博 士 （ 医 学 ） 金 内 優 典

学位論文題名Inductionofapo
pto
sisbythep53‑273L(Arg‑ Leu)
mutant in HSC3cellswithout transactivation
ofp21Wa．fl/Cipl/Sdilandbax（p 53−273L(Arg→Leu)変異株のHSC3細胞におけるp21Wan/CipレSdilおよびbaxの転写活性化によらないアポトーシス誘導能についての研究）

学位論文 内容の要旨

I．緒言
p53遺伝子のコドン273における変異は，実際にヒト癌細胞でしばしば見いだされ，ホットス
ポッ トのー っと 認識 され ている ．我 々は 6種 類の コド ン273変 異株の 機能 解析 を行い，p53‑273 L(ArgうLeu）は配列特異的転写活性化能を失っているにもかかわらず，細胞増殖を抑制しうることを明らかにした，そこで，この変異型p53−273Lの細胞増殖抑制能の本態を明らかにするために，野生型p53，変異型p53−175H(Arg→His）あるいはp53‑273Lを各々導入したHSC3細胞株を樹立し，導入遺伝子をZnz゛で誘導することにより各p53遺伝子の細胞内での転写調節能や細胞増殖に与える影響について検討した．
II.材料と方法（1）プラスミド及びブ口一ブ
野生型p5 3(pC53‑S N3），変異型p5 3(pC53‑175H，pC53−2731)からBamHI消化により分離された各p5 3cDNAを，2n2゛で発現を誘導出来るプロモーターを有するpS V2‑ HMT/Terベクターにクローニングし，pSV2ーHMT/Ter‑ SN3，‑175H，−273Lを得た.p5031＊ーanti‑p53はMMTV‑LTR
プロ モー ター 下流に 野生 型p53 cDNAのア ンチ セン スDNAをクローニングして作製した．ヒトb axプロ ーブ は既知 の塩 基配 列を もとに PCR法に て増 幅し 作製 した.p53， p21プロ ーブは各cDNAフ゜ラスミド(pC53―SN3，pcDSRa△‑Sdil）より調製した．
（2）誘導可能なp53遺伝子を有するHSC3細胞株の樹立
2x 10＾個のHSC3細胞に，各p53クローン(pSV2ーHMT/Ter‑SN3，‑17 5H，−273L）とp5031゛−an ti‑p 53とをりン酸カルシウム法にてコ・トランスフェクトし，G418（350ルg/ml)セレクションに て耐 性コ ロニー を分 離した（HSC3/SN3，HS C3/175H，HSC3/2731).導入p53遺伝子の発現はZfi2十（150ルM)存在下でスクリーニングした，（3）ルシフェラーゼアッセイ
2 x10＾個のHSC3細胞に，2.5ルgのWWP−Lucレポータープラスミドと0.1，0.5，1．0，2.5凪gのpCMV‑Neo Bam（ベクターフ゜ラスミド），pC53‑SN3，pC53−175H，pC53‑273Lとを，リン酸カルシウム法にてコ・トランスフェクトし、24時間後の細胞抽出液における各々のルシフェラーーゼ活性を測定、比較した．
ー 155 ‑

