博士（医学）藤原幸雄
学位論文題名
糖尿病性網膜症の遺伝子発現解析→ マ ウ ス 酸 素 誘導 網膜 症の 遺伝 子発 現解 析―

学位論文内容の要旨
糖尿病網膜症は，腎症および神経症とともに微小血 管症に分類される重大な糖尿病合併症の―つである．糖尿病網膜症は，高血糖に起因す る血管障害により網膜組織に虚血状態 が引 き起 こさ れ， それ によ り血 管新 生が 誘導 さ れる．VEG
Fが虚血誘導性の網膜血管新生において中心的な役割を果たすと考えられてお り，近年，VEGFを標的とした治療薬の開発がすすめられている，しかし，この虚血性血 管新生の発生機序はいまだ不明な点が多い．
今回我々は，虚血性網膜血管新生を示す動物モデル である新生児マウスによる酸素誘導網膜症モデルを用いて糖尿病網膜症の血管新生にか かわる新たな遺伝子を探索し，病態との関連性を解析することを目的として実験を行っ た．
C57
BL/6 Cr Slcマウス新生児を母動物とともに生後 7日から12日までの連続5日問75％酸素分圧下に暴露し，その後通常の酸素分圧下で飼育 した．75％酸素分圧下に暴露したマウス新生児にFITC‑dextr
an/saline溶液を灌流し，網膜のwhole‑
mount
標本を作製したと
ころ，生後17日網膜には，視神経乳頭周囲に無灌流部 位が認められ，その周辺部には新生血 管の 塊が 顕著 にみ られ た， さら に， 網膜 のHE染 色組織標本において生後15日以降内境 界膜 を越 えて 硝子 体内 に存 在す る新 生血 管が 顕 著に認められた，CD31抗体による
免疫 染色 にお いて も生 後15日以 降硝 子体 内の 新生 血 管像が顕著であった，生後12日の75％ 酸 素 分 圧 暴 露 終 了 後 0， 12お よ び 24時 間 に お け る VEGFの mRNA発 現 は 時 間 の 経―524―

過と と もに増 加を示 し，暴露 終了後 24時間では 0時間 に比し 発現比は ほぼ2倍にま で達した，以上より，酸素誘導網膜症モデルは適切に作成されていると判断した，
そ こ で 生後 17日のマ ウス新生 児網膜 における 75％酸素 分圧下暴 露と通 常酸素分 圧下(20％02)でのmRNA発現をD
ifferentia
ldis
play法により網羅的に比較検討した，その結果，75％ 酸素分 圧下暴露 により発 現が増 加したバ ンドが 18個，逆に発現が減少したバンドが17個 であり，ホモロジ―検索により発現が増加したバンドから12個，減少したバンドから15個 の遺伝 子を同定 したさら に，これら計27個の遺伝子の発現変化を realti
meRT‑PCRに より定量的に再確認した．その結果，75％酸素分圧下暴露により発現が増加した遺伝子は4個で ，逆に 発現が顕 著に減 少した遺 伝子が2個で あった，既知の遺伝子との相同性を検 索したと ころ， 発現が増 加した遺伝子として，ABIN2遺伝子が，また，発現が顕著に減少 した遺伝 子とし て代謝型 グルタミン酸受容体6(mGlu6)とヌクレオポリン54遺伝子が同定できた，
上 記3遺 伝 子は ， い ずれ も 酸 素 誘導 網 膜 症と の 直接的 関連は 不明であ る，しか し，AB
IN2に関 しては， 血管新生 に関与することを強く示唆する報告がなされている，即ち，ABIN2はTie2(TyrosinekinasewithIgandEGFhomologydomains‑2)により活性化し，NF‑だB阻害作 用を示す ．また ，AB
IN2はAngiopoieti
n・1の抗apoptosis
作用に関与すること が報告されている，Angi
opoietin‑lはTie2と結合し，PI3
1
く/Akt
シグナルおよびMAPK
シグ ナル経路 により 血管新生 を誘導する，ABI
N‑2はPI
3I
くノAkt
シグナル経路の上流で機能しapoptosisを 阻害する ことが 示唆されている，したがって，糖尿病網膜症における血管新 生を理解 するう えで，ABIN‑2が血管新 生にど の様な機能を有しているかより詳細な検●討が必要と考えられる，

