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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

66—145（ 45 ）日本感染症医薬品協会奨励賞受賞講演会記録
2012 年 11 月 8 日，学士会館 202 号室【2012 年度受賞講演，座長：清田浩】

HIV プロテアーゼの 2 量体形成機構の解析と新規のHIV プロテアーゼ 2 量体形成阻害剤の開発
䧀康博

熊本大学医学部血液内科学，感染免疫診療部

はじめにされた本疾患は「コントロール可能な慢性感染2012 年度の日本感染症医薬品協会奨励賞の受症」と再定義し得る程となった。この進歩は，逆賞内容は，最近の筆者らの研究内容である 1）多転 写 酵 素 阻 害 剤（reverse transcriptase inhibitors:剤耐性 HIV-1 に対して高い活性を発揮する HIV-1RTIs）とプロテアーゼ阻害剤（protease inhibitors:プロテアーゼ阻害剤 darunavir（DRV）に対する高PIs）を組み合わせた多剤併用療法（combinational度耐性 HIV-1 の試験管内誘導，2）DRV 高度耐性

antiretroviral therapy: cART）に負うところが大でHIV-1 に新たに出現した HIV-1 プロテアーゼ領域ある。しかし，HIV-1 が RTIs と PIs の両剤に対しの変異が DRV のプロテアーゼ 2 量体形成阻害機て耐性を獲得してその多くが交差耐性であって治構に与える影響の検討，の 2 つの研究から主に療抵抗性となった症例数の増大，また耐性ウイルなっている。本稿ではこれまで筆者らが行ってきスによる初感染症例増多の報告が続いており，野た 1）多剤耐性 HIV-1 に対して高い活性を発揮す

生 HIV-1 株と多剤耐性株の双方に強力な活性を発る新規のプロテアーゼ阻害剤の開発，2）HIV-1 プ揮し，薬剤耐性を誘導しにくく，副作用が少なく，ロテアーゼの 2 量体形成機構の検出系の確立と阻服用しやすい新規の薬剤の開発が依然として急務

害剤の開発過程も紹介し，我々の一連の研究に対の課題となっている。筆者は抗 HIV-1 剤開発研する理解がより深まれば幸いである。

究，特に薬剤耐性 HIV-1 にも有効な新規の PIs の開発，HIV-1 の PIs に対する耐性機構の解明等の多剤耐性 HIV-1 に対して高い活性を発揮するプロテアーゼ阻害剤，DRV の開発研究をこれまで行ってきた。
我々のグループは化合物の P2 部位に bis-tetra-ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）感染によってhydrofuranylurethane（bis-THF）というユニーク起こる後天性免疫不全症候群（AIDS）に対する化な構造を有し，既存の PIs が HIV-1 プロテアーゼ

学療法は長足の進歩を遂げ，かつて「死の病」と （protease: PR）の活性部位の側鎖に結合するのと［Proceedings］YASUHIRO KOH: Study of HIV protease dimerization（PD）and identi¿cation of novel
PD inhibitors（PDIs）.

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図 1. DRV と野生型 HIV-1 プロテアーゼ複合体の X 線結晶構造

結晶構造解析によって，DRV の P2 部位の bis-THF 基が HIV-1 プロテアーゼの主要な活性中心部位のアミノ酸である Asp-29 と Asp-30 の主鎖と極めて強固な水素結合を形成していることが明らかとなった。水素結合を点線で示す。（文献 1 より改変して掲載）

異なり，PR の主要活性部位である Asp-29，Asp-30

HIV-1 プロテアーゼ 2 量体形成の検出系の確立の主鎖（backbone）と強固な水素結合を形成し， と 2 量体形成阻害剤の開発
広いスペクトラムの薬剤耐性 HIV 株に高い活性HIV-1 PR は 2 量体（homodimer）を形成し，酵TMを発揮する PI, TMC114/darunavir/Prezista （DRV） 素活性を発揮，HIV-1 PR の 2 量体形成（dimerization）についての細胞生物学的，ウイルス学的，結晶構は HIV-1 の増殖，複製にとって，必須と考えられ造学解析を米国 Purdue University の Dr. GHOSH のている 2,3）。これまでも HIV-1 PR dimerization の研究グループとの共同研究で世界に先駆けて進阻害は，PR 酵素活性を阻害し，HIV-1 の複製も阻め，2003 年この物質の標的である HIV PR の結晶

