパ節における infトを投与することで、c-di-GMP による Th17 細胞DC 誘導について検討を行った。その結果、予想誘導抑制効果を打ち消すことができるのではない

どおり AddaVax では inf DC が誘導されていなかかと考え、検討を行った。これまでと同様に、った一方で、cGAMP および c-di-GMP では誘導

c-di-GMP を OVA とともに大腿四頭筋内へ注射投される傾向が認められた。さらに、その他の樹状与し、その 24 時間後に合成 RORt アゴニストで細胞サブセットの誘導に対する影響は認められなある SR0987 を腹腔内投与した。そして、筋肉内かったことから、cGAMP および c-di-GMP は DC投与から 1 週間後の所属リンパ節において、サブセットの中でも inf DC を特異的に誘導できc-di-GMP 投与により抑制されていた RORt 発現る可能性が示された。Interleukin（IL)-1・、IL-6、が SR0987 の投与により上昇する傾向が認められIL-23 および transforming growth factor（TGF)-

た。したがって、RORt アゴニストの投与によりは Th17 細胞分化を促進するサイトカインであるTh17 細胞を誘導できる可能性が示唆された。

ことが知られており、inf DC はこれらのサイトカインを産生することで Th17 細胞分化誘導に寄与1.3 結論

すると考えられている。
Adv ワクチンにより IL-1、Adv ワクチンとは異なり、cGAMP や c-di-GMP

IL-6、IL-23 発現は誘導される一方で、TGF-・発は Th17 細胞を誘導できる可能性はあるものの、現は誘導されないことから、iLN における前者 3十分には誘導できない可能性が示された。しかしつのサイトカイン発現について評価を行った。そながら、RORt アゴニストを共投与することでの結果、cGAMP 投与群ではいずれのサイトカイTh17 細胞をより強く誘導できる可能性も見出す

ンの発現も OVA 単独投与群と同程度であり、ことができた。当初の目的を達成し、さらに研究

c-di-GMP 投与群では Il1b および Il23a の発現はを推進することで、我が国の保健医療の向上に貢OVA 単独投与群と比較して上昇傾向にあったも献することを目指す。のの、Il6 の発現は同程度であった。以上の結果より 、 Adv ワ ク チ ン と 同 様 に cGAMP お よ び

2．発表（研究成果の発表）

c-di-GMP は、I 型 IFN シグナル依存的に inf DC

村田 雄飛、岡田 直貴、立花 雅史、抗原特異的なを誘導するが、その inf DC は Th17 細胞誘導に寄粘膜免疫応答の誘導を目指したc-di-GMPの全身与するほど十分には活性化されていない可能性が投与、日本薬学会第140年会（web開催、2020年3示された。

月）

1.2.4 合成 RORt アゴニストは、c-di-GMP により抑制された RORt 遺伝子発現の低下を回復させる
健常マウスの脾臓およびリンパ節よりセルソー
ターを用いて単離した naïve CD4+ T 細胞に、抗原
刺 激 と と も に サ イ ト カ イ ン 刺 激 （ IL-1, IL-6,IL-23）を加えて培養することで Th17 細胞が得られるが、c-di-GMP を添加したところ、RORt 発