博 士 （ 理 学 ） 吉 田 徳 之
学 位 論 文題 名IN/Iolecular Biological Analyses of Protein Kinases
Activated during Oocyte lx/Iaturationin Fish and Amphibians（魚類・両生類卵成熟過程で活性化される蛋白質リン酸化酵素の分子生物学的解析）

学位論文内容の要旨
卵は成熟することで、受精・発生可能となる。産卵期になると脳下垂体から生殖腺刺激ホルモン（GTH）が分泌される。GTHは卵母細胞を取り囲む濾胞細胞に働き、卵成熟誘起ホルモン（MIH）を合成、分泌させる。M
IHは卵母細胞の細胞膜に作用し、最終的に細胞内で卵成熟促進因子（MPF）が活性化することで卵は成熟し、受精可能となる。M
PFは卵成熟の最終誘起因子のみならず、体細胞分裂のM期促進因子として全真核生物で普遍的に機能する。分子構造も種を越えて共通で、触媒サブユニットのCdc2と調節サブュニットのサイクリンBからなる蛋白質リン酸化酵素である。しかし、MPFの活性化機構は種により異なり、アフリカツメガェルタイブとキンギョ・ニホンアカガェルタイ
プの2っに大別できる。ツメガェルタイプでは未成熟卵中にCdc2とサイクリンBは既に存在し、複合体を形成している。しかし、抑制的なりン酸化修飾を受けているため、このMPF
はりン酸化酵素活性を持たない（pre‑MPF）。 M
IH
刺激後、抑制的なりン酸化部位が脱リン酸化されることでM
PFは活性化する。一方、キンギョ・アカガェルタイプでは未成熟卵中にサイクリンBは存在せず、Cdc2は単量体で存在する。M
IH
刺激 後、サイクリンBが合成され、Cdc2と複合体を形成することでM
PFは活性化する。両タイプの機構においても、MIHが細胞膜に作用すると、卵内で多くの蛋白質がりン酸化されることが知られており、MP
F以外のりン酸化酵素も重要な役割を果たしていると考えられるが、その詳細は不明である。本研究では、この卵成熟過程で活性化されるりン酸化酵素に注目し、その作用機序を明らかにすることを目的に以下の研究を行った。
【 第 1章 】 キ ン ギ ョ ・ ア フ リ カ ツ メ ガ ェ ル 卵 成 熟 に 関 わ る 蛋 白 質 リ ン 酸 化 酵 素 の 検 索
キンギョとツメガェルの卵成熟誘起に関わる蛋白質リン酸化酵素を検索することを目的に、MIH
刺激後経時的に得た卵抽出液に44種の外来基質を加え、リン酸化の程度を測定した。その結果、キンギョでは18種の蛋白質がりン酸化され、そのうち卵成熟過程でりン酸化の程度が変化したのは4種であった。ツメガェルでは18種の蛋白質がりン酸化され、変化が認められたのは6種であった。両種で共 通 な も の は ヒ ス ト ン H1、 ミ ェ リ ン 塩 基 性 蛋 白 質 （ MBP） 、 ベ プ シ ン の 3種 で あ っ た 。
ヒ ス ト ン Hlは MPFと Cdk2で 、 MBPは mitogen‑activated protein kinase（ MAPキ ナ ーゼ）でりン酸化されることが知られている。酵母のG1/S期ではCdc2が機能するが、真核生物では機能しない。Cdk2は酵母のG1/S期でのCdc2の機能を相補しうるcDNAとしてク□−ニングされた。
MAPキナーゼは哺乳類の培養細胞で細胞増殖因子の刺激により活性化されるりン酸化酵素として発見された。ベプシンをりン酸化する酵素はこれまで知られていなかったが、本研究によりMPFでりン酸化されることが明らかになった。