害，新規の薬剤標的部位と考えられてきたが，過1）解析の結果まで含めて世界で初めて発表した（図 1）。 去に報告された種々の化合物，物質が PR dimerization

DRV は 2006 年に米国食品医薬品局（FDA）で処を阻害したという直接的な証拠はいままでなかっ方薬として認可，米国とヨーロッパの主要各国でた。我々は，ある蛍光分子の他の分子への励起エ臨床に供されて薬剤耐性ウイルス保持者で著しいネルギーの移動する現象で，細胞内で起こる蛋白臨床効果をもたらしており，本邦においても 2007

質間の相互作用や分子レベルでの事象を検出する年に認可され，臨床に供されている。

手段となりうる FRET（Àuorescence resonance emissiontransfer）の系を用いて，HIV-1 PR dimerization を検出する系の確立を試みた。図 2-A に示すように

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図 2.

66—147（ 47 ）FRET HIV-1 発現系の確立（A）FRET HIV-1 発現系の確立。CFP，YFP タグ付き PR を有する感染性組み換え HIV-1 クローン（pHIV-PRWTCFP, pHIV-PRWTYFP）を作成した。5 つのアラニンからなるリンカーを PR と蛍光蛋白の間に挿入し，HIV-1 PR が切断する phenylalanine-proline site を蛍光蛋白と逆転写酵素の間に導入した。図にリンカーと蛍光蛋白を有するプロテアーゼのモノマーとダイマーを示す。FRET は蛍光蛋白が 1 〜 10 nm と近接する場合に起こる。
（B）アクセプター（YFP）フォトブリーチング前後における COS7 細胞の蛍光イメージ。CFP，YFP タグ付き野生型 PR を有する感染性クローン pHIV-PRWTCFP と pHIV-PRWTYFP を COS7 細胞に co-transfection し，72 時間後に走査型レーザ生物顕微鏡 Fluoview FV500 により観察した。CFP タグ付き野生型 HIV-1 PR と YFP タグ付き野生型 HIV-1 PR はフォトブリーチング前に発現が確認された。フォトブリーチングした細胞は YFP の蛍光が著明に減少し，フォトブリーチング前後の YFP の蛍光の比は 0.17 と減少したが，一方 CFP の蛍光の前後比は 1.38 と増加した。このことは，YFP, CFP タグ付き PR monomer サブユニットが 2 量体を形成していることを示す。
（C）フォトブリーチング前後の蛍光強度の比。CFP タグ付き野生型 HIV-1 PR と YFP タグ付き野生型 HIV-1 PR を co-transfection した各細胞の蛍光強度をフォトブリーチング前後で測定した。フォトブリーチング前後の比を測定した CFP A/B ratio は 1.24±0.11（n＝23）であり，一（文献 6 を参考に改変し方 YFP A/B ratio は 0.47±0.09（n＝23）あった。CFP A/B ratio が 1.0 以上であれば，FRET が起こっていることを示す。て掲載）

蛍光色素である青色蛍光色素（cyan Àuorescent

FRET の定量化の方法として，以前にも種々の方protein; CFP）あ る い は 黄 色 蛍 光 色 素（yellow法が報告されているが，我々はアクセプターフォÀuorescent protein; YFP）タグ付き PR を有する組トブリーチング法を用いた（図 2-B）4,5）。すなわ