(4)ノーザンブ口ットハイブリダイゼーション
40ルgのtotaIRNAを6.7％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動後，ナイ口ン膜に転写し，32Pでラベルしたプ口ーフ(p53，p21，bax，p―actin）でハイブリダイゼーション後，オートラジオグラフイーを行った．
（5）ウェスタンブ口ッテイング
Zn 添加前と添加後12時間の各細胞株から抽出した蛋白（10ルg）を10％PAGEで展開し，二トロセルロース膜に転写し，一次抗体(PAb1801あるいはDO−7），二次抗体に反応させ化学発光法にてバンドを検出した．
(6)細胞増殖曲線
各細胞株の細胞（1xio＾個）を10 cmディッシュに播種し，Zn2゛存在（100ルM)下に5％及び0.1％ FBS添 加 DMEMで 培 養 し っ 48時 間 毎 に 生 細 胞 数 を カ ウ ン ト し 作 成 し た ．
(7)FACS解析及びDNA断片化の検出(6)と同様に培養した細胞を5％血清下ではday‑0とday−6に，0.1％血清下ではday‑0，1，3，5，7に浮遊細胞も含め回収し，propidium iodide(50ルg/ml)溶液でDNA染色を行い細胞周期の解析を行った．また0.1％血清下で得られたサンプルから．フェノール／ク口口ホルム法によってDNAを抽 出し ジゴキ シゲ ニン 法に てラベ ル後 ．2％ア ガ口 ース ゲルに て電 気泳 動しナイ口ン
メンブランに転写，化学発光法にてDNA断片化を検索した，
III．結果親株及び樹立した各細胞株を，Zn 添加（150ルM)下で培養すると，親株を除き，導入した各p53遺伝子 は6時間 後に は既に誘導されており，この誘導は24時間後にも持続していることが確認された．ウェスタン法にて親株以外の細胞株においてp53蛋白の誘導も確認された．また野 生型 p53の発 現に よっ てのみ p21が誘 導さ れ， 273L，17SHの発現ではp21は誘導されなかった.baxの発現には，どの細胞株においても明らかな変化を認めなかった．ルシフェラーゼアッセ イに より ，野生 型p53のみがp21プ口モーターを転写活性化し，273L及び175Hではこの機能を欠いていることが確認された．
これ らの 細胞株 を5％FBS，Zn2十（100ルM)下で培養すると，HSC3/SN3の細胞増殖は親株に比 ベ 抑 制 され た が ， HSC3/273Lの 細 胞 増殖 は 親 株 と 同 等 で あ っ た ． しか し 0.1％ FBS下 では ，H SC3/175Hの 細胞 増殖 は親 株に比 ベ促 進さ れた のに対し，HSC3/273Lでは著しく抑制された．
FACS解析の結果，5％FBS，2n2゛（100ルM)下では，HSC3/S N3においてday―6におけるGl分画の細胞数がdayー0に比ベ30％以上増加していた．親株，HSC3/175H，HSC 3/27 3LではGl分画の細胞数に変化は認められなかった．一方0.1％FBS，Zn2゛（100ルM)下では，親株においてday−3か らsub‑G1分画の 増加 が確認されたが，HS C3/S N3，HSC3/175Hではsub―Gl分画の増加は認められなかった．しかし，HSC3/273Lでは，day‑3，5，7と著しくsub−G1分画が増加していくことが 確 認 さ れ ， day‑7で 親 株 の 約 3倍 に 達 し て い た ． ア ボ ト ― シ ス に よ る DNAの 断 片 化 はHSC3／ SN3，HSC3/175Hで は 認 め ら れ な かっ た の に 対 し ， 親 株 で は day‑5か ら 検 出 さ れ 始
め，HSC3/273Lではday‑3から著しく生じていることが確認された．
IV.考察
p53遺伝 子に よる 細胞 増殖抑 制効 果は その配 列特異的転写活性化能とよく相関すると考えられている，今回，Zn2十で誘導可能な野生型p53，変異型p53（‑175H，−273L)を導入し樹立した
HSC3細 胞 株 を 用 い て ， 変 異型 p53‑273Lが ， 低 血 清 条 件下で はp21や baxを 介さな い機 序で

H
SC3細胞に アポトーシスを誘導し，細胞増殖を抑制し得ることを明らかにした．また、野性型p53に よる p21の誘 導は アポト ーシ スを 抑制することも確認された．従ってp53遺伝子によるアポトーシス誘導には，配列特異的転写活性化を介さない経路が存在することが示された，
さらに変異型p53−273
Lは，実際にヒトの癌で見出される変異でありながらこの経路を活性化する働きを保持していると考えられた．

