工学院大学研究報告 第 117 号

平成 26 年 10 月

氏 名（本 籍）望 月 千 尋（秋田県）

学 位 の 種 類

博士（工学）

学 位 記 番 号

博乙第 117 号

学位授与の要件

学位規則第 4 条第 2 項

学位授与年月日

平成 26 年 2 月 27 日

学位論文題目Ca 錯体を用いるアパタイト粉末合成および薄膜形成と生体硬組織再生への応用

論文審査委員

主査

佐藤光 史

副査

木村雄 二

大

倉利 典

門

間英 毅（本学名誉教授・法政大学客員教授）

論文要旨
目次

ト（HA：Ca10（PO4）（OH）62）に代表される六方晶系のリン酸カルシウム化合物（CP）である各種アパタイトについて，生体材料の形成分野で用いられることの少な

第1章

研究の背景と目的かった金属錯体の利用に着目した．本研究では，（１）第2章

Ca 錯体からのアパタイト粉末合成

短時間反応で再現性良く均一組成のアパタイトを与える

第3章

結 晶性制御アパタイトと生分解性ポリマー複化学合成と生成物の特徴の解明，（２）合成アパタイト合スキャフォールドと生分解性ポリマーからなる複合スキャフォールドの形

第4章

水溶液スプレー法の開発と形成 CA 薄膜評価

成と骨再生能の評価，（３）インプラントのアパタイト

第5章

ア ミノ酸の Ca 錯体を用いるアパタイト / ゼラ

コートに有効な新たなコーティング法の開発と形成材料

チン複合スキャフォールドの評価，（４）錯体を利用する生体高分子化合物をマト

第6章

総括リックスとするアパタイト複合化スキャフォールドの新規形成法の開発を目的とした．これらの目的に対して，

本論文は，Ca 錯体を用いるアパタイト粉末合成およ水溶液中における Ca 錯体の安定度を考慮し，また材料

び薄膜形成と生体硬組織再生への応用に関する研究をまの安全性の観点から配位子としてアミノ酸類を主に用いとめた．以下に，各章の概要を記した．て研究を展開した．

第1章

第2章

研究の背景と目的

本章では，骨再生用材料としてのアパタイトの研究背景および本研究の目的を述べた．

Ca 錯体からのアパタイト粉末合成

本章では，Ca 錯体の水溶液中反応でアパタイト粉末を形成する方法を先ず検討した．現在の工業的なアパタ社会の高齢化に伴い，従来の方法で生活の質を回復す

イト合成法は湿式法で，pH の厳密な制御と長時間反応ることが困難な疾患や，事故による硬組織欠損部の治療を要する欠点がある．そこで，分子プレカーサー法で炭に対して，代替材料であるインプラントの活用を含む再酸アパタイト（CA）薄膜形成に用いるエチレンジアミ

生医療が期待されている．特に，細胞と細胞の足場材料ン四酢酸（EDTA）をはじめ，多座配位子の Ca 錯体を経（スキャフォールド）を組合せる組織工学は，生体硬組由するアパタイト粉末合成を試みた．合成に当たっては，織の再生に有効とされている．一般に，組織工学で使用

Ca 錯体の水溶液中での安定度に着目し，多座配位子をする生体材料は開発コストに依存して高価で，かつ汎用EDTA からイミノ二酢酸（IDA；H2ida）やその異性体で性に乏しい．2013 年現在の日本で，骨粗しょう症や関天然アミノ酸のアスパラギン酸（L−Asp）を選択した．

節症，歯周病などによる硬組織の要治療者数が年間 20

各錯体水溶液から，生体中の反応環境に近い温和な条件万人を超す背景から，量産化が可能で安全で安価な生体下での低結晶性アパタイト粉末合成を検討し，簡便な合材料の開発が急務であり，簡便な方法による材料形成が成方法を確立した．また，得られたアパタイトには炭酸必須である．