み換え感染性 HIV-1 クローン pNL-PRWTCFP，pNL-

ち，YFP を選択的にアルゴンレーザーによりフォYFP

PRWT

CFPplasmids を 作 成 し， COS7 細 胞 に pNL-

トブリーチング，退色させた細胞において，ブリーplasmids を co-transfection

チング前後における CFP の蛍光強度を測定し，し，72 時間後，走査型レーザ生物顕微鏡（confocal

CFP の蛍光強度の前後比である CFP Àuorescencelaser scanning microscope）Fluoview FV500 を用い

after photobleaching/CFP fluorescence before

PRWTと pNL-PRWT

YFPて細胞内で FRET が起こるかどうかを確認した。 photobleaching（CFPA/B ratio）が 1.0 以上であれば，

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図 3. DRV，TPV による HIV-1 PR 2 量体形成の阻害1 ȝM の各種 PIs（DRV, SQV, NFV, APV, IDV, RTV, LPV, ATV, TPV）存在下の COS7 細胞に pNL-PRWTCFP と pNL-PRWTYFP を co-transfection した。72 時間後，培養細胞を走査型レーザ生物顕微鏡 Fluoview FV500 を用いて観察し，CFPA/B ratios を決定した。CFPA/B ratios が 1.0 以上であれば，FRET が起こっており，HIV-1 PR が 2 量体形成していることを示す。比の平均値は横線で示す。（文献 6 を参考に改変して掲載）

CFP，YFP 間の蛍光エネルギーの移行（FRET）が起こっていたと考えられ，このことは PRWTCFPとPRWTYFP 蛋白間の 2 量体が形成されていることを示している（図 2-C）。

多剤耐性臨床分離株の混合株を用いた DRV 高度耐性 HIV-1 の試験管内誘導
野生 HIV-1 株を用いた試験管内耐性誘導実験において，DRV の耐性発現は既存の PIs と比較してそこで我々は，この FRET-HIV-1 PR 発現系を極めて遅延し，野生 HIV-1 株からの DRV 高度耐用いて，種々の既存の抗 HIV-1 剤，新規に合成し性 HIV の試験管内誘導は今までに成功した報告た化合物を検討し，PR dimerization を阻害する一はなかった。そこで，我々は DRV が感受性を発群の新規低分子化合物（PR dimerization inhibitors:

揮，維持している多剤耐性臨床分離株を用いて，6）

PDIs）を 開 発 し 同 定 し た 。興 味 深 い こ と に， DRV に対する高度耐性 HIV-1 の誘導を試みた。8amprenavir（APV），nel¿navir（NFV）等の既存の種類の multidrug-resistant HIV-1（HIV-1MDR）を単

PIs は PR dimerization には影響を与えないのに対一，あるいは mixture した混合株を用いて，DRVして，我々が開発し多剤耐性 HIV-1 に対して高い耐性誘導実験を行った。単一の HIV-1MDR をそれ活性を発揮する新規のプロテアーゼ阻害剤であるぞれ用いた耐性誘導実験では HIV-1C を用いた実DRV は成熟 PR 活性の阻害効果のみならず，PR 前験のみで DRV 耐性を誘導し得たが，その他の単駆体が成熟するために必須の過程である

一の HIV-1MDR は DRV 存在下では増殖，複製できdimerization をも阻止する bifunctional PI（あるいなかった。8 種類の HIV-1MDR の混合株を用いた実は PDI）であることが明らかとなった（図 3）。

験では，39 passage で DRV 1 ȝM 存在下，51 passage
では DRV 5 ȝM 存在下で増殖，複製可能な HIV-1を誘導することに成功し，HIV-1C 単一株を用いた

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66—149（ 49 ）DRV 耐性誘導実験と比較して，耐性発現遅延が積が認められ，HIV-1 混合株の中で，主要株とより早く，高濃度（5 ȝM）の DRV 存在下まで誘導なっている HIV-1C と比較して，新たに 4 つの変異し得た（図 4）。HIV-1MIX

P51の PR 領域には，野生の 蓄 積（V32I, L33F, I54M, I84V）が 認 め ら れ た

HIV-1NL4-3 と比較して，14 個のアミノ酸変異の蓄 （図 5：太字で示す）。DRV 耐性誘導実験で得られ
図 4.

多剤耐性臨床分離株を用いた DRV 耐性誘導実験

複数の PIs に対して耐性となった 8 種類の臨床分離株の混合株である HIV-1MIX（▲）と単一の多剤耐性臨床分離株である HIV-1C（●）をそれぞれ，DRV の濃度を徐々に上昇させながら，MT-4 細胞を用いて継代培養を続けた。耐性誘導実験は計 60 passages まで続けられ，HIV-1MIX
は 0.006 ȝM の DRV 存在下で継代を始め，51 passage では 5.0 ȝM の DRV 存在下で増殖複製可能となった。
（文献 7 を参考に改変して掲載）

図 5.

