倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1457

新規膵がん遺伝子型モデル動物に立脚した
膵がん個別化治療法の開発
代表研究者

園下将大

北海道大学遺伝子病制御研究所

教授

Developing personalized therapy for pancreatic cancer leveraging a novel
whole-animal platform
Principal Researcher

Masahiro Sonoshita,
Hokkaido University Institute for Genetic Medicine Professor膵がんは、代表的な難治がんである。近年、患者の遺伝子型に合わせた個別化医療が注目を集めているが、膵がんにおける開発はいまだ十分ではない。我々は本研究で膵がんの遺伝子変異を模倣した初のショウジョウバエモデル群を作出・解析し、遺伝子型が腫瘍形質を規定することを見出すとともに、網羅的遺伝学解析により新規治療標的を同定することに成功した。これらの結果は、膵がんの個別化医療の実現に向けた基盤となるものである。
Pancreatic cancer is a typical intractable cancer. In recent years, personalized medicine based on thepatient's genotype has been attracting attention, but its development in pancreatic cancer is stillinsufficient. In this study, we generated and analyzed the first Drosophila models that mimic the genetic
mutations of pancreatic cancer. Analyzing them, we found that genotype determines tumor characteristics,
and successfully identified novel therapeutic targets by comprehensive genetic analysis. These results
provide the basis for achieving personalized medicine for pancreatic cancer.

1．研究内容cDNA を得た。ハエゲノムには P16 が存在しない1.1 新規膵がん遺伝子型モデルハエの作出ため、哺乳類の P16 不活性化とハエにおいて機能膵がん臨床検体では、がん遺伝子 KRAS の活性的に等価な CycE の発現により、本研究では P16化や、がん抑制遺伝子群 TP53・P16・SMAD4 の不活性化を模倣した。これらの配列をハエ p53 と不活性化が単独あるいは組み合わせとして各々観

Smad4 のノックダウンのための shRNA ととも察される。膵がんの病態の包括的な理解には多様にベクターに搭載して w ハエ 受 精 卵 に 顕 微 注

なこれらの多様な遺伝子型を模倣した動物モデル入し、これらの外来遺伝子を生殖系列に持が不可欠である。

つ ハ エ を 作 成 し た 。 こ の ハ エ を patched

そこで申請者らは、ハエを使用して新規モデル(ptc)-gal4-GFP ド ラ イ バ ー 系 統 と 交 配 す る こ動物の作出を試みた。まず、非遺伝子組換えであとで、これらの外来遺伝子が幼虫の翅原基を含る w ハエから cDNA を得た。これを鋳型とし、PCRむ単層上皮組織で発現する ptc>RasG12D（1-hit）

にてハエ野生型 Ras と Cyclin E (CycE) の全⻑

ハ エ や ptc>Ras G12D-p53 shRNA-CycE-Smad4 shRNA倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成（4-hit）ハエを作出した。

すると患者の予後が悪化する報告と矛盾しない

これらのハエを 16℃にて飼育したところ、形質（Qian et al. JAMA Oncol 2018）。

転換が発生した。特に 4-hit ハエは、致死表現型を以上の結果は、膵がんの遺伝子型を模倣した初呈した（図１）。これは Ras のみを活性化した 1-hitのモデルハエの作出に申請者らが成功したことをモデルよりも重篤な表現型で、遺伝子変異が蓄積示している。

1-hit
RasG12D

controlptc>GFP

4-hit
RasG12D-p53shRNACycE-Smad4shRNA

翅原基（ 上皮）10055
ハエ生存率（ ％）0

図１：膵臓がん遺伝子型ハエモデル。
翅原基（赤：輪郭）で、patched (ptc)プロモーター活性を利用して約 10 細胞ぶんの幅の単層上皮細胞に遺伝子操作を施した。⿊い領域は野生型細胞。Ras 遺伝
子を活性化すると、形質転換細胞の増殖が亢進して帯が広くなる（1-hit）。４遺伝子異常ハエ（4-hit）では一層増殖が活発になり、遊走能が亢進した腫瘍細胞が出現し（右；矢頭）、ハエは致死となる。

1.2 新規膵がん治療標的の同定
申請者らは次に、膵がんの新規治療標的を遺伝4-hit

子型ごとに同定すべく、まず 4-hit ハエを使用して+balancer[gal80]

網羅的遺伝学スクリーニングを実施した。本研究では、ハエのキノーム中の全キナーゼ（252 遺伝子）のヘテロ接合性変異体（BDSC）を網羅した「キノーム変異体ライブラリ」を構築し、これらの変異体を各々4-hit ハエと交配した。これにより、各々のキナーゼのヘテロ接合性変異を有する4-hit ハエを作出した。そして、簡便な定量化が可

4-hitkinase×vs.

