博 士（水 産科学） 山本幸 弘
学 位 論 文 題 名ホ ス ホ リ パ ー ゼ を用 い た 機 能性 化 合 物 のり ン 脂 質 誘導 化 法 に 関す る 研 究
学位 論文内容の要旨

抗 酸化作用や抗癌作用詮どの機能性を有する 化合物を食品成分や化粧品素材，医薬品として用いる場 合，乳化剤等を併用することで分散性や安 定性，吸収性を高める必要がある。しかし，それによっ て利用用途が制限されることも少なくなぃ 。そのため機能性化合物に両親媒性を付与することが出 来れぱ幅広い利用が可能となる。この様な 機能性改善の手段のーっとして，アシル化やりン酸化 等 の誘 導 化 が 挙 げ ら れ ， そ れ によ っ て 分 散 性 や 吸 収 性 を 大 きく 改 善 出 来 る 。
本 研究では，優れた生体適合性と両親媒性か ら医療品や機能性食品，化粧品素材として広範に利用さ れているりン脂質の分子構造に着目し，種 々の機能性物質をりン脂質誘導化するための新規反応プ ロセスの開発と，得られたりン脂質誘導体 の機能性評価に関して研究を行った。その際，生体触媒であるpho
sph01ip鵠eA2（PLA2）やphosphohp鵠cD￠LD）といったりン脂質関連酵素を利用し，温和な環境で特異的な反応を簡便に進める方法 について検討した。
第 1章で は， 抗癌 作用 や抗 肥満作用を有する ことから機能性脂肪酸として近年注目されている共役リ ノー ル酸 （CLA）に 着目 し， PLA2を用 いた エス テル 化反応によるCLA含有ホスファチジルコリン（CLハPC）の合成を試みた（Fig．1）。特に，PLA2を用いたエステル化反応では，副反応である加水分解 反応 を制 御す る反 応系 中の 至 適水 分量 の調 節が 非常 に難しかったため，必須水代替物として
fomlalmdeを利用 したC
LA‐PCの合成を試みた 。
ま ず， ブタ 膵臓 由来 PLA20pPLA2）を 用い て， gり cerolを分 散媒 とし て用 いた 反応 系にてCLAと卵 黄 由 来 LPCと の エ ス テ ル 合 成 反 応 を 行 っ た。 LPCllmg， CLA18mg g． 1
ycer01550
nlg ppP
LA2‑ 959−

3.3xl04U，CaCl2 0.
3 ymol 37℃，48hの反 応条件に 韜いて ，酵素を 活性化す る目的 で水50m或いは formamide 50山 を 添加 し CLA‑PCの 合 成 を試 み た と ころ ， 水 を用 い た 系で は 合 成率 が 僅 かに 2mol％で あった 。それに 対し，formamideを用 いた系 では46mol％ となり，大幅に合成率が高まること が 明 ら か と な っ た 。 得 ら れ た CLA‑PCの 脂 肪酸 組 成 をGC分 析 した と こ ろ， 基 質 とし て 用 いた
CLAの 約 半 分 の脂 肪 酸 組成 比 で あっ た こ とよ り ， LPCの sn‑2位 に特 異 的 に基 質 CLAが 導 入さ れ ていること が示さ れた。更 に，合成 率に及 ばすform
amid
e添加量 やglyC
erol
添加量，ppPI丿b添加量の影 響 を 検 討 し て ，至 適 反 応条 件 を LPC11mg， CLA18mg， glycer・ 015
50皿 g ppP
LA23． 3x104U，fo：mla1血de50
山 ，CaC
120．3岬ol，37℃ ，6hとし た。その 至適反 応条件においては65m01％の合成率を 得 た 。し か し ，上 記 の反応 条件で は反応時 間6h以降 では合成 率の低 下が見ら れた。 その要因として大 気中か ら吸湿さ れる水分 や，エ ステル合 成反応 の進行に より生成した水が加水分解反応を亢進した と推察 し，albu
1二n
血 やcaselなどのタンパク質を添加することによりPLA2近傍に存在する過剰な水 分のコ ントロー ルを試み た。そ の結果， 前述の 反応系に aIbun11lnlgを 添加す ることで ，合成率の 低下を 抑えるこ とが可能 となっ た。酵素 以外の タンパク 質を添加するだけで合成率を維持でき る 結 果は ， 水 分の 調 節が困 難であ ったPL
