<環境システム工学専攻>

平成 27 年度 修士論文要旨
極低濃度のメタンを酸化分解する土壌中メタン酸化細菌の培養と検出
水圏土壌環境研究室
指導教員

山口鶴岡

夏海隆司，幡本将史

１．はじめにメタンは，強力な温室効果ガスの一つである．メタンはメタン酸化細菌によって酸化されるが，特に大気中のメタンは森林土壌中に生息するメタン酸化細菌によって最も効果的に酸化されることが知られている（Dalal and Allen, 2008）．通常メタン酸化細菌の微生物解析は，メタン酸化細菌が固有に持つメタン酸化酵素の一部をコードした pmoA 遺伝子を標的として行われる．大気メタンを主に酸化していると考えられているメタン酸化細菌の pmoA 遺伝子は USCα，USCγ，Cluster 1と呼ばれているグループに分類されるが，培養されておらず分離株が得られていないためにどのようなメタン酸化細菌なのか明らかになっていない（Kolb, 2009）.
そこで本研究では，土壌中に生息する極低濃度のメタンの酸化分解を担うメタン酸化細菌を明らかにすることを目的として，これら微生物の集積培養を試みた．
２．実験方法（１）培養装置
土壌試料は，学内の植生の異なる 2 箇所から採取した土壌 A，B を用いた．培養装置の概略を Fig.
1 に示す．カラム 1 は，容積 255 cm3 の円筒形ガラスカラムを用い，内部に土壌を入れた．カラム
2 は，容積 982 cm3 の円筒形ガラスカラムを用い，内部に土壌を植種したスポンジ担体を入れた．
土壌 A，B に対してそれぞれ 2 つのタイプの培養方法を用いた．カラムは 30℃のインキュベーターに設置し，基質として 8.9 ppm のメタンガスを含む空気をカラムに連続的に供給し，週に一度の頻度で無機塩培地を 5 ml 供給した．
（２）メタン酸化活性試験
培養前の土壌の初期メタン酸化活性は，採取直後の土壌を 70 ml のバイアル瓶に詰めてメタン酸化活性試験を行った．それぞれのバイアル瓶は，ヘッドスペースに 8.9 ppm のメタンガスを 1 分間パージし，30℃の恒温槽内で静置した．採取した土壌のメタン酸化活性値は，パージ後と 2 時間
後にバイアル内の気相をシリンジで 0.5 ml 採取して測定したメタン濃度の差分から算出した．集積培養系内のメタン酸化活性値は，ガラスカラムへのガスの供給を停止した直後とその 2 時間後に，ガラスカラム内の気相をシリンジで 0.5 ml 採取して測定したメタン濃度の差分から算出した．
（３）メタン酸化細菌の検出
メタン酸化細菌の検出には，pmoA 遺伝子を標的とするプライマーセット A189，mb661 を用いてPCR 増幅を行った．増幅産物は QIA Quick PCR
Purification Kit を用いて精製後，TOPO TA Cloning
Kid for sequencing を用いてクローンライブラリを作成し，塩基配列の解析を行った．得られた配列はNCBI の BLAST により相同性検索を行った．

Fig. 1

培養装置の概略図

３．実験結果（1）環境中土壌のメタン酸化
Table 1 に培養に用いた土壌の諸特性を示す．土壌 A は，pmoA 遺伝子を標的としたクローン解析の結果，Methylocystis sp. 0510-P-6 の pmoA 遺伝子配列と 95%以上の相同性を示したものと，Methylocystis sp. SS2C の pmoA 遺伝子配列と 96%の相同性を示すメタン酸化細菌を検出した．
しかし，メタン酸化活性試験における 2 時間後の活性値は負の値を示した．土壌 B は，pmoA 遺伝子の検出が無かったものの，活性値は 0.32 ng・g-soil-1・h-1 を示し，8.9 ppm のメタンを 8 時間後には 2.0 ppm と大気レベルにまで低下させた．
（2）集積培養系内のメタン酸化活性
Table 1 採取した土壌の特性

各集積培養系内のメタン酸化活性値は，培養日数による上昇または低下のいずれの傾向も見210.-3//(5.946.11

22%
41%
Methylocystis
*sp.+

られなかった．カラムごとに土壌の活性値を比較すると，カラム 1，2 どちらにおいても土壌 Bは，土壌 A の 2 倍程度の活性値を有していた．

pmoA

また，どちらの土壌においても活性値のばらつ

B1-2 (4/12)
  ((%A2-3 (8/11), -0.021
A1-6 (8/12)
A1-5 (4/12)
&!4!)'#$ 4" 

きは，カラム 1 よりもカラム 2 のほうが 3 倍以6594上も大きかった．以上より，カラム 1 とカラム

99
8850

ン酸化活性値は高くないが安定してメタンの酸メタン酸化活性値は高くなるものの，ばらつきが大きく，土壌 A は生成側にも値が大きくふれていた．
（3）集積培養系内のメタン酸化細菌の検出
集積培養系内の土壌を対象に pmoA 遺伝子を標的としたクローン解析を行った結果，土壌 Aはカラム 1，2 において，メタン酸化細菌の存在を確認できた．カラム 1 において確認できたメ0.1タ ン 酸 化 細 菌 は ， Methylocystis sp. Kb7 と75と 96%以上の相同性を示した．カラム 2 において検出できたメタン酸化細菌は，Methylocystis
遺伝子配列と 96%以上，Methylocystis sp. Pi5/4