学位論文審査の要旨
主 査

教 授長 嶋 和 郎

副 査

教 授

吉 木

副 査

教 授

敬

藤 本 征 一 郎

学位論文題名Inductionofapoptos
isbyt
hep
53‑273L(Arg→Leu)mutantin H
SC3 cellsw
ithout tr
ansac
tiv
ationo
fp
21
Wa'''
Cip'/
Sdiland bax（ p 53― 273L(Arg→ Leu)変 異 株 の HSC3細 胞 に お け る p21Wafl/Cipレ Sdil
お よ び baxの 転 写 活 性 化 に よ ら な い ア ポ ト ー シ ス 誘 導 能 に つ い て の 研 究 ）p53遺 伝 子 の コ ド ン 273変 異 株 （ 6種 類 ） の 機 能 解 析 を 行 い ,p53‑273L(Arg+Leu)は 配 列 特異 的 転 写 活 性 化 能 を 失 っ て い る に も か か わ ら ず ， 細 胞 増殖 を 抑 制し う る こと を 申 請者 ら はす でに 明 ら かに し た ．そ こ で 申請 者 は 今 回， こ の 変異 型 p53‑273Lの 細胞 増 殖 抑制 能 の 本 態を明 ら か に す る た め に ， 野 生 型p53， 変異 型 p53‑175H(Arg→ His)ある い は p53‑273Lを 各々 導 入し た HSC3細 胞 株 を 樹 立 し ， 導 入 遺 伝 子 を 2n2゛ で 誘 導 す る こ と に よ り 各 p53遺 伝 子 の 細 胞内での 転写調 節能や細 胞増殖に 与える 影響につ いて検 討した．
野 生 型 p53(pC53‑SN3)， 変 異 型 p53(pC53‑175H， pC53‑273L)
か ら Bam HI
消 化 に より 分 離 され た 各 p53cDNAを ， 2n2゛ で 発 現 を 誘 導 出 来 る ブ ロ モ 一 夕 ー を 有 す る pSV2‑HMT/Terベ ク ターにク 口ーニ ングし， pSV
2‑HMT/Ter―SN3，―175H，‑273
Lを得た．p503l*‑anti‑p53はMMTV−LTRプ ロ モ 一 夕 ー 下 流 に 野 生 型 p53cDNAの ア ン チ セ ン ス DNAを ク ロ ー ニ ン グ し て 作 製 し た ．
ヒ ト baxプ ロ ー ブ は 既 知 の 塩 基 配 列 を も と に PCR法 に て 増 幅 し 作 製 し た .p53,p21プ ロ ー ブは各cD
NAプ ラスミ ド(pC53‑SN3，pcD
SR口 △‑Sdil）より調 製した ，2X l
06個 のHSC3
細 胞 に ， 各p53クロ ー ン (pSV2― HMT/Ter― SN3，―175H， −273L)とp50
31*―antiー p53とを りン酸 カルシウ ム法に てコ・ト ランスフ ェクト し，G418(350ルg/ml)セレク ショ
ン に て 耐 性 コ 口 二 一 を 分 離 した (HSC3/SN3， HS
C3/1
75H，HSC3/273L)， 導 入p53遺伝 子 の 発現は2n2゛（150ルM)
存在 下でス クリーニ ングした ．
40ル gの tot
alRN
Aを 6． 7％ ホ ル ムア ル デ ヒド グ ル で電 気 泳 動後 ，ナ イ口ン 膜に転写 し，3゜P
でラベ ルした プ口ーブ (p53っp21，bax，p−actin)でハイブリダイゼーション後，オートラジオグ
ラフイ ーを行 った．
2n2゛添 加 前 と添 加 後 12時 間 の 各細 胞 株 から 抽 出 した 蛋 白 （10ル g） を 10％ PAGEで 展 開 し，二 ト 口 セ ル 口 ー ス 膜 に 転 写 し， 一 次 抗 体(PAb1801
あ る い はD0‑7)， 二 次抗 体 に 反 応さ せ 化 学
発光法 にてバ ンドを検 出した．
親株及 び樹立 した各細 胞株を ，2n2゛ 添加（150ルM)
下 で培養す ると， 親株を除き，導入した各
p53遺 伝 子 は 6時 間 後 に は 誘 導 さ れ て お り ， 24時 間 後 に も 持続 し て いる こ と が確 認 さ れ た．

