博 士 （ 医 学 ） 合 田 千 穂．学位論文題名Inv
olv
ementofI
I」―32inactiv
ation−inducedcelldeathin
Tcells(
IL―32のT細胞の活性化誘導細胞死への関与）

学位論文内容の要旨
Natural Kill
er cell tran
script
4（以下NK4)は、活性化NK細胞から得たcDNAライブラりにおいて発現が増強している転写物として同定され た。その遺伝子は染色体16番に存在し、4つのアイソフオームが報告されている。最近、IL‑18、11‑
1ロ、IFN‑ッ、IL‑12のような炎症性サイト
カイン刺激によって、NK4はある種の細胞株で誘導され、さらに単球系細胞株において、細胞外から作用してtumor necrosisfactor（以下TNF)、MIP−2、IL‑8の産生を誘導することが示された。
これらの知見からNK4はI
L‑32と再命名された。しかしながら、IL一32の生物学的活性は依然として不明な点が多く、IL‑32は細胞内で働くのか細胞外で働くのかも未だ議論のあるところである。
今回我々は、I
L一32の細胞内における機能を検討したので報告する。
（1）I
L‑32はT細胞とNK細胞￣瑚騎Iされる
我 カは まず 、プ ライ マリ ーのT細胞とN
K細胞、B細胞におけるI
L‑32の発現を 調べた。その結果、 活性 化し たヒ トT細 胞と NK細胞においてI
L‑32の発現増強がみられたが、B細胞をI
L‑4と抗エgM抗体、抗CD40抗体刺激しても強い発現誘導はみられなかった。
（ 2） 活 性 化 T細 胞 に お い て は ア イ ソ フ オ ー ム の う ち IL‑32ロ が 優 位 に 発 現 し て い た
次に活性化T細胞に おいてどのアイソフオームが主に発現しているかをR
T
一P
C
Rにより調べたと
ころ、67%がIL
一32ロ であった。このときわれわれは、新規アイソフオームとしてIL‑32EとIL‑32くを同定した。さらにウサギポリクローナル抗体を作製し、ウエスタンブロッティングを行った
ところ、タンパク質レ ベルでも活性化T細胞とNK細 胞で発現誘導されるのはI
L‑32ロであることが確認された。
（ 3） 8ctivation‑indu
ced cell death(AICD)を起 こし てい るT細 胞で はIL‑32が特 異的 に 発現している
T細胞 を抗 CD3
抗 体で 刺激 する とAICDを 誘 導す るこ とが知られている。T細胞を抗CD3抗体で刺激した後T
UNEL
アッ セイを行い、I
L一32の発現フローサイトメトリーで調べたところ、IL‑32発
現とTUNE
Lシグナルに相関が認められた。また、同 様にI
L一32発現は活性化カスパーゼ3シグナ
ルとも相関を認めだ（4）HeLa細胞においてI
L‑32はアポトーシスを誘導した
H
eLaT
et‑Off/I
L―32細胞を作製し、アポトーシスを評価した。テトラサイクリン除去によりIL‑32発現を誘導するとTU
NEL
陽性細胞が増える一方、こ の状態でRNAiでI
L‑32をノッ クダウンすると
TUNEI，陽性細胞が減少した。
（5）T細胞ではI
L‑32は細胞内で機能している
活性化T
細胞の細胞 溶解液と培養上清を継時的にウエスタンブロッティングでみたところ、培一431−

養72時間で培養上清にI
L一32シグナルを認めた。しかし72時間後には本来細胞質に存在するGAPDHも上清に多くなっていた。これらの結果から培養上清に検出されたI
L‑
32は積極的に分泌されたも の で は な く 、 ア ポ ト ー シ ス に よ り 細 胞 質 か ら 漏 出 し た 可 能 性 が示 唆 さ れた 。
以上より、活性化T細胞において誘導されるIL−32のアイソフオームを同定すると共に、細胞質 に お け る ア ポ ト ー シ ス 誘導 と いう 新 たな 生 物学 的 機能 を見 出 した 。
●― 432ー学位 論文審査の要旨
主査 教授 小野江和則
副査 教授 大 野重昭
主査 教授 畠 山鎮次

