平 成
年 度

23

金沢医科大学共同研究成果報告書・奨励研究成果報告書

２０１１

平成２３年度金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

平成平成２５年１２月

年

25

月

12

金沢医科大学

金沢医科大学はじめに

平成 23 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では、平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や、学部、大学院、総合医学研究所、他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。また、平成 17 年度からは、奨励
研究に萌芽的研究の枠を設けるなど研究の多様化にも対応しています。
平成 19 年度からは、看護学部が設置されたことに伴い、医学領域と看護学領域に分けて募集しています。
平成 23 年度は、前年度同様学内公募を行った結果、医学領域では、共同研究に 11 件の申請があり 4 件を採択、奨励研究に 28 件の申請があり 12 件が採択されました。また、看護学領域では、共同研究に 2 件、奨励研究に 1 件の申請があり、各々1 件が採択されました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
なお、従来より別刷の掲載をしておりましたが、電子ジャーナルが充実していること、また、著作権処理が困難になってきていることから、昨年度より別刷掲載を見合わせることとし、アブストラクトのみを掲載しております。
今後、これらの共同研究と奨励研究で得られた研究成果を、社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に、本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会、研究推進課並びに関係各位に感謝します。

平成 25 年 12 月
金沢医科大学
学長

勝田

省吾

目

次

はじめに

平成 23 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2011－1.

種を越えて保存された新規がん抑制遺伝子ファミリー
FAM107 分子の包括的探索研究代表者・中島日出夫･･････

C2011－2.

1

腫瘍血管の機構、構造、機能に対する一酸化窒素の関与とその修飾による腫瘍血管の正常化および抗腫瘍薬効果増強への応用研究代表者・甲 野 裕 之･･････

C2011－3.

5動脈硬化治療薬による最適化治療を目指した
遺伝子・バイオマーカー診断法の開発
研究代表者・梶 波 康 二･･････

C2011－4.

9

ミトコンドリア機能制御による老化・代謝疾患の新たな治療法の確立
研究代表者・古 家 大 祐･･････ 13[看護学領域]
C2011－5.

ドレーン排液の色調モニタリングシステム開発に向けての基礎的研究
研究代表者・紺家千津子･･････ 17

平成 23 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2011－1.

転写因子 Storkhead-protein 1 不全の糖尿病血管合併症における意義研究代表者・金 崎 啓 造･･････ 21

S2011－2.

血管内皮 Sirt1 を標的とした高脂肪負荷による血管内皮機能障害
およびインスリン抵抗性に対する新規治療法の開発
研究代表者・北 田 宗 弘･･････ 25

S2011－3.

ヒト心筋細胞の世界標準モデル構築：
非線形力学的並びに比較生理学的手法によるアプローチ
研究代表者・倉 田 康 孝･･････ 29

S2011－4.

低酸素による可溶型 VEGF 受容体（可溶型 Flt-1）
産生抑制機構の解明
研究代表者・池 田 崇 之･･････ 33

S2011－5.

p53 結合タンパク質 53BP1 のアポトーシスと死細胞排除における新規機能の解明
研究代表者・橋 本 優 実･･････ 37

S2011－6.

ヒト培養細胞における M 期進行制御の解析
研究代表者・石 垣 靖 人･･････ 39

S2011－7.

新規リウマチ関節炎制御因子 FRP/FSTL1 の機能解析研究代表者・田 中 真 生･･････ 43

S2011－8.

エピジェネティック機序に着目した肺癌先進部でのアクアポリンの発現誘導の解明
研究代表者・町田雄一郎･･････ 45

S2011－9.

胎児造血における ACTH の赤芽球分化誘導の生理的意義研究代表者・島村英理子･･････ 49

S2011－10. 炎症性大腸腫瘍形成における NF-kappaB の役割
研究代表者・尾 山

武･･････ 53

S2011－11. 正常ヒト皮膚線維芽細胞の過酸化水素曝露による早期老化に対する柴胡桂枝湯の抗老化効果研究代表者・高 田 尊 信･･････ 57
S2011－12. 炎症の抑制因子 SLPI によるアレルギー疾患制御機構の解明
研究代表者・松葉慎太郎･･････ 61[看護学領域]
S2011－13. 外来で術後補助化学療法を受ける消化器がん患者のマネジメント能力、自己効力感、QOL の関係
研究代表者・北 村 佳 子･･････ 65

平成 23 年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2011-1～4

看護学領域

C2011-5

１．研究課題名：種を越えて保存された新規がん抑制遺伝子ファミリーFAM107 分子の包括的探索（研究番号

C2011-1）

２．キーワード：１）がん抑制遺伝子 (tumor suppressor gene)
２）熱ショック蛋白質 (heat-shock protein)３）FAM107 分子 (FAM107 family gene)
３．研究代表者：中島日出夫・医学部・准教授・腫瘍内科学（採択時）
研究分担者：元雄
佐久間

良治・医学部・教勉・医学部・教授・腫瘍内科学
授・呼吸器外科学

小泉恵太・金沢大学子どものこころ発達研究センター・准教授

丸山

光生・国立長寿医療研究センター研究所・老化機構研究部・部長

４．研 究 目 的
がん温熱療法は化学療法や放射線療法との併用で抗腫瘍効果を増強させることから、補助療法の一つとして位置づけられているが、その分子機構には謎が多い。一方、熱に対する生体の応答は熱ショック蛋白質(HSP)を中心として研究・理解されていて、HSP70 や HSP90 は癌細胞で発現が上昇し、その発現によって各種治療に抵抗性となる。HSP27 の発現は前立腺がんの予後不良のマーカーである。また、HSP の発現を誘導する転写因子 HSF-1 も癌化を促進する。したがって HSP は癌原遺伝子であり、実臨床（温熱療法）と基礎医学(HSP)との間に理論上大きな矛盾が存在する。これを解決すべく白血病細胞に熱ショックを与え、がん抑制遺伝子候補である FAM107B 分子を同定した。
FAM107 ファミリー分子は進化の上で非常に良く保存された分子であり、哺乳類をはじめ、
カエル、魚類、ショウジョウバエにも相同遺伝子が存在し、また、ヒトとマウス／ラットの間ではそのアミノ酸配列が 98％以上一致している。哺乳類は FAM107A と FAM107B の２つのサブタイプが存在し、FAM107A は TU3A あるいは DRR1 と命名されていて、腎細胞癌、肺癌、脳腫瘍などで発現が低下し、強制発現で腫瘍の増殖抑制や細胞死を誘導する事から癌抑制遺伝子の候補とされている。FAM107B について我々は、消化管の癌の進展に伴って発現が低下し、熱ショック／温熱療法によって発現が誘導される熱ショック蛋白質の一種であることを証明し、HITS (Heat-shock Inducible Tumor Small protein)と命名した。HITS は、癌細胞で発現が低下して強制発現により腫瘍の増殖抑制効果を持つ事から、癌抑制遺伝子の候補と考えられる。また、TU3A (FAM107A)の発現は神経系に偏在しているのに対して HITS
(FAM107B)は広汎な組織に発現し、各種臓器の進化・分化の過程において重要な働きをしている事が推測される。FAM107 ファミリー分子の機能は癌をはじめとする疾患や神経・免疫の分化などにおいて決定的な働きをしている可能性が高く、生化学的解析・病理学的検討・
遺伝子改変体による解析など包括的探索を行い、その全容を解明したいと考えている。

‑ 1 ‑５．研 究 計 画
HITS (FAM107B)をがん抑制遺伝子として確固たるものにするため、癌種を以前より解析してきた胃癌と大腸癌に加えて、肺癌（佐久間との共同研究）や膵癌（元雄との共同研究）などに広げて病理学的・細胞生物学的解析を行い、適応拡大を試みる。また、FAM107 ファミ
リー分子のがん抑制遺伝子としての分子機構は依然不明のため、分子間相互作用やシグナル伝達機構の解明をマイクロアレイやプロテオーム解析の技術を駆使して行う（石垣との共同
研究）。
さらに研究の対象を癌のみならず、神経系（小泉との共同研究）や老化／免疫系（丸山との共同研究）に拡大し、それら器官の発生や分化に対する影響を調べる。FAM107 分子の生体での働きを明らかにするために、遺伝子改変体の作製を遂行する。今までに FAM107 のショウジョウバエの相同遺伝子(CG9328)を RNAi でノックダウンさせた系統を小泉との共同研究で樹立していて、それを使って各シグナル伝達経路との遺伝学的相互作用を in vivo で確認する。また、ショウジョウバエの各種疾患モデル（癌や神経変性疾患）と CG9328 の改変体との交配を行って、疾患との相互作用を明らかにする。一方、ノックアウトマウスの作製は丸山の協力の下に行い、FAM107A と FAM107B のそれぞれのノックアウトマウスの系統を樹立し、その交配を重ねて FAM107A,B 両遺伝子の欠損したダブルノックアウトマウスの作製を最終目標とする。
６．研 究 成 果癌との関連：抗 HITS 抗体（ウサギポリクローナル抗体）が作製済であり、それを利用して各種組織における免疫染色を行い、癌化との関連を病理組織学的に解析した。消化器癌において、大腸癌への多段階進展過程（正常粘膜→腺腫→癌）の経過に伴って HITS の発現量が段階的に低下し、また、胃癌をその主要な組織型別に解析したところ、腸型癌では HITSの発現量が顕著に低下しているのに対して、びまん型癌では低下していないことを報告した(International Journal of Oncology 37: 583-593, 2010)。組織アレイを用いて組織を拡大して大規
模スクリーニングを行った結果、癌化に伴った HITS の発現低下が、甲状腺癌・乳癌・肺癌・
子宮頸癌・精巣腫瘍など複数の臓器で見られた。さらにそれぞれの臓器に対する組織アレイ
を用いて統計学的解析を施行した結果、乳癌・甲状腺癌では HITS 発現強度と病理学的ステージ分類（TNM 分類、なかでも T 因子）との間に逆相関関係が見られた。さらに乳癌では、PgR 陰性、HER2 陽性、Ki67 陽性、スキルスタイプで HITS の発現量が高いことを証明した(International Journal of Oncology 41: 1347-1357, 2012)。
Tet-ON システムによる誘導発現系を用いた実験で、癌細胞に HITS を in vitro で強制発現させると増殖因子に対する応答性が低下して細胞増殖の抑制が見られ、また、in vivo（ヌード
マウスを使った xenograft モデル）で HITS を誘導発現させても腫瘍の増殖抑制効果が確認された。つまり、HITS の発現により腫瘍が増殖抑制される事を in vivo, in vitro の両方の系で証明することができた (International Journal of Oncology 37: 583-593, 2010 & 41: 1347-1357,
2012 )。同じ Tet-ON システムによる誘導発現系を用いて、DNA マイクロアレイや Real-time‑ 2 ‑PCR による遺伝子発現解析を行った結果、細胞骨格系や細胞運動に関する分子（SNAIL,
KRT17, AREG, IDH1, Nudix, KPNA7 等）の変動が確認できた。
分子機構の解明：HITS の分子間相互作用を解明するために、酵母ツーハイブリッドとプロ
テオーム解析を行った。免疫沈降や GST 融合蛋白質による pull down アッセイを施行し、未だ核心に迫る分子の同定はできていないが、β-アクチンをはじめとする細胞骨格系や細胞運動に関わる転写因子や接着分子と連動している証拠を得た。
神経系における働き：FAM107 ファミリー分子の神経軸索伸長時の役割について検討した。
ラット神経様細胞 PC12 を用いた FAM107 ファミリー分子の強制発現系や RNAi を用いた実験から、HITS (FAM107B)が neurite 伸長を抑制、DRR1 (FAM107A)が増強に働くことを突き止めた。マウス脳初代培養実験からも同様の結果を得ており、FAM107 ファミリー分子が神経軸索伸長に決定的な役割を持つことが証明された（投稿準備中）。
遺伝子改変体：ショウジョウバエの遺伝子改変体を使った実験で、tublin-GAL4 によってHITS を全身に強制発現させると、毛細胞の異常が起きアクチン複合体の形成に関与している
ことがわかった。また、パラコートによる酸化ストレス／熱ショックによるストレスに対して耐性が低下する事が判明した。さらに各種疾患モデルと CG9328 のノックアウト／ノックダウン／トランスジェニックのショウジョウバエとの交配を進めた結果、疾患モデル（癌化）である oncogenic な Ras85DV12 を眼に特異的に発現させた系統と交配させると、Ras85DV12
による眼の変性がレスキューされる事が観察され、癌化と HITS との遺伝学的相関を in vivoで証明することができた。一方、神経変性疾患–自閉症のモデルであるユビキチンリガーゼ
Ube3a の変異を眼に発現させた系統と交配した結果、HITS を強制発現する事により約 50％で眼の変性をレスキューする事ができ、HITS と神経変性疾患との遺伝学的相関を証明する事ができた。ノックアウトマウスに関しては、依然、商業ベースで販売される ES 細胞の作製・購入待ちの状態である。
７．研究の考察・反省
HITS のがん抑制遺伝子である状況証拠（各種癌組織で発現の低下・腫瘍増殖の抑制）は固
まってきた印象がある。病理学的検索・生化学的解析は金沢医科大学で十分な研究環境が整備されており、比較的順調に進んだと思われる。分子間相互作用のプロテオーム解析も石垣らによる協力のもと精力的に行ったが、未だ核心に迫る分子を同定できず、今後はプロテイ
ンアレイなどの新しい手法を試す必要があると考えている。
神経系の解析は、小泉の全面的な協力で神経軸索伸長に FAM107 ファミリー分子が決定的な役割を持っていることを証明し、現在論文を投稿準備中である。マウスやショウジョウバ
エを使った神経系の実験も金沢大学で行うことができ、ほぼ期待通りに進むことができた。
遺伝子改変体であるが、ショウジョウバエは小泉の協力で疾患との相関を示す面白いデー
タが得られた。しかしながら、ノックアウト（ショウジョウバエ／マウス）の作製は他所に全面的に依存しなければならない状態であり、自分で作製すると膨大な時間と労力を必要とするため、商業ベースでの販売を待つこととなってしまった。

‑ 3 ‑８．研 究 発 表Nakajima H, Koizumi K, Tanaka T, Ishigaki Y, Yoshitake Y, Yonekura H, Sakuma T, Fukushima T,
Umehara H, Ueno S, Minamoto T, Motoo Y. Loss of HITS (FAM107B) expression in cancers ofmultiple organs: tissue microarray analysis. Int J Oncol 2012; 41: 1347-1357.
Abstract: Family with sequence similarity 107 (FAM107) proteins consist of two subtypes,
FAM107A and FAM107B in mammals, possessing a conserved N-terminal domain of unknown
function. Recently we found that FAM107B, an 18 kDa nuclear protein, is expressed in a broad rangeof tissues and is downregulated in gastrointestinal cancer. Because FAM107B expression is amplified
by heat-shock stimulation, we designated it heat shock-inducible tumor small protein (HITS).
Although data related to FAM107A as a candidate tumor suppressor have been accumulated, little
biological information is available for HITS. In the present study, we examined HITS expression using
immunohistochemistry with tissue microarrays and performed detailed statistical analyses. By
screening a high-density multiple organ tumor and normal tissue microarray, HITS expression was
decreased in tumor tissues of the breast, thyroid, testis and uterine cervix as well as the stomach andcolon. Further analysis of tissue microarrays of individual organs showed that loss of HITS expression
in cancer tissues was statistically significant and commonly observed in distinct organs in ahistological type-specific manner. The HITS expression intensity was inversely correlated with theprimary tumor size in breast and thyroid cancers. In addition, effects of tetracycline-inducible HITS
expression on tumor growth were investigated in vivo. Forced expression of HITS inhibited tumor
xenograft proliferation, compared with the mock-treated tumor xenograft model. These results showthat loss of HITS expression is a common phenomenon observed in cancers of distinct organs andinvolved in tumor development and proliferation.

‑ 4 ‑１．研究課題名：腫瘍血管の機構、構造、機能に対する一酸化窒素の関与とその修飾による腫瘍
血管の正常化および抗腫瘍薬効果増強への応用（研究番号C2011-2）

２．キーワード：１）一酸化窒素 (nitric oxide)２）腫瘍血管 (tumor vessel)３）転移 (metastasis)
４）腫瘍微小環境 (tumor microcirculation)５）肝循環 (hepatic circulation)
３．研究代表者：甲野裕之・看護学部・教授・医科学研究分担者：芝本利重・医学部・教授・生理学Ⅱ

望月隆・医学部・教授・皮膚科学

中沢実・金沢工業大学情報学部・教授・情報工学科

４．研 究 目 的
腫瘍の増殖や転移には酸素と栄養を補給するために腫瘍血管の新生が必要となる。腫瘍組
織における異常な血管とそれに起因する異常な微小環境は、腫瘍組織内の低酸素状態の誘導
あるいは抗腫瘍薬の輸送や効果を減弱させ、腫瘍細胞の悪性形質の獲得に有利に働くものと考えられている。一方、一酸化窒素 (NO) は多彩な生理機能や病態に関与することが知られており、種々の腫瘍組織においても NO 合成酵素 (NOS) の発現亢進や NO 濃度の上昇が認められるなど、腫瘍血管あるいはがん実質から分泌される NO が腫瘍の増殖や腫瘍血管維持に関与するとの報告がなされており、NO 産生の修飾による腫瘍血管の正常化誘導を利用した新規治療法の開発が期待されている。本研究では、腫瘍血管を病理学的かつ生理学的に解析し、腫瘍血管の機構、構造、機能に対する NO の関与を明らかにするとともに、NO 産生の修飾による腫瘍血管の正常化ならびに抗腫瘍薬の効果増強の可能性を探ることを目的とする。
５．研 究 計 画
１）転移性肝腫瘍モデルの確立①ラット転移性肝腫瘍モデルの検討
前年度、RCN-9 細胞を用いた転移性肝腫瘍の形成を試みたが、先行研究に準じた方法では転移性肝腫瘍の形成がみられなかった。本年度は投与方法および投与する腫瘍細胞の濃度などを改変し、肝腫瘍形成を試みる。
②マウス転移性肝腫瘍モデルの検討
前年度の検討において、BALB/c マウス由来の colon-26 細胞を用いた転移性肝腫の形成を試みたが、微小な転移性肝腫瘍の形成にとどまったため、他のマウス転移性肝腫瘍モデルについても検討を行う。

