博士 （ 水産 科学）高橋潤学位論文題名スサビノリPorphy7:ayez
oe7zszsにおける形質転 換技術 の開発に 向けた 無性胞子 の生理学的研究
学 位論文 内容の要旨

海 産 紅藻 ス サビ ノ リ (Porphyrayezoensis)は 、我が 国の水産 業に茄け る代表的栽 培種であると ともに、 海洋植物 のモデルの 候補と考 えられて おり、研 究基盤技 術の整備が進められてい る。しか しながら、スサビノりをはじめとした海産大型藻類においては、生活環、形態 形 成 およ び 環境 応 答 の分 子 機構 の 解 析に 必 須な形質転 換技術は 未だ確立 されてお らず、海藻 類におけ る分子生 物学的研究 が進まな い大きな 原因とな っている 。その打開に向けて、筆 者の所属 研究室では形質転換技術の基盤となる遺伝子導入法の開発を進めて韜り、最近 、 コ ドン 頻 度を スサビノ りのそれ を適合さ せた改変GUS遺 伝子や改 変螢光タ ンパク質遺伝子を レポータ ーとした パーティク ルガン法 による一 過的遺伝 子発現系 を確立した。しかし、こ の方法は 藻体片を 使用してい るため、 ゲノムへ の遺伝子 導入を考 えた場合、藻体片からの 遺伝子導 入細胞の 単離や選抜 が大きな 問題とな る。筆者 は、この 問題がプロトプラス ト ま たは 単 胞子 を利用す ることで 解決でき ると考え、 本研究に おいて3っ のアプロ ーチでその 検証を行 なった。 具体的には 藻体片か ら遺伝子導入細胞を単離するために、1）プロトプラ スト調整 法の利用 の検討、2） 単胞子大 量放出を可能とする新規人工合成培地の作製、そし て3）単胞 子放出機 構の生理学 的研究で ある。
まず、プ ロトプラ スト調整 法を用いる ことによ って藻体 片から遺 伝子導入 細胞を単離できるかを 検討した 。海洋バ クテリア由 来の細胞 壁分解酵素(AMX)溶液処理とアラントイン処理の 2つ の 方法 を 試し たところ 、5．0mgのス サビノリ 葉状体から AMX溶液を用 いて得ら れたプ ロ ト プラ ス トは 平 均 0.7xl06個 で あっ た 。 しか し なが ら 、 得ら れ たプ ロ トプラ スト―1052―

の再生は確認できなかった。一方、アラントイン添加培地にて培養した藻体をホモジェナイズすることにより得られたプロトプラストは、藻体O． lg当たり平均1xl06個であり、その中の約70％の個体が葉状体へと再生した。このことから、アラントイン処理により調整可能なプロトプラスト数はAMX溶液の場合に比べて、藻体湿重量当たりで換算すると1/14であったが、遺伝子導入したスサビノリ藻体から再生可能なプロトプラストを得る方法としては大変有効であると考えられた。次に、実際にアラントイン処理した藻体にパーティクルガン法にて遺伝子導入を行ない、藻体から一過的遺伝子導入された細胞を単離することを試みた。遺伝子導入後、アラントイン処理した藻体においては遺伝子導入された細胞が藻体片1枚あたり(3.0xl05細胞）約700個の細胞が確認された。また、遺伝子導入後に得られたプロトプラストは藻体1枚当たり約40細胞であり、これは藻体1枚当たりに確認できる遺伝子発現細胞数(700細胞）の約6％に相当するに過ぎなかったが、それらは発芽体へと再生することが確認された。
次に、単胞子の放出を遺伝子導入細胞の単離に利用するために単胞子大量放出を可能とする新規人工合成培地の作製を試みた。所属研究室ではスサビノりの培養には通常ESL培地を用いているが、ESLの作製に用いる市販のSEALIFEの成分組成は公表されていない。
そのため、本研究では以前Provasoliらにより海藻培養用の人工合成培地として開発されたASP12の組成を改変した基本培地ASPMT1を作製した。これを用いて藻体を培養した結果、ESL培地で培養した葉状体と比較して生長量の減少が見られたが、単胞子嚢の形成が促進され、単胞子の放出量が約2倍増加することを見出した。この結果から、ASPMT1を用いるこ と で 藻 体か ら 大 量 の 単 胞 子 を得 る こ と が で き るこ と が 明ら かに なった 。
以上の結果から、スサビノリ藻体片からの遺伝子導入細胞の回収は、アラントイン処理した藻体片を用いることで再生可能なプロトプラストとして可能であること、およぴ人工合 成培地 を用 いる ことで 単胞 子としても回収できる可能性があることが示された。
本研究ではさらに、上記の単胞子の回収をより効率的なものに改良するためには単胞子の形成と放出のメカニズムに関する知見が必須であると考え、人工合成培地を用いた単胞一 1053−