A2を 用いたエ ステル化 反応に おいて極 めて有 用な知見である 。水分 活性の調 整や減圧 下での 反応では 最終的 な収率を 高めることは可能であるが，反応初速度が 低下す る。それ に対して タンパ ク質の添 加によ る反応法 は，簡便であるのみならずその吸水性が反 応速度 に影響を 及ばさな い点が 利点であ ること が示され た。
一第2章 ではPLDを用い たホスフ ァチジ ル基転移 反応￠ ig．2） による 機能性ア ルコール のりン 脂質誘導化法 につい て検討し た。ホス ファチ ジル基転 移反応 を様カな 機能性化合物に応用する為には，様々なア ルコー ル化合物 を基質と して用 いて反応 特性を 明らかに する必要がある。そのような観点‑ 960 ‑

か ら，本研 究ではこ れまで 報告例の ないテ ルペンア ルコール化合物やフェニルアルコール化合物に着目し，それらのホスファチジル基転移反応について検討した。
PL
Dを 用 いたホ スファチ ジル基 転移反応 は一般 に，水と クロロ ホルムな どの有機 溶媒と の2相系に より行わ れるが， そのよ うな有機 溶媒の 使用は工 業的応用をはかる際，安全面で問題点となる。
そ こ で 大豆 PC (SoyPC)と テルペン アルコー ルとの ホスファ チジル 基転移反 応では ，酢酸エ チルと0.
2M
酢 酸緩衝液 (pH 5.6)との2相系 及び，0.
2M
酢 酸緩衝 液(pH 5.6)に基 質を分散 きせて反応を行う
水 系にて試 みた。反 応系に 及ばすgeraniol (1)の添加 量の影響と酵素添加量の影響を検討し，合成率 の経時的測定を行い最終的に至適反応条件を2相系；SoyPC50ymol 基質アルコール500l.unol，酢酸エチル1.
6ml，Streptomycessp.
由来PLD(ssPLD)1.
6U，0.
2M
酢酸緩衝液(pH5.
6)0.
8ml，37℃，24h，水系 ；Soy
PC 50 ymol，基質 アルコー ル2000umol, ssPLDl.
6U，0.
2M
酢酸緩衝液(pH5.6)0.
8ml，37℃，24hと定めた。この反応条件に船けるphosphmdyl−geraniく）1の合成率は2相系では52mol％
で あったの に対し水 系では 90mol％と なり， テルペン アルコ ールのり ン脂質 誘導化では水系が適して いること が明らか とたっ た。一方 ，フェ ニルアル コール のりン脂 質誘導化 は，S0yPC
を基質リン脂 質とし酢酸エチルと0．2M酢酸緩衝液（pH5．6）との2相系によルホスファチジル基転移反応を行つた 。1弧os01く8）の添加量の影響を検討するとともに，合成率の経時的変化を測定した結果，至適反応 条 件 をS0yP
C50叫n01，酢 酸 エ チル 1．6nd，基 質アルコ ール50
0岬101，sSPLD1．6U，0．2M酢酸緩衝液QH5．6）O．8耐，37℃，24hのように定め，この反応条件においてphosphぬdyl―1弘osolの合成率は87士3．7n101％に達した。
次 いで，至 適反応 条件に茄 いて各種 基質ア ルコール を用い合成率を比較したところ，基質テルペ―961ーンアルコールの鎖長が長くなる程合成率が低下すること，perillymcohol（5）や卿げten01（6冫のような分子 内に 環状 構造 を有 する テ ルペ ンア ルコ ール もホ スフ ァチ ジル 基転 移反応の 基質になり得ることを 明ら かに した 。ま た， フ ェニ ルア ルコ ール のべ ンゼ ン環 から ホス フんチジ ル基に置換される・OH基ま での 距離 が合 成率 に 大き く影 響を 与えるの に対し，p位の置換基はその 種類によらずほとんど反応に影響を及ぼさないことが明らかになった（Fig，3）。
第 3章で は第 2章 で合 成さ れ た各 種リ ン脂 質誘 導体 につ いて 機能 性評 価を行っ た。特にヒト癌細胞株 を用 いた 増殖 抑制 試験 や DPPHラジ カル 捕捉 能， 酸化 安定 性を 指標 に，抗癌 作用ならぴに抗酸化作用を評価した。