‑ 5 ‑\\DOCUDISK\disk2\●元データ保存●\2013-保管データ\13-11 月仕事\261931-医科大 共同研究成果\先方データ\本文\修正版
C2011-2_甲野（看護学部）.doc２）腫瘍血管の病理学的解析・免疫組織化学的解析
肝転移モデルより得られた腫瘍組織を摘出し、腫瘍血管と正常血管の病理学的解析なら
びに免疫組織化学的解析、ならびに正常血管との腫瘍血管における各分子の発現量ならびに分布の相違点を明らかにする。また免疫組織化学的解析では、各分子の発現陽性陰性の解析、画像解析装置を用いた各分子の発現量の定量化を試みる。
３）腫瘍血管の血管抵抗分布ならびに反応性の解析
転移性肝腫瘍モデルにて形成された肝腫瘍組織を用いて微小血管圧、微小循環動態の測定を行い、腫瘍血管と正常血管との機能、構造の相違を生理学的に解析する。
４）肝腫瘍形成動物に対する NO 産生修飾剤の投与による修飾作用の検討
肝腫瘍形成動物に NO 産生修飾剤を投与し、腫瘍血管と正常血管の病理学的解析、免疫
組織化学的解析および生理学的解析を行い、NO 産生修飾剤による血管機能の正常化の可能性を検討する。
６．研 究 成 果１）転移性肝腫瘍モデルの確立①ラット転移性肝腫瘍モデルの検討
先行研究で報告されている RCN-9 細胞の門脈投与法を改変し、投与細胞の細胞数、細胞密度を増やすことを試みたが、転移性肝腫瘍の形成は認められなかった。さらに RCN-9細胞を脾臓より投与する方法も試みたが、転移性肝腫瘍の形成は認められなかった。
②マウス転移性肝腫瘍モデルの検討
新たなマウス転移性肝腫瘍モデルとして RL♂1 細胞（東北大学医用細胞資源センター保管）によるヌードマウス転移性肝腫瘍モデルを計画したが、東日本大震災の影響により研究期間内での細胞供与が不可能となったため計画を断念した。
２）腫瘍血管の病理学的解析・免疫組織化学的解析
Colon-26 細胞を用いた転移性肝腫瘍モデルを用いて病理学的解析・免疫組織化学的解析に供する転移性肝腫瘍の採取を試みたが、肝転移の頻度が低く、また移植早期より原発巣からの腹膜播種、悪液質によると考えられる顕著な体重減少が認められたため、転移性肝腫瘍の形成が不十分な状態での犠牲死を余儀なくされた。そのため種々の解析に耐えられるような腫瘍塊を得ることができず、計画した解析の遂行ができなかった。一方、画像解析装置による免疫組織化学的解析ではヒト乳がん組織標本での Her2 発現の定量的な解析を試みた。病理医によるスコアリングと画像解析結果を比較検討したところ 80%以上の分類精度を獲得できることを確認した。
３）腫瘍血管の血管抵抗分布ならびに反応性の解析
ラットおよびマウスを用いた転移性肝腫瘍モデルの確立が遅れたため、ラットの肝血管収縮部位の観察を、アナフィラキシー反応誘発による肝血管収縮部血管造影にて行った。
アナフィラキシー反応誘発により門脈細静脈での収縮が強く認められ、さらに収縮が認められた部位はエンドセリンの収縮部位とほぼ一致していたことから、収縮部位が門脈の体‑ 6 ‑\\DOCUDISK\disk2\●元データ保存●\2013-保管データ\13-11 月仕事\261931-医科大 共同研究成果\先方データ\本文\修正版
C2011-2_甲野（看護学部）1122.doc

循環の抵抗血管にあたる可能性が示唆された。
４）肝腫瘍形成動物に対する NO 産生修飾剤の投与による修飾作用の検討
Colon-26 細胞を用いたマウス転移性肝腫瘍モデルを用いて、iNOS 阻害薬である L-NAME(100 ppm) 混餌投与による肝腫瘍形成の修飾作用について検討した。肝腫瘍形成率は対照
群で 20％、L-NAME 投与群で 10％であったが、肝腫瘍形成頻度が低く、転移巣も極めて微小であったため、iNOS 阻害薬による肝腫瘍形成の修飾作用については十分な検証はできなかった。
７．研究の考察・反省
ラットとマウスの摘出潅流肝臓を用いることにより種々の条件下における微小循環動態の計測、微小血管圧、微小循環動態の解析、血管造影などが可能であることを示すことができた。さらに画像解析装置を用いた定量的な免疫組織化学的解析の可能性を示すことができた。
一方、本研究の根幹をなす転移性肝腫瘍モデルの確立においては、転移性肝腫瘍モデルの作製が困難を極め、転移性肝腫瘍の十分な解析を行うことができなかった。計画が思うように進まなかった原因としては、転移モデル確立の困難さに加え、事前の情報収集が不十分であったことが大きな反省点である。今後は今回使用した肝転移性細胞株を基にして in vivo での高転移細胞株のセレクションなどを行い、転移頻度の高い肝腫瘍モデルの確立を試み、NO
産生修飾剤ならびに抗腫瘍薬との併用による抗腫瘍活性の検討に繋げていきたいと考える。
８．研 究 発 表
Kitadate M, Shibamoto T, Tsutsumi M, Tonami H. Portal venular constriction during anaphylactic
shock in anesthetized rats. Biomed Res 2013; 34: 61-68.
Abstract: Hepatic venoconstriction occurs in rat anaphylactic hypotension. However, the exact
venoconstrictive site remains unknown, and we therefore attempted to determine its location by using
hepatic venography and histology. Anaphylaxis was induced in anesthetized Sprague-Dawley rats byi.v. administration of ovalbumin antigen. Venography of the portal vein (n = 8) was obtained atbaseline and maximal hepatic venoconstriction. We separately examined photomicrographs of theliver sections. Along with systemic hypotension, portal venous pressure increased to a peak of 28 ± 3
cm- H2O at 2 min after antigen injection. Post-antigen portal venography revealed that 40% of portal
venuls (76 vessels/total 188 vessels) with diameters from 160 to 300 μm were not visualized,
suggesting that stenosis or obliteration occurred distally. The corresponding upstream portal vessels
exhibited markedly bulging. Stenosis was also observed in some portal branches with diameters from180 to 420 μm (9%; 17 vessels/total 188 vessels). Light microscopically, most portal venules with anestimated baseline diameter less than 110 μm showed stenosis, but statistically significant stenosis
was found in those with baseline diameters of 20-70 μm. In conclusion, anaphylactic hepatic
venoconstriction occurs over a wide range of portal veins with diameters less than 420 μm, and occurs
markedly in portal venules with diameters less than 70 μm in anesthetized rats.

‑ 7 ‑１．研究課題名：動脈硬化治療薬による最適化治療を目指した遺伝子・バイオマーカー診断法の開発（研究番号C2011-3）

２．キーワード：１）動脈硬化性心血管疾患 (atherosclerotic cardiovascular diseases)
２）個別化医療 (individualized medicine)３）スタチン (statin)
４）ワルファリン (warfarin)
５）薬理遺伝学 (pharmacogenomics)
３．研究代表者：梶波研究分担者：河合康二・医学部・教授・循環器内科学

康幸・医学部・准教授・循環器内科学

杉山雄一・独立行政法人理化学研究所 ｲﾉﾍﾞｰｼｮﾝ推進ｾﾝﾀｰ・特別招聘研究員

前田

和哉・東京大学大学院薬学研究科・講師

斎藤嘉朗・国立医薬品食品衛生研究所・部長・医薬安全科学部

黒瀬光一・国立医薬品食品衛生研究所・室長・医薬安全科学部

４．研 究 目 的
生活習慣の欧米化と高齢者人口の急激な増加により、狭心症や心筋梗塞など動脈硬化性心血管疾患は近年増加の一途を辿り、その克服は大きな社会課題となっている。近年これら疾患に対し有効性の確立された種々の治療法が登場したが、その中で、投与前に効果と副作用を予知し、治療設計の最適化を実現したものは皆無である。その大きな障壁の一つとして薬効ならびに副作用を規定する素因の人種差ならびに個体差が指摘されており、日本人独自の知見を多角的に集積・分析する必要がある。
本研究は、動脈硬化治療薬による最適化治療を目指し、薬効と副作用を予測するための遺伝子・バイオマーカーを用いた統合的診断法開発を試みるもので、平成 20 年度以降参加し成果を挙げている NEDO プロジェクト共同研究を基盤に、薬物動態・薬効・副作用の定量的解
析により創薬研究をリードしてきた東京大学杉山グループ、薬物副作用に関し日本全国から集約された情報を元に世界に向けて研究成果を発信してきた国立医薬品食品衛生研究所の斎藤グループと共同で、現行の薬物治療が持つ限界を打破する新知見を得、その早期臨床実用化を目指す、新しいスタイルの医学・薬学統合研究である。
５．研 究 計 画
頻用される動脈硬化治療薬であるコレステロール低下薬と抗血小板薬を対象に、i)既投与
例の後ろ向き研究、ii)臨床適応に沿った新規投与例の前向き研究により、バイオマーカー解析ならびに遺伝子解析用サンプルを集積するとともに、臨床情報を収集する（国内９大学からなる共同研究チームを既に発足させている）。
薬効（コレステロール低下率などのサロゲート指標、心血管イベントなどハードエンドポ‑ 9 ‑イント）規定因子としては、杉山・前田らによって薬物動態や薬効に関わることが示された遺伝子群における遺伝子多型を、副作用（横紋筋融解などの筋障害）関連因子については斎
藤・黒瀬らが従来蓄積した日本人における副作用規定因子を中心に、それぞれ検討する。同時に新規バイオマーカー探索として、梶波・河合らの従来研究を基盤に植物ステロールや心筋障害マーカー、さらには血栓関連分子を測定する。
６．研 究 成 果
１）有害事象発現症例の集積
・金沢医科大学および国内８大学（山梨、神戸、近畿、和歌山県立医科、徳島、福岡、熊本、佐賀）の共同研究チームを発足した。各施設の倫理委員会承認後、スタチン投与例対象とした後ろ向き研究として、筋障害発症例を登録し、バイオマーカー解析ならびに遺伝子解析用サンプル収集を開始。現在までに 25 例が登録されサンプル収集が進行中である（発表予定）（梶波、河合）。
・各施設におけるスタチン投与症例総数との関係から、筋障害発症頻度についての日本人初のデータとなることが期待される（発表予定）（梶波、河合）。
・横紋筋融解症等に関し、平成 24 年度末までに、全国より患者ゲノム DNA および臨床情報を計 101 例、収集した。さらにケースカードによる診断確定は 86 例中 60 例であった。残りは筋炎 9 例、筋痛 12 例、判定不能 5 例であった。このうちスタチンを被疑薬とする横紋筋融解症症例は 19 例であった。250 万多型を測定しうる DNA マイクロアレイを用いてゲノム網羅的遺伝子多型解析を行い、日本人健常人データと比較したところ、免疫系、細胞骨格、神経機能関連遺伝子等の領域に、統計学的な多重性補正後も有意に関連する多型を10 種以上見いだした。またスタチン処方例に限定した場合、トランスポーター、免疫系、シグナル伝達関連遺伝子等の領域に関連する多型を検出した（発表予定）（斎藤、黒瀬、梶波）。
・またこの研究過程において、医療記録からの横紋筋融解症症例抽出手法について、またDNA サンプルの調整法について、それぞれ新知見を報告した（斎藤、黒瀬）。
２）薬効規定因子の探索
・実臨床例において、マイクロドース法を用い atorvastatin 薬物動態が OATP1B1 遺伝子多型
により有意に異なることを明らかにした（抄録①：梶波、河合、杉山、前田）。
・スタチンを用いて行われた大規模臨床研究(PROSPER)においてスタチン代謝に関与する取り込みトランスポーターOATP1B1 の機能的遺伝子多型がコレステロール低下率の規定因子であること、KIF6 および ABCA1 遺伝子多型が心血管イベント予防効果の規定因子であることをそれぞれ報告した（投稿中：梶波、赤尾）。
・atorvastatin 代謝の律速段階は CYP3A4 ではなく OATP1B1 を介した肝細胞取り込みであることを明らかにした（杉山、前田）。
・消化管吸収から肝細胞取り込みにいたる代謝経路における薬物間相互作用を予測する方法
論を検討し、種々のスタチンについて応用可能なモデルを検討し、取り込み過程の阻害が‑ 10 ‑

重要であることを明らかにした（杉山、前田）。
・スタチン類について、欧米人とアジア人の血中濃度の比較しうるデータを多数収集し、理論に基づく動態解析を実行したところ、各種 OATPs の基質となるスタチンについて、日本人の方が、欧米人より投与量で規格化した血中 AUC が 1.5～2 倍程度高いことが示され、
OATPs 基質薬物に共通の現象である可能性を見出した（前田、杉山）。
・抗血小板薬であるクロピドグレルの作用に関する個人差を規定する CYP2C19 多型は、東アジアでの人種差は大きくなく、地域差の大きい欧州とは異なることを見出した（斎藤、
黒瀬）。
・動脈硬化性心血管病治療に用いられる抗凝固薬であるワルファリンの薬効規定因子を食事からのビタミン K 摂取量を考慮した薬理栄養遺伝学の観点から検討し、VKORC1 変異アレル保持者では摂取量の影響が大きいことを見出した（論文②：梶波、河合、赤尾、石田）。
７．研究の考察・反省スタチンに関して、筋障害を発症した臨床例の蓄積が進まず、この副作用の発症頻度が予想外に低いと想定された。このことと、基礎研究における薬物代謝の人種差の背景となる分子メカニズムをつなぎ合わせると、この現象自体が日本人の特徴である可能性が想定された。
ゲノム網羅的遺伝子解析結果がようやく明らかになりつつあることから、これを踏まえて今後の研究発展に期待される。また進行中の薬効規定因子についても、今後日本人独自の知見を探索する予定である。
８．研 究 発 表
Saito R, Takeda K, Yamamoto K, Nakagawa A, Aoki H, Fujibayashi K, Wakasa M, Motoyama A,
Iwadare M, Ishida R, Fujioka N, Tsuchiya T, Akao H, Kawai Y, Kitayama M, Kajinami K,
Nutri-pharmacogenomics of warfarin anticoagulation therapy: VKORC1 genotype-dependent
influence of dietary vitamin K intake. J Thromb Thrombolysis (in press) 2013.
Abstract: Background: Warfarin is the most widely prescribed oral anticoagulant, but large
interindividual variations exist in the dose required to achieve comparable therapeutic effects. Several
clinical and genetic variables have been identified that influence warfarin dosing. However,interactions between genotype and nutrition remain uncertain in terms of dietary vitamin K intake.
Methods and Results: To investigate genotype-nutrient interactions in warfarin anticoagulation
therapy, 202 consecutive outpatients (M/F=142/60, mean age, 69 years) undergoing treatment withwarfarin were enrolled. Prevalent single nucleotide polymorphisms in VKORC1 and CYP2C9 were
genotyped, and dietary vitamin K intake during the week preceding the blood sampling wasquantitatively estimated by a dietitian-assisted questionnaire. Patients were classified according to low,
medium, or high vitamin K intake. The mean daily warfarin dose in subjects with a VKORC1 -1639
A/A genotype was significantly smaller than that with a -1639A/G genotype (2.74 vs. 3.91 mg/day,
respectively, p<0.0001). Dose requirements did not differ between subjects with a CYP2C9 *1/*3‑ 11 ‑

genotype vs. a CYP2C9 *1/*1 genotype. In subjects with a variant VKORC1 -1639 G allele, the mean
daily warfarin dose was significantly attenuated by low vitamin K intake compared with medium andhigh intake after adjustment for covariates (3.4 vs. 5.0 vs. 4.0 mg/day, respectively, p=0.028). No suchgenotype effects were observed in homozygous patients for the VKORC1 -1639 A allele.
Conclusions: The results of the present study suggest that the capacity of dietary vitamin K intake toinfluence warfarin dose requirements during anticoagulation therapy is VKORC1 genotype-dependent,
at least in part.

‑ 12 ‑

１．研究課題名：ミトコンドリア機能制御による老化・代謝疾患の新たな治療法の確立（研究番号

C2011-4）

２．キーワード：１）ミトコンドリア (mitochondria)
２）老化 (aging)３）代謝疾患 (metabolic disease)４）オートファジー (autophagy)５）サーチュイン (sirtuin)
３．研究代表者：古家大祐・医学部・教授・糖尿病・内分泌内科学

研究分担者：金崎啓造・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

北田宗弘・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

前川聡・滋賀医科大学医学部・教授・内科学講座（糖尿病･腎臓･神経内科）

久米

真司・滋賀医科大学医学部・特任助教・内科学講座（糖尿病･腎臓･神経内科）

４．研 究 目 的
総務省統計局からの報告では、65 歳以上の高齢者人口（平成 24 年９月 15 日現在推計）は3074 万人で、総人口に占める割合は 24.1％となっている。この現状に加えて、小子化問題を考慮すると 20 年後には 30％強が 65 歳以上となり、わが国は超高齢化社会に突入すると言っても過言ではない。こうした問題に対処するための重要な解決策は、高齢者が肉体的・精神的健康を維持して、個人としても社会においても生産的な老後を送ることを可能にしていくことである。したがって、老化疾患と老化に伴って著増する糖尿病など代謝疾患に対して、根本的な老化制御メカニズムの理解に基づいた新たな治療法を講じていくことがわが国にとって急務の課題である。
そこで我々は、カロリー制限食同様にオートファジーを惹起しうる食事介入治療を開発し得ないかと考えた。予備的検討にて高脂肪食負荷によりオートファジー系破綻が生じ、高脂肪食負荷下、高ケト原性アミノ酸含有食投与によって脂肪肝が組織学的に改善していることも見い出している。本研究では高ケト原性アミノ酸含有食がミトコンドリア機能制御を介した新たな治療戦略になる可能性を検証することを目的とした。
５．研 究 計 画
マウス(C57Bl6)を用い、高脂肪食・ケト原性アミノ酸含有高脂肪食をあたえる。12 週、24
週後に耐糖能・エネルギー代謝を評価し屠殺。各臓器を採取し組織学的・生化学的・分子生物学的検討を行う。オートファジーを可視化する事ができる LC3-GFP マウスを用い、オート
ファジー機構の演じる役割を詳細に検討する。

‑ 13 ‑

６．研 究 成 果
8 週齢のマウスを、通常食、高脂肪食、高脂肪食+ケト原性アミノ酸食（脂質、炭水化物エ
ネルギー比率は通常食と同様、図 1）、12、16 週後に耐糖能、肝臓の組織検査（oil red O 染色）、肝臓におけるオートファジー関連シグナル、内臓脂肪の大きさとマクロファージ浸潤を検討した。その結果、摂食量に変わりはないが、ケト原性アミノ酸食群によって高脂肪食群と比Control dietA

B

C

図 1. ケト原性アミノ酸食の組成

較して、１）体重が有意な減少、
２）内臓脂肪重量(Epididymal fat)

図 2. 高脂肪食による非アルコール性脂肪肝(NAFLD)が、ケト原性アミノ酸によって改善するが有意に減少とマクロファージの浸潤の減少、３）オートファジーの亢進、４）非アルコール性脂肪肝(NAFLD)の改善（図 2）、５）耐糖能異常の改善、が認められた。
さらに、上流の分子メカニズムとして、高脂肪食群における肝臓での LKB1-AMPK シグナルの低下と
mTOR の活性化が、ケト原性アミノ酸食によって改善されていた。
さらに、高脂肪食群でみられた
SIRT1 の発現低下も、ケト原性ア