DRV 存在下で継代された HIV-1MIX の PR 領域のアミノ酸変異の蓄積

DRV 存在下で継代培養された HIV-1MIX の 4 つの異なる passages から得られた HIV-1 の PR 領域のアミノ酸変異を示す。対照として，野生HIV-1NL4-3 の PR 全長（99 アミノ酸）を上に示す。（文献 7 を参考に改変して掲載）

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多剤耐性臨床分離 HIV-1 の mixture を DRV の濃度を徐々にあげながら，継代培養を重ね，DRV 高度耐性 HIV-1 を誘導した。耐性誘導実験中の 1, 10, 30, 39, 51 各 passage の HIV-1 を分離，それらの誘導株に対する DRV 及び他の PIs の活性（EC50: ȝM）は，MT-4 細胞を用いた p24 assay で検討された。括弧（ ）内の数字は各薬剤が野生株 HIV-1ERS104pre と比較して耐性株に何倍EC50 値が上昇したかを示す。（文献 7 を参考に改変して掲載）

表 1.

DRV 耐性誘導実験で得られた多剤耐性臨床分離混合株（HIV-1MIX）に対する種々の PIs の抗ウイルス活性（EC50: ȝM）

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た HIV-1MIX に対する種々の PIs の抗 HIV 活性を検討したところ，継代を経るにつれて HIV-1MIX は，

APV, IDV, NFV, RTV, LPV, ATV に 対 し て 高 度 耐性を獲得し，SQV, TPV に対して中等度耐性を認めた（表 1）。DRV に対しても徐々に耐性を獲得
し，39 passage，あるいは 51 passage を経た HIV-

1MIX に対する DRV の抗ウイルス活性は EC50 値が1 ȝM 以上と DRV 高度耐性を獲得していることが明らかとなった。これらの研究から HIV-1 の DRV耐性は極めて困難ではあるが，複数の PIs 耐性

HIV 変異体の homologous recombination が起これ
ば，HIV-1 は DRV 高度耐性となりうる可能性を示した 7）。

DRV 耐性関連変異と HIV protease dimerizationの関連性
最後に，我々が誘導した DRV 高度耐性 HIV-1に 新 た に 出 現 し た 4 つ の PR 変 異（V32I, L33F,I54M, I84V）の DRV 耐性に与える影響について検討を重ねた。まず，これらの試験内で認められた変異が DRV 耐性臨床分離株にも共通して認められるかを検討したところ，PR 領域の 32, 33, 54,84 番の変異は DRV 高度耐性となった複数の臨床分離株から認められていることを米国 Stanford 大学の Dr. SHAFER との共同研究で明らかとした（表2：太字で示す）。また，これら 4 つの変異（V32I/L33F/I54M/I84V）を含んだ感染性組み換え HIV
変異体を作成し，DRV の抗 HIV-1 活性を検討した
ところ，これら 4 つの変異が蓄積すると DRV のEC50 値は 0.64 ȝM と野生株に対する抗ウイルス活性（EC50 値；0.003 ȝM）と比較して，213 倍もの高度耐性となることを明らかとした 8）。更に，前述した FRET-HIV-1 発現系を用いて，これらの変異が DRV の PR dimerization 阻害活性に与える影響と検討した。V32I, L33F, I54M, I84V のそれぞれ単一の変異を導入した PR 変異体では DRV のdimerization 阻 害 活 性 に 対 し て 耐 性 と は な ら なTHE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICSDRV 高度耐性 HIV-1 から得られた PR 領域のアミノ酸変異を示す。HIV8MIXP51 は我々が試験管内で誘導した DRV 高度耐性株 7），3 つの組み換え感染性クローン rCLHIVF16, rCLHIVT45, rCLHIVT48
は DRV を含んだ抗 HIV 療法が失敗した患者から分離された臨床分離株を示す 8）。表中の括弧（ ）内の数字は各薬剤が野生株 HIV-1ERS104pre と比較して耐性株に何倍 EC50 値が上昇したかを示す。表中の下から 2 番目のアミノ酸変異は，DE MEYER 9），MITSUYA10）らによって報告された変異，1 番下のアミノ酸変異は DRV 耐性に最も寄与すると VAN MARCK らによって報告された変異を示す 11）。（文献 8 を参考に改変して掲載）

