博 士（ 理 学 ） 三 浦嘉 晃
学 位 論 文 題 名

DRUG DELIVERY SYSTEM AND ITSMECHANISM
BY 6 ‑O‑CARBOXYMETHYL‑CHITIN（6ー0一カルボキシメチルキチンによる薬物送達とその機構）

学位論文内容の要旨［ 緒言 ］ 医薬 の化 学修 飾あ る いは 高分 子化 合物 や 小胞 体を 利用 し て医 薬の 有効 利用 が
図 ら れ て お り 、 ド ラ ッ グ デ リ バ リ ー シ ス テ ム (DDS)と 呼 ば れ て い る 。 そ の 中 でも 特に 、薬 物 の生 体内 挙動 や血 中 濃度 を制 御す るた め に、 薬物 を高 分 子化 合物 に結 合さ せて 高分 子 化医 薬と する 試み は 、非 常に 期待 され る もの であ る。 一 般に 、普 通用 いら れる 薬物 は 低分 子化 合物 であ る ため に細 胞や 組織 に 容易 に拡 散し て いく が、 反面 、代 謝や 体外 へ の排 泄も 速く 、一 定 量の 医薬 が長 期に わ たり 供給 され る こと が望 まれ る（ 徐放 性） 。 本研 究は 、リ ゾチ ー ムに より 分解 され る 生体 内消 化性 多 糖で ある キチ ンの 水溶 性誘 導 体6． 〇． カ ルボ キシ メチ ル キチ ン(CM‑キ チン ） を低分子医薬 を運搬するための 薬物 担 体に 用い て、 薬物 を 徐放 しう る高 分子 化 医薬 の構 築を 目 的と した 。毒 性・ 抗原 性等 を 考慮 に入 れ、 アミ ノ 酸あ るい はジ ペプ チ ドを スペ ーサ ー に用 いて モデ ルド ラッ グ を CM‑キ チ ン に 共 有 結 合 に よ り 導 入 し て 、 数 種の 高分 子化 医 薬を 合成 した 。CM‑
キ チン は 、リ ゾチ ーム によ っ て加 水分 解さ れる の で、 薬物 を担 持 する 結合 を蛋 白質 分
解 酵素 に 受容 性を 有す るよ う に分 子設 計す ると 、 薬物 の放 出に は 少な くと も二 段階 の加 水分 解 が介 在す るこ とと な る。 この 過程 を「 二 段階 徐放 」と 位 置付 け、 調製 され た
CM‑キ チ ン − 医 薬 結 合 体 の 酵素 加水 分 解に よる モデ ルド ラ ッグ の放 出挙 動 と分 子量 依
存 性 の 観 察 か ら CM‑キ チ ン を用 いた 高 分子 化医 薬に よる 薬 物徐 放性 の発 現 およ びそ の機構を検討した。
［ 実験 ］ 高分 子化 医薬 中で の 薬物 の結 合様 式を 、 アミ ド結 合と エ ステ ル結 合と する ため、モ デル薬物としてp‐ニトロア ニリン（pN A)とp．ニトロフェノール（ONp)を用いた。
フェニルアラニン（‑Phe−）．グリシルフェニルアラニン（‑ Gly‑Phe‑）．アラニルフェニルアラニ ン（‑Ala‑Phe‑）及び4‐アミノブチリルフェニルアラニン（‑Abu‑Phe‑）のフェニルア‑74―ラニンのカルボキシル基にpNAを導入して、アミド系の高分子化医薬を設計した。工ステル系の分子設計では、一般的に言われるその不安定性を考慮して、非天然アミノ酸である4‐アミノ酪酸・アミノイソ酪酸・アミノカプ口ン酸を用いてONpを導入した。
薬物放出にかかる加水分解酵素としてりゾチームとa‑キモトリプシンを指標として用いinvitro
モデル系での二段階徐放発現を評価した。薬物徐放性と高分子化医薬の分子量との関連を見るため、それぞれのモデル化合物をあらかじめ第一段階であるりゾ
チーム加水分解反応により担体高分子の分子量を小さくしておき、第二段階の酵素加水分解反応を行なった。さらに、医薬結合体の分解過程を見積るためにりゾチームによる加水分解反応を詳細に観察した。毒性（免疫原性）の検討には、ウサギをC
M‑
キチン―薬物結合体のモデル化合物で免疫し、それらの免疫応答をみた。また、CM‑
キチン． C
a2+複合体の疎水性アミノ酸吸着能を利用したペプチド医薬の安定化についても耐酵素加水分解反応性から検討を試みた。C
M‑
キチン．C
a2+複合体による吸着能解明の一環として、X線吸収端微細構造（EXAFS）法により、カルシウムのCM‑キチン中における局所環境を観察した。
［結果・考察］アミド型医薬結合体のa‑キモトリプシンとりゾチームによる同時加水分解を行なったところ、特にスペーサーがアミノ酸一残基からなる化合物では、薬物の放出が顕著に薬物結合体の分子量によって支配されることが明らかとなった。a．キモトリプシンによる活性医薬放出の過程を種々の分子量の薬物結合体を用いて速度論的に解析した。その結果、スペーサーの分子設計と医薬結合体の分子量が「二段階徐放」発現に大きく寄与することが示唆された。っまり、高分子量時においては、担体のC
M‑キチン分子がカルシウムとのキレートによる疎水性アミノ酸吸着能を含んだ様式で医薬を包接することで酵素の接近を妨げ、リゾチームによって低分子化されるにっれて、スペーサー・薬物部分が露出されることとなり、そこでは低分子基質として容易に活性薬物が放出されることが明らかとなった。一方、エステル型薬物結合体では、天然のアミノ酸をスペーサーに用いても有意な医薬の徐放性が達成されなかったが、非天然アミノ酸をスペーサーに用いることで所期の目標を達成しうることが示された。
C
M‑キチン・薬物結合体の生体内分解を類推するため、薬物導入量の異なる医薬結合体と担体のC
M‑キチンそれぞれのりゾチームによる加水分解反応の速度論的解析を75行なったところ、薬物分子のCM‑キチン分子への導入は、酵素受容性を顕著に増大させることが見いだされた。またそれに伴いりゾチームは、C
M‑キチンの薬物結合部位近傍を優先的に切断していくことも示唆された。その結果、比較的高分子量の医薬結合体が残されながらも、次の酵素加水分解に受容性の高い低分子量医薬結合体が生成されることが確認された。以上の結果は、「二段階徐放」の発現を理論的に説明する有カな証拠となるであろう。
また、担体高分子自体に免疫原性が無くとも他の分子を導入することで免疫原性を示す場合があるため、毒性に関する評価も重要な課題である。そこで、アミド型とエステル型のC
M‑キチン‐薬物結合体をそれぞれ丶ウサギに免疫した。その結果、三0月間にわたる免疫でもそれらの抗血清はC
M‑キチン・薬物結合体に対して有意な免疫応答を示さず、本研究における分子設計では安全性も高いことが示唆された。これはおそらく、CM‑キチンの水溶性と高い生体内消化性に起因するもので、CM‑キチンの薬物担体としての優位性が示されたといえる。
疎水性分子吸着能を有するC
M‑
キチン‐Ca2+複合体をX線回折法で調べたところ、低置換度CM‑キチンでは部分的にキチンの結晶構造が保たれていた。またその複合体のカルシウムの局所構造をEX
A
FS法で観察すると、高置換度CM‑キチン及び酢酸カルシウムには共通の情報が得られたが、低置換度C
M‑キチンに特異的なカルシウムの局所的存在が観察された。従って、CM‑
キチンのカルシウムの特異結合にはその結晶構造に由来するN‑アセチルグルコサミン残基の立体配置が大きく寄与していることが示唆された。また、そのC
M‑
キチン‐Ca2+複合体への吸着によってペプチド性医薬が酵素の攻撃に対して安定化され、CM‑
キチン｜Ca2+複合体から徐放されうることが見いだされた。
以上の結果から、CM‑キチンの薬物徐放性担体としての有効性か明確に示され、「二段階徐放」の達成が適切な分子設計のもとになされることが見いだされた。また、その徐放を制御する因子についても同定されたので、分子設計ヘフィードバックされることで実用的な医薬結合体も調製されうると思われる。これらの知見は、CM‑キチンにとどまらず、高分子化医薬を設計する際の普遍的な指標ともなりうるであろう。

