博 士 （ 医 学 ） 高 橋 哲 也

学位論文題名
Signal Residue for工 nductionofDirectionalNucleotideSubstitution（核酸変異方向を誘導するシグナルについて）

学位論文内容の要旨

ウ ィルス のオープ ンリー ディング フレーム では種 特異的ヌクレオチド組成が存在し、これは 温 血 動物 の mR
NAの ヌ クレ オ チ ド組 成 と は違 っ て 大き な パ ラツ キ を 持つ 。 この種 特異的ヌ クレオ チド組成 はヌクレ オチド 置換の方 向を維 持するメ カニズムの存在を示唆しており、このメカニズムについては（1）Transitional /transVersional substitution，(2)Adaptationto t
RNA abu
ndance，(3) Methylationーdeamination‑mut
ation，(4)Selectiv
eadv
antage，(5) Mutational pressure，(6) S
im ultaneo
us doub
le‑nucleot
ideSubstitutionとしユう6つの仮説が考えられている。
ワ クチニ アウィル スの構 造夕ンバ クを単離 精製、 N
末端 アミノ 酸を解析 すること により、各 夕ンバ クをコー ドしてい るジー ンを同定 し、さ らに野生 株及び近縁種での同じジーンについ ても解 析を重ね ていった 結果、 種問での ヌクレ オチドの 相違には一定の規則性が存在し、こ れはゲ ノムのヌ クレオチ ド組成 により生 じる選 択圧だけ では説明できないものであった。
当 初、 ワ ク チニ ア 、 ヴ ァリ オ ラ 、MCVのポ ッ クス ウィル スでのポ リメラー ゼ・ジ ーンのヌ クレオ チド変異 を既存の 仮説に よって解 釈しよ うと試み たが、完全に当てはめることはで
き な か った 。 そ こで Sign
al Nucleotide Residu
eとい う考え方 によ り、これ らのヌク レオチド置換の方向性を説明付けることを行った。
そ の過 程 で は上 記 6つ の既 存 仮 説と Base‑palrre
Iati
onshi
ps， Stran
dbias，ErrorぢpeCOde＿ degeneration， SynonymouSSubStitution， OVer‐ andunder‐ preSentationof
dinucleotides， Replicationmode， Fourparametermodelと い っ た 推 計 学 的 な 検 証 を同 時 に 行 っ た 。 結 果 、 ワ ク チ ニ ア ウ ィ ル ス で の ヌ ク レ オ チ ド 組 成 が 特 異 な Signal
NuC
leot
ideReSjdueにより規定されていることがわかった。
さ らにこ の考え方 をポッ クスウィ ルス以外 にへル ベスウィルス（単純ヘルベス、水痘―帯状 疱 疹 、EB、 サイ ト メ ガ ロ、 ヘ ル ベス サ イ ミリ ） ピ コル ナ ウ ィル ス （ ポリ オ1型、2型、3型 、 A型 肝 炎 ） 、 ヘ パ ド ナ ウ ィ ル ス （ B型 肝 炎 ） 、 レ ト ロ ウ ィ ル ス （ HIV、 SIV） に関しても調ベ、一定の解を得ることができた。
こ の 結 果 は DNAウ ィ ル ス 、 RNAウ ィ ル ス を 問 わず 、 同 じ種 保 存 メカ こ ズ ムが 存 在 してい ること を表して おり、ウ ィルス 種の進化 を解明 するため の手がかりとなると考えられる。
ま た 、 頻繁 に 起 こる 疾 病性ウィ ルスの抗 原性変 異の解明 の一助 となるこ とが期 待される 。

‑ 146 ‑

学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 志 田 壽 利
副 査 教 授 高 田 賢 蔵
副 査 教 授 皆 川 知 紀