表 2. DRV 耐性関連アミノ酸変異の同定

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図 6. PR 領域の複数のアミノ酸変異の組み合わせが DRV の PR 2 量体形成阻害能に与える影響

薬剤非存在下，あるいは 0.1 ȝM, 1 ȝM DRV 存在下の COS7 細胞に V32I/I84V, V32I/L33F/I84V, V32I/L33F/I54M, V32I/L33F/I54M/I84V の PR
変異をそれぞれ有する pNL-PRMUTANTCFP と pNL-PRMUTANTYFP をペアで co-transfection した。72 時間後，培養細胞を走査型レーザ生物顕微鏡
Fluoview FV500 を用いて観察し，CFPA/B ratios を決定した。CFPA/B ratios が 1.0 以上であれば，FRET が起こっており，HIV PR が 2 量体形成していることを示す。比の平均値は横線で示す。（文献 8 を参考に改変して掲載）かった。2 つあるいは 3 つの変異の組み合わせをまとめ，今後の研究計画導入した PR 変異体でも DRV の dimerization 阻害

筆者らは，1）多剤耐性 HIV-1 に対して高い抗ウ活性に対して耐性とはならなかったが， V32I/イルス活性を発揮する PI; DRV の開発，2）HIV-1

L33F/I54M/I84V の 4 つの変異を導入したところ， の 複 製，増 殖 に 必 須 と 考 え ら れ る HIV-1 PR
HIV-1 PR 変異体は DRV の dimerization 阻害活性

dimerization の検出系の確立と DRV を含んだ一連8）から escape しうることが明らかとなった（図 6） 。 の PDIs の同定，3）多剤耐性臨床分離株の混合株
これらの実験データより，HIV-1 は DRV が発揮すを用いて DRV 高度耐性 HIV-1 変異体の誘導に成る PR dimerization 阻害効果を減弱させ，DRV 高功，4） DRV 耐 性 関 連 変 異 が DRV の 有 す る PR度耐性となりうるといった HIV-1 の新しい薬剤耐dimerization 阻害活性に与える影響を検討し，4 つ性機構を明らかとなった。同時に PR 領域の 4 つの変異（V32I/L33F/I54M/I84V）の蓄積によって，の変異（V32I/L33F/I54M/I84V）の組み合わせが， HIV-1 が DRV の dimerization 阻害活性から耐性とDRV の PR dimerization 阻害効果の減弱に必要でなりうるといった新しい薬剤耐性機構の解明，とあったことは，DRV に対する HIV-1 の耐性発現はいった研究を一貫して行ってきた。今後は，質量極めて遅延し，かつ困難であることを示すもので分析（ESI-MS），結晶構造，ウイルス，酵素学的あった。

アプローチによる DRV の HIV-1 PR モノマーとの結合様式，結合部位の解析，DRV 以外の PDI であり現在海外で認可されている PI，tipranavir の PR

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dimerization 阻 害 機 構 の 解 析 12），DRV 高 度 耐 性
HIV-1MDR PR（本文中の HIV-1MIXP51 等）の結晶構造解析のデータに基づいた，より強力な新規のPDIs の開発等を目指す。
謝辞この度，2012 年度の日本感染症医薬品協会奨励賞を受賞することになりましたことを深く感謝致します。本研究は，熊本大学医学部血液内科学で主に行った研究であり，これまで御指導頂きました熊本大学満屋裕明教授および諸先生方，本賞の選考にあたられました選考委員の先生方に厚く御礼申し上げます。

文献1）KOH, Y.; H. NAKATA, K. MAEDA, et al.: Novelbis-tetrahydrofuranylurethane-containing
nonpeptidic protease inhibitor（PI）UIC-94017（TMC114）with potent activity against multiPI-resistant human immunode¿ciency virus invitro. Antimicrob. Agents Chemother. 47:
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