ウエスタ ン法にて親 株以外の 細胞株に おいてp53蛋 白の誘導 も確認された．また野生型p53の発現に よってのみ p21が誘導さ れ，273L，175Hの発現ではp21は誘導されなかった．baxの発現には 、どの細胞株においても明らかな変化を認めなかった，ルシフウラーゼァッセイにより ， 野生 型 p53のみ が p21プ 口 モ 一夕一 を転写活 性化し， 273L及ぴ175Hではこ の機能を欠いていることが石寉認された，
これらの 細胞株を5％FBS，2n2゛（100以M)下で培養すると，HSC3/SN3の細胞増殖は親株に比ベ 抑 制さ れ た が， HSC3/273Lの 細 胞増殖は 親株と同 等であっ た．しかし 0．1％FBS下では，HSC3/175Hの細 胞増殖は親 株に比ベ 促進され たのに対 し，HSC3/273Lでは著しく抑制された．
FACS解析の結 果，5％FBS，2n2゛ (100ルM)下では ，HSC3/SN3においてday‑6におけるGl分画の 細 胞数がday‑0に 比ベ30％以 上増加し ていた． 親株，HSC3/175H， HSC3/273LではGl分画の細胞数に変化は認められなかった，一方O．1％FBS，2r12゛(100肛M)
下では，親株においてday―3からsub‑Gl分 画の増加が 確認され たが，HSC3/SN3， HSC3/175
Hではsub―Gl分画の増加は認められなかった．しかし，HSC3/27
3Lでは，day‑3，5，7と著しくsub‑Gl分画が増加していく こ とが確認 され，day‑7で 親株の約 3倍に達し ていた， アポトーシ スによる DNAの断片化は HSC3/SN3， HSC3/175Hでは認め られなか ったのに 対し，親 株ではday− 5から検出さ れ
始 め ， HSC3/273Lで は day‑3か ら 著 し く 生 じ て い る こ と が 確 認 さ れ た ．
2n2゛で誘導可能な野生型p53，変異型p53(‑175H，―273L)を導入し樹立したHSC3細胞株を用い て ，変異型 p53‑273Lが，低血 清条件下 ではロ´ やbaxを介さ ない機序で HSC3細胞にアポトーシ スを誘導し，細胞増殖を抑制し得ることを本研究において明らかにした．また、野性型 p53によ る p21の誘 導 はア ボ ト ーシ ス を 抑制 す るこ と も 確認 され た．従っ てp53遺伝子による アポトーシ ス誘導に は，配列 特異的転 写活性化 を介さな い経路が存在することがはじめて 示された，さらに変異型p53‑273L
は，実際にヒトの癌で見出される変異でありながらこの経路を活性化する働きを保持していると考えられた，公 開 発 表 に際 し ，副 査 の 吉木 教 授 から ， HSC3細胞 を 実 験に 供 した 理 由 ，HSC3細 胞 でのアボト ーシス誘導経路が他の癌細胞において存在する可能性，今回のin v
itroの成果をinvivo(例えば SCIDマウス） で確認し たか，ヒ トにおい てこの変 異をもつこ との予想 される効果，配 列特異的転 写活性化 を介さな い経路で のアポト ーシス誘 導について具体的な実験
施行 の 有無 ， ア ポト ー シス 誘 導 にお けるp53と p21との関係 ，p53‑273Lによるア ボトーシ
ス誘 導 経路 の 解 明に あ たり ， p21，bax以 外の他の 因子の検 討の必要性 ，などに っいて質問があっ た．副査の 藤本教授 からは， p53‑273Lが検出さ れるヒト 癌の特徴とその癌の自然史，低血清濃度で細胞を培養したことの臨床的意義，亜鉛濃度（100l.
t M)を設定した根拠，
D0‑7抗体 を 用い た ウ エス タ ン法 で 野 生型 p53蛋白 の バ ンド が 認 められ なかった 理由，などについ て質問があ った．主 査の長嶋 教授から は，細胞 株樹立時 の回収ク口ーン数とクローン 間 での p53‑273L誘 導 の差 異 ，p21の他にコ ドン273領域 が転写活 性化する因 子，p53‑273Lが 独 自に 活 性 化す る 因子 の 存 在， p53のり ン 酸 化と p53‑273L変 異と の 関 連， 273コドン が 口イシン に変化す ることに よるp53蛋白 の立体構 造への影響 ，などに っいて質 問があった． これらの質 問に対し て，申請 者は自身 のこれま での研究 成績や文献的情報をもとに概ね妥当な回答をなしえた・
審 査員 一 同 は， p21お よぴ baxの転 写活性 化によら ないp53‑273Lによ るアボトー シス誘導能を初 めて示唆し た本研究 の成果を 評価し， 申請者が 博士（医 学）の学位を受けるのに資格を有するものと判定した．