博 士 （ 医 学 ） 廣谷真

学位論文題名Immunoregulatory function mediated byToll一like receptor9inBcells in multiple sclerosis（多発性硬化症のB細胞におけるToll・likereceptor9と免疫調節性機能に関する研究）

学位論文内容の要旨【背景と目的】
多発性硬化症(Multiplesclerosis:MS)
は脱髄を主体とした中枢神経系の炎症性疾患であり、中枢神経の複数の部位に病変が存在し（空間的多発性）、また増悪と寛解を繰り返す（時間的多発性）ことを特徴とする。中枢神経髄鞘を標的とした自己免疫疾患と考えられているが詳細な病態は解明されておらず、免疫学的機序のほか、遺伝的要因や環境要因など様々た角度から病態の研究が行われている。
近年、本邦ではMSの有病率が大きく上昇しており、それに伴い、従来日本人に多いとされて きた 視神 経脊髄型 M
Sから欧米人と同様な病像を呈する、いわゆる通常型MSへと臨床像が変化しつっある。このように本邦におけるMSの臨床像はここ数年で大きく変化しつつある 。MSにお ける 自己 免疫 動態 はThl細胞 、Th17細胞系列が疾患増悪に関連す るとした獲得免疫を中心に解析されてきたが、このような変化の一因にM
Sの自己免疫動態における自然免疫の影響が示唆されている。古くからMSの発症や再燃に関わる因子のひとっに微生物感染が挙げられており、その一因として分子相同性やToll‑likereceptor(TLR)を介したシグナル伝達の関与が推測されている。
TLRは自然免疫における病 原体認識分子であるが、その機能は自然免疫にとどまらず獲得免疫もダイナミックに誘導することから近年注目されているレセプターである。自己免疫疾患におけるTLRの機能は 疾患増悪と寛解のいずれにも働くことが報告されており、その詳細な作用機序は不明であるが、最近自己免疫性脳脊髄炎においてTLR9が免疫調節性機能を誘導する可能性が報告された。TLR9はB細胞と形質細胞様樹状細胞に発現し、非メチル化DNA(CpGDNA）がりガンドとして同定されている。
一 方、 B
細 胞の 液性免疫機能は古くから知られて いるが、近年B細胞のもつ免 疫調節性機能が注目されている。その免疫調節の機序としてB細胞より産生されるinterleukin(IL)‑10の重 要性 が指 摘され、 MSではB細胞のIL‑10産生が低下していることが報告され ている。
B細胞の免疫調節性機能に関 わる因子として、樹状細胞の関与や、B細胞に発現するTLR、B細胞受容体、CD40が報告されている。
こ の よ う な背 景か らMSのB細胞 にお け るTLR9を 介し た免 疫調 節性 機能 の可 能性 について検討することを研究課題とした。
【対象と方法】
再 発 寛 解 型MS患者 36例 （再 発期 6例 、 寛解 期30例で 寛解 期症 例は 未治 療10例、 イン‑ 408−

