課題番号52

基底小体付属構造体の構築を担う分子基盤の解明とその役割の解析［１］組織代表者：千葉 秀平（大阪市立大学大学院医学系研究科）
対応者：安井 明、菅野 新一郎（東北大学加齢医学研究所）
研究費：物件費 28 万 3 千円，旅費 1 万 7 千円

［２］ 研究経過[背景と目的]
一次繊毛は細胞外の物理的・化学的刺激、液性

図 1: 中心体と基底小体の構造と各構成部位の名称

因子などの細胞外シグナルを受容するアンテナとしての役割を担っており、その構造面・機能面の欠陥ている細胞周期と中心体・BB 構造変化の密接な連は発生異常や嚢胞性腎疾患、網膜変性や肥満を複合動性を生む分子システムを明らかにすることを目的的に呈する遺伝性疾患 (繊毛症)の発症と密接に関連とする。

する。細胞が血清飢餓や細胞間接触により増殖相か中心体関連因子 ODF2 の欠失(KO)細胞は、DAP おら休止相 (G0 期) に移行すると、中心体を構成する

よび SAP の形成不全を呈する。一方で、KO 細胞へ２つの中心小体 (親中心小体、娘中心小体) のうち、の ODF2 変異遺伝子の導入は SAP のみの形成不全を特徴的な付属構造体である Distal Appendages (DAP)と呈する (Tateishi et al. J.Cell Biol. 2013)。上記の結果は、Subdistal Appendages (SAP)を保持する親中心小体は基ODF2 が 2 つの突起構造の形成の基礎となる重要な底小体(Basalbody:BB)へと変換され、遠位部からの軸因子であることを示す。本研究はプロテオミクス技

糸伸長を伴って、一次繊毛が形成される(図 1)。一術を基盤とする ODF2 相互作用蛋白質の網羅的解析

連の中心体-BB の構造変換は細胞周期依存的に起こを皮切りとして平成 27 年度にスタートし、前年度ると想定されているが、現時点では中心体の構造変までに複数の ODF2 相互作用タンパク質 (ODF2化を細胞周期と連動させる機構の詳細は不明であinteracting protein: ODF2IP) の同定に成功した。本年度

る。DAP は一次繊毛形成の初期段階で BB の膜直下は前年度に引き続き、ODF2IP のひとつであるへの繋留に必要である。一方で、SAP の欠損は一次Cep128 について、基底小体構造、繊毛構築、細胞繊毛の形成自体には必須でないものの、一次繊毛の周期進行に果たす役割を解析した。さらに、機能構築における役割はほとんど明らかになっていODF2、Cep128 の相互作用蛋白質について、既存オない。そこで、本研究は基底小体付属構造体、特にミクスデータの統合的解析を行い、両者に相互作用

SAP について、その分子基盤ならびに構成機序の解すると想定される候補因子に関して、その局在解析明を足がかりとして、未だに不明な点が多く残されならびに相互作用解析を行った。

[研究打ち合わせの開催状況]
当該年度の研究計画、達成目標は代表者の千葉と菅野講師は主に電子メールが通じて連絡をとりあい設定した。進捗状況については頻繁に連絡をとりあい、その都度、課題の共有や実験手法の見直しを図ってきた。本年度 3 月には、千葉が加齢研を訪れ、これまでの成果をまとめた学術論文の投稿に向けた具体的なプロセスを話し合った。

［３］ 成果（３－１）研究成果
前年度までに構造化照明顕微鏡法 (Structuredillumination microscopy : SIM)による超解像度顕微鏡イメージングと電子顕微鏡による解析から、Cep128が ODF2依存的に SAPに局在すること、Cep128欠損細胞は SAP の形成不全を呈すること、ODF2-Cep128が階層最上位として既知SAP分子の中心体局在を制御することを見出した。本年度は Cep128 の相互作用因子として新規に見出した細胞周期制御因子について、細胞内免疫沈降法と in vitro 結合実験による相互作用解析を行い、この因子が Cep128 との結合により中心体に局在し、活性が亢進することを見出した。この因子は細胞周期 G1-S 期の移行に欠くことのできない重要な因子として知られるが、実際、Cep128 の欠損細胞では G1-S 期への移行が著しく阻害され、細胞は休止期へと積極的に移行し、繊毛を形成することが明らかになった。これらの成果については現在、学術論文投稿に向けて準備している。
加えて、菅野講師はin silico解析によって新たに相互作用すると想定される因子を見出しており、今後この因子に関しても相互作用解析を行っていく予定である。

（３－２） 波及効果と発展性など
これまでに構築した ODF2変異細胞株は DAPならびにSAPの機能や制御基盤を個々に解析するツールとして役立つことが大いに期待される。さらに、
ODF2-Cep128 を起点として、中心体・基底小体付属構造体の構築を担う分子基盤が詳細に明らかになっていくことが期待される。本研究では、上述の通り
Cep128 の発現抑制が増殖 相から休止相への移行(増殖阻害)と一次繊毛の形成を促進することを見出している。一部の組織では増殖と分化への移行にかけてSAPが消失することが報告されており、付属構造体の構築制御自体が細胞周期の進行を制御することも想定される。現時点では細胞周期が中心体・BB 構造変換を制御するのか、中心体・BB 構造変換が細胞周期を制御しうるのか、はたまたその両方が連携しあうことで細胞周期と中心体・BB 構造変化の密接な連動性が生まれるのかを示す決定的な証拠は見いだせていないが、本研究を足がかりとして ”中心体による細胞周期制御システム” という新しい概念の提唱に加えて、その一端を担うと想定される分子システムの全貌が明らかになることが期待される。また、SAP の構築異常は原発性繊毛機能不全症と関連することが明らかになっており、本研究で得られた成果は繊毛病の原因究明、新たな病理マーカーの発見、繊毛症治療方針の提案などの臨床面での応用へと派生することが期待される。

［４］成果資料 (主なものを示す)
1. 『超解像度技術の一次繊毛解析への応用』
千葉秀平 (2018) 羊土社 実験医学 4 月号 Vol.36. 970971
2. Glucose deprivation induces primary cilium formation
through mTORC1 inactivation. Takahashi, K. Nagai, T.,
Chiba, S., Nakayama, K., Mizuno, K. (2018) J. Cell Sci. 131,jcs208769. doi:10.1242/jcs.208769
3. 「一次繊毛形成と細胞周期を制御する中心体の分子基盤」 柏原宏香、千葉秀平、加藤洋平、菅野新一郎、中山和久、矢野智樹、月田早智子(2018) 生体運動研究合同班会議プログラム. 1 月
5~7 日 法政大学 市ヶ谷キャンパス
4. 膨張顕微鏡法を用いた一次繊毛の超解像イメー
ジング」 加藤洋平、千葉秀平、中山和久 (2017)
生命科学系学会合同年次大会. 12 月 6-9 日. 兵庫・神戸国際会議場
5. 「中心体機能制御インターフェースとしてのア
ペンデージ構造の分子基盤」 柏原宏香，千葉秀平，菅野新一郎，月田早智子 (2017) 第 69 回日
本細胞生物学会大会シンポジウム. 6 月 5 日-８日宮城・仙台国際センター