図 3. 高脂肪食による栄養応答シグナルの破綻が、ケト
原性アミノ酸によって改善する

ミノ酸食によって改善されていた（図 3）。
７．研究の考察・反省
以上の結果から、ケト原性アミノ酸によって、高脂肪食時におけるオートファジーの低下
が非アルコール性脂肪肝(NAFLD)形成と耐糖能異常に重要な役割を演じていること、さらにケト原性アミノ酸による栄養応答シグナルの破綻の改善が、オートファジー機構を介して、非アルコール性脂肪肝(NAFLD)形成と耐糖能異常を改善しえることが明らかとなった。
８．研 究 発 表
① Xu L, Kanasaki M, He J, Kitada M, Nagao K, Jinzu H, Noguchi Y, Maegawa H, Kanasaki K, Koya D.
Ketogenic essential amino acids replacement diet ameliorated hepatosteatosis with altering‑ 14 ‑

autophagy-associated molecules. Biochim Biophys Acta 2013; 1832(10):1605-1612.
Abstract: Ketogenic amino acid (KAA) replacement diet has been shown to cure hepatic steatosis, aserious liver disease associated with diverse metabolic defects. In this study, we investigated theeffects of KAA replacement diet on nutrition sensing signaling pathway and analyzed whether
induction of hepatic autophagy was involved. Mice are fed with high fat diet (HFD) or KAA
replacement in high-fat diet (30% fat in food; HFD)-fed (HFD(KAAR)) and sacrificed at 8, 12,16weeks after initiation of experimental food. Hepatic autophagy was analyzed in protein expressionof several autophagy-associated molecules and in light chain-3 green fluorescent protein (LC-3 GFP)
transgenic mice. HFD(KAAR) showed increased AMP-activated protein kinase (AMPK)
phosphorylation and enhanced liver kinase B1 (LKB1) expression compared to control HFD-fed mice.
The KAA-HFD-induced activation of AMPK was associated with an increased protein expression of
sirtuin 1 (Sirt1), decreased forkhead box protein O3a (Foxo3a) level, and suppression of mammaliantarget of rapamycin (mTOR) phosphorylation compared with the HFD-fed mice. The intervention
study revealed that a KAA-replacement diet also ameliorated all the established metabolic andautophagy defects in the HFD-fed mice, suggesting that a KAA-replacement diet can be usedtherapeutically in established diseases. These results indicate that KAA replacement in food could bea novel strategy to combat hepatic steatosis and metabolic abnormalities likely involvement of an
induction of autophagy.
② He J, Xu Y, Koya D, Kanasaki K. Role of the endothelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosisof chronic kidney disease. Clin Exp Nephrol (in press) 2013.
Abstract: All types of progressive chronic kidney disease (CKD) inevitably induce renal fibrosis,
the hallmark of which is the activation and accumulation of a large number of matrix-producing
fibroblasts or myofibroblasts. The activated fibroblasts or myofibroblasts are derived from diverse
origins, such as residential fibroblasts, vascular pericytes, epithelial-to-mesenchymal transition(EMT), and bone marrow (circulating fibrocytes). Recently, endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT) or endothelial-to-myofibroblast transition has also been suggested to promote fibrosis and isrecognized as a novel mechanism for the generation of myofibroblasts. Similar to EMT, during
EndMT, endothelial cells lose their adhesion and apical-basal polarity to form highly invasive,
migratory, spindle-shaped, elongated mesenchymal cells. More importantly, biochemical changes
accompany these distinct changes in cell polarity and morphology, including the decreased expressionof endothelial markers and the acquisition of mesenchymal markers. This review highlights evidence
supporting the important role of EndMT in the development of renal fibrosis in CKD and its
underlying mechanisms, including novel biological significance of microRNA regulation.
③ Kanasaki K, Taduri G, Koya D. Diabetic nephropathy: the role of inflammation in fibroblast
activation and kidney fibrosis. Front Endocrinol (Lausanne) 2013; 4: 7.

‑ 15 ‑

Abstract: Kidney disease associated with diabetes mellitus is a major health problem worldwide.
Although established therapeutic strategies, such as appropriate blood glucose control, blood pressure
control with renin-angiotensin system blockade, and lipid lowering with statins, are used to treat
diabetes, the contribution of diabetic end-stage kidney disease to the total number of cases requiring
hemodialysis has increased tremendously in the past two decades. Once renal function starts declining,it can result in a higher frequency of renal and extra-renal events, including cardiovascular events.
Therefore, slowing renal function decline is one of the main areas of focus in diabetic nephropathy
research, and novel strategies are urgently needed to prevent diabetic kidney disease progression.
Regardless of the type of injury and etiology, kidney fibrosis is the commonly the final outcome ofprogressive kidney diseases, and it results in significant destruction of normal kidney structure andaccompanying functional deterioration. Kidney fibrosis is caused by prolonged injury anddysregulation of the normal wound-healing process in association with excess extracellular matrix
deposition. Kidney fibroblasts play an important role in the fibrotic process, but the origin of the
fibroblasts remains elusive. In addition to the activation of residential fibroblasts, other importantsources of fibroblasts have been proposed, such as pericytes, fibrocytes, and fibroblasts originatingfrom epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition. Inflammatory cells andcytokines play a vital role In the process of fibroblast activation. In this review, we will analyze thecontribution of inflammation to the process of tissue fibrosis, the type of fibroblast activation and thetherapeutic strategies targeting the inflammatory pathways in an effort to slow the progression ofdiabetic kidney disease.
④ Kume S, Kitada M, Kanasaki K, Maegawa H, Koya D. Anti-aging molecule, Sirt1: a novel
therapeutic target for diabetic nephropathy. Arch Pharm Res 2013; 36(2): 230-236.
Abstract: Caloric restriction prolongs the lifespan of many species. Therefore, investigators haveresearched the usefulness of caloric restriction for healthy lifespan extension. Sirt1, an
NAD+-dependent deacetylase, was identified as a molecule necessary for caloric restriction-related
anti-aging strategies. Sirt1 functions as an intracellular energy sensor to detect the concentration of
NAD+, and controls in vivo metabolic changes under caloric restriction and starvation through its
deacetylase activity to many targets including histones, nuclear transcriptional factors, and enzymes.
During the past decade, investigators have reported the relationship between disturbance of Sirt1
activation and the onset of aging- and obesity-associated diseases such as diabetes, cardiovasculardisease and neurodegenerative disorders. Consequently, a calorie restriction-mimetic action of Sirt1 is
now expected as a new therapy for these diseases. In addition, recent studies have gradually clarified
the role of Sirt1 in the onset of kidney disease. Its activation may also become a new target oftreatment in the patients with chronic kidney disease including diabetic nephropathy. In this article,
we would like to review the role of Sirt1 in the onset of kidney disease based on previous studies, anddiscuss its possibility as the target of treatment in diabetic nephropathy.

‑ 16 ‑

１．研究課題名：ドレーン排液の色調モニタリングシステム開発に向けての基礎的研究（研究番号

C2011-5）

２．キーワード：１）ドレーン排液の色調 (color of the drainage fluid)２）術後出血 (postoperative bleeding)
３）ヘモグロビン濃度 (hemoglobin concentration)
４）併存妥当性 (concurrent validity)
３．研究代表者：紺家千津子・看護学部・教授・成人看護学
研究分担者：小坂健夫・医学部・教授・一般・消化器外科学

高野則之・金沢工業大学工学部・教授・機械系

内田真紀・福井県立大学看護福祉学部・講師・成人看護学

山崎

松美・看護学部・助教・成人看護学

４．研 究 目 的
逆行性感染予防のため術後ドレーンの管理方法は、ドレーンからの排液をバックに貯留させる閉鎖型が主流となっている。この場合の看護の観察視点には、量と色調がある。排液の量と色を観察することによりアセスメントできる術後合併症には、出血、感染、縫合不全の3 つがある。出血は、出血の有無と程度を見るために、ヘモグロビン（以下、Hb とする）濃度を反映する赤い色調と出血量を反映する排液量を観察する。感染は、膿分泌の有無を見るために、膿の貯留を反映する混濁と白色の色調を観察する。縫合不全は、消化液等の有無と程度を見るために、縫合部位を反映する黄色などの色調と消化液の量を反映する排液量を観察する。
ドレーン排液の量と色調の観察の表現には、量は ml という単位を用い、色調は血性、淡血性、淡黄色などという性状と色相を用いる。量は ml と絶対的評価にて数量化できるため、誰もが共通した観察が可能である。一方、色調は、血性、淡血性など主観的な表現であるため絶対的評価ではない。かつ、言語におきかえるため、評定者間、もしくは評定者内においても信頼性があるとはいえない。
前述の合併症の中でも、感染、縫合不全のように異常のない状態から変化が起こる場合には、色調の変化に気づきやすい。一方、出血の場合は、正常な治癒過程でも、ドレーン排液
中に血液が混入するためアセスメントは難しくなる。さらに、術後のドレーンの排液は、時間経過とともに、血性、淡血性、淡黄血性、淡々血性、淡黄色、透明に推移する。したがって、時間経過とともに推移する色調が正常か否かのアセスメントは重要で、誤ると迅速な治療が必要となる術後出血の発見の遅れから、患者が生命危機に陥る危険性もある。
そのため、看護師には排液中の血液混入の程度を色調で反映する Hb 濃度をアセスメントする能力の妥当性が求められる。
ドレーン排液による出血のアセスメントについては、色調表現は医療者間で一致していな‑ 17 ‑

いため、色調表現の統一を図るためにカラースケールや判別ライトを作成したという報告がある。したがって、目視では信頼性は確保できないため、ツールを用い色調を観察する工夫を行っている。しかし、出血を見極める Hb 濃度等をアセスメントする妥当性については、
目視のみならずツールでも検証されていない。したがって、患者の生命を管理している看護師が、ドレーン排液の色調から出血を見極める Hb 濃度を的確にアセスメントできているのかを把握することは急務といえる。
そこで、本研究は看護師による一般外科患者のドレーン排液の色調による Hb 濃度のアセ
スメント力の基準関連妥当性を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
研究デザインは、質問紙調査法による調査研究である。調査対象者は、外科看護の経験がある看護師 15 名である。
排液の入った 10 本のスピッツのサンプル写真を配布し、無記名の調査用紙に Hb 濃度の順
位と排液の危険性の回答を依頼し、アセスメント力を分析した。 質問紙の設問内容は、①看護師と外科看護の臨床経験年数、②10 画像の Hb 濃度の順位、③その色調を臨床的に危険と判断するか否かとした。
分析は、排液の Hb 濃度の順位と対象者のつけた順位の一致率と相関をみた。相関は、Spearman の順位相関係数を算出した。さらに、排液毎に危険と判断した人数の割合を算出した。
倫理的配慮は、金沢医科大学臨床研究倫理審査委員会の承認を得て実施した（受付番号177）。ドレーン排液の対象者には、研究の目的、方法、調査協力と途中辞退の自由を説明し、書面にて同意を得た。調査対象者には、研究の目的、方法、調査協力の自由を説明し、調査用紙の提出によって同意を得たと判断した。
６．研 究 成 果
１）調査対象者とドレーン排液の概要
調査対象者は、15 名であった。看護師経験年数は中央値 10 年（レンジ 2-25 年）、外科
看護経験年数は中央値 7 年（レンジ 2-22 年）であった。
10 本の排液スピッツの調査対象者は 10 名で、疾患は乳癌が 5 名と最も多く、次いで肝臓癌が 3 名、胆嚢癌と膵臓癌が各々1 名であった。術式は、乳房切除術が 5 名、膵頭十二指腸切除術と肝切除術が各々2 名、胆嚢切除術が 1 名であった。ドレーンの位置は、前胸部が 5 部位、ウインスローと横隔膜下が各々2 部位、肝切離面が 1 部位であった。
２）排液の Hb 濃度の順位と対象者のつけた順位の関係
Hb 濃度の順位と対象者の判断した順位の一致率で 60％を超えたのは、Hb 濃度が 0.1～
2.1 g/dl と 5.5 g/dl であった。Hb 濃度の 3.0g/dl と 6.2 g/dl と 8.1 g/dl の一致率は、0.0％であった。
スピッツ 10 本における Hb 濃度の順位と対象者の判断した順位の相関は、r  0.652‑ 18 ‑

(p0.001) であった。Hb 濃度下位 5 画像における相関をみると r  0.894 (p0.001) であった。一方 Hb 濃度上位 5 画像における相関をみると r  0.416 (p0.001) であった。
３）看護師による危険な色調の判断状況
看護師が危険な色調と判断した人数の割合は、Hb 濃度 3.0～7.2g/dl までの検体では 80％以上であったが、最も Hb 濃度が高い 8.1g/dl の検体では 46.7％であった。
７．研究の考察・反省
１）排液の Hb 濃度の順位と対象者のつけた順位の関係
一般外科術後患者のドレーン排液 Hb 濃度の順位と看護師の判断した順位の一致率で60％を超えたのは、Hb 濃度が 0.1～2.1 g/dl と 5.5 g/dl と低い数値の検体であった。一方、
Hb 濃度が 3.0 g/dl と 6.2 g/dl と 8.1 g/dl は一致率が 0.0％であった。したがって、Hb 濃度が低い場合の看護師のアセスメントは適切といえるが、高い場合には目視だけでは判断できないという危険性がある。
さらに、ドレーン排液における Hb 濃度のアセスメント力は、淡血性、淡々血性といわれた色調の排液には r  0.894 と強い正の相関がみられた。一方、Hb 濃度の高い、血性といわれた色調の排液に対する相関は r  0.416 とやや負の相関があった。このことからも、
Hb 濃度が低い場合の看護師のアセスメントは適切といえるが、高い場合には適切とはいえない。
２）看護師による危険な色調の判断状況
最も Hb 濃度が高い 8.1 g/dl の検体に対し、何を基準に危険性の有無を判断したのかは不明ではあるが、危険性ありと判断した割合は 46.7％であった。この濃度は、臨床的には出血の危険性があるにもかかわらず、色調によるアセスメントでは Hb 濃度の高い 5 画像の中でも危険性大と判断した割合が最少であった。したがって、目視による色のみのアセス
メントでは、出血の異常を見逃す危険性があるといえる。
３）研究の限界一般外科術後患者のドレーン排液のみを検体とした。胸部外科術後患者のドレーン排液は一般外科術後患者のドレーン排液と比較し、動脈性の出血の危険性が高いためにヘモグ
ロビン濃度が高いと鮮やかになり、色調が異なる恐れがある。したがって、胸部外科術後患者のドレーン排液を用いて、同様な検証をする必要があると考えている。
８．研 究 発 表
論文は、現在投稿中である。

‑ 19 ‑

平成 23 年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2011-

1～１2

看護学領域

S2011-１3

１．研究課題名：転写因子 Storkhead-protein 1 不全の糖尿病血管合併症における意義（研究番号S2011-1）
２．キーワード：１）糖尿病 (Diabetes)
２）糖尿病性腎症 (Diabetic Nephropathy)３）レニン (Renin)４）尿タンパク (urine protein)
５）腎線維化 (kidney fibrosis)
３．研究者氏名：金崎啓造・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
転写因子 Storkhead-protein 1 (Stox1)の SNP は妊娠高血圧腎症と関係があると報告されている。申請者らは世界に先駆け Stox1 ノックアウトマウスを作成し、Stox1 ノックアウトマウス
が胎盤レニンの過剰発現と妊娠高血圧を発症すること、Stox1 がレニン mRNA 分解促進分子であることを見出した。Stox1 の染色体上局在部位 10q22 は、2 型糖尿病性腎症や重症高血圧の責任部位との報告もあることから、申請者らは Stox1 ノックアウトマウスを用いて糖尿病
モデルを誘導し、Stox1 不全の糖尿病血管合併症発症進展における意義を解明するとともに、
将来 Stox1 作用増強薬開発を展開する為の基盤となる分子生物学的検討も行う。
５．研 究 計 画
転写因子 Stox1 機能異常の生物学的意義・調節機構と特に糖尿病血管合併症における病理学的意義を解明する為、以下の研究項目を予定した。
①

2 型糖尿病 Stox1 ノックアウトマウスの血管合併症を中心として網羅的に解析する。

②

1 型糖尿病 Stox1 ノックアウトマウスを 2 型糖尿病モデルと比較検討することにより、
Stox1 不全の糖尿病血管合併症発症進展において演じる全体像を解明する。

③

Stox1 と相互作用する蛋白を同定し、Stox1－Stox1 結合蛋白相互作用の生物学的意義を検討する。

これら中で①、②を主に解析し、①に関しては当初遺伝子改変マウス（db/db もしくは ob/ob）と stox1 ノックアウトマウスを掛け合わせる予定であったが、高脂肪食投与（30% fat in energy:
クイックファット、日本クレア）によりメタボリックシンドロームを模倣したモデルを用いて主に腎症に注目して phenotype のスクリーニングを行った。②に関しては stox1 ノックアウ
トマウスおよび litter mate wild type マウスに対して streptozotocin(200mg/kgBW)を用いて 1 型
糖尿病モデルを導入し予定通り検討を行った。これらマウス表現系解析に関しては、組織学的検討および尿アルブミン排泄、腎臓を用いたレニン蛋白の発現レベルを検討した。①に関しては C57Bl6 マウスに逆交配した物を用い、②に関しては 129 系統と、C57Bl6 系統の２系
統を用いて検討した。③に関しては Stox1cDNA クローニングは終了した。

‑ 21 ‑

㸴㸬◊ ✲ ᡂ ᯝ
stox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ࣐࢘ࢫࡣ 129 ⣔⤫࡛࠶ࡗࡓࡀࠊ⭈⮚௦ㅰᐇ㦂࡟ỗ⏝ࡉࢀࡿ C57Bl6 ࣐࢘
ࢫ࡟㏫஺㓄ࡋࠊstox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ C57Bl6 ࣐࢘ࢫࢆస〇ࡋࡓࠋձ 㧗⬡⫫㣗ᢞ୚࣓ࢱ࣎ࣜࢵࢡࢩࣥࢻ࣮࣒࣐ࣟ࢘ࢫ࡟࡚ࠊண᝿࡟཯ࡋ࡚㸯㸰㐌ࡲ࡛⤒㐣ࡋ࡚ࡶᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥ᤼ἥቑຍࢆㄆࡵࡎ㸦㏫࡟పୗࡋࡓ㸧ࠊࡑࢀࡽ࡟ genotype ࡢᙳ㡪ࡣㄆࡵ࡞࠿ࡗࡓࠋࡋ࠿ࡋ࡞ࡀࡽ⯆࿡῝࠸஦࡟ࠊᑐ↷⩌(wild type littermate male)࡛ࡣ㧗⬡⫫㣗⩌࡛ᒀ⣽⟶࡟㢧ⴭ࡞ lipid droplet ࢆㄆࡵࡿࡢ࡟ᑐࡋ࡚ࠊStox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ࣐࢘ࢫ࡛ࡣ lipid
droplet ࡣ࡯࡜ࢇ࡝Ꮡᅾࡋ࡞࠿ࡗࡓࠋLipid droplet ࡟ࡣ⭈ࢆྵࡵࡓ⮚ჾಖㆤຠᯝࡀ࠶ࡿ࡜
ࡶሗ࿌ࡉࢀ࡚࠾ࡾࠊ௒ᚋ᳨ウࢆ⾜ࡗ࡚⾜ࡃࠋ⭈⮚⥺⥔໬ࡶ㸯㸰㐌㛫ࡲ࡛ᢞ୚ࡋࡓ࣐࢘ࢫ
࡛ࡣ࠸ࡎࢀࡢ genotype ࡛ࡶㄆࡵ࡞࠿ࡗࡓࠋ
ղ streptozotocin ㄏⓎ 1 ᆺ⢾ᒀ⑓ࣔࢹࣝ࡟㛵ࡋ࡚ࡣࠊstreptozotocin ᢞ୚ᚋ㸰ࣨ᭶࡛ C57Bl6⣔⤫࠾ࡼࡧ 129 ⣔⤫ඹ࡟ littermate wild type ࣐࢘ࢫ࡛ᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥࡢቑຍࢆㄆࡵࡓࡀࠊᒀ
⣽⟶㛫㉁⑓ኚࢆㄆࡵࡓࡢࡣ 129 ⣔⤫ࡢࡳ࡛࠶ࡗࡓࠋLittermate wild type ࣐࢘ࢫ࡜ stox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ࣐࢘ࢫࢆẚ㍑᳨ウࡋࡓሙྜࠊC57Bl6 ⣔⤫࡛ࡣ genotype ࡟ࡼࡿᕪࢆㄆࡵ࡞࠿
ࡗࡓࡀࠊ129 ⣔⤫࡛ࡣ wild type ࡟ẚࡋ stox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ࣐࢘ࢫ࡛᭷ព࡞ᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥ
ୖ᪼㸦ᅗ㸯㸧࡜ⴭ᫂࡞ᒀ⣽⟶㛫㉁ࡢ⥺⥔໬㸦ᅗ㸰㸧ࢆㄆࡵࡓࠋࡲࡓࡇࡢࡼ࠺࡞⭈⮚⾲⌧⣔ࡢ㐪࠸ࡣ⭈⮚ࣞࢽࣥࡢⓎ⌧࡜ࡶ┦㛵ࡋࠊC57Bl6 ࣐࢘ࢫ࡛ࡣ⭈⮚ࣞࢽࣥⓎ⌧࡟ genotype
࡟ࡼࡿᕪ␗ࢆㄆࡵ࡞࠿ࡗࡓࡀࠊ129 ⣔⤫࣐࢘ࢫ࡛ࡣ stox1 ࣀࢵࢡ࢔࢘ࢺ࣐࢘ࢫ࡛⭈ࣞࢽࣥࡢቑຍࢆㄆࡵࡓࠋ
ճ stox1 ⤖ྜ⺮ⓑࡢࢫࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢ࡟㛵ࡋ࡚ࡣࠊᐇ㦂⣔ࡢጇᙜᛶࢆྵࡵ࡚ࡶ࠺୍ᗘ᳨ウࡋ┤
ࡋࡓࠋStox1 cDNA ࡢࢡ࣮ࣟࢽࣥࢢࡣ⤊஢ࡋ࡚࠸ࡿࡀࠊ௒ᚋࡲࡎᶆⓗ㑇ఏᏊ renin ࡢ stox1
࡟ࡼࡿไᚚᶵᵓࢆ☜❧ࡍࡿࠋᅗ㸯㸸streptozotocin ㄏᑟ㸯ᆺ⢾ᒀ⑓࣐࢘ࢫ࡟࠾ࡅࡿ
ᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥቑຍ࡜ Stox1 ୙඲ࡢᙳ㡪.