子放出機 構の解析を 試みた。 結果とし て、ASPMT1中に おける単 胞子放出 の増加は培地中のCa2゛含有量 が要因であ ることが 明らかに なった。 実際にASPMT1の組成を改変したところ、ASPMT1中のCa2゛量 を増加させることで単胞子の放出量が少なくなり、逆にCa2゛量を減少させると多 くなった。 このこと から、ス サビノり の単胞子 の放出に は生育環境 における細胞外Ca2゛量の 変動が大き く影響を 及ばすと 考えられ た。また、この単胞子放出が光依存的である こ と、 韜 よ ぴそ れ が光 照 射 条件 下 で も光 合 成阻 害剤(DCMU)を 添加する ことによ り抑制される ことを見出 した。さ らにCa2゛を 細胞内に 流入させるカルシウムイオノフォアを添加するこ とで暗条件 下におい ても単胞 子の放出 が起こる ことがわ かった。こ れらのことから、スサ ビノリ葉状 体に韜け る単胞子 の放出は 、培養培地に含まれるCa2゛量が減少することで光合 成依存的な 細胞外Ca2゛ の細胞内 への流入 が起こり、それが引き金となって単胞子が大量に 放出される と考えら れたため 、現在培 地中のCa2゛濃度の調節による発生可能な単胞子の大 量調整への 応用を試 みている 。
以上のよ うに、スサ ビノりに おける安 定的形質 転換技術 を確立す る上で必須 である藻体片からの 遺伝子導入 細胞の回 収は、ア ラントイ ン処理を 施すこと で回収率は 低いが可能であること 、また新規 の人工合 成培地を 用いるこ とで単胞 子として も回収でき る可能性があることが 示された。 従って、 これらを 利用する ことで遺 伝子導入 細胞の効率 的な培養と選抜が可能 になると考 えられる 。さらに 、人工合 成培地を 用いた実 験により、 これまで明らかにされ ていなかっ たスサビ ノりの無 J陸生殖の 制御機構に関する生理学的知見を得ることができた 。これらの 知見は、 今後スサ ビノリ葉 状体にお ける単胞 子嚢形成船 よぴ単胞子放出を制御 している分 子機構の 解明や効 率的な単 胞子の単 離およぴ とその回収 の技術的な進展に貢献 すると期待 される。