ターフェロン(IFr.D
口‑1a
治療10例、IFNロ‑lb
治療10例）と健常者10例を対象とした。対象者の末梢血を採取し、 Flowc
ytometryを利用しCD
19陽性B
細胞表面におけるCD27、CD80、CD86と B
細 胞内 にお け るTLR9の 発現 を測 定した。また、単核 球を分離したのち、磁気ビー ズ で CD19陽 性 B細 胞 を 分 離 、 0.25pMの CpGDNA (ODN2006)で 24時 間 刺 激 し 、enzyme‑linkedimmunosorbentassay(ELISA)にて上清中のIL‑
10、IL‑
12(p40)、tumornecrosisfactor (TNF)‑a、Lymphotoxin(LT)‑aを測定した。統計解析は全群間におけるサイトカイン 産生 とB細胞 の抗原発現を一元 配置分散分析(Analysis ofVariance：ANOVA)ならぴに
Turkey‑Kramer検定を用いて行い、相関解析に関してはSpearmanの相関解析を使用した。なお、本研究は北海道大学 病院自主臨床研究審査委員会で承認され、対象者より文書で同意を頂いた。
【結果】
今回得られた知見は以下のとおりである。
(1)CpGDNA
刺激によるB細胞のIL‑10産生はMS群で有意に低かった。
(2) CpGDNA刺 激 に よ る B細 胞 の IL‑12 (p40)産 生 は 再 発 期 MS群 で 有 意 に 高 か っ た 。
(3) CpGDNA刺 激 に よ る B細 胞 の TNF‑a、 LT‑a産 生 は 各 群 で 有 意 差 が 詮 か っ た 。
(4) IFN
治 療群 と非 治 療群 では C
pG D
NA刺激 によるB細胞のサ イトカイン産生に有意な差を認めなかった。
(5) memory
B細胞に茄けるTL
R9のMean FluorescenceIntensity (MFI)はMS群で有意に低かった。
(6) memoryB
細 胞に お ける T
LR9のMFIと B細胞 のIL‑10産 生に 有意 な正 の相関を認めた。
【考察】
今回 の結 果か ら、 MS
患 者で はTLR9を 介し たB
細胞のサイト カイン産生に調節障害があり 、 TLR9を 介 し た B細 胞 の IL‑10産 生 の 低 下 は memoryB細 胞 に お け る T
LR9発現 の低 下に 起 因 す る 可能 性が 考え られ た 。naiveB細胞 とmemoryB
細 胞 はい ずれ もTLR
9を 介し てIL‑10産 生 を 誘導 しう るが 、CpG DNAは一 般に TLR9が高 発現 して いる memory
B細 胞へ 直接 的に 作用 し細 胞分化を強く誘導することが報告されている 。今回の結果と併せ、MSのmemoryB
細 胞に おけ る T
LR9発現 の低 下が I
L‑10産 生 の低 下に 影響 して いる可能性が考えら れた 。ま た、 T
LR9刺激 によ るB細 胞産 生性 I
L‑10はTh17細 胞の 機能 を抑制することが
報 告さ れて おり 、TLR9を 介し たB細 胞へ の刺 激が T細胞 など を含 むMSの免疫動態に影響している可能性が考えられた。
【結論】
MSで は TLR9を 介し たB細 胞の IL‑10産生 が低 下し 、B細胞 に よる 免疫 調節 性機 能が 低下 して いる 可能 性が示唆された。また、TLR9を介したB細胞のIL‑10産生の低下はmemoryB細胞におけるTL
R9発現の低下に起因する可能性が考えられた。
今 後 は MSの形 質細 胞様 樹状 細 胞に おけ るTLR
9の 機能 解析 や、 B細胞 にお ける T
LR9とBCR、 CD40との 相互 作 用の 解析 を研 究課 題と 考え てい る。 MSに おけ るTL
Rをはじめとした自然免疫に関する病態 は未解明の部分が多く、また治療ターゲットのーっになり得る可能 性を 十分に 秘め てい るこ とか ら、 今後 更な る研 究を 推し 進め る予定である。

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学 位論文審査の要 旨
主査

教授

石田晋

副査

教授

今村雅寛

副査

教授

小池隆夫

副査

教授

清野 研一 郎副査

教授

佐々 木秀 直学位論文題名Immunoregulatory function mediated byToll− like receptor9inBcellsinmultiplesclerosis（多発性硬化症のB細胞におけるTon―likereceptor9と免疫調節性機能に関する研究）