ヒト白血病細胞（HL‐60）の細胞増殖に 対するテルペンアルコール及びそのりン脂質誘導体の影響を調べたところ，母化合物であるg讎血ol（1），p面llyldcohol（5），m舛enol（6），nerol（7）は400u
Mで 40％程 度の 増殖 抑制 効果 であ った のに 対し ，そ のり ン脂 質 誘導 体で はl00uMで生 細胞 数 がコ ントロールの20ー30％まで減少し，リン脂質誘導化するこ とで抗癌作用が増強されることが示きれた。
また ，ヘ キス ト染色によルアポトー シス細胞が観察されたことから，少なくとも部分的には アポトーシ スを 誘導 することでこれらの増 殖抑制が起こされていることが明らかとなった。一方， 高度不飽和 脂肪 酸に 富む イク ラPCを基 質リ ン脂 質として得られたTyrosol (8)のりン脂質誘導体は ，基質
リ ン 脂 質 に は 無 い DPPHラ ジカ ル捕 捉活 性な らぴ に酸 化 安定 性を 有す る新 規リ ン脂 質で ある ことが明らかとなり，優れた供給形態であることが示された 。
以 上， 本研 究に より P
LA2及ぴ PL
Dを 用い た機 能性 化合 物の りン 脂質 誘導 化法 を確 立 し， それ にー962−より得られたりン脂質誘導体の新規機能性を見出した。

− 963―

学 位論文 審査の要旨
主 査 教 授 宮下和 夫
副査 教授 高橋是太郎
副査 准教授 細川雅史

学 位 論 文 題 名ホス ホ1J
パ ーゼを用いた機能性化合物のりン 脂質誘導化法に関する研究
抗 酸化 作用 や抗 癌作 用な どの 機能性を有する化合物を食品成分や化粧品素材、 医薬 品と して 用い る場 合、 乳化剤等を併用することで分散性や安定性、吸収 性を 高め る必 要が ある 。し かし、それによって利用用途の制限や、栄養機能 性の 低下 とい った 欠点 も生 ずる。ー方、機能性化合物に両親媒性を付与する こと が出 来れ ば幅 広い 利用 が可能となる。この様な機能性改善の手段のー っ と し て 、 ア シ ル 化 や リ ン 酸 化 等 の 誘 導 化 が 挙 げ られ 、誘 導化 に より 分散性や 吸収 性を 大き く改 善出 来る 可能性がある。そこで、本研究では、優れた生体 適合 性と 両親 媒性 から 医療 品や機能性食品、化粧品素材として広範に利用さ れて いる りン 脂質 の分 子構 造に着目し、種々の機能性物質をりン脂質誘導化 する ため の新 規反 応プ ロセ スの開発と、得られたりン脂質誘導体の機能性 評 価 に 関 し て 研 究 を 行 っ た 。 そ の 際 、 生 体 触 媒 で あ る phospholipase A2(PLA2)や phospholipaseD(PLD)と い っ た り ン 脂 質 関 連 酵 素 を 利 用 し 、 温 和な環 境で 特異 的な 反応 を簡 便に 進める方法について検討し、以下のような成果を得た。
1． 抗 癌 作 用 や 抗 肥 満 作 用 を 有 す る こ と か ら 機 能 性 脂 肪 酸 と し て 近 年 注 目 さ
れ て い る 共 役 リ ノ ー ル 酸 (CLA)に 着 目 し 、 PLA2を 用 い た エ ス テ ル 化 反 応 に よる CLA含 有 ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン (CLA― PC)の 合 成 を 試 み た 。 特 に ， PLA2を 用
いた エステ ル化 反応 では 、副 反応である加水分解反応を制御する反応系中の至適 水分量 の調 節が 非常 に難 しかったため、必須水代替物（ホルムアミド）を活 用し、 かつ 、食 品タ ンパ ク質を用いて反応水を吸収することにより、ホス ホ リ パ ー ゼ A2に よ る 効 果 的 ぬ り ン 脂 質 合 成 法 を 確 立 し た 。 こ れ を 機 能 性脂 肪 酸 の エ ス テ ル化 反 応 に 活 用 し 、 高 い 合 成 率 を 得 る こ と に 成 功 し た 。