ᅗ㸰㸸Stox1 ୙඲࡟ࡼࡿ⢾ᒀ⑓࣐࢘ࢫ࡟࠾ࡅࡿ
⭈⥺⥔໬.

㠀⢾ᒀ⑓࡛ࡣ Stox1 ୙඲࡟ࡼࡿᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥ᤼ἥ࡟
ᑐࡍࡿᙳ㡪ࢆㄆࡵ࡞࠸ࡀࠊ⢾ᒀ⑓࣐࢘ࢫ࡛ࡣ stox1 ୙඲࡟ࡼࡾᒀ࢔ࣝࣈ࣑ࣥࡀⴭ᫂࡟ቑຍࡋࡓ

Stox1 ୙඲࡟ࡼࡾ streptozotocin ㄏᑟ㸯ᆺ⢾ᒀ⑓࣐࢘ࢫ࡛ࡣᒀ⣽⟶㛫㉁ࡢ᭷Ⅽ࡞⥺⥔໬ࡀ⏕ࡌࡓ

７．研究の考察・反省
今回の検討では stox1 不全による糖尿病腎症の発症進展機序への寄与を検討した。残念ながら 2 型糖尿病モデルマウスはヒト表現系を再現する良いモデルが存在せず、高脂肪食投与
メタボリックシンドロームモデルを用いたが、尿アルブミン排泄が wild type で増加せず、実験系の再考が必要である。レプチン不全マウス(ob/ob)やレプチン受容体不全マウス(db/db)が最も容易に腎組織-尿タンパク排泄増加などが観察できるモデルではあるが、ヒトではそのよ
うなレプチン不全は稀であり、結果の解釈には注意を要する。今回は高脂肪食にクイックフ
ァット(30% fat in energy)を用いたが、更に高い脂肪含有食(60% fat in energy: Research Diet)を用いてより長い検討を行う事を検討している。
Streptozotocin 投与１型糖尿病モデルマウスでは、マウス系統により表現系に違いがある事、
stox1 不全の影響もマウス系統により差異がある事が明らかとなった stox1 不全による腎臓レニン発現増加も 129 系統マウスでのみ認められている。マウスはヒトと違い、レニン遺伝子は 2 つ(REN1, REN2)が染色体上に tandem repeat して存在している。それぞれマウス系統により REN1,2 臓器特異性がある事が知られており、今回の検討により Stox1 によるマウスレニン遺伝子に対する感受性の違いがこれらの差をもたらしたのかもしれない。また、非糖尿病
状態では腎臓レニンに発現の差を genotype に関わらず認めておらず、糖尿病条件下のみで認められるプログラムがこれらの変化をもたらす可能性がある。現在これらの観点から検討を行っている。
Stox1 相互作用蛋白のスクリーニングに関しては、実験系を再考している。レニン遺伝子の転写調節に的を絞りながら、レニン 3’UTR を標的とする miRNA などの知見も数年前には得られなかった知見が増えてきており、分子生物学的視点から実験系を組み立てる。
８．研 究 発 表
論文化は行っているが、未だアクセプトには至っていない。

‑ 23 ‑

１．研究課題名：血管内皮Sirt1を標的とした高脂肪負荷による血管内皮機能障害およびインスリン抵抗性に対する新規治療法の開発（研究番号S2011-2）

２．キーワード：１）Sirt1２）血管内皮細胞 (endothelial cell)３）高脂肪負荷 (high fat diet)４）インスリン抵抗性 (insulin resistance)５）血管内皮機能障害 (endothelial dysfunction)
３．研究者氏名：北田宗弘・医学部・講師・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
血管内皮における Sirt1 の発現および、その活性増強により、１）高脂肪食による血管内皮機能障害を抑制できるか、２）血管内皮のインスリン・シグナル伝達作用の改善効果を介して、高脂肪食負荷時にみられる、骨格筋でのインスリン抵抗性（糖取り込みの低下）をも改善できるかについて、血管内皮特異的 Sirt1 高発現マウスを用いて明らかにする。
５．研 究 計 画
平成２３年度（及び２４年度）
1）マウス大動脈・腎臓における血管障害の評価：
機能的評価：尿アルブミン排泄量、腎機能（シスタチン C 測定、糸球体濾過量測定）、血管拡張能、白血球ローリング・癒着

組織学的評価：オイルＯレッド染色、SudanIII 染色

メサンギウム領域の拡大（PAS 染色）、ファイブロネクチン及び、マクロファージ免疫組
織染色（F4/80 抗体）、マッソン・トリクローム染色、炎症マーカーの評価： MCP-1, ICAM-1,
VCAM-1, TNF-α発現、酸化ストレスの評価：8-OHdG（免疫染色、尿中排泄量、ミトコ
ンドリア(mt) DNA 中の含有量）、アポトーシスの評価： TUNEL 染色、caspase 3、PARP
発現

Sirt1 の発現と活性：Sirt1 活性としてのアセチル化-蛋白の評価(NF-kB, p53, FOXO3,

PGC-1α, eNOS, IRS2)
平成２３年度（及び２４年度）
2）マウスの糖・脂質代謝、インスリン伝達機構の評価：
体重、血圧、血糖値、摂食量は２週間ごとに測定し、２０週後に血糖値、インスリン値、脂質（コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸）、糖化 Hb 値の測定、糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコースクランプ、インスリン伝達関連分子の評価：インスリン投与
下での、インスリン受容体のチロシン・リン酸化、IRS-1,2 発現およびリン酸化・アセチ
ル化、Akt リン酸化、eNOS リン酸化
3）予備実験として、2 型糖尿病 Wistar fatty (fa/fa)ラットの腎臓における Sirt1 の役割をカロリ
ー制限モデルを用いて検証する。40%カロリー制限を 24 週間行い、腎臓における Sirt1 の‑ 25 ‑

発現と NF-kkB のアセチ
チル化、炎症
症関連遺伝子子発現、マクロファージ の浸潤を免疫
疫組織染
色で評価する。
平成成２４年度
4）Sirt1 活性変変異の血管内内皮細胞におおける炎症・酸化ストレス・インス リン抵抗性にに関わる分子機構の解解明i))

野生型マ
マウス(C57B
BL6)と血管内内皮特異的 Sirt1
S
高発現マウスの大動動脈（あるいいは肺）から、ICCAM-2 抗体体、マグネッットビーズ・システムを用いて、血管管内皮細胞を単離し
培養する
る。

iii)

Sirt1 過剰剰発現及びノノックダウン
ン血管内皮細細胞の培養：：レトロウイ
イルスを用いいた Sirt1
過 剰 発 現 、 Sirt1 ノ ッ ク ダ ウ ン (siRNA-Siirt1) 血 管 内 皮 細 胞 の 樹 立 。 pBABE
E-Sirt1 、
pSUPER
R-Sirt1 RNAii ベクターをを用いそれぞぞれ、過剰発現およびノ ックダウン細細胞を樹立する。（各ベクター
ーは既に供与与済み）

iiii) 血管内皮皮細胞での脂脂肪酸による 炎症、酸化ストレス、イインスリン抵抵抗性に関すする分子機構の解明
i）、ii）でで得られた血血管内皮細胞
胞において、炎症・酸化ストレス・イインスリン抵抵抗性に関連する以下の項目にに関して検討
討する。
① Sirt1 活性性としてのアセチル化-蛋蛋白の評価 (NF-kB, p53, FOXO3, PG
GC-1α, eNOS
S, IRS-2)② 炎症：MC
CP-1, ICAM--1, VCAM-1,, TNF-α発現
現量③ 酸化ストレス：Mn-SOD 発現量・・Mt 8-OHdG
G /核 8-OHdG
G・単離 Mt における活性性酸素測
定④ アポトーシス：TUNE
EL 染色、caaspase 3、PA
ARP 発現⑤ インスリン伝達機構の変異：IRS
S-2 発現とアアセチル化、インスリンン刺激による
る、IRS-2のリン酸化
化、Akt のリ
リン酸化、eNNOS のリンン酸化６．研 究 成 果
高高脂肪食を 20
2 週間負荷した野生型マ
マウスでは、尿中アルブブミン排泄量量（血管内皮障障害マーカーー）が通常食食野生型（対照照マウス）にに比べて、有意に増加した
たが、EC-Sirrt1-TG マウス
スでは、
高脂
脂肪食負荷ににもかかわららず、尿アル
ルブミン排泄
泄量が、減少していた。 また、野生型
型高脂肪食負負荷マウスででみられる耐耐糖能障害（（HbA1c・空腹時血糖値・随時血糖値値の増加,インスリン負荷荷テストの障障害）が、EC
C-Sirt1-TG マ
マウスで改善善していた（下図）。

①①野生型(通常食
食), ②EC-Sirt1-TG(通常食食), ③野生型(高高脂肪食), ④E
EC-Sirt1-TG(高高脂肪食),(N
N=6,♯:p0.055vs 他群)‑ 26 ‑

各群のマウスの大動脈における Sirt1 および、ICAM1 の mRNA 発現をリアルタイム PCRにて評価した。大動脈における Sirt1 の mRNA 発現は、EC-Sirt1-TG 群にて野生型と比較して有意に増加を認めた。ICAM1 の mRNA 発現は野生型（高脂肪食）にて野生型（通常食）と比較して有意に増加していたが、EC-Sirt1-TG マウスでは高脂肪食負荷をしたにも関わらず、野生型（高脂肪食）にて認められた ICAM1 の発現増加は有意に減少し、野生型（通常食）と同等レベルとなった（下図）。
① 野生型(通常食),② EC-Sirt1-TG(通常食),③ 野生型(高脂肪食),④ EC-Sirt1-TG(高脂肪食), (N=6,♯:p0.05vs 他群)

腎糸球体 PAS 染色においてメサンギウム領域の拡大の有無を評価したところ、野生型（高脂肪食）マウスにてメサンギウム領域の拡大を認めたが、EC-Sirt1-TG（高脂肪食）マウスでは認めず、野生型（通常食）あるいは、
EC-SIrt1-TG（通常食）
マウスとほぼ同等であった（右図）。
Sirt1 の 抗 炎 症 作
用を評価するために、2 型糖尿病モデルラット(Wistar fatty fa/fa)における 40%カロリー制限の糖尿病により誘発される腎の炎症に対する効果を検証した。その結果、糖尿病の腎皮質では
Sirt1 発現が低下しており、それに随伴する NF-kB のアセチル化の増加と ICAM1 を含む炎症関連遺伝子の発現増加していること、カロリー制限は、Sirt1 およびそれらの変異を回復し腎症を改善する可能性があることを見出した。
７．研究の考察・反省●血管内皮 Sirt1 の抗炎症、血管内皮保護作用：高脂肪負荷による尿アルブミン排泄量の増加がEC-Sirt1-TG マウスにおいて低下を認めたこと、高脂肪負荷にて増加した大動脈 ICAM-1 のmRNA 発現もまた EC-Sirt1-TG マウスにおいて低下を認めたことから、血管内皮 Sirt1 は抗炎症、血管内皮保護作用を発揮する可能性が考えられた。実験計画にあげているさらなる詳細な血管機能的評価、組織学的評価、酸化ストレス/アポトーシス関連の評価は引き続き継続中である。
●血管内皮 Sirt1 の糖脂質代謝への影響：HbA1c、血糖値、インスリン負荷試験の結果から、
EC-Sirt1-TG マウスでは糖代謝、特にインスリン抵抗性の改善効果が示唆される。その分子機構を明らかにするために、引き続き、インスリン伝達機構への影響を中心に解析を行っている。
●In vitro における検証：培養血管内皮細胞における Sirt1 の抗炎症効果をはじめとする細胞保‑ 27 ‑

護効果とその機序の解明については、Sirt1 高発現あるいはノックダウン細胞株（MS-1 細胞）を供与頂いており現在行っている。
●2 型糖尿病 Wistar fatty (fa/fa)ラットの腎皮質では Sirt1 の発現低下を認め、炎症関連遺伝子の発現誘導に中心的役割を果たす NF-kB のアセチル化の増強が観察された。その結果、
ICAM1,VCAM1,MCP1 の mRNA 発現の増強、また組織学的にも糸球体及び尿細管間質へのマ
クロファージの浸潤増加が認められた。40%カロリー制限は、Sirt1 を含む糖尿病においてみられる変異を回復させた。以上から、Sirt1 は腎臓においては抗炎症効果を発揮して糖尿病腎症の発症・進展を抑制している可能性が示唆された。
８．研 究 発 表
Kitada M, Takeda A, Nagai T, Ito H, Kanasaki K, Koya D. Dietary restriction ameliorates diabetic
nephropathy through anti-inflammatory effects and regulation of the autophagy via restoration of
Sirt1 in Diabetic Wistar fatty (fa/fa) rats: a model of type 2 diabetes. Exp Diabetes Res 2011; 2011:
908185.
Abstract: Aim. Despite the beneficial effects of dietary restriction (DR) on lifespan, age-relateddiseases, including diabetes and cardiovascular diseases, its effects on type 2 diabetic nephropathy
remain unknown. This study examined the renoprotective effects of DR in Wistar fatty (fa/fa) rats
(WFRs). Methods. WFRs were treated with DR (40% restriction) for 24 weeks. Urinary albumin
excretion, creatinine clearance, renal histologies, acetylated-NF-κB (p65), Sirt1 protein expression,and p62/Sqstm 1 accumulation in the renal cortex, as well as electron microscopic observation of
mitochondrial morphology and autophagosomes in proximal tubular cells were estimated. Results. DR
ameliorated renal abnormalities including inflammation in WFRs. The decrease in Sirt1 levels,
increase in acetylated-NF-κB, and impaired autophagy in WFRs were improved by DR. Conclusions.
DR exerted anti-inflammatory effects and improved the dysregulation of autophagy through therestoration of Sirt1 in the kidneys of WFRs, which resulted in the amelioration of renal injuries intype 2 diabetes.

‑ 28 ‑

１．研究課題名：ヒト心筋細胞の世界標準モデル構築：非線形力学的並びに比較生理学的手法によるアプローチ（研究番号S2011-3）

２．キーワード： １）ヒト心筋細胞 (human cardiac myocytes)２）数理モデル (mathematical models)
３）非線形力学 (nonlinear dynamics)４）分岐理論 (bifurcation theory)５）コンピュータ・シミュレーション (computer simulation)
３．研究者氏名： 倉田康孝・医学部・准教授・生理学Ⅱ

４．研 究 目 的
本研究の目的は、ヒト心筋細胞の電気生理学的特性を記述する世界標準モデルを構築し、それらをモジュールとするヒト心臓モデル構築のための基盤を確立することである。ヒト心筋細胞モデルに基づいた心臓モデルが構築されれば、不整脈の発生機序や治療法の解明に用いることができる。しかしながら、従来のヒト心筋細胞モデルはいずれも完成度が低く、より完成度の高いヒト心筋細胞の標準モデル構築が切望される。そのためには、①ヒト ES・iPS
細胞由来心筋細胞の電気生理学的特性に関する実験データの収集・解析、②実験データ不足を補うための動物心筋モデルを用いた比較生理学的手法（種差・部位差の分析）、③ヒト心筋細胞モデルの非線形力学的特性（分岐構造）を解析・制御するための数学的手法（分岐解析）の３つを駆使する必要がある。本研究では、ヒト ES・iPS 細胞由来心筋細胞から得られた最新の電気生理学的実験データを基に、比較生理学的データ分析と非線形力学的解析を行い、ヒト心房・心室筋細胞の新たな標準モデルを作成する。さらに、新しいヒト固有心筋細胞モデルの分岐構造（パラメータに依存した安定性とダイナミクスの変化）と自動能発現条件を解析することにより、ヒト洞結節・Purkinje 線維細胞モデルを構築する。
５．研 究 計 画
（１）心筋細胞のモデル・実験データ収集とデータベース作成
モデルデータベースを利用して 1994 年以降に作成されたヒト及び動物（ウサギ・イヌ・
モルモット・ラット・マウス）の心筋細胞モデルを収集し、各イオン輸送系のモデル構造（状態モデルと数学的定式化の方法）とイオン電流動態を比較するためのデータベースを作成する。さらに、ヒト ES・iPS 細胞由来心筋細胞から得られた電気生理学的実験データを収集し、従来のヒト心筋のデータとの相違点・整合性を比較分析する。
（２）ヒト心房筋・心室筋細胞の標準モデル作成とシミュレーションによる検証
従来のヒト心房筋モデルとヒト心室筋モデル(Kurata et al, Biophys J 83:2074-2101, 2005)
をベースモデルとし、上記の比較解析データを基に、モデルの改良に必要な各イオン輸送
系の最適モデル構造（状態モデルと数学的定式化の方法）を決定し、各イオン輸送系及び‑ 29 ‑