学 位論文審査の要旨
主査 教授 嵯 峨直恆
副査 教授 安 井 肇
副査 准教授 三上浩司
副査 准教授 水田浩之

学 位 論 文 題 名

スサビノリP
orphyrayezoe
7zszs
における形質転 換技術の 開発に 向けた無 性胞子の生理学的研究
海 産紅 藻スサ ビノリ(Porphyra．閃 z
弸ロ 曲Ueda）は 、我が国 の水産 業におけ る代表 的栽培種 であるとともに、海洋植物のモデルの候補と考えられており、研究基盤技術の整備が進められている。
しかしな がら、 スサビノ りをは じめとし た海産大 型藻類においては、それらの生命現象の分子機構の解析に 必須な 形質転換 技術は 未だ確立 されてい ない。スサビノりにおいては藻体片中の細胞に遺伝子 導 入するこ とが可 能となっ ている が、遺伝 子導入 細胞の単 離や選抜 が大き な問題と なって いる。本研 究は、 スサビノ リ藻体 片からの 遺伝子導 入細胞の回収を可能とするためにスサビノりの無性胞子の 生理学 的研究を 行うこ とで、ス サビノり における安定的形質転換技術の確立に貢献することを目的 として いる。
まず、プ ロトプ ラスト調 整法を 用いるこ とによ って藻体片から遺伝子導入細胞を単離できるかを検討した 。海洋 バクテリ ア由来 の細胞壁 分解酵素 溶液処 理とアラ ントイ ン処理の2つの方法を試したところ 、いず れにおい てもプ ロトプラ ストを得 ることができたが、アラントイン処理した藻体片から得ら れたプ ロトプラ ストの みが再生 可能であ った。また、実際にアラントイン処理した藻体片にパーテ ィクル ガン法で 遺伝子 導入した ところ、 藻体片中の遺伝子導入細胞を回収率は低いが、再生可能なプ ロトプラス トとして単 離すること に成功し、 その再生体 も確認できた。
次に、単 胞子の 放出を遺 伝子導 入細胞の 単離に 利用するために単胞子大量放出を可能とする新規人工合成 培地の 作製を試 み、そ れを用い て藻体を 培養することで単胞子嚢の形成が促進され、単胞― 1055ー

子放出 量が増加 すること を見出 した。さ らに、 上記の単 胞子の回収をより効率的なものに改良するために は単胞子 の形成と 放出の メカニズ ムに関 する知見 が必須であると考え、人工合成培地を用いた単胞 子放出機 構の解析 を試み た結果、培養培地に含まれるCa2゛量が減少することで光合成依存的な細胞 外Ca2゛ の細胞内 への流 入が起こり、それが引き金となって単胞子が大量に放出されることを明らか にした。
以上の 結果から 、スサ ビノりに おける安 定的形 質転換技術を確立する上で必須である藻体片からの遺伝 子導入細 胞の回収 は、ア ラントイ ン処理 を施すこ とで回収率は低いが可能であること、また新規の 人工合成 培地を用 いるこ とで単胞 子とし ても回収 できる可能性があることが示され、これらを利用 すること で遺伝子 導入細 胞の効率 的な培 養と選抜 が可能になると考えられた。さらに、人工合成培 地を用い た実験に より、 これまで 明らか にされて いぬかったスサビノりの無性生殖の制御機構に関 する生理 学的知見 を得る ことがで きてお り、これ らの知見は今後スサビノリ葉状体における単胞 子 嚢 形成 およ ぴ単胞子 放出を 制御して いる分子 機構の 解明や効 率的な 単胞子の 単離お よびその回収 の技術的 な進展に 貢献す ると期待 される 。
主 論 文 は 平 成 23年 1月 20日 11時 か ら12時 まで 第 2研究 棟 特 別 講義 室 に おい て 、 審査 員 お よび
関連 教 員 14名 および 一般聴講 26名のも と発表さ れた。 ー般聴講 におい ては、細 胞壁分解 酵素を 用
いて調 整したプ ロトプラ ストが 発生し栓い理由、藻類における形質転換技術の現状、低C
a2゛下における藻 体の成長 について の質問 がなされ た。ま た、審査 員およぴ関連教員においては、単胞子に対しての パーティ クルガン 法の利 用、単胞 子放出 時におけ る藻体の状態、単胞子のノリ養殖への利用および 単胞子放 出機構の その他 のアマノ リ属植 物への応 用について質問がなされた。また、自然界で生育 している スサビノ りの単 胞子放出を考えた場合、海水中のCa2゛の低下は河川水の流入や天候による 影響を考 慮する必 要があ るをどの コメン トがなさ れた。得られた結果は本種に関わる基礎生
物学 の 充 実の みな らず、今 後の海 産藻類の 応用研究 の発展 に大いに 寄与す るものと 評価で きる。
よっ て 審 査員 一同 は申請者 が博士 （水産科 学）の学 位を授 与される 資格の あるもの と判定 した。

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