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以上の 実験結 果から、 卵成熟 過程に おいて キンギ ョとツメガェルの両種で共通して働いているのはMPF、 Cdk2、 MAPキ ナ ー ゼ で あ り 、 ヒ スト ン H1、MBP、 ペ プ シン 以 外 の 基質 が キ ン ギョ と ツ メ ガエルで異 なるこ とから 、両種 の卵成 熟では 異なる りン酸 化酵素カスケードが作用していることが明らかになっ た。ま た、両 種では MPFの活性 化機構 が大き く異な り、本 研究結 果はこ れを反映したものと推測され る。
【 第2章】 キンギ ョ卵成熟 過程に おける サイク リンE/Cdk2の役割
第 1章 の実 験 結 果 から 、 通 常 サイ ク リ ン Eと 複 合体 を 形 成 して G1期 やG1/S移 行で機 能する Cdk2がM期の 進 行 を 含む 卵 成 熟 過程 で 活 性 化さ れ る こ とが明ら かにな った。 卵成熟 過程で のCdk2のパ ート
ナ ー や 活性 化 の 分 子機 構は 不明で ある。 これら を明らか にする ため、 Cdk2のサ イクリン パート ナ―と してサ イクリン Eに注目 し、キ ンギョ 卵成熟 におけ るサイ クリン Eの挙動を解析した。その結果、卵成 熟 過 程で サ イ ク リン EはCdk2と 複 合 体 を形 成 し、 Cdk2を活性 化する ことが 明らか になっ た。さ らに 、 卵 成熟 の 開 始 、つ ま り MPFの活 性 化 と 卵核 胞 崩 壊 （GVBD）へ の サ イ クリ ン E/Cdk2の関 与 を 調
べ た 結 果、 未 成 熟 卵で サ イ ク リン E/Cdk2を 活 性化 し て も 、MPF活 性 化 ．GVBDは 起 こ っ た。 卵 成 熟
過 程 で サイ ク リ ン E/Cdk2活 性 を 阻 害し て も 、 MPF活 性 化 ． GVBDは起 こ る 。 これ ら の 結 果は 、 サ イ
ク リ ン E/Cdk2は 卵 成 熟過 程で活 性化さ れるが、 卵成熟 の開始 には直 接関与 しない ことを 示す。 さらに 、サイ クリンE/Cdk2複合体 はサイ クリン Eととも に胞胚 期で消 失するこ とから 、胚発 生の初 期段階で 機能す ることが 示唆さ れた。
【第 3章】ニ ホンア カガエ ル卵成 熟過程に おける Mos/MAPキナ ーゼの 役割
第1章の 実 験 結 果か ら 、 ど のタ イ プ の MPF活 性 化 機 構で あれ 、MAPキナ ―ゼは 卵成熟 過程で 共通して 活 性化 さ れ る こと が 明 ら かに なっ た。一 方、MAPキ ナーゼ は間接 的にMosに よって 活性化 される こと が 知 ら れ て い る。 Mosは 癌 遺 伝子 産 物 で 、蛋 白 質 リ ン酸 化 酵 素 であ る 。 ツ メガ ェ ル で は、 Mos/MAPキ ナ ― ゼが 卵 成 熟 に必 要 不可 欠であ ると考 えられ ている 。実際 、多〈 の脊椎 動物の卵 成熟過 程に お いて Mos/MAPキ ナ ― ゼが 活 性 化 する こ と が 報告 さ れ ている 。しか し、そ の機能 の詳細 は未だ 不明で ある。
アカ ガェ ルでは 、くD2細 胞期胚 の片方 の割球 でMos/MAPキ ナーゼ を活性 化させる と、そ の割球 は中期 で 停 止 し た 。 ◎ 未 成 熟 卵 で Mos/MAPキナ ー ゼ を 活性 化 さ せ ても 、 MPF活 性化 ． GVBDは 誘 起 されな か っ た 。 逆 に 、卵 成 熟 過 程で の Mosの 合成 ま た は MAPキ ナ ― ゼ の活 性 化 を 阻害 し て も 、MPF活 性化 ． GVBDは 誘起さ れた。く Dの結果 はツメ ガエル やキン ギョの 結果と 同様で 、卵の 第二減数 分裂中 期