や脱離配位子が含まれていることを実証した．

本論文では，生体硬組織の主成分である水酸アパタイ

EDTA の Ca 錯体を用いるアパタイト粉末合成では，

工学院大学研究報告84

高濃度過酸化水素溶液中にリン酸と EDTA の Ca 錯体を定度が，室温の水溶液中で生成する水酸アパタイトが加え，アンモニアを添加して透明溶液を得た．これをCa 欠損型と充足型に分岐する臨界点であることを見出

50°
C で超音波照射すると CDHA（Ca 欠損型水酸アパタ

した．

イ ト ） が， 還 流 す る と CHA（ 炭 酸 水 酸 ア パ タ イ ト ）/CDHA 混 合 粉 末 が 選 択 的 に 得 ら れ た．CDHA と CHA/
CDHA の各結晶子サイズは 24 と 34 nm で，結晶性を制第3章

結 晶性制御アパタイトと生分解性ポリマーの複合スキャフォールド

御 し た ア パ タ イ ト 粉 末 を 得 る こ と が で き た．CHA/

HA や TCP（三リン酸カルシウム）の CP 粉末を生分

CDHA は淡黄色を呈していたが，700°C の熱処理により解性ポリマーと複合化した成型材料がスキャフォールド

結晶子サイズ 40 nm の白色結晶を得た．過酸化水素によとして注目され，その生体適合性や骨再生能が盛んに研る Ca 錯体の部分酸化分解により Ca を供給できるこの究されている．一方で，いまだ明確な材料設計指針が得方法は，煩わしい pH 制御が不要で，Ca 錯体によるアパられていないだけでなく，CP の結晶性に着目した研究

タイト粉末合成の有効性を示した．

はなかった．そこで，第 2 章で合成した複数のアパタイ2＋次に，より温和な反応条件下での低結晶性アパタイト

トの結晶性が骨再生能に及ぼす影響を調べるために，新粉末の合成を検討するために，EDTA の部分構造からなたな複合スキャフォールドを形成し，in vitro と in vivo

る IDA の Ca 錯体を単離した．水に溶解した錯体にリンで評価した．

酸を添加しても，通常 Ca イオンと反応して析出するマトリックスとして生分解性ポリマーPLGA（ポリ乳CP は生成しなかった．一方，この均一溶液にアンモニ酸−グルコール酸共重合体，70/30）を選択し，多孔性ア

アを一度に添加すると常温で白色粉末が得られ，その結パタイト複合スキャフォールドについて，PBS（リン酸晶子サイズが 13 nm の低結晶性 CDHA だった．また，90緩衝液）や HBSS（ハンクス溶液）の疑似体液中でのス°C の反応溶液から得た粉末の組成は CHA/HA で，そのキャフォールド分解挙動と CP 生成挙動を検討した．そ結晶子サイズは 14 nm の低結晶性で，いずれも配位子由の結果，アパタイトの複合化は，PBS 中でスキャフォー来の有機物を含有していた．このように，IDA の Ca 錯ルド分解速度を抑制でき，さらに HBSS 中で CP の析出2＋体を含む均一溶液から，反応温度に寄らず低結晶性アパ速度を高めることが分かった．また，繊維芽細胞や骨芽タイトを短時間かつ高収率で得る方法を見出し，EDTA細胞の初期付着も良好で，材料に毒性がないことを確認錯体系との相違点を考察した．

した．さらに，EDTA の Ca 錯体から得た低結晶性 CDHA

以上のように，Ca 錯体を用いる新たなアパタイト粉と複合化したスキャフォールドのウサギ大腿骨への埋入末合成法によって，生成物中に IDA を含む低結晶性アパ試験によって，新生骨が 4 週間後から生成し始め，12 週タイト粉末を得た．そこで，IDA の構造異性体で非コ間後には形成骨が皮質骨に変化し，周辺組織と良好に結