細胞内 Ca2+動態のモデル構造の改良・再定式化とパラメータ調整を行い、新たなヒト心房・心室筋細胞の標準モデルを構築する。ワークステーション(Hewlett-Packard Z800)及び数値
計算用ソフトウェア MATLAB 7 (Math Works Inc., USA)を用い、①活動電位の再構成及び活
動電位パラメータの計算、②活動電位波形のパラメータ依存性変化の計算・プロットを行
うための解析システムを作成し、実験データ再現性を検証する。
（３）ヒト洞結節・Purkinje 線維細胞モデルの作成とシミュレーションによる検証
収集したデータの比較解析から電気生理学的特性の相違点（部位差）―“洞結節 vs.固有
心房筋”、“Purkinje 線維 vs.固有心室筋”―を明らかにし、分岐解析のためのパラメータ（内向き整流 K+チャネル電流・過分極活性化陽イオンチャネル電流の最大コンダクタンスなど）を決定する。作成したヒト心房・心室筋細胞モデルのパラメータに依存した分岐構造（自動能発現条件、自動能発現過程における安定性とダイナミクス）を解析するために、
MATLAB 7 及び分岐追跡用ソフトウェア(MATCONT)を用い、モデルシステムの平衡点（定常状態）と周期軌道（活動電位）及びその安定性のパラメータ依存性変化を表す分岐図を作成するための解析システムを構築する。この分岐解析システムを用い、データ比較の結果に従って各パラメータ値を洞結節・Purkinje 線維細胞に適した値に調整した後、内向き
整流 K+チャネル電流の抑制と過分極活性化陽イオンチャネル電流の導入を想定して分岐図を作成することにより、自動能発現条件（平衡点の不安定化と周期軌道の出現をもたらすパラメータ領域）を決定する。分岐図による解析結果に基づいて各イオン電流系のパラメータ値を再調整することにより、電気生理学的実験データを再現できるヒト洞結節・Purkinje 線維細胞モデルを構築する。
６．研 究 成 果（１）心筋細胞モデル・実験データベースの構築
モデルデータベースを利用して 1994 年以降に作成されたヒト及び動物の心筋細胞モデ
ルを収集し、各イオン輸送系のモデル構造とイオン電流動態を比較するためのデータベースを構築した。さらに、ヒト ES 細胞由来心筋細胞から得られた電気生理学的実験データを収集し、従来のヒト心筋のデータとの相違点・整合性を比較分析するためのデータベースを作成した。
（２）ヒト心室筋細胞の標準モデル作成とシミュレーションによる検証
上記のモデル構築・比較解析用データベース（ヒト及び動物心筋から得られた電気生理学的実験データ・モデルデータ）を基に、新たなヒト心室筋細胞モデルを構築した。この新しいモデルは、我々が 2005 年に発表したモデル(Kurata et al, Biophys J 89, 2865-2887)と2011 年に発表された O'Hara-Rudy モデル(O'Hara et al, PLOS Comp Biol 7, 1-29)をベースモデ
ルとし、上記データベースに基づいて形質膜及び筋小胞体における各イオンチャネル・輸
送体の動態を再定式化（改良）したものであり、実験データ再現性と分岐解析への適用性に優れた（ヒト心室筋の主な電気生理学的特性を再現できる）最新のヒト心室筋細胞モデルであることが証明された。

‑ 30 ‑

（３）ヒトPurkinje線維細胞モデルの作成とシミュレーションによる検証
収集した比較解析データ及び新たな心臓部位別イオンチャネル遺伝子(mRNA)発現量データから得られた固有心室筋と Purkinje 線維における電気生理学的特性（イオンチャネル
密度等）の相違点が明らかとなり、内向き整流 K+チャネル電流の抑制と過分極活性化陽イ
オンチャネル電流（ヒト心筋細胞の実験データを基に定式化）の導入における心室筋モデ
ル細胞の分岐構造を解析することにより、過分極活性化陽イオンチャネル電流依存性の自動能をもつ Purkinje 線維細胞モデルを構築した。
７．研究の考察・反省本研究では、ヒト及び動物から得られた主な電気生理学的実験データとモデルデータを収集した比較解析用データベースを作成し、新たなヒト心筋細胞モデル（及びその分岐構造解
析システム）を構築することができた。本研究の最大の特色と成果は、非線形システムの分岐理論に基づいたヒト心室筋モデル細胞の分岐構造解析を行い、従来の方法論では困難であったヒト Purkinje 線維のモデルを構築したことである。これらモデル細胞（及び分岐構造解
析システム）の完成は、ヒト心臓モデル開発につながるものであり、不整脈発生機序の体系的解明、不整脈制御（薬物効果の予測）理論の確立、バイオペースメーカーシステム設計等の応用研究を促進させるものと期待される。
研究計画ではヒト心房筋・洞結節細胞モデルも作成する予定であったが、ヒト心房筋・洞結節細胞に関しては電気生理学的実験・モデルデータのさらなる追加収集が必要であり、動物心筋モデルを用いた分岐構造解析（解析手法の確立）に留まっている。新たな心臓部位別
イオンチャネル遺伝子(mRNA)発現データ等によって心室筋・心房筋・洞結節のイオンチャ
ネル発現量と電気生理学的特性における相違点が明らかとなったため、ヒト心房筋・洞結節細胞モデルの完成にも目処が立っている（現在開発中である）。
８．研 究 発 表
① Kurata Y, Hisatome I, Shibamoto T. Roles of sarcoplasmic reticulum Ca2+ cycling and Na+/Ca2+
exchanger in sinoatrial node pacemaking: insights from bifurcation analysis of mathematical models.
Am J Physiol Heart Circ Physiol 2012; 302: H2285-H2300.
Abstract: To elucidate the roles of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ cycling and Na+/Ca2+
exchanger (NCX) in sinoatrial node (SAN) pacemaking, we have applied stability and bifurcation
analyses to a coupled-clock system model developed by Maltsev and Lakatta (Am J Physiol Heart
Circ Physiol 296: H594-H615, 2009). Equilibrium point (EP) at which the system is stationary (i.e.,the oscillatory system fails to function), periodic orbit (limit cycle), and their stability were
determined as functions of model parameters. The stability analysis to detect bifurcation points
confirmed crucial importance of SR Ca2+ pumping rate constant (Pup), NCX density (kNCX), andL-type Ca2+ channel conductance for the system function reported in previous parameter-dependent
numerical simulations. We showed, however, that the model cell does not exhibit self-sustained‑ 31 ‑

automaticity of SR Ca2+ release at any clamped voltage and therefore needs further tuning to
reproduce oscillatory local Ca2+ release and net membrane current reported experimentally at -10 mV.
Our further extended bifurcation analyses revealed important novel features of the pacemaker systemthat go beyond prior numerical simulations in relation to the roles of SR Ca2+ cycling and NCX in
SAN pacemaking. Specifically, we found that 1) NCX contributes to EP instability and enhancementof robustness in the full system during normal spontaneous action potential firings, while stabilizing
EPs to prevent sustained Ca2+ oscillations under voltage clamping; 2) SR requires relatively large
kNCX and subsarcolemmal Ca2+ diffusion barrier (i.e., subspace) to contribute to EP destabilization andenhancement of robustness; and 3) decrementing Pup or kNCX decreased the full system robustness
against hyperpolarizing loads because EP stabilization and cessation of pacemaking were observed at
the lower critical amplitude of hyperpolarizing bias currents, suggesting that SR Ca2+ cycling
contributes to enhancement of the full system robustness by modulating NCX currents and promoting
EP destabilization.
② Kurata Y, Hisatome I, Tanida M, Shibamoto T. Effect of hyperpolarization-activated current If on
robustness of sinoatrial node pacemaking: theoretical study on influence of intracellular Na+
concentration. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2013; 304: H1337-H1351.
Abstract: To elucidate the effects of hyperpolarization-activated current If on robustness of sinoatrial
node (SAN) pacemaking in connection with intracellular Na+ concentration (Nai) changes, wetheoretically investigated 1) the impacts of If on dynamical properties of SAN model cells during
inhibition of L-type Ca2+ channel currents (ICaL) or hyperpolarizing loads and 2) If-dependent changes
in Nai and their effects on dynamical properties of model cells. Bifurcation analyses were performed
for Nai-variable and Nai-fixed versions of mathematical models for rabbit SAN cells; equilibrium
points (EPs), limit cycles (LCs), and their stability were determined as functions of model parameters.
Increasing If conductance (gf) shrank ICaL conductance (gCaL) regions of unstable EPs and stable LCs(rhythmic firings) in the Nai-variable system but slightly broadened that of rhythmic firings at lower
gf in the Nai-fixed system. In the Nai-variable system, increased gf yielded elevations in Nai at EPs
and during spontaneous oscillations, which caused EP stabilization and shrinkage in the parameterregions of unstable EPs and rhythmic firings. As gf increased, parameter regions of unstable EPs andstable LCs determined for hyperpolarizing loads shrank in the Nai-variable system but were enlarged
in the Nai-fixed system. These findings suggest that 1) If does not enhance but rather attenuatesrobustness of rabbit SAN cells via facilitating EP stabilization and LC destabilization even inphysiological gf ranges; and 2) the enhancing effect of If on robustness of pacemaker activity, which
could be observed at lower gf when Nai was fixed, is actually reversed by If-dependent changes in Nai.

‑ 32 ‑

１．研究課題名：低酸素による可溶型 VEGF 受容体（可溶型 Flt-1）産生抑制機構の解明（研究番号

S2011-4）

２．キーワード：１）可溶型 Flt-1 (soluble Flt-1)２）選択的 3’端プロセシング (alternative 3’-end processing)３）低酸素 (hypoxia)４）RNA 結合タンパク質 (RNA binding proteins)
５）レンチウイルス (lentivirus)
３．研究者氏名：池田崇之・医学部・講師・生化学Ⅱ

４．研 究 目 的
低酸素刺激は主要な生理的血管新生要因で、個体発生・組織形成時に血管新生を誘導する。
また、がんの増殖・転移や糖尿病性網膜症などの疾患にも低酸素による血管新生が深く関与している。低酸素刺激によって組織やがん細胞から血管内皮増殖因子(VEGF)が分泌され血管新生を誘導することはよく知られているが、低酸素刺激そのものに対する内皮細胞の応答にはまだ不明な点が多い。
VEGF は血管内皮細胞膜に結合した受容体を介して血管新生を促進するが、受容体の１つである Flt-1 は、細胞膜受容体に加えて mRNA 選択的 3’端プロセシングによって細胞外ドメ
インのみからなる可溶型受容体（可溶型 Flt-1）としても産生されている。この可溶型 Flt-1
は細胞膜受容体と拮抗的に働くことによって血管新生を抑制する作用があることが知られている。池田は、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)において低酸素刺激が選択的 3’端プロセシン
グに影響して可溶型 Flt-1 の産生を抑制することを明らかにした。本研究は、低酸素が mRNA
選択的 3’端プロセシングを制御する詳細なメカニズムを解明する。
５．研 究 計 画
(1) 可溶型 Flt-1 産生を制御する Flt-1 pre-mRNA 結合タンパク質を同定する。
制 御タン パク 質は以 下の ２通り の方 法によ り同 定する 。 (i) 制 御 配列を 含 む Flt-1
pre-mRNA 配列を固定化した磁気ビーズと、通常酸素濃度および低酸素状態にした HMVECから抽出した核抽出液とを混合し、RNA に結合するタンパク質として同定する。(ii) 低酸
素状態で変動する因子を解析、あるいは制御配列に結合する RNA 結合タンパク質に注目し、可溶型 Flt-1 産生を変動させるタンパク質として同定する。同定した RNA 結合タンパ
ク質が制御配列を認識することを、RNA EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay)法で確認するとともに、Flt-1 ミニ遺伝子を用いて検証する。RNA 結合タンパク質発現プラスミドまたは siRNA と Flt-1 ミニ遺伝子を HMVEC に導入し、RNA 結合タンパク質の発現によって野生型ミニ遺伝子で可溶型の産生が変化し、変異型ミニ遺伝子で変化しないことを確認する。

‑ 33 ‑

(2) RNA 結合タンパク質の活性調節機構を明らかにする。
通常酸素濃度と低酸素状態での RNA 結合タンパク質の翻訳後修飾の違いを、修飾部位
認識抗体等を用いて解析する。また、低酸素刺激による量的変化も同時に特異的抗体を用いてウエスタンブロット法で解析する。さらに、RNA 結合タンパク質が低酸素刺激で活性化される伝達経路を探索する。これまで低酸素で変動することが知られているリン酸化酵
素や水酸化酵素など修飾酵素の阻害剤が与える影響を解析し、シグナル伝達経路を同定する。
(3) 上記で同定された可溶型 Flt-1 産生制御タンパク質（群）の血管新生における役割を明らかにする。
制御タンパク質（群）の過剰発現および shRNA 発現レンチウイルスベクターを作製し、HMVEC に感染させ、低酸素刺激に対する細胞増殖能、細胞移動能、管腔形成能に与える影響を in vitro で解析する。さらに、高転移性ルイス肺がんを用いたがん増殖・転移モデル
系に上記レンチウイルスを投与することで、がん増殖・転移に与える影響を in vivo で解析する。
６．研 究 成 果
これまで、低酸素刺激による可溶型 Flt-1 産生の特異的な抑制が、選択的 3’端プロセシン
グを介して制御されていることを明らかにしてきたが、可溶型 Flt-1 mRNA の分解が亢進しているかどうかは不明であった。そこで、HMVEC を低酸素刺激下で転写阻害剤 actinomycin
D 処理により新たに mRNA が合成されない状態にし、膜型および可溶型 Flt-1 mRNA 量を定量的 RT-PCR で測定したところ、両者に分解速度の差は認められなかった。したがって、可溶型 Flt-1 特異的な産生抑制は可溶型 Flt-1 が特異的に分解されているわけではなく、選択的
3’端プロセシングを介していることが裏付けられ、プロセシング制御タンパク質が関与していることを強く示唆した。
通常酸素濃度と低酸素下での mRNA 発現変動を調べるためマイクロアレイ解析を行った。
低酸素刺激で発現上昇している RNA 結合タンパク質（5 種類）を HMVEC 細胞に過剰発現させ、Flt-1 の発現を定量したところ、可溶型 Flt-1 の特異的な抑制は認められなかった。プロ
セシング制御に関与しているタンパク質は RNA レベルでの発現変動で制御されていないと考えられ、マイクロアレイ解析での探索は難しいことが明らかになった。そこで、制御配列
および 3'端切断部位周辺に結合しうるタンパク質を 9 種類に絞り、それぞれのタンパク質を血管内皮細胞に過剰発現させ、Flt-1 の発現を解析したところ、hnRNP D タンパク質を過剰発現させた時にのみ、低酸素刺激で見られた可溶型 Flt-1 の減少、および膜型 Flt-1 の増加が観察された。さらに、hnRNP D 遺伝子の shRNA をデザインし、血管内皮細胞でノックダウン
したところ、可溶型 Flt-1 の増加、膜型 Flt-1 の減少という、過剰発現とは逆の結果が得られた。したがって、hnRNP D が可溶型 Flt-1 産生を制御しているタンパク質である可能性が示唆された。
hnRNP D タンパク質は 2 ヶ所のセリン残基でリン酸化されることが知られており、リン酸‑ 34 ‑

化によって RNA への結合能が変化することが明らかになっていることから、低酸素刺激下での hnRNP D タンパク質のリン酸化を解析した。Phos-Tag ゲル(Wako)を用いて、hnRNP Dの移動度を解析したが、通常酸素濃度と低酸素濃度で大きな差異は検出されなかったことから、HMVEC では hnRNP D はリン酸化されず、低酸素刺激下でもリン酸化は誘導されないことが明らかとなった。したがって、可溶型 Flt-1 の産生制御には hnRNP D タンパク質のリン酸化は関与していないことが示唆された。
７．研究の考察・反省
本研究により、これまで明らかにしてきた低酸素刺激による可溶型 Flt-1 産生の抑制が、mRNA の安定性ではなくプロセシングの段階で制御されていることが確認され、新たな制御
メカニズムの存在を強く示唆する結果となった。制御タンパク質の同定に関しては、制御配
列を認識配列とする RNA 結合タンパク質に注目し RNA 結合タンパク質過剰発現による可溶型 Flt-1 の発現変動を解析したところ、hnNRP D で顕著な減少が認められた。さらに、hnRNP
D の発現を shRNA によりノックダウンすると、可溶型 Flt-1 の増加が認められたことから、
hnRNP D が制御タンパク質の有力な候補であると考えられた。ただし、hnRNP D が制御タン
パク質であることを言うためには、hnRNP D が制御配列に結合することを証明する必要があり、今後明らかにしなければならない課題である。また、低酸素によって hnRNP D がどのように制御されているかという点も、メカニズムの解明には重要であるが、本研究では hnRNP
D のリン酸化は起きていないということまでしか明らかにできておらず、さらに詳細な解析が必要である。
今後は、低酸素刺激による hnRNP D の活性調節機構の解明を進めることによって、制御メ
カニズムの全容を明らかにし、血管新生制御法の確立に繋げていきたい。
８．研 究 発 表
該当なし

‑ 35 ‑

１．研究課題名：p53 結合タンパク質 53BP1 のアポトーシスと死細胞排除における新規機能の解明（研究番号

S2011-5）

２．キーワード：１）p53 結合タンパク質 1 (53BP1)
２）アポトーシス (apoptosis)
３）カスパーゼ (Caspase)３．研究者氏名：橋本優実・医学部・助教・生化学 I（採択時）

４．研 究 目 的
53BP1 は、アポトーシス誘導因子 p53 に結合し、p53 の転写を促進するタンパク質として
所属研究室 岩淵邦芳教授らにより同定された。これまでに 53BP1 の機能としては、X 線照射によって生じる DNA 二本鎖切断部位のメチル化ヒストンに結合し、DNA 損傷修復や細胞周期制御に働くことが報告されている。しかし、それ以外の 53BP1 の機能はよくわかっていない。53BP1 は p53 に結合することから、アポトーシスに関わることが予想される。
これまでに私は、ヒト白血病由来細胞株 Jurkat をアポトーシス誘導剤スタウロスポリンで処理すると、53BP1 は、カスパーゼ依存的に末端部分を含む断片(53BP1C)となること、ヒト
骨肉腫由来細胞株 U2OS において 53BP1 がスタウロスポリンによるアポトーシスを抑制する
ことを見出した。本研究は、53BP1 によるアポトーシス制御の分子機構を明らかにすることを目的とする。
５．研 究 計 画
１）53BP1 遺伝子の破壊による 53BP1 欠損細胞株の樹立
相同組み換えにより、比較的効率に遺伝子欠損を導入することができるヒト B 細胞白血病
細胞株 Nalm-6 を用いて、53BP1 欠損細胞株を樹立する。Nalm-6 は野性型 p53 を有しており、スタウロスポリンのみならず、X 線による DNA 損傷誘導においてもアポトーシスに陥ることが知られている。
２）53BP1C の働き方の解明①53BP1C と相互作用する因子の同定
53BP1C とアポトーシス時に結合するタンパク質を免疫沈降法により回収し、質量分析法により同定する。
②53BP1C とその相互作用因子を介したアポトーシス制御機構の解明
アポトーシス誘導時の両分子が同経路で働くかを調べる。
６．研 究 成 果
本研究により以下のことが明らかになった。
(1) 残念ながら 53BP1 欠損 Nalm-6 細胞株は得られなかった。

‑ 37 ‑

(2)(1)の代替策として、RNA 干渉により Jurkat 細胞、ヒト B 細胞白血病細胞株 MOLT-4 細胞および Nalm-6 細胞の 53BP1 タンパク質の発現を効率良く抑制する系を構築した。

(3)