近年、本邦では多発性硬化症(
MultipleSclerosis:MS)の有病率が大きく上昇している。それに伴 い、 本邦 におけるMSの臨床像は、従来日本人に多いとされてきた視神経脊髄 型M
Sから欧 米人 と同 様な病像を 呈する、いわゆる通常型MSへとシフトしっっある。MSに おける
免疫動態は獲得免疫を中心に解析されてきた が、このような変化は自然免疫の影響が示唆
き れ 、 特 に 分 子 相 同 性 や Toll‑like receptor (TLR)の 関 与 が 推 測 さ れ て い る 。
自己免疫疾患におけるTL
Rの機能は疾患増悪と寛解のいずれにも働くこ とが報告されているが、最近自己免疫性脳脊髄炎においてTLR9が免疫調節性機能を誘導する可能性が報告され た。 TL
R9はB細 胞と 形質 細胞 様樹 状細 胞に 発現 し、 CpG DNAが りガンドとし て同定されている。一方、近年B細胞のもつ免疫調節性機能が注目されており、その機序としてB細胞産生性interleukin(IL)‑10の重要性が指摘されている。
こ の よ うな 背 景か らMSのB細胞 にお ける TLR
9を 介し た免 疫調 節性 機能 の可 能性 について 検討 する こと を研 究課 題と し た。 M
S患 者36例を 対象 にCpG DNAでB細胞を刺 激し、その サイ トカ イン産生を 検討したところ、MS患者ではIL‑10産生が有意に低く、IL‑12産生 が 有 意 に高 い こと が判 明し た。 また 、MS患者 のmemoryB細胞 では T
LR9発現 強度 が有意 に 低 く 、さ ら にmemoryB
細 胞に おけ るTLR9発現 強度 とB細胞 から のIL‑10
産 生に は強い相 関が 存在 した 。こ れら の結 果 から M
Sで はTLR
9刺 激に よる B細胞 性I
L‑10産生 が低下
し て お り 、 B細 胞 に よ る 免 疫 調 節 性 機 能 が 低 下 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
審査ではM
Sの有病率上昇についてMR
Iによる診断技術の向上ぬど、有病 率上昇の修飾因
子の 可能 性に ついて問い があった。発表者は2006年Houzenらの論文を引用し、疫 学調査のデザインについて触れ、MRIなどの診断技術向上によるところはなく、真の有病率上昇が考えられることを説明した。また、衛生仮説 にっいてその概要の問いがあった。発表者は
従来 のThlーTh2
パラダイ ムでは衛生環境が改善することによりThlからTh2
偏倚が 誘導さ― 410―れることでア レルギー性疾患が増えている点を説明した。またMSは潰瘍性大腸炎などと同様にThl優位の疾患と考えられてきたが、 近年Th17の病態への関与が報告されていることに触れ、衛生 仮説は前述のThlからTh2へのシフトのみではなく、IL−10やTGF‑p産生低下に より 自己免疫疾患全体の増加に影響してい る可能性を説明した。今回提示したMSでは
TL
R9を介した B細胞由来のIL―10産生が低 下している一方でIL一12産生が上昇している結果にっいて、 その機序を求める問いがあった。発表者はTLR9受容体を介した後の、下流シグナル伝達の 差異を可能性に挙げた。また、B細胞由来のIL−10はMS群全体で低下している一方で、IL―12産生は再発期MS群でのみ上昇している結果に注目し、疾患活動性も影響している可能 性を挙げた。M
Sでは衛生仮説の他にも感染が発症や再燃の誘導因子になる知見 を冒 頭で 紹介 した が、 MSにお いてC
D27陽性memory
B細胞におけるTLR9発現が低下するという実験結 果は過去の知見と相反すると解釈できる点について推測を求める問いもあった 。発 表者 はま ず、 今回 の 実験 モデルにっいて、本来であればCD27陽性 memoryB
細胞を抽出してサイ トカイン産生能を評価することが妥当であるが、実際にはmemoryB
細胞を抽出することは 大量の末梢血を必要とすることから困難であり、B細胞の抽出にとどまっている 点に つい て触 れた 。そ の 上で 、MSのmemory
B細胞におけるTLR9発現の低下は何らかのfeedback機構 が関与している可能性を示した。最後に、本研究の臨床への応用について問い があ った。発表者は今回の結果がMSの初発 、いわゆるclinicall
y isolated syndrome
からMSへの移 行を占う因子になる可能性に触れた。さらに、近年TLRは腸管免疫にも関連するとの報告 が相次いでおり、食生活の欧米化や衛生環境の変化が腸管免疫を介してMS発症に影響して いるという仮説を提唱し、今回の結果がMSの予防に一石を投じる可能性についても説明し た。
この論文は 、MSにおける自然免疫と免疫調節性機能の重要性を示した点、またMSの臨床像の変化を免 疫学的機序の観点から考察している点で高く評価され、今後のMS病態の更なる解明に寄与 することが期待される。
審査員一同 は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併 せ申 請者 が博 士（ 医学 ） の学 位を 受け るの に十 分な 資格 を有するものと判定した。

ー 411−