で の 停止 に 関 与 する 細 胞 分 裂抑 制 因 子 （CSF） の ー っと し て Mos/MAPキ ナ― ゼ は 種を越 えて普 遍的に 機 能す る こ と が示 さ れ た 。＠ の 結 果 から 、 Mos/MAPキ ナーゼ はツメ ガェル とは異 なり、 アカガ ェル 卵 成 熟 で は MPF活 性 化 ． GVBDに 直 接 関 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。 こ の こ と か ら 、 Mos/MAPキナ ー ゼが pre‑MPFを 活 性 化す る こ と で卵 成 熟 を 誘起 す る た め、 pre‑MPFが 存 在 しな いアカ ガェル では機 能しな いので はない かという 仮説を 導いた 。
また 、 MAPキ ナー ゼ を 予 め活 性 化 さ せた 未 成 熟 卵を MIH処理し た場合 、MPFの活 性化が 早まり 、逆に 、 卵 成 熟 過 程 での MAPキ ナ ーゼ 活 性 を 阻害 し た 場 合、 MPFの 活 性化 が 遅 れ た。 MAPキ ナ ―ゼ が 活性 化 しな い 状 態 でMosの み を 活性 化させ ると、 少量の サイク リンB蛋 白質が 合成さ れた。こ れらの 結果 は 、 ア カ ガ エ ル卵 成 熟 に おい て 、 Mos/MAPキナ ー ゼ は MPFの活 性 化 に 必要 十 分 で はな い が 、 Mosが MPFの構 成 成 分 であ る サ イ クリ ン Bの 合 成 を 補助 的 に 促 進し 、 MAPキ ナー ゼ が MPFの安 定化に 機能して いるこ とを示 す。こ の事実は ツメガ エルタ イプの 卵成熟 機構を 持つ動 物を用 いた実験では発見不可能 で、ア カガエ ルを用 いること で初め て明ら かにで きたも のであ る。
以上 、本研 究はそ れそれ の実験動 物の特徴を生かした実験により、魚類・両生類卵成熟で活性化される 蛋白質 リン酸化 酵素の 機能を 解析したもので、生殖生物学の発展に多大な貢献をなすものと考える。
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学 位 論 文 審 査の 要 旨
主 査 教 授 山 下 正 兼
副 査 教 授 鈴 木 範 男
副 査 教 授 高 橋 孝 行

学位論文題名h/IolecularBio
log
ic
alA
nal
ysesofP
rotei
nKi
na
ses
Activated during Oocyte :N/Iaturation
inFi
shandAmphibians（魚類・両生類卵成熟過程で活性化される蛋白質リン酸化酵素の分子生物学的解析）

近年、卵成熟誘起の分子機構の解析が盛んに行われている。濾胞細胞から分泌される
卵成熟誘起ホルモン(MIH)の刺激下、卵細胞内で蛋白質リン酸化酵素である卵成熟促
進因 子(MPF)が形 成・ 活性 化され るこ とで 卵成熟 は最終的に誘起されるが、MPF以外のりン酸化酵素も卵成熟の誘起やその正常な進行に重要な役割を果たすと考えられている。しかし、その詳細は未だ不明である。本研究は、卵成熟過程で活性化されるりン酸化酵素の作用機序を明らかにすることを目的に行われた。
学位論文は3章から成る。第1章では、キンギョとアフリカツメガェルの卵成熟過程で活性化する蛋白質リン酸化酵素の検索を目的に、MIH刺激後経時的に得た卵抽出液に44種の外来基質を加え、リン酸化の程度を測定した。その結果、両種で共通にりン酸化された基質はヒストンHl、ミェリン塩基性蛋白質(MBP)、ペプシンの3種であった。