‑76学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 戸倉清 一
教授 引地邦 男
教授 山岸晧 彦
助教授 西 則雄

学 位論 文題 名
DRUG DEL
IVERY SYSTEM AND ITS MECH
ANISM BY
6→〇゜CARBOXYMETHYL‑CHITIN（ 6‑0‑カ ル ボ キ シ メ チ ル キ チ ン に よ る 薬 物 輸 送 と そ の 機 構 ）近年医薬の著しい進歩により人間の寿命が延びた反面、医薬の副作用による被害も非常に多くなり、社会的な注目を浴びる事件も多く成りつっある。従って新しく医薬を開発するためには、この副作用を念頭に置いた研究が要求されるように成ってきた。
しかし医薬の副作用を投与形態の側から見ると経口投与にしろ注射にしろ、動物体内での拡散速度が高いため一度に多量投与する結果、医薬の血中濃度が異常に高く成るためである。また多量投与しなければ有効医薬濃度を保てない。この様な副作用を軽減するため高分子物質を用いて医薬を固定化してから投与し、医薬が徐々に血中へ放出されるように分子設計された徐放性医薬か考え出された。しかしながら使われた高分 子 化合 物の 免疫 原性 等の 毒性 のた め実 用化 され てい る のは 極く 僅か であ る。
本申請者はムコ多糖類のキチンが生体内消化性に加えて低毒性である点に注目し、医薬を生体内ヘ輸送する担体として利用することを考えついた。しかしキチンはほとんどの溶媒に難溶性のため、キチン粉末をアルカリ性溶液に分散した不均一系で位置特異的にカルボキシメチル化して6‑0‑カルボキシメチル・キチン（CM‑キチン）なる水溶性誘導体とした。更にその生体内消化性から薬物輸送担体としての適合性を検討した。
論文ではペンダント型徐放性医薬をモデルとしてスペーサーペプチドのアミ丿酸構成と 免 疫 原 性 及 び 生 理 条 件 下 で の 医 薬 安 定 化 に つ い て も 検 討 し て い る。

