博 士 （ 医 学 ）木 嶋 ． 美 香
学位論文題名Natural killer cells play role in MHC classIin vzvo
induction in tumor cells that are IVIH
C negative iTl vit7'o（生体内におけるNK細胞の腫瘍細胞上のMHC classIの発現誘導作用）

学位論文内容の要旨【目的と背景】
NK細 胞 は MHC classI抗 原 を 消 失 し たmissing self の 腫瘍 細胞 を認 識し 、自 然免

疫に おいて 重要 な役 割を 呆た す細 胞の ひと っで ある 。し かし 、近年NK細胞はMHC classI分 子(Ly49D， Ly49H)や 非 MHC classI分 子 (NKG2D)を 発 現 し た 細 胞 を 認識 する こと が報告されており、NK細胞の細胞認識メカニズムはいくっか存在することが示唆される。また、NK細胞は IL― 2に よっ て正 に制 御されており、活性化および細胞増殖が惹起されるが、IL−2は む 汀 voお よ ぴ む 汀 む 〇 でNK細 胞 にIFN‑yの 産生 を誘 導し 、抗 腫瘍 効果 を発 揮す
る こと も 報告 され てい る。 IFN‑yの抗 腫瘍 効果 のひ とっ には 腫瘍 細胞 上に MHC classIを誘導 し、CTLよる腫瘍特異的な反応を惹起させる作用がある。よって本研究ではMHC class
Iが消 失し てい るた め免 疫原 性の 低いB16メラノーマ細胞にIL―2遺伝子を導入して免疫遺伝 子療 法 モデ ルを 作成 し、 missing self の状 態に あるB16に 対す るNK細胞 の役 割を明らかにするため以下の実験を行った。
【方法と結果】
マ ウス のメラノーマ細胞であるB16（H−2b)にIL−2遺伝子を導入し、限界希釈法によりIL― 2産 生 ク ロー ンを 樹立し た。 腫瘍 から のILー2の産生 はELISA法に よっ て確 認した 。
ILー2に よる 抗腫 瘍効 果を む汀 voで 検討するため、同系統のC57BL/6マウス（H−2b冫にmock遺伝 子導 入群 (B16/mock)あ るいは ILー2遺伝子導入群(B16/IL−2）を各1X l06個皮下接種 し、 腫瘍径を測定した。B16/ILー2はB16/mockに比べ増殖速度が遅く、7日目において腫瘍径が最大となり、33日目には完全退縮に至った。
次に生体内における腫瘍表面のMHC classI（H―2Db/H―2Kb）の発現の有無を検討した。マウスにB16/mock、B16/IL―2それぞれを接種し、腫瘍内の免疫細胞を除去して腫瘍細胞を解析し たと ころ 、B16/ILー2で は腫 瘍細 胞にMHC classIが強く発現し、B16/mockに韜いても部分 的な MHC classIの 発現 が認 められ た。他方、腫瘍から分泌されるIL―2による腫瘍自身に 対す るMHC classIの発 現誘 導能カ の有無を確認したところ、む灯troではB16/mock、B16/IL一2共にMHC classIの発現は認められなかった。

腫瘍 内ヘ 浸潤 する NK細 胞お よび T細胞 の浸 潤数 を検 討し たと ころ 、B16/IL―2では腫瘍内へのNK細胞の浸潤数がB16/mockに比ベ、約10倍（0．73％→7．6％）上昇し、T細胞も2．7倍 (7. 2%‑+19.8％） に浸 潤数 が増 加し た。またILー2によるNK細胞の活性化をCD69の発現を 指 標 と し て検 討し たと ころ 、B16/IL― 2に 浸潤 した NK細 胞の62.4％ はCD69を 発現 し、B16/mock (41.7%)に比べより多くの細胞に活性化がみられた。
NK細 胞の IFN‑yの発 現を real‑time PCR法を 用い てmRNAレ ベル での 発現を検討したところ 、 B16/ILー 2群 に お い て 有 意 に IFN‑yの mRNAの 発 現 増 加 が み ら れ た 。
む汀 voで のMHC classIの発 現に NK細 胞が関 与し てい るか 検討 する ため、anti−asialoGM1抗 体を 用いて NK細 胞を 除去 し、 腫瘍 細胞上のMHC classIの発現を解析した。B16/mock
ではanti−asialo GM1処理によって部分的に発現していたMHC classIは消失し、B16/IL―2に お い て も MHC classIの 発現 の減少 がみ られ た。 また 、NK細胞 がT細 胞に 与え る影 響を
検 討 す る た め、 B16/mock、B16/IL‑2各群 でNK細胞 を除 去し 、腫 瘍内 に浸 潤し てい るT細胞 の割 合を 検討 した とこ ろ、 B16/mockではT細胞の浸潤数に変化がみられなかったのに対し、B16/IL−2では腫瘍内へのT細胞の浸潤数の減少がみられた。
【考察】
腫 瘍局 所よ り産 生さ れる IL― 2は腫 瘍内へのNK細胞の浸潤数を増加させ、活性化およぴ
IFN'yの 産 生を 誘導 させ る。 さら にIL― 2遺 伝子 を導 入さ れた B16で はむ 汀voにお いて 腫
瘍 細 胞 に強 いMHC classIの発 現が 認め られ た。 また 、こ のMHC classIの 発現 はIL−2の直接 の作 用で はな いこ とは わ汀 むャ の系で確認された。このことよりIL−2はNK細胞を活性化し、間接的に抗腫瘍効果を発揮していることが示唆された。
そ こで 、NK細胞 がむ 汀voでMHC classIの発現 に関 与し てい るか 検討を行ったところ、anti−asialo GM1抗体 を用 いて NK細 胞を 除去し たB16/mockで はMHC classIの発現が完全に消 失し 、B16/IL―2に おい ても MHC classIの発現の減少がみられた。その機序のひとっに B16/mock（ 未 治 療 系） で は NK細 胞 由 来 の IFN‑yによ っ て MHC classIが誘 導さ れる ことが 考え られるが、IL−2遺伝子治療モデルではIL―2によって活性化されたNK細胞を介する以 外に も腫瘍表面にMHC classIを誘導させる機構が存在することが示唆された。また、腫 瘍 内 のNK細胞 はCTLを 活性 化さ せると の報 告が され てい るこ とよ り、 NK細 胞を 除去 した 腫 瘍 内の T細 胞の 浸潤 数を 検討 したと ころ 、B16/mockで は変 化が なか った のに 対し 、B16/IL一 2では腫瘍内でのT細胞数の減少がみられた。このことより、NK細胞は活性化にとも な い 、 T細 胞 の 浸 潤 数 を 増 加 さ せ る よ う な 効 果 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。
以 上 よ り 、 NK細 胞 は而 汀 vに お い てmissing self の 認 識 の み な らず 、細 胞性 免

