「様式３－A」

課題番号39

家族性乳がんにおける BRCA 1 / 2 遺伝子変異と BRCA1 結合分子の発現の相関［１］ 組織代表者：渡部 剛（東北大学乳腺内分泌外科）
対応者：千葉 奈津子（東北大学加齢医学研究所）
分担者：石田 孝宣（東北大学乳腺内分泌外科）
大内 憲明（東北大学乳腺内分泌外科）
古田 昭彦（石巻赤十字病院）
野水 整（星総合病院））
研究費：物件費 25 万円，旅費 0 円［２］研究経過全乳がんの 5-7％が家族性乳がんとされ、その25%が BRCA1 または BRCA2 の遺伝子変異が原因となる遺伝性乳がん・卵巣がん症候群である。
その他の散発性がんにも、BRCA1/2 の機能が低下しているがんが存在すると考えられている。また、
BRCA1/2 遺伝子変異・機能不全は、DNA 障害性抗癌剤や、poly(ADP-ribose)polymerase (PARP)阻害剤に対し高感受性を示し、BRCA1/2 の評価による個別化医療も期待されている。
BRCA1 は DNA 修復、中心体制御に関与する。
共同研究者の千葉は、BRCA1 の家族性乳がん由来の多くの変異体が DNA 修復と中心体制御能の両機能に異常を来すこと (Kais et al. Oncogene2012)を明らかにし、また、プロテオミクス解析により BRCA1 に結合する新規分子である Obg-likeATPase 1 (OLA1)の同定に成功し、OLA1 が中心体や紡錘体極に局在し、BRCA1、中心体の主要構成因子であるγ-tubulin と直接結合し、中心体の数や活性を制御することを明らかにした(Matsuzawa et al. Mol. Cell 2014)。がん由来の
OLA1 変異体では、BRCA1 との結合能が消失し、中心体制御能が障害されており、家族性乳がん由来で中心体制御能に異常がある BRCA1 の変異体
では、OLA1 との結合能が著しく低下していた。

また、OLA1 は BRCA2 とも相互作用し、OLA1が関与する中心体制御能が、BRCA1 と BRCA2のがん抑制能に関与する可能性が示唆された。
本研究では、BRCA1/2 遺伝子検査が行われている乳がんを用いて、BRCA1/2 の遺伝子変異の有無と、中心体の数の異常との関連、OLA1 やその新規結合分子での局在や発現との関連を検討し、これらをバイオマーカーとした乳がんの個別化医療を開発することを目的として研究を行った。
具体的には以下の２つを研究目的とする。
1. BRCA1/2遺伝子変異の有無と中心体数の増加との相関を解析する。
2. BRCA1/2 遺伝子変異の有無と OLA1、OLA1 の新規結合分子の局在や発現量との相関を解析する。
以下，研究活動状況の概要を記す。
本研究では、共同研究者の施設（星総合病院、石巻赤十字病院）から家族性乳がん患者の組織標本を、東北大学に送付してもらい、免疫染色を行う。まず東北大学倫理委員会で本研究承認を得た後、各施設でも倫理委員会に申請し、承認を得た。
承認を得た後、BRCA1/2 遺伝子検索を行った 73例（星総合病院から 63 例、石巻赤十字病院から 10例）の未染色スライド 6 枚を送付してもらった。
目的１の中心体の免疫染色をするため抗体薬の選定から、条件設定までを行った。まず染色方法であるが、一般的な DAB 染色では細胞質に均質に染まり、中心体の foci をみることはできなかった（東北大学病理検査学分野の協力にて確認）。
そのため蛍光免疫染色を用いる方針とし、当院での乳癌症例でγ-tubulin の蛍光免疫染色条件設定をした。また陽性コントロールを作成するため BRCA 変異のあるHCC1937と陰性コントロールとしてMCF7細胞とHeLa 細胞のセルブロックを作成し、最適な免疫染色の条件設定を行った。当院の乳癌症例、細胞株においてもBRCA変異で中心体の増加を示唆するfociの数が増加しているのが確認された。
［３］成果（３－１）研究成果
本年後は、前年度まで検討された抗体・条件設定を用い、BRCA1/2 遺伝子検索が行われた 73 例のγ-tubulin の蛍光免疫染色を行った。BZ-9000（Keyence)を用いて、×100 倍の油浸レンズで 4μm の薄切切片を 0.4μm ずつ Z 軸方向の撮影し、これを 1 症例あたり４～６視野において行い、すべてデータとして保存した。画像データは Hybrid Cell
Count (Keyence)を用いて、細胞あたりの foci の数を定量的に計測した。
最終的に 70 症例検討し、BRCA1 変異 6 例、BRCA2 変異 18 例、BRCA1/２共に変異が 1 例であった。
細胞あたりのγ-tubulin の foci 数は、BRCA1
and/or 2 変異で 1.7 (95%; CI, 1.3–2.2) BRCA 変異なしで 0.7 (95%; CI, 0.4–1.0)で、明らかに BRCA変異群でγ-tubulin(中心体) foci の増加を認めた(p<0.001)。BRCA1 変異 1.3 (95%;CI 0.3–2.3)、
BRCA2 変異 2.1 (95%;CI 1.6–2.6) もそれぞれでBRCA 変異なしと比較し有意差を認めた (p =0.004, p < 0.0001,)。BRCA 変異ではγ-tubulin の数が増加し、BRCA 遺伝子診断の前検査として有用なことが示唆された。
この結果は第 10 回 AACR-JCA 国際学会（2016年 2 月マウイ）で発表した。
また既存の BRCA 遺伝子変異予測ツール、BRCAPRO、Myriad Table, KOHcal とも本研究を比較し、最も優れた BRCA 変異予測診断である可能 性 を 示 し た （ AUC0.86, sensitivity93%,specificity 95%, positive predictive value 90%)。この結果は 今年 4 月の外科学会 WS で発表予定である。また現在論文投稿準備中である。
研究目的２に関しては、研究目的１のめどがつき次第、研究開始予定としている。

（３－２）波及効果と発展性など
研究目的１では，臨床検体を用い、細胞内微小構造物を蛍光免疫染色で染色・評価することができた。
これらは現在までの免疫染色ではわからなかったもので、同様の細胞内微小構造物の蛍光免疫染色が、その他の機能評価判定等の発展に繋がることが期待される。
研究目的２では OLA1 と OLA1 の新規結合分子とも中心体制御に関わることが明らかになっており、
BRCA 変異の有無と OLA1 と OLA1 の新規結合分子の発現・局在、中心体の数などの関連を詳細に検討することにより、タンパク質の新たな相互作用やメカニズムが明らかになる可能性がある。また予後と、上記の BRCA 関連タンパク質の相関も検討する予定である。

［４］成果資料
1. Matsuzawa A, Kanno S, Nakayama M, Mochiduki
H, Wei L, Shimaoka T, Furukawa Y, Kato K,Shibata S, Yasui A, Ishioka C, and Chiba N. The
BRCA1/BARD1-interacting
protein
OLA1
functions in centrosome regulation. Molecular Cell,
53,101-104, 2014
2. Kais Z, Chiba N, Ishioka C, Parvin J D. Functional
differences among BRCA1 missense mutations in
the control of centrosome duplication. Oncogene,31(6):799-804 2012
3. Ransburgh D*, Chiba N*, Ishioka C, Toland A, andParvin J D. (*co-first author) Identification ofbreast tumor mutations in BRCA1 that abolish
its function in homologous DNA recombination.
Cancer Research 70(3);988-95, 2010

学会発表
第 10 回 AACR-JCA 国際学会
（2016 年 2 月マウイ）