学位論文題名
Signal Residue forInductionofDirectionalNuCleotideSubStitution（ 核 酸 変 異 方 向 を 誘 導 す る シ グ ナル に つ いて ）ワクチ ニアウ ィルスの 構造夕ンパクを単離精製し、N末端アミノ酸を解析することにより、各夕ンパクをコードしている遺伝子を同定し、近縁種での同じ遺伝子との比較研究を行った。
さらに 細胞間 融合、細 胞ウィ ルス融合 で得られ た結果 を伴わせて解析を重ねた結果、ヌクレオチド 置換の 方向を維 持する ウィルス 独自のメ カニズ ムがあるのではないかと考えられた。
ワクチ ニアウ ィルスゲ ノムで どのよう な変異が 起こっ たのか．、種としての安定度合いを測る こと は でき な い か、 と い う疑 問 を解 明 す るた め にゲ ノ ム の解 析 研究 を始めた 。
ヌクレ オチド 置換にっ いての 一般的な 仮説は 現象を数量化したものであり、ヌクレオチド構成バ ターン がどう生 み維持 されるか を充分に 説明す るものではない。そこで、レプルカー
ゼコン プレッ クスがレ プリケ ーション サイクル の中で 、シグナルとなるヌクレオチドに導かれる形 で置換 を起こす のでは ないかと いう仮説 を立て た。
まず、 ワクチ ニアウィ ルスの ゲノム中 にジヌ クレオチドがどれだけ存在するかを調べた。
こ の際 に シ グナ ルヌ クレオ チドと置 換ヌク レオチド の位置 が離れて いる必要 がある かもしれない 可能性 を考慮し 、間隔 を持った ジヌクレ オチド の場合も調べた。それらの存在数を単純にヌ クレオ チド構成 から計 算された 期待値で 除すこ とにより、ジヌクレオチドの結びっきの強さ （アソ シエーシ ョン強 度）を求 めた。
さらに 、一方 のヌクレ オチド を固定し たまま 、一定間隔上に存在するヌクレオチド種同士のアソ シエー ション強 度の比 をとった 。現存す るゲノ ムがヌクレオチド置換をある程度引き起こし た結果 として存 在して いること から、こ の比は ある置換方向におけるシグナルの強度を表し ている と考えら れる。
この結 果を用 い、逆に 置換方 向を固定 した場 合の各間隔に位置するシグナルヌクレオチドとその 強度を マトリク ス化し 、高い強 度のシグ ナルヌ クレオチドを抽出することにより、その置 換 方向 での シグナルヌクレオ チドの配列を得る ことができる。
さらに 、この 置換位置 とされ るヌクレ オチド の組み合わせを任意のヌクレオチドが特定のヌクレ オチド に置換さ れると いう置換 方向と、 方向性 の無い置換を起こしやすいヌクレオチ
ドとい う2種類のエ ラータイ プに分 け、この シグナ ルヌクレ オチド を配列さ せところ、それぞ れ3種 あ るシ グ ナ ルヌ ク レ オ チド は 数 学的 に偶然 性を否 定できる だけの一 致性が あるこ― 147−

とがわか った。ま た、そ の配列は 5 側と3 側でコ ンプリ メンタリ ーとな った。こ れはりーディン グ、ラギ ング鎖 合成で同 じ1つのレプ リカーゼ を使う ワクチニアウィルスの特徴に当てはま るもので あり、 当初の仮 説の妥 当性を支 持する 。
また、置 換頻度 を数値化 できたこ とにより、既存のゲノムの安定度理論による「選択圧が発生しな いシノニ マス置 換が3ヌクレ オチド周 期で現れ る」こ とを利用したパラメーターを用いるこ とにより 、種の 安定性を 測定し た。ワク チニア ウィルス のG
C含量 の少なさ は単純に GCが 減 少 し 、 ATが 増 え て いる の で は なく 、 Gとい う ヌ クレ オ チ ドの 3 側に 位 置 する
ヌクレオ チドがAかTに置換 されやす いため に起こっ た結果 であると 考えら れ、かな り安定したゲノ ムに達し ている という結 果が得 られた。
審査員か ら「本 仮説の一 般化の可 能性」「抗原性変異の予測」「コーディング域とノンコーディン グ域の違 い」に 関しての 質問があり、申請者はそれぞれ、「レプリケーションシステムの違 い」「変 異と置 換の違い 」「ワクチニアウィルスのゲノム構造」をもとにおおむね妥当に解 答した。
この論文 は、ウ ィルス種 の進化を 解明するための手がかりとなると考えられる。また、頻繁に 起 こる 疾 病 性ウ ィ ルス の 抗 原性 変 異の 解 明 の一 助と なること が期待され る。
審査員一 同は、 これらの 成果を高 く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格 を有する ものと 判定した 。

148−