ヒ ス ト ン HlはMPF (Cdc2ノ サ イ ク リ ン B） とCdk2で 、 MBPは マ イ ト ジェ ン活 性化リン酸化酵素(MAPキナーゼ）でりン酸化される。ペプシンをりン酸化する酵素はこれまで知られていなかったが、本研究によりMPFでりン酸化されることが明らかになった。以上の実験結果から、キンギョとツメガェルの卵成熟過程で共通して働いているのはMPF、Cdk2、MAPキナーゼのみで、両種で異なるりン酸化酵素が作用していることが示唆された。両種のMPF活性化機構は大きく異なり、本研究結果はこれを反映したものと推測された。
第 1章 の 実 験結 果 か ら 、 通 常 、 サイ クリ ンEと結 合し てGl期やGl/S移 行で 機能するCdk2が、M期の進行を含む卵成熟過程でも活性化されることが明らかになった。

卵成熟過程でのCdk2のサイクリンパートナーや活性化の分子機構は不明である。第2章で はCdk2の パートナーとしてサイクリンEに注目し、キンギョ卵成熟におけるサイク リン Eの挙動 を解 析し た。そ の結 果、 卵成熟過程でサイクリンEはCdk2と複合体を形成し、Cdk2を活性化することが明らかになった。さらに、未成熟卵でサイクリン E/Cdk2を 活 性化 し て も 、 MPFの 活 性 化 と 卵核 胞 崩 壊 (GVBD)は起 こら ず、 卵成
熟 過 程 で サ イ クリ ン E/Cdk2活 性 を 阻 害 し て も、 MPFの 活 性 化 とGVBDは 起こ ることがわかった。これらの結果は、サイクリンE/Cdk2は卵成熟過程で活性化するが、卵成熟の開始には直接関与しないことを示す。サイクリンE/Cdk2複合体はサイクリンEとともに胞胚期で消失することから、胚発生の初期段階で機能することが示唆された。
第1章の実験結果から、キンギョとツメガェル卵成熟過程でMAPキナーゼが活性化することが明らかになった。脊椎動物に限らず、多くの動物種の卵成熟過程においてMAPキナーゼが活性化することが報告されている。しかし、その機能の詳細は未だ不明である。脊椎動物においては、MAPキナーゼは癌遺伝子産物であるMosによって活性化される。第3章ではアカガェルを実験材料に、Mos/MAPキナーゼの卵成熟における機能を解析し、以下の結果を得た。＠2細胞期胚の片方の割球でMos/MAPキナーゼを活性化させると、その割球は分裂中期で停止した。◎未成熟卵でMos/′MAPキナー
ゼ を 活 性 化 さ せ て も 、 MPFの 活 性 化 は 早 ま る が GVBDは 誘起 さ れ ず 、 Mos/MAPキ
ナ ー ゼ を 阻 害 して も 、 MPFの 活性 化は 遅れ るが GVBDは 誘起 され た。 ◎MAPキ ナー
ゼの活性阻害下でMosを活性化させると、サイクリンB蛋白質が合成された。◎の結果はツメガェルやキンギョの結果と同様で、卵の第2減数分裂中期での停止に関与する細胞 分裂 抑制 因子 （CSF） として Mos/MAPキナ ーゼは種を越えて普遍的に機能することを示す・。◎、◎の結果はツメガェルと異なり、アカガェル卵成熟ではMos/MAPキナ ーゼ はMPFの 活性 化に 必要十 分で はな いが 、Mosが MPFの構 成成 分であ るサイ
クリ ンBの 合成を 誘起 し、 MAPキナ ーゼ がMPFを 安定化 する こと で卵 成熟を 促進することを示す。
以上をまとめると、著者は魚類・両生類卵成熟過程で活性化される蛋白質リン酸化酵素の 機能 を解 析し、Cdk2ノサイクリンEとMos/MAPKの機能に関する新知見を得たもので、卵成熟誘起で機能するりン酸化酵素カスケードの理解、特にMos/MAPキナーゼの一般的機能の理解に貢献するところ大なるものがある。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認める。