倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成■受領№1448

長期記憶維持における細胞小器官の局在変化と分子基盤の解明
代表研究者

上田（石原）

奈津実

東邦大学 理学部 生物分子科学科准教授

Elucidation of the molecular mechanisms and organelle
localization underlying long-term memory retention
Principal Researcher

Natsumi Ageta-Ishihara,
Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University associate professor

昨今、軽度認知障害は正常と認知症の中間状態(経験した出来事を時間、空間的な文脈とともに記憶するエピソード記憶の障害はあるが、日常生活に支障がない状態)と定義された。申請者はセプチンの脳神経における役割を研究している。この過程で、セプチン⽋損マウスはエピソード記憶の⻑期記憶障害を示すことを見出した。本研究では創薬や診断技術への応用を見据え、記憶維持の分子・細胞基盤を解明することを目指した。
Mild cognitive impairment has been defined as an intermediate state between normal and dementia(impairment in the retention of episodic memory, etc., while not interfering with daily life). We have been
studying the physiological significance of the neural network formation and maintenance of the septin
cytoskeleton. In this process, they found that septin-deficient mice exhibit long-term impairment ofepisodic memory. The aim is to elucidate the molecular and cellular basis of memory maintenance, which
will be a breakthrough for research on drug candidate molecules and diagnostic methods for mild
cognitive impairment.

1．研究内容している(Ageta-Ishihara et al., Nature Commun

目的2013, Nature Commun 2015, Neurochem Int 2018,

認知症の中核症状は進行性の学習・記憶障害でNeurosci Res 2021)。申請者は、系統的行動解析をあり、日常生活に支障をきたすこともある。近年、実施し、認知機能を中心にセプチン⽋損マウスの経験した出来事を時間、空間的な文脈とともに記示す行動レベルでの異常をスクリーニングした。

憶するエピソード記憶の障害はあるが、日常生活その結果、セプチン⽋損マウスは複数の行動解析に支障をきたさない状態が正常と認知症の中間状パラダイムで一貫してエピソード記憶障害のみを態として軽度認知障害と定義された。認知症を根示す珍しいマウスであることを見出した(未発表)。

治できる薬物療法は存在しないことから、可逆性学習や記憶の細胞レベルの素過程として、神経の残る軽度認知障害に対する創薬候補分子の探索

細胞同⼠の結合部における伝達効率が⻑時間上昇が求められている。申請者は細胞骨格セプチンのする⻑期増強(L-LTP)が知られている。とりわけ、脳神経回路形成と維持における生理的意義を研究

情報を受け取る神経線維(樹状突起)から突き出て倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成いるスパインの形態および構成タンパク質の可塑解析には ImageJ を用いた。神経細胞の細胞体部分的変化は学習記憶などの高次機能に重要と考えらに ROI を設定して、ROI 内の GCaMP6f 輝度値のれている。申請者はエピソード記憶の分子・細胞平均（ROI 内の総輝度値 / ピクセル数）を算出しレベルの基盤を解明するため、スパイン形態と構造た。同形の ROI でバックグラウンドノイズを算出を精査し、興味深い結果を得ている(Ageta-Ishihara

し減算した（F(t)）。F(t)の平均値を F0 として、

et al., 未発表)。本研究では「記憶維持の細胞基盤⊿F/F を算出した（⊿F/F= (F(t)−F0) / F0）。カとして神経細胞の持続的な伝達効率上昇の持続にルシウムイベントが観察されない 5 秒間の⊿F/F

は刺激依存的なスパイン内ダイナミクスとそれに標準偏差を noise と定義して、SD response を算出

伴う局所 Ca2+濃度上昇が必要である」と仮説を立し た （ SD response = ( ⊿ F/F) / noise ）。 SDて立証すること、創薬や診断・治療技術への応用

response の値が 5 を上回り、下回るまでを 1 回のを見据えた分子基盤の網羅的同定を目的とした。

カルシウムイベントと定義して、イベント回数を具体的には、神経細胞に刺激を与え、対象分子や定量した。解析後、イベント回数を目視で計測し、Ca2+の時空間的動態をイメージングで解析すると解析結果と差異がないことを確認した。上記の方ともに、質量分析を用いたセプチン会合分子の同法で正確に解析ができなかった細胞は解析から除定を行った。

