博士（医学）片岡昭彦

学位論文題名Developmen
t ofaYeast Stop Codon AssayRead
ilyand Generally Applicable to Human Genes（任 意のヒ ト遺 伝子 に即 時適 用可 能な 酵母 スト ップ コドンアッセイの開発）

学位論文内容の要旨
背景、目的
ヒト遺伝子DNAに生じる変異は特殊なものを除けば塩基置換、欠失・挿入が大部分をしめる。さらに塩基置換のうちではナンセンス変異が、欠失・挿入においてはフレームシフト変異となることが多い。このようなナンセンス変異やフレームシフト変異を酵母を用いて効率的に診断する方法が報告され、さらにレポーターの改良でコロニーの色彩で容易に変異を判定することが可能である。この酵母ストップコドンアッセイは優れた遺伝子診断法であるがひとっの対象遺伝子領域に対して専用のベクターが必要なため、新たな対象をアッセイするときはベクターの作成からおこなわねばならず時間、労力、費用を要する。
そこでこの酵母ストップコドンアッセイの利点を損ねず、かつひとつのべクターで多数の遺伝子に対応できる汎用型のストップコドンアッセイ（ユニバーサルストップコドンアッセイ）の開発を試みた。
材料、方法および結果従来のAD．田をレポーターとしたストップコドンアッセイを改変した。その改良、工夫の要点は、相同組み換えに必要なベクター断端部24bpの塩基配列を両端にっけた形で対象
遺 伝 子 領 域 を PCR増 幅 し 、 汎 用 型 線 形 化 ベ ク タ ー を 再 環 状 化 す る こ と で あ る 。
ユニバーサルストップコドンアッセイの概要は以下のとおりである。対象遺伝子領域をこの新たな方法でPCR増幅し、汎用型線形化ベクターとともに酵母内に導入、形質転換する。この際、被検遺伝子領域を創）E．2
遺伝子の上流にin‐frame
挿入しADE2とのキメラ蛋白としてイD口欠損酵母株に発現させる。選択培地で培養しイD田遺伝子発現があれば正常に発育し白いコロニーに、被検遺伝子領域のナンセンス変異やフレームシフト変異により 発 現 が な け れ ば adenine合 成経 路の 中間 代謝 産物 が蓄 積し 赤い コロ ニーと なる 。
この方針のもとにバックグラウンドレベルに影響する自己再環状化の少ない専用ベクターの作成と被検（c）DNAのPCR増幅法を工夫した。
酵母は発芽酵母S．cerevisiae株であるyPH857を使用した。（遺伝子型［MATa甜朋3−H
伽 2‐ 8DJ口 da2‐ J〇 Jカ む 3＿ 42D〇 お pJ‐ 463た 甜 2‐ 4J〔 ツ ´ ￠ R］ ）ベクターはび兄43マーカー遺伝子とCEM4尺S配列、イけりおよびColEl伽fを持ち、CyC
プロモータで駆動されイD．田を発現する酵母／大腸菌シャトルベクターpL
S381を改良した。
被検遺伝子が入る部分での線形化ベクターの自己再環状化を最小限に抑えるのを目的に
CyCプロモーターと創）田遺伝子の聞の切断部位を平滑末端として本アッセイに用いる線状化ベクターpMT18を作成した。