学位 論文 題名Involvement of IL―32 in activati
on―induced cell death inTcells(IL−32のT細胞の活性化誘導細胞死への関与）

本 研 究の 内容 は 、（ 1）活 性化 T細胞 、NK細胞 で主に誘導されるIL一32のアイソフオ ームはI
L‑32B
であ り、このIL‑32ロは細胞内タ ンパク質であるこ と、また、（2）HeLa細胞に おいてI
L‑32の強制発現によルアポトーシスが誘導され、T細胞におけるTCR鯉問触こよ るI
L一32の発現とアポトーシス誘導は相関していたこと、以上より、IL‑32は細胞内で作用して、T細胞におけるAICD嚠幾序に関与し ていると考えられる 、という発表であ った
質疑応答は 、最初に副査の畠 山鎮次教授から(DIL‑32ロが 分泌されていないとする根拠について。（回答）シグナルシー
クエンスを持 っていないこと、 上清と細胞溶解液の ウエスタンブロッ ティングの結果お よび、免疫染色の結果から細胞内タンパク質で あると考える。 IL‑32ぱr
細 胞・NK細胞ピf外の細胞では発現していないのカ丶（回答）ユビキタスに他の組織や細胞でもみ られる。＠アポトーシスの経路のどこで働いているカゝ。（回答）現段階では不明。＠疾患との隱童にっいて。
（回答）先の 免疫学会でりウマ チ患者の滑膜で発現 のA
進が みられたと報告があ ったが、まだ疾患 については調べていなレヽ。以上4つの質問と その回答があった 。最後に今後眼疾 患でも調べてみるよう提言があった。次に副査の大野重昭教授との間では以 下の質疑と応答があった。＠卿胞内で働いているとするとインターロイキンという命名についてどう思うカゝ。
（回答）他施 設においてりコン ビナントIL‑32
タンパク質を肺癌細胞昧であるA
549などの―ヒ皮系細胞に細胞外から作用させてTNFの分泌がみられて いるため、分泌タ ンパク質であるこ とを否定するのは難 しいが、今回の実 験ではI
L‑32yはロにス
プライシング されることや、C末にHisタグをっけた I
L一32ッを強糾発 現させて上清を免 疫沈降しても発現がみられなかったことから、 上清に分泌されて いないのにインタ ーロイキン という名牽舛識封弛勧ミある。◎眼における発現粒は。回答）免疫組織 染色では眼のいず 加の細織にもみられ たが、角膜上皮でも輪部幹細胞にはみられす蠱丶中央の細胞にみられ、水晶体上皮は 中央で発現が少な く、赤道部の細胞に みられたことから 、増殖する細胞よ りは分化した細胞に発現していると考えている 。◎I
L‑32を増強するまたは 抑制する薬剤など の有無について。（回答）薬剤はいまのところ増強するものも抑制するもの も見っかっていな いが、上皮系細胞に おいてIL‑18、IL一1ロ、I
L‑12、IFN‑vにより発現が誘導されることが報告されてい る。最後に眼疾患 においてアポトーシ スが関連している 疾患はべーチェッ ト病をはじめとして多数あることから 、 眼疾 患に おけ るI
L‑3a0発現につい て今後研究をすす めるよう提言があ った。最後に主査の 小野江和則剃受か ら＠
I
L‑32新規アイソフオー ムである￡、くに ついては機能解析を行っているか（回答）行っていない。（至NKr細胞では発現しているか（回 答）調べていなぃ、。にっいての質問とその回答があった。また、方法論において、経路の違う莉黼：を行っているが、機能 を探っていく上で 牽I
甓鮒ま そろえるべきであ るという提言があっ た。
本研 究 は、 IL‑32のT細 胞に お ける 局在 と 新た な機 能 解析 を解 明 した 点で 高 く評 価さ れ、今後様々な細 繃粥よU
竢 患にお け る IL・ 32の 役 割 が 検 討 さ れ 、 臨 繭 こ お い て 病 態 の 解 升 潮 台 療 へ の 応 用 が 期 待 さ れ る 。
審査 員 一同 は、 こ れら の成 果 を高 く評 価 し、 大学 院 課程 にお ける研鑚や取 得単位なども併せ申 請者が博士（医学 ）の判立を受ける のに充分な劑各を 有するものと判定し た‑ 433−