53BP1C 末と結合するタンパク質 53BP1C-BPX（仮名）を同定した。

(4) アポトーシス Jurkat 細胞において 53BP1C-BPX のタンパク質量に変化はみられなかった。
(5) スタウロスポリン処理により Jurkat 細胞あるいは MOLT-4 細胞にアポトーシスを誘導す
ると、53BP1C は、核内から細胞質へと移行した。この時、53BP1C-BPX は 53BP1C と共局在を示し、核内から細胞質へと移行した。
７．研究の考察・反省
アポトーシス過程の進行に伴い DNA が断片化される時には、DNA 損傷修復タンパク質は不要となる。実際多くの DNA 損傷修復タンパク質は、アポトーシス誘導後カスパーゼ依存性に切断され、修復タンパク質としての機能を消失すると考えられている。一方、カスパー
ゼによる切断後に残った修復タンパク質の断片が、アポトーシスに対してどのような影響を及ぼしているかについては不明な点が多い。私は本研究と同時に進行させているプロジェク
トにおいて、DNA 二重鎖切断修復タンパク質である XRCC4 がアポトーシス時にカスパーセ
依存性に切断されること、切断後に残った XRCC4N 末断片がアポトーシス特異的な DNA 断片化を促進することを見出している。カスパーゼによる切断後の 53BP1C も何らかの方法でアポトーシス過程を制御している可能性が考えられる。本研究では、免疫沈降法と質量分析法を用いることで、53BP1C と結合するタンパク質 53BP1C-BPX を同定した。今後、53BP1Cと 53BP1C-BPX の結合が、アポトーシス過程の進行にどのような影響を及ぼすかを調べていく予定である。
８．研 究 発 表
該当なし。

‑ 38 ‑

１．研究課題名：ヒト培養細胞における M 期進行制御の解析（研究番号S2011-6）

２．キーワード：１）RBM8A (RBM8A)
２）細胞周期 (Cell cycle)３）Magoh (Magoh)４）G2/M 期 (G2/M phase)
５）アポトーシス (Apoptosis)
３．研究者氏名：石垣靖人・総合医学研究所・准教授・生命科学研究領域

４．研 究 目 的RBM8A タンパク質は Conclin ら(2000)によって RNA 結合因子として同定され、mRNA 上のエキソンジャンクションに局在する複合体の一員であることが知られている（Ballute ら、
2005、石垣ら、2001）。一方で、この因子をノックダウンすると細胞死が誘導されることが報告され（Sudo ら、2010）、さらに癌組織での発現亢進が知られるようになった（Kim ら、2008）。
これらの結果をふまえ細胞周期進行での役割を探索した結果、特に M 期進行と細胞死に深くかかわることを明らかにしてきた（石垣ら、未発表データ）。
私の研究グループでは RNA 結合因子として同定された RBM8A タンパク質が、細胞周期 M
期進行と遺伝的安定性の維持においても働く可能性を見出しつつある。この成果を発展させて、RBM8A の細胞周期における機能と役割を分子レベルで明らかにすることが本研究の目的である。
このために、
１） 細胞周期に依存した RBM8A タンパク質の局在解析
２） RBM8A による複合体形成
３） 細胞での新規機能を明らかにすることを目指した。
５．研 究 計 画
(1) RBM8A タンパク質の細胞内局在解析
多重免疫染色および蛍光タンパク質標識を発現させて、ツアィス共焦点レーザー顕微鏡とオリンパスタイムラプス顕微鏡でリアルタイムに局在解析を行う。中心体などの細胞周期進行装置および M 期細胞ブリッジにおける局在を解析する。さらに免疫染色したサンプ
ルを電子顕微鏡下で観察し、超微細形態での観察を行う。
(2) RBM8A 複合体形成の解析
ダブルチミジンブロックからのリリースにより各細胞周期の細胞を集積し、ここから抽出したライセートより免疫沈降実験を行い RBM8A タンパク質と細胞周期依存的に複合体を形成するタンパク質群を網羅的に解析、同定する。さらに、In situ proximity ligation アッ‑ 39 ‑

セイにより、抗体染色を利用した細胞内複合体形成を観察した。
(3) M 期進行と細胞内アポトーシス経路を解明
ノックダウンによる細胞死誘導効果は確認済みであり、活性化される経路を DNA マイク
ロアレイおよびカスパーゼ活性の評価系により同定する。
(4) ゲノム安定性への寄与を検討
ノックダウンによるゲノム安定性への寄与を解析する。
６．研 究 成 果
(1) RBM8A タンパク質の細胞内局在解析
細胞内の局在は Sigma-Aldrich 社から販売されているマウスモノクローナル抗体、Abcam
社から販売されているウサギ抗体、および自作のウサギ抗体（N 末端および C 末端を認識）により、常法に従って免疫染色により解析した。その結果、すべての抗体において細胞質に明瞭なドットが存在し、細胞分裂時に現れる収縮環にもシグナルの局在が観察された。
また透過型電子顕微鏡下で観察できた免疫染色像は、mRNA の形態を伴って線状あるいは集積した形態を観察することができた（論文投稿中）が、細胞質内の集積は検出できなかった。このことは、光学顕微鏡下で観察できる集積が、きわめて限局された領域にあることを示唆するものと考えられる。また In situ proximity ligation アッセイではいくつかの候補
タンパク質を同定することができた。
(2) RBM8A 複合体形成の解析
プロテオミクス解析により特異的な結合因子を探索したところ、17kDa 付近に再現性よくバンドが現れた。これは、既に結合因子として知られている Magoh タンパク質のバンドであると考えられる。さらに、80kDa よりも大きな分子量領域に複数のバンドが検出できたが、本学に設置された日立ナノフロンティア質量分析装置では同定には至らなかった。
解析中では有意差がでなかったものの RNA 結合因子のペプチドも検出されており、解析そのものは順当に機能していると考えている。申請者としては、細胞室内の共局在について
プロテオミクス解析を行うことを目指し、密度勾配遠心法により分画を得ることを目指したものの、ここでは再現性のある結果を得ることができなかった。そこで、ダブルチミジ
ンブロック法を利用して各細胞周期をわけて細胞を集めた後、免疫沈降により細胞周期特異的に結合する因子の解析を現在行っている。
(3) M 期進行と細胞内アポトーシス経路を解明、(4)ゲノム安定性への寄与を検討
RBM8A タンパク質は Magoh タンパク質と細胞内で強固な２量体を形成していることが知られている。このため、この２つのタンパク質が欠損すると同じような症状が観察されると考えられてきた。
最近 Magoh のマウス突然変異体が報告され、神経幹細胞の分裂異常に伴う小頭症の発症が明らかにされた。一方、人における RBM8A の欠損は脳に欠損が現れる訳ではなく、橈
骨と血小板に異常が観察される。従って、RBM8A の欠損が細胞の分裂以上を引き起こすかどうかは興味深いテーマとなっていた。RBM8A タンパク質を欠損させた際に、もしも、２‑ 40 ‑

つのタンパク質が別々の機能を持つならば、細胞分裂に異常は起きないであろうし、同じ機能しか持たないならば細胞の分裂異常が観察されるはずである。
そこで、ヒト培養細胞で RBM8A と Magoh を RNAi によりノックダウンし、細胞周期進行への関与を解析した。その結果、両者のノックダウンは速やかに細胞周期 G2/M 期での停止を引き起こすことが明らかとなった。ダブルチミジンブロックからリリースさせた細胞集団をフローサイトメトリーにより解析すると、ノックダウン細胞では G2/M から次のG1 への進行が明らかに遅延していた。染色体標本を作製し、ノックダウンによるゲノム安定性への寄与を解析したところ、大部分の細胞が染色体を形成した状態で集積し、Mitotic
index が有意に上昇することが明らかとなった。染色体に質的量的異常は認められなかった。
このため、ゲノム安定性に直接関与している可能性は低いと考えている。ただし、アポトーシス経路が欠損したような状態では染色体の分離に異常がおこりゲノム不安定性に結びつくかもしれない。本学に設置されたオリンパス社のタイムラプス顕微鏡を利用して動画で観察したところ、細胞は丸い状態で停止した後細かなアポトーシス小体を形成して細胞死に至ることが明らかとなった。そこで、機能している Caspase を同定するために、Promega
社の蛍光プレートリーダーを利用して解析を行ったところ、Caspase3 および７の活性化が観察され、よく見られるアポトーシス経路が働いていることが明らかとなった。
Affymetrix 社の DNA マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析では、細胞から抽出した全 RNA をサンプルとして解析するとアポトーシスと細胞周期関連遺伝子の発現変動が観察され、上記の Caspase の活性化と相関する結果が得られた。また、RBM8A 遺伝子が結合している mRNA を抽出し、同様に DNA マイクロアレイにて解析を行うと、結合している mRNA 群を同定することができた。
また、RBM8A 特異的な siRNA にてノックダウンを行うと、不思議なことに結合因子である Magoh のタンパク質量の低下も観察された。逆に Magoh のノックダウンも RBM8Aの低下を引き起こすことが明らかとなった。このような結果は、複合体形成がお互いの安定性に関与していることを示唆すると考えられる。このような発現の相関が、RNA レベルで起きているものなのか、それともタンパク質レベルで起きているものなのかを検討する
ために、ABI 社のリアルタイム PCR 装置を利用して mRNA の定量を行った。その結果、
RBM8A または Magoh の siRNA によるノックダウンは、それぞれの標的遺伝子の mRNA量の低下を引き起こしたが、相手側の mRNA 量の有意な低下は観察されなかった。このため、RBM8A と Magoh はお互いにタンパク質レベルで安定性に寄与していることが示唆された。タンパク量の現象にユビキチン-プロテアソーム系が関与している可能性も検討したが、少なくとも我々が解析した範囲では、ポリユビキチン化に特有なシグナルは観察されなかった。
７．研究の考察・反省
プロテオミクス解析において、質量分析装置による解析が思うように進まず、結果的には新しい結合因子の探索に失敗してしまった。研究の方向性としては、単に RNA 結合因子と‑ 41 ‑

して認識されてきた RBM8A と Magoh が小頭症の発症や遺伝子発現にどのように関与しているのかを、今後検討していきたいと考えている。
８．研 究 発 表
Ishigaki Y, Nakamura Y, Tatsuno T, Hashimoto M, Shimasaki T, Iwabuchi K, Tomosugi N. Depletionof RNA-binding protein RBM8A (Y14) causes cell cycle deficiency and apoptosis in human cells.
Exp Biol Med 2013; 238: 889-897.

Abstract: RBM8A (Y14) contains an RNA-binding motif and forms a tight heterodimer with
Magoh. The heterodimer is known to be a member of the exon junction complex that forms on
mRNA before export and it is required for mRNA metabolism processes such as splicing, mRNA
export and nonsense-mediated mRNA decay. Recently, deficient cellular proliferation has been
observed in RBM8A- or Magoh-depleted cells. These results prompted us to study the role of
RBM8A in cell cycle progression of human tumour cells. The depletion of RBM8A in A549 cells
resulted in poor cell survival and the accumulation of mitotic cells. After release from G1/S arrest
induced by a double thymidine block, the RBM8A-silenced cells could not proceed to the next
G1 phase beyond G2/M phase. Finally, the sub-G1 population increased and the apoptosis
markers caspases 3/7 were activated. Silenced cells exhibited an increased frequency ofmultipolar or monopolar centrosomes, which may have caused the observed deficiency in cell
cycle progression. Finally, silencing of either RBM8A or Magoh resulted in mutual
downregulation of the other protein. These results illustrate that the RBM8A-Magoh mRNAbinding complex is required for M phase progression and both proteins may be novel targets for
anticancer therapy.

‑ 42 ‑

１．研究課題名：新規リウマチ関節炎制御因子 FRP/FSTL1 の機能解析（研究番号S2011-7）

２．キーワード：１）ホリスタチン関連蛋白 (FRP, FSTL1)
２）CD14
３）TLR4４）自然免疫 (innate immunity)５）関節リウマチ (rheumatoid arthritis)
３．研究者氏名：田中真生・医学部・准教授・血液免疫内科学

４．研 究 目 的
FRP (follistatin-related protein) は分泌タンパクであり，その名はアクチビンの活性を阻害す
るホリスタチン (follistatin) とのホモロジーに由来する．現在 FSTL1 (follistatin-like 1) とも呼ばれている．申請者は関節リウマチにおける自己抗原の一つとして FRP をクローニングし，
マウス関節炎モデルで関節炎抑制作用を実証した．しかし免疫応答に対する作用に関し見解が分かれ，マウス実験関節炎ではむしろ増悪させる報告や，ラット心移植実験では免疫寛容を誘導する報告がある．申請者は FRP の受容体として CD14 および DIP2A のクローニングにも成功しており，FRP による免疫応答の違いがこれら受容体の違いに由来すると仮定した．
５．研 究 計 画
DIP2A は機能未知の分子で実験資源も乏しいため，CD14 について解析した．まず FRP が生理的な条件で細胞表面上の CD14 に結合するかどうか，CD14 強制発現ヒト 293 細胞を用いて FACS 解析した．CD14 を介するシグナルとして LPS による TLR4 シグナルの活性化がよく知られている．ヒト培養関節滑膜細胞やマウス NIH-3T3 細胞を用いたり，TLR4 欠損マ
ウスの脾細胞や (loss of function)，CD14 およびこれと会合しシグナルを伝達するのに不可欠な MD2 と TLR4 の 3 分子を強制発現させたヒト 293 細胞を用いて，IL-6 や IL-8 の産生量を測定した (gain of function)．また実験系が異なるがマウス実験関節炎で，ヒト FRP では改善
しマウス FRP では増悪するように，種の違いで活性が異なる可能性が示唆されていたため，両者を使用した比較実験も行った．さらに FRP が LPS と同様に LPS トレランスを誘導するかどうかも確認した．
６．研 究 成 果
ヒト FRP はヒト培養関節滑膜細胞の IL-6 産生を促進した．マウス FRP はマウス NIH-3T3の IL-6 産生を促進した．この場合ヒト FRP ではその作用が弱かった．同じ実験系でのマウス実験関節炎で，マウス FRP を高発現させた II 型コラーゲン特異的 T 細胞を移入すると，関節炎は増悪した．ヒト FRP を高発現させた場合はむしろ関節炎が減弱した．従って，これら FRP の作用にはリガンド・レセプタータンパク間の種特異性が存在した．野生型マウス由‑ 43 ‑

来の脾細胞では，添加したマウス FRP の濃度に依存して IL-6 産生が増加するのに対し，TLR4欠損マウスの脾細胞では無反応であった．そして CD14，MD2，TLR4 を発現させたヒト 293
細胞では，添加したヒト FRP の濃度に依存して IL-8 産生が増加するのに対し，CD14 を除く
2 分子，MD2，TLR4 を発現させたヒト 293 細胞では無反応であった．また FRP は LPS と同
様に TLR4 シグナルのトレランスを誘導した．
７．研究の考察・反省
これまでの報告を検討すると，免疫系での FRP の作用は，炎症反応に関して一義的なものではない．移植免疫領域では炎症反応を抑制すると考えられ，この場合の受容体は，前回報
告した膜タンパク DIP2A が候補である．そして自然免疫領域では炎症反応を促進し，この場合の受容体が TLR4 であることを本研究で解明した．TLR4 リガンドには，LPS など病原体に由来する外因性リガンドのほか，内因性リガンドとして熱ショックタンパク，HMGB1，β－ディフェンシンなどが報告されている．FRP も内因性リガンドの一つと言える．FRP は関節リウマチの自己抗原であるが，内因性 TLR4 リガンドとして関節リウマチの病態形成に関与する可能性が示唆された．
しかし我々の主要な関心である FRP の炎症反応抑制作用に関して，今回の研究でも具体的な解明の糸口を得るに至らなかったことは残念であり反省すべき点である．
８．研 究 発 表
Murakami K, Tanaka M, Usui T, Kawabata D, Shiomi A, Iguchi-Hashimoto M, Shimizu M, Yukawa
N, Yoshifuji H, Nojima T, Ohmura K, Fujii T, Umehara H, Mimori T. Follistatin-related
protein/follistatin-like 1 evokes an innate immune response via CD14 and toll-like receptor 4. FEBS
Lett 2012; 586: 319-324.
Abstract: Follistatin-related protein (FRP)/follistatin-like 1 (FSTL1) has multi-specific binding
nature especially with TGF-β superfamily proteins, and thereby modulates organ development.
However, its function in immune systems remains unclear. Previously, we reported FRP interacts with
CD14, which is known to mediate toll-like receptor 4 (TLR4) signaling. Here, we investigatedwhether FRP activates TLR4 signaling. Recombinant FRP induced interleukin 6 or interleukin 8
production from target cells in a CD14- and TLR4-dependent manner. Moreover, similar to
lipopolysaccharide (LPS), FRP induced tolerance to the second LPS stimulation. FRP has the functionof evoking innate immune responses as one of the endogenous TLR4 agonists.