4-hitハエ（ キナーゼヘテ ロ 変異）

kinase+balancer
4-hit+balancer
4-hitハエ（ 対照）

図２：網羅的遺伝学解析による、膵がん形質を規定するキナーゼの探索。
キナーゼ遺伝子（全 252 種）のヘテロ接合性変異（kinase-）

能なハエ生存率を指標とし、これらの各系統の腫を 4-hit ハエに独立に導入し、ハエの生存率を対照ハエ（キ瘍形質を比較した（図２）。

ナーゼ野生型）と比較する。あるキナーゼの変異により 生全てのキナーゼ遺伝子の機能を検索した結果、存率が改善した場合、このキナーゼの本来の機能は膵がん形キナーゼ遺伝子 X のヘテロ接合性変異を 4-hit ハ質の促進と判断できる。balancer, バランサー染色体（変異エに導入すると、導入しない場合と比較してハエ遺伝子の発現やヘテロ接合性変異の維持に必要な染色体）。の生存率が著明に改善することが分かった（図３

阻害する化合物 A は、申請者らが別の実験で膵がA）。この結果は、X の活性の阻害が膵がん形質のん形質抑制効果を見出していた MEK キナーゼの抑制につながる可能性を示している。実際に X を阻害剤（MEKi: 0.5 μM）との同時投与により、

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成にルシフェラーゼを導入した。そして、この細胞を BALB/c ヌードマウスの膵臓に同所移植した。
定期的にルシフェリンを腹腔内投与し In VivoImaging System（IVIS）を使用してルシフェラーゼ活性を測定したところ、腫瘍由来の発光量が日数経過とともに増大することが分かった（図５A）。
以上の結果より、ヒト膵がん細胞が個体内で生着・成長する膵がんマウスモデルの樹立に成功し、今後の実験の基盤を構築できたと言える。
図３：膵がん形質促進キナーゼの同定。
A,キナーゼ遺伝子 X のヘテロ接合性変異は、4-hit ハエの生1234（週）存率を改善する。B, MEK 阻害剤（MEK i）と X の阻害剤 Aの併用は、4-hit ハエの生存率を改善する。*、P < 0.05 inDunnett test。

4-hit ハエの生存率の著明な改善をもたらした（図３B）。また A やこの組み合わせは、ヒト膵がん細胞株 MIA Paca-2 の増殖を著明に抑制した（図図５：ヒト膵がん細胞同所移植モデルマウスの作出。

４）。申請者らは、同様の細胞増殖抑制効果をルシフェラーゼ標識した AsPC-1 細胞をヌードマウスの膵臓Panc-1 や Capan-1 など他のヒト膵がん細胞株でに移植し、毎週 IVIS（In Vivo Imaging System）にて腫瘍の成も確認した。これらの結果は、これらの結果は、Xと RAS-MEK 経路の同時阻害が膵がん形質を抑制することを示唆している。

⻑を測定した。⻘から赤に変化するにつれて発光強度が⾼い。

1.4 考察と今後の展望
本研究により、膵がん形質を規定する機序の一端が明らかとなった。すなわち、遺伝子型の相違Aが膵がん形質に大きな影響を与えることが分かった。我々の知見は、悪性になるほど変異している遺伝子数が増加するという膵がん臨床検体の知見

MEKi
図４：化合物の併用によるヒト膵がん細胞の増殖抑制。
MIA Paca-2 細胞に A と MEK 阻害剤を添加し、３日後の相対生存細胞数を測定した。他のヒト膵がん細胞株 Panc-1や Capan-1 細胞においても同様の結果を得ている。*、P <0.05 in Dunnett test。

（Morris et al. Nat Rev Cancer 2010）や、4-hit 膵がんを有する患者は 1/2/3-hit 膵がんを有する患者よりも予後が悪いとする報告（Qian et al. JAMA Oncol2018）と矛盾せず、ハエが膵がん研究の重要なモデル生物となり得ることを示している。
また我々は本研究で、4-hit 膵がんの新規治療標的や治療薬シーズを同定することに成功した。
我々は最近他の遺伝子変異パターンを模倣したハ1.3 膵がんマウスモデルの作出エの作出にも成功しており、今後は、これらのハ我々は現在、これらの結果が哺乳類個体レベルエで同様の解析を実施することで、患者の遺伝子でも再現するか検討を進めている。この目的のた型にあわせた膵がんの個別化医療の基盤を創出でめ、まず 4-hit 変異を有するヒト膵がん細胞 AsPC-1きると期待される。

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2．発表（研究成果の発表）2.1 論文
Yamamura R, Ooshio T, Sonoshita M. Tiny
Drosophila makes giant strides in cancer research.
Cancer Sci. 112:505-514, 2021.
2.2 学会発表• Masahiro Sonoshita Determining therapeutic
vulnerabilitiesinpancreaticcancerusingawhole-animal platform. 第80回日本癌学会学術総会（2021年）•園下将大 個体表現型スクリーニングが加速する
新規がん治療薬開発. 第25回日本がん分子標的治療学会（2021年）• Masahiro Sonoshita Drosophila approaches todevelopnovel

cancerdrugs.

TheTARAInternational Symposium（2021年）•Masahiro Sonoshita A whole-animal platform toadvance drug discovery. Imperial College London
Life Sciences Seminar（2021年）
謝辞
本研究は、公益財団法人日立財団の2020年度倉田奨励金により実施することができました。ご支援に深く感謝申し上げます。