ラーゲンタンパク質構成アミノ酸の Asp を配位子とする合 す る こ と が 分 か っ た． ま た，12 週 間 後 の 高 結 晶 性

Ca 錯体を原料とするアパタイト合成を検討した．より

CHA/CDHA の複合スキャフォールドは，欠損部の一部安定度が低いにもかかわらず，Asp の Ca 錯体水溶液にに新生骨を形成したものの，PLGA 単独では新生骨を形リン酸を添加しても，安定な均一溶液（以下「Ca−Asp−成しなかった．このように，低結晶性アパタイトの複合PO4 三元系錯体水溶液」という．
）を得ることができた．

化が，骨形成に対して有効なことが分かった．

常温でアンモニアを添加して得られたアパタイト粉末

一方，IDA と Asp の Ca 錯体を経由した低結晶性アパは，結晶子サイズ 13 nm の低結晶性 CDHA/HA であった．

タ イ ト 粉 末 を，PLGA を マ ト リ ッ ク ス と す る ス キ ャまた，90°C に加熱した Ca−Asp−PO4 三元系錯体水溶液にフォールドについて，in vivo 試験を実施した．その結果，アンモニアを添加して得た粉末は，同一の結晶子サイズ低結晶性アパタイトは溶解して残存していないにも関わの HA/CHA であった．いずれの生成物も Asp を含み，アら ず，12 週 間 後 で も 骨 形 成 が 不 完 全 で， 骨髄 内 部 にパタイトに対する物質量換算の含有率は IDA 系と等倍かPLGA 由来の残存物が混入していた．本試験に用いた2.7 倍であった．

PLGA マトリックスの気孔率が 96％で，先に検討した

このように，従来の湿式法に比べて極めて短時間で，EDTA錯体系の92％よりも高かったために強度が低下し，生成アパタイトの種類を選択的に効率よく合成できる方アパタイト結晶を有効に保持できなかったことが不完全法を開発した．Ca2＋イオンをブロックするアミノ酸錯体な骨再生の主要因と考えられる．このようにスキャ形成は，リン酸が共存する均一水溶液を調製する方法とフォールドの骨再生能には，気孔率に依存するマトリッして有効であった．また，Ca−Asp−PO4 三元系錯体の安クス強度が著しく影響することが示された．

本学において授与された博士論文の要旨

第4章

水溶液スプレー法の開発と形成 CA 薄膜評価

硬組織代替材料であるインプラントへのアパタイト85溶液調製法を用いたが，ゲル化前の反応水溶液は無色透明だった．このゲルの上層に，非コラーゲンタンパク質コーティングの重要性を第 1 章で述べた．本章では，構成アミノ酸である Arg の水溶液を静置したところ，固Ca2＋イオンへの配位子としてアミノ酸より単純な炭酸イ液界面からゲル内部に向かって白色結晶が析出した．

オンと，リン酸イオンを同時に配位したことが推定されCa−Asp−PO4 水溶液と Arg との反応で得られた粉末は，る新規な錯体を設計して，簡便にアパタイトを析出可能

HA/CDHA 混合物で，結晶子サイズは 15 nm の低結晶性なコーティング水溶液合成を検討し，得られたアパタイであったことから，ゲル内部に析出した白色結晶は HA/ト膜の CP 析出について in vitro で評価した結果を記載しCDHA 混合物と推定される．上層の水溶液を除去し，た．

結晶が析出したゲルを凍結乾燥したアパタイト / ゼラチ

二酸化炭素を飽和させた炭酸水素カルシウム水溶液にリン酸を添加すると，安定な酸性水溶液，Ca−CO3−PO4ン複合成型体の気孔径は，細胞増殖に好適な 100〜300μm で，すでに in vivo の評価に着手している．

三元系錯体水溶液を調製できた．この水溶液でアパタイ

このように，Asp が Ca2＋イオンに錯形成して，Ca2＋イトを膜状に析出させ得るか検討し，簡便なスプレーにオンとリン酸との直接反応を防止した水溶液を固定化しよって成膜できる水溶液スプレー（ASC）法を考案し，たゼラチンゲルは，Arg 水溶液と固液相間で反応し，自静電スプレー析出法などでは避けられない揮発性有機物発的にアパタイトをゲル内部に析出した．反応や形成操（VOC）の発生しないスプレー法を開発できた．5 分間