2. PLDを 用 い た ホ ス フ ァ チ ジ ル 基 転 移 反 応 に よ る 機 能 性 ア ル コ ー ル の り ン
脂 質誘導 化法 にっ いて 検討 した 。ホスファチジル基転移反応を様々な機能性化 合物に 応用 する 為に は、 様々 なアルコール化合物を基質として用いて反応
特 性を明 らか にす る必 要が ある 。そのような観点から、本研究ではこれまで
報 告例の ない テル ペン アル コー ル化合物やフェニルアルコール化合物に着目し、 それ らの ホスファチジル基転移反応にっいて検討した。その結果、優れた機 能性 を有 するテルペンアルコール類とフェニルアルコール類をりン脂質の り ン 酸基 に 結 合 さ せ る こ と に初 めて 成功 した。 また 、PLDを 用い たホ ス
ファ チジ ル基 転移反 応は 一般 に、 水と クロ ロホルムなどの有機溶媒との2相系に より 行わ れるが、そのような有機溶媒の使用は工業的応用をはかる際、安全 面で 問題 点とな る。 そこ で本 研究 では 水系 での 合成 を試 みた 。そ の結
果 、 水 系で の 方 が 2相 系 よ りも 高い 収率 を得 られ る条 件を 見出 した 。例 えば、phosphatidyl―geraniolの合成率は2相系では52 mol％であったのに対し水系では90mol％となり、テルペンア・，ノレコールのりン脂質誘導化では水系が適していることが明らかにした。
3．至 適反 応条 件に おい て各 種基 質ア ルコ ールを用い合成率を比較したとこ
ろ、 基質 テル ペンア ルコ ール の鎖 長が 長く なる 程合 成率 が低 下す るこ と、
perillyl alcoholや myrtenolのよ う極 分子 内に 環状 構造 を有 する テル ペン
アル コー ルも ホスファチジル基転移反応の基質になり得ることを明らかにした。 また 、フ ェニルアルコールのベンゼン環からホスファチジル基に置換される −OH基ま での距離が合成率に大きく影響を与えるのに対し、p‑位の置換基は その 種類 によら ずほ とん ど反 応に 影響 を及 ばさ ない こと を明 らか にした。
4.各 種リ ン脂 質誘 導体 にっ いて 機能 性評価 を行 った 。特 にヒ ト癌 細胞 株を用い た増 殖抑 制試 験やDPPHラジカル捕捉能、酸化安定性を指標に、抗癌作用なら ぴに 抗酸 化作 用を評価した。ヒト白血病細胞(HLー60)の細胞増殖に対するテ ルベ ンア ルコ ール及びそのりン脂質誘導体の影響を調べたところ，母化合 物 が geraniol、 perillyl alcohol、myrtenol、 nerolの場 合に は、 リン脂質 誘導 化す るこ とで抗癌作用が増強されることが示された。また、ヘキス
ト染 色に よル アポ トーシス細胞が観察きれたことから、少なくとも部分的にはア ポト ーシ スを 誘導することでこれらの増殖抑制が起こされていることが明ら かと なっ た。 一方、高度不飽和脂肪酸に富むイクラPCを基質リン脂質として 得ら れた Tyrosolの りン 脂質 誘導 体は 、基 質リン脂質には無いDPPHラジ
カル 捕捉 活性 なら びに酸化安定性を有する新規リン脂質であることが明らかとな り、 優れ た供 給形態であることが示された。このように、誘導体化により、 基質 とし た用 いたテルベンアルコールとフェニルアルコールとは異なる機能 性を 示す こと を見 出し た。
こ のよ うに 、本 研究では、リン脂質を出発物質として、種々の機能性成分を、 酵素 （リ パー ゼ）を用いてエステル化させることに成功した。本研究で合成 に成 功し たり ン脂質誘導体は、優れた生体適合性と両親媒性から医療品や機 能性 食品 、化 粧品素材としての活用が期待される。これらの成果は、生物素 材利 用の 研究 分野において重要を知見になるとともに、機能性食品・化粧品 への 高度 利用 や水産資源の有効利用の分野に新たた視点を与える意義深
いも ので ある 。よ って審査員一同は本研究の申請者が博士（水産科学）の学位を 授与 され る資 格の ある もの と判 定した 。