対 象 遺 伝 子 領 域 の 増 幅 は nested PCRで お こ な っ た 。 lst PCRで 目 的 部 位 を 含 む 領 域 を 、2nd PCRで 相 同 組 み 換 え の た め の pMT18の 両 端 24bpと 同 じ 配 列 を 付 加 す る プ ラ イ マ ー で増 幅 し た 。 DNA polymeraseに は 校 正 機 能 を 持 つ Pfu TURBO polymerase (Stratagene)を 、 hot
start法 でlst PCRは10cycle、2nd PCRは30ー35cycleでおこなっ た。
乳 癌 細 胞 株 MCF‑7や ZR‑75‑1な ど よ り 抽 出 し た genomlcDNAを 用 い て 別 ぞ Cイ ´ 遺 伝 子 のexon11（codon224￣1365）を前約2／3（2．2kb）、後約2／3（2．2kb）、中間部約1／3（1．0kb）に分けて 対象 遺伝 子と して アッ セ イを おこ ない 、ベ クタ ーの 自己 再環 状化 の頻 度、 バッ クグラウ
ン ドレ ベル の設 定、 相同 組 み換 えの 精度 、相 同組 み換 え部 の至 適サ イズ 、ア ッセ イ可能な対象遺 伝子の大きさ、変異検出の定 量性の有無などを検討した 。
自己 再環状化の頻度は粘着末端の pSL381と比較し減少した。
バッ クグラウンドレベルは20％未 満で、おおくはlO％以下で あった。
選 択 培 地 上 の 任 意 の 白 コ ロ ニ ー 40個 の す べ て （ 95％ 信 頼 区 間 0． 911‐ 1． ooO） に 目 的 の 遺伝子領 域が組み込まれており十分な 相同組み換えの精度であっ た。
相 同 組 み 換 え の た め の 至 適 塩 基 数 を 決 め る た め 18bp、 24bp、 30bp、 39bpの 場 合 で 検 討 した とこ ろバ ック グラ ウン ド レベ ルで は差 はな かっ たが 、目 的の 遺伝 子領 域が ベク ターに組
み 込 ま れ て い る か 否 か を 調 べ た 結 果 、 39bpの 場 合 で そ の 精 度 は 低 下 し て い た 。 非 特 異 的PCR産 物 や PCR増 幅 不 良 が 原 因 で あ っ た 。 こ の 結 果 よ り 本 法 で は 相 同 組 み 換 え 用 の 塩 基 数を24bpとした。
対 象 遺 伝 子 領 域 の 犬 き さ を 1． 0kbと 2． 2kbで 検 討 し た が い ず れ も 問 題 な か っ た 。
． 野生 型の アリ ルと 人工 的 に導 入し た変 異ア リル を種 々の 比率 で混 合し た検 体を アッセイ
し 、 赤 コ ロ ニ ー の 比 率 を 検 討 す る と 直 線 に 回 帰 で き r O． 99と 高 い 相 関 を 示 し た 。
以 上 の 手 法 で ィ PC遺 伝 子 の exon15の codonll13‐ 1493に つ い て 大 腸 癌 細 胞 株 お よ び 切 除
大 腸 癌 組 織 を ア ッ セ イ し 、 既 存 の イ 尸 Cの ス ト ッ プ コ ド ン ア ッ セ イ と 比 較 し た と こ ろ 同 様 の結果を 得た。
さ ら に ヵ 朋 鰤 6遺 伝 子 の codon170‐ 402を 大 腸 癌 細 胞 株 よ り 抽 出 し た mRNAか ら の cDNAでアッ セイし、HCT15の一塩基欠失 の変異を見いだした。
次 に Bcロ ぬ P′ m遺 伝 子 全 体 を 一 部 オ ー バ ー ラ ッ プ さ せ て 3分 割 し 同 様 に ア ッ セ イ を 行 つた とこ ろ第 一の 領域 にお い て赤 コロ ニー と判 別が 困難 なピ ンク 色の コロ ニー が多 数出現した 。目 的の 遺伝 子領 域は 組 み入 れら れて おり かつ 変異 はみ られ なか った 。こ の原 因としてADE2を 含 む キ メ ラ 蛋 白 の 高 次 構 造 の 影 響 で ADE2の 酵 素 活 性 が 十 分 に 発 揮 で き な か っ た
た め と 考 え ら れ た 。 そ こ で 高 次 構 造 の 変 化 を ね ら い 、 Bcロ ぬ げ 細 と 創 ）五 ，2と の 間に tag配列
で あ る FLAGを 挿 入 し た pMT18nagを 新 た に 作 成 し 、 選 択 培 地 の adenine量 を 増 量 す る ことによ ルコロニーの色彩判別が可能 となった。
考 察、まとめ
任意 のヒ ト遺 伝子 に即 時 適用 可能 な酵 母ス トッ プコ ドン アッ セイ を開 発し た。 新たな対象 遺伝 子領 域の 増幅 のた め のプ ライ マー 設計 から 数日 でア ッセ イが 可能 で、 しか もいちどに 多 数 の 検 体 を処 理で きるた めス クリ ーニ ング法 とし て有 用とお もわ れる 。
本ア ッセ イの 開発 にお い ては 酵母 内で の線 形化 ベク ター の被 検遺 伝子 によ る再 環状化の
際 の 相 同 組 み 換 え の た め の 塩 基 数 が 、 従 来 型 で の l00ー 200bpは 必 ず し も 必 要 で は な く 18
ー 24bpで 十 分 で あ る こ と が 確 認 で き た こ と 、 さ ら に そ の 相 同 組 み 換 え 用 の 配 列 を 被 検 遺 伝
子の両 端に付加して増幅するPCR法 を確立できたことが重要であ った。
E― cロ ぬ e′ 加 遺 伝 子 で 新 た jこ pMT18の 一 部 改 変 な ど が 必 要 で あ っ た が 、 こ れ は 本 ユ ニ バ ー
サ ルス トッ プコ ドン アッ セ イに 限ら ず従 来型 の酵 母ス トッ プコ ドン アッ セイ でも 共通の問
題 であ る。 今後 さら に対 象 とする遺伝子が増せば新たな問題が生じる かもしれない。また、― 222―

PC
R増幅に難渋する遺伝子配列もあろうが、本アッセイは対象遺伝子領域を容易に変えることができるため従来型よりも対応しやすいとおもわれる。
さらに、本法は約2kbまでの遺伝子断片をクローニングする方法としても有用で、たとえば白コロニーからの野生型のライブラリー作成やミスセンス変異の同定に利用することも考えられる。
ポストゲノム時代においての有用なアッセイのひとっとなりうるものとおもわれる。