‑ 44 ‑

１．研究課題名：エピジェネティック機序に着目した肺癌先進部でのアクアポリンの発現誘導の解明（研究番号S2011-8）

２．キーワード：１）肺癌 (Lung cancer)
２）エピジェネティクス (Epigenetics)
３）AQP (Aquaporin)
４）ヒストン修飾 (Histone modifications)３．研究者氏名：町田雄一郎・医学部・助教・呼吸器外科学
４．研 究 目 的
肺癌は高い浸潤・転移能を特徴とする。近年、分子標的薬の開発により治療に幅が生まれたが、その効果は満足できるものではない。アクアポリン aquaporin (AQP)は、あらゆる生命
現象の基盤をなす水分子に対する特異的チャネルとして発見された(Preston GM, et al. Science1992)。近年、細胞増殖や浸潤・転移などがんの生物学的特性に重要な役割を果たしている可能性が提唱され(Verkman AS, et al. J Mol Med 2008)、我々は AQP1, 5 の過剰発現が術後転移発
生と生命予後に密接に関係していることをこれまでに明らかにした(Machida Y, et al, Hum
pathol 2011)。
エピジェネティックは、同一 DNA 配列から異なった表現型を誘導する仕組みで、癌における遺伝子発現抑制での役割が現在注目されている。肺癌細胞を含め AQP1,5 の腫瘍細胞での発現調節機構の報告は数少なく、エピジェネティック制御機構に関しては全く知られていない。エピジェネティックな遺伝子の発現制御には、DNA のメチル化、ヒストン修飾とクロマチン再構築が互いに協調・拮抗し遺伝子発現の制御に関わっている。エピジェネティック機序に着目した肺癌浸潤先進部における AQP 遺伝子の発現誘導機構の解明を目的とし、研究を行った。
５．研 究 計 画
金沢医科大学呼吸器外科で切除された 92 例肺癌症例（肺腺癌 81 例、扁平上皮癌 8 例、小細胞癌 3 例）を対象とした。ヒストン修飾は H3K4diMe(dimethylated histone 3 lysine 4),
H3K9Ac(acethylated histone 3 lysine 9), H3K18Ac(acethylated histone 3 lysine 18), H3K27triMe(trimethylated histone 3 lysine 27), H4R3diMe(dimethylated histone 4 arginine 3)の 5 つを使用した。
すべての統計解析は、StatView ソフトウェアを使用し、p0.05 で統計学的に有意であるとみなした。
1) 免疫組織染色による発現比較解析：Spiral array を作製し、AQP1,5 とヒストン修飾関連因子の免疫組織染色を行い、AQP1,5 過剰発現とヒストン修飾の関係を臨床病理学的因子と絡めて解析する。
a)ヒストン修飾 H3K9Ac,H3K18Ac,H3K27triMe,H3K4diMe,H4R3diMe と生命予後との関連性‑ 45 ‑

b)ヒストン修飾と癌関連遺伝子(CEA, p53, Ki67)との関連性
c)ヒストン修飾と諸因子（組織・年齢・性別・腫瘍径・喫煙歴・Stage）との関連性
d)ヒストン修飾と FDG-PET との関連性
e)ヒストン修飾と AQP1,5 の関係性
*免疫染色：Spiral array 法による tissue microarray を作製。染色条件の均一化を図った。
2) Western blot による蛋白の定量的発現比較解析：術後転移陽性例と対照として術後再発陰性例各 3 例ずつ用いて蛋白発現を定量的に比較解析する。
６．研 究 成 果1) 免疫組織染色による発現比較解析：
a)ヒストン修飾 H3K9Ac,H3K18Ac,H3K27triMe,H3K4diMe,H4R3diMe と生命予後との関連性
H3K4diMe の高発現と術後再発に関連を認めた。H3K4dime の高発現は、肺腺癌の術後再発率と有意な関連性を認めるとともに、術後の無症候性生存期間の有意な短縮が示唆された(p 0.0029)。単変量解析では H3K4diMe は有意差を認めた(p  0.017)が、多変量解析では有意差を認めなかった。
b)ヒストン修飾と癌関連遺伝子(CEA, p53, Ki67)との関連性
Ki67 と H3K18Ac の発現で関連を認めた(p 0.0427)が、その他のヒストン修飾と癌関連遺伝子との関連は認めなかった。
c)ヒストン修飾と諸因子（組織・年齢・性別・腫瘍径・喫煙歴・Stage）との関連性
Stage と H4R3diMe の発現で関連を認めた(p 0.039)が、その他のヒストン修飾と諸因子との関連は認められなかった。
d)ヒストン修飾と FDG-PET との関連性
H3K4diMe の発現は FDG-PET の集積と関連を示し、H3K4diMe が肺癌における重要な因子であることが示唆された(p 0.0201) 。
e)ヒストン修飾と AQP1,5 の関係性
5 つのヒストン修飾と AQP1,5 の発現には統計上有意差を認めなかった。
2) Western blot による蛋白の定量的発現比較解析：
術後再発を認めた肺癌で H3K4diMe の蛋白発現を認め、術後再発を認めなかった肺癌で
H3K4diMe の蛋白発現を認めなかった。
７．研究の考察・反省本研究で、AQP1,5 とヒストン修飾に直接的に関係するようなデータを得ることは出来なかった。しかし、ヒストン修飾 H3K4diMe(dimethylated histone 3 lysine 4)が肺癌における重要な因子であることが十分示唆できるような結果を得ることが出来た。
H4R3diMe(dimethylated histone 4 arginine 3)も肺癌の Stage との関連を認めており、肺癌の進展において何らかの役割をしている可能性があると考えられた。今回の研究結果より、肺癌の進展においてヒストン修飾は重大な役割をしている可能性が示唆された。in vivo で得られ‑ 46 ‑

たこの情報を in vitro で立証する必要があると考える。今後は、AQP の遺伝子の発現誘導機
構の解明を続けるとともに、肺癌におけるヒストン修飾という未知の領域についても解明を続ける予定である。
８．研 究 発 表
現在、論文作成中。

‑ 47 ‑

１．研究課題名：胎児造血における ACTH の赤芽球分化誘導の生理的意義（研究番号S2011-9）

２．キーワード：１）赤血球 (red blood cell)２）造血 (hematopoiesis)
３）副腎皮質刺激ホルモン (adrenocorticotropic hormone)
４）メラノコルチン受容体 (melanocortin receptor)
５）造血幹細胞 (hematopoietic stem cell)３．研究者氏名：島村英理子・医学部・講師・解剖学Ⅰ
４．研 究 目 的
副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)は生体内で種々の標的臓器に作用し、その多様な生理活性を発現する重要なホルモンの一つである。α-メラノサイト刺激ホルモン(α-MSH)、β-MSH、
γ-MSH とともに ACTH はメラノコルチンと総称され、プロオピオメラノコルチン(POMC)
を前駆体としている。
メラノコルチンの受容体には melanocortin receptor1 – 5 (MC1-5R)が存在する。我々の先行研究により、胎児造血において、胎盤由来の ACTH が有核赤血球の脱核を誘導する作用を示すことが明らかとなった。しかし、ACTH による赤芽球の分化誘導において、MCR の機能は不明であった。我々は、胎児造血のモデルとしてヒト臍帯血由来造血幹細胞を用いて、特にMC1R、2R および 5R の赤芽球の分化過程における役割について検討した。
５．研 究 計 画
（１）赤血球を誘導する培養系
CD34 陽性造血幹細胞から赤血球を分化誘導する培養系は図１を基本とする。

図１CD34 陽性造血幹細胞から赤血球を誘導する培養方法
細胞：ヒト臍帯血由来 CD34 陽性造血幹細胞(Lonza 社)
培養液：Expansion (E0-E7): HPGM + stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), Flt-3
ligand (FL); Differentiation (D0-D3) : HPGM + SCF, IL-3, IL-6, erythropoietin (EPO);
Maturation (M0-M7): HPGM + EPO, # (ACTH またはα-MSH のいずれか)‑ 49 ‑

（２）赤芽球分化成熟過程における MC1R、2R および MC5R の発現解析
フローサイトメーターを用いて、各分化段階における MC1R、MC2R および MC5R 陽性細胞の比率を計測した。
（３）MC1R、2R および MC5R の阻害がおよぼす赤芽球分化への影響
MC1R、2R および 5R の特異抗体を用いて各受容体を阻害し、各分化段階における赤芽球の細胞数の比率および脱核率を計測した。また、中和抗体により各受容体を阻害した後に、ERK、AKT および STAT5 のリン酸化の状態をウエスタンブロットにより解析した。
（４）MC1R、2R および MC5R の actin-myosin 系に対する作用
脱核に関与すると考えられる myosin light chain2 のリン酸化ならびに脱核中の細胞における actin および MCR の局在について、共焦点レーザー顕微鏡により解析した。
（５）胎盤時期特異的 Pomc ノックダウンシステムの構築と母体 LIF-胎盤 ACTH による脱核誘導機構の in vivo 解析
胎児血球の分化誘導および脱核誘導において、ヒト造血幹細胞培養実験で確認された
MC1R、2R および 5R の調節機構が胎児でも機能しているかを検証する。
① レンチウイルスベクターに各受容体の shRNA を組み込んだノックダウンベクターを複数種類作成し、造血幹細胞を用いてノックダウン効率が最も高いものを選別する。
② 最も効率の良い shRNA をマウス胎児心臓に in utero injection し、赤芽球の分化誘導抑制作用および脱核誘導抑制作用を検証する。
③ Pomc shRNA を複数作成しノックダウン効率をマウス栄養膜幹細胞（TS 細胞）（東京大学田中智准教授より分与）の培養実験で検証する。
④ 受精卵は C57BL/6J マウスから採取し、偽妊娠マウスは ICR を用いて図１のシステムを構築する。レンチウイルス感染実験は生化学 2 との共同研究で行う。Tet-On システム
（クローンテック社）を組み込み、時期特異的ノックダウンシステムに改変する。構
築した時期特異的に胎盤 Pomc をノックダウンできる shRNA-トランスジェニックマウ
ス（sh-TG マウス）を作成する。
６．研 究 成 果
（１）ACTH の赤芽球脱核誘導作用
本培養系において、ACTH 添加後 7 日目(M7)における脱核率は、ACTH 投与群(1 nM)で84%、陰性対照群で 55% (p0.00011)であった。
（２）MC1R、2R および MC5R の発現解析
MC1R は培養 1 日目(M1)において最も陽性細胞数が多く(60%)、分化の進行に伴い陽性細胞数を減じ、M5 では約 40%となった。一方、MC5R 陽性細胞は、M1 ではほとんど検出されないが、M5 では約 20%まで増加した。MC2R 陽性細胞の比率は培養期間をとおして恒常的に 70-80%を示した。
（３）MCR 阻害の赤芽球分化に対する影響
中和抗体添加培養液で 5 日間赤芽球を培養したところ、抗 MC1R では多染性赤芽球で、‑ 50 ‑

MC2R では好塩基性赤芽球で、MC5R では正染性赤芽球の段階で分化が止まった。また
MC2R の阻害では細胞の増殖が抑制されることも示唆されたことから、MC2R は分化初期において重要であると考えられた。一方、培養４－５日(M4-M5)にのみ中和抗体を添加した場合、MC5R 抗体のみが脱核抑制作用を示した。このことから、赤芽球の脱核に関与するのは MC5R であることが示唆された。
（４）MC1R、2R および MC5R の脱核過程における機能解析
脱核中の細胞の共焦点レーザー顕微鏡観察により、脱核開始直前の核脱出部付近において actin、p-MLC2 および MC5R が共局在することが分かった。また、myosin light chain2 のリン酸化が MC5R の阻害によって抑制を受けることが明らかとなった。このことからも赤芽 球 の 脱 核 に は MC5R を 介 し た シ グ ナ ル が 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、MC1R-STAT5、MC2R-ERK、MC5R-AKT の組み合わせで、メラノコルチンシステムが赤芽球の分化調節に関与していることが示唆された。
（５）胎盤時期特異的 Pomc ノックダウンシステムの構築と母体 LIF-胎盤 ACTH による脱核誘導機構の in vivo 解析
マウス栄養膜幹細胞（TS 細胞）培養系のセットアップは終了したものの、有効なノックダウンベクターを確立することができず、現在も検討を続けている。ノックアウト胚の胚移殖実験については、妊娠 C57BL/6J マウスからの blastocyst の回収、胚の初代培養（この間にノックダウン処理）と偽妊娠 ICR マウスへ胚移植するための実験系の基礎を立ち上げることができた。しかし、現時点ではノックダウン処理を行っていない陰性対象胚の移植成功率が低いことと、有効なノックダウンベクターが確立できていないことから、ノックダウン胚の移植実験系を研究期間内に確立することができなかった。
７．研究の考察・反省
メラノコルチン受容体の発現解析と機能阻害実験から、赤芽球の分化時期ごとに異なる受容体が発現することで、同一のリガンド(ACTH)が時期選択的に異なる作用を示すことが示された。In vitro 実験系を用いた赤芽球分化におけるメラノコルチンシステムの機能解析については、概ね計画通りに研究を進めることができた（論文投稿中）。しかしながら、in vivo 実
験に関しては、実験系の確立に至らなかったため、予定していた研究を遂行することができなかった。今後、in vivo 実験系の問題点について詳細に検討し、改善する必要がある。
８．研 究 発 表
Arikawa T, Simamura E, Shimada H, Nishi N, Tatsuno T, Ishigaki Y, Tomosugi N, Yamashiro C, Hata
T, Takegami T, Mogami H, Yamaguchi K, Nakamura T, Otani H, Hatta T, Shoji H. Expression patternof Galectin 4 in rat placentation. Placenta 2012; 33: 885-887.
Abstract: Galectin 4 (Gal4) is abundantly expressed in the epithelium of the gastrointestinal tract,and functional analysis has concentrated on its roles associated with polarized membrane trafficking.
This study aimed to investigate the expression of Gal4 in placentation. The expression level of Gal4

‑ 51 ‑

was revealed to be lower in differentiated Rcho-1 cells (a model system of rat trophoblast
differentiation) than in proliferative cells. In the rat placenta, immunohistochemical analysis showedthat Gal4 is preferentially located in the maternal-fetal junctional zone. These results suggest that
down-regulation of Gal4 may be involved in the promotion of trophoblast cell differentiation.

‑ 52 ‑

１．研究課題名：炎症性大腸腫瘍形成における NF-kappaB の役割（研究番号S2011-10）

２．キーワード：１）大腸癌 (colon cancer)２）炎症 (inflammation)３）炎症性大腸腫瘍形成 (colitis associated cancer)４）NF-kappaB
５）アポリポ蛋白 E (apolipoprotein E)
３．研究者氏名：尾山武・医学部・助教・病理学Ⅰ（採択時）

４．研 究 目 的
炎症とがんの関係は古くから知られており、大腸においても炎症性腸疾患ではがん発生のリスクが高いことが疫学的に多数報告されている。また炎症性腸疾患のうち、潰瘍性大腸炎(UC)においても罹病期間が長くなるほど大腸がんリスクが高くなることが知られている。今
回、潰瘍性大腸炎および炎症性大腸腫瘍形成のモデルとして、Azoxymethane (AOM)/Dextran
sulfate sodium (DSS)をマウスに投与することにより大腸腫瘍を誘発する系を用いた。このモデルに対して、特に NF-B に着目して検索する目的で、NF-B の細胞表面受容体であり、特に脂質代謝にも関与するものとして Low-density lipoprotein receptor–related protein (LRP)があるが、そのリガンドである Apolipoprotein (Apo) E 遺伝子の欠損マウスを用いることにより、AOM /DSSに誘発された炎症性大腸腫瘍形成に対する NF-B 経路の関与を検索した。
５．研 究 計 画
６週齢の雄性 Apo E 欠損マウスならびに対照群に initiation 処理として、AOM を 10 mg/kg
体重の濃度で単回腹腔内投与し、その１週間後より 1.5% DSS を 1 週間飲水投与した。実験開始後 8 週に動物を犠牲死させ、大腸の摘出および採血を行った。摘出した大腸の非病変部の粘膜に対して炎症関連遺伝子の mRNA 発現解析を行った。また実験開始後 18 週にも動物を犠牲死させ、同様に大腸の摘出および採血を行った。摘出した大腸を用いて病理学的解析を行い、また血清脂質への影響についても検討した（図－１）。

図１．AOM/DSS 処理により誘発された炎症性大腸腫瘍形成モデル‑ 53 ‑

６．研 究 成 果
Apo E 欠損マウスにおいては大腸腫瘤性病変の一個体あたりの平均病変数は対照群と比較して有意に増加していた（図－２、３）。非病変部の大腸粘膜における炎症関連遺伝子のmRNA 発現のうち iNOS の発現は Apo E 欠損マウスにおいて対照群と比較して有意に高値であったが、NF-B、Cox-2、TNF-、STAT3 等の発現に有意な差を認めなかった（図－４）。
血清中の脂質の電気泳動パターンからは very low density lipoprotein (VLDL)、intermediate
density lipoprotein (IDL)、low density lipoprotein (LDL)の比率の増加傾向ならびに high density
lipoprotein (HDL)の減少傾向を見た（図－５）。Apo E 欠損マウスにおける血清中の LDL コレ
ステロール濃度は対照群と比較して有意に高値であり、HDL コレステロール濃度は有意に低値であった（図－６）。Apo E 欠損マウスにおける血清総コレステロール濃度は対照群と比較して有意に高値であったが triglyceride 濃度に有意な差を認めなかった（図－７）。以上より Apo E 欠損マウスは対照群と比較して血清中 LDL、総コレステロール値の有意な増加を呈しておりまた

AOM/DSSによって誘発された大腸病変の有意な増加をみた。

図２．AOM/DSS 処理により誘発された Apo E 欠損マウス
および対照群の大腸マクロ像

図３．AOM/DSS 処理により誘発された
Apo E 欠損マウスおよび対照群における大腸腫瘤性病変の一個体あたりの平均病変数

図４．Apo E 欠損マウスおよび対照群における、実験開始後 8 週時の非病変部の大腸粘膜における炎症関連遺伝子の mRNA 発現‑ 54 ‑

図５．AOM/DSS 処理により誘発された Apo E 欠損マウスおよび対照群における血清中の脂質の電気泳動パターン

図７．Apo E 欠損マウスおよび対照群における血清総コレステロール濃度およびtriglyceride 濃度

図６．Apo E 欠損マウスおよび対照群における血清中の LDL コレステロール、HDL
コレステロール濃度７．研究の考察・反省
NF-B の細胞表面受容体であり、脂質代謝にも関与することが示唆されている LRP のリ
ガンドである Apo E の欠損マウスに対して炎症性大腸腫瘍形成を誘発することにより、本モ
デルに対する NF-B 経路の関与を検討した。その結果、Apo E 欠損マウスにおいては一個体あたりの平均大腸病変数は対照群と比較して有意に増加し、Apo E 欠損マウスでは対照群と比較して血清中 LDL、総コレステロール値の有意な増加を呈していた。本研究においては動物モデルを用いることにより、炎症性大腸腫瘍形成に NF-B 経路が関与する可能性を検討したが、Apo E の欠損により大腸病変数が増加したことから、炎症性大腸腫瘍形成に Apo Eの関与が示唆された一方で、大腸粘膜における NF-B の mRNA 発現は有意な差を認めなかったことから NF-B の関与についてはさらなる検討が必要であると考えられる。その一方で、大腸粘膜における iNOS mRNA の有意な発現上昇ならびに血清中の LDL 、HDL コレ
ステロール濃度の有意な上昇が確認され、それら炎症性大腸腫瘍形成に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。今後はこれらの関与についても検討したい。
８．研 究 発 表
投稿準備中

‑ 55 ‑

１．研究課題名：正常ヒト皮膚線維芽細胞の過酸化水素曝露による早期老化に対する柴胡桂枝湯の抗老化効果（研究番号S2011-11）

２．キーワード：１）柴胡桂枝湯 (Saikokeishito)２）早期老化 (premature senescence)３）トランスフォーミング増殖因子ベータ 1 (Transforming growth factor beta1)４）p53
５）アデノシンモノリン酸活性化タンパクキナーゼアルファ 1(Adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1)

３．研究者氏名：高田尊信・総合医学研究所・助教・先端医療研究領域

４．研 究 目 的
正常ヒト皮膚線維芽細胞の老化モデルを構築することにより、老化に関与するタンパク質の発現増加および発現減少を誘導し、さらにその老化特徴的なタンパク質の変動を、漢方製剤「柴胡桂枝湯エキス」により抑制しうるかを解析する。

５．研 究 計 画
研究の第 1 計画として、正常ヒト皮膚線維芽細胞の継代を繰り返し、分裂回数の限界に近づけることにより、分裂回数の少ない細胞と比較して変動があるかを調べ、その変動を抗老化物質候補(柴胡桂枝湯エキスを含む)において抑制しうるかを計画した。
この実験がうまくいかない場合に、第 2 計画として、過酸化水素曝露による prematuresenescence を生じさせる方法を選択することとした。
正常ヒト皮膚線維芽細胞に、無血清培地条件下で 100 M～250 M の各濃度の過酸化水素
を 4 時間暴露し、老化関連タンパク質である p53、Transforming growth factor beta1 (TGF-1)、
14-3-3 protein sigma (14-3-3 )、SIRT1、Adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 1(AMPK1)、AMPK2 およびスタンダードとしての-actin (actin)の発現変動を調べる。その後、それらの変動を 48 時間の柴胡桂枝湯エキス入り培地での培養によって抑制しうるかを検証し、
柴胡桂枝湯エキスの抗老化効果を解析する。

６．研 究 成 果
正常ヒト皮膚線維芽細胞の継代を繰り返し、分裂回数 12 回を超える（細胞販売メーカーの保証する、細胞に異常を起こさない分裂限界 15 回）を細胞と、分裂回数 4 回以内の細胞のライセートを調製し、蛍光標識試薬 Cy2、Cy3、Cy5 によってライセートの標識を行い、ディファレンシャル解析を行った。分子量 100 kDa、等電点 5 付近に著名に変動した spot が 1 つ発