外した。実験の結果、対照群では、刺激後 30 分で増加したカルシウムイベント(自発発火)回数は、刺激後 300 分まで、刺激前よりも高い状態に維持

結果
1. 対象分子や Ca のイメージング2+された。このことは、刺激により⻑期増強が誘発

SD ラット生後 1 日(親付)を日本エスエルシー株されたことで、各スパインにおけるシナプス伝達式会社より購入した。全ての動物実験は、名古屋効率の上昇が⻑期に維持された結果であると考え大学の動物実験委員会の許可を受け、動物実験ガられる。一方、刺激依存的な対象分子の移動が生イドラインに従い行った。生後 1 日齢ラット海馬じないセプチン⽋乏群では、刺激後 30 分では対照ニューロンを分散培養し、7 日目(div7）にリポフ群と同様にカルシウムイベント回数が増加したもェクション法を用いて、プラスミドベクターを導のの、刺激後 300 分では、刺激前と同等のレベル入 し た 。 div19-23 に 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡まで減少する様子が観察された。以上より、刺激/LSM-780 で観察した。細胞体内カルシウムイメー

セプチン依存的な対象分子の移動が、刺激に伴うジングは神経活動を誘発する刺激と組み合わせて神経活動の亢進を⻑期的に維持させることに必要実施した。刺激の 15 分前、60 分後、300 分後にであることが示唆された。

それぞれ細胞体の撮影を行った。各撮影では、256× 256 ピクセル、0.6 倍ズーム、ピンホール径最2. 質量分析を用いたセプチン会合分子の同定

大で、4 Hz、90 秒間の GFP（GCaMP6f）蛍光画

3 か月齢、オスの野生型マウスの脳を摘出し、像を取得した。1 回の実験で 15-20 細胞程度の撮セプチンの特異的抗体を用いた免疫沈降と質量分影を行った。レーザーパワーは、4Hz、5 分間の連析によりセプチン会合分子を網羅的に同定した。

続撮影を行った際に、①GCaMP6f のベースライ同定分子群の会合や刺激に伴う翻訳後修飾の有無ン蛍光輝度値や、②カルシウムイベント(神経発を生化学的解析により定量しており、刺激に伴う火)頻度の急激な増加が観察されないように設定

神経活動の亢進を⻑期的に維持させる分子基盤をした。実験中に一度もカルシウムイベントが観察同定している。引き続き、データを積み重ね論文されなかった細胞や、死細胞は解析から除外した。

として纏める。

倉田奨励金研究報告書 第 51 集｜2020 年度（第 52 回）助成
自然科学・工学研究部門：1 年助成

最後になりましたが、本研究課題を実施するにあたり、多大な研究助成を賜りました公益財団法
人 日立財団に深く感謝申し上げます。

2．発表（研究成果の発表）（講演会発表）・上田(石原)奈津実, 木下専
記憶の⻑期化に寄与するスパイン内⼩胞体の役割
第19回神経科学研究会
2022年1月22日, オンライン
・Ageta-Ishihara N
A new kind of positive feed-back regulation via theorganelle extension
RIKEN BDR ‘Women and Future in Science’Seminar
2021年12月20日, オンライン（学会発表）・ Ageta-Ishihara N, Fukazawa Y, Takao K,
Kengaku M, Miyakawa T, Inokuchi K, BitoH, Kinoshita M.
A myosin/septin-dependent postsynaptic regulation
required for memory consolidation
第44回 日本神経科学大会、第1回 CJK 国際会議
2021年7月30日, 神⼾コンベンションセンター