作は極めて簡便で，アミノ酸錯体を応用する有効性を示の短時間スプレーによる約 1 μm の厚さからなる膜の化すことができた．

学組成が Ca10（PO4）（CO・2CO2・3H2O であることを明63）らかとし，さらにこの膜を Ar 気流中 600°C で熱処理す

第6章

総括

ると，組成が Ca10（HPO4）（PO4）（CO（OH）
・CO2 に変化
53）

以上の各章に述べたように，従来アパタイト粉末合成し，そのせん断強度が飛躍的に向上することも明らかにや薄膜形成に用いられたことがほとんどなかった Ca 錯した．

体を利用して，アパタイトの簡便な合成や成膜を達成し，ASC 法では，水溶液のスプレー時間調整で膜厚を容易さらに固液界面の錯体反応による新しいゼラチン複合スに制御でき，約 0.1 μm の薄膜も得た．これらの CA 膜表キャフォールド形成反応を達成した．これらの成果につ面は，径が 10〜15 μm の膜厚に寄らない網目状構造で，いて，硬組織再生材料設計に指針を与える工学的な視点

約 0.3 μm の高さの隆起で区切られていた．これらの CAから，本章で研究を総括した．

膜に対する骨芽様細胞 MC3T3−E1 の仮足伸展について評価したところ，網目径や隆起部の高さが重要な因子であった．

論文審査要旨
本論文は，Ca 錯体を用いてアパタイト粉末合成およ以上のように，新たな VOC フリーコーティング法をび薄膜を形成し，生体硬組織再生材料として応用した研提案できただけでなく，ASC 法による CA 形成メカニズ究を全 6 章にまとめたものである．応用例に乏しかった

ムを考察したほか，前章で述べたスキャフォールドに要Ca 錯体を利用し，通常リン酸と容易に結合する Ca2＋ を求される材料設計指針についてもいくつかの重要な知見

ブロックして直接反応を防止し，外部刺激でアパタイトを得て，本章で考察した．

が生じる水溶液系を設計して材料形成に応用した．細胞足場材料（スキャフォールド）とインプラントのコー

第5章

ア ミノ酸の Ca 錯体を用いるアパタイト / ゼラ

ティングに適用して，各材料が生体硬組織再生に有効なチン複合スキャフォールドの形成ことを示し，発展的な新分野を拓いた．

本章では，Ca−Asp−PO4 三元系錯体を含む水溶液を用

第 1 章には，生体硬組織再生用材料とアパタイトに関いて，アパタイト含有ゼラチンスキャフォールドの簡便する研究背景と目的が述べられている．スキャフォールな作製方法を検討し，その結果を記載した．

ドを活用する組織工学と，インプラントの活用を含む再60°
C の Asp の Ca 錯体水溶液に医療用ゼラチンを溶解

生医療の重要性が記載されている．これら生体材料は一し，37°C に冷却後 Ca/P 比 1.67 となるリン酸を添加して般に高価で，汎用性に乏しいが，安全で安価な生体材料冷蔵保存したところ，透明なゲルが得られた．合成に当開発が社会の高齢化に伴って重要である．

たっては，ゼラチンの溶解温度を考慮して，2 章 3 節で第 2 章では，Ca 錯体の水溶液中反応でアパタイト粉末

述べた Ca−Asp−PO4 三元系錯体水溶液合成法とは異なるの合成について検討し，工業的なアパタイト合成法が，

工学院大学研究報告86

厳密な pH 制御と長時間反応を要する欠点の克服を目指

第 4 章では，炭酸イオンとリン酸イオンを同時に配位して検討した．合成に当たっては，Ca 錯体の水溶液中した三元系Ca錯体を設計して，簡便に膜形成できるコーでの安定度に着目し，汎用有機多座配位子や天然アミノティング水溶液の合成に成功し，インプラント材料のチ酸を用い，リン酸イオンが共存する各錯体水溶液から短タン板上に得たアパタイト膜についての評価結果が記載