‑ 57 ‑

見されたほか、分子量 25 kDa 付近、等電点 4～7 付近で 3 つの spot の変動が確認された。これらの spot に対応する spot をマスターゲルから切り出し、タンパク質同定をする予定であったが、メーカーの細胞コンディション保証分裂回数である 12 回を超えて分裂させた細胞においても、老化した細胞特有の形態変化が認められなかったことから、一時中断した。
その後、細胞分裂をさらに繰り返し、メーカーの保証する正常なコンディションを維持した分裂回数を超えても老化細胞特有の形態変化が認められないことから、細胞分裂を繰り返しての老化モデル調製計画を中断した。
上記の実験を中断し、過酸化水素曝露による細胞の premature senescence（早期老化）の実験に移行した。過酸化水素による細胞毒性を調べるため 96 well plate に細胞をまき、72 時間の pretreatment の後、無血清培地に交換して 100～250 M の過酸化水素に 4 時間曝露させ、MTT 試験を行った。いずれの濃度においても細胞生存率は 80%程度であった。次に、60 mm
dish にまいた細胞に同じ条件で過酸化水素を曝露し、老化関連タンパク質の発現量をウェス
タンブロッティング(WB)により解析した。p53 と TGF-1 について、250 M を除き、4 時間の過酸化水素曝露により濃度依存的な発現上昇が認められた。p53 と TGF-1 は 200 M の過
酸化水素曝露において最大の発現を示し、発現量はそれぞれ 138%と 162%であった。一方で、
p53 により発現誘導されることが報告されている 14-3-3 においては、いずれの過酸化水素濃度においてもほとんど変化が認められなかった。
SIRT1 と AMPK1 は 150～250 M の濃度で、それぞれ 55～61%、60～70%の発現減少を示した。
AMPK2 は、100 M の過酸化水素濃度で増加を示し、他の濃度においては control とほとんど変化がなかった。
柴胡桂枝湯エキスの抗老化効果を検証するに先立ち、エキス自身の細胞毒性を調べた。0.1～250 mg/mL の濃度の柴胡桂枝湯エキス入り培地および 100、200 M のアスコルビン酸入り培地で細胞を 48 時間培養して MTT 試験をしたところ、2.5 mg/mL 以上の濃度で細胞毒性を示した。一方、アスコルビン酸培地は細胞毒性を占め差なった。そこで、0.1、0.5、1.0 mg/mLの柴胡桂枝湯エキス入り培地の抗老化効果を調べることとし、200 M アスコルビン酸入り培
地を陽性コントロールとして選択した。
上記と同様に、60 mm dish に細胞をまいて 24 時間後に柴胡桂枝湯エキス入り培地あるいはアスコルビン酸入り培地に交換して 48 時間培養し、無血清培地に交換後 200 M の過酸化水
素に 4 時間曝露させた。細胞ライセートを回収後、上記タンパク質群について WB 解析を行った。柴胡桂枝湯エキスは、濃度依存的に p53 と TGF-の発現を抑制した。14-3-3- protein に対しては、発現の変動をもたらさなかった（アスコルビン酸も同様）。SIRT1 に対しては、いずれの濃度においても早期老化による発現減少を抑制することはできなかったが、これはアスコルビン酸も同様であった。一方、AMPK1 に対しては、濃度依存的に発現増加が認められ、早期老化による AMPK1 の発現減少を抑制していた。AMPK2 に対しては、変動を‑ 58 ‑

もたらさなかった。

７．研究の考察・反省
NHDF を過酸化水素曝露させることによって、老化関連タンパク質である p53、TGF-、
AMPK1、SIRT1 の発現変動を生じさせることができたことから、早期老化の実験として適したモデルによって実験を行えたと考える（ただし p53 により発現誘導される 14-3-3 や
AMPK1 のファミリーである AMPK2 において過酸化水素曝露の影響が認められなかった点については今後、検討が必要である）。細胞老化モデルにおいて、柴胡桂枝湯エキスは細胞毒性を生じない濃度において、p53、TGF-の発現増加を抑制し、AMPK1 の発現減少を抑制できていたことから、抗老化効果をもつ薬の候補であると考えられる。上流タンパク質である AMPK1 の発現減少が抑制できているにも関わらず SIRT1 の発現減少を抑制できなかった
問題点については、リン酸化 AMPK1 の存在が SIRT1 の発現に必要であることから、リン酸
化 AMPK1 の発現量もあわせて WB を行い、検討するべきであるという考察をし、今後の早期老化実験の課題であると考える。

８．研 究 発 表
本研究について、論文投稿のため執筆中。

※本研究は、ウェルナー症候群患者皮膚由来線維芽細胞を使用する計画であったが、細胞の提供を受けることが困難になり、研究計画等を変更することとなった。

‑ 59 ‑

１．研究課題名：炎症の抑制因子 SLPI によるアレルギー疾患制御機構の解明（研究番号 S2011-12）

２．キーワード：１）secretory leukoprotease inhibitor２）好塩基球 (basophils)
３）好酸球 (eosinophils)４）サイトカイン (cytokine)５）アレルギー (allergy)

３．研究者氏名：松葉慎太郎・医学部・助教・免疫学

４．研 究 目 的アレルギー反応のエフェクター細胞はマスト細胞、好塩基球、好酸球からなる。これらの細胞は抗原刺激により、ヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質や様々なサイトカ
インを産生するが、この他にもキマーゼやカテプシン G、さらにはエラスターゼなどのプロ
テアーゼを産生することが知られている。一方、生体には炎症性プロテアーゼを抑制するイ
ンヒビターも存在する。代表的なプロテアーゼインヒビターとして気道上皮細胞から産生される secretory leukoprotease inhibitor (SLPI) が知られているが、近年、SLPI は気道上皮細胞のみならず様々な免疫担当細胞から分泌されており、NF-B の転写活性を抑制するなど多彩な作用があることが判明している。また SLPI 遺伝子欠損マウスを用いた解析から、SLPI は敗血症に対する抑制作用も明らかになっている。このように気道上皮細胞やマクロファージ、好中球における SLPI の機能が明らかにされているが、マスト細胞、好塩基球、好酸球においては発現すら確認されていない。また、アレルギー疾患におけるプロテアーゼインヒビタ
ーの役割は不明である。そこで本研究では炎症の抑制因子 SLPI によるアレルギー疾患の新規制御機構の解明を目的とし、SLPI 遺伝子欠損マウスを用いた解析を行った。

５．研 究 計 画
(1) マウス骨髄より誘導したマスト細胞、好塩基球および好酸球における SLPI の発現を免疫染色や定量的 RT-PCR 法などにより解析した。
(2) SLPI 遺伝子欠損マウス骨髄よりマスト細胞、好塩基球および好酸球を誘導し、これらの細胞の様々なリガンド刺激によるサイトカイン産生に及ぼす SLPI の影響を検討した。
(3) FcR遺伝子欠損マウスに B6 あるいは SLPI 遺伝子欠損好塩基球を移入し、遅延型皮膚ア
レルギー反応による耳介肥厚を測定することにより、好塩基球における SLPI の機能を検討した。

‑ 61 ‑

６．研 究 成 果(1) マスト細胞、好塩基球、好酸球における SLPI の発現解析
C57BL/6 マウス骨髄よりインターロイキン-3 にてマスト細胞や好塩基球、Flt-3、Stemcell factor およびインターロイキン 5 にて好酸球を誘導した。これらの細胞からそれぞれ
ライセートを調製し、ウエスタンブロットにより各ライセートにおける SLPI の発現を確認した。その結果、好中球と比較してマスト細胞は約 0.26 倍、好塩基球は約 22 倍、好酸球は約 1.96 倍となり、好塩基球において極めて高発現していることを見いだした。また、
抗 SLPI 抗体を用いた蛍光免疫染色の解析において、SLPI は細胞質内に存在することが明らかとなった。一方、これらの細胞から Total RNA を抽出し、定量的 RT-PCR 法によって
SLPImRNA を定量した結果、その発現量は骨髄細胞に対して好塩基球で約 35 倍、好酸球
で約 1.5 倍、マスト細胞で 0.04 倍であり、ウエスタンブロットによる結果と同様に好塩基球および好酸球に強く発現していた。これらの結果から、SLPI は好塩基球および好酸球に発現していることが明らかとなった。
(2) リガンド刺激によるサイトカイン産生応答性についての検討
好塩基球および好酸球における SLPI の役割を検討するために、SLPI 遺伝子欠損マウスの骨髄より好塩基球および好酸球を誘導し、これらの細胞の IgE や LPS などのリガンド刺激によるサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。その結果、SLPI 遺伝子欠損好塩
基球は C57BL/6 に対して、IgE または LPS 刺激によるインターロイキン-4,6, 13 産生が亢進していた。また、SLPI 遺伝子欠損好酸球においても、LPS 刺激による IL-6 産生が亢進していた。これらの結果から、SLPI は好塩基球において LPS あるいは IgE 刺激によるインターロイキン-4,6, 13 産生を、好酸球において LPS 刺激によるインターロイキン-6 産生を抑制していることが示唆された。
(3) in vivo アレルギーモデルにおける検討
アレルギー反応は即時型と遅延型に分類され、即時型は主にマスト細胞、遅延型は好塩
基球および好酸球により惹起される。上記 (1) (2) の検討おいて、SLPI は好塩基球および好酸球において発現し、これらの細胞のサイトカイン産生を制御していることが判明した
ため、我々は FcR遺伝子欠損マウスに C57BL/6 あるいは SLPI 遺伝子欠損好塩基球を移入し、遅延型皮膚アレルギー反応による耳介肥厚を測定することにより、好塩基球における SLPI の機能を検討した。その結果、SLPI 遺伝子欠損好塩基球を移入した群は、C57BL/6
好塩基球を移入した群に比べて、より強く耳介の肥厚が確認された。この結果より、SLPI
は好塩基球を主体としたアレルギー反応を抑制している可能性が示唆された。

７．研究の考察・反省
本研究において、SLPI は好塩基球および好酸球に発現し、これらの細胞におけるサイトカ
イン産生を抑制し、好塩基球を主体とした遅延型皮膚反応を制御している可能性が示された。

‑ 62 ‑

アレルギーのエフェクター細胞におけるプロテアーゼインヒビターの発現パターンおよび機能がほとんど不明である中、好塩基球や好酸球における SLPI の働きの一端を明らかにできたことは、現在も増加傾向にあるアレルギーの発症機序の解明や新たな治療法の確立につながる有意義な結果と思われる。しかしながら、好塩基球や好酸球内での SLPI のサイトカイン産生抑制機序やリコンビナント SLPI を用いた実験など検討すべき課題はまだ多くあり、今後はこれらの点を中心に解析を進めたいと考える。

８．研 究 発 表なし。

‑ 63 ‑

１．研究課題名：外来で術後補助化学療法を受ける消化器がん患者のマネジメント能力、自己効
力感、QOL の関係（研究番号S2011-13）

２．キーワード：１）化学療法 (chemotherapy)２）がん外来患者 (cancer outpatients)
３）大腸がん術後患者 (postoperative colon cancer patients)４）セルフマネジメント (self-management)
５）症状 (symptoms)
３．研究者氏名：北村佳子・看護学部・助教・成人看護学

４．研 究 目 的2002 年の診療報酬改定以降、病院内に外来化学療法室が整備されている。それに伴い、外来で化学療法を受けるがん患者数は増加している。患者は、医療者がいない環境で療養行動を実施することとなる。それゆえ、セルフケアを実施できることが患者の目標となり、看護師には、患者が十分な情報から自分で考え、セルフケアを実行・継続できるセルフマネジメ
ント力を向上させるための教育が求められる。今回は、手術後に長期化学療法が必要な大腸がん患者に注目した。
大腸がん術後患者に関するセルフマネジメント教育に関する先行研究はない。大腸がん術
後患者の特徴として、手術によって排泄機能に障害が生じる上、長期に及ぶ術後化学療法による有害事象が加わり、生活上の調整が必要となる点がある。しかしながら、症状の体験が不明であるため、セルフマネジメント力を向上させる教育のあり方を検討するに至っていない。
本研究は、外来でがん化学療法を受ける大腸がん術後患者の症状の体験を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
１）研究デザイン：質問紙による実態調査。２）対象者：Ａ病院外来で化学療法を受ける大腸がん術後患者 38 名。３）データ収集方法：（１）対象者の概要：性別、年齢、術式、手術後経過期間、化学療法開始後経過期間、化学療法の内容、Performance Status（以後、PS と示す）。（２）症状の体験：栄養状態の変化、排泄の変化、身体可動性/皮膚統合性/神経学的変化、安楽の変調、ボディーイメージの変化、心理社会的変化。計 25 項目。４）調査方法：面接による聞き取り調査。５）調査期間：平成 23 年 10 月から 1 年間。６）分析方法：記述統計。７）倫理的配慮：対象者に研究の目的、方法、プライバシー保護など文書と口頭で説明し、同意書のサインをもって同意とした。金沢医科大学臨床研究倫理審査会の承認を得て実施した（受付番号 176）。

‑ 65 ‑

６．研 究 成 果
１）対象者の概要（表 1）
性別は、男性 27 名、女性 11 名であった。平均年齢は、67.1 (SD±9.7) 歳であった。人数の多かったものは、術式は低位前方切除術、手術後経過期間は 2 ヶ月から 6 ヶ月と 13 ヶ月
以上、化学療法開始後経過期間は 2 ヶ月から 6 ヶ月、化学療法の内容は FOLFOX/XELOX、
PS は 1 であった。症状の体験の自覚がありと回答した人は 28 名で、なしと回答した 10 名
より多かった。
２）症状の体験と PS の関係（表 2）
栄養状態の変化と PS は、一致していた。また、排泄の変化、身体可動性/皮膚統合性/
神経学的変化、心理社会的変化は、PS とは一致していなかった。なお、安楽の変調、ボディーイメージの変化は、PS にばらつきがあった。
３）症状の体験の自覚
症状の体験がなしと回答した人 10 名全員に症状の体験が、実際にはあった。具体的には、栄養状態の変化では 8 名（80.0％）、排泄の変化では 6 名（60.0％）、身体可動性/皮膚統合性/神経学的変化では 5 名（50.0％）、安楽の変調では 1 名（10.0％）、ボディーイメージの変化では 2 名（20.0％）、心理社会的変化では 4 名（40.0％）であった。
７．研究の考察・反省
１）症状の体験と PS の関係について
本研究結果より、排泄の変化、身体可動性/皮膚統合性/神経学的変化、心理社会的変化と PS は、一致していなかった。特に、心理社会的変化では PS が低くても生活が脅かされていると感じていた。つまり、PS のみでは心理社会的変化が見落としやすいので、その側面でのアセスメントが重要であるといえる。
２）症状の体験なしと回答した 10 名について
症状の体験を自覚していないと回答した患者全員が症状の体験があった。したがって、症状に関する知識を患者が持っておらず、セルフマネジメントに影響する恐れがある。
３）看護への示唆
外来化学療法を受ける大腸がん術後患者のセルフマネジメント力を向上させる教育として、①起こり得る症状に関する十分な情報提供や適宜確認していくこと、②心理社会的側面でのアセスメントを行うことが重要であることが示唆された。
４）反省点
今回は研究対象者が 38 名と少なく、対象者の概要に偏りがある。今後は、セルフマネジ
メント力向上させるケアの方向性を導くために研究を重ねて検証していく。
８．研 究 発 表
該当なし

‑ 66 ‑

表1
項目
性別対象者の概要内容
男性
女性

NorMean
27
11
67.1
11
10
07
05
0 3
02
06
14
04
14
07
15
08
08
15
11
03
02
02
05
12
17
0 09
10
28

年齢
術式

低位前方切除術
S状結腸切除術
回盲部切除術右半結腸切除術
下行結腸切除術
横行結腸切除術
手術後経過期間
0～1ヶ月以内
2ヶ月～6ヶ月
7ヶ月～12ヶ月
13ヶ月～
化学療法開始後経過期間
0～1ヶ月以内
2ヶ月～6ヶ月
7ヶ月～12ヶ月
13ヶ月～
化学療法の内容
FOLFOX/XELOX
ベバシズムマブ併用化学療法
FOLFIRI/CPT-11
パニツムマブ併用化学療法
5Fu/L-LV
その他（CPT-11、UFT/LVなど）
PS
0： 全く問題なく活動できる
1： 歩行は可能だが軽作業や座っての作業は可能
2： 身のまわりのことは可能、作業はできない
なし
症状の体験
あり
表2
項目

（N=38）
％orSD
71.0
28.9
09.7
28.9
26.3
18.4
13.1
07.8
05.2
15.7
36.8
10.5
36.8
18.4
39.4
21.0
21.0
39.4
28.9
07.8
05.2
05.2
13.1
31.6
44.7
23.7
26.3
73.6

症状の体験と PS の関係（％）

0（N＝12）N （％）

P S
1（N＝17）N （％）

2（N＝9）N （％）

全体（N＝38）
N

栄養状態の変化
食欲がない
食事の摂り方が変わった
体重が落ちた
身体がだるい・疲れやすい
元気がでない吐き気がある
排泄の変化
便の性状や回数が変わった
尿の性状や回数が変わった
排泄に関わる苦痛を感じている
排泄に関わる心配事のため外出できない
身体可動性/皮膚統合性/神経学的変化
皮膚に痛みや痒みがある
しびれがある
爪や爪周囲の変化
筋肉や関節の痛みがある
皮膚の乾燥や亀裂がある
むくんでいる
安楽の変調
眠りが浅い、眠れない
気持ちが落ち着かない
ボディーイメージの変化
髪の毛が抜ける
自分自身に対する感じ方が変わった
心理社会的変化家事や仕事に支障が生じている症状を軽減するために費やすエネルギーが大きい
自分の生活が症状に脅かされている
自分の大事な人や物とのつながりが感じられない

17（44.7）

04（33.3）7（41.1）

6（66.6）15（39.4）
13（34.2）
06（15.7）04（10.5）02（05.2）

04（33.3）03（25.0）01（08.3）
01（08.3）
01（08.3）7（41.1）6（35.2）3（17.6）1（05.8）0（00.0）4（44.4）4（44.4）2（22.2）2（22.2）
1（11.1）23（60.5）07（18.4）05（13.1）
05（13.1）

11（91.6）
02（16.6）03（25.0）03（25.0）9（52.9）2（11.7）2（11.7）2（11.7）3（33.3）3（33.3）0（00.0）0（00.0）09（23.6）
07（18.4）05（13.1）
05（13.1）
03（07.8）02（05.2）

01（08.3）
02（16.6）
01（08.3）00（00.0）00（00.0）01（08.3）

4（23.5）4（23.5）3（17.6）4（23.5）2（11.7）0（00.0）4（44.4）1（11.1）1（11.1）1（11.1）1（11.1）1（11.1）09（23.6）
01（02.6）

04（33.3）00（00.0）2（11.7）0（00.0）3（33.3）1（11.1）05（13.1）
04（10.5）00（00.0）02（16.6）

3（17.6）1（05.8）2（22.2）
1（11.1）14（36.8）
13（34.2）
10（26.3）
02（05.2）

03（25.0）04（33.3）05（41.6）00（00.0）5（29.4）6（35.2）3（17.6）1（05.8）6（66.6）3（33.3）2（22.2）
1（11.1）‑ 67 ‑

２０11

平成 23 年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書編 集
発行所

平成 25 年 12 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

禁無断転載