疫に おい て腫瘍を認識するのに必要なlVfHC classI分子を腫瘍に誘導することで自然免疫と獲得免疫の橋渡しを行っていることが本研究で示唆され、ILー2による免疫療法への応用が期待される。

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 野 江 和 則
副 査 教 授 上出 利 光
副 査 教 授 西村 孝 司

学位論文題名Natural killer cells play role in R/IHC classIi7l VIVO
induction in tumor cells thatareMHCnegatiVe励 ぴ ヵ ァ D（ 生 体 内 に お け る NK細 胞 の 腫 瘍 細 胞 上 の MHCclassIの 発現 誘導作 用）

申請者は、腫瘍の拒絶におけるNK細胞の果す役割について検討し、NK細胞が産生するIFNYにより腫瘍のMHCclassI分子の発現がinvivoで誘導され、その結果CD3陽性T細胞による腫瘍の拒絶が起こるヌカニズムを同定した。C57BL/6マウス由来ヌラノーマ細胞株であるB16はinvitroにおいてはMHCclassIを発現していないが、invivoにおいてはMHC classIの発現が誘導されることを示した。B16にIL−2遺伝子を導入しIL―2を産生するようになった遺伝子導入細胞株を作成しこれをマウスに移植すると対照Mock遺伝子導入株に比較して拒絶されやすくなり、in vivoにおいてより強くMHC classIを発現するようになることを示した。また、これらのin vivoにおけるMHC classI発現と、腫瘍内 NK細 胞浸潤 、IFNy産 生、 CD3陽性 T細 胞浸 潤の 関連を 検討し抗NK細胞抗体であるアシア口GM1抗体投与の与える影響を解析した。アシア口GM1投
与に より NK細胞 の腫 瘍内 浸潤 が消失 し、 CD3陽性 T細胞の 腫瘍内浸潤が減
少し、腫瘍のMHC classI発現増強効果が消失した。このことより、IL−2によって活性化、誘導されたNK細胞がIFN‑産生を介して腫瘍のMHC classI発現を誘導し、また腫瘍内にCD3陽性T細胞を浸潤させる働きを持ち、この浸潤CD3陽性T細胞による腫瘍の拒絶を誘導することを示した。
発表後、主査の小野江教授より腫瘍細胞の免疫担当細胞による傷害への感受性、キラ一T細胞の活性化の検討、遺伝子導入が腫瘍細胞に与える影響、T細胞の腫瘍浸潤に関与する分子等について質問があった。次いで副査の上出教授
よルアシアロGM1抗体投与により腫瘍浸潤の減少を示す細胞群、腫瘍のMHCclassI発現に関与するNK細胞以外の細胞群の可能性等について質問があった。

さらに副査の西村孝司教授より腫瘍拒絶のヌカニズム、T細胞記憶の形成、アシア 口GM1陽 性CD8陽 性T細胞 の関与の可能性等について質問があった。最後に会場の参加者から腫瘍拒絶におけるT細胞の必要性等について質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は自身のデータや関連する論文報告などを引用し、滞り無く適切な回答をした。
この論文は腫瘍のMHC classIの発現調節を通じて抗腫瘍免疫応答においてNK細胞が自然免疫系から獲得免疫系の橋渡しという重要な役割を果していることを示唆する点で高く評価され、抗腫瘍免疫の精緻な理解、今後の有効な癌の免疫学的治療の開発に貢献することが期待される。
審査員一同はこれらの成果を高く評価し、大学院過程における研鑽や取得単位などをも併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判断した。