学 位論文審査の要旨
主査 教 授 上出 利光
副査 教授 小野江和則
副査 教 授 大野 重昭

学 位 論 文 題 名

糖尿病性 網膜症 の遺伝子発現解析― マ ウ ス 酸 素 誘導 網膜 症の 遺伝 子発 現解 析ー

糖尿病網膜症は、腎症および神経症とともに微小血管症に分類される重大な糖尿病合併症のーつである。糖尿病網膜症は、高血糖に起因する血管障害により網膜組織に虚血状態が弓jき起こされ、それにより血管新生が誘導される。血管増殖因子(VEGF)が 虚血 誘導 性の網膜血管新生において中心的な役割を果たすと考えられており、近年、VEGFを標的とした治療薬の開発がすすめられている。しかし、この虚血性血 管新 生の 発生 機序はいまだ不明な点が多い。本研究は、虚血性網膜血管新生を示す動物モデルである新生児マウスによる酸素誘導網膜症モデルを用いて糖尿病網膜症の血管新生にかかわる新たな遺伝子を探索し、病態との関連性を解析することを目的として実験を行った。C57BU6 Cr Sicマウス新生児を母動物とともに生後7日から12日までの連続5日間75}6酸素分圧下に暴露し、その後通常の酸素分圧下で飼育した。75%酸素分圧下に暴露したマウス新生児にFI
TC‑dext他n/saIjne溶液を灌流し、網膜のwhole一moun
t標本を作製したところ、生後17日網膜には、視神経乳頭周囲に無灌流部位が認められ、その周辺都に｜ま新生血管の塊が顕著にみられた。さらに、 網膜 のHE染色 組織標本において生後15日以降、内境界膜を越えて硝子体内に存在 する 新生 血管 が顕著に認められた。CD31抗体による免疫染色においても生後15日 以降 硝子 体内 の新 生血 管像 が顕 著で あっ た。生 後12日の 75臓 素分 圧暴 露終
了後 0、 12お よび 24時間 にお ける VEGFのmRNA発 現｜よ時間の経過とともに増加を示し 、暴 露終 了後 24時間では0時間に比し発現比はほぼ2倍にまで達した。以上より、酸素誘導網膜症モデルは適切に作成されていると判断した。そこで生後17日のマウス 新生 児網 膜に おける75X酸素分圧下暴露と通常酸素分圧下（2偽02）でのmRNA発現をDi偽re觸a書dispIa
y法によ川罔羅的に比較検討した。その結果、7X酸素分圧下暴露により発現が増加したバンドが18個、逆に発現が減少したバンドが17侶であり、ホモロジ一検索により発現が増加したバンドから12個、滅少したバンドから15個の遺伝 子 を 同定 し た 。さ ら に 、こ れ ら 計 27個 の 遺伝子 の発現変 化をrealtimeRT‑PCRにより 定 量 的に 再 確 認し た 。 その 結 果 、 75%酸 素分 圧下暴露 により 発現が増 加した 遺伝子は 4個 で、 逆 に 発現 が 顕 著に 減 少 し た遺 伝 子 が2個 で あっ た 。 既知 の 遺 伝子と の相同性 を検索し たとこ ろ、発現 が増加 した遺伝 子とし て、ABIN2遺伝子 が、また 、発現が顕著 に滅少し た遺伝 子として 代謝型 グルタミ ン酸受 容体6(mGlu6)とヌク レオポリン54
遺伝 子が同定 できた 。このう ち、ABIN
2に関し ては、 血管新生 に関与 すること を強く示唆
す る 報 告 が な さ れ て いる 。 即 ち、 ABI
N2は Tie2(Tyrosinekina
se w
ithIg and EGF
homology domains− 2） に よ り活 性 化 し、 ． NF‑KB阻 害作 用 を 示す 。 ま た、 ABI
N2はAngiopoietin−1の 抗apoptosis作用に関与することが報告されている。Angiopoietin−1
は Tie2と 結 合 し 、 P13K/Aktシ グ ナ ル お よ び MAPKシグ ナ ル 経路 に よ り血 管 新 生を 誘
導 す る 。ABIN2は PI
3K/Aktシ グ ナル 経 路 の上 流 で 機能 し apoptosisを 阻害 すること が示 唆 さ れて い る 。し た が って 、 糖 尿 病網 膜 症 にお け る 血管 新 生 を理 解 するう えで、ABIN
2が 血 管新 生 に どの 様 な 機 能を 有 し てい るか を今後よ り詳細 に検討す ること が必要 と 考 えら れ る 。発表 に当た り、副査 の大野 教授より 、今回 の研究に 用いた動 物モデ
ル を 糖 尿 病 網 膜 症 の モデ ル と する こ と の根 拠 及 びそ の 妥 当性 、 ABI
N2の 発現 増 加 の意 義 等 につ い て 質問が あった 。次いで 、副査 の小野江 教授よ り、糖尿 病マウス モデルに よ る 解析 の 実 施、高 酸素ス 卜レスに よる影 響等につ いて質 問があっ た。最後 に、主査 の 上 出 教 授 よ り 、 ヒト 臍 帯 静脈 血 管 内皮 細 胞 (HUVEC)を 用 いた 管 腔 構造 形 成 モデ
ル と 虚 血性 血 管 新生 病 態 の類 似 性 、 in vi
tro虚血 性 血 管新 生 モ デル の 情報 および過去 に 報 告 さ れ た 糖 尿 病 網 膜 症 の 網 羅 的 遺 伝 子 発現 解 析 結果 と の 整 合性 に つ いて 質問 が あ った 。 こ れらの 質問に 対して、 申請者 は自己の データ や糖尿病 網膜症モ デルおよ び AB
IN2に関 す るこ れまでの 論文報告 を弓1用し、 概ね適 切な回答 をなし得 た。こ の論 文 は 、糖 尿 病 網膜 症 を 含む 虚 血 性 網膜 血 管 新生 に 関 与す る こ とが 示 唆され る新規分 子 を 詞定 し た ことで 高く評 価され、 今後の 病態メカ ニズム 解明およ び新規治 療法開発 へ の 応用 が 期 待され る。審 査員一同 は、こ れらの成 果を高 く評価し 、大学院 課程にお け る 研鑽 や 取 得単 位 な ども 併 せ 申 請者 が 博 士（ 医 学 ）の 学 位 を受 け るのに 十分な資 格を有す るもの と判定し た。