98100化を行うことが示された．一方でカラム 2 は，sp. Kb7 と Methylocystis sp. 0510-P-6 の pmoA

B1-3 (7/12)

B1-25 (1/12)
  A2-2 (3/11)((%, 0.42Methylocystis sp. Kb711
KP862531
Methylocystis sp. 0510-P-6 EU275143
&!4!)'#$ 4" 

2 の培養方法を比較すると，カラム 1 は，メタMethylocystis sp. 0510-P-6 の pmoA 遺伝子配列0.3277

Methylocystis sp. Pi5/4 AJ459013
Methylocystis sp. SS2C AB636307
8 4 Unidentified alpha proteobacterium LR1 Y18443
99 99
Methylocystis sp. SC2 AJ431386
9 8 Methylocystis sp. L6 AJ868405
8 5 Methylocystis sp. DWT AJ868404
Type II methanotroph
Methylocystis parvus U31651
B1-2 (4/12)
Methylocystis sp. KS3 AJ459033
65
A2-3 (8/11) 9 3 Methylocystis echinoides AJ459000
9 4 A1-6 (8/12)
Methylocystis sp. 5FB2 AJ868407
100
A1-5 (4/12) 6 8 Methylocystis sp. H9a AJ459027
99
8 8 B1-3 (7/12)
Methylosinus trichosporium AJ459015
75
B1-25 (1/12) Methylosinus sporium AJ459026
50
9 8 A2-2 (3/11)
91
Methylosinus sporium AJ459018
Methylocystis sp.
Kb7 KP862531
Methylosinus
trichosporium KS21AJ431389
Methylocystis
sp.
0510-P-6
EU275143
PmoA2
Methylocystis
sp. SC2 AJ431387
93100
78
Methylocystis
sp. Pi5/4
AJ459013sporium AJ544098
Methylosinus
MethylocystisMethanocapsa
sp. SS2C AB636307
acidophila AJ278727
proteobacterium
LR1 Y18443
Uncultured
methanotrophRA14 AF148521
8 4 Unidentified alpha7799 99
Methylocystis
SC2 AJ431386
USCa
Uncultured
bacterium MR2 AF200726
1 0 0 sp.
9 8 Methylocystis
6 4 sp.Uncultured
L6 AJ868405
methanotroph AJ786675
8 5 Methylocystis sp. DWT
AJ868404
Nitrosomonas
europaea L08050
Type II methanotroph
Methylocystis parvus U31651
Methylocystis sp. KS3 AJ459033
Methylocystis echinoides AJ459000
93
Methylocystis sp. 5FB2 AJ868407
10068
Methylocystis sp. H9a AJ459027
Methylosinus trichosporium AJ459015
Methylosinus sporium AJ459026
91
Methylosinus sporium AJ459018
Methylosinus trichosporium KS21AJ431389
PmoA2
Methylocystis sp. SC2 AJ431387
93
78
Methylosinus sporium AJ544098
Methanocapsa acidophila AJ278727
Uncultured methanotroph RA14 AF148521
USCa
1 0 0 Uncultured bacterium MR2 AF200726
64
Uncultured methanotroph AJ786675
Nitrosomonas europaea L08050の pmoA 遺伝子配列と 97%の相同性を示した．

Fig. 2 pmoA 遺伝子配列に基づいた系統樹．450 bp

土壌 B は，培養前に pmoA 遺伝子を検出できの塩基配列を用いて Neighbor-joining 法で解析をなかったが，カラム 1 において Methylocystis sp.

行 っ た ． ア ウ ト グ ル ー プ は Nitrosomonas

0.10510-P-6 の pmoA 遺伝子配列と 95%以上の相europaea (L08050) を用いた．A1 は土壌 A のカラム 1，B1 は土壌 B のカラム 1 を示す．

同性を示したものと，Methylocystis sp. Pi5/4 の pmoA 遺伝子配列と 97%の相同性を示す pmoA 遺伝子が検出された．
４．まとめ
本集積培養系は，植生および pH の異なる 2 つの土壌を,同じメタン濃度で集積培養を行ったにも関わらず，両土壌において Methylocystis 属に分類される pmoA 遺伝子が優占して検出された． このことから 8.9 ppm のメタンは，主に Methylocystis 属によって酸化分解されていることが示唆された．他の大気レベルのメタン酸化を担う微生物を培養するには，メタン濃度，培地条件などの培養条件の更なる検討が重要である．
参考文献
Dalal, R.C. and Allen, D.E. (2008) Greenhouse gas fluxes from natural ecosystems, Aust J Bot 56, pp.369-407
Kolb S., (2009) The quest for atmospheric methane oxidizers in forest soils, Environ Microbiol Rep, 1, pp. 336-346
Shrestha P. M. et al., (2012) Linking activity, composition and seasonal dynamics of atmospheric methane
oxidizers in a meadow soil, The ISME Journal 6, pp. 1115-1126