― 223―

学位論文審査の要旨

主査教授浅香正博
副査教授守内哲也
副査教授藤堂 省
学位 論文 題名
Development ofaYeast Stop Codon Assay Readily
and Generally Applicable to Human Genes（任 意の ヒト 遺伝 子に 即時 適用可 能な 酵母 スト ップ コドンアッセイの開発）

ヒト遺伝子DNAにストップコドンが生・じるナンセンス変異やフレームシフ卜変異を効率的に診断する酵母ストップコドンアッセイは優れた遺伝子診断法であるが、ひとつの対象遺伝子領域に対して専用のべクターが必要という欠点があった。この酵母ストップコドンアッセイの利点を損ねず、かっひとつのべクターで多数の遺伝子に対応できる汎用型のスト ップ コドンアッセイ（ユニバーサルストップコドンアッセイ）の開発を試みた。
切断部位を平滑末端とした汎用型線形化ベクターpMT18と相同組み換えに必要なべクター断端部24bpの塩基配列を両端に付加するnested
PCRで増幅した対象遺伝子領域を発芽
酵母 であ るyPH857内に導入、形質転換する。この際、被検遺伝子領域をADE2の上流に挿入 しADE2とのキメラ蛋白として発現させる。選択培地で培養しADE2発現があれば正常に発育し白いコロニーに、被検遺伝子領域のストッブコドンとなる変異により発現がなければadenine合成経路の中間代謝産物が蓄積し赤いコ口ニーとなり、変異の有無がコロニーの色彩で容易に判別できる。アッセイの信頼性、有用性、実用性を検討するためベクターの自己再環状化の頻度、／くックグラウンドレベルの設定、相同組み換えの精度、相同組み換え部の至適サイズ、変異検出の実際などを調べた．、自己再環状化の頻度は数％以下、ノくックグラウンドレベルは20％未満で、おおくは10％以下であった。選択培地上の任意の白コロニーで目的の遺伝子領域の組み込みを調ベ十分な相同組み換えの精度であることを確認した。相同組み換えのための至適塩基数を決める
ため相同組み換え部の塩基数がl8bp、30bp、39bpの場合でも検討し24bpを適当とした。
野生型のアリルと変異型アリルを種々の比率で混合した検体をアッセイし、変異型アリルの比率と赤コロニーの比率を検討すると直線に回帰でき高い相関を示した。イP('について
大腸癌細胞株および大腸癌組織をアッセイし、既存のイP( のストッブコドンアッセイと比較したところ同様の結果を得た。さらに大腸癌細胞株HCT15のカM,SH6の一塩基欠失の変異を見いだした。E‑cadher inのアッセイで野生型遺伝子領域が赤コロニーおよび赤コ口ニーと判別が困難なピンク色のコロニーが多数出現したことにたいしてはADE2ロ）前にtag‑ 224−

配列 であるFLAGを 挿入した pMT18flagを新たに 作成し、選択培地のadenine量を増量することによルコロニーの色彩判別が可能となった。以上より、任意のヒト遺伝子に即時適用可能な酵母ス卜ップコドンアッセイ（ユニバーサルストップコドンアッセイ）の開発が確認された。
審査にあたって副査の守内教授よりE‑cadherinでのアッセイにおけるその蛋白構造の影
響、選択培地のアデニン量、異常のあった癌組織の人種などについて、遺伝子ク口ーニングヘの応用の具体例について、従来のAPC用の酵母アッセイとの簡便さの比較についての質問があった。申請者はE‑cadherinのロ‑sheet構造、アデニン量の50％増量、外国の症例であること、酵母内へのクローニングであること、PCRではやや作業が増えることなどを回答した。副査の藤堂教授より癌の発生、悪性度、治療などと遺伝子異常のかかわり、本法のはたす役割についての質問があり、申請者は遺伝子構成の変異はいまなお重要な異常であり本法により腫瘍の構造面のキャラクターを明らかにすることができると回答した。
最後に主査の浅香教授よルバックグラウンドレベルの設定について、HCT
I5のhIv
fSH
6での赤コロニー率の意味について、PCRでのアニーリング温度について、マウス、ラットは対象となりうるかとの質問があった。申請者は切除組織では正常細胞の混入の程度で変わりうるので一律には困難かもしれないこと、HCT15は一方の対立遺伝子のみの変異であること、対象遺伝子固有のプライマー部を主とした条件設定が重要であること、マウスなどでは経験がないが可能とおもわれることを回答した。
この論文で示されたユニパーサルストップコドンアッセイはストップコドンとなる遺伝子変異を酵母を用い簡便に、迅速に、省力化しスクリーニングできる手法でアッセイとして 確 立さ れ たと 認 め 、今 後 有 用な 方 法と し て ひろ く 用い ら れ るも の と期 待 さ れる
審査員一同はこの成果を高く評価し、研究歴と併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

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