77ー

こ の研究は 異物に 対し非 常に敏 感に反 応して 抗体を 産生す るケース を想定 した場 合、最 も 初 歩 的な 研 究 と して 要 求 さ れる も の を 対象 と し て いる 。 即 ち アミ ノ 酸 2‑3残 基から 成 る ス ペ ー サ ー ペ プ チ ド の 末 端 残 基 を 免 疫 原 性 の 比 較 的 高 い フ ェ ニ ル アラ ニ ン（ Phe） を 配置 し て 医 薬と の 結合 点がキ モトリ プシン 系ペプ チダーゼ で加水 分解さ れる
よ う に分子 設計し ても抗 体産生 は見ら れなし 、ことを 明らか にして いる。 この場 合医薬と ス ペ ー サー ペ プ チ ドと の 結 合 がア ミ ド 結 合の 場 合 生 体条 件 下 で も、 担 体 の CM‑キチン が 加 水 分解 さ れ て 低分 子 量 化 が起 こ る ま では 医 薬 の遊離 が見ら れない が、エ ステル
結 合 の 場 合は 生 体 条 件下 で は 直 ちに 加 水 分 解さ れ て 医薬の 遊離が 観察さ れるこ とを報
告 し て い る。 こ の 現 象は CM‑キ チ ンが カ ル シ ウム イ オ ン を特 異 的 に キレ ー ト し、 更にそ の キ レ ー ト 面 に Phe側 鎖 の べ ン ジ ル 基 が 吸 着 さ れる 現 象 と 密接 に 関 連 する こ と を
示 唆 し て いる 。 こ の 医薬 の 生 体 内安 定 化 は 医薬 の 副 作用や 医薬を 特定の 臓器等 へ輸送
す る に 際 して 重 要 な 知見 と し て 評価 さ れ る もの で あ る。さ らに申 請者は ムコ多 糖のグ
リ コ シ ド 結合 と 医 薬 とス ペ ー サ ー間 の 結 合 との 加 水 分解反 応の動 力学的 解析を 行い、担 体 側 の グリ コ シ ド 結合 の 加 水 分解 速 度 が スペ ー サ ー医薬 結合の それよ り高く 成るよう に 分子設 計する ことに より、 不活性 医薬で あるプロ ドラッ グをま ず血中 に徐放 させ、次 い で 生 体内 の 特 定 の部 位 で ス ペー サ ー ― 医薬 問 結 合が加 水分解 され活 性医薬 に転換
さ れ る と 言う 、 全 く 新し い 高 分 子医 薬 に よ る

二 次 元徐放 機構を提案 してい る。申請 者 等 が 見い 出 し た マウ ス 静 脈 注射 後 の CM‑キチ ン が 、 生体 内 消 化 でオ リ ゴ マー 化され 骨 髄 に 特異 的 に 集 約さ れ る こ とを 考 え 併 せ、 リ ン パ球産 生制御 等の面 から非 常に興味 深 い 機 構 と し て 注 目 さ れ て い る 。 な お 、 こ の 研 究 が 1992年 度 ア メ リ カ 化 学 会 春季 年会

高分子 医薬の 生体内 輸送に 関するシ ンポジウム

6回国 際医薬 輸送シ ンポジ ウム（サンフランシスコ）及び第（1993年2月 23日ユ 夕大学） で各々 招待講 演に指 定された ことは 注目度 の高さ を表わ してい るものと 考えら れる。
以 上 の様 に 、 本 申請 者 は 医 薬徐 放 に 関 して 担 体 に 求めら れる諸機 能の中 でも最 も基
本 的 な 、 担体 の 生 体 内加 水 分 解 作用 、 二 次 元徐 放 機 構に於 けるス ペーサ ーの特 性、医薬 の 生 体 内安 定 性 と 担体 分 子 量 との 関 係 及 び安 全 性 の基準 ともな る免疫 原性等 について 詳 し く 検討 し 、 新 しい タ イ プ の高 分 子 医 薬へ の 道 を切り 拓いた と言え る。審 査員一
同 は 、 申 請 者 が 博 士（ 理 学 ） の学 位 を 受 ける の に 充 分な 資 格 を 持っ も の と 認め た 。

78―