時間で均一組成のアパタイトを得る簡便な方法を確立されている．

し，その化学組成を詳細に検討した．

Ca−CO3−PO4 三元系錯体水溶液を用いて，揮発性有機

先ず，EDTA 錯体を原料として，超音波照射で低結晶物を発生しないスプレー法を考案し，アパタイト膜形成性の Ca 欠損型水酸アパタイト（CDHA）を，高温反応メカニズムを考察した．5 分間で約 1 μm厚の膜を形成し，で 2 種類のアパタイト混合粉末を選択的に得た．過酸化さらに熱処理後の膜についても化学組成を明らかにし

水素水を用いるものの，錯体の利用で，結晶性を制御して，そのせん断強度変化について結晶学的観点から考察た一定組成のアパタイト粉末の短時間合成を実現した．

した．また，特徴的な網目状構造をもつより薄い膜形成

次いで，イミノ二酢酸（IDA）錯体を用いて，より温も達成し，網目隆起部高さが，細胞の伸展に重要なこと和な条件下の反応を検討し，過酸化水素が不要で，低結を見出したほか，前章のスキャフォールドに要求される晶性アパタイトを効率良く得る方法を見出した．

材料設計指針についても，重要な知見を得て考察した．

さらに，IDA の構造異性体で酸性アミノ酸のアスパラ

第 5 章では，2 章で合成した Ca−Asp−PO4 三元系錯体水ギン酸（Asp）を用いて，Ca−Asp−PO4 三元系錯体水溶溶液を応用し，アパタイト含有ゼラチンスキャフォール液を得て，常温反応で低結晶性アパタイト粉末合成を達

ドの簡便な作製方法を検討した．先ず，錯体水溶液と塩成した．このように，リン酸が共存する均一水溶液を調基性アミノ酸のアルギニン（Arg）との反応で得た粉末製するために，Ca のアミノ酸錯体の有効性を見出し，が，HA/CDHA 混合物で，低結晶性であることを明らか選択的で，かつ効率の良い合成法を開発した．また，アとした．そこで，錯体水溶液と医療用ゼラチンから均一スパラギン酸錯体の安定度が，室温水溶液中で水酸アパ透明なゲルを得て，その上層に Arg 水溶液を静置し，界タイトが Ca 欠損型と充足型に分岐する臨界点であるこ面からゲル内部に白色結晶を析出させる独創的な方法とを見出す特筆すべき成果を得た．

で，アパタイト / ゼラチン複合成型体の形成に成功した．

第 3 章では，2 章で合成した結晶性制御アパタイトを気孔径は細胞増殖に好適で，動物へのスキャフォールド複合化したスキャフォールドを形成し，その評価結果を埋入手術に適用可能なことを示した．スキャフォールド

記述している．これら複合スキャフォールドには未だ明形成操作は極めて簡便で，アミノ酸錯体を活用する有効確な設計指針がなく，複合化するアパタイトの結晶性に性を示した．

着目した研究として最初の例である．

第 6 章では，これらの成果について，工学的な視点か生分解性のポリ乳酸−グルコール酸共重合体（PLGA）ら研究を総括し，さらに非コラーゲンタンパク質構成アを用いた複合スキャフォールドについて，疑似体液中でミノ酸の錯体が有効なことから，骨のリモデリング機構の挙動を先ず検討し，複合化が材料の分解を抑制し，ま解明に関わる研究への発展性について考察した．

た Ca 化合物析出速度を高め，さらに細胞の初期付着も以上のように，本論文は，生体材料創成分野で利用例良好なことを確認した．これを基に，複数の複合スキャの少なかった金属錯体を活用した独創的な研究成果をまフォールドをウサギ大腿骨に埋入し，低結晶性アパタイとめており，工学の分野において大きな成果を得たこと

トの複合化が新生骨形成に特に有効なことを明らかとしが認められ，博士（工学）の学位を授与するに十分値すた．また，スキャフォールドの骨再生能には，マトリッるものである．

クス強